32001R0213

Komission asetus (EY) N:o 213/2001,

annettu 9 päivänä tammikuuta 2001,

asetuksen (EY) N:o 1255/1999 soveltamista koskevista yksityiskohtaisista säännöistä maidon ja maitotuotteiden analysoimisen ja laadun arvioimisen osalta sekä asetusten (EY) N:o 2771/1999 ja (EY) N:o 2799/1999 muuttamisesta

EUROOPAN YHTEISÖJEN KOMISSIO, joka

ottaa huomioon Euroopan yhteisön perustamissopimuksen,

ottaa huomioon maito- ja maitotuotealan yhteisestä markkinajärjestelystä 17 päivänä toukokuuta 1999 annetun neuvoston asetuksen (EY) N:o 1255/1999(1) ja erityisesti sen 10 ja 15 artiklan, 26 artiklan 3 kohdan, 29 artiklan 1 kohdan ja 31 artiklan 14 kohdan,

sekä katsoo seuraavaa:

(1) Komission asetuksissa (ETY) N:o 1216/68, (ETY) N:o 3942/92, (EY) N:o 86/94, (EY) N:o 2721/95, (EY) N:o 1080/96, (EY) N:o 1081/96, (EY) N:o 1082/96, (EY) N:o 1854/96, (EY) N:o 880/98 ja (EY) N:o 1459/98, joiden täydelliset lähdeviitteet esitetään tämän asetuksen liitteessä XXVI, vahvistetaan viite- ja rutiinimenetelmät maidon ja maitotuotteiden analysoimiseksi ja laadun arvioimiseksi samoin kuin mainittujen menetelmien soveltamisala ja soveltamista koskevat säännöt. Selkeyden vuoksi edellä mainitut asetukset olisi muotoiltava uudelleen yhdistämällä ne yhdeksi tekstiksi, jotta alan toimijat saisivat käyttöönsä yhden ainoan kokoelman mainituista menetelmistä ja niiden soveltamista koskevista säännöistä. Samasta syystä olisi muutettava neuvoston asetuksen (EY) N:o 1255/1999 soveltamista koskevista yksityiskohtaisista säännöistä voin ja kerman markkinoiden interventiotoimenpiteiden osalta 16 päivänä joulukuuta 1999 annettu komission asetus (EY) N:o 2771/1999(2) ja asetuksen (EY) N:o 1255/1999 soveltamista koskevista yksityiskohtaisista säännöistä eläinten rehuksi tarkoitetun rasvattoman maidon ja rasvattoman maitojauheen tuen ja mainitun rasvattoman maitojauheen myynnin osalta 17 päivänä joulukuuta 1999 annettu komission asetus (EY) N:o 2799/1999(3), jotta tähän asetukseen saataisiin sisällytettyä mainittujen asetusten määritysmenetelmiä koskevat liitteet.

(2) Asetuksessa (EY) N:o 1255/1999 säädettyjen järjestelmien yhteydessä maidon ja maitotuotteiden koostumuksesta ja laadullisista ominaisuuksista vahvistetut säännökset on tarkastettava sen varmistamiseksi, että kyseiset säännökset noudattavat näitä vaatimuksia tunnollisesti.

(3) Usein edellytetään, että näissä tarkastuksissa käytettävät vertailumenetelmät, joita kansainväliset järjestöt saattavat ajan tasalle säännöllisesti, ovat sellaisten järjestöjen kuin CEN:in, IDF:n, ISO:n ja AOAC Internationalin julkaisemia. Tietyissä tapauksissa on otettu käyttöön yhteisön vertailumenetelmä. Toisissa tapauksissa yhteisön lainsäädännössä ei ole täsmennetty vertailumenetelmää. Vertailumenetelmien soveltamisen yhdenmukaisuuden varmistamiseksi olisi laadittava vuosittain luettelo vertailumenetelmistä ja täsmennettävä, että on käytettävä menetelmää, joka mainitaan kyseisessä luettelossa.

(4) Rutiinimenetelmien soveltamista ei pidä kieltää. Tästä syystä niiden käyttöedellytykset olisi täsmennettävä.

(5) Analyysien tulosten arviointia koskevan yhdenmukaisen käytännön luomiseksi olisi myös vahvistettava yhteiset menetelmät. Sama koskee kyseisten tuotteiden aistinvaraista arviointia ja kiistanalaisten tulosten uudelleentarkastelua.

(6) Tietyille analyyseille ei ole vielä olemassa kansainvälisesti hyväksyttyjä validoituja vertailumenetelmiä. Tästä syystä ei ole saatavilla tietoja eri laboratorioiden analyysien tulosten välisestä vaihtelusta. Näin ollen yhteisössä olisi otettava käyttöön menetelmiä, jotka on validoitu kansainvälisten sääntöjen mukaisesti ja joita sovelletaan vertailumenetelminä.

(7) Voin myynnistä alennettuun hintaan sekä konditoriatuotteiden, jäätelöiden ja muiden elintarvikkeiden valmistukseen tarkoitetulle kermalle, voille ja voiöljylle myönnettävästä tuesta 15 päivänä joulukuuta 1997 annetussa komission asetuksessa (EY) N:o 2571/97(4), sellaisena kuin se on viimeksi muutettuna asetuksella (EY) N:o 635/2000(5), säädetään merkkiaineiden lisäämisestä kermaan, voihin ja voiöljyyn tietyissä olosuhteissa sen varmistamiseksi, että kyseisiä tuotteita käytetään lopputuotteisiin oikealla tavalla. Järjestelmän moitteettoman toiminnan ja siihen osallistuvien toimijoiden yhtäläisen kohtelun varmistamiseksi olisi mahdollisuuksien mukaan otettava käyttöön tiettyjen merkkiaineiden määrittämistä koskevat yhteiset menetelmät.

(8) Voiöljynä suoraan kulutukseen tarkoitetun interventiovoin myynnistä alennettuun hintaan 11 päivänä marraskuuta 1985 annetun komission asetuksen (ETY) N:o 3143/85(6), sellaisena kuin se on viimeksi muutettuna asetuksella (EY) N:o 101/1999(7), ja yhteisössä suoraan kulutukseen tarkoitetulle voiöljylle tarjouskilpailulla myönnettävästä tuesta 20 päivänä helmikuuta 1990 annetun komission asetuksen (ETY) N:o 429/90(8), sellaisena kuin se on viimeksi muutettuna asetuksella (EY) N:o 124/1999(9) ja asetuksella (EY) N:o 2571/97, mukaisesti voiöljy on merkittävä valvonnanalaisena. Voiöljyn merkitsemistä koskevien vaatimusten tiukka noudattaminen on välttämätöntä petosten estämiseksi. Näin ollen olisi määriteltävä yhteinen menetelmä näiden merkkianeiden toteamiseksi.

(9) Uuhen maidosta valmistetun juuston yksityiselle varastoinnille voidaan myöntää tukea asetuksen (EY) N:o 1255/1999 9 artiklan nojalla. Samoille tuotteille voidaan myöntää erityistukea mainitun asetuksen 31 artiklan nojalla. Uuhen-, vuohen- tai puhvelinmaidosta taikka uuhen-, vuohen- ja puhvelinmaidon seoksista valmistettuja juustoja voidaan tuoda yhteisöön tietyistä kolmansista maista suosituimmuusjärjestelyjen mukaisesti. Edellä tarkoitettujen säännösten vuoksi on tarpeen varmistaa asianmukaisilla tarkastuksilla, etteivät kyseiset tuotteet sisällä lehmänmaitoa. Näin ollen olisi vahvistettava yhteisön vertailumenetelmä lehmänmaidon toteamiseksi, sanotun kuitenkaan rajoittamatta rutiinimenetelmien käyttöä, jos ne ovat tiettyjen perusteiden mukaisia.

(10) Kaseiinin ja kaseinaattien valmistukseen käytettävän rasvattoman maidon tuen myöntämisestä 10 päivänä lokakuuta 1990 annetussa komission asetuksessa (ETY) N:o 2921/90(10), sellaisena kuin se on viimeksi muutettuna asetuksella (EY) N:o 2654/1999(11), säädetään, että koliformien esiintyminen on tutkittava. Koliformien toteamiseksi maidossa ja maitotuotteissa käytetty kansainvälisesti hyväksytty vertailumenetelmä on kansainvälisen IDF-standardin 73A:1985 mukainen. Sitä voidaan kuitenkin soveltaa ainoastaan muunnetussa muodossa koliformien toteamiseksi tietyssä tuotemäärässä. Näin ollen olisi vahvistettava edellä mainittuun standardiin perustuva yhteisön vertailumenetelmä koliformien havaitsemiseksi.

(11) Tariffi- ja tilastonimikkeistöstä ja yhteisestä tullitariffista 23 päivänä heinäkuuta 1987 annetussa neuvoston asetuksessa (ETY) N:o 2658/87(12), sellaisena kuin se on viimeksi muutettuna asetuksella (EY) N:o 254/2000(13), esitellään nimikkeeseen 2309 kuuluvien rehuseosten tullit niiden maitotuotepitoisuuden perusteella. Kyseisten säännösten yhtenäisen soveltamisen varmistamiseksi olisi määriteltävä kaikissa jäsenvaltioissa pakollisesti sovellettava laktoosipitoisuuden määritysmenetelmä. Tähän tarkoitukseen olisi valittava jokin yleisesti tunnettu menetelmä.

(12) Asetuksessa (EY) N:o 1255/1999 säädetään, että interventioon tarkoitetun voin ja rasvattoman maitojauheen tai eläinten ruokinnassa käytetyn rasvattoman maitojauheen on vastattava tiettyjä laatuvaatimuksia. Näin ollen olisi vahvistettava vertailumenetelmät mainittujen vaatimusten noudattamisen varmistamiseksi.

(13) Joidenkin tällä asetuksella ensimmäistä kertaa käyttöön otettujen menetelmien toteuttaminen edellyttää sopeutumisaikaa. Niiden soveltamista olisi näin ollen lykättävä.

(14) Maidon ja maitotuotteiden hallintokomitea ei ole antanut lausuntoa puheenjohtajansa asettamassa määräajassa,

ON ANTANUT TÄMÄN ASETUKSEN:

I LUKU

YLEISET SÄÄNNÖKSET

1 artikla

Tarkoitus ja soveltamisala

Tässä asetuksessa vahvistetaan asetuksella (EY) N:o 1255/1999 perustetun maidon ja maitotuotteiden yhteisen markkinajärjestelyn mukaisiin järjestelmiin kuuluvien maidon ja maitotuotteiden kemiallisten, fysikaalisten ja mikrobiologisten analyysimenetelmien samoin kuin aistinvaraisen arvioinnin soveltamista koskevat säännöt sekä jotkin näistä menetelmistä.

2 artikla

Luettelo menetelmistä

1. Liitteessä I vahvistetaan luettelo 1 artiklassa tarkoitettuihin analyyseihin sovellettavista vertailumenetelmistä.

2. Komissio saattaa mainitun luettelon ajan tasalle vähintään kerran vuodessa asetuksen (EY) N:o 1255/1999 42 artiklassa säädettyä menettelyä noudattaen.

3 artikla

Rutiinimenetelmät

Rutiinimenetelmiä voidaan käyttää yhteisön lainsäädännössä vaadittuihin analyyseihin, jos ne on huolellisesti kalibroitu ja säännöllisesti tarkastettu vertailumenetelmän mukaisesti.

Liitteessä II kuvattuja menetelmiä voidaan soveltaa sellaisten rutiinimenetelmillä saatujen tulosten tarkastamiseen, jotka ovat lähellä kyseisissä asetuksissa täsmennettyjä raja-arvoja.

Jos asiasta on erimielisyyttä, vertailumenetelmällä saadut tulokset ovat ratkaisevia.

4 artikla

Vertailumenetelmien validointi

1. Vertailumenetelmä on validoitu, jos se vastaa toistettavuutta ja uusittavuutta koskevia vaatimuksia varten ennalta vahvistettuja tarkkuusperusteita.

2. Jos kyseisissä asetuksissa säädettyä vertailumenetelmää ei ole validoitu, jäsenvaltioiden on vahvistettava väliaikaiset uusittavuutta koskevat vaatimukset.

Vaatimustenmukaiset raja-arvot asetetaan liitteessä III olevassa b kohdassa määriteltyä menettelyä noudattaen. Jäsenvaltiot voivat kuitenkin käyttää jotain vastaavaa menettelyä kymmenen kuukauden ajan tämän asetuksen voimaantulosta.

Raja-arvon noudattaminen tarkastetaan vähintään kerran vuodessa.

3. Jos validoiduilla vertailumenetelmillä tai väliaikaisia tarkkuusarvoja soveltavilla menetelmillä saadut tulokset ylittävät raja-arvon, sovelletaan liitteessä IV kuvattua analyysien tulosten arviointimenettelyä raja-arvon kriittisen eron määrittelemiseksi.

5 artikla

Analyysien tulosten hyväksyttävyys

1. Analyysit tehdään liitteessä V olevassa a kohdassa kuvattua sisäistä laadunvalvontamenettelyä tai vastaavaa menettelyä noudattavissa laboratorioissa.

Laboratoriossa on oltava saatavilla yksityiskohtainen kuvaus sovellettavasta menettelystä.

2. Laboratoriot vahvistavat tarkkuutta koskevat sisäiset raja-arvonsa kaikkien käytössä olevien menetelmien osalta noudattaen

a) liitteessä V olevassa b kohdassa määriteltyä menetelmää tai

b) julkaistua validoitua menetelmää, jolle on esitetty toistettavuutta koskeva raja-arvo.

Uusittavuutta koskevan raja-arvon noudattaminen on tarkastettava vähintään kerran vuodessa liitteessä III olevassa a kohdassa määriteltyä menetelmää noudattaen.

Toista alakohtaa ei sovelleta, jos laboratorio on osallistunut pätevyyskokeeseen vuoden aikana.

3. Analyysin tuloksista tehdyssä laboratoriokertomuksessa on oltava riittävästi tietoja, jotta tuloksia voidaan arvioida liitteiden IV ja VIII mukaisesti.

4. Analyysin tuloksia pidetään hyväksyttävinä, jos ne on saatu 1 kohdassa tarkoitetussa sisäisessä laadunvalvontamenettelyssä kuvattujen hyväksyttävyysperusteiden ja 2 kohdassa tarkoitettujen tarkkuutta koskevien sisäisten raja-arvojen mukaisesti.

6 artikla

Aistinvarainen arviointi

1. Voin osalta liitteessä VI olevia menetelmiä sovelletaan arvioijien suorituksen ja tulosten luotettavuuden tarkastukseen. Liitteessä VII kuvattua menetelmään sovelletaan aistinvaraisen arvioinnin vertailumenetelmänä.

2. Maidon ja muiden maitotuotteiden kuin voin osalta jäsenvaltioiden on käytettävä aistinvaraisen arvioinnin vertailumenetelmänä IDF-standardia 99C/1997 tai muita vastaavia menetelmiä, jotka niiden on annettava tiedoksi komissiolle.

Liitteessä VI olevia menetelmiä voidaan soveltaa arvioijien suorituksen sekä tulosten luotettavuuden tarkastukseen.

7 artikla

Näytteenotto ja analyysien tulosten kiistäminen

1. Yhteisön lainsäädännössä säädettyjen analyysien tekemiseksi on otettava kaksoisnäytteitä.

2. Liitteessä VIII määriteltyä menettelyä sovelletaan, jos toimija ei hyväksy analyysin tuloksia.

II LUKU

MÄÄRITYSMENETELMÄT

8 artikla

Voin vesi-/kuiva-aine-/rasvapitoisuus

1. Liitteessä IX kuvattua määritysmenetelmää sovelletaan vertailumenetelmänä määritettäessä voin vesipitoisuutta.

2. Liitteessä X kuvattua määritysmenetelmää sovelletaan vertailumenetelmänä määritettäessä voin rasvattoman kuiva-aineen pitoisuutta.

3. Liitteessä XI kuvattua määritysmenetelmää sovelletaan vertailumenetelmänä määritettäessä voin rasvapitoisuutta.

9 artikla

Merkkiaineet

1. Liitteessä XII kuvattua määritysmenetelmää sovelletaan vertailumenetelmänä määritettäessä voiöljyn, voin tai kerman vanilliinipitoisuutta.

2. Liitteessä XIII kuvattua määritysmenetelmää sovelletaan vertailumenetelmänä määritettäessä voiöljyn tai voin beeta-apo-8'-karoteenihapon etyyliesteripitoisuutta.

3. Liitteessä XIV kuvattua määritysmenetelmää sovelletaan vertailumenetelmänä määritettäessä voin ja voiöljyn stigmasteroli- tai beeta-sitosterolipitoisuutta.

4. Voiöljy, voi tai kerma on merkitty asianmukaisen yhteisön lainsäädännön mukaisesti, jos saadut tulokset vastaavat liitteessä 8 olevan 1, 2 ja 3 kohdan vaatimuksia.

10 artikla

Lehmänmaidon kaseiinin toteaminen

1. Liitteessä XV olevaa vertailumenetelmää sovelletaan sen varmistamiseksi, ettei juusto, joka on valmistettu yksinomaan uuhen-, vuohen- tai puhvelinmaidosta taikka uuhen-, vuohen- ja puhvelinmaidon seoksista, sisällä lehmänmaidon kaseiinia.

Lehmänmaidon kaseiinia katsotaan esiintyvän, jos analysoitavan näytteen lehmänmaidon kaseiinipitoisuus on yhtä suuri tai suurempi kuin liitteessä XV kuvatun 1 prosenttia lehmänmaitoa sisältävän standardinäytteen pitoisuus.

2. Lehmänmaidon kaseiinin toteamiseksi edellä 1 kohdassa tarkoitetuista juustoista voidaan käyttää rutiinimenetelmiä seuraavin edellytyksin:

a) toteamisrajan on oltava enintään 0,5 prosenttia,

b) vääriä positiivisia tuloksia ei saa esiintyä,

c) lehmänmaidon kaseiinin on oltava havaittavissa vaaditulla herkkyydellä pitkienkin kypsyttämisjaksojen jälkeen, kuten voi tapahtua tavanomaisissa kaupallisissa olosuhteissa.

Jos b alakohdassa säädettyä vaatimusta ei voida täyttää, kaikki näytteet, joista on saatu positiivinen tulos, on analysoitava vertailumenetelmää käyttäen.

Jos c alakohdassa säädetty vaatimus ei täyty jonkin 1 artiklassa tarkoitetun juuston osalta, kyseinen juusto on analysoitava vertailumenetelmää käyttäen.

11 artikla

Koliformien toteaminen

1. Liitteessä XVI kuvattua vertailumenetelmää sovelletaan koliformien havaitsemiseksi voissa, rasvattomassa maitojauheessa, kaseiinissa ja kaseinaateissa.

2. Koliformien havaitsemiseen voidaan käyttää rutiinimenetelmiä, jos saadut tulokset vastaavat mainitussa liitteessä kuvatun vertailumenetelmän avulla saatuja tuloksia. Rutiinimenetelmillä on erityisesti oltava riittävä toteamisraja. Vääriä negatiivisia tuloksia ei saa esiintyä. Jos väärien positiivisten tulosten esiintymistä ei voida estää, kaikki positiiviset tulokset on vahvistettava vertailumenetelmän avulla.

12 artikla

Laktoosipitoisuus

Yhdistetyn nimikkeistön nimikkeeseen 2309 kuuluvien tuotteiden laktoosipitoisuuden määritysmenetelmä kuvataan liitteessä XVII.

13 artikla

Herajuoksutteen toteaminen

1. Liitteessä XVIII kuvataan menetelmä herajuoksutteen toteamiseksi julkiseen varastointiin tarkoitetusta rasvattomasta maitojauheesta.

2. Liitteessä XIX kuvataan menetelmä herajuoksutteen toteamiseksi rasvattomasta maitojauheesta ja rehun esiseoksista.

14 artikla

Kirnupiimän toteaminen

Liitteessä XX kuvataan menetelmä kirnupiimän toteamiseksi rasvattomasta maitojauheesta.

15 artikla

Mikrobien torjunta-aineiden jäämät

Liitteessä XXI kuvataan menetelmä antibiootti- ja sulfonamidi-dapsonijäämien toteamiseksi rasvattomasta maitojauheesta.

16 artikla

Rasvattoman maitojauheen pitoisuus

Liitteessä XXII kuvataan menetelmän rasvattoman maitojauheen pitoisuuden toteamiseksi rehuseoksista.

17 artikla

Tärkkelyksen toteaminen

Liitteessä XXIII kuvataan menetelmä tärkkelyksen toteamiseksi rasvattomasta maitojauheesta, denaturoidusta maitojauheesta ja rehuseoksista.

18 artikla

Happaman kirnupiimäjauheen kosteuspitoisuus

Liitteessä XXIV kuvataan menetelmä happaman kirnupiimäjauheen kosteuspitoisuuden toteamiseksi eläinten rehusta.

19 artikla

Vieraiden rasvojen toteaminen

Liitteessä XXV kuvataan menetelmä vieraiden rasvojen määrittämiseksi maitorasvasta.

III LUKU

LOPPUSÄÄNNÖKSET

20 artikla

Asetuksen (EY) N:o 2771/1999 muutokset

Muutetaan asetus (EY) N:o 2771/1999 seuraavasti:

1) Korvataan 4 artiklan 1 kohdan ensimmäinen virke seuraavasti: "Toimivaltaisten viranomaisten on tarkastettava voin laatu liitteessä I tarkoitettujen menetelmien ja liitteessä IV olevien yksityiskohtaisten sääntöjen mukaisesti otettujen näytteiden perusteella."

2) Korvataan liitteessä I oleva alaviite 2 seuraavasti: "Ks. asetuksen (EY) N:o 213/2001 liite I (tämä asetus)."

3) Poistetaan liitteet II ja III.

4) Korvataan liitteessä IV olevan 2 kohdan toiseksi viimeisellä rivillä ilmaisu "liitteessä III" ilmaisulla "asetuksen (EY) N:o 213/2001 (tämä asetus) liitteessä VII".

21 artikla

Asetuksen (EY) N:o 2799/1999 muutokset

Muutetaan asetus (EY) N:o 2799/1999 seuraavasti:

1) Korvataan 20 artiklan 1, 2, 3 ja 4 kohta seuraavasti: "1. Esiseosten ja rehuseosten rasvattoman maitojauheen pitoisuus tarkastetaan vähintään kahteen kertaan tehdyllä analyysillä asetuksen (EY) N:o 213/2001 (tämä asetus) liitteessä XXII kuvatun menetelmän mukaisesti ja sitä täydennetään tämän asetuksen 17 artiklan 3 kohdassa mainituilla tarkastuksilla. Jos tulosten ja näiden tarkistusten välillä ilmenee ristiriitaa, paikalla tehtyjen tarkastusten tulos on ratkaiseva.

2. Herajuoksetteen pitoisuus vahvistetaan asetuksen (EY) N:o 213/2001 (tämä asetus) liitteessä XIX kuvatun menetelmän mukaisesti.

3. Rehuseosten tärkkelyspitoisuus vahvistetaan tämän asetuksen 17 artiklan 3 kohdassa mainituilla tarkastuksilla, joita täydennetään asetuksen (EY) N:o 213/2001 (tämä asetus) liitteessä XXIII kuvatulla määritysmenetelmällä.

4. Happaman kirnupiimäjauheen kosteuspitoisuus määritetään asetuksen (EY) N:o 213/2001 liitteessä XXIV kuvatulla määritysmenetelmällä."

2) Poistetaan liitteet III, IV, V ja VI.

22 artikla

Kumoamiset

Kumotaan asetukset (ETY) N:o 1216/68, (ETY) N:o 3942/92, (ETY) N:o 86/94, (EY) N:o 2721/95, (EY) N:o 1854/96, (EY) N:o 1080/96, (EY) N:o 1081/96, (EY) N:o 1082/96, (EY) N:o 880/98 ja (ETY) N:o 1459/98.

Viittauksia kumottuihin asetuksiin pidetään viittauksina tähän asetukseen.

23 artikla

Voimaantulo

Tämä asetus tulee voimaan seitsemäntenä päivänä sen jälkeen, kun se on julkaistu Euroopan yhteisöjen virallisessa lehdessä.

Liitteessä III, liitteessä IV olevassa 4 kohdassa sekä liitteissä V, VI ja VIII kuvattuja menetelmiä sovelletaan kuitenkin kahdeksantoista kuukautta tämän asetuksen voimaantulon jälkeen.

Tämä asetus on kaikilta osiltaan velvoittava, ja sitä sovelletaan sellaisenaan kaikissa jäsenvaltioissa.

Tehty Brysselissä 9 päivänä tammikuuta 2001.

Komission puolesta

Franz Fischler

Komission jäsen

(1) EYVL L 160, 26.6.1999, s. 48.

(2) EYVL L 333, 24.12.1999, s. 11.

(3) EYVL L 340, 31.12.1999, s. 3.

(4) EYVL L 350, 20.12.1997, s. 3.

(5) EYVL L 76, 25.3.2000, s. 9.

(6) EYVL L 298, 12.11.1985, s. 9.

(7) EYVL L 11, 16.1.1999, s. 14.

(8) EYVL L 45, 21.2.1990, s. 8.

(9) EYVL L 16, 21.1.1999, s. 19.

(10) EYVL L 279, 11.10.1990, s. 22.

(11) EYVL L 325, 17.12.1999, s. 10.

(12) EYVL L 256, 7.9.1987, s. 1.

(13) EYVL L 28, 3.2.2000, s. 16.

LIITE I

(2 artikla)

LUETTELO VERTAILUMENETELMISTÄHuomautukset luetteloon Euroopan unionin vertailumenetelmistä:

Huomautus 1: Maitorasvan erottaminen IDF-standardin 6B:1989 mukaisesti (valolta suojaaminen).

Huomautus 2: Vertailumenetelmää ei ole vahvistettu.

Huomautus 3: Näytteet valmistettava IDF-standardin 122C:1996 tai IDF-standardin 73A:1985 mukaisesti.

Huomautus 4: Inkubointi 48 tunnin ajan 55 °C:n lämpötilassa. Pyrittävä välttämään kasvatusalustan kuivuminen.

Huomautus 5: SNF-% = kuiva-aine-% - rasva-%

Huomautus 6: Voin on vastattava komission asetuksen (EY) N:o 2771/1999 liitteessä V tarkoitettua tuotantojäsenvaltion kansallista laatuluokkaa.

Huomautus 7: Komission direktiivi (ETY) N:o 4/84.

Huomautus 8: Komission asetus (EY) N:o 1758/94 (EYVL L 183, 19.7.1994, s. 14).

Huomautus 9: Komission direktiivi 78/633/ETY.

>TAULUKON PAIKKA>

>TAULUKON PAIKKA>

LIITE II

(3 artikla)

RUTIINIMENETELMILLÄ SAATUJEN, ASETUKSISSA TÄSMENNETTYJÄ KOOSTUMUSTA JA LAADULLISIA OMINAISUUKSIA KOSKEVIA RAJA-ARVOJA LÄHELLÄ OLEVIEN TULOSTEN TARKASTAMINEN

Jos mo on asetuksessa täsmennetty koostumusta ja laadullisia ominaisuuksia koskeva raja-arvo, toimenpidettä edellyttävä raja-arvo (L) on

>VIITTAUS KAAVIOON>

jos RRout/RRef <= 1RRout: Rutiinimenetelmän uusittavuutta koskeva raja-arvo

RRef: Vertailumenetelmän uusittavuutta koskeva raja-arvo

Jos mo on ylempi raja-arvo ja RRout/RRef > 1, toimenpidettä edellyttävä raja-arvo saadaan kaavasta

>VIITTAUS KAAVIOON>

Jos samoissa olosuhteissa mo on alempi raja-arvo, toimenpidettä edellyttävä raja-arvo saadaan kaavasta

>VIITTAUS KAAVIOON>

CrD95: vertailumenetelmän kriittinen ero (ks. liite IV).

Jos mo on ylempi raja-arvo, toimenpidettä edellyttävän raja-arvon yläpuolella oleva rutiinimenetelmällä saatu lopullinen tulos on korvattava vertailumenetelmällä saadulla lopullisella tuloksella. Tämän lopullisen tuloksen on perustuttava vähintään yhtä suureen määrään analyysejä/otoksia kuin rutiinimenetelmän lopullisen tuloksen.

Jos mo on alempi raja-arvo, on noudatettava samaa menettelyä sellaisen rutiinimenetelmällä saadun lopullisen tuloksen saamiseksi, joka on alempi kuin toimenpidettä edellyttävä raja-arvo.

Huomautus

Edellä kuvattua menettelyä voidaan soveltaa, jos matriisivaikutuksia ei ole havaittavissa.

Matriisivaikutukset voidaan havaita seuraavasti: jokaisen kalibrointiin käytetyn näytteen osalta määritellään vertailumenetelmällä ja rutiinimenetelmällä saadun tuloksen ero (wi).

Standardipoikkeamaa, joka saadaan kaavasta

>VIITTAUS KAAVIOON>

m: kalibroinnissa käytettyjen näytteiden määrä

verrataan vertailumenetelmän ja rutiinimenetelmän standardipoikkeaman toistettavuuden aritmeettisen keskiarvon kanssa

>VIITTAUS KAAVIOON>

Matriisivaikutus on otettava huomioon, jos

>PIC FILE= "L_2001037FI.001502.EPS">

jossa:

f= m (f: vapausasteiden lukumäärä)

α= virhetodennäköisyys; α = 0,05.

Tällöin lisätutkimukset ovat tarpeen ennen toimenpidettä edellyttäen raja-arvon vahvistamista.

LIITE III

(4 ja 5 artikla)

a) Menettely vahvistetun uusittavuutta koskevan raja-arvon noudattamisen määrittämiseksi (kemiallinen määritys)

Se ovatko tulokset uusittavuutta koskevan raja-arvon mukaisia tarkastetaan vertaamalla laboratoriotuloksia kokeneen laboratorion(1) tuloksiin, jotka on saatu samanlaisella näytteellä. Kummassakin laboratoriossa tehdään rinnakkaismääritys ja tulokset arvioidaan käyttämällä seuraavaa kaavaa:

>VIITTAUS KAAVIOON>

jossa:

CrD95: kriittinen ero (P = 0,95)

>VIITTAUS KAAVIOON>: laboratoriossa 1 saatujen kahden tuloksen aritmeettinen keskiarvo

>VIITTAUS KAAVIOON>: laboratoriossa 2 saatujen kahden tuloksen aritmeettinen keskiarvo

R: uusittavuutta koskeva raja-arvo: määritellään interpoloimalla

r: toistettavuutta koskeva raja-arvo: jos tarkkuus vaihtelee pitoisuuden mukaan.

Jos kriittinen ero ylittyy, on tehtävä toinen koe kahden kuukauden kuluessa. Jos tulokset eivät ole uusittavuutta koskevan raja-arvon mukaisia toisessa kokeessa, toimivaltaisten viranomaisten on toteutettava tarvittavat toimenpiteet.

b) Menettely uusittavuutta koskevan väliaikaisen raja-arvon saamiseksi (kemiallinen määritys)

Uusittavuutta koskeva väliaikainen raja-arvo (Rprov) saadaan seuraavasta yhtälöstä:

>VIITTAUS KAAVIOON>

jossa:

>VIITTAUS KAAVIOON>: laboratoriossa 1 saatujen kahden tuloksen keskiarvo

>VIITTAUS KAAVIOON>: laboratoriossa 2 saatujen kahden tuloksen keskiarvo (ks. liitteessä III oleva a kohta)

r: toistettavuutta koskeva raja-arvo tai toistettavuutta koskeva väliaikainen raja-arvo.

Huomautukset:

1. Rprov:ia voidaan käyttää kriittisten erojen laskemiseen (ks. liite VI).

2. Rprov vahvistetaan 2r:ksi, jos Rprov:in laskettu arvo on pienempi kuin 2r.

3. Jos laskettu arvo on suurempi kuin 3r tai suurempi kuin Horwitzin yhtälöstä(2) johdettu R-arvo kerrottuna kahdella, Rprov on liian korkea eikä sitä voida käyttää kriittisen eron laskemiseen.

4. Rprov on laskettu vähintään kerran vuodessa kahdessa laboratoriossa saatujen tulosten perusteella (ks. liite IV).

5. Kriittisen eron laskemisessa on käytettävä Rprov:in keskiarvoa. Edellä 2 ja 3 kohdassa annettuja sääntöjä sovelletaan Rprov:in keskiarvoon.

Uusittavuutta koskeva raja-arvo (R-arvo) saadaan RSDR-arvosta seuraavasti:

>VIITTAUS KAAVIOON>

(>VIITTAUS KAAVIOON>

= saatujen tulosten aritmeettinen keskiarvo)

Joitakin laskettuja RSDR-arvoja (esimerkkejä)

>TAULUKON PAIKKA>

Kun analysoitavan aineen pitoisuus on 1 g/100 g,

>VIITTAUS KAAVIOON>.

(1) Kokeneen laboratorion on yleensä oltava sellainen laboratorio, joka on osallistunut menestyksellisesti joko testimenetelmän validointiin tai pätevyyskokeeseen.

(2) Horwitzin yhtälö:

>VIITTAUS KAAVIOON>

jossa:

RSDR: Uusittavuuden suhteellinen standardipoikkeama

C: pitoisuus, ilmaistuna desimaalilukuna (esimerkiksi: 10 g/100 g = 0,1).

Viite:

Peeler, J.T., Horwitz, W. ja Albert, R.

J. Ass. Off. Anal. Chem.

72 (5), 784-806 (1989).

LIITE IV

(4 artikla)

VALIDOIDUILLA MENETELMILLÄ SAATUJEN ANALYYSIEN TULOSTEN ARVIOINTI

Jos analyysin tuloksesta käy ilmi, että raja-arvo on ylitetty, lasketaan kahden tai useamman tuloksen aritmeettinen keskiarvo. Menettely on seuraavanlainen:

1. Jos analyysin tulos edustaaa yhtä tulosta, toinen analyysi on tehtävä toistettavuusvaatimukset täyttävissä olosiuhteissa. Jos kahta analyysiä ei voida tehdä toistettavuusvaatimukset täyttävissä olosuhteissa, on tehtävä uusi rinnakkaismääritys toistettavuusvaatimukset täyttävissä olosuhteissa ja käytettävä näitä tuloksia arvioitaessa, ovatko tulokset kriittistä eroa koskevien vaatimusten mukaiset.

2. Lasketaan toistettavuusvaatimukset täyttävissä olosuhteissa saatujen tulosten aritmeettisen keskiarvon ja raja-arvon välisen erotuksen absoluuttinen arvo. Kriittistä eroa suurempi erotuksen absoluuttinen arvo merkitsee sitä, että analysoitu näyte ei täytä vaatimuksia.

Kriittinen ero määritetään seuraavasta kaavasta:

>VIITTAUS KAAVIOON>

jossa:

>VIITTAUS KAAVIOON>: saatujen tulosten aritmeettinen keskiarvo

mo: raja-arvo

n: analyysien/näytteiden lukumäärä

Jos tarkkuus vaihtelee pitoisuuden mukaan, voi olla tarpeen määrittää r ja R interpoloimalla.

Yleensä näytteestä esitetystä lopullisesta tuloksesta on käytävä ilmi, että se on asetettujen raja-arvojen mukainen.

Seuraavien raja-arvojen välissä olevia lopullisia tuloksia saa sen vuoksi esiintyä ainoastaan poikkeustapauksissa:

-

>VIITTAUS KAAVIOON>

ja

>VIITTAUS KAAVIOON>, jos raja-arvo on enimmäisraja, ja

-

>VIITTAUS KAAVIOON>

ja

>VIITTAUS KAAVIOON>, jos raja on vähimmäisraja.

Edellä mainituissa rajoissa esiintyviä lopullisia tuloksia hyväksytään ainoastaan, jos niitä ilmenee enintään yksi viidestä analysoitavasta näytteestä erää kohden. Jos analysoidaan vähemmän kuin viisi näytettä erää kohden, hyväksytään yksi mainittuihin rajoihin sijoittuva tulos. Tästä huolimatta on noudatettava sääntöä, jonka mukaan viittä analysoitavaa näytettä kohden saa olla ainoastaan yksi mainittuihin rajoihin sijoittuva tulos, jos tuottaja toimittaa eriä jatkuvasti.

3. Jos lopullinen tulos x lasketaan kaavasta x = y1 +/- y2 (esimerkki: vesi + voin rasvaton kuiva-ainepitoisuus rasvapitoisuuden laskemiseksi), jossa y1 ja y2 ovat yksittäisen analyysin lopullisia tuloksia, lopullisten tulosten (x) toisettavuuden ja uusittavuuden kokonaisrajat (rx ja Rx) lasketaan kaavasta:

>VIITTAUS KAAVIOON>

>VIITTAUS KAAVIOON>

jossa r1 ja r2 ovat toistettavuutta koskevat raja-arvot ja R1 ja R2 ovat y1:n ja y2:n uusittavuutta koskevat raja-arvot.

Lopullista tulosta x verrataan mo-rajaan 1 ja 2 kohdassa täsmennettyjen sääntöjen mukaisesti. Kriittinen ero määritetään seuraavasta kaavasta:

>VIITTAUS KAAVIOON>

jossa x on saatujen tulosten (x1) aritmeettinen keskiarvo.

4. Jos lopullinen tulos lasketaan kaavasta

>VIITTAUS KAAVIOON>

(esimerkiksi rasvaa juuston kuiva-ainepitoisuudesta)

jossa y1 ja y2 ovat yksittäisen analyysin lopullisia tuloksia, toistettavuuden ja uusittavuuden kokonaisrajat (rx ja Rx) lasketaan kaavasta

>VIITTAUS KAAVIOON>

>VIITTAUS KAAVIOON>

>VIITTAUS KAAVIOON>

μ1: y1:n raja- tai tavoitearvo (esimerkiksi rasva)

μ2: y2:n raja- tai tavoitearvo (esimerkiksi kuiva-aine)

>VIITTAUS KAAVIOON>

>VIITTAUS KAAVIOON>

jossa:

r1: toistettavuutta koskeva raja-arvo y1

r2: toistettavuutta koskeva raja-arvo y2

>VIITTAUS KAAVIOON>

>VIITTAUS KAAVIOON>

jossa:

R1: uusittavuutta koskeva raja-arvo y1

R2: uusittavuutta koskeva raja-arvo y2

Menetelmiä rx:n ja Rx:n laskemiseksi sovelletaan vain, jos toistettavuutta ja uusittavuutta koskevat suhteelliset raja-arvot (r*1, r*2; R*1; R*2) ovat pienempiä tai yhtä suuria kuin 0,15.

Lopullista tulosta x verrataan μx -rajaan 1 ja 2 kohdassa täsmennettyjen sääntöjen mukaisesti. Kriittinen ero määritetään kaavasta

>VIITTAUS KAAVIOON>

jossa

>VIITTAUS KAAVIOON>

on aikajärjestyksessä saatujen tulosten (x) aritmeettinen keskiarvo(1).

(1) Huomautus:

Esimerkiksi jos saadaan tulokset y11, y12, y21 ja y22, on laskettava y11/y21:n ja y12/y22:n aritmeettinen keskiarvo.

LIITE V

SISÄINEN VALVONTA

(5 artikla)

a) Sisäinen laadunvalvontamenettely (IQC) (kemiallinen määritys)

Valvontamateriaalin määrittely

Sisäistä laadunvalvontamenettelyä varten käytetylle aineistolle tehdään samat tai osittain samat määritykset kuin testattavalle aineistolle.

Valvontamateriaali voi olla esimerkiksi:

- varmennettu vertailumateriaali,

- laboratorion oma vertailumateriaali,

- eri laboratorioissa tehdyissä kokeissa validoitu materiaali,

- materiaali, johon on lisätty määritettävää ainetta.

Menettely IQC:n laatimiseksi

Laboratorion olisi laadittava sisäinen laadunvalvontamenettelynsä (IQC) IUPAC:n asiakirjassa "Yhdenmukaiset ohjeet sisäisen laadunvalvonnan suorittamiseksi analyyttisissä laboratorioissa" esitetyn menettelyn mukaisesti(1).

IQC suoritetaan ottamalla valvontamateriaali mukaan analyyttiseen sarjaan tai määrittämällä testattava näyte rinnakkaismäärityksin. Valvontamateriaalien on vastattava kemialliselta koostumukseltaan testattavia näytteitä, ja niiden on oltava riittävän stabiileja tarkkailujakson ajan. On voitava osoittaa, että ne voidaan jakaa samanlaisiin osiin analyysiä varten ja että analysoitavan aineen pitoisuusalue soveltuu kyseiseen tutkimukseen.

Valvontamateriaali on otettava mukaan vähintään kerran kuhunkin analyysisarjaan, ja saatu arvo on merkittävä valvontakorttiin pitkäaikaisten virheiden mittaamiseksi. Laboratorion on lisäksi ajoittain osoitettava, että se täyttää toistettavuuden edellytykset analyysisarjan sisällä. Tämä osoitetaan valvontamateriaalin ja/tai testattavan materiaalin rinnakkaismäärityksellä. Näiden analyysien tuloksia olisi verrattava mahdollisiin julkaistuihin toistettavuutta koskeviin raja-arvoihin ja laboratorion omiin tarkkuustietoihin.

Jos käytetään valvontamateriaalia, sarjojen välissä saadut valvontamateriaalia koskevat tulokset merkitään Shewhart-korttiin (ISO 8258 (1991)). Asianmukaiset valvontarajat on myös merkittävä. Toimintarajat asetetaan arvoon

>VIITTAUS KAAVIOON>,

jossa st on kokonaisstandardipoikkeama,

ja varoitusrajat asetetaan arvoon

>VIITTAUS KAAVIOON>

Kokonaisstandardipoikkeama:

>VIITTAUS KAAVIOON>

jossa:

sb: standardipoikkeama sarjojen välillä

sw: standardipoikkeama sarjan sisällä

n: määritysten lukumäärä

Jos valvontamateriaalia ei käytetä (esimerkiksi jos materiaali ei ole stabiilia), vähintään yhdestä testattavista materiaaleista on tehtävä rinnakkaismääritys jokaisen sarjan sisällä.

Sarjan sisällä suoritetuista rinnakkaismäärityksistä saadut absoluuttiset erot (ks. liite III) merkitään korttiin. Kortin keskilinja on 1,128 sw, alempi raja-arvo 0 ja ylempi raja-arvo (toimintaraja) 3,686 sw, jossa sw on standardipoikkeama sarjan sisällä.

Valvontamenettelyyn on kuuluttava alhaisen ja korkean pitoisuuden omaavia materiaaleja, kun pitoisuusalue on laaja.

Jos testattavien materiaalien pitoisuuserot ovat suuret, laboratorion on osoitettava määritystarkkuuden ja pitoisuuden välinen suhde. Jos tarkkuus on verrannollinen pitoisuuteen, seuraava kontrolli olisi suoritettava suhteellisen tarkkuuden perusteella (toisin sanoen absoluuttinen ero prosentteina keskiarvosta).

Analyysijärjestelmä ei ole luotettava, jos jotakin seuraavista tapahtuu:

A. graafisen kuvaajan arvo sijoittuu toimintarajojen ulkopuolelle,

B. nykyinen arvo ja aikaisempi arvo sijoittuvat varoitusrajojen ulkopuolelle, mutta toimintarajojen sisäpuolelle,

C. jos käytetään valvontamateriaaleja, yhdeksän peräkkäistä arvoa sijoittuu keskiarvokuvaajan samalle puolelle.

Laboratorion olisi reagoitava tällaisiin tilanteisiin seuraavasti:

A. lopettamalla analyysi ja odottamalla vian määritystä ja korjaavaa toimia tilanteen parantamiseksi ja

B. hylkäämällä analyysisarjan tulokset ja analysoimalla testattava aineisto uudelleen.

b) Laboratorion oman valvontamateriaalin valintamenettely sekä laboratorion omien tarkkuutta koskevien raja-arvojen määritysmenettely (kemiallinen määritys)

Tiedot laboratorion analyysien tarkkuudesta saadaan valvontamateriaalien ja/tai testattavien näytteiden toistuvalla analyysillä.

Laboratorioiden on määriteltävä jäljempänä esitetyllä tavalla sarjan sisäistä ja sarjojen välistä vaihtelua kuvaavat tarkkuuteen liittyvät muuttujat, joita käytetään laadunvalvontakuvaajan laatimiseksi. Laboratoriot voivat käyttää myös vaihtoehtoisia menettelyjä, jos ne voivat asianmukaisesti osoittaa, että tarkkuutta koskevat tiedot ovat luotettavia.

1. Valvontamateriaalin valinta

Jos laboratorio käyttää valvontamateriaalia, on ensin kerättävä tiedot raja-arvojen asettamiseksi. Mahdollisuuksien mukaan on käytettävä varmennettuja vertailumateriaaleja. Valvontamateriaalit on analysoitava toistettavuusvaatimukset täyttävissä olosuhteissa samassa sarjassa siten, että mukana on soveltuva varmennettu vertailumateriaali. On tehtävä rinnakkaismäärityksiä ja satunnaismäärityksiä. Jos tämän menettelyn käyttö on mahdotonta, laboratorioiden olisi osallistuttava pätevyyskokeisiin ja vahvistettava yhteisesti hyväksyttyjä keskiarvoja, joita voidaan pitää oikeina keskiarvoina, joihin liittyy huomattavaa epätarkkuutta. Muihin menettelyihin kuuluu todellisten arvojen vahvistaminen valmistamalla tai käyttämällä valvontamateriaaleja, joihin on lisätty määritettävää ainetta.

Jos laboratorio tekee säännöllisesti tällaisia analyysejä ja on jo ottanut käyttöön tilastollisen valvonnan, kaikki uudet valvontamateriaalit (joita tarvitaan esimerkiksi varastojen loppumisen vuoksi) on valittava siten, että otetaan huomioon analyysit, joita varten on jo olemassa aiemmin käyttöön otettuihin materiaaleihin perustuva valvontamenettely.

2. Raja-arvojen vahvistaminen

Valvontamateriaalin valittuaan laboratorion on vahvistettava tällä materiaalilla analyysisarjan sisäistä ja analyysisarjojen välistä tarkkuutta osoittavat luvut.

Vähimmäisvaatimus tarkkuutta kuvaavien tunnuslukujen laatimiseksi analyysisarjan sisällä on, että tehdään 12 rinnakkaismääritystä. Rinnakkaismääritys on tehtävä toistettavuusvaatimukset täyttävissä olosuhteissa, toisin sanoen on sama tekijä, samat reagenssit jne. Valvontamateriaalin rinnakkaismääritys on tehtävä satunnaisesti analyysisarjan sisällä. Kukin rinnakkaismääritys on tehtävä eri päivinä tietyn ajanjakson aikana, jotta voidaan varmistaa riittävä vaihtelu analyysisarjojen välillä. Huomioon on otettava tavanomainen vaihtelu, joka liittyy esimerkiksi reagensseihin, välineiden uudelleenkalibrointiin ja tarvittaessa analyysin tekijöiden vaihtumiseen.

Huomautus:

Jos käytetään mittaustuloksia, joissa sarjojen välinen vaihtelu ei ole täysin edustava, voidaan analyysi joutua toistamaan tarpeettomasti liian tiukkojen raja-arvojen asettamisen vuoksi. Laboratorion, jossa tarkkuus on liian epämääräinen, voi olla mahdotonta noudattaa vertailumenetelmien raja-arvoja. Näin ollen sen tulos on huonompi kuin muissa vastaavissa laboratorioissa eikä se pysty toimittamaan käyttökelpoisia tietoja aiottua tarkoitusta varten.

2.1 Tarkkuuden määritys analyysisarjan sisällä

2.1.1 Sarjan sisäinen tarkkuus silloin, kun valvontamateriaalia on saatavilla

Rinnakkaisarvoille (vähintään 12 rinnakkaismääritystä) olisi tehtävä ensin Cochranin enimmäisvariaatiotesti. Siinä verrataan suurinta rinnakkaismäärityserotuksen neliötä erotusten neliöiden summaan.

>VIITTAUS KAAVIOON>

jossa:

di= rinnakkaismääritysten välinen ero.

Cochranin parametrin arvoa (C) verrataan taulukoituihin arvoihin (ISO 5725 (1994)). Jos arvo on epäilyttävä arvo tai harha-arvo, tulosta on tutkittava selityksen (esimerkiksi tekninen virhe, tietokonevirhe, kokeen yhteydessä sattunut virhe, väärän näytteen analysointi) löytämiseksi. Jos tekninen virhe on sellainen, ettei epäilyttävää tulosta voida korvata, se on hylättävä todellisena harha-arvona. Jos jäljelle jää epäilyttäviä arvoja tai harha-arvoja, joille ei löydy selitystä, epäilyttävät arvot otetaan mukaan oikeina tuloksina ja tilastolliset harha-arvot hylätään. Laboratorion on pyrittävä tekemään uudet määritykset.

Kun laboratorio on saanut harha-arvot poistetuksi, standardipoikkeama analyysisarjan sisällä (sw) lasketaan seuraavasti:

Lasketaan jokaisen rinnakkaismääritystulosparin xi1, xi2 (p kpl) summa

>VIITTAUS KAAVIOON>

ja erotus

>VIITTAUS KAAVIOON>

ja nämä lasketaan yhteen, jotta saadaan

>VIITTAUS KAAVIOON>

>VIITTAUS KAAVIOON>

>VIITTAUS KAAVIOON>

Analyysisarjan sisäisen standardipoikkeaman estimaatti on

>VIITTAUS KAAVIOON>

Tarkkuutta koskeva sisäinen raja-arvo on 2,8 sw.

Vertailumenetelmää käytettäessä tarkkuutta koskevaa sisäistä raja-arvoa verrataan julkaistuun toistettavuutta koskevaan raja-arvoon. Laboratorion tulosten on oltava vertailumenetelmällä saatujen tulosten mukaisia. Jos nämä vaatimukset eivät täyty, on asia tutkittava.

Asetettuja raja-arvoja on pidettävä väliaikaisina, ja ne on tarkistettava.

2.1.2 Sarjan sisäinen tarkkuus silloin, kun valvontamateriaalia ei ole saatavilla

Laboratorio voi määrittää analyysisarjan sisäisen tarkkuuden edustavista testattavista näytteistä suoritettavilla rinnakkaismäärityksillä (vähintään 12 rinnakkaismääritystä). Jos on mahdotonta käyttää valvontamateriaaleja (esimerkiksi niiden epästabiilisuuden vuoksi), rinnakkaismäärityksistä saatu tieto on kerättävä tällä menetelmällä.

Huomautus:

Analyysien oletetaan kattavan suhteellisen kapean alueen arvoja, minkä vuoksi kaikkiin näytteisiin voidaan soveltaa yhtä arvoa. Jos tulosten vaihtelualue on laajempi (esimerkiksi kertaluokkaa suurempi) ja tarkkuus riippuu pitoisuudesta, laboratorion on pyrittävä käyttämään suhteellista standardipoikkeamaa.

Tuloksille on tehtävä Cochranin testi 2.1.1 kohdassa kuvatulla tavalla. Kun laboratorio on saanut harha-arvot poistetuksi, standardipoikkeama analyysisarjan sisällä ja laboratorion oma tarkkuutta koskeva raja-arvo saadaan 2.1.1 kohdassa kuvatulla tavalla.

Standardipoikkeamaa analyysisarjan sisällä (sw) voidaan käyttää valvontakorttien laatimiseen (ks. liite II). Asetettuja raja-arvoja on pidettävä väliaikaisina, ja ne on tarkistettava.

2.2 Analyysisarjojen välisen tarkkuuden määritys

Lasketaan jokaisen parin keskiarvo (s1/2) ja tehdään näille arvoille Grubbsin testi (ISO 5725 (1994)). Harha-arvojen tai epäilyttävien arvojen hylkäämis- ja hyväksymisperusteet kuvataan 2.1.1 kohdassa. Laboratorion on pyrittävä löytämään korvaava arvo hylätylle tulokselle. Kun laboratorio on saanut harha-arvot poistetuksi, lasketaan standardipoikkeama (sb) analyysisarjojen välillä.

>VIITTAUS KAAVIOON>

tai 0, jos merkintä neliöjuuren alla on negatiivinen.

Kokonaisstandardipoikkeamaa (st) käytetään n:n määrityksen keskiarvona valvontakorttien laadintaan (ks. liite II). Asetettuja raja-arvoja on pidettävä väliaikaisina, ja ne on tarkistettava.

3. Alustavien raja-arvojen tarkistus

Edellä kuvattuja laadunvalvonnassa sovellettavaa raja-arvoja on pidettävä alustavina arvioina.

Analyysisarjan sisällä hyväksyttävän tarkkuuden perusteella asetettujen raja-arvojen saattamiseksi ajan tasalle (2.1.2 jakso) on kerättävä lisää rinnakkaismääritysten tuloksia testattavista näytteistä. Tarkistusta edeltävän ajanjakson pituus riippuu analyysitiheydestä. Tiedot olisi tarkistettava esimerkiksi 10 uuden rinnakkaismäärityksen jälkeen. Kaikille kerätyille tuloksille on tämän jälkeen tehtävä Cochranin testi ja uudet raja-arvot on vahvistettava uuden standardipoikkeaman perusteella. Myöhemmin tehtävät valvontarajojen oikeellisuutta koskevat päätökset on tehtävä näiden lisätietojen perusteella.

Analyysisarjan sisäistä tarkkuutta varten tehtyjen määritysten tulosten tarkistamistarve riippuu myös analyysitiheydestä. Kun valvontamateriaalin analyysistä (yksi analyysi erää kohti) on saatu 10 uutta datapistettä, on suositeltavaa tarkistaa alussa arvioidut standardipoikkeama ja keskiarvo.

Kaikille tuloksille on tehtävä Grubbsin testi, jotta voidaan havaita suuresti poikkeavat arvot. Keskiarvo ja standardipoikkeama on laskettava uudelleen uusien tulosten perusteella.

Lisäksi laboratorion olisi käytettävä tässä vaiheessa Cusumin korttia (BS S700: (1984) ja muutos 5480 (1987)) esimerkiksi reagenssien vanhenemiseen liittyvien ongelmien analysoimiseksi. Jokainen yksittäinen tulos, joka poikkeaa Cusumin "V-mask:in" rajoista, on tutkittava.

Uudet raja-arvot (keskiarvo ja standardipoikkeama) on tarkastettava säännöllisesti Cusumin menetelmällä. Kaikki viitteet valvontamateriaalin kyseenalaisuudesta on tutkittava huolellisesti.

4. Tarkkuustietojen raportointi

Laboratorion on toimitettava kansallisille toimivaltaisille viranomaisille seuraavat tiedot:

- käytetty menetelmä,

- analyysisarjan sisäinen standardipoikkeama (sw) ja laboratorion omat tarkkuutta koskevat raja-arvot,

- analyysisarjojen välinen standardipoikkeama (sb),

- kokonaisstandardipoikkeama (sl),

- tarkkuustietojen saamiseksi tehtyjen analyysien lukumäärä.

(1) M. Thompson and R. Wood: "Pure and Applied Chemistry" 67 (4), 649-666 (1995).

LIITE VI

(6 artikla)

ARVIOIJIEN ARVIOINTI JA AISTINVARAISISSA ANALYYSEISSÄ SAATUJEN TULOSTEN LUOTETTAVUUS

Seuraavia menettelyjä sovelletaan käytettäessä pisteytysmenetelmiä (IDF-standardi 99C/1997).

a) Toistettavuuksien määrittäminen

Arvioijan on arvioitava kahdentoista kuukauden aikana vähintään kymmenen rinnakkaista sokeanäytettä. Tämä tapahtuu tavallisesti useissa eri arviointitilaisuuksissa. Yksittäisiä tuotteen laatuominaisuuksia koskevat tulokset arvioidaan seuraavasta kaavasta:

>VIITTAUS KAAVIOON>

jossa:

w1: toistettavuusindeksi

xi1: näytteen xi ensimmäisen arvioinnin pisteet

xi2: näytteen xi toisen arvioinnin pisteet

n: näytteiden lukumäärä

Arvioitavien näytteiden on oltava laadultaan tarpeeksi erilaisia. w1 ei saa olla suurempi kuin 1,5 (viiden pisteen asteikko).

b) Poikkeamaindeksin määrittäminen

Tätä indeksiä käytetään tarkistettaessa, käyttääkö arvioija laadun arvioinnissa samaa asteikkoa kuin ryhmä kokeneita arvioijia. Arvioijan antamia pisteitä verrataan ryhmän antamien pisteiden keskiarvoon.

Tulokset arvioidaan seuraavasta kaavasta:

>VIITTAUS KAAVIOON>

jossa:

xi1; xi2: ks. a alakohta

>VIITTAUS KAAVIOON>;

>VIITTAUS KAAVIOON>: arvioijaryhmän antamien pisteiden keskiarvo näytteen xi ensimmäisessä ja toisessa arvioinnissa.

n: näytteiden lukumäärä (vähintään kymmenen näytettä 12 kuukauden aikana).

Arvioitavien näytteiden on oltava laadultaan tarpeeksi erilaisia. D1 ei saa olla suurempi kuin 1,5 (viiden pisteen asteikko).

Jäsenvaltioiden on ilmoitettava tämän menettelyn soveltamisessa ilmenevistä vaikeuksista.

c) Jäsenvaltion eri alueilla ja eri jäsenvaltioissa saatujen tulosten vertailu

Vuosittain on järjestettävä mahdollisuuksien mukaan vähintään yksi koe, jonka avulla on mahdollista vertailla arvioijien eri alueilla saamia tuloksia. Jos tuloksissa ilmenee merkittäviä eroavaisuuksia, on toteutettava tarvittavat toimet niiden syiden selvittämiseksi ja vertailukelpoisiin tuloksiin pääsemiseksi.

Jäsenvaltiot voivat järjestää kokeita, joiden avulla on mahdollista vertailla oman maan arvioijien ja naapurijäsenvaltioiden arvioijien saamia tuloksia. Jos merkittäviä eroavaisuuksia ilmenee, on tehtävä perusteellinen tutkimus vertailukelpoisiin tuloksiin pääsemiseksi.

Jäsenvaltioiden on ilmoitettava komissiolle näiden vertailujen tuloksista.

LIITE VII

(6 artikla)

VOIN AISTINVARAINEN ARVIOINTI

1. Soveltamisala

Tässä esitetyn voin aistinvaraisen arviointimenettelyn tarkoituksena on tarjota käyttöön yhtenäinen menetelmä, jota voidaan soveltaa kaikissa jäsenvaltioissa.

2. Määritelmät

Aistinvaraisella arvoinnilla tarkoitetaan tuotteen ominaisuuksien tutkimista aistielinten avulla.

Raadilla tarkoitetaan valittujen arvioijien ryhmää, jonka jäsenet tekevät työtään arvioinnin aikana itsenäisesti ja vaikuttamatta toinen toisiinsa.

Pisteytyksellä tarkoitetaan aistinvaraista arviota, jonka raati ilmaisee numeroasteikolla. Arvioinnissa on käytettävä virhenimikkeistöä.

Luokituksella tarkoitetaan pisteytyksen perusteella tehtävää laatuluokitusta.

Valvonta-asiakirjoilla tarkoitetaan asiakirjoja, joihin kirjataan kunkin ominaisuuden pistemäärä ja tuotteen lopullinen luokitus. (Valvonta-asiakirjaan voidaan merkitä myös tuotteen kemiallinen koostumus).

3. Arviointihuone

3.1 Järjestelyjen avulla on varmistettava, että ulkoiset tekijät eivät vaikuta arviointihuoneessa oleviin arvioijiin.

3.2 Arviointihuoneessa ei saa olla vieraita hajuja, ja huoneen on oltava helposti siivottavissa. Seinien on oltava vaaleat.

3.3 Arviointihuoneen ja sen valaistuksen on oltava sellaiset, että ne eivät vaikuta pisteytettävien tuotteiden ominaisuuksiin. Huoneessa on oltava asianmukainen lämpötilan säätö.

4. Arvioijien valinta

Arvioijan on tunnettava erityyppiset voit, ja hänen on oltava pätevä tekemään aistinvaraista luokitusta. Toimivaltaisen viranomaisen on arvioitava arvioijan pätevyys säännöllisesti (vähintään kerran vuodessa).

5. Raatia koskevat vaatimukset

Raadissa on oltava pariton määrä arvioijia, kuitenkin vähintään kolme. Raadin jäsenten enemmistön on oltava toimivaltaisen viranomaisen työntekijöitä tai hyväksyttyjä henkilöitä, jotka eivät ole meijeriteollisuuden palveluksessa.

Ennen arviointia on otettava huomioon useita seikkoja, jotta arvioijat pystyisivät suoriutumaan tehtävistään mahdollisimman hyvin:

- Arvioijat eivät saa sairastaa tauteja, jotka voivat vaikuttaa heidän tehtäviinsä. Tällaisissa tapauksissa paneeliin osallistuva arvioija on korvattava toisella arvioijalla.

- Voidakseen osallistua arviointiin arvioijien on saavuttava paikalle ajoissa ja varmistettava, että heillä on tarpeeksi aikaa arvioinnin suorittamiseen.

- Arvioijat eivät saisi käyttää vahvasti tuoksuvia tuotteita (kuten parfyymeja, partavesiä ja deodorantteja) eivätkä syödä vahvasti maustettuja ruokia.

- Arvioijat eivät saisi tupakoida, syödä tai juoda muuta kuin vettä arviointia edeltävän 30 minuutin aikana.

6. Kunkin ominaisuuden arviointi

6.1 Aistinvarainen arviointi koskee seuraavaa kolmea ominaisuutta: ulkonäkö, kiinteys ja maitto.

Ulkonäöllä tarkoitetaan seuraavia piirteitä: väri, silmin havaittava puhtaus, mahdollinen homekasvu ja irrallinen vesi. Irralisen veden esiintyminen tutkitaan IDF-standardin 112A/1989 mukaisesti.

Kiinteydellä tarkoitetaan seuraavia piirteitä: kovuus ja levittyvyys.

Voin kiinteyttä voidaan arvioida fysikaalisin menetelmin. Komission on tarkoitus yhtenäistää nämä menetelmät tulevaisuudessa.

Maittoon kuuluvat seuraavat piirteet: haju ja maku.

Huomattava poikkeama suositellusta lämpötilasta estää kiinteyden ja maiton luotettavan arvioinnin. Lämpötilan merkitys on keskeinen.

6.2 Kukin ominaisuus on arvioitava erikseen aistinvaraisesti. Pisteytyksen on oltava taulukon 1 mukainen.

6.3 Arvioijen voi olla aiheellista ennen varsinaisen arvioinnin alkua pisteyttää yhteisesti yhden tai useamman vertailunäytteen ulkonäkö, kiinteys ja maitto, jotta saavutetaan yhteinäinen arviointikäytäntö.

6.4 Hyväksymisen edellyttämät pistemäärät ovat seuraavat:

>TAULUKON PAIKKA>

Jos vaadittua pistemäärää ei saavuteta, virhe on kuvattava. Kunkin arvioijan antama pistemäärä on kirjattava valvonta-asiakirjaan erikseen jokaisen ominaisuuden osalta. Tuote hyväksytään tai hylätään enemmistön päätöksen perusteella. Tuloksia, joissa kunkin ominaisuuden pistemäärät poikkeavat toisistaan enemmän kuin yhden pisteen verran, ei saisi esiintyä usein (enintään yhdessä näytteessä 20:stä). Muussa tapauksessa raadin johtajan on tarkistettava raadin pätevyys.

7. Valvonta

Raadin johtaja, jonka on oltava toimivaltaisen viranomaisen virkamies, vastaa yleisesti koko menettelystä; hän voi olla raadin jäsen. Hänen on allekirjoitettava kunkin ominaisuuden yksittäiset pistemäärät valvonta-asiakirjaan ja todistettava tuotteen hyväksyminen tai hylkääminen.

8. Näytteenotto ja näytteen valmistelu

8.1 - Puolueellisuuden välttämiseksi on suotavaa säilyttää näytteiden nimettömyys arvioinnin ajan.

- Raadin johtajan on tehtävä tämän edellyttämät järjestelyt ennen arvointia ja raadin jäsenten poissaollessa.

8.2 Kun aistinvarainen arviointi tehdään kylmävarastolla, näyte otetaan voikairalla. Jos arviointi tehdään muualla kuin kylmävarastolla, näytettä on otettava vähintään 500 g.

8.3 Arvioinnin ajan voin lämpötilan tulisi olla 10-12 °C. Suuria poikkeamia on vältettävä kaikin keinoin.

9. Nimistö

Katso taulukkoa 2.

Taulukko 1: Voin pisteytys

>TAULUKON PAIKKA>

>TAULUKON PAIKKA>

>TAULUKON PAIKKA>

Taulukko 2: Voin virhenimikkeistö

I Ulkonäkö

1. irrallista vettä

2. epätasainen väri, kaksivärinen

3. juovikas

4. kirjava, marmoroitu

5. väriläiskiä

6. öljyn erottumista

7. liikaa värjätty

8. huokoinen

9. rakeinen

10. vieraita aineita

11. hometta

12. liukenematonta suolaa

II Kiinteys

14. lyhyt, hauras, mureneva

15. paksu, salvamainen

16. tahmea

17. kova

18. pehmeä

III Maitto (haju ja maku)

20. aromiton, mieto

21. epäpuhdas(1)

22. vieras maku, sivumaku, jälkimaku

23. vanhan maku

24. juustomainen

25. hapan

26. hiivan maku

27. a) keitetyn maku

b) palaneen maku

28. homeen maku

29. eltaantunut

30. öljyinen, kalan maku

31. talin maku

32. a) hapettuneen maku

b) metallin maku

33. rehun maku

34. kitkerä, karvas

35. liian suolainen

36. ummehtunut, mädäntynyt

37. maltaan maku

38. kemikaalin maku

(1) Tätä virhenimitystä on käytettävä mahdollisimman harvoin ja ainoastaan, jos virhettä ei voida kuvata tarkemmin.

LIITE VIII

(7 artikla)

MENETTELY, JOTA ON SOVELLETTAVA, KUN KEMIALLISTEN ANALYYSIEN TULOKSET OVAT KIISTANALAISIA

1. Uusi analyysi voidaan suorittaa toimeksiantajan pyynnöstä seitsemän työpäivän kuluessa ensimmäisen analyysin tulosten toimittamisesta, jos tuotteesta on saatavilla sinetöityjä rinnakkaisnäytteitä ja jos ne on asianmukaisesti varastoitu toimivaltaisten viranomaisten tiloihin.

2. Toimivaltainen viranomainen toimittaa nämä näytteet toiseen laboratorioon toimeksiantajan pyynnöstä ja tämän kustannuksella. Viimeksi mainitun laboratorion on oltava virallisten analyysien suorittamiseen hyväksytty laboratorio ja todistetusti pätevä kyseisten analyysien suorittamiseen. Pätevyys on osoitettava todisteilla menestyksellisestä osallistumisesta laboratorioiden välisiin tutkimuksiin, pätevyyskokeisiin tai laboratorioiden välisiin vertailuihin. Tämän toisen laboratorion on käytettävä vertailumenetelmää. Laboratorioissa saatuja tuloksia verrataan seuraavasti:

a) Kun molempien laboratorioiden tulokset ovat toistettavuutta ja uusittavuutta koskevien vaatimusten mukaiset

Lopullisena tuloksena ilmoitetaan molemmissa laboratorioissa saatujen koetulosten aritmeettinen keskiarvo. Lopullista tulosta arvioidaan ottamalla huomioon kriittinen ero, joka lasketaan seuraavan kaavan avulla:

>VIITTAUS KAAVIOON>

jossa:

>VIITTAUS KAAVIOON>: molemmissa laboratorioissa saatujen kaikkien tulosten aritmeettinen keskiarvo

mo: raja-arvo

R: uusittavuus

r: toistettavuus

n1: laboratoriossa 1 saatujen tulosten lukumäärä

n2: laboratoriossa 2 saatujen tulosten lukumäärä.

Huomautus:

Jos lopullinen tulos lasketaan kaavasta

>VIITTAUS KAAVIOON>

tai

>VIITTAUS KAAVIOON>

(ks. liitteessä IV oleva 3 ja 4 kohta), korvataan R2 ja r2 arvoilla R2x ja r2x.

b) Kun molempien laboratorioiden tulokset ovat toistettavuutta koskevien vaatimusten mukaiset, mutta eivät vastaa uusittavuutta koskevia vaatimuksia

Jos ensimmäisen analyysin tulokset vahvistuvat toisessa analyysissä, analysoitu erä hylätään vaatimustenvastaisena. Muussa tapauksessa se hyväksytään.

c) Kun ainoastaan toisen laboratorion tulokset ovat toistettavuutta koskevien vaatimusten mukaiset

Laboratoriossa, jossa toistettavuusvaatimus täyttyy, saatua lopullista tulosta käytetään päätettäessä analysoidun erän hyväksymisestä.

d) Kun kummankaan laboratorion tulokset eivät ole toistettavuutta koskevien vaatimusten mukaiset, mutta vastaavat uusittavuutta koskevia vaatimuksia

Sovelletaan a alakohtaa.

e) Kun kummankaan laboratorion tulokset eivät ole toistettavuutta ia uusittavuutta koskevien vaatimusten mukaiset

Analysoitu erä hyväksytään, jos toisessa laboratoriossa saadut tulokset johtavat tällaiseen johtopäätökseen.

f) Kun tulokset on saatu käyttämällä validoimattomia menetelmiä

Analysoitu erä hyväksytään, jos toisessa laboratoriossa saadut tulokset johtavat tällaiseen johtopäätökseen.

3. Toimivaltainen viranomainen toimittaa toisen analyysin tulokset toimeksiantajalle mahdollisimman pian. Toisesta analyysistä aiheutuvista kustannuksista vastaa toimeksiantaja silloin, kun analysoitu erä hylätään.

4. Jos toimeksiantaja asettaa näytteenottomenettelyn kyseenalaiseksi, on otettava mahdollisuuksien mukaan uudet näytteet viiden työpäivän kuluessa ensimmäisestä näytteenotosta. Jos uusien näytteiden ottaminen ei ole mahdollista, analysoitu erä hyväksytään.

LIITE IX

(8 artikla)

VOIN VESIPITOISUUDEN MÄÄRITTÄMINEN

1. Soveltamisala

Seuraavassa esitetään vertailumenetelmänä voin vesipitoisuuden määrittämiseksi.

2. Viite

IDF Standard 50 C: 1995 - Milk and milk products - Methods of sampling

3. Määritelmä

Voin vesipitoisuus: massan pienenemisen määrä, kun tässä standardissa esitetty kuumentamisprosessi on suoritettu loppuun. Ilmaistaan grammoina 100:aa grammaa kohti.

4. Periaate

Näytteestä haihdutetaan vesi hohkakiven läsnäollessa 102 °C:n lämpötilassa kuivausuunissa.

5. Laitteet ja tarvikkeet

Tavallisia laboratoriotarvikkeita, erityisesti:

5.1 Analyysivaaka, herkkyys 1 mg.

5.2 Eksikkaattori, jossa on tehokasta kuivausainetta (esimerkiksi vasta kuivattua piihappogeeliä, jossa on vesipitoisuuden merkkiainetta).

5.3 Kuivausuuni, jossa on tuuletus ja lämpötilan säätö ja jonka koko työtilan lämpötila pysyy 102 ± 2 °C:ssa.

5.4 Lasista, posliinista tai syöpymistä kestävästä metallista valmistettuja astioita, joiden korkeus on noin 20 mm ja halkaisija 60-80 mm.

5.5 Rakeista, pestyä hohkakiveä, jonka rakeiden halkaisija on 0,8-10 mm.

6. Näytteenotto

Katso IDF 50 C: 1995

7. Suoritus

7.1 Näytteenvalmistus

Laboratorionäytettä pannaan suljettavaan lasista tai sopivasta muovista valmistettuun astiaan siten, että astia on puoliksi - kaksi kolmasosalta täysi, lämmitetään, kunnes näyte on niin pehmeää, että se voidaan sekoittaa tasaiseksi (koneella tai käsin). Sekoituslämpötila ei saisi olla korkeampi kuin 35 °C. Näyte jäähdytetään huoneenlämpötilaan. Mahdollisimman pian jäähdytyksen jälkeen astia avataan ja näytettä sekoitetaan vähän aikaa (enintään 10 s) sopivalla esineellä, esimerkiksi lusikalla tai lastalla, ennen punnitsemista.

7.2 Vesipitoisuuden määritys

7.2.1 Astiaan pannaan noin 10 g hohkakiveä (5.4).

7.2.2 Astia kuivataan hohkakiven kanssa uunissa (5.3) a 102 ± 2 °C:n lämpötilassa vähintään 1 tunnin ajan.

Huom.

Kohdissa 7.2.2, 7.2.5 ja 7.2.7 mainitut kuivausajat lasketaan siitä, kun uunin lämpötila saavuttaa 102 ± 2 °C.

7.2.3 Astia saa jäähtyä eksikkaattorissa (5.2) vaakahuoneen lämpötilaan, ja se punnitaan 1 mg:n tarkkuudella.

7.2.4 Astiaan punnitaan 1 mg:n tarkkuudella noin 5 g näytettä.

7.2.5 Astia pannaan uuniin 102 ± 2 °C:n lämpötilaan 3 tunniksi.

7.2.6 Astia saa jäähtyä eksikkaattorissa (5.2) vaakahuoneen lämpötilaan, ja se punnitaan 1 mg:n tarkkuudella.

7.2.7 Kuivausjakso toistetaan 1 tunti kerrallaan, ja näyte jäähdytetään ja punnitaan kuten kohdassa 7.2.6, kunnes massa ei muutu (muutos on pienempi kuin 1 mg).

Jos massa suurenee, otetaan laskutoimitusta varten alhaisin kirjattu massa.

8. Tulosten ilmoittaminen

8.1 Laskumenetelmä ja kaava

Lasketaan vesipitoisuus W painoprosentteina seuraavalla kaavalla:

>VIITTAUS KAAVIOON>

jossa

>TAULUKON PAIKKA>

Tulos ilmoitetaan yhden desimaalin tarkkuudella.

8.2 Toistettavuus

Samaan aikaan tai hyvin nopeasti peräkkäin saman työntekijän samoissa olosuhteissa samasta näytemateriaalista tehdyn kahden yksittäisen määrityksen välinen absoluuttinen ero ei saa olla suurempi kuin 0,2 %.

8.3 Uusittavuus

Kahden eri laboratorioissa työskentelevän työntekijän yksittäiset ja toisistaan riippumattomat tulokset samasta näytemateriaalista eivät saa erota toisistaan enempää kuin 0,3 %.

9. Määritysseloste

Määritysselosteessa on mainittava käytetty menetelmä ja saadut tulokset. Siinä on myös mainittava kaikki yksityiskohdat, joita ei mainita tässä kansainvälisessä standardissa tai joita pidetään valinnaisina, sekä tuloksiin mahdollisesti vaikuttaneet yksityiskohdat ja tapahtumat. Määritysselosteessa on esitettävä kaikki tiedot, jotka tarvitaan näytteen täydelliseksi tunnistamiseksi.

LIITE X

(8 artikla)

VOIN RASVATTOMAN KUIVA-AINEEN MÄÄRITYS

1. Soveltamisala

Seuraavassa esitetään vertailumenetelmä voin rasvattoman kuiva-aineen pitoisuuden määrittämiseksi.

2. Viitteet

IDF Standard 50 C: 1995 - Milk and milk products - Methods of sampling.

3. Määritelmät

Voin rasvattoman kuiva-aineen pitoisuus: esitetyllä menetelmällä määritettyjen aineiden painoprosentti. Ilmaistaan grammoina 100:aa grammaa kohti.

4. Periaate

Tunnetusta määrästä voita haihdutetaan vesi, rasvat uutetaan petrolieetterillä ja jäännös punnitaan.

5. Reagenssi

Petrolieetteri, joka kiehuu välillä 30-60 °C. Reagenssista ei saa jäädä enempää kuin 1 mg jäännöstä, kun sitä on haihdutettu 100 ml.

6. Laitteet ja tarvikkeet

6.1 Analyysivaaka, herkkyys 1 mg.

6.2 Eksikkaattori, jossa on tehokasta kuivausainetta (esimerkiksi vasta kuivattua piihappogeeliä, jossa on vesipitoisuuden merkkiainetta).

6.3 Kuivausuuni, jossa on tuuletus ja lämpötilan säätö ja jonka koko työtilan lämpötila pysyy 102 +- 2 °C:ssa.

6.4 Lasista, posliinista tai syöpymistä kestävästä metallista valmistettuja astioita, joiden korkeus nokkaan on 20 mm ja halkaisija 60-80 mm, ja lasinen sekoitussauva.

6.5 Suodatinupokas, sintterilasia, huokoisten halkaisija 16-40 μm, ja imupullo.

7. Näytteenotto

Katso IDF 50 C: 1995

8. Suoritus

8.1 Näytteenvalmistus

Laboratorionäytettä pannaan suljettavaan lasista tai sopivasta muovista valmistettuun astiaan siten, että astia on puoliksi - kaksi kolmasosalta täysi, lämmitetään, kunnes näyte on niin pehmeää, että se voidaan sekoittaa tasaiseksi (koneella tai käsin). Sekoituslämpötila ei saisi olla korkeampi kuin 35 °C. Näyte jäähdytetään huoneenlämpötilaan. Mahdollisimman pian jäähdytyksen jälkeen astia avataan ja näytettä sekoitetaan vähän aikaa (enintään 10 s) sopivalla esineellä, esimerkiksi lusikalla tai lastalla.

8.2 Määritys

8.2.1 Kuivataan astiaa, sauvaa (6.4) ja upokasta (6.5) uunissa (6.3) 1 tunti. Annetaan jäähtyä eksikkaattorissa ja punnitaan yhdessä (astia, sauva ja upokas) 1 mg:n tarkkuudella (m0).

Huomautuksia:

- Yleensä jäähdyttämiseen riittää 45 min.

- On tärkeää, että kullekin näytteelle käytetään samaa astian, sauvan ja upokkaan yhdistelmää, jos erästä määritetään useampi kuin yksi näyte.

8.2.2 Upokas otetaan pois ja astian ja sauvan yhteispaino kirjataan 1 mg:n tarkkuudella (m1).

8.2.3 Astiaan punnitaan 1 mg:n tarkkuudella noin 5 g näytettä (8.1) (m2).

8.2.4 Astia (jossa on sauva ja voi) pannaan uuniin 102 +- 2 °C:n lämpötilaan yli yön.

8.2.5 Astia (8.2.3) saa jäähtyä huoneen lämpötilaan.

8.2.6 Astiaan lisätään 15 ml lämmintä (noin 25 °C) petrolieetteriä ja irrotetaan lasisauvalla astiaan tarttunutta saostumaa mahdollisimman pian. Liuotin siirretään upokkaaseen ja sen annetaan suodattua imupulloon.

8.2.7 Vaihe (8.2.6) toistetaan vielä neljä kertaa. Jos astian pinnalla ei näy rasvajälkiä, siirretään neljännessä pesussa kvntitatiivisesti mahdollisimman paljon saostumaan upokkaaseen. Muussa tapauksessa vaihetta 8.2.6 toistetaan, kunnes kaikki rasvajäljet ovat hävinneet.

8.2.8 Saostumaa pestään upokkaassa 25 ml:lla lämmintä petrolieetteriä.

8.2.9 Kuivataan astia, lasisauva ja upokas uunissa 102 +- 2 °C:n lämpötilassa 30 minuutin ajan.

8.2.10 Annetaan jäähtyä eksikkaattorissa huoneenlämpötilaan ja punnitaan 1 milligramman tarkkuudella.

8.2.11 Vaiheet 8.2.9 ja 8.2.10 toistetaan, kunnes astian, sauvan ja upokkaan yhteinen massa (m3) ei muutu (muutos ei ole suurempi kuin 1 mg).

9. Tulosten ilmoittaminen

9.1 Rasvattoman kuiva-aineen määritys

Lasketaan rasvattoman kuiva-aineen pitoisuus (SNF) painoprosentteina seuraavalla kaavalla:

>VIITTAUS KAAVIOON>

jossa

m0 on tyhjän astian, lasisauvan ja upokkaan massa grammoina (8.2.1)

m1 on tyhjän astian ja lasisauvan massa grammoina ennen kuivausta (8.2.2)

m2 on koenäytteen, astian ja lasisauvan massa grammoina (8.2.3)

m3 on astian, lasisauvan ja upokkaan sekä saostuman loppumassa grammoina (8.2.11)

Tulos ilmoitetaan yhden desimaalin tarkkuudella.

9.2 Toistettavuus

Samaan aikaan tai hyvin nopeasti peräkkäin saman työntekijän samoissa olosuhteissa samasta näytemateriaalista tehdyn kahden yksittäisen määrityksen välinen absoluuttinen ero ei saa olla suurempi kuin 0,1 %.

9.3 Uusittavuus

Kahden eri laboratoriossa työskentelevän työntekijän yksittäiset ja toisistaan riippumattomat tulokset samasta näytemateriaalista eivät saa erota toisistaan enempää kuin 0,2 %.

10. Määritysseloste

Määritysselosteessa on mainittava käytetty menetelmä ja saadut tulokset. Siinä on myös mainittava kaikki yksityiskohdat, joita ei mainita tässä kansainvälisessä standardissa tai joita pidetään valinnaisina, sekä tuloksiin mahdollisesti vaikuttaneet yksityiskohdat ja tapahtumat. Määritysselosteessa on esitettävä kaikki tiedot, jotka tarvitaan näytteen täydelliseksi tunnustamiseksi.

Huom.

>TAULUKON PAIKKA>

Voidaan päätellä, että rasvattoman kuiva-aineen luotettavuusarvot sopivat myös maidon rasvattoman kuiva-aineen määrittämiseen.

LIITE XI

(8 artikla)

VOIN RASVAPITOISUUDEN MÄÄRITTÄMINEN

Rasvapitoisuus saadaan epäsuorasti määrittämällä vesipitoisuus ja rasvattoman kuiva-aineen pitoisuus liitteiden IX ja X mukaisesti. Rasvan painoprosenttimäärä on

>VIITTAUS KAAVIOON>

jossa

W: veden painoprosentti

SNF: rasvattoman kuiva-aineen painoprosentti

>TAULUKON PAIKKA>

LIITE XII

(9 artikla)

VOIÖLJYN, VOIN TAI KERMAN VANILLIINIPITOISUUDEN MÄÄRITTÄMINEN HPLC-MENETELMÄLLÄ

1. Tarkoitus ja soveltamisala

Tässä kuvataan menetelmä vanilliinin kvantitatiiviseksi määrittämiseksi voista, voiöljystä tai kermasta.

2. Periaate

Tietynsuuruinen näyte uutetaan isopropanoli/etanoli/asetonitriili -seoksella (1:1:2). Pääosa rasvasta saostetaan jäähdyttämällä - 15 ja - 20 °C:n välillä, minkä jälkeen näyte sentrifugoidaan.

Laimennetaan vedellä, minkä jälkeen vanilliinipitoisuus määritetään HPLC-menetelmällä.

3. Välineet

Tavalliset laboratoriovälineet ja erityisesti seuraavat:

3.1 Pakastin, lämpötilansäätö - 15 ja - 20 °C:n välillä.

3.2 2 ml:n kertakäyttöruiskuja.

3.3 Kalvosuodattimia (huokoskoko 0,45 μm), jotka kestävät liuosta, joka sisältää 5 % uuttoliuosta (4.4).

3.4 Nestekromatografi, johon kuuluu pumppu (virtaus 1,0 ml/min), injektiolaite (tilavuus 20 μl, käsikäyttöinen tai automaattinen), UV-detektori (aallonpituus 306 nm, 0,01 AU täysi asteikko), piirturi tai integraattori ja 25 °C:seen termostoitu kolonni.

3.5 Analyyttinen HPLC-kolonni (pituus 250 mm, sisähalkaisija 4,6 mm), joka on pakattu LiChrosper RP 18:lla (Merck, 5 μm) tai vastaavalla.

3.6 Esikolonni (pituus noin 20 mm, sisähalkaisija 3 mm), joka on kuivapakattu Perisorb RP 18:lla (30-40 μm) tai vastaavalla.

4. Reagenssit

Kaikkien käytettävien reagenssien on oltava analyysipuhtausluokkaa.

4.1 Isopropanoli

4.2 Etanoli 96 % (v/v)

4.3 Asetonitriili

4.4 Uuttoliuos

Sekoitetaan isopropanolia (4.1), etanolia, (4.2) ja asetonitriiliä (4.3) suhteessa 1:1:2 (v/v).

4.5 Vanilliini (4-hydroksi-3-metoksibentsaldehydi)

4.5.1 Vanilliinin kantaliuos (= 500 μg/ml)

Punnitaan 0,1 mg:n tarkkuudella noin 50 mg (CM mg) vanilliinia (4.5) 100 ml:n mittapulloon, lisätään 25 ml uuttoliuosta (4.4) ja täytetään merkkiin vedellä.

4.5.2 Vanilliinin standardiliuos (= 10 μg/ml)

Pipetoidaan 5 ml vanilliinin kantaliuosta (4.5.1) 250 ml:n mittapulloon ja täytetään merkkiin vedellä.

4.6 Metanoli, HPLC-laatu

4.7 Jääetikka

4.8 Vesi, HPLC-laatu

4.9 HPLC:n liikkuva faasi

Sekoitetaan 300 ml metanolia (4.6), noin 500 ml vettä (4.8) ja 20 ml etikkahappoa (4.7) 1000 ml:n mittapullossa ja täytetään merkkiin vedellä (4.8). Suodatetaan 0,45 μm:n suodattimen läpi (3.3).

5. Suoritus

5.1 Koenäytteen esikäsittely

5.1.1 Voi

Lämmitetään näytettä kunnes se alkaa sulaa. Varotaan lämpötilan kohoamista paikallisesti yli 40 °C:n. Kun näyte on tarpeeksi juokseva, homogenoidaan ravistamalla. Sekoitetaan voita 15 sekunnin ajan ennen näytteen ottamista. Punnitaan 1 mg:n tarkkuudella noin 5 g (SM g) voita 100 ml:n mittapulloon.

5.1.2 Voiöljy

Juuri ennen näytteenottoa pidetään voiöjyä sisältävää astiaa 40-50 °C:ssa lämpökaapissa kunnes öljy on sulanut täysin. Sekoitetaan näyte pyörivällä liikkeellä tai sekoittamalla välttäen liian voimakkaasta sekoittamisesta aiheutuvia ilmakuplia. Punnitaan 1 mg:n tarkkuudella noin 4 g (SM g) voiöljyä 100 ml:n mittapulloon.

5.1.3 Kerma

Lämmitetään näyte vesihauteessa tai lämpökaapissa 35-40 °C:n lämpötilassa. Sekoitetaan tasaiseksi pyörivällä liikkeellä ja tarvittaessa sekoittamalla. Jäähdytetään näyte nopeasti 20 +- 2 °C:seen. Jollei näyte ole homogeeninen, toistetaan sama menettely. Punnitaan 1 mg:n tarkkuudella noin 10 g (SM g) kermaa 100 ml:n mittapulloon.

5.2 Testiliuoksen valmistus

Lisätään noin 75 ml uuttoliuosta (4.4) testiannokseen (5.1.1, 5.1.2 tai 5.1.3), sekoitetaan tai ravistellaan voimakkaasti noin 15 minuutin ajan ja täytetään merkkiin uuttoliuoksella (4.4). Siirretään noin 10 ml tätä uutetta tulpalla varustettuun koeputkeen. Sijoitetaan koeputki pakastimeen (3.1) noin 30 minuutiksi. Sentrifugoidaan kylmää uutetta 5 minuuttia, noin 2000 kierrosta minuutissa, ja dekantoidaan viipymättä. Annetaan dekantoidun liuoksen jäähtyä huoneenlämpöiseksi. Pipetoidaan 5 ml dekantoitunutta liuosta 100 ml:n mittapulloon ja täytetään merkkiin vedellä. Suodatetaan osa siitä kalvosuodattimen läpi (3.3). Suodos on valmis HPLC-määritykseen.

5.3 Kalibrointi

Pipetoidaan 5 ml vanilliinin standardiliuosta (4.5.2) 100 ml:n mittapulloon. Lisätään 5 ml uuttoliuosta (4.4) ja täytetään merkkiin vedellä. Tämä liuos sisältää 0,5 μg/ml vanilliinia.

5.4 Määrittäminen HPLC-menetelmällä

Annetaan kromatografialaitteen stabiloitua noin 30 minuutin ajan. Injisoidaan standardiliuos (5.3). Toistetaan kunnes kahden perättäisen injektoinnin piikkien pinta-alojen tai korkeuksien välinen ero on alle 2 %. Edellä kuvatuissa olosuhteissa vanilliinin retentioaika on noin 9 minuuttia. Analysoidaan standardiliuos (5.3) kahdesti injisoimalla 20 μl. Injisoidaan 20 μl testiliuosta (5.2). Määritetään saadun vanilliinipiikin pinta-ala tai korkeus. Toistetaan standardiliuoksen (5.3) rinnakkaismääritys, kun testinäytettä on injisoitu 10 kertaa (5.2).

6. Tulosten laskeminen

Lasketaan vanilliinipiikkien keskimääräinen piikin pinta-ala (tai korkeus) (AC) rinnakkaismäärityksistä molempien testiliuossarjojen alussa ja lopussa (yhteensä 4 pinta-alaa tai korkeutta).

Lasketaan vastekerroin (R):

>VIITTAUS KAAVIOON>

jossa CM on vanilliinin massa milligrammoina (4.5.1).

Testinäytteen vanilliinipitoisuus (C, mg/kg) saadaan kaavasta

>VIITTAUS KAAVIOON>

jossa:

AS= testinäytteen vanilliinipiikin pinta-ala

SM= testinäytteen massa grammoina (5.1.1, 5.1.2 tai 5.1.3).

Kun vanilliinipitoisuus analysoidaan kermasta, merkkiainepitoisuus on ilmaistava milligrammoina merkkiainetta/kilogrammassa voirasvaa. Tämä saadaan kertomalla C tekijällä 100/f, jossa f on kerman rasvapitoisuus prosentteina (m/m).

20= kerroin, jolla otetaan huomioon standardi- ja testinäytteiden laimennokset

0,96= korjauskerroin testinäytteen ensimmäisen laimennoksen rasvapitoisuudelle

Huomautus:

Piikkien pinta-alojen sijasta voidaan käyttää piikkien korkeuksia (ks. 8.3 kohta).

7. Menetelmän tarkkuus

7.1 Toistettavuus (r)

Saman suorittajan samaa laitteistoa käyttäen samasta testiaineistosta mahdollisimman lähellä toisiaan tekemän kahden määrityksen tulosten välinen ero ei saa olla yli 16 mg/kg.

7.2 Uusittavuus (R)

Kahden eri laboratorioissa eri laitteistoa käyttäen samasta testiaineistosta suoritetun määrityksen tulosten välinen ero ei saa olla yli 27 mg/kg.

8. Toleranssirajat

8.1 Merkitystä tuotteesta on otettava kolme näytettä homogeenisuuden tarkistamiseksi.

8.2 Vaniljasta tai synteettisestä vanilliinista saatu merkkiaine.

8.2.1 4-hydroksi-3-metoksibentsaldehydiä lisätään 250 g voiöljy- tai voitonnia kohden. Kun merkitään kermaa, lisätään 250 g voirasvatonnia kohden.

8.2.2 Tuoteanalyysin kolmesta näytteestä saatujen tulosten avulla tarkistetaan lisättyjen merkkiaineiden määrä ja homogeenisuus. Pienintä näistä arvoista verrataan seuraaviin raja-arvoihin (kun kriittinen ero 95 %:n todennäköisyydellä (DCr95) otetaan huomioon):

- 221,0 mg/kg (95 % pienimmästä lisättävästä määrästä)

- 159,0 mg/kg (70 % pienimmästä lisättävästä määrästä).

Merkkiaineen pitoisuutta näytteessä, joka antaa pienimmän tuloksen, käytetään interpoloinnissa arvojen 221,0 mg/kg ja 159,0 mg/kg välillä.

8.3 Vaniljakodista tai näiden kokonaisuutteista saatu merkkiaine

8.3.1 4-hydroksi-3-metoksibentsaldehydiä lisätään 100 g voiöljy- tai voitonnia kohden. Kun merkitään kermaa, lisätään 100 g voirasvatonnia kohden.

8.3.2 Tuoteanalyysin kolmesta näytteestä saatujen tulosten avulla tarkistetaan lisättyjen merkkiaineiden määrä ja homogeenisuus. Pienintä näistä arvoista verrataan seuraaviin raja-arvoihin (kun kriittinen ero 95 %:n todennäköisyydellä (DCr95) otetaan huomioon):

- 79,0 mg/kg (95 % pienimmästä lisättävästä määrästä)

- 54,0 mg/kg (70 % pienimmästä lisättävästä määrästä).

Merkkiaineen pitoisuutta näytteessä, joka antaa pienimmän tuloksen, käytetään interpoloinnissa arvojen 79,0 mg/kg ja 54,0 mg/kg välillä.

9. Huomautuksia

9.1 Toistettavuus r on arvo, jonka alapuolella samalla menetelmällä samasta testiaineistosta samoissa olosuhteissa (sama laitteisto, sama laboratorio ja lyhyt aikaväli) saadun kahden yksittäisen testituloksen välinen absoluuttinen ero sijaitsee tietyllä todennäköisyydellä; jollei muita tietoja ole, todennäköisyys on 95 %.

9.2 Uusittavuus R on arvo, jonka alapuolella samalla menetelmällä samasta testiaineistosta eri olosuhteissa (eri suorittaja, eri laitteisto, eri laboratorio ja/tai eri ajankohta) saadun kahden yksittäisen testituloksen välinen absoluuttinen ero sijaitsee tietyllä todennäköisyydellä; jollei muita tietoja ole, todennäköisyys on 95 %.

9.3 Lisätyn vanilliinin takaisinsaanto tasolla 250 mg/kg voiöljyä vaihtelee välillä 97,0-103,8. Todettu keskimääräinen pitoisuus on ollut testeissä 99,9 % ja sen standardipoikkeama 2,7 %.

9.4 Standardiliuos sisältää 5 % uuttoliuosta, joka kompensoi piikin levenemisen, joka johtuu siitä, että näyteliuoksissa on 5 % uuttoliuosta. Tämän ansiosta kvantitatiivinen määritys voidaan suorittaa piikkien korkeuden avulla.

9.5 Analyysi perustuu lineaariseen kalibrointikäyrään, jonka leikkauspiste on nollassa.

Lineaarisuus tulisi tarkastaa käyttäen standardiliuoksen (4.5.2) sopivia laimennoksia ensimmäistä analyysiä suoritettaessa ja sen jälkeen säännöllisin väliajoin sekä aina, kun HPLC-laitteistoon on tehty muutoksia tai sitä on korjattu.

LIITE XIII

(9 artikla)

BEETA-APO-8'-KAROTEENIHAPON ETYYLIESTERIN SPEKTROMETRINEN MÄÄRITYS VOISTA JA VOIÖLJYSTÄ

1. Tarkoitus ja soveltamisala

Tässä kuvataan menetelmä beeta-apo-8'-karoteenihapon (apokaroteeniesteri) etyyliesterin kvantitatiiviseksi määrittämiseksi voista ja voiöljystä. Apokaroteeniesteri on kaikkien sellaisten menetelmässä kuvatuissa olosuhteissa valmistetussa uutteessa esiintyvien aineiden summa, jotka absorboivat valoa aallonpituudella 440 nm.

2. Periaate

Voirasva liuotetaan liuotinbensiiniin ja absorbanssi mitataan aallonpituudella 440 nm. Apokaroteeniesterin pitoisuus määritetään ulkoiseen standardiin vertaamalla.

3. Laitteet

3.1 Mittapipettejä, jakovälit 0,25; 0,50; 0,75 ja 1,0 ml.

3.2 Spektrofotometri, joka sopii käytettäväksi aallonpituudella 440 nm (ja 447-449 nm) ja jonka kyvettien valotie on 1 cm.

3.3 Mittapulloja, 20 ml ja 100 ml.

3.4 Analyysivaaka, jonka tarkkuus on 0,1 mg.

4. Reagenssit

Kaikkien reagenssien on oltava tunnustettua analyysilaatua.

4.1 Apokaroteeniesterin suspensio (noin 20 %).

4.1.1 Suspension pitoisuus määritetään seuraavasti:

Mittapulloon (100 ml) punnitaan noin 400 mg, liuotetaan 20 ml:aan kloroformia (4.4) ja täytetään merkkiin sykloheksaanilla (4.5). Laimennetaan 5 ml tätä liuosta 100 ml:ksi sykloheksaanilla (liuos A). Laimennetaan 5 ml liuosta A 100 ml:ksi sykloheksaanilla. Mitataan absorbanssi aallonpituudella 447-449 nm (mitataan maksimi käyttäen sykloheksaania nollanäytteenä 1 cm:n kyveteillä).

>VIITTAUS KAAVIOON>

Amax= mittaliuoksen maksimiabsorbanssi

A= näytteen paino (g)

2550= liuoksen A (1 %, 1 cm) arvo

Suspension puhtaus on P (%).

Huomautus:

Apokaroteeniesterin suspensio on herkkä ilmalle, lämmölle ja valolle. Sitä voidaan säilyttää viileässä paikassa avaamattomassa, alkuperäisessä pakkauksessaan (typessä) noin 12 kuukautta. Avaamisen jälkeen sisältö on käytettävä nopeasti.

4.1.2 Apokaroteeniesterin standardiliuos, noin 0,2 mg/ml

Punnitaan 0,1 mg:n tarkkuudella noin 0,100 g apokaroteeniesterin suspensiota (4.1.1) (Wg), liuotetaan liuotinbensiiniin (4.2), siirretään kvantitatiivisesti tilavuudeltaan 100 ml:n mittapulloon ja täytetään merkkiin liuotinbensiinillä.

Tämä liuos sisältää (W.P) 10 mg/ml apokaroteeniesteriä.

Huomautus:

Liuosta on säilytettävä viileässä paikassa valolta suojattuna. Käyttämätön liuos säilyy kuukauden.

4.2 Liuotinbensiini (40-60 °C).

4.3 Natriumsulfaatti, vedetön, rakeina, kuivattu ennalta 102 °C:ssa kahden tunnin ajan.

4.4 Kloroformi

4.5 Sykloheksaani

5. Suoritus

5.1 Koenäytteen esikäsittely

5.1.1 Voiöljy

Näyte sulatetaan lämpökaapissa noin 45 °C:ssa.

5.1.2 Voi

Näyte sulatetaan lämpökaapissa noin 45 °C:ssa ja suodatetaan edustava osa noin 10 g vedetöntä natriumsulfaattia (4.3) sisältävän suodattimen läpi voimakkaalta luonnon- ja keinovalolta suojatussa ympäristössä pitäen lämpötila 45 °C:ssa. Kerätään sopiva määrä voirasvaa.

5.2 Määritys

Punnitaan 1 mg:n tarkkuudella noin 1 g voiöljyä tai voirasvaa (5.1.2), (Mg). Siirretään kvantitatiivisesti 20 ml:n (V ml) mittapulloon liuotinbensiiniä (4.2) käyttäen, täytetään merkkiin ja sekoitetaan huolellisesti.

Siirretään määräosa 1 cm:n kyvettiin ja mitataan absorbanssi aallonpituudella 440 nm käyttäen liuotinbensiiniä nollanäytteenä. Liuoksessa esiintyvän apokaroteeniesterin pitoisuus saadaan kalibrointikäyrästä (C μg/ml).

5.3 Kalibrointikäyrä

Pipetoidaan 0; 0,25; 0,5; 0,75 ja 1,0 ml apokaroteeniesterin standariliuosta (4.1.2) viiteen 100 ml:n mittapulloon. Laimennetaan ja täytetään merkkiin liuotinbensiinillä (4.2) ja sekoitetaan.

Liuosten pitoisuudet vaihtelevat välillä 0-2 μg/ml, ja ne lasketaan tarkasti vertaamalla standardiliuoksen (4.1.2) pitoisuuteen (WP/10 mg/ml). Mitataan absorbanssit aallonpituudella 440 nm käyttäen liuotinbensiiniä (4.2) vertailuarvona.

Piirretään absorbanssiarvot y-akselille apokaroteeniesterin pitoisuuden funktiona x-akselilla.

6. Tulosten laskeminen

6.1 Apokaroteeniesterin pitoissu, ilmaistuna yksiköissä mg/kg, saadaan seuraavasti:

Voiöljy (C.V)/M

Voi: 0,82 (C.V)M

jossa:

C= apokaroteeniesterin pitoisuus (μg/ml) kalibrointikäyrältä (5.3) luettuna

V= koeliuoksen (5.2) määrä (ml)

M= näytteen (5.2) massa (g)

0,82= korjauskerroin voin voirasvapitoisuudelle

7. Menetelmän tarkkuus

7.1 Toistettavuus

7.1.1 Voin analyysi

Saman suorittajan samaa laitteistoa käyttäen samasta testiaineistosta mahdollisimman lähellä toisiaan tekemän kahden määrityksen tulosten välinen ero ei saa olla yli 1,4 mg/ml.

7.1.2 Voiöljyn analyysi

Saman suorittajan samaa laitteistoa käyttäen samasta testiaineistosta mahdollisimman lähellä toisiaan tekemän kahden määrityksen tulosten välinen ero ei saa olla yli 1,6 mg/ml.

7.2 Uusittavuus

7.2.1 Voin analyysi

Kahden eri laboratorioissa eri laitteistoa käyttäen samasta testiaineistosta suoritetun määrityksen tulosten välinen ero ei saa olla yli 4,7 mg/kg.

7.2.2 Voiöljyn analyysi

Kahden eri laboratorioissa eri laitteistoa käyttäen samasta testiaineistosta suoritetun määrityksen tulosten välinen ero ei saa olla yli 5,3 mg/kg.

7.3 Teknisten tietojen lähde

Tarkkuutta koskevat tiedot määritettiin vuonna 1995 suoritetusta kokeesta, johon osallistui 11 laboratoriota ja jossa määritettiin 12 merkittyä näytettä (kuusi rinnakkaista sokeanäytettä) voin osalta ja 12 merkittyä näytettä (kuusi rinnakkaista sokeanäytettä) voiöljyn osalta.

8. Toleranssirajat

8.1 Merkitystä tuotteesta on otettava kolme näytettä sen tarkastamiseksi, että tuote on merkitty oikein.

8.2 Voi

8.2.1 Kokonaisarvo voille, tausta-absorbanssi mukaan lukien, on 22 mg/kg.

8.2.2 Tuoteanalyysin kolmesta näytteestä saatujen tulosten avulla tarkistetaan lisättyjen merkkiaineiden määrä ja homogeenisuus, ja pienintä näistä arvoista verrataan seuraaviin raja-arvoihin (kun kriittinen ero 95 %:n todennäköisyydellä (CrD95) otetaan huomioon):

- 18,0 mg/kg (95 % pienimmästä lisättävästä määrästä)

- 13,0 mg/kg (70 % pienimmästä lisättävästä määrästä).

Merkkiaineen pitoisuutta näytteessä, joka antaa pienimmän tuloksen, käytetään interpoloinnissa arvojen 18,0 mg/kg ja 13,0 mg/kg välillä.

8.3 Voiöljy

8.3.1 Kokonaisarvo voiöljylle, tausta-absorbanssi mukaan lukien, on 24 mg/kg.

8.3.2 Tuoteanalyysin kolmesta näytteestä saatujen tulosten avulla tarkistetaan lisättyjen merkkiaineiden määrä ja homogeenisuus, ja pienintä näistä arvoista verrataan seuraaviin raja-arvoihin (kun kriittinen ero 95 %:n todennäköisyydellä (CrD95) otetaan huomioon):

- 20,0 mg/kg (95 % pienimmästä lisättävästä määrästä)

- 14,0 mg/kg (70 % pienimmästä lisättävästä määrästä).

Merkkiaineen pitoisuutta näytteessä, joka antaa pienimmän tuloksen, käytetään interpoloinnissa arvojen 20,0 mg/kg ja 14,0 mg/kg välillä.

LIITE XIV

(9 artikla)

VOIN JA VOIÖLJYN SISÄLTÄMÄN SITOSTEROLIN TAI STIGMASTEROLIN MÄÄRITYS KAASUKROMATOGRAFISESTI KAPILLAARIKOLONNILLA

1. Tarkoitus ja soveltamisala

Tässä kuvataan menetelmä voin ja voiöljyn sisältämän sitosterolin tai stigmasterolin kvantitatiiviseksi määrittämiseksi. Sitosteroli on (β-sitosterolin ja 22-dihydro-β-sitosterolin summa, kun muita sitosteroleita pidetään merkityksettöminä.

2. Periaate

Voi tai voiöljy saippuoidaan kaliumhydroksidin avulla etanoliliuoksessa ja saippuoitumattomat osat uutetaan eetterillä.

Sterolit muutetaan trimetyylisilyylieettereiksi ja määritetään kaasukromatografisesti kapillaarikolonnin avulla suhteessa sisäiseen standardiin betuliiniin.

3. Välineet

3.1 Saippuoimispullo, 150 ml, varustettuna palautusjäähdyttimellä, jossa on lasihiokset.

3.2 Erotussuppiloita, 500 ml.

3.3 Pulloja, 250 ml.

3.4 Paineentasauspulloja, 250 ml tai sisällöltään vastaavia, tarkoitettu pois heitettävän eetterin keräämiseen.

3.5 Lasikolonni, 350 mm x 20 mm, varustettuna hioslasiliitoksella.

3.6 Vesihaude tai tasalämpöinen mantteli.

3.7 Pieniä reaktiopulloja, 2 ml.

3.8 Kaasukromatografialaitteisto, jota voidaan käyttää kapillaarikolonnin kanssa ja johon kuuluu:

3.8.1 termostoitu kolonniuuni, joka ylläpitää halutun lämpötilan +- 1 °C:n tarkkuudella;

3.8.2 lämpötilasäätöinen injektori;

3.8.3 liekki-ionisaatiodetektori ja signaalinmuunnin vahvistin;

3.8.4 integraattori-piirturi, jota voidaan käyttää signaalinmuunnin-vahvistimen (3.8.3) kanssa.

3.9 Kvartsilasinen kapillaarikolonni, joka on kokonaan päällystetty BP 1:llä tai vastaavalla aineella tasaisesti 0,25 μm:n paksuudella; kolonnilla on pystyttävä erottamaan lanosterolin ja sitosterolin trimetyylisilyylijohdannaiset. Tähän tarkoitukseen sopii kolonni BP 1 (pituus 12 m ja sisähalkaisija 0,2 mm).

3.10 Mikroruisku, 1 μl, kärki karkaistua terästä, kaasukromatografiaa varten.

4. Reagenssit

Kaikkien reagenssien on oltava tunnustettua analyysilaatua. Veden on oltava tislattua tai puhtaudeltaan vähintään sitä vastaavaa.

4.1 Etanoli, puhtaus vähintään 95 %

4.2 Kaliumhydroksidi, 60 % liuos, liuotetaan 600 g kaliumhydroksidia (vähintään 85 %) veteen ja täytetään 1 litraksi vedellä

4.3 Betuliini, puhtaus vähintään 99 %

4.3.1 Betuliiniliuoksia dietyylieetterissä (4.4)

4.3.1.1 Sitosterolin määritykseen käytettävän betuliiniliuoksen pitoisuuden on oltava 1,0 mg/ml.

4.3.1.2 Stigmasterolin määritykseen käytettävän betuliiniliuoksen pitoisuuden on oltava 0,4 mg/ml.

4.4 Dietyylieetteri, analyysilaatua (ei sisällä peroksideja tai jäämiä)

4.5 Natriumsulfaatti, vedetön, rakeina, kuivattu ennalta 102 °C:ssa 2 tunnin ajan

4.6 Silylointireagenssi, esimerkiksi TRI-SIL (Pierce Chemical Co., Cat nro 49001) tai vastaava. (Varoitus: TRI-SIL on syttyvää, myrkyllistä, syövyttävää ja voi olla karsinogeenista. Laboratoriohenkilökunnan on tunnettava hyvin TRI-SIL:iin sovellettavat turvallisuusohjeet ja heidän on noudatettava välttämättömiä varotoimenpiteitä).

4.7 Lanosteroli

4.8 Sitosteroli, puhtaus tunnettu, vähintään 90 % (P)

Huomautus 1:

Kalibrointiin käytettävien standardiaineiden puhtaus on määritettävä standardimenetelmän avulla. Lähdetään olettamuksesta, että kaikki näytteessä olevat sterolit esiintyvät kromatogrammissa, että piikkien kokonaispinta-ala edustaa 100 %:sti steroleja ja että sterolit antavat saman detektorivasteen. Järjestelmän lineaarisuus on tarkistettava kyseeseen tulevilla pitoisuusalueilla.

4.8.1 Sitosterolin standardiliuos: valmistetaan 0,001 mg/ml:n tarkkuudella liuos, joka sisältää noin 0,5 mg/ml (W1) sitosterolia (4.8) dietyylieetterissä (4.4).

4.9 Stigmasteroli, puhtaus tunnettu, vähintään 90 % (P).

4.9.1 Stigmasterolin standardiliuos: valmistetaan 0,001 mg/ml:n tarkkuudella liuos, joka sisältää noin 0,2 mg/ml (W1) stigmasterolia (4.9) dietyylieetterissä (4.4).

4.10 Seos resoluutiotestiä varten: valmistetaan liuos, joka sisältää 0,05 mg/ml lanosterolia (4.7) ja 0,5 mg/ml sitosterolia (4.8) dietyylieetterissä (4.4).

5. Suoritus

5.1 Standardiliuosten valmistus kromatografiaa varten: lisätään sisäinen standardiliuos (4.3.1) sopivaan sterolistandardiliuokseen samanaikaisesti saippuoidun näytteen (5.2.2) kanssa.

5.1.1 Sitosterolin kromatografinen standardiliuos: siirretään 1 ml sitosterolin standardiliuosta (4.8.1) kahteen reaktiopulloon (3.7) ja poistetaan eetteri typpivirran avulla. Lisätään 1 ml sisäistä standardiliuosta (4.3.1.1) ja poistetaan eetteri typpivirran avulla.

5.1.2 Stigmasterolin kromatografinen standardiliuos: siirretään 1 ml stigmasterolin standardiliuosta (4.9.1) kahteen reaktiopulloon (3.7) ja poistetaan eetteri typpivirran avulla. Lisätään 1 ml sisäistä standardiliuosta (4.3.1.2) ja poistetaan eetteri typpivirran avulla.

5.2 Saippuoitumattomien osien valmistus

5.2.1 Sulatetaan voinäyte enintään 35 °C:n lämpötilassa. Sekoitetaan se huolellisesti.

Punnitaan 1 mg:n tarkkuudella noin 1 g voita (W2) tai voiöljyä (W2) 150 ml:n pulloon (3.1). Lisätään 50 ml etanolia (4.1) ja 10 ml kaliumhydroksidiliuosta (4.2). Liitetään pulloon palautusjäähdytin ja kuumennetaan noin 75 °C:ssa 30 minuuttia. Irrotetaan jäähdytin ja annetaan pullon jäähtyä huoneenlämpötilaan.

5.2.2 Lisätään pulloon 1,0 ml sisäistä standardiliuosta (4.3.1.1, jos määritetään sitosterolia, tai 4.3.1.2, jos määritetään stigmasterolia). Sekoitetaan huolellisesti. Siirretään pullon sisältö kvantitatiivisesti 500 ml:n erotussuppiloon (3.2). Huuhdellaan pullo 50 ml:lla vettä ja tämän jälkeen 250 ml:lla dietyylieetteriä (4.4). Erotussuppiloa ravistetaan voimakkaasti 2 minuutin ajan ja annetaan faasien erottua. Poistetaan alempi vesifaasi ja huuhdellaan eetterifaasi ravistellen neljällä peräkkäisellä 100 ml:n määräosalla vettä.

Huomautus 2:

Emulsion muodostumisen välttämiseksi on välttämätöntä, että kaksi ensimmäistä vesihuuhtelua suoritetaan varoen (10 kertaa käännellen). Kolmannessa huuhtelussa voidaan ravistella voimakkaasti 30 sekuntia. Jos emulsio muodostuu, se voidaan poistaa lisäämällä 5-10 ml etanolia. Jos etanolia lisätään, on välttämätöntä suorittaa vielä kaksi voimakasta vesihuuhtelua.

5.2.3 Kaadetaan kirkas, saippuaton eetterifaasi lasikolonniin (3.5), joka sisältää 30 g vedetöntä natriumsulfaattia (4.5). Kerätään eetteri 250 ml:n pulloon (3.3). Lisätään kiehumakiviä ja haihdutetaan vesihauteessa tai tasalämpöisessä manttelissa lähes kuivaksi huolehtien siitä, että poistettavat liuottimet kerätään talteen.

Huomautus 3:

Jos näytteiden uutteet haihdutetaan kuivaksi liian korkeassa lämpötilassa, voi tapahtua sterolihäviöitä.

5.3 Trimetyylisilyylieettereiden valmistus

5.3.1 Siirretään pulloon jäänyt eetteriliuos 2 ml:n reaktiopulloon (3.7) käyttäen apuna 2 ml:aa eetteriä ja poistetaan eetteri typpivirralla. Pestään pullo kahdella ylimääräisellä 2 ml:n määräosalla eetteriä siirtäen ne reaktiopulloon ja poistaen eetteri kummallakin kerralla typellä.

5.3.2 Näyte silyloidaan lisäämällä 1 ml TRI-SILiä (4.6). Suljetaan pullo ja ravistetaan voimakkaasti aineen liukenemiseksi. Jos liukeneminen on epätäydellistä, lämmitetään 65-70 °C:seen. Annetaan seistä vähintään 5 minuutin ajan ennen injektointia kaasukromatografiin. Standardit silyloidaan samalla tavoin kuin näytteet. Erotuskyvyn testaamiseen käytettävä seos (4.10) silyloidaan samalla tavoin kuin näytteet.

Huomautus 4:

Silyloinnin on tapahduttava vedettömissä oloissa. Betuliinin epätäydellinen silyloituminen näkyy betuliinipiikin lähellä olevana toisena piikkinä.

Etanolin läsnäolo silyloinnin aikana häiritsee silylointia. Tämä voi olla seurausta riittämättömästä huuhtelusta uuton aikana. Jos tämä ongelma toistuu, uuttovaiheeseen voidaan lisätä viides huuhtelu, joka tapahtuu ravistellen voimakkaasti 30 sekunnin ajan.

5.4 Kaasukromatografinen analyysi

5.4.1 Ajon olosuhteiden valinta

Kaasukromatografi ohjelmoidaan valmistajan ohjeiden mukaisesti.

Ohjeelliset ajon olosuhteet ovat seuraavat:

- kolonnin lämpötila: 265 °C

- injektorin lämpötila: 280 °C

- detektorin lämpötila: 300 °C

- kantajakaasun virtausnopeus: 0,6 ml/min

- vedyn paine: 84 kPa

- ilmanpaine: 155 kPa

- jakosuhde: 10/1-50/1; jakosuhde on optimoitava valmistajan ohjeiden mukaisesti ja detektorin vasteen lineaarisuus on sitten validoitava kyseiselle pitoisuusalueelle.

Huomautus 5:

On erityisen tärkeää, että höyrystymiskammio puhdistetaan säännöllisesti.

- injektoitavan aineen määrä: 1 μl TMSE-liuosta.

Annetaan järjestelmän tasapainottua, kunnes saadaan riittävän stabiili vaste ennen minkään analyysin aloittamista.

Näitä olosuhteita voidaan muuttaa kolonnin ja kaasukromatografin ominaisuuksien mukaan, jotta saadaan seuraavat edellytykset täyttävät kromatogrammit:

- sitosterolin piikin on erotuttava riittävästi lanosterolista. Kuviossa 1 esitetään tyypillisen kromatogrammi, jollainen on saatava erotustestiin käytetystä silyloidusta seoksesta (4.10).

- seuraavien steroleiden suhteellisten retentioaikojen olisi oltava suunnilleen:

kolesteroli: 1,0

stigmasteroli: 1,3

sitosteroli: 1,5

betuliini: 2,5

- betuliinin retentioajan olisi oltava noin 24 minuuttia.

5.4.2 Analyysin suoritus

Injektoidaan 1 μl silyloitua standardiliuosta (stigmasterolia tai sitosterolia) ja säädetään integraattorin kalibrointiparametrit.

Injektoidaan uudelleen 1 μl silyloitua standardiliuosta vastekertoimen määrittämiseksi suhteessa betuliiniin.

Injektoidaan 1 μl silyloitua näyteliuosta ja mitataan piikkien pinta-ala. Standardit on ajettava aina ennen ja jälkeen näytesarjan.

Standardien injektointi voidaan yleensä suorittaa kuuden näytteen sarjan jälkeen.

Huomautus 6:

Stigmasterolipiikin integroinnin olisi käsitettävä kuviossa 2 b olevassa 1, 2 ja 3 kohdassa osoitettujen pisteiden välinen alue.

Arvioitaessa sitosterolia kokonaisuudessaan sitosterolipiikin integroinnin olisi sisällettävä 22-dihydro-β-sitosterolipiikin (stigmastanoli) pinta-ala, joka eluoituu välittömästi sitosterolin jälkeen (kuvio 3 b).

6. Tulosten laskeminen

6.1 Määritetään kahden standardin steroli- ja betuliinipiikkien pinta-ala jokaisen sarjan alussa ja lopussa ja lasketaan R1:

>VIITTAUS KAAVIOON>

Määritetään steroli- (stigmasteroli tai sitosteroli) ja betuliinipiikkien pinta-ala näytteestä ja lasketaan R2:

>VIITTAUS KAAVIOON>

W1= sterolin määrä (mg) 1 ml:ssa standardiliuosta (4.8.1 tai 4.9.1)

W2= näytteen paino (g) (5.2.1)

P= sterolistandardiliouksen puhtaus (4.8 tai 4.9).

>VIITTAUS KAAVIOON>

7. Menetelmän tarkkuus

7.1 Voi

7.1.1 Toistettavuus

7.1.1.1 Stigmasteroli

Saman suorittajan samaa laitteistoa käyttäen samasta testiaineistosta mahdollisimman lähellä toisiaan tekemän kahden määrityksen tulosten välinen ero ei saa olla yli 19,3 mg/kg.

7.1.1.2 Sitosteroli

Saman suorittajan samaa laitteistoa käyttäen samasta testiaineistosta mahdollisimman lähellä toisiaan tekemän kahden määrityksen tulosten välinen ero ei saa olla yli 23,0 mg/kg.

7.1.2 Uusittavuus

7.1.2.1 Stigmasteroli

Kahden määrityksen, jotka suoritetaan eri laboratorioissa eri laitteistoja käyttäen täysin samasta koemateriaalista, tulosten välinen ero ei saa olla yli 31,9 mg/kg.

7.1.2.2 Sitosteroli

Kahden määrityksen, jotka suoritetaan eri laboratorioissa eri laitteistoja käyttäen täysin samasta koemateriaalista, tulosten välinen ero ei saa olla yli 8,7 % suhteessa määritysten keskiarvoon.

7.1.3 Tarkkuutta koskevien tietojen lähde

Tarkkuutta koskevat tiedot määritettiin vuonna 1992 suoritetusta kokeesta, johon osallistui 8 laboratoriota ja jossa määritettiin kuusi näytettä (kolme rinnakkaista sokeanäytettä) stigmasterolin osalta ja kuusi näytettä (kolme rinnakkaista sokeanäytettä) sitosterolin osalta.

7.2 Voiöljy

7.2.1 Toistettavuus

7.2.1.1 Stigmasteroli

Saman suorittajan samaa laitteistoa käyttäen samasta testiaineistosta mahdollisimman lähellä toisiaan tekemän kahden määrityksen tulosten välinen ero ei saa olla yli 10,2 mg/kg.

7.2.1.2 Sitosteroli

Saman suorittajan samaa laitteistoa käyttäen samasta testiaineistosta mahdollisimman lähellä toisiaan tekemän kahden määrityksen tulosten välinen ero ei saa olla yli 3,6 % suhteessa määritysten keskiarvoon.

7.2.2 Uusittavuus

7.2.2.1 Stigmasteroli

Kahden määrityksen, jotka suoritetaan eri laboratorioissa eri laitteistoja käyttäen täysin samasta koemateriaalista, tulosten välinen ero ei saa olla yli 25,3 mg/kg.

7.2.2.2 Sitosteroli

Kahden määrityksen, jotka suoritetaan eri laboratorioissa eri laitteistoja käyttäen täysin samasta koemateriaalista, tulosten välinen ero ei saa olla yli 8,9 % suhteessa määritysten keskiarvoon.

7.2.3 Tarkkuutta koskevien tietojen lähde

Tarkkuutta koskevat tiedot määritettiin vuonna 1991 suoritetusta kokeesta, johon osallistui yhdeksän laboratoriota ja jossa määritettiin kuusi näytettä (kolme rinnakkaista sokeanäytettä) stigmasterolin osalta ja kuusi näytettä (kolme rinnakkaista sokeanäytettä) sitosterolin osalta.

8. Toleranssirajat

8.1 Merkitystä tuotteesta on otettava kolme näytettä sen tarkastamiseksi, että tuote on merkitty oikein.

8.2 Voi

8.2.1 Stigmasteroli

8.2.1.1 Stigmasterolin osalta lisätään 150 g stigmasterolia (puhtaus vähintään 95 %) voitonnia kohden eli 142,5 mg/kg tai 170 g stigmasterolia (puhtaus vähintään 85 %) voitonnia kohden eli 144,5 mg/kg.

8.2.1.2 Tuoteanalyysin kolmesta näytteestä saatujen tulosten avulla tarkistetaan lisättyjen merkkiaineiden määrä ja homogeenisuus, ja pienintä näistä arvoista verrataan seuraaviin raja-arvoihin (kun kriittinen ero 95 %:n todennäköisyydellä (CrD95) otetaan huomioon):

- 116,0 mg/kg (95 % pienimmästä lisättävästä määrästä, kun stigmasterolin puhtaus on 95 %)

- 118,0 mg/kg (95 % pienimmästä lisättävästä määrästä, kun stigmasterolin puhtaus on 85 %)

- 81,0 mg/kg (70 % pienimmästä lisättävästä määrästä, kun stigmasterolin puhtaus on 95 %)

- 82,0 mg/kg (70 % pienimmästä lisättävästä määrästä, kun stigmasterolin puhtaus on 85 %).

Merkkiaineen pitoisuutta näytteessä, joka antaa pienimmän tuloksen, käytetään interpoloinnissa arvojen 116,0 mg/kg ja 81,0 mg/kg välillä tai arvojen 118,0 mg/kg ja 82,0 mg/kg välillä.

8.2.2 Sitosteroli

8.2.2.1 Sitosterolin osalta lisätään 600 g sitosterolia (puhtaus vähintään 90 %) voitonnia kohden eli 540 mg/kg.

8.2.2.2 Tuoteanalyysin kolmesta näytteestä saatujen tulosten avulla tarkistetaan lisättyjen merkkiaineiden määrä ja homogeenisuus, ja pienintä näistä arvoista verrataan seuraaviin raja-arvoihin (kun kriittinen ero 95 %:n todennäköisyydellä (CrD95) otetaan huomioon):

- 486,0 mg/kg (95 % pienimmästä lisättävästä määrästä, kun sitosterolin puhtaus on 90 %)

- 358,0 mg/kg (70 % pienimmästä lisättävästä määrästä, kun sitosterolin puhtaus on 90 %).

Merkkiaineen pitoisuutta näytteessä, joka antaa pienimmän tuloksen, käytetään interpoloinnissa arvojen 486,0 mg/kg ja 358,0 mg/kg välillä.

8.3 Voiöljy

8.3.1 Stigmasteroli

8.3.1.1 Stigmasterolin osalta lisätään 150 g stigmasterolia (puhtaus vähintään 95 %) voiöljytonnia kohden eli 142,5 mg/kg tai 170 g stigmasterolia (puhtaus vähintään 85 %) voiöljytonnia kohden eli 144,5 mg/kg.

8.3.1.2 Tuoteanalyysin kolmesta näytteestä saatujen tulosten avulla tarkistetaan lisättyjen merkkiaineiden määrä ja homogeenisuus, ja pienintä näistä arvoista verrataan seuraaviin raja-arvoihin (kun kriittinen ero 95 %:n todennäköisyydellä (CrD95) otetaan huomioon):

- 120,0 mg/kg (95 % pienimmästä lisättävästä määrästä, kun stigmasterolin puhtaus on 95 %)

- 122,0 mg/kg (95 % pienimmästä lisättävästä määrästä, kun stigmasterolin puhtaus on 85 %)

- 84,0 mg/kg (70 % pienimmästä lisättävästä määrästä, kun stigmasterolin puhtaus on 95 %)

- 86,0 mg/kg (70 % pienimmästä lisättävästä määrästä, kun stigmasterolin puhtaus on 85 %).

Merkkiaineen pitoisuutta näytteessä, joka antaa pienimmän tuloksen, käytetään interpoloinnissa arvojen 120,0 mg/kg ja 84,0 mg/kg välillä tai arvojen 122,0 mg/kg ja 86,0 mg/kg välillä.

8.3.2 Sitosteroli

8.3.2.1 Sitosterolin osalta lisätään 600 g sitosterolia (puhtaus vähintään 90 %) voiöljytonnia kohden eli 540 mg/kg.

8.3.2.2 Tuoteanalyysin kolmesta näytteestä saatujen tulosten avulla tarkistetaan lisättyjen merkkiaineiden määrä ja homogeenisuus, ja pienintä näistä arvoista verrataan seuraaviin raja-arvoihin (kun kriittinen ero 95 %:n todennäköisyydellä (CrD95) otetaan huomioon):

- 486,0 mg/kg (95 % pienimmästä lisättävästä määrästä, kun sitosterolin puhtaus on 90 %)

- 358,0 mg/kg (70 % pienimmästä lisättävästä määrästä, kun sitosterolin puhtaus on 90 %).

Merkkiaineen pitoisuutta näytteessä, joka antaa pienimmän tuloksen, käytetään interpoloinnissa arvojen 486,0 mg/kg ja 358,0 mg/kg välillä.

>PIC FILE= "L_2001037FI.004801.EPS">

>PIC FILE= "L_2001037FI.004901.EPS">

>PIC FILE= "L_2001037FI.005001.EPS">

LIITE XV

(10 artikla)

VERTAILUMENETELMÄ LEHMÄNMAIDON JA KASEINAATIN TOTEAMISEKSI UUHEN-, VUOHEN- TAI PUHVELINMAIDOSTA TAI UUHEN-, VUOHEN- JA PUHVELINMAIDON SEOKSISTA VALMISTETUISSA JUUSTOISSA

1. Tarkoitus

Lehmänmaidon ja kaseinaatin toteaminen uuhen-, vuohen- tai puhvelinmaidosta tai uuhen-, vuohen- ja puhvelinmaidon seoksista valmistetuissa juustoissa plasminolyysin jälkeisten γ-kaseiinien isoelektrisellä fokusoinnilla.

2. Soveltamisala

Menetelmä sopii käsittelemättömän ja lämpökäsitellyn lehmänmaidon ja kaseinaatin toteamiseen hyvällä herkkyydellä ja spesifistisesti uuhen-, vuohen- tai puhvelinmaidosta tai uuhen-, vuohen- ja puhvelinmaidon seoksista valmistetuissa tuoreissa ja kypsytetyissä juustoissa. Se ei sovellu maidon ja juuston toteamiseen, joita on väärennetty lämpökäsittelyillä naudan heraproteiinikonsentraateilla.

3. Menetelmän periaate

3.1 Kaseiinien eristäminen juustosta ja vertailustandardeista.

3.2 Eristettyjen kaseiinien liuottaminen ja plasmiinilla (EC.3.4.21.7) pilkkominen.

3.3 Plasmiini-käsiteltyjen kaseiinien isoelektrinen fokusointi urean läsnäollessa ja proteiinien värjäys.

3.4 Värjättyjen γ3- ja γ2-kaseiinikuvioiden (todiste lehmänmaidosta) arviointi vertaamalla näytteestä saatua kuviota kuvioihin, jotka on saatu samasta 0 % ja 1 % lehmänmaitoa sisältävien vertailustandardien geelistä.

4. Reagenssit

On käytettävä analyysilaatuisia kemikaaleja, ellei toisin mainita. Veden on oltava kahdesti tislattua tai puhtaudeltaan sitä vastaavaa.

Huom.

Seuraavia yksityiskohtaisia ohjeita sovelletaan laboratoriossa valmistettuihin ureaa sisältäviin polyakryyliamidigeeleihin, joiden mitat ovat 265 x 125 x 0,25 mm. Jos käytetään muunkokoisia ja -tyyppisiä geelejä, erotusolosuhteita voidaan joutua säätämään.

Isoelektrinen fokusointi

4.1 Reagenssit ureaa sisältävien polyakryyliamidigeelien valmistamiseksi

4.1.1 Geelin varastoliuos

Liuotetaan

4,85 g akryyliamidia

0,15 g N, N'-metyleeni-bis-akryyliamidia (BIS)

48,05 g ureaa

15,00 g glyserolia (87 % w/w)

veteen ja täydennetään 100 ml:ksi, säilytetään ruskeassa lasipullossa jääkaapissa.

Huom.

Käytetään mieluummin kaupallisesti saatavaa esisekoitettua akryyliamidi/BIS-liuosta kuin annettuja painoltaan määrättyjä hermomyrkyllisiä akryyliamideja. Kun tällainen liuos sisältää 30 % w/v akryyliamidia ja 0,8 % w/v BIS:ä, tätä on käytettävä 16,2 ml varastoliuokseen määrättyjen painojen sijaan. Varastoliuoksen säilyvyys on enintään 10 päivää; jos sen johtokyky on suurempi kuin 5 μS, on suoritettava ioninpoisto sekoittamalla sitä 2 g:n Amerblite MB-3 kanssa 30 minuutin ajan ja sitten suodatettava 0,45 μm:n kalvon läpi.

4.1.2 Geeliliuos

Valmistetaan geeliliuos sekoittamalla varastoliuokseen lisäaineita ja amfolyyttejä (ks. 4.1.1).

9,0 ml varastoliuosta

24 mg de β-alaniinia

500 μl amfolyyttiä, pH 3,5-9,5(1)

250 μl amfolyyttiä, pH 5-7(2)

250 μl amfolyyttiä, pH 6-8(3)

Geeliliuosta sekoitetaan ja poistetaan ilmaa kahden - kolmen minuutin ajan ultraäänihauteessa tai tyhjiössä.

Huom.

Geeliliuos valmistetaan välittömästi ennen sen kaatamista (ks. 6.2).

4.1.3 Katalyyttiliuokset

4.1.3.1 N, N, N', N'-tetrametyylietyleenidiamiini (TEMED)

4.1.3.2 40 % w/v ammoniumpersulfaatti (PER):

Liuotetaan 800 mg PER:ää veteen ja täydennetään 2 ml:ksi.

Huom.

Aina on käytettävä juuri valmistettua PER-liuosta.

4.2 Kontaktineste

Petroli tai parafiiniöljy.

4.3 Anodiliuos

Liuotetaan 5,77 g fosforihappoa (85 % w/w) veteen ja laimennetaan 100 ml:ksi.

4.4 Katodiliuos

Liuotetaan 2,00 g natriumhydroksia veteen ja laimennetaan 100 ml:ksi vedellä.

Näytteen valmistus

4.5 Reagenssit proteiinien eristämiseksi

4.5.1 Laimea etikkahappo (25,0 ml jääetikkaa täydennetään 100 ml:ksi vedellä).

4.5.2 Dikloorimetaani.

4.5.3 Asetoni.

4.6 Proteiinia liuottava puskuriliuos

Liuotetaan

5,75 g glyserolia (87 % w/w)

24,03 g ureaa

250 mg ditiotreitolia

veteen ja täydennetään 50 ml:ksi.

Huom:

Säilytetään jääkaapissa, säilyvyys enintään 1 viikko.

4.7 Reagenssit kaseiinien pilkkomiseksi plasmiinilla

4.7.1 Ammoniumkarbonaattipuskuri

Titrataan 0,2 mol/l ammoniumvetykarbonaattiliuos (1,58 g/100 ml vettä), joka sisältää 0,05 mol/l etyleenidiamiinitetraetikkahappoa (EDTA, 1,46 g/100 ml vettä), 0,2 mol/l ammoniumkarbonaattiliuoksella (1,92 g/100 ml vettä), joka sisältää 0,05 mol/l EDTA:a, siten että pH:ksi saadaan 8.

4.7.2 Naudan plasmiini (E.C.3.4.21.7), aktiivisuus vähintään 5 U/ml.

4.7.3 ε-Aminokapronihappoliuos entsyymi-inhibitiota varten

Liuotetaan 2,624 g ε-aminokapronihappoa (6-amino-n-heksaanihappoa) 100 ml:aan 40 % (v/v) etanolia.

4.8 Standardit

4.8.1 Varmennettuja vertailustandardeja juoksetetusta rasvattomasta uuhenmaidon ja vuohenmaidon seoksesta, joka sisältää 0 % ja 1 % lehmänmaitoa, on saatavana komission Mittaus- ja vertailumateriaalien tutkimuslaitoksesta (Institute for Reference Materials and Measurements), B-2440 Geel, Belgia.

4.8.2 Laboratorion välistandardien valmistaminen puhvelin juoksutetusta maidosta, joka sisältää 0 % ja 1 % lehmänmaitoa.

Rasvaton maito valmistetaan sentrifugoimalla joko puhvelin tai naudan käsittelemätöntä irtomaitoa 37 °C:ssa nopeudella 2500 g 20 minuutin ajan. Sen jälkeen, kun koeputki ja sen sisältö on jäähdytetty nopeasti lämpötilaan 6-8 °C, poistetaan ylempi rasvakerros kokonaan. 1 % standardin valmistamiseksi lisätään 5,00 ml naudan rasvatonta maitoa 495 ml:aan puhvelin rasvatonta maitoa 1 l:n dekantterilasissa, säädetään pH:n arvoksi 6,4 laimeaa maitohappoa (10 % w/v) lisäämällä. Säädetään lämpötila 35 °C:seen ja lisätään 100 μl vasikanjuoksetta (juoksetteen aktiivisuus 1:10000, n. 3000 U/ml), sekoitetaan 1 minuutin ajan ja sen jälkeen dekantterilasi jätetään seisomaan alumiinifoliolla päällystettynä 35 °C:seen yhdeksi tunniksi juustomassan muodostamiseksi. Kun juustomassa on muodostunut, juoksettunut maito kylmäkuivataan kokonaisuudessaan ilman enempää homogenisointia tai heran valuttamista. Kylmäkuivauksen jälkeen se jauhetaan hienoksi homogeenisen jauheen saamiseksi. 0 % standardin valmistamiseksi suoritetaan sama menettely aitoa rasvatonta puhvelinmaitoa käyttäen. Standardeja on säilytettävä lämpötilassa - 20 °C.

Huom.

On suositeltavaa tarkistaa puhvelinmaidon puhtaus plasmiini-käsiteltyjen kaseiinien isoelektrisellä fokusoinnilla ennen standardien valmistamista.

Reagenssit proteiinien värjäykseen

4.9 Kiinnitysaine

Liuotetaan 150 g trikloorietikkahappoa veteen ja täydennetään 1000 ml:ksi.

4.10 Värinpoistoliuos

Laimennetaan 500 ml metanolia ja 200 ml jääetikkaa 2000 ml:ksi tislatulla vedellä.

Huom.

Värinpoistoliuos on valmistettava tuoreeksi joka päivä; se voidaan valmistaa sekoittamalla yhtä suuret tilavuudet varastoliuoksia, 50 % (v/v) metanolia ja 20 % (v/v) jääetikkaa.

4.11 Värjäysliuokset

4.11.1 Värjäysliuos (varastoliuos 1)

Liuotetaan 3,0 g Coomassie-briljanttisinistä G 250 (C.I. 42655) 1000 ml:aan 90 % (v/v) metanolia magneettisekoittajaa käyttäen (n. 45 minuuttia), suodatetaan kahden keskinopean taitetun suodatinpaperin läpi.

4.11.2 Värjäysliuos (varastoliuos 2)

Liuotetaan 5,0 g kuparisulfaattipentahydraattia 1000 ml:aan 20 % (v/v) etikkahappoa.

4.11.3 Värjäysliuos (työskentelyliuos)

Sekoitetaan yhteen 125 ml kumpaakin varastoliuosta (4.11.1, 4.11.2) välittömästi ennen värjäystä.

Huom.

Värjäysliuos tulisi valmistaa sinä päivänä, jolloin sitä käytetään.

5. Välineet

5.1 Lasilevyjä (265 x 125 x 4 mm); kumitela (leveys 15 cm); vaakatasopöytä.

5.2 Kantaja-arkki geelille (265 x 125 mm).

5.3 Peitearkki (280 x 125 mm). Kiinnitetään teippinauha (280 x 6 x 0,25 mm) kummallekin pitkälle sivulle (ks. kuva 1).

5.4 Elektrofokusointikammio, jossa on jäähdytyslevy (esim. 265 x 125 mm) ja sopiva virtalähde (>= 2,5 kV) tai automaattinen elektroforeesilaite.

5.5 Kiertokryostaatti, säädetty termostaatilla lämpötilaan 12 +- 0,5 °C.

5.6 Sentrifugi, säädettävissä nopeuteen 3000 g.

5.7 Elektroninauhat (pituus >= 265 mm).

5.8 Muovisia tippapulloja anodi- ja katodiliuoksille.

5.9 Näyteapplikaattoreita (10 x 5 mm, viskoosia tai niukasti proteiineja absorboivaa suodatinpaperia).

5.10 Ruostumatonta terästä olevia saksia, leikkausveitsiä ja pinsettejä.

5.11 Ruostumatonta terästä olevia tai lasisia värjäys- ja värinpoistoastioita (esim. 280 x 150 mm välinetarjottimia).

5.12 Säädettävissä oleva sauvahomogenisaattori (varren halkaisija 10 mm), rpm alueella 8000-20000.

5.13 Magneettisekoittaja.

5.14 Ultraäänihaude.

5.15 Kalvojen saumaukseen sopiva laite.

5.16 Mikropipettejä, 5-25 μl.

5.17 Tyhjiöhaihdutin tai kylmäkuivain.

5.18 Vesihaude, joka on termostaatilla säädeltävissä lämpötiloihin 35 ja 40 +- 1 °C, ravistelijalla varustettuna.

5.19 Tiheysmittari, luettavissa aallonpituudella λ = 634 nm.

6. Menettely

6.1 Näytteen valmistus

6.1.1 Kaseiinien eristäminen

Punnitaan 5 g:aa vastaava määrä juuston kuiva-ainetta tai vertailustandardeja 100 ml:n sentrifugiputkeen, lisätään 60 ml tislattua vettä ja homogenisoidaan sauvahomogenisaattorilla (8000-10000 rpm). Säädetään pH-arvoon 4,6 laimean etikkahapon (4.5.1) avulla ja sentrifugoidaan (5 min, 3000 g). Dekantoidaan rasva ja hera, homogenisoidaan jäännös nopeudella 20000 rpm 40 ml:n kanssa tislattua vettä, jonka pH on säädetty arvoon 4,5 laimean etikkahapon (4.5.1) avulla, lisätään 20 ml dikloorimetaania (4.5.2), homogenisoidaan jälleen ja sentrifugoidaan (5 min, 3000 g). Poistetaan lastalla kaseiinikerros, joka kelluu vesifaasin ja orgaanisen faasin välissä (ks. kuva 2) ja dekantoidaan molemmat faasit pois. Homogenisoidaan kaseiini uudelleen 40 ml:n tislattua vettä (ks. edellä) ja 20 ml:n dikloorimetaania (4.5.2) kanssa ja sentrifugoidaan. Toistetaan menettely, kunnes molemmat uuttofaasit ovat värittömiä (2-3 kertaa). Homogenisoidaaan proteiinijäännös 50 ml:n kanssa asetonia (4.5.3) ja suodatetaan keskinopean taitetun suodatinpaperin läpi. Pestään suodatinpaperille jäävä jäännös kahdesti kahdella erillisellä 25 ml:n annoksella asetonia ja annetaan kuivua ilmassa tai typpivirrassa; tämän jälkeen jauhetaan hienoksi huhmareessa.

Huom.

Kuivat eristetyt kaseiinit on säilytettävä lämpötilassa - 20 °C.

6.1.2 β-kaseiinien pilkkominen plasmiinilla γ-kaseiinin vahvistamiseksi

Dispergoidaan 25 mg eristettyjä kaseiineja (6.1.1) 0,5 ml:aan ammoniumkarbonaattipuskuria (4.7.1) ja homogenisoidaan 20 minuutin ajan esim. ultraäänikäsittelyä käyttäen. Kuumennetaan lämpötilaan 40 °C ja lisätään 10 μl plasmiinia (4.7.2), sekoitetaan ja inkuboidaan tunnin ajan 40 °C:ssa jatkuvasti ravistellen. Entsyymin inhiboimiseksi lisätään 20 μl ε-kapronihappoliuosta (4.7.3), tämän jälkeen lisätään 200 mg kiinteää ureaa ja 2 mg ditiotreitolia.

Huom.

Symmetrisempien kaseiiniviivojen saamiseksi fokusoinnissa on suositeltavaa kylmäkuivata liuos ε-kapronihappoliuoksen lisäämisen jälkeen ja liuottaa sitten jäännökset 0,5 ml:aan proteiinia liuottavaan puskuriin (4.6).

6.2 Ureaa sisältävien polyakryyliamidigeelien valmistus

Muutaman vesipisaran avulla levitetään geelin kantaja-arkki (5.2) lasilevyn (5.1) päälle poistaen kaikki ylimääräinen vesi paperipyyhkeellä tai kankaalla. Samoin levitetään peitearkki (5.3), jossa on välikkeet (0,25 mm), toisen lasilevyn päälle. Asetetaan levy vaakasuoraan vaakatasopöydälle.

Lisätään 10 μl TEMED:tä (4.1.3.1) valmistettuun ilmattomaan geeliliuokseen (4.1.2), sekoitetaan ja lisätään 10 μl PER-liuosta (4.1.3.2), sekoitetaan huolellisesti ja kaadetaan välittömästi tasaisesti peitearkin keskikohtaan. Asetetaan geelin kantajalevyn yksi reuna (arkkipuoli alaspäin) peitearkin päälle ja lasketaan sitä hitaasti niin, että geelikerros muodostuu arkkien väliin ja leviää tasaisesti ja ilman kuplien muodostumista (kuva 3). Lasketaan varovasti geelin kantajalevy kokonaan alas ohutta lastaa käyttäen ja asetetaan vielä kolme lasilevyä sen päälle painoksi. Kun polymeroituminen on tapahtunut (noin 60 min), poistetaan geelin kantaja-arkille polymeroitunut geeli yhdessä peitearkin kanssa lasilevyjä koputellen. Puhdistetaan kantaja-arkin kääntöpuoli huolellisesti geelijäännösten ja urean poistamiseksi. Saumataan geeli-sandwich kalvorullaksi ja säilytetään jääkaapisssa (enintään 6 viikkoa).

Huom.

Välikkeellistä peitearkkia voidaan käyttää uudelleen. Polyakryyliamidigeeli voidaan leikata pienempiin osiin, mitä suositellaan, kun näytteitä on ainoastaan muutama tai jos käytetään automaattista elektroforeesilaitetta (2 geeliä, koko 4,5 x 5 cm).

6.3 Isoelektrinen fokusointi

Säädetään jäähdyttävä termostaatti 12 °C:seen. Pyyhkäistään geelin kantaja-arkin kääntöpuoli petrolilla, tipautetaan sitten muutama pisara petrolia (4.2) jäähdytyslohkon keskelle. Sen jälkeen geeli-sandwich levitetään kantajapuoli alaspäin lohkon päälle siten, ettei muodostu kuplia. Pyyhkäistään ylimääräinen petroli pois ja poistetaan peitearkki. Imeytetään elektrodinauhoihin elektrodiliuoksia (4.3, 4.4), leikataan geelin pituisiksi ja asetetaan asianmukaisille paikoille (elektrodien etäisyys 9,5 cm).

Isoelektrisen fokusoinnin olosuhteet:

6.3.1 Geelikoko 265 mm x 125 mm x 0,25 mm

>TAULUKON PAIKKA>

Huom.

Jos geelien paksuutta tai leveyttä muutetaan, sähkövirran ja tehon arvoja on säädettävä sopivasti (esim. sähkövirran ja tehon arvot on kaksinkertaistettava, jos käytetään 265 mm x 125 mm x 0,5 mm geeliä).

6.3.2 Esimerkki automaattisen elektroforeesilaitteen jänniteohjelmasta (2 kooltaan 5,0 x 4,5 cm geeliä); elektrodit asetetaan suoraan geeliin ilman nauhoja.

>TAULUKON PAIKKA>

Asetetaan näyteapplikaattori vaiheessa 2, kun volttitunnit ovat 0 Vh

Poistetaan näyteapplikaattori vaiheessa 2, kun volttitunnit ovat 30 Vh

6.4 Proteiinien värjäys

6.4.1 Proteiinien kiinnitys

Poistetaan elektrodinauhat välittömästi virran sammuttamisen jälkeen ja asetetaan geeli välittömästi värjäys/värinpoistoastiaan, joka on täytetty 200 ml:lla kiinnitysainetta (4.9); jätetään 15 minuutiksi, jatkuvasti ravistellen.

6.4.2 Geelilevyn pesu ja värjäys

Valutetaan kiinnitysaine huolellisesti pois ja pestään geelilevy kahdesti, 30 sekuntia kummallakin kerralla, 100 ml:lla värinpoistoliuosta (4.10). Kaadetaan värinpoistoliuos pois ja täytetään astia 250 ml:lla värjäysliuosta (4.11.3); annetaan värjäytyä 45 minuuttia kevyesti ravistellen.

6.4.3 Geelilevyn värinpoisto

Kaadetaan värjäysliuos pois, pestään geelilevy kahdesti käyttäen 100 ml:aa värinpoistoliuosta (4.10) kummallakin kerralla, ravistellaan sitten 15 minuutin ajan 200 ml:ssa värinpoistoliuosta ja toistetaan värinpoistovaihe vähintään 2 tai 3 kertaa, kunnes tausta on kirkas ja väritön. Huuhdellaan geelilevy sen jälkeen tislatulla vedellä (2 x 2 min.) ja kuivataan ilmassa (2-3 tuntia) tai hiustenkuivaajalla (10-15 min.).

Huom. 1:

Kiinnitys, pesu, värjäys ja värinpoisto on tehtävä 20 °C:ssa. Korkeampia lämpötiloja ei saa käyttää.

Huom. 2:

Jos herkempää hopeavärjäystä (esim. Silver Staining Kit, Protein, Pharmacia Biotech, Code N:o 17-1150-01) pidetään parempana, plasmiini-käsitellyt kaseiininäytteet on laimennettava 5 mg/ml:ksi.

7. Arviointi

Arviointi suoritetaan vertaamalla tuntemattoman näytteen proteiinikuviota vertailustandardeihin samassa geelissä. Lehmänmaidon toteaminen uuhen-, vuohen- ja puhvelinmaidosta sekä uuhen-, vuohen- ja puhvelinmaidon seoksesta valmistetuissa juustoissa tapahtuu γ2- ja γ3-kaseiinien välityksellä, joiden isoelektriset pisteet vaihtelevat välillä pH 6,5-7,5 (kuvat 4a ja 4b, kuva 5). Toteamisraja on alle 0,5 %.

7.1 Silmämääräinen arviointi

Naudanmaidon määrän arvioimiseksi silmämääräisesti on suositeltavaa säätää näytteiden ja standardien pitoisuudet samantasoisten intensiteettien saamiseksi lampaan, vuohen ja/tai puhvelin γ2- ja γ3-kaseiineille (ks. "γ2 E, G, B" ja "γ3 E, G, B" kuvissa 4a ja 4b, kuvassa 5). Näiden mukaisesti naudanmaidon määrä (vähemmän kuin, yhtä paljon kuin tai enemmän kuin 1 %) tuntemattomassa näytteessä voidaan todeta suoraan vertaamalla naudan γ3- ja γ2-kaseiinien voimakkuutta (ks. "γ3 C" ja "γ2 C" kuvissa 4a ja 4b, kuvassa 5) vastaaviin 0 %:n ja 1 %:n vertailustandardeihin (uuhi, vuohi) tai laboratorion välistandardeihin (puhveli).

7.2 Tiheysmittaukseen perustuva arviointi

Jos mahdollista, käytetään tiheysmittaria (5.19) naudan γ2- ja γ3-kaseiinien piikkien pinta-alojen määrittämiseksi suhteessa lampaan, vuohen ja/tai puhvelin vastaaviin (ks. kuva 5). Tätä arvoa verrataan 1 %:n vertailustandardin (uuhi, vuohi) tai laboratorion välistandardin (puhveli) γ2- ja γ3 -kaseiinipiikkien pinta-alan suhteeseen, kun analysointi on suoritettu samassa geelissä.

Huom.

Menetelmä toimii tyydyttävästi, jos 1 %:n vertailustandardissa esiintyy selvä positiivinen merkki sekä naudan γ2- että γ3-kaseiineista, muttei merkkejä 0 %:n vertailustandardeissa. Jos näin ei ole, menettelyä on parannettava noudattamalla täsmällisesti menetelmän yksityiskohtia.

Näyte todetaan positiiviseksi, jos naudan sekä γ2- että γ3-kaseiinien tai vastaavien piikkien pinta-alojen suhteet ovat yhtä suuret tai suuremmat kuin 1 %:n vertailustandardin taso.

8. Viitteet

1. Addeo F., Moio L., Chianese L., Stingo C., Resmini P., Berner I., Krause I., Di Luccia A., Bocca A.: Use of plasmin to increase the sensitivity of the detection of bovine milk in ovine and/or caprine cheese by gel isoelectric focusing of γ2-caseins. Milchwissenschaft 45, 708-711 (1990).

2. Addeo F., Nicolai M.A., Chianese L., Moio L., Spagna Musso S., Bocca A., Del Giovine L.: A control method to detect bovine milk in ewe and water buffalo cheese using immunoblotting. Milchwissenschaft 50, 83-85 (1995).

3. Krause I., Berner I., Klostermeyer H.: Sensitive detection of cow milk in ewe and goat milk and cheese by carrier ampholyte - and carrier ampholytel/immobilized pH gradient - isoelectric focusing of γ2-caseins using plasmin as signal amplifier. Julkaisussa: Electrophoresis-Forum '89 (B.J. Radola, toim.) ss 389-393, Bode-Verlag, München (1989).

4. Krause I., Belitz H.-D., Kaiser K.-P.: Nachweis von Kuhmilch in Schaf- und Ziegenmilch bzw. -käse durch isoelektrische Fokussierung in harnstoffhaltigen Polyacrylamidgelen. Z. Lebensm. Unters. Forsch. 174, 195-199 (1982).

5. Radola B.J.: Ultrathin-layer isoelectric focusing in 50-100 μm polyacrylamide gels on silanised glass plates or polyester films. Electrophoresis 1, 43-56 (1980).

Kuva 1: Kaaviokuva peitearkista

>PIC FILE= "L_2001037FI.005701.EPS">

Kuva 2: Vesifaasin ja orgaanisen faasin välissä kelluva kaseiinikerros sentrifugoinnin jälkeen

>PIC FILE= "L_2001037FI.005702.EPS">

Kuva 3: Sulkemistekniikka erittäin ohuiden polyakryyliamidigeelien valmistamiseksi.

>PIC FILE= "L_2001037FI.005703.EPS">

a = väliketeippi (0,25 mm); b = peitearkki (5.3); c, e = lasilevyt (5.1); d = geeliliuos (4.1.2); f = geelin kantaja-arkki (5.2)

Kuva 4a: Uuhen- ja vuohenmaidosta valmistetun juuston, joka sisältää eri määriä lehmänmaitoa, plasmiini-käsiteltyjen kaseiinien isoelektrinen fokusointi.

>PIC FILE= "L_2001037FI.005801.EPS">

Merkinnät: % CM = lehmänmaidon prosenttiosuus, C = lehmä, E = uuhi, G = vuohi.

Kuvassa on esitetty IEF-geelin ylempi puolisko.

Kuva 4b: Uuhen-, vuohen- ja puhvelinmaidon seoksista valmistetun juuston, joka sisältää eri määriä lehmänmaitoa, plasmiini-käsiteltyjen kaseiinien isoelektrinen fokusointi.

>PIC FILE= "L_2001037FI.005802.EPS">

Merkinnät: % CM = lehmänmaidon prosenttiosuus, 1 + = näyte, joka sisältää 1 % lehmänmaitoa ja johon on lisätty puhdasta naudan kaseiinia linjan keskellä. C = lehmä, E = uuhi; G = vuohi, B = puhveli.

Kuvassa on esitetty IEF-geelin koko erotusetäisyys.

Kuva 5: Standardin (STD) sekä uuhen- ja vuohenmaidon seoksesta valmistetun juuston näytteiden densitogrammit päällekkäin asetettuna isoelektrisen fokusoinnin jälkeen.

>PIC FILE= "L_2001037FI.005901.EPS">

a, b = standardit, jotka sisältävät 1 ja 1 % lehmänmaitoa, c-g = juustonäytteet, jotka sisältävät 0, 1, 2, 3 ja 7 % lehmänmaitoa. C = lehmä, E = uuhi, G = vuohi.

Ylempi puolisko IEF-geelistä tutkittiin aallonpituudella λ = 634 nm.

(1) Valmisteet Ampholine® pH 3,5-9,5 (Pharmacia) ja Resolyte® pH 5-7 ja pH 6-8 (BHD, Merck) ovat osoittautuneet erityisen sopiviksi vaaditun γ-kaseiinien erottumisen saamiseksi.

(2) Valmisteet Ampholine® pH 3,5-9,5 (Pharmacia) ja Resolyte® pH 5-7 ja pH 6-8 (BHD, Merck) ovat osoittautuneet erityisen sopiviksi vaaditun γ-kaseiinien erottumisen saamiseksi.

(3) Valmisteet Ampholine® pH 3,5-9,5 (Pharmacia) ja Resolyte® pH 5-7 ja pH 6-8 (BHD, Merck) ovat osoittautuneet erityisen sopiviksi vaaditun γ-kaseiinien erottumisen saamiseksi.

LIITE XVI

(11 artikla)

VERTAILUMENETELMÄ KOLIFORMIEN HAVAITSEMISEKSI VOISSA, RASVATTOMASSA MAITOJAUHEESSA, KASEIINISSA JA KASEINAATEISSA

Jos testataan voita koliformien havaitsemiseksi, 1 g:n voinäytteet siirrostetaan elatusaineeseen.

Jos testataan rasvatonta maitojauhetta, kaseiinia ja kaseinaatteja koliformien havaitsemiseksi, elatusaineeseen siirrostetaan 0,1 g:n näytteet.

Sovelletaan IDF-standardin 73A/1985 menetelmää B seuraavin muutoksin:

1) Näyte valmistetaan IDF-standardin 122B:1992 mukaisesti. Happokaseiininäyte voidaan valmistaa vaihtoehtoisesti IDF-standardissa 73A:1985 kuvatun menettelyn mukaisesti.

2) Viljely tapahtuu koeputkissa, joihin on siirrostettu 1 g näytettä (voi) tai vastaavasti 0,1 g näytettä (rasvaton maitojauhe, kaseiini/kaseinaatit), ja tulokset arvioidaan. Kymmenkertaisia laimennuksia ei tehdä.

Tulosten arviointi

>TAULUKON PAIKKA>

Huomautus

Koliformien määrä: keskimäärin yksi kappale 10 grammassa voita, yksi kappale grammassa rasvatonta maitojauhetta, kaseiinia tai kaseinaatteja.

Tulokset, joista käy ilmi, että vaatimus täyttyy, on ilmoitettava 93 %:n todennäköisyydellä.

Koliformien määrä: keskimäärin yksi kappale grammassa voita, yksi kappale 0,1 grammassa rasvatonta maitojauhetta, kaseiinia tai kaseinaatteja.

Tulokset, joista käy ilmi, että vaatimus ei täyty, on ilmoitettava 91 %:n todennäköisyydellä.

(Oletus: Tulokset noudattavat Poissonin jakaumaa)

LIITE XVII

(12 artikla)

YHDISTETYN NIMIKKEISTÖN NIMIKKEESEEN 2309 KUULUVIEN TUOTTEIDEN LAKTOOSIPITOISUUDEN MÄÄRITYSMENETELMÄ(1)

I OSA

1. Soveltamisala

Menetelmää voidaan soveltaa tapauksissa, joissa laktoosipitoisuus on yli 0,5 %.

2. Periaate

Liuotetaan sokerit veteen. Annetaan hiivan (Saccharomyces cerevisiae) vaikuttaa; laktoosi jää koskemattomaksi. Määritetään liuoksen laktoosipitoisuus Luff-Schoorl -menetelmällä kirkastuksen ja suodatuksen jälkeen.

3. Reagenssit

Natriumtiosulfaatti, 0,1 N

Indikaattori: tärkkelysliuos. Lisätään 5 g liukoista tärkkelystä (tarvittaessa lisätään 10 mg elohopeajodidia säilöntäaineeksi) ja 30 ml vettä yhteen litraan kiehuvaa vettä. Pidetään seos kiehuvana kolmen minuutin ajan ja annetaan jäähtyä.

Kaliumjodidiliuos, analyysilaatua, 30 % (m/V)

Rikkihappoliuos, 6 N

Luff-Schoorlin reagenssi:

a) Liuotetaan 25 g kuparisulfaattia (CuSO45H2O; analyysilaatua, rautavapaa) 100 ml:aan vettä.

b) Liuotetaan 50 g sitruunahappoa (C6H8O7.H2O, analyysilaatu) 50 ml:aan vettä.

c) Liuotetaan 143,8 g natriumkarbonaattia (Na2CO2, analyysilaatu, vedetön) noin 300 ml:aan lämmintä vettä.

Lisätään liuos b liuokseen c (jäähtymisen jälkeen) kevyesti ravistellen. Tämän jälkeen lisätään vielä liuos a. Täytetään litraksi ja annetaan seistä yhden yön ajan. Suodatetaan. Valmistetun reagenssin normaalius on tarkistettava (Cu 0,1 N, Na2CO3 2 N). pH:n on oltava noin 9,4.

Carrez I -liuos: liuotetaan 23,8 g Zn (C2H3O2)2.2H2O ja 3 g jääetikkaa veteen ja täytetään 100 ml:ksi.

Carrez II -liuos: liuotetaan 10,6 g K4F2 (CN)6.3H2O veteen ja täytetään 100 ml:ksi.

Kiehumakiviä, kiehautettu suolahapossa, pesty vedellä ja kuivattu. Saccaromyces cerevisiae -suspensio: 25 g tuoretta hiivaa 100 ml:ssa vettä (säilyy yhden viikon ajan jääkaapissa).

4. Suoritus

Punnitaan 1 mg:n tarkkuudella 1 g analysoitavaa näytettä 100 ml:n mittapulloon. Lisätään 25-30 ml vettä. Asetetaan pullo 30 minuutiksi kiehuvaan vesihauteeseen; jäähdytetään sen jälkeen noin 35 °C:seen.

Lisätään 5 ml hiivasuspensiota(2) ja ravistellaan. Pidetään mittapulloa sisältöineen 2 tuntia vesihauteessa 38-40 °C:n lämpötilassa.

Käymisen jälkeen jäähdytetään noin 20 °C:n lämpötilaan. Lisätään 2,5 ml Carrez I-liuosta ja ravistellaan 30 sekuntia; lisätään 2,5 ml Carrez II-liuosta ja ravistellaan uudelleen 30 sekuntia. Täytetään 100 ml:ksi vedellä, sekoitetaan ja suodatetaan. Pipetoidaan enintään 25 ml:aa suodosta, jonka laktoosipitoisuus on 40-80 mg. Tarvittaessa täytetään 25 ml:ksi vedellä ja määritetään vedetön laktoosipitoisuus Luff-Schoorlin mukaisesti.

Tehdään sokeakoe ainoastaan hiivaa käyttäen.

II OSA

1. Laktoosipitoisuuden määritys Luff-Schoorlin menetelmällä

Pipetoidaan 25 ml Luff-Schoorlin reagenssia 300 ml:n erlenmeyerpulloon. Lisätään täsmälleen 25 ml kirkastettua liuosta.

Lisätään kaksi kiehumakiveä, kuumennetaan käsin ravistellen keskikokoisella vapaalla liekillä ja saatetaan neste kiehuvaksi noin kahdessa minuutissa. Asetetaan erlenmeyerpullo välittömästi asbestisuojuksella varustetun ja liekin päällä olevan metalliverkon päälle. Liekki säädetään siten, että erlenmeyerpullo kuumenee ainoastaan pohjastaan. Liitetään palautusjäähdytin. Tästä alkaen annetaan kiehua täsmälleen 10 minuuttia. Jäähdytetään välittömästi kylmässä vedessä ja titrataan noin viiden minuutin kuluttua seuraavasti:

Lisätään nesteeseen 10 ml kaliumjodidia ja viipymättä tämän jälkeen varovasti (runsaan vaahdonmuodostuksen takia) 25 ml rikkihappoa (6 N).

Titrataan natriumtiosulfaatilla kunnes saadaan himmeän keltainen sävy. Titrauksen loppuvaiheessa lisätään tärkkelysindikaattori.

Sama titraus tehdään seokselle, jossa on tarkalleen 25 ml Luff-Schoorlin reagenssia ja 25 ml vettä, sen jälkeen kun siihen on ensin lisätty 10 ml kaliumjodidia ja 25 ml rikkihappoa (6 N), mutta tällä kertaa ilman kiehuttamista.

Jäljempänä olevan taulukon avulla todetaan määrä (mg), joka vastaa kahden titrauksen tulosten välistä erotusta (ml:ina 0,1 N natriumtiosulfaattia).

TAULUKKO

Taulukko 25 ml:lle Luff-Schoorlin reagenssia

(ks. tekstissä esitetyt vaatimukset)

1. Natriumtiosulfaatti, 0,1 N

2. Laktoosi C12H22O11

>TAULUKON PAIKKA>

(1) Asetus (ETY) N:o 222/88

(2) Jos tuotteet sisältävät yli 40 % käymiskykyisiä sokereita, suspension määrä on lisättävä.

LIITE XVIII

(13 artikla)

JULKISEEN VARASTOINTIIN TARKOITETUN RASVATTOMAN MAITOJAUHEEN HERAJUOKSUTETUTKIMUS GLYKOMAKROPEPTIDIEN MÄÄRITYKSEN AVULLA SUUREN EROTUSKYVYN NESTEKROMATOGRAFIAA (HPLC) KÄYTTÄEN

1. Tavoite ja soveltamisala

Tämän menetelmän avulla voidaan todeta herajuoksutteen esiintyminen julkiseen varastointiin tarkoitetussa rasvattomassa maitojauheessa glykomakropeptidien määritystä käyttäen.

2. Viitteet

Kansainvälinen standardi ISO 707 - "Maito ja maitotuotteet - Näytteenotto-menetelmät" liitteessä I olevan 2 kohdan c alakohdan viimeisen luetelmakohdan mukaisesti.

3. Määritelmä

Rasvattoman maitojauheen glykomakropeptidipitoisuus: jäljempänä kuvatun menetelmän mukaisesti määritetty aineiden pitoisuus massaprosentteina ilmaistuna.

4. Periaate

- Rasvattoman maitojauheen ennastus, rasvojen ja proteiinien poisto trikloorietikkahapolla, ja sentrifugointi

- kelluvassa liuoksessa esiintyvien glykomakropeptidien (GMP) määrän määritys suuren erotuskyvyn nestekromatografialla (HPLC)

- saadun tuloksen arviointi suhteessa rasvattoman maitojauheen standardinäytteisiin, joissa ei ole tai joihin on lisätty tunnettu prosenttimäärä herajauhetta.

5. Reagenssit

Kaikkien reagenssien on oltava hyväksyttävää analyysilaatua. Käytettävän veden on oltava tislattua vettä tai puhtaudeltaan vähintään sitä vastaavaa.

5.1 Trikloorietikkahappoliuos

Liuotetaan 240 g trikloorietikkahappoa (C13CCOOH) veteen ja täytetään 1000 ml:ksi.

5.2 Eluointiliuos, pH 6,0

Liuotetaan 1,74 g dikaliumfosfaattia (K2HPO4), 12,37 g monokaliumfosfaattia (KH2PO4) ja 21,41 g natriumsulfaattia (Na2SO4) noin 700 ml:aan vettä. Tarvittaessa säädetään pH 6,0:ksi fosforihappo- tai kaliumhydroksidiliuoksen avulla.

Täytetään 1000 ml:ksi vedellä ja homogenoidaan.

Eluointiliuos suodatetaan ennen käyttöä huokoskooltaan 0,45 μm:n kalvosuodattimen läpi.

5.3 Pesuliuos ja kolonnien säilytys

Sekoitetaan yksi tilavuusosa asetonitriiliä (CH3CN) 9 tilavuusosaan vettä. Suodatetaan seos ennen käyttöä huokoskooltaan 0,45 μm:n kalvosuodattimen läpi.

Huom:

Mitä tahansa pesuliuosta, jolla on bakteereja tappava vaikutus ja joka ei heikennä kolonnien erotuskykyä, voidaan käyttää.

5.4 Standardinäytteet

5.4.1 Tämän asetuksen vaatimuksia vastaava rasvaton maitojauhe eli [0].

5.4.2 Sama rasvaton maitojauhe sekoitettuna 5 %:ksi (m/m) juoksutetyyppisellä, koostumukseltaan standardilla herajauheella eli [5].

6. Laitteisto

6.1 Analyysivaaka.

6.2 Sentrifugi, jonka keskipakovoimaksi saadaan 2200 g, varustettuna noin 25 ml:n suljettavilla sentrifugiputkilla.

6.3 Mekaaninen sekoitin.

6.4 Magneettisekoittaja.

6.5 Halkaisijaltaan noin 7 cm:n lasisuppiloita.

6.6 Halkaisijaltaan noin 12,5 cm:n keskinopeita suodatinpapereita.

6.7 Lasinen suodatuslaite, varustettuna huokoskooltaan 0,45 μm:n kalvosuodattimella.

6.8 Mittapipetti, jolla voidaan annostella 10 ml (ISO 648, luokka A tai ISO/R 835).

6.9 Vesihaude, jonka lämpötila on säädetty 25 +- 0,5 °C:seen.

6.10 HPLC-laitteisto, johon kuuluu

6.10.1 pumppu,

6.10.2 käsikäyttöinen tai automaattinen injektori, jonka tilavuus on 15-30 μl,

6.10.3 kaksi TSK 2000 SW -kolonnia sarjassa (pituus 30 cm, sisähalkaisija 0,75 cm) tai tehokkuudeltaan vastaavat kolonnit ja yksi esikolonni ylävirran puolella (3 cm x 0,3 cm) pakattuna I 125:llä tai tehokkuudeltaan vastaavalla materiaalilla,

6.10.4 kolonniuuni, jonka lämpötila on säädetty termostaatilla 35 +- 1 °C:seen,

6.10.5 aaltopituudeltaan säädeltävissä oleva UV-detektori, jolla voidaan suorittaa mittauksia 205 nm:ssä 0,008 A:n herkkyydellä,

6.10.6 integraattori, jolla voidaan integroida piikin kannan käännepisteestä käännepisteeseen

Huom:

Huoneenlämpötilassa olevilla kolonneilla voidaan työskennellä, mutta niiden erotuskyky on hieman heikompi. Tässä tapauksessa lämpötilan muutosten saman analyysisarjan aikana täytyy olla alle +- 5 °C.

7. Näytteenotto

7.1 Kansainvälinen standardi ISO 707 - "Maito ja maitotuotteet - Näytteenottomenetelmät" liitteessä I olevan 2 kohdan c alakohdassa esitettyjen ohjeiden mukaisesti.

7.2 Näyte säilytetään sellaisissa olosuhteissa, ettei koostumuksessa pääse tapahtumaan mitään pilaantumista eikä muuttumista.

8. Menettely

8.1 Koenäytteen esikäsittely

Maitojauhe siirretään astiaan, joka on siihen nähden tilavuudeltaan noin kaksinkertainen ja jossa on ilmatiivis kansi. Astia suljetaan välittömästi. Sekoitetaan maitojauhe hyvin kääntelemällä astiaa ylösalaisin.

8.2 Näyte

Punnitaan 2,000 +- 0,001 g koenäytettä sentrifugiputkeen (6.2).

8.3 Rasvojen ja proteiinien poisto

8.3.1 Lisätään 20,0 g haaleaa vettä (50 °C) näytteeseen. Liuotetaan jauhe sekoittaen 5 minuutin ajan sekoittimella (6.3). Jäähdytetään putki 25 °C:n lämpötilaan.

8.3.2 Lisätään 10,0 ml trikloorietikkahappoliuosta (5.1) kahden minuutin aikana magneettisekoittajalla (6.4) sekoittaen. Asetetaan putki vesihauteeseen (6.9) ja pidetään siellä 60 minuuttia.

8.3.3 Sentrifugoidaan (6.2) kiihtyvyydellä 2200 g 10 minuutin ajan tai suodatetaan paperin (6.6) läpi heittäen ensimmäiset 5 ml suodosta pois.

8.4 Kromatografinen määritys

8.4.1 Injektoidaan tarkasti mitattuna 15-30 μl kelluvaa liuosta tai suodosta (8.3.3) HPLC-laitteistoon (6.10) virtausnopeudella 1,0 ml eluointiliuosta (5.2) minuutissa.

Huom:

1. Eluointiliuos (5.2) on pidettävä koko kromatografisen määrityksen ajan 85 °C:ssa eluaatin pitämiseksi kaasuttomana ja kaiken bakteerikasvun estämiseksi. Mitä tahansa saman vaikutuksen tuottavaa varotoimea voidaan käyttää.

2. Jokaisen keskeytyksen aikana kolonnit on huuhdeltava vedellä. Eluointiliuosta (5.2) ei saa koskaan jättää niihin.

Ennen jokaista yli 24 tunnin keskeytystä kolonnit on huuhdeltava vedellä ja pestävä sitten liuoksella (5.3) vähintään kolmen tunnin ajan virtausnopeudella 0,2 ml/minuutti.

8.4.2 Koenäytteen [E] kromatografisen määrityksen tulokset saadaan kromatogrammin muodossa, jossa jokainen piikki tunnistetaan sen retentioajasta RT seuraavasti:

>TAULUKON PAIKKA>

Kolonnien laatu voi vaikuttaa eri piikkien retentioaikoihin.

Integraattori (6.10.6) laskee automaattisesti jokaisen piikin pinta-alan A, eli:

>TAULUKON PAIKKA>

Laitteiston tai kolonnien huonosta toiminnasta tai määritetyn näytteen luonteesta ja alkuperästä johtuvien mahdollisten poikkeavuuksien havaitsemiseksi on välttämätöntä tutkia jokainen kromatogrammi ennen kvantitatiivista tulkintaa.

Jos esiintyy epäilyjä, määritys toistetaan.

8.5 Kalibrointi

8.5.1 Standardinäytteisiin (5.4) sovelletaan täsmälleen 8.2-8.4.2 kohdassa kuvattua menettelyä.

On käytettävä juuri valmistettuja liuoksia, sillä GMP:t hajoavat 8 %:n triklooriasetaatti-ympäristössä. Itse asiassa niiden pitoisuus pienenee noin 0,2 %/tunti 30 °C:ssa.

8.5.2 Ennen näytteiden kromatografiseen määritykseen siirtymistä, kolonnit on valmisteltava injektoimalla toistuvasti standardinäytteen (5.4.2) liuosta (8.5.1), kunnes GMP:jä vastaavan piikin pinta-ala ja retentioaika pysyvät vakiona.

8.5.3 Määritetään vasteen R kertoimet injektoimalla sama tilavuusmäärä suodoksia (8.5.1) kuin näytteitä.

9. Tulosten esittäminen

9.1 Laskutapa ja kaavat

9.1.1 Vasteen R kertoimien laskeminen:

>TAULUKON PAIKKA>

jossa

RII et RIV= piikkien II ja IV vastekertoimet

AII [0] ja AIV [0]= edellä 8.5.3 kohdassa saadut standardinäytteen piikkien II ja IV pinta-alat

>TAULUKON PAIKKA>

jossa

RIII= piikin III vastekerroin

AIII [0] ja AIII [5]= edellä 8.5.3 kohdassa saadut standardinäytteiden [0] ja [5] piikin III pinta-alat

W= standardinäytteessä [5] esiintyvän heran määrä eli 5.

9.1.2 Näytteen [E] piikkien suhteellisen pinta-alan laskeminen

>VIITTAUS KAAVIOON>

>VIITTAUS KAAVIOON>

>VIITTAUS KAAVIOON>

jossa

SII [E], SIII [E], SIV [E]= näytteen [E] piikkien II, III ja IV suhteelliset pinta-alat,

AII [E], AIII [E], AIV [E]= edellä 8.4.2 kohdassa saadut näytteen [E] piikkien II, III ja IV pinta-alat,

RII, RIII, RIV= edellä 9.1.1 kohdassa lasketut vastekertoimet.

9.1.3 Näytteen [E] piikin III suhteellisen retentioajan laskeminen:

>VIITTAUS KAAVIOON>

jossa

RRTIII [E]= näytteen [E] piikin III suhteellinen retentioaika,

RTIII [E]= edellä 8.4.2 kohdassa saatu näytteen [E] piikin III retentioaika,

RTIII [5]= edellä 8.5.3 kohdassa saatu standardinäytteen [5] piikin III retentioaika.

9.1.4 Kokeet ovat osoittaneet, että on olemassa lineaarinen riippuvuus piikin III suhteellisen retentioajan eli RRTIII [E]:n ja aina 10 %:iin asti lisätyn herajauheen prosenttiosuuden välillä:

- pitoisuudella > 5 % RRTIII [E] on < 1,000,

- pitoisuudella <= 5 % RRTIII [E] on >= 1,000.

Sallittu epätarkkuus RRTIII-arvoille on +- 0,002.

Tavallisesti RRTIII [0]-arvo eroaa vähän arvosta 1,034. Kolonnien kunnosta riippuen tämä arvo voi lähestyä arvoa 1,000, mutta sen on oltava aina tätä suurempi.

9.2 Näytteessä esiintyvän herajuoksutejauheen prosenttiosuuden laskeminen

>VIITTAUS KAAVIOON>

jossa

W= näytteessä [E] esiintyvän herajuoksutteen prosenttiosuus m/m,

SIII [E]= edellä 9.1.2 kohdassa saatu koenäytteen [E] piikin III suhteellinen pinta-ala,

1,3= piikin III keskimääräinen suhteellinen pinta-ala, ilmaistuna grammoina 100:aa grammaa herajuoksutetta kohti, joka on määritelty alkuperältään erilaisista muuntamattomista rasvattomista maitojauheista; tämä luku on saatu kokeellisesti,

SIII [0]= piikin III suhteellinen pinta-ala, joka on yhtä suuri kuin RIII x AIII [0]; nämä arvot on saatu 9.1.1 ja 8.5.3 kohdasta,

(SIII [0] - 0,9)= suoritettava korjaus keskimääräiseen suhteelliseen pinta-alaan 1,3, kun SIII [0]-arvo poikkeaa 0,9:stä; kokeellisesti standardinäytteen [0] piikin III keskimääräinen suhteellinen pinta-ala on 0,9.

9.3 Menetelmän tarkkuus

9.3.1 Toistettavuus

Kahden samanaikaisesti tai lyhyellä aikavälillä suoritetun, saman henkilön samalla laitteistolla samasta näytteestä tehdyn määrityksen tulosten välinen ero ei saa ylittää 0,2 %:a m/m.

9.3.2 Uusittavuus

Kahden yksittäisen ja toisistaan riippumattoman, kahdessa eri laboratoriossa samasta näytteestä saadun tuloksen välinen ero ei saa ylittää 0,4 %:a m/m.

9.4 Tulkinta

9.4.1 Todetaan herattomuus, jos piikin III suhteellinen pinta-ala, SIII [E], grammoina herajuoksutetta 100:aa tuotegrammaa kohti ilmaistuna, on <=

>VIITTAUS KAAVIOON>

jossa

>TAULUKON PAIKKA>

9.4.2 Jos piikin III suhteellinen pinta-ala SIII [E] on >

>VIITTAUS KAAVIOON>

ja piikin II suhteellinen pinta-ala SII [E] <= 160, lasketaan esiintyvän herajuoksutteen pitoisuus 9.2 kohdassa esitetyllä tavalla.

9.4.3 Jos piikin III suhteellinen pinta-ala SIII [E] on >

>VIITTAUS KAAVIOON>

ja piikin II suhteellinen pinta-ala SII [E] > 160, määritetään kokonaisproteiinipitoisuus (P %); sitten tutkitaan kuvat 1 ja 2.

9.4.3.1 Muuntamattomien rasvattoman maitojauheen näytteiden määrityksestä saadut tiedot, joissa proteiinien kokonaispitoisuus on suuri, on ryhmitelty kuviin 1 ja 2.

Yhtenäisellä viivalla kuvattu suora edustaa lineaarisen regression suoraa, jonka kertoimet on laskettu pienimmän neliösumman menetelmällä.

Katkoviivalla kuvattu suora määrää piikin III suhteellisen pinta-alan ylärajan, jota todennäköisyydellä 90 % tapauksista ei ylitetä.

Kuvien 1 ja 2 katkoviivalla kuvattujen suorien yhtälöt ovat

>TAULUKON PAIKKA>

jossa

>TAULUKON PAIKKA>

Nämä yhtälöt ovat yhtä suuria kuin 9.2 kohdassa mainittu luku 1,3.

Poikkeama (T1 ja T2) saadun suhteellisen pinta-alan SIII [E] ja suhteellisen pinta-alan SIII välillä saadaan seuraavista yhtälöistä:

>VIITTAUS KAAVIOON>

>VIITTAUS KAAVIOON>

9.4.3.2

>TAULUKON PAIKKA>

Herajuoksutteen pitoisuus lasketaan seuraavalla kaavalla:

>VIITTAUS KAAVIOON>

jossa

0,91 edustaa poikkeamaa pystyakselilla yhtenäisellä viivalla kuvatun suoran ja katkoviivalla kuvatun suoran välillä.

>PIC FILE= "L_2001037FI.006801.EPS">

LIITE XIX

(13 artikla)

ASETUKSESSA (EY) N:o 2799/1999 TARKOITETUSSA RASVATTOMASSA MAITOJAUHEESSA JA ESISEOKSISSA OLEVAN KUIVAN HERAJUOKSETTEEN MÄÄRITYS

1. Tavoite: Lisätyn kuivan herajuoksetteen toteaminen seuraavissa tuotteissa:

a) Asetuksen (EY) N:o 2799/1999 2 artiklassa määritelty rasvaton maitojauhe,

b) Asetuksen (EY) N:o 2799/1999 4 artiklassa määritellyt esiseokset.

2. Viitteet: Kansainvälinen ISO-standardi 707

3. Määritelmä

Kuivan herajuoksetteen pitoisuus määritellään kuvattua menettelyä noudattaen prosenttiosuutena (painosta).

4. Periaate

Glykomakropeptidi A -pitoisuus määritetään liitteen XVIII mukaisesti. Positiivisia tuloksia antavista näytteistä määritetään glykomakropeptidi A suuren erotuskyvyn nestekromatografialla käänteisfaasimenetelmällä (HPLC). Tulos arvioidaan vertaamalla sitä rasvatonta maitojauhetta sisältäviin standardinäytteisiin, joista toisiin on ja toisiin ei ole lisätty herajauhetta. Yli 1 %:n tuloksista (m/m) käy ilmi, että kuivaa herajuoksetta esiintyy.

5. Reagenssit

Kaikkien reagenssien on oltava tunnustettua analyysilaatua. Veden on oltava tislattua tai puhtaudeltaan vähintään sitä vastaavaa. Asetonitriilin on oltava spektroskopia- tai HPLC-laatua.

Menetelmässä käytettävät reagenssit selostetaan tämän asetuksen liitteessä XVIII.

Käänteisfaasi-HPLC-menetelmässä tarvittavat reagenssit

5.1 Trikloorietikkahappoliuos

Liuotetaan 240 g trikloorietikkahappoa (CCI3CCOOH) veteen ja täytetään 1000 ml:ksi.

5.2 Eluointiliuokset A ja B

Eluointiliuos A: Mitataan 1000 ml:n mittapulloon 150 ml asetonitriiliä (CH3CN), 20 ml isopropanolia (CH3CHOHCH3) ja 1,00 ml trifluorietikkahappoa (TFA, CF3COOH). Laimennetaan 1000 ml:ksi vedellä. Eluointiliuos B: Mitataan 1000 ml:n mittapulloon 550 ml asetonitriiliä, 20 ml isopropanolia ja 1,00 ml TFA:a. Laimennetaan 1000 ml:ksi vedellä. Eluointiliuos suodatetaan ennen käyttöä huokoskooltaan 0,45 mikrometrin (μm) kalvosuodattimen läpi.

5.3 Kolonnin säilytys

Määritysten jälkeen kolonni huuhdellaan ensin eluointiliuoksella B (gradientilla) ja sitten asetonitriilillä (gradientilla 30 minuuttia). Kolonni säilytetään asetonitriilissä.

5.4 Standardinäytteet

5.4.1 Julkista varastointia koskevia vaatimuksia vastaava rasvaton maitojauhe eli (0).

5.4.2 Sama rasvaton maitojauhe, jossa on sekoitettuna 5 % (m/m) juoksutetyyppistä, koostumukseltaan standardia herajauhetta eli (5).

5.4.3 Sama rasvaton maitojauhe, jossa on sekoitettuna 50 % (m/m) juoksutetyyppistä, koostumukseltaan standardia herajauhetta eli (50)(1).

6. Välineet

Tarvittavat laitteet kuvataan tämän asetuksen liitteessä XVIII.

6.1.1 Analyysivaaka

6.2 Sentrifugi, jolla voidaan saavuttaa 2200 g:n keskipakovoima, varustettuna noin 50 ml:n suljettavilla sentrifugiputkilla.

6.3 Mekaaninen sekoitin, joka toimii 50 °C:ssa.

6.4 Magneettisekoitin.

6.5 Lasisuppiloita, halkaisija noin 7 cm.

6.6 Suodatinpapereita, keskinopea suodatus, halkaisija noin 12,5 cm.

6.7 Lasinen suodatuslaite, varustettu huokoskoon 0,45 mikrometrin kalvosuodattimella.

6.8 Mittapipettejä, joilla voidaan annostella 10 ml (ISO 648, luokka A tai ISO/R 835), tai järjestelmä, jolla voidaan annostella 10,0 ml kahdessa minuutissa.

6.9 Vesihaude, säädettynä termostaatilla 25 +- 0,5 °C:seen.

6.10 HPLC-laitteisto, johon kuuluu

6.10.1 pumppu, jolla voidaan tehdä kahden liuoksen gradientti,

6.10.2 käsikäyttöinen tai automaattinen injektori, injektiotilavuus 100 mikrolitraa (μl),

6.10.3 Dupont Protein Plus -kolonni (pituus: 25 cm, sisähalkaisija: 0,46 cm) tai vastaava käänteisfaasikolonni, piidioksidipohjainen, suurihuokoinen,

6.10.4 kolonniuuni säädettynä termostaatilla 35 +- °C:seen,

6.10.5 aallonpituudeltaan muunneltavissa oleva UV-detektori, jolla voidaan mitata 210 nm:ssä (tarvittaessa voidaan käyttää suurempaa aaltopituutta aina 220 nm:iin asti), herkkyys 0,02 Å,

6.10.6 integraattori, jolla voidaan integroida piikin kannan käännepisteestä käännepisteeseen.

Huomautus

Kolonneja voi käyttää myös huoneenlämmössä, jos lämpötilavaihtelua on enintään 1 °C; muussa tapauksessa GMPÅ:n retentioajassa esiintyy melko suuria vaihteluita.

7. Näytteenotto

7.1 Näytteet otetaan kansainvälisessä ISO-standardissa 707 kuvatun menettelyn mukaisesti. Jäsenvaltiot voivat kuitenkin käyttää muuta näytteenottomenetelmää, jos se on edellä mainitun standardin periaatteiden mukainen.

7.2 Näyte säilytetään siten, ettei sen koostumus huonone tai muutu.

8. Suoritus

8.1 Koenäytteen esikäsittely

Maitojauhe siirretään astiaan, joka on siihen verrattuna tilavuudeltaan noin kaksinkertainen ja jossa on ilmatiivis kansi. Astia suljetaan välittömästi. Maitojauhe sekoitetaan käännellen astiaa toistuvasti ympäri.

8.2 Näytteen punnitusmäärä

Punnitaan 2,00 +- 0,001 g koenäytettä sentrifugiputkeen (6.2 kohta) tai suljettuun pulloon (50 ml).

8.3 Rasvojen ja proteiinien poisto

8.3.1 Lisätään 20,0 g lämmintä vettä (50 °C) näytteeseen. Jauhe liuotetaan sekoittaen viisi minuuttia sekoittimella tai hapan kirnupiimä liuotetaan sekoittaen 30 minuuttia mekaanisella sekoittimella (6.3 kohta). Asetetaan putki vesihauteeseen (6.9 kohta) ja annetaan putken lämpötilan tasaantua 25 °C:seen.

8.3.2 Lisätään kahden minuutin aikana 10,0 ml 25 °C:ista trikloorietikkahappoliuosta (5.1 kohta) koko ajan voimakkaasti magneettisekoittimella sekoittaen (6.4 kohta). Asetetaan putki vesihauteeseen (6.9 kohta) 60 minuutin ajaksi.

8.3.3 Sentrifugoidaan (6.2 kohta) kiihtyvyydellä 2200 g kymmenen minuuttia tai suodatetaan paperin läpi (6.6 kohta). Poistetaan suodoksen viisi ensimmäistä millilitraa.

8.4 Kromatografinen määritys

8.4.1 Tehdään liitteessä XVIII kuvattu HPLC-määritys. Jos tulos on negatiivinen, analysoitu näyte ei sisällä havaittavia määriä herajuoksetetta. Jos tulos on positiivinen, on käytettävä jäljempänä kuvattua käänteisfaasi-HPLC-menetelmää. Happaman kirnupiimän esiintyminen jauheena voi johtaa vääriin positiivisiin tuloksiin. Käänteisfaasi-HPLC-menetelmä sulkee pois tämän mahdollisuuden.

8.4.2 Ennen käänteisfaasin HPLC-määritystä on gradientin olosuhteet optimoitava. Retentioaika 26 +- 2 minuuttia GMPA:lle on ihanteellinen gradienttijärjestelmille, joissa kuollut tilavuus on noin 6 ml (tilavuus siitä kohdasta, jossa liuottimet yhtyvät siihen kohtaan, jossa injektiosilmukka loppuu). Gradienttijärjestelmissä, joissa kuollut tilavuus on pienempi (esimerkiksi 2 ml), on käytettävä 22 minuuttia optimaalisena retentioaikana.

Valmistetaan standardinäytteet (ks. 5.4 kohta) ilman ja yhdessä 50 %:sta herajuoksetetta.

Injektoidaan 100 μl kelluvaa nestettä tai suodosta (ks. 8.3.3 kohta) HPLC-laitteistoon käyttäen taulukossa 1 esitettyjä gradientin viiteolosuhteita.

Taulukko 1

Gradientin viiteolosuhteet kromatografian optimoimiseksi

>TAULUKON PAIKKA>

Kahden kromatogrammin vertailun olisi paljastettava GMPÅ-piikin sijainti.

Jäljempänä annetulla kaavalla voidaan laskea normaalille gradientille alussa käytettävän liuottimen koostumus (ks. 8.4.3 kohta) seuraavasti:

>VIITTAUS KAAVIOON>

>VIITTAUS KAAVIOON>

jossa:

RTmgpA= GMPÅ:n retentioaika viitegradientissa

10= viitegradientin B % alussa

2,5= B % keskikohdassa miinus B % alussa normaalissa gradientissa

13,5= viitegradientin aika puolivälissä

26= GMPÅ:lle tarvittava retentioaika

6= viitegradientin ja normaalin gradientin kaadesuhde

30= B % alussa miinus B % 27 minuutin kohdalla viitegradientissa

27= viitegradientin ajoaika.

8.4.3 Koenäytteiden injektointi

Injektoidaan tarkasti mitattuna 100 μl kelluvaa nestettä tai suodosta (ks. 8.3.3 kohta) HPLC-laitteistoon virtausnopeudella 1,0 ml eluointiliuosta (ks. 5.2 kohta) minuutissa.

Määrityksen alussa eluaattikoostumus saadaan 8.4.2 kohdasta. Se on tavallisesti lähellä A:B = 76:24 (ks. 5.2 kohta). Välittömästi injektoinnin jälkeen aloitetaan lineaarinen gradientti, joka johtaa 5 %:a suurempaan B:n prosenttiosuuteen 27 minuutin jälkeen. Sen jälkeen aloitetaan lineaarinen gradientti, joka saa eluaattikoostumuksen B:n 90 %:ksi viidessä minuutissa. Tätä koostumusta ylläpidetään viisi minuuttia. Sen jälkeen aina lineaarisen gradientin avulla palataan alkuperäiseen koostumukseen viidessä minuutissa. Pumppausjärjestelmän sisäisen tilavuuden mukaan seuraava injektointi voidaan tehdä 15 minuutin kuluttua, kun alkuperäiset olosuhteet on saavutettu.

Huomautuksia

1. Glykomakropeptidien retentioajan olisi oltava 26 +- 2 minuuttia, joka voidaan saavuttaa vaihtelemalla ensimmäisen gradientin alku- ja loppuolosuhteita. Kuitenkin ensimmäisen gradientin B %:n alku- ja loppuolosuhteiden eron on pysyttävä 5 %:ssa B:stä.

2. Eluaateista on poistettava kaasut riittävästi ja ne on myös säilytettävä kaasuttomina. Tämä on välttämätöntä gradientin pumppausjärjestelmän asianmukaisen toiminnan kannalta. GMP-piikin retentioajan standardipoikkeaman on oltava pienempi kuin 0,1 minuuttia (n = 10).

3. Joka viidennen näytteen jälkeen on injektoitava viitenäytettä (5) ja käytettävä sitä uuden vastekertoimen R laskemiseksi (ks. 9.1.1 kohta).

8.4.4 Koenäytteen (E) kromatografisen määrityksen tulokset saadaan kromatogrammina, jossa GMP-piikki, tunnistetaan sen noin 26 minuutin retentioajasta.

Integraattori (ks. 6.10.6 kohta) laskee automaattisesti GMP-piikin H-piikin korkeuden. Jokaisen kromatogrammin pohjaviiva on tarkistettava. Määritys tai integrointi on toistettava, jos pohjaviiva on sijainnut väärässä kohdassa.

Mahdollisesti laitteiston tai kolonnin huonosta toiminnasta tai määritettävän näytteen alkuperästä ja luonteesta johtuvien poikkeavuuksien havaitsemiseksi on välttämätöntä tutkia jokainen kromatogrammi ennen kvantitatiivista tulkintaa. Jos esiintyy epäilyjä, määritys on toistettava.

8.5 Kalibrointi

8.5.1 Standardinäytteille (ks. 5.4.1 ja 5.4.2 kohta) sovelletaan täsmälleen 8.2-8.4.4 kohdassa kuvattua menettelyä. On käytettävä juuri valmistettuja liuoksia, sillä GMP hajoaa 8 % trikloorietikkahappoympäristössä huoneenlämmössä. 4 °C:ssa liuos pysyy stabiilina 24 tuntia. Jos määrityssarjat ovat pitkiä, on toivottavaa käyttää jäähdytettyä näytetarjotinta automaatti-injektorissa.

Huom.

Edellinen 8.4.2 kohta voidaan jättää pois, jos B % tunnetaan alkuolosuhteissa aikaisempien määritysten perusteella.

Vertailunäytteen (5) kromatogrammin on oltava kuvan 1 mukainen. Tässä kuvassa GMPÅ-piikkiä edeltää kaksi pientä piikkiä. On välttämätöntä saada samanlainen erottuminen.

8.5.2 Ennen näytteiden kromatografista määritystä injektoidaan 100 μl standardinäytettä, joka ei sisällä herajuoksetetta (0) (ks. 5.4.1 kohta).

Kromatogrammissa ei saa esiintyä piikkiä GMPÅ-piikin retentioajan kohdalla.

8.5.3 Määritetään vasteen R kertoimet injektoimalla sama tilavuus suodosta (ks. 8.5.1 kohta) kuin näytteille on käytetty.

9. Tulosten ilmoittaminen

9.1 Laskutapa ja kaavat

9.1.1 Vasteen R kertoimen laskeminen:

GMP-piikki = W/Hjossa:

R= GMP-piikin vastekerroin,

H= GMP-piikin korkeus,

W= standardinäytteen (5) sisältämän heran määrä.

9.2 Näytteessä esiintyvän herajuoksetejauheen prosenttiosuuden laskeminen

W(E) = R x H (E)jossa:

W(E)= näytteen (E) herajuoksetteen prosenttiosuus m/m,

R= GMP-piikin vastekerroin (ks. 9.1.1 kohta),

H(E)= näytteen (E) GMP-piikin korkeus.

Jos W(E) on yli 1 % ja jos retentioajan ja standardinäytteen (5) retentioajan välinen ero on pienempi kuin 0,2 minuuttia, herajuoksetteen esiintyminen on osoitettu.

9.3 Menetelmän tarkkuus

9.3.1 Toistettavuus

Samanaikaisesti tai lyhyenä ajanjaksona, saman tekijän samalla laitteistolla samasta näytteestä suoritetun kahden määrityksen tulosten välinen ero ei saa olla suurempi kuin 0,2 %:a m/m.

9.3.2 Uusittavuus

Ei vielä määritelty.

9.3.3 Lineaarisuus

Aina 16 %:iin saakka herajuoksetetta saadaan lineaarinen riippuvuus korrelaatiokertoimen > 0,99 kanssa.

9.4 Tulkinta

9.4.1 Heran katsotaan esiintyvän, jos 9.2 kohdassa saatu tulos on yli 1 % m/m ja jos GMP-piikin retentioaika eroaa vähemmän kuin 0,2 minuuttia standardinäytteen (5) retentioajasta. Edellinen 1 %:n raja on valittu asetuksen (ETY) N:o 625/78 liitteen V 9.2 ja 9.4.1 kohdan säännösten mukaisesti.

>PIC FILE= "L_2001037FI.007301.EPS">

(1) Koostumukseltaan standardin juoksetetyypin herajauhetta sekä muunnettua rasvatonta maitojauhetta on saatavana osoitteesta NIZO, Kernhemseweg 2, PO Box 20, NL-6710 BA. Kuitenkin NIZOn jauheita vastaavia tuloksia antavia jauheita voidaan myös käyttää.

LIITE XX

(14 artikla)

RASVATON MAITOJAUHE: FOSFATIDYYLISERIININ JA FOSFATIDYYLIETANOLIAMIININ MÄÄRITYS

Käänteisfaasi-HPLC-menetelmä

1. TARKOITUS JA SOVELTAMISALA

Tässä kuvataan menetelmä rasvattomassa maitojauheessa (RMJ) olevan fosfatidyyliseriinin (FS) ja fosfatidyylietanoliamiinin (FE) kvantitatiiviseksi määrittämiseksi. Menetelmän avulla voidaan havaita RMJ:ssä esiintyvät kirnupiimän kiintoaineet.

2. MÄÄRITELMÄ

FS + FE -pitoisuus: massaosuus tässä esitetyllä menetelmällä määritetystä aineesta. Tulos ilmaistaan milligrammoina (mg) fosfatidyylietanoliamiinidipalmitoyyliä (FEDP) 100 grammassa jauhetta.

3. PERIAATE

Aminofosfolipidit uutetaan metanolilla ennastetusta maitojauheesta. FS ja FE määritetään o-ftaalidialdehydi (OFA)-johdannaisina käänteisfaasi-HPLC:llä (RP-HPLC) ja fluoresenssidetektion avulla. Koenäytteen FS- ja FE -pitoisuuden kvantitatiivinen määritys vertaamalla standardinäytteeseen, joka sisältää tunnetun määrän FEDP:tä.

4. REAGENSSIT

Kaikkien reagenssien on oltava tunnustettua analyysilaatua. Veden on oltava tislattua tai puhtaudeltaan vähintään sitä vastaavaa, ellei toisin määritellä.

4.1 Vertailumateriaali: FEDP, puhtaus vähintään 99 %

Huomautus:

Vertailumateriaali on säilytettävä - 18 °C:n lämpötilassa.

4.2 Reagenssit standardinäytteen ja koenäytteen valmistamiseksi

4.2.1 Metanoli, HPLC-laatua

4.2.2 Kloroformi, HPLC-laatua

4.2.3 Tryptamiinimonohydrokloridi

4.3 Reagenssit o-ftaalidialdehydi -johdannaisten valmistamiseen

4.3.1 Natriumhydroksidi, 12 M vesiliuos

4.3.2 Boorihappo, 0,4 M vesiliuos, pH säädettynä arvoon 10,0 natriumhydroksidin (4.3.1) avulla

4.3.3 2-merkaptoetanoli

4.3.4 o-ftaalidialdehydi (OFA)

4.4 HPLC-eluutioliuottimet

Eluutioliuottimet on valmistettava HPLC-laatuisia reagensseja käyttäen.

4.4.1 Vesi, HPLC-laatua

4.4.2 Metanoli, puhtaus tutkittu fluorometrillä

4.4.3 Tetrahydrofuraani

4.4.4 Natriumdivetyfosfaatti

4.4.5 Natriumasetaatti

4.4.6 Etikkahappo

5. VÄLINEET

5.1 Analyysivaaka

5.2 Dekantterilaseja, tilavuus 25 ja 100 ml

5.3 Pipettejä, joilla voi annostella 1 ja 10 ml

5.4 Magneettisekoitin

5.5 Mittapipettejä, joilla voi annostella 0,2; 0,5 ja 5 ml

5.6 Mittapulloja, tilavuus 10, 50 ja 100 ml

5.7 Injektioruiskuja, tilavuus 20 ja 100 μl

5.8 Ultraäänihaude

5.9 Sentrifugi, 27000 x g

5.10 Pieniä lasipulloja, tilavuus noin 5 ml

5.11 Mittalasi, tilavuus 25 ml

5.12 pH-mittari

5.13 HPLC-laitteisto

5.13.1 Säädettävä gradientin pumppausjärjestelmä, virtausnopeus 1,0 ml/min 200 bar:in paineessa

5.13.2 Automaattinen näytteenkäsittelijä, jossa voi valmistaa johdannaisia

5.13.3 Kolonnin lämmitin, säädettynä 30 °C:n lämpötilaan

5.13.4 Fluoresenssidetektori, säädettynä heräteaallonpituudelle 330 nm ja emissioaallonpituudelle 440 nm

5.13.5 Integraattori tai tietojenkäsittelyohjelmisto, jolla pystytään mittaamaan piikkien pinta-aloja

5.13.6 Lichrosphere-100 -kolonni (250 x 4,6 mm) tai vastaava kolonni, joka on pakattu oktadekyylisilaanilla (C 18), hiukkaskoko 5 μm

6. NÄYTTEENOTTO

Näytteet otetaan IDF-standardin 50B.1985 mukaisesti.

7. SUORITUS

7.1 Sisäisen standardiliuoksen valmistus

Punnitaan 30,0 +- 0,1 mg tryptamiinimonohydrokloridia (4.2.3) 100 ml:n mittapulloon (5.6) ja täytetään merkkiin metanolilla (4.2.1). Pipetoidaan 1 ml (5.3) tätä liuosta 10 ml:n mittapulloon (5.6) ja täytetään merkkiin metanolilla (4.2.1), jotta saadaan 0,15 mM:n tryptamiinipitoisuus.

7.2 Koenäyteliuoksen valmistus

Punnitaan 1,000 +- 0,001 g RMJ:ta 25 ml:n dekantterilasiin (5.2). Lisätään pipetillä 10 ml lämpötilaltaan 40 °C:ta olevaa tislattua vettä (5.3) ja sekoitetaan magneettisekoittimella (5.4) 30 minuutin ajan mahdollisten paakkujen liuottamiseksi. Pipetoidaan 0,2 ml (5.5) ennastettua maitoa 10 ml:n mittapulloon (5.6), lisätään injektioruiskulla (5,7) 100 μl 0,15 mM:n tryptamiiniliuosta (7.1) ja täytetään merkkiin metanolilla (4.2.1). Sekoitetaan huolellisesti käännellen ja käsitellään ultraäänellä (5.8) 15 minuutin ajan. Sentrifugoidaan (5.9) kiihtyvyydellä 27000 x g 10 minuutin ajan ja kerätään supernatantti neste pieneen lasipulloon (5.10).

Huomautus:

Koenäyteliuos on säilytettävä 4 °C:n lämpötilassa, kunnes HPLC-analyysi suoritetaan.

7.3 Ulkoisen standardiliuoksen valmistus

Punnitaan 55,4 mg FEDP:tä (4.1) 50 ml:n mittapulloon (5.6) ja lisätään mittalasilla (5.11) noin 25 ml kloroformia (4.2.2). Kuumennetaan suljettu pullo 50 °C:n lämpötilaan ja sekoitetaan huolellisesti, kunnes FEDP liukenee. Jäähdytetään pullo 20 °C:n lämpötilaan, täytetään merkkiin metanolilla (4.2.1) ja sekoitetaan käännellen. Pipetoidaan (5.3) 1 ml tätä liuosta 100 ml:n mittapulloon (5.6) ja täytetään merkkiin metanolilla (4.2.1). Pipetoidaan (5.3) 1 ml tätä liuosta 10 ml:n mittapulloon (5.6), lisätään 100 ul (5.7) 0,15 mM:n tryptamiiniliuosta (7.1) ja täytetään merkkiin metanolilla (4.2.1). Sekoitetaan käännellen.

Huomautus:

Standardinäyteliuos on säilytettävä 4 °C:n lämpötilassa, kunnes HPLC-analyysi suoritetaan.

7.4 Derivointireagenssin valmistus

Punnitaan 25,0 +- 0,1 mg OFA:ta (4.3.4) 10 ml:n mittapulloon (5.6), lisätään 0,5 ml (5.5) metanolia (4.2.1 ) ja sekoitetaan huolellisesti OFA:n liuottamiseksi. Täytetään merkkiin boorihappoliuoksella (4.3.2) ja lisätään injektioruiskulla (5.7) 20 μl 2-merkaptoetanolia (4.3.3).

Huomautus:

Derivointireagenssi on säilytettävä 4 °C:n lämpötilassa pienessä tummassa pullossa. Se pysyy stabiilina 1 viikon ajan.

7.5 HPLC-määritys

7.5.1 Eluutioliuottimet (4.4)

Liuotin A:

0,3 mM natriumdivetyfosfaatti ja 3mM natriumasetaattiliuos (pH säädettynä etikkahapolla arvoon 6,5): metanoli:tetrahydrofuraani = 558:440:2 (v/v/v).

Liuotin B:

metanoli

7.5.2 Ehdotettu eluointigradientti:

>TAULUKON PAIKKA>

Huomautus:

Eluointigradientti voi vaatia pieniä muutoksia kuviossa 1 esitetyn erotuskyvyn saamiseksi.

Kolonnin lämpötila: 30 °C

7.5.3 Injektoitava määrä: 50 μl derivointireagenssia ja 50 μl näyteliuosta.

7.5.4 Kolonnin tasapainotus

Kun järjestelmä käynnistetään päivittäin, kolonnia huuhdellaan 100-prosenttisella liuottimella B 15 minuutin ajan, tämän jälkeen asetetaan A:B = 40:60 ja saatetaan tasapainoon virtausnopeuden ollessa 1 ml/min 15 minuutin ajan. Suoritetaan ajo injektoimalla metanolia (4.2.1) sokeakokeeksi.

Huomautus:

Jos kolonnia ei aiota käyttää pitkään aikaan, sitä huuhdellaan metanolin ja kloroformin seoksella (80:20 (v/v)) 30 minuutin ajan.

7.5.5 Koenäytteen FS + FE -pitoisuuden määritys

7.5.6 Suoritetaan kromatografisten analyysien sarja pitäen ajojen välinen aika vakiona vakioisten retentioaikojen saamiseksi. Ulkoista standardiliuosta (7.3) injektoidaan aina 5-10 koenäyteliuoksen välein vastekertoimen arvioimiseksi.

Huomautus:

Kolonni on huuhdeltava 100-prosenttisella liuottimella B (7.5.1) vähintään 30 minuutin ajan aina 20-25 ajon jälkeen.

7.6 Integrointimenetelmä

7.6.1 FEDP-piikki

FEDP eluoituu yhtenä piikkinä. Määritetään piikin pinta-ala integroimalla.

7.6.2 Tryptamiinipiikki

Tryptamiini eluoituu yhtenä piikkinä (kuvio 1). Määritetään piikin pinta-ala integroimalla.

7.6.3 FS- ja FE -piikkiryhmät

Kuvatuissa olosuhteissa (kuvio 1) FS eluoituu kahtena pääasiallisena, osittain erottumattomana piikkinä, jota edeltää pieni piikki. FE eluoituu kolmena pääasiallisena, osittain erottumattomana piikkinä. Määritetään jokaisen piikkiryhmän kokonaispinta-ala asettaen pohjaviiva kuviossa 1 esitetyllä tavalla.

8. LASKEMINEN JA TULOSTEN ILMAISEMINEN

Koenäytteen FS- ja FE -pitoisuus lasketaan kaavasta

>VIITTAUS KAAVIOON>

jossa:

C= koenäytteen FS- tai FE -pitoisuus (mg/100 g jauhetta)

A1= standardinäyteliuoksen (7.3) FEDP-piikin pinta-ala

A2= koenäyteliuoksen 7.2 FS- tai FE -piikin pinta-ala

T1= standardinäyteliuoksen 7.3 tryptamiini piikin pinta-ala

T2= koenäyteliuoksen (7.2) tryptamiinipiikin pinta-ala.

9. TARKKUUS

Huomautus:

Toistettavuusarvot on laskettu kansainvälisen IDF-standardin(1) mukaisesti. Uusittavuutta koskeva väliaikainen raja-arvo lasketaan liitteessä III olevan b kohdan mukaisesti.

9.1 Toistettavuus

Toistettavuuden suhteellinen standardipoikkeama, joka ilmaisee saman tekijän samalla laitteella samoissa olosuhteissa samasta koenäytteestä lähellä toisiaan saatujen riippumattomien analyysitulosten vaihtelevuutta, ei saa olla yli 2 % suhteellisesti. Jos näissä olosuhteissa tehdään kaksi määritystä, kahden tuloksen suhteellinen ero ei saa olla yli 6 % tulosten aritmeettisesta keskiarvosta.

9.2 Uusittavuus

Kun eri tekijät tekevät eri laboratorioissa eri laitteita käyttäen eri olosuhteissa kaksi määritystä samasta koenäytteestä, niistä saatujen kahden tuloksen välinen suhteellinen ero ei saa olla yli 11 % tulosten aritmeettisesta keskiarvosta.

10. KIRJALLISUUSVIITTEET

10.1 Resmini (P.), Pellegrino (L.), Hogenboom (J.A.), Sadini (V.), Rampilli (M.), "Detection of buttermilk solids in skim milk powder by HPLC quantification of aminophospholipids", Sci. Tecn. Latt.-Cas., 39, 395 (1988).

Kuva 1: HPLC-kuvio fosfatidyyliseriinin (FS) ja fosfatidyylietanoliamiinin (FE) OFA-johdannaisista ennastetun rasvattoman maitojauheen metanoliuutteessa. Esitetään FS-, FE- ja tryptamiini- (sisäinen standardi) piikkien integrointitapa.

>PIC FILE= "L_2001037FI.007801.EPS">

(1) Kansainvälinen IDF-standardi I35B/1991. Maito ja maitotuotteet. Tunnusmerkit analyyttisten menetelmien luotettavuudelle. Yhteenveto kollaboratiivisesta tutkimusmenettelystä.

LIITE XXI

(15 artikla)

ANTIBIOOTTI- JA SULFONAMIDI-DAPSONIJÄÄMIEN HAVAITSEMINEN RASVATTOMASSA MAITOJAUHEESSA

Käytetään mikrobi-inhibitioon perustuvaa seulontatestiä, jossa testin mikro-organismina toimiva Bacillus stearothermophilus var. calidolactis C953 on riittävän herkkä havaitsemaan 4 μg bentsyylipenisilliiniä maitolitrassa ja 100 μg sulfadimidiiniä maitolitrassa. Kaupallisia testipakkauksia on saatavissa ja niitä voidaan käyttää, jos niillä on vaadittava herkkyys bentsyylipenisilliinille ja sulfadimidiinille(1).

Testiä varten käytetään ennastettua rasvatonta maitojauhetta (1 g jauhetta + 9 ml tislattua vettä). Testi suoritetaan kuten IDF-tiedotteen n:o 258/1991 1 osan 2 luvussa on kuvattu tai testipakkauksen valmistajan ohjeiden mukaisesti.

Positiiviset tulokset tulkitaan seuraavasti:

1. Toistetaan testi lisäämällä penisillinaasia testijärjestelmään:

Positiivinen tulos: Inhiboivaa ainetta ei voida tunnistaa tällä menettelyllä.

Negatiivinen tulos: Inhiboiva aine on β-laktaamiantibiootti.

2. Toistetaan testi lisäämällä p-aminobentsoehappoa testijärjestelmään:

Positiivinen tulos: Inhiboivaa ainetta ei voida tunnistaa tällä menettelyllä.

Negatiivinen tulos: Inhiboiva aine on sulfonamidi/dapsoni.

3. Toistetaan testi lisäämällä penisillinaasia + p-aminobentsoehappoa testijärjestelmään:

Positiivinen tulos: Inhiboivaa ainetta ei voida tunnistaa tällä menettelyllä.

Negatiivinen tulos: Inhiboivat aineet ovat β-laktaamiantibiootti ja sulfonamidi/dapsoni.

(1) Tärkeää huomata:

Kun rasvatonta maitojauhetta analysoidaan, voidaan saada vääriä positiivisia tuloksia. Siksi on tärkeää varmistaa, että käytetty testijärjestelmä ei anna vääriä positiivisia tuloksia.

LIITE XXII

(16 artikla)

REHUSEOKSISSA ESIINTYVÄN RASVATTOMAN MAITOJAUHEEN KVANTITATIIVINEN MÄÄRITYS PARA-KASEIININ ENTSYMAATTISELLA KOAGULOINNILLA

1. Tarkoitus

Rehuseoksessa esiintyvän rasvattoman maitojauheen kvantitatiivinen määritys para-kaseiinin entsymaattisella koaguloinnilla.

2. Soveltamisala

Tämä menetelmä sopii rehuseoksille, jotka sisältävät vähintään 10 % rasvatonta maitojauhetta; kirnupiimän ja/tai tiettyjen proteiinien esiintyminen merkittävinä määrinä voi häiritä määritystä.

3. Menetelmän periaate

3.1 Rehuseoksen sisältämän kaseiinin saattaminen liukoiseksi natriumsitraattiliuoksella uuttamalla.

3.2 Kalsiumionien pitoisuuden säätäminen para-kaseiinin saostamisen edellyttämälle tasolle; kaseiinin muuttaminen para-kaseiiniksi juoksutteen avulla.

3.3 Typen määritys para-kaseiinista standardissa IDF 20 A 1986 tarkoitetulla Kjeldahl-menetelmällä tehdyn mineralisoinnin jälkeen; esiintyvän rasvattoman maitojauheen määrän laskeminen kaseiinin vähimmäispitoisuuden 27,5 % (ks. 9.1) perusteella.

4. Reagenssit

Käytettävien reagenssien on oltava analyysilaatua. Käytetyn veden on oltava tislattua tai puhtaudeltaan vastaavaa. Juoksutetta (4.5) lukuun ottamatta kaikkien reagenssien ja käytettävien liuosten on oltava typettömiä.

4.1 Trinatriumsitraatti, dihydraatti (1 % m/V-liuos).

4.2 Kalsiumkloridi (2M-liuos). Punnitaan 20,018 g CaCO3:a (määrityslaatua) sopivan suuruiseen posliiniastiaan (150-200 ml) tai dekantterilasiin. Peitetään tislatulla vedellä ja siirretään vesihauteeseen. Lisätään hitaasti 50-60 ml HCl-liuosta (väk. HCl: vesi = 1:1) kaiken karbonaatin liuottamiseksi. Pidetään vesihauteessa CaCl2:n kuivumiseen asti reagoimattoman HCI:n poistamiseksi. Siirretään tislatun veden avulla 100 ml:n mittapulloon ja laimennetaan merkkiin. Tarkistetaan pH-arvo, joka ei saa olla pienempi kuin 4,0. Säilytetään liuos jääkaapissa.

4.3 Natriumhydroksidi, 0,1 N

4.4 Vetykloridihappo, 0,1 N

4.5 Standardoitu juoksuteliuos 1:10000 (vasikan juoksutusmahan uute); säilytetään jääkaapissa 4-6 °C:ssa.

4.6 Reagenssit typen määrittämiseksi standardissa IDF 20A 1986 tarkoitetulla Kjeldahl-menetelmällä.

5. Välineistö

Tavanomaiset laboratoriovälineet ja erityisesti:

5.1 Huhmar tai homogenointimylly

5.2 Analyysivaaka

5.3 Pöytäsentrifugi (2000-3000 kierrosta minuutissa) varustettuna 50 ml:n sentrifugiputkilla

5.4 Magneettisekoittaja ja 10-15 mm:n sauvat

5.5 Dekantterilaseja, 150-200 ml

5.6 Keittopulloja, 250 ml ja 500 ml

5.7 Lasisuppiloita, halkaisija 60-80 mm

5.8 Tuhkattomia pyöreitä suodatinpapereita, nopea suodatus, halkaisija 150 mm (S.S. 5892, S.S. 595 1/2)

5.9 Erikokoisia pipettejä

5.10 Vesihaude säädettynä termostaatilla 37 °C:seen

5.11 pH-mittari

5.12 Kjeldahl-menetelmän mineralisointi- ja tislauslaitteisto sekä tarvittavat varusteet

5.13 Mittabyretti titrausta varten, 25 ml

5.14 Muovinen pesupullo tislatulle vedelle

5.15 Lastoja, ruostumatonta terästä

5.16 Lämpömittari

5.17 Uuni, jonka lämpötila on säädettävissä

6. Menettely

6.1 Näytteen esikäsittely

Jauhetaan 10-20 g näytettä huhmaressa tai sekoitetaan homogenisaattorilla, kunnes seos on tasa-aineinen.

6.2 Maitojauheen saattaminen liukoiseksi ja liukenemattoman jäännöksen erottaminen.

6.2.1 Punnitaan 1,000 +- 0,002 g hyvin homogenoitua (6.1) rehuseosta suoraan 50 ml:n sentrifugiputkeen. Lisätään 30 ml trinatriumsitraattiliuosta (4.1), joka on ennalta lämmitetty 45 °C:seen. Dispergoidaan jauhe magneettisekoittajalla vähintään viiden minuutin ajan.

6.2.2 Sentrifugoidaan kiihtyvyydellä 500 g (2000-3000 kierrosta minuutissa) 10 minuutin ajan ja kerätään pinnalle erottunut vesiliuos 150-200 ml:n dekantterilasiin. On varottava, ettei liukenemattomia hiukkasia siirry pintaliuokseen tässä yhteydessä.

6.2.3 Uutetaan jäännös vielä kaksi kertaa noudattaen samaa menettelyä ja sekoitetaan nämä kolme vesiuutetta keskenään.

6.2.4 Jos pintaan muodostuu rasvakerros, jäähdytetään kunnes rasvafaasi kiinteytyy ja poistetaan se sitten lastalla.

6.3 Kaseiinin koagulointi juoksutteen entsyymeillä.

6.3.1 Yhdistettyihin vesiuutteisiin (noin 100 ml) lisätään pisaroittain samalla sekoittaen 3,4 ml kylläistä kalsiumkloridiliuosta (4.2). Säädetään pH-arvoksi 6,4-6,5 laimealla NaOH- (4.3) tai HCl (4.4) -liuoksella. Asetetaan liuos 37 °C:n termostaattihauteeseen 15-20 minuutiksi suolatasapainon saavuttamiseksi. Tämä nähdään siitä, että liuos muuttuu maidonvalkeaksi.

6.3.2 Siirretään neste yhteen (tai kahteen) sentrifugiputkeen ja sentrifugoidaan kiihtyvyydellä 2000 g 10 minuuttia sakan poistamiseksi. Siirretään kelluva neste pohjasakkaa pesemättä yhteen (tai kahteen) sentrifugiputkeen.

6.3.3 Saatetaan kelluvan nesteen lämpötila 37 °C:seen. Lisätään uutteeseen pisaroittain sekoitellen 0,5 ml nestemäistä juoksetetta (4.5). Koaguloituminen tapahtuu 1-2 minuutissa.

6.3.4 Näyte laitetaan uudelleen vesihauteeseen ja jätetään 37 °C:n lämpötilaan 15 minuutiksi. Näyte otetaan hauteesta ja rikotaan koagulantti sekoitellen. Sentrifugoidaan kiihtyvyydellä 2000 g 10 minuuttia. Suodatetaan kelluva neste sopivan suodatinpaperin läpi(1) (Whatman nro 541 tai vastaava) ja säilytetään suodatinpaperi. Pohjasakka pestään sentrifugiputkessa 50 ml:lla vettä noin 35 °C:ssa pohjasakkaa sekoitellen.

Sentrifugoidaan uudelleen kiihtyvyydellä 2000 g 10 minuuttia. Suodatetaan kelluva neste aikaisemmasta säilytetyn suodatinpaperin läpi.

6.4 Kaseiinitypen määritys

6.4.1 Pesun jälkeen pohjasakka siirretään kvantitatiivisesti aikaisemmasta säilytetylle suodatinpaperille (6.3.4) tislatun veden avulla. Suodatinpaperi siirretään Kjeldahl-kolviin. Typpipitoisuus määritetään standardissa IDF 20 A 1986 kuvatun Kjeldahl-menetelmällä.

7. Sokeakoe

7.1 Sokeakoe tehdään järjestelmällisesti käyttäen tuhkatonta suodatinpaperia (5.8) kostutettuna seoksella, jossa on 90 ml natriumsitraattiliuosta (4.1), 1 ml kylläistä kalsiumkloridiliuosta (4.2), 0,5 ml nestemäistä juoksutetta (4.5), ja pestään 3 x 15 ml:lla vettä ennen standardissa IDF 20 A 1986 tarkoitetulla Kjeldahl-menetelmällä tehtävää mineralisointia.

7.2 Sokeakokeeseen tarvittava määrä happoa (4.4) on vähennettävä tutkittavan näytteen titraukseen käytettävästä happomäärästä.

8. Tarkistuskoe

8.1 Määritysmenetelmän ja edellä mainittujen reagenssien tarkistamiseksi määritetään koostumukseltaan vakioitu rehuseos, jonka rasvattoman maitojauheen tunnettu pitoisuus on vahvistettu kollaboratiivisella määrityksellä. Kahden määrityksen tulosten keskiarvo saa erota enintään 1 %:n kollaboratiivisen määrityksen tuloksesta.

9. Tulosten ilmoittaminen

9.1 Rehuseoksessa olevan rasvattoman maitojauheen prosenttiosuus lasketaan

>VIITTAUS KAAVIOON>

jossa N on para-kaseiinin typen prosenttiosuus, 27,5 on tekijä, jolla muunnetaan määritetty kaseiini rasvattoman maitojauheen prosenttiosuudeksi, 2,81 ja 0,908 ovat regressioanalyysillä saatuja korjaustekijöitä.

10. Menetelmän tarkkuus

10.1 Toistettavuus

Vähintään 95 %:ssa tutkituista tapauksista kahden yksittäisen tuloksen välinen ero ei saa olla suurempi kuin 6,5 g rasvatonta maitojauhetta 100 g:aa tutkittua rehuseosta kohti, kun tulokset ovat samasta näytteestä, samasta laboratoriosta ja saman tekijän saamat.

10.2 Uusittavuus

Vähintään 95 %:ssa tutkituista tapauksista kahden laboratorion samasta näytteestä saamien tulosten välinen ero ei saa olla suurempi kuin 6,5 g rasvatonta maitojauhetta 100 g:aa tutkittua rehuseosta kohti.

11. Sietoraja

CrD95-arvo (kriittinen ero; luotettavuusraja 95 %) lasketaan kaavalla (ISO 5725):

>VIITTAUS KAAVIOON>

(R: uusittavuus; r: toistettavuus)

Kaksinkertainen määritys: CrD95 = 4,5 g

Kun kemiallisen määrityksen tulos ei eroa ilmoitetusta rasvattoman maitojauheen pitoisuudesta enemmän kuin 4,5 g:aa (kaksinkertainen määritys), rehuseoserää on pidettävä asetuksen tämän säännöksen mukaisena.

12. Huomautuksia

12.1 Tiettyjen muiden kuin maitoproteiinien ja erityisesti soijaproteiinien lisääminen merkittävinä prosenttiosuuksina valmistuksen aikana aiheuttaa liian suuria tuloksia, jos nämä proteiinit on kuumennettu maitojauheen kanssa; tämä johtuu mainittujen proteiinien saostumisesta yhdessä maidon parakaseiinin kanssa.

12.2 Kirnupiimän lisääminen voi toisinaan johtaa liian pieniin tuloksiin, sillä määritys tehdään ainoastaan rasvattomasta uutteesta. Tietynlaisen happaman kirnupiimän lisääminen voi antaa huomattavan pieniä tuloksia, sillä sen liukeneminen sitraattiliuokseen on epätäydellistä.

12.3 Vähintään 0,5 %:n lesitiinilisäys voi myös johtaa liian pieniin tuloksiin.

12.4 Korkeaan lämpötilaan kuumennetun maitojauheen (high-heat) lisääminen voi antaa liian suuria tuloksia, mikä johtuu tiettyjen heraproteiinien saostumisesta yhdessä maidon para-kaseiinin kanssa.

(1) Käytettävä tuhkakonta nopeasuodatteista paperia.

LIITE XXIII

(17 artikla)

TÄRKKELYKSEN KVALITATIIVINEN MÄÄRITYS RASVATTOMASTA MAITOJAUHEESTA, DENATUROIDUSTA MAITOJAUHEESTA JA REHUSEOKSISTA

1. Soveltamisala

Tätä menetelmää sovelletaan denaturoiduissa maitojauheissa merkkiaineena käytetyn tärkkelyksen toteamiseksi.

Menetelmän toteamisraja on 0,05 g tärkkelystä noin 100 g:ssa näytettä.

2. Periaate

Reaktio perustuu jodometriassa käytettyyn:

- vapaiden jodikolloidien sitoutumiseen vesiliuoksessa,

- tärkkelysmisellien absorptioon ja värin muodostumiseen.

3. Reagenssi

3.1 Jodiliuos:

- jodia: 1 g,

- kaliumjodidia: 2 g,

- tislattua vettä: 100 ml.

4. Välineistö

4.1 Analyysivaaka

4.2 Vesihaude

4.3 Koeputkia, 25 x 200 mm

5. Menettely

Punnitaan 1 g näytettä ja siirretään koeputkeen (4.3).

Lisätään 20 ml tislattua vettä ja ravistetaan näytteen dispergoimiseksi.

Asetetaan kiehuvaan vesihauteeseen (4.2) 5 minuutiksi.

Otetaan vesihauteesta ja annetaan jäähtyä huoneenlämpötilaan.

Lisätään 0,5 ml jodiliuosta (3.1); ravistetaan ja havaitaan saatu väri.

6. Tulosten ilmaiseminen

Sininen väri osoittaa natiivitärkkelyksen esiintymisen näytteessä.

Kun näyte sisältää muunnettua tärkkelystä, väri ei voi olla sininen.

7. Huomautukset

Väri, värin voimakkuus ja tärkkelyksen mikroskooppinen kuva vaihtelee natiivitärkkelyksen alkuperän (esimerkiksi: maissi tai peruna) ja näytteessä esiintyvän muunnetun tärkkelystyypin mukaisesti.

Kun esiintyy muunnettuja tärkkelyksiä, saatu väri vaihtelee violettiin, punaiseen tai ruskeaa natiivitärkkelyksen kiderakenteen muunnosasteen mukaisesti.

LIITE XXIV

(18 artikla)

JAUHEENA OLEVAN HAPPAMAN KIRNUPIIMÄN KOSTEUDEN MÄÄRITYS

1. Tarkoitus

Eläinten rehuksi tarkoitetun jauheena olevan happaman kirnupiimän kosteuspitoisuuden määrittäminen.

2. Periaate

Näyte kuivataan alipaineessa. Painohäviö todetaan punnitsemalla.

3. Välineistö

3.1 Analyysivaaka.

3.2 Korroosionkestävästä metallista tai lasista valmistettuja kuivausastioita, jotka voidaan sulkea ilmatiiviillä kannella; työtaso, jolle testattava näyte voidaan levittää noin 0,3 g/cm2:n alueelle.

3.3 Säädettävä sähkölämmitteinen vakuumilämpökaappi, jossa on öljypumppu ja johon voidaan johtaa kuumaa, kuivaa ilmaa tai jossa voidaan käyttää kuivausainetta (esim. kalsiumoksidia).

3.4 Eksikaattori, joka sisältää tehokasta kuivausainetta.

3.5 Säädettävissä oleva lämpökaappi 102 +- 2 °C, jossa on tuuletusjärjestelmä.

4. Menettely

Kuumennetaan astia (3.2) ja sen kansi lämpökaapissa (3.5) vähintään 1 tunnin ajan. Suljetaan astia kannella ja siirretään ne välittömästi eksikaattoriin (3.4), annetaan jäähtyä huoneenlämmössä ja punnitaan 0,5 milligramman tarkkuudella.

Näyteastia (3.2) punnitaan kansineen 0,5 milligramman tarkkuudella. Punnittuun astiaan punnitaan noin 5 grammaa näytettä 1 milligramman tarkuudella ja se levitetään nopeasti. Astia asetetaan ilman kantta 83 °C:een lämmitettyyn vakuumilämpökaappiin (3.3). Lämpökaapin lämpötilan tarpeettoman laskun välttämiseksi astia viedään uuniin mahdollisimman nopeasti.

Paine säädetään 100 torriksi (13,3 kPa) ja astian annetaan kuivua vielä neljän tunnin ajan tässä paineessa, joko kuumassa, kuivassa ilmavirrassa tai kuivauspainetta käyttäen (noin 300 grammaa 20:tä näytettä kohden). Jälkimmäisessä tapauksessa vakuumipumppu kytketään pois päältä, kun vaadittu paine on saavutettu. Kuivausaika lasketaan siitä hetkestä, kun lämpökaapin lämpötila on uudelleen saavuttanut 83 °C. Kuivausajan päätyttyä lämpökaapin paine palautetaan varovasti normaalipaineeseen. Lämpökaappi avataan, näyteastia suljetaan välittömästi kannella, se otetaan pois lämpökaapista, annetaan jäähtyä 30-45 minuuttia eksikaattorissa (3.4) ja punnitaan 1 milligramman tarkkuudella. Näytteen annetaan kuivua vielä 30 minuuttia vakuumikuivauskaapissa (3.3) 83 °C:ssa ja se punnitaan uudelleen. Kahden punnituksen välinen ero ei saa ylittää 0,1:tä prosenttia kosteudesta.

5. Tulosten laskeminen

>VIITTAUS KAAVIOON>

jossa:

E= alkuperäinen näytemäärä grammoina,

m= näytteen paino grammoina kuivauksen jälkeen.

6. Tarkkuus

6.1 Toistettavuusraja

Samanlaisesta näyteaineistosta samoilla välineillä kahden mahdollisimman lyhyen aikavälin kuluessa tehdyn määrityksen tulosten välinen ero ei saa ylittää 0,4:ää grammaa vettä/100 grammaa jauheena olevaa hapanta kirnupiimää.

6.2 Verrattavuusraja

Samanlaisesta näyteaineistosta eri välineistöllä eri laboratorioissa tehdyn kahden määrityksen tulosten välinen ero ei saa ylittää 0,6:ta grammaa vettä/100 grammaa jauheena olevaa hapanta kirnupiimää.

6.3 Tarkkuustietojen lähde

Tarkkuutta koskevat tiedot määritettiin vuonna 1995 suoritetusta koejärjestelystä, johon osallistui kahdeksan laboratoriota ja kaksitoista näytettä (kuusi sokeakokeen kaksoisnäytettä).

LIITE XXV

(19 artikla)

MÄÄRITYSMENETELMÄ VIERAIDEN RASVOJEN TOTEAMISEKSI MAITORASVASTA TRIGLYSERIDIEN KROMATOGRAFISEN MÄÄRITYKSEN AVULLA - VERSIO 1

1. Laajuus ja soveltamisala

Tässä standardissa vahvistetaan triglyseridien kaasukromatografinen määritysmenetelmä, jonka avulla voidaan todeta maidon ja maitotuotteiden maitorasvassa olevat vieraat kasvi- ja eläinrasvat kuten naudantali ja ihra.

Kasvi- ja eläinrasvat voidaan erottaa puhtaasta maitorasvasta kvalitatiivisesti ja kvantitatiivisesti huolimatta ruokinta- ja lypsyolosuhteista.

Huomautus 1:

Vaikka voihapon (C4), jota esiintyy yksinomaan maitorasvassa, avulla voidaan tehdä kvantitatiivisia arvioita pienistä ja keskisuurista maitorasvapitoisuuksista kasvirasvoissa, kvalitatiivista ja kvantitatiivista tietoa tuskin saadaan tapauksessa, jossa puhtaaseen maitorasvaan on lisätty enintään 20 % (painoprosenttia) vierasta rasvaa; tämä johtuu siitä, että maitorasvan C4-pitoisuus vaihtelee suuresti, n. 3,5 %:sta 4,5 %:iin (painoprosenttia).

Huomautus 2:

Kvantitatiivisia tuloksia voidaan käytännössä saada ainoastaan triglyseridimäärityksillä, koska kasvirasvojen sterolipitoisuus vaihtelee tuotanto- ja käsittelyolosuhteiden mukaan.

2. Määritelmä

Maitorasvan sisältämät vieraat rasvat. Tässä standardissa vierailla rasvoilla tarkoitetaan kaikkia muita kasvi- ja eläinrasvoja kuin maitorasvaa.

3. Menetelmän periaate

Maitorasvan uuttamisen jälkeen valmistetaan perusliuos. Tästä liuoksesta määritetään triglyseridit (kokonaishiililuvut) pakattuja kolonneja käyttäen kaasukromatografisesti. Kun erikokoisten rasvamolekyylien (C24 - C54 - vain parilliset luvut) painoprosenttiarvot sijoitetaan triglyseridikaavaan, vieraat rasvat voidaan joko todeta kvalitatiivisesti tai määrittää kvantitatiivisesti.

Huomautus:

Tässä selostettua määritystä noudattaen voidaan käyttää kapillaarikaasukromatografiaa, jos saadaan takeet siitä, että tulokset ovat vertailukelpoiset(1).

4. Reagenssit

Käytettävien kemikaalien on oltava analyysilaatua.

4.1 Kantajakaasu: typpi, puhtausaste [gE ] 99,996 %

4.2 Triglyseridistandardeja(2), tyydyttyneitä ja kolesteroleja, vakiomaitorasvan 6.5.4 kohdan mukaiseen vakiointiin

4.3 Vedetön metanoli

4.4 n-heksaani

4.5 n-heptaani

4.6 Tolueeni

4.7 Dimetyylikloorisilaaniliuos: liuotetaan 50 ml dimetyylikloorisilaania 283 ml:aan tolueenia.

4.8 Liekkikaasu: vetyä ja synteettistä ilmaa

4.9 Stationaarifaasi: 125/150 μm (100/120 mesh) GasChromQ:n(3) päällä 3 %:n OV-1

4.10 10-prosenttinen kaakaovoiliuos

5. Laitteisto

Tavanomainen laboratoriovälineistö ja erityisesti seuraavat:

5.1 Korkean lämpötilan kaasukromatografi, joka soveltuu vähintään 400-450 °C:n lämpötiloihin ja joka on varustettu liekki-ionisaatiodetektorilla (FID) ja kantajakaasun vakiomassavirtaussäätimellä. Liekkikaasu: 30 ml/min (H2), 270 ml/min (synteettinen ilma).

Koska kantajakaasun virtausnopeus on suuri, liekkisuihkun on oltava erityisen leveä.

Huomautus:

Koska triglyseridimäärityksen aikana esiintyy korkeita lämpötiloja, FID:n ja injektorijärjestelmän lasinen sisäputki on puhdistettava usein.

Kaasukromatografissa on oltava septumit, jotka kestävät korkeita lämpötiloja, vuotavat erittäin vähän ja joita voidaan käyttää toistuvasti.

Huomautus:

Chromblue (tm) -septumit (Chrompack) ovat sopivia.

Septumit on vaihdettava säännöllisin väliajoin, esimerkiksi noin sadan injektion jälkeen tai erotuskyvyn heikentyessä (ks. kuva 4).

5.2 Kromatografiakolonni

U-kirjaimen muotoinen lasikolonni (sisäläpimitta 2 mm, pituus 500 mm), joka silanoidaan aluksi 6.1 kohdan mukaisesti dimetyylikloorisilaanilla lasipinnan aktiivisuuden poistamiseksi.

Huomautus:

Myös jonkin verran pidemmät (800-2000 mm) pakatut kolonnit soveltuvat. Niiden avulla voidaan saavuttaa hieman parempi tulosten uusittavuus. Toisaalta stationaarifaasissa esiintyy toisinaan murtumia käytön jälkeen, mikä saattaa puolestaan heikentää kvantitatiivisia tuloksia. Lisäksi FID-liekki sammuu helposti, koska kantajakaasun virtausnopeuden on oltava erittäin suuri, 75-85 ml/min.

5.3 Kolonnin täyttämisen järjestelyt (ks. kuva 1)

Kuva 1

Kolonnin täyttäminen

>PIC FILE= "L_2001037FI.008701.EPS">

5.3.1 Muovikolonni, jonka päissä on kierretulpat ja jossa on stationaarifaasin täyttökorkeutta osoittava merkki

5.3.2 Tiheä seula (reikien koko noin 100 mikrometriä), jossa on kierretulppa, joka kiinnittyy lasikolonniin kuvassa 1 esitetyllä tavalla

5.3.3 Deaktivoitua, silanoitua lasivillaa

5.3.4 Tärytin, jolla varmistetaan stationaarifaasin tasainen jakautuminen täytön aikana

5.4 1-3 mm:n Extrelut-kolonni(4), jossa on silikageeliä. Tätä kolonnia voidaan vaihtoehtoisesti käyttää maitorasvan uuttamiseen.

5.5 6,4 mm:n (1/4") grafiittitiiviste, jossa on 6 mm:n reikä

5.6 Laitteisto, jolla lasikolonnin pinta silanoidaan 6.1 kohdan mukaisesti

5.6.1 Wulfin pullo

5.6.2 Vesi-imupumppu

5.7 Vesihaude, jonka lämpötilaksi voidaan asettaa (50 +- 2) °C

5.8 Kuivauskaappi, jonka lämpötilaksi voidaan asettaa (50 +- 2) °C ja (100 +- 2) °C.

5.9 Mikrolitrapipetti

5.10 Asteikolla varustettu 5 ml:n pipetti, jolla voidaan annostella 1,5 ml metanolia

5.11 50 ml:n pyöreäpohjainen pullo

5.12 Erlenmeyerpullo, jonka nimellistilavuus on 50 ml

5.13 Suppilo

5.14 Suodatin, jossa on pieni huokoskoko

5.15 Pyöröhaihdutin

5.16 Ampulleja, joiden nimellistilavuus on 1 ml ja jotka voidaan sulkea alumiinitulpalla, jossa on sisäpuolinen kalvo

5.17 Injektioruisku, jonka mäntä ei ulotu neulan kärkeen.

Huomautus:

Tällaisen ruiskun avulla saavutetaan parempi tulosten uusittavuus.

Jotta vältetään septumin vioittuminen, neulan kärki olisi tarkastettava säännöllisin väliajoin (esim. stereomikroskoopilla).

6. Menettely

6.1 Kolonnin valmistaminen (silanointi)

Kun Wulffin pullo on liitetty kuvan 2 osoittamalla tavalla vesi-imupumppuun, putki 2 upotetaan 4.7 kohdassa tarkoitettuun liuokseen. Kolonni täytetään sulkemalla sulkuhana; tämän jälkeen poistetaan letku 2.

Kuva 2

Silanointijärjestely

>PIC FILE= "L_2001037FI.008801.EPS">

Kolonni kiinnitetään telineeseen ja täytetään kokonaan dimetyylidikloorisilaanin liuoksella käyttäen pipettiä.

Wulffin pullon tilalle vaihdetaan 20-30 minuutin kuluttua suodatinpullo, ja kolonni tyhjennetään liittämällä se vesi-imupumppuun (ks. kuva 3).

6.2 Kolonnin täyttäminen

Seuraavaksi huuhdellaan 75 ml:lla tolueenia ja 50 ml:lla metanolia; tämän jälkeen tyhjennettyä kolonnia kuivataan kuivauskaapissa 100 °C:n lämpötilassa noin 30 minuuttia.

Kuva 3

Huuhtelujärjestely

>PIC FILE= "L_2001037FI.008901.EPS">

Kolonnin täyttämiseen käytetään kuvassa 1 esitettyä järjestelyä. Muovikolonni täytetään 4.9 kohdan mukaisella stationaarifaasilla merkkiin asti.

Täytettävän lasikolonnin alapäähän työnnetään terässauvalla noin 1 cm:n pituinen lasivillatulppa, joka on etukäteen silanoitu. Tämän jälkeen kolonnin pää suljetaan 5.3.2 kohdan mukaisella seulalla. Kolonni täytetään stationaarifaasilla paineen alaisena (3 bar, N2). Tärytintä siirrellään edestakaisin lasikolonnia pitkin, jotta tämä täyttyisi yhtenäisesti, kauttaaltaan ja tiiviisti.

Täytön jälkeen kolonnin toiseen päähän painetaan tiivis silanoitu lasivillatulppa, putkesta ulos pistävät kuidut leikataan ja tulppaa työnnetään sisään päin muutama millimetri käyttäen spaattelia.

6.3 Näytteiden valmistaminen

Näytteet valmistetaan käyttäen jotakin seuraavista kolmesta menetelmästä:

6.3.1 Maitorasvan erottaminen voista

Sulatetaan 5-10 g voita sopivassa astiassa 5.7 kohdan mukaisessa vesihauteessa 50 °C:n lämpötilassa.

Erlenmeyerpullo (50 ml) ja 5.14 kohdan mukaisella suodattimella varustettu suppilo lämmitetään kuivauskaapissa 50 °C:n lämpötilaan. Sulatetun voinäytteen rasvakerros suodatetaan kyseisellä esilämmitetyllä laitteistolla.

Saatu maitorasva ei sisällä juuri lainkaan fosfolipidejä.

6.3.2 Rasvajakeen uuttaminen Röse-Gottlieb-menetelmällä

Uuttaminen tehdään joko IDF-standardin IC: 1987, 16C: 1987 116A: 1987 tai 22 B: 1987 mukaisesti.

Näin saadun maitorasvan fosfolipidit antavat n. 0,1 % kolesterolipiikin.

Menetelmä ei siten vaikuta mainittavasti triglyseridispektriin, joka vakioidaan 100:aan kolesterolin avulla.

6.3.3 Uuttaminen maidosta silikageelikolonnan avulla

Mikrolitrapipetillä annostellaan 0,7 millilitraa 20 °C:n lämpötilaan lämmitettyä maitoa 5.4 kohdan mukaiseen 1-3 ml:n Extrelut-kolonniin, ja maidon annetaan levitä tasaisesti silikageeliin noin 5 minuutin ajan.

Valkuais-lipidikompleksit denaturoidaan lisäämällä pipetillä 1,5 ml metanolia. Tämän jälkeen näyte uutetaan 20 ml:lla n-heksaania. n-heksaani lisätään hitaasti pieninä erinä, ja ulos tippuva liuotin kerätään 50 ml:n pyöreäpohjaiseen pulloon, joka on etukäteen kuivattu tunnettuun vakiopainoon.

Uuttamisen jälkeen kolonnin annetaan valua tyhjäksi.

Liuottimet haihdutetaan eluaatista pyöröhaihduttimen avulla vesihauteessa 40-50 °C:n lämpötilassa.

Pullo kuivataan ja rasvamäärä määritetään punnitsemalla.

Huomautus:

Rasvan uuttaminen Gerber-, Weibull-Berntrop- tai Schmid-Bondzynski-Ratzlaff-menetelmällä taikka maitorasvan erottaminen detergenteillä (BDI-menetelmä) ei sovellu triglyseridi-määritykseen, koska näissä menetelmissä rasvafaasiin joutuu suurehkoja määriä osittaisia glyseridejä tai fosfolipidejä.

6.4 Näyteliuoksen valmistus

Kaasukromatografiaa varten käytetään 6.3 kohdassa saadun rasvan 5-prosenttista n-heptaaniliuosta. Tämä näyteliuos valmistetaan punnitsemalla vastaavat määrät 6.3.1 ja 6.3.2 kohdassa saatua näyteainesta ja liuottamalla ne vastaaviin määriin n-heptaania.

Jos näyte on valmistettu 6.3.3 kohdan mukaisesti, pullossa olevaan näyteainekseen lisättävän n-heptaanin määrä lasketaan punnituksen perusteella ja jäännös liuotetaan siihen.

Noin 1 ml näyteliuosta pannaan 5.16 kohdan mukaiseen ampulliin.

6.5 Triglyseridien kromatografinen määritys

Kun käytetään korkeaa lämpötilaa ([lE ] 350 °C) pitkäketjuisten triglyseridien C52-C56 eluointiin, perusviiva alkaa herkästi kohota etenkin, jos kolonneja ei ole riittävästi valmisteltu ennen määritystä. Perusviivan kohoaminen korkeassa lämpötilassa voidaan kokonaan ehkäistä joko yhdistämällä kaksi kolonnia tai käyttämällä perusviivan vähennystä.

Kun käytetään kompensointikolonnia tai yhtä kolonnia, on käytettävä 5.5 kohdan mukaisia grafiittitiivisteitä; niitä on käytettävä myös injektorin ja detektorin lasiosissa.

6.5.1 Perusviivan korjaus

Perusviivan kohoaminen estetään käyttäen jotakin seuraavista neljästä menetelmästä:

6.5.1.1 Kolonnien yhdistäminen

Käytetään kahta pakattua kolonnia kompensointiin.

6.5.1.2 Perusviivan korjaus kaasukromatografilla

Perusviivan kohoaminen voidaan ehkäistä siten, että käytetään kaasukromatografia ensin ilman rasvaliuoksen injektointia, tallennetaan saatu perusviiva ja vähennetään se määrityksen perusviivasta.

6.5.1.3 Perusviivan korjaus integrointiohjelmiston avulla

Perusviivan kohoaminen voidaan ehkäistä siten, että käytetään integrointijärjestelmää ensin ilman rasvaliuoksen injektointia, tallennetaan saatu perusviiva ja vähennetään se määrityksen perusviivasta.

6.5.1.4 Perusviivan korjaus kolonnin riittävän esikäsittelyn avulla

Kun kolonni esikäsitellään alussa riittävästi ja maitorasvaliuosta injektoidaan noin 20 kertaa, perusviivan kohoaminen korkeassa lämpötilassa on usein niin vähäistä, ettei perusviivan korjausta tarvita.

6.5.2 Injektiomenettely

Diskriminaatiovaikutuksen välttämiseksi sovelletaan kuumainjektiomenettelyä, jolla myös saadaan parempia kvantitatiivisia tuloksia, kun on kyse korkeassa lämpötilassa kiehuvista triglyseridikomponenteista. Tässä menettelyssä rasvaliuos imetään ruiskuun ja kylmää neulaa lämmitetään injektiopesässä noin 3 sekunnin ajan ennen infektiota. Tämän jälkeen ruiskun sisältö injektoidaan nopeasti.

Huomautus:

Tämä menettely vähentää ruiskussa tai injektiopesässä tapahtuvan fraktioitumisen vaaraa. Suoraa injektointia kolonnin kuumennettuun alkupäähän ei käytetä, koska kyseiseen paikkaan kertyvät septumin hiukkaset ja vieraat aineet voidaan helposti eliminoida käytetyn menettelyn avulla, kun injektoriosa vaihdetaan säännöllisesti irrottamatta kolonnia.

Septumin vaurioitumisen välttämiseksi on ehdottomasti varottava taivuttamasta neulan kärkeä koskettamalla sillä näyteastian pohjaa (kärjen taipumista ei aina havaitse paljaalla silmällä).

Kuva 4

Maitorasvanäytteen triglyseridikromatogrammi

>PIC FILE= "L_2001037FI.009101.EPS">

6.5.3 Pakatun kolonnin esikäsittely

Vaiheiden a)-c) aikana kolonnin alkupäätä ei ole saastumisen välttämiseksi kiinnitetty detektoriin.

Edellä olevan 6.2 kohdan mukaisesti täytetyt kolonnit valmistellaan seuraavasti:

a) 15 min 40 ml/min N2-virtaus 50 °C:n lämpötilassa

b) kuumennetaan 1 K/min 355 °C lämpötilaan, 10 ml N2/min

c) pidetään 355 °C lämpötilassa 12-15 h

d) injektoidaan kahdesti 1 μl kaakaovoiliuosta (4.1 kohta) ja vastaava lämpötilaohjelma

e) injektoidaan 20 kertaa 0,5 μl maitorasvaliuosta (6.4 kohta) 2-3 päivän ajan

Huomautus:

Kaakaovoi koostuu lähes yksinomaan korkeassa lämpötilassa kiehuvista C50-C56 -triglyserireistä. Kaakaovoin injektointi soveltuu erityisesti tätä pitkäketjuista aluetta varten. Kun on kyse korkeassa lämpötilassa kiehuvista triglyserideistä C50-C54, voi esiintyä jopa vastekertoimia, jotka ovat noin 1,20. Kun maitorasvaliuosta injektioidaan toistuvasti, alunperin korkea C50-C54 -triglyseridien vastekerroin pienenee. Kun on kyse triglyserideistä, joiden asyyli-c-luku on alhainen, kertoimet ovat lähellä 1:tä.

Vastaavasti esikäsitellään kolme paria 6.2 kohdan mukaisesti täytettyjä kolonneja. Esikäsitellyt parit tarkistetaan maitorasvamäärityksellä tavanomaista testausta varten. Jatkossa käytetään kolonniparia, jolla saavutetaan parhaat kvantitatiiviset tulokset (vastekertoimet lähes 1). Jos vastekertoimet ovat suurempia kuin 1,20, kolonnia ei käytetä.

6.5.4 Kalibrointi

Kalibrointia varten määritetään vastaavien triglyseridien ja maitorasvan (vakioitu rasva) kolesterolin vastekertoimet käyttäen triglyseridistandardeja (ainakin tyydyttyneet triglyseridit C24, C30, C36, C42, C48 ja C54 sekä kolesteroli; myös C50 ja C52 olisi edullista ottaa mukaan). Väliin jäävät vastekertoimet voidaan määrittää interpoloimalla.

Päivittäin on tehtävä 2-3 kalibrointia käyttäen vakioitua rasvaa. Jos saadaan lähes yhtenevät tulokset, näytteiden triglyseridimäärityksessä saadaan hyvin uusittavissa olevat kvantitatiiviset tulokset.

Vakioitu maitorasva säilyy useita kuukausia enintään -18 °C:n varastointilämpötilassa, joten sitä voidaan käyttää vertailuvakiona.

Huomautus:

Kaikki vastekertoimet voidaan määrittää myös käyttäen vakioitua rasvaa, jonka triglyseridikoostumus on varmennettu. Esimerkki: CRM 519 (vedetön maitorasva), jota voi ostaa Geelissä (Belgia) sijaitsevasta "Institut de Matériaux de Référence et de Mesures" -laitoksesta.

6.5.5 Lämpötilaohjelma, kantajakaasu ja muut triglyseridimäärityksen olosuhteet

Lämpötilaohjelma: kolonnin alkulämpötila 210 °C, pidetään tässä lämpötilassa 1 minuutin ajan, minkä jälkeen ohjelmoidaan nousemaan 6 °C minuutissa 350 °C:seen, jota pidetään yllä 5 minuutin ajan.

Detektorin ja injektorin lämpötila: 370 °C.

Huomautus:

Detektorin, injektorin ja uunin lämpötilat (alkulämpötilat) olisi pidettävä vakioina (myös öisin sekä viikonloppujen ja pyhien ajan).

Kantajakaasu: typpi, virtausnopeus 40 ml/min.

Huomautus:

Jos käytetään 80 cm:n kolonneja, virtausnopeuden on oltava vähintään 75 ml/min N2. Kantajakaasun virtaus on pidettävä samana (myös öisin sekä viikonloppujen ja pyhien ajan). Täsmällinen kantajakaasuvirtaus on säädettävä siten, että kolonnin pituudesta riippumatta C54 eluoituu 341 °C:n lämpötilassa.

Määrityksen kesto: 29,3 min.

Injektoitava määrä: 0,5 μl.

Huomautus:

Ruisku on jokaisen infektion jälkeen huuhdeltava puhtaalla heptaanilla moneen kertaan.

FID-olosuhteet: 5.1 kohdan mukaiset.

Huomautus:

Liekki-ionisaatiodetektori sytytetään jokaisen työpäivän alussa.

7. Integrointi, tulosten arviointi ja mittausolosuhteiden valvonta

Triglyseridit, joiden asyyli-c-luku on pariton (2n + 1), yhdistetään edeltävään parilliseen triglyseridiin (2n). Huonommin uusittavia alhaisia C56-pitoisuuksia ei oteta huomioon. Muut kromatogrammin triglyseridit (huipun pinta-ala), mukaan lukien kolesteroli (huippu C24:n lähellä) kerrotaan vastaavilla vakiorasvan vastekertoimilla (viimeinen kalibrointi) ja normeerataan 100:aan. Vapaan kolesterolin lisäksi määritetään siten triglyseridit C24, C26, C28, C30, C32, C34, C36, C38, C40, C42, C44, CV46, C48, C50, C52 ja C54. Tulokset ilmaistaan painoprosentteina (g/100 g).

Kromatogrammin huiput olisi arvioitava integraattorilla, jolla perusviiva voidaan tulostaa. Optimoiduilla integrointiparametreillä tehtävän uudelleenintegroinnin tulisi olla mahdollista.

Kuvissa 5 ja 6 esitetään kaksi esimerkkiä triglyseridien kromatogrammeista. Kuvassa 5 on kromatogrammi, jonka arviointi on helppoa, mutta kuvassa 6 esiintyy satunnainen virhe alueella C50-C54: perusviiva kulkee väärin verrattuna kuvaan 5. Tällaiset tyypilliset virheet voidaan havaita suurella varmuudella ja välttää ainoastaan käyttämällä integraattoria, jossa perusviiva tulostuu.

Kuva 5

Helposti arvioitavissa oleva maitorasvan triglyseridikromatogrammi perusviivoineen

>PIC FILE= "L_2001037FI.009201.EPS">

Kuva 6

Virheellisesti integroitu maitorasvan kromatogrammi

>PIC FILE= "L_2001037FI.009301.EPS">

Mittausolosuhteiden valvonnassa voidaan käyttää suhteellisia standardipoikkeamia (RSD: vaihtelukerroin x 100), jotka esitetään eri triglyseridien osalta taulukossa 1. Ne on laskettu saman maitorasvan 19 peräkkäisen analyysin perusteella.

Taulukko 1

Triglyseridipitoisuuksien suhteelliset standardipoikkeamat (RSD) (n=19)

>TAULUKON PAIKKA>

Kun RSD:t ovat huomattavasti taulukossa esitettyjä arvoja suuremmat, kromatografiset olosuhteet eivät ole asianmukaiset. Septumit ja kantajakaasun virtausnopeus on tarkastettava. Lisäksi septumista irronneita pieniä hiukkasia voi olla kertynyt kolonnin alkupään lasivillatulppaan tai kolonni voi olla muuttunut tarkoitukseen soveltumattomaksi vanhentumisen, lämpätilavaikutusten tms. vuoksi (ks. kuvio 3).

Huomautus:

Taulukossa 1 annetut arvot eivät ole sitovia. Niitä voidaan käyttää laadunvalvonnassa ohjeellisina. Jos hyväksytään korkeampia RSD-arvoja, on kuitenkin noudatettava 11 kohdassa annettuja toistettavuutta ja uusittavuutta koskevia raja-arvoja.

8. Vieraiden rasvojen kvalitatiivinen toteaminen

Vieraiden rasvojen toteamista varten on kehitetty triglyseridikaavoja (taulukko 2), joihin liittyy S-arvojen rajat (taulukko 3), joiden sisällä puhtaan maitorasvan S-arvot voivat vaihdella. Jos nämä rajat ylittyvät, näytteen voidaan olettaa sisältävän vierasta rasvaa.

Esimerkiksi ihralisäyksen toteamista varten herkin kaava on seuraava:

>VIITTAUS KAAVIOON>

Huomautus:

puhtaalle maitorasvalle saatiin 99 prosentin luottamusväli S = 97,96-102,04 ja kaikkien S-arvojen keskihajonta 0,39897, kun käytettiin 755:tä erilaista maitorasvanäytettä.

Tällaisen kaavan avulla voidaan ilman tietokonetta selvittää, poikkeaako tuntemattoman rasvanäytteen triglyseridisisällön tässä mainituilla kertoimilla painotettu summa alueesta 97,96-102,04, jolloin on todennäköisimmin kyse vieraan rasvan lisäyksestä.

Taulukossa 2 on erilaisia triglyseridikaavoja erilaisten vieraiden rasvojen toteamista varten. Seuraavien vierasrasvaryhmien toteamiseen voidaan käyttää yhteistä kaavaa: soijapapuöljy, auringonkukkaöljy, oliiviöljy, rapsinsiemenöljy, pellavansiemenöljy, vehnänalkioöljy, maissinalkioöljy, puuvillansiemenöljy ja hydrattu kalaöljy; kookosrasva ja palmunydinrasva; palmuöljy ja naudantali.

Koska myös vieraitten rasvojen triglyseridikoostumus vaihtelee, käytettiin jopa neljää erilaista saman vierasrasvatyypin kokeellisesti mitattua triglyseridiarvojoukkoa. (Samaa vierasrasvatyyppiä koskevista raja-arvoista epäsuotuisin otettiin huomioon (ks. taulukko 4).)

Seuraavalla "yleiskaavalla" saadaan yhtäläisen hyviä tuloksia kaikkien vieraitten rasvojen osalta:

>VIITTAUS KAAVIOON>

Mielivaltaisen vierasrasvayhdistelmän toteamista maitorasvassa koskevat laskelmat ovat osoittaneet, että vaikka esim. ihraa varten taulukossa 2 esitetyssä kaavassa kyseisen vieraan rasvan toteamisraja on alhainen (2,7 %), toteamisrajaltaan korkeammat rasvat kuten kookosöljy (toteamisraja 26,8 %), palmuöljy (12,5 %) tai palmunydinrasva (19,3 %) voidaan todeta ainoastaan, jos niitä on lisätty erittäin paljon maitorasvaan. Sama huomautus koskee muita taulukon 2 kaavoja.

Taulukko 2

Triglyseridikaavat erilaisten vieraitten rasvojen toteamiseksi maitorasvasta sekä S-arvojen keskihajonta (SD)

Kaava soijapapu-, auringonkukka-, oliivi-, rapsinsiemen-, pellavansiemen-, vehnänalkio-, maissinalkio-, puuvillansiemen- ja kalaöljyä varten

>VIITTAUS KAAVIOON>

Kaava kookos- ja palmunydinrasvaa varten

>VIITTAUS KAAVIOON>

Kaava palmuöljyä ja naudantalia varten

>VIITTAUS KAAVIOON>

Kaava ihraa varten

>VIITTAUS KAAVIOON>

Tuntemattoman rasvanäytteen määritystä varten on siten käytettävä kaikkia taulukon 2 kaavoja ja yleiskaavaa (2), jos on todennäköistä, että näyte on seos, jossa on maitorasvaa ja jotakin 14 vierasrasvasta tai jotakin kyseisten vierasrasvojen yhdistelmää. Jos määritettävän rasvanäytteen triglyseridiarvoja kaavoihin sijoitettaessa ainoastaan yhdessä viidestä kaavasta saadaan taulukon 3 rajojen ulkopuolella oleva S-arvo, kyse on todennäköisimmin muunnetusta maitorasvasta. Jos ainoastaan yksi taulukon 2 neljästä kaavasta osoittaa vierasrasvaa, lisätyn vieraan rasvan lajista ei voida tehdä päätelmiä.

Taulukko 3

Maitorasvojen S-arvojen rajat

>TAULUKON PAIKKA>

Taulukossa 4 esitetään eri vierasrasvojen toteamisrajojen arvot 99 prosentin luottamustasolla. Ensimmäisessä sarakkeessa on vähimmäistoteamisraja taulukon 2 parhaita maitorasvakaavoja varten. Toisessa sarakkeessa ovat yleiskaavan toteamisrajat. Vaikka yleiskaavan toteamisrajat ovat jonkin verran korkeammat, hieman suurempien vierasrasvapitoisuuksien toteamiseen tarvitaan vain tätä kaavaa. Kaikilla kaavoilla voidaan todeta myös erilaiset vieraitten rasvojen yhdistelmät. Tietynlaisten vieraitten rasvojen triglyseridipitoisuuksien vaihteluväli ei vaikuta merkittävästi toteamisrajoihin.

Taulukko 4

Vieraitten rasvojen lisäystä maitorasvaan koskevat toteamisrajat prosentteina 99 prosentin luettamustasolla

>TAULUKON PAIKKA>

Huomautus:

S-vaihteluvälit on laskettu siten, että vieraan rasvan lisäysoletus tehdään ainoastaan, jos yksittäisten kaavojen rajat ylittyvät (ks. taulukko 4).

9. Vieraan rasvan kvantitatiivinen määritys

Seuraavan kaavan avulla saadaan kvantitatiivista tietoa vieraan rasvan pitoisuudesta maitorasvanäytteessä:

>VIITTAUS KAAVIOON>, jossa X on tuntemattoman vieraan rasvan tai rasvaseoksen määrä maitorasvassa. Vieraan rasvan lisäämisen muuttama S-arvo saadaan sijoittamalla vierasrasva-maitorasvaseoksen triglyseridiarvot yleistriglyseridikaavaan. Jos maitorasvaan lisätään tuntematonta vierasta rasvaa, SF:n arvoksi valitaan yleiskaavan eri vierasrasvoille tuottamien S-arvojen keskiarvo (SF = 7,46). Hyviä kvantitatiivisia tuloksia kaikkia vierasrasvalisäyksiä varten saadaan myös käyttämällä palmuöljy-naudantalikaavaa (taulukko 2) ja keskiarvoa SF = 10,57.

Jos vierasrasvan laji tunnetaan, edellä olevaan kaavaan on sijoitettava seuraavat SF-arvot ja on käytettävä vieraan rasvan lajia vastaavaa taulukon 2 kaavaa.

Taulukko 5

Eri vierasrasvojen SF-arvot

>TAULUKON PAIKKA>

10. Toteamismenetelmän soveltamisala

Edellä esitetty menetelmä soveltuu irtomaidon tutkimiseen ja perustuu maitorasvanäytteiden edustavuuteen.

Erittäin valikoiva toteaminen olisi mahdollista, jos edellä esitettyjä vastaavat kaavat edustavan maitorasvojen joukon osalta määritettäisiin kutakin maata varten erikseen.

Toteamismahdollisuudet olisivat erityisen suotuisat, jos edellä esitettyjä vastaavat kaavat edustavan maitorasvojen joukon osalta määritettäisiin kussakin maassa erikseen. Tällöin ei tarvita monimutkaisia tietokoneohjelmia, jos sovelletaan taulukossa 2 käytettyjä triglyseridiyhdistelmiä ja kertoimet määritetään uudelleen pienimmän neliösumman menetelmällä.

Kun käytetään taulukossa 3 olevia S-arvon vaihteluvälejä, kaavoja voidaan yleisesti soveltaa erityisissä ruokintaolosuhteissa, kun esimerkiksi on kyse aliruokinnasta tai lehmien ruokinnasta rehuhiivalla tai Ca-saippuoilla. Kaavat voivat osittain tuottaa muunnettuun maitorasvaan viittaavia tuloksia ainoastaan äärimmäisissä ruokintaolosuhteissa (esimerkiksi rehuöljyjen runsas antaminen, Ca-saippuoiden runsas antaminen rehurasvojen yhteydessä jne.).

Huomautus:

Fraktioituneet maitorasvat tulkitaan yleensä muuntamattomaksi maitorasvaksi, jos muuntamista epäillään ainoastaan, kun raja-arvot ylittyvät. Kaavat osoittavat muuntamisen tapahtuneen ainoastaan, jos fraktioituneen maitorasvan rasvahappokoostumus on poikkeuksellinen (esimerkiksi kova fraktio, joka saadaan aikaan fraktioitaessa fysikaalisen menetelmin korkeassa n. 30 °C:n lämpötilassa ja saannon ollessa alhainen [muutama prosentti] tai fraktioitaessa ylikriittisen CO2:n avulla).

Maitorasvan fraktioituminen voidaan kuitenkin tunnistaa muilla menettelyillä kuten erottavalla pyyhkäisykalorimetrialla.

11. Menetelmän tarkkuus

Määritetään maitorasvaa käyttäen taulukon 2 kaavojen ja taulukon 3 S-arvoalueiden perusteella.

11.1 Toistettavuus

Ilmaistaan niiden S-arvojen erona, jotka on saatu kahdessa mahdollisimman lähekkäin tehdyssä määrityksessä, jotka tekee sama henkilö samaa menettelyä noudattaen samanlaisesta näyteaineistosta samoissa olosuhteissa (sama henkilö, samat välineet/laitteet, sama laboratorio):

Taulukko 6

Eri kaavojen toistettavuusrajat (r)

>TAULUKON PAIKKA>

11.2 Uusittavuus

Ilmaistaan niiden S-arvojen erona, jotka on saatu kahdessa eri aikaan tehdyssä määrityksessä, jotka tehdään eri laboratorioissa samaa menettelyä noudattaen samanlaisesta näyteaineistosta erilaisissa olosuhteissa (eri henkilö, eri välineet/laitteet).

Taulukko 7

Eri kaavojen uusittavuusrajat (R)

>TAULUKON PAIKKA>

11.3 Kriittinen ero

Toistettavuus- (r) ja uusittavuusrajojen (R) avulla voidaan laskea kriittiset erot kaikkia taulukossa 3 olevia S-arvojen vaihteluvälejä varten (kaksoismääritys). Vastaavat arvot ovat taulukossa 8.

Taulukko 8

Kriittiset erot kaikkia triglyseridikaavoja varten

>TAULUKON PAIKKA>

11.4 Tulosten hyväksyttävyys

Kaikki kahden desimaalin tarkkuuteen pyöristetyt triglyseridien C24, C26, C28-C54 sekä kolesterolin pitoisuudet on normeerattava tarkasti 100:aan.

Kaksoismäärityksen tulosten avulla tarkistetaan tulosten toistettavuus. Toistettavuusvaatimus täyttyy, jos kaikista viidestä triglyseridikaavasta yhdenkään antamien kahden S-arvon erotus ei ylitä taulukossa 6 esitettyjä r-arvoja.

Ihanteellisten kaasukromatografiaolosuhteiden ja erityisesti kolonnin laadun tarkistamista varten on varmistettava, että 10 määrityskerran tuottamien pienimmän ja suurimman S-arvon erotus ei minkään viiden triglyseridikaavan osalta ylitä arvoa x· r, jossa x = 1,58 [10 toistokertaa, ks. kirjallisuusviite (16)], eikä toistettavuuden raja-arvo r ylity minkään taulukossa 6 olevan kaavan osalta.

12. Standardiviitteet

>TAULUKON PAIKKA>

13. Viitteet

1. Commission of the European Communities: Detection of foreign fats in milk fat by means of gas chromatographic triglyceride analysis; Doc N:o VI/5202/90-EN, VI/2645/91.

2. Commission of the European Communities: Control of butter fat purity of 100 different samples of different feeding periods From 11 EEC countries; Doc N:o VI/4577/93.

3. Commission of the European Communities: Consideration of results from the first, second, third, fourth, fifth and sixth EEC collaborative trial: Determination of triglycerides in milk fat; Doc N:o VI/2644/91, VI/8.11.91, VI/1919/92, VI/3842/92, VI/5317/92, VI/4604/93.

4. Timms, R. E.: Detection and quantification of non-milk fat in mixtures of milk and non-milk fats. Dairy Research 47 295-303 (1980).

5. Precht, D., Heine, K.: Nachweis von modifiziertem Milchfett mit der Triglyceridanalyse. 2. Fremdfettnachweis im Milchfett mit Hilfe von Triglyceridkombinationen 41 406-410 (1986).

6. Luf, W., Stock, A., Brandl, E.: Zum Nachweis von Fremdfett in Milchfett über die Trigylceridanalyse. Österr. Milchwirtsch. Wissensch. Beilage 5, 42 29-35 (1987).

7. Precht, D.: Bestimmung von pflanzlichen Fetten oder tierischen Depotfetten in Milchfett. Kieler Milchwirtsch. Forschungsber. 42 143-157 (1989).

8. Precht D.: Schnelle Extraktion von Milchfett, Kieler Milchwirtsch. Forschungsber. 42 119-128 (1990).

9. Precht, D.: Schnelle gaschromatographische Triglyceridanalyse von Milchfett. Kieler Milchwirtsch. Forschungsber. 42 139-154 (1900).

10. Precht, D.: Control of milk fat purity by gas chromatographic triglyceride analysis. Kieler Milchtwirtsch. Forschungsber. 43 (3) 219-242 (1991).

11. Precht, D.: Detection of adulterated milk fat by fatty acid and triglyceride analysis. Fat Sci. Technol. 93 538-544 (1991).

12. Precht, D.: Detection for foreign fat in milk fat. I. Qualitative detection by triacylglycerol formulae. II. Quantitative evaluation of foreign fat mixtures. Z. Lebensm. Unters. Forsch. 194 1-8, 107-114 (1992).

13. Precht, D.: "Gas chromatography of triacylglycerols and other lipids on packed columns", GRC Handbook of Chromatography: Analysis of lipids, blz. 123-138, Ed. K.D. Mukherjee, N. Weber, J. Sherma, CRC Press, Boca Raton (1993).

14. Precht, D., Molkentin, J.: Quantitative triglyceride analysis using short capillary columns, Chrompack News 4 16-17 (1993).

15. Molkentin, J., Precht, D.: Comparison of packed and capillary columns for quantitative gas chromatography of triglycerides in milk fat. Chromatographia 39 (5/6) 265-270 (1994).

16. Stange, K.: Angewandte Statistik, Erster Teil, Eindimensionale Probleme, Springer-Verlag, Berlijn, blz. 378 (1970).

(1) Sopivia menetelmiä on jo kuvattu, ks. D. Precht ja J. Molkentin: Quantitative triglyceride analysis using short capillary columns, Chrompack News 4 16-17 (1993).

(2) Sopivia kaupallisia tuotteita on saatavissa.

(3) Esimerkkejä sopivien alan erikoiskaupasta saatavien tuotteiden kauppanimistä ovat Extrelut, GasChromQ, Chrompack. Annetun tiedon tarkoituksena on helpottaa standardin soveltamista, ei kehottaa käyttämään tiettyä tuotetta. Raekoon ilmaisemisessa on siirrytty SI-mittajärjestelmän mukaiseen mikrometriin standardin BS 410: 1988 "British Standard Specification for test sieves" mukaisesti.

(4) Ks. sivun 86 alaviite 3.

LIITE XXVI

LUETTELO JOHDANTO-OSAN ENSIMMÄISESSÄ KAPPALEESSA TARKOITETUISTA ASETUKSISTA

- Komission asetus (ETY) N:o 1216/68, annettu 9 päivänä elokuuta 1968, kolmansista maista tuotujen rehuseosten laktoosipitoisuuden määritysmenetelmästä(1), sellaisena kuin se on muutettuna komission asetuksella (ETY) N:o 222/88, annettu 22 päivänä joulukuuta 1987, tiettyjen maito- ja maitotuotealan säädösten muuttamisesta yhdistetyn nimikkeistön käyttöönoton johdosta(2);

- Komission asetus (ETY) N:o 3942/92, annettu 22 päivänä joulukuuta 1992, vertailumenetelmästä sitosterolin ja stigmasterolin määrittämiseksi voiöljystä(3), sellaisena kuin se on viimeksi muutettuna komission asetuksella (EY) N:o 175/1999, vertailumenetelmistä tiettyjen merkkiaineiden määrittämiseksi voista, voiöljystä ja kermasta annettujen asetusten (ETY) N:o 3942/92, (ETY) N:o 86/94, (EY) N:o 1082/96 ja (EY) N:o 1459/98 muuttamisesta(4);

- Komission asetus (EY) N:o 86/94, annettu 19 päivänä tammikuuta 1994, voin sisältämän sitosterolin ja stigmasterolin määrittämisessä käytettävästä vertailumenetelmästä(5), sellaisena kuin se on muutettuna asetuksella (EY) N:o 175/1999;

- Komission asetus (EY) N:o 2721/95, annettu 24 päivänä marraskuuta 1995, viite- ja rutiinimenetelmien soveltamista koskevista yksityiskohtaisista säännöistä maidon ja maitotuotteiden analysoimiseksi ja laadun arvioimiseksi yhteisessä markkinajärjestelyssä(6);

- Komission asetus (EY) N:o 1080/96, annettu 14 päivänä kesäkuuta 1996, vertailumenetelmästä koliformien havaitsemiseksi voissa, rasvattomassa maitojauheessa ja kaseiinissa/kaseinaateissa(7);

- Komission asetus (EY) N:o 1081/96, annettu 14 päivänä kesäkuuta 1996, vertailumenetelmästä lehmänmaidon ja kaseinaatin toteamiseksi uuhen-, vuohen- tai puhvelinmaidosta tai uuhen-, vuohen- ja puhvelinmaidon seoksista valmistetuissa juustoissa ja asetuksen (ETY) N:o 690/92 kumoamisesta(8);

- Komission asetus (EY) N:o 1082/96, annettu 14 päivänä kesäkuuta 1996, vertailumenetelmästä beeta-apo-8'-karoteenihapon etyyliesterin määrittämiseksi voista ja voiöljystä(9), sellaisena kuin se on muutettuna asetuksella (EY) N:o 175/1999;

- Komission asetus (EY) N:o 1854/96, annettu 26 päivänä syyskuuta 1996, luettelon laatimisesta maidon ja maitotuotteiden analysoimiseksi ja laadun arvioimiseksi sovelletuista vertailumenetelmistä yhteisessä markkinajärjestelyssä(10), sellaisena kuin se on muutettuna asetuksella (EY) N:o 881/1999(11);

- Komission asetus (EY) N:o 880/98, annettu 24 päivänä huhtikuuta 1998, vertailumenetelmien vahvistamisesta voin vesipitoisuuden, rasvattoman kuiva-aineen ja rasvapitoisuuden määrittämiseksi(12);

- Komission asetus (EY) N:o 1459/98, annettu 8 päivänä heinäkuuta 1998, voiöljyn, voin tai kerman vanilliinipitoisuuden määrittämisen vertailumenetelmästä(13), sellaisena kuin se on muutettuna asetuksella (EY) N:o 175/1999.

(1) EYVL L 198, 10.8.1968, s. 13.

(2) EYVL L 28, 1.2.1988, s. 1.

(3) EYVL L 399, 31.12.1992, s. 29.

(4) EYVL L 20, 27.1.1999, s. 22.

(5) EYVL L 17, 20.1.1994, s. 7.

(6) EYVL L 283, 25.11.1995, s. 7.

(7) EYVL L 142, 15.6.1996, s. 13.

(8) EYVL L 142, 15.6.1996, s. 15.

(9) EYVL L 142, 15.6.1996, s. 26.

(10) EYVL L 246, 27.9.1996, s. 5.

(11) EYVL L 111, 29.4.1999, s. 24.

(12) EYVL L 124, 25.4.1998, s. 16.

(13) EYVL L 193, 9.7.1998, s. 16.