32000L0032

Kommissionens direktiv 2000/32/EG

av den 19 maj 2000

om anpassning till tekniska framsteg för tjugosjätte gången av rådets direktiv 67/548/EEG om tillnärmning av lagar och andra författningar om klassificering, förpackning och märkning av farliga ämnen(1)

(Text av betydelse för EES)

EUROPEISKA GEMENSKAPERNAS KOMMISSION HAR ANTAGIT DETTA DIREKTIV

med beaktande av Fördraget om upprättandet av Europeiska gemenskapen,

med beaktande av rådets direktiv 67/548/EEG av den 27 juni 1967 om tillnärmning av lagar och andra författningar om klassificering, förpackning och märkning av farliga ämnen(2), senast ändrat genom Europaparlamentets och rådets direktiv 1999/33/EG(3), särskilt artikel 28 i detta, och

av följande skäl:

(1) Bilaga I till direktiv 67/548/EEG innehåller en förteckning över farliga ämnen samt uppgifter om klassificering och märkning av varje ämne. Det nuvarande vetenskapliga och tekniska kunnandet har visat att förteckningen över farliga ämnen i den bilagan bör ändras. I vissa språkversioner av direktivet är det också nödvändigt att ändra vissa delar av förordet till bilaga I och tabell A i samma bilaga.

(2) Bilaga III till direktiv 67/548/EEG innehåller en förteckning över de riskfraser som tilldelats farliga ämnen och preparat. Bilaga IV till direktiv 67/548/EEG innehåller en förteckning över de skyddsfraser som tilldelats farliga ämnen och preparat. Bilaga VI till direktiv 67/548/EEG innehåller riktlinjer för klassificering och märkning av farliga ämnen och preparat. I vissa språkversioner av direktivet är det nödvändigt att ändra vissa delar av bilagorna III, IV och VI.

(3) I bilaga V till direktiv 67/548/EEG anges metoder för bestämning av fysikalisk-kemiska egenskaper, toxicitet och ekotoxicitet hos ämnen och preparat. Det är nödvändigt att anpassa denna bilaga till den tekniska utvecklingen.

(4) Bilaga IX till direktiv 67/548/EEG innehåller bestämmelser om barnsäkra förslutningsanordningar. Dessa bestämmelser bör anpassas och uppdateras. Det är nödvändigt att öka räckvidden för användningen av barnsäkra förslutningsanordningar.

(5) De åtgärder som föreskrivs i detta direktiv är förenliga med yttrandet från Kommittén för anpassning till tekniska framsteg av direktiv som syftar till att undanröja tekniska handelshinder avseende farliga ämnen och preparat.

HÄRIGENOM FÖRESKRIVS FÖLJANDE.

Artikel 1

Direktiv 67/548/EEG ändras på följande sätt:

1. Bilaga I skall ändras på följande sätt:

a) Anmärkning Q i bilaga 1A till detta direktiv skall ersätta motsvarande anmärkning i förordet.

b) Raderna i bilaga 1B till detta direktiv skall ersätta motsvarande rader i tabell A.

c) Uppgifterna i bilaga 1C till detta direktiv skall ersätta motsvarande uppgifter.

d) Uppgifterna i bilaga 1D till detta direktiv skall införas.

2. Riskfrasen i bilaga 2 till detta direktiv skall ersätta motsvarande fras i bilaga III.

3. Bilaga IV skall ändras på följande sätt:

a) Skyddsfraserna i bilaga 3A till detta direktiv skall ersätta motsvarande fraser i bilaga IV.

b) De sammansatta skyddsfraserna i bilaga 3B till detta direktiv skall ersätta motsvarande fraser i bilaga IV.

4. Del B i bilaga V skall ändras på följande sätt:

a) Texten i bilaga 4A till detta direktiv skall ersätta avsnitt B.10.

b) Texten i bilaga 4B till detta direktiv skall ersätta avsnitt B.11.

c) Texten i bilaga 4C till detta direktiv skall ersätta avsnitt B.12.

d) Texten i bilaga 4D till detta direktiv skall ersätta avsnitt B.13 och B.14.

e) Texten i bilaga 4E till detta direktiv skall ersätta avsnitt B.17.

f) Texten i bilaga 4F till detta direktiv skall ersätta avsnitt B.23. Rubriken på avsnitt B.23 i den förklarande anmärkningen skall ändras på motsvarande sätt.

g) Texten i bilaga 4G till detta direktiv skall läggas till.

5. Fjärde strecksatsen i den allmänna inledningen till del C i bilaga V skall utgå.

6. Texten i bilaga 5 till detta direktiv skall ersätta motsvarande text i bilaga VI.

7. Bilaga IX skall ändras i enlighet med bilaga 6 till detta direktiv.

Artikel 2

1. Medlemsstaterna skall sätta i kraft de lagar och andra författningar som är nödvändiga för att följa detta direktiv senast den 1 juni 2001. De skall genast underrätta kommissionen om detta.

När en medlemsstat antar dessa bestämmelser skall de innehålla en hänvisning till detta direktiv eller åtföljas av en sådan hänvisning när de offentliggörs. Närmare föreskrifter om hur hänvisningen skall göras skall varje medlemsstat själv utfärda.

2. Medlemsstaterna skall till kommissionen överlämna texterna till centrala bestämmelser i nationell lagstiftning som de antar inom det område som omfattas av detta direktiv.

Artikel 3

Detta direktiv träder i kraft den tredje dagen efter det att det offentliggjorts i Europeiska gemenskapernas officiella tidning.

Artikel 4

Detta direktiv riktar sig till medlemsstaterna.

Utfärdat i Bryssel den 19 maj 2000.

På kommissionens vägnar

Margot Wallström

Ledamot av kommissionen

(1) Antagen efter den tjugosjunde anpassningen.

(2) EGT 196, 16.8.1967, s. 1.

(3) EGT L 199, 30.7.1999, s. 57.

BILAGA 1A

FÖRORD TILL BILAGA I

Förklaring till anmärkningarna om identifiering, klassificering och märkning av ämnen

DA:

Note Q:

Klassificeringen som kræftfremkaldende kan udelades for fibre, som opfylder en af følgende betingelser:

- en kortvarig biopersistensprøve ved inhalation har vist, at fibre, der er længere end 20 µm, har en vægtet halveringstid på mindre end 10 dage

- en kortvarig biopersistensprøve ved intratrakeal instillation har vist, at fibre, der er længere end 20 µm, har en vægtet halveringstid på mindre end 40 dage

- en egnet intra-peritoneal prøve ikke har vist kræftfremkaldende virkning, eller

- en egnet langvarig inhalationsprøve ikke har vist relevante sygdomsfremkaldende virkninger eller neoplastiske forandringer.

SV:

Note Q:

Ämnet behöver inte klassificeras som cancerframkallande om det kan visas att det uppfyller ett av följande villkor:

- ett korttidstest för att bestämma den biologiska beständigheten vid inhalation har visat att fibrer längre än 20 µm har en viktad halveringstid på mindre än 10 dagar

- ett korttidstest för att bestämma den biologiska beständigheten vid intratrakeal instillation har visat att fibrer längre än 20 µm har en viktad halveringstid på mindre än 40 dagar

- ett lämpligt intraperitonealt test har inte givit belägg för förhöjd cancerogenitet

- frånvaro av relevant patogenitet eller neoplastiska förändringar i ett lämpligt långtids inhalationstest.

(Berör inte den ES versionen)

(Berör inte den DE versionen)

(Berör inte den EL versionen)

(Berör inte den EN versionen)

(Berör inte den FR versionen)

(Berör inte den IT versionen)

(Berör inte den NL versionen)

(Berör inte den PT versionen)

(Berör inte den FI versionen)

BILAGA 1B

"TABELL A

>Plats för tabell>"

BILAGA 1C

>Plats för tabell>

BILAGA 1D

>Plats för tabell>

BILAGA 2

R 66

>Plats för tabell>

(Berör inte den ES versionen)

(Berör inte den DA versionen)

(Berör inte den DE versionen)

(Berör inte den EL versionen)

(Berör inte den EN versionen)

(Berör inte den FR versionen)

(Berör inte den NL versionen)

(Berör inte den PT versionen)

(Berör inte den FI versionen)

(Berör inte den SV versionen)

BILAGA 3A

S 23

>Plats för tabell>

(Berör inte den ES versionen)

(Berör inte den DA versionen)

(Berör inte den DE versionen)

(Berör inte den EL versionen)

(Berör inte den EN versionen)

(Berör inte den IT versionen)

(Berör inte den NL versionen)

(Berör inte den PT versionen)

(Berör inte den FI versionen)

(Berör inte den SV versionen)

S 26

>Plats för tabell>

(Berör inte den ES versionen)

(Berör inte den DA versionen)

(Berör inte den EL versionen)

(Berör inte den EN versionen)

(Berör inte den FR versionen)

(Berör inte den IT versionen)

(Berör inte den NL versionen)

(Berör inte den PT versionen)

(Berör inte den FI versionen)

(Berör inte den SV versionen)

S 56

>Plats för tabell>

(Berör inte den ES versionen)

(Berör inte den DA versionen)

(Berör inte den EL versionen)

(Berör inte den FR versionen)

(Berör inte den NL versionen)

(Berör inte den PT versionen)

(Berör inte den FI versionen)

(Berör inte den SV versionen)

BILAGA 3B

S 27/28

>Plats för tabell>

(Berör inte den ES versionen)

(Berör inte den DA versionen)

(Berör inte den EL versionen)

(Berör inte den EN versionen)

(Berör inte den FR versionen)

(Berör inte den IT versionen)

(Berör inte den NL versionen)

(Berör inte den PT versionen)

(Berör inte den FI versionen)

(Berör inte den SV versionen)

S 29/56

>Plats för tabell>

(Berör inte den DA versionen)

(Berör inte den EL versionen)

(Berör inte den FR versionen)

(Berör inte den PT versionen)

(Berör inte den FI versionen)

BILAGA 4A

"B.10. MUTAGENICITET - TEST IN VITRO AV KROMOSOMAVVIKELSER HOS DÄGGDJUR

1. METOD

DENNA METOD ÄR EN KOPIA AV METODEN OECD TG 473, Test In Vitro av kromosomavvikelser hos däggdjur (1997).

1.1 INLEDNING

Avsikten med testen av kromosomavvikelser in vitro är att identifiera ämnen som orsakar strukturella kromosomavvikelser hos odlade däggdjursceller (1) (2) (3). Strukturella avvikelser kan vara av två typer, kromosomala eller kromatida. Majoriteten av de kemiska mutagenerna inducerar avvikelser av kromatidtyp, men även avvikelser av kromosomtyp förekommer. En ökning av polyploidin kan indikera att ett kemiskt ämne har potential att inducera numeriska avvikelser. Denna metod är dock inte utformad för att mäta numeriska avvikelser och används inte rutinmässigt för det ändamålet. Kromosommutationer och liknande händelser är orsaken till många genetiska sjukdomar och det finns påtagliga bevis för att kromosommutationer och liknande händelser som ger upphov till förändringar i onkogener och tumörsuppressorgener i somatiska celler är inblandade i cancerinduktion hos människa och hos försöksdjur.

Test av kromosomavvikelser in vitro kan göras med kulturer av etablerade cellinjer, cellstammar eller primära cellkulturer. De celler som används väljs ut på grundval av tillväxtförmåga vid odling, karyotypens stabilitet, antalet kromosomer, kromosomernas mångfald och den spontana frekvensen av kromosomavvikelser.

Tester som utförs in vitro kräver i allmänhet att en exogen källa för metabolisk aktivering används. Detta metaboliska system för aktivering kan inte helt och hållet efterlikna de förhållanden som råder i däggdjuret in vitro. Man bör se till att undvika sådana förhållanden som skulle leda till positiva resultat som inte återspeglar den verkliga mutageniciteten och kan ha sin orsak i pH-förändringar, osmolalitet eller hög cytotoxicitet (4) (5).

Denna test används för att söka efter möjliga mutagener och karcinogener hos däggdjur. Många ämnen som är positiva i detta test är karcinogena hos däggdjur, men det finns ingen perfekt korrelation mellan detta test och karcinogenicitet. Korrelationen är beroende på den kemiska klassen och det finns allt starkare bevis för att det finns karcinogener som inte detekteras med detta test, eftersom det ser ut som om de verkar genom andra mekanismer än direkta DNA-skador.

Se även Allmän inledning, del B.

1.2 DEFINITIONER

avvikelser av kromatidtyp: en strukturell kromosomskada, uttryckt i form av brott på enstaka kromatider eller brott och återförening mellan kromatider.

avvikelser av kromosomtyp: en strukturell kromosomskada, uttryckt som brott, eller brott och återförening, hos båda kromatiderna på samma ställe.

endoreduplikation: en process där kärnan efter den S-fas under DNA-replikationen inte övergår i mitos utan inleder ännu en S-fas. Resultatet är kromosomer med 4, 8, 16, ... kromatider.

lucka: en akromatisk skada som är mindre än bredden hos en kromatid, och med ett minimum av misspassning hos kromatiderna.

mitotiskt index: den andel celler som är i metafas delat med det totala antalet celler som kan observeras i en cellpopulation; en indikation på graden av tillväxt hos den populationen.

numerisk avvikelse: en förändring av antalet kromosomer jämfört med det normala antalet karakteristika hos de celler som används.

polyploidi: en multipel av det haploida antalet kromosomer (n) som skiljer sig från det diploida antalet (dvs. 3n, 4n och så vidare).

strukturell avvikelse: en förändring i kromosomstrukturen som kan detekteras genom en mikroskopisk undersökning av celldelningens metafasstadium, och som uppträder i form av deletioner och fragment, interna eller externa utbyten.

1.3 TESTMETODENS PRINCIP

Cellodlingar exponeras för testsubstansen både med och utan metabolisk aktivering. Vid förutbestämda intervall, efter att cellodlingen har exponerats för testsubstansen, utförs behandling med ett ämne som stoppar celldelningen i metafas (t.ex. Colcemid® eller colchicin). Därefter skördas cellerna och färgas in, varpå närvaro av kromosomavvikelser i metafascellerna analyseras mikroskopiskt.

1.4 BESKRIVNING AV TESTMETODEN

1.4.1 Förberedelser

1.4.1.1 Celler

Ett antal olika cellinjer, stammar eller primära cellkulturer, inklusive humanceller, kan användas (t.ex. fibroblaster från kinesisk hamster, perifera blodlymfocyter från människor eller andra däggdjur).

1.4.1.2 Typ av medium och kultur

Lämpliga odlingsmedier och inkubationsförhållanden (odlingskärl, CO2-koncentration, temperatur och luftfuktighet) bör väljas för odlingarna. Etablerade cellinjer och stammar bör rutinmässigt kontrolleras med avseende på stabilitet hos det modala kromosomantalet och frånvaro av kontaminerad mykoplasma. Om kontaminering har skett bör de inte användas. Cellernas normala cellcykeltid och de odlingsförhållanden som används bör vara kända.

1.4.1.3 Förberedelse av kulturer

Etablerade cellinjer och stammar: celler dras upp från stamkulturer, inokuleras i ett odlingsmedium som har en sådan densitet att kulturerna inte kommer att växa samman innan det är dags att skörda, och inkuberas vid 37 °C.

Lymfocyter: helblod, behandlat med en antikoagulant (t.ex. heparin) eller separerade lymfocyter som erhållits från friska individer, tillsätts till odlingsmediet, vilket innehåller en mitogen substans (t.ex. fytohemaglutinin), varpå inkubering sker vid 37 °C.

1.4.1.4 Metabolisk aktivering

Celler bör exponeras för testsubstansen både i närvaro och frånvaro av ett lämpligt metaboliskt system för aktivering. Det mest använda systemet är en kofaktorstödd post-mitokondriell fraktion (S9) beredd ur lever från gnagare vilka behandlats med enzyminducerande ämnen såsom Aroclor 1254 (6) (7) (8) (9) eller en blandning av fenobarbiton och β-naftoflavon (10) (11) (12).

Den postmitokondriella fraktionen används vanligen vid koncentrationer i området 1 till 10 % v/v i det slutliga testmediet. Tillståndet hos ett system för metabolisk aktivering kan bero på den klass av kemikalier som testas. I vissa fall kan det vara lämpligt att använda mer än en koncentration av den post-mitokondriella fraktionen.

Ett antal vidareutvecklingar, inklusive skapandet av genetiskt modifierade cellinjer som uttrycker specifika aktiverande enzymer, kan erbjuda en potential för endogen aktivering. Valet av de cellinjer som skall användas bör vara vetenskapligt underbyggt (t.ex. genom relevansen av cytokrom P450 isoenzym för metabolismen hos testsubstansen).

1.4.1.5 Beredning av testsubstansen

Fasta testsubstanser bör lösas upp i eller blandas med lämpligt lösningsmedel eller vehikel och spädas ut om detta är lämpligt före det att cellerna behandlas. Flytande testsubstanser kan tillsättas direkt till testsystemen och/eller spädas ut innan behandlingen startas. Nygjorda beredningar av testsubstansen bör användas om inte stabilitetsdata påvisar att lagring är acceptabelt.

1.4.2 Försöksbetingelser

1.4.2.1 Lösningsmedel/vehikel

Lösningsmedlet/vehikeln bör inte kunna misstänkas för att reagera kemiskt med testsubstansen och bör vara förenlig med överlevnaden för cellerna samt S9-aktiviteten. Om andra lösningsmedel/vehiklar än gängse brukliga används bör det finnas data som visar att de är kompatibla. Det rekommenderas att vattenbaserade lösningsmedel/vehiklar i första hand bör övervägas närhelst det är möjligt. När substanser som är instabila i vatten testas, bör de organiska lösningsmedel som används vara fria från vatten. Vatten kan avlägsnas genom tillsats av en molekylsikt.

1.4.2.2 Exponeringskoncentrationer

Bland de kriterier som skall övervägas när den högsta koncentrationen skall fastställas är cytotoxicitet, löslighet i testsystemet och förändringar i pH eller osmolalitet.

Cytotoxicitet bör fastställas, såväl med som utan metabolisk aktivering i huvudexperiment, med hjälp av en lämplig indikation på cellernas integritet och tillväxt, såsom graden av sammanväxning, viabilitetsräkning av cellerna, eller ett mitotiskt index. Det kan vara lämpligt att fastställa cytotoxicitet och löslighet i ett förberedande experiment.

Minst tre analyserbara koncentrationer bör användas. Där cytotoxicitet uppträder bör dessa koncentrationer täcka in ett område som sträcker sig från maximal toxicitet ner till liten eller ingen toxicitet. Detta innebär normalt att koncentrationerna bör separeras av minst en faktor mellan 2 och [radic ]10. Vid tiden för skörd av cellerna bör den högsta koncentrationen visa en signifikant reduktion i graden av konfluens, cellräkning eller mitotiskt index (alla större än 50 %). Det mitotiska indexet är endast ett indirekt mått på cytotoxiska/cytostatiska effekter och är beorende av tiden efter behandlingen. Det mitotiska indexet är dock acceptabelt för suspensionskulturer där andra toxicitetsmätningar kan vara besvärliga och opraktiska. Information om kinetiken för cellcykler, såsom medelgenerationstid (AGT), kan användas som extra information. AGT är dock ett övergripande medelvärde som inte alltid avslöjar existensen av försenade subpopulationer, och även små ökningar av medelgenerationstiden kan associeras med en mycket påtaglig senareläggning av tiden för optimalt utbyte av avvikelser.

För substanser som är relativt icke-cytotoxiska bör den maximala testkoncentrationen vara 5 µl/ml, 5 mg/ml eller 0,01 M, beroende på vilket av dessa värden som är det lägsta.

För relativt olösliga substanser, som inte är toxiska vid koncentrationer som är lägre än koncentrationen där olöslighet inträder, bör den högsta använda dosen vara en koncentration som ligger över löslighetsgränsen i det avslutande odlingsmediet mot slutet av behandlingsperioden. I vissa fall (t.ex. när toxicitet endast uppträder vid koncentrationer som är högre än den lägsta olösliga koncentrationen) är det lämpligt att testa vid mer än en koncentration med synlig fällning. Det kan vara lämpligt att fastställa losligheten vid början och slutet av behandlingen, eftersom lösligheten kan ändras under det att exponeringen i testsystemet pågår, beroende på närvaro av celler, S9, serum, etc. Löslighet kan detekteras med blotta ögat. Fällningen torde inte störa bestämningen.

1.4.2.3 Negativa och positiva kontroller

Samtidiga positiva och negativa kontroller (lösningsmedel eller vehikel), både med och utan metabolisk aktivering, bör inkluderas i varje experiment. När metabolisk aktivering används, bör den positiva kontrollkemikalien vara av en sådan typ att aktivering krävs för att ge ett mutagent svar.

Positiva kontroller bör utnyttja en känd klastogen vid exponeringsnivåer som förväntas ge en reproducerbar och detekterbar ökning jämfört med bakgrunden och som demonstrerar känsligheten hos testsystemet.

Positiva kontrollkoncentrationer bör väljas på ett sådant sätt att effekterna är tydliga men inte omedelbart avslöjar identiteten hos kodade utstryksglas för läsaren. I tabellen nedan ges några exempel på positiva kontrollsubstanser.

>Plats för tabell>

Andra lämpliga positiva kontrollsubstanser kan användas. Användning av kemiska klassrelaterade positiva kontrollkemikalier bör övervägas när sådana finns att tillgå.

Negativa kontroller, bestående av lösningsmedel eller enbart en vehikel i behandlingsmediet, och hanterade på samma sätt som behandlingsodlingarna, bör inkluderas var gång som odlingen skördas. Dessutom bör obehandlade kontroller också användas om det inte finns historiska kontrolldata som påvisar att inga skadliga eller mutagena effekter induceras av det valda lösningsmedlet.

1.4.3 Förfarande

1.4.3.1 Behandling med en testsubstans

Prolifererande celler behandlas med testsubstansen i såväl närvaro som frånvaro av ett system för metabolisk aktivering. Behandling av lymfocyter bör inledas när cirka 48 timmar gått efter den mitogena stimuleringen.

1.4.3.2 Två kulturer bör normalt användas för varje koncentration, och rekommenderas varmt för negativa kontrollkulturer eller kontrollkulturer för lösningsmedel. Där minimala variationer mellan två kulturer kan påvisas (13) (14) ur historiska data, kan det vara acceptabelt att en enda kultur används för varje koncentration.

Gasformiga eller flyktiga substanser bör testas med hjälp av lämpliga metoder, t.ex. test i slutna odlingskärl (15) (16).

1.4.3.3 Tid för skörd av odlingen

I det första experimentet bör cellerna exponeras för testsubstansen, både med och utan metabolisk aktivering, under 3-6 timmar och prov bör tas ut vid en tid som motsvarar cirka 1,5 gånger den normala cellcykelns längd efter det att behandlingen har påbörjats (12). Om detta protokoll ger negativa resultat både med och utan aktivering, bör ytterligare ett experiment utan aktivering utföras, med kontinuerlig behandling fram till att provtagning sker vid en tidpunkt som motsvarar cirka 1,5 gånger den normala cellcyklens längd. Vissa kemikalier kan vara enklare att detektera vid behandlings-/provtagningstider som är längre är 1,5 cykellängder. Negativa resultat med metabolisk aktivering måste bekräftas från fall till fall. I de fall där det inte anses nödvändigt att bekräfta negativa resultat bör detta motiveras.

1.4.3.4 Kromosomberedning

Cellkulturer behandlas vanligtvis med Colcemid® eller colchicin under 1-3 timmar innan skördning sker. Varje cellkultur skördas och behandlas separat för preparationen av kromosomer. Kromosomberedning innefattar hypoton behandling av cellerna, fixering och infärgning.

1.4.3.5 Analys

Alla utstryksglas, inklusive de med positiva och negativa kontroller, bör kodas upp oberoende av varandra innan den mikroskopiska analysen utförs. Eftersom fixeringen ofta ger upphov till brott på en del av de celler som är i metafas, med åtföljande förlust av kromosomer, bör de celler som påträffas därför innehålla ett centromerantal som är ekvivalent med det modala antalet ± 2 för alla celltyper. Åtminstone 200 väl spridda metafaser bör förekomma per koncentration och kontroll, med lika fördelning mellan dubbelproven, om det är tillämpligt. Detta antal kan reduceras när ett stört antal avvikelser observeras.

Även om syftet med testet är att detektera strukturella kromosomavvikelser, är det viktigt att notera polyploidi och endoreduplikation när dessa händelser observeras.

2. DATA

2.1 BEHANDLING AV RESULTATEN

Den experimentella enheten utgörs av cellen, och därför bör den procentandel av cellerna som uppvisar strukturella kromosomavvikelser utvärderas. Olika typer av strukturella kromosomavvikelser bör listas med antal och frekvenser för experimentella kulturer samt kontrollkulturer. Luckor i DNA-strängen noteras separat och rapporteras men inkluderas inte generellt i den totala frekvensen för avvikelser.

Samtidiga mätningar av cytotoxicitet för alla behandlade och negativa kontrollkulturer i huvudexperimenten avseende avvikelser bör även samlas in.

Individuella data för kulturen bör tas fram. Dessutom bör alla data sammanställas i form av en tabell.

2.2 UTVÄRDERING OCH TOLKNING AV RESULTATEN

Det finns ett flertal kriterier som används för att bestämma om ett resultat är positivt, t.ex. en koncentrationsrelaterad ökning eller en reproducerbar ökning av antalet celler med kromosomavvikelser. Man bör i första hand överväga resultatets biologiska relevans. Statistiska metoder kan användas som en hjälp vid utvärderingen av testresultaten (3) (13). Statistisk signifikans bör dock inte vara den enda faktor som bestämmer om resultatet är positivt.

En ökning av antalet polyploida celler kan utgöra en indikation på att testsubstansen har potential att inhibera mitotiska processer och att inducera numeriska kromosomavvikelser. En ökning av antalet celler med endoreduplicerade kromosomer kan utgöra en indikation på att testsubstansen har potential att inhibera cellcykelns förlopp (17) (18).

En testsubstans för vilken resultatet inte uppfyller ovanstående kriterier bedöms såsom icke-mutagen i detta system.

Även om de flesta experiment kommer att ge tydligt positiva eller negativa resultat, så kan i sällsynta fall uppsättningen av data göra det omöjligt att utföra en otvetydig bedömning med avseende på testsubstansens aktivitet. Resultatet kan förbli tvetydigt eller tveksamt, oavsett hur många experiment som utförs.

Positiva resultat från testet av kromosomavvikelser in vitro indikerar att testsubstansen inducerar strukturella kromosomavvikelser hos odlade somatiska däggdjursceller. Negativa resultat indikerar att testsubstansen inte inducerar kromosomavvikelser hos odlade somatiska däggdjursceller under de betingelser som rådde under testet.

3. RAPPORTERING

TESTRAPPORT

Testrapporten måste innehålla följande information:

Lösningsmedel/vehikel:

- motivering av valet av vehikel

- testsubstansens stabilitet och löslighet i lösningsmedlet/vehikeln, om detta är känt

Celler:

- cellernas typ och ursprung

- den använda celltypens karyotypegenskaper och lämplighet

- frånvaro av mykoplasma, om detta är tillämpligt

- information om cellcykelns längd

- bloddonatorernas kön, helblod eller separerade lymfocyter, använd mitogen substans antal passager, om detta är tillämpligt

- metoder för underhåll av cellkulturen, om detta är tillämpligt

- det normala antalet kromosomer

Försöksbetingelser:

- identitet hos det ämne som stoppar celldelningen i metafasen, dess koncentration och cellexponeringens varaktighet

- grund för val av koncentrationer och antalet kulturer som ingår, t.ex. data för cytotoxicitet och begränsningar i löslighet, om detta finns tillgängligt

- mediets sammansättning, CO2-koncentration, om detta är tillämpligt

- testsubstansens koncentration

- den tillsatta vehikelns och testsubstansens volym

- inkubationstemperatur

- inkubationstid

- behandlingens varaktighet

- celldensitet vid inokulering, om detta är tillämpligt

- typ och sammansättning hos det system som används för metabolisk aktivering, inklusive acceptabilitetskriterier

- positiva och negativa kontroller

- metoder för preparation av utstryksglas

- kriterier för bedömning av avvikelser

- antal metafaser som analyserats

- metoder för toxicitetsmätningarna

- kriterier för när studierna skall anses vara positiva, negativa eller osäkra

Resultat:

- tecken på toxicitet, t.ex. grad av sammanväxning, cellcykeldata, cellräkningar, mitotiskt index

- tecken på utfällning

- data om behandlingsmediets pH och osmolalitet, om detta har uppmätts

- definition av avvikelser, inklusive luckor i DNA-strängen

- antalet celler med kromosomavvikelser och typ av sådana avvikelser, angivna separat för varje behandlad kultur samt kontrollkultur

- förändringar i ploiditet, om detta observerats

- dos/respons-förhållande, där det är möjligt

- statistiska analyser, om sådana finns

- samtidiga negativa (lösningsmedel/vehikel) och positiva kontrolldata

- historiska negativa (lösningsmedel/vehikel) och positiva kontrolldata, med variationer, medelvärden och standardavvikelser

Diskussion av resultaten.

Slutsatser.

4. REFERENSER

(1) Evans, H. J. (1976). Cytological Methods for Detecting Chemical Mutagens. In: Chemical mutagens, Principles and Methods for their Detection, Vol. 4, Hollaender, A. (ed) Plenum Press, New York and London, s. 1-29.

(2) Ishidate, M. Jr. and Sofuni, T. (1985). The In Vitro Chromosomal Aberration Test Using Chinese Hamster Lung (CHL) Fibroblast Cells in Culture. In: Progress in Mutation Research, Vol. 5, Ashby, J. et al., (eds) Elsevier Science Publishers, Amsterdam-New York-Oxford, s. 427-432.

(3) Galloway, S. M., Armstrong, M. J., Reuben, C., Colman, S., Brown, B., Cannon, C., Bloom, A. D., Nakamura, F., Ahmed, M., Duk, S., Rimpo, J., Margolin, G.H., Resnick, M. A, Anderson, G. and Zeiger, E. (1978). Chromosome aberration and sister chromatic exchanges in Chinese hamster ovary cells: Evaluation of 108 chemicals. Environs. Molec. Mutagen 10 (suppl.10), s. 1-175.

(4) Scott, D. Galloway, S. M., Marshall, R. R., Ishidate, M. Jr., Brusick, D., Ashby, J. and Myhr, B. C. (1991). Genotoxicity under Extreme Culture Conditions. A report from ICPEMC Task Group 9. Mutation Res., 257, s. 147-204.

(5) Morita, T., Nagaki, T., Fukuda, I. and Okumura, K., (1992). Clastogenicity of low pH to Various Cultured Mammalian Cells. Mutation Res., 268, s. 297-305.

(6) Ames, B. N., McCann, J. and Yamasaki, E. (1975). Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian Microsome Mutagenicity Test. Mutation Res., 31, s. 347-364.

(7) Maron, D. M. and Ames, B. N. (1983). Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test. Mutation Res., 113, s. 173-215.

(8) Natarajan, A. T., Tates, A. D., van Buul, P. P. W., Meijers, M. and de Vogel, N. (1976). Cytogenetic Effects of Mutagen/Carcinogens after Activation in a Microsomal System In Vitro, I. Induction of Chromosome Aberrations and Sister Chromatid Exchange by Diethylnitrosamine (DEN) and Dimethylnitrosamine (DMN) in CHO Cells inthe Presence of Rat-Liver Microsomes. Mutation Res., 37, s. 83-90.

(9) Matsuoka, A., Hayashi, M. and Ishidate, M. Jr. (1979). Chromosomal Aberration Tests on 29 Chemicals Combined with S9 Mix In Vitro. Mutation Res., 66, s. 277-290.

(10) Elliot, B. M., Combes, R. D., Elcombe, C. R., Gatehouse, D. G., Gibson, G. G., Mackay, J. M. and Wolf, R. C. (1992). Report of UK Environmental Mutagen Society Working Party. Alternatives to Aroclor 1254-induced S9 in In Vitro Genotoxicity Assays. Mutagenesis, 7, s. 175-177.

(11) Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. (1976). A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems. In: de Serres, F. J., Fouts, J. R., Bend, J. R. and Philpot, R. M. (eds) In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, Elsevier, North-Holland, s. 85-88.

(12) Galloway, S. M., Aardema, M. J., Ishidate, M. Jr., Ivett, J. L., Kirkland, D. J., Morita, T., Mosesso, P., Sofuni, T. (1994). Report from Working Group on in In Vitro Tests for Chromosomal Aberrations. Mutation Res., 312, s. 241-261.

(13) Richardson, C., Williams, D. A., Allen, J. A., Amphlett, G., Chanter, D. O. and Phillips, B. (1989). Analysis of Data from In Vitro Cytogenetic Assays. In Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. Kirkland, D. J., (ed) Cambridge University Press, Cambridge, s. 141-154.

(14) Soper, K. A. and Galloway, S. M. (1994). Replicate Flasks are not Necessary for In Vitro Chromosome Aberration Assays in CHO Cells. Mutation Res., 312, s. 139-149.

(15) Krahn, D. F., Barsky, F. C. and McCooey, K. T. (1982). CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids. In: Tice, R. R., Costa, D. L., Schaich, K. M. (eds). Genotoxic Effects of Airborne Agents. New York, Plenum, s. 91-103.

(16) Zamora, P. O., Beson, J. M., Li, A. P. and Brooks, A. L. (1983). Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown on Collagen Gels of Detecting Highly Volatile Mutagens in the CHO/HGPRT Mutation Assay. Environmental Mutagenesis, 5, s. 795-801.

(17) Locke-Huhle, C. (1983). Endoreduplication in Chinese hamster cells during alpha-radiation induced G2 arrest. Mutation Res., 119, s. 403-413.

(18) Huang, Y., Change, C. and Trosko, J. E. (1983). Aphidicolin-induced endoreduplication in Chinese hamster cells. Cancer Res., 43, s. 1362-1364."

BILAGA 4B

"B.11. MUTAGENICITET - TEST IN VIVO AV KROMOSOMAVVIKELSER I BENMÄRG HOS DÄGGDJUR

1. METOD

Denna metod är en kopia av OECD TG 475, Test av kromosomavvikelser i benmärg hos däggdjur (Mammalian Bone Marrow Chromosome Aberration Test (1997)).

1.1 INLEDNING

Testet in vivo avseende kromosomavvikelser hos däggdjur används för att detektera strukturella kromosomavvikelser inducerade av testsubstansen i benmärgsceller hos djur, vanligen hos gnagare (1) (2) (3) (4). Strukturella kromosomavvikelser kan vara av två typer, kromosomala eller kromatida. En ökning av polyploidin kan indikera att en kemikalie har potential att inducera numeriska avvikelser. För huvuddelen av de kemiska mutagenerna utgörs de inducerade avvikelserna av kromatidtypen, men även avvikelser av kromosomtyp kan förekomma. Kromosommutationer och liknande händelser är orsaken till många genetiska sjukdomar hos människa och det finns omfattande bevis för att kromosommutationer och liknande händelser som ger upphov till förändringar i onkogener samt att tumörsuppressorgener är inblandade i cancer hos människa och i experimentella system.

Gnagare används rutinmässigt i detta test. Benmärg är målvävnaden i detta test, eftersom det är en mycket kärlrik vävnad som innehåller en cellpopulation med en snabb cellcykel, och där cellerna enkelt kan isoleras och bearbetas. Andra arter och målvävnader används inte med denna metod.

Detta test av kromosomavvikelser är särskilt relevant för att fastställa mutagena risker, eftersom det medger överväganden av faktorer in vivo för metabolism, farmakokinetik och processer för DNA-reparationer, även om dessa faktorer kan variera mellan olika arter och vävnader. Ett test in vivo är även användbart för fortsatta undersökningar av en mutagen effekt, med detektion genom tester in vitro.

Om det finns bevis för att testsubstansen, eller en reaktiv metabolit, inte kommer att nå målvävnaden, är det inte lämpligt att använda detta test.

Se även Allmän inledning, del B.

1.2 DEFINITIONER

avvikelser av kromatidtyp: en strukturell kromosomskada, uttryckt i form av brott på enstaka kromatider eller brott och återförening mellan kromatider.

avvikelser av kromosomtyp: en strukturell kromosomskada, uttryckt som brott, eller brott och återförening, hos båda kromatiderna på samma ställe.

endoreduplikation: en process där kärnan efter den S-fas under DNA-replikationen inte övergår i mitos utan inleder ännu en S-fas. Resultatet är kromosomer med 4, 8, 16, ... kromatider.

lucka: en akromatisk skada som är mindre än bredden hos en kromatid, och med ett minimum av misspassning hos kromatiderna.

numerisk avvikelse: en förändring av antalet kromosomer jämfört med det normala antalet karakteristika hos de celler som används.

polyploidi: en multipel av det haploida antalet kromosomer (n) som skiljer sig från det diploida antalet (dvs. 3n, 4n.).

Strukturell avvikelse: en förändring i kromosomstrukturen som kan detekteras genom en mikroskopisk undersökning av celldelningens metafasstadium, och som uppträder i form av deletioner och fragment, interna eller externa utbyten.

1.3 TESTMETODENS PRINCIP

Djur exponeras för testsubstansen genom en lämplig metod för exponering och de avlivas på lämpliga tider efter behandlingen. Innan de avlivas behandlas djuren med ett ämne som gör att celler stannar upp i metafas (t.ex. colchicin eller Colcemid®). Kromosomberedningsar görs sedan från benmärgscellerna och färgas in, varpå celler i metafas analyseras med avseende på kromosomavvikelser.

1.4 BESKRIVNING AV TESTMETODEN

1.4.1 Förberedelser

1.4.1.1 Val av djurarter

Vanligen används råttor, möss och kinesiska hamstrar, även om vilket lämpligt däggdjur som helst kan utnyttjas. Man bör välja de stammar av unga, friska vuxna djur som vanligen används på laboratorier. När undersökningen skall påbörjas, är det lämpligt att viktskillnaden mellan djuren är så liten som möjligt och den bör inte överstiga ± 20 % av medelvikten för varje kön.

1.4.1.2 Förhållanden vid förvaring och utfodring

De generella förhållanden som anges i den Allmänna inledningen till del B gäller. Man bör dock sträva efter en relativ luftfuktighet på 50-60 %.

1.4.1.3 Förberedelse av djuren

Friska, unga vuxna djur väljs ut slumpartat för placering i kontroll- och behandlingsgrupperna. Burar bör arrangeras på ett sådant sätt att möjliga effekter beroende på placeringen av burarna blir så små som möjligt. Djuren skall ha en unik identifiering. De bör vänjas vid förhållandena i laboratoriet under minst fem dagar.

1.4.1.4 Beredning av doser

Fasta testsubstanser bör lösas upp i eller blandas med lämpliga lösningsmedel eller vehiklar och spädas ut, om så är lämpligt, innan dosen administreras till djuren. Testsubstanser i flytande form kan doseras direkt eller spädas ut före dosering. Nygjorda beredningar av testsubstansen bör användas, om inte stabilitetsdata visar att lagring är acceptabel.

1.4.2 Försöksbetingelser

1.4.2.1 Lösningsmedel/vehikel

Lösningsmedlet/vehikeln bör inte ge upphov till toxiska effekter vid de dosnivåer som används och bör inte kunna misstänkas för att reagera kemiskt med testsubstansen. Om andra lösningsmedel/vehiklar än gängse brukliga används, bör användningen av dem ha stöd från data som visar på deras kompatibilitet. Därhelst det är möjligt rekommenderas att man i första hand överväger att använda vattenbaserade lösningsmedel/vehiklar.

1.4.2.2 Kontroller

Samtidiga positiva och negativa kontroller (lösningsmedel/vehikel) bör ingå för varje kön i varje test. Förutom behandling med testsubstansen, bör djuren i kontrollgrupperna hanteras på ett identiskt sätt i förhållande till djuren i de grupper där behandling skett.

Positiva kontroller bör ge strukturella avvikelser in vivo vid exponeringsnivåer som förväntas ge en detekterbar ökning i förhållande till bakgrunden. Positiva kontrolldoser bör väljas på ett sådant sätt att effekterna är tydliga men att identiteten hos kodade utstryksglas inte omedelbart avslöjas för läsaren. Det är acceptabelt att den positiva kontrollen administreras via en annan tillförselväg än testsubstansen och att provtagning endast sker vid ett enstaka tillfälle. Användning av kemiska klassrelaterade positiva kontrollkemikalier kan dessutom övervägas när dessa finns tillgängliga. I tabellen nedan ges några exempel på positiva kontrollsubstanser.

>Plats för tabell>

Negativa kontroller, behandlade enbart med lösningsmedel eller vehikel, och i övrigt behandlade på samma sätt som behandlingsgrupperna, bör inkluderas för varje provtagningstillfälle, om inte acceptabel variabilitet och frekvens hos celler med kromosomavvikelser hos djuren kan erhållas från historiska kontrolldata. Om enstaka provtagning används för negativa kontroller, är den lämpligast tiden det första provtagningstillfället. Dessutom bör obehandlade kontroller även användas om det inte finns historiska eller publicerade kontrolldata som visar att inga skadliga eller mutagena effekter induceras av det valda lösningsmedlet/vehikeln.

1.5 FÖRFARANDE

1.5.1 Försöksdjurens antal och kön

Varje behandlad grupp samt kontrollgruppen måste bestå av minst 5 analyserbara djur av varje kön. Det räcker med att testa enbart det ena könet, om det vid tiden för undersökningens genomförande finns data tillgängliga från undersökningar av samma art och där man har använt sig av samma exponeringssätt, så att det går att visa att det inte finns några substantiella skillnader i toxicitet mellan könen. I de fall där exponering för kemikalier hos människa kan vara könsspecifik, vilket t.ex. kan vara fallet för vissa läkemedel, bör testet utföras med försöksdjur av lämpligt kön.

1.5.2 Behandlingsschema

Testsubstanser administreras med fördel som en enstaka behandling. Testsubstanser kan även administreras i form av en delad dos, två behandlingar under samma dag med högst några timmars intervall, för att underlätta administrering av en stor volym. Andra doseringsscheman bör vara vetenskapligt motiverade.

Prover bör tas vid två separata tillfällen efter behandling under en dag. Det första provtagningstillfället för gnagare ligger på 1,5 gånger den normala cellcykelns längd (den senare är normalt 12-18 timmar) efter behandling. Eftersom den tid som går åt för upptag och metabolism av testsubstansen, likväl som dess effekt på cellcykelns kinetik, kan påverka den optimala tiden för detektion av kromosomavvikelser, så rekommenderas att provtagningen senareläggs till 24 timmar efter det första provtagningstillfället. Om doseringsscheman på mer än en dag används, bör man använda en provtagningstid på 1,5 gånger den normala cellcykelns längd efter den slutliga behandlingen.

Innan djuren avlivas bör de injiceras intraperitonealt med en lämplig dos av ett ämne som stoppar celldelningen i metafas (t.ex. Colcemid ® eller colchicin). Prov på försöksdjur bör därefter tas vid lämpliga intervall. För möss är detta intervall ca 3-4 timmar; för kinesiska hamstrar ligger intervallet på ca 4-5 timmar. Celler skördas från benmärgen och analyseras med avseende på kromosomavvikelser.

1.5.3 Dosnivåer

Om det inte finns några lämpliga data tillgängliga och en undersökning därför utförs för att fastställa omfattningen, bör denna undersökning utföras i samma laboratorium, och med samma arter, stammar, kön och behandlingsschema som senare skall användas i huvudundersökningen (5). Vid toxicitet används tre dosnivåer för det första provtagningstillfället. Dessa dosnivåer bör täcka in ett område som sträcker sig från maximal till liten eller ingen toxicitet. Vid senare provtagningstillfällen räcker det med att endast den högsta dosen används. Den högsta dosen definieras som den dos som producerar tecken på toxicitet och så att högre dosnivåer baserade på samma doseringsschema skulle förväntas leda till att försöksdjuret dör. Substanser med specifika biologiska verkningar vid låga icke-toxiska doser (såsom hormoner och mitogena substanser) kan utgöra undantag från kriterier som är dosbestämmande och bör utvärderas från fall till fall. Den högsta dosen kan även definieras som en dos vilken ger upphov till någon indikation på toxicitet i benmärgen (t.ex. mer än 50 % reduktion av mitotiskt index).

1.5.4 'Limit-test'

En fullständig undersökning med tre dosnivåer kan inte anses vara nödvändig om ett test på en dosnivå på minst 2000 mg/kg kroppsvikt och med en enstaka behandling, eller i form av två behandlingar under samma dag, inte ger upphov till observerbara toxiska effekter, och om ingen genotoxicitet kan förväntas utifrån data om strukturellt relaterade substanser. För undersökningar med en längre varaktighet ligger gränsdosen på 2000 mg/kg/kroppsvikt/dag vid behandlingar upp till 14 dagar, och 1000 mg/kg/kroppsvikt/dag för behandlingar som varar längre än 14 dagar. Förväntad exponering av människor kan utgöra en indikation på behovet av att använda en högre dosnivå i ett 'limit-test'.

1.5.5 Administrering av doser

Testsubstansen administreras normalt genom sondmatning med hjälp av en magsond, en lämplig intuberingskanyl eller genom en intraperitoneal injektion. Andra vägar för exponering kan vara acceptabla där de kan motiveras. Den maximala vätskevolymen som kan administreras med hjälp av sondmatning eller injektion vid ett tillfälle beror på försöksdjurets storlek. Volymen bör inte överstiga 2 ml/100 g kroppsvikt. Användning av volymer som är högre än dessa måste motiveras. Förutom för irriterande eller korrosiva substanser, som normalt kommer att visa på stegrade effekter med högre koncentrationer, bör variationer av testvolymen minimeras genom en justering av koncentrationen för att säkerställa att volymen är konstant vid alla dosnivåer.

1.5.6 Kromosomberedning

Omedelbart efter avlivningen tas benmärgen ut, tillsätts hypoton lösning och fixeras. Cellerna sprids sedan ut på utstryksglas och färgas in.

1.5.7 Analys

Det mitotiska indexet bör fastställas om ett mått på cytotoxicitet hos minst 1000 celler per djur för alla behandlade försöksdjur (inklusive positiva kontroller) och obehandlade försöksdjur för negativ kontroll.

Minst 100 celler bör analyseras för varje försöksdjur. Detta antal kan reduceras när ett stort antal avvikelser observeras. Alla utstryksglas, inklusive de för positiva och negativa kontroller, bör kodas oberoende av varandra innan de analyseras i mikroskop. Eftersom beredningen av utstryksglas ofta resulterar i brott på en del av de celler som är i metafas med förlust av kromosomer som följd, bör de celler som påträffas därför innehålla ett centromererantal som är lika med antalet 2n ± 2.

2. DATA

2.1 BEHANDLING AV RESULTATEN

Individuella data för försöksdjuren bör presenteras i tabellform. Den experimentella enheten utgörs av djuret. För varje försöksdjur bör antalet celler som påträffas, antalet avvikelser per cell och procentandelen celler med strukturella kromosomavvikelser utvärderas. Antalet och frekvensen av olika typer av strukturella kromosomavvikelser bör listas för behandlade grupper och kontrollgrupper. Luckor i DNA-strängen noteras separat och rapporteras men inkluderas inte generellt i den totala frekvensen av avvikelser. Om det inte finns några bevis för en skillnad i resultaten mellan könen, kan data från båda könen kombineras för statistisk analys.

2.2 UTVÄRDERING OCH TOLKNING AV RESULTATEN

Det finns ett flertal kriterier som används för att bestämma om ett resultat är positivt, t.ex. en dosrelaterad ökning i det relativa antalet celler med kromosomavvikelser eller en tydlig ökning av antalet celler som uppvisar avvikelser i en grupp som fått en enstaka dos vid ett enstaka provtagningstillfälle. Man bör i första hand överväga resultatets biologiska relevans. Statistiska metoder kan vara till hjälp vid utvärdering av testresultatet (6). Statistisk signifikans bör dock inte vara den enda faktor som bestämmer om resultatet är positivt. Tvetydiga resultat bör klarläggas genom fortsatta tester, lämpligen vid ändrade experimentella betingelser.

En ökning av polyploidin kan utgöra en indikation på att testsubstansen har potential att inducera numeriska kromosomavvikelser. En ökning av endoreduplikationen kan utgöra en indikation på att testsubstansen har potential att inhibera cellcykelns förlopp (7) (8).

En testsubstans för vilken resultatet inte uppfyller ovanstående kriterier anses vara icke-mutagen i detta test.

Även om de flesta experiment kommer att ge tydligt positiva eller negativa resultat, så kan i sällsynta fall uppsättningen av data göra det omöjligt att utföra en otvetydig bedömning med avseende på testsubstansens aktivitet. Resultatet kan förbli tvetydigt eller tveksamt, oavsett hur många experiment som utförs.

Positiva resultat från testet av kromosomavvikelser in vitro, indikerar att en substans inducerar kromosomavvikelser i benmärgen hos de arter som testades. Negativa resultat indikerar att testsubstansen, under dessa försöksbetingelser, inte inducerar kromosomavvikelser i benmärgen hos de arter som testades.

Sannoliketen för att testsubstansen eller dess metaboliter når ut till det stora kretsloppet eller specifikt till målvävnaden (t.ex. systemisk toxicitet) bör diskuteras.

3. RAPPORTERING

TESTRAPPORT

Testrapporten måste innehålla följande information:

Lösningsmedel/vehikel:

- motivering av valet av vehikel

- testsubstansens stabilitet och löslighet i lösningsmedlet/vehikeln, om detta är känt

Försöksdjur:

- art/stam som används

- försöksdjurens antal, ålder och kön

- källa, förhållanden vid förvaring, diet, etc.

- individuell vikt hos försöksdjuren vid försökets början, inklusive kroppsviktsintervallet, medelvärde och standardavvikelse för varje grupp

Försöksbetingelser:

- positiva och negativa kontroller (vehikel/lösningsmedel)

- data från en undersökning av lämpligt intervall, om en sådan har utförts

- grund för valet av dosnivå

- uppgifter om beredningen av testsubstansen

- uppgifter om administreringen av testsubstansen

- grund för administreringens tillförselväg

- metoder för att verifiera att testsubstansen nådde det stora kretsloppet eller målvävnaden, om detta är tillämpbart

- omvandling från koncentration av testsubstansen i diet/dricksvatten (ppm) till den verkliga dosen (mg/kg/kroppsvikt/dag), om detta är tillämpbart

- uppgifter om fodrets och vattnets kvalitet

- detaljerad beskrivning av behandlings- och provtagningsscheman

- metoder för mätningar av toxicitet

- identiteten hos substanser som stoppar cellcykeln i metafas, deras koncentration och behandlingens varaktighet

- metoder för preparation av utstryksglas

- kriterier för hur avvikelser påvisas

- antalet celler som analyserats per försöksdjur

- kriterier för bedömning av om undersökningarna är positiva, negativa eller tvetydiga

Resultat:

- tecken på toxicitet

- mitotiskt index

- typ av och antal avvikelser, angivna separat för varje försöksdjur

- det totala antalet avvikelser per grupp med medelvärden och standardavvikelser

- antal celler med avvikelser per grupp med medelvärden och standardavvikelser

- förändringar i ploiditet, om några sådana har observerats

- dos/respons-förhållande, där så är möjligt

- statistiska analyser, om några sådana förekommer

- samtidiga negativa kontrolldata

- historiska negativa kontrolldata med områden, medelvärden och standardavvikelser

- samtidiga positiva kontrolldata

Diskussion av resultaten.

Slutsatser.

4. REFERENSER

(1) Adler, I. D. (1984). Cytogenetic tests in Mammals. In: Mutagenicity Testing: a Practical Approach. S. Venitt and J. M. Parry (eds). IRL Press, Oxford, Washington D. C., s. 275-306.

(2) Preston, R. J., Dean, B. J., Galloway, S., Holden, H., McFee, A. F. and Shelby, M. (1987). Mammalian In Vivo Cytogenetic Assays: Analysis of Chromosome Aberrations in Bone Marrow Cells. Mutation Res., 189, s. 157-165.

(3) Richold, M., Chandley, A., Ashby, J., Gatehouse, D. G., Bootman, J. and Henderson, L. (1990). In Vivo Cytogenetic Assays. In: D. J. Kirkland (ed.) Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report. Part I revised. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, s. 115-141.

(4) Tice, R. R., Hayashi, M., MacGregor, J. T., Anderson, D., Blakey, D. H. Holden, H. E., Kirsch-Volders, M., Oleson Jr., F. B., Pacchierotti, F., Preston, R. J., Romagna, F., Simada, H., Sutou, S. and Vannier, B. (1994). Report from the Working Group on the In Vivo Mammalian Bone Marrow Chromosomal Aberration Test. Mutation Res., 312, s. 305-312.

(5) Fielder, R. J., Allen, J. A., Boobis, A. R., Botham, P. A., Doe, J., Esdaile, D. J., Gatehouse, D. G., Hodson-Walker, G., Morton, D. B., Kirkland, D. J. and Richold, M. (1992). Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group: Dose setting in In Vivo Mutagenicity Assays. Mutgenesis, 7, s. 313-319.

(6) Lovell, D. P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G. E., Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D. G. and Savage, J. R. K. (1989). Statistical Analysis of In Vivo Cytogenetic Assays. In: UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report Part. III. Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. D. J. Kirkland, (ed.) Cambridge University Press, Cambridge. s. 184-232.

(7) Locke-Huhle, C. (1983). Endoreduplication in Chinese hamster cells during alpha-radiation induced G2 arrest. Mutation Res., 119, s. 403-413.

(8) Huang, Y., Change, C. and Trosko, J. E. (1983). Aphidicolin-induced endoreduplication in Chinese hamster cells. Cancer Res., 43, s. 1362-1364."

BILAGA 4C

"B.12. MUTAGENICITET - TEST AV MIKROKÄRNOR IN VIVO I ERYTROCYTER HOS DÄGGDJUR

1. METOD

Denna metod är en kopia av testet OECD TG 474, Test av mikrokärnor i erytrocyter hos däggdjur (Mammalian Erythrocyte Micronucleus Test (1997)).

1.1. INLEDNING

Testet av mikrokärnor in vivo hos däggdjur används för detektion av sådana skador på kromosomer eller på den mitotiska apparaten hos erytroblaster som induceras av testsubstansen, genom analys av erytrocyter från provtagning på benmärg och/eller perifert blod från djurceller, vanligtvis gnagare.

Avsikten med testet av mikrokärnor är att identifiera substanser som orsakar cytogen skada, vilket resulterar i bildning av mikrokärnor som innehåller isolerade kromosomfragment eller hela kromosomer.

När en erytroblast från benmärg utvecklas till en polykromatisk erytrocyt stöts huvudkärnan ut. Varje mikrokärna som har bildats kan bli kvar i den annars kärnfria cytoplasman. Visualisering av mikrokärnor underlättas i dessa celler eftersom de saknar en huvudkärna. En ökning av frekvensen av polykromatiska erytrocyter med mikrokärnor hos behandlade försöksdjur utgör en indikation på inducerade kromosomskador.

Benmärg från gnagare används rutinmässigt i detta test eftersom polykromatiska erytrocyter produceras i sådan vävnad. Mätningen av omogna (polykromatiska) erytrocyter med mikrokärnor i perifert blod är lika acceptabelt hos alla arter där oförmågan hos mjälten att avlägsna erytrocyter med mikrokärnor har kunnat påvisas, eller som har uppvisat en adekvat sensitivitet för att detektera ämnen som orsakar strukturella eller numeriska kromosomavvikelser. Mikrokärnor kan särskiljas genom ett antal olika kriterier. Dessa innefattar identifiering av närvaron eller frånvaron av en kinetochor eller av centromer-DNA i mikrokärnor. Frekvensen av omogna (polykromatiska) erytrocyter med mikrokärnor utgör den huvudsakliga slutpunkten. Antalet mogna (normokromatiska) erytrocyter i perifert blod som innehåller mikrokärnor bland ett givet antal mogna erytrocyter kan även användas som slutpunkt på undersökningen, när försöksdjur behandlas kontinuerligt under fyra veckor eller längre.

Detta test av mikrokärnor in vivo på däggdjur är särskilt relevant för att fastställa mutagena risker, eftersom det möjliggör överväganden av faktorer för in vivo metabolism, farmakokinetik och processer för DNA-reparationer, även om sådana faktorer kan variera mellan olika arter, vävnader och genetiska slutpunkter. Ett test in vivo är även användbart för fortsatta undersökningar av en mutagen effekt, med detektion i ett in vitro-system.

Om det finns bevis för att testsubstansen eller en reaktiv metabolit inte kommer att nå målvävnaden, är det inte lämpligt att använda detta test.

Se även Allmän inledning, del B.

1.2. DEFINITIONER

centromer (Kinetochor): Delar av en kromosom till vilka spindelfibrer är fästa under celldelning, vilket ger upphov till en ordnad rörelse av dotterkromosomerna mot dottercellernas poler.

mikrokärnor: Små extra kärnor som är separata från cellernas huvudkärna, och som produceras under mitosens telofas (meios) från isolerade kromosomfragment eller hela kromosomer.

normokromatisk erytrocyt: Mogna erytrocyter som saknar ribosomer och som kan särskiljas från omogna polykromatiska erytrocyter genom infärgning som är selektiv för ribosomer.

polykromatisk erytrocyt: Omogen erytrocyt, i ett intermediärt utvecklingsstadium, vilken fortfarande innehåller ribosomer och därför kan särskiljas från mogna, normokromatiska erytrocyter genom infärgning som är selektiv för ribosomer.

1.3. TESTMETODENS PRINCIP

Försöksdjur bör exponeras för testsubstansen på ett lämpligt sätt. Om benmärg används, bör försöksdjuren avlivas vid lämpliga tider efter behandling, varvid benmärg extraheras, preparationer görs och färgas in (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7). När perifert blod används, samlas blodet upp vid lämpliga tidpunkter efter behandling och utstrykspreparationer görs, vilka sedan färgas in (4) (8) (9) (10). Vid undersökningar med perifert blod, bör det gå så kort tid som möjligt mellan den sista exponeringen och skörden av cellerna. Preparationerna analyseras med avseende på närvaron av mikrokärnor.

1.4. BESKRIVNING AV TESTMETODEN

1.4.1. Förberedelser

1.4.1.1. Val av djurarter

Råttor, möss och kinesiska hamstrar används vanligen, även om vilket lämpligt däggdjur som helst kan användas. Vid användning av perifert blod rekommenderas möss. Det är emellertid även möjligt att använda andra däggdjursarter, förutsatt att det är en art där mjälten inte avlägsnar erytrocyter med mikrokärnor eller en art som har uppvisat en adekvat känslighet när det gäller att detektera ämnen som kan orsaka strukturella eller numeriska kromosomavvikelser. Vanligt använda laboratoriestammar av unga, friska försöksdjur bör komma i fråga. Vid undersökningens början bör viktskillnaden mellan försöksdjuren vara minimal och inte överskrida ±20 % av medelvikten för varje kön.

1.4.1.2. Förhållanden vid förvaring och utfodring

De generella förhållanden som anges i den allmänna inledningen till del B gäller. Man bör dock sträva efter en relativ luftfuktighet på 50-60 %.

1.4.1.3. Förberedelse av djuren

Friska, unga vuxna djur väljs ut slumpartat för placering i kontroll- och behandlingsgrupperna. Burar bör arrangeras på ett sådant sätt att möjliga effekter beroende på placeringen av burarna blir så små som möjligt. Djuren skall ha en unik identifiering. De bör vänjas vid förhållandena i laboratoriet under minst fem dagar.

1.4.1.4. Beredning av doser

Fasta testsubstanser bör lösas upp i eller blandas med lämpliga lösningsmedel eller vehiklar och spädas ut, om så är lämpligt, innan dosen administreras till djuren. Testsubstanser i flytande form kan doseras direkt eller spädas ut före dosering. Nygjorda beredningar av testsubstansen bör användas om inte stabilitetsdata visar att lagring är acceptabel.

1.4.2. Försöksbetingelser

1.4.2.1. Lösningsmedel/vehikel

Lösningsmedlet/vehikeln bör inte ge upphov till toxiska effekter vid de dosnivåer som används och bör inte kunna misstänkas för att reagera kemiskt med testsubstansen. Om andra lösningsmedel/vehiklar än gängse brukliga används, bör användningen av dem ha stöd från data som visar på deras kompatibilitet. Det rekommenderas att, därhelst det är möjligt, man i första hand överväger vattenbaserade lösningsmedel/vehiklar.

1.4.2.2. Kontroller

Samtidiga positiva och negativa kontroller (lösningsmedel/vehikel) bör ingå för varje test. Förutom behandling med testsubstansen, bör djuren i kontrollgrupperna hanteras på ett identiskt sätt i förhållande till djuren i de grupper där behandling skett.

Positiva kontroller bör ge mikrokärnor in vivo vid de exponeringsnivåer som förväntas ge en detekterbar ökning i förhållande till bakgrunden. Positiva kontrolldoser bör väljas på ett sådant sätt att effekterna är tydliga, men att identiteten hos kodade utstryksglas inte omedelbart avslöjas för läsaren. Det är acceptabelt att den positiva kontrollen administreras via en annan tillförselväg än testsubstansen och att provtagning endast sker vid ett enstaka tillfälle. Användning av kemiska klassrelaterade positiva kontrollkemikalier kan dessutom övervägas när dessa finns tillgängliga. I tabellen nedan ges några exempel på positiva kontrollsubstanser.

>Plats för tabell>

Negativa kontroller, behandlade enbart med lösningsmedel eller vehiklar, och i övrigt behandlade på samma sätt som behandlingsgrupperna, bör inkluderas för varje provtagningstillfälle, om inte acceptabel variabilitet och frekvens hos celler med kromosomavvikelser hos djuren kan erhållas ur historiska kontrolldata. Om enstaka provtagningar används för negativa kontroller, är den lämpligaste tiden det första provtagningstillfället. Dessutom bör obehandlade kontroller även användas om det inte finns historiska eller publicerade kontrolldata som visar att inga skadliga eller mutagena effekter induceras av det valda lösningsmedlet/vehinkeln.

Om perifert blod används, kan även ett prov taget innan behandlingen påbörjas vara acceptabelt som en samtidig negativ kontroll, men endast för de korta perifera undersökningarna av blod (t.ex. 1-3 behandling(ar)) när resulterande data ligger inom det förväntade området för den historiska kontrollen.

1.5. FÖRFARANDE

1.5.1. Försöksdjurens antal och kön

Varje behandlad grupp samt kontrollgruppen måste bestå av minst 5 analyserbara djur av varje kön. Det räcker med att testa enbart det ena könet, om det vid tiden för undersökningens genomförande finns data tillgängliga från undersökningar av samma art och där man har använt sig av samma exponeringssätt, så att det går att visa att det inte finns några substantiella skillnader i toxicitet mellan könen. I de fall där exponering för kemikalier hos människa kan vara könsspecifik, vilket t.ex. kan vara fallet för vissa läkemedel, bör testet utföras med försöksdjur av lämpligt kön.

1.5.2. Behandlingsschema

Inget standardiserat behandlingsschema (t.ex en, två eller flera behandlingar med 24 timmars intervall) kan rekommenderas. Proverna från utökade doseringsscheman är acceptabla så länge som en positiv effekt har demonstrerats för denna typ av undersökning eller, för en negativ undersökning, så länge som toxicitet har påvisats eller gränsvärdesdosen har använts, och doseringen fortsatte tills det var dags för provtagning. Testsubstanser kan även administreras i form av en delad dos, dvs. två behandlingar under en och samma dag med högst några timmars intervall, för att på så sätt underlätta administrering av stora volymer med material.

Testet kan utföras på två sätt

a) Försöksdjur behandlas en gång med testsubstansen. Prover på benmärg tas ut minst två gånger, med början tidigast 24 timmar och senast 48 timmar efter behandling, och med lämpliga intervall mellan proven. Om prover tas tidigare än 24 timmar efter behandling bör detta motiveras. Prover på perifert blod tas ut minst två gånger, med början tidigast 36 timmar efter behandling, och i lämpliga intervall efter det första provet, men inte senare än efter 72 timmar. När ett positivt svar identifieras vid ett provtagningstillfälle, så är ytterligare provtagning inte nödvändig.

b) Om två eller flera dagliga behandlingar utförs (t.ex. två eller flera behandlingar med 24 timmars intervall), bör prover tas ut en gång mellan 18 och 24 timmar efter den slutliga behandlingen av benmärgen och en gång mellan 36 och 48 timmar efter den slutliga behandlingen av det perifera blodet (12).

Prover kan dessutom tas vid andra tidpunkter när detta är lämpligt.

1.5.3. Dosnivåer

Om det inte finns några lämpliga data tillgängliga och en undersökning därför utförs för att fastställa omfattningen, bör denna undersökning utföras i samma laboratorium, och med samma arter, stammar, kön och behandlingsschema som senare skall användas i huvudundersökningen (13). Vid toxicitet används tre dosnivåer för det första provtagningstillfället. Dessa dosnivåer bör täcka in ett område som sträcker sig från maximal till liten eller ingen toxicitet. Vid senare provtagningstillfällen räcker det med att endast den högsta dosen används. Den högsta dosen definieras som den dos som producerar tecken på toxicitet och så att högre dosnivåer baserade på samma doseringsschema skulle förväntas leda till att försöksdjuret dör. Substanser med specifika biologiska vekningar vid låga icke-toxiska doser (såsom hormoner och mitogena substanser) kan utgöra undantag från kriterier som är dosbestämmande och bör utvärderas från fall till fall. Den högsta dosen kan även definieras som en dos vilken ger upphov till någon indikation på toxicitet i benmärgen (t.ex. en reduktion av andelen omogna erytrocyter jämfört med det totala antalet erytrocyter i benmärgen eller i perifert blod).

1.5.4. 'Limit-test'

En fullständig undersökning med tre dosnivåer kan inte anses vara nödvändig om ett test på en dosnivå på minst 2000 mg/kg kroppsvikt och med en enstaka behandling, eller i form av två behandlingar under samma dag, inte ger upphov till observerbara toxiska effekter, och om ingen genotoxicitet kan förväntas utifrån data om strukturellt relaterade substanser. För undersökningar med en längre varaktighet ligger gränsdosen på 2000 mg/kg/kroppsvikt/dag vid behandlingar upp till 14 dagar, och på 1000 mg/kg/kroppsvikt/dag för behandlingar som varar längre än 14 dagar. Förväntad exponering av människor kan utgöra en indikation på behovet av att använda en högre dosnivå i ett 'limit-test'

1.5.5. Administrering av doser

Testsubstansen administreras normalt genom sondmatning med hjälp av en magsond, en lämplig intuberingskanyl eller genom en intraperitoneal injektion. Andra tillförselvägar för exponering kan vara acceptabla där de kan motiveras. Den maximala vätskevolymen som kan administreras med hjälp av sondmatning eller injektion vid ett tillfälle beror på försöksdjurets storlek. Volymen bör inte överstiga 2 ml/100 g kroppsvikt. Användning av volymer som är högre än dessa måste motiveras. Förutom för irriterande eller korrosiva substanser, som normalt kommer att visa på stegrade effekter med högre koncentrationer, bör variationer av testvolymen minimeras genom en justering av koncentrationen för att säkerställa att volymen är konstant vid alla dosnivåer.

1.5.6. Beredning av benmärg/blod

Benmärgsceller erhålls vanligen från lårbenet eller skenbenet omedelbart efter det att djuret avlivats. Normalt avlägsnas cellerna från lårbenet eller skenbenet, prepareras och färgas in med hjälp av etablerade metoder. Perifert blod erhålls från svansvenen eller någon annan lämplig blodåder. Blodceller färgas omedelbart in supravitalt (8) (9) (10) eller så görs utstrykspreparationer vilka sedan färgas in. Användningen av ett DNA-specifikt färgämne (t.ex. akridinorange (14) eller Hoechst 33258 plus pyronin-Y (15)) kan eliminera några av de artefakter som är associerade med användning av ett färgämne som inte är DNA-specifikt. Denna fördel utesluter inte användningen av konventionella färgämnen (t.ex. Giemsa). Ytterligare system (t.ex. cellulosakolonner för att avlägsna celler med kärnor (16)) kan även användas, förutsatt att dessa system har visat sig fungera på ett adekvat sätt vid preparation av mikrokärnor i laboratoriet.

1.5.7. Analys

Andelen omogna erytrocyter bland det totala antalet erytrocyter (omogna + mogna) bestäms för varje djur genom att totalt räkna minst 200 erytrocyter för benmärg och 1000 erytrocyter för perifert blod (17). Alla utstryksglas, inklusive de från positiva och negativa kontroller, bör ges en oberoende kodning innan analys i mikroskop utförs. Minst 2000 omogna erytrocyter per djur undersöks med avseende på förekomst av omogna erytrocyter med mikrokärnor. Ytterligare information kan erhållas genom att söka efter mogna erytrocyter med mikrokärnor. Vid analys av utstryksglas bör antalet omogna erytrocyter jämfört med det totala antalet erytrocyter inte vara mindre än 20 % av kontrollvärdet. När djur behandlas kontinuerligt under fyra veckor eller mer kan även minst 2000 mogna erytrocyter per djur undersökas med avseende på förekomst av mikrokärnor. System för automatiserad analys (bildanalys och flödescytometri av cellsuspensioner) är acceptabla alternativ till manuell utvärdering om lämplig verifiering och validering sker.

2. DATA

2.1. BEHANDLING AV RESULTATEN

Individuella data från försöksdjur bör presenteras i tabellform. Den experimentella enheten utgörs av försöksdjuret. Antalet omogna erytrocyter som påträffas, antalet omogna erytrocyter med mikrokärnor, och antalet omogna bland det totala antalet erytrocyter bör listas separat för varje djur som analyseras. När försöksdjur behandlas kontinuerligt under fyra veckor eller mer, bör data över mogna erytrocyter också presenteras, om dessa har samlats in. Andelen omogna erytrocyter bland det totala antalet erytrocyter och, om det anses tillämpligt, procentandelen av erytrocyter med mikrokärnor, bör anges för varje försöksdjur. Om det inte finns några bevis för en skillnad i resultaten mellan könen, kan data från båda könen kombineras för statistisk analys.

2.2. UTVÄRDERING OCH TOLKNING AV RESULTATEN

Det finns ett flertal kriterier som används för att bestämma om ett resultat är positivt, t.ex. en dosrelaterad ökning av antalet celler med mikrokärnor eller en tydlig ökning av antalet celler med mikrokärnor hos en grupp som fått en enstaka dos vid ett enstaka provtagningstillfälle. Man bör i första hand överväga resultatets biologiska relevans. Statistiska metoder kan användas som en hjälp vid utvärdering av testresultatet (18) (19). Statistisk signifikans bör dock inte vara den enda faktor som bestämmer om resultatet är positivt. Tvetydiga resultat bör klarläggas genom fortsatta tester, lämpligen vid ändrade experimentella betingelser.

En testsubstans för vilken resultatet inte uppfyller ovanstående kriterier anses vara icke-mutagen i detta test.

Aven om de flesta experiment kommer att ge tydligt positiva eller negativa resultat, kan i sällsynta fall uppsättningen av data göra det omöjligt att utföra en otvetydig bedömning med avseende på testsubstansens aktivitet. Resultatet kan förbli tvetydigt eller tveksamt, oavsett hur många gånger experimentet upprepas.

Positiva resultat i testet av mikrokärnor tyder på att substansen inducerar mikrokärnor som är ett resultat av en kromosomal skada eller skada på den mitotiska apparaten i erytroblasterna hos den art som testas. Negativa resultat indikerar att testsubstansen, under dessa försöksbetingelser, inte ger upphov till mikrokärnor i de omogna erytrocyterna hos den art som testas.

Sannolikheten för att testsubstansen eller någon av dess metaboliter skall nå ut i det stora kretsloppet eller specifikt till målvävnaden (t.ex. systemisk toxicitet) bör diskuteras.

3. RAPPORTERING

TESTRAPPORT

Testrapporten måste innehålla följande information:

Lösningsmedel/vehikel:

- motivering för valet av vehikel

- testsubstansens löslighet och stabilitet i lösningsmedlet/vehikeln, om detta är känt

Försöksdjur:

- art/stam som används

- försöksdjurens antal, ålder och kön

- källa, förhållanden vid förvaring, diet, etc.

- individuell vikt hos försöksdjuren vid försökets början, inklusive kroppsviktsintervallet, medelvärde och standardavvikelse för varje grupp

Försöksbetingelser:

- positiva och negativa kontrolldata (vehikel/lösningsmedel)

- data från en undersökning av spännvidden, om en sådan har utförts

- grund för valet av dosnivå

- uppgifter om beredningen av testsubstansen

- uppgifter om administreringen av testsubstansen

- grund för det sätt administreringen sker på

- metoder för att verifiera att testsubstansen nådde det stora kretsloppet eller målvävnaden, om detta är tillämpbart

- omvandling av koncentrationen för testsubstansen i diet/dricksvatten (ppm) till den verkliga dosen (mg/kg/kroppsvikt/dag), om detta är tillämpbart

- fodrets och vattnets kvalitet

- detaljerad beskrivning av behandlings- och provtagningsscheman

- metoder för preparation av utstryksglas

- metoder för mätningar av toxicitet

- kriterier för bestämning av omogna erytrocyter med mikrokärnor

- antalet analyserade celler per djur

- kriterier för bedömning av om undersökningarna är positiva, negativa eller tvetydiga

Resultat:

- tecken på toxicitet

- andelen omogna erytrocyter av det totala antalet erytrocyter

- antalet omogna erytrocyter med mikrokärnor, angett separat för varje djur

- medelvärde ± standardavvikelse för omogna erytrocyter med mikrokärnor per grupp

- dos/respons-förhållande, närhelst detta är möjligt

- statistiska analyser och metoder som används

- samtidiga och historiska negativa kontrolldata

- samtidiga positiva kontrolldata

Diskussion av resultaten.

Slutsatser.

4. REFERENSER

(1) Heddle, J. A. (1973). A Rapid In Vivo Test for Chromosomal Damage, Mutation Res., 18, s. 187-190.

(2) Schmid, W. (1975). The micronucleus Test, Mutation Res., 31, s. 9-15.

(3) Heddle, J. A., Salamone, M. F., Hite, M., Kirkhart, B., Mavournin, K., MacGregor, J. G. and Newell, G. W. (1983). The Induction of Micronuclei as a Measure of Genotoxicity. Mutation Res. 123. s. 61-118.

(4) Mavourmin, K. H., Blakey, D. H., Cimino, M. C., Salamone, M. F. and Heddle, J. A. (1990). The In Vivo Micronucleus Assay in Mammalian Bone Marrow and Peripheral Blood. A report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program, Mutation Res., 239, s. 29-80.

(5) MacGregor, J. T., Schlegel, R. Choy, W. N., and Wehr, C. M. (1983). Micronuclei in Circulating Erythrocytes: A Rapid Screen for Chromosomal Damage During Routine Toxicity Testing in Mice. in: 'Developments in Science and Practice of Toxicology', ed. A. W. Hayes, R. C. Schnell and T. S. Miya, Elsevier, Amsterdam, s. 555-558.

(6) MacGregor, J. T., Heddle, J. A. Hite, M., Margolin, G. H., Ramel, C., Salamone, M. F., Tice, R. R., and Wild, D. (1987) Guidelines for the Conduct of Micronucleus Assays in Mammalian Bone Marrow Erythrocytes. Mutation Res., 189: s. 103-112.

(7) MacGregor, J. T., Wehr, C. M., Henika, P. R., and Selby, M. E. (1990). the In vivo Erythrocyte Micronucleus Test: Measurement at Steady State Increases Assay Efficiency and Permits Integration with Toxicity Studies. Fund. Appl. Toxicol. 14, s. 513-522.

(8) Hayashi, M., Morita, T., Kodama, Y., Sofuni, T. and Ishidate, M. Jr. (1990). The Micronucleus Assay with Mouse Peripheral Blood Reticulocytes Using Acridine Orange-Coated Slides. Mutation Res., 245, s. 245-249.

(9) The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test (1992). Micronucleus Test with Mouse Peripheral Blood Erythrocytes by Acridine Orange supravital Staining: The Summary Report of the 5th Collaborative Study by CSGMT/JEMMS. MMS. Mutation Res. 278, s. 83-98.

(10) The Collaborative Study Group for the Micronuculeus Test (CSGMT/JEMMS. MMS: The Mammalian Mutagenesis Study Group of the Environmental Mutagen Society of Japan) (1995). Protocol recommended for the short-term mouse peripheral blood micronucleus test. Mutagenesis, 10, s. 153-159.

(11) Hayashi, M., Tice, R. R., MacGregor, J. T., Anderson, D., Blackey, D. H., Kirsch-Volders, M., Oleson, Jr. F. B., Pacchierotti, F., Romagna, F., Shimada, H., Sutou, S. and Vannier, B. (1994). In vivo Rodent Erythrocyte Micronucleus Assay. Mutation Res., 312, s. 293-304.

(12) Higashikuni, N. and Sutou, S. (1995). An optimal, generalized sampling time of 30 ± 6 h after double dosing in the mouse peripheral blood micronucleus test. Mutagenesis, 10, s. 313-319.

(13) Fielder, R. J., Allen, J. A., Boobis, A. R., Botham, P. A., Doe, J., Esdaile, D. J., Gatehouse, D. G., Hodson-Walker, G., Morton, D. B., Kirkland, D. J. and Rochold, M. (1992). Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group: Dose Setting in In Vivo Mutagenicity Assays. Mutagenesis, 7, s. 313-319.

(14) Hayashi, M., Sofuni, T. and Ishidate, M. Jr. (1983). An Application of Acridine Orange Fluorescent Staining to the Micronucleus Test. Mutation Res. 120, s. 241-247.

(15) MacGregor, J. T., Wehr, C. M. and Langlois, R. G. (1983). A Simple Fluorescent Staining Procedure for Micronuclei and RNA in Erythrocytes Using Hoechst 33258 and Pyronin Y. Mutation Res., 120, s. 269-275.

(16) Romagna, F. and Staniforth, C. D. (1989). The automated bone marrow micronucleus test. Mutation Res. 213, s. 91-104.

(17) Gollapudi, B. and McFadden, L. G. (1995). Sample size for the estimation of polychromatic to normochromatic erythrocyte ratio in the bone marrow micronucleus test. Mutation Res., 347, s. 97-99.

(18) Richold, M., Ashby, J., Bootman, J., Chandley, A., Gatehouse, D. G. and Henderson, L. (1990). In Vivo Cytogenetics Assay. In: D. J. Kirkland (ed) Basic Mutagenicity tests. UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report, Part I, revised. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Sydney, s. 115-141.

(19) Lovell, D. P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G. E., Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D. G. and Savage, J. R. K. (1989). Statistical Analysis of In Vivo Cytogenetic Assays. In: D. J. Kirkland (ed) Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report, Part III. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, s. 184-232."

BILAGA 4D

"B.13/14. MUTAGENICITET - TEST AV ÅTERMUTATION HOS BAKTERIER

1. METOD

Denna metod är en kopia av OECD TG 471, Omvänt bakteriellt mutationstest (Bakterial Reserve Mutation Test (1997)).

1.1 INLEDNING

I detta test av återmutation hos bakterier används aminosyraberoende stammar av Salmonelle typhimurium och Escherichia coli för att detektera punktmutationer, vilka innfattar substitution, addition eller deletion av ett eller några DNA-baspar (1) (2) (3). Testet bygger på principen att man detekterar mutationer som gör att redan existerande mutationer i teststammarna går tillbaka varvid den funktionella förmågan hos bakterierna att syntetisera en essentiell aminosyra återställs. De återmuterade bakterierna detekteras på grundval av sin förmåga att växa i frånvaro av den aminosyra som krävs hos den ursprungliga teststammen.

Punktmutationer är orsaken till många genetiska sjukdomar hos människor och mycket tyder på att punktmutationer i onkogener och suppressorgener för tumörer i somatiska celler är inblandade i bildning av tumörer hos människor och försöksdjur. Testet av återmutation hos bakterier är snabbt, billigt och relativt enkelt att utföra. Många av testarterna har ett flertal egenskaper som gör dem mera känsliga för detektion av mutationer inklusive responsiva DNA-sekvenser vid reversionssäten, ökad cellerpermeabilitet för stora molekyler och eliminering av reparationssystem för DNA eller förstärkning av felbenägna reparationsprocesser för DNA. Specificiteten hos teststammarna kan erbjuda en del nyttig information om de typer av mutationer som induceras av genotoxiska ämnen. En mycket stor databas med resultat för ett stort antal olika strukturer finns tillgänglig för tester av återmutation hos bakterier och väletablerade metoder har utvecklats för testning av kemikaler med olika fysisk-kemiska egenskaper, inklusive flyktiga ämnen.

Se även Allmän inledning, del B.

1.2 DEFINITIONER

ett test av återmutation hos antingen Salmonella typhimurium eller Escherichia coli detekterar mutation i en aminosyraberoende stam (histidin respektive tryptofan) vilket ger en stam som är oberoende av en extern tillförsel av aminosyror.

mutagener som ger basparsubstitutioner är ämnen som orsakar en basförändring i DNA. I ett test av återmutation kan denna förändring uppträda vid sätet för den ursprungliga mutationen eller på ett andra säte i det bakteriella genomet.

mutagener som ger förskjutningar (frameshift) är ämnen som orsakar addition eller deletion av ett eller flera baspar i DNA, vilket då ger en ändrad avläsningsordning i RNA.

1.3 INLEDANDE ÖVERVÄGANDEN

Testet av återmutation hos bakterier utnyttjar prokaryota celler, vilka skiljer sig från däggdjursceller med avseende på sådana faktorer som upptag, metabolism, kromosomstruktur och processer för DNA-reparation. Tester som utförs in vitro kräver i allmänhet att det finns en yttre källa för metabolisk aktivering. Hos system för metabolisk aktivering in vitro kan inte förhållandena för däggdjur in vivo efterliknas helt och hållet. Testet ger därför ingen direkt information om den mutagena och den karcinogena potensen hos en substans i däggdjur.

Testet av återmutation hos bakterier används vanligen som en inledande undersökning av genotoxisk aktivitet och, i synnerhet, av aktivitet som inducerar punktmutationer. En omfattande databas har demonstrerat att många kemikalier som ger positiva resultat i detta test även uppvisar mutagen aktivitet i andra tester. Det finns exempel på mutagena ämnen som inte kan detekteras med hjälp av detta test. Skälen till dessa tillkortakommanden kan tillskrivas den specifika naturen hos den detekterade slutpunkten, skillnader i metabolisk aktivering, eller skillnader i biotillgänglighet. Å andra sidan kan faktorer som höjer känsligheten hos testet leda till en överskattning av den mutagena aktiviteten.

Testet av återmutation hos bakterier kan visa sig olämpligt för utvärdering av vissa klasser av kemikalier såsom starkt baktericida ämnen (t.ex. vissa antibiotika) och de som anses (eller är kända för att) interferera specifikt med systemet för cellreplikation hos däggdjur (t.ex. vissa inhibitorer av topoisomeras och vissa nukleosidanaloger). I sådana fall kan mutationstester på däggdjur vara mera lämpliga.

Även om många ämnen som ger positiva resultat i detta test är karcinogena för däggdjur, är korrelationen inte absolut. Den är beroende på kemisk klass och det finns karcinogener som inte kan detekteras med hjälp av detta test, eftersom de verkar genom andra, icke-genotoxiska mekanismer eller mekanismer som saknas i bakterieceller.

1.4 TESTMETODENS PRINCIP

Suspensioner med bakterieceller exponeras för testsubstansen i närvaro och i frånvaro av ett exogent system för metabolisk aktivering. I plattinkorporeringsmetoden blandas dessa suspensioner med en toppskiktsagar varpå plattor omedelbart görs på minimalmedium. I preinkubationsmetoden inkuberas behandlingsblandningen och sedan blandas denna med en toppskiktsagar innan plattor görs på minimalmedium. I båda metoderna räknas återmuterade kolonier efter två eller tre dagars inkubering och jämförs med antalet spontant återmuterade kolonier på kontrollplattor med lösningsmedel.

Ett flertal procedurer för att utföra testet av återmutation hos bakterier har beskrivits. Bland de som vanligtvis används ingår plattinkorporeringsmetoden (1) (2) (3) (4), preinkubationsmetoden (2) (3) (5) (6) (7) (8), fluktueringsmetoden (9) (10) och suspensionsmetoden (11). Modifikationer för testning av gaser eller ångor har tidigare beskrivits (12).

De procedurer som beskrivs i metoden hänför sig primärt till plattinkorporerings- och preinkubationsmetoder. Inga av dem är acceptabla för att genomföra experiment både med och utan metabolisk aktivering. Vissa substanser kan detekteras mer effektivt med hjälp av preinkubationsmetoden. Dessa substanser tillhör kemiska klasser som innefattar korta kedjor med alifatiska nitrosaminer, tvåvärda metaller, aldehyder, azofärger och diazoföreningar, pyrolizidinalkoloider, allylföreningar och nitroföreningar (3). Det är även känt att vissa klasser av mutanter inte alltid detekteras med hjälp av standardprocedurer såsom plattinkorporeringsmetoden eller preinkubationsmetoden. Dessa bör uppfattas som 'speciella fall' och det rekommenderas varmt att alternativa procedurer används för detektionen av dem. De följande 'speciella fallen' bör identifieras (tillsammans med exempel på procedurer som kan användas för detektionen av dem): azofärger och diazoföreningar (3) (5) (6) (13), gaser och flyktiga kemikaler (12) (14) (15) (16) samt glykosider (17) (18). En avvikelse från standardproceduren måste vara vetenskapligt motiverad.

1.5 BESKRIVNING AV TESTMETODEN

1.5.1 Förberedelser

1.5.1.1 Bakterier

Nya kulturer med bakterier bör få växa till sig fram till den sena exponentiella eller tidiga stationära tillväxtfasen (ungefär 109 celler per ml). Kulturer som befinner sig i sen stationär fas bör inte användas. Det är viktigt att de kulturer som används i experimentet har en hög tider med livsdugliga bakterier. Titern kan fås fram antingen ur tillväxtkurvor från historiska kontrolldata, eller ur varje försök genom att bestämma antalet livsdugliga celler med hjälp av ett utstrykningsexperiment.

Den rekommenderade inkubationstemparaturen är 37 °C.

Minst fem bakteriestammar bör användas. Dessa bör inkludera fyra av S. typhimurium (TA 1535; Ta 1537 eller TA97a eller TA97; TA98; och TA100) som har visat sig vara tillförlitliga och ge en reproducerbar respons i olika laboratorier. Dessa fyra stammar av S. typhimurium har GC-baspar vid det primära återmutationsstället och det är känt att de inte kan detektera vissa oxiderande mutagener, tvärbindande ämnen och hydraziner. Sådana substanser kan detekteras med hjälp av E. coli WP2-stammar eller S. typhimurium TA 102 (19) som har ett AT-baspar vid det primära återmutationsstället. Den rekommenderade kombinationen av stammar är därför:

- S. typhimurium TA 1535,

- S. typhimurium TA1537 eller TA97 eller TA97a,

- S. typhimurium TA98,

- S. typhimurium TA100, och

- E. coli WP2 uvrA, eller E. coli WP2 uvrA (pKM101), eller S. typhimurium TA102.

Fär att kunna detektera tvärbindande mutagener kan det vara lämpligt att inkludera TA102 eller att också använda en DNA-reparationsduglig stam av E. coli (t.ex. E.coli WP2 eller E. coli WP2 (pKM101)).

Etablerade procedurer för beredning av baskulturer, markörverifiering och lagring bör användas. Behovet av aminosyror för tillväxten bör påvisas för varje frusen preparation av baskulturer (histidin för stammar av S. typhimurium och tryptofan för stammar av E. coli). Andra fenotypiska karakteristika bör kontrolleras på liknande sätt, nämligen närvaron eller frånvaron av R-faktorplasmider där detta är lämpligt (dvs. ampicillin-resistens i stammarna TA98, TA100 och TA97a eller TA97, WP2 uvrA och WP2 uvrA (pKM101) och ampicillin + tetracyklinreststens i stammen TA102); närvaron av karakteristiska mutationer (dvs. rfa-mutation i S. typhimurium genom känslighet för kristallviolett och uvrA-mutation i E. coli eller uvrB-mutation i S. typhimurium genom känslighet för ultraviolett ljus) (2) (3). Stammarna bör även ge spontant återmuterande platträkningar av kolonier inom de frekvensområden som kan förväntas från laboratoriets historiska kontrolldata och helst inom det område som rapporteras i litteraturen.

1.5.1.2 Medium

Använd en lämplig minimalagar (t.ex. innehållande Vogel-Bonner minimalmedium E och glukos) och ett agartoppskikt som innehåller histindin och biotin eller tryptofan, så att några stycken celldelningar skall kunna ske (1) (2) (9).

1.5.1.3 Metabolisk aktivering

Bakterier bör exponeras för testsubstansen både i närvaro och frånvaro av ett lämpligt system för metabolisk aktivering. Det vanligaste systemet som används är en post-mitokondriell fraktion där en kofaktor tillsatts (S9) vilken beretts ur lever från gnagare vilka behandlats med enzyminducerande ämnen såsom Aroclor 1254 (1) (2) eller en kombination av fenobarbiton och β-naftoflavon (18) (20) (21). Den post-mitokondriella fraktionen används vanligen vid koncentrationer i området från 5 till 30 % v/v i S9-blandningen. Valet av och betingelserna hos ett system för metabolisk aktivering kan bero på den klass av kemikalier som testas. I vissa fall kan det vara lämpligt att använda mer än en koncentration av den postmitokondriella fraktionen. För azofärger och diazoämnen, kan användning av ett reduktivt system för metabolisk aktivering vara lämpligare (6) (13).

1.5.1.4 Beredning av testsubstansen

Fasta testsubstanser bör lösas upp i eller blandas med lämpliga lösningsmedel eller vehiklar och spädas ut, om detta är lämpligt, före det att bakterierna behandlas. Flytande testsubstanser kan tillsättas direkt till testsystemen och/eller spädas ut före behandling. Nygjorda beredningar bör användas om inte stabilitetsdata visar att lagring kan accepteras.

Lösningsmedel/vehiklar bör inte kunna misstänkas för att reagera kemiskt med testsubstansen och bör vara förenliga med bakteriernas överlevnad samt S9-aktivitet (22). Om man använder andra lösningsmedel/vehiklar än gängse brukliga, bör användningen av dem ha stöd från data som visar på deras kompatibilitet. Därhelst det är möjligt, rekommenderas att man i första hand överväger vattenbaserade lösningsmedel/vehiklar.

1.5.2 Försöksbetingelser

1.5.2.1 Teststammar (se 1.5.1.1)

1.5.2.2 Exponeringskoncentration

Cytotoxiciteten och lösligheten i den slutliga behandlingsblandningen är några av de kriterier som man måste ta hänsyn till vid bestämningen av den högsta mängd av testsubstansen som skall användas.

Det kan vara bra att bestämma toxicitet och löslighet i ett förberedande experiment. Cytotoxicitet kan detekteras genom en minskning av antalet återmuterande kolonier, en uttunning eller minskning av bakgrundstillväxten, eller graden av överlevnad hos de behandlade kulturerna. Cytotoxiciteten hos en substans kan ändras i närvaro av system för metabolisk aktivering. Olöslighet bör fastställas som en utfällning i den slutliga blandningen, under de verkliga försöksbetingelserna och skall vara synlig för blotta ögat.

Den maximala rekommenderade testkoncentrationen för lösliga icke-cytotoxiska substanser är 5 mg/platta eller 5 µl/platta. För icke-cytotoxiska substanser som inte är lösliga vid 5 mg/platta eller 5 µl/platta, bör en eller flera av de koncentrationer som testas vara olösliga i den slutliga behandlingsblandningen. Testsubstanser som är cytotoxiska redan under 5 mg/platta eller 5 µl/platta bör testas upp till en cytotoxisk koncentration. Fällningen torde inte störa bestämningen.

Minst fem olika analyserbara koncentrationer av testsubstansen bör användas, med ungefär halva log-intervall (dvs. [radic ]10) mellan testpunkterna för ett inledande experiment. Mindre intervall kan vara lämpliga när ett koncentrationssvar håller på att undersökas. Testning över en koncentration på 5 mg/platta eller 5 µl/platta kan övervägas vid utvärdering av substanser som innehåller avsevärda mängder av potentiellt mutagena föroreningar.

1.5.2.3 Negativa och positiva kontroller

Samtidiga stamspecifika positiva och negativa kontroller (lösningsmedel eller vehikel), både med och utan metabolisk aktivering, bör inkluderas i varje försök. Positiva kontrollkoncentrationer som visar på det effektiva utfallet för varje försök bör väljas.

För försök där ett system för metabolisk aktivering används, bör den positiva kontrollreferenssubstansen väljas på basis av de typer av bakteriestammar som används.

De följande substanserna utgör exempel på lämpliga positiva kontroller för försök med metabolisk aktivering:

>Plats för tabell>

Följande substans är en lämplig positiv kontroll för den reduktiva metaboliska aktiveringsmetoden:

>Plats för tabell>

2-aminoantracen bör inte användas som den enda indikatorn på effektiviteten hos S9-blandningen. Om 2-aminoanracen används, bör varje sats av S9 även karakteriseras med en mutagen som kräver metabolisk aktivering med hjälp av mikrosomala enzymer, t.ex. bens[a]pyren, dimetylbensantracen.

Följande substanser utgör exempel på sortspecifika positiva kontroller för försök som utförs utan exogena system för metabolisk aktivering:

>Plats för tabell>

Andra lämpliga positiva kontrollreferenssubstanser kan användas. Användningen av kemiska klassrelaterade positiva kontrollkemikalier bör övervägas när sådana finns att tillgå.

Negativa kontroller, bestående av enbart lösningsmedel eller vehikel, utan testsubstans, och i övrigt hanterade på samma sätt som för de behandlade grupperna, bör inkluderas. Obehandlade kontroller bör dessutom även användas, om det inte finns historiska kontrolldata som visar att inga farliga eller mutagena effekter induceras av det valda lösningsmedlet.

1.5.3 Förfarande

Vid plattinkorporeringsmetoden (1) (2) (3) (4), utan metabolisk aktivering, blandas vanligen 0,05 ml eller 0,1 ml av testlösningarna, 0,1 ml av färsk bakteriekultur (innehållande ungefär 108 livsdugliga celler) och 0,5 ml av steril buffert med 2,0 ml av toppskiktsagar. För ett försök med metabolisk aktivering blandas vanligen 0,5 ml av en metabolisk aktiveringsblandning, vilken innehåller en adekvat mängd postmitokondriell fraktion (i området från 5 till 30 % v/v i den metaboliska aktiveringsblandningen) med toppskiktsagar (2,0 ml), tillsammans med bakterierna och testsubstansen/testlösningen. Innehållet i varje rör blandas och hälls över ytan på en minimalagarplatta. Toppskiktsagarn tillåts att stelna innan inkubering sker.

För förinkubationsmetoden (2) (3) (5) (6), förinkuberas testsubstansen/testlösningen med teststamman (innehållande ungefär 108 livsdugliga celler) och steril buffert eller med system för metabolisk aktivering (0,5 ml), vanligen under 20 minuter eller längre vid 30-37 °C, innan den blandas med toppskiktsagarn och hälls uppå ytan på en minimalagarplatta. Vanligen blandas 0,05 eller 0,1 ml av testsubstansen/testlösningen, 0,1 ml bakterier och 0,5 ml av S9-blandningen eller steril buffert blandat med 2,0 ml av toppskiktsagar. Rören bör luftas under förinkubationen med hjälp av en skakmaskin.

För att möjliggöra en rimlig uppskattning av variationen bör tre plattor användas vid varje dosnivå. Användning av två plattor är acceptabelt när detta är vetenskapligt motiverat. Förlust av en enstaka platta innebär inte nödvändigtvis att ett försök blir ogiltigt.

Gasformiga eller flyktiga substanser bör testas med lämpliga metoder, såsom i slutna kärl (12) (14) (15) (16).

1.5.4 Inkubering

Alla plattor i en given assay bör inkuberas vid 37 °C under 48-72 timmar. Efter inkubationsperioden räknas antalet återmuterande kolonier per plattor.

2. DATA

2.1 BEHANDLING AV RESULTATEN

Data bör presenteras som antalet återmuterande kolonier per platta. Antalet återmuterande kolonier på såväl negativa (lösningsmedelskontroll och obehandlad kontroll, om en sådan används) och positiva kontrollplattor bör även anges. Individuella platträkningar, medelantalet för de återmuterande kolonierna per platta och standardavvikelsen bör uppges för såväl testsubstansen som för positiva och negativa (obehandlade och/eller (lösningsmedels) kontroller.

Der finns inget krav på verifiering av ett tydligt positivt svar. Tvetydiga resultat bör klarläggas genom fortsatta tester, lämpligen vid ändrade experimentella betingelser. Negativa resultat måste bekräftas från fall till fall. I de fall där det inte anses nödvändigt att bekräfta negativa resultat bör detta motiveras. Vid uppföljningsexperiment bör man överväga att ändra parametrarna i undersökningen för att utvidga de bedömda försöksbetingelserna. De försöksparametrar som skulle kunna modifieras innefattar koncentrationsindelningen, metoden för behandling (plattinkorporering eller förinkubation i vätska), och betingelser för metabolisk aktivering.

2.2 UTVÄRDERING OCH TOLKNING AV RESULTATEN

Det finns ett flertal kriterier som används för att bestämma om ett resultat är positivt, t.ex. en koncentrationsrelaterad ökning över hela det testade området och/eller en reproducerbar ökning, vid en eller flera koncentrationer, av antalet återmuterande kolonier per platta för minst en stam, med eller utan ett system för metabolisk aktivering (23). Man bör i första hand överväga resultatets biologiska relevans. Statistiska metoder kan användas som en hjälp vid utvärdering av testresultatet (24). Statistisk signifikans bör dock inte vara den enda faktor som bestämmer om svaret är positivt

En testsubstans för vilken resultatet inte uppfyller ovanstående kriterier anses vara icke-mutagen i detta test.

Även om de flesta experiment kommer att ge tydligt positiva eller negativa resultat, kan uppsättningen av data i sällsynta fall göra det omöjligt att utföra en otvetydig bedömning med avseende på testsubstansens aktivitet. Resultatet kan förbli tvetydigt eller tveksamt, oavsett hur många gånger experimentet upprepas.

Positiva resultat från testet av återmutation hos bakterier indikerar att substansen inducerar punktmutationer genom bassubstitutioner eller förskjutningar i genomet hos antingen Salmonella typhimurium och/eller Escherichia coli. Negativa resultat indikerar att testsubstansen inte är mutagen hos den testade sorten under dessa försöksbetingelser.

3. RAPPORTERING

TESTRAPPORT

Följande information måste ingå i testrapporten:

Lösningsmedel/vehikel:

- motivering för valet av lösningsmedel/vehikel

- testsubstansens löslighet och stabilitet i lösningsmedlet /vehikeln, om detta är känt,

Stammar:

- stammar som används

- antalet celler per kultur

- karakteristika för stammen

Försöksbetingelser:

- mängd av testsubstansen per platta (mg/platta eller µl/platta) med grund för val av dos och antal plattor per koncentration

- använda medier

- typ och sammansättning hos det system som används för metabolisk aktivering, inklusive acceptabilitetskriterier

- behandlingsprocedurer

Resultat:

- tecken på toxicitet

- teken på utfällning

- individuella platträkningar

- medelantalet återmuterande kolonier per platta och standardavvikelse

- dos/respons-förhållande, där detta är möjligt

- statistiska analyser, om några sådana finns

- samtidiga negativa (lösningsmedel/vehikel) och positiva kontrolldata, med omfattning, medelvärden och standardavvikelser

- historiska negativa (lösningsmedel/vehikel) och positiva kontrolldata, med omfattning, medelvärden och standardavvikelser

Diskussion av resultaten.

Slutsatser.

4. REFERENSER

(1) Ames, B. N., McCann, J. and Yamasaki E. (1975). Metods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian-Microsome Mutagenitic Test. Mutation Res., 31, s. 347-364.

(2) Maron, D. M. and Ames, B. N. (1983). Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test. Mutation Res. 113, s. 173-215.

(3) Gatehouse, D., Haworth, S., Cebula, T., Gocke, E., Kier, L. Matsushima, T. Melcion, C., Nohmi, T., Venitt, S. and Zeiger, E. (1994). Recommendations for the Performance of Bacterial Mutation Assays. Mutation Res. 312, s. 217-233.

(4) Kier, L. D. , Brusick D. J., Auletta, A. E., Von Halle, E. S., Brown, M. M., Simmon, V. F., dunkel, V., McCann, J., Mortelmans, K., Prival, M., Rao, T.K. and Ray V. (1986). The Salmonella typhimurium/ Mammalian Microsomal Assay: A Report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program. Mutation Res. 168, s. 69-240.

(5) Yahagi, T., Degawa, M., Seino, Y. Y. , Matsushima, T., Nagao, M., Sugimura, T. and Hashimoto, Y. (1975). Mutagenicity of Carcinogen Azo Dyes and their Derivatives, Cancer Letters, 1, s. 91-96.

(6) Matsushima, M., Sugimura, T., Nagao, M., Yahagi, T., Shirai, A. and Sawamura, M. (1980), Factors Modulating Mutagenicity Microbial Tests, in: Short-term Test Systems for Detecting Carcinogens, ed. Norpoth K. H. and Garner, R. C., Springer, Berlin-Heidelberg-New York, s. 273-285.

(7) Gatehouse, D. G., Rowland, I. R., Wilcox, P., Callender, R. D. and Foster, R. (1980), Bacterial Mutation Assays, in: Basic Mutagenicity Tests: UKEMS Part 1 Revised, ed. D. J. Kirkland, Cambridge University Press, s. 13-61.

(8) Aeschacher, H. U., Wolleb, U. and Porchet, L. (1987), Liquid Preincubation Mutagenicity Test for Foods, J. Food Safety, 8, s. 167-177.

(9) Green, M. H. L., Muriel, W. J. and Bridges, B. A. (1976), Use of a simplified fluctuation test to detect low levels of mutagens, Mutation Res., 38, s. 33-42.

(10) Hubbard, S. A., Green, M. H. L., Gatehouse, D. and Bridges, J. W. (1984), The Fluctuation Test in Bacteria, in: Handbook of Mutagenicity Test Procedures, 2nd Edition, ed. Kilbey, B. J., Legator, M., Nichols, W. and Ramel, C., Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, s. 141-161.

(11) Thompson, E. D. and Melampy, P. J. (1981), An Examination of the Quantitative Suspension Assay for Mutagenesis with Strains of Salmonella typhimurium, Environmental Mutagenesis, 3, s. 453-465.

(12) Araki, A., Noguchi, T., Kato, F. and Matsushima, T. (1994), Improved Method for Mutagenicity Testing of Gaseous Compounds by Using a Gas Sampling Bag, Mutation Res., 307, s. 335-344.

(13) Prival, M. J., Bell, S. J., Mitchell, V. D., Reipert, M. D. and Vaughan, V. L. (1984), Mutagenicity of Benzidine and Benzidine-Congener Dyes and Selected Monoazo Dyes in a Modified Salmonella Assay, Mutation Res., 136, s. 33-47.

(14) Zeiger, E., Anderson, B. E., Haworth, S., Lawlor, T. and Mortelmans, K. (1992), Salmonella Mutagenicity Tests. V. Results from the Testing of 311 Chemicals, Environ. Mol. Mutagen., 19, s. 2-141.

(15) Simmon, V., Kauhanen, K. and Tardiff, R. G. (1977), Mutagenic Activity of Chemicals Identified in Drinking Water, In Progress in Genetic Toxicology, D. Scott, B. Bridges and F., Sobels (eds.) Elsevier, Amsterdam, s. 249-258.

(16) Hughes, T. J., Simmons, D. M., Monteith, I. G. and Claxton, L. D. (1987), Vaporization Technique to Measure Mutagenic Activity of Volatile Organic Chemicals in the Ames/Salmonella Assay, Environmental Mutagenesis, 9, s. 421-441.

(17) Matsushima, T., Matsumoto, A., Shirai, M., Sawamura, M., and Sugimura, T. (1979), Mutagenicity of the Naturally Occurring Carcinogen Cycasin and Synthetic Methylazoxy Methane Conjugates in Salmonella typhimurium, Cancer Res., 39, s. 3780-3782.

(18) Tamura, G., Gold, C., Ferro-Luzzi, A. and Ames, B. N. (1980), Fecalase: A Model for Activation of Dietary Glycosides to Mutagens by Intestinal Flora, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, s. 4961-4965.

(19) Wilcox, P., Naidoo, A., Wedd, D. J. and Gatehouse, D. G. (1990), Comparison of Salmonella typhimurium TA 102 with Escherichia coli WP2 Tester strains, Mutagenesis, 5, s. 285-291.

(20) Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. (1976), A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer or Metabolic Activation Systems, in: In vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, eds. F. J. de Serres et al. Elsevier, North Holland, s. 85-88.

(21) Elliot, B. M., Combes, R. D., Elcombe, C. R., Gatehouse, D. G., Gibson, G. G., Mackay, J. M. and Wolf, R. C. (1992), Alternatives to Aroclor 1254-induced S9 in in vitro Genotoxicity Assays, Mutagenesis, 7, s. 175-177.

(22) Maron, D., Katzenellenbogen, J. and Ames, B. N. (1981), Compatibility of Organic Solvents with the Salmonella/Microsome Test, Mutation Res., 88, s. 343-350.

(23) Claxton, L. D., Allen, J., Auletta, A., Mortelmans, K., Nestmann, E. and Zeiger, E. (1987), Guide for the Salmonella typhimurium/Mammalian Microsome Tests for Bacterial Mutagenicity, Mutation Res., 189, s. 83-91.

(24) Mahon, G. A. T., Green, M. H. L., Middleton, B., Mitchel, I., Robinson, W. D. and Tweats, D. J. (1989), Analysis of Data from Microbial Colony Assays, in: UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing, Part II. Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, ed. Kirkland, D. J., Cambridge University Press, s. 28-65."

BILAGA 4E

"B.17. MUTAGENICITET - TEST AV GENMUTATIONER HOS DÄGGDJURSCELLER IN VITRO

1. METOD

Denna metod är en kopia av OECD TG 476, Test av genmutationer hos däggdjursceller in vitro (In Vitro Mammalian Cell Gene Mutation Test (1997)).

1.1 INLEDNING

Genmutationstestet in vitro för däggdjursceller kan användas för att detektera genmutationer som inducerats med hjälp av kemiska substanser. Lämpliga cellinjer innefattar L5178Y muslymfomceller, CHO-, CHO-AS52- och V79-linjerna från kinesiska hamsterceller och TK6 lymfoblastoidceller från människa (1). I dessa cellinjer mäter de vanligast använda genetiska slutpunkterna mutation av tymidinkinas (TK) och hypoxanthinguanin fosforibosyltransferas (HPRT), och en transgen av xanthin-guanin fosforibosyltransferas (XPRT). Mutationstesterna TK, HPRT och XPRT detekterar olika spektra av genetiska händelser. Den autosomala lokaliseringen av TK och XPRT kan göra det möjligt att detektera genetiska händelser (t.ex. stora deletioner) som inte detekteras vid HPRT-lokuset på X-kromosomer (2) (3) (4) (5) (6).

I genmutationstestet in vitro för däggdjursceller kan kulturer med etablerade cellinjer eller celltyper användas. De celler som används väljs ut på basis av tillväxtförmåga vid odling och stabilitet med avseende på spontan mutationsfrekvens.

Tester som utförs in vitro kräver i allmänhet att en exogen källa för metabolisk aktivering används. Detta system för metabolisk aktivering kan inte fullt ut efterlikna förhållandena in vivo hos däggdjur. Försiktighet bör iakttagas så att man undviker förhållanden som skulle kunna leda till resultat som inte avspeglar den verkliga mutageniciteten. Positiva resultat som inte avspeglar den verkliga mutageniciteten kan uppkomma från förändringar i pH, osmolalitet eller hög cytotoxicitet (7).

Detta test används för att undersöka möjliga mutagener och karcinogener i däggdjur. Många ämnen som är positiva i detta test är karcinogena i däggdjur. Det föreligger dock ingen perfekt korrelation mellan detta test och karcinogenicitet. Korrelationen är beroende på den kemiska klassen och det finns allt fler bevis för att det finns karcinogener som inte detekteras med hjälp av detta test, eftersom de verkar uppträda genom andra, icke-genotoxiska mekanismer eller mekanismer som är frånvarande i bakterieceller (6).

Se även Allmän inledning, del B.

1.2 DEFINITIONER

framåtmutation: en genmutation från den parentala typen till den mutanta formen, vilket ger upphov till en förändring eller en förlust av den enzymatiska aktiviteten i funktionen hos det protein som bildas.

mutagener som ger basparsubstitutioner: substanser som orsakar substitution av ett eller flera baspar i DNA.

förskjutnings (frameshift)-mutagener: substanser som orsakar addition eller deletion av ett eller flera baspar i DNA-molekylen.

fenotypisk expressionstid: en period under vilken celler som nyligen muterat töms på oförändrade genprodukter.

mutantfrekvens: antalet mutanta celler som observerats, delat med antalet livskraftiga celler.

relativ total tillväxt: ökningen av antalet celler över tiden jämfört med en kontrollpopulation av celler, beräknat som produkten av suspensionstillväxten i förhållande till den negativa kontrollen, gånger kloningseffektiviteten i förhållande till den negativa kontrollen.

relativ suspensionstillväxt: ökning av cellantalet delat med expressionsperioden i relation till den negativa kontrollen.

viabilitet: kloningens effektivitet hos de behandlade cellerna vid tiden för utstryk på platta, under selektiva betingelser efter expressionsperioden.

överlevnad: kloningens effektivitet hos de behandlade cellerna när utstryk på platta sker vid behandlingsperiodens slut. Överlevnaden uttrycks vanligen i förhållande till överlevnaden hos kontrollens cellpopulation.

1.3 TESTMETODENS PRINCIP

Celler som lider brist på tymidinkinas (TK), beroende på mutationen TK+/- TK-/-, är resistenta mot de cytotoxiska effekterna av pyrimidinanalogen trifluortymidin (TFT). Celler med väl fungerande tymidinkinas är känsliga för TFT, eftersom TFT ger upphov till inhibering av cellmetabolismen och stoppar fortsatt celldelning. Mutanta celler kan således utvecklas i närvaro av TFT, medan däremot normala celler, som innehåller tymidinkinas, inte klarar detta. Celler som lider brist på HPRT eller XPRT kan på liknande sätt väljas ut genom resistens mot 6-tioguanin (TG) eller 8-azaguanin (AG). Egenskaperna hos testsubstansen bör noggrant gås igenom om en basanalog eller ett ämne som är relaterat till det selektiva ämnet testas i något av testerna för genmutationer i däggdjursceller. Exempelvis bör varje misstänkt selektiv toxicitet hos testsubstansen mot mutanta och icke-mutanta celler undersökas. Det sätt som det selekterande systemet/ämnet fungerar på, måste således bekräftas när man testar kemikalier som är strukturellt relaterade med det selektiva ämnet (8).

Celler i suspension eller kulturer i form av ett enkelskikt exponeras för testsubstansen, både med och utan metabolisk aktivering, under en lämplig tidsperiod och subkultiveras för att bestämma cytotoxiciteten och för att tillåta fenotypisk expression innan mutantvalet sker (9) (10) (11) (12) (13). Cytotoxiciteten bestäms i vanliga fall genom att mäta den relativa kloningseffektiviteten (överlevnad) eller den relativa totala tillväxten för kulturerna efter behandlingsperioden. De behandlade kulturerna bibehålls i ett tillväxtmedium under en tillräckligt lång tid, karakteristisk för varje selekterat lokus och celltyp, för att tillåta i det närmaste optimal fenotypisk expression av inducerade mutationer. Mutationsfrekvensen bestäms genom att inockulera ett känt antal celler i ett medium som innehåller det selektiva ämnet för detektion av mutanta celler, och i ett medium utan selektivt ämne för bestämning av kloningseffektiviteten (viabiliteten). Efter en lämplig inkubationstid räknas cellerna. Mutationsfrekvensen erhålls från antalet mutanta kolonier i selektivt medium och antalet kolonier i icke-selektivt medium.

1.4 BESKRIVNING AV TESTMETODEN

1.4.1 Förberedelser

1.4.1.1 Celler

Det finns ett antal olika celltyper som kan användas i detta test, inklusive subkloner från L5178Y, CHO, CHO-AS52, V79 eller TK6-celler. De celltyper som används i detta test bör ha en demonstrerad känslighet mot kemiska mutagener, en hög kloningseffektivitet och en stabil spontan mutationsfrekvens. Cellerna bör kontrolleras med avseende på kontaminering från mykoplasma och bör inte användas om kontaminering skett.

Testet bör utformas på ett sådant sätt att det har en förutbestämd känslighet och styrka. Antalet celler, kulturer och koncentrationer av testsubstansen som används bör reflektera dessa definierade parametrar (14). Det minsta antalet livskraftiga celler som överlever behandlingen och används vid varje stadium av testet bör baseras på den spontana mutationsfrekvensen. En generell regel är att använda ett cellantal som är minst tio gånger det inverterade värdet av den spontana mutationsfrekvensen. Det rekommenderas dock att minst 106 celler används. Adekvata historiska data för det cellsystem som används bör vara tillgängliga för att kontrollera att testet ger reproducerbara resultat.

1.4.1.2 Betingelser för media och kulturer

Lämpliga kulturmedia och inkubationsbetingelser (odlingskärl, temperatur, CO2-koncentration och luftfuktighet) bör användas. Mediet bör väljas ut i enighet med de selektiva system och celltyper som används i testet. Det är särskilt viktigt att betingelserna för kulturerna väljs på ett sådant sätt att man säkrar en optimal celltillväxt under expressionsperioden och en förmåga till bildning av kolonier för både mutanta och icke-mutanta celler.

1.4.1.3 Förberedelse av kulturer

Celler dras upp från stamkulturer, inokuleras i ett odlingsmedium och inkuberas vid 37 °C. Innan de används i detta test kan kulturerna behöva tvättas rena från redan existerande mutanta celler.

1.4.1.4 Metabolisk aktivering

Celler bör exponeras för testsubstansen både i närvaro och frånvaro av ett lämpligt system för metabolisk aktivering. Det system som vanligen används är en postmitokondriell fraktion som tillsatts en kofaktor (S9), beredd ur levern från gnagare vilka behandlats med enzyminducerande ämnen såsom Aroclor 1254 (15) (16) (17) (18) eller en kombination av fenobarbiton och β-naftoflavon (19) (20).

Den postmitokondriella fraktionen används vanligen vid koncentrationer i området 1-10 % v/v i det slutliga testmediet. Valet av och betingelserna för ett system för metabolisk aktivering kan vara beroende av klassen av kemikalier som testas. I vissa fall kan det vara lämpligt att använda mer än en koncentration av den postmitokondriella fraktionen.

Ett antal vidareutvecklingar, inklusive konstruktion av genetiskt modifierade cellinjer som uttrycker specifika aktiverande enzymer, kan ge en potential för endogen aktivering. Valet av de cellinjer som används bör vara vetenskapligt motiverat (t.ex. genom relevansen av cytokrom P450 isoenzym för metabolismen av testsubstansen).

1.4.1.5 Beredning av testsubstansen

Fasta testsubstanser bör lösas upp i eller blandas med lämpliga lösningsmedel eller vehiklar och spädas ut innan cellerna behandlas, om detta är lämpligt. Flytande testsubstanser kan tillsättas direkt till testsystemen och/eller spädas ut innan behandlingen startas. Nygjorda beredningar av testsubstansen bör användas om inte stabilitetsdata tyder på att lagring kan accepteras.

1.4.2 Försöksbetingelser

1.4.2.1 Lösningsmedel/vehikel

Lösningsmedlet/vehikeln bör inte kunna misstänkas för att reagera kemiskt med testsubstansen och bör vara förenlig med överlevnaden för cellerna samt S9-aktiviteten. Om andra lösningsmedel/vehiklar än gängse brukliga används bör det finnas data som visar att de är kompatibla. Det rekommenderas att vattenbaserade lösningsmedel/vehiklar i första hand bör övervägas närhelst det är möjligt. När substanser som är instabila i vatten testas, bör de organiska lösningsmedel som används vara fria från vatten. Vatten kan avlägsnas genom tillsats av en molekylsikt.

1.4.2.2 Exponeringskoncentrationer

Bland de kriterier som skall övervägas när den högsta koncentrationen skall fastställas är cytotoxicitet, löslighet i testsystemet och förändringar i pH eller osmolalitet.

Cytotoxicitet bör fastställas såväl med som utan metabolisk aktivering i huvudexperimentet med hjälp av lämplig indikation på cellernas integritet och tillväxt, såsom relativ kloningseffektivitet (överlevnad ) eller relativ total tillväxt. Det kan vara lämpligt att fastställa cytotoxicitet och löslighet i ett förberedande experiment.

Minst fyra analyserbara koncentrationer bör användas. Där cytotoxicitet uppträder bör dessa koncentrationer täcka in ett område som sträcker sig från maximal toxicitet ner till liten eller ingen toxicitet. Detta innebär normalt att koncentrationsnivåerna bör separeras av minst en faktor mellan 2 och [radic ]10. Om den maximala koncentrationen är baserad på cytotoxicitet bör detta då resultera i ungefär 10-20 % (men inte mindre än 10 %) relativ överlevnad (relativ kloningseffektivitet) eller relativ total tillväxt. För relativt icke-cytotoxiska substanser, bör den maximala testkoncentrationen vara 5 mg/ml, 5 µl/ml eller 0,01 M, beroende på vilket som är det lägsta.

Relativt olösliga substanser bör testas upp till eller över sin löslighetsgräns under odlingsbetingelserna för kulturen. Bevis för olöslighet bör bestämmas i det slutliga behandlingsmediet för vilket cellerna exponeras. Det kan vara lämpligt att fastställa lösligheten vid behandlingens början och slutpunkt, eftersom lösligheten kan förändras under exponeringsförloppet i testsystemet beroende på närvaron av celler, S9, serum, etc. Olöslighet kan detekteras med hjälp av blotta ögat. Fällningen torde inte störa bestämningen.

1.4.2.3 Kontroller

Samtidiga positiva och negativa kontroller (lösningsmedel eller vehikel), både med och utan metabolisk aktivering, bör inkluderas i varje experiment. När metabolisk aktivering används, bör den positiva kontrollkemikalien vara av sådant slag att den kräver aktivering för att ge ett mutagent svar.

I tabellen nedan ges några exempel på positiva kontrollsubstanser.

>Plats för tabell>

Andra lämpliga referenssubstanser för positiv kontroll kan användas, t.ex. om ett laboratorium har en historisk databas med 5-brom-2'-deoxiuridin [CAS-nummer 59-14-3, EINECS-nummer 200-415-9] skulle även denna referenssubstans kunna användas. Användning av kemiska klassrelaterade positiva kontrollkemikalier bör övervägas när sådana finns att tillgå.

Negativa kontroller, bestående av enbart ett lösningsmedel eller en vehikel i behandlingsmediet och behandlade på samma sätt som behandlingsgrupperna bör inkluderas. Dessutom bör även obehandlade kontroller användas, om det inte finns historiska kontrolldata som visar att inga skadliga eller mutagena effekter induceras av det valda lösningsmedlet.

1.4.3 Förfarande

1.4.3.1 Behandling med testsubstansen

Prolifererande celler bör exponeras för testsubstansen både med och utan metabolisk aktivering. Exponering bör ske under en lämplig tidsperiod (normalt är 3-6 timmar effektivt). Exponeringstiden kan utsträckas över en eller flera cellcykler.

Antingen en eller två behandlade kulturer kan användas vid varje koncentration som testas. När enstaka kulturer används, bör antalet koncentrationer ökas så att ett adekvat antal kulturer säkerställs för analys (t.ex. minst åtta analyserbara koncentrationer). Två negativa (lösningsmedels-) kontrollkulturer bör användas.

Gasformiga eller flyktiga substanser bör testas med hjälp av lämpliga metoder, såsom slutna odlingskärl (21) (22).

1.4.3.2 Mätning av överlevnad, viabilitet och mutantfrekvens

Mot slutet av exponeringsperioden tvättas cellerna och odlas för att bestämma överlevnad och för att medge att den mutanta fenotypen uttrycks. Mätning av cytotoxicitet, genom en bestämning av den relativa kloningseffektiviteten (överlevnad) eller relativa totala tillväxten för kulturerna, initieras normalt efter behandlingsperioden.

Varje lokus har definierade krav på minimitid, så att närmast optimal fenotypisk expression av nyligen inducerade mutanter medges (HPRT och XPRT kräver minst 6-8 dagar och TK minst två dagar). Celler odlas ofta i ett medium med och utan selektiva ämnen för att såväl antalet mutanter som kloningens effektivitet skall kunna bestämmas. Mätningen av viabiliteten (används för att beräkna mutantfrekvensen) initieras vid slutet av expressionstiden genom utstryk på platta i ett icke-selektivt medium.

Om testsubstansen är positiv i testet L5178Y TK+/-, bör storleksmätning av kolonierna utföras på åtminstone en av testkulturerna (den högsta positiva koncentrationen) och på de negativa och positiva kontrollerna. Om testsubstansen är negativ i testet L5178Y TK+/-, bör storleksmätning av kolonierna utföras på de negativa och positiva kontrollerna. I undersökningar där TK6TK+/- används, kan storleksmätning av kolonierna utföras även där.

2. DATA

2.1 BEHANDLING AV RESULTATEN

Data bör inkludera en bestämning av cytotoxicitet och viabilitet, räkning av kolonier och mutantfrekvenser för de behandlade kulturerna och kontrollkulturerna. Om testet L5178Y TK+/- ger ett positivt svar, påvisas kolonier utifrån kriterier för små och stora kolonier för åtminstone en koncentration av testsubstansen (högsta positiva koncentrationen) och för de negativa och positiva kontrollerna. Den molekylära och cytogenetiska naturen hos både stora och små mutanta kolonier har undersökts mycket ingående (23) (24). I testet TK+/- påvisas kolonier utifrån kriterier för normal tillväxt (stora) och långsam tillväxt (små) av kolonier (25). Mutanta celler som har utsatts för den mest omfattande genetiska skadan uppvisar förlängda dubbleringstider och bildar därför små kolonier. Denna skada sträcker sig typiskt i en skala från förlust av hela genen till karyotypiskt synliga kromosomavvikelser. Induktion av mutanter som ger små kolonier har associerats med kemikalier som inducerar omfattande kromosomavvikelser (26). Mutanta celler som är mindre allvarligt påverkade växer med hastigheter liknande de som parentala celler uppvisar och bildar stora kolonier.

Överlevnad (relativa kloningseffektiviteter) eller relativ total tillväxt bör anges. Mutantfrekvensen bör uttryckas som antalet mutanta celler per antalet celler som överlever.

Individuella data för kulturerna bör anges. Alla data bör dessutom sammanfattas i tabellform.

Det finns inget krav på verifiering av ett tydligt positivt svar. Tvetydiga resultat bör klarläggas genom fortsatta tester, lämpligen vid ändrade experimentella betingelser. Negativa resultat måste bekräftas från fall till fall. I de fall där det inte anses nödvändigt att bekräfta ett negativt resultat bör detta motiveras. Vid tvetydiga eller negativa resultat bör man vid uppföljningsexperiment överväga att ändra parametrarna i undersökningen för att utvidga de bedömda försöksbetingelserna. Försöksparametrar som kan behöva modifieras inkluderar koncentrationsstegen och villkoren för metabolisk aktivering.

2.2 UTVÄRDERING OCH TOLKNING AV RESULTATET

Det finns ett flertal kriterier som används för att bestämma om ett resultat är positivt, t.ex. en koncentrationsrelaterad ökning eller en reproducerbar ökning i mutationsfrekvensen. Man bör i första hand överväga resultatets biologiska relevans. Statistiska metoder kan vara till hjälp vid utvärdering av testresultatet. Statistisk signifikans bör dock inte vara den enda faktor som bestämmer om resultatet är positivt.

En testsubstans för vilken resultatet inte uppfyller ovanstående kriterier anses vara icke-mutagen i detta test.

Även om de flesta experiment kommer att ge tydligt positiva eller negativa resultat, kan i sällsynta fall uppsättningen av data göra det omöjligt att utföra en otvetydig bedömning med avseende på testsubstansens aktivitet. Resultatet kan förbli tvetydigt eller tveksamt, oavsett hur många gånger som experimentet upprepas.

Positiva resultat från testet av genmutationen in vitro hos däggdjursceller indikerar att testsubstansen inducerar genmutationer i de odlade däggdjursceller som används. Ett positivt koncentrationssvar som är reproducerbart är mycket meningsfullt. Negativa resultat indikerar att testsubstansen, under försöksbetingelserna, inte inducerar genmutationer i de odlade däggdjursceller som används.

3. RAPPORTERING

TESTRAPPORT

Följande information måste ingå i testrapporten:

Lösningsmedel/vehikel:

- motivering för valet av vehikel/lösningsmedel

- testsubstansens stabilitet och löslighet i lösningsmedlet/vehikeln, om detta är känt

Celler:

- cellernas typ och källa

- antalet cellkulturer

- antalet cellpassager, om detta är tillämpligt

- metoder för bibehållande av cellkulturen, om detta är tillämpligt

- frånvaro av mykoplasma

Försöksbetingelser:

- grund för val av koncentrationer och antalet kulturer inklusive t.ex. data för cytotoxicitet och löslighetsbegränsningar, om dessa finns att tillgå

- mediernas sammansättning, CO2-koncentration

- testsubstansens koncentration

- den tillsatta vehikelns och testsubstansens volym

- inkubationstemperatur

- inkubationstid

- behandlingens varaktighet

- celldensitet under behandlingen

- typ och sammansättning hos det system som används för metabolisk aktivering, inklusive acceptabilitetskriterier

- positiva och negativa kontroller

- expressionsperiodens varaktighet (inklusive antalet celler som inokulerats, samt subkulturer och scheman för näringstillförsel, om detta är tillämpligt)

- selektiva ämnen

- kriterier för när tester skall anses som positiva, negativa eller tvetydiga

- metoder som används för att räkna antalet livskraftiga och muterade celler

- definition av kolonier vars storlek och typ skall beaktas (inklusive kriterier för 'små' och 'stora' kolonier, där detta är tillämpligt)

Resultat:

- tecken på toxicitet

- tecken på utfällning

- data för pH och osmolalitet under det att exponering för testsubstansen sker, om sådana data har uppmätts

- koloniernas storlek (i de fall de räknats) för åtminstone negativa och positiva kontroller

- laboratoriets möjligheter att detektera mutanter som ger små kolonier med L5178Y TK+/--systemet, där detta är tillämpligt

- dos/respons-förhållande, där detta är möjligt

- statistiska analyser, om sådana finns

- samtidiga negativa (lösningsmedel/vehikel) och positiva kontrolldata

- historiska negativa (lösningsmedel/vehikel) och positiva kontrolldata med intervall, medelvärden och standardavvikelser

- mutationsfrekvens

Diskussion av resultaten.

Slutsatser.

4. REFERENSER

(1) Moore, M. M., DeMarini, D. M. DeSerres, F. J. and Tindal, K. R. (eds.) (1987), Banbury Report 28; Mammalian Cell Mutagenesis, Cold Spring Harbor Laboratory, New York.

(2) Chu, E. H. Y. and Malling H. V. (1968), Mammalian Cell Genetics. II. Chemical Induction of Specific Locus Mutations in Chinese Hamster Cells In Vitro, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 61, s. 1306-1312.

(3) Liber, H. L. and Thilly, W. G. (1982), Mutation Assay at the Thymidine Kinase Locus in Diploid Human Lymphoblasts, Mutation Res., 94, s. 467-485.

(4) Moore, M. M., Harington-Brock, K., Doerr, C. L. and Dearfield, K. L. (1989), Differential Mutant Quantitation at the Mouse Lymphoma TK and CHO HGPRT Loci. Mutagenesis, s. 394-403.

(5) Aaron, C. S., and Stankowski, Jr. L. F., (1989), Comparison of the AS52/XPRT and the CHO/HPRT Assays: Evaluation of the Six Drug Candidates, Mutation Res., 223, s. 121-128.

(6) Aaron, C. S., Bolcsfoldi, G., Glatt, H. R., Moore, M., Nishi, Y., Stankowski, Jr. L. F., Theiss, J. and Thompson, E. (1994), Mammalian Cell Gene Mutation Assays Working Group Report. Report of the International Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Procedures. Mutation Res., 312, s. 235-239.

(7) Scott, D., Galloway, S. M., Marshall, R. R., Ishidate, M., Brusick, D., Ashby, J. and Myhr, B. C. (1991) Genotoxicity Under Extreme Culture Conditions. A report from ICPEMC Task Group 9, Mutation Res., 257, s. 147-204.

(8) Clive, D., McCuen, R., Spector, J. F. S., Piper, C. and Mavournin, K. H. (1983), Specific Gene Mutations in L5178Y Cells in Culture. A Report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program. Mutation Res., 115, s. 225-251.

(9) Li, A. P., Gupta, R. S., Heflich, R. H. and Wasson, J. S. (1988), A Review and Analysis of the Chinese Hamster Ovary/Hypoxanthine Guanine Phosphoribosyl Transferase System to Determine the Mutagenicity of Chemical Agents: A Report of Phase III of the U.S. Environmental Protections Agency Gene-Tox Program, Mutation Res., 196, s. 17-36.

(10) Li, A. P., Carver, J. H., Choy, W. N., Hsie, A. W., Gupta, R. S., Loveday, K. S., O'Neill, J. P., Riddle, J. C., Stankowski, L. F. Jr. and Yang, L. L. (1987), A Guide for the Performance of the Chinese Hamster Ovary Cell/Hypoxanthine-Guanine Phosphoribosyl Transferase Gene Mutation Assay, Mutation Res., 189, s. 135-141.

(11) Liber, H. L., Yandell, D. W. and Little, J. B. (1989), A Comparison of Mutation Induction at the TK and HPRT Loci in Human Lymphoblastoid Cells: Quantitative Differences are Due to an Additional Class of Mutations at the Autosomal TK Locus, Mutation Res., 216, s. 9-17.

(12) Stankowski, L. F. Jr., Tindal,, K. R., and Hsie, A. W. (1986), Quantitative and Molecular Analyses of Ethyl Methanosulphonate and ICR 191-Induced Molecular Analyses of Ethyl Methanosulphonate and ICR 191 Induced Mutation in AS52 Cells, Mutation Res., 160, s. 133-147.

(13) Turner, N. T., Balton, A. G. and Clive, D. (1984), Procedure for the L5178Y/TK+/- - TK+/- Mouse Lymphoma Cell Mutagenicity Assay, in: Kilbey, B.J. et all (eds.) Handbook of Mutagenicity Test Procedures, Elsevier Science Publishers, New York, s. 239-268.

(14) Arlett, C. F., Smith, D. M., Clarke, G. M., Green, M. H. L., Cole, J., McGregor, D. B. and Asquith S. C. (1989), Mammalian Cell Gene Mutation Assays Based upon Colony Formation, in: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Kirkland, D. J., ed., Cambirdge University Press, s. 66-101.

(15) Abbondandolo, A., Bonatti, S., Corti, G., Fiorio, R., Loprieno, N. and Mazzaccaro, A. (1977), Induction of 6-Thioguanine-Resistant Mutants in V79 Chinese Hamster Cells by Mouse-Liver Microsome- Activated Dimethyllnitrosamine, Mutation Res., 46, s. 365-373.

(16) Ames, B. N., McCann, J. and Yamasaki, E. (1975), Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian-Microsome Mutagenicity Test, Mutation Res., 31, s. 347-364.

(17) Clive, D., Johnson, K. O., Spector, J. F. S., Batson A. G. and Brown M. M. M. (1979), Validation and Characterization of the L5178Y/TK+/- - Mouse Lymphoma Mutagen Assay System, Mutat. Res., 59, s. 61-108.

(18) Maron, D. M. and Ames, B. N. (1983), Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test, Mutuation Res., 113, s. 173-215.

(19) Elliott, E. M., Combes, R. D., Elcombe, C. R., Gatehouse, D. G., Gibson, G. G., Mackay, J. M. and Wolf, R. C. (1992), Alternatives to Aroclor 1254-Induced S9 in: In Vitro Genotoxicity Assays, Mutagenesis 7, s. 175-177.

(20) Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. (1976), A Safe Substitute for Polycholrinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems, in:In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, de Serres, F. J., Fouts, J. R., Bend, J. R. and Philpot, R. M. (eds), Elsevier, North-Holland, s. 85-88.

(21) Krahn, D. F., Barsky, F. C. and McCooey, K. T. (1982), CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids, in: Tice, R. R., Costa, D. L., Schaich, K. M. (eds), Genotoxic Effects of Airborne Agents, New York, Plenum, s. 91-103.

(22) Zamora, P. O., Benson, J. M., Li, A. P. and Brooks, A. L. (1983), Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown on Gollagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in the CHO/HGPRT Mutation Assay, Environmental Mutagenesis, 5, s. 795-801.

(23) Applegate, M. L., Moore, M. M., Broder, C. B., Burrell, A. and Hozier, J. C. (1990), Molecular Dissection of Mutations at the Heterozygous Thymidine Kinase Locus in Mouse Lymphoma Cells, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, s. 51-55.

(24) Moore, M. M., Clive, D. Hozier, J. C., Howard, B. E., Batson, A. G., Turner, N. T. and Sawyer, J. (1985), Analysis of Trifluoronthymidine, Resistant (TFT) Mutants of L5178Y/TK+/- - Mouse Lymphoma Cells, Mutation Res., 151, s. 161-174.

(25) Yandell, D. W., Dryja, T. P. and Little, J. B. (1990), Molecular Genetic Analysis of Recessive Mutations at a Heterozygous Autosomal Locus in Human Cells, Mutation Res., 229, s. 89-102.

(26) Moore, M. M. and Doerr, C. L. (1990), Comparison of Chromosome Aberration Frequency and Small Colony TK-Deficient Mutant Frequency in L5178Y/TK+/- - 3.7.2C Mouse Lymphoma Cells, Mutagenesis, 5, s. 609-614."

BILAGA 4F

"B.23. SPERMATOGONIAL TEST AV KROMOSOMAVVIKELSER HOS DÄGGDJUR

1. METOD

Denna metod är en kopia av testet OECD TG 483, Spermatogonial test av kromosomavvikelser hos däggdjur (Mammalian Spermatogonial Chromosome Aberration Test (1997)).

1.1 INLEDNING

Ändamålet med testet av spermatogoniala avvikelser in vivo hos däggdjur, är att identifiera de substanser som orsakar strukturella kromosomavvikelser i spermatogoniala celler hos däggdjur (1) (2) (3) (4) (5). Strukturella avvikelser kan vara av två typer, kromosomala eller kromatida. Majoriteten av de kemiska mutagenerna inducerar avvikelser av kromatidtyp, men även avvikelser av kromosomtyp förekommer. Denna metod är inte utformad för att mäta numeriska avvikelser och används inte rutinmässigt för detta ändamål. Kromosommutationer och relaterade händelser är orsaken till många genetiska sjukdomar hos människor.

Detta test mäter kromosomhändelser i spermatogoniala könsceller och förväntas därför utgöra en förutsägelse på induktion av ärftliga mutationer i könsceller.

Gnagare används rutinmässigt i detta test. Detta cytogenetiska test in vivo detekterar kromosomavvikelser i spermatogoniala mitoser. Andra målceller omfattas inte av denna metod.

För att detektera avvikelser av kromatidtyp i spermatogoniala celler, bör den första mitotiska celldelningen efter behandlingen undersökas innan dessa skador förloras i de påföljande celldelningarna. Ytterligare information från behandlade spermatogoniala stamceller kan erhållas genom meiotisk kromosomanalys av avvikelser av kromosomtyp vid diakinesmetafas I, när de behandlade cellerna förvandlas till spermatocyter.

Detta in vivo-test är utformat för att undersöka om mutagener för somatiska celler även är aktiva i könsceller. Det spermatogoniala testet är dessutom relevant för att fastställa risken för mutagenicitet, eftersom det medger att faktorer för in vivo metabolism, farmakokinetik och reparationsprocesser för DNA beaktas.

Ett antal generationer av spermatogonier finns närvarande i testikeln med ett spektrum av känslighet för kemisk behandling. De avvikelser som detekteras representerar alltså ett samlat svar på behandlade spermatogoniala cellpopulationer, där de mera talrika differentierade spermatogoniala cellerna överväger. Olika generationer av spermatogonier kan där komma i kontakt med det stora kretsloppet. Om detta sker eller ej avgörs av deras position inne i testikeln, beroende på den fysiska och fysiologiska Sertoli-cellbarriären och på blod/testikelbarriären.

Om det finns bevis för att testsubstansen, eller en reaktiv metabolit, inte kommer att nå fram till målvävnaden, är det inte lämpligt att använda detta test.

Se även Allmän inledning, del B.

1.2 DEFINITIONER

avvikelse av kromatidtyp: strukturell kromosomskada uttryckt som brott på enstaka kromatider eller brott och återförening mellan kromatider.

avvikelse av kromosomtyp: strukturell kromosomskada uttryckt som brott och återförening, på båda kromatiderna på samma ställe.

lucka: en akromatisk skada som är mindre än bredden på en kromatid, och med ett minimum av misspassning hos kromatiderna.

numerisk avvikelse: en förändring av antalet kromosomer från det normala antalet karakteristiskt for det försöksdjur som används.

polyploidi: en multipel av det haploida kromosomantalet (n) som skiljer sig från det diploida (d.v.s. 3n, 4n o.s.v.).

Strukturell avvikelse: en förändring av kromosomstrukturen som är detekterbar med hjälp av en mikroskopisk undersökning av metafasstadiet vid celldelning, observerad i form av deletioner, interna eller externa utbyten.

1.3 TESTMETODENS PRINCIP

Försöksdjur exponeras för testsubstansen genom ett lämpligt exponeringssätt och avlivas sedan vid en lämplig tid efter behandling. Innan avlivningen sker, behandlas försöksdjuren med en substans som gör att celldelningen stannar upp i metafas (t.ex. colchicin eller Colcemid®). Kromosomberedninger görs sedan från könsceller och färgas in, varpå de celler som är i metafas analyseras med avseende på kromosomavvikelser.

1.4 BESKRIVNING AV TESTMETODEN

1.4.1 Förberedelser

1.4.1.1 Val av djurarter

Handjur av kinesiska hamstrar och möss används i stor utsträckning. Det är även möjligt att använda hanar från andra lämpliga däggdjursarter. Man bör välja de stammar av unga, friska vuxna djur som vanligen används på laboratorier. När undersökningen skall påbörjas är det lämpligt att viktskillnaden mellan djuren är så liten som möjligt och den bör inte överstiga ± 20 % av medelvikten.

1.4.1.2 Förhållanden vid förvaring och utfodring

De generella förhållanden som anges i den Allmänna inledningen till del B gäller. Man bör dock sträva efter en relativ luftfuktighet på 50-60 %.

1.4.1.3 Förberedelse av djuren

Friska, unga vuxna djur väljs ut slumpartat för placering i kontroll- och behandlingsgrupperna. Burar bör arrangeras på ett sådant sätt att möjliga effekter beroende på placeringen av burarna blir så små som möjligt. Djuren skall ha en unik identifiering. De bör vänjas vid förhållandena i laboratoriet under minst fem dagar innan undersökningen börjar.

1.4.1.4 Beredning av doser

Festa testsubstanser bör lösas upp i eller blandas med lämpliga lösningsmedel eller vehiklar och spädas ut, om så är lämpligt, innan dosen administreras till djuren. Testsubstanser i flytande form kan doseras direkt eller spädas ut före dosering. Nygjorda beredningar av testsubstansen bör användas, om inte stabilitetsdata visar att lagring är acceptabel.

1.4.2 Försöksbetingelser

1.4.2.1 Lösningsmedel/vehikel

Lösningsmedlet/vehikeln bör inte ge upphov till toxiska effekter vid de dosnivåer som används och bör inte kunna misstänkas för att reagera kemiskt med testsubstansen. Om andra lösningsmedel/vehiklar än gängse brukliga används, bör användningen av dem ha stöd från data som visar på deras kompatibilitet. När det är möjligt, rekommenderas att man i första hand överväger att använda vattenbaserade lösningsmedel/vehiklar.

1.4.2.2 Kontroller

Samtidiga positiva och negativa (lösningsmedel/vehikel) kontroller bör inkluderas i varje test. Utom vid behandling med testsubstansen, bör försöksdjuren i kontrollgrupperna hanteras på ett sätt om är identiskt med sättet för försöksdjuren i de grupper som behandlas.

Positiva kontroller bör de strukturella kromosomavvikelser in vivo i spermatogoniala celler när administrering sker vid exponeringsnivåer som förväntas ge en detekterbar ökning i förhållande till bakgrunden.

Positiva kontrolldoser bör väljas på ett sådant sätt att effekterna är tydliga men inte omedelbart avslöjar identiteten hos kodade utstryksglas för läsaren. Det är acceptabelt att den positiva kontrollen administreras via en annan tillförselväg än testsubstansen och att provtagningen endast sker vid ett tillfälle. Dessutom kan användningen av kemiska klassrelaterade positiva kontrollkemikalier övervägas när sådana finns att tillgå. I tabellen nedan ges några exempel på positiva kontrollsubstanser.

>Plats för tabell>

Negativa kontroller, behandlade med enbart ett lösningsmedel eller en vehikel, och i övrigt behandlade på samma sätt som behandlingsgrupperna, bör inkluderas för varje provtagningstillfälle, om inte acceptabel variabilitet och frekvens för celler med kromosomavvikelser mellan försöksdjuren kan påvisas från historiska kontrolldata. Dessutom bör obehandlade kontroller även användas, om det inte finns historiska eller publicerade kontrolldata som visar att inga skadliga eller mutagena effekter induceras av det valda lösningsmedlet/vehikeln.

1.5 FÖRFARANDE

1.5.1 Antal försöksdjur

Varje behandlad grupp och kontrollgrupp måste inkludera minst fem analyserbara hanar.

1.5.2 Behandlingsschema

Testsubstanser bör lämpligen administreras en eller två gånger (d.v.s. som en enstaka behandling eller som två behandlingar). Testsubstanser kan även administreras i form av en delad dos, d.v.s. två behandlingar under samma dag med högst några timmars intervall, för att underlätta administrering av stora volymer. Andra doseringsscheman bör vara vetenskapligt motiverade.

I den högsta dosgruppen används två provtagningstider efter behandlingen. Eftersom cellcykelns kinetik kan påverkas av testsubstansen, används en tidig och en sen provtagningstid vid ungefär 24 och 48 timmar efter behandlingen. För andra doser än den högsta dosen bör en provtagningstid vid 24 timmar eller 1,5 cellcyklers längd efter behandlingen användas, om inte andra provtagningstider är kända för att vara lämpligare för detektion av effekter (6).

Dessutom kan andra provtagningstider användas. När det t.ex. gäller fall där kemikalier kan inducera kromosom-'lagging', eller när de kan ge upphov till S-oberoende effekter, kan tidigare provtagningstider visa sig vara lämpligare (1).

Man måste i varje enskilt fall fastställa om det är lämpligt att använda ett upprepat behandlingsschema. Efter ett upprepat behandlingsschema bör försöksdjuren avlivas 24 timmar (1,5 gånger cellcykelns längd) efter den sista behandlingen. Ytterligare provtagningstider kan användas där så är lämpligt.

Innan avlivningen sker, injiceras försöksdjuren intraperitonealt med en lämplig dos av en substans som stoppar celldelningen i metafas (t.ex. Colcemid® eller colchicin). Provtagning på försöksdjur sker därefter med lämpliga intervall. För möss ligger detta intervall på ungefär 3-5 timmar och för kinesiska hamstrar ligger intervallet på ungefär 4-5 timmar.

1.5.3 Dosnivåer

Om det inte finns några lämpliga data tillgängliga och en undersökning därför utförs för att fastställa omfattningen, bör denna undersökning utföras i samma laboratorium, och med samma arter, stammar och behandlingsschema som senare skall användas i huvudundersökningen. Vid toxicitet används tre dosnivåer för det första provtagningstillfället. Dessa dosnivåer bör täcka in ett intervall som sträcker sig från maximal till liten eller ingen toxicitet. Vid senare provtagningstillfällen räcker det med att endas den högsta dosen används. Den högsta dosen definieras som den dos som producerar tecken på toxicitet och så att högre dosnivåer baserade på samma doseringsschema skulle förväntas leda till att försöksdjuret dör.

Substanser med specifika biologiska verkningar vid låga icke-toxiska doser (såsom hormoner och mitogena substanser) kan utgöra undantag från kriterier som är dosbestämmande och bör utvärderas ifrån fall till fall. Den högsta dosen kan även definieras som en dos vilken ger upphov till någon indikation på toxicitet i den spermatogoniala cellerna (t.ex. en reduktion i kvoten av spermatogoniala mitoser hos de första och andra meiotiska metafaserna; denna reduktion bör inte överskrida 50 %).

1.5.4 'Limit-test'

En fullständig undersökning med tre dosnivåer kan inte anses vara nödvändig om ett test på en dosnivå vid minst 2000 mg/kg kroppsvikt och med en enstaka behandling, eller i form av två behandlingar under samma dag, inte per upphov till observerbara toxiska effekter, och om ingen genotoxicitet kan förväntas utifrån data om strukturellt relaterade substanser. En förväntad exponering av människor kan visa på behovet av att en högre dosnivå används i 'limit-testen'.

1.5.5 Administrering av doser

Testsubstansen administreras normalt genom sondmatning med hjälp av en magsond, en lämplig intuberingskanyl eller genom en intraperitoneal injektion. Andra tillförselvägar för exponering kan vara acceptabla där de kan motiveras. Den maximala vätskevolymen som kan administreras med hjälp av sondmatning eller injektion vid ett tillfälle beror på försöksdjurets storlek. Volymen bör inte överstiga 2 ml/100 g kroppsvikt. Användning av volymer som är större än dessa måste motiveras. Förutom för irriterande eller korrosiva substanser, som normalt kommer att visa på stegrade effekter med högre koncentrationer, bör variationer av testvolymen minimeras genom att en justering av koncentrationen sker för att säkerställa att volymen är konstant vid alla dosnivåer.

1.5.6 Kromosomberedning

Omedelbart efter avlivning, tas cellsuspensioner ut från en eller båda testiklarna, exponeras för en hypoton lösning och fixeras. Cellerna stryks sedan ut på utstryksglas och färgas in.

1.5.7 Analys

För varje försöksdjur bör minst 100 väl spridda metafaser analyseras (d.v.s. ett minimum på 500 metafaser per grupp). Detta antal skulle kunna reduceras när ett stort antal avvikelser observeras. Alla utstryksglas, inklusive de från positiva och negativa kontroller, bör få en oberoende kodning innan den mikroskopiska analysen utförs. Eftersom fixeringsprocedurerena ofta resulterar i brott på en del av de celler som är i metafas, med förlust av kromosomer som följd, bör de celler som påvisas innehålla ett antal centromerer som motsvarar antalet 2 N ± 2.

2. DATA

2.1 BEHANDLING AV RESULTATEN

Individuella data från försöksdjur bör presenteras i tabellform. Den experimentella enheten utgörs av försöksdjuret. För varje individuellt försöksdjur bör antalet celler med strukturella kromosomavvikelser och antalet kromosomavvikelser per cell utvärderas. Olika typer av strukturella kromosomavvikelser bör listas med antal och frekvenser för behandlade grupper och kontrollgrupper. Luckor i DNA-strängen registreras separat och rapporteras men inkluderas i allmänhet inte i den totala avvikelse frekvensen,

Om såväl mitos som meios observeras, bör förhållandet mellan spermatogoniala mitoser och de första och andra meiotiska metafaserna fastställas som ett mått på cytotoxicitet för alla behandlade och negativa kontrollförsöksdjur vid ett totalt prov på 100 celler som delar sig per djur för att etablera en möjligt cytotoxisk effekt. Om endast mitos kan observeras, bör mitosindexet bestämmas i minst 1000 celler för varje försöksdjur.

2.2 UTVÄRDERING OCH TOLKNING AV RESULTATEN

Det finns ett flertal kriterier som används för att bestämma om ett resultat är positivt, t.ex. en dosrelaterad ökning av det relativa antalet celler med kromosomavvikelser eller en tydlig ökning av antalet celler hos en grupp som fått en enstaka dos vid ett enstaka provtagningstillfälle. Man bör i första hand överväga resultatets biologiska relevans. Statistiska metoder kan användas som en hjälp vid utvärdering av testresultatet (8). Tvetydiga resultat bör klarläggas genom fortsatta tester, lämpligen vid ändrade experimentella betingelser.

En testsubstans för vilken resultatet inte uppfyller ovanstående kriterier anses vara icke-mutagen i detta test.

Även om de flesta experiment kommer att ge tydligt positiva eller negativa resultat, så kan i sällsynta fall uppsättningen av data göra det omöjligt att utföra en otvetydig bedömning med avseende pa testsubstansens aktivitet. Resultatet kan förbli tvetydigt eller tveksamt, oavsett hur många gånger som experimentet upprepas.

Positiva resultat från in vivo-test för spermatogoniala kromosomavvikelser indikerar att testsubstansen inducerar strukturella kromosomavvikelser i könscellerna hos den art som testas. Negativa resultat indikerar att testsubstansen, under försöksbetingelserna, inte inducerar kromosomavvikelser i könscellerna på den art som testas.

Sannolikheten för att testsubstansen eller dess metaboliter når målvävnaden bör diskuteras.

3. RAPPORTERING

TESTRAPPORT

Testrapporten måste innehålla följande information:

Lösningsmedel/vehikel:

- motivering av valet av vehikel

- testsubstansens löslighet och stabilitet i lösningsmedlet/vehikeln, om detta är känt

Försöksdjur:

- art/stam som används

- försöksdjurens antal och ålder

- ursprung, förhållanden vid förvaring, diet, etc.

- individuell vikt hos försöksdjuren vid försökets början, inklusive kroppsviktsintervallet, medelvärde och standardavvikelse för varje grupp

Försöksbetingelser:

- data från en omfångsundersökning, om en sådan genomförts

- grund för valet av dosnivå

- grund för administrationsvägen

- uppgifter om beredningen av testsubstansen

- uppgifter om administreringen av testsubstansen

- grund för avlivningstiderna

- omvandling från koncentration av testsubstansen i diet/dricksvatten (ppm) till den verkliga dosen (mg/kg kroppsvikt/dag), om detta är tillämpbart

- uppgifter om fodrets och vattnets kvalitet

- detaljerad beskrivning av behandlings- och provtagningsscheman

- metoder för mätningar av toxicitet

- identiteten hos substanser som stoppar cellcykeln i metafas, deras koncentration och behandlingens varaktighet

- metoder för preparation av utstryksglas

- kriterier för hur avvikelser påvisas

- antalet celler som analyserats per försöksdjur

- kriterier för bedömning av om undersökningarna är positiva, negativa eller tvetydiga

Resultat:

- tecken på toxicitet

- mitotiskt index

- förhållandet mellan spermatogoniala mitosceller och de första och andra meiotiska metafaserna

- typ av och antal avvikelser, angivna separat för varje försöksdjur

- det totala antalet avvikelser per grupp

- antalet celler med avvikelser per grupp

- dos/respons-förhållande, där så är möjligt

- statistiska analyser, om några sådana förekommer

- samtidiga negativa kontrolldata

- historiska negativa kontrolldata med omfång, medelvärden och standardavvikelser

- samtidiga positiva kontrolldata

- förändringar i ploiditet, om sådana har observerats.

Diskussion av resultaten.

Slutsatser.

4. REFERENSER

(1) Adler, I. D., (1986), Clastogenic Potential in Mouse Spermatogonia of Chemical Mutagens Related to their Cell-Cycle Specifications, in: Genetic Toxicology of Environmental Chemicals, Part B: Genetic Effects and Applied Mutagenesis, Ramel, C., Lambert, B. and Magnusson, J. (eds) Liss, New York, s. 477-484.

(2) Adler, I. D., (1984), Cytogenetic tests in Mammals, in: Mutagenicity Testing: a Practical Approach, (ed.) S. Venitt and J. M. Parry, IRL Press, Oxford, Washington DC, s. 275-306.

(3) Evans, E. P., Breckon, G. and Ford, C. E. (1964), An Air-drying Method for Meiotic Preparations from Mammalian Testes, Cytogenetics and Cell Genetics, 3, s. 289-294.

(4) Richold, M., Ashby, J., Chandley, A., Gatehouse, D. G. and Henderson, L. (1990), In Vivo Cytogenetic Assays, in: D. J. Kirkland (ed.), Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Subcommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report. Part I revised, Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, s. 115-141.

(5) Yamamoto, K. and Kikuchi, Y. (1978), A New Method for Preparation of Mammalian Spermatogonial Chromosomes, Mutation Res. 52, s. 207-209.

(6) Adler, I. D., Shelby M. D., Bootman, J., Favor, J., Generoso, W., Pacchierotti, F., Shibuya, T. and Tanaka N. (1994), International Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Procedures. Summary Report of the Working Group on Mammalian Germ Cell Tests, Mutation Res. 312, s. 313-318.

(7) Fielder, R. J., Allen, J. A., Boobis, A. R., Botham, P. A., Doe, J., Esdaile, D. J., Gatehouse, D. G., Hodson-Walker, G., Morton, D. B., Kirkland, D. J. and Richold, M. (1992), Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group: Dose setting in In Vivo Mutagenicity Assays, Mutagenesis, 7, s. 313-319.

(8) Lovell, D. P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G. E., Clarc, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D. G. and Savage, J. R. K. (1989), Statistical Analysis of In Vivo Cytogenetic Assays, in: D. J. Kirkland (ed.), Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. UKEMS Subcommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing, report, Part III. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, s. 184-232."

BILAGA 4G

"B.39. TEST AV REPARATIONSSYNTES (UDS) HOS LEVERCELLER FRÅN DÄGGDJUR IN-VIVO

1. METOD

Denna metod är en kopia av testet OECD TG 486, Test av reparationssyntes (UDS) hos leverceller från däggdjur in vivo (Unscheduled DNA Synthesys (UDS) Test with Mammalian Liver Celler in Vivo (1997)).

1.1 INLEDNING

Ändamålet med testet av reparationssyntes (UDS) hos leverceller från däggdjur in vivo är att identifiera testsubstanser som inducerar DNA-reparation i leverceller från behandlade försöksdjur (se (1) (2) (3) (4).

Detta in vivo-test erbjuder en metod för undersökning av genotoxiska effekter av kemikaler i levern. Slutpunktsmätning är indikativt för DNA-skador och påföljande reparation i leverceller. Levern är vanligen det huvudsakliga sätet för metabolismen av absorberade ämnen. Det är således ett lämpligt säte för att mäta DNA-skador in vivo.

Om det finns bevis för att testsubstansen inte kommer att nå målvävnaden är det inte lämpligt att använda detta test.

Reparationssyntesens slutpunkt mäts genom att bestämma upptaget av märkta nukleosider i celler som inte undergår reguljär DNA syntes (S-fas). Den teknik som är den mest använda är bestämning av upptag av tritiummärkt tymidin (H-TdR) med hjälp av autoradiografi. Råttlever används med fördel för UDS-tester in vivo. Andra vävnader än lever kan användas, men omfattas inte av denna metod.

Detektionen av ett UDS-svar är beroende av antalet DNA-baser som 'klipps bort' och byts ut vid platsen för skadan. UDS-testet är därför särskilt värdefullt för att detektera substansinducerad 'longpatch'-reparation (20-30 baser). 'Shortpatch'-reparation (1-3 baser) detekteras däremot med mycket lägre känslighet. Vidare kan mutagena händelser inträffa på grund av utebliven reparation, felreparation eller felreplikation av DNA-skador. Omfattningen av UDS-svaret ger ingen indikation på noggrannheten i reparationsprocessen. Dessutom är det möjligt att ett mutagen reagerar med DNA men att DNA-skadan inte repareras via en reparationsprocess där DNA-baser 'klipps bort' och byts ut. Bristen på specifik information rörande mutagen aktivitet, erhållen genom UDS-testet, kompenseras för genom dess potentiella känslighet, eftersom den mäts i hela genomet.

Se även Allmän inledning, del B.

1.2 DEFINITIONER

celler som repareras: ett nettoantal korn i kärnan (net nuclear grain, NNG) som är större än ett förvalt värde, vilket skall verifieras av det laboratorium som utför testet.

nettoantal korn i kärnan (NNG): kvantitativ mätning av UDS-aktivitet hos celler i autoradiografiska UDS-tester, beräknade genom att subtrahera medelantalet av de cytoplasmiska kornen i kärnekvivalenta cytoplasmiska områden (CG) från antalet korn i kärnan (nuclear grains, NG): NNG = NG - CG. NNG-räkningar beräknas för individuella celler och slås sedan samman för celler i en kultur, i parallella kulturer, etc.

reparationssyntes (UDS): DNA-reparationssyntes efter 'bortklippning' och avlägsnande av en DNA-sträng som innehåller ett avsnitt med skador inducerats av kemiska substanser eller fysiska ämnen. (UDS)

1.3 TESTMETODENS PRINCIP

UDS-testet med leverceller från däggdjur in vivo indikerar DNA-reparationssyntes efter 'bortklippning' och avlägsnande av en sträng med DNA innehållande ett avsnitt med skador, vilka inducerats av kemiska substanser eller fysiska ämnen. Testet baseras i vanliga fall på en inkorporering av 3H-TdR i DNA hos leverceller, vilka har en låg frekvens av celler som befinner sig i cellcykelns S-fas. Upptaget av 3H-TdR bestäms vanligen genom autoradiografi, eftersom denna teknik inte är så mottaglig för interferens från celler i S-fas som, t.ex. vätske-scintillationsräkning

1.4 BESKRIVNING AV METODEN

1.4.1 Förberedelser

1.4.1.1 Val av djurarter

Vanligen används råttor men det går även bra att använda ett annat lämpligt däggdjur. Man bör välja de stammar av unga, friska vuxna försöksdjur som vanligen används på laboratorier. När undersökningen skall påbörjas, är det lämpligt att viktskillnaden mellan djuren är så liten möjligt och den bör inte överstiga ± 20 % av medelvikten för varje kön.

1.4.1.2 Förhållanden vid förvaring och utfodring

De generella förhållanden som anges i den Allmänna inledningen till del B gäller. Man bör dock sträva efter en relativ luftfuktighet på 50-60 %.

1.4.1.3 Förberedelse av djuren

Friska, unga och vuxna försöksdjur väljs ut slumpartat för placering i kontroll- och behandlingsgrupperna. Burar bör arrangeras på ett sådant sätt att möjliga effekter beroende på placeringen av burarna blir så små som möjligt. Djuren skall ha en unik identifiering och hållas i sina burar under minst fem dagar innan undersökningen börjar, för att göra det möjligt för dem att acklimatiseras till förhållandena i laboratoriet.

1.4.1.4 Berdning av testsubstansen

Testsubstanser i fast form bör lösas upp i eller blandas med lämpliga lösningsmedel eller vehiklar och spädas ut, om så är lämpligt, innan dosen administreras till försöksdjuren. Testsubstanser i flytande form kan doseras direkt eller så späds de ut före dosering. Nygjorda beredningar av testsubstansen bör användas om inte stabilitetsdata visar att lagring är acceptabelt.

1.4.2 Försöksbetingelser

1.4.2.1 Lösningsmedel/vehikel

Lölsningsmedlet/vehikeln bör inte ge upphov till toxiska effekter vid de dosnivåer som används och bör inte kunna misstänkas för att reagera kemiskt med testsubstansen. Om andra lösningsmedel/vehiklar än gängse brukliga används, bör användningen av dem ha stöd från data som visar på deras kompatibilitet. När det är möjligt, rekommenderas att man i första hand överväger vattenbaserade lösningsmedel/vehiklar.

1.4.2.2 Kontroller

Samtidiga positiva och negativa kontroller (lösningsmedel/vehikel) bör ingå i varje oberoende utförd del av experimentet. Förutom vid behandling med testsubstansen, bör försöksdjuren i kontrollgrupperna hanteras på ett identiskt sätt i förhållande till djuren i de grupper där behandling skett.

Positiva kontroller bör utgöras av substanser som är kända för att ge UDS när de administreras vid exponeringsnivåer som kan förväntas att ge en detekterbar ökning jämfört med bakgrunden. Positiva kontroller som kräver metabolisk aktivering bör användas vid doser som framkallar ett måttligt svar (4). Doserna kan väljas på ett sådant sätt att effekterna är tydliga men att de inte omedelbart avslöjar identiteten hos kokade utstryksglas för läsaren. I tabellen nedan ges några exempel på positiva kontrollsubstanser.

>Plats för tabell>

Andra lämpliga positiva kontrollsubstanser kan används. Det är acceptabelt att den positiva kontrollen administreras via en annan tillförselväg än testsubstansen.

1.5 FÖRFARANDE

1.5.1 Försökdjurens antal och kön

Ett lämpligt antal försöksdjur bör användas, för att man skall kunna ta hänsyn till den naturliga biologiska variationen hos testresultaten. Antalet försöksdjur bör utgöras av minst tre analyserbara försöksdjur per grupp. Där det finns en signifikant historiks databas som har ackumulerats, krävs det endast ett eller två försöksdjur för de samtidiga negativa och positiva kontrollgrupperna.

Om det vid tiden för undersökningen visar sig att det finns data som är tillgängliga från undersökningar på samma stam och där samma tillförselväg för exponering har använts, samt att dessa visar att det inte finns några betydande skillnader i toxicitet mellan könen, kan testning på endast ett kön, helst på hanar, vara tillräckligt. I de fall där exponering av människa för kemikaler kan ge könsspecifika resultat, som t.ex. för vissa läkemedel, bör testet utföras med försöksdjur av lämpligt kön.

1.5.2 Behandlingsschema

Testsubstanser administreras i allmänhet i form av en enstaka behandling.

1.5.3 Dosnivåer

Normalt används minst två olika dosnivåer. Den högsta dosen definieras som dos vilken producerar tecken på toxicitet på ett sådant sätt att högre dosnivåer, baserade på en likadan doseringsregim, skulle förväntas leda till letalitet. I allmänhet bör den lägre dosen vara 50 % till 25 % av den högre dosen.

Substanser med specifika biologiska verkningar vid låga icke-toxiska doser (såsom hormoner och mitogena substanser) kan utgöra undantag med avseende pa de dosbestämmande kriterierna och bör utvärderas från fall till fall. Om en undersökning för att bestämma intervallet utförs på grund av att det inte finns några lämpliga data tillgängliga, bör denna utföras i samma laboratorium, och där man använder samma arter, stammar, kön och behandlingsschema som i huvudundersökningen.

Den högsta dosen kan även definieras som en dos vilken producerar en indikation på toxicitet i levern (t.ex. pyknotiska kärnor).

1.5.4 Limit-test

En fullständig undersökning kan inte anses vara nödvändig om ett test på en dosnivå vid minst 2000 mg/kg kroppsvikt och med en enstaka behandling, eller i form av två behandlingar under samma dag, inte ger upphov till observerbara toxiska effekter, och om ingen genotoxicitet kan förväntas utifrån data om strukturellt relaterade substanser. En förväntad exponering av människor kan visa på behovet av att en högre dosnivå används i 'limit-testen'.

1.5.5 Administrering av doser

Testsubstansen administreras vanligen via sondmatning genom att använda en magsond eller en lämplig intubationskanyl. Andra tillförselvägar för exponering kan vara acceptabla, där de kan motiveras. Den intraperitoneala vägen rekommenderas dock inte, eftersom den skulle kunna exponera levern direkt för testsubstansen snarare än via det cirkulatoriska systemet. Den maximala vätskevolymen som kan administreras genom sondmatning eller injektion vid ett tillfälle beror av försöksdjurets storlek. Volymen bör inte överskrida 2 ml/100 g kroppsvikt. Användningen av större volymer måste motiveras. Förutom när det gäller irriterande eller korrosiva substanser, vilka normalt kommer att avslöja förvarade effekter vid högre koncentrationer, bör variationer av testvolymen minimeras genom en justering av koncentrationen, så att konstant volym kan säkerställas vid alla dosnivåer.

1.5.6 Beredning av leverceller

I normala fall bereds leverceller från behandlade försöksdjur 12-16 timmar efter dosering. Ytterligare en tidig provtagningstidpunkt (normalt 2-4 timmar efter behandlingen) är normalt nödvändig om inte det finns ett tydligt positivt svar efter 12-16 timmar. Alternativa provtagningstidpunkter kan används när det är motiverat utifrån toxikokinetiska data.

Kortvariga kulturer med leverceller från däggdjur startas genom att skölja lever in situ med kollagenas och att låta nyligen dissocierade leverceller fästa sig på en lämplig yta. Leverceller från negativa kontrollförsöksdjur bör ha en viabilitet (5) på minst 50 %.

1.5.7 Bestämning av UDS

Nyligen isolerade leverceller från däggdjur inkuberas normalt med ett medium som innehåller 3H-TdR under en tid som är tillräckligt lång, t.ex. 3-8 timmar. När inkubationsperioden går mot sitt slut, bör mediet avlägsnas från cellerna, vilken sedan kan inkuberas i ett medium som innehåller ett överskott på omärkt tymidin för att försvaga oinkorporerad radioaktivitet ('cold chase'). Cellerna tvättas sedan, fixeras och torkas. Vid längre inkubationstider, kan 'cold chase' visa sig vara onödigt. Utstryksglas doppas sedan i en autoradiografisk emulsion, exponeras i mörker (t.ex. nedkylda under 7-14 dagar) framkallas och färgas in, varpå exponerade silverkorn sedan räknas. Två till tre utstryksglas bereds från varje försöksdjur.

1.5.8 Analys

Preparationerna av utstryksglas bör innehålla tillräckligt många celler med normal morfologi för att medge en meningsfull bestämning av UDS. Preparationer undersöks mikroskopiskt efter tecken på uppenbar cytotoxicitet (t.ex. pyknos, reducerade nivåer av radioaktiv märkning).

Utstryksglas bör kodas innan kornen räknas. Normalt påvisas 100 celler från varje försöksdjur från minst två utstryksglas. om mindre än 100 celler/försöksdjur påvisas bör detta motiveras. Vid kornräkningar påvisas inte kärnor i S-fas, men proportionen av celler i S-fas kan registreras.

Mängden av 3H-TdR som inkorporerats i kärnan och cytoplasman hos morfologiskt normala celler, som bevisats av upplagringen av silverkorn, bör bestämmas med hjälp av lämpliga metoder.

Kornräkningar bestäms i kärnorna (nuclear grains, NG) och kärnekvivalenta områden i cytoplasman (cytoplasmic grains, CG). CG-räkningar mäts genom att antingen ta det område av cytoplasman som har den mest omfattande märkningen. eller genom att ta ett medeltal av två eller tre slumpmässiga cytoplasmaräkningar nära kärnan. Andra räknemetoder (t.ex. helcellsräkning) kan användas om de kan motiveras (6).

2. DATA

2.1 BEHANDLING AV RESULTATEN

Individuella utstryksglas och försöksdjursdata bör tas fram. Dessutom bör alla data sammanfattas i tabellform. Räkningar av nettoantalet korn i kärnan (NNG) bör tas fram för varje cell, för varje försöksdjur och för varje dos och tid genom att subtrahera CG-räkningar från NG-räkningar. Om 'celler under reparation' räknas in, bör kriterierna för definition av 'celler under reparation' vara motiverade och baserade på historiska eller samtidiga negativa kontrolldata. Numeriska resultat kan utvärderas utifrån statistiska metoder. Om statistiska tester används, bör de selekteras och motiveras innan undersökningen utförs.

2.2 UTVÄRDERING OCH TOLKNING AV RESULTATEN

>Plats för tabell>

Den biologiska relevansen hos registrerade data bör uppmärksammas: d.v.s. parameter såsom variationer mellan olika försöksdjur, dos/respons-förhållanden och cytotoxicitetet bör också beaktas. Statistiska metoder kan användas såsom en hjälp vid utvärderingen av testresultaten. Statistisk signifikans bör dock inte vara den enda faktor som bestämmer om resultatet är positivt.

Även om de flesta experiment kommer att ge tydligt positiva eller negativa resultat, kan uppsättningen av data i sällsynta fall göra det omöjligt att utföra en otvetydig bedömning med avseende på testsubstansens aktivitet. Resultatet kan förbli tvetydigt eller tveksamt, oavsett hur många gånger som experimentet upprepas.

Ett positivt resultat från UDS-testet på leverceller från däggdjur in vivo indikerar att testsubstansen inducerar DNA-skador i leverceller från däggdjur in vivo, vilka kan repareras av reparartionssyntes in vitro. Ett negativt resultat indikerar att testsubstansen, under försöksbetingelserna, inte inducerar skador på DNA som är detekterbara med hjälp av detta test.

Sannolikheten för att testsubstansen eller dess metaboliter skall nå ut i det stora kretsloppet eller specifikt till målvävnaden (t.ex. systemisk toxicitet) bör diskuteras.

3. RAPPORTERING

TESTRAPPORT

Testrapporten måste innehålla följande information:

Lösningsmedel/vehikel:

- motivering för valet av vehikel

- testsubstansens stabilitet och löslighet i lösningsmedel/vehikeln, om detta är känt

Försöksdjur:

- art/stam som används

- försöksdjurens antal, ålder och kön

- ursprung, förhållanden vid förvaring, diet, etc.

- individuell vikt hos försöksdjuren vid försökets början, inklusive kroppsviktsintervallet, medelvärde och standardavvikelse för varje grupp

Försöksbetingelser:

- positiva och negativa kontroller (vehikel/lösningsmedel)

- data från en undersökning av spännvidden, om en sådan har utförts

- grund för valet av dosnivå

- uppgifter om beredningen av testsubstansen

- uppgifter om administreringen av testsubstansen

- grund för det sätt administreringen sker på

- metoder för att verifiera att testsubstansen nådde det stora kretsloppet eller målvävnaden, om detta är tillämpbart

- omvandling från koncentration av testsubstansen i diet/dricksvatten (ppm) till den verkliga dosen (mg/kg kroppsvikt/dag), om detta är tillämpbart

- uppgifter om fodrets och vattnets kvalitet

- detaljerad beskrivning av behandlings- och provtagningsscheman

- metoder för mätning av toxicitet

- metod för beredning och odling av leverceller

- den autoradiografiska teknik som använts

- antalet utstryksglas som preparerats och antalet celler som påvisats

- kriterier för utvärdering

- kriterier för att bedöma om undersökningarna är positiva, negativa eller tvetydiga

Resultat:

- individuella utstryksglas, försöksdjurs- och gruppmedelvärden för antalet korn i kärnan, cytoplasmiska korn, och nettoantalet korn i kärnan (NNG)

- dos/respons-förhållande, om detta är tillgängligt

- statistisk utvärdering, om en sådan utförts

- tecken på toxicitet

- samtidiga negativa (lösningsmedel/vehikel) och positiva kontrolldata

- historiska negativa och positiva kontrolldata (lösningsmedel/vehikel) med intervall, medelvärden och standardavvikelser

- antalet 'celler under reparation', om detta har fastställts

- antalet celler i S-fas, om detta har bestämts

- cellernas viabilitet

Diskussion av resultaten.

Slutsatser.

4. REFERENSER

(1) Ashby, J., Lefevre, P. A., Burlison, B. and Penman, M. G. (1985). An Assessment of the In Vivo Rat Hepatocyte DNA Repair Assay. Mutation Res., 156, s. 1-18.

(2) Butterworth, B. E., Ashby, J., Bermudez, E., Casciano, D., Mirsalis, J., Probst, G. and Williams, G. (1987). A Protocol and Guide for the In Vivo Rat Hepatocyte DNA-Repair Assay. Mutation Res., 189, s. 123-133.

(3) Kennelly, J. C., Waters, R., Ashby, J., Lefevre, P. A., Burlison, B., Benford, D. J., Dean, S. W. and Mitchell, I. de G. (1993). In Vivo Rat Liver UDS Assay, in Kirkland D. J. and Fox M., (eds) Supplementary Mutagenicity Tests: UKEM Recommended Procedures. UKEMS Subcommitee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report Part II revised. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney s. 52-77.

(4) Madle, S., Dean, S. W., Andrae, U., Brambilla, G., Burlinson, B., Doolittle, D. J., Furihata, C., Herner, T., McQueen, C. A. and Mori, H. (1993). Recommendations for the Performance of UDS Tests In Vitro and In Vivo. Mutation Res., 312, s. 263-285.

(5) Fautz, R., Hussain, B., Efstathiou, E. and Hechenberger-Freudl, C. (1993). Assesment of the Relation Between the Initial Viability and the Attachment of Freshly Isoladet Rat Hepatocytes Used for the In Vivo/In Vitro DNA Repair Assay (UDS). Mutation Res., 291, s. 21-27.

(6) Mirsalis, J. C., Tyson, C. K. and Butterworth, B. E. (1982). Detection of Genotoxic Carcinogens in the In Vivo/In Vitro Hepatocyte DNA Repair Assay. Environ. Mutagen, 4, s. 553-562."

BILAGA 5

SV:

3.2.3 Farligt

R65 Farligt: kan ge lungskador vid förtäring.

Flytande ämnen och beredningar som på grund av sin låga viskositet utgör en fara för människa vid aspiration.

a) För ämnen och beredningar som innehåller alifatiska, alicykliska och aromatiska kolväten i en total koncentration av 10 % eller mer och

- har en flödestid mindre än 30 sekunder, uppmätt med en 3 mm utloppsbägare enligt ISO 2431, eller

- har en kinematisk viskositet lägre än 7 × 10-6 m2/s vid 40 °C, uppmätt med en kalibrerad kapillärviskosimeter av glas, enligt ISO 3104 och ISO 3105, eller

- har en kinematisk viskositet lägre än 7 × 10-6 m2/s vid 40 °C, bestämd från rotationsviskosimetri enligt ISO 3219.

Ämnen och beredningar, som uppfyller dessa kriterier, behöver dock inte klassificeras om de har en genomsnittlig ytspänning högre än 33 mN/m vid 25 °C, uppmätt med du Noüytensiometer eller enligt de testmetoder som finns beskrivna i bilaga V del A.5.

b) För ämnen och beredningar, baserat på praktiska erfarenheter från människa.

(Berör inte den ES versionen)

(Berör inte den DA versionen)

(Berör inte den DE versionen)

(Berör inte den EL versionen)

(Berör inte den EN versionen)

(Berör inte den FR versionen)

(Berör inte den IT versionen)

(Berör inte den NL versionen)

(Berör inte den PT versionen)

(Berör inte den FI versionen)

FI:

3.2.6.1 Ihon tulehtuminen

Seuraava vaaraa osoittava lauseka määräytyy alla esiteltävien perusteitten mukaan:

R38 Ärsyttää ihoa

- Aineet ja valmisteet aiheuttavat ihon merkittävän tulehtumisen enintään neljän tunnin altistuksessa määritettynä kanilla liitteessä V mainitulla ihoärsytstestillä. Tulehdus kestää vähintään 24 tuntia.

Ihon tulehdus on merkittävää, jos:

a) punoituksen ja ruvenmuodostuksen tai turvotuksen voimakkuutta kuvaavien lukuarvojen keskiarvo laskettuna kaikista koe-eläimistä on vähintään 2;

b) tai kun liitteessä V tarkoitettua testiä on täydennetty käyttämällä kolmea koe-eläintä, vähintään kahden koe-eläimen ihon punoituksen ja ruvenmuodostuksen tai turvotuksen voimakkuutta kuvaavien lukuarvojen keskiarvo on, jokaiselle koe-eläimelle laskettuna erikseen, vähintään 2.

Kummassakin tapauksessa keskiarvojen lasekmiseen on käytettävä kaikkia niitä lukuarvoja, jotka saadaan arvioitaessa vaikutusta 24 tunnin, 48 tunnin ja 72 tunnin välein.

Tulehdusta pidetään myös merkittävänä, jos ihon tulehtuminen jatkuu ainakin kahdella koe-eläimellä havainnointiajan päättymiseen asti. Erityiset vaikutukset kuten esimerkiksi hyperplasia, hilseileminen, värin muutokset, halkeamat, ruvet ja karvojenlähtö on otettava huomioon.

Tähän liittyviä tietoja voidaan saada myös eläimillä tehtävistä ei-akuuttisista altistuskokeista (katso lauseketta R48 koskevat huomautukset jaksossa 2.d). Vaikutuksia pidetään merkittävinä, jos ne vastaavat edellä kuvattuja vaikutuksia.

- Aineet ja valmisteet, jotka aiheuttavat ihmisillä merkittävää ihotulehdusta, kun kosketus on ollut välitön, jatkuva tai toistuva.

- Orgaaniset peroksidit, paitsi jos on olemassa näyttöä siitä, että tällaista vaikutusta ei ole.

Tuntoharha ("paresthesia"):

Pyretroiditorjunta-aineen ihokosketuksen aiheuttamaa tuntoharhaa ihmisessä ei pidetä ärsytysvaikutuksena, joka oikeuttaisi luokituksen Xi; R38. S-lauseketta S24 on kuitenkin sovellettava aineisiin, joilla on tällainen vaikutus.

(Berör inte den ES versionen)

(Berör inte den DA versionen)

(Berör inte den DE versionen)

(Berör inte den EL versionen)

(Berör inte den EN versionen)

(Berör inte den FR versionen)

(Berör inte den IT versionen)

(Berör inte den NL versionen)

(Berör inte den PT versionen)

(Berör inte den SV versionen)

In point 6.2 (Skyddsfraser för ämnen och preparat):

DE:

S 28 Bei Berührung mit der Haut sofort mit viel ... abwaschen (vom Hersteller anzugeben)

- Anwendungsbereich:

- sehr giftige, giftige oder ätzende Stoffe und Zubereitungen;

- Verwendung:

- obligatorisch für sehr giftige Stoffe und Zubereitungen;

- empfohlen für sonstige obengenannte Stoffe und Zubereitungen, inbesondere, wenn Wasser nicht die geeignete Spülflüssigkeit ist;

- empfohlen für ätzende Stoffe und Zubereitungen, die an die allgemeine Öffentlichkeit abgegeben werden.

(Berör inte den ES versionen)

(Berör inte den DA versionen)

(Berör inte den EL versionen)

(Berör inte den EN versionen)

(Berör inte den FR versionen)

(Berör inte den IT versionen)

(Berör inte den NL versionen)

(Berör inte den PT versionen)

(Berör inte den FI versionen)

(Berör inte den SV versionen)

FI:

S 29 Ei saa tyhjentää viemäriin

- Soveltamisala:

- erittäin helposti syttyvät tai helposti syttyvät veteen sekoittumattomat nesteet,

- erittäin myrkylliset tai myrkylliset aineet ja valmisteet,

- ympäristölle vaaralliset aineet.

- Käytön perusteet:

- pakollinen yleisessä kulutuksessa todennäkoisesti käytettäville ympäristölle vaarallisille ja tunnuksella N luokitelluille aineille, jollei kyseessä ole aineen tarkoitettu käyttö,

- suositeltava yleisessä kulutuksessa todennäkoisesti käytettäville muille edellä mainituille aineille tai valmisteille, jollei kyseessä ole kemikaalin tarkoitettu käyttö.

(Berör inte den ES versionen)

(Berör inte den DA versionen)

(Berör inte den DE versionen)

(Berör inte den EL versionen)

(Berör inte den EN versionen)

(Berör inte den FR versionen)

(Berör inte den IT versionen)

(Berör inte den NL versionen)

(Berör inte den PT versionen)

(Berör inte den SV versionen)

BILAGA 6

"BILAGA IX

DEL A

Bestämmelser om barnskyddande förslutningar

Som komplement till bestämmelserna i artikel 22.1 i detta direktiv skall behållare, oavsett storlek, som innehåller ämnen som utgör en risk för aspiration (Xn; R65) och som klassificerats och märkts i enlighet med punkt 3.2.3 i bilaga 6 till detta direktiv, med undantag för ämnen som släpps ut på marknaden i form av aerosoler eller i en behållare försedd med en förseglad sprayanordning, vara försedda med barnskyddande förslutningar.

1. Återförslutbara förpackningar

Barnskyddande förslutningar på återförslutbara förpackningar skall uppfylla den internationella standarden ISO 8317 (utgåvan av den 1 juli 1989) om "Förpackning - Barnsäkra förpackningar - Krav och provningsmetoder för återförslutningsbara förpackningar" antagen av Internationella standardiseringsorganisationen (ISO).

2. Icke återförslutbara förpackningar

Barnskyddande förslutningar på icke återförslutbara förpackningar skall uppfylla kraven i CEN-standarden EN 862 (från mars 1997) om "Förpackning - Barnskyddande förpackningar - Krav och provningsmetoder för icke återförslutningsbara förpackningar för andra produkter än läkemedel" antagen av Europeiska standardiseringsorganisationen (CEN).

3. Anmärkningar

1. Intyg om överensstämmelse med ovan nämnda standarder får endast utfärdas av laboratorier som uppfyller kraven i europeisk standard serie EN 45 000.

2. Särskilda fall

Om det framstår som uppenbart att en förpackning är tillräckligt säker för barn eftersom de inte kan komma åt innehållet utan hjälp av verktyg, behöver provet inte genomföras.

I alla andra fall och när det finns goda skäl att betvivla att förslutningen är säker för barn får den nationella myndigheten kräva att den som är ansvarig för att släppa ut produkten på marknaden skall lämna ett intyg från ett sådant laboratorium som beskrivs under 3.1. Av intyget skall framgå, antingen

- att förslutningen är av en sådan typ att den inte behöver provas mot den ISO-standard eller CEN-standard som avses ovan,

eller

- att förslutningen har provats och funnits uppfylla kraven i den standard som avses ovan.

DEL B

Bestämmelser om kännbar varningsmärkning

De tekniska specifikationerna för kännbar varningsmärkning skall uppfylla ISO-standarden 11683 (1997 års utgåva) om kännbar varningsmärkning, "Förpackningar - Kännbar varningssymbol - Fordringar"."