„4.   ОПРЕДЕЛЯНЕ НА СУРОВИ МАСЛА И МАЗНИНИ

1.   Задача и обхват

Настоящият метод дава възможност за определяне на съдържанието на сурови масла и мазнини в храни за животни. Той не обхваща анализа на семена и плодове за добиване на масла, определени с Регламент 136/66/ЕИО на Съвета от 22 септември 1966 г.

В зависимост от характера на животинските храни трябва да се използва един от двата описани метода.

1.1.   Метод А

Приложим при храни за животни без примеси от растителен произход, с изключение на тези, за които е известно, че съдържат масла и мазнини, които не могат напълно да бъдат извлечени с петролен етер без предварителна хидролиза. Между тях са глутените, дрождите, соевите и картофените белтъчини. Настоящият метод е също така приложим за комбинирани храни за животни, с изключение на тези, които съдържат мляко на прах или от които не могат напълно да бъдат извлечени масла и мазнини с петролен етер без предварителна хидролиза.

1.2.   Метод Б

Приложим при директни храни за животни от животински произход, както и при храните за животни, посочени в точка 1.1, като изключение за метод А.

2.   Принцип

2.1.   Метод А

Пробата се извлича с петролен етер. Разтворителят се дестилира и утайката се изсушава и измерва.

2.2.   Метод Б

Пробата се обработва термично със солна киселина Сместа се охлажда и се филтрира. След като бъде промит и изсушен, остатъкът се подлага на определяне съгласно метод А.

3.   Реактиви

3.1.   Петролен етер, диапазон на кипене: от 40 до 60 °С. Индексът на брома трябва да бъде по-малък от 1, а остатъкът след изпарението — по-малък от 2 mg/100 ml.

3.2.   Натриев сулфат, безводен.

3.3.   Солна киселина 3N.

3.4.   Филтрираща добавка например инфузорна пръст Hyflo-supercel.

4.   Апаратура

4.1.   Екстрактор. Ако апаратът е със сифон (Сокслетов апарат), дебитът на нагряването с обратен хладник трябва да бъде такъв, че да се получават около 10 цикъла на час; ако апаратът е без сифон, дебитът на нагряването на обратния хладник трябва да бъде около 10 ml в минута.

4.2.   Екстракционни патрони, свободни от разтворими вещества в петролен етер и чиято порьозност съответства на изискванията на точка 4.1.

4.3.   Сушилня или вакуумсушилня, настроена на 75 ± 3 °С или въздушна пещ, настроена на 100 ± 3 °С.

5.   Процедура

5.1.   Метод А (виж точка 8.1)

Претеглят се 5 g от пробата с точност 1 mg, прехвърлят се в екстракционнен патрон (4.2) и се покриват с памучен обезмаслен тампон.

Патронът се поставя в екстрактор (4.1) и се извлича в продължение на шест часа с петролен етер (3.1). Екстрактът се събира в суха претеглена колба, която съдържа късчета пемза (1).

Чрез дестилация се отстранява разтворителят. Остатъкът се изсушава, като колбата се държи в продължение на един час и половина в сушилня (4.3). Оставя се да се охлади в сушилен шкаф и се претегля. Изсушава се отново в продължение на 30 минути, за да се гарантира, че теглото на маслата и мазнините ще остане постоянно (загубата на тегло между две последователни претегляния трябва да бъде по-малка от 1 mg).

5.2.   Метод Б

Претеглят се 2,5 г от пробата с точност 1 mg (виж точка 8.2), поставят се в бехерова чаша 400 ml или в ерленмайерова колба 300 ml и се добавят 100 мл солна киселина 3N (3.3) и късчета пемза. Бехеровата чаша се покрива с наблюдателно стъкло или се слага към коничната колба с обратен хладник. Сместа се нагрява до слабо кипене на слаб пламък или на котлон и така се държи в продължение на един час. Следи се продуктът да не залепне по стените на контейнера.

Охлажда се и се добавя достатъчно количество от филтрационната добавка (3.4), за да се предотврати всякаква загуба на масла и мазнина при филтрирането. Филтрира се през навлажнена обезмаслена двойно филтрираща хартия. Остатъкът се промива в студена вода до получаване на неутрален филтрат. Филтратът се проверява за съдържание на масла или мазнини. Тяхното наличие показва, че пробата трябва да бъде извлечена с петролен етер, като се използва метод А преди хидролизата.

Двойната филтрираща хартия, съдържаща сухия остатък, се поставя върху наблюдателно стъкло и се суши в продължение на час и половина в пещта при 100 ± 3 °С.

Двойната филтрираща хартия се поставя в екстракционен патрон (4.2), който се покрива с памучен обезмаслен тампон. Патронът се поставя в екстрактора (4.1) и се продължава, както е посочено в точка 5.1, втори и трети параграф.

6.   Изразяване на резултатите

Теглото на остатъка се изразява като процент от пробата.

7.   Повторяемост

Разликата между резултатите на две паралелни определяния, извършени на същата проба от един и същ лаборант, не трябва да превишава:

8.   Наблюдения

8.1.   При продукти с високо съдържание на масла и мазнини, които е трудно да се строшат или са неподходящи за изтегляне на хомогенна редуцирана проба за изпитване, се процедира, както следва.

Претеглят се 20 g от пробата с точност 1 mg и се смесват с 10 g или повече безводен натриев сулфат (3.2). С петролен етер (3.1) се извлича, както е посочено в точка 5.1. Полученият екстракт се долива до 500 ml с петролен етер (3.1) и се хомогенизира. Вземат се 50 мл от разтвора и се поставят в малка суха претеглена колба, която съдържа късчета пемза (1). Разтворителят се отстранява чрез дестилиране, изсушава се и се продължава, както е посочено в точка 5.1, последен параграф.

Разтворителят се отстранява от остатъка от екстракцията, останал в патрона, остатъкът се строшава до едрина на частиците 1 mm, връща се в екстракционния патрон (без да се добавя натриев сулфат) и се продължава, както е посочено в точка 5.1, втори и трети параграф.

Съдържанието на масла и мазнини се изчислява като процент от пробата, като се използва следната формула:

(10 a + b) × 5

където:

а= масата в грамове на остатъка след първата екстракция (аликватна част на екстракта),

b= масата в грамове на остатъка след втората екстракция.

8.2.   При продукти, които имат ниско съдържание на масла и мазнини, пробата за изпитване може да се увеличи до 5 g.

„5.   Определяне на вирджиниямицин

— чрез дифузия в среда агар-агар —

1.   Задача и обхват

Методът е за определяне на вирджиниямицин в храни за животни и премикси. Долната граница на определяне е 2 mg/kg (2 ppm) (1).

2.   Принцип

Пробата се екстрахира с метанолов разтвор Tween 80. Екстрактът се декантира или центрофугира и се разрежда. Неговата антибиотична активност се определя чрез измерване дифузията на вирджиниямицина в агарова среда, засята с Micrococcus luteus. Дифузията става видима по образуването на зони на инхибиране в присъствието на микроорганизма. Диаметърът на тези зони се счита за правопропорционален на логаритъма на концентрацията на антибиотика в обхвата на изследваните антибиотични концентрации.

3.   Микроорганизъм: Micrococcus luteus АТСС 9341 (NCTC 8340, NCIB 8553)

3.1.   Поддържане на щама

Инокулира се епруветка скосен агар с хранителна среда (4.1) с Micrococcus luteus и се инкубира в течение на 24 часа при 30 °С. Културата се съхранява в хладилник при 4 °С. Реинокулира се на всеки две седмици.

3.2.   Приготвяне на бактериалната суспензия (2)

Бактериите се събират от наскоро приготвена епруветка скосен агар (3.1) с 2 до 3 ml разтвор на натриев хлорид (4.3). С тази суспензия се инокулира колба на Roux, съдържаща 250 ml хранителна среда (4.1), и се култивира в продължение на 18 до 20 часа при 30 °С. Бактериите се събират в 25 ml разтвор на натриев хлорид (4.3) и се хомогенизира. Суспенсията се разрежда до 1/10 с разтвор на натриев хлорид (4.3). Пропускливостта на светлината на суспенсията трябва да бъде около 75 %, измерена при 650 mm в клетка 1 cm, спрямо разтвор на натриев хлорид (4.3). Тази суспензия може да се съхранява една седмица при около 4 °С.

4.   Хранителна среда и реактиви

4.1.   Хранителна и изпитателна среда (3)

4.2.   Фосфатен буфер рН 6

4.3.   Разтвор на натриев хлорид 0,8 % (w/v): разтваря се 8 g натриев хлорид във вода и се разрежда до 1 000 ml; стерилизира се.

4.4.   Метанол.

4.5.   Смес от разтвор на фосфатен буфер (4.2)/метанол (4.4): 80/20 по обем.

4.6.   Метанолов разтвор на Tween 80 05 % (w/v): разтваря се 5 g Tween 80 в метанол (4.4) и се разрежда с метанол до 1 000 ml.

4.7.   Стандартна субстанция: вирджиниямицин с известна активност.

5.   Стандартни разтвори

Разтваря се точно претеглено количество стандартна субстанция (4.7) в метанол (4.4) и се разрежда с метанол (4.4), за да се получи изходен разтвор, съдържащ 1 000 mg вирджиниямицин на 1 ml.

Когато се съхранява в запушена колба при 4 °С, този разтвор е стабилен до пет дни.

От този изходен разтвор се приготвят чрез последващо разреждане със сместа (4.5) следните разтвори:

6.   Приготвяне на екстракта и разтворите за изпитване

6.1.   Екстракция

6.1.1.   Продукти със съдържание на вирджиниямицин до 100 mg/kg

Взема се 50 g от пробата, добавя се 200 ml разтвор (4.6) и се разтръсква в продължение на 30 минути. Оставя се да се утаи или се центрофугира, вземат се 20 ml от плаващия отгоре разтвор и се изпарява до около 5 ml в ротационен изпарител при температура, която не превишава 40 °С. Утайката се разрежда със сместа (4.5), за да се получи очакваното съдържание на вирджиниямицин от 1 mg/ml (= u8).

6.1.2.   Продукти със съдържание на вирджиниямицин, по-голямо от 100 mg/kg

Взема се проба количество, което не превишава 10,0 g и съдържа между 1 и 50 mg вирджиниямицин, добавя се 100 мл разтвор (4.6) и се разтръсква в продължение на 30 минути. Оставя се да се утаи или се центрофугира, след което се разрежда плаващият отгоре разтвор със сместа (4.5), за да се получи очакваното съдържание на вирджиниямицин от 1 mg/ml (= u8).

6.2.   Разтвори за изпитване

От разтвор u8 се приготвя разтвор u4 (очаквано съдържание: 0,5 mg), u2 (очаквано съдържание: 0,25 mg) и u1 (очаквано съдържание: 0,125 mg) чрез последователно разреждане (1 + 1) със сместа (4.5).

7.   Процедура на определяне

7.1.   Инокулиране на хранителната среда

Хранителната среда (4.1) се инокулира с бактериалната суспензия (3.2) при около 50 °С. Чрез предварителни опити в петри със среда (4.1) се определя количеството на бактериалната суспензия, което се изисква, за да се получат най-големи и ясни зони на инхибиране с различните концентрации на вирджиниямицин.

7.2.   Подготовка на паничките

Дифузията в агар се провежда в панички, като се използват четири концентрации на стандартния разтвор (s8, s4, s2, и s1) и четири концентрации на екстракта (u8, u4, u2, и u1). Тези четири концентрации на екстракта и стандартът е необходимо да се поставят във всяка паничка. За тази цел се изберат панички, достатъчно големи, за да позволят да се направят в агарова среда най-малко осем дупки с диаметър от 10 до 13 mm и не по-малко от 30 mm между центровете. Тестът може да се извърши на паничките, които се състоят от стъклен лист с поставени върху него алуминиеви или пластмасови пръстени с диаметър 200 mm и височина 20 mm.

Излива се в паничката част от средата (4.1), инокулирана, както е указано в точка 7.1, за да се получи пласт дебел около 2 mm (60 ml за панички с диаметър 200 mm). Оставя се да се разстеле равномерно, пробиват се дупки и в тях се поставят точно премерени обеми от изпитваните и стандартните разтвори (между 0,10 и 0,15 ml на дупка в зависимост от диаметъра). За всяка проба разрежданията се повтарят най-малко четири пъти с всяка концентрация, така че всяко определяне да включва оценяването на 32 зони на инхибиране.

7.3.   Инкубиране

Паничките се инкубират от 16 до 18 часа при 30 ± 2 °С.

8.   Оценяване

За предпочитане е диаметърът на зоните на инхибиране да се измери с точност до 0,1 mm. Записват се средните аритметични стойности на измерванията за всяка концентрация милиметрова хартия, която показва логаритъма на концентрациите спрямо диаметрите на зоните на инхибиране. Начертават се линиите на най-добро съвпадане на стандартния разтвор и екстракта, например както по-долу:

Определя се точката на „най-добро съвпадане“ за най-ниското ниво на стандарта (SL), като се използва формулата:

Определя се точката на „най-добро съвпадане“ за най-високото ниво на стандарта (SН), като се използва формулата:

По същия начин се изчисляват точките на „най-добро съвпадане“ за най-ниското ниво на екстракта (UL) и най-високото ниво на екстракта (UH), като се заместят u8, u4, u2, и u1 и s8, s4, s2, и s1 в горните формули.

Отбелязват се изчислените стойности на SL и SH на същата милиметрова хартия и се съединяват, за да се получи линията на „най-добро съвпадане“ за стандартния разтвор. По същия начин се отбелязват UL и UH и се съединяват, за да се получи линията на „най-добро съвпадане“ за екстракта.

При отсъствие на външни влияния линиите трябва да бъдат успоредни. За практични цели линиите могат да се считат успоредни, ако стойностите (SH – SL) и (UH – UL) не се различават с повече от 10 % от тяхната средна аритметична стойност.

Ако линиите не са успоредни, могат да се изключат или u1 и s1, или u8 и s8 и да изчислят SL, SH, UL и UH, като се използват алтернативните формули, за да се получат линиите на „най-добро съвпадане“:

и по-същия начин за UL и UH. Трябва да бъде удовлетворен същият критерий за успоредност. Фактът, че резултатът е бил изчислен от три нива, трябва да бъде отбелязан в крайния отчет.

Когато линиите се считат за успоредни, се изчислява логаритъмът на относителната активност (log A) чрез една от следните формули, в зависимост от това дали за оценка на успоредността са били използвани четири или три нива.

За четири нива

За три нива

или

Активността на екстракта от пробата = активността на съответния стандарт × А

(u8 = s8 × А)

Ако се установи, че относителната активност е извън обхвата от 0,5 до 2,0, изпитването се повторя, като се правят подходящи корекции на концентрациите на екстракта или ако това не е възможно — на стандартните разтвори. Когато относителната активност не може да бъде вкарана в изисквания обхват, всеки получен резултат трябва да се счита за приблизителен и това трябва да бъде отбелязано в крайния отчет.

Когато се счита, че линиите не са успоредни, определянето се повтаря. Ако и тогава не се постига успоредност, определянето трябва да счита за незадоволително.

Резултатът се изразява в милиграми вирджиниямицин на килограм храни за животни.

9.   Повторяемост

Разликата между резултатите на две паралелни определяния, проведени с една и съща проба от същия лаборант, не трябва да превишават:

„1.   ОПРЕДЕЛЯНЕ НА ЦИНК БАЦИТРАЦИН

— чрез дифузия в среда агар-агар —

1.   Задачи и обхват

Методът служи за определяне на цинк бацитрацин във храни за животни и премикси. Долната граница на определяне е 5 mg/kg (5ppm) (1).

2.   Принцип

Пробата се екстрахира при рН 2 със смес на метанол/вода/солна киселина и разтвор на натриев сулфат. Натриевият сулфат се добавя, за да се утаят всички разтворими медни соли, които могат да повлияят на изпитването. Екстрактът се довежда до рН 6,5, концентриран (когато е необходимо) и разреден. Неговата антибиотична активност се определя чрез измерване дифузията на вирджиниямицин в среда агар-агар, инокулирана с Micrococcus luteus (flavus). Дифузията става видима от образуването на зони на инхибиране в присъствието на микроорганизма. Диаметърът на тези зони се счита за правопропорционален на логаритъма на концентрацията на антибиотика в обхвата на изследваните антибиотични концентрации.

3.   Микроорганизъм: Micrococcus luteus АТСС 10240

3.1.   Поддържане на щама

Инокулира се епруветка скосен агар с хранителна среда (4.1) с Micrococcus luteus (flavus) и се инкубира в продължение на 24 часа при 30 °С. Културата се съхранява в хладилник при 4 °С. Реинокулира се на всеки две седмици.

3.2.   Приготвяне на бактериалната суспензия (2)

Бактериите се събират от наскоро приготвена епруветка скосен агар (3.1) с 2 до 3 ml разтвор на натриев хлорид (4.3). С тази суспензия се инокулира колба на Roux, съдържаща 250 ml хранителна среда (4.1) и се култивира в продължение на 18 до 20 часа при 30 °С. Бактериите се събират в 25 ml разтвор на натриев хлорид (4.3) и се хомогенизира. Суспенсията се разрежда до 1/10 с разтвор на натриев хлорид (4.3). Пропускливостта на светлината на суспенсията трябва да бъде около 75 %, измерена при 650 mm в клетка 1 cm, спрямо разтвор на натриев хлорид (4.3). Тази суспензия трябва да се съхранява една седмица при около 4 °С.

4.   Хранителна среда и реактиви

4.1.   Хранителна (3)

4.2.   Изпитателна среда (4)

4.3.   Разтвор на натриев хлорид 0,8 % (w/v): разтварят се 8 g натриев хлорид във вода и се разрежда до 1 000 ml; стерилизира се.

4.4.   Смес на метанол/вода/солна киселина (4.6):

80/17,5/2,5 (v/v/v)

4.5.   Фосфатен буфер рН 6,5:

4.6.   Солна киселина (d: 1,18 до 1,19).

4.7.   Солна киселина (0,1 М).

4.8.   Натриев хидроксид разтвор 1 М.

4.9.   Натриев сулфид разтвор около 0,5 М.

4.10.   Разтвор на бромокрезол, пурпурен разтвор 0,04 % (w/v): разтваря се 0,1 g пурпурен бромокрезол в 18,5 ml разтвор на натриев хидроксид 0,01 М. Добавя се до 250 ml с вода и се смесва.

4.11.   Стандартна субстанция: цинк бацитрацин с известна активност (в i.u.).

5.   Стандартни разтвори

Разтваря се количество от стандартна субстанция (4.11), което съответства на 1 050 м.е. (съгласно посочената активност). Добавя се 5 ml солна киселина 0,1 М (4.7) и се оставят спокойно в продължение на 15 минути. Добавя се 30 ml вода, коригира се рН до 4,5 с фосфатен буфер (4.5) (около 4 ml), долива се до 50 ml с вода и се смесва добре (1 ml = 21 i.u.).

От този разтвор се приготвят чрез последователно разреждане с фосфатен буфер (4.5) следните разтвори:

6.   Приготвяне на екстракта и разтворите за изпитване

6.1.   Екстракция

6.1.1.   Премикси и минерални храни

Претегля се от 2,0 до 5,0 g от пробата, добавя се 29,0 ml от сместа (4.4) и 1,0 ml разтвор на натриев сулфид (4.9) и се разтръсква за кратко. Проверява се дали рН е около 2. Разтръсква се в продължение на 10 минути, добавя се 30 ml фосфатен буфер (4.5), разтръсква се в продължение на 15 минути и се центрофугира. Взема се подходящ аликват от разтвора, който плава отгоре, и рН се довежда до 6,5 с помощта на хидроксиден разтвор 1 М (4.8) с рН метър или с разтвор на бромкрезол пурпур (4.10) като индикатор. Разрежда се с фосфатен буфер (4.5), за да се получи очакваното съдържание на цинк бацитрацин 0,42 i.u./ml (= u8).

6.1.2.   Протеинови концентрати

Претегля се 10,0 от пробата, добавя се 49,0 ml от сместа (4.4) и 1,0 ml разтвор на натриев сулфид (4.9) и се разтръсква за кратко. Проверява се дали рН е около 2. Разтръсква се в продължение на 10 минути. Добавя се 50 ml фосфатен буфер (4.5), разтръсква се в продължение на 15 минути и се центрофугира. Взема се подходящ аликват от разтвора, който плава отгоре, и рН се довежда до 6,5 с помощта на хидроксиден разтвор 1 М (4.8) с рН метър или с разтвор на бромкрезол пурпур (4.10) като индикатор. Изпарява се до приблизително половината обем в ротационен изпарител при температура, която не превишава 35 °С.

Разрежда се с фосфатен буфер (4.5), за да се получи очакваното съдържание на цинк бацитрацин 0,42 i.u./ml (= u8).

6.1.3.   Други храни

Претегля се 10,0 g от пробата (20,0 g за очаквано съдържание на цинк бацитрацин 5 mg/kg). Добавя се 24,0 ml от сместа (4.4) и 1,0 ml разтвор на натриев сулфид (4.9) и се хомогенизира в продължение на 10 минути. Добавя се 25 ml фосфатен буфер (4.5), разтръсква се в продължение на 15 минути и се центрофугира. Взема се 20 ml от разтвора, който плава отгоре, и рН се довежда до 6,5 с помощта на хидроксиден разтвор 1 М (4.8) с рН метър или с разтвор на бромкрезол пурпур (4.10) като индикатор. Изпарява се около 4 ml в ротационен изпарител при температура, която не превишава 35 °С. Разрежда се с фосфатен буфер (4.5), за да се получи очакваното съдържание на цинк бацитрацин 0,42 i.u./мл (= u8).

6.2.   Разтвори за изпитване

От разтвор u8 се приготвят разтвори u4 /очаквано съдържание: 0,21 i.u./ml), u2 (очаквано съдържание: 0,105 i.u./ml) и u1 (очаквано съдържание: 0,0525 i.u./ml) чрез последователно разреждане (1 + 1) със сместа (4.5).

7.   Процедура на изпитване

7.1   Инокулиране на хранителната среда

Хранителната среда (4.2) се инокулира с бактериалната суспензия (3.2) при около 50 °С. Чрез предварителни опити в петри със среда (4.2) се определя количеството на бактериалната суспензия, което се изисква, за да се получат най-големи и ясни зони на инхибиране с различните концентрации на цинк бацитрацин.

7.2.   Подготовка на паничките

Дифузията в агар се осъществява в панички, като се използват четири концентрации на стандартния разтвор (s8, s4, s2, и s1) и четири концентрации на екстракта (u8, u4, u2, и u1). Тези четири концентрации на екстракта и стандарта е необходимо да се поставят във всяка паничка. За тази цел се избират панички, достатъчно големи да позволят да се направят в агарова среда най-малко осем дупки с диаметър от 10 до 13 mm и не по-малко от 30 mm между центровете. Тестът може да се извърши на панички, които се състоят от стъклен лист с поставени върху него алуминиеви или пластмасови пръстени с диаметър 200 mm и височина 20 mm.

Излива се в паничката част от средата (4.2), инокулирана, както е указано в точка 7.1, за да се получи пласт, дебел около 2 mm (60 ml за панички с диаметър 200 mm). Оставя се да се разстеле равномерно, пробиват се дупки и в тях се поставят точно премерени обеми от изпитваните и стандартните разтвори (между 0,10 и 0,15 ml на дупка в зависимост от диаметъра). За всяка проба разрежданията се повтарят най-малко четири пъти с всяка концентрация, така че всяко определяне да включва оценяването на 32 зони на инхибиране.

7.3.   Инкубиране

Паничките се инкубират от 16 до 18 часа при 30 ± 2 °С.

8.   Оценяване

За предпочитане е диаметърът на зоните на инхибиране да се измери с точност до 0,1 mm. Записват се средните аритметични стойности на измерванията за всяка концентрация на милиметрова хартия, която показва логаритъма на концентрациите спрямо диаметрите на зоните на инхибиране. Начертават се линиите на най-добро съвпадане на стандартния разтвор и екстракта, например както по-долу:

Определя се точката на „най-добро съвпадане“ за най-ниското ниво на стандарта (SL), като се използва формулата:

Определя се точката на „най-добро съвпадане“ за най-високото ниво на стандарта (SН), като се използва формулата:

По същия начин се изчисляват точките на „най-добро съвпадане“ за най-ниското ниво на екстракта (UL) и най-високото ниво на екстракта (UH), като се заместят u8, u4, u2, и u1 и s8, s4, s2, и s1 в горните формули.

Отбелязват се изчислените стойности на SL и SH на същата милиметрова хартия и се съединяват, за да се получи линията на „най-добро съвпадане“ за стандартния разтвор. По същия начин се отбелязват UL и UH и се съединяват, за да се получи линията на „най-добро съвпадане“ за екстракта.

При отсъствие на външни влияния линиите трябва да бъдат успоредни. За практични цели линиите могат да се считат успоредни, ако стойностите (SH – SL) и (UH – UL) не се различават с повече от 10 % от тяхната средна аритметична стойност.

Ако линиите не са успоредни, могат да се изключат или u1 и s1, или u8 и s8 и да изчислят SL, SH, UL и UH, като се използват алтернативните формули, за да се получат линиите на „най-добро съвпадане“:

и по-същия начин за UL и UH. Трябва да бъде удовлетворен същият критерий за успоредност. Фактът, че резултатът е бил изчислен от три нива, трябва да бъде отбелязан в крайния отчет.

Когато линиите се считат за успоредни, се изчислява логаритъмът на относителната активност (log A) чрез една от следните формули, в зависимост от това дали четири или три нива са били използвани за оценка на успоредността.

За четири нива

За три нива

илиг

Активността на екстракта от пробата = активността на съответния стандарт × А

(u8 = s8 × А)

Ако се установи, че относителната активност е извън обхвата 0,5 до 2,0, изпитването се повтаря, като се направят подходящи корекции на концентрациите на екстракта или ако това не е възможно, на стандартните разтвори. Когато относителната активност не може да бъде вкарана в изисквания обхват, всеки получен резултат трябва да се счита за приблизителен и това трябва да бъде отбелязано в крайния отчет.

Когато се счита, че линиите не са успоредни, определянето се повтаря. Ако и тогава не се постига успоредност, определянето трябва да счита за незадоволително.

Резултатът се изразява в милиграми бацитрацин на килограм храни за животни.

9.   Повторяемост

Разликата между резултатите на две паралелни определяния, проведени върху същата проба от същия лаборант, не трябва да превишават: