1.

Il-metodu ta' ttestjar tal-Opaċità u tal-Permeabilità tal-Kornea tal-Bovini (BCOP) huwa metodu ta' ttestjar in vitro li jista' jintuża, f'ċerti ċirkustanzi u b'limitazzjonijiet speċifiċi, sabiex sustanzi u taħlitiet jiġu kklassifikati bħala ‘sustanzi korrużivi u irritanti severi għall-għajnejn’ (1) (2) (3). Għall-fini ta' dan il-metodu ta' ttestjar, irritanti severi huma ddefiniti bħala dawk li jikkawżaw leżjonijiet fl-għajnejn li jippersistu fil-fenek għal tal-anqas 21 jum wara l-amministrazzjoni. Filwaqt li ma jitqiesx validu bħala sostituzzjoni kompluta għat-test in vivo li jsir fuq għajnejn il-fniek, il-BCOP huwa rrakkomandat biex jintuża bħala strateġija ta' ttestjar imtarraġ għall-klassifikazzjoni u t-tikkettar regolatorji fi ħdan dominju speċifiku ta' applikabilità (4) (5). Is-sustanzi tat-test u t-taħlitiet (6) jistgħu jiġu kklassifikati bħala sustanzi korrużivi jew irritanti severi għall-għajnejn mingħajr ma jsir aktar ittestjar fuq il-fniek. Sustanza li tagħti riżultat negattiv tkun teħtieġ li tiġi ttestjata fuq il-fniek permezz ta' strateġija ta' ttestjar sekwenzjali, kif deskritt fil-Linja Gwida għall-Ittestjar tal-OECD 405 (7) (il-kapitolu B.5 ta' dan l-Anness).

2.

L-għan ta' dan il-metodu ta' ttestjar huwa li jiddeskrivi l-proċeduri użati għall-evalwazzjoni tal-potenzjal li sustanza tat-test tikkawża korrużività jew irritazzjoni severa kif imkejla mill-ħila tas-sustanza li tikkawża opaċità jew żieda fil-permeabilità f'kornea bovina iżolata. L-effetti tossiċi għall-kornea jitkejlu skont: (i) it-trażmissjoni mnaqqsa tad-dawl (opaċità), u (ii) iż-żieda fil-passaġġ taż-żebgħa fluworexxina tas-sodju (permeabilità). Il-valutazzjonijiet tal-opaċità u l-permeabilità tal-kornea wara esponiment għas-sustanza tat-test jiġu kkombinati għad-derivazzjoni ta' Punteġġ tal-Irritanza In Vitro (IVIS), li jintuża biex jiġi kklassifikat il-livell ta' kemm tikkawża irritazzjoni s-sustanza tat-test.

3.

L-irritanti għall-għajnejn li jikkawżaw leżjonijiet li jitilqu f'anqas minn 21 jum u sustanzi li mhumiex irritanti ġew ittestjati wkoll bl-użu tal-metodu ta' ttestjar BCOP. Madankollu, l-akkuratezza u l-kredibilità tal-metodu ta' ttestjar BCOP għas-sustanzi f'dawn il-kategoriji ma ġewx evalwati b'mod formali.

4.

Id-definizzjonijiet huma pprovduti fl-Appendiċi 1.

5.

Dan il-metodu ta' ttestjar huwa bbażat fuq il-protokoll tal-metodu ta' ttestjar BCOP tal-Kumitat ta' Koordinazzjoni Interaġenzjali dwar il-Validazzjoni ta' Metodi Alternattivi (ICCVAM) (8), li ġie żviluppat wara studju ta' validazzjoni internazzjonali (4)(5)(9), b'kontribuzzjonijiet miċ-Ċentru Ewropew għall-Validazzjoni ta' Metodi Alternattivi (ECVAM) u ċ-Ċentru Ġappuniż għall-Validazzjoni ta' Metodi Alternattivi (JaCVAM). Il-protokoll huwa bbażat fuq tagħrif miksub mill-Istitut għax-Xjenzi In Vitro (IIVS) u l-Protokoll 124 INVITTOX (10), li jirrappreżentaw il-protokoll użat għall-istudju tal-prevalidazzjoni tal-assaġġ BCOP, li twettaq bejn l-1997 u l-1998 u li kien sponsorjat mill-Komunità Ewropea. Iż-żewġ protokolli huma bbażati fuq il-metodoloġija ta' assaġġ BCOP li ġiet irrappurtata għall-ewwel darba minn Gautheron et al (11).

6.

Il-limitazzjonijiet identifikati għal dan il-metodu ta' ttestjar huma bbażati fuq ir-rati għoljin ta' pożittivi foloz għall-alkoħols u l-ketoni u r-rata għolja ta' negattivi foloz għas-solidi osservata fil-bażi tad-dejta tal-validazzjoni (ara l-paragrafu 44) (5). Meta s-sustanzi ta' dawn il-klassijiet kimiċi u fiżiċi jiġu esklużi mill-bażi tad-dejta, l-akkuratezza tal-BCOP skont is-sistemi ta' klassifikazzjoni tal-UE, l-EPA u l-GHS titjieb b'mod sostanzjali (5). Abbażi tal-għan ta' dan l-assaġġ (i.e., li jidentifika biss is-sustanzi korrużivi/irritanti severi għall-għajnejn), rati ta' negattivi foloz mhumiex kritiċi minħabba li tali sustanzi sussegwentement jiġu ttestjati fuq il-fniek jew b'testijiet oħra in vitro vvalidati b'mod xieraq, skont ir-rekwiżiti regolatorji, bl-użu ta' strateġija ta' ttestjar sekwenzjali b'approċċ ibbażat fuq l-importanza tal-evidenza. Barra minn hekk, il-bażi tad-dejta tal-validazzjoni attwali ma tippermettix evalwazzjoni xierqa ta' wħud mill-klassijiet kimiċi jew tal-prodotti (eż., it-taħlitiet). Madankollu, l-investigaturi jistgħu jqisu li jużaw dan il-metodu ta' ttestjar għat-tipi kollha ta' materjali tat-test (inklużi t-taħlitiet), fejn riżultat pożittiv ikun jista' jiġi aċċettat bħala indikattiv ta' reazzjoni għal sustanza korrużiva jew irritant sever għall-għajnejn. Madankollu, riżultati pożittivi miksuba bl-alkoħols jew il-ketoni għandhom jiġu interpretati b'ċertu kawtela minħabba r-riskju ta' tbassir żejjed.

7.

Il-proċeduri kollha li jinvolvu għajnejn bovini u kornej bovini għandhom isegwu r-regolamenti u l-proċeduri applikabbli tal-istallazzjoni tal-ittestjar f'dak li għandu x'jaqsam mal-manipulazzjoni ta' materjali dderivati mill-annimali, li jinkludu, iżda li mhumiex limitati għal, tessuti u fluwidi tat-tessuti. Il-prekawzjonijiet universali tal-laboratorji huma rrakkomandati (12).

8.

Limitazzjoni tal-metodu ta' ttestjar hija dik li, għalkemm il-metodu jqis uħud mill-effetti fuq l-għajnejn evalwati fil-metodu ta' ttestjar tal-irritanza f'għajnejn il-fenek u sa ċertu punt is-severità tagħhom, il-metodu ma jqisx feriti fil-konġuntiva u fil-ħabba tal-għajnejn. Barra dan, għalkemm ir-riversibilità tal-feriti fil-kornea ma tistax tiġi evalwata per se fl-assaġġ BCOP, ġie propost, abbażi ta' studji fuq għajnejn il-fniek, li valutazzjoni tal-fond inizjali tal-ferita fil-kornea tista' tintuża biex issir distinzjoni bejn effetti riversibbli u dawk irriversibbli (13). Fl-aħħar nett, il-BCOP ma jippermettix valutazzjoni tal-potenzjal għal tossiċità sistemika assoċjata ma' esponiment tal-għajnejn.

9.

Qed isiru sforzi kontinwi sabiex jiġu kkaratterizzati aktar il-limitazzjonijiet tal-assaġġ BCOP kif ukoll kemm huwa utli għall-identifikazzjoni ta' irritanti mhux severi u sustanzi li mhumex irritanti (ara wkoll il-paragrafu 45). L-utenti qed jiġu inkoraġġuti wkoll jipprovdu lill-organizzazzjonijiet tal-validazzjoni b'kampjuni u/jew dejta għal evalwazzjoni formali ta' użi futuri possibbli tal-metodu ta' ttestjar BCOP, inklużi dawk għall-identifikazzjoni ta' irritanti mhux severi u sustanzi li mhumex irritanti.

10.

Għal kwalunkwe laboratorju li inizjalment ikun qed jistabbilixxi dan l-assaġġ, għandhom jintużaw is-sustanzi kimiċi ta' profiċjenza pprovduti fl-Appendiċi 2. Laboratorju jista' juża dawn is-sustanzi kimiċi biex juri l-kompetenza teknika tiegħu fit-twettiq tal-metodu ta' ttestjar BCOP qabel ma jissottometti dejta tal-assaġġ BCOP għall-finijiet tal-klassifikazzjoni regolatorja tal-perikli.

11.

Il-metodu ta' ttestjar BCOP huwa mudell organotipiku li jipprovdi manutenzjoni fuq perjodu ta' żmien qasir tal-funzjoni fiżjoloġika u bijokimika normali tal-kornea tal-bovini in vitro. F'dan il-metodu ta' ttestjar, il-ħsara mis-sustanza tat-test tiġi vvalutata minn kejl kwantitattiv ta' bidliet fl-opaċità u l-permeabilità tal-kornea permezz ta' opaċitometru u spettrofotometru ta' dawl viżibbli, rispettivament. Iż-żewġ tipi ta' kejl jintużaw biex jiġi kkalkulat IVIS, li jintuża biex tiġi assenjata kategorija ta' klassifikazzjoni ta' periklu ta' irritazzjoni in vitro għat-tbassir tal-potenzjal tas-sustanza tat-test li tikkawża irritazzjoni fl-għajnejn in vivo (ara l-kriterji tad-Deċiżjoni).

12.

Il-metodu ta' ttestjar BCOP juża kornej iżolati mill-għajnejn ta' bhejjem li jkunu għadhom kemm inqatlu. L-opaċità tal-kornea titkejjel b'mod kwantitattiv bħala l-ammont ta' trażmissjoni ta' dawl minn ġol-kornea. Il-permeabilità titkejjel b'mod kwantitattiv bħala l-ammont ta' żebgħa fluworexxina tas-sodju li jgħaddi min-naħa għall-oħra tal-ħxuna kollha tal-kornea, kif individwat fil-midjum fil-kavità posterjuri. Is-sustanzi tat-test, li jiġu introdotti fil-kavità anterjuri tal-apparat fejn titqiegħed il-kornea, jiġu applikati fis-superfiċje tal-epitelju tal-kornea. L-Appendiċi 3 tipprovdi deskrizzjoni u dijagramma tal-apparat fejn titqiegħed il-kornea użat fil-BCOP. L-apparat fejn titqiegħed il-kornea jista' jinxtara minn sorsi differenti jew jista' jinbena.

13.

Bhejjem mibgħuta l-biċċeriji tipikament jinqatlu jew għall-konsum mill-bniedem inkella għal użi kummerċjali oħra. Bħala sors ta' kornej għall-użu fil-BCOP jintużaw biss l-annimali b'saħħithom li jitqiesu xierqa biex jidħlu fil-katina tal-ikel tal-bniedem. Minħabba li l-bhejjem għandhom skala wiesgħa ta' piżijiet, skont ir-razza, l-età u s-sess, mhemmx piż irrakkomandat għall-annimal meta jiġi biex jinqatel.

14.

Meta jintużaw għajnejn minn annimali ta' età differenti jistgħu jirriżultaw varjazzjonijiet fid-dimensjonijiet tal-kornej. Kornej b'dijametru orizzontali > 30,5 mm u valuri tal-ħxuna ċentrali tal-kornea (CCT) ≥ 1 100 μm ġeneralment jinkisbu minn bhejjem li jkollhom aktar minn tmien snin, filwaqt li dawk b'dijametru orizzontali < 28,5 mm u CCT < 900 μm ġeneralment jinkisbu minn bhejjem li jkollhom anqas minn ħames snin (14). Minħabba f'hekk, għajnejn minn bhejjem li jkollhom aktar minn 60 xahar tipikament ma jintużawx. Għajnejn minn bhejjem li jkollhom anqas minn 12-il xahar tradizzjonalment ma ntużawx għaliex l-għajnejn ikunu għadhom qegħdin jiżviluppaw u l-ħxuna tal-kornea u d-dijametru tal-kornea jkunu iżgħar b'mod konsiderevoli minn dawk irrapportati għall-għajnejn mill-bhejjem adulti. Madankollu, l-użu ta' kornej minn annimali żgħar (i.e., ta' età minn 6 xhur sa 12-il xahar) huwa permess minħabba li hemm xi vantaġġi, bħal pereżempju disponibilità akbar, skala dejqa ta' etajiet, u inqas perikli marbuta ma' esponiment potenzjali tal-ħaddiema għall-Enċefalopatija Sponġiforma Bovina (15). Minħabba li aktar evalwazzjoni tal-effett tad-daqs jew il-ħxuna tal-kornea fuq is-sensibilità għal sustanzi korrużivi u irritanti tkun utli, l-utenti huma inkoraġġuti jirrapportaw stima tal-età u/jew il-piż tal-annimali li jipprovdu l-kornej użati fi studju.

15.

L-għajnejn jinġabru mill-impjegati tal-biċċerija. Sabiex kemm jista' jkun titnaqqas kull tip ta' ħsara fl-għajnejn, kemm dik mekkanika kif ukoll tipi oħra ta' ħsara, l-għajn għandha titneħħa mill-ħofra tagħha mill-aktar fis possibbli wara l-mewt. Sabiex jiġi evitat l-esponiment tal-għajnejn għal sustanzi potenzjalment irritanti, l-impjegati tal-biċċeriji ma għandhomx jużaw deterġenti meta jlaħilħu ras l-annimal.

16.

L-għajnejn għandhom jingħaddsu kompletament f'soluzzjoni tal-melħ ekwilibrata ta' Hanks, (Hanks' Balanced Salt Solution, HBSS) f'reċipjent ta' daqs adattat, u ttrasportati lejn il-laboratorju b'mod li kemm jista' jkun inaqqas id-deterjorament u/jew il-kontaminazzjoni mill-batterji. Minħabba li l-għajnejn jinġabru waqt il-proċess tal-qatla, dawn jistgħu jiġu esposti għad-demm u għal sustanzi bijoloġiċi oħra, inklużi batterji u mikroorganiżmi oħra. Għalhekk huwa importanti li jiġi żgurat li r-riskju ta' kontaminazzjoni jitnaqqas kemm jista' jkun (eż. billi r-reċipjent li jkun fih l-għajnejn jinżamm fuq silġ imxarrab, billi jiżdiedu antibjotiċi fl-HBSS li tintuża għall-ħżin tal-għajnejn waqt it-trasport [eż. 100 IU/mL ta' peniċillina u 100 mg/mL ta' streptomiċina]).

17.

L-intervall tal-ħin li jgħaddi minn meta jinġabru l-għajnejn u l-kornej jintużaw fil-BCOP għandu jitnaqqas kemm jista' jkun (tipikament għandhom jinġabru u jintużaw fl-istess ġurnata) u għandu jintwera li dan ma jikkompromettix ir-riżultati tal-assaġġ. Dawn ir-riżultati huma bbażati fuq il-kriterji tal-għażla għall-għajnejn, kif ukoll ir-reazzjonijiet tal-kontrolli pożittivi u negattivi. L-għajnejn kollha użati fl-assaġġ għandhom ikunu mill-istess grupp ta' għajnejn miġbura f'ġurnata speċifika.

18.

Malli jaslu fil-laboratorju l-għajnejn jiġu eżaminati bir-reqqa għad-difetti inklużi żieda fl-opaċità, grif u neovaskularizzazzjoni. Għandhom jintużaw biss il-kornej minn għajnejn li ma jkollhom l-ebda difett ta' dan it-tip.

19.

Il-kwalità ta' kull kornea tiġi evalwata wkoll fi stadji li jokkorru aktar 'il quddiem fl-assaġġ. Kornej li jkollhom opaċità akbar minn seba' unitajiet ta' opaċità (NOTA: l-opaċitometru għandu jkun ikkalibrat mal-istandards ta' opaċità li jintużaw biex jiġu stabbiliti l-unitajiet ta' opaċità, ara l-Appendiċi 3) wara perjodu inizjali ta' ekwilibrazzjoni ta' siegħa għandhom jintremew.

20.

Kull grupp ta' trattament (sustanza tat-test, kontrolli negattivi u pożittivi konkorrenti) jikkonsisti minn minimu ta' tliet għajnejn. Fl-assaġġ BCOP għandhom jintużaw tliet kornej għall-kontroll negattiv. Minħabba li l-kornej kollha jinqatgħu barra mill-globu sħiħ, u jitqiegħdu fil-kavitajiet tal-kornej, il-manipulazzjoni tagħhom tista' tirriżulta f'artefatti fil-valuri tal-opaċità u l-permeabilità tal-kornej individwali (inkluż il-kontroll negattiv). Barra minn hekk, il-valuri tal-opaċità u l-permeabilità mill-kornej tal-kontroll negattiv jintużaw biex jikkoreġu l-valuri tal-opaċità u l-permeabilità tal-kornej tal-oġġett tat-test u l-kornej tal-kontroll pożittiv fil-kalkoli tal-IVIS.

21.

Kornej li ma jkollhom l-ebda difett jiġu ddissektjati b'tali mod li jibqa' minn 2 sa 3 ċm ta' xifer tal-isklerotika sabiex jgħin il-manipulazzjoni sussegwenti, u dan isir b'attenzjoni sabiex tiġi evitata kwalunkwe ħsara fl-epitelju u l-endotelju. Kornej iżolati jitqiegħdu f'apparat fejn titqiegħed il-kornea ddisinjat speċjalment għal dan il-għan li jikkonsisti f'kavitajiet anterjuri u posterjuri, li jkunu f'kuntatt mal-ġenb epiteljali u l-ġenb endoteljali tal-kornea, rispettivament. Iż-żewġ kavitajiet jimtlew sax-xifer bil-midjum essenzjali minimu ta' Eagle (Eagle's Minimum Essential Medium, EMEM) (l-ewwel il-kavità posterjuri), filwaqt li jiġi żgurat li ma jifformawx bżieżaq. L-apparat imbagħad jiġi kkalibrat għal tal-anqas siegħa f'temperatura ta' 32 ± 1°C sabiex il-kornej jekwilibraw mal-midjum u jiksbu kemm jista' jkun possibbli attività metabolika normali (it-temperatura approssimattiva tas-superfiċje tal-kornea in vivo hija 32 °C).

22.

Wara l-perjodu ta' ekwilibrazzjoni, EMEM frisk u msaħħan minn qabel jiżdied fiż-żewġ kavitajiet u jittieħed l-ewwel qari tal-valuri tal-opaċità għal kull kornea. Kwalunkwe kornea li jkollha ħsara makroskopika fit-tessut tagħha (eż., grif, pigmentazzjoni, neovaskularizzazzjoni) jew opaċità > 7 unitajiet ta' opaċità tintrema. L-opaċità medja tal-kornej kollha ekwilibrati tiġi kkalkulata. Minimu ta' tliet kornej b'valuri ta' opaċità qrib il-valur medjan għall-kornej kollha jintgħażlu bħala kornej għall-kontroll negattiv (jew solvent). Il-kornej li jibqa' jiġu ddistribwiti fi grupp ta' trattament u ta' kontroll pożittiv.

23.

Minħabba li l-kapaċità tas-sħana tal-ilma hija ogħla minn dik tal-arja, l-ilma jipprovdi kundizzjonijiet ta' temperatura aktar stabbli għall-inkubazzjoni. Għalhekk, huwa rrakkomandat l-użu ta' banju tal-ilma sabiex l-apparat fejn titqiegħed il-kornea u l-kontenut tiegħu jinżammu f'temperatura ta' 32 ± 1°C. Madankollu, jistgħu jintużaw ukoll inkubaturi tal-arja, filwaqt li jittieħdu prekawzjonijiet sabiex tinżamm l-istabilità tat-temperatura (eż., billi l-apparat u l-midja jissaħħnu minn qabel).

24.

Jintużaw żewġ protokolli ta' trattament, wieħed għal-likwidi u l-aġenti tensjoattivi (solidi jew likwidi), u ieħor għal solidi li mhumiex aġenti tensjoattivi.

25.

Il-likwidi jiġu ttestjati meta ma jkunux iddilwiti, filwaqt li l-aġenti tensjoattivi jiġu ttestjati f'konċentrazzjoni ta' 10 % w/v f'soluzzjoni tal-klorur tas-sodju ta' 0,9 %, ilma distillat, jew solvent ieħor li jkun intwera li ma għandu l-ebda effetti avversi fuq is-sistema tat-test. Semisolidi, kremi u x-xema' kollha tipikament jiġu ttestjati bħala likwidi. Għandha tiġi pprovduta ġustifikazzjoni xierqa għal konċentrazzjonijiet ta' dilwizzjoni alternattivi. Il-kornej jiġu esposti għal-likwidi u l-aġenti tensjoattivi għal 10 minuti. L-użu ta' ħinijiet oħra ta' esponiment għandu jkun abbażi ta' raġuni xjentifika xierqa.

26.

Solidi li mhumiex aġenti tensjoattivi tipikament jiġu ttestjati bħala soluzzjonijiet jew suspensjonijiet f'konċentrazzjoni ta' 20 % f'soluzzjoni tal-klorur tas-sodju ta' 0,9 %, ilma distillat, jew solvent ieħor li jkun intwera li ma għandu l-ebda effetti avversi fuq is-sistema tat-test. F'ċerti ċirkostanzi u b'ġustifikazzjoni xjentifika xierqa, is-solidi jistgħu jiġu ttestjati puri b'applikazzjoni diretta fuq is-superfiċje tal-kornea permezz tal-metodu tal-kavità miftuħa (ara l-paragrafu 29). Il-kornej jiġu esposti għas-solidi għal erba' sigħat, iżda bħal ma jsir għal-likwidi u l-aġenti tensjoattivi, jistgħu jintużaw ħinijiet ta' esponiment alternattivi abbażi ta' raġuni xjentifika xierqa.

27.

Jistgħu jintużaw metodi ta' trattament differenti, skont in-natura fiżika u l-karatteristiċi kimiċi (eż. solidi, likwidi, likwidi viskużi jew mhux viskużi) tas-sustanza tat-test. Il-fattur kritiku huwa li jiġi żgurat li s-sustanza tat-test tkopri b'mod xieraq is-superfiċje tal-epitelju u li titneħħa b'mod xieraq waqt l-istadji tat-tlaħliħ. Metodu tal-kavità magħluqa tipikament jintuża għal sustanzi tat-test li jvarjaw minn likwidi mhux viskużi għal likwidi viskużi ftit, filwaqt li metodu tal-kavità miftuħa tipikament jintuża għal sustanzi tat-test li jvarjaw minn likwidi semiviskużi għal likwidi viskużi u għal solidi puri.

28.

Fil-metodu tal-kavità magħluqa, ammont tas-sustanza tat-test (750 μL) li jkun biżżejjed biex ikopri l-kavità anterjuri jiġi introdott minn ġot-toqob tal-iddożar fuq is-superfiċje ta' fuq tal-kavità, u t-toqob sussegwentement jiġu ssiġillati bit-tappieri tal-kavità waqt l-esponiment. Huwa importanti li jiġi żgurat li kull kornea tiġi esposta għas-sustanza tat-test għall-intervall tal-ħin xieraq.

29.

Fil-metodu tal-kavità miftuħa, iċ-ċirku li jsakkar it-tieqa u t-tieqa tal-ħġieġ jitneħħew mill-kavità anterjuri qabel ma jibda t-trattament. Il-kontroll jew is-sustanza tat-test (750 μL, jew biżżejjed sustanza tat-test biex tkopri l-kornea kompletament) jiġi/tiġi applikat(a) direttament fuq is-superfiċje tal-epitelju tal-kornea permezz ta' mikropipetta. Jekk sustanza tat-test ma tkunx tista' tiġi ppipettata faċilment, is-sustanza tat-test tista' tinġibed permezz tal-pressjoni f'pipetta bi spostament pożittiv sabiex jiġi ffaċilitat l-iddożar. Il-ponta tal-pipetta bi spostament pożittiv, tiddaħħal fil-ponta tad-distribuzzjoni tas-siringa sabiex il-materjal ikun jista' jinġibed fil-ponta tal-pipetta taħt pressjoni. Imbagħad jeħtieġ li l-pistun tal-pipetta jinġibed 'il fuq fl-istess waqt li l-pistun tas-siringa jingħafas 'l isfel. Jekk fil-ponta tal-pipetta jiffurmaw xi bżieżaq tal-arja, is-sustanza tat-test għandha titneħħa (tinħareġ 'il barra) u l-proċess jiġi ripetut sa mal-ponta timtela mingħajr ma jkun hemm bżieżaq tal-arja. Jekk ikun meħtieġ, tista' tintuża siringa normali (mingħajr labra) minħabba li din tippermetti l-kejl ta' volum akkurat tas-sustanza tat-test u applikazzjoni eħfef fuq is-superfiċje tal-epitelju tal-kornea. Wara l-iddożar, it-tieqa tal-ħġieġ terġa' titqiegħed fuq il-kavità anterjuri biex terġa' tinħoloq sistema magħluqa.

30.

Wara l-perjodu ta' esponiment, is-sustanza tat-test, is-sustanza tal-kontroll negattiv, jew tal-kontroll pożittiv titneħħa mill-kavità anterjuri u l-epitelju jinħasel tal-anqas tliet darbiet (jew sakemm ma tkun tista' tiġi osservata l-ebda evidenza viżiva tas-sustanza tat-test) bl-EMEM (li jkun fih il-fenol aħmar). Midjum li jkun fih il-fenol aħmar jintuża għat-tlaħliħ minħabba li bidla fil-kulur tal-fenol aħmar tista' tiġi mmonitorjata sabiex tiġi ddeterminata l-effikaċja tat-tlaħliħ ta' materjali aċidużi jew alkalini. Il-kornej jinħaslu aktar minn tliet darbiet jekk il-fenol aħmar jibqa' jibdel il-kulur (isfar jew vjola), jew is-sustanza tat-test tkun għadha viżibbli. Ladarba l-midjum ma jibqagħlux sustanza tat-test, il-kornej jitlaħalħu għall-aħħar darba bl-EMEM (mingħar fenol aħmar). L-EMEM (mingħajr fenol aħmar) jintuża għall-aħħar tlaħliħa sabiex jiġi żgurat li l-fenol aħmar jitneħħa kompletament mill-kavità anterjuri qabel ma titkejjel l-opaċità. Il-kavità anterjuri mbagħad terġa' timtela b'EMEM frisk mingħajr fenol aħmar.

31.

Għal-likwidi jew l-aġenti tensjoattivi, wara t-tlaħliħ, il-kornej jiġu inkubati għal sagħtejn oħra f'temperatura ta' 32 ± 1 °C. F'ċerti ċirkostanzi ħin itwal ta' inkubazzjoni wara l-esponiment jista' jkun utli. Dan għandu jitqies skont il-każ. Kornej trattati b'solidi jitlaħalħu kompletament fi tmiem il-perjodu ta' esponiment li jdum erba' sigħat, iżda ma jeħtiġux aktar inkubazzjoni.

32.

Fi tmiem il-perjodu ta' inkubazzjoni wara l-esponiment għal-likwidi u l-aġenti tensjoattivi u fi tmiem il-perjodu ta' esponiment ta' erba' sigħat għas-solidi li mhumiex aġenti tensjoattivi, jiġu rreġistrati l-opaċità u l-permeabilità ta' kull kornea. Barra minn hekk, kull kornea tiġi osservata b'mod viżiv u l-osservazzjonijiet pertinenti jiġu rreġistrati (eż. tqaxxir tat-tessuti, sustanza tat-test residwa, opaċità mhux uniformi). Dawn l-osservazzjonijiet jistgħu jkunu importanti għax jistgħu jiġu riflessi minn varjazzjonijiet fil-qari tal-valuri tal-opaċitometru.

33.

Kontrolli negattivi jew tas-solvent/tal-midjum u kontrolli pożittivi jiġu inklużi b'mod konkorrenti f'kull esperiment.

34.

Meta sustanza likwida tiġi ttestjata f'100 %, kontroll negattiv (eż., soluzzjoni tal-klorur tas-sodju ta' 0,9 % jew ilma distillat) jiġi inkluż fil-metodu ta' ttestjar BCOP sabiex bidliet mhux speċifiċi fis-sistema tat-test ikunu jistgħu jiġu individwati u sabiex tiġi pprovduta linja ta' bażi għall-punti tat-tmiem tal-assaġġ. Dan jiżgura wkoll li l-kundizzjonijiet tal-assaġġ ma jirriżultawx b'mod li mhux xieraq f'reazzjoni irritanti.

35.

Meta jiġi ttestjat likwidu dilwit, aġent tensjoattiv jew solidu fil-metodu ta' ttestjar BCOP, b'mod konkorrenti, jiġi inkluż grupp ta' kontroll tas-solvent/tal-midjum sabiex bidliet mhux speċifiċi fis-sistema tat-test ikunu jistgħu jiġu individwati u sabiex tiġi pprovduta linja ta' bażi għall-punti tat-tmiem tal-assaġġ. Jista' jintuża biss solvent/midjum li jkun intwera li ma għandu l-ebda effett avvers fuq is-sistema tat-test.

36.

F'kull esperiment jiġi inkluż irritant għall-għajnejn magħruf sabiex jiġi vverifikat li tkun ġiet ikkawżata reazzjoni xierqa. Minħabba li l-assaġġ BCOP qed jintuża f'dan it-test biex jidentifika sustanzi korrużivi jew irritanti severi, idealment il-kontroll pożittiv għandu jkun sustanza ta' referenza li tipprovoka reazzjoni severa f'dan il-metodu ta' ttestjar. Madankollu, sabiex jiġi żgurat li l-varjabilità fir-reazzjoni tal-kontroll pożittiv tista' tiġi vvalutata, id-daqs tar-reazzjoni irritanti ma għandux ikun eċċessiv.

37.

Id-dimetilformammid jew l-idrossidu tas-sodju 1 % huma eżempji ta' kontrolli pożittivi għal sustanzi tat-test likwidi. Eżempju ta' kontroll pożittiv għal sustanzi tat-test solidi huwa l-imidażol 20 % (piż mqabbel mal-volum) f'soluzzjoni tal-klorur tas-sodju 0,9 %.

38.

Sustanzi ta' riferiment huma utli għall-evalwazzjoni tal-potenzjal li kimiċi mhux magħrufa ta' klassi speċifika ta' kimiċi jew prodotti jikkawżaw irritazzjoni għall-għajnejn, jew għall-evalwazzjoni tal-potenzjal relattiv li sustanza irritanti għall-għajnejn tikkawża irritazzjoni fi ħdan skala speċifika ta' reazzjonijiet ta' sustanzi irritanti.

39.

L-opaċità tiġi ddeterminata mill-ammont ta' trażmissjoni ta' dawl minn ġol-kornea. L-opaċità tal-kornea titkejjel b'mod kwantitattiv permezz ta' opaċitometru, li jagħti valuri ta' opaċità fuq skala kontinwa.

40.

Il-permeabilità tiġi ddeterminata mill-ammont taż-żebgħa fluworexxina tas-sodju li tippenetra s-saffi kollha taċ-ċelluli tal-kornea (i.e., l-epitelju fuq is-superfiċje esterna tal-kornea għal ġol-endotelju fuq is-superfċije interna tal-kornea). 1 mL ta' soluzzjoni ta' fluworexxina tas-sodju (4 jew 5 mg/mL meta jiġu ttestjati likwidi jew aġenti tensjoattivi jew solidi li mhumiex aġenti tensjoattivi, rispettivament) jiżdied fil-kavità anterjuri tal-apparat fejn titqiegħed il-kornea, li tkun f'kuntatt mal-ġenb epiteljali tal-kornea, filwaqt li l-kavità posterjuri, li tkun f'kuntatt mal-ġenb endoteljali tal-kornea, timtela b'EMEM frisk. L-apparat imbagħad jiġi inkubat f'pożizzjoni orizzontali għal 90 ± 5 minuta f'temperatura ta' 32 ± 1 °C. L-ammont ta' fluworexxina tas-sodju li jgħaddi għal ġol-kavità posterjuri jitkejjel b'mod kwantitattiv permezz ta' spettrofotometru UV/VIS. Kejl spettrofotometriku evalwat f'490 nm jiġi rreġistrat bħala densità ottika (OD490) jew valuri ta' assorbanza li jitkejlu fuq skala kontinwa. Il-valuri ta' permeabilità tal-fluworexxina jiġu ddeterminati bl-użu ta' valuri ta' OD490 abbażi ta' spettrofotometru viżibbli li juża traġitt ottiku standard ta' 1 ċm

41.

Alternattivament, jista' jintuża qarrej tal-folja tal-mikrotitrazzjoni b'96 bir sakemm; (i) tkun tista' tiġi stabbilita l-iskala ta' valuri lineari tal-qarrej tal-folja għad-determinazzjoni tal-valuri OD490; u (ii), jintuża l-volum korrett ta' kampjuni tal-fluworexxina fuq il-folja ta' 96 bir sabiex jinkisbu valuri ta' OD490 ekwivalenti għat-traġitt ottiku standard ta' 1 ċm (dan jista' jkun li jkun jeħtieġ bir mimli kompletament [ġeneralment 360mL]).

42.

Ladarba l-valuri (OD490) tal-opaċità u l-permeabilità medja jkunu ġew ikkoreġuti għall-opaċità tal-isfond u l-valuri OD490 tal-permeabilità tal-kontroll negattiv, il-valuri medji OD490 tal-opaċità u l-permeabilità għal kull grupp ta' trattament għandhom jiġu kkombinati f'formula dderivata empirikament sabiex jiġi kkalkulat punteġġ tal-irritanza in vitro (IVIS) għal kull grupp ta' trattament kif ġej:

IVIS = valur medju tal-opaċità + (15 × valur OD490 medju tal-permeabilità)

Sina et al. (16) irrappurtaw li din il-formula ġiet idderivata matul studji interni u bejn laboratorju u ieħor. Id-dejta ġġenerata għal serje ta' 36 kompost fi studju fost bosta laboratorji ġiet soġġetta għal analiżi b'varjabbli mutlipli sabiex tiġi ddeterminata l-ekwazzjoni tal-aqwa adattament bejn id-dejta in vivo u dik in vitro. Din l-analiżi twettqet minn xjenzati f'żewġ kumpaniji separati, li dderivaw ekwazzjonijiet kważi identiċi.

43.

Il-valuri tal-opaċità u tal-permeabilità għandhom jiġu evalwati wkoll b'mod indipendenti sabiex jiġi ddeterminat jekk sustanza tat-test tkunx ipprovokat korrużività jew irritazzjoni severa permezz ta' wieħed biss miż-żewġ punti tat-tmiem (ara l-Kriterji tad-Deċiżjoni).

44.

Sustanza li tipprovoka IVIS ≥ 55,1 tiġi ddefinita bħala sustanza korrużiva jew irritant sever. Skont il-paragrafu 1, jekk is-sustanza tat-test ma tiġix identifikata bħala korrużiva għall-għajnejn jew irritant sever, għandu jitwettaq aktar ittestjar għall-finijiet ta' klassifikazzjoni u ttikkettar. Il-metodu ta' ttestjar BCOP għandu akkuratezza kumplessiva ta' 79 % (113/143) sa 81 % (119/147). rata pożittiva falza ta' 19 % (20/103) sa 21 % (22/103), u rata negattiva falza ta' 16 % (7/43) sa 25 % (10/40), meta mqabbel mad-dejta, tal-metodu ta' ttestjar in vivo li jsir fuq għajnejn il-fniek, ikklassifikata skont is-sistemi ta' klassifikazzjoni tal-EPA (1), l-UE (2), jew il-GHS (3). Meta sustanzi f'ċerti klassijiet kimiċi (i.e., alkoħols, ketoni) jew fiżiċi (i.e., solidi) ikunu esklużi mill-bażi tad-dejta, l-akkuratezza tal-BCOP skont is-sistemi ta' klassifikazzjoni tal-UE, l-EPA u l-GHS tvarja minn 87 % (72/83) sa 92 % (78/85), ir-rati ta' pożittivi foloz ivarjaw minn 12 % (7/58) sa 16 % (9/56), u r-rati ta' negattivi foloz ivarjaw minn 0 % (0/27) sa 12 % (3/26).

45.

Anke jekk għas-sustanza tat-test ma tinkiseb l-ebda klassifikazzjoni ta' sustanza korrużiva jew irritant sever għall-għajnejn, id-dejta BCOP tista' tkun utli, flimkien mad-dejta tat-test in vivo li jsir fuq għajnejn il-fniek jew minn test in vitro vvalidat kif xieraq, sabiex jiġu evalwati aktar il-limitazzjonijiet tal-metodu ta' ttestjar BCOP kif ukoll kemm dan huwa utli għall-identifikazzjoni ta' irritanti li mhumiex severi u sustanzi li mhumex irritanti (qed jiġi żviluppat Dokument ta' Gwida dwar l-użu ta' metodi ta' ttestjar in vitro fuq l-għajnejn).

46.

Test jitqies aċċettabbli jekk il-kontroll pożittiv jagħti IVIS li jkun fi ħdan żewġ devjazzjonijiet standard tal-medja storika attwali, li tiġi aġġornata tal-anqas kull tliet xhur, jew kull darba li jitwettaq test aċċettabbli f'laboratorji fejn it-testijiet ma jitwettqux b'mod frekwenti (i.e., anqas minn darba fix-xahar). Ir-reazzjonijiet mill-kontroll negattiv jew tas-solvent/tal-midjum għandhom jirriżultaw f'valuri ta' opaċità u permeabilità li jkunu anqas mill-ogħla limiti stabbiliti għall-valuri tal-opaċità u l-permeabilità tal-isfond għall-kornej bovini trattati bil-kontroll negattiv jew tas-solvent/tal-midjum rispettiv.

47.

Ir-rapport tat-test għandu jinkludi t-tagħrif li ġej, jekk ikun rilevanti għat-twettiq tal-istudju:

Sustanzi tat-Test u tal-Kontroll

Tagħrif dwar l-Isponser u l-Istallazzjoni tat-Test

Ġustifikazzjoni tal-Metodu ta' Ttestjar u tal-Protokoll Użati

Integrità tal-Metodu ta' Ttestjar

Il-proċedura użata sabiex tiġi żgurata l-integrità (i.e., akkuratezza u affidabilità) tal-metodu ta' ttestjar tul iż-żmien (eż., ittestjar perjodiku ta' sustanzi ta' profiċjenza, użu ta' dejta storika ta' kontrolli negattivi u pożittivi).

Kriterji għal Test Aċċettabbli

Kundizzjonijiet tat-Test

Riżultati

Diskussjoni tar-Riżultati

Konklużjoni

(1)

U.S. EPA (1996). Label Review Manual: 2nd Edition. EPA737-B-96-001. Washington, DC: U.S. Environmental Protection Agency.

(2)

Ir-Regolament (KE) Nru 1272/2008 tal-Parlament Ewropew u tal-Kunsill tas-16 ta' Diċembru 2008 dwar il-klassifikazzjoni, l-ittikkettar u l-imballaġġ tas-sustanzi u t-taħlitiet, li jemenda u jħassar id-Direttivi 67/548/KEE u 1999/45/KE, u li jemenda r-Regolament (KE) Nru 1907/2006. ĠU L 353, 31.12.2008, p. 1.

(3)

UN (2007). Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS). Second revised edition, New York & Geneva: United Nations Publications, 2007. Disponibbli fuq:

[http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev02/02files_e.html]

(4)

ESAC (2007). Statement on the conclusion of the ICCVAM retrospective study on organotypic in vitro assays as screening tests to identify potential ocular corrosives and severe eye irritants. Disponibbli fuq:

[http://ecvam.jrc.it/index.htm]

(5)

ICCVAM (2007). Test Method Evaluation Report - In Vitro Ocular Toxicity Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and Corrosives. Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No.: 07-4517. Disponibbli fuq:

[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm]

(6)

Ir-Regolament (KE) Nru 1907/2006 tal-Parlament Ewropew u tal-Kunsill tat-18 ta' Diċembru 2006 dwar ir-Reġistrazzjoni, il-Valutazzjoni, l-Awtorizzazzjoni u r-Restrizzjoni ta' Sustanzi Kimiċi (REACH), li jistabbilixxi Aġenzija Ewropea għas-Sustanzi Kimiċi, li jemenda d-Direttiva 1999/45/KE u li jħassar ir-Regolament (KEE) Nru 793/93 tal-Kunsill u r-Regolament (KE) Nru 1488/94 tal-Kummissjoni kif ukoll id-Direttiva 76/769/KEE tal-Kunsill u d-Direttivi 91/155/KEE, 93/67/KEE, 93/105/KE u 2000/21/KE tal-Kummissjoni. ĠU L 396, 30.12.2006, p. 1.

(7)

OECD (2002). Test Guideline 405. OECD Guideline for Testing of Chemicals. Acute eye irritation/corrosion. Disponibbli fuq:

[http://www.oecd.org/document/40/0,2340,en_2649_34377_37051368_1_1_1_1,00.html]

(8)

ICCVAM (2007). ICCVAM Recommended BCOP Test Method Protocol. In: ICCVAM Test Method Evaluation Report - In Vitro Ocular Toxicity Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and Corrosives. Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No.: 07-4517. Disponibbli fuq:

[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm]

(9)

ICCVAM. (2006). Current Status of In Vitro Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Bovine Corneal Opacity and Permeability Test Method. NIH Publication No.: 06-4512. Research Triangle Park: National Toxicology Program. Disponibbli fuq:

[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_ice.htm]

(10)

INVITTOX (1999). Protocol 124: Bovine Corneal Opacity and Permeability Assay – SOP of Microbiological Associates Ltd. Ispra, Italy: European Center for the Validation of Alternative Methods (ECVAM).

(11)

Gautheron, P., Dukic, M., Alix, D. and Sina, J.F. (1992). Bovine corneal opacity and permeability test: An in vitro assay of ocular irritancy. Fundam. Appl. Toxicol. 18:442-449.

(12)

Siegel, J.D., Rhinehart, E., Jackson, M., Chiarello, L., and the Healthcare Infection Control Practices Advisory Committee (2007). Guideline for Isolation Precautions: Preventing Transmission of Infectious Agents in Healthcare Settings. Disponibbli fuq:

[http://www.cdc.gov/ncidod/dhqp/pdf].

(13)

Maurer, J.K., Parker, R.D. and Jester, J.V. (2002). Extent of corneal injury as the mechanistic basis for ocular irritation: key findings and recommendations for the development of alternative assays. Reg. Tox. Pharmacol. 36:106-117.

(14)

Doughty, M.J., Petrou, S. and Macmillan, H. (1995). Anatomy and morphology of the cornea of bovine eyes from a slaughterhouse. Can. J. Zool. 73:2159-2165.

(15)

Collee, J. and Bradley, R. (1997). BSE: A decade on - Part I. The Lancet 349: 636-641.

(16)

Sina, J.F., Galer, D.M., Sussman, R.S., Gautheron, P.D., Sargent, E.V., Leong, B., Shah, P.V., Curren, R.D., and Miller, K. (1995). A collaborative evaluation of seven alternatives to the Draize eye irritation test using pharmaceutical intermediates. Fundam Appl Toxicol 26:20-31.

(17)

ICCVAM (2006). Background review document, Current Status of In Vitro Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Bovine Corneal Opacity and Permeability (BCOP) Test Method. Disponibbli fuq:

[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_bcop.htm]

(18)

ICCVAM (2006). Background review document, Current Status of In Vitro Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Isolated Chicken Eye (ICE) Test Method. Disponibbli fuq:

[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_bcop.htm]

1.

Il-metodu ta' ttestjar ta' Għajnejn tat-Tiġieġ Iżolati (ICE) huwa metodu ta' ttestjar in vitro li jista' jintuża, f'ċerti ċirkustanzi u b'limitazzjonijiet speċifiċi, sabiex sustanzi u taħlitiet jiġu kklassifikati bħala sustanzi korrużivi u irritanti severi għall-għajnejn (1) (2) (3). Għall-fini ta' dan il-metodu ta' ttestjar, irritanti severi huma ddefiniti bħala dawk li jikkawżaw leżjonijiet fl-għajnejn li jippersistu fil-fenek għal tal-anqas 21 jum wara l-amministrazzjoni. Filwaqt li ma jitqiesx validu bħala sostituzzjoni kompluta għat-test in vivo li jsir fuq għajnejn il-fniek, l-ICE huwa rrakkomandat biex jintuża bħala strateġija ta' ttestjar imtarraġ għall-klassifikazzjoni u t-tikkettar regolatorji fi ħdan dominju speċifiku ta' applikabilità (4) (5). Is-sustanzi u t-taħlitiet tat-test (6) li jkunu pożittivi fl-assaġġ jistgħu jiġu kklassifikati bħala sustanzi korrużivi jew irritanti severi għall-għajnejn mingħajr ma jsir aktar ittestjar fuq il-fniek. Sustanza li tagħti riżultat negattiv tkun teħtieġ li tiġi ttestjata fuq il-fniek permezz ta' strateġija ta' ttestjar sekwenzjali, kif deskritt fil-Linja Gwida għall-Ittestjar tal-OECD 405 (7) (il-kapitolu B.5 ta' dan l-Anness).

2.

L-għan ta' dan il-metodu ta' ttestjar huwa li jiddeskrivi l-proċeduri użati għall-evalwazzjoni tal-potenzjal ta' sustanza tat-test li tikkawża korrużività jew irritanza severa potenzjali kif imkejla mill-ħila tas-sustanza li tikkawża tossiċità f'għajn ta' tiġieġa mneħħija mill-ħofra tagħha. Effetti tossiċi għall-kornea jitkejlu permezz ta' (i) valutazzjoni kwalitattiva tal-opaċità, (ii) valutazzjoni kwalitattiva tal-ħsara għall-epitelju abbażi tal-applikazzjoni tal-fluworexxina fl-għajn (żamma tal-fluworexxina), (iii) kejl kwantitattiv ta' żieda fil-ħxuna (nefħa), u (iv) evalwazzjoni kwalitattiva ta' ħsara morfoloġika makroskopika fis-superfiċje. Il-valutazzjonijiet tal-opaċità, tan-nefħa, u tal-ħsara fil-kornea wara l-esponiment għal sustanza tat-test jiġu vvalutati b'mod individwali u jiġu kkombinati sabiex tiġi dderivata Klassifikazzjoni tal-Irritanza għall-Għajnejn.

3.

L-irritanti għall-għajnejn li jikkawżaw leżjonijiet li jitilqu f'anqas minn 21 jum u sustanzi li mhumiex irritanti ġew ittestjati wkoll bl-użu tal-metodu ta' ttestjar ICE. Madankollu, l-akkuratezza u l-kredibilità tal-metodu ta' ttestjar ICE għas-sustanzi f'dawn il-kategoriji ma ġewx evalwati b'mod formali.

4.

Id-definizzjonijiet huma pprovduti fl-Appendiċi 1.

5.

Dan il-metodu ta' ttestjar huwa bbażat fuq il-protokoll tal-metodu ta' ttestjar ICE tal-Kumitat ta' Koordinazzjoni Interaġenzjali dwar il-Validazzjoni ta' Metodi Alternattivi (ICCVAM) (8), li ġie żviluppat b'segwitu għal studju ta' validazzjoni internazzjonali (4) (5) (9), b'kontribuzzjonijiet mingħand iċ-Ċentru Ewropew għall-Validazzjoni ta' Metodi Alternattivi (ECVAM) u ċ-Ċentru Ġappuniż għall-Validazzjoni ta' Metodi Alternattivi, u l-Kwalità tal-Ħajja TNO tad-Dipartiment tat-Tossikoloġija u Farmakoloġija Applikata (il-Pajjiżi l-Baxxi). Il-protokoll huwa bbażat fuq tagħrif miksub minn protokolli ppubblikati, kif ukoll il-protokoll attwali użat mit-TNO (10) (11) (12) (13) (14).

6.

Il-limitazzjonijiet identifikati għal dan il-metodu huma bbażati fuq ir-rata ta' pożittivi foloz għall-alkoħols u r-rata ta' negattivi foloz għas-solidi u l-aġenti tensjoattivi (ara l-paragrafu 47) (4). Meta s-sustanzi ta' dawn il-klassijiet kimiċi u fiżiċi jiġu esklużi mill-bażi tad-dejta, l-akkuratezza tal-ICE skont is-sistemi ta' klassifikazzjoni tal-UE, l-EPA u l-GHS titjieb b'mod sostanzjali (4). Abbażi tal-għan ta' dan l-assaġġ (i.e., li jidentifika biss is-sustanzi korrużivi/irritanti severi għall-għajnejn), rati ta' negattivi foloz mhumiex kritiċi minħabba li tali sustanzi sussegwentement jiġu ttestjati fuq il-fniek jew b'testijiet oħra in vitro vvalidati b'mod xieraq, skont ir-rekwiżiti regolatorji, bl-użu ta' strateġija ta' ttestjar sekwenzjali b'approċċ ibbażat fuq l-importanza tal-evidenza. Barra minn hekk, il-bażi tad-dejta tal-validazzjoni attwali ma tippermettix evalwazzjoni xierqa ta' wħud mill-klassijiet kimiċi jew tal-prodotti (eż., it-taħlitiet). Madankollu, l-investigaturi jistgħu jqisu li jużaw dan il-metodu ta' ttestjar għall-ittestjar tat-tipi kollha ta' materjali (inklużi t-taħlitiet), fejn riżultat pożittiv ikun jista' jiġi aċċettat bħala indikattiv ta' reazzjoni għal sustanza korrużiva jew irritant sever għall-għajnejn. Madankollu, riżultati pożittivi miksuba bl-alkoħols għandhom jiġu interpretati b'ċertu kawtela minħabba r-riskju ta' tbassir żejjed.

7.

Il-proċeduri kollha li jinvolvu għajnejn tat-tiġieġ għandhom isegwu r-regolamenti u l-proċeduri applikabbli tal-istallazzjoni tal-ittestjar f'dak li għandu x'jaqsam mal-manipulazzjoni ta' materjali derivati mill-bnedmin jew l-annimali, li jinkludu, iżda li mhumiex limitati għal, tessuti u fluwidi tat-tessuti. Il-prekawzjonijiet universali tal-laboratorji huma rrakkomandati (15).

8.

Limitazzjoni tal-metodu ta' ttestjar hija dik li, għalkemm il-metodu jqis uħud mill-effetti fuq l-għajnejn evalwati fil-metodu ta' ttestjar tal-irritanza f'għajnejn il-fenek u sa ċertu punt is-severità tagħhom, il-metodu ma jqisx feriti fil-konġuntiva u fil-ħabba tal-għajnejn. Barra dan, għalkemm ir-riversibilità tal-feriti fil-kornea ma tistax tiġi evalwata per se fl-assaġġ ICE, ġie propost, abbażi ta' studji fuq għajnejn il-fniek, li valutazzjoni tal-fond inizjali tal-ferita fil-kornea tista' tintuża biex issir distinzjoni bejn effetti riversibbli u dawk irriversibbli (16). Fl-aħħar nett, il-metodu ta' ttestjar ICE ma jippermettix valutazzjoni tal-potenzjal għal tossiċità sistemika assoċjata ma' esponiment tal-għajnejn.

9.

Qed isiru sforzi kontinwi sabiex jiġu kkarratterizzati aktar il-limitazzjonijiet tal-metodu ta' ttestjar ICE kif ukoll kemm huwa utli għall-identifikazzjoni ta' irritanti li mhumiex severi u sustanzi li mhumex irritanti (ara wkoll il-paragrafu 48). L-utenti qed jiġu inkoraġġuti wkoll jipprovdu lill-organizzazzjonijiet ta' validazzjoni b'kampjuni u/jew dejta għal evalwazzjoni formali ta' użi futuri possibbli tal-metodu ta' ttestjar ICE, inklużi dawk għall-identifikazzjoni ta' irritanti li mhumiex severi u sustanzi li mhumex irritanti għall-għajnejn.

10.

Għal kwalunkwe laboratorju li inizjalment ikun qed jistabbilixxi dan l-assaġġ, għandhom jintużaw is-sustanzi kimiċi ta' profiċjenza pprovduti fl-Appendiċi 2. Laboratorju jista' juża dawn is-sustanzi kimiċi biex juri l-kompetenza teknika tiegħu fit-twettiq tal-metodu ta' ttestjar ICE qabel ma jissottometti dejta tal-ICE għall-finijiet tal-klassifikazzjoni regolatorja tal-perikli.

11.

Il-metodu ta' ttestjar ICE huwa mudell organotipiku li jipprovdi manutenzjoni fuq terminu ta' żmien qasir fuq għajnejn it-tiġieġ in vitro. F'dan il-metodu ta' ttestjar, il-ħsara mis-sustanza tat-test tiġi vvalutata bid-determinazzjoni tan-nefħa, l-opaċità u ż-żamma tal-fluworexxina fil-kornea. Filwaqt li l-aħħar żewġ parametri jinvolvu valutazzjoni kwalitattiva, analiżi tan-nefħa fil-kornea tipprovdi valutazzjoni kwantitattiva. Kull kejl jew jinqaleb għal punteġġ kwantitattiv li jintuża għall-kalkolu ta' Indiċi ta' Irritazzjoni kumplessiv, inkella jiġi assenjat kategorizzazzjoni kwantitattiva li tintuża biex tiġi assenjata klassifikazzjoni tal-korrużività u l-irritanza severa għall-għajnejn in vitro. Kull wieħed minn dawn ir-riżultati mbagħad ikun jista' jintuża biex jipprevedi l-potenzjal ta' sustanza tat-test li tikkawża korrużività u irritanza severa għall-għajnejn in vivo (ara l-Kriterji tad-Deċiżjoni).

12.

Storikament, għal dan l-assaġġ intużaw għajnejn li jkunu ttieħdu mit-tiġieġ minn biċċerija fejn jinqatlu għall-konsum mill-bniedem, u b'hekk ġiet eliminata l-ħtieġa ta' annimali tal-laboratorju. Jintużaw biss għajnejn ta' annimali b'saħħithom li huma xierqa li jidħlu fil-katina alimentari tal-bniedem.

13.

Għalkemm ma twettaq l-ebda studju kontrollat għall-valutazzjoni tal-età ideali tat-tiġieġ, l-età u l-piż tat-tiġieġ użati storikament f'dan il-metodu ta' ttestjar huma dawk ta' tiġieġ tar-rebbiegħa li tradizzjonalment jiġu pproċessati minn biċċerija tat-tjur (i.e., bejn wieħed u ieħor ta' età ta' 7 ġimgħat, u piż ta' 1,5 – 2,5 kg).

14.

L-irjus għandhom jitneħħew immedjatament wara s-sedazzjoni tat-tiġieġ, ġeneralment b'xokk elettriku u inċiżjoni tal-għonq għall-fsada. Għandu jiġi lokalizzat sors lokali ta' tiġieġ qrib il-laboratorju sabiex l-irjus tat-tiġieġ jiġu ttrasferiti mill-biċċerija sal-laboratorju malajr biżżejjed sabiex kemm jista' jkun jonqos/tonqos id-deterjoramnet u/jew il-kontaminazzjoni mill-batterji. L-intervall tal-ħin li jgħaddi minn meta jinġabru l-irjus tat-tiġieġ u l-għajnejn jintużaw fil-metodu ta' ttestjar ICE għandu jitnaqqas kemm jista' jkun (tipikament fi żmien sagħtejn) u għandu jintwera li dan ma jikkompromettix ir-riżultati tal-assaġġ. Dawn ir-riżultati huma bbażati fuq il-kriterji tal-għażla għall-għajnejn, kif ukoll ir-reazzjonijiet tal-kontrolli pożittivi u negattivi. L-għajnejn kollha użati fl-assaġġ għandhom ikunu mill-istess grupp ta' għajnejn miġbura f'ġurnata speċifika.

15.

Minħabba l-fatt li l-għajnejn jiġu ddissektjati fil-laboratorju, l-irjus intatti jiġu ttrasportati mill-biċċerija f'temperatura ambjentali f'kaxex tal-plastik umdifikati b'xugamani mxarrba b'soluzzjoni iżotonika ta' ilma bil-melħ.

16.

Għajnejn li jkollhom punteġġ għoli ta' titbigħ bil-fluworexxina (i.e., > 0,5) jew punteġġ għoli ta' opaċità fil-kornea (i.e., > 0,5) wara li jitneħħew mill-ħofra tal-għajn jitwarrbu.

17.

Kull grupp ta' trattament u kontroll pożittiv konkorrenti jikkonsisti minn tal-anqas tliet għajnejn. Il-grupp ta' kontrolli negattivi jew il-kontroll tas-solvent (jekk jintuża solvent li ma jkunx ilma bil-melħ) jikkonsisti minn tal-anqas għajn waħda.

18.

Tebqet il-għajn tinqata' barra b'ħafna attenzjoni sabiex ma ssir l-ebda ħsara fil-kornea. L-integrità tal-kornea tiġi vvalutata malajr b'qatra fluworexxina tas-sodju 2 % (w/v) li tiġi applikata fuq is-superfiċje tal-kornea għal ftit sekondi, u mbagħad titlaħlaħ b'soluzzjoni iżotonika ta' ilma bil-melħ. Għajnejn trattati bil-fluworexxina mbagħad jiġu eżaminati b'mikroskopju tal-kornea sabiex jiġi żgurat li l-kornea ma jkollha l-ebda ħsara (i.e., punteġġi taż-żamma tal-fluworexxina u tal-opaċità tal-kornea ≤ 0,5).

19.

Jekk l-għajn ma jkollha l-ebda ħsara tinqata' aktar, 'il barra mill-kranju b'attenzjoni kbira sabiex ma ssir l-ebda ħsara lill-kornea. Il-boċċa tal-għajn tinġibed mill-orbita billi wieħed iżomm sod il-membrana tat-tegħmiż b'forċipi kirurġiċi, u l-muskoli tal-għajn jinqatgħu b'imqass mgħawweġ u b'ponta spuntata. Huwa importanti li wieħed jevita li jikkawża ħsara fil-kornea minħabba pressjoni eċċessiva (i.e., artefatti ta' kompressjoni.)

20.

Meta l-għajn titneħħa mill-orbita, porzjon viżibbli tan-nerv ottiku għandu jibqa' mwaħħal. Ladarba titneħħa mill-orbita, l-għajn titqiegħed fuq kuttunar assorbenti u l-membrana tat-tegħmiż u tessut konnettiv ieħor jinqatgħu.

21.

L-għajn imneħħija mill-ħofra tagħha titqiegħed fuq klamp tal-azzar li ma jissaddadx b'tali mod li l-kornea tkun f'pożizzjoni vertikali. Il-klamp imbagħad jiġi ttrasferit f'kavità fl-apparat tas-superfużjoni (16). Il-klampi għandhom jitqiegħdu fl-apparat tas-superfużjoni b'tali mod li l-kornea kollha tkun qed tiġi provduta bid-dripp tas-soluzzjoni iżotonika tal-ilma bil-melħ. Il-kavitajiet tal-apparat tas-superfużjoni għandu jkollu temperatura kkontrollata ta' 32 ± 1,5 °C. L-Appendiċi 3 jipprovdi dijagramma ta' apparat tipiku tas-superfużjoni u l-klampi tal-għajnejn, li jistgħu jinxtraw jew jinbnew. L-apparat jista' jitbiddel sabiex jissodisfa l-ħtiġijiet ta' laboratorju individwali (eż., biex jakkomoda għadd differenti ta' għajnejn).

22.

Wara li jitqiegħdu fl-apparat tas-superfużjoni, l-għajnejn jerġgħu jiġu eżaminati b'mikroskopju tal-kornea sabiex jiġi żgurat li ma tkun saritilhom l-ebda ħsara waqt il-proċedura tad-dissezzjoni. Il-ħxuna tal-kornea fil-quċċata tal-kornea għandha titkejjel ukoll issa bl-użu tal-apparat li jkejjel il-fond fuq il-mikroskopju tal-kornea. Għajnejn; (i) b'punteġġ ta' żamma ta' fluworexxina ta' > 0,5; (ii) opaċità tal-kornea > 0,5; jew, (iii), kwalunkwe sinjal addizzjonali ta' ħsara għandhom jiġu ssostitwiti. Għal għajnejn li ma jitwarrbux abbażi ta' kwalunkwe minn dawn il-kriterji, għajnejn individwali bi ħxuna tal-kornea li tiddevja b'aktar minn 10 % mill-valur medju għall-għajnejn kollha għandhom jitwarrbu. L-utenti għandhom ikunu konxji li l-mikroskopji tal-kornea jistgħu jagħtu kejl differenti ta' ħxuna tal-kornea jekk is-setting tal-wisa' tal-fetħa tkun differenti. Il-wisa' tal-fetħa għandha tkun immontata għal 0,095 mm.

23.

Ladarba l-għajnejn kollha jiġu eżaminati u approvati, l-għajnejn jiġu inkubati għal madwar 45 sa 60 minuta sabiex jiġu ekwilibrati mas-sistema tat-test qabel l-iddożar. Wara l-perjodu ta' ekwilibrazzjoni, jiġi rreġistrat il-punt żero ta' referenza għall-ħxuna u l-opaċità tal-kornea sabiex iservi bħala linja ta' bażi (i.e., ħin = 0). Il-punteġġ tal-fluworexxina ddeterminat fid-dissezzjoni jintuża bħala l-ewwel kejl għal dak il-punt tat-tmiem.

24.

Eżatt wara l-kejl tal-punt żero ta' referenza, l-għajn (fl-apparat fejn titqiegħed) titneħħa mill-apparat tas-superfużjoni, titqiegħed f'pożizzjoni orizzontali, u s-sustanza tat-test tiġi applikata fuq il-kornea.

25.

Sustanzi tat-test likwidi tipikament jiġu ttestjati mhux iddilwiti, iżda jistgħu jiġu ddilwiti jekk dan jitqies neċessarju (eż., bħala parti mit-tfassil tal-istudju). Is-solvent preferut għas-sustanzi dilwiti huwa l-ilma bil-melħ fiżjoloġiku. Madankollu, solventi alternattivi jistgħu jintużaw ukoll taħt kundizzjonijiet kontrollati, iżda għandu jintwera li dawn ikunu solventi xierqa biex jintużaw minflok l-ilma bil-melħ fiżjoloġiku.

26.

Sustanzi tat-test likwidi jiġu applikati fuq il-kornea b'tali mod li s-superfiċje sħiħa tal-kornea tkun miksija b'mod indaqs bis-sustanza tat-test; il-volum standard huwa 0,03 mL.

27.

Jekk possibbli, is-sustanzi solidi għandhom jintaħnu f'mehrież u lida, sa ma jkunu kemm jista' jkun fini, jew f'għodda tat-tħin komparabbli. It-trab jiġi applikat fuq il-kornea b'tali mod li l-kornea tkun miksija b'mod uniformi bis-sustanza tat-test; l-ammont standard huwa 0,03 gm.

28.

Is-sustanza tat-test (likwida jew solida) tiġi applikata għal 10 sekondi u mbagħad titlaħlaħ minn fuq l-għajn bl-ilma bil-melħ iżotoniku (madwar 20 mL) f'temperatura ambjentali. L-għajn (fl-apparat fejn titqiegħed) imbagħad terġa' titqiegħed fl-apparat tas-superfużjoni fil-pożizzjoni wieqfa oriġinali.

29.

Kontrolli negattivi jew tas-solvent/midjum konkorrenti għandhom jiġu inklużi f'kull esperiment.

30.

Meta jkunu qed jiġu ttestjati likwidi f'100 % jew solidi, jintuża ilma bil-melħ fiżjoloġiku bħala kontroll negattiv konkorrenti fil-metodu ta' ttestjar ICE sabiex jiġu individwati bidliet mhux speċifiċi fis-sistema tat-test, u sabiex jiġi żgurat li l-kundizzjonijiet tal-assaġġ ma jirriżultawx bla bżonn f'reazzjoni irritanti.

31.

Meta jkunu qed jiġu ttestjati likwidi ddilwiti, fil-metodu ta' ttestjar ICE jiġi inkluż grupp ta' kontrolli tas-solvent/midjum konkorrenti sabiex jiġu individwati bidliet mhux speċifiċi fis-sistema tat-test, u sabiex jiġi żgurat li l-kundizzjonijiet tal-assaġġ ma jirriżultawx bla bżonn f'reazzjoni irritanti. Skont il-paragrafu 25, jista' jintuża biss solvent/midjum li jkun intwera li ma jkollu l-ebda effett avvers fuq is-sistema tat-test.

32.

F'kull esperiment jiġi inkluż irritant għall-għajnejn magħruf sabiex jiġi vverifikat li tkun ġiet ikkawżata reazzjoni xierqa. Minħabba li l-assaġġ ICE qed jintuża f'dan il-metodu ta' ttestjar biex jidentifika sustanzi korrużivi jew irritanti severi, il-kontroll pożittiv għandu jkun sustanza ta' referenza li tikkawża reazzjoni severa f'dan il-metodu ta' ttestjar. Madankollu, sabiex jiġi żgurat li l-varjabilità fir-reazzjoni tal-kontroll pożittiv tkun tista' tiġi vvalutata tul iż-żmien, id-daqs tar-reazzjoni severa ma għandux ikun eċċessiv. Għandha tiġi ġġenerata biżżejjed dejta in vitro għall-kontroll pożittiv sabiex għall-kontroll pożittiv tkun tista' tiġi kkalkulata skala ta' valuri ddefiniti statistikament li tkun aċċettabbli. Jekk ma jkunx hemm disponibbli dejta storika xierqa tal-metodu ta' ttestjar ICE għal kontroll pożittiv partikolari, jista' jkun meħtieġ li jitwettqu studji li jipprovdu dan it-tagħrif.

33.

Eżempji ta' kontrolli pożittivi għal sustanzi tat-test likwidi huma l-aċidu aċetiku 10 % jew il-klorur tal-benżalkonju 5 %, filwaqt li eżempji ta' kontrolli pożittivi għal sustanzi tat-test solidi huma l-idrossidu tas-sodju jew l-imidażol.

34.

Sustanzi ta' riferiment huma utli għall-evalwazzjoni tal-potenzjal li kimiċi mhux magħrufa ta' klassi speċifika ta' kimiċi jew prodotti jikkawżaw irritazzjoni għall-għajnejn, jew għall-evalwazzjoni tal-potenzjal relattiv li sustanza irritanti għall-għajnejn tikkawża irritazzjoni fi ħdan skala speċifika ta' reazzjonijiet ta' sustanzi irritanti.

35.

Il-kornej trattati jiġu evalwati qabel it-trattament u mbagħad fit-30, fil-75, fil-120, fil-180 u fil-240 minuta (± 5 minuti) wara t-tlaħliħa ta' wara t-trattament. Dawn il-punti tal-ħin jipprovdu għadd xieraq ta' kejl tul il-perjodu tat-trattament ta' erba' sigħat, filwaqt li jħallu biżżejjed ħin jgħaddi bejn kejl u ieħor sabiex isiru l-osservazzjonijiet neċessarji li għandhom isiru għall-għajnejn kollha.

36.

Il-punti tat-tmiem evalwati għall-opaċità, nefħa, żamma tal-fluworexxina fil-kornea u l-effetti morfoloġiċi (eż., tħaffir jew illaxkar tal-epitelju). Il-punti tat-tmiem kollha, bl-eċċezzjoni taż-żamma tal-fluworexxina (li tiġi ddeterminata biss qabel it-trattament u 30 minuta wara l-esponiment għas-sustanza tat-test) jiġu ddeterminati f'kull wieħed mill-punti tal-ħin imsemmija hawn fuq.

37.

It-teħid ta' ritratti huwa rrakkomandat għad-dokumentazzjoni tal-opaċità, iż-żamma tal-fluworexxina, l-effetti morfoloġiċi fil-kornea u, jekk issir, l-istopatoloġija.

38.

Wara l-eżami finali li jsir fir-raba' siegħa, l-utenti huma inkoraġġuti jippreservaw l-għajnejn f'fissattiv xieraq (eż., soluzzjoni buffer ta' formalina newtrali) għal eżami istopatoloġiku possibbli.

39.

In-nefħa fil-kornea tiġi ddeterminata mill-kejl tal-ħxuna fil-kornea li jsir permezz ta' pakimetru ottiku fuq mikroskopju tal-kornea. In-nefħa tiġi espressa bħala perċentwal u tiġi kkalkulata mill-kejl tal-ħxuna tal-kornea skont il-formula li ġejja:

40.

Il-perċentwal medju tan-nefħa fil-kornea għat-testijiet kollha tal-għajnejn jiġi kkalkulat għall-punti tal-ħin ta' osservazzjoni kollha. Abbażi tal-ogħla punteġġ medju għan-nefħa fil-kornea, kif jiġi osservat fi kwalunkwe punt tal-ħin, jingħata punteġġ tal-kategorija għal kull sustanza tat-test.

41.

Għall-punteġġ l-opaċità fil-kornea tiġi kkalkulata skont il-parti tal-kornea li tkun opaċifikata l-aktar. Il-valur medju tal-opaċità fil-kornea għat-testijiet kollha tal-għajnejn jiġi kkalkulat għall-punti tal-ħin ta' osservazzjoni kollha. Abbażi tal-ogħla punteġġ medju għall-opaċità fil-kornea, kif jiġi osservat fi kwalunkwe punt tal-ħin, jingħata punteġġ tal-kategorija għal kull sustanza tat-test (it-Tabella 1).

Tabella 1

Punteġġi tal-opaċità tal-kornea

42.

Il-valur medju taż-żamma tal-fluworexxina għat-testijiet kollha tal-għajnejn jiġi kkalkulat biss għall-punt tal-ħin osservat fit-30 minuta, li jintuża għall-punteġġ kumplessiv tal-kategorija għal kull sustanza tat-test (it-Tabella 2).

Tabella 2

Punteġġi taż-żamma tal-fluworexxina

43.

Effetti morfoloġiċi inkluż ‘tħaffir’ taċ-ċelluli tal-epitelju tal-kornea, ‘illaxkar’ tal-epitelju, ‘taħrix’ tas-superfiċje tal-kornea u ‘twaħħil’ tas-sustanza tat-test mal-kornea. Dawn is-sejbiet jistgħu jvarjaw fis-severità u jistgħu jokkorru b'mod simultanju. Il-klassifikazzjoni ta' dawn is-sejbiet hija suġġettiva skont l-interpretazzjoni tal-investigatur.

44.

Ir-riżultati tal-opaċità, in-nefħa, u ż-żamma tal-fluworexxina fil-kornea għandhom jiġu evalwati b'mod separat sabiex tinħoloq klassi separata għal kull punt tat-tmiem. Il-klassijiet tal-ICE għal kull punt tat-tmiem imbagħad jiġu kkombinati biex tinħoloq Klassifikazzjoni tal-Irritanza għal kull sustanza tat-test.

45.

Ladarba kull punt tat-tmiem ikun ġie evalwat, il-klassijiet tal-ICE jistgħu jiġu assenjati abbażi ta' skala ta' valuri ddeterminata minn qabel. L-interpretazzjoni tal-ħxuna tal-kornea (it-Tabella 3), l-opaċità (it-Tabella 4), u ż-żamma tal-fluworexxina (it-Tabella 5) bl-użu ta' erba' klassijiet tal-ICE ssir skont l-iskali li ġejjin:

Tabella 3

Kriterji tal-klassifikazzjoni tal-ICE għall-ħxuna tal-kornea

Tabella 4

Kriterji tal-klassifikazzjoni tal-ICE għall-opaċità

Tabella 5

Kriterji tal-klassifikazzjoni tal-ICE għaż-żamma medja tal-fluworexxina

46.

Il-klassifikazzjoni kumplessiva tal-irritanza in vitro għal sustanza tat-test tiġi vvalutata billi tinqara l-klassifikazzjoni ta' irritanza li tikkorrispondi għall-kombinazzjoni tal-kategoriji miksuba għan-nefħa fil-kornea, l-opaċità fil-kornea, u ż-żamma tal-fluworexxina u bl-applikazzjoni tal-iskema ppreżentata fit-Tabella 6.

Tabella 6

Klassifiki kumplessivi tal-irritanza in vitro

47.

Skont il-paragrafu 1, jekk is-sustanza tat-test ma tiġix identifikata bħala korrużiva għall-għajnejn jew irritant sever, għandu jitwettaq aktar ittestjar għall-finijiet ta' klassifikazzjoni u ttikkettar. Il-metodu ta' ttestjar ICE għandu akkuratezza kumplessiva ta' 83 % (120/144) sa 87 % (134/154), rata pożittiva falza ta' 6 % (7/122) sa 8 % (9/116), u rata negattiva falza ta' 41 % (13/32) sa 50 % (15/30) għall-identifikazzjoni ta' sustanzi korrużivi u irritanti severi għall-għajnejn, meta mqabbel mad-dejta, tal-metodu ta' ttestjar in vivo li jsir fuq għajnejn il-fniek, ikklassifikata skont is-sistemi ta' klassifikazzjoni tal-EPA (1), l-UE (2), jew il-GHS (3). Meta sustanzi f'ċerti klassijiet kimiċi (i.e., alkoħols u aġenti tensjoattivi) u fiżiċi (i.e., solidi) ikunu esklużi mill-bażi tad-dejta, l-akkuratezza tal-ICE skont is-sistemi ta' klassifikazzjoni tal-UE, l-EPA u l-GHS tvarja minn 91 % (75/82) sa 92 % (69/75), ir-rati ta' pożittivi foloz ivarjaw minn 5 % (4/73) sa 6 % (4/70), u r-rati ta' negattivi foloz ivarjaw minn 29 % (2/7) sa 33 % (3/9) (4).

48.

Anke jekk għas-sustanza tat-test ma tinkiseb l-ebda klassifikazzjoni ta' sustanza korrużiva jew irritant sever għall-għajnejn, id-dejta ICE tista' tkun utli, flimkien mad-dejta tat-test in vivo li jsir fuq għajnejn il-fniek jew minn test in vitro vvalidat kif xieraq, sabiex jiġu evalwati aktar il-limitazzjonijiet tal-metodu ta' ttestjar ICE kif ukoll kemm dan huwa utli għall-identifikazzjoni ta' irritanti li mhumiex severi u sustanzi li mhumex irritanti (qed jiġi żviluppat Dokument ta' Gwida dwar l-użu ta' metodi ta' ttestjar in vitro fuq l-għajnejn).

49.

Test jitqies aċċettabbli jekk il-kontrolli negattivi jew tal-midjum/solvent konkorrenti u l-kontrolli pożittivi konkorrenti jagħtu Klassifikazzjoni tal-Irritanza simili għal dik li tinsab fil-klassijiet ta' irritanti severi/sustanzi korrużivi, rispettivament.

50.

Ir-rapport tat-test għandu jinkludi t-tagħrif li ġej, jekk ikun rilevanti għat-twettiq tal-istudju:

Sustanzi tat-Test u tal-Kontroll

Tagħrif dwar l-Isponser u l-Istallazzjoni tat-Test

Ġustifikazzjoni tal-Metodu ta' Ttestjar u tal-Protokoll Użati

Integrità tal-Metodu ta' Ttestjar

Il-proċedura użata sabiex tiġi żgurata l-integrità (i.e., akkuratezza u affidabilità) tal-metodu ta' ttestjar tul iż-żmien (eż., ittestjar perjodiku ta' sustanzi ta' profiċjenza, użu ta' dejta storika ta' kontrolli negattivi u pożittivi).

Kriterji għal Test Aċċettabbli

Jekk applikabbli, firxiet aċċettabbli ta' punti ta' riferiment ta' kontroll konkorrenti bbażati fuq dejta storika;

Kundizzjonijiet tat-Test

Riżultati

Diskussjoni tar-Riżultati

Konklużjoni

(1)

U.S. EPA (1996). Label Review Manual: 2nd Edition. EPA737-B-96-001. Washington, DC: U.S. Environmental Protection Agency.

(2)

Ir-Regolament (KE) Nru 1272/2008 tal-Parlament Ewropew u tal-Kunsill tas-16 ta' Diċembru 2008 dwar il-klassifikazzjoni, l-ittikkettar u l-imballaġġ tas-sustanzi u t-taħlitiet, li jemenda u jħassar id-Direttivi 67/548/KEE u 1999/45/KE, u li jemenda r-Regolament (KE) Nru 1907/2006. ĠU L 353, 31.12.2008, p. 1.

(3)

United nations (UN) (2007). Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS), Second revised edition, UN New York and Geneva, 2007. Disponibbli fuq:

[http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev02/02files_e.html]

(4)

ICCVAM (2007). Test Method Evaluation Report - In Vitro Ocular Toxicity Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and Corrosives. Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No.: 07-4517. Disponibbli fuq:

[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm]

(5)

ESAC (2007). Statement on the conclusion of the ICCVAM retrospective study on organotypic in vitro assays as screening tests to identify potential ocular corrosives and severe eye irritants. Disponibbli fuq:

[http://ecvam.jrc.it/index.htm].

(6)

Ir-Regolament (KE) Nru 1907/2006 tal-Parlament Ewropew u tal-Kunsill tat-18 ta' Diċembru 2006 dwar ir-Reġistrazzjoni, il-Valutazzjoni, l-Awtorizzazzjoni u r-Restrizzjoni ta' Sustanzi Kimiċi (REACH), li jistabbilixxi Aġenzija Ewropea għas-Sustanzi Kimiċi, li jemenda d-Direttiva 1999/45/KE u li jħassar ir-Regolament (KEE) Nru 793/93 tal-Kunsill u r-Regolament (KE) Nru 1488/94 tal-Kummissjoni kif ukoll id-Direttiva 76/769/KEE tal-Kunsill u d-Direttivi 91/155/KEE, 93/67/KEE, 93/105/KE u 2000/21/KE tal-Kummissjoni. ĠU L 396, 30.12.2006, p. 1.

(7)

OECD (2002). Test Guideline 405. OECD Guideline for Testing of Chemicals. Acute eye irritation/corrosion. Disponibbli fuq:

[http://www.oecd.org/document/40/0,2340,en_2649_34377_37051368_1_1_1_1,00.html]

(8)

ICCVAM (2007). ICCVAM Recommended ICE Test Method Protocol. In: ICCVAM Test Method Evaluation Report - In Vitro Ocular Toxicity Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and Corrosives. Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No.: 07-4517. Disponibbli fuq:

[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm]

(9)

ICCVAM. (2006). Current Status of In Vitro Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Isolated Chicken Eye Test Method. NIH Publication No.: 06-4513. Research Triangle Park: National Toxicology Program. Disponibbli fuq:

[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_ice.htm]

(10)

Prinsen, M.K. and Koëter, B.W.M. (1993). Justification of the enucleated eye test with eyes of slaughterhouse animals as an alternative to the Draize eye irritation test with rabbits. Fd. Chem. Toxicol. 31:69-76.

(11)

INVITTOX (1994). Protocol 80: Chicken enucleated eye test (CEET). Disponibbli fuq:

[http://ecvam.jrc.it/index.htm].

(12)

Balls, M., Botham, P.A., Bruner, L.H. and Spielmann H. (1995). The EC/HO international validation study on alternatives to the Draize eye irritation test. Toxicol. In Vitro 9:871-929.

(13)

Prinsen, M.K. (1996). The chicken enucleated eye test (CEET): A practical (pre)screen for the assessment of eye irritation/corrosion potential of test materials. Food Chem. Toxicol. 34:291-296.

(14)

Chamberlain, M., Gad, S.C., Gautheron, P. and Prinsen, M.K. (1997). IRAG Working Group I: Organotypic models for the assessment/prediction of ocular irritation. Food Chem. Toxicol. 35:23-37.

(15)

Siegel, J.D., Rhinehart, E., Jackson, M., Chiarello, L., and the Healthcare Infection Control Practices Advisory Committee (2007). Guideline for Isolation Precautions: Preventing Transmission of Infectious Agents in Healthcare Settings. Disponibbli fuq:

[http://www.cdc.gov/ncidod/dhqp/pdf/isolation2007.pdf].

(16)

Maurer, J.K., Parker, R.D. and Jester J.V. (2002). Extent of corneal injury as the mechanistic basis for ocular irritation: key findings and recommendations for the development of alternative assays. Reg. Tox. Pharmacol. 36:106-117.

(17)

Burton, A.B.G., M. York and R.S. Lawrence (1981). The in vitro assessment of severe irritants. Fd. Cosmet.- Toxicol.- 19, 471-480.

(18)

ICCVAM (2006). Background review document, Current Status of In Vitro Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Bovine Corneal Opacity and Permeability (BCOP) Test Method. Disponibbli fuq:

[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_bcop.htm]

(19)

ICCVAM (2006). Background review document, Current Status of In Vitro Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe IrritantsIsolated Chicken Eye (ICE) Test Method. Disponibbli fuq:

[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_bcop.htm]