Use quotation marks to search for an "exact phrase". Append an asterisk (*) to a search term to find variations of it (transp*, 32019R*). Use a question mark (?) instead of a single character in your search term to find variations of it (ca?e finds case, cane, care).
Commission Regulation (EU) No 260/2014 of 24 January 2014 amending, for the purpose of its adaptation to technical progress, Regulation (EC) No 440/2008 laying down test methods pursuant to Regulation (EC) No 1907/2006 of the European Parliament and of the Council on the Registration, Evaluation, Authorisation and Restriction of Chemicals (REACH) Text with EEA relevance
A Bizottság 260/2014/EU rendelete ( 2014. január 24. ) a vegyi anyagok regisztrálásáról, értékeléséről, engedélyezéséről és korlátozásáról (REACH) szóló 1907/2006/EK európai parlamenti és a tanácsi rendelet értelmében alkalmazandó vizsgálati módszerek megállapításáról szóló 440/2008/EK rendeletnek a műszaki fejlődéshez való hozzáigazítás céljából történő módosításáról EGT-vonatkozású szöveg
A Bizottság 260/2014/EU rendelete ( 2014. január 24. ) a vegyi anyagok regisztrálásáról, értékeléséről, engedélyezéséről és korlátozásáról (REACH) szóló 1907/2006/EK európai parlamenti és a tanácsi rendelet értelmében alkalmazandó vizsgálati módszerek megállapításáról szóló 440/2008/EK rendeletnek a műszaki fejlődéshez való hozzáigazítás céljából történő módosításáról EGT-vonatkozású szöveg
HL L 81., 2014.3.19, pp. 1–253
(BG, ES, CS, DA, DE, ET, EL, EN, FR, HR, IT, LV, LT, HU, MT, NL, PL, PT, RO, SK, SL, FI, SV)
a vegyi anyagok regisztrálásáról, értékeléséről, engedélyezéséről és korlátozásáról (REACH) szóló 1907/2006/EK európai parlamenti és a tanácsi rendelet értelmében alkalmazandó vizsgálati módszerek megállapításáról szóló 440/2008/EK rendeletnek a műszaki fejlődéshez való hozzáigazítás céljából történő módosításáról
(EGT-vonatkozású szöveg)
AZ EURÓPAI BIZOTTSÁG,
tekintettel az Európai Unió működéséről szóló szerződésre,
tekintettel a vegyi anyagok regisztrálásáról, értékeléséről, engedélyezéséről és korlátozásáról (REACH), az Európai Vegyianyag-ügynökség létrehozásáról, az 1999/45/EK irányelv módosításáról, valamint a 793/93/EGK tanácsi rendelet, az 1488/94/EK bizottsági rendelet, a 76/769/EGK tanácsi irányelv, a 91/155/EGK, a 93/67/EGK, a 93/105/EK és a 2000/21/EK bizottsági irányelv hatályon kívül helyezéséről szóló, 2006. december 18-i 1907/2006/EK európai parlamenti és tanácsi rendeletre (1) és különösen annak 13. cikke (3) bekezdésére,
mivel:
(1)
A 440/2008/EK bizottsági rendelet (2) az 1907/2006/EK rendelettel összefüggésben történő alkalmazás céljából vizsgálati módszereket határoz meg az anyagok fizikai-kémiai tulajdonságainak, toxicitásának és ökotoxicitásának meghatározására.
(2)
A kísérleti célokra felhasznált állatok számának csökkentése érdekében, a tudományos célokra felhasznált állatok védelméről szóló, 2010. szeptember 22-i 2010/63/EU európai parlamenti és tanácsi irányelvnek (3) és a kísérleti és egyéb tudományos célokra felhasznált állatok védelmére vonatkozó tagállami törvényi, rendeleti és közigazgatási rendelkezések közelítéséről szóló, 1986. november 24-i 86/609/EGK tanácsi irányelvnek (4) megfelelően a 440/2008/EK rendeletet naprakésszé szükséges tenni oly módon, hogy a rendeletbe mielőbb bekerüljenek egyes, az OECD által a közelmúltban elfogadott új, illetve aktualizált vizsgálati módszerek.
(3)
A módosításban két módszer foglalkozik az anyagok fizikai-kémiai jellemzőinek meghatározásával: az egyik a vízben való oldhatóság meghatározási módszerének átdolgozása, a másik pedig egy új, a perzisztens, bioakkumulatív és mérgező anyagok megoszlási hányadosának meghatározására szolgáló módszer; további négy új és egy átdolgozott módszer az anyagok ökotoxicitásának, valamint környezeti sorsának és viselkedésének meghatározására szolgál; a fennmaradó kilenc pedig a toxicitás és más egészségi hatások meghatározására vonatkozik: négy közülük – három átdolgozás és egy új módszer – az inhalációs toxicitás mérését szolgálja, és a felhasznált állatok számának csökkentése mellett a hatások értékelését is javítja, egy további átdolgozás az ismételt adagolású 28 napos orális toxicitásvizsgálatot egészíti ki az endokrin aktivitás értékelését szolgáló paraméterekkel, egy további átdolgozás a toxikológiai vizsgálatok megtervezését és értelmezését segítő toxikokinetikai vizsgálatot, a fennmaradó változtatások pedig a krónikus toxicitás vizsgálati módszerét, a rákkeltő hatás vizsgálati módszerét, valamint a krónikus toxicitás és a rákkeltő hatás együttes vizsgálatának módszerét érintik.
(4)
A 440/2008/EK rendeletet ezért megfelelően módosítani kell.
(5)
Az e rendeletben előírt intézkedések összhangban vannak az 1907/2006/EK rendelet 133. cikke alapján létrehozott bizottság véleményével,
ELFOGADTA EZT A RENDELETET:
1. cikk
A 440/2008/EK rendelet melléklete e rendelet mellékletének megfelelően módosul.
2. cikk
Ez a rendelet az Európai Unió Hivatalos Lapjában való kihirdetését követő harmadik napon lép hatályba.
Ez a rendelet teljes egészében kötelező és közvetlenül alkalmazandó valamennyi tagállamban.
A 440/2008/EK rendelet melléklete a következőképpen módosul:
1.
Az A.6. fejezet helyébe a következő szöveg lép:
„A.6. OLDHATÓSÁG VÍZBEN
BEVEZETÉS
1.
A jelen vizsgálati módszer egyenértékű az OECD 105. vizsgálati iránymutatásában (1995) leírt módszerrel. A vizsgálati módszer az eredeti, 1981-ben elfogadott 105. vizsgálati iránymutatás átdolgozott változata. A jelenlegi és az 1981. évi változat között tartalmi különbség nincs. A módosítások elsősorban formai jellegűek. Az átdolgozás alapjául az »Oldhatóság vízben« elnevezésű európai uniós vizsgálati módszer szolgált (1).
KIINDULÁSI MEGFONTOLÁSOK
2.
Egy anyag vízoldékonyságát jelentősen befolyásolhatja a szennyeződések jelenléte. Ez a vizsgálati módszer a lényegében tiszta, vízben stabil, nem illékony anyagok vízoldékonyságának megállapítására szolgál. A vízoldékonyság megállapítása előtt érdemes előzetes információkat szerezni a vizsgált anyagról, például annak szerkezeti képletéről, gőznyomásáról, disszociációs állandójáról és a pH függvényében kifejezett hidrolíziséről.
3.
Ez a vizsgálati módszer két, a 10–2 g/l alatti, illetve feletti oldhatóságra kiterjedő módszer – az oszlopelúciós és a lombikmódszer – leírását foglalja magában. Tartalmazza emellett egy egyszerű előzetes vizsgálat leírását is. Ez utóbbi lehetővé teszi a végleges vizsgálathoz használandó minta megfelelő mennyiségének hozzávetőleges meghatározását, valamint a telítettség eléréséhez szükséges idő megállapítását.
FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK ÉS MÉRTÉKEGYSÉGEK
4.
Valamely anyag vízoldékonysága az anyag adott hőmérsékleten vízben fennálló telítettségi tömegkoncentrációját jelenti.
5.
A vízoldékonyságot oldott anyag tömege/oldattérfogat egységekben fejezik ki. Az SI-mértékegység a kg/m3, azonban a g/l is használható.
REFERENCIAANYAGOK
6.
Az anyagok vizsgálata során nem szükséges referenciaanyagokat alkalmazni.
A MÓDSZEREK LEÍRÁSA
Vizsgálati körülmények
7.
A vizsgálatot lehetőleg 20 ± 0,5 °C hőmérsékleten kell végrehajtani. A kiválasztott hőmérsékletet állandó értéken kell tartani a berendezés minden lényeges részében.
Előzetes vizsgálat
8.
Körülbelül 0,1 g, csiszolt üvegdugójú, 10 ml-es mérőhengerben lévő mintához (ha a vizsgált anyag szilárd, porítani kell) adjunk hozzá fokozatosan egyre nagyobb térfogatú, szobahőmérsékletű vizet. Minden egyes vízmennyiség hozzáadása után a keveréket 10 percig rázzuk, és szemrevételezéssel ellenőrizzük, hogy vannak-e a mintának fel nem oldott részei. Amennyiben 10 ml víz hozzáadása után a minta vagy annak egyes részei nem oldódtak fel, a kísérletet 100 ml-es mérőhengerben kell folytatni. A lenti 1. táblázatban látható az oldhatóság közelítőleges értéke azon vízmennyiség alatt, amelyben a minta teljesen feloldódik. Alacsony oldhatóság esetében a vizsgált anyag feloldása hosszú időt vehet igénybe, és ez esetben legalább 24 órát kell várni. Ha a vizsgált anyag 24 óra elteltével sem oldódott fel, hosszabb ideig (akár 96 óráig) kell várni, vagy további hígítással próbálkozva meg kell állapítani, hogy az oszlopelúciós vagy a lombikmódszer alkalmazandó-e.
1.táblázat
ml víz 0,1 g oldott anyaghoz
0,1
0,5
1
2
10
100
> 100
közelítőleges oldhatóság (g/l)
> 1 000
1 000 –200
200–100
100–50
50–10
10–1
< 1
Oszlopelúciós módszer
Elv
9.
Ez a módszer a vizsgált anyag vízzel, mikrooszlopból végrehajtott elúcióján alapul; az oszlop a vizsgált anyag feleslegével előzetesen bevont inert hordozóanyaggal van megtöltve (2). A vízoldékonyságot az eluátum tömegkoncentrációja határozza meg, amikor az koncentrációplatót ér el az idő függvényében.
Készülék
10.
A készülék egy állandó hőmérsékleten tartott mikrooszlopból áll (1. ábra). A mikrooszlop vagy egy újrakeringtető szivattyúhoz (2. ábra), vagy egy kiegyenlítő tartályhoz (3. ábra) csatlakozik. A mikrooszlop inert hordozóanyagot tartalmaz, amelyet egy, a részecskék kiszűrésére is szolgáló, kisméretű üveggyapotdugó rögzít. Hordozóanyagként üveggyöngy, kovaföld vagy egyéb inert anyagok alkalmazhatók.
11.
Az 1. ábrán egy, az újrakeringtető szivattyúhoz való csatlakoztatásra alkalmas mikrooszlop látható. A mikrooszlop öt (a kísérlet elején kiöntött) tartálytérfogat és öt (a kísérlet során elemzési célból eltávolított) minta tárolására alkalmas töltőtérrel rendelkezik. Más megoldásként kisebb méret is alkalmazható, ha a kísérlet során víz tölthető a rendszerbe a szennyeződésekkel eltávolított öt kezdeti tartálytérfogat pótlására. Az oszlop inert anyagból készült csövön keresztül csatlakozik a körülbelül 25 ml/h áramlási sebesség elérésére képes újrakeringtető szivattyúhoz. Az újrakeringtető szivattyú például perisztaltikus szivattyú vagy membránszivattyú lehet. Gondoskodni kell arról, hogy a cső anyaga ne okozzon semmilyen szennyeződést és/vagy adszorpciót.
12.
A 3. ábrán egy kiegyenlítő tartályt alkalmazó megoldás vázlatos elrendezése látható. Ebben az elrendezésben a mikrooszlop egyirányú üvegcsappal van ellátva. A kiegyenlítő tartállyal való összeköttetést egy csiszolt üvegből készült csatlakozó és inert anyagból készült csővezeték biztosítja. A kiegyenlítő tartályból való áramlás sebessége körülbelül 25 ml/óra kell, hogy legyen.
1.ábra
2.ábra
3.ábra
13.
Töltsünk körülbelül 600 mg hordozóanyagot egy 50 ml-es gömblombikba. Oldjunk fel kellő mennyiségű vizsgált anyagot analitikai tisztaságú illékony oldószerben, és ebből az oldatból megfelelő mennyiséget adjunk hozzá a hordozóanyaghoz. Az oldószert teljesen párologtassuk el, például forgó párologtatóval, mivel egyébként az elúciós lépés során a felületen jelentkező megoszlás miatt nem érhető el a hordozóanyag vízzel történő telítése. A megtöltött hordozóanyagot két órán át áztassuk körülbelül 5 ml vízben, és ezután a szuszpenziót töltsük a mikrooszlopba. Más megoldásként száraz megtöltött hordozóanyag önthető a vízzel teli mikrooszlopba, és körülbelül két óra alatt hozható egyensúlyba.
14.
A hordozóanyag megtöltése problémákat, és következésképpen hibás eredményeket okozhat, például ha a vizsgált anyag olajos fázisként leülepszik. Ezeket a problémákat ki kell vizsgálni, és a részleteket jegyzőkönyvbe kell venni.
Eljárás újrakeringtető szivattyú használata esetén
15.
Indítsuk el az áramlást az oszlopon keresztül. Az ajánlott áramlási sebesség körülbelül 25 ml/óra, ami az itt leírt oszlop esetében 10 tartálytérfogat/óra sebességnek felel meg. Legalább az első öt tartálytérfogatot öntsük ki, hogy eltávolítsuk a vízben oldható szennyeződéseket. Ezt követően a szivattyút az egyensúlyi állapot létrejöttéig hagyjuk működni öt olyan, egymást követő, véletlenszerűen választott minta felhasználásával, amelyek koncentrációja nem tér el egymástól ± 30 %-nál nagyobb mértékben. E minták levétele között legalább tíz tartálytérfogat áthaladásának megfelelő időnek kell eltelnie. Az alkalmazott analitikai módszertől függően ajánlatos lehet az egyensúlyi állapot létrejöttét koncentráció/idő görbével ábrázolni.
Eljárás kiegyenlítő tartály használata esetén
16.
Az egymást követő eluátumfrakciókat össze kell gyűjteni, és elemezni kell a kiválasztott módszerrel. Az oldhatóság meghatározására abból a középső eluátumtartományból származó frakciókat használjuk, ahol a koncentrációk legalább öt egymást követő frakcióban ± 30 %-on belül állandóak.
17.
Az ajánlott eluáló anyag a kétszer desztillált víz. 10 megohm/cm feletti ellenállású és 0,01 % alatti összes szerves széntartalmú deionizált víz is használható.
18.
Mindkét eljárás esetében egy második méréssorozatot is végre kell hajtani az első méréssorozat áramlási sebességének felét alkalmazva. Amennyiben a két méréssorozat eredményei megegyeznek egymással, a vizsgálat kielégítő. Ha a kisebb áramlási sebesség mellett nagyobb a mért oldhatóság, az áramlási sebesség felezését folytatni kell, amíg két egymást követő méréssorozat azonos oldhatóságot nem ad.
19.
Mindkét eljárás során a Tyndall-jelenség előfordulásának vizsgálatával ellenőrizni kell, hogy a frakciókban nincs-e jelen kolloidanyag. Részecskék jelenléte esetén a vizsgálat érvénytelennek tekintendő, és az oszlop szűrési hatásának javítását követően megismétlendő.
20.
Meg kell mérni minden egyes minta pH-ját, lehetőleg különleges indikátorpapírral.
Lombikmódszer
Elv
21.
A vizsgált anyagot (a szilárd anyagokat porítani kell) oldjuk fel a vizsgálati hőmérsékletnél némileg magasabb hőmérsékletű vízben. A telítés elérésekor hűtsük le a keveréket, és tartsuk a vizsgálati hőmérsékleten. Más megoldásként – ha megfelelő mintavételezéssel meggyőződtünk a telítettségi egyensúly létrejöttéről – a mérés közvetlenül a vizsgálati hőmérsékleten is végrehajtható. Ezt követően alkalmas analitikai módszerrel határozzuk meg a vizsgált anyag tömegkoncentrációját a vizes oldatban, amely nem tartalmazhat fel nem oldott részecskét (3).
Készülék
22.
A következő felszerelések szükségesek:
—
szokásos laboratóriumi üvegeszközök és műszerek,
—
oldatok szabályozott, állandó hőmérséklet melletti keverésére alkalmas készülék,
—
centrifuga (lehetőleg szabályozott hőmérsékletű), ha emulziókhoz szükséges, és
—
analitikai felszerelés.
Eljárás
23.
Az előzetes vizsgálat alapján becsléssel határozzuk meg a vizsgált anyag kívánt vízmennyiség telítéséhez szükséges mennyiségét. E mennyiségnek körülbelül ötszörösét mérjük be a három, becsiszolt üvegdugóval felszerelt üvegedénybe (például centrifuga-kémcsőbe, lombikba). Az analitikai módszer és az oldhatósági tartomány függvényében kiválasztott vízmennyiséget töltsük be az egyes edényekbe. Az edényeket szorosan dugózzuk le, majd 30 °C hőmérsékleten rázzuk össze. Állandó hőmérsékleten való működésre képes rázó- vagy keverőkészüléket, például szabályozott hőmérsékletű vízfürdőben elhelyezett mágneses keverőberendezést kell használni. Egy nap eltelte után az egyik edényt vizsgálati hőmérsékleten 24 óráig hagyjuk egyensúlyi állapotba állni, és időnkénti rázzuk fel. Az edény tartalmát ezután vizsgálati hőmérsékleten centrifugáljuk, és alkalmas analitikai módszerrel határozzuk meg a vizsgált anyag koncentrációját a tiszta, átlátszó vizes fázisban. A másik két lombikot hasonlóan kezeljük a kezdeti, 30 °C hőmérsékleten két, illetve három napon át végrehajtott egyensúlyba hozatal után. Amennyiben legalább az utolsó két edény vizsgálata során mért koncentrációk legfeljebb 15 %-kal térnek el egymástól, a vizsgálat kielégítő. Ha az 1., 2. és 3. edényből kapott eredmények növekvő tendenciájúak, a teljes vizsgálatot meg kell ismételni hosszabb egyensúlyba hozatali idő alkalmazásával.
24.
A vizsgálat 30 °C-on végrehajtott előzetes inkubáció nélkül is végrehajtható. A telítési egyensúly beállítása sebességének becsléséhez vegyünk mintákat mindaddig, amíg a keverési idő már nincs hatással a mért koncentrációra.
25.
Meg kell mérni minden egyes minta pH-ját, lehetőleg különleges indikátorpapírral.
Analitikai meghatározások
26.
Előnyben részesítendő az anyagspecifikus módszer, mivel a kis mennyiségekben jelen lévő oldható szennyeződések jelentős hibákat okozhatnak a mért oldhatóságban. Ilyen módszer például a gáz- vagy folyadékkromatográfia, a titrálás, a fotometria, a voltametria.
ADATOK ÉS JEGYZŐKÖNYVEZÉS
Adatok
Oszlopelúciós módszer
27.
Minden egyes méréssorozatból ki kell számítani a telítési plató legalább öt egymást követő mintájának középértékét, valamint a szórást. A különböző áramlási sebességgel végrehajtott két vizsgálatban kapott középértékek legfeljebb 30 %-kal térhetnek el egymástól.
Lombikmódszer
28.
A három lombiknál kapott egyes eredményeket, amelyek legfeljebb 15 %-kal térhetnek el egymástól, átlagoljuk.
Vizsgálati jegyzőkönyv
Oszlopelúciós módszer
29.
A vizsgálati jegyzőkönyvnek a következő információkat kell tartalmaznia:
—
az előzetes vizsgálat eredményei,
—
kémiai azonosság és szennyeződések (adott esetben az előzetes tisztítási művelet),
—
minden egyes minta koncentrációja, áramlási sebessége és pH-ja,
—
minden egyes méréssorozat telítettségi platója legalább öt mintájának középértékei és szórása,
—
legalább két egymást követő méréssorozat átlaga,
—
a víz hőmérséklete a telítési folyamat során,
—
az elemzési módszer,
—
a hordozóanyag jellege
—
a hordozóanyag betöltése,
—
a felhasznált oldószer,
—
az anyag vizsgálat során észlelt bármilyen kémiai instabilitásának bizonyítéka,
—
az eredmények értelmezése szempontjából lényeges minden információ, különösen a vizsgált anyag szennyeződéseivel és halmazállapotával kapcsolatban.
Lombikmódszer
30.
A vizsgálati jegyzőkönyvnek a következő információkat kell tartalmaznia:
—
az előzetes vizsgálat eredményei,
—
kémiai azonosság és szennyeződések (adott esetben az előzetes tisztítási művelet),
—
az egyes analitikai meghatározások és azok átlagai, ha egynél több értéket határoztunk meg az egyes lombikokhoz,
—
minden minta pH-ja,
—
az egymással egyező, különböző lombikokból kapott értékek átlaga,
—
a vizsgálati hőmérséklet,
—
az analitikai módszer,
—
az anyag vizsgálat során észlelt bármilyen kémiai instabilitásának bizonyítéka,
—
az eredmények értelmezése szempontjából lényeges minden információ, különösen a vizsgált anyag szennyeződéseivel és halmazállapotával kapcsolatban.
SZAKIRODALOM
(1)
A Bizottság 1992. július 31-i 92/69/EGK irányelve a veszélyes anyagok osztályozására, csomagolására és címkézésére vonatkozó törvényi, rendeleti és közigazgatási rendelkezések közelítéséről szóló 67/548/EGK tanácsi irányelvnek a műszaki fejlődéshez történő tizenhetedik hozzáigazításáról, HL L 383., 1992.12.29., 113. o.
(2)
NF T 20-045 (AFNOR) (September 1985). Chemical products for industrial use – Determination of water solubility of solids and liquids with low solubility – Column elution method
(3)
NF T 20-046 (AFNOR) (September 1985). Chemical products for industrial use – Determination of water solubility of solids and liquids with high solubility – Flask method”
2.
A melléklet a következő A.23. fejezettel egészül ki:
„A.23. MEGOSZLÁSI HÁNYADOS (1-OKTANOL/VÍZ): LASSÚ KEVERÉSES MÓDSZER
BEVEZETÉS
1.
A jelen vizsgálati módszer egyenértékű az OECD 123. vizsgálati iránymutatásában (2006) leírt módszerrel. A lassú keveréses módszert sikerrel alkalmazták az 1-oktanol/víz megoszlási hányados (POW) pontos meghatározására log POW = 8,2 értékig (1). Ez a kísérleti megközelítés éppen ezért alkalmas az erősen hidrofób anyagok POW értékének közvetlen meghatározására.
2.
Az 1-oktanol/víz megoszlási hányados (POW) meghatározásának egyéb módszerei a lombikrázásos módszer (2), valamint a POW fordított fázisú nagynyomású folyadékkromatográfiával (HPLC) kapott retencióból történő meghatározása (3). A lombikrázásos módszernél az oktanol-mikrocseppek vizes fázisba való átkerülése miatt fennáll a torzított mérési eredmények veszélye. Minél nagyobb a POW értéke, annál inkább előfordulhat e cseppek vizes fázisban való jelenléte miatt a vizsgált anyag vízben oldott koncentrációjának túlbecslése. Éppen ezért e módszer alkalmazása a 4-nél kisebb log POW értékű anyagokra korlátozódik. A második módszer közvetlen módon meghatározott, konkrét POW-adatokat használ a HPLC technikával megállapított retenciós viselkedés és a mért POW értékek közötti összefüggés kalibrálással való meghatározásához. Az ionizálható anyagok 1-oktanol/víz megoszlási hányadosának meghatározásához állt ugyan rendelkezésre OECD-iránymutatástervezet (4), ez azonban már nem alkalmazható.
3.
A jelen vizsgálati módszert Hollandiában dolgozták ki. Az itt leírt vizsgálatok precizitását egy 15 laboratórium részvételével végzett validációs körvizsgálati tanulmány keretében validálták és optimalizálták (5).
KIINDULÁSI MEGFONTOLÁSOK
Szignifikancia és alkalmazási terület
4.
Inert szerves anyagoknál erősen szignifikáns összefüggést mutattak ki az 1-oktanol/víz megoszlási hányados (POW) és az anyag halakban történő bioakkumulációja között. Ezen túlmenően összefüggést találtak a POW és a halakra gyakorolt toxikus hatás, valamint a vegyi anyagok szilárd anyagok, például talaj és üledékek általi felvétele között. A hivatkozott irodalom (6) széles körű áttekintést nyújt ezen összefüggésekről.
5.
Számos különböző összefüggést állapítottak meg az 1-oktanol/víz megoszlási hányados és az anyagok környezeti toxikológia és kémia szempontjából lényeges egyéb tulajdonságai között. Ennek következtében az 1-oktanol/víz megoszlási hányados meghatározó paraméterré vált a vegyi anyagok környezeti kockázatának értékelése, valamint a vegyi anyagok környezeti sorsának előrejelzése szempontjából.
Alkalmazási kör
6.
A lassú keveréses kísérlet során feltételezhetően kisebb mértékű a mikrocseppek 1-oktanol-cseppekből való képződése a vizes fázisban. Ennek következtében nem fordul elő a vízben oldott koncentrációnak a vizsgált anyag e cseppekhez kötődő molekulái miatti túlbecslése. A lassú keveréses módszer éppen ezért különösen alkalmas az 5 vagy annál nagyobb várt log POW értékű anyagok POW értékének meghatározására, amelyeknél a lombikrázásos módszer (2) gyakran ad hibás eredményeket.
FOGALOMMEGHATÁROZÁS ÉS MÉRTÉKEGYSÉGEK
7.
Egy adott anyag víz és lipofil oldószer (1-oktanol) közötti megoszlási hányadosa a vegyi anyag két fázis közötti egyensúlyi megoszlását írja le. A víz és 1-oktanol közötti megoszlási hányados (POW) a vizsgált anyag vízzel telített 1-oktanolban (CO) és 1-oktanollal (CW) telített vízben fennálló egyensúlyi koncentrációinak hányadosát jelenti.
Koncentrációhányados lévén dimenzió nélküli szám. A legtöbb esetben 10-es alapú logaritmusként (log POW) adják meg. A POW hőmérsékletfüggő, ezért a jegyzőkönyvezett adatok között szerepelnie kell a mérési hőmérsékletnek.
A MÓDSZER ELVE
8.
A megoszlási hányados meghatározásához a vizet, az 1-oktanolt és a vizsgált anyagot állandó hőmérsékleten egyensúlyba hozzuk egymással. Ezt követően meghatározzuk a vizsgált anyag koncentrációját a két fázisban.
9.
Az itt javasolt lassú keveréses módszerrel csökkenthetők a lombikrázásos kísérlet során jelentkező mikrocseppképződéssel összefüggő kísérleti nehézségek. A lassú keveréses kísérlet során vizet, 1-oktanolt és vizsgált anyagot hozunk egyensúlyba egy termosztátos keverőreaktorban. A fázisok közötti anyagmozgást keveréssel gyorsítjuk. A keverés korlátozott turbulenciával jár, ami mikrocseppek képződése nélkül fokozza az 1-oktanol és a víz közötti anyagmozgást (1).
A VIZSGÁLAT ALKALMAZHATÓSÁGA
10.
Mivel a vizsgált anyagtól eltérő anyagok jelenléte befolyásolhatja a vizsgált anyag aktivitási együtthatóját, a vizsgált anyagot tiszta formában kell vizsgálni. Az 1-oktanol/víz kísérlethez a kereskedelmi forgalomban kapható legnagyobb tisztaságú anyagot kell felhasználni.
11.
A jelen módszer tiszta anyagokra vonatkozik, amelyeknél nem figyelhető meg disszociáció vagy asszociáció, illetve jelentős mértékű határfelületi aktivitás. A módszerrel az ilyen anyagok, valamint a keverékek 1-oktanol/víz megoszlási hányadosa határozható meg. Amennyiben a módszert keverékeknél alkalmazzuk, a megállapított 1-oktanol/víz megoszlási hányados feltételesnek tekintendő, és függ a vizsgált keverék kémiai összetételétől, valamint a vizes fázisként alkalmazott elektrolit-összetételtől. A módszer disszociáló vagy asszociáló vegyületekre is alkalmazható, ugyanakkor ez esetben további műveleteket kell elvégezni (12. bekezdés).
12.
Mivel a disszociáló anyagok – például szerves savak és fenolok, szerves lúgok, valamint szerves fémvegyületek – 1-oktanol/víz megoszlása során vízben és 1-oktanolban több egyensúlyi állapot jön létre, az 1-oktanol/víz megoszlási hányados feltételes állandó, amely nagymértékben függ az elektrolit összetételétől (7) (8). Az 1-oktanol/víz megoszlási hányados meghatározásához éppen ezért a kísérlet során szabályozni és jegyzőkönyvezni kell a pH-t és az elektrolit összetételét. E megoszlási hányadosok értékelésekor szakértői megítélésre kell támaszkodni. A disszociációs állandó(k) értéke alapján alkalmas pH-értékeket kell kiválasztani úgy, hogy minden egyes ionizációs állapothoz meghatározható legyen a megoszlási hányados. A szerves fémvegyületek vizsgálatához olyan puffereket kell használni amelyekben nem képződnek komplex vegyületek (8). A kísérleti feltételeket a vizes fázisról rendelkezésre álló kémiai ismeretek (komplexképzési állandók, disszociációs állandók) figyelembevételével oly módon kell kiválasztani, hogy megbecsülhető legyen a vizsgált anyagból a vizes fázisban keletkező változatok megjelenése. Háttérelektrolit használatával minden kísérlet során azonos ionerősséget kell biztosítani.
13.
Alacsony vízoldékonysággal vagy magas POW értékkel rendelkező anyagok vizsgálata során nehézségek merülhetnek fel, mivel a vízben oldott koncentráció ez esetben olyan alacsony, hogy nehéz pontosan meghatározni. Ez a vizsgálati módszer útmutatást ad az említett probléma kezeléséhez.
INFORMÁCIÓK A VIZSGÁLT ANYAGRÓL
14.
Analitikai vagy annál nagyobb tisztasági fokú kémiai reagenseket kell alkalmazni. Javasolt jelöletlen, ismert kémiai összetételű, lehetőség szerint legalább 99 %-os tisztaságú vizsgált anyagokat, vagy radioaktívan jelölt, ismert kémiai összetételű, radiokémiai tisztaságú vizsgált anyagokat használni. Rövid felezési idejű nyomjelző elem használata esetén korrekciókat kell végezni a bomlás figyelembevétele érdekében. Radioaktívan jelölt vizsgált anyag esetén az adott vegyi anyagra specifikus analitikai módszert kell alkalmazni annak érdekében, hogy a mért radioaktivitás közvetlenül a vizsgált anyaghoz kötődjön.
15.
A log POW becslése kereskedelmi forgalomban kapható, a log POW becslésére szolgáló szoftverrel, vagy a két oldószerben mérhető oldékonyság hányadosa alapján végezhető el.
16.
A POW meghatározására szolgáló, lassú keveréses kísérlet elvégzése előtt a vizsgált anyagról az alábbi információknak kell rendelkezésre állniuk:
a)
szerkezeti képlet;
b)
az anyag vízben és 1-oktanolban oldott koncentrációjának meghatározására alkalmas analitikai módszerek;
c)
ionizálható anyagok esetén a disszociációs állandó(k) (112. OECD-iránymutatás (9));
d)
vízoldékonyság (10);
e)
abiotikus hidrolízis (11);
f)
gyors biológiai lebonthatóság (12);
g)
gőznyomás (13).
A MÓDSZER LEÍRÁSA
Felszerelések és készülékek
17.
Általános laboratóriumi felszerelések, így különösen a következők szükségesek:
—
mágneses keverők és teflonbevonatú mágneses keverőrudak a vizes fázis keveréséhez,
—
a vizsgált anyag várható koncentrációjának meghatározására alkalmas analitikai műszerek,
—
alul csappal ellátott keverőedény. A becsült log POW értéktől és a vizsgált vegyület kimutatási határától (LOD) függően megfontolandó egy ugyanolyan geometriai kialakítású, 1 liternél nagyobb kapacitású reakcióedény használata, hogy kellő mennyiségű víz álljon rendelkezésre a kémiai extraháláshoz és elemzéshez. Ez magasabb koncentrációt eredményez a kivett vízmintában, és következésképpen megbízhatóbb analitikai meghatározást tesz lehetővé. A szükséges térfogat becsült minimális értékét, a vegyület LOD-ját és becsült log POW értékét, valamint vízoldékonyságát az 1. függelék táblázata tartalmazza. A táblázat a log POW és az oktanolban és vízben való oldhatóság hányadosa közötti, Pinsuwan és munkatársai által bemutatott összefüggésen (14) alapul:
ahol
(molaritásban kifejezve),
a táblázat alapjául szolgál továbbá a Lyman által a vízoldékonyság előrejelzéséhez megadott összefüggés (15) is. Az 1. függelékben szereplő egyenlettel kiszámított vízoldékonysági értékeket első közelítésnek kell tekinteni. Megjegyzendő, hogy a vizsgálatot végző személy a vízoldékonyságot bármilyen, a víztaszító képesség és az oldékonyság közötti kapcsolat ábrázolására alkalmasabbnak tekintett összefüggés alapján is megbecsülheti. Szilárd vegyületek esetén például ajánlott az oldékonyság előrejelzése során az olvadáspontot is figyelembe venni. Módosított egyenlet alkalmazása esetén meg kell bizonyosodni arról, hogy az oktanolban való oldhatóság számítására szolgáló egyenlet módosítva is érvényes. A 2. függelék tartalmazza egy körülbelül 1 liter térfogatú, kettősfalú üveg keverőedény vázlatrajzát. A 2. függelékben ábrázolt edény arányai előnyösnek bizonyultak, és eltérő méretű eszköz használata esetén is célszerű megtartani azokat,
—
a lassú keveréses kísérlet során alapvető fontosságú az állandó hőmérsékletet biztosító eszköz használata.
18.
Inert anyagból készült edényeket kell használni, hogy az edény felületén elhanyagolható mértékű adszorpció jelentkezzen.
A vizsgált oldatok előkészítése
19.
A POW meghatározásához a kereskedelmi forgalomban kapható legnagyobb (legalább 99 %-os) tisztaságú 1-oktanolt kell használni. Ajánlott az 1-oktanolt savval, lúggal és vízzel végzett extrakció, majd pedig szárítás útján tisztítani. Az 1-oktanol ezenkívül desztillálással is tisztítható. A tisztított 1-oktanolt a vizsgált anyagok standard oldatainak elkészítésére kell felhasználni. A POW meghatározásához üveg- vagy kvarcedényben desztillált, vagy tisztítórendszerrel nyert vizet kell használni, illetve használható HPLC-tisztaságú víz is. Desztillált víz esetén 0,22 μm-es szűrővel végzett szűrés szükséges, továbbá vakmintákat is kell készíteni annak ellenőrzése érdekében, hogy a koncentrált kivonatokban nincs-e jelen a vizsgált anyagot esetlegesen befolyásoló szennyeződés. Üvegszálas szűrő használata esetén a szűrőt három órán keresztül 400 °C hőmérsékleten végzett hőkezeléssel kell tisztítani.
20.
A kísérlet előtt mindkét oldószert kölcsönösen telítsük egymással úgy, hogy megfelelő méretű edényben egyensúlyi állapotba hozzuk azokat. Ez a kétfázisú rendszer két napon át tartó lassú keverésével történik.
21.
Válasszuk ki a vizsgált anyag megfelelő koncentrációját, és ennek megfelelő anyagmennyiséget oldjunk fel (vízzel telített) 1-oktanolban. Az 1-oktanol/víz megoszlási hányadost híg 1-oktanolos és vizes oldatban kell meghatározni. A vizsgált anyag koncentrációja ezért az egyes fázisokban nem haladhatja meg az oldhatóság 70 %-át, és legfeljebb 0,1 mól lehet (1). A kísérlet során használt 1-oktanol-oldatok nem tartalmazhatnak lebegő, szilárd vizsgált anyagot.
22.
Megfelelő mennyiségű vizsgált anyagot oldjunk fel (vízzel telített) 1-oktanolban. Ha a log POW becsült értéke 5-nél nagyobb, ügyelni kell arra, hogy a kísérlet során használt 1-oktanolos oldatok ne tartalmazzanak lebegő, szilárd vizsgált anyagot. Ennek érdekében az 5-nél nagyobb becsült log POW értékű vegyi anyagok esetében az alábbi eljárást kell alkalmazni:
—
a vizsgált anyagot oldjuk fel (vízzel telített) 1-oktanolban,
—
várjuk meg, amíg az oldatból a lebegő szilárd anyag kiülepedik. Az ülepítés ideje alatt kísérjük figyelemmel a vizsgált anyag koncentrációját,
—
miután az 1-oktanolos oldatban mért koncentráció megállapodik egy stabil értéken, a törzsoldatot hígítsuk megfelelő mennyiségű 1-oktanollal,
—
mérjük meg a hígított törzsoldat koncentrációját. Ha a mért koncentráció összhangban van a hígítás mértékével, a hígított törzsoldat felhasználható a lassú keveréses kísérlethez.
A minták extrahálása és elemzése
23.
Az anyag vizsgálatához validált analitikai módszert kell alkalmazni. A vizsgálatot végző személyeknek bizonyítaniuk kell, hogy a vízzel telített 1-oktanol, valamint az 1-oktanollal telített víz fázisban a kísérlet során mért koncentrációk az alkalmazott analitikai eljárások mennyiségi kimutatásának módszertani határértéke fölött vannak. Amennyiben extrahálási módszerek szükségesek, a vizsgált anyag vizes és 1-oktanolos fázisból történő analitikai visszanyerését a kísérlet előtt meg kell állapítani. Az analitikai jelet vakmintákkal korrigálni kell, és ügyelni kell arra, hogy az analit ne kerüljön át az egyik mintából a másikba.
24.
A hidrofób vizsgált anyagok vizes fázisban fennálló meglehetősen alacsony koncentrációja miatt az elemzés előtt valószínűleg el kell végezni a vizes fázis szerves oldószerrel történő extrahálását, és az extraktumot be kell töményíteni. Ugyanezen okból csökkenteni kell az esetleges vakminták koncentrációját. Ennek érdekében magas tisztasági fokú, lehetőség szerint szermaradék-elemzésre szolgáló oldószereket kell alkalmazni. A keresztszennyeződés ezenkívül előzőleg alaposan megtisztított(például oldószerrel kimosott vagy magas hőmérsékleten hőkezelt) üvegeszközök használatával is elkerülhető.
25.
A log POW becsült értéke becslési programmal vagy szakértői megítélés alapján kapható meg. Ha az érték 6-nál nagyobb, a vakmintákkal való korrekciókat és az analit áthordását szorosan figyelemmel kell kísérni. Hasonlóképpen, ha a log POW 6-nál nagyobb, a magas betöményítési tényezők elérése érdekében kötelező helyettesítő standardot alkalmazni a visszanyeréssel való korrekciókhoz. A kereskedelmi forgalomban több szoftverprogram is kapható a log POW becsléséhez, (1) például Clog P (16), KOWWIN (17), ProLogP (18) és ACD log P (19). A becslési módszerek leírása a hivatkozott irodalomban olvasható (20–22).
26.
A vizsgált anyag 1-oktanolban és vízben oldott mennyiségének megállapításához használt mennyiségi meghatározási határértékeket (LOQ) elfogadott módszerek alapján kell meghatározni. Általános szabályként a mennyiségi meghatározás módszerspecifikus határértéke akként a vízben vagy 1-oktanolban oldott koncentrációként határozható meg, amely 10-es jel/zaj arányt eredményez. Megfelelő extrahálási és betöményítési módszert kell kiválasztani, továbbá meg kell határozni az analitikai visszanyeréseket is. Megfelelő betöményítési tényezőt válasszunk ki annak érdekében, hogy az analitikai meghatározás eredményeként szükséges nagyságú jelet kapjunk.
27.
Az analitikai módszer paraméterei és a várt koncentrációk alapján határozzuk meg a vegyület pontos koncentrációjának megállapításához szükséges hozzávetőleges mintaméretet. Kerülendő az olyan vizes minták használata, amelyek túl kis mennyiségűek ahhoz, hogy megfelelő analitikai jelet adjanak. Kerülendő továbbá a túl nagy méretű vízminták használata, mivel ellenkező esetben túl kevés víz maradhat a minimális számú (n = 5) elemzés elvégzéséhez. Az 1. függelék az edény térfogatának, valamint a vizsgált anyag LOD értékének és oldhatóságának függvényében adja meg a minimális mintamennyiséget.
28.
A vizsgált anyagok mennyiségi meghatározása az adott vegyület kalibrálási görbéivel való összehasonlítás alapján történik. Az elemzett mintákban oldott koncentrációknak a standardok koncentrációi közé kell esniük.
29.
Hatnál nagyobb becsült log POW értékű vizsgált anyagok esetén az extrahálás előtt helyettesítő standardot kell a vízmintához adni, hogy a vízminták extrahálása és betöményítése során történő veszteségek észlelhetők legyenek. A visszanyeréssel való pontos korrekció érdekében a helyettesítő standardoknak a vizsgált anyagéihoz nagyon hasonló vagy azokkal azonos tulajdonságokkal kell rendelkezniük. Erre a célra lehetőség szerint a vizsgált anyagok izotóppal jelölt (stabil) (például deutériumos vagy C13 izotóppal jelölt) analógjait kell használni. Amennyiben jelölt stabil izotópok – azaz C13 vagy H2 – használatára nincs lehetőség, a szakirodalomban közzétett megbízható adatok alapján igazolni kell, hogy a helyettesítő standard fizikai és kémiai tulajdonságai nagyon hasonlóak a vizsgált anyagéihoz. A vizes fázis folyadék-folyadék extrakciója során emulziók képződhetnek. Ez csökkenthető, ha sót adunk a mintához, és hagyjuk az emulziót egy éjszakán át ülepedni. A minták extrahálására és betöményítésére alkalmazott módszereket jegyzőkönyvezni kell.
30.
Az 1-oktanolos fázisból nyert minták elemzés előtt megfelelő oldószerrel szükség szerint hígíthatók. Ezen túlmenően javasolt a helyettesítő standardok visszanyeréssel való korrekció érdekében történő alkalmazása az olyan anyagok esetén, amelyeknél a visszanyerési kísérletek tekintetében nagymértékű variáció (10 %-nál nagyobb relatív szórás) volt tapasztalható.
31.
Az analitikai módszer részleteit jegyzőkönyvezni kell. Ebbe beleértendő az extrakciós módszer, a betöményítési és hígítási tényező, a műszerek paraméterei, a kalibrálási eljárás, a kalibrálási tartomány, a vizsgált anyag vízből való analitikai visszanyerése, helyettesítő standardok visszanyeréssel való korrekció céljából történő alkalmazása, a vakminták értékei, kimutatási határok és mennyiségi meghatározási határértékek.
A vizsgálat végrehajtása
Optimális 1-oktanol/víz térfogatarányok
32.
A víz és az 1-oktanol térfogatának kiválasztásakor figyelembe kell venni az 1-oktanolra és vízre vonatkozó LOQ-t, a vizes mintákra alkalmazott betöményítési tényezőket, az 1-oktanolból és vízből vett minták térfogatát, valamint a várt koncentrációkat. A lassú keveréses rendszerben alkalmazott 1-oktanol térfogatát a kísérlettel összefüggő okokból úgy kell kiválasztani, hogy az 1-oktanol-réteg kellően vastag (> 0,5 cm) legyen ahhoz, hogy az 1-oktanolos fázisból annak felkavarása nélkül lehessen mintát venni.
33.
A 4,5 vagy annál nagyobb log POW értékű vegyületek meghatározásához jellemzően használt fázisarány 20–50 ml 1-oktanol és 950–980 ml víz 1 literes edényben.
Vizsgálati körülmények
34.
A vizsgálat során a reakcióedényt termosztáttal szabályozzuk, hogy a hőmérséklet-ingadozás 1 °C alá csökkenjen. A vizsgálatot 25 °C-on kell elvégezni.
35.
A kísérleti rendszert vagy a kísérlet sötétkamrában való elvégzésével, vagy a reakcióedény alufóliával való bevonásával védeni kell a napfénytől.
36.
A kísérletet (a lehetőségekhez mérten) pormentes környezetben kell elvégezni.
37.
Az 1-oktanol–víz rendszert az egyensúlyi állapot létrejöttéig keverjük. Egy lassú keveréses kísérletet, valamint a vízből és az 1-oktanolból történő, rendszeres időközönkénti mintavételt magában foglaló előkísérlettel mérjük fel az egyensúlyba hozatalhoz szükséges időt. A mintavételi időpontok között legalább öt órának kell eltelnie.
38.
Minden egyes POW-meghatározást legalább három, egymástól független lassú keveréses kísérlettel kell elvégezni.
Az egyensúlyba hozatali idő meghatározása
39.
Abból kell kiindulni, hogy az egyensúlyi állapot akkor jön létre, amikor az 1-oktanol/víz koncentrációs arány idő függvényében meghatározott regressziójának négy megfigyelési időpontot magában foglaló időtartam alatti meredeksége 0,05 értékű p-szint mellett nem tér el szignifikáns mértékben a nullától. A mintavétel megkezdése előtti minimális egyensúlyba hozatali idő egy nap. Általános szabályként az 5-nél kisebb becsült log POW értékű anyagok mintavételezése a második és a harmadik napon végezhető. Víztaszítóbb vegyületek esetén az egyensúlyba hozatalhoz hosszabb időre lehet szükség. Egy 8,23-nál nagyobb log POW értékű vegyület (dekaklór-bifenil) esetén 144 óra elegendőnek bizonyult az egyensúlyi állapot kialakulásához. Az egyensúly értékelése egyetlen edényből végzett ismételt mintavétellel történik.
A kísérlet megkezdése
40.
A kísérlet kezdetekor a reakcióedényt töltsük meg 1-oktanollal telített vízzel. Kellő időt kell hagyni a termosztált hőmérséklet eléréséhez.
41.
A kívánt mennyiségű (szükséges térfogatnyi, vízzel telített 1-oktanolban feloldott) vizsgált anyagot óvatosan töltsük a reakcióedénybe. Ez a kísérlet kritikus lépése, ugyanis kerülendő a két fázis turbulens keveredése. Éppen ezért az 1-oktanolos fázist lassan, a kísérleti edény fala mentén, a vízfelülethez közelről kell pipettával csepegtetni. Az anyag ezt követően lefolyik az üvegfal mentén, és a vizes fázis felett vékony réteget képez. Feltétlenül kerülendő az 1-oktanol közvetlenül a lombikba történő átöntése; az 1-oktanol-cseppek nem hullhatnak közvetlenül a vízbe.
42.
A keverés megkezdését követően a keverési sebességet lassan növelni kell. Ha a keverőmotorok nem állíthatók be megfelelően, transzformátor alkalmazását kell megfontolni. A keverési sebességet úgy kell beállítani, hogy a víz és az 1-oktanol határfelületénél 0,5 és legfeljebb 2,5 cm közötti mélységű örvény alakuljon ki. Ha az örvény mélysége meghaladja a 2,5 cm-t, a keverési sebességet csökkenteni kell, máskülönben az 1-oktanol-cseppekből mikrocseppek képződhetnek a vizes fázisban, ami a vizsgált anyag vízben oldott koncentrációjának túlbecsléséhez vezet. A 2,5 cm mélységű örvényt eredményező keverési sebesség a validációs körvizsgálati tanulmány (5) eredményei alapján ajánlott. Ez a sebesség kompromisszumot jelent az egyensúlyi állapot gyors elérése és az 1-oktanol-mikrocseppek keletkezésének korlátozása között.
Mintavétel és a minták kezelése
43.
A keverőt a mintavétel előtt ki kell kapcsolni, és meg kell várni, amíg a folyadékok mozgása megáll. A mintavétel befejeztével a keverőt alacsony sebességen, a fent leírtaknak megfelelően indítsuk újra, majd a keverési sebességet fokozatosan növeljük.
44.
A vizes fázisból való mintavétel a reakcióedény alján található üvegcsapon keresztül történik. A csapok holttérfogatából származó vizet (a 2. függelékben ábrázolt edény esetén ez körülbelül 5 ml) nem szabad felhasználni. A csapokban lévő víz nem keveredik, így nincs egyensúlyban az elegy főtömegével. A vizes minták térfogatát fel kell jegyezni, és ügyelni kell arra, hogy a fel nem használt vízben lévő vizsgált anyagot figyelembe vegyük az anyagmérleg meghatározásakor. Az elpárolgással járó veszteségeket minimalizálni kell azáltal, hogy a vizet óvatosan, a víz–1-oktanol réteg felkavarása nélkül engedjük a választótölcsérbe áramolni.
45.
Az 1-oktanol mintavételezése kis mennyiségű (kb. 100 μl) aliquotnak az 1-oktanol-rétegből 100 mikroliteres színüveg-fém fecskendővel való felszívásával történik. Ügyelni kell arra, hogy ne kavarjuk fel a határfelületet. A folyadékminta térfogatát jegyezzük fel. Kis mennyiségű aliquot elegendő, mivel az 1-oktanol-mintát hígítani fogjuk.
46.
Kerülendő a minta szükségtelen átöntése. A minta térfogatát éppen ezért gravimetriai módszerrel kell meghatározni. Vízminták esetén ez a vízmintának a szükséges mennyiségű oldószert már tartalmazó választótölcsérbe való gyűjtésével érhető el.
ADATOK ÉS JEGYZŐKÖNYVEZÉS
47.
A jelen vizsgálati módszer szerint a POW meghatározása érdekében három lassú keveréses kísérletet (három kísérleti egységet) végzünk azonos körülmények között a vizsgált vegyületen. Az egyensúlyi állapot létrejöttének igazolására használt regressziónak legalább négy, egymást követő időpontokban végzett CO-/CW-meghatározás eredményein kell alapulnia. Ez lehetővé teszi az egyes kísérleti egységek révén kapott átlagérték bizonytalanságának mércéjeként szolgáló szórásnégyzet kiszámítását.
48.
A POW az egyes kísérleti egységek révén nyert adatok szórásnégyzetével jellemezhető. Ezen információk alapján számítjuk ki a POW-t az egyes kísérleti egységek eredményeinek súlyozott átlagaként. Ehhez a kísérleti egységek eredményei szórásnégyzetének reciprokát használjuk súlyozási tényezőként. Ennek eredményeként a nagy (szórásnégyzetként kifejezett) változékonyságú, tehát kisebb megbízhatóságú adatok kevésbé befolyásolják az eredményt, mint az alacsony szórásnégyzetű adatok.
49.
Ezzel analóg módon kell kiszámítani a súlyozott szórást. Ez a POW-mérés ismételhetőségét jellemzi. A kis súlyozott szórás azt jelenti, hogy a POW-meghatározás egy adott laboratóriumon belüli ismételhetősége igen magas. Az adatok formális statisztikai feldolgozásának menete az alábbiakban olvasható.
Az eredmények feldolgozása
Az egyensúlyi állapot létrejöttének igazolása
50.
Minden egyes mintavételi időponthoz számítsuk ki a vizsgált anyag 1-oktanolban és vízben oldott koncentrációja hányadosának logaritmusát (log (Co/Cw)). A kémiai egyensúly létrejöttét e logaritmus idő függvényében való ábrázolásával igazoljuk. Ha az így kapott görbén legalább négy egymást követő időpontot magában foglaló plató figyelhető meg, az egyensúlyi állapot létrejött, és a vegyület ténylegesen feloldódott az 1-oktanolban. Ellenkező esetben a vizsgálatot addig kell folytatni, amíg a görbe négy egymást követő időpont között olyan meredekséget nem ad, amely 0,05-ös p-szint mellett nem tér el szignifikánsan a 0-tól, ami arra utal, hogy a log Co/Cw független az időtől.
A log POW kiszámítása
51.
Az adott kísérleti egység log POW értékét a log Co/Cw idő függvényében ábrázolt görbéje azon része log Co/Cw értékeinek súlyozott átlagaként kell kiszámítani, amelynél az egyensúlyi állapot fennállását igazoltuk. A súlyozott átlagot az adatoknak a szórásnégyzet reciprokával történő súlyozásával kell kiszámítani annak érdekében, hogy az adatok végeredményre gyakorolt hatása fordítottan arányos legyen azok bizonytalanságával.
A log POW átlagértéke
52.
A különböző kísérleti egységek log POW értékének átlagát az egyes kísérleti egységek eredményei átlagának az azokhoz tartozó szórásnégyzettel való súlyozásával kell kiszámítani.
A számítás a következőképpen történik:
ahol
log POW,i
=
az i-edik önálló kísérleti egység log POW értéke,
log POW,Av
=
az egyes log POW-meghatározások súlyozott átlagértéke,
wi
=
az i-edik kísérleti egység log POW értékéhez rendelt statisztikai súlyozási faktor.
A log POW,i szórásnégyzetének reciprokát használjuk wi-ként ()
53.
A log POW átlagának hibáját az egyes kísérleti egységekben az egyensúlyi fázis során meghatározott log Co/Cw ismételhetőségeként becsüljük meg. Ezt az értéket a log POW,Av (σlog Pow,Av) súlyozott szórásaként fejezik ki, amely pedig a log POW,Av értékhez kapcsolódó hiba mértéke. A súlyozott szórás a súlyozott szórásnégyzetből (varlog Pow,Av) a következőképpen számítható ki:
Az n a kísérleti egységek számát jelöli.
Vizsgálati jegyzőkönyv
54.
A vizsgálati jegyzőkönyvnek a következő információkat kell tartalmaznia:
Vizsgált anyag:
—
közhasználatú név, kémiai elnevezés, CAS-szám, szerkezeti képlet (radioaktívan jelölt anyag használata esetén a jelölés pozíciójának feltüntetésével), valamint a vonatkozó fizikai és kémiai tulajdonságok (lásd a 17. bekezdést),
—
a vizsgált anyag tisztasága (szennyeződései),
—
a jelölt vegyi anyagok jelölőanyagának tisztasága és moláris aktivitása (ha szükséges),
—
a log Pow előzetes becslése, valamint ezen érték levezetésének módszere.
Vizsgálati körülmények:
—
a vizsgálatok elvégzésének időpontja,
—
kísérleti hőmérséklet,
—
az 1-oktanol és a víz térfogata a vizsgálat kezdetekor,
—
a kivett 1-oktanol- és vízminták térfogata,
—
a reakcióedényekben hátramaradó 1-oktanol és víz térfogata,
—
a reakcióedény és a keverési körülmények leírása (a keverőrúd és a reakcióedény geometriai jellemzői, az örvény magassága mm-ben, valamint adott esetben a keverési sebesség),
—
a vizsgált anyag meghatározásához használt analitikai módszerek és a mennyiségi meghatározás módszerspecifikus határértéke,
—
mintavételi időpontok,
—
a vizes fázis pH-ja és a felhasznált pufferek, ha a pH-t ionizálható molekulák miatt be kellett állítani,
—
a párhuzamos mérések száma.
Eredmények:
—
az alkalmazott analitikai módszerek ismételhetősége és érzékenysége,
—
a vizsgált anyag 1-oktanolban és vízben meghatározott koncentrációja az idő függvényében,
—
az anyagmérleg bemutatása,
—
hőmérséklet és annak szórása, vagy a kísérlet során fennálló hőmérsékleti tartomány,
—
a koncentrációarány regressziója az idő függvényében,
—
a log Pow,Av átlagértéke és annak standard hibája,
—
az eredmények szöveges értékelése és értelmezése,
—
példák a reprezentatív elemzés alapadataira (az összes alapadatot a helyes laboratóriumi gyakorlat [GLP] szabályainak megfelelően kell tárolni), beleértve a helyettesítő standardok visszanyerését, valamint a kalibráláshoz használt szintek számát (a kalibrációs görbe korrelációs együtthatójára vonatkozó kritériumokkal együtt), továbbá a minőségbiztosítás/minőség-ellenőrzés (QA/QC) eredményeit,
—
amennyiben rendelkezésre áll: a vizsgálati eljárás validációs jelentése (a hivatkozások között feltüntetendő).
SZAKIRODALOM
(1)
De Bruijn JHM, Busser F, Seinen W, Hermens J. (1989). Determination of octanol/water partition coefficients with the ‘slow-stirring’ method. Environ. Toxicol. Chem. 8: 499-512.
(2)
E melléklet A.8., Megoszlási hányados című fejezete.
(3)
E melléklet A.8., Megoszlási hányados című fejezete.
(4)
OECD (2000). OECD Draft Guideline for the Testing of Chemicals: 122 Partition Coefficient (n-Octanol/Water): pH-Metric Method for Ionisable Substances. Paris.
Boethling RS, Mackay D (eds.) (2000). Handbook of property estimation methods for chemicals. Lewis Publishers Boca Raton, FL, USA.
(7)
Schwarzenbach RP, Gschwend PM, Imboden DM (1993). Environmental Organic Chemistry. Wiley, New York, NY.
(8)
Arnold CG, Widenhaupt A, David MM, Müller SR, Haderlein SB, Schwarzenbach RP (1997). Aqueous speciation and 1-octanol-water partitioning of tributyl- and triphenyltin: effect of pH and ion composition. Environ. Sci. Technol. 31: 2596-2602.
(9)
OECD (1981) OECD Guidelines for the Testing of Chemicals: 112 Dissociation Constants in Water. Paris.
(10)
E melléklet A.6., Oldhatóság vízben című fejezete.
(11)
E melléklet C.7., Lebomlás – abiotikus lebomlás: hidrolízis a pH függvényében című fejezete.
(12)
E melléklet C.4., A »gyors« biológiai lebonthatóság meghatározása című fejezetének II–VII. része (A–F. módszer).
(13)
E melléklet A.4., Gőznyomás című fejezete.
(14)
Pinsuwan S, Li A and Yalkowsky S.H. (1995). Correlation of octanol/water solubility ratios and partition coefficients, J. Chem. Eng. Data. 40: 623-626.
(15)
Lyman WJ (1990). Solubility in water. In: Handbook of Chemical Property Estimation Methods: Environmental Behavior of Organic Compounds, Lyman WJ, Reehl WF, Rosenblatt DH, Eds. American Chemical Society, Washington, DC, 2-1 to 2-52.
(16)
Leo A, Weininger D (1989). Medchem Software Manual. Daylight Chemical Information Systems, Irvine, CA.
(17)
Meylan W (1993). SRC-LOGKOW for Windows. SRC, Syracuse, N.Y.
(18)
Compudrug L (1992). ProLogP. Compudrug, Ltd, Budapest.
Lyman WJ (1990). Octanol/water partition coefficient. In Lyman WJ, Reehl WF, Rosenblatt DH, eds, Handbook of chemical property estimation, American Chemical Society, Washington, D.C.
(21)
Rekker RF, de Kort HM (1979). The hydrophobic fragmental constant: An extension to a 1 000 data point set. Eur. J. Med. Chem. Chim. Ther. 14: 479-488.
(22)
Jübermann O (1958). Houben-Weyl, ed, Methoden der Organischen Chemie: 386-390.
1. függelék
Táblázat a különböző LOG POW értékű vizsgált anyagok vizes fázisban való kimutatásához szükséges legkisebb víztérfogatok kiszámításához
Feltételezések:
—
Az egyes aliquotok maximális térfogata = a teljes térfogat 10 %-a; 5 aliquot = a teljes térfogat 50 %-a.
—
. Alacsonyabb koncentráció esetén nagyobb térfogat szükséges.
—
Az LOD meghatározásához használt térfogat = 100 ml.
—
A log Pow–log Sw és log Pow–SR (Soct/Sw) görbékkel a vizsgált anyagokra vonatkozó összefüggések elfogadhatóan megjeleníthetők.
Az Sw becslése
log Pow
Egyenlet
log Sw
Sw (mg/l)
4
0,496
3,133E+00
4,5
0,035
1,084E+00
5
–0,426
3,750E-01
5,5
–0,887
1,297E-01
6
–1,348
4,487E-02
6,5
–1,809
1,552E-02
7
–2,270
5,370E-03
7,5
–2,731
1,858E-03
8
–3,192
6,427E-04
Az Soct becslése
log Pow
Egyenlet
Soct (mg/l)
4
3,763E+04
4,5
4,816E+04
5
6,165E+04
5,5
7,890E+04
6
1,010E+05
6,5
1,293E+05
7
1,654E+05
7,5
2,117E+05
8
2,710E+05
Vizsgált anyag összes tömege
(mg)
Tömegokt/tömegvíz
TömegH2O
(mg)
Konc.H2O
(mg/l)
Tömegokt
(mg)
Konc.okt
(mg/l)
1 319
526
2,5017
2,6333
1 317
26 333
1 686
1 664
1,0127
1,0660
1 685
33 709
2 158
5 263
0,4099
0,4315
2 157
43 149
2 762
16 644
0,1659
0,1747
2 762
55 230
3 535
52 632
0,0672
0,0707
3 535
70 691
4 524
1664 36
0,0272
0,0286
4 524
90 480
5 790
5263 16
0,0110
0,0116
5 790
115 807
7 411
1 664 357
0,0045
0,0047
7 411
148 223
9 486
5 263 158
0,0018
0,0019
9 486
189 713
A térfogatok kiszámítása
A H2O fázis egyes LOD-koncentrációk mellett szükséges minimális térfogata
log Kow
LOD (mikrogramm/l)→
0,001
0,01
0,10
1,00
10
4
0,04
0,38
3,80
38
380
4,5
0,09
0,94
9,38
94
938
5
0,23
2,32
23,18
232
2 318
5,5
0,57
5,73
57,26
573
5 726
6
1,41
14,15
141
1 415
14 146
6,5
3,50
34,95
350
3 495
34 950
7
8,64
86,35
864
8 635
86 351
7,5
21,33
213
2 133
21 335
213 346
8
52,71
527
5 271
52 711
527 111
LOD-hez használt térfogat (l)
0,1
Jelmagyarázat a számításokhoz
A vizes fázis teljes térfogatának < 10 %-a 1 literes reakcióedényben.
A vizes fázis teljes térfogatának < 10 %-a 2 literes reakcióedényben.
A vizes fázis teljes térfogatának < 10 %-a 5 literes reakcióedényben.
A vizes fázis teljes térfogatának < 10 %-a 10 literes reakcióedényben.
A 10 literes reakcióedény 10 %-ánál is nagyobb.
A vízoldékonyság és a log Pow függvényében meghatározott szükséges térfogatok áttekintése
A H2O fázis egyes LOD-koncentrációk mellett szükséges minimális térfogata (ml)
log Pow
Sw (mg/l)
LOD (mikrogramm/l)→
0,001
0,01
0,10
1,00
10
4
10
0,01
0,12
1,19
11,90
118,99
5
0,02
0,24
2,38
23,80
237,97
3
0,04
0,40
3,97
39,66
396,62
1
0,12
1,19
11,90
118,99
1 189,86
4,5
5
0,02
0,20
2,03
20,34
203,37
2
0,05
0,51
5,08
50,84
508,42
1
0,10
1,02
10,17
101,68
1 016,83
0,5
0,20
2,03
20,34
203,37
2 033,67
5
1
0,09
0,87
8,69
86,90
869,01
0,5
0,17
1,74
17,38
173,80
1 738,02
0,375
0,23
2,32
23,18
231,75
2 317,53
0,2
0,43
4,35
43,45
434,51
4 345,05
5,5
0,4
0,19
1,86
18,57
185,68
1 856,79
0,2
0,37
3,71
37,14
371,36
3 713,59
0,1
0,74
7,43
74,27
742,72
7 427,17
0,05
1,49
14,85
148,54
1 485,43
14 854,35
6
0,1
0,63
6,35
63,48
634,80
6 347,95
0,05
1,27
12,70
126,96
1 269,59
12 695,91
0,025
2,54
25,39
253,92
2 539,18
25 391,82
0,0125
5,08
50,78
507,84
5 078,36
50 783,64
6,5
0,025
2,17
21,70
217,02
2 170,25
21 702,46
0,0125
4,34
43,40
434,05
4 340,49
43 404,93
0,006
9,04
90,43
904,27
9 042,69
90 426,93
0,003
18,09
180,85
1 808,54
18 085,39
180 853,86
7
0,006
7,73
77,29
772,89
7 728,85
77 288,50
0,003
15,46
154,58
1 545,77
15 457,70
154 577,01
0,0015
23,19
231,87
2 318,66
23 186,55
231 865,51
0,001
46,37
463,73
4 637,31
46 373,10
463 731,03
7,5
0,002
19,82
198,18
1 981,77
19 817,73
198 177,33
0,001
39,64
396,35
3 963,55
39 635,47
396 354,66
0,0005
79,27
792,71
7 927,09
79 270,93
792 709,32
0,00025
158,54
1 585,42
15 854,19
158 541,86
1 585 418,63
8
0,001
33,88
338,77
3 387,68
33 876,77
338 767,72
0,0005
67,75
677,54
6 775,35
67 753,54
677 535,44
0,00025
135,51
1 355,07
13 550,71
135 507,09
1 355 070,89
0,000125
271,01
2 710,14
27 101,42
271 014,18
2 710 141,77
LOD-hez használt térfogat (l)
0,1
2. függelék
Példa egy kettősfalú üveg reakcióedényre a POW meghatározására szolgáló lassú keveréses kísérlethez
”
3.
A B.2. fejezet helyébe a következő szöveg lép:
„B.2. AKUT INHALÁCIÓS TOXICITÁS
BEVEZETÉS
1.
A jelen vizsgálati módszer egyenértékű az OECD 403. vizsgálati iránymutatásban (2009) (1) leírt módszerrel. Az akut inhalációs toxicitásra vonatkozó eredeti 403. vizsgálati iránymutatást 1981-ben fogadták el. A jelen felülvizsgált B.2. vizsgálati módszert (a felülvizsgált 403. vizsgálati iránymutatás megfelelőjeként) a nagyobb rugalmasságot, az állatkísérletek csökkentését és a szabályozási igények kielégítését szem előtt tartva dolgozták ki. A felülvizsgált vizsgálati módszer kétféle tanulmányt foglal magában: egy hagyományos LC50-protokollt és egy koncentráció x idő (C x t) protokollt. E vizsgálati módszer fő jellemzői, hogy alkalmas a nem halálostól a halálos kimenetelig terjedő koncentráció-hatás összefüggésnek a medián halálos koncentráció (LC50), a nem halálos küszöbérték-koncentráció (például LC01) és a meredekség levezetése érdekében történő meghatározására, valamint a nemek szerint esetlegesen eltérő érzékenység megállapítására. A C x t protokoll abban az esetben alkalmazandó, ha meghatározott szabályozási vagy tudományos igény miatt, így többek között veszélyhelyzeti intézkedések tervezéséhez (például akut expozíciós iránymutatási szintek [AEGL], vészhelyzeti intézkedési tervezési iránymutatások [ERPG] vagy akut expozíciós küszöbértékek [AETL] levezetéséhez) vagy területrendezési célból van szükség több időtartamon át végzett állatkísérletekre.
2.
A jelen vizsgálati módszer szerinti vizsgálatok végrehajtásával és értelmezésével kapcsolatos útmutatás az akut inhalációs toxicitási vizsgálatokra vonatkozó (39. számú) iránymutatásban (2) található.
3.
Az e vizsgálati módszer összefüggésében alkalmazott fogalmak meghatározása a jelen fejezet végén, valamint a 39. iránymutatásban (2) található.
4.
Ez a vizsgálati módszer lehetővé teszi a vizsgált vegyi anyag jellemzését és mennyiségi kockázatértékelését, valamint a vizsgált anyagoknak az 1272/2008/EK rendelet (3) szerinti rangsorolását és osztályozását. A megfelelő vizsgálati módszer akut hatások vizsgálatához történő kiválasztásához a 39. iránymutatásban (2) található útmutatás. Ha csak osztályozással és címkézéssel kapcsolatos információk szükségesek, általában e melléklet B.52. fejezetét (4) javasolt alkalmazni (lásd a 39. iránymutatást (2)). A jelen B.2. vizsgálati módszer nem kifejezetten különleges anyagok – például alacsony oldhatóságú izometrikus vagy rostos anyagok, illetve mesterséges nanoanyagok – vizsgálatára szolgál.
KIINDULÁSI MEGFONTOLÁSOK
5.
A jelen vizsgálati módszer szerinti vizsgálatok elvégzésének mérlegelése előtt a vizsgálati laboratóriumnak az állatkísérletek minimalizálása érdekében figyelembe kell vennie a vizsgált vegyi anyagról rendelkezésre álló összes információt, beleértve az olyan meglévő tanulmányokat (például az e melléklet B.52. fejezetében (4) leírtakat), amelyek adatai a további vizsgálatok elvégzésének mellőzését támasztják alá. A legalkalmasabb faj, törzs, nem, expozíciós mód és a megfelelő vizsgálati koncentrációk kiválasztását esetlegesen segítő információk közé tartozik a vizsgált vegyi anyag azonossága, kémiai szerkezete, valamint fizikai és kémiai tulajdonságai, az esetleges in vitro vagy in vivo toxicitási vizsgálatok eredményei, a várható felhasználási területek és a humán expozíció lehetősége, a szerkezetileg rokon anyagokról rendelkezésre álló (Q)SAR- és toxikológiai adatok (lásd a 39. iránymutatást (2)).
6.
Amennyire csak lehet, kerülendő a maró vagy irritáló hatású vegyi anyagok olyan koncentrációban történő vizsgálata, amely előreláthatóan súlyos fájdalmat és/vagy szorongást okozna. Annak megállapítása érdekében, hogy a további vizsgálatoktól el lehet-e tekinteni, szakértői megítélés alapján értékelni kell a lehetséges maró, illetve irritáló hatást, olyan bizonyítékokra támaszkodva, mint az embereknél és állatoknál (például nem maró, illetve nem irritáló koncentráció mellett ismételt dózisokkal végzett vizsgálatok során) tapasztalt hatások, meglévő in vitro adatok (például az e melléklet B.40. (5) és B.40A. fejezetében (6) vagy az OECD 435. vizsgálati iránymutatásában (7) leírtak), pH-értékek, hasonló anyagokra vonatkozó adatok vagy bármely egyéb kapcsolódó adat. A jelen vizsgálati módszer meghatározott szabályozási igények esetén (például vészhelyzeti tervezési célokból) alkalmazható állatok ilyen anyagoknak való expozíciójára, mivel a vizsgálatvezető vagy a vezető kutató számára irányítást biztosít a célkoncentrációk kiválasztása felett. A célkoncentrációk azonban nem okozhatnak súlyos irritáló, illetve maró hatást, ugyanakkor elegendőnek kell lenniük ahhoz, hogy a koncentráció-hatás görbét a vizsgálat szabályozási és tudományos céljának megfelelő szintekre kiterjesszék. Ezeket a koncentrációkat eseti alapon kell kiválasztani, és a választást indokolni kell (lásd a 39. iránymutatást (2)).
A VIZSGÁLAT ELVE
7.
A jelen felülvizsgált B.2. vizsgálati módszert a vizsgált vegyi anyag akut toxicitására vonatkozó elegendő, az anyag osztályozását lehetővé tevő információ megszerzése, valamint a mennyiségi kockázatértékelés elvégzéséhez szükséges, az egyik vagy mindkét nemre vonatkozó letalitási adatok (például LC50, LC01 és meredekség) biztosítása érdekében dolgozták ki. A vizsgálati módszer két módszert foglal magában. Az első egy hagyományos protokoll, amelynek során állatok csoportjait tesszük ki egy határkoncentrációnak (határérték-vizsgálat) vagy fokozatosan növekedő koncentrációk sorozatának előre meghatározott, általában 4 órás időtartamra. Meghatározott szabályozási célok elérése érdekében más expozíciós időtartamok is alkalmazhatók. A másik módszer egy (C x t) protokoll, amelynek során állatok csoportjait tesszük ki egy határkoncentrációnak vagy fokozatosan növekedő koncentrációk sorozatának több időtartamon keresztül.
8.
Az elhullásközeli állapotban lévő, nyilvánvalóan fájdalmakkal küszködő vagy súlyos és tartós szorongás jeleit mutató állatokat humánus módon el kell pusztítani, és a vizsgálat eredményeinek értelmezésekor a vizsgálat során elhullott állatokkal azonos módon kell figyelembe venni. A megjósolható vagy közeli elhullás felismerését segítő iránymutatás, valamint az elhullás közelében lévő vagy súlyosan szenvedő állatok elpusztítására vonatkozó döntési kritériumok a humánus végpontokról szóló 19. OECD-iránymutatásban (8) találhatók.
A MÓDSZER LEÍRÁSA
Az állatfaj kiválasztása
9.
Általánosan használt laboratóriumi törzsekből származó egészséges, fiatal, ivarérett állatokat kell alkalmazni. A javasolt állatfaj a patkány, más faj használata esetén a döntést indokolni kell.
Az állatok előkészítése
10.
Olyan nőstényeket kell választani, amelyek még egyszer sem ellettek, és nem vemhesek. Az expozíció napján az állatoknak 8–12 hetes fiatal, ivarérett egyedeknek kell lenniük, a testsúlyuk pedig a korábbi expozíciókkal érintett, azonos életkorú állatok nemenkénti átlagos testsúlyától legfeljebb ± 20 %-kal térhet el. Az állatokat véletlenszerűen kell kiválasztani, és egyedi azonosítás céljából meg kell jelölni. Az állatokat a laboratóriumi körülményekhez való szoktatás céljából a vizsgálat megkezdése előtt legalább 5 napig tartsuk a ketrecükben. Az állatokat a vizsgálatot megelőzően rövid ideig szoktatni kell a vizsgálati eszközökhöz, mivel ezzel csökkenthető az új környezet okozta stressz.
Az állatok tartása
11.
A kísérleti állatok tartására használt helyiség hőmérséklete 22 ± 3 °C kell, hogy legyen. A relatív páratartalmat ideális esetben 30–70 %-os tartományban kell tartani, ugyanakkor ez nem feltétlenül lehetséges, ha vivőanyagként vizet használunk. Az expozíció előtt és után az állatokat általában nemek és koncentrációk szerinti csoportokban kell a ketreceikben elhelyezni, azonban az állatok ketrecenkénti számának nem szabad akadályoznia az egyes állatok megfigyelését, és minimalizálnia kell a kannibalizmus és a marakodás okozta veszteségeket. Ha az állatok expozíciója csak orron át történik, szükséges lehet szoktatni azokat a lefogásukra szolgáló csövekhez. Az állatok lefogására szolgáló csövek nem okozhatnak az állatoknak indokolatlan fizikai, termális vagy a mozgásképtelenség okozta stresszt. A lefogás hatással lehet olyan fiziológiai végpontokra, mint a testhőmérséklet (hipertermia) és/vagy a percenkénti légzésvolumen. Amennyiben a rendelkezésre álló általános adatok azt igazolják, hogy ilyen változások nem lépnek fel számottevő mértékben, az állatok lefogására szolgáló csövekhez való előzetes szoktatás mellőzhető. Az aeroszoloknak egész testfelületükön kitett állatokat az expozíció során külön ketrecben kell elhelyezni, hogy a vizsgált aeroszol ne szűrődhessen át a többi állat szőrzetén. Hagyományos és minősített laboratóriumi takarmány alkalmazható – kivéve az expozíció időtartama alatt –, korlátlan mennyiségű ivóvíz biztosítása mellett. A világítás legyen mesterséges, 12 órás világos és 12 órás sötét periódusok váltsák egymást.
Inhalációs kamrák
12.
Az inhalációs kamra kiválasztásakor figyelembe kell venni a vizsgált vegyi anyag jellegét és a vizsgálat célját. Az előnyben részesítendő expozíciós mód a csak orron keresztüli expozíció (ez magában foglalja a csak a fejet, orrot vagy szájat érintő expozíciót). A csak orron keresztüli expozíció általában előnyben részesítendő a folyékony vagy szilárd aeroszolok, valamint a lecsapódva esetlegesen aeroszolt alkotó gőzök vizsgálata esetén. Előfordulhat, hogy a vizsgálat különleges céljai egész testfelületen keresztüli expozíció alkalmazásával hatékonyabban elérhetők, ezt azonban indokolni kell a vizsgálati jegyzőkönyvben. Egész testfelületen keresztüli expozícióra szolgáló kamra használata esetén a légköri stabilitás biztosítása érdekében a vizsgált állatok össztérfogata nem haladhatja meg a kamra térfogatának 5 %-át. A csak orron át történő és az egész testfelületen keresztüli expozíciós technikák elveit, valamint azok különös előnyeit és hátrányait a 39. iránymutatás (2) ismerteti.
EXPOZÍCIÓS KÖRÜLMÉNYEK
A koncentrációk beadása
13.
Csak orron át történő expozíció esetén az expozíció időtartama patkányoknál 6 óráig terjedhet. Egerek csak orron át történő expozíciója esetén az expozíciós időtartam általában nem haladhatja meg a 4 órát. Amennyiben hosszabb vizsgálati időtartam szükséges, a döntést indokolni kell (lásd a 39. iránymutatást (2)). Az egész testfelületen keresztüli expozícióra szolgáló kamrában aeroszoloknak kitett állatokat külön ketrecben kell tartani, hogy az állatok egymás tisztogatása során ne nyelhessék le a vizsgált vegyi anyagot. Az expozíció időtartama alatt az állatok nem kaphatnak takarmányt. Az állatoknak víz az egész testfelületen keresztüli expozíció teljes időtartama alatt adható.
14.
Az állatokat gáz, gőz, aeroszol vagy ezek keveréke formájában tesszük ki a vizsgált vegyi anyagnak. A vizsgálandó halmazállapot a vizsgált vegyi anyag fizikai és kémiai tulajdonságaitól, a kiválasztott koncentrációtól és/vagy a vizsgált vegyi anyag kezelése és használata során legnagyobb valószínűséggel előforduló halmazállapottól függ. A higroszkopikus és kémiailag reakcióképes vizsgált vegyi anyagokat száraz levegős körülmények között kell vizsgálni. Ügyelni kell a robbanékony koncentrációk keletkezésének elkerülésére.
Részecskeméret-eloszlás
15.
Minden aeroszol, valamint a lecsapódva esetlegesen aeroszolt alkotó gőzök esetén részecskeméretezést kell végezni. A légzőrendszer összes lényeges részének expozíciója érdekében 1 és 4 μm közötti tömegfelező aerodinamikai átmérővel (MMAD) rendelkező, az 1,5 és 3,0 közötti tartományba eső geometriai szórású (σg) aeroszolok használata javasolt (2) (9) (10). Habár ésszerű keretek között törekedni kell az e szabványnak való megfelelésre, szakértői megítélésre kell hagyatkozni, ha erre nincs lehetőség. A fémgőzök részecskéi például kisebbek lehetnek e szabványos méretnél, míg a töltéssel rendelkező részecskék, a rostok és a higroszkopikus anyagok (amelyek részecskemérete a légzőrendszer nedves környezetében nő) meghaladhatják azt.
A vizsgált vegyi anyag előkészítése vivőanyagban
16.
A vizsgált vegyi anyag megfelelő légköri koncentrációjának és részecskeméretének eléréséhez vivőanyag alkalmazható. Főszabályként a víz részesítendő előnyben. A részecskéket képző anyagok mechanikai eljárásoknak vethetők alá a szükséges részecskeméret-eloszlás elérése érdekében, ugyanakkor ügyelni kell arra, hogy a vizsgált vegyi anyag ne induljon bomlásnak és ne módosuljon. Amennyiben úgy véljük, hogy a mechanikai folyamatok (például a túlzott őrlésből adódó súrlódás miatt kialakult szélsőséges hőmérséklet) megváltoztatták a vizsgált vegyi anyag összetételét, a vizsgált vegyi anyag összetételét analitikai úton ellenőrizni kell. Kellő figyelmet kell fordítani a vizsgált vegyi anyag szennyeződésének elkerülésére. A nem morzsálódó, szándékosan belélegezhetetlen összetétellel készült szemcsés anyagokat nem szükséges vizsgálni. Kopásvizsgálattal kell igazolni, hogy a szemcsés anyag kezelése során nem keletkeznek belélegezhető részecskék. Ha a kopásvizsgálat során belélegezhető anyagok keletkezését észleljük, inhalációs toxicitási vizsgálatot kell végezni.
Kontrollállatok
17.
Negatív (levegővel kezelt) kontrollcsoport párhuzamos vizsgálata nem szükséges. Amennyiben a vizsgálati légkör létrehozása során víztől eltérő vivőanyagot alkalmazunk, vivőanyaggal kezelt kontrollcsoportra csak akkor van szükség, ha nem állnak rendelkezésre múltbeli inhalációs toxicitási adatok. Ha a vivőanyaggal kevert vizsgált vegyi anyag a toxicitási vizsgálat alapján nem bizonyul toxikusnak, a vizsgált koncentráció mellett a vivőanyag sem tekintendő toxikusnak, tehát nincs szükség vivőanyaggal kezelt kontrollra.
AZ EXPOZÍCIÓS KÖRÜLMÉNYEK NYOMON KÖVETÉSE
Kamrabeli légáramlás
18.
A kamrán keresztüli légáramlást gondosan szabályozni kell, folyamatosan nyomon kell követni, és minden expozíció során legalább óránként fel kell jegyezni. A vizsgálati légköri koncentráció (vagy stabilitás) nyomon követése valamennyi dinamikus paraméter globális mérését jelenti, és közvetett lehetőséget nyújt a légkör előállítása szempontjából lényeges összes dinamikus paraméter szabályozására. Különös figyelmet kell fordítani a csak orron át történő expozícióra szolgáló kamrában az újbóli belélegzés elkerülésére, amennyiben az expozíciós rendszeren keresztüli légáramlás nem elegendő a vizsgált vegyi anyagot tartalmazó légkör dinamikus áramlásának biztosítására. Előírt módszerek állnak rendelkezésre annak igazolására, hogy a választott működési körülmények között nem történik újbóli belélegzés (2) (11). Az oxigénkoncentrációnak legalább 19 %-nak kell lennie, a szén-dioxid-koncentráció pedig legfeljebb 1 % lehet. Amennyiben bármilyen okból feltételezhető, hogy ezek a szabványok nem teljesíthetők, az oxigén- és szén-dioxid-koncentrációt mérni kell.
A kamra hőmérséklete és relatív páratartalma
19.
A kamra hőmérsékletét 22 ± 3 °C-on kell tartani. Az állatok belégzési zónájában fennálló relatív páratartalmat a csak orron át történő és az egész testfelületen keresztüli expozíció esetén egyaránt nyomon kell követni, és legfeljebb 4 órás időtartamú expozíciók esetén legalább háromszor, rövidebb időtartamok esetén pedig óránként fel kell jegyezni. A relatív páratartalmat ideális esetben 30–70 %-os tartományban kell tartani, ugyanakkor előfordulhat, hogy ez vagy nem érhető el (például vízalapú keverékek vizsgálata esetén), vagy nem mérhető a vizsgált vegyi anyag vizsgálati módszerrel való interferenciája miatt.
Vizsgált vegyi anyag: névleges koncentráció
20.
Az expozíciós kamrában fennálló névleges koncentrációt lehetőség szerint ki kell számítani és fel kell jegyezni. A névleges koncentrációt úgy kapjuk meg, hogy az előállított vizsgált vegyi anyag tömegét elosztjuk a kamrarendszeren áthaladt levegő össztérfogatával. A névleges koncentráció nem az állatok expozíciójának jellemzésére szolgál, ugyanakkor a névleges és a tényleges koncentráció összehasonlításával megismerhető a vizsgálati rendszer előállítási hatásfoka, és így feltárhatók az előállítással összefüggő problémák.
Vizsgált vegyi anyag: tényleges koncentráció
21.
A tényleges koncentráció a vizsgált vegyi anyagnak az inhalációs kamrán belül, az állatok belégzési zónájában fennálló koncentrációját jelenti. A tényleges koncentráció specifikus módszerekkel (például közvetlen mintavétellel, adszorpciós vagy kémiai reakcióképességet vizsgáló módszerekkel, valamint utólagos analitikai jellemzéssel), vagy nem specifikus módszerekkel, például gravimetriai szűrőelemzéssel határozható meg. A gravimetriai elemzés csak egykomponensű por alakú aeroszolok, illetve alacsony illékonyságú folyadékok aeroszoljai esetén elfogadható, és alkalmazását a vizsgált vegyi anyag megfelelő, a vizsgálat előtt végzett jellemzésével kell alátámasztani. A gravimetriai elemzés a többkomponensű por alakú aeroszolok koncentrációjának meghatározására szintén alkalmazható. Ebben az esetben azonban analitikai adatokkal kell alátámasztani, hogy a levegőben lévő anyag összetétele hasonló a kiindulási anyagéhoz. Amennyiben ilyen információ nem áll rendelkezésre, a (lehetőleg levegőben lebegő) vizsgált vegyi anyag rendszeres időközönként végzett újbóli elemzésére lehet szükség a vizsgálat során. Olyan aeroszolizálódott ágensek esetén, amelyek elpárologhatnak vagy szublimálhatnak, igazolni kell, hogy mindegyik fázisból a választott módszerrel vettünk mintát. A cél-, a névleges és a tényleges koncentrációt fel kell tüntetni a vizsgálati jegyzőkönyvben, azonban a letális koncentráció értékének kiszámításához csak a tényleges koncentrációkat kell felhasználni.
22.
Lehetőség szerint a vizsgált vegyi anyag egyetlen tételét kell használni, és a vizsgált mintát olyan körülmények között kell tárolni, hogy megőrződjön annak tisztasága, homogenitása és stabilitása. A vizsgálat megkezdését megelőzően el kell végezni a vizsgált vegyi anyag jellemzését, meghatározva többek között annak tisztaságát, valamint amennyiben technikailag lehetséges, az észlelt szennyező anyagok és szennyeződések azonosságát és mennyiségét. Ez többek között – de nem kizárólag – a következő adatokkal mutatható ki: retenciós idő és relatív csúcsterület, tömegspektroszkópiai vagy gázkromatográfiás elemzéssel meghatározott molekulatömeg, illetve más becslések. Bár a vizsgált minta azonosságának meghatározása nem tartozik a vizsgálati laboratórium feladatai közé, óvatosságból érdemes lehet a vizsgálati laboratóriumban legalábbis korlátozott módon (például szín, fizikai jelleg stb. alapján) meggyőződni a megbízó által adott jellemzés helytállóságáról.
23.
Az expozíciós légkört amennyire csak lehet, állandó állapotban kell tartani, továbbá az analitikai módszertől függően folyamatosan és/vagy időszakosan ellenőrizni kell. Időszakos mintavétel esetén a kamrából a négyórás vizsgálat során legalább kétszer kell légköri mintát venni. Ha az alacsony légáramlási sebesség vagy koncentráció miatt ez nem megoldható, a teljes expozíciós időszak alatt egy mintavétel végezhető. Ha jelentős ingadozás figyelhető meg az egyes minták között, a következőnek vizsgált koncentrációkat expozíciónként négy minta alapján kell vizsgálni. Az egyes kamrakoncentráció-minták gázok és gőzök esetében legfeljebb ± 10 %-kal, folyékony vagy szilárd aeroszolok esetében pedig legfeljebb ± 20 %-kal térhetnek el az átlagkoncentrációtól. A kamra egyensúlyi állapotának kialakulásához szükséges időt (t95) ki kell számítani és fel kell jegyezni. Egy adott expozíció időtartama magában foglalja a vizsgált vegyi anyag előállításának idejét, utóbbihoz pedig figyelembe kell venni a t95 eléréséhez szükséges időt. A t95 becsléséhez a 39. iránymutatásban (2) található útmutatás.
24.
A nagyon összetett, gázokból/gőzökből és aeroszolokból álló keverékek (például égésterekből származó, valamint meghatározott célra szolgáló végfelhasználói termékekből/készülékekből kibocsátott vizsgált vegyi anyagok) esetén az egyes fázisok eltérően viselkedhetnek az inhalációs kamrában, ezért mindegyik fázishoz (gáz/gőz és aeroszol) legalább egy indikátoranyagot (analitot) – általában a keverék elsődleges hatóanyagát – kell kiválasztani. Amennyiben a vizsgált vegyi anyag keverék, az analitikai koncentrációt a keverék, nem pedig csak a hatóanyag vagy összetevő (analit) vonatkozásában kell a jegyzőkönyvben feltüntetni. A tényleges koncentrációról további információ a 39. iránymutatásban található (2).
Vizsgált vegyi anyag: részecskeméret-eloszlás
25.
Az aeroszolok részecskeméret-eloszlását mindegyik 4 órás expozíció során legalább kétszer meg kell határozni sorozatos ütközésmérő vagy alternatív műszer, például aerodinamikai részecskeméret-meghatározó segítségével. Ha bizonyítható, hogy a sorozatos ütközésmérővel és az alternatív műszerrel kapott eredmények egyeznek, az alternatív műszer a teljes vizsgálat folyamán használható. Az elsődleges műszerrel párhuzamosan egy második eszközt, például gravimetriai szűrőt vagy impingert/gázbuborékoltatót kell használni az elsődleges műszer mintavételi hatékonyságának ellenőrzésére. A részecskeméret-elemzés útján kapott tömegkoncentrációnak a szűrőelemzéssel kapott tömegkoncentrációt ésszerű mértékben meg kell közelítenie (lásd a 39. iránymutatást (2)). Ha a vizsgálat kezdeti szakaszában egyezés mutatható ki, a további ellenőrző mérések mellőzhetők. Az állatok jóléte érdekében intézkedéseket kell tenni az expozíció eseteges megismétlését szükségessé tevő kétes adatok előfordulásának minimalizálása érdekében. Gőzök esetében a részecsekeméret-eloszlást mesterségesen kell beállítani, ha fennáll annak a lehetősége, hogy a gőz lecsapódásával aeroszol keletkezhet, vagy ha vegyes fázisok alkotására képes részecskéket észlelünk a gőzatmoszférában (lásd a 15. bekezdést).
ELJÁRÁS
26.
Az alábbiakban kétféle vizsgálatot ismertetünk: a hagyományos és a C × t protokollt. Mindkét protokoll magában foglalhat egy dózisbehatároló vizsgálatot, egy fő vizsgálatot és/vagy egy határérték-vizsgálatot (hagyományos protokoll) vagy egy határkoncentráció mellett végzett vizsgálatot (C × t). Ha ismert, hogy valamelyik nem érzékenyebb a vizsgált anyagra, a vizsgálatvezető dönthet úgy, hogy a vizsgálatokat csak az érzékenyebb nemen kell elvégezni. Patkányoktól eltérő rágcsálófajok csak orron át történő expozíciója esetén az expozíció maximális időtartama kiigazítható a fajspecifikus szorongás minimalizálása érdekében. A vizsgálat megkezdése előtt minden rendelkezésre álló adatot figyelembe kell venni az állatkísérletek számának minimalizálására. Az e melléklet B.52. fejezetét (4) alkalmazva előállított adatok például szükségtelenné tehetik a dózisbehatároló vizsgálat elvégzését, valamint azt is kimutathatják, hogy valamelyik nem érzékenyebb-e a vizsgált anyagra (lásd a 39. iránymutatást (2)).
HAGYOMÁNYOS PROTOKOLL:
Általános megfontolások: hagyományos protokoll
27.
A hagyományos vizsgálat keretében állatok csoportjait tesszük ki meghatározott (általában 4 órás) időtartamra a vizsgált vegyi anyagnak, vagy csak orron keresztüli, vagy az egész testfelületen át történő expozícióra szolgáló kamrában. Az állatokat vagy határkoncentrációnak (határérték-vizsgálat), vagy legalább három, fokozatosan növekvő koncentrációnak tesszük ki (fő vizsgálat). A fő vizsgálat előtt dózisbehatároló vizsgálat végezhető, hacsak nem állnak már rendelkezésre bizonyos információk a vizsgált vegyi anyagról, például egy korábbi, a B.52. fejezet szerint végzett vizsgálat alapján (lásd a 39. iránymutatást (2)).
Dózisbehatároló vizsgálat: hagyományos protokoll
28.
A dózisbehatároló vizsgálat célja a vizsgált vegyi anyag hatóképességének becslése, a vegyi anyagra való érzékenység tekintetében a nemek között fennálló különbségek meghatározása, valamint a fő vizsgálat és a határérték-vizsgálat során alkalmazott koncentrációszintek kiválasztásának elősegítése. A dózisbehatároló vizsgálat során alkalmazandó koncentrációszintek kiválasztásakor fel kell használni minden rendelkezésre álló információt, beleértve a rendelkezésre álló (Q)SAR-adatokat és a hasonló vegyi anyagok adatait. Mindegyik koncentrációnak legfeljebb három hím és három nőstény tehető ki (a nemek közötti különbség megállapításához nemenként 3 állat vizsgálatára lehet szükség). A dózisbehatároló vizsgálat vonatkozhat egyetlen koncentrációra, de szükség esetén több koncentráció is vizsgálható. A dózisbehatároló vizsgálat során nem vizsgálható annyi állat és koncentráció, hogy az már egy fő vizsgálathoz legyen hasonló. Dózisbehatároló vizsgálat helyett alkalmazhatók egy, a B.52. módszer (4) szerint elvégzett korábbi vizsgálat adatai (lásd a 39. iránymutatást (2)).
Határérték-vizsgálat: hagyományos protokoll
29.
Határérték-vizsgálatot akkor kell végezni, ha a vizsgált vegyi anyagról ismert vagy várható, hogy gyakorlatilag nem mérgező, azaz csak a hatóságilag előírt határkoncentráció felett idéz elő toxikus reakciót. A határérték-vizsgálat során egyetlen, három hímből és három nőstényből álló csoportot teszünk ki a vizsgált vegyi anyagnak határkoncentráció mellett. A vizsgált vegyi anyag toxicitásával kapcsolatban hasonló vizsgált vegyi anyagokra vonatkozó adatokból nyerhetők információk, figyelembe véve a toxikológiai szempontból fontos komponenseket, valamint azok százalékos arányát. Olyan esetekben, ha kevés az anyag toxicitásával kapcsolatos információ, vagy egyáltalán nem áll rendelkezésre, vagy ha a vizsgálandó vegyi anyag várhatóan toxikus, a fő vizsgálatot kell elvégezni.
30.
A határkoncentrációk kiválasztását általában a szabályozási követelmények határozzák meg. Az 1272/2008/EK rendelet alkalmazása esetén a gázok, gőzök és aeroszolok határkoncentrációja rendre 20 000 ppm, 20 mg/l és 5 mg/l (vagy az elérhető legnagyobb koncentráció) (3). Bizonyos vizsgált vegyi anyagok, különösen a gőzök és az aeroszolok határkoncentrációjának előállítása technikai szempontból kihívást jelenthet. Aeroszolok vizsgálata esetén az elsődleges cél a belélegezhető részecskeméret (1–4 μm-es MMAD) elérése. Ez a legtöbb vizsgált vegyi anyag esetén 2 mg/l koncentrációnál érhető el. Aeroszolok 2 mg/l feletti koncentrációnál történő vizsgálatát csak akkor szabad megkísérelni, ha ezzel elérhető a belélegezhető részecskeméret (lásd a 39. iránymutatást (2)). Az 1272/2008/EK rendelet szerint az állatok jóléte érdekében a határkoncentráció felett végzett vizsgálatok ellenjavallottak (3). A határkoncentráció alkalmazását csak abban az esetben szabad kilátásba helyezni, ha egy ilyen vizsgálat eredménye nagy valószínűséggel közvetlen jelentőséggel bírna az emberi egészség védelme szempontjából (3), továbbá ha mindezt a vizsgálati jegyzőkönyvben indokoljuk. Robbanásveszélyes vizsgált vegyi anyagok esetén ügyelni kell a robbanást elősegítő körülmények elkerülésére. A szükségtelen állatkísérletek elkerülése végett a határérték-vizsgálatot megelőzően állatok nélküli próbavizsgálatot kell végezni annak érdekében, hogy a kamrában elérhetők legyenek a határérték-vizsgálathoz szükséges körülmények.
31.
Ha a határkoncentrációnál állatok elhullását vagy elhullásközeli állapotát figyeljük meg, a határérték-vizsgálat eredményei dózisbehatároló vizsgálatként használhatók más koncentrációknál végzett további vizsgálatokhoz (lásd a fő vizsgálatról szóló részt). Ha a vizsgált vegyi anyag fizikai vagy kémiai tulajdonságaiból adódóan a határkoncentráció nem érhető el, a legmagasabb elérhető koncentrációt kell vizsgálni. Ha az elhullási arány az elérhető legnagyobb koncentráció mellett 50 %-nál alacsonyabb, nincs szükség további vizsgálatok elvégzésére. Ha a határkoncentrációt nem sikerült elérni, a vizsgálati jegyzőkönyvnek tartalmaznia kell ennek magyarázatát, valamint az alátámasztó adatokat. Ha egy gőz legnagyobb elérhető koncentrációja nem vált ki toxikus reakciót, a vizsgált vegyi anyag folyékony aeroszoljának előállítására lehet szükség.
Fő vizsgálat: hagyományos protokoll
32.
A fő vizsgálatot általában koncentrációszintenként öt hímen és öt nőstényen végezzük el (vagy a vizsgált anyagra érzékenyebb nem 5 egyedén, amennyiben az ismert) legalább három koncentrációszinten. A megalapozott statisztikai elemzés érdekében elegendő számú koncentrációszintet kell alkalmazni. Az egyes expozíciós csoportok vizsgálata közötti időtartamot a mérgezési tünetek megjelenésének időpontja, időtartama és súlyossága határozza meg. Az állatok következő koncentrációszintnek való expozícióját addig kell halasztani, amíg ésszerű biztonsággal nem várható az előzőleg vizsgált állatok túlélése. Ez lehetővé teszi a vizsgálatvezető számára a következő expozíciós csoport célkoncentrációjának kiigazítását. Mivel mindez összetett technológiát igényel, inhalációs vizsgálatok esetén nem feltétlenül praktikus, ezért az állatok következő koncentrációszintnek való expozícióját korábbi tapasztalatokra és tudományos mérlegelésre kell alapozni. Keverékek vizsgálata esetén a 39. iránymutatás (2) alkalmazandó.
KONCENTRÁCIÓ × IDŐ (C × T) PROTOKOLL
Általános megfontolások: C × t protokoll
33.
Az inhalációs toxicitás értékeléséhez a hagyományos protokoll helyett megfontolható egy fokozatos C x t vizsgálat elvégzése (12) (13) (14). Ez a módszer lehetővé teszi az állatok vizsgált vegyi anyagnak több koncentrációszinten és több időtartamon keresztül történő expozícióját. Minden vizsgálatot csak orron át történő expozícióra szolgáló kamrában végzünk el (az egész testfelületen keresztüli expozícióra szolgáló kamrák alkalmazása ennél a protokollnál nem praktikus). A protokollt az 1. függelékben található folyamatábra szemlélteti. Szimulációs elemzéssel megállapították, hogy mind a hagyományos, mind a C × t protokoll alkalmas megalapozott LC50 értékek meghatározására, azonban a megalapozott LC01 és LC10 értékek meghatározására általában alkalmasabb a C × t protokoll (15).
34.
Szimulációs elemzéssel igazolták, hogy C × t-intervallumonként két állat (mindkét nem vizsgálata estén nemenként egy, vagy a vizsgált anyagra érzékenyebb nemből két példány) általában elegendő, ha a fő vizsgálat során 4 koncentrációt és 5 expozíciós időtartamot vizsgálunk. Bizonyos körülmények között a vizsgálatvezető döntése alapján minden C × t-intervallumhoz nemenként két patkány alkalmazható (15). Ha minden koncentrációhoz és időponthoz nemenként 2 állatot alkalmazunk, csökkenhet a becslések torzítása és variabilitása, nőhet a sikeres becslések aránya, és javulhat a konfidenciaintervallum lefedettsége. A becsléshez használt adatokhoz való nem kellően szoros illeszkedés esetén azonban (amennyiben nemenként egy állatot vagy az adott anyagra érzékenyebb nemből két példányt vizsgálunk) egy 5. expozíciós koncentráció használata is elég lehet. A C × t vizsgálat során használandó állatok és koncentrációk számával kapcsolatban a 39. iránymutatás tartalmaz további útmutatást (2).
Dózisbehatároló vizsgálat: C × t protokoll
35.
A dózisbehatároló vizsgálat célja a vizsgált vegyi anyag hatóképességének becslése és a fő vizsgálat során alkalmazott koncentrációszintek kiválasztásának elősegítése. A fő vizsgálat során alkalmazandó megfelelő kiindulási koncentráció kiválasztása, valamint a vizsgált állatok számának minimalizálása érdekében nemenként és koncentrációnként legfeljebb három állatot alkalmazó dózisbehatároló vizsgálatra lehet szükség (részleteket lásd a 39. iránymutatás III. függelékében (2)). A nemek közötti eltérés megállapításához nemenként három állat vizsgálata lehet szükséges. Ezeket az állatokat egyetlen, általában 240 perces időtartamra kell kitenni a vizsgált anyagnak. A megfelelő vizsgálati légkörök előállításának megvalósíthatóságát az álatok nélkül végzett előzetes műszaki vizsgálatok során kell felmérni. Általában nem szükséges dózisbehatároló vizsgálatot végezni, ha elhullási adatok állnak rendelkezésre egy, a B.52. módszer szerint végzett vizsgálat alapján (4). A kiindulási célkoncentráció B.2. módszer szerinti vizsgálat során való kiválasztásakor a vizsgálatvezetőnek figyelembe kell vennie az esetlegesen rendelkezésre álló, B.52. módszer szerinti vizsgálatok (4) során mindkét nem és minden vizsgált koncentráció tekintetében megfigyelt elhullási mintákat (lásd a 39. iránymutatást (2)).
Kiindulási koncentráció: C × t protokoll
36.
Kiindulási koncentrációként (I. expozíciós szakasz) (1. függelék) vagy határkoncentrációt, vagy egy, a vizsgálatvezető által a dózisbehatároló vizsgálat alapján kiválasztott koncentrációt alkalmazunk. Ennek a koncentrációnak nemenként 1 állatot teszünk ki több időtartamra (például 15, 30, 60, 120 vagy 240 percre), így az állatok teljes száma 10 (ezt nevezik az I. expozíciós szakasznak) (1. függelék).
37.
A határkoncentrációk kiválasztását általában a szabályozási követelmények határozzák meg. Az 1272/2008/EK rendelet alkalmazása esetén a gázok, gőzök és aeroszolok határkoncentrációja rendre 20 000 ppm, 20 mg/l és 5 mg/l (vagy az elérhető legnagyobb koncentráció) (3). Bizonyos vizsgált vegyi anyagok, különösen a gőzök és az aeroszolok határkoncentrációjának előállítása technikai szempontból kihívást jelenthet. Aeroszolok vizsgálata esetén a cél a belélegezhető részecskeméret (azaz 1–4 μm-es MMAD) elérése 2 mg/l határkoncentráció mellett. Ez a legtöbb vizsgált vegyi anyag esetén elérhető. Aeroszolok 2 mg/l feletti koncentrációnál történő vizsgálatát csak akkor szabad megkísérelni, ha ezzel elérhető a belélegezhető részecskeméret (lásd a 39. iránymutatást (2)). Az 1272/2008/EK rendelet szerint az állatok jóléte érdekében a határkoncentráció felett végzett vizsgálatok ellenjavallottak (3). A határkoncentráció feletti vizsgálatot csak abban az esetben szabad kilátásba helyezni, ha egy ilyen vizsgálat eredménye nagy valószínűséggel közvetlen jelentőséggel bírna az emberi egészség védelme szempontjából (3); a vizsgálati jegyzőkönyvben mindezt indokolni kell. Robbanásveszélyes vizsgált vegyi anyagok esetén ügyelni kell a robbanást elősegítő körülmények elkerülésére. A szükségtelen állatkísérletek elkerülése végett a kiindulási koncentráció melletti vizsgálatot megelőzően állatok nélküli próbavizsgálatot kell végezni annak érdekében, hogy a kamrában elérhetők legyenek az e koncentrációhoz szükséges körülmények.
38.
Ha a kiindulási koncentrációnál állatok elhullását vagy elhullásközeli állapotát figyeljük meg, az e koncentráció mellett kapott eredmények felhasználhatók más koncentrációk mellett végzett további vizsgálatok kiindulópontjaként (lásd a fő vizsgálatról szóló részt). Ha a vizsgált vegyi anyag fizikai vagy kémiai tulajdonságaiból adódóan a határkoncentráció nem érhető el, a legmagasabb elérhető koncentrációt kell vizsgálni. Ha az elhullási arány az elérhető legnagyobb koncentráció mellett 50 %-nál alacsonyabb, nincs szükség további vizsgálatok elvégzésére. Ha a határkoncentrációt nem sikerült elérni, a vizsgálati jegyzőkönyvnek tartalmaznia kell ennek magyarázatát, valamint az alátámasztó adatokat. Ha egy gőz legnagyobb elérhető koncentrációja nem vált ki toxikus reakciót, a vizsgált vegyi anyag folyékony aeroszoljának előállítására lehet szükség.
Fő vizsgálat: C x t protokoll
39.
A fő vizsgálat során vizsgált kiindulási koncentrációként (I. expozíciós szakasz) (1. függelék) vagy határkoncentrációt, vagy egy, a vizsgálatvezető által a dózisbehatároló vizsgálat alapján kiválasztott koncentrációt alkalmazunk. Ha az I. expozíciós szakasz során vagy azt követően állatok elhullását figyeljük meg, az elhullást okozó minimális koncentrációt (C x t) kell alapul venni a II. expozíciós szakasz során alkalmazandó koncentrációk és expozíciós időtartamok meghatározásához. Minden soron következő expozíciós szakaszt az azt megelőző szakasz határoz meg (lásd az 1. függeléket).
40.
Számos vizsgált vegyi anyag esetében a kiindulási koncentráció mellett kapott eredmények, valamint három további, kisebb időbeli távolságú (azaz az expozíciós időtartamok közötti, két egymást követő időtartam – általában √2 értékű – tényezője által kifejezett geometriai távolságú) expozíciós szakasz eredményei elegendők a C x t és az elhullás közötti összefüggés meghatározására (15), azonban egy 5. expozíciós koncentráció alkalmazása előnyökkel járhat (lásd az 1. függeléket és a 39. iránymutatást (2)). A C x t protokoll eredményeinek matematikai feldolgozását az 1. függelék ismerteti.
MEGFIGYELÉSEK
41.
Az expozíció időtartama alatt az állatokat gyakori klinikai megfigyeléseknek kell alávetni. Az expozíciót követően az expozíció napján legalább kétszer, vagy – amennyiben az állatok kezelésre adott reakciója ezt indokolja – annál gyakrabban, az azt követő 14 nap során pedig naponta legalább egyszer klinikai megfigyeléseket kell végezni. A megfigyelés időtartama nem rögzített, hanem a klinikai tünetek jellege és jelentkezésének ideje, valamint a felépülés időtartama alapján határozandó meg. Fontos a toxicitási tünetek megjelenésének és megszűnésének időpontja, különösen, ha fennáll a toxicitási tünetek késleltetett megjelenésének tendenciája. Minden megfigyelést szisztematikusan rögzíteni kell olyan módon, hogy minden állat esetében önálló adatsort veszünk fel. Állatjóléti okokból humánus módon el kell pusztítani az elhullásközeli állapotban lévő, valamint súlyos fájdalom és/vagy tartós és súlyos szorongás jeleit mutató állatokat. A toxicitás klinikai tünetei előfordulásának vizsgálata során ügyelni kell arra, hogy az expozíciós eljárás okozta kezdeti beteges megjelenést és átmeneti légúti változásokat ne azonosítsuk tévesen a vizsgált vegyi anyaggal összefüggő, az állatok idő előtti elpusztítását szükségessé tevő toxicitásként. A humánus végpontokról szóló (19. számú) iránymutatásban összegzett elveket és követelményeket is figyelembe kell venni (7). Ha az állatokat humánus okok miatt el kell pusztítani, vagy ha azok elhullnak, a lehető legpontosabban fel kell jegyezni az elhullás időpontját.
42.
A ketrecben tartott állatok megfigyelésének ki kell terjednie a bőr és a szőrzet, a szem és a nyálkahártya, valamint a légzőrendszer, a keringési rendszer, a vegetatív és a központi idegrendszer, továbbá a szomatomotoros aktivitás és a viselkedési minták változásaira. Lehetőség szerint fel kell jegyezni, ha különbséget lehet tenni a helyi és szisztémás hatások között. Figyelmet kell szentelni a remegés, görcsök, nyáladzás, hasmenés, letargia, alvás és kóma megfigyelésére. A végbélben mért hőmérséklet bizonyítékot szolgáltathat a kezelés vagy a fogság okozta bradipnoés reflexre vagy hipo-/hipertermiára.
Testsúly
43.
Az egyes állatok súlyát a szoktatási időszak során egy alkalommal, az expozíció napján (0. nap) az expozíció előtt, valamint legalább az 1., 3. és 7. napon (azt követően pedig hetente) egy-egy alkalommal, továbbá az 1. napon túli elhullás vagy elpusztítás időpontjában fel kell jegyezni. A testsúly a toxicitás kulcsfontosságú indikátorának számít, ezért a vizsgálat előtti értékekhez képest legalább 20 %-os tartós súlycsökkenést mutató állatokat szorosan figyelemmel kell kísérni. Az expozíciót követő időszak végén az életben maradt állatokat újra megmérjük, majd humánus módon elpusztítjuk.
Patológia
44.
Minden kísérleti állatot makroszkópos boncolásnak kell alávetni, azokat is, amelyek a vizsgálat során elpusztultak, vagy amelyeket állatjóléti okok miatt el kellett pusztítani és ki kellett vonni a vizsgálatból. Ha a boncolás nem végezhető el rögtön azután, hogy az elpusztult állatot észrevettük, az állatot hűtve (nem fagyasztva) kell tárolni az autolízis minimalizálásához kellően alacsony hőmérsékleten. A boncolást a lehető leghamarabb, általában egy vagy két napon belül el kell végezni. Minden állat esetén fel kell jegyezni minden makroszkopikus patológiai elváltozást, különös tekintettel a légzőrendszert érintő változásokra.
45.
A vizsgálat értelmező értékének fokozása érdekében előzetesen, terv szerint kilátásba helyezhetők olyan további vizsgálatok, mint az életben maradt patkányok tüdeje súlyának megmérése és/vagy az irritációnak a légzőrendszer mikroszkópos vizsgálatával való igazolása. Megvizsgálhatók azok a szervek is, amelyek makroszkopikus patológia jeleit mutatják 24 óráig vagy annál tovább életben maradt állatoknál, valamint olyan szervek, amelyekről ismert vagy várható, hogy a vizsgált anyag hatást gyakorolt azokra. A teljes légzőrendszer mikroszkópos vizsgálata hasznos információkkal szolgálhat a vízzel könnyen reagáló vizsgált vegyi anyagokról, például a savakról és higroszkópos vegyi anyagokról.
ADATOK ÉS JEGYZŐKÖNYVEZÉS
Adatok
46.
Meg kell adni az egyes állatok testsúlyával és boncolási eredményeivel kapcsolatos adatokat. A klinikai megfigyelések adatait táblázatos formában össze kell foglalni, minden egyes vizsgált csoporthoz megadva a csoportban lévő állatok számát, a specifikus mérgezési tüneteket mutató, valamint a vizsgálat során elhullott vagy humánus okokból elpusztított állatok számát, az egyes állatok elhullásának időpontját, a toxikus hatások leírását, időbeli lefolyását és visszafordíthatóságát, valamint a boncolások eredményeit.
Vizsgálati jegyzőkönyv
47.
A vizsgálati jegyzőkönyvnek a következő információkat kell értelemszerűen tartalmaznia:
Kísérleti állatok és azok tartása
—
a ketrecben való tartás körülményei, beleértve a következőket: az állatok ketrecenkénti száma (vagy számának változása), az alom anyaga, környezeti hőmérséklet és relatív páratartalom, a megvilágítás időtartama, valamint a takarmány meghatározása,
—
a vizsgált faj/törzs, valamint a patkánytól eltérő faj alkalmazásának indokolása,
—
az állatok száma, kora és neme,
—
a véletlen kiválasztás módszere,
—
a táplálék és a víz minőségére vonatkozó adatok (ezen belül a takarmány típusa/eredete, a víz eredete),
—
a vizsgálat előtti esetleges kondicionálás leírása, beleértve a takarmányt, a karantént és a betegség kezelését,
Vizsgált vegyi anyag
—
fizikai jelleg, tisztaság, valamint – ha lényeges – fizikai és kémiai tulajdonságok (beleértve az izomerizációt),
—
azonosító adatok és – amennyiben ismert – a Vegyianyag Nyilvántartási Szolgálat szerinti nyilvántartási szám (CAS-szám),
Vivőanyag
—
a vivőanyag használatának, valamint kiválasztásának indokolása (ha a vivőanyag nem víz),
—
múltbeli vagy párhuzamosan kapott adatok, amelyek igazolják, hogy a vivőanyag nem befolyásolja a vizsgálat eredményét,
Inhalációs kamra
—
az inhalációs kamra leírása, beleértve annak méreteit és térfogatát,
—
az állatok expozíciójához és a légkör előállításához használt berendezések eredete és leírása,
—
a hőmérséklet, páratartalom, részecskeméret és tényleges koncentráció mérésére szolgáló berendezések,
—
a levegő forrása és a bevitt/elszívott levegő kezelése, valamint a kondicionáló rendszer,
—
az eszközök homogén vizsgálati légkör biztosítása érdekében történő kalibrálására alkalmazott módszerek,
—
nyomáskülönbség (pozitív vagy negatív),
—
expozíciós nyílások száma kamránként (csak orron keresztüli expozíció), az állatok helye a rendszerben (egész testfelületen keresztüli expozíció),
—
a vizsgálati légkör időbeli homogenitása/stabilitása,
—
a hőmérséklet- és páratartalom-érzékelők, valamint a vizsgálati légkör mintavételének helye a kamrában,
—
légáramlási sebességek, légáramlási sebesség expozíciós nyílásonként (csak orron keresztüli expozíció), vagy az állatok terhelése kamránként (egész testfelületen keresztüli expozíció),
—
adott esetben az oxigén és a szén-dioxid mérésére használt eszközökre vonatkozó információk,
—
az inhalációs kamra egyensúlyi állapotának eléréséhez szükséges idő (t95),
—
a térfogatváltozások óránkénti száma,
—
mérőberendezések (ha vannak),
Expozíciós adatok
—
a fő vizsgálathoz kiválasztott célkoncentráció indokolása,
—
névleges koncentrációk (az inhalációs kamrába való bejuttatásra előállított vizsgált vegyi anyag össztömege osztva a kamrán áthaladt levegő térfogatával),
—
a vizsgált vegyi anyagnak az állatok belégzési zónájából gyűjtött tényleges koncentrációi; a heterogén halmazállapotokat (gáz, gőz, aeroszol) felvevő keverékek esetén mindegyik külön elemezhető,
—
minden levegőbeli koncentrációt tömegegységekben (például mg/l, mg/m3 stb.) kell megadni; zárójelben a térfogategységekben (például ppm, ppb stb.) kifejezett értékek is feltüntethetők;
—
részecskeméret-eloszlás, tömegfelező aerodinamikai átmérő (MMAD), valamint geometriai szórás (σg), beleértve azok kiszámításának módját. Jegyzőkönyvezni kell az egyes részecskeméret-elemzéseket,
Vizsgálati körülmények
—
a vizsgált vegyi anyag előkészítésének részletei, beleértve a szilárd anyagok részecskeméretének csökkentésére vagy a vizsgált vegyi anyag oldatainak készítésére esetlegesen alkalmazott eljárások részleteit. Amennyiben a mechanikai folyamatok megváltoztatták a vizsgált vegyi anyag összetételét, a vizsgált vegyi anyag összetételének ellenőrzése érdekében végzett elemzések eredményeit is fel kell tüntetni,
—
a vizsgálati légkör előállítására és az állatok vizsgálati légkörnek való kitételére alkalmazott berendezések leírása (lehetőség szerint vázlatrajzzal),
—
az alkalmazott kémiai analitikai módszer és a módszer validációjának részletei (beleértve a vizsgált vegyi anyag mintavételi közegből való visszanyerésének hatásfokát),
—
a vizsgált koncentrációk kiválasztásának indokolása,
Eredmények
—
a kamrabeli hőmérséklet, páratartalom és légáramlás táblázatos összefoglalása,
—
a kamra névleges és tényleges koncentrációs adatainak táblázatos összefoglalása,
—
részecskeméret-adatok táblázatos összefoglalása, beleértve az analitikai mintavételi adatokat, a részecskeméret-eloszlást, valamint az MMAD és a σg számításait,
—
a válaszadatok és a koncentrációszintek táblázatos összefoglalása minden egyes állatra vonatkozóan (azaz a mérgezési tüneteket mutató és köztük az elhullt állatok, a hatások jellege, súlyossága, megjelenésének időpontja és időtartama),
—
az egyes állatok vizsgálat során mért testsúlya, az elhullás dátuma és időpontja, amennyiben az a tervszerű elpusztítást megelőzően történt, a toxicitási tünetek megjelenésének időbeli alakulása, valamint annak megjelölése, hogy azok visszafordíthatók voltak-e az egyes állatoknál,
—
a boncolások és adott esetben a kórszövettani vizsgálatok eredményei minden egyes állatra vonatkozóan,
—
letalitási becslések (például LC50, LD01), beleértve a 95 %-os konfidenciahatárokat és a meredekséget (amennyiben az értékelési módszerrel meghatározható),
—
statisztikai reláció, beleértve az n exponens becslését (C × t protokoll). Fel kell tüntetni az alkalmazott statisztikai szoftver nevét,
Az eredmények szöveges értékelése és értelmezése
—
különös hangsúlyt kell fektetni az e vizsgálati módszer feltételeinek – például a határkoncentrációnak vagy a részecskeméretnek – való megfelelés érdekében alkalmazott módszerek leírására,
—
ki kell térni a részecskék belélegezhetőségére az általános megállapítások tükrében, különösen ha a részecskeméretre vonatkozó feltétel nem teljesült,
—
magyarázatot kell szolgáltatni, amennyiben a humánus végpontokról szóló OECD-iránymutatás (8) szerinti kritériumok alapján humánus módon el kellett pusztítani a fájdalommal küszködő vagy súlyos és tartós szorongás jeleit mutató állatokat,
—
amennyiben az e melléklet B.52. fejezete (4) szerinti vizsgálatot felfüggesztettük, hogy helyette a jelen B.2. vizsgálati módszert alkalmazzuk, a döntést indokolni kell,
—
a vizsgálat általános értékelésének ismertetnie kell a névleges és a tényleges koncentrációk meghatározására használt módszerek konzisztenciáját, valamint a tényleges és a névleges koncentráció közötti összefüggést,
—
ki kell térni az elhullás valószínű okára, valamint az elsődleges hatásmechanizmusra (szisztémás vagy helyi).
SZAKIRODALOM
(1)
OECD (2009). Acute Inhalation Toxicity Testing. OECD Guideline for Testing of Chemicals No. 403, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
(2)
OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 39, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
(3)
Az Európai Parlament és a Tanács 2008. december 16-i 1272/2008/EK rendelete az anyagok és keverékek osztályozásáról, címkézéséről és csomagolásáról, a 67/548/EGK és az 1999/45/EK irányelv módosításáról és hatályon kívül helyezéséről, valamint az 1907/2006/EK rendelet módosításáról, HL L 353., 2008.12.31., 1. o.
(4)
E melléklet B.52., Akut inhalációs toxicitás – Akut toxikus osztály (ATC) módszer című fejezete.
(5)
E melléklet B.40., In vitro bőrkorrózió: transzkután elektromos rezisztencia vizsgálat (TER) című fejezete.
(6)
E melléklet B.40A., In vitro bőrkorrózió: emberi bőrmodellen végzett vizsgálat című fejezete.
(7)
OECD (2005), In Vitro Membrane Barrier Test Method For Skin Corrosion. OECD Guideline for Testing of Chemicals No. 435, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
(8)
OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 19, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
(9)
SOT (1992). Technical Committee of the Inhalation Specialty Section, Society of Toxicology (SOT). Recommendations for the Conduct of Acute Inhalation Limit Tests. Fund. AppéldáulToxicol. 18: 321-327.
(10)
Phalen RF (2009). Inhalation Studies: Foundations and Techniques. (2nd Edition) Informa Healthcare, New York.
(11)
Pauluhn J and Thiel A (2007). A Simple Approach to Validation of Directed-Flow Nose-Only Inhalation Chambers. J. AppéldáulToxicol. 27: 160-167.
(12)
Zwart JHE, Arts JM, ten Berge WF, Appelman LM (1992). Alternative Acute Inhalation Toxicity Testing by Determination of the Concentration-Time-Mortality Relationship: Experimental Comparison with Standard LC50 Testing. Reg. Toxicol. Pharmacol. 15: 278-290.
(13)
Zwart JHE, Arts JM, Klokman-Houweling ED, Schoen ED (1990). Determination of Concentration-Time-Mortality Relationships to Replace LC50 Values. Inhal. Toxicol. 2: 105-117.
(14)
Ten Berge WF and Zwart A (1989). More Efficient Use of Animals in Acute Inhalation Toxicity Testing. J. Haz. Mat. 21: 65-71.
(15)
OECD (2009). Performance Assessment: Comparison of 403 and C x t Protocols via Simulation and for Selected Real Data Sets. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 104, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
(16)
Finney DJ (1977). Probit Analysis, 3rd ed. Cambridge University Press, London/New York.
FOGALOMMEGHATÁROZÁS
Vizsgált vegyi anyag: A jelen vizsgálati módszer alkalmazásával vizsgált bármely anyag vagy keverék.
1. függelék
C × t PROTOKOLL
1.
Az inhalációs toxicitás értékeléséhez a hagyományos protokoll helyett megfontolható egy fokozatos koncentráció × idő (C × t) vizsgálat elvégzése (12) (13) (14). Ez a vizsgálat lehetőség szerint abban az esetben végzendő el, ha meghatározott szabályozási vagy tudományos igény miatt, például veszélyhelyzeti intézkedések tervezéséhez vagy területrendezéshez több időtartamon át végzett állatkísérletekre van szükség. A módszer általában egy határkoncentráción végzett vizsgálattal kezdődik (I. expozíciós szakasz), amelynek során az állatokat a vizsgált anyagnak öt időtartamra (például 15, 30, 60, 120 és 240 percre) tesszük ki úgy, hogy egyetlen expozíciós szakasz során több időtartamot vizsgálunk (lásd az 1. ábrát). Az 1272/2008/EK rendelet alkalmazása esetén a gázok, gőzök és aeroszolok határkoncentrációja rendre 20 000 ppm, 20 mg/l és 5 mg/l. Ezek a szintek kizárólag akkor léphetők túl, ha az adott szinteken történő vizsgálatot szabályozási vagy tudományos igény indokolja (lásd a B.2. fejezet fő szövegének 37. bekezdését).
2.
Amennyiben kevés a vizsgált vegyi anyag toxicitásával kapcsolatos információ, vagy egyáltalán nem áll rendelkezésre, dózisbehatároló vizsgálatot kell végezni, amelynek során nemenként legfeljebb 3 állatból álló csoportokat teszünk ki a vizsgálatvezető által kiválasztott célkoncentrációknak, általában 240 percre.
3.
Ha az I. expozíciós szakasz során határkoncentrációt vizsgálunk, és az elhullási arány 50 % alatti, nincs szükség további vizsgálatokra. Amennyiben szabályozási vagy tudományos igény mutatkozik a koncentráció, az idő és a válasz közötti összefüggésnek a megjelölt határkoncentrációt meghaladó szinten történő meghatározására, a következő expozíciót magasabb szinten, például határkoncentráció kétszeresénél kell végrehajtani (lásd az 1. ábrán a 2L szintet).
4.
Ha a határkoncentrációnál toxicitást figyelünk meg, további vizsgálat (fő vizsgálat) elvégzése szükséges. Ezeket a további expozíciókat vagy alacsonyabb koncentrációk mellett (az 1. ábrán a II., III. vagy IV’. expozíciós szakasz), vagy magasabb koncentrációk mellett, rövidebb időtartamon át (az 1. ábrán a IV. expozíciós szakasz) kell elvégezni, kiigazított és egymástól kevésbé távoli időtartamok alkalmazásával.
5.
A vizsgálatot (kiindulási koncentráció és további koncentrációk mellett) nemenként, koncentrációnként és időpontonként 1 állaton, vagy koncentrációnként és időpontonként a vizsgált anyagra érzékenyebb nem 2 példányán végezzük el. Bizonyos körülmények között a vizsgálatvezető nemenként, koncentrációnként és időpontonként 2 patkány (vagy koncentrációnként és időpontonként a vizsgált anyagra érzékenyebb nem 4 példányának) vizsgálata mellett is dönthet (15). Ha minden koncentrációhoz és időponthoz nemenként 2 állatot alkalmazunk, általában csökkenthető a becslések torzítása és variabilitása, növelhető a sikeres becslések aránya, és javítható a konfidenciaintervallum lefedettsége az itt ismertetett protokollhoz viszonyítva. További részletek a 39. iránymutatásban (2) olvashatók.
6.
Ideális esetben mindegyik expozíciós szakaszt ugyanazon a napon hajtjuk végre. Ez lehetővé teszi, hogy a következő expozíciót addig halasszuk, amíg ésszerű biztonsággal nem várható az állatok túlélése, valamint a vizsgálatvezető számára lehetőséget biztosít a következő expozíciós szakasz célkoncentrációjának kiigazítására. Javasolt mindegyik expozíciós szakaszt azzal a csoporttal kezdeni, amelynek expozíciója a leghosszabb ideig fog tartani, például a 240 perces expozíciós csoporttal, folytatva a 120 perces expozíciós csoporttal stb. Ha például a 240 perces csoportban vizsgált állatok 90 perc elteltével elpusztulnak vagy a toxicitás súlyos tüneteit mutatják (például a légzésritmus szélsőséges változásait, beleértve a nehéz légzést), a következő csoportot nem volna célszerű 120 perces expozíciónak kitenni, mivel az elhullási arány feltehetően 100 %-os lenne. A vizsgálatvezetőnek javasolt tehát rövidebb (például 90, 65, 45, 33 és 25 perces) expozíciós időtartamokat választania az adott koncentrációhoz.
7.
A kamrabeli koncentrációt gyakran kell mérni az egyes expozíciós időtartamok időarányosan súlyozott átlagkoncentrációjának meghatározása érdekében. Lehetőség szerint minden egyes állat elhullásának időpontját (nem pedig az expozíciós időtartamot) kell a statisztikai elemzés során felhasználni.
8.
Az első négy expozíciós szakasz eredményeit megvizsgálva meg kell határozni a koncentráció-idő görbe azon részét, amelyen az adatok hiányosak (lásd az 1. ábrát). Nem megfelelő illeszkedés esetén egy további (5. koncentráció melletti) expozíció végezhető. Az 5. expozícióhoz használt koncentrációt és időtartamokat úgy kell megválasztani, hogy lefedjék e hiányzó adatokat.
9.
Mindegyik expozíciós szakaszt (beleértve az elsőt is) felhasználjuk a koncentráció-idő-válasz összefüggés statisztikai elemzés útján történő meghatározására (16). Lehetőség szerint minden egyes C × t-intervallumhoz az időarányosan súlyozott átlagkoncentrációt és (amennyiben az elhullás az expozíció során következik be) az elhullásig eltelt expozíciós időt kell felhasználni.
Nemenként, koncentrációnként és időpontonként 1, összesen 10 állat.
—
Állatok öt csoportját tesszük ki alacsonyabb koncentrációnak (4) (1/2L), némileg hosszabb (√2 tényezővel elválasztott) expozíciós időtartamokra (lásd az 1. ábrát).
↓
III. expozíciós szakasz –fő vizsgálat
—
Nemenként, koncentrációnként és időpontonként 1, összesen 10 állat.
—
Állatok öt csoportját tesszük ki alacsonyabb koncentrációnak (4) (1/4L), némileg hosszabb (√2 tényezővel elválasztott) expozíciós időtartamokra (lásd az 1. ábrát).
↓
IV’. expozíciós szakasz –fő vizsgálat
—
Nemenként, koncentrációnként és időpontonként 1, összesen 10 állat.
—
Állatok öt csoportját tesszük ki alacsonyabb koncentrációnak (4) (1/8L), némileg hosszabb (√2 tényezővel elválasztott) expozíciós időtartamokra (lásd az 1. ábrát).
↓ vagy
IV. expozíciós szakasz –fő vizsgálat
—
Nemenként, koncentrációnként és időpontonként 1, összesen 10 állat.
—
Állatok öt csoportját tesszük ki magasabb koncentrációnak (5) (2L), némileg rövidebb (√2 tényezővel elválasztott) expozíciós időtartamokra (lásd az 1. ábrát).
A C × t protokoll eredményeinek matematikai feldolgozása
11.
Egy 4 vagy 5 expozíciós koncentrációra és 5 időtartamra kiterjedő C × t eljárással 20 vagy 25 adatpont kapható. Ezen adatpontok alapján statisztikai elemzéssel (16) kiszámítható a C × t összefüggés:
1. egyenlet:
ahol C = koncentráció; t = az expozíció időtartama, vagy
2. egyenlet:
ahol
Az 1. egyenlettel kiszámítható az LC50 értéke egy adott időtartamra (például 4 órára, 1 órára, 30 percre vagy a vizsgált időtartamok tartományán belüli bármely időtartamra) a P = 5 (50 %-os válasz) értéket alkalmazva. Megjegyzendő, hogy a Haber-szabály csak akkor alkalmazható, ha n = 1. Az LC01 a P = 2,67 érték segítségével számítható ki.
”
4.
A B.7. és a B.8. fejezet helyébe a következő szöveg lép:
„B.7. ISMÉTELT ADAGOLÁSÚ, 28 NAPOS ORÁLIS TOXICITÁSI VIZSGÁLAT RÁGCSÁLÓKON
BEVEZETÉS
1.
A jelen vizsgálati módszer egyenértékű az OECD 407. vizsgálati iránymutatásában (2008) leírt módszerrel. Az eredeti 407. vizsgálati iránymutatást 1981-ben fogadták el. 1995-ben felülvizsgált változatot fogadtak el, amellyel további információk nyerhetők a vizsgált állatokról, különösen neurotoxicitási és immuntoxicitási szempontból.
2.
1998-ban az OECD a meglévő vizsgálati iránymutatások felülvizsgálatára, valamint az endokrin rendszert esetlegesen károsító anyagok kiszűrésére és vizsgálatára vonatkozó új vizsgálati iránymutatások kidolgozására irányuló, kiemelt fontosságú tevékenységet indított (8). A tevékenység részeként az »ismételt adagolású, 28 napos orális toxicitási vizsgálat rágcsálókon« elnevezésű eljárásra vonatkozó (407. számú) OECD-iránymutatást a vizsgált vegyi anyagok endokrin aktivitásának észlelésére alkalmas paraméterekkel frissítették. Az eljárást átfogó nemzetközi program keretében vizsgálták, hogy megállapítsák az új paraméterek relevanciáját és gyakorlati alkalmazhatóságát, a paraméterek (anti)ösztrogén, (anti)androgén és (anti)tiroid hatású vegyi anyagok tekintetében nyújtott teljesítményét, a laboratóriumon belüli és laboratóriumközi ismételhetőséget, valamint azt, hogy az új paraméterek mennyiben akadályozzák a 407. vizsgálati iránymutatást megelőzően előírt paraméterek alkalmazását. Az így kapott nagy mennyiségű adatot egy átfogó OECD-jelentésben (9) foglalták össze és értékelték részletesen. Ez a frissített (a 407. vizsgálati iránymutatással egyenértékű) B.7. vizsgálati módszer a nemzetközi vizsgálati program tapasztalatain és eredményein alapul. A jelen vizsgálati módszer lehetővé teszi bizonyos, az endokrin rendszer útján kifejtett hatások egyéb toxikológiai hatások összefüggésében történő értékelését.
KIINDULÁSI MEGFONTOLÁSOK ÉS KORLÁTOK
3.
Egy vegyi anyag toxikus jellemzőinek értékelése és felmérése során az ismételt adagolású orális toxicitást azután lehet meghatározni, hogy az akut toxicitási vizsgálatok kezdeti eredményei már rendelkezésre állnak. A jelen vizsgálati módszer célja a hatásoknak a lehetséges toxicitási célok igén széles körénél történő vizsgálata. A módszer információkkal szolgál a viszonylag rövid időn belüli ismételt expozíció valószínű egészségügyi kockázatairól, beleértve az idegrendszerre, az immunrendszerre és az endokrin rendszerre gyakorolt hatásokat. E meghatározott végpontok tekintetében rendszerint azonosítja azokat a neurotoxikus potenciállal rendelkező vegyi anyagokat, amelyek e tekintetben további, részletes vizsgálatokat indokolhatnak, valamint a pajzsmirigyet fiziológiai szempontból befolyásoló vegyi anyagokat. Adatokkal szolgálhat emellett a fiatal ivarérett állatok hím és/vagy nőstény szaporítószerveire hatást gyakorló vegyi anyagokról, továbbá jelezheti azok immunológiai hatásait.
4.
A jelen B.7. vizsgálati módszerrel kapott eredmények a veszélyek azonosítására és kockázatértékelésre használandók. Az endokrin rendszerrel kapcsolatos paraméterek alkalmazásával kapott eredményeket az OECD endokrin rendszert károsító anyagok vizsgálatára és értékelésére vonatkozó elvi keretrendszerének összefüggésében kell értelmezni (11). A módszer egy alapvető, ismételt adagolású toxicitási vizsgálatot foglal magában, amely a 90 napos vizsgálatot nem igénylő vegyi anyagok esetén (például abban az esetben, ha az előállított mennyiség nem halad meg bizonyos határértékeket), vagy egy hosszú távú vizsgálat előzetes vizsgálataként alkalmazható. Az expozíció időtartama 28 nap.
5.
A vizsgált vegyi anyag endokrin aktivitásának esetleges észlelésére alkalmas paraméterek validálása érdekében folytatott nemzetközi program során kimutatták, hogy a jelen B.7. vizsgálati módszerrel kapott adatok minősége jelentős mértékben függ a vizsgálati laboratórium tapasztalatától. Ez konkrétan a nőstény szaporítószervek ciklikus változásainak kórszövettani meghatározásához, valamint a kisméretű, nehezen boncolható hormonfüggő szervek súlyának meghatározásához kapcsolódik. A kórszövettani vizsgálathoz iránymutatást dolgoztak ki (19). Az iránymutatás elérhető az OECD vizsgálati iránymutatásokkal foglalkozó nyilvános weboldalán. Célja, hogy segítse a kórboncnokok vizsgálatait, valamint fokozza a vizsgálat érzékenységét. Több paraméterről találták úgy, hogy alkalmas az endokrin rendszerrel kapcsolatos toxicitás kimutatására, és ezeket belefoglalták a vizsgálati módszerbe. Azokat a paramétereket, amelyekről nem állt rendelkezésre elegendő adat azok hasznosságának igazolására, vagy amelyek endokrin rendszert károsító anyagok kimutatásának elősegítésére való képességéről a validációs program során csekély bizonyítékot találtak, a módszer opcionális végpontként javasolja (lásd a 2. függeléket).
6.
A validációs folyamat során előállított adatok alapján hangsúlyozandó, hogy e vizsgálat nem kellően érzékeny valamennyi (anti)androgén és (anti)ösztrogén hatásmechanizmusú anyag azonosítására (9). A jelen vizsgálati módszer nem alkalmazandó az endokrin rendszert károsító hatásokra leginkább érzékeny életszakaszban. A vizsgálati módszerrel a validációs folyamat során ennek ellenére azonosítottak a pajzsmirigy működésére gyenge és erős hatást gyakorló anyagokat, valamint erős és mérsékelt, ösztrogén vagy androgén receptorokon keresztül ható endokrin hatóanyagokat, ugyanakkor a legtöbb esetben nem sikerült azzal azonosítani az ösztrogén vagy androgén receptorokra gyenge hatást gyakorló endokrin hatóanyagokat. Éppen ezért a vizsgálat nem nevezhető az endokrin aktivitás szűrésére szolgáló vizsgálatnak.
7.
Következésképpen az e hatásmechanizmusokkal összefüggő hatások hiánya nem tekinthető az endokrin rendszerre gyakorolt hatások hiánya bizonyítékának. Az endokrin rendszer által közvetített hatások tekintetében az anyag jellemzését éppen ezért nem szabad kizárólag az e vizsgálati módszerrel kapott eredményekre alapozni, hanem azokat az adatok bizonyító erejének súlyozásához kell felhasználni, a lehetséges endokrin aktivitás jellemzéséhez figyelembe véve a vegyi anyagról rendelkezésre álló összes adatot. Éppen ezért az endokrin aktivitásra (az anyag jellemzésére) vonatkozó szabályozói döntéshozatalnak átfogó alapokon kell nyugodnia, és nem alapulhat kizárólag az e vizsgálati módszer alkalmazásával kapott eredményeken.
8.
Elismerik, hogy minden, állatkísérleteken alapuló eljárást az állatgondozásra vonatkozó helyi szabványoknak megfelelően kell végrehajtani; az alábbiakban foglalt, gondozásra és kezelésre vonatkozó leírások minimális teljesítményszabványok, amelyeket a szigorúbb helyi szabályozások felülbírálnak. Az állatokkal való humánus bánásmódról további iránymutatás a megfelelő OECD-kiadványban található (14).
9.
Az alkalmazott fogalmak meghatározását az 1. függelék tartalmazza.
A VIZSGÁLAT ELVE
10.
A vizsgált vegyi anyagot naponta, szájon át adjuk be több kísérleti állatcsoportnak, csoportonként más-más adagolási szinten, 28 napon keresztül. Az anyag beadásának időszakában az állatokat a toxicitás jeleinek észlelése érdekében minden nap gondosan megfigyeljük. A vizsgálat során elpusztult vagy elpusztított állatokat felboncoljuk, továbbá a vizsgálat befejezése után az életben maradt állatokat is elpusztítjuk és felboncoljuk. A 28 napos vizsgálat információkkal szolgál az ismételt orális expozíció hatásairól, és jelezheti a további, hosszú távú vizsgálatok szükségességét. Információkat biztosíthat továbbá a hosszabb távú vizsgálatokhoz használandó koncentrációk kiválasztásához. A jelen vizsgálati módszer alkalmazásával kapott adatok lehetővé teszik a vizsgált vegyi anyag toxicitásának jellemzését, a dózis-válasz összefüggés kimutatását, valamint a még nem észlelhető káros hatásszint (NOAEL) meghatározását.
A MÓDSZER LEÍRÁSA
Az állatfaj kiválasztása
11.
A javasolt rágcsálófaj a patkány, bár más rágcsálófajok is alkalmazhatók. Ha a jelen B.7. vizsgálati módszerben meghatározott paramétereket más rágcsálófajon vizsgáljuk, a döntést részletesen indokolni kell. Bár biológiailag elképzelhető, hogy más fajok a patkányhoz hasonlóan reagálnak a toxikus anyagokra, a kisebb méretű fajok alkalmazása nagyobb variabilitáshoz vezethet a kisebb szervek boncolásával összefüggő technikai nehézségek miatt. A nemzetközi validációs programban a patkány volt az endokrin rendszert károsító anyagok kimutatására használt egyetlen faj. Általánosan használt laboratóriumi törzsekből származó egészséges, fiatal, ivarérett állatokat kell alkalmazni. Olyan nőstényeket kell választani, amelyek még egyszer sem ellettek, és nem vemhesek. Az adagolást az elválasztás után a lehető legrövidebb időn belül célszerű elkezdeni, de mindenképpen az állatok 9 hetes kora előtt. A vizsgálat megkezdésekor az egyes kísérleti állatok testsúlyának csak minimális mértékben szabad különböznie egymástól, és egyik nem esetében sem térhet el ± 20 %-nál nagyobb mértékben a nem átlagától. Amennyiben az ismételt orális adagolást egy hosszabb távú vizsgálat előzetes vizsgálataként végezzük, lehetőség szerint azonos törzsből való, azonos eredetű állatokat kell alkalmazni mindkét vizsgálathoz.
Az állatok tartása és etetése
12.
Minden eljárásnak meg kell felelnie a laboratóriumi állatgondozásra vonatkozó helyi szabványoknak. A kísérleti állatok tartására használt helyiség hőmérséklete 22 °C (± 3 °C) kell, hogy legyen. Noha a helyiség relatív páratartalmának legalább 30 %-nak kell lennie, és – a takarítás időtartamától eltekintve – lehetőség szerint nem szabad meghaladnia a 70 %-ot, a célértéknek 50–60 % között kell lennie. A világítás legyen mesterséges, 12 órás világos és 12 órás sötét periódusok váltsák egymást. Az etetéshez hagyományos laboratóriumi takarmány alkalmazható, korlátlan mennyiségű ivóvíz biztosítása mellett. A takarmány megválasztását a vizsgált vegyi anyaggal való megfelelő keveredés igénye is befolyásolhatja, ha a vizsgált vegyi anyagot a takarmánnyal adjuk be. Az állatokat nemek szerint elkülönítve, kis csoportokban kell tartani; tudományos szempontból indokolt esetekben az állatok egyenként is elhelyezhetők. Ketrecben való csoportos elhelyezés esetén egy ketrecben legfeljebb öt állat tartható.
13.
Rendszeresen ellenőrizni kell, hogy a takarmány nem tartalmaz-e szennyező anyagokat. A takarmányból egy mintát a jegyzőkönyv véglegesítéséig meg kell őrizni.
Az állatok előkészítése
14.
Egészséges, fiatal, ivarérett állatokat osztunk véletlenszerűen a kontroll- és kezelt csoportokba. A ketreceket úgy kell elrendezni, hogy minimálisra lehessen csökkenteni a ketrec elhelyezésének lehetséges hatásait. Az állatokat az egyedi azonosíthatóság céljából megjelöljük, és a vizsgálat megkezdése előtt legalább öt napig a ketrecükben tartjuk a laboratóriumi körülményekhez való szoktatás céljából.
A dózisok előkészítése
15.
A vizsgált vegyi anyagot gyomorszondán át, vagy az állatok táplálékába vagy ivóvizébe keverve adjuk be. A szájon át történő beadás módszerét a vizsgálat céljától, valamint a vizsgált vegyi anyag fizikai, kémiai és toxikokinetikai tulajdonságaitól függően választjuk meg.
16.
A vizsgált vegyi anyagot szükség esetén feloldjuk vagy szuszpendáljuk alkalmas vivőanyagban. Lehetőség szerint elsősorban vizes oldatot/emulziót ajánlatos alkalmazni, másodsorban olajos (például kukoricacsíra-olajban elkészített) oldatot vagy emulziót, és csak harmadsorban más vivőanyagokban elkészített oldatot. Amennyiben nem víz a vivőanyag, a vivőanyag toxikus tulajdonságainak ismertnek kell lenniük. Meg kell határozni azt is, hogy a vizsgált vegyi anyag mennyire stabil az adott vivőanyagban.
ELJÁRÁS
Az állatok száma és neme
17.
Minden egyes adagolási szinthez legalább 10 állatot (5 hímet és 5 nőstényt) kell alkalmazni. Ha időközi elpusztítást tervezünk, a létszámot annyival kell megnövelni, ahány állatot a vizsgálat befejezése előtt el szándékozunk pusztítani. Meg kell fontolni egy további, tíz állatból (nemenként öt példányból) álló kísérő csoport alkalmazását a kontrollcsoportban és a legnagyobb adaggal kezelt csoportban, amelyen a kezelés időszakát követően legalább 14 napig megfigyeljük a toxikus hatás visszafordíthatóságát, tartósságát vagy késleltetett kialakulását.
Adagolás
18.
Általában legalább három vizsgálati és egy kontrollcsoport alkalmazandó, azonban ha más adatok értékelése alapján 1 000 mg/testsúlykilogramm/nap adag esetén nem várható hatás, határérték-vizsgálat végezhető. Ha nem állnak rendelkezésre megfelelő adatok, az alkalmazandó dózisok meghatározása céljából tartománybehatároló vizsgálat végezhető (azonos törzsből való, azonos eredetű állatokon). A kontrollcsoportba tartozó állatokat a vizsgált vegyi anyag beadásától eltekintve ugyanolyan módon kell kezelni, mint a vizsgálati csoportokban lévőket. Ha a vizsgált vegyi anyag beadásához vivőanyagot alkalmazunk, a kontrollcsoportnak a vivőanyagból a felhasznált legnagyobb mennyiséget kell kapnia.
19.
Az adagolási szintek kiválasztásánál figyelembe kell venni a vizsgált, vagy azzal rokon vegyi anyagok toxicitására és (toxiko)kinetikájára vonatkozóan rendelkezésre álló adatokat. A legmagasabb dózist úgy kell kiválasztani, hogy az toxikus tüneteket keltsen, de ne okozzon halált vagy súlyos szenvedést a kísérleti állatoknak. Ezután az adagokat fokozatosan csökkentjük, azzal a céllal, hogy a legalacsonyabb adagolási szinten kimutassuk az dózistól függő hatásokat és a nem észlelhető káros hatásszintet (NOAEL). A csökkenő dózisszintek beállításához gyakran optimális a 2–4-szeres intervallumok alkalmazása, a dózisok közötti nagyon nagy intervallumok (például 10-nél magasabb szorzófaktor) alkalmazásával szemben pedig gyakran előnyben részesítendő egy negyedik vizsgálati csoport beiktatása.
20.
Ha általános toxicitást (például testsúlycsökkenést, a májra, a szívre, a tüdőre vagy a vesére kifejtett hatásokat stb.) vagy egyéb, nem feltétlenült toxikus reakcióra utaló változásokat (például csökkent táplálékfogyasztást, májmegnagyobbodást) figyelünk meg, az immun-, ideg- és endokrin rendszer szempontjából érzékeny végpontok tekintetében megfigyelt hatások értelmezésekor óvatosan kell eljárni.
Határérték-vizsgálat
21.
Ha a vizsgálat során egyetlen, legalább 1 000 mg/testsúlykilogramm/nap adagolási szint, vagy a takarmányban vagy ivóvízben beadott anyagmennyiség ennek megfelelő (a testsúly alapján végzett számításokon alapuló) százaléka, és az e vizsgálathoz leírt eljárás betartása mellett a vizsgált anyag nem okoz észlelhető toxikus hatásokat, valamint ha a szerkezetileg rokon vegyi anyagokra vonatkozó adatok alapján nem is várható a toxicitás bekövetkezése, akkor a teljes, három adagolási szintet átfogó tanulmány elvégzése nem feltétlenül tekintendő szükségesnek. A határérték-vizsgálat alkalmazandó, kivéve, ha az emberi expozíció ennél nagyobb adagolási szint használatát indokolja.
A dózisok beadása
22.
Az állatoknak 28 napon keresztül naponta, a hét 7 napján adjuk be a vizsgált vegyi anyagot. Ha a vizsgált vegyi anyagot szondán át adagoljuk, lehetőleg egyetlen adagban kell gyomorszondán vagy megfelelő intubációs kanülön át beadni. Az egy alkalommal beadható folyadék maximális mennyisége a kísérleti állat méretétől függ. E mennyiség nem haladhatja meg az 1 ml/100 testsúlygramm arányt, kivéve vizes oldatok esetében, amelyeknél 2 ml/100 testsúlygramm is alkalmazható. A magasabb koncentrációértékek esetén rendszerint fokozottabb hatást kiváltó irritatív vagy maró vegyi anyagok kivételével a koncentráció megfelelő beállításával a minimálisra kell csökkenteni a vizsgált anyag mennyiségének változásait, hogy a mennyiség valamennyi adagolási szinten konstans legyen.
23.
A takarmánnyal vagy ivóvízzel adagolt vegyi anyagok esetében fontos biztosítani, hogy a vizsgált vegyi anyag beadott mennyisége ne zavarja meg a szokásos táplálékfelvételt vagy a vízháztartás egyensúlyát. Ha a vizsgált vegyi anyagot a takarmánnyal juttatjuk be, akkor vagy állandó takarmánykoncentráció (ppm), vagy az állatok testsúlyára kiszámított állandó dózisszint alkalmazható, és meg kell jelölni, hogy melyik alternatívát alkalmazzuk. A szondával bejuttatott vegyi anyagok esetében a dózist mindig a nap hasonló időszakában kell beadni, és szükség szerint ki kell igazítani ahhoz, hogy az állat testsúlyához viszonyítva állandó értéken lehessen tartani. Ha az ismételt adagolású vizsgálatot egy hosszú távú vizsgálat előtanulmányaként végezzük, mindkét vizsgálatban hasonló takarmányt kell alkalmazni.
Megfigyelések
24.
A megfigyelési időszak 28 nap. A kísérő csoportban lévő állatokat, amelyekkel további megfigyeléseket tervezünk, még legalább további 14 napig kell kezelés nélkül tartani, hogy a toxikus hatások késleltetett előfordulását, megmaradását vagy visszafordíthatóságát megfigyeljük.
25.
Naponta legalább egyszer, lehetőleg minden nap ugyanazon időpont(ok)ban általános klinikai megfigyelést kell végezni, figyelembe véve az adagolást követően várható hatások érvényesülésének csúcsidőszakát. Fel kell jegyezni a kísérleti állatok klinikai kórállapotát. Naponta legalább kétszer meg kell vizsgálni az összes állatot megbetegedés és elhullás szempontjából.
26.
Az első expozíció előtt egyszer (az egyedek közötti összehasonlítás érdekében), azt követően pedig legalább hetente egyszer az összes állatot részletes klinikai vizsgálatoknak kell alávetni. E megfigyeléseket az állatok tartására egyébként használt ketreceken kívül, lehetőleg egy szabványos karámban, minden alkalommal a nap hasonló időszakában kell elvégezni. A megfigyeléseket gondosan fel kell jegyezni, lehetőleg a vizsgálatokat végző laboratórium által kifejezetten meghatározott pontozásos rendszer segítségével. Törekedni kell arra, hogy minimálisak legyenek a kísérleti körülmények közötti eltérések, és hogy a megfigyeléseket lehetőleg olyan megfigyelők végezzék, akik nem tudnak a kezelésről. A feljegyzett észleléseknek ki kell terjedniük többek között a bőr, a szőrzet, a szemek és a nyálkahártyák állapota, a váladékok és kiválasztott anyagok előfordulása, valamint az autonóm aktivitás (például könnyezés, szőrzet felborzolódása, pupillaméret, szokatlan légzési ritmusok) tekintetében megfigyelhető változásokra. A járás, a testtartás és a kézbevételre adott reakció megváltozását, valamint a klónusos vagy tónusos görcsök, sztereotip viselkedés (például túlzott mosdás, megkergülés) vagy bármilyen bizarr viselkedésmód (például öncsonkítás, hátrafelé járás) megfigyelt eseteit is fel kell jegyezni (2).
27.
Az expozíció negyedik hetében a különböző típusú ingerekre (2) (például hallószervi, vizuális és önérzékelési ingerekre) (3) (4) (5) mutatott reakciókat vizsgáljuk, felmérjük a szorítás erejét (6) és a motoros aktivitást (7). A követendő eljárásokkal kapcsolatban további részletek a vonatkozó szakirodalomban találhatók. Ettől függetlenül a hivatkozottaktól eltérő alternatív eljárások is alkalmazhatók.
28.
Az expozíció negyedik hetében mellőzhetők a funkcionális megfigyelések, ha a vizsgálatot egy azt követő (90 napos) szubkrónikus toxicitási vizsgálat előzetes vizsgálataként végezzük. Ebben az esetben a funkcionális megfigyeléseket az utóbbi vizsgálat részeként kell elvégezni. Másrészt az ismételt adagolású vizsgálat során végzett funkcionális megfigyelések adatainak megléte segítheti az azt követő szubkrónikus toxicitási vizsgálat során a dózisok kiválasztását.
29.
Kivételes esetekben a funkcionális megfigyelések elhagyhatók azon csoportoknál is, amelyek egyébként olyan mértékű toxicitási tüneteket mutatnak, hogy az jelentős mértékben megzavarná a funkcionális vizsgálat eredményeit.
30.
A boncolásnál minden nőstény ivari ciklusa meghatározható hüvelykenet alapján (nem kötelező). E megfigyelések információkkal szolgálnak az ivari ciklus elpusztítás időpontjában fennálló stádiumáról, és segíthetik az ösztrogénre érzékeny szövetek szövettani értékelését (lásd a szövettanra vonatkozó iránymutatást (19)).
Testsúly és táplálék-/vízfogyasztás
31.
Minden állat súlyát hetente legalább egyszer le kell mérni. A felvett táplálék mennyiségét heti rendszerességgel le kell mérni. Amennyiben a vizsgált vegyi anyagot az ivóvízzel adjuk be, a vízfogyasztást is legalább hetente le kell mérni.
Hematológia
32.
A vizsgálati időszak végén a következő hematológiai vizsgálatokat kell elvégezni: hematokrit, hemoglobinkoncentráció, vörösvértestszám, retikulociták, teljes és differenciált vérkép, trombocitaszám és a véralvadási idő/képesség mérése. Ha a vizsgált vegyi anyagról vagy annak vélt metabolitjairól ismert vagy feltételezhető, hogy oxidáló tulajdonságokkal rendelkeznek, az említett vizsgálatokon kívül többek között a methemoglobinkoncentrációt és a Heinz-testek előfordulását is meg kell határozni.
33.
A vérmintákat egy megnevezett helyről kell venni, közvetlenül az állatok elpusztítása előtt vagy aközben, és azokat megfelelő körülmények között kell tárolni. Az állatokat az elpusztítás előtti éjszaka koplaltatni kell (2).
Klinikai biokémiai vizsgálatok
34.
A klinikai biokémiai értékeknek a szövetekben jelentkező fontosabb toxikus hatások és különösen a vesére és a májra gyakorolt hatások vizsgálata érdekében végzett meghatározását a közvetlenül az állatok elpusztítása előtt vagy annak részeként elvégzett vérvétel során valamennyi állattól vett mintákon kell elvégezni (eltekintve az elhullásközeli állapotban lévő és/vagy időközben elpusztított egyedektől). A vérplazma- és vérszérum-meghatározások során vizsgálandó anyagok közé tartozik a nátrium, a kálium, a vércukor, az összkoleszterin, a karbamid, a kreatinin, az összprotein és az albumin, továbbá legalább két, májsejti hatásokat jelző enzim (például alanin-aminotranszferáz, aszpartát-aminotranszferáz, alkáli foszfatáz, γ-glutamil-transzpeptidáz és glutamát-dehidrogenáz), valamint az epesavak. Bizonyos körülmények között hasznos információk nyerhetők további (májból vagy máshonnan származó) enzimek, valamint a bilirubin méréséből.
35.
Kiegészítésként a vizsgálat utolsó hetében a vizeletet előre meghatározott időpontokban való gyűjtése mellett a vizelet alábbi tulajdonságainak meghatározása is elvégezhető: megjelenés, mennyiség, ozmolalitás vagy fajsúly, pH-érték, fehérjék, glukóz és vér/vérsejtek.
36.
Ezeken túlmenően megfontolandó az általános szöveti roncsolódás plazma- vagy szérummarkereinek vizsgálata. Más vizsgálatokat is el kell végezni, ha a vizsgált vegyi anyag ismert tulajdonságai hatással vannak vagy lehetnek a kapcsolódó anyagcsere-folyamatokra; ilyen például a kalcium, a foszfát, a trigliceridek, egyes hormonok, valamint a kolinészteráz mérése. Ezeket az értékeket az egyes besorolási osztályokhoz tartozó vegyi anyagokra nézve vagy eseti alapon kell meghatározni.
37.
Bár az endokrin rendszerrel kapcsolatos végpontok nemzetközi értékelése során nem nyert egyértelmű bizonyítást, hogy ez a pajzsmirigyhormonok (T3, T4) és a pajzsmirigyserkentő hormon (TSH) meghatározása tekintetében előnyös, hasznos lehet plazma- vagy szérummintákat megőrizni a T3, a T4 és a TSH (nem kötelező) mérése érdekében, amennyiben az agyalapi mirigy-pajzsmirigy tengelyre kifejtett hatásra utaló jeleket tapasztalunk. E minták tárolás céljából -20 °C hőmérsékletre fagyaszthatók. A hormonok meghatározásának variabilitását és az azzal kapott abszolút koncentrációt az alábbi tényezők befolyásolhatják:
—
az elpusztítás időpontja, tekintettel a hormonkoncentrációk nap folyamán tapasztalható ingadozására,
—
az állatot érő indokolatlan stressz elkerülése érdekében alkalmazott elpusztítási mód, amely hatással lehet a hormonkoncentrációkra,
—
a hormonmeghatározásokhoz alkalmazott, standard görbéjük tekintetében esetlegesen eltérő vizsgálati készletek.
A pajzsmirigyre ható vegyi anyagok egyértelmű azonosítása kórszövettani vizsgálat útján hatékonyabban elvégezhető, mint hormonszintek alapján.
38.
A kifejezetten hormon-meghatározási célra szánt plazmamintákat a nap hasonló időpontjában kell gyűjteni. Javasolt megfontolni a T3, T4 és TSH pajzsmirigyi kórszövettani elváltozások esetén végzett meghatározását. A kereskedelmi fogalomban kapható különböző vizsgálati készletek eltérő számszerű értékeket adnak a hormonkoncentrációk elemzése során. Következésképpen nem feltétlenül lehet teljesítménykritériumokat megadni egységes múltbeli adatok alapján. Másik lehetőségként a laboratóriumoknak törekedniük kell arra, hogy a T3 és a T4 variációs együtthatója 25 alatt, a TSH-é pedig 35 alatt maradjon. Minden koncentrációt ng/ml-ben kell feljegyezni.
39.
Ha a rendelkezésre álló kiinduló adatok nem bizonyulnak elegendőnek, megfontolandó a hematológiai és klinikai biokémiai változók meghatározása az adagolás kezdete előtt, lehetőség szerint az állatok egy, a kísérleti csoportokba nem tartozó csoportjánál.
PATOLÓGIA
Autopszia
40.
A vizsgálatokba bevont összes állatot teljes körű, beható autopsziának kell alávetni, ideértve a következők alapos vizsgálatát: a test külső felszíne, az összes testnyílás, a koponya, a mellüreg, a hasüreg és ezek tartalma. Az összes állat máját, veséit, mellékveséit, heréit, mellékheréit, prosztatáját és ondóhólyagját a koaguláló mirigyekkel együtt, csecsemőmirigyét, lépét, agyát és szívét (eltekintve az elhullásközeli és/vagy a vizsgálat befejeztét megelőzően elpusztított egyedekéitől) megfelelően megtisztítjuk minden rátapadt szövettől, és azok nedves súlyát a boncolást követően a lehető legrövidebb időn belül megmérjük, mielőtt azok kiszáradnának. A prosztata és a kapcsolódó szervek megtisztítása során ügyelni kell arra, hogy ne szúrjuk át a folyadékkal teli ondóhólyagokat. Másik lehetőségként az ondóhólyagok és a prosztata megtisztítása és megmérése a fixálást követően is elvégezhető.
41.
Ezenkívül nem kötelező jelleggel két további szövet is megmérhető a boncolást követő lehető legrövidebb időn belül, mielőtt kiszáradna: páros petefészkek (nedves súly), valamint méh, beleértve a méhnyakat (a méhszövet eltávolítása és súlymérésre való előkészítése tekintetében az OECD 440. vizsgálati iránymutatása (18) nyújt útmutatást).
42.
A pajzsmirigy súlya (nem kötelező) a fixálást követően is meghatározható. A megtisztítás a szövetkárosodás elkerülése érdekében ez esetben is igen óvatosan, kizárólag a fixálást követően végzendő el. A szövetkárosodás veszélyeztetheti a kórszövettani elemzést.
43.
Az alábbi testszöveteket mind a szövet típusa, mind pedig a szándékolt későbbi kórszövettani vizsgálatok (lásd a 47. fejezetet) szempontjából legmegfelelőbb fixálóközegben kell tartósítani: minden szövet, amelyen makroszkopikus elváltozás figyelhető meg, az agy (jellemző részek, például a nagyagy, a kisagy és a nyúltagyi híd), a gerincvelő, a szem, a gyomor, a vékony- és vastagbél (beleértve a Peyer-plakkot), a máj, a vesék, a mellékvesék, a lép, a szív, a csecsemőmirigy, a pajzsmirigy, a légcső és a tüdők (ezeket először megtöltjük fixálószerrel, és azután merítjük alá), az ivarmirigyek (herék és petefészkek), a járulékos nemi szervek (a méh és a méhnyak, a mellékherék, a prosztata és az ondóhólyagok a koaguláló mirigyekkel együtt), a hüvely, a húgyhólyag, a nyirokcsomók (a legközelebbi elvezető nyirokcsomón kívül egy további nyirokcsomót is ki kell venni a laboratórium tapasztalatainak megfelelően (15)), perifériás idegek (csípő vagy sípcsont környéki), lehetőleg az izomzathoz közeli helyről véve, harántcsíkolt izom, valamint csont csontvelővel (metszet vagy másik lehetőségként egy friss, csontvelőből felszívott minta formájában). A herék fixálását javasolt Bouin- vagy módosított Davidson-féle fixálószerbe merítéssel végezni (16) (17). A tunica albugineán a fixálószer gyors bejutása érdekében tűvel óvatosan sekély szúrást kell ejteni a szerv mindkét végén. A klinikai és más jellegű megfigyelések alapján további testszövetek vizsgálata is szükséges lehet. A fentieken túl meg kell őrizni minden olyan más szervet is, amely a vizsgált vegyi anyag ismert tulajdonságai alapján valószínűleg célszervnek tekinthető.
44.
Az alábbi szövetek értékesek lehetnek az endokrin rendszerrel kapcsolatos hatások kimutatása szempontjából: Az ivarmirigyek (herék és petefészkek), a járulékos nemi szervek (a méh, beleértve a méhnyakat, a mellékherék, az ondóhólyagok a koaguláló mirigyekkel együtt, a dorsolateralis és a hasoldali prosztata), a hüvely, az agyalapi mirigy, a hím emlőmirigy, a pajzsmirigy és a mellékvese. A hím emlőmirigyek elváltozásairól nem áll rendelkezésre kellő dokumentáció, azonban ez a paraméter igen érzékeny lehet az ösztrogén hatású anyagokra. A 43. bekezdésben fel nem sorolt szervek, illetve szövetek megfigyelése nem kötelező (lásd a 2. függeléket).
45.
A kórszövettani iránymutatás (19) további információkat tartalmaz az endokrin szövetek boncolásával, fixálásával, metszeteinek elkészítésével és kórszövettani vizsgálatával kapcsolatban.
46.
A nemzetközi vizsgálati program szolgált némi bizonyítékkal arra, hogy a nemi hormonok homeosztázisára gyakorolt hatás tekintetében kismértékű potenciállal rendelkező vegyi anyagok endokrin rendszerre kifejtett, kevésbé szembetűnő hatásai az ivari ciklus különböző szövetekben végbemenő szinkronizálásának zavarai alapján ismerhetők fel, semmint a női ivarszervek nyilvánvaló kórszövettani elváltozásai alapján. Ugyan e hatásokra nem találtak egyértelmű bizonyítékot, a petefészkek (tüsző-, theca és granulosa sejtek), a méh, a méhnyak és a hüvely kórszövettani eredményeinek értelmezése során javasolt figyelembe venni az ivari ciklus esetleges aszinkronizmusának bizonyítékait. Ha értékeltük, a ciklus hüvelykenet alapján megállapított stádiuma is felhasználható ezen összehasonlítás során.
Kórszövettani vizsgálatok
47.
A tartósított szerveket és szöveteket mind a kontrollcsoportok, mind a magas dózissal kezelt csoportok összes egyede esetében teljes kórszövettani vizsgálatnak kell alávetni. Ha a magas dózissal kezelt csoport egyedei esetében a kezelésnek tulajdonítható elváltozások figyelhetők meg, e vizsgálatot az összes többi, különböző dózissal kezelt csoport egyedeire is ki kell terjeszteni.
48.
Minden makroszkopikus elváltozást meg kell vizsgálni.
49.
Kísérő csoport használata esetén azon szerveken és szöveteken kell kórszövettani vizsgálatot végezni, amelyeknél a kezelt csoportok egyedei esetében elváltozásokat lehetett kimutatni.
ADATOK ÉS JEGYZŐKÖNYVEZÉS
Adatok
50.
Az adatokat minden egyes állattal kapcsolatban rögzíteni kell. Ezenfelül az összes adatot táblázat formájában összegezni kell, a vizsgált állatok minden csoportja tekintetében bemutatva, hogy hány egyeddel indult a vizsgálat, hány állat pusztult el, illetve hányat kellett elpusztítani humánus okokból a vizsgálat során, valamint az elpusztulás vagy elpusztítás időpontját; a toxicitás jeleit mutató állatok számát, a megfigyelt toxicitási tünetek leírását, ideértve bármely toxikus hatás kezdetének idejét, időtartamát és súlyosságát, az elváltozásokat mutató állatok számát, az elváltozások típusát, súlyosságát és az egyes elváltozástípusokat mutató állatok százalékos arányát.
51.
A számszerű eredményeket lehetőség szerint megfelelő és általánosan elfogadott statisztikai módszer alkalmazásával kell kiértékelni. A hatás dózistartomány mentén történő összehasonlításaival kiküszöbölhető a több t-próba alkalmazása. A statisztikai módszereket a vizsgálat tervezésekor kell megválasztani.
52.
A minőség-ellenőrzéshez javasolt múltbeli kontrolladatokat gyűjteni, a számszerű adatokhoz pedig kiszámítani a variációs együtthatót, különösen az endokrin rendszert károsító anyagok kimutatásával összefüggő paraméterek tekintetében. Ezek az adatok felhasználhatók összehasonlítási célokra a tényleges vizsgálatok kiértékelése során.
Vizsgálati jegyzőkönyv
53.
A vizsgálati jegyzőkönyvnek a következő információkat kell tartalmaznia:
Vizsgált vegyi anyag:
—
fizikai jelleg, tisztaság, fizikai és kémiai tulajdonságok,
—
azonosító adatok.
Vivőanyag (ha van):
—
a vivőanyag kiválasztásának indokolása, ha az nem víz.
Kísérleti állatok:
—
használt faj/törzs,
—
az állatok száma, kora és neme,
—
az állatok származása, tartási körülmények, takarmány stb.,
—
az egyes állatok testsúlya a vizsgálat kezdetekor,
—
patkánytól eltérő faj alkalmazásának indokolása.
Vizsgálati körülmények:
—
az adagolási szintek kiválasztásának indokai,
—
a vizsgált vegyi anyag formulázásával/a takarmány előkészítésével, az elért koncentrációval, a készítmény stabilitásával és homogenitásával kapcsolatos adatok,
—
a vizsgált vegyi anyag beadására vonatkozó adatok,
—
átszámítás a vizsgált vegyi anyagnak a takarmányban/ivóvízben meglévő koncentrációjáról (ppm) a tényleges dózisra (mg/kg testsúly/nap), ha ez alkalmazható,
—
a táplálék és a víz minőségére vonatkozó adatok.
Vizsgált opcionális végpontok
—
a vizsgált opcionális végpontok felsorolása.
Eredmények:
—
testsúly és annak változásai,
—
táplálék- és vízfogyasztásra vonatkozó adatok, ha alkalmazható,
—
toxikus reakcióra vonatkozó adatok nemek és adagolási szintek szerinti csoportosításban, beleértve a toxicitás jeleit,
—
a klinikai megfigyelések jellege, súlyossága és időtartama (a változások visszafordíthatók-e vagy sem),
—
az érzékszervi aktivitás, a szorítási erősség és a motoros aktivitás értékelése,
—
hematológiai vizsgálatok eredményei, a megfelelő viszonyítási értékekkel,
—
a klinikai biokémiai vizsgálatok eredményei, a megfelelő viszonyítási értékekkel,
—
az állatok testsúlya az elpusztításkor és a szerveik súlya,
—
boncolási eredmények,
—
a kórszövettani vizsgálatok összes eredményének részletes ismertetése,
—
abszorpciós adatok, ha rendelkezésre állnak,
—
adott esetben az eredmények statisztikai feldolgozása.
Az eredmények tárgyalása.
Következtetések.
1. függelék
FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK
Androgenitás: egy vegyi anyag azon képessége, hogy emlősállatok szervezetében természetes androgén hormonokhoz (például a tesztoszteronhoz) hasonló hatást fejtsen ki.
Antiandrogenitás: egy vegyi anyag azon képessége, hogy emlősállatok szervezetében a természetes androgén hormonok (például a tesztoszteron) hatását gátolja.
Antiösztrogenitás: egy vegyi anyag azon képessége, hogy emlősállatok szervezetében a természetes ösztrogén hormonok (például a 17ß-ösztradiol) hatását gátolja.
Antitiroid hatás: egy vegyi anyag azon képessége, hogy emlősállatok szervezetében a természetes pajzsmirigyhormon (például a T3) hatását gátolja.
Adagolás: általános fogalom, amely a dózist, valamint az adagolás gyakoriságát és időtartamát foglalja magában.
Dózis: a vizsgált vegyi anyag beadott mennyisége. A dózist a vizsgált vegyi anyag súlyának és a kísérleti állat egységnyi testsúlyának napi hányadosaként (például mg/testsúlykilogramm/nap), vagy a takarmányban lévő állandó koncentrációként fejezik ki.
Nyilvánvaló toxicitás: általános fogalom, amely a toxicitás vizsgált vegyi anyag beadását követően kialakuló egyértelmű tüneteire vonatkozik. E tüneteknek elegendőnek kell lenniük a veszély felméréséhez, továbbá olyan szintet kell képviselniük, amelynél a beadott dózis növelése várhatóan a toxicitás súlyos jeleinek kialakulásához és valószínű elhulláshoz vezet.
NOAEL: a »no-observed-adverse-effect level« (nem észlelhető káros hatásszint) rövidítése. Ez a legmagasabb dózisszint, amelynél még nem figyelhetők meg a kezelés okozta káros hatások.
Ösztrogenitás: egy vegyi anyag azon képessége, hogy emlősállatok szervezetében a természetes ösztrogén hormonokhoz (például a 17ß-ösztradiolhoz) hasonló hatást fejtsen ki.
Vizsgált vegyi anyag: A jelen vizsgálati módszer alkalmazásával vizsgált bármely anyag vagy keverék.
Tiroid hatás: egy vegyi anyag azon képessége, hogy emlősállatok szervezetében a természetes pajzsmirigyhormonhoz (például a T3-hoz) hasonló hatást gyakoroljon.
Validáció: tudományos folyamat, amelynek célja egy adott vizsgálati módszer működési követelményeinek és korlátjainak jellemzése, valamint megbízhatóságának és egy adott célhoz kapcsolódó relevanciájának igazolása.
2. függelék
Az endokrin rendszert károsító anyagok jelen B.7. Vizsgálati módszerrel történő kimutatásához javasolt végpontok
Kötelező végpontok
Nem kötelező végpontok
Súly
—
herék
—
mellékherék
—
mellékvesék
—
prosztata és az ondóhólyagok a koaguláló mirigyekkel együtt
—
petefészkek
—
méh, beleértve a méhnyakat
—
pajzsmirigy
Kórszövettani vizsgálatok
—
ivarmirigyek:
—
herék és
—
petefészkek
—
járulékos nemi szervek:
—
mellékherék,
—
prosztata és az ondóhólyag a koaguláló mirigyekkel együtt
—
méh, beleértve a méhnyakat
—
mellékvese
—
pajzsmirigy
—
hüvely
—
hüvelykenet
—
hím emlőmirigyek
—
agyalapi mirigy
Hormonokkal kapcsolatos mérések
—
a T3 és a T4 szintje a keringési rendszerben
—
a TSH szintje a keringési rendszerben
SZAKIRODALOM
(1)
OECD (Paris, 1992). Chairman’s Report of the Meeting of the ad hoc Working Group of Experts on Systemic Short-term and (Delayed) Neurotoxicity.
(2)
IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity Associated with Exposure to Chemicals. Environmental Health Criteria Document No. 60
(3)
Tupper DE, Wallace RB (1980). Utility of the Neurologic Examination in Rats. Acta Neurobiol. Exp. 40: 999-1003.
(4)
Gad SC (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxicology. J. Toxicol Environ. Health 9: 691-704.
(5)
Moser VC, McDaniel KM, Phillips PM (1991). Rat Strain and Stock Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of Amitraz. Toxicol. AppéldáulPharmacol. 108: 267-283.
(6)
Meyer OA, Tilson HA, Byrd WC, Riley MT (1979). A Method for the Routine Assessment of Fore- and Hindlimb Grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxicol. 1: 233-236.
(7)
Crofton KM, Howard JL, Moser VC, Gill MW, Reiter LW, Tilson HA, MacPhail RC (1991). Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol. 13: 599-609.
(8)
OECD (1998). Report of the First Meeting of the OECD Endocrine Disrupter Testing and Assessment (EDTA) Task Force, 10th-11th March 1998, ENV/MC/CHEM/RA(98)5.
(9)
OECD. (2006). Report of the Validation of the Updated Test Guideline 407: Repeat Dose 28-day Oral Toxicity Study in Laboratory Rats. Series on Testing and Assessment No 59, ENV/JM/MONO(2006)26.
(10)
OECD (2002). Detailed Review Paper on the Appraisal of Test Methods for Sex Hormone Disrupting Chemicals. Series on Testing and Assessment No 21, ENV/JM/MONO(2002)8.
(11)
OECD (2012).Conceptual Framework for Testing and Assessment of Endocrine Disrupting Chemicals. http://www.oecd.org/document/58/0,3343,fr_2649_37407_2348794_1_1_1_37407,00.html
(12)
OECD (2006). Final Summary report of the meeting of the Validation Management Group for mammalian testing. ENV/JM/TG/EDTA/M(2006)2.
(13)
OECD. Draft Summary record of the meeting of the Task Force on Endocrine Disrupters Testing and Assessment. ENV/JM/TG/EDTA/M(2006)3.
(14)
OECD (2000). Guidance document on the recognition, assessment and use of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluation. Series on Testing and Assessment No 19. ENV/JM/MONO(2000)7.
(15)
Haley P, Perry R, Ennulat D, Frame S, Johnson C, Lapointe J-M, Nyska A, Snyder PW, Walker D, Walter G (2005). STP Position Paper: Best Practice Guideline for the Routine Pathology Evaluation of the Immune System. Toxicol Pathol 33: 404-407.
(16)
Hess RA, Moore BJ (1993). Histological Methods for the Evaluation of the Testis. In: Methods in Reproductive Toxicology, Chapin RE and Heindel JJ (eds). Academic Press: San Diego, CA, pp. 52-85.
(17)
Latendresse JR, Warbrittion AR, Jonassen H, Creasy DM.(2002) Fixation of testes and eyes using a modified Davidson’s fluid: comparison with Bouin’s fluid and conventional Davidson’s fluid. Toxicol. Pathol. 30, 524-533.
(18)
OECD (2007). OECD Guideline for Testing of Chemicals No440: Uterotrophic Bioassay in Rodents: A short-term screening test for oestrogenic properties.
(19)
OECD (2009). Guidance Document 106 on Histologic evaluation of Endocrine and Reproductive Tests in Rodents ENV/JM/Mono(2009)11.
B.8. SZUBAKUT INHALÁCIÓS TOXICITÁS: 28 NAPOS VIZSGÁLAT
ÖSSZEFOGLALÁS
A jelen felülvizsgált B.8. vizsgálati módszert úgy alakították ki, hogy azzal teljes körűen jellemezhető legyen a rövidebb időn (28 napon) belüli ismételt expozícióval, belégzés útján bejuttatott vizsgált vegyi anyag toxicitása, valamint adatokat lehessen gyűjteni a mennyiségi inhalációs kockázatértékelésekhez. Legalább 5 hím és 5 nőstény rágcsálóból álló csoportokat teszünk ki 28 napon át napi 6 órára a) a vizsgált vegyi anyagnak legalább három koncentrációs szinten, b) szűrt levegőnek (negatív kontroll) és/vagy c) a vivőanyagnak (vivőanyaggal kezelt kontroll). Az állatok expozíciója általában heti 5 napon történik, azonban a hét 7 napján történő expozíció is megengedett. Mindig kell hímeket és nőstényeket is vizsgálni, azonban az egyes nemek különböző koncentrációszinteknek is kitehetők, amennyiben ismert, hogy valamelyik nem érzékenyebb a vizsgált vegyi anyagra. Ez a módszer lehetőséget biztosít a vizsgálatvezetőnek, hogy a vizsgált vegyi anyag toxicitásának alaposabb jellemzése érdekében kísérő (a visszafordíthatóság vizsgálatára alkalmazott) csoportokat, bronchoalveoláris átmosást (BAL), neurológiai vizsgálatokat, valamint további klinikai kórtani és kórszövettani értékeléseket is belefoglaljon a vizsgálatba.
BEVEZETÉS
1.
A jelen vizsgálati módszer egyenértékű az OECD 412. vizsgálati iránymutatásával (2009). A szubakut inhalációs toxicitásra vonatkozó eredeti 412. vizsgálati iránymutatást 1981-ben fogadták el (1). A jelen B.8. (a felülvizsgált 412. vizsgálati iránymutatással egyenértékű) vizsgálati módszert a tudomány jelenlegi állásának megfelelően, valamint a jelenlegi és jövőbeli szabályozási igények kielégítése érdekében frissítették.
2.
Ez a módszer lehetővé teszi a vizsgált vegyi anyagnak 28 napon át belégzés útján történő, naponta ismételt expozíció nyomán kialakuló káros hatások jellemzését. A 28 napos szubakut inhalációs toxicitási vizsgálatok során kapott adatok felhasználhatók mennyiségi kockázatelemzési célokra (ha nem követi azokat 90 napos szubkrónikus inhalációs toxicitási vizsgálat [lásd e melléklet B.29. fejezetét]). Ezen adatok információkkal szolgálhatnak továbbá a hosszabb távú vizsgálatok, például a 90 napos szubkrónikus inhalációs toxicitási vizsgálat során használandó koncentrációk kiválasztásához is. E vizsgálati módszer nem kifejezetten nanoanyagok vizsgálatára szolgál. Az e vizsgálati módszer összefüggésében alkalmazott fogalmak meghatározása a jelen fejezet végén, valamint a 39. iránymutatásban (2) található.
KIINDULÁSI MEGFONTOLÁSOK
3.
A vizsgálat minőségének fokozása és az állatkísérletek minimalizálása érdekében a vizsgálati laboratóriumnak a vizsgálat elvégzése előtt figyelembe kell vennie a vizsgálandó vegyi anyagról rendelkezésre álló minden információt. A megfelelő vizsgálati koncentrációk kiválasztását segítő információk közé tartozhat a vizsgált vegyi anyag azonossága, kémiai szerkezete, valamint fizikai és kémiai tulajdonságai, az esetleges in vitro vagy in vivo toxicitási vizsgálatok eredményei, a várható felhasználási terület(ek) és a humán expozíció lehetősége, a szerkezetileg rokon anyagokról rendelkezésre álló (Q)SAR- és toxikológiai adatok, valamint az akut inhalációs toxicitási vizsgálatokból származó adatok. Ha a vizsgálat során neurotoxicitás várható vagy figyelhető meg, a vizsgálatvezető dönthet úgy, hogy a vizsgálat részeként megfelelő értékeléseket is kell végezni, például funkcionális megfigyelési vizsgálatot (FOB) és a motoros aktivitás mérését. Az expozícióknak az egyes vizsgálatokhoz viszonyított időzítése ugyan kritikus lehet, e kiegészítő tevékenységek azonban nem szabad, hogy akadályozzák az vizsgálat alapvető tervezését.
4.
A maró vagy irritáló hatású vegyi anyagok vizsgálhatók hígítva, olyan koncentrációban, amellyel elérhető a kívánt mértékű toxicitás (lásd a 39. iránymutatást (2)). Az állatok ezen anyagoknak való expozíciója során a célkoncentrációknak kellően alacsonynak kell lenniük ahhoz, hogy ne okozzanak jelentős fájdalmat és szorongást, ugyanakkor elegendőnek kell lenniük ahhoz, hogy a koncentráció-hatás görbe kiterjeszthető legyen a vizsgálat szabályozási és tudományos céljának megfelelő szintekre. E koncentrációkat eseti alapon kell kiválasztani, lehetőleg egy megfelelően megtervezett tartománybehatároló vizsgálat alapján, amely információkkal szolgál a kritikus végpontról, az esetleges irritációs küszöbértékről, valamint a hatás kezdetének idejéről (lásd a 11–13. bekezdést). A választott koncentrációt indokolni kell.
5.
Az elhullásközeli állapotban lévő, nyilvánvalóan fájdalmakkal küszködő vagy súlyos és tartós szorongás jeleit mutató állatokat humánus módon el kell pusztítani. Az elhullásközeli állapotban lévő állatokat a vizsgálat során elhullott állatokkal azonos módon kell figyelembe venni. A megjósolható vagy közeli elhullás felismerését segítő iránymutatás, valamint az elhullás közelében lévő vagy súlyosan szenvedő állatok elpusztítására vonatkozó döntési kritériumok a humánus végpontokról szóló OECD-iránymutatásban (3) találhatók.
A MÓDSZER LEÍRÁSA
Az állatfaj kiválasztása
6.
Általánosan használt laboratóriumi törzsekből származó egészséges, fiatal, ivarérett rágcsálókat kell alkalmazni. A javasolt faj a patkány. Más faj használata esetén a döntést indokolni kell.
Az állatok előkészítése
7.
Olyan nőstényeket kell választani, amelyek még egyszer sem ellettek, és nem vemhesek. A véletlen kiválasztás napján az állatoknak 7–9 hetes fiatal, ivarérett egyedeknek kell lenniük. A testsúlyuk a nemenkénti átlagos testsúlytól legfeljebb ± 20 %-kal térhet el. Az állatokat véletlenszerűen választjuk ki, egyedi azonosítóval látjuk el, és a laboratóriumi körülményekhez való szoktatás céljából a vizsgálat megkezdése előtt legalább 5 napig a ketrecükben tartjuk.
Az állatok tartása
8.
Az állatokat a megfigyelések megkönnyítése és összetévesztésük elkerülése érdekében egyedi azonosítóval, lehetőleg bőr alatti jeladóval kell ellátni. A kísérleti állatok tartására használt helyiség hőmérséklete 22 ± 3 °C kell, hogy legyen. A relatív páratartalmat ideális esetben 30–70 %-os tartományban kell tartani, ugyanakkor ez nem feltétlenül lehetséges, ha vivőanyagként vizet használunk. Az expozíció előtt és után az állatokat általában nemek és koncentrációk szerinti csoportokban kell a ketreceikben elhelyezni, azonban az állatok ketrecenkénti számának nem szabad akadályoznia az egyes állatok megfigyelését, és minimalizálnia kell a kannibalizmus és a marakodás okozta veszteségeket. Ha az állatok expozíciója csak orron át történik, szükséges lehet szoktatni azokat a lefogásukra szolgáló csövekhez. Az állatok lefogására szolgáló csövek nem okozhatnak az állatoknak indokolatlan fizikai, termális vagy a mozgásképtelenség okozta stresszt. A lefogás hatással lehet olyan fiziológiai végpontokra, mint a testhőmérséklet (hipertermia) és/vagy a percenkénti légzésvolumen. Amennyiben a rendelkezésre álló általános adatok azt igazolják, hogy ilyen változások nem lépnek fel számottevő mértékben, az állatok lefogására szolgáló csövekhez való előzetes szoktatás mellőzhető. Az aeroszoloknak egész testfelületükön kitett állatokat az expozíció során külön ketrecben kell elhelyezni, hogy a vizsgált aeroszol ne szűrődhessen át a többi állat szőrzetén. Hagyományos és minősített laboratóriumi takarmány alkalmazható – kivéve az expozíció időtartama alatt –, korlátlan mennyiségű ivóvíz biztosítása mellett. A világítás legyen mesterséges, 12 órás világos és 12 órás sötét periódusok váltsák egymást.
Inhalációs kamrák
9.
Az inhalációs kamra kiválasztásakor figyelembe kell venni a vizsgált vegyi anyag jellegét és a vizsgálat célját. Az előnyben részesítendő expozíciós mód a csak orron keresztüli expozíció (ez magában foglalja a csak a fejet, orrot vagy szájat érintő expozíciót). A csak orron keresztüli expozíció általában előnyben részesítendő a folyékony vagy szilárd aeroszolok, valamint a lecsapódva esetlegesen aeroszolt alkotó gőzök vizsgálata esetén. Előfordulhat, hogy a vizsgálat különleges céljai egész testfelületen keresztüli expozíció alkalmazásával hatékonyabban elérhetők, ezt azonban indokolni kell a vizsgálati jegyzőkönyvben. Egész testfelületen keresztüli expozícióra szolgáló kamra használata esetén a légköri stabilitás biztosítása érdekében a vizsgált állatok összesített »térfogata« nem haladhatja meg a kamra térfogatának 5 %-át. A csak orron át történő és az egész testfelületen keresztüli expozíciós technikák elveivel, valamint azok különös előnyeivel és hátrányaival a 39. iránymutatás (2) foglalkozik.
TOXICITÁSI VIZSGÁLATOK
Határkoncentrációk
10.
Az akut vizsgálatoktól eltérően a 28 napos szubakut inhalációs toxicitási vizsgálatok esetén nincsenek meghatározott határkoncentrációk. A maximális vizsgált koncentráció kiválasztásakor a következőket kell figyelembe venni: 1) az elérhető maximális koncentráció, 2) a legrosszabb esetben fennálló humán expozíció szintje, 3) a megfelelő oxigénellátás biztosításának szükségessége és/vagy 4) állatjóléti szempontok. Amennyiben nincsenek adatokon alapuló határértékek, az 1272/2008/EK rendeletben (13) szereplő akut határértékek alkalmazhatók (azaz aeroszolok esetén legfeljebb 5 mg/l, gőzök esetén 20 mg/l, gázok esetén pedig 20 000 ppm); lásd a 39. iránymutatást (2). Amennyiben gázok vagy erősen illékony anyagok (például hűtőfolyadékok) vizsgálata esetén e határértékeket túl kell lépni, a döntést indokolni kell. A határkoncentrációnak egyértelmű toxicitást kell előidéznie anélkül, hogy az állatoknak indokolatlan stresszt okozna vagy befolyásolná az élettartamukat (3).
Tartománybehatároló vizsgálat
11.
A fő vizsgálat megkezdése előtt tartománybehatároló vizsgálat elvégzése lehet szükséges. A tartománybehatároló vizsgálat átfogóbb a dózisbehatároló vizsgálatnál, mivel nem korlátozódik a koncentráció kiválasztására. A tartománybehatároló vizsgálat révén szerzett információk hozzájárulhatnak a fő vizsgálat sikeréhez. A tartománybehatároló vizsgálat például technikai jellegű információkkal szolgálhat az analitikai módszerek, a részecskeméretezés, a toxikus hatásmechanizmusok felismerése, a klinikai kórtani és kórszövettani adatok, valamint a fő vizsgálat lehetséges NOAEL- és MTC-koncentrációinak becslése vonatkozásában. A vizsgálatvezető a tartománybehatároló vizsgálatot alkalmazhatja a légzőrendszer irritációs küszöbértékének (például a légzőrendszer kórszövettani elemzése, a tüdő működésének vizsgálata vagy bronchoalveoláris átmosás útján történő) meghatározása, az állatoknak indokolatlan stresszt nem okozó, elfogadható maximális koncentráció, valamint a vizsgált vegyi anyag toxicitását legjobban jellemző paraméterek meghatározása céljából.
12.
A tartománybehatároló vizsgálat egy vagy több koncentrációszintre is kiterjedhet. Mindegyik koncentrációszintnek legfeljebb három hím és három nőstény tehető ki. A tartománybehatároló vizsgálatnak legalább 5 napig kell tartania, és általában nem tarthat tovább 14 napnál. A vizsgálati jegyzőkönyvnek tartalmaznia kell a fő vizsgálathoz kiválasztott koncentrációk indokolását. A fő vizsgálat célja a koncentráció-válasz összefüggésnek a feltételezett legérzékenyebb végpont alapján történő kimutatása. Alsó koncentrációként lehetőleg olyan koncentráció választandó, amelynél nem észlelhető káros hatás, míg a felső koncentrációnak egyértelmű toxicitást kell előidéznie anélkül, hogy az állatoknak indokolatlan stresszt okozna vagy befolyásolná az élettartamukat (3).
13.
A tartománybehatároló vizsgálat során alkalmazandó koncentrációszintek kiválasztásakor figyelembe kell venni minden rendelkezésre álló információt, beleértve a szerkezet-aktivitás összefüggéseket és a hasonló vegyi anyagok adatait (lásd a 3. bekezdést). A tartománybehatároló vizsgálat megerősítheti, illetve megcáfolhatja a legérzékenyebbnek vélt mechanisztikai alapú végpontokat, például az organofoszfátok kolineszterázgátló hatását, a vörösvérsejtekre toxikus anyagok okozta methemoglobinképződést, a pajzsmirigyre toxikus anyagok esetén a pajzsmirigyhormonokat (T3, T4), a fehérjét, az LDH-t, vagy az ártalmatlan, nehezen oldható részecskék vagy a tüdőt irritáló aeroszolok esetén a bronchoalveoláris átmosási folyadékban lévő neutrofileket.
Fő vizsgálat
14.
A fő szubakut toxicitási vizsgálat általában három koncentrációszintre, valamint szükség szerint azokkal párhuzamos negatív (levegővel kezelt) és/vagy vivőanyaggal kezelt kontrollokra terjed ki (lásd a 17. bekezdést). A megfelelő expozíciós szintek kiválasztásának elősegítéséhez fel kell használni minden rendelkezésre álló adatot, beleértve a szisztémás toxicitási vizsgálatok eredményeit, az anyagcserére vonatkozó és kinetikai adatokat (különös hangsúlyt kell fektetni a kinetikai folyamatokat telítő magas koncentrációszintek elkerülésére). Mindegyik vizsgált csoport legalább 10 rágcsálóból (5 hím és 5 nőstény egyedből) áll, amelyeket heti 5 napon napi 6 órára teszünk ki a vizsgált vegyi anyagnak 4 héten keresztül (a vizsgálat teljes időtartama 28 nap). Az állatok heti 7 napon is kitehetők a vizsgált anyagnak (például belélegezhető gyógyszerek vizsgálata esetén). Amennyiben ismert, hogy valamelyik nem érzékenyebb a vizsgált vegyi anyagra, az egyes nemek különböző koncentrációszinteknek is kitehetők a 15. bekezdésben ismertetett koncentráció-válasz összefüggés optimális feltárása érdekében. Patkányoktól eltérő rágcsálófajok csak orron át történő expozíciója esetén az expozíció maximális időtartama kiigazítható a fajspecifikus szorongás minimalizálása érdekében. Napi 6 óránál rövidebb expozíciós idő alkalmazása vagy hosszabb időtartamú (például napi 22 órás), egész testfelületen keresztüli expozíciós vizsgálat szükségessége esetén indokolást kell adni (lásd a 39. iránymutatást (2)). Az expozíció időtartama alatt az állatok nem kaphatnak takarmányt, kivéve, ha az időtartam meghaladja a 6 órát. Az állatoknak víz az egész testfelületen keresztüli expozíció teljes időtartama alatt adható.
15.
A célkoncentrációkat úgy kell megválasztani, hogy azonosítható(k) legyen(ek) a célszerv(ek) és egyértelmű koncentráció-válasz összefüggés legyen kimutatható:
—
A felső koncentrációszintnek toxikus hatásokat kell előidéznie anélkül, hogy késleltetett tüneteket vagy elhullást okozna, ami kizárná az érdemi értékelést.
—
A köztes koncentrációszint(ek)et úgy kell felosztani, hogy a toxikus hatások fokozatosan növekedjenek az alsó és a felső koncentrációszint között.
—
Az alsó koncentrációszint nem, vagy csak kis mértékben idézheti elő toxicitás jeleit.
Kísérő (visszafordíthatósági) vizsgálat
16.
Kísérő (visszafordíthatósági) vizsgálat végezhető a toxicitás visszafordíthatóságának, elhúzódó vagy késve fellépő voltának a kezelést követő megfelelő hosszúságú, de legalább 14 napos időszak során történő megfigyelése érdekében. A kísérő (visszafordíthatósági) vizsgálathoz használt csoportok öt hímből és öt nőstényből állnak, amelyeket a fő vizsgálatban megfigyelt kísérleti állatokkal egyidejűleg teszünk ki a vizsgált vegyi anyagnak. A kísérő (visszafordíthatósági) vizsgálathoz használt csoportokat a legnagyobb koncentrációban kell kitenni a vizsgált vegyi anyagnak, és ezzel párhuzamosan szükség szerint levegővel és/vagy vivőanyaggal kezelt kontrollok vizsgálatát is el kell végezni (lásd a 17. bekezdést).
Kontrollállatok
17.
A párhuzamosan vizsgált negatív (levegővel kezelt) kontrollállatokat a vizsgált csoportokban lévő állatokkal azonos módon kell kezelni, azzal a különbséggel, hogy a vizsgált vegyi anyag helyett szűrt levegőnek tesszük ki azokat. Amennyiben vizet vagy más anyagot használunk a vizsgálati légkör létrehozásának elősegítésére, a vizsgálathoz negatív (levegővel kezelt) kontrollcsoport helyett vivőanyaggal kezelt kontrollcsoportot kell alkalmazni. Vivőanyagként lehetőség szerint vizet kell használni. Ha a vivőanyag víz, a kontrollállatokat ugyanolyan relatív páratartalmú levegőnek kell kitenni, mint a vizsgált anyagnak kitett csoportokat. Az alkalmas vivőanyag kiválasztásának megfelelően elvégzett előzetes vizsgálaton vagy múltbeli adatokon kell alapulnia. Ha a vivőanyag toxicitásáról nincsenek részletes információk, a vizsgálatvezető dönthet úgy, hogy negatív (levegővel kezelt) és vivőanyaggal kezelt kontrollt egyaránt alkalmazni kell, ez azonban erősen ellenjavallt. Ha a múltbeli adatok alapján a vivőanyag nem toxikus, nincs szükség negatív (levegővel kezelt) kontrollcsoportra, és ez esetben csak vivőanyaggal kezelt kontrollcsoportot kell alkalmazni. Amennyiben a vivőanyaggal kevert vizsgált vegyi anyag az előzetes vizsgálat alapján nem bizonyul toxikusnak, a vizsgált koncentráció mellett a vivőanyag sem tekintendő toxikusnak, és ezt a vivőanyagkontrollt kell használni.
EXPOZÍCIÓS KÖRÜLMÉNYEK
A koncentrációk beadása
18.
Az állatokat gáz, gőz, aeroszol vagy ezek keveréke formájában tesszük ki a vizsgált vegyi anyagnak. A vizsgálandó halmazállapot a vizsgált vegyi anyag fizikai és kémiai tulajdonságaitól, a kiválasztott koncentrációtól és/vagy a vizsgált vegyi anyag kezelése és használata során legnagyobb valószínűséggel előforduló halmazállapottól függ. A higroszkopikus és kémiailag reakcióképes vizsgált vegyi anyagokat száraz levegős körülmények között kell vizsgálni. Ügyelni kell a robbanékony koncentrációk keletkezésének elkerülésére. A részecskéket képző anyagok mechanikai eljárásoknak vethetők alá a részecskeméret csökkentése érdekében. További útmutatás a 39. iránymutatásban (2) olvasható.
Részecskeméret-eloszlás
19.
Minden aeroszol, valamint a lecsapódva esetlegesen aeroszolt alkotó gőzök esetén részecskeméretezést kell végezni. A légzőrendszer összes lényeges részének expozíciója érdekében 1 és 3 μm közötti tömegfelező aerodinamikai átmérővel (MMAD) rendelkező, az 1,5 és 3,0 közötti tartományba eső geometriai szórású (σg) aeroszolok használata javasolt (4). Habár ésszerű keretek között törekedni kell az e szabványnak való megfelelésre, szakértői megítélésre kell hagyatkozni, ha erre nincs lehetőség. A fémgőzök részecskéi például kisebbek lehetnek e szabványos méretnél, míg a töltéssel rendelkező részecskék és a rostok meghaladhatják azt.
A vizsgált vegyi anyag előkészítése vivőanyagban
20.
A vizsgált vegyi anyag ideális esetben vivőanyag nélkül vizsgálandó. Ha a vizsgált vegyi anyag megfelelő koncentrációjának és részecskeméretének előállításához vivőanyag alkalmazása szükséges, a víz részesítendő előnyben. Ha a vizsgált vegyi anyagot vivőanyagban oldjuk fel, minden esetben igazolni kell annak stabilitását.
AZ EXPOZÍCIÓS KÖRÜLMÉNYEK NYOMON KÖVETÉSE
Kamrabeli légáramlás
21.
Az expozíciós kamrán keresztüli légáramlást gondosan szabályozni kell, folyamatosan nyomon kell követni, és minden expozíció során legalább óránként fel kell jegyezni. A vizsgálati légköri koncentráció (vagy időbeli stabilitás) valós idejű nyomon követése valamennyi dinamikus paraméter globális mérését jelenti, és közvetett lehetőséget nyújt valamennyi lényeges dinamikus inhalációs paraméter szabályozására. A koncentráció valós idejű nyomon követése esetén a légáramlásokat elegendő expozíciónként és naponként egy alkalommal mérni. Különös figyelmet kell fordítani a csak orron át történő expozícióra szolgáló kamrában az újbóli belélegzés elkerülésére. Az oxigénkoncentrációnak legalább 19 %-nak kell lennie, a szén-dioxid-koncentráció pedig legfeljebb 1 % lehet. Amennyiben feltételezhető, hogy ez a szabvány nem teljesíthető, az oxigén- és szén-dioxid-koncentrációt mérni kell. Ha az expozíció első napján végzett mérések azt mutatják, hogy e gázok szintje megfelelő, rendszerint nincs szükség további mérésekre.
A kamra hőmérséklete és relatív páratartalma
22.
A kamra hőmérsékletét 22 ± 3 °C-on kell tartani. Az állatok belégzési zónájában fennálló relatív páratartalmat a csak orron át történő és az egész testfelületen keresztüli expozíció esetén egyaránt folyamatosan nyomon kell követni, és lehetőség szerint minden expozíció során óránként fel kell jegyezni. A relatív páratartalmat lehetőség szerint 30–70 %-os tartományban kell tartani, ugyanakkor előfordulhat, hogy ez vagy nem érhető el (például vízalapú keverékek vizsgálata esetén), vagy nem mérhető a vizsgált vegyi anyag vizsgálati módszerrel való interferenciája miatt.
Vizsgált vegyi anyag: névleges koncentráció
23.
Az expozíciós kamrában fennálló névleges koncentrációt lehetőség szerint ki kell számítani és fel kell jegyezni. A névleges koncentrációt úgy kapjuk meg, hogy az előállított vizsgált vegyi anyag tömegét elosztjuk az inhalációs kamrarendszeren áthaladt levegő össztérfogatával. A névleges koncentráció nem az állatok expozíciójának jellemzésére szolgál, ugyanakkor a névleges és a tényleges koncentráció összehasonlításával megismerhető a vizsgálati rendszer előállítási hatásfoka, és így feltárhatók az előállítással összefüggő problémák.
Vizsgált vegyi anyag: tényleges koncentráció
24.
A tényleges koncentráció a vizsgált vegyi anyagnak az inhalációs kamrán belül, az állatok belégzési zónájában végzett mintavétellel megállapított koncentrációját jelenti. A tényleges koncentráció vagy specifikus módszerekkel (például közvetlen mintavétellel, adszorpciós vagy kémiai reakcióképességet vizsgáló módszerekkel, valamint utólagos analitikai jellemzéssel), vagy nem specifikus módszerekkel, például gravimetriai szűrőelemzéssel határozható meg. A gravimetriai elemzés csak egykomponensű, por alakú aeroszolok, illetve alacsony illékonyságú folyadékok aeroszoljai esetén elfogadható, és alkalmazását a vizsgált vegyi anyag megfelelő, a vizsgálat előtt végzett jellemzésével kell alátámasztani. A gravimetriai elemzés a többkomponensű, por alakú aeroszolok koncentrációjának meghatározására szintén alkalmazható. Ebben az esetben azonban analitikai adatokkal kell alátámasztani, hogy a levegőben lévő anyag összetétele hasonló a kiindulási anyagéhoz. Amennyiben ilyen információ nem áll rendelkezésre, a (lehetőleg levegőben lebegő) vizsgált vegyi anyag rendszeres időközönként végzett újbóli elemzésére lehet szükség a vizsgálat során. Olyan aeroszolizálódott ágensek esetén, amelyek elpárologhatnak vagy szublimálhatnak, igazolni kell, hogy mindegyik fázisból a választott módszerrel vettünk mintát.
25.
Lehetőség szerint a vizsgált vegyi anyag egyetlen tételét kell használni a vizsgálat teljes időtartama alatt, és a vizsgált mintát olyan körülmények között kell tárolni, hogy megőrződjön annak tisztasága, homogenitása és stabilitása. A vizsgálat megkezdését megelőzően el kell végezni a vizsgált vegyi anyag jellemzését, meghatározva többek között annak tisztaságát, valamint amennyiben technikailag lehetséges, az észlelt szennyező anyagok és szennyeződések azonosságát és mennyiségét. Ez többek között – de nem kizárólag – a következő adatokkal mutatható ki: retenciós idő és relatív csúcsterület, tömegspektroszkópiai vagy gázkromatográfiás elemzéssel, illetve más becslésekkel meghatározott molekulatömeg. Bár a vizsgált minta azonosságának meghatározása nem tartozik a vizsgálati laboratórium feladatai közé, óvatosságból érdemes lehet a vizsgálati laboratóriumban legalábbis korlátozott módon (például szín, fizikai jelleg stb. alapján) megerősíteni a megbízó által adott jellemzést.
26.
Az expozíciós légkört amennyire csak lehet, állandó állapotban kell tartani. Az expozíciós körülmények stabilitásának bizonyítására valós idejű nyomonkövetési eszköz – például aeroszolok esetén aeroszolfotométer, vagy gőzök esetén az összes szénhidrogéntartalmat elemző műszer – alkalmazható. A kamrabeli tényleges koncentrációt minden expozíciós napon minden expozíciós szint tekintetében legalább háromszor meg kell mérni. Ha az alacsony légáramlási sebesség vagy koncentráció miatt ez nem megoldható, expozíciós időszakonként egy mintavétel is elfogadható. Ideális esetben ezt a mintavételt a teljes expozíciós időszak folyamán kell elvégezni. Az egyes kamrakoncentráció-minták gázok és gőzök esetén legfeljebb ± 10 %-kal, folyékony vagy szilárd aeroszolok esetén pedig legfeljebb ± 20 %-kal térhetnek el a kamrabeli átlagkoncentrációtól. A kamra egyensúlyi állapotának kialakulásához szükséges időt (t95) ki kell számítani és jegyzőkönyvezni kell. Egy adott expozíció időtartama magában foglalja a vizsgált vegyi anyag előállításának idejét. Ehhez figyelembe kell venni a kamra egyensúlyi állapotának eléréséhez és a bomláshoz szükséges időt (t95). A t95 becsléséhez a 39. iránymutatásban (2) található útmutatás.
27.
A nagyon összetett, gázokból/gőzökből és aeroszolokból álló keverékek (például égési légkörök, valamint meghatározott célra szolgáló végfelhasználói termékekből/készülékekből kibocsátott vizsgált vegyi anyagok) esetén az egyes fázisok eltérően viselkedhetnek az inhalációs kamrában. Éppen ezért mindegyik fázishoz (gáz/gőz és aeroszol) legalább egy indikátoranyagot (analitot) – általában a keverék elsődleges hatóanyagát – kell kiválasztani. Amennyiben a vizsgált vegyi anyag keverék, az analitikai koncentrációt a teljes keverék, nem pedig csak az aktív összetevő vagy az indikátoranyag (analit) vonatkozásában kell a jegyzőkönyvben feltüntetni. A tényleges koncentrációról további információ a 39. iránymutatásban található (2).
Vizsgált vegyi anyag: részecskeméret-eloszlás
28.
Az aeroszolok részecskeméret-eloszlását mindegyik koncentrációszint tekintetében legalább hetente meg kell határozni sorozatos ütközésmérő vagy alternatív műszer, például aerodinamikai részecskeméret-meghatározó (APS) segítségével. Ha bizonyítható, hogy a sorozatos ütközésmérővel és az alternatív műszerrel kapott eredmények egyeznek, az alternatív műszer a teljes vizsgálat folyamán használható.
29.
Az elsődleges műszerrel párhuzamosan egy második eszközt, például gravimetriai szűrőt vagy impingert/gázbuborékoltatót kell használni az elsődleges műszer mintavételi hatékonyságának megerősítése érdekében. A részecskeméret-elemzés útján kapott tömegkoncentrációnak a szűrőelemzéssel kapott tömegkoncentrációt ésszerű mértékben meg kell közelítenie (lásd a 39. iránymutatást (2)). Ha a vizsgálat kezdeti szakaszában vizsgált összes koncentrációnál bizonyítható az egyezés, a további megerősítő mérések mellőzhetők. Az állatok jóléte érdekében intézkedéseket kell tenni a vizsgálat eseteges megismétlését szükségessé tevő kétes adatok előfordulásának minimalizálása érdekében.
30.
Gőzök esetén részecskeméretezést kell végezni, ha fennáll annak a lehetősége, hogy a gőz lecsapódásával aeroszol keletkezhet, vagy ha vegyes fázisok alkotására képes részecskéket észlelünk a gőzatmoszférában.
MEGFIGYELÉSEK
31.
Az állatokat expozíciós időtartam előtt, alatt és után klinikai megfigyeléseknek kell alávetni. Az állatok expozíció során megfigyelt reakciójától függően gyakoribb megfigyelések is kilátásba helyezhetők. Ha az állatok megfigyelését az azok lefogására szolgáló csövek használata, az egész testfelületen keresztüli expozícióra szolgáló kamra rossz megvilágítása vagy az átlátszatlan légkör akadályozza, az állatokat az expozíció után alapos megfigyelésnek kell alávetni. A következő napi expozíció előtt végzett megfigyelésekkel felmérhető a toxikus hatások visszafordíthatósága vagy súlyosbodása.
32.
Minden megfigyelést rögzíteni kell olyan módon, hogy minden állat esetében önálló adatsort veszünk fel. Ha az állatokat humánus okok miatt el kell pusztítani, vagy ha azok elhullnak, a lehető legpontosabban fel kell jegyezni az elhullás időpontját.
33.
A ketrecben tartott állatok megfigyelésének ki kell terjednie a bőr és a szőrzet, a szem és a nyálkahártya, a légző-, keringési és idegrendszer, valamint a szomatomotoros aktivitás és a viselkedési minták változásaira. Figyelmet kell szentelni a remegés, görcsök, nyáladzás, hasmenés, letargia, alvás és kóma megfigyelésére. A végbélben mért hőmérséklet bizonyítékot szolgáltathat a kezelés vagy a fogság okozta bradipnoés reflexre vagy hipo-/hipertermiára. A vizsgálati protokollba további értékelések is felvehetők, ilyenek például a kinetikai vizsgálatok, a biomonitoring, a tüdőműködés vizsgálata, a tüdőszövetben felgyülemlő, rosszul oldható anyagok visszamaradásának vizsgálata, valamint a viselkedésbeli változások megfigyelése.
TESTSÚLY
34.
Az egyes állatok súlyát röviddel az első expozíció (0. nap) előtt, azt követően pedig hetente kétszer (például az expozíció nélküli hétvégén végbement felépülés bizonyítása céljából pénteken és hétfőn, vagy a szisztémás toxicitás felmérését lehetővé tevő időközönként), valamint az elhullás vagy elpusztítás időpontjában fel kell jegyezni. Amennyiben az első 2 héten semmilyen hatás nem figyelhető meg, a vizsgálat hátralevő részében a testsúly heti rendszerességgel is mérhető. A kísérő (visszafordíthatósági) vizsgálatban alkalmazott állatok (ha vannak) súlyának heti rendszerességgel végzett mérését a felépülési időszak során is folytatni kell. A vizsgálat lezárásakor minden állat súlyát meg kell mérni röviddel az elpusztítás előtt, hogy torzításmentesen kiszámítható legyen a szervek súlyának testsúlyhoz viszonyított aránya.
TÁPLÁLÉK- ÉS VÍZFOGYASZTÁS
35.
A felvett táplálék mennyiségét heti rendszerességgel le kell mérni. A felvett víz mennyisége szintén mérhető.
KLINIKAI PATOLÓGIA
36.
Minden állaton – beleértve a kontroll- és kísérő (visszafordíthatósági) csoportokba tartozókat – klinikai patológiai értékelést kell végezni az elpusztításkor. Az expozíció vége és a vérvétel között eltelt időt fel kell jegyezni, különösen ha az adott végpontra gyors regeneráció jellemző. A rövid plazmabeli felezési idejű paramétereknél (például COHb, CHE és MetHb) az expozíció végét követően végzendő mintavétel.
37.
A minden toxikológiai vizsgálathoz általánosan előírt klinikai patológiai paraméterek felsorolása az 1. táblázatban található. Rendszeres vizeletelemzés nem kötelező, de elvégezhető, ha a várt vagy megfigyelt toxicitás alapján célszerűnek ítéljük. A vizsgálatvezető a vizsgált vegyi anyag toxicitásának alaposabb jellemzése érdekében további paraméterek értékelése mellett dönthet (például kolineszteráz, lipidek, hormonok, sav-bázis egyensúly, methemoglobin vagy Heinz-testek, kreatin-kináz, csontvelő/eritroid arány, troponinok, artériás vérgáz, laktát-dehidrogenáz, szorbit-dehidrogenáz, glutamát-dehidrogenáz és gamma-glutamil-transzpeptidáz).
1.táblázat
Szabványos klinikai patológiai paraméterek
Hematológiai paraméterek
vörösvértestszám
hematokrit
hemoglobinkoncentráció
átlagos korpuszkuláris hemoglobin
átlagos korpuszkuláris térfogat
átlagos korpuszkuláris hemoglobinkoncentráció
retikulociták
teljes vérkép
differenciált vérkép
trombocitaszám
véralvadási képesség (a következők egyikét kell választani):
Amennyiben arra utaló bizonyítékot találunk, hogy az alsó légutak (azaz az alveolusok) jelentik a lerakódás és a visszamaradás elsődleges helyét, a bronchoalveoláris átmosás (BAL) lehet a legalkalmasabb technika a hipotézisen alapuló dózis-hatás paraméterek alveolitiszre, tüdőgyulladásra és foszfolipidózisra összpontosító mennyiségi elemzéséhez. Ez lehetővé teszi az alveolusok károsodása dózis-válasz és idő-lefolyás típusú változásainak megfelelő vizsgálatát. A BAL eljárás útján nyert folyadék elemezhető teljes és differenciált vérkép, összes fehérje, valamint laktát-dehidrogenáz tekintetében. Figyelembe vehetők továbbá egyéb, lizoszómakárosodásra, foszfolipidózisra, fibrózisra, valamint irritáció okozta vagy allergiás gyulladásra utaló paraméterek is, ami magában foglalhatja a gyulladást serkentő citokinek/kemokinek meghatározását. A BAL-mérések általában kiegészítik a kórszövettani vizsgálatok eredményeit, azonban nem helyettesíthetik azokat. A tüdőátmosás elvégzéséhez a 39. iránymutatásban (2) található útmutatás.
MAKROSZKOPIKUS PATOLÓGIA ÉS A SZERVEK SÚLYA
39.
Minden kísérleti állaton teljes kivéreztetést és (ha lehetséges) makroszkopikus boncolást kell végezni, beleértve azokat is, amelyek a vizsgálat során elpusztultak, vagy amelyeket állatjóléti okok miatt el kellett távolítani a vizsgálatból. Minden egyes állatnál fel kell jegyezni az utolsó expozíció és az elpusztítás között eltelt időt. Ha a boncolás nem végezhető el rögtön azután, hogy az elpusztult állatot észrevettük, az állatot hűtve (nem fagyasztva) kell tárolni az autolízis minimalizálásához kellően alacsony hőmérsékleten. A boncolást a lehető leghamarabb, általában egy vagy két napon belül el kell végezni. Minden állat esetén fel kell jegyezni minden makroszkopikus patológiai elváltozást, különös tekintettel a légzőrendszert érintő változásokra.
40.
A makroszkopikus boncolás során kórszövettani vizsgálat céljából megfelelő közegben megőrizendő szervek és szövetek felsorolása a 2. táblázatban található. A [szögletes zárójelben] feltüntetett szervek és szövetek, valamint bármely egyéb szerv és szövet megőrzéséről a vizsgálatvezető saját mérlegelése alapján dönthet. A félkövérrel szedett szerveket a kiszáradás elkerülése érdekében a boncolás után a lehető legrövidebb időn belül meg kell tisztítani, és azok nedves súlyát meg kell mérni. A pajzsmirigy és a mellékherék súlyát csak akkor javasolt megmérni, ha szükséges, mivel az azok megtisztítása során keletkező mesterséges elváltozások akadályozhatják a kórszövettani értékelést. A szöveteket és a szerveket közvetlenül a boncolás után, és az alkalmazandó fixálószertől függően legalább 24–48 órával a megtisztítás előtt 10 %-os pufferelt formalinban vagy egyéb, megfelelő fixálószerben fixálni kell.
2.táblázat
A makroszkopikus boncolás során megőrizendő szervek és szövetek
Mellékvesék
Csontvelő (és/vagy friss felszívott minta)
Agy (beleértve a nagyagy, a kisagy és a nyúltvelő/nyúltagyi híd metszeteit)
[Szemek (retina, látóideg) és szemhéjak]
Szív
Vesék
Gégefő (3 szinten, amelyek egyikének tartalmaznia kell a gégefedő alapját)
Máj
Tüdő (egy szinten készített metszet mindegyik lebenyről, beleértve a fő hörgőket)
Nyirokcsomók a tüdő hilusok körüli részéről, különösen nehezen oldható, szemcsés vizsgált vegyi anyagok esetén. Alaposabb vizsgálatok és/vagy immunológiára összpontosító tanulmányok esetében további nyirokcsomók megőrzése is megfontolható, például a gátori, nyaki/állkapocs alatti és/vagy fülcse körüli részekről.
Orr-garati szövetek (legalább 4 szinten, amelyek egyikének tartalmaznia kell az orr-garati csatornát és az orrhoz társuló nyirokszövetet [NALT])
Nyelőcső
[Szaglógumó]
Petefészkek
Ondóhólyagok
Gerincoszlop (nyaki, mellkasi középső és ágyéki szakasz)
Lép
Gyomor
Herék
Csecsemőmirigy
Pajzsmirigy
Légcső (legalább 2 szinten, beleértve egy hosszirányú metszetet a carinán keresztül, valamint egy keresztmetszetet)
[Húgyhólyag]
Méh
Minden makroszkopikus elváltozás
41.
A tüdőt sértetlenül kell eltávolítani, le kell mérni, és a tüdő szerkezetének megőrzése érdekében megfelelő fixálószert kell belecsepegtetni 20-30 cm víznek megfelelő nyomáson (5). Mindegyik lebenyről metszetet kell készíteni egy szinten, beleértve a fő hörgőket, ugyanakkor tüdőátmosás alkalmazása esetén az át nem mosott lebenyről három szinten kell metszetet készíteni (nem sorozatos metszeteket).
42.
Az orr-garati szöveteket legalább 4 szinten kell vizsgálni, amelyek egyikének tartalmaznia kell az orr-garati csatornát (5, 6, 7, 8, 9), lehetővé téve a laphámsejtes, átmeneti (csillószőrrel nem borított légúti), légúti (csillószőrrel borított) és szaglóhámszövet, valamint az elvezető nyirokszövet (NALT, 10, 11) megfelelő vizsgálatát. A gégefőt három szinten kell vizsgálni, amelyek egyikének tartalmaznia kell a gégefedő alapját (12). A légcsövet legalább két szinten kell vizsgálni, beleértve egy hosszirányú metszetet az extrapulmonális hörgők elágazásánál lévő carinán keresztül, valamint egy keresztmetszetet.
KÓRSZÖVETTANI VIZSGÁLATOK
43.
A 2. táblázatban felsorolt összes szerv és szövet kórszövettani vizsgálatát el kell végezni a kontrollcsoportoknál és a magas koncentrációnak kitett csoportoknál, valamint a vizsgálat során elpusztult vagy elpusztított összes állatnál. Különös figyelmet kell fordítani a légzőrendszerre, a célszervekre, valamint a makroszkopikus elváltozásokra. Azon szerveket és szöveteket, amelyeken a magas koncentrációnak kitett csoportnál elváltozások figyelhetők meg, mindegyik csoportnál meg kell vizsgálni. A vizsgálatvezető a koncentráció-válasz összefüggés egyértelmű kimutatása érdekében dönthet úgy, hogy további csoportoknál is végezni kell kórszövettani értékelést. Kísérő (visszafordíthatóság vizsgálatára szolgáló) csoport alkalmazása esetén minden olyan szerv és szövet kórszövettani értékelését el kell végezni, amelynél a kezelt csoportok egyedei esetében elváltozások figyelhetők meg. Ha a magas koncentrációnak kitett csoportnál túlzott mértékű idő előtti elhullás vagy egyéb problémák veszélyeztetik az adatok szignifikanciáját, az eggyel alacsonyabb koncentrációra vonatkozóan kell kórszövettani vizsgálatot végezni. Meg kell kísérelni a makroszkopikus és mikroszkopikus megfigyelések közötti összefüggések feltárását.
ADATOK ÉS JEGYZŐKÖNYVEZÉS
Adatok
44.
Meg kell adni az egyes állatok testsúlyára, táplálékfelvételére, klinikai patológiai eredményeire, makroszkopikus boncolási eredményeire, szerveinek súlyára, valamint kórszövettani eredményeire vonatkozó adatokat. A klinikai megfigyelések adatait táblázatos formában össze kell foglalni, minden egyes vizsgált csoporthoz megadva a csoportban lévő állatok számát, a specifikus mérgezési tüneteket mutató, valamint a vizsgálat során elhullott vagy humánus okokból elpusztított állatok számát, az egyes állatok elhullásának időpontját, a toxikus hatások leírását, időbeli lefolyását és visszafordíthatóságát, valamint a boncolások eredményeit. Mind a számszerű, mind a járulékos eredményeket megfelelő statisztikai módszerrel kell kiértékelni. Bármilyen általánosan elfogadott statisztikai módszer alkalmazható, és a statisztikai módszereket a vizsgálat tervezésekor kell kiválasztani.
Vizsgálati jegyzőkönyv
45.
A vizsgálati jegyzőkönyvnek a következő információkat kell értelemszerűen tartalmaznia:
Kísérleti állatok és azok tartása
—
A ketrecben való tartás körülményei, beleértve különösen az állatok ketrecenkénti számát (vagy számának változását), az alom anyagát, a környezeti hőmérsékletet és a relatív páratartalmat, a megvilágítás időtartamát, valamint a takarmány meghatározását.
—
A vizsgált faj/törzs, valamint a patkánytól eltérő faj alkalmazásának indokolása. Forrás és múltbéli adatok is megadhatók, amennyiben azokat hasonló expozíciós, tartási és koplaltatási körülményeknek kitett állatokon gyűjtötték.
—
Az állatok száma, kora és neme.
—
A véletlen kiválasztás módszere.
—
A vizsgálat előtti esetleges kondicionálás leírása, beleértve a takarmányozást, a karantént és a betegségek kezelését.
Vizsgált vegyi anyag
—
Fizikai jelleg, tisztaság, valamint – ha lényeges – fizikai és kémiai tulajdonságok (beleértve az izomerizációt).
—
Azonosító adatok és – amennyiben ismert – a Vegyianyag Nyilvántartási Szolgálat szerinti nyilvántartási szám (CAS-szám).
Vivőanyag
—
A vivőanyag használatának, valamint megválasztásának indokolása (ha a vivőanyag nem víz).
—
Múltbeli vagy párhuzamosan kapott adatok, amelyek igazolják, hogy a vivőanyag nem befolyásolja a vizsgálat eredményét.
Inhalációs kamra
—
Az inhalációs kamra részletes leírása, beleértve annak térfogatát és vázlatrajzát is.
—
Az állatok expozíciójához és a légkör előállításához használt berendezések eredete és leírása.
—
A hőmérséklet, a páratartalom, a részecskeméret és a tényleges koncentráció mérésére szolgáló berendezések.
—
A levegő forrása és a kondicionáló rendszer.
—
Az eszközök homogén vizsgálati légkör biztosítása érdekében történő kalibrálására alkalmazott módszerek.
—
Nyomáskülönbség (pozitív vagy negatív).
—
Expozíciós nyílások száma kamránként (csak orron keresztüli expozíció), az állatok helye a kamrában (egész testfelületen keresztüli expozíció).
—
A vizsgálati légkör stabilitása.
—
A hőmérséklet- és páratartalom-érzékelők, valamint a vizsgálati légkör mintavételének helye a kamrában.
—
A bevitt/elszívott levegő kezelése.
—
Légáramlási sebességek, légáramlási sebesség expozíciós nyílásonként (csak orron keresztüli expozíció), vagy az állatok terhelése kamránként (egész testfelületen keresztüli expozíció).
—
Az inhalációs kamra egyensúlyi állapotának eléréséhez szükséges idő (t95).
—
A térfogatváltozások óránkénti száma.
—
Mérőberendezések (ha vannak).
Expozíciós adatok
—
A fő vizsgálathoz kiválasztott célkoncentráció indokolása.
—
Névleges koncentrációk (az inhalációs kamrába való bejuttatásra előállított vizsgált vegyi anyag össztömege osztva a kamrán áthaladt levegő térfogatával).
—
A vizsgált vegyi anyagnak az állatok belégzési zónájából gyűjtött tényleges koncentrációi; a heterogén halmazállapotokat (gáz, gőz, aeroszol) felvevő keverékek esetén mindegyik külön elemezhető.
—
Minden levegőbeli koncentrációt tömegegységekben (mg/l, mg/m3 stb.), nem pedig térfogategységekben (ppm, ppb stb.) kell megadni.
—
Részecskeméret-eloszlás, tömegfelező aerodinamikai átmérő (MMAD), valamint geometriai szórás (σg), beleértve kiszámításuk módját is. Jegyzőkönyvezni kell az egyes részecskeméret-elemzéseket.
Vizsgálati körülmények
—
A vizsgált vegyi anyag előkészítésének részletei, beleértve a szilárd anyagok részecskeméretének csökkentésére vagy a vizsgált vegyi anyag oldatainak elkészítésére esetlegesen alkalmazott eljárások részleteit is.
—
A vizsgálati légkör előállítására és az állatok vizsgálati légkörnek való expozíciójára alkalmazott berendezések leírása (lehetőség szerint vázlatrajzzal).
—
A kamrabeli hőmérséklet, páratartalom és légáramlás megfigyelésére használt berendezések részletei (kalibrációs görbe meghatározása).
—
A kamrabeli koncentráció és részecskeméret-eloszlás meghatározásához alkalmazott minták gyűjtésére használt berendezések részletei.
—
Az alkalmazott kémiai analitikai módszer és a módszer validációjának részletei (beleértve a vizsgált vegyi anyag mintavételi közegből való visszanyerésének hatásfokát is).
—
Az állatok vizsgálati és kontrollcsoportokba való besorolásához alkalmazott véletlen kiválasztási módszer.
—
A táplálék és a víz minőségére vonatkozó adatok (ezen belül a takarmány típusa/eredete, a víz eredete).
—
A vizsgált koncentrációk kiválasztásának indokolása.
Eredmények
—
A kamrabeli hőmérséklet, páratartalom és légáramlás értékeinek táblázatos összefoglalása.
—
A kamrabeli névleges és tényleges koncentráció adatainak táblázatos összefoglalása.
—
Részecskeméret-adatok táblázatos összefoglalása, beleértve az analitikai mintavételi adatokat, a részecskeméret-eloszlást, valamint az MMAD és a σg számításait is.
—
A válaszadatok és a koncentrációszintek táblázatos összefoglalása minden egyes állatra (azaz a mérgezési tüneteket mutató és köztük az elhullt állatokra) vonatkozóan (ideértve a hatások jellegét, súlyosságát, megjelenésének időpontját és időtartamát is).
—
Az egyes állatok súlyának táblázatos összefoglalása.
—
A táplálékfelvétel táblázatos összefoglalása.
—
A klinikai patológiai adatok táblázatos összefoglalása.
—
A boncolások és, ha rendelkezésre állnak, a kórszövettani vizsgálatok eredményei minden egyes állatra vonatkozóan.
—
Minden egyéb mért paraméter táblázatos összefoglalása.
Az eredmények szöveges értékelése és értelmezése
—
Különös hangsúlyt kell fektetni az e vizsgálati módszerben – például a határkoncentráció vagy a részecskeméret kapcsán – előírt feltételeknek való megfelelés érdekében alkalmazott módszerek leírására.
—
Ki kell térni a részecskék belélegezhetőségére az általános megállapítások tükrében, különösen ha a részecskeméretre vonatkozó feltételek nem teljesültek.
—
A vizsgálat általános értékelésének ismertetnie kell a névleges és a tényleges koncentrációk meghatározására használt módszerek következetességét, valamint a tényleges és a névleges koncentráció közötti összefüggést.
—
Ki kell térni az elhullás valószínű okára, valamint az elsődleges hatásmechanizmusra (szisztémás vagy helyi).
—
Magyarázatot kell szolgáltatni, amennyiben a humánus végpontokról szóló OECD-iránymutatás (3) szerinti kritériumok alapján humánus módon el kellett pusztítani a fájdalommal küszködő vagy súlyos és tartós szorongás jeleit mutató állatokat.
—
Meg kell jelölni a célszerve(ke)t.
—
Meg kell határozni a NOAEL és a LOAEL értékét.
SZAKIRODALOM
(1)
OECD (1981). Subchronic Inhalation Toxicity Testing, Original Test Guideline No 412, Environment Directorate, OECD, Paris.
(2)
OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paris.
(3)
OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation, Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris.
(4)
Whalan JE and Redden JC (1994). Interim Policy for Particle Size and Limit Concentration Issues in Inhalation Toxicity Studies. Office of Pesticide Programs, United States Environmental Protection Agency.
(5)
Dungworth DL, Tyler WS, Plopper CE (1985). Morphological Methods for Gross and Microscopic Pathology (Chapter 9) in Toxicology of Inhaled Material, Witschi, H.P. and Brain, J.D. (eds), Springer Verlag Heidelberg, pp. 229-258.
(6)
Young JT (1981). Histopathological examination of the rat nasal cavity. Fundam. Appéldául Toxicol. 1: 309-312.
(7)
Harkema JR (1990). Comparative pathology of the nasal mucosa in laboratory animals exposed to inhaled irritants. Environ. Health Perspect. 85: 231-238.
(8)
Woutersen RA, Garderen-Hoetmer A, van Slootweg PJ, Feron VJ (1994). Upper respiratory tract carcinogenesis in experimental animals and in humans. In: Waalkes MP and Ward JM (eds) Carcinogenesis. Target Organ Toxicology Series, Raven Press, New York, 215-263.
(9)
Mery S, Gross EA, Joyner DR, Godo M, Morgan KT (1994). Nasal diagrams: A tool for recording the distribution of nasal lesions in rats and mice. Toxicol. Pathol. 22: 353-372.
(10)
Kuper CF, Koornstra PJ, Hameleers DMH, Biewenga J, Spit BJ, Duijvestijn AM, Breda Vriesman van PJC, Sminia T (1992). The role of nasopharyngeal lymphoid tissue. Immunol. Today 13: 219-224.
(11)
Kuper CF, Arts JHE, Feron VJ (2003). Toxicity to nasal-associated lymphoid tissue. Toxicol. Lett. 140-141: 281-285.
(12)
Lewis DJ (1981). Mitotic Indices of Rat Laryngeal Epithelia. Journal of Anatomy 132(3): 419-428.
(13)
Az Európai Parlament és a Tanács 2008. december 16-i 1272/2008/EK rendelete az anyagok és keverékek osztályozásáról, címkézéséről és csomagolásáról, a 67/548/EGK és az 1999/45/EK irányelv módosításáról és hatályon kívül helyezéséről, valamint az 1907/2006/EK rendelet módosításáról, HL L 353., 2008.12.31., 1. o.
1. függelék
FOGALOMMEGHATÁROZÁS
Vizsgált vegyi anyag: A jelen vizsgálati módszer alkalmazásával vizsgált bármely anyag vagy keverék.
”
5.
A B.29. és a B.30. fejezet helyébe a következő szöveg lép:
„B.29. SZUBKRÓNIKUS INHALÁCIÓS TOXICITÁS: 90 NAPOS VIZSGÁLAT
ÖSSZEFOGLALÁS
A jelen felülvizsgált B.29. vizsgálati módszert úgy alakították ki, hogy azzal teljes körűen jellemezhető legyen a szubkrónikus időtartamon (90 napon) át, belégzés útján bejuttatott vizsgált vegyi anyag toxicitása, valamint megbízható adatokat lehessen gyűjteni a mennyiségi inhalációs kockázatértékelésekhez. 10 hím és 10 nőstény rágcsálóból álló csoportokat teszünk ki 90 napon (13 héten) át napi 6 órára a) a vizsgált vegyi anyagnak legalább három koncentrációszinten, b) szűrt levegőnek (negatív kontroll) és/vagy c) a vivőanyagnak (vivőanyaggal kezelt kontroll). Az állatok expozíciója általában heti 5 napon történik, azonban a hét 7 napján történő expozíció is megengedett. Mindig kell hímeket és nőstényeket is vizsgálni, azonban az egyes nemek különböző koncentrációszinteknek is kitehetők, amennyiben ismert, hogy valamelyik nem érzékenyebb a vizsgált vegyi anyagra. Ez a módszer lehetőséget biztosít a vizsgálatvezetőnek, hogy a vizsgált vegyi anyag toxicitásának alaposabb jellemzése érdekében kísérő (a visszafordíthatóság vizsgálatára alkalmazott) csoportokat, időközi elpusztításokat, bronchoalveoláris átmosást (BAL), neurológiai vizsgálatokat, valamint további klinikai kórtani és kórszövettani értékeléseket is belefoglaljon a vizsgálatba.
BEVEZETÉS
1.
A jelen vizsgálati módszer egyenértékű az OECD 413. vizsgálati iránymutatásával (2009). A szubkrónikus inhalációs toxicitásra vonatkozó eredeti 413. vizsgálati iránymutatást 1981-ben fogadták el (1). A jelen B.29. (a felülvizsgált 413. vizsgálati iránymutatással [2009] egyenértékű) vizsgálati módszert a tudomány jelenlegi állásának megfelelően, valamint a jelenlegi és jövőbeli szabályozási igények kielégítése érdekében frissítették.
2.
A szubkrónikus inhalációs toxicitási vizsgálatok elsődleges célja a munkahelyi környezetben a munkavállalókra nézve fennálló kockázat értékeléséhez használt hatósági koncentrációk meghatározása. Emellett a lakossági, közlekedési és környezeti humán kockázatok értékelésére is alkalmazzák azokat. Ez a módszer lehetővé teszi a vizsgált vegyi anyagnak 90 napon (a patkányok élettartamának körülbelül 10 %-án) át belégzés útján történő, naponta ismételt expozíció nyomán kialakuló káros hatások jellemzését. A szubkrónikus inhalációs toxicitási vizsgálatok során kapott adatok felhasználhatók mennyiségi kockázatértékelési célokra, valamint a krónikus vizsgálatok során alkalmazott koncentrációk kiválasztásához is. E vizsgálati módszer nem kifejezetten nanoanyagok vizsgálatára szolgál. Az e vizsgálati módszer összefüggésében alkalmazott fogalmak meghatározása a jelen fejezet végén, valamint a 39. iránymutatásban (2) található.
KIINDULÁSI MEGFONTOLÁSOK
3.
A vizsgálat minőségének fokozása és az állatkísérletek minimalizálása érdekében a vizsgálati laboratóriumnak a vizsgálat elvégzése előtt figyelembe kell vennie a vizsgálandó vegyi anyagról rendelkezésre álló minden információt. A megfelelő vizsgálati koncentrációk kiválasztását segítő információk közé tartozhat a vizsgált vegyi anyag azonossága, kémiai szerkezete, valamint fizikai és kémiai tulajdonságai, az esetleges in vitro vagy in vivo toxicitási vizsgálatok eredményei, a várható felhasználási terület(ek) és a humán expozíció lehetősége, a szerkezetileg rokon anyagokról rendelkezésre álló (Q)SAR- és toxikológiai adatok, valamint egyéb ismételt expozíciós vizsgálatokból származó adatok. Ha a vizsgálat során neurotoxicitás várható vagy figyelhető meg, a vizsgálatvezető dönthet úgy, hogy a vizsgálat részeként megfelelő értékeléseket is kell végezni, például funkcionális megfigyelési vizsgálatot (FOB) és a motoros aktivitás mérését. Az expozícióknak az egyes vizsgálatokhoz viszonyított időzítése ugyan kritikus lehet, e kiegészítő tevékenységek azonban nem szabad, hogy akadályozzák az vizsgálat alapvető tervezését.
4.
A maró vagy irritáló hatású vegyi anyagok vizsgálhatók hígítva, olyan koncentrációban, amellyel elérhető a kívánt mértékű toxicitás. További információ a 39. iránymutatásban (2) található. Az állatok ezen anyagoknak való expozíciója során a célkoncentrációknak kellően alacsonynak kell lenniük ahhoz, hogy ne okozzanak jelentős fájdalmat és szorongást, ugyanakkor elegendőnek kell lenniük ahhoz, hogy a koncentráció-hatás görbe kiterjeszthető legyen a vizsgálat szabályozási és tudományos céljának megfelelő szintekre. E koncentrációkat eseti alapon kell kiválasztani, lehetőleg egy megfelelően megtervezett tartománybehatároló vizsgálat alapján, amely információkkal szolgál a kritikus végpontról, az esetleges irritációs küszöbértékről, valamint a hatás kezdetének idejéről (lásd a 11–13. bekezdést). A választott koncentrációt indokolni kell.
5.
Az elhullásközeli állapotban lévő, nyilvánvalóan fájdalmakkal küszködő vagy súlyos és tartós szorongás jeleit mutató állatokat humánus módon el kell pusztítani. Az elhullásközeli állapotban lévő állatokat a vizsgálat során elhullott állatokkal azonos módon kell figyelembe venni. A megjósolható vagy közeli elhullás felismerését segítő iránymutatás, valamint az elhullás közelében lévő vagy súlyosan szenvedő állatok elpusztítására vonatkozó döntési kritériumok a humánus végpontokról szóló OECD-iránymutatásban (3) találhatók.
A MÓDSZER LEÍRÁSA
Az állatfaj kiválasztása
6.
Általánosan használt laboratóriumi törzsekből származó egészséges, fiatal, ivarérett rágcsálókat kell alkalmazni. A javasolt faj a patkány. Más faj használata esetén a döntést indokolni kell.
Az állatok előkészítése
7.
Olyan nőstényeket kell választani, amelyek még egyszer sem ellettek, és nem vemhesek. A véletlen kiválasztás napján az állatoknak 7–9 hetes fiatal, ivarérett egyedeknek kell lenniük. A testsúlyuk a nemenkénti átlagos testsúlytól legfeljebb ± 20 %-kal térhet el. Az állatokat véletlenszerűen választjuk ki, egyedi azonosítóval látjuk el, és a laboratóriumi körülményekhez való szoktatás céljából a vizsgálat megkezdése előtt legalább 5 napig a ketrecükben tartjuk.
Az állatok tartása
8.
Az állatokat a megfigyelések megkönnyítése és összetévesztésük elkerülése érdekében egyedi azonosítóval, lehetőleg bőr alatti jeladóval kell ellátni. A kísérleti állatok tartására használt helyiség hőmérséklete 22 ± 3 °C kell, hogy legyen. A relatív páratartalmat ideális esetben 30–70 %-os tartományban kell tartani, ugyanakkor ez nem feltétlenül lehetséges, ha vivőanyagként vizet használunk. Az expozíció előtt és után az állatokat általában nemek és koncentrációk szerinti csoportokban kell a ketreceikben elhelyezni, azonban az állatok ketrecenkénti számának nem szabad akadályoznia az egyes állatok megfigyelését, és minimalizálnia kell a kannibalizmus és a marakodás okozta veszteségeket. Ha az állatok expozíciója csak orron át történik, szükséges lehet szoktatni azokat a lefogásukra szolgáló csövekhez. Az állatok lefogására szolgáló csövek nem okozhatnak az állatoknak indokolatlan fizikai, termális vagy a mozgásképtelenség okozta stresszt. A lefogás hatással lehet olyan fiziológiai végpontokra, mint a testhőmérséklet (hipertermia) és/vagy a percenkénti légzésvolumen. Amennyiben a rendelkezésre álló általános adatok azt igazolják, hogy ilyen változások nem lépnek fel számottevő mértékben, az állatok lefogására szolgáló csövekhez való előzetes szoktatás mellőzhető. Az aeroszoloknak egész testfelületükön kitett állatokat az expozíció során külön ketrecben kell elhelyezni, hogy a vizsgált aeroszol ne szűrődhessen át a többi állat szőrzetén. Hagyományos és minősített laboratóriumi takarmány alkalmazható – kivéve az expozíció időtartama alatt –, korlátlan mennyiségű ivóvíz biztosítása mellett. A világítás legyen mesterséges, 12 órás világos és 12 órás sötét periódusok váltsák egymást.
Inhalációs kamrák
9.
Az inhalációs kamra kiválasztásakor figyelembe kell venni a vizsgált vegyi anyag jellegét és a vizsgálat célját. Az előnyben részesítendő expozíciós mód a csak orron keresztüli expozíció (ez magában foglalja a csak a fejet, orrot vagy szájat érintő expozíciót). A csak orron keresztüli expozíció általában előnyben részesítendő a folyékony vagy szilárd aeroszolok, valamint a lecsapódva esetlegesen aeroszolt alkotó gőzök vizsgálata esetén. Előfordulhat, hogy a vizsgálat különleges céljai egész testfelületen keresztüli expozíció alkalmazásával hatékonyabban elérhetők, ezt azonban indokolni kell a vizsgálati jegyzőkönyvben. Egész testfelületen keresztüli expozícióra szolgáló kamra használata esetén a légköri stabilitás biztosítása érdekében a vizsgált állatok össztérfogata nem haladhatja meg a kamra térfogatának 5 %-át. A csak orron át történő és az egész testfelületen keresztüli expozíciós technikák elveivel, valamint azok különös előnyeivel és hátrányaival a 39. iránymutatás (2) foglalkozik.
TOXICITÁSI VIZSGÁLATOK
Határkoncentrációk
10.
Az akut vizsgálatoktól eltérően a szubkrónikus inhalációs toxicitási vizsgálatok esetén nincsenek meghatározott határkoncentrációk. A maximális vizsgált koncentráció kiválasztásakor a következőket kell figyelembe venni: 1) az elérhető maximális koncentráció, 2) a legrosszabb esetben fennálló humán expozíció szintje, 3) a megfelelő oxigénellátás biztosításának szükségessége és/vagy 4) állatjóléti szempontok. Amennyiben nincsenek adatokon alapuló határértékek, az 1272/2008/EK rendeletben (13) szereplő akut határértékek alkalmazhatók (azaz aeroszolok esetén legfeljebb 5 mg/l, gőzök esetén 20 mg/l, gázok esetén pedig 20 000 ppm); lásd a 39. iránymutatást (2). Amennyiben gázok vagy erősen illékony anyagok (például hűtőfolyadékok) vizsgálata esetén e határértékeket túl kell lépni, a döntést indokolni kell. A határkoncentrációnak egyértelmű toxicitást kell előidéznie anélkül, hogy az állatoknak indokolatlan stresszt okozna vagy befolyásolná az élettartamukat (3).
Tartománybehatároló vizsgálat
11.
A fő vizsgálat megkezdése előtt általában tartománybehatároló vizsgálat elvégzése szükséges. A tartománybehatároló vizsgálat átfogóbb a dózisbehatároló vizsgálatnál, mivel nem korlátozódik a koncentráció kiválasztására. A tartománybehatároló vizsgálat révén szerzett információk hozzájárulhatnak a fő vizsgálat sikeréhez. A tartománybehatároló vizsgálat például technikai jellegű információkkal szolgálhat az analitikai módszerek, a részecskeméretezés, a toxikus hatásmechanizmusok felismerése, a klinikai kórtani és kórszövettani adatok, valamint a fő vizsgálat lehetséges NOAEL- és MTC-koncentrációinak becslése vonatkozásában. A vizsgálatvezető a tartománybehatároló vizsgálatot alkalmazhatja a légzőrendszer irritációs küszöbértékének (például a légzőrendszer kórszövettani elemzése, a tüdő működésének vizsgálata vagy bronchoalveoláris átmosás útján történő) meghatározása, az állatoknak indokolatlan stresszt nem okozó, elfogadható maximális koncentráció, valamint a vizsgált vegyi anyag toxicitását legjobban jellemző paraméterek meghatározása céljából.
12.
A tartománybehatároló vizsgálat egy vagy több koncentrációszintre is kiterjedhet. A választott végponttól függően mindegyik koncentrációszintnek 3–6 hímet és 3–6 nőstényt kell kitenni. A tartománybehatároló vizsgálatnak legalább 5 napig kell tartania, és általában nem tarthat tovább 28 napnál. A vizsgálati jegyzőkönyvnek tartalmaznia kell a fő vizsgálathoz kiválasztott koncentrációk indokolását. A fő vizsgálat célja a koncentráció-válasz összefüggésnek a feltételezett legérzékenyebb végpont alapján történő kimutatása. Alsó koncentrációként lehetőleg olyan koncentráció választandó, amelynél nem észlelhető káros hatás, míg a felső koncentrációnak egyértelmű toxicitást kell előidéznie anélkül, hogy az állatoknak indokolatlan stresszt okozna vagy befolyásolná az élettartamukat (3).
13.
A tartománybehatároló vizsgálat során alkalmazandó koncentrációszintek kiválasztásakor figyelembe kell venni minden rendelkezésre álló információt, beleértve a szerkezet-aktivitás összefüggéseket és a hasonló vegyi anyagok adatait (lásd a 3. bekezdést). A tartománybehatároló vizsgálat megerősítheti, illetve megcáfolhatja a legérzékenyebbnek vélt mechanisztikai alapú végpontokat, például az organofoszfátok kolineszterázgátló hatását, a vörösvérsejtekre toxikus anyagok okozta methemoglobinképződést, a pajzsmirigyre toxikus anyagok esetén a pajzsmirigyhormonokat (T3, T4), a fehérjét, az LDH-t, vagy az ártalmatlan, nehezen oldható részecskék vagy a tüdőt irritáló aeroszolok esetén a bronchoalveoláris átmosási folyadékban lévő neutrofileket.
Fő vizsgálat
14.
A fő szubkrónikus toxicitási vizsgálat általában három koncentrációszintre, valamint szükség szerint azokkal párhuzamosan vizsgált negatív (levegővel kezelt) és/vagy vivőanyaggal kezelt kontrollokra terjed ki (lásd a 18. bekezdést). A megfelelő expozíciós szintek kiválasztásának elősegítéséhez fel kell használni minden rendelkezésre álló adatot, beleértve a szisztémás toxicitási vizsgálatok eredményeit, az anyagcserére vonatkozó és kinetikai adatokat (különös hangsúlyt kell fektetni a kinetikai folyamatokat telítő magas koncentrációszintek elkerülésére). Mindegyik vizsgált csoport 10 hím és 10 nőstény rágcsálóból áll, amelyeket hetente 5 napon napi 6 órára teszünk ki a vizsgált vegyi anyagnak 13 héten keresztül (a vizsgálat teljes időtartama 90 nap). Az állatok heti 7 napon is kitehetők a vizsgált anyagnak (például belélegezhető gyógyszerek vizsgálata esetén). Amennyiben ismert, hogy valamelyik nem érzékenyebb a vizsgált vegyi anyagra, az egyes nemek különböző koncentrációszinteknek is kitehetők a 15. bekezdésben ismertetett koncentráció-válasz összefüggés optimális feltárása érdekében. Patkányoktól eltérő rágcsálófajok csak orron át történő expozíciója esetén az expozíció maximális időtartama kiigazítható a fajspecifikus szorongás minimalizálása érdekében. Napi 6 óránál rövidebb expozíciós idő alkalmazása vagy hosszabb időtartamú (például napi 22 órás), egész testfelületen keresztüli expozíciós vizsgálat szükségessége esetén indokolást kell adni (lásd a 39. iránymutatást) (2). Az expozíció időtartama alatt az állatok nem kaphatnak takarmányt, kivéve, ha az időtartam meghaladja a 6 órát. Az állatoknak víz az egész testfelületen keresztüli expozíció teljes időtartama alatt adható.
15.
A célkoncentrációkat úgy kell megválasztani, hogy azonosítható(k) legyen(ek) a célszerv(ek) és egyértelmű koncentráció-válasz összefüggés legyen kimutatható:
—
A felső koncentrációszintnek toxikus hatásokat kell előidéznie anélkül, hogy késleltetett tüneteket vagy elhullást okozna, ami kizárná az érdemi értékelést.
—
A köztes koncentrációszint(ek)et úgy kell felosztani, hogy a toxikus hatások fokozatosan növekedjenek az alsó és a felső koncentrációszint között.
—
Az alsó koncentrációszint nem, vagy csak kis mértékben idézheti elő toxicitás jeleit.
Időközi elpusztítás
16.
Ha időközi elpusztítást tervezünk, az egyes expozíciós szintekhez tartozó állatok számát annyival kell megnövelni, ahány állatot a vizsgálat befejezése előtt el szándékozunk pusztítani. Az időközi elpusztítást indokolni kell, és a statisztikai elemzések során megfelelően figyelembe kell venni.
Kísérő (visszafordíthatósági) vizsgálat
17.
Kísérő (visszafordíthatósági) vizsgálat végezhető a toxicitás visszafordíthatóságának, elhúzódó vagy késve fellépő voltának a kezelést követő megfelelő hosszúságú, de legalább 14 napos időszak során történő megfigyelése érdekében. A kísérő (visszafordíthatósági) vizsgálathoz használt csoportok 10 hímből és 10 nőstényből állnak, amelyeket a fő vizsgálatban megfigyelt kísérleti állatokkal egyidejűleg teszünk ki a vizsgált vegyi anyagnak. A kísérő (visszafordíthatósági) vizsgálathoz használt csoportokat a legnagyobb koncentrációban kell kitenni a vizsgált vegyi anyagnak, és ezzel párhuzamosan szükség szerint levegővel és/vagy vivőanyaggal kezelt kontrollok vizsgálatát is el kell végezni (lásd a 18. bekezdést).
Kontrollállatok
18.
A párhuzamosan vizsgált negatív (levegővel kezelt) kontrollállatokat a vizsgált csoportokban lévő állatokkal azonos módon kell kezelni, azzal a különbséggel, hogy a vizsgált vegyi anyag helyett szűrt levegőnek tesszük ki azokat. Amennyiben vizet vagy más anyagot használunk a vizsgálati légkör létrehozásának elősegítésére, a vizsgálathoz negatív (levegővel kezelt) kontrollcsoport helyett vivőanyaggal kezelt kontrollcsoportot kell alkalmazni. Vivőanyagként lehetőség szerint vizet kell használni. Ha a vivőanyag víz, a kontrollállatokat ugyanolyan relatív páratartalmú levegőnek kell kitenni, mint a vizsgált anyagnak kitett csoportokat. Az alkalmas vivőanyag kiválasztásának megfelelően elvégzett előzetes vizsgálaton vagy múltbeli adatokon kell alapulnia. Ha a vivőanyag toxicitásáról nincsenek részletes információk, a vizsgálatvezető dönthet úgy, hogy negatív (levegővel kezelt) és vivőanyaggal kezelt kontrollt egyaránt kell alkalmazni, ez azonban erősen ellenjavallt. Ha a múltbeli adatok alapján a vivőanyag nem toxikus, nincs szükség negatív (levegővel kezelt) kontrollcsoportra, és ez esetben csak vivőanyaggal kezelt kontrollcsoportot kell alkalmazni. Amennyiben a vivőanyaggal kevert vizsgált vegyi anyag az előzetes vizsgálat alapján nem bizonyul toxikusnak, a vizsgált koncentráció mellett a vivőanyag sem tekintendő toxikusnak, és ezt a vivőanyagkontrollt kell használni.
EXPOZÍCIÓS KÖRÜLMÉNYEK
A koncentrációk beadása
19.
Az állatokat gáz, gőz, aeroszol vagy ezek keveréke formájában tesszük ki a vizsgált vegyi anyagnak. A vizsgálandó halmazállapot a vizsgált vegyi anyag fizikai és kémiai tulajdonságaitól, a kiválasztott koncentrációktól és/vagy a vizsgált vegyi anyag kezelése és használata során legnagyobb valószínűséggel előforduló halmazállapottól függ. A higroszkopikus és kémiailag reakcióképes vizsgált vegyi anyagokat száraz levegős körülmények között kell vizsgálni. Ügyelni kell a robbanékony koncentrációk keletkezésének elkerülésére. A részecskéket képző anyagok mechanikai eljárásoknak vethetők alá a részecskeméret csökkentése érdekében. További útmutatás a 39. iránymutatásban (2) olvasható.
Részecskeméret-eloszlás
20.
Minden aeroszol, valamint a lecsapódva esetlegesen aeroszolt alkotó gőzök esetén részecskeméretezést kell végezni. A légzőrendszer összes lényeges részének expozíciója érdekében 1 és 3 μm közötti tömegfelező aerodinamikai átmérővel (MMAD) rendelkező, az 1,5 és 3,0 közötti tartományba eső geometriai szórású (σg) aeroszolok használata javasolt (4). Habár ésszerű keretek között törekedni kell az e szabványnak való megfelelésre, szakértői megítélésre kell hagyatkozni, ha erre nincs lehetőség. A fémgőzök részecskéi például kisebbek e szabványos méretnél, míg a töltéssel rendelkező részecskék és a rostok meghaladhatják azt.
A vizsgált vegyi anyag előkészítése vivőanyagban
21.
A vizsgált vegyi anyag ideális esetben vivőanyag nélkül vizsgálandó. Ha a vizsgált vegyi anyag megfelelő koncentrációjának és részecskeméretének előállításához vivőanyag alkalmazása szükséges, a víz részesítendő előnyben. Ha a vizsgált vegyi anyagot vivőanyagban oldjuk fel, minden esetben igazolni kell annak stabilitását.
AZ EXPOZÍCIÓS KÖRÜLMÉNYEK NYOMON KÖVETÉSE
Kamrabeli légáramlás
22.
Az expozíciós kamrán keresztüli légáramlást gondosan szabályozni kell, folyamatosan nyomon kell követni, és minden expozíció során legalább óránként fel kell jegyezni. A vizsgálati légköri koncentráció (vagy időbeli stabilitás) valós idejű nyomon követése valamennyi dinamikus paraméter globális mérését jelenti, és közvetett lehetőséget nyújt valamennyi lényeges dinamikus inhalációs paraméter szabályozására. A koncentráció valós idejű nyomon követése esetén a légáramlásokat elegendő expozíciónként és naponként egy alkalommal mérni. Különös figyelmet kell fordítani a csak orron át történő expozícióra szolgáló kamrában az újbóli belélegzés elkerülésére. Az oxigénkoncentrációnak legalább 19 %-nak kell lennie, a szén-dioxid-koncentráció pedig legfeljebb 1 % lehet. Amennyiben feltételezhető, hogy ez a szabvány nem teljesíthető, az oxigén- és szén-dioxid-koncentrációt mérni kell. Ha az expozíció első napján végzett mérések azt mutatják, hogy e gázok szintje megfelelő, rendszerint nincs szükség további mérésekre.
A kamra hőmérséklete és relatív páratartalma
23.
A kamra hőmérsékletét 22 ± 3 °C-on kell tartani. Az állatok belégzési zónájában fennálló relatív páratartalmat a csak orron át történő és az egész testfelületen keresztüli expozíció esetén egyaránt folyamatosan nyomon kell követni, és lehetőség szerint minden expozíció során óránként fel kell jegyezni. A relatív páratartalmat lehetőleg 30–70 %-os tartományban kell tartani, ugyanakkor előfordulhat, hogy ez vagy nem érhető el (például vízalapú keverékek vizsgálata esetén), vagy nem mérhető a vizsgált vegyi anyag vizsgálati módszerrel való interferenciája miatt.
Vizsgált vegyi anyag: névleges koncentráció
24.
Az expozíciós kamrában fennálló névleges koncentrációt lehetőség szerint ki kell számítani és fel kell jegyezni. A névleges koncentrációt úgy kapjuk meg, hogy az előállított vizsgált vegyi anyag tömegét elosztjuk az inhalációs kamrarendszeren áthaladt levegő össztérfogatával. A névleges koncentráció nem az állatok expozíciójának jellemzésére szolgál, ugyanakkor a névleges és a tényleges koncentráció összehasonlításával megismerhető a vizsgálati rendszer előállítási hatásfoka, és így feltárhatók az előállítással összefüggő problémák.
Vizsgált vegyi anyag: tényleges koncentráció
25.
A tényleges koncentráció a vizsgált vegyi anyagnak az inhalációs kamrán belül, az állatok belégzési zónájában végzett mintavétellel megállapított koncentrációját jelenti. A tényleges koncentráció vagy specifikus módszerekkel (például közvetlen mintavétellel, adszorpciós vagy kémiai reakcióképességet vizsgáló módszerekkel, valamint utólagos analitikai jellemzéssel), vagy nem specifikus módszerekkel, például gravimetriai szűrőelemzéssel határozható meg. A gravimetriai elemzés csak egykomponensű, por alakú aeroszolok, illetve alacsony illékonyságú folyadékok aeroszoljai esetén elfogadható, és alkalmazását a vizsgált vegyi anyag megfelelő, a vizsgálat előtt végzett jellemzésével kell alátámasztani. A gravimetriai elemzés a többkomponensű, por alakú aeroszolok koncentrációjának meghatározására szintén alkalmazható. Ebben az esetben azonban analitikai adatokkal kell alátámasztani, hogy a levegőben lévő anyag összetétele hasonló a kiindulási anyagéhoz. Amennyiben ilyen információ nem áll rendelkezésre, a (lehetőleg levegőben lebegő) vizsgált vegyi anyag rendszeres időközönként végzett újbóli elemzésére lehet szükség a vizsgálat során. Olyan aeroszolizálódott ágensek esetén, amelyek elpárologhatnak vagy szublimálhatnak, igazolni kell, hogy mindegyik fázisból a választott módszerrel vettünk mintát.
26.
Lehetőség szerint a vizsgált vegyi anyag egyetlen tételét kell használni a vizsgálat teljes időtartama alatt, és a vizsgált mintát olyan körülmények között kell tárolni, hogy megőrződjön annak tisztasága, homogenitása és stabilitása. A vizsgálat megkezdését megelőzően el kell végezni a vizsgált vegyi anyag jellemzését, meghatározva többek között annak tisztaságát, valamint amennyiben technikailag lehetséges, az észlelt szennyező anyagok és szennyeződések azonosságát és mennyiségét. Ez többek között – de nem kizárólag – a következő adatokkal mutatható ki: retenciós idő és relatív csúcsterület, tömegspektroszkópiai vagy gázkromatográfiás elemzéssel, illetve más becslésekkel meghatározott molekulatömeg. Bár a vizsgált minta azonosságának meghatározása nem tartozik a vizsgálati laboratórium feladatai közé, óvatosságból érdemes lehet a vizsgálati laboratóriumban legalábbis korlátozott módon (például szín, fizikai jelleg stb. alapján) megerősíteni a megbízó által adott jellemzést.
27.
Az expozíciós légkört amennyire csak lehet, állandó állapotban kell tartani. Az expozíciós körülmények stabilitásának bizonyítására valós idejű nyomonkövetési eszköz – például aeroszolok esetén aeroszolfotométer, vagy gőzök esetén az összes szénhidrogéntartalmat elemző műszer – alkalmazható. A kamrabeli tényleges koncentrációt minden expozíciós napon minden expozíciós szint tekintetében legalább háromszor meg kell mérni. Ha az alacsony légáramlási sebesség vagy koncentráció miatt ez nem megoldható, expozíciós időszakonként egy mintavétel is elfogadható. Ideális esetben ezt a mintavételt a teljes expozíciós időszak folyamán kell elvégezni. Az egyes kamrakoncentráció-minták gázok és gőzök esetén legfeljebb ± 10 %-kal, folyékony vagy szilárd aeroszolok esetén pedig legfeljebb ± 20 %-kal térhetnek el a kamrabeli átlagkoncentrációtól. A kamra egyensúlyi állapotának kialakulásához szükséges időt (t95) ki kell számítani és jegyzőkönyvezni kell. Egy adott expozíció időtartama magában foglalja a vizsgált vegyi anyag előállításának idejét. Ehhez figyelembe kell venni a kamra egyensúlyi állapotának eléréséhez és a bomláshoz szükséges időt (t95). A t95 becsléséhez a 39. iránymutatásban (2) található útmutatás.
28.
A nagyon összetett, gázokból/gőzökből és aeroszolokból álló keverékek (például égési légkörök, valamint meghatározott célra szolgáló végfelhasználói termékekből/készülékekből kibocsátott vizsgált vegyi anyagok) esetén az egyes fázisok eltérően viselkedhetnek az inhalációs kamrában. Éppen ezért mindegyik fázishoz (gáz/gőz és aeroszol) legalább egy indikátoranyagot (analitot) – általában a keverék elsődleges hatóanyagát – kell kiválasztani. Amennyiben a vizsgált vegyi anyag keverék, az analitikai koncentrációt a teljes keverék, nem pedig csak az aktív összetevő vagy az indikátoranyag (analit) vonatkozásában kell a jegyzőkönyvben feltüntetni. A tényleges koncentrációról további információ a 39. iránymutatásban található (2).
Vizsgált vegyi anyag: részecskeméret-eloszlás
29.
Az aeroszolok részecskeméret-eloszlását mindegyik koncentrációszint tekintetében legalább hetente meg kell határozni sorozatos ütközésmérő vagy alternatív műszer, például aerodinamikai részecskeméret-meghatározó (APS) segítségével. Ha bizonyítható, hogy a sorozatos ütközésmérővel és az alternatív műszerrel kapott eredmények egyeznek, az alternatív műszer a teljes vizsgálat folyamán használható.
30.
Az elsődleges műszerrel párhuzamosan egy második eszközt, például gravimetriai szűrőt vagy impingert/gázbuborékoltatót kell használni az elsődleges műszer mintavételi hatékonyságának megerősítése érdekében. A részecskeméret-elemzés útján kapott tömegkoncentrációnak a szűrőelemzéssel kapott tömegkoncentrációt ésszerű mértékben meg kell közelítenie (lásd a 39. iránymutatást (2)). Ha a vizsgálat kezdeti szakaszában vizsgált összes koncentrációnál bizonyítható az egyezés, a további megerősítő mérések mellőzhetők. Az állatok jóléte érdekében intézkedéseket kell tenni a vizsgálat eseteges megismétlését szükségessé tevő kétes adatok előfordulásának minimalizálása érdekében.
31.
Gőzök esetén részecskeméretezést kell végezni, ha fennáll annak a lehetősége, hogy a gőz lecsapódásával aeroszol keletkezhet, vagy ha vegyes fázisok alkotására képes részecskéket észlelünk a gőzatmoszférában.
MEGFIGYELÉSEK
32.
Az állatokat az expozíciós időtartam előtt, alatt és után klinikai megfigyeléseknek kell alávetni. Az állatok expozíció során megfigyelt reakciójától függően gyakoribb megfigyelések is kilátásba helyezhetők. Ha az állatok megfigyelését az azok lefogására szolgáló csövek használata, az egész testfelületen keresztüli expozícióra szolgáló kamra rossz megvilágítása vagy az átlátszatlan légkör akadályozza, az állatokat az expozíció után alapos megfigyelésnek kell alávetni. A következő napi expozíció előtt végzett megfigyelésekkel felmérhető a toxikus hatások visszafordíthatósága vagy súlyosbodása.
33.
Minden megfigyelést rögzíteni kell olyan módon, hogy minden állat esetében önálló adatsort veszünk fel. Ha az állatokat humánus okok miatt el kell pusztítani, vagy ha azok elhullnak, a lehető legpontosabban fel kell jegyezni az elhullás időpontját.
34.
A ketrecben tartott állatok megfigyelésének ki kell terjednie a bőr és a szőrzet, a szem és a nyálkahártya, a légző-, keringési és idegrendszer, valamint a szomatomotoros aktivitás és a viselkedési minták változásaira. Figyelmet kell szentelni a remegés, görcsök, nyáladzás, hasmenés, letargia, alvás és kóma megfigyelésére. A végbélben mért hőmérséklet bizonyítékot szolgáltathat a kezelés vagy a fogság okozta bradipnoés reflexre vagy hipo-/hipertermiára. A vizsgálati protokollba további értékelések is felvehetők, ilyenek például a kinetikai vizsgálatok, a biomonitoring, a tüdőműködés vizsgálata, a tüdőszövetben felgyülemlő, rosszul oldható anyagok visszamaradásának vizsgálata, valamint a viselkedésbeli változások megfigyelése.
TESTSÚLY
35.
Az egyes állatok súlyát röviddel az első expozíció (0. nap) előtt, azt követően pedig hetente kétszer (például az expozíció nélküli hétvégén végbement felépülés bizonyítása céljából pénteken és hétfőn, vagy a szisztémás toxicitás felmérését lehetővé tevő időközönként), valamint az elhullás vagy elpusztítás időpontjában kell feljegyezni. Amennyiben az első 4 héten semmilyen hatás nem figyelhető meg, a vizsgálat hátralevő részében a testsúly heti rendszerességgel is mérhető. A kísérő (visszafordíthatósági) vizsgálatban alkalmazott állatok (ha vannak) súlyának heti rendszerességgel végzett mérését a felépülési időszak során is folytatni kell. A vizsgálat lezárásakor minden állat súlyát meg kell mérni röviddel az elpusztítás előtt, hogy torzításmentesen kiszámítható legyen a szervek súlyának testsúlyhoz viszonyított aránya.
TÁPLÁLÉK- ÉS VÍZFOGYASZTÁS
36.
A felvett táplálék mennyiségét heti rendszerességgel le kell mérni. A felvett víz mennyisége szintén mérhető.
KLINIKAI PATOLÓGIA
37.
Minden állaton – beleértve a kontrollokat és a kísérő (visszafordíthatósági) csoportokba tartozókat – klinikai patológiai értékelést kell végezni az elpusztításkor. Az expozíció vége és a vérvétel között eltelt időt fel kell jegyezni, különösen ha az adott végpontra gyors regeneráció jellemző. A rövid plazmabeli felezési idejű paramétereknél (például COHb, CHE és MetHb) az expozíció végét követően végzendő mintavétel.
38.
A minden toxikológiai vizsgálathoz általánosan előírt klinikai patológiai paraméterek felsorolása az 1. táblázatban található. Rendszeres vizeletelemzés nem kötelező, de elvégezhető, ha a várt vagy megfigyelt toxicitás alapján célszerűnek ítéljük. A vizsgálatvezető a vizsgált vegyi anyag toxicitásának alaposabb jellemzése érdekében további paraméterek értékelése mellett dönthet (például kolineszteráz, lipidek, hormonok, sav-bázis egyensúly, methemoglobin vagy Heinz-testek, kreatin-kináz, csontvelő/eritroid arány, troponinok, artériás vérgáz, laktát-dehidrogenáz, szorbit-dehidrogenáz, glutamát-dehidrogenáz és gamma-glutamil-transzpeptidáz).
1.táblázat
Szabványos klinikai patológiai paraméterek
Hematológiai paraméterek
vörösvértestszám
hematokrit
hemoglobinkoncentráció
átlagos korpuszkuláris hemoglobin
átlagos korpuszkuláris térfogat
átlagos korpuszkuláris hemoglobinkoncentráció
retikulociták
teljes vérkép
differenciált vérkép
trombocitaszám
véralvadási képesség (a következők egyikét kell választani):
Amennyiben arra utaló bizonyítékot találunk, hogy az alsó légutak (azaz az alveolusok) jelentik a lerakódás és a visszamaradás elsődleges helyét, a bronchoalveoláris átmosás (BAL) lehet a legalkalmasabb technika a hipotézisen alapuló dózis-hatás paraméterek alveolitiszre, tüdőgyulladásra és foszfolipidózisra összpontosító mennyiségi elemzéséhez. Ez lehetővé teszi az alveolusok károsodása dózis-válasz és idő-lefolyás típusú változásainak megfelelő vizsgálatát. A BAL eljárás útján nyert folyadék elemezhető teljes és differenciált vérkép, összes fehérje, valamint laktát-dehidrogenáz tekintetében. Figyelembe vehetők továbbá egyéb, lizoszómakárosodásra, foszfolipidózisra, fibrózisra, valamint irritáció okozta vagy allergiás gyulladásra utaló paraméterek is, ami magában foglalhatja a gyulladást serkentő citokinek/kemokinek meghatározását. A BAL-mérések általában kiegészítik a kórszövettani vizsgálatok eredményeit, azonban nem helyettesíthetik azokat. A tüdőátmosás elvégzéséhez a 39. iránymutatásban (2) található útmutatás.
SZEMÉSZETI VIZSGÁLAT
40.
A vizsgált vegyi anyag beadása előtt az összes állaton, továbbá az összes, magas koncentrációnak kitett és kontrollcsoport esetén a vizsgálat lezárásakor oftalmoszkóppal vagy azzal egyenértékű eszközzel el kell végezni a szemfenék, a fénytörő közegek, a szivárványhártya és a kötőhártya szemészeti vizsgálatát. Amennyiben a szem elváltozásait észleljük, a többi csoportba tartozó összes állatot is meg kell vizsgálni, beleértve a kísérő (visszafordíthatósági) csoportba tartozókat.
MAKROSZKOPIKUS PATOLÓGIA ÉS A SZERVEK SÚLYA
41.
Minden kísérleti állaton teljes kivéreztetést és (ha lehetséges) makroszkopikus boncolást kell végezni, beleértve azokat is, amelyek a vizsgálat során elpusztultak, vagy amelyeket állatjóléti okok miatt el kellett távolítani a vizsgálatból. Minden egyes állatnál fel kell jegyezni az utolsó expozíció és az elpusztítás között eltelt időt. Ha a boncolás nem végezhető el rögtön azután, hogy az elpusztult állatot észrevettük, az állatot hűtve (nem fagyasztva) kell tárolni az autolízis minimalizálásához kellően alacsony hőmérsékleten. A boncolást a lehető leghamarabb, általában egy vagy két napon belül el kell végezni. Minden állat esetén fel kell jegyezni minden makroszkopikus patológiai elváltozást, különös tekintettel a légzőrendszert érintő változásokra.
42.
A makroszkopikus boncolás során kórszövettani vizsgálat céljából megfelelő közegben megőrizendő szervek és szövetek felsorolása a 2. táblázatban található. A [szögletes zárójelben] feltüntetett szervek és szövetek, valamint bármely egyéb szerv és szövet megőrzéséről a vizsgálatvezető saját mérlegelése alapján dönthet. A félkövérrel szedett szerveket a kiszáradás elkerülése érdekében a boncolás után a lehető legrövidebb időn belül meg kell tisztítani, és azok nedves súlyát meg kell mérni. A pajzsmirigy és a mellékherék súlyát csak akkor javasolt megmérni, ha szükséges, mivel az azok megtisztítása során keletkező mesterséges elváltozások akadályozhatják a kórszövettani értékelést. A szöveteket és a szerveket közvetlenül a boncolás után, és az alkalmazandó fixálószertől függően legalább 24–48 órával a megtisztítás előtt 10 %-os pufferelt formalinban vagy egyéb, megfelelő fixálószerben fixálni kell.
2.táblázat
A makroszkopikus boncolás során megőrizendő szervek és szövetek
Mellékvesék
Aorta
Csontvelő (és/vagy friss felszívott minta)
Agy (beleértve a nagyagy, a kisagy és a nyúltvelő/nyúltagyi híd metszeteit)
Vakbél
Vastagbél
Patkóbél
[Mellékherék]
[Szemek (retina, látóideg) és szemhéjak]
Combcsont és térdízület
Epehólyag (ha van)
[Harder-mirigyek]
Szív
Csípőbél
Éhbél
Vesék
[Könnymirigyek (szemüregen kívüli)]
Gégefő (3 szinten, beleértve a gégefedő alapját)
Máj
Tüdő (egy szinten készített metszet mindegyik lebenyről, beleértve a fő hörgőket)
Nyirokcsomók a tüdő hilusok körüli részéről, különösen nehezen oldható, szemcsés vizsgált vegyi anyagok esetén. Alaposabb vizsgálatok és/vagy immunológiára összpontosító tanulmányok esetében további nyirokcsomók megőrzése is megfontolható, például a gátori, nyaki/állkapocs alatti és/vagy fülcse körüli részekről.
Nyirokcsomók (a bejutás helyétől távoli helyről)
Emlőmirigy (nőstény)
Izomszövet (comb)
Orr-garati szövetek (legalább 4 szinten, amelyek egyikének tartalmaznia kell az orr-garati csatornát és az orrhoz társuló nyirokszövetet [NALT])
Nyelőcső
[Szaglógumó]
Petefészkek
Hasnyálmirigy
Mellékpajzsmirigyek
Perifériás ideg (csípő vagy sípcsont környéki, lehetőleg az izomzathoz közeli helyről véve)
Agyalapi mirigy
Prosztata
Végbél
Nyálmirigyek
Ondóhólyagok
Bőr
Gerincoszlop (nyaki, mellkasi középső és ágyéki szakasz)
Lép
Szegycsont
Gyomor
Fogazat
Herék
Csecsemőmirigy
Pajzsmirigyek
[Nyelv]
Légcső (legalább 2 szinten, beleértve egy hosszirányú metszetet a carinán keresztül, valamint egy keresztmetszetet)
[Húgyvezeték]
[Húgycső]
Húgyhólyag
Méh
Célszervek
Minden makroszkopikus elváltozás és szövetszaporulat
43.
A tüdőt sértetlenül kell eltávolítani, le kell mérni, és a tüdő szerkezetének megőrzése érdekében megfelelő fixálószert kell belecsepegtetni 20–30 cm víznek megfelelő nyomáson (5). Mindegyik lebenyről metszetet kell készíteni egy szinten, beleértve a fő hörgőket, ugyanakkor tüdőátmosás alkalmazása esetén az át nem mosott lebenyről három szinten kell metszetet készíteni (nem sorozatos metszeteket).
44.
Az orr-garati szöveteket legalább 4 szinten kell vizsgálni, amelyek egyikének tartalmaznia kell az orr-garati csatornát (5) (6) (7) (8) (9), lehetővé téve a laphámsejtes, átmeneti (csillószőrrel nem borított légúti), légúti (csillószőrrel borított) és szaglóhámszövet, valamint az elvezető nyirokszövet (NALT) (10) (11) megfelelő vizsgálatát. A gégefőt három szinten kell vizsgálni, amelyek egyikének tartalmaznia kell a gégefedő alapját (12). A légcsövet legalább két szinten kell vizsgálni, beleértve egy hosszirányú metszetet az extrapulmonális hörgők elágazásánál lévő carinán keresztül, valamint egy keresztmetszetet.
KÓRSZÖVETTANI VIZSGÁLATOK
45.
A 2. táblázatban felsorolt összes szerv és szövet kórszövettani vizsgálatát el kell végezni a kontrollcsoportoknál és a magas koncentrációnak kitett csoportoknál, valamint a vizsgálat során elpusztult vagy elpusztított összes állatnál. Különös figyelmet kell fordítani a légzőrendszerre, a célszervekre, valamint a makroszkopikus elváltozásokra. Azon szerveket és szöveteket, amelyeken a magas koncentrációnak kitett csoportnál elváltozások figyelhetők meg, mindegyik csoportnál meg kell vizsgálni. A vizsgálatvezető a koncentráció-válasz összefüggés egyértelmű kimutatása érdekében dönthet úgy, hogy további csoportoknál is végezni kell kórszövettani értékelést. Kísérő (visszafordíthatóság vizsgálatára szolgáló) csoport alkalmazása esetén minden olyan szerv és szövet kórszövettani értékelését el kell végezni, amelynél a kezelt csoportok egyedei esetében elváltozások figyelhetők meg. Ha a magas koncentrációnak kitett csoportnál túlzott mértékű idő előtti elhullás vagy egyéb problémák veszélyeztetik az adatok szignifikanciáját, az eggyel alacsonyabb koncentrációra vonatkozóan kell kórszövettani vizsgálatot végezni. Meg kell kísérelni a makroszkopikus és mikroszkopikus megfigyelések közötti összefüggések feltárását.
ADATOK ÉS JEGYZŐKÖNYVEZÉS
Adatok
46.
Meg kell adni az egyes állatok testsúlyára, táplálékfelvételére, klinikai patológiai eredményeire, makroszkopikus boncolási eredményeire, szerveinek súlyára, valamint kórszövettani eredményeire vonatkozó adatokat. A klinikai megfigyelések adatait táblázatos formában össze kell foglalni, minden egyes vizsgált csoporthoz megadva a csoportban lévő állatok számát, a specifikus mérgezési tüneteket mutató, valamint a vizsgálat során elhullott vagy humánus okokból elpusztított állatok számát, az egyes állatok elhullásának időpontját, a toxikus hatások leírását, időbeli lefolyását és visszafordíthatóságát, valamint a boncolások eredményeit. Mind a számszerű, mind a járulékos eredményeket megfelelő statisztikai módszerrel kell kiértékelni. Bármilyen általánosan elfogadott statisztikai módszer alkalmazható, és a statisztikai módszereket a vizsgálat tervezésekor kell kiválasztani.
Vizsgálati jegyzőkönyv
47.
A vizsgálati jegyzőkönyvnek a következő információkat kell értelemszerűen tartalmaznia:
Kísérleti állatok és azok tartása
—
A ketrecben való tartás körülményei, beleértve a következőket: az állatok ketrecenkénti száma (vagy számának változása), az alom anyaga, környezeti hőmérséklet és relatív páratartalom, a megvilágítás időtartama, valamint a takarmány meghatározása.
—
A vizsgált faj/törzs, valamint a patkánytól eltérő faj alkalmazásának indokolása. Forrás- és múltbéli adatok is megadhatók, amennyiben azok hasonló expozíciós, tartási és koplaltatási körülmények között kitett állatokra vonatkoznak.
—
Az állatok száma, kora és neme.
—
A véletlen kiválasztás módszere.
—
A vizsgálat előtti esetleges kondicionálás leírása, beleértve a takarmányt, a karantént és a betegség kezelését.
Vizsgált vegyi anyag
—
Fizikai jelleg, tisztaság, valamint – ha lényeges – fizikai és kémiai tulajdonságok (beleértve az izomerizációt).
—
Azonosító adatok és – amennyiben ismert – a Vegyianyag Nyilvántartási Szolgálat szerinti nyilvántartási szám (CAS-szám).
Vivőanyag
—
A vivőanyag használatának, valamint kiválasztásának indokolása (ha a vivőanyag nem víz).
—
Múltbeli vagy párhuzamosan kapott adatok, amelyek igazolják, hogy a vivőanyag nem befolyásolja a vizsgálat eredményét.
Inhalációs kamra
—
Az inhalációs kamra részletes leírása, beleértve annak térfogatát és vázlatrajzát.
—
Az állatok expozíciójához és a légkör előállításához használt berendezések eredete és leírása.
—
A hőmérséklet, páratartalom, részecskeméret és tényleges koncentráció mérésére szolgáló berendezések.
—
A levegő forrása és a kondicionáló rendszer.
—
Az eszközök homogén vizsgálati légkör biztosítása érdekében történő kalibrálására alkalmazott módszerek.
—
Nyomáskülönbség (pozitív vagy negatív).
—
Expozíciós nyílások száma kamránként (csak orron keresztüli expozíció), az állatok helye a kamrában (egész testfelületen keresztüli expozíció).
—
A vizsgálati légkör stabilitása.
—
A hőmérséklet- és páratartalom-érzékelők, valamint a vizsgálati légkör mintavételének helye a kamrában.
—
A bevitt/elszívott levegő kezelése.
—
Légáramlási sebességek, légáramlási sebesség expozíciós nyílásonként (csak orron keresztüli expozíció), vagy az állatok terhelése kamránként (egész testfelületen keresztüli expozíció).
—
Az inhalációs kamra egyensúlyi állapotának eléréséhez szükséges idő (t95).
—
A térfogatváltozások óránkénti száma.
—
Mérőberendezések (ha vannak).
Expozíciós adatok
—
A fő vizsgálathoz kiválasztott célkoncentráció indokolása.
—
Névleges koncentrációk (az inhalációs kamrába való bejuttatásra előállított vizsgált vegyi anyag össztömege osztva a kamrán áthaladt levegő térfogatával).
—
A vizsgált vegyi anyagnak az állatok belégzési zónájából gyűjtött tényleges koncentrációi; a heterogén halmazállapotokat (gáz, gőz, aeroszol) felvevő keverékek esetén mindegyik külön elemezhető.
—
Minden levegőbeli koncentrációt tömegegységekben (mg/l, mg/m3 stb.), nem pedig térfogategységekben (ppm, ppb stb.) kell megadni.
—
Részecskeméret-eloszlás, tömegfelező aerodinamikai átmérő (MMAD), valamint geometriai szórás (σg), beleértve azok kiszámításának módját. Jegyzőkönyvezni kell az egyes részecskeméret-elemzéseket.
Vizsgálati körülmények
—
A vizsgált vegyi anyag előkészítésének részletei, beleértve a szilárd anyagok részecskeméretének csökkentésére vagy a vizsgált vegyi anyag oldatainak elkészítésére esetlegesen alkalmazott eljárások részleteit.
—
A vizsgálati légkör előállítására és az állatok vizsgálati légkörnek való kitételére alkalmazott berendezések leírása (lehetőség szerint vázlatrajzzal).
—
A kamrabeli hőmérséklet, páratartalom és légáramlás (azaz a kalibrációs görbe kialakulásának) megfigyelésére használt berendezések részletei.
—
A kamrabeli koncentráció és részecskeméret-eloszlás meghatározásához alkalmazott minták gyűjtésére használt berendezések részletei.
—
Az alkalmazott kémiai analitikai módszer és a módszer validációjának részletei (beleértve a vizsgált vegyi anyag mintavételi közegből való visszanyerésének hatásfokát).
—
Az állatok vizsgálati és kontrollcsoportokba való besorolásához alkalmazott véletlen kiválasztási módszer.
—
A táplálék és a víz minőségére vonatkozó adatok (ezen belül a takarmány típusa/eredete, a víz eredete).
—
A vizsgált koncentrációk kiválasztásának indokolása.
Eredmények
—
A kamrabeli hőmérséklet, páratartalom és légáramlás táblázatos összefoglalása.
—
A kamrabeli névleges és tényleges koncentráció adatainak táblázatos összefoglalása.
—
Részecskeméret-adatok táblázatos összefoglalása, beleértve az analitikai mintavételi adatokat, a részecskeméret-eloszlást, valamint az MMAD és a σg számításait.
—
A válaszadatok és a koncentrációszintek táblázatos összefoglalása minden egyes állatra vonatkozóan (azaz a mérgezési tüneteket mutató és köztük az elhullt állatok, a hatások jellege, súlyossága, megjelenésének időpontja és időtartama).
—
Az egyes állatok súlyának táblázatos összefoglalása.
—
A táplálékfelvétel táblázatos összefoglalása.
—
A klinikai patológiai adatok táblázatos összefoglalása.
—
A boncolások és adott esetben a kórszövettani vizsgálatok eredményei minden egyes állatra vonatkozóan.
Az eredmények szöveges értékelése és értelmezése
—
Különös hangsúlyt kell fektetni az e vizsgálati módszer feltételeinek – például a határkoncentrációnak vagy a részecskeméretnek – való megfelelés érdekében alkalmazott módszerek leírására.
—
Ki kell térni a részecskék belélegezhetőségére az általános megállapítások tükrében, különösen ha a részecskeméretre vonatkozó feltétel nem teljesült.
—
A vizsgálat általános értékelésének ismertetnie kell a névleges és a tényleges koncentrációk meghatározására használt módszerek konzisztenciáját, valamint a tényleges és a névleges koncentráció közötti összefüggést.
—
Ki kell térni az elhullás valószínű okára, valamint az elsődleges hatásmechanizmusra (szisztémás vagy helyi).
—
Magyarázatot kell szolgáltatni, amennyiben a humánus végpontokról szóló OECD-iránymutatás (3) szerinti kritériumok alapján humánus módon el kellett pusztítani a fájdalommal küszködő vagy súlyos és tartós szorongás jeleit mutató állatokat.
—
Meg kell jelölni a célszerve(ke)t.
—
Meg kell határozni a NOAEL és a LOAEL értékét.
SZAKIRODALOM
(1)
OECD (1981). Subchronic Inhalation Toxicity Testing, Original Test Guideline No 413, Environment Directorate, OECD, Paris.
(2)
OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paris.
(3)
OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation, Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris.
(4)
Whalan.E and Redden JC (1994). Interim Policy for Particle Size and Limit Concentration Issues in Inhalation Toxicity Studies. Office of Pesticide Programs, United States Environmental Protection Agency.
(5)
Dungworth DL, Tyler WS, Plopper CE (1985). Morphological Methods for Gross and Microscopic Pathology (Chapter 9) in Toxicology of Inhaled Material, Witschi, H.P. and Brain, J.D. (eds), Springer Verlag Heidelberg, pp. 229-258.
(6)
Young JT (1981). Histopathological examination of the rat nasal cavity. Fundam. Appéldául Toxicol. 1: 309-312.
(7)
Harkema JR (1990). Comparative pathology of the nasal mucosa in laboratory animals exposed to inhaled irritants. Environ. Health Perspect. 85: 231-238.
(8)
Woutersen RA, Garderen-Hoetmer A, van Slootweg PJ, Feron VJ (1994). Upper respiratory tract carcinogenesis in experimental animals and in humans. In: Waalkes MP and Ward JM (eds) Carcinogenesis. Target Organ Toxicology Series, Raven Press, New York, 215-263.
(9)
Mery S, Gross EA, Joyner DR, Godo M, Morgan KT (1994). Nasal diagrams: A tool for recording the distribution of nasal lesions in rats and mice. Toxicol. Pathol. 22: 353-372.
(10)
Kuper CF, Koornstra PJ, Hameleers DMH, Biewenga J, Spit BJ, Duijvestijn AM, Breda Vriesman van PJC, Sminia T (1992). The role of nasopharyngeal lymphoid tissue. Immunol. Today 13: 219-224.
(11)
Kuper CF, Arts JHE, Feron VJ (2003). Toxicity to nasal-associated lymphoid tissue. Toxicol. Lett. 140-141: 281-285.
(12)
Lewis DJ (1981). Mitotic Indices of Rat Laryngeal Epithelia. Journal of Anatomy 132(3): 419-428.
(13)
Az Európai Parlament és a Tanács 2008. december 16-i 1272/2008/EK rendelete az anyagok és keverékek osztályozásáról, címkézéséről és csomagolásáról, a 67/548/EGK és az 1999/45/EK irányelv módosításáról és hatályon kívül helyezéséről, valamint az 1907/2006/EK rendelet módosításáról, HL L 353., 2008.12.31., 1. o.
1. függelék
FOGALOMMEGHATÁROZÁS
Vizsgált vegyi anyag: A jelen vizsgálati módszer alkalmazásával vizsgált bármely anyag vagy keverék.
B.30. KRÓNIKUS TOXICITÁSI VIZSGÁLATOK
BEVEZETÉS
1.
A jelen vizsgálati módszer egyenértékű az OECD 452. vizsgálati iránymutatásában (2009) leírt módszerrel. Az eredeti 452. vizsgálati iránymutatást 1981-ben fogadták el. A jelen felülvizsgált B.30. vizsgálati módszer kidolgozását az állatjóllét és a szabályozási követelmények terén az elmúlt időszakban bekövetkezett változások figyelembevétele érdekében tartották szükségesnek (1) (2) (3) (4). E B.30. vizsgálati módszer frissítése e melléklet B.32., A rákkeltő hatás vizsgálata című és B.33., A krónikus toxicitás és a rákkeltő hatás együttes vizsgálata című fejezetének felülvizsgálatával párhuzamosan történt meg a vizsgálatban alkalmazott állatokra vonatkozó további információk megszerzése, valamint a dózis kiválasztásával kapcsolatos további részletek biztosítása céljából. A jelen vizsgálati módszer vegyi anyagok széles skálájának vizsgálatára szolgál, beleértve a növényvédő szereket és az ipari vegyszereket.
2.
A krónikus toxicitási vizsgálatok többségét rágcsálófajokon végzik, ezért a jelen vizsgálati módszer elsősorban az e fajokon végzett vizsgálatokra alkalmazandó. Amennyiben az ilyen vizsgálatokat rágcsálóktól eltérő fajokon kell elvégezni, a megfelelő módosításokkal a jelen vizsgálati módszerben vázolt elvek és eljárások is alkalmazhatók, az e melléklet B.27., 90 napos, ismételt adagolású orális toxicitási vizsgálat nem rágcsálókon című fejezetében (5) vázoltakkal együtt, a krónikus toxicitási vizsgálatok és a rákkeltő hatás meghatározására irányuló vizsgálatok tervezésére és elvégzésére vonatkozó 116. OECD-iránymutatásban leírtak szerint (6).
3.
A krónikus toxicitási vizsgálatok során alkalmazott három fő beadási mód az orális, a dermális és az inhalációs. A beadási mód kiválasztása függ a vizsgált vegyi anyag fizikai és kémiai tulajdonságaitól, valamint az emberi expozíció jellemző módjától. Az expozíciós mód kiválasztására vonatkozó további információk a 116. OECD-iránymutatásban találhatók (6).
4.
A jelen vizsgálati módszer az orális expozíciós módra összpontosít, amely a krónikus toxicitási vizsgálatok során a leggyakrabban alkalmazott mód. Az emberi egészségre jelentett kockázat értékeléséhez és/vagy bizonyos szabályozási rendszerek előírásai alapján dermális vagy inhalációs expozíciót alkalmazó, hosszú távú krónikus toxicitási vizsgálatok elvégzésére is szükség lehet ugyan, azonban technikai szempontból e két expozíciós mód mindegyike igen összetett. Az ilyen vizsgálatokat eseti alapon kell megtervezni, bár az itt ismertetett, a krónikus toxicitás orális beadás útján történő meghatározására és értékelésére szolgáló vizsgálati módszer a kezelési időszakokra, klinikai és patológiai paraméterekre stb. vonatkozó ajánlások tekintetében alapul szolgálhat az inhalációs és/vagy dermális vizsgálatokra vonatkozó protokollhoz. A vizsgált vegyi anyagok inhalációs (6) (7) és dermális (6) módon történő beadásával kapcsolatban OECD-iránymutatások állnak rendelkezésre. E melléklet B.8. (8) és B.29. fejezetét (9), valamint az akut inhalációs vizsgálatra vonatkozó OECD-iránymutatást (7) kifejezetten alkalmazni kell az inhalációs expozíciót alkalmazó, hosszabb távú vizsgálatok tervezése során. A dermális beadással végzett vizsgálatok esetében e melléklet B.9. fejezetét (10) kell alkalmazni.
5.
A krónikus toxicitási vizsgálat információt szolgáltat az ismételt, a vizsgált faj élettartamának jelentős részére kiterjedő expozícióból valószínűsíthetően fakadó egészségügyi kockázatokról. A vizsgálat információkkal szolgál a vizsgált vegyi anyag toxikus hatásairól, jelzi a célszerveket és a felhalmozódás lehetőségét. Becslést adhat továbbá az észlelhető káros hatással nem járó szintre is, amely felhasználható az emberi expozícióra vonatkozó biztonsági kritériumok meghatározásához. Hangsúlyos szerepet kap az állatok lehető legtöbb információ megszerzése érdekében történő körültekintő klinikai vizsgálatának szükségessége is.
6.
A jelen vizsgálati módszerben ismertetett vizsgálatok célkitűzései többek között a következők:
—
a vizsgált vegyi anyag krónikus toxicitásának meghatározása,
—
a célszervek meghatározása,
—
a dózis-válasz összefüggés jellemzőinek meghatározása,
—
a nem észlelhető káros hatás szintjének (NOAEL) vagy a benchmark-dózis (BMD) meghatározásához szükséges kiindulópontnak a meghatározása,
—
a krónikus toxicitás hatásainak előrejelzése az emberi expozíciós szintek vonatkozásában,
—
a hatásmechanizmusra vonatkozó hipotézisek vizsgálatához szükséges adatok biztosítása (6).
KIINDULÁSI MEGFONTOLÁSOK
7.
A vizsgált vegyi anyag toxikológiai jellemzőinek vizsgálata és értékelése során a vizsgálati laboratóriumnak a vizsgált vegyi anyagra vonatkozó összes rendelkezésre álló információt figyelembe kell vennie a vizsgálat megkezdését megelőzően annak érdekében, hogy a vizsgálati terv a vizsgált vegyi anyag lehetséges krónikus toxicitásának hatékonyabb vizsgálatára összpontosítson, valamint hogy az állatkísérleteket minimálisra csökkentsük. A vizsgálat megtervezését segítő információk többek között a vizsgált vegyi anyag azonossága, kémiai szerkezete, valamint fizikai és kémiai tulajdonságai, a hatásmechanizmusra vonatkozó bármely információ, bármely in vitro vagy in vivo toxicitási vizsgálat eredményei, a várható felhasználási terület(ek) és az emberi expozíció lehetősége, a szerkezetileg rokon vegyi anyagok rendelkezésre álló (Q)SAR- és toxikológiai adatai, a rendelkezésre álló toxikokinetikai adatok (egyszeri dózisra és adott esetben ismételt dózisra vonatkozó kinetikai adatok), valamint egyéb ismételt expozíciós vizsgálatokból származó adatok. A krónikus toxicitás meghatározása csak a toxicitásra vonatkozó, 28 napos vagy 90 napos ismételt dózisú toxicitási vizsgálatokból származó kezdeti információk megszerzését követően végzendő el. Az adott vizsgált vegyi anyag lehetséges egészségkárosító hatásai átfogó vizsgálatának részeként a krónikus toxicitás vizsgálatának fokozatos megközelítését kell megfontolni (11) (12) (13) (14).
8.
Az eredmények elemzése szempontjából legmegfelelőbb statisztikai módszereket az adott kísérleti tervre és célkitűzésekre tekintettel a vizsgálat kezdetét megelőzően kell meghatározni. A megfontolandó kérdések közé tartozik, hogy tartalmazzanak-e a statisztikák a túléléssel kapcsolatos kiigazítást, valamint egy vagy több csoport idő előtti megszüntetése esetén végzett elemzést. A megfelelő statisztikai elemzésekre vonatkozó útmutatást, továbbá a nemzetközileg elfogadott statisztikai módszerekre vonatkozó főbb hivatkozásokat a 116. iránymutatás (6), valamint a krónikus toxicitás és a rákkeltő hatás meghatározására irányuló vizsgálatok elemzésével és értékelésével kapcsolatos 35. iránymutatás (15) tartalmazza.
9.
A krónikus toxicitási vizsgálatok elvégzése során a klinikai tünetek mint a biztonsági értékeléshez használt kísérleti állatok humánus végpontjai felismeréséről, értékeléséről és használatáról szóló 19. OECD-iránymutatásban (16), különösen annak 62. bekezdésében ismertetett vezérelveket és szempontokat minden esetben követni kell. E bekezdés szerint: »Ha az ismételt adagolást alkalmazó vizsgálatok során egy állat progresszív, az állapot további romlásához vezető klinikai tüneteket mutat, tájékozott döntést kell hozni az állat humánus elpusztítására vonatkozóan. A döntéshozatal során mérlegelni kell az állat vizsgálatának folytatása révén szerezhető információk értékét az állat általános állapotához viszonyítva. Ha úgy döntünk, hogy az állatot továbbra is vizsgálni kell, a megfigyelések gyakoriságát szükség szerint növelni kell. Ha ez nem befolyásolja hátrányosan a vizsgálat céljának elérését, lehetséges az adagolás átmeneti szüneteltetése – ha ez csökkenti a fájdalmat vagy a szorongást – vagy a vizsgálati dózis csökkentése.«
10.
A krónikus toxicitás és a rákkeltő hatás meghatározására irányuló vizsgálatok során alkalmazott dózisok kiválasztásnak elveire vonatkozó részletes útmutatás és ezen elvek leírása a 116. iránymutatásban (6), valamint a Nemzetközi Élettudományi Intézet két kiadványában található (17) (18). A fő dózis-kiválasztási stratégia a vizsgálat elsődleges célkitűzésétől vagy célkitűzéseitől függ (6. bekezdés). A megfelelő dózisszintek kiválasztásakor egyensúlyt kell találni egyfelől a veszélyesség vizsgálata, másfelől az alacsony dózisra adott válaszok jellemzése és azok relevanciája között. Ez különösen lényeges a krónikus toxicitás és a rákkeltő hatás együttes vizsgálata (e melléklet B.33. fejezete) esetében (11. bekezdés).
11.
Meg kell fontolni a krónikus toxicitás és a rákkeltő hatás együttes vizsgálatának elvégzését (e melléklet B.33. fejezete) a krónikus toxicitási vizsgálat (a jelen B.30. vizsgálati módszer) és a rákkeltő hatás vizsgálatának (e melléklet B.32. fejezete) külön-külön történő elvégzése helyett. A két külön vizsgálat elvégzéséhez viszonyítva az együttes vizsgálat idő- és költséghatékonyabb anélkül, hogy befolyásolná az adatok minőségét a krónikus fázisban vagy a karcinogenitási fázisban. A krónikus toxicitás és a rákkeltő hatás együttes vizsgálata során (e melléklet B.33. fejezete) azonban körültekintően figyelembe kell venni a dóziskiválasztás elveit (9. és 20–25. bekezdés), továbbá azt is meg kell jegyezni, hogy bizonyos szabályozási keretrendszerek a vizsgálatok külön-külön történő elvégzését írhatják elő.
12.
A jelen vizsgálati módszer összefüggésében használt fogalmak meghatározása a jelen fejezet végén és a 116. iránymutatásban található (6).
A VIZSGÁLAT ELVE
13.
A vizsgált vegyi anyagot naponta adjuk be fokozatos dózisokban a kísérleti állatok több csoportjának, általában 12 hónapig, bár hosszabb és rövidebb időtartam is választható a szabályozási követelményektől függően (lásd a 33. bekezdést). A kiválasztott időtartamnak elég hosszúnak kell lennie ahhoz, hogy lehetővé tegye a kumulatív toxicitás esetleges hatásainak megjelenését a geriátriai változások zavaró hatásai nélkül. A 12 hónapos expozíciós időtartamtól való eltérést indokolni kell, különösen a rövidebb időtartamok esetében. A vizsgált vegyi anyagot általában orális úton juttatjuk be, azonban az inhalációs vagy dermális bejuttatással történő vizsgálat is megfelelő lehet. A vizsgálati terv egy vagy több időközi elpusztítást is tartalmazhat, például a 3. és a 6. hónapot követően, és állatok további csoportjai vonhatók be ennek kiegyenlítése érdekében (lásd a 19. bekezdést). Az anyag beadásának időszakában az állatokat a toxicitás jeleinek észlelése érdekében gondosan megfigyeljük. A vizsgálat során elpusztult vagy elpusztított állatokat felboncoljuk, továbbá a vizsgálat befejezése után az életben maradt állatokat is elpusztítjuk és felboncoljuk
A MÓDSZER LEÍRÁSA
Az állatfaj kiválasztása
14.
A jelen vizsgálati módszer elsősorban a krónikus toxicitás rágcsálókban történő vizsgálatával és értékelésével foglalkozik (lásd a 2. bekezdést), ugyanakkor tudatában kell lenni annak, hogy bizonyos szabályozási rendszerek hasonló vizsgálatok nem rágcsálókon történő elvégzését írhatják elő. A faj kiválasztását indokolni kell. A rágcsálóktól eltérő fajokon végzett krónikus toxicitási vizsgálatok tervezésének és elvégzésének adott esetben a jelen vizsgálati módszerben ismertetett elveken, valamint az e melléklet B.27., 90 napos, ismételt adagolású orális toxicitási vizsgálat nem rágcsálókon című fejezetében (5) leírtakon kell alapulnia. A faj és törzs kiválasztására vonatkozó további információk a 116. iránymutatásban találhatók (6).
15.
A jelen vizsgálati módszer szerint előnyben részesítendő rágcsálófaj a patkány, de más rágcsálófaj, például az egér is használható. A patkányok és az egerek a viszonylag rövid élettartamuk, gyógyszerészeti és toxikológiai vizsgálatokban elterjedt használatuk, a tumorindukcióra való fogékonyságuk, valamint a megfelelően jellemzett törzsek rendelkezésre állása miatt preferált kísérleti modellek. E tulajdonságok eredményeképpen nagy mennyiségű információ áll rendelkezésre fiziológiájukról és patológiájukról. Általánosan használt laboratóriumi törzsekből származó egészséges, fiatal, ivarérett állatokat kell alkalmazni. A krónikus toxicitás vizsgálatát olyan állatokon kell elvégezni, amelyek törzse és eredete megegyezik a rövidebb időtartamú előzetes toxicitási vizsgálat(ok)ban felhasznált állatokéval. Olyan nőstényeket kell választani, amelyek még egyszer sem ellettek, és nem vemhesek.
Tartási és etetési körülmények
16.
Az állatokat külön, vagy azonos nemű egyedekből álló kis csoportokban kell tartani; a külön történő tartást csak akkor kell fontolóra venni, ha az tudományos szempontból indokolt (19) (20) (21). A ketreceket úgy kell elrendezni, hogy minimálisra lehessen csökkenteni a ketrec elhelyezésének lehetséges hatásait. A kísérleti állatok tartására szolgáló helyiség hőmérséklete 22 °C (± 3 °C) kell, hogy legyen. Noha a helyiség relatív páratartalmának legalább 30 %-nak kell lennie, és – a takarítás időtartamától eltekintve – lehetőség szerint nem szabad meghaladnia a 70 %-ot, a célértéknek 50–60 % között kell lennie. A világítás legyen mesterséges, 12 órás világos és 12 órás sötét periódusok váltsák egymást. Az etetéshez hagyományos laboratóriumi takarmány alkalmazható, korlátlan mennyiségű ivóvíz biztosítása mellett. A takarmánynak meg kell felelnie a vizsgált faj összes tápanyagigényének, és a vizsgálat eredményét esetlegesen befolyásoló takarmány-szennyeződések mennyiségének – beleértve többek között a növényvédőszer-maradványokat, a perzisztens szerves szennyező anyagokat, a fitoösztrogéneket, a nehézfémeket és a mikotoxinokat – a lehető legalacsonyabbnak kell lennie. A tápanyagokban és takarmányokban lévő szennyező anyagok szintjére vonatkozó analitikai információkat időszakos jelleggel kell meghatározni, legalább a vizsgálat kezdetekor, valamint amikor változás következik be a felhasznált adagban, és ezeket az információkat a zárójelentésben közölni kell. A vizsgálat során felhasznált ivóvízre vonatkozó analitikai információkat hasonló módon kell megadni. A vizsgált vegyi anyag táplálékkal történő beadása esetén a takarmány megválasztását befolyásolhatja annak szükségessége, hogy az megfelelően keveredjen el a takarmánnyal és kielégítse az állatok táplálkozási igényeit.
Az állatok előkészítése
17.
A laboratóriumi körülményekhez legalább 7 napig szoktatott, egészséges állatokat kell használni, amelyek korábban nem voltak kitéve kísérleti eljárásoknak. Rágcsálók esetében az állatoknak történő adagolást az elválasztást és szoktatást követően a lehető leghamarabb, és lehetőleg az állatok 8 hetes kora előtt meg kell kezdeni. A kísérleti állatokat faj, törzs, eredet, nem, súly és életkor szerint kell jellemezni. A vizsgálat kezdetén az állatok súlya az egyes nemeken belül csak minimálisan térhet el egymástól, a vizsgálatban használt összes állat súlyának átlagos értékétől pedig legfeljebb ± 20 %-kal különbözhet mindkét nem esetében. Az állatokat véletlenszerűen kell besorolni a kontroll- és kezelt csoportokba. A véletlenszerű kiválasztást követően nem lehet lényeges különbség az egyes nemeken belül a csoportok átlagos testsúlya között. Ha statisztikailag szignifikáns különbségek fordulnak elő, a véletlenszerű kiválasztás lépését lehetőség szerint meg kell ismételni. Minden egyes állatnak egyedi azonosító számot kell kapnia, és minden egyes állatot maradandóan meg kell jelölni ezzel a számmal tetoválás, mikrochip-beültetés vagy más megfelelő módszer segítségével.
ELJÁRÁS
Az állatok száma és neme
18.
A vizsgálathoz mindkét nemet fel kell használni. Megfelelő számú állatot kell használni, hogy a vizsgálat végén mindegyik csoportban elegendő állat álljon rendelkezésre az alapos biológiai és statisztikai értékeléshez. Rágcsálók esetén az egyes dózisszintekhez általában nemenként és csoportonként legalább 20 állat, nem rágcsálók esetén pedig nemenként és csoportonként legalább 4 állat javasolt. Az egerekkel végzett vizsgálatok esetében további állatok bevonása lehet szükséges minden egyes dóziscsoportban az összes előírt hematológiai meghatározás elvégzése céljából.
Időközi elpusztításra, kísérő csoportokra és jelzőállatokra vonatkozó rendelkezések
19.
Amennyiben ez tudományos szempontból indokolt, a vizsgálat a toxikológiai változások alakulására vonatkozó és mechanisztikai információk megszerzése céljából előírhatja az időközi elpusztítást (legalább 10 állat/nem/csoport esetén), például a 6. hónapban. Abban az esetben, ha ilyen információk a vizsgált vegyi anyaggal végzett korábbi, ismételt adagolású toxicitási vizsgálatokból már rendelkezésre állnak, az időközi elpusztítás tudományos szempontból nem feltétlenül indokolt. Kísérő csoportok is bevonhatók a vizsgált vegyi anyag által esetlegesen okozott toxikológiai változások visszafordíthatóságának megfigyelése céljából; ezek vizsgálata általában a vizsgálat legnagyobb dózisával való kezelésre és kontrollvizsgálatra korlátozódik. Szükség szerint egy jelzőállatokból álló további (jellemzően nemenként 5 állatból álló) csoport is bevonható a betegség állapotának a vizsgálat közben történő megfigyelése céljából (22). Ha időközi elpusztítás vagy kísérő, illetve jelzőcsoportok alkalmazását tervezzük, az állatok vizsgálati tervben szereplő létszámát annyival kell megnövelni, ahány állatot a vizsgálat befejezése előtt el szándékozunk pusztítani. Ezeket az állatokat általában ugyanazoknak a megfigyeléseknek kell alávetni, mint a fő vizsgálat krónikus toxicitási fázisában vizsgált állatokat, beleértve a testsúlyra, táplálék-/vízfogyasztásra, hematológiára és klinikai kémiára vonatkozó méréseket, valamint patológiai vizsgálatokat, de előírható (az időközi elpusztítás céljából bevont csoportoknál), hogy a mérések csak bizonyos főbb paraméterekre, például a neurotoxicitásra vagy az immuntoxicitásra korlátozódjanak.
Dóziscsoportok és adagolás
20.
A dózis kiválasztásának és a dózisszintek felosztásának összes szempontjára vonatkozó útmutatás a 116. iránymutatásban (6) található. Legalább három dózisszintet és egy ezzel párhuzamos kontrollt kell alkalmazni, kivéve, ha határérték-vizsgálatot végzünk (lásd a 27. bekezdést). A dózisszintek megválasztása általában a rövidebb távú ismételt adagolású vagy tartománybehatároló vizsgálatok eredményein alapul, figyelembe véve a vizsgált vegyi anyagra vagy rokon vegyi anyagokra vonatkozóan rendelkezésre álló bármilyen toxikológiai és toxikokinetikai adatot.
21.
Ha a vizsgált vegyi anyag fizikai és kémiai jellege vagy biológiai hatásai nem szabnak ennek korlátot, a legmagasabb dózisszintet általában olyan módon kell kiválasztani, hogy az alkalmas legyen az elsődleges célszervek és toxikus hatások meghatározására, ugyanakkor elkerülhető legyen a szenvedés, a súlyos toxicitás, a morbiditás vagy az elhullás. A 22. bekezdésben bemutatott tényezők figyelembevétele mellett a legmagasabb dózisszintet úgy kell megválasztani, hogy toxicitást váltson ki, amely például a testsúly növekedésének (körülbelül 10 %-os) visszaesésével bizonyítható.
22.
A vizsgálat célkitűzéseitől függően azonban (lásd a 6. bekezdést) a toxicitást bizonyíthatóan kiváltó dózisnál alacsonyabb maximális dózis is választható, például ha egy dózis káros hatást idéz elő, amely azonban csak kismértékben befolyásolja az élettartamot vagy a testsúlyt. A maximális dózis nem haladhatja meg az 1 000 mg/testsúlykilogramm/nap értéket (határdózis, lásd a 27. bekezdést).
23.
A dózisszintek és azok felosztása megválasztható úgy, hogy meghatározható legyen a dózis-válasz összefüggés és a NOAEL, vagy a vizsgálat egyéb tervezett kimenetele, például a legalacsonyabb dózisszinten megfigyelhető BMD (lásd a 25. bekezdést). Az alacsonyabb dózis kiválasztása során figyelembe veendő tényezők többek között a dózis-válasz görbe várható meredeksége, azok a dózisok, amelyeknél fontos változások következhetnek be a metabolizmusban vagy a toxikus hatás mechanizmusában, amelyeknél küszöbérték várható, vagy amelyeknél az alacsony dózis extrapolálásához használható kiindulási pont várható.
24.
A dózisszintek felosztásának kiválasztása függ a vizsgált vegyi anyag jellemzőitől, és nem írható elő a jelen vizsgálati módszerben, ugyanakkor csökkenő dózisszintek meghatározásához gyakran optimális a 2–4-szeres intervallumok alkalmazása, az adagolások közötti nagyon nagy intervallumok (például körülbelül 6–10-nél magasabb szorzófaktor) alkalmazásával szemben pedig gyakran előnyben részesítendő egy negyedik vizsgálati csoport beiktatása. A 10-nél magasabb szorzófaktorokat általában kerülni kell, és használatukat meg kell indokolni.
25.
A 116. iránymutatásban (6) részletesebben leírtak szerint a dózis kiválasztásakor figyelembe veendő szempontok többek között a következők:
—
ismert vagy feltételezett nemlinearitások vagy elhajlási pontok a dózis-válasz görbén,
—
toxikokinetika, valamint azok a dózistartományok, amelyek esetében a metabolikus indukció, a telítettség vagy a külső és belső dózisok közötti nemlinearitás előfordul, vagy nem fordul elő,
—
prekurzor elváltozások, hatásmarkerek vagy a főbb mögöttes biológiai folyamatok működésének mutatói,
—
A hatásmechanizmus főbb (vagy feltételezett) aspektusai, például azok a dózisok, amelyeknél megjelenik a citotoxicitás, felborulnak a hormonszintek és a homeoszatikus mechanizmusok stb.,
—
A dózis-válasz görbe azon területei, ahol különösen pontos becslés szükséges, például a várt BMD vagy egy feltétezett küszöbérték tartományában,
—
a várható humán expozíciós szintek figyelembevétele.
26.
Kontrollcsoportként egy kezeletlen csoport, vagy ha a vizsgált vegyi anyag beadásához vivőanyagot használunk, egy vivőanyaggal kezelt kontrollcsoport alkalmazandó. A kontrollcsoportba tartozó állatokat a vizsgált vegyi anyag beadásától eltekintve ugyanolyan módon kell kezelni, mint a vizsgálati csoportokban lévőket. Vivőanyag alkalmazása esetén a kontrollcsoportban a vivőanyagot a dóziscsoportokban alkalmazott legnagyobb mennyiségben kell beadni. Ha a vizsgált vegyi anyagot a táplálékkal adjuk be, és emiatt a táplálékfogyasztás a táplálék lecsökkent ízletessége miatt jelentősen csökken, hasznos lehet egy párban etetett kontrollcsoport alkalmazása a megfelelőbb kontroll biztosítása érdekében.
27.
Ha előzetes vizsgálatokból származó információk alapján előre jelezhető, hogy az egyetlen, legalább 1 000 mg/testsúlykilogramm/nap dózisnak megfelelő dózisszinttel, az e vizsgálathoz leírt eljárásokat követve végzett vizsgálat valószínűleg nem okoz kedvezőtlen hatásokat, valamint a szerkezetileg rokon vegyi anyagokra vonatkozó adatok alapján nem várható a toxicitás bekövetkezése, akkor a teljes, három adagolási szintet átfogó vizsgálat elvégzése nem feltétlenül szükséges. 1 000 mg/testsúlykilogramm/nap határadag alkalmazható, kivéve, ha a humán expozíció magasabb dózisszint használatát indokolja.
A dózisok előkészítése és a vizsgált vegyi anyag beadása
28.
A vizsgált vegyi anyagot általában orálisan, a takarmánnyal vagy az ivóvízzel, vagy gyomorszonda segítségével adjuk be. A bejuttatás útvonalára és módjára vonatkozó további információk a 116. iránymutatásban találhatók (6). A bejuttatás útvonala és módja függ a vizsgálat céljától, a vizsgált vegyi anyag fizikai/kémiai tulajdonságaitól, biológiai hozzáférhetőségétől, valamint az emberi expozíció meghatározó útvonalától és módjától. A bejuttatás útvonalának és módjának kiválasztását indokolni kell. Állatjóléti okokból gyomorszonda rendszerint csak olyan hatóanyagoknál alkalmazandó, amelyek esetében a bejuttatásnak ez az útvonala és módja ésszerűen tükrözi a lehetséges humán expozíciót (például gyógyszerek esetében). A táplálékban vagy környezetben előforduló vegyi anyagok, többek között a növényvédő szerek esetében a beadás jellemzően a táplálékon vagy az ivóvízen keresztül történik. Néhány forgatókönyv, például a munkahelyi expozíció esetében ugyanakkor a beadás egyéb útvonalai megfelelőbbnek bizonyulhatnak.
29.
A vizsgált vegyi anyagot szükség esetén feloldjuk vagy szuszpendáljuk alkalmas vivőanyagban. Adott esetben figyelembe kell venni a vivőanyag és más adalékanyagok következő tulajdonságait: a vizsgált vegyi anyag felszívódására, eloszlására, metabolizmusára vagy visszamaradására gyakorolt hatások, a vizsgált vegyi anyag kémiai tulajdonságaira gyakorolt azon hatások, amelyek módosíthatják annak toxikus jellemzőit, valamint az állatok táplálék- és vízfogyasztására vagy tápláltsági állapotára gyakorolt hatások. Lehetőség szerint elsősorban vizes oldatot/szuszpenziót ajánlatos alkalmazni, másodsorban olajos (például kukoricacsíra-olajban elkészített) oldatot vagy emulziót, és csak harmadsorban más vivőanyagokban elkészített oldatot. A víztől eltérő vivőanyagok esetében ismerni kell a vivőanyag toxikológiai tulajdonságait. A vizsgált vegyi anyag beadási körülmények közötti (például takarmánnyal történő beadás során fennálló) stabilitására és (adott esetben) a beadáshoz használt oldatok vagy takarmányok homogenitására vonatkozó információknak rendelkezésre kell állniuk.
30.
A takarmánnyal vagy ivóvízzel adagolt vegyi anyagok esetében fontos biztosítani, hogy a vizsgált vegyi anyag beadott mennyisége ne zavarja meg a szokásos táplálékfelvételt vagy a vízháztartás egyensúlyát. A takarmánnyal történő beadást alkalmazó hosszú távú toxicitási vizsgálatok esetében a takarmányban lévő vizsgált vegyi anyag koncentrációja a kiegyensúlyozatlan táplálkozás elkerülése érdekében általában nem haladhatja meg a teljes takarmány 5 %-át. Ha a vizsgált vegyi anyagot a takarmányba keverve adjuk be, akkor vagy állandó takarmánykoncentráció (mg/takarmánykilogramm vagy ppm), vagy az állatok testsúlyára heti rendszerességgel kiszámított állandó dózisszint (mg/testsúlykilogramm) alkalmazható. A kiválasztott alternatívát meg kell nevezni.
31.
Orális úton történő beadás esetén a vizsgált vegyi anyagot naponta kell az állatoknak beadni (heti hét napon keresztül) általában 12 hónapon át (lásd még a 33. bekezdést), bár a szabályozási követelményektől függően hosszabb időtartam is szükséges lehet. Bármely más adagolási rendszer – például heti öt napon történő beadás – használatát indokolni kell. Dermális úton történő beadás esetén az állatokat az e melléklet B.9. fejezetében (10) meghatározottak szerint általában legalább napi 6 órán keresztül, heti 7 napon kell a vizsgált vegyi anyaggal kezelni 12 hónapon át. Az inhaláció útján történő expozíciót napi 6 órán keresztül, heti 7 nap kell elvégezni, de indokolt esetben heti 5 napos expozíció is alkalmazható. Az expozíció időtartama általában 12 hónap. Patkányoktól eltérő rágcsálófajok csak orron át történő expozíciója esetén az expozíció maximális időtartama kiigazítható a fajspecifikus szorongás minimalizálása érdekében. A napi 6 óránál rövidebb expozíciós időtartam alkalmazását indokolni kell. Lásd még e melléklet B.8. fejezetét (8).
32.
Ha a vizsgált vegyi anyagot szondán át adagoljuk, a dózist mindig a nap hasonló időszakában, gyomorszondán vagy megfelelő intubációs kanülön át kell beadni az állatoknak. Általában egyetlen dózist kell beadni naponta egyszer; abban az esetben, ha a vegyi anyag például helyi irritációt okoz, a napi dózisarány fenntartható lehet elosztott (napi kétszeri) beadással. Az egy alkalommal beadható folyadék maximális mennyisége a kísérleti állat méretétől függ. A mennyiséget a lehető legalacsonyabb szinten kell tartani, és rágcsálók esetében általában nem haladhatja meg az 1 ml/100 testsúlygramm térfogatot (22). A koncentráció megfelelő beállításával a minimálisra kell csökkenteni a vizsgált anyag mennyiségének változásait, hogy valamennyi dózisszinten konstans mennyiséget lehessen adagolni. A fentiek alól kivételt jelentenek az esetlegesen maró vagy irritatív hatást kiváltó anyagok, amelyeket hígítani kell a súlyos helyi hatások elkerülése érdekében. Kerülni kell az emésztőrendszerben valószínűsíthetően maró vagy irritatív hatást kiváltó koncentrációkkal történő vizsgálatokat.
A vizsgálat időtartama
33.
A jelen vizsgálati módszert ugyan elsődlegesen 12 hónapos krónikus toxicitási vizsgálatként dolgozták ki, a vizsgálati terv azonban az adott szabályozási rendszer követelményeitől vagy bizonyos mechanisztikai céloktól függően lehetővé teszi a rövidebb (például 6 vagy 9 hónapos) vagy hosszabb (például 18 vagy 24 hónapos) időtartamú vizsgálatokat, illetve alkalmazható ilyen időtartamú vizsgálatok során is. A 12 hónapos expozíciós időtartamtól való eltérést indokolni kell, különösen a rövidebb időtartamok esetében. A vizsgált vegyi anyag által esetlegesen okozott toxikológiai változások visszafordíthatóságának megfigyelése céljából bevont kísérő csoportokat az expozíció megszüntetését követően legalább 4 hétig, de legfeljebb a vizsgálat teljes időtartamának egyharmadáig fenn kell tartani adagolás nélkül. További, többek között a vizsgálat során életben maradt állatok figyelembevételével kapcsolatos útmutatás a 116. iránymutatásban (6) található.
MEGFIGYELÉSEK
34.
Rendszerint a nap elején és végén – beleértve a hétvégéket és az ünnepnapokat is – az összes állatot meg kell vizsgálni, hogy nem mutatja-e megbetegedés jeleit vagy nem hullott-e el. Általános klinikai megfigyelést naponta legalább egyszer kell végezni, lehetőleg minden nap ugyanazon időpont(ok)ban, szondával történő adagolás esetén figyelembe véve az adagolást követően várható hatások érvényesülésének csúcsidőszakát.
35.
Az első expozíció előtt legalább egyszer (az egyedek közötti összehasonlítás érdekében), a vizsgálat első hetének végén, azt követően pedig havonta egyszer az összes állatot részletes klinikai megfigyeléseknek kell alávetni. A megfigyelési protokollt úgy kell kialakítani, hogy az egyes megfigyelők közötti különbségek minimálisak legyenek, és függetlenek legyenek a vizsgált csoportoktól. E megfigyeléseket az állatok tartására egyébként használt ketreceken kívül, lehetőleg egy szabványos karámban, minden alkalommal a nap hasonló időszakában kell elvégezni. A megfigyeléseket gondosan fel kell jegyezni, lehetőleg a vizsgálatokat végző laboratórium által kifejezetten meghatározott pontozásos rendszer segítségével. Törekedni kell arra, hogy a megfigyelési körülmények közötti különbségek minimálisak legyenek. A feljegyzett észleléseknek ki kell terjedniük többek között a bőr, a szőrzet, a szemek és a nyálkahártyák állapota, a váladékok és kiválasztott anyagok előfordulása, valamint az autonóm aktivitás (például könnyezés, szőrzet felborzolódása, pupillaméret, valamint szokatlan légzési ritmusok) tekintetében megfigyelhető változásokra. A járás, a testtartás és a kézbevételre adott reakció megváltozását, valamint a klónusos vagy tónusos görcsök, sztereotip viselkedés (például túlzott mosdás, megkergülés) vagy bármilyen bizarr viselkedésmód (például öncsonkítás, hátrafelé járás) megfigyelt eseteit is fel kell jegyezni (24).
36.
A vizsgált vegyi anyag első beadását szemtükörrel vagy más, megfelelő eszközzel végzett szemészeti vizsgálat előzi meg, amelyet az összes állaton el kell végezni. E vizsgálatot a vizsgálatsorozat végén meg kell ismételni, lehetőleg az összes állaton, de legalább a magas dózissal kezelt és kontrollcsoportok tagjain. Ha a szemben a kezeléssel összefüggő elváltozást tapasztalunk, az összes állatot meg kell vizsgálni. Ha szerkezeti elemzés vagy egyéb információ szemtoxicitásra utal, a szemvizsgálatot gyakrabban kell elvégezni.
37.
Az olyan vegyi anyagok esetében, amelyeknél a korábbi, ismételt adagolású, 28 napos és/vagy 90 napos toxicitási vizsgálatok lehetséges neurotoxikus hatásokat jeleztek, a vizsgálat megkezdését megelőzően, valamint a vizsgálat kezdetét követő 12. hónap végéig 3 hónapos időközönként, továbbá a vizsgálat végén (ha az tovább tart 12 hónapnál) elvégezhető a különböző típusú ingerekre (24) (például hallószervi, vizuális, önérzékelési ingerek) mutatott érzékszervi reakciók vizsgálata (25), (26), (27), a szorítás erejének értékelése (28) és a motoros aktivitás felmérése (29). A követendő eljárásokkal kapcsolatban további részletek a vonatkozó szakirodalomban találhatók. Ettől függetlenül a hivatkozottaktól eltérő alternatív eljárások is alkalmazhatók.
38.
Az olyan vegyi anyagok esetében, amelyeknél a korábbi, ismételt adagolású, 28 napos és/vagy 90 napos toxicitási vizsgálatok lehetséges immuntoxikus hatásokat jeleztek, e végpont további vizsgálatát lehet végezni a vizsgálat végén.
Testsúly, táplálék-/vízfogyasztás és táplálékhasznosítási képesség
39.
A kezelés kezdetekor, az első 13 hét során legalább hetente egyszer, ezután pedig legalább havonta egyszer meg kell mérni az összes állat testsúlyát. A táplálékfogyasztást és a táplálékhasznosítási képességet a vizsgálat első 13 hetében legalább hetente, azt követően pedig legalább havonta egyszer kell mérni. Ha a vizsgált vegyi anyagot ivóvízzel adjuk be, a vízfogyasztást a vizsgálat első 13 hetében legalább hetente, azt követően pedig legalább havonta egyszer kell mérni. A vízfogyasztás mérését olyan vizsgálatok esetében is fontolóra kell venni, amelyek során az ivási szokások megváltoznak.
Hematológiai és klinikai biokémiai vizsgálatok
40.
A rágcsálókon végzett vizsgálatok esetében csoportonként legalább 10 hím és 10 nőstény állaton hematológiai vizsgálatokat kell végezni a 3., 6. és 12. hónapban, valamint a vizsgálat végén (ha az hosszabb, mint 12 hónap), mindegyikhez ugyanazokat az állatokat használva. Az egereken végzett vizsgálatok esetében kísérő csoportra lehet szükség az összes előírt hematológiai vizsgálat elvégzése céljából (lásd a 18. bekezdést). A nem rágcsálókon végzett vizsgálatok esetében kisebb számú (kutyákon végzett kísérleteknél például nemenként 4) állattól kell mintát venni köztes mintavételi időpontokban, valamint a vizsgálat végén, a rágcsálók esetében leírtak szerint. Ha a korábbi, hasonló dózisszintekkel elvégzett 90 napos vizsgálatok nem mutattak változást a hematológiai paraméterek vonatkozásában, a vizsgálat 3. hónapjában nem szükséges méréseket végezni, rágcsálók és egyéb fajok esetében sem. Vérmintákat meghatározott helyről kell venni, például a szívből vagy a szemgolyó mögötti üregből altatás alatt.
41.
Az alábbi paramétereket kell vizsgálni (30): teljes és differenciált leukocitaszám, eritrocitaszám, trombocitaszám, hemoglobinkoncentráció, hematokrit (vérsejtsüllyedés), átlagos sejttérfogat (MCV), eritrociták átlagos hemoglobintartalma (MCH), eritrociták átlagos hemoglobinkoncentrációja (MCHC), prothrombin idő, valamint aktivált parciális tromboplasztin idő. A vizsgált vegyi anyag toxicitásától függően szükség szerint egyéb hematológiai paramétereket, például Heinz-testeket vagy egyéb atipikus eritrocitamorfológiát vagy methemoglobint is lehet mérni. Általánosságban elmondható, hogy rugalmas megközelítés alkalmazandó, amely az adott vizsgált vegyi anyag megfigyelt és/vagy várható hatásaitól egyaránt függ. Ha a vizsgált vegyi anyag a vérképző rendszerre hat, a retikulocitaszám és a csontvelőcitológia is feltüntethető, habár ezek vizsgálatát nem szükséges rutinszerűen elvégezni.
42.
A szövetekben jelentkező fontosabb toxikus hatások és különösen a vesékre és a májra gyakorolt hatás vizsgálata érdekében a klinikai biokémiai értékek meghatározását legalább 10 hím és 10 nőstény állattól vett vérmintákból kell elvégezni a hematológiai vizsgálatokhoz meghatározott időközönként, minden esetben ugyanazokat az állatokat használva. Az egereken végzett vizsgálatok esetében kísérő csoportra lehet szükség az összes előírt klinikai biokémiai vizsgálat elvégzése céljából. A nem rágcsálókon végzett vizsgálatok esetében kisebb számú (kutyákon végzett kísérleteknél például nemenként 4) állattól kell mintát venni köztes mintavételi időpontokban, valamint a vizsgálat végén, a rágcsálók esetében leírtak szerint. Ha a korábbi, hasonló dózisszintekkel elvégzett 90 napos vizsgálatok nem mutattak változást a klinikai biokémiai paraméterek vonatkozásában, a vizsgálat 3. hónapjában nem szükséges méréseket végezni, rágcsálók és egyéb fajok esetében sem. A vérvétel előtti éjszaka javasolt az állatokat koplaltatni (kivéve egerek esetében). A következő paramétereket kell vizsgálni (30): glükóz, karbamid (karbamid-nitrogén), kreatinin, teljes fehérje, albumin, kalcium, nátrium, kálium, teljes koleszterin, legalább két értékelhető minta a májsejtek értékeléséhez (alanin-aminotranszferáz, aszpartát-aminotranszferáz, glutamát-dehidrogenáz, teljes epesav) (31), valamint legalább két értékelhető minta a máj és az eperendszer értékeléséhez (alkáli foszfatáz, gamma-glutamil-transzpeptidáz, 5’-nukleotidáz, teljes bilirubin, teljes epesav) (31). A vizsgált vegyi anyag toxicitásától függően szükség szerint más klinikai kémiai paraméterek, például az éhgyomorra mért trigliceridek, bizonyos hormonok és a kolinészterázszint mérése is elvégezhető. Általánosságban elmondható, hogy rugalmas megközelítés alkalmazandó, amely az adott vizsgált vegyi anyag megfigyelt és/vagy várható hatásaitól egyaránt függ.
43.
Vizeletelemzést legalább 10 hím és 10 nőstény állaton kell végezni a hematológiai és klinikai kémiai vizsgálatokhoz meghatározott időközönként levett mintákon. Ha a korábbi, hasonló dózisszintekkel elvégzett 90 napos vizsgálatok nem mutattak változást a vizeletelemzés vonatkozásában, a vizsgálat 3. hónapjában nem szükséges méréseket végezni. A klinikai patológiai vizsgálatra vonatkozó szakértői ajánlás a következő vizsgálandó paramétereket tartalmazza (30): küllem, mennyiség, ozmolalitás vagy fajsúly, pH-érték, összes fehérje, valamint glükóz. Az egyéb mérések közé tartozik a keton, az urobilinogén, a bilirubin és a vizeletben jelen lévő vér vizsgálata. Szükség szerint további paraméterek vizsgálatát is be lehet vezetni a megfigyelt hatás(ok) vizsgálati körének bővítése érdekében.
44.
Általánosan elfogadott, hogy kutyákon végzett vizsgálatok esetében a kezelés előtt kiinduló hematológiai és klinikai biokémiai változókra van szükség, rágcsálok vizsgálatánál azonban ez nem szükséges (30). Ha azonban a rendelkezésre álló kiinduló adatok (lásd az 50. bekezdést) nem bizonyulnak elegendőnek, megfontolandó ezen adatok meghatározása.
Patológia
Autopszia
45.
Általában a vizsgálatokba bevont összes állatot teljes körű, beható autopsziának kell alávetni, ideértve a következők alapos vizsgálatát: a test külső felszíne, az összes testnyílás, a koponya, a mellüreg, a hasüreg és ezek tartalma. Előírható ugyanakkor (az időközi elpusztítás céljából bevont vagy kísérő csoportoknál), hogy a mérések csak bizonyos főbb paraméterekre, például a neurotoxicitásra vagy immuntoxicitásra korlátozódjanak (lásd a 19. bekezdést). Ezeket az állatokat nem kell alávetni boncolásnak és az azt követő, a következő bekezdésekben ismertetett eljárásoknak. A jelzőállatok esetében a vizsgálatvezető döntésétől függően eseti alapú boncolásra lehet szükség.
46.
A 45. bekezdés utóbbi részében kivételként megjelölt állatokéin kívül az összes állat szerveinek súlyát meg kell mérni. Az összes állat (eltekintve az elhullásközeli állapotban lévő és/vagy a vizsgálat befejeztét megelőzően elpusztított egyedektől) mellékveséit, agyát, mellékheréit, szívét, veséit, máját, petefészkeit, lépét, heréit, pajzsmirigyét (amelyet fixálás után mérünk meg a mellékpajzsmirigyekkel együtt) és méhét megfelelően meg kell tisztítani minden rátapadt szövettől, és azok nedves súlyát a boncolást követően a lehető legrövidebb időn belül meg kell mérni, mielőtt azok kiszáradnának. Egereken végzett vizsgálat esetén a mellékvese megmérése nem kötelező.
47.
Az alábbi szöveteket a szövet típusa és a később elvégezni kívánt kórszövettani vizsgálat szempontjából legmegfelelőbb fixálóanyaggal kell tartósítani (32) (a szögletes zárójelben megadott szövetek megőrzése nem kötelező):
minden makroszkopikus elváltozás
szív
hasnyálmirigy
gyomor (előgyomor, mirigygyomor)
mellékvese
csípőbél
mellékpajzsmirigy
[fogazat]
aorta
éhbél
perifériás idegek
here
agy (beleértve a nagyagy, a kisagy és a nyúltvelő/nyúltagyi híd metszeteit)
vese
agyalapi mirigy
csecsemőmirigy
vakbél
könnymirigy (szemüregen kívüli)
prosztata
pajzsmirigy
méhnyak
máj
végbél
[nyelv]
koaguláló mirigy
tüdő
nyálmirigy
légcső
vastagbél
nyirokcsomók (felszíni és mély)
ondóhólyag
húgyhólyag
patkóbél
emlőmirigy (nőstényeknél kötelező, hímeknél csak ha láthatóan kimetszhető)
harántcsíkolt izom
méh (beleértve a méhnyakat)
mellékhere
[felső légutak, beleértve az orrot, az orrkagylókat és az orrmelléküregeket]
bőr
[húgyvezeték]
szem (beleértve a retinát)
nyelőcső
gerincvelő (három szinten: nyaki, mellkasi középső és ágyéki szakasz)
[húgycső]
[combcsont az ízületi felülettel együtt]
[szaglógumó]
lép
hüvely
epehólyag (patkánytól eltérő fajoknál)
petefészek
[szegycsont]
metszet a csontvelőből és/vagy egy friss, csontvelőből felszívott minta
Harder-mirigy
Páros szervek, például vesék, mellékvesék esetében mind a két szervet tartósítani kell. A klinikai és más jellegű megfigyelések alapján további testszövetek vizsgálata is szükséges lehet. A fentieken túl meg kell őrizni minden olyan más szervet is, amely a vizsgált vegyi anyag ismert tulajdonságai alapján valószínűleg célszervnek tekinthető. A dermális úton történő bejuttatást alkalmazó vizsgálatok esetében az orális módon történő beadásnál felsorolt szerveket kell tartósítani, továbbá elengedhetetlen a bőrből történő mintavétel a beadás helyéről és e minta tartósítása. Inhalációs vizsgálatok esetében a légzőrendszerből származó tartósított és vizsgált szövetek felsorolásának követnie kell az e melléklet B.8. (8) és B.29. fejezetében (9) tett ajánlásokat. Egyéb szervek/szövetek esetében (valamint a légzőrendszerből származó tartósított szöveteken túl) az orális úton történő beadásnál felsorolt szerveket kell vizsgálni.
Kórszövettani vizsgálatok
48.
A toxikológiai patológiai vizsgálatok elvégzésének legjobb gyakorlatára vonatkozóan iránymutatás áll rendelkezésre (32). Legalább a következő szöveteket kell kórszövettani vizsgálatnak alávetni:
—
a magas dózissal kezelt csoportból és a kontrollcsoportokból származó összes szövet,
—
a vizsgálat során elpusztult vagy elpusztított állatokból származó összes szövet,
—
a makroszkopikus rendellenességeket mutató összes szövet,
—
a célszöveteket, vagy azon szöveteket, amelyek a legnagyobb dózissal kezelt csoportnál a kezelésnek tulajdonítható elváltozásokat mutatnak, az összes többi dóziscsoport összes állatánál meg kell vizsgálni,
—
páros szervek, például vesék, mellékvesék esetében mind a két szervet vizsgálni kell.
ADATOK ÉS JEGYZŐKÖNYVEZÉS
Adatok
49.
Az összes értékelt paraméterre vonatkozó adatokat minden egyes állat esetében rögzíteni kell. Ezenfelül az összes adatot táblázat formájában összegezni kell, a vizsgált állatok minden csoportja tekintetében bemutatva, hogy hány egyeddel indult a vizsgálat, hány állat pusztult el, illetve hányat kellett elpusztítani humánus okokból a vizsgálat során, valamint az elpusztulás vagy humánus okokból való elpusztítás időpontját, a toxicitás jeleit mutató állatok számát, a megfigyelt toxicitási tünetek leírását, ideértve bármely toxikus hatás kezdetének idejét, időtartamát és súlyosságát, az elváltozásokat mutató állatok számát, az elváltozások típusát és az egyes elváltozástípusokat mutató állatok százalékos arányát. Az összegző adattáblázatoknak tartalmazniuk kell a toxikus hatásokat vagy elváltozásokat mutató állatokra vonatkozó átlagértékeket és szórásokat (folyamatos vizsgálati adatok esetében), valamint az elváltozások osztályozását.
50.
A vizsgálat eredményeinek értékelése szempontjából hasznosak lehetnek a korábbi kontrolladatok, például abban az esetben, ha a párhuzamos kontrollokból származó adatok vélhetően lényegesen eltolódottak az ugyanabban a vizsgálati létesítményben/kolóniában lévő kontrollállatoktól származó újabb adatokhoz képest. Korábbi kontrolladatok elemzése esetén ugyanazon laboratórium által benyújtott, ugyanolyan korú és ugyanabba a törzsbe tartozó állatokra vonatkozó, az adott vizsgálatot megelőző öt évből származó adatokat kell felhasználni.
51.
A számszerű eredményeket adott esetben megfelelő és általánosan elfogadott statisztikai módszer alkalmazásával kell kiértékelni. A statisztikai módszereket és az elemezendő adatokat a vizsgálat tervezése során kell kiválasztani (8. bekezdés). A kiválasztás során szükség szerint elő kell írni a túlélésre vonatkozó kiigazításokat.
Vizsgálati jegyzőkönyv
52.
A vizsgálati jegyzőkönyvnek a következő információkat kell tartalmaznia:
Vizsgált vegyi anyag:
—
fizikai jelleg, tisztaság, valamint fizikai és kémiai tulajdonságok,
—
azonosító adatok,
—
a vegyi anyag származási helye,
—
gyártási szám,
—
kémiai elemzésről szóló tanúsítvány.
Vivőanyag (ha van):
—
a vivőanyag kiválasztásának indokolása (ha az nem víz).
Kísérleti állatok:
—
a felhasznált faj/törzs, és a választás indokolása,
—
az állatok száma, életkora és neme a vizsgálat kezdetekor,
—
az állatok származása, tartási körülmények, takarmány stb.,
—
az egyes állatok testsúlya a vizsgálat kezdetekor,
Vizsgálati körülmények:
—
a beadási mód és a dózis kiválasztásának indokolása,
—
az adatok elemzéséhez adott esetben használt statisztikai módszerek,
—
a vizsgált vegyi anyag formulázására/a takarmány előkészítésére vonatkozó részletes adatok,
—
a készítmény elért koncentrációjára, stabilitására és homogenitására vonatkozó analitikai adatok,
—
a beadási mód és a vizsgált vegyi anyag bejuttatására vonatkozó részletes adatok,
—
inhalációs vizsgálatok esetében információ arra vonatkozóan, hogy a bejuttatás csak orron vagy a teljes testfelületen keresztül történt-e,
—
tényleges dózisok (mg/testsúlykilogramm/nap), valamint a vizsgált vegyi anyagnak a takarmányban/ivóvízben meglévő koncentrációjáról (mg/kg vagy ppm) a tényleges dózisra való átszámításhoz használt átszámítási tényező, ha ez alkalmazható,
—
a táplálék és a víz minőségére vonatkozó adatok.
Eredmények (az adatok táblázatos összefoglalását és az egyes állatokra vonatkozó adatokat is meg kell adni):
—
túlélési adatok,
—
testsúly és annak változásai,
—
takarmányfogyasztás, a táplálékhasznosítási képességgel kapcsolatos számítások, ha vannak, valamint adott esetben vízfogyasztás,
—
toxikus reakcióra vonatkozó adatok nemek és adagolási szintek szerinti csoportosításban, beleértve a toxicitás jeleit,
—
a megfigyelt klinikai tünetek jellege, előfordulása (valamint ha pontozzuk, súlyossága) és időtartama (átmeneti vagy állandó),
—
szemészeti vizsgálat,
—
hematológiai vizsgálatok,
—
klinikai biokémiai vizsgálatok,
—
vizeletelemzés,
—
az esetleges neurotoxicitási vagy immuntoxicitási vizsgálatok eredménye,
—
testsúly elpusztuláskor,
—
szervek súlya (és ezek aránya, ha alkalmazható),
—
boncolási eredmények,
—
a kórszövettani vizsgálatok összes, kezeléssel összefüggő eredményének részletes ismertetése,
—
abszorpciós adatok, ha rendelkezésre állnak.
Az eredmények statisztikai feldolgozása, ha alkalmazható
Az eredmények tárgyalása, beleértve a következőket:
—
dózis-válasz összefüggések,
—
a hatásmechanizmusra vonatkozó bármely információ figyelembevétele,
—
az esetlegesen alkalmazott modellezési megközelítések tárgyalása,
—
BMD, NOAEL vagy LOAEL meghatározása,
—
korábbi kontrolladatok,
—
humán relevancia.
Következtetések
SZAKIRODALOM
(1)
OECD (1995). Report of the Consultation Meeting on Sub-chronic and Chronic Toxicity/Carcinogenicity Testing (Rome, 1995), internal working document, Environment Directorate, OECD, Paris.
(2)
Combes RD, Gaunt I, Balls M (2004). A Scientific and Animal Welfare Assessment of the OECD Health Effects Test Guidelines for the Safety Testing of Chemicals under the European Union REACH System. ATLA 32: 163-208.
(3)
Barlow SM, Greig JB, Bridges JW et al. (2002). Hazard identification by methods of animal-based toxicology. Food. Chem. Toxicol. 40, 145-191.
(4)
Chhabra RS, Bucher JR, Wolfe M, Portier C (2003). Toxicity characterization of environmental chemicals by the US National Toxicology Programme: an overview. Int. J. Hyg. Environ. Health 206: 437-445.
(5)
E melléklet B.27., Szubkrónikus orális toxicitási vizsgálat, 90 napos, ismételt adagolású orális toxicitási vizsgálat nem rágcsálókon című fejezete.
(6)
OECD (2012). Guidance Document on the Design and Conduct of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies, Supporting Test Guidelines 451, 452 and 453 – Second edition. Series on Testing and Assessment No. 116, available on the OECD public website for Test Guideline at www.oecd.org/env/testguidelines.
(7)
OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, Series on Testing and Assessment N°39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paris.
(8)
E melléklet B.8., Szubakut inhalációs toxicitás: 28 napos vizsgálat című fejezete.
(9)
E melléklet B.29., Szubkrónikus inhalációs toxicitás: 90 napos vizsgálat című fejezete.
(10)
E melléklet B.9., Ismételt adagolású (28 napos) toxicitás (dermális) című fejezete.
(11)
Carmichael NG, Barton HA, Boobis AR et al. (2006). Agricultural Chemical Safety Assessment: A Multisector Approach to the Modernization of Human Safety Requirements. Critical Reviews in Toxicology 36: 1-7.
(12)
Barton HA, Pastoor TP, Baetcke T et al. (2006). The Acquisition and Application of Absorption, Distribution, Metabolism, and Excretion (ADME) Data in Agricultural Chemical Safety Assessments. Critical Reviews in Toxicology 36: 9-35.
(13)
Doe JE, Boobis AR, Blacker A et al. (2006). A Tiered Approach to Systemic Toxicity Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. Critical Reviews in Toxicology 36: 37-68.
(14)
Cooper RL, Lamb JS, Barlow SM et al. (2006). A Tiered Approach to LIFE Stages Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. Critical Reviews in Toxicology 36: 69-98.
(15)
OECD (2002). Guidance Notes for Analysis and Evaluation of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies, Series on Testing and Assessment No. 35 and Series on Pesticides No. 14, ENV/JM/MONO(2002)19, OECD, Paris.
(16)
OECD (2000). Guidance Document on the recognition, assessment, and use of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluation, No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris.
(17)
Rhomberg LR, Baetcke K, Blancato J, Bus J, Cohen S, Conolly R, Dixit R, Doe J, Ekelman K, Fenner-Crisp P, Harvey P, Hattis D, Jacobs A, Jacobson-Kram D, Lewandowski T, Liteplo R, Pelkonen O, Rice J, Somers D, Turturro A, West W, Olin S (2007). Issues in the Design and Interpretation of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies in Rodents: Approaches to Dose Selection Crit Rev. Toxicol. 37 (9): 729 – 837.
(18)
ILSI (International LIFE Sciences Institute) (1997). Principles for the Selection of Doses in Chronic Rodent Bioassays. Foran JA (Ed.). ILSI Press, Washington, DC.
(19)
Az Európai Parlament és a Tanács 2010/63/EU irányelve (2010. szeptember 22.) a tudományos célokra felhasznált állatok védelméről HL L 276., 2010.10.20., 33. o.
(20)
National Research Council, 1985. Guide for the care and use of laboratory animals. NIH Publication No. 86-23. Washington D.C., US. Dept. of Health and Human Services.
(21)
GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für Versuchstierkunde, 1988). Publication on the Planning and Structure of Animal Facilities for Institutes Performing Animal Experiments. ISBN 3-906255-04-2.
(22)
GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für Versuchstierkunde, 2006). Microbiological monitoring of laboratory animals in various housing systems.
(23)
Diehl K-H, Hull R, Morton D, Pfister R, Rabemampianina Y, Smith D, Vidal J-M, van de Vorstenbosch C. 2001. A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. Journal of Applied Toxicology 21:15-23.
(24)
IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity Associated with Exposure to Chemicals. Environmental Health Criteria Document No. 60.
(25)
Tupper DE, Wallace RB (1980). Utility of the Neurologic Examination in Rats. Acta Neurobiol. Exp. 40: 999-1003.
(26)
Gad SC (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxicology. J. Toxicol.Environ. Health 9: 691-704.
(27)
Moser VC, McDaniel KM, Phillips PM (1991). Rat Strain and Stock Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of Amitraz. Toxicol. Appéldául Pharmacol. 108: 267-283.
(28)
Meyer OA, Tilson HA, Byrd WC, Riley MT (1979). A Method for the RoutineAssessment of Fore- and Hind-limb Grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxicol. 1: 233-236.
(29)
Crofton KM, Howard JL, Moser VC, Gill MW, Reiter LW, Tilson HA, MacPhail RC (1991). Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol. 13: 599-609.
(30)
Weingand K, Brown G, Hall R et al. (1996). Harmonisation of Animal Clinical Pathology Testing in Toxicity and Safety Studies. Fundam. & Appéldául Toxicol. 29: 198-201.
Crissman JW, Goodman DG, Hildebrandt PK et al. (2004). Best Practices Guideline: Toxicological Histopathology. Toxicologic Pathology 32: 126-131.
1. függelék
FOGALOMMEGHATÁROZÁS
Vizsgált vegyi anyag: A jelen vizsgálati módszer alkalmazásával vizsgált bármely anyag vagy keverék.
”
6.
A B.32. és a B.33. fejezet helyébe a következő szöveg lép:
„B.32. A RÁKKELTŐ HATÁS VIZSGÁLATA
BEVEZETÉS
1.
A jelen vizsgálati módszer egyenértékű az OECD 451. vizsgálati iránymutatásában (2009) leírt módszerrel. A rákkeltő hatás vizsgálatára vonatkozó eredeti 451. vizsgálati iránymutatást 1981-ben fogadták el. A jelen felülvizsgált B.32. vizsgálati módszer kidolgozását az állatjóllét és a szabályozási követelmények terén az elmúlt időszakban bekövetkezett változások figyelembevétele érdekében tartották szükségesnek (2) (3) (4) (5) (6). E B.32. vizsgálati módszer frissítése e melléklet B.30., Krónikus toxicitási vizsgálatok című és B.33., A krónikus toxicitás és a rákkeltő hatás együttes vizsgálata című fejezetének felülvizsgálatával párhuzamosan történt meg a vizsgálatban alkalmazott állatokra vonatkozó további információk megszerzése, valamint a dózis kiválasztásával kapcsolatos további részletek biztosítása céljából. A jelen B.32. vizsgálati módszer vegyi anyagok széles skálájának vizsgálatára szolgál, beleértve a növényvédő szereket és az ipari vegyszereket. Meg kell jegyezni azonban, hogy gyógyszeranyagok esetében néhány részlet és követelmény eltérő lehet (lásd: International Conference on Harmonisation (ICH) Guidance S1B on Testing for Carcinogenicity of Pharmaceuticals).
2.
A rákkeltő hatással foglalkozó vizsgálatok többségét rágcsálófajokon végzik, ezért a jelen vizsgálati módszer elsősorban az e fajokon végzett vizsgálatokra alkalmazandó. Amennyiben az ilyen vizsgálatokat rágcsálóktól eltérő fajokon kell elvégezni, a megfelelő módosításokkal a jelen vizsgálati módszerben vázolt elvek és eljárások alkalmazandók, az e melléklet B.27., 90 napos, ismételt adagolású orális toxicitási vizsgálat nem rágcsálókon című fejezetében (6) vázoltakkal együtt. További útmutatás a krónikus toxicitási vizsgálatok és a rákkeltő hatás meghatározására irányuló vizsgálatok tervezésére és elvégzésére vonatkozó 116. OECD-iránymutatásban (7) található.
3.
A rákkeltő hatás meghatározására irányuló vizsgálatok során alkalmazott három fő beadási mód az orális, a dermális és az inhalációs. A beadási mód kiválasztása függ a vizsgált vegyi anyag fizikai és kémiai tulajdonságaitól, valamint az emberi expozíció jellemző módjától. Az expozíciós mód kiválasztására vonatkozó további információk a 116. iránymutatásban találhatók (7).
4.
A jelen vizsgálati módszer az orális expozíciós módra összpontosít, amely a rákkeltő hatás meghatározására irányuló vizsgálatok során a leggyakrabban alkalmazott mód. Az emberi egészségre jelentett kockázat értékeléséhez és/vagy bizonyos szabályozási rendszerek előírásai alapján dermális vagy inhalációs expozíciót alkalmazó, rákkeltő hatás meghatározására irányuló vizsgálatok elvégzésére is szükség lehet ugyan, azonban technikai szempontból e két expozíciós mód mindegyike igen összetett. Az ilyen vizsgálatokat eseti alapon kell megtervezni, bár az itt ismertetett, a rákkeltő hatás orális beadás útján történő meghatározására és értékelésére szolgáló vizsgálati módszer a kezelési időszakokra, klinikai és patológiai paraméterekre stb. vonatkozó ajánlások tekintetében alapul szolgálhat az inhalációs és/vagy dermális vizsgálatokra vonatkozó protokollhoz. A vizsgált vegyi anyagok dermális (7) és inhalációs (7) (8) módon történő beadásával kapcsolatban OECD-iránymutatások állnak rendelkezésre. E melléklet B.8. (9) és B.29. fejezetét (10), valamint az akut inhalációs vizsgálatra vonatkozó OECD-iránymutatást (8) kifejezetten alkalmazni kell az inhalációs expozíciót alkalmazó, hosszabb távú vizsgálatok tervezése során. A dermális beadással végzett vizsgálatok esetében e melléklet B.9. fejezetét (11) kell alkalmazni.
5.
A rákkeltő hatás vizsgálata információt szolgáltat az ismételt, a vizsgált fajok élettartamának akár egészére is kiterjedő expozícióból valószínűsíthetően fakadó egészségügyi kockázatokról. A vizsgálat információkkal szolgál a vizsgált vegyi anyag toxikus hatásairól, beleértve a lehetséges rákkeltő hatást, továbbá jelezheti a célszerveket és a felhalmozódás lehetőségét. Becslést adhat a toxikus hatások észlelhető káros hatással nem járó szintjére, valamint a nem genotoxikus karcinogének esetében a tumorválaszra nézve, amely felhasználható az emberi expozícióra vonatkozó biztonsági kritériumok meghatározásához. Hangsúlyos szerepet kap az állatok lehető legtöbb információ megszerzése érdekében történő körültekintő klinikai vizsgálatának szükségessége is.
6.
A jelen vizsgálati módszerben ismertetett, rákkeltő hatás meghatározására irányuló vizsgálatok célkitűzései többek között a következők:
—
a vizsgált vegyi anyag rákkeltő tulajdonságainak meghatározása, amelyek a párhuzamos kontrollcsoportokhoz viszonyítva megnövelik a neoplazmák gyakoriságát, megnövelik a rosszindulatú neoplazmák arányát vagy lerövidítik a neoplazmák megjelenéséhez szükséges időt,
—
a rákkeltő hatás célszervének (célszerveinek) meghatározása,
—
a neoplazmák megjelenési idejének meghatározása,
—
a tumorok kialakulásával kapcsolatos dózis-válasz összefüggés jellemzőinek meghatározása,
—
a nem észlelhető káros hatás szintjének (NOAEL) vagy a benchmark-dózis (BMD) meghatározásához szükséges kiindulópontnak a meghatározása,
—
a rákkeltő hatások extrapolálása az alacsony dózisú emberi expozíciós szintekre,
—
a hatásmechanizmusra vonatkozó hipotézisek vizsgálatához szükséges adatok biztosítása (2) (7) (12) (13) (14) (15).
KIINDULÁSI MEGFONTOLÁSOK
7.
A vizsgált vegyi anyag potenciális rákkeltő hatásának vizsgálata és értékelése során a vizsgálati laboratóriumnak a vizsgált vegyi anyagra vonatkozó összes rendelkezésre álló információt figyelembe kell vennie a vizsgálat megkezdését megelőzően annak érdekében, hogy a vizsgálati terv a lehetséges rákkeltő hatás hatékonyabb vizsgálatára összpontosítson, valamint hogy az állatkísérleteket minimálisra csökkentsük. A feltételezett karcinogén hatásmechanizmusára vonatkozó információk és a hatásmechanizmus figyelembevétele (2) (7) (12) (13) (14) (15) különösen fontos, mivel az optimális terv eltérő lehet attól függően, hogy a vizsgált vegyi anyag ismert vagy feltételezett genotoxikus karcinogén-e. A hatásmechanizmus figyelembevételére vonatkozó további útmutatás a 116. iránymutatásban (7) szerepel.
8.
A vizsgálat megtervezését segítő információk többek között a vizsgált vegyi anyag azonossága, kémiai szerkezete, valamint fizikai és kémiai tulajdonságai, bármely in vitro vagy in vivo toxicitási vizsgálat eredményei, beleértve a genotoxicitási vizsgálatokéit, a várható felhasználási terület(ek) és az emberi expozíció lehetősége, a szerkezetileg rokon vegyi anyagok rendelkezésre álló (Q)SAR-adatai, mutagenitásra/genotoxicitásra, rákkeltő hatásra vonatkozó és egyéb toxikológiai adatai, a rendelkezésre álló toxikokinetikai adatok (egyszeri dózisra és lehetőség szerint ismételt dózisra vonatkozó kinetikai adatok), valamint egyéb ismételt expozíciós vizsgálatokból származó adatok. A rákkeltő hatás értékelése a toxicitásra vonatkozó, 28 napos vagy 90 napos ismételt dózisú toxicitásvizsgálatokból származó kezdeti információk megszerzését követően végezendő el. A rák előidézésére, illetve elősegítésére vonatkozó rövid távú vizsgálatok szintén hasznos információkat szolgáltathatnak. Az adott vizsgált vegyi anyag lehetséges egészségkárosító hatásai átfogó vizsgálatának részeként a rákkeltő hatás vizsgálatának fokozatos megközelítését kell megfontolni (16) (17) (18) (19).
9.
Az eredmények elemzése szempontjából legmegfelelőbb statisztikai módszereket az adott kísérleti tervre és célkitűzésekre tekintettel a vizsgálat kezdetét megelőzően kell meghatározni. A megfontolandó kérdések közé tartozik, hogy tartalmazzanak-e a statisztikák a túléléssel kapcsolatos kiigazítást, a kumulatív tumorkockázat túlélési időtartamhoz viszonyított elemzését, a tumor kialakulási idejének elemzését, valamint egy vagy több csoport idő előtti megszüntetése esetén végzett elemzést. A megfelelő statisztikai elemzésekre vonatkozó útmutatást, továbbá a nemzetközileg elfogadott statisztikai módszerekre vonatkozó főbb hivatkozásokat a 116. iránymutatás (7), valamint a krónikus toxicitás és a rákkeltő hatás meghatározására irányuló vizsgálatok elemzésével és értékelésével kapcsolatos 35. iránymutatás (20) tartalmazza.
10.
A rákkeltő hatás meghatározására irányuló vizsgálatok elvégzése során a klinikai tünetek mint a biztonsági értékeléshez használt kísérleti állatok humánus végpontjai felismeréséről, értékeléséről és használatáról szóló 19. OECD-iránymutatásban (21), különösen annak 62. bekezdésében ismertetett vezérelveket és szempontokat minden esetben követni kell. E bekezdés szerint: »Ha az ismételt adagolást alkalmazó vizsgálatok során egy állat progresszív, az állapot további romlásához vezető klinikai tüneteket mutat, tájékozott döntést kell hozni az állat humánus elpusztítására vonatkozóan. A döntéshozatal során mérlegelni kell az állat vizsgálatának folytatása révén szerezhető információk értékét az állat általános állapotához viszonyítva. Ha úgy döntünk, hogy az állatot továbbra is vizsgálni kell, a megfigyelések gyakoriságát szükség szerint növelni kell. Ha ez nem befolyásolja hátrányosan a vizsgálat céljának elérését, lehetséges az adagolás átmeneti szüneteltetése – ha ez csökkenti a fájdalmat vagy a szorongást – vagy a vizsgálati dózis csökkentése.«
11.
A krónikus toxicitás és a rákkeltő hatás meghatározására irányuló vizsgálatok során alkalmazott dózisok kiválasztásnak elveire vonatkozó részletes útmutatás és ezen elvek leírása a 116. iránymutatásban (7), valamint a Nemzetközi Élettudományi Intézet két kiadványában található (22) (23). A fő dózis-kiválasztási stratégia a vizsgálat elsődleges célkitűzésétől vagy célkitűzéseitől függ (6. bekezdés). A megfelelő dózisszintek kiválasztásakor egyensúlyt kell találni egyfelől a veszélyesség vizsgálata, másfelől az alacsony dózisra adott válaszok jellemzése és azok relevanciája között. Ez különösen lényeges a krónikus toxicitás és a rákkeltő hatás együttes vizsgálata (e melléklet B.33. fejezete) esetében (12. bekezdés).
12.
Meg kell fontolni a krónikus toxicitás és a rákkeltő hatás együttes vizsgálatának elvégzését (e melléklet B.33. fejezete) a krónikus toxicitási vizsgálat (e melléklet B.30. fejezete) és a rákkeltő hatás vizsgálatának (a jelen B.32. vizsgálati módszer) külön-külön történő elvégzése helyett. A két külön vizsgálat elvégzéséhez viszonyítva az együttes vizsgálat idő- és költséghatékonyabb anélkül, hogy befolyásolná az adatok minőségét a krónikus fázisban vagy a karcinogenitási fázisban. A krónikus toxicitás és a rákkeltő hatás együttes vizsgálata során (e melléklet B.33. fejezete) azonban körültekintően figyelembe kell venni a dóziskiválasztás elveit (11. és 22–25. bekezdés), továbbá azt is meg kell jegyezni, hogy bizonyos szabályozási keretrendszerek a vizsgálatok külön-külön történő elvégzését írhatják elő.
13.
A jelen vizsgálati módszerrel összefüggésében használt fogalmak meghatározása a jelen fejezet végén és a 116. iránymutatásban található (7).
A VIZSGÁLAT ELVE
14.
A vizsgált vegyi anyagot naponta, fokozatosan emelkedő dózisokban, általában orális úton adjuk be a vizsgált állatok több csoportjának az élettartamuk jelentős részén keresztül. Inhalációs vagy dermális bejuttatással történő vizsgálat is megfelelő lehet. Az állatokat gondosan megfigyeljük a toxicitás jeleinek és a neoplasztikus elváltozások kialakulásának észlelése érdekében. A vizsgálat során elpusztult vagy elpusztított állatokat felboncoljuk, továbbá a vizsgálat befejezése után az életben maradt állatokat is elpusztítjuk és felboncoljuk.
A MÓDSZER LEÍRÁSA
Az állatfaj kiválasztása
15.
A jelen vizsgálati módszer elsősorban a rákkeltő hatás rágcsálókban történő vizsgálatával és értékelésével foglalkozik (2. bekezdés). A rágcsálóktól eltérő fajok használata fontolóra vehető, ha a rendelkezésre álló adatok arra utalnak, hogy az ilyen fajok relevánsabbak az emberekre gyakorolt egészségi hatások előrejelzése tekintetében. A faj kiválasztását indokolni kell. Az előnyben részesítendő rágcsálófaj a patkány, de más rágcsálófaj, például az egér is használható. Habár az egér használatának hasznossága a rákkeltő hatás meghatározására irányuló vizsgálatok során korlátozott lehet (24) (25) (26), néhány jelenlegi szabályozási program megköveteli a rákkeltő hatás egereken történő vizsgálatát, hacsak nem nyert megállapítást, hogy az ilyen vizsgálat tudományos szempontból nem szükséges. A patkányok és az egerek a viszonylag rövid élettartamuk, gyógyszerészeti és toxikológiai vizsgálatokban elterjedt használatuk, a tumorindukcióra való fogékonyságuk, valamint a megfelelően jellemzett törzsek rendelkezésre állása miatt preferált kísérleti modellek. E tulajdonságok eredményeképpen nagy mennyiségű információ áll rendelkezésre fiziológiájukról és patológiájukról. A faj és törzs kiválasztására vonatkozó további információk a 116. iránymutatásban találhatók (7).
16.
Általánosan használt laboratóriumi törzsekből származó egészséges, fiatal, ivarérett állatokat kell alkalmazni. A rákkeltő hatás vizsgálatát lehetőleg olyan állatokon kell elvégezni, amelyek törzse és eredete megegyezik a rövidebb időtartamú előzetes toxicitási vizsgálat(ok)ban felhasznált állatokéval, habár ha ismert, hogy az ehhez a törzshöz tartozó és ilyen eredetű állatoknál problémák jelentkeznek a hosszú távú vizsgálatok esetében általánosan elfogadott túlélési szempontok teljesítése tekintetében (lásd a 116. iránymutatást (7)), fontolóra kell venni egy, a hosszú távú vizsgálatok esetében elfogadható túlélési aránnyal rendelkező állattörzs használatát. Olyan nőstényeket kell választani, amelyek még egyszer sem ellettek, és nem vemhesek.
Az állatok tartása és etetése
17.
Az állatokat külön, vagy azonos nemű egyedekből álló kis csoportokban kell tartani; a külön történő tartást csak akkor kell fontolóra venni, ha az tudományos szempontból indokolt (27) (28) (29). A ketreceket úgy kell elrendezni, hogy minimálisra lehessen csökkenteni a ketrec elhelyezésének lehetséges hatásait. A kísérleti állatok tartására használt helyiség hőmérséklete 22 °C (± 3 °C) kell, hogy legyen. Noha a helyiség relatív páratartalmának legalább 30 %-nak kell lennie, és – a takarítás időtartamától eltekintve – lehetőség szerint nem szabad meghaladnia a 70 %-ot, a célértéknek 50–60 % között kell lennie. A világítás legyen mesterséges, 12 órás világos és 12 órás sötét periódusok váltsák egymást. Az etetéshez hagyományos laboratóriumi takarmány alkalmazható, korlátlan mennyiségű ivóvíz biztosítása mellett. A takarmánynak meg kell felelnie a vizsgált faj összes tápanyagigényének, és a vizsgálat eredményét esetlegesen befolyásoló takarmány-szennyeződések mennyiségének – beleértve többek között a növényvédőszer-maradványokat, a perzisztens szerves szennyező anyagokat, a fitoösztrogéneket, a nehézfémeket és a mikotoxinokat – a lehető legalacsonyabbnak kell lennie. A tápanyagokban és takarmányokban lévő szennyező anyagok szintjére vonatkozó analitikai információkat időszakos jelleggel kell meghatározni, legalább a vizsgálat kezdetekor, valamint amikor változás következik be a felhasznált adagban, és ezeket az információkat a zárójelentésben közölni kell. A vizsgálat során felhasznált ivóvízre vonatkozó analitikai információkat hasonló módon kell megadni. A vizsgált vegyi anyag táplálékkal történő beadása esetén a takarmány megválasztását befolyásolhatja annak szükségessége, hogy az megfelelően keveredjen el a takarmánnyal és kielégítse az állatok táplálkozási igényeit.
Az állatok előkészítése
18.
A laboratóriumi körülményekhez legalább 7 napig szoktatott, egészséges állatokat kell használni, amelyek korábban nem voltak kitéve kísérleti eljárásoknak. Rágcsálók esetében az állatoknak történő adagolást az elválasztást és szoktatást követően a lehető leghamarabb, és lehetőleg az állatok 8 hetes kora előtt meg kell kezdeni. A kísérleti állatokat faj, törzs, eredet, nem, súly és életkor szerint kell jellemezni. A vizsgálat kezdetén az állatok súlya az egyes nemeken belül csak minimálisan térhet el egymástól, a vizsgálatban használt összes állat súlyának átlagos értékétől pedig legfeljebb ± 20 %-kal különbözhet mindkét nem esetében. Az állatokat véletlenszerűen kell besorolni a kontroll- és kezelt csoportokba. A véletlenszerű kiválasztást követően nem lehet lényeges különbség az egyes nemeken belül a csoportok átlagos testsúlya között. Ha statisztikailag szignifikáns különbségek fordulnak elő, a véletlenszerű kiválasztás lépését lehetőség szerint meg kell ismételni. Minden egyes állatnak egyedi azonosító számot kell kapnia, és minden egyes állatot maradandóan meg kell jelölni ezzel a számmal tetoválás, mikrochip-beültetés vagy más megfelelő módszer segítségével.
ELJÁRÁS
Az állatok száma és neme
19.
A vizsgálathoz mindkét nemet fel kell használni. Megfelelő számú állatot kell használni az alapos biológiai és statisztikai értékelés lehetővé tétele érdekében. Éppen ezért minden egyes dóziscsoport és kísérő kontrollcsoport nemenként legalább 50 állatból kell álljon. A vizsgálat céljától függően a főbb becslések statisztikai ereje növelhető lehet az állatok különböző dóziscsoportokba történő egyenlőtlen elosztásával oly módon, hogy több mint 50 állatnak kell lennie az alacsony dózisú csoportokban, például az alacsony dózisok karcinogenitásának becslése céljából. Meg kell azonban jegyezni, hogy a csoport méretének mérsékelt növelése viszonylag kis mértékben növeli a vizsgálat statisztikai erejét. A vizsgálat statisztikai tervezéséről és a dózisszinteknek a statisztikai erő maximális szintre való növelése érdekében történő kiválasztásáról további információk a 116. iránymutatásban (7) találhatók.
Időközi elpusztítás és kísérő (jelző-) csoportok alkalmazásának előírása
20.
Amennyiben ez tudományos szempontból indokolt, a vizsgálat a neoplasztikus elváltozások alakulására vonatkozó és mechanisztikai információk megszerzése céljából előírhatja az időközi elpusztítást, például a 12. hónapban. Abban az esetben, ha ilyen információk a vizsgált vegyi anyaggal végzett korábbi, ismételt adagolású toxicitási vizsgálatokból már rendelkezésre állnak, az időközi elpusztítás tudományos szempontból nem feltétlenül indokolt. Ha a vizsgálati terv időközi elpusztítást tartalmaz, az időközben elpusztítandó állatok száma minden egyes dóziscsoportban rendszerint nemenként 10, a vizsgálati tervben szereplő állatok teljes számát pedig annyival kell megnövelni, ahány állat elpusztítását tervezzük a vizsgálat befejezése előtt. Szükség szerint egy jelzőállatokból álló további (jellemzően nemenként 5 állatból álló) csoport is bevonható a betegség állapotának a vizsgálat közben történő megfigyelése céljából (30). További útmutatás a 116. iránymutatásban (7) található.
Dóziscsoportok és adagolás
21.
A dózis kiválasztásának és a dózisszintek felosztásának összes szempontjára vonatkozó útmutatás a 116. iránymutatásban található (7). Legalább három dózisszintet és egy ezzel párhuzamos kontrollt kell alkalmazni. A dózisszintek megválasztása általában a rövidebb távú ismételt adagolású vagy tartománybehatároló vizsgálatok eredményein alapul, figyelembe véve a vizsgált vegyi anyagra vagy rokon vegyi anyagokra vonatkozóan rendelkezésre álló bármilyen toxikológiai és toxikokinetikai adatot.
22.
Ha a vizsgált vegyi anyag fizikai és kémiai jellege vagy biológiai hatásai nem szabnak ennek korlátot, a legmagasabb dózisszintet olyan módon kell kiválasztani, hogy az alkalmas legyen az elsődleges célszervek és toxikus hatások meghatározására, ugyanakkor elkerülhető legyen a szenvedés, a súlyos toxicitás, a morbiditás vagy az elhullás. A 23. bekezdésben bemutatott tényezők figyelembevétele mellett a legmagasabb dózisszintet általában úgy kell megválasztani, hogy toxicitást váltson ki, amely például a testsúly növekedésének (körülbelül 10 %-os) visszaesésével bizonyítható. A vizsgálat célkitűzéseitől függően azonban (lásd a 6. bekezdést) a toxicitást bizonyíthatóan kiváltó dózisnál alacsonyabb maximális dózis is választható, például ha egy dózis káros hatást idéz elő, amely azonban csak kismértékben befolyásolja az élettartamot vagy a testsúlyt.
23.
A dózisszintek és azok felosztása megválasztható úgy, hogy meghatározható legyen a dózis-válasz összefüggés, valamint a vizsgált vegyi anyag hatásmechanizmusától függően a NOAEL vagy a vizsgálat egyéb tervezett kimenetele, például a legalacsonyabb dózisszinten megfigyelhető BMD (lásd a 25. bekezdést). Az alacsonyabb dózis kiválasztása során figyelembe veendő tényezők többek között a dózis-válasz görbe várható meredeksége, azok a dózisok, amelyeknél fontos változások következhetnek be a metabolizmusban vagy a toxikus hatás mechanizmusában, amelyeknél küszöbérték várható, vagy amelyeknél az alacsony dózis extrapolálásához használható kiindulási pont várható.
24.
A dózisszintek felosztásának kiválasztása függ a vizsgált vegyi anyag jellemzőitől, és nem írható elő a jelen vizsgálati módszerben, ugyanakkor csökkenő dózisszintek meghatározásához gyakran optimális a 2–4-szeres intervallumok alkalmazása, az adagolások közötti nagyon nagy intervallumok (például körülbelül 6–10-nél magasabb szorzófaktor) alkalmazásával szemben pedig gyakran előnyben részesítendő egy negyedik vizsgálati csoport beiktatása. A 10-nél magasabb szorzófaktorokat általában kerülni kell, és használatukat meg kell indokolni.
25.
A 116. iránymutatásban (7) részletesebben kifejtettek szerint a dózis kiválasztásakor figyelembe veendő szempontok többek között a következők:
—
ismert vagy feltételezett nemlinearitások vagy elhajlási pontok a dózis-válasz görbén,
—
toxikokinetika, valamint azok a dózistartományok, amelyek esetében a metabolikus indukció, a telítettség vagy a külső és belső dózisok közötti nemlinearitás előfordul, vagy nem fordul elő,
—
prekurzor elváltozások, hatásmarkerek vagy a főbb mögöttes biológiai folyamatok működésének mutatói,
—
a hatásmechanizmus főbb (vagy feltételezett) aspektusai, például azok a dózisok, amelyeknél megjelenik a citotoxicitás, felborulnak a hormonszintek és a homeoszatikus mechanizmusok stb.,
—
a dózis-válasz görbe azon területei, ahol különösen pontos becslés szükséges, például a várt BMD vagy egy feltétezett küszöbérték tartományában,
—
a várható humán expozíciós szintek figyelembevétele.
26.
Kontrollcsoportként egy kezeletlen csoport, vagy ha a vizsgált vegyi anyag beadásához vivőanyagot használunk, egy vivőanyaggal kezelt kontrollcsoport alkalmazandó. A kontrollcsoportba tartozó állatokat a vizsgált vegyi anyag beadásától eltekintve ugyanolyan módon kell kezelni, mint a vizsgálati csoportokban lévőket. Vivőanyag alkalmazása esetén a kontrollcsoportban a vivőanyagot a dóziscsoportokban alkalmazott legnagyobb mennyiségben kell beadni. Ha a vizsgált vegyi anyagot a táplálékkal adjuk be, és emiatt a táplálékfogyasztás a táplálék lecsökkent ízletessége miatt jelentősen csökken, hasznos lehet egy párban etetett kontrollcsoport alkalmazása a megfelelőbb kontroll biztosítása érdekében.
A dózisok előkészítése és a vizsgált vegyi anyag beadása
27.
A vizsgált vegyi anyagot általában orálisan, a takarmánnyal vagy az ivóvízzel, vagy gyomorszonda segítségével adjuk be. A bejuttatás útvonalára és módjára vonatkozó további információk a 116. iránymutatásban találhatók (7). A bejuttatás útvonala és módja függ a vizsgálat céljától, a vizsgált vegyi anyag fizikai és kémiai tulajdonságaitól, biológiai hozzáférhetőségétől, valamint az emberi expozíció meghatározó útvonalától és módjától. A bejuttatás útvonalának és módjának kiválasztását indokolni kell. Állatjóléti okokból gyomorszonda rendszerint csak olyan hatóanyagoknál alkalmazandó, amelyek esetében a bejuttatásnak ez az útvonala és módja ésszerűen tükrözi a lehetséges humán expozíciót (például gyógyszerek esetében). A táplálékban vagy környezetben előforduló vegyi anyagok, többek között a növényvédő szerek esetében a beadás jellemzően a táplálékon vagy az ivóvízen keresztül történik. Néhány forgatókönyv, például a munkahelyi expozíció esetében ugyanakkor a beadás egyéb útvonalai megfelelőbbnek bizonyulhatnak.
28.
A vizsgált vegyi anyagot szükség esetén feloldjuk vagy szuszpendáljuk alkalmas vivőanyagban. Adott esetben figyelembe kell venni a vivőanyag és más adalékanyagok következő tulajdonságait: a vizsgált vegyi anyag felszívódására, eloszlására, metabolizmusára vagy visszamaradására gyakorolt hatások, a vizsgált vegyi anyag kémiai tulajdonságaira gyakorolt azon hatások, amelyek módosíthatják annak toxikus jellemzőit, valamint az állatok táplálék- és vízfogyasztására vagy tápláltsági állapotára gyakorolt hatások. Lehetőség szerint elsősorban vizes oldatot/szuszpenziót ajánlatos alkalmazni, másodsorban olajos (például kukoricacsíra-olajban elkészített) oldatot vagy emulziót, és csak harmadsorban más vivőanyagokban elkészített oldatot. A víztől eltérő vivőanyagok esetében ismerni kell a vivőanyag toxikológiai tulajdonságait. A vizsgált vegyi anyag beadási körülmények közötti (például takarmánnyal történő beadás során fennálló) stabilitására és (adott esetben) a beadáshoz használt oldatok vagy takarmányok homogenitására vonatkozó információknak rendelkezésre kell állniuk.
29.
A takarmánnyal vagy ivóvízzel adagolt vegyi anyagok esetében fontos biztosítani, hogy a vizsgált vegyi anyag beadott mennyisége ne zavarja meg a szokásos táplálékfelvételt vagy a vízháztartás egyensúlyát. A takarmánnyal történő beadást alkalmazó hosszú távú toxicitási vizsgálatok esetében a takarmányban lévő vizsgált vegyi anyag koncentrációja a kiegyensúlyozatlan táplálkozás elkerülése érdekében általában nem haladhatja meg a teljes takarmány 5 %-át. Ha a vizsgált vegyi anyagot a takarmányba keverve adjuk be, akkor vagy állandó takarmánykoncentráció (mg/takarmánykilogramm vagy ppm), vagy az állatok testsúlyára heti rendszerességgel kiszámított állandó dózisszint (mg/testsúlykilogramm) alkalmazható. A kiválasztott alternatívát meg kell nevezni.
30.
Orális úton történő beadás esetén a vizsgált vegyi anyagot naponta kell az állatoknak beadni (heti hét napon keresztül), rágcsálóknál általában 24 hónapon át (lásd még a 32. bekezdést). Bármely más adagolási rendszer – például heti öt napon történő beadás – használatát indokolni kell. Dermális úton történő beadás esetén az állatokat az e melléklet B.9. fejezetében (11) meghatározottak szerint általában legalább napi 6 órán keresztül, heti 7 napon kell a vizsgált vegyi anyaggal kezelni 24 hónapon át. Az inhaláció útján történő expozíciót napi 6 órán keresztül, heti 7 nap kell elvégezni, de indokolt esetben heti 5 napos expozíció is alkalmazható. Az expozíció időtartama általában 24 hónap. Patkányoktól eltérő rágcsálófajok csak orron át történő expozíciója esetén az expozíció maximális időtartama kiigazítható a fajspecifikus szorongás minimalizálása érdekében. A napi 6 óránál rövidebb expozíciós időtartam alkalmazását indokolni kell. Lásd még e melléklet B.8. fejezetét (9).
31.
Ha a vizsgált vegyi anyagot szondán át adagoljuk, a dózist mindig a nap hasonló időszakában, gyomorszondán vagy megfelelő intubációs kanülön át kell beadni az állatoknak. Általában egyetlen dózist kell beadni naponta egyszer; abban az esetben, ha a vegyi anyag például helyi irritációt okoz, a napi dózisarány fenntartható lehet elosztott (napi kétszeri) beadással. Az egy alkalommal beadható folyadék maximális mennyisége a kísérleti állat méretétől függ. A mennyiséget a lehető legalacsonyabb szinten kell tartani, és rágcsálók esetében általában nem haladhatja meg az 1 ml/100 testsúlygramm térfogatot (31). A koncentráció megfelelő beállításával a minimálisra kell csökkenteni a vizsgált anyag mennyiségének változásait, hogy valamennyi dózisszinten konstans mennyiséget lehessen adagolni. A fentiek alól kivételt jelentenek az esetlegesen maró vagy irritatív hatást kiváltó anyagok, amelyeket hígítani kell a súlyos helyi hatások elkerülése érdekében. Kerülni kell az emésztőrendszerben valószínűsíthetően maró vagy irritatív hatást kiváltó koncentrációkkal történő vizsgálatokat.
A vizsgálat időtartama
32.
A vizsgálat időtartama rágcsálók esetében általában 24 hónap, amely a felhasznált állatok normális élettartamának legnagyobb részére kiterjed. A vizsgált állattörzs élettartamától függően rövidebb vagy hosszabb vizsgálati időtartamok is alkalmazhatók, de ezt meg kell indokolni. Bizonyos egértörzsek, például az AKR/J, a C3H/J vagy a C57BL/6J törzs esetében a 18 hónapos időtartam megfelelőbb lehet. A következőkben iránymutatás olvasható a vizsgálat idejével és befejezésével, valamint a túléléssel kapcsolatban; további, többek között a negatív karcinogenitás túlélési arányhoz viszonyított elfogadhatóságának megfontolásával kapcsolatos útmutatás a krónikus toxicitási vizsgálatok és a rákkeltő hatás meghatározására irányuló vizsgálatok tervezésére és elvégzésére vonatkozó 116. OECD-iránymutatásban (7) található.
—
Meg kell fontolni a vizsgálat befejezését, ha az életben maradt állatok száma az alacsonyabb dózissal kezelt csoportokban vagy a kontrollcsoportban 25 százalék alá csökken.
—
Abban az esetben, ha csak a magas dózissal kezelt csoportban figyelhető meg idő előtti elhullás a toxicitás következtében, a vizsgálatot nem kell befejezni.
—
Az életben maradt egyedek számát nemenként külön-külön kell figyelembe venni.
—
A vizsgálat nem tarthat tovább annál a pontnál, amikor a vizsgálat révén nyert adatok már nem elegendőek a statisztikailag érvényes értékelés lefolytatásához.
MEGFIGYELÉSEK
33.
Rendszerint a nap elején és végén – beleértve a hétvégéket és az ünnepnapokat is – az összes állatot meg kell vizsgálni, hogy nem mutatja-e megbetegedés jeleit vagy nem hullott-e el. Ezen túlmenően az állatokat naponta egyszer meg kell vizsgálni, hogy mutatnak-e meghatározott, toxikológiai szempontból lényeges tüneteket, szondával történő adagolás esetén figyelembe véve az adagolást követően várható hatások érvényesülésének csúcsidőszakát. Külön figyelmet kell fordítani a daganatképződésre; minden, szemmel látható vagy kitapintható daganat megjelenésének idejét, helyét, méreteit, megjelenési formáját és növekedését fel kell jegyezni.
Testsúly, táplálék-/vízfogyasztás és táplálékhasznosítási képesség
34.
A kezelés kezdetekor, az első 13 hét során legalább hetente egyszer, ezután pedig legalább havonta egyszer meg kell mérni az összes állat testsúlyát. A táplálékfogyasztást és a táplálékhasznosítási képességet a vizsgálat első 13 hetében legalább hetente, azt követően pedig legalább havonta egyszer kell mérni. Ha a vizsgált vegyi anyagot ivóvízzel adjuk be, a vízfogyasztást a vizsgálat első 13 hetében legalább hetente, azt követően pedig legalább havonta egyszer kell mérni. A vízfogyasztás mérését olyan vizsgálatok esetében is fontolóra kell venni, amelyek során az ivási szokások megváltoznak.
Hematológiai, klinikai biokémiai és egyéb mérések
35.
A vizsgálatból nyerhető lehető legtöbb információ megszerzése érdekében – különösen a hatásmechanizmussal kapcsolatos szempontok meghatározása céljából – a vizsgálatvezető mérlegelése szerint vérminták vehetők a hematológiai és klinikai biokémiai vizsgálatokhoz. Vizeletelemzés elvégzése is célszerű lehet. Az ilyen minták karcinogenitási vizsgálat részeként történő levételének értékére vonatkozó további útmutatás a 116. iránymutatásban található (7). Amennyiben megfelelőnek ítéljük, a hematológiai és klinikai kémiai meghatározások céljából végzett vérvétel, valamint a vizeletelemzés valamelyik időközi elpusztítás (20. bekezdés) részeként, továbbá a vizsgálat befejezésekor végezhető el, nemenként és csoportonként legalább 10 állaton. Vérmintákat meghatározott helyről kell venni, például a szívből vagy a szemgolyó mögötti üregből altatás alatt, és adott esetben a megfelelő körülmények között kell tárolni. Vérkenet is készíthető vizsgálat céljára, különösen akkor, ha a csontvelő tűnik a célszervnek, bár az ilyen jellegű vizsgálatnak a karcinogén/onkogén hatás meghatározása szempontjából képviselt értéke megkérdőjelezhető (32).
PATOLÓGIA
Autopszia
36.
A jelzőállatok (lásd a 20. bekezdést) és a kísérő csoportba tartozó többi állat kivételével a vizsgálatokba bevont összes állatot teljes körű, beható autopsziának kell alávetni, ideértve a következők alapos vizsgálatát: a test külső felszíne, az összes testnyílás, a koponya, a mellüreg, a hasüreg és ezek tartalma. A jelzőállatok és a kísérő csoportba tartozó többi állat esetében a vizsgálatvezető döntésétől függően eseti alapú boncolásra lehet szükség. A szervek súlyának mérése általában nem képezi a rákkeltő hatás meghatározására irányuló vizsgálatok részét, mivel a geriátriai változások és – a későbbi szakaszokban – a tumorok kifejlődése zavaró tényezők lehetnek a szervek súlyával kapcsolatos adatok hasznosságát illetően. Ezek a mérések azonban kritikusak lehetnek az adatok bizonyító erejének mérlegelése során és különösen a hatásmechanizmussal kapcsolatos megfontolások tekintetében. Ha a szervek súlyának mérése kísérő vizsgálat részét képezi, a mérést legkésőbb a vizsgálat megkezdése után egy évvel el kell végezni.
37.
Az alábbi szöveteket a szövet típusa és a később elvégezni kívánt kórszövettani vizsgálat szempontjából legmegfelelőbb fixálóanyaggal kell tartósítani (33) (a szögletes zárójelben megadott szövetek megőrzése nem kötelező):
minden makroszkopikus elváltozás
szív
hasnyálmirigy
gyomor (előgyomor, mirigygyomor)
mellékvese
csípőbél
mellékpajzsmirigy
[fogazat]
aorta
éhbél
perifériás idegek
here
agy (beleértve a nagyagy, a kisagy és a nyúltvelő/nyúltagyi híd metszeteit)
vese
agyalapi mirigy
csecsemőmirigy
vakbél
könnymirigy (szemüregen kívüli)
prosztata
pajzsmirigy
méhnyak
máj
végbél
[nyelv]
koaguláló mirigy
tüdő
nyálmirigy
légcső
vastagbél
nyirokcsomók (felszíni és mély)
ondóhólyag
húgyhólyag
patkóbél
emlőmirigy (nőstényeknél kötelező, hímeknél csak ha láthatóan kimetszhető)
harántcsíkolt izom
méh (beleértve a méhnyakat)
mellékhere
[felső légutak, beleértve az orrot, az orrkagylókat és az orrmelléküregeket]
bőr
[húgyvezeték]
szem (beleértve a retinát)
nyelőcső
gerincvelő (három szinten: nyaki, mellkasi középső és ágyéki szakasz)
[húgycső]
[combcsont az ízületi felülettel együtt]
[szaglógumó]
lép
hüvely
epehólyag (patkánytól eltérő fajoknál)
petefészek
[szegycsont]
metszet a csontvelőből és/vagy egy friss, csontvelőből felszívott minta
Harder-mirigy
Páros szervek, például vesék, mellékvesék esetében mind a két szervet tartósítani kell. A klinikai és más jellegű megfigyelések alapján további testszövetek vizsgálata is szükséges lehet. A fentieken túl meg kell őrizni minden olyan más szervet is, amely a vizsgált vegyi anyag ismert tulajdonságai alapján valószínűleg célszervnek tekinthető. A dermális úton történő bejuttatást alkalmazó vizsgálatok esetében az orális módon történő beadásnál felsorolt szerveket kell tartósítani, továbbá elengedhetetlen a bőrből történő mintavétel a beadás helyéről és e minta tartósítása. Inhalációs vizsgálatok esetében a légzőrendszerből származó tartósított és vizsgált szövetek felsorolásának követnie kell az e melléklet B.8. és B.29. fejezetében tett ajánlásokat. Egyéb szervek/szövetek esetében (valamint a légzőrendszerből származó tartósított szöveteken túl) az orális úton történő beadásnál felsorolt szerveket kell vizsgálni.
Kórszövettani vizsgálatok
38.
A toxikológiai patológiai vizsgálatok elvégzésének legjobb gyakorlatára vonatkozóan iránymutatás áll rendelkezésre (33). Legalább az alábbi szöveteket kell vizsgálni:
—
a magas dózissal kezelt csoportból és a kontrollcsoportokból származó összes szövet,
—
a vizsgálat során elpusztult vagy elpusztított állatokból származó összes szövet,
—
a makroszkopikus rendellenességeket, többek között tumorokat mutató összes szövet,
—
azon szöveteket, amelyek a legnagyobb dózissal kezelt csoportnál a kezelésnek tulajdonítható kórszövettani elváltozásokat mutatnak, az összes többi dóziscsoport összes állatánál meg kell vizsgálni,
—
páros szervek, például vesék, mellékvesék esetében mind a két szervet vizsgálni kell.
ADATOK ÉS JEGYZŐKÖNYVEZÉS
Adatok
39.
Az összes értékelt paraméterre vonatkozó adatokat minden egyes állat esetében rögzíteni kell. Ezenfelül az összes adatot táblázat formájában összegezni kell, a vizsgált állatok minden csoportja tekintetében bemutatva, hogy hány egyeddel indult a vizsgálat, hány állat pusztult el, illetve hányat kellett elpusztítani humánus okokból a vizsgálat során, valamint az elpusztulás vagy humánus okokból való elpusztítás időpontját, a toxicitás jeleit mutató állatok számát, a megfigyelt toxicitási tünetek leírását, ideértve bármely toxikus hatás kezdetének idejét, időtartamát és súlyosságát, az elváltozásokat mutató állatok számát, az elváltozások típusát és az egyes elváltozástípusokat mutató állatok százalékos arányát. Az összegző adattáblázatoknak tartalmazniuk kell a toxikus hatásokat vagy elváltozásokat mutató állatokra vonatkozó átlagértékeket és szórásokat (folyamatos vizsgálati adatok esetében), valamint az elváltozások osztályozását.
40.
A vizsgálat eredményeinek értékelése szempontjából hasznosak lehetnek a korábbi kontrolladatok, például abban az esetben, ha a párhuzamos kontrollokból származó adatok vélhetően lényegesen eltolódottak az ugyanabban a vizsgálati létesítményben/kolóniában lévő kontrollállatoktól származó újabb adatokhoz képest. Korábbi kontrolladatok elemzése esetén ugyanazon laboratórium által benyújtott, ugyanolyan korú és ugyanabba a törzsbe tartozó állatokra vonatkozó, az adott vizsgálatot megelőző öt évből származó adatokat kell felhasználni.
41.
A számszerű eredményeket adott esetben megfelelő és általánosan elfogadott statisztikai módszer alkalmazásával kell kiértékelni. A statisztikai módszereket és az elemezendő adatokat a vizsgálat tervezése során kell kiválasztani (9. bekezdés). A kiválasztás során szükség szerint elő kell írni a túlélésre vonatkozó kiigazításokat.
Vizsgálati jegyzőkönyv
42.
A vizsgálati jegyzőkönyvnek a következő információkat kell tartalmaznia:
Vizsgált vegyi anyag:
—
fizikai jelleg, tisztaság, valamint fizikai és kémiai tulajdonságok,
—
azonosító adatok,
—
a vegyi anyag származási helye,
—
gyártási szám,
—
kémiai elemzésről szóló tanúsítvány,
Vivőanyag (ha van):
—
a vivőanyag kiválasztásának indokolása (ha az nem víz),
Kísérleti állatok:
—
a felhasznált faj/törzs, és a választás indokolása,
—
az állatok száma, életkora és neme a vizsgálat kezdetekor,
—
az állatok származása, tartási körülmények, takarmány stb.,
—
az egyes állatok testsúlya a vizsgálat kezdetekor,
Vizsgálati körülmények:
—
a beadási mód és a dózis kiválasztásának indokolása,
—
az adatok elemzéséhez adott esetben használt statisztikai módszerek,
—
a vizsgált vegyi anyag formulázására/a takarmány előkészítésére vonatkozó részletes adatok,
—
a készítmény elért koncentrációjára, stabilitására és homogenitására vonatkozó analitikai adatok,
—
a beadási mód és a vizsgált vegyi anyag bejuttatására vonatkozó részletes adatok,
—
inhalációs vizsgálatok esetében információ arra vonatkozóan, hogy a bejuttatás csak orron vagy a teljes testfelületen keresztül történt-e,
—
tényleges dózisok (mg/testsúlykilogramm/nap), valamint a vizsgált vegyi anyagnak a takarmányban/ivóvízben meglévő koncentrációjáról (mg/kg vagy ppm) a tényleges dózisra való átszámításhoz használt átszámítási tényező, ha ez alkalmazható,
—
a táplálék és a víz minőségére vonatkozó adatok,
Eredmények (az adatok táblázatos összefoglalását és az egyes állatokra vonatkozó adatokat is meg kell adni)
Általános
—
túlélési adatok,
—
testsúly és annak változásai,
—
takarmányfogyasztás, a táplálékhasznosítási képességgel kapcsolatos számítások, ha vannak, valamint vízfogyasztás, ha alkalmazható,
—
toxikokinetikai adatok (ha rendelkezésre állnak),
—
oftalmoszkópia (ha rendelkezésre áll),
—
hematológia (ha rendelkezésre áll),
—
klinikai kémia (ha rendelkezésre áll),
Klinikai leletek
—
toxicitási tünetek,
—
az esetleges rendellenességek előfordulása (és – ha pontozzuk – azok súlyossága),
—
a megfigyelt klinikai tünetek jellege, súlyossága és időtartama (átmeneti vagy állandó),
Boncolási adatok
—
testsúly elpusztuláskor,
—
szervek súlya és ezek aránya, ha alkalmazható,
—
boncolási eredmények, rendellenességek előfordulása és súlyossága,
Kórszövettani vizsgálatok
—
nem neoplasztikus kórszövettani leletek,
—
neoplasztikus kórszövettani leletek,
—
a makroszkopikus és mikroszkopikus vizsgálatok leletei közötti összefüggés,
—
a kezeléssel összefüggő összes kórszövettani lelet részletes leírása, beleértve a súlyossági fokokat,
—
a tárgylemezek szakértői felülvizsgálatáról szóló jelentés,
Az eredmények statisztikai feldolgozása, ha alkalmazható
Az eredmények tárgyalása, beleértve a következőket:
—
az esetlegesen alkalmazott modellezési megközelítések tárgyalása,
—
dózis-válasz összefüggések,
—
korábbi kontrolladatok,
—
a hatásmechanizmusra vonatkozó bármely információ figyelembevétele,
—
BMD, NOAEL vagy LOAEL meghatározása,
—
humán relevancia.
Következtetések
IRODALOM
(1)
OECD (1995). Report of the Consultation Meeting on Sub-chronic and Chronic Toxicity/Carcinogenicity Testing (Rome, 1995), internal working document, Environment Directorate, OECD, Paris.
(2)
EPA (2005). Guidelines for Carcinogen Risk Assessment Risk Assessment Forum U.S. Environmental Protection Agency Washington, DC.
(3)
Combes RD, Gaunt, I, Balls M (2004). A Scientific and Animal Welfare Assessment of the OECD Health Effects Test Guidelines for the Safety Testing of Chemicals under the European Union REACH System. ATLA 32: 163-208.
(4)
Barlow SM, Greig JB, Bridges JW et al (2002). Hazard identification by methods of animal-based toxicology. Food. Chem. Toxicol. 40: 145-191.
(5)
Chhabra RS, Bucher JR, Wolfe M, Portier C (2003). Toxicity characterization of environmental chemicals by the US National Toxicology Programme: an overview. Int. J. Hyg. Environ. Health 206: 437-445.
(6)
E melléklet B.27., Szubkrónikus orális toxicitási vizsgálat, 90 napos, ismételt adagolású orális toxicitási vizsgálat nem rágcsálókon című fejezete.
(7)
OECD (2012). Guidance Document on the Design and Conduct of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies, Supporting Test Guidelines 451, 452 and 453 – Second edition. Series on Testing and Assessment No. 116, available on the OECD public website for Test Guideline at www.oecd.org/env/testguidelines.
(8)
OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, Series on Testing and Assessment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paris.
(9)
E melléklet B.8., Szubakut inhalációs toxicitás: 28 napos vizsgálat című fejezete.
(10)
E melléklet B.29., Szubkrónikus inhalációs toxicitás: 90 napos vizsgálat című fejezete.
(11)
E melléklet B.9., Ismételt adagolású (28 napos) toxicitás (dermális) című fejezete.
(12)
Boobis AR, Cohen SM, Dellarco V, McGregor D, Meek ME, Vickers C, Willcocks D, Farland W (2006). IPCS Framework for analyzing the Relevance of a Cancer Mode of Action for Humans. Crit. Rev. in Toxicol, 36: 793-801.
(13)
Cohen SM, Meek ME, Klaunig JE, Patton DE, and Fenner-Crisp PA (2003). The human relevance of information on carcinogenic Modes of Action: An Overview. Crit. Rev. Toxicol. 33:581-589.
(14)
Holsapple MP, Pitot HC, Cohen SN, Boobis AR, Klaunig JE, Pastoor T, Dellarco VL, Dragan YP (2006). Mode of Action in Relevance of Rodent Liver Tumors to Human Cancer Risk. Toxicol. Sci. 89:51-56.
(15)
Meek EM, Bucher JR, Cohen SM, Dellarco V, Hill RN, Lehman-McKemmon LD, Longfellow DG, Pastoor T, Seed J, Patton DE (2003). A Framework for Human Relevance analysis of Information on Carcinogenic Modes of Action. Crit. Rev. Toxicol. 33:591-653.
(16)
Carmichael NG, Barton HA, Boobis AR et al (2006). Agricultural Chemical Safety Assessment: A Multisector Approach to the Modernization of Human Safety Requirements. Critical Reviews in Toxicology 36: 1-7.
(17)
Barton HA, Pastoor TP, Baetcke T et al (2006). The Acquisition and Application of Absorption, Distribution, Metabolism, and Excretion (ADME) Data in Agricultural Chemical Safety Assessments. Critical Reviews in Toxicology 36: 9-35.
(18)
Doe JE, Boobis AR, Blacker A et al (2006). A Tiered Approach to Systemic Toxicity Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. Critical Reviews in Toxicology 36: 37-68.
(19)
Cooper RL, Lamb JS, Barlow SM et al (2006). A Tiered Approach to LIFE Stages Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. Critical Reviews in Toxicology 36: 69-98.
(20)
OECD (2002). Guidance Notes for Analysis and Evaluation of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies, Series on Testing and Assessment No. 35 and Series on Pesticides No. 14, ENV/JM/MONO(2002)19, OECD, Paris.
(21)
OECD (2000). Guidance Document on the recognition, assessment, and use of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluation, Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris.
(22)
Rhomberg LR, Baetcke K, Blancato J, Bus J, Cohen S, Conolly R, Dixit R, Doe J, Ekelman K, Fenner-Crisp P, Harvey P, Hattis D, Jacobs A, Jacobson-Kram D, Lewandowski T, Liteplo R, Pelkonen O, Rice J, Somers D, Turturro A, West, W, Olin S(2007). Issues in the Design and Interpretation of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies in Rodents: Approaches to Dose Selection Crit Rev. Toxicol. 37 (9): 729 – 837.
(23)
ILSI (International LIFE Sciences Institute) (1997). Principles for the Selection of Doses in Chronic Rodent Bioassays. Foran JA (Ed.). ILSI Press, Washington, DC.
(24)
Griffiths SA, Parkinson C, McAuslane JAN and Lumley CE (1994). The utility of the second rodent species in the carcinogenicity testing of pharmaceuticals. The Toxicologist 14(1):214.
(25)
Usui T, Griffiths SA and Lumley CE (1996). The utility of the mouse for the assessment of the carcinogenic potential of pharmaceuticals. In D’Arcy POF & Harron DWG (eds). Proceedings of the Third International Conference on Harmonisation. Queen’s University Press, Belfast. pp 279-284.
(26)
Carmichael NG, Enzmann H, Pate I, Waechter F (1997). The Significance of Mouse Liver Tumor Formation for Carcinogenic Risk Assessment: Results and Conclusions from a Survey of Ten Years of Testing by the Agrochemical Industry. Environ Health Perspect. 105:1196-1203.
(27)
Az Európai Parlament és a Tanács 2010. szeptember 22-i 2010/63/EU irányelve a tudományos célokra felhasznált állatok védelméről, HL L 276., 2010.10.20., 33. o.
(28)
National Research Council, 1985. Guide for the care and use of laboratory animals. NIH Publication No. 86-23. Washington, D.C., US Dept. of Health and Human Services.
(29)
GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für Versuchstierkunde, 1988). Publication on the Planning and Structure of Animal Facilities for Institutes Performing Animal Experiments. ISBN 3-906255-04-2.
(30)
GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für Versuchstierkunde, 2006). Microbiological monitoring of laboratory animals in various housing systems.
(31)
Diehl K-H, Hull R, Morton D, Pfister R, Rabemampianina Y, Smith D, Vidal J-M, van de Vorstenbosch C. (2001). A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. Journal of Applied Toxicology 21:15-23.
(32)
Weingand K, et al. (1996). Harmonization of Animal Clinical Pathology Testing in Toxicity and Safety Studies. Fund. Appéldául Toxicol. 29: 198-201.
(33)
Crissman J, Goodman D, Hildebrandt P, et al. (2004). Best Practices Guideline: Toxicological Histopathology. Toxicologic Pathology 32: 126-131.
1. függelék
FOGALOMMEGHATÁROZÁS
Vizsgált vegyi anyag: A jelen vizsgálati módszer alkalmazásával vizsgált bármely anyag vagy keverék.
B.33. A KRÓNIKUS TOXICITÁS ÉS A RÁKKELTŐ HATÁS EGYÜTTES VIZSGÁLATA
BEVEZETÉS
1.
A jelen vizsgálati módszer egyenértékű az OECD 453. vizsgálati iránymutatásában (2009) leírt módszerrel. Az eredeti 453. vizsgálati iránymutatást 1981-ben fogadták el. A jelen frissített B.33. vizsgálati módszer kidolgozását az állatjóllét és a szabályozási követelmények terén az elmúlt időszakban bekövetkezett változások figyelembevétele érdekében tartották szükségesnek (1) (2) (3) (4) (5). E B.33. vizsgálati módszer frissítése e melléklet B.32., A rákkeltő hatás vizsgálata című és B.30., Krónikus toxicitási vizsgálatok című fejezetének felülvizsgálatával párhuzamosan történt meg a vizsgálatban alkalmazott állatokra vonatkozó további információk megszerzése, valamint a dózis kiválasztásával kapcsolatos további részletek biztosítása céljából. A jelen vizsgálati módszer vegyi anyagok széles skálájának vizsgálatára szolgál, beleértve a növényvédő szereket és az ipari vegyszereket. Meg kell azonban jegyezni, hogy gyógyszeranyagok esetében néhány részlet és követelmény eltérő lehet (lásd: International Conference on Harmonisation (ICH) Guidance S1B on Testing for Carcinogenicity of Pharmaceuticals).
2.
A krónikus toxicitási vizsgálatok és a rákkeltő hatás meghatározására irányuló vizsgálatok többségét rágcsálófajokon végzik, ezért a jelen vizsgálati módszer elsősorban az e fajokon végzett vizsgálatokra alkalmazandó. Amennyiben az ilyen vizsgálatokat rágcsálóktól eltérő fajokon kell elvégezni, a megfelelő módosításokkal az itt vázolt elvek és eljárások is alkalmazhatók, az e melléklet B.27., 90 napos, ismételt adagolású orális toxicitási vizsgálat nem rágcsálókon című fejezetében (6) vázoltakkal együtt, a krónikus toxicitási vizsgálatok és a rákkeltő hatás meghatározására irányuló vizsgálatok tervezésére és elvégzésére vonatkozó 116. OECD-iránymutatásban leírtak szerint (7).
3.
A krónikus toxicitási vizsgálatok, illetve a rákkeltő hatás meghatározására irányuló vizsgálatok során alkalmazott három fő beadási mód az orális, a dermális és az inhalációs. A beadási mód kiválasztása függ a vizsgált vegyi anyag fizikai és kémiai tulajdonságaitól, valamint az emberi expozíció jellemző módjától. Az expozíciós mód kiválasztására vonatkozó további információk a 116. iránymutatásban találhatók (7).
4.
A jelen vizsgálati módszer az orális expozíciós módra összpontosít, amely a krónikus toxicitási és a rákkeltő hatás meghatározására irányuló vizsgálatok során a leggyakrabban alkalmazott mód. Az emberi egészségre jelentett kockázat értékeléséhez és/vagy bizonyos szabályozási rendszerek előírásai alapján dermális vagy inhalációs expozíciót alkalmazó, hosszú távú vizsgálatok elvégzésére is szükség lehet ugyan, azonban technikai szempontból e két expozíciós mód mindegyike igen összetett. Az ilyen vizsgálatokat eseti alapon kell megtervezni, bár az itt ismertetett, a krónikus toxicitás és a rákkeltő hatás orális beadás útján történő meghatározására és értékelésére szolgáló vizsgálati módszer a kezelési időszakokra, klinikai és patológiai paraméterekre stb. vonatkozó ajánlások tekintetében alapul szolgálhat az inhalációs és/vagy dermális vizsgálatokra vonatkozó protokollhoz. A vizsgált vegyi anyagok inhalációs (7) (8) és dermális (7) módon történő beadásával kapcsolatban OECD-iránymutatások állnak rendelkezésre. E melléklet B.8. (9) és B.29. fejezetét (10), valamint az akut inhalációs vizsgálatra vonatkozó OECD-iránymutatást (8) kifejezetten alkalmazni kell az inhalációs expozíciót alkalmazó, hosszabb távú vizsgálatok tervezése során. A dermális beadással végzett vizsgálatok esetében e melléklet B.9. fejezetét (11) kell alkalmazni.
5.
A krónikus toxicitás és a rákkeltő hatás együttes vizsgálata információt szolgáltat az ismételt, a vizsgált fajok élettartamának akár egészére is kiterjedő expozícióból valószínűsíthetően fakadó egészségügyi kockázatokról. A vizsgálat információkkal szolgál a vizsgált vegyi anyag toxikus hatásairól, beleértve a lehetséges rákkeltő hatást, jelzi a célszerveket és a felhalmozódás lehetőségét. Becslést adhat a toxikus hatások észlelhető káros hatással nem járó szintjére, valamint a nem genotoxikus karcinogének esetében a tumorválaszra nézve, amely felhasználható az emberi expozícióra vonatkozó biztonsági kritériumok meghatározásához. Hangsúlyos szerepet kap az állatok lehető legtöbb információ megszerzése érdekében történő körültekintő klinikai vizsgálatának szükségessége is.
6.
A jelen vizsgálati módszerben ismertetett, krónikus toxicitás, illetve rákkeltő hatás meghatározására irányuló vizsgálatok célkitűzései többek között a következők:
—
a vizsgált vegyi anyag rákkeltő tulajdonságainak meghatározása, amelyek a párhuzamos kontrollcsoportokhoz viszonyítva megnövelik a neoplazmák gyakoriságát, megnövelik a rosszindulatú neoplazmák arányát vagy lerövidítik a neoplazmák megjelenéséhez szükséges időt,
—
a neoplazmák megjelenési idejének meghatározása,
—
a vizsgált vegyi anyag krónikus toxicitásának meghatározása,
—
a krónikus toxicitás és a rákkeltő hatás célszervének (célszerveinek) meghatározása,
—
a dózis-válasz összefüggés jellemzőinek meghatározása,
—
a nem észlelhető káros hatás szintjének (NOAEL) vagy a benchmark-dózis (BMD) meghatározásához szükséges kiindulópontnak a meghatározása,
—
a rákkeltő hatások extrapolálása az alacsony dózisú emberi expozíciós szintekre,
—
a krónikus toxicitás hatásainak előrejelzése az emberi expozíciós szintek vonatkozásában,
—
a hatásmechanizmusra vonatkozó hipotézisek vizsgálatához szükséges adatok biztosítása (2) (7) (12) (13) (14) (15).
KIINDULÁSI MEGFONTOLÁSOK
7.
A vizsgált vegyi anyag potenciális rákkeltő hatásának és krónikus toxicitásának vizsgálata és értékelése során a vizsgálati laboratóriumnak a vizsgált vegyi anyagra vonatkozó összes rendelkezésre álló információt figyelembe kell vennie a vizsgálat megkezdését megelőzően annak érdekében, hogy a vizsgálati terv a vizsgált vegyi anyag toxikológiai tulajdonságainak hatékonyabb vizsgálatára összpontosítson, valamint hogy az állatkísérleteket minimálisra csökkentsük. A feltételezett karcinogén hatásmechanizmusára vonatkozó információk és a hatásmechanizmus figyelembevétele (2) (7) (12) (13) (14) (15) különösen fontos, mivel az optimális terv eltérő lehet attól függően, hogy a vizsgált vegyi anyag ismert vagy feltételezett genotoxikus karcinogén-e. A hatásmechanizmus figyelembevételére vonatkozó további útmutatás a 116. iránymutatásban szerepel (7).
8.
A vizsgálat megtervezését segítő információk többek között a vizsgált vegyi anyag azonossága, kémiai szerkezete, valamint fizikai és kémiai tulajdonságai, a hatásmechanizmusra vonatkozó bármely információ, bármely in vitro vagy in vivo toxicitási vizsgálat eredményei, beleértve a genotoxicitási vizsgálatokéit, a várható felhasználási terület(ek) és az emberi expozíció lehetősége, a szerkezetileg rokon vegyi anyagok rendelkezésre álló (Q)SAR-adatai, mutagenitásra/genotoxicitásra, rákkeltő hatásra vonatkozó és egyéb toxikológiai adatai, a rendelkezésre álló toxikokinetikai adatok (egyszeri dózisra és lehetőség szerint ismételt dózisra vonatkozó kinetikai adatok), valamint egyéb ismételt expozíciós vizsgálatokból származó adatok. A krónikus toxicitást/rákkeltő hatás meghatározása csak a toxicitásra vonatkozó, 28 napos vagy 90 napos ismételt dózisú toxicitási vizsgálatokból származó kezdeti információk megszerzését követően végzendő el. A rák előidézésére, illetve elősegítésére vonatkozó rövid távú vizsgálatok szintén hasznos információkat szolgáltathatnak. Az adott vizsgált vegyi anyag lehetséges egészségkárosító hatásai átfogó vizsgálatának részeként a rákkeltő hatás vizsgálatának fokozatos megközelítését kell megfontolni (16) (17) (18) (19).
9.
Az eredmények elemzése szempontjából legmegfelelőbb statisztikai módszereket az adott kísérleti tervre és célkitűzésekre tekintettel a vizsgálat kezdetét megelőzően kell meghatározni. A megfontolandó kérdések közé tartozik, hogy tartalmazzanak-e a statisztikák a túléléssel kapcsolatos kiigazítást, a kumulatív tumorkockázat túlélési időtartamhoz viszonyított elemzését, a tumor kialakulási idejének elemzését, valamint egy vagy több csoport idő előtti megszüntetése esetén végzett elemzést. A megfelelő statisztikai elemzésekre vonatkozó útmutatást, továbbá a nemzetközileg elfogadott statisztikai módszerekre vonatkozó főbb hivatkozásokat a 116. iránymutatás (7), valamint a krónikus toxicitás és a rákkeltő hatás meghatározására irányuló vizsgálatok elemzésével és értékelésével kapcsolatos 35. iránymutatás (20) tartalmazza.
10.
A rákkeltő hatás meghatározására irányuló vizsgálatok elvégzése során a klinikai tünetek mint a biztonsági értékeléshez használt kísérleti állatok humánus végpontjai felismeréséről, értékeléséről és használatáról szóló OECD-iránymutatásban (21), különösen annak 62. bekezdésében ismertetett vezérelveket és szempontokat minden esetben követni kell. E bekezdés szerint: »Ha az ismételt adagolást alkalmazó vizsgálatok során egy állat progresszív, az állapot további romlásához vezető klinikai tüneteket mutat, tájékozott döntést kell hozni az állat humánus elpusztítására vonatkozóan. A döntéshozatal során mérlegelni kell az állat vizsgálatának folytatása révén szerezhető információk értékét az állat általános állapotához viszonyítva. Ha úgy döntünk, hogy az állatot továbbra is vizsgálni kell, a megfigyelések gyakoriságát szükség szerint növelni kell. Ha ez nem befolyásolja hátrányosan a vizsgálat céljának elérését, lehetséges az adagolás átmeneti szüneteltetése – ha ez csökkenti a fájdalmat vagy a szorongást – vagy a vizsgálati dózis csökkentése.«
11.
A krónikus toxicitás és a rákkeltő hatás meghatározására irányuló vizsgálatok során alkalmazott dózisok kiválasztásnak elveire vonatkozó részletes útmutatás és ezen elvek leírása a 116. iránymutatásban (7), valamint a Nemzetközi Élettudományi Intézet két kiadványában található (22) (23). A fő dózis-kiválasztási stratégia a vizsgálat elsődleges célkitűzésétől vagy célkitűzéseitől függ (6. bekezdés). A megfelelő dózisszintek kiválasztásakor egyensúlyt kell találni egyfelől a veszélyesség vizsgálata, másfelől az alacsony dózisra adott válaszok jellemzése és azok relevanciája között. Ez különösen lényeges a krónikus toxicitás és a rákkeltő hatás együttes vizsgálata esetében.
12.
Meg kell fontolni a krónikus toxicitás és a rákkeltő hatás együttes vizsgálatának elvégzését a krónikus toxicitási vizsgálat (e melléklet B.30. fejezete) és a rákkeltő hatás vizsgálatának (e melléklet B.32. fejezete) külön-külön történő elvégzése helyett. A két külön vizsgálat elvégzéséhez viszonyítva az együttes vizsgálat idő- és költséghatékonyabb, valamint a használt állatok számának némi csökkenésével jár, anélkül hogy befolyásolná az adatok minőségét a krónikus fázisban vagy a karcinogenitási fázisban. A krónikus toxicitás és a rákkeltő hatás együttes vizsgálata során azonban körültekintően figyelembe kell venni a dóziskiválasztás elveit (11. és 22–26. bekezdés), továbbá azt is meg kell jegyezni, hogy bizonyos szabályozási keretrendszerek a vizsgálatok külön-külön történő elvégzését írhatják elő. A krónikus toxicitás és a rákkeltő hatás együttes vizsgálatának oly módon történő megtervezésére vonatkozóan, hogy az állatok száma csökkentésének lehetősége szempontjából és a különböző kísérleti eljárások egyszerűsítése révén elérhető legyen a vizsgálat maximális hatékonysága, a 116. iránymutatás (7) tartalmaz további útmutatást.
13.
A jelen vizsgálati módszerrel összefüggésében használt fogalmak meghatározása a jelen fejezet végén és a 116. iránymutatásban található (7).
A VIZSGÁLAT ELVE
14.
A vizsgálati terv két párhuzamos fázist tartalmaz: egy krónikus fázist és egy rákkeltő fázist (az időtartamot lásd a 34. és a 35. bekezdésben). A vizsgált vegyi anyagot általában orális úton juttatjuk be, azonban az inhalációs vagy dermális bejuttatással történő vizsgálat is megfelelő lehet. A krónikus fázis esetében a vizsgált vegyi anyagot naponta adjuk be fokozatos dózisokban a kísérleti állatok több csoportjának, csoportonként egy dózisszintet alkalmazva, általában 12 hónapig, bár hosszabb és rövidebb időtartam is választható a szabályozási követelményektől függően (lásd a 34. bekezdést). A kiválasztott időtartamnak elég hosszúnak kell lennie ahhoz, hogy lehetővé tegye a kumulatív toxicitás esetleges hatásainak megjelenését a geriátriai változások zavaró hatásai nélkül. A vizsgálati terv egy vagy több időközi elpusztítást is tartalmazhat, például a 3. és a 6. hónapot követően, és állatok további csoportjai vonhatók be ennek kiegyenlítése érdekében (lásd a 20. bekezdést). A rákkeltő fázis esetében a vizsgált vegyi anyagot naponta adjuk be a vizsgált állatok több csoportjának az élettartamuk jelentős részén keresztül. Az állatokat mindkét fázisban gondosan megfigyeljük a toxicitás jeleinek és a neoplasztikus elváltozások kialakulásának észlelése érdekében. A vizsgálat során elpusztult vagy elpusztított állatokat felboncoljuk, továbbá a vizsgálat befejezése után az életben maradt állatokat is elpusztítjuk és felboncoljuk.
A MÓDSZER LEÍRÁSA
Az állatfaj kiválasztása
15.
A jelen vizsgálati módszer elsősorban a krónikus toxicitás és a rákkeltő hatás rágcsálókban történő vizsgálatával és értékelésével foglalkozik (2. bekezdés). A rágcsálóktól eltérő fajok használata fontolóra vehető, ha a rendelkezésre álló adatok arra utalnak, hogy az ilyen fajok relevánsabbak az emberekre gyakorolt egészségi hatások előrejelzése tekintetében. A faj kiválasztását indokolni kell. Az előnyben részesítendő rágcsálófaj a patkány, de más rágcsálófaj, például az egér is használható. Habár az egér használatának hasznossága a rákkeltő hatás meghatározására irányuló vizsgálatok során korlátozott lehet (24) (25) (26), néhány jelenlegi szabályozási program megköveteli a rákkeltő hatás egereken történő vizsgálatát, hacsak nem nyert megállapítást, hogy az ilyen vizsgálat tudományos szempontból nem szükséges. A patkányok és az egerek a viszonylag rövid élettartamuk, gyógyszerészeti és toxikológiai vizsgálatokban elterjedt használatuk, a tumorindukcióra való fogékonyságuk, valamint a megfelelően jellemzett törzsek rendelkezésre állása miatt preferált kísérleti modellek. E tulajdonságok eredményeképpen nagy mennyiségű információ áll rendelkezésre fiziológiájukról és patológiájukról. A rágcsálótól eltérő fajokon történő, krónikus toxicitás/rákkeltő hatás meghatározására irányuló vizsgálatok tervezésének és elvégzésének adott esetben a jelen vizsgálati módszerben ismertetett elveken, valamint az e melléklet B.27., 90 napos, ismételt adagolású orális toxicitási vizsgálat nem rágcsálókon című fejezetében (6) leírtakon kell alapulnia. A faj és törzs kiválasztására vonatkozó további információk a 116. iránymutatásban találhatók (7).
16.
Általánosan használt laboratóriumi törzsekből származó egészséges, fiatal, ivarérett állatokat kell alkalmazni. A krónikus toxicitás/rákkeltő hatás együttes vizsgálatát olyan állatokon kell elvégezni, amelyek törzse és eredete megegyezik a rövidebb időtartamú előzetes toxicitási vizsgálat(ok)ban felhasznált állatokéval, habár ha ismert, hogy az ehhez a törzshöz tartozó és ilyen eredetű állatoknál problémák jelentkeznek a hosszú távú vizsgálatok esetében általánosan elfogadott túlélési szempontok teljesítése tekintetében (lásd a 116. iránymutatást (7)), fontolóra kell venni egy, a hosszú távú vizsgálatok esetében elfogadható túlélési aránnyal rendelkező állattörzs használatát. Olyan nőstényeket kell választani, amelyek még egyszer sem ellettek, és nem vemhesek.
Tartási és etetési körülmények
17.
Az állatokat külön, vagy azonos nemű egyedekből álló kis csoportokban kell tartani; a külön történő tartást csak akkor kell fontolóra venni, ha az tudományos szempontból indokolt (27) (28) (29). A ketreceket úgy kell elrendezni, hogy minimálisra lehessen csökkenteni a ketrec elhelyezésének lehetséges hatásait. A kísérleti állatok tartására szolgáló helyiség hőmérséklete 22 °C (± 3 °C) kell, hogy legyen. Noha a helyiség relatív páratartalmának legalább 30 %-nak kell lennie, és – a takarítás időtartamától eltekintve – lehetőség szerint nem szabad meghaladnia a 70 %-ot, a célértéknek 50–60 % között kell lennie. A világítás legyen mesterséges, 12 órás világos és 12 órás sötét periódusok váltsák egymást. Az etetéshez hagyományos laboratóriumi takarmány alkalmazható, korlátlan mennyiségű ivóvíz biztosítása mellett. A takarmánynak meg kell felelnie a vizsgált faj összes tápanyagigényének, és a vizsgálat eredményét esetlegesen befolyásoló takarmány-szennyeződések mennyiségének – beleértve többek között a növényvédőszer-maradványokat, a perzisztens szerves szennyező anyagokat, a fitoösztrogéneket, a nehézfémeket és a mikotoxinokat – a lehető legalacsonyabbnak kell lennie. A tápanyagokban és takarmányokban lévő szennyező anyagok szintjére vonatkozó analitikai információkat időszakos jelleggel kell meghatározni, legalább a vizsgálat kezdetekor, valamint amikor változás következik be a felhasznált adagban, és ezeket az információkat a zárójelentésben közölni kell. A vizsgálat során felhasznált ivóvízre vonatkozó analitikai információkat hasonló módon kell megadni. A vizsgált vegyi anyag táplálékkal történő beadása esetén a takarmány megválasztását befolyásolhatja annak szükségessége, hogy az megfelelően keveredjen el a takarmánnyal és kielégítse az állatok táplálkozási igényeit.
Az állatok előkészítése
18.
A laboratóriumi körülményekhez legalább 7 napig szoktatott, egészséges állatokat kell használni, amelyek korábban nem voltak kitéve kísérleti eljárásoknak. Rágcsálók esetében az állatoknak történő adagolást az elválasztást és szoktatást követően a lehető leghamarabb, és lehetőleg az állatok 8 hetes kora előtt meg kell kezdeni. A kísérleti állatokat faj, törzs, eredet, nem, súly és életkor szerint kell jellemezni. A vizsgálat kezdetén az állatok súlya az egyes nemeken belül csak minimálisan térhet el egymástól, a vizsgálatban használt összes állat súlyának átlagos értékétől pedig legfeljebb ± 20 %-kal különbözhet mindkét nem esetében. Az állatokat véletlenszerűen kell besorolni a kontroll- és kezelt csoportokba. A véletlenszerű kiválasztást követően nem lehet lényeges különbség az egyes nemeken belül a csoportok átlagos testsúlya között. Ha statisztikailag szignifikáns különbségek fordulnak elő, a véletlenszerű kiválasztás lépését lehetőség szerint meg kell ismételni. Minden egyes állatnak egyedi azonosító számot kell kapnia, és minden egyes állatot maradandóan meg kell jelölni ezzel a számmal tetoválás, mikrochip-beültetés vagy más megfelelő módszer segítségével.
ELJÁRÁS
Az állatok száma és neme
19.
A vizsgálathoz mindkét nemet fel kell használni. Megfelelő számú állatot kell használni az alapos biológiai és statisztikai értékelés lehetővé tétele érdekében. Rágcsálók esetében ezért a vizsgálat karcinogenitási fázisára szánt minden egyes dóziscsoport (a 22. bekezdésben leírtak szerint) és kísérő kontrollcsoport nemenként legalább 50 állatból kell álljon. A vizsgálat céljától függően a főbb becslések statisztikai ereje növelhető lehet az állatok különböző dóziscsoportokba történő egyenlőtlen elosztásával oly módon, hogy több mint 50 állatnak kell lennie az alacsony dózisú csoportokban, például az alacsony dózisok karcinogenitásának becslése céljából. Meg kell azonban jegyezni, hogy a csoport méretének mérsékelt növelése viszonylag kis mértékben növeli a vizsgálat statisztikai erejét. Rágcsálók esetében a vizsgálat krónikus toxicitási fázisára szánt minden egyes dóziscsoport (a 22. bekezdésben leírtak szerint) és kísérő kontrollcsoport nemenként legalább 10 állatból kell álljon. Meg kell jegyezni, hogy ez a szám alacsonyabb, mint a krónikus toxicitási vizsgálatnál (e melléklet B.30. fejezete). Az együttes vizsgálat krónikus toxicitási fázisában vizsgált, csoportonként kisebb számú állattól származó adatok értelmezését ugyanakkor a vizsgálat karcinogenitási fázisában vizsgált, nagyobb számú állattól származó adatokkal lehet alátámasztani. Az egerekkel végzett vizsgálatok esetében a krónikus toxicitási fázisban további állatok bevonása lehet szükséges minden egyes dóziscsoportban az összes előírt hematológiai meghatározás elvégzése céljából. A vizsgálat statisztikai tervezéséről és a dózisszinteknek a statisztikai erő maximális szintre való növelése érdekében történő kiválasztásáról további információk a 116. iránymutatásban (7) találhatók.
Időközi elpusztításra, kísérő csoportra és jelzőállatokra vonatkozó rendelkezések
20.
Amennyiben ez tudományos szempontból indokolt, a vizsgálat a nem neoplasztikus elváltozások alakulására vonatkozó és mechanisztikai információk megszerzése céljából előírhatja az időközi elpusztítást, például a krónikus toxicitási fázis esetén a 6. hónapban. Abban az esetben, ha ilyen információk a vizsgált vegyi anyaggal végzett korábbi, ismételt adagolású toxicitási vizsgálatokból már rendelkezésre állnak, az időközi elpusztítás tudományos szempontból nem feltétlenül indokolt. A vizsgálat krónikus toxicitási fázisában általában 12 hónapon keresztül használt állatok (34. bekezdés) időközi elpusztítással kapcsolatos adatokat szolgáltatnak a vizsgálat karcinogenitási fázisához, ezzel csökkentve az összesen felhasznált állatok számát. Kísérő csoportok is bevonhatók a vizsgálat krónikus toxicitási fázisába a vizsgált vegyi anyag által esetlegesen okozott toxikológiai változások visszafordíthatóságának megfigyelése céljából. E csoportok vizsgálata korlátozódhat a vizsgálat legnagyobb dózisával való kezelésre és kontrollvizsgálatra. Szükség szerint egy jelzőállatokból álló további (jellemzően nemenként 5 állatból álló) csoport is bevonható a betegség állapotának a vizsgálat közben történő megfigyelése céljából (30). A vizsgálat időközi elpusztításokat, kísérő csoportokat és jelzőállatokat magában foglaló, és egyúttal az összesen felhasznált állatok számát minimálisra csökkentő megtervezésével kapcsolatban a 116. iránymutatásban (7) található további útmutatás.
21.
Ha a vizsgálati terv kísérő csoportot és/vagy időközi elpusztítást tartalmaz, az erre a célra bevont állatok száma rendszerint minden egyes dóziscsoportban nemenként 10, a vizsgálati tervben szereplő állatok teljes számát pedig annyival kell megnövelni, ahány állat elpusztítását tervezzük a vizsgálat befejezése előtt. Az időközben elpusztított és a kísérő csoportban lévő állatokat általában ugyanazoknak a megfigyeléseknek kell alávetni, mint a fő vizsgálat krónikus toxicitási fázisában vizsgált állatokat, beleértve a testsúlyra, táplálék-/vízfogyasztásra, hematológiára és klinikai kémiára vonatkozó méréseket, valamint patológiai vizsgálatokat, de előírható (az időközi elpusztítás céljából bevont csoportoknál), hogy a mérések csak bizonyos főbb paraméterekre, például a neurotoxicitásra vagy az immuntoxicitásra korlátozódjanak.
Dóziscsoportok és adagolás
22.
A dózis kiválasztásának és a dózisszintek felosztásának összes szempontjára vonatkozó útmutatás a 116. iránymutatásban található (7). Legalább három dózisszintet és egy ezzel párhuzamos kontrollt kell alkalmazni, a krónikus és a karcinogenitási fázishoz egyaránt. A dózisszintek megválasztása általában a rövidebb távú ismételt adagolású vagy tartománybehatároló vizsgálatok eredményein alapul, figyelembe véve a vizsgált vegyi anyagra vagy rokon vegyi anyagokra vonatkozóan rendelkezésre álló bármilyen toxikológiai és toxikokinetikai adatot.
23.
A vizsgálat krónikus toxicitási fázisa esetében a három dózisszintet alkalmazó teljes vizsgálat nem feltétlenül szükséges, ha előre jelezhető, hogy az egyetlen, legalább 1 000 mg/testsúlykilogramm/nap dózisnak megfelelő dózisszinttel végzett vizsgálat valószínűleg nem okoz kedvezőtlen hatásokat. Ennek az előrejelzésnek előzetes vizsgálatokból származó információkon, valamint azon a megfontoláson kell alapulnia, hogy a szerkezetileg rokon anyagokkal kapcsolatos adatok alapján nem várható toxicitás. 1 000 mg/testsúlykilogramm/nap határadag alkalmazható, kivéve, ha a humán expozíció magasabb dózisszint használatát indokolja.
24.
Ha a vizsgált vegyi anyag fizikai és kémiai jellege vagy biológiai hatásai nem szabnak ennek korlátot, a legmagasabb dózisszintet olyan módon kell kiválasztani, hogy az alkalmas legyen az elsődleges célszervek és toxikus hatások meghatározására, ugyanakkor elkerülhető legyen a szenvedés, a súlyos toxicitás, a morbiditás vagy az elhullás. A legmagasabb dózisszintet általában úgy kell megválasztani, hogy toxicitást váltson ki, amely például a testsúly növekedésének (körülbelül 10 %-os) visszaesésével bizonyítható. A vizsgálat célkitűzéseitől függően azonban (lásd a 6. bekezdést) a toxicitást bizonyíthatóan kiváltó dózisnál alacsonyabb maximális dózis is választható, például ha egy dózis káros hatást idéz elő, amely azonban csak kismértékben befolyásolja az élettartamot vagy a testsúlyt.
25.
A dózisszintek és azok felosztása megválasztható úgy, hogy meghatározható legyen a dózis-válasz összefüggés, valamint a vizsgált vegyi anyag hatásmechanizmusától függően a NOAEL vagy a vizsgálat egyéb tervezett kimenetele, például a BMD (lásd a 27. bekezdést). Az alacsonyabb dózis kiválasztása során figyelembe veendő tényezők többek között a dózis-válasz görbe várható meredeksége, azok a dózisok, amelyeknél fontos változások következhetnek be a metabolizmusban vagy a toxikus hatás mechanizmusában, amelyeknél küszöbérték várható, vagy amelyeknél az alacsony dózis extrapolálásához használható kiindulási pont várható. A rákkeltő hatás/krónikus toxicitás együttes vizsgálatának elsődleges célja a karcinogenitási kockázatértékelést szolgáló információk megszerzése, a krónikus toxicitásra vonatkozó információk megszerzése pedig rendszerint másodlagos cél. Ezt szem előtt kell tartani a vizsgálat dózisszintjeinek és a dózisszintek felosztásának kiválasztásakor.
26.
A dózisszintek felosztásának kiválasztása függ a vizsgálat célkitűzéseitől és a vizsgált vegyi anyag jellemzőitől, és nem írható elő részletesen a jelen vizsgálati módszerben, ugyanakkor csökkenő dózisszintek meghatározásához gyakran optimális a 2–4-szeres intervallumok alkalmazása, az adagolások közötti nagyon nagy intervallumok (például körülbelül 6–10-nél magasabb szorzófaktor) alkalmazásával szemben pedig gyakran előnyben részesítendő egy negyedik vizsgálati csoport beiktatása. A 10-nél magasabb szorzófaktorokat általában kerülni kell, és használatukat meg kell indokolni.
27.
A 116. iránymutatásban részletesebben leírtak szerint (7) a dózis kiválasztásakor figyelembe veendő szempontok többek között a következők:
—
ismert vagy feltételezett nemlinearitások vagy elhajlási pontok a dózis-válasz görbén,
—
toxikokinetika, valamint azok a dózistartományok, amelyek esetében a metabolikus indukció, a telítettség vagy a külső és belső dózisok közötti nemlinearitás előfordul, vagy nem fordul elő,
—
prekurzor elváltozások, hatásmarkerek vagy a főbb mögöttes biológiai folyamatok működésének mutatói,
—
a hatásmechanizmus főbb (vagy feltételezett) aspektusai, például azok a dózisok, amelyeknél megjelenik a citotoxicitás, felborulnak a hormonszintek és a homeoszatikus mechanizmusok stb.,
—
a dózis-válasz görbe azon területei, ahol különösen pontos becslés szükséges, például a várt BMD vagy egy feltétezett küszöbérték tartományában,
—
a várható humán expozíciós szintek figyelembevétele, különösen a közepes és alacsony dózis kiválasztása során.
28.
Kontrollcsoportként egy kezeletlen csoport, vagy ha a vizsgált vegyi anyag beadásához vivőanyagot használunk, egy vivőanyaggal kezelt kontrollcsoport alkalmazandó. A kontrollcsoportba tartozó állatokat a vizsgált vegyi anyag beadásától eltekintve ugyanolyan módon kell kezelni, mint a vizsgálati csoportokban lévőket. Vivőanyag alkalmazása esetén a kontrollcsoportban a vivőanyagot a dóziscsoportokban alkalmazott legnagyobb mennyiségben kell beadni. Ha a vizsgált vegyi anyagot a táplálékkal adjuk be, és emiatt a táplálékfogyasztás a táplálék lecsökkent ízletessége miatt jelentősen csökken, hasznos lehet egy párban etetett kontrollcsoport alkalmazása a megfelelőbb kontroll biztosítása érdekében.
A dózisok előkészítése és a vizsgált vegyi anyag beadása
29.
A vizsgált vegyi anyagot általában orálisan, a takarmánnyal vagy az ivóvízzel, vagy gyomorszonda segítségével adjuk be. A bejuttatás útvonalára és módjára vonatkozó további információk a 116. iránymutatásban találhatók (7). A bejuttatás útvonala és módja függ a vizsgálat céljától, a vizsgált vegyi anyag fizikai/kémiai tulajdonságaitól, biológiai hozzáférhetőségétől, valamint az emberi expozíció meghatározó útvonalától és módjától. A bejuttatás útvonalának és módjának kiválasztását indokolni kell. Állatjóléti okokból gyomorszonda rendszerint csak olyan hatóanyagoknál alkalmazandó, amelyek esetében a bejuttatásnak ez az útvonala és módja ésszerűen tükrözi a lehetséges humán expozíciót (például gyógyszerek esetében). A táplálékban vagy környezetben előforduló vegyi anyagok, többek között a növényvédő szerek esetében a beadás jellemzően a táplálékon vagy az ivóvízen keresztül történik. Néhány forgatókönyv, például a munkahelyi expozíció esetében ugyanakkor a beadás egyéb útvonalai megfelelőbbnek bizonyulhatnak.
30.
A vizsgált vegyi anyagot szükség esetén feloldjuk vagy szuszpendáljuk alkalmas vivőanyagban. Adott esetben figyelembe kell venni a vivőanyag és más adalékanyagok következő tulajdonságait: a vizsgált vegyi anyag felszívódására, eloszlására, metabolizmusára vagy visszamaradására gyakorolt hatások, a vizsgált vegyi anyag kémiai tulajdonságaira gyakorolt azon hatások, amelyek módosíthatják annak toxikus jellemzőit, valamint az állatok táplálék- és vízfogyasztására vagy tápláltsági állapotára gyakorolt hatások. Lehetőség szerint elsősorban vizes oldatot/szuszpenziót ajánlatos alkalmazni, másodsorban olajos (például kukoricacsíra-olajban elkészített) oldatot vagy emulziót, és csak harmadsorban más vivőanyagokban elkészített oldatot. A víztől eltérő vivőanyagok esetében ismerni kell a vivőanyag toxikológiai tulajdonságait. A vizsgált vegyi anyag beadási körülmények közötti (például takarmánnyal történő beadás során fennálló) stabilitására és (adott esetben) a beadáshoz használt oldatok vagy takarmányok homogenitására vonatkozó információknak rendelkezésre kell állniuk.
31.
A takarmánnyal vagy ivóvízzel adagolt vegyi anyagok esetében fontos biztosítani, hogy a vizsgált vegyi anyag beadott mennyisége ne zavarja meg a szokásos táplálékfelvételt vagy a vízháztartás egyensúlyát. A takarmánnyal történő beadást alkalmazó hosszú távú toxicitási vizsgálatok esetében a takarmányban lévő vizsgált vegyi anyag koncentrációja a kiegyensúlyozatlan táplálkozás elkerülése érdekében általában nem haladhatja meg a teljes takarmány 5 %-át. Ha a vizsgált vegyi anyagot a takarmányba keverve adjuk be, akkor vagy állandó takarmánykoncentráció (mg/takarmánykilogramm vagy ppm), vagy az állatok testsúlyára heti rendszerességgel kiszámított állandó dózisszint (mg/testsúlykilogramm) alkalmazható. A kiválasztott alternatívát meg kell nevezni.
32.
Orális úton történő beadás esetén a vizsgált vegyi anyagot naponta kell az állatoknak beadni (heti hét napon keresztül) 12 hónapon (krónikus toxicitási fázis) vagy 24 hónapon át (karcinogenitási fázis), lásd még a 33. és a 34. bekezdést. Bármely más adagolási rendszer – például heti öt napon történő beadás – használatát indokolni kell. Dermális úton történő beadás esetén az állatokat az e melléklet B.9. fejezetében meghatározottak szerint általában legalább napi 6 órán keresztül, heti 7 napon kell a vizsgált vegyi anyaggal kezelni 12 hónapon (krónikus toxicitási fázis) vagy 24 hónapon át (karcinogenitási fázis). Az inhaláció útján történő expozíciót napi 6 órán keresztül, heti 7 nap kell elvégezni, de indokolt esetben heti 5 napos expozíció is alkalmazható. Az expozíció időtartama általában 12 hónap (krónikus toxicitási fázis) vagy 24 hónap (karcinogenitási fázis). Patkányoktól eltérő rágcsálófajok csak orron át történő expozíciója esetén az expozíció maximális időtartama kiigazítható a fajspecifikus szorongás minimalizálása érdekében. A napi 6 óránál rövidebb expozíciós időtartam alkalmazását indokolni kell. Lásd még e melléklet B.8. fejezetét (9).
33.
Ha a vizsgált vegyi anyagot szondán át adagoljuk, a dózist mindig a nap hasonló időszakában, gyomorszondán vagy megfelelő intubációs kanülön át kell beadni az állatoknak. Általában egyetlen dózist kell beadni naponta egyszer; abban az esetben, ha a vegyi anyag például helyi irritációt okoz, a napi dózisarány fenntartható lehet elosztott (napi kétszeri) beadással. Az egy alkalommal beadható folyadék maximális mennyisége a kísérleti állat méretétől függ. A mennyiséget a lehető legalacsonyabb szinten kell tartani, és rágcsálók esetében általában nem haladhatja meg az 1 ml/100 testsúlygramm térfogatot (31). A koncentráció megfelelő beállításával a minimálisra kell csökkenteni a vizsgált anyag mennyiségének változásait, hogy valamennyi dózisszinten konstans mennyiséget lehessen adagolni. A fentiek alól kivételt jelentenek az esetlegesen maró vagy irritatív hatást kiváltó anyagok, amelyeket hígítani kell a súlyos helyi hatások elkerülése érdekében. Kerülni kell az emésztőrendszerben valószínűsíthetően maró vagy irritatív hatást kiváltó koncentrációkkal történő vizsgálatokat.
A vizsgálat időtartama
34.
Az adagolási időszak és a vizsgálat krónikus toxicitási fázisának időtartama általában 12 hónap, bár a vizsgálati terv az adott szabályozási rendszer követelményeitől vagy bizonyos mechanisztikai céloktól függően lehetővé teszi a rövidebb (például 6 vagy 9 hónapos) vagy hosszabb (például 18 vagy 24 hónapos) időtartamú vizsgálatokat, illetve alkalmazható ilyen időtartamú vizsgálatok során is. A 12 hónapos expozíciós időtartamtól való eltérést indokolni kell, különösen a rövidebb időtartamok esetében. Az ehhez a fázishoz hozzárendelt összes dóziscsoportot a krónikus toxicitás értékelése és a nem neoplasztikus patológiai vizsgálatok céljából meg kell szüntetni a meghatározott időpontban. A vizsgált vegyi anyag által esetlegesen okozott toxikológiai változások visszafordíthatóságának megfigyelése céljából bevont kísérő csoportokat az expozíció megszüntetését követően legalább 4 hétig, de legfeljebb a vizsgálat teljes időtartamának egyharmadáig fenn kell tartani adagolás nélkül.
35.
A vizsgálat karcinogenitási fázisának időtartama rágcsálók esetében általában 24 hónap, amely a felhasznált állatok normális élettartamának legnagyobb részére kiterjed. A vizsgált állattörzs élettartamától függően rövidebb vagy hosszabb vizsgálati időtartamok is alkalmazhatók, de ezt meg kell indokolni. Bizonyos egértörzsek, például az AKR/J, a C3H/J vagy a C57BL/6J törzs esetében a 18 hónapos időtartam megfelelőbb lehet. A következőkben iránymutatás olvasható a vizsgálat idejével és befejezésével, valamint a túléléssel kapcsolatban; további, többek között a negatív karcinogenitás túlélési arányhoz viszonyított elfogadhatóságának megfontolásával kapcsolatos útmutatás a 116. iránymutatásban (7) található:
—
Meg kell fontolni a vizsgálat befejezését, ha az életben maradt állatok száma az alacsonyabb dózissal kezelt csoportokban vagy a kontrollcsoportban 25 százalék alá csökken.
—
Abban az esetben, ha csak a magas dózissal kezelt csoportban figyelhető meg idő előtti elhullás a toxicitás következtében, a vizsgálatot nem kell befejezni.
—
Az életben maradt egyedek számát nemenként külön-külön kell figyelembe venni.
—
A vizsgálat nem tarthat tovább annál a pontnál, amikor a vizsgálat révén nyert adatok már nem elegendőek a statisztikailag érvényes értékelés lefolytatásához.
MEGFIGYELÉSEK (KRÓNIKUS TOXICITÁSI FÁZIS)
36.
Rendszerint a nap elején és végén – beleértve a hétvégéket és az ünnepnapokat is – az összes állatot meg kell vizsgálni, hogy nem mutatja-e megbetegedés jeleit vagy nem hullott-e el. Általános klinikai megfigyelést naponta legalább egyszer kell végezni, lehetőleg minden nap ugyanazon időpont(ok)ban, szondával történő adagolás esetén figyelembe véve az adagolást követően várható hatások érvényesülésének csúcsidőszakát.
37.
Az első expozíció előtt legalább egyszer (az egyedek közötti összehasonlítás érdekében), a vizsgálat első hetének végén, azt követően pedig havonta egyszer az összes állatot részletes klinikai megfigyeléseknek kell alávetni. A megfigyelési protokollt úgy kell kialakítani, hogy az egyes megfigyelők közötti különbségek minimálisak legyenek, és függetlenek legyenek a vizsgált csoportoktól. E megfigyeléseket az állatok tartására egyébként használt ketreceken kívül, lehetőleg egy szabványos karámban, minden alkalommal a nap hasonló időszakában kell elvégezni. A megfigyeléseket gondosan fel kell jegyezni, lehetőleg a vizsgálatokat végző laboratórium által kifejezetten meghatározott pontozásos rendszer segítségével. Törekedni kell arra, hogy a megfigyelési körülmények közötti különbségek minimálisak legyenek. A feljegyzett észleléseknek ki kell terjedniük többek között a bőr, a szőrzet, a szemek és a nyálkahártyák állapota, a váladékok és kiválasztott anyagok előfordulása, valamint az autonóm aktivitás (például könnyezés, szőrzet felborzolódása, pupillaméret, szokatlan légzési ritmusok) tekintetében megfigyelhető változásokra. A járás, a testtartás és a kézbevételre adott reakció megváltozását, valamint a klónusos vagy tónusos görcsök, sztereotip viselkedés (például túlzott mosdás, megkergülés) vagy bármilyen bizarr viselkedésmód (például öncsonkítás, hátrafelé járás) megfigyelt eseteit is fel kell jegyezni (32).
38.
A vizsgált vegyi anyag első beadását szemtükörrel vagy más, megfelelő eszközzel végzett szemészeti vizsgálat előzi meg, amelyet az összes állaton el kell végezni. E vizsgálatot a vizsgálatsorozat végén meg kell ismételni, lehetőleg az összes állaton, de legalább a magas dózissal kezelt és kontrollcsoportok tagjain. Ha a szemben a kezeléssel összefüggő elváltozást tapasztalunk, az összes állatot meg kell vizsgálni. Ha szerkezeti elemzés vagy egyéb információ szemtoxicitásra utal, a szemvizsgálatot gyakrabban kell elvégezni.
39.
Az olyan vegyi anyagok esetében, amelyeknél a korábbi, ismételt adagolású, 28 napos és/vagy 90 napos toxicitási vizsgálatok lehetséges neurotoxikus hatásokat jeleztek, a vizsgálat megkezdését megelőzően, valamint a vizsgálat kezdetét követő 12. hónap végéig 3 hónapos időközönként, továbbá a vizsgálat végén (ha az tovább tart 12 hónapnál) elvégezhető a különböző típusú ingerekre (32) (például hallószervi, vizuális, önérzékelési ingerek) mutatott érzékszervi reakciók vizsgálata (33) (34) (35), a szorítás erejének értékelése (36) és a motoros aktivitás felmérése (37). A követendő eljárásokkal kapcsolatban további részletek a vonatkozó szakirodalomban találhatók. Ettől függetlenül a hivatkozottaktól eltérő alternatív eljárások is alkalmazhatók.
40.
Az olyan vegyi anyagok esetében, amelyeknél a korábbi, ismételt adagolású, 28 napos és/vagy 90 napos toxicitási vizsgálatok lehetséges immuntoxikus hatásokat jeleztek, e végpont további vizsgálatát lehet végezni a vizsgálat végén.
Testsúly, táplálék-/vízfogyasztás és táplálékhasznosítási képesség
41.
A kezelés kezdetekor, az első 13 hét során legalább hetente egyszer, ezután pedig legalább havonta egyszer meg kell mérni az összes állat testsúlyát. A táplálékfogyasztást és a táplálékhasznosítási képességet a vizsgálat első 13 hetében legalább hetente, azt követően pedig legalább havonta egyszer kell mérni. Ha a vizsgált vegyi anyagot ivóvízzel adjuk be, a vízfogyasztást a vizsgálat első 13 hetében legalább hetente, azt követően pedig legalább havonta egyszer kell mérni. A vízfogyasztás mérését olyan vizsgálatok esetében is fontolóra kell venni, amelyek során az ivási szokások megváltoznak.
Hematológiai és klinikai biokémiai vizsgálatok
42.
A rágcsálókon végzett vizsgálatok esetében az összes vizsgált állaton (csoportonként 10 hímen és 10 nőstényen) hematológiai vizsgálatokat kell végezni a 3., 6. és 12. hónapban, valamint a vizsgálat végén (ha az hosszabb, mint 12 hónap). Az egereken végzett vizsgálatok esetében kísérő csoportra lehet szükség az összes előírt hematológiai vizsgálat elvégzése céljából (lásd a 19. bekezdést). A nem rágcsálókon végzett vizsgálatok esetében kisebb számú (kutyákon végzett kísérleteknél például nemenként 4) állattól kell mintát venni köztes mintavételi időpontokban, valamint a vizsgálat végén, a rágcsálók esetében leírtak szerint. Ha a korábbi, hasonló dózisszintekkel elvégzett 90 napos vizsgálatok nem mutattak változást a hematológiai paraméterek vonatkozásában, a vizsgálat 3. hónapjában nem szükséges méréseket végezni, rágcsálók és egyéb fajok esetében sem. Vérmintákat meghatározott helyről kell venni, például a szívből vagy a szemgolyó mögötti üregből altatás alatt.
43.
Az alábbi paramétereket kell vizsgálni (38): teljes és differenciált leukocitaszám, eritrocitaszám, trombocitaszám, hemoglobinkoncentráció, hematokrit (vérsejtsüllyedés), átlagos sejttérfogat (MCV), eritrociták átlagos hemoglobintartalma (MCH), eritrociták átlagos hemoglobinkoncentrációja (MCHC), prothrombin idő, valamint aktivált parciális tromboplasztin idő. A vizsgált vegyi anyag toxicitásától függően szükség szerint egyéb hematológiai paramétereket, például Heinz-testeket vagy egyéb atipikus eritrocitamorfológiát vagy methemoglobint is lehet mérni. Általánosságban elmondható, hogy rugalmas megközelítés alkalmazandó, amely az adott vizsgált vegyi anyag megfigyelt és/vagy várható hatásaitól egyaránt függ. Ha a vizsgált vegyi anyag a vérképző rendszerre hat, a retikulocitaszám és a csontvelőcitológia is feltüntethető, habár ezek vizsgálatát nem szükséges rutinszerűen elvégezni.
44.
A szövetekben jelentkező fontosabb toxikus hatások és különösen a vesékre és a májra gyakorolt hatás vizsgálata érdekében a klinikai biokémiai értékek meghatározását az összes vizsgált állattól (csoportonként 10 hím és 10 nőstény egyedtől) vett vérmintákból kell elvégezni a hematológiai vizsgálatokhoz meghatározott időközönként. Az egereken végzett vizsgálatok esetében kísérő csoportra lehet szükség az összes előírt klinikai biokémiai vizsgálat elvégzése céljából. A nem rágcsálókon végzett vizsgálatok esetében kisebb számú (kutyákon végzett kísérleteknél például nemenként 4) állattól kell mintát venni köztes mintavételi időpontokban, valamint a vizsgálat végén, a rágcsálók esetében leírtak szerint. Ha a korábbi, hasonló dózisszintekkel elvégzett 90 napos vizsgálatok nem mutattak változást a klinikai biokémiai paraméterek vonatkozásában, a vizsgálat 3. hónapjában nem szükséges méréseket végezni, rágcsálók és egyéb fajok esetében sem. A vérvétel előtti éjszaka ajánlatos az állatokat koplaltatni (kivéve egerek esetében) (3). A következő paramétereket kell vizsgálni (38): glükóz, karbamid (karbamid-nitrogén), kreatinin, teljes fehérje, albumin, kalcium, nátrium, kálium, teljes koleszterin, legalább két értékelhető minta a májsejtek értékeléséhez (alanin-aminotranszferáz, aszpartát-aminotranszferáz, glutamát-dehidrogenáz, teljes epesav) (39), valamint legalább két értékelhető minta a máj és az eperendszer értékeléséhez (alkáli foszfatáz, gamma-glutamil-transzpeptidáz, 5’-nukleotidáz, teljes bilirubin, teljes epesav) (39). A vizsgált vegyi anyag toxicitásától függően szükség szerint más klinikai kémiai paraméterek, például az éhgyomorra mért trigliceridek, bizonyos hormonok és a kolinészterázszint mérése is elvégezhető. Általánosságban elmondható, hogy rugalmas megközelítés alkalmazandó, amely az adott vizsgált vegyi anyag megfigyelt és/vagy várható hatásaitól egyaránt függ.
45.
Vizeletelemzést az összes vizsgált állaton (csoportonként 10 hím és 10 nőstény egyeden), a hematológiai és klinikai kémiai vizsgálatokhoz meghatározott időközönként levett mintákon kell elvégezni. Ha a korábbi, hasonló dózisszintekkel elvégzett 90 napos vizsgálatok nem mutattak változást a vizeletelemzés vonatkozásában, a vizsgálat 3. hónapjában nem szükséges méréseket végezni. A klinikai patológiai vizsgálatra vonatkozó szakértői ajánlás a következő vizsgálandó paramétereket tartalmazza (38): küllem, mennyiség, ozmolalitás vagy fajsúly, pH-érték, összes fehérje, valamint glükóz. Az egyéb mérések közé tartozik a keton, az urobilinogén, a bilirubin és a vizeletben jelen lévő vér vizsgálata. Szükség szerint további paraméterek vizsgálatát is be lehet vezetni a megfigyelt hatás(ok) vizsgálati körének bővítése érdekében.
46.
Általánosan elfogadott, hogy kutyákon végzett vizsgálatok esetében a kezelés előtt meg kell határozni a kiinduló hematológiai és klinikai biokémiai változókat, rágcsálok vizsgálatánál azonban ez nem szükséges (38). Ha azonban a rendelkezésre álló kiinduló adatok (lásd az 58. bekezdést) nem bizonyulnak elegendőnek, megfontolandó ezen adatok meghatározása.
PATOLÓGIA
Autopszia
47.
Általában a vizsgálatokba bevont összes állatot teljes körű, beható autopsziának kell alávetni, ideértve a következők alapos vizsgálatát: a test külső felszíne, az összes testnyílás, a koponya, a mellüreg, a hasüreg és ezek tartalma. Előírható ugyanakkor (az időközi elpusztítás céljából bevont vagy kísérő csoportoknál), hogy a mérések csak bizonyos főbb paraméterekre, például a neurotoxicitásra vagy immuntoxicitásra korlátozódjanak (lásd a 21. bekezdést). Ezeket az állatokat nem kell alávetni boncolásnak és az azt követő, a következő bekezdésekben ismertetett eljárásoknak. A jelzőállatok esetében a vizsgálatvezető döntésétől függően eseti alapú boncolásra lehet szükség.
48.
A 47. bekezdés utóbbi részében kivételként megjelölt állatokéin kívül az összes állat szerveinek súlyát meg kell mérni. Az összes állat (eltekintve az elhullásközeli állapotban lévő és/vagy a vizsgálat befejeztét megelőzően elpusztított egyedektől) mellékveséit, agyát, mellékheréit, szívét, veséit, máját, petefészkeit, lépét, heréit, pajzsmirigyét (amelyet fixálás után mérünk meg a mellékpajzsmirigyekkel együtt) és méhét megfelelően meg kell tisztítani minden rátapadt szövettől, és azok nedves súlyát a boncolást követően a lehető legrövidebb időn belül meg kell mérni, mielőtt azok kiszáradnának.
49.
Az alábbi szöveteket a szövet típusa és a később elvégezni kívánt kórszövettani vizsgálat szempontjából legmegfelelőbb fixálóanyaggal kell tartósítani (40) (a szögletes zárójelben megadott szövetek megőrzése nem kötelező):
minden makroszkopikus elváltozás
szív
hasnyálmirigy
gyomor (előgyomor, mirigygyomor)
mellékvese
csípőbél
mellékpajzsmirigy
[fogazat]
aorta
éhbél
perifériás idegek
here
agy (beleértve a nagyagy, a kisagy és a nyúltvelő/nyúltagyi híd metszeteit)
vese
agyalapi mirigy
csecsemőmirigy
vakbél
könnymirigy (szemüregen kívüli)
prosztata
pajzsmirigy
méhnyak
máj
végbél
[nyelv]
koaguláló mirigy
tüdő
nyálmirigy
légcső
vastagbél
nyirokcsomók (felszíni és mély)
ondóhólyag
húgyhólyag
patkóbél
emlőmirigy (nőstényeknél kötelező, hímeknél csak ha láthatóan kimetszhető)
harántcsíkolt izom
méh (beleértve a méhnyakat)
mellékhere
[felső légutak, beleértve az orrot, az orrkagylókat és az orrmelléküregeket]
bőr
[húgyvezeték]
szem (beleértve a retinát)
nyelőcső
gerincvelő (három szinten: nyaki, mellkasi középső és ágyéki szakasz)
[húgycső]
[combcsont az ízületi felülettel együtt]
[szaglógumó]
lép
hüvely
epehólyag (patkánytól eltérő fajoknál)
petefészek
[szegycsont]
metszet a csontvelőből és/vagy egy friss, csontvelőből felszívott minta
Harder-mirigy
Páros szervek, például vesék, mellékvesék esetében mind a két szervet tartósítani kell. A klinikai és más jellegű megfigyelések alapján további testszövetek vizsgálata is szükséges lehet. A fentieken túl meg kell őrizni minden olyan más szervet is, amely a vizsgált vegyi anyag ismert tulajdonságai alapján valószínűleg célszervnek tekinthető. A dermális úton történő bejuttatást alkalmazó vizsgálatok esetében az orális módon történő beadásnál felsorolt szerveket kell vizsgálni, továbbá a bőrből mintát kell venni a beadás helyéről, és ezt a mintát tartósítani kell. Inhalációs vizsgálatok esetében a légzőrendszerből származó tartósított és vizsgált szövetek felsorolásának követnie kell az e melléklet B.8. (9) és B.29. fejezetében (10) tett ajánlásokat. Egyéb szervek/szövetek esetében (valamint a légzőrendszerből származó tartósított szöveteken túl) az orális úton történő beadásnál felsorolt szerveket kell vizsgálni.
Kórszövettani vizsgálatok
50.
A toxikológiai patológiai vizsgálatok elvégzésének legjobb gyakorlatára vonatkozóan iránymutatás áll rendelkezésre (40). Legalább a következő szöveteket kell kórszövettani vizsgálatnak alávetni:
—
a magas dózissal kezelt csoportból és a kontrollcsoportokból származó összes szövet,
—
a vizsgálat során elpusztult vagy elpusztított állatokból származó összes szövet,
—
a makroszkopikus rendellenességeket mutató összes szövet,
—
a célszöveteket, vagy azon szöveteket, amelyek a legnagyobb dózissal kezelt csoportnál a kezelésnek tulajdonítható elváltozásokat mutatnak, az összes többi dóziscsoport összes állatánál meg kell vizsgálni,
—
páros szervek, például vesék, mellékvesék esetében mind a két szervet vizsgálni kell.
MEGFIGYELÉSEK (KARCINOGENITÁSI FÁZIS)
51.
Rendszerint a nap elején és végén – beleértve a hétvégéket és az ünnepnapokat is – az összes állatot meg kell vizsgálni, hogy nem mutatja-e megbetegedés jeleit vagy nem hullott-e el. Ezen túlmenően az állatokat naponta egyszer meg kell vizsgálni, hogy mutatnak-e meghatározott, toxikológiai szempontból lényeges tüneteket. A gyomorszondát alkalmazó vizsgálatok esetében az állatokat közvetlenül az adagolás után meg kell vizsgálni. Külön figyelmet kell fordítani a daganatképződésre; minden, szemmel látható vagy kitapintható daganat megjelenésének idejét, helyét, méreteit, megjelenési formáját és növekedését fel kell jegyezni.
52.
A kezelés kezdetekor, az első 13 hét során legalább hetente egyszer, ezután pedig legalább havonta egyszer meg kell mérni az összes állat testsúlyát. A táplálékfogyasztást és a táplálékhasznosítási képességet a vizsgálat első 13 hetében legalább hetente, azt követően pedig legalább havonta egyszer kell mérni. Ha a vizsgált vegyi anyagot ivóvízzel adjuk be, a vízfogyasztást a vizsgálat első 13 hetében legalább hetente, azt követően pedig legalább havonta egyszer kell mérni. A vízfogyasztás mérését olyan vizsgálatok esetében is fontolóra kell venni, amelyek során az ivási szokások megváltoznak.
Hematológiai, klinikai biokémiai és egyéb mérések
53.
A vizsgálatból nyerhető lehető legtöbb információ megszerzése érdekében – különösen a hatásmechanizmussal kapcsolatos szempontok meghatározása céljából – vérminták vehetők a hematológiai és klinikai biokémiai vizsgálatokhoz, habár ez a vizsgálatvezető döntésén múlik. Vizeletelemzés elvégzése is célszerű lehet. Ezekről a paraméterekről a vizsgálat rendszerint 12 hónapig tartó (lásd a 34. bekezdést) krónikus toxicitási fázisában használt állatokra vonatkozó adatok szolgáltatnak információt. Az ilyen minták karcinogenitási vizsgálat részeként történő levételének értékére vonatkozó további útmutatás a 116. iránymutatásban található (7). Vérminták levétele esetén ezeket a mintákat a vizsgálati időszak végén kell levenni, közvetlenül az állatok elpusztítása előtt vagy ennek részeként. Vérmintákat meghatározott helyről kell venni, például a szívből vagy a szemgolyó mögötti üregből altatás alatt. Vérkenet is készíthető vizsgálat céljára, különösen akkor, ha a csontvelő tűnik a célszervnek, bár a vérkenetek karcinogenitási fázisban történő ilyen jellegű vizsgálatának a karcinogén/onkogén hatás meghatározása szempontjából képviselt értéke megkérdőjelezhető (38).
PATOLÓGIA
Autopszia
54.
A jelzőállatok és a kísérő csoportba tartozó többi állat kivételével (lásd a 20. bekezdést) a vizsgálatokba bevont összes állatot teljes körű, beható autopsziának kell alávetni, ideértve a következők alapos vizsgálatát: a test külső felszíne, az összes testnyílás, a koponya, a mellüreg, a hasüreg és ezek tartalma. A jelzőállatok és a kísérő csoportba tartozó többi állat esetében a vizsgálatvezető döntésétől függően eseti alapú boncolásra lehet szükség. A szervek súlyának mérése általában nem képezi a rákkeltő hatás meghatározására irányuló vizsgálatok részét, mivel a geriátriai változások és – a későbbi szakaszokban – a tumorok kifejlődése zavaró tényezők lehetnek a szervek súlyával kapcsolatos adatok hasznosságát illetően. Ezek a mérések azonban kritikusak lehetnek az adatok bizonyító erejének mérlegelése során és különösen a hatásmechanizmussal kapcsolatos megfontolások tekintetében. Ha a szervek súlyának mérése kísérő vizsgálat részét képezi, a mérést legkésőbb a vizsgálat megkezdése után egy évvel el kell végezni.
55.
Az alábbi szöveteket a szövet típusa és a később elvégezni kívánt kórszövettani vizsgálat szempontjából legmegfelelőbb fixálóanyaggal kell tartósítani (40) (a szögletes zárójelben megadott szövetek megőrzése nem kötelező):
minden makroszkopikus elváltozás
szív
hasnyálmirigy
gyomor (előgyomor, mirigygyomor)
mellékvese
csípőbél
mellékpajzsmirigy
[fogazat]
aorta
éhbél
perifériás idegek
here
agy (beleértve a nagyagy, a kisagy és a nyúltvelő/nyúltagyi híd metszeteit)
vese
agyalapi mirigy
csecsemőmirigy
vakbél
könnymirigy (szemüregen kívüli)
prosztata
pajzsmirigy
méhnyak
máj
végbél
[nyelv]
koaguláló mirigy
tüdő
nyálmirigy
légcső
vastagbél
nyirokcsomók (felszíni és mély)
ondóhólyag
húgyhólyag
patkóbél
emlőmirigy (nőstényeknél kötelező, hímeknél csak ha láthatóan kimetszhető)
harántcsíkolt izom
méh (beleértve a méhnyakat)
mellékhere
[felső légutak, beleértve az orrot, az orrkagylókat és az orrmelléküregeket]
bőr
[húgyvezeték]
szem (beleértve a retinát)
nyelőcső
gerincvelő (három szinten: nyaki, mellkasi középső és ágyéki szakasz)
[húgycső]
[combcsont az ízületi felülettel együtt]
[szaglógumó]
lép
hüvely
epehólyag (patkánytól eltérő fajoknál)
petefészek
[szegycsont]
metszet a csontvelőből és/vagy egy friss, csontvelőből felszívott minta
Harder-mirigy
Páros szervek, például vesék, mellékvesék esetében mind a két szervet tartósítani kell. A klinikai és más jellegű megfigyelések alapján további testszövetek vizsgálata is szükséges lehet. A fentieken túl meg kell őrizni minden olyan más szervet is, amely a vizsgált vegyi anyag ismert tulajdonságai alapján valószínűleg célszervnek tekinthető. A dermális úton történő bejuttatást alkalmazó vizsgálatok esetében az orális módon történő beadásnál felsorolt szerveket kell vizsgálni, továbbá a bőrből mintát kell venni a beadás helyéről, és ezt a mintát tartósítani kell. Inhalációs vizsgálatok esetében a légzőrendszerből származó tartósított és vizsgált szövetek felsorolásának követnie kell az e melléklet B.8. (8) és B.29. fejezetében (9) tett ajánlásokat. Egyéb szervek/szövetek esetében (valamint a légzőrendszerből származó tartósított szöveteken túl) az orális úton történő beadásnál felsorolt szerveket kell vizsgálni.
Kórszövettani vizsgálatok
56.
A toxikológiai patológiai vizsgálatok elvégzésének legjobb gyakorlatára vonatkozóan iránymutatás áll rendelkezésre (40). Legalább az alábbi szöveteket kell vizsgálni:
—
a magas dózissal kezelt csoportból és a kontrollcsoportokból származó összes szövet,
—
a vizsgálat során elpusztult vagy elpusztított állatokból származó összes szövet,
—
a makroszkopikus rendellenességeket, többek között tumorokat mutató összes szövet,
—
azon szöveteket, amelyek a legnagyobb dózissal kezelt csoportnál a kezelésnek tulajdonítható kórszövettani elváltozásokat mutatnak, az összes többi dóziscsoport összes állatánál meg kell vizsgálni,
—
páros szervek, például vesék, mellékvesék esetében mind a két szervet vizsgálni kell.
ADATOK ÉS JEGYZŐKÖNYVEZÉS (KARCINOGENITÁS ÉS KRÓNIKUS TOXICITÁS)
Adatok
57.
Az összes értékelt paraméterre vonatkozó adatokat minden egyes állat esetében rögzíteni kell. Ezenfelül az összes adatot táblázat formájában összegezni kell, a vizsgált állatok minden csoportja tekintetében bemutatva, hogy hány egyeddel indult a vizsgálat, hány állat pusztult el, illetve hányat kellett elpusztítani humánus okokból a vizsgálat során, valamint az elpusztulás vagy humánus okokból való elpusztítás időpontját, a toxicitás jeleit mutató állatok számát, a megfigyelt toxicitási tünetek leírását, ideértve bármely toxikus hatás kezdetének idejét, időtartamát és súlyosságát, az elváltozásokat mutató állatok számát, az elváltozások típusát és az egyes elváltozástípusokat mutató állatok százalékos arányát. Az összegző adattáblázatoknak tartalmazniuk kell a toxikus hatásokat vagy elváltozásokat mutató állatokra vonatkozó átlagértékeket és szórásokat (folyamatos vizsgálati adatok esetében), valamint az elváltozások osztályozását.
58.
A vizsgálat eredményeinek értékelése szempontjából hasznosak lehetnek a korábbi kontrolladatok, például abban az esetben, ha a párhuzamos kontrollokból származó adatok vélhetően lényegesen eltolódottak az ugyanabban a vizsgálati létesítményben/kolóniában lévő kontrollállatoktól származó újabb adatokhoz képest. Korábbi kontrolladatok elemzése esetén ugyanazon laboratórium által benyújtott, ugyanolyan korú és ugyanabba a törzsbe tartozó állatokra vonatkozó, az adott vizsgálatot megelőző öt évből kell származó adatokat kell felhasználni.
59.
A számszerű eredményeket adott esetben megfelelő és általánosan elfogadott statisztikai módszer alkalmazásával kell kiértékelni. A statisztikai módszereket és az elemezendő adatokat a vizsgálat tervezése során kell kiválasztani (9. bekezdés). A kiválasztás során szükség szerint elő kell írni a túlélésre vonatkozó kiigazításokat.
60.
A vizsgálati jegyzőkönyvnek a következő információkat kell tartalmaznia:
Vizsgált vegyi anyag:
—
fizikai jelleg, tisztaság, valamint fizikai és kémiai tulajdonságok,
—
azonosító adatok,
—
a vegyi anyag származási helye,
—
gyártási szám,
—
kémiai elemzésről szóló tanúsítvány.
Vivőanyag (ha van):
—
a vivőanyag kiválasztásának indokolása (ha az nem víz).
Kísérleti állatok:
—
a felhasznált faj/törzs, és a választás indokolása,
—
az állatok száma, életkora és neme a vizsgálat kezdetekor,
—
az állatok származása, tartási körülmények, takarmány stb.,
—
az egyes állatok testsúlya a vizsgálat kezdetekor.
Vizsgálati körülmények:
—
a beadási mód és a dózis kiválasztásának indokolása,
—
az adatok elemzéséhez adott esetben használt statisztikai módszerek,
—
a vizsgált vegyi anyag formulázására/a takarmány előkészítésére vonatkozó részletes adatok,
—
a készítmény elért koncentrációjára, stabilitására és homogenitására vonatkozó analitikai adatok,
—
a beadási mód és a vizsgált vegyi anyag bejuttatására vonatkozó részletes adatok,
—
inhalációs vizsgálatok esetében információ arra vonatkozóan, hogy a bejuttatás csak orron vagy a teljes testfelületen keresztül történt-e,
—
tényleges dózisok (mg/testsúlykilogramm/nap), valamint a vizsgált vegyi anyagnak a takarmányban/ivóvízben meglévő koncentrációjáról (mg/kg vagy ppm) a tényleges dózisra való átszámításhoz használt átszámítási tényező, ha ez alkalmazható,
—
a táplálék és a víz minőségére vonatkozó adatok.
Eredmények (az adatok táblázatos összefoglalását és az egyes állatokra vonatkozó adatokat is meg kell adni):
Általános
—
túlélési adatok,
—
testsúly/testsúlyban bekövetkezett változások,
—
takarmányfogyasztás, a táplálékhasznosítási képességgel kapcsolatos számítások, ha vannak, valamint adott esetben vízfogyasztás,
—
toxikokinetikai adatok, ha rendelkezésre állnak,
—
oftalmoszkópia (ha rendelkezésre áll),
—
hematológia (ha rendelkezésre áll),
—
klinikai kémia (ha rendelkezésre áll).
Klinikai leletek
—
toxicitási tünetek,
—
az esetleges rendellenességek előfordulása (és – ha pontozzuk – azok súlyossága),
—
a megfigyelt klinikai tünetek jellege, súlyossága és időtartama (átmeneti vagy állandó).
Boncolási adatok
—
testsúly elpusztuláskor,
—
szervek súlya és ezek aránya, ha alkalmazható,
—
boncolási eredmények; rendellenességek előfordulása és súlyossága.
Kórszövettani vizsgálatok
—
nem neoplasztikus kórszövettani leletek,
—
neoplasztikus kórszövettani leletek,
—
a makroszkopikus és mikroszkopikus vizsgálatok leletei közötti összefüggés,
—
a kezeléssel összefüggő összes kórszövettani lelet részletes leírása, beleértve a súlyossági fokokat,
—
a tárgylemezek szakértői felülvizsgálatáról szóló jelentés.
Az eredmények statisztikai feldolgozása, ha alkalmazható
Az eredmények tárgyalása, beleértve a következőket:
—
az esetlegesen alkalmazott modellezési megközelítések tárgyalása,
—
dózis-válasz összefüggések,
—
korábbi kontrolladatok,
—
a hatásmechanizmusra vonatkozó bármely információ figyelembevétele,
—
BMD, NOAEL vagy LOAEL meghatározása,
—
humán relevancia.
Következtetések
SZAKIRODALOM
(1)
OECD (1995). Report of the Consultation Meeting on Sub-chronic and Chronic Toxicity/Carcinogenicity Testing (Rome, 1995), internal working document, Environment Directorate, OECD, Paris.
(2)
EPA (2005). Guidelines for Carcinogen Risk Assessment Risk Assessment Forum U.S. Environmental Protection Agency Washington, DC.
(3)
Combes RD, Gaunt I, Balls M (2004). A Scientific and Animal Welfare Assessment of the OECD Health Effects Test Guidelines for the Safety Testing of Chemicals under the European Union REACH System. ATLA 32: 163-208
(4)
Barlow SM, Greig JB, Bridges JW et al (2002). Hazard identification by methods of animal-based toxicology. Food. Chem. Toxicol. 40: 145-191
(5)
Chhabra RS, Bucher JR, Wolfe M, Portier C (2003). Toxicity characterization of environmental chemicals by the US National Toxicology Programme: an overview. Int. J. Hyg. Environ. Health 206: 437-445
(6)
E melléklet B.27., Szubkrónikus orális toxicitási vizsgálat, 90 napos, ismételt adagolású orális toxicitási vizsgálat nem rágcsálókon című fejezete.
(7)
OECD (2012). Guidance Document on the Design and Conduct of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies, Supporting Test Guidelines 451, 452 and 453 – Second edition. Series on Testing and Assessment No. 116, available on the OECD public website for Test Guideline at www.oecd.org/env/testguidelines.
(8)
OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing. Series on Testing and Assessment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paris.
(9)
E melléklet B.8., Szubakut inhalációs toxicitás: 28 napos vizsgálat című fejezete.
(10)
E melléklet B.29., Szubkrónikus inhalációs toxicitás: 90 napos vizsgálat című fejezete.
(11)
E melléklet B.9., Ismételt adagolású (28 napos) toxicitás (dermális) című fejezete.
(12)
Boobis AR, Cohen SM, Dellarco V, McGregor D, Meek ME, Vickers C, Willcocks D, Farland W (2006). IPCS Framework for analyzing the Relevance of a Cancer Mode of Action for Humans. Crit. Rev. in Toxicol, 36: 793-801.
(13)
Cohen SM, Meek ME, Klaunig JE, Patton DE, Fenner-Crisp PA (2003). The human relevance of information on carcinogenic Modes of Action: An Overview. Crit. Rev. Toxicol. 33: 581-589.
(14)
Holsapple MP, Pitot HC, Cohen SN, Boobis AR, Klaunig JE, Pastoor T, Dellarco VL, Dragan YP (2006). Mode of Action in Relevance of Rodent Liver Tumors to Human Cancer Risk. Toxicol. Sci. 89: 51-56.
(15)
Meek EM, Bucher JR, Cohen SM, Dellarco V, Hill RN, Lehman-McKemmon LD, Longfellow DG, Pastoor T, Seed J, Patton DE (2003). A Framework for Human Relevance analysis of Information on Carcinogenic Modes of Action. Crit. Rev. Toxicol. 33: 591-653.
(16)
Carmichael NG, Barton HA, Boobis AR et al. (2006). Agricultural Chemical Safety Assessment: A Multisector Approach to the Modernization of Human Safety Requirements. Crit. Rev. Toxicol. 36, 1-7.
(17)
Barton HA, Pastoor TP, Baetcke T et al. (2006). The Acquisition and Application of Absorption, Distribution, Metabolism, and Excretion (ADME) Data in Agricultural Chemical Safety Assessments. Crit. Rev. Toxicol. 36: 9-35.
(18)
Doe JE, Boobis AR, Blacker A et al. (2006). A Tiered Approach to Systemic Toxicity Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. Crit. Rev. Toxicol. 36: 37-68.
(19)
Cooper RL, Lamb JS, Barlow SM et al. (2006). A Tiered Approach to LIFE Stages Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. Crit. Rev. Toxicol. 36: 69-98.
(20)
OECD (2002). Guidance Notes for Analysis and Evaluation of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies, Series on Testing and Assessment No. 35 and Series on Pesticides No. 14, ENV/JM/MONO(2002)19, OECD, Paris.
(21)
OECD (2000). Guidance Document on the recognition, assessment, and use of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluation, Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris.
(22)
Rhomberg LR, Baetcke K, Blancato J, Bus J, Cohen S, Conolly R, Dixit R, Doe J, Ekelman K, Fenner-Crisp P, Harvey P, Hattis D, Jacobs A, Jacobson-Kram D, Lewandowski T, Liteplo R, Pelkonen O, Rice J, Somers D, Turturro A, West W, Olin S (2007). Issues in the Design and Interpretation of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies in Rodents: Approaches to Dose Selection Crit Rev. Toxicol. 37 (9): 729 – 837.
(23)
ILSI (International LIFE Sciences Institute) (1997). Principles for the Selection of Doses in Chronic Rodent Bioassays. Foran JA (Ed.). ILSI Press, Washington, DC.
(24)
Griffiths SA, Parkinson C, McAuslane JAN and Lumley CE (1994). The utility of the second rodent species in the carcinogenicity testing of pharmaceuticals. The Toxicologist 14(1): 214.
(25)
Usui T, Griffiths SA and Lumley CE (1996). The utility of the mouse for the assessment of the carcinogenic potential of pharmaceuticals. In D’Arcy POF & Harron DWG (eds). Proceedings of the Third International Conference on Harmonisation. Queen’s University Press, Belfast. pp 279-284.
(26)
Carmichael NG, Enzmann H, Pate I, Waechter F (1997). The Significance of Mouse Liver Tumor Formation for Carcinogenic Risk Assessment: Results and Conclusions from a Survey of Ten Years of Testing by the Agrochemical Industry. Environ Health Perspect 105: 1196-1203.
(27)
Az Európai Parlament és a Tanács 2010. szeptember 22-i 2010/63/EU irányelve a tudományos célokra felhasznált állatok védelméről HL L 276., 2010.10.20., 33. o.
(28)
National Research Council, 1985. Guide for the care and use of laboratory animals. NIH Publication No. 86-23. Washington D.C., US. Dept. of Health and Human Services.
(29)
GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für Versuchstierkunde, December, 1989). Publication on the Planning and Structure of Animal Facilities for Institutes Performing Animal Experiments. ISBN 3-906255-06-9.
(30)
GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für Versuchstierkunde, 2006). Microbiological monitoring of laboratory animals in various housing systems.
(31)
Diehl K-H, Hull R, Morton D, Pfister R, Rabemampianina Y, Smith D, Vidal J-M, van de Vorstenbosch C. (2001). A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. Journal of Applied Toxicology, 21: 15-23.
(32)
IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity Associated with Exposure to Chemicals. Environmental Health Criteria Document No. 60.
(33)
Tupper DE, Wallace RB (1980). Utility of the Neurologic Examination in Rats. Acta Neurobiol. Exp. 40: 999-1003.
(34)
Gad SC (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxicology. J. Toxicol.Environ. Health 9: 691-704.
(35)
Moser VC, McDaniel KM, Phillips PM (1991). Rat Strain and Stock Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of Amitraz. Toxicol. Appéldául Pharmacol. 108: 267-283.
(36)
Meyer OA, Tilson HA, Byrd WC, Riley MT (1979). A Method for the RoutineAssessment of Fore- and Hind-limb Grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxicol. 1: 233-236.
(37)
Crofton KM, Howard JL, Moser VC, Gill MW, Reiter LW, Tilson HA, MacPhail RC (1991). Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol. 13: 599-609.
(38)
Weingand K, Brown G, Hall R et al. (1996). Harmonisation of Animal Clinical Pathology Testing in Toxicity and Safety Studies. Fundam. & Appéldául Toxicol. 29: 198-201.
Crissman JW, Goodman DG, Hildebrandt PK et al. (2004). Best Practices Guideline: Toxicological Histopathology. Toxicologic Pathology 32: 126-131.
1. függelék
FOGALOMMEGHATÁROZÁS
Vizsgált vegyi anyag: A jelen vizsgálati módszer alkalmazásával vizsgált bármely anyag vagy keverék.
”
7.
A B.36. fejezet helyébe a következő szöveg lép:
„B.36. TOXIKOKINETIKAI VIZSGÁLAT
BEVEZETÉS
1.
A jelen vizsgálati módszer egyenértékű az OECD 417. vizsgálati iránymutatásában (2010) leírt módszerrel. A vizsgált vegyi anyag toxikokinetikai vizsgálatára irányuló tanulmányok célja a vegyi anyag felszívódásával, eloszlásával, biotranszformációjával (azaz metabolizmusával) és kiürülésével kapcsolatos megfelelő információk megszerzése, a megfigyelt toxicitás és a koncentráció vagy a dózis közötti összefüggés meghatározásának, valamint a toxicitás mechanizmusa megértésének elősegítése. A toxikokinetika a vizsgált állatok vizsgált vegyi anyagnak való szisztémás kitettségének bizonyítása, valamint a keringésbe került molekularészek (kiindulási vegyi anyagok/metabolitok) meghatározása révén hozzájárulhat a toxikológiai vizsgálatok értelmezéséhez. Az e vizsgálatok alapján meghatározott alapvető toxikokinetikai paraméterek információt szolgáltatnak továbbá a vizsgált vegyi anyag szövetekben és/vagy szervekben történő felhalmozódásra, valamint a vizsgált vegyi anyagnak való kitettség eredményeként bekövetkező biotranszformáció előidézésére való képességéről.
2.
A toxikokinetikai adatok hozzájárulhatnak az állati toxicitással kapcsolatos adatok emberi veszély- és/vagy kockázatértékelés céljából történő extrapolálásra való alkalmasságának és relevanciájának értékeléséhez. A toxikokinetikai vizsgálatok hasznos információt szolgáltathatnak továbbá a toxicitási vizsgálatokhoz szükséges dózisszintek (lineáris, illetve nem lineáris kinetika), a beadási módok okozta hatások, a biológiai hozzáférhetőség, valamint a vizsgálati tervvel kapcsolatos kérdések meghatározásához. A toxikokinetikai adatok bizonyos típusai felhasználhatók élettani alapú toxikokinetikai (PBTK) modellek kidolgozásához.
3.
A metabolit-/toxikokinetikai adatok fontos felhasználási területei közé tartozik például a lehetséges toxicitások és hatásmechanizmusok feltárása, valamint ezek dózisszinthez és expozíciós útvonalhoz való viszonyának meghatározása. A metabolizmussal kapcsolatos adatok emellett olyan információkat szolgáltathatnak, amelyek hasznosak lehetnek a vizsgált vegyi anyag exogén módon termelt metabolitjainak való kitettség toxikológiai jelentőségének értékelésében.
4.
A megfelelő toxikokinetikai adatok hasznosak lehetnek a mennyiségi szerkezet-hatás összefüggések, a vegyi anyagok biztonsági értékelése csoportosításos vagy read across módszer alapján történő megközelítése további elfogadhatóságának és alkalmazhatóságának támogatása szempontjából. A kinetikai adatok felhasználhatók továbbá egyéb (például in vivo/in vitro) vizsgálatok toxikológiai relevanciájának értékelésében is.
5.
Amennyiben a szöveg más bejuttatási útvonalat nem említ (lásd különösen a 74–78. bekezdést), a jelen vizsgálati módszert a vizsgált vegyi anyag szájon át történő bejuttatására kell alkalmazni.
KIINDULÁSI MEGFONTOLÁSOK
6.
A szabályozási rendszerek különböző követelményeket és igényeket támasztanak a vegyi anyagok különböző osztályainak (például növényvédő szerek, biocid anyagok, ipari vegyszerek) toxikokinetikájával kapcsolatos végpontok és paraméterek mérésével szemben. A legtöbb vizsgálati módszerrel ellentétben ez a vizsgálati módszer toxikokinetikai vizsgálatot határoz meg, amely több mérést és végpontot foglal magában. A jövőben több új vizsgálati módszer és/vagy iránymutatás kidolgozására kerülhet sor minden egyes végpont külön-külön és részletesebben történő leírása érdekében. A jelen vizsgálati módszer esetében az elvégzendő vizsgálatokat vagy értékeléseket az egyes szabályozási rendszerek követelményei és/vagy igényei határozzák meg.
7.
Számos vizsgálat végezhető el egy vizsgált vegyi anyag toxikokinetikai viselkedésének szabályozási célú értékelése érdekében. Meghatározott szabályozási igényektől vagy helyzetektől függően azonban nem feltétlenül szükséges az összes lehetséges vizsgálatot elvégezni a vizsgált vegyi anyag értékeléséhez. A toxikokinetikai vizsgálatok tervezését rugalmasan, a szóban forgó vizsgált vegyi anyag jellemzőinek figyelembevételével kell megközelíteni. Bizonyos esetekben csak néhány kérdést szükséges feltárni a vizsgált vegyi anyaggal összefüggésbe hozható veszélyességi vagy kockázati problémák megoldásához. Bizonyos helyzetekben a toxikokinetikai adatok egyéb toxikológiai vizsgálatok értékelésének részeként gyűjthetők össze. Más esetekben további és/vagy kiterjedtebb toxikokinetikai vizsgálatok szükségesek a szabályozási igényektől függően és/vagy ha új kérdések merülnek fel a vizsgált vegyi anyag értékelése során.
8.
A vizsgálat elvégzése előtt a vizsgálati laboratóriumnak a vizsgált vegyi anyagra, valamint az ahhoz kapcsolódó metabolitokra és analóg vegyületekre vonatkozó összes rendelkezésre álló információt figyelembe kell vennie a vizsgálat minőségének javítása és a szükségtelen állatkísérletek elkerülése érdekében. Ebbe beletartozhatnak egyéb releváns vizsgálati módszerek (in vivo vizsgálatok, in vitro vizsgálatok és/vagy in silico értékelések) adatai. A fizikai és kémiai tulajdonságok – úgymint a (log POW-ként kifejezett) oktanol-víz megoszlási hányados, a pKa, a vízoldékonyság, a gőznyomás, valamint a vegyi anyag molekulatömege – hasznosak lehetnek a vizsgálat tervezése és az eredmények értelmezése szempontjából. Ezek a megfelelő vizsgálati módszereknél leírt módszerek használatával határozhatók meg.
KORLÁTOK
9.
Ez a vizsgálati módszer nem alkalmas speciális körülmények között, például vemhes vagy szoptató állatoknál vagy fiatal állatoknál, vagy a vizsgált anyagnak kitett élelmiszertermelő állatokban lévő lehetséges maradványok értékelése céljából való alkalmazásra. A B.36. vizsgálatból szerzett adatok azonban háttér-információt szolgáltathatnak az ilyen vizsgálatokhoz szükséges konkrét tanulmányok tervezéséhez. A jelen vizsgálati módszer nem nanoanyagok vizsgálatára szolgál. Az OECD vizsgálati iránymutatásainak nanoanyagokra történő alkalmazhatóságára vonatkozó előzetes felülvizsgálatról szóló jelentés szerint a 147. vizsgálati iránymutatás (amely a jelen B.36. vizsgálati módszerrel egyenértékű) nem alkalmazható nanoanyagokra (1).
FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK
10.
A jelen vizsgálati módszer alkalmazásában használt fogalommeghatározások a függelékben találhatók.
ÁLLATJÓLLÉTI SZEMPONTOK
11.
Az állatokkal való kíméletes bánásmódra vonatkozóan az OECD 19. iránymutatásában (2) található útmutatás. Ajánlott az OECD 19. iránymutatásának alkalmazása a jelen vizsgálati módszerben meghatározott összes in vivo és in vitro vizsgálat esetében.
A MÓDSZEREK LEÍRÁSA
Előzetes vizsgálatok
12.
A toxikokinetikai vizsgálatok kísérleti paramétereinek megválasztása érdekében (például metabolizmus, tömegmérleg, analitikai eljárások, dózismeghatározás, CO2 kilégzése stb.) előzetes vizsgálatok elvégzése javasolt. E paraméterek némelyikének jellemzése nem feltétlenül teszi szükségessé a radioizotóppal megjelölt vegyi anyagok használatát.
Az állatok kiválasztása
Faj
13.
A toxikokinetikai vizsgálatokhoz használt állatfaj (és törzs) lehetőleg ugyanaz legyen, mint amelyet az adott vizsgált vegyi anyaggal elvégzett egyéb toxikológiai vizsgálatokhoz használunk. Általában a patkányt kell használni, mivel ezt a fajt széles körben alkalmazzák a toxikológiai vizsgálatokhoz. Egyéb vagy további fajok használata abban az esetben indokolt, ha kritikus toxikológiai vizsgálatok bizonyítják az e fajokban megfigyelhető jelentős toxicitást, vagy ha e fajok toxicitási/toxikokinetikai szempontból hasonlóbbak az emberhez. Az állatfaj és a törzs megválasztását indokolni kell.
14.
Amennyiben a vizsgálati módszer más fajt nem említ, a jelen vizsgálati módszer alkalmazásában vizsgálati faj alatt a patkány értendő. A módszer egyes szempontjai más vizsgálati fajok használata esetén módosításra szorulhatnak.
Életkor és törzs
15.
Egészséges, fiatal, ivarérett (általában az adagolás időpontjában 6–12 hetes) állatokat kell használni a vizsgálat során (lásd még a 13. és 14. bekezdést). Amennyiben az állatok nem fiatal, ivarérett egyedek, használatukat indokolni kell. Az összes állatnak hasonló életkorúnak kell lennie a vizsgálat kezdetekor. Az egyes állatok súlya nem térhet el ± 20 %-nál nagyobb mértékben a vizsgált csoport átlagértékétől. A használt törzsnek ideális esetben meg kell egyeznie a vizsgált vegyi anyag toxikológiai adatbázisának előállításához használt törzzsel.
Az állatok száma és neme
16.
Minden egyes vizsgált dózishoz legalább négy, azonos nemű állat szükséges. A felhasznált állatok nemére vonatkozó döntést indokolni kell. Meg kell fontolni mindkét nem (négy hím és négy nőstény) használatát, ha a nemek között jelentős különbségek bizonyíthatóak a toxicitás vonatkozásában.
Tartási és etetési körülmények
17.
A vizsgálati időszak alatt az állatokat általában külön-külön kell tartani. Különleges körülmények között indokolt lehet a csoportos tartás. A világítás legyen mesterséges, 12 órás világos és 12 órás sötét periódusok váltsák egymást. A kísérleti állatok tartására szolgáló helyiség hőmérséklete 22 °C (± 3 °C), relatív páratartalma 30–70 % között kell, hogy legyen. Az etetéshez hagyományos laboratóriumi takarmány alkalmazható, korlátlan mennyiségű ivóvíz biztosítása mellett.
Vizsgált vegyi anyag
18.
A tömegmérleg és a metabolitok meghatározásához C14 radioizotóppal megjelölt vizsgált vegyi anyagot kell használni, azonban nem szükséges a radioizotóppal megjelölt vizsgált vegyi anyag használata, ha az alábbiak bizonyíthatók:
—
a tömegmérleg- és metabolitmeghatározás megfelelően értékelhető a nem jelölt vizsgált vegyi anyag használatával,
—
a nem radioaktív vizsgált vegyi anyag használatán alapuló módszer analitikai specifikussága és érzékenysége megegyezik vagy nagyobb annál, amelyet a radioizotóppal jelölt vizsgált vegyi anyag használatával lehetett volna elérni.
Egyéb radioaktív és stabil izotópok is használhatók, különösen abban az esetben, ha az adott elem a vizsgált vegyi anyag toxikus részéért felelős vagy annak részét képezi. Amennyiben lehetséges, a radioizotópos jelölésnek a molekula olyan, központi részében kell elhelyezkednie, amely metabolikusan stabil (nem kicserélhető, anyagcsere útján nem távozik CO2-ként, és nem válik a szervezet egy szénatomos csoportjának részévé). A vizsgált vegyi anyag metabolikus útjának nyomon követése céljából a molekula több területének vagy meghatározott régióinak jelölése is szükséges lehet.
19.
A radioizotóppal jelölt és nem jelölt vizsgált vegyi anyagokat a megfelelő módszerek alkalmazásával kell elemezni a tisztaság és az azonosság meghatározása érdekében. A radioaktív vizsgált vegyi anyag radiokémiai tisztaságának az adott vizsgált vegyi anyagnál elérhető legmagasabbnak (ideális esetben 95 %-nál nagyobbnak) kell lennie, és ésszerű erőfeszítéseket kell tenni a 2 %-os vagy annál nagyobb arányú szennyeződések azonosítása érdekében. A tisztaságot, valamint minden azonosított szennyeződés meghatározását és arányát jegyzőkönyvezni kell. Egyes szabályozási programok további iránymutatást adhatnak a keverékekből összetevődő vizsgált vegyi anyagok meghatározásának és specifikációjának, valamint a tisztaság meghatározására szolgáló módszerek kialakításának támogatása érdekében.
A dózis megválasztása
Előzetes vizsgálat
20.
Általában egyetlen, szájon át beadott dózis elegendő az előzetes vizsgálathoz. A dózis nem lehet toxikus, de elég magasnak kell lennie ahhoz, hogy lehetővé tegye a kiürülő anyagokból (és adott esetben plazmából) történő metabolitmeghatározást, valamint ahhoz, hogy megfeleljen az előzetes vizsgálat kitűzött céljának a jelen vizsgálati módszer 12. bekezdése szerint.
Fő vizsgálatok
21.
A fő vizsgálatokhoz legalább két dózis javasolt, mivel a legalább két dóziscsoportból nyert információk segítséget nyújthatnak a dózisok más toxikológiai vizsgálatokban történő meghatározásához, valamint segíthetnek a már rendelkezésre álló toxicitási vizsgálatok dózis-válasz összefüggésének értékelésében.
22.
Két dózis bejuttatása esetén mindkét dózisnak elég magasnak kell lennie ahhoz, hogy lehetővé tegye a szervezetből kiürülő anyagokból (és adott esetben plazmából) történő metabolitmeghatározást. A dózis megválasztásakor figyelembe kell venni a rendelkezésre álló toxicitási adatokból származtatott információkat. Ha nem áll rendelkezésre információ (például a toxicitás klinikai tüneteit rögzítő akut orális toxicitási vizsgálatokból vagy ismételt dózisú toxicitási vizsgálatokból), a magasabb dózisként egy, a becsült LD50 értéknél (szájon át vagy bőrön át történő bejuttatás) vagy LC50 értéknél (belégzésen keresztül történő bejuttatás) alacsonyabb, vagy az akut toxicitási tartomány legkisebb becsült értékénél alacsonyabb érték fontolható meg. Az alacsonyabb dózisnak a magasabb dózis valamely hányadának kell lennie.
23.
Amennyiben csak egy dózisszintet vizsgálunk, a dózisnak ideális esetben elég magasnak kell lennie ahhoz, hogy lehetővé tegye a kiürülő anyagokból (és adott esetben plazmából) történő metabolitmeghatározást anélkül, hogy megfigyelhető toxicitást okozna. A második dózisszint kihagyását indokolni kell.
24.
Ha a dózis kinetikai folyamatokra gyakorolt hatását kell meghatározni, lehetséges, hogy két dózis nem elegendő, és legalább az egyik dózisnak elég magasnak kell lennie e folyamatok telítéséhez. Ha a plazmakoncentráció-idő görbe alatti terület a fő vizsgálatban használt valamely két dózisszint között nem lineáris, az annak a határozott jele, hogy egy vagy több kinetikai folyamat telítődése valahol a két dózisszint között következik be.
25.
Az alacsony toxicitású vizsgált vegyi anyagok esetében a maximális dózis 1 000 mg/testsúlykilogramm (szájon és bőrön át történő bejuttatás) (belégzés útján történő bejuttatás esetén e melléklet B.2. fejezete ad iránymutatást, az ez esetben alkalmazott dózis általában nem haladja meg a 2 mg/l mennyiséget). Az adott vegyi anyaggal összefüggő szempontok a szabályozási igényektől függően magasabb dózist tehetnek szükségessé. A dózis megválasztását minden esetben indokolni kell.
26.
A felhalmozódás és/vagy maradandóság lehetőségének meghatározásához elegendőek lehetnek az egyszeri dózisú vizsgálatokból származó toxikokinetikai és szöveti eloszlási adatok. Bizonyos körülmények között azonban ismételt dózis bejuttatása válhat szükségessé i. a felhalmozódás és/vagy maradandóság vagy a toxikokinetikai változások (azaz például az enzimindukció és -inhibíció) lehetőségének teljesebb körű meghatározása céljából, vagy ii. ha az alkalmazandó szabályozási rendszer megköveteli. Az ismételt adagolású vizsgálatok esetében az ismételt alacsony dózis beadása ugyan általában elegendő, bizonyos körülmények között azonban a magas dózis megismétlése is szükséges lehet (lásd még az 57. bekezdést).
A vizsgált vegyi anyag bejuttatása
27.
A vizsgált vegyi anyagot homogén módon kell feloldani vagy szuszpendálni a vizsgált vegyi anyaggal elvégzett más orális szondás toxicitási vizsgálatoknál alkalmazott vivőanyagban, amennyiben a vivőanyagra vonatkozó információk rendelkezésre álnak. A vivőanyag megválasztását indokolni kell. A választott vivőanyagot és a dózis mértékét figyelembe kell venni a vizsgálat tervezésekor. A hagyományos bejuttatási módszer a szájon át történő szondatáplálás, azonban bizonyos helyzetekben előnyös lehet a zselatinkapszulával vagy étrendi keverékként történő bejuttatás (mindkét esetben indokolás szükséges). Az egyes állatoknak ténylegesen beadott dózist meg kell erősíteni.
28.
A szájon át történő szondatáplálás révén egyszerre bejuttatandó folyadék maximális mennyisége a vizsgált állatok méretétől, a dózis vivőanyagának típusától, valamint attól függ, hogy az etetést felfüggesztjük-e a vizsgált vegyi anyag bejuttatása előtt. Az adagolás előtti etetést vagy annak korlátozását indokolni kell. A mennyiséget általában a lehető legalacsonyabb szinten kell tartani a vizes és nem vizes vivőanyagok esetében is. Rágcsálók esetében a dózis mennyisége rendszerint nem haladhatja meg a 10 ml/testsúlykilogrammot. A zsírban jobban oldódó vizsgált vegyi anyagokhoz használt vivőanyag mennyisége 4 ml/testsúlykilogrammnál is kezdődhet. Ismételt adagolás esetén, amikor a napi táplálékmegvonás nem javasolt, alacsonyabb dózismennyiségek (például 2-4 ml/testsúlykilogramm) alkalmazását kell megfontolni. Amennyiben lehetséges, megfontolható a vizsgált vegyi anyaggal elvégzett egyéb, szájon át történő szondatáplálásos vizsgálatok során bejuttatott dózisnak megfelelő mennyiség használata.
29.
A biológiai hozzáférhetőség vagy a szájon át történő relatív felszívódás meghatározásához alkalmazható a vizsgált vegyi anyag intravénás bejuttatása, valamint a vizsgált vegyi anyag vérben és/vagy kiürülő anyagokban történő mérése. Az intravénás vizsgálat esetében a vizsgált vegyi anyag egyszeri (az alacsonyabb, szájon át bejuttatott dózissal általában megegyező, de azt meg nem haladó – lásd a dózis megválasztására vonatkozó részt) dózisát juttatjuk be a megfelelő vivőanyag használatával. Ezt az anyagot a megfelelő mennyiségben (például 1 ml/testsúlykilogramm) kell bejuttatni legalább négy, megfelelő nemű állat választott bejuttatási területén (indokolt esetben mindkét nem is használható, lásd a 16. bekezdést). A vizsgált vegyi anyag intravénás bejuttatásához teljesen feloldódott vagy szuszpendált dóziskészítmény szükséges. Az intravénás bejuttatáshoz használt vivőanyag nem befolyásolhatja a vér integritását vagy a véráramlást. Ha a vizsgált vegyi anyagot infúzióval juttatjuk be, az infúzió adagolását jegyzőkönyvezni és az egyes állatok között egységesíteni kell, feltéve, hogy infúziós pumpát használunk. Érzéstelenítést kell használni, ha kanült helyezünk a nyaki vénába (a vizsgált vegyi anyag bejuttatásához és/vagy vérvételhez), vagy ha a vegyi anyagot a combverőéren keresztül juttatjuk be. Az érzéstelenítés típusára kellő figyelmet kell fordítani, mivel hatással lehet a toxikokinetikára. Az állatok számára lehetővé kell tenni a megfelelő felépülést a vizsgált vegyi anyag és a vivőanyag bejuttatását megelőzően.
30.
Bizonyos vizsgált vegyi anyagok esetében egyéb bejuttatási útvonalak – például a bőrön vagy belégzésen keresztüli bejuttatás (lásd a 74–78. bekezdést) – alkalmazhatók azok fizikai és kémiai tulajdonságainak, valamint a várt emberi használat vagy kitettség figyelembevételével.
Mérések
Tömegmérleg
31.
A tömegmérleget a bejuttatott (radioaktív) dózis vizelettel, széklettel és kilélegzett levegővel kiürülő százalékának, valamint a szövetekben, elhullott állatokban és ketreclemosóban jelen lévő százalékának összeadásával határozzuk meg (lásd a 46. bekezdést). Általában a bejuttatott vizsgált vegyi anyag (radioaktivitás) 90 %-nál nagyobb mennyiségének visszanyerése tekinthető megfelelőnek.
Felszívódás
32.
A felszívódás kezdeti becslése úgy kapható meg, hogy kihagyjuk a dózis emésztőrendszerben és/vagy a székletben lévő százalékát a tömegmérleg meghatározásából. A felszívódás százalékos arányának számítási módját lásd a 33. bekezdésben. A kiürülés vizsgálatához lásd a 44–49. bekezdést. Ha a szájon át történő adagolást követő felszívódás pontos mértékét nem lehet meghatározni a tömegmérleg-vizsgálatokkal (például ha a bejuttatott dózis több mint 20 %-a található meg a székletben), további vizsgálatok lehetnek szükségesek. Ezek a vizsgálatok vagy 1) a vizsgált vegyi anyag beadásából és a vizsgált vegyi anyag epében történő méréséből, vagy 2) a vizsgált vegyi anyag szájon át vagy intravénásan történő bejuttatásából és a vizsgált vegyi anyag vizeletben, valamint a kilélegzett levegőben és az elhullott állatokban jelen lévő nettó mennyiségének mindkét bejuttatási mód tekintetében történő méréséből állnak. Mindkét vizsgálati tervben a vizsgált vegyi anyag és a metabolitok vegyszerspecifikus elemzésére szolgáló helyettesítő módszerként elvégezzük a radioaktivitás mérését.
33.
Az epén keresztüli kiürülés vizsgálata során általában a szájon át történő bejuttatást alkalmazzuk. A vizsgálat során kanült kell vezetni legalább négy, megfelelő nemű (vagy indokolt esetben mindkét nemből választott) állat epevezetékébe, és a vizsgált vegyi anyag egyszeri dózisát kell bejuttatni. A vizsgált vegyi anyag bejuttatását követően a radioaktivitás/vizsgált vegyi anyag epén keresztüli kiürülését addig kell megfigyelni, ameddig az szükséges a bejuttatott dózis ezen útvonalon kiürülő százalékának becsléséhez, amely alapján a következőképpen közvetlenül kiszámítható a szájon át történő felszívódás mértéke:
34.
A vizsgált vegyi anyagok néhány osztálya esetében a felszívódott dózis közvetlen kiürülése fordulhat elő a bélcsatorna membránjai között. Ilyen esetekben a százalékos dózis azon patkány székletében a szájon át történő adagolást követően végzett mérése, amelynek az epevezetékébe kanült vezettünk, nem tekinthető reprezentatívnak a nem felszívódott dózis szempontjából. Amennyiben vélhetően bélcsatornán keresztüli kiürülés is előfordulhat, ajánlott a dózis százalékos felszívódását a szájon át történő és az intravénás bejuttatást követő kiürülés (érintetlen vagy kanülözött epevezetékű patkány) összehasonlításából kiszámított felszívódás alapján meghatározni (lásd a 35. bekezdést). Amennyiben a bélcsatornán keresztüli kiürülés mennyiségének meghatározását szükségesnek ítéljük, ajánlott a kanülözött epevezetékű patkányból történő kiürülés intravénás bejuttatást követő mérése is.
Biológiai hozzáférhetőség
35.
A biológiai hozzáférhetőséget az orális és intravénás csoportok plazmájának/vérének kinetikája alapján lehet meghatározni az 50–52. bekezdésben leírtak szerint, a vizsgált vegyi anyag és/vagy a megfelelő metabolitok speciális kémiai elemzése útján, így ez esetben nincs szükség radioizotóppal jelölt vizsgált vegyi anyag használatára. A vizsgált vegyi anyag vagy a megfelelő metabolit(ok) biológiai hozzáférhetősége (F) a következőképen számítható ki:
ahol az AUC a plazmakoncentráció-idő görbe alatti terület, az exp pedig a kísérleti útvonal (szájon át, bőrön át vagy belégzéssel történő adagolás).
36.
A szisztémás hatások kockázatfelmérésében történő használatkor a toxikus összetevő biológiai hozzáférhetősége általában elsőbbséget élvez a százalékos felszívódással szemben az állatkísérletekből megállapított szisztémás koncentrációk és a munkahelyi kitettséggel kapcsolatos vizsgálatokból származó analóg biomonitoring-adatok összehasonlítása során. A helyzet összetettebbé válhat, ha a dózisok a nem lineáris tartományban vannak, fontos tehát, hogy a toxikokinetikai szűréssel a lineáris tartományban lévő dózisokat határozzuk meg.
Szöveti eloszlás
37.
A vizsgált vegyi anyag és/vagy metabolitjai szövetekben történő eloszlásának ismerete fontos a célszövetek meghatározása, valamint a toxicitás mögöttes mechanizmusainak megértése szempontjából, továbbá a vizsgált vegyi anyag és a metabolit felhalmozódási vagy megmaradási képességével kapcsolatos információk megszerzése céljából. A teljes (radioaktív) dózis szövetekben, valamint az elhullott állatokban lévő százalékos arányát legalább a kiürülési kísérlet befejezésekor (például általában az adagolást követő 7 napig, vagy a vizsgált vegyi anyagra jellemző viselkedéstől függően rövidebb ideig) kell mérni. Ha a vizsgálat befejezésekor nem észlelhető vizsgált vegyi anyag a szövetekben (például mert a vizsgált vegyi anyag annak rövid felezési ideje miatt kiürülhetett a vizsgálat befejezése előtt), megfelelő körültekintéssel kell eljárni az adatok félreértelmezésének megelőzése érdekében. Ebben a helyzetben a szöveti eloszlást akkor kell vizsgálni, amikor a vizsgált vegyi anyag (és/vagy metabolit) plazmában/vérben lévő koncentrációja a legmagasabb (Tmax), vagy amikor a vizeleten keresztül történő kiürülés mennyisége a legmagasabb (lásd a 38. bekezdést). A vizsgált vegyi anyag és/vagy metabolitjai szövetekben történő eloszlásának meghatározása, (adott esetben) az időtől való függőség értékelése, a tömegmérleg meghatározásának elősegítése érdekében és/vagy az illetékes hatóság előírásai szerint a szövetek további időpontokban történő gyűjtésére is szükség lehet. A begyűjtendő szövetek közé tartoznak a májszövetek, a zsírszövetek, az emésztőrendszerből származó szövetek, a vese-, lép-, teljesvér-szövetek, az elpusztult állatokból származó szövetek, a célszervből származó szövetek, valamint bármely egyéb szövet (például pajzsmirigyszövetek, eritrociták, szaporítószervekből származó szövetek, bőrszövetek, szemszövetek [különösen a pigmentált állatokból]), amely jelentőséggel bírhat a vizsgált vegyi anyag toxikológiai értékelése szempontjából. Meg kell fontolni további szövetek ugyanazon időpontokban történő elemzését az állatok lehető legteljesebb felhasználása céljából, valamint abban az esetben, ha célszervi toxicitás figyelhető meg szubkrónikus és krónikus toxicitási vizsgálatokban. A (radioaktív) maradvány koncentrációját, valamint a szövet-plazma (vér) arányt is jegyzőkönyvezni kell.
38.
Szükséges lehet, vagy az illetékes hatóság előírhatja, hogy a plazma/vér megfelelő kinetikai vagy kiürülési kísérletei alapján megállapított szöveti eloszlást további időpontokban is értékeljük, például akkor, amikor a plazmában/vérben lévő koncentráció a legmagasabb (például Tmax), vagy amikor a vizeleten keresztül történő kiürülés mennyisége a legmagasabb. Ezen információk hasznosak lehetnek a toxicitás megértése, valamint a vizsgált vegyi anyag és a metabolit felhalmozódási és megmaradási képességének meghatározása szempontjából. A minták megválasztását indokolni kell; az elemzendő mintáknak általában meg kell egyezniük a fent említettekkel (lásd a 37. bekezdést).
39.
A radioaktivitás szöveti eloszlási vizsgálatokhoz szükséges mennyiségi meghatározását szervboncolás, homogenizáció, oxidáció és/vagy oldhatóvá tétel segítségével lehet elvégezni, amelyet a befogott maradványok folyadékszcintillációs számlálása (LSC) követ. Bizonyos, jelenleg a fejlesztés különböző stádiumaiban lévő technikák – például a mennyiségi egésztest-autoradiográfia és a mikroszkópos receptor-autoradiográfia – hasznosnak bizonyulhatnak a vizsgált vegyi anyag szervekben és/vagy szövetekben történő eloszlásának maghatározása szempontjából (3) (4).
40.
A szájon át történő bejutás kivételével az expozíciós útvonalak tekintetében meghatározott szöveteket kell gyűjteni és elemezni, például tüdőszöveteket az inhalációs vizsgálatok során és bőrszöveteket a bőrön át történő bejutással kapcsolatos vizsgálatok során. Lásd a 74–78. bekezdést.
Metabolizmus
41.
A változatlan vizsgált vegyi anyag, valamint a metabolitok azonosításához és mennyiségének meghatározásához a kiürülő anyagok (és adott esetben plazma) összegyűjtése szükséges a 44–49. bekezdésben leírtak szerint. A kiürülő anyagok metabolitok egy adott dóziscsoporton belüli meghatározásának elősegítése céljából történő összevonása megengedhető. Ajánlatos az egyes időszakokból származó metabolitok profiljának meghatározása. Ha azonban a minta és/vagy radioaktivitás hiánya ezt kizárja, a több időpontban gyűjtött vizelet és széklet összevonása megengedhető, de a több nemhez vagy dózishoz tartozó vizeleté és székleté nem. Megfelelő minőségi és mennyiségi módszerek használata szükséges a kezelt állatok vizeletének, székletének, kiürült radioaktivitásának és adott esetben epéjének vizsgálatához.
42.
Ésszerű erőfeszítéseket kell tenni a bejuttatott dózis 5 vagy nagyobb százalékában jelen lévő összes metabolit azonosságának meghatározása, valamint a vizsgált vegyi anyag metabolikus rendszerének meghatározása érdekében. A kiürülő anyagokban a bejuttatott dózis 5 vagy több százalékában jelen lévő vizsgált vegyi anyagoknakmeg kell határozni az azonosságát. Az azonosság meghatározása az összetevők pontos strukturális meghatározását jelenti. Az azonosság meghatározása általában vagy a metabolit ismert standardokkal való, két lényegileg különböző rendszer használatával végzett együttes kromatográfiájával, vagy pozitív strukturális azonosításra alkalmas technikákkal, például tömegspektrometriával, magmágneses rezonanciával (NMR) stb. történik. Együttes kromatográfia esetén nem tekinthetők a metabolit azonossága megfelelő kétmódszeres ellenőrzési módszerének azok a kromatográfiai technikák, amelyek ugyanazt az állófázist használják két különböző oldószerrendszerrel, mivel a két módszer nem független egymástól. Az azonosság együttes kromatográfiával történő meghatározását két különböző, analitikailag egymástól független rendszerrel, például reverz és normál fázisú vékonyréteg-kromatográfiával (TLC) vagy nagy teljesítményű folyadékkromatográfiával (HPLC) kell elvégezni. Spektroszkópiai módszerekkel végzett további megerősítés nem szükséges, ha a kromatográfiai szeparáció megfelelő minőségű. Alternatív módszerként az azonosság egyértelmű meghatározása strukturális információkat szolgáltató módszerek, például folyadékkromatográfia/tömegspektrometria (LC-MS), vagy folyadékkromatográfia/tandem tömegspektrometria (LC-MS/MS), gázkromatográfia/tömegspektrometria (GC-MS) és NMR-spektometria alkalmazásával is elvégezhető.
43.
Ha a bejuttatott dózis 5 vagy nagyobb százalékában jelen lévő metabolitok azonosságának meghatározása nem lehetséges, a zárójelentésben ezt meg kell indokolni/magyarázni. Ahhoz, hogy a vizsgált vegyi anyaggal kapcsolatos veszélyek és/vagy kockázatok elemzéséhez az anyagcsere-útvonalakat alaposabban is megismerhessük, helyénvaló lehet a bejuttatott dózis kevesebb mint 5 %-át kitevő mennyiségben jelen lévő metabolitok azonosságát is meghatározni. Ahol csak lehetséges, strukturális megerősítést is kell végezni. Ez magában foglalhatja a plazmában vagy vérben, vagy más szövetekben történő profilmeghatározást.
Kiürülés
44.
A bejuttatott dózis kiürülésének sebességét és mértékét a vizeletből, székletből és kilélegzett levegőből visszanyert (radioaktív) dózis százalékos arányának mérésével kell meghatározni. Ezek az adatok segítenek a tömegmérleg meghatározásában is. A vizeleten, székleten és kilélegzett levegőn keresztül távozó vizsgált vegyi anyag (radioaktivitás) mennyiségét megfelelő időközönként kell meghatározni (lásd a 47–49. bekezdést). Az ismételt dózisú kísérleteket úgy kell megtervezni, hogy azok a 26. bekezdésben meghatározott célkitűzések elérése érdekében lehetővé tegyék a kiürülési adatok összegyűjtését. Ez lehetővé teszi az egyszeri dózisú kísérletekkel történő összehasonlítást.
45.
Ha az előzetes vizsgálat eredményei azt mutatják, hogy nem ürül ki jelentős mennyiségű vizsgált vegyi anyag (radioaktivitás) a kilélegzett levegővel (a 49. bekezdés szerint), akkor a fő vizsgálat során nem szükséges a kilélegzett levegő összegyűjtése.
46.
A kiürülő anyagok (vizelet, széklet, kilélegzett levegő) gyűjtéséhez minden állatot külön metabolikus egységbe kell helyezni. Az egyes gyűjtési időszakok végén (lásd a 47–49. bekezdést) a metabolikus egységeket át kell mosni megfelelő oldószerrel (úgynevezett »ketreclemosóval«) a vizsgált vegyi anyag (radioaktivitás) maximális visszanyerése érdekében. A kiürülő anyagok gyűjtésével 7 nap után kell felhagyni, vagy azután, hogy a bejuttatott dózis legalább 90 %-át visszanyertük, attól függően, hogy melyik következik be előbb.
47.
A vizsgált vegyi anyag (radioaktivitás) vizeletben jelen lévő teljes mennyiségét a gyűjtés első napján legalább két időpontban kell meghatározni, amelyek közül az egyiknek az adagolást követő 24. órában kell történnie, azt követően pedig a vizsgálat befejezéséig naponta. Az első napon érdemes lehet kettőnél több mintavételi időpontot is kijelölni (például a 6., a 12. és a 24. órában). Az alternatív, illetve a további gyűjtési időpontokat az előzetes vizsgálatok eredményei alapján kell kijelölni. A gyűjtés ütemezését indokolni kell.
48.
A vizsgált vegyi anyag (radioaktivitás) székletben jelen lévő teljes mennyiségét, hacsak az előzetes vizsgálatok eltérő vagy további gyűjtési időpontokat nem indokolnak, naponta kell meghatározni a vizsgálat befejezéséig, első alkalommal az adagolást követő 24. órában. Az ettől eltérő gyűjtési ütemezést indokolni kell.
49.
A kilélegzés útján távozó CO2 és egyéb illékony anyagok gyűjtését meg kell szakítani az adott vizsgálatban, ha egy 24 órás gyűjtési időszak alatt a bejuttatott dózis kevesebb mint 1 %-át találjuk a kilélegzett levegőben.
Az időbeli lefolyással kapcsolatos vizsgálatok
A plazma/vér kinetikája
50.
E vizsgálatok célja a vizsgált vegyi anyag alapvető toxikokinetikai paramétereinek (például Cmax, Tmax, felezési idő [t1/2], AUC) becslése. Ezek a vizsgálatok egy dózissal, vagy – gyakrabban – két vagy több dózissal végezhetők el. A dózis beállítását a kísérlet jellege és/vagy a vizsgálat célja határozza meg. A kinetikai adatok olyan kérdések megválaszolásához lehetnek szükségesek, mint a vizsgált vegyi anyag biológiai hozzáférhetősége és/vagy a dózis kiürülésre gyakorolt hatásának meghatározása (például annak meghatározása, hogy a kiürülés dózistól függően telítődik-e).
51.
Ezekhez a vizsgálatokhoz dóziscsoportonként legalább négy, azonos nemű állatot kell használni. A felhasznált állatok nemére vonatkozó döntést indokolni kell. Meg kell fontolni mindkét nem (négy hím és négy nőstény) használatát, ha a rendelkezésre álló adatok alapján a nemek között jelentős különbségek feltételezhetők a toxicitás vonatkozásában.
52.
A (radioizotóppal jelölt) vizsgált vegyi anyag bejuttatása után megfelelő mintavételi módszertan alkalmazásával megfelelő időpontokban minden állattól vérmintát kell venni. Az állatonként levehető vérminták mennyiségét és számát korlátozhatja az ismételt mintavételnek az állat egészségére/fiziológiájára gyakorolt lehetséges hatása és/vagy az analitikai módszer érzékenysége. A mintákat minden egyes állatra vonatkozóan kell elemezni. Bizonyos körülmények között (például a metabolitok jellemzőinek meghatározásakor) több állattól származó minták összevonására lehet szükség. Az összevont mintákat egyértelműen azonosítani kell, és az összevonást indokolni kell. Amennyiben radioizotóppal jelölt vizsgált vegyi anyagot használunk, megfelelő lehet a jelen lévő teljes radioaktivitás elemzése. Ebben az esetben a teljes radioaktivitást a teljes vérben és plazmában, vagy a plazmában és a vörösvérsejtekben kell elemezni, ami lehetővé teszi a vér/plazma arány kiszámítását. Más körülmények között a kiindulási vegyület és/vagy a metabolitok azonosítását igénylő konkrétabb vizsgálatok, vagy a fehérjekötés vizsgálatának elvégzése lehet szükséges.
Egyéb szövetek kinetikája
53.
E vizsgálatok célja időbeli lefolyással kapcsolatos információk megszerzése olyan szempontokkal összefüggő kérdéseknek a vizsgált vegyi anyag különböző szövetekben lévő szintjeinek meghatározása révén történő megválaszolása céljából, mint a toxikus hatásmechanizmus, a bioakkumuláció és a bioperzisztencia. A szövetek megválasztása és az értékelt időpontok száma a megválaszolandó kérdéstől és a vizsgált vegyi anyagra vonatkozó toxikológiai adatbázistól függ. E további, szövetek kinetikájával kapcsolatos vizsgálatok megtervezésekor figyelembe kell venni a 37–40. bekezdésben leírtak szerint összegyűjtött információkat. Ezek a vizsgálatok egyszeri vagy ismételt adagolással végezhetők el. A választott megközelítést részletesen indokolni kell.
54.
A szövetek kinetikájával kapcsolatos egyéb vizsgálatok elvégzésének okai többek között a következők lehetnek:
—
bizonyíték a vérben megfigyelhető hosszabb felezési időre, ami a vizsgált vegyi anyag különböző szövetekben történő lehetséges felhalmozódására utal, vagy
—
annak vizsgálatához fűződő érdek, hogy kialakult-e egy állandósult állapot bizonyos szövetekben (az ismételt dózisú vizsgálatokban például annak ellenére, hogy a vizsgált vegyi anyag nyilvánvaló állandósult állapota már kialakulhatott a vérben, érdekek fűződhetnek annak megerősítéséhez, hogy a célszövetekben is kialakult az állandósult állapot).
55.
Az ilyen típusú, időbeli lefolyással kapcsolatos vizsgálatok esetén a vizsgált vegyi anyag megfelelő dózisát időpontonként és dózisonként legalább négy állatnak kell szájon át beadni, és az eloszlás időbeli lefolyását meg kell figyelni a választott szövetekben. Csak az egyik nem egyedei használhatók, hacsak nem figyelhető meg egy adott nemre jellemző toxicitás. A megválaszolandó kérdéstől is függ, hogy a teljes radioaktivitást, vagy a kiindulási vegyületet és/vagy a metabolitokat elemezzük-e. A szöveteken belüli eloszlást a megfelelő technikák alkalmazásával kell vizsgálni.
Enzimindukció/-inhibíció
56.
A vizsgált vegyi anyag enzimindukciójának/-inhibíciójának vagy biotranszformációjának lehetséges hatásaival foglalkozó vizsgálatokra akkor lehet szükség, ha az alábbi feltételek közül egy vagy több fennáll:
1.
a rendelkezésre álló bizonyítékok a vizsgált vegyi anyag biotranszformációja és a megnövekedett toxicitás közötti kapcsolatra utalnak;
2.
a rendelkezésre álló toxicitási adatok a dózis és a metabolizmus közötti nem lineáris kapcsolatra utalnak;
3.
a metabolitok azonosítására irányuló vizsgálatok egy potenciálisan toxikus metabolit meghatározását eredményezték, amelyet a vizsgált vegyi anyag által előidézett enzimfolyamat hozhatott létre;
4.
olyan hatásokra keresünk magyarázatot, amelyek feltételezhetően enzimindukciós jelenségekkel függnek össze;
5.
ha a vizsgált vegyi anyag metabolitprofiljában különböző fajokkal vagy különböző körülmények között elvégzett in vitro vagy in vivo kísérletek révén toxikológiai szempontból jelentős váltakozások figyelhetőek meg, szükség lehet az érintett enzim(ek) (például 1-es fázisú enzimek, úgymint a citokróm P450-függő monooxigenáz rendszer izoenzimei, 2-es fázisú enzimek, úgymint a szulfotranszferáz vagy az uridin-difoszfát-glükuroniltranszferáz izoenzimei, vagy bármely más, ide tartozó enzim) jellemzőinek meghatározására. Ezek az információk felhasználhatók a fajok közötti extrapoláció megfelelőségének értékeléséhez.
57.
A vizsgált vegyi anyaggal összefüggő toxikokinetikai változások értékelésére megfelelően validált és indokolt vizsgálati protokollokat kell alkalmazni. A példaként megemlíthető vizsgálati tervek a jelöletlen vizsgált vegyi anyag ismételt adagolását, azt követően pedig a radioizotóppal jelölt vizsgált vegyi anyag 14. napon történő egyszeri adagolását, vagy a radioizotóppal jelölt vizsgált vegyi anyag ismételt adagolását és az 1., 7. és 14. napon a metabolitprofilok meghatározása céljából végzett mintavételt foglalják magukban. A radioizotóppal jelölt vizsgált vegyi anyag ismételt adagolása információkat szolgáltathat a bioakkumulációról is (lásd a 26. bekezdést).
KIEGÉSZÍTŐ MEGKÖZELÍTÉSEK
58.
A jelen vizsgálati módszerben leírt in vivo kísérleteken túlmutató kiegészítő megközelítések hasznos információkat szolgáltathatnak a vizsgált vegyi anyag bizonyos fajokban végbemenő felszívódásával, eloszlásával, metabolizmusával vagy kiürülésével kapcsolatban.
In vitro információk használata
59.
A vizsgált vegyi anyag metabolizmusával kapcsolatos számos kérdés megválaszolható megfelelő vizsgálati rendszereket alkalmazó in vitro vizsgálatok segítségével. A májból származó, frissen izolált vagy tenyésztett hepatociták és szubcelluláris frakciók (például mikroszómák és citoszol vagy S9 frakció) felhasználhatók az esetleges metabolitok vizsgálatához. A célszervben, például a tüdőben végbemenő helyi metabolizmus vizsgálata hasznos lehet a kockázatértékelés szempontjából. Ebből a célból hasznosak lehetnek a célszövetek mikroszómás frakciói. A mikroszómákkal végzett vizsgálatok hasznosak lehetnek a lehetséges nembeli és életkorbeli különbségek meghatározása, valamint az enzimparaméterek (Km és Vmax) jellemzőinek meghatározása szempontjából, amelyek segítséget nyújthatnak a metabolizmus dózisfüggőségének kitettségi szintek vonatkozásában történő vizsgálatához. A mikroszómák hasznosak lehetnek továbbá a vizsgált vegyi anyag metabolizmusában részt vevő egyes mikroszómás enzimek azonosításában, ami a fajok közötti extrapoláció szempontjából lehet lényeges (lásd még az 56. bekezdést). A biotranszformáció előidézésének lehetősége is vizsgálható a szóban forgó vizsgált vegyi anyaggal előkezelt állatok májából származó szubcelluláris frakciók (például mikroszómák és citoszol) használatával, in vitro kísérletekben hepatocitaindukció alapján, vagy a megfelelő enzimeket kimutató egyes sejtvonalakon keresztül. Bizonyok körülmények között és a megfelelő feltételek mellett emberi szövetekből származó szubcelluláris frakciók használatát is fontolóra lehet venni a biotranszformációval kapcsolatban a fajok között esetlegesen fennálló különbségek meghatározásához. Az in vitro vizsgálatok eredményei hasznosak lehetnek a PBTK-modellek kidolgozása szempontjából is (5).
60.
A bőrön keresztüli felszívódással kapcsolatos in vitro vizsgálatok kiegészítő információkat szolgáltathatnak a felszívódás jellemzőinek meghatározásához (6).
61.
A májsejtekből származó elsődleges sejttenyészetek és a friss szövetszeletek felhasználhatók a májmikroszómákra vonatkozókhoz hasonló kérdések megválaszolásához. Bizonyos esetekben meghatározott kérdések a megfelelő enzimet határozottan kimutató sejtvonalak vagy mesterséges sejtvonalak használatával is megválaszolhatók lehetnek. Bizonyos esetekben hasznos lehet egyes citokróm P450 izoenzimek (például CYP1A1, 2E1, 1A2 és más enzimek) és/vagy 2-es fázisú enzimek kiindulási vegyület általi inhibíciójának és indukciójának in vitro kísérletek révén történő vizsgálata. Az így szerzett információk hasznosak lehetnek a hasonló szerkezetű vegyületek szempontjából.
Toxicitásvizsgálatokból származó toxikokinetikai adatok kiegészítő információként történő használata
62.
A bármely más toxicitásvizsgálat során gyűjtött vér-, szövet-, és/vagy kiürülőanyag-minták elemzése adatokat szolgáltathat a biológiai hozzáférhetőségről, a plazmakoncentráció időbeli változásáról (AUC, Cmax), a bioakkumulációs képességről, a kiürülési sebességről, valamint a metabolizmus és kinetika nemtől vagy életkortól függő változásairól.
63.
A vizsgálati terv figyelembevétele felhasználható az alábbiakkal kapcsolatos kérdések megválaszolásához: a felszívódás telítődése, biotranszformáció vagy kiürülési útvonalak magasabb dózisszinteknél, új anyagcsere-útvonalak működése magasabb dózisoknál, valamint a toxikus metabolitok korlátozása magasabb dózisoknál.
64.
Az egyéb veszélyértékelési megfontolások közé tartozhatnak a következők:
—
életkorral összefüggő érzékenység a vér-agy gát, a vese és/vagy a detoxikációs képesség állapotában fennálló különbségek miatt,
—
szubpopulációra jellemző érzékenység a biotranszformációs képességben fennálló vagy egyéb toxikokinetikai különbségek miatt,
—
a magzat vagy újszülött kitettsége a vegyszerek placentán, illetve szoptatáson keresztüli átvitele révén.
Toxikokinetikai modellezés alkalmazása
65.
A toxikokinetikai modellek hasznosak lehetnek a veszélyesség- és kockázatértékelés különböző szempontjai, például a szisztémás kitettség és a belső szövetdózis előrejelzése tekintetében. Ezenkívül a hatásmechanizmussal kapcsolatos egyes kérdések is megválaszolhatók, és ezek a modellek a fajok közötti extrapoláció, az expozíciós útvonalak, az adagolási sémák és a humán kockázatértékelés alapjául szolgálhatnak. Az adott vizsgált vegyi anyag bármely fajra vonatkozó PBTK-modelljeinek kidolgozásához többek között a következő adatok lehetnek hasznosak: 1) megoszlási hányadosok, 2) biokémiai állandók és fiziológiai paraméterek, 3) útvonalspecifikus felszívódási paraméterek és 4) a modellek értékeléséhez használt in vivo kinetikai adatok (például a megfelelő [> 10 %] kiválasztódási folyamatokhoz tartozó kiürülési paraméterek, a metabolizmus vonatkozásában a Km és a Vmax). A modellek kidolgozásához felhasznált kísérleti adatokat tudományos szempontból megalapozott módszerekkel kell előállítani, és az előállított modelleket validálni kell. A vizsgált vegyi anyagtól és a fajtól függő paramétereket, például a felszívódási arányokat, a vér-szövet megoszlást és a metabolizmus gyorsaságának állandóit gyakran határozzuk meg a nem kompartment és az élettani alapú modellek kidolgozásának elősegítése céljából (7).
ADATOK ÉS JEGYZŐKÖNYVEZÉS
66.
Ajánlott tartalomjegyzéket készíteni a vizsgálati jegyzőkönyvhöz.
A jegyzőkönyv törzse
67.
A jegyzőkönyv törzsének a jelen vizsgálati módszerben leírt információkat kell tartalmaznia, amelyeket az alábbiak szerint kell szakaszokra és bekezdésekre tagolni:
Összefoglalás
68.
A vizsgálati jegyzőkönyv e részének tartalmaznia kell a vizsgálati terv összefoglalását, valamint az alkalmazott módszerek leírását. Az összefoglalásban ki kell emelni a tömegmérleggel, a metabolitok jellegével és mennyiségével, a szövetmaradványokkal, a kiürülés sebességével, a bioakkumulációs képességgel, a nemek szerinti különbségekkel stb. kapcsolatos fő megállapításokat is. Az összefoglalásnak kellően részletesnek kell lennie ahhoz, hogy lehetővé tegye a megállapítások értékelését.
Bevezetés
69.
A jegyzőkönyv e részének tartalmaznia kell a vizsgálat célkitűzéseit, indokolását és tervét, valamint a megfelelő hivatkozásokat és az esetleges előzményeket.
Anyagok és módszerek
70.
A jegyzőkönyv e részének tartalmaznia kell az összes lényeges információ, többek között az alábbiak részletes leírását:
a)
Vizsgált vegyi anyag
Ennek az alszakasznak tartalmaznia kell a vizsgált vegyi anyag meghatározását: kémiai név, molekuláris szerkezet, a kémiai összetétel minőségi és mennyiségi meghatározása, kémiai tisztaság, valamint lehetőség szerint az esetleges szennyeződések típusa és mennyisége. Információkat kell tartalmaznia továbbá a fizikai/kémiai tulajdonságokkal, többek között a fizikai halmazállapottal, színnel, bruttó oldhatósággal és/vagy megoszlási hányadossal, stabilitással, valamint adott esetben a maró hatással kapcsolatban. Adott esetben az izomerekkel kapcsolatos információkat is fel kell tüntetni. Ha a vizsgált vegyi anyag radioizotóppal jelölt, ennek az alszakasznak a következőkre vonatkozó információkat is tartalmaznia kell: a radioizotóp típusa, a jelölés helye, fajlagos aktivitás és radiokémiai tisztaság.
A vizsgált vegyi anyag bejuttatásához használt bármilyen vivőanyag, hígítószer, szuszpendáló anyag és emulgeálószer, vagy más anyag típusát vagy leírását is meg kell adni.
b)
Kísérleti állatok
Ennek az alszakasznak a kísérleti állatokra vonatkozó információkat kell tartalmaznia, beleértve a faj, a törzs és a vizsgálat kezdetekori életkor megválasztását és ennek indokolását, az állatok nemét, valamint testsúlyát, egészségi állapotát és az állattartás módját.
c)
Módszerek
Ennek az alszakasznak részleteznie kell a vizsgálati tervet és az alkalmazott módszertant. Tartalmaznia kell az alábbiak leírását:
(1)
adott esetben az expozíciós útvonal és expozíciós körülmények bármilyen módosításának indokolása;
(2)
a dózisszintek megválasztásának indokolása;
(3)
az utóvizsgálatok kísérleti tervezéséhez használt előzetes vizsgálatok leírása, ha voltak ilyenek. Be kell nyújtani az előzetes vizsgálatot alátámasztó adatokat;
(4)
az adagoló oldat elkészítésének módja, valamint a felhasznált oldószer vagy vivőanyag típusa, ha van ilyen;
(5)
a kezelt csoportok száma és az állatok száma csoportonként;
(6)
adagolási szintek és mennyiségek (valamint radioaktivitás használata esetén a dózis fajlagos aktivitása);
(7)
bejuttatási útvonal(ak) és módok;
(8)
az adagolás gyakorisága;
(9)
táplálékmegvonási időszak (ha van ilyen);
(10)
teljes radioaktivitás állatonként;
(11)
az állatok tartása;
(12)
a minták gyűjtése és kezelése;
(13)
a metabolitok szétválasztásához, mennyiségének meghatározásához és azonosításához használt analitikai módszerek;
(14)
az alkalmazott módszerek kimutatási határa;
(15)
az alkalmazott egyéb kísérleti mérések és eljárások (beleértve a metabolitelemzéshez használt módszerek validációját).
d)
Statisztikai elemzés
Ha a vizsgálat megállapításait statisztikai elemzés útján értékeljük, elegendő információt kell megadni az elemzési módszerre és az alkalmazott számítógépes programra vonatkozóan ahhoz, hogy egy független bíráló/statisztikus újra tudja értékelni vagy rekonstruálni tudja az elemzést.
A rendszermodellezési vizsgálatok, például a PBTK-vizsgálatok esetében a modellek bemutatásának tartalmaznia kell a modell teljes leírását a modell független rekonstrukciójának és validációjának lehetővé tétele érdekében (lásd a 65. bekezdést és a Függelék: Fogalommeghatározások című részt).
Eredmények
71.
Ebben a szakaszban az összes adatot össze kell foglalni és táblázatba kell rendezni a megfelelő statisztikai értékeléssel együtt, valamint szövegesen le kell írni. A radioaktivitás számlálásával kapcsolatos adatokat a vizsgálatnak megfelelő módon kell összefoglalni és bemutatni, általában mikrogramm vagy milligramm egyenérték/minta tömege egységekben, de más egységek is használhatók. Ennek a szakasznak tartalmaznia kell a megállapítások grafikus ábrázolását, a reprezentatív kromatográfiai és spektrometriai adatok reprodukcióját, a metabolitok meghatározását/számszerűsítését, valamint a várható anyagcsere-útvonalakat, beleértve a metabolitok molekuláris szerkezetét. Ennek a szakasznak adott esetben az alábbi információkat is tartalmaznia kell:
(1)
A vizeletből, székletből, kilélegzett levegőből, valamint a ketreclemosóban talált vizeletből és székletből visszanyert radioaktivitás mennyisége és százalékos aránya.
—
Bőrvizsgálatok esetén a kezelt bőrből, bőrlemosókból visszanyert vizsgált vegyi anyaggal, valamint a bőrt takaró eszközön és a metabolikus egységen visszamaradt radioaktivitással kapcsolatos adatokat, továbbá a bőrlemosási vizsgálat eredményeit is meg kell adni. További részleteket lásd a 74–77. bekezdésben.
—
Inhalációs vizsgálatok esetén a tüdőből és az orrszövetekből visszanyert vizsgált vegyi anyaggal kapcsolatos adatokat is meg kell adni (8). További részleteket lásd a 78. bekezdésben.
(2)
A bejuttatott dózis százalékaként kifejezett szöveti eloszlás és koncentráció (mikrogramm egyenértékek/a szövet grammban kifejezett súlya), valamint a szövet-vér vagy szövet-plazma arány,
(3)
a testszövetek és kiürülő anyagok vizsgálatát magában foglaló egyes vizsgálatokból kiszámított anyagmérleg,
(4)
plazmakoncentráció és toxikokinetikai paraméterek (biológiai hozzáférhetőség, AUC, Cmax, Tmax, kiürülés, felezési idő) a megfelelő expozíciós útvonal(ak)on keresztül történő bejuttatást követően,
(5)
a vizsgált vegyi anyag felszívódásának sebessége és mértéke a megfelelő expozíciós útvonal(ak)on keresztül történő bejuttatást követően,
(6)
a vizsgált vegyi anyag és metabolitok kiürülő anyagokból gyűjtött mennyisége (a bejuttatott dózis százalékában kifejezve),
(7)
hivatkozás a függelék adataira, amelyek magukban foglalják az egyes állatok összes mérési végpontra vonatkozó adatait (például dózis bejuttatása, százalékos visszanyerés, koncentrációk, toxikokinetikai paraméterek stb.),
(8)
a várható anyagcsere-útvonalakat és a metabolitok molekuláris szerkezetét bemutató ábra.
Tárgyalás és következtetések
72.
Ebben a szakaszban a szerzőnek
(1)
be kell mutatnia a várható anyagcsere-útvonalakat a vizsgált vegyi anyag metabolizmusa és eloszlása vizsgálatának eredményei alapján,
(2)
tárgyalnia kell a vizsgált vegyi anyag eloszlásával és/vagy biotranszformációjával kapcsolatos, fajjal és nemmel összefüggő lehetséges eltéréseket,
(3)
táblázatba kell foglalnia és tárgyalnia kell a metabolitok meghatározását és mennyiségét, a kiürülés sebességét, a bioakkumulációs képességet, valamint a kiindulási vegyület és/vagy a metabolitok szövetekben jelen lévő maradványait, továbbá a toxikokinetikai paraméterek lehetséges, dózistól függő változásait, ha vannak,
(4)
bele kell foglalnia ebbe a szakaszba a toxicitásvizsgálatok elvégzése során szerzett bármely lényeges toxikokinetikai adatot,
(5)
röviden össze kell foglalnia a vizsgálat megállapításaival alátámasztható következtetéseket,
(6)
további szakaszokat kell beillesztenie (ha szükséges vagy helyénvaló).
73.
Az alátámasztó szakirodalmi információknak, táblázatoknak, ábráknak, függelékeknek stb. további szakaszokban kell helyet kapniuk.
ALTERNATÍV EXPOZÍCIÓS ÚTVONALAK
Bőrön át történő expozíció
Bőrön át történő kezelés
74.
Ez a szakasz a vizsgált vegyi anyag bőrön keresztüli toxikokinetikájának vizsgálatával kapcsolatos konkrét információkat tartalmaz. A bőrön keresztüli felszívódással kapcsolatban az e melléklet B.44. fejezetében (Bőrön át történő felszívódás: in vivo módszer (9)) találhatók információk. Egyéb végpontokkal, például az eloszlással és a metabolizmussal kapcsolatban a jelen B.36. vizsgálati módszer használható. A bőrön át történő kezelés során a vizsgált vegyi anyagot egy vagy több dózisszinten kell bejuttatni. A vizsgált vegyi anyagnak (például a bőrön alkalmazott, vizsgált vegyi anyagot tartalmazó tiszta, hígított vagy kevert anyagnak) meg kell egyeznie azzal az anyaggal, amelynek az emberek vagy más lehetséges célfajok ki lehetnek téve (vagy ennek reális helyettesítőjének kell lennie). A dózisszint(ek)et a jelen vizsgálati módszer 20–26. bekezdésében leírtaknak megfelelően kell megválasztani. A bőrön át bejuttatott dózis megválasztásakor figyelembe vehető tényezők többek között a várható humán kitettség és/vagy olyan dózisok, amelyeknél toxicitást figyeltek meg más dermális toxicitási vizsgálatok során. A bőrön át bejuttatott dózis(oka)t szükség szerint fel kell oldani megfelelő vivőanyagban, és olyan mennyiségben kell felvinni, amely elegendő a dózis bejuttatásához. Röviddel a vizsgálat megkezdése előtt a törzs háti felületén le kell nyírni a kísérleti állatok szőrét. Borotválás is alkalmazható, de azt a vizsgálat megkezdése előtt megközelítőleg 24 órával kell elvégezni. A szőrzet nyírásakor vagy borotválásakor ügyelni kell arra, nehogy lehorzsoljuk a bőrt, mert az megváltoztathatja a bőr áteresztő képességét. A vizsgált vegyi anyag felviteléhez a testfelület körülbelül 10 %-át kell megtisztítani. Erősen toxikus vegyi anyagok esetében a lefedett testfelület 10 %-nál kevesebb is lehet, de a felület lehető legnagyobb részét le kell fedni egy vékony és egységes filmréteggel. Ugyanazt a kezelt felületrészt kell használni az összes bőrvizsgálati csoportnál. A kezelt területeket megfelelő, rögzített borítással kell védeni. Az állatokat külön kell tartani.
75.
Bőrlemosási vizsgálatot kell végezni a vizsgált vegyi anyag felvitt dózisa azon mennyiségének megállapítása érdekében, amelyet el lehet távolítani a bőrről a kezelt bőrfelület kímélő szappannal és vízzel történő lemosásával. Ez a vizsgálat a vizsgált vegyi anyag bőrön keresztüli bejuttatása esetén a tömegmérleg meghatározásában is segíthet. E bőrlemosási vizsgálathoz a vizsgált vegyi anyag egyszeri dózisát kell két állatra felvinni. A dózisszintet a jelen vizsgálati módszer 23. bekezdésének megfelelően kell megválasztani (lásd még a bőrrel való érintkezés időtartamát tárgyaló 76. bekezdést). A vizsgált vegyi anyag lemosókból visszanyert mennyiségét meg kell határozni a vizsgált vegyi anyag lemosási eljárással történő eltávolítása hatékonyságának értékelése céljából.
76.
Amennyiben a maró hatás ezt nem zárja ki, a felvitt vizsgált vegyi anyagot legalább 6 órán keresztül kell a bőrön hagyni. A védőborítás eltávolításakor a kezelt területet a bőrlemosási vizsgálatnál leírtak szerint le kell mosni az eljárást követően (lásd a 75. bekezdést). A védőborítást és a lemosókat is elemezni kell a visszamaradt vizsgált vegyi anyag kimutatása céljából. A vizsgálat befejezésekor minden állatot humánus módon el kell pusztítani a (2) kiadványnak megfelelően, és a kezelt bőrt el kell távolítani. A kezelt bőr megfelelő részét elemezni kell a visszamaradt vizsgált vegyi anyag (radioaktivitás) meghatározása céljából.
77.
Gyógyszerészeti készítmények toxikokinetikai értékeléséhez a vonatkozó szabályozási rendszernek megfelelően eltérő eljárások lehetnek szükségesek.
Belélegeztetés
78.
A vizsgált vegyi anyag egyszeri (vagy szükség esetén többszöri) koncentrációját kell alkalmazni. A koncentráció(ka)t a jelen vizsgálati módszer 20–26. bekezdésében leírtaknak megfelelően kell megválasztani. A belélegeztetéses kezelést orrtölcséres vagy csak fejen alkalmazott berendezés segítségével kell elvégezni annak érdekében, hogy megelőzhető legyen az alternatív expozíciós útvonalakon keresztüli felszívódás (8). Ha egyéb belélegeztetési expozíciós körülményeket alkalmazunk, a módosítás indokolását dokumentálni kell. A belélegeztetés általi expozíció időtartamát meg kell határozni; az expozíció jellemző időtartama 4–6 óra.
SZAKIRODALOM
(1)
OECD (2009). Preliminary Review of OECD Test Guidelines for their Applicability to Manufactured Nanomaterials, Series on the Safety of Manufactured Nanomaterials No. 15, ENV/JM/MONO(2009)21, OECD, Paris.
(2)
OECD (2000). Guidance Document on Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation; Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment N°19, ENV/JM/MONO(2000), OECD, Paris.
(3)
Solon E G, Kraus L (2002). Quantitative whole-body autoradiography in the pharmaceutical industry; Survey results on study design, methods, and regulatory compliance, J Pharm and Tox Methods 46: 73-81.
(4)
Stumpf WE (2005). Drug localization and targeting with receptor microscopic autoradiography. J. Pharmacological and Toxicological Methods 51: 25-40.
(5)
Loizou G, Spendiff M, Barton HA, Bessems J, Bois FY, d’Yvoire MB, Buist H, Clewell HJ 3rd, Meek B, Gundert-Remy U, Goerlitz G, Schmitt W. (2008). Development of good modelling practice for physiologically based pharmacokinetic models for use in risk assessment: The first steps. Regulatory Toxicology and Pharmacology 50: 400 – 411.
(6)
E melléklet B.45., Bőrön át történő felszívódás: In vitro módszer című fejezete.
(7)
IPCS (2010). Characterization and application of Physiologically-BasedPharmacokinetic Models in Risk Assessment. IPCS Harmonization Project Document No 9. Geneva, World Health Organization, International Programme on Chemical Safety.
(8)
OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, Series on Testing and Assessment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paris.
(9)
E melléklet B.44., Bőrön át történő felszívódás: In vivo módszer című fejezete.
(10)
Barton HA, et al. (2006). The Acquisition and Application of Absorption, Distribution, Metabolism, and Excretion (ADME) Data in Agricultural Chemical Safety Assessments, Critical Reviews in Toxicology 36: 9-35.
(11)
Gibaldi M and Perrier D, (1982), Pharmacokinetics, 2nd edition, Marcel Dekker, Inc., New York.
Függelék
FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK
Felszívódás: Vegyi anyagok szövetekbe vagy szöveteken keresztül történő felvételének folyamata(i). A felszívódás a kiindulási vegyületre és annak összes metabolitjára vonatkozik. Nem összetévesztendő a biológiai hozzáférhetőség fogalmával.
Felhalmozódás (bioakkumuláció): A vizsgált vegyi anyag mennyiségének időbeli növekedése a szöveteken belül (általában zsírszövetekben, az ismételt expozíciót követően); ha a vizsgált vegyi anyag nagyobb mennyiségben jut be a testbe, mint amennyi kiürül, a szervezet felhalmozza a vizsgált vegyi anyagot, és a vizsgált vegyi anyag toxikus koncentrációi lehetnek megfigyelhetők.
ADME: Az angol »Absorption, Distribution, Metabolism, Excretion« (felszívódás, eloszlás, metabolizmus, kiürülés) szavak rövidítése.
AUC (a plazmakoncentráció-idő görbe alatti terület): A vizsgált vegyi anyag plazmában lévő koncentrációját az idő függvényében bemutató ábrán a görbe alatti terület. A testben előre meghatározott időtartamon belül felszívódott vizsgált vegyi anyag teljes mennyiségét jelenti. Lineáris feltételek mellett az AUC (a nullától a végtelenig) a felszívódás sebességétől függetlenül arányos a testben felszívódott vizsgált vegyi anyag teljes mennyiségével.
Autoradiográfia (egésztest-autoradiográfia): Radioaktív vizsgált vegyi anyagok szöveteken belüli lokalizációjának minőségi és/vagy mennyiségi meghatározására szolgáló technika, amely röntgenfilmet, vagy az utóbbi időben digitális foszforos képalkotást alkalmaz a radioizotóppal jelölt molekulák vagy molekulafragmentumok láthatóvá tételére oly módon, hogy rögzíti a vizsgált tárgyon belül kibocsátott sugárzást. A mennyiségi egésztest-autoradiográfia előnyökkel járhat a szerv feltárásával szemben a vizsgált vegyi anyag eloszlásának értékelése, valamint a szövetekben lévő radioaktív anyag általános visszanyerésének és bomlásának vizsgálata szempontjából. A módszer egyik jelentős előnye például, hogy felhasználható egy pigmentált állatokat alkalmazó modellben a vizsgált vegyi anyag a bizonyos molekulák megkötésére képes melaninnal történő lehetséges összekapcsolódásának vizsgálatához. Ugyanakkor bár megfelelő képet nyújthat az egész testről a nagy kapacitású és alacsony affinitású kötési helyek vonatkozásában, a technológia korlátokba ütközhet olyan konkrét célterületek felismerésekor, mint a receptorkötési területek, ahol viszonylag nagy felbontás és magas érzékenység szükséges az észleléshez. Az autoradiográfia használata esetén a bejuttatott vegyület tömegmérlegének meghatározására irányuló kísérleteket különálló csoportként vagy külön vizsgálat során kell elvégezni, nem a szöveti eloszlást vizsgáló kísérlet részeként, ahol az összes kiürülő anyagot (amely magában foglalhatja a kilélegzett levegőt is) és egész testeket homogenizálunk és vizsgálunk folyadékszcintillációs számlálás segítségével.
Epén keresztüli kiürülés: Kiválasztódás az epevezetékeken keresztül.
Bioakkumuláció: Lásd: »Felhalmozódás«.
Biológiai hozzáférhetőség: A bejuttatott dózis azon frakciója, amely eléri a szisztémás keringést, vagy amely elérhetővé válik a fiziológiai hatás helyén. Egy vizsgált vegyi anyag biológiai hozzáférhetősége általában a kiindulási vegyületre vonatkozik, de vonatkozhat annak metabolitjára is. Csak az egyik kémiai formát veszi figyelembe. Nota bene: a biológiai hozzáférhetőség és a felszívódás nem ugyanaz. A szájon át történő felszívódás (azaz a bélfalon és a portális keringésben való jelenlét) és a biológiai hozzáférhetőség (azaz a szisztémás vérben és szövetekben való jelenlét) közötti különbség például a kémiai lebomlásból adódhat a bélfali anyagcsere vagy a bél belső részébe történő kiáramló szállítás vagy a májban végbemenő preszisztémás metabolizmus, vagy más tényezők miatt (10). A toxikus összetevő (kiindulási vegyület vagy metabolit) biológiai hozzáférhetősége kritikus paraméter a humán kockázat értékelése (a magasról az alacsony dózisra való extrapoláció, útvonalak közötti extrapoláció) során a belső értékek külső NOAEL vagy BMD (alkalmazott dózis) alapján történő kiszámítása szempontjából. A májra szájon át történő bejuttatás nyomán gyakorolt hatások tekintetében a szájon át történő felszívódás vizsgálata elegendő. A bejutás helyén jelentkező hatások kivételével azonban a biológiai hozzáférhetőség általában az összes hatás szempontjából megbízhatóbb paraméter a kockázatértékelésben történő további használatra, mint a felszívódás.
Bioperzisztencia: Lásd: »Perzisztencia«.
Biotranszformáció: Az adott vizsgált vegyi anyag (általában enzimatikus) kémiai átalakulása egy másik vegyi anyaggá a testen belül. A metabolizmus szinonimája.
Cmax: Vagy a bejuttatást követő maximális (legmagasabb) koncentráció a vérben (plazmában/szérumban), vagy a bejuttatást követő maximális (legnagyobb mértékű) kiürülés (vizeletben vagy székletben).
Kiürülési sebesség: A vizsgált vegyi anyag vérből, plazmából vagy egy bizonyos szövetből egy egységnyi idő alatt történő távozása mértékének mennyiségi meghatározása.
Kompartment: A test, szövet, vagy sejt strukturális vagy biokémiai része (vagy egysége), amely független a többitől.
Detoxikációs útvonalak: A toxikus vegyi anyagok testből történő, metabolikus változás vagy kiürülés útján végbemenő kiürüléséhez vezető lépések sorozata.
Eloszlás: A vizsgált vegyi anyag és származékainak eloszlása a szervezet egészében.
Enzimek/izoenzimek: Kémiai reakciókat katalizáló fehérjék. Az izoenzimek hasonló kémiai reakciókat katalizáló, de aminosav-szekvenciájukban különböző enzimek.
Enzimatikus paraméterek: Km: Michaelis-állandó, valamint Vmax: maximális sebesség.
Kiürülés: Azon folyamat(ok), amely(ek) révén a bejuttatott vizsgált vegyi anyag és/vagy annak metabolitjai távoznak a szervezetből.
Exogén: A szervezeten vagy rendszeren kívülről bejuttatott vagy ott termelt.
Extrapoláció: Egy vagy több ismeretlen értékre való következtetés ismert vagy megfigyelt adatok alapján.
Felezési idő (t1/2): Egy adott kompartmentben lévő vizsgált vegyi anyag koncentrációjának felére való csökkenéséhez szükséges idő. Általában a plazmabeli koncentrációra vagy a vizsgált vegyi anyag egész testben jelen lévő mennyiségére vonatkozik.
Indukció/enzimindukció: Környezeti inger vagy indukáló molekula hatására lezajló enzimszintézis.
Linearitás/lineáris kinetika: Egy folyamat kinetikai szempontból akkor lineáris, ha a kompartmentek közötti átvitel sebessége arányos a jelen lévő mennyiségekkel vagy koncentrációkkal, azaz elsőrendű. Következésképpen a kiürülési és eloszlási mennyiségek, valamint a felezési idők is állandók. Az elért koncentrációk arányosak az adagolás mértékével (expozícióval), és a felhalmozódás is könnyebben előre jelezhető. A linearitás/nemlinearitás a vonatkozó paraméterek, például a különböző dózisok utáni vagy egyszeri, illetve ismételt expozíció utáni AUC összehasonlításával vizsgálható. A dózistól való függőség hiánya a vegyület metabolizmusában részt vevő enzimek telítődésére, az AUC ismételt expozíciót követő, egyszeri expozícióhoz képesti növekedése pedig a metabolizmus akadályozására utalhat, míg az AUC csökkenése a metabolizmus indukcióját jelezheti (lásd még: (11)).
Tömegmérleg: A vizsgált vegyi anyag szervezetbe bejutott és onnan távozó mennyiségének mérlege.
Anyagmérleg: Lásd: »Tömegmérleg«.
Toxicitás mechanizmusa (módja)/hatásmechanizmus (-mód): A hatásmechanizmus azokat a meghatározott biokémiai interakciókat jelenti, amelyek révén a vizsgált vegyi anyag kifejti hatását. A hatás módja a vizsgált vegyi anyag toxicitásához vezető általánosabb folyamatokat jelenti.
Metabolizmus: A biotranszformáció szinonimája.
Metabolitok: A metabolizmus vagy a metabolikus folyamatok termékei.
Szájon át történő felszívódás: A vizsgált vegyi anyag dózisának a bejuttatás helyén (például az emésztőrendszerben) felszívódott százaléka. Ez a kritikus paraméter felhasználható a bejuttatott vizsgált vegyi anyag azon frakciójának megismeréséhez amely eléri a portális vénát, majd a májat.
Megoszlási hányados: Más néven megoszlási együttható; egy vegyi anyag két oldószerben fennálló különböző oldhatóságát fejezi ki.
Vérben (plazmában/szérumban) megfigyelhető legmagasabb szintek: A bejuttatást követő maximális (legmagasabb) koncentráció a vérben (plazmában/szérumban) (lásd még: »Cmax«).
Perzisztencia (bioperzisztencia): Az adott vegyi anyag hosszú távú jelenléte (egy biológiai rendszerben) a lebomlásnak/eltávolításnak való ellenállás következtében.
Read-across módszer: Egy vagy több vegyi anyag végponti információinak felhasználása a célvegyszer végpontjának előrejelzéséhez.
Receptoros mikroszkopikus autoradiográfia (vagy receptoros mikroautoradiográfia): Ez a technológia a meghatározott szöveti helyekkel vagy sejtpopulációkkal történő xenobiotikus interakció vizsgálatára használható, például a receptorkötéssel vagy meghatározott hatásmóddal foglalkozó vizsgálatok során, amelyek nagy felbontást és magas fokú érzékenységet igényelhetnek, és amelyek más technológiákkal, például egésztest-autoradiográfiával nem megvalósíthatók.
Bejuttatási útvonal (szájon át történő, intravénás, bőrön át történő, belélegeztetéssel történő stb.): A vegyi anyagok testbe történő bejuttatásának módját jelenti (például szájon át szondatáplálással, szájon át táplálékkal, bőrön át, belélegeztetéssel, intravénásan stb.).
Telítettség: Az az állapot, amikor egy vagy több kinetikai folyamat (például felszívódás, metabolizmus vagy kiürülés) eléri a maximumát (azaz »telítetté« válik).
Érzékenység: Egy módszer vagy eszköz azon képessége, hogy meg tudja különböztetni az adott változó különböző szintjeire utaló mérési eredményeket.
Állandósult vér- (plazma-) szintek: Egy nyílt rendszer nem egyensúlyi állapota, amelyben a rendszerre ható összes hatást pontosan kiegyenlítik az ellentétes hatások, oly módon, hogy a rendszer összes összetevőjének koncentrációja állandó annak ellenére, hogy a rendszeren anyag áramlik keresztül.
Rendszermodell (élettani alapú toxikokinetikai, farmakokinetikai alapú, élettani alapú farmakokinetikai, biológiai alapú stb.): Egy rendszer viselkedését a matematika nyelvén leíró absztrakt modell.
Célszövet: Az a szövet, amelyben egy toxikus anyag valamely elsődleges negatív hatása megmutatkozik.
Vizsgált vegyi anyag: A jelen vizsgálati módszer alkalmazásával vizsgált bármely vegyi anyag vagy keverék.
Szöveti eloszlás: A vizsgált vegyi anyagnak a test egyik helyéről a másikra történő, visszafordítható mozgása. A szöveti megoszlás a szerv feltárása, homogenizáció, oxidáció és folyadékszcintillációs számlálás, vagy minőségi és/vagy mennyiségi egésztest-autoradiográfia segítségével vizsgálható. Az előbbi hasznos az ugyanazon állatok szöveteiből és maradványaiból visszanyert vizsgált vegyi anyag koncentrációjának és százalékos arányának meghatározásához, de felbontása nem feltétlenül megfelelő az összes szövet vizsgálatához, és lehet, hogy általánosságban nem képes elérni a visszanyert vegyi anyag ideális mennyiségét (< 90 %). Az utóbbi meghatározását lásd fent.
Tmax: A Cmax eléréséhez szükséges idő.
Toxikokinetika (farmakokinetika): Vegyi anyagok időbeli felszívódásának, eloszlásának, metabolizmusának és kiürülésének vizsgálata.
Modellek validációja: Egy modell rendelkezésre álló toxikokinetikai adatok konzisztens leírására való megfelelősége értékelésének folyamata. A modelleket azok előrejelzéseinek a kísérleti értékekkel történő statisztikai és vizuális összehasonlításával lehet értékelni egy közös, független változó (például az idő) alapján. Az értékelés mértékét indokolni kell a modell tervezett használata vonatkozásában.
”
8.
A melléklet a következő B.52. fejezettel egészül ki:
„B.52. AKUT INHALÁCIÓS TOXICITÁS – AKUT TOXIKUS OSZTÁLY MÓDSZER
BEVEZETÉS
1.
A jelen vizsgálati módszer egyenértékű az OECD 436. vizsgálati iránymutatásban (2009) leírt módszerrel. Az akut inhalációs toxicitásra vonatkozó első 403. vizsgálati iránymutatást 1981-ben fogadták el, és azóta felülvizsgálták (lásd e melléklet B.2. fejezetét (1)). Az inhalációs akut toxikus osztály (ATC) módszer (2) (3) (4) kidolgozását helyénvalónak ítélték a felülvizsgált orális ATC módszer elfogadását követően (a e B.1b. fejezete) (5). Az ATC vizsgálati módszer akut inhalációs toxicitásra vonatkozó visszamenőleges teljesítmény-értékelésének eredménye azt mutatta, hogy a módszer megfelelő az osztályozási és címkézési célból történő használatra (6). Az inhalációs ATC vizsgálati módszer rögzített célkoncentrációk melletti sorozatos, lépésenkénti vizsgálatot tesz lehetővé a vizsgált vegyi anyag toxicitásának besorolása céljából. A letalitás kulcsfontosságú végpont, azonban a súlyos fájdalom vagy szorongás jeleit mutató, szenvedő vagy elhullásközeli állapotban lévő állatokat humánus módon el kell pusztítani a szenvedés minimalizálása érdekében. A humánus végpontokra vonatkozóan az OECD 19. iránymutatásában (7) található útmutatás.
2.
A jelen vizsgálati módszer szerinti vizsgálatok végrehajtásához és értelmezéséhez az akut inhalációs toxicitási vizsgálatokra vonatkozó (39. számú) iránymutatás (8) nyújt útmutatást.
3.
Az e vizsgálati módszer összefüggésében alkalmazott fogalmak meghatározása az 1. függelékben, valamint a 39. iránymutatásban (8) található.
4.
A jelen vizsgálati módszer információkat szolgáltat a veszélyes tulajdonságokról, és lehetővé teszi a vizsgált vegyi anyagnak az akut toxicitást okozó vegyi anyagok osztályozására vonatkozó 1272/2008/EK rendelet (9) szerinti besorolását és osztályozását. Abban az esetben, ha az LC50 értékek pontbecslése vagy a koncentráció-válasz összefüggés elemzése szükséges, az e melléklet B.2. fejezetében leírt vizsgálati módszert kell alkalmazni (1). A vizsgálati módszer kiválasztására vonatkozó további útmutatás a 39. iránymutatásban (8) található. A jelen vizsgálati módszer nem kifejezetten különleges anyagok – például alacsony oldhatóságú izometrikus vagy rostos anyagok, vagy mesterséges nanoanyagok – vizsgálatára szolgál.
KIINDULÁSI MEGFONTOLÁSOK
5.
A jelen vizsgálati módszer szerinti vizsgálat alkalmazásának mérlegelése előtt a vizsgálati laboratóriumnak az állatkísérletek minimalizálása érdekében figyelembe kell vennie minden, a vizsgált vegyi anyagról rendelkezésre álló információt, beleértve az olyan, meglévő tanulmányokat, amelyek adatai a további vizsgálatok elvégzésének mellőzését támasztják alá. A legalkalmasabb faj, törzs, nem, expozíciós mód és a megfelelő vizsgálati koncentráció kiválasztását esetlegesen segítő információk közé tartozik a vizsgált vegyi anyag azonossága, kémiai szerkezete, valamint fizikai és kémiai tulajdonságai, az esetleges in vitro vagy in vivo toxicitási vizsgálatok eredményei, a várható felhasználási terület(ek) és a humán expozíció lehetősége, a szerkezetileg rokon vegyi anyagokról rendelkezésre álló (Q)SAR- és toxikológiai adatok. A maró (4) vagy súlyosan irritáló hatásuk miatt várhatóan súlyos fájdalmat vagy szorongást okozó koncentrációk jelen vizsgálati módszerrel való vizsgálata nem javasolt (lásd a 39. iránymutatást (8)).
A VIZSGÁLAT ELVE
6.
A progresszív eljáráson alapuló vizsgálat elve, hogy a 4 órás expozíciós időszak alatt elegendő információt szerezzünk a vizsgált vegyi anyag akut inhalációs toxicitására vonatkozóan a vizsgált vegyi anyag osztályozásának lehetővé tétele érdekében. Meghatározott szabályozási célok elérése érdekében más expozíciós időtartamok is alkalmazhatók. A lépésenként változó koncentráció bejuttatásának minden meghatározott szakaszában nemenként 3 állatot kell vizsgálni. Az elhullási aránytól és/vagy az állatok elhullásközeli állapotától függően 2 lépés elegendő lehet a vizsgált vegyi anyag akut toxicitásának megítéléséhez. Ha bizonyítható, hogy az egyik nem érzékenyebb a vizsgált anyagra, mint a másik, a vizsgálat folytatható csak az érzékenyebb nemmel. Az előző lépés eredménye meghatározza a következő lépést, az alábbiak szerint:
a)
nincs szükség további vizsgálatra;
b)
nemenként 3 állat vizsgálata szükséges; vagy
c)
6 állat vizsgálata szükséges csak az érzékenyebb nemből, azaz a toxikus osztály becsült alsó határainak vizsgált koncentrációs csoportonként nemtől függetlenül 6 állaton kell alapulniuk.
7.
Az elhullásközeli állapotban lévő, nyilvánvalóan fájdalmakkal küszködő vagy súlyos és tartós szorongás jeleit mutató állatokat humánus módon el kell pusztítani, és a vizsgálat eredményeinek értelmezésekor a vizsgálat során elhullott állatokkal azonos módon kell figyelembe venni. A megjósolható vagy közeli elhullás felismerését segítő iránymutatás, valamint az elhullás közelében lévő vagy súlyosan szenvedő állatok elpusztítására vonatkozó döntési kritériumok a humánus végpontokról szóló 19. iránymutatásban (7) találhatók.
A MÓDSZER LEÍRÁSA
Az állatfaj kiválasztása
8.
Általánosan használt laboratóriumi törzsekből származó egészséges, fiatal, ivarérett állatokat kell alkalmazni. A javasolt állatfaj a patkány, más faj használata esetén a döntést indokolni kell.
Az állatok előkészítése
9.
Olyan nőstényeket kell választani, amelyek még egyszer sem ellettek, és nem vemhesek. Az expozíció napján az állatoknak 8–12 hetes fiatal, ivarérett egyedeknek kell lenniük, a testsúlyuk pedig a korábbi expozíciókkal érintett, azonos életkorú állatok nemenkénti átlagos testsúlyától legfeljebb ± 20 %-kal térhet el. Az állatokat véletlenszerűen kell kiválasztani, egyedi azonosítás céljából meg kell jelölni azokat. Az állatokat a laboratóriumi körülményekhez való szoktatás céljából a vizsgálat megkezdése előtt legalább 5 napig a ketrecükben tartjuk. Az állatokat a vizsgálatot megelőzően rövid ideig szoktatni kell a vizsgálati eszközökhöz, mivel ezzel csökkenthető az új környezet okozta stressz.
Az állatok tartása
10.
A kísérleti állatok tartására használt helyiség hőmérséklete 22 ± 3 °C kell, hogy legyen. A relatív páratartalmat ideális esetben 30–70 %-os tartományban kell tartani, ugyanakkor ez nem feltétlenül lehetséges, ha vivőanyagként vizet használnak. Az expozíció előtt és után az állatokat általában nemek és koncentrációk szerinti csoportokban kell a ketreceikben elhelyezni, azonban az állatok ketrecenkénti számának nem szabad akadályoznia az egyes állatok megfigyelését, és minimalizálnia kell a kannibalizmus és a marakodás okozta veszteségeket. Ha az állatok expozíciója csak orron át történik, szükséges lehet szoktatni azokat a lefogásukra szolgáló csövekhez. Az állatok lefogására szolgáló csövek nem okozhatnak az állatoknak indokolatlan fizikai, termális vagy a mozgásképtelenség okozta stresszt. A lefogás hatással lehet olyan fiziológiai végpontokra, mint a testhőmérséklet (hipertermia) és/vagy a percenkénti légzésvolumen. Amennyiben a rendelkezésre álló általános adatok azt igazolják, hogy ilyen változások nem lépnek fel számottevő mértékben, az állatok lefogására szolgáló csövekhez való előzetes szoktatás mellőzhető. Az aeroszoloknak egész testfelületükön kitett állatokat az expozíció során külön ketrecben kell elhelyezni, hogy a vizsgált aeroszol ne szűrődhessen át a többi állat szőrzetén. Hagyományos és minősített laboratóriumi takarmány alkalmazható – kivéve az expozíció időtartama alatt –, korlátlan mennyiségű ivóvíz biztosítása mellett. A világítás legyen mesterséges, 12 órás világos és 12 órás sötét periódusok váltsák egymást.
Inhalációs kamrák
11.
Az inhalációs kamra kiválasztásakor figyelembe kell venni a vizsgált vegyi anyag jellegét és a vizsgálat célját. Az előnyben részesítendő expozíciós mód a csak orron keresztüli expozíció (ez magában foglalja a csak a fejet, orrot vagy szájat érintő expozíciót). A csak orron keresztüli expozíció általában előnyben részesítendő a folyékony vagy szilárd aeroszolok, valamint a lecsapódva esetlegesen aeroszolt alkotó gőzök vizsgálata esetén. Előfordulhat, hogy a vizsgálat különleges céljai egész testfelületen keresztüli expozíció alkalmazásával hatékonyabban elérhetők, ezt azonban indokolni kell a vizsgálati jegyzőkönyvben. Egész testfelületen keresztüli expozícióra szolgáló kamra használata esetén a légköri stabilitás biztosítása érdekében a vizsgált állatok össztérfogata nem haladhatja meg a kamra térfogatának 5 %-át. A csak orron át történő és az egész testfelületen keresztüli expozíciós technikák elveit, valamint azok különös előnyeit és hátrányait a 39. iránymutatás (8) ismerteti.
EXPOZÍCIÓS KÖRÜLMÉNYEK
A koncentrációk beadása
12.
Az expozíció javasolt időtartama négy óra, amelybe nem tartozik bele az egyensúlyi állapot eléréséhez szükséges időtartam. Meghatározott követelmények teljesítése érdekében ettől eltérő időtartamok alkalmazása lehet szükséges, ezt azonban a vizsgálati jegyzőkönyvben indokolni kell (lásd a 39. iránymutatást (8)). Az anyagnak egész testfelületen keresztüli expozícióra szolgáló kamrában kitett állatokat külön ketrecben kell tartani, hogy az állatok egymás tisztogatása során ne nyelhessék le a vizsgált vegyi anyagot. Az expozíció időtartama alatt az állatok nem kaphatnak takarmányt. Az állatoknak víz az egész testfelületen keresztüli expozíció teljes időtartama alatt adható.
13.
Az állatokat gáz, gőz, aeroszol vagy ezek keveréke formájában tesszük ki a vizsgált vegyi anyagnak. A vizsgálandó halmazállapot a vizsgált vegyi anyag fizikai és kémiai tulajdonságaitól, a kiválasztott koncentrációtól és/vagy a vizsgált vegyi anyag kezelése és használata során legnagyobb valószínűséggel előforduló halmazállapottól függ. A higroszkopikus és kémiailag reakcióképes vizsgált vegyi anyagokat száraz levegős körülmények között kell vizsgálni. Ügyelni kell a robbanékony koncentrációk keletkezésének elkerülésére.
Részecskeméret-eloszlás
14.
Minden aeroszol, valamint a lecsapódva esetlegesen aeroszolt alkotó gőzök esetén részecskeméretezést kell végezni. A légzőrendszer összes lényeges részének expozíciója érdekében 1 és 4 μm közötti tömegfelező aerodinamikai átmérővel (MMAD) rendelkező, az 1,5 és 3,0 közötti tartományba eső geometriai szórású (σg) aeroszolok használata javasolt (8) (13) (14). Habár ésszerű keretek között törekedni kell az e szabványnak való megfelelésre, szakértői megítélésre kell hagyatkozni, ha erre nincs lehetőség. A fémgőzök részecskéi például kisebbek lehetnek e szabványos méretnél, míg a töltéssel rendelkező részecskék, a rostok és a higroszkopikus anyagok (amelyek részecskemérete a légzőrendszer nedves környezetében nő) meghaladhatják azt.
A vizsgált vegyi anyag előkészítése vivőanyagban
15.
A vizsgált vegyi anyag megfelelő légköri koncentrációjának és részecskeméretének eléréséhez vivőanyag alkalmazható. Főszabályként a víz részesítendő előnyben. A részecskéket képző anyagok mechanikai eljárásoknak vethetők alá a szükséges részecskeméret-eloszlás elérése érdekében, ugyanakkor ügyelni kell arra, hogy a vizsgált vegyi anyag ne induljon bomlásnak és ne módosuljon. Amennyiben úgy véljük, hogy a mechanikai folyamatok (például a túlzott őrlésből adódó súrlódás miatt kialakult szélsőséges hőmérséklet) megváltoztatták a vizsgált vegyi anyag összetételét, a vizsgált vegyi anyag összetételét analitikai úton ellenőrizni kell. Kellő figyelmet kell fordítani a vizsgált vegyi anyag szennyeződésének elkerülésére. A nem morzsálódó, szándékosan belélegezhetetlen összetétellel készült szemcsés anyagokat nem szükséges vizsgálni. Kopásvizsgálattal kell igazolni, hogy a szemcsés anyag kezelése során nem keletkeznek belélegezhető részecskék. Ha a kopásvizsgálat során belélegezhető részecskék keletkezését észlelik, inhalációs toxicitási vizsgálatot kell végezni.
Kontrollállatok
16.
Negatív (levegővel kezelt) kontrollcsoport párhuzamos vizsgálata nem szükséges. Amennyiben a vizsgálati légkör létrehozása során víztől eltérő vivőanyagot alkalmazunk, vivőanyaggal kezelt kontrollcsoportra csak akkor van szükség, ha nem állnak rendelkezésre múltbeli inhalációs toxicitási adatok. Ha a vivőanyaggal kevert vizsgált vegyi anyag a toxicitási vizsgálat alapján nem bizonyul toxikusnak, a vizsgált koncentráció mellett a vivőanyag sem tekintendő toxikusnak, tehát nincs szükség vivőanyaggal kezelt kontrollra.
AZ EXPOZÍCIÓS KÖRÜLMÉNYEK NYOMON KÖVETÉSE
Kamrabeli légáramlás
17.
A kamrán keresztüli légáramlást gondosan szabályozni kell, folyamatosan nyomon kell követni, és minden expozíció során legalább óránként fel kell jegyezni. A vizsgálati légköri koncentráció (vagy stabilitás) nyomon követése valamennyi dinamikus paraméter globális mérését jelenti, és közvetett lehetőséget nyújt a légkör előállítása szempontjából lényeges összes dinamikus paraméter szabályozására. Különös figyelmet kell fordítani a csak orron át történő expozícióra szolgáló kamrában az újbóli belélegzés elkerülésére, amennyiben az expozíciós rendszeren keresztüli légáramlás nem elegendő a vizsgált vegyi anyagot tartalmazó légkör dinamikus áramlásának biztosítására. Előírt módszerek állnak rendelkezésre annak igazolására, hogy a választott működési körülmények között nem történik újbóli belélegzés (8) (15). Az oxigénkoncentrációnak legalább 19 %-nak kell lennie, a szén-dioxid-koncentráció pedig legfeljebb 1 % lehet. Amennyiben bármilyen okból feltételezhető, hogy ezek a szabványok nem teljesíthetők, az oxigén- és szén-dioxid-koncentrációt mérni kell.
A kamra hőmérséklete és relatív páratartalma
18.
A kamra hőmérsékletét 22 ± 3 °C-on kell tartani. Az állatok belégzési zónájában fennálló relatív páratartalmat a csak orron át történő és az egész testfelületen keresztüli expozíció esetén egyaránt nyomon kell követni, és legfeljebb 4 órás időtartamú expozíciók esetén legalább háromszor, rövidebb időtartamok esetén pedig óránként fel kell jegyezni. A relatív páratartalmat ideális esetben 30–70 %-os tartományban kell tartani, ugyanakkor előfordulhat, hogy ez vagy nem érhető el (például vízalapú keverékek vizsgálata esetén), vagy nem mérhető a vizsgált vegyi anyag vizsgálati módszerrel való interferenciája miatt.
Vizsgált vegyi anyag: névleges koncentráció
19.
Az expozíciós kamrában fennálló névleges koncentrációt lehetőség szerint ki kell számítani és fel kell jegyezni. A névleges koncentrációt úgy kapjuk meg, hogy az előállított vizsgált vegyi anyag tömegét elosztjuk a kamrarendszeren áthaladt levegő össztérfogatával. A névleges koncentráció nem az állatok expozíciójának jellemzésére szolgál, ugyanakkor a névleges és a tényleges koncentráció összehasonlításával megismerhető a vizsgálati rendszer előállítási hatásfoka, és így feltárhatók az előállítással összefüggő problémák.
Vizsgált vegyi anyag: tényleges koncentráció
20.
A tényleges koncentráció a vizsgált vegyi anyagnak az inhalációs kamrán belül, az állatok belégzési zónájában fennálló koncentrációját jelenti. A tényleges koncentráció vagy specifikus módszerekkel (például közvetlen mintavétellel, adszorpciós vagy kémiai reakcióképességet vizsgáló módszerekkel, valamint utólagos analitikai jellemzéssel), vagy nem specifikus módszerekkel, például gravimetriai szűrőelemzéssel határozható meg. A gravimetriai elemzés csak egykomponensű, por alakú aeroszolok, illetve alacsony illékonyságú folyadékok aeroszoljai esetén elfogadható, és alkalmazását a vizsgált vegyi anyag megfelelő, a vizsgálat előtt végzett jellemzésével kell alátámasztani. A gravimetriai elemzés a többkomponensű, por alakú aeroszolok koncentrációjának meghatározására szintén alkalmazható. Ebben az esetben azonban analitikai adatokkal kell alátámasztani, hogy a levegőben lévő anyag összetétele hasonló a kiindulási anyagéhoz. Amennyiben ilyen információ nem áll rendelkezésre, a (lehetőleg levegőben lebegő) vizsgált vegyi anyag rendszeres időközönként végzett újbóli elemzésére lehet szükség a vizsgálat során. Olyan aeroszolizálódott ágensek esetén, amelyek elpárologhatnak vagy szublimálhatnak, igazolni kell, hogy mindegyik fázisból a választott módszerrel vettünk mintát. A cél-, névleges és tényleges koncentrációt fel kell tüntetni a vizsgálati jegyzőkönyvben, azonban a letális koncentráció értékének kiszámításához csak a tényleges koncentrációkat kell felhasználni.
21.
Lehetőség szerint a vizsgált vegyi anyag egyetlen tételét kell használni, és a vizsgált mintát olyan körülmények között kell tárolni, hogy megőrződjön annak tisztasága, homogenitása és stabilitása. A vizsgálat megkezdését megelőzően el kell végezni a vizsgált vegyi anyag jellemzését, meghatározva többek között annak tisztaságát, valamint amennyiben technikailag lehetséges, az észlelt szennyező anyagok és szennyeződések azonosságát és mennyiségét. Ez többek között – de nem kizárólag – a következő adatokkal mutatható ki: retenciós idő és relatív csúcsterület, tömegspektroszkópiai vagy gázkromatográfiás elemzéssel, illetve más becslésekkel meghatározott molekulatömeg. Bár a vizsgált minta azonosságának meghatározása nem tartozik a vizsgálati laboratórium feladatai közé, óvatosságból érdemes lehet a vizsgálati laboratóriumban legalábbis korlátozott módon (például szín, fizikai jelleg stb. alapján) megerősíteni a megbízó által adott jellemzést.
22.
Az expozíciós légkört amennyire csak lehet, állandó állapotban kell tartani, továbbá az analitikai módszertől függően folyamatosan és/vagy időszakosan nyomon kell követni. Időszakos mintavétel esetén a kamrából a négyórás vizsgálat során legalább kétszer kell légköri mintát venni. Ha az alacsony légáramlási sebesség vagy koncentráció miatt ez nem megoldható, a teljes expozíciós időszak alatt egy mintavétel végezhető. Ha jelentős ingadozás figyelhető meg az egyes minták között, a következőnek vizsgált koncentrációkat expozíciónként négy minta alapján kell vizsgálni. Az egyes kamrakoncentráció-minták gázok és gőzök esetén legfeljebb ± 10 %-kal, folyékony vagy szilárd aeroszolok esetén pedig legfeljebb ± 20 %-kal térhetnek el a kamrabeli átlagkoncentrációtól. A kamra egyensúlyi állapotának kialakulásához szükséges időt (t95) ki kell számítani és fel kell jegyezni. Egy adott expozíció időtartama magában foglalja a vizsgált vegyi anyag előállításának idejét, utóbbihoz pedig figyelembe kell venni a t95 eléréséhez szükséges időt. A t95 becsléséhez a 39. iránymutatásban (8) található útmutatás.
23.
A nagyon összetett, gőzökből/gázokból és aeroszolokból álló keverékek (például égési légkörök, valamint meghatározott célra szolgáló végfelhasználói termékekből/készülékekből kibocsátott vizsgált vegyi anyagok) esetén az egyes fázisok eltérően viselkedhetnek az inhalációs kamrában, ezért mindegyik fázishoz (gőz/gáz és aeroszol) legalább egy indikátoranyagot (analitot) – általában a keverék elsődleges hatóanyagát – kell kiválasztani. Amennyiben a vizsgált vegyi anyag keverék, az analitikai koncentrációt a teljes keverék, nem pedig csak az aktív összetevő vagy a komponens (analit) vonatkozásában kell a jegyzőkönyvben feltüntetni. A tényleges koncentrációról további információ a 39. iránymutatásban található (8).
Vizsgált vegyi anyag: részecskeméret-eloszlás
24.
Az aeroszolok részecskeméret-eloszlását mindegyik 4 órás expozíció során legalább kétszer meg kell határozni sorozatos ütközésmérő vagy alternatív műszer, például aerodinamikai részecskeméret-meghatározó segítségével. Ha bizonyítható, hogy a sorozatos ütközésmérővel és az alternatív műszerrel kapott eredmények egyeznek, az alternatív műszer a teljes vizsgálat folyamán használható. Az elsődleges műszerrel párhuzamosan egy második eszközt, például gravimetriai szűrőt vagy impingert/gázbuborékoltatót kell használni az elsődleges műszer mintavételi hatékonyságának megerősítése érdekében. A részecskeméret-elemzés útján kapott tömegkoncentrációnak a szűrőelemzéssel kapott tömegkoncentrációt ésszerű mértékben meg kell közelítenie (lásd a 39. iránymutatást (8)). Ha a vizsgálat kezdeti szakaszában egyezés mutatható ki, a további megerősítő mérések mellőzhetők. Az állatok jóléte érdekében intézkedéseket kell tenni az expozíció eseteges megismétlését szükségessé tevő kétes adatok előfordulásának minimalizálása érdekében. Gőzök esetén részecskeméretezést kell végezni, ha fennáll annak a lehetősége, hogy a gőz lecsapódásával aeroszol keletkezhet, vagy ha vegyes fázisok alkotására képes részecskéket észlelünk a gőzatmoszférában (lásd a 14. bekezdést).
ELJÁRÁS
Fő vizsgálat
25.
Minden szakaszhoz nemenként három állatot, vagy az anyagra érzékenyebb nemből hat állatot kell használni. Patkányoktól eltérő rágcsálófajok csak orron át történő expozíciója esetén az expozíció maximális időtartama kiigazítható a fajspecifikus szorongás minimalizálása érdekében. A kiindulási dózisként alkalmazandó koncentrációszintet négy meghatározott szint közül kell kiválasztani, és kiindulási koncentrációszintként azt a szintet kell választani, amely a legnagyobb valószínűséggel eredményez toxicitást a kezelt állatok némelyikénél. A gázokra, gőzökre és aeroszolokra vonatkozó (a 2–4. függelékben bemutatott) vizsgálati rendszerek az 1–4. CLP-kategória (9) határértékeivel történő vizsgálatokra vonatkoznak gázok (100, 500, 2 500, 20 000 ppm/4 h) (2. függelék), gőzök (0,5, 2, 10, 20 mg/l/4 h) (3. függelék) és aeroszolok (0,05, 0,5, 1, 5 mg/l/4 h) (4. függelék) esetében. Az 1272/2008/EK rendeletben (9) nem szereplő 5. kategória a vonatkozó határkoncentrációkat meghaladó koncentrációkra vonatkozik. Minden egyes kiindulási koncentrációra a vonatkozó vizsgálati rendszert kell alkalmazni. A humánus módon elpusztított vagy elhullott állatok számától függően a vizsgálati eljárás a jelzett nyilakat követi mindaddig, amíg az osztályozás el nem végezhető.
26.
Az egyes expozíciós csoportok vizsgálata közötti időtartamot a mérgezési tünetek megjelenésének időpontja, időtartama és súlyossága határozza meg. Az állatok következő koncentrációszintnek való expozícióját addig kell halasztani, amíg ésszerű biztonsággal nem várható az előzőleg vizsgált állatok túlélése. Minden egyes koncentrációszint esetében az expozíciók között három- vagy négynapos időszak biztosítása javasolt a késleltetett toxicitás megfigyelésének lehetővé tétele érdekében. Ez az időtartam szükség szerint – például nem egyértelmű válaszok esetén – kiigazítható.
Határérték-vizsgálat
27.
Határérték-vizsgálatot akkor kell végezni, ha a vizsgált vegyi anyagról ismert vagy várható, hogy gyakorlatilag nem mérgező, azaz csak a hatóságilag előírt határkoncentráció felett idéz elő toxikus reakciót. A vizsgált vegyi anyag toxicitásával kapcsolatban hasonló vizsgált anyagokra vagy hasonló keverékekre vonatkozó adatokból nyerhetők információk, figyelembe véve a toxikológiai szempontból fontos komponenseket, valamint azok százalékos arányát. Olyan esetekben, ha kevés az anyag toxicitásával kapcsolatos információ, vagy egyáltalán nem áll rendelkezésre, vagy ha a vizsgálandó vegyi anyag várhatóan toxikus, a fő vizsgálatot kell elvégezni (további útmutatás a 39. iránymutatásban (8) található).
28.
A jelen vizsgálati módszer határérték-vizsgálataként szolgáló szokásos eljárás alkalmazása során nemenként három állatot, vagy az anyagra érzékenyebb nemből hat állatot teszünk ki gázok esetén 20 000 ppm, gőzök esetén 20 mg/l, porok/párák esetén pedig 5 mg/l koncentrációnak (ha ez megvalósítható). Aeroszolok vizsgálata esetén az elsődleges cél a belélegezhető részecskeméret (azaz 1–4 μm-es MMAD) elérése. Ez a legtöbb vizsgált vegyi anyag esetén 2 mg/l koncentrációnál érhető el. Aeroszolok 2 mg/l feletti koncentráció mellett történő vizsgálatát csak akkor szabad megkísérelni, ha ezzel elérhető a belélegezhető részecskeméret (lásd a 39. iránymutatást (8)). A GHS-nek (16) megfelelően a határkoncentrációt meghaladó koncentrációnál végzett vizsgálat állatjóléti okokból nem javasolt. Az 1272/2008/EK rendeletben (9) nem szereplő 5. GHS-kategóriában (16) végzett vizsgálatot csak abban az esetben szabad kilátásba helyezni, ha egy ilyen vizsgálat eredménye nagy valószínűséggel közvetlen jelentőséggel bírna az emberi egészség védelme szempontjából, továbbá ha mindezt a vizsgálati jegyzőkönyvben indokoljuk. Robbanásveszélyes vizsgált vegyi anyagok esetén ügyelni kell a robbanást elősegítő körülmények elkerülésére. A szükségtelen állatkísérletek elkerülése végett a határérték-vizsgálatot megelőzően állatok nélküli próbavizsgálatot kell végezni annak érdekében, hogy a kamrában elérhetők legyenek a határérték-vizsgálathoz szükséges körülményeket.
MEGFIGYELÉSEK
29.
Az expozíció időtartama alatt az állatokat gyakori klinikai megfigyeléseknek kell alávetni. Az expozíciót követően az expozíció napján legalább kétszer, vagy – amennyiben az állatok kezelésre adott reakciója ezt indokolja – annál gyakrabban, az azt követő 14 nap során pedig naponta legalább egyszer klinikai megfigyeléseket kell végezni. A megfigyelés időtartama nem rögzített, hanem a klinikai tünetek jellege és jelentkezésének ideje, valamint a felépülés időtartama alapján határozandó meg. Fontos a toxicitási tünetek megjelenésének és megszűnésének időpontja, különösen, ha fennáll a toxicitási tünetek késleltetett megjelenésének tendenciája. Minden megfigyelést szisztematikusan rögzíteni kell olyan módon, hogy minden állat esetében önálló adatsort veszünk fel. Állatjóléti okokból humánus módon el kell pusztítani az elhullásközeli állapotban lévő, valamint súlyos fájdalom és/vagy tartós és súlyos szorongás jeleit mutató állatokat. A toxicitás klinikai tünetei előfordulásának vizsgálata során ügyelni kell arra, hogy az expozíciós eljárás okozta kezdeti beteges megjelenést és átmeneti légúti változásokat ne azonosítsuk tévesen a kezeléssel összefüggő hatásokként. A humánus végpontokra vonatkozó iránymutatásban összegzett elveket és feltételeket figyelembe kell venni (7). Ha az állatokat humánus okok miatt el kell pusztítani, vagy ha azok elhullnak, a lehető legpontosabban fel kell jegyezni az elhullás időpontját.
30.
A ketrecben tartott állatok megfigyelésének ki kell terjednie a bőr és a szőrzet, a szem és a nyálkahártya, valamint a légzőrendszer, a keringési rendszer, a vegetatív és a központi idegrendszer, továbbá a szomatomotoros aktivitás és a viselkedési minták változásaira. Lehetőség szerint fel kell jegyezni, ha különbséget lehet tenni a helyi és szisztémás hatások között. Figyelmet kell szentelni a remegés, görcsök, nyáladzás, hasmenés, letargia, alvás és kóma megfigyelésére. A végbélben mért hőmérséklet bizonyítékot szolgáltathat a kezelés vagy a fogság okozta bradipnoés reflexre vagy hipo-/hipertermiára.
Testsúly
31.
Az egyes állatok súlyát az szoktatási időszak során egy alkalommal, az expozíció napján (0. nap) az expozíció előtt, valamint legalább az 1., 3. és 7. napon (azt követően pedig hetente) egy-egy alkalommal, továbbá az 1. napon túli elhullás vagy elpusztítás időpontjában fel kell jegyezni. A testsúly a toxicitás kulcsfontosságú indikátorának számít, és a vizsgálat előtti értékekhez képest legalább 20 %-os tartós súlycsökkenést mutató állatokat szorosan figyelemmel kell kísérni. Az expozíciót követő időszak végén az életben maradt állatokat újra megmérjük, majd humánus módon elpusztítjuk.
Patológia
32.
Minden kísérleti állatot makroszkópos boncolásnak kell alávetni, azokat is, amelyek a vizsgálat során elpusztultak, vagy amelyeket állatjóléti okok miatt el kellett pusztítani és ki kellett vonni a vizsgálatból. Ha a boncolás nem végezhető el rögtön azután, hogy az elpusztult állatot észrevették, az állatot hűtve (nem fagyasztva) kell tárolni az autolízis minimalizálásához kellően alacsony hőmérsékleten. A boncolást a lehető leghamarabb, általában egy vagy két napon belül el kell végezni. Minden állat esetén fel kell jegyezni minden makroszkopikus patológiai elváltozást, különös tekintettel a légzőrendszert érintő változásokra.
33.
A vizsgálat értelmező értékének fokozása érdekében előzetesen, terv szerint kilátásba helyezhetők olyan további vizsgálatok, mint az életben maradt patkányok tüdeje súlyának megmérése és/vagy az irritációnak a légzőrendszer mikroszkópos vizsgálatával való igazolása. Megvizsgálhatók azok a szervek is, amelyek makroszkopikus patológia jeleit mutatják 24 óráig vagy annál tovább életben maradt állatoknál, valamint olyan szervek, amelyekről ismert vagy várható, hogy a vizsgált anyag hatást gyakorolt azokra. A teljes légzőrendszer mikroszkópos vizsgálata hasznos információkkal szolgálhat a vízzel könnyen reagáló vizsgált vegyi anyagokról, például a savakról és higroszkópos vegyi anyagokról.
ADATOK ÉS JEGYZŐKÖNYVEZÉS
Adatok
34.
Meg kell adni az egyes állatok testsúlyával és boncolási eredményeivel kapcsolatos adatokat. A klinikai megfigyelések adatait táblázatos formában össze kell foglalni, minden egyes vizsgált csoporthoz megadva a csoportban lévő állatok számát, a specifikus mérgezési tüneteket mutató, valamint a vizsgálat során elhullott vagy humánus okokból elpusztított állatok számát, az egyes állatok elhullásának időpontját, a toxikus hatások leírását, időbeli lefolyását és visszafordíthatóságát, valamint a boncolások eredményeit.
Vizsgálati jegyzőkönyv
35.
A vizsgálati jegyzőkönyvnek a következő információkat kell értelemszerűen tartalmaznia:
Kísérleti állatok és azok tartása
—
a ketrecben való tartás körülményei, beleértve a következőket: az állatok ketrecenkénti száma (vagy számának változása), az alom anyaga, környezeti hőmérséklet és relatív páratartalom, a megvilágítás időtartama, valamint a takarmány meghatározása,
—
a vizsgált faj/törzs, valamint a patkánytól eltérő faj alkalmazásának indokolása,
—
az állatok száma, kora és neme,
—
a véletlen kiválasztás módszere,
—
a táplálék és a víz minőségére vonatkozó adatok (ezen belül a takarmány típusa/eredete, a víz eredete),
—
a vizsgálat előtti esetleges kondicionálás leírása, beleértve a takarmányt, a karantént és a betegség kezelését,
Vizsgált vegyi anyag
—
fizikai jelleg, tisztaság, valamint – ha lényeges – fizikai és kémiai tulajdonságok (beleértve az izomerizációt),
—
azonosító adatok és – amennyiben ismert – a Vegyianyag Nyilvántartási Szolgálat szerinti nyilvántartási szám (CAS-szám),
Vivőanyag
—
a vivőanyag használatának, valamint kiválasztásának indokolása (ha a vivőanyag nem víz),
—
múltbeli vagy párhuzamosan kapott adatok, amelyek igazolják, hogy a vivőanyag nem befolyásolja a vizsgálat eredményét,
Inhalációs kamra
—
az inhalációs kamra leírása, beleértve annak méreteit és térfogatát,
—
az állatok expozíciójához és a légkör előállításához használt berendezések eredete és leírása,
—
a hőmérséklet, páratartalom, részecskeméret és tényleges koncentráció mérésére szolgáló berendezések,
—
a levegő forrása, a bevitt/elszívott levegő kezelése, valamint a kondicionáló rendszer,
—
az eszközök homogén vizsgálati légkör biztosítása érdekében történő kalibrálására alkalmazott módszerek,
—
nyomáskülönbség (pozitív vagy negatív),
—
expozíciós nyílások száma kamránként (csak orron keresztüli expozíció), az állatok helye a rendszerben (egész testfelületen keresztüli expozíció),
—
a vizsgálati légkör időbeli homogenitása/stabilitása,
—
a hőmérséklet- és páratartalom-érzékelők, valamint a vizsgálati légkör mintavételének helye a kamrában,
—
légáramlási sebességek, légáramlási sebesség expozíciós nyílásonként (csak orron keresztüli expozíció), vagy az állatok terhelése kamránként (egész testfelületen keresztüli expozíció),
—
adott esetben az oxigén és a szén-dioxid mérésére használt eszközökre vonatkozó információk,
—
az inhalációs kamra egyensúlyi állapotának eléréséhez szükséges idő (t95),
—
a térfogatváltozások óránkénti száma,
—
mérőberendezések (ha vannak),
Expozíciós adatok
—
a fő vizsgálathoz kiválasztott célkoncentráció indokolása,
—
névleges koncentrációk (az inhalációs kamrába való bejuttatásra előállított vizsgált vegyi anyag össztömege osztva a kamrán áthaladt levegő térfogatával),
—
a vizsgált vegyi anyagnak az állatok belégzési zónájából gyűjtött tényleges koncentrációi; a heterogén halmazállapotokat (gáz, gőz, aeroszol) felvevő vizsgált keverékek esetén mindegyik külön elemezhető,
—
minden levegőbeli koncentrációt tömegegységekben (például mg/l, mg/m3 stb.) kell megadni; zárójelben a térfogategységekben (például ppm, ppb) kifejezett értékek is feltüntethetők,
—
részecskeméret-eloszlás, tömegfelező aerodinamikai átmérő (MMAD), valamint geometriai szórás (σg), beleértve azok kiszámításának módját. Jegyzőkönyvezni kell az egyes részecskeméret-elemzéseket,
Vizsgálati körülmények
—
A vizsgált vegyi anyag előkészítésének részletei, beleértve a szilárd anyagok részecskeméretének csökkentésére vagy a vizsgált vegyi anyag oldatainak elkészítésére esetlegesen alkalmazott eljárások részleteit. mennyiben a mechanikai folyamatok megváltoztatták a vizsgált vegyi anyag összetételét, a vizsgált vegyi anyag összetételének ellenőrzése érdekében végzett elemzések eredményeit is fel kell tüntetni,
—
a vizsgálati légkör előállítására és az állatok vizsgálati légkörnek való kitételére alkalmazott berendezések leírása (lehetőség szerint vázlatrajzzal),
—
az alkalmazott kémiai analitikai módszer és a módszer validációjának részletei (beleértve a vizsgált vegyi anyag mintavételi közegből való visszanyerésének hatásfokát),
—
a vizsgált koncentrációk kiválasztásának indokolása,
Eredmények
—
a kamrabeli hőmérséklet, páratartalom és légáramlás táblázatos összefoglalása,
—
a kamra névleges és tényleges koncentrációs adatainak táblázatos összefoglalása,
—
részecskeméret-adatok táblázatos összefoglalása, beleértve az analitikai mintavételi adatokat, a részecskeméret-eloszlást, valamint az MMAD és a σg számításait,
—
a válaszadatok és a koncentrációszintek táblázatos összefoglalása minden egyes állatra vonatkozóan (azaz a mérgezési tüneteket mutató és elhullt állatok, a hatások jellege, súlyossága és időtartama),
—
az egyes állatok vizsgálati napokon mért testsúlya, az elhullás dátuma és időpontja, amennyiben az a tervszerű elpusztítást megelőzően történt, a toxicitási tünetek megjelenésének időbeli alakulása, valamint annak megjelölése, hogy azok visszafordíthatók voltak-e az egyes állatoknál,
—
a boncolások és adott esetben a kórszövettani vizsgálatok eredményei minden egyes állatra vonatkozóan,
—
CLP-kategóriák szerinti besorolás és az LC50-határérték,
Az eredmények szöveges értékelése és értelmezése
—
különös hangsúlyt kell fektetni az e vizsgálati módszer feltételeinek – például a határkoncentrációnak vagy a részecskeméretnek – való megfelelés érdekében alkalmazott módszerek leírására,
—
ki kell térni a részecskék belélegezhetőségére az általános megállapítások tükrében, különösen ha a részecskeméretre vonatkozó feltétel nem teljesült,
—
a vizsgálat általános értékelésének ismertetnie kell a névleges és a tényleges koncentrációk meghatározására használt módszerek konzisztenciáját, valamint a tényleges és a névleges koncentráció közötti összefüggést,
—
ki kell térni az elhullás valószínű okára, valamint az elsődleges hatásmechanizmusra (szisztémás vagy helyi),
—
magyarázatot kell szolgáltatni, amennyiben a humánus végpontokról szóló OECD-iránymutatás (7) szerinti kritériumok alapján humánus módon el kellett pusztítani a fájdalommal küszködő vagy súlyos és tartós szorongás jeleit mutató állatokat.
SZAKIRODALOM
(1)
E melléklet B.2., Akut toxicitás (inhaláció) című fejezete.
(2)
Holzhütter H-G, Genschow E, Diener W, and Schlede E (2003). Dermal and Inhalation Acute Toxicity Class Methods: Test Procedures and Biometric Evaluations for the Globally Harmonized Classification System. Arch. Toxicol. 77: 243-254.
(3)
Diener W, Kayser D and Schlede E (1997). The Inhalation Acute-Toxic-Class Method; Test Procedures and Biometric Evaluations. Arch. Toxicol. 71: 537-549.
(4)
Diener W and Schlede E (1999). Acute Toxic Class Methods: Alternatives to LD/LC50 Tests. ALTEX 1: 129-134.
(5)
E melléklet B.1b., Akut orális toxicitás – Akut toxikus osztály módszer című fejezete.
(6)
OECD (2009). Report on Biostatistical Performance Assessment of the Draft TG 436 Acute Toxic Class Testing Method for Acute Inhalation Toxicity. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 105, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
(7)
OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 19. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
(8)
OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 39, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
(9)
Az Európai Parlament és a Tanács 2008. december 16-i 1272/2008/EK rendelete az anyagok és keverékek osztályozásáról, címkézéséről és csomagolásáról, a 67/548/EGK és az 1999/45/EK irányelv módosításáról és hatályon kívül helyezéséről, valamint az 1907/2006/EK rendelet módosításáról, HL L 353., 2008.12.31., 1. o.
(10)
E melléklet B.40., In vitro bőrkorrózió: transzkután elektromos rezisztencia vizsgálat (TER) című fejezete.
(11)
E melléklet B.40a., In vitro bőrkorrózió: emberi bőrmodellen végzett vizsgálat című fejezete.
(12)
OECD (2005). In Vitro Membrane Barrier Test Method for Skin Corrosion. OECD Guideline for testing of chemicals No. 435, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
(13)
Phalen RF (2009). Inhalation Studies: Foundations and Techniques. (2nd Edition) Informa Healthcare, New York.
(14)
SOT (1992). Technical Committee of the Inhalation Specialty Section, Society of Toxicology (SOT). Recommendations for the Conduct of Acute Inhalation Limit Tests. Fund. Appéldául Toxicol. 18: 321-327.
(15)
Pauluhn J and Thiel A (2007). A Simple Approach to Validation of Directed-Flow Nose-Only Inhalation Chambers. J. Appéldául Toxicol. 27: 160-167
(16)
UN (2007), United Nations Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS), ST/SG/AC.10/30, UN New York and Geneva. Available: [http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_welcome_e.html]
1. függelék
FOGALOMMEGHATÁROZÁS
Vizsgált vegyi anyag: A jelen vizsgálati módszer alkalmazásával vizsgált bármely anyag vagy keverék.
2. függelék
Az egyes kiindulási gázkoncentrációk esetében követendő eljárás (ppm/4 óra)
Ez a vizsgálati módszer egyenértékű az OECD 303. vizsgálati iránymutatásában (2001) leírt módszerrel. Az 1950-es években felismerték, hogy az újonnan bevezetett felületaktív anyagok túlzott habképződést okoznak a szennyvíztisztító telepeken és a folyókban. Az aerob szennyvíztisztítás során ezeket az anyagokat nem lehetett teljes mértékben eltávolítani, és egyes esetekben más szerves anyagok eltávolítását is korlátozták. Számos kutatás indult annak felderítésére, hogy a felületaktív anyagok hogyan távolíthatók el a szennyvízből, illetve hogy az ipar által előállított új vegyi anyagok eltávolíthatók-e egyáltalán a szennyvíztisztítás során. Erre a célra az aerob biológiai szennyvíztisztítás két fő típusát (eleveniszapos és csepegtetőtestes szennyvíztisztítás) képviselő modellberendezéseket alkalmaztak. Gyakorlati szempontból – még helyi szinten is – célszerűtlen és nagyon költséges lett volna minden egyes új vegyi anyagot elkülönítve vizsgálni és nagyüzemi szennyvízkezelő telepeket megfigyelni.
KIINDULÁSI MEGFONTOLÁSOK
Eleveniszapos berendezések
2.
Az eleveniszapos modellek mérete a leírások szerint 300 ml és kb. 2 000 ml között változott. Ezek között voltak olyanok, amelyek a valódi méretű szennyvíztisztító telepek mintájára készültek, azaz iszapülepítő tartállyal rendelkeztek, ahonnan a leülepedett iszapot visszapumpálták egy levegőztető edénybe, és olyanok is, ahol nem történt ülepítés (például Swisher (1)). A készülék méretét kettős követelmény szem előtt tartásával kellett meghatározni: egyrészt elég nagynak kellett lennie ahhoz, hogy mechanikai szempontból működőképes legyen, és kellő mennyiségű minta vételét tegye lehetővé anélkül, hogy ez a működést befolyásolná, másrészt viszont nem lehetett túlzottan hely- és anyagigényes.
3.
Ez a vizsgálati módszer azt a két készüléktípust – a Husmann-berendezést (2) és a »lyukacsos edényt« (3)(4) – ismerteti, amelyeket széles körben és kielégítő módon alkalmaztak, első alkalommal a felületaktív anyagok kutatása során. Léteznek más modellek is, például az Eckenfelder (5), amelyek alkalmazása kielégítő eredményt adott. Mivel ez a szimulációs vizsgálat viszonylag drága és munkaigényes, egyidejűleg egyszerűbb és olcsóbb szűrővizsgálatok is szerepeltek a kutatásban, amelyek az e melléklet C.4. fejezetében szereplő A–F módszereknél (6) kerülnek bemutatásra. A nagy számú felületaktív anyaggal és más vegyi anyaggal végzett kísérlet azt mutatta, hogy azok az anyagok, amelyek a szűrővizsgálaton átmentek (biológiailag gyorsan lebonthatók), a szimulációs vizsgálat során is lebomlottak. Azok az anyagok, amelyek nem mentek át a szűrővizsgálaton, részben átmentek a jellegénél fogva biológiailag lebontható anyagok azonosítására szolgáló szűrővizsgálaton (e melléklet C.12. és C.19. fejezetei (7) (8)), ám ez utóbbi csoportból csak néhány bomlott le a szimulációs vizsgálat során, míg azok a vegyi anyagok, amelyek a jellegénél fogva biológiailag lebontható anyagok azonosítására szolgáló szűrővizsgálaton nem mentek át a (9)(10)(11) szimulációs vizsgálatok során sem bomlottak le.
4.
Bizonyos célokra egyetlen üzemi feltételrendszer mellett végzett szimulációs vizsgálatok is elegendők; az eredmények kifejezésére a vizsgált vegyi anyag vagy az oldott szerves szén (DOC) százalékos eltávolítását használjuk. Ez a vizsgálati módszer egy ilyen vizsgálatot ismertet. A fejezet előző változatával szemben, amely mindössze egyetlen – mesterségesen készített szennyvizet használó, kapcsolt üzemmódban működő és viszonylag durva iszapelvételi módszert alkalmazó – készüléktípust ismertetett, a jelenlegi szöveg több változatot mutat be. A készülék típusára és üzemmódjára, valamint a szennyvízre és az iszapelvételre vonatkozóan egyaránt több alternatívát kínál. A szöveg szorosan igazodik az ISO 11733 szabvány (12) szövegéhez, amelyet az előkészítése során alapos vizsgálatnak vetettek alá, jóllehet a módszer nem képezte körvizsgálat tárgyát.
5.
Más célokra pontosabban kell ismerni a vizsgált vegyi anyag koncentrációját a berendezés elfolyó vízében, amely egy alaposabb módszert igényel. Például, a vizsgálat időszaka alatt minden nap precízebben kell ellenőrizni az iszapelvétel arányát, és a berendezéseket különféle arányokkal kell működtetni. Ha egy mindenre kiterjedő módszerre van szükség, akkor mindezeken túl két vagy három eltérő hőmérsékletérték alkalmazásával kell a vizsgálatokat elvégezni: egy ilyen módszert ír le Birch (13)(14) és foglal össze a 6. függelék. A jelenleg rendelkezésre álló ismeretek azonban nem elégségesek annak eldöntéséhez, hogy a kinetikai modellek közül melyek alkalmasak a vegyi anyagok szennyvíztisztítás során és általában véve a vízi környezetben történő biológiai lebomlása mérésére. A 6. függelékben példaként ismertetett Monod-féle kinetikai modell alkalmazhatósága az 1 mg/l és annál nagyobb koncentrációban jelen lévő vegyi anyagokra korlátozódik, de egyes vélemények szerint még ez sem bizonyított. A szennyvízre jellemzőhöz közelebb álló koncentrációk mellett végzett vizsgálatokat ír le a 7. függelék, de a 6. függelékben bemutatottakhoz hasonlóan ezek is csak egy függelékben kerülnek megjelentetésre, nem pedig külön kiadott vizsgálati módszerként.
Szűrők
6.
A csepegtetőtestes modellekre jóval kisebb figyelem irányult, melynek oka talán abban keresendő, hogy nehézkesebbek és nagyobb helyet foglalnak el, mint az eleveniszapos modellek. Gerike et al. kapcsolt üzemmódban működtetett csepegtetőtestes berendezéseket fejlesztett ki (15), amelyek viszonylag nagyméretűek (2 m magasak és 60 l térfogatúak) voltak, és minden egyes berendezés üzemeltetéséhez óránként 2 l szennyvízre volt szükség. Baumann et al (16) 1 méteres (14 mm belső átmérőjű) csövekbe helyezett gyapjúszerű poliészterszalagokat használt a csepegtetőtestes szennyvíztisztítás szimulálásához, amelyeket előzőleg 30 percig tömény eleveniszapban áztatott. A kizárólagos szénforrásként szolgáló vizsgált vegyi anyagot sóoldatban adagolták a függőlegesen elhelyezett csőbe, a biológiai lebonthatóságot a berendezés elfolyó vízének oldott szerves széntartalmának (DOC) és az eltávozó gáz széndioxid-tartalmának mérései alapján értékelték.
7.
A bioszűrők szimulálására alkalmazott másik módszernél (15) a vizsgált vegyi anyagot tartalmazó illetve nem tartalmazó szennyvizet (kb. 250 ml/h) a vízszinteshez viszonyítva kis dőlésszögben elhelyezett forgó csövek belsejébe adagolták, majd elemezték a berendezés felfogott elfolyó vízének DOC és/vagy vizsgált vegyianyag-tartalmát.
A VIZSGÁLAT ELVE
8.
E módszer célja a vízben oldható szerves vegyi anyagok aerob körülmények közötti, mikroorganizmusok által történő lebontásának és elsődleges, illetve teljes biológiai lebonthatóságának a meghatározása egy eleveniszapos folyamatot szimuláló, folyamatos üzemű vizsgálati elrendezésben. A mikroorganizmusok számára a vizsgált szerves vegyi anyag és egy biológiailag gyorsan lebontható szerves közeg jelentik a szén- és energiaforrást.
9.
Két folyamatos üzemű vizsgálóberendezést (eleveniszapos szennyvíztisztítót vagy »lyukacsos edényt«) működtetünk azonos, a vizsgálat céljának megfelelően kiválasztott feltételek mellett. Az átlagos hidraulikus tartózkodási idő általában 6 óra, az átlagos iszapkor (iszaptartózkodási idő) 6–10 nap. A fölösiszap-elvétel két módszer egyikével történik; a vizsgált vegyi anyagot csak az egyik berendezésbe befolyó szennyvízhez (szerves közeghez) adagoljuk, általában úgy, hogy a szerves szén (DOC) koncentráció a 10 mg/l és 20 mg/l között legyen. A másik berendezést kontroll berendezésként használjuk a szerves közeg biológiai lebonthatósága meghatározására.
10.
Gyakori mintavétel segítségével meghatározzuk – lehetőség szerint – a berendezés elfolyó vízének DOC-koncentrációját vagy kémiai oxigénigényét (COD), valamint – szükség esetén – specifikus analízis segítségével a vizsgált vegyi anyag koncentrációját annak a berendezésnek az elfolyó vizében, amelybe a vizsgált vegyi anyagot adagoltuk. Feltételezzük, hogy a vizsgálati berendezés és a kontroll berendezés elfolyó vízében mért DOC-koncentrációk vagy COD értékek különbsége a vizsgált vegyi anyagnak vagy szerves metabolitjainak tulajdonítható. A vizsgált vegyi anyag lebomlásának meghatározásához ezt a különbséget összehasonlítjuk a befolyó szennyvíz vizsgált vegyi anyag hozzáadásának tulajdonítható DOC-koncentrációjával vagy COD értékével.
11.
A lebomlást az idő függvényében ábrázoló görbe alapos vizsgálata általában lehetővé teszi a biológiai lebontás biológiai adszorpciótól való megkülönböztetését, megerősítése pedig általában a gyors biológiai lebonthatóság megállapítására szolgáló vizsgálat segítségével lehetséges, amelyhez abból a berendezésből gyűjtött akklimatizált oltóanyagot kell használni, amelybe a vizsgált vegyi anyagot adagoltuk.
A VIZSGÁLT VEGYI ANYAGRA VONATKOZÓ INFORMÁCIÓK
12.
Az eredmények helyes értelmezéséhez ismerni kell a vizsgált vegyi anyag tisztasági, vízoldékonysági, illékonysági és adszorpciós jellemzőit. Illékony és oldhatatlan vegyi anyagok általában csak különleges óvintézkedések megtétele esetén vizsgálhatók (lásd az 5. függeléket). Az elméleti értékek kiszámításához, illetve a paraméterek mért értékeinek ellenőrzéséhez (például elméleti oxigénigény (ThOD), oldott szerves szén (DOC) és kémiai oxigénigény (COD)) a kémiai szerkezet vagy legalább a tapasztalati képlet ismerete is szükséges.
13.
A vizsgált vegyi anyag mikroorganizmusokra gyakorolt toxikus hatására vonatkozó információk (lásd a 4. függeléket) hasznosak lehetnek a megfelelő vizsgálati koncentrációk kiválasztásánál és különösen fontosak lehetnek az alacsony biológiai lebomlási értékek helyes értelmezéséhez.
MEGFELELÉSI SZINTEK
14.
A felületaktív anyagok elsődleges biológiai lebonthatósága szimulációs (igazoló) vizsgálatának eredeti követelményei szerint a meghatározott vegyi anyagnak legalább 80 %-os eltávolítási szintet kellett elérnie ahhoz, hogy a felületaktív anyag forgalmazható legyen. 80 % alatti érték esetén a felületaktív anyag csak akkor forgalmazható, ha az itt bemutatott szimulációs (igazoló) vizsgálat alkalmazása során a meghatározott vegyi anyag több mint 90 %-a eltávolítható. A vegyi anyagok többségénél a megfelelési szint általában nem vet fel kérdéseket, az eltávolítás százalékos értéke pedig felhasználható a vegyi anyagok veszélyességének értékelése során alkalmazandó várható környezeti koncentráció közelítő becsléséhez. A vizsgálatok általában »mindent vagy semmit« eredményt hoznak. Számos vizsgálatban a tiszta vegyületek több mint háromnegyede 90 % feletti százalékos DOC-eltávolítást mutatott, a jelentősebb fokú biológiai lebonthatóságot mutató vegyületek több mint 90 %-a pedig 80 % feletti eredményt ért el.
15.
Az itt bemutatott vizsgálathoz használt (10 mg C/l körüli) koncentrációban viszonylag kevés vegyi anyag van jelen a szennyvízben (például felületaktív anyagok). Egyes vegyi anyagok esetében ez gátló koncentráció lehet, míg más estekben az alacsony koncentráció megváltoztatja az eltávolítás kinetikáját. A lebomlás pontosabb értékelése a módszerek módosításával, a vizsgált vegyi anyag valóságosnak megfelelő, alacsony koncentrációban történő használatával, majd a kapott adatokból számítható kinetikai állandók meghatározásával lehetséges. Az ehhez szükséges kísérleti módszerek teljes körű validálása, illetve a biológiai bomlási reakciókat leíró kinetikai modellek kidolgozása azonban még nem történt meg (lásd 7. függelék).
REFERENCIA-VEGYIANYAGOK
16.
A kísérleti eljárás helyes végrehajtásának biztosítása érdekében időnként ajánlott ismert viselkedésű vegyi anyagokat is vizsgálni a vizsgált anyaggal egyidejűleg. Ezek közé tartozik például az adipinsav, a 2-fenilfenol, az 1-naftol, a difénsav, az 1-naftoesav, stb. (9)(10)(11).
A VIZSGÁLATI EREDMÉNYEK MEGISMÉTELHETŐSÉGE
17.
A szimulációs vizsgálatok szakirodalma jóval szegényesebb, mint a gyors biológiai lebonthatóságra vonatkozó vizsgálatoké. A legalább 80 %-ban lebomló vegyi anyagoknál az (egyidejű) ismétlések jó reprodukálhatósági értéket mutatnak (10–15 %-on belül), a nehezebben lebomló vegyi anyagok esetén azonban nagyobb a variabilitás. Emellett néhány határesetnek minősülő vegyi anyag esetében nagyon eltérő eredmények kerültek feljegyzésre a vizsgálat 9 hetes megengedett időtartama alatt a különböző időpontokban (például 10 %, 90 %).
18.
A kétféle készüléktípus alkalmazásával kapott eredmények között kicsi az eltérés, de egyes vegyi anyagok lebomlása nagyobb mértékben és következetesebben volt megfigyelhető a háztartási szennyvízben, mint az OECD iránymutatása szerinti, mesterségesen készített szennyvízben.
A VIZSGÁLATI MÓDSZER LEÍRÁSA
Készülékek
Vizsgálati elrendezés
19.
A vizsgálati elrendezés minden egyes vizsgált vegyi anyag esetén egy vizsgálati berendezésből és egy kontroll berendezésből áll; ha csak specifikus analízis (elsődleges biológiai lebonthatóság meghatározása) elvégzésére kerül sor, akkor azonban egy vizsgálati berendezés is elegendő. Egy kontroll berendezés ugyanazon vegyi anyag vagy különböző vegyi anyagok vizsgálatához használt több vizsgálati berendezéshez is tartozhat. Kapcsolt berendezések alkalmazása (3. függelék) esetén mindegyik vizsgálati berendezéshez külön kontroll berendezést kell biztosítani. A vizsgálati elrendezés kétféle lehet: eleveniszapos szennyvíztisztítót modellező Husmann-berendezés (1. függelék, 1. ábra) vagy »lyukacsos edény« (1. függelék, 2. ábra). Mindkét esetben szükség van a befolyó szennyvíz és az elfolyó víz tárolására szolgáló megfelelő méretű tartályokra, valamint adagolópumpákra, amelyek keverve vagy külön-külön adagolják a befolyó szennyvizet és a vizsgált vegyi anyag oldatát.
20.
Mindegyik eleveniszapos berendezésnek rendelkeznie kell egy ismert térfogatú, körülbelül 3 liter eleveniszap befogadására alkalmas levegőztető edénnyel és egy körülbelül 1,5 liter térfogatú szeparátorral (másodlagos tisztítás céljára); a térfogat a szeparátor magasságának változtatásával bizonyos mértékig módosítható. Eltérő méretű edények alkalmazása a hidraulikus terhelés megfelelő módosítása esetén megengedett. Ha a vizsgálati helyiségben nem biztosítható a kívánatos tartományon belüli hőmérséklet, akkor ajánlott szabályozott hőfokú vízköpennyel körülvett edényeket használni. A szeparátorból kikerülő eleveniszapot légpumpa vagy adagoló szivattyú segítségével folyamatosan vagy egyenlő hosszúságú szüneteket tartva szakaszosan vezetjük vissza a levegőztető edénybe.
21.
A »lyukacsos edény« elrendezés egy porózus falú, kúpos aljú hengeres belső tartályból és egy azt körülfogó, valamivel nagyobb, ugyanolyan alakú vízzáró műanyag edényből áll. A lyukacsos tartály elkészítésére alkalmas anyag a 90 μm legnagyobb pórusátmérőjű, 2 mm vastag porózus polietilén. Az iszap és a tisztított szerves közeg szétválasztása azon alapul, hogy a két anyag különbözőképpen halad át a lyukacsos falon. A kilépő termék a gyűrű alakú részen gyűlik össze, ahonnan kifolyik a gyűjtőedénybe. Mivel az iszap nem ülepszik le, nem kell visszavezetni. Az egész elrendezés szabályozott hőmérsékletű vízfürdőben is kialakítható. A működtetés kezdeti szakaszaiban a lyukacsos edény eltömődése következtében túlfolyás fordulhat elő. Ilyenkor a lyukacsos betétet ki kell cserélni egy tisztára, amelyhez az eltömődött betét kivétele előtt egy szívócsövön keresztül át kell vezetni az iszapot az edényből egy tiszta vödörbe. Az eltömődött betét oldalaira tapadt iszapot is gondosan le kell kaparni és át kell rakni. Az eltömődött edény tisztítása során először gyenge vízsugárral lemossuk a visszamaradt iszapot, majd az edényt híg nátrium-hipoklorit oldatba és azt követően vízbe merítjük, és végül vízzel alaposan leöblítjük.
22.
Az iszap levegőztető edényben történő levegőztetéséhez mindkét elrendezésben megfelelő módszert kell alkalmazni, például porlasztókövet és sűrített levegőt. Ha a levegőt tisztítani kell, akkor egy megfelelő szűrőn és levegőmosón kell átvezetni. Az aerob feltételek fenntartása és az iszappelyhek állandó szuszpenzióban tartása érdekében a vizsgálat során mindvégig elegendő mennyiségű levegőnek kell áthaladnia a rendszeren.
Szűrőkészülék vagy centrifuga
23.
A minták szűrésére szolgáló, megfelelő pórusméretű (0,45 μm névleges lyukátmérőjű) membránszűrők, amelyek minimális mértékben adszorbeálják az oldható szerves vegyületeket és bocsátanak ki szerves szenet. Szerves szenet kibocsátó szűrők alkalmazása esetén a kioldódó szén eltávolítása érdekében a szűrőket meleg vízzel gondosan ki kell mosni. A másik lehetséges megoldás a 40 000 m/s2 gyorsulás elérésére képes centrifuga alkalmazása.
Analitikai berendezések
24.
A következők meghatározására alkalmas készülékek:
—
DOC (oldott szerves szén) és TOC (összes szerves szén) vagy COD (kémiai oxigénigény),
—
meghatározott vegyi anyag, ha szükséges,
—
lebegő anyagok, pH, víz oxigénkoncentrációja,
—
hőmérséklet, kémhatás,
—
ammónium, nitrit és nitrát, ha a vizsgálat a nitrifikációt befolyásoló feltételek mellett kerül elvégzésre.
Víz
25.
Kevesebb mint 3 mg/l DOC-koncentrációjú csapvíz. Ha a lúgosság nem ismert, meg kell határozni.
26.
Kevesebb mint 2 mg/l DOC-koncentrációjú ionmentesített víz.
Szerves közeg
27.
Szerves közegként mesterségesen készített szennyvíz, háztartási szennyvíz vagy ezek keverékének a használata megengedett. Kimutatták (11)(14), hogy a háztartási szennyvíz önmagában történő alkalmazása sok esetben magasabb százalékos DOC-eltávolítást eredményez, sőt olyan vegyi anyagok eltávolítását és biológiai lebontását is lehetővé teszi, amelyek az OECD által meghatározott mesterségesen készített szennyvíz alkalmazása esetén nem bonthatók le biológiailag. Ugyancsak kimutatták, hogy a háztartási szennyvíz folyamatos vagy szakaszos hozzáadása gyakran stabilizálja az eleveniszapot és a döntő fontosságú jó ülepedési képességet. Ezért háztartási szennyvíz alkalmazása ajánlott. Új tétel használata előtt mindig meg kell határozni a szerves közeg DOC vagy COD koncentrációját. A szerves közeg savasságát vagy lúgosságát ismerni kell. Ha a szerves közeg nem elég savas vagy lúgos, akkor megfelelő puffer (nátrium-hidrogén-karbonát vagy kálium-dihidrogén-foszfát) hozzáadásával lehet fenntartani a 7,5 ± 0,5 körüli pH-értéket a levegőztető edényben a vizsgálat során. Minden esetben egyedi alapon kell meghatározni, hogy mikor és mennyi puffert kell a szerves közeghez hozzáadni. Keverék folyamatosan vagy szakaszosan történő adagolása esetén gondoskodni kell arról, például vízzel való hígítás révén, hogy a keverék oldott szerves széntartalma (DOC) vagy kémiai oxigénigénye (COD) közelítőleg állandó maradjon.
Mesterségesen készített szennyvíz
28.
Csapvízben oldjunk fel literenként 160 mg peptont, 110 mg húskivonatot, 30 mg karbamidot, 28 mg dikálium-hidrogénfoszfátot (K2HPO4), 7 mg nátrium-kloridot (NaCl), 4 mg kalcium-klorid-dihidrátot (CaCl2.2H2O) és 2 mg magnézium-szulfát-heptahidrátot (Mg2SO4.7H20). Ezzel az OECD által meghatározott és példaként megadott módszerrel körülbelül 100 mg/l átlagos DOC-koncentrációjú befolyó szennyvíz készíthető. Alternatívaként alkalmazható más összetétel is, amely hozzávetőleg hasonló, a valódi szennyvízéhez közelebb álló DOC-koncentrációt eredményez. Ha kisebb töménységű befolyó szennyvízre van szükség, akkor a mesterségesen készített szennyvizet hígíthatjuk csapvízzel – például 1:1 arányban, amelynek segítségével 50 mg/l körüli koncentrációt érhetünk el. Mivel a hígabb szennyvíz alkalmazása elősegíti a nitrifikáló organizmusok szaporodását, a nitrifikáló szennyvíztisztító telepek szimulációjának vizsgálata esetén ezt a módosítást el kell végezni. Desztillált vízzel kevert műszennyvíz koncentrátumot is készíthetünk, amely 1 °C hőmérsékleten egy hétig tárolható. Felhasználás előtt hígítsuk csapvízzel. (Bár ez a közeg nem teljesen megfelelő, például a nitrogén koncentrációja túl magas, míg a széntartalom viszonylag alacsony, a foszfát puffer hozzáadásán és a pepton tartalom növelésén kívül jobb javaslat eddig nem született).
Háztartási szennyvíz
29.
Elsősorban háztartási szennyvizet fogadó szennyvíztisztító telepről származó, naponta frissen gyűjtött, ülepített szennyvizet használjunk. A durva részecskéktől jobbára mentes szennyvizet az elsődleges ülepítést megelőzően, az elsődleges ülepítőtartály túlfolyójából vagy az eleveniszapos üzem betáplálási pontjáról kell gyűjteni. A szennyvíz felhasználás előtt több (általában legfeljebb hét) napig tárolható 4 °C hőmérsékleten, amennyiben bizonyítható, hogy a DOC-koncentráció (vagy a COD) nem csökken jelentős mértékben (azaz legalább 20 %-kal) a tárolás során. Új tétel használata előtt mindig be kell állítani a DOC-koncentrációt (vagy a COD-t) egy megfelelő állandó értékre, például csapvíz hozzáadásával, hogy a vizsgálat során minél kisebb zavar keletkezzen.
Eleveniszap
30.
Az oltóanyagként használt eleveniszapot egy elsősorban háztartási szennyvizet kezelő, megfelelően üzemeltetett szennyvíztisztító telep vagy laboratóriumi méretű eleveniszapos berendezés levegőztető tartályából gyűjtsük.
A vizsgált vegyi anyag törzsoldatai
31.
A megfelelően oldható vegyi anyagok törzsoldatait ionmentesített víz vagy a mesterségesen készített szennyvíz ásványi összetevőjének felhasználásával készítjük el a megfelelő koncentrációban (például 1-5 g/l). (Az oldhatatlan és illékony vegyi anyagokra vonatkozóan lásd az 5. függeléket.) Határozzuk meg a törzsoldat DOC és összes szerves szén (TOC) tartalmát, és a későbbiekben minden új tételnél ismételjük meg a mérést. Ha a DOC és a TOC különbsége nagyobb, mint 20 %, akkor ellenőrizzük a vizsgált vegyi anyag vízoldékonyságát. A visszanyerési arány megfelelőségének ellenőrzéséhez (általában > 90 % várható) hasonlítsuk össze a DOC-tartalmat vagy a vizsgált vegyi anyag törzsoldat specifikus analízisével meghatározott koncentrációját a névleges értékkel. Különösen diszperziók esetén kell ellenőrizni, hogy a DOC használható analitikai paraméter, vagy csak a vizsgált vegyi anyagra specifikus analitikai módszert lehet alkalmazni. Diszperzió használata esetén a mintákat centrifugálni kell. Minden új tételre vonatkozóan meg kell határozni az oldott szerves széntartalmat, a kémiai oxigénigényt, illetve – specifikus analízissel – a vizsgált vegyi anyag tartalmat.
32.
Határozzuk meg a törzsoldat pH értékét. A szélsőséges értékek azt jelzik, hogy a vegyi anyag hozzáadása hatással lehet az eleveniszap pH értékére a vizsgálati elrendezésben. Ebben az esetben kis mennyiségű szervetlen sav vagy bázis segítségével semlegesíthetjük a törzsoldatot, azaz a pH értéket 7 ± 0,5-re állíthatjuk be, ügyelve arra, hogy elkerüljük a vizsgált vegyi anyag kicsapódását.
ELJÁRÁS
33.
Az itt leírt eljárás eleveniszapos berendezés használata esetén alkalmazandó; »lyukacsos edény« használata esetén kis mértékben módosítani kell.
Az oltóanyag előkészítése
34.
A vizsgálat kezdetén eleveniszapot vagy kisszámú mikroorganizmust használunk oltóanyagként a vizsgálati elrendezésben. Az oltóanyagot a felhasználás előtt megfelelő szellőzést biztosítva szobahőmérsékleten kell tartani, és 24 órán belül fel kell használni. Az első esetben egy főként háztartási szennyvizet fogadó, jól működő biológiai szennyvíztisztító telep vagy laboratóriumi szennyvíztisztító berendezés levegőztető tartályából eleveniszap-mintát veszünk. Nitrifikáló feltételek szimulálása esetén nitrifikáló szennyvíztisztító telepről származó mintát kell használni. Meghatározzuk a lebegőanyag koncentrációt, és szükség esetén ülepítéssel töményítjük az iszapot, hogy a lehető legkisebb mennyiséget kelljen a vizsgálati elrendezésben használni. A szárazanyag kezdeti koncentrációját 2,5 g/l-re kell beállítani.
35.
A második esetben háztartási szennyvizet fogadó biológiai szennyvíztisztító telep elfolyó vizét használjuk oltóanyagként 2–10 ml/l koncentrációban, amelyhez érdemes különféle más forrásokból – például felszíni vizekből – származó oltóanyagokat hozzáadni, hogy minél több különböző baktériumfaj legyen jelen. Ebben az esetben az eleveniszap a vizsgálati elrendezésben jön létre és képződik.
A szerves közeg adagolása
36.
A vizsgálat megkezdésekor és a vizsgálat alatt mindvégig gondoskodjunk arról, hogy a befolyó szennyvizet és az elfolyó vizet tartalmazó tartályok és a befolyó szennyvizet tartalmazó edényekből kivezető, illetőleg az elfolyó vizet tartalmazó edényekbe bevezető csövek mindig alaposan meg legyenek tisztítva, hogy ne alakulhassanak ki rajtuk mikrobatenyészetek. A vizsgálati elrendezést szabályozott (általában 20–25 °C) hőmérsékletű helyiségben kell felállítani, vagy vízköpenyes vizsgálati berendezéseket kell alkalmazni. Készítsünk elegendő mennyiséget a szükséges szerves közegből (27–29. bekezdés). Töltsük fel a levegőztető edényt és a szeparátort a szerves közeggel, majd adjuk hozzá az oltóanyagot (34–35. bekezdés). Indítsuk el a levegőztetést úgy, hogy az iszapot szuszpenzióban és aerob körülmények között tartsuk, majd kezdjük meg a befolyó szennyvíz adagolását, valamint a leülepedett iszap visszavezetését. A vizsgálati és a kontrollberendezésekben a szerves közeget a tárolóedényből a levegőztető edénybe kell adagolni (20–21. bekezdés), az elfolyó vizet pedig hasonló tárolóedényekben kell felfogni. A 6 órás szokásos hidraulikus tartózkodási idő eléréséhez 0,5 l/h sebességgel kell a szerves közeget pumpálni. A sebesség beállításához az adagolt szerves közeg napi mennyiségét úgy mérjük, hogy figyeljük a tárolóedényekben található mennyiség csökkenését. A vegyi anyagok szakaszos kiengedése vagy a sokkszerű terhelés hatásainak meghatározásához más adagolási módszer szükséges.
37.
Ha a szerves közeget 1 napnál hosszabb ideig tartó használatra készítjük, körülbelül 4 °C hőmérsékletre kell hűteni, vagy más tartósítási módszert kell alkalmazni a mikroorganizmusok szaporodásának és a vizsgálati berendezésen kívüli biológiai lebomlás megakadályozására (29. bekezdés). Mesterségesen készített szennyvíz használata esetén tömény (példáulpéldául 10-szeres töménységű) törzsoldat készíthető (28. bekezdés), amelyet körülbelül 4 °C hőmérsékleten lehet tárolni. Ezt a törzsoldatot használat előtt megfelelő mennyiségű csapvízzel jól el kell keverni; alternatívaként közvetlenül a készülékbe adagolható, miközben a megfelelő mennyiségű csapvíz adagolása külön történik.
A vizsgált vegyi anyag adagolása
38.
A vegyi anyag törzsoldatából (31. bekezdés) töltsünk megfelelő mennyiséget a befolyó szennyvizet tartalmazó tárolóedénybe, vagy adagoljuk közvetlenül a levegőztető edénybe egy külön adagolópumpa segítségével. A vizsgálat során a befolyó szennyvíz szokásos átlagos DOC-koncentrációját 10 mg/l és 20 mg/l közötti értékre kell beállítani, a maximális koncentráció pedig nem haladhatja meg az 50 mg/l értéket. Ha a vizsgált vegyi anyag vízben rosszul oldódik, vagy toxikus hatásai lehetnek, akkor a DOC-koncentrációt 5 mg/l-re vagy annál alacsonyabb értékre csökkenthetjük, amennyiben létezik megfelelő specifikus analitikus módszer, és azt el is végeztük (a vízben rosszul oldódó vizsgált vegyi anyagból készített diszperzió adagolásának speciális módszereit lásd az 5. függelékben).
39.
A vizsgált vegyi anyag adagolásának megkezdése előtt meg kell várni, amíg a rendszer állapota stabilizálódik, és a szerves közegből történő DOC-eltávolítás hatékonysága eléri a megfelelő szintet (kb. 80 %). A vizsgált vegyi anyag hozzáadása előtt ellenőrizni kell, hogy valamennyi berendezés egyforma hatékonysággal üzemel; ellenkező esetben a különböző iszapok összekeveredhetnek, és egyenlő mennyiség kerülhet vissza az egyes berendezésekbe. Ha (kb.) 2,5 g/l (száraz tömeg) eleveniszapot tartalmazó oltóanyagot használunk, akkor a vizsgált vegyi anyag adagolását már a vizsgálat megkezdésekor el lehet indítani, mivel a kezdettől fogva növekvő mennyiségben történő közvetlen adagolás azzal az előnnyel jár, hogy az eleveniszap jobban tud alkalmazkodni a vizsgált vegyi anyaghoz. A vizsgált vegyi anyag hozzáadásának módjától függetlenül ajánlott rendszeres időközönként ellenőrizni az áramlási sebességet és/vagy a tárolóedény(ek)ben lévő mennyiségeket.
Az eleveniszap kezelése
40.
Az alkalmazott oltóanyagtól függetlenül az eleveniszap lebegőanyag-koncentrációja – a szerves közeg minőségétől és töménységétől, az üzemi feltételektől, a jelen lévő mikroorganizmusok természetétől, valamint a vizsgált vegyi anyag hatásától függően – az 1–3 g/l (száraz tömeg) tartományon belül stabilizálódik a vizsgálat során.
41.
Hetente vagy gyakrabban vagy meg kell határozni a lebegőanyag-koncentrációt a levegőztető edényekben és a fölös iszap megfelelő hányadát el kell távolítani úgy, hogy a koncentráció folyamatosan 1 g/l és 3 g/l (száraz tömeg) között maradjon, vagy pedig gondoskodni kell arról, hogy az átlagos iszapkor értéke állandó – általában 6–10 nap –legyen. Így például 8 napos iszaptartózkodási idő esetén az eleveniszap 1/8-át kell minden nap eltávolítani a levegőztető edényből és megsemmisíteni. Ezt a műveletet naponta, vagy, ami előnyösebb, egy szakaszos üzemű automata szivattyú segítségével kell elvégezni. A lebegőanyag-koncentráció állandó szinten vagy egy szűk tartományon belül tartása önmagában nem biztosítja, hogy az iszaptartózkodási idő (SRT) – a vizsgált vegyi anyag elfolyó vízben mért koncentrációját meghatározó üzemi változó – értéke is állandó lesz.
42.
A vizsgálat időtartama alatt naponta vagy gyakrabban el kell távolítani és újra kell szuszpendálni a levegőztető edény és a szeparátor falára tapadt iszapot. A biofilmképződés megakadályozása érdekében a csöveket és a vezetékeket rendszeresen ellenőrizni és tisztítani kell. A leülepedett iszapot lehetőleg szakaszos szivattyúzással áramoltassuk vissza a szeparátorból a levegőztető edénybe. A »lyukacsos edény« elrendezésben nem történik visszaáramoltatás, de ebben az esetben is gondoskodni kell arról, hogy a belső edényt tisztára cseréljük, mielőtt túlzottan megtelik (21. bekezdés).
43.
Husmann-berendezés alkalmazása esetén előfordulhat, hogy rossz ülepedést és iszapveszteséget tapasztalunk. Ezek az alább felsorolt intézkedések legalább egyikének a vizsgálati és a kontroll berendezésnél történő egyidejű végrehajtásával orvosolhatók:
—
Rendszeres időközönként – például hetente – alkalmazzunk adalékként friss eleveniszapot vagy derítőszert (például edényenként 2 ml 50 g/l FeCl3) de vigyázva, hogy a vizsgált vegyi anyag ne csapódjon ki vagy lépjen reakcióba a FeCl3-dal.
—
Cseréljük ki a légpumpát perisztaltikus pumpára. Ezzel lehetővé tesszük, hogy az iszap-visszaáramlás sebessége közel egyenlő legyen az alkalmazandó szennyvíz-beáramlási sebességgel, és anaerob zóna alakulhasson ki a leülepedett iszapban (a légpumpa geometriája a befolyó áramlási sebesség körülbelül 12-szeresére korlátozza az iszap-visszaáramoltatás minimális sebességét),
—
Pumpáljuk szakaszosan az iszapot a szeparátorból a levegőztető edénybe (például óránként 1–1,5 l visszaáramoltatásához 2,5 óránként 5 percig).
—
A habképződés miatti veszteség megelőzése érdekében használjunk nem toxikus habzásgátlót (például szilikonolaj) minimális koncentrációban.
—
Rövid, lökésszerű hullámokban fúvassunk keresztül levegőt a szeparátorban lévő iszapon (például óránként 10 másodpercig).
—
Adagoljuk szakaszosan a szerves közeget a levegőztető edénybe (például óránként 3–10 percig).
Mintavétel és analízis
44.
Rendszeres időközönként mérni kell a levegőztető edényben lévő iszap oldott oxigén koncentrációját, hőmérsékletét és pH-értékét. Gondoskodjunk arról, hogy mindig elegendő oxigén álljon rendelkezésre (> 2 mg/l), és a hőmérséklet az előírt tartományon belül legyen (általában 20–25 °C). A 7,5 ± 0,5 pH-érték fenntartásához adagoljunk kis mennyiségű szervetlen bázist vagy savat a levegőztető edénybe vagy a befolyó szennyvízhez, illetve növeljük a szerves közeg pufferkapacitását (lásd a 27. bekezdést). Nitrifikáció esetén sav keletkezik: 1 mg N oxidációjának a terméke körülbelül 7 mg CO3 – dal egyenértékű. A mérés gyakorisága, amely a napi és a heti mérés között mozoghat, a mérni kívánt paramétertől és a rendszer stabilitásától függ.
45.
Mérni kell a kontroll és az ellenőrző berendezések befolyó szennyvízének DOC vagy COD értékét. A vizsgált vegyi anyag koncentrációját a vizsgálathoz használt befolyó szennyvízben specifikus analízissel vagy a törzsoldat koncentrációja (31. bekezdés), a felhasznált mennyiség és a vizsgálati berendezésbe adagolt szennyvíz mennyisége alapján történő becsléssel kell meghatározni. A koncentrációra vonatkozó adatok variabilitásának csökkentése érdekében a vizsgált vegyi anyag koncentrációját is ajánlott kiszámítani.
46.
A gyűjtött elfolyó vízből vett megfelelő mintákat (például 24 órás összetett minták) 0,45 μm lyukátmérőjű membránszűrőn át kell szűrni vagy körülbelül 15 percig kb. 40 000 m/s2 intenzitással centrifugálni kell. Centrifugálást akkor kell alkalmazni, ha a szűrés problémás. A DOC vagy COD meghatározását a teljes biológiai lebonthatóság méréséhez legalább egyszer meg kell ismételni, az elsődleges biológiai lebonthatóság méréséhez pedig – amennyiben ez szükséges – a vizsgált vegyi anyagra specifikus analízissel kell végezni
47.
A COD alkalmazása csak akkor ajánlott, ha a vizsgálat során elég nagy koncentrációt (kb. 30 mg/l) használunk, mivel alacsony koncentrációk esetén analitikai nehézségeket okozhat. Erősen adszorbeálódó vegyi anyagok esetén ajánlott továbbá a vegyi anyagra specifikus analitikai módszert alkalmazni az adszorbeált vegyi anyag mennyiségének mérésére az iszapban.
48.
A mintavétel gyakoriságát a vizsgálat várható időtartama határozza meg. Heti három mintavétel javasolt. Ha a berendezések már hatékonyan üzemelnek, akkor a vizsgált vegyi anyag bevezetését követően egytől legfeljebb hat hétig tartó időszak szükséges az alkalmazkodáshoz és az állandósult állapot eléréséhez. Lehetőség szerint 15 érvényes értéket kell gyűjteni az általában 3 hétig tartó állandósult állapot (59. bekezdés) időszaka alatt ahhoz, hogy a vizsgálat eredménye értékelhető legyen. A vizsgálatot akkor lehet befejezni, ha sikerült elérni a megfelelő lebomlási fokot (például > 90 %), és rendelkezésre áll ez a 15 érték, amely a 3 hetes időszak munkanapjaira eső analízisek eredményét képviseli. Általában törekedni kell arra, hogy a vizsgált vegyi anyag adagolásának megkezdését követően a vizsgálat legfeljebb 12 hétig tartson.
49.
Nitrifikáló iszap és a vegyi anyag nitrifikációra gyakorolt hatásai vizsgálata esetén hetente legalább egyszer kell a vizsgálati és a kontroll berendezés elfolyó vizéből vett minták ammónium és/vagy nitrit-nitrát analízisét elvégezni.
50.
Minden analízist – különösen a nitrogén meghatározását – a mintavételt követő lehető legkorábbi időpontban kell elvégezni. Ha az analízist későbbre kell halasztani, akkor a mintákkal teletöltött, szorosan lezárt üvegeket körülbelül 4 °C hőmérsékleten, sötétben kell tárolni. 48 óránál hosszabb ideig történő tárolás esetén a mintákat mélyhűtéssel, sal (például literenként 10 ml 400 g/l töménységű kénsavoldat hozzáadásával) vagy megfelelő toxikus anyag (például literenként 20 ml 10 g/l töménységű higany (II)-klorid-oldat) hozzáadásával kell tartósítani. A tartósítási módszer nem befolyásolhatja az analízis eredményét.
Kapcsolt vizsgálati berendezések alkalmazása
51.
Kapcsolt berendezések alkalmazása (3. függelék) esetén a vizsgálati berendezés és a hozzá tartozó kontroll berendezés levegőztető edényei között naponta cseréljünk ki azonos mennyiségű eleveniszapot (háromliteres levegőztető edény esetén 1 500 ml-ből 150 ml-t). Ha a vizsgált vegyi anyag erősen adszorbeálódik az iszapon, akkor csak a szeparátorok felülúszó folyadékát kell kicserélni. A vizsgálati eredmények kiszámításához mindkét esetben egy korrekciós tényezőt kell használni (55. bekezdés).
ADATOK ÉS JEGYZŐKÖNYVVEZETÉS
Az eredmények kezelése
52.
A vizsgált vegyi anyag DOC vagy COD csökkenésének százalékos értékét a következő képlettel számítjuk ki az adott időpontokban történő értékeléshez:
ahol:
Dt
=
%-os DOC vagy COD csökkenés a t időpontban
Cs
=
a vizsgált vegyi anyagnak tulajdonítható, lehetőleg a törzsoldat alapján becsült befolyó DOC vagy COD, (mg/l)
E
=
a vizsgálati berendezés elfolyó vízében mért DOC vagy COD a t időpontban (mg/l)
Eo
=
a kontroll berendezés elfolyó vízében mért DOC vagy COD a t időpontban (mg/l)
53.
A kontroll berendezésbe adagolt szerves közeg DOC vagy COD csökkenésének foka hasznos információt nyújt az eleveniszap vizsgálat során megfigyelhető biológiai lebontó képességének az értékeléséhez. A százalékos lebomlás az alábbi képletből számítható ki:
ahol:
DB
=
a kontroll berendezésbe adagolt szerves közeg %-os DOC vagy COD csökkenése a t időpontban
CM
=
a kontroll berendezésbe adagolt szerves közeg befolyó DOC vagy COD értéke (mg/l)
Igény szerint a vizsgálati berendezésbe adagolt szerves közegnek és vizsgált vegyi anyagnak tulajdonítható százalékos DOC vagy COD csökkenés is kiszámítható a következő képletből:
ahol:
DT
=
összes %-os DOC vagy COD csökkenés a vizsgálati berendezésben
CT
=
összes befolyó vagy törzsoldatokból számított DOC vagy COD a vizsgálati berendezésben
54.
Amennyiben specifikus analitikai módszerrel mérjük a vizsgált vegyi anyag eltávolítását, a következő képlettel számítjuk ki a vizsgált vegyi anyag lebomlását:
ahol:
DST
=
a vizsgált vegyi anyag elsődleges lebomlási %-a t időpontban
Si
=
a vizsgált vegyi anyag mért vagy becsült koncentrációja a vizsgálati berendezés befolyó szennyvízében (mg/l)
Se
=
a vizsgált vegyi anyag mért koncentrációja a vizsgálati berendezés elfolyó vízében a t időpontban (mg/l)
55.
Kapcsolt üzemmód esetén a levegőztető edényben lévő vizsgált vegyi anyag iszapcserével történő hígításának ellensúlyozására korrekciós tényezőt kell alkalmazni (lásd 3. függelék). 6 órás átlagos hidraulikus tartózkodási idő és a levegőztető edényben lévő eleveniszap felének kicserélése esetén az alábbi képletet alkalmazva korrigálni kell a meghatározott napi lebomlási értékeket (Dt, 52. bekezdés) ahhoz, hogy a vizsgált vegyi anyag valódi lebomlását (Dtc) megállapíthassuk:
A vizsgálati eredmények bemutatása
56.
A Dt (vagy Dtc) és Dst százalékos lebomlást az idő függvényében ábrázoljuk (lásd 2. függelék). A vizsgált vegyi anyag vagy az oldott szerves szén bomlását mutató görbe alakjából az eltávolítási folyamatra vonatkozó következtéseket lehet levonni.
Adszorpció
57.
Ha egy vizsgált vegyi anyag esetében a vizsgálat kezdetétől fogva nagyfokú DOC-csökkenés figyelhető meg, akkor a vizsgált vegyi anyag lebomlása valószínűleg az eleveniszapban található szilárd anyagokon való adszorbeálódásának köszönhető. Ezt az adszorbeált vizsgált vegyi anyag specifikus analízissel történő meghatározásával lehet bizonyítani. Az adszorbeálható vegyi anyagok DOC-csökkenése általában nem marad mindvégig nagyfokú a vizsgálat során; a kezdetben tapasztalható nagyfokú eltávolítás rendszerint fokozatosan csökken, majd eléri az egyensúlyi értéket. Ha azonban az adszorbeálható vegyi anyag valamilyen módon a mikrobapopuláció akklimatizálódását okozza, a vizsgált vegyi anyag DOC-csökkenése a későbbiekben növekszik, majd egy magas értéken állandósul.
Alkalmazkodási fázis
58.
A statikus szűrővizsgálatokhoz hasonlóan a biológiai lebontást számos vizsgált vegyi anyag esetében egy alkalmazkodási fázis előzi meg. Az alkalmazkodási fázisban a lebontó baktériumok akklimatizálódnak vagy alkalmazkodnak, és szinte egyáltalán nem figyelhető meg a vizsgált vegyi anyag eltávolítása; ezt a baktériumok szaporodásának kezdeti időszaka követi. Miután ez a szakasz véget ért, a lebontó fázis kezdetének azt az időpontot tekintjük, amikor a vizsgált vegyi anyag kezdeti mennyiségének körülbelül 10 % százaléka kerül eltávolításra (figyelembe véve az esetleges adszorpciót). Az alkalmazkodási fázis általában rendkívül változatos és kevéssé reprodukálható.
Állandósult állapot
59.
Egy folyamatos vizsgálat során a bomlási görbe állandó szakasza azt a fázist jelöli, amikor a legnagyobb fokú lebontás figyelhető meg. Az állandósult állapotnak legalább 3 hétig kell tartania, és körülbelül 15 mért értéknek kell tartoznia hozzá.
A vizsgált vegyi anyag átlagos lebomlási foka
60.
Számítsuk ki a vizsgált vegyi anyag állandósult állapothoz tartozó Dt lebomlási értékeinek számtani közepét, majd kerekítsük a legközelebbi egész számra (1 %). Ez lesz a vizsgált vegyi anyag lebomlási foka. A számtani közép 95 %-os konfidencia intervallumát is ajánlott kiszámítani.
A szerves közeg lebomlása
61.
A kontroll berendezésbe adagolt szerves közeg százalékos DOC vagy COD csökkenését az idő függvényében ábrázoljuk (DB). Az átlagos lebomlási fokot ugyanúgy határozzuk meg, mint a vizsgált vegyi anyag esetében (60. bekezdés).
A biológiai lebontás jele
62.
Ha a vizsgált vegyi anyag nem adszorbeálódik jelentős mértékben az eleveniszapon, és a bomlási görbe a biológiai bomlási görbére jellemző tipikus alakot mutatja (alkalmazkodási fázis, lebontó fázis, állandósult állapot) (58–59. bekezdés), a mért csökkenést biztonsággal lehet a biológiai lebontásnak tulajdonítani. Ha kezdetben nagyfokú eltávolítás figyelhető meg, a szimulációs vizsgálat nem tud különbséget tenni a biológiai és a nem biológiai bomlási folyamatok között. Ebben az esetben és minden más esetben, amikor a biológiai lebontással kapcsolatban kétségek merülnek fel (például sztrippelés esetén), analizálni kell az adszorbeált vizsgált vegyi anyagot, vagy a biológiai folyamatokra egyértelműen utaló paramétereken alapuló kiegészítő statikus biológiai lebonthatósági vizsgálatokat kell végezni. Ilyenek például az oxigénfelvételt vizsgáló módszerek (az e melléklet C.4. fejezetében szereplő D, E és F módszerek (6)), a széndioxid képződést mérő vizsgálat (az e melléklet C.4. fejezetében szereplő C módszer (6)) vagy a gőztér CO2-tartalmának ISO szabvány szerinti vizsgálata (18), amelyhez a szimulációs vizsgálatból származó, a vizsgált vegyi anyagnak már kitett oltóanyagot használunk. Ha a DOC-eltávolítást és az adott vegyi anyag eltávolítását is mértük, az eltávolítási százalékok jelentős különbsége (az előbbi alacsonyabb, mint az utóbbi) olyan szerves köztes termékek jelenlétére utal az elfolyó vízben, amelyek nehezebben lebonthatók lehetnek, mint a kiindulási vegyi anyag.
A vizsgálati eredmények érvényessége
63.
Az oltóanyag szokásos biológiai lebonthatóságára a szerves közeg kontroll berendezésben (53. bekezdés) megfigyelhető lebomlási fokából lehet következtetni. A vizsgálatot akkor tekintjük érvényesnek, ha a DOC vagy COD csökkenés foka a kontroll berendezés(ek)ben két hét elteltével meghaladja a 80 %-ot, és semmilyen szokatlan jelenséget nem figyeltünk meg.
64.
Gyorsan lebontható (referencia) vegyi anyag használata esetén a biológiai lebomlás fokának (Dt, 52. bekezdés) nagyobbnak kell lennie, mint 90 %.
65.
Nitrifikáló feltételek mellett végzett vizsgálat esetén az átlagos elfolyó ammónia-N és nitrit-N koncentráció nem érheti el az 1 mg/l, illetve a 2 mg/l értéket.
66.
Ha ezek a követelmények (63–65 bekezdés) nem teljesülnek, akkor a vizsgálatot más forrásból származó oltóanyaggal meg kell ismételni, el kell végezni egy referencia-vegyianyag vizsgálatát, és valamennyi kísérleti eljárást ellenőrizni kell.
Vizsgálati jegyzőkönyv
67.
A vizsgálati jegyzőkönyvnek a következőket kell tartalmaznia:
Vizsgált vegyi anyag:
—
azonosító adatok,
—
fizikai jelleg és adott esetben a fizikai és kémiai tulajdonságok.
Vizsgálati körülmények:
—
a vizsgálati elrendezés típusa, oldhatatlan és illékony vegyi anyagok vizsgálata esetén szükséges módosítások,
—
a szerves közeg típusa,
—
a szennyvízben található ipari szennyvizek aránya és jellege, ha ismert,
—
az oltóanyag és jellege, a mintavétel helye(i), az alkalmazott koncentráció és esetleges előkezelés,
—
a vizsgált vegyi anyag törzsoldata, DOC és TOC tartalom, szuszpenzió esetén az elkészítés módja, a vizsgálathoz használt koncentráció, 10-20 mg/l tartományon kívül eső DOC-koncentráció okai; a hozzáadás módszere és első időpontja, az esetleges változtatások,
—
átlagos iszapkor és átlagos hidraulikus tartózkodási idő, iszapelvétel módja, iszapduzzadás, iszapveszteség stb. elkerülésének módszerei,
—
alkalmazott analitikai módszerek,
—
vizsgálati hőmérséklet,
—
iszapduzzadás jellemzői, iszapvolumen index (SVI), eleveniszap lebegőanyag koncentrációja (MLSS),
—
a szabványos eljárásoktól való bármely eltérés és az eredményeket esetlegesen befolyásoló körülmények.
Vizsgálati eredmények:
—
mért adatok (DOC, COD, specifikus analízis, pH, hőmérséklet, oxigénkoncentráció, lebegőanyag koncentráció, N-vegyületek, ha releváns,
—
Dt (vagy Dtc), DB, DSt számított értékei táblázatos formában és a bomlási görbék,
—
az alkalmazkodási fázisra és az állandósult állapotra vonatkozó információk, a vizsgálat időtartama, a vizsgált vegyi anyag lebomlási foka és a szerves közeg lebomlási foka a kontroll berendezésben, statisztikai adatokkal és a biológiai lebonthatóságra valamint a vizsgálat érvényességére vonatkozó megállapításokkal kiegészítve,
—
az eredmények szöveges elemzése.
SZAKIRODALOM
(1)
Swisher RD (1987). „Surfactant Biodegradation”, 2nd Edn. Marcel Dekker Inc. New York, 1085 pp.
(2)
German Government (1962). Ordinance of the degradability of detergents in washing and cleaning agents. Bundesgesetzblatt, Pt.1 No.49: 698-706.
(3)
Painter HA and King EF (1978a). WRc porous-pot method for assessing biodegradability. Technical Report No. 70, Water Research Centre, Medmenham, UK.
(4)
Painter HA and King EF (1978b). The effect of phosphate and temperature on growth of activated sludge and on biodegradation of surfactants. Wat. Res. 12: 909-915.
(5)
Eckenfelder, W.W (19) US EPA.
(6)
E melléklet C.4. fejezete: A »gyors« biológiai lebonthatóság meghatározása.
(7)
E melléklet C.12. fejezete: Biológiai lebomlás – módosított SCAS-vizsgálat.
(8)
E melléklet C.19. fejezete: Adszorpciós együttható (KOC) becslése talajon és szennyvíziszapon nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiával (HPLC).
(9)
Gerike P and Fischer WK (1979). A correlation study of biodegradability determinations with various chemicals in various tests. Ecotox. Env. Saf. 3: 157-173.
(10)
Gerike P and Fischer WK (1981), as (9), II Additional results and conclusions. Ecotox. Env. Saf. 5: 45-55.
(11)
Painter HA and Bealing D (1989). Experience and data from the OECD activated sludge simulation test. pp 113-138, In: Laboratory tests for simulation of water treatment processes. CEC Water Pollution Report 18. Eds. Jacobsen BN, Muntau H, Angeletti G.
(12)
ISO 11733 (1995; felülvizsgált szöveg 2004). Szerves vegyületek eltávolításának és biológiai lebonthatóságának meghatározása vizes közegben. Eleveniszapos szimulációs teszt.
(13)
Birch RR (1982). The biodegradability of alcohol ethoxylates. XIII Jornado Com. Espanol. Deterg.: 33–48.
Gerike P, Fischer WK and Holtmann W (1980). Biodegradability determinations in trickling filter units compared with the OECD confirmatory test. Wat.Res. 14: 753–758.
(16)
Baumann U, Kuhn G and Benz M. (1998). Einfache Versuchsanordnung zur Gewinnung gewässerökologisch relevanter Daten, UWSF – Z. Umweltchem. Ökotox. 10: 214–220.
(17)
Her Majesty’s Stationery Office (1982). Assessment of biodegradability. Methods for the examination of waters and associated materials. pp. 91–98 ISBN 011 751661 9.
(18)
ISO 14593 (1998). Vízminőség. Szerves vegyületek teljes aerob biológiai lebonthatóságának kiértékelése vizes közegben. A lezárt edényzet szervetlen széntartalmának meghatározásán alapuló módszer.
1. függelék
1. ábra
A biológiai lebonthatóság értékelésére szolgáló készülék
Husmann-berendezés
2. ábra
A biológiai lebonthatóság értékelésére szolgáló készülék
Lyukacsos edény
3. ábra
A háromliteres lyukacsos levegőztető edény részletes rajza
Az iszapcsere célja, hogy megpróbáljuk kiegyenlíteni az iszapokban kialakuló mikrobapopulációk nagyságát a vizsgálati berendezésben, amelybe a vizsgált vegyületet tartalmazó szennyvizet adagolunk, valamint a kontroll berendezésben, amelybe csak szennyvizet töltünk. (1). Az eljárás a »kapcsolt berendezések alkalmazása« nevet kapta, a módszer pedig »kapcsolt üzemmódként« ismert. Az eljárást eredetileg eleveniszapos Husmann-berendezésekkel alkalmazták, de a »lyukacsos edény« elrendezésben is sor került már a használatára (2)(3). Mivel a kapcsolt üzemmód sem a Husmann-berendezés, sem a lyukacsos edény esetén nem eredményezett jelentős eredménybeli eltérést a nem kapcsolt üzemmódhoz képest, a kapcsolt berendezések alkalmazásához szükséges idő és energia befektetése nem hoz különösebb hasznot.
Az iszapcsere következtében látszólag meglehetősen nagyarányú eltávolítás tapasztalható, mivel a vizsgált vegyi anyag egy része is áthelyezésre kerül, és ezáltal a vizsgált vegyi anyag koncentrációja közel egyenlő lesz a vizsgálati és a kontroll berendezésben. Ezért korrekciós tényezőt kell használni, amelynek értékét a kicserélt mennyiség és az átlagos hidraulikus tartózkodási idő határozza meg. A részletes számítás a szakirodalomban (1) megtalálható.
A korrigált DOC vagy COD csökkenési fok az általános képlettel számítható ki:
ahol:
Dtc
=
korrigált %-os DOC vagy COD csökkenés
Dt
=
meghatározott %-os DOC vagy COD csökkenés
a
=
eleveniszap kicserélt hányada
r
=
átlagos hidraulikus tartózkodási idő (h)
Például, ha a levegőztető edény tartalmának felét cseréljük ki (a = 0,5), az átlagos hidraulikus tartózkodási idő pedig 6 óra, akkor korrigált érték kiszámításának képlete:
SZAKIRODALOM
(1)
Fischer W, Gerike P, Holtmann W (1975). Biodegradability Determinations via Unspecific Analyses (Kémiai oxigénigény, DOC) in Coupled Units of the OECD Confirmatory Test. I The test. Wat. Res. 9: 1131–1135.
(2)
Painter HA, Bealing DJ (1989). Experience and Data from the OECD Activated Sludge Szimulációs vizsgálat. pp. 113–138. In: Laboratory Tests for Simulation of Water Treatment Processes CEC Water Pollution Report 18. Eds. Jacobsen BN, Muntau H, Angeletti G.
(3)
Painter HA, King EF (1978). Water Research Centre Porous Pot Method for Assessing Biodegradability. Technical Report TR70, Water Research Centre, Stevenage, UK.
4. függelék
ELEVENISZAP GÁTLÁS ÉRTÉKELÉSE
A vizsgált vegyi anyag hatása a folyamatra
1.
Léteznek olyan vegyi anyagok (vagy szennyvizek), amelyek azon túl, hogy a szimulációs vizsgálat során nem bomlanak le, illetve távolítódnak el, gátló hatást gyakorolnak az iszapban található mikroorganizmusokra. Más vegyi anyagok alacsony koncentrációban biológiailag lebonthatók, nagyobb koncentrációban viszont gátló hatásúak (hormesis). A gátló hatást vagy egy korábbi szakaszban már észleltük, vagy a szimulációs vizsgálatban alkalmazotthoz hasonló vagy azzal azonos oltóanyaggal végzett toxicitás vizsgálattal állapítható meg (1). Ilyen módszerek az oxigénfogyasztás-gátlás mérése (e melléklet C.11. fejezete (2) és ISO 8192 (3)) vagy az iszapban található organizmusok növekedés-gátlásának értékelése (ISO 15522 (4)).
2.
A szimulációs vizsgálat során a gátlás abból látható, hogy a kísérleti edény és a kontroll edény elfolyó oldott szerves szén (DOC) vagy kémiai oxigénigény (COD) értékének különbsége nagyobb, mint a vizsgált vegyi anyag formájában hozzáadott DOC. Másként kifejezve, a vizsgált vegyi anyag jelenléte következtében kisebb mértékű lesz a kezelt szerves közeg DOC (és biokémiai oxigénigény (BOD), kémiai oxigénigény (COD), és/vagy NH+4) értékének a százalékos csökkenése. Ennek előfordulása esetén ismételt vizsgálatot kell végrehajtani, amelynek során addig a szintig kell csökkenteni a vizsgált vegyi anyag koncentrációját, amikor a gátlás megszűnik, vagy amíg a vegyi anyag biológiai lebontása bekövetkezik. Abban az esetben azonban, ha a vizsgált vegyi anyag (vagy szennyvíz) minden vizsgált koncentrációban hátrányos hatással van a folyamatra, arra lehet következtetni, hogy a vegyi anyag biológiai úton nehezen vagy egyáltalán nem bontható. Mindazonáltal érdemes a vizsgálatot megismételni más forrásból származó eleveniszappal és/vagy fokozatosabb alkalmazkodást engedve az iszapnak.
3.
Fordított esetben, ha a vizsgált vegyi anyag biológiai lebomlása az első próbálkozásra bekövetkezik a szimulációs vizsgálat során, akkor növelni kell a koncentrációt annak megállapításához, hogy az esetleges gátló hatás megállapítható legyen.
4.
A gátlás mértékének meghatározására tett kísérlet során nem szabad elfelejteni, hogy az eleveniszap mikroorganizmus-populációja változhat, azaz idővel ellenállóképességet szerezhet a gátló hatású vegyi anyaggal szemben.
5.
A gátlás mértékének kiszámítása:
A teljes százalékos BOD, DOC, COD stb. csökkenés (Ro) a vizsgálati és a kontroll berendezésben a következő képlettel számítható ki:
ahol:
I
=
a vizsgálati és a kontroll berendezés befolyó BOD, DOC, COD stb. értéke (mg/l)
E
=
a hozzá tartozó elfolyó koncentráció (mg/l).
Az I és E értéket korrigálni kell a vizsgálati berendezésbe adagolt vizsgált vegyi anyagnak tulajdonítható DOC-mennyiséggel, hogy a kiszámított százalékos gátlás helyes legyen.
A vizsgált vegyi anyag jelenlétének tulajdonítható gátlás mértéke a következő képlettel számítható ki:
ahol:
Rc
=
százalékos csökkenés a kontroll berendezésekben
Rt
=
százalékos csökkenés a vizsgálati berendezésekben
SZAKIRODALOM
(1)
Reynolds L et al. (1987). Evaluation of the toxicity of substances to be assessed for biodegradability. Chemosphere 16: 2259.
(2)
E melléklet C.11. fejezete: Biológiai lebomlás – eleveniszap-légzésgátlási vizsgálat.
(3)
ISO 8192 (2007) Vízminőség. Az eleven iszap oxigénfogyasztás-gátlásának vizsgálata szén- és ammóniumoxidációval.
(4)
ISO 15522 (1999) Vízminőség. A víz alkotóelemei által az eleven iszap mikroorganizmusaira kifejtett gátó hatás meghatározása.
5. függelék
Vízben rosszul oldódó vizsgált vegyi anyagok – illékony vegyi anyagok
Vízben rosszul oldódó vegyi anyagok
A vízben rosszul oldódó és oldhatatlan vegyi anyagokkal végzett, szennyvíztisztítást szimuláló vizsgálatok szakirodalma nem túl gazdag (1)(2)(3).
Nem létezik olyan módszer a vizsgált vegyi anyag eloszlatására, amely valamennyi oldhatatlan vegyi anyagra alkalmazható lenne. Az ISO 10634 szabványban (4) leírt négy fajta módszer közül kettő – az emulgálószer használata és/vagy az ultrahangos emulgálás tűnik alkalmasnak arra, hogy a szimulációs vizsgálat céljára megkíséreljünk diszperziót készíteni a vizsgált vegyi anyagból. A diszperziónak legalább 24 órán keresztül meg kell őriznie a stabilitását. A kellőképpen stabilizált diszperziót állandó keverés mellett egy tartályból (38. bekezdés) adagoljuk a levegőztető edénybe a háztartási (mesterségesen készített) szennyvíztől elkülönítve.
Ha a diszperzió stabil, meg kell vizsgálni, hogy milyen módszert alkalmazhatunk a diszpergált vizsgált vegyi anyag meghatározására az elfolyó vízben, az elfolyó víz szilárdanyag-tartalmában és az eleveniszapban. Mivel a DOC általában nem alkalmas paraméter, a vizsgált vegyi anyagra specifikus módszert kell keresni. Ezt követően meghatározzuk, hogy mi történik a vizsgált vegyi anyaggal az eleveniszapos folyamat szimulációjának folyadék és szilárd fázisaiban. A vizsgált vegyi anyag biológiai lebonthatóságát a »tömegegyensúly« alapján ítéljük meg. Ez azonban csak az elsődleges biológiai lebonthatóságot jelzi. A teljes biológiai lebonthatóság kimutatását a gyors biológiai lebonthatóság respirométeres módszer (az e melléklet C.4. fejezetében szereplő C, F vagy D módszer (5)) segítségével kísérelhetjük meg, amelyhez a szimulációs vizsgálat során a vizsgált vegyi anyag hatásának már kitett iszapot használunk oltóanyagként.
Illékony vegyi anyagok
A szennyvíztisztítás szimulációk illékony vegyi anyagok esetében történő alkalmazása egyaránt vitatott és problematikus. Vízben rosszul oldódó vizsgált vegyi anyagokhoz hasonlóan az illékony vegyi anyagokkal végzett szimulációs vizsgálatok szakirodalma sem túl gazdag. A tökéletes elegyítésre alkalmas hagyományos berendezésen a következő módosításokat hajtjuk végre: a levegőztető és ülepítő tartályokat légmentesen lezárjuk, a levegőáramlást áramlásmérő segítségével mérjük és szabályozzuk, az eltávozó gázt az illékony szerves anyagok elválasztására szolgáló csapdán vezetjük keresztül. Esetenként az eltávozó gázt egy vákuumpumpa segítségével Tenax és szilikagél töltetet tartalmazó tisztító csapdán vagy hűtött csapdán vezetjük keresztül gázkromatográfia céljára. A csapdázott vizsgált vegyi anyag meghatározásához analitikai módszert használunk.
A vizsgálat két részből áll. A berendezéseket először iszap nélkül üzemeltetjük, de a mesterségesen készített szennyvizet és a vizsgált vegyi anyagot a levegőztető edénybe pumpáljuk. Néhány napon keresztül elemezzük a befolyó és az elfolyó vízből, valamint az eltávozó gázból vett minták összetételét. A gyűjtött adatokból kiszámítható a vizsgált vegyi anyag sztrippeléssel történő százalékos eltávolítása (Rvs).
Ezt követően a sztrippelési vizsgálatnál alkalmazottal azonos feltételek mellett elvégezzük a szokásos biológiai vizsgálatot (iszappal). A berendezések hatékony működésének ellenőrzése céljából DOC vagy COD méréseket is végzünk. A vizsgálat első szakaszában alkalomszerűen meghatározzuk a vizsgált vegyi anyag jelenlétét a befolyó és az elfolyó vízben, valamint az eltávozó gázban; az alkalmazkodási fázist követően növeljük az analízisek gyakoriságát. Az állandósult állapot időszaka alatt gyűjtött adatokból kiszámítható a vizsgált vegyi anyag különféle (fizikai és biológiai) folyamatoknak tulajdonítható összes százalékos eltávolítása (RT) a folyadékfázisban, valamint a sztrippeléssel eltávolított arány (RV).
Számítás:
a)
A vizsgált vegyi anyag sztrippeléssel történő százalékos eltávolítása (RVP) a nem biológiai vizsgálat során a következő képlettel számítható ki:
ahol
RVP
=
a vizsgált vegyi anyag illékonyságnak tulajdonítható eltávolítása (%),
a vizsgált vegyi anyag befolyó koncentrációja (mg/l).
b)
A vizsgált vegyi anyag sztrippeléssel történő százalékos eltávolítása (RV) a biológiai vizsgálat során a következő képlettel számítható ki:
ahol
RV
=
a vizsgált vegyi anyag illékonyságnak tulajdonítható eltávolítása (%),
SV
=
a biológiai vizsgálat során csapdázott vizsgált vegyi anyag, befolyó-folyadékkoncentráció egyenértékben kifejezve (mg/l),
SI
=
a vizsgált vegyi anyag befolyó koncentrációja (mg/l).
c)
A vizsgált vegyi anyag különféle folyamatoknak tulajdonítható összes százalékos eltávolítása (RT) a biológiai vizsgálat során:
ahol
SE= a vizsgált vegyi anyag befolyó (folyadék) koncentrációja (mg/l).
d)
Következésképpen a biológia lebontással és adszorpcióval történő százalékos eltávolítás (RBA) a következő képlettel számítható ki:
Az vizsgált vegyi anyag adszorbeálódásának megállapítására külön vizsgálatokat kell végezni; adszorbeálódás esetén további korrekció szükséges.
e)
A biológiai kezelés vizsgált vegyi anyag légkörbe történő kibocsátására gyakorolt hatására a biológiai és a nem biológiai vizsgálat során mért, sztrippeléssel történő eltávolítási arányok (Rv és Rvp) összehasonlításából lehet következtetni.
Példa:
Benzol
Iszaptartózkodási idő = 4 nap
Mesterségesen készített szennyvíz; tartózkodási idő = 8 h
SIP
=
SI = 150 mg/l
SVP
=
150 mg/l (SEP = 0)
SV
=
22,5 mg/l
SE
=
50 μg/l
Tehát
RVP
=
100 %, RV = 15 %
RT
=
100 % and RBA = 85 %.
Feltételezzük, hogy a benzol nem adszorbeálódik az iszapon.
SZAKIRODALOM
(1)
Horn JA, Moyer JE, Hale JH (1970). Biological degradation of tertiary butyl alcohol. Proc. 25th Ind. Wastes Conference Purdue Univ.: 939–854.
(2)
Pitter P, Chudoba J (1990). Biodegradability of organic substances in the aquatic environment. CRC Press. Boston, USA.
(3)
Stover EL, Kincannon DF (1983). Biological treatability of specific organic compounds found in chemical industry waste waters. J. Wat. Pollut. Control Fed. 55: 97.
(4)
ISO 10634 (1995) Vízminőség. Útmutató a vízben rosszul oldódó szerves vegyületek előkészítésére és kezelésére azok vizes közegben való biológiai lebonthatóságának értékeléséhez.
(5)
E melléklet C.4. fejezete: A »gyors« biológiai lebonthatóság meghatározása.
6. függelék
Az iszaptartózkodási idő (SRT) hatása a vegyi anyagok kezelhetőségére
BEVEZETÉS
1.
A főszövegben ismertetett módszer annak megállapítására szolgál, hogy egy vizsgált vegyi anyag (amelyről általában tudott, hogy jellegénél fogva biológiailag lebontható, de nem gyorsan lebontható) biológiailag lebontható-e a szennyvíztisztító telepek korlátai között. Az eredményt százalékos eltávolításként vagy százalékos biológiai lebonthatóságként fejezzük ki. Az eleveniszapos berendezések üzemi feltételei és a befolyó szennyvíz típusa azonban nagymértékben befolyásolják a vegyi anyag elfolyó koncentrációját. A vizsgálatok során általában csak egy névleges lebegőanyag koncentrációt vagy névleges iszaptartózkodási időt (SRT) veszünk figyelembe, holott az SRT értéke az alkalmazott iszapelvételi módszertől függően napról napra, sőt egy napon belül is nagymértékben változhat.
2.
Ennél a változatnál (1)(2) jóval szűkebb határok között tartjuk az SRT értékét az egyes 24 órás időszakokon belül (ahogy a nagyméretű üzemeknél is történik), melynek eredményeként az elfolyó koncentráció állandóbb értéket mutat. Háztartási szennyvíz használata ajánlott, mivel egységesebb és magasabb eltávolítási százalékot eredményez. A különböző SRT értékek hatásai mellett részletesebb vizsgálattal a hőmérséklet bizonyos tartományon belüli változásának elfolyó koncentrációra gyakorolt hatásai is meghatározhatók.
3.
Még nincs általános egyetértés arról, hogy milyen kinetikai modellel írható le a vegyi anyagok szennyvíztisztítási körülmények közötti biológiai lebomlása. Mivel a módszert csak sok tonnára rúgó mennyiségben előállított és ennek következtében a szennyvízben 1 mg/l feletti koncentrációban előforduló vegyi anyagok esetén történő alkalmazásra szánjuk, a baktérium-szaporodási sebesség szubsztrátumtól való függésének Monod-féle modelljét választottuk a gyűjtött adatok feldolgozására (1)(2). Az egyszerűsített modell és az alkalmazott feltevések érvényességének megállapítására különböző elsődleges biológiai lebonthatósági fokkal rendelkező elemekből álló alkohol-etoxilát sorozatot használtunk (2)(3).
Megjegyzés:
A módszernek ez a változata sokban hasonlít a C.10. fejezet A részében leírt vizsgálati módszerhez, ezért a következőkben csak az eltéréseket ismertetjük részletesen.
A VIZSGÁLAT ELVE
4.
Az iszaptartózkodási idő (SRT vagy θs) nagyon pontos szabályozását lehetővé tevő, (szinte) folyamatos iszapelvételt biztosító »lyukacsos edény« típusú eleveniszapos berendezéseket különböző SRT és – igény szerint – hőmérsékleti értékekkel működtetünk nem kapcsolt üzemmódban. Az iszaptartózkodási időt általában 2–10 nap, a hőmérsékletet 5–20 °C között változtatjuk. A szennyvizet (lehetőleg háztartási) és a vizsgált vegyi anyag oldatát külön adagoljuk a berendezésbe úgy, hogy a kívánt iszaptartózkodási idő (3–6 óra) és befolyó vizsgált vegyi anyag koncentráció biztosított legyen. Az összehasonlítás céljára a vizsgált vegyi anyagot nem tartalmazó kontroll berendezést működtetünk a vizsgálati berendezéssel párhuzamosan.
5.
Más típusú készülék is használható, de különös gondot kell fordítani arra, hogy az SRT jól szabályozható legyen. Például, ülepítő edénnyel rendelkező berendezés használata esetén figyelembe kell venni az elfolyó lebegőanyag veszteséget. Különleges óvintézkedéseket kell tenni továbbá az ülepítő edényben lévő iszapmennyiség eltéréseiből adódó hibák elkerülése.
6.
Miután a választott üzemi feltételekkel működtetett berendezés elérte az egyensúlyi állapotot, körülbelül három héten keresztül figyeljük az állandósult állapothoz tartozó átlagos vizsgált vegyi anyag és – igény szerint – DOC-koncentrációt az elfolyó vízben. A százalékos vizsgált vegyi anyag eltávolítás és – igény szerint – DOC-csökkenés értékelése mellett grafikusan ábrázoljuk az üzemi feltételek és az elfolyó koncentráció közötti összefüggést. Ennek alapján tentatív kinetikai állandókat számíthatunk és meghatározhatjuk, hogy milyen feltételek mellett kezelhető a vizsgált vegyi anyag.
A VIZSGÁLT VEGYI ANYAGRA VONATKOZÓ INFORMÁCIÓK
7.
A C.10. fejezet A részének 12–13. bekezdéseiben foglaltak alkalmazandók.
MEGFELELÉSI SZINTEK
8.
A C.10. fejezet A részének 14–15. bekezdéseiben foglaltak alkalmazandók.
REFERENCIA-VEGYIANYAGOK
9.
A C.10. fejezet A részének 16. bekezdésében foglaltak alkalmazandók.
A VIZSGÁLATI EREDMÉNYEK MEGISMÉTELHETŐSÉGE
10.
A C.10. fejezet A részének 17–18. bekezdéseiben foglaltak alkalmazandók.
A MÓDSZER LEÍRÁSA
Készülékek
11.
Megfelelően módosított lyukacsos edény (6.1. függelék), amely egy 3,2 mm vastagságú és kb. 90 μm pórusátmérőjű porózus polietilénből, tompavarratos hegesztéssel készült belső edényből (vagy betétből) áll (ez a berendezés masszívabb, mint a C.10. fejezet A részének 21. bekezdésében leírt változat), amely egy áthatolhatatlan külső edényben helyezkedik el. Ez két részből áll: egy kerek alaplapból, amelybe két légvezeték és egy iszap elvezetésére szolgáló vezeték csatlakoztatására szolgáló lyukakat fúrtunk, és egy hengeres tartályból, amelyet csavarok rögzítenek az alaplaphoz, és amelynek a kimenete úgy van elhelyezve, hogy a lyukacsos edény térfogata ismert (3 l) legyen. Az egyik légvezetékhez egy porlasztókő van csatlakoztatva, a másik vége nyitott, és az edényben elhelyezett porlasztókővel derékszöget zár be. Ez a rendszer biztosítja a szükséges légáramlást ahhoz, hogy az edény tartalma tökéletesen elkeveredjen, és az oldott oxigén koncentráció értéke 2 mg/l felett legyen.
12.
A megfelelő számú berendezést 5–20 °C (±1 °C) tartományon belüli szabályozott hőmérséklet mellett üzemeltetjük vízfürdőben vagy állandó hőmérsékletű helyiségben. A vizsgált vegyi anyag oldatát és az ülepített szennyvizet adagolópumpák segítségével juttatjuk a levegőztető edénybe a megfelelő adagolási sebességet (0–1,0 ml/perc, illetve 0–25 ml/perc) biztosítva, a levegőztető edényből történő iszapelvételre pedig egy harmadik szivattyút alkalmazunk. Az iszapelvételhez nagyon alacsony áramlási sebességet kell alkalmazni, amelyet a magasabb sebességre beállított szivattyú időkapcsoló segítségével történő, szakaszos működtetésével érhetünk el: például percenként 10 mp üzemidő esetén a 3 ml/percre beállított átviteli teljesítmény 0,5 ml/perc iszapelvételi sebességet biztosít.
Szűrőkészülék vagy centrifuga
13.
A C.10. fejezet A részének 23. bekezdésében foglaltak alkalmazandók.
Analitikai berendezések
14.
A C.10. fejezet A részének 24. bekezdésében foglaltak alkalmazandók.
Víz
15.
A C.10. fejezet A részének 25–26. bekezdéseiben foglaltak alkalmazandók.
Szerves közeg
16.
A C.10. fejezet A részének 27. bekezdésében foglaltak alkalmazandók.
Mesterségesen készített szennyvíz
17.
A C.10. fejezet A részének 28. bekezdésében foglaltak alkalmazandók.
Háztartási szennyvíz
18.
A C.10. fejezet A részének 29. bekezdésében foglaltak alkalmazandók.
Eleveniszap
19.
A C.10. fejezet A részének 30. bekezdésében foglaltak alkalmazandók.
A vizsgált vegyi anyag törzsoldatai
20.
A C.10. fejezet A részének 31–32. bekezdéseiben foglaltak alkalmazandók.
ELJÁRÁS
Az oltóanyag előkészítése
21.
A C.10. fejezet A részének 34. bekezdésében foglaltak alkalmazandók azzal, hogy csak eleveniszap használható (kb. 2,5 g/l).
A vizsgálati berendezések száma
22.
Egy egyszerű vizsgálathoz – például a százalékos eltávolítás méréséhez – egyetlen SRT elegendő, de a kinetikai állandók számításához szükséges adatok gyűjtése már 4 vagy 5 SRT alkalmazását igényli. Általában 2–10 nap közötti értékeket kell választani. Gyakorlati szempontból kényelmes megoldás, ha egy hőmérséklet mellett párhuzamosan 4 vagy 5 különböző iszaptartózkodási idővel végezzük el a vizsgálatot; míg terjedelmesebb vizsgálatoknál ugyanazokat vagy esetleg más SRT értékeket használunk az 5–20 °C tartományon belüli más hőmérsékletekkel. Az elsődleges biológiai lebonthatóság vizsgálatához (a fő felhasználási terület) általában feltétel-rendszerenként egy berendezés elegendő. A teljes biológiai lebonthatóság megítéléséhez azonban minden feltételrendszerhez külön kontroll berendezés szükséges, amelybe csak szennyvizet adagolunk a vizsgált vegyi anyag nélkül. Ha feltételezhető, hogy a vizsgált vegyi anyag jelen van az alkalmazott szennyvízben, akkor az elsődleges biológiai lebonthatóság értékeléséhez is kell kontroll berendezés, a számítások során pedig el kell végezni a szükséges korrekciókat.
A szerves közeg és a vizsgált vegyi anyag adagolása
23.
A C.10. fejezet A részének 36–39. bekezdéseiben foglaltak alkalmazandók, de a vizsgált vegyi anyag oldatát külön kell adagolni, és különböző iszapelvételi arányokat kell alkalmazni. Rendszeresen – például naponta kétszer – ellenőrizzük, hogy a befolyó, az elfolyó és az iszapelvételi sebesség a ±10 % tűréshatáron belül van, és szükség esetén állítsuk utána az áramlási sebességet. Ha háztartási szennyvizet használunk, és az analitikai módszerek alkalmazása során nehézséget tapasztalunk, akkor végezzük el a vizsgálatot mesterségen készített szennyvízzel, de gondoskodjunk arról, hogy az eltérő hordozóanyag ne eredményezzen eltérő kinetikai adatokat.
Az eleveniszapos berendezések kezelése
24.
A C.10. fejezet A részének 40–43. bekezdéseiben foglaltak alkalmazandók, de csak az »állandó« iszap-elvétellel szabályozzuk az iszaptartózkodási időt.
Mintavétel és analízis
25.
A C.10. fejezet A részének 44–50. bekezdéseiben foglaltak alkalmazandók azzal a kivétellel, hogy a vizsgált vegyi anyag koncentrációját kell csak meghatározni, a DOC meghatározása választható; a COD nem alkalmazandó.
ADATOK ÉS JEGYZŐKÖNYVVEZETÉS
Az eredmények kezelése
26.
A C.10. fejezet A részének 52–54. bekezdéseiben foglaltak alkalmazandók.
A vizsgálati eredmények bemutatása
27.
A C.10. fejezet A részének 56–62. bekezdéseiben foglaltak alkalmazandók.
Kinetikai állandók számítása
28.
A százalékos elsődleges biológiai lebonthatóságnál reálisabb képet nyújt, ha a vizsgált vegyi anyag állandósult állapothoz tartozó átlagos elfolyó koncentrációját adjuk meg, és leírjuk, hogy ez a paraméter hogyan változik az üzemi feltételek függvényében. Ehhez a 6.2. függelékben szereplő (6) egyenletet használhatjuk, amellyel meghatározható a KS, a μm és a θSC, azaz a kritikus iszaptartózkodási idő.
(A másik lehetőség, hogy egy a 2. egyenlettel (6.2. függelék) megadott elméleti görbét a kapott kísérleti értékekhez illesztő egyszerű számítógépes programmal határozzuk meg a KS és a μm közelítő értékeit. Bár egyetlen megoldás sem lesz egyértelmű, a KS és μm elfogadható közelítését adja.)
A vizsgálati eredmények változatossága
29.
Általános tapasztalat, hogy az egyes vegyi anyagok változatos kinetikai paramétereinek meghatározott értékei eltéréseket mutatnak. Vélhetőleg az iszapfejlődés körülményei és az alkalmazott vizsgálati körülmények (miként az 5. bekezdésben említett és más vizsgálatoknál) egyaránt jelentős hatást gyakorolnak a kapott értékekre. A változatosság egyik aspektusának elemzése során Grady et al (4) az »extant« és az »intrinzikus« kifejezéseket javasolta annak a két szélsőséges fiziológiai állapotnak a leírására, amelyeket egy baktériumkultúra egy kinetikai kísérlet során elérhet. Ha a vizsgálat során nem megengedett az állapotváltozás, akkor a kinetikai paraméterek értékei a mikroorganizmusok származási helyére jellemző környezeti feltételeket tükrözik; ezeket nevezzük extant, azaz »már meglévő« értékeknek. A másik szélsőség, amikor a vizsgálati körülmények a lehető leggyorsabb növekedési sebességet engedve a fehérjeszintetizáló rendszer teljes kifejlődését lehetővé teszik. Az így kapott kinetikai paraméterek intrizikusak, azaz kizárólag a szubsztrátum jellegétől és a baktériumkultúra típusától függenek. Útmutatásként elmondható, hogy ha a szubsztrátum-koncentráció kompetens mikroorganizmusokhoz viszonyított arányát (So/Xo) alacsonyan tartjuk (például 0,025), akkor extant értékeket kapunk, míg intrinzikus értékek akkor születnek, ha ez az arány magas (például legalább 20). Az So egyik esetben sem lehet kisebb, mint a Ks féltelítési állandó vonatkozó értéke.
30.
A változatosság kérdésével és a biológiai lebonthatóság kinetikai vizsgálatának egyéb aspektusaival egy közelmúltban rendezett SETAC workshop is foglalkozott (5). Az ilyen és hasonló – már leírt illetve tervezett – kutatások egyre világosabb képet adnak a szennyvíztisztító telepeken végbenő folyamatok kinetikájáról, és ezáltal lehetővé teszik a jelenleg rendelkezésre álló adatok jobb értelmezését, valamint alapul szolgálnak a helytállóbb jövőbeli vizsgálati módszerek kialakításához.
SZAKIRODALOM:
(1)
Birch RR (1982). The biodegradability of alcohol ethoxylates. XIII Jornado Com. Espanol Deterg.: 33–48.
(2)
Birch RR (1984). Biodegradation of nonionic surfactants. J.A.O.C.S., 61(2): 340–343.
(3)
Birch RR (1991). Prediction of the fate of detergent chemicals during sewage treatment. J. Chem. Tech. Biotechnol., 50: 411–422.
(4)
Grady CPL, Smets BF and Barbeau DS (1996). Variability in kinetic parameter estimates: A review of possible causes and a proposed terminology. Wat. Res., 30 (3): 742–748.
(5)
Biodegradation kinetics: Generation and use of data for regulatory decision making (1997). Workshop at Port Sunlight, UK. Eds. Hales SG, Feitjel T, King H, Fox K, Verstraete W. 4–6th Sept. 1996. SETAC- Europe, Brussels.
Feltételezve a Monod-féle kinetikai modell alkalmazhatóságát, valamint az aktív szilárd anyagok és a szubsztrátum tömegegyensúlyát az eleveniszapos rendszerben (1), a következő egyenlettel írható le az állandósult állapot:
[1]
vagy
[2]
ahol:
S1
=
elfolyó szubsztrátum koncentráció (mg/l)
KS
=
féltelítési állandó, a koncentráció amelynél μ = μm/2 (mg/l)
μ
=
fajlagos növekedési sebesség (d–1)
μm
=
μm maximális értéke (d–1)
Kd
=
aktív szilárd anyagok fajlagos bomlási sebessége (d–1)
θS
=
átlagos iszaptartózkodási idő, SRT (d)
Az egyenlet vizsgálatából az alábbi következtetések vonhatók le:
i.
Az elfolyó koncentráció független a befolyó koncentrációtól (S0); következésképpen a százalékos biológiai lebomlás az S0 befolyó koncentrációnak megfelelően változik.
ii.
Az S1 koncentrációt befolyásoló egyetlen üzemszabályozási paraméter az θS iszaptartózkodási idő.
iii.
Adott S0 befolyó koncentráció mellett a kritikus iszaptartózkodási idő:
[3]
ahol:
θSC= kritikus iszaptartózkodási idő, amely alatt a kompetens mikroorganizmusok kimosódnak az üzemből.
iv.
Mivel a (2) egyenlet többi paramétere a növekedés kinetikájával áll összefüggésben, a hőmérséklet valószínűleg befolyásolja az elfolyó szubsztrátum-szintet és a kritikus iszaptartózkodási időt, azaz a hőmérséklet csökkenésével nő az adott tisztítási fok eléréséhez szükséges iszaptartózkodási idő.
2.
Feltételezve, hogy az X2 elfolyó lebegőanyag koncentráció a levegőztető edényben mért X1 koncentrációhoz képest alacsony, a lebegőanyagok tömegegyensúlyát alapul véve a »lyukacsos edény« rendszerben az iszaptartózkodási idő:
[4]
és
ahol:
V
=
a levegőztető edény térfogata (l)
X1
=
lebegőanyag koncentráció a levegőztető edényben (mg/l)
X2
=
elfolyó lebegőanyag koncentráció (mg/l)
Q0
=
befolyó áramlási sebesség (l/d)
Q1
=
iszapelvétel áramlási sebessége (l/d)
Tehát a Q1 iszapelvételi sebesség szabályozásával az iszaptartózkodási idő az előre meghatározott értéken tartható.
Következtetések:
3.
A vizsgálat elsődleges célja, hogy lehetővé tegye az elfolyó koncentráció és annak alapján a vizsgált vegyi anyag fogadó vizekben mérhető előfordulási szintjének az előrejelzését.
4.
Egyes esetekben az S1 alakulását a θS függvényében ábrázoló görbéről azonnal leolvasható a θSC kritikus iszaptartózkodási idő (például az 1. ábrán létható 3. számú görbe). Ha ez nem lehetséges, akkor az θSC, valamint a μm és a KS közelítő értékeinek a kiszámításához a S1•θS függvényében ábrázoljuk az S1 alakulását.
Az (1) egyenlet átrendezése után a következő egyenletet kapjuk:
[5]
Ha a Kd alacsony, akkor 1 + θs • Kd ~ 1, és az [5] egyenlet a következőképpen írható fel:
[6]
Ez egy 1/μm meredekségű egyenest ír le, amely áthalad a KS/μm ponton; a θS ~1/μm (lásd a 2. ábrát).
1.ábra
Az SRT alakulása három hőmérsékletérték mellett
2.ábra
Az SRT S1 vs. S1 regressziós egyenes T = 5 °C hőmérsékletérték mellett
Glosszárium:
elfolyó koncentráció
görbe
7. függelék
ALACSONY (μg/l) KONCENTRÁCIÓ-TARTOMÁNYBAN VÉGZETT VIZSGÁLAT
1.
Sok vegyi anyag általában rendkívül alacsony (μg/l) koncentrációban van jelen a vízi környezetben, sőt még a szennyvizekben is. Ilyen koncentrációban feltételezhetően nem szolgálnak elsődleges növekedési szubsztrátumként, hanem nagyobb a valószínűsége annak, hogy a természetesen előforduló különféle szénvegyületekhez hasonló módon, növekedést nem eredményező másodlagos szubsztrátumként kerülnek lebontásra. Következésképpen az ilyen vegyi anyagok lebomlása nem írható le a 6. függelékben bemutatott modellel. Számos alkalmazható modell létezik, és elképzelhető, hogy a szennyvíztisztító rendszerekben uralkodó körülmények között egyszerre több is működik párhuzamosan. E probléma megoldása még sok kutatást igényel.
2.
A C.10. fejezet A része főszövegében ismertetett eljárás alkalmazható ugyan, de csak az elsődleges biológiai lebonthatóság értékelésére, megfelelően alacsony (< 100 μg/l) koncentrációk és validált analitikai eljárás használata mellett. A százalékos biológiai lebomlás kiszámítása (lásd a vizsgálati módszer 54. bekezdését) is lehetséges, de az abiotikus folyamatokat (adszorpció, illékonyság, stb.) is figyelembe kell venni. Példaként Nyholm és társai (1)(2) 4 órás ciklus és feltöltés-leszívás eljárás alkalmazásán alapuló kutatására lehet hivatkozni. A kutatók 5 vegyületre határoztak meg pszeudo-elsőrendű állandókat, amelyeket 5–100 μg/l koncentrációban adagoltak mesterségesen készített szennyvízhez. (A teljes biológiai lebonthatóság értékeléséhez 14C-vel jelölt vizsgált vegyi anyagokat használhatunk. Ennek ismertetése meghaladja ennek a vizsgálati módszernek a kereteit, mivel elfogadott eljárások egyelőre nincsenek, bár az ISO 14592 szabvány (3) egyik javasolt módszerében útmutatást találunk a 14C-vel jelölt vizsgált vegyi anyagok használatára.
SCAS vizsgálat
3.
A későbbi javaslatokban egy egyszerűbb, kétlépcsős vizsgálat szerepelt (4)(5)(6), amelynek során a félfolyamatos eleveniszapos (SCAS) módszer alkalmazását követően a SCAS berendezésből gyűjtött mintákat rövid távú kinetikai vizsgálatoknak vetjük alá. A SCAS berendezést ismert iszapelvételi arányokkal (az eredeti C.12. vizsgálati módszerrel ellentétben) és az OECD iránymutatása szerinti, mesterségesen készített szennyvíz módosított változatával vagy háztartási szennyvízzel üzemeltetjük. A mesterségesen készített szennyvizet – a változó pH-érték és a rossz iszapülepedés miatt – foszfát puffer, élesztőkivonat, vas(III)-klorid és nyomelem mennyiségben sók hozzáadásával módosítjuk, COD tartalmát pedig a pepton és a húskivonat koncentrációjának növelésével mintegy 750 mg/l-re emeljük. A berendezéseket 24 órás ciklusokban működtetjük: a mesterségesen készített szennyvíz és a vizsgált vegyi anyag legfeljebb 100 μg/l (azaz a rövid távú vizsgálat során használttal hozzávetőlegesen megegyező) koncentrációban történő adagolását a 23 óráig tartó levegőztetést, az iszapelvételt, az ülepítést és a felülúszó (elfolyó) folyadék elvezetését követően kezdjük meg. A kiegyensúlyozott mikrobapopuláció fenntartása érdekében hetente egy alkalommal az összes iszap 10 %-át friss iszapra cseréljük.
4.
A vizsgált vegyi anyag koncentrációját a ciklus elején és a levegőztetési periódus végén mérjük, és a vizsgálatot addig folytatjuk, amíg a vizsgált vegyi anyag eltávolítása állandó szintet ér el; ez egy héttől több hónapig tarthat.
Rövid távú vizsgálat
5.
A rövid távú (például 8 órás) vizsgálat célja a vizsgált vegyi anyag különböző, ismert eredetű és múltú eleveniszapokban való lebomlása (pszeudo) elsőrendű sebességi állandójának a meghatározása. Az alkalmazkodási kísérlet (3–4. bekezdés) során a levegőztetési periódus végén, amikor a szerves szubsztrátum koncentráció alacsony, iszapmintákat veszünk a SCAS reaktorokból. Összehasonlítás céljára egy párhuzamosan üzemeltetett, a vizsgált vegyi anyagnak nem kitett SCAS berendezésből is vehetünk iszapot. Az iszap és a vizsgált vegyi anyag két vagy több eltérő, az 1–50 μg/l tartományon belüli koncentrációban adagolt keverékét mesterségesen készített szennyvíz vagy más szerves szubsztrátum hozzáadása nélkül levegőztetjük. Legfeljebb 24 órán keresztül rendszeres időközönként meghatározzuk az oldott vizsgált vegyi anyag maradék koncentrációját (például óránként, a vegyi anyag lebonthatóságától függően). A mintákat a megfelelő analízist megelőzően centrifugálni kell.
Számítások
6.
A SCAS berendezésekből származó adatokat a vizsgált vegyi anyag százalékos eltávolításának a kiszámításához használjuk fel (54. bekezdés). Emellett a következőképpen számíthatjuk ki a (lebegőanyag koncentrációra vonatkoztatott) K1 átlagos sebességi állandót:
ahol:
t
=
levegőztetési idő (23 h)
Ce
=
koncentráció a levegőztetési periódus végén (μg/l)
Ci
=
koncentráció a levegőztetés kezdetén (μg/l)
SS
=
eleveniszap lebegőanyag koncentrációja (g/l)
7.
A rövid távú vizsgálat során a log% maradék koncentrációt az idő függvényében ábrázoljuk. A görbe kezdeti szakaszának (10–50 % lebomlás) meredeksége a K1 (pszeudo) elsőrendű állandónak felel meg. Az iszap lebegőanyag koncentrációjára vonatkoztatott állandó kiszámításához a meredekséget elosztjuk a lebegőanyag koncentrációval. Az eredmény bemutatásának a kiinduló vizsgált vegyi anyag és lebegőanyag koncentrációk, az iszaptartózkodási idő, az iszapterhelés és az iszap forrása, valamint a vizsgált vegyi anyagnak való kitétel előtti állapot (ha van ilyen) részletezését is tartalmaznia kell.
Az eredmények változatossága
8.
A változatosság kérdésével és a biológiai lebonthatóság kinetikai vizsgálatának egyéb aspektusaival egy közelmúltban rendezett SETAC workshop is foglalkozott (7). Az ilyen és hasonló – már leírt illetve tervezett – kutatások egyre világosabb képet adnak a szennyvíztisztító telepeken végbenő folyamatok kinetikájáról, és ezáltal lehetővé teszik a jelenleg rendelkezésre álló adatok jobb értelmezését, valamint alapul szolgálnak a helytállóbb jövőbeli vizsgálati módszerek kialakításához.
SZAKIRODALOM
(1)
Nyholm N, Jacobsen BN, Pedersen BM, Poulsen O, Dambourg A and Schultz B (1992). Removal of micropollutants in laboratory activated sludge reactors. Biodegradability. Wat. Res. 26: 339–353.
(2)
Jacobsen BN, Nyholm N, Pedersen BM, Poulsen O, and Ostfeldt P (1993). Removal of organic micropollutants in laboratory activated sludge reactors under various operating conditions: Sorption. Wat. Res. 27: 1505–1510.
(3)
ISO 14592 (ISO/TC 147/SC5/WG4, N264) (1998). Vízminőség. A vízben kis koncentrációban jelen lévő szerves vegyületek aerob biológiai lebonthatóságának kiértékelése.
(4)
Nyholm N, Ingerslev F, Berg UT, Pedersen JP and Frimer-Larsen H (1996). Estimation of kinetic rate constants for biodegradation of chemicals in activated sludge waste water treatment plants using short-term batch experiments and μg/l range spiked concentrations Chemosphere 33 (5): 851–864.
(5)
Berg UT and Nyholm N (1996). Biodegradability simulation Studies in semi-continuous activated sludge reactors with low (μg/l range) and standard (ppm range) chemical concentrations. Chemosphere 33 (4): 711–735.
(6)
Danish Environmental Protection Agency. (1996). Activated sludge biodegradability simulation test. Environmental Project, No. 337. Nyholm, N. Berg, UT. Ingerslev, F. Min. of Env. and Energy, Copenhagen.
(7)
Biodegradation kinetics: Generation and use of data for regulatory decision making (1997). Workshop at Port Sunlight, UK. Eds. Hales, SG. Feitjel, T. King, H. Fox, K. and Verstraete, W. 4–6th Sept. 1996. SETAC- Europe, Brussels.
C.10-B:Biofilmek
BEVEZETÉS
1.
Szimulációs vizsgálatot általában olyan vegyi anyagoknál alkalmazunk, amelyek a gyors biológiai lebonthatóság megállapítására szolgáló szűrővizsgálaton nem mentek át (az e melléklet C.4. fejezetében szereplő A–F módszerek (9)), a jellegénél fogva biológiailag lebontható anyagok azonosítására szolgáló vizsgálaton viszont átmentek. Kivételesen akkor is alkalmazható szimulációs vizsgálat, ha valamely vegyi anyagról – különösen egy sok tonnára rúgó mennyiségben előállított vegyi anyagról – több információra van szükségünk, amely esetben általában eleveniszapos vizsgálatot (C.10. fejezet A része) végzünk. Bizonyos körülmények között azonban a vegyi anyag biofilmes szennyvíztisztítási módszerekkel – nevezetesen a csepegtetőtestes, forgó biológiai kontaktoros és a fluidágyas eljárásokkal – szembeni viselkedésére vonatkozó konkrét információ szükséges. Az ilyen igények kielégítésére különféle eszközöket fejlesztettek ki.
2.
Gerike et al. (1) nagyméretű kísérleti csepegtetőtesteket alkalmazott, amelyeket kapcsolt üzemmódban működtetett. Ezek a berendezések nagy helyet foglaltak el, és viszonylag nagy mennyiségű szennyvizet vagy mesterségesen készített szennyvizet igényeltek. Truesdale et al. (2) kisebb (6 ft x 6 in. átmérőjű) szűrőket írt le, amelyekbe azonban még mindig elég nagy mennyiségben kellett a felületaktív anyagoktól mentes természetes szennyvizet tölteni. Az »érett« biofilm kialakulásához hosszú, 14 hetes időszak kellett, a vizsgált felületaktív anyag adagolásának megkezdése előtti alkalmazkodáshoz pedig további 4–8 hétre volt szükség.
3.
Baumann et al. (3) egy jóval kisebb szűrőt fejlesztett ki, amelyben egy eleveniszapban előáztatott, gyapjúszerű poliészterszalagot használtak a biofilmképződést támogató semleges közegként. Kizárólagos szénforrásként a vizsgált vegyi anyag szolgált, a biológiai lebonthatóságot pedig a befolyó és az elfolyó víz oldott szerves szén (DOC), valamint az eltávozó gáz CO2 tartalmának mérései alapján értékelték.
4.
Egy egészen más megközelítést alkalmazott a forgótárcsás reaktort feltaláló Gloyna et al. (4). Ebben az esetben a biofilm-képződés a vízszinteshez viszonyítva kis dőlésszögben elhelyezett forgó cső ismert területű belső felületén megy végbe a felülről befolyó szennyvíz áthaladása következtében. A reaktort felületaktív anyagok biológiai lebonthatóságának tanulmányozására (5), valamint a biofilm optimális vastagságának és a filmen való optimális áthaladásnak a vizsgálatára használták (6). A reaktort ugyanezek a szerzők továbbfejlesztették, és többek között alkalmassá tették az eltávozó gáz CO2 tartalmának a meghatározására.
5.
A forgótárcsás reaktort a Standing Committee of Analysts (UK) a vegyi anyagok biológiai lebonthatósága (7), valamint a szennyvizek kezelhetősége és toxicitása (8) értékelésének szabványos módszereként fogadta el. Az itt bemutatott módszer előnye egyszerűségében, tömörségében, reprodukálhatóságában és viszonylag korlátozott szerves közeg igényében rejlik.
A VIZSGÁLAT ELVE
6.
A mesterségesen készített vagy háztartási szennyvizet és a vizsgált vegyi anyagot keverék formájában vagy külön-külön egy lassan forgó, döntött cső belsejébe vezetjük. A belső felületen a bioszűrők közegén jelen lévőhöz hasonló mikroorganizmus-réteg képződik. A reaktor működési feltételeit úgy kell megválasztani, hogy megfelelő mértékű szerves anyag lebomlást és szükség esetén ammónium oxidációt biztosítson.
7.
A csőből kifolyó vizet felfogjuk, és ülepítjük vagy szűrjük, mielőtt az oldott szerves szén (DOC) és/vagy – egy specifikus módszerrel – a vizsgált vegyi anyag mennyiségét meghatározzuk. Összehasonlítás céljából azonos feltételek mellett egyidejűleg kontroll berendezéseket működtetünk, amelyekbe nem adagolunk vizsgált vegyi anyagot. Feltételezzük, hogy a vizsgálati és a kontroll berendezések elfolyó vizében mért DOC-koncentrációk különbsége a vizsgált vegyi anyagnak és szerves metabolitjainak tulajdonítható. A vizsgált vegyi anyag lebomlásának meghatározásához ezt a különbséget összehasonlítjuk a hozzáadott vizsgált vegyi anyag (DOC) koncentrációjával.
8.
A lebomlást az idő függvényében ábrázoló görbe alapos vizsgálata általában lehetővé teszi a biológiai lebontás biológiai adszorpciótól való megkülönböztetését. Megerősítése általában a gyors biológiai lebonthatóság megállapítására szolgáló (oxigénfelvétel vagy széndioxid-termelés) vizsgálat segítségével lehetséges, amelyhez abból a rektorból kell a vizsgálat végén akklimatizált oltóanyagot gyűjteni, amelybe a vizsgált vegyi anyagot adagoltuk.
A VIZSGÁLT VEGYI ANYAGRA VONATKOZÓ INFORMÁCIÓK
9.
Az eredmények helyes értelmezéséhez ismerni kell a vizsgált vegyi anyag tisztasági, vízoldékonysági, illékonysági és adszorpciós jellemzőit.
10.
Illékony és rosszul oldódó vegyi anyagok általában csak különleges óvintézkedések megtétele esetén vizsgálhatók (lásd a C.10. fejezet A részének 5. függelékét). Az elméleti értékek kiszámításához, illetve a paraméterek mért értékeinek ellenőrzéséhez (például elméleti oxigénigény (ThOD), (DOC) a kémiai szerkezet vagy legalább a tapasztalati képlet ismerete is szükséges.
11.
A vizsgált vegyi anyag mikroorganizmusokra gyakorolt toxikus hatására vonatkozó információk (lásd a C.10. fejezet A részének 4. függelékét) hasznosak lehetnek a megfelelő vizsgálati koncentrációk kiválasztásánál és különösen fontosak lehetnek az alacsony biológiai lebomlási értékek helyes értelmezéséhez.
MEGFELELÉSI SZINTEK
12.
Az eredeti követelmények szerint egy felületaktív anyagnak legalább 80 %-os elsődleges biológiai lebonthatósági szintet kellett elérnie ahhoz, hogy forgalmazható legyen. 80 % alatti érték esetén a felületaktív anyag csak akkor forgalmazható, ha az itt bemutatott szimulációs (igazoló) vizsgálat alkalmazása során a meghatározott vegyi anyag több mint 90 %-a eltávolítható. A vegyi anyagok többségénél a megfelelési szint általában nem vet fel kérdéseket, és az eltávolítás százalékos értéke a vegyi anyagok veszélyességének értékelése során alkalmazandó várható környezeti koncentráció közelítő becsléséhez használható fel. Számos vizsgálatban a tiszta vegyületek több mint háromnegyede 90 % feletti százalékos DOC-eltávolítást mutatott, a jelentősebb fokú biológiai lebonthatóságot mutató vegyületek több mint 90 %-a pedig 80 % feletti eredményt ért el.
REFERENCIA-VEGYIANYAGOK
13.
A kísérleti eljárás helyes végrehajtásának biztosítása érdekében időnként ajánlott ismert viselkedésű vegyi anyagokat is megvizsgálni. Ezek közé tartozik például az adipinsav, a 2-fenilfenol, az 1-naftol, a difénsav, az 1-naftoesav.
A VIZSGÁLATI EREDMÉNYEK MEGISMÉTELHETŐSÉGE
14.
Az Egyesült Királyságban egy laboratórium megállapította, hogy a vizsgálatokon belüli relatív szórás 3,5 %, a vizsgálatok közötti 5 % volt (7).
A MÓDSZER LEÍRÁSA
Készülékek
Forgótárcsás reaktorok
15.
A készülék (lásd a 8. függelék 1. és 2. ábrját) fémállványra helyezett, gumikarimás tárcsákra szerelt akrilcsövekből áll, amelyek mindegyike 30,5 cm hosszú, és 5 cm belső átmérővel rendelkezik. Az egyes csöveket körülbelül 0,5 cm szélességű külső perem tartja a tárcsákon, belső felületük durva fémgyapottal van érdesítve, felső (adagoló) nyílásukon pedig egy 0,5 cm szélességű perem van kialakítva, amely megakadályozza a csövekbe kerülő folyadék kifolyását. A tiszta csőbe vezetett vizsgálati közeggel való kellő ideig tartó érintkezés eléréséhez a csöveket a vízszinteshez viszonyítva körülbelül 1 fokos dőlésszögben kell elhelyezni. A gumiabroncsos tárcsákat egy változtatható fordulatszámú motor forgatja lassú sebességgel. A csövek hőmérsékletének szabályozása végett egy állandó hőmérsékletű helyiségben állítjuk fel a készüléket.
16.
Ha a forgótárcsás reaktorokat egy-egy valamivel nagyobb, fedeles csőbe helyezzük, és gondoskodunk arról, hogy a csatlakozásoknál ne szökhessenek ki gázok, akkor az eltávozó CO2 a későbbi mérés céljából lúgos oldatban elnyelethető (6).
17.
Minden egyes csőhöz egy 20 l űrtartalmú tárolóedény csatlakozik (A), amelyben 24 órára elegendő szerves közeg és – ha szükséges – hozzáadott vizsgált vegyi anyag van (lásd a 2. ábrát). Szükség esetén a vizsgált vegyi anyag oldata külön adagolható. A tárolóedény aljához közel egy kivezető nyílás van, amelyhez egy megfelelő – példáuléldául szilikongumiból készült – cső segítségével egy perisztaltikus pumpán (B) keresztül egy, a döntött cső (C) felső (adagoló) nyílásába 2–4 cm-re benyúló üveg vagy akril továbbítócső csatlakozik. Az elfolyó víz a döntött cső alsó nyílásán egy másik tárolóedénybe (D) csepeg. Az analízist megelőzően az elfolyó vizet ülepítjük vagy szűrjük.
Szűrőkészülék – centrifuga
18.
A minták szűrésére olyan, megfelelő pórusméretű (0,45 μm névleges lyukátmérőjű) membránszűrőket alkalmazunk, amelyek minimális mértékben adszorbeálják a szerves vegyületeket és bocsátanak ki szerves szenet. Szerves szenet kibocsátó szűrők alkalmazása esetén a kioldódó szén eltávolítása érdekében a szűrőket meleg vízzel gondosan ki kell mosni. A másik lehetséges megoldás a 40 000 m/s2 gyorsulás elérésére képes centrifuga alkalmazása.
19.
A következők meghatározására alkalmas analitikai berendezések:
—
DOC/összes szerves szén (TOC) vagy kémiai oxigénigény (COD),
—
meghatározott vegyi anyag (HPLC, GC stb.), ha szükséges,
—
pH, hőmérséklet, kémhatás,
—
ammónium, nitrit, nitrát, ha a vizsgálatok a nitrifikációt befolyásoló feltételek mellett kerülnek elvégzésre.
Víz
20.
Kevesebb, mint 3 mg/l DOC-koncentrációjú csapvíz.
21.
Kevesebb, mint 2 mg/l DOC-koncentrációjú ionmentesített vagy desztillált víz.
Szerves közeg
22.
Szerves közegként mesterségesen készített szennyvíz, háztartási szennyvíz vagy ezek keveréke használható. Kimutatták, hogy a háztartási szennyvíz önmagában történő alkalmazása sok esetben magasabb százalékos DOC-eltávolítást eredményez (eleveniszapos berendezésekben), sőt olyan vegyi anyagok eltávolítását és biológiai lebontását is lehetővé teszi, amelyek az OECD által meghatározott mesterségesen készített szennyvíz alkalmazása esetén nem bonthatók le biológiailag. Ezért háztartási szennyvíz alkalmazása ajánlott. Új tétel használata előtt mindig meg kell határozni a szerves közeg DOC- vagy COD-koncentrációját. A szerves közeg savasságát vagy lúgosságát ismerni kell. Ha a szerves közeg nem elég savas vagy lúgos, akkor megfelelő puffer (nátrium-hidrogén-karbonát vagy kálium-hidrogén-foszfát) hozzáadásával lehet fenntartani a 7,5 ± 0,5 körüli pH-értéket a reaktorban a vizsgálat során. Minden esetben egyedi alapon kell meghatározni, hogy mikor és mennyi puffert kell a szerves közeghez hozzáadni.
Mesterségesen készített szennyvíz
23.
Csapvízben oldjunk fel literenként 160 mg peptont, 110 mg húskivonatot, 30 mg karbamidot, 28 mg dikálium-hidrogén-foszfátot (K2HPO4), 7 mg nátrium-kloridot (NaCl), 4 mg kalcium-klorid-dihidrátot (CaCl2.2H2O) és 2 mg magnézium-szulfát-heptahidrátot (Mg2SO4.7H2O). Ezzel az OECD által meghatározott és e helyütt példaként megadott módszerrel körülbelül 100 mg/l átlagos DOC-koncentrációjú befolyó szennyvíz készíthető. Alternatívaként alkalmazható más olyan összetétel is, amely hozzávetőleg hasonló ehhez, és a valódi szennyvízéhez közelebb álló DOC-koncentrációt eredményez. Desztillált vízzel kevert olyan műszennyvíz-koncentrátumot is készíthetünk, amely 1 °C hőmérsékleten egy hétig tárolható. Szükség esetén hígítsuk csapvízzel. (Bár ez a közeg nem teljesen megfelelő, például a nitrogén koncentrációja túl magas, míg a széntartalom viszonylag alacsony, a foszfátpuffer hozzáadásán és a peptontartalom növelésén kívül jobb javaslat eddig nem született.)
Háztartási szennyvíz
24.
Elsősorban háztartási szennyvizet fogadó szennyvíztisztító telepről származó, naponta frissen gyűjtött, ülepített szennyvizet használjunk. A durva részecskéktől jobbára mentes szennyvizet az elsődleges ülepítőtartály túlfolyójából vagy az eleveniszapos üzem betáplálási pontjáról kell gyűjteni. A szennyvíz felhasználás előtt több (általában legfeljebb hét) napig tárolható 4 °C hőmérsékleten, amennyiben bizonyítható, hogy a DOC-koncentráció (vagy a COD) nem csökken jelentős mértékben (azaz legalább 20 %-kal) a tárolás során. Új tétel használata előtt mindig be kell állítani a DOC-koncentrációt (vagy a COD-t) egy megfelelő állandó értékre, például csapvíz hozzáadásával, hogy a vizsgálat során minél kisebb zavar keletkezzen.
Kenőanyag
25.
A perisztaltikus pumpa görgőit glicerinnel vagy olívaolajjal kenjük: mindkettő alkalmas a szilikongumi csövekkel való használatra.
A vizsgált vegyi anyag törzsoldatai
26.
A megfelelően oldható vegyi anyagok törzsoldatait ionmentesített víz vagy a mesterségesen készített szennyvíz ásványi összetevőjének felhasználásával készítjük el a megfelelő koncentrációban (például 1 to 5 g/l). Az oldhatatlan vegyi anyagokra vonatkozóan lásd a C.10. fejezet A részének 5. függelékét. Illékony vegyi anyagok esetén ez a módszer csak akkor alkalmazható, ha módosítjuk a forgótárcsás reaktort (16. bekezdés). Határozzuk meg a törzsoldat DOC és összes szerves szén (TOC) tartalmát, és a későbbiekben minden új tételnél ismételjük meg a mérést. Ha a DOC és a TOC különbsége nagyobb, mint 20 %, akkor ellenőrizzük a vizsgált vegyi anyag vízoldékonyságát. A visszanyerési arány megfelelőségének ellenőrzéséhez (általában > 90 % várható) hasonlítsuk össze a DOC-tartalmat vagy a vizsgált vegyi anyag törzsoldat specifikus analízisével meghatározott koncentrációját a névleges értékkel. Különösen diszperziók esetén kell ellenőrizni, hogy a DOC használható analitikai paraméter, vagy csak a vizsgált vegyi anyagra specifikus analitikai módszert lehet alkalmazni. Diszperzió használata esetén a mintákat centrifugálni kell. Minden új tételre vonatkozóan meg kell határozni az oldott szerves széntartalmat, a kémiai oxigénigényt, illetve – specifikus analízissel – a vizsgált vegyi anyag tartalmat.
27.
Határozzuk meg a törzsoldat pH értékét. A szélsőséges értékek azt jelzik, hogy a vegyi anyag hozzáadása hatással lehet az eleveniszap pH értékére a vizsgálati elrendezésben. Ebben az esetben kis mennyiségű szervetlen sav vagy bázis segítségével semlegesíthetjük a törzsoldatot, azaz a pH értéket 7 ± 0,5-re állíthatjuk be – ügyelve arra, hogy elkerüljük a vizsgált vegyi anyag kicsapódását.
ELJÁRÁS
A szerves közeg előkészítése az adagoláshoz
28.
A vizsgálat megkezdésekor és a vizsgálat alatt mindvégig gondoskodjunk arról, hogy a befolyó szennyvizet és az elfolyó vizet tartalmazó tartályok és az elvezető csövek mindig alaposan meg legyenek tisztítva, hogy ne alakulhassanak ki rajtuk mikrobatenyészetek.
29.
Minden nap friss műszennyvizet (23. bekezdés) használjunk, amelyet a szilárd anyagok vagy a törzsoldat koncentrátum csapvízzel történő hígításával készítünk. Egy mérőhenger segítségével mérjük ki a szükséges mennyiséget, és töltsük egy tiszta edénybe, amelyet a befolyó szennyvíz tárolására használunk. Szükség esetén a hígítás előtt adjunk megfelelő mennyiséget a vizsgált vegyi anyag vagy a referencia-vegyianyag törzsoldatából a mesterségesen készített szennyvízhez. Egy külön tartályban is elkészíthetjük a vizsgált vegyi anyag hígított oldatát, hogy egy külön adagolópumpa segítségével adagoljuk a döntött csövekbe, amennyiben ez a megoldás kényelmesebb, vagy a vizsgált vegyi anyaggal takarékoskodni kell.
30.
Alternatívaként (és lehetőség szerint) használjunk ülepített háztartási szennyvizet (24. bekezdés), amelyet lehetőleg minden nap frissen gyűjtsünk.
A forgótárcsás reaktorok működtetése
31.
Egy vizsgált vegyi anyag értékeléséhez két egyforma forgótárcsás reaktor szükséges, amelyeket állandó – szokásos körülmények között 22 ± 2 °C – hőmérsékletű helyiségben kell felállítani.
32.
A perisztaltikus pumpák átviteli teljesítményét úgy állítsuk be, hogy óránként 250 ± 25 ml szerves közeget továbbítsanak (a vizsgált vegyi anyag nélkül) a 18 ± 2 rpm fordulatszámmal forgó döntött csövekbe. A berendezés megfelelő működésének biztosítása és élettartamának meghosszabbítása érdekében a vizsgálat megkezdésekor és a vizsgálat időszaka alatt rendszeres időközönként kenjük a pumpacsöveket (25. bekezdés).
33.
A csövek vízszinteshez viszonyított dőlésszögét úgy állítsuk be, hogy a tiszta csőbe adagolt anyag tartózkodási ideje 125 ± 12,5 mp legyen. A tartózkodási idő becsléséhez adjunk nem biológiai markert (például NaCl, semleges festékanyag) a betöltött anyaghoz: az elfolyó csúcskoncentráció eléréséhez szükséges időt tekintjük átlagos tartózkodási időnek (ha a film eléri a maximális vastagságot, a tartózkodási idő kb. 30 percre nőhet).
34.
Kimutatták, hogy ezekkel az átfolyási, sebesség és idő értékekkel megfelelő mértékű (> 80 %) DOC (vagy COD) csökkenés érhető el, és nitrifikált elfolyó szennyvíz keletkezik. Elégtelen eltávolítás vagy egy adott szennyvíztisztító telep teljesítményének szimulálása esetén változtatni kell az áramlási sebességen. Az utóbbi esetben a szerves közeg adagolási sebességét úgy kell módosítani, hogy a reaktor teljesítménye megfeleljen a szennyvíztisztító teljesítményének.
Beoltás
35.
Mesterségesen készített szennyvíz használata esetén a mikroorganizmusok növekedésének beindításához elegendő a levegővel történő érintkezés, máskülönben 3 napon keresztül adjunk literenként 1 ml ülepített szennyvizet a berendezésbe adagolt folyadékhoz.
Mérések
36.
Rendszeres időközönként ellenőrizzük, hogy az adagolási és a forgási sebesség az előírt határértékek között van. Mérjük továbbá az elfolyó víz pH-értékét, különösen akkor, ha nitrifikációra számítunk.
Mintavétel és analízis
37.
A vizsgálat céljának megfelelő mintavételi módszert, rendszert és gyakoriságot kell választani. Használhatunk például a befolyó és az elfolyó vízből vett gyors (vagy próba) mintákat, vagy hosszabb időszakon – például 3–6 órán – keresztül gyűjtött mintákat. Az első időszakban, amikor még nem adagoljuk a vizsgált vegyi anyagot, hetente kétszer vegyünk mintát. A mintákat membránszűrő segítségével szűrjük, vagy centrifugáljuk kb. 40 000 m/s2 intenzitással körülbelül 15 percig (18. bekezdés). A membránszűrés előtt szükség lehet a minták ülepítésére és/vagy durva szűrésére. A DOC vagy COD meghatározását legalább egyszer meg kell ismételni, és adott esetben szükség lehet a BOD, ammónium és nitrit/nitrát meghatározására.
38.
Minden analízist a mintavételt és a minták előkészítését követő lehető legkorábbi időpontban kell elvégezni. Ha az analízist későbbre kell halasztani, akkor a mintákkal teletöltött, szorosan lezárt üvegeket körülbelül 4 °C hőmérsékleten, sötétben kell tárolni. 48 óránál hosszabb ideig történő tárolás esetén a mintákat mélyhűtéssel, savanyítással vagy megfelelő toxikus anyag (például literenként 20 ml 10 g/l töménységű higany (II)-klorid-oldat) hozzáadásával kell tartósítani. A tartósítási módszer nem befolyásolhatja az analízis eredményét.
Bejáratási időszak
39.
Ez alatt az általában 2 hétig tartó, de 6 hétnél nem hosszabb időszak alatt éri el a felületen képződő biofilm az optimális vastagságot. A DOC (vagy COD) csökkenés (44. bekezdés) mértéke nő, majd beáll egy állandó értékre. Miután egy hasonló érték mellett mindkét berendezésnél bekövetkezett az állandósult állapot elérése, kiválasztjuk, hogy melyiket használjuk kontroll berendezésként a vizsgálat hátralevő részében, amelynek során állandó teljesítményt kell mutatnia.
A vizsgált vegyi anyag bevezetése
40.
Ebben a szakaszban kezdjük adagolni a vizsgált vegyi anyagot a másik reaktorba a megfelelő – általában 10–20 mg C/l – koncentrációban.
Akklimatizációs időszak
41.
Folytatjuk a heti kétszeri DOC (vagy COD) analíziseket, és ha az elsődleges biológiai lebonthatóságot kell értékelni, akkor specifikus analízis segítségével mérjük a vizsgált vegyi anyag koncentrációját. A vizsgált vegyi anyag bevezetését követően egytől hat hétig tartó – különleges körülmények között hosszabb – időszak szükséges az alkalmazkodáshoz. Miután a százalékos eltávolítás (43–45. bekezdés) elérte a maximális szintet, az állandósult állapot időszaka alatt körülbelül 3 héten keresztül 12–15 érvényes értéket kell gyűjteni az átlagos százalékos eltávolítás értékeléséhez. A vizsgálatot akkor lehet befejezettnek tekinteni, amikor kellően magas lebomlási fokot sikerült elérni. Általában törekedni kell arra, hogy a vizsgált vegyi anyag adagolásának megkezdését követően a vizsgálat legfeljebb 12 hétig tartson.
Biofilm leválás
42.
Viszonylag rendszeres időközönként nagy mennyiségű fölös biofilm válik vagy szakad le a csövek faláról. A vizsgálatok időszaka legalább két teljes növekedési és leválási ciklusra terjedjen annak érdekében, hogy az eredmények összehasonlíthatóságát ez ne befolyásolja.
ADATOK ÉS JEGYZŐKÖNYVVEZETÉS
Az eredmények kezelése
43.
A vizsgált vegyi anyag DOC (vagy COD) csökkenésének százalékos értékét a következő képlettel számítjuk ki az adott időpontokban történő értékeléshez:
ahol:
Dt
=
százalékos DOC (vagy COD) csökkenés a t időpontban,
Cs
=
a vizsgált vegyi anyagnak tulajdonítható, lehetőleg a törzsoldat koncentrációja és hozzáadott mennyisége alapján becsült befolyó DOC (vagy COD) (mg/l),
E
=
a vizsgálati berendezés elfolyó vízében mért DOC (vagy COD) a t időpontban (mg/l),
Eo
=
a kontroll berendezés elfolyó vízében mért DOC (vagy COD) a t időpontban (mg/l).
A referencia-vegyianyag vizsgálata esetén a referencia-vegyianyagra vonatkozóan is végezzük el a számítást.
A kontroll reaktor teljesítménye
44.
A kontroll reaktorokba adagolt szerves közeg DOC (vagy COD) csökkenésének foka hasznos információt nyújt a biofilm vizsgálat során megfigyelhető biológiai lebontó képességének az értékeléséhez. A százalékos lebomlás az alábbi képletből számítható ki:
ahol:
Cm= a kontroll berendezésbe adagolt szerves közeg befolyó DOC vagy COD értéke (mg/l).
45.
Amennyiben specifikus analitikai módszerrel mérjük a vizsgált vegyi anyag eltávolítását, a következő képlettel számítjuk ki a vizsgált vegyi anyag lebomlását:
ahol:
Si
=
a vizsgált vegyi anyag mért vagy lehetőség szerint becsült koncentrációja a vizsgálati berendezés befolyó szennyvízében (mg/l)
Se
=
a vizsgált vegyi anyag mért koncentrációja a vizsgálati berendezés elfolyó vízében a t időpontban (mg/l)
Ha nem módosított szennyvíz esetén az analitikai módszer az Sc mg/l értékével egyező pozitív eredményt ad, akkor a százalékos eltávolítás (DSC) kiszámítása a következő:
A vizsgálati eredmények bemutatása
46.
A Dt és DST (vagy DSC) százalékos lebomlást az idő függvényében ábrázoljuk (lásd a C.10. fejezet A részének 2. függelékét). A vizsgált vegyi anyag százalékos eltávolítását az állandósult állapothoz tartozó 12–15 DT (és ha rendelkezésre áll, DST) érték (legközelebbi egész számra kerekített) számtani közepe és szórása alapján határozzuk meg. A bomlási görbe alakjából az eltávolítási folyamatokra vonatkozó következtéseket lehet levonni.
Adszorpció
47.
Ha egy vizsgált vegyi anyag esetében a vizsgálat kezdetétől fogva nagyfokú DOC-csökkenés figyelhető meg, akkor a vizsgált vegyi anyag lebomlása valószínűleg a biofilmen való adszorbeálódásának köszönhető. Ezt a biofilmről levált szilárd anyagokon adszorbeálódott vizsgált vegyi anyag meghatározásával lehet bizonyítani. Az adszorbeálható vegyi anyagok DOC-csökkenése általában nem marad mindvégig nagyfokú a vizsgálat során; a kezdetben tapasztalható nagyfokú eltávolítás rendszerint fokozatosan csökken, majd eléri az egyensúlyi értéket. Ha azonban az adszorbeálható vegyi anyag valamilyen módon a mikrobapopuláció akklimatizálódását okozza, a vizsgált vegyi anyag DOC-csökkenése a későbbiekben növekszik, majd egy magas értéken állandósul.
Alkalmazkodási fázis
48.
A statikus szűrővizsgálatokhoz hasonlóan a biológiai lebontást számos vizsgált vegyi anyag esetében egy alkalmazkodási fázis előzi meg. Az alkalmazkodási fázisban a kompetens baktériumok akklimatizálódnak (vagy alkalmazkodnak), és szinte egyáltalán nem figyelhető meg a vizsgált vegyi anyag eltávolítása; ezt a baktériumok szaporodásának kezdeti időszaka követi. Miután ez a szakasz véget ért, a lebontó fázis kezdetének önkényesen azt az időpontot tekintjük, amikor a vizsgált vegyi anyag kezdeti mennyiségének körülbelül 10 % százaléka kerül eltávolításra (figyelembe véve az esetleges adszorpciót). Az alkalmazkodási fázis általában rendkívül változatos és kevéssé reprodukálható.
Állandósult állapot
49.
Egy folyamatos vizsgálat során a bomlási görbe állandó szakasza azt a fázist jelöli, amikor a legnagyobb fokú lebontás figyelhető meg. Az állandósult állapotnak legalább 3 hétig kell tartania, és körülbelül 12–15 mért értéknek kell tartoznia hozzá.
A vizsgált vegyi anyag átlagos lebomlási foka
50.
Számítsuk ki a vizsgált vegyi anyag állandósult állapothoz tartozó Dt (és ha rendelkezésre áll, Dst) lebomlási értékeinek számtani közepét, majd kerekítsük a legközelebbi egész számra (1 %). Ez lesz a vizsgált vegyi anyag lebomlási foka. A számtani közép 95 %-os konfidencia intervallumát is ajánlott kiszámítani. Hasonlóképpen számítsuk ki a kontroll berendezésbe adagolt szerves közeg átlagos lebomlási fokát (DB).
A biológiai lebontás jele
51.
Ha a vizsgált vegyi anyag nem adszorbeálódik jelentős mértékben a biofilmen, és a bomlási görbe a biológiai bomlási görbére jellemző tipikus alakot mutatja (alkalmazkodási fázis, lebontó fázis, állandósult állapot) (48–49. bekezdés), a mért csökkenést biztonsággal lehet a biológiai lebontásnak tulajdonítani. Ha kezdetben nagyfokú eltávolítás figyelhető meg, a szimulációs vizsgálat nem tud különbséget tenni a biológiai és az abiotikus bomlási folyamatok között. Ebben az esetben és minden más esetben, amikor a biológiai lebontással kapcsolatban kétségek merülnek fel (például sztrippelés esetén), biofilm mintákon analizálni kell az adszorbeált vizsgált vegyi anyagot, vagy a biológiai folyamatokra egyértelműen utaló paramétereken alapuló kiegészítő statikus biológiai lebonthatósági (szűrő-) vizsgálatokat kell végezni. Ilyenek például az oxigénfelvételt vizsgáló módszerek (az e melléklet C.4. fejezetében szereplő D, E és F módszerek) (9) vagy a CO2 képződést mérő vizsgálat (az e melléklet C.4. fejezetében szereplő C módszer vagy a gőztér CO2-tartalmának vizsgálata) (10); oltóanyagként a megfelelő reaktorból származó, a vizsgált vegyi anyagnak már kitett oltóanyagot használunk.
52.
Ha a DOC-eltávolítást és az adott vegyi anyag eltávolítását is mértük, az eltávolítási százalékok jelentős különbsége (az előbbi alacsonyabb, mint az utóbbi) olyan szerves köztes termékek jelenlétére utal az elfolyó vízben, amelyek nehezebben lebonthatók lehetnek; ezt vizsgálatnak kell alávetni.
Validity of test results
53.
A vizsgálatot akkor tekintjük érvényesnek, ha a DOC (vagy COD) csökkenés foka (DB) a kontroll berendezés(ek)ben 2 hetes működtetést követően meghaladja a 80 %-ot, és semmilyen szokatlan jelenséget nem figyeltünk meg.
54.
Gyorsan lebontható (referencia) vegyi anyag vizsgálata esetén a biológiai lebomlás fokának nagyobbnak kell lennie, mint 90 %, és a megismételt vizsgálat során kapott érték nem mutathat 5 %-nál nagyobb eltérést. Ha ez a két feltétel nem teljesül, felül kell vizsgálni a kísérleti eljárásokat és/vagy más forrásból kell háztartási szennyvizet szerezni.
55.
Hasonlóképpen, az ugyanazt a vizsgált vegyi anyagot párhuzamosan kezelő berendezésekkel kapott biológiai lebonthatósági értékek között nem lehet 5 %-nál nagyobb eltérés (amennyiben párhuzamos berendezéseket használunk). Ha ez a feltétel nem teljesül, de az eltávolítás nagyfokú, akkor az elemzést még három hétig folytatni kell. Ha az eltávolítás foka alacsony, akkor meg kell vizsgálni a vizsgált vegyi anyag gátló hatásait, amennyiben még nem ismertek, és ha kivitelezhető, akkor a vizsgált vegyi anyagot alacsonyabb koncentrációban használva meg kell ismételni a vizsgálatot.
Vizsgálati jegyzőkönyv
56.
A vizsgálati jegyzőkönyvnek a következőket kell tartalmaznia:
Vizsgált vegyi anyag:
—
azonosító adatok,
—
fizikai jelleg és adott esetben a fizikai és kémiai tulajdonságok.
Vizsgálati körülmények:
—
a vizsgálati elrendezés esetleges módosításai, különösen oldhatatlan és illékony vegyi anyagok vizsgálata esetén,
—
a szerves közeg típusa,
—
a szennyvízben található ipari hulladékok aránya és jellege, amennyiben vannak és ismertek,
—
a beoltás módja,
—
a vizsgált vegyi anyag törzsoldata – DOC (oldott szerves szén) és TOC (összes szerves szén) tartalom, szuszpenzió esetén az elkészítés módja, a vizsgálathoz használt koncentráció(k), 10-20 mg/l tartományon kívül eső DOC-koncentráció okai; a hozzáadás módszere és első időpontja, a koncentráció esetleges változtatásai,
—
átlagos hidraulikus tartózkodási idő (amikor még nincs biofilm növekedés), cső forgási sebessége, hozzávetőleges dőlésszög, ha meghatározható,
—
biofilm leválás részletei, idő és intenzitás,
—
vizsgálati hőmérséklet és tartomány,
—
alkalmazott analitikai módszerek,
Vizsgálati eredmények:
—
mért adatok: DOC, COD, specifikus analízis, pH, hőmérséklet, N-vegyületek, ha releváns,
—
a számított Dt (vagy Dtc), DB, DS adatok táblázatos formában és a bomlási görbék,
—
az alkalmazkodási fázisra és az állandósult állapotra vonatkozó információk, a vizsgálat időtartama, a vizsgált vegyi anyag, a referencia-vegyianyag (ha vizsgált) és a szerves közeg (kontroll berendezésben) lebomlási foka, statisztikai adatokkal és a biológiai lebonthatóságra valamint a vizsgálat érvényességére vonatkozó megállapításokkal kiegészítve,
—
az eredmények szöveges elemzése.
SZAKIRODALOM
(1)
Gerike P, Fischer W, Holtmann W (1980). Biodegradability determinations in trickling filter units compared with the OECD Confirmatory Test. Wat. Res. 14: 753-758.
(2)
Truesdale GA, Jones K, Vandyke KG (1959). Removal of synthetic detergents in sewage treatment processes: Trials of a new biologically attackable material.Wat. Waste Tr. J. 7: 441–444.
(3)
Baumann U, Kuhn G and Benz M. (1998) Einfache Versuchsanordnung zur Gewinnung gewässerökologisch relevanter Daten, UWSF – Z. Umweltchem. Ökotox. 10: 214–220.
(4)
Gloyna EF, Comstock RF, Renn CE (1952). Rotary tubes as experimental trickling filters. Sewage ind. Waste 24: 1355–1357.
(5)
Kumke GW, Renn CE (1966). LAS removal across an institutional trickling filter. JAOCS 43: 92–94.
(6)
Tomlinson TG, Snaddon DHM, (1966). Biological oxidation of sewage by films of micro-organisms. Int.J. Air Wat. Pollut. 10: 865–881.
(7)
Her Majesty’s Stationery Office (1982). Methods for the examination of waters and associated materials. Assessment of biodegradability, 1981, London.
(8)
Her Majesty’s Stationery Office (1984). Methods for the examination of waters and associated materials. Methods for assessing the treatability of chemicals and industrial waste waters and their toxicity to sewage treatment processes, 1982, London.
(9)
E melléklet C.4. fejezete: A »gyors« biológiai lebonthatóság meghatározása, A–F részek.
(10)
ISO 14593 (1998). Vízminőség. Szerves vegyületek teljes aerob biológiai lebonthatóságának kiértékelése vizes közegben. A lezárt edényzet szervetlen széntartalmának meghatározásán alapuló módszer.
8. függelék
1. ábra
Forgótárcsás reaktor
2. ábra
Áramlási diagram
FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK:
Vizsgált vegyi anyag: Bármely, ennek a vizsgálati módszernek az alkalmazásával vizsgált anyag vagy keverék.
Vegyi anyagok: »Meg kell jegyezni, hogy a ’vegyi anyag’ kifejezést tág értelemben használják az UNCED-szerződésekben és a későbbi dokumentumokban, hogy a termékeket, keverékeket, készítményeket vagy a létező rendszerekben a hatály megjelölésére használt egyéb kifejezéseket magában foglalja«.
”
10.
A melléklet a következő C.27., C.28., C.29. és C.30. fejezettel egészül ki:
„C.27. SZENNYEZETT ÜLEDÉKKEL VÉGZETT ÜLEDÉK-VÍZ TOXICITÁSI VIZSGÁLAT ÁRVASZÚNYOGLÁRVÁKKAL
BEVEZETÉS
1.
Ez a vizsgálati módszer egyenértékű az OECD 218. vizsgálati iránymutatásában (2004) leírt módszerrel. E vizsgálati módszer célja a kétszárnyúak rendjébe tartozó édesvízi üledéklakó árvaszúnyoglárvák vegyi anyagoknak való tartós kitettsége hatásainak az értékelése. A Chironomus riparius és Chironomus tentans árvaszúnyog fajokkal végzett toxicitás vizsgálati protokollokon alapul, amelyeket Európában (1)(2)(3) és Észak-Amerikában (4)(5)(6)(7)(8) dolgoztak ki, és körvizsgálatnak vetettek alá (1)(6)(9). Más jól dokumentált árvaszúnyog fajok, például Chironomus yoshimatsui (10)(11) is használhatók.
2.
A vizsgálati módszer által alkalmazott expozíciós forgatókönyv az üledék szennyezése a vizsgált anyaggal. A megfelelő expozíciós forgatókönyv a vizsgálat tervezett felhasználásától függ. Az üledékszennyezési forgatókönyv az üledékben tartósan jelen lévő vegyi anyagok felhalmozódását hivatott szimulálni. Ennél az expozíciós elrendezésnél a szennyezett üledék egy üledékből és vízből álló vizsgálati elrendezés részét képezi.
3.
Az anyagok, amelyek üledéklakó organizmusokra gyakorolt hatását vizsgálni kell, általában hosszú ideig maradnak ebben a környezetben. Az üledéklakó organizmusok többféle módon lehetnek kitéve ezeknek az anyagoknak. Az egyes expozíciós útvonalak viszonylagos fontossága és a teljes toxikus hatás egyes expozíciós útvonalaknak tulajdonítható részének kialakulásához szükséges időtartam az érintett vegyi anyag fizikai és kémiai tulajdonságaitól függ. Az erősen adszorbeálódó (például log Kow > 5) vagy az üledékbe kovalens kötéssel beépülő anyagok esetében fontos expozíciós útvonal lehet a szennyezet táplálék megemésztése. Az erősen lipofil anyagok toxicitása alulbecsülésének elkerülése érdekében megfontolandó, hogy a táplálékot a vizsgált anyaggal való szennyezést megelőzően az üledékbe keverjük. Az itt bemutatott vizsgálati módszer a tartós kitettségre épül, amely azt a célt szolgálja, hogy valamennyi lehetséges expozíciós útvonal figyelembe vehető legyen. A vizsgálat időtartama a C. riparius és a C. yoshimatsui esetében 20–28 nap, a C. tentans esetében 28–65 nap. Ha egy meghatározott célra – például egy instabil vegyület hatásainak a vizsgálatára – rövid távú adatok kellenek, a felesleges ismétlések tíz nap után eltávolíthatók.
4.
A mért végpontok a kikelt kifejlett példányok száma és a kikeléshez szükséges idő. Ha kiegészítő rövid távú adatokra van szükség, akkor a lárvák túlélésének és fejlődésének mérését csak a tíznapos időszak eltelte után ajánlott megkezdeni, megfelelő számú ismétlést alkalmazva.
5.
Mesterséges üledék használata ajánlott. A mesterséges üledék számos előnnyel rendelkezik a természetes üledékkel szemben:
—
a kísérlet változékonysága kisebb, mivel a mesterséges üledék egy reprodukálható »szabványosított közeget« biztosít, és nem kell szennyezésmentes, tiszta üledékforrást keresni,
—
a vizsgálatok bármikor elkezdhetők anélkül, hogy a vizsgálathoz használt üledék szezonális változékonyságát figyelembe kellene venni, és az üledéket nem kell előzetes kezelésnek alávetni a honos fauna eltávolítása végett; a mesterséges üledék alkalmazása a rutinvizsgálatokhoz szükséges mennyiségű üledék terepen történő gyűjtésével kapcsolatos költségeket is csökkenti,
—
a mesterséges üledék alkalmazása lehetővé teszi a különböző anyagok toxicitásának összehasonlítását és ennek megfelelő rangsorolását.
6.
A használt fogalmak meghatározását az 1. függelék tartalmazza.
A VIZSGÁLAT ELVE
7.
Első fejlődési szakaszban lévő árvaszúnyoglárvákat teszünk ki a vizsgált vegyi anyag különböző koncentrációinak üledék-víz elrendezésekben. Az üledéket a vizsgált anyaggal szennyezzük, majd első fejlődési szakaszban lévő lárvákat helyezünk a kísérleti edényekbe, amelyekben az üledék és víz koncentrációját előzőleg stabilizáltuk. Az árvaszúnyoglárvák kikelésének és fejlődésének ütemét a vizsgálat végén mérjük. Szükség esetén 10 nap elteltével is mérhetjük a lárvák túlélését és súlyát (megfelelő számú ismétlést alkalmazva). A kapott adatokból regressziós modell segítségével megbecsüljük azt a koncentrációt, amely a kikelésnek vagy a lárvák túlélésének, illetve fejlődésének x %-os csökkenését okozná (például EC15, EC50, stb.), vagy statisztikai hipotézisvizsgálattal meghatározzuk a megfigyelhető hatást nem okozó koncentrációt, illetve a megfigyelhető hatást okozó legkisebb koncentrációt (NOEC/LOEC). Az utóbbi esetben a hatást okozó értékeket statisztikai vizsgálatok segítségével össze kell hasonlítani a kontroll értékekkel.
A VIZSGÁLT ANYAGRA VONATKOZÓ INFORMÁCIÓK
8.
Ismerni kell a vizsgált anyag vízoldékonyságát, páranyomását, mért vagy számított megoszlását az üledékben, valamint stabilitását vízben és az üledékben. Rendelkezni kell egy megbízható analitikai módszerrel a vizsgált anyag mennyiségi meghatározásához a fedővízben, a pórusvízben és az üledékben, amelynek pontossága és kimutatási határa ismert és dokumentált. Hasznos információ a vizsgált anyag szerkezeti képlete és kémiai tisztasága. Ugyancsak hasznos információ, hogy milyen kémiai folyamatokon megy keresztül a vizsgált anyag (például disszipáció, nem biológiai és biológiai lebomlás, stb.). A vizsgálat elvégzését megnehezítő fizikai és kémiai tulajdonságokkal rendelkező anyagok vizsgálatára vonatkozóan a szakirodalom (12) nyújt további tájékoztatást.
REFERENCIA-VEGYIANYAGOK
9.
A vizsgálati protokoll és a vizsgálati körülmények megbízhatóságának megerősítése céljából rendszeres időközönként érdemes referencia-vegyianyagokkal elvégezni a vizsgálatot. Körvizsgálatokban és validálási vizsgálatokban eredményesen használt mérgező referenciaanyagok például a következők: lindane, trifluralin, pentaklórfenol, kadmium-klorid és a kálium-klorid (1)(2)(5)(6)(13).
A VIZSGÁLAT ÉRVÉNYESSÉGE
10.
A következő feltételeknek kell teljesülniük ahhoz, hogy a vizsgálat érvényes legyen:
—
A lárvák kikelésének aránya a kontroll edényekben legalább 70 % a vizsgálat végén (1)(6).
—
A kontroll edényekben 12–23 nappal a behelyezést követően kell megjelenniük a kifejlett C. riparius és C. yoshimatsui példányoknak; a C. tentans esetében ehhez 20–65 nap szükséges.
—
A vizsgálat végén mindegyik edényben meg kell mérni a pH-t és az oldott oxigén koncentrációját. Az oxigénkoncentrációnak a levegő alkalmazott hőmérséklet melletti telítettségi értéke (ASV) legalább 60 százalékának kell lennie, a fedővíz pH-értékének pedig minden edényben a 6–9 tartományon belülre kell esnie.
—
a víz hőmérséklete legfeljebb ± 1,0 °C-kal változhat. A vízhőmérséklet szabályozásának egyik lehetséges módja, hogy a vizsgálatot állandó hőmérsékletű helyiségben végezzük, amely esetben a helyiség hőmérsékletét megfelelő időközönként ellenőrizni kell.
A MÓDSZER LEÍRÁSA
Vizsgálati edények
11.
A vizsgálatot 600 ml-es üvegedényekben végezzük, amelyek átmérője 8 cm. Amennyiben az üledék és a fedővíz megfelelő mélysége biztosított, ettől eltérő edények is alkalmazhatók. Lárvánként 2–3 cm2 nagyságú üledékfelületet kell biztosítani. Az üledékréteg és a fedővíz mélységének aránya 1:4 legyen. A vizsgálati edényeknek és a vizsgálati elrendezéssel érintkező egyéb készülékeknek teljes mértékben üvegből vagy más kémiailag semleges anyagból (például teflon) kell készülniük.
A fajok kiválasztása
12.
A vizsgálatot lehetőleg a Chironomus riparius fajjal végezzük. Chironomus tentans is alkalmazható, de nehezebben kezelhető, és hosszabb vizsgálati időszakot igényel. Chironomus yohimatsui szintén használható. A 2. függelékben részletezett tenyésztési módszerek a Chironomus riparius fajra vonatkoznak. A szakirodalomban más fajok – úgymint a Chironomus tentans (4) és a Chironomus yoshimatsui (11) – tenyésztési körülményeire vonatkozó tudnivalók is megtalálhatók. A vizsgálat megkezdése előtt ellenőrzésképpen fajmeghatározást kell végezni, de ha a példányok saját tenyészetből származnak, akkor ezt nem szükséges minden vizsgálat előtt megtenni.
Üledék
13.
Lehetőleg mesterséges üledék (más néven formulázott, kevert vagy műüledék) használata ajánlott. Ha azonban mégis természetes üledéket használunk, akkor azt jellemezni kell (legalább a pH-t és a szerves széntartalmat meg kell határozni, de más paraméterek, például a C/N arány és a szemcseszerkezet vizsgálata is ajánlott), és mentesnek kell lennie mindenféle szennyezéstől, valamint az árvaszúnyoggal versengő vagy az azt fogyasztó egyéb organizmusoktól. Az árvaszúnyoglárvákkal végzett toxicitási vizsgálatban való felhasználás előtt ajánlott továbbá a természetes üledéket az elkövetkező vizsgálat során uralkodókkal megegyező körülmények között hét napon keresztül kondicionálni. E vizsgálat során az alábbi, a C.8. vizsgálati módszerben (14) alkalmazott mesterséges talajon alapuló mesterséges üledék alkalmazása ajánlott (1)(15)(16):
a)
4–5 % (száraz tömeg) tőzeg, amelynek pH-ja a lehető legközelebb esik az 5,5–6,0 értékhez; fontos, hogy por alakú, finomra őrölt (részecskeméret ≤ 1 mm) és kizárólag levegőn szárított tőzeget használjunk.
75–76 % (száraz tömeg) kvarchomok (túlnyomó részben finom homok, amely részecskéinek több mint 50 százaléka 50 és 200 μm közötti szemcsemérettel rendelkezik).
d)
Annyi ionmentesített víz, amely ahhoz szükséges, hogy végtermékként 30-50 % nedvességtartalmú keveréket kapjunk.
e)
A végtermékként kapott üledékkeverék pH-jának 7,0 ± 0,5 értékre történő beállításához szükséges mennyiségű vegytiszta minőségű kalcium-karbonát (CaCO3). A végtermékként kapott keveréknek 2 % (± 0,5 %) szerves széntartalommal kell rendelkeznie, amelyet az a) és c) pont szerinti megfelelő mennyiségű tőzeg és homok hozzáadásával érünk el.
14.
A tőzegnek, a kaolinagyagnak és a homoknak ismert forrásból kell származnia. Ellenőrizni kell, hogy az üledék összetevőiben nem fordulnak elő kémiai szennyeződések (például nehézfémek, szerves klórvegyületek, szerves foszforvegyületek, stb.) A mesterséges üledék elkészítésének egy példáját a 3. függelék mutatja be. Száraz összetevők keverése is elfogadott, amennyiben bizonyítható, hogy a fedővíz hozzáadását követően az üledék nem esik szét összetevőire (például a vízben lebegő tőzegrészecskékre), és a tőzeget vagy az üledéket megfelelően kondicionáltuk.
Víz
15.
Az elfogadható hígítóvíz 2. és 4. függelékben felsorolt kémiai tulajdonságaival rendelkező bármely víz alkalmas a vizsgálathoz. Tenyésztővízként és kísérleti vízként bármely alkalmas víz, természetes víz (felszíni vagy talajvíz), mesterséges víz (lásd a 2. függeléket) vagy klórtalanított csapvíz elfogadható, amelyben az árvaszúnyoglárvák a tenyésztés és a vizsgálat időszaka alatt életben maradnak anélkül, hogy stressz jeleit mutatnák. A vizsgálat kezdetén a vizsgálathoz alkalmazott víz pH-értékének 6 és 9 között kell lennie, keménysége pedig nem haladhatja meg a 400 mg/l CaCO3 értéket. Ennél lágyabb vizet kell azonban alkalmazni akkor, ha gyanítható, hogy a keménységet okozó ionok és a vizsgált anyag között kölcsönhatás alakul ki (és ezért ebben az esetben az Elendt-féle M4 közeg nem alkalmazható). A vizsgálat teljes időtartama alatt ugyanazt a víztípust kell használni. A 4. függelékben felsorolt vízminőségi jellemzőket évente legalább kétszer kell mérni, illetve minden olyan alkalommal, amikor fennáll a gyanúja annak, hogy e jellemzők jelentős mértékben megváltoztak.
Törzsoldatok – szennyezett üledékek
16.
A választott koncentrációjú szennyezett üledéket általában úgy készítjük, hogy a vizsgált anyag oldatát közvetlenül az üledékhez adjuk. A vizsgált anyag ionmentesített vízben oldott törzsoldatát hengerszék vagy tápkeverő segítségével vagy kézzel elkeverjük a mesterséges üledékkel. Ha a vizsgált anyag rosszul oldódik vízben, akkor a célnak megfelelő, lehető legkisebb mennyiségű szerves oldószerben (például hexán, aceton vagy kloroform) oldhatjuk. Ezt követően az oldatot vizsgálati edényenként 10 g finom kvarchomokkal elkeverjük. Az oldószert hagyjuk elpárologni, hogy teljes mértékben eltávozzon a homokból; majd a homokot összekeverjük a vizsgálati edényenként szükséges megfelelő mennyiségű üledékkel. A vizsgált anyag oldódásának megkönnyítéséhez, diszpergálásához vagy emulgeálásához csak gyorsan párolgó szer használható. Nem szabad elfelejteni, hogy az üledék elkészítése során a vizsgált anyag és a homok keverékéből származó homokot is figyelembe kell venni (azaz az üledéket kevesebb homokkal kell készíteni). Biztosítani kell az üledékhez adott vizsgált anyag egyenletes eloszlását az üledékben. Szükség esetén részminták analizálásával határozzuk meg a homogenitás fokát.
A VIZSGÁLAT MEGTERVEZÉSE
17.
A vizsgálat megtervezése a vizsgálat során alkalmazott koncentrációk számának és osztásközének, az egyes koncentrációkkal használt edények számának, valamint a lárvák edényenkénti számának a megválasztását jelenti. Ideális esetben a vizsgálatot az alábbiakra tekintettel kell megtervezni. Az EC pontnak és a NOEC becslésének, valamint a határérték-vizsgálatnak a megtervezését ismertetjük.
A regressziós analízis megtervezése
18.
A vizsgálat során alkalmazott koncentrációknak le kell fedniük a hatáskoncentrációt (például EC15, EC50) és azt a koncentrációtartományt, amelyen belül a vizsgált anyag érdeklődésre számot tartó hatással rendelkezik. A hatáskoncentráció becsléseknek (ECx) a pontossága és különösképpen az érvényessége általában jobb, ha a hatáskoncentráció a vizsgált koncentrációtartományon belül helyezkedik el. A lehető legkisebb pozitív koncentrációnál jóval alacsonyabb és a legnagyobb koncentrációnál jóval magasabb értékek extrapolálását kerülni kell. Az alkalmazandó koncentrációtartomány kiválasztásához hasznos lehet előzetes behatároló vizsgálatot végezni (lásd 27. bekezdés).
19.
Az ECx becsléséhez legalább öt koncentrációt kell vizsgálni, és mindegyik koncentráció esetében három ismétlést kell alkalmazni. A jó modellbecslés lehetővé tétele érdekében minden esetben tanácsos elegendő vizsgálati koncentrációt használni. A rákövetkező koncentráció legfeljebb kétszerese legyen az előzőnek (kivételt képeznek azok az esetek, amikor a dózis-válasz görbe lapos). Az eltérő választ kiváltó vizsgálati koncentrációk számának emelkedése esetén az egyes kezeléseknél alkalmazott ismétlésszám csökkenthető. Az ismétlésszám növelése vagy a vizsgálat során alkalmazott koncentráció intervallum szűkítése általában a konfidencia intervallum csökkenéséhez vezet. A lárvák tíznapos túlélési arányának és fejlődési sebességének a becslése esetén további ismétlések szükségesek.
A NOEC/LOEC becslésének megtervezése
20.
A LOEC vagy a NOEC becsléséhez öt koncentrációt kell vizsgálni legalább négy ismétlést alkalmazva úgy, hogy a rákövetkező koncentráció legfeljebb kétszerese legyen az előzőnek. Az ismétlések számának elegendőnek kell lennie ahhoz, hogy a kontrollhoz viszonyított 20 %-os különbséget 5 %-os szignifikancia-szint (p = 0,05) mellett megfelelő valószínűséggel kimutasson egy statisztikai próba. A fejlődési ütem esetében általában varianciaanalízist (ANOVA), például Dunnett vagy Williams próbát (17)(18)(19)(20) lehet alkalmazni. Ha a kikelési arányt vizsgáljuk, akkor a Cochran-Armitage, a Fisher-féle egzakt (Bonferroni-féle korrekcióval) vagy a Mantel-Haenszel próbát használhatjuk.
Határérték-vizsgálat
21.
Határérték-vizsgálatot akkor lehet végezni (egy vizsgálati és egy kontroll koncentrációval), ha az előzetes behatároló vizsgálat során nem voltak megfigyelhető hatások. A határérték-vizsgálat célja annak a koncentrációnak a meghatározása, amely elég nagy ahhoz, hogy az elvégzett vizsgálat lehetővé tegye a döntéshozók számára a vizsgált anyag lehetséges toxikus hatásainak a kizárását, és annak a határértéknek a megállapítását, amelyen túli koncentrációknak az előfordulása semmilyen esetben sem várható. Az ajánlott koncentráció 1 000 mg/kg (száraz tömeg). Általában mind a kezelés, mind a kontroll esetében legalább hat ismétlés szükséges. Bizonyítni kell, hogy a kontrollhoz viszonyított 20 %-os különbséget 5 %-os szignifikancia-szint (p = 0,05) mellett megfelelő valószínűséggel képes kimutatni egy statisztikai próba. Metrikus válasz (fejlődési ütem és súly) esetén alkalmas statisztikai módszer a t-próba, ha az adatok az alkalmazási feltéteknek (normalitás, szóráshomogenitás) megfelelnek. Ha a feltételek nem teljesülnek, akkor a nem egyenlő szórásnégyzeteket feltételező t-próba vagy egy nemparaméteres próba, például a Wilcoxon-Mann-Whithey próba alkalmazható. A kikelési arány esetében a Fisher-féle egzakt próba a megfelelő.
ELJÁRÁS
Expozíciós körülmények
A szennyezett üledék – víz elrendezés előállítása
22.
Az üledék vizsgált anyaggal való szennyezését a »C.8: Toxicitás földigilisztákra« című vizsgálati módszernél leírt eljárás szerint ajánlott elvégezni (14). A szennyezett üledéket elhelyezzük az edényekben, majd felöntjük vízzel úgy, hogy az üledék és a fedővíz mennyiségének az aránya 1:4 legyen (lásd a 11. és a 15. bekezdést). Az üledékrétegnek 1,5–3 cm mélynek kell lennie. Annak elkerülése érdekében, hogy a vizsgálathoz használt víz hozzáadása során az üledék összetevőire essen szét, és a finom anyag a vízrétegben felkavarodjon, az üledéket letakarhatjuk egy műanyag lappal, miközben a vizet ráöntjük, amelyet közvetlenül a felöntést követően eltávolítunk. Erre a célra más eszközök is alkalmasak lehetnek.
23.
A vizsgálati edényeket le kell fedni (például üveglappal). Az eredeti vízszint fenntartása érdekében a vizsgálat során pótoljuk az elpárolgott vizet, ha szükséges. A sófelhalmozódás elkerülése végett desztillált vagy ionmentesített vizet használjunk.
Stabilizálódás
24.
A vízzel fedett szennyezett üledék előállítását követően hagyjuk, hogy a vizsgált anyag a vízfázisból az üledékbe kerüljön, és abban eloszoljon (3)(4)(6)(13). Ez lehetőleg a vizsgálat során alkalmazottal megegyező hőmérsékleti és levegőztetési viszonyok mellett történjen. Az ekvilibrációs idő üledék és vegyi anyag specifikus, tartama óráktól napokig terjedhet, de ritka esetekben több (4–5) hetet is igénybe vehet. Mivel ez alatt az idő alatt számos vegyi anyag lebomolhat, az egyensúlyi állapot beálltának megvárása helyett 48 órás ekvilibrációs időszak alkalmazása ajánlott. Ezen ekvilibrációs idő elteltével mérjük meg a vizsgált anyagnak legalább a legnagyobb és a legalacsonyabb koncentrációját a fedővízben, a pórusvízben és az üledékben (38. bekezdés). Ezek a vizsgált anyagra vonatkozó analitikai meghatározások lehetővé teszik a tömegegyensúly kiszámítását és az eredmények mért koncentrációk alapján történő kifejezését.
A vizsgálathoz használt organizmusok hozzáadása
25.
A vizsgálathoz használt organizmusok vizsgálati edényekbe történő behelyezése előtt négy-öt nappal helyezzük a tenyészetből gyűjtött petecsomókat tenyésztőközeget tartalmazó kisméretű edényekbe. A törzstenyészetből vett vagy frissen készített tenyésztőközeg egyaránt használható. Ez utóbbi használata esetén adjunk a tenyésztőközeghez kis mennyiségű táplálékot, például zöldalgát és/vagy finomra őrölt pehely formájú haleledelből készített szuszpenzió szüredékéből néhány cseppet (lásd a 2. függeléket). Csak frissen lerakott petecsomókat szabad használni. A lárvák általában néhány nappal a peterakást követően kezdenek kikelni (a Chironomus riparius esetében ez 20 °C-on 2–3 nap, a Chironomus tentans és a Chironomus yoshimatui esetében pedig 23 °C-on, illetve 25 °C-on 1–4 nap). A lárvák fejlődése négy, egyenként 4–8 napig tartó szakaszra osztható. A vizsgálathoz az első fejlődési szakaszban lévő lárvákat kell gyűjteni (2–3 vagy 1–4 nappal a kikelést követően). Az árvaszúnyoglárvák fejlődési szakaszát a fejszélesség alapján ellenőrizhetjük (6).
26.
Mindegyik szennyezett üledéket és vizet tartalmazó vizsgálati edénybe húsz darab, tetszőlegesen kiválasztott lárvát helyezünk egy tompa végű pipetta segítségével. A lárvák vizsgálati edénybe helyezésének ideje alatt állítsuk le a víz levegőztetését, és a behelyezést követő 24 órás időszakon keresztül hagyjuk így (lásd a 25. és a 32. bekezdést). Az alkalmazott vizsgálati tervnek (lásd a 19. és a 20. bekezdést) megfelelően az EC pont becsléséhez legalább 60, a NOEC meghatározásához 80 lárvát használjunk koncentrációnként.
A vizsgálathoz használt koncentrációk
27.
A vizsgálat végleges változatában használt koncentrációk meghatározásához hasznos lehet behatároló vizsgálatot végezni. E célra a vizsgált anyag koncentrációinak nagy osztásközű sorozatát használjuk. Annak érdekében, hogy az egy árvaszúnyoglárvára jutó felület megfeleljen a vizsgálat végleges változatában alkalmazandó lárvasűrűségnek, a lárvákat annyi ideig tesszük ki a vizsgált anyag egyes koncentrációinak, amely lehetővé teszi a megfelelő vizsgálati koncentrációk becslését anélkül, hogy ismétlésekre lenne szükség.
28.
A vizsgálat végleges változatában használt koncentrációkat a behatároló vizsgálat eredménye alapján határozzuk meg. Legalább öt, a 18–20. bekezdésben leírt módszerrel kiválasztott koncentrációt kell használni.
Kontroll edények
29.
A vizsgálat során a megfelelő ismétlésszám (lásd a 19–20. bekezdést) biztosításához szükséges számú – a vizsgált anyaggal nem szennyezett üledéket tartalmazó – kontroll edényt kell alkalmazni. Ha a vizsgált anyag bevitele oldószer segítségével történt (lásd a 16. bekezdést), akkor az oldószer hatásainak az ellenőrzése céljára külön kontroll edények szükségesek.
Vizsgálati elrendezés
30.
Statikus elrendezést alkalmazunk. Kivételes esetekben – például ha a vízminőségi jellemzők nem felelnek meg a vizsgálathoz használt organizmusoknak, vagy befolyásolják a kémiai egyensúlyt (például túlságosan lecsökken az oldott oxigénszint, túlságosan megnő a kiválasztási termékek koncentrációja, vagy ásványi anyagok lúgozódnak ki az üledékből és hatást gyakorolnak a víz pH-jára és/vagy keménységére) – félstatikus vagy átfolyó rendszerű, a fedővíz szakaszos vagy folyamatos cseréjét lehetővé tévő vizsgálati elrendezések is alkalmazható. Mindazonáltal a fedővíz minőségének javítására szolgáló módszerek, így például a levegőztetés, általában elégségesek, és előnyben részesítendők.
Táplálék
31.
A lárvákat lehetőség szerint naponta vagy legalább hetente háromszor kell etetni. Az első 10 napban a fiatal lárvák számára megfelelőnek tűnik naponta lárvánként 0,25–0,5 mg (a C. yoshimatui esetében 0,35–0,5 mg) haleledelt adni (amely lehet vizes szuszpenzió vagy finomra őrölt eledel, például Tetra-Min vagy Tetra-Phyll; a részleteket lásd a 2. függelékben). Az idősebb lárváknak valamivel több táplálékra lehet szükségük: a vizsgálat hátralevő részében lárvánként naponta 0,5–1 mg mennyiségnek elegendőnek kell lennie. Gombaképződés vagy a lárvák pusztulása esetén a táplálékadagot valamennyi kísérleti és kontroll edényben csökkenteni kell. Ha a gombák szaporodása nem állítható meg, akkor a vizsgálatot meg kell ismételni. Erősen adszorbeálódó (példáull log Kow > 5) vagy az üledékbe kovalens kötéssel beépülő anyagok vizsgálata esetén az organizmusok túlélésének és természetes fejlődésének biztosításához szükséges mennyiségű táplálékot még a stabilizálódás időszaka előtt a mesterséges üledékbe keverhetjük. Erre a célra haleledel helyett növényi anyagot használjunk (például 0,5 % (száraz tömeg) finomra őrölt nagy csalán (Urtica dioica), fehér eperfa (Morus alba), fehér here (Trifolium repens), paraj (Spinacia oleracea) levelet vagy más növényi anyagot (Cerophyl vagy alfa-cellulóz) adhatunk az üledékhez).
Inkubációs körülmények
32.
A lárvák vizsgálati edényekbe történő behelyezését követően lehetőleg 24 órán keresztül finoman levegőztessük a fedővizet, és a vizsgálat egész időtartama alatt biztosítsunk gyenge levegőztetést (ügyelve arra, hogy az oldott oxigén koncentrációja ne süllyedjen a levegő telítettségi érték (ASV) 60 százaléka alá. A levegőt az üledékréteg fölött 2–3 cm-rel rögzített üveg Pasteur pipettán keresztül vezessük be (másodpercenként egy vagy néhány buborék). Illékony vegyi anyagok vizsgálata esetén megfontolandó, hogy az üledék-víz elrendezés levegőztetésétől eltekintsünk.
33.
A vizsgálatot 20 °C (± 2 °C) állandó hőmérséklet mellett hajtsuk végre. C. tentans használata esetén 23 °C, a C. yoshimatui esetében pedig 25 °C az ajánlott hőmérséklet (± 2 °C). 16 órás fényperiódust alkalmazzunk, 500–1 000 lux fényintenzitással.
Expozíciós időtartam
34.
A kitétel a lárvák szennyezett üledéket tartalmazó, illetve kontroll edényekbe történő behelyezésekor veszi kezdetét. A maximális expozíciós időtartam a C. riparius és a C. yoshimatsui esetében 28 nap, C. tentans használata esetén 65 nap. Ha az árvaszúnyogok előbb kikelnek, akkor a vizsgálatot legalább öt nappal azt követően lehet befejezni, hogy a kontroll edényekben az utolsó kifejlett példány megjelent.
Megfigyelések
Kikelés
35.
Meg kell határozni a fejlődési időt és a kikelt kifejlett hím és nőstény árvaszúnyogok összes számát. A hímek tollas csápjukról könnyen felismerhetők
36.
A kísérleti edényekben legalább hetente háromszor kell ellenőrizni a kontroll edényekben megfigyelhetőhöz képest rendellenesnek értékelhető viselkedést (például üledék elhagyása, szokatlan úszás). A kikelés várható időszaka alatt naponta meg kell számolni a kikelt árvaszúnyogokat. Naponta fel kell jegyezni a kikelt kifejlett egyedek nemét és számát. Az azonosítást követően az árvaszúnyogokat ki lehet engedni az edényekből. A vizsgálat befejezése előtt lerakott petecsomókat dokumentálni kell, és az új lárvák üledékbe kerülésének megelőzése érdekében el kell távolítani. Fel kell jegyezni továbbá a ki nem kelt bábok megfigyelhető számát. A kikelés méréséhez az 5. függelék nyújt útmutatást.
Fejlődés és túlélés
37.
Ha a lárvák 10 napos túlélési és fejlődési adatait is be kell mutatni, akkor már a vizsgálat kezdetétől fogva a későbbiekben használható kiegészítő kontroll edényeket kell alkalmazni. Az ezekből származó üledéket átszitáljuk egy 250 μm-es szitán, amelyen a lárvák fennmaradnak. Az elhullás kritériumai a mozdulatlanság, illetve a mechanikai ingerekre adott válasz hiánya. A hiányzó lárvákat is elhullottnak kell tekinteni (a vizsgálat elején elpusztult lárvákat a mikroorganizmusok már lebonthatták). Meghatározzuk a túlélő lárvák edényenkénti (elhullott lárvák maradványai nélküli) száraz tömegét, majd kiszámítjuk az egyedek egy edényre eső átlagos száraz tömegét. A túlélő lárvák fejlődési szakaszának a meghatározása is hasznos; ezt a fejszélesség mérése segítségével tehetjük meg.
Analitikai mérések
A vizsgált anyag koncentrációja
38.
A vizsgálat megkezdése (azaz a lárvák behelyezése) előtt kezelésenként legalább egy edényből vegyünk ömlesztett üledék mintát a vizsgált anyag koncentrációjának analitikai meghatározásához az üledékben. A fedővíz, a pórusvíz és az üledék legnagyobb és legkisebb koncentrációnál vett mintáit ajánlott legalább a vizsgálat kezdetén és végén analizálni (lásd a 24. bekezdést). A vizsgált anyag így meghatározott koncentrációja tájékoztatást nyújt a vizsgált anyag viselkedéséről/megoszlásáról a víz-üledék elrendezésben.
39.
Ha a vizsgálat közben is végzünk méréseket (például a 7. napon), és az analízishez nagy minták szükségesek, amelyek nem gyűjthetők a kísérleti edényekből anélkül, hogy a mintavétel a vizsgálati elrendezésre hatással lenne, az analitikai meghatározásokat ugyanolyan kezelésnek alávetett (a vizsgálathoz használt organizmusokat is beleértve), de a biológiai megfigyelések céljára nem használt, külön vizsgálati edényekből származó mintákon kell elvégezni
40.
A pórusvíz elkülönítésére ajánlott módszer például a 10 000 g intenzitással történő centrifugálás 4 °C-on 30 percig. Szűrést is lehet alkalmazni, amennyiben bizonyított, hogy szűrő nem adszorbeálja a vizsgált anyagot. Ha a minta mérete túl kicsi, akkor előfordulhat, hogy nem analizálható a koncentráció a pórusvízben.
Fizikai és kémiai paraméterek
41.
A kísérleti edények pH-ját és hőmérsékletét megfelelő módon kell mérni (lásd a 10. bekezdést). A vizsgálat kezdetén és végén a legnagyobb koncentrációnál meg kell mérni a víz keménységét és ammónia tartalmát a kontroll edényekben és egy kísérleti edényben.
ADATOK ÉS JEGYZŐKÖNYVVEZETÉS
Az eredmények kezelése
42.
E vizsgálat célja a vizsgált anyag kikelt kifejlett hím és nőstény árvaszúnyogok összes számára és fejlődési ütemére, illetve 10 napos vizsgálat esetében a lárvák túlélésére és súlyára gyakorolt hatásainak a meghatározása. Ha semmi nem utal a nemek statisztikailag eltérő érzékenységére, akkor a hímekre és a nőstényekre vonatkozó eredmények a statisztikai elemzés céljára összevonhatók. Az érzékenység nemek közötti különbségének statisztikai megítélésére például a χ2-r x 2 próba alkalmazható. Szükség esetén 10 nap elteltével meg kell határozni a lárvák túlélését és az egyedek egy edényre eső átlagos száraz tömegét.
43.
A száraz tömeg alapján meghatározott és kifejezett hatáskoncentrációkat lehetőleg a vizsgálat kezdetén mért üledékkoncentrációk alapján kell kiszámítani (lásd a 38. bekezdést).
44.
Az EC50 vagy bármely más ECx pontbecsléséhez az edényenkénti statisztikákat valódi ismétléseknek kell tekinteni. Bármely ECx konfidencia intervallumának a kiszámítása során vagy figyelembe kell venni az edények közötti eltéréseket, vagy ki kell mutatni, hogy az eltérés elhanyagolható mértékű. Ha a modell mérési pontokhoz illesztéséhez a legkisebb négyzetek módszerét használjuk, akkor a szóráshomogenitás javítása érdekében az edényenkénti statisztikákat transzformálni kell. Az ECx értékeket az eredeti válaszértékekre való visszatranszformálás után kell kiszámítani.
45.
Ha a statisztikai elemzés célja a NOEC/LOEC hipotézisvizsgálattal történő meghatározása, az edények közötti eltérések figyelembevételére például hierarchikus varianciaanalízist (nested ANOVA) kell végezni. Alternatívaként ennél robosztusabb próbák (21) is helyénvalók lehetnek olyan esetekben, amikor az ANOVA szokásos alapfeltevései nem teljesülnek.
Kikelési arány
46.
A kikelési arányok kvantális adatok, amelyek a Cochran-Armitage próbával elemezhetők a lefelé lépegető eljárást alkalmazva, amennyiben arra számítunk, hogy a dózis-válasz függvény monoton, és az adatok ennek az elvárásnak megfelelnek. Ha ez nem így van, akkor a Fisher-féle egzakt próbát vagy a Mantel-Haenszel próbát használhatjuk a p-értékek Bonferroni- vagy Holm-féle eljárással történő korrekciójával. Ha az ugyanazon koncentrációhoz tartozó ismétlések közötti eltérések bizonyítottan nagyobbak, mint amit a binomiális eloszlás indokolna (amelyet gyakran »extra-binomiális« variációnak neveznek), akkor egy robusztus Cochran-Armitage vagy Fisher-féle egzakt próbát kell alkalmazni, mint amilyet például a (21) javasol.
Meg kell határozni az egy edényre jutó kikelt árvaszúnyogok számát (ne), majd el kell osztani a behelyezett lárvák számával (na):
ahol:
ER
=
kikelési arány
ne
=
kikelt árvaszúnyogok egy edényre jutó száma
na
=
behelyezett lárvák egy edényre jutó száma
47.
Egy másik, legfőképp nagy minták és extra-binomiális variáció esetén alkalmazható lehetőség, hogy a kikelési arányt folyamatos változóként kezeljük, és amennyiben arra számítunk, hogy a dózis-válasz függvény monoton, és ez az elvárás összhangban áll a kapott ER adatokkal, a Williams próbához hasonló eljárást alkalmazunk. Ha a monotonitás nem áll fenn, a Dunnett próbát lehet alkalmazni. A nagy mintát itt úgy értelmezzük, hogy az egy ismétlésre (edényre) jutó kikelt és nem kikelt árvaszúnyogok száma egyaránt meghaladja az ötöt.
48.
Az ANOVA módszerek alkalmazásához az ER értékeket először négyzetgyök arkusz-szinusz vagy Freeman-Tukey transzformáció segítségével átalakítjuk, hogy a normálishoz közeli eloszlást kapjunk, és a szórásokat kiegyenlítsük. Abszolút gyakoriságok esetén a Cochran-Armitage, a Fisher-féle egzakt (Bonferroni) vagy a Mantel-Haenszel próbát használhatjuk. A négyzetgyök arkusz-szinusz transzformáció az ER négyzetgyökének az arkusz szinuszát (sin–1) adja.
49.
A kikelési arányok meghatározásához regressziós analízissel (vagy például probit (22), logit, Weibull, kereskedelmi forgalomban kapható megfelelő szoftverrel stb.) számítjuk ki az ECx értékeket. Ha a regressziós analízis alkalmatlannak bizonyul (például kettőnél kevesebb részleges válasz esetén), más nemparaméteres módszert, például mozgóátlag-módszert vagy egyszerű interpolációt használunk.
Fejlődési ütem
50.
Az átlagos fejlődési idő a lárvák kísérleti edényekbe történő behelyezésétől (a vizsgálat 0. napjától) az árvaszúnyogok kikeléséig tartó átlagos időtartamot jelenti. (A valódi fejlődési idő kiszámításához figyelembe kell venni a lárvák életkorát a behelyezés időpontjában). A fejlődési ütem a fejlődési idő reciproka (egysége: 1/nap), és a lárvafejlődés egy napra eső részét fejezi ki. Az ilyen jellegű üledék-toxicitási vizsgálatok értékeléséhez inkább a fejlődési ütemet használjuk, mivel kisebb a szórása, homogénebb és a normálishoz közelebb álló eloszlást mutat, mint a fejlődési idő. Ennélfogva a fejlődési ütem hatásosabb paraméteres vizsgálati eljárások alkalmazását teszi lehetővé, mint a fejlődési idő. A folyamatos változónak tekintett fejlődési ütemhez tartozó ECx értékek becslésére regressziós analízist használunk (például (23), (24)).
51.
A következő statisztikai próbákhoz feltételezzük, hogy az x. ellenőrzési napon megfigyelt számú árvaszúnyog az x. nap és az x–1. nap (l = az ellenőrzések közötti intervallum hossza, általában 1 nap) közötti időintervallum közepén kelt ki. Az egy edényre jutó átlagos fejlődési ütemet a következő képlet szerint számítjuk ki:
ahol:
:
egy edényre jutó átlagos fejlődési ütem
i
:
ellenőrzési intervallum indexe
m
:
ellenőrzési intervallumok maximális száma
:
az i ellenőrzési intervallumban kikelt árvaszúnyogok száma
ne
:
kikelt árvaszúnyogok száma összesen a kísérlet végén (= )
xi
:
az i ellenőrzési intervallumban kikelt árvaszúnyogok fejlődési üteme
ahol:
dayi
:
ellenőrzési nap (a behelyezés óta eltelt napok száma)
li
:
az i ellenőrzési intervallum hossza (napokban kifejezve, általában 1 nap)
Vizsgálati jegyzőkönyv
52.
A vizsgálati jegyzőkönyvnek legalább a következő információkat kell tartalmaznia:
Vizsgált anyag:
—
fizikai jelleg és adott esetben a fizikai és kémiai tulajdonságok (vízoldékonyság, páranyomás, talajra (vagy ha rendelkezésre áll, az üledékre) vonatkozó megoszlási hányados, stabilitás vízben, stb.),
—
kémiai azonosító adatok (közönséges név, kémiai név, szerkezeti képlet, CAS-szám, stb.,) beleértve a kémiai tisztaságot és a vizsgált anyag mennyiségi meghatározásának analitikai módszerét.
A vizsgálathoz felhasznált faj:
—
a vizsgálathoz felhasznált állatok: faj, tudományos elnevezés, az organizmusok származása és tenyésztési körülményei,
—
a petecsomók és a lárvák kezelésére vonatkozó információk,
—
a vizsgálathoz felhasznált állatok életkora az edényekbe történő behelyezésükkor.
Vizsgálati körülmények:
—
az alkalmazott üledék, azaz természetes vagy mesterséges üledék,
—
természetes üledék esetén az üledékminta gyűjtésének helye és a mintavételi hely leírása, beleértve lehetőség szerint a szennyezés történetét; jellemzők: pH, szerves széntartalom, C/N arány és szemcseszerkezet (ha indokolt),
—
a mesterséges üledék előállítása: összetevők és jellemzők (szerves széntartalom, pH, nedvességtartalom, stb. a vizsgálat kezdetén),
—
a vizsgálathoz használt víz előállítása (mesterségesen készített víz esetén) és jellemzői (oxigénkoncentráció, pH, vezetőképesség, keménység, stb. a vizsgálat kezdetén),
—
az üledék és a fedővíz mélysége,
—
a fedővíz és a pórusvíz mennyisége; a nedves üledék tömege pórusvízzel és pórusvíz nélkül,
—
vizsgálati edények (anyag és méret),
—
az üledékszennyezés módszere: alkalmazott vizsgálati koncentrációk, ismétlésszám és esetlegesen használt oldószer,
—
a szennyezett üledék-víz elrendezés stabilizálódása és egyensúlyi fázisa: időtartam és körülmények,
—
inkubációs körülmények: hőmérséklet, fényciklus és intenzitás, levegőztetés (gyakoriság és intenzitás),
—
a táplálásra vonatkozó információk, beleértve a táplálék típusát, elkészítését, mennyiségét és a táplálás rendjét.
Eredmények:
—
a névleges vizsgálati koncentrációk, a mért vizsgálati koncentrációk és a kísérleti edények vizsgált anyag koncentrációjának a meghatározására használt analízisek eredményei,
—
a víz minősége a vizsgálati edényekben, azaz pH, hőmérséklet, oldott oxigén, vízkeménység és ammóniatartalom,
—
az elpárolgott víz pótlása a vizsgálati edényekben, ha pótoljuk,
—
a kikelt hím és nőstény árvaszúnyogok egy edényre és napra eső száma,
—
ki nem kelt lárvák egy edényre jutó száma,
—
a lárvák egy edényre és – adott esetben – egy fejlődési szakaszra jutó átlagos száraz tömege,
—
ismétlésenkénti és vizsgálati koncentrációnkénti százalékos kikelés (hím és nőstény árvaszúnyogok együttesen),
—
kikelt kifejlett árvaszúnyogok ismétlésenkénti és kezelési arányonkénti átlagos fejlődési üteme (hím és nőstény árvaszúnyogok együttesen),
—
toxicitási végpontok – például ECx (és a hozzá tartozó konfidencia intervallum), NOEC és/vagy LOEC – becsült értékei, valamint a meghatározásukhoz használt statisztikai módszerek,
—
az eredmények szöveges elemzése, beleértve az e vizsgálati módszertől való eltérések vizsgálat kimenetelére gyakorolt hatását.
SZAKIRODALOM
(1)
BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H. Köpp. Berlin 1995.
(2)
Fleming R et al. (1994). Sediment Toxicity Tests for Poorly Water-Soluble Substances. Final Report to them European Commission. Report No: EC 3738. August 1994. WRc, UK.
(3)
SETAC (1993). Guidance Document on Sediment toxicity Tests and Bioassays for Freshwater and Marine Environments. From the WOSTA Workshop held in the Netherlands.
(4)
ASTM International/E1706-00 (2002). Test Method for Measuring the Toxicity of Sediment-Associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. pp 1125–1241. In ASTM International 2002 Annual Book of Standards. Volume 11.05. Biological Effects and Environmental Fate; Biotechnology; Pesticides. ASTM. International, West Conshohocken, PA.
(5)
Environment Canada (1997). Test for Growth and Survival in Sediment using Larvae of Freshwater Midges (Chironomus tentans or Chironomus riparius). Biological Test Method. Report SPE 1/RM/32. December 1997.
(6)
US-EPA (2000). Methods for Measuring the Toxicity and Bioaccumulation of Sediment-associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. Second edition. EPA 600/R-99/064. March 2000. Revision to the first edition dated June 1994.
Milani D, Day KE, McLeay DJ, and Kirby RS (1996). Recent intra- and inter-laboratory studies related to the development and standardisation of Environment Canada’s biological test methods for measuring sediment toxicity using freshwater amphipods (Hyalella azteca) and midge larvae (Chironomus riparius). Technical Report. Environment Canada. National Water Research Institute. Burlington, Ontario, Canada.
(10)
Sugaya Y (1997). Intra-specific variations of the susceptibility of insecticides in Chironomus yoshimatsui. Jp. J. Sanit. Zool. 48 (4): 345–350.
(11)
Kawai K (1986). Fundamental studies on Chironomid allergy. I. Kultúra methods of some Japanese Chironomids (Chironomidae, Diptera). Jp. J. Sanit. Zool. 37(1): 47–57.
(12)
OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. OECD Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 23.
(13)
Environment Canada (1995). Guidance Document on Measurement of Toxicity Test Precision Using Control Sediments Spiked with a Reference Toxicant. Report EPS 1/RM/30. September 1995.
(14)
E melléklet C.8. vizsgálati módszere: Toxicitás földigilisztákra.
(15)
Suedel BC and JH Rodgers (1994). Development of formulated reference sediments for freshwater and estuarine sediment testing. Environ. Toxicol. Chem. 13: 1163–1175.
(16)
Naylor C and C Rodrigues (1995). Development of a test method for Chironomus riparius using a formulated sediment. Chemosphere 31: 3291–3303.
(17)
Dunnett CW (1964). A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Amer. Statis. Assoc., 50: 1096–1121.
(18)
Dunnett CW (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics, 20: 482–491.
(19)
Williams DA (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics, 27: 103–117.
(20)
Williams DA (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics, 28: 510–531.
(21)
Rao JNK and Scott AJ (1992). A simple method for the analysis of clustered binary data. Biometrics 48: 577–585.
(22)
Christensen ER (1984). Dose-response functions in aquatic toxicity testing and the Weibull model. Water Research 18: 213–221.
(23)
Bruce and Versteeg (1992). A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry 11: 1485–1494.
(24)
Slob W (2002). Dose-response modelling of continuous endpoints. Toxicol. Sci. 66: 298–312.
1. függelék
FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK
E vizsgálati módszer alkalmazásában a következő fogalommeghatározások alkalmazandók:
Mesterséges üledék vagy formulázott, kevert vagy műüledék: a természetes üledék fizikai összetevőinek az imitálására használt anyagok keveréke.
Fedővíz: a vizsgálati edényben az üledék felé kerülő víz.
Pórusvíz vagy szemcseközi víz: az üledék és a talaj szemcséi közötti helyet kitöltő víz.
Szennyezett üledék: a vizsgált vegyi anyaggal szennyezett üledék.
Vizsgált vegyi anyag: Bármely, ennek a vizsgálati módszernek az alkalmazásával vizsgált anyag vagy keverék.
2. függelék
Ajánlások a Chironomus riparius tenyésztéséhez
1.
Az árvaszúnyoglárvákat kristályosító csészékben vagy nagyobb edényekben tenyésztjük. Az edény aljára szórjunk vékony réteg (kb. 5–10 mm) kvarchomokot. A szilikagél (például Merck, cikkszám: 8117) is megfelelő szubsztrátumnak bizonyult (ebből vékonyabb, pár milliméternyi réteg is elegendő). Ezt követően töltsünk néhány centiméternyi megfelelő vizet az edénybe. A vízszint fenntartása és a kiszáradás megelőzése érdekében szükség szerint pótoljuk az elpárolgott vizet. Cserélhetjük is a vizet, ha kell. Biztosítsunk gyenge levegőztetést. A lárvatenyésztő edényeket tartsuk egy megfelelő ketrecben, amelyből a kikelő kifejlett példányok nem tudnak kiszökni. A ketrecben legyen elég hely a kikelt kifejlett példányoknak a mozgásra, mert ellenkező esetben nem fognak párosodni (minimum kb. 30 × 30 × 30 cm).
2.
A ketreceket tartsuk szobahőmérsékleten vagy 20 ± 2 °C állandó hőmérsékletű helyiségben, 16 órán keresztül világosban (fényintenzitás kb. 1 000 lux) és 8 órán keresztül sötétben. Dokumentálták, hogy a 60 % RH alatti légnedvesség gátolhatja a szaporodást.
Hígítóvíz
3.
Bármilyen alkalmas természetes vagy művíz használható. Általában kútvizet, klórtalanított csapvizet vagy mesterséges közeget (például Elendt-féle M4 vagy M7 közeget, lásd lentebb) használunk. Használat előtt a vizet levegőztetni kell. Szükség esetén cserélhetjük a tenyésztéshez használt vizet. Ehhez a használt vizet öntsük le vagy szívjuk ki a tenyésztő edényekből ügyelve arra, hogy a lárvák által épített lakócsöveket el ne pusztítsuk.
A lárvák táplálása
4.
Az árvaszúnyoglárvákat pehely formájú haleledellel (Tetra Min®, Tetra Phyll® vagy hasonló, védett márkájú haltáppal) etessük, amelyből naponta körülbelül 250 mg-ot adjunk minden edényhez porrá őrölve szárazon vagy vizes szuszpenzióban, amelynek az elkészítéséhez 1,0 g pehely formájú haleledelt keverjünk el 20 ml hígítóvízben úgy, hogy homogén keveréket kapjunk. Ebből a készítményből naponta 5 ml-t adjunk minden edényhez (használat előtt felrázandó). Az idősebb lárvák kaphatnak ennél többet.
5.
A táplálék mennyiségét a vízminőséghez kell igazítani. Ha a tenyésztőközeg zavarossá válik, akkor csökkenteni kell a mennyiséget. Az adott táplálék mennyiségét szigorú ellenőrzés alatt kell tartani. Ha túl kevés a táplálék, akkor a lárvák a vízrétegbe vándorolnak, ha túl sok, akkor fokozódik a mikrobatevékenység és csökken az oxigénkoncentráció. Mindkét körülmény a fejlődési ütem lassulását okozhatja.
6.
Az újonnan létesített tenyésztő edényekhez zöldalga (például Scenedesmus subspicatus, Chlorella vulgaris) sejtek is adhatók.
A kikelt kifejlett példányok táplálása
7.
Egyes kísérletek szerint a kikelt kifejlett példányok számára egy telített cukoroldatba mártott vattakorong szolgálhat táplálékként.
Kikelés
8.
20 ± 2 °C hőmérsékleten a kifejlett példányok körülbelül 13–15 nap elteltével kezdenek megjelenni a lárvatenyésztő edényekben. A hímek tollas csápjuk alapján könnyen megkülönböztethetők.
Petecsomók
9.
Miután a kifejlett példányok megjelentek a tenyésztőketrecben, a lárvatenyésztő edényekben hetente háromszor ellenőrizni kell a lerakott zselatinszerű petecsomókat, amelyeket gondosan el kell távolítani, és át kell helyezni egy tenyésztővíz-mintát tartalmazó kisméretű edénybe. A petecsomókat új tenyészetek létrehozására (például 2–4 petecsomó/edény) vagy toxicitási vizsgálatok céljára használjuk fel.
10.
Az első fejlődési szakaszban lévő lárváknak 2–3 napon belül kell kikelniük.
Új tenyészetek létesítése
11.
A stabil tenyészetekből hetente vagy – a vizsgálati követelményektől függően – ritkábban friss lárvatenyészetek hozhatók létre, miközben a régebbi edényeket a kifejlett árvaszúnyogok megjelenését követően eltávolítjuk. Ezzel a rendszerrel minimális kezelést igénylő módon biztosítható a kifejlett példányok rendszeres utánpótlása.
A vizsgálathoz használt »M4« és »M7« oldatok előállítása
12.
Az »M4« közeg leírása Elendt (1990) munkájában megtalálható. Az »M7« közeg ugyanúgy készül, mint az »M4«, azzal a különbséggel, hogy az 1. táblázatban feltüntetett anyagok koncentrációja az »M7« esetében négyszer alacsonyabb, mint az »M4« készítésekor. Az »M7« közegről szóló publikáció előkészületben van (Elendt, személyes közlés). A vizsgálathoz használt oldatot azért nem Elendt és Bias (1990) szerint kell előállítani, mert a törzsoldatok elkészítéséhez megadott NaSiO3 5 H2O, NaNO3, KH2PO4 és K2HPO4 koncentrációk nem megfelelők.
Az »M7« közeg előállítása
13.
Az (I) törzsoldatok mindegyikét külön kell elkészíteni, majd az (I) törzsoldatokból egy (II) kombinált törzsoldatot készítünk (lásd az 1. táblázatot). Az »M7« közeg előállításához a (II) kombinált törzsoldat 50 ml-ét és az egyes makrotápanyagok törzsoldatainak a 2. táblázatban megadott mennyiségeit ionmentesített vízzel 1 literre hígítjuk. Vitamin-törzsoldatot készítünk, amelyhez három vitamint ionmentesített vízhez adunk a 3. táblázatban meghatározottak szerint, majd röviddel a felhasználás előtt az »M7« közeghez adunk 0,1 ml-t a kombinált vitamin törzsoldatból. (A vitamin-törzsoldatot kis aliquot részekben, fagyasztott állapotban kell tartani). A közeget levegőztetni és stabilizálni kell.
SZAKIRODALOM
BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H. Köpp. Berlin 1995.
Vitamin- törzsoldat M4 és M7 közeg előállításához használt mennyisége
(ml/l)
Végleges koncentráció a vizsgálathoz használt M4 és M7 oldatban
(mg/l)
Tiamin-hidroklorid
750
0,1
0,075
Cianokobalamin (B12)
10
0,1
0,0010
Biotin
7,5
0,1
0,00075
SZAKIRODALOM
Elendt, B.P. (1990). Selenium Deficiency in Crustacean. Protoplasma 154: 25–33.
Elendt, B.P. & W.-R. Bias (1990). Trace Nutrient Deficiency in Daphnia magna Kultúrad in Standard Medium for Toxicity Testing. Effects on the Optimization of Kultúra Conditions on LIFE History Parameters of D. magna. Water Research 24 (9): 1157–1167.
3. függelék
MESTERSÉGES ÜLEDÉK KÉSZÍTÉSE
Az üledék összetétele
A mesterséges üledék összetétele a következő:
Összetevő
Jellemzők
Üledék száraz
tömegének %-a
Tőzeg
Tőzegmoha, amelynek pH-ja a lehető legközelebb esik az 5,5-6,0 értékhez, és nem tartalmaz látható növénymaradványokat, finomra őrölve (részecskeméret ≤ 1 mm) és levegőn szárítva
4 - 5
Kvarchomok
Szemcseméret: a részecskék több mint 50 százaléka a 50–200 μm tartományban
75 - 76
Kaolinit agyag
Kaolinit tartalom ≥ 30 %
20
Szerves szén
Tőzeg és homok hozzáadásával beállítva
2 (± 0,5)
Kalcium-karbonát
Porított, vegytiszta CaCO3
0,05 - 0,1
Víz
Vezetőképesség ≤ 10 μS/cm
30 - 50
Elkészítés
A levegőn szárított tőzeget finom porrá őröljük. Nagyteljesítményű homogenizáló készülék segítségével ionmentesített vízzel szuszpenziót készítünk a szükséges mennyiségű tőzegporból. A szuszpenzió pH-ját CaCO3 hozzáadásával beállítjuk 5,5 ± 0,5 értékre. A pH és a mikrobiológiai összetétel stabilizálása végett 20 ± 2 °C hőmérsékleten lassú keveréssel legalább két napig kondicionáljuk a szuszpenziót. Az ezt követően ismét megmért pH-nak 6,0 ± 0,5 értéket kell mutatnia. Ezek után a szuszpenziót összekeverjük a többi összetevővel (homok és kaolinagyag), valamint az ionmentesített vízzel úgy, hogy az üledék száraz tömegének 30–50 százaléka közötti víztartalommal rendelkező, homogén üledéket kapjunk. A végtermékként kapott keverék pH-ját ismételten megmérjük, és szükség esetén CaCO3 hozzáadásával beállítjuk 6,5–7,5 értékre. Az üledékből vett minta alapján meghatározzuk a száraz tömeget és a szerves széntartalmat. Ezt követően az árvaszúnyogokkal végzett toxicitási vizsgálatban való felhasználás előtt ajánlott a mesterséges üledéket hét napig a vizsgálatban használni kívántakkal megegyező körülmények között kondicionálni.
Tárolás
A mesterséges üledék előállításához használt száraz összetevők száraz, hűvös helyen, szobahőmérsékleten tárolhatók. Az összeállított (nedves) üledék a vizsgálatban való felhasználás előtt nem tárolható. Az előállításának záró lépését képező 7 napos kondicionálási időszakot követően azonnal fel kell használni.
SZAKIRODALOM
E melléklet C.8. fejezete: Toxicitás földigilisztákra.
Meller M, Egeler P, Rombke J, Schallnass H, Nagel R, Streit B (1998). Short-term Toxicity of Lindane, Hexachlorobenzene and Copper Sulfate on Tubificid Sludgeworms (Oligochaeta) in Artificial MEDIA. Ecotox. and Environ. Safety 39: 10–20.
Összes szerves foszfort tartalmazó növényvédő szer
< 50 ng/l
Összes szerves klórt tartalmazó növényvédő szer plusz poliklórozott bifenilek
< 50 ng/l
Összes szerves klór
< 25 ng/l
5. függelék
Útmutató az árvaszúnyoglárvák kikelésének figyelemmel kíséréséhez
A vizsgálati edényekre csapdákat helyezünk a kikelt példányok számára. A csapdák a 20. naptól a vizsgálat végéig szükségesek. Ezek egy példáját mutatja be az alábbi ábra:
C.28. SZENNYEZETT VÍZZEL VÉGZETT ÜLEDÉK-VÍZ TOXICITÁSI VIZSGÁLAT ÁRVASZÚNYOGLÁRVÁKKAL
BEVEZETÉS
1.
Ez a vizsgálati módszer egyenértékű az OECD 219. vizsgálati iránymutatásában (2004) leírt módszerrel. E vizsgálati módszer célja a kétszárnyúak rendjébe tartozó édesvízi üledéklakó árvaszúnyoglárvák vegyi anyagoknak való tartós kitettsége hatásainak az értékelése. Főként a BBA mesterséges talajjal és vízoszlopban való expozíciós forgatókönyvvel végzett üledék-víz vizsgálati elrendezésre vonatkozó iránymutatásán alapul (1). Figyelembe veszi továbbá a Chironomus riparius és Chironomus tentans árvaszúnyog fajokkal végzett toxicitás vizsgálati protokollokat, amelyeket Európában és Észak-Amerikában (2)(3)(4)(5)(6)(7)(8) dolgoztak ki, és körvizsgálatnak vetettek alá (1)(6)(9). Más jól dokumentált árvaszúnyog fajok, például Chironomus yoshimatsui (10)(11) is használhatók.
2.
A vizsgálati módszer által alkalmazott expozíciós forgatókönyv a víz szennyezése. A megfelelő expozíciós forgatókönyv a vizsgálat tervezett felhasználásától függ. A vízoszlopban való expozíción alapuló forgatókönyv a vízoszlop szennyezését foglalja magában, amely a növényvédő szerek permetezéssel történő vízbe jutását hivatott szimulálni, és a pórusvízben mérhető kezdeti csúcskoncentrációkra terjed ki. A vizsgálat időtartamánál hosszabb ideig tartó felhalmozódással járó folyamatok kivételével más típusú expozíciók (többek között a vegyi anyagok kiömlése) esetén is hasznos.
3.
Az anyagok, amelyek üledéklakó organizmusokra gyakorolt hatását vizsgálni kell, általában hosszú ideig maradnak ebben a környezetben. Az üledéklakó organizmusok többféle módon lehetnek kitéve ezeknek az anyagoknak. Az egyes expozíciós útvonalak viszonylagos fontossága és a teljes toxikus hatás egyes expozíciós útvonalaknak tulajdonítható részének kialakulásához szükséges időtartam az érintett vegyi anyag fizikai és kémiai tulajdonságaitól függ. Az erősen adszorbeálódó (például log Kow > 5) vagy az üledékbe kovalens kötéssel beépülő anyagok esetében fontos expozíciós útvonal lehet a szennyezet táplálék megemésztése. Az erősen lipofil anyagok toxicitása alulbecsülésének elkerülése érdekében megfontolandó, hogy a táplálékot a vizsgált anyaggal való szennyezést megelőzően az üledékbe keverjük. Az itt bemutatott vizsgálati módszer a tartós kitettségre épül, amely azt a célt szolgálja, hogy valamennyi lehetséges expozíciós útvonal figyelembe vehető legyen. A vizsgálat időtartama a C. riparius és a C. yoshimatsui esetében 20–28 nap, a C. tentans esetében 28–65 nap. Ha egy meghatározott célra – például instabil vegyületek hatásainak a vizsgálatára – rövid távú adatok kellenek, a felesleges ismétlések tíz nap után eltávolíthatók.
4.
A mért végpontok a kikelt kifejlett példányok száma és a kikeléshez szükséges idő. Ha kiegészítő rövid távú adatokra van szükség, akkor a lárvák túlélésének és fejlődésének mérését csak a tíznapos időszak eltelte után ajánlott megkezdeni, megfelelő számú ismétlést alkalmazva.
5.
Mesterséges üledék használata ajánlott. A mesterséges üledék számos előnnyel rendelkezik a természetes üledékkel szemben:
—
a kísérlet változékonysága kisebb, mivel a mesterséges üledék egy reprodukálható »szabványosított közeget« biztosít, és nem kell szennyezésmentes, tiszta üledékforrást keresni,
—
a vizsgálatok bármikor elkezdhetők anélkül, hogy a vizsgálathoz használt üledék szezonális változékonyságát figyelembe kellene venni, és az üledéket nem kell előzetes kezelésnek alávetni a honos fauna eltávolítása végett; a mesterséges üledék alkalmazása a rutinvizsgálatokhoz szükséges mennyiségű üledék terepen történő gyűjtésével kapcsolatos költségeket is csökkenti,
—
a mesterséges üledék alkalmazása lehetővé teszi a különböző anyagok toxicitásának összehasonlítását és ennek megfelelő rangsorolását: a természetes és a mesterséges üledékkel végzett vizsgálatokból származó toxicitási adatok számos vegyi anyag esetében összehasonlíthatók voltak (2).
6.
A használt fogalmak meghatározását az 1. függelék tartalmazza.
A VIZSGÁLAT ELVE
7.
Első fejlődési szakaszban lévő árvaszúnyoglárvákat teszünk ki a vizsgált anyag különböző koncentrációinak üledék-víz elrendezésekben. A vizsgálat kezdetén első fejlődési szakaszban lévő lárvákat helyezünk az üledék-víz elrendezést tartalmazó vizsgálati edényekbe, majd ezt követően a vizsgált anyaggal szennyezzük a vizet. Az árvaszúnyoglárvák kikelésének és fejlődésének ütemét a vizsgálat végén mérjük. Szükség esetén 10 nap elteltével is mérhetjük a lárvák túlélését és súlyát (megfelelő számú ismétlést alkalmazva). A kapott adatokból regressziós modell segítségével megbecsüljük azt a koncentrációt, amely a kikelésnek vagy a lárvák túlélésének, illetve fejlődésének x %-os csökkenését okozná (például EC15, EC50, stb.), vagy statisztikai hipotézisvizsgálattal meghatározzuk a megfigyelhető hatást nem okozó koncentrációt, illetve a megfigyelhető hatást okozó legkisebb koncentrációt (NOEC/LOEC). Az utóbbi esetben a hatást okozó értékeket statisztikai vizsgálatok segítségével össze kell hasonlítani a kontroll értékekkel.
A VIZSGÁLT ANYAGRA VONATKOZÓ INFORMÁCIÓK
8.
Ismerni kell a vizsgált anyag vízoldékonyságát, páranyomását, mért vagy számított megoszlását az üledékben, valamint stabilitását vízben és az üledékben. Rendelkezni kell egy megbízható analitikai módszerrel a vizsgált anyag mennyiségi meghatározásához a fedővízben, a pórusvízben és az üledékben, amelynek pontossága és kimutatási határa ismert és dokumentált. Hasznos információ a vizsgált anyag szerkezeti képlete és kémiai tisztasága. Ugyancsak hasznos információ, hogy milyen kémiai folyamatokon megy keresztül a vizsgált anyag (például disszipáció, nem biológiai és biológiai lebomlás, stb.). A vizsgálat elvégzését megnehezítő fizikai és kémiai tulajdonságokkal rendelkező anyagok vizsgálatára vonatkozóan a szakirodalom (12) nyújt további tájékoztatást.
REFERENCIA-VEGYIANYAGOK
9.
A vizsgálati protokoll és a vizsgálati körülmények megbízhatóságának megerősítése céljából rendszeres időközönként érdemes referencia-vegyianyagokkal elvégezni a vizsgálatot. Körvizsgálatokban és validálási vizsgálatokban eredményesen használt mérgező referenciaanyagok például a következők: lindane, trifluralin, pentaklórfenol, kadmium-klorid és a kálium-klorid (1)(2)(5)(6)(13).
A VIZSGÁLAT ÉRVÉNYESSÉGE
10.
A következő feltételeknek kell teljesülniük ahhoz, hogy a vizsgálat érvényes legyen:
—
A lárvák kikelésének aránya a kontroll edényekben legalább 70 % a vizsgálat végén (1)(6).
—
A kontroll edényekben 12–23 nappal a behelyezést követően kell megjelenniük a kifejlett C. riparius és C. yoshimatsui példányoknak; a C. tentans esetében ehhez 20–65 nap szükséges.
—
A vizsgálat végén mindegyik edényben meg kell mérni a pH-t és az oldott oxigén koncentrációját. Az oxigénkoncentrációnak a levegő alkalmazott hőmérséklet melletti telítettségi értéke (ASV) legalább 60 %-ának kell lennie, a fedővíz pH-értékének pedig minden edényben a 6–9 tartományon belülre kell esnie.
—
a víz hőmérséklete legfeljebb ± 1,0 °C-kal változhat. A vízhőmérséklet szabályozásának egyik lehetséges módja, hogy a vizsgálatot állandó hőmérsékletű helyiségben végezzük, amely esetben a helyiség hőmérsékletét megfelelő időközönként ellenőrizni kell.
A MÓDSZER LEÍRÁSA
Vizsgálati edények
11.
A vizsgálatot 600 ml-es üvegedényekben végezzük, amelyek átmérője 8 cm. Amennyiben az üledék és a fedővíz megfelelő mélysége biztosított, ettől eltérő edények is alkalmazhatók. Lárvánként 2–3 cm2 nagyságú üledékfelületet kell biztosítani. Az üledékréteg és a fedővíz mélységének aránya 1:4 legyen. A vizsgálati edényeknek és a vizsgálati elrendezéssel érintkező egyéb készülékeknek teljes mértékben üvegből vagy más kémiailag semleges anyagból (például teflon) kell készülniük.
A fajok kiválasztása
12.
A vizsgálatot lehetőleg a Chironomus riparius fajjal végezzük. Chironomus tentans is alkalmazható, de nehezebben kezelhető, és hosszabb vizsgálati időszakot igényel. Chironomus yohimatsui szintén használható. A 2. függelékben részletezett tenyésztési módszerek a Chironomus riparius fajra vonatkoznak. A szakirodalomban más fajok – úgymint a Chironomus tentans (4) és a Chironomus yoshimatsui (11) – tenyésztési körülményeire vonatkozó tudnivalók is megtalálhatók. A vizsgálat megkezdése előtt ellenőrzésképpen fajmeghatározást kell végezni, de ha a példányok saját tenyészetből származnak, akkor ezt nem szükséges minden vizsgálat előtt megtenni.
Üledék
13.
Lehetőleg mesterséges üledék (más néven formulázott, kevert vagy műüledék) használata ajánlott. Ha azonban mégis természetes üledéket használunk, akkor azt jellemezni kell (legalább a pH-t és a szerves széntartalmat meg kell határozni, de más paraméterek, például a C/N arány és a szemcseszerkezet vizsgálata is ajánlott), és mentesnek kell lennie mindenféle szennyezéstől, valamint az árvaszúnyoggal versengő vagy az azt fogyasztó egyéb organizmusoktól. Az árvaszúnyoglárvákkal végzett toxicitási vizsgálatban való felhasználás előtt ajánlott továbbá a természetes üledéket az elkövetkező vizsgálat során uralkodókkal megegyező körülmények között hét napon keresztül kondicionálni. E vizsgálat során az alábbi, a C.8. vizsgálati módszerben (14) alkalmazott mesterséges talajon alapuló mesterséges üledék alkalmazása ajánlott (1)(15)(16):
a)
4–5 % (száraz tömeg) tőzeg, amelynek pH-ja a lehető legközelebb esik az 5,5–6,0 értékhez; fontos, hogy por alakú, finomra őrölt (részecskeméret ≤ 1 mm) és kizárólag levegőn szárított tőzeget használjunk.
75–76 % (száraz tömeg) kvarchomok (túlnyomó részben finom homok, amely részecskéinek több mint 50 %-a 50 és 200 μm közötti szemcsemérettel rendelkezik).
d)
Annyi ionmentesített víz, amely ahhoz szükséges, hogy végtermékként 30-50 % nedvességtartalmú keveréket kapjunk.
e)
A végtermékként kapott üledékkeverék pH-jának 7,0 ± 0,5 értékre történő beállításához szükséges mennyiségű vegytiszta minőségű kalcium-karbonát (CaCO3).
f)
A végtermékként kapott keveréknek 2 % (±0,5 %) szerves széntartalommal kell rendelkeznie, amelyet az a) és c) pont szerinti megfelelő mennyiségű tőzeg és homok hozzáadásával érünk el.
14.
A tőzegnek, a kaolinagyagnak és a homoknak ismert forrásból kell származnia. Ellenőrizni kell, hogy az üledék összetevőiben nem fordulnak elő kémiai szennyeződések (például nehézfémek, szerves klórvegyületek, szerves foszforvegyületek, stb.) A mesterséges üledék elkészítésének egy példáját a 3. függelék mutatja be. Száraz összetevők keverése is elfogadott, amennyiben bizonyítható, hogy a fedővíz hozzáadását követően az üledék nem esik szét összetevőire (például a vízben lebegő tőzegrészecskékre), és a tőzeget vagy az üledéket megfelelően kondicionáltuk.
Víz
15.
Az elfogadható hígítóvíz 2. és 4. függelékben felsorolt kémiai tulajdonságaival rendelkező bármely víz alkalmas a vizsgálathoz. Tenyésztővízként és kísérleti vízként bármely alkalmas víz, természetes víz (felszíni vagy talajvíz), mesterséges víz (lásd a 2. függeléket) vagy klórtalanított csapvíz elfogadható, amelyben az árvaszúnyoglárvák a tenyésztés és a vizsgálat időszaka alatt életben maradnak anélkül, hogy stressz jeleit mutatnák. A vizsgálat kezdetén a vizsgálathoz alkalmazott víz pH-értékének 6 és 9 között kell lennie, keménysége pedig nem haladhatja meg a 400 mg/l CaCO3 értéket. Ennél lágyabb vizet kell azonban alkalmazni akkor, ha gyanítható, hogy a keménységet okozó ionok és a vizsgált anyag között kölcsönhatás alakul ki (és ezért ebben az esetben az Elendt-féle M4 közeg nem alkalmazható). A vizsgálat teljes időtartama alatt ugyanazt a víztípust kell használni. A 4. függelékben felsorolt vízminőségi jellemzőket évente legalább kétszer kell mérni, illetve minden olyan alkalommal, amikor fennáll a gyanúja annak, hogy e jellemzők jelentős mértékben megváltoztak.
Törzsoldatok – szennyezett víz
16.
A vizsgálathoz használt koncentrációk kiszámítása a vízoszlopban, azaz az üledék feletti vízrétegben mérhető koncentrációk alapján történik. A vizsgálathoz használt, választott koncentrációjú oldatokat általában törzsoldat hígításával készítjük. A törzsoldatokat lehetőség szerint a vizsgált anyag vizsgálathoz használt közegben való feloldásával kell elkészíteni. Egyes esetekben oldószer vagy diszpergálószer használatára lehet szükség a megfelelő töménységű törzsoldat előállításához. Alkalmas oldószerek például a következők: aceton, etanol, metanol, etilénglikol-dimetiléter, dimetilformamid és trietilén-glikol. A felhasználható diszpergálószerek: Cremophor RH40, Tween 80, metilcellulóz (0,01 %-os) és HCO-40. Az oldódást segítő szer csak minimális (azaz ≤ 0,1 ml/l) koncentrációban lehet jelen a végtermékként kapott, vizsgálathoz használandó közegben, és minden kezeléshez ugyanazt a szert kell használni. Az oldódást segítő szer nem lehet jelentős hatással a túlélésre, és nem lehet látható hátrányos hatása az árvaszúnyoglárvákra a csak oldószerrel kezelt kontrollcsoporttal végzett vizsgálat által feltártak alapján.
A VIZSGÁLAT MEGTERVEZÉSE
17.
A vizsgálat megtervezése a vizsgálat során alkalmazott koncentrációk számának és osztásközének, az egyes koncentrációkkal használt edények számának, valamint a lárvák edényenkénti számának a megválasztását jelenti. Ideális esetben a vizsgálatot az alábbiakra tekintettel kell megtervezni. Az EC pontnak és a NOEC becslésének, valamint a határérték-vizsgálatnak a megtervezését ismertetjük. A hipotézisvizsgálat elsődleges módszere a regressziós analízis.
A regressziós analízis megtervezése
18.
A vizsgálat során alkalmazott koncentrációknak le kell fedniük a hatáskoncentrációt (például EC15, EC50) és azt a koncentrációtartományt, amelyen belül a vizsgált anyag érdeklődésre számot tartó hatással rendelkezik. A hatáskoncentráció becsléseknek (ECx) a pontossága és különösképpen az érvényessége általában jobb, ha a hatáskoncentráció a vizsgált koncentrációtartományon belül helyezkedik el. A lehető legkisebb pozitív koncentrációnál jóval alacsonyabb és a legnagyobb koncentrációnál jóval magasabb értékek extrapolálását kerülni kell. Az alkalmazandó koncentrációtartomány kiválasztásához hasznos lehet előzetes behatároló vizsgálatot végezni (lásd 27. bekezdés).
19.
Az ECx becsléséhez legalább öt koncentrációt kell vizsgálni, és mindegyik koncentráció esetében három ismétlést kell alkalmazni. A jó modellbecslés lehetővé tétele érdekében minden esetben tanácsos elegendő vizsgálati koncentrációt használni. A rákövetkező koncentráció legfeljebb kétszerese legyen az előzőnek (kivételt képeznek azok az esetek, amikor a dózis-válasz görbe lapos). Az eltérő választ kiváltó vizsgálati koncentrációk számának emelkedése esetén az egyes kezeléseknél alkalmazott ismétlésszám csökkenthető. Az ismétlésszám növelése vagy a vizsgálat során alkalmazott koncentráció intervallum szűkítése általában a konfidencia intervallum csökkenéséhez vezet. A lárvák tíznapos túlélési arányának és fejlődési sebességének a becslése esetén további ismétlések szükségesek.
A NOEC/LOEC becslésének megtervezése
20.
A LOEC/NOEC becsléséhez öt koncentrációt kell vizsgálni legalább négy ismétlést alkalmazva úgy, hogy a rákövetkező koncentráció legfeljebb kétszerese legyen az előzőnek. Az ismétlések számának elegendőnek kell lennie ahhoz, hogy a kontrollhoz viszonyított 20 %-os különbséget 5 %-os szignifikancia-szint (p = 0,05) mellett megfelelő valószínűséggel kimutasson egy statisztikai próba. A fejlődési ütem esetében általában varianciaanalízist (ANOVA), például Dunnett vagy Williams próbát (17)(18)(19)(20) lehet alkalmazni. Ha a kikelési arányt vizsgáljuk, akkor a Cochran-Armitage, a Fisher-féle egzakt (Bonferroni-féle korrekcióval) vagy a Mantel-Haenszel próbát használhatjuk.
Határérték-vizsgálat
21.
Határérték-vizsgálatot akkor lehet végezni (egy vizsgálati és egy kontroll koncentrációval), ha az előzetes behatároló vizsgálat során nem voltak megfigyelhető hatások. A határérték-vizsgálat célja annak jelzése, hogy a vizsgált anyagra vonatkozó toxikus érték nagyobb, mint a vizsgált koncentrációs határérték. Ennél a vizsgálati módszernél nem lehet meghatározni az ajánlott koncentrációt; ez a szabályozók megítélésétől függ. Általában mind a kezelés, mind a kontroll esetében legalább hat ismétlés szükséges. Bizonyítni kell, hogy a kontrollhoz viszonyított 20 %-os különbséget 5 %-os szignifikancia-szint (p = 0,05) mellett megfelelő valószínűséggel képes kimutatni egy statisztikai próba. Metrikus válasz (fejlődési ütem és súly) esetén alkalmas statisztikai módszer a t-próba, ha az adatok az alkalmazási feltéteknek (normalitás, szóráshomogenitás) megfelelnek. Ha a feltételek nem teljesülnek, akkor a nem egyenlő szórásnégyzeteket feltételező t-próba vagy egy nemparaméteres próba, például a Wilcoxon-Mann-Whithey próba alkalmazható.
ELJÁRÁS
Expozíciós körülmények
A szennyezett víz – üledék elrendezés előállítása
22.
A vizsgálati edényekbe megfelelő mennyiségű mesterséges üledéket (lásd a 3. függelék 13–14. bekezdéseit) helyezünk úgy, hogy az üledékréteg legalább 1,5 cm legyen. 6 cm mélységig vizet adunk hozzá (lásd a 15. bekezdést). Az üledékréteg és a víz mélységének az aránya legfeljebb 1:4 lehet, és az üledékréteg mélysége nem haladhatja meg a 3 cm-t. A vizsgálathoz használt organizmusok behelyezése előtt hét napon keresztül finoman levegőztessük az üledék-víz elrendezés (lásd a 14. bekezdést és a 3. függeléket). Annak elkerülése érdekében, hogy a vizsgálathoz használt víz hozzáadása során az üledék összetevőire essen szét, és a finom anyag a vízrétegben felkavarodjon, az üledéket letakarhatjuk egy műanyag lappal, miközben a vizet ráöntjük, amelyet közvetlenül a felöntést követően eltávolítunk. Erre a célra más eszközök is alkalmasak lehetnek.
23.
A vizsgálati edényeket le kell fedni (például üveglappal). Az eredeti vízszint fenntartása érdekében a vizsgálat során pótoljuk az elpárolgott vizet, ha szükséges. A sófelhalmozódás elkerülése végett desztillált vagy ionmentesített vizet használjunk.
A vizsgálathoz használt organizmusok hozzáadása
24.
A vizsgálathoz használt organizmusok vizsgálati edényekbe történő behelyezése előtt négy-öt nappal helyezzük a tenyészetből gyűjtött petecsomókat tenyésztőközeget tartalmazó kisméretű edényekbe. A törzstenyészetből vett vagy frissen készített tenyésztőközeg egyaránt használható. Ez utóbbi használata esetén adjunk a tenyésztőközeghez kis mennyiségű táplálékot, például zöldalgát és/vagy finomra őrölt pehely formájú haleledelből készített szuszpenzió szüredékéből néhány cseppet (lásd a 2. függeléket). Csak frissen lerakott petecsomókat szabad használni. A lárvák általában néhány nappal a peterakást követően kezdenek kikelni (a Chironomus riparius esetében ez 20 °C-on 2–3 nap, a Chironomus tentans és a Chironomus yoshimatui esetében pedig 23 °C-on, illetve 25 °C-on 1–4 nap). A lárvák fejlődése négy, egyenként 4–8 napig tartó szakaszra osztható. A vizsgálathoz az első fejlődési szakaszban lévő lárvákat kell gyűjteni (2–3 vagy 1–4 nappal a kikelést követően). Az árvaszúnyoglárvák fejlődési szakaszát a fejszélesség alapján ellenőrizhetjük (6).
25.
Mindegyik szennyezett üledéket és vizet tartalmazó vizsgálati edénybe húsz darab, tetszőlegesen kiválasztott lárvát helyezünk egy tompa végű pipetta segítségével. A lárvák vizsgálati edénybe helyezésének ideje alatt állítsuk le a víz levegőztetését, és a behelyezést követő 24 órás időszakon keresztül hagyjuk így (lásd a 24. és a 32. bekezdést). Az alkalmazott vizsgálati tervnek (lásd a 19. és a 20. bekezdést) megfelelően az EC pont becsléséhez legalább 60, a NOEC meghatározásához 80 lárvát használjunk koncentrációnként.
26.
Huszonnégy órával a lárvák behelyezését követően a vizsgált anyaggal szennyezzük a fedővíz-réteget, és ismét gyenge levegőztetést biztosítunk. Pipettával kis mennyiséget juttatunk a vízfelszín alá a vizsgált anyag oldatából. Ezt követően a fedővizet gondosan megkeverjük, ügyelve arra, hogy az üledék ne kavarodjon fel.
A vizsgálathoz használt koncentrációk
27.
A vizsgálat végleges változatában használt koncentrációk meghatározásához hasznos lehet behatároló vizsgálatot végezni. E célra a vizsgált anyag koncentrációinak nagy osztásközű sorozatát használjuk. Annak érdekében, hogy az egy árvaszúnyoglárvára jutó felület megfeleljen a vizsgálat végleges változatában alkalmazandó lárvasűrűségnek, a lárvákat annyi ideig tesszük ki a vizsgált anyag egyes koncentrációinak, amely lehetővé teszi a megfelelő vizsgálati koncentrációk becslését anélkül, hogy ismétlésekre lenne szükség.
28.
A vizsgálat végleges változatában használt koncentrációkat a behatároló vizsgálat eredménye alapján határozzuk meg. Legalább öt, a 18–20. bekezdésben leírt módszerrel kiválasztott koncentrációt kell használni.
Kontroll edények
29.
A vizsgálat során a megfelelő ismétlésszám (lásd a 19–20. bekezdést) biztosításához szükséges számú – csak üledéket, a vizsgált anyagot viszont nem tartalmazó – kontroll edényt kell alkalmazni. Ha a vizsgált anyag bevitele oldószer segítségével történt (lásd a 16. bekezdést), akkor az oldószer hatásainak az ellenőrzése céljára külön kontroll edények szükségesek.
Vizsgálati elrendezés
30.
Statikus elrendezést alkalmazunk. Kivételes esetekben – például ha a vízminőségi jellemzők nem felelnek meg a vizsgálathoz használt organizmusoknak, vagy befolyásolják a kémiai egyensúlyt (például túlságosan lecsökken az oldott oxigénszint, túlságosan megnő a kiválasztási termékek koncentrációja, vagy ásványi anyagok lúgozódnak ki az üledékből és hatást gyakorolnak a víz pH-jára és/vagy keménységére) – félstatikus vagy átfolyó rendszerű, a fedővíz szakaszos vagy folyamatos cseréjét lehetővé tévő vizsgálati elrendezések is alkalmazható. Mindazonáltal a fedővíz minőségének javítására szolgáló módszerek, így például a levegőztetés, általában elégségesek, és előnyben részesítendők.
Táplálék
31.
A lárvákat lehetőség szerint naponta vagy legalább hetente háromszor kell etetni. Az első 10 napban a fiatal lárvák számára megfelelőnek tűnik naponta lárvánként 0,25–0,5 mg (a C. yoshimatui esetében 0,35–0,5 mg) haleledelt adni (amely lehet vizes szuszpenzió vagy finomra őrölt eledel, például Tetra-Min vagy Tetra-Phyll; a részleteket lásd a 2. függelékben). Az idősebb lárváknak valamivel több táplálékra lehet szükségük: a vizsgálat hátralevő részében lárvánként naponta 0,5–1 mg mennyiségnek elegendőnek kell lennie. Gombaképződés vagy a lárvák pusztulása esetén a táplálékadagot valamennyi kísérleti és kontroll edényben csökkenteni kell. Ha a gombák szaporodása nem állítható meg, akkor a vizsgálatot meg kell ismételni. Erősen adszorbeálódó (például log Kow > 5) vagy az üledékbe kovalens kötéssel beépülő anyagok vizsgálata esetén az organizmusok túlélésének és természetes fejlődésének biztosításához szükséges mennyiségű táplálékot még a stabilizálódás időszaka előtt a mesterséges üledékbe keverhetjük. Erre a célra haleledel helyett növényi anyagot használjunk (például 0,5 % finomra őrölt nagy csalán (Urtica dioica), fehér eperfa (Morus alba), fehér here (Trifolium repens), paraj (Spinacia oleracea) levelet vagy más növényi anyagot (Cerophyl vagy alfa-cellulóz) adhatunk az üledékhez).
Inkubációs körülmények
32.
A lárvák vizsgálati edényekbe történő behelyezését követően lehetőleg 24 órán keresztül finoman levegőztessük a fedővizet, és a vizsgálat egész időtartama alatt biztosítsunk gyenge levegőztetést (ügyelve arra, hogy az oldott oxigén koncentrációja ne süllyedjen a levegő telítettségi érték (ASV) 60 %-a alá. A levegőt az üledékréteg fölött 2–3 cm-rel rögzített üveg Pasteur pipettán keresztül vezessük be (másodpercenként egy vagy néhány buborék). Illékony vegyi anyagok vizsgálata esetén megfontolandó, hogy az üledék-víz elrendezés levegőztetésétől eltekintsünk.
33.
A vizsgálatot 20 °C (± 2 °C) állandó hőmérséklet mellett hajtsuk végre. C. tentans használata esetén 23 °C, a C. yoshimatui esetében pedig 25 °C az ajánlott hőmérséklet (± 2 °C). 16 órás fényperiódust alkalmazzunk, 500–1 000 lux fényintenzitással.
Expozíciós időtartam
34.
A kitétel a lárvák szennyezett vizet tartalmazó, illetve kontroll edényekbe történő behelyezésekor veszi kezdetét. A maximális expozíciós időtartam a C. riparius és a C. yoshimatsui esetében 28 nap, C. tentans használata esetén 65 nap. Ha az árvaszúnyogok előbb kikelnek, akkor a vizsgálatot legalább öt nappal azt követően lehet befejezni, hogy a kontroll edényekben az utolsó kifejlett példány megjelent.
MEGFIGYELÉSEK
Kikelés
35.
Meg kell határozni a fejlődési időt és a kikelt kifejlett hím és nőstény árvaszúnyogok összes számát. A hímek tollas csápjukról könnyen felismerhetők
36.
A kísérleti edényekben legalább hetente háromszor kell ellenőrizni a kontroll edényekben megfigyelhetőhöz képest rendellenesnek értékelhető viselkedést (például üledék elhagyása, szokatlan úszás). A kikelés várható időszaka alatt naponta meg kell számolni a kikelt árvaszúnyogokat. Naponta fel kell jegyezni a kikelt kifejlett egyedek nemét és számát. Az azonosítást követően az árvaszúnyogokat ki lehet engedni az edényekből. A vizsgálat befejezése előtt lerakott petecsomókat dokumentálni kell, és az új lárvák üledékbe kerülésének megelőzése érdekében el kell távolítani. Fel kell jegyezni továbbá a ki nem kelt bábok megfigyelhető számát. A kikelés méréséhez az 5. függelék nyújt útmutatást.
Fejlődés és túlélés
37.
Ha a lárvák 10 napos túlélési és fejlődési adatait is be kell mutatni, akkor már a vizsgálat kezdetétől fogva a későbbiekben használható kiegészítő kontroll edényeket kell alkalmazni. Az ezekből származó üledéket átszitáljuk egy 250 μm-es szitán, amelyen a lárvák fennmaradnak. Az elhullás kritériumai a mozdulatlanság, illetve a mechanikai ingerekre adott válasz hiánya. A hiányzó lárvákat is elhullottnak kell tekinteni (a vizsgálat elején elpusztult lárvákat a mikroorganizmusok már lebonthatták). Meghatározzuk a túlélő lárvák edényenkénti (elhullott lárvák maradványai nélküli) száraz tömegét, majd kiszámítjuk az egyedek egy edényre eső átlagos száraz tömegét. A túlélő lárvák fejlődési szakaszának a meghatározása is hasznos; ezt a fejszélesség mérése segítségével tehetjük meg.
Analitikai mérések
A vizsgált anyag koncentrációja
38.
A fedővíz, a pórusvíz és az üledék legnagyobb és legkisebb koncentrációnál vett mintáit legalább a vizsgálat kezdetén (lehetőleg egy órával a vizsgált anyaggal történő szennyezést követően) és végén analizálni kell. A vizsgált anyag így meghatározott koncentrációja tájékoztatást nyújt a vizsgált anyag viselkedéséről/megoszlásáról a víz-üledék elrendezésben. Mivel a vizsgálat kezdetén történő mintavétel az üledékből hatással lehet a vizsgálati elrendezésre (például a vizsgálathoz használt lárvák eltávolítása révén), külön kísérleti edényeket kell használni az analitikai meghatározások vizsgálat kezdetén és adott esetben a vizsgálat során (lásd a 39. bekezdést) történő elvégzéséhez. Az üledékre vonatkozó mérések nem feltétlenül szükségesek abban az esetben, ha a vizsgált anyag megoszlása a víz és az üledék között egyértelműen meghatározható egy – például az üledék vízhez viszonyított aránya, a szennyezés típusa, az üledék szerves széntartalma tekintetében – összehasonlítható körülmények között végzett víz/üledék vizsgálat segítségével.
39.
Ha a vizsgálat közben is végzünk méréseket (például a 7. napon), és az analízishez nagy minták szükségesek, amelyek nem gyűjthetők a kísérleti edényekből anélkül, hogy a mintavétel a vizsgálati elrendezésre hatással lenne, az analitikai meghatározásokat ugyanolyan kezelésnek alávetett (a vizsgálathoz használt organizmusokat is beleértve), de a biológiai megfigyelések céljára nem használt, külön vizsgálati edényekből származó mintákon kell elvégezni
40.
A pórusvíz elkülönítésére ajánlott módszer például a 10 000 g intenzitással történő centrifugálás 4 °C-on 30 percig. Szűrést is lehet alkalmazni, amennyiben bizonyított, hogy szűrő nem adszorbeálja a vizsgált anyagot. Ha a minta mérete túl kicsi, akkor előfordulhat, hogy nem analizálható a koncentráció a pórusvízben.
Fizikai és kémiai paraméterek
41.
A vizsgálathoz használt víz pH-ját és oldott oxigén koncentrációját, valamint a kísérleti edények hőmérsékletét megfelelő módon kell mérni (lásd a 10. bekezdést). A vizsgálat kezdetén és végén a legnagyobb koncentrációnál meg kell mérni a víz keménységét és ammónia tartalmát a kontroll edényekben és egy kísérleti edényben.
ADATOK ÉS JEGYZŐKÖNYVVEZETÉS
Az eredmények kezelése
42.
E vizsgálat célja a vizsgált anyag kikelt kifejlett hím és nőstény árvaszúnyogok összes számára és fejlődési ütemére, illetve 10 napos vizsgálat esetében a lárvák túlélésére és súlyára gyakorolt hatásainak a meghatározása. Ha semmi nem utal a nemek statisztikailag eltérő érzékenységére, akkor a hímekre és a nőstényekre vonatkozó eredmények a statisztikai elemzés céljára összevonhatók. Az érzékenység nemek közötti különbségének statisztikai megítélésére például a χ2-r x 2 próba alkalmazható. Szükség esetén 10 nap elteltével meg kell határozni a lárvák túlélését és az egyedek egy edényre eső átlagos száraz tömegét.
43.
A fedővízben mért koncentrációkként kifejezett hatáskoncentrációkat lehetőleg a vizsgálat kezdetén mért koncentrációk alapján kell kiszámítani (lásd a 38. bekezdést).
44.
Az EC50 vagy bármely más ECx pontbecsléséhez az edényenkénti statisztikákat valódi ismétléseknek kell tekinteni. Bármely ECx konfidencia intervallumának a kiszámítása során vagy figyelembe kell venni az edények közötti eltéréseket, vagy ki kell mutatni, hogy az eltérés elhanyagolható mértékű. Ha a modell mérési pontokhoz illesztéséhez a legkisebb négyzetek módszerét használjuk, akkor a szóráshomogenitás javítása érdekében az edényenkénti statisztikákat transzformálni kell. Az ECx értékeket az eredeti válaszértékekre való visszatranszformálás után kell kiszámítani.
45.
Ha a statisztikai elemzés célja a NOEC/LOEC hipotézisvizsgálattal történő meghatározása, az edények közötti eltérések figyelembevételére például hierarchikus varianciaanalízist (nested ANOVA) kell végezni. Alternatívaként ennél robosztusabb próbák (21) is helyénvalók lehetnek olyan esetekben, amikor az ANOVA szokásos alapfeltevései nem teljesülnek.
Kikelési arány
46.
A kikelési arányok kvantális adatok, amelyek a Cochran-Armitage próbával elemezhetők a lefelé lépegető eljárást alkalmazva, amennyiben arra számítunk, hogy a dózis-válasz függvény monoton, és az adatok ennek az elvárásnak megfelelnek. Ha ez nem így van, akkor a Fisher-féle egzakt próbát vagy a Mantel-Haenszel próbát használhatjuk a p-értékek Bonferroni- vagy Holm-féle eljárással történő korrekciójával. Ha az ugyanazon koncentrációhoz tartozó ismétlések közötti eltérések bizonyítottan nagyobbak, mint amit a binomiális eloszlás indokolna (amelyet gyakran »extra-binomiális« variációnak neveznek), akkor egy robusztus Cochran-Armitage vagy Fisher-féle egzakt próbát kell alkalmazni, mint amilyet például a (21) javasol.
47.
Meg kell határozni az egy edényre jutó kikelt árvaszúnyogok számát (ne), majd el kell osztani a behelyezett lárvák számával (na):
ahol:
ER
=
kikelési arány
ne
=
kikelt árvaszúnyogok egy edényre jutó száma
na
=
behelyezett lárvák egy edényre jutó száma
48.
Egy másik, legfőképp nagy minták és extra-binomiális variáció esetén alkalmazható lehetőség, hogy a kikelési arányt folyamatos változóként kezeljük, és amennyiben arra számítunk, hogy a dózis-válasz függvény monoton, és ez az elvárás összhangban áll a kapott ER adatokkal, a Williams próbához hasonló eljárást alkalmazunk. Ha a monotonitás nem áll fenn, a Dunnett próbát lehet alkalmazni. A nagy mintát itt úgy értelmezzük, hogy az egy ismétlésre (edényre) jutó kikelt és nem kikelt árvaszúnyogok száma egyaránt meghaladja az ötöt.
49.
Az ANOVA módszerek alkalmazásához az ER értékeket először négyzetgyök arkusz-szinusz vagy Freeman-Tukey transzformáció segítségével átalakítjuk, hogy a normálishoz közeli eloszlást kapjunk, és a szórásokat kiegyenlítsük. Abszolút gyakoriságok esetén a Cochran-Armitage, a Fisher-féle egzakt (Bonferroni) vagy a Mantel-Haenszel próbát használhatjuk. A négyzetgyök arkusz-szinusz transzformáció az ER négyzetgyökének az arkusz szinuszát (sin–1) adja.
50.
A kikelési arányok meghatározásához regressziós analízissel (vagy például probit (22), logit, Weibull, kereskedelmi forgalomban kapható megfelelő szoftverrel) számítjuk ki az ECx értékeket. Ha a regressziós analízis alkalmatlannak bizonyul (például kettőnél kevesebb részleges válasz esetén), más nemparaméteres módszert, például mozgóátlag-módszert vagy egyszerű interpolációt használunk.
Fejlődési ütem
51.
Az átlagos fejlődési idő a lárvák kísérleti edényekbe történő behelyezésétől (a vizsgálat 0. napjától) az árvaszúnyogok kikeléséig tartó átlagos időtartamot jelenti. (A valódi fejlődési idő kiszámításához figyelembe kell venni a lárvák életkorát a behelyezés időpontjában). A fejlődési ütem a fejlődési idő reciproka (egysége: 1/nap), és a lárvafejlődés egy napra eső részét fejezi ki. Az ilyen jellegű üledék-toxicitási vizsgálatok értékeléséhez inkább a fejlődési ütemet használjuk, mivel kisebb a szórása, homogénebb és a normálishoz közelebb álló eloszlást mutat, mint a fejlődési idő. Ennélfogva a fejlődési ütem hatásosabb paraméteres vizsgálati eljárások alkalmazását teszi lehetővé, mint a fejlődési idő. A folyamatos változónak tekintett fejlődési ütemhez tartozó ECx értékek becslésére regressziós analízist használunk (például (23)(24)).
52.
A következő statisztikai próbákhoz feltételezzük, hogy az x. ellenőrzési napon megfigyelt számú árvaszúnyog az x. nap és az x–1. nap (l = az ellenőrzések közötti intervallum hossza, általában 1 nap) közötti időintervallum közepén kelt ki. Az egy edényre jutó átlagos fejlődési ütemet (x) a következő képlet szerint számítjuk ki:
ahol:
:
egy edényre jutó átlagos fejlődési ütem
i
:
ellenőrzési intervallum indexe
m
:
ellenőrzési intervallumok maximális száma
:
az i ellenőrzési intervallumban kikelt árvaszúnyogok száma
ne
:
kikelt árvaszúnyogok száma összesen a kísérlet végén (= )
xi
:
az i ellenőrzési intervallumban kikelt árvaszúnyogok fejlődési üteme
ahol:
dayi
:
ellenőrzési nap (a behelyezés óta eltelt napok száma)
li
:
az i ellenőrzési intervallum hossza (napokban kifejezve, általában 1 nap)
Vizsgálati jegyzőkönyv
53.
A vizsgálati jegyzőkönyvnek legalább a következő információkat kell tartalmaznia:
Vizsgált anyag:
—
fizikai jelleg és adott esetben a fizikai és kémiai tulajdonságok (vízoldékonyság, páranyomás, talajra (vagy ha rendelkezésre áll, az üledékre) vonatkozó megoszlási hányados, stabilitás vízben, stb.),
—
kémiai azonosító adatok (közönséges név, kémiai név, szerkezeti képlet, CAS-szám, stb.,) beleértve a kémiai tisztaságot és a vizsgált anyag mennyiségi meghatározásának analitikai módszerét.
A vizsgálathoz felhasznált faj:
—
a vizsgálathoz felhasznált állatok: faj, tudományos elnevezés, az organizmusok származása és tenyésztési körülményei,
—
a petecsomók és a lárvák kezelésére vonatkozó információk,
—
a vizsgálathoz felhasznált állatok életkora az edényekbe történő behelyezésükkor.
Vizsgálati körülmények:
—
az alkalmazott üledék, azaz természetes vagy mesterséges üledék,
—
természetes üledék esetén az üledékminta gyűjtésének helye és a mintavételi hely leírása, beleértve lehetőség szerint a szennyezés történetét; jellemzők: pH, szerves széntartalom, C/N arány és szemcseszerkezet (ha indokolt),
—
a mesterséges üledék előállítása: összetevők és jellemzők (szerves széntartalom, pH, nedvességtartalom, stb. a vizsgálat kezdetén),
—
a vizsgálathoz használt víz előállítása (mesterségesen készített víz esetén) és jellemzői (oxigénkoncentráció, pH, vezetőképesség, keménység, stb. a vizsgálat kezdetén),
—
az üledék és a fedővíz mélysége,
—
a fedővíz és a pórusvíz mennyisége; a nedves üledék tömege pórusvízzel és pórusvíz nélkül,
—
vizsgálati edények (anyag és méret),
—
a törzsoldatok előállításának módszere és a vizsgálathoz használt koncentrációk,
—
a vizsgált anyag bevitele: alkalmazott vizsgálati koncentrációk, ismétlésszám és esetlegesen használt oldószer,
—
inkubációs körülmények: hőmérséklet, fényciklus és intenzitás, levegőztetés (gyakoriság és intenzitás),
—
a táplálásra vonatkozó információk, beleértve a táplálék típusát, elkészítését, mennyiségét és a táplálás rendjét.
Eredmények:
—
a névleges vizsgálati koncentrációk, a mért vizsgálati koncentrációk és a kísérleti edények vizsgált anyag koncentrációjának a meghatározására használt analízisek eredményei,
—
a víz minősége a vizsgálati edényekben, azaz pH, hőmérséklet, oldott oxigén, vízkeménység és ammóniatartalom,
—
az elpárolgott víz pótlása a vizsgálati edényekben, ha pótoljuk,
—
a kikelt hím és nőstény árvaszúnyogok egy edényre és napra eső száma,
—
ki nem kelt lárvák egy edényre jutó száma,
—
a lárvák egy edényre és – adott esetben – egy fejlődési szakaszra jutó átlagos száraz tömege,
—
ismétlésenkénti és vizsgálati koncentrációnkénti százalékos kikelés (hím és nőstény árvaszúnyogok együttesen),
—
kikelt kifejlett árvaszúnyogok ismétlésenkénti és kezelési arányonkénti átlagos fejlődési üteme (hím és nőstény árvaszúnyogok együttesen),
—
toxicitási végpontok – például ECx (és a hozzá tartozó konfidencia intervallum), NOEC és/vagy LOEC – becsült értékei, valamint a meghatározásukhoz használt statisztikai módszerek,
—
az eredmények szöveges elemzése, beleértve az e vizsgálati módszertől való eltérések vizsgálat kimenetelére gyakorolt hatását.
SZAKIRODALOM
(1)
BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H. Köpp. Berlin 1995.
(2)
Fleming R et al. (1994). Sediment Toxicity Tests for Poorly Water-Soluble Substances. Final Report to them European Commission. Report No: EC 3738. August 1994. WRc, UK.
(3)
SETAC (1993). Guidance Document on Sediment toxicity Tests and Bioassays for Freshwater and Marine Environments. From the WOSTA Workshop held in the Netherlands.
(4)
ASTM International/E1706-00 (2002). Test Method for Measuring the Toxicity of Sediment-Associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. pp 1125–1241. In ASTM International 2002 Annual Book of Standards. Volume 11.05. Biological Effects and Environmental Fate; Biotechnology; Pesticides. ASTM International, West Conshohocken, PA.
(5)
Environment Canada (1997). Test for Growth and Survival in Sediment using Larvae of Freshwater Midges (Chironomus tentans or Chironomus riparius). Biological Test Method. Report SPE 1/RM/32. December 1997.
(6)
US-EPA (2000). Methods for Measuring the Toxicity and Bioaccumulation of Sediment-associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. Second edition. EPA 600/R-99/064. March 2000. Revision to the first edition dated June 1994.
Milani D, Day KE, McLeay DJ, Kirby RS (1996). Recent intra- and inter-laboratory studies related to the development and standardisation of Environment Canada’s biological test methods for measuring sediment toxicity using freshwater amphipods (Hyalella azteca) and midge larvae (Chironomus riparius). Technical Report. Environment Canada. National Water Research Institute. Burlington, Ontario, Canada.
(10)
Sugaya Y (1997). Intra-specific variations of the susceptibility of insecticides in Chironomus yoshimatsui. Jp. J. Sanit. Zool. 48 (4): 345–350.
(11)
Kawai K (1986). Fundamental studies on Chironomid allergy. I. Kultúra methods of some Japanese Chironomids (Chironomidae, Diptera). Jp. J. Sanit. Zool. 37(1): 47–57.
(12)
OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. OECD Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 23.
(13)
Environment Canada (1995). Guidance Document on Measurement of Toxicity Test Precision Using Control Sediments Spiked with a Reference Toxicant. Report EPS 1/RM/30. September 1995.
(14)
E melléklet C.8. fejezete: Toxicitás földigilisztákra.
(15)
Suedel BC and Rodgers JH (1994). Development of formulated reference sediments for freshwater and estuarine sediment testing. Environ. Toxicol. Chem. 13: 1163–1175.
(16)
Naylor C and Rodrigues C (1995). Development of a test method for Chironomus riparius using a formulated sediment. Chemosphere 31: 3291–3303.
(17)
Dunnett CW (1964). A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Amer. Statis. Assoc. 50: 1096–1121.
(18)
Dunnett CW (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics 20: 482–491.
(19)
Williams DA (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27: 103–117.
(20)
Williams DA (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics 28: 510–531.
(21)
Rao JNK and Scott AJ (1992). A simple method for the analysis of clustered binary data. Biometrics 48:577–585.
(22)
Christensen ER (1984). Dose-response functions in aquatic toxicity testing and the Weibull model. Water Research 18: 213–221.
(23)
Bruce and Versteeg (1992). A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry 11:1485–1494.
(24)
Slob W (2002). Dose-response modelling of continuous endpoints. Toxicol. Sci. 66: 298–312.
1. függelék
FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK
E módszer alkalmazásában a következő fogalommeghatározások alkalmazandók:
Mesterséges üledék vagy formulázott, kevert vagy műüledék: a természetes üledék fizikai összetevőinek az imitálására használt anyagok keveréke.
Fedővíz: a vizsgálati edényben az üledék felé kerülő víz.
Pórusvíz vagy szemcseközi víz: az üledék és a talaj szemcséi közötti helyet kitöltő víz.
Szennyezett víz: a vizsgált vegyi anyaggal szennyezett víz.
Vizsgált vegyi anyag: Bármely, ennek a vizsgálati módszernek az alkalmazásával vizsgált anyag vagy keverék.
2. függelék
Ajánlások a Chironomus riparius tenyésztéséhez
1.
Az árvaszúnyoglárvákat kristályosító csészékben vagy nagyobb edényekben tenyésztjük. Az edény aljára szórjunk vékony réteg (kb. 5–10 mm) kvarchomokot. A szilikagél (például Merck, cikkszám: 8117) is megfelelő szubsztrátumnak bizonyult (ebből vékonyabb, pár milliméternyi réteg is elegendő). Ezt követően töltsünk néhány centiméternyi megfelelő vizet az edénybe. A vízszint fenntartása és a kiszáradás megelőzése érdekében szükség szerint pótoljuk az elpárolgott vizet. Cserélhetjük is a vizet, ha kell. Biztosítsunk gyenge levegőztetést. A lárvatenyésztő edényeket tartsuk egy megfelelő ketrecben, amelyből a kikelő kifejlett példányok nem tudnak kiszökni. A ketrecben legyen elég hely a kikelt kifejlett példányoknak a mozgásra, mert ellenkező esetben nem fognak párosodni (minimum kb. 30 × 30 × 30 cm).
2.
A ketreceket tartsuk szobahőmérsékleten vagy 20 ± 2 °C állandó hőmérsékletű helyiségben, 16 órán keresztül világosban (fényintenzitás kb. 1 000 lux) és 8 órán keresztül sötétben. Dokumentálták, hogy a 60 % RH alatti légnedvesség gátolhatja a szaporodást.
Hígítóvíz
3.
Bármilyen alkalmas természetes vagy művíz használható. Általában kútvizet, klórtalanított csapvizet vagy mesterséges közeget (például Elendt-féle M4 vagy M7 közeget, lásd lentebb) használunk. Használat előtt a vizet levegőztetni kell. Szükség esetén cserélhetjük a tenyésztéshez használt vizet. Ehhez a használt vizet öntsük le vagy szívjuk ki a tenyésztő edényekből ügyelve arra, hogy a lárvák által épített lakócsöveket el ne pusztítsuk.
A lárvák táplálása
4.
Az árvaszúnyoglárvákat pehely formájú haleledellel (Tetra Min®, Tetra Phyll® vagy hasonló, védett márkájú haltáppal) etessük, amelyből naponta körülbelül 250 mg-ot adjunk minden edényhez porrá őrölve szárazon vagy vizes szuszpenzióban, amelynek az elkészítéséhez 1,0 g pehely formájú haleledelt keverjünk el 20 ml hígítóvízben úgy, hogy homogén keveréket kapjunk. Ebből a készítményből naponta 5 ml-t adjunk minden edényhez (használat előtt felrázandó). Az idősebb lárvák kaphatnak ennél többet.
5.
A táplálék mennyiségét a vízminőséghez kell igazítani. Ha a tenyésztőközeg zavarossá válik, akkor csökkenteni kell a mennyiséget. Az adott táplálék mennyiségét szigorú ellenőrzés alatt kell tartani. Ha túl kevés a táplálék, akkor a lárvák a vízrétegbe vándorolnak, ha túl sok, akkor fokozódik a mikrobatevékenység és csökken az oxigénkoncentráció. Mindkét körülmény a fejlődési ütem lassulását okozhatja.
6.
Az újonnan létesített tenyésztő edényekhez zöldalga (például Scenedesmus subspicatus, Chlorella vulgaris) sejtek is adhatók.
A kikelt kifejlett példányok táplálása
7.
Egyes kísérletek szerint a kikelt kifejlett példányok számára egy telített cukoroldatba mártott vattakorong szolgálhat táplálékként.
Kikelés
8.
20 ± 2 °C hőmérsékleten a kifejlett példányok körülbelül 13–15 nap elteltével kezdenek megjelenni a lárvatenyésztő edényekben. A hímek tollas csápjuk alapján könnyen megkülönböztethetők.
Petecsomók
9.
Miután a kifejlett példányok megjelentek a tenyésztőketrecben, a lárvatenyésztő edényekben hetente háromszor ellenőrizni kell a lerakott zselatinszerű petecsomókat, amelyeket gondosan el kell távolítani, és át kell helyezni egy tenyésztővíz-mintát tartalmazó kisméretű edénybe. A petecsomókat új tenyészetek létrehozására (például 2–4 petecsomó/edény) vagy toxicitási vizsgálatok céljára használjuk fel.
10.
Az első fejlődési szakaszban lévő lárváknak 2–3 napon belül kell kikelniük.
Új tenyészetek létesítése
11.
A stabil tenyészetekből hetente vagy – a vizsgálati követelményektől függően – ritkábban friss lárvatenyészetek hozhatók létre, miközben a régebbi edényeket a kifejlett árvaszúnyogok megjelenését követően eltávolítjuk. Ezzel a rendszerrel minimális kezelést igénylő módon biztosítható a kifejlett példányok rendszeres utánpótlása.
A vizsgálathoz használt »M4« és »M7« oldatok előállítása
12.
Az »M4« közeg leírása Elendt (1990) munkájában megtalálható. Az »M7« közeg ugyanúgy készül, mint az »M4«, azzal a különbséggel, hogy az 1. táblázatban feltüntetett anyagok koncentrációja az »M7« esetében négyszer alacsonyabb, mint az »M4« készítésekor. Az »M7« közegről szóló publikáció előkészületben van (Elendt, személyes közlés). A vizsgálathoz használt oldatot azért nem Elendt és Bias (1990) szerint kell előállítani, mert a törzsoldatok elkészítéséhez megadott NaSiO3 5 H2O, NaNO3, KH2PO4 és K2HPO4 koncentrációk nem megfelelők.
Az »M7« közeg előállítása
13.
Az (I) törzsoldatok mindegyikét külön kell elkészíteni, majd az (I) törzsoldatokból egy (II) kombinált törzsoldatot készítünk (lásd az 1. táblázatot). Az »M7« közeg előállításához a (II) kombinált törzsoldat 50 ml-ét és az egyes makrotápanyagok törzsoldatainak a 2. táblázatban megadott mennyiségeit ionmentesített vízzel 1 literre hígítjuk. Vitamin-törzsoldatot készítünk, amelyhez három vitamint ionmentesített vízhez adunk a 3. táblázatban meghatározottak szerint, majd röviddel a felhasználás előtt az »M7« közeghez adunk 0,1 ml-t a kombinált vitamin törzsoldatból. (A vitamin-törzsoldatot kis aliquot részekben, fagyasztott állapotban kell tartani). A közeget levegőztetni és stabilizálni kell.
Vitamin- törzsoldat M4 és M7 közeg előállításához használt mennyisége
(ml/l)
Végleges koncentráció a vizsgálathoz használt M4 és M7 oldatban
(mg/l)
Tiamin-hidroklorid
750
0,1
0,075
Cianokobalamin (B12)
10
0,1
0,0010
Biotin
7,5
0,1
0,00075
SZAKIRODALOM
BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H. Köpp. Berlin 1995.
Elendt BP (1990). Selenium Deficiency in Crustacean. Protoplasma 154: 25–33.
Elendt BP and Bias W-R (1990). Trace Nutrient Deficiency in Daphnia magna Kultúrad in Standard Medium for Toxicity Testing. Effects on the Optimization of Kultúra Conditions on LIFE History Parameters of D. magna. Water Research 24 (9): 1157–1167.
3. függelék
MESTERSÉGES ÜLEDÉK KÉSZÍTÉSE
Az üledék összetétele
A mesterséges üledék összetétele a következő:
Összetevő
Jellemzők
üledék száraz
tömegének %-a
Tőzeg
Tőzegmoha, amelynek pH-ja a lehető legközelebb esik az 5,5-6,0 értékhez, és nem tartalmaz látható növénymaradványokat, finomra őrölve (részecskeméret ≤ 1 mm) és levegőn szárítva
4–5
Kvarchomok
Szemcseméret: a részecskék több mint 50 százaléka a 50–200 μm tartományban
75–76
Kaolinit agyag
Kaolinit tartalom ≥ 30 %
20
Szerves szén
Tőzeg és homok hozzáadásával beállítva
2 (±0,5)
Kalcium-karbonát
Porított, vegytiszta CaCO3
0,05 - 0,1
Víz
Vezetőképesség ≤ 10 μS/cm
30 - 50
Elkészítés
A levegőn szárított tőzeget finom porrá őröljük. Nagyteljesítményű homogenizáló készülék segítségével ionmentesített vízzel szuszpenziót készítünk a szükséges mennyiségű tőzegporból. A szuszpenzió pH-ját CaCO3 hozzáadásával beállítjuk 5,5 ± 0,5 értékre. A pH és a mikrobiológiai összetétel stabilizálása végett 20 ± 2 °C hőmérsékleten lassú keveréssel legalább két napig kondicionáljuk a szuszpenziót. Az ezt követően ismét megmért pH-nak 6,0 ± 0,5 értéket kell mutatnia. Ezek után a szuszpenziót összekeverjük a többi összetevővel (homok és kaolinagyag), valamint az ionmentesített vízzel úgy, hogy az üledék száraz tömegének 30–50 százaléka közötti víztartalommal rendelkező, homogén üledéket kapjunk. A végtermékként kapott keverék pH-ját ismételten megmérjük, és szükség esetén CaCO3 hozzáadásával beállítjuk 6,5–7,5 értékre. Az üledékből vett minta alapján meghatározzuk a száraz tömeget és a szerves széntartalmat. Ezt követően az árvaszúnyogokkal végzett toxicitási vizsgálatban való felhasználás előtt ajánlott a mesterséges üledéket hét napig a vizsgálatban használni kívántakkal megegyező körülmények között kondicionálni.
Tárolás
A mesterséges üledék előállításához használt száraz összetevők száraz, hűvös helyen, szobahőmérsékleten tárolhatók. Az összeállított (nedves) üledék a vizsgálatban való felhasználás előtt nem tárolható. Az előállításának záró lépését képező 7 napos kondicionálási időszakot követően azonnal fel kell használni.
SZAKIRODALOM:
E melléklet C.8. fejezete: Toxicitás földigilisztákra.
Meller M, Egeler P, Rombke J, Schallnass H, Nagel R, Streit B (1998). Short-term Toxicity of Lindane, Hexachlorobenzene and Copper Sulfate on Tubificid Sludgeworms (Oligochaeta) in Artificial MEDIA. Ecotox. and Environ. Safety 39: 10–20.
Összes szerves foszfort tartalmazó növényvédő szer
< 50 ng/l
Összes szerves klórt tartalmazó növényvédő szer plusz poliklórozott bifenilek
< 50 ng/l
Összes szerves klór
< 25 ng/l
5. függelék
Útmutató az árvaszúnyoglárvák kikelésének figyelemmel kíséréséhez
A vizsgálati edényekre csapdákat helyezünk a kikelt példányok számára. A csapdák a 20. naptól a vizsgálat végéig szükségesek. Ezek egy példáját mutatja be az alábbi ábra:
C.29. GYORS BIOLÓGIAI LEBONTHATÓSÁG: SZÉN-DIOXID-VIZSGÁLAT LÉGMENTESEN ZÁRT EDÉNYEKBEN (A GŐZTÉR CO2-TARTALMÁNAK VIZSGÁLATA)
BEVEZETÉS
1.
Ez a vizsgálati módszer egyenértékű az OECD 310. vizsgálati iránymutatásában (2006) leírt módszerrel. A módszer olyan szűrővizsgálat, amely a vegyi anyagok gyors biológiai lebonthatóságának értékelésére szolgál, és hasonló információkat nyújt, mint az e melléklet C.4. fejezetében ismertetett A–F vizsgálati módszerek. Ezért azok a vegyi anyagok, amelyek esetében ez a vizsgálati módszer pozitív eredményt ad, biológiailag könnyen lebonthatónak, és ennek következtében a környezetben gyorsan lebomlónak tekinthetők.
2.
A rosszul oldható és erősen adszorbeálódó vegyi anyagok esetében hagyományosan általában a jól bevált szén-dioxid-módszer (CO2-módszer) (1) az elsődleges választás, amely a szerves vegyületek biológiai lebonthatóságának eredeti Sturm-féle vizsgálatán (2) alapul, és a mikrobatevékenység eredményeként felszabaduló szén-dioxid mérésével határozza meg a biológiai lebonthatóságot. Oldható (de nem illékony) vegyi anyagok esetében is erre a módszerre esik a választás, mivel sokan a szén-dioxid-fejlődést tekintik a mikrobatevékenység egyetlen kétségbevonhatatlan bizonyítékának. Az oldott szerves szén eltávolítása egyaránt lehet fizikai-kémiai folyamatok – adszorpció, volatilizáció, precipitáció, hidrolízis – és mikrobatevékenység eredménye, oxigénfogyasztás pedig számos nem biológiai reakcióban is megfigyelhető; CO2 viszont ritkán keletkezik szerves vegyületekből nem biológiai úton. Az eredeti és a módosított Sturm-féle vizsgálatban (1)(2) a CO2 eltávolítása a folyadékfázisból történik, és a CO2 gáz-átbuborékoltatás eredményeként kerül az elnyelető edényekbe (a CO2 eltávolítására megfelelő kezeléssel alkalmassá tett levegőt buborékoltatnak át a folyékony közegen), míg a Larson-féle változatban (3)(4) a CO2 úgy kerül a reakcióedényből az abszorberekbe, hogy a vizsgálati edény folyamatos rázása mellett CO2-mentes levegőt vezetnek keresztül a gőztéren. A reakcióedény rázása csak a Larson-féle módosításban szerepel; az ISO 9439 szabvány (5) és az Egyesült Államokban alkalmazott eredeti változat (6) csak oldhatatlan anyagok esetében ír elő keverést, és mindkettőben gáz-átbuborékoltatás, nem pedig a gőztér cseréje szerepel. Egy másik hivatalos, Gledhill módszerén (8) alapuló és az USA Környezetvédelmi Hivatala (EPA) által elfogadott módszer (7) szerint a CO2-t a légkör felé zárt, rázott reakcióedényen belül közvetlenül a gázfázisból nyeletik el lúgban, miként a klasszikus Warburg–Barcroft-féle respirométer-palackban.
3.
Kimutatták azonban, hogy a szabványos, módosított Sturm-féle vizsgálat számos vegyi anyag esetében történő alkalmazása során szervetlen szén (IC) halmozódik fel a közegben (9). 20 mg C/l koncentrációban használt anilin lebomlása során 8 mg/l IC koncentrációt is mértek. Ezért a lúgban elnyeletett CO2 nem ad valódi képet arról, hogy a lebomlás során az egyes köztes időpontokban mennyi CO2 keletkezik mikrobiológiai folyamatok eredményeként. Ennek következtében egyes vegyi anyagoknál, amelyek az oldott szerves szén (DOC) eltávolítása alapján biológiailag gyorsan lebonthatónak minősülnének, nem teljesül az a követelmény, amely szerint a biológiailag gyorsan lebontható anyagok esetében a CO2-fejlődés elméleti maximumának (ThCO2) több mint 60 %-át el kell érni a »tíznapos ablakban« (a 10 %-os biológiai lebomlás elérését közvetlenül követő 10 napban).
4.
Ha a százalékos lebomlás értéke a vártnál alacsonyabb, akkor lehetséges, hogy IC halmozódott fel a vizsgálathoz használt oldatban. Ekkor a lebonthatóság a gyors biológiai lebonthatóság megállapítására szolgáló további vizsgálatokkal értékelhető.
5.
A Sturm-féle módszertan egyéb hátrányai (nehézkesség, időigényesség, nagyobb kísérleti hibalehetőség, és az illékony vegyi anyagok vizsgálatára való alkalmatlanság) arra ösztönözték a kutatókat, hogy a gázátáramoltatás (10)(11) helyett egy – a Gledhill által javasolttól eltérő – zárt edényes technikát keressenek. Boatman et al. (12) a korábbi módszerek áttekintését követően egy olyan zárt elrendezést alkalmazott, amelyben a közeg savas kezelését követően a CO2 az inkubálás végén a gőztérbe távozik. A CO2 mérésére a gőztérből automatikusan vett minták szervetlenszén-tartalmának gázkromatográfiás analízisét ((GC)/IC) használták, de a folyadékfázis oldott szervetlenszén-tartalmát (DIC) nem vették figyelembe. Emellett az alkalmazott edények nagyon kicsik (20 ml) voltak, és csak 10 ml közeget tartalmaztak, ami problémákat okozott: például az oldhatatlan vizsgált anyagokból szükségszerűen nagyon kis mennyiséget kellett bevinni, és/vagy előfordulhatott, hogy a beoltott közegben nem vagy nem kellő mennyiségben voltak jelen a vizsgált vegyi anyagok lebontására képes mikroorganizmusok.
6.
E nehézségek leküzdéséhez Struijs és Stoltenkamp (13), valamint az anaerob körülmények közötti biológiai lebonthatóság vizsgálatában (15) használt készülékkel szerzett tapasztalataikból ihletet merítő Birch és Fletcher (14) független kutatásai járultak hozzá. Az előbbi szerzőpáros módszere (13) a gőztér CO2-tartalmának savas kezelést és ekvilibrációt követő mérésén alapult, míg az utóbb említettek (14) mind a gázfázisban, mind a folyadékfázisban mérték a DIC értékét, és semmilyen kezelést nem alkalmaztak; a keletkező IC 90 %-a a folyadékfázisban volt jelen. A Sturm-féle vizsgálattal összehasonlítva mindkét módszer rendelkezik előnyökkel, mivel a vizsgálati elrendezés kompakt és jobban kezelhető, alkalmas az illékony vegyi anyagok vizsgálatára, és lehetővé teszi a felszabaduló CO2 késleltetett mérésének az elkerülését.
7.
Ezt a két megközelítést ötvözte a gőztér CO2-tartalmának vizsgálatára vonatkozó ISO-szabvány (16), amelyet körvizsgálatnak is alávetettek (17), és amely az itt bemutatott vizsgálati módszernek is az alapját képezi. Ugyancsak ezt a két megközelítést használja fel az EPA módszere (18). A CO2 mérésének két ajánlott módszere létezik: a gőztér CO2-tartalmának meghatározása savas kezelést követően (13) és az IC meghatározása a folyadékfázisban lúgfölösleg hozzáadása után. Az utóbbi módszert Peterson vezette be annak a CONCAWE által végzett körvizsgálatnak (19) a során, amelynek tárgya a gőztér CO2-tartalma vizsgálatának módosított, a jellegüknél fogva biológiailag lebontható anyagok értékelésére alkalmas módszere volt. Az itt bemutatott vizsgálati módszer tartalmazza a gyors biológiai lebonthatóság meghatározására vonatkozóan e melléklet C.4. fejezetében ismertetett módszereken az 1992-es átdolgozás (20) keretében végrehajtott módosításokat, így a vizsgálati körülmények (közeg, időtartam stb.) egyebekben megegyeznek a módosított Sturm-féle vizsgálatban alkalmazottakkal (20). Birch és Fletcher (14) kimutatták, hogy a gőztér CO2-tartalmának e vizsgálata nagyon hasonló eredményeket adott, mint az átdolgozott vizsgálati módszerekre ugyanazon vegyi anyagokkal elvégzett OECD-körvizsgálat (21).
A VIZSGÁLAT ELVE
8.
A kizárólagos szén- és energiaforrásként szolgáló vizsgált vegyi anyagot – általában 20 mg C/l koncentrációt alkalmazva – vegyes mikroorganizmus-populációval beoltott, ásványi sókat tartalmazó pufferközegben inkubáljuk. A vizsgálatot az aerob körülmények közötti teljes biológiai lebomláshoz szükséges oxigént tartalmazó gőztérrel rendelkező, légmentesen zárt palackokban végezzük. A vizsgált vegyi anyag aerob körülmények közötti teljes biológiai lebomlása során felszabaduló szén-dioxid meghatározásához megmérjük, hogy a kísérleti palackokban mennyivel több szervetlen szén (IC) keletkezik, mint a vakpróbákhoz használt, csak a beoltott közeget tartalmazó palackokban. A biológiai lebomlás mértékét az IC-termelődés elméleti maximuma (ThIC) százalékában fejezzük ki, a kezdetben bevitt vizsgált vegyi anyag (mint szerves szén) mennyisége alapján.
9.
A DOC-csökkenés és/vagy a vizsgált vegyi anyag elsődleges biológiai lebonthatósága is mérhető (20).
A VIZSGÁLT VEGYI ANYAGRA VONATKOZÓ INFORMÁCIÓK
10.
A százalékos lebomlás kiszámításához ismerni kell a vizsgált vegyi anyag szerves széntartalmát (tömegszázalékban kifejezve), amely a kémiai szerkezet alapján vagy méréssel határozható meg. Illékony vizsgált vegyi anyagok esetében a gőztér és a folyadék térfogata közötti megfelelő arány meghatározását segíti a mért vagy számított Henry-állandó. A vizsgált vegyi anyag mikroorganizmusokra gyakorolt toxikus hatására vonatkozó információk a megfelelő vizsgálati koncentrációk kiválasztásához és a rossz biológiai lebonthatóságra utaló eredmények értelmezéséhez hasznosak: amennyiben nem bizonyított, hogy a vizsgált vegyi anyag nincs gátló hatással a mikrobatevékenységre, ajánlott a gátló hatás ellenőrzésére szolgáló kontrolledényt (lásd a 24. bekezdést) szerepeltetni a vizsgálatban.
A MÓDSZER ALKALMAZHATÓSÁGA
11.
A vizsgálat a vízben oldható és a nem oldható vegyi anyagok vizsgálatára egyaránt alkalmas, bár a vizsgált vegyi anyag megfelelő eloszlatását biztosítani kell. Az ajánlott 1:2 gőztér-folyadék térfogatarány alkalmazása mellett az illékony vegyi anyagok 50 Pa.m3.mol–1 Henry-állandóig vizsgálhatók, mivel így a vizsgált vegyi anyag aránya a gőztérben nem fogja meghaladni az 1 %-ot (13). Illékonyabb vegyi anyagok vizsgálata esetén kisebb térfogatú gőztér is használható, de biológiai hasznosíthatóságuk korlátozó tényező lehet, különösen akkor, ha vízben rosszul oldódnak. A felhasználóknak úgy kell megválasztaniuk a gőztér és a folyadék térfogatának arányát és a vizsgált vegyi anyag koncentrációját, hogy elegendő oxigén álljon rendelkezésre az aerob körülmények közötti teljes biológiai lebomláshoz (azaz kerülni kell a magas szubsztrátumkoncentrációt és a kis gőztértérfogatot). Erre a kérdésre vonatkozóan a szakirodalom (13)(23) nyújt útmutatást.
REFERENCIA-VEGYIANYAGOK
12.
Az eljárás ellenőrzése érdekében érdemes egyidejűleg olyan referencia-vegyianyagokat is vizsgálni, amelyek biológiai lebonthatósága ismert. Vízben oldható vegyi anyagok vizsgálata esetén anilin, nátrium-benzoát vagy etilénglikol, rosszul oldódó vizsgált vegyi anyagok esetén pedig 1-oktanol használható erre a célra (13). E vegyületeknek a ThIC százalékában kifejezett biológiai lebomlásának 14 napon belül több mint 60 %-ot kell elérnie.
REPRODUKÁLHATÓSÁG
13.
A módszer ISO-körvizsgálata (17) során a következő eredmények születtek az ajánlott körülmények között, a vizsgált vegyi anyag 20 mg C/l koncentrációban történő alkalmazása mellett.
Vizsgált vegyi anyag
Százalékos biológiai lebomlás középértéke
(28 nap alatt)
Relatív szórás
(%)
Laboratóriumok száma
Anilin
90
16
17
1-oktanol
85
12
14
A vizsgálaton belüli variabilitást (megismételhetőséget) illetően megállapítható, hogy anilin alkalmazása esetén szinte valamennyi vizsgálatsorozatban alacsony, 5 %-ot nem meghaladó volt a relatív szórás. A gyengébb megismételhetőséget mutató két esetben a nagyobb variabilitást valószínűleg az okozta, hogy a vakpróbákban magas volt az IC-termelődés. Az 1-oktanol alkalmazása gyengébb megismételhetőséget eredményezett, de a vizsgálatsorozatok 79 %-ában még így is 10 % alatt maradt a relatív szórás. Ebben az esetben adagolási hibák okozhatták a vizsgálaton belüli nagyobb variabilitást, mivel nagyon kis mennyiségű (3–4 μl) 1-oktanolt kellett befecskendezni a lezárt kísérleti palackokba. A vizsgált vegyi anyag kisebb koncentrációban történő alkalmazása nagyobb relatív szórást eredményezett, különösen a 10 mg C/l értéknél alacsonyabb koncentrációk esetében. Az oltóanyagban lévő összes szervetlen szén (TIC) koncentrációjának csökkentésével ez részben kiküszöbölhető volt.
14.
Egy EU-körvizsgálat (24) során, amelyben öt felületaktív anyagot alkalmaztak 10 mg C/l koncentrációban, a következő eredmények születtek:
Az eredmények azt mutatják, hogy a nehezebben lebomló felületaktív anyagok esetében általában véve nagyobb volt a variabilitás. A vizsgálaton belüli variabilitás az esetek 90 %-ában nem érte el a 15 %-ot, a legmagasabb érték 30–40 % volt.
MEGJEGYZÉS:
A felületaktív anyagok többségükben nem azonos szerkezetű molekulákból állnak, hanem több izomer, homológ stb. keverékei, amelyek lebomlása nem egyforma alkalmazkodási fázist követően, eltérő reakciósebesség mellett történik, »zavaros«, laposabb görbét eredményezve, ezért előfordulhat, hogy a »tíznapos ablakban« nem érhető el a 60 %-os megfelelési érték, holott az egyes molekulafajták önmagukban vizsgálva 10 nap alatt elérnék a 60 % feletti szintet. Ez a jelenség más összetett keverékek esetében is megfigyelhető.
A MÓDSZER LEÍRÁSA
Készülékek
15.
A szokásos laboratóriumi készülékek és:
a)
üveg szérumpalackok, butilkaucsuk septummal rendelkező alumíniumkupakkal lezárva. Az ajánlott méret a 160 ml körüli össztérfogattal rendelkező »125 ml-es« palack (ebben az esetben mindegyik palacknak ismert, 160 ± 1 ml térfogatúnak kell lennie). Kisebb edény is használható, amennyiben az eredmények megfelelnek a 66. és a 67. bekezdésben leírt feltételeknek;
b)
szénanalizátor vagy a szervetlen szén mérésére alkalmas egyéb műszer (pl. gázkromatográf);
c)
fecskendők nagy pontosságú gáz- és folyadékminta-vételhez;
CO2-mentes levegő-utánpótlás, amely levegő nátronmész-granulátumon történő átvezetésével vagy 80 % N2/20 % O2 összetételű gázkeverék alkalmazásával oldható meg (nem kötelező, lásd a 28. bekezdést);
Olyan desztillált vagy ionmentesített vizet kell használni, amelynek összes szervesszén-koncentrációja ≤ 1 mg/l. Ez az ajánlott dózisban alkalmazott vizsgált vegyi anyaggal a vizsgálat kezdetén bevitt szerves széntartalom legfeljebb 5 %-ának felel meg.
Törzsoldatok az ásványisó-tartalmú közeg előállításához
18.
A törzsoldatok és az ásványisó-tartalmú közeg hasonló az ISO 14593 szabvány (16) és a gyors biológiai lebonthatóság vizsgálata kapcsán a C.4. fejezetben leírt vizsgálati módszer (20) által előírthoz. Magasabb ammónium-klorid-koncentráció (0,5 g/l helyett 2,0 g/l) alkalmazása csak nagyon kivételes esetekben szükséges, például ha a vizsgált vegyi anyag koncentrációja > 40 mg C/l. A törzsoldatokat hűtve kell tárolni, és hat hónap után – kicsapódásra vagy mikroorganizmus-növekedésre utaló jel esetén korábban – meg kell semmisíteni. A következő törzsoldatokat kell elkészíteni:
a)
8,50 g kálium-dihidrogén-foszfátot (KH2PO4),
21,75 g dikálium-hidrogén-foszfátot (K2HPO4),
33,40 g dinátrium-hidrogén-foszfát-dihidrátot (Na2HPO4.2H2O) és
0,50 g ammónium-kloridot (NH4Cl)
vízben feloldunk, és 1 literre hígítunk. 7,4 (± 0,2) pH-jú oldatot kell kapnunk. Ha ez nem így van, akkor új oldatot kell készíteni.
b)
36,40 g kalcium-klorid-dihidrátot (CaCl2.2H2O)
vízben feloldunk, és 1 literre hígítunk.
c)
22,50 g magnézium-szulfát-heptahidrátot (MgSO4.7H2O)
vízben feloldunk, és 1 literre hígítunk.
d)
0,25 g vas(III)-klorid-hexahidrátot (FeCl3.6H20)
vízben feloldunk, és 1 literre hígítunk, és hozzáadunk egy csepp tömény HCl-t.
Ásványisó-tartalmú közeg előállítása
19.
Az a) jelű oldatból 10 ml-t körülbelül 800 ml vízzel elkeverünk (17. bekezdés), majd hozzáadunk a b), a c) és a d) jelű oldatok mindegyikéből 1 ml-t, és az így kapott elegyet vízzel 1 literre hígítjuk (17. bekezdés).
Egyéb reagensek
20.
Tömény foszforsav (H3PO4) (> 85 % m/V).
Nátrium-hidroxid-oldat (7M)
21.
Oldjunk fel 280 g nátrium-hidroxidot (NaOH) 1 liter vízben (17. bekezdés). Határozzuk meg az oldat DIC-koncentrációját, és ezt az értéket vegyük figyelembe a vizsgálat eredményének kiszámítása során (lásd az 55. és a 61. bekezdést), különös tekintettel a 66. bekezdés b) pontjában szereplő érvényességi kritériumra. Ha a DIC-koncentráció túl magas, készítsünk friss oldatot.
Vizsgált vegyi anyag
22.
Ha a vizsgált vegyi anyag megfelelően oldható vízben, akkor készítsünk vízben (17. bekezdés) vagy a vizsgálathoz használt közegben (19. bekezdés) lehetőleg a vizsgálathoz használandó végleges koncentráció százszorosának megfelelő koncentrációjú törzsoldatot; ha a törzsoldat pH-ja nem megfelelő, akkor be kell állítani. A törzsoldatot adjuk az ásványisó-tartalmú közeghez úgy, hogy 2 és 40 mg C/l közötti, lehetőleg 20 mg C/l végleges szervesszén-koncentrációt kapjunk. Ennél alacsonyabb koncentráció esetén az eredmények pontossága romolhat. Az oldható és az oldhatatlan folyékony vizsgált anyagok nagy pontosságú fecskendő segítségével közvetlenül bejuttathatók az edényekbe. A rosszul oldható, illetve oldhatatlan vizsgált vegyi anyagok speciális kezelést igényelhetnek (25). A választási lehetőségek a következők:
a)
ismert lemért mennyiségek közvetlen bejuttatása;
b)
ultrahangos diszpergálás a hozzáadás előtt;
c)
szétoszlatás emulgeálószer segítségével, amelynek mikrobatevékenységet gátló vagy serkentő hatását a hozzáadás előtt ellenőrizni kell;
d)
a folyékony vizsgált vegyi anyag – vagy megfelelő, illékony oldószerrel készített oldata – adszorbeálása semleges közegen vagy eszközön (például üvegszálas szűrőn), majd az esetleg használt oldószer elpárologtatása, és ismert mennyiségek bejuttatása;
e)
a vizsgált vegyi anyag könnyen párolgó oldószerrel készített oldata ismert mennyiségének bejuttatása az üres kísérleti edénybe, majd az oldószer elpárologtatása.
A c), a d) és az e) pontban említett szerek mikrobatevékenységet gátló vagy serkentő hatását a hozzáadás előtt vizsgálattal ellenőrizni kell (lásd a 42. bekezdés b) pontját).
Referencia-vegyianyag
23.
Vízzel készítsünk a vizsgálathoz használandó végleges koncentráció (20 mg C/l) lehetőleg százszorosának megfelelő koncentrációjú törzsoldatot az (oldható) referencia-vegyianyagból (17. bekezdés).
Gátló hatás ellenőrzése
24.
A gyors biológiai lebonthatóság értékeléséhez használt körülmények között a vizsgált vegyi anyagok gyakran nem mutatnak jelentős mértékű lebomlást. Ennek egyik lehetséges oka, hogy a vizsgált vegyi anyag a vizsgálat során alkalmazott koncentrációban gátló hatást gyakorol az oltóanyagra. A gátló hatás lehetséges okként vagy közreműködő tényezőként való (utólagos) azonosításának megkönnyítése érdekében a gátló hatás ellenőrzése beépíthető a vizsgálati tervbe. A másik lehetőség, hogy a gátló hatás ellenőrzése kizárja az ilyen zavaró kölcsönhatásokat, és kimutatja, hogy a lebomlás hiánya vagy csekély mértéke kizárólag annak tulajdonítható, hogy a vizsgált vegyi anyag a vizsgálati körülmények között nem hozzáférhető a mikrobák számára. A vizsgált vegyi anyag (aerob) mikroorganizmusokra gyakorolt toxikus hatására vonatkozó információk beszerzéséhez készítsünk a vizsgált vegyi anyagból és a referencia-vegyianyagból (19. bekezdés) oldatot a vizsgálathoz használt közegben úgy, hogy mindkettő az alkalmazott koncentrációban legyen jelen az oldatban (lásd a 22. és a 23. bekezdést).
Oltóanyag
25.
Az oltóanyag különféle forrásokból származhat: lehet eleveniszap, szennyvíztisztító elfolyó vize (klórozatlan), felszíni víz és talaj, vagy ezek keveréke (20). A forrás biológiai lebontó képességét referencia-vegyianyag segítségével ellenőrizzük. Bármely forrásból is származzanak, a vizsgált vegyi anyagnak korábban már kitett mikroorganizmusok nem alkalmazhatók, ha az eljárás célja a gyors biológiai lebonthatóság vizsgálata.
Figyelmeztetés:
Az eleveniszap, a szennyvíz és a szennyvíztisztító elfolyó vize kórokozókat tartalmazhat, ezért körültekintéssel kell kezelni.
26.
A tapasztalatok alapján az oltóanyag optimális mennyisége az a mennyiség, amely:
—
elégséges biológiai lebontó képességet biztosít,
—
a referencia-vegyianyag esetében a meghatározott százalékos lebomlást eredményezi (lásd a 66. bekezdést),
—
milliliterenként 102–105 darab telepképző egységet biztosít a végtermékként kapott keverékben,
—
szokásos körülmények között 4 mg/l lebegőanyag-koncentrációt biztosít a végtermékként kapott keverékben eleveniszap használata esetén; a koncentráció 30 mg/l értékig elfogadható, de ez jelentős mértékben növelheti a CO2-fejlődést a vakpróbákban (26),
—
a vizsgált vegyi anyaggal bevitt kezdeti szervesszén-koncentráció kevesebb mint 10 %-át adja,
—
biztosítja, hogy a vizsgálathoz használt oldat 1 literére általában 1–10 ml oltóanyag jusson.
Eleveniszap
27.
Az eleveniszapot frissen kell gyűjteni elsősorban háztartási szennyvizet fogadó szennyvíztisztító telep vagy laboratóriumi méretű szennyvíztisztító berendezés levegőztető tartályából. Szükség esetén a durva szemcséket szitálással el kell távolítani (például 1 mm2 szemnagyságú szitaháló segítségével), és az iszapot a felhasználásig aerob körülmények között kell tartani.
28.
A másik lehetőség a durva részecskék eltávolítása utáni ülepítés vagy centrifugálás (például 1 100 g intenzitással 10 percig). A felülúszó folyadékot távolítsuk el. Az iszapot át lehet mosni az ásványi oldattal. A tömény iszapot az ásványi oldatban szuszpendáljuk úgy, hogy 3–5 g/l lebegőanyag-koncentrációt kapjunk. Ezt követően az iszapot a szükséges időn keresztül levegőztessük.
29.
Az iszapot megfelelően működő hagyományos szennyvíztisztító telepről kell gyűjteni. Ha az iszapot nagy terhelésű szennyvíztisztítóból kellett gyűjtenünk, vagy úgy gondoljuk, hogy gátló hatású anyagokat tartalmaz, akkor mosni kell. Az újraszuszpendált iszapot alapos keverést követően ülepítsük vagy centrifugáljuk, majd távolítsuk el a felülúszó folyadékot, és a mosott iszapot ismét szuszpendáljuk egy újabb adag ásványi közegben. Ezt az eljárást addig ismételjük, amíg az iszap a fölös szubsztrátumtól vagy gátló anyagoktól mentesnek tekinthető.
30.
A teljes újraszuszpendálódás elérése után, vagy ha kezeletlen iszapot használunk, vegyünk mintát közvetlenül a felhasználás előtt a lebegőanyagok száraz tömegének meghatározása céljából.
31.
Egy további lehetőség az eleveniszap homogenizálása (3–5 g/l lebegőanyag-koncentráció). Az iszapot Waring laboratóriumi turmixgépben közepes sebességgel 2 percig keverjük. Az így kezelt iszapot 30 percen vagy szükség esetén hosszabb időn keresztül hagyjuk ülepedni, majd az oltóanyagként használni kívánt folyadékot dekantáljuk úgy, hogy az ásványi közeg minden literére körülbelül 10 mg oltóanyag jusson.
32.
A vakpróbákban a CO2-fejlődés még tovább csökkenthető az iszap egy éjszakán keresztüli, CO2-mentes levegővel történő levegőztetésével. Ebben a vizsgálatban olyan oltóanyagot használjunk, amelynek eleveniszap-eredetű lebegőanyag-koncentrációja 4 mg/l (13).
Szennyvíztisztító tisztított elfolyó vize
33.
Alternatívaként elsősorban háztartási szennyvizet fogadó szennyvíztisztító telep vagy laboratóriumi méretű szennyvíztisztító berendezés tisztított elfolyó vizéből is származhat az oltóanyag. A mintát aerob körülmények között kell tartani, és a gyűjtés napján fel kell használni, vagy szükség esetén előkondicionálni kell. A durva szemcsés anyag eltávolítása végett az elfolyó vizet durva szűrőn át kell szűrni, és meg kell mérni a pH-ját.
34.
IC-tartalmának csökkentése érdekében 1 órán keresztül buborékoltassunk át a szüredéken CO2-mentes levegőt (15. bekezdés e) pont), miközben a pH-t foszforsav segítségével tartsuk 6,5 értéken (20. bekezdés). Nátrium-hidroxiddal állítsuk vissza a pH eredeti értékét (21. bekezdés), és körülbelül 1 órás ülepítést követően vegyünk megfelelő mennyiségű felülúszó folyadékot oltóanyagnak. Az átbuborékoltatás csökkenti az oltóanyag IC-tartalmát. Például ha a szűrt és átbuborékoltatott elfolyó víz ajánlott maximális literenkénti mennyiségét (100 ml) használtuk oltóanyagként, a vakpróbákban az edényekben jelen lévő IC mennyisége a 0,4–1,3 mg/l tartományon belül volt (14), ami a vizsgált vegyi anyaggal bevitt szén 2–6,5 %-ának felel meg 20 mg C/l koncentráció alkalmazása esetén és 4–13 %-ának, ha az alkalmazott koncentráció 10 mg C/l.
Felszíni víz
35.
Megfelelő felszíni vízből mintát veszünk. A mintát aerob körülmények között kell tartani, és a mintavétel napján fel kell használni. A mintát szükség esetén szűréssel vagy centrifugálással koncentráljuk. Az egyes kísérleti edényekben használandó oltóanyagnak meg kell felelnie a 26. bekezdésben meghatározott követelményeknek.
Talaj
36.
Megfelelő talajból mintát veszünk a talajfelszín alatt legfeljebb 20 cm mélységből. A kövek, a növénymaradványok és a gerinctelen állatok eltávolítását követően a talajmintát 2 mm-es szitahálón átszitáljuk (ha a minta túl nedves az azonnali szitáláshoz, akkor a szitálás megkönnyítése érdekében levegőn kicsit szárítjuk). A mintát aerob körülmények között tartjuk, és a mintavétel napján felhasználjuk. (Ha a mintát lazán bekötött fekete polietilén tasakban szállítjuk, akkor abban 2–4 °C hőmérsékleten legfeljebb egy hónapig tárolható.)
Az oltóanyag előkondicionálása
37.
Az oltóanyag előkondicionálható a kísérleti körülményekhez, de nem adaptálódhat előre a vizsgált vegyi anyaghoz a kísérlet megkezdése előtt. Előkondicionálással csökkenthető a vakpróbákban tapasztalható CO2-fejlődés. Az előkondicionálás azt jelenti, hogy az eleveniszapot a vizsgálathoz használt közegben való, 30 mg/l koncentrációra történő feloldást követően CO2-mentes nedves levegővel legfeljebb 5–7 napig levegőztetjük a vizsgálat során alkalmazandó hőmérsékleten.
VIZSGÁLATI ELJÁRÁS
A palackok száma
38.
A vizsgálathoz szükséges palackok száma (lásd a 15. bekezdés a) pontját) az analízisek gyakoriságától és a vizsgálat időtartamától függ.
39.
Ajánlott a palackokat hármasával analízisnek alávetni olyan időintervallumonként, amely lehetőséget ad a »tíznapos ablak« meghatározására. Emellett a vizsgálat végén az a), a b) és a c) sorozatból (lásd a 42. bekezdést) legalább öt palackot (15. bekezdés a) pont) kell analizálni, hogy a százalékos biológiai lebomlás középértékének 95 %-os konfidenciaintervallumai kiszámíthatók legyenek.
Beoltott közeg
40.
Az oltóanyagot úgy kell használni, hogy 4 mg/l eleveniszap-eredetű szárazanyag-koncentrációt kapjunk. Közvetlenül a felhasználás előtt készítsünk elegendő mennyiségű beoltott közeget, például 2 ml megfelelően kezelt, 2 000 mg/l koncentrációjú eleveniszap (27–32. bekezdés) 1 liter ásványisó-közeghez való hozzáadásával (19. bekezdés). Szennyvíztisztító tisztított elfolyó vizének használata esetén legfeljebb 100 ml elfolyó vizet (33. bekezdés) kell 900 ml ásványisó-közeghez adni (19. bekezdés), és a közeggel 1 literre hígítani.
A palackok előkészítése
41.
A beoltott közeg aliquot részeit adagoljuk a palackokba úgy, hogy a gőztér és a folyadék térfogataránya 1:2 legyen (például egy 160 ml befogadóképességű palackba 107 ml kerüljön). Ettől eltérő térfogatarány is alkalmazható, de a 11. bekezdésben foglaltakat figyelembe kell venni. Mindegyik oltóanyagtípus esetében ügyelni kell arra, hogy a beoltott közeg megfelelően legyen elkeverve, és így a kísérleti palackok között egyformán elosztható legyen.
42.
Az előkészített palacksorozatoknak (15. bekezdés a) pont) a következőket kell tartalmazniuk:
a)
a kísérleti palackok (FT) tartalmazzák a vizsgált anyagot;
b)
a vakpróbákhoz használt kontrollpalackok (FB) csak a vizsgálathoz használt közeget és az oltóanyagot tartalmazzák; ha a vizsgált anyag kísérleti edényekbe történő bejuttatásához bármilyen vegyi anyagot, oldószert, egyéb szert vagy üvegszálas szűrőt használtunk, akkor a palackoknak ezeket is tartalmazniuk kell;
c)
az eljárás ellenőrzésére használt edények (FC) referencia-vegyianyagot tartalmaznak;
d)
amennyiben szükségesek, a vizsgált vegyi anyag lehetséges gátló hatásának ellenőrzésére használt edények (FI) a vizsgált vegyi anyagot az FT, a referencia-vegyianyagot az FC palackokkal megegyező koncentrációban tartalmazzák (24. bekezdés);
e)
a lehetséges nem biológiai lebomlási folyamatok ellenőrzésére használt edényekhez (FS) az a) pontban leírtakon túl 50 mg/l HgCl2-t kell adni vagy az edényeket más módon (például autoklávban) sterilizálni kell.
43.
A vízben oldható vizsgált vegyi anyagok és referencia-vegyianyagok bejuttatása vizes törzsoldat formájában történik (22., 23. és 24. bekezdés) úgy, hogy 10–20 mg C/l koncentrációt kapjunk.
44.
Az oldhatatlan vizsgált vegyi anyagok és referencia-vegyianyagok a vizsgált vegyi anyag természetének megfelelően különféle módszerekkel juttathatók a palackokba (lásd a 22. bekezdés a)–e) pontját) a beoltott közeg hozzáadása előtt vagy után, a vizsgált vegyi anyag kezelésének módszerétől függően. A 22. bekezdés a)–e) pontjában felsorolt eljárások alkalmazása esetén a vakpróbákhoz használt FB palackokat (42. bekezdés b) pont) hasonló módon kell kezelni, de a vizsgált vegyi anyag vagy a referencia-vegyianyag nélkül.
45.
Az illékony vizsgált vegyi anyagokat a lezárt palackokba kell befecskendezni (47. bekezdés) mikrofecskendő segítségével. A dózist a befecskendezett mennyiség és a vizsgált vegyi anyag sűrűsége alapján kell kiszámítani.
46.
Az edényekbe szükség esetén vizet kell adagolni úgy, hogy mindegyik edényben egyforma legyen a folyadék mennyisége. A gőztér és a folyadék térfogatarányát (általában 1:2), valamint a vizsgált vegyi anyag koncentrációját úgy kell megválasztani, hogy a gőztérben elegendő oxigén álljon rendelkezésre a teljes biológiai lebomláshoz.
47.
Ezt követően valamennyi palackot le kell zárni, például butilkaucsuk septummal ellátott alumínium kupakkal. Az illékony vizsgált vegyi anyagokat ekkor kell bejuttatni (45. bekezdés). A vizsgálathoz használt oldat DOC-koncentrációja csökkenésének figyelése és a kezdeti IC-koncentráció vagy más meghatározandó tényezők nulladik időpontban végzett analízise esetén (steril kontrollok, 42. bekezdés e) pont), megfelelő mintát kell venni a kísérleti edényből. A kísérleti edényt és tartalmát ezt követően meg kell semmisíteni.
48.
A lezárt palackokat (15. bekezdés d) pont) a tartalmuk alapos elkeverése és szuszpenzióban tartása céljára megfelelő rázási sebességet (pl. 150–200 rpm) biztosító rotációs rázókészülékre helyezzük (15. bekezdés d) pont), és sötétben, 20 °C ± 1 °C értéken tartott hőmérsékleten inkubáljuk.
Mintavétel
49.
A mintavétel menete az alkalmazkodási fázis hosszától és a vizsgált vegyi anyag biológiai lebomlásának reakciósebességétől függ. Az analízis céljára felhasznált palackokat a legalább hetente vagy – a teljes bomlási görbe megrajzolásához – gyakrabban (például hetente kétszer) végzett mintavétel napján megsemmisítjük. Az FT, az FB és az FC, valamint – ha használjuk – az FI és az FS palackokból (42. bekezdés) a szükséges számú darabot levesszük a rázókészülékről. A vizsgálat időtartama általában 28 nap. Ha a biológiai bomlás görbéjéből arra lehet következtetni, hogy az állandósult állapot a 28. nap előtt beállt, akkor a 28. napnál korábban is be lehet fejezni a vizsgálatot. A százalékos biológiai lebomlás relatív szórását, illetve konfidenciahatárait a vizsgálat 28. napjára megmaradt öt palackból vett minták analízisének eredményeiből kell kiszámítani. A gátló hatás és a nem biológiai lebomlási folyamatok ellenőrzésére használt palackokból nem kell olyan gyakran mintát venni, mint a többi palackból: az 1. és a 28. napon végzett mintavétel elegendő.
Szervetlen szén (IC) analízise
50.
A palackokban végbemenő CO2-fejlődést a szervetlen szén (IC) koncentrációja inkubációs időszak alatti növekedésének mérésével határozzuk meg. A vizsgálat során keletkező IC-mennyiség mérésére két ajánlott módszer létezik, amelyeket az alábbiakban ismertetünk. Mivel a két módszer kissé eltérő eredményre vezethet, ugyanazon vizsgálatsorozaton belül csak az egyiket használjuk.
51.
Az a) módszer alkalmazása akkor ajánlott, ha a közeg tartalmazhatja például az üvegszálas szűrőpapír és/vagy az oldhatatlan vizsgált vegyi anyag maradványait. Ha szénanalizátor nem áll rendelkezésre, akkor gázkromatográfot is használhatunk ennek az analízisnek az elvégzéséhez. Fontos, hogy a gőztér gáztartalmának elemzésekor a palackok hőmérséklete a vizsgálat során használt hőmérséklettel megegyező vagy ahhoz közeli legyen. Az IC mérésére szénanalizátort használó laboratóriumok a b) módszert egyszerűbbnek találhatják. Fontos, hogy a CO2 karbonáttá alakításához használt nátrium-hidroxid-oldat (21. bekezdés) vagy frissen készüljön, vagy IC-tartalma ismert legyen, hogy a vizsgálat eredményeinek kiszámítása során ezt az értéket vehessük figyelembe (lásd a 66. bekezdés b) pontját).
a) módszer:3 alatti pH-értéket eredményező savas kezelés
52.
Az egyes analízissorozatok előtt az IC-analizátort megfelelő IC-etalonnal (pl. N2 -ben 1 tömegszázalék CO2) kalibrálni kell. A mintavételre felhasznált palackok mindegyikébe a septum kupakon keresztül tömény foszforsavat (20. bekezdés) fecskendezünk, hogy a pH-t 3 alatti értékre csökkentsük (például 107 ml vizsgálati közeghez 1 ml-t adunk). Ezt követően a palackokat visszahelyezzük a rázókészülékre. A vizsgálathoz használt hőmérsékleten egy óráig folytatott rázást követően a palackokat levesszük a rázókészülékről, és mindegyik palack gőzteréből aliquot résznyi (pl. 1 ml) mintát veszünk, amelyet az IC-analizátorba fecskendezünk. A mért IC-koncentrációt mg C/l mértékegységben jegyezzük fel.
53.
A módszer elve, hogy a 3 alatti pH-t eredményező savas kezelést és a 20 °C-on történő ekvilibrációt követően a folyadék- és a gázfázis közötti – koncentrációként mért – CO2-megoszlás egyensúlyi állandója 1,0 (13). Ezt a következőképpen legalább egyszer ki kell mutatni a vizsgálati elrendezésre vonatkozóan:
Készítsünk 5 és 10 mg/l IC-koncentrációjú palackokat vízmentes nátrium-karbonát (Na2CO3) CO2-mentes vízben készített oldatát alkalmazva, amelyhez tömény foszforsavval (20. bekezdés) savasítsuk úgy a vizet, hogy a pH 6,5 legyen, és egy éjszakán buborékoltassunk át rajta CO2-mentes levegőt, majd lúggal emeljük a pH-t semleges szintre. Gondoskodjunk arról, hogy a gőztér és a folyadék térfogatának aránya ugyanolyan legyen, mint a vizsgálatok során (pl. 1:2). Az 52. bekezdésben leírtak szerint végezzük el a savas kezelést és az ekvilibrációt, majd mind a gőztérben, mind a folyadékfázisban mérjük meg az IC koncentrációját. Ellenőrizzük a két koncentráció kísérleti hibahatáron belüli egyezését. Ha az egyezés nem áll fenn, akkor ellenőrizni kell az eljárást. Az IC folyadék- és gázfázis közötti megoszlásának ezt az ellenőrzését nem kell minden vizsgálat alkalmával elvégezni, valószínűleg a kalibráció során a legcélszerűbb végrehajtani.
54.
A DOC-csökkenés mérése esetén (csak vízben oldható vizsgált vegyületek esetében) a külön (savas kezelésnek nem alávetett) palackok folyadékfázisaiból vett mintákat membránszűrővel történő szűrést követően a DOC-analizátorba fecskendezzük. Ezek a palackok szükség szerint az elsődleges biológiai lebonthatóság mérésére szolgáló további analízisek céljára is felhasználhatók.
b) módszer:a CO2 karbonáttá alakítása
55.
Az egyes analízissorozatok előtt az IC-analizátort megfelelő etalonnal – például nátrium-bikarbonát (NaHCO3) CO2-mentes vízben készített, 0–20 mg/l tartományon belüli IC-koncentrációjú oldata (lásd az 53. bekezdést) felhasználásával – kalibrálni kell. A mintavételre felhasznált palackok mindegyikébe a septum kupakon keresztül nátrium-hidroxid-oldatot (7M, 21. bekezdés) fecskendezünk (például 107 ml közeghez 1 ml-t adunk), majd a palackokat a vizsgálathoz használt hőmérsékleten egy órán keresztül rázókészülékkel kezeljük. Az egy napon felhasznált palackok mindegyikéhez ugyanazt az NaOH oldatot használjuk, de ez nem szükséges a vizsgálat során végrehajtott valamennyi mintavétel esetében. Ha a mintavételek alkalmával az abszolút vak IC-értékeket is meg kell határozni, akkor az NaOH-oldat IC-koncentrációját minden egyes használat alkalmával meg kell határozni. A rázókészülékről való levételt követően hagyjuk ülepedni a palackok tartalmát. Mindegyik palack esetében fecskendővel szívjunk fel megfelelő mennyiséget (pl. 1 000-ből 50 μl) a folyadékfázisból. A mintákat fecskendezzük az IC-analizátorba, és jegyezzük fel az IC-koncentráció értékeit. E módszer használata során gondoskodni kell arról, hogy az alkalmazott analizátor képes legyen a lúgos minták kezelésére.
56.
A módszer elve, hogy a lúgos oldat hozzáadását és a rázást követően elhanyagolható lesz az IC koncentrációja a gőztérben. Ezt IC-etalont használva legalább egyszer ellenőrizni kell a vizsgálati elrendezésre vonatkozóan, amelynek során a lúg hozzáadását és az ekvilibrációt követően mind a gőztérben, mind a folyadékfázisban meg kell mérni az IC koncentrációját (lásd az 53. bekezdést). A gőztérben nullához kell közelítenie a koncentrációnak. A lényegében teljes mértékű CO2-abszorpciónak ezt az ellenőrzését nem szükséges minden vizsgálat alkalmával elvégezni.
57.
A DOC-csökkenés mérése esetén (csak vízben oldható vizsgált vegyületek esetében) a külön (hozzáadott lúgot nem tartalmazó) palackok folyadékfázisaiból vett mintákat membránszűrővel történő szűrést követően a DOC-analizátorba fecskendezzük. Ezek a palackok szükség szerint az elsődleges biológiai lebonthatóság mérésére szolgáló további analízisek céljára is felhasználhatók
ADATOK ÉS JEGYZŐKÖNYVVEZETÉS
Az eredmények kiszámítása
58.
A vizsgált vegyi anyag 100 %-os mineralizációját, azaz teljes széntartalma CO2-vé alakulását feltételezve a ThIC vakpróbákban keletkező mennyiséget meghaladó része az egyes kísérleti palackokba a vizsgálat kezdetén bejuttatott TOC mennyiséggel egyenlő, vagyis:
Az összes szervetlen szén (TIC) tömege (mg) az egyes palackokban:
[1] egyenlet
ahol:
VL
=
a folyadék térfogata a palackban (liter)
CL
=
IC koncentrációja a folyadékban (mg/l szénkoncentráció);
VH
=
a gőztér térfogata (liter);
CH
=
IC koncentrációja a gőztérben (mg/l szénkoncentráció).
A TIC kiszámítását az IC mérésére használható két analitikai módszerrel a 60. és a 61. bekezdés ismerteti. A százalékos biológiai lebomlás (% D) mindkét esetben:
[2] egyenlet
ahol:
TICt
=
a kísérleti palack TIC értéke a t időpontban (mg);
TICb
=
a vakpróbák TIC értékeinek középértéke a t időpontban (mg);
TOC
=
a kísérleti edénybe bejuttatott TOC kezdeti értéke (mg).
A százalékos biológiai lebomlást (% D) a kísérleti (FT), a referencia-vegyianyagot tartalmazó (FC) és – ha a vizsgálatban szerepelnek – a gátló hatás ellenőrzésére használt (FI) palackokra egyaránt ki kell számítani az egyes mintavételi időpontokig keletkező TIC megfelelő mennyiségéből.
59.
Ha a steril kontrollok (FS) TIC-tartalma jelentős növekedést mutat a vizsgálat időszaka alatt, akkor ebből a vizsgált vegyi anyag nem biológiai úton történő lebomlására lehet következtetni, amit a D értékének [2] egyenlettel történő kiszámítása során figyelembe kell venni.
3 alatti pH-értéket eredményező savas kezelés
60.
Mivel a 3 alatti pH-értéket eredményező savas kezelés kiegyenlíti a TIC koncentrációját a folyadék- és a gázfázisban, az IC-koncentrációt csak a gázfázisban kell mérni. Tehát az [1] egyenletből , ahol VB = a szérumpalack térfogata.
A CO2 karbonáttá alakítása
61.
Ennél a módszernél is az [1] egyenlettel végezzük a számításokat, de mivel az IC mennyisége a gázfázisban elhanyagolható, ezt nem vesszük figyelembe, vagyis és .
Az eredmények kifejezése
62.
A százalékos biológiai lebomlást (D) az inkubálási idő függvényében ábrázoló biológiai bomlási görbének lehetőség szerint mutatnia kell az alkalmazkodási fázist, a biológiai lebontási fázist, a tíznapos ablakot és az állandósult állapotot, azaz azt a fázist, amelyben a maximális lebomlási fok elérése után a görbe egy adott értéknél vízszintessé válik. Ha a párhuzamos kísérleti edények (FT) értékei hasonlók (20 %-nál kisebb különbséget mutatnak), akkor elegendő a középértékek görbéjét megrajzolni (lásd 2. függelék, 1. ábra); ha nem, akkor minden egyes edény görbéjét meg kell rajzolni. Meg kell határozni a százalékos biológiai lebomlás állandósult állapothoz tartozó középértékét vagy a legmagasabb értékét (például amikor a görbe állandósult állapothoz tartozó szakasza csökkenést mutat), de az utóbbi esetben értékelni kell, hogy nem hibás értékről van-e szó. A vizsgálati jegyzőkönyvben a biológiai lebomlás így meghatározott maximális szintjét kell »a vizsgált vegyi anyag biológiai lebomlási fokaként« feltüntetni. Ha a kísérleti edények száma nem volt elegendő az állandósult állapot megjelenítéséhez, akkor a vizsgálat utolsó napján mért adatokat kell a középérték kiszámításához felhasználni. Ez az utolsó érték – öt ismétlés középértéke – jelzi a százalékos biológiai lebomlás meghatározásának pontosságát. A jegyzőkönyvben a »tíznapos ablak« végén kapott értéket is szerepeltetni kell.
63.
Ugyanezzel a módszerrel meg kell rajzolni a referencia-vegyianyag (FC) és – ha a vizsgálatban szerepelt – a nem biológiai lebomlási folyamatok és a gátló hatás ellenőrzésére használt edények (FS és FI) görbéjét.
64.
Dokumentálni kell továbbá a vakpróbákhoz használt kontrollpalackokban (FB) és – ha a vizsgálatban szerepeltek – a nem biológiai lebomlási folyamatok ellenőrzésére használt edényekben (FS) jelen lévő TIC mennyiségét.
65.
Számítsuk ki a keverék egyetlen összetevője, a referencia-vegyianyag alapján várható elméleti IC-hozam felhasználásával az FI-vel jelölt edényekhez tartozó D értéket. Ha a 28. napon [(DFC(12) – DFI(13))/DFC] x 100 > 25 %, akkor feltételezhető, hogy a vizsgált vegyi anyag gátló hatással volt az oltóanyag aktivitására, és ez lehet a vizsgálati körülmények között kapott alacsony DFT értékek magyarázata. Ebben az esetben a vizsgálatot alacsonyabb vizsgálati koncentrációval meg kell ismételni, és lehetőség szerint az oltóanyag DIC-tartalmát és a vakpróbákban keletkező TIC mennyiségét is csökkenteni kell, mert ellenkező esetben az alacsonyabb koncentráció alkalmazása csökkenteni fogja a módszer pontosságát. Alternatív megoldásként használhatunk másik oltóanyagot. Ha a nem biológiai lebomlási folyamatok ellenőrzésére használt FS palackban a TIC mennyiségének jelentős (> 10 %) növekedése figyelhető meg, akkor lehetséges, hogy nem biológiai lebomlási folyamatok mentek végbe.
Az eredmények érvényessége
66.
A vizsgálat akkor tekinthető érvényesnek, ha:
a)
a referencia-vegyianyagot tartalmazó FC edényekben a százalékos lebomlás középértéke 60 % fölé emelkedik az inkubálás 14. napjáig; és
b)
a vakpróbákhoz használt FB edényekben jelen lévő TIC mennyiségének középértéke a vizsgálat végén meghaladja a 3 mg C/l értéket.
Ha ezek a követelmények nem teljesülnek, akkor a vizsgálatot egy másik forrásból származó oltóanyaggal meg kell ismételni, és/vagy felül kell vizsgálni az eljárásokat. Például ha az a probléma, hogy a vakpróbákban sok IC keletkezik, akkor a 27–32. bekezdésben leírt eljárást kell alkalmazni.
67.
Ha kimutatásra került, hogy a vizsgált vegyi anyagnak nincs gátló hatása (65. bekezdés), és mégsem sikerül elérni a ThIC 60 % százalékát, akkor a vizsgálatot emelt koncentrációjú oltóanyaggal (legfeljebb 30 mg/l eleveniszap, illetve literenként 100 ml szennyvíztisztító elfolyó vizének használata esetén) vagy más forrásokból származó oltóanyagokkal meg lehet ismételni, különösen akkor, ha a lebomlás a 20–60 % tartományon belül volt.
Az eredmények értelmezése
68.
A ThIC 60 %-a feletti biológiai lebomlás a tíznapos ablakban ennél a vizsgálatnál azt mutatja, hogy a vizsgált vegyi anyag aerob körülmények között biológiailag gyorsan lebontható.
69.
Ha a ThIC 60 %-aként meghatározott megfelelési értéket nem sikerül elérni, akkor meg kell határozni a közeg pH-értékét azokban a palackokban, amelyek nem lettek savval vagy lúggal kezelve; a 6,5 alatti érték arra utalhat, hogy nitrifikáció zajlott le. Ebben az esetben a vizsgálatot emelt koncentrációjú pufferoldattal meg kell ismételni.
Vizsgálati jegyzőkönyv
70.
Állítsunk össze egy táblázatot, amely az egyes mintavételi napokon felhasznált minden egyes kísérleti palackhoz (FT), referencia-vegyianyagot tartalmazó palackhoz (FC) és – ha a vizsgálatban szerepel – gátló hatás ellenőrzésére szolgáló kontrollpalackhoz (FI) tartozó % D értékeket mutatja. Dokumentáljuk a vakpróbákban (FB) és a steril kontrollokban (FS) keletkező TIC mennyiségét, a DOC értékeket és/vagy az egyéb meghatározandó értékeket, valamint ezek százalékos csökkenését.
71.
Határozzuk meg az állandósult állapothoz tartozó % D értékek középértékét, vagy használjuk a legmagasabb értéket, ha a biológiai bomlási görbe állandósult állapothoz tartozó szakasza csökkenő, és a jegyzőkönyvben ezt tüntessük fel »a vizsgált vegyi anyag biológiai lebomlási fokaként«. Az utóbbi esetben ellenőrizni kell, hogy nem hibás értékről van-e szó.
72.
A vizsgálati jegyzőkönyvnek a következő információkat kell tartalmaznia:
Vizsgált anyag:
—
közönséges név, kémiai név, CAS-szám, szerkezeti képlet és a releváns fizikai és kémiai tulajdonságok,
—
a vizsgált vegyi anyag kémiai tisztasága (szennyezettsége).
Vizsgálati körülmények:
—
hivatkozás erre a vizsgálati módszerre,
—
az alkalmazott vizsgálati elrendezés leírása (pl. az edény térfogata, a gőztér és a folyadék térfogataránya, keverési módszer stb.),
—
a vizsgált vegyi anyag és a referencia-vegyianyag vizsgálati elrendezésbe történő bevitele: alkalmazott vizsgálati koncentrációk és az egyes kísérleti palackokba adagolt szénmennyiség, oldószer esetleges használata,
—
az alkalmazott oltóanyag részletezése, esetleges előkezelés és előkondicionálás,
—
inkubálási hőmérséklet,
—
az IC-analízis elvének validálása,
—
az alkalmazott IC-analizátor (és bármely egyéb alkalmazott analitikai módszer) fő jellemzői,
—
a párhuzamos edények száma.
Eredmények:
—
nyers adatok és a biológiai lebonthatóság számított értékei táblázatos formában,
—
a vizsgált és a referencia-vegyianyagok százalékos lebomlását az idő függvényében ábrázoló grafikon, az alkalmazkodási fázis, a bomlási fázis, a tíznapos ablak és a meredekség,
—
százalékos lebomlás az állandósult állapotban, a vizsgálat végén és a tíznapos ablak végén,
—
a vizsgálati eredmények esetleges elvetésének oka,
—
az alkalmazott eljárás szempontjából releváns bármely egyéb körülmény,
—
az eredmények szöveges elemzése.
SZAKIRODALOM
(1)
E melléklet C.4. fejezete: A »gyors« biológiai lebonthatóság meghatározása – CO2-fejlődés-vizsgálat (C.4-C. módszer)
(2)
Sturm RN (1973). Biodegradability of Nonionic surfactants: screening test for predicting rate and ultimate biodegradation. J.A,.Oil Chem Soc. 50: 159-167.
(3)
Larson RJ (1979). Estimation of biodegradation potential of xenobiotic organic chemicals. Appl Env. Microbiol. 38: 1153-1161.
(4)
Larson RJ, Hansmann MA and Bookland EA (1996). Carbon dioxide recovery in ready biodegradability tests: mass transfer and kinetic constants, Chemosphere 33: 1195-1210.
(5)
ISO 9439 (1990; felülvizsgált szöveg: 1999). Vízminőség. Szerves vegyületek vizes közegben való teljes, aerob, biológiai lebonthatóságának kiértékelése. Szén-dioxid-fejlődéssel járó vizsgálat (Sturm).
(6)
US EPA (1996). Fate, Transport and Transformation Test Guideline. 835. 3110 Carbon dioxide evolution test. Office, Prevention Pesticides and Toxic Substances Washington, DC.
(7)
US EPA (1996). Fate, Transport and Transformation Test Guideline. 835. 3100. Aerobic aquatic biodegradation. Office, Prevention Pesticides and Toxic Substances Washington, DC.
(8)
Gledhill WE (1975). Screening test for assessment of biodegradability: Linear alkyl benzene sulfonate. Appl Microbiol. 30: 922-929.
(9)
Weytjens D, Van Ginneken I and Painter HA (1994). The recovery of carbon dioxide in the Sturm test for ready biodegradability. Chemosphere 28: 801-812.
(10)
Ennis DM and Kramer A (1975). A rapid microtechnique for testing biodegradability of nylons and polyamides. J. Food Sci. 40: 181-185.
(11)
Ennis DM, Kramer A, Jameson CW, Mazzoccki PH and Bailey PH (1978). Appl. Env. Microbiol. 35: 51-53.
(12)
Boatman RJ, Cunningham SL and Ziegler DA (1986). A method for measuring the biodegradation of organic chemicals, Env. Toxicol. Chem. 5: 233-243.
(13)
Struijs J and Stoltenkamp J (1990). Head space determination of evolved carbon dioxide in a biodegradability screening test. Ecotox. Env. Safety 19: 204-211.
(14)
Birch RR and Fletcher RJ (1991). The application of dissolved inorganic carbon measurements to the study of aerobic biodegradability. Chemosphere 23: 507-524.
(15)
Birch RR, Biver C, Campagna R, Gledhill WE, Pagga U, Steber J, Reust H, and Bontinck WJ (1989). Screening of chemicals for anaerobic biodegradation. Chemosphere 19: 1527-1550.
(16)
ISO 14593, (1999) Vízminőség. Szerves vegyületek teljes aerob biológiai lebonthatóságának kiértékelése vizes közegben. A lezárt edényzet szervetlen széntartalmának meghatározásán alapuló módszer (a gőztér CO2-tartalmának vizsgálata).
(17)
Battersby NS (1997). The ISO headspace C02 biodegradation test, Chemosphere 34: 1813-1822.
(18)
US EPA (1996). Fate, Transport and Transportation. 835.3120. Sealed vessel carbon dioxide production test. Office, Prevention Pesticides and Toxic Substance, Washington, DC.
(19)
Battersby NS, Ciccognani D, Evans MR, King D, Painter HA, Peterson DR and Starkey M (1999). An „inherent” biodegradability test for oil products: description and results of an international ring test. Chemosphere 38: 3219-3235.
(20)
E melléklet C.4. fejezete: A »gyors« biológiai lebonthatóság meghatározása
(21)
OECD (1988). OECD Ring-test of methods for determining ready biodegradability: Chairman’s report (M. Hashimoto; MITI) and final report (M. Kitano and M. Takatsuki; CITI). Paris.
(22)
E melléklet C.11. fejezete: Eleveniszap-légzésgátlási vizsgálat.
(23)
Struijs J, Stoltenkamp-Wouterse MJ and Dekkers ALM (1995). A rationale for the appropriate amount of inoculum in ready biodegradability tests. Biodegradation 6: 319-327.
(24)
EU (1999). Ring-test of the ISO Headspace CO2 method: application to surfactants: Surfactant Ring Test-1, Report EU4697, Water Research Centre, May 1999, Medmenham, SL7 2HD, UK.
(25)
ISO 10634 (1996) Vízminőség. Útmutató a vízben rosszul oldódó szerves vegyületek előkészítésére és kezelésére azok vizes közegben való biológiai lebonthatóságának értékeléséhez.
1. függelék
RÖVIDÍTÉSEK ÉS FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK
IC: Szervetlen szén
ThCO2: Elméleti szén-dioxid-felszabadulás (mg): az a számított szén-dioxid-mennyiség, amelynek a vizsgált vegyi anyag ismert vagy mért széntartalmából létre kell jönnie a teljes mineralizáció során; mg fejlődött szén-dioxid/mg vizsgált vegyi anyag formában is használják.
DOC: Oldott szerves szén: az oldatban jelen lévő szerves szén, vagy a 0,45 mikrométeres szűrőn átszűrhető, vagy 15 percig tartó kb. 4 000 g (kb. 40 000 m sec–2) intenzitású centrifugálást követően a felülúszó folyadékban maradó szerves szén.
DIC: Oldott szervetlen szén.
ThIC: Elméleti szervetlenszén-termelődés.
TIC: Összes szervetlen szén.
Biológiailag gyorsan lebontható: Önkényes besorolás, amelybe olyan vegyi anyagok tartoznak, amelyek bizonyos meghatározott, a teljes biológiai lebonthatóság meghatározására szolgáló szűrővizsgálatok követelményeinek megfeleltek; ezek a vizsgálatok olyan szigorúak, hogy feltételezhető, hogy az ilyen vegyi anyagok vízi környezetben aerob körülmények között biológiailag gyorsan és teljesen lebomlanak.
Tíznapos ablak: A 10 %-os biológiai lebomlás elérését közvetlenül követő 10 nap.
Jellegénél fogva biológiailag lebontható: Besorolás, amelybe olyan vegyi anyagok tartoznak, amelyekre nézve a biológiai lebonthatóság valamely vizsgálata egyértelműen igazolta az elsődleges vagy teljes biológiai lebonthatóságot.
Aerob körülmények közötti teljes biológiai lebomlás: Az a lebomlási szint, amely akkor következik be, amikor a vizsgált vegyületet teljesen felhasználják a mikroorganizmusok, és ez szén-dioxid, víz, ásványi sók és új mikrobás sejtalkotórészek (biomassza) keletkezését eredményezi.
Mineralizáció: A mineralizáció egy szerves vegyület teljes lebontása aerob körülmények között CO2-re és H2O-ra, anaerob körülmények között pedig CH4-re, CO2-re és H2O-ra.
Alkalmazkodási fázis: A vizsgálat kezdetétől addig az időpontig tartó időszak, amikor a lebontó mikroorganizmusok akklimatizálódása és/vagy alkalmazkodása bekövetkezik, és a vizsgált vegyi anyag vagy szerves anyag biológiai lebomlása észlelhető szintet ér el (például a maximális elméleti biológiai lebomlás 10 %-át vagy ennél alacsonyabb szintet a mérési technika pontosságától függően).
Bomlási fázis: Az alkalmazkodási fázis végétől a maximális lebomlási szint 90 %-ának eléréséig tartó időszak
Állandósult állapot: Az állandósult állapot az a fázis, amelyben a lebomlás maximális szintet ér el, és a biológiai bomlási görbe vízszintessé válik.
Vizsgált vegyi anyag: Bármely, e vizsgálati módszer alkalmazásával vizsgált anyag vagy keverék.
2. függelék
Példa a biológiai bomlási görbére
1.ábra
1-oktanol biológiai lebomlása a gőztér CO2 tartalmának vizsgálata során
Glosszárium
biológiai lebomlás
lebontási fázis
a biológiai lebomlás maximális szintje
állandósult állapot
Tíznapos ablak
Vizsgálat ideje (nap)
C.30. BIOLÓGIAI FELHALMOZÓDÁS SZÁRAZFÖLDI KEVÉSSERTÉJŰEKBEN
BEVEZETÉS
1.
Ez a vizsgálati módszer egyenértékű az OECD 317. vizsgálati iránymutatásában (2010) leírt módszerrel. A vegyi anyagok környezetben bekövetkező sorsára vonatkozó vizsgálati módszerek közül a »Biokoncentráció vizsgálata: átfolyásos hal vizsgálat« (e melléklet C.13. fejezete (49)) 1996-ban, a »Biológiai felhalmozódás fenékiszapban élő üledéklakó kevéssertéjűekben« (53) 2008-ban került kiadásra. A vegyi anyagok vízi környezetben élő szervezetekre vonatkozó biológiai felhalmozódására vonatkozó adatok azonban nehezen vagy egyáltalán nem extrapolálhatók szárazföldi szervezetekre, például földigilisztákra. A vegyi anyagok talajban való biológiai felhalmozódása értékelésére jelenleg a vizsgált vegyi anyag lipofilitásán alapuló modellszámításokat – például (14) (37) – használunk, például ahogy az EU szakmai útmutatója (19) leírja. A kompartment specifikus vizsgálati módszer iránti igény már megfogalmazódott a szakirodalomban (például (55)). Egy ilyen módszer különösen fontos a szárazföldi táplálékláncokban végbemenő másodlagos mérgezés értékeléséhez (4). A halaktól különböző szervezetekben való biológiai felhalmozódás vizsgálatára több nemzeti módszer létezik (például (2) és (72)). Az American Society for Testing and Materials kidolgozott egy módszert a szennyezett talajokból származó anyagok trágyagilisztákban (Eisenia fetida, Savigny) és televényférgekben való biológiai felhalmozódásának a mérésére (3). A biológiai felhalmozódás mesterségesen szennyezett talajban való meghatározásának egy nemzetközileg elfogadott módszere – például (25) (29) – javíthatja a vegyi anyagok szárazföldi ökoszisztémákra gyakorolt kockázatának az értékelését.
2.
A talajban élő lebontó gerinctelen állatok ki vannak téve a talajhoz kötött vegyi anyagok hatásainak. Az ezen állatok közé tartozó szárazföldi kevéssertéjűek fontos szerepet játszanak a talaj szerkezete és funkciója szempontjából (15) (20). A szárazföldi kevéssertéjűek a talajban és részben a talajfelszínen (különösen az alomrétegben) élnek; a biomasszát tekintve gyakran a legnépesebb fajokat képviselik (54). A talajban végzett bioturbációs tevékenységük révén és zsákmányállatként ezek az állatok jelentős mértékben befolyásolhatják a vegyi anyagok más szervezetek, például gerinctelen állatok (például ragadozó atkák és bogarak; például (64)), illetve gerinces ragadozók (például róka, sirály) számára való biológiai hozzáférhetőségét (18) (62). A szárazföldi kevéssertéjűek közé tartozó egyes fajok ökotoxikológiai vizsgálatokban való jelenlegi felhasználását az 5. függelék ismerteti.
3.
Az ASTM a földigilisztafélék családjába tartozó trágyagilisztával (Eisenia fetida) és a közönséges televényféreggel (Enchytraeus albidus) végzett laboratóriumi talajtoxicitási és bioakkumulációs vizsgálatokra vonatkozó irányadó útmutatója (3) számos alapvető és hasznos részletet közöl a talajból felvett vizsgált vegyi anyag biológiai felhalmozódása itt bemutatott vizsgálatának az elvégzésével kapcsolatban. A vizsgálati módszer ismertetése hivatkozik továbbá az OECD 315. vizsgálati iránymutatására (Biokoncentráció vizsgálata: átfolyásos hal vizsgálat) (49) és C.51. fejezetére (Biológiai felhalmozódás fenékiszapban élő üledéklakó kevéssertéjűekben) (53). A talajból felvett vizsgált vegyi anyag biológiai felhalmozódásának vizsgálatára vonatkozó gyakorlati tapasztalatok és szakirodalom – például (1) (5) (11) (12) (28) (40) (43) (45) (57) (59) (76) (78) (79) – ugyancsak fontos információforrásként szolgálnak ehhez a vizsgálati módszerhez.
4.
Ez a vizsgálati módszer leginkább a talajon való adszorbeálódásra hajlamos stabil, semleges szerves vegyi anyagok vizsgálatára alkalmas. Lehetővé teszi továbbá a talajrészecskékhez kötődő stabil fémorganikus vegyületek biológiai felhalmozódásának a vizsgálatát. Fémek és más nyomelemek esetében ugyancsak alkalmazható.
ELŐFELTÉTELEK
5.
Vegyi anyagok szárazföldi kevéssertéjűekben való biológiai felhalmozódását eddig nehézfémek (lásd például (63)), valamint 3,0 és 6,0 közötti log Kow értékekkel rendelkező megmaradó szerves vegyi anyagok – például (40) – esetében vizsgálták. Ilyen vizsgálatok vonatkoztak még a következőkre:
—
6,0 feletti log Kow értéket mutató vegyi anyagok (szuperhidrofób vegyi anyagok),
—
olyan vegyi anyagok, amelyek élő szervezetekben való biológiai felhalmozódásra való képessége ismert, például felületaktív vagy erősen adszorbeálódó vegyi anyagok,
—
vegyi anyagok, amelyek szerkezeti jellemzői utalnak a biológiai felhalmozódás képességére, például ismert biológiai felhalmozódási potenciállal rendelkező vegyi anyagokkal analógok, és
—
fémek.
6.
A vizsgálat megkezdése előtt bizonyos információknak – mint amilyen például a közönséges név, a kémiai név (lehetőleg IUPAC név), a szerkezeti képlet, a CAS regisztrációs szám, a kémiai tisztaság, a biztonsági előírások, a megfelelő tárolási körülmények és az analitikai módszerek – rendelkezésre kell állniuk a vizsgált vegyi anyagokról. Mindezek mellett ismerni kell a következő információkat:
a)
oldhatóság vízben;
b)
oktanol-víz megoszlási hányados (Kow);
c)
talaj- víz megoszlási hányados Koc-ként kifejezve,
d)
páranyomás;
e)
lebomlási képesség (például talajban, vízben);
f)
ismert metabolitok.
7.
A vizsgált vegyi anyag lehet radioaktívan jelölt vagy nem jelölt. Az analízis megkönnyítése érdekében azonban ajánlott radioaktívan jelölt vizsgált vegyi anyagot használni. A döntést a kimutathatósági határértékek alapján kell meghozni, vagy attól függően, hogy a kiindulási vegyi anyagra és metabolitjaira vonatkozó mérések szükségesek-e. Radioaktívan jelölt vizsgált vegyi anyag használata és az összes radioaktív maradvány mérése esetén fontos jellemezni a kiindulási vegyi anyag és a kiindulási vegyi anyagtól eltérő jelölt anyag százalékarányát a talajban és a vizsgálathoz használt organizmusokban található radioaktívan jelölt maradványok esetében egyaránt, például az állandósult állapot időszaka alatt vagy a felvételi fázis végén gyűjtött mintákban, hogy a kiindulási vizsgált vegyi anyag és a talajban található metabolitok biológiai felhalmozódási tényezője (BAF) kiszámítható legyen (50. bekezdés). Az itt bemutatott módszer módosítható, például annak érdekében, hogy a radioaktívan nem jelölt szerves vizsgált vegyi anyagok vagy fémek méréséhez elegendő biomassza álljon rendelkezésre. Az összes radioaktív maradvány mérése esetén (az extrakciót, égetést vagy szövetstabilizálódást követő folyadékszcintillációs számlálással) a biológiai felhalmozódási tényezőt a kiindulási vegyi anyag és metabolitjai határozzák meg. A BAF kiszámítását lehetőség szerint az organizmusokban mért kiindulási vizsgált vegyi anyag és az összes radioaktív maradvány alapján kell végezni. Ezt követően a biológiai felhalmozódási tényezőből kiszámítható a féreg lipidtartalmára és a talaj szerves széntartalmára (OC) vonatkoztatott bióta-talaj felhalmozódási tényező (BSAF) a különböző biológiai felhalmozódási vizsgálatok eredményeinek az összehasonlítása végett.
8.
Ismerni kell a vizsgált vegyi anyag vizsgálathoz használt fajokra gyakorolt toxikus hatását, például a felvételi fázis időtartamához tartozó hatáskoncentrációt (ECx) vagy a letális koncentrációt (LCx) (például (19)). A vizsgált vegyi anyag választott koncentrációja lehetőleg az akut aszimptotikus LC50 körülbelül 1 %-ának feleljen meg, és legalább tízszer nagyobb legyen, mint a használt analitikai módszerrel talajban kimutatható határérték. Lehetőség szerint a szubletális végpontokkal végzett hosszú távú vizsgálatokból származó toxicitási értékeket kell előnyben részesíteni (51) (52). Ha ilyen adatok nem állnak rendelkezésre, akkor egy akut toxicitási vizsgálat nyújthat hasznos információt (lásd például (23)).
9.
Rendelkezni kell egy ismert pontosságú, precizitású és érzékenységű, megfelelő analitikai módszerrel a vegyi anyag mennyiségi meghatározására a vizsgálathoz használt oldatokban, a talajban és a biológiai anyagban, a minták előállítására és tárolására vonatkozó részletes eljárásokkal, valamint az anyagbiztonsági adatlapokkal. Ismerni kell továbbá a vizsgált tétel talajban és féregszövetben való analitikai kimutathatóságának határértékeit. 14 C-vel jelölt vizsgált vegyi anyag használata esetén ismerni kell a fajlagos radioaktivitást (Bq/mol) és a szennyező anyagokhoz tartozó százalékos radioaktivitást. A vizsgált vegyi anyag fajlagos radioaktivitásának olyan nagynak kell lennie, hogy az analízist megkönnyítse, de a vizsgálathoz használt koncentráció ne váltson ki toxikus hatásokat.
10.
A vizsgálat mesterséges talajjal és természetes talajokkal egyaránt végezhető. Természetes talaj használata esetén a vizsgálat megkezdése előtt ismerni kell például a talaj vagy a talajösszetevők eredetét, a pH-t, a szerves széntartalmat, a részecskeméret-eloszlást (homok, iszap és agyag százalékaránya) és a víztartó képességet (WHC) (3) (48).
A VIZSGÁLAT ELVE
11.
A vizsgált vegyi anyag biológiai felhalmozódását jellemző paraméterek a biológiai felhalmozódási tényező (BAF), a felvételi sebességi állandó (ks) és az ürülési sebességi állandó (ke). Meghatározásaikat az 1. függelék tartalmazza.
12.
A vizsgálat két fázisra oszlik: a felvételi (expozíciós) fázisra és az ürülési (expozíció utáni) fázisra. A felvételi fázisban kellő ismétlésszámot alkalmazva férgek csoportjait tesszük ki a vizsgált vegyi anyaggal mesterségesen szennyezett talaj hatásának. A kísérleti állatok mellett a vizsgált vegyi anyagtól eltekintve ugyanolyan körülmények között tartott kontrollcsoportokat alkalmazunk. Mérjük a kísérleti organizmusok száraz tömegét és lipidtartalmát. A kontrollcsoportba tartozó férgek esetében is meg lehet tenni ugyanezt. Analitikai háttérértékek (vakértékek) a kontrollcsoportba tartozó férgekből és a talajból vett minták elemzésével kaphatók. Az ürülési fázishoz a férgeket át kell helyezni a vizsgált vegyi anyagot nem tartalmazó talajba. Az ürülési fázis csak akkor hagyható el, ha az expozíciós fázisban jelentős mértékű volt a vizsgált vegyi anyag felvétele. Az ürülési fázis arról nyújt tájékoztatást, hogy a kísérletben részt vevő szervezetek milyen ütemben választják ki a vizsgált vegyi anyagot (például (27)). Ha a felvételi fázis során nem állt be állandósult állapot, akkor a kinetikai paramétereket – a kinetikai biológiai felhalmozódási tényezőt (BAFk), valamint a felvételi és az ürülési sebességi állandó(ka)t – a felvételi és az ürülési fázisokban kapott eredmények szimultán illesztése alapján kell meghatározni. A vizsgált vegyi anyag koncentrációját a férgekben/férgeken a vizsgálat mindkét fázisa során mindvégig figyelemmel kell kísérni.
13.
A felvételi fázisban az állandósult állapot eléréséig legfeljebb 14 napig (televényférgeknél) vagy 21 napig (földigilisztáknál) kell mintákat venni a mérések elvégzéséhez (11) (12) (67). Az állandósult állapot akkor következik be, amikor a férgekben mért koncentrációt az idő függvényében mutató görbe az időtengellyel párhuzamossá válik, és a legalább kétnaponta vett mintákon végzett koncentrációanalízisek statisztikai összehasonlítása (például varianciaanalízis, regressziós analízis) három egymást követő esetben legfeljebb ± 20 %-os eltérést mutat.
14.
Az ürülési fázishoz a vizsgálathoz használt organizmusokat át kell helyezni olyan edényekbe, amelyek ugyanazt a szubsztrátumot tartalmazzák, de a vizsgált vegyi anyag nélkül. Az ürülési fázis során 14 napon keresztül (televényférgeknél) vagy 21 napon keresztül (földigilisztáknál) kell mintákat venni a mérések elvégzéséhez, kivéve, ha a korábbi analitikai meghatározások a vizsgált vegyi anyag 90 %-os csökkenését mutatták a férgekben. A vizsgált vegyi anyagnak az ürülési fázis végén a férgekben mért koncentrációját ki nem választott maradványokként kell dokumentálni. Lehetőleg egyaránt ki kell számítani az állandósult állapothoz tartozó biológiai felhalmozódási tényezőt (BAFss) – a láthatóan beállt állandósult állapotban a férgekben (Ca) és a talajban (Cs) mért koncentrációk hányadosaként – és a kinetikai biológiai felhalmozódási tényezőt (BAFK) – a talajból való felvétel sebességi állandója (ks) és az ürülési sebességi állandó (ke) hányadosaként (a meghatározásokat lásd az 1. függelékben), elsőrendű kinetikát feltételezve (a számításokat lásd a 2. függelékben). Ha nyilvánvalóan nem elsőrendű a kinetika, akkor más modelleket kell alkalmazni.
15.
A felvételi sebességi állandót, az ürülési sebességi állandót (vagy más modellek használata esetén állandókat), a kinetikai biológiai felhalmozódási tényezőt (BAFK) és – amennyiben lehetséges – e paraméterek mindegyike esetében a konfidenciahatárokat számítógépes módszerrel kell kiszámítani modellegyenletekből (az útmutatást lásd a 2. függelékben). Bármely modell esetében az illeszkedés megfelelősége meghatározható például a korrelációs együttható vagy a determinációs együttható alapján (az együttható 1-hez közeli értéke jelzi a jó illeszkedést), vagy khi-négyzet próbával. A becsült paraméterek szórásából vagy konfidenciahatárából is következtetni lehet a modell illeszkedésének megfelelőségére.
16.
Erősen lipofil vizsgált anyagok esetén a vizsgálati eredmények variabilitásának csökkentése érdekében a biológiai felhalmozódási tényezőket a lipidtartalomra és a szerves széntartalomra vonatkoztatva kell kifejezni (a talaj szerves széntartalmának (OC) hány kilogrammja jut a férgek lipidtartalmának egy kilogrammjára). Ez a megközelítés azon a tényen alapul, hogy a vegyi anyagok egyes osztályainál nyilvánvaló összefüggés áll fenn a biológiai felhalmozódási potenciál és a lipofilitás között, amint azt halaknál egyértelműen kimutatták (47). Az ilyen vegyi anyagok biológiai felhalmozódása a hal lipidtartalmától függ. A fenékiszapban élő organizmusoknál is hasonló korrelációt állapítottak meg, például (30) (44). A szárazföldi kevéssertéjűeknél is kimutattak hasonló összefüggést, például (5) (6) (7) (14). Ha elegendő féregszövet áll rendelkezésre, akkor a kísérleti állatok lipidtartalmát ugyanabból a biológiai anyagból lehet meghatározni, mint amit a vizsgált vegyi anyag koncentrációjának a meghatározására használunk. A másik lehetőség, hogy kontroll állatokat használunk a lipidtartalom mérésére.
A VIZSGÁLAT ÉRVÉNYESSÉGE
17.
A következő feltételeknek kell teljesülniük mind a kontrollok, mind a kezelések során ahhoz, hogy a vizsgálat érvényes legyen:
—
A vizsgálat végén a felvételi és az ürülési fázisban mért mortalitás összességében nem haladhatja meg a behelyezett férgek összlétszámának 10 %-át (földigilisztáknál), illetve 20 %-át (televényférgeknél).
—
Eisenia fetida és Eisenia andrei használata esetén a felvételi és az ürülési fázis végén mért tömegveszteség középértéke nem haladhatja meg az egyes fázisok elején mért kezdeti friss tömeg 20 %-át.
A MÓDSZER LEÍRÁSA
A vizsgálathoz használt fajok
18.
A biológiai felhalmozódás vizsgálatához a szárazföldi kevéssertéjűek közé tartozó több faj is ajánlott. A leggyakrabban használt fajok az Eisenia fetida vagy Eisenia andrei (földigiliszta-félék), illetve az Enchytraeus albidus, Enchytraeus crypticus vagy Enchytraeus luxuriosus (televényférgek), amelyek leírását az 5. függelék tartalmazza.
Készülékek
19.
A berendezés valamennyi részét illetően kerülni kell az olyan anyagok használatát, amelyek oldódhatnak, adszorbeálhatják a vizsgált vegyi anyagot, vagy amelyekből más vegyi anyagok mosódhatnak ki, illetve amelyek ártalmasak lehetnek a vizsgálathoz használt állatokra. Szabványos, kémiailag semleges anyagból készült, a terhelés mértékének – vagyis a kísérleti állatok számának – megfelelő térfogatú négyszögletes vagy hengeres edények használhatók. A vizsgálathoz használt közeggel érintkező felszerelések rozsdamentes acélból, műanyagból vagy üvegből készülhetnek. A vizsgálati edényeket megfelelő módon le kell fedni, hogy a férgek ne szökhessenek ki belőlük, de az elegendő levegőellátás biztosított legyen. Magas adszorpciós együtthatóval rendelkező vegyi anyagok, például szintetikus piretroidok vizsgálata esetén szilanizált üveg használata lehet szükséges. Ilyenkor a felszerelést használat után meg kell semmisíteni (49). Ügyelni kell, hogy a radioaktívan jelölt vizsgált tételek és illékony vegyi anyagok ne kikerülhessenek ki a vizsgálati elrendezésből. Megfelelő abszorbenst tartalmazó csapdák (például üveg gázmosó palackok) alkalmazásával meg kell akadályozni a maradványok elillanását a vizsgálati edényekből.
Talaj
20.
A vizsgálathoz olyan minőségű talajt kell használni, amely lehetővé teszi a vizsgálathoz használt organizmusok túlélését és lehetőség szerinti szaporodását az alkalmazkodási és a vizsgálati időszakok alatt anélkül, hogy rendellenes megjelenést vagy viselkedést mutatnának. A férgeknek bele kell ásniuk magukat a talajba.
21.
A vizsgálat során az e melléklet C.8. fejezetében (48) leírt mesterséges talajt ajánlott szubsztrátumként használni. A biológiai felhalmozódási vizsgálatokhoz való használatra szánt mesterséges talaj előállítását és a mesterséges talaj tárolására vonatkozó ajánlásokat a 4. függelék tartalmazza. A levegőn szárított mesterséges talaj a felhasználásig szobahőmérsékleten tárolható.
22.
Szennyezésmentes helyről származó természetes talajok is szolgálhatnak a vizsgálathoz és/vagy a férgek tenyésztéséhez használt talajként. A természetes talajokat jellemezni kell legalább a következőkkel: származás (gyűjtés helye), pH, szerves széntartalom, részecskeméret-eloszlás (homok, iszap és agyag százalékaránya), maximális víztartó képesség (WHCmax) és százalékos víztartalom (3). A talajban, illetve a talajösszetevőkben található mikro-szennyező anyagok analízise a felhasználás előtt hasznos információkat szolgáltathat. Mezőgazdasági földterületről származó talaj használata esetén meg kell győződni arról, hogy a talajt nem kezelték növényvédőszerrel vagy kezelt állatoktól származó trágyával a mintavételt megelőző legalább egy évben, illetve szerves trágyával a mintavételt megelőző legalább fél évben (50). A természetes talajok kevéssertéjűekkel végzett ökotoxikológiai laboratóriumi vizsgálatok során történő felhasználás előtti kezelésének leírása a szakirodalomban megtalálható (3). A természetes talajokat a lehető legrövidebb ideig szabad csak a laboratóriumban tárolni.
A vizsgált anyag bevitele
23.
A vizsgált vegyi anyagnak be kell épülnie a talajba. Ehhez figyelembe kell venni a vizsgált vegyi anyag fizikai és kémiai tulajdonságait. Ha a vizsgált vegyi anyag vízben oldható, akkor a talajba keverés előtt vízben fel kell oldani. Vízben rosszul oldódó vizsgált vegyi anyagok esetén egy vagy több (mesterséges) talajösszetevő vizsgált vegyi anyaggal való bevonása az ajánlott szennyezési eljárás. A kvarchomokot vagy annak egy részét például át lehet itatni a vizsgált vegyi anyag megfelelő szerves oldószerrel készített oldatával, amelyet aztán lassan elpárologtatunk, amíg a homok megszárad. Ezt követően a bevont részt össze lehet keverni a nedves talajjal. Ennek az eljárásnak az a legfőbb előnye, hogy a talajba nem kerül oldószer. Természetes talaj használata esetén a vizsgált vegyi anyag bejuttatásához szennyezhetjük a talaj egy levegőn szárított részét a vizsgált vegyi anyaggal a mesterséges talajra vonatkozóan az imént bemutatott módon, vagy a nedves talajba keverhetjük a vizsgált vegyi anyagot, majd a következő lépésben elpárologtatjuk az oldódást segítő szert, amennyiben ilyet használtunk. A nedves talaj oldószerekkel való érintkezését általában amennyire csak lehet kerülni kell. Figyelembe kell venni a következőket (3):
—
Ha nem vizet használunk oldószerként, akkor olyan oldószert kell használni, amely vízzel elegyíthető, és/vagy eltávolítható (például elpárologtatható) úgy, hogy csak a vizsgált vegyi anyag maradjon a talajban.
—
Az oldószer vizsgálatára szolgáló kontroll használata esetén negatív kontroll nem szükséges. Az oldószer vizsgálatára szolgáló kontroll edénynek a legnagyobb koncentrációban kell tartalmaznia a talajhoz adott oldószert, amelynek ugyanabból a tételből kell származnia, mint amelyet a törzsoldat készítéséhez használtunk. Az oldódást segítő megfelelő szer kiválasztásának fő szempontjai az oldószer toxikus hatása és illékonysága, valamint a vizsgált vegyi anyag választott oldószerben való oldhatósága.
24.
Vízben és szerves oldószerekben rosszul oldódó vizsgált vegyi anyagok esetén a kívánt vizsgálati koncentráció eléréséhez vizsgálati edényenként 2,0–2,5 g finomra őrölt kvarchomokot összedolgozhatunk a vizsgált vegyi anyag megfelelő mennyiségével például mozsárban. A kvarchomok és a vizsgált vegyi anyag e keverékét hozzáadjuk az előnedvesített talajhoz, és alaposan elkeverjük megfelelő mennyiségű ionmentesített vízzel úgy, hogy a szükséges nedvességtartalmat kapjuk. A végtermékként kapott keveréket elosztjuk a vizsgálati edények között. Az eljárást minden egyes vizsgálati koncentráció esetén megismételjük, és egy vizsgálati edényenként 2,0–2,5 g finomra őrölt kvarchomokot tartalmazó, megfelelő kontroll edényt is készítünk.
25.
A szennyezést követően meg kell határozni a vizsgált vegyi anyag koncentrációját a talajban. A vizsgálathoz használt organizmusok behelyezése előtt ellenőrizni kell a vizsgált vegyi anyag homogén eloszlását a talajban. A szennyezési módszert és az adott szennyezési eljárás indoklását dokumentálni kell (24).
26.
A talaj és a pórusvíz fázis közötti egyensúlynak ideális esetben a vizsgálathoz használt organizmusok behelyezése előtt be kell állnia; 20 °C hőmérsékleten erre négy napot ajánlott számítani. Számos vízben rosszul oldódó szerves vegyi anyag esetében az adszorbeálódott és oldott frakciók közötti valódi egyensúly eléréséhez napokra vagy hónapokra lehet szükség. A vizsgálat céljától függően, például ha a környezeti feltételeket kell utánozni, a mesterségesen szennyezett talaj hosszabb ideig »érlelhető«, például fémek esetében három héten keresztül 20 °C hőmérséklet mellett (22).
A vizsgálathoz használt organizmusok tenyésztése
27.
A férgeket lehetőleg állandó laboratóriumi tenyészetben kell tartani. Az Eisenia fetida és az Eisenia andrei, valamint a televényféreg fajok laboratóriumi körülmények közötti tenyésztésének módszereire vonatkozóan az 5. függelék ad útmutatást (lásd még (48) (51) (52)).
28.
A vizsgálathoz használt férgeken nem lehetnek megfigyelhető betegségek, rendellenességek és paraziták.
A VIZSGÁLAT ELVÉGZÉSE
29.
A vizsgálathoz használt organizmusokat a felvételi fázisban tesszük ki a vizsgált vegyi anyag hatásának. A felvételi fázis 14 nap (televényférgeknél) vagy 21 nap (földigilisztáknál), kivéve, ha kimutatható, hogy az állandósult állapot elérése ennél előbb bekövetkezett.
30.
Az ürülési fázishoz a férgeket át kell helyezni a vizsgált vegyi anyagot nem tartalmazó talajba. Az első mintavételt az ürülési fázis kezdete után 4 – 24 órával kell végezni. A 21 napos felvételi fázisra és 21 napos ürülési fázisra vonatkozó mintavételi ütemtervekre a 3. függelék mutat be példákat.
A vizsgálathoz használt organizmusok
31.
A szárazföldi televényférgek számos fajánál az egyedtömeg nagyon kicsi (például az Enchytraeus albidus esetében egy egyed nedves tömege 5–10 mg, az Enchytraeus crypticus vagy az Enchytraeus luxuriosus esetében pedig még kevesebb); a tömegmérések és a kémiai analízisek elvégzéséhez szükség lehet az egyes ismétlésekhez tartozó férgek együttes vizsgálatára (azaz az adott ismétléshez tartozó valamennyi férget fel kell használni ahhoz, hogy egyetlen analitikai szöveteredményt kapjunk). Minden egyes ismétléshez 20 televényféreg egyedet kell használni, és legalább három ismétlést kell alkalmazni. Ha a vizsgált vegyi anyag analitikai kimutathatósági határértéke magas, több féregre lehet szükség. Ha a vizsgálathoz nagyobb egyedtömeggel rendelkező fajokat használunk (Eisenia fetida és Eisenia andrei), akkor egy egyedet tartalmazó ismétlések is használhatók.
32.
A vizsgálathoz hasonló tömegű földigilisztákat (például az Eisenia fetida és az Eisenia andrei esetében 250–600 mg tömegű egyedeket) kell használni. A televényférgeknek (például Enchytraeus albidus) körülbelül 1 cm hosszúnak kell lenniük. Az egy adott vizsgálathoz használt valamennyi féregnek ugyanabból a forrásból kell származnia, és kifejlett állatnak kell lennie, amelynél a nyereg (clitellum) már kialakult (lásd az 5. függeléket). Mivel az állatok tömege és kora hatással lehet a BAF értékekre (például az eltérő lipdtartalom és/vagy a peték jelenléte következtében), ezeket a paramétereket pontosan dokumentálni kell, és figyelembe kell venni az eredmények értelmezése során. Az expozíciós időszak alatt lerakott gubók is befolyásolhatják a BAF értékeket. Az átlagos nedves és a száraz tömeg becslése végett ajánlott a vizsgálat előtt lemérni a vizsgálathoz használt férgek egy részmintáját.
33.
A talaj férgekhez viszonyított arányának elég nagynak kell lennie ahhoz, hogy a felvételi fázisban minél kevésbé csökkenjen a vizsgált vegyi anyag koncentrációja a talajban. Eisenia fetida, illetve Eisenia andrei használata esetén 50 g (száraz tömeg), a televényférgek esetében pedig 10–20 g (száraz tömeg) egy féregre jutó minimális talajmennyiség biztosítása ajánlott. Az edényeknek 2–3 cm (televényférgeknél), illetve 4–5 cm (földigilisztáknál) talajréteget kell tartalmazniuk.
34.
A tenyészetből kivesszük a vizsgálathoz használni kívánt férgeket (például ékszerész csipesszel televényférgek használata esetén). A kifejlett állatokat nem kezelt kísérleti talajba helyezzük, hogy akklimatizálódjanak, és tápláljuk (lásd a 36. bekezdést). Ha a vizsgálati körülmények eltérnek a tenyésztési körülményektől, akkor 24–72 órás akklimatizálódási időszak szükséges ahhoz, hogy a férgek alkalmazkodjanak a vizsgálati körülményekhez. Az akklimatizációt követően a földigilisztákat tiszta vizet tartalmazó üvegedényekbe (például petri-csészékbe) helyezzük, és leöblítjük, majd azt követően lemérjük a tömegüket, mielőtt a vizsgálathoz használt talajba helyeznénk őket. A mérés előtt a férgeket finoman az edény széléhez kell ütögetni, vagy enyhén megnedvesített papírtörölközővel óvatosan meg kell őket törölgetni, hogy a felesleges vizet eltávolíthassuk róluk.
35.
A vizsgálathoz használt organizmusok viselkedését figyelni és dokumentálni kell. A földigilisztákkal végzett kísérletekben az állatok (a kontroll és a kezelt csoport egyaránt) akkor mutatnak normális viselkedést, ha néhány órán belül beássák magukat a talajba; ezt a férgek vizsgálati edényekbe való behelyezését követő 24 órán belül ellenőrizni kell. Ha a földigiliszták nem ássák be magukat a talajba (például a felvételi fázis félidejét több mint 10 %-kal meghaladó időszak elteltével), az vagy arra utal, hogy a vizsgálati körülmények nem megfelelők, vagy arra, hogy a vizsgálathoz használt organizmusok nem egészségesek. Ilyen esetben a vizsgálatot le kell állítani, és meg kell ismételni. A televényférgek főként a talajszemcsék közti pórusokban élnek, és kültakarójuk gyakran csak részben érintkezik a környező szubsztrátummal; a televényférgek esetében az expozíciót egyenértékűnek tételezzük fel függetlenül attól, hogy beássák-e magukat a talajba, vagy sem, és az utóbbi esetben a vizsgálatot nem feltétlenül szükséges megismételni.
Táplálás
36.
Ha a vizsgálathoz használt talaj összes szerves széntartalma alacsony, akkor a férgeket táplálni kell. Mesterséges talaj használata esetén az ajánlott heti táplálékadag (amelyet hetente egyszer kell adni) a földigilisztáknál a talaj száraz tömegének minden grammjára 7 mg szárított istállótrágya, televényférgeknél pedig a talaj száraz tömegének minden grammjára 2–2,5 mg őrölt zabpehely (11). Az első táplálékadagot közvetlenül a vizsgálathoz használt organizmusok behelyezését követően kell a talajba keverni. Lehetőleg ugyanolyan típusú táplálékot kell használni, mint a tenyésztés során (lásd az 5. függeléket).
Fény és hőmérséklet
37.
A vizsgálatot szabályozott, 16 órás világos és 8 órás sötét periódusból álló ciklusokat alkalmazva kell végezni, lehetőleg úgy, hogy a vizsgálati edények 400–800 lx fényt kapjanak (3). A vizsgálat teljes időszaka alatt 20 ± 2 °C hőmérsékletet kell biztosítani.
Vizsgálati koncentrációk
38.
A vizsgálathoz egyetlen koncentrációt használunk. A további koncentráció(k) szükségességét indokolni kell. Az analitikai kimutathatósági határértékhez közeli toxicitású (ECx) vegyi anyag vizsgálata esetén nagy fajlagos aktivitást biztosító radioaktív jelölésre van szükség. Fémek esetén a koncentrációnak a szövetre és a talajra jellemző háttérszint felett kell lennie.
Ismétlések
39.
A kinetikai mérésekhez (a felvételi és az ürülési fázisban) mintavételi pontonként legalább három ismétlést kell alkalmazni minden egyes kezelt edény esetében. Összességében az ismétlésszámnak elegendőnek kell lennie ahhoz, hogy a felvételi és az ürülési fázisban valamennyi mintavételt el lehessen végezni a megfelelő időpontban.
40.
A biológiai megfigyelésekhez és mérésekhez (például a száraz és nedves tömeg aránya, lipidtartalom), valamint a férgek és a talaj háttér-koncentrációjának analíziséhez használt negatív kontrollok esetében legalább 12 ismétlés szükséges (négy a vizsgálat kezdetén, négy a felvételi fázis végén és négy az ürülési fázis végén végzett mintavételekhez), amennyiben a vízen kívül más oldószert nem használunk. Ha a vizsgált vegyi anyaggal való szennyezéshez oldódást segítő szert használtunk, akkor a kezelt ismétlések mellett a vizsgált vegyi anyagon kívül minden egyéb összetevőt tartalmazó kontrollokat is be kell állítani a szolubilizáló szer hatásának az ellenőrzésére (négy ismétlést a vizsgálat kezdetén, négyet a felvételi fázis végén és négyet az ürülési fázis végén végzett mintavételekhez). Ebben az esetben a negatív kontrollok esetében további négy ismétlésre (oldószert nem tartalmazó edények) lehet szükség a felvételi fázis végén végzett választható mintavételekhez. Ezek az ismétlések az oldószer kontrollal való biológiai összehasonlításra szolgálnak, amelyből az oldószer vizsgálathoz használt organizmusokra gyakorolt lehetséges hatásáról kaphatunk tájékoztatást. Ajánlatos elegendő számú (például nyolc) további tartalék ismétlést is biztosítani mind a kezelt, mind a kontroll edényekhez.
A talajminőség-mérés gyakorisága
41.
A vizsgálat kezdetén, valamint a felvételi és az ürülési fázisok végén meg kell mérni a talaj pH-ját és nedvességtartalmát, valamint a vizsgálat elvégzésére szolgáló helyiség (állandó) hőmérsékletét. A talaj nedvességtartalmát hetente egyszer ellenőrizni kell, amelyhez meg kell mérni a vizsgálati edények tömegét, és a tényleges értékeket össze kell hasonlítani a vizsgálat kezdetén mért kiindulási értékekkel. A vízveszteséget ionmentesített víz hozzáadásával pótolni kell.
A féreg- és talajminták gyűjtése és analízise
42.
A földigilisztával és televényféreggel végzett biológiai felhalmozódási vizsgálatok felvételi és ürítési fázisaira vonatkozó ütemterv egy példáját a 3. függelék mutatja be.
43.
A vizsgált vegyi anyag koncentrációjának a meghatározásához a férgek behelyezése előtt, valamint a felvételi és az ürülési fázis során talajmintákat kell venni a vizsgálati edényekből. A vizsgálat során meg kell határozni a vizsgált vegyi anyag koncentrációjának alakulását a férgekben és a talajban. Általában a talajra jellemző összkoncentrációt szokás mérni. Kiegészítésképpen a pórusvízre jellemző koncentráció is mérhető; ebben az esetben a vizsgálat megkezdése előtt ki kell dolgozni az indoklást és a megfelelő módszereket, amelyeknek a jegyzőkönyvben is szerepelniük kell.
44.
A felvételi és az ürülési fázis során legalább hat alkalommal kell féreg- és talajmintákat gyűjteni. Ha a vizsgált vegyi anyag stabilitása bizonyított, a talajanalízisek száma csökkenthető. A felvételi fázis kezdetén és végén ajánlott legalább három ismétlést analizálni. Ha a talajban mért koncentráció a felvételi fázis végén több mint 30 %-kal eltér a kezdeti koncentrációtól, akkor a más napokon vett talajmintákat is analizálni kell.
45.
Minden egyes mintavétel alkalmával el kell távolítani a férgeket az adott edény talajtartalmából (például az edény talajtartalmát egy nem túl mély tálon szétterítjük, majd egy puha ékszerész csipesszel kiemeljük a férgeket), és vízzel gyorsan át kell öblíteni egy nem túl mély pohárban vagy acéltálban. A fölösleges vizet el kell távolítani (lásd a 34. bekezdést). A férgeket óvatosan át kell helyezni egy előre lemért edénybe, majd azonnal le kell mérni a béltartalommal együtt.
46.
Ezt követően hagyni kell, hogy a földigiliszták (Eisenia sp.) az éjszaka folyamán kiürítsék a béltartalmukat, például egy lefedett petri-csészében elhelyezett nedves szűrőpapíron (lásd a 34. bekezdést). A béltartalom ürítését követően a biomassza vizsgálat időszaka alatti esetleges csökkenésének az értékelése céljából meg kell határozni a férgek tömegét (lásd az érvényességi kritériumokat a 17. bekezdésben). A televényférgek tömegének mérését és szövetelemzését a béltartalom ürítése nélkül kell elvégezni, ám ez a férgek kis mérete miatt technikailag nehezen lenne kivitelezhető. A végleges tömeg meghatározását követően a férgeket azonnal el kell pusztítani a lehető legmegfelelőbb módszert alkalmazva (például folyékony hidrogénnel vagy –18 °C alatti hőmérsékletre történő fagyasztással).
47.
Az ürülési fázis során a férgek szennyezett béltartalma tiszta talajra cserélődik. Ez azt jelenti, hogy ha a közvetlenül az ürülési fázis előtt vett mintában szereplő férgeken a béltartalom ürítése nélkül végezzük el a méréseket (televényférgek esetében), akkor azok a szennyezett talajból álló béltartalmat is tartalmazni fogják. A vízi kevéssertéjűek esetében azt feltételezzük, hogy az ürülési fázis első 4–24 órájában a szennyezett béltartalom nagy része tiszta üledékre cserélődik, például (46). Földigiliszták esetében hasonló eredmények születtek a radioaktívan jelölt kadmium és cink felhalmozódására vonatkozó vizsgálatok során (78). A televényférgek esetében az ürülési fázisban elsőként vett mintában mért koncentrációt lehet a béltartalom kiürülése utáni szövetkoncentrációnak tekinteni. Annak ellensúlyozása végett, hogy a vizsgált vegyi anyag koncentrációja a nem szennyezett talaj általi hígítás miatti csökkenhet az ürülési fázisban, a béltartalom tömegét a férgek nedves tömegének az elpusztult férgek tömegéhez viszonyított aránya, illetve a férgek száraz tömegének az elpusztult férgek tömegéhez viszonyított aránya alapján is meg lehet becsülni.
48.
A lebomlás vagy egyéb veszteségek elkerülése érdekében a talaj- és féregmintákat lehetőleg közvetlenül az edényből való eltávolítást követően (vagyis 1–2 napon belül) kell analizálni, és ajánlott közelítő felvételi és ürülési sebesség értékeket számítani, ahogy a vizsgálat halad előre. Ha az analízist késleltetni kell, akkor a mintákat megfelelő módszert alkalmazva, például mélyhűtve (≤ -18 °C) kell tárolni.
49.
Ellenőrizni kell, hogy a kémiai analízis pontossága és reprodukálhatósága, valamint a vizsgált vegyi anyag talaj- és féregmintákból való visszanyerése megfelel az adott módszernek; dokumentálni kell az extrakciós hatékonyságot, a kimutathatósági határértéket (LOD) és a mennyiségi meghatározás határértékét (LOQ). Hasonlóképpen ellenőrizni kell, hogy a vizsgált vegyi anyag nem mutatható ki a háttérnél nagyobb koncentrációban a kontroll edényekben. Ha a vizsgált vegyi anyag koncentrációja a vizsgálathoz használt organizmusokban (Ca) a kontroll férgek esetében nagyobb, mint 0, ezt a kinetikai paraméterek számításánál figyelembe kell venni (lásd a 2. függeléket). A vizsgálat során a mintákat mindvégig úgy kell kezelni, hogy a szennyeződés és a veszteség (például a vizsgált vegyi anyag mintavevő eszközön való adszorbeálódása következtében) a lehető legkisebb mértékű legyen.
50.
Radioaktívan jelölt vizsgált vegyi anyagok használata esetén lehetőség van a kiindulási anyag és a metabolitok analízisére. A vizsgált kiindulási vegyi anyag és a metabolitok mennyiségi meghatározása az állandósult állapotban vagy a felvételi fázis végén fontos információkat szolgáltat. A mintákat ezt követően »meg kell tisztítani«, hogy a vizsgált kiindulási vegyi anyag mennyisége külön is meghatározható legyen. Ajánlott azonosítani azokat a metabolitokat, amelyek önmagukban meghaladják az analizált minta (minták) összes radioaktivitásának 10 %-át.
51.
Dokumentálni és a jegyzőkönyvben is szerepeltetni kell az összes visszanyerést, a vizsgált vegyi anyag visszanyerését a férgekben, a talajban és – ha a vizsgálatban szerepelnek – az elpárolgott vizsgált anyag elnyelésére szolgáló abszorbenst tartalmazó csapdákban.
52.
Az adott vizsgálati edényből vett mintában szereplő egyedek összevonása a földigilisztánál kisebb televényférgek használata esetén elfogadható. Az ismétlések számának csökkenésével járó összevonás azonban korlátozza az adatok feldolgozására alkalmazható statisztikai eljárásokat. Ha egy adott statisztikai eljárást kell alkalmazni, vagy a próba erejének el kell érnie egy bizonyos szintet, akkor a vizsgálat során olyan számú ismétlést kell alkalmazni, amely a kívánt összevonás mellett az ezeknek a követelményeknek való megfelelést is biztosítja.
53.
A BAF értékét ajánlott egyaránt kifejezni az összes száraz súly függvényében és – ha szükséges (azaz erősen hidrofób vegyi anyagok esetén) – a lipidtartalom függvényében. A lipidtartalom meghatározására megfelelő módszereket kell alkalmazni (egyes létező módszerek – például (31) (58) – e célra történő adaptálásával). Ezek a módszerek a kloroform/metanol extrakciós technikára épülnek. A klórozott oldószerek használata azonban kerülendő, a Bligh- és Dyer-féle módszer (9) szakirodalomban (17) leírt módosítását kell alkalmazni. Mivel előfordulhat, hogy a különböző módszerek eltérő értékeket eredményeznek, az alkalmazott módszert részletesen ismertetni kell. Amennyiben lehetséges, vagyis ha elegendő féregszövet áll rendelkezésre, akkor a lipidanalízist a vizsgált anyag analíziséhez használttal azonos mintán vagy extraktumon kell elvégezni, mivel a lipideket gyakran el kell távolítani az extraktumból ahhoz, hogy kromatográfiás módszerrel analizálható legyen (49). A másik lehetőség, hogy kontroll állatokat használunk a lipidtartalom mérésére, amelyre majd a BAF értékeket vonatkoztathatjuk. Ha ezt az utóbbi megközelítést használjuk, akkor a felszerelés kevésbé szennyeződik a vizsgált vegyi anyaggal.
ADATOK ÉS JEGYZŐKÖNYVVEZETÉS
Az eredmények kezelése
54.
A vizsgált anyag felvételi görbéje az idő függvényében, aritmetikus skálán ábrázolja a vizsgált anyag férgekben/férgeken mért koncentrációjának alakulását a felvételi fázisban. Amennyiben a görbe kiegyenesedett, vagyis elérte az állandósult állapotot (a meghatározásokat lásd az 1. függelékben), az állandósult állapothoz tartozó BAFss biológiai felhalmozódási tényezőt a következőképpen kell kiszámítani:
Ca a vizsgált vegyi anyag koncentrációja a vizsgálathoz használt organizmusban
Cs a vizsgált vegyi anyag koncentrációja a talajban
55.
Ha nem állt be az állandósult állapot, akkor a BAFss helyett a kinetikai biológiai felhalmozódási tényezőt (BAFK) kell kiszámítani a sebességi állandók alapján, az alábbiak szerint:
—
A BAFK-t a ks és a ke hányadosaként kell meghatározni.
—
A felvételi és az ürülési sebességet lehetőleg párhuzamosan kell kiszámítani (lásd a 11. egyenletet a 2. függelékben).
—
Az ürülési sebességi állandó (ke) meghatározása általában az ürülési görbe alapján történik (amely a vizsgált tétel férgekben mért koncentrációjának az alakulását ábrázolja az ürülési fázisban). Ezt követően a felvételi sebességi állandó kiszámítható a ke adott értékéből, valamint a Ca felvételi görbéből levezetett értékéből – ezeknek a módszereknek a leírását lásd a 2. függelékben. A BAFK és a sebességi állandók meghatározásához lehetőleg számítógéppel végzett nemlineáris paraméterbecslést kell használni. Ha az ürülés folyamata nyilvánvalóan nem az elsőrendű kinetikát követi, akkor összetettebb modelleket kell alkalmazni.
Vizsgálati jegyzőkönyv
56.
A vizsgálati jegyzőkönyvnek a következőket kell tartalmaznia:
Vizsgált vegyi anyag:
—
A vizsgált vegyi anyag talajban élő kevéssertéjűekre gyakorolt akut vagy hosszú távú toxikus hatására vonatkozóan rendelkezésre álló információk (például ECx, LCx, NOEC)
—
kémiai tisztaság, fizikai jelleg, valamint fizikai és kémiai tulajdonságok, például log Kow, vízben való oldhatóság,
—
kémiai azonosító adatok; a vizsgált tétel származása, a használt oldószer meghatározása és koncentrációja,
—
radioaktívan jelölt vizsgált vegyi anyag használata esetén a jelölt atomok pontos elhelyezkedése, a fajlagos radioaktivitás és a radiokémiai tisztaság.
A vizsgálathoz felhasznált faj:
—
tudományos név, törzs, származás, esetleges előkezelés, akklimatizáció, életkor, mérettartomány, stb.
Vizsgálati körülmények:
—
az alkalmazott vizsgálati eljárás,
—
az alkalmazott megvilágítás típusa és jellemzői, valamint a fényperiódus(ok),
—
a vizsgálat kialakítása (például vizsgálati edények száma és mérete, talajtömeg és a talajréteg magassága, ismétlések száma, egy ismétlésre jutó férgek száma, vizsgálati koncentrációk száma, a felvételi és az ürítési fázisok időtartama, mintavételi gyakoriság),
—
a vizsgálati edény anyagának indoklása,
—
a vizsgálati tétel előkészítése és alkalmazása, valamint az adott módszer választásának okai,
—
a névleges vizsgálati koncentrációk, a vizsgálati edényekben mért értékek középértékei és szórásuk, valamint az ezen értékek előállításának módszere,
—
a mesterséges talaj összetevőinek a forrása vagy – természetes közeg használata esetén – a talaj származása, esetleges előkezelés leírása, kontroll eredmények (túlélés, biomassza képződés, szaporodás), a talaj jellemzői (pH, összes szerves széntartalom, részecskeméret-eloszlás (homok, iszap és agyag százalékaránya), WHCmax, százalékos víztartalom a vizsgálat elején és végén, valamint az elvégzett egyéb mérések),
—
a talaj- és féregminták kezelésének részletes bemutatása, beleértve az előkészítés részleteit, a tárolást, a szennyezési eljárásokat, az extrakciót és az analitikai eljárásokat (és pontosságukat) a férgekre és a talajra vonatkozóan, valamint a lipidtartalmat (ha a mérése szerepelt a vizsgálatban) és a vizsgált tétel visszanyerését.
Eredmények:
—
a férgek mortalitása a kontroll és az egyes vizsgálati edényekben, bármely megfigyelt rendellenes viselkedés (például talajkerülés, televényférgekkel végzett biológiai felhalmozódási vizsgálat esetén a szaporodás hiánya),
—
a talaj és a vizsgálathoz használt organizmusok száraz és nedves tömegének az aránya (hasznos a viszonyításhoz),
—
a férgek nedves tömege az egyes mintavételi időpontokban; földigilisztáknál a vizsgálat kezdetén és az egyes mintavételi időpontokban a béltartalom ürítése előtt és után mért nedves tömeg,
—
a vizsgálathoz használt organizmusok lipidtartalma (ha meghatározásra került),
—
a vizsgált vegyi anyag férgek általi felvételének és férgekből való kiürülésének kinetikáját ábrázoló görbék, valamint az állandósult állapot eléréséhez szükséges idő,
—
a mintavételi időpontokhoz tartozó Ca és Cs (szórással és tartománnyal együtt, esettől függően) (a Ca a férgek nedves és száraz tömegének kg-jára jutó g-ban, a Cs a talaj nedves és száraz tömegéhez kg-jára jutó g-ban kifejezve). Ha a bióta-talaj felhalmozódási tényezőt (BSAF) is meg kell határozni (például a különböző lipidtartalmú állatokkal végzett kettő vagy több vizsgálat eredményeinek az összehasonlítása céljára), a Ca az organizmus lipidtartalmának kg-jára jutó g-ban, a Cs pedig a talaj szerves szén (OC) tartalmának kg-jára jutó g-ban is kifejezhető,
—
ezeken kívül a jegyzőkönyvben szerepelhet még a BAF (amely azt fejezi ki, hogy a talaj hány grammja jut a férgek kilogrammjára), a talajból való felvétel sebességi állandója (amely azt fejezi ki, hogy egy napra vetítve a talaj hány grammja jut a férgek kilogrammjára), valamint a ke ürülési sebességi állandó (amely az egy napra jutó ürülés mértékét fejezi ki); a BSAF (amely azt fejezi ki, hogy a talaj szerves széntartalmának hány kilogrammja jut a férgek lipidtartalmának egy kilogrammjára),
—
ha a vizsgálatban a mérése szerepelt, a következők talajban és a vizsgálathoz használt állatokban kimutatott százaléka: a kiindulási vegyi anyag, a metabolitok és a megkötött maradványok (azaz a vizsgált vegyi anyag közönséges extrakciós módszerekkel nem kinyerhető százaléka),
—
az adatok statisztikai elemzéséhez használt módszerek.
Az eredmények értékelése:
—
az eredmények megfelelése a 17. bekezdésben felsorolt érvényességi kritériumoknak,
—
nem várt vagy szokatlan eredmények, például a vizsgált vegyi anyag nem teljes mértékű kiürülése a vizsgálathoz használt állatokból.
SZAKIRODALOM
(1)
Amorim M (2000). Chronic and toxicokinetic behavior of Lindane (γ-HCH) in the Enchytraeid Enchytraeus albidus. Master thesis, University Coimbra.
(2)
ASTM (2000). Standard guide for the determination of the bioaccumulation of sediment-associated contaminants by benthic invertebrates. American Society for Testing and Materials, E 1688-00a.
(3)
ASTM International (2004). Standard guide for conducting laboratory soil toxicity or bioaccumulation tests with the Lumbricid earthworm Eisenia fetida and the Enchytraeid potworm Enchytraeus albidus. ASTM International, E1676-04: 26 pp.
(4)
Beek B, Boehling S, Bruckmann U, Franke C, Joehncke U, Studinger G (2000). The assessment of bioaccumulation. In Hutzinger, O. (editor), The Handbook of Environmental Chemistry, Vol. 2 Part J (Vol. editor: B. Beek): Bioaccumulation – New Aspects and Developments. Springer-Verlag Berlin Heidelberg: 235–276.
(5)
Belfroid A, Sikkenk M, Seinen W, Van Gestel C, Hermens J (1994). The toxicokinetic behavior of chlorobenzenes in earthworms (Eisenia andrei): Experiments in soil. Environ. Toxicol. Chem. 13: 93–99.
(6)
Belfroid A, Van Wezel A, Sikkenk M, Van Gestel C, Seinen W & Hermens J (1993). The toxicokinetic behavior of chlorobenzenes in earthworms (Eisenia andrei): Experiments in water. Ecotox. Environ. Safety 25: 154–165.
(7)
Belfroid A, Meiling J, Drenth H, Hermens J, Seinen W, Van Gestel C (1995). Dietary uptake of superlipophilic compounds by earthworms (Eisenia andrei). Ecotox. Environ. Safety 31: 185–191.
(8)
Bell AW (1958). The anatomy of Enchytraeus albidus, with a key to the species of the genus Enchytraeus. Ann. Mus. Novitat. 1902: 1–13.
(9)
Bligh EG and Dyer WJ (1959). A rapid method of total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Pysiol. 37: 911–917.
(10)
Bouche M (1972). Lombriciens de France. Ecologie et Systematique. INRA, Annales de Zoologie-Ecologie animale, Paris, 671 p.
(11)
Bruns E, Egeler Ph, Moser T, Römbke J, Scheffczyk A, Spörlein P (2001a). Standardisierung und Validierung eines Bioakkumulationstests mit terrestrischen Oligochaeten. Report to the German Federal Environmental Agency (Umweltbundesamt Berlin), R&D No.: 298 64 416.
(12)
Bruns E, Egeler Ph, Römbke J Scheffczyk A, Spörlein P (2001b). Bioaccumulation of lindane and hexachlorobenzene by the oligochaetes Enchytraeus luxuriosus and Enchytraeus albidus (Enchytraeidae, Oligochaeta, Annelida). Hydrobiologia 463: 185–196.
(13)
Conder JM and Lanno RP (2003). Lethal critical body residues as measures of Cd, Pb, and Zn bioavailability and toxicity in the earthworm Eisenia fetida. J. Soils Sediments 3: 13–20.
(14)
Connell DW and Markwell RD (1990). Bioaccumulation in the Soil to Earthworm System. Chemosphere 20: 91–100.
(15)
Didden WAM (1993). Ecology of Terrestrial Enchytraeidae. Pedobiologia 37: 2–29.
(16)
Didden W (2003). Oligochaeta, In: Bioindicators and biomonitors. Markert, B.A., Breure, A.M. & Zechmeister, H.G. (eds.). Elsevier Science Ltd., The Netherlands, pp. 555–576.
(17)
De Boer J, Smedes F, Wells D, Allan A (1999). Report on the QUASH interlaboratory study on the determination of total-lipid in fish and shellfish. Round 1 SBT-2, Exercise 1000, EU, Standards, Measurement and Testing Programme.
(18)
Dietrich DR, Schmid P, Zweifel U, Schlatter C, Jenni-Eiermann S, Bachmann H, Bühler U, Zbinden N (1995). Mortality of birds of prey following field application of granular carbofuran: A Case Study. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 29: 140–145.
(19)
Az Európai Parlament és a Tanács 2006. December 18-I 1907/2006/EK rendelete a vegyi anyagok regisztrálásáról, értékeléséről, engedélyezéséről és korlátozásáról (REACH), az Európai Vegyianyag-ügynökség létrehozásáról, az 1999/45/EK irányelv módosításáról, valamint a 793/93/EGK tanácsi rendelet, az 1488/94/EK bizottsági rendelet, a 76/769/EGK tanácsi irányelv, a 91/155/EGK, a 93/67/RGK, a 93/105/EK és a 2000/21/EK bizottsági irányelv hatályon kívül helyezéséről, HL L 396., 2006.12.30., 1. o.
(20)
Edwards CA and Bohlen PJ (1996). Biology and ecology of earthworms. Third Edition, Chapman & Hall, London, 426 pp.
(21)
OECD (2008), Bioaccumulation in Sediment-dwelling Benthic Oligochates, Test Guideline No. 315, Guidelines for the testing of chemicals, OECD, Paris.
(22)
Egeler Ph, Gilberg D, Scheffczyk A, Moser Th and Römbke J (2009). Validation of a Soil Bioaccumulation Test with Terrestrial Oligochaetes by an International Ring Test (Validierung einer Methode zur standardisierten Messung der Bioakkumulation mit terrestrischen Oligochaeten). Report to the Federal Environmental Agency (Umweltbundesamt Dessau-Rosslau), R&D No.: 204 67 458: 149 pp. Available for download at: http://www.oecd.org/dataoecd/12/20/42552727.pdf.
(23)
Elmegaard N and Jagers op Akkerhuis GAJM (2000). Safety factors in pesticide risk assessment, Differences in species sensitivity and acute-chronic relations. National Environmental Research Institute, NERI Technical Report 325: 57 pp.
(24)
Environment Canada (1995). Guidance document on measurement of toxicity test precision using control sediments spiked with a reference toxicant. Environmental Protection Series Report EPS 1/RM/30.
Franke C (1996). How meaningful is the bioconcentration factor for risk assessment? Chemosphere 32: 1897–1905.
(27)
Franke C, Studinger G, Berger G, Böhling S, Bruckmann U, Cohors-Fresenborg D, Jöhncke U (1994). The assessment of bioaccumulation. Chemosphere 29: 1501–1514.
(28)
Füll C (1996). Bioakkumulation und Metabolismus von -1,2,3,4,5,6-Hexachlorcyclohexan (Lindan) und 2-(2,4-Dichlorphenoxy)-propionsäure (Dichlorprop) beim Regenwurm Lumbricus rubellus (Oligochaeta, Lumbricidae). Dissertation University Mainz, 156 pp.
(29)
Füll C, Schulte C, Kula C (2003). Bewertung der Auswirkungen von Pflanzenschutzmitteln auf Regenwürmer. UWSF – Z. Umweltchem, Ökotox. 15: 78–84.
(30)
Gabric A.J, Connell DW, Bell PRF (1990). A kinetic model for bioconcentration of lipophilic compounds by oligochaetes. Wat. Res. 24: 1225–1231.
(31)
Gardner WS, Frez WA, Cichocki EA, Parrish CC (1985). Micromethods for lipids in aquatic invertebrates. Limnology and Oceanography 30: 1099–1105.
(32)
Hawker DW and Connell DW (1988). Influence of partition coefficient of lipophilic compounds on bioconcentration kinetics with fish. Wat. Res. 22: 701–707.
(33)
Hund-Rinke K and Wiechering H (2000). Earthworm avoidance test for soil assessments: An alternative for acute and reproduction tests. J. Soils Sediments 1: 15–20.
(34)
Hund-Rinke K, Römbke J, Riepert F, Achazi R (2000). Beurteilung der Lebensraumfunktion von Böden mit Hilfe von Regenwurmtests. In: Toxikologische Beurteilung von Böden. Heiden, S., Erb, R., Dott, W. & Eisentraeger, A. (eds.), Spektrum Verl., Heidelberg, 59–81.
(35)
ISO 11268-2 (1998) Talajminőség. Szennyező anyagok hatása a földigilisztára (Eisenia fetida). 2. rész: A reprodukciós hatások meghatározása.
(36)
Jaenike J (1982). »Eisenia foetida« is two biological species. Megadrilogica 4: 6–8.
(37)
Jager T (1998). Mechanistic approach for estimating bioconcentration of organic chemicals in earthworms (Oligochaeta). Environ. Toxicol. Chem. 17: 2080–2090.
(38)
Jager T, Sanchez PA, Muijs B, van der Welde E, Posthuma L (2000). Toxicokinetics of polycyclic aromatic hydrocarbons in Eisenia andrei (Oligochaeta) using spiked soil. Environ. Toxicol. Chem. 19: 953–961.
(39)
Jager T, Baerselman R, Dijkman E, De Groot AC, Hogendoorn EA, DeJong A, Kruitbosch JAW, Peijnenburg W J G. M (2003a). Availability of polycyclic aromatic hydrocarbons to earthworms (Eisenia andrei, Oligochaeta) in field-polluted soils and soil-sediment mixtures. Environ. Toxicol. Chem. 22: 767–775.
(40)
Jager T, Fleuren RLJ, Hoogendoorn E, de Korte G (2003b). Elucidating the routes of exposure for organic chemicals in the earthworm, Eisenia andrei (Oligochaeta). Environ. Sci. Technol. 37: 3399–3404.
(41)
Janssen MPM, Bruins A, De Vries TH, Van Straalen NM (1991). Comparison of cadmium kinetics in four soil arthropod species. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 20: 305–312.
(42)
Kasprzak K (1982). Review of enchytraeid community structure and function in agricultural ecosystems. Pedobiologia 23: 217–232.
(43)
Khalil AM (1990). Aufnahme und Metabolismus von 14C-Hexachlorbenzol und 14C-Pentachlornitrobenzol in Regenwürmern. Dissertation University München, 137 pp.
(44)
Landrum PF (1989). Bioavailability and toxicokinetics of polycyclic aromatic hydrocarbons sorbed to sediments for the amphipod Pontoporeia hoyi. Environ. Sci. Toxicol. 23: 588–595.
(45)
Marinussen MPJC, Van der Zee SEATM, De Haan FA (1997). Cu accumulation in Lumbricus rubellus under laboratory conditions compared with accumulation under field conditions. Ecotox. Environ. Safety 36: 17–26.
(46)
Mount DR, Dawson TD, Burkhard LP (1999). Implications of gut purging for tissue residues determined in bioaccumulation testing of sediment with Lumbriculus variegates. Environ. Toxicol. Chem. 18: 1244–1249.
(47)
Nendza M (1991). QSARs of bioaccumulation: Validity assessment of log Kow/log BCF correlations, In: R. Nagel and R. Loskill (eds.): Bioaccumulation in aquatic systems, Contributions to the assessment, Proceedings of an international workshop, Berlin 1990, VCH, Weinheim.
(48)
E melléklet C.8. fejezete: Toxicitás földigilisztákra.
(49)
E melléklet C.13. fejezete: Biokoncentráció vizsgálata: átfolyásos hal vizsgálat.
(50)
E melléklet C.21. fejezete: Talajlakó mikroorganizmusok: nitrogén-átalakítási vizsgálat.
(51)
OECD (2004a), Enchytraeid reproduction test, Test Guideline No. 220, Guidelines for the testing of chemicals, OECD, Paris.
(52)
OECD (2004b), Earthworm reproduction test (Eisenia fetida/Eisenia Andrei), Test Guideline No. 222, Guidelines for the testing of chemicals, OECD, Paris.
(53)
OECD (2008), Bioaccumulation in Sediment-dwelling Benthic Oligochates, Test Guideline No. 315, Guidelines for the testing of chemicals, OECD, Paris.
(54)
Petersen H and Luxton M (1982). A comparative analysis of soil fauna populations and their role in decomposition processes. Oikos 39: 287–388.
(55)
Phillips DJH (1993). Bioaccumulation. In: Handbook of Ecotoxicology Vol. 1. Calow P. (ed.). Blackwell Scientific Publ., Oxford. 378–396.
(56)
Pflugmacher J (1992). Struktur-Aktivitätsbestimmungen (QSAR) zwischen der Konzentration von Pflanzenschutzmitteln und dem Octanol-Wasser-Koeffzienten UWSF- Z. Umweltchem. Ökotox. 4: 77–81.
(57)
Posthuma L, Weltje L, Anton-Sanchez FA (1996). Joint toxic effects of cadmium and pyrene on reproduction and growth of the earthworm Eisenia fetida. RIVM Report No. 607506001, Bilthoven.
(58)
Randall RC, Lee II H, Ozretich RJ, Lake JL, Pruell RJ (1991). Evaluation of selected lipid methods for normalising pollutant bioaccumulation. Environ.Toxicol. Chem. 10: 1431–1436.
(59)
Römbke J, Egele, P, Füll C (1998). Literaturstudie über Bioakkumulationstests mit Oligochaeten im terrestrischen Medium. UBA-Texte 28/98, 84 S.
(60)
Römbke J and Moser Th (1999). Organisation and performance of an international ring-test for the validation of the Enchytraeid reproduction test. UBA-Texte 4/99: 373 pp.
(61)
Römbke J, Riepert F, Achazi R (2000). Enchytraeen als Testorganismen, In: Toxikologische Beurteilung von Böden. Heiden, S., Erb, R., Dott, W. & Eisentraeger, A. (eds.). Spektrum Verl., Heidelberg. 105–129.
(62)
Romijn CA.FM, Luttik R, Van De Meent D, Slooff W,Canton JH (1993). Presentation of a General Algorithm to Include Effect Assessment on Secondary Poisoning in the Derivation of Environmental Quality Criteria, Part 2: Terrestrial food chains. Ecotox. Envir. Safety 27: 107–127.
(63)
Sample BE, Suter DW, Beauchamp JJ, Efroymson RA (1999). Literature-derived bioaccumulation models for earthworms: Development and validation. Environ. Toxicol. Chem. 18: 2110–2120.
(64)
Schlosser H-J and Riepert F (1992). Entwicklung eines Prüfverfahrens für Chemikalien an Bodenraubmilben (Gamasina), Teil 2: Erste Ergebnisse mit Lindan und Kaliumdichromat in subletaler Dosierung. Zool. Beitr. NF 34: 413–433.
(65)
Schmelz R and Collado R (1999). Enchytraeus luxuriosus sp. nov., a new terrestrial oligochaete species (Enchytraeide, Clitellata, Annelida). Carolinea 57: 93–100.
(66)
Sims R W and Gerard BM (1985). Earthworms, In: Kermack, D. M. & Barnes, R. S. K. (Hrsg.): Synopses of the British Fauna (New Series) No. 31. 171 S. London: E. J. Brill/Dr. W. Backhuys.
(67)
Sousa JP, Loureiro S, Pieper S, Frost M, Kratz W, Nogueira AJA, Soares AMVM (2000). Soil and plant diet exposure routes and toxicokinetics of lindane in a terrestrial isopod. Environ. Toxicol. Chem. 19: 2557–2563.
(68)
Spacie A and Hamelink JL (1982). Alternative models for describing the bioconcentration of organics in fish. Environ. Toxicol. Chem. 1, 309–320.
(69)
Stephenson GL, Kaushik A, Kaushik NK, Solomon KR, Steele T, Scroggins RP (1998). Use of an avoidance-response test to assess the toxicity of contaminated soils to earthworms. In: Advances in earthworm ecotoxicology. S. Sheppard, J. Bembridge, M. Holmstrup, L. Posthuma (eds.). Setac Press, Pensacola, 67–81.
(70)
Sterenborg I, Vork NA, Verkade SK, Van Gestel CAM, Van Straalen NM (2003). Dietary zinc reduces uptake but not metallothionein binding and elimination of cadmium in the springtail Orchesella cincta. Environ. Toxicol. Chemistry 22: 1167–1171.
(71)
UBA (Umweltbundesamt) (1991). Bioakkumulation – Bewertungskonzept und Strategien im Gesetzesvollzug. UBA-Texte 42/91. Berlin.
(72)
US EPA (2000). Methods for measuring the toxicity and bioaccumulation of sediment-associated contaminants with freshwater invertebrates. Second Edition, EPA 600/R-99/064, US, Environmental Protection Agency, Duluth, MN, March 2000.
(73)
Van Brummelen TC and Van Straalen NM (1996). Uptake and elimination of benzo(a)pyrene in the terrestrial isopod Porcellio scaber. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 31: 277–285.
(74)
Van Gestel CAM. (1992). The influence of soil characteristics on the toxicity of chemicals for earthworms; a review, In: Ecotoxicology of Earthworms (Ed. Becker, H, Edwards, PJ, Greig-Smith, PW & Heimbach, F). Intercept Press, Andover (GB).
(75)
Van Gestel CA and Ma W-C (1990). An approach to quantitative structure-activity relationships (QSARs) in earthworm toxicity studies. Chemosphere 21: 1023–1033.
(76)
Van Straalen NM, Donker MH, Vijver MG, van Gestel CAM (2005). Bioavailability of contaminants estimated from uptake rates into soil invertebrates. Environmental Pollution 136: 409–417.
(77)
Venter JM and Reinecke AJ (1988). The life-cycle of the compost-worm Eisenia fetida (Oligochaeta). South African J. Zool. 23: 161–165.
(78)
Vijver MG, Vink JPM, Jager T, Wolterbeek HT, van Straalen NM, van Gestel CAM (2005). Biphasic elimination and uptake kinetics of Zn and Cd in the earthworm Lumbricus rubellus exposed to contaminated floodplain soil. Soil Biol, Biochem. 37: 1843–1851.
(79)
Widianarko B and Van Straalen NM (1996). Toxicokinetics-based survival analysis in bioassays using nonpersistent chemicals, Environ. Toxicol. Chem. 15: 402–406.
1. függelék
FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK
Biológiai felhalmozódás: a vizsgált vegyi anyag koncentrációjának növekedése egy szervezetben/szervezeten a vizsgált vegyi anyagnak a környező közegben lévő koncentrációjához viszonyítva. A biológiai felhalmozódás biokoncentrációs és biomagnifikációs folyamatok eredménye (lásd lentebb).
Biokoncentráció: a vizsgált vegyi anyag koncentrációjának növekedése egy szervezetben/szervezeten – a vegyi anyagnak kizárólag a környező közegből való (vagyis a testfelületen keresztüli és talajemésztéssel történő) felvétele eredményeként – a vizsgált vegyi anyagnak a környező közegben lévő koncentrációjához viszonyítva.
Biomagnifikáció: a vizsgált vegyi anyag koncentrációjának növekedése egy szervezetben/szervezeten – kizárólag szennyezett táplálékból vagy zsákmányállatból való felvétel eredményeként – a vizsgált vegyi anyagnak a szennyezett táplálékban vagy zsákmányállatban lévő koncentrációjához viszonyítva. A biomagnifikáció a vizsgált tétel táplálékhálón belüli átadásához vagy felhalmozódásához vezethet.
Ürülés: a vizsgált vegyi anyag kiürülése a vizsgálathoz használt organizmus szövetéből aktív vagy passzív folyamatok eredményeként, amelyek a vizsgált vegyi anyag környező közegben való jelenlététől vagy hiányától függetlenül mennek végbe.
Biológiai felhalmozódási tényező (BAF): a vizsgált vegyi anyag biológiai felhalmozódási vizsgálat felvételi fázisának bármely időpontjában a vizsgálathoz használt organizmusban/organizmuson mért koncentrációjának (Ca, a férgek száraz tömegének kg-jára jutó grammban kifejezve) és a vegyi anyag környező közegben lévő koncentrációjának a hányadosa (Cs, a talaj száraz tömegének kg-jára jutó grammban kifejezve); a BAF azt fejezi ki, hogy a talaj hány kilogrammja jut a férgek egy kilogrammjára.
Állandósult állapothoz tartozó biológiai felhalmozódási tényező (BAFss): az állandósult állapothoz tartozó BAF, amely nem változik jelentősen egy hosszabb időtartamon keresztül, amely alatt a vizsgált vegyi anyag koncentrációja a környező közegben (Cs, a talaj száraz tömegének kg-jára jutó grammban kifejezve) állandó.
A közvetlenül a talajból való felvétel sebességi állandója és az ürülési sebességi állandó (ks és ke, lásd lentebb) hányadosából számított biológiai felhalmozódási tényezőt kinetikai biológiai felhalmozódási tényezőnek (BAFK) nevezzük.
Bióta-talaj felhalmozódási tényező (BSAF): a vizsgált vegyi anyag vizsgálathoz használt organizmusban/organizmuson mért, lipidtartalomra vonatkoztatott koncentrációjának és a vizsgált vegyi anyag talajban mért, szerves széntartalomra vonatkoztatott koncentrációjának a hányadosa az állandósult állapotban. A Ca-t az organizmus lipidtartalmának kilogrammjára jutó grammban, a Cs-t a talaj szerves széntartalmának kilogrammjára jutó grammban fejezzük ki; a BSAF azt fejezi ki, hogy a talaj szerves széntartalmának hány kilogrammja jut a férgek lipidtartalmának egy kilogrammjára.
Állandósult állapot vagy plató: az expozíciós fázisban párhuzamosan végbemenő felvételi és ürülési folyamatok közötti egyensúly. Az állandósult állapot akkor következik be, amikor a BAF alakulását az idő függvényében ábrázoló görbe párhuzamossá válik az időtengellyel, és a legalább kétnapos időközönként vett három egymást követő mintán végzett BAF analízis eredménye 20 %-nál kisebb eltérést mutat, és a három mintavételi időszak nem mutat statisztikailag számottevő eltéréseket. Ha a vizsgált vegyi anyag felvétele lassú, helyénvalóbb lehet a hétnapos időközök alkalmazása (49).
Szerves szén – víz megoszlási hányados (Koc): a vegyi anyag talaj szerves szén frakciójában/frakcióján és vízben mért koncentrációjának a hányadosa az egyensúlyi állapotban.
Oktanol – víz megoszlási hányados (Kow): a vegyi anyag n-oktanolban és vízben való oldhatóságának a hányadosa az egyensúlyi állapotban, esetenként Pow-val is jelölik. A vegyi anyag vízi szervezetekben való felhalmozódási képességének kifejezésére a Kow logaritmusát (log Kow) használjuk.
Felvételi vagy expozíciós fázis: azt az időtartamot jelöli, amelyen keresztül a vizsgálathoz használt organizmusok ki vannak téve a vizsgált vegyi anyag hatásának.
Talajból való felvétel sebességi állandója (ks): a vizsgált tétel vizsgálathoz használt organizmusban/organizmuson mért koncentrációjának a vizsgált tétel talajfázisból való felvétele eredményeként bekövetkező növekedésének az ütemét meghatározó számérték. A ks azt fejezi ki, hogy egy napra vetítve a talaj hány grammja jut a férgek kilogrammjára.
Ürülési fázis: azt az időtartamot jelöli, amelyen keresztül a vizsgált vegyi anyag vizsgálathoz használt organizmusokból való kiürülését (vagy a vizsgálathoz használt organizmusokban való nettó csökkenését) vizsgáljuk a vizsgálathoz használt organizmusok szennyezett közegből a vizsgált anyagot nem tartalmazó közegbe való áthelyezését követően.
Ürülési sebességi állandó (ke): a vizsgált tétel vizsgálathoz használt organizmusban/organizmuson mért koncentrációjának a vizsgálathoz használt organizmusok vizsgált anyagot tartalmazó közegből a vizsgált anyagot nem tartalmazó közegbe való áthelyezését követő csökkenésének az ütemét meghatározó számérték; a ke az egy napra jutó ürülés mértékét fejezi ki.
Vizsgált vegyi anyag: Bármely, ennek a vizsgálati módszernek az alkalmazásával vizsgált anyag vagy keverék.
2. függelék
A felvételi és az ürülési paraméterek kiszámítása
A biológiai felhalmozódási vizsgálatok fő végpontja a biológiai felhalmozódási tényező (BAF). A BAF értéke az állandósult állapotban a vizsgálathoz használt organizmusban mért koncentráció (Ca) és a talajban mért koncentráció (Cs) hányadosaként számítható ki. Ha a felvételi fázisban nem következik be az állandósult állapot, az állandósult állapothoz tartozó biológiai felhalmozódási tényező (BAFss) helyett a kinetikai biológiai felhalmozódási tényezőt (BAFK) kell kiszámítani a sebességi állandókból. Jelezni kell azonban, hogy a BAF az állandósult állapothoz tartozó koncentrációkon alapul-e vagy sem.
A BAFK, a talajból való felvétel sebességi állandója (ks) és az ürülési sebességi állandó (ke) meghatározása általában számítógéppel végzett nemlineáris paraméterbecsléssel történik, például a szakirodalomban (68) leírt modellek alapján. Ezek a számítógépes programok az egymást követő időpontokban gyűjtött koncentráció adatokból és a következő modellegyenletekből számítják ki a BAFK, a ks és a ke értékeit:
0 < t < tc
[1. egyenlet]
vagy
t > tc
[2. egyenlet]
ahol:
Ca
=
a vegyi anyag koncentrációja a férgekben [nedves vagy száraz tömeg kg-jára jutó g]
ks
=
szövetben való felvételi sebességi állandó [a talaj egy napra vetítve a férgek kg-jára jutó grammja]
Cs
=
a vegyi anyag koncentrációja a talajban [nedves vagy száraz tömeg kg-jára jutó g]
ke
=
ürülési sebességi állandó [1/nap]
tc
=
a felvételi fázis végének időpontja
Ha a vizsgált vegyi anyag hatásának ki nem tett férgekben a háttér-koncentráció – például a 0. napon – jelentős mértékben eltér a nullától (ez például fémek esetén fordulhat elő), akkor a háttér-koncentrációt (Ca,0) bele kell foglalni az egyenletekbe, amelyek így a következők:
0 < t < tc
[3. egyenlet]
és
t > tc
[4. egyenlet]
Ha a felvételi fázisban a vizsgált vegyi anyag koncentrációja a talajban jelentős csökkenést mutat, akkor a következő modellek alkalmazhatók (például (67) (79)):
[5. egyenlet]
ahol:
Cs
=
a vegyi anyag koncentrációja a talajban [nedves vagy száraz tömeg kg-jára jutó g]
k0
=
talajban való lebomlás sebességi állandója [1/nap]
C0
=
a vegyi anyag kezdeti koncentrációja a talajban [nedves vagy száraz tömeg kg-jára jutó g]
0 < t < tc
[6. egyenlet]
t > tc
[7. egyenlet]
ahol:
Ca
=
a vegyi anyag koncentrációja a férgekben [nedves vagy száraz tömeg kg-jára jutó g]
ks
=
szövetben való felvételi sebességi állandó [a talaj egy napra vetítve a férgek kg-jára jutó grammja]
k0
=
talajban való lebomlás sebességi állandója [1/nap]
ke
=
ürülési sebességi állandó [1/nap]
tc
=
a felvételi fázis végének időpontja.
Amennyiben a felvételi fázis alatt beáll az állandósult állapot (vagyis t = ∞), az 1. egyenlet
0 < t < tc
[1. egyenlet]
leegyszerűsíthető a következőképpen:
vagy
[8. egyenlet]
Ezt követően a vizsgált tétel állandósult állapothoz tartozó koncentrációja a féregszövetben (Ca,ss) kiszámítható a ks/ke x Cs képlettel.
A bióta-talaj felhalmozódási tényező (BSAF) a következőképpen számítható ki:
[9. egyenlet]
ahol foc a szerves szén frakció a talajban, flip pedig a lipid frakció a féregben, amelyeket lehetőleg a vizsgálat során gyűjtött mintákon kell meghatározni a száraz, illetve a nedves tömeg alapján.
Az ürülés kinetikája az ürülési fázisból származó adatokból, az alábbi modellegyenlet és számítógépes nemlineáris paraméterbecslés alkalmazásával modellezhető. Ha az idő függvényében ábrázolt adatpontok a vizsgált tétel állatokban mért koncentrációjának folyamatos exponenciális csökkenését jelzik, akkor az ürülés időbeli alakulása egyrekeszes modellel (9. egyenlet) jellemezhető.
[10. egyenlet]
Az ürülési folyamatok esetenként kétfázisúak, azaz a korai fázisban a Ca gyors csökkenése figyelhető meg, amelyet az ürülés későbbi fázisaiban a vizsgált tételek koncentrációjának lassúbb csökkenése vált fel, például (27) (68). A két fázis azzal a feltevéssel értelmezhető, hogy a szervezet két különböző részből áll, amelyekből eltérő sebességgel ürül ki a vizsgált tétel. Ebben az esetben tanulmányozni kell a vonatkozó szakirodalmat, például (38) (39) (40) (78).
A fenti modellegyenletekkel egyszerre is kiszámíthatók a kinetikai paraméterek (ks és ke), ha az elsőrendű kinetikai modellt a felvételi és az ürülési fázisból származó valamennyi adatra egyidejűleg alkalmazzuk. A felvételi és az ürülési sebességi állandók együttes kiszámítását lehetővé tévő módszer leírása a szakirodalomban (41), (73) és (70) megtalálható.
[11. egyenlet]
Megjegyzés:
A felvételi és ürülési paraméterek egyesített felvételi és ürülési adatokból történő egyidejű becslése esetén a 11. egyenletben az »m« deszkriptor teszi lehetővé a számítógépes program számára az egyenletben szereplő résztényezők hozzárendelését az adott fázishoz tartozó adathalmazokhoz és az értékelés helyes elvégzését (a felvételi fázis esetén m = 1; az ürülési fázis esetén m = 2).
Mindazonáltal ezeket a modellegyenleteket kellő körültekintéssel kell használni, különösen akkor, ha a vizsgált vegyi anyag biológiai hozzáférhetősége vagy (biológiai) lebomlása a vizsgálat folyamán változik (lásd például (79)).
3. függelék
PÉLDÁK A TALAJBÓL FELVETT VIZSGÁLT VEGYI ANYAG BIOLÓGIAI FELHALMOZÓDÁSA VIZSGÁLATÁNAK ÜTEMTERVÉRE
Földigilisztával végzett vizsgálat
a)
Felvételi fázis 8 különböző napon történő mintavétellel a kinetikai számítások céljára
Nap
Tennivaló
– 6
Az elkészített talaj kondicionálása 48 órán keresztül,
– 4
A talajfrakció szennyezése a vizsgált vegyi anyag oldatával; az esetlegesen használt oldószer elpárologtatása; a talajösszetevők összekeverése; a talaj szétosztása a vizsgálati edényekben; ekvilibráció 4 napon keresztül a vizsgálati körülmények között (fémmel szennyezett talaj esetén 3 napon keresztül),
– 3 – – 1
A vizsgálathoz felhasználandó organizmusok kiemelése az akklimatizációs tenyészetből; a talajösszetevők előkészítése és nedvesítése,
0
a hőmérséklet és a talaj pH-jának mérése; talajminták gyűjtése a kezelt edényekből és az oldószer kontrollokból a vizsgált vegyi anyag koncentrációjának a meghatározásához; táplálékadag adása; a férgek tömegének lemérése és a férgek véletlenszerű elosztása a vizsgálati edények között; elegendő féreg-alminta elkülönítése az analitikai háttérértékek, a nedves és száraz tömeg, valamint a lipidtartalom meghatározásához; a vizsgálati edények tömegének lemérése a talaj nedvességtartalmának az ellenőrzése végett; zárt vizsgálati elrendezés használata esetén a levegőellátás ellenőrzése,
1
A levegőellátás ellenőrzése, a férgek viselkedésének és a hőmérsékletnek a dokumentálása; talaj- és féregminták gyűjtése a vizsgált tétel koncentrációjának a meghatározásához,
2
Ugyanaz, mint az 1. napon,
3
A levegőellátás ellenőrzése, a férgek viselkedésének és a hőmérsékletnek a dokumentálása,
4
Ugyanaz, mint az 1. napon,
5 – 6
Ugyanaz, mint a 3. napon,
7
Ugyanaz, mint az 1. napon; táplálékadag adása; a vizsgálati edények tömegének ismételt lemérése a talaj nedvességtartalmának ellenőrzésére, és az elpárolgott víz pótlása,
8 – 9
Ugyanaz, mint a 3. napon,
10
Ugyanaz, mint az 1. napon,
11 – 13
Ugyanaz, mint a 3. napon,
14
Ugyanaz, mint az 1. napon; táplálékadag adása; a vizsgálati edények tömegének ismételt lemérése a talaj nedvességtartalmának ellenőrzésére, és az elpárolgott víz pótlása,
15 – 16
Ugyanaz, mint a 3. napon,
17
Ugyanaz, mint az 1. napon,
18 – 20
Ugyanaz, mint a 3. napon,
21
Ugyanaz, mint az 1. napon; a hőmérséklet és a talaj pH-jának mérése; a vizsgálati edények tömegének ismételt lemérése a talaj nedvességtartalmának ellenőrzésére; a felvételi fázis vége; a férgek áthelyezése a fennmaradó expozíciós edényekből tiszta talajt tartalmazó edényekbe az ürítési fázishoz (béltartalom-ürítés nélkül); talaj- és féregminták gyűjtése az oldószer kontrollokból.
Az expozíció előtti tennivalókat (ekvilibrációs fázis) a vizsgált vegyi anyag tulajdonságainak a figyelembevételével kell ütemezni.
A 3. napnál leírt tennivalókat minden nap el kell végezni (legalább munkanapokon).
b)
Ürülési fázis
Nap
Tennivaló
– 6
A talajösszetevők előállítása és nedvesítése; az elkészített talaj kondicionálása 48 órán keresztül,
– 4
A talajösszetevők összekeverése; a talaj szétosztása a vizsgálati edényekben; inkubálás 4 napon keresztül a vizsgálati körülmények között,
0 (a felvételi fázis vége)
A hőmérséklet és a talaj pH-jának mérése; a férgek tömegének lemérése és a férgek véletlenszerű elosztása a vizsgálati edények között; táplálékadag adása; a férgek áthelyezése a fennmaradó expozíciós edényekből tiszta talajt tartalmazó edényekbe; talaj- és féregminták gyűjtése 4 – 6 óra elteltével a vizsgált vegyi anyag koncentrációjának a meghatározásához,
1
A levegőellátás ellenőrzése, a férgek viselkedésének és a hőmérsékletnek a dokumentálása; talaj- és féregminták gyűjtése a vizsgált vegyi anyag koncentrációjának a meghatározásához,
2
Ugyanaz, mint az 1. napon,
3
A levegőellátás ellenőrzése, a férgek viselkedésének és a hőmérsékletnek a dokumentálása,
4
Ugyanaz, mint az 1. napon,
5–6
Ugyanaz, mint a 3. napon,
7
Ugyanaz, mint az 1. napon; táplálékadag adása; a vizsgálati edények tömegének ismételt lemérése a talaj nedvességtartalmának ellenőrzésére, és az elpárolgott víz pótlása,
8–9
Ugyanaz, mint a 3. napon,
10
Ugyanaz, mint az 1. napon,
11–13
Ugyanaz, mint a 3. napon,
14
Ugyanaz, mint az 1. napon; táplálékadag adása; a vizsgálati edények tömegének ismételt lemérése a talaj nedvességtartalmának ellenőrzésére, és az elpárolgott víz pótlása,
15–16
Ugyanaz, mint a 3. napon,
17
Ugyanaz, mint az 1. napon,
18–20
Ugyanaz, mint a 3. napon,
21
Ugyanaz, mint az 1. napon; a hőmérséklet és a talaj pH-jának mérése; a vizsgálati edények tömegének ismételt lemérése a talaj nedvességtartalmának ellenőrzésére; talaj- és féregminták gyűjtése az oldószer kontrollokból.
Az ürülési fázis kezdete előtt ugyanúgy kell előkészíteni a talajt, mint a felvételi fázis előtt.
A 3. napnál leírt tennivalókat minden nap el kell végezni (legalább munkanapokon).
Televényféreggel végzett vizsgálat
a)
Felvételi fázis 8 különböző napon történő mintavétellel a kinetikai számítások céljára
Nap
Tennivaló
– 6
Az elkészített talaj kondicionálása 48 órán keresztül,
– 4
A talajfrakció szennyezése a vizsgált vegyi anyag oldatával; az esetlegesen használt oldószer elpárologtatása; a talajösszetevők összekeverése; a talaj szétosztása a vizsgálati edényekben; ekvilibráció 4 napon keresztül a vizsgálati körülmények között (fémmel szennyezett talaj esetén 3 napon keresztül),
– 3 – – 1
A vizsgálathoz felhasználandó organizmusok kiemelése az akklimatizációs tenyészetből; a talajösszetevők előkészítése és nedvesítése,
0
a hőmérséklet és a talaj pH-jának mérése; talajminták gyűjtése a kezelt edényekből és az oldószer kontrollokból a vizsgált vegyi anyag koncentrációjának a meghatározásáho; táplálékadag hozzáadása a talajhoz; a férgek tömegének lemérése és a férgek véletlenszerű elosztása a vizsgálati edények között; elegendő féreg-alminta elkülönítése az analitikai háttérértékek, a nedves és száraz tömeg, valamint a lipidtartalom meghatározásához; a vizsgálati edények tömegének lemérése a talaj nedvességtartalmának az ellenőrzése végett; zárt vizsgálati elrendezés használata esetén a levegőellátás ellenőrzése,
1
A levegőellátás ellenőrzése, a férgek viselkedésének és a hőmérsékletnek a dokumentálása; talaj- és féregminták gyűjtése a vizsgált tétel koncentrációjának a meghatározásához,
2
Ugyanaz, mint az 1. napon,
3
A levegőellátás ellenőrzése, a férgek viselkedésének és a hőmérsékletnek a dokumentálása,
4
Ugyanaz, mint az 1. napon,
5–6
Ugyanaz, mint a 3. napon,
7
Ugyanaz, mint az 1. napon; táplálékadag hozzáadása a talajhoz; a vizsgálati edények tömegének ismételt lemérése a talaj nedvességtartalmának ellenőrzésére, és az elpárolgott víz pótlása,
9
Ugyanaz, mint az 1. napon,
10
Ugyanaz, mint a 3. napon,
11
Ugyanaz, mint az 1. napon,
12–13
Ugyanaz, mint a 3. napon,
14
Ugyanaz, mint az 1. napon; táplálékadag hozzáadása a talajhoz; a hőmérséklet és a talaj pH-jának mérése; a vizsgálati edények tömegének ismételt lemérése a talaj nedvességtartalmának ellenőrzésére; a felvételi fázis vége; a férgek áthelyezése a fennmaradó expozíciós edényekből tiszta talajt tartalmazó edényekbe az ürítési fázishoz (béltartalom-ürítés nélkül); talaj- és féregminták gyűjtése az oldószer kontrollokból.
Az expozíció előtti tennivalókat (ekvilibrációs fázis) a vizsgált vegyi anyag tulajdonságainak a figyelembevételével kell ütemezni.
A 3. napnál leírt tennivalókat minden nap el kell végezni (legalább munkanapokon).
4. függelék
Mesterséges talaj – Az előállításra és a tárolásra vonatkozó ajánlások
Mivel az adott forrásból származó természetes talaj nem biztos, hogy az egész év folyamán rendelkezésre áll, és a talajban élő organizmusok, valamint a mikro-szennyező anyagok jelenléte befolyásolhatják a vizsgálatot, ajánlott az e melléklet C.8. fejezetében (Toxicitás földigilisztákra) (48) leírtaknak megfelelően készített mesterséges szubsztrátumot használni ebben a vizsgálatban. Ez a talaj számos faj számára lehetővé teszi a túlélést, a növekedést és a szaporodást, teljes mértékben szabványosított, és rendelkezésre állnak a vizsgálati és tenyésztési körülmények laboratóriumon belüli és laboratóriumok közötti összehasonlításának az adatai.
Talajösszetevők
Tőzeg:
10 %
Az OECD 207. iránymutatása (48) szerinti tőzegmoha,
Kvarchomok:
70 %
Ipari kvarchomok (levegőn szárított); szemcseméret: a részecskék több mint 50 százaléka a 50–200 μm tartományban, de minden részecske mérete ≤ 2 mm,
Kaolinit agyag:
20 %
Kaolinit tartalom ≥ 30 %,
Kalcium-karbonát:
≤ 1 %
Porított, vegytiszta CaCO3.
A mesterséges talaj szerves széntartalma igény szerint csökkenthető, például a tőzegtartalom száraz talaj 4–5 %-ára való csökkentésével és a homoktartalom ennek megfelelő növelésével. A szerves széntartalom csökkentése esetén kisebb a lehetősége a vizsgált vegyi anyag talajon (szerves szénen) való adszorbeálódásának, miközben a vizsgált vegyi anyag hozzáférhetősége a férgek számára javul (74). Kimutatták, hogy az alacsonyabb – például 2,7 % (33), (61), szerves széntartalmú természetes talajokban vizsgált Enchytraeus albidus és az Eisenia fetida esetében a szaporodással kapcsolatos érvényességi kritériumok teljesülnek, és a tapasztalatok szerint ez az 5 %-os tőzegtartalommal rendelkező mesterséges talajjal is elérhető.
Előállítás
A talaj száraz összetevőit alaposan összekeverjük (például nagyüzemi méretű laboratóriumi keverőgéppel). Ezt körülbelül egy héttel a vizsgálat megkezdése előtt kell megtenni. Az összekevert száraz talajösszetevőket a vizsgált tétellel való szennyezés előtt ionmentesített vízzel legalább 48 órán keresztül nedvesítjük a savasság kiegyensúlyozása/stabilizálása céljából. A pH meghatározásához a talaj és 1 M KCl oldat 1:5 arányú keverékét használjuk. Ha a pH a szükséges tartományon (6,0 ± 0,5) kívül van, akkor megfelelő mennyiségű CaCO3-t kell a talajhoz adni, vagy új adag talajt kell készíteni.
A mesterséges talaj maximális víztartó képességét (WHC) az ISO 11268-2 szabvány (35) szerint kell meghatározni. A vizsgálat megkezdése előtt legalább két nappal a száraz mesterséges talajt annyi ionmentesített víz vagy művíz hozzáadásával nedvesítjük, hogy a végső víztartalom körülbelül felét kapjuk. A végső víztartalom a maximális WHC 40–60 %-a. A vizsgálat kezdetén az előnedvesített talajt annyi adagra osztjuk, ahány vizsgálati koncentrációt és kontrollt használunk a vizsgálathoz, és a vizsgált tétel oldata és/vagy ionmentesített víz vagy művíz hozzáadásával a nedvességtartalmat beállítjuk a WHCmax 40–60 %-ának megfelelő szintre. A nedvességtartalmat a vizsgálat kezdetén és végén meg kell határozni (105 °C-on). Az optimális nedvességtartalmat a faj igényei határozzák meg (a nedvességtartalom a következőképpen is ellenőrizhető: ha a talajt a kezünkkel finoman összenyomjuk, kis vízcseppeknek kell megjelenniük az ujjaink között).
Tárolás
A mesterséges talaj száraz összetevői a felhasználás időpontjáig szobahőmérsékleten tárolhatók. Az elkészített, előnedvesített talajt a szennyezés előtt legfeljebb három napig lehet hűvös helyen tárolni; gondoskodni kell arról, hogy minél kevesebb víz párologhasson el belőle. A vizsgált tétellel szennyezett talajt azonnal fel kell használni, kivéve, ha olyan információk állnak rendelkezésre, amelyek szerint az adott talaj tárolása nem befolyásolja a vizsgált tétel toxikus hatását és biológiai hozzáférhetőségét. Ebben az esetben a szennyezett talajmintákat az adott vizsgált tétel esetében ajánlott körülmények között lehet tárolni az analízis elvégzéséig.
5. függelék
A talajból felvett vizsgált vegyi anyag biológiai felhalmozódásának vizsgálatához ajánlott szárazföldi kevéssertéjű féregfajok
Földigiliszták
A vizsgálathoz ajánlott faj a földigilisztafélék (Lumbricidae) családjába tartozó Eisenia fetida (Savigny 1826). 1972 óta két alfajt különböztetünk meg (Eisenia fetida és Eisenia andrei (10)). Jaenike (36) szerint ezek valódi, külön fajok. Az Eisenia fetida könnyen felismerhető a gyűrűin keresztülfutó élénksárga csíkozásáról, míg az Eisenia andrei egységes sötétvörös színű. A valószínűleg a Fekete-tenger vidékéről származó földigiliszták ma már világszerte elterjedtek, különösen az olyan, antropogén tevékenység hatására létrejött élőhelyeken, mint a komposzthalmok. Mindkét földigilisztaféle egyaránt használható ökotoxikológiai és biológiai felhalmozódási vizsgálatokhoz.
Az Eisenia fetida és az Eisenia andrei kereskedelmi forgalomban beszerezhető, például horgászcsaliként. Más földigilisztafélékkel összehasonlítva életciklusuk rövid, körülbelül 2–3 hónap alatt érik el az ivarérett kort (szobahőmérsékleten). A 20–24 °C körüli hőmérséklet az optimális a számukra. A viszonylag nedves, közel semleges pH-jú, magas szervesanyag-tartalommal rendelkező tenyésztalajokat kedvelik. Mivel ezeket a fajokat immár 25 éve széles körben használják a szabványosított ökotoxikológiai vizsgálatokban, tenyésztésük jól meghatározott (48) (77).
Mindkét faj állati eredetű trágyák széles körében tenyészthető. Az ISO szabványban (35) ajánlott tenyésztőközeg ló- vagy szarvasmarhatrágya és tőzeg fele-fele arányú keveréke. A közegnek 6–7 körüli pH-értékkel (kalcium-karbonáttal szabályozható) és alacsony ionos vezetőképességgel (6 mS/cm-nél alacsonyabb vezetőképességgel vagy 0,5 %-nál alacsonyabb sókoncentrációval) kell rendelkeznie, valamint ammóniával vagy állati vizelettel bőségesen szennyezettnek kell lenni. Használható továbbá kereskedelmi forgalomban beszerezhető, adalékanyagoktól mentes kertészeti célú talaj vagy az OECD iránymutatása (48) szerinti mesterséges talaj, illetve ezek fele-fele arányú keveréke. A szubsztrátumnak nedvesnek kell lennie, de ne legyen túl vizes. A tenyésztéshez 10–50 liter térfogatú tartályok a megfelelők.
Ahhoz, hogy szabványos életkorú és tömegű giliszták álljanak a rendelkezésünkre, a legcélszerűbb gubókból kezdeni a tenyésztést. Tehát a friss szubsztrátumot tartalmazó tenyésztőedényekbe kifejlett férgeket kell helyezni, amelyek lerakják a gubókat. A gyakorlati tapasztalatok szerint körülbelül 100 kifejlett féreg/1 kg szubsztrátum (nedves tömeg) populációsűrűséggel jó szaporodási ütem érhető el. A kifejlett férgeket 28 nap elteltével el kell távolítani. A gubókból kikelő földigilisztákat ivarérett korban, azaz legalább 2, de nem több mint 12 hónap elteltével lehet a vizsgálat céljára felhasználni.
A fent bemutatott fajok egyedei akkor tekinthetők egészségeseknek, ha a szubsztrátumban mozognak, nem próbálják elhagyni azt, és folyamatosan szaporodnak. A nagyon lassú mozgás vagy a farokrész sárga színe (az Eisenia fetida esetében) a szubsztrátum kimerülésére utal. Ebben az esetben friss szubsztrátum használata vagy a tartályban lévő állatok számának a csökkentése ajánlott.
Kiegészítő válogatott irodalomjegyzék
Gerard BM (1964). Synopsis of the British fauna. No. 6 Lumbricidae. Linnean Soc. London, 6: 1–58.
Graff O (1953). Die Regenwürmer Deutschlands. Schr. Forsch. Anst. Landwirtsch. 7: 1–81.
Römbke J, Egeler P, Füll C (1997). Literaturstudie über Bioakkumulationstests mit Oligochaeten im terrestrischen Medium. Bericht für das UBA F + E 206 03 909, 86 S.
Rundgren S (1977). Seasonality of emergence in lumbricids in southern Sweden. Oikos 28: 49–55.
Satchell JE (1955). Some aspects of earthworm ecology. Soil Zoology (Kevan): 180–201.
Sims RW and Gerard BM (1985). A synopsis of the earthworms. Linnean Soc. London 31: 1–171.
Tomlin AD (1984). The earthworm bait market in North America. In: Earthworm Ecology – from Darwin to vermiculture. Satchell, J.E. (ed.), Chapman & Hall, London. 331–338 pp.
Televényférgek
A vizsgálathoz ajánlott faj az Enchytraeus albidus Henle 1837 (közönséges televényféreg). A gyűrűsférgek (Annelida) törzsébe tartozó televényférgek (Enchytraeidae) családján belül az Enchytraeus albidus az egyik legnagyobb méretű faj (akár a 15 mm-t is elérheti), és világszerte elterjedt (például (8)). Az Enchytraeus albidus tengeri, édesvízi és szárazföldi élőhelyeken egyaránt megtalálható, főként rothadó szerves anyagban (hínár, komposzt), ritkábban réteken fordul elő (42). Ez a széles ökológiai tolerancia, valamint egyes morfológiai változatok arra utalnak, hogy a fajon belül különböző fajták lehetnek.
Az Enchytraeus albidus kereskedelmi forgalomban beszerezhető, haleledelként árulják. Ellenőrizni kell, hogy a tenyészetben ne legyenek más, általában kisebb fajok (60). A tenyészet ilyen szennyeződése esetén az összes férget vízzel át kell mosni egy petri-csészében. Ezt követően ki kell válogatni a kifejlett Enchytraeus albidus példányokat (sztereomikroszkóp segítségével), és új tenyészetet kell létesíteni. Az összes többi férget meg kell semmisíteni. A televényférgek életciklusa rövid, 33 nap (18 °C-on), illetve 74 nap (12 °C-on) alatt érik el az ivarérett kort. A vizsgálathoz csak olyan tenyészetet szabad felhasználni, amelyen legalább 5 héten keresztül (egy generáció) semmilyen probléma nem volt megfigyelhető a laboratóriumban.
A célra az Enchytraeus nemzetségbe tartozó más fajok is alkalmasak, különösen az Enchytraeus luxuriosus. Ez a nemrégiben leírt (65) faj valódi talajlakó. Más televényféreg fajok használata esetén a használt fajt egyértelműen azonosítani, a választást pedig indokolni kell a jegyzőkönyvben.
Az Enchytraeus crypticus (Westheide & Graefe 1992) ugyanabba a fajcsoportba tartozik, mint az Enchytraeus luxuriosus. A természetes környezetben való létezése még nem bizonyított, eddig csak földigiliszta-tenyészetekben és komposztban való előfordulásáról számoltak be (Römbke 2003). Eredeti ökológiai igényei tehát nem ismertek. A közelmúltban különféle természetes talajokon végzett laboratóriumi kutatások azonban megerősítették, hogy ez a faj széles körű toleranciát mutat az olyan talajtulajdonságokkal szemben, mint a pH és a textúra (Jänsch et al. 2005). Az elmúlt években gyakran használták ezt a fajt ökotoxikológiai vizsgálatokban, mivel könnyen tenyészthető és vizsgálható (például Kuperman et al. 2003). Kis mérete (3 – 12 mm; átlagosan 7 mm (Westheide & Müller 1996)) miatt azonban nehezebben kezelhető, mint az Enchytraeus albidus. Ha az Enchytraeus albidus helyett ezt a fajt használjuk, akkor lehet – de nem szükséges – kisebb vizsgálati edényt alkalmazni. Ezenkívül azt is figyelembe kell venni, hogy ez a faj nagyon gyorsan szaporodik, generációs ideje 20 ± 2 °C hőmérsékleten nem éri el a 20 napot (Achazi et al. 1999), magasabb hőmérsékleten pedig még ennél is rövidebb.
Az Enchytraeus albidus (és más televényféreg fajok) egyedei mesterséges talaj és kereskedelmi forgalomban beszerezhető, szennyezésmentes, adalékanyagokat nem tartalmazó, kertészeti célú talaj keverékét tartalmazó, nagyméretű műanyag tartályokban tenyészthetők (például 30 × 60 × 10 cm vagy 20 × 12 × 8 cm, amely a kisméretű férgek tenyésztésére alkalmas). A komposzt kerülendő, mivel toxikus vegyi anyagokat, például nehézfémeket tartalmazhat. A tenyésztéshez használt talajból használat előtt háromszor megismételt mélyhűtéssel el kell távolítani a benne élő állatokat. Mesterséges talaj önmagában is használható, de lassúbb szaporodási ütemet eredményezhet, mint a kevert tenyésztalaj. A szubsztrátumnak 6,0 ± 0,5 pH-értékkel kell rendelkeznie. A tenyészetet 15 ± 2 °C hőmérsékleten, fénytől elzártan, inkubátorban kell tartani. A 23 °C fölötti hőmérsékletet feltétlenül kerülni kell. A mesterséges/természetes talajnak nedvesnek kell lennie, de ne legyen túl vizes. Ha a talajt a kezünkkel finoman összenyomjuk, kis vízcseppeknek kell megjelenniük. Az oxigénhiányos körülményeket feltétlenül kerülni kell (például fedél használata esetén elég nagy nyílásoknak kell lenniük rajta ahhoz, hogy a megfelelő levegőcsere biztosított legyen). A tenyésztalajt levegőztetés céljából hetente egyszer óvatosan át kell keverni.
A férgeket igény szerint, de hetente legalább egyszer kell etetni zabpehellyel, amelyet a talaj felszínén kialakított mélyedésbe kell helyezni, majd földdel befedni. Ha a legutóbbi etetési időpontban adott táplálék megmarad, a táplálék adagolását megfelelően módosítani kell. Ha a megmaradó táplálékon penészgomba jelenik meg, akkor egy új adag zabpehelyre kell cserélni. A szaporodás serkentése érdekében a zabpehely kéthetente kiegészíthető kereskedelmi forgalomban beszerezhető, vitaminnal dúsított fehérjeporral. Három hónap elteltével az állatokat át kell helyezni egy frissen készített tenyészetbe vagy szubsztrátumba. A zabpelyhet légmentesen zárt edényekben kell tárolni és használat előtt autoklávban kezelni, vagy felmelegíteni a lisztatka (például Glyzyphagus sp., Astigmata, Acarina) vagy ragadozó atka (például Hypoaspis (Cosmolaelaps) miles, Gamasida, Acarina) fertőzés elkerülése végett. A fertőtlenítést követően a táplálékot meg kell őrölni, hogy könnyen a talajfelületre szórható legyen. További lehetséges táplálékforrások a sütőélesztő vagy a TetraMin® haleledel.
Általánosságban a tenyésztési körülmények akkor megfelelők, ha a férgek nem próbálják meg elhagyni a szubsztrátumot, gyorsan mozognak a talajban, kültakarójuk fényes, nem tapadnak rá talajszemcsék, többé-kevésbé fehéres árnyalatú, és ha különböző életkorú férgek láthatók. Alapvetően a férgek akkor tekinthetők egészségesnek, ha folyamatosan szaporodnak.
Kiegészítő válogatott irodalomjegyzék
Achazi RK, Fröhlich E, Henneken M, Pilz C (1999). The effect of soil from former irrigation fields and of sewage sludge on dispersal activity and colonizing success of the annelid Enchytraeus crypticus (Enchytraeidae, Oligochaeta). Newsletter on Enchytraeidae 6: 117–126.
Jänsch S, Amorim MJB, Römbke J (2005). Identification of the ecological requirements of important terrestrial ecotoxicological test species. Environ. Reviews 13: 51–83.
Kuperman RG, Checkai RT, Simini M, Phillips CT, Kolakowski JE, Kurnas CW, Sunahara GI (2003). Survival and reproduction of Enchytraeus crypticus (Oligochaeta, Enchytraeidae) in a natural sandy loam soil amended with the nitro-heterocyclic explosives RDX and HMX. Pedobiologia 47: 651–656.
Römbke J (2003). Ecotoxicological laboratory tests with enchytraeids: A review. Pedobiologia 47: 607–616.
Westheide W and Graefe U (1992). Two new terrestrial Enchytraeus species (Oligochaeta, Annelida). J. Nat. Hist. 26: 479–488.
Westheide W and Müller MC (1996). Cinematographic documentation of enchytraeid morphology and reproductive biology. Hydrobiologia 334: 263–267.”
”
(1) Ezek az információk csupán a felhasználók kényelmét szolgálják. Más, egyenértékű számítógépes programok is használhatók, amennyiben bizonyítottan képesek azonos eredmények előállítására.
(1) Amennyiben nem áll rendelkezésre információ az anyagra való érzékenység tekintetében a nemek között fennálló különbségről, mindkét nemhez tartozó patkányokat, azaz nemenként és koncentrációnként 1 állatot vizsgálunk. Meglévő információk alapján, vagy ha ezen expozíciós szakasz során nyilvánvalóvá válik, hogy az egyik nem érzékenyebb a vizsgált anyagra, a további vizsgálatok során mindegyik koncentrációszintnél az érzékenyebb nem 10 egyedét vizsgáljuk (koncentrációnként és időpontonként 2 állatot).
(2) Az 1272/2008/EK rendelet alkalmazása esetén a gázok, gőzök és aeroszolok határkoncentrációja rendre 20 000 ppm, 20 mg/l és 5 mg/l. Várható toxicitás esetén vagy a dózisbehatároló vizsgálat eredményei alapján alacsonyabb kiindulási koncentrációkat kell választani. Szabályozási vagy tudományos igény esetén magasabb koncentráció is alkalmazható.
(3) Az állatok következő koncentrációszintnek való expozícióját ideális esetben addig kell halasztani, amíg ésszerű biztonsággal nem várható az előzőleg kezelt állatok túlélése. Ez lehetővé teszi a vizsgálatvezető számára a következő expozíciós szakasz célkoncentrációjának és időtartamainak kiigazítását.
(4) A kiindulási koncentráció mellett (az I. expozíciós szakaszban) elhullást okozó legalacsonyabb dózist (koncentráció × idő) vesszük alapul a koncentráció és az expozíciós időtartamok következő kombinációjának meghatározásakor. A koncentrációt általában felezzük (1/2L), és az állatokat új, az első expozíció során megfigyelt minimális halálos dózisszint (idő × koncentráció) ideje körül 1,4-es tényező (√2, lásd a 11. hivatkozást) alapján geometriailag elosztott expozíciós időtartamokból álló, sűrűbb felosztású időtartomány folyamán tesszük ki a vizsgált anyagnak. Ezen az ábrán (1. ábra) az I. expozíciós szakaszban először 15 percnél figyeltek meg elhullást; a II. szakasz időtartamait ezért a 30 perces időtartam körül határozzák meg 15, 21, 30, 42 és 60 percben. Az első két expozíciót követően határozottan javasolt az adatokat egy, a fentihez hasonló grafikonon ábrázolni, és ellenőrizni, hogy a koncentráció és az idő közötti összefüggés 45 fokos szöget zár be (n = 1), vagy a koncentráció-idő-válasz összefüggés meredeksége kisebb (például n = 2), illetve nagyobb (például n = 0,8). Az utóbbi esetekben erősen javasolt a következő koncentrációkat és időtartamokat ennek megfelelően kiigazítani.
(5) Bizonyos esetekben a koncentráció növelésére (2L) lehet szükség új, az első expozíció során megfigyelt minimális halálos koncentrációszint ideje körül 1,4-es tényező (√2) alapján geometriailag elosztott expozíciós időtartamokból álló, még sűrűbb felosztású időtartományt alkalmazva. Az expozíció minimális időtartamának lehetőség szerint meg kell haladnia az 5 percet, az expozíció maximális időtartama nem lehet több 8 óránál.
(2) Bizonyos szérum- és a plazmavizsgálatok, főleg a glükóz meghatározása esetén ajánlatos a vizsgálat előtti éjszaka koplaltatni az állatokat. Ennek fő indoka az, hogy a vizsgálatokat megelőző koplaltatás mellőzése szükségszerűen növelné a kapott eredmények variabilitását, ami így megnehezítené a kevésbé jellegzetes hatások felismerését és értelmezését. Másrészről az éjszakai koplaltatás befolyásolhatja az állatok általános anyagcseréjét, valamint – különösen azon vizsgálatok esetében, amelyeknél a vizsgált anyagot a táplálékkal adagolják – megzavarhatja a vizsgált vegyi anyagnak való napi expozíciót. Ha az éjszakai koplaltatás mellett döntünk, a klinikai biokémiai paramétereket a vizsgálat negyedik hetében, a funkcionális megfigyeléseket követően kell meghatározni.
(*1) Mivel a hosszas koplaltatás torzíthatja a kezelt állatok glükózszintjének a kontrollállatokéhoz viszonyítva mért értékét, a vizsgálatvezetőnek döntenie kell, hogy célszerű-e az állatokat koplaltatni. Koplaltatási idő alkalmazása esetén annak a vizsgált fajhoz kell igazodnia, patkány esetén például 16 óra lehet (éjszakai koplaltatás). A koplaltatás mellett mérhető glükózszint meghatározása az utolsó expozíciós héten történő éjszakai koplaltatás után, vagy a boncolás előtti éjszakai koplaltatás után végezhető el (utóbbi esetben az összes többi klinikai patológiai paraméterrel együtt kell meghatározni).
(*2) Mivel a hosszas koplaltatás torzíthatja a kezelt állatok glükózszintjének a kontrollállatokéhoz viszonyítva mért értékét, a vizsgálatvezetőnek döntenie kell, hogy célszerű-e az állatokat koplaltatni. Koplaltatási idő alkalmazása esetén annak a vizsgált fajhoz kell igazodnia, patkány esetén például 16 óra lehet (éjszakai koplaltatás). A koplaltatás mellett mérhető glükózszint meghatározása az utolsó expozíciós héten történő éjszakai koplaltatás után, vagy a boncolás előtti éjszakai koplaltatás után végezhető el (utóbbi esetben az összes többi klinikai patológiai paraméterrel együtt kell meghatározni).
(3) Bizonyos szérum- és a plazmavizsgálatok, főleg a glükóz meghatározása esetén ajánlatos a vizsgálat előtti éjszaka koplaltatni az állatokat. Ennek fő indoka az, hogy a vizsgálatokat megelőző koplaltatás mellőzése szükségszerűen növelné a kapott eredmények variabilitását, ami így megnehezítené a kevésbé jellegzetes hatások felismerését és értelmezését. Meg kell jegyezni azonban, hogy az éjszakai koplaltatás megzavarhatja az állatok általános anyagcseréjét és – különösen azon vizsgálatok esetében, amelyeknél a vizsgált anyagot a táplálékkal adagolják – megzavarhatja a vizsgált vegyi anyagnak való napi expozíciót. Az összes állatot ugyanabban a fiziológiai állapotban kell megvizsgálni, és ezért a részletes vagy neurológiai vizsgálatokat lehetőleg más napra kell ütemezni, mint a klinikai biokémiai vizsgálatokhoz szükséges mintavételt.
(4) A maró hatás értékelése egyebek között az alábbi bizonyítékokat felhasználó szakértői véleményen alapulhat: emberekkel és állatokkal kapcsolatos tapasztalatok, rendelkezésre álló (in vitro) adatok, például a jelen melléklet B.40. (10), B.40a. fejezete (11), vagy az OECD 435. iránymutatása (12), pH-értékek, hasonló vegyszerekkel kapcsolatos információk vagy bármely más vonatkozó adat.
(5) Az alábbi táblázatokban a GHS (Globally Harmonised System of Classification and Labelling of Chemicals) rendszerre találhatók hivatkozások. A rendszer uniós megfelelője az 1272/2008/EK rendelet. Az akut inhalációs toxicitás esetében az 1272/2008/EK rendeletben (9) nem szerepel az 5. kategória.
(6) Az alábbi táblázatokban a GHS (Globally Harmonised System of Classification and Labelling of Chemicals) rendszerre találhatók hivatkozások. A rendszer uniós megfelelője az 1272/2008/EK rendelet. Az akut inhalációs toxicitás esetében az 1272/2008/EK rendeletben (9) nem szerepel az 5. kategória.
(7) Az alábbi táblázatokban a GHS (Globally Harmonised System of Classification and Labelling of Chemicals) rendszerre találhatók hivatkozások. A rendszer uniós megfelelője az 1272/2008/EK rendelet. Az akut inhalációs toxicitás esetében az 1272/2008/EK rendeletben (9) nem szerepel az 5. kategória.
(8) Ezeknek az anyagoknak az esetében a fent jelzett módon eltér az M4 és az M7.
(9) Ezeket az oldatokat külön kell elkészíteni, majd összeönteni és azonnal autoklávban kezelni.
(*3) Meg kell azonban jegyezni, hogy ha a keménységet okozó ionok és a vizsgált anyag között gyaníthatóan kölcsönhatás alakul ki, akkor lágyabb vizet kell alkalmazni (és ezért az Elendt-féle M4 közeg ilyen esetben nem alkalmazható).
(10) Ezeknek az anyagoknak az esetében a fent jelzett módon eltér az M4 és az M7.
(11) Ezeket az oldatokat külön kell elkészíteni, majd összeönteni és azonnal autoklávban kezelni.
(*4) Meg kell azonban jegyezni, hogy ha a keménységet okozó ionok és a vizsgált anyag között gyaníthatóan kölcsönhatás alakul ki, akkor lágyabb vizet kell alkalmazni (és ezért az Elendt-féle M4 közeg ilyen esetben nem alkalmazható).
(*5) A toxikus hatás semlegesítése SiO2 hozzáadásával történt.
(12) Százalékos lebomlás a referencia-vegyianyagot tartalmazó FC edényekben.
In force
