Accept Refuse

EUR-Lex Access to European Union law

Back to EUR-Lex homepage

This document is an excerpt from the EUR-Lex website

Document 32016R0635

Prováděcí nařízení Komise (EU) 2016/635 ze dne 22. dubna 2016, kterým se mění příloha nařízení (ES) č. 2870/2000, pokud jde o některé referenční metody používané pro rozbor lihovin

C/2016/2252

OJ L 108, 23.4.2016, p. 1–21 (BG, ES, CS, DA, DE, ET, EL, EN, FR, HR, IT, LV, LT, HU, MT, NL, PL, PT, RO, SK, SL, FI, SV)

In force

ELI: http://data.europa.eu/eli/reg_impl/2016/635/oj

23.4.2016   

CS

Úřední věstník Evropské unie

L 108/1


PROVÁDĚCÍ NAŘÍZENÍ KOMISE (EU) 2016/635

ze dne 22. dubna 2016,

kterým se mění příloha nařízení (ES) č. 2870/2000, pokud jde o některé referenční metody používané pro rozbor lihovin

EVROPSKÁ KOMISE,

s ohledem na Smlouvu o fungování Evropské unie,

s ohledem na nařízení Evropského parlamentu a Rady (ES) č. 110/2008 ze dne 15. ledna 2008 o definici, popisu, obchodní úpravě, označování a ochraně zeměpisných označení lihovin a o zrušení nařízení Rady (EHS) č. 1576/89 (1), a zejména na čl. 28 odst. 2 uvedeného nařízení,

vzhledem k těmto důvodům:

(1)

Nařízení Komise (ES) č. 2870/2000 (2) uvádí seznam referenčních metod používaných pro rozbor lihovin a popisuje je. Některé metody uvedené v příloze uvedeného nařízení, mezi něž patří metody pro stanovení těkavých kyselin a celkového obsahu cukru v lihovinách, však ještě nebyly popsány.

(2)

Na metody pro stanovení těkavých kyselin a celkového obsahu cukru v některých lihovinách se zaměřily dvě mezinárodní validační studie, které byly provedeny v souladu s mezinárodně schválenými postupy, a výkonnostní parametry těchto metod byly shledány jako přijatelné. Studie byly uskutečněny jako součást výzkumného projektu Evropské komise začleněného do rámce IV Program norem, měření a pokusů (SMT). Popis uvedených metod by proto měl být zařazen do přílohy nařízení (ES) č. 2870/2000.

(3)

Nařízení (ES) č. 110/2008 stanoví požadavky pro některé kategorie lihovin, které mají stárnout v dřevěných nádobách, a stanoví, že jiné lihoviny mohou stárnutí prodělat. Rozbor hlavních sloučenin pocházejících ze dřeva může pomoci při posuzování, zda je vzorek v souladu s definicí odpovídající příslušné kategorii lihoviny. Mezinárodní organizace pro révu a víno (OIV) uznala metodu rozboru ke stanovení těchto sloučenin ve svém usnesení OIV/OENO 382 A/2009. Uznání této metody vycházelo z údajů získaných z mezinárodní studie výkonnosti metod u různých lihovin, která byla provedena na základě mezinárodně dohodnutých postupů. Tato metoda a její popis by proto měly být přidány k referenčním metodám Unie používaným pro rozbor lihovin uvedeným v příloze nařízení (ES) č. 2870/2000.

(4)

Nařízení (ES) č. 2870/2000 by proto mělo být odpovídajícím způsobem změněno.

(5)

Opatření stanovená tímto nařízením jsou v souladu se stanoviskem Výboru pro lihoviny,

PŘIJALA TOTO NAŘÍZENÍ:

Článek 1

Příloha nařízení (ES) č. 2870/2000 se mění v souladu s přílohou tohoto nařízení.

Článek 2

Toto nařízení vstupuje v platnost třetím dnem po vyhlášení v Úředním věstníku Evropské unie.

Toto nařízení je závazné v celém rozsahu a přímo použitelné ve všech členských státech.

V Bruselu dne 22. dubna 2016.

Za Komisi

předseda

Jean-Claude JUNCKER


(1)  Úř. věst. L 39, 13.2.2008, s. 16.

(2)  Nařízení Komise (ES) č. 2870/2000 ze dne 19. prosince 2000, kterým se stanoví referenční metody Společenství používané pro rozbor lihovin (Úř. věst. L 333, 29.12.2000, s. 20).


PŘÍLOHA

Příloha nařízení (ES) č. 2870/2000 se mění takto:

1)

Obsah se mění takto:

a)

v bodech III.3 a VIII se odstraňuje výraz „(p.m.)“;

b)

doplňuje se nový bod, který zní:

„X.

Stanovení složek dřeva: „furfural, 5-hydroxymethylfurfural, 5-methylfurfural, vanilin, syringaldehyd, koniferaldehyd, sinapaldehyd, kyselina gallová, kyselina ellagová, kyselina vanilová, kyselina syringová a skopoletin“.“

2)

V kapitole III se doplňuje nová část, která zní:

„III.3   STANOVENÍ TĚKAVÝCH KYSELIN V LIHOVINÁCH

1.   Oblast použití

Tato metoda byla validována mezilaboratorní studií pro rum, brandy, matolinové a ovocné destiláty s obsahem od 30 mg/l do 641 mg/l.

2.   Odkazy na normy

ISO 3696: 1987 Jakost vody pro analytické účely – Specifikace a zkušební metody

3.   Definice

3.1.   Obsah těkavých kyselin se vypočítá odečtením obsahu netěkavých kyselin od celkového obsahu kyselin.

3.2.   Celkový obsah kyselin je součet titrovatelných kyselin.

3.3.   Obsah netěkavých kyselin je tvořen zbytky po odpaření lihoviny do sucha.

4.   Podstata metody

Celkový obsah kyselin a obsah netěkavých kyselin se určí titrací či potenciometrií.

5.   Reakční činidla a materiál

Není-li uvedeno jinak, použijí se při rozboru pouze reakční činidla o čistotě p.a. a voda o čistotě alespoň 3 podle normy ISO 3696:1987.

5.1.   0,01 M roztoku chloridu sodného (NaOH)

5.2.   Směsný indikátorový roztok:

 

Odváží se 0,1 g indigokarmínu a 0,1 g fenolové červeni.

 

Rozpustí se ve 40 ml vody a doplní se ethanolem na 100 ml.

6.   Přístroje a vybavení

Laboratorní vybavení na nepřímé měření, laboratorní sklo třídy A a následující vybavení:

6.1.

Vodní vývěva

6.2.

Rotační odpařovač nebo ultrazvuková lázeň

6.3.

Vybavení na potenciometrickou titraci (nepovinné)

7.   Odběr vzorků a vzorky

Před rozborem se vzorky uchovávají při pokojové teplotě.

8.   Postup

8.1.   Celkový obsah kyselin

8.1.1.   Příprava vzorku

V případě potřeby se lihovina ozáří ultrazvukovými vlnami (ultrasonikace) nebo se v případě potřeby míchá ve vakuu po dobu dvou minut, aby byla zbavena oxidu uhličitého.

8.1.2.   Titrace

25 ml lihoviny se pipetou přenese do Erlenmeyerovy baňky o obsahu 500 ml.

Přidá se přibližně 200 ml zchlazené převařené destilované vody (čerstvě připravené každý den) a 2–6 kapek směsného indikátorového roztoku (5.2).

Titruje se s 0,01 M roztokem hydroxidu sodného (5.1), dokud se v případě bezbarvé lihoviny žlutozelená barva nezmění ve fialovou a v případě hnědě zbarvené lihoviny v červenohnědou.

Je rovněž možné provést potenciometrickou titraci do pH 7,5.

Nechť n1 ml je objem 0,01 M přidaného roztoku hydroxidu sodného.

8.1.3.   Výpočet

Celkový obsah kyselin (CK) vyjádřený v miliekvivalentech na litr lihoviny je 0,4 × n1.

Celkový obsah kyselin (CK′) vyjádřený v miliekvivalentech na litr lihoviny je 24 × n1

8.2.   Obsah netěkavých kyselin

8.2.1.   Příprava vzorku

Nechá se odpařit 25 ml lihoviny do sucha:

 

25 ml lihoviny se přenese pipetou do válcové odpařovací misky o průměru 55 mm s rovným dnem. Během první hodiny odpařování je odpařovací miska umístěna na poklopu lázně s vařící vodou, aby se kapalina nevařila, protože by při vystříknutí mohlo dojít k jejím ztrátám.

 

Vzorek se dosuší umístěním odpařovací misky do sušárny při 105 °C na dvě hodiny. Odpařovací miska se nechá zchladnout v exsikátoru.

8.2.2.   Titrace

Zbytek po odpařování se rozpustí pomocí zchlazené převařené destilované vody (čerstvě připravené každý den), doplňuje se až do objemu přibližně 100 ml a přidá se 2–6 kapek směsného indikátorového roztoku (5.2).

Titruje se s 0,01 M roztokem hydroxidu sodného (5.1).

Je rovněž možné provést potenciometrickou titraci do pH 7,5.

Nechť n2 ml je objem 0,01 M přidaného roztoku hydroxidu sodného.

8.2.3.   Výpočet

Obsah netěkavých kyselin (NK) vyjádřený v miliekvivalentech na litr lihoviny je 0,4 × n2.

Obsah netěkavých kyselin (NK) vyjádřený v mg kyseliny octové na litr lihoviny je 24 × n2.

9.   Výpočet obsahu těkavých kyselin

9.1.   Vyjádřeno v miliekvivalentech na litr:

Nechť:

CK

=

celkový obsah kyselin v miliekvivalentech na litr

NK

=

obsah netěkavých kyselin v miliekvivalentech na litr

Obsah těkavých kyselin, TK, v miliekvivalentech na litr je:

CK – NK

9.2.   Vyjádřeno v mg kyseliny octové na litr:

Nechť:

CK′

=

celkový obsah kyselin v mg kyseliny octové na litr

NK′

=

obsah netěkavých kyselin v mg kyseliny octové na litr

Obsah těkavých kyselin, TK, v mg kyseliny octové na litr je:

CK′ – NK′

9.3.   Vyjádřeno v g kyseliny octové na hl čistého alkoholu o 100 % objemových je:Formula

kde A je objemový obsah alkoholu v lihovině

10.   Účinnostní charakteristiky metody (přesnost)

10.1.   Statistické výsledky mezilaboratorního testu

Následující údaje byly získány při mezinárodním mezilaboratorním experimentu zaměřeném na parametry metody prováděném mezinárodně dohodnutým postupem [1] [2].

Rok provedení mezilaboratorního testu

2000

Počet laboratoří

18

Počet vzorků

6


Vzorky

A

B

C

D

E

F

Počet zahrnutých laboratoří po vyloučení odlehlých výsledků

16

18

18

14

18

18

Počet odlehlých výsledků (laboratoří)

2

 

 

4

 

 

Počet zahrnutých výsledků

32

36

36

28

36

36

Střední hodnota

Formula

[mg/L]

272*

241*

30

591*

641*

46

107

492

Směrodatná odchylka za podmínek opakovatelnosti, sr [mg/l]

8,0

3,6

15,0

3,7

6,7

8,5

Relativní směrodatná odchylka za podmínek opakovatelnosti, RSDr [%]

3,1

11,8

2,4

8,0

6,2

1,7

Mez opakovatelnosti, r [mg/l]

23

10

42

10

19

24

Směrodatná odchylka reprodukovatelnosti, sR [mg/l]

8,5

8,4

25,0

4,55

13,4

24,4

Relativní směrodatná odchylka reprodukovatelnosti, RSDR [%]

3,3

27,8

4,1

9,9

12,5

5,0

Mez reprodukovatelnosti, R [mg/l]

24

23

70

13

38

68

Typy vzorků

A

Švestkový destilát: rozdělená úroveň (*).

B

Rum I: neoznačené duplikáty.

C

Rum II: rozdělená úroveň (*).

D

Slivovice: neoznačené duplikáty.

E

Brandy: neoznačené duplikáty.

F

Matolinová pálenka: neoznačené duplikáty.

[1]

Horwitz, W., „Protocol for the Design, Conduct and Interpretation of Method-Performance Studies“, Pure and Applied Chemistry 67, 1995, s. 332–343.

[2]

Horwitz, W., „Evaluation of Analytical Methods Used for Regulation of Foods and Drugs“, Analytical Chemistry 54, 1982, s. 67 A–76 A.“

3)

Doplňuje se kapitola VIII, která zní:

„VIII.   CELKOVÝ OBSAH CUKRU

1.   Oblast použití

Ke stanovení celkového obsahu cukru (vyjádřeného jako invertní cukr) v lihovinách, s výjimkou lihovin obsahujících vaječné či mléčné produkty, je použitelná metoda HPLC–RI.

Tato metoda byla validována mezilaboratorní studií pro pastis, destilovaný anis, třešňový likér, crème de (s uvedením názvu ovoce nebo použité suroviny) a crème de cassis v množstvích od 10,86 g/l do 509,7 g/l. Linearita odezvy přístroje však byla prokázána pro rozsah koncentrace od 2,5 g/l do 20,0 g/l.

Tato metoda není určena pro stanovení nízkých hodnot obsahu cukru.

2.   Odkazy na normy

ISO 3696:1987 Jakost vody pro analytické účely – Specifikace a zkušební metody

3.   Podstata metody

K určení koncentrace glukózy, fruktózy, sacharózy, maltózy a laktózy v cukerných roztocích se používá vysokoúčinná kapalinová chromatografie.

Tato metoda využívá alkylaminovou stacionární fázi a diferenční refraktometrickou detekci a slouží jako příklad. Jako stacionární fázi je možné použít také aniontoměničové pryskyřice.

4.   Reakční činidla a materiál

4.1.   Glukóza (CAS 50-99-7), o čistotě alespoň 99 %.

4.2.   Fruktóza (CAS 57-48-7), o čistotě alespoň 99 %.

4.3.   Sacharóza (CAS 57-50-1), o čistotě alespoň 99 %.

4.4.   Laktóza (CAS 5965-66-2), o čistotě alespoň 99 %.

4.5.   Monohydrát maltózy (CAS 6363-53-7), o čistotě alespoň 99 %.

4.6.   Čistý acetonitril (CAS 75-05-8) na rozbor pomocí HPLC.

4.7.   Destilovaná nebo demineralizovaná voda, nejlépe mikrofiltrovaná.

4.8.   Rozpouštědla (příklad)

Eluční rozpouštědlo se skládá z:

 

75 objemových částí acetonitrilu (4.6)

 

25 objemových částí destilované vody (4.7)

Před použitím se nechá roztokem po dobu 5–10 minut pomalu procházet helium, aby došlo k odplynění.

Pokud se nepoužívá mikrofiltrovaná voda, je třeba rozpouštědlo přefiltrovat pomocí filtru pro organická rozpouštědla s maximální velikostí pórů 0,45 μm.

4.9.   Absolutní ethanol (CAS 64-17-5).

4.10.   Roztok ethanolu (5 % obj.).

4.11.   Příprava standardního zásobního roztoku (20 g/l)

Odváží se 2 g každého cukru, který má být analyzován (4.1–4.5), a vzorky se beze ztrát přenesou do odměrné baňky o objemu 100 ml. (Poznámka: 2 g maltózy odpovídá 2,11 g monohydrátu maltózy).

Doplní se roztokem alkoholu o 5 % obj. (4.10) do 100 ml, protřepe se a uchovává při teplotě přibližně + 4 °C. Každý týden se připraví nový zásobní roztok.

4.12.   Příprava standardních pracovních roztoků (2,5; 5,0; 7,5; 10,0 a 20,0 g/l)

Odpovídajícím způsobem se zředí zásobní roztok – 20 g/l (4.11) – roztokem alkoholu o 5 % obj. (4.10), aby se získalo pět standardních pracovních vzorků o hmotnostní koncentraci 2,5; 5,0; 7,5; 10,0 a 20,0 g/l. Přefiltruje se pomocí filtru s maximální velikostí pórů 0,45 μm (5.3).

5.   Přístroje a vybavení

5.1.   Systém pro HPLC, který umožňuje separaci všech cukrů na základní linii.

5.1.1.   Vysokoúčinný kapalinový chromatograf s šesticestným vstřikovacím ventilem a 10 μl smyčkou nebo jiným automatickým nebo manuálním zařízením, které umožňuje spolehlivé dávkování velmi malých objemů.

5.1.2.   Čerpací systém umožňující s velkou přesností dosáhnout stálého či programovaného průtoku a udržet jej.

5.1.3.   Diferenciální refraktometr.

5.1.4.   Integrátor či zapisovač, jehož výkon je kompatibilní s ostatním vybavením.

5.1.5.   Předkolona:

Doporučuje se k analytické koloně připojit vhodnou předkolonu.

5.1.6.   Kolona (příklad):

Materiál:

nerezavějící ocel nebo sklo.

Vnitřní průměr:

2–5 mm.

Délka:

100–250 mm (v závislosti na velikosti částic plnícího materiálu), například pokud je průměr částic 5 μm, odpovídající délka je 250 mm.

Stacionární fáze:

alkylaminové funkční skupiny vázané na oxid křemičitý s maximální velikostí častíc 5 μm.

5.1.7.   Podmínky chromatografie (příklad):

 

Eluční rozpouštědlo (4.8.), průtok: 1 ml/minuta.

 

Detekce: Diferenční refraktometrie.

Aby byla zajištěna dokonalá stabilita detektoru, měl by být zapnutý po dobu několika hodin před použitím. Referenční část musí být naplněna elučním rozpouštědlem.

5.2.   Analytické váhy s přesností 0,1 mg.

5.3.   Filtr na malé objemy s mikromembránou 0,45 μm.

6.   Uchovávání vzorků

Ihned po obdržení se vzorky umísťují do prostředí s pokojovou teplotou, kde jsou před rozborem uchovávány.

7.   Postup

7.1.   ČÁST A: Příprava vzorku

7.1.1.   Vzorek se protřepe.

7.1.2.   Přefiltruje se pomocí filtru s maximální velikostí pórů 0,45 μm (5.3).

7.2.   ČÁST B: HPLC

7.2.1.   Stanovení

Vstříkne se 10 μl standardních roztoků (4.12.) a vzorků (7.1.2.). Za vhodných podmínek pro chromatografii, například výše popsaných, se provede rozbor.

7.2.2.   Pokud je plocha (nebo výška) některého píku vzorku větší než u nejkoncentrovanějšího standardu, příslušný vzorek je třeba zředit destilovanou vodou a zanalyzovat znovu.

8.   Výpočet

Srovnají se chromatogramy získané z rozboru standardního roztoku a z rozboru lihoviny. Podle retenčních časů se určí píky. Změří se plochy (či výšky) píků a metodou vnějšího standardu se vypočítají koncentrace. Zohlední se naředění vzorku.

Výsledkem je součet obsahu sacharózy, maltózy, laktózy, glukózy a fruktózy vyjádřený jako invertní cukr v g/l.

Invertní cukr se vypočítá jako součet všech přítomných monosacharidů a redukujících disacharidů plus stechiometrické množství glukózy a fruktózy vypočítané z přítomné sacharózy.

Invertní cukr (g/l)

=

glukóza (g/l) + fruktóza (g/l) + maltóza (g/l) + laktóza (g/l) + (sacharóza (g/l) × 1,05)

1,05

=

(molekulární hmotnost fruktózy + molekulární hmotnost glukózy)/molekulární hmotnost sacharózy

9.   Účinnostní charakteristiky metody (přesnost)

9.1.   Statistické výsledky mezilaboratorního testu

Následující údaje byly získány při mezinárodním mezilaboratorním experimentu zaměřeném na parametry metody prováděném mezinárodně dohodnutým postupem [1] [2].

Rok provedení mezilaboratorního testu

2000

Počet laboratoří

24

Počet vzorků

8

[1]

Horwitz, W., „Protocol for the Design, Conduct and Interpretation of Method-Performance Studies“, Pure and Applied Chemistry 67, 1995, s. 332–343.

[2]

Horwitz, W., „Evaluation of Analytical Methods Used for Regulation of Foods and Drugs“, Analytical Chemistry 54, 1982, s. 67 A–76 A.

Tabulka 1

Fruktóza, glukóza, maltóza

Analyt

Fruktóza

Glukóza

Maltóza

Vzorky (× 2)

Crème de cassis

Standard (50 g/l)

Anýzové lihoviny

Crème de cassis

Standard (50 g/l)

Anýzové lihoviny

Standard (10 g/l)

Střední hodnota [g/l]

92,78

50,61

15,62

93,16

50,06

15,81

9,32

Počet laboratoří bez odlehlých výsledků

21

22

21

23

19

21

22

Směrodatná odchylka opakovatelnosti, sr, [g/l]

2,34

2,12

0,43

3,47

1,01

0,48

0,54

Relativní směrodatná odchylka opakovatelnosti, RSDr [%]

2,53

4,2

2,76

3,72

2,03

3,02

5,77

Mez opakovatelnosti, r [g/l]

(r = 2,8 × sr)

6,56

5,95

1,21

9,71

2,84

1,34

1,51

Směrodatná odchylka reprodukovatelnosti, sR [g/l]

7,72

3,13

0,84

9,99

2,7

0,88

1,4

Relativní směrodatná odchylka reprodukovatelnosti, RSDR [%]

8,32

6,18

5,37

10,72

5,4

5,54

15,06

Mez reprodukovatelnosti, R [g/l]

(R = 2,8 × sR)

21,62

8,76

2,35

27,97

7,57

2,45

3,93


Tabulka 2

Sacharóza

Analyt

Sacharóza

Vzorky

Pastis

Ouzo

Třešňový likér

Crème de menthe

Crème de cassis

Standard (100 g/l)

Střední hodnota [g/l]

10,83

29,2

19,7 (*)

103,33

349,96

319,84

99,83

Počet laboratoří bez odlehlých výsledků

19

19

20

18

18

18

Směrodatná odchylka opakovatelnosti, sr, [g/l]

0,09

0,75

2,17

5,99

4,31

1,25

Relativní směrodatná odchylka opakovatelnosti, RSDr [%]

0,81

3,07

2,1

1,71

1,35

1,25

Mez opakovatelnosti, r [g/l]

(r = 2,8 × sr)

0,25

2,1

6,07

16,76

12,06

3,49

Směrodatná odchylka reprodukovatelnosti, sR [g/l]

0,79

0,92

4,18

9,94

16,11

4,63

Relativní směrodatná odchylka reprodukovatelnosti, RSDR [%]

7,31

3,76

4,05

2,84

5,04

4,64

Mez reprodukovatelnosti, R [g/l]

(R = 2,8 × sR)

2,22

2,57

11,7

27,84

45,12

12,97


Tabulka 3

Celkový obsah cukru

(Poznámka: tyto údaje byly vypočítány pro celkový obsah cukru, ne pro invertní cukr definovaný výše v bodu 8.)


Vzorky

Pastis

Ouzo

Anýzové lihoviny

Třešňový likér

Crème de menthe

Crème de cassis

Standard (220 g/l)

Střední hodnota [g/l]

10,86

29,2

19,7 (**)

31,59

103,33

349,73

509,69

218,78

Počet laboratoří bez odlehlých výsledků

20

19

20

20

18

18

19

Směrodatná odchylka opakovatelnosti, sr, [g/l]

0,13

0,75

0,77

2,17

5,89

5,59

2,71

Relativní směrodatná odchylka opakovatelnosti, RSDr [%]

1,16

3,07

2,45

2,1

1,69

1,1

1,24

Mez opakovatelnosti, r [g/l]

(r = 2,8 × sr)

0,35

2,1

2,17

6,07

16,5

15,65

7,59

Směrodatná odchylka reprodukovatelnosti, sR [g/l]

0,79

0,92

1,51

4,18

9,98

14,81

8,53

Relativní směrodatná odchylka reprodukovatelnosti, RSDR [%]

7,25

3,76

4,79

4,04

2,85

2,91

3,9

Mez reprodukovatelnosti R [g/l]

(R = 2,8 × sR)

2,21

2,57

4,24

11,7

27,94

41,48

23,89

4)

Vkládá se nová kapitola X, která zní:

„X.   STANOVENÍ NÁSLEDUJÍCÍCH SLOUČENIN ZE DŘEVA V LIHOVINÁCH POMOCÍ VYSOKOÚČINNÉ KAPALINOVÉ CHROMATOGRAFIE (HPLC): FURFURAL, 5-HYDROXYMETHYLFURFURAL, 5-METHYLFURFURAL, VANILIN, SYRINGALDEHYD, KONIFERALDEHYD, SINAPALDEHYD, KYSELINA GALLOVÁ, KYSELINA ELLAGOVÁ, KYSELINA VANILOVÁ, KYSELINA SYRINGOVÁ A SKOPOLETIN

1.   Oblast použití

Tato metoda umožňuje pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie stanovit furfural, 5-hydroxymethylfurfural, 5-methylfurfural, vanilin, syringaldehyd, koniferaldehyd, sinapaldehyd, kyselinu gallovou, kyselinu ellagovou, kyselinu vanilovou, kyselinu syringovou a skopoletin.

2.   Odkazy na normy

Analytická metoda uznaná valným shromážděním Mezinárodní organizace pro révu a víno (OIV) a zveřejněná touto organizací pod číslem OIV-MA-BS-16: R2009.

3.   Podstata metody

Stanovení pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC) a detekce ultrafialovou spektrofotometrií na několika vlnových délkách a spektrofluorimetrií.

4.   Reakční činidla

Reakční činidla musí mít analytickou jakost. Je třeba použít destilovanou vodu nebo vodu přinejmenším srovnatelné čistoty. Doporučuje se použít mikrofiltrovanou vodu s měrným odporem 18,2 ΜΩ.cm.

4.1.   Roztok alkoholu o 96 % obj.

4.2.   Methanol jakosti vhodné pro metodu HPLC (rozpouštědlo B).

4.3.   Kyselina octová o koncentraci 0,5 % obj. (Rozpouštědlo A).

4.4.   Mobilní fáze: (pouze jako příklad).

Rozpouštědlo A (0,5 % kyselina octová) a rozpouštědlo B (čistý methanol). Přefiltrujte přes membránu (porozita 0,45 μm). Pokud nutno, odplyňte v ultrazvukové lázni.

4.5.   Referenční standardy o minimálně o 99 % čistotě: furfural, 5-hydroxymethylfurfural, 5-methylfurfural, vanilin, syringaldehyd, koniferaldehyd, sinapaldehyd, kyselina gallová, kyselina ellagová, kyselina vanilová, kyselina syringová a skopoletin.

4.6.   Referenční roztok: standardní látky jsou rozpuštěny v 50 % obj. roztoku alkoholu a vody. Výsledné koncentrace v referenčním roztoku by měly být řádově:

furfural: 5 mg/l; 5-hydroxymethyl furfural: 10 mg/l; 5-methylfurfural 2 mg/l; vanilin: 5 mg/l; syringaldehyd: 10 mg/l; koniferaldehyd: 5 mg/l; sinapaldehyd: 5 mg/l; kyselina gallová: 10 mg/l; kyselina ellagová: 10 mg/l; kyselina vanilová: 5 mg/l; kyselina syringová: 5 mg/l; skopoletin: 0,5 mg/l.

5.   Přístroje a pomůcky

Běžné laboratorní vybavení

5.1.   Vysoce účinný kapalinový chromatograf podporující binární gradient, který obsahuje:

5.1.1.

Spektrofotometrický detektor schopný měřit ve vlnových délkách 260–340 nm. Je však vhodnější použít detektor s diodovým polem schopný měřit ve více vlnových délkách nebo podobný detektor, aby bylo možné potvrdit čistotu píků.

5.1.2.

Spektrofluorimetrický detektor – excitační vlnová délka: 354 nm, emisní vlnová délka: 446 nm (pro stanovení skopoletinu – lze ho rovněž detekovat spektrofotometrií na vlnové délce 313 nm).

5.1.3.

Dávkovací zařízení schopné vstříknout (například) 10 či 20 μl testovaného vzorku.

5.1.4.

Kolona pro vysokoúčinnou kapalinovou chromatografii, typ RP C18, maximální velikost částic 5 μm.

5.2.   Stříkačky na vysokoúčinnou kapalinovou chromatografii (HPLC).

5.3.   Zařízení na membránovou filtraci malých objemů.

5.4.   Integrátor či zapisovač, jehož výkon je kompatibilní s celou aparaturou; především musí mít několik přijímacích kanálů.

6.   Postup

6.1.   Příprava dávkovacího roztoku.

V případě potřeby jsou referenční roztok a lihovina přefiltrovány přes membránu s póry o průměru nejvýše 0,45 μm.

6.2.   Podmínky pro provedení chromatografie: provede se rozbor při teplotě okolního prostředí pomocí vybavení popsaného v bodě 5.1 a za použití mobilních fází (4.4) s průtokem přibližně 0,6 ml za minutu podle níže uvedeného gradientu (pouze jako příklad).

Čas: 0 min. 50 min. 70 min. 90 min.

rozpouštědlo A (voda–kyselina): 100 % 60 % 100 % 100 %

rozpouštědlo B (methanol) 0 % 40 % 0 % 0 %

Je třeba mít na paměti, že v některých případech je třeba gradient upravit, aby nedošlo ke koeluci.

6.3.   Stanovení

6.3.1.   Referenční standardy se vstříknou odděleně, poté smíchané.

Provozní podmínky se upraví tak, aby separační faktor píků všech sloučenin byl přinejmenším 1.

6.3.2.   Vzorek připravený v bodě 6.1 se vstříkne do aparatury.

6.3.3.   Změří se plocha píků pro referenční roztoky a lihoviny a vypočítají se koncentrace.

7.   Vyjádření výsledků

Koncentrace každé složky se vyjádří v mg/l.

8.   Pracovní charakteristiky metody (přesnost)

Následující údaje byly získány v roce 2009 při mezinárodním mezilaboratorním experimentu zaměřeném na parametry metody, který zkoumal množství lihovin a byl prováděn mezinárodně dohodnutým postupem [1] [2].

8.1.   Furfural:

Analyt

Furfural:

Vzorky

Whisky

Brandy

Rum

Koňak 1

Bourbon

Koňak 2

Počet zúčastněných laboratoří

15

15

15

15

15

15

Počet zahrnutých výsledků (laboratoří)

14

12

13

14

13

13

Střední hodnota [mg/l]

2,9

1,2

1,7

10,6

15,3

13,9

Směrodatná odchylka opakovatelnosti, sr [mg/l]

0,04

0,05

0,04

0,18

0,23

0,20

Relativní směrodatná odchylka opakovatelnosti, RSDr [%]

1,4

4,5

2,3

1,7

1,5

1,5

Mez opakovatelnosti, r [mg/l]

(r = 2,8 × sr)

0,1

0,2

0,1

0,5

0,6

0,6

Směrodatná odchylka reprodukovatelnosti, sR[mg/l]

0,24

0,18

0,09

1,4

0,49

0,69

Relativní směrodatná odchylka reprodukovatelnosti, RSDR [%]

8

15

5

13

3

5

Mez reprodukovatelnosti, R [g/l]

(R = 2,8 × sR)

0,7

0,5

0,3

3,8

1,4

1,9

8.2.   5-hydroxymethylfurfural

Analyt

5-hydroxymethylfurfural

Vzorky

Whisky

Brandy

Rum

Koňak 1

Bourbon

Koňak 2

Počet zúčastněných laboratoří

16

16

16

16

16

16

Počet zahrnutých výsledků (laboratoří)

14

14

14

14

14

14

Střední hodnota [mg/l]

5,0

11,1

9,4

33,7

5,8

17,5

Směrodatná odchylka opakovatelnosti, sr [mg/l]

0,09

0,09

0,09

0,42

0,07

0,13

Relativní směrodatná odchylka opakovatelnosti, RSDr [%]

1,7

0,8

1,0

1,3

1,2

0,8

Mez opakovatelnosti, r [mg/l]

(r = 2,8 × sr)

0,2

0,3

0,3

1,2

0,2

0,4

Směrodatná odchylka reprodukovatelnosti, sR[mg/l]

0,39

1,01

0,50

4,5

0,4

1,6

Relativní směrodatná odchylka reprodukovatelnosti, RSDR [%]

8

9

5

13

7

9

Mez reprodukovatelnosti, R [g/l]

(R = 2,8 × sR)

1,1

2,8

1,4

12,5

1,1

4,6

8.3.   5-methylfurfural

Analyt

5-methylfurfural

Vzorky

Whisky

Brandy

Rum

Koňak 1

Bourbon

Koňak 2

Počet zúčastněných laboratoří

11

11

11

11

11

11

Počet zahrnutých výsledků (laboratoří)

11

11

8

11

10

11

Střední hodnota [mg/l]

0,1

0,2

0,1

0,5

1,7

0,8

Směrodatná odchylka opakovatelnosti, sr [mg/l]

0,01

0,01

0,02

0,02

0,03

0,07

Relativní směrodatná odchylka opakovatelnosti, RSDr [%]

10,7

6,1

13,6

4,7

2,0

10,0

Mez opakovatelnosti, r [mg/l]

(r = 2,8 × sr)

0,0

0,0

0,1

0,1

0,1

0,2

Směrodatná odchylka reprodukovatelnosti, sR[mg/l]

0,03

0,04

0,03

0,18

0,20

0,26

Relativní směrodatná odchylka reprodukovatelnosti, RSDR [%]

35

18

22

39

12

35

Mez reprodukovatelnosti, R [g/l]

(R = 2,8 × sR)

0,1

0,1

0,1

0,5

0,6

0,7

8.4.   Vanilin

Analyt

Vanilin

Vzorky

Whisky

Brandy

Rum

Koňak 1

Bourbon

Koňak 2

Počet zúčastněných laboratoří

16

15

16

16

16

16

Počet zahrnutých výsledků (laboratoří)

16

15

16

16

16

16

Střední hodnota [mg/l]

0,5

0,2

1,2

1,2

3,2

3,9

Směrodatná odchylka opakovatelnosti, sr [mg/l]

0,03

0,02

0,06

0,11

0,11

0,09

Relativní směrodatná odchylka opakovatelnosti, RSDr [%]

6,8

9,6

4,6

8,9

3,5

2,3

Mez opakovatelnosti, r [mg/l]

(r = 2,8 × sr)

0,1

0,1

0,2

0,3

0,3

0,3

Směrodatná odchylka reprodukovatelnosti, sR[mg/l]

0,09

0,06

0,18

0,27

0,41

0,62

Relativní směrodatná odchylka reprodukovatelnosti, RSDR [%]

19

25

15

22

13

16

Mez reprodukovatelnosti, R [g/l]

(R = 2,8 × sR)

0,3

0,2

0,5

0,8

1,2

1,7

8.5.   Syringaldehyd

Analyt

Syringaldehyd

Vzorky

Whisky

Brandy

Rum

Koňak 1

Bourbon

Koňak 2

Počet zúčastněných laboratoří

16

15

16

16

16

16

Počet zahrnutých výsledků (laboratoří)

13

13

13

12

14

13

Střední hodnota [mg/l]

1,0

0,2

4,8

3,2

10,5

9,7

Směrodatná odchylka opakovatelnosti, sr [mg/l]

0,03

0,02

0,04

0,08

0,10

0,09

Relativní směrodatná odchylka opakovatelnosti, RSDr [%]

2,6

8,1

0,8

2,6

0,9

0,9

Mez opakovatelnosti, r [mg/l]

(r = 2,8 × sr)

0,1

0,1

0,1

0,2

0,3

0,3

Směrodatná odchylka reprodukovatelnosti, sR[mg/l]

0,08

0,07

0,23

0,19

0,39

0,43

Relativní směrodatná odchylka reprodukovatelnosti, RSDR [%]

8

33

5

6

4

4

Mez reprodukovatelnosti, R [g/l]

(R = 2,8 × sR)

0,2

0,2

0,7

0,5

1,1

1,2

8.6.   Koniferaldehyd

Analyt

Koniferaldehyd

Vzorky

Whisky

Brandy

Rum

Koňak 1

Bourbon

Koňak 2

Počet zúčastněných laboratoří

13

12

13

12

13

13

Počet zahrnutých výsledků (laboratoří)

12

12

13

12

13

13

Střední hodnota [mg/l]

0,2

0,2

0,6

0,8

4,6

1,3

Směrodatná odchylka opakovatelnosti, sr [mg/l]

0,02

0,02

0,03

0,03

0,09

0,06

Relativní směrodatná odchylka opakovatelnosti, RSDr [%]

9,2

9,8

4,6

4,3

1,9

4,5

Mez opakovatelnosti, r [mg/l]

(r = 2,8 × sr)

0,04

0,04

0,07

0,09

0,24

0,16

Směrodatná odchylka reprodukovatelnosti, sR[mg/l]

0,04

0,04

0,11

0,18

0,38

0,25

Relativní směrodatná odchylka reprodukovatelnosti, RSDR [%]

23

27

21

23

8

19

Mez reprodukovatelnosti, R [g/l]

(R = 2,8 × sR)

0,1

0,1

0,3

0,5

1,1

0,7

8.7.   Sinapaldehyd

Analyt

Sinapaldehyd

Vzorky

Whisky

Brandy

Rum

Koňak 1

Bourbon

Koňak 2

Počet zúčastněných laboratoří

14

14

14

14

15

14

Počet zahrnutých výsledků (laboratoří)

14

13

12

13

13

12

Střední hodnota [mg/l]

0,3

0,2

0,2

1,6

8,3

0,3

Směrodatná odchylka opakovatelnosti, sr [mg/l]

0,02

0,01

0,02

0,06

0,14

0,03

Relativní směrodatná odchylka opakovatelnosti, RSDr [%]

7,5

4,6

11,2

3,7

1,6

11,4

Mez opakovatelnosti, r [mg/l]

(r = 2,8 × sr)

0,06

0,03

0,06

0,17

0,38

0,08

Směrodatná odchylka reprodukovatelnosti, sR[mg/l]

0,09

0,05

0,08

0,20

0,81

0,18

Relativní směrodatná odchylka reprodukovatelnosti, RSDR [%]

31

27

46

13

10

73

Mez reprodukovatelnosti, R [g/l]

(R = 2,8 × sR)

0,2

0,2

0,2

0,6

2,3

0,5

8.8.   Kyselina gallová

Analyt

Kyselina gallová

Vzorek

Whisky

Brandy

Rum

Koňak 1

Bourbon

Koňak 2

Počet zúčastněných laboratoří

16

15

16

16

16

16

Počet zahrnutých výsledků (laboratoří)

15

14

16

16

16

16

Střední hodnota [mg/l]

1,2

0,4

2,0

6,1

7,3

21,8

Směrodatná odchylka opakovatelnosti, sr [mg/l]

0,07

0,04

0,06

0,18

0,18

0,60

Relativní směrodatná odchylka opakovatelnosti, RSDr [%]

6,1

8,1

2,9

3,0

2,4

2,8

Mez opakovatelnosti, r [mg/l]

(r = 2,8 × sr)

0,2

0,1

0,2

0,5

0,5

1,7

Směrodatná odchylka reprodukovatelnosti, sR[mg/l]

0,43

0,20

0,62

3,3

2,2

7,7

Relativní směrodatná odchylka reprodukovatelnosti, RSDR [%]

36

47

31

53

30

35

Mez reprodukovatelnosti, R [g/l]

(R = 2,8 × sR)

1,2

0,6

1,7

9,1

6,2

21,7

8.9.   Kyselina ellagová

Analyt

Kyselina ellagová

Vzorky

Whisky

Brandy

Rum

Koňak 1

Bourbon

Koňak 2

Počet zúčastněných laboratoří

7

7

7

7

7

7

Počet zahrnutých výsledků (laboratoří)

7

7

7

7

7

6

Střední hodnota [mg/l]

3,2

1,0

9,5

13

13

36

Směrodatná odchylka opakovatelnosti, sr [mg/l]

0,20

0,16

0,30

0,41

0,95

0,34

Relativní směrodatná odchylka opakovatelnosti, RSDr [%]

6,3

16

3,2

3,2

7,4

1,0

Mez opakovatelnosti, r [mg/l]

(r = 2,8 × sr)

0,6

0,4

0,9

1,1

2,7

1,0

Směrodatná odchylka reprodukovatelnosti, sR[mg/l]

1,41

0,42

4,0

5,0

4,9

14

Relativní směrodatná odchylka reprodukovatelnosti, RSDR [%]

44

43

42

39

39

40

Mez reprodukovatelnosti, R [g/l]

(R = 2,8 × sR)

4,0

1,2

11

14

14

40

8.10.   Kyselina vanilová

Analyt

Kyselina vanilová

Vzorky

Whisky

Brandy

Rum

Koňak 1

Bourbon

Koňak 2

Počet zúčastněných laboratoří

15

15

15

15

15

15

Počet zahrnutých výsledků (laboratoří)

12

11

14

14

15

14

Střední hodnota [mg/l]

0,2

0,2

1,5

0,8

2,4

2,7

Směrodatná odchylka opakovatelnosti, sr [mg/l]

0,03

0,04

0,03

0,10

0,13

0,21

Relativní směrodatná odchylka opakovatelnosti, RSDr [%]

14,2

16,5

2,3

12,6

5,3

7,7

Mez opakovatelnosti, r [mg/l]

(r = 2,8 × sr)

0,1

0,1

0,1

0,3

0,4

0,6

Směrodatná odchylka reprodukovatelnosti, sR[mg/l]

0,06

0,05

0,51

0,2

1,22

0,70

Relativní směrodatná odchylka reprodukovatelnosti, RSDR [%]

28

20

35

31

51

26

Mez reprodukovatelnosti, R [g/l]

(R = 2,8 × sR)

0,2

0,1

1,4

0,7

3,4

2,0

8.11.   Kyselina syringová

Analyt

Kyselina syringová

Vzorky

Whisky

Brandy

Rum

Koňak 1

Bourbon

Koňak 2

Počet zúčastněných laboratoří

16

15

16

16

16

16

Počet zahrnutých výsledků (laboratoří)

16

15

15

15

16

15

Střední hodnota [mg/l]

0,4

0,2

2,5

1,4

3,4

4,8

Směrodatná odchylka opakovatelnosti, sr [mg/l]

0,03

0,02

0,06

0,13

0,08

0,11

Relativní směrodatná odchylka opakovatelnosti, RSDr [%]

6,7

12,6

2,3

9,0

2,3

2,3

Mez opakovatelnosti, r [mg/l]

(r = 2,8 × sr)

0,1

0,1

0,2

0,4

0,2

0,3

Směrodatná odchylka reprodukovatelnosti, sR[mg/l]

0,08

0,05

0,29

0,26

0,43

0,67

Relativní směrodatná odchylka reprodukovatelnosti, RSDR [%]

19

29

11

18

13

14

Mez reprodukovatelnosti, R [g/l]

(R = 2,8 × sR)

0,2

0,1

0,8

0,7

1,2

1,9

8.12.   Skopoletin

Analyt

Skopoletin

Vzorky

Whisky

Brandy

Rum

Koňak 1

Bourbon

Koňak 2

Počet zúčastněných laboratoří

10

10

10

10

10

10

Počet zahrnutých výsledků (laboratoří)

9

8

9

8

8

8

Střední hodnota [mg/l]

0,09

0,04

0,11

0,04

0,65

0,15

Směrodatná odchylka opakovatelnosti, sr [mg/l]

0,0024

0,0008

0,0018

0,0014

0,0054

0,0040

Relativní směrodatná odchylka opakovatelnosti, RSDr [%]

2,6

2,2

1,6

3,3

0,8

2,7

Mez opakovatelnosti, r [mg/l]

(r = 2,8 × sr)

0,007

0,002

0,005

0,004

0,015

0,011

Směrodatná odchylka reprodukovatelnosti, sR[mg/l]

0,01

0,01

0,03

0,01

0,09

0,02

Relativní směrodatná odchylka reprodukovatelnosti, RSDR [%]

15

16

23

17

15

15

Mezní reprodukovatelnosti, R [g/l]

(R = 2,8 × sR)

0,04

0,02

0,07

0,02

0,26

0,06

[1]

Horwitz, W., „Protocol for the Design, Conduct and Interpretation of Method-Performance Studies“, Pure and Applied Chemistry 67, 1995, s. 332–343.

[2]

Horwitz, W., „Evaluation of Analytical Methods Used for Regulation of Foods and Drugs“, Analytical Chemistry 54, 1982, s. 67 A–76 A.“


(*)  rozdělení na úrovně

(**)  rozdělení na úrovně“


Top