1.1.

«Nível de ação», o teor de uma dada substância, tal como definido no anexo da Recomendação 2013/711/UE, que dá início a investigações para identificar a fonte dessa substância, nos casos em que é detetado um aumento dos teores da substância.

1.2.

«Métodos de pré-seleção», os métodos utilizados na seleção das amostras com teores de PCDD/F e PCB sob a forma de dioxina que excedam os teores máximos, ou os níveis de ação. Esta abordagem deve permitir um método de pré-seleção que permita uma boa relação custo-eficácia com a análise de um elevado número de amostras, aumentando assim a oportunidade de descobrir novos incidentes com elevada exposição e riscos para a saúde dos consumidores. Os métodos de pré-seleção devem basear-se em métodos bioanalíticos ou em GC-MS. Os resultados de amostras que excedem o valor-limite para verificar a conformidade com o teor máximo devem ser verificados por uma reapreciação completa da amostra inicial com recurso a um método de confirmação.

1.3.

«Métodos de confirmação», métodos que fornecem informação completa ou complementar que permite a identificação e a quantificação inequívocas do teor máximo ou, em caso de necessidade, do nível de ação de PCDD/F e de PCB sob a forma de dioxina. Tais métodos utilizam a cromatografia em fase gasosa/espectrometria de massa de alta resolução (GC-HRMS) ou cromatografia gasosa/espectrometria de massa em tandem (GC-MS/MS).

1.4.

«Métodos bioanalíticos», os métodos baseados na utilização de princípios biológicos, como ensaios com células, ensaios com recetores ou imunoensaios. Não dão resultados ao nível do congénere, mas apenas uma indicação (2) do valor TEQ, expresso em equivalentes bioanalíticos (BEQ), no sentido de reconhecer o facto de que nem todos os compostos presentes num extrato de amostra que produzem uma resposta no teste podem cumprir todos os requisitos do princípio de TEQ.

1.5.

«Recuperação aparente do bioensaio», o valor BEQ calculado a partir da curva de calibração da TCDD ou do PCB 126 corrigida em função do resultado do ensaio em branco e, em seguida, dividido pelo valor TEQ determinado pelo método de confirmação. Visa corrigir fatores como a perda de PCDD/PCDF (a seguir PCDD/F) e de compostos sob a forma de dioxina durante as fases de extração e de limpeza, compostos co-extraídos que aumentam ou diminuem a resposta (efeitos agonísticos e antagónicos), a qualidade de ajustamento da curva, ou diferenças entre os valores FET e REP. A recuperação aparente do bioensaio é calculada a partir de amostras de referência apropriadas com padrões de congéneres representativos próximos do teor máximo ou do nível de ação.

1.6.

«Métodos semiquantitativos», métodos que dão uma indicação aproximada da concentração do analito suposto, embora o resultado numérico não preencha os requisitos para os métodos quantitativos.

1.7.

«Limite de quantificação específico aceite para um congénere individualnuma amostra», o teor mais baixo do analito que pode ser medido com uma certeza estatística razoável, cumprindo os critérios de identificação, tal como descritos em normas reconhecidas internacionalmente, por exemplo, na norma EN 16215:2012 (Alimentação animal — determinação de dioxinas e de PCB sob a forma de dioxina por GC/HRMS e de PCB indicadores por GC/HRMS) e/ou nos métodos EPA 1613 e 1668, revistos.

O limite de quantificação de um congénere individual pode ser identificado como:

1.8.

«Limite superior», o conceito que preconiza que o contributo de cada congénere não quantificado seja igual ao limite de quantificação.

1.9.

«Limite inferior», o conceito que preconiza que o contributo de cada congénere não quantificado seja igual a zero.

1.10.

«Limite médio», o conceito que preconiza que o contributo de cada congénere não quantificado seja igual a metade do limite de quantificação.

1.11.

«Lote», quantidade de alimentos identificável, entregue de uma vez, que apresenta, conforme estabelecido pelo agente responsável, características comuns tais como a origem, a variedade, o tipo de embalagem, o embalador, o expedidor ou a marcação. No caso do peixe e/ou de produtos da pesca, deve também ser comparável o seu tamanho. Se, dentro de uma remessa, o tamanho e/ou o peso do peixe não forem comparáveis, a remessa pode ainda ser considerada um lote, mas tem de ser aplicado um procedimento de amostragem específico.

1.12.

«Sublote», parte designada de um grande lote para aplicação do método de amostragem a essa parte designada. Cada sublote deve ser fisicamente separado e identificável.

1.13.

«Amostra elementar», quantidade de material colhido num só ponto do lote ou sublote.

1.14.

«Amostra global», a combinação da totalidade das amostras elementares colhidas no lote ou sublote.

1.15.

«Amostra de laboratório», uma parte/quantidade representativa da amostra global destinada ao laboratório.

BEQ

Equivalentes bioanalíticos

GC

Cromatografia em fase gasosa

HRMS

Espectrometria de massa de elevada resolução

LRMS

Espectrometria de massa de baixa resolução

EM/EM

Espectrometria de massa em tandem

PCB

Bifenilos policlorados

PCDD

Dibenzeno-p-dioxinas policloradas

PCDF

Dibenzofuranos policlorados

QC

Controlo da qualidade

REP

Atividade relativa

FET

Fator de equivalência tóxica

TEQ

Equivalentes tóxicos

TCDD

Tetraclorodibenzodioxina

U

Incerteza expandida da medição

—

Caso o lote a amostrar contenha peixes pequenos (cada um com peso inferior a cerca de 1 kg), o peixe inteiro é colhido como amostra elementar para efeitos de constituição da amostra global. Se a amostra global daí resultante pesar mais de 3 kg, as amostras elementares podem consistir da parte do meio dos peixes que formam a amostra global, pesando cada parte pelo menos 100 gramas. A parte inteira à qual o teor máximo seja aplicável é usada para a homogeneização da amostra.

A parte do meio do peixe é aquela em que se situa o centro de gravidade e que está localizado, na maioria dos casos, na barbatana dorsal (se o peixe tiver uma barbatana dorsal) ou a meio entre a abertura branquial e o ânus.

—

Caso o lote a amostrar contenha peixes maiores (cada um com peso superior a cerca de 1 kg), a amostra elementar consistirá na parte do meio do peixe. Cada amostra elementar deve pesar, no mínimo, 100 gramas.

Para peixes de tamanho intermédio (com cerca de 1-6 kg), a amostra elementar é colhida como uma porção da parte do meio do peixe, entre a espinha dorsal e a barriga.

Para peixes muito grandes (por exemplo, com peso superior a cerca de 6 kg), a amostra elementar é colhida da parte comestível lateral-dorsal do lado direito (perspetiva frontal) da parte do meio do peixe. Caso a extração de uma porção da parte do meio do peixe possa resultar num prejuízo económico significativo, pode considerar-se suficiente a extração de três amostras elementares de, pelo menos, 350 gramas cada, independentemente da dimensão do lote, ou, em alternativa, podem ser colhidas porções iguais da parte comestível perto da cauda e da parte comestível perto da cabeça de um único peixe para formar a amostra elementar representativa do teor de dioxinas no peixe inteiro.

—

São aplicáveis as disposições do ponto III.3 no que respeita à constituição da amostra.

—

No caso de uma classe/categoria de tamanho ou peso ser predominante (cerca de 80 % ou mais do lote), a amostra é colhida dos peixes com o tamanho ou peso predominantes. Esta amostra deve ser considerada representativa do lote inteiro.

—

Se não predominar nenhuma classe/categoria específica de tamanho ou peso, então é necessário garantir que os peixes selecionados para a amostra são representativos do lote. No documento de orientação para a amostragem de peixes inteiros de tamanho e/ou peso diferentes (1) («Guidance on sampling of whole fishes of different size and/or weight») são apresentadas diretrizes específicas para estes casos.

—

calculando a incerteza expandida, utilizando um fator de expansão de 2, que permite obter um nível de confiança de cerca de 95 %. Um lote ou sublote não é conforme se o valor medido menos U for superior ao teor permitido definido,

—

estabelecendo o limite de decisão (CCα) em conformidade com o disposto na Decisão 2002/657/CE (ponto 3.1.2.5 do anexo I da referida decisão — caso das substâncias com um teor permitido definido). Um lote ou sublote não está conforme se o valor medido for igual ou superior ao CCα.

—

realizada mediante um método de pré-selecção, com uma taxa de falsos resultados conformes inferior a 5 %, indicar que o teor não excede o respetivo teor máximo de PCDD/F nem a soma de PCDD/F e PCB sob a forma de dioxina, tal como previsto no Regulamento (CE) n.o 1881/2006;

—

realizada mediante um método de confirmação não exceder o respetivo teor máximo de PCDD/F nem a soma de PCDD/F e PCB sob a forma de dioxina, tal como previsto no Regulamento (CE) n.o 1881/2006, tendo em conta a incerteza da medição.

—

calculando a incerteza expandida, utilizando um fator de expansão de 2, que permite obter um nível de confiança de cerca de 95 %. Um lote ou sublote não é conforme se o valor medido menos U for superior ao teor permitido definido. No caso de uma determinação em separado de PCDD/F e de PCB sob a forma de dioxina, a soma da incerteza expandida estimada dos resultados analíticos separados de PCDD/F e de PCB sob a forma de dioxina tem de ser utilizada para a incerteza expandida estimada da soma dos PCDD/F e dos PCB sob a forma de dioxina,

—

estabelecendo o limite de decisão (CCα) em conformidade com o disposto na Decisão 2002/657/CE (ponto 3.1.2.5 do anexo I da referida decisão — caso das substâncias com um limite permitido definido). Um lote ou sublote não é conforme se o valor medido for igual ou superior ao CCα.

a)

Métodos de pré-seleção

O objetivo dos métodos de pré-seleção é selecionar as amostras com teores de PCDD/F e PCB sob a forma de dioxina que excedam os teores máximos, ou os níveis de ação. Os métodos de pré-seleção devem permitir uma boa relação custo-eficácia com a análise de um elevado número de amostras, aumentando assim a oportunidade de descobrir novos incidentes com elevada exposição e riscos para a saúde dos consumidores. A sua aplicação deverá ter como objetivo evitar falsos resultados conformes. Podem incluir métodos bioanalíticos e métodos GC/MS.

Os métodos de pré-seleção comparam o resultado analítico com um valor-limite, fornecendo uma decisão de tipo sim/não sobre a eventual superação do teor máximo ou do nível de ação. É necessário que a concentração de PCDD/F e a soma de PCDD/F e de PCB sob a forma de dioxina em amostras suspeitas de não conformidade com o teor máximo seja determinada/confirmada por um método de confirmação.

Além disso, os métodos de pré-seleção podem dar uma indicação dos teores de PCDD/F e de PCB sob a forma de dioxina presentes na amostra. Em caso de aplicação de métodos bioanalíticos de pré-seleção, o resultado é expresso em equivalentes bioanalíticos (BEQ) enquanto que em caso de aplicação de métodos físico-químicos GC-MS, o mesmo é expresso em equivalentes tóxicos (TEQ). Os resultados dos métodos de pré-seleção indicados numericamente são adequados para a demonstração da conformidade ou da suspeita de não conformidade ou da superação dos níveis de ação e fornecem uma indicação da gama de teores em caso de acompanhamento através de métodos de confirmação. Estes métodos não são adequados para fins como a avaliação dos níveis de base, a estimativa da ingestão, o seguimento das tendências ao longo do tempo dos teores ou a reavaliação dos níveis de ação e dos teores máximos.

b)

Métodos de confirmação

Os métodos de confirmação permitem a identificação e a quantificação inequívocas de PCDD/F e PCB sob a forma de dioxina presentes numa amostra, e fornecem informações exaustivas com base nos congéneres. Por conseguinte, estes métodos permitem o controlo dos teores máximos e dos níveis de ação, incluindo a confirmação de resultados obtidos por métodos de pré-seleção. Além disso, os resultados podem ser utilizados para outros fins, como é o caso da determinação de níveis de base reduzidos na monitorização dos alimentos, o seguimento das tendências ao longo do tempo, a avaliação da exposição da população e a criação de uma base de dados para uma eventual reavaliação dos níveis de ação e dos teores máximos. São também importantes para o estabelecimento de padrões de congéneres com vista a identificar a fonte de uma eventual contaminação; tais métodos utilizam GC-HRMS. Para confirmar a conformidade ou não conformidade com o teor máximo, também se pode utilizar a GC-MS/MS.

—

Devem ser tomadas medidas para evitar a contaminação cruzada em cada etapa do procedimento de amostragem e de análise.

—

As amostras devem ser conservadas e transportadas em recipientes de vidro, alumínio, polipropileno ou polietileno, adequados para o armazenamento sem qualquer influência nos níveis de PCDD/F e PCB sob a forma de dioxina das amostras. Devem ser removidos do recipiente da amostra os vestígios de poeiras de papel.

—

O armazenamento e o transporte das amostras têm de ser realizados de modo a manter a integridade da amostra de alimentos.

—

Desde que relevante, triturar finamente e misturar cuidadosamente cada amostra de laboratório, mediante um processo relativamente ao qual se tenha demonstrado que possibilita uma homogeneização completa (por exemplo, trituração que permita passar por um crivo de 1 mm); as amostras devem ser exsicadas antes da trituração, caso o teor em humidade seja demasiado elevado.

—

É de importância geral o controlo dos reagentes, do material de vidro e do equipamento relativamente a uma possível influência nos resultados baseados em TEQ ou em BEQ.

—

Deve ser efetuada uma análise em branco através da realização de todo o procedimento analítico, omitindo apenas a amostra.

—

Para os métodos bioanalíticos, é de grande importância que todo o material de vidro e solventes utilizados na análise sejam testados para verificar se estão livres de compostos que interfiram com a deteção de compostos-alvo na gama de trabalho. O material de vidro deve ser enxaguado com solventes ou/e aquecido a temperaturas adequadas para remover da sua superfície vestígios de PCDD/F, de compostos sob a forma de dioxina e de compostos interferentes.

—

A quantidade de amostra utilizada para a extração deve ser suficiente para cumprir os requisitos relativos a uma gama de trabalho suficientemente baixa, incluindo as concentrações dos teores máximos ou dos níveis de ação.

—

Os procedimentos específicos de preparação de amostras utilizados para os produtos em causa devem seguir orientações aceites internacionalmente.

—

No caso dos peixes, a pele tem de ser removida, dado que o teor máximo é aplicável à parte comestível sem pele. Contudo, é necessário que todos os restos da parte comestível e do tecido adiposo do lado interno da pele sejam cuidadosamente raspados e completamente separados da pele e sejam adicionados à amostra a analisar.

—

Em conformidade com o disposto no Regulamento (CE) n.o 882/2004 do Parlamento Europeu e do Conselho (1), os laboratórios devem ser acreditados por um organismo reconhecido que opere em conformidade com o Guia ISO 58, a fim de assegurar que aplicam a garantia de qualidade analítica. Os laboratórios devem ser acreditados em conformidade com a norma EN ISO/IEC/17025.

—

A competência de um laboratório é comprovada mediante uma participação contínua e bem-sucedida em estudos interlaboratoriais para a determinação de PCDD/F e de PCB sob a forma de dioxina nas matrizes alimentares e nas gamas de concentrações relevantes.

—

Os laboratórios que aplicam métodos de pré-seleção para o controlo de rotina de amostras devem estabelecer uma estreita cooperação com os laboratórios que aplicam o método de confirmação, tanto para o controlo da qualidade como para a confirmação do resultado analítico das amostras suspeitas.

—

Para os PCDD/F, as quantidades detetáveis devem situar-se na gama alta dos femtogramas (10–15 g) devido à extrema toxicidade de alguns destes compostos. Para a maioria das congéneres de PCB, o limite de quantificação na gama dos nanogramas (10–9 g) já é suficiente. No entanto, para a medição dos congéneres de PCB sob a forma de dioxina mais tóxicos (designadamente, os congéneres não-orto substituídos), o limite inferior da gama de trabalho deve atingir os valores inferiores dos picogramas (10-12 g).

—

É necessário estabelecer uma distinção entre PCDD/F e PCB sob a forma de dioxina e inúmeros compostos coextraídos e eventualmente interferentes, que estão presentes em concentrações que podem atingir várias ordens de grandeza superiores às dos analitos requeridos. Nos métodos de cromatografia gasosa/espectrometria de massa (GC-MS), é necessária uma diferenciação entre vários congéneres, nomeadamente entre congéneres tóxicos (por exemplo, os dezassete PCDD/F substituídos nas posições 2,3,7 e 8 e os doze PCB sob a forma de dioxina) e outros congéneres.

—

Os métodos bioanalíticos devem ser capazes de detetar os compostos-alvo como a soma de PCDD/F e/ou de PCB sob a forma de dioxina. A limpeza (clean-up) das amostras destina-se a remover compostos conducentes a falsos resultados não conformes ou compostos que possam diminuir a resposta, provocando falsos resultados conformes.

—

Para os métodos GC-MS, a determinação deve fornecer uma estimativa válida da verdadeira concentração numa amostra. É necessária uma exatidão elevada (exatidão da medição: proximidade da concordância entre o resultado de uma medição e o valor verdadeiro ou que se presume verdadeiro da grandeza medida) por forma a evitar a rejeição do resultado da análise de uma amostra com base na reduzida fiabilidade do valor TEQ determinado. A exatidão é expressa em termos de rigor (diferença entre o valor médio medido para um analito num material certificado e o respetivo valor certificado, expresso em percentagem deste valor) e de precisão (RSDR, desvio-padrão relativo, calculado a partir de resultados obtidos em condições de reprodutibilidade).

—

Para métodos bioanalíticos, deve ser determinada a recuperação aparente do bioensaio.

—

Os laboratórios devem demonstrar o desempenho de um método na gama do teor máximo (por exemplo, 0,5 × 1 × e 2 × o teor máximo) com um coeficiente de variação aceitável para análises repetidas, durante o processo de validação e/ou durante a análise de rotina.

—

Os controlos regulares com ensaios em branco, com amostras enriquecidas ou análises de amostras de controlo (de preferência, se disponível, material de referência certificado) devem ser realizados como medidas internas de controlo da qualidade. Devem registar-se e verificar-se os gráficos de controlo de qualidade (CQ) para ensaios em branco, com amostras enriquecidas ou análises de amostras de controlo, a fim de garantir que o desempenho analítico está em conformidade com os requisitos.

—

Para o método bioanalítico de pré-seleção, o estabelecimento do LOQ não é um requisito indispensável, mas deve provar-se que o método é capaz de distinguir entre o valor do branco e o valor-limite. Quando se transmite um valor BEQ, deve ser estabelecido um nível de notificação para lidar com as amostras com uma resposta abaixo desse nível. Deve demonstrar-se que o nível de notificação é diferente, pelo menos por um fator de três, das amostras em branco do procedimento com uma resposta inferior à gama de trabalho. Por conseguinte, deve ser calculado a partir das amostras que contenham os compostos-alvo próximos do teor mínimo exigido, e não a partir de um rácio S/R ou um ensaio em branco.

—

O limite de quantificação (LOQ) de um método de confirmação deve ser de cerca de um quinto do teor máximo.

—

Para obter resultados fiáveis a partir dos métodos de confirmação ou de pré-seleção, devem ser satisfeitos os seguintes critérios na gama do teor máximo ou do nível de ação, respetivamente, para o valor TEQ ou o valor BEQ, quer determinado como valor TEQ total (como a soma de PCDD/F e PCB sob a forma de dioxina) ou separadamente para PCDD/F e PCB sob a forma de dioxina.

—

Para a pré-seleção tanto podem ser utilizados métodos bioanalíticos como GC-MS. Para os métodos GC-MS devem ser utilizados os requisitos descritos no ponto 6 do presente anexo. Para os métodos bioanalíticos baseados em células, os requisitos específicos estão descritos no ponto 7 do presente anexo.

—

Os laboratórios que aplicam métodos de pré-seleção para o controlo de rotina de amostras devem estabelecer uma estreita cooperação com os laboratórios que aplicam o método de confirmação.

—

A verificação do desempenho do método de pré-seleção é necessária durante a análise de rotina, por controlo da qualidade analítica e validação contínua do método. Deve existir um programa contínuo para o controlo dos resultados conformes.

—

Controlo da eventual supressão da resposta das células e da citotoxicidade

20 % dos extratos de amostras devem ser medidos em pré-seleção de rotina com e sem adição de 2,3,7,8-TCDD, correspondente ao teor máximo ou ao nível de ação, a fim de verificar se a resposta é eventualmente suprimida por substâncias interferentes presentes no extrato da amostra. A concentração medida da amostra enriquecida é comparada com a soma da concentração do extrato não enriquecido mais a concentração do enriquecimento. Se esta concentração medida for inferior à (soma da) concentração calculada em mais do que 25 %, tal é uma indicação de uma potencial supressão do sinal e a respetiva amostra deve ser submetida a análise de confirmação. Os resultados devem ser monitorizados através de gráficos de controlo de qualidade.

—

Controlo da qualidade de amostras conformes

Aproximadamente 2 % a 10 % das amostras conformes, dependendo da matriz da amostra e da experiência do laboratório, devem ser confirmadas.

—

Determinação das taxas de falsos resultados conformes a partir de dados de controlo de qualidade

A taxa de falsos resultados conformes obtidos na pré-seleção de amostras abaixo e acima do teor máximo ou do nível de ação deve ser determinada. As taxas reais de falsos resultados conformes devem ser inferiores a 5 %.

Logo que o controlo de qualidade das amostras conformes revele, pelo menos, 20 resultados confirmados por matriz/grupo de matrizes, devem ser retiradas conclusões sobre a taxa de falsos resultados conformes a partir dessa base de dados. Os resultados das amostras analisadas em ensaios interlaboratoriais ou durante incidentes de contaminação, abrangendo uma gama de concentrações que pode atingir, por exemplo, duas × o teor máximo (TM), também podem ser incluídos no mínimo de 20 resultados para a avaliação da taxa de falsos resultados conformes. As amostras devem abranger os padrões de congéneres mais frequentes, que representem diferentes fontes.

Embora os testes de pré-seleção devam, de preferência, ter como objetivo a deteção de amostras que excedem o nível de ação, o critério para determinar as taxas de falsos resultados conformes é o teor máximo, tendo em conta a incerteza de medição do método de confirmação.

—

Os resultados potencialmente não conformes na pré-seleção devem ser sempre verificados por uma reanálise completa da amostra inicial por um método de confirmação. Estas amostras podem também servir para avaliar a taxa de falsos resultados não conformes. Para os métodos de pré-seleção, a taxa de «falsos resultados não conformes» é a fração dos resultados conformes que foram confirmados por análises de confirmação, quando na pré-seleção realizada anteriormente a amostra tinha sido declarada suspeita de ser não conforme. No entanto, a avaliação da vantagem do método de pré-seleção deve basear-se na comparação das amostras com falsos resultados não conformes com o número total de amostras verificadas. Esta taxa deve ser suficientemente baixa para tornar vantajoso o uso do instrumento de pré-seleção.

—

Pelo menos nas condições de validação, os métodos bioanalíticos devem fornecer uma indicação válida do valor TEQ, calculado e expresso em BEQ.

—

Para os métodos bioanalíticos levados a cabo em condições de repetibilidade, a RSDr intralaboratorial devia tipicamente ser inferior à reprodutibilidade RSDR.

—

A diferença entre os limites superior e inferior não deve ultrapassar 20 % para a confirmação da superação do teor máximo ou, em caso de necessidade, dos níveis de ação.

—

Logo no início do método analítico, por exemplo antes da extração, deve proceder-se à adição de padrões internos de PCDD/F marcados com 13C e substituídos com cloro nas posições 2,3,7 e 8 e de padrões internos de PCB sob a forma de dioxina marcados com 13C, por forma a validar o procedimento analítico. Deve ser adicionado, pelo menos, um congénere para cada grupo homólogo de PCDD/F tetra a octo-clorado e, pelo menos, um congénere para cada grupo homólogo de PCB sob a forma de dioxina (alternativamente, deve ser utilizado para o controlo de PCDD/F e de PCB sob a forma de dioxina, pelo menos, um congénere para cada função de registo de iões selecionados por espectrometria de massa). No caso dos métodos de confirmação, deve utilizar-se a totalidade dos 17 padrões internos de PCDD/F substituídos nas posições 2,3,7 e 8 e marcados com 13C e a totalidade dos 12 padrões internos de PCB sob a forma de dioxina marcados com 13C.

—

Também devem ser determinados fatores de resposta relativos no caso dos congéneres para os quais não se adiciona um composto análogo marcado com 13C, através da utilização de soluções de calibração adequadas.

—

Em relação aos géneros alimentícios de origem vegetal e aos géneros alimentícios de origem animal que contenham menos de 10 % de gorduras, a adição de padrões internos é obrigatória antes da extração. Em relação aos géneros alimentícios de origem animal que contenham mais de 10 % de gorduras, os padrões internos podem ser adicionados antes ou após a extração de gorduras. Deve ser efetuada uma validação adequada da eficácia da extração, dependendo da fase em que são introduzidos os padrões internos e de os resultados serem notificados com base no produto ou nas gorduras.

—

Antes da análise por GC-MS, devem ser adicionados 1 ou 2 padrões de recuperação (substitutos).

—

É necessário efetuar um controlo da recuperação. Para os métodos de confirmação, as recuperações de cada padrão interno devem situar-se na gama de 60 a 120 %. São aceitáveis recuperações inferiores ou superiores para congéneres individuais, nomeadamente para algumas dibenzo-p-dioxinas e alguns dibenzofuranos hepta- e octo-clorados, desde que a sua contribuição para o valor TEQ não exceda 10 % do valor TEQ total (com base na soma de PCDD/F e PCB sob a forma de dioxina). Para os métodos de pré-selecção GC-MS, as recuperações devem situar-se na gama de 30 a 140 %.

—

Deve proceder-se à separação entre PCDD/F e compostos clorados interferentes, tais como PCB não semelhantes a dioxinas e éteres difenílicos clorados através de técnicas cromatográficas adequadas (de preferência, com uma coluna de florisil, alumina e/ou carbono).

—

É suficiente a separação de isómeros por cromatografia gasosa (< 25 % de pico a pico entre 1,2,3,4,7,8-HxCDF e 1,2,3,6,7,8-HxCDF).

—

A gama da curva de calibração deve abranger a gama relevante dos teores máximos ou dos níveis de ação.

—

Para GC-HRMS:

—

Para GC-MS/MS:

—

Ao calcular as concentrações a partir de uma curva de calibração da TCDD, os valores nas extremidades inferior e superior da curva apresentam uma grande variação [coeficiente de variação (CV) elevado]. A gama de trabalho é a área em que este CV é inferior a 15 %. A extremidade inferior da gama de trabalho (limite de notificação) deve ainda ser estabelecida num nível significativamente superior (pelo menos, por um fator de três) ao dos ensaios em branco do procedimento. A extremidade superior da gama de trabalho é geralmente representada pelo valor EC70 (70 % da concentração efetiva máxima), mas deve ser inferior caso o CV seja superior a 15 % nesta gama. A gama de trabalho é estabelecida durante a validação. Os valores-limite (7.3) devem situar-se dentro da gama de trabalho.

—

As soluções-padrão e os extratos de amostras devem ser testados, pelo menos, em duplicado. No caso de utilização de duplicados, uma solução-padrão ou um extrato-testemunha testado em 4 a 6 cavidades repartidas ao longo da placa deve produzir uma resposta ou concentração (apenas possível na gama de trabalho) com base numa CV < 15 %.

—

Os teores nas amostras podem ser estimados por comparação da resposta ao teste com uma curva de calibração da TCDD (ou do PCB 126 ou de uma mistura-padrão de PCDD/F/PCB sob a forma de dioxina) para calcular o valor BEQ no extrato e, posteriormente, na amostra.

—

As curvas de calibração devem conter 8 a 12 concentrações (pelo menos em duplicado), com concentrações suficientes na parte inferior da curva (gama de trabalho). Será dada especial atenção à qualidade de ajustamento da curva na gama de trabalho. Como tal, o valor R2 tem pouco ou nenhum valor para estimar a adequação do ajustamento em regressão não linear. Um melhor ajustamento será alcançado através de uma redução da diferença entre os teores calculados e os teores observados na gama de trabalho da curva (por exemplo, minimizando a soma dos quadrados dos desvios).

—

O teor estimado no extrato de amostra é posteriormente corrigido em função do valor BEQ calculado para uma amostra em branco de matriz/solvente (para ter em conta as impurezas provenientes dos solventes e dos produtos químicos utilizados) e da recuperação aparente (calculada a partir do valor BEQ de amostras de referência adequadas com padrões de congéneres representativos próximos do teor máximo ou do nível de ação). Para a correção da recuperação, a recuperação aparente deve sempre situar-se dentro dos limites da gama exigida (ver ponto 7.1.4). As amostras de referência utilizadas para a correção da recuperação devem cumprir os requisitos indicados no ponto 7.2.

—

As amostras de referência representam a matriz da amostra, os padrões de congéneres e as gamas de concentrações dos PCDD/F e dos PCB sob a forma de dioxina próximos do teor máximo ou do nível de ação.

—

Cada série de testes deve comportar um ensaio em branco do procedimento, ou de preferência um ensaio em branco da matriz, bem como uma amostra de referência com o teor máximo ou o nível de ação. Estas amostras devem ser extraídas e testadas ao mesmo tempo e em condições idênticas. A amostra de referência deve apresentar uma resposta claramente elevada em comparação com a amostra em branco e, por conseguinte, assegurar a adequação do teste. Estas amostras podem servir para as correções em função do ensaio em branco e da recuperação.

—

As amostras de referência escolhidas para efetuar uma correção em função da recuperação devem ser representativas das amostras de ensaio, o que significa que os padrões de congéneres não devem conduzir a uma subestimação dos teores.

—

Podem incluir-se amostras de referência suplementares com teores, por exemplo de 0,5 × e 2 × o teor máximo ou o nível de ação, para demonstrar o desempenho correto do teste dentro da gama requerida para o controlo do teor máximo ou do nível de ação. Combinadas, estas amostras podem servir para calcular os valores BEQ em amostras de ensaio (7.1.2.2).

BEQDL

BEQ correspondente ao limite de decisão do método de confirmação é o TM incluindo a incerteza de medição

sy,x

desvio-padrão residual

t α,f=m-2

fator de Student (α = 5 %, f = graus de liberdade, unilateral)

m

número total de pontos de calibração (índice j)

n

número de repetições para cada teor

xi

Concentração da amostra (em TEQ) do ponto de calibração i, determinado por um método de confirmação

média das concentrações (em TEQ) de todas as amostras de calibração

Qxx =

=

i =

=

índice do ponto de calibração i

SDR

desvio-padrão dos resultados do bioensaio no BEQDL, medidos em condições de reprodutibilidade intralaboratorial

1.

a partir da faixa inferior do intervalo de previsão de 95 % no limite de decisão do método de confirmação,

2.

a partir de análises múltiplas de amostras (n > 6) contaminadas no limite de decisão do método de confirmação como a extremidade inferior da distribuição dos dados (representados na figura por uma curva em forma de sino) no valor BEQ médio correspondente.

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Uma vez que não se podem utilizar padrões internos nos métodos bioanalíticos, devem ser realizados testes de repetibilidade para se obter informações sobre o desvio-padrão numa série de testes e entre séries de testes. A repetibilidade deve ser inferior a 20 % e a reprodutibilidade intralaboratorial inferior a 25 %. Tal deve basear-se nos valores calculados em BEQ após correção em função do ensaio em branco e da recuperação.

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Como parte do processo de validação, o teste deve demonstrar que discrimina entre uma amostra em branco e um teor no valor-limite, permitindo a identificação de amostras acima do valor-limite correspondente (ver ponto 7.1.2).

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Devem ser definidos os compostos-alvo, as possíveis interferências e os teores máximos toleráveis para a amostra em branco.

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O desvio-padrão percentual na resposta ou concentração calculada a partir da resposta (apenas possível na gama de trabalho) de uma determinação em triplicado de um extrato da amostra não deve ser superior a 15 %.

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Os resultados não corrigidos das amostras de referência expressos em BEQ (ensaio em branco e teor máximo ou nível de ação) devem ser utilizados para a avaliação do desempenho do método bioanalítico durante um período de tempo constante.

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Devem registar-se e verificar-se os gráficos de controlo de qualidade (CQ) para ensaios em branco do procedimento e para cada tipo de amostra de referência, a fim de garantir que o desempenho analítico está em conformidade com os requisitos, nomeadamente no tocante aos ensaios em branco do procedimento, no que respeita à diferença mínima requerida em relação à extremidade inferior da gama de trabalho e, no tocante às amostras de referência, no que respeita à reprodutibilidade intralaboratorial. Os ensaios em branco do procedimento devem ser bem controlados, a fim de evitar falsos resultados conformes, quando subtraídos.

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Os resultados dos métodos de confirmação de amostras suspeitas e 2 % a 10 % das amostras conformes (mínimo de 20 amostras por matriz) devem ser recolhidos e utilizados para avaliar o desempenho do método de pré-seleção e a relação entre BEQ e TEQ. Esta base de dados pode ser utilizada para efeitos de reavaliação dos valores-limite aplicáveis às amostras de rotina para as matrizes validadas.

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Os bons desempenhos do método podem também ser demonstrados pela participação em ensaios interlaboratoriais. Os resultados de amostras analisadas em ensaios interlaboratoriais, abrangendo uma gama de concentrações que pode atingir, por exemplo, 2 × o TM, também podem ser incluídos na avaliação da taxa de falsos resultados conformes, se um laboratório estiver em condições de demonstrar os seus bons desempenhos. As amostras devem abranger os padrões de congéneres mais frequentes, que representem diferentes fontes.

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Em caso de incidentes, os valores-limite podem ser reavaliados, refletindo a matriz e os padrões de congéneres específicos para cada incidente.

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Na medida em que o procedimento analítico utilizado o permita, os resultados analíticos devem conter os teores de cada congénere de PCDD/F e PCB sob a forma de dioxina e serem notificados em termos de limite inferior, limite superior e limite médio, a fim de incluir o máximo de informações possível na notificação dos resultados e, deste modo, permitir a interpretação dos resultados de acordo com requisitos específicos.

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O relatório deve também incluir o método utilizado para a extração dos PCDD/F, dos PCB sob a forma de dioxina e dos lípidos. O teor de lípidos da amostra deve ser determinado e notificado para as amostras de alimentos com teores máximos expressos com base na gordura e com uma concentração esperada de gorduras na gama de 0 % — 2 % (em função da legislação em vigor); para as outras amostras, a determinação do teor de lípidos é facultativa.

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As recuperações de cada padrão interno devem ser disponibilizadas se se situarem fora da gama mencionada no ponto 6.2, se o teor máximo for excedido (neste caso, as recuperações para uma das duas análises duplicadas) e noutros casos mediante pedido.

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Como a incerteza da medição deve ser tida em conta ao decidir da conformidade de uma amostra, este parâmetro deve igualmente ser disponibilizado. Assim, os resultados analíticos devem ser notificados enquanto x ± U, em que x é o resultado analítico e U é a incerteza expandida de medição, utilizando um fator de expansão de 2, o que permite obter um nível de confiança de cerca de 95 %. No caso de uma determinação em separado dos PCDD/F e dos PCB sob a forma de dioxina, a soma da incerteza expandida estimada dos resultados analíticos separados dos PCDD/F e dos PCB sob a forma de dioxina tem de ser utilizada para a soma dos PCDD/F e dos PCB sob a forma de dioxina.

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Se a incerteza de medição for tida em conta mediante a aplicação de um CCα (tal como descrito no anexo II, ponto IV.2), este parâmetro deve ser mencionado.

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Os resultados devem ser expressos nas mesmas unidades e com (pelo menos) o mesmo número de algarismos significativos que os teores máximos definidos no Regulamento (CE) n.o 1881/2006.

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O resultado da pré-selecção deve ser expresso como conforme ou suspeito de ser não conforme («suspeito»).

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Além disso, pode ser dado um resultado de PCDD/F e/ou de PCB sob a forma de dioxina expresso em equivalentes bioanalíticos (BEQ) (não TEQ) (ver anexo III, ponto 1). As amostras com uma resposta inferior ao limite de notificação devem ser indicadas como inferiores ao limite de notificação.

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Para cada tipo de matriz da amostra, o relatório deve mencionar o teor máximo ou o nível de ação em que se baseia a avaliação.

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O relatório deve mencionar o tipo de teste aplicado, o princípio de base do teste e o tipo de calibração.

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O relatório deve também incluir o método utilizado para a extração dos PCDD/F, dos PCB sob a forma de dioxina e dos lípidos. O teor de lípidos da amostra deve ser determinado e notificado para as amostras de alimentos com teores máximos ou níveis de ação expressos com base na gordura e com uma concentração esperada de gorduras na gama de 0 % — 2 % (em função da legislação em vigor); para as outras amostras, a determinação do teor de lípidos é facultativa.

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Em caso de amostras suspeitas de não conformidade, o relatório deve incluir uma nota sobre as medidas a adotar. A concentração de PCDD/F e a soma de PCDD/F e de PCB sob a forma de dioxina nas amostras com teores elevados tem de ser determinada/confirmada por um método de confirmação.

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Tempo de retenção relativo em relação a padrões internos ou padrões de referência (desvio aceitável de ± 0,25 %).

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Deve confirmar-se, por cromatografia gasosa, que houve separação entre os seis PCB indicadores (PCB 28, PCB 52, PCB 101, PCB 138, PCB 153 e PCB 180) e substâncias interferentes, especialmente PCB co-eluídos, em especial se os teores das amostras se situarem na gama dos limites legais e da não conformidade.

Os congéneres que co-eluem frequentemente são, por exemplo, os PCB 28/31, os PCB 52/69 e os PCB 138/163/164. Em relação à GC-MS, devem também ter-se em conta as eventuais interferências de fragmentos de congéneres mais fortemente clorados.

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Para técnicas GC-MS:

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Para GC-ECD:

Confirmação de resultados que excedem a tolerância por meio de duas colunas de GC com fases estacionárias de polaridade diferente.

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Utilização de padrões internos adequados com propriedades físico-químicas comparáveis aos analitos requeridos.

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Adição de padrões internos:

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Requisitos para os métodos que utilizem os seis congéneres de PCB indicadores marcados com isótopos:

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Requisitos para os métodos que não utilizem os seis padrões internos marcados com isótopos ou outros padrões internos:

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As recuperações de congéneres não marcados devem ser verificadas por amostras enriquecidas ou amostras de controlo da qualidade com concentrações na gama do teor máximo. As recuperações aceitáveis para estes congéneres situam-se entre 70 % e 120 %.

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Na medida em que o procedimento analítico utilizado o permita, os resultados analíticos devem conter os teores de cada congénere de PCB e ser indicados em termos de limite inferior, limite superior e limite médio, a fim de incluir o máximo de informações possível na notificação dos resultados e, deste modo, permitir a interpretação dos resultados de acordo com requisitos específicos.

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O relatório deve também incluir o método utilizado para a extração dos PCB e dos lípidos. O teor de lípidos da amostra deve ser determinado e notificado para as amostras de alimentos com teores máximos expressos com base na gordura e com uma concentração esperada de gorduras na gama de 0 %–2 % (em função da legislação em vigor); para as outras amostras a determinação do teor de lípidos é facultativa.

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As recuperações de cada padrão interno devem ser disponibilizadas se se situarem fora da gama mencionada no ponto 6, se o teor máximo for excedido e noutros casos mediante pedido.

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Como a incerteza da medição deve ser tida em conta ao decidir da conformidade de uma amostra, este parâmetro deve igualmente ser disponibilizado. Assim, os resultados analíticos devem ser notificados enquanto x ± U, em que x é o resultado analítico e U é a incerteza expandida de medição, utilizando um fator de expansão de 2, o que permite obter um nível de confiança de cerca de 95 %.

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Se a incerteza de medição for tida em conta mediante a aplicação de um CCα (tal como descrito no anexo II, ponto IV.1), este parâmetro deve ser mencionado.

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Os resultados devem ser expressos nas mesmas unidades e com (pelo menos) o mesmo número de algarismos significativos que os teores máximos definidos no Regulamento (CE) n.o 1881/2006.