1.

A szarvasmarha-szaruhártya opacitásának és permeabilitásának mérésén alapuló vizsgálati módszer (a továbbiakban: BCOP vizsgálat) olyan in vitro vizsgálati módszer, amely bizonyos körülmények között és bizonyos korlátok mellett felhasználható anyagok és vegyületek »szemkorróziót és súlyos szemirritációt okozóként« történő besorolására (1) (2) (3). E vizsgálati módszer alkalmazásában súlyos szemirritációt okozó anyagok azok az anyagok, amelyek a nyulak esetében a felvitelt követően legalább 21 napon át tartó szemléziókat okoznak. Noha a vizsgálat nem váltja ki teljes mértékben a nyulakon végzett in vivo szemvizsgálatot, a BCOP vizsgálat alkalmazása a szabályozói követelmények szerinti besorolás és címkézés egy adott alkalmazási területen történő meghatározására szolgáló, többszintű vizsgálati stratégia részeként ajánlott (4) (5). A vizsgált anyagok és keverékek (6) nyulakon végzett további vizsgálatok nélkül »szemkorróziót vagy súlyos szemirritációt okozó« besorolást kaphatnak. Azokat az anyagokat, amelyek vizsgálata negatív eredményt adott, az OECD 405. vizsgálati iránymutatásában (e melléklet B.5. fejezete) (7) leírtak szerint lépcsőzetes vizsgálati stratégia alkalmazásával nyulakon végzett további vizsgálatoknak kell alávetni.

2.

E vizsgálati módszer célja a vizsgált anyag szemkorróziót vagy súlyos szemirritációt okozó esetleges hatásának kimutatása annak alapján, hogy izolált szarvasmarha-szaruhártyában milyen mértékben vált ki opacitást és fokozott permeabilitást. A szaruhártyára gyakorolt toxikus hatások jellemzése (i) a csökkent fényátbocsátás (opacitás) és (ii) a fluoreszcein-nátrium festékanyag fokozott áthatolása (permeabilitás) mérésével történik. A szaruhártya vizsgált anyagnak való expozícióját követően megállapítható opacitásból és permeabilitásból együttesen származtatjuk az ún. in vitro irritációs pontszámot (In Vitro Irritancy Score, a továbbiakban: IVIS), amely a vizsgált anyag irritáció szempontjából való osztályba sorolására szolgál.

3.

A BCOP vizsgálattal 21 napnál rövidebb idő alatt gyógyuló szemléziókat kiváltó szemirritációt okozó, illetve irritációt nem okozó anyagokat is vizsgáltak. Az ezekbe a kategóriákba tartozó anyagok tekintetében azonban nem történt meg a BCOP vizsgálat pontosságának és megbízhatóságának formális értékelése.

4.

A fogalommeghatározások az 1. függelékben találhatók.

5.

E vizsgálati módszer alapja az alternatív módszerek validálásával foglalkozó ügynökségközi koordinációs bizottság (ICCVAM) BCOP vizsgálati protokollja (8), amelynek kidolgozása az alternatív módszerek validálásával foglalkozó európai, illetve japán központ (ECVAM, JaCVAM) részvételével végrehajtott nemzetközi validációs vizsgálat (4) (5) (9) alapján történt. A protokoll alapját az In Vitro Tudományok Intézetétől (IIVS) kapott adatok, illetve az INVITTOX 124. protokoll (10) képezi; ez a protokoll szolgált a BCOP vizsgálat Európai Közösség által finanszírozott, 1997–1998-ban elvégzett elővalidációjának protokolljaként. Mindkét protokoll alapja az a BCOP vizsgálati módszer, amelyről elsőként Gautheron et al. (11) számolt be.

6.

A vizsgálati módszer azonosított korlátai a validációs adatbázisban az alkoholok és a ketonok esetében tapasztalt nagy hamis pozitív arányokon és a szilárd anyagok esetében tapasztalt nagy hamis negatív arányon alapulnak (lásd a 44. pontot) (5). Ha az említett kémiai és fizikai osztályokba tartozó anyagokat kizárjuk az adatbázisból, akkor a BCOP vizsgálat pontossága az EU, az EPA és a GHS besorolási rendszerében egyaránt jelentősen javul (5). A vizsgálat célját (azaz kizárólag a szemkorróziót, illetve súlyos szemirritációt okozó anyagok azonosítása) is figyelembe véve a hamis negatív arányok jelentősége nem kritikus, hiszen az érintett anyagokat a szabályozói követelményektől függően – az adatok bizonyító erejének mérlegelésével, lépcsőzetes vizsgálati stratégia alkalmazásával – később nyulakon vagy más, megfelelően validált in vitro vizsgálatokkal is megvizsgálják. Emellett a jelenleg rendelkezésre álló validációs adatbázis nem teszi lehetővé egyes kémiai osztályok vagy termékcsoportok (például a keverékek) megfelelő értékelését. A vizsgálat végrehajtója azonban a vizsgálati módszer alkalmazását valamennyi típusú vizsgálandó anyag esetében (beleértve a keverékeket is) fontolóra veheti, a pozitív eredmény ugyanis ilyenkor is elfogadható lehet a szemkorrózió, illetve a súlyosan irritatív hatás jelzésére. Az alkoholok és a ketonok esetében azonban a kapott pozitív eredményeket a túlzó előrejelzés kockázata miatt óvatosan kell értelmezni.

7.

A szarvasmarhaszemmel és a szarvasmarha-szaruhártyával végzett valamennyi eljárás során be kell tartani a vizsgáló intézménynek az állati eredetű anyagok – ideértve többek között a szöveteket és a szöveti folyadékokat – kezelésére vonatkozó rendelkezéseit és eljárásait. Ajánlott továbbá követni az általános laboratóriumi óvintézkedéseket is (12).

8.

A vizsgálati módszernek korlátja, hogy noha figyelembe vesz egyes szemre gyakorolt, a nyulakon végzett szemirritációs vizsgálatban elemzett hatásokat, illetve bizonyos fokig azok súlyosságát is, nem veszi figyelembe a kötőhártya- és az íriszsérüléseket. Másrészről, noha maga a BCOP vizsgálat nem alkalmas a szaruhártya-léziók visszafordíthatóságának értékelésére, a nyulakon végzett szemvizsgálatok alapján korábban javasolták, hogy a szaruhártya-sérülés kezdeti mélységének értékelése alkalmas lehet a visszafordíthatatlan és a visszafordítható hatások megkülönböztetésére (13). Végezetül a BCOP vizsgálat nem alkalmas a szembe kerülés következtében fellépő szisztémás toxicitási potenciál megítélésére.

9.

Továbbra is folyik a munka a BCOP vizsgálat nem súlyos irritációt okozó, illetve irritációt nem okozó anyagok azonosítására való használhatósága, valamint korlátai részletesebb leírása érdekében (lásd még a 45. pontot is). A felhasználókat bátorítjuk arra, hogy mintáikat és/vagy adataikat küldjék meg a validáló szervezeteknek, ezzel ugyanis segíthetik a BCOP vizsgálat jövőbeli felhasználásainak (ideértve a nem súlyos irritációt okozó, illetve az irritációt nem okozó anyagok azonosítását is) formális értékelését.

10.

Minden olyan laboratóriumnak, amely a vizsgálatot először alkalmazza, a 2. függelékben felsorolt jártassági tesztanyagok felhasználásával ajánlatos meggyőződnie felkészültségéről. Mielőtt a laboratórium a BCOP vizsgálat adatait a szabályozói követelmények szerinti veszélyességi besorolás céljaira rendelkezésre bocsátaná, e vegyi anyagok vizsgálatával demonstrálhatja a BCOP vizsgálat elvégzésében való jártasságát.

11.

A BCOP vizsgálat olyan organotipikus módszer, amely rövid távon in vitro fenntartja a szarvasmarhák izolált szaruhártyájának normál fiziológiai és biokémiai működését. A módszerrel a vizsgált anyag által okozott károsodás jellemzése a szaruhártya opacitásváltozásának opaciméterrel, illetőleg permeabilitásváltozásának látható fényes fényspektroszkópiával való kvantitatív mérése útján történik. A két mérés alapján számítjuk az IVIS értékét, amely a vizsgált anyag in vivo szemirritációs hatásának előrejelzését megalapozó in vitro veszélyességi besorolási kategória megállapítására szolgál (lásd a döntési kritériumokat).

12.

A BCOP vizsgálat frissen levágott szarvasmarhából izolált szaruhártyákat használ fel. A szaruhártya opacitásának mérése kvantitatív módon, a szaruhártyán átbocsátott fény mennyiségének mérésével történik. A permeabilitás mérése ugyancsak kvantitatív módon, a szaruhártya teljes vastagságán áthatoló és a hátsó kamrában található közegben kimutatható fluoreszcein-nátrium festékanyag mennyiségének mérésével történik. A vizsgált anyagoknak a szaruhártya felhámjának felületére történő felvitele a szaruhártyatartó elülső kamrájába történő bevitellel történik. A 3. függelék tartalmazza a BCOP vizsgálatban felhasznált szaruhártyatartó leírását és ábráját. A szaruhártyatartó a kereskedelmi forgalomban különféle forrásokból beszerezhető, vagy saját használatra megépíthető.

13.

A vágóhídon a szarvasmarhákat rendszerint emberi fogyasztás céljából vagy más kereskedelmi célokból ölik le. A BCOP vizsgálat céljára felhasználandó szaruhártyák csak az emberi élelmiszerláncba való bekerülésre alkalmas, egészséges állatokból vehetők. Mivel a szarvasmarhák tömege fajtától, életkortól és nemtől függőn jelentős mértékben eltérhet, a vágásra kerülő állatok tekintetében nincs ajánlott tömeg.

14.

Különböző életkorú állatokból származó szemek esetén a szaruhártya mérete változó lehet. A 30,5 mm vízszintes átmérőt meghaladó és legalább 1 100 μm középponti vastagságú szaruhártyák általában nyolcévesnél idősebb, a 28,5 mm átmérő és 900 μm középponti vastagság alatti szaruhártyák általában ötévesnél fiatalabb szarvasmarhából származnak (14). Emiatt nem szokás 60 hónaposnál idősebb szarvasmarhákból származó szaruhártyákat felhasználni. Hagyományosan nem szokás 12 hónaposnál fiatalabb szarvasmarhákból származó szemeket sem felhasználni, mivel ebben az életkorban a szemek még fejlődésben vannak, és a szaruhártya vastagsága és átmérője lényegesen kisebb a kifejlett szarvasmarhából származó szaruhártyákon mért értékeknél. Előnyeikre való tekintettel ugyanakkor megengedhető a fiatal (6 és 12 hónap közötti életkorú) állatokból származó szaruhártyák használata is, mivel ezek nagyobb mennyiségben állnak rendelkezésre, szűkebb az életkori tartományuk, és ez esetben kisebb a munkavállalóknak a szarvasmarhák szivacsos agyvelőbántalmával szembeni kitettsége is (15). Mivel a szaruhártya méretének és vastagságának a korróziót és az irritációt okozó anyagokkal szembeni reagálási képességre gyakorolt hatásával kapcsolatban hasznos volna további értékelést végezni, a felhasználókat bátorítjuk arra, hogy számoljanak be a vizsgálataikban felhasznált szaruhártyákat adó állatok becsült életkoráról és/vagy tömegéről.

15.

A szemeket a vágóhíd alkalmazottai gyűjtik be. A mechanikai és egyéb károsodásnak a lehető legkisebb mértékűre való csökkentése érdekében a szemeket a halál bekövetkezése után mihamarabb ki kell venni. A szemek potenciálisan irritatív anyagokkal szembeni expozíciójának megelőzése érdekében a vágóhíd alkalmazottai az állat fejének leöblítésekor mosószert nem használhatnak.

16.

A szemeket megfelelő méretű edénybe öntött Hank-féle sóoldatba (HBBS-oldat) kell helyezni oly módon, hogy az oldat a szemeket teljesen befedje, és a laboratóriumba oly módon kell beszállítani, hogy a lehető legkisebb legyen a károsodás és/vagy a bakteriális fertőzés esélye. Mivel a begyűjtés a vágás során történik, a szemek vérrel és más biológiai anyagokkal – ideértve a baktériumokat és más mikroorganizmusokat is – érintkezhetnek. Ezért fontos annak biztosítása, hogy a kontamináció veszélye a lehető legkisebb legyen (például a szemeket tartalmazó edény jégen tárolásával, a szemek szállítás közbeni tárolására használt HBSS-oldathoz antibiotikumok [például penicillin 100 IU/ml és streptomicin 100 mg/ml koncentrációban] hozzáadásával).

17.

A szemek begyűjtése és a szaruhártyának a BCOP vizsgálatban való felhasználása között eltelt időnek a lehető legrövidebbnek kell lennie (a begyűjtésnek és a felhasználásnak rendszerint ugyanazon a napon meg kell történnie), és igazolni kell, hogy ez az idő nem befolyásolja a vizsgálat eredményeit, azaz a szemek kiválasztási kritériumait, valamint a pozitív és a negatív kontrollminták eredményeit. A vizsgálatban felhasznált valamennyi szemnek egy meghatározott napon begyűjtött szemállományból kell származnia.

18.

A szemek épségét a laboratóriumba való beérkezést követően gondosan meg kell vizsgálni; ennek keretében ellenőrizni kell különösen a fokozott opacitást, valamint a karcolások és a rendellenes érburjánzás (neovaszkularizáció) jelenlétét. A vizsgálat céljára csak ép szemekből származó szaruhártyák használhatók fel.

19.

Az egyes szaruhártyák minőségét a vizsgálat során később is kell értékelni. A vizsgálatból ki kell zárni azokat a szaruhártyákat, amelyek opacitása a kezdeti egyórás ekvilibrációs időszak elteltével hét opacitásegységnél nagyobb (MEGJEGYZÉS: az opacimétert az opacitási egységek meghatározásához használt opacitásetalonnal kell kalibrálni, lásd a 3. függeléket).

20.

Minden kezelt csoportnak (a vizsgált anyaggal és a negatív és a pozitív kontrollanyaggal kezelt csoportnak egyaránt) legalább három szemből kell állnia. A BCOP vizsgálatban a negatív kontroll céljára három szaruhártyát kell felhasználni. Mivel a szaruhártyák a teljes szemgolyóból kivágással kerülnek eltávolításra, majd pedig rögzítésre kerülnek a szaruhártyakamrában, fennáll annak a veszélye, hogy a különböző műveletek befolyásolják az egyes szaruhártyák (a negatív kontrollt is ideértve) opacitás- és permeabilitásértékét. Figyelembe veendő még az is, hogy az IVIS számítása során a vizsgált anyaggal és a pozitív kontrollanyaggal kezelt szaruhártyák opacitás- és permeabilitásértékeinek korrekciója a negatív kontrollanyaggal kezelt szaruhártyák opacitás- és permeabilitásértékeinek felhasználásával történik.

21.

Az ép szaruhártyákat a későbbi kezelés elősegítése érdekében preparáljuk úgy, hogy a szaruhártya körül 2–3 mm-es perem maradjon, ügyelve arra, hogy a szaruhártya fel- és belhámja ne sérüljön. A preparált szaruhártyákat felerősítjük az erre a célra kialakított, a szaruhártya felhámja elé kerülő elülső, illetve belhámja elé kerülő hátsó kamrából álló szaruhártyatartókra. Mindkét kamrát (a hátsó kamrával kezdve) teljesen feltöltjük előmelegített Eagle-féle tápfolyadékkal (Eagle’s Minimum Essential Medium, a továbbiakban: EMEM oldat), ügyelve a buborékképződés megelőzésére. A berendezést ezt követően 32 ± 1 °C-on legalább egy órán át ekvilibráljuk annak érdekében, hogy a szaruhártyák a közeggel kiegyenlítődjenek, és lehetőség szerint elérjék normális metabolikus aktivitásukat (a szaruhártya felületének hőmérséklete in vivo 32 °C).

22.

Az ekvilibrációs idő eltelte után mindét kamrát új EMEM oldattal feltöltjük, és minden egyes szaruhártyán leolvassuk a kiindulási opacitásértéket. A vizsgálatból ki kell zárni a makroszkopikus szöveti károsodást (például karcolásokat, elszíneződést, rendellenes érburjánzást) mutató és a 7-nél nagyobb opacitású szaruhártyákat. Kiszámítjuk valamennyi ekvilibrált szaruhártya opacitásának számtani közepét. A negatív kontroll céljára legalább három olyan szaruhártyát kell kiválasztani, amelynek opacitása az összes szaruhártyán mért opacitásértékek mediánjának közelében van. A megmaradó szaruhártyákat ezt követően kezelt csoportra és pozitív kontrollcsoportra osztjuk.

23.

Mivel a víz fajhője nagyobb, mint a levegőé, a víz stabilabb hőmérsékleti viszonyokat biztosít az inkubáláshoz. Ezért a szaruhártyatartó és tartalmának 32 ± 1 °C hőmérsékleten való tartására vízfürdő használata ajánlott. A hőmérséklet állandóságának biztosítását szolgáló óvintézkedések (például a tartók és a közeg előmelegítése) mellett azonban használható levegős inkubátor is.

24.

Két eltérő kezelési protokoll használatos, az egyik a folyadékok és a szilárd és a folyékony felületaktív anyagok, a másik pedig a nem felületaktív szilárd anyagok esetében.

25.

A folyadékok vizsgálata hígítatlan állapotban, a felületaktív anyagoké 10 vegyes százalék (m/V) koncentrációban, 0,9 %-os nátrium-klorid oldattal, desztillált vízzel vagy más olyan oldószerrel készített oldatban történik, amely igazoltan nem gyakorol káros hatást a vizsgálatra. A félszilárd anyagok, krémek és gyanták vizsgálata rendszerint a folyadékokra vonatkozó protokoll szerint történik. Ha a hígítás koncentrációja ettől eltérő, akkor azt megfelelően meg kell indokolni. A szaruhártyákat a folyadéknak vagy felületaktív anyagnak 10 percig kell kitenni. Ettől eltérő behatási idő alkalmazását tudományos szempontból megfelelően meg kell indokolni.

26.

A nem felületaktív szilárd anyagok vizsgálata 20 % koncentrációban, 0,9 %-os nátrium-klorid-oldattal, desztillált vízzel vagy más olyan oldószerrel készült oldat vagy szuszpenzió formájában történik, amely igazoltan nem gyakorol káros hatást a vizsgálatra. A szilárd anyagok bizonyos körülmények között és megfelelő tudományos indokolással hígítatlanul, a szaruhártya felületére a nyitott kamrás módszerrel (lásd a 29. pontot) való közvetlen felvitellel is vizsgálhatók. A szaruhártyát a szilárd anyagnak négy órán át kell kitenni, de a folyadékok és a felületaktív anyagok esetéhez hasonlóan – tudományos szempontú megfelelő indokolással – más behatási idő is alkalmazható.

27.

A vizsgált anyag fizikai jellegétől és kémiai jellemzőitől (pl. szilárd anyag vagy folyadék, viszkózus vagy nem viszkózus folyadék) függően más felviteli módok is alkalmazhatók. A legfontosabb annak biztosítása, hogy a vizsgált anyag megfelelően beborítsa a felhám felületét, valamint hogy azt az öblítési lépések során megfelelően eltávolítsuk. A nem és a kissé viszkózus folyadékok esetében rendszerint a zárt kamrás, míg a közepes és a nagy viszkozitású folyadékok, illetve a szilárd anyagok esetében rendszerint a nyitott kamrás módszer használatos.

28.

A zárt kamrás módszer esetében az elülső kamrába a szaruhártya felhámjának befedéséhez elegendő mennyiségű (750 μl) vizsgált anyagot kell a kamra tetején található adagolónyílásokon keresztül bevinni, majd az expozíció idejére a nyílásokat a kamradugaszokkal le kell zárni. Fontos annak biztosítása, hogy valamennyi szaruhártya megfelelő ideig legyen kitéve a vizsgált anyagnak.

29.

A nyitott kamrás módszer esetében a kezelés előtt levesszük az elülső kamra ablakzáró gyűrűjét és az ablaknyílás üvegét. A kontrollanyagot vagy a vizsgált anyagot (750 μl vagy a szaruhártya teljes befedéséhez szükséges mennyiségben) mikropipettával közvetlenül a szaruhártya felhámjának felületére visszük fel. Ha a vizsgált anyagot nehezen lehet pipettába felszívni, akkor az adagolás megkönnyítésére finnpipettába pumpálható. A finnpipetta hegyét behelyezzük a fecskendő adagolójába, hogy az anyagot nyomás alatt lehessen befecskendezni a hegybe. A fecskendő dugattyúját a pipetta szelepének felfelé húzásával egyidejűleg benyomjuk. Ha a pipetta hegyében légbuborékok jelennek meg, a vizsgálati anyagot el kell távolítani (ki kell nyomni) és a műveletet mindaddig ismételni kell, amíg a pipetta hegye légbuborékok nélkül feltelik. Szükség esetén normál fecskendő is használható (tű nélkül), mivel ez lehetővé teszi a vizsgált anyag pontos mérését és a szaruhártya felhámjának felületére való egyszerű felvitelét. Az adagolást követően a zárt rendszer visszaállítása érdekében az ablaknyílás üvegét vissza kell szerelni az elülső kamrára.

30.

A behatási idő elteltével a vizsgált anyagot vagy negatív vagy pozitív kontrollanyagot kivesszük az elülső kamrából, és a felhámot legalább háromszor (de legalább a vizsgált anyag látható nyomainak teljes eltávolításáig) fenolvörös indikátort tartalmazó EMEM oldattal lemossuk. Az öblítéshez azért kell fenolvörös indikátort tartalmazó közeget használni, mert a fenolvörös indikátor színváltozásának megfigyelésével ellenőrizhető a savas és a lúgos anyagok leöblítésének eredményessége. A szaruhártyát háromnál többször is le kell mosni, ha a fenolvörös indikátor még mindig elszíneződik (sárgára vagy lilára) vagy ha a vizsgált anyag még mindig látható. A közeg vizsgált anyagtól való megtisztítását követően a szaruhártyákat még egyszer le kell mosni EMEM oldattal (mely ekkor fenolvörös indikátort már nem tartalmaz). Az utolsó öblítéshez azért kell fenolvörös indikátort nem tartalmazó EMEM oldatot használni, mert így biztosítható az opacitásmérés előtt a fenolvörös indikátornak az elülső kamrából való eltávolítása. Ezt követően az elülső kamrát – fenolvörös indikátor bekeverése nélkül – ismételten feltöltjük új EMEM oldattal.

31.

Folyadékok és felületaktív anyagok esetében a szaruhártyákat az öblítést követően legalább további két órán át 32 ± 1 °C hőmérsékleten inkubálni kell. Bizonyos körülmények között hasznos lehet hosszabb utóinkubációs időt alkalmazni, amiről eseti alapon kell dönteni. A szilárd anyagokkal kezelt szaruhártyákat a négyórás behatási idő végén alaposan le kell öblíteni, utóinkubáció azonban nem szükséges.

32.

Folyadékok és felületaktív anyagok esetében az utóinkubáció végén, nem felületaktív szilárd anyagok esetében a négyórás behatási idő elteltével minden egyes szaruhártya opacitását és permeabilitását feljegyezzük. Egyben minden szaruhártyát szemrevételezéssel is megvizsgálunk, és az esetleges észrevételeket (pl. szövetleválás, vizsgált anyag maradéka, egyenetlen fényáteresztési minták) feljegyezzük. Ezek a megfigyelések fontosak lehetnek, mert befolyásolhatják az opaciméteren leolvasott értékeket.

33.

Minden vizsgálatban párhuzamosan negatív vagy oldószeres/vivőanyagos kontrollt és pozitív kontrollt is kell végezni.

34.

Hígítatlan folyadékok vizsgálatakor a vizsgálati elrendezés esetleges nem jellemző változásainak észlelése és a vizsgálat végpontjaiban figyelembe veendő kiindulási értékek meghatározása céljából a BCOP vizsgálatban párhuzamos negatív kontrollanyagot (például 0,9 %-os nátrium-klorid oldatot vagy desztillált vizet) kell alkalmazni. A negatív kontrollanyag alkalmazása egyben azt is biztosítja, hogy a vizsgálat körülményei ne eredményezzenek tévesen irritatív hatást.

35.

Hígított folyadékok, felületaktív anyagok és szilárd anyagok vizsgálatakor a vizsgálati elrendezés esetleges nem jellemző változásainak észlelése és a vizsgálat végpontjaiban figyelembe veendő kiindulási értékek meghatározása céljából a BCOP vizsgálatban párhuzamos oldószeres/vivőanyagos kontrollt kell alkalmazni. Csak olyan oldószer, illetőleg vivőanyag alkalmazható, amely igazoltan nem gyakorol káros hatást a vizsgálatra.

36.

Annak ellenőrzése érdekében, hogy a kiváltott hatás valóban megfelelő-e, a vizsgálatnak mindig tartalmaznia kell egy ismerten szemirritációt okozó anyaggal végzett párhuzamos pozitív kontrollvizsgálatot is. Mivel a BCOP vizsgálat célja a szemkorróziót és a súlyos szemirritációt okozó anyagok azonosítása, a pozitív kontrollanyagnak ideális esetben olyan referenciaanyagnak kell lennie, amely ebben a vizsgálatban súlyos hatást vált ki. Annak érdekében azonban, hogy a pozitív kontrollvizsgálatban jelentkező hatás időbeli változása is megfigyelhető legyen, az irritatív hatás nem lehet túlságosan erőteljes.

37.

Folyékony vizsgált anyagok esetében pozitív kontrollanyagként például dimetil-formamid vagy 1 %-os nátrium-hidroxid alkalmazható. Szilárd vizsgált anyagok esetében pozitív kontrollanyagként például 0,9 %-os nátrium-klorid-oldathoz 20 vegyes százalék (m/V) koncentrációban adagolt imidazol alkalmazható.

38.

A referenciaanyagok jól használhatók egy adott vegyianyag- vagy termékosztályba tartozó ismeretlen vegyi anyagok szemirritációs hatásának értékelésére vagy valamely szemirritációs anyag relatív irritatív hatásának az irritatív hatás egy adott tartományán belüli értékelésére.

39.

Az opacitást a szaruhártyán átbocsátott fény mennyiségének mérésével határozzuk meg. A szaruhártya opacitásának kvantitatív mérése opaciméterrel történik, amely a mért opacitásértéket folyamatos skálán mutatja.

40.

A permeabilitás meghatározása a szaruhártya összes sejtrétegén (azaz a szaruhártya külső felületén a felhámtól a szaruhártya belső felületén a belhámig) áthatoló fluoreszcein-nátrium festékanyag mennyiségének mérésével történik. A szaruhártyatartónak a felhám elé kerülő elülső kamráját 1 ml (folyadék vagy felületaktív anyag vizsgálata esetében 4 mg/ml, nem felületaktív szilárd anyag vizsgálata esetében 5 mg/ml) fluoreszcein-nátrium-oldattal, a belhám elé kerülő hátsó kamrát pedig új EMEM oldattal feltöltjük. A tartót ezt követően vízszintes helyzetben 90 ± 5 percig 32 ± 1 °C hőmérsékleten inkubáljuk. A hátsó kamrába áthatoló fluoreszcein-nátrium mennyiségének mérése ultraibolya- és látható fényes fényspektroszkópiás eljárással történik. Az eljárás keretében folyamatos skálán meg kell határozni és fel kell jegyezni a 490 nm-hez tartozó optikai sűrűségek (OD490) vagy abszorbanciák értékét. A fluoreszceines mérés keretében a permeabilitásértékeket a szabványos 1 cm-es fényút alkalmazásával, a látható fényes fényspektroszkópiával mért OD490 értékek alapján kell meghatározni.

41.

Az előzőekben leírt módszer alternatívájaképpen 96 lyukú mikrotiterlemez-olvasó is alkalmazható azzal a feltétellel, hogy (i) a fluoreszceines OD490 értékek meghatározásához megállapítható a lemezolvasó lineáris tartománya, és (ii) a 96 lyukú lemezbe annyi fluoreszceinmintát teszünk, amennyi ahhoz szükséges, hogy az így meghatározott OD490 értékek megegyezzenek a szabványos 1 cm-es fényúttal mért értékekkel (ehhez gyakran teljesen [általában 360 ml-rel] feltöltött lyukak szükségesek).

42.

Azt követően, hogy az opacitás- és az átlagos permeabilitásértékeket (OD490) a háttéropacitás, illetve a negatív kontroll OD490 permeabilitásértékeinek figyelembevételével korrigáltuk, az egyes kezelt csoportok átlagos opacitás- és átlagos OD490 permabilitásértékeit egy kísérleti úton származtatott összefüggés segítségével kezelt csoportonként egyetlen jelzőszámmá, az in vitro irritációs pontszámmá (IVIS) alakítjuk:

IVIS = átlagopacitás + (15 × OD490 átlagpermeabilitás).

Sina et al. (16) szerint ezt az összefüggést belső és laboratóriumközi vizsgálatok keretében dolgozták ki. Egy több laboratóriumban 36 anyagon elvégzett vizsgálatsorozat adatain többváltozós analízist hajtottak végre azon összefüggés meghatározása végett, amely az in vivo és az in vitro adatok között a legjobb illeszkedést biztosítja. Ezt az analízist két különböző cég kutatói is elvégezték, és csaknem azonos összefüggésre jutottak.

43.

Az opacitás- és a permeabilitásértékeket egymástól függetlenül is ki kell értékelni annak meghatározására, hogy a vizsgált anyag a korróziót vagy a súlyos irritációt nem csak a két végpont egyikében váltotta-e ki (lásd a döntési kritériumokat).

44.

Korróziót vagy súlyos irritációt okozónak kell tekinteni azt az anyagot, amelyre IVIS ≥ 55,1 adódik. Mint az 1. pontban láttuk, ha a vizsgált anyagot a vizsgálat nem mutatja szemkorróziót vagy súlyos szemirritációt okozónak, akkor a besorolás és a címkézés céljára további vizsgálatokat kell végezni. A nyulakon végzett in vivo szemvizsgálatból származó, az EPA (1), az EU (2) vagy a GHS (3) besorolási rendszer szerint osztályozott adatokkal összehasonlítva a BCOP vizsgálat általános pontossága 79 % (113/143) és 81 % (119/147) között, hamis pozitív aránya 19 % (20/103) és 21 % (22/103) között, hamis negatív aránya pedig 16 % (7/43) és 25 % (10/40) között van. Ha az adatbázisból egyes meghatározott kémiai (alkoholok, ketonok) vagy fizikai (szilárd anyagok) osztályokat kizárunk, akkor az EU, az EPA és a GHS besorolási rendszerben a BCOP vizsgálat pontossága 87 % (72/83) és 92 % (78/85), hamis pozitív aránya 12 % (7/58) és 16 % (9/56), hamis negatív aránya pedig 0 % (0/27) és 12 % (3/26) közé kerül.

45.

Ha a vizsgált anyagot a vizsgálat nem mutatja is szemkorróziót vagy súlyos szemirritációt okozónak, a BCOP vizsgálat adatai – a nyulakon végzett in vivo szemvizsgálatból vagy megfelelően validált más in vitro vizsgálatból származó adatokkal együtt – jól használhatók annak további meghatározásában, hogy a BCOP vizsgálat mennyire és milyen korlátokkal alkalmas a nem súlyos irritációt okozó, illetve az irritációt nem okozó anyagok azonosítására (jelenleg folyik egy útmutató elkészítése az in vitro szemtoxicitás-vizsgálati módszerekre vonatkozóan).

46.

A vizsgálat akkor elfogadható, ha a pozitív kontrollanyaghoz tartozó IVIS érték az aktuális (legalább háromhavonta, illetőleg az ilyen vizsgálatot havi egy alkalomnál ritkábban végző laboratóriumok esetében minden elfogadható vizsgálat után aktualizált) történeti átlagtól legfeljebb a szórás kétszeresének megfelelő mértékben tér el. A negatív kontrollanyagon és az oldószeren/vivőanyagon megfigyelt hatásokhoz tartozó opacitás- és permeabilitásértékeknek kisebbnek kell lenniük az adott negatív kontrollanyaggal vagy oldószerrel/vivőanyaggal kezelt szarvasmarha-szaruhártyára megállapított felső háttéropacitás- és háttérpermeabilitás-korlátnál.

47.

A vizsgálati jegyzőkönyvnek a következő információkat kell tartalmaznia, amennyiben azok a vizsgálat lefolytatása szempontjából relevánsak:

Vizsgált anyag és kontrollanyagok

A megbízó és a vizsgálatot végző laboratórium adatai

Az alkalmazott vizsgálati módszer és protokoll indokolása

A vizsgálati módszer integritása

A vizsgálati módszer időbeli integritásának (például pontosságának, megbízhatóságának) biztosítására alkalmazott módszer (például jártassági tesztanyagokon végzett időszakos vizsgálatok, negatív és pozitív történeti kontrolladatok felhasználása)

A vizsgálat elfogadhatóságának kritériumai

Vizsgálati körülmények

Eredmények

Az eredmények szöveges elemzése

Következtetések

(1)

U.S. EPA (1996). Label Review Manual: 2nd Edition. EPA737-B-96-001. Washington, DC: US Environmental Protection Agency.

(2)

Az Európai Parlament és a Tanács 1272/2008/EK rendelete (2008. december 16.) az anyagok és keverékek osztályozásáról, címkézéséről és csomagolásáról, a 67/548/EGK és az 1999/45/EK irányelv módosításáról és hatályon kívül helyezéséről, valamint az 1907/2006/EK rendelet módosításáról, HL L 353., 2008.12.31., 1. o.

(3)

UN (2007). Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS). Second revised edition, New York & Geneva: United Nations Publications, 2007. Elektronikus formátumban:

[http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev02/02files_e.html]

(4)

ESAC (2007). Statement on the conclusion of the ICCVAM retrospective study on organotypic in vitro assays as screening tests to identify potential ocular corrosives and severe eye irritants. Elektronikus formátumban:

[http://ecvam.jrc.it/index.htm]

(5)

ICCVAM (2007). Test Method Evaluation Report - In Vitro Ocular Toxicity Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and Corrosives. Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program (NTP) Interagency Centre for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No.: 07-4517. Elektronikus formátumban:

[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm]

(6)

Az Európai Parlament és a Tanács 1907/2006/EK rendelete (2006. december 18.) a vegyi anyagok regisztrálásáról, értékeléséről, engedélyezéséről és korlátozásáról (REACH), az Európai Vegyianyag-ügynökség létrehozásáról, az 1999/45/EK irányelv módosításáról, valamint a 793/93/EGK tanácsi rendelet, az 1488/94/EK bizottsági rendelet, a 76/769/EGK tanácsi irányelv, a 91/155/EGK, a 93/67/EGK, a 93/105/EK és a 2000/21/EK bizottsági irányelv hatályon kívül helyezéséről, HL L 396., 2006.12.30., 1. o.

(7)

OECD (2002). Test Guideline 405. OECD Guideline for the Testing of Chemicals. Acute eye irritation/corrosion. Elektronikus formátumban:

[http://www.oecd.org/document/40/0,2340,en_2649_34377_37051368_1_1_1_1,00.html]

(8)

ICCVAM (2007). ICCVAM Recommended BCOP Test Method Protocol. In: ICCVAM Test Method Evaluation Report - In Vitro Ocular Toxicity Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and Corrosives. Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program (NTP) Interagency Centre for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No.: 07-4517. Elektronikus formátumban:

[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm]

(9)

ICCVAM. (2006). Current Status of In Vitro Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Bovine Corneal Opacity and Permeability Test Method. NIH Publication No.: 06-4512. Research Triangle Park: National Toxicology Program. Elektronikus formátumban:

[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_ice.htm]

(10)

INVITTOX (1999). Protocol 124: Bovine Corneal Opacity and Permeability Assay – SOP of Microbiological Associates Ltd. Ispra, Italy: European Centre for the Validation of Alternative Methods (ECVAM).

(11)

Gautheron, P., Dukic, M., Alix, D. and Sina, J.F. (1992). Bovine corneal opacity and permeability test: An in vitro assay of ocular irritancy. Fundam. Appl. Toxicol. 18:442-449.

(12)

Siegel, J.D., Rhinehart, E., Jackson, M., Chiarello, L., and the Healthcare Infection Control Practices Advisory Committee (2007). Guideline for Isolation Precautions: Preventing Transmission of Infectious Agents in Healthcare Settings. Elektronikus formátumban:

[http://www.cdc.gov/ncidod/dhqp/pdf].

(13)

Maurer, J.K., Parker, R.D. and Jester, J.V. (2002). Extent of corneal injury as the mechanistic basis for ocular irritation: key findings and recommendations for the development of alternative assays. Reg. Tox. Pharmacol. 36:106-117.

(14)

Doughty, M.J., Petrou, S. and Macmillan, H. (1995). Anatomy and morphology of the cornea of bovine eyes from a slaughterhouse. Can. J. Zool. 73:2159-2165.

(15)

Collee, J. and Bradley, R. (1997). BSE: A decade on - Part I. The Lancet 349: 636-641.

(16)

Sina, J.F., Galer, D.M., Sussman, R.S., Gautheron, P.D., Sargent, E.V., Leong, B., Shah, P.V., Curren, R.D., and Miller, K. (1995). A collaborative evaluation of seven alternatives to the Draize eye irritation test using pharmaceutical intermediates. Fundam Appl Toxicol 26:20-31.

(17)

ICCVAM (2006). Background review document, Current Status of In Vitro Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Bovine Corneal Opacity and Permeability Test Method. Elektronikus formátumban:

[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_ice.htm]

(18)

ICCVAM (2006). Background review document, Current Status of In Vitro Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Isolated Chicken Eye (ICE) Test Method. Elektronikus formátumban:

[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_ice.htm]

1.

Az izolált csirkeszem vizsgálatán alapuló vizsgálati módszer (a továbbiakban: ICE vizsgálat) olyan in vitro vizsgálati módszer, amely bizonyos körülmények között és bizonyos korlátok mellett felhasználható anyagok és vegyületek »szemkorróziót és súlyos szemirritációt okozóként« történő besorolására (1) (2) (3). E vizsgálati módszer alkalmazásában súlyos szemirritációt okozó anyagok azok az anyagok, amelyek a nyulak esetében a felvitelt követően legalább 21 napon át tartó szemléziókat okoznak. Noha a vizsgálat nem váltja ki teljes mértékben a nyulakon végzett in vivo szemvizsgálatot, az ICE vizsgálat alkalmazása a szabályozói követelmények szerinti besorolás és címkézés egy adott alkalmazási területen történő meghatározására szolgáló, többszintű vizsgálati stratégia részeként ajánlott (4) (5). A vizsgálatban pozitív eredményt adó vizsgált anyagok és keverékek (6) nyulakon végzett további vizsgálatok nélkül »szemkorróziót vagy súlyos szemirritációt okozó« besorolást kaphatnak. Azokat az anyagokat, amelyek vizsgálata negatív eredményt adott, az OECD 405. vizsgálati iránymutatásában (e melléklet B.5. fejezete) (7) leírtak szerint lépcsőzetes vizsgálati stratégia alkalmazásával nyulakon végzett további vizsgálatoknak kell alávetni.

2.

E vizsgálati módszer célja a vizsgált anyag szemkorróziót vagy súlyos szemirritációt okozó esetleges hatásának kimutatása annak alapján, hogy a csirkéből eltávolított csirkeszemben milyen mértékben vált ki toxikus hatást. A szaruhártyára gyakorolt toxikus hatások jellemzése (i) az opacitás kvalitatív értékelésével, (ii) a szembe juttatott fluoreszcein következtében bekövetkező felhámkárosodás (fluoreszcein-visszatartás) kvalitatív értékelésével, (iii) a megvastagodás (felduzzadás) kvantitatív mérésével és (iv) a felület makroszkopikus morfológiai károsodásának kvalitatív értékelésével történik. A szaruhártya vizsgált anyagnak való expozícióját követően megállapítható szaruhártya-opacitást, felduzzadást és károsodást külön-külön jellemezzük, majd ezekből a jellemzőkből együttesen származtatjuk az ún. szemirritációs osztályt.

3.

Az ICE vizsgálattal 21 napnál rövidebb idő alatt gyógyuló szemléziókat kiváltó szemirritációt okozó, illetve irritációt nem okozó anyagokat is vizsgáltak. Az ezekbe a kategóriákba tartozó anyagok tekintetében azonban nem történt meg az ICE vizsgálat pontosságának és megbízhatóságának formális értékelése.

4.

A fogalommeghatározások az 1. függelékben találhatók.

5.

E vizsgálati módszer alapja az alternatív módszerek validálásával foglalkozó ügynökségközi koordinációs bizottság (ICCVAM) ICE vizsgálati protokollja (8), amelynek kidolgozása az alternatív módszerek validálásával foglalkozó európai, illetve japán központ (ECVAM, JaCVAM), valamint a hollandiai TNO Quality of Life Department of Toxicology and Applied Pharmacology kutatószervezet részvételével végrehajtott nemzetközi validációs vizsgálat (4) (5) (9) alapján történt. A protokoll alapját publikált protokollokból származó információk, valamint a protokoll alkalmazása kapcsán a TNO-nál szerzett tapasztalatok képezik (10) (11) (12) (13) (14).

6.

A módszer azonosított korlátai az alkoholok esetében tapasztalt hamis pozitív arányokon és a szilárd és a felületaktív anyagok esetében tapasztalt hamis negatív arányon alapulnak (lásd a 47. pontot) (4). Ha az említett kémiai és fizikai osztályokba tartozó anyagokat kizárjuk az adatbázisból, akkor az ICE vizsgálat pontossága az EU, az EPA és a GHS besorolási rendszerében egyaránt jelentősen javul (4). A vizsgálat célját (azaz kizárólag a szemkorróziót, illetve súlyos szemirritációt okozó anyagok azonosítása) is figyelembe véve a hamis negatív arányok jelentősége nem kritikus, hiszen az érintett anyagokat a szabályozói követelményektől függően – az adatok bizonyító erejének mérlegelésével, lépcsőzetes vizsgálati stratégia alkalmazásával – később nyulakon vagy más, megfelelően validált in vitro vizsgálatokkal is megvizsgálják. Emellett a jelenleg rendelkezésre álló validációs adatbázis nem teszi lehetővé egyes kémiai osztályok vagy termékcsoportok (például a keverékek) megfelelő értékelését. A vizsgálat végrehajtója azonban a vizsgálati módszer alkalmazását valamennyi típusú anyag vizsgálata esetében (beleértve a keverékeket is) fontolóra veheti, a pozitív eredmény ugyanis ilyenkor is elfogadható lehet a szemkorrózió, illetve a súlyosan irritatív hatás jelzésére. Az alkoholok esetében azonban a kapott pozitív eredményeket a túlzó előrejelzés kockázata miatt óvatosan kell értelmezni.

7.

A csirkeszemmel végzett valamennyi eljárás során be kell tartani a vizsgáló intézménynek az emberi és az állati eredetű anyagok – ideértve többek között a szöveteket és a szöveti folyadékokat – kezelésére vonatkozó rendelkezéseit és eljárásait. Ajánlott továbbá követni az általános laboratóriumi óvintézkedéseket is (15).

8.

A vizsgálati módszernek korlátja, hogy noha figyelembe vesz egyes szemre gyakorolt, a nyulakon végzett szemirritációs vizsgálatban elemzett hatásokat, illetve bizonyos fokig azok súlyosságát is, nem veszi figyelembe a kötőhártya- és az íriszsérüléseket. Másrészről, noha maga az ICE vizsgálat nem alkalmas a szaruhártya-léziók visszafordíthatóságának értékelésére, a nyulakon végzett szemvizsgálatok alapján korábban javasolták, hogy a szaruhártya-sérülés kezdeti mélységének értékelése alkalmas lehet a visszafordíthatatlan és a visszafordítható hatások megkülönböztetésére (16). Végezetül az ICE vizsgálat nem alkalmas a szembe kerülés következtében fellépő szisztémás toxicitási potenciál megítélésére.

9.

Továbbra is folyik a munka az ICE vizsgálat nem súlyos irritációt okozó, illetve irritációt nem okozó anyagok azonosítására való használhatósága, valamint korlátai részletesebb leírása érdekében (lásd még a 48. pontot is). A felhasználókat bátorítjuk arra, hogy mintáikat és/vagy adataikat küldjék meg a validáló szervezeteknek, ezzel ugyanis segíthetik az ICE vizsgálat jövőbeli felhasználásainak (ideértve a nem súlyos szemirritációt okozó, illetve a szemirritációt nem okozó anyagok azonosítását is) formális értékelését.

10.

Minden olyan laboratóriumnak, amely a vizsgálatot először alkalmazza, a 2. függelékben felsorolt jártassági tesztanyagok felhasználásával ajánlatos meggyőződnie felkészültségéről. Mielőtt a laboratórium az ICE vizsgálat adatait a szabályozói követelmények szerinti veszélyességi besorolás céljaira rendelkezésre bocsátaná, e vegyi anyagok vizsgálatával demonstrálhatja a BCOP vizsgálat elvégzésében való jártasságát.

11.

Az ICE vizsgálat olyan organotipikus módszer, amely rövid távon in vitro fenntartja a csirkeszem működését. A módszerrel a vizsgált anyag által okozott károsodás jellemzése a szaruhártya felduzzadásának, opacitásának és károsodásának értékelése útján történik. Míg e két utóbbi paraméter kvalitatív értékelést igényel, a szaruhártya felduzzadásának jellemzése kvantitatív módszerrel történik. A mérési eredményeket vagy kvantitatív pontszámmá transzformáljuk, amely az átfogó jellemzést adó irritációs index kiszámításához szükséges, vagy kvalitatív jellemzés formájában fejezzük ki, amely a vizsgált anyag in vitro szemkorróziót és súlyos szemirritációt okozó hatású anyagként történő besorolására szolgál. Ezt követően e két eredmény bármelyike felhasználható a vizsgált anyag in vivo szemkorróziót és súlyos szemirritációt okozó hatásának előrejelzésére (lásd a döntési kritériumokat).

12.

A múltban a vizsgálathoz vágóhídról beszerzett, emberi fogyasztás céljából leölt csirkékből nyert szemeket használtak, ami biztosította, hogy nem kellett laboratóriumi állatokat tartani. Csak az emberi élelmiszerláncba való bekerülésre alkalmas, egészséges állatokból nyert szemek használhatóak fel.

13.

Bár a csirkék optimális életkorának meghatározása céljából nem végeztek átfogó ellenőrzött vizsgálatot, a vizsgálat céljára igénybe vett csirkék életkora és tömege a hagyományosan vágóhídra kerülő vágócsirkék életkorának és tömegének felel meg (kb. 7 hetes, 1,5–2,5 kg tömegű csirkék).

14.

A csirke elkábítását (mely rendszerint elektromos sokkal történik) és a nyak kivéreztetési célú bemetszését követően a fejet azonnal el kell távolítani. Annak érdekében, hogy a csirkefejeket a vágóhídról a károsodás és/vagy bakteriális fertőzés megelőzéséhez szükséges gyorsasággal a laboratóriumba lehessen szállítani, a laboratórium közelében helyi beszerzési forrást célszerű találni. A fejek begyűjtése és a szemeknek az ICE vizsgálatban való felhasználása között eltelt időnek a lehető legrövidebbnek kell lennie (mindennek rendszerint két órán belül meg kell történnie), és igazolni kell, hogy ez az idő nem befolyásolja a vizsgálat eredményeit, azaz a szemek kiválasztási kritériumait, valamint a pozitív és negatív kontrollminták eredményeit. A vizsgálatban felhasznált valamennyi szemnek egy meghatározott napon begyűjtött szemállományból kell származnia.

15.

Mivel a szemeknek a fejből való kimetszése a laboratóriumban történik, az egész fejeket szobahőmérsékleten, izotóniás sóoldattal nedvesített törülközőkkel párásított műanyag dobozokban kell a vágóhídról a laboratóriumba szállítani.

16.

A vizsgálatból ki kell zárni azokat a szemeket, amelyek esetében a kivételt követően nagy (0,5-nél nagyobb) a fluoreszceines foltosodás kiindulási értéke vagy a szaruhártya-opacitási pontszám.

17.

Minden kezelt csoportnak és pozitív kontrollcsoportnak legalább három szemből kell állnia. A negatív, illetve – ha az oldószer nem sóoldat – az oldószeres kontrollcsoportnak legalább egy szemből kell állnia.

18.

A szemhéjat óvatosan bemetsszük, ügyelve arra, hogy elkerüljük a szaruhártya sérülését. Ezután a szaruhártya épségét a szaruhártya felületére néhány másodpercre felvitt, majd izotóniás sóoldattal leöblített, egy cseppnyi 2 vegyes százalékos (m/V) fluoreszcein-nátrium alkalmazásával gyorsan értékeljük. A fluoreszceinnel kezelt szemeket ezután réslámpás mikroszkóppal megvizsgáljuk, és ellenőrizzük, hogy a szaruhártya nem sérült-e meg (a fluoreszcein-visszatartási és a szaruhártya-opacitási pontszám legfeljebb 0,5 lehet).

19.

Ha a szem sérüléstől mentes, akkor eltávolítjuk a koponyából, ügyelve arra, hogy elkerüljük a szaruhártya sérülését. A szemgolyót – a pislogóhártyát sebészeti csipesszel feszesen tartva – kihúzzuk a szemüregből, és a szemizmokat tompa hegyű hajlított ollóval átvágjuk. Fontos, hogy ne fejtsünk ki olyan erős nyomást, amely károsíthatja a szaruhártyát (nyomásos szövetelváltozás következhet be).

20.

Amikor a szemet a szemüregből eltávolítjuk, a szemidegből egy szabad szemmel is jól látható részt rajta hagyunk. A szemet a szemüregből való eltávolítást követően nedvszívó párnára helyezzük, majd levágjuk róla a pislogóhártyát és az egyéb kötőszöveteket.

21.

A kivett szemet korrózióálló acél csíptetőre erősítjük úgy, hogy a szaruhártya függőleges helyzetben legyen. A csíptetőt ezt követően behelyezzük a szuperfúziós készülék egyik kamrájába (16). A csíptetőt a szuperfúziós készülékben úgy kell elhelyezni, hogy az izotóniás sóoldat cseppjei a teljes szaruhártyát érjék. A szuperfúziós készülék kamráinak hőmérsékletét 32 ± 1,5 °C-on kell tartani. A 3. függelék bemutatja a szuperfúziós készülék jellemző kialakítását és a szemcsíptetőket; ezek az eszközök kereskedelmi forgalomban is kaphatók, de saját használatra is megépíthetők. A készülék az egyes laboratóriumok igényeinek (például a vizsgálandó szemek számának) megfelelően módosítható.

22.

A szemeket a szuperfúziós készülékbe való behelyezés után ismét megvizsgáljuk réslámpás mikroszkóppal annak ellenőrzésére, hogy az előkészítés során nem sérültek-e meg. A réslámpás mikroszkóp mélységmérőjével ekkor a szaruhártya legmagasabb pontján megmérjük a szaruhártya vastagságát is. Nem vizsgálhatók tovább azok a szemek, (i) amelyeknek fluoreszcein-visszatartási pontszáma 0,5-nél nagyobb, (ii) amelyeknek szaruhártya-opacitása 0,5-nél nagyobb, valamint (iii) amelyek a károsodás bármely további jelét mutatják. Az e szempontok alapján ki nem zárt szemek közül ki kell zárni mindazokat, amelyek szaruhártya-vastagsága az összes szem középértékétől 10 %-kal nagyobb mértékben eltér. A felhasználóknak tisztában kell lenniük azzal, hogy a réslámpás mikroszkópok különböző résbeállítások esetén eltérő szaruhártya-vastagságot adhatnak. A résszélességet 0,095 mm-re kell állítani.

23.

Valamennyi szem megvizsgálása és jóváhagyása után a szemeket körülbelül 45–60 percig inkubálni kell annak érdekében, hogy a vizsgálandó anyag felvitele előtt a rendszerrel ekvilibrálódjanak. Az ekvilibrációs idő eltelte után fel kell jegyezni a kiindulási (azaz a zérus időpillanatban érvényes) szaruhártya-vastagságot és opacitást. A fluoreszcein-visszatartás végpontban kiindulási értékként az előkészítéskor meghatározott fluoreszcein-pontszámot kell figyelembe venni.

24.

A kiindulási referenciamérések után a szemeket (tartójukkal együtt) azonnal ki kell venni a szuperfúziós készülékből, vízszintes helyzetbe kell hozni, majd fel kell vinni a vizsgált anyagot a szaruhártyára.

25.

A folyadékokat általában hígítatlan állapotban vizsgáljuk, de szükség esetén (például ha a vizsgálat leírása így rendelkezik) hígítás is alkalmazható. Hígítás esetén lehetőleg fiziológiás sóoldatot alkalmazunk. Ellenőrzött körülmények között másféle oldószer is használható, a fiziológiás sóoldattól eltérő oldószerek megfelelőségét azonban külön igazolni kell.

26.

A folyékony vizsgált anyagot úgy visszük fel a szaruhártya felületére , hogy a szaruhártya teljes felületét egyenletesen beborítsa. A szabványos térfogat 0,03 ml.

27.

A szilárd anyagokat lehetőleg dörzscsészében, mozsárban vagy hasonló őrlőeszközben a lehető legfinomabbra őröljük. A port úgy visszük fel a szaruhártya felületére, hogy a vizsgált anyag egyenletesen fedje azt be. A szabványos mennyiség 0,03 g.

28.

A vizsgált anyagot (akár folyékony, akár szilárd) 10 másodpercig hagyjuk hatni, majd szobahőmérsékleten leöblítjük kb. 20 ml izotóniás sóoldattal. Ezt követően a szemet (tartójával együtt) az eredeti függőleges helyzetben visszahelyezzük a szuperfúziós készülékbe.

29.

Minden vizsgálatban párhuzamosan negatív vagy oldószeres/vivőanyagos kontrollt és pozitív kontrollt is kell végezni.

30.

Hígítatlan folyadékok és szilárd anyagok vizsgálatakor a vizsgálati elrendezés esetleges nem jellemző változásainak észlelése céljából és annak biztosítására, hogy a vizsgálat körülményei ne eredményezzenek tévesen irritatív hatást, az ICE vizsgálatban párhuzamos negatív kontrollanyagként fiziológiás sóoldatot kell alkalmazni.

31.

Hígított folyadékok vizsgálatakor a vizsgálati elrendezés esetleges nem jellemző változásainak észlelése céljából és annak biztosítására, hogy a vizsgálat körülményei ne eredményezzenek tévesen irritatív hatást, az ICE vizsgálatban párhuzamos oldószeres/vivőanyagos kontrollt kell alkalmazni. A 25. pontnak megfelelően csak olyan oldószer, illetőleg vivőanyag alkalmazható, amely igazoltan nem gyakorol káros hatást a vizsgálatra.

32.

Annak ellenőrzése érdekében, hogy a kiváltott hatás valóban megfelelő-e, a vizsgálatnak mindig tartalmaznia kell egy ismerten szemirritációt okozó anyaggal végzett párhuzamos pozitív kontrollvizsgálatot is. Mivel az ICE vizsgálat célja a szemkorróziót és a súlyos szemirritációt okozó anyagok azonosítása, a pozitív kontrollanyagnak olyan referenciaanyagnak kell lennie, amely ebben a vizsgálatban súlyos hatást vált ki. Annak érdekében azonban, hogy a pozitív kontrollvizsgálatban jelentkező hatás időbeli változása is megfigyelhető legyen, az irritatív hatás nem lehet túlságosan erőteljes. A pozitív kontrollanyagra vonatkozóan megfelelő mennyiségű in vitro adatot kell létrehozni úgy, hogy meghatározható legyen a pozitív kontrollanyag statisztikailag meghatározott elfogadható tartománya. Ha egy adott pozitív kontrollanyagra vonatkozóan nincs elegendő korábbi adat az ICE vizsgálat alkalmazásából, akkor ezen adatok előállításához külön vizsgálatok lehetnek szükségesek.

33.

Folyékony vizsgált anyagok esetében pozitív kontrollanyagként például 10 %-os ecetsav vagy 5 %-os benzalkónium-klorid, szilárd vizsgált anyagok esetében például nátrium-hidroxid vagy imidazol alkalmazható.

34.

A referenciaanyagok jól használhatók egy adott vegyianyag- vagy termékosztályba tartozó ismeretlen vegyi anyagok szemirritációs hatásának értékelésére vagy valamely szemirritációs anyag relatív irritatív hatásának az irritatív hatás egy adott tartományán belüli értékelésére.

35.

A kezelt szaruhártyákat a kezelés előtt, majd a kezelést követő leöblítés után 30, 75, 120, 180 és 240 perc (± 5 perc) elteltével értékeljük. Ezek az időpontok a négyórás behatási időn belül megfelelő mennyiségű mérést adnak, miközben a mérések között elegendő idő áll rendelkezésre valamennyi szem szükséges vizsgálatának elvégzéséhez.

36.

Az értékelt végpontok: a szaruhártya opacitása, felduzzadása, fluoreszcein-visszatartása és morfológiai elváltozásai (például a felhám benyomódása vagy fellazulása). A fluoreszcein-visszatartás kivételével (amelyet csak a kezelés előtt és a vizsgált anyagnak való expozíció után 30 perccel határozunk meg) minden végpontot valamennyi fenti időpontban meg kell határozni.

37.

A szaruhártya opacitásának, fluoreszcein-visszatartásának, morfológiai elváltozásainak és – ha vizsgáljuk – hisztopatológiájának dokumentálására ajánlott fényképeket készíteni.

38.

A négy óra elteltével végrehajtott utolsó vizsgálatot követően ajánlatos a szemeket az esetleges hisztopatológiai vizsgálathoz megfelelő fixálóban (például semleges pufferolt formalinban) tartani.

39.

A szaruhártya felduzzadását a réslámpás mikroszkóp optikai pachométerével végzett szaruhártyavastagság-mérésekből határozzuk meg. A felduzzadást százalékban fejezzük ki, és a következő képletből, a mért szaruhártya-vastagságok felhasználásával számítjuk (a képletben t c a vizsgált időpillanathoz, t c0 pedig a t = 0 időpillanathoz tartozó szaruhártya-vastagságot jelenti):

40.

Minden megfigyelési időpontban meghatározzuk az összes vizsgált szem szaruhártya-felduzzadásának középértékét. Az összes időpontban megfigyelt szaruhártyafelduzzadás-középértékek maximuma alapján minden vizsgált anyaghoz átfogó jellemzést adó pontszámot rendelünk.

41.

A szaruhártya-opacitási pontszámot a szaruhártya legsűrűbben opálos területe alapján kell megállapítani. Minden megfigyelési időpontban meghatározzuk az összes vizsgált szem szaruhártya-opacitásának középértékét. Az összes időpontban megfigyelt szaruhártyaopacitás-középértékek maximuma alapján minden vizsgált anyaghoz átfogó jellemzést adó pontszámot rendelünk (1. táblázat).

1.   táblázat

Szaruhártya-opacitási pontszámok

42.

Kizárólag a 30 perc elteltével végzett megfigyelés alkalmával meghatározzuk az összes szem fluoreszcein-visszatartásának középértékét, és ennek alapján minden vizsgált anyaghoz átfogó jellemzést adó pontszámot rendelünk (2. táblázat).

2.   táblázat

Fluoreszcein-visszatartási pontszámok

43.

A morfológiai elváltozások között megemlítendő a szaruhártya felhámsejtjeinek »benyomódása«, a felhám »fellazulása«, a szaruhártya felületének »érdesedése« és a vizsgált anyag »feltapadása« a szaruhártya felületére. Ezek a megfigyelések különböző súlyosságúak lehetnek, és egyidejűleg is előfordulhatnak. A megfigyelések besorolása a vizsgálatot végző személy szubjektív megítélésétől függ.

44.

A szaruhártya opacitását, felduzzadását és fluoreszcein-visszatartását külön-külön értékeljük, és az egyes végpontokhoz külön-külön ICE-osztályt állapítunk meg. Ezt követően az egyes végpontokhoz tartozó ICE-osztályok együttes figyelembevételével meghatározzuk az egyes vizsgált anyagok irritációs besorolását.

45.

Az egyes végpontok értékelését követően az ICE-osztályok megállapítását előre meghatározott tartományok alapján végezzük. A szaruhártya-vastagság (3. táblázat), az opacitás (4. táblázat) és a fluoreszcein-visszatartás (5. táblázat) jellemzése a következő skálákon, négy ICE-osztály figyelembevételével történik:

3.   táblázat

A szaruhártya-vastagság besorolási kritériumai az ICE vizsgálatban

4.   táblázat

Az opacitás besorolási kritériumai az ICE vizsgálatban

5.   táblázat

A fluoreszcein-visszatartás középértékének besorolási kritériumai az ICE vizsgálatban

46.

A vizsgált anyag általános in vitro irritációs besorolását a szaruhártya opacitása, felduzzadása és fluoreszcein-visszatartása alapján meghatározott kategóriák alapján, a 6. táblázatban bemutatott séma szerint állapítjuk meg.

6.   táblázat

Összesített in vitro irritációs besorolás

47.

Mint az 1. pontban láttuk, ha a vizsgált anyagot a vizsgálat nem mutatja szemkorróziót vagy súlyos szemirritációt okozónak, akkor a besorolás és a címkézés céljára további vizsgálatokat kell végezni. A nyulakon végzett in vivo szemvizsgálatból származó, az EPA (1), az EU (2) vagy a GHS (3) besorolási rendszer szerint osztályozott adatokkal összehasonlítva az ICE vizsgálat általános pontossága a szemkorróziót és a súlyos szemirritációt okozó anyagok azonosítása tekintetében 83 % (120/144) és 87 % (134/154) között, hamis pozitív aránya 6 % (7/122) és 8 % (9/116) között, hamis negatív aránya pedig 41 % (13/32) és 50 % (15/30) között van. Ha az adatbázisból egyes meghatározott kémiai (alkoholok, felületaktív anyagok) és fizikai (szilárd anyagok) osztályokat kizárunk, akkor az EU, az EPA és a GHS besorolási rendszerben az ICE vizsgálat pontossága 91 % (75/82) és 92 % (69/75), hamis pozitív aránya 5 % (4/73) és 6 % (4/70), hamis negatív aránya pedig 29 % (2/7) és 33 % (3/9) közé kerül (4).

48.

Ha a vizsgált anyagot a vizsgálat nem mutatja is szemkorróziót vagy súlyos szemirritációt okozónak, az ICE vizsgálat adatai – a nyulakon végzett in vivo szemvizsgálatból vagy megfelelően validált más in vitro vizsgálatból származó adatokkal együtt – jól használhatók annak további meghatározásában, hogy az ICE vizsgálat mennyire és milyen korlátokkal alkalmas a nem súlyos irritációt okozó, illetve az irritációt nem okozó anyagok azonosítására (jelenleg folyik egy útmutató elkészítése az in vitro szemtoxicitás-vizsgálati módszerekre vonatkozóan).

49.

A vizsgálat akkor elfogadható, ha a szemirritáció szempontjából az egyidejű negatív vagy vivőanyagos/oldószeres kontroll irritációt nem okozónak, az egyidejű pozitív kontroll súlyos irritációt /korróziót okozónak bizonyul.

50.

A vizsgálati jegyzőkönyvnek a következő információkat kell tartalmaznia, amennyiben azok a vizsgálat lefolytatása szempontjából relevánsak:

Vizsgált anyag és kontrollanyagok

A megbízó és a vizsgálatot végző laboratórium adatai

Az alkalmazott vizsgálati módszer és protokoll indokolása

A vizsgálati módszer integritása

A vizsgálati módszer időbeli integritásának (például pontosságának, megbízhatóságának) biztosítására alkalmazott módszer (például jártassági tesztanyagokon végzett időszakos vizsgálatok, negatív és pozitív történeti kontrolladatok felhasználása)

A vizsgálat elfogadhatóságának kritériumai

Az elfogadható párhuzamos referencia-kontrolltartományok a történeti adatok alapján, szükség szerint

Vizsgálati körülmények

Eredmények

Az eredmények szöveges elemzése

Következtetések

(1)

U.S. EPA (1996). Label Review Manual: 2nd Edition. EPA737-B-96-001. Washington, DC: US Environmental Protection Agency.

(2)

Az Európai Parlament és a Tanács 1272/2008/EK rendelete (2008. december 16.) az anyagok és keverékek osztályozásáról, címkézéséről és csomagolásáról, a 67/548/EGK és az 1999/45/EK irányelv módosításáról és hatályon kívül helyezéséről, valamint az 1907/2006/EK rendelet módosításáról, HL L 353, 2008.12.31., 1. o.

(3)

United Nations (UN) (2007). Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS), Second revised edition, UN New York and Geneva, 2007. Elektronikus formátumban:

[http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev02/02files_e.html]

(4)

ICCVAM (2007). Test Method Evaluation Report - In Vitro Ocular Toxicity Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and Corrosives. Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No.: 07-4517. Elektronikus formátumban:

[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm]

(5)

ESAC (2007). Statement on the conclusion of the ICCVAM retrospective study on organotypic in vitro assays as screening tests to identify potential ocular corrosives and severe eye irritants. Elektronikus formátumban:

[http://ecvam.jrc.it/index.htm]

(6)

Az Európai Parlament és a Tanács 1907/2006/EK rendelete (2006. december 18.) a vegyi anyagok regisztrálásáról, értékeléséről, engedélyezéséről és korlátozásáról (REACH), az Európai Vegyianyag-ügynökség létrehozásáról, az 1999/45/EK irányelv módosításáról, valamint a 793/93/EGK tanácsi rendelet, az 1488/94/EK bizottsági rendelet, a 76/769/EGK tanácsi irányelv, a 91/155/EGK, a 93/67/EGK, a 93/105/EK és a 2000/21/EK bizottsági irányelv hatályon kívül helyezéséről, HL L 396, 2006.12.30., 1. o.

(7)

OECD (2002). Test Guideline 405. OECD Guideline for the Testing of Chemicals. Acute eye irritation/corrosion. Elektronikus formátumban:

[http://www.oecd.org/document/40/0, 2340, en_2649_34377_37051368_1_1_1_1,00.html]

(8)

ICCVAM (2007). ICCVAM Recommended BCOP Test Method Protocol. In: ICCVAM Test Method Evaluation Report - In Vitro Ocular Toxicity Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and Corrosives. Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No.: 07-4517. Elektronikus formátumban:

[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm]

(9)

ICCVAM. (2006). Current Status of In Vitro Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Isolated Chicken Eye Test Method. NIH Publication No.: 06-4513. Research Triangle Park: National Toxicology Program. Elektronikus formátumban:

[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_ice.htm]

(10)

Prinsen, M.K. and Koëter, B.W.M. (1993). Justification of the enucleated eye test with eyes of slaughterhouse animals as an alternative to the Draize eye irritation test with rabbits. Fd. Chem. Toxicol. 31:69-76.

(11)

INVITTOX (1994). Protocol 80: Chicken enucleated eye test (CEET). Elektronikus formátumban:

[http://ecvam.jrc.it/index.htm]

(12)

Balls, M., Botham, P.A., Bruner, L.H. and Spielmann H. (1995). The EC/HO international validation study on alternatives to the Draize eye irritation test. Toxicol. In Vitro 9:871-929.

(13)

Prinsen, M.K. (1996). The chicken enucleated eye test (CEET): A practical (pre)screen for the assessment of eye irritation/corrosion potential of test materials. Food Chem. Toxicol. 34:291-296.

(14)

Chamberlain, M., Gad, S.C., Gautheron, P. and Prinsen, M.K. (1997). IRAG Working Group I: Organotypic models for the assessment/prediction of ocular irritation. Food Chem. Toxicol. 35:23-37.

(15)

Siegel, J.D., Rhinehart, E., Jackson, M., Chiarello, L., and the Healthcare Infection Control Practices Advisory Committee (2007). Guideline for Isolation Precautions: Preventing Transmission of Infectious Agents in Healthcare Settings. Elektronikus formátumban:

[http://www.cdc.gov/ncidod/dhqp/pdf/isolation2007.pdf].

(16)

Maurer, J.K., Parker, R.D. and Jester, J.V. (2002). Extent of corneal injury as the mechanistic basis for ocular irritation: key findings and recommendations for the development of alternative assays. Reg. Tox. Pharmacol. 36:106-117.

(17)

Burton, A.B.G., M. York and R.S. Lawrence (1981). The in vitro assessment of severe irritants. Fd. Cosmet.- Toxicol.- 19, 471-480.

(18)

ICCVAM (2006). Background review document, Current Status of In Vitro Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Bovine Corneal Opacity and Permeability (BCOP) Test Method. Elektronikus formátumban:

[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_ice.htm]

(19)

ICCVAM (2006). Background review document, Current Status of In Vitro Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe IrritantsIsolated Chicken Eye (ICE) Test Method. Elektronikus formátumban:

[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_bcop.htm]