32001R0213

posebna izdaja v češčini: poglavje 03 zvezek 031 str. 240 - 338
posebna izdaja v estonščini: poglavje 03 zvezek 031 str. 240 - 338
posebna izdaja v latvijščini: poglavje 03 zvezek 031 str. 240 - 338
posebna izdaja v litovščini: poglavje 03 zvezek 031 str. 240 - 338
posebna izdaja v madžarščini poglavje 03 zvezek 031 str. 240 - 338
posebna izdaja v malteščini: poglavje 03 zvezek 031 str. 240 - 338
posebna izdaja v poljščini: poglavje 03 zvezek 031 str. 240 - 338
posebna izdaja v slovaščini: poglavje 03 zvezek 031 str. 240 - 338
posebna izdaja v slovenščini: poglavje 03 zvezek 031 str. 240 - 338
posebna izdaja v bolgarščini: poglavje 03 zvezek 036 str. 43 - 141
posebna izdaja v romunščini: poglavje 03 zvezek 036 str. 43 - 141

32001R0213

Uredba Komisije (ES) št. 213/2001 z dne 9. januarja 2001 o določitvi podrobnih pravil za izvajanje Uredbe Sveta (ES) št. 1255/1999 o analitskih metodah in ocenjevanju kakovosti mleka in mlečnih proizvodov ter dopolnitvenih uredb (ES) št. 2771/1999 in (ES) št. 2799/1999

Uradni list L 037 , 07/02/2001 str. 0001 - 0099
CS.ES poglavje 3 zvezek 31 str. 240 - 338
ET.ES poglavje 3 zvezek 31 str. 240 - 338
HU.ES poglavje 3 zvezek 31 str. 240 - 338
LT.ES poglavje 3 zvezek 31 str. 240 - 338
LV.ES poglavje 3 zvezek 31 str. 240 - 338
MT.ES poglavje 3 zvezek 31 str. 240 - 338
PL.ES poglavje 3 zvezek 31 str. 240 - 338
SK.ES poglavje 3 zvezek 31 str. 240 - 338
SL.ES poglavje 3 zvezek 31 str. 240 - 338

Uredba Komisije (ES) št. 213/2001

z dne 9. januarja 2001

o določitvi podrobnih pravil za izvajanje Uredbe Sveta (ES) št. 1255/1999 o analitskih metodah in ocenjevanju kakovosti mleka in mlečnih proizvodov ter dopolnitvenih uredb (ES) št. 2771/1999 in (ES) št. 2799/1999

KOMISIJA EVROPSKIH SKUPNOSTI JE –

ob upoštevanju Pogodbe o ustanovitvi Evropske skupnosti,

ob upoštevanju Uredbe Sveta (ES) št. 1255/1999 z dne 17. maja 1999 o skupni ureditvi trga z mlekom in mlečnimi proizvodi [1], in zlasti členov 10 in 15 ter členov 26(3), 29(1) in 31(14) Uredbe,

ob upoštevanju naslednjega:

(1) V uredbah Komisije (EGS) št. 1216/68 in (EGS) št. 3942/92 ter (ES) št. 86/94, (ES) št. 2721/95, (ES) št. 1080/96, (ES) št. 1081/96, (ES) št. 1082/96, (ES) št. 1854/96, (ES) št. 880/98 in (ES) št. 1459/98, za katere so podrobna napotila podana v Prilogi XXVI k tej uredbi, so določene referenčne in rutinske analitske metode in metode za ocenjevanje kakovosti mleka in mlečnih proizvodov ter podana področje uporabe in pravila za izvajanje teh metod. Zaradi preglednosti ter zato, da bi tisti, ki v tem sektorju delajo, imeli enoten sklop metod in pravil za njihovo uporabo, bi bilo treba zgoraj navedene uredbe prenoviti in zbrati v enotnem besedilu. Iz enakih vzrokov bi bilo treba spremeniti uredbi Komisije (ES) št. 2771/1999 z dne 16. decembra 1999 o določitvi podrobnih pravil za izvajanje Uredbe Sveta (ES) št. 1255/1999 o intervencijah na trgu z maslom in smetano [2] in (ES) št. 2799/1999 z dne 17. decembra 1999 o določitvi podrobnih pravil za izvajanje Uredbe (ES) št. 1255/1999 o dodeljevanju pomoči za posneto mleko in posneto mleko v prahu, namenjeno živalski krmi, ter za prodajo takega posnetega mleka v prahu [3] tako, da se lahko priloge k tem uredbam, povezane z analitskimi metodami, vključijo v to uredbo.

(2) Preveriti je treba, ali se dosledno izpolnjujejo zahteve glede sestave in kakovosti mleka in mlečnih proizvodov, navedene v ureditvah, določenih v Uredbi (ES) št. 1255/1999.

(3) Referenčne metode za tako preverjanje so pogosto metode, ki jih objavijo mednarodne organizacije, kot so CEN, IDF, ISO in AOAC International, ki jih tudi redno osvežujejo. V nekaterih primerih je določena referenčna metoda Skupnosti, medtem ko v drugih primerih ni v pravilih Skupnosti opredeljena nobena referenčna metoda. Da bi bilo zagotovljeno enotno izvajanje referenčnih metod, je treba vsako leto sestaviti seznam referenčnih metod, uporabljati pa se smejo le metode s tega seznama.

(4) Uporaba rutinskih metod se ne sme izključiti, zato je treba natančno določiti pogoje za njihovo uporabo.

(5) Uvesti je treba tudi enotne metode, da se zagotovi enotno ocenjevanje rezultatov analiz pri senzoričnem ocenjevanju zadevnih proizvodov in ponovnem pregledu spornih rezultatov.

(6) Za nekatere analize trenutno ni nobenih mednarodno validiranih referenčnih metod, zato ni na voljo podatkov o odstopanjih rezultatov analiz od laboratorija do laboratorija. Zato je treba na ravni Skupnosti določiti metode, ki so validirane v skladu z mednarodno sprejetimi pravili in se uporabljajo kot referenčne metode.

(7) Uredba Komisije (ES) št. 2571/97 z dne 15. decembra 1997 o prodaji masla po znižanih cenah in dodeljevanju pomoči za smetano, maslo in zgoščeno maslo za uporabo v proizvodnji peciva, sladoleda in drugih živil [4], kakor je bila nazadnje spremenjena z Uredbo (ES) št. 635/2000 [5], določa sledenje smetani, maslu in zgoščenemu maslu v nekaterih okoliščinah, da bi se zagotovila pravilna končna uporaba teh proizvodov. Ker je sledenje pomembno za pravilno delovanje sistema in za zagotovitev enakovrednega obravnavanja tistih, ki so vključeni v ta sistem, je treba uvesti enotne metode za določitev nekaterih od teh sledilcev.

(8) V skladu z Uredbo Komisije (EGS) št. 3143/85 z dne 11. novembra 1985 o prodaji intervencijskega masla, namenjenega neposredni porabi v obliki zgoščenega masla, po znižanih cenah [6], kakor je bila nazadnje spremenjena z Uredbo (ES) št. 101/1999 [7], Uredbo Komisije (EGS) št. 429/90 z dne 20. februarja 1990 o dodeljevanju pomoči na podlagi javnih razpisov za zgoščeno maslo, namenjeno neposredni porabi v Skupnosti [8], kakor je bila nazadnje spremenjena z Uredbo (ES) št. 124/1999 [9], in Uredbo (ES) št. 2571/97 mora biti dodajanje sledilcev zgoščenemu maslu opravljeno pod nadzorom. Skladnost z zahtevami za izsleditev zgoščenega masla je treba strogo uveljavljati za zagotovitev, da se proizvodi ne spremenijo. Zato je treba določiti enotno metodo za ugotavljanje takih sledilcev.

(9) V skladu s členom 9 Uredbe (ES) št. 1255/1999 se lahko dodeli pomoč za zasebno skladiščenje sira, izdelanega iz ovčjega mleka. Po členu 31 zgoraj navedene uredbe se lahko za te proizvode dodeli posebno povračilo. Sir, izdelan iz ovčjega, kozjega in bivoljega mleka ter mešanic ovčjega, kozjega in bivoljega mleka, se lahko uvaža v Skupnost po sporazumih o preferenčnem obravnavanju iz nekaterih tretjih držav. V skladu z zgoraj navedenimi določbami so potrebni primerni pregledi za zagotovitev, da v take proizvode ni dodano kravje mleko. Zato je treba na ravni Skupnosti uvesti metodo za ugotavljanje kravjega mleka ne glede na uporabo rutinskih metod, če izpolnjujejo nekatera merila.

(10) V skladu z Uredbo Komisije (EGS) št. 2921/90 z dne 10. oktobra 1990 o dodeljevanju pomoči za posneto mleko, ki se uporablja za proizvodnjo kazeina in kazeinatov [10], kakor je bila nazadnje spremenjena z Uredbo (ES) št. 2654/1999 [11], ne smejo biti prisotne koliformne bakterije. Mednarodno sprejeta referenčna metoda za ugotavljanje koliformnih bakterij v mleku in mlečnih proizvodiproizvodih je mednarodni standard IDF 73A:1985. Vendar je standard uporaben le v spremenjeni obliki za ugotavljanje koliformnih bakterij v določeni količini proizvoda. Zato je na ravni Skupnosti določena referenčna metoda za ugotavljanje koliformnih bakterij na podlagi zgoraj navedenega standarda.

(11) Uredba Sveta (EGS) št. 2658/87 z dne 23. julija 1987 o tarifni in statistični nomenklaturi ter skupni carinski tarifi [12], kakor je bila nazadnje spremenjena z Uredbo (ES) št. 254/2000 [13], določa različne carinske stopnje za krmne mešanice, ki spadajo pod tarifno številko 2309 glede na njihovo vsebnost mlečnegaproizvoda proizvoda. Določiti je treba splošno priznano metodo za analizo vsebnosti laktoze, ki jo morajo uporabljati vse države članice, da bi zagotovile enotno izvajanje zadevnih pravil.

(12) V skladu z Uredbo (ES) št. 1255/1999 morata maslo in posneto mleko v prahu, namenjeni intervenciji ali posneto mleko v prahu tudi uporabi za živalsko krmo, izpolnjevati nekatere kakovostne zahteve. Določiti je treba referenčne metode, s katerimi se preveri, ali so te zahteve izpolnjene.

(13) Za izvedbo nekaterih metod, prvič prikazanih v tej uredbi, je potrebno prilagoditveno obdobje. Uporabo teh metod bi bilo zato treba preložiti.

(14) Upravljalni odbor za mleko in mlečne proizvode ni podal mnenja v roku, ki ga je določil njegov predsednik –

SPREJELA NASLEDNJO UREDBO:

POGLAVJE I

SPLOŠNE DOLOČBE

Člen 1

Namen in področje uporabe

Ta uredba določa pravila za uporabo metod za kemično, fizikalno in mikrobiološko analizo ter senzorično oceno mleka in mlečnih proizvodov, ki se uporabljajo v skladu z režimi za skupno ureditev trga z mlekom in mlečnimi proizvodi, določenimi v Uredbi (ES) št. 1255/1999. Določa tudi nekatere od teh metod.

Člen 2

Seznam metod

1. Priloga I k tej uredbi vsebuje seznam referenčnih metod, primernih za analize, kakor so navedene v členu 1.

2. Komisija mora najmanj enkrat na leto osvežiti seznam po postopku, določenem v členu 42 Uredbe (ES) št. 1255/1999.

Člen 3

Rutinske metode

Rutinske metode se lahko uporabljajo za analize, ki jih zahtevajo pravila Skupnosti, če so pravilno umerjene in se redno preverjajo glede na referenčne metode.

Postopek, opisan v Prilogi II, se lahko uporablja za preverjanje rezultatov, dobljenih z rutinskimi metodami, ki so blizu mejnih vrednosti, določenih v zadevnih uredbah.

V primeru odstopanj so odločilni rezultati, dobljeni z referenčno metodo.

Člen 4

Validacija referenčnih metod

1. Referenčne metode so veljavne, če izpolnjujejo predhodno določena merila natančnosti v zvezi z mejnimi vrednostmi ponovljivosti in obnovljivosti.

2. Če v zadevnih uredbah določena referenčna metoda ni veljavna, države članice določijo začasno mejno vrednost obnovljivosti.

Ta mejna vrednost se določi po postopku, opisanem v Prilogi III(b). Vendar lahko države članice v prvih 18 mesecih po uveljavitvi te uredbe uporabijo enakovreden postopek.

Skladnost z mejno vrednostjo se preveri najmanj enkrat na leto.

3. Kadar rezultati uporabe veljavnih referenčnih metod ali metod z začasnimi vrednostmi natančnosti pokažejo, da je meja presežena, se lahko analitski rezultati preračunajo z uporabo metode, opisane v Prilogi IV, da se določi kritično odstopanje od zadevne mejne vrednosti.

Člen 5

Sprejemljivost rezultatov analize

1. Analize se opravijo v laboratorijih, v katerih izvajajo notranji postopek nadzora kakovosti, kakor je opisano v Prilogi V(a), ali postopek enakovrednega standarda.

Na voljo mora biti podroben opis uporabljenega postopka za posvetovanje v laboratoriju.

2. Laboratoriji določijo svojo interno natančnost v času izvajanja za vse metode v skladu s:

(a) postopkom, navedenim v Prilogi V(b), ali

(b) objavljenim validiranim postopkom z določeno ponovljivostjo.

Skladnost z mejno vrednostjo obnovljivosti je treba preveriti najmanj enkrat na leto po postopku, opisanem v Prilogi III(a).

Drugi pododstavek ne velja za laboratorije, ki so bili v zadevnem letu vključeni v program preskušanja strokovnosti.

3. Laboratorijska poročila o rezultatih analiz morajo vsebovati zadostne podatke za oceno rezultatov, ki se opravi v skladu s Prilogo IV in Prilogo VIII.

4. Rezultati analize se štejejo za dopustne, če so dobljeni v skladu z merili sprejemljivosti, opisanimi v internem postopku nadzora kakovosti iz odstavka 1, in interno natančnostjo iz odstavka 2.

Člen 6

Senzorično ocenjevanje

1. Za maslo se uporabljajo v Prilogi VI navedeni postopki za preverjanje dela ocenjevalcev in zanesljivosti rezultatov. Postopek, naveden v Prilogi VII, se uporabi kot referenčna metoda za senzorično ocenjevanje.

2. Za senzorično ocenjevanje mleka in mlečnih proizvodov razen masla morajo države članice kot referenčno metodo uporabiti standard IDF 99C/1997 ali druge primerljive metode, o katerih uradno obvestijo Komisijo.

V Prilogi VI navedeni postopek se lahko uporabi za preverjanje dela ocenjevalcev in zanesljivosti rezultatov.

Člen 7

Vzorčenje in nesoglasja glede rezultatov analiz

1. Kadar to zahtevajo pravila Skupnosti, je treba vzeti dvojne vzorce za analize.

2. Kadar se izvajalec ne strinja z rezultati analize, je treba uporabiti postopek, naveden v Prilogi VIII.

POGLAVJE II

ANALITSKE METODE

Člen 8

Vsebnost vode/suhe snovi brez maščobe/maščobe v maslu

1. Kot referenčna metoda za določanje vsebnosti vode v maslu se uporablja analitska metoda, navedena v Prilogi IX.

2. Kot referenčna metoda za določanje vsebnosti suhe snovi brez maščobe v maslu se uporablja analitska metoda, navedena v Prilogi X.

3. Kot referenčna metoda za določanje vsebnosti maščobe v maslu se uporablja analitska metoda, navedena v Prilogi XI.

Člen 9

Sledilci

1. Kot referenčna metoda za določanje vsebnosti vanilina v zgoščenem maslu, maslu in smetani se uporablja analitska metoda, navedena v Prilogi XII.

2. Kot referenčna metoda za določanje vsebnosti etil estra beta-apo-8’ karotenske kisline v zgoščenem maslu in maslu se uporablja analitska metoda, navedena v Prilogi XIII.

3. Kot referenčna metoda za določanje vsebnosti β-sitosterola ali stigmasterola v maslu in zgoščenem maslu se uporablja analitska metoda, navedena v Prilogi XIV.

4. Sledenje zgoščenemu maslu, maslu in smetani se opravlja v skladu z ustreznimi pravili Skupnosti, če so dobljeni rezultati skladni s specifikacijami, podanimi v odstavku 8 v prilogah, navedenih v odstavkih 1, 2 in 3 zgoraj.

Člen 10

Ugotavljanje kazeina kravjega mleka

1. Za zagotovitev, da sir, ki mora biti izdelan izključno iz ovčjega, kozjega ali bivoljega mleka ali iz mešanice ovčjega, kozjega in bivoljega mleka, dejansko ne vsebuje kazeina kravjega mleka, se uporablja referenčna analitska metoda, navedena v Prilogi XV.

Če je vsebnost kazeina kravjega mleka v analiziranem vzorcu enaka ali višja od vsebnosti v referenčnem vzorcu, ki vsebuje 1 % kravjega mleka, kakor je opisano v Prilogi XV, se šteje, da je kazein kravjega mleka prisoten.

2. Rutinske metode za ugotavljanje kazeina kravjega mleka v siru, kakor je navedeno v odstavku 1, se lahko uporabijo, če:

(a) je meja zaznavnosti 0,5 % ali nižja,

(b) ni napačnih pozitivnih rezultatov,

(c) se kazein kravjega mleka lahko odkrije z zahtevano občutljivostjo tudi po daljših obdobjih zorenja, kakor se lahko dogaja v običajnih trgovinskih pogojih.

Če zahteva iz (b) ni izpolnjena, je treba z referenčno metodo analizirati vsak vzorec, za katerega je dobljen rezultat pozitiven.

Če zahteva iz (c) ni izpolnjena za eno ali več vrst sira, navedenega v odstavku 1, je treba ta sir analizirati z referenčno metodo.

Člen 11

Ugotavljanje koliformnih bakterij

1. Za ugotavljanje prisotnosti koliformnih bakterij v maslu, posnetem mleku v prahu, kazeinu in kazeinatih se uporablja referenčna analitska metoda, navedena v Prilogi XVI.

2. Rutinske metode za ugotavljanje koliformnih bakterij se lahko uporabijo, če so pridobljeni rezultati primerljivi z rezultati, dobljenimi z referenčno metodo, navedeno v omenjeni prilogi. Rutinske metode morajo imeti zlasti ustrezno mejo zaznavnosti. Napačni negativni rezultati ne smejo biti prisotni. Če prisotnosti napačnih pozitivnih rezultatov ni mogoče izločiti, je treba vsak pozitiven rezultat potrditi z referenčno metodo.

Člen 12

Vsebnost laktoze

Metoda za določanje vsebnosti laktoze v proizvodih, ki spadajo pod oznako KN 2309, je navedena v Prilogi XVII.

Člen 13

Ugotavljanje siriščne sirotke

1. Metoda za ugotavljanje siriščne sirotke v posnetem mleku v prahu, namenjenem javnem skladiščenju, je navedena v Prilogi XVIII.

2. Metoda za ugotavljanje siriščne sirotke v posnetem mleku v prahu, namenjenem za živalsko krmo, je navedena v Prilogi XIX.

Člen 14

Ugotavljanje pinjenca

Metoda za ugotavljanje pinjenca v posnetem mleku v prahu je navedena v Prilogi XX.

Člen 15

Antimikrobni ostanki

Metoda za ugotavljanje ostankov antibiotikov in sulfonamidov/dapson v posnetem mleku v prahu je navedena v Prilogi XXI.

Člen 16

Vsebnost posnetega mleka v prahu

Metoda za ugotavljanje vsebnosti posnetega mleka v prahu v krmnih mešanicah je navedena v Prilogi XXII.

Člen 17

Ugotavljanje škroba

Metoda za ugotavljanje škroba v posnetem mleku v prahu, denaturiranem mleku v prahu in krmnih mešanicah je navedena v Prilogi XXIII.

Člen 18

Vsebnost vlage kislega pinjenca v prahu

Metoda ugotavljanja vsebnosti vlage v kislem pinjencu v prahu, namenjenem uporabi v krmi, je navedena v Prilogi XXIV.

Člen 19

Ugotavljanje tujih maščob

Metoda za ugotavljanje tujih maščob v mlečni maščobi je navedena v Prilogi XXV.

POGLAVJE III

KONČNE DOLOČBE

Člen 20

Spremembe Uredbe (ES) št. 2771/1999

Uredba (ES) št. 2771/1999 se spremeni:

1. Prvi stavek člena 4(1) se nadomesti z naslednjim: "Pristojni organi pregledajo kakovost masla z metodami, navedenimi v Prilogi I, ter na podlagi vzorcev, odvzetih v skladu s pravili iz Priloge IV."

2. V Prilogi I se opomba 2 nadomesti z: "Glej Prilogo I k Uredbi (ES) št. 213/2001".

3. Prilogi II in III se črtata.

4. V predzadnjem stavku Priloge IV.2 se besede "s Prilogo III" nadomestijo z "s Prilogo VII k Uredbi (ES) št. 213/2001".

Člen 21

Spremembe Uredbe (ES) št. 2799/1999

Uredba (ES) št. 2799/1999 se spremeni:

1. Členi 20(1), (2), (3) in (4) se nadomestijo z naslednjim:

"1. Vsebnost posnetega mleka v prahu v krmnih mešanicah se določi tako, da se vsak vzorec preskuša najmanj v dveh ponovitvah z analitsko metodo, navedeno v Prilogi XXII k Uredbi (ES) št. 213/2001, ki se dopolni s pregledi, predvidenimi v členu 17(3) te uredbe. Če pri rezultatih teh pregledov pride do odstopanja, je odločilen rezultat pregleda, opravljenega na kraju samem.

2. Odsotnost siriščne sirotke se dokaže z metodo iz Priloge XIX k Uredbi (ES) št. 213/2001.

3. Vsebnost škroba v krmnih mešanicah se določi na podlagi pregledov, navedenih v členu 17(3) te uredbe, ki jih je treba dopolniti z analitsko metodo iz Priloge XXIII k Uredbi (ES) št. 213/2001.

4. Vsebnost vlage v kislem pinjencu v prahu se določi z analizno metodo iz Priloge XXIV k Uredbi (ES) št. 213/2001."

2. Priloge III, IV, V in VI se črtajo.

Člen 22

Razveljavitve

Razveljavijo se uredbe (EGS) št. 1216/68, (EGS) št. 3942/92, (ES) št. 86/94, (ES) št. 2721/95, (ES) št. 1854/96, (ES) št. 1080/96, (ES) št. 1081/96, (ES) št. 1082/96, (ES) št. 880/98 in (ES) št. 1459/98.

Sklicevanja na razveljavljene uredbe veljajo kot sklicevanja na to uredbo.

Člen 23

Začetek veljave

Ta uredba začne veljati sedmi dan po objavi v Uradnem listu Evropskih skupnosti.

Metode, opisane v prilogah III, IV.4, V, VI in VIII, se začnejo uporabljati 18 mesecev po začetku veljave te uredbe.

Ta uredba je v celoti zavezujoča in se neposredno uporablja v vseh državah članicah.

V Bruslju, 9 januarja 2001

Za Komisijo

Franz Fischler

Član Komisije

[1] UL L 160, 26.6.1999, str. 48.

[2] UL L 333, 24.12.1999, str. 11.

[3] UL L 340, 31.12.1999, str. 3.

[4] UL L 350, 20.12.1997, str. 3.

[5] UL L 76, 25.3.2000, str. 9.

[6] UL L 298, 12.11.1985, str. 9.

[7] UL L 11, 16.1.1999, str. 14.

[8] UL L 45, 21.2.1990, str. 8.

[9] UL L 16, 21.1.1999, str. 19.

[10] UL L 279, 11.10.1990, str. 22.

[11] UL L 325, 17.12.1999, str. 10.

[12] UL L 256, 7.9.1987, str. 1.

[13] UL L 28, 3.2.2000, str. 16.

--------------------------------------------------

PRILOGA I

(Člen 2)

SEZNAM REFERENČNIH METOD

Seznam okrajšav

Min. = najmanj,

maks. = največ,

Priloga = priloga k navedeni uredbi,

SNF = suha snov brez maščobe,

FFA = proste maščobne kisline,

PV = peroksidno število,

A = videz,

F = aroma,

C = konzistenca,

TBC = skupno število bakterij,

Term. = število termofilnih bakterij,

MS = država članica,

IDF = International Dairy Federation,

ISO = International Standards Organisation,

IUPAC = International Union of Pure and Applied Chemistry,

ADPI = American Dairy Products Institute;

SCM = sladkano zgoščeno mleko,

EMC = evaporirano mleko ali smetana,

MSNF = mlečna suha snov brez maščobe.

Opomba 1 : Izolacija mlečne maščobe, kakor je opisana v standardu IDF 6B:1989 (zavarovano pred svetlobo).

Opomba 2 : Uvedena ni bila nobena referenčna metoda.

Opomba 3 : Vzorec je treba pripraviti v skladu s standardom IDF 122C:1996 ali standardom IDF 73A:1985.

Opomba 4 : Inkubacija 48 ur pri temperaturi 55 °C, preprečiti je treba izsušitev umetnega gojišča.

Opomba 5 : % SNF = % suhe snovi – % maščobe.

Opomba 6 : Maslo mora ustrezati nacionalnemu kakovostnemu razredu države članice proizvajalke, navedenemu v Prilogi V k Uredbi Komisije (ES) št. 2771/1999.

Opomba 7 : Direktiva Komisije 84/8/EGS.

Opomba 8 : Uredba Komisije (ES) št. 1758/94 (UL L 183, 19.7.1994, str. 14).

Opomba 9 : Direktiva Komisije 78/633/EGS.

Voda | Do 16 % | Priloga IX | |

SNF | Do 2 % | Priloga X | |

FFA (maks.) | 1,2 mmol/100 g maščobe | Standard IDF 6B:1989 | |

PV (maks.) | 0,3 mekv. kisika/1000 g maščobe | Standard IDF 74A:1991 (angleška verzija) | Opomba 1 |

Koliformne bakterije | Pod mejo zaznavnosti v 1 g | | |

Nemlečna maščoba | Pod mejo zaznavnosti za analizo trigliceridov | Priloga XVII | Opomba 3 |

Sterolni sledilci | Pod mejo zaznavnosti | Priloga XXVI | |

Drugi sledilci: | Pod mejo zaznavnosti | Priloga XIV | |

– vanilin | Pod mejo zaznavnosti | Priloga XII | |

– etil ester karotenske kisline | Pod mejo zaznavnosti | Priloga XIII | |

– trigliceridi heptanojske kisline | Najmanj 4 od 5 točk za A, G in C | IUPAC 2.301 pod. 5 | |

Senzorične lastnosti | Najmanj 4 točke | Priloga VII | |

Disperzija vode | | Standard IDF 112A:1989 | |

Voda | Do 16 % | Priloga IX | |

Voda | Do 16 % | Priloga IX | |

Sol | Do 2 % | Standard IDF 12B:1988 | |

Voda | Do 16 % | Priloga IX | |

Sledilci: | | | |

– steroli | | Priloge XIV | |

– vanilin | | Priloga XII | |

– etil ester karotenske kisline | | Priloga XIII | |

– trigliceridi heptanojske kisline | | IUPAC 2.301 pod. 5 | |

Voda | Do 16 % | Priloga IX | |

Sol | Do 2 % | Standard IDF 12B:1988 | |

Sledilci: | | | |

– steroli | | Priloga XIV | |

– vanilin | | Priloga XII | |

– etil ester karotenske kisline | | Priloga XIII | |

– trigliceridi heptanojske kisline | | IUPAC 2.301 pod 5 | |

Vlaga in MSNF | Do 0,2 % | Standard IDF 23A:1988 (vlaga) | |

FFA | Do 0,35 % (oleinska) | Standard IDF 24:1964 (MSNF) | |

PV (maks.) | 0,5 mekv kisika/1000 g maščobe | Standard IDF 6B: 1989 | |

Nemlečna maščoba | Ni prisotna | Standard IDF 74A:1991 (angleška verzija) | Opomba 1 |

Aroma | Čista | | |

Vonj | Odsotnost tujih vonjav | Priloga XXV | |

Drugo | Odsotnost nevtralizacijskih sredstev, antioksidantov in konzervansov | Priloga XIV | |

Sledilci: | | Priloga XII | |

– steroli | | Priloga XIII | |

– vanilin | | IUPAC 2.301 pod 5 | |

– etil ester karotenske kisline | | | |

– trigliceridi heptanojske kisline | | | |

Sledilci: | | Postopke odobri pristojni organ | Opomba 2 |

– steroli | | Priloga XII | |

– vanilin | | Postopke odobri pristojni organ | Opomba 2 |

– etil ester karotenske kisline | | IUPAC 2.301 pod 5 | |

– trigliceridi heptanojske kisline | | | |

SNF | Do 2 % | Postopke odobri pristojni organ | Opomba 2 |

Sledilci: | 15 g/100 kg zgoščenega masla | Priloga XIV | |

– stigmasterol (95 %) | 17 g/100 kg zgoščenega masla | Priloga XIV | |

– stigmasterol (85 %) | | IUPAC 2.301 pod 5 | |

– trigliceridi heptanojske kisline | 1,1 kg/100 kg zgoščenega masla | Priloga XIV | Opomba 2 |

–– etil ester maslene kisline in stigmasterol | Glej Prilogo, točka 1(c) | Postopke odobri pristojni organ | Opomba 2 |

– lecitin (E 322) | Do 0,5 % | Standard IDF 12B:1988 | |

NaCl | Do 0,75 % | Standard IDF 6B:1989 | |

FFA | Do 0,35 % (oleinska) | Standard IDF 74A:1991 (angleška verzija) | Opomba 1 |

PV (maks.) | Do 0,5 mekv kisika/1000 g maščobe | | |

Aroma | Čista | | |

Vonj | Odsotnost tujih vonjav | | |

Drugo | Odsotnost sredstev za nevtralizacijo, antioksidantov in konzervansov | | |

Voda | Do 16 % | Priloga IX | |

Voda | Do 16 % | Priloga IX | |

Sol | Do 2 % | Standard IDF 12B:1988 | |

Maščoba | Do 1,75 % | Standard IDF 127A:1988 | |

Proste kisline | Do 0,30 % (mlečna) | Standard IDF 91:1979 | |

Maščoba | Do 1,00 % | Standard IDF 127A:1998 | |

Pepel | Min. 7,50 % | Standard IDF 90:1979 | |

Mlečne beljakovine | Min. 88,00 % | Standard IDF 92:1979 | |

Maščoba in pepel | Do 6,00 % | Standard IDF 127A:1988 Standard IDF 89:1979 ali Standard IDF 90:1979 | |

Maščoba | Do 1,50 % | Standard IDF 127A:1988 | |

Proste kisline | Do 0,20 % (mlečna) | Standard IDF 91:1979 | |

TBC (maks.) | 30000/g | Standard IDF 100B:1991 | Opomba 3 |

Koliformne bakterije | Pod mejo zaznavnosti v 0,1 g | Priloga XVI | Opomba 3 |

Term. (maks.) | 5000 l/g | Standard IDF 100B:1991 | Opombi 3 in 4 |

Maščoba | Do 1,00 % | Standard IDF 127A:1988 | |

Pepel | Min. 7,50 % | Standard IDF 90:1979 | |

TBC (maks.) | 30000/g | Standard IDF 100B:1991 | Opomba 3 |

Koliformne bakterije | Pod mejo zaznavnosti v 0,1 g | Priloga XVI | Opomba 3 |

Term. (maks.) | 5000/g | Standard IDF 100B:1991 | Opombi 3 in 4 |

Mlečne beljakovine | Min. 88,00 % | Standard IDF 92:1979 | |

Maščoba in pepel | Do 6,00 % | Standard IDF 127A:1988 Standard IDF 89:1979 ali 90:1979 | |

TBC (maks.) | 30000/g | Standard IDF 100B:1991 | Opomba 3 |

Koliformne bakterije | Pod mejo zaznavnosti v 0,1 g | Priloga XVI | Opomba 3 |

Term. (maks.) | 5000/g | Standard IDF 100B:1991 | Opombi 3 in 4 |

Mlečne beljakovine | Min. 85,00 % | Standard IDF 92:1979 | |

Maščoba | Do 1,50 % | Standard IDF 127A:1988 | |

Laktoza | Do 1,00 % | Standard IDF 106:1982 | |

Pepel | Do 6,50 % | Standard IDF 89:1979 ali 90:1979 | |

TBC (maks.) | 30000/g | Standard IDF 100B:1991 | Opomba 3 |

Koliformne bakterije | Pod mejo zaznavnosti v 0,1 g | Priloga XVI | Opomba 3 |

Term. (maks.) | 5000/g | Standard IDF 100B:1991 | Opombi 3 in 4 |

Uredba (ES) št. 2799/1999 (UL L 340, 31.12.1999, str. 3) | Krmne mešanice in posneto mleko v prahu (SMP) (kadar se uporablja kot krma) | Voda (kisli pinjenec v prahu) | Do 5 % | | |

Beljakovine | 31,4 % (min.) na suho snov brez maščobe | Standard IDF 20B:1993 | |

Voda (SMP) | Do 5 % | Standard IDF 26A:1993 | |

Maščobe (SMP) | Do 11 % | Standard IDF 9C:1987 | |

Siriščna sirotka (SMP) | Ni prisotna | Priloga XIX | Opomba 7 |

Škrob (SMP) | Ni prisoten | Priloga XXIII | |

Voda (mešanice) | Do 5 % suhe snovi brez maščobe | Standard IDF 26A:1993 | |

Maščobe (mešanice) | – | Direktiva Komisije 84/4/EGS (UL L 15, 18.1.1984, str. 28) | |

Siriščna sirotka (mešanice) | Ni prisotna | Priloga XIX | |

Vsebina SMP (v končnemproizvoduproizvodu) | Min. 50 % | Priloga XXII | Opomba 7 |

Maščobe (v končnemproizvoduproizvodu) | Min. 2,5 % ali 5 % | Direktiva Komisije 84/4/EGS | Opomba 8 |

Škrob (v končnem proizvodu) | Min. 2 % | Priloga XXIII | Opomba 9 |

Baker (v končnem proizvodu) | 25 ppm | Direktiva Komisije 78/633/EGS (UL L 206, 26.7.1987, str. 43) | |

Beljakovine | 31,4 % (min.) na suho snov brez maščobe | Standard IDF 20B:1993 | |

Voda | Do 3,5 % | Standard IDF 26A:1993 | |

Kisline (N/10 NaOH) | Do 19,5 ml | Standard IDF 86:1981 | |

Laktati | Do 150 mg/100 g | Standard IDF 69B:1987 | |

Fosfat | Negativno | Standard ISO 3356:1975 | |

Topnost | Do 0,5 ml pri 24 °C | Standard IDF 129A:1988 | |

Sežgani delci | Plošča B najmanj (15,0 mg) | ADPI:1990 | |

TBC | 40000 l/g | Standard IDF 100B:1991 | Opomba 3 |

Koliformne bakterije | Negativno/0,1 g | Priloga XVI | Opomba 3 |

Pinjenec | Negativno | Priloga XX | |

Siriščna sirotka | Negativno | Priloga XVIII | |

Kisla sirotka | Negativno | Postopek odobri pristojni organ | Opomba 2 |

Protimikrobna sredstva | | Priloga XXI | |

DEL B

Referenčne metode, naštete v delu B, se lahko uporabijo za analizo proizvodov, zajetih v kateri koli od uredb iz stolpca 1.

Uredba (EGS) št. 2658/87 (UL L 256, 7.9.1987, str. 1) Uredba (ES) št. 2414/98 (UL L 299, 10.11.1998, str. 7) Uredba (ES) št. 1374/98 | Mleko in smetana, nezgoščena, brez dodanega sladkorja ali drugih sladil | 0401 | Maščoba ( 6 %) | Veljajo omejitve, določene v opisu oznake KN za določeni proizvod, ki so podrobneje določene, kjer je primerno, v Uredbi Komisije (EGS) št. 3846/87 (UL L 366, 24.12.1987, str. 1), delu 9 izvozne nomenklature ali Uredbi (ES) št. 1374/98 (UL L 185, 30.6.1998, str. 21) | Standard IDF 1D:1996 | |

Maščoba (> 6 %) | Standard IDF 16C:1987 | |

Maščobe (v trdni obliki) | Standard IDF 9C:1987 | |

Beljakovine | Standard IDF 20B:1993 | |

Saharoza (običajna vsebnost) | Standard IDF 35A:1992 | |

Saharoza (nizka vsebnost) | Postopke odobri pristojni organ | Opomba 2 |

Trdne snovi (SCM) | Standard IDF 15B:1991 | |

Trdne snovi (EMC) | Standard IDF 21B:1987 | |

Voda (mleko in smetana v prahu) | Standard IDF 26A:1993 | |

Pinjenec, fermetirano ali kislo mleko in smetana, zgoščena ali nezgoščena, z dodanim sladkorjem ali drugim sladilom | 0403 | Maščoba | Standardi IDF 1D:1996, 9C:1987, 16C:1987, 22B:1987, 126A:1988 | |

Beljakovine | Standard IDF 20B:1993 | |

Saharoza (običajna vsebnost) | Standard IDF 35A:1992 | |

Saharoza (nizka vsebnost) | Postopke odobri pristojni organ | Opomba 2 |

Voda (kisli pinjenec v prahu) | Priloga XXIV | |

Voda (sladki pinjenec v prahu) | Standard IDF 26A:1993 | |

Trdne snovi (drugi proizvodi) | Postopke odobri pristojni organ | |

Sirotka, zgoščena ali nezgoščena, z dodanim sladkorjem ali drugim sladilom; proizvodi iz naravnih mlečnih sestavin | 0404 | Maščoba | Standardi IDF 9C:1987, 16C:1987 22B:1987 | |

Beljakovine | Standard IDF 20B:1993 | |

Saharoza (običajna vsebnost) | Standard IDF 35A:1992 | |

Saharoza (nizka vsebnost) | Postopke odobri pristojni organ | Opomba 2 |

040490 | Beljakovine | Standard IDF 20B:1993 | |

Voda | Standard IDF 26A:1993 | |

Trdne snovi | Standard IDF 15B:1991 | |

(Zgoščeni proizvodi) | Standard IDF 21B:1987 | |

Voda | Priloga IX | |

Maslo | SNF | Priloga X | |

NaCl | Standard IDF 12B:1998 | |

Masleno–mlečna maščoba | Maščoba (če je je > 99 %) | Standard IDF 24:1964 | |

Voda (če je maščobe < 99 %) | Standard IDF 23A:1988 | |

Trdne snovi | Standard IDF 4A:1982 | |

Trdne snovi (Ricotta) | Standard IDF 58:1970 | |

NaCl | Standard IDF 88A:1988 | |

Laktoza | Standard IDF 79B:1991 | |

--------------------------------------------------

PRILOGA II

(Člen 3)

PREVERJANJE Z OBIČAJNIMI METODAMI PRIDOBLJENIH REZULTATOV, KI SO BLIZU MEJAM, NAVEDENIM V UREDBAH O ZAHTEVAH GLEDE SESTAVE IN KAKOVOSTI

Če je mO v uredbi navedena meja za zahteve glede sestave in kakovosti, je meja odločitve (L)

L = m

če je RRout/RRef ≤ 1

RRout : meja obnovljivosti običajne metode

RRef : meja obnovljivosti referenčne metode

Če je mo zgornja meja in RRout/RRef > 1, se meja odločitve dobi po enačbi

L = m

· CrD

Če je pri enakih pogojih mO spodnja meja, se meja odločitve dobi po enačbi

L = m

· CrD

kjer je CrD95 kritična razlika referenčne metode (glej Prilogo IV).

Kadar je mO zgornja meja, je treba končni rezultat nad mejo odločitve, dobljen z običajno metodo, zamenjati s končnim rezultatom, dobljenim z referenčno metodo. Ta končni rezultat mora temeljiti najmanj na enakem številu analiz/vzorcev kot končni rezultat, dobljen z običajno metodo.

Kadar je mO spodnja meja, je treba pri končnem rezultatu pod mejo odločitve, dobljenim z običajno metodo, postopati enako.

Opomba

Zgoraj opisani postopek se lahko uporablja, če ni zaznavnih vplivov matriksa.

Vplivi matriksa se lahko zaznajo na naslednji način: za vsak vzorec, uporabljen pri umerjanju, se določi razlika (wi) med rezultatoma, dobljenima po referenčni in običajni metodi.

Izračun standardnega odmika po enačbi

s =

∑ w

i/2mm

število vzorcev, uporabljenih pri umerjanju : se primerja z aritmetično sredino standardnega odmika ponovljivosti referenčne in običajne metode

+ s

rrout2/2

Vpliv matriksa se ne sme izključiti, če je

+++++ TIFF +++++

kjer je:

f = m (f: število prostostnih stopenj)

α = verjetnost napak; α = 0,05.

V tem primeru je treba pred določitvijo meje odločitve opraviti dodatne raziskave.

--------------------------------------------------

PRILOGA III

(Člena 4 in 5)

(a) Postopek za določitev skladnosti z uveljavljeno mejo obnovljivosti (kemijska analiza)

Skladnost z mejo obnovljivosti se preveri s primerjavo laboratorijskih rezultatov z rezultati izkušenega laboratorija [1], dobljenih z uporabo enakega vzorca. Dvojno določanje se opravi v obeh laboratorijih, rezultati pa se ocenijo po enačbi:

CrD

kjer je:

CrD

95 : kritična razlika (P = 0,95)

-1 : aritmetična sredina dveh rezultatov, dobljenih v laboratoriju 1

-2 : aritmetična sredina dveh rezultatov, dobljenih v laboratoriju 2

R : meja obnovljivosti: določi se z interpolacijo

r : meja ponovljivosti: če se natančnost spreminja z nivojem.

Če je kritična razlika presežena, je treba v roku dveh mesecev opraviti dodaten preskus. Če rezultati drugega preskusa niso v skladu z mejo obnovljivosti, morajo pristojni organi sprejeti potrebne ukrepe.

(b) Postopek za določitev začasne meje obnovljivosti (kemijska analiza)

Začasna meja obnovljivosti (Rprov) se določi po naslednji enačbi:

r22

kjer je:

-1 : povprečje dveh rezultatov, dobljenih v laboratoriju 1

-2 : povprečje dveh rezultatov, dobljenih v laboratoriju 2 (glej Prilogo IIIa)

r : meja ponovljivosti ali začasna meja ponovljivosti

Opombe:

1. Rprov se lahko uporabi za izračun kritičnih razlik (glej Prilogo VI).

2. Rprov se določi pri 2r, če je izračunana vrednost za Rprov nižja od 2r.

3. RSDR c [2], potem je Rprov nesprejemljivo visok in se ne sme uporabiti za izračun kritične razlike.

4. Rprov je treba določiti najmanj enkrat na leto na podlagi rezultatov, dobljenih v dveh laboratorijih (glej Prilogo IV).

5. Povprečno vrednost Rprov je treba uporabiti pri izračunu kritičnih razlik. Pravili, navedeni v točkah 2 in 3, se uporabljata za povprečno vrednost Rprov.

Meja obnovljivosti (vrednost R) se dobi iz izračunane vrednosti RSDR na naslednji način:

R = 0,0283

RSD

- : aritmetična sredina dobljenih rezultatov

Nekateri primeri izračunanih vrednosti RSDR:

Koncentracija | RSDR (%) |

1 g/100 g | 4 |

0,01 g/100 g | 8 |

1 mg/1000 g | 16 |

Koncentracija analita 1 g/100 g da:

R = 0,0283 * 1 * 4 = 0,11 g/100 g.

[1] Na splošno velja, da je izkušeni laboratorij tisti, ki je uspešno sodeloval pri potrditvi preskusnega postopka ali uspešno opravil preskus strokovne usposobljenosti laboratorija.

[2] koncentracija, izražena kot decimalni ulomek (primer: 10 g/100 g = 0,1).Vir:Peeler, J.T., Horwitz, W. in Albert, R.J. Ass. Off. Anal. Chem.72(5), 784-806 (1989).

--------------------------------------------------

PRILOGA IV

(Člen 4)

OCENA ANALITIČNIH REZULTATOV, DOBLJENIH Z VALIDIRANIMI METODAMI

Če analitični rezultat pokaže, da je bila meja presežena, se izračuna aritmetična sredina dveh ali več rezultatov. Uporabiti je treba naslednji postopek:

1. V primerih, ko je analitični rezultat edini rezultat, je treba pri ponovljivih pogojih opraviti še drugo analizo. Če obeh analiz ni mogoče opraviti pri ponovljivih pogojih, se opravi dodatna vzporedna analizo pri ponovljivih pogojih in ti rezultati se uporabijo pri oceni skladnosti kritične razlike.

2. Določita se absolutna vrednost razlike med aritmetično sredino rezultatov, dobljenih pri ponovljivih pogojih, in meja. Absolutna vrednost razlike, ki je večja od kritične razlike, pomeni, da analizirani vzorec ne izpolnjuje zahtev.

Kritična razlika se določi z naslednjo enačbo:

CrD

- m

kjer je:

- : aritmetična sredina dobljenih rezultatov

m0 : meja

n : število analiz/vzorcev

Če se natančnost z nivojem spreminja, se r in R lahko določita z interpolacijo.

Ponavadi mora končno poročilo rezultata za vzorec pokazati, da je meja z njim usklajena.

Končni rezultati

- v razponu m

in m

+ CrD

, če je meja največja vrednost;

- v razponu m

in m

+ CrD

, če je meja najmanjša vrednost,

se torej lahko pojavijo samo izjemoma.

Končni rezultati v navedenih razponih so sprejemljivi samo, če se pojavijo največ enkrat na vsakih pet vzorcev, analiziranih na pošiljko. Če se analizira manj kot pet vzorcev na pošiljko, je sprejemljiv en rezultat iz navedenega razpona. Vendar je treba pravilo, da se lahko iz omenjenega razpona dobi samo en rezultat na pet analiziranih vzorcev, upoštevati, če gre za ponavljajoče se pošiljke proizvajalca.

3. Če se končni rezultat x izračuna po enačbi x = y1 ± y2 (primer: vsebnost vode + suhe snovi brez živilske maščobe v maslu, pri izračunu vsebnosti maščobe), kjer sta y1 in y2 končna rezultata ene vrste analize, potem se splošni meji ponovljivosti in obnovljivosti rx in Rx končnih rezultatov x izračunata kot:

2r12+ r22

2R12+ R22

kjer sta r1 in r2 meji ponovljivosti, R1 in R2 pa meji obnovljivosti y1 in y2.

x se primerja z mejo m0 po pravilih, navedenih v točkah 1 in 2. Kritična razlika se določi po naslednji enačbi:

CrD

x - m

kjer je x aritmetična sredina dobljenih rezultatov x1.

4. Če se končni rezultat izračuna po enačbi

x =

(primer: maščoba v suhi snovi sira)

kjer sta y1 in y2 končna rezultata ene vrste analize, potem se splošni meji ponovljivosti in obnovljivosti rx in Rx lahko izračunata kot:

= μ

x2r*12+ r*22

= μ

x2R*12+ R*22

= μ

| μ

μ1 : mejna ali ciljna vrednost za y1 (primer: maščoba)

μ2 : mejna ali ciljna vrednost za y2 (primer: suha snov)

≤ 0,15

kjer je:

r1 : meja ponovljivosti, y1

r2 : meja ponovljivosti, y2

≤ 0,15

kjer je:

R1 : meja obnovljivosti y1

R2 : meja obnovljivosti y2

Postopki za izračun rx in Rx se uporabljajo samo, če so relativne meje ponovljivosti in obnovljivosti (r*1, r*2; R*1; R*2) manjše ali enake 0,15.

x se primerja z mejo po pravilih, navedenih pod točkama 1 in 2. Kritična razlika se določi po enačbi:

CrD

- μ

kjer je:

kjer je aritmetična sredina rezultatov x, dobljenih po kronološkem vrstnem redu [1].

[1] Opomba:Če se na primer dobijo rezultati y11, y12, y21 in y22, je treba izračunati aritmetično sredino y11/y21 in y12/y22.

--------------------------------------------------

PRILOGA V

NOTRANJA KONTROLA

(Člen 5)

(a) Postopek notranje kontrole kakovosti (IQC) (kemijska analiza)

Opredelitev kontrolnega materiala

Za material, uporabljen za namen IQC, velja enak ali deloma enak postopek kot za preskusni material.

Kontrolni material je lahko:

- certificirani referenčni material,

- interni referenčni material,

- material, validiran z medlaboratorijskim preskusom,

- material z dodatki.

Postopek za uvedbo IQC

Laboratorij mora uvesti IQC po postopku, opisanem v gradivu IUPAC "Usklajene smernice za notranjo kontrolo kakovosti v analitskih laboratorijih" [1].

IQC zajema vključitev kontrolnih materialov v analitično zaporedje ali ponavljajočo analizo preskusnega vzorca. Kontrolni materiali morajo biti po kemični sestavi podobni preskusnim vzorcem in ustrezno nespremenljivi celoten čas proučevanja. Dokazati je treba, da jih je mogoče ustrezno razdeliti na enake dele zaradi analiziranja in da koncentracija analita ustreza območju merjenja.

Kontrolni material je treba vstaviti najmanj enkrat v vsaki analitični seriji, dobljeno vrednost pa prikazati v kontrolni karti zaradi merjenja dolgoročnih napak. Poleg tega mora laboratorij redno dokazovati izpolnjevanje pogojev ponovljivosti v seriji. To se lahko doseže z vzporednima izvajanjema analize kontrolnih in/ali preskusnih materialov. Rezultate teh analiz je treba primerjati z vsemi objavljenimi mejami ponovljivosti in obstoječimi podatki o interni natančnosti.

Pri uporabi kontrolnih materialov je treba vrednosti, dobljene v seriji analiz kontrolnega materiala, grafično prikazati s Shewhartovim diagramom (ISO 8258(1991)) in navedbo ustreznih kontrolnih mej. Meje ukrepanja je treba naravnati na

x ± 3s

kjer je st skupni standardni odmik,

meje opozarjanja pa na

x ± 2s

Skupni standardni odmik:

2sb2+ sw2/n

kjer je:

sb : standardni odmik med serijami

sw : standardni odmik v seriji

n : število določitev.

Kadar se kontrolni materiali ne uporabljajo (npr. zaradi premajhne stabilnosti), je treba v vsaki seriji vzporedno izvesti dve analizi najmanj enega od preskusnih materialov.

Absolutno razliko, dobljeno iz vzporednih analiz v seriji (glej Prilogo III), je treba prikazati grafično. Osrednja linija poteka pri 1,128 sw, spodnja meja pri 0, zgornja meja (meja ukrepanja) pri 3,686 sw, kjer je sw, standardni odmik v seriji.

Pri širokem razponu koncentracij je treba v kontrolni postopek zajeti materiale na nizkem in visokem nivoju.

Če preskusni materiali zajemajo širok razpon koncentracij analita, mora laboratorij vzpostaviti razmerje med natančnostjo in nivojem. Če je natančnost sorazmerna z nivojem, mora nadaljnja kontrola temeljiti na relativni natančnosti (tj. absolutna razlika kot odstotek povprečne vrednosti).

Znamenja, da analitični sistem ni obvladovan, so naslednji pojavi:

A. trenutna grafično prikazana vrednost pade zunaj meja ukrepanja,

B. trenutna vrednost in predhodna vrednost padeta zunaj meja opozarjanja, vendar ostaneta v okviru meja ukrepanja,

C. pri uporabi kontrolnih materialov pade devet zaporednih vrednosti na isto stran črte, ki označuje srednjo vrednost.

Laboratorij se mora na razmere neobvladovanja sistema odzvati z:

A. zaustavitvijo analize nedokončanih diagnostičnih preskusov in ukrepi za odpravo napak, in

B. zavrnitvijo niza rezultatov in ponovno analizo preskusnih materialov.

(b) Postopek za izbiro internega kontrolnega materiala in določitev "internih" meja natančnosti (kemijska analiza)

Podatki o natančnosti v laboratoriju se lahko dobijo s ponovitvijo analize kontrolnih materialov in/ali ponovno analizo preskusnih vzorcev.

V laboratorijih morajo pri določitvi parametrov natančnosti za odstopanje v seriji in med serijami za nadaljnjo uporabo pri izdelavi kontrolnih kart uporabiti naslednji postopek. Laboratoriji lahko sprejmejo nadomestne postopke, če lahko ustrezno dokažejo, da se z njimi dobijo zanesljivi podatki natančnosti.

1. Izbira kontrolnih materialov

Kadar uporaba kontrolnega materiala laboratoriju ustreza, je treba najprej zbrati podatke za določitev meja. Po možnosti je treba uporabiti certificirane referenčne materiale (CRM). Predlagane kontrolne materiale je treba analizirati pri pogojih ponovljivosti v seriji, ki vključuje ustrezne CRM s ponovljivostjo in naključnostjo. Kadar takšen pristop ni mogoč, si morajo laboratoriji prizadevati za sodelovanje pri preskušanju usposobljenosti in za uvedbo dogovorjenih srednjih vrednosti (določenih vrednosti), ki lahko veljajo za konvencionalne dejanske srednje vrednosti, katerim se lahko pripiše dokajšnja nezanesljivost. Drugi postopki vključujejo določitev dejanske vrednosti z oblikovanjem ali uporabo kontrolnih materialov z dodatkom.

Poleg tega mora laboratorij, ki redno opravlja tovrstne analize in je že uvedel statistično kontrolo, vse nove kontrolne materiale (ki jih potrebuje, ker so pošle zaloge) pridobiti s sklicevanjem na analize, ki so pri uporabi obstoječih materialov pod nadzorom.

2. Določitev meja

Potem ko laboratorij izbere kontrolni material, ga mora uporabiti za določitev vrednosti natančnosti v seriji in med serijami.

Najmanj, kar se zahteva pri ugotavljanju natančnosti v seriji, je, da je treba kontrolni material analizirati z dvema vzporednima izvajanjema ob 12 priložnostih. Vzporedne analize je treba izvajati pri pogojih ponovljivosti; tj. isti izvajalec, enaki reagenti itd. Vzporedna analiza kontrolnega materiala mora biti v analitični seriji naključna. Vsako vzporedno analizo je treba opraviti na drugi dan časovnega obdobja, da se tako odrazijo zmerna odstopanja med serijami, ob upoštevanju običajnih odstopanj, npr. reagenti, ponovna umeritev instrumentov, in če je primerno, različni analitiki.

Opomba:

Uporaba podatkov, ki ne predstavljajo odstopanja med serijami v celoti, ima lahko za posledico nepotrebno ponavljanje analize zaradi določitve pretirano tesnih meja. Nasprotno pa se lahko zgodi, da laboratorij, ki prikaže preveč nenatančne podatke natančnosti, ne more izpolniti predpisanih meja pri referenčnih postopkih in lahko pričakuje slabšo uspešnost v primerjavi s sorodnimi laboratoriji, podatki, ki jih pridobiva, pa lahko ne ustrezajo namenu.

2.1 Določitev natančnosti v seriji

2.1.1 Natančnost v seriji, kadar je na voljo kontrolni material

Najprej je treba vzporedne podatke (najmanj 12 vzporednih izvajanj) preveriti s Cochranovim preskusom največje neskladnosti. Ta zajema primerjavo kvadrata največjega niza podvojenih izvajanj z vsoto kvadratnih nizov.

c =

max

∑

kjer je

di = razlika med vzporednimi izvajanji.

Vrednost Cochranovega merila, C, se primerja z vrednostmi iz preglednice (ISO 5725(1994)). Kadar je vrednost mogoče označiti za ubežnika, je treba rezultat preveriti in poiskati razlago zanj. Ugotoviti je treba, ali gre za tehnično napako, računsko napako, napako pri izvajanju preskusa ali analizo napačnega vzorca. Če razlaga tehnične napake dokazuje, da sumljivega rezultata ni mogoče nadomestiti, potem je treba takšen rezultat zavreči kot dejanskega ubežnika. Če ostanejo kakršnikoli ubežniki, ki jih ni mogoče razložiti, se ubežniki ohranijo kot pravilni, statistični ubežniki pa zavrnejo. Laboratorij si mora prizadevati za pridobitev nadomestnih vrednosti.

Potem ko se laboratorij prepriča, da med podatki ni ubežnikov, se standardni odmik v seriji sw dobi na naslednji način: za vsak par xi1, xi2 podatkov iz vzporednih izvajanj se vsota vzporednih izvajanj

= x

+ x

in razlika vzporednih izvajanj

= x

- x

izračunata in seštejeta:

A = ∑

B = ∑

C = ∑

Izračun standardnega odmika v seriji:

2B2p

Interna meja natančnosti znaša 2,8 Sw.

Pri uporabi referenčne metode je treba interno mejo natančnosti primerjati z objavljeno mejo ponovljivosti. Laboratorij mora izpolnjevati zahtevo referenčne metode. Neizpolnjevanje te zahteve je treba raziskati.

Postavljene meje je treba obravnavati kot začasne in jih je treba preverjati.

2.1.2 Natančnost v seriji, kadar kontrolni material ni na voljo

Laboratorij se lahko odloči, da ugotovi natančnost v seriji z vzporednim izvajanjem analize reprezentativnih preskusnih vzorcev (najmanj 12 vzporednih izvajanj analize). Kadar uporaba kontrolnega materiala ni mogoča, npr. zaradi nestabilnosti, je treba podatke za vzporedna izvajanja pridobiti po tem postopku.

Opomba:

Predpostavlja se, da analize zajemajo sorazmerno ozek razpon vrednosti in se zato lahko ena vrednost uporablja za vse vzorce. Kadar je razpon rezultatov širši, npr. pri obsežnejšem naročilu, natančnost pa je odvisna od nivoja, morajo laboratoriji proučiti uporabo relativnih standardnih odmikov.

Podatke je treba preveriti s Cochranovim preskusom, tako kot v točki 2.1.1. Ko se laboratorij prepriča, da med podatki ni ubežnikov, se standardni odmik v seriji in interna meja natančnosti lahko dobita kot v točki 2.1.1.

Standardni odmik v seriji sw se lahko uporabi pri izdelavi kontrolnih kart (glej Prilogo II). Postavljene meje je treba obravnavati kot začasne in jih je treba preverjati.

2.2 Določitev natančnosti med serijami

Izračunajte povprečno vrednost (s1/2) za vsak par in jo preverite s Grubbsovim preskusom (ISO 5725(1994). Zavrnitvena/sprejemna merila za ubežnike so opisana v točki 2.1.1. Laboratorij si mora prizadevati za pridobitev nadomestne vrednosti za vsak zavrženi rezultat. Potem ko se laboratorij prepriča, da med podatki ni ubežnikov, izračuna standardni odmik med serijami sb.

C -

B -

ali 0, če je enačba pod kvadratnim korenom negativna.

Skupni standardni odmik st se uporabi pri izdelavi kontrolnih kart za povprečje določitev n (glej Prilogo II). Postavljene meje je treba obravnavati kot začasne in jih je treba preverjati.

3. Pregled začetnih meja

Kontrolne meje, določene po zgoraj opisanem postopku, je treba obravnavati kot začetne ocene.

Za ažuriranje omejitev, določenih na podlagi sprejemljive natančnosti v seriji (točka 2.1.2), je treba zbrati dodatne vzporedne podatke o preskusnih vzorcih. Presledek pred pregledom je odvisen od pogostnosti analiz. Kot smernico je mogoče navesti, naj se podatki pregledajo po vsakih nadaljnjih 10 vzporednih izvajanjih analize. Vse podatke je nato treba preveriti s Cochranovim preskusom, meje pa ponovno določiti na podlagi novega podatka za standardni odmik. Nadaljnje odločitve glede veljavnosti kontrolnih meja je treba sprejemati v povezavi z dodatnimi podatki.

Pregled začetnih podatkov, dobljenih za natančnost med serijami, je tudi odvisen od pogostnosti analiz. Kot smernico je mogoče navesti, naj se po nadaljnjih desetih podatkovnih točkah, pridobljenih z analizo kontrolnega materiala, pri pogostnosti ena analiza na proizvodno serijo, pregledajo začetne predpostavke, sprejete glede standardnega odmika in srednje vrednosti.

Vse podatke je treba zaradi ubežnikov preveriti z Grubbsovim preskusom. Srednjo vrednost in standardni odmik je treba ponovno izračunati na podlagi novih podatkov.

Poleg tega mora laboratorij v tej fazi uporabiti Cusumovo kontrolno karto (BS S700:(1984) in dopolnilo 5480(1987)) za preverjanje vseh težav, ki so lahko povezane npr. s staranjem reagentov. Vsak posamezen rezultat, ki ni v mejah Cusumovih kontrolnih kart, je treba raziskati.

Nove meje (za srednjo vrednost in standardni odmik) je treba redno preverjati s Cusumovo tehniko. Vsako znamenje, da je veljavnost kontrolnega materiala postala vprašljiva, je treba temeljito raziskati.

4. Javljanje podatkov natančnosti

Laboratoriji morajo pristojnemu državnemu organu poslati naslednje podatke:

- uporabljeni postopek,

- standardni odmik v seriji sw, in interno mejo natančnosti,

- standardni odmik med serijami sb,

- skupni standardni odmik s1,

- število analiz, opravljenih pri pridobivanju podatkov natančnosti.

[1] M. Thompson in R. Wood: "Čista in uporabna kemija" 67(4), 649-666 (1995).

--------------------------------------------------

PRILOGA VI

(Člen 6)

PREVERJANJE OCENJEVALCEV IN ZANESLJIVOST REZULTATOV PRI SENZORIČNIH ANALIZAH

Pri uporabi točkovalnih postopkov se uporabljajo naslednji postopki (Standard IDF 99C/1997).

(a) Določevanje "indeksa ponovljivosti"

Ocenjevalec analizira najmanj deset slepih vzorcev v vzporednih izvajanjih v roku 12 mesecev. To se navadno dogaja v več zasedanjih. Rezultati za značilnosti posameznih proizvodov se ovrednotijo po naslednji enačbi:

∑

kjer je:

1 : indeks ponovljivosti

i1 : točke prve ocenitve vzorca xi

i2 : točke druge ocenitve vzorca xi

n : število vzorcev

Ocenjevani vzorci morajo odražati visoko kakovost. w1 ne sme presegati 1,5 točke (na lestvici s petimi točkami).

(b) Določevanje "indeksa odklona"

Ta indeks je treba uporabiti za preverjanje, ali ocenjevalec uporablja enako lestvico za kakovostno ocenjevanje kot izkušena skupina za ocenjevanje. Točke, ki jih dobi ocenjevalec, se primerjajo s povprečjem točk, ki jih dobi skupina za ocenjevanje.

Za ovrednotenje rezultatov se uporablja naslednja enačba:

= 1 +

∑

- x

-i222n

kjer je:

xi1; xi2 : glej točko (a)

; x

-i2 : povprečno število točk ocenjevalne skupine za prvo in drugo ocenjevanje vzorca xi

n : število vzorcev (najmanj deset na 12 mesecev).

Vzorci, ki se ocenjujejo, morajo odražati visoko kakovost. D1 ne sme presegati 1,5 točke (na lestvici s petimi točkami).

Države članice morajo javiti vsakršne težave, na katere naletijo pri uporabi tega postopka.

Preskus je treba, kadar je to primerno, organizirati najmanj enkrat na leto zaradi primerjave rezultatov, ki jih dobijo ocenjevalci iz različnih pokrajin. Če se opazijo pomembne razlike, je treba sprejeti potrebne ukrepe, da se ugotovijo vzroki zanje in dosežejo primerljivi rezultati.

Države članice lahko organizirajo preskuse za primerjavo rezultatov, ki jih dobijo njihovi lastni ocenjevalci, z rezultati ocenjevalcev iz sosednjih držav članic. Večje razlike morajo sprožiti poglobljeno preiskavo s ciljem priti do primerljivih rezultatov.

Države članice morajo o rezultatih teh primerjav obvestiti Komisijo.

--------------------------------------------------

PRILOGA VII

(Člen 6)

SENZORIČNO OCENJEVANJE MASLA

1. Namen in področje uporabe

Namen tega postopka za senzorično ocenjevanje masla je zagotoviti enoten postopek, ki bi se uporabljal v vseh državah članicah.

2. Opredelitev pojmov

Senzorično ocenjevanje (ovrednotenje) pomeni preverjanje lastnosti proizvoda s čutili.

Skupina ocenjevalcev pomeni skupino izbranih ocenjevalcev, ki ocenjujejo brez medsebojne komunikacije in zunanjega vpliva.

Določanje indeksa odklona pomeni senzorično ocenjevanje skupine ocenjevalcev, ki uporablja številčno lestvico. Uporabljati je treba nomenklaturo pomanjkljivosti.

Točkovanje pomeni razvrščanje po kakovosti, ki poteka na podlagi doseženih točk.

Ocenjevalni listi: listine, ki se uporabljajo za beleženje posameznih točk za vsako lastnost in končno razvrstitev proizvoda. (Ta listina se lahko uporabi tudi za zapis kemične sestave.)

3. Prostor za ocenjevanje

3.1 Poskrbeti je treba, da na ocenjevalce v prostoru preskusa ne vplivajo zunanji dejavniki.

3.2 V prostoru preskusa ne sme biti tujih vonjev in mora biti enostaven za čiščenje. Stene morajo biti svetle barve.

3.3 Prostor preskusa in njegova osvetlitev morata biti takšna, da ne vplivata na lastnosti ocenjevanih proizvodov. Prostor mora biti opremljen z ustrezno napravo za uravnavanje temperature.

4. Zahteve za ocenjevalce

Ocenjevalec mora poznati proizvode iz masla in biti usposobljen za razvrščanje teh proizvodov v kakovostne razrede na podlagi senzoričnega ocenjevanja. Njegovo usposobljenost mora redno (najmanj enkrat na leto) oceniti pristojni organ.

5. Zahteve za skupino ocenjevalcev

Število ocenjevalcev v skupini mora biti neparno, najmanjše število članov je tri. Večina od njih mora biti zaposlena pri pristojnem organu ali pa morajo biti to pristojne osebe, ki niso zaposlene v mlekarski industriji.

Pred ocenjevanjem je treba upoštevati številne dejavnike, da se doseže optimalna uspešnost posameznikov:

- član komisije ne sme imeti bolezni, ki bi lahko vplivala na njegovo uspešnost; če jo ima, mora zadevnega ocenjevalca zamenjati v skupini nekdo drug;

- člani morajo z ocenjevanjem začeti pravočasno in poskrbeti, da imajo dovolj časa za svoje ocenjevanje;

- osebe ne smejo uporabljati intenzivno dišečih sredstev, kot so parfum, losjoni po britju, deodoranti itd., in ne smejo uživati močno dišeče, začinjene in aromatične hrane itd.;

- člani pol ure pred začetkom ocenjevanja ne smejo kaditi, jesti in piti nič drugega kot vodo.

6. Ocenjevanje vrednosti posameznih lastnosti

6.1 Senzorično ocenjevanje je treba opraviti v povezavi z naslednjimi tremi lastnostmi: zunanjim videzom, konzistenco in aromo.

Zunanji videz vključuje naslednje značilnosti: barvo, zunanji videz, plesnivost in razporeditev vode. Razporeditev vode se ugotavlja po standardu IDF 112A/1989.

Konzistenca zajema naslednji značilnosti: teksturo in mazavost.

Za ocenjevanje konzistence masla se lahko uporabljajo fizikalni postopki. Komisija ES načrtuje uskladitev teh postopkov v prihodnje.

Aroma zajema naslednji značilnosti: okus in vonj.

Znatno odstopanje od priporočene temperature onemogoča zanesljivo ocenjevanje konzistence in arome. Temperatura je odločilnega pomena.

6.2 Vsako lastnost je treba senzorično oceniti ločeno. Točke se določijo v skladu s tabelo 1.

6.3 Lahko je zaželeno, da ocenjevalci pred začetkom ocenjevanja skupaj določijo točke enemu ali več referenčnim vzorcem za videz, konzistenco in aromo, da se tako doseže enotnost.

6.4 Število točk za sprejemljivost proizvoda je naslednje:

| Največje število | Zahtevano število |

Zunanji videz | 5 | 4 |

Konzistenca | 5 | 4 |

Aroma | 5 | 4 |

Kadar proizvod ne doseže zahtevanega števila točk, je treba pripraviti opis pomanjkljivosti. Število točk, ki so jih posamezni ocenjevalci dali za posamezno lastnost, je treba zabeležiti v ocenjevalni list. Proizvod se sprejme ali zavrne na podlagi odločitve večine. Primeri, kjer so razlike med določitvami točk posameznikov za posamezno lastnost večje od ene točke navzgor ali navzdol, se ne smejo pojavljati pogosto (najpogosteje enkrat na 20 vzorcev). Sicer mora usposobljenost skupine ocenjevalcev preveriti njihov vodja.

7. Nadzor

Vodja skupine ocenjevalcev, ki mora biti uradno zaposlen pri pristojnem organu in je lahko član komisije, mora biti na splošno odgovoren za celoten postopek. V ocenjevalni list mora zapisovati posamezne točke za vsako lastnost in potrditi sprejem ali zavrnitev proizvoda.

8. Vzorčenje in priprava vzorca

8.1 - Zaželeno je, da je identiteta vzorcev med ocenjevanjem prikrita, da se tako lahko prepreči kakršna koli pristranost.

- Za to mora poskrbeti vodja skupine ocenjevalcev pred ocenjevanjem brez navzočnosti drugih članov skupine.

8.2 Kadar se ocenjujejo vzorci masla v hladilnicah, se vzorci odvzamejo s pripomočkom za vzorčenje masla. Če pa se ocenjuje maslo iz drugih skladišč, je treba odvzeti najmanj 500 g vzorca.

8.3 Med ocenjevanjem mora imeti maslo temperaturo 10 do 12 °C. Velikim odstopanjem se je treba izogibati za vsako ceno.

9. Nomenklatura

Glej priloženo tabelo 2.

Tabela 1: Določanje točk maslu

Zunanji videz | Konzistenca | Aroma + vonj |

Tč. | Št. [1] | Opombe | Točke (Kakov. | Št. [1] | Opombe | Točke (Kakov. Razred) | Št. [1] | Opombe |

5 | | Zelo dober odličen vzorec najvišja kakovost (enakomerno suho) | 5 | | Zelo dobra odličen vzorec najvišja kakovost (dobro mazavo) | 5 | | Zelo dobra odličen vzorec najvišja kakovost (popolnoma čista fina aroma) |

4 | | Dober [2] | 4 | | Dobra [2] | 4 | | Dobra [2] |

| | 18 | mehko | | |

3 | | Primeren (manjše napake) | 3 | | Primerna (manjše napake) | 3 | | Primerna (manjše napake) |

1 | izločena voda | 14 | prhko, krhko, drobljivo | 21 | nečist |

2 | neenotno, dvobarvno | 15 | testeno, oljnato | 22 | tuj okus |

3 | progasto | 16 | lepljivo | 25 | ocetno kisel |

4 | pisano, marmorirano | 17 | trdo | 27 | vonj po kuhanem, po zažganem |

5 | lisasto | 18 | mehko | 33 | okus po krmi |

6 | izločena maščoba | | | 34 | grenak, trpek |

7 | preizrazita barva | | | 35 | preslan |

8 | premalo čvrsto | | | | |

2 | | Slab (očitne napake) | 2 | | Slaba (očitne napake) | 2 | | Slaba (očitne napake) |

1 | izločena voda progasto | 14 | prhko, krhko, drobljivo | 21 | Nečist |

3 | pisano, marmorirano | 15 | testeno, oljnato | 22 | tuj okus |

4 | lisasto | 16 | lepljivo | 23 | netipičen |

5 | lisasto | 17 | trdo | 25 | ocetno kisel |

6 | izločena maščoba | 18 | mehko | 32 | oksidiran, |

10 | tuji delčki | | | 33 | metalen okus okus po krmi |

11 | plesnivo | | | 34 | grenak, trpek |

12 | neraztopljena sol | | | 35 | preslan |

| | | | 36 | okus po plesni |

| | | | 38 | okus po kemikalijah |

1 | | Zelo slab (velike napake) | 1 | | Zelo slaba (velike napake) | 1 | | Zelo slaba (velike napake) |

1 | izločena voda | 14 | prhko, krhko, drobljivo | 22 | tuj okus |

3 | progasto | 15 | testeno, oljnato | 24 | sirast, sirasto |

4 | pisano, marmorirano | 16 | lepljivo | 25 | kisel |

5 | lisasto | 17 | trdo | 26 | ocetno kisel |

6 | izločena maščoba | 18 | mehko | 28 | kvasast |

7 | preizrazita barva | | | 29 | okus po plesni |

9 | zrnasto | | | 30 | žarek okus |

10 | tuji delčki | | | 31 | okus po olju, ribah |

11 | plesnivo | | | 32 | okus po loju |

12 | neraztopljena sol | | | 34 | oksidiran, metalen okus |

| | | | 36 | grenak, trpek |

| | | | 37 | zatohel, gniloben okus po sladu |

| | | | 38 | okus po kemikalijah |

Tabela 2: Tabela pomanjkljivosti masla

I. Zunanji videz

1. izločena voda

2. neenotno, dvobarvno

3. progasto

4. pisano, marmorirano

5. lisasto

6. izločena mačoba

7. preizrazita barva

8. premalo čvrsto

9. zrnasto

10. tuji delčki

11. plesnivo

12. neraztopljena sol

II. Konzistenca

14. prhko, krhko, drobljivo

15. testeno, oljnato

16. lepljivo

17. trdo

18. mehko

III. Aroma in vonj

20. brez arome

21. nečist [3]

22. tuj okus

23. netipičen

24. sirast, sirasto kisel

25. ocetno kisel

26. kvasast

27. (a) (a) okus po kuhanem

(b) okus po zaganem

28. okus po plesni

29. žarek okus

30. okus po olju, ribah

31. okus po loju

32. (a) (a) oksidiran okus

(b) metalen okus

33. okus po krmi

34. grenak, trpek

35. preslan

36. zatohel, gniloben okus

37. okus po sladu

38. okus po kemikalijah

[1] Tabela 2.

[2] Pomanjkljivosti, navedene pod "dober", so samo zelo majhna odstopanja od odličnega vzorca.

[3] To oznako je treba po mo nosti čcim redkeje uporabljati, samo kadar pomanjkljivosti ni mogočce opisati natančcneje.

--------------------------------------------------

PRILOGA VIII

(Člen 7)

POSTOPEK PRI SPORNIH REZULTATIH ANALIZ (kemijska analiza)

1. Na zahtevo izvajalca se lahko v roku sedmih delovnih dni po objavi rezultatov prve analize opravi dodatna analiza, če so na voljo zapečatene kopije vzorcev proizvoda, ki jih ustrezno hranijo pristojni organi.

2. Pristojni organ pošlje te vzorce drugemu laboratoriju na zahtevo in stroške izvajalca. Ta laboratorij mora biti pooblaščen za izvajanje uradnih analiz in mora biti preverjeno usposobljen za zadevne analize. To usposobljenost je treba dokumentirati z uspešnim sodelovanjem v skupnih raziskavah, preskusih usposobljenosti ali medlaboratorijskih primerjavah. Ta drugi laboratorij mora uporabiti referenčni postopek. Rezultate, dobljene v obeh laboratorijih, je treba oceniti na naslednji način:

(a) Kadar oba laboratorija izpolnjujeta zahtevo ponovljivosti in zahtevo obnovljivosti

Aritmetična sredina rezultatov preskusa, dobljenih v obeh laboratorijih, se objavi kot končni rezultat. Končni rezultat se oceni ob upoštevanju kritične razlike po naslednji enačbi:

CrD

- m

1 -

kjer je:

- : aritmetična sredina vseh rezultatov, dobljenih v obeh laboratorijih

mo : meja

R : obnovljivost

r : ponovljivost

n1 : število rezultatov, dobljenih v laboratoriju 1

n2 : število rezultatov, dobljenih v laboratoriju 2.

Opomba:

Če je končni rezultat izračunan po enačbi

x = y

± y

ali

x = y

(glej Prilogo IV(3) in (4)), je treba v enačbo namesto R2 in r2 vstaviti R2x in r2x.

(b) Kadar oba laboratorija izpolnjujeta zahtevo ponovljivosti, ne pa zahteve obnovljivosti

Če druga analiza potrdi prvo, je treba analizirano količino zavrniti kot neustrezno. Drugače je treba količino sprejeti.

Pri odločitvi, ali se analizirana količina sprejme, je treba uporabiti končni rezultat laboratorija, ki izpolnjuje zahtevo ponovljivosti.

(d) Kadar nobeden od laboratorijev ne izpolnjuje zahteve ponovljivosti, izpolnjujeta pa zahtevo obnovljivosti,

se uporablja postopek iz točke (a).

(e) Kadar nobeden od laboratorijev ne izpolnjuje zahteve ponovljivosti niti zahteve obnovljivosti

Analizirano količino je treba sprejeti, če k takšnemu sklepu navajajo rezultati, dobljeni v enem laboratoriju.

(f) Kadar so bili rezultati dobljeni po nevalidiranih postopkih

Analizirano količino je treba sprejeti, če k takšnemu sklepu navajajo rezultati, dobljeni v enem laboratoriju.

3. Rezultate druge analize mora pristojni organ čimprej javiti izvajalcu. Če se analizirana količina zavrne, stroške druge analize plača izvajalec.

4. Če izvajalec lahko v petih dneh po vzorčenju dokaže, da postopek vzorčenja ni potekal pravilno, je treba vzorčenje po možnosti ponoviti. Če vzorčenja ni mogoče ponoviti, je treba analizirano količino sprejeti.

--------------------------------------------------

PRILOGA IX

(Člen 8)

DOLOČITEV VSEBNOSTI VODE V MASLU

1. Namen in področje uporabe

S to referenčno metodo je določen postopek za določitev vsebnosti vode v maslu.

2. Sklicevanje

Standard IDF 50C:1995 — Mleko in mlečni proizvodi — Metode vzorčenja

3. Opredelitev pojma

Vsebnost vode v maslu: izguba mase po zaključku postopka segrevanja, določenega v tem standardu. Izražena je v gramih na 100 gramov.

4. Princip

Izhlapevanje vode iz odtehte vzorca ob prisotnosti kremenovega peska pri temperaturi 102 °C v sušilniku.

5. Oprema in materiali

Običajna laboratorijska oprema, še zlasti pa:

5.1 Analitska tehtnica s točnostjo 1 mg.

5.2 Eksikator z učinkovitim sušilnim sredstvom (na primer, sveže posušen silikagel s higroskopičnim indikatorjem).

5.3 Sušilnik, ventilatorski, termostatsko krmiljen, ki deluje pri temperaturi 102 ± 2 °C po celotni delovni površini.

5.4 Steklene, porcelanske ali nerjavne kovinske posode z višino približno 20 mm in premerom 60 do 80 mm.

5.5 Kremenov pesek, v zrnih, opran, s premerom 0,8–10 mm.

6. Vzorčenje

Glej IDF 50C:1995

7. Postopek

7.1 Priprava preskusnega vzorca

Segrejte laboratorijski vzorec v zaprti stekleni ali primerni plastični posodi, napolnjeni med eno polovico in dvema tretjinama, do temperature, ko postane vzorec dovolj mehak, da ga je mogoče temeljito premešati do homogenega stanja (bodisi z mehanskim mešalnikom ali na roko). Temperatura mešanja naj navadno ne bi presegala 35 °C. Ohladite vzorec na temperaturo okolice. Po ohlajenju čimprej odprite posodo in vzorec pred tehtanjem na hitro (največ deset sekund) premešajte s primernim orodjem, na primer z žlico ali lopatico.

7.2 Določitev vsebnosti vode

7.2.1 V posodo dajte približno 10 g kremenovega peska (5.4).

7.2.2 Sušite posodo s kremenovim peskom v sušilniku (5.3) pri temperaturi 102 ± 2 °C najmanj eno uro.

Opomba:

Časi sušenja, navedeni v 7.2.2, 7.2.5 in 7.2.7, začnejo teči, ko temperatura sušilnika doseže 102 ± 2 °C.

7.2.3 Pustite, da se posoda ohladi v eksikatorju (5.2) na temperaturo prostora tehtanja in stehtajte na 1 mg natančno.

7.2.4 V posodo natehtajte na 1 mg natančno približno 5 g preskusnega vzorca.

7.2.5 Postavite posodo v sušilnik pri temperaturi 102 ± 2 °C in jo v njej pustite tri ure.

7.2.6 Pustite, da se posoda v eksikatorju ohladi do temperature prostora tehtanja, in stehtajte na 1 mg natančno.

7.2.7 Ponavljajte postopek sušenja za nadaljnjo eno uro, vsakič ponovite hlajenje in tehtanje, kakor je opisano v 7.2.6, dokler ne dosežete stalne mase (sprememba mase ne presega 1 mg).

Če bi se masa povečala, vzemite za izračun najnižjo zabeleženo maso.

8. Podajanje rezultatov

8.1 Postopek izračuna in enačba

Vsebnost vode, W, se izračuna kot masni delež po naslednji enačbi:

W =

- m

× 100

kjer je:

m0 v gramih izraena masa posode s peskom (7.2.3)

m1 v gramih izražena masa odtehte vzorca, posode in peska pred sušenjem (7.2.4)

m2 v gramih izraena masa odtehte vzorca, posode in peska po sušenju (7.2.7)

Rezultat se zaokroži na eno decimalno mesto.

8.2 Ponovljivost

Absolutna razlika med rezultatoma dveh posameznih določitev, ki ju izvede hkrati ali v zelo kratkem presledku isti izvajalec pri enakih pogojih na istovetnem preskusnem materialu, ne sme presegati 0,2 %.

8.3 Obnovljivost

Absolutna razlika med dvema posameznima in neodvisnima rezultatoma, ki ju dobita dva izvajalca v različnih laboratorijih na istovetnem preskusnem materialu, ne sme presegati 0,3 %.

9. Poročilo o preskusu

V poročilu o preskusu je treba opisati uporabljeno metodo in navesti dobljene rezultate. V njem je treba navesti tudi vse podrobnosti v zvezi z izvajanjem, ki niso opisane v tem mednarodnem standardu ali ne veljajo za neobvezne, skupaj s podrobnostmi o vseh pripetljajih, ki so morda vplivali na rezultate. V poročilo o preskusu je treba zajeti vse podatke, potrebne za popolno prepoznavnost vzorca.

--------------------------------------------------

PRILOGA X

(Člen 8)

MASLO: DOLOČITEV VSEBNOSTI SUHE SNOVI BREZ MAŠČOBE

1. Namen in področje uporabe

V tem standardu je določena metoda za določitev vsebnosti suhe snovi v maslu, ki ni maščoba.

2. Sklicevanje

Standard IDF 50C:1995 — Mleko in mlečni proizvodi — Metode vzorčenja

3. Opredelitev pojma

Vsebnost suhe snovi brez maščobe v maslu: masni delež, kakor se določi po opisanem postopku. Izražen je v gramih na 100 gramov.

4. Princip

Izhlapevanje vode iz znane mase masla, ekstrakcija maščobe s petroletrom in tehtanje ostanka.

5. Reagent

Petroleter z razponom vrelišča med 30 °C in 60 °C. Reagent po izparevanju 100 ml ne sme pustiti več kot 1 mg ostanka.

6. Oprema in materiali

6.1 Analitska tehtnica s točnostjo 1 mg.

6.2 Eksikator z učinkovitim sušilnim sredstvom (na primer sveže posušen silikagel s higroskopičnim indikatorjem).

6.3 Sušilnik, ventilatorski, termostatsko krmiljen, ki deluje pri temperaturi 102 ± 2 °C po celotni delovni površini.

6.4 Steklene, porcelanske ali nerjavne kovinske posode z višino približno 20 mm in premerom 60 do 80 mm, skupaj s stekleno paličko za mešanje.

6.5 Filtrirni žarilni lonček iz sintranega stekla z luknjicami s premerom 16 do 14 μm s presesalno bučo.

7. Vzorčenje

Glej standard IDF 50C:1995.

8. Postopek

8.1 Priprava preskusnega vzorca

Segrejte laboratorijski vzorec v zaprti stekleni ali primerni plastični posodi, napolnjeni med eno polovico in dvema tretjinama, do temperature, ko postane vzorec dovolj mehak, da ga je mogoče temeljito premešati do homogenega stanja (bodisi z mehanskim mešalnikom ali na roko). Temperatura mešanja navadno ne sme presegati 35 °C. Ohladite vzorec na temperaturo okolice. Čimprej po ohladitvi vzorca odprite posodo in vzorec pred tehtanjem na hitro (največ deset sekund) premešajte s primernim orodjem, na primer z žlico ali lopatko.

8.2 Določitev

8.2.1 Sušite posodo skupaj z mešalno paličko (6.4) in filtrirnim lončkom (6.5) v sušilniku (6.3) eno uro. Pustite, da se ti predmeti ohladijo v eksikatorju in jih skupaj stehtajte (posodo, paličko in lonček) na 1 mg natančno (mo).

Opombe:

- Praviloma zadostuje čas hlajenja 45 minut,

- Pomembno je, da se za vsak preskusni vzorec uporabi isti sestav posode, paličke in lončka, če se analizira več kot ena odtehta v seriji.

8.2.2 Odstranite lonček, zapišite maso posode in paličke skupaj na 1 mg natančno (m1).

8.2.3 V posodo natehtajte na 1 mg natančno približno 5 g preskusnega vzorca (8.1) (m2).

8.2.4 Postavite posodo (s paličko in maslom) v sušilnik pri temperaturi 102 ± 2 °C in jo pustite čez noč.

8.2.5 Pustite, da se posoda (8.2.3) ohladi na temperaturo prostora.

8.2.6 V posodo dodajte 15 ml toplega (približno 25 °C) petroletra in s stekleno paličko čimbolj odstranite usedlino, ki se je prijela posode. Prenesite topilo v lonček in pustite, da se prefiltrira v presesalno bučko.

8.2.7 Postopek 8.2.6 ponovite še štirikrat. Če na površini posode ni več sledi maščobe, prenesite med četrtim spiranjem kvantitativno čim več usedline v lonček. V nasprotnem primeru ponavljajte postopek 8.2.6 do popolne odstranitve vsakršnih sledi maščobe.

8.2.8 Izperite usedlino v lončku s 25 ml toplega petroletra.

8.2.9 Sušite posodo in stekleno paličko skupaj z lončkom v sušilniku pri 102 ± 2 °C 30 minut.

8.2.10 Pustite, da se ohladijo v eksikatorju na temperaturo prostora, in jih stehtajte na 1 mg natančno.

8.2.11 Ponavljajte postopka iz točk 8.2.9 in 8.2.10, dokler ne dosežete stalne mase (sprememba mase ne sme presegati 1 mg) za posodo, paličko in lonček skupaj (m3).

9. Podajanje rezultatov

9.1 Izračun vsebnosti suhe snovi brez maščobe

Vsebnost suhe snovi brez maščobe, SNF, se izračuna kot masni delež po naslednji enačbi:

SNF =

- m

× 100

kjer je:

m0 v gramih izražena masa prazne posode s stekleno paličko in filtrirnim lončkom (8.2.1)

m1 v gramih izražena masa prazne posode s stekleno paličko (8.2.2)

m2 v gramih izražena masa odtehte vzorca in posode s stekleno paličko (8.2.3)

m3 v gramih izražena končna masa v posodi, skupaj s paličko in lončkom, ki vsebuje usedlino (8.2.11)

Rezultat se zaokroži na eno decimalno mesto.

9.2 Ponovljivost

Absolutna razlika med rezultatoma dveh posameznih določitev, ki ju isti izvajalec izvede hkrati ali takoj drugo za drugo pri enakih pogojih na istovetnem preskusnem materialu, ne sme presegati 0,1 %.

9.3 Obnovljivost

Absolutna razlika med dvema posameznima in neodvisnima rezultatoma, ki ju dobita dva izvajalca v različnih laboratorijih na istovetnem preskusnem materialu, ne sme presegati 0,2 %.

10. Poročilo o preskusu

V poročilu je treba navesti uporabljeno metodo in dobljene rezultate. V njem je treba omeniti tudi vse podrobnosti v zvezi z izvajanjem preskusa, ki niso navedene v tem mednarodnem standardu ali pa ne veljajo za neobvezne, skupaj s podrobnostmi o vseh pripetljajih, ki so morda lahko vplivali na rezultate. V poročilo o preskusu je treba zajeti vse podatke, potrebne za popolno razpoznavnost vzorca.

Opomba:

Če se analizira soljeno maslo, se dodana sol določi kot suha snov brez mačobe. Pri določitvi vsebnosti mlečne suhe snovi brez mačobe je treba vsebnost dodane soli odteti od vsebnosti suhe snovi brez mačobe. Izračunane vrednosti natančnosti za določitev mlečne suhe snovi brez mačobe so:

Ponovljivost : r = 0,104 %

Obnovljivost : R = 0,206 %

Sklepati je mogoče, da vrednosti za natančnost, dobljene za določitev suhe snovi brez maščobe, veljajo za določitev vsebnosti mlečne suhe snovi brez maščobe.

--------------------------------------------------

PRILOGA XI

(Člen 8)

DOLOČITEV VSEBNOSTI MAŠČOBE V MASLU

Vsebnost maščobe se dobi posredno z določitvijo vsebnosti vode in suhe snovi brez maščobe v skladu s Prilogo IX in Prilogo X. Masni delež znaša

100 -

W + SNF

kjer je:

W : masni delež vode

SNF : masni delež suhe snovi brez mačobe

Izračunane vrednosti za natančnost za določitev vsebnosti maščobe so:

Ponovljivost: | r = 0,22 % |

Obnovljivost: | R = 0,36 %. |

--------------------------------------------------

PRILOGA XII

(Člen 9)

DOLOČITEV VSEBNOSTI VANILINA V ZGOŠČENEM MASLU, MASLU ALI SMETANI S TEKOČINSKO KROMATOGRAFIJO VISOKE LOČLJIVOSTI

1. Namen in področje uporabe

Metoda opisuje postopek za kvantitativno določitev vanilina v zgoščenem maslu, maslu ali smetani.

2. Princip

Ekstrakcija znane količine vzorca z mešanico izopropanola/etanola/acetonitrila (1:1:2). Sedimentacija večine maščobe z ohladitvijo med -15 °C in -20 °C, ki ji sledi centrifugiranje.

Po razredčenju z vodo sledi določitev vsebnosti vanilina s tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti (HPLC).

3. Oprema

Običajna laboratorijska oprema, še posebej pa naslednja:

3.1 zamrzovalnik, ki deluje pri temperaturnem razponu -15 °C do -20 °C;

3.2 brizgalke z razpoložljivo prostornino 2 ml;

3.3 membranski mikrofiltri z velikostjo luknjic 0,45 μm, odporni na raztopino, ki vsebuje 5 % ekstrakcijske raztopine (4.4);

3.4 sistem za tekočinsko kromatografijo, ki vsebuje črpalko (pretok 1,0 ml/min), injektor (z injekcijsko prostornino 20 μl, avtomatski ali ročni), UV-detektor (ki deluje pri 306 nm, 0,01 AU celotne lestvice), rekorder ali integrator in grelnik kolone, ki deluje pri 25 °C;

3.5 analitska kolona (250 mm × 4,6 mm ID), napolnjena z LiChrospherjem RP 18 (Merck, 5 μm) ali enakovrednim polnilom;

3.6. varovalna kolona (pribl. 20 mm × 3 mm ID), suho polnjena s Perisorbom RP 18 (30 do 40 μm) ali enakovrednim polnilom.

4. Reagenti

Vsi uporabljeni reagenti morajo biti priznane analitske kakovosti.

4.1 Izopropanol

4.2 Etanol 96 % (v/v)

4.3 Acetonitril

4.4 Ekstrakcijska raztopina

Pripravite zmes izopropanola (4.1), etanola (4.2) in acetonitrila (4.3) v razmerju 1:1:2 (v/v);

4.5 Vanilin (4-hidroksi-3-matoksibenzaldehid)

4.5.1 Osnovna raztopina vanilina (= 500 μg/ml)

V 100-mililitrsko merilno bučko natehtajte približno 50 mg (CM mg) vanilina (4.5) na 0,1 mg natančno, dodajte 25 ml ekstrakcijske raztopine (4.4) in dopolnite z vodo.

4.5.2 Standardna raztopina vanilina (= 10 μg/ml).

V 250-mililitrsko merilno bučko odpipetirajte 5 ml osnovne raztopine vanilina (4.5.1) in dopolnite z vodo.

4.6 Metanol, HPLC-čistote

4.7 Ledocetna kislina

4.8 Voda, HPLC-čistote

4.9 Mobilna faza HPLC

V 1000-mililitrski merilni bučki zmešajte 300 ml metanola (4.6) s približno 500 ml vode (4.8) in 20 ml ocetne kisline (4.7) ter dopolnite z vodo (4.8). Zmes prefiltrirajte skozi filter 0,45 μm (3.3).

5. Postopek

5.1 Priprava preskusnega vzorca

5.1.1 M a s l o

Maslo segrevajte toliko časa, da se začne taliti. Maslo se na posameznih mestih ne sme pregreti prek 40 °C. Ko vzorec postane dovolj plastičen, ga homogenizirajte z mešanjem. Maslo mešajte 15 s, preden vzamete vzorec. V 100-mililitrsko merilno bučko natehtajte približno 5 g (SM g) masla na 1 mg natančno.

5.1.2 Z g o š č e n o m a s l o

Tik pred vzorčenjem postavite posodo z zgoščenim maslom v sušilnik, segret na 40 do 50 °C, dokler se ta popolnoma ne stali. Vzorec premešajte z vrtenjem ali mešanjem, preprečite nastajanje zračnih mehurčkov zaradi premočnega mešanja. V 100-mililitrsko merilno bučko natehtajte na 1 mg natančno približno 4 g (SM g) zgoščenega masla.

5.1.3 S m e t a n a

Vzorec segrejte v vodni kopeli ali inkubatorju pri temperaturi 35 °C do 40 °C. Maščobo enakomerno razporedite z vrtenjem ali, če je treba, z mešanjem. Vzorec na hitro ohladite na 20 ± 2 °C. Vzorec mora izgledati homogen, drugače je treba postopek ponoviti. V 100-mililitrsko merilno bučko natehtajte približno 10 g (SM g) smetane na 1 mg natančno.

5.2 Priprava preskusne raztopine

Preskusni količini vzorca (5.1.1, 5.1.2 ali 5.1.3) dodajte približno 75 ml ekstrakcijske raztopine (4.4), približno 15 minut dobro mešajte ali stresajte, nato dolijte ekstrakcijsko raztopino (4.4). Približno 10 ml tega ekstrakta prenesite v epruveto z zamaškom. Postavite epruveto v zamrzovalnik (3.1) in jo pustite v njem približno 30 minut. Centrifugirajte hladni ekstrakt pet minut pri približno 2000 vrtljajih na minuto in ga takoj oddekantirajte. Pustite, da se odcejena raztopina ohladi na temperaturo okolice. Odpipetirajte 5 ml oddekantirane raztopine v 100-mililitrsko merilno bučko in dopolnite vodo. Prefiltrirajte alikvot skozi membranski mikrofilter (3.3). Filtrat je pripravljen za določitev s HPLC.

5.3 Umerjanje

Odpipetirajte 5 ml standardne raztopine vanilina (4.5.2) v 100-mililitrsko merilno bučko. Dodajte 5 ml ekstrakcijske raztopine (4.4) in dopolnite z vodo do oznake. Ta raztopina vsebuje 0,5 μg/ml vanilina.

5.4 Določitev s HPLC

Pustite kromografski sistem približno 30 minut, da se umiri. Injicirajte standardno raztopino (5.3). To ponavljate, dokler razlika na površini vrha ali višini vrha med dvema zaporednima injiciranjima ne znaša manj kot 2 %. Pri opisanih pogojih znaša retenzijski čas vanilina približno 9 minut. Opravite dve vzporedni analiz standardne raztopine (5.3) z injiciranjem 20 μl. Vbrizgajte 20 μl preskusne raztopine (5.2). Določite površino ali višino dobljenega vrha vanilina. Ponovite vzporedno injiciranje standardne raztopine (5.3), 10 injiciranj preskusnih vzorcev (5.2).

6. Izračun rezultatov

Izračunajte povprečno površino vrha (ali višino) (AC) vrhov za vanilin v povezavi z določenim številom vzporednih vbrizganj za vsako serijo preskusne raztopine (skupaj štiri površine ali višine).

Izračunajte odzivni faktor (R):

R = AC/CM

kjer je CM masa vanilina v mg (4.5.1).

Vsebnost (mg/kg) vanilina (C) v preskusnem vzorcu se izračuna:

C =

AS × 20 × 0,96SM × R

kjer je:

AS = površina vrha vanilina pri vzorcu

SM =

masa preskusnega vzorca v g (5.1.1, 5.1.2 ali 5.1.3)

Pri analizi vanilina v smetani mora biti koncentracija slediva izražena v mg slediva/kg mlečne maščobe. To se naredi tako, da se C pomnoži s 100/f, kjer je f vsebnost maščobe v smetani, izražena v odstotkih (m/m).

20 = faktor, ki upošteva redčenje standardnega in preskusnega vzorca

0,96 = korekcijski faktor za vsebnost maščobe pri prvi dopolnitvi preskusnega vzorca.

Opomba:

Namesto površine vrha se lahko uporabi višina vrha (glej 8.3).

7. Natančnost postopka

7.1 Ponovljivost (r)

Razlika med rezultatoma dveh določitev, ki ju isti izvajalec opravi v najkrajšem izvedljivem časovnem presledku z isto opremo na istovetnem preskusnem materialu, ne sme presegati 16 mg/kg.

7.2 Obnovljivost (R)

Razlika med rezultatoma dveh določitev izvajalce v različnih laboratorijih z različno opremo na istovetnem preskusnem materialu, ne sme presegati 27 mg/kg.

8. Tolerančne meje

8.1 Od proizvoda, ki se sledi, je treba vzeti tri vzorce, da se preveri homogenost.

8.2 Sledivo, pridobljeno iz vanilina ali sintetičnega vanilina;

8.2.1 Inkorporacijska stopnja za 4-hidroksi-3-metoksibenzaldehid je 250 g na tono zgoščenega masla ali masla. Pri sledenju smetane znaša inkorporacijska stopnja 250 g na tono mlečne maščobe.

8.2.2 Rezultati za vse tri vzorce, dobljene z analizo proizvoda, se uporabijo za preverjanje stopnje in homogenosti inkorporacije slediva, najnižji od treh rezultatov pa se primerja z naslednjimi mejami (upoštevana je kritična razlika za 95-odstotno verjetnostno stopnjo (DCr95)):

- 221,0 mg/kg (95 % od najmanjše inkorporacijske stopnje),

- 159,0 mg/kg (70 % od najmanjše inkorporacijske stopnje).

Koncentracija slediva v vzorcu, s katero se doseže najnižji rezultat, se uporabi v zvezi z interpolacijo med 221,0 mg/kg in 159,0 mg/kg.

8.3 Slediva, dobljena izključno iz vanilijevih zrn ali njihovih integralnih ekstraktov:

8.3.1 Inkorporacijska stopnja za 4-hidroksi-3-metoksibenzaldehid znaša 100 g na tono zgoščenega masla ali masla. Pri sledenju smetane znaša inkorporacijska stopnja 100 g na tono mlečne maščobe.

8.3.2 Rezultati vseh treh vzorcev, dobljeni z analizo proizvoda, se uporabijo za preverjanje stopnje in homogenosti inkorporacije slediva, najnižji od treh rezultatov pa se primerja z naslednjimi mejami (upoštevana je kritična razlika za 95-odstotno verjetnostno stopnjo (DCr95):

- 79,0 mg/kg (95 % od najmanjše inkorporacijske stopnje),

- 54,0 mg/kg (70 % od najmanjše inkorporacijske stopnje).

Koncentracijo slediva v vzorcu, s katero se doseže najnižji rezultat, se uporabi v zvezi z interpolacijo med 70,0 mg/kg in 54,0 mg/kg.

9. Opombe

9.1 Ponovljivost r je vrednost, pod katero se lahko z določeno verjetnostjo pričakuje, da leži absolutna razlika med dvema posameznima preskusnima rezultatoma, dobljenima po enakem postopku na istovetnem preskusnem materialu pri enakih pogojih (ista oprema, isti laboratorij in v kratkem časovnem presledku); če ni navedeno drugače, znaša verjetnost 95 %.

9.2 Obnovljivost R je vrednost, pod katero se lahko z določeno verjetnostjo pričakuje, da leži absolutna razlika med dvema posameznima preskusnima rezultatoma, dobljenima po enakem postopku na istovetnem preskusnem materialu pri različnih pogojih (različni izvajalci, različna oprema, različni laboratoriji in/ali različen čas); če ni navedeno drugače, znaša verjetnost 95 %.

9.3 Izkoristek dodanega vanilina pri stopnji 250 mg/kg maslenega olja se giblje med 97,0 in 103,8. Povprečna ugotovljena vsebnost je znašala 99,9 % s standardnim odmikom 2,7 %.

9.4 Standardna raztopina vsebuje 5 % ekstrakcijske raztopine, ki uravnava širjenje vrha, ki ga povzroči 5-odstotna ekstrakcijska raztopina preskusnih vzorcev. To omogoča kvantitativno določitev z višino vrha.

9.5 Analiza temelji na linearni umeritveni krivulji s presečiščem 0.

Pri ustreznih redčenjih standardne raztopine (4.5.2) je treba preveriti linearnost pri prvem izvajanju analize in nato v rednih časovnih presledkih ali po spremembah ali popravilu opreme HPLC.

--------------------------------------------------

PRILOGA XIII

(Člen 9)

DOLOČITEV ETIL ESTRA BETA-APO-8’-KAROTENSKE KISLINE V ZGOŠČENEM MASLU IN MASLU S SPEKTROFOTOMETRIJO

1. Namen in področje uporabe

Metoda opisuje postopek za kvantitativno določitev etil estra beta-apo-8’-karotenske kisline (apo-karotenski ester) v zgoščenem maslu in v maslu. Apo-karotenski ester je vsota vseh snovi, prisotnih v dekstraktu vzorcev, dobljenih pri pogojih, opisanih v postopku, ki absorbirajo svetlobo pri 440 nm.

2. Princip

Maslena maščoba se raztopi v petroletru, absorbanca pa se meri pri 440 nm. Vsebnost apo-karotenskega estra se določi s sklicevanjem na eksterni standard.

3. Oprema

3.1 Pipete — polnilne, s prostornino 0,25, 0,50, 0,75 in 1,0 ml

3.2 Spektrofotometer — primeren za uporabo pri 440 nm (in 447-449 nm) in opremljen s kiveto, dolgo 1 cm

3.3 Merilni bučki, 20 ml in 100 ml

3.4 Analitska tehtnica s točnostjo 0,1 mg.

4. Reagenti

Vsi reagenti morajo biti analitsko čisti.

4.1 Suspenzija apo-karotenskega estra (približno 20 %)

4.1.1 Ugotovite vsebnost suspenzije na naslednji način:

V merilno bučko (100 ml) natehtajte približno 400 mg, raztopite jo v 20 ml kloroforma (4.4) in prostornino dopolnite s cikloheksanom (4.5). Razredčite 5 ml te raztopine na 100 ml s cikloheksanom (raztopina A). Razredčite 5 ml raztopine A na 100 ml s cikloheksanom. Merite absorbanco pri 447-449 nm (izmeri se največja vrednost proti cikloheksanu kot slepemu vzorcu v 1-centimetrski kiveti).

Vsebnost apo-karotenskega estra

Amaks · 40000A · 2550

Amaks = največja absorbanca merjene raztopine

A = masa vzorca (g)

2550 = referenčna vrednost A (1 %, 1 cm)

Čistota suspenzije je P (%).

Opomba:

Suspenzija apo-karotenskega estra je občutljiva na zrak, toploto in svetlobo. V zaprti prvotni posodi (na prodaj pod dušikom) in na hladnem mestu se lahko hrani približno eno leto. Po odprtju je treba vsebino čimprej porabiti.

4.1.2 Standardna raztopina apo-karotenskega estra, pribl. 0,2 mg/ml

Natehtajte na 0,1 mg natančno približno 0,100 g suspenzije apo-karotenskega estra (4.1.1) (Wg), raztopite jo v petroletru (4.2), kvantitativno jo prenesite v merilno bučko s prostornino 100 ml in jo dopolnite s petroletrom do oznake.

Ta raztopina vsebuje (W.P)/10 mg/ml apo-karotenskega estra.

Opomba:

Raztopino je treba hraniti v hladnem in temnem prostoru. Neporabljeno raztopino po enem mesecu zavrzite.

4.2 Petroleter (40 — 60 °C).

4.3 Natrijev sulfat, brezvodni, v zrnih, predhodno sušen dve uri pri 102 °C.

4.4 Kloroform.

4.5 Cikloheksan.

5. Postopek

5.1 Priprava preskusnega vzorca

5.1.1 Zgoščeno maslo

Vzorec raztalite v sušilniku pri temperaturi približno 45 °C.

5.1.2 Maslo

Vzorec raztalite v sušilniku pri približno 45 °C in prefiltrirajte reprezentativno količino skozi filter, ki vsebuje približno 10 g brezvodnega natrijevega sulfata (4.3), v okolici, zaščiteni pred močno naravno in umetno svetlobo, in ga hranite pri temperaturi 45 °C. Zberite primerno količino maslene maščobe.

5.2 Določitev

Natehtajte na 1 mg natančno približno 1 g zgoščenega masla (ali izločene maslene maščobe (5.1.2)) (Mg). Kvantitativno ga prenesite v 20-mililitrsko (Vml) merilno bučko s petroletrom (4.2), dopolnite do oznake in temeljito premešajte.

Prenesite alikvot v 1-centimetrsko kiveto in izmerite absorbanco pri 440 nm proti petroletru kot slepemu vzorcu. Določite koncentracijo apo-karotenskega estra v raztopini glede na umeritveno krivuljo (C μ/ml).

5.3 Umeritvena krivulja

Odpipetirajte 0, 0,25, 0,5, 0,75 in 1,0 ml standardne raztopine apo-karotenskega estra (4.1.2) v pet 100-mililitrskih merilnih bučk. Dopolnite celotno prostornino s petroletrom (4.2) in zmešajte.

Približne koncentracije raztopin segajo od 0 do 2 μg/ml, točno pa se izračunajo glede na koncentracijo standardne raztopine (4.1.2) (W.P)/10 mg/ml. Izmerite absorbance pri 440 nm proti slepemu vzorcu petroletra (4.2).

Nanesite vrednosti absorbance na os y, koncentracijo apo-karotenskega estra pa na os x.

6. Izračun rezultatov

6.1 Vsebnost apo-karotenskega estra, izražena v mg/kg, je podana z:

Zgoščeno maslo: (C.V)/M

Maslo: 0,82 (C.V)M

kjer je:

C = vsebnost apo-karotenskega estra, μg/ml, odčitana na umeritveni krivulji (5.3)

V = prostornina (ml) preskusne raztopine (5.2)

M = masa (g) odtehtanega vzorca (5.2)

0,82 = korekcijski faktor za vsebnost maslene maščobe v maslu.

7. Natančnost postopka

7.1 Ponovljivost

7.1.1 Analiza masla

Razlika med rezultatoma dveh določitev, ki ju isti izvajalec izvede v najkrajšem možnem časovnem presledku z isto opremo na istovetnem preskusnem materialu, ne sme presegati 1,4 mg/kg.

7.1.2 Analiza zgoščenega masla

Razlika med rezultatoma dveh določitev, ki ju isti izvajalec izvede v najkrajšem možnem časovnem presledku z isto opremo na istovetnem preskusnem materialu, ne sme presegati 1,6 mg/kg.

7.2 Obnovljivost

7.2.1 Analiza masla

Razlika med rezultatoma dveh določitev, ki ju izvajalci opravijo v različnih laboratorijih z različno opremo na istovetnem preskusnem materialu, ne sme presegati 4,7 mg/kg.

7.2.2 Analiza zgoščenega masla

Razlika med rezultatoma dveh določitev, ki ju izvajalci opravijo v različnih laboratorijih z različno opremo na istovetnem preskusnem materialu, ne sme presegati 5,3 mg/kg.

7.3 Vir podatkov natančnosti

Podatki natančnosti so bili določeni s preskusom leta 1995, pri katerem je sodelovalo 11 laboratorijev in 12 sledenih vzorcev (šest slepih vzporednih izvajanj) za maslo in 12 sledenih (šest slepih vzporednih analiz) za zgoščeno maslo.

8. Tolerančne meje

8.1 Od sledenega proizvoda je treba vzeti tri vzorce, da se preveri pravilno sledenje proizvoda.

8.2 Maslo

8.2.1 Inkorporacijska stopnja za maslo znaša ob upoštevanju absorbance ozadja 22 mg/kg.

8.2.2 Rezultati za vse tri vzorce, dobljeni z analizo proizvoda, se uporabijo za preverjanje stopnje in homogenosti inkorporacije slediva, najnižji od teh rezultatov pa se primerja z naslednjimi mejami [upoštevana je kritična razlika za 95-odstotno verjetnostno stopnjo (DCr95)]:

- 18,0 mg/kg (95 % od najmanjše inkorporacijske stopnje),

- 13,0 mg/kg (70 % od najmanjše inkorporacijske stopnje).

Koncentracija slediva vzorca, ki da najnižji rezultat, se uporabi v zvezi z interpolacijo med 18,0 mg/kg in 13,0 mg/kg.

8.3 Zgoščeno maslo

8.3.1 Inkorporacijska stopnja za zgoščeno maslo ob upoštevanju absorbance ozadja znaša 24 mg/kg.

8.3.2 Rezultati za vse tri vzorce, dobljeni z analizo proizvoda, se uporabijo za preverjanje stopnje in homogenosti inkorporacije slediva, najnižji od treh rezultatov pa se primerja z naslednjimi omejitvami [upoštevana je kritična razlika za 95-odstotno verjetnostno stopnjo (DCr95)]:

- 20,0 mg/kg (95 % od najmanjše inkorporacijske stopnje),

- 14,0 mg/kg (70 % od najmanjše inkorporacijske stopnje).

Koncentracija slediva vzorca, ki da najnižji rezultat, se uporabi v zvezi z interpolacijo med 20,0 mg/kg in 14,0 mg/kg.

--------------------------------------------------

PRILOGA XIV

(Člen 9)

DOLOČITEV SITOSTEROLA ALI STIGMASTEROLA V MASLU ALI V ZGOŠČENEM MASLU S KAPILARNO-PLINSKO KROMATOGRAFIJO

1. NAMEN IN PODROČJE UPORABE

Metoda opisuje postopek za kvantitativno določitev sitosterola ali sigmasterola v maslu in v zgoščenem maslu. Za sitosterol se vzame vsota β-sitosterola in 22 dihidro-β-sitosterola, za druge sitosterole se predpostavlja, da so nepomembni.

2. PRINCIP

Maslo ali zgoščeno maslo se umili v etanolski raztopini kalijevega hidroksida, snovi, ki jih ni mogoče umiliti, se ekstrahirajo z dietiletrom.

Steroli se preoblikujejo v trimetil-silil etre in se analizirajo s kapilarno-kolonsko plinsko kromatografijo glede na interni standard/betulin.

3. OPREMA

3.1 150-mililitrska bučka za umiljenje s povratnim hladilnikom z obrusi.

3.2 500-mililitrski lij ločniki.

3.3 250-mililitrske bučke.

3.4 Lijaki za izenačenje tlaka, 250 ml ali podobni, za zbiranje odpadnega dietiletra.

3.5 Steklena kolona, 350 mm × 20 mm z zamaškom iz sintranega stekla.

3.6 Vodna kopel ali grelna obloga.

3.7 Reakcijske stekleničke, 2 ml.

3.8 Plinski kromatograf, primeren za uporabo s kapilarno nosilno kolono z razcepitvenim sistemom, ki ga sestavljajo:

3.8.1 Termostatski grelnik za kolone, ki lahko vzdržuje želeno temperaturo do ± 1 °C natančno;

3.8.2 Izparjevalnik z možnostjo nastavitve temperature;

3.8.3 Detektor plamenske ionizacije (FID) in pretvornik – ojačevalnik;

3.8.4 Integrator – rekorder, primeren za uporabo s pretvornikom – ojačevalnikom (3.8.3);

3.9 Kapilarne kolone iz taljenega kremenovega stekla, v celoti prevlečene z BP1 ali enakovrednim materialom z enakomerno debelino 0,25 μm; v koloni mora biti mogoče ločiti trimetil-silil derivate lanosterola in sitosterola. Primeren je BP1 z dolžino 12 m in notranjim premerom 0,2 mm.

3.10 1 μl mikrobrizgalka z iglo s trdo konico za plinsko kromatografijo.

4. REAGENTI

Vsi reagenti morajo biti priznane analitske kakovosti. Uporabljena voda mora biti destilirana ali pa mora biti najmanj enakovredne čistote.

4.1 Etanol, najmanj 95-odstotno čist.

4.2 Kalijev hidroksid, 60-odstotna raztopina, raztopite 600 g kalijevega hidroksida (najmanj 85 %) v vodi in dopolnite do enega litra z vodo.

4.3 Betulin, najmanj 99-odstotno čist.

4.3.1 Raztopine betulina v dietiletru (4.4).

4.3.1.1 Koncentracija raztopine betulina, ki se uporabi pri določitvi sitosterola, mora znašati 1,0 mg/ml.

4.3.1.2 Koncentracija raztopine betulina, ki se uporabi pri določitvi stigmasterola, mora znašati 0,4 mg/ml.

4.4 Dietileter, analitsko čist (brez peroksidov ali ostankov).

4.5 Natrijev sulfat, brezvodni, v zrnih, predhodno sušen dve uri pri 102 °C.

4.6 Sililacijski reagent, na primer TRI–SIL (na voljo pri Pierce Chemical Co, kat. št. 49001) ali enakovreden (Pomembno: TRI–SIL je nevnetljiv, strupen, koroziven in lahko karcinogen; laboratorijsko osebje se mora seznaniti z varnostnimi podatki o TRI–SILU in sprejeti ustrezne varnostne ukrepe).

4.7 Lanosterol.

4.8 Sitosterol, znane čistote, ki ne sme biti manjša od 90 % (P).

Opomba 1:

Čistoto standardnih materialov, ki se uporabijo za umerjanje, je treba določiti po postopku normalizacije. Predpostavite, da so vsi steroli, prisotni v vzorcu, prikazani na kromatogramu, celotna površina vrhov pa pomeni 100 % sestavin sterola, in da steroli dajejo enak detektorski odziv. Linearnost sistema je treba potrditi za celotni razpon koncentracij, ki se proučujejo.

4.8.1 Standardna raztopina sitosterola — pripravite raztopino, ki vsebuje na 0,001 mg/ml natančno, približno 0,5 mg/ml (W1) sitosterola (4.8) v dietiletru (4.4).

4.9 Stigmasterol, znane čistote, ki mora biti najmanj 90 % (P).

4.9.1 Standardna raztopina stigmasterola — pripravite raztopino, ki na 0,001 mg/m natančno vsebuje približno 0,2 mg/ml (W1) stigmasterola (4.9) v dietiletru (4.4).

4.10 Zmes za ločbe. Pripravite raztopino, ki vsebuje 0,05 mg/ml lanosterola (4.7) in 0,5 mg/ml sitosterola (4.8) v dietiletru (4.4).

5. POSTOPEK

5.1 Priprava standardne raztopine za kromatografijo. Raztopini internega standarda (4.3.1) je treba dodati ustrezni standardni raztopini sterola hkrati z njenim dodajanjem umiljenemu vzorcu (glej 5.2.2).

5.1.1 Standardna kromografska raztopina sitosterola: 1 ml standardne raztopine sitosterola (4.8.1) prenesite v vsako od dveh reakcijskih stekleničk (3.7) in odstranite dietileter s tokom dušika. Dodajte 1 ml raztopine internega standarda (4.3.1.1) in odstranite dietileter s tokom dušika.

5.1.2 Standardna kromatografska raztopina stigmasterola: 1 ml standardne raztopine stigmasterola (4.9.1) prenesite v vsako od dveh reakcijskih stekleničk (3.7) in odstranite dietileter s tokom dušika. Dodajte 1 ml raztopine internega standarda (4.3.1.2) in odstranite dietileter s tokom dušika.

5.2 Priprava neumiljivih snovi

5.2.1 Raztalite vzorec masla pri temperaturi, ki ne presega 35 °C, in vzorec temeljito premešajte.

V 150-mililitrsko bučko (3.1) natehtajte na 1 mg natančno približno 1 g masla (W2) ali zgoščenega masla (W2). Dodajte 50 ml etanola (4.1) in 10 ml raztopine kalijevega hidroksida (4.2). Namestite povratni hladilnik in segrevajte 30 minut pri približno 75 °C. Odstranite kondenzator in bučko ohladite približno na temperaturo okolice.

5.2.2 Pri ugotavljanju sitosterola dodajte v bučko 1,0 ml raztopine internega standarda (4.3.1.1), pri ugotavljanju stigmasterola pa (4.3.1.2). Temeljito premešajte. Kvantitativno prenesite vsebino bučke v 500-mililitrski lij ločnik (3.2), nato bučko sperite zaporedoma s 50 ml vode in 250 ml dietiletra (4.4). Dve minuti močno stresajte lij ločnik in nato pustite, da se faze ločijo. Odločite spodnji vodni sloj in sperite sloj etra s stresanjem s štirimi zaporednimi 100 ml alikvoti vode.

Opomba 2:

Da se prepreči nastanek emulzije, je bistveno, da se prvi dve izpiranji z vodo opravita z občutkom (10 vrtljajev). Pri tretjem spiranju se lahko 30 sekund močno pretresa. Če nastane emulzija, se odstrani z dodajanjem 5–10 ml etanola. Če se doda etanol, je zelo pomembno, da se opravita še dve dodatni močni spiranji z vodo.

5.2.3 Čisti sloj etra brez mila spustite skozi stekleno kolono (3.5), ki vsebuje 30 g brezvodnega natrijevega sulfata (4.5). Zberite eter v 250-mililitrsko bučko (3.3). Dodajte vrelne kamenčke in izparevajte skoraj do suhega v vodni kopeli ali grelni oblogi, pri tem pa poskrbite, da zberete odpadna topila.

Opomba 3:

Če se ekstrakti vzorca popolnoma posušijo pri previsoki temperaturi, se sterol lahko izgubi.

5.3 Priprava trimetil silil etrov

5.3.1 Prenesite raztopino etra, ki je ostala v bučki, v 2-mililitrsko reakcijsko stekleničko (3.7) skupaj z 2 ml dietiletra in eter odstranite s tokom dušika. Sperite bučko z dvema dodatnima 2 ml alikvotoma dietiletra, prenesite v stekleničko in vsakič odstranite eter z dušikom.

5.3.2 Sililirajte vzorec z dodatkom 1 ml TRI-SIL-a (4.6). Zaprite stekleničko in močno stresajte, da se vsebina raztopi. Če se ne raztopi popolnoma, jo segrejte na 65-70 °C. Pred njenim vbrizganjem v plinski kromatograf jo pustite stati najmanj pet minut. Enako kot vzorce sililirajte tudi standardne raztopine. Enako kot vzorce sililirajte tudi za preverjanje ločbe.

Opomba 4:

Sililacija mora potekati v suhem okolju. Nepopolna sililacija betulina se pokaže kot drugi vrh poleg vrha betulina.

Prisotnost etanola v fazi sililacije moti sililacijo. Do tega pride lahko zaradi nezadostnega spiranja v fazi ekstrakcije. Če prihaja do te težave, se lahko v fazi ekstrakcije uvede peto spiranje s 30-sekundnim močnim stresanjem.

5.4 Analiza s plinskim kromatografom

5.4.1 Izbira pogojev za izvajanje

Namestite plinski kromatograf po navodilih proizvajalca.

Smernice glede pogojev izvajanja so naslednje:

- temperatura kolone: 265 °C

- temperatura injektorja: 265 °C

- temperatura detektorja: 300 °C

- pretok nosilnega plina: 0,6 ml/min

- tlak vodika: 84 kPa

- zračni tlak: 155 kPa

- cepitev vzorca: 10:1 do 50:1; cepitveno razmerje mora biti optimizirano glede na navodila proizvajalca in premočrtnost odziva detektorja, nato ga je treba potrditi za celotno koncentracijsko območja proučevanja.

Opomba 5:

Še posebej pomembno je redno čiščenje vložka injektorja (liner).

- količina injicirane snovi: 1 μl raztopine TMSE.

Preden začnete s kakršno koli analizo, pustite, da se sistem uravnovesi in odziva dovolj stabilno.

Te pogoje je treba spreminjati glede na značilnosti kolone in plinskega kromatografa, da se dobijo kromatogrami, ki izpolnjujejo naslednje zahteve:

- vrh sitosterola se mora ustrezno ločiti od lanosterola; na sliki 1 je predstavljen tipični kromatogram, ki ga je treba dobiti za sililizirano zmes za preverjanje ločbe (4.10),

- relativni retenzijski časi naslednjih sterolov morajo znašati približno:

holesterol: 1,0

stigmasterol: 1,3

sitosterol: 1,5

betulin: 2,5

- retenzijski čas za betulin bi moral znašati približno 24 minut.

5.4.2 Analizni postopek

Injicirajte 1 μl sililizirane standardne raztopine (stigmastrola ali sitosterola) in prilagodite umerjalne parametre integratorja.

Injicirajte dodatni 1μl sililizirane standardne raztopine, da določite odzivne faktorje glede na betulin.

Vbrizgajte 1 μl raztopine sililiziranega vzorca in izmerite površino vrhov. Vsaka kromografska serija mora biti omejena z injiciranjem standardov.

Kot smernico je mogoče navesti, da naj bo v vsako serijo vključenih šest vbrizganj vzorca.

Opomba 6:

V integracijo vrha stigmasterola je treba zajeti vsakršen rep, kakor je določeno v točkah 1, 2 in 3 slike 2b.

Pri oceni celotnega sitosterola je treba v integracijo vrha sitosterola zajeti površino vrha za 22 dihidro-β-sitosterol (stigmastanol), ki se eluira takoj za sitosterolom (glej sliko 3b).

6. IZRAČUN REZULTATOV

6.1 Določi se površina vrhov sterola in vrhov betulina v obeh standardih, ki omejujeta serijo vzorcev na začetku in koncu, in izračuna R1:

povprečna površina vrha sterola v standardupovprečna površina vrha betulina v standardu

Določi se površina vrha sterola (stigmasterola in sitosterola) in vrha betulina v vzorcu in izračuna R2:

površina vrha sterola v vzorcupovršina vrha betulina v vzorcu

W1 = vsebnost sterola v standardu (mg), ki ga vsebuje 1 ml standardne raztopine (4.8.1 ali 4.9.1)

W2 = masa vzorca (g) (5.2.1)

P = čistota standarda sterola (4.8 ali 4.9)

Obsah sterolu ve vzorku

× P × 10

7. NATANČNOST METODE

7.1 Maslo

7.1.1 Ponovljivost

7.1.1.1 Stigmasterol

Razlika med rezultatoma dveh določitev, ki ju isti izvajalec opravi v najkrajšem možnem časovnem presledku z isto opremo na istovetnem preskusnem materialu, ne sme presegati 19,3 mg/kg.

7.1.1.2 Sitosterol

Razlika med rezultatoma dveh določitev, ki ju isti izvajalec opravi v najkrajšem možnem časovnem presledku z isto opremo na istovetnem preskusnem materialu, ne sme presegati 23,0 mg/kg.

7.1.2 Obnovljivost

7.1.2.1 Stigmasterol

Razlika med rezultatoma dveh določitev, ki ju opravijo izvajalci v različnih laboratorijih z različno opremo na istovetnem preskusnem materialu, ne sme presegati 31,9 mg/kg.

7.1.2.2 Sitosterol

Razlika med rezultatoma dveh določitev, ki ju opravijo izvajalci v različnih laboratorijih z različno opremo na istovetnem preskusnem materialu, ne sme presegati 8,7 % glede na srednjo vrednost določitve.

7.1.3 Vir podatkov natančnosti

Podatki natančnosti so bili določeni s preskusom leta 1992, pri katerem je sodelovalo 8 laboratorijev in 6 vzorcev (tri slepa vzporedna izvajanja)) za stigmasterol in šest vzorcev (tri slepa vzporedna izvajanja) za sitosterol.

7.2 Zgoščeno maslo

7.2.1 Ponovljivost

7.2.1.1 Stigmasterol

Razlika med rezultatoma dveh določitev, ki ju isti izvajalec opravi v najkrajšem možnem časovnem presledku z isto opremo na istovetnem preskusnem materialu, ne sme presegati 10,2 mg/kg.

7.2.1.2 Sitosterol

Razlika med rezultatoma dveh določitev, ki ju isti izvajalec opravi v najkrajšem možnem časovnem presledku z isto opremo na istovetnem preskusnem materialu, ne sme presegati 3,6 % glede na srednjo vrednost določitev.

7.2.2 Obnovljivost

7.2.2.1 Stigmasterol

Razlika med rezultatoma dveh določitev, ki ju opravijo izvajalci v različnih laboratorijih z različno opremo na istovetnem preskusnem materialu, ne sme presegati 25,3 mg/kg.

7.2.2.2 Sitosterol

Razlika med rezultatoma dveh določitev, ki ju opravijo izvajalci v različnih laboratorijih z različno opremo na istovetnem preskusnem materialu, ne sme presegati 8,9 % glede na srednjo vrednost določitev.

7.2.3 Vir podatkov natančnosti

Podatki natančnosti so bili določeni s preskusom leta 1991, pri katerem je sodelovalo 9 laboratorijev in 6 vzorcev (tri slepa vzporedna izvajanja) za stigmasterol in šest vzorcev (tri slepa vzporedna izvajanja) za sitosterol.

8. TOLERANČNE MEJE

8.1 Od proizvoda, ki ga sledimo, je treba vzeti tri vzorce, da se preveri pravilno sledenje proizvoda.

8.2 Maslo

8.2.1 Stigmastirol

8.2.1.1 Inkorporacijska stopnja za stigmasterol je 150 g najmanj 95-odstotno čistega stigmasterola na tono masla, tj. 142,5 mg/kg, ali 170 g najmanj 85-odstotno čistega stigmasterola na tono masla, tj. 144,5 mg/kg.

8.2.1.2 Rezultati za vse tri vzorce, dobljeni z analizo proizvoda, se uporabijo za preverjanje stopnje in homogenosti inkorporacije slediva, najnižji od treh rezultatov pa se primerja z naslednjimi mejami (upoštevana je kritična razlika za 95-odstotno verjetnostno stopnjo (DCr95)):

- 116,0 mg/kg (95 % od najmanjše inkorporacijske stopnje za 95-odstotno čist stigmasterol),

- 118,0 mg/kg (95 % od najmanjše inkorporacijske stopnje za 85-odstotno čist stigmasterol),

- 81,0 mg/kg (70 % od najmanjše inkorporacijske stopnje za 95-odstotno čist stigmasterol),

- 82,0 mg/kg (70 % od najmanjše inkorporacijske stopnje za 85-odstotno čist stigmasterol).

Koncentracija slediva v vzorcu, s katero se doseže najnižji rezultat, se uporabi v zvezi z interpolacijo med 116,0 mg/kg in 81,0 mg/kg ali 118,o mg/kg in 82,0 mg/kg.

8.2.2 Sitoserol

8.2.2.1 Inkorporacijska stopnja za sitosterol je 600 g najmanj 90-odstotno čistega sitosterola na tono masla, tj. 540 mg/kg.

8.2.2.2 Rezultati za vse tri vzorce, dobljeni z analizo proizvoda, se uporabijo za preverjanje stopnje in homogenosti inkorporacije slediva, najnižji od treh rezultatov pa se primerja z naslednjimi mejami (upoštevana je kritična razlika za 95-odstotno verjetnostno stopnjo (DCr95)):

- 486,0 mg/kg (95 % od najmanjše inkorporacijske stopnje za 90-odstotno čist sitosterol),

- 358,0 mg/kg (70 % od najmanjše inkorporacijske stopnje za 90-odstotno čist sitosterol).

Koncentracija slediva v vzorcu, s katero se doseže najnižji rezultat, se uporabi v zvezi z interpolacijo med 486,0 mg/kg in 358,0 mg/kg.

8.3 Zgoščeno maslo

8.3.1 Stigmasterol

8.3.1.1 Inkorporacijska stopnja za stigmasterol je 150 g najmanj 95-odstotno čistega stigmasterola na tono zgoščenega masla, tj. 142,5 mg/kg; ali 170 g najmanj 85 % čistega stigmasterola na tono zgoščenega masla, t.j. 144,5 mg/kg.

8.3.1.2 Rezultati za vse tri vzorce, dobljeni z analizo proizvoda, se uporabijo za preverjanje stopnje in homogenosti inkorporacije slediva, najnižji od treh rezultatov pa se primerja z naslednjimi mejami (upoštevana je kritična razlika za 95-odstotno verjetnostno stopnjo (DCr95)):

- 120,0 mg/kg (95 % od najmanjše inkorporacijske stopnje za 95-odstotno čist stigmasterol),

- 122,0 mg/kg (95 % od najmanjše inkorporacijske stopnje za 85-odstotno čist stigmasterol),

- 84,0 mg/kg (70 % od najmanjše inkorporacijske stopnje za 95-odstotno čist stigmasterol),

- 86,0 mg/kg (70 % od najmanjše inkorporacijske stopnje za 85-odstotno čist stigmasterol).

Koncentracija slediva v vzorcu, s katero se doseže najnižji rezultat, se uporabi v zvezi z interpolacijo med 120,0 mg/kg in 84,0 mg/kg ali 122,0 mg/kg in 86,0 mg/kg.

8.3.2 Sitosterol

8.3.2.1 Inkorporacijska stopnja za sitosterol je 600 g najmanj 90-odstotno čistega sitosterola na tono zgoščenega masla, tj. 540 mg/kg.

8.3.2.2 Rezultati za vse tri vzorce, dobljeni z analizo proizvoda, se uporabijo za preverjanje stopnje in homogenosti inkorporacije slediva, najnižji od teh rezultatov pa se primerja z naslednjimi mejami (upoštevana je kritična razlika za 95-odstotno verjetnostno stopnjo (DCr95)):

- 486,0 mg/kg (95 % od najmanjše inkorporacijske stopnje za 90-odstotno čist sitosterol),

- 358,0 mg/kg (70 % od najmanjše inkorporacijske stopnje za 90-odstotno čist sitosterol).

Koncentracija slediva v vzorcu, s katero se doseže najnižji rezultat, se uporabi v zvezi z interpolacijo med 486,0 mg/kg in 358,0 mg/kg.

+++++ TIFF +++++

--------------------------------------------------

PRILOGA XV

(Člen 10)

REFERENČNA METODA ZA UGOTAVLJANJE KRAVJEGA MLEKA IN KAZEINATA V SIRIH IZ OVČJEGA, KOZJEGA ALI BIVOLJEGA MLEKA ALI MEŠANIC OVČJEGA, KOZJEGA IN BIVOLJEGA MLEKA

1. Namen

Ugotavljanje kravjega mleka in kazeinata v sirih iz ovčjega, kozjega in bivoljega mleka ali mešanic ovčjega, kozjega in bivoljega mleka s pomočjo izoelektričnega fokusiranja y-kazeinov po plazminolizi.

2. Področje uporabe

Ta metoda je primerna za občutljivo, specifično ugotavljanje surovega in toplotno obdelanega kravjega mleka in kazeinata v svežih in zorenih sirih iz ovčjega, kozjega in bivoljega mleka ter iz mešanic ovčjega, kozjega in bivoljega mleka. Ni pa primerna za ugotavljanje mlečnih ali sirnih ponaredkov s toplotno obdelanimi proteinskimi koncentrati govejega sirila.

3. Princip metode

3.1 Izolacija kazeinov iz sira in referenčni standardi.

3.2 Raztopitev izoliranih kazeinov in izpostavitev v plazminsko cepitev (EC. 3.4.21.7).

3.3 Izoelektrično fokusiranje plazminsko obdelanih kazeinov v prisotnosti uree in obarvanje proteinov.

3.4 Vrednotenje obarvanih y3- in y2-kazeinskih vzorcev (dokaz kravjega mleka) s primerjavo vzorca s tistimi, pridobljenimi v istem gelu iz referenčnih standardov, ki vsebujejo 0 % in 1 % kravjega mleka.

4. Reagenti

Razen če ni določeno drugače, je treba uporabiti analitsko čiste kemikalije. Voda mora biti dvakrat destilirana ali enakovredne čistote.

Opomba:

Naslednje podrobnosti veljajo za laboratorijsko pripravljene poliakrilamidne gele z velikostjo 265 × 125 × 0,25 mm in z vsebnostjo uree. Kjer so uporabljene druge velikosti in vrste gelov, se pogoji ločbe lahko prilagodijo.

Izoelektrično fokusiranje

4.1 Reagenti za izdelavo poliakrilamidnih gelov z vsebnostjo uree.

4.1.1 Osnovna gelska raztopina

V vodi raztopite:

4,85 g akrilamida

0,15 g N, N’-metilen-bis-akrilamida (BIS)

48,05 g uree

15,00 g glicerola (87 % w/w)

in dopolnite do 100 ml in raztopino shranite v rjavi steklenici v hladilniku.

Opomba:

Namesto navedenih določenih količin nevrotoksičnih akrilamidov se lahko uporabi tudi industrijska mešanica akrilamidne/BIS raztopine. Kjer taka raztopina vsebuje 30 % w/v akrilamida in 0,8 % w/v BIS, je treba za pripravek vzeti 16,2 ml namesto navedenih količin. Rok uporabnosti raztopine je največ 10 dni. Če je njena prevodnost več kot 5 μS, deionizirajte z mešanjem z 2 g amberlita MB-3 30 minut, nato filtrirajte skozi 0,45 μm membrano.

4.1.2 Gelska raztopina

Raztopino gela pripravite z mešanjem dodatkov, amfolitov in raztopine gela iz zaloge (glejte 4.1.1).

9,0 ml osnovne gelske raztopine

24 mg β-alanina

500 μl amfolita pH 3,5-9,5 [1]

250 μl amfolita pH 5-7 [2]

250 μl amfolita pH 6-8 [3].

Zmešajte raztopino gela in jo razplinite za dve do tri minute v ultrazvočni kopeli ali v vakuumu.

Opomba:

Raztopino gela pripravite, tik preden jo nalijete (glej 6.2).

4.1.3 Katalizatorske raztopine

4.1.3.1 N, N, N’ N’ — tetrametiletilendiamin (Temed).

4.1.3.2 40 % w/v amonijev persulfat (PER):

Raztopite 800 mg PER v vodi in dopolnite do 2 ml.

Opomba:

Vedno uporabite sveže pripravljeno raztopino PER.

4.2 Kontaktna tekočina

Kerozen ali tekoči parafin.

4.3 Anodna raztopina

Raztopite 5,77 g fosforjeve(V) kisline (85 % w/w) v vodi in dopolnite z vodo do 100 ml.

4.4 Katodna raztopina

Raztopite 2,00 g natrijevega hidroksida v vodi in dopolnite z vodo do 100 ml.

Priprava vzorca

4.5 Reagent za izolacijo proteinov

4.5.1 Razredčena ocetna kislina (25,0 ml ledocetne kisline dopolnite z vodo do 100 ml.)

4.5.2 Diklorometan

4.5.3 Aceton

4.6 Pufer za raztapljanje proteinov

V vodi raztopite

5,75 g glicerola (87 % w/w)

24,03 g uree

250 mg ditiotreitolain dopolnite do 50 ml.

Opomba:

Hranite v hladilniku; najdaljši rok uporabnosti je en teden.

4.7 Reagenti za plazminsko cepitev kazeinov

4.7.1 Pufer amonijevega hidrogenkarbonata

Titrirajte 0,2 mol/l raztopine amonijevega hidrogenkarbonata (1,58 g/100 ml vode), ki vsebuje 0,05 mol/l etilendiamintetraocetne kisline (EDTA, 1,46 g/100 ml) z 0,2 mol/l raztopine amonijevega karbonata (1,92 g/100 ml vode), ki vsebuje 0,05 mol/l EDTA do pH 8.

4.7.2 Goveji plazmin (EC. 3.4.21.7) z aktivnostjo najmanj 5 U/ml.

4.7.3 Raztopina ε-aminokapronske kisline za inhibiranje encimov.

Raztopite 2,624 g ε-aminokapronske kisline (6 amino-n-heksanojske kisline) v 100 ml 40 % (v/v) etanola.

4.8 Standardi

4.8.1 Certificirani referenčni standardi mešanice sesirjenega posnetega ovčjega in kozjega mleka, ki vsebuje 0 % in 1 % kravjega mleka, so na voljo na Inštitutu za referenčne materiale in meroslovje, B–2440 Geel, Belgija, v okviru Komisije.

4.8.2 Priprava laboratorijskih delovnih standardov sesirjenega bivoljega mleka, ki vsebujejo 0 % in 1 % kravjega mleka.

Posneto mleko se pripravi z 20-minutnim centrifugiranjem vzorca surovega bivoljega ali kravjega mleka pri 37 °C in 2500 g. Po hitri ohladitvi epruvete za centifugiranje in vsebine na 6 do 8 °C se popolnoma odstrani zgornja plast maščobe. Za pripravo 1 % standarda v litrski čaši k 495 ml posnetega bivoljega mleka dodajte 5 ml posnetega kravjega mleka, nastavite pH na 6,4 z dodajanjem razredčene mlečne kisline (10 % w/v). Nastavite temperaturo na 35 °C in dodajte 100 μl telečjega sirila (aktivnost sirila je 1:10000, c. 3000 U/ml), mešajte 1 minuto in nato pustite eno uro čašo pokrito z aluminijevo folijo pri 35 °C, da se naredi gruda. Ko se je naredila gruda, se celotno sesirjeno mleko posuši z zmrzovanjem (freeze–dry) brez predhodne homogenizacije ali odločitve sirotke. Po tem postopku grudo fino zmeljite, da dobite homogen prah. Za pripravo 0 % standarda uporabite isti postopek z naravnim posnetim bivoljim mlekom. Standarda morate shraniti pri –20 °C.

Opomba:

Pred pripravo standardov je priporočljivo, da se preveri čistota bivoljega mleka z izoelektričnim fokusiranjem plazminsko obdelanih kazeinov.

Reagenti za obarvanje proteinov

4.9 Fiksir

Raztopite 150 g trikloroocetne kisline v vodi in dopolnite do 1000 ml.

4.10 Raztopina za razbarvanje

Dopolnite 500 ml metanola in 200 ml ledocetne kisline z destilirano vodo do 2000 ml.

Opomba:

Vsak dan pripravite svežo raztopino za razbarvanje. Lahko jo pripravite z mešanjem enakih prostornin osnovnih raztopin 50 % (v/v) metanola in 20 % (v/v) ocetne kisline.

4.11 Raztopine za obarvanje

4.11.1 Raztopina za obarvanje (osnovna raztopina 1)

Raztopite 3,0 g Coomassie Brillant Blue G–250 (C.I. 42655) v 1000 ml 90 % (v/v) metanola z magnetnim mešalom (približno 45 minut), filtrirajte skozi dva srednje hitra nagubana filtra.

4.11.2 Raztopina za obarvanje (osnovna raztopina 2)

Raztopite 5,0 g bakrovega sulfata pentahidrata v 1000 ml 20 % (v/v) ocetne kisline.

4.11.3 Raztopina za obarvanje (delovna raztopina)

Tik pred obarvanjem zmešajte skupaj 125 ml vsake osnovne raztopine (4.11.1, 4.11.2).

Opomba:

Raztopino za obarvanje morate pripraviti na dan uporabe.

5. Pribor

5.1 Stekleni plošči (265 × 125 × 4 mm); gumeni valjček (širine 15 cm); nivelirna miza.

5.2 Nosilna folija za gel (265 × 125 mm).

5.3 Pokrivna folija (280 × 125 mm). Na vsak dolgi rob zalepite trak lepilnega traku (280 × 6 × 0,25 mm) (glej sliko 1).

5.4 Elektrofokusirna komora s hladilno ploščo (npr. 265 × 125 mm) in ustrezen vir energije (≥2,5 kV) ali avtomatska naprava za elektroforezo.

5.5 Cirkulacijski kriostat, termostatsko nadzorovan na 12 ± 0,5 °C.

5.6 Centrifuga, nastavljiva do 3000 g.

5.7 Elektrodni trakovi (dolgi 265 mm).

5.8 Plastične kapalke za anodne in katodne raztopine.

5.9 Trakovi za nanos vzorca (10 × 5 mm, iz viskoze ali nizkoadsorpcijski filtrirni papir).

5.10 Škarje iz nerjavnega jekla, skalpeli in pincete.

5.11 Posode iz nerjavnega jekla ali steklene posode za obarvanje in razbarvanje (npr. 280 × 150 mm pladnji za instrumente).

5.12 Prilagodljiv palični homogenizator (premer osi 100 m), v razponu od 8000 do 20000 vrtljajev/minuto.

5.13 Magnetno mešalo.

5.14 Ultrazvočna kopel.

5.15 Varilnik folije.

5.16 Mikropipete s prostornino 25 μl.

5.17 Vakuumski koncentrator ali – zamrzovalni sušilnik (freeze–dryer).

5.18 Termostatsko nadzorovana vodna kopel, prilagodljiva na 35 in 40 ± 1 °C z mešalnikom.

5.19 Densitometer za odčitavanje pri λ = 634 nm.

6. Postopek

6.1 Priprava vzorca

6.1.1 Izolacija kazeinov

Stehtajte količino, enakovredno 5 g suhe mase sira ali referenčnih standardov v 100-mililitrski epruveti za centrifugiranje, dodajte 60 ml destilirane vode in homogenizirajte s paličnim homogenizatorjem (8000 do 10000 vrt./min). Nastavite na pH 4,6 z razredčeno ocetno kislino (4.5.1) in centrifugirajte (5 minut, 3000 g). Odlijte maščobo in sirotko, homogenizirajte ostanek pri 20000 vrt./min v 40 ml destilirane vode s pH 4,5, dobljenim z razredčeno ocetno kislino (4.5.1); dodajte 20 ml diklorometana (4.5.2), znova homogenizirajte in centrifugirajte (5 minut, 3000 g). Z lopatico odstranite kazeinsko plast, ki leži med vodno in organsko fazo (glej sliko 2) in odlijte obe fazi. Znova homogenizirajte kazein v 40 ml destilirane vode (glej zgoraj) in 20 ml diklorometana (4.5.2) in centrifugirajte. Nadaljujte postopek (dva- do trikrat), dokler obe ekstrakcijski fazi ne postaneta brezbarvni. Homogenizirajte proteinski preostanek s 50 ml acetona (4.53) in filtrirajte prek srednje hitrega nagubanega filtrirnega papirja. Vsakič sperite ostanek na filtru z dvema ločenima 25-mililitrskima odmerkoma acetona in pustite, da se posuši na zraku ali v toku dušika, nato ga v terilnici zdrobite v fin prah.

Opomba:

Izoliran suh kazein morate hraniti pri –20 °C.

6.1.2 Plazminsko cepljenje β-kazeinov za ojačitev γ-kazeinov

Disperzirajte 25 mg izoliranih kazeinov (6.1.1) v 0,5 ml pufra amonijevega karbonata (4.7.1) in 20 minut homogenizirajte, npr. z uporabo ultrazvočnega postopka. Ogrejte na 40 °C in dodajte 10 μl plazmina (4.7.2), zmešajte in eno uro inkubirajte pri 40 °C z neprestanim tresenjem. Za inhibicijo encima dodajte 20 μl raztopine ε-aminokapronske kisline (4.7.3), nato dodajte 200 mg trdne uree in 2 ml ditiotreitola.

Opomba:

Da bi dobili več simetrije v fokusiranih kazeinskih trakovih, je priporočljivo, da raztopino sušite z zmrzovanjem (freeze–dry), potem ko ste dodali ε-aminokapronsko kislino, in nato raztopite preostanek v 0,5 ml pufra za raztapljanje proteinov (4.6).

6.2 Priprava uree, ki vsebuje poliakrilamidne gele

S pomočjo nekaj kapljic vode povaljajte nosilno folijo za gel (5.2) po stekleni plošči (5.1), odstranite vso odvečno vodo s papirnato brisačo ali tkanino. Na enak način povaljajte pokrivno folijo (5.3) z distančniki (0,25 mm) po drugi stekleni plošči. Položite ploščo vodoravno na nivelirno mizo.

Dodajte 10 μl Temed-a (4.1.3.1) v pripravljeno in razplinjeno gelsko raztopino (4.1.2), pomešajte in dodajte 10 μl PER-raztopine (4.1.3.2), dobro premešajte in takoj enakomerno nalijte na sredino pokrivne folije. En rob nosilne plošče gela (folija naj bo obrnjena navzdol) položite na pokrivno folijo in jo počasi spuščajte, tako da se med folijami naredi film gela in se enakomerno ter brez mehurčkov razširi (slika 3). Pazljivo do konca spustite nosilno ploščo gela s tanko spatulo in nanjo položite še tri steklene plošče, ki bodo služile za uteži. Potem ko je polimerizacija končana (po približno 60 minutah), premestite polimerizirani gel na nosilno folijo skupaj s pokrivno folijo, tako da rahlo udarite po steklenih ploščah. Skrbno očistite hrbtno stran nosilne folije ostankov gela in uree. Zavarite gelov sendvič v filmski tulec in shranite v hladilnik (največ 6 tednov).

Opomba:

Pokrivna folija z distančniki se lahko uporabi znova. Poliakrilamidni gel se lahko razreže v manjše kose, kar je priporočljivo še zlasti, kadar je malo vzorcev ali če uporabljate avtomatsko elektroforezno napravo (dva gela, velikost 4,5 × 5 cm).

6.3 Izoelektrično fokusiranje

Nastavite termostat za hlajenje na 12 °C. S kerozenom zbrišite hrbtno stran nosilne folije, nato kapnite nekaj kapljic kerozena (4.2) na sredo hladilnega bloka. Nato po njem povaljajte gelov sendvič, z nosilno stranjo navzdol, in pazite, da ne nastanejo mehurčki. Obrišite ves odvečni kerozen in odstranite pokrivno folijo. Prepojite elektrodna trakova z elektrodnima raztopinama (4.3, 4.4), ju odrežite v dolžini gela in postavite v pripravljene položaje (razdalja elektrod 9,5 cm).

Pogoji za izoelektrično fokusiranje:

6.3.1 Velikost gela 265 × 125 × 0,25 mm

Opomba:

Če sta debelina ali širina gela spremenjeni, se morata ustrezno prilagoditi vrednosti za tok in moč (npr. podvojite vrednosti za električni tok in moč, če se uporabi gel 265 × 125 × 0,5).

6.3.2 Primer programa napetosti za avtomatsko elektroforezno napravo (2 gela 5,0 × 4,5 cm), elektrodi brez trakov, ki se neposredno naneseta na gel.

1. predfokusiranje | 1000 V | 10,0 mA | 3,5 W | 8 °C | 85 Vh |

2. vzorčno fokusiranje | 250 V | 5,0 mA | 2,5 W | 8 °C | 30 Vh |

3. fokusiranje | 1200 V | 10,0 mA | 3,5 W | 8 °C | 89 Vh |

4. fokusiranje | 1500 V | 5,0 mA | 7,0 W | 8 °C | 570 Vh |

V 2. koraku postavite trak za nanos vzorca na 0 Vh.

V 2. koraku odstranite trak za nanos vzorca pri 30 Vh.

6.4 Proteinsko obarvanje

6.4.1 Proteinsko fiksiranje

Po izključitvi elektrike takoj odstranite elektrodna trakova in dajte gel v posodo za obarvanje/razbarvanje, napolnjeno z 200 ml fiksirja (4.9); pustite 15 minut in neprestano stresajte.

6.4.2 Umivanje in obarvanje gelske plošče

Temeljito odtočite fiksir in dvakrat vsakič po 30 sekund spirajte gelsko ploščo s 100 ml raztopine za razbarvanje (4.10). Odlijte raztopino za razbarvanje in dopolnite posodo z 250 ml raztopine za obarvanje (4.11.3); 45 minut z rahlim tresenjem omogočite, da se obarva.

6.4.3 Razbarvanje gelske plošče

Odlijte kontrastno raztopino, dvakrat vsakič sperite gelsko ploščo s 100 ml dekontrastne raztopine (4.10), nato 15 minut tresite z 200 ml dekontrastne raztopine in najmanj dvakrat ali trikrat ponovite korak dekontrastiranja, dokler ozadje ne postane čisto in brezbarvno. Nato splaknite gelsko ploščo z destilirano vodo (2 × 2 minuti) in sušite na zraku (2 do 3 ure) ali s sušilnikom za lase (10-15 minut).

Opomba 1:

Fiksiranje, pomivanje, obarvanje in razbarvanje izpeljite pri temperaturi 20 °C. Ne uporabljajte visokih temperatur.

Opomba 2:

Če raje uporabljate bolj občutljivo obarvanje s srebrom (npr. oprema za obarvanje s srebrom, protein, Pharmacia Biotech, št. kode 17-1150-01), morate plazminsko obdelane kazeinske vzorce dopolniti do 5 mg/ml.

7. Ovrednotenje

Ovrednotenje se izvaja s primerjavo proteinskih vzorcev neznanega vzorca z referenčnimi standardi na istem gelu. Ugotavljanje kravjega mleka v sirih iz ovčjega, kozjega in bivoljega mleka in mešanic ovčjega, kozjega in bivoljega mleka se izvaja prek y3- in y2-kazeinov, katerih izoelektrične točke so v razponu med pH 6,5 in pH 7,5 (slike 4a, b, slika 5). Meja zaznavnosti je manj kot 0,5 %.

7.1 Vizualna ocena

Za vizualno ocenitev količine kravjega mleka je priporočljivo, da se koncentracije vzorcev in standardov prilagodijo za pridobitev iste stopnje intenzitete ovčjih, kozjih in/ali bivoljih y2- in y3-kazeinov (glej "y2, E,G,B" in "y3, E,G,B" na slikah 4a, b in 5). Po njem se lahko neposredno presodi količina kravjega mleka (manj kot, enako ali več kot 1 %) v neznanem vzorcu s primerjavo intenzitete kravjih y3- in y2-kazeinov (glej "y3 C" in "y2 C" na slikah 4a, b in 5) s tistimi od 0 % in 1 % referenčnih standardov (ovca, koza) ali laboratorijskimi vmesnimi standardi (bivol).

7.2 Denzitometrijska ocena

Če je na voljo, uporabite denzitometrijo (5.19) za določitev razmerja površin pod vrhovi za kravja, ovčja, kozja in/ali bivolja kazeina y2 in y3 (glej slika 5). Primerjajte to vrednost z razmerjem površin pod vrhovi y2- in y3-kazeinov 1-odstotnega referenčnega standarda (ovca, koza) ali laboratorijskega vmesnega standarda (bivol), analiziranega na istem gelu.

Opomba:

Metoda deluje zadovoljivo, če obstaja jasen pozitiven signal za goveja kazeina y2 in y3 v 1-odstotnem referenčnem standardu, toda ne v 0-odstotnem referenčnem standardu. Če ne, optimizirajte postopek tako, da natančno sledite podrobnostim metode.

Vzorec je ocenjen kot pozitiven, kadar sta oba goveja kazeina y2 in y3 ali ustrezajoče razmerje površin pod vrhovi enako ali večje, kot je stopnja 1-odstotnega referenčnega standarda.

8. Reference

1. Addeo F., Moio L., Chianese L., Stingo C., Resmini P., Berner I, Krause I., Di Luccia A., Bocca A.: Use of plasmin to increase the sensitivity of the detection of bovine milk in ovine and/or caprine cheese by gel isoelectric focusing of y2-caseins. Milchwissenschaft 45, 708–711 (1990).

2. Addeo F., Nicolai M.A., Chianese L., Moio L., Spagna Musso S., Bocca A., Del Giovine L.: A control method to detect bovine milk in ewe and water buffalo cheese using immunoblotting. Milchwissenschaft 50, 83–85 (1995).

3. Krause I., Berner I., Klostermeyer H.: Sensitive detection of cow milk in ewe and goat milk and cheese by carrier ampholyte — and carrier ampholyte/immobilized pH gradient — isoelectric focusing of !!! error character !!! ο!!! error character !!! Ώ!!! error character !!! Ώ-caseins using plasmin as signal amplifier. in: Electrophoresis-Forum 89 (B.J.Radola,ed.) pp 389–393, Bode-Verlag, München (1989).

4. Krause Ι., Belitz H.-D., Kaiser K.-P.: Nachweis von Kuhmilch in Schaf and Ziegenmilch bzw. -käse durch isoelektrische Fokussierung in harnstoffhaltigen Polyacrylamidgelen. Z. Lebensm. Unters. Forsch. 174, 195–199 (1982).

5. Radola B.J.: Ultrathin-layer isoelectric focusing in 50–100 μm polyacrylamide gels on silanised glass plates or polyester films. Electrophoresis 1,43–56 (1980).

+++++ TIFF +++++

[1] Proizvoda Ampholine® pH 3,5 – 9,5 (Pharmacia) in Resolyte® pH 5 – 7 in pH 6 – 8 (BDH, Merck) sta se izkazala za posebno primerna za pridobitev potrebnih ločitev y–kazeinov.

[2] Proizvoda Ampholine® pH 3,5 – 9,5 (Pharmacia) in Resolyte® pH 5 – 7 in pH 6 – 8 (BDH, Merck) sta se izkazala za posebno primerna za pridobitev potrebnih ločitev y–kazeinov.

[3] Proizvoda Ampholine® pH 3,5 – 9,5 (Pharmacia) in Resolyte® pH 5 – 7 in pH 6 – 8 (BDH, Merck) sta se izkazala za posebno primerna za pridobitev potrebnih ločitev y–kazeinov.

[4] Nanašanje vzorca: po predfokusiranju (korak 1) s pipeto nakapajte 18 µl vzorca in standardne raztopine na trakove za nanos vzorca (10 x 5 mm), jih položite na gel v razmiku 1 mm drug od drugega in 5 mm podolžno od anode ter rahlo pritisnite. Izvedite fokusiranje pod gornjimi pogoji, previdno odstranite trakove za nanos vzorca po 60–minutnem fokusiranju vzorca.

--------------------------------------------------

PRILOGA XVI

(Člen 11)

REFERENČNA METODA ZA UGOTAVLJANJE KOLIFORMNIH BAKTERIJ V MASLU, POSNETEM MLEKU V PRAHU, KAZEINU IN KAZEINATIH

Kadar se preverja prisotnost koliformnih bakterij v maslu, se v gojišče vcepijo vzorci, ki ustrezajo 1 g masla.

Kadar se preverja prisotnost koliformnih bakterij v prahu iz posnetega mleka, kazeinu ali kazeinatih, se v gojišče vcepi 0,1 g vzorca.

Standard IDF 73A:1985, metoda B, uporabi se z naslednjimi modifikacijami:

1. Priprava vzorca je v skladu s standardom IDF 128B:1992. Za kisli kazein se lahko kot druga možnost uporabi postopek priprave vzorca, opisan v standardu IDF 73A:1985.

2. Inkubirajo in ovrednotijo se samo epruvete, v katere je bil vcepljen 1 g vzorca (maslo) ali 0,1 g vzorca (posneto mleko v prahu, kazein/kazeinati). Ne pripravljajo se nobena decimalna redčenja.

Vrednotenje rezultatov

Trije negativni rezultati: | Zahteva je izpolnjena |

Dva ali trije pozitivni rezultati: | Zahteva ni izpolnjena |

Dva negativna rezultata: | Analizirati je treba dva nadaljnja vzorca z maso 1 g (maslo) in 0,1 g (posneto mleko v prahu, kazein/kazeinati). Če sta zadnja dva rezultata negativna, je zahteva izpolnjena, drugače zahteva ni izpolnjena. |

Opomba

Vsebnost koliformnih bakterij: v povprečju 1/10 g za maslo; 1/g za posneto mleko v prahu, kazein/kazeinate.

Rezultati, ki kažejo, da je zahteva izpolnjena, so dobljeni s 93-odstotno verjetnostjo.

Vsebnost koliformnih bakterij: v povprečju 1/g za maslo: 1/0,1g za posneto mleko v prahu, kazein/kazeinate.

Rezultati, ki kažejo, da zahteva ni izpolnjena, so dobljeni z 91-odstotno verjetnostjo.

(Predpostavka: Poissonova porazdelitev)

--------------------------------------------------

PRILOGA XVII

(Člen 12)

METODA ZA DOLOČANJE VSEBNOSTI LAKTOZE V PROIZVODIH KI SPADAJO POD CN KODO 2309 [1]

DEL 1

1. Področje uporabe

Metodo je treba uporabiti, kadar vsebnost laktoze presega 0,5 %.

2. Princip

Raztopite sladkorje v vodi. Pustite, da reagirajo s kvasovkami (Saccharomyces cerevisiae); laktoza bo pri tem ostala nespremenjena. Po zbistritvi in filtriranju določite vsebnost laktoze v tej raztopini z metodo po Luff–Schoorlu.

3. Reagenti

Natrijev tiosulfat 0,1 N.

Indikator: raztopina škroba. V 1 liter vrele vode dodajte zmes 5 g topnega škroba (kot konzervans lahko dodate 10 mg živosrebrovega jodida) in 30 ml vode; pustite mešanico vreti tri minute; pustite, da se ohladi.

Raztopina kalijevega jodida, 30 % (m/V).

Žveplena kislina, 6 N.

Luff–Schoorlov reagent:

(a) raztopite 25 g bakrovega (II) sulfata pentahidrata (CuSO45H2O), ki ne vsebuje železa, v 100 ml vode

(b) raztopite 50 g citronske kisline monohidrata (C6H8O7H2O) v 50 ml vode

Med rahlim stresanjem zmešajte (b) in (c), nato dodajte (a). Dopolnite do 1 litra, pustite preko noči in nato filtrirajte. Preverite normaliteto tako dobljenega reagenta (Cu 0,1 N, Na2CO3 2 N). pH mora biti približno 9,4.

Carrez I raztopina: raztopite 23,8 g Zn (C2H3O2)2.2H2O in 3 g ledocetne kisline v vodi in dopolnite do 100 ml.

Carrez II raztopina: raztopite 10,6 g K4Fe2(CN)6.3H2O v vodi in dopolnite do 100 ml.

Vrelni kamenčki, obdelani z vrenjem s klorovodikovo kislino, sprani z vodo in posušeni. Suspenzija Saccharomyces cerevisiae: 25 g svežega kvasa v 100 ml vode (ne hranite v hladilniku več kot en teden).

4. Postopek

Odtehtajte na 1 mg natančno 1 g vzorca za analizo in ga dajte v umerjeno 100-mililitrsko bučko. Dodajte 25 do 30 ml vode. Postavite bučko v vrelo vodno kopel za trideset minut, nato ohladite na približno 35 °C.

Dodajte 5 ml suspenzije kvasnic [2] in pretresite. Merilno bučko in njeno vsebino pustite dve uri v vodni kopeli s temperaturo 38 do 40 °C.

Po fermentaciji ohladite na temperaturo približno 20 °C. Dodajte 2,5 ml raztopine Carrez I in stresajte trideset sekund, nato dodajte 2,5 ml raztopine Carrez II in ponovno stresajte trideset sekund. Dopolnite z vodo do 100 ml, premešajte in filtrirajte. Odpipetirajte količino filtrata, ki ni večja od 25 ml in naj vsebuje 40 do 80 mg laktoze, dopolnite z vodo do 25 ml in določite vsebnost brezvodne laktoze z metodo po Luff–Schoorlu.

Izvedite celoten slepi preskus s samim kvasom.

DEL II

1. Določitev vsebnosti laktoze z metodo po Luff–Schoorlu

V 300-mililitrsko erlenmajerico odpipetirajte 25 ml Luff–Schoorlovega reagenta, dodajte 25 ml natančno odmerjene bistre raztopine vzorca.

Po dodatku dveh vrelnih kamenčkov segrevajte med ročnim mešanjem nad odprtim povprečno visokim plamenom do vrenja v približno dveh minutah. Erlenmajerico takoj postavite na žičnat okvir z azbestno mrežico, pod katero je bil predhodno prižgan plamen. Ta je uravnan tako, da se erlenmajerica segreva samo na dnu, nato priklopite povratni hladilnik. Od tega trenutka kuhajte natančno deset minut. Takoj ohladite v hladni vodi in po približno desetih minutah preskusite, kakor sledi:

Tekočini dodajte 10 ml kalijevega jodida in takoj nato, ampak previdno (ker lahko pride do znatnega penjenja) 25 ml 6 N žveplene kisline.

Titrirajte z natrijevim tiosulfatom do pojava zamolkle rumene barve in proti koncu dodajte škrobni indikator.

Enak preskus izvedite z mešanico natančno 25 ml Luff–Schoorlovega reagenta in 25 ml vode, po dodatku 10 ml kalijevega jodida in 25 ml 6 N žveplene kisline, tokrat brez vrenja.

Z uporabo naslednje tabele določite vsebnost laktoze v mg, ki ustreza razliki rezultatov obeh preskusov (izraženo v ml 0,1 N natrijevega tiosulfata).

TABELA

Tabela za 25 ml Luff–Schoorlovega reagenta

(glej pogoje v besedilu)

1. Natrijev tiosulfat 0,1 N

2. Laktoza C12H22O11

1 | 2 |

ml | mg | Rozdíl |

1 | 3,6 | |

| | 3,7 |

2 | 7,3 | |

| | 3,7 |

3 | 11,0 | |

| | 3,7 |

4 | 14,7 | |

| | 3,7 |

5 | 18,4 | |

| | 3,7 |

6 | 22,1 | |

| | 3,7 |

7 | 25,8 | |

| | 3,7 |

8 | 29,5 | |

| | 3,7 |

9 | 33,2 | |

| | 3,8 |

10 | 37,0 | |

| | 3,8 |

11 | 40,8 | |

| | 3,8 |

12 | 44,6 | |

| | 3,8 |

13 | 48,4 | |

| | 3,8 |

14 | 52,2 | |

| | 3,8 |

15 | 56,0 | |

| | 3,9 |

16 | 59,9 | |

| | 3,9 |

17 | 63,8 | |

| | 3,9 |

18 | 67,7 | |

| | 4,0 |

19 | 71,7 | |

| | 4,0 |

20 | 75,7 | |

| | 4,1 |

21 | 79,8 | |

| | 4,1 |

22 | 83,9 | |

| | 4,1 |

23 | 88,0 | |

[1] Uredba (EGS) št. 222/88.

[2] Pri proizvodih, ki vsebujejo več kot 40 % fermentirajočega sladkorja, povečajte količino suspenzije.

--------------------------------------------------

PRILOGA XVIII

(Člen 13)

UGOTAVLJANJE SIRIŠČNE SIROTKE V POSNETEM MLEKU V PRAHU, NAMENJENEM ZA JAVNO SKLADIŠČENJE, Z DOLOČITVIJO GLIKOMAKROPEPTIDOV S TEKOČINSKO KROMATOGRAFIJO VISOKE LOČLJIVOSTI (HPLC)

1. Namen in področje uporabe

Metoda dopušča ugotavljanje siriščne sirotke v posnetem mleku v prahu, namenjenem za javno skladiščenje, z določitvijo glikomakropeptidov.

2. Reference

Mednarodni standard ISO 707 — Mleko in mlečni proizvodi — Metode vzorčenja, v skladu z navodili, vsebovanimi v prilogi I(2)(c), zadnji odstavek.

3. Opredelitev pojma

Vsebnost glikomakropeptidov v posnetem mleku v prahu: vsebnost snovi, določenih s spodaj opisano metodo, izraženih v utežnih odstotkih.

4. Princip

- Rekonstitucija posnetega mleka v prahu, odstranitev maščob in beljakovin s triklorocetno kislino, sledi centrifugiranje;

- Določitev količine glikomakropeptidov (GMP) v supernatantu s tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti (HPLC);

- Ovrednotenje rezultatov, dobljenih za vzorce, glede na standardne vzorce posnetega mleka v prahu z dodatkom znanega odstotka sirotke v prahu ali brez njega.

5. Reagenti

Vsi reagenti morajo imeti razpoznavno analitsko čistoto. Uporabljena voda mora biti destilirana ali najmanj primerljive čistote.

5.1 Raztopina triklorocetne kisline

V vodi raztopite 240 g triklorocetne kisline (Cl3CCOOH) in dopolnite do 1000 ml.

5.2 Raztopina eluenta, pH 6,0.

V približno 700 ml vode raztopite 1,74 g dikalijevega hidrogen fosfata (K2HPO4), 12,37 g kalijevega dihidrogen fosfata (KH2PO4) in 21,41 g natrijevega sulfata (Na2SO4). Če je potrebno, uravnajte pH na vrednost 6,0 z uporabo raztopin fosforjeve (V) kisline ali kalijevega hidroksida.

Dopolnite z vodo do 1000 ml in homogenizirajte.

Pred uporabo filtrirajte raztopino eluenta skozi membranski filter s premerom por 0,45 μm.

5.3 Raztopina za izpiranje

Zmešajte en volumski del acetonitrila (CH3CN) z devetimi volumskimi deli vode. Filtrirajte zmes pred uporabo skozi membranski filter s premerom por 0,45 μm.

Opomba:

Uporabi se lahko katera koli druga raztopina za izpiranje z baktericidnim učinkom, ki ne poslabša ločljivosti kolone.

5.4 Standardi

5.4.1 Posneto mleko v prahu skladno z zahtevami Uredbe (tj. [0]).

5.4.2 Isto posneto mleko v prahu, potvorjeno z dodatkom 5 % (m/m) siriščne sirotke s standardno sestavo (tj. [5]).

6. Oprema

6.1 Analitska tehtnica.

6.2 Centrifuga s sposobnostjo doseganja centrifugalne sile 2200 g, opremljena z zaprtimi epruvetami za centrifugiranje s prostornino 25 ml.

6.3 Mehanski stresalnik.

6.4 Magnetno mešalo.

6.5 Stekleni liji s premerom približno 7 cm.

6.6 Filtrirni papir, srednja velikost por, s premerom približno 12,5 cm.

6.7 Oprema za filtriranje iz stekla z membranskim filtrom s premerom por 0,45 μm.

6.8 10-mililitrske polnilne pipete (ISO 648, razred A, ali ISO/R 835).

6.9 Termostatska vodna kopel, nastavljena na temperaturo 25 ± 0,5 °C.

6.10 HPLC-oprema, ki jo sestavljajo:

6.10.1 Črpalka.

6.10.2 Injektor, ročni ali avtomatski, s prostornino 15 do 30 μl.

6.10.3 Dve zaporedno vezani koloni TSK 2000–SW (dolžina 30 cm, premer 0,75 cm) ali enakovredni koloni in predkolona (3 cm × 0,3 cm), polnjeni z I 125 ali snovjo z enakovredno učinkovitostjo.

6.10.4 Termostatiran grelnik za kolono, nastavljen na 35 ± 1 °C.

6.10.5 UV-detektor z nastavljivo valovno dolžino z možnostjo merjenja pri 205 nm z občutljivostjo 0,008A.

6.10.6 Integrator s sposobnostjo integriranja dolina–dolina.

Opomba:

Delo je mogoče tudi s kolonami pri sobni temperaturi, vendar je njihova sposobnost ločbe rahlo zmanjšana. V tem primeru lahko temperatura niha manj kot ± 5 °C med enim setom analiz.

7. Vzorčenje

7.1 Mednarodni standard ISO 707 — "Mleko in mlečni proizvodi — Metode vzorčenja" v skladu z navodili v Prilogi I(2)(c), zadnji odstavek.

7.2 Hranite vzorec pri pogojih, ki izključujejo kakršno koli kvarjenje ali spremembo sestave.

8. Postopek

8.1 Priprava preskusnega vzorca

Prenesite mlečni prah v posodo s približno dvakrat večjo prostornino, kakor je prostornina prahu, ki ima zračno tesen pokrov. Posodo takoj zaprite. Zmešajte mlečni prah s ponavljajočim obračanjem posode.

8.2 Odtehtava

Odtehtajte 2,000 ± 0,001 g preskusnega vzorca v epruveto za centrifugiranje (6.2).

8.3 Odstranitev maščob in beljakovin

8.3.1 Odtehtanemu vzorcu dodajte 50 ml tople vode (50 °C). Raztopite prah s petminutnim stresanjem na mehanskem stresalniku.

8.3.2 V času dveh minut dodajte 10,0 ml triklorocetne kisline (5.1) in pri tem mešajte z magnetnim mešalom (6.4.). Postavite epruveto v vodno kopel (6.9) in pustite 60 minut.

8.3.3 Centrifugirajte (6.2) 10 minut pri 2200 g ali filtrirajte skozi filtrirni papir (6.6) ter zavrzite prvih 5 ml filtrata.

8.4 Kromatografska določitev

8.4.1 Injicirajte 15 do 30 μl natančno odmerjenega supernatanta ali filtrata (8.3.3) v HPLC-aparat (6.10), ki deluje s pretokom 1,0 ml eluenta na minuto.

Opombe:

1. Raztopina eluenta (5.2) naj ima med kromatografsko analizo 85 °C, kar omogoča vzdrževanje razplinjenja eluenta in preprečuje rast bakterij. Uporabi se lahko katerikoli ukrep z istim učinkom.

2. Med vsako prekinitvijo sperite kolone z vodo. Nikoli ne pustite v njih raztopine eluenta (5.2).

Pred kakršno koli prekinitvijo, ki traja več kot 24 ur, spirajte kolone z vodo in nato z raztopino (5.3) pri pretoku 0,2 ml na minuto najmanj tri ure.

8.4.2 Rezultati kromatografske analize preskusnega vzorca [E] so dobljeni v obliki kromatogramov, pri katerih je vsak vrh opredeljen z retenzijskim časom RT, kakor sledi:

Vrh II: | Drugi vrh v kromatogramu z RT približno 12,5 minute. |

Vrh III: | Tretji vrh v kromatogramu, ki ustreza GMP, z RT približno 15,5 ± 1,0 minuta. |

Vrh IV: | Četrti vrh v kromatogramu z RT približno 17,5 minute. |

Kakovost kolone lahko vpliva na retenzijske čase posameznih vrhov.

Integrator (6.10.6) samodejno izračuna površino A vsakega vrha:

AII: | površina vrha II, |

AIII: | površina vrha III, |

AIV: | površina vrha IV. |

Pred kvantitativno interpretacijo je treba pregledati videz vsakega kromatograma, da bi tako lahko izsledili kakršne koli anomalije kot posledico slabega delovanja bodisi kromatografa ali kolon ali pa kot posledico izvora in narave analiziranega vzorca.

V primeru dvoma ponovite analizo.

8.5 Umerjanje

8.5.1 Za standardne vzorce (5.4) uporabite postopek, naveden od točke 8.2 do točke 8.4.2.

Uporabite sveže pripravljene raztopine, ker se GMP razgrajujejo v 8-odstotni triklorocetni kislini. Izguba je ocenjena na 0,2 % na uro pri 30 °C.

8.5.2 Pred kromatografsko analizo vzorcev kondicionirajte kolono s ponavljajočim injiciranjem standardnega vzorca (5.4.2) v raztopini (8.5.1), dokler površina in retenzijski čas vrha, ki ustrezata GMP, nista konstantna.

8.5.3 Določite odzivne faktorje R z injiciranjem enakih prostornin filtratov (8.5.1), kakor so bili uporabljeni pri vzorcih.

9. Podajanje rezultatov

9.1 Metoda za izračun in enačbe

9.1.1 Izračun odzivnih faktorjev R:

Vrh II: | RII=100AII0 |

Vrh IV: | RIV=100AIV0 |

kjer je:

RII in RIV = odzivna faktorja posameznih vrhov II in IV,

AII [0] in AIV [0] = površini posameznih vrhov II in IV standardnega vzorca [0], dobljenega v 8.5.3.

Vrh III: | RIII=WAIII5- AIII0 |

kjer je:

RIII = odzivni faktor vrha III,

AIII [0] in AIII [5] = površini posameznih vrhov standardnih vzorcev [0] in [5], dobljenih v 8.5.3,

W = količina sirotke v standardnem vzorcu [5], tj. 5.

9.1.2 Izračun relativnih površin vrhov vzorca [E]

= R

× A

IIE

III

= R

× A

IVE

kjer je:

SII [E], SIII [E], SIV [E] = relativne površine posameznih vrhov II, III in IV v vzorcu [E],

AII [E], AIII [E], AIV [E] = površine posameznih vrhov II, III in IV v vzorcu [E], dobljenem v 8.4.2,

RII, RIII, RIV = odzivni faktorji, izračunani v 9.1.1.

9.1.3 Izračun relativnega retenzijskega časa vrha III v vzorcu [E]:

RRT

III5

kjer je:

RTIII [E] = relativni retenzijski čas vrha III v vzorcu [E],

RTIII [E] = retenzijski čas vrha III v vzorcu [E], dobljenem v 8.4.2,

RTIII [5] = retenzijski čas vrha III v kontrolnem vzorcu [5], dobljenem v 8.5.3.

9.1.4 Poskusi so pokazali, da obstaja linearna zveza med relativnim retenzijskim časom vrha III, to je RRTIII [E], in odstotkom dodane sirotke v prahu do 10 %.

- RRTIII [E] je < 1,000, kadar je vsebnost sirotke > 5 %;

- RRTIII [E] je 1,000, kadar je vsebnost sirotke 5 %.

Dopustna negotovost vrednosti RRT je 0,002.

Vrednost RRTIII [0] navadno malo odstopa od 1,034. Odvisno od stanja kolon se vrednost lahko približa 1,000, ampak mora biti vedno večja od 1,000.

9.2 Izračun vsebnosti siriščne sirotke v prahu v vzorcu:

W = S

- 0,9

kjer je:

W = masni delež (m/m) sirične sirotke v prahu v vzorcu;

SIII [E] = relativna površina vrha III preskusnega vzorca [E], dobljenega, kakor je opisano v 9.1.2;

1,3 = predstavlja relativno povprečno povrino vrha III, izraeno v gramih sirične sirotke v prahu na 100 g, določenih v nepotvorjenem posnetem mleku v prahu različnega izvora. Ta vrednost je bila dobljena eksperimentalno;

SIII [0] = predstavlja relativno površino vrha III, ki je enaka RIII × AIII [0]. Te vrednosti so dobljene v 9.1.1 in 8.5.3;

(SIII [0] – 0,9) = predstavlja korekcijo relativne povprečne povrine, ki jo je treba narediti, kadar SIII [0] ni enak 0,9. Eksperimentalno je relativna povprečna povrina vrha III kontrolnega vzorca [0] enaka 0,9.

9.3 Zanesljivost postopka

9.3.1 Ponovljivost

Razlika med rezultatoma dveh določitev, ki jih izvede simultano ali po kratkem času isti analitik na isti opremi in istovetnem preskusnem materialu, ne sme presegati 0,2 % m/m.

9.3.2 Obnovljivost

Razlika med dvema posamičnima in neodvisnima rezultatoma, dobljenima v dveh različnih laboratorijih na istovetnem preskusnem materialu, ne sme presegati 0,4 % m/m.

9.4 Interpretacija

9.4.1 Če je relativna površina vrha III, SIII [E], izražena v g siriščne sirotke na 100 g proizvoda, manjša od

2,0 +

kjer je:

2,0 = največja dovoljena vrednost relativne povrine vrha III, upotevajoč relativno povrino vrha III, to je 1,3, negotovost zaradi sprememb v sestavi prahu iz posnetega mleka in obnovljivost metode (9.3.2),

SIII [0] – 0,9 = popravek, ki ga je treba narediti, kadar je površina SIII [0] različna od 0,9 (glej točko 9.2)

9.4.2 Če je relativna površina vrha III,

> 2,0 +

, in je relativna površina vrha II, SII [E] ≤ 160, določite vsebnost siriščne sirotke, kakor je nakazano v točki 9.2.

9.4.3 Če je relativna površina vrha III,

> 2,0 +

, in je relativna površina vrha II, SII [E] ≤ 160, določite vsebnost skupnih beljakovin (P %); nato preučite diagrama 1 in 2.

9.4.3.1 Podatki, dobljeni po analizi nepotvorjenih vzorcev posnetega mleka v prahu z visoko vsebnostjo skupnih beljakovin, so zbrani v diagramih 1 in 2.

Neprekinjena črta predstavlja linearno regresijo, katere koeficienti so izračunani z metodo najmanjših kvadratov.

Prekinjena ravna črta označuje zgornjo mejo relativne površine vrha III z verjetnostjo, da v 90 % primerov ni prekoračena.

Enačbi prekinjenih ravnih črt v diagramih 1 in 2 sta:

SIII= 0,376 P % - 10,7 | (diagram 1) |

SIII= 0,0123 SIIE + 0,93 | (diagram 2) |

kjer je:

SIII relativna povrina vrha III, izračuna bodisi glede na vsebnost skupnih beljakovin bodisi na relativno povrino vrha SII [E],

P % vsebnost skupnih beljakovin, izraena v masnih odstotkih,

SII [E] relativna povrina vzorca, izračunana v točki 9.1.2.

Te enačbe so enakovredne vrednosti 1,3, navedeni v točki 9.2.

Odstopanje (T1 in T2) med dobljeno relativno površino SIII [E] in relativno površino SIII je podano s pomočjo naslednjih enačb:

= S

- 0,9

= S

0,0123 S

+ 0,93

- 0,9

9.4.3.2 Če je T1 in/ali T2 nič ali manj, prisotnosti sirične sirotke ni mogoče določiti.

Če sta T1 in T2 več kot nič, je sirična sirotka prisotna.

Vsebnost siriščne sirotke se izračuna v skladu z naslednjo enačbo:

W = T

+ 0,91

kjer je:

0,91 razdalja na navpični osi med neprekinjeno in prekinjeno ravno črto.

+++++ TIFF +++++

--------------------------------------------------

PRILOGA XIX

(Člen 13)

DOLOČANJE SUHE SNOVI SIRIŠČNE SIROTKE V POSNETEM MLEKU V PRAHU IN MEŠANICAH, KI SE NANAŠAJO NA UREDBO (ES) št. 2799/1999

1. Namen: Ugotavljanje dodatka suhe snovi siriščne sirotke k:

(a) posnetemu mleku v prahu, kakor je opredeljeno v členu 2 Uredbe (ES) št. 2799/1999, in

(b) mešanicam, kakor je opredeljeno v členu 4 Uredbe (ES) št. 2799/1999.

2. Reference: Mednarodni standard ISO 707

3. Opredelitev pojma

Vsebnost suhe snovi siriščne sirotke je opredeljena z utežnim deležem, ki se določi z opisanim postopkom.

4. Princip

Vsebnost glikomakropeptida A je določena v skladu s Prilogo XVIII. Vzorci, ki dajejo pozitivne rezultate, se analizirajo na vsebnost glikomakropeptida A s tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti na reverzni fazi (HPLC-postopek). Rezultati se vrednotijo glede na standardne vzorce posnetega mleka v prahu z in brez znanega dodatka sirotke v prahu. Rezultati višji od 1 % (m/m) kažejo, da je suha snov siriščne sirotke prisotna.

5. Reagenti

Vsi reagenti morajo imeti razpoznavno analitsko čistoto. Uporabljena voda mora biti destilirana ali najmanj primerljive čistote. Acetonitril mora biti za spektroskopijo ali HPLC-čistote.

Reagenti, potrebni za postopek, so opisani v Prilogi XVIII te uredbe.

Reagenti za HPLC na reverzni fazi.

5.1 Raztopina triklorocetne kisline

V vodi raztopite 240 g triklorocetne kisline (CCl3COOH) in dopolnite do 1000 ml.

5.2 Eluenta A in B

Eluent A: V 1000-mililitrsko merilno bučko date 150 ml acetonitrila (CH3CN), 20 ml izopropanola (CH3CHOCHCH3) in 1 ml trifluorocetne kisline (TFA, CF3COOH). Dopolnite z vodo do 1000 ml. Eluent B: V 1000-mililitrsko merilno bučko date 550 ml acetonitrila, 20 ml izopropanola in 1 ml trifluorocetne kisline. Dopolnite z vodo do 1000 ml. Pred uporabo raztopino eluenta filtrirate skozi membranski filter s premerom por 0,45 μm.

5.3 Hranjenje kolone

Po analizi kolono sperete z eluentom B (gradientno) in potem še z acetonitrilom (gradientno v 30 minutah.). Kolono hranite v acetonitrilu.

5.4 Standardi

5.4.1 Posneto mleko v prahu skladno z zahtevami za javno skladiščenje (tj, [0]).

5.4.2 Isto posneto mleko v prahu, potvorjeno z dodatkom 5 % (m/m) siriščne sirotke v prahu s standardno sestavo (tj. [5]).

5.4.3 Isto posneto mleko v prahu, potvorjeno z dodatkom 50 % (m/m) siriščne sirotke v prahu s standardno sestavo (tj. [50]).

6. Oprema

Oprema, potrebna za opisani postopek, je opisana v Prilogi XVIII te Uredbe.

6.1.1 Analitska tehtnica.

6.2 Centrifuga s sposobnostjo doseganja centrifugalne sile 2200 g, opremljena z zaprtimi epruvetami za centrifugiranje s prostornino 50 ml.

6.3 Mehanski stresalnik z možnostjo delovanja pri 50 °C.

6.4 Magnetno mešalo.

6.5 Stekleni liji s premerom približno 7 cm.

6.6 Filtrirni papir, srednja velikost por, s premerom približno 12,5 cm.

6.7 Oprema za filtriranje iz stekla z membranskim filtrom s premerom por 0,45 μm.

6.8 10-mililitrske polnilne pipete (ISO 648, razred A, ali ISO/R 835) ali sistem z možnostjo doziranja 10 ml v dveh minutah.

6.9 Termostatska vodna kopel, nastavljena na temperaturo 25 ± 0,5 °C.

6.10 HPLC-oprema, ki jo sestavljajo:

6.10.1 Binarni gradientni sistem črpalk.

6.10.2 Injektor, ročni ali avtomatski, s prostornino 100 μl.

6.10.3 Dupontove Protein Plus kolone (dolžina 25 cm, notranji premer 0,46 cm) ali enakovredne silicijeve kolone s širokimi porami za reverzno kromatografijo.

6.10.4 Termostatiran grelnik za kolono, nastavljen na 35 ± 1 °C.

6.10.5 UV-detektor z nastavljivo valovno dolžino in z možnostjo merjenja pri 210 nm (če je potrebno, se lahko uporabi višja valovna dolžina do 220 nm) z občutljivostjo 0,02 Å.

6.10.6 Integrator s sposobnostjo integriranja dolina–dolina.

Opomba:

Delo s kolonami je mogoče tudi pri sobni temperaturi, če temperatura niha manj kot ± 1 °C, sicer pride do prevelikega nihanja retenzijskega časa GMPÅ.

7. Vzorčenje

7.1 Vzorci morajo biti vzeti v skladu z mednarodnim standardom ISO 707. Vendar pa države članice lahko uporabijo drugo metodo vzorčenja, če je skladna z zgoraj navedenim standardom.

7.2 Vzorec hranite pri pogojih, ki izključujejo kakršno koli kvarjenje ali spremembo sestave.

8. Postopek

8.1 Priprava preskusnega vzorca

8.2 Odtehta

Odtehtajte 2,000 ± 0,001 g preskusnega vzorca v epruveto za centrifugiranje (6.2) ali primerno posodo z zamaškom (50 ml).

8.3 Odstranitev maščob in beljakovin

8.3.1 Odtehtanemu vzorcu dodajte 20,0 g tople vode (50 °C). Raztopite prah s petminutnim stresanjem na mehanskem stresalniku ali tridesetminutnim stresanjem v primeru kislega pinjenca. Postavite epruveto v vodno kopel (6.9) in pustite, da se temperatura uravnoteži na 25 °C.

8.3.2 V času dveh minut dodajte 10,0 ml triklorocetne kisline (5.1) in pri tem intenzivno mešajte z magnetnim mešalom (6.4.). Postavite epruveto v vodno kopel (6.9) in pustite 60 minut.

8.3.3 Centrifugirajte (6.2) 10 minut pri 2200 g ali filtrirajte skozi filter in zavrzite prvih 5 ml filtrata.

8.4 Kromatografska določitev

8.4.1 Izvedi HPLC-analizo, kakor je opisano v Prilogi XVIII. Če je dobljeni rezultat negativen, analizirani vzorec ne vsebuje suhe snovi siriščne sirotke v zaznavnih količinah. Če je rezultat pozitiven, je treba uporabiti HPLC-kromatografijo na reverzni fazi. Prisotnost kislega pinjenca lahko privede do lažno pozitivnih rezultatov. Metoda HPLC na reverzni fazi to možnost izključuje.

8.4.2 Pred izvedbo HPLC-analize na reverzni fazi je treba optimizirati gradientne pogoje. Retenzijski čas 26 ± 2 minuti je optimalen za gradientne sisteme z mrtvo prostornino približno 6 ml (prostornina od točke, kjer pridejo skupaj topila do vključno prostornine injekcijske zanke). Gradientni sistemi z manjšo mrtvo prostornino (npr. 2 ml) naj uporabijo 22 minut kot optimalen retenzijski čas.

Vzemite raztopine standardnih vzorcev brez siriščne sirotke in s 50 % siriščne sirotke.

Injicirajte 100 μl supernatanta ali filtrata (8.3.3) v HPLC-instrument, ki deluje pri predlaganih gradientnih pogojih, danih v tabeli 1.

Tabela 1

Predlagani gradientni pogoji za optimizacijo kromatografije

začetek | 1,0 | 90 | 10 | * |

27 | 1,0 | 60 | 40 | linearna |

32 | 1,0 | 10 | 90 | linearna |

37 | 1,0 | 10 | 90 | linearna |

42 | 1,0 | 90 | 10 | linearna |

Iz primerjave dveh kromatogramov se razbere lokacija vrha GMPA.

Z uporabo spodnje enačbe se lahko izračuna sestava začetnega topila, ki se uporabi za normalni gradient (glej 8.4.3).

% B = 10 - 2,5 +

* 30/27

% B = 7,5 +

* 1,11

kjer je:

RTgmpA : retenzijski čas GMPA v predlaganem gradientu

10 : začetni % B v predlaganem gradientu

2,5 : % B na sredini minus % B na začetku normalnega gradienta

13,5 : srednji čas predlaganega gradienta

26 : zahtevani retenzijski čas GMPA

6 : razmerje naklonov predlaganega in normalnega gradienta

30 : % B na začetku minus % B pri 27 minutah predlaganega gradienta

27 : celotni čas predlaganega gradienta.

8.4.3 Vzemite raztopine preskusnih vzorcev

Injicirajte 100 μl natančno odmerjenega supernatanta ali filtrata (8.3.3) v HPLC-aparat, ki deluje pri pretoku 1,0 ml raztopine eluenta (5.2) na minuto.

Sestavo eluenta na začetku analize dobite iz 8.4.2. Ponavadi je blizu A:B = 76:24 (5.2). Takoj po injiciranju startajte linearni gradient in po 27 minutah se delež B poveča za 5 %. Nato startajte linearni gradient, ki v 5 minutah pripelje delež eluenta B na 90 %. To sestavo držite konstantno pet minut, nato pa jo spremenite in prek linearnega gradienta v petih minutah dosežete začetno sestavo. Odvisno od notranje prostornine sistema črpalk lahko naslednje injiciranje sledi 15 minut zatem, ko dosežete začetno sestavo.

Opombe

1. Retenzijski čas glikomakropeptida naj bi bil 26 2 minuti. To je mogoče doseči s spreminjanjem začetnih in končnih pogojev linearnega gradienta. Vendar pa mora razlika % B pri začetnih in končnih pogojih prvega gradienta ostati 5 % B.

2. Eluente je treba primerno razpliniti in morajo ostati razplinjeni. To je nujen pogoj za pravilno delovanje gradientnega sistema črpalk. Standardni odmik retenzijskega časa GMP vrha naj bo manjši od 0,1 minute (n = 10).

3. Vsakih pet vzorcev je treba injicirati referenčni vzorec (5) in ga uporabiti za izračun novega odzivnega faktorja R (9.1.1).

8.4.4 Rezultati kromatografske analize preskusnega vzorca (E) so dobljeni v obliki kromatograma, v katerem je vrh GMP prepoznan z retenzijskim časom približno 26 minut.

Integrator (6.40.6) samodejno izračuna višino vrha H vrha GMP. Na vsakem kromatogramu je treba preveriti lokacijo bazne linije. Analizo ali integracijo je treba ponoviti, če je bazna linija nepravilno locirana.

Pred kvantitativno interpretacijo je treba pregledati videz vsakega kromatograma, da bi tako lahko izsledili kakršne koli anomalije kot posledice slabega delovanja bodisi kromatografa ali kolone ali pa kot posledice izvora in narave analiziranega vzorca. V primeru dvoma se analiza ponovi.

8.5 Umerjanje

8.5.1 Za standardne vzorce (5.4.1 do 5.4.2) se uporabi postopek, opisan od točke 8.2 do točke 8.4.4. Uporabijo se sveže pripravljene raztopine, ker se GMP razgrajujejo v 8-odstotni triklorocetni kislini pri sobni temperaturi. Pri 4 °C ostane raztopina stabilna 24 ur. Pri veliki seriji analiz je zaželena uporaba hlajenega pladnja za vzorce v avtomatskem injektorju.

Opomba

Točko 8.4.2 je mogoče izpustiti, če je % B pri začetnih pogojih znan iz prejšnjih analiz.

Kromatogram referenčnega vzorca (5) mora biti analogen sliki 1. Na tej sliki sta pred vrhom GMPA dva majhna vrhova. Nujno je, da dobite podobno ločbo.

8.5.2 Pred kromatografsko določitvijo vzorcev injicirajte 100 μl standardnega vzorca brez siriščne sirotke (0) (5.4.1).

Kromatogram ne sme imeti vrha pri retenzijskem času vrha GMPA.

8.5.3 Z injiciranjem enake prostornine filtrata (8.5.1), kakor je uporabljen pri vzorcih, določite odzivni faktor R.

9. Podajanje rezultatov

9.1 Metoda za izračun in enačbe

9.1.1 Izračun odzivnega faktorja R:

vrh GMP: R = W/H

kjer je:

R = odzivni faktor vrha GMP

H = višina vrha GMP

W = količina sirotke v standardnem vzorcu (5).

9.2 Izračun deleža siriščne sirotke v prahu v vzorcu

W(E) = R × H(E)

kjer je:

W(E) = masni delež (M/M) siriščne sirotke v vzorcu (E)

R = odzivni faktor vrha GMP (9.1.1)

H(E) = višina vrha GMP vzorca (E)

Če je W(E) večji od 1 % in razlika med retenzijskim časom pri vzorcu in standardnem vzorcu manjša od 0,2 minute, potem je suha snov siriščne sirotke prisotna.

9.3 Zanesljivost postopka

9.3.1 Ponovljivost

Razlika med rezultatoma dveh določitev, ki jih izvede simultano ali po kratkem času isti analitik z isto opremo in na istovetnem preskusnem materialu, ne sme presegati 0,2 % m/m.

9.3.2 Obnovljivost

Še ni določena.

9.3.3 Linearnost

Linearno zvezo s korelacijskim koeficientom > 0,99 je treba dobiti v območju od 0 do 16 % siriščne sirotke.

9.4 Interpretacija

9.4.1 Šteje se, da je sirotka prisotna, če je rezultat, dobljen v 9.2, višji od 1 % m/m in se retenzijski čas vrha GMP razlikuje manj kot 0,2 minute od tistega, ki je dobljen pri standardnem vzorcu (5). Meja 1 % je postavljena v skladu z zahtevami točk 9.2 in 9.4.1 Priloge V k Uredbi (EGS) št.625/78.

+++++ TIFF +++++

--------------------------------------------------

PRILOGA XX

(Člen 14)

POSNETO MLEKO V PRAHU: KVANTITATIVNA DOLOČITEV FOSFATIDILSERINA IN FOSFATIDILETANOLAMINA

Metoda: HPLC na reverzni fazi

1. Namen in področje uporabe

Metoda navaja postopek za kvantitativno določitev fosfatidilserina (PS) in fosfatidiletanolamina (PE) v posnetem mleku v prahu (SMP) in je primerna za ugotavljanje trdnega pinjenca v SMP.

2. Opredelitev pojma

Vsebnost PS + PE: masni delež snovi, določen s tukaj opisanim postopkom. Rezultat se izrazi v miligramih fosfatidiletanolamina dipalmitola (PEDP) na 100 g prahu.

3. Princip

Ekstrakcija aminofosfolipidov iz rekonstruiranega mleka v prahu. Določitev PS in PE kot derivatov o-ftaldialdehida (OPA) s HPLC na reverzni fazi (RP) in fluorescenčno detekcijo. Kvantitativno ovrednotenje vsebnosti PS in PE v preskusnem vzorcu glede na standardni vzorec, ki vsebuje znano količino PEDP.

4. Reagenti

Vsi reagenti morajo biti analitsko čisti. Uporabljena voda mora biti destilirana ali vsaj primerljive čistote, če ni navedeno drugače.

4.1 Standard: PEDP s čistoto najmanj 99 %

Opomba:

Standard je treba hraniti pri –18 °C.

4.2 Reagenti za pripravo standarda in vzorcev

4.2.1 Metanol, HPLC-čistota

4.2.2 Kloroform, HPLC-čistota

4.2.3 Triptamin-monohidroklorid

4.3 Reagenti za o-ftalaldehidno derivatizacijo

4.3.1 Natrijev hidroksid, 12 M vodna raztopina

4.3.2 Borna kislina, 0,4 M vodna raztopina, uravnana na pH 10,0 z natrijevim hidroksidom (4.3.1)

4.3.3 2-merkaptoetanol

4.3.4 o-ftalaldehid (OPA)

4.4 Reagenti za HPLC (eluenti)

Eluente je treba pripraviti z uporabo reagentov HPLC-čistote.

4.4.1 Voda, HPLC-čistote

4.4.2 Metanol, čistota za fluorimetrijo

4.4.3 Tetrahidrofuran

4.4.4 Natrijev dihidrogen fosfat

4.4.5 Natrijev acetat

4.4.6 Ocetna kislina

5. Oprema

5.1 Analitska tehtnica

5.2 Čaše s prostornino 25 in 100 ml

5.3 Pipete, 1 ml in 10 ml

5.4 Magnetno mešalo

5.5 Polnilne pipete s prostornino 0,2, 0,5 in 5 ml

5.6 Merilne bučke s prostornino 10, 50 in 100 ml

5.7 Siringe s prostornino 20 in 100 μl

5.8 Ultrazvočna kopel

5.9 Centrifuga, delujoča pri 27000 × g

5.10 Reakcijske stekleničke s prostornino približno 5 ml

5.11 Merilni valj s prostornino 25 ml

5.12 pH–meter

5.13 HPLC-oprema

5.13.1 Gradientni sistem črpalk z možnostjo delovanja pri pretoku 1,0 ml/min pri 200 barih

5.13.2 Avtomatski vzorčevalnik z možnostjo izvajanja derivatizacije

5.13.3 Grelnik kolone, nastavljen na 30 °C

5.13.4 Fluorescenčni detektor z valovno dolžino vzbujanja 330 nm in valovno dolžino emisije 440 nm

5.13.5 Integrator ali programska oprema za obdelavo podatkov s sposobnostjo merjenja površine vrha

5.13.6 Kolona Lichrosphere – 100 (250 × 4,6 mm) ali enakovredna kolona, polnjena z oktadecilsilanom (C 18), velikost delcev 5 μm.

6. Vzorčenje

Vzorčenje mora biti izvedeno v skladu s standardom IDF 50B:1985.

7. Postopek

7.1 Priprava raztopine internega standarda

Natehtajte 30,0 0,1 mg triptamin-monohidroklorida (4.2.3) v 100-mililitrsko merilno bučko (5.6) in dopolnite do oznake z metanolom (4.2.1). Odpipetirajte 1 ml (5.3) te raztopine v 10-mililitrsko merilno bučko (5.6) in dopolnite do oznake z metanolom (4.2.1), da dobite raztopino s koncentracijo 0,15 mM triptamina.

7.2 Priprava raztopine preskusnega vzorca

Odtehtajte 1,000 0,001 g vzorca SMP v 25 ml čašo (5.2). S pipeto (5.3) dodajte 10 ml destilirane vode pri 40 °C in mešajte 30 minut z magnetnim mešalom (5.4), da raztopite morebitne grudice. Odpipetirajte 0,2 ml (5.5) rekonstruiranega vzorca mleka v 10-mililitrsko merilno bučko (5.6), dodajte 100 μl 0,15 mM raztopine triptamina (7.1) s pomočjo siringe (5.7) in dopolnite do oznake z metanolom (4.2.1). Previdno zmešajte z obračanjem bučke in postavite v ultrazvočno kopel (5.8) za 15 min. Centrifugirajte (5.9) 10 minut pri 27000 g in zberite bistro tekočino v stekleno vialo (5.10).

Opomba:

Raztopino preskusnega vzorca je treba do HPLC-analize hraniti pri 4 °C.

7.3 Priprava raztopine eksternega standarda

Odtehtajte 55,4 mg PEDP (4.1) v 50-mililitrsko merilno bučko (5.6) in dodajte z merilnim valjem (5.11) približno 25 ml kloroforma (4.2.2). Zaprto bučko segrejte do 50 °C in previdno premešajte, da se PEDP raztopi. Ohladite bučko na 20 °C in dopolnite do oznake z metanolom (4.2.1). Odpipetirajte 1 ml (5.3) te raztopine v 10-mililitrsko merilno bučko (5.6)), dodajte 100 μl (5.7) 0,15 mM raztopine triptamina (7.1) s pomočjo siringe (5.7) in dopolnite do oznake z metanolom (4.2.1). Zmešajte z obračanjem bučke.

Opomba:

Raztopino referenčnega vzorca je treba do HPLC-analize hraniti pri 4 °C.

7.4 Priprava reagenta za derivatizacijo

Odtehtajte 25,0 0,1 mg OPA (4.3.4) v 10-mililitrsko merilno bučko (5.6), dodajte 0,5 ml (5.5) metanola (4.2.1) in previdno premešajte, da se OPA raztopi. Dopolnite do oznake z raztopino borne kisline (4.3.2) in dodajte s pomočjo siringe (5.7) 20 μl 2-merkaptoetanola (4.3.3).

Opomba:

Reagent za derivatizacijo je treba hraniti v temni viali pri 4 °C in je stabilen en teden.

7.5 HPLC-določitev

7.5.1 Topila (eluenti) (4.4)

Topilo A:

0,3 mM raztopina natrijevega dihidrogen fosfata in 3 mM natrijevega acetata (pH uravnan na 6,5 z ocetno kislino): metanol: tetrahidrofuran = 558:440:2 (v/v/v)

Topilo B:

Metanol

7.5.2 Predlagani elucijski gradient

Čas (minute) | Topilo A (%) | Topilo B (%) | Pretok (ml/min) |

začetek | 40 | 60 | 0 |

0,1 | 40 | 60 | 0,1 |

5,0 | 40 | 60 | 01 |

6,0 | 40 | 60 | 0,1 |

6,5 | 40 | 60 | 1,0 |

9,0 | 36 | 64 | 1,0 |

10,0 | 20 | 80 | 1,0 |

11,5 | 16 | 84 | 1,0 |

12,0 | 16 | 84 | 1,0 |

16,0 | 10 | 90 | 1,0 |

19,0 | 0 | 100 | 1,0 |

20,0 | 0 | 100 | 1,0 |

21,0 | 40 | 60 | 1,0 |

29,0 | 40 | 60 | 1,0 |

30,0 | 40 | 60 | 0 |

Opomba:

Elucijski gradient je morda treba rahlo spremeniti, da bi dobili ločbo, kakor je prikazana na sliki 1.

Temperatura kolone: 30 °C.

7.5.3 Prostornina injiciranja: 50 μl reagenta za derivatizacijo in 50 μl raztopine vzorca.

7.5.4 Vzpostavitev ravnotežja v koloni

Če se sistem začne dnevno, se kolona spira 15 minut s 100-odstotnim topilom B, potem nastavi A:B = 40:60 in 15 minut vzpostavlja ravnotežje pri pretoku 1 ml/min. Slepa določitev se izvede z injiciranjem metanola (4.2.1).

Opomba:

Pred daljšim hranjenjem je treba kolono spirati 30 minut z mešanico metanol: kloroform = 80:20 (v/v).

7.5.5 Določitev vsebnosti PS + PE v preskusnem vzorcu

7.5.6 Izvedite zaporedje kromatografskih analiz s konstantnim časom med dvema analizama, da s tem zagotovite konstanten retenzijski čas. Vsakih 5-10 preskusnih vzorcev injicirajte raztopino eksternega standarda (7.3) za ovrednotenje odzivnega faktorja.

Opomba:

Na vsakih 20-25 analiz je nujno kolono najmanj 30 minut spirati s 100-odstotnim topilom B.

7.6 Način integracije

7.6.1 Vrh PEDP

Vrh PEDP se pojavi samostojno. Njegova površina se določi z integracijo dolina–dolina.

7.6.2 Vrh triptamina

Vrh triptamina se pojavi samostojno (slika 1). Njegova površina se določi z integracijo dolina–dolina.

7.6.3 Skupine vrhov PS in PE

Pri opisanih pogojih (slika 1) se PS eluira v obliki dveh delno neločenih vrhov, pred katerima je še en manjši vrh. PE se eluira v obliki treh glavnih delno neločenih vrhov. Površina vsake skupine vrhov se določi z nastavitvijo bazne linije, kakor je prikazano na sliki 1.

8. Izračun in podajanje rezultatov

Vsebnost PS in PE v vzorcu se izračuna, kakor sledi:

C =55,36 x

T1T2

kjer je:

C = vsebnost PS ali PE (v mg/100g vzorca) v preskusnem vzorcu

1 = površina vrha PEDP raztopine standardnega vzorca (7.3)

2 = površina vrha PS ali PE raztopine preskusnega vzorca (7.2)

1 = površina vrha triptamina v raztopini standardnega vzorca (7.3)

2 = površina vrha triptamina v raztopini preskusnega vzorca (7.2)

9. Natančnost

Opomba:

Vrednosti za ponovljivost so bile izračunane v skladu z mednarodnim standardom IDF [1]. Predpisana meja za obnovljivost je bila izračunana v skladu s postopkom, opredeljenimi v Prilogi III(b).

9.1 Ponovljivost

Relativni standardni odmik ponovljivosti, izražajoč variabilnost neodvisnih analitskih rezultatov, ki jih dobi isti analitik z isto opremo pri enakih pogojih na istem preskusnem vzorcu v kratkem časovnem intervalu, ne sme presegati vrednosti 2 % relativno. Če sta dve določitvi izvedeni pri teh pogojih, relativna razlika med dvema rezultatoma ne sme biti večja od 6 % aritmetične sredine teh rezultatov.

9.2 Obnovljivost

Če sta dve določitvi izvedeni v različnih laboratorijih z različno opremo pri različnih pogojih analize na enakem preskusnem vzorcu, relativna razlika med dvema rezultatoma ne sme biti večja od 11 % aritmetične sredine teh rezultatov.

10. Reference

10.1 Resmini P., Pellegrino L., Hogenboom J.A., Sadini V., Rampilli M., "Detection of Buttermilk solids in skimmilk powder bY HPLC quantification of aminophospholipids." Sci. Tech. Latt.-Cas., 39, 395(1988).

+++++ TIFF +++++

[1] Mednarodni standard IDF 135B/1991. Mleko in mlečni proizvodi. Značilnosti natančnosti analitskih metod. Prikaz rezultatov medlaboratorijske študije.

--------------------------------------------------

PRILOGA XXI

(Člen 15)

UGOTAVLJANJE OSTANKOV ANTIBIOTIKOV IN SULFONAMIDA/DAPSON V POSNETEM MLEKU V PRAHU

Uporablja se mikrobni inhibitorski presejalni preskus z Bacillus stearothermophilus var. calidolactis C953 kot preskusnim mikroorganizmom, ker je dovolj občutljiv, da zazna 4 μg benzilpenicilina v mleku in 100 μg sulfadimina v mleku. Na voljo so komercialni kompleti za preskušanje in se lahko uporabijo, če imajo zahtevano občutljivost za benzilpenicilin in sulfadimin [1].

Za preskus se uporabi rekonstituirano posneto mleko v prahu (1 g prahu + 9 ml destilirane vode). Preskus se izvede, kakor je opisano v IDF – Biltenu št. 258/1991, oddelek 1, poglavje 2, ali v skladu z navodili proizvajalca preskusnega kompleta.

Pozitivni rezultati naj se interpretirajo tako:

1. Ponovite preskus z dodatkom penicilinaze preskusnemu sistemu:

Pozitivni rezultat: Inhibitorske substance s tem postopkom ni mogoče razpoznati.

Negativni rezultat: Inhibitorska substanca je β-laktamski antibiotik.

2. Ponovite preskus z dodatkom p-amino benzojske kisline preskusnemu sistemu:

Pozitivni rezultat: Inhibitorske substance s tem postopkom ni mogoče razpoznati.

Negativni rezultat: Inhibitorska substanca je sulfonamid/dapson.

3. Ponovite preskus z dodatkom penicilinaze + p-amino benzojske kisline preskusnemu sistemu:

Pozitivni rezultat: Inhibitorske substance s tem postopkom ni mogoče razpoznati.

Negativni rezultat: Inhibitorska substanca je β-laktamski antibiotik in sulfonamid/dapson.

[1] Pomembna opomba:Pri analizi posnetega mleka v prahu so rezultati lahko lano pozitivni. Zato je zelo pomembno preveriti, da uporabljeni preskusni sistem ne daje lano pozitivnih rezultatov.

--------------------------------------------------

PRILOGA XXII

(Člen 16)

KVANTITATIVNA DOLOČITEV POSNETEGA MLEKA V PRAHU V KRMNIH MEŠANICAH Z ENCIMATSKO KOAGULACIJO PARA-KAZEINA

1. Namen

Kvantitativna določitev posnetega mleka v prahu v krmnih mešanicah z encimatsko koagulacijo para-kazeina.

2. Področje

Ta metoda se uporablja za krmne mešanice, ki vsebujejo najmanj 10 % posnetega mleka v prahu; velike količine pinjenca in/ali določene ne-mlečne beljakovine lahko motijo (povzročijo interference).

3. Princip

3.1 Raztapljanje kazeina, ki je v krmni mešanici, z ekstrakcijo z raztopino natrijevega citrata.

3.2 Uravnanje koncentracije kalcijevih ionov na zahtevano raven za obarjanje para-kazeina; z dodatkom sirišča se iz kazeina tvori para-kazein.

3.3 Vsebnost dušika v oborini para-kazeina se določi s Kjeldahlovo metodo, kakor je opisana v standardu IDF 20A:1986; količina posnetega mleka v prahu se izračuna na podlagi najmanjše vsebnosti kazeina 27,5 % (glej 9.1).

4. Reagenti

Vsi reagenti morajo biti analitsko čisti. Uporabljena voda mora biti destilirana ali vsaj primerljive čistote. Z izjemo sirišča (4.5) morajo biti vsi reagenti in raztopine brez dušikovih spojin.

4.1 Trinatrijev citrat, dihidrat (1 % m/v raztopina).

4.2 Kalcijev klorid (2M raztopina). Odtehtajte 20,018 g CaCO3 (analitske čistote) v primerno veliko porcelansko posodo (150 do 200 ml) ali v čašo. Prelijte z destilirano vodo in postavite na vrelo vodno kopel. Počasi dodajte 50 do 60 ml raztopine HCl (konc. HCl:voda = 1:1), da se karbonat popolnoma raztopi. Pustite na vodni kopeli, da se CaCl2 posuši in odstrani HCl, ki ni reagiral. Z destilirano vodo prenesite v 100-mililitrsko merilno bučko in dopolnite do oznake. Izmerite vrednost pH, ki ne sme biti nižja od 4,0. Hranite raztopino v hladilniku.

4.3 0,1 N raztopina natrijevega hidroksida.

4.4 0,1 N solna kislina.

4.5 Tekoče goveje sirišče (moč sirjenja 1: 10000). Hranite v hladilniku pri 4 do 6 °C.

4.6 Reagenti za kvantitativno določitev dušika v skladu s Kjeldahlovo metodo, kakor je opisana v standardu IDF 20A:1986.

5. Oprema

Običajna laboratorijska oprema, vključno:

5.1 Terilnica ali homogenizator

5.2 Analitska tehtnica

5.3 Namizna centrifuga (2000 do 3000 obratov na minuto) s 50-mililitrskimi epruvetami

5.4 Magnetno mešalo z (10 do 15 mm) magnetki

5.5 5150 do 200-mililitrske čaše

5.6 6250 in 500-mililitrske bučke

5.7 Steklene cevke s premerom 60 do 80 mm

5.8 Filtri za hitro filtriranje s premerom 150 mm brez pepela (S.S.5892, S.S. 595 1/2)

5.9 Pipete z različnimi nazivnimi prostorninami

5.10 Termostatsko kontrolirana vodna kopel pri 37 °C

5.11 pH-meter

5.12 Oprema za Kjeldahlov razklop in destilacijo s priključki

5.13 25-mililitrska graduirana bireta

5.14 Plastična izpiralka za destilirano vodo

5.15 Spatule iz nerjavnega jekla

5.16 Termometri

5.17 Temperaturno kontroliran sušilnik.

6. Postopek

6.1 Priprava vzorca.

Sterite v terilnici ali homogenizirajte v mlinu 10 do 20 g vzorca, da dobite homogeno zmes.

6.2 Raztapljanje mlečnega prahu in odstranitev netopnega ostanka.

6.2.1 Odtehtajte 1,000 0,002 g dobro homogenizirane krmne mešanice (6.1) neposredno v 50-mililitrsko epruveto za centrifugiranje. Dodajte 30 ml raztopine trinatrijevega citrata (4.1), predhodno segrete na 45 °C. Mešajte z magnetnim mešalom najmanj pet minut.

6.2.2 Centrifugirajte pri 500 g (2000 do 3000 vrtljajev na minuto) 10 minut in dekantirajte čisti vodni supernatant v 150- do 200-mililitrsko čašo, pri čemer pazite, da ne prelijete rahle usedline.

6.2.3 Po istem postopku izvedite še dve nadaljnji ekstrakciji ostanka in združite ekstrakta s prvim.

6.2.4 Če na površini nastane plast maščobe, ohladite v hladilniku, da se strdi, in odstranite trdno plast s spatulo.

6.3 Koagulacija kazeina s siriščnimi encimi.

6.3.1 Med stalnim mešanjem dodajte skupnemu vodnemu ekstraktu (približno 100 ml) po kapljicah 3,4 ml raztopine kalcijevega klorida (4.2). Uravnajte pH na 6,4-6,5 z raztopinama NaOH (4.3) ali HCl (4.4). Postavite v termostatirano vodno kopel pri 37 °C za 15 do 20 minut, da vzpostavite ravnotežje soli. To postane razločneje ob pojavu rahle motnosti.

6.3.2 Prenesite tekočino v eno (ali dve) epruveti za centrifugiranje in centrifugirajte pri 2000 g 10 minut, da odstranite oborino. Prenesite supernatant brez izpiranja sedimenta v eno (ali dve) epruveti za centrifugiranje.

6.3.3 Ponovno temperirajte supernatant na 37 °C. Med mešanjem ekstrakta dodajte po kapljicah 0,5 ml tekočega sirišča (4.5). Do koagulacije pride v eni do dveh minutah.

6.3.4 Ponovno vrnite vzorec v vodno kopel in pustite 15 minut pri temperaturi 37 °C. Odstranite vzorec iz kopeli in razbijte koagulat z mešanjem. Centrifugirajte pri 2000 g 10 minut. Filtrirajte supernatant skozi primeren filtrirni papir [1] (Whatman št. 541) in filtrirni papir zadržite. Sperite oborino v epruveti za centrifugiranje s 50 ml vode pri približno 35 °C z mešanjem oborine.

Ponovno centrifugirajte pri 2000 g 10 minut. Filtrirajte supernatant skozi predhodno shranjen filtrirni papir.

6.4 Določitev kazeinskega dušika.

6.4.1 Po spiranju kvantitativno prenesite oborino z destilirano vodo na filtrirni papir, shranjen iz 6.3.4. Filtrirni papir prenesite v Kjeldahlovo epruveto. Določite dušik po Kjeldahlovi metodi, kakor je opisano v standardu IDF 20A:1986.

7. Slepi preskus

7.1 Slepi preskus je treba redno izvajati z uporabo filtrirnega papirja brez pepela (5.8) z zmesjo 90 ml (4.1) raztopine natrijevega citrata, 1 ml nasičene raztopine kalcijevega klorida (4.2), 0,5 ml tekočega sirišča (4.5), ki se spere s 3 × 15 ml destilirane vode pred mineralizacijo po Kjeldahlovi metodi, kakor je opisano v standardu IDF 20A:1986.

7.2 Prostornino kisline, porabljeno za slepi preskus, je treba odšteti od prostornine kisline (4.4), porabljene za titracijo vzorca.

8. Kontrolni preskus

8.1 Za preverjanje zgoraj navedenega postopka in reagentov izvedite določitev v standardni krmni mešanici z znano vsebnostjo posnetega mleka v prahu, ki je ugotovljena v medlaboratorijski primerjavi. Povprečni rezultat vzporedne določitve ne sme odstopati več kot 1 % od tistega, dobljenega v medlaboratorijski primerjavi.

9. Podajanje rezultatov

9.1 Odstotek posnetega mleka v prahu v krmni mešanici se izračuna po naslednji enačbi:

% MMP =

27,5

-2,81

0,908

kjer je N odstotek dušika iz para-kazeina; 27,5 je faktor za pretvorbo dobljenega kazeina v odstotek posnetega mleka v prahu; 2,81 in 0,908 sta korekcijska faktorja, dobljena iz regresijske analize.

10. Natančnost metode

10.1 Ponovljivost

V najmanj 95 % obdelanih primerov razlika dveh vzporednih analiz, ki ju opravi isti analitik v istem laboratoriju z istim vzorcem, ne sme biti večja od 2,3 g posnetega mleka v prahu v 100 g krmne mešanice.

10.2 Obnovljivost

V najmanj 95 % obdelanih primerov razlika dveh vzporednih analiz istega vzorca v dveh laboratorijih ne sme biti večja od 6,5 g posnetega mleka v prahu v 100 g krmne mešanice.

11. Tolerančne meje

Vrednost CrD95 (kritična razlika; 95-odstotna meja zanesljivosti) se izračuna z enačbo (ISO 5725):

CrD

(R = ponovljivost; r = obnovljivost)

Vzporedna (dvojna) določitev: CrD95 = 4,5 g

Kadar se rezultat kemijske analize ne razlikuje od deklarirane vsebnosti posnetega mleka v prahu več kot 4,5 g (vzporedna (dvojna) določitev), se šteje, da krmna mešanica ustreza zahtevam Uredbe.

12. Opažanja

12.1 Dodatek visokih odstotkov določenih nemlečnih proteinov in posebej sojinih proteinov pri segrevanju skupaj s posnetim mlekom v prahu ima za posledico previsoke rezultate zaradi soobarjanja z mlečnim para-kazeinom.

12.2 Dodatek pinjenca povzroči nekoliko nizke rezultate, ker se določajo samo nemlečni proteini. Dodatek določenega kislega pinjenca daje znatno nižje rezultate zaradi nepopolnega raztapljanja v raztopini citrata.

12.3 Dodatek 0,5 % ali več lecitina tudi daje nižje rezultate.

12.4 Vključitev visoko temperaturnega posnetega mleka v prahu lahko tudi vodi do previsokih rezultatov zaradi soobarjanja določenih beljakovin sirotke skupaj z mlečnim para-kazeinom.

[1] Uporabiti je treba filtrirni papir, ki omogoča čim hitreje filtriranje.

--------------------------------------------------

PRILOGA XXIII

(Člen 17)

KVALITATIVNA DOLOČITEV ŠKROBA V POSNETEM MLEKU V PRAHU, DENATURIRANEM MLEČNEM PRAHU IN KRMNIH MEŠANICAH

1. Namen

S to metodo se ugotavlja škrob, ki je pokazatelj za denaturirani mlečni prah.

Meja zaznavnosti metode je približno 0,05 g škroba na 100 g vzorca.

2. Princip

Reakcija temelji na tisti, ki se uporablja pri jodometriji:

- fiksacija s koloidi prostega joda v vodni raztopini,

- absorpcija s škrobnimi micelami in tvorbo barve.

3. Reagenti

3.1 Raztopina joda:

- jod: 1 g,

- kalijev jodid: 2 g

- destilirana voda: 100 ml.

4. Oprema

4.1 Analitska tehtnica

4.2 Vodna kopel

4.3 Preskusne epruvete, 25 mm × 200 mm

5. Postopek

Odtehtajte 1 g vzorca in ga prenesite v preskusno epruveto (4.3).

Dodajte 20 ml destilirane vode in stresajte, da vzorec dispergira.

Postavite v vrelo vodno kopel (4.2) in pustite 5 minut.

Odstranite iz kopeli in ohladite na sobno temperaturo.

Dodajte 0,5 ml raztopine joda (3.1), stresite in opazujte nastalo barvo.

6. Podajanje rezultatov

Modro obarvanje nakazuje prisotnost nativnega škroba v vzorcu.

Kadar vzorec vsebuje modificirani škrob, se lahko zgodi, da barva ni modra.

7. Opombe

Barva, intenziteta barve in mikroskopska pojavnost škroba se razlikujejo glede na izvor nativnega škroba (npr. koruzni ali krompirjev) in glede na vrsto modificiranega škroba, prisotnega v vzorcu.

V prisotnosti modificiranega škroba se nastala barva spremeni v vijolično, rdečo ali rjavo v skladu s stopnjo modificiranosti kristalne strukture nativnega škroba.

--------------------------------------------------

PRILOGA XXIV

(Člen 18)

DOLOČITEV VLAGE V KISLEM PINJENCU V PRAHU

1. Namen

Za določitev vsebnosti vlage v kislem pinjencu v prahu, namenjenem za krmo živali.

2. Princip

Vzorec se posuši v vakuumu. Izguba mase se določi s tehtanjem.

3. Oprema

3.1 Analitska tehtnica.

3.2 Suhe posode iz nekorozivne kovine ali stekla s pokrovi, ki omogočajo zapiranje, neprepustno za zrak; delovna površina, ki omogoča, da se vzorec razprostre približno na 0,3 g/cm2.

3.3 Nastavljiv električni vakuumski sušilnik, opremljen z oljno črpalko in ali z mehanizmom za vnašanje suhega vročega zraka ali s sušilnim sredstvom (npr. kalcijevim kloridom).

3.4 Eksikator z učinkovitim sušilnim sredstvom.

3.5 Sušilnik z ventilacijo, termostatsko kontroliran, pri 102 2 °C.

4. Postopek

Segrevajte posodo (3.2) s pokrovom v sušilniku (3.5) najmanj eno uro. Zaprite posodo s pokrovom, takoj prenesite v eksikator (3.4), pustite, da se ohladi do sobne temperature, in stehtajte na 0,5 mg natančno.

Stehtajte posodo s pokrovom (3.2) na 0,5 mg natančno. V stehtano posodo odtehtajte približno 5 g vzorca na 1 mg natančno in ga enakomerno razprostrite. Posodo brez pokrova postavite v vakuumski sušilnik (3.3), segret na 83 °C. Da preprečite prevelik padec temperature, vnesite posodo kolikor je mogoče hitro.

Uravnajte tlak na 100 torrov (13,3 kPa) in sušite pri tem tlaku štiri ure bodisi v toku suhega vročega zraka ali pa z uporabo sušilnega sredstva (približno 300 g za 20 vzorcev). V zadnjem primeru odklopite vakuumsko črpalko, ko je želeni tlak dosežen. Upoštevajte čas sušenja od trenutka, ko temperatura sušilnika spet doseže 83 °C. Previdno izenačite tlak v sušilniku z atmosferskim. Odprite sušilnik, takoj pokrijte posodo, jo odstranite iz sušilnika, pustite, da se ohlaja 30 do 45 minut v eksikatorju (3.4), in stehtajte na 1 mg natančno. V vakuumskem sušilniku (3.3) sušite dodatnih 30 minut pri 83 °C in ponovno stehtajte. Razlika obeh tehtanj ne sme biti večja od 0,1 % vlage.

5. Izračun

100E

kjer je:

E = izhodna masa preskusnega vzorca, v gramih,

m = masa suhega vzorca, v gramih.

6. Natančnost

6.1 Meja ponovljivosti

Razlika med rezultatoma dveh določitev, ki ju isti analitik izvede v najkrajšem možnem času z isto opremo na istovetnem preskusnem materialu, ne sme presegati 0,4 g vode/100 g kislega pinjenca v prahu.

6.2 Meja obnovljivosti

Razlika med rezultatoma dveh določitev, ki ju izvedeta dva analitika v različnih laboratorijih z različno opremo na istovetnem preskusnem materialu, ne sme presegati 0,6 g vode/100 g kislega pinjenca v prahu.

6.3 Vir podatkov za natančnost

Podatki za natančnost so bili dobljeni pri eksperimentu, izvedenem v letu 1995, ki je vključeval osem laboratorijev in 12 vzorcev (12 slepih dvojnikov).

--------------------------------------------------

PRILOGA XXV

(Člen 19)

REFERENČNA METODA ZA UGOTAVLJANJE TUJIH MAŠČOB V MLEKU S PLINSKO KROMATOGRAFSKO ANALIZO TRIGLECIRIDOV — PREGLED 1

1. Namen in področje uporabe

Ta standard določa metodo za ugotavljanje tujih maščob rastlinskega in živalskega izvora, kot sta goveji loj in svinjska mast, v mlečni maščobi mlečnih proizvodov z uporabo plinske kromatografske analize trigliceridov.

Z uporabo opredeljenih trigliceridnih enačb se rastlinske in živalske maščobe v čisti mlečni maščobi ugotavljajo kvalitativno in kvantitativno ne glede na prehranjevalne ali laktacijske pogoje.

Opomba 1:

Čeprav maslena kislina (C4), ki se pojavlja izključno v mlečnih maščobah, omogoča kvantitativne ocene nizkih do srednjih količin mlečne maščobe v rastlinskih maščobah, je pri dodatku do najmanj 20 % (utežni %) tuje maščobe čisti mlečni maščobi težko dobiti kvalitativne in kvantitativne podatke zaradi velikih variacij C4, ki segajo od približno 3,5 do 4,5 % (utežni %).

Opomba 2:

Kvantitativne rezultate je pravzaprav mogoče dobiti le s trigliceridnimi analizami, ker je vsebnost sterola rastlinskih maščob zaradi pogojev pridobivanja in obdelave različna.

2. Opredelitev pojma

Tuje maščobe v mlečni maščobi: tuje maščobe, kakor jih opredeljuje ta standard, so vse rastlinske in živalske maščobe razen mlečne maščobe.

3. Princip metode

Po ekstrakciji mlečne maščobe se pripravi osnovna raztopina. Iz te raztopine se s plinsko kromatografijo na polnjenih kolonah določijo trigliceridi (celotna ogljikova števila). Z vstavitvijo utežnih % maščobnih molekul različnih velikosti (C24 — C54 — samo soda števila) v trigliceridno enačbo se bodisi kvalitativno bodisi kvantitativno določijo tuje maščobe.

Opomba:

Glede na zgoraj opisano določanje vrednosti se lahko uporabi tudi kapilarna plinska kromatografija, če bodo z njo zagotovo doseženi podobni rezultati [1].

4. Reagenti

Uporabiti je treba analitsko čiste kemikalije.

4.1 Nosilni plin: dušik, stopnja čistote 99,996 %.

4.2 Standardni trigliceridi [2], nasičeni, in tudi holesterol za standardiziranje standardne mlečne maščobe v skladu s točko 6.5.4.

4.3 Metanol, brezvoden.

4.4 n-heksan

4.5 n-heptan

4.6 Toluen

4.7 Dimetilklorosilanova raztopina: 50 ml dimetilklorosilana raztopite v 283 ml toluena.

4.8 Gorljiv plin: vodik in sintetični zrak

4.9 Stacionarna faza, 3– % OV-1 na 125/150 μm (100/120 mesh) Gas ChromQ [3].

4.10 10-odstotna raztopina kakavovega masla

5. Oprema

Običajna laboratorijska oprema, še zlasti:

5.1 Visokotemperaturni plinski kromatograf, primeren za temperature od najmanj 400 do 450 °C, opremljen s plamenskim ionizacijskim detektorjem (FID) in regulatorjem stalnega pretoka za nosilni plin. Gorljiv plin: 30 ml/min H2, 270 ml/min sintetični zrak.

Glede na visok pretok nosilnega plina mora biti plamen še posebej močan.

Opomba:

Steklene vstavke v FID ali v injektorskem sistemu je treba zaradi visokih temperatur, ki se pojavljajo pri analizah trigliceridov, pogosto očistiti.

Plinski kromatograf mora biti opremljen s septami, odpornimi proti visokim temperaturam, ki se lahko pogosto uporabijo in imajo na splošno zelo nizko stopnjo "puščanja".

Opomba:

Primerne so septe Chromblue (tm) (Chrompack).

Septe je treba redno menjati, npr. po približno 100 injiciranjih ali takoj, ko se ločljivost poslabša (glej sliko 4).

5.2 Kromatografska kolona

Steklena kolona v obliki črke U (notranji premer 2 mm, dolžina 500 mm), ki jo je treba najprej silanizirati z dimetilklorosilanom v skladu s točko 6.1, da se deaktivira steklena površina.

Opomba:

Primerne so nekoliko daljše (80 — 200 mm dolge) polnjene kolone. Z njimi je mogoče doseči nekoliko boljšo obnovljivost rezultatov. Po drugi strani se na stacionarni fazi po uporabi občasno pojavijo frakture, čemur lahko sledijo slabši kvantitativni rezultati. Poleg tega lahko plamen FID hitro ugasne zaradi izjemno hitrega pretoka nosilnega plina od 75 do 85 ml/min, ki je pri tem potreben.

5.3 Priprave za polnjenje kolone (glej sliko 1)

+++++ TIFF +++++

5.3.1 Plastična kolona z navitimi končnimi pokrovčki in oznako, do katere se lahko kolona napolni s potrebno količino stacionarne faze.

5.3.2 Drobno sito (gostota sita približno 100 μm) s pokrovčkom, primernim za zaprtje steklene kolone v skladu s sliko 1.

5.3.3 Deaktivirana, silanizirana steklena volna.

5.3.4 Vibrator za enakomerno porazdelitev stacionarne faze med polnjenjem.

5.4 1 do 3 ml kolone Extrelut [4] s silikagelom. Ta kolona se lahko izmenično uporablja tudi za ekstrakcijo mlečne maščobe.

5.5 Grafitno tesnilo 6,4 mm (1/4″) s 6-milimetrsko odprtino

5.6 Naprave za silaniziranje steklene površine kolone v skladu s točko 6.1.

5.6.1 5.6.1 Woulffova steklenica

5.6.2 5.6.2 Vodna črpalka

5.7 Vodna kopel, nastavljiva na (50 ± 2) °C

5.8 Sušilnik, nastavljiv na (50 ± 2) °C in (100 ± 2) °C

5.9 Mikrolitrska pipeta (mikropipeta)

5.10 5-mililitrska graduirana pipeta za doziranje 1,5 ml metanola

5.11 50-mililitrska buča z okroglim dnom

5.12 Erlenmajerica z nazivno prostornino 50 ml

5.13 Lijak

5.14 Filter z drobnimi porami

5.15 Rotacijski izparilnik

5.16 Ampule z nazivno prostornino 1 ml, zapirajo se z aluminijastim pokrovom, s septo v notranjosti

5.17 Brizgalka, bat uporabljene brizgalke ne sme segati v konico igle.

Opomba:

Take brizgalke omogočajo boljšo obnovljivost rezultatov.

Da bi se preprečilo poškodovanje septe, je konico igle treba redno preverjati (npr. s stereomikroskopom).

6. Postopek

6.1 Priprava kolone (silaniziranje)

Po priključitvi Woulffove steklenice, kakor je prikazana na sliki 2, na vodno črpalko, cev 2 potopite v raztopino iz razdelka 4.7. Kolona se napolni, ko zaprete zaporni ventil. Takoj nato odstranite obe cevi.

+++++ TIFF +++++

Kolono pritrdite na stojalo, s pipeto pa jo napolnite z dimetilklorosilanovo raztopino.

Po 20–30 minutah Woulffovo steklenico zamenjajte s stekleničko za filtriranje, kolono pa izpraznite, tako da jo povežete z vodno črpalko (glej sliko 3).

6.2 Polnjenje kolone

Temu sledi zaporedno izpiranje kolone s 75 ml toluena in 50 ml metanola; izpraznjeno kolono nato približno 30 minut sušite v sušilniku pri 100 °C.

+++++ TIFF +++++

Za polnjenje kolone se uporablja priprava, kakor je prikazana na sliki 1. Plastično kolono napolnite s stacionarno fazo v skladu s točko 4.9 do oznake. Spodnji del kolone, ki jo boste napolnili, zaprite s približno 1 cm dolgim čepom iz silanizirane steklene volne, ki ga potisnite noter z jekleno paličico. Konec kolone nato zaprite s sitom v skladu s točko 5.3.2.

Kolono napolnite s stacionarno fazo pod tlakom (3 bar, z N2). Da bi dobili homogeno, enakomerno in trdno polnjene, se med polnjenjem po stekleni koloni premika gor in dol vibrator.

Po polnjenju v drugi konec polnjene kolone potisnite trden čep iz silanizirane steklene volne, pri čemer štrleče dele odrezite, čep pa z lopatico potisnite nekaj milimetrov v kolono.

6.3 Priprava vzorcev

Za pripravo vzorcev se uporabi ena od naslednjih treh metod:

6.3.1 Izolacija mlečne maščobe iz masla

5 do 10 g masla raztalite v primerni posodi v vodni kopeli v skladu s točko 5.7 pri 50 °C.

50-mililitrsko erlenmajerico in lijak z vstavljenim filtrom v skladu s točko 5.14 segrejte na 50 °C v sušilniku. Maščobni sloj staljenega masla prefiltrirajte z vnaprej segreto napravo.

Taka mlečna maščoba je skoraj brez fosfolipidov.

6.3.2 Ekstrakcija maščobne frakcije po Röse-Gottliebovi metodi.

Ekstrakcija se opravi po standardu IDF 1C:1987, 16C:1987, 116A:1987 ali 22B:1987.

S tako mlečno maščobo lahko s pomočjo fosfolipidov dobite holesterolni vrh, ki je povečan za približno 0,1 %.

Trigliceridni spekter, standardiziran na 100 s holesterolom, je tako le pod zanemarljivim vplivom.

6.3.3 Ekstrakcija iz mleka s silikagel kolonami

0,7 ml mlečnega vzorca, temperiranega na 20 °C, s pomočjo mikrolitrske pipete v skladu s točko 5.4 nanesite na 1 do 3 ml kolone Extrelut, nato počakajte približno pet minut, da se vzorec enakomerno porazdeli po silikagelu.

Za denaturiranje proteinsko-lipidnih kompleksov s pomočjo pipete vzorcu dodajte 1,5 ml metanola. Nato z 20 ml n-heksana vzorec ekstrahirajte. N-heksan dodajajte počasi v majhnih količinah, pri čemer odtekajoče topilo ulovite v 50-mililitrsko bučo z okroglim dnom, ki ste jo pred tem osušili na konstantno, znano maso.

Po ekstrakciji pustite, da se kolona izprazni.

Topila iz eluata oddestilirajte v rotacijskem izparilniku pri temperaturi vodne kopeli od 40 do 50 °C.

Bučo posušite, ostanek maščobe pa stehtajte.

Opomba:

Ekstrakcije maščobe po Gerberju, Weibull–Berntropu, Schmid–Bondzynski–Ratzlaffu ali izolacija mlečne maščobe z uporabo detergentov (metoda BDI) niso primerne za analizo trigliceridov, ker pri teh metodah lahko pride do prehoda večjih ali manjših količin delnih gliceridov ali fosfolipidov v maščobno fazo.

6.4 Priprava raztopine vzorca

Za plinsko kromatografijo se uporabi 5-odstotna raztopina maščobe v n-heptanu, dobljena v skladu s točko 6.3. Za pripravo te raztopine vzorca odtehtajte ustrezno količino vzorčnega materiala, dobljenega v skladu s točkama 6.3.1 in 6.3.2, in jih raztopite v ustreznih količinah n-heptana.

Pri pripravi vzorca v skladu s točko 6.3.3 se količina n-heptana, ki se doda vzorčnemu materialu v buči, izračuna na podlagi tehtanja in v njem raztopljenega preostanka.

V ampulo vnesete približno 1 ml raztopine vzorca skladno s točko 5.16.

6.5 Kromatografsko določanje trigliceridov

Pri visokih temperaturah do 350 °C za eluiranje dolgoverižnih trigliceridov C52-C56 se lahko pojavi dvig bazne linije, še zlasti če kolone niso bile primerno pripravljene. Povišanju bazne linije pri visokih temperaturah se je mogoče popolnoma izogniti s kombiniranjem dveh kolon ali s subtrakcijo bazne linije.

Pri kompenzacijskem načinu ali pri delu s posameznimi kolonami tako v injektorju kot tudi v detektorju je treba za steklene vstavke uporabiti grafitna tesnila v skladu s točko 5.5.

6.5.1 Popravek bazne linije

Da bi se izognili dvigu bazne linije, uporabite eno od naslednjih štirih metod:

6.5.1.1 Kombinacija kolon

Uporabita se dve polnjeni koloni v kompenzacijskem načinu.

6.5.1.2 Popravek bazne linije s plinskim kromatografom

Dvigu bazne linije se lahko izognete tako, da posnamete kromatogram brez injiciranja raztopine maščobe in potem odštevate shranjeno bazno linijo.

6.5.1.3 Popravek bazne linije s programsko opremo (integratorjem)

Dvigu bazne linije se lahko izognete tako, da posnamete kromatogram brez injiciranja raztopine maščobe in potem odštevate shranjeno bazno linijo.

6.5.1.4 Popravek bazne linije z ustreznim kondicioniranjem

Z ustreznim kondicioniranjem kolone in približno 20 vbrizganji raztopine mlečne maščobe je povišanje bazne linije pri visokih temperaturah pogosto tako nizko, da popravki bazne linije niso potrebni.

6.5.2 Tehnika injiciranja

Da bi se izognili vplivom različnih pogojev in dosegli boljše kvantitativne rezultate pri trigliceridnih komponentah z visokim vreliščem, uporabite "vročo vbrizgalno tehniko". Pri tem siringo napolnite z raztopino maščobe, iglo siringe pa pred vbrizganjem približno 3 sekunde segrevajte v injektorski glavi. Nato vsebino siringe hitro vbrizgajte.

Opomba:

S to vbrizgalno tehniko se zmanjša tveganje frakcioniranja v injekciji ali v injekcijskem bloku. Neposrednega vbrizganja v zgornji, razširjeni segreti del kolone ne izvedete, ker se lahko fragmenti septuma, ki so se nabrali tu, in tudi kontaminacije zlahka odstranijo z rednim menjavanjem injektorskih vstavkov brez demontiranja kolone.

Nujno se je treba izogniti ukrivljenju konice igle, do katerega pride pri dotiku dna posode z vzorcem (čeprav je očesu težko viden), da ne bi poškodovali septuma.

+++++ TIFF +++++

6.5.3 Kondicioniranje polnjene kolone

Med koraki (a) do (c) vrh kolone ni priključen na detektor, s čimer se prepreči kontaminacija.

Kolone, polnjene v skladu s točko 6.2, se obdela, kakor sledi:

(a) 15 min 40 ml/min N2-pretok pri 50 °C;

(b) segrevanje z 1 K/min do 355 °C pri 10ml N2/min;

(d) dve vbrizganji po 1 μl raztopine kakavovega masla v skladu s točko 4.10 in zadevni temperaturni program;

(e) 20 vbrizganj po 0,5 raztopine mlečne maščobe, porazdeljenih na dva ali tri dni v skladu s točko 6.4.

Opomba:

Kakavovo maslo sestoji skoraj izključno iz C5O do C56 trigliceridov z visokim vreliščem. Vbrizganje kakavovega masla je namenjeno posebni predhodni obdelavi v tem dolgoverižnem obsegu. Pri C50 do C56 trigliceridih z visokim vreliščem se lahko deloma pojavijo odzivni faktorji do približno 1,20. Ponavadi je treba pri večkratnem vbrizganju raztopine mlečne maščobe pričakovati znižanje sprva visokih odzivnih faktorjev za C50 do C54. Pri trigliceridih z nizkim acil-c številom faktorji znašajo približno 1. Pripravita se 2 para kolon, polnjena v skladu s točko 6.2. Predhodno obdelani pari se rutinsko preverijo z analizo mlečne maščobe.

V nadaljnjem postopku se uporabi par z najboljšimi kvantitativnimi rezultati (odzivni faktorji skoraj 1). Kolone z odzivnimi faktorji >1,20 se ne uporabijo.

6.5.4 Umerjanje

Za umerjanje se odzivni faktorji ustreznih trigliceridov in tudi holesterola mlečne maščobe (standardizirane maščobe) določijo s pomočjo standardiziranih trigliceridov (najmanj nasičeni trigliceridi C24, C30, C36, C42, C48 in C54 in tudi holesterol; še bolje dodatno C50 in C52). Takojšnje odzivne faktorje je mogoče dobiti z matematično interpolacijo.

S standardizirano maščobo je treba opraviti dve do tri umeritve na dan. Če se pojavljajo skoraj enaki rezultati, se pri analizi vzorcev trigliceridov dosežejo dobro obnovljivi kvantitativni rezultati.

Standardizirana mlečna maščoba je pri temperaturi skladiščenja največ –18 °C obstojna nekaj mesecev, zato jo je mogoče uporabiti kot standard.

Opomba:

Odzivni faktor vsake sestavine se lahko določi z uporabo standardizirane maščobe s potrjeno trigliceridno sestavo, kot je CRM 519 (brezvodna mlečna maščoba), ki jo je mogoče dobiti pri Inštitutu za referenčne materiale in meritve iz Geela v Belgiji.

6.5.5 Temperaturni program, nosilni plin in drugi pogoji za analizo trigliceridov

Temperaturni program: začetna temperatura kolone 210 °C, pustite konstantno eno minuto, nato programirajte na 6 °C/min do 350 °C in pustite konstantno pet minut na končni temperaturi.

Temperatura detektorja in injektorja: 370 °C vsak.

Opomba:

Temperature detektorja, injektorja in pečice (začetna temperatura) je treba vzdrževati na konstantni ravni (tudi čez noč, med vikendi in prazniki).

Nosilni plin: dušik, hitrost pretoka 40 ml/min.

Opomba:

Če uporabljate 80-centimetrske kolone, mora biti pretok najmanj 75 ml/min N2. Pretok nosilnega plina je treba stalno vzdrževati (tudi čez noč, med vikendi in prazniki). Pretok nosilnega plina mora biti tako natančno nastavljen, da se C54 neodvisno od dolžine kolone eluira pri 341 °C.

Trajanje analize: 29,3 minute.

Prostornina vbrizganja: 0,5 μl.

Opomba:

Po vsakem vbrizganju je treba brizgalko večkrat sprati s čistim heptanom.

Pogoji FID: v skladu s točko 5.1.

Opomba:

Plamenski ionizacijski detektor se prižge ob začetku vsakega delovnega dne.

7. Integracija, ocena in nadzor pogojev merjenja

Trigliceridi z lihim acil-c številom (2n + 1) se vežejo s predhodnimi trigliceridi s sodim številom (2n). Manj obnovljiva nizka vsebnost C56 se ne upošteva. Preostali trigliceridi (območje vrhov) v kromatogramu, vključno s holesterolom (vrh blizu C24), se pomnožijo z zadevnimi odzivnimi faktorji standardne maščobe (zadnje umerjanje), vse skupaj pa se normira na 100. Poleg prostega holesterola se tako ocenijo trigliceridi C24, C26, C28, C30, C32, C34, C36, C38, C40, C42, C44, C46, C48, C50, C52 in C54. Rezultati so podani v masnih odstotkih (g/100 g).

Oceno vrhov kromatograma je treba opraviti z integratorjem, s katerim se lahko izriše bazna linija. Mogoča mora biti reintegracija z optimiziranimi integracijskimi parametri.

Na slikah 5 in 6 sta prikazana dva primera kromatogramov trigliceridov. Slika 5 prikazuje kromatogram, ki ga je mogoče dobro oceniti, medtem ko je na sliki 6 prikazana sporadična napaka v razponu od C50 do C54, pri čemer bazna linija v primerjavi s sliko 5 poteka napačno. Take tipične napake je mogoče z veliko gotovostjo odkriti z integratorjem, s katerim se izriše bazna linija.

+++++ TIFF +++++

Za nadzor pogojev merjenja se lahko uporabijo relativna standardna odstopanja (RSD: koeficient variacije × 100), podana v tabeli 1 za različne trigliceride. Odstopanja so bila izračunana na podlagi 19 zaporednih analiz iste mlečne maščobe.

Tabela 1

Relativna standardna odstopanja (RSD) vsebnosti trigliceridov (n = 19)

Triglicerid | RSD (%) |

C24 | 10,00 |

C26 | 2,69 |

C28 | 3,03 |

C30 | 1,76 |

C32 | 1,03 |

C34 | 0,79 |

C36 | 0,25 |

C38 | 0,42 |

C40 | 0,20 |

C42 | 0,26 |

C44 | 0,34 |

C46 | 0,37 |

C48 | 0,53 |

C50 | 0,38 |

C52 | 0,54 |

C54 | 0,60 |

Če so RSD bistveno višji od vrednosti v tabeli 1, kromatografski pogoji niso ustrezni in je treba preveriti septe ali hitrost pretoka nosilnega plina. Mogoče je tudi, da so se majhni delci sept nabrali na stekleni volni pri vhodu kolone ali pa je kolona zaradi obrabe, vplivov temperature itd. postala neprimerna za uporabo (glej sliko 3).

Opomba:

Vrednosti iz tabele 1 niso obvezne, ampak so samo v oporo za nadzor kakovosti. Če pa se dopustijo večje vrednosti RSD, je kljub temu treba upoštevati mejne vrednosti ponovljivosti in obnovljivosti, podane v točki 11.

8. Kvalitativno ugotavljanje tujih maščob

Za ugotavljanje tujih maščob so bile razvite trigliceridne enačbe (tabela 2) z mejami S (tabela 3), v katerih lahko S-vrednosti čiste mlečne maščobe nihajo. Če so te meje prekoračene, se lahko predvideva prisotnost tuje maščobe.

Najobčutljivejša enačba za odkrivanje dodatka svinjske masti je npr.

6,5125 · C26 + 1,2052 · C32 + 1,7336 · C34 + 1,7557 · C36 + 2,2325 · C42 + 2,8006 · C46 + 2,5432 · C52 + 0,9892 · C54 = S

Opomba:

Ob uporabi 755 različnih vzorcev mlečne maščobe je bil za vzorce mlečne maščobe s standardnim odstopanjem za vse S-vrednosti SD = 0,39897 ugotovljen 99-odstotni interval zaupanja S = 97,96 – 102,04.

Izhajajoč iz sestave trigliceridov vzorca neznane maščobe taka enačba omogoča brez uporabe računalnika preprost način preverjanja, ali vsota vsebnosti trigliceridov, navedenih tu z ustreznimi faktorji, izpade iz razpona 97,96 – 102,04, kar kaže, da imamo skoraj zagotovo opraviti z dodatkom tuje maščobe.

Tabela 2

vsebuje še druge trigliceridne enačbe za ugotavljanje različnih tujih maščob. Za dokazovanje sojinega olja, sončničnega olja, oljčnega olja, repičnega olja, lanenega olja, olja iz pšeničnih kalčkov, olja iz koruznih kalčkov, olja iz bombaža in hidrogeniranega ribjega olja, maščobe kokosovih orehov in palmovih jedrc in tudi za dokazovanje palmovega olja in govejega loja se lahko uporabi skupna enačba.

Ker je tudi sestava trigliceridov tujih maščob nagnjena k nihanjem, so bili uporabljeni do štirje različni, eksperimentalno izmerjeni podatki o trigliceridih tujih maščob. (Pri enakih vrstah tuje maščobe je bila upoštevana najneugodnejša mejna vrednost (glej sliko 4)).

Naslednja "skupna enačba" omogoča podobno dobre rezultate za vse tuje maščobe:

– 2,7575 · C26 + 6,4077 · C28 + 5,5437 · C30 – 15,3247 · C32 + 6,2600 · C34 + 8,0108 · C40 – 5,0336 · C42 + 0,6356 · C44 + 6,0171 · C46 = S

Izračuni za dokazovanje katere koli kombinacije tuje maščobe v mlečni maščobi so pokazali, da se kljub temu, da je s formulo za svinjsko mast iz tabele 2 meja za to tujo maščobo nizka, namreč 2,7 %, lahko druge maščobe, kot so kokosova maščoba, palmovo olje ali maščoba palmovih jedrc, z mejami detekcije 26,8, 12,5 ali 19,3 % za posamezno zvrst s to enačbo odkrijejo le, če so bile mlečni maščobi dodane izredno njihove visoke količine. To velja tudi za druge enačbe v tabeli 2.

Tabela 2

Trigliceridne enačbe za odkrivanje različnih tujih maščob v mlečni maščobi z navedbo standardnih odstopanj SD za S

Enačba za sojino olje, oljčno olje, repično olje, laneno olje, olje iz pšeničnih kalčkov, olje iz koruznih kalčkov, olje iz bombaža in ribje olje

2,0983 · C30 + 0,7288 · C34 + 0,6927 · C36 + 0,6353 · C38 + 3,7452 · C40 - 1,2929 · C42 + 1,3544 · C44 + 1,7013 · C46 + 2,5283 · C50 = S; SD = 0,38157

Enačba za maščobo kokosovih orehov in palmovih jedrc

3,7453 · C32 + 1,1134 · C36 + 1,3648 · C38 + 2,1544 · C42 + 0,4273 · C44 + 0,5809 · C46 + 1,1226 · C48 + 1,0306 · C50 + 0,9953 · C52 + 1,2396 · C54 = S; SD = 0,11323

Enačba za palmovo olje in goveji loj

3,6644 · C28 + 5,2297 · C30 - 12,5073 · C32 + 4,4285 · C34 - 0,2010 · C36 + 1,2791 · C38 + 6,7433 · C40 - 4,2714 · C42 + 6,3739 · C46 = S; SD = 0,81094

Enačba za svinjsko mast

6,5125 · C26 + 1,2052 · C32 + 1,7336 · C34 + 1,7557 · C36 + 2,2325 · C42 + 2,8006 · C46 + 2,5432 · C52 + 0,9892 · C54 = S; SD = 0,39897

Za preverjanje vzorca neznane maščobe je torej treba uporabiti vse enačbe, podane v tabeli 2, in "skupno" enačbo (2), če je vzorec verjetno mešanica mlečne maščobe in ene izmed 14 različnih tujih maščob ali kombinacija teh tujih maščob. Če se pri vstavitvi triglicerida vzorca maščobe za analizo dobi S-vrednost, ki ne spada v območje samo ene izmed petih enačb iz tabele 3, potem je vzorec zelo verjetno modificirana mlečna maščoba. Odkrivanje tuje maščobe v mlečni maščobi s pomočjo ene izmed 4 enačb iz tabele 2 ne omogoča sklepov o vrsti primesi tuje maščobe.

Tabela 3

S-meje za mlečne maščobe

Enačba za odkrivanje | S-razpon |

sojinega olja, sončničnega olja, oljčnega olja, repičnega olja, lanenega olja, olja iz pšeničnih kalčkov, olja iz koruznih kalčkov, olja iz bombaža in ribjega olja | 98,05 – 101,95 |

maščobe kokosovih orehov in palmovih jedrc | 99,42 – 100,58 |

palmovega olja in govejega loja | 95,90 – 104,10 |

svinjske masti | 97,96 – 102,04 |

skupna enačba | 95,68 – 104,32 |

V tabeli 4 so prikazane meje zaznavnosti različnih tujih maščob z 99-odstotno zanesljivostjo. V prvem stolpcu so navedene najnižje meje zaznavnosti za najboljše enačbe mlečne maščobe tabele 2. V drugem stolpcu so navedene meje zaznavnosti za skupno enačbo. Čeprav so meje nekoliko višje, je samo ta enačba potrebna za odkritje nekoliko višjih količin tujih maščob. Z vsemi enačbami se lahko izsledijo tudi kombinacije različnih tujih maščob. Razponi nihanj trigliceridov različnih tujih maščob ene vrste ne vplivajo bistveno na meje zaznavnosti.

Tabela 4

99-odstotne meje zaznavnosti za dodatke tuje maščobe mlečni maščobi v %

| Posamezna enačba | Skupna enačba |

Sojino olje | 2,1 | 4,4 |

Sončnično olje | 2,3 | 4,8 |

Oljčno olje | 2,4 | 4,7 |

Maščoba kokosovih orehov | 3,5 | 4,3 |

Palmovo olje | 4,4 | 4,7 |

Maščoba palmovih jedrc | 4,6 | 5,9 |

Repično olje | 2,0 | 4,4 |

Laneno olje | 2,0 | 4,0 |

Olje iz pšeničnih kalčkov | 2,7 | 6,4 |

Olje iz koruznih kalčkov | 2,2 | 4,5 |

Olje iz bombaža | 3,3 | 4,4 |

Svinjska mast | 2,7 | 4,7 |

Goveji loj | 5,2 | 5,4 |

Hidrogenirano ribje olje | 5,4 | 6,1 |

Opomba:

S–razponi se izračunajo tako, da se tuja maščoba predvidi samo, če so prekoračene meje posamezne enačbe (glej tabelo 4).

9. Kvantitativno določanje tuje maščobe

Da se dobijo kvantitativni podatki o koncentraciji tuje maščobe v vzorcu mlečne maščobe, se uporablja naslednja enačba

= 100 ·

100 - S

kjer je X količina neznane tuje maščobe ali mešanice tujih maščob v neznani mlečni maščobi. S se dobi iz dodatka neznane tuje maščobe, tako da se trigliceridi mešanice tuje maščobe/mlečne maščobe vstavijo v gornjo skupno trigliceridno enačbo. Če je mlečni maščobi dodana neznana tuja maščoba, se za SF izbere povprečna S-vrednost različnih tujih maščob v skupni enačbi; ta povprečna S-vrednost se dobi z vstavitvijo trigliceridnih podatkov čistih tujih maščob v to enačbo in z izračunom srednje vrednosti (SF = 7,46). Dobri kvantitativni rezultati glede dodatkov katere koli tuje maščobe se prav tako dobijo z uporabo enačbe za palmovo olje/goveji loj (tabela 2) in povprečje SF-vrednosti 10,57.

Pri znanih vrstah tuje maščobe je treba v zgornjo enačbo vstaviti naslednje SF-vrednosti in iz tabele 2 izbrati zadevno enačbo za tujo maščobo:

Tabela 5

SF-vrednosti različnih tujih maščob

Tuja maščoba | SF |

Sojino olje | 8,18 |

Sončnično olje | 9,43 |

Oljčno olje | 12,75 |

Maščoba kokosovih orehov | 118,13 |

Palmovo olje | 7,55 |

Olje iz palmovih jedrc | 112,32 |

Repično olje | 3,30 |

Laneno olje | 4,44 |

Olje iz pšeničnih kalčkov | 27,45 |

Olje iz koruznih kalčkov | 9,29 |

Olje iz bombaža | 41,18 |

Svinjska mast | 177,55 |

Goveji loj | 17,56 |

Ribje olje | 64,12 |

10. Namen uporabe metode ugotavljanja

Opisana metoda se nanaša na večino vzorcev mleka in temelji na reprezentativnosti vzorcev mlečne maščobe.

Zelo specifično ugotavljanje bi bilo mogoče, če bi za reprezentativno število mlečnih maščob za različne države izpeljali enačbe, kot so opisane zgoraj.

Posebej ustrezne možnosti ugotavljanja bi bilo mogoče doseči, če bi v posameznih državah izdelali take enačbe reprezentativnega števila mlečnih maščob. Če se uporabijo trigliceridne formule iz tabele 2, niso potrebni zapleteni računalniški programi, in se na novo določijo faktorji s pomočjo metode najmanjših kvadratov.

Z uporabo S-razponov iz tabele 3 so enačbe v posebnih prehranjevalnih pogojih, kot na primer pri nezadostnem hranjenju ali hranjenju krav s kvasovkami ali kalcijevimi preparati (op. to so preparati, ki povzročijo umiljenje maščob), na splošno uporabne. Samo v primerih izjemnih prehranjevalnih pogojev (npr. visok privzem čistih krmnih olj, visok odmerek kalcijevih preparatov skupaj s krmno maščobo) enačbe delno nakazujejo modificirano mlečno maščobo.

Opomba:

Frakcionirane mlečne maščobe na splošno prepoznate kot nemodificirano mlečno maščobo, če predpostavite, da je modifikacija le, kadar so meje presežene. Samo pri frakcioniranih mlečnih maščobah z nenavadno sestavo mlečne maščobe, kot je na primer pri trdi frakciji, dobljeni pri frakcioniranju s fizičnimi metodami pri visokih temperaturah približno 30 °C z nizkimi izkoristki nekaj odstotkov ali pri frakcioniranju s superkritičnim CO2, enačbe nakazujejo modifikacijo.

Frakcioniranje mlečne maščobe je mogoče odkriti tudi z drugimi postopki, kot je na primer diferenčna scanning kalorimetrija.

11. Natančnost metode

Ugotovljena z uporabo mlečne maščobe na podlagi enačbe iz tabele 2 in S-razponov iz tabele 3.

11.1 Ponovljivost

Razlika S-vrednosti dveh raziskav, ki ju opravi en operater v najkrajšem izvedljivem času po istem postopku in z enakim vzorčnim materialom ter pod enakimi pogoji (ista oseba, isti instrumenti/naprava, isti laboratorij):

Tabela 6

Meje ponovljivosti (r) za različne enačbe

Enačba za odkrivanje | r |

sojinega olja, sončničnega olja, oljčnega olja, repičnega olja, lanenega olja, olja iz pšeničnih kalčkov, olja iz koruznih kalčkov, olja iz bombaža in ribjega olje | 0,67 |

maščobe kokosovih orehov in palmovih jedrc | 0,12 |

palmovega olja in govejega loja | 1,20 |

svinjske masti | 0,58 |

skupna enačba | 1,49 |

11.2 Obnovljivost

Razlika S-vrednosti dveh raziskav, ki ju opravita dva operaterja v različnih laboratorijih po istem postopku z istovetnim vzorčnim materialom pod različnimi pogoji (druga oseba, različni instrumenti) ob različnem času.

Tabela 7

Meje obnovljivosti (R) za različne enačbe

Enačba za odkrivanje | R |

sojinega olja, sončničnega olja, oljčnega olja,repičnega olja, lanenega olja, olja iz pšeničnih kalčkov, olja iz koruznih kalčkov,olja iz bombaža in ribjega olja | 1,08 |

maščobe kokosovih orehov in palmovih jedrc | 0,40 |

palmovega olja in govejega loja | 1,81 |

svinjske masti | 0,60 |

skupne formule | 2,07 |

11.3 Kritična razlika

Z mejami ponovljivosti (r) in mejami obnovljivosti (R) je mogoče izračunati kritične razlike za vse S-razpone v tabeli 3 (dvojne analize). Zadevne vrednosti so podane v tabeli 8.

Tabela 8

Kritične razlike za vse trigliceridne enačbe

Enačba za odkrivanje | razpon |

sojinega olja, sončničnega olja, oljčnega olja, repičnega olja, lanenega olja, olja iz pšeničnih kalčkov, olja iz koruznih kalčkov, olja iz bombaža in ribjega olje | 97,43 – 102,57 |

maščobe kokosovih orehov in palmovih jedrc | 99,14 – 100,86 |

palmovega olja in govejega loja | 94,91 – 105,09 |

svinjske masti | 97,65 – 102,35 |

skupna formula | 94,58 – 105,42 |

11.4 Sprejemljivost rezultatov

Vse umerjene, na dve decimalki zaokrožene vsebnosti trigliceridov C24, C26, C28 do C54 in tudi holesterol je treba natančno normirati na 100.

Rezultati zaporednih (dvojnih) analiz se uporabijo za kontrolo ponovljivosti. Če absolutna razlika dveh S-rezultatov za vseh pet trigliceridnih enačb ne prekorači mej ponovljivosti r iz tabele 6, potem so zahteve ponovljivosti izpolnjene.

Za nadzor optimalnih pogojev plinske kromatografije in še zlasti kakovosti kolone je treba zagotoviti, da v 10 ponovitvah razlika med največjimi in najmanjšimi S-vrednostmi ne prekorači razpona x !!! error character !!! Β· r, pri čemer je x = 1,58 (za 10 potekov glej literaturo (16)) in r meja ponovljivosti za različne enačbe v tabeli 6.

12. Citirani standardi

DIN 10 336:1994 | Nachweis und bestimmung von Fremdfetten in Milchfett anhand einer gaschromatographischen Triglyceridanalyse |

Norma IDF 1C:1987 | Milk. Determination of Fat Content - Röse-Gottlieb Gravimetric Method |

Norma IDF 16C: 1987 | Cream. Determination of Fat Content - Röse-Gottlieb Gravimetric Method |

Norma IDF 116A:1987 | Milk-Based Edible Ices and Ice Mixes. Determination of Fat Content - Röse-Gottlieb Gravimetric Method |

IDF Standard 22B:1987 | Skimmed Milk, Whey & Buttermilk. Determination of Fat Content - Röse-Gottlieb Gravimetric Method |

13. Reference

1. Komise Evropských společenství: Detection of foreign fats in milk fat by means of gas chromatographic triglyceride analysis; Dok. č. VI/5202/90-EN, VI/2645/91.

2. Komise Evropských společenství: Control of butter fat purity of 100 different samples of different feeding periods from 11 EEC countries;. Dok. 4. VI/4577/93.

3. Komise Evropských společenství: Consideration of results from the first, second, third, fourth, fifth and sixth EEC collaborative trial: Determination of triglycerides in milk fat; Dok. č. VI/2644/91, VI/8.11.91, VI/1919/92, VI/3842/92, VI5317/92? VI/4604/93.

4. Timms, R.E.: Detection and quantification of non-milk fat in mixtures of milk and non-milk fats. Dairy Research 47, 295-303 (1980).

5. Precht, D., Heine, K.: Nachweis von modifiziertem Milchfett mit der Triglyceridanalyse. 2. Fremdfettnachweis im Milchfett mit Hilfe von Triglyceridkombinationen, 41406-410 (1986).

6. Luf, W., Stock, A., Brandl, E.: Zum Nachweis von Fremdfett in Milchfett über die triglyceridanalyse, Österr. Milchwirtsch. Wissensch. Beilage 5, 42 29-35 (1987).

7. Precht, D.: Bestimmung von pflanzlichen Fetten oder tierische Depotfetten in Milchfett, Kieler Milchwirtsch. Forschungber. 42143-157 (1989).

8. Precht, D.: Schnelle Extraktion von Milchfett., Kieler Milchwirtsch. Forschungber. 42119-128 (1990).

9. Precht, D.: Schnelle gaschromatographische Triglyceridanalyse von Milchfett. Kieler Milchwirtsch. Forschungber. 42139-154 (1900).

10. Precht, D.: Control of milk fat purity by gas chromatographic triglyceride analysis. Kieler Milchwirtsch. Forschungber. 43 (3) 219-242 (1991.

11. Precht, D.: Detection of adulterated milk fat by fatty acid and triglyceride analysis. Fat Sci. Technol. 93538-544 (1991).

12. Precht, D: Detection for foreign fat in milk fat. I. Qualitative detection by triacylglycerol formulae. II Quantitative evaluation of foreign fat mixtures. Z. Lebensm. Unters. Forsch. 194 1-8, 107-114 (1992).

13. Precht D.: Gas chromatography of triacylglycerols and other lipids on packed columns in CRC Handbook of Chromatography: Analysis of lipids, p. 123-138, Ed. K.D. Mukherjee, N. Weber, J. Sherma, CRC Press, Boca Raton (1993).

14. Precht, D., Molkentin, J.: Quantitative triglyceride analysis using short capillary columns. Chrompack News 4 16-17 (1993).

15. Molkentin, J., Precht, D.: Comparison of packed and capillary columns for quantitative gas chromatography of triglycerides in milk fat. Chromatographia 39 (5/6) 265-270 (1994).

16. Stange, K.: Angewandte Statistik, Erster Teil, Eindimensionale Probleme. Springer Verlag, berlin, P. 378 (1970).

[1] Primerne metode so bile že opisane, glej D. Precht and J. Molkentin: Kvantitativna trigliceridna analiza z uporabo kratkih kapilarnih kolon, Chrompack News 4, 16–17 (1993).

[2] Ustrezni proizvodi so na voljo na trgu.

[3] Blagovne znamke, kot so npr. Extrelut, GasChromQ, Chrompack, so primeri ustreznih proizvodov, ki so na voljo v stroki. Ta podatek je namenjen samo prikazu preproste uporabe standarda pri uporabniku in ne predstavlja obveznega izdelka. Oznaka za zrno je bila prenesena na enoto SI μm v skladu z BS 410:1988 "Specifikacija britanskega standarda za preskusna sita".

[4] Glej opombo 3 na strani 86.

--------------------------------------------------

PRILOGA XXVI

SEZNAM UREDB, NAVEDENIH V PRVI UVODNI IZJAVI

- Uredba Komisije (EGS) št. 1216/68 z dne 9. avgusta 1968 o določitvi metode za določanje vsebnosti laktoze v krmnih mešanicah, uvoženih iz držav nečlanic [1], kakor je bila nazadnje spremenjena z Uredbo Komisije (EGS) št. 222/88 z dne 22. decembra 1987 o spremembi nekaterih ukrepov o uporabi skupne ureditve trga za mleko in mlečne proizvode po uvedbi kombinirane nomenklature [2];

- Uredba Komisije (EGS) št. 3942/92 z dne 22. decembra 1992 o določitvi referenčne metode za ugotavljanje sitosterola in stigmasterola v mlečni maščobi [3], kakor je bila nazadnje spremenjena z Uredbo Komisije (ES) št. 175/1999 o spremembi uredb (EGS) št. 3942/92, (ES) št. 86/94, (ES) št. 1082/96 in (ES) št. 1459/98 o določitvi referenčnih metod za ugotavljanje nekaterih indikatorjev v maslu, mlečni maščobi in smetani [4];

- Uredba Komisije (ES) št. 86/94 z dne 19. januarja 1994 o določitvi referenčne metode za ugotavljanje sitosterola in stigmasterola v maslu [5], kakor je bila spremenjena z Uredbo (ES) št. 175/1999;

- Uredba Komisije (ES) št. 2721/95 z dne 24. novembra 1995 o določitvi pravil za uporabo referenčnih in rutinskih analitskih metod in oceno kakovosti mleka in mlečnih proizvodov po skupni ureditvi trga [6];

- Uredba Komisije (ES) št. 1080/96 z dne 14. junija 1996 o določitvi referenčne metode za ugotavljanje koliformnih bakterij v maslu, posnetem mleku v prahu in kazeinih/kazeinatih [7];

- Uredba Komisije (ES) št. 1081/96 z dne 14. junija 1996 o določitvi referenčne metode za ugotavljanje kravjega mleka in kazeinatov v sirih iz ovčjega mleka, kozjega mleka in bivoljega mleka ali mešanic iz ovčjega, kozjega in bivoljega mleka in o razveljavitvi Uredbe (EGS) št. 690/92 [8];

- Uredba Komisije (ES) št. 1082/96 z dne 14. junija 1996 o določitvi referenčne metode za določanje etilnega estra beta-apo-8’-karotenske kisline v zgoščenem maslu in maslu [9], kakor je bila nazadnje spremenjena z Uredbo (ES) št. 175/1999;

- Uredba Komisije (ES) št. 1854/96 z dne 26. septembra 1996 o določitvi seznama referenčnih metod, ki se uporabljajo za analizo in oceno kakovosti mleka in mlečnih proizvodov po skupni ureditvi trga [10], kakor je bila spremenjena z Uredbo (ES) št. 881/1999 [11];

- Uredba Komisije (ES) št. 880/98 z dne 24. aprila 1998 o določitvi referenčnih metod za določanje vsebnosti vode, trdnih snovi brez maščobe in maščobe v maslu [12];

- Uredba Komisije (ES) št. 1459/98 z dne 8. julija 1998 o določitvi referenčne metode za odkrivanje vanilina v zgoščenem maslu, maslu ali smetani [13], kakor je bila spremenjena z Uredbo (ES) št. 175/1999.

[1] UL L 198, 10.8.1968, str. 13.

[2] UL L 28, 1.2.1988, str. 1.

[3] UL L 399, 31.12.1992, str. 29.

[4] UL L 20, 27.1.1999, str. 22.

[5] UL L 17, 20.1.1994, str. 7.

[6] UL L 283, 25.11.1995, str. 7.

[7] UL L 142, 15.6.1996, str. 13.

[8] UL L 142, 15.6.1996, str. 15.

[9] UL L 142,15.6.1996, str. 26.

[10] UL L 246, 27.9.1996, str. 5.

[11] UL L 111, 29.4.1999, str. 24.

[12] UL L 124, 25.4.1998, str. 16.

[13] UL L 193, 9.7.1998, str. 16.

--------------------------------------------------