1)

w spisie treści wprowadza się następujące zmiany:

2)

w rozdziale III dodaje się część w brzmieniu:

„III.3.   OZNACZANIE KWASOWOŚCI LOTNEJ NAPOJÓW SPIRYTUSOWYCH

1.   Zakres

Niniejsza metoda została potwierdzona w międzylaboratoryjnym badaniu porównawczym przeprowadzonym w odniesieniu do rumu, brandy, okowity z wytłoków z winogron i okowity z wytłoków z owoców na poziomach 30–641 mg/l.

2.   Odniesienia normatywne

ISO 3696:1987 Woda do zastosowań w laboratorium analitycznym – specyfikacje i metody testów

3.   Definicje

3.1.   Kwasowość lotną oblicza się, odejmując kwasowość stałą od kwasowości ogólnej.

3.2.   Kwasowość ogólna jest sumą kwasowości potencjalnych.

3.3.   Kwasowość stała oznacza kwasowość pozostałości po odparowaniu napoju spirytusowego do sucha.

4.   Zasada

Kwasowość ogólną i kwasowość stałą określa się przez miareczkowanie lub metodą potencjometryczną.

5.   Odczynniki i materiały

W trakcie analizy, o ile nie zostało to inaczej określone, używać wyłącznie odczynników o rozpoznanym stopniu analitycznym oraz wody o przynajmniej 3 stopniu czystości, zgodnie z definicją ISO 3696:1987.

5.1.   Roztwór wodorotlenku sodu (NaOH) o stężeniu 0,01 M

5.2.   Roztwór wskaźnika mieszanego:

6.   Aparatura i wyposażenie

Pośrednia aparatura laboratoryjna, szkło laboratoryjne klasy A oraz następujące wyposażenie:

7.   Pobieranie próbek i próbki

Próbki są przechowywane przed analizą w temperaturze pokojowej.

8.   Procedura

8.1.   Kwasowość ogólna

8.1.1.   Przygotowanie próbki

Napój spirytusowy zostaje poddany napromieniowaniu ultradźwiękowemu (sonikacji) lub jest mieszany przez dwie minuty w warunkach próżni w celu pozbycia się dwutlenku węgla, jeżeli jest to wymagane.

8.1.2.   Miareczkowanie

Wprowadzić pipetą 25 ml alkoholu do kolby stożkowej o pojemności 500 ml.

Dodać około 200 ml schłodzonej, przegotowanej wody destylowanej (przygotowywanej świeżo codziennie) i 2–6 kropel roztworu wskaźnika mieszanego (5.2).

Miareczkować roztworem wodorotlenku sodu o stężeniu 0,01 M (5.1) do zmiany zabarwienia z żółtozielonego na fioletowe w przypadku alkoholi bezbarwnych i z żółtobrązowego na czerwonobrązowe w przypadku alkoholi o brązowej barwie.

Miareczkowanie można również przeprowadzić metodą potencjometryczną do pH 7,5.

Przyjmijmy, że n1 ml oznacza dodaną objętość roztworu wodorotlenku sodu o stężeniu 0,01 M.

8.1.3.   Obliczanie

Kwasowość ogólna (KO) wyrażona w miliekwiwalentach na litr napoju spirytusowego jest równa 0,4 × n1.

Kwasowość ogólna (KO) wyrażona w mg kwasu octowego na litr napoju spirytusowego jest równa 24 × n1.

8.2.   Kwasowość stała

8.2.1.   Przygotowanie próbki

Odparować 25 ml alkoholu do sucha:

8.2.2.   Miareczkowanie

Rozpuścić pozostałość po odparowywaniu w schłodzonej, przegotowanej wodzie destylowanej (przygotowywanej świeżo codziennie) i uzupełnić objętość do około 100 ml oraz dodać 2–6 kropel roztworu wskaźnika mieszanego (5.2).

Miareczkować roztworem wodorotlenku sodu o stężeniu 0,01 M (5.1).

Miareczkowanie można również przeprowadzić metodą potencjometryczną do pH 7,5.

Przyjmijmy, że n2 ml oznacza dodaną objętość roztworu wodorotlenku sodu o stężeniu 0,01 M.

8.2.3.   Obliczanie

Kwasowość stała (KS) wyrażona w miliekwiwalentach na litr napoju spirytusowego jest równa 0,4 × n2.

Kwasowość stała (KS) wyrażona w mg kwasu octowego na litr napoju spirytusowego jest równa 24 × n2.

9.   Obliczenie kwasowości lotnej

9.1.   Wyrażona w miliekwiwalentach na litr:

Przyjmijmy, że:

kwasowość lotna, KL, w miliekwiwalentach na litr jest równa:

KO – KS

9.2.   Wyrażona w mg kwasu octowego na litr:

Przyjmijmy, że:

Kwasowość lotna, KL, w mg kwasu octowego na litr jest równa:

KO′ – KS′

9.3.   Wyrażona w g kwasu octowego na hektolitr czystego alkoholu 100 % obj. jest równa:

gdzie A oznacza objętościową zawartość alkoholu w napoju spirytusowym.

10.   Charakterystyka wydajnościowa metody (precyzja)

10.1.   Wyniki statystyczne badania międzylaboratoryjnego.

Poniższe dane zostały uzyskane ze studiów wydajnościowych metod międzynarodowych przeprowadzonych zgodnie z międzynarodowo ustalonymi procedurami [1] [2].

Rodzaje próbek:

3)

dodaje się rozdział VIII w brzmieniu:

„VIII.   ŁĄCZNA ZAWARTOŚĆ CUKRÓW

1.   Zakres

Metoda HPLC–RI ma zastosowanie do oznaczania łącznej zawartości cukrów (wyrażonej jako cukier inwertowany) w napojach spirytusowych, z wyłączeniem likierów zawierających produkty jajeczne i mleczne.

Niniejsza metoda została potwierdzona w międzylaboratoryjnym badaniu porównawczym przeprowadzonym w odniesieniu do anyżówki (pastisu), anisu destylowanego, likieru wiśniowego, likieru z (nazwa owocu lub użytego surowca) i crème de cassis na poziomach 10,86–509,7 g/l. Liniowość rekcji przyrządu została jednak dowiedziona w odniesieniu do stężeń z zakresu 2,5–20,0 g/l.

Niniejsza metoda nie służy do oznaczania niskich poziomów cukrów.

2.   Odniesienia normatywne

ISO 3696:1987 Woda do zastosowań w laboratorium analitycznym – specyfikacje i metody testów

3.   Zasada

Analizy płynnego cukru przy wykorzystaniu wysokosprawnej chromatografii cieczowej w celu określenia zawartego w nim stężenia glukozy, fruktozy, sacharozy, maltozy i laktozy.

W ramach niniejszej metody wykorzystuje się alkiloaminową fazę stacjonarną i wykrywanie z zastosowaniem refraktometrii różnicowej i metoda ta została przedstawiona jako przykład. Zastosowanie żywicy anionowymiennej jako fazy stacjonarnej również byłoby możliwe.

4.   Odczynniki i materiały

4.1.   Glukoza (CAS 50-99-7) o czystości co najmniej 99 %.

4.2.   Fruktoza (CAS 57-48-7) o czystości co najmniej 99 %.

4.3.   Sacharoza (CAS 57-50-1) o czystości co najmniej 99 %.

4.4.   Laktoza (CAS 5965-66-2) o czystości co najmniej 99 %.

4.5.   Monohydrat maltozy (CAS 6363-53-7) o czystości co najmniej 99 %.

4.6.   Czysty cyjanek metylu (CAS 75-05-8) do celów analizy HPLC.

4.7.   Woda destylowana lub dejonizowana, najlepiej mikrofiltrowana.

4.8.   Rozpuszczalniki (przykład)

Eluent składa się z:

Przepuszczać przez niego hel w wolnym tempie przez 5–10 minut, zanim zostanie wykorzystany do odgazowania.

Jeżeli używana woda nie była poddana mikrofiltracji, zaleca się przefiltrowanie rozpuszczalnika przez filtr dla rozpuszczalników organicznych o wielkości porów mniejszej lub równej 0,45 μm.

4.9.   Etanol absolutny (CAS 64-17-5).

4.10.   Roztwór etanolu (5 %, v/v).

4.11.   Przygotowanie podstawowego roztworu wzorcowego (20 g/l)

Odważyć po 2 g każdego z cukrów, który ma zostać poddany analizie (4.1–4.5), przenieść je bez strat do kolby miarowej o pojemności 100 ml. (Uwaga: 2,11 g monohydratu maltozy odpowiada 2 g maltozy).

Uzupełnić do 100 ml roztworem alkoholu 5 % obj. (4.10), wstrząsnąć i przechowywać w temperaturze około + 4 °C. Przygotowywać nowy roztwór podstawowy raz w tygodniu.

4.12.   Przygotowanie roboczych roztworów wzorcowych (2,5, 5,0, 7,5, 10,0 i 20,0 g/l)

Odpowiednio rozcieńczyć roztwór podstawowy, 20 g/l, (4.11) roztworem alkoholu 5 % obj. (4.10), tak aby otrzymać pięć roboczych roztworów wzorcowych o gęstości 2,5, 5,0, 7,5, 10,0 i 20,0 g/l. Przefiltrować przez filtr o wielkości porów mniejszej lub równej 0,45 μm (5.3).

5.   Aparatura i wyposażenie

5.1.   System HPLC wystarczający do uzyskania rozdzielczości odniesienia w odniesieniu do wszystkich cukrów.

5.1.1.   Wysokosprawny chromatograf cieczowy wyposażony w 6-portowy zawór wtryskowy z pętlą 10 μL lub jakiekolwiek inne urządzenie, zarówno automatyczne, jak i ręczne, w celu niezawodnego wtryskiwania mikroobjętości.

5.1.2.   System pompowania umożliwiający z wielką dokładnością uzyskanie i utrzymanie stałego lub zaprogramowanego natężenia przepływu.

5.1.3.   Refraktometr różnicowy

5.1.4.   Integrator lub rejestrator obliczeniowy, kompatybilny z pozostałymi elementami systemu.

5.1.5.   Przedkolumna:

Zaleca się dołączenie odpowiedniej przedkolumny do kolumny analitycznej.

5.1.6.   Kolumna (przykład):

5.1.7.   Warunki chromatografii (przykład):

Aby zapewnić doskonałą stabilność detektora, należy go włączyć na kilka godzin przed użyciem. Komora odniesienia musi być wypełniona eluentem.

5.2.   Waga analityczna o dokładności do 0,1 mg.

5.3.   Układ filtracyjny dla małych objętości wykorzystujący mikromembranę o wielkości porów 0,45 μm.

6.   Przechowywanie próbek

Po otrzymaniu próbki należy przechowywać w temperaturze pokojowej, dopóki nie zostaną wykorzystane do analizy.

7.   Procedura

7.1.   CZĘŚĆ A: Przygotowanie próbek

7.1.1.   Wstrząsnąć próbkę.

7.1.2.   Przefiltrować próbkę przez filtr o wielkości porów mniejszej lub równej 0,45 μm (5.3).

7.2.   CZĘŚĆ B: HPLC

7.2.1.   Oznaczanie

Wstrzyknąć 10 μl roztworów wzorcowych (4.12) i próbek (7.1.2). Przeprowadzić analizę przy zastosowaniu warunków chromatografii, na przykład warunków opisanych powyżej.

7.2.2.   W przypadku gdyby jakikolwiek pik próbki miał większą powierzchnię (lub wysokość) niż odpowiadający mu pik w roztworze wzorcowym o największym stężeniu, wówczas należy rozcieńczyć próbkę wodą destylowaną i poddać ponownej analizie.

8.   Obliczanie

Porównać oba chromatogramy uzyskane w odniesieniu do roztworu wzorcowego i napoju spirytusowego. Zidentyfikować piki na podstawie ich czasów retencji. Przeprowadzić pomiary ich powierzchni (lub wysokości) i obliczyć stężenia zgodnie z metodą standardu zewnętrznego. Wziąć pod uwagę wszelkie rozcieńczenia próbki.

Wynik końcowy jest sumą sacharozy, maltozy, laktozy, glukozy i fruktozy wyrażoną jako cukier inwertowany w g/l.

Cukier inwertowany oblicza się jako sumę wszystkich obecnych monosacharydów i disacharydów redukujących oraz stechiometrycznej ilości glukozy i fruktozy obliczonej na podstawie obecnej sacharozy.

9.   Charakterystyka wydajnościowa metody (precyzja)

9.1.   Wyniki statystyczne badania międzylaboratoryjnego.

Poniższe dane zostały uzyskane ze studiów wydajnościowych metod międzynarodowych przeprowadzonych zgodnie z międzynarodowo ustalonymi procedurami [1] [2].

Tabela 1

Fruktoza, glukoza, maltoza

Tabela 2

Sacharoza

Tabela 3

Łączna zawartość cukrów

(Uwaga: Podane dane obliczono w odniesieniu do łącznej zawartości cukrów, a nie w odniesieniu do cukru inwertowanego, jak określono w sekcji 8 powyżej.)

4)

dodaje się rozdział X w brzmieniu:

„X.   OZNACZANIE W NAPOJACH SPIRYTUSOWYCH NASTĘPUJĄCYCH ZWIĄZKÓW WYSTĘPUJĄCYCH W DREWNIE METODĄ WYSOKOSPRAWNEJ CHROMATOGRAFII CIECZOWEJ (HPLC): FURFURALU, 5-HYDROKSYMETYLOFURFURALU, 5-METYLOFURFURALU, WANILINY, ALDEHYDU SYRYNGOWEGO, ALDEHYDU KONIFERYLOWEGO, ALDEHYDU SINAPYLOWEGO, KWASU GALUSOWEGO, KWASU ELAGOWEGO, KWASU WANILINOWEGO, KWASU SYRYNGOWEGO I SKOPOLETYNY

1.   Zakres

Niniejsza metoda dotyczy oznaczania furfuralu, 5-hydroksymetylofurfuralu, 5-metylofurfuralu, waniliny, aldehydu syryngowego, aldehydu koniferylowego, aldehydu sinapylowego, kwasu galusowego, kwasu elagowego, kwasu wanilinowego, kwasu syryngowego i skopoletyny metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej.

2.   Odniesienie normatywne

Metoda analityczna uznana przez Ogólne Zgromadzenie Międzynarodowej Organizacji ds. Wina i Winorośli (OIV) i opublikowane przez OIV pod numerem referencyjnym OIV-MA-BS-16: R2009.

3.   Zasada

Oznaczanie metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) z wykrywaniem za pomocą spektrofotometrii w nadfiolecie na szeregu długości fal i za pomocą spektrofluorymetrii.

4.   Odczynniki

Odczynniki muszą posiadać czystość analityczną. Woda wykorzystywana musi być wodą destylowaną lub wodą o co najmniej równorzędnej czystości. Zaleca się stosowanie wody mikrofiltrowanej o rezystywności 18,2 M Ω.cm.

4.1.   Alkohol 96 % obj.

4.2.   Metanol o czystości HPLC (rozpuszczalnik B).

4.3.   Kwas octowy rozcieńczony do 0,5 % obj. (rozpuszczalnik A).

4.4.   Fazy ruchome: (podano jedynie przykład).

Rozpuszczalnik A (0,5-procentowy kwas octowy) i rozpuszczalnik B (czysty metanol). Przefiltrować przez membranę (o porowatości 0,45 μm). W razie potrzeby odgazować w łaźni ultradźwiękowej.

4.5.   Roztwory wzorcowe o minimalnej czystości 99 %: furfural, 5-hydroksymetylofurfural, 5-metylofurfural, wanilina, aldehyd syryngowy, aldehyd koniferylowy, aldehyd sinapylowy, kwas galusowy, kwas elagowy, kwas wanilinowy, kwas syryngowy i skopoletyna.

4.6.   Roztwór referencyjny: substancje wzorcowe rozpuszcza się w roztworze wodno-alkoholowym 50 % obj. Końcowe stężenia w roztworze referencyjnym powinny być następujące:

furfural: 5 mg/l; 5-hydroksymetylofurfural: 10 mg/l; 5-metylofurfural 2 mg/l; wanilina: 5 mg/l; aldehyd syryngowy: 10 mg/l; aldehyd koniferylowy: 5 mg/l; aldehyd sinapylowy: 5 mg/l; kwas galusowy: 10 mg/l; kwas elagowy: 10 mg/l; kwas wanilinowy: 5 mg/l; kwas syryngowy: 5 mg/l; skopoletyna: 0,5 mg/l.

5.   Aparatura

Standardowa aparatura laboratoryjna

5.1.   Wysokosprawny chromatograf cieczowy, który może funkcjonować w trybie dwuskładnikowego gradientu i który jest wyposażony w:

5.2.   Strzykawki do HPLC.

5.3.   Urządzenie do przeprowadzenia filtracji membranowej małych objętości.

5.4.   Integrator lub rejestrator o parametrach zgodnych z całym aparatem, który w szczególności musi posiadać szereg kanałów pozyskiwania.

6.   Procedura

6.1.   Przygotowanie roztworu do wstrzyknięcia.

W razie potrzeby filtruje się roztwór referencyjny i napój spirytusowy przez membranę o maksymalnej średnicy porów wynoszącej 0,45 μm.

6.2.   Warunki przeprowadzania chromatografii: przeprowadzić analizę w temperaturze otoczenia przy pomocy aparatury opisanej w pkt 5.1, korzystając z faz ruchomych (4.4) o przepływie wynoszącym około 0,6 ml na minutę, zgodnie z poniższym gradientem (podanym wyłącznie jako przykład).

Czas: 0 min 50 min 70 min 90 min

rozpuszczalnik A (woda–kwas): 100 % 60 % 100 % 100 %

rozpuszczalnik B (metanol): 0 % 40 % 0 % 0 %

Należy zauważyć, że w niektórych przypadkach powinno się modyfikować ten gradient w celu uniknięcia koelucji.

6.3.   Oznaczanie

6.3.1.   Oddzielnie wstrzyknąć roztwory wzorcowe, następnie wymieszać.

Przystosować warunki działania, tak aby czynniki rozdzielczości pików wszystkich związków były równe co najmniej 1.

6.3.2.   Wstrzyknąć próbkę przygotowaną zgodnie z opisem w pkt 6.1.

6.3.3.   Zmierzyć powierzchnię pików w roztworze referencyjnym i napoju spirytusowym i obliczyć stężenia.

7.   Przedstawienie wyników

Przedstawić stężenie każdego składnika w mg/l.

8.   Charakterystyka wydajnościowa metody (precyzja)

Poniższe dane zostały uzyskane w 2009 r. ze studiów wydajnościowych metod międzynarodowych przeprowadzonych na różnych napojach spirytusowych zgodnie z międzynarodowo ustalonymi procedurami [1], [2].

8.1.   Furfural

8.2.   5-hydroksymetylofurfural

8.3.   5-metylofurfural

8.4.   Wanilina

8.5.   Aldehyd syryngowy

8.6.   Aldehyd koniferylowy

8.7.   Aldehyd sinapylowy

8.8.   Kwas galusowy

8.9.   Kwas elagowy

8.10.   Kwas wanilinowy

8.11.   Kwas syryngowy

8.12.   Skopoletyna