32001R0213

REGULAMENTUL (CE) NR. 213/2001 AL COMISIEI

din 9 ianuarie 2001

de stabilire a normelor de aplicare a Regulamentului (CE) nr. 1255/1999 al Consiliului privind metodele de analiză și evaluare calitativă a laptelui și produselor lactate și de modificare a Regulamentelor (CE) nr. 2771/1999 și (CE) nr. 2799/1999

COMISIA COMUNITĂȚILOR EUROPENE,

având în vedere Tratatul de instituire a Comunității Europene,

având în vedere Regulamentul (CE) nr. 1255/1999 al Consiliului din 17 mai 1999 privind organizarea comună a pieței în sectorul laptelui și produselor lactate (1), în special articolele 10 și 15 și articolul 26 alineatul (3), articolul 29 alineatul (1) și articolul 31 alineatul (14),

întrucât:

ADOPTĂ PREZENTUL REGULAMENT:

CAPITOLUL I

DISPOZIȚII GENERALE

Articolul 1

Obiectul și domeniul de aplicare

Prezentul regulament stabilește normele de aplicare a metodelor de analiză chimică, fizică, microbiologică și de evaluare senzorială a laptelui și produselor lactate care urmează să fie folosite în cadrul aranjamentelor prevăzute în organizarea comună a pieței în sectorul laptelui și produselor lactate instituită prin Regulamentul (CE) nr. 1255/1999. De asemenea, stabilește unele dintre metodele respective.

Articolul 2

Lista metodelor

(1)   Anexa I la prezentul regulament conține lista metodelor de referință aplicabile analizelor menționate la articolul 1.

(2)   Comisia actualizează lista cel puțin o dată pe an în conformitate cu procedura prevăzută la articolul 42 din Regulamentul (CE) nr. 1255/1999.

Articolul 3

Metodele de rutină

Metodele de rutină pot fi folosite pentru analizele necesare în conformitate cu normele comunitare, cu condiția să fie ajustate în mod adecvat și verificate cu regularitate pe baza metodei de referință.

Pentru verificarea rezultatelor obținute prin metodele de rutină care sunt aproape de limitele descrise în regulamentele în cauză se poate aplica procedura descrisă în anexa II.

În cazul unor contestații, rezultatele obținute prin metoda de referință sunt hotărâtoare.

Articolul 4

Validarea metodelor de referință

(1)   Metodele de referință sunt validate în cazul în care îndeplinesc criteriile de precizie prestabilite privind limita de repetabilitate și reproductibilitate.

(2)   În cazul în care o metodă de referință prevăzută în regulamentele în cauză nu a fost validată, statele membre stabilesc o limită orientativă de reproductibilitate.

Limita menționată trebuie obținută conform procedurii descrise în anexa III litera (b). Cu toate acestea, pe parcursul primelor 18 luni de la intrarea în vigoare a prezentului regulament, statele membre pot folosi o procedură echivalentă.

Respectarea limitei este verificată cel puțin o dată pe an.

(3)   În cazul în care rezultatele obținute în urma aplicării metodelor de referință validate sau a metodelor cu cifre orientative privind precizia arată că a fost depășită o limită, rezultatele analitice pot fi evaluate prin metoda descrisă în anexa IV pentru a se determina diferența critică față de limita în cauză.

Articolul 5

Admisibilitatea rezultatelor analizelor

(1)   Analizele se realizează în laboratoare în care există o procedură internă de control al calității conformă cu cea descrisă în anexa V litera (a) sau o procedură cu standard echivalent.

O descriere detaliată a procedurii aplicate trebuie să fie disponibilă pentru consultare în laborator.

(2)   Laboratoarele își stabilesc precizia proprie pentru toate metodele urmând:

Conformarea la limita de reproductibilitate trebuie verificată cel puțin o dată pe an folosindu-se procedura descrisă în anexa III litera (a).

Al doilea paragraf nu se aplică laboratoarelor care au participat la un program de testare a competenței pe parcursul anului.

(3)   Rapoartele de laborator privind rezultatele analizelor trebuie să conțină suficiente informații pentru a se putea realiza o evaluare a rezultatelor în conformitate cu anexa IV și anexa VIII.

(4)   Rezultatele analizei se consideră admisibile în cazul în care au fost obținute în conformitate cu criteriile de admisibilitate descrise în procedura de control intern al calității menționată la alineatul (1) și cu precizia internă menționată la alineatul (2).

Articolul 6

Evaluarea senzorială

(1)   Pentru unt se aplică procedurile descrise în anexa VI pentru verificarea performanței evaluatorilor și a preciziei rezultatelor. Procedura descrisă în anexa VII se aplică ca metodă de referință pentru evaluarea senzorială.

(2)   Pentru lapte și produse lactate altele decât untul, metoda de referință care trebuie folosită de către statele membre pentru evaluarea senzorială este fie standardul FIL 99C/1997, fie alte metode comparabile pe care acestea le notifică Comisiei.

Procedurile descrise în anexa VI pot fi folosite pentru verificarea performanței evaluatorilor și a preciziei rezultatelor.

Articolul 7

Prelevarea de probe și contestarea rezultatelor analizelor

(1)   Pentru analizele obligatorii conform regulilor comunitare se prelevează probe martor.

(2)   Procedura descrisă în anexa VIII se folosește în cazurile în care rezultatele unei analize nu sunt acceptate de către operator.

CAPITOLUL II

METODE DE ANALIZĂ

Articolul 8

Conținutul de apă/substanțe solide negrase/grăsime al untului

(1)   Metoda de analiză descrisă în anexa IX se folosește ca metodă de referință pentru determinarea conținutului de apă al untului.

(2)   Metoda de analiză descrisă în anexa X se folosește ca metodă de referință pentru determinarea conținutului de substanțe solide negrase al untului.

(3)   Metoda de analiză descrisă în anexa XI se folosește ca metodă de referință pentru determinarea conținutului de grăsime al untului.

Articolul 9

Marcatori

(1)   Metoda de analiză descrisă în anexa XII se folosește ca metodă de referință pentru determinarea vanilinei în untul concentrat, unt și smântână.

(2)   Metoda de analiză descrisă în anexa XIII se folosește ca metodă de referință pentru determinarea conținutului de etil ester al acidului beta-apo-8' carotenic în untul concentrat și în unt.

(3)   Metoda de analiză descrisă în anexa XIV se folosește ca metodă de referință pentru determinarea conținutului de sitosterol și stigmasterol în unt și în untul concentrat.

(4)   Untul concentrat, untul și smântâna au fost marcate în conformitate cu normele comunitare relevante în cazul în care rezultatele obținute sunt conforme cu specificațiile din alineatul (8) din anexele menționate la alineatele (1), (2) sau (3).

Articolul 10

Detectarea cazeinei din laptele de vacă

(1)   Metoda de referință pentru analiza descrisă în anexa XV se folosește pentru a se asigura faptul că brânza care trebuie produsă numai din lapte de oaie, din lapte de capră sau din lapte de bivoliță sau dintr-un amestec de lapte de oaie, capră și bivoliță nu conține de fapt cazeină din lapte de vacă.

Se consideră că este prezentă cazeina din lapte de vacă în cazurile în care conținutul evident de cazeină din lapte de vacă al probei care trebuie analizată este egal cu sau mai mare decât conținutul probei de referință conținând 1 % lapte de vacă în conformitate cu anexa XV.

(2)   Metodele de rutină pentru detectarea cazeinei din laptele de vacă în brânzeturi în conformitate cu alineatul (1) pot fi folosite cu condiția:

În cazul în care cerințele prevăzute la litera (b) nu sunt îndeplinite, orice probă pentru care se obțin rezultate pozitive trebuie analizată prin metoda de referință.

În cazul în care cerințele prevăzute la litera (c) nu sunt îndeplinite pentru unul dintre tipurile de brânză menționate la alineatul (1), brânza respectivă trebuie analizată prin metoda de referință.

Articolul 11

Detectarea bacteriilor coliforme

(1)   Metoda de referință pentru analiză descrisă în anexa XVI se folosește pentru detectarea prezenței bacteriilor coliforme în unt, lapte praf degresat, cazeină și cazeinați.

(2)   Se pot folosi metodele de rutină pentru detectarea bacteriilor coliforme cu condiția ca rezultatele obținute să fie comparabile cu cele obținute prin metoda de referință descrisă în anexa menționată anterior. Este foarte important ca metodele de referință să aibă o limită de detecție adecvată. Nu trebuie să apară rezultate fals negative. În cazul în care nu se poate elimina apariția rezultatelor fals pozitive, orice rezultat pozitiv trebuie confirmat prin metoda de referință.

Articolul 12

Conținutul de lactoză

Metoda de determinare a conținutului de lactoză al produselor care intră sub incidența codului CN 2309 este descrisă în anexa XVII.

Articolul 13

Detectarea zerului închegat

(1)   Metoda de detectare a zerului închegat în laptele praf degresat destinat depozitării publice este descrisă în anexa XVIII.

(2)   Metoda de detectare a zerului închegat în laptele praf degresat și în amestecurile destinate utilizării ca furaje pentru animale este descrisă în anexa XIX.

Articolul 14

Detectarea zarei

Metoda de detectare a zarei în laptele praf degresat este descrisă în anexa XX.

Articolul 15

Reziduuri antimicrobiotice

Metoda de detectare a reziduurilor de antibiotice și sulfamide/dapson în laptele praf degresat este descrisă în anexa XXI.

Articolul 16

Conținutul de lapte praf degresat

Metoda de determinare a conținutului de lapte praf degresat din furajele combinate este descrisă în anexa XXII.

Articolul 17

Detectarea amidonului

Metoda de detectare a amidonului în laptele praf degresat, în laptele praf denaturat și în furajele combinate este descrisă în anexa XXIII.

Articolul 18

Conținutul umed al zarei praf acide

Metoda de determinare a conținutului umed al zarei praf acide destinate utilizării în furaje este descrisă în anexa XXIV.

Articolul 19

Detectarea grăsimilor străine

Metoda de detectare a grăsimilor străine din grăsimile din lapte este descrisă în anexa XXV.

CAPITOLUL III

DISPOZIȚII FINALE

Articolul 20

Modificări ale Regulamentului (CE) nr. 2771/1999

Regulamentul (CE) nr. 2771/1999 se modifică după cum urmează:

Articolul 21

Modificări ale Regulamentului (CE) nr. 2799/1999

Regulamentul (CE) nr. 2799/1999 se modifică după cum urmează:

Articolul 22

Abrogări

Regulamentele (CEE) nr. 1216/68, (CEE) nr. 3942/92, (CE) nr. 86/94, (CE) 2721/95, (CE) nr. 1854/96, (CE) nr. 1080/96, (CE) nr. 1081/96, (CE) nr. 1082/96, (CE) nr. 880/98 și (CE) nr. 1495/98 se abrogă.

Trimiterile la regulamentele abrogate se interpretează ca trimiteri la prezentul regulament.

Articolul 23

Intrarea în vigoare

Prezentul regulament intră în vigoare în a șaptea zi de la data publicării în Jurnalul Oficial al Comunităților Europene.

Cu toate acestea, metodele descrise în anexele III, IV.4, V, VI și VII se aplică timp de 18 luni de la data intrării în vigoare a prezentului regulament.

(1)  JO L 160, 26.6.1999, p. 48.

(2)  JO L 333, 24.12.1999, p. 11.

(3)  JO L 340, 31.12.1999, p. 3.

(4)  JO L 350, 20.12.1997, p. 3.

(5)  JO L 76, 25.3.2000, p. 9.

(6)  JO L 298, 12.11.1985, p. 9.

(7)  JO L 11, 16.1.1999, p. 14.

(8)  JO L 45, 21.2.1990, p. 8.

(9)  JO L 16, 21.1.1990, p. 19.

(10)  JO L 279, 11.10.1990, p. 22.

(11)  JO L 325, 17.12.1999, p. 10.

(12)  JO L 256, 7.9.1987, p. 1.

(13)  JO L 28, 3.2.2000, p. 16.

ANEXA I

(Articolul 2)

LISTA METODELOR DE REFERINȚĂ

Index:

Min. = minimum, Max = maximum, Anexă = anexa la regulamentul menționat anterior, SNF = substanțe solide negrase, FFA = acizi grași liberi, PV = valoarea peroxidului, A = aspect, F = miros, C = consistență, TBC = număr total de bacterii, Therm = număr de bacterii termofile, MS = stat membru, FIL = Federația Internațională a Lactatelor, ISO = Organizația Internațională de Standardizare, IUPAC = Uniunea Internațională de Chimie Pură și Aplicată, ADPI = Institutul American pentru Produse Lactate, SCM = lapte condensat îndulcit, EMC = lapte sau smântână evaporate, MSNF = substanțe solide negrase conținute în lapte.

PARTEA A

PARTEA B

Metodele de referință enumerate în partea B pot fi folosite pentru analiza produselor din domeniul reglementat de oricare dintre regulamentele enumerate în coloana 1.

ANEXA II

(Articolul 3)

VERIFICAREA REZULTATELOR OBȚINUTE PRIN METODE DE RUTINĂ CARE SUNT APROAPE DE LIMITELE SPECIFICATE ÎN REGULAMENTELE PRIVIND CERINȚELE DE COMPOZIȚIE ȘI CALITATE

În cazul în care m0 este limita pentru cerințele de compoziție și calitate specificate în unul dintre regulamente, limita de decizie (L) este

dacă RRout/RRef ≤ 1

RRout: Limita de reproductibilitate a metodei de rutină

RRef: Limita de reproductibilitate a metodei de referință

În cazul în care m0 este o limită superioară iar RRout/RRef > 1, această limită de decizie se obține cu ajutorul formulei

Dacă, în aceleași condiții, m0 este o limită inferioară, limita de decizie se obține cu ajutorul formulei

unde CrD95 este diferența critică a metodei de referință (a se vedea anexa IV).

În cazul în care m0 este o limită superioară, rezultatele finale care se situează deasupra limitei de decizie obținute printr-o metodă de rutină se înlocuiesc cu un rezultat final obținut prin metoda de referință. Acest rezultat final trebuie să se bazeze pe cel puțin același număr de analize/probe ca și rezultatul final obținut prin metoda de rutină.

În cazul în care m0 este o limită inferioară, se urmează aceeași procedură pentru rezultatele finale care se situează sub limita de decizie obținută prin metoda de rutină.

Notă

Procedura descrisă mai sus poate fi urmată în cazul în care nu există efecte matriciale detectabile.

Efectele matriciale pot fi detectate în modul următor: pentru fiecare probă folosită pentru calibrare se determină diferența (wi) dintre rezultatele obținute prin metodele de referință și de rutină.

Valoarea deviației standard calculată cu ajutorul formulei

m: Numărul probelor folosite pentru calibrare

se compară cu media aritmetică a deviației standard a repetabilității metodelor de referință și de rutină

Efectul matricial nu poate fi exclus dacă

unde

f= m (f: numărul de grade de libertate)

α= probabilitatea de eroare; α = 0,05.

În acest caz, sunt necesare investigații ulterioare înainte de a se putea stabili o limită de decizie.

ANEXA III

(Articolele 4 și 5)

(a)   Procedura de determinare a respectării unei limite de reproductibilitate stabilite (Analiză chimică)

Respectarea limitei de reproductibilitate se verifică prin compararea rezultatele de laborator cu rezultatele obținute într-un laborator cu experiență (1), utilizându-se o probă identică. În ambele laboratoare se realizează o dublă determinare, iar rezultatele se evaluează cu ajutorul formulei:

unde:

În cazul în care diferența critică este depășită, se realizează un alt experiment în decursul următoarelor două luni. În cazul în care rezultatele celui de-al doilea experiment nu sunt conforme cu limita de reproductibilitate, autoritățile competente iau măsurile necesare.

(b)   Procedura pentru obținerea unei limite orientative de reproductibilitate (Analiză chimică)

Limita orientativă de reproductibilitate (Rprov) se obține cu ajutorul următoarei ecuații:

unde:

Observații:

Limita de reproductibilitate (valoarea lui R) se obține din valoarea calculată a RSD

după cum urmează

: media aritmetică a rezultatelor obținute)

Câteva valori calculate ale RSDR (exemple)

Cu o concentrație a analitului de 1 g/100 g se obține:

.

(1)  Laboratorul cu experiență este în general unul care a participat cu succes fie la validarea metodei de testare, fie la un test de competență.

(2)  Ecuația Horwitz:

unde:

Referințe:

Peele, J.T., Horwitz, W. și Albert, R.J.Ass. Off. Anal. Chem.72(5), 784-806 (1989).

ANEXA IV

(Articolul 4)

EVALUAREA REZULTATELOR ANALITICE OBȚINUTE PRIN METODE VALIDATE

În cazul în care rezultatul analitic arată că a fost depășită o limită, se calculează media aritmetică a două sau mai multe rezultate. Se utilizează procedura următoare:

2.

Se determină valoarea absolută a diferenței dintre media aritmetică a rezultatelor obținute în condiții de repetabilitate și se determină limita. O valoare absolută a diferenței mai mare decât diferența critică denotă faptul că proba supusă analizei nu îndeplinește condițiile. Diferența critică se determină cu ajutorul următoarei formule: unde: : media aritmetică a rezultatelor obținute m0: limita n: numărul de analize/probe În cazul în care gradul de precizie variază cu nivelul, este necesară determinarea lui r și R prin interpolare. În mod normal, un rezultat final raportat pentru o probă trebuie să arate că a fost respectată o limită. Rezultatele finale — cuprinse în intervalulși, în cazul în care limita este maximă; — cuprinse în intervalulși, în cazul în care limita este minimă vor apărea deci numai în mod excepțional. Rezultatele finale cuprinse în intervalele menționate se acceptă numai în cazul în care se întâlnesc nu mai mult de o dată la fiecare cinci probe supuse analizei per lot. În cazul în care se analizează mai puțin de cinci probe per lot, un rezultat din intervalul menționat este acceptabil. Cu toate acestea, în cazul în care loturile sunt oferite în mod repetat de către un producător, se respectă regula potrivit căreia din cinci probe analizate se obține numai un rezultat cuprins în intervalul menționat.

3.

În cazul în care rezultatul final x se calculează utilizând o formulă de forma x = y1 ± y2 (de exemplu: apă + conținutul de grăsimi solide nealimentare din unt pentru a calcula conținutul de grăsime) unde y1 și y2 sunt rezultatele finale ale unui singur tip de analiză, atunci limitele finale de repetabilitate și de reproductibilitate rx și Rx pentru rezultatele finale x se calculează ca: unde r1 și r2 sunt limitele de repetabilitate, iar R1 și R2 limitele de reproductibilitate ale y1 și respectiv y2. x se compară cu limita m0 urmând regulile menționate la 1 și 2. Diferența critică se determină folosind formula: unde x este media aritmetică a rezultatelor x1 obținute.

4.

În cazul în care rezultatul final se calculează pe baza unei formule de forma (de exemplu: grăsimea din conținutul de materie uscată al brânzei) unde y1 și y2 sunt rezultatele finale ale unui singur tip de analiză, atunci limitele totale de repetabilitate și de reproductibilitate rx și Rx se pot calcula ca: μ1: valoare limită sau țintă pentru y1 (exemplu: grăsime) μ2: valoare limită sau țintă pentru y2 (exemplu: materie uscată) unde r1: limita de repetabilitate, y1 r2: limita de repetabilitate, y2 unde R1: limita de reproductibilitate, y1 R2: limita de reproductibilitate, y2 Procedurile pentru calculul lui rx și Rx pot fi aplicate numai în cazul în care limitele relative de repetabilitate și de reproductibilitate (r*1; r*2; R*1; R*2) sunt mai mici sau egale cu 0,15. x se compară cu limita μx urmând regulile enunțate la 1 și 2. Diferența critică se determină utilizând formula: unde este media aritmetică a rezultatelor x obținute în ordine cronologică (1).

(1)  

Notă: În cazul în care, de exemplu, se obțin rezultatele y11, y12, y21 și y22, trebuie calculată media aritmetică a lui y11/y21 și y12/y22.

ANEXA V

CONTROLUL INTERN

(Articolul 5)

(a)   Procedura de control intern al calității (IQC) (analiză chimică)

Definiția materialului de control

Materialul folosit în scopul IQC este supus aceleiași, sau unei părți a aceleiași, proceduri ca și materialele analizate.

Materialul de control poate fi:

Procedura de stabilire a IQC

Laboratorul introduce IQC urmând procedura descrisă în documentul IUPAC „Harmonized Guidelines for Internal Quality Control in analytical laboratories” (Orientări armonizate pentru controlul intern al calității în laboratoarele analitice) (1).

IQC presupune includerea materialelor de control în ciclul de analiză sau repetarea analizei probei analizate. Materialele de control trebuie să aibă o compoziție chimică similară cu cea a probelor și să aibă o stabilitate corespunzătoare pe parcursul perioadei respective. Trebuie să se demonstreze că ele pot fi împărțite în mod corespunzător în cantități identice spre a fi analizate, și au o concentrație a analitului adecvată intervalului în cauză.

Materialul de control este introdus cel puțin o dată în fiecare ciclu analitic iar valoarea obținută se reprezintă pe un grafic de control în vederea măsurării erorilor pe termen lung. În plus, laboratorul trebuie să demonstreze periodic respectarea condițiilor de repetabilitate în cadrul ciclului. Acest lucru se poate realiza prin analize ale probei martor și/sau a materialelor de analiză în duplicat. Rezultatele acestor analize se compară cu orice limite de repetabilitate publicate și cu orice date existente despre precizia internă.

În cazul în care se folosesc materiale de control, valorile obținute pentru analiza dintre cicluri a materialelor de control se reprezintă pe un grafic Shewhart [ISO 8258 (1991)] cu limite de control adecvate. Limitele de acțiune se stabilesc la

Deviație standard totală:

în care:

În cazul în care nu se folosesc materiale de control (de exemplu, din cauza lipsei de stabilitate), cel puțin unul dintre materialele testate se analizează în duplicat în fiecare ciclu.

Diferența absolută obținută din analizele în duplicat dintr-un ciclu (a se vedea anexa III) se reprezintă grafic. Linia de bază este 1,128 sw, limita inferioară este 0, limita superioară (limita de acțiune) este 3,3686 sw, unde sw este deviația standard în interiorul ciclului.

Procedura de control include materiale de nivel înalt și scăzut când gama de concentrațiilor este mare.

În cazul în care materialele de analiză acoperă o gamă largă de concentrații ale analitului, laboratorul stabilește relația dintre precizie și nivel. În cazul în care precizia este proporțională cu nivelul, controlul ulterior se bazează pe precizie relativă (respectiv diferența absolută ca procent din valoarea medie).

Apariția unei situații care nu poate fi controlată în sistemul de analiză este semnalată în următoarele cazuri:

Laboratorul acționează în cazul unei situații care nu poate fi controlată, prin:

(b)   Procedură pentru selectarea materialului intern de control și determinarea limitelor interne de precizie (analiză chimică)

Date privind precizia laboratorului pot fi obținute prin repetarea analizei materialelor de control și/sau prin repetarea analizei probelor.

Laboratoarele folosesc următoarea procedură pentru a stabili parametri de precizie pentru variația dintre cicluri și în interiorul ciclului pentru uz ulterior în întocmirea graficelor de control. Laboratoarele pot adopta proceduri alternative cu condiția să poată demonstra în mod adecvat că datele rezultate sunt de o precizie corespunzătoare.

1.   Selecția materialelor de control

Dacă este cazul ca laboratorul să folosească material de control, se colectează mai întâi datele necesare pentru a se stabili limite. În cazul în care este posibil, se folosesc materiale de referință certificate (MRC). Materialele de control propuse se analizează în condiții de repetabilitate în cadrul unui ciclu incluzând MRC potrivite, cu repetarea analizelor și cu randomizare. În cazul în care această abordare nu este posibilă, laboratoarele caută să susțină teste de competență și să stabilească mijloace asupra cărora s-a ajuns la un consens (cu valori stabilite) care pot fi considerate un adevărat mijloc convențional căruia îi poate fi atribuită o nesiguranță adecvată. Alte proceduri includ atribuirea valorii reale prin formularea sau utilizarea materialelor de control dopate.

În plus, în cazul în care laboratorul desfășoară în mod regulat astfel de analize și a instituit deja controlul statistic, orice material nou de control (de exemplu, solicitat din cauza epuizării stocurilor) se obține în raport cu analizele în desfășurare pentru care se folosesc materialele existente.

2.   Atribuirea limitelor

După selectarea materialului de control, laboratorul îl folosește pentru a stabili cifrele de precizie dintre cicluri și în interiorul ciclului.

Ca cerință minimă pentru stabilirea preciziei în interiorul ciclului, analiza materialului de control se realizează în duplicat de 12 ori. Analiza în duplicat se efectuează în condiții de repetabilitate, respectiv de către același operator, cu aceiași reactivi etc. Analiza materialului de control în duplicat se randomizează în cadrul unui ciclu de analiză. Fiecare analiză în duplicat se realizează în zile diferite dintr-o perioadă de timp pentru a se stabili variația rezonabilă de la un ciclu la altul, luând în considerare variațiile normale, de exemplu reactivii, recalibrarea instrumentelor și, după caz, operatorii diferiți.

Notă: Utilizarea datelor care nu sunt total reprezentative pentru variația dintre cicluri pot duce la repetarea inutilă a analizei din cauza limitelor foarte stricte care au fost stabilite. Dimpotrivă, este de așteptat ca un laborator în care datele de precizie care sunt prea imprecise să nu poată face față limitelor prevăzute în metodele de referință, performanța sa fiind slabă în comparație cu cea a laboratoarelor de același tip, iar datele rezultate nefiind adecvate scopului căruia îi sunt destinate.

2.1.   Determinarea preciziei în interiorul ciclului

2.1.1.   Precizia în interiorul ciclului în cazul în care este disponibil un material de control

Datele în duplicat (minim 12 duplicate) trebuie mai întâi supuse la testului Cochran pentru gradul maxim de libertate. Aceasta implică compararea pătratului seriei maxime de duplicate cu suma pătratelor seriilor.

unde

Valoarea criteriului lui Cochran, C, este comparată cu valorile tabelare [ISO 5725 (1994)]. În cazul în care o valoare poate fi clasificată ca fiind o valoare minimă sau maximă excepțională, rezultatul trebuie investigat pentru a se găsi o explicație, de exemplu, o eroare tehnică, o greșeală de calcul, o scăpare în realizarea testului, analiza unei alte probe. În cazul în care explicația erorii tehnice dovedește că înlocuirea rezultatului suspect este imposibilă, acesta este înlăturat, fiind considerat o valoare maximă excepțională reală. În cazul în care rămân cazuri neexplicate, de valori minime sau maxime excepționale, valorile minime excepționale sunt reținute ca fiind corecte, iar valorile statistice maxime excepționale sunt înlăturate. Laboratorul trebuie să încerce să obțină valori care să le înlocuiască pe acestea.

De îndată ce laboratorul s-a asigurat că datele nu cuprind valori maxime excepționale, deviația standard în interiorul ciclului sw se obține după cum urmează:

pentru fiecare pereche xi1, xi2 a datelor duplicat p, suma duplicatelor,

și diferența duplicatelor,

sunt calculate și însumate ca

Evaluarea deviației standard în interiorul ciclului este

Limita de precizie internă este 2.8. sw.

În cazul în care se utilizează o metodă de referință, limita de precizie internă se compară cu limita de repetabilitate publicată. Laboratorul trebuie să îndeplinească cerința metodei de referință. Neconformarea la această cerință trebuie investigată.

Limitele stabilite sunt considerate provizorii și sunt revizuite.

2.1.2.   Precizia în interiorul ciclului în cazul în care nu este disponibil un material de control

Laboratorul poate alege să stabilească precizia în interiorul ciclului prin analize ale probelor reprezentative în duplicat (minim 12 analize în duplicat). În cazurile în care utilizarea de materiale de control este imposibilă, de exemplu din cauza instabilității, se folosește această metodă pentru acumularea de date în duplicat.

Notă: Se presupune că analizele acoperă o gamă relativ restrânsă de valori și deci se va aplica o singură valoare tuturor probelor. În cazul unei game mai largi de rezultate, de exemplu deasupra unui ordin de mărime, iar precizia depinde de nivel, laboratoarele trebuie să studieze utilizarea deviațiilor standard relative.

Datele trebuie supuse testului Cochran, ca la 2.1.1. Imediat ce laboratorul se asigură că datele nu conțin valori maxime excepționale, se pot obține deviația standard și limita de precizie internă în interiorul ciclului ca la punctul 2.1.1.

Deviația standard în interiorul ciclului sw poate fi folosită pentru a realizarea de grafice de control (a se vedea anexa II). Limitele stabilite sunt considerate provizorii și sunt revizuite.

2.2.   Determinarea preciziei între cicluri

Valoarea medie (s1/2) se calculează pentru fiecare pereche și se supune la testul Grubbs [ISO 5725 (1994)]. Criteriile de respingere/acceptare a valorilor excepționale maxime și minime sunt descrise la 2.1.1. Laboratorul trebuie să încerce să obțină o valoare de înlocuire pentru orice rezultat care a fost înlăturat. După ce laboratorul se asigură că datele nu conțin valori excepționale minime și maxime, se calculează deviația standard în interiorul ciclului sb.

sau 0 în cazul în care expresia de sub semnul radical este negativă.

Deviația standard totală st se folosește pentru realizarea de grafice de control pentru media de n determinări (a se vedea anexa II). Limitele stabilite sunt considerate provizorii și sunt revizuite.

3.   Revizuirea limitelor inițiale

Limitelor de control stabilite după cum s-a arătat mai sus sunt considerate estimări inițiale.

Pentru actualizarea limitele stabilite pe baza preciziei acceptabile în interiorul ciclului (punctul 2.1.2), se colectează date suplimentare în duplicat asupra probelor. Intervalul de timp dinaintea revizuirii depinde de frecvența analizelor. Ca orientare, datele se revizuiesc după obținerea a alte 10 duplicate. Apoi toate datele se supun testului Cochran, iar limitele se restabilesc pe baza noii valori a deviației standard. În baza noilor date se iau decizii asupra validității limitelor de control.

Și revizuirea datelor inițiale obținute pentru precizia dintre cicluri depinde de frecvența analizelor. Ca orientare, după obținerea prin analiza materialului de control a zece puncte de date, la o frecvență de o analiză per lot, presupunerile inițiale privind deviația standard și medie se revizuiesc.

Tuturor datelor li se aplică testul Grubbs pentru valorile maxime excepționale. Deviația medie și standard se recalculează pe baza noilor date.

În plus, în această fază, laboratorul trebuie să folosească un grafic Cusum [BS S700: (1984) și amendamentul 5480 (1987)] pentru a investiga orice probleme care pot apărea, de exemplu îmbătrânirea reactivilor. Orice rezultat individual care nu se încadrează în limitele Cusum „V-mask” trebuie investigat.

Noile limite (deviația medie și standard) trebuie supuse controalelor periodice utilizându-se tehnica Cusum. Orice indiciu că validitatea materialului de control este nesigură se investighează temeinic.

4.   Raportarea datelor cu precizie

Laboratoarele trimit autorității naționale competente următoarele informații:

(1)  M. Thompson și R. Wood: „Pure and Applied Chemistry” (Chimie pură și aplicată) 67 (4), 649-666 (1995).

ANEXA VI

(Articolul 6)

EVALUAREA EVALUATORILOR ȘI FIABILITATEA REZULTATELOR ÎN ANALIZELE SENZORIALE

În cazul în care se folosesc metode de punctare se aplică următoarele proceduri (Standardul FIL 99C/1997).

(a)   Determinarea „indicelui de repetabilitate”

Cel puțin 10 probe sunt analizate de un evaluator ca duplicat probă martor într-o perioadă de 12 luni. Această procedură se realizează de obicei în câteva ședințe. Rezultatele pentru caracteristicile produsului individual sunt evaluate utilizându-se formula:

unde:

w1: indice de repetabilitate

xi1: punctajul pentru prima evaluare a probei xi

xi2: punctajul pentru a doua evaluare a probei xi

n: numărul de probe

Probele care urmează a fi evaluate trebuie să reflecte o gamă largă de calitate. w1 nu trebuie să depășească 1,5 (pe o scară de 5 puncte).

(b)   Determinarea „indicelui de deviație”

Acest indice trebuie utilizat pentru a se verifica în cazul în care un evaluator utilizează aceeași scală pentru evaluarea calitativă ca și un grup de evaluatori experimentați. Punctajul obținut de evaluator este comparat cu media punctajelor obținute de grupul de evaluatori.

Pentru evaluarea rezultatelor se folosește următoarea formulă:

unde:

xi1; xi2: a se vedea punctul (a)

;

: punctajul mediu al grupului de evaluatori pentru prima respectiv a doua evaluare a probei x

n: numărul de probe (cel puțin zece per 12 luni).

Probele care urmează a fi evaluate trebuie să reflecte o gamă largă de calitate. D1 nu trebuie să depășească 1,5 (pe scale de 5 puncte).

Statele membre notifică orice dificultăți întâmpinate în aplicarea prezentei proceduri.

(c)   Compararea rezultatelor obținute în regiuni diferite ale statelor membre și în diferite state membre

După caz, se organizează un test cel puțin o dată pe an pentru a compara rezultatele obținute de evaluatorii din diferite regiuni. În cazul în care se constată diferențe semnificative, se iau măsurile necesare pentru a se identifica motivele și pentru a se obține rezultate comparabile.

Statele membre pot organiza teste pentru a compara rezultatele obținute de evaluatorii lor cu cele obținute de cei ai statelor membre învecinate. Diferențele semnificative duc la investigații detaliate în scopul de a se obține rezultate comparabile.

Statele membre notifică Comisiei rezultatele acestor comparații.

ANEXA VII

(Articolul 6)

EVALUAREA SENZORIALĂ A UNTULUI

1.   Domeniul de aplicare

Scopul acestei proceduri de evaluare senzorială a untului este de a furniza o metodă uniformă aplicabilă în toate statele membre.

2.   Definiții

3.   Cameră de testare

4.   Selecția evaluatorilor

Evaluatorii trebuie să fie familiarizați cu produsele din unt și să aibă competența necesară pentru a realiza o gradare a sensibilității senzoriale. Competența evaluatorului este evaluată de către autoritatea competentă în mod regulat (cel puțin o dată pe an).

5.   Cerințe pentru panel

Numărul evaluatorilor din panel trebuie să fie impar, numărul minim fiind de trei. Majoritatea acestora trebuie să fie angajați ai autorității competente sau persoane autorizate care nu sunt angajate în industria de prelucrare a laptelui.

Înainte de evaluare trebuie avuți în vedere mai mulți factori pentru obținerea unor performanțe optime ale subiecților:

6.   Evaluarea valorii fiecărei caracteristici

6.1.   Evaluarea senzorială se realizează pentru următoarele caracteristici: aspect, consistență și aromă.

Aspectul implică următoarele caracteristici: culoare, puritate vizibilă, creștere a fungilor ciupercilor și dispersia apei. Dispersia apei se testează în conformitate cu standardul FIL 112A/1989.

Consistența implică următoarele caracteristici: fermitate și tartinabilitate.

Pentru evaluarea consistenței untului se pot aplica metode fizice. Comisia preconizează viitoarea armonizare a acestor măsuri.

Aroma implică următoarele caracteristici: gustul și mirosul.

O deviație semnificativă față de temperatura recomandată împiedică evaluarea sigură a consistenței și aromei. Temperatura este extrem de importantă.

6.2.   Fiecare caracteristică trebuie să facă obiectul unei evaluări senzoriale separate. Punctarea se realizează în conformitate cu tabelul 1.

6.3.   Uneori este adecvat ca evaluatorii să puncteze împreună, înainte de evaluare, una sau mai multe probe de referință în privința aspectului, consistenței și aromei, pentru a se obține uniformitate.

6.4.   Punctajul de acceptare este următorul:

În cazurile în care nu se obține punctajul necesar trebuie să se facă o descriere a defectului. Punctajul acordat de fiecare evaluator pentru fiecare caracteristică trebuie înregistrat în documentul de control. Produsul este acceptat sau respins pe baza deciziei majorității. Nu trebuie să se înregistreze în mod frecvent cazuri în care diferențele dintre punctajele individuale acordate pentru fiecare caracteristică să fie mai mari de un punct (nu mai frecvent de un caz la 20 de probe). În caz contrar competența panelului trebuie verificată de conducătorul panelului.

7.   Supraveghere

Conducătorul panelului, care trebuie să fie angajat oficial al autorității competente și care poate fi membru al panelului trebuie să răspundă în general pentru întreaga procedură. El trebuie să înregistreze punctajele individuale pentru fiecare caracteristică în documentul de control și să certifice în cazul în care produsul este acceptat sau respins.

8.   Prelevarea și prepararea probei

9.   Nomenclator

Consultați tabelul 2 anexat.

Tabelul 1:   Punctajul pentru unt

Tabelul 2:   Tabelul defectelor untului

I.   Aspect

II.   Consistență

III.   Miros și aromă

(1)  Tabelul 2

(2)  Defectele menționate la „bun” reprezintă numai deviații foarte mici de la tipul ideal.

(3)  Această desemnare trebuie folosită cât mai rar posibil și numai atunci când defectul nu poate fi descris mai exact.

ANEXA VIII

(Articolul 7)

PROCEDURA APLICABILĂ CÂND REZULTATELE UNEI ANALIZE SUNT CONTESTATE (analiză chimică)

1.   La cererea operatorului se poate realiza o analiză suplimentară în termen de șapte zile lucrătoare de la notificarea rezultatelor primei analize, cu condiția să fie disponibile probe martor sigilate din produs care să fi fost depozitate corespunzător de autoritatea competentă.

Autoritatea competentă trimite aceste probe unui al doilea laborator, la cererea și pe cheltuiala operatorului. Acest laborator trebuie să fie autorizat în vederea efectuării de analize oficiale și trebuie să aibă competențe dovedite în realizarea analizelor în cauză. Această competență trebuie documentată printr-o participare încununată de succes în studii de colaborare, teste de eficiență sau comparații între laboratoare. Al doilea laborator trebuie să folosească metoda de referință. Rezultatele obținute de cele două laboratoare se compară după cum urmează:

(a)   În cazul în care ambele laboratoare îndeplinesc cerința de repetabilitate și cerința de reproductibilitate

Media aritmetică a rezultatelor testelor obținute de ambele laboratoare este raportată ca rezultat final. Acest rezultat final este evaluat luându-se în considerare diferența critică, cu ajutorul următoarei formule:

unde

Notă: În cazul în care rezultatul final se calculează cu formula

sau

[a se vedea anexa IV punctul 3 și respectiv 4], R2 x și r2 x se inserează în formulă în loc de R2 și r2.

(b)   În cazul în care ambele laboratoare îndeplinesc cerința de repetabilitate dar nu și cerința de reproductibilitate

În cazul în care a doua analiză o confirmă pe prima, cantitatea analizată este respinsă ca neconformă. În caz contrar, cantitatea este acceptată.

(c)   În cazul în care numai un laborator îndeplinește condiția de repetabilitate

Pentru a se stabili în cazul în care cantitatea analizată este acceptată sau nu se folosește rezultatul final al laboratorului care îndeplinește cerința de repetabilitate.

(d)   În cazul în care nici unul dintre laboratoare nu îndeplinește cerința de repetabilitate, dar este îndeplinită cerința de reproductibilitate.

(a) se aplică.

(e)   În cazul în care nici unul dintre laboratoare nu îndeplinește nici cerința de repetabilitate, nici cerința de reproductibilitate

Cantitatea analizată este acceptată în cazul în care rezultatele obținute de unul dintre laboratoare conduc la această concluzie.

(f)   În cazul în care rezultatele au fost obținute prin folosirea de metode nevalidate

Cantitatea analizată este acceptată în cazul în care rezultatele obținute de unul dintre laboratoare conduc la această concluzie.

3.   Rezultatele celei de-a doua analize trebuie notificate de către autoritatea competentă operatorului cât mai curând posibil. Costurile celei de-a doua analize sunt suportate de operator în cazul în care cantitatea analizată este respinsă.

4.   În cazul în care operatorul poate dovedi, în termen de cinci zile lucrătoare de la prelevarea probei, că procedura de prelevare a probelor nu a fost realizată corect, prelevarea probelor trebuie efectuată din nou în cazul în care este posibil. În cazul în care prelevarea probelor nu poate fi repetată, cantitatea analizată trebuie acceptată.

ANEXA IX

(Articolul 8)

DETERMINAREA CONȚINUTULUI DE APĂ DIN UNT

1.   Obiectul și domeniul de aplicare

Această metodă de referință precizează o metodă de determinare a conținutului de apă din unt.

2.   Referința

Standardul FIL 50 C: 1995 – Lapte și produse lactate – Metode de prelevare a probelor

3.   Definiție

Conținutul de apă din unt: pierderea de masă după încheierea procesului de încălzire specificat în acest standard. Se exprim în grame per 100 de grame.

4.   Principiu

Evaporarea apei din cantitatea analizată în prezența unei pietre ponce la o temperatură de 102 °C într-un cuptor de uscare.

5.   Aparatură și materiale

Aparate obișnuite de laborator, în special:

6.   Prelevarea probelor

A se vedea FIL 50 C: 1995

7.   Procedură

7.1.   Prepararea probei

Se încălzește proba de laborator într-un recipient închis de sticlă sau dintr-un plastic adecvat, care trebuie să fie umplut de la jumătate până la două treimi, la o temperatură la care proba este suficient de moale pentru a facilita amestecarea ei temeinică până la o stare omogenă (cu ajutorul unui agitator mecanic sau manual). În mod normal temperatura de amestecare nu trebuie să depășească 35 °C. Proba se răcește până la temperatura ambiantă. Cât mai curând posibil după răcire, se deschide recipientul care conține proba și se amestecă rapid (nu mai mult de 10 secunde) cu un dispozitiv adecvat, de exemplu, o lingură sau o spatulă, înainte de cântărire.

7.2.   Determinarea conținutului de apă

În cazul în care masa crește, se folosește pentru calcule cea mai mică masă înregistrată.

8.   Exprimarea rezultatelor

8.1.   Metoda și formula de calcul

Conținutul de apă, W, se calculează ca procent de masă folosindu-se următoarea formulă:

unde

Rezultatul se raportează cu o singură zecimală.

8.2.   Repetabilitate

Diferența absolută dintre rezultatele a două determinări separate, realizate simultan sau în succesiune rapidă de către același operator, în aceleași condiții și cu material de analiză identic nu trebuie să depășească 0,2 %.

8.3.   Reproductibilitate

Diferența absolută dintre două rezultate separate și independente, obținute de doi operatori care lucrează în laboratoare diferite cu același material de analiză nu trebuie să depășească 0,3 %.

9.   Raportul de analiză

În raportul de analiză se precizează metoda folosită și rezultatele obținute. De asemenea, se menționează toate detaliile de funcționare care nu sunt specificate în acest standard internațional sau sunt considerate opționale, alături de detalii asupra oricăror incidente care ar fi putut influența rezultatele. Raportul de analiză include toate informațiile necesare pentru identificarea completă a probei.

ANEXA X

(Articolul 8)

UNT: DETERMINAREA CONȚINUTULUI DE SUBSTANȚE SOLIDE NEGRASE

1.   Obiectul și domeniul de aplicare

Acest standard descrie o metodă de determinare a conținutului de substanțe solide negrase din unt.

2.   Referințe

Standardul FIL 50 C: 1995 – Lapte și produse lactate – Metode de prelevare a probelor

3.   Definiții

Conținut de solide negrase al untului: procentul de masă al substanțelor determinat prin procedura specificată. Se exprimă în grame per 100 grame.

4.   Principiu

Evaporarea apei dintr-o cantitate cunoscută de unt, extragerea grăsimilor cu eter de petrol și cântărirea reziduului.

5.   Reactiv

Eter de petrol cu temperatura de fierbere în intervalul 30-60 °C. Reactivul nu trebuie să formeze mai mult de 1 g de reziduu după evaporarea a 100 ml.

6.   Aparatură și materiale

7.   Prelevarea probelor

A se vedea standardul FIL 50 C: 1995.

8.   Procedură

8.1.   Prepararea probei:

Se încălzește proba de laborator într-un recipient închis de sticlă sau dintr-un plastic adecvat, care trebuie să fie umplut de la jumătate până la două treimi, la o temperatură la care proba este suficient de moale pentru a facilita amestecarea ei temeinică până la o stare omogenă (cu ajutorul unui agitator mecanic sau manual). În mod normal, temperatura de amestecare nu trebuie să depășească 35 °C. Proba se răcește până la temperatura ambiantă. Cât mai curând posibil după răcire, se deschide recipientul care conține proba și se amestecă rapid (nu mai mult de 10 secunde) cu un dispozitiv adecvat, de exemplu o lingură sau o spatulă, înainte de cântărire.

8.2.   Determinarea

8.2.1.   Vasul, agitatorul (6.4) și creuzetul (6.5) se usucă în cuptor (6.3) timp de o oră. Aceste obiecte se lasă se răcească în desicator și se cântăresc împreună (respectiv vasul, agitatorul și creuzetul) până la cel mai apropiat 1 mg (m0).

Note:

8.2.2.   Se îndepărtează creuzetul, se înregistrează greutatea vasului și a agitatorului împreună, cu o precizie de 1 gm (m1).

8.2.3.   Se cântărește în vas, cu o precizie de 1 mg, o cantitate analizată de aproximativ 5 g din probă (8.1) (m2).

8.2.4.   Se pune vasul (conținând agitatorul și untul) în cuptor la 102 + 2 °C și se lasă peste noapte.

8.2.5.   Se lasă vasul (8.2.3.) să se răcească la temperatura camerei.

8.2.6.   Se adaugă 15 ml de eter de petrol cald (aproximativ 25 °C) în vas și se desprinde cât mai mult posibil din sedimentul lipit de vas cu ajutorul agitatorului. Solventul se transferă în creuzet și se lasă să se filtreze în balonul de aspirație.

8.2.7.   Se efectuează operația 8.2.6 de încă patru ori. În cazul în care nu există urme de grăsime pe suprafața vasului, se transferă cantitativ în timpul celei de-a patra spălări cât mai mult sediment posibil în creuzet. În caz contrar, se repetă operația 8.2.6 până la eliminarea completă a tuturor urmelor de grăsime.

8.2.8.   Sedimentul din creuzet se spală cu 25 ml de eter de petrol cald.

8.2.9.   Vasul, agitatorul și creuzetul se usucă împreună în cuptor la 102 + 2 °C timp de 30 minute.

8.2.10.   Se lasă să se răcească în desicator până la temperatura camerei și se cântăresc cu o precizie de 1 mg.

8.2.11.   Operațiile 8.2.9 și 8.2.10 se repetă până se obține o masă comună constantă (modificările masei nu depășesc 1 mg) a vasului, agitatorului și creuzetului (m3).

9.   Exprimarea rezultatelor

9.1.   Calcularea conținutului de substanțe solide negrase

Conținutul de substanțe solide negrase SNF, se calculează ca procent de masă folosindu-se următoarea formulă:

unde

Rezultatul se raportează cu o singură zecimală.

9.2.   Repetabilitate

Diferența absolută dintre rezultatele a două determinări separate, realizate simultan sau în succesiune rapidă de către același operator, în aceleași condiții și cu material de analiză identic nu trebuie să depășească 0,1 %.

9.3.   Reproductibilitate

Diferența absolută dintre două rezultate separate și independente, obținute de doi operatori care lucrează în laboratoare diferite cu același material de analiză nu trebuie să depășească 0,2 %.

10.   Raportul de analiză

În raportul de analiză se precizează metoda folosită și rezultatele obținute. De asemenea, se menționează toate detaliile de funcționare care nu sunt specificate în acest standard internațional sau sunt considerate opționale, alături de detalii asupra oricăror incidente care ar fi putut influența rezultatele. Raportul de analiză include toate informațiile necesare pentru identificarea completă a probei.

Notă:

În cazul în care se analizează unt sărat, sarea adăugată se determină ca substanță solidă negrasă. Pentru determinarea conținutului de substanțe solide negrase conținute în lapte, conținutul de sare adăugată se scade din conținutul de substanțe solide negrase. Cifrele calculate privind precizia determinării conținutului de substanțe solide negrase conținute în lapte sunt:

Se poate concluziona că aceste cifre privind precizia obținute pentru determinarea substanțelor solide negrase sunt valabile pentru determinarea conținutului de substanțe solide negrase conținute în lapte.

ANEXA XI

(Articolul 8)

DETERMINAREA CONȚINUTULUI DE GRĂSIMI AL UNTULUI

unde

Cifrele calculate privind precizia determinării conținutului de grăsimi sunt:

ANEXA XII

(Articolul 9)

DETERMINAREA CONȚINUTULUI DE VANILINĂ ÎN UNTUL CONCENTRAT, UNT ȘI SMÂNTÂNĂ PRIN CROMATOGRAFIE LICHIDĂ DE ÎNALTĂ PERFORMANȚĂ

1.   Obiectul și domeniul de aplicare

Metoda implică o procedură de determinare cantitativă a vanilinei din untul concentrat, unt și smântână.

2.   Principiu

Extragerea unei cantități cunoscute din probă cu autorul unui amestec de izopropanol/etanol/acetonitril (1:1:2). Precipitarea majorității grăsimii prin răcire între –15 °C și –20 °C, urmată de centrifugare.

După diluarea cu apă, determinarea conținutului de vanilină prin cromatografie lichidă de înaltă performanță (HPLC).

3.   Aparatura

Aparatură obișnuită de laborator și, în special, următoarele:

4.   Reactivi

Toți reactivii utilizați trebuie să fie de calitate analitică recunoscută.

5.   Procedură

5.1.   Prepararea probei

5.1.1.   Unt

Se încălzește proba până când începe să se topească. Se evită supraîncălzirea unor porțiuni din probă la peste 40 °C. Când proba devine suficient de maleabilă se omogenizează prin scuturare. Se cântăresc, cu o precizie de 1 mg, aproximativ 5 g de unt într-un balon cotat de 100 ml.

5.1.2.   Unt concentrat

Imediat după prelevarea probei, recipientul conținând un concentrat se introduce în cuptor la 40-50 °C până când se topește complet. Proba se amestecă prin turbionare sau agitare, evitându-se formarea de bule de aer din cauza amestecării prea puternice. Se cântăresc cu o precizie de 1 mg aproximativ 4 g de unt concentrat într-un balon cotat de 100 ml.

5.1.3.   Smântână

Proba se încălzește în baie de apă sau într-un incubator la o temperatură de 35-40 °C. Grăsimea se distribuie omogen prin turbionare și, după caz, prin amestecare. Proba se răcește rapid la 20 ± 2 °C. Proba trebuie să aibă un aspect omogen; în caz contrar procedura trebuie repetată. Se cântăresc, cu o precizie de 1 mg, aproximativ 10 g de smântână într-un balon cotat de 100 ml.

5.2.   Prepararea soluției de analiză

Se adaugă aproximativ 75 ml de soluție de extragere (4.4) la proba prelevată (5.1.1, 5.1.2 sau 5.1.3), se agită sau se scutură cu putere timp de aproximativ 15 minute și se completează cu soluție de extragere (4.4). Se transferă aproximativ 10 ml din acest extract într-o eprubetă prevăzută cu dop. Eprubeta se introduce în refrigerator (3.1) timp de aproximativ 30 minute. Extractul rece se centrifughează timp de 5 minute la aproximativ 2 000 rpm și se decantează imediat. Soluția decantată se lasă să se răcească la temperatura camerei. Se pipetează 5 ml din soluția decantată într-un balon cotat de 100 ml și se completează cu apă. Se filtrează o parte alicotă printr-o membrană microfiltrantă (3.3). Filtratul este gata pentru determinarea HPLC.

5.3.   Calibrare

Se pipetează 5 ml de soluție standard de vanilină (4.5.2) într-un balon cotat de 100 ml. Se adaugă 5 ml de soluție de extragere (4.4) și se completează cu apă până la marcaj. Această soluție conține 0,5 μg/ml de vanilină.

5.4.   Determinarea HPLC

Se lasă sistemul cromatografic să se stabilizeze timp de aproximativ 30 minute. Se injectează soluția standard (5.3). Procedura se repetă până când diferența dintre suprafețele vârfurilor sau dintre înălțimile vârfurilor a două injectări succesive este sub 2 %. În condițiile descrise timpul de retenție al vanilinei este de aproximativ 9 minute. Soluția standard (5.3) se analizează în duplicat prin injectarea a 20 μl. Se injectează 20 μl din soluția de analiză (5.2). Se determină suprafața sau înălțimea vârfului obținut pentru vanilină. Se repetă injectarea soluției standard (5.3) în duplicat, modificându-se 10 injectări ale probei (5.2).

6.   Calcularea rezultatelor

Se calculează suprafața (sau înălțimea) medie a vârfurilor (AC) pentru vârfurile vanilinei asociate injectării duplicatelor la începutul și la sfârșitul fiecărui lot de soluție de analiză (în total patru suprafețe sau înălțimi).

Se calculează coeficientul de răspuns (R):

unde CM este masa vanilinei în mg (4.5.1).

Conținutul (mg/kg) de vanilină (C) din probă se calculează cu ajutorul formulei:

unde:

La analiza vanilinei din smântână concentrația marcatorului se exprimă ca mg marcator/kg grăsime din lapte. Pentru aceasta se înmulțește C cu 100/f. f este conținutul de grăsime al smântânii în procente (m/m).

Notă: În locul suprafeței vârfului se poate folosi înălțimea vârfului (a se vedea 8.3)

7.   Precizia metodei

7.1.   Repetabilitate (r)

Diferența dintre rezultatele a două determinări realizate în cel mai scurt interval de timp posibil de către un operator care utilizează aceleași instrumente și un material de analiză identic nu trebuie să fie mai mare de 16 mg/kg.

7.2.   Reproductibilitate (R)

Diferența dintre rezultatele a două determinări realizate în cel mai scurt interval de timp posibil de operatori din laboratoare diferite, care utilizează instrumente diferite și un material de analiză identic nu trebuie să fie mai mare de 27 mg/kg.

8.   Limitele de toleranță

8.1.   Trebuie să se preleveze trei probe din produsul urmărit pentru a se verifica omogenitatea.

Marcator obținut fie din vanilie, fie din vanilină sintetică:

8.2.1.   Rata de încorporare pentru 4-hidroxi-3-metoxibenzaldehidă est de 250 g pe tonă de unt concentrat sau de unt. Pentru smântâna marcată, rata de încorporare este de 250 g pe tonă de grăsime din lapte.

8.2.2.   Rezultatele pentru cele trei probe obținute în urma analizei produsului se folosesc pentru verificarea ratei și omogenității de încorporare a marcatorului, iar cel mai slab rezultat se compară cu următoarele limite [avându-se în vedere o diferență critică pentru un nivel de probabilitate de 95 % (DCr95)]:

Concentrația marcatorului din proba cu rezultatul cel mai slab este utilizată prin interpolare între 221,0 mg/kg și 159,0 mg/kg.

Marcator obținut numai din păstăi de vanilie sau extracte integrale ale acesteia:

8.3.1.   Rata de încorporare pentru 4-hidroxi-3-metoxibenzaldehidă est de 100 g pe tonă de unt concentrat sau de unt. Pentru smântâna marcată, rata de încorporare este de 100 g pe tonă de grăsime din lapte.

8.3.2.   Rezultatele pentru cele trei probe obținute în urma analizei produsului se folosesc pentru verificarea ratei și omogenității de încorporare a marcatorului, iar cel mai slab rezultat se compară cu următoarele limite [avându-se în vedere o diferență critică pentru un nivel de probabilitate de 95 % (DCr95)]:

Concentrația marcatorului din proba cu rezultatul cel mai slab este utilizată prin interpolare între 79,0 mg/kg și 54,0 mg/kg

9.   Note

9.1.   Repetabilitatea r este valoarea sub care se consideră că există o probabilitate specifică de producere a diferenței unei absolute dintre două rezultate de analiză distincte obținute prin aceeași metodă cu material de analiză identic, în aceleași condiții (aceleași instrumente, același laborator și într-un interval de timp scurt); în absența altor indicații, probabilitatea este de 95 %.

9.2.   Reproductibilitatea R este valoarea sub care se consideră că există o probabilitate specifică de producere a unei diferenței absolute dintre două rezultate de analiză distincte obținute prin aceeași metodă cu material de analiză identic, în condiții diferite (operatori diferiți, instrumente diferite și/sau momente diferite); în absența altor indicații, probabilitatea este de 95 %.

9.3.   Recuperarea vanilinei adăugate la un nivel de 250 mg/kg ulei de unt variază de la 97,0 la 103,8. Conținutul mediu identificat a fost de 99,9 %, cu o deviație standard de 2,7 %.

9.4.   Soluția standard conține 5 % soluție de extragere pentru a compensa creșterea suprafeței vârfului provocată de prezența a 5 % soluție de extragere în probă. Astfel se poate opera o clasificare în funcție de înălțimea vârfului.

9.5.   Analiza se bazează pe o curbă liniară de etalonare, cu intersecție cu punctul zero.

Folosindu-se soluții diluate adecvate de soluție standard (4.5.2) se verifică liniaritatea în momentul realizării primei analize, iar apoi la intervale regulate și după modificări sau reparații la echipamentul HPLC.

ANEXA XIII

(Articolul 9)

DETECTAREA PRIN SPECTROMETRIE A ETIL ESTERULUI ACIDULUI BETA-APO-8'-CAROTENIC ÎN UNTUL CONCENTRAT ȘI ÎN UNT

1.   Obiectul și domeniul de aplicare

Această metodă descrie o procedură de determinare cantitativă a etil esterului acidului beta-apo-8'-carotenic (ester apo-carotenic) în untul concentrat și în unt. Esterul apo-carotenic este suma tuturor substanțelor prezente într-un extract din probe prelevate în condițiile prevăzute pentru această metodă, care absorb lumină la 440 nm.

2.   Principiu

Grăsimea din unt se dizolvă în eter de petrol și se măsoară absorbanța la 440 nm. Conținutul de ester apo-carotenic se determină prin raportare la un standard extern.

3.   Aparatură

4.   Reactivi

Toți reactivii trebuie să aibă o puritate analitică cunoscută.

5.   Procedură

5.1.   Prepararea probei de analiză

5.1.1.   Unt concentrat

Proba se topește în cuptor la aproximativ 45 °C.

5.1.2.   Unt

Proba se topește în cuptor la aproximativ 45 °C și se filtrează o parte reprezentativă printr-un filtru care conține aproximativ 10 g de sulfat de sodiu anhidru (4.3) într-un mediu protejat de lumina naturală sau artificială puternică și se păstrează la 45 °C. Se colectează o cantitate adecvată de grăsime din unt.

5.2.   Determinare

Se cântărește, cu o precizie de 1 mg, aproximativ 1 g de unt concentrat, [sau grăsime extrasă din unt (5.1.2)], (mg). Se transferă cantitativ într-un balon cotat de 20 ml (Vml), folosindu-se ligroină (4.2), se completează până la marcaj și se amestecă bine.

Se transferă o parte alicotă într-o celulă de 1 cm și se măsoară absorbanța la 440 nm, față de o probă martor de ligroină. Concentrația de ester apo-carotenic în soluție se determină conform curbei de etalonare (C μg/ml).

5.3.   Curba de etalonare

Se pipetează 0, 0,25, 0,5, 0,75 și 1,0 ml de soluție standard de ester apo-carotenic (4.1.2) în cinci baloane cotate de 100 ml. Se diluează la volum cu ligroină (4.2) și se amestecă.

Concentrațiile aproximative ale soluției variază între 0 și 2 μg/ml și se calculează cu precizie prin referire la concentrația soluției standard (4.1.2) (W.P)/100 mg/ml. Se măsoară absorbanța la 440 nm față de o probă martor de ligroină (4.2).

Valorile absorbanței se reprezintă pe axa y, iar pe axa x se reprezintă concentrația esterului apo-carotenic.

6.   Calcularea rezultatelor

7.   Precizia metodei

7.1.   Repetabilitate

7.1.1.   Analiza untului

Diferența dintre rezultatele a două determinări realizate în cel mai scurt interval de timp posibil de către un operator care utilizează aceleași instrumente și un material de analiză identic nu trebuie să fie mai mare de 1,4 mg/kg.

7.1.2.   Analiza untului concentrat

Diferența dintre rezultatele a două determinări realizate în cel mai scurt interval de timp posibil de către un operator care utilizează aceleași instrumente și un material de analiză identic nu trebuie să fie mai mare de 1,6 mg/kg.

7.2.   Reproductibilitate

7.2.1.   Analiza untului

Diferența dintre rezultatele a două determinări realizate de operatori din laboratoare diferite, care utilizează instrumente diferite și un material de analiză identic nu trebuie să fie mai mare de 4,7 mg/kg.

7.2.2.   Analiza untului concentrat

Diferența dintre rezultatele a două determinări realizate de operatori din laboratoare diferite, care utilizează instrumente diferite și un material de analiză identic nu trebuie să fie mai mare de 5,3 mg/kg.

7.3.   Sursa datelor de precizie

Datele de precizie au fost determinate printr-un experiment realizat în 1995, în cadrul căruia au participat 11 laboratoare și s-au folosit 12 probe urmărite (șase duplicate probă martor) pentru unt și 12 probe urmărite (șase duplicate probă martor) pentru unt concentrat.

8.   Limitele de toleranță

8.1.   Trebuie să se preleveze trei probe din produsul urmărit pentru a se verifica omogenitatea.

8.2.   Unt

8.2.1.   Rata de încorporare pentru unt, având în vedere absorbanța de fond, este de 22 mg/kg.

8.2.2.   Rezultatele pentru cele trei probe obținute în urma analizei produsului se folosesc pentru verificarea ratei și omogenității de încorporare a marcatorilor, iar cel mai slab rezultat se compară cu următoarele limite [avându-se în vedere o diferență critică pentru un nivel de probabilitate de 95 % (DCr95)]:

Concentrația marcatorilor din proba cu rezultatul cel mai slab este utilizată prin interpolare între 18,0 mg/kg și 13,0 mg/kg

8.3.   Unt concentrat

8.3.1.   Rata de încorporare pentru untul concentrat, având în vedere absorbanța de fond, este de 24 mg/kg

8.3.2.   Rezultatele pentru cele trei probe obținute în urma analizei produsului se folosesc pentru verificarea ratei și omogenității de încorporare a marcatorilor, iar cel mai slab rezultat se compară cu următoarele limite [avându-se în vedere o diferență critică pentru un nivel de probabilitate de 95 % (DCr95)]:

Concentrația marcatorilor din proba cu rezultatul cel mai slab este utilizată prin interpolare între 20,0 mg/kg și 14,0 mg/kg.

ANEXA XIV

(Articolul 9)

DETERMINAREA SITOSTEROLULUI SAU STIGMASTEROLULUI DIN UNT ȘI UNT CONCENTRAT PRIN CROMATOGRAFIA ÎN FAZĂ DE GAZ CU COLOANĂ CAPILARĂ

1.   OBIECTUL ȘI DOMENIUL DE APLICARE

Metoda implică o procedură care permite determinarea cantitativă a sitosterolului și a stigmasterolului din unt și din untul concentrat. Conținutul de sitosterol reprezintă suma cantităților de β-sitosterol și de 22-dihidro-β-sitosterol, ceilalți sitosteroli fiind considerați nesemnificativi.

2.   PRINCIPIU

Untul sau untul concentrat este saponificat cu hidroxid de potasiu într-o soluție de etanol, iar substanțele nesaponificabile sunt extrase cu ajutorul dietil eterului.

Sterolii se transformă în trimetil-silil-eteri și sunt analizați prin cromatografie în fază de gaz cu coloană capilară prin raportare la un etalon intern/betulina.

3.   APARATURA

4.   REACTIVI

Toți reactivii utilizați trebuie să fie de calitate analitică recunoscută. Apa utilizată trebuie să fie apă distilată sau apă de o puritate cel puțin echivalentă.

4.1.   Etanol, cu o puritate de cel puțin 95 %.

4.2.   Hidroxid de potasiu, soluție 60 %, prin dizolvarea a 600 g de hidroxid de potasiu (minimum 85 %) în apă, la care se adaugă apă până la 1 l.

Betulină cu o puritate de cel puțin 99 %.

Soluții de betulină în eter dietilic (4.4).

4.4.   Eter dietilic de puritate analitică (fără peroxizi sau reziduuri).

4.5.   Sulfat de sodiu anhidru, granulat, deshidratat în prealabil la 102 °C timp de 2 ore.

4.6.   Reactiv de sililare, de exemplu, TRI-SIL (poate fi procurat de la Pierce Chemical Co., Categoria nr. 49001) sau un reactiv echivalent. (Atenție: TRI-SIL este inflamabil și toxic, coroziv și are un posibil potențial cancerigen. Personalul de laborator trebuie să cunoască normele de siguranță aplicabile în cazul utilizării TRI-SIL și trebuie să ia toate măsurile de precauție care se impun).

4.7.   Lanosterol

Sitosterol, cu puritate cunoscută, mai mare sau egală cu 90 % (P).

Nota 1: Puritatea materialelor etalon utilizate pentru calibrare trebuie determinată prin metoda de normalizare. Se presupune că toți sterolii din probă sunt reprezentați în cromatogramă, că suprafața totală a vârfurilor reprezintă 100 % din compușii sterolilor și că sterolii dau aceeași reacție la detector. Liniaritatea sistemului trebuie validată pentru nivelurile de concentrație luate în calcul.

4.8.1.   Soluție etalon de sitosterol: se prepară o soluție cu o precizie de 0,001 mg/ml, conținând aproximativ 0,5 mg/ml (W1) de sitosterol (4.8) în eter dietilic (4.4).

Stigmasterol, cu puritate cunoscută, mai mare sau egală cu 90 % (P).

4.9.1.   Soluție etalon de stigmasterol: se prepară o soluție cu o precizie de 0,001 mg/ml, conținând aproximativ 0,2 mg/ml (W1) de stigmasterol (4.9) în eter dietilic (4.4).

4.10.   Amestec pentru testul de rezoluție. Se prepară o soluție conținând 0,05 mg/ml de lanosterol (4.7) și 0,5 mg/ml de sitosterol (4.8) în eter dietilic (4.4).

5.   METODĂ

Prepararea soluțiilor etalon pentru cromatografie. Se adaugă soluția etalon intern (4.3.1) la soluția etalon de sterol adecvată și, simultan, la proba saponificată (a se vedea 5.2.2).

5.1.1.   Soluția cromatografică etalon de sitosterol: se transferă 1 ml de soluție etalon de sitosterol (4.8.1) în fiecare din cele două eprubete de reacție (3.7) și se elimină dietil eterul sub flux de azot. Se adaugă 1 ml de soluție etalon intern (4.3.1.1) și se elimină dietil eterul sub flux de azot.

5.1.2.   Soluția cromatografică etalon de stigmasterol: se transferă 1 ml de soluție etalon de stigmasterol (4.9.1) în fiecare din cele două eprubete de reacție (3.7) și se elimină dietil eterul sub flux de azot. Se adaugă 1 ml de soluție etalon intern (4.3.1.2) și se elimină dietil eterul sub flux de azot.

5.2.   Prepararea substanțelor nesaponificabile

5.2.1.   Se topește proba de unt la o temperatură de maximum 35 °C; se amestecă cu grijă.

Se cântărește, cu o precizie de 1 mg, aproximativ 1 g de unt (W2) sau de unt concentrat (W2) într-un balon de 150 ml (3.1). Se adaugă 50 ml de etanol (4.1) și 10 ml de soluție de hidroxid de potasiu (4.2). Se adaptează refrigeratorul cu reflux și se aduce la aproximativ 75 °C timp de 30 de minute. Se deconectează refrigeratorul și se lasă balonul să se răcească la temperatura camerei.

5.2.2.   Se adaugă 1,0 ml de soluție etalon intern în balon (4.3.1.1) în cazul în care se determină sitosterolul sau (4.3.1.2) în cazul în care se determină stigmasterolul. Se amestecă bine. Se transferă cantitativ conținutul balonului într-o conductă de decantare de 500 ml (3.2), se spală balonul cu 50 ml de apă, apoi cu 250 ml de eter dietilic (4.4). Se agită puternic conducta de decantare timp de 2 minute și se lasă fazele să se separe. Se elimină faza apoasă inferioară și se spală faza eterică agitându-se 4 părți alicote succesive de 100 ml apă.

Nota 2: Pentru a evita formarea unei emulsii, este neapărat necesar ca primele două spălări cu apă să se efectueze ușor (10 rotații). Pentru a treia spălare, se poate agita mai puternic timp de 30 de secunde. În cazul în care se formează o emulsie, aceasta poate fi eliminată prin adăugarea a 5 până la 10 ml de etanol. În cazul în care se adaugă etanol, este absolut necesar să se efectueze încă două spălări puternice cu apă.

5.2.3.   Se trece faza eterică limpede și desaponificată pe o coloană de sticlă (3.5) care conține 30 g de sulfat de sodiu anhidru (4.5). Se colectează eterul într-un balon de 250 ml (3.3). Se adaugă bile antiproiecție și se evaporă până la uscare aproape completă într-o baie de apă sau într-o izotermă, colectându-se solvenții care trebuie eliminați.

Nota 3: În cazul în care anumite părți din probă se evaporă în uscat la o temperatură prea ridicată, este posibil să se piardă cantități de sterol.

5.3.   Prepararea trimetil-silil-eterilor.

5.3.1.   Se transferă soluția de eter rămasă în balon într-o eprubetă de reacție de 2 ml (3.7) cu ajutorul a 2 ml de dietil eter și se elimină eterul sub flux de azot. Se spală balonul cu două părți alicote suplimentare de 2 ml de eter dietilic, transferându-se conținutul în eprubetă și eliminându-se eterul de fiecare dată sub flux de azot.

5.3.2.   Se sililează proba prin adăugarea a 1 ml de TRI-SIL (4.6). Se astupă eprubeta și se agită puternic pentru a produce dizolvarea. În cazul în care proba nu s-a dizolvat complet, se aduce la temperatura de 65-70 °C. Se lasă să stea cel puțin 5 minute înainte de a se injecta în cromatograful cu gaz. Se sililează etaloanele în același mod ca și probele. Se sililează amestecul pentru testul de rezoluție (4.10) în același mod ca și probele.

Nota 4: Sililarea trebuie efectuată într-un mediu anhidru. Sililarea incompletă a betulinei se recunoaște prin obținerea unui al doilea vârf apropiat de cel al betulinei.

Prezența etanolului în timpul sililării va interfera cu procesul de sililare. Acest fapt poate fi consecința unei spălări insuficiente în momentul extragerii. În cazul în care această problemă persistă, în etapa de extragere se va include o a cincea spălare, cu agitare puternică timp de 30 de secunde.

5.4.   Analiza prin cromatografie cu gaz

5.4.1.   Alegerea condițiilor pentru procedură

Se instalează cromatograful cu gaz conform instrucțiunilor producătorului.

Condițiile indicate pentru procedură sunt următoarele:

Nota 5: Curățarea regulată a camerei de vaporizare este deosebit de importantă.

Se lasă sistemul să se echilibreze și se obține un răspuns suficient de stabil înainte de a se efectua vreo analiză.

Aceste condiții pot fi modificate în funcție de caracteristicile coloanei și ale cromatografului cu gaz, pentru a se obține cromatograme care să îndeplinească condițiile următoare:

5.4.2.   Protocolul de analiză

6.   CALCULAREA REZULTATELOR

6.1.   Se determină suprafața vârfurilor sterolului și a vârfurilor betulinei în cele două etaloane, la începutul și la finalul fiecărei serii, și se calculează R1:

Se determină suprafața vârfului de sterol (stigmasterol sau sitosterol) și a vârfului betulinei în probă și se calculează R2:

7.   PRECIZIA METODEI

7.1.   Unt

7.1.1.   Repetabilitate

7.1.1.1.   Stigmasterol

Diferența dintre rezultatele a două determinări efectuate în cel mai scurt interval de timp posibil de un operator care utilizează aceeași aparatură pe material de analiză identic nu trebuie să depășească 19,3 mg/kg.

7.1.1.2.   Sitosterol

Diferența dintre rezultatele a două determinări efectuate în cel mai scurt interval de timp posibil de un operator care utilizează aceeași aparatură pe material de analiză identic nu trebuie să depășească 23,0mg/kg.

7.1.2.   Reproductibilitate

7.1.2.1.   Stigmasterol

Diferența dintre rezultatele a două determinări efectuate de operatori din laboratoare diferite care utilizează aparatură diferită pe material de analiză identic nu trebuie să depășească 31,9 mg/kg.

7.1.2.2.   Sitosterol

Diferența dintre rezultatele a două determinări efectuate de operatori din laboratoare diferite care utilizează aparatură diferită pe material de analiză identic nu trebuie să depășească 8,7 % din valoarea medie a acestor determinări.

7.1.3.   Sursa datelor de precizie

Datele de precizie au fost determinate printr-un experiment realizat în 1992 în care au fost implicate opt laboratoare și șase probe (trei duplicate probă martor) pentru stigmasterol și șase probe (trei duplicate probă martor) pentru sitosterol.

7.2.   Unt concentrat

7.2.1.   Repetabilitate

7.2.1.1.   Stigmasterol

Diferența dintre rezultatele a două determinări efectuate în cel mai scurt interval de timp posibil de un operator care utilizează aceeași aparatură pe material de analiză identic nu trebuie să depășească 10,2 mg/kg.

7.2.1.2.   Sitosterol

Diferența dintre rezultatele a două determinări efectuate în cel mai scurt interval de timp posibil de un operator care utilizează aceeași aparatură pe material de analiză identic nu trebuie să depășească 3,6 % din valoarea medie a acestor determinări.

7.2.2.   Reproductibilitate

7.2.2.1.   Stigmasterol

Diferența dintre rezultatele a două determinări efectuate de operatori din laboratoare diferite care utilizează aparatură diferită pe material de analiză identic nu trebuie să depășească 25,3 mg/kg.

7.2.2.2.   Sitosterol

Diferența dintre rezultatele a două determinări efectuate de operatori din laboratoare diferite care utilizează aparatură diferită pe material de analiză identic nu trebuie să depășească 8,9 % din valoarea medie a acestor determinări.

7.2.3.   Sursa datelor de precizie

Datele de precizie au fost determinate printr-un experiment realizat în 1991 în care au fost implicate opt laboratoare și șase probe (trei duplicate probă martor) pentru stigmasterol și șase probe (trei duplicate probă martor) pentru sitosterol.

8.   LIMITE DE TOLERANȚĂ

8.1.   Pentru a verifica marcarea corectă a produsului, trebuie prelevate trei probe din produsul studiat.

8.2.   Unt

8.2.1.   Stigmasterol

8.2.1.1.   Rata de încorporare pentru stigmasterol este de 150 g de stigmasterol, cu o puritate de cel puțin 95 %, pe o tonă de unt, respectiv 142,5 mg/kg, sau de 170 g de stigmasterol, cu o puritate de cel puțin 85 %, pe o tonă de unt, respectiv 144,5 mg/kg.

8.2.1.2.   Rezultatele pentru cele trei probe obținute în urma analizei produsului se folosesc pentru verificarea ratei și omogenității de încorporare a marcatorului, iar cel mai slab rezultat se compară cu următoarele limite [avându-se în vedere o diferență critică pentru un nivel de probabilitate de 95 % (DCr95)]:

Concentrația marcatorului din proba cu rezultatul cel mai slab este utilizată prin interpolare între 116,0 mg/kg și 81,0 mg/kg sau între 118,0 mg/kg și 82,0 mg/kg

8.2.2.   Sitosterol

8.2.2.1.   Rata de încorporare pentru sitosterol este de 600 g de sitosterol, cu o puritate de cel puțin 90 %, pe o tonă de unt, respectiv 540 mg/kg.

8.2.2.2.   Rezultatele pentru cele trei probe obținute în urma analizei produsului se folosesc pentru verificarea ratei și omogenității de încorporare a marcatorului, iar cel mai slab rezultat se compară cu următoarele limite [avându-se în vedere o diferență critică pentru un nivel de probabilitate de 95 % (DCr95)]:

Concentrația marcatorului din proba cu rezultatul cel mai slab este utilizată prin interpolare între 486,0 mg/kg și 358,0 mg/kg.

8.3.   Unt concentrat

8.3.1.   Stigmasterol

8.3.1.1.   Rata de încorporare pentru stigmasterol este de 150 g de stigmasterol, cu o puritate de cel puțin 95 %, pe o tonă de unt concentrat, respectiv 142,5 mg/kg; sau de 170 g de stigmasterol, cu o puritate de cel puțin 85 %, pe o tonă de unt concentrat, respectiv 144,5 mg/kg.

8.3.1.2.   Rezultatele pentru cele trei probe obținute în urma analizei produsului se folosesc pentru verificarea ratei și omogenității de încorporare a marcatorului, iar cel mai slab rezultat se compară cu următoarele limite [avându-se în vedere o diferență critică pentru un nivel de probabilitate de 95 % (DCr95)]:

Concentrația marcatorului din proba cu rezultatul cel mai slab este utilizată prin interpolare între 120,0 mg/kg și 84,0 mg/kg sau între 122,0 mg/kg și 86,0 mg/kg.

8.3.2.   Sitosterol

8.3.2.1.   Rata de încorporare pentru sitosterol este de 600 g de sitosterol, cu o puritate de cel puțin 90 %, pe o tonă de unt concentrat, respectiv 540 mg/kg.

8.3.2.2.   Rezultatele pentru cele trei probe obținute în urma analizei produsului se folosesc pentru verificarea ratei și omogenității de încorporare a marcatorului, iar cel mai slab rezultat se compară cu următoarele limite [avându-se în vedere o diferență critică pentru un nivel de probabilitate de 95 % (DCr95)]:

Concentrația marcatorului din proba cu rezultatul cel mai slab este utilizată prin interpolare între 486,0 mg/kg și 358,0 mg/kg.

ANEXA XV

(Articolul 10)

METODĂ DE REFERINȚĂ PENTRU DETECTAREA LAPTELUI DE VACĂ ȘI A CAZEINEI ÎN BRÂNZETURILE PRODUSE DIN LAPTE DE OAIE, LAPTE DE CAPRĂ SAU LAPTE DE BIVOLIȚĂ SAU DIN AMESTECURI DE LAPTE DE OAIE, CAPRĂ ȘI BIVOLIȚĂ

1.   Domeniu de aplicare

Detectarea laptelui de vacă și a cazeinei în brânzeturile produse din lapte de oaie, lapte de capră, lapte de bivoliță sau din amestecuri de lapte de oaie, capră și bivoliță prin focalizarea izoelectrică a γ-cazeinelor după plasminoliză.

2.   Domeniu de aplicare

Această metodă poate fi folosită pentru detectarea sensibilă și specifică a laptelui de vacă natural și tratat termic și a cazeinatului în brânzeturile proaspete și maturate produse din lapte de oaie, lapte de capră, lapte de bivoliță sau din amestecuri de lapte de oaie, capră și bivoliță. Nu poate fi folosită pentru detectarea falsificării laptelui și a brânzei cu concentrate de proteine de zer de bovine tratate termic.

3.   Principiul metodei

4.   Reactivi

În afara cazurilor se precizează altceva, produsele chimice folosite trebuie să fie de puritate analitică. Apa folosită trebuie să fie dublu-distilată sau de o puritate echivalentă.

Notă: Următoarele detalii se aplică gelurilor de poliacrilamide cu conținut de uree preparate în laborator, cu dimensiunile de 265 × 125 × 0,25 mm. În cazul în care se folosesc geluri de alte dimensiuni sau tipuri, poate fi necesară modificarea condițiilor de separare.

Focalizarea izoelectrică

4.1.   Reactivi pentru producerea gelurilor de poliacrilamide cu conținut de uree

4.1.1.   Soluție stoc de gel

Se dizolvă în apă:

și se completează cu apă până la 100 ml, apoi se păstrează produsul obținut în refrigerator, într-un recipient de sticlă de culoare maro.

Notă: În locul cantităților fixe de acrilamide neurotoxice menționate mai sus se poate folosi o soluție de acrilamidă/BIS prefabricată disponibilă în comerț. În cazul în care o asemenea soluție conține 30 % m/v acrilamidă și 0,8 % m/v BIS, cantitățile de acrilamidă și BIS din preparatul de mai sus se înlocuiesc cu 16,2 ml de soluție. Termenul de valabilitate a soluției stoc este de maxim 10 zile; în cazul în care conductibilitatea acesteia este mai mare de 5 μS, se deionizează substanța prin agitare cu 2 g Amberlite MB-3 timp de 30 minute, ulterior se filtrează printr-o membrană de 0,45 μm.

4.1.2.   Soluția de gel

Se prepară o soluție de gel amestecând aditivii și amfoliții cu soluția stoc de gel (a se vedea 4.1.1).

Se amestecă soluția de gel și se degazeifică timp de două sau trei minute într-o baie ultrasonică sau sub vid.

Notă: Soluția de gel se prepară imediat înainte de a o turna (a se vedea 6.2).

4.1.3.   Soluții catalizator

4.1.3.1.   N, N, N′ N′ - tetrametiletilendiamină (Temed).

4.1.3.2.   40 % m/v persulfat de amoniu (PER):

Se dizolvă 800 mg PER în apă și se completează cu apă până la 2 ml.

Notă: A se folosi întotdeauna soluție PER proaspăt preparată.

4.2.   Fluid de contact

Kerosen sau parafină lichidă

4.3.   Soluție anodică

Se dizolvă în apă 5,77 g acid fosforic (85 % m/m) și se diluează până la 100 ml.

4.4.   Soluție catodică

Se dizolvă în apă 2,00 g hidroxid de sodiu și se diluează până la 100 ml.

Prepararea probei

4.5.   Reactivi pentru izolarea proteinelor

4.5.1.   Se diluează acid acetic (25,0 ml acid acetic cristalizabil completat cu apă până la 100 ml)

4.5.2.   Diclorometan

4.5.3.   Acetonă

4.6.   Soluție tampon de dizolvare a proteinei

Se dizolvă în apă

și se completează cu apă până la 50 ml

Notă: Se păstrează substanța în refrigerator, termen de valabilitate: maximum o săptămână.

4.7.   Reactivi pentru clivarea plasminică a cazeinelor

4.7.1.   Soluție tampon de carbonat de amoniu

Se titrează până la pH 8 o soluție de hidrogencarbonat de amoniu 0,2 mol/l (1,58 g/100 ml apă) conținând acid etilendiaminotetraacetic 0,05 mol/l (EDTA, 1,46 g/100 ml) cu o soluție de carbonat de amoniu 0,2 mol/l (1,92 g/100 ml apă) conținând 0,05 mol/l EDTA.

4.7.2.   Plasmină bovină (EC 3.4.21.7), cu activitate de minim 5 U/ml.

4.7.3.   Soluție de acid Ðε-aminocaproic pentru inhibarea enzimelor

Se dizolvă 2,624 g acid ε-aminocaproic (acid 6-amino-n-hexanoic) în 100 ml de etanol 40 % (v/v).

4.8.   Standarde

4.8.1.   De la Institutul pentru Materiale și Măsurători de Referință al Comisiei, B-2440 Geel, Belgia pot fi obținute probe de referință certificate obținute din amestecuri de lapte închegat de oaie și capră conținând 0 %, respectiv 1 % lapte de vacă.

4.8.2.   Prepararea probelor de referință provizorii de laborator din lapte de bivoliță închegat conținând 0 % și 1 % lapte de vacă

Laptele degresat se prepară prin centrifugarea laptelui crud de bivoliță sau de vacă în vrac la 37 °C (2 500 g, timp de 20 minute). După răcirea rapidă a tubului și a conținutului la 6-8 °C, stratul superior de grăsime se îndepărtează în totalitate. Pentru prepararea probei standard 1 % se adaugă 5,00 ml de lapte de vacă degresat la 495 ml lapte de bivoliță degresat într-un vas de 1 l, se ajustează pH-ul la 6,4 prin adăugarea de acid lactic diluat (10 % m/v). Se ajustează temperatura la 35 °C și se adaugă 100 μl de cheag de vițel (activitatea reninică 1:10 000, c. 3 000 U/ml), se amestecă timp de 1 minut, apoi se acoperă vasul cu o folie de aluminiu și se lasă la 35 °C timp de 1 oră pentru a se putea forma coagulul. După formarea acestuia, laptele închegat este liofilizat în întregime fără omogenizare prealabilă și fără a se extrage zerul. După liofilizare, produsul se zdrobește până se obține o pulbere fină omogenă. Pentru prepararea probei standard 0 %, se urmează aceeași procedură folosind lapte degresat de bivoliță veritabil. Probele trebuie păstrate la –20 °C.

Notă: Înaintea preparării probelor standard se recomandă verificarea purității laptelui de bivoliță prin focalizarea izoelectrică a cazeinelor tratate cu plasmină.

Reactivi pentru colorarea proteinelor

4.9.   Fixativ

Se dizolvă în apă 150 g acid tricloroacetic și se completează cu apă până la 1 000 ml.

4.10.   Soluție pentru decolorare

Se diluează în apă distilată până la 2 000 ml 500 ml metanol și 200 ml acid acetic cristalizabil.

Notă: Se prepară zilnic o soluție proaspătă de decolorare; soluția poate fi preparată prin amestecarea de volume egale de soluții stoc metanol 50 % (v/v) și acid acetic cristalizabil 20 % (v/v).

4.11.   Soluții pentru colorare

4.11.1.   Soluție pentru colorare (soluție stoc 1)

Se dizolvă 3,0 g Albastru Briliant de Coomassie G-250 (C.I. 42655) în 1 000 ml metanol 90 % (v/v) folosind un agitator magnetic (timp de aproximativ 45 minute), apoi se filtrează prin două filtre pliate de viteză medie.

4.11.2.   Soluție pentru colorare (soluție stoc 2)

Se dizolvă 5,0 g sulfat de cupru pentahidrat în 1 000 ml acid acetic 20 % (v/v).

4.11.3.   Soluție pentru colorare (soluție de lucru)

Se amestecă 125 ml din fiecare soluție stoc (4.11.1, 4.11.2) imediat înainte de colorare.

Nota: Se recomandă prepararea soluției de colorare în ziua folosirii acesteia.

5.   Aparatură

5.1.   Plăci de sticlă (265 × 125 × 4 mm); rolă de cauciuc (lățime 15 cm); masă reglabilă

5.2.   Foaie susținătoare de gel (265 × 125 mm).

5.3.   Foaie de acoperire (280 × 125 mm). Se lipește o bucată de bandă adezivă (280 × 6 × 0,25 mm) pe fiecare latură lungă (a se vedea figura 1).

5.4.   Cuvă de electrofocalizare cu placă de răcire (de exemplu 265 × 125 mm) cu unitate de alimentare electrică adecvată (≥ 2,5 kV) sau cu aparat automat de electroforeză.

5.5.   Criostat de circulație controlat termostatic la 12 ± 0,5 °C.

5.6.   Centrifugă ajustabilă la 3 000 g.

5.7.   Benzi de electrozi (lungime ≥ 265 mm).

5.8.   Sticle picurătoare de plastic pentru soluțiile anodice și catodice.

5.9.   Aplicatoare de probe (10 × 5 mm, vâscoză sau hârtie de filtru cu absorbție redusă a proteinelor).

5.10.   Foarfeci, scalpele și pensete din oțel inoxidabil.

5.11.   Cuve din oțel inoxidabil pentru colorare și decolorare (de exemplu, tăvi de 280 x 150 mm).

5.12.   Omogenizator ajustabil cu tijă (diametrul tijei 10 mm), viteză de rotație 8 000-20 000 rpm.

5.13.   Agitator magnetic.

5.14.   Baie ultrasonică.

5.15.   Aparat de sudură a foliilor.

5.16.   Micropipete de 25 μl.

5.17.   Concentrator sub vid sau liofilizator.

5.18.   Baie de apă cu agitator, controlată termostatic și ajustabilă la 35 și 40 ± 1 °C.

5.19.   Echipament de densitometrie cu citire la λ = 634 nm.

6.   Procedură

6.1.   Prepararea probei

6.1.1.   Izolarea cazeinelor

Se cântărește într-un tub de centrifugă de 100 ml echivalentul a 5 g materie uscată de brânză sau probă de referință, se adaugă 60 ml apă distilată și se omogenizează cu un omogenizator cu tijă (8 000-10 000 rpm). Se ajustează la un pH de 4,6 cu o soluție de acid acetic diluat (4.5.1) și se pune în centrifugă (5 minute, 3 000 g). Se decantează grăsimea și zerul, se omogenizează reziduul la 20 000 rpm în 40 ml apă distilată ajustată la un pH de 4,5 cu soluție de acid acetic diluat (4.5.1), se adaugă 20 ml diclorometan (4.5.2), se omogenizează din nou și se pune în centrifugă (5 minute, 3 000 g). Se îndepărtează cu o spatulă stratul de cazeină care se află între faza apoasă și cea organică (a se vedea figura 2) și se elimină ambele faze. Se reomogenizează cazeina în 40 ml apă distilată (a se vedea mai sus) și în 20 ml diclorometan (4.5.2), apoi se pune în centrifugă. Se repetă procedura până când ambele faze extrase sunt incolore (de două sau trei ori). Se omogenizează reziduul de proteină cu 50 ml acetonă (4.5.3) și se filtrează printr-o hârtie de filtru pliată de viteză medie. Se spală de fiecare dată reziduul de pe filtru cu câte două porții separate de 25 ml acetonă și se lasă să se usuce în aer sau sub jet de azot, apoi se transformă în pulbere într-un mojar.

Notă: Cazeina izolată uscată trebuie păstrată la –20 °C.

6.1.2.   Clivarea plasminică al ß-cazeinelor pentru intensificarea γ-cazeinelor

Se prepară o suspensie de 25 mg cazeine izolate (6.1.1) în 0,5 ml soluție tampon de carbonat de amoniu (4.7.1) și se omogenizează timp de 20 minute folosind, de exemplu, tratamentul ultrasonic. Se încălzește la 40 °C ș se adaugă 10 μl plasmină (4.7.2), apoi se amestecă și se incubează timp de o oră la 40 °C, agitând continuu. Pentru a inhiba enzimele se adaugă 20 μl soluție de acid ε-aminocaproic (4.7.3), apoi se adaugă 200 mg uree solidă și 2 mg ditiotreitol.

Notă: Pentru a obține o simetrie mai mare a benzilor cazeinice focalizate se recomandă liofilizarea soluției după adăugarea acidului ε-aminocaproic și dizolvarea reziduurilor în 0,5 ml soluție tampon pentru dizolvarea proteinelor (4.6).

6.2.   Prepararea gelurilor poliacrilamide care conțin uree

Cu ajutorul câtorva picături de apă se întinde foaia susținătoare de gel (5.2) pe o placă de sticlă (5.1), îndepărtându-se surplusul de apă cu un șervețel. Se întinde în mod similar foaia de acoperire (5.3) cu spațiatoare (0,25 mm) pe o altă placă de sticlă. Se așează placa orizontal pe masa reglabilă.

Se adaugă 10 μl Temed (4.1.3.1) la soluția de gel degazeificată pregătită (4.1.2), se amestecă și se adaugă 10 μl soluție PER (4.1.3.2), se amestecă bine și se toarnă imediat amestecul într-un strat egal pe centrul foii de acoperire. Se pune o margine a plăcii susținătoare de gel (cu fața foii îndreptată în jos) pe placa de acoperire și se coboară încet, astfel încât între foi să se formeze un strat subțire de gel care să se întindă uniform și fără bule (figura 3). Se coboară cu grijă până la capăt placa susținătoare de gel, folosind o spatulă subțire, apoi se așează încă trei plăci de sticlă deasupra, pentru a acționa ca greutate. După încheierea polimerizării (aproximativ 60 minute), se transferă gelul polimerizat împreună cu foaia de acoperire pe foaia susținătoare de gel, înclinând plăcile de sticlă. Se curăță cu grijă spatele foii susținătoare de gel pentru a elimina reziduurile de gel și de uree. Se sudează marginile „sandvișului” de gel, astfel încât să se obțină un tub și se păstrează în refrigerator (timp de maxim șase săptămâni).

Notă: Foaia de acoperire și spațiatoarele pot fi refolosite. Gelul de poliacrilamidă poate fi tăiat la dimensiuni mai mici, acțiune care este recomandată în cazul în care există puține probe sau în cazul în care se folosește un aparat automat de electroforeză (două geluri format 4,5 × 5 cm).

6.3.   Focalizarea izoelectrică

Se reglează termostatul de răcire la 12 °C. Se șterge cu kerosen spatele foii susținătoare de gel, apoi se picură câteva picături de kerosen (4.2) pe centrul blocului de răcire. Se rulează apoi pe el „sandvișul” de gel, cu partea susținătoare de gel îndreptată în jos, având grijă să se evite formarea bulelor. Se șterge excesul de kerosen și se îndepărtează foaia de acoperire. Se îmbibă benzile de electrozi în soluțiile electrolitice (4.3, 4.4), se taie după lungimea gelului și se plasează în poziția prevăzută (distanța dintre electrozi de 9,5 cm).

Condiții pentru focalizarea izoelectrică:

6.3.1.   Dimensiunile gelului 265 x 125 x 0,25 mm

Notă: În cazul în care se modifică grosimea sau lățimea gelurilor, atunci intensitatea și puterea curentului trebuie ajustate în consecință (de exemplu, în cazul în care se folosește un gel de 265 × 125 × 0,5 mm se dublează valorile pentru intensitatea și puterea curentului electric).

6.3.2.   Exemplu de program de tensiune pentru un aparat automat de electroforeză (2 geluri de 5,0 × 4,5 cm), cu electrozi fără benzi și aplicați direct pe gel.

Se plasează aplicatorul probei la pasul 2 la 0 Vh.

Se îndepărtează aplicatorul probei la pasul 2 la 30 Vh.

6.4.   Colorarea proteinelor

6.4.1.   Fixarea proteinelor

Se îndepărtează benzile de electrozi imediat după stingerea aparatului și se plasează imediat gelul într-o cuvă de colorare/decolorare umplută cu 200 ml fixativ (4.9); se lasă acolo timp de 15 minute, agitând în continuu.

6.4.2.   Spălarea și colorarea plăcii de gel

Se scurge cu grijă fixativul și se spală placa de gel de două ori, timp de câte 30 de secunde, cu 100 ml soluție decolorantă (4.10). Se decantează soluția decolorantă și se umple cuva cu 250 ml soluție colorantă (4.11.3); se lasă 45 minute să se coloreze, agitându-se ușor cuva.

6.4.3.   Decolorarea plăcii de gel

Se decantează soluția colorantă, se spală placa de gel de două ori, cu câte 100 ml soluție decolorantă (4.10), apoi se agită timp de 15 minute cu 200 ml soluție decolorantă și se repetă pasul de decolorare de cel puțin două-trei ori, până când fundul vasului este curățat și incolor. Se clătește apoi cu apă distilată placa de gel (2 × 2 minute) și se usucă la aer (2-3 ore) sau cu un uscător de păr (10-15 minute).

Nota 1: Fixarea, spălarea, colorarea și decolorarea se efectuează la 20 °C. A nu se folosi temperaturi ridicate.

Nota 2: În cazul în care se preferă colorarea mai sensibilă cu argint (de exemplu, Silver Staining Kit, Protein, Pharmacia Biotech, cod nr. 17-1150-01), probele de cazeină tratate cu plasmină trebuie diluate la 5 mg/ml.

7.   Evaluare

Evaluarea este efectuată prin compararea benzilor de proteine ale probei necunoscute cu probele de referință efectuate pe același gel. Detectarea laptelui de vacă în brânzeturile din lapte de oaie, lapte de capră și lapte de bivoliță și în amestecurile de lapte de oaie, capră și bivoliță se face prin intermediul γ3- și γ2-cazeinelor, ale căror puncte izoelectrice se află în intervalul pH 6,5-pH 7,5 (figurile 4 a, b, figura 5). Limita de detecție este mai mică de 0,5 %.

7.1.   Estimare vizuală

Pentru evaluarea vizuală a cantității de lapte de vacă se recomandă ajustarea concentrațiilor probelor și a probelor standard pentru a obține același nivel de intensitate a γ3- și γ2-cazeinelor din laptele de ovine, caprine și/sau bivolițe (a se vedea „γ2-E, G, B” și „γ3-E, G, B” din figurile 4 a, b și din figura 5). După aceasta, nivelul de lapte de vacă (mai mic decât, egal cu sau mai mare de 1 %) din proba necunoscută poate fi estimat direct, prin compararea intensității γ3- și γ2-cazeinelor din laptele de vacă (a se vedea „γ3-C” și „γ2-C” din figurile 4 a, b și din figura 5) cu cea a probelor de referință de 0 % și 1 % (oaie, capră) sau cu standardele provizorii de laborator (bivoliță).

7.2.   Estimare densitometrică

În cazul în care este disponibilă, se aplică densitometria (5.19) pentru determinarea raportului dintre suprafața vârfurilor γ3- și γ2-cazeinelor din laptele de vacă, respectiv din laptele de oaie, capră și/sau bivoliță (a se vedea figura 5). Această valoare se compară cu raportul dintre suprafața vârfurilor γ3- și γ2-cazeinelor pentru proba de referință 1 % (oaie, capră) sau pentru standardul provizoriu de laborator (bivoliță), analizate pe același gel.

Notă: Metoda funcționează corespunzător în cazul în care se obține un semnal pozitiv clar pentru ambele cazeine bovine γ3- și γ2- din proba de referință 1 %, dar nu și din proba de referință 0 %. Dacă nu, procedura trebuie îmbunătățită respectându-se cu exactitate detaliile metodei.

O probă este considerată pozitivă în cazul în care ambele cazeine bovine γ3- și γ2- sau raportul suprafeței vârfurilor corespunzător sunt mai mari sau egale cu nivelul din proba de referință 1 %.

8.   Referințe

(1)  Produsele Ampholine® pH 3,5-9,5 (Pharmacia) și Resolyte® pH 5-7 și pH 6-8 (BDH, Merck) s-au dovedit deosebit de adecvate pentru obținerea gradului necesar de separare a γ-cazeinelor.

(2)  Aplicarea probei: După prefocalizare (etapa 1), se picură 18 μl din proba și din soluțiile standard pe aplicatorii probei (10 × 5 mm), se plasează aplicatorii pe gel la distanță de 1 mm unul de celălalt și la 5 mm longitudinal față de anod și se apasă ușor. Procedura de focalizare se finalizează în condițiile specificate mai sus, îndepărtând cu grijă aplicatorii probei după 60 minute de focalizare a probei.

ANEXA XVI

(Articolul 11)

METODĂ DE REFERINȚĂ PENTRU DETECTAREA BACTERIILOR COLIFORME DIN UNT, LAPTE PRAF DEGRESAT, CAZEINĂ ȘI CAZEINAȚI

La analiza untului pentru detectarea prezenței bacteriilor coliforme se inoculează probe de 1 g de unt în mediul de cultură.

Pentru detectarea prezenței bacteriilor coliforme în lapte praf degresat sau cazeină/cazeinați, se inoculează probe de 0,1 g în mediul de cultură.

Se folosește standardul FIL 73A: 1985, metoda B cu următoarele modificări:

Evaluarea rezultatelor

Notă

Conținut de bacterii coliforme: 1/10 g pentru unt; 1/g în medie pentru lapte praf degresat, cazeină/cazeinați.

Rezultatele care indică satisfacerea cerinței trebuie să aibă o probabilitate de 93 %.

Conținut de bacterii coliforme: 1/g pentru unt; 1/0,1 g în medie pentru lapte praf degresat sau cazeină/cazeinați.

Rezultatele care indică faptul că cerința nu a fost satisfăcută trebuie să aibă o probabilitate de 91 %.

(Presupunere: distribuția Poisson)

ANEXA XVII

(Articolul 12)

METODĂ DE DETERMINARE A CONȚINUTULUI DE LACTOZĂ AL PRODUSELOR CU COD NC 2309 (1)

PARTEA I

1.   Domeniul de aplicare

Metoda se alică în cazurile în care conținutul de lactoză depășește 0,5 %.

2.   Principiu

Se dizolvă zaharurile în apă. Se lasă drojdia (Saccharomyces cerevisiae) să acționeze; lactoza va rămâne intactă. Se determină conținutul de lactoză al soluției prin metoda Luff-Schoorl, după decantare și filtrare.

3.   Reactivi

Tiosulfat de sodiu 0,1 N.

Indicator: soluție de amidon. Se adaugă un amestec de 5 g de amidon solubil (ca agent de conservare se pot adăuga 10 mg de iodură de mercur) și 30 ml de apă la un litru de apă care fierbe; amestecul se lasă să fiarbă timp de trei minute; se lasă să se răcească.

Sluție AR de iodură de potasiu la 30 % (m/v).

Soluție de acid sulfuric 6 N.

Reactiv Luff-Schoorl:

Se adaugă (b) la (c) și se agită ușor, apoi se adaugă (a). Se completează până la 1 litru, se lasă să stea peste noapte și apoi se filtrează. Se verifică normalitatea reactivului obținut în acest mod (Cu 0.1 N, Na2CO3 2 N). pH-ul trebuie să fie de aproximativ 9,4.

Soluție Carrez I: se dizolvă 23,8 g Zn (C2H3O2)2.2H2O și 3 g de acid acetic glacial în apă și se completează până la 100 ml.

Carrez II: se dizolvă 10,6 g de K4F2(CN)6. 3H2O în apă și se completează până la 100 ml.

Granule de piatră ponce, tratate în timpul fierberii cu acid clorhidric, clătite cu apă și uscate. Suspensie de Saccharomyces cerevisiae: 25 g de drojdie proaspătă în 100 ml de apă (a nu se păstra în refrigerator mai mult de o săptămână).

4.   Procedură

Se cântărește, cu o precizie de 1 mg, 1 g din proba de analiză; aceasta se introduce într-un balon calibrat de 100 ml. Se adaugă 25-30 ml de apă. Balonul se introduce într-o baie de apă care fierbe timp de 30 de minute, apoi se răcește la aproximativ 35 °C.

Se adaugă 5 ml de suspensie de drojdie (2) și se agită. Balonul calibrat și conținutul acestuia se lasă timp de două ore într-o baie de apă la temperatura de 38-40 °C.

După fermentare se răcește la aproximativ 20 °C. Se adaugă 2,5 ml de soluție Carrez I și se agită timp de 30 de secunde; apoi se adaugă 2,5 ml de soluție Carrez II și se agită din nou treizeci de secunde. Se completează cu apă până la 100 ml, se amestecă și se filtrează. Se pipetează o cantitate de filtrat nu mai mare de 25 ml, care să conțină de preferință 40-80 mg de lactoză; se completează până la 25 ml cu apă și se determină conținutul de lactoză anhidră prin metoda Luff-Schoorl.

Se realizează un test complet cu probă martor numai pentru drojdie.

PARTEA II

1.   Determinarea conținutului de lactoză prin metoda Luff-Schoorl

Se pipetează 25 ml de reactiv Luff-Schoorl și se introduce într-un balon Erlenmeyer de 300 ml; se adaugă 25 ml măsurați cu precizie din soluția decantată.

Se adaugă două granule de piatră ponce, apoi se încălzește, se agită manual pe o flacără deschisă de înălțime medie și se aduce lichidul la punctul de fierbere timp de aproximativ două minute. Balonul Erlenmeyer se așează mediat pe o sită metalică cu azbest sub care se aprinde în prealabil o flacără. Aceasta se reglează astfel încât să fie încălzit numai fundul paharului Erlenmeyer; apoi se instalează un condensator cu reflux. Din acest moment se fierbe timp de exact zece minute. Se răcește imediat în apă rece și după aproximativ cinci minute se analizează după cum urmează.

Se adaugă lichidului 10 ml de iodură de potasiu și imediat, dar cu grijă (întrucât se poate produce o spumare importantă) 25 ml de acid sulfuric 6 N.

Se testează cu tiosulfat de sodiu până la apariția unei colorații corespunzătoare în galben, iar spre sfârșit se adaugă indicatorul de amidon.

Se efectuează exact aceeași analiză folosindu-se un amestec de format din exact 25 ml de reactiv Luff-Schoorl și 25 ml de apă după adăugarea a 10 ml de iodură de potasiu și 25 ml de acid sulfuric 6 N fără a se aduce la punctul de fierbere.

Pe baza următorului tabel se stabilește cantitatea de lactoză exprimată în mg care corespunde diferenței între rezultatele a două analize (exprimate în ml de soluție de tiosulfat de sodiu 0,1 N).

TABEL

Tabel pentru 25 ml de reactiv Luff-Schoorl

(a se vedea condițiile din textul de mai sus)

(1)  Regulamentul (CEE) nr. 222/88.

(2)  Pentru produsele care coțin peste 40 % zahăr fermentabil, se adaugă o cantitate mai mare de suspensie.

ANEXA XVIII

(Articolul 13)

DETECTAREA ZERULUI PRAF DIN LAPTELE PRAF DEGRESAT DESTINAT DEPOZITĂRII PUBLICE PRIN DETERMINAREA CROMATOGRAFIEI LICHIDE DE ÎNALTĂ PERFORMANȚĂ A GLICOMACROPEPTIDELOR (HPLC)

1.   Obiectul și domeniul de aplicare

Această metodă permite detectarea zerului închegat din laptele praf degresat destinat depozitării publice prin determinarea glicomacropeptidelor.

2.   Referințe

Standardul internațional ISO 707 – Lapte și produse lactate – Metode de prelevare a probelor conform indicațiilor din anexa I punctul 2 litera (c) ultimul paragraf.

3.   Definiție

Conținutul de glicomacropeptide al laptelui praf degresat: conținutul de substanțe determinat prin metoda de mai jos, exprimat ca procent de masă.

4.   Principiu

5.   Reactivi

Toți reactivii trebuie să aibă o puritate analitică recunoscută. Apa utilizată trebuie să fie apă distilată sau apă de o puritate cel puțin echivalentă.

5.1.   Soluție de acid tricloroacetic

Se dizolvă 240 g de acid tricloroacetic (Cl3CCOOH) în apă și se completează până la 1 000 ml.

5.2.   Soluție eluantă, pH 6,0

Se dizolvă 1,74 g de fosfat dipotasic (K2HPO4), 12,37 g de fosfat monopotasic (KH2PO4) și 21,41 g de sulfat de sodiu (Na2SO4) în aproximativ 700 ml de apă. În cazul în care este necesar se ajustează cu ajutorul unei soluții de acid fosforic sau hidroxid de potasiu până la obținerea unui pH de 6,0.

Se completează cu apă până la 1 000 ml și se omogenizează.

Soluția eluantă se filtrează înainte de folosire printr-o membrană filtrantă cu diametrul porilor de aproximativ 0,45 μm.

5.3.   Solvent de spălare

Se amestecă un volum de acetonitril (CH3CN) cu nouă volume de apă. Amestecul se filtrează înainte de folosire printr-o membrană filtrantă cu pori cu diametrul de 0,45.

Notă: Se poate folosi orice alt solvent de spălare cu efect bactericid care nu afectează eficiența rezoluției coloanelor.

5.4.   Probe etalon

6.   Aparatură

Notă: Se poate lucra cu coloanele aflate la temperatura camerei, dar puterea lor de rezoluție este puțin mai mică. În acest caz, temperatura nu trebui să varieze cu mai mult de + 5 °C în nici o serie de analize.

7.   Prelevarea probelor

8.   Procedură

8.1.   Prepararea probei de analiză

Se transferă laptele praf într-un recipient cu o capacitate aproximativ dublă față de volumul laptelui praf, prevăzut cu un capac etanș la aer. Recipientul se închide imediat. Laptele praf se amestecă bine prin răsturnări repetate ale recipientului.

8.2.   Cantitatea analizată

Se cântăresc 2,000 + 0,001 g din proba analizată într-un tub de centrifugare (6.2).

8.3.   Îndepărtarea grăsimii și a proteinelor