32001R0213

Regulamento (CE) n.o 213/2001 da Comissão

de 9 de Janeiro de 2001

que estabelece as normas de execução do Regulamento (CE) n.o 1255/1999, no que respeita aos métodos a utilizar para a análise e a avaliação da qualidade do leite e dos produtos lácteos e, altera os Regulamentos (CE) n.o 2771/1999 e (CE) n.o 2799/1999

A COMISSÃO DAS COMUNIDADES EUROPEIAS,

Tendo em conta o Tratado que institui a Comunidade Europeia,

Tendo em conta o Regulamento (CE) n.o 1255/1999 do Conselho, de 17 de Maio de 1999, que estabelece a organização comum de mercado no sector do leite e dos produtos lácteos(1) e, nomeadamente, os seus artigos 10.o e 15.o, o n.o 3 do seu artigo 26.o, o n.o 1 do seu artigo 29.o e o n.o 14 do seu artigo 31.o,

Considerando o seguinte:

(1) Os Regulamentos da Comissão (CEE) n.o 1216/68, (CEE) n.o 3942/92, (CE) n.o 86/94, (CE) n.o 2721/95, (CE) n.o 1080/96, (CE) n.o 1081/96, (CE) n.o 1082/96, (CE) n.o 1854/96, (CE) n.o 880/98 e (CE) n.o 1459/98, cujas referências completas figuram no anexo XXVI do presente regulamento, estabelecem métodos de referência e de rotina para a análise e a avaliação da qualidade do leite e dos produtos lácteos, bem como o domínio e as normas de aplicação dos referidos métodos. Por motivos de clareza, de modo a proporcionar aos operadores do sector um corpus dos métodos e respectivas normas de aplicação, é conveniente reformular os regulamentos supramencionados, agrupando-os num único texto. É também oportuno alterar os Regulamentos da Comissão (CE) n.o 2771/1999, de 16 de Dezembro de 1999, que estabelece normas de execução do Regulamento (CE) n.o 1255/1999 do Conselho no referente a medidas de intervenção no mercado da manteiga e da nata(2) e (CE) n.o 2799/1999, de 17 de Dezembro de 1999, que estabelece normas de execução do Regulamento (CE) n.o 1255/1999 no que se refere à concessão de uma ajuda ao leite desnatado e ao leite em pó desnatado destinados à alimentação animal e à venda deste último(3) de modo a incluir no presente regulamento os seus anexos respeitantes aos métodos de análise.

(2) As características de composição e de qualidade do leite e dos produtos lácteos fixadas no âmbito dos regimes previstos pelo Regulamento (CE) n.o 1255/1999 devem ser verificadas de modo a garantir a sua estrita conformidade às exigências estabelecidas.

(3) Encontra-se frequentemente estipulado que os métodos de referência a utilizar para as referidas verificações são métodos publicados por organismos internacionais tais como o CEN, a FIL, a ISO e a AOAC International, regularmente actualizados pelos organismos em causa. Em alguns casos, encontra-se estabelecido um método de referência comunitário. Em outros casos, a regulamentação comunitária não especifica qualquer método de referência. De modo a garantir a aplicação uniforme dos métodos de referência, deve estabelecer-se anualmente uma lista de métodos de referência e especificar a necessidade de o método a aplicar figurar na mesma.

(4) Não deve excluir-se a aplicação de métodos de rotina, devendo especificar-se as suas condições de utilização.

(5) De modo a estabelecer uma prática uniforme para a avaliação dos resultados de análise, há que estabelecer também métodos comuns. O mesmo sucede no que respeita ao exame organoléptico dos produtos em causa e ao reexame dos resultados objecto de contestação.

(6) No que respeita a determinadas análises, não existem na actualidade métodos de referência validados de aceitação internacional. Por esse facto, não se encontram disponíveis quaisquer informações sobre as variações interlaboratoriais dos resultados de análise. É pois, oportuno fixar métodos a nível comunitário, validados em conformidade com as normas estabelecidas internacionalmente, a aplicar como métodos de referência.

(7) O Regulamento (CE) n.o 2571/97 da Comissão, de 15 de Dezembro de 1997, relativo à venda a preço reduzido de manteiga e à concessão de uma ajuda à nata, à manteiga e à manteiga concentrada destinadas ao fabrico de produtos de pastelaria, de gelados alimentares e de outros produtos alimentares(4), com a última redacção que lhe foi dada pelo Regulamento (CE) n.o 635/2000(5), prevê, em determinadas circunstâncias, a marcação das natas, da manteiga e da manteiga concentrada para garantir a utilização final adequada dos produtos em causa. Em virtude da importância da marcação para o bom funcionamento do regime e de modo a garantir a igualdade de tratamento entre os operadores participantes, é conveniente estabelecer, na medida do possível, métodos comuns de determinação de alguns dos referidos marcadores.

(8) A manteiga concentrada deve ser objecto de uma marcação sujeita a controlo, em conformidade com o Regulamento (CEE) n.o 3143/85 da Comissão, de 11 de Novembro de 1985, relativo ao escoamento a preço reduzido da manteiga de intervenção destinada ao consumo directo sob a forma de manteiga concentrada(6), com a última redacção que lhe foi dada pelo Regulamento (CE) n.o 101/1999(7) e o Regulamento (CEE) n.o 429/90 da Comissão, de 20 de Fevereiro de 1990, relativo à concessão por concurso de uma ajuda à manteiga concentrada destinada ao consumo directo na Comunidade(8) com a última redacção que lhe foi dada pelo Regulamento (CE) n.o 124/1999(9) e o Regulamento (CE) n.o 2571/97. Para evitar riscos de práticas não autorizadas, é indispensável o estrito respeito das condições relativas à marcação da manteiga concentrada. Há, pois, que definir um método comum de detecção dos marcadores em causa.

(9) Nos termos do artigo 9.o do Regulamento (CE) n.o 1255/1999, pode ser concedida uma ajuda à armazenagem privada dos queijos à base de leite de ovelha. O artigo 31.o do referido regulamento estipula que pode ser concedida uma restituição especial aos produtos em causa. Prevê-se a importação na Comunidade a partir de determinados países terceiros, em condições preferenciais, de queijos à base de leite de ovelha, de leite de cabra e de leite de búfala ou de misturas de leite de ovelha, cabra e búfala. Em virtude das disposições supracitadas, é necessário verificar, mediante inspecções adequadas, que não foi incorporado leite de vaca nos produtos em causa. Consequentemente, deve estabelecer-se um método de referência comunitário para a detecção do leite de vaca, sem prejuízo da aplicação de métodos de rotina, caso sejam conformes a determinados critérios.

(10) O Regulamento (CEE) n.o 2921/90 da Comissão, de 10 de Outubro de 1990, relativo à concessão de ajudas ao leite desnatado com vista ao fabrico de caseína e de caseinatos(10), com a última redacção que lhe foi dada pelo Regulamento (CE) n.o 2654/1999(11) prevê que deve comprovar-se a ausência de coliformes. O método de referência aceite internacionalmente para a pesquisa de coliformes no leite e nos produtos lácteos é a norma internacional FIL73A: 1985. Todavia, esta norma apenas é aplicável sob uma forma modificada à detecção de coliformes numa determinada quantidade de produto. Deste modo, estabelece-se um método comunitário de referência para a detecção dos coliformes baseada na norma supracitada.

(11) O Regulamento (CEE) n.o 2658/87 do Conselho de 23 de Julho de 1987, relativo à nomenclatura pautal e estatística e à pauta aduaneira comum(12), com a última redacção que lhe foi dada pelo Regulamento (CE) n.o 254/2000(13) diferencia os níveis dos direitos aduaneiros aplicáveis aos alimentos compostos para animais abrangidos pela posição pautal 2309, em função do seu teor de produtos lácteos. De modo a garantir a aplicação uniforme das disposições em causa, há que definir um método de determinação do teor de lactose obrigatório para todos os Estados-Membros e estabelecer, para esse fim, um método de aceitação geral.

(12) O Regulamento (CE) n.o 1255/1999 estipula que devem respeitar-se determinadas condições qualitativas no que se refere à manteiga e ao leite em pó desnatado destinados a intervenção e ao leite em pó desnatado destinado à alimentação animal. É, pois, oportuno fixar métodos de referência para a verificação das referidas condições.

(13) A aplicação de alguns dos métodos introduzidos pela primeira vez pelo presente regulamento necessita de um período de adaptação, pelo que é oportuno diferir a sua aplicação.

(14) O Comité de Gestão do Leite e dos Produtos Lácteos não emitiu qualquer parecer no prazo fixado pelo seu presidente,

ADOPTOU O PRESENTE REGULAMENTO:

CAPÍTULO I

DISPOSIÇÕES GERAIS

Artigo 1.o

Objecto e âmbito de aplicação

O presente regulamento estabelece as normas de aplicação dos métodos de análise química, física, microbiológica, bem como de exame organoléptico, do leite e dos produtos lácteos no âmbito dos regimes previstos pela organização comum de mercado no sector do leite e dos produtos lácteos, estabelecida pelo Regulamento (CE) n.o 1255/1999, bem como alguns dos referidos métodos.

Artigo 2.o

Lista de métodos

1. A lista dos métodos de referência aplicáveis às análises referidas no artigo 1.o é estabelecida no anexo I.

2. A Comissão actualizará a referida lista pelo menos uma vez por ano, em conformidade com o procedimento previsto no artigo 42.o do Regulamento (CE) n.o 1255/1999.

Artigo 3.o

Métodos de rotina

Podem ser utilizados métodos de rotina para as análises previstas pela legislação comunitária, na condição de serem devidamente calibrados e regularmente aferidos em relação ao método de referência.

O procedimento constante do anexo II pode ser aplicado à verificação de resultados obtidos por métodos de rotina que sejam próximos dos limites especificados nos regulamentos em causa.

Em caso de litígio, os resultados obtidos pelo método de referência são determinantes.

Artigo 4.o

Validação dos métodos de referência

1. Um método de referência é validado se for conforme a critérios de precisão pré-estabelecidos, relativos ao limite de repetibilidade e de reprodutibilidade.

2. Se um método de referência estabelecido pelos regulamentos em causa não tiver sido validado, os Estados-Membros fixam um limite de reprodutibilidade provisório.

O referido limite é obtido em conformidade com o procedimento definido na alínea b) do anexo III. Todavia, nos dezoito meses seguintes à entrada em vigor do presente regulamento, os Estados-Membros podem utilizar um procedimento equivalente.

O respeito do limite é verificado pelo menos uma vez por ano.

3. Se os resultados da aplicação de métodos de referência validados ou de métodos com dados provisórios relativos à precisão forem superiores ao limite estabelecido, o método de avaliação dos resultados da análise descrita no anexo IV é aplicável à determinação da diferença crítica em relação ao limite em causa.

Artigo 5.o

Admissibilidade dos resultados de análise

1. As análises são efectuadas em laboratórios que aplicam um método interno de controlo da qualidade conforme ao descrito na alínea a) do anexo V, ou um método de nível comparável.

Deve encontrar-se disponível no laboratório uma descrição pormenorizada do método aplicado.

2. Os laboratórios estabelecem as suas normas internas de precisão numa série para todos os métodos, de acordo com:

a) o método definido na alínea b) do anexo V ou

b) um método validado, publicado, de repetibilidade específica.

O respeito do limite de reprodutibilidade deve ser verificado pelo menos uma vez por ano, em conformidade com o procedimento definido na alínea a) do anexo III.

O segundo parágrafo não é aplicável se, no decurso do ano, o laboratório tiver participado num programa de ensaio de aptidão.

3. O relatório laboratorial de análise deve incluir elementos suficientes para permitir a avaliação dos resultados em conformidade com os anexos IV e VIII.

4. Os resultados de uma análise são considerados admissíveis se tiverem sido obtidos de acordo com os critérios de aceitabilidade especificados no método interno de controlo da qualidade referido no n.o 1 e as normas internas de precisão referidas no n.o 2.

Artigo 6.o

Exame organoléptico

1. No que respeita à manteiga, os métodos descritos no anexo VI são aplicados para a verificação do desempenho dos provadores e da fiabilidade dos resultados. O método descrito no anexo II é aplicado como método de referência para o exame organoléptico.

2. No que respeita ao leite e aos produtos lácteos à excepção da manteiga, os Estados-Membros utilizam como método de referência para o exame organoléptico a norma FIL 99C/1997 ou a outros métodos comparáveis, que comunicam à Comissão.

Os métodos descritos no anexo VI podem ser aplicados à verificação do desempenho dos provadores e da fiabilidade dos resultados.

Artigo 7.o

Amostragem e contestação dos resultados de análise

1. Devem colher-se amostras em duplicado para a realização das análises previstas pela legislação comunitária.

2. O procedimento definido no anexo VIII é aplicável caso os resultados de uma análise não sejam aceites pelo operador.

CAPÍTULO II

MÉTODOS DE ANÁLISE

Artigo 8.o

Teor de humidade/matéria seca/matéria gorda da manteiga

1. O método de análise descrito no anexo IX é aplicado como método de referência na determinação do teor de humidade da manteiga.

2. O método de análise descrito no anexo X é aplicado como método de referência na determinação do teor de matéria seca não-gorda da manteiga.

3. O método de análise descrito no anexo XI é aplicado como método de referência na determinação do teor de matéria gorda da manteiga.

Artigo 9.o

Marcadores

1. O método de análise descrito no anexo XII é aplicado como método de referência na determinação da vanilina da manteiga concentrada, da manteiga e da nata.

2. O método de análise descrito no anexo XIII é aplicado como método de referência na determinação do teor de éster etílico do ácido β-apo-8'-caroténico da manteiga concentrada e da manteiga.

3. O método de análise descrito no anexo XIV é aplicado como método de referência na determinação do teor de estigmasterol e de β-sitosterol da manteiga e da manteiga concentrada.

4. Considera-se que a manteiga concentrada, a manteiga e a nata foram marcadas em conformidade com a legislação comunitária aplicável se os resultados obtidos corresponderem às especificações do ponto 8 dos anexos referidos nos n.os 1, 2 e 3.

Artigo 10.o

Detecção de caseína de leite de vaca

1. O método de análise descrito no anexo XV é aplicado para garantir que o queijo que deve ser produzido exclusivamente com leite de ovelha, leite de cabra ou leite de búfala, ou uma mistura de leite de ovelha, cabra e búfala, não contém caseína de leite de vaca.

Considera-se que se encontra presente caseína de leite de vaca se o teor aparente de caseína de leite de vaca da amostra a analisar for igual ou superior ao teor da amostra de referência que contém 1 % de leite de vaca, prevista no anexo XV.

2. Os métodos de rotina para a detecção de caseína de leite de vaca nos queijos referidos no n.o 1 podem ser utilizados nas seguintes condições:

a) o limite máximo de detecção deve ser de 0,5 %,

b) não podem observar-se falsos resultados positivos,

c) a caseína de leite de vaca deve ser detectável com a sensibilidade requerida, mesmo após longos períodos de maturação, nomeadamente nas condições habituais de exploração comercial.

Se a condição prevista na alínea b) não for satisfeita, todas as amostras com resultados positivos devem ser analisadas pelo método referência.

Se a exigência prevista na alínea b) não for satisfeita para um dos tipos de queijos referidos no n.o 1, o queijo em causa deve ser analisado pelo método de referência.

Artigo 11.o

Detecção de coliformes

1. O método de análise de referência descrito no anexo XVI é aplicável à detecção da presença de coliformes na manteiga, no leite em pó desnatado, na caseína e nos caseinatos.

2. Podem ser utilizados métodos de rotina para a detecção de coliformes na condição de os resultados serem comparáveis aos obtidos pelo método de referência descrito no referido anexo. Os métodos de rotina devem, nomeadamente, possuir um limite de detecção suficiente. Não podem observar-se falsos resultados negativos. Caso não seja possível excluir a ocorrência de falsos resultados positivos, todos os resultados positivos devem ser confirmados por recurso ao método de referência.

Artigo 12.o

Teor de lactose

O método de determinação do teor de lactose dos produtos incluídos na posição 2309 da nomenclatura combinada é definido no anexo XVII.

Artigo 13.o

Detecção de soro de coagulação desidratado

1. O método de detecção da presença de soro de coagulação desidratado no leite em pó desnatado destinado à armazenagem pública é definido no anexo XVIII.

2. O método de detecção da presença de soro de coagulação desidratado no leite em pó desnatado e nas misturas destinados à alimentação animal é definido no anexo XIX.

Artigo 14.o

Detecção de leitelho

O método de detecção da presença de leitelho no leite em pó desnatado é definido no anexo XX.

Artigo 15.o

Resíduos de produtos antimicrobianos

O método de determinação da presença de resíduos de antibióticos e de sulfonamidas/dapson no leite em pó desnatado é definido no anexo XXI.

Artigo 16.o

Teor de leite em pó desnatado

O método de determinação do teor de leite em pó desnatado nos alimentos compostos para animais é definido no anexo XXII.

Artigo 17.o

Detecção de amido

O método de detecção da presença de amido no leite em pó desnatado, no leite em pó desnaturado e nos alimentos compostos para animais é definido no anexo XXIII.

Artigo 18.o

Teor de humidade do leitelho ácido em pó

O método de determinação do teor de humidade do leitelho ácido em pó destinado a ser utilizado nos alimentos para animais é definida no anexo XXIV.

Artigo 19.o

Detecção de matérias gordas estranhas

O método de determinação da presença de matérias gordas estranhas nas matérias gordas lácteas é definido no anexo XXV.

CAPÍTULO III

DISPOSIÇÕES FINAIS

Artigo 20.o

Alterações do Regulamento (CE) n.o 2771/1999

O Regulamento (CE) n.o 2771/1999 é alterado do seguinte modo:

1. A primeira frase do n.o 1 do artigo 4.o passa a ter a seguinte redacção: "As autoridades competentes controlam a qualidade da manteiga por recurso aos métodos descritos no anexo I e com base em amostras colhidas de acordo com os métodos descritos no anexo IV".

2. A nota de rodapé n.o 2 do anexo I, passa a ter a seguinte redacção: Ver o anexo I do Regulamento (CE) n.o 213/2001.

3. São revogados os anexos II e III.

4. No ponto 2, antepenúltima linha, do anexo IV, os termos "no anexo III" são substituídos por "no anexo VII do Regulamento (CE) 213/2001".

Artigo 21.o

Alteração do Regulamento (CE) n.o 2799/1999

O Regulamento (CE) n.o 2799/1999 é alterado do seguinte modo

1. Os n.os 1, 2, 3 e 4 do artigo 20.o passam a ter a seguinte redacção "1. O teor de leite em pó desnatado das misturas e dos alimentos compostos é verificado através de uma análise efectuada pelo menos em duplo, em conformidade com o método descrito no anexo XXII do Regulamento (CE) n.o 213/2001, complementada pelas medidas de controlo mencionadas no n.o 3 do artigo 17.o do presente regulamento. Em caso de desacordo entre os resultados das referidas verificações, o resultado dos controlos no local é determinante.

2. A ausência de soro de coagulação desidratado é estabelecida por recurso ao método definido no anexo XIX do Regulamento (CE) n.o 213/2001.

3. O teor de amido dos alimentos compostos é estabelecido pelas medidas de controlo descritas no n.o 3 do artigo 17.o do presente regulamento, que devem ser complementadas pelo método de análise definido no anexo XXIII do Regulamento (CE) n.o 213/2001.

4. O teor de humidade do leitelho ácido em pó é determinado por recurso ao método de análise definido no anexo XXIV do Regulamento (CE) n.o 213/2001."

2. São revogados os anexos III, IV, V e VI.

Artigo 22.o

Revogações

São revogados os Regulamentos (CEE) n.o 1216/68, (CEE) n.o 3942/92, (CEE) n.o 86/94, (CE) n.o 2721/95, (CE) n.o 1854/96, (CE) n.o 1080/96, (CE) n.o 1081/96, (CE) n.o 1082/96, (CE) n.o 880/98 e (CEE) n.o 1459/98.

As referências aos regulamentos revogados consideram-se feitas ao presente regulamento.

Artigo 23.o

Entrada em vigor

O presente regulamento entra em vigor no sétimo dia seguinte ao da sua publicação no Jornal Oficial das Comunidades Europeias.

Todavia, os métodos previstos no anexo III, no ponto 4 do anexo IV e nos anexos V, VI e VIII são aplicáveis dezoito meses após a entrada em vigor do presente regulamento.

O presente regulamento é obrigatório em todos os seus elementos e directamente aplicável em todos os Estados-Membros.

Feito em Bruxelas, em 9 de Janeiro de 2001.

Pela Comissão

Franz Fischler

Membro da Comissão

(1) JO L 160 de 26.6.1999, p. 48.

(2) JO L 333 de 24.12.1999, p. 11.

(3) JO L 340 de 31.12.1999, p. 3.

(4) JO L 350 de 20.12.1997, p. 3.

(5) JO L 76 de 25.3.2000, p. 9.

(6) JO L 298 de 12.11.1985, p. 9.

(7) JO L 11 de 16.1.1999, p. 14.

(8) JO L 45 de 21.2.1990, p. 8.

(9) JO L 16 de 21.1.1999, p. 19.

(10) JO L 279 de 11.10.1990, p. 22.

(11) JO L 325 de 17.12.1999, p. 10.

(12) JO L 256 de 7.9.1987, p. 1.

(13) JO L 28 de 3.2.2000, p. 16.

ANEXO I

(Artigo 2.o)

LISTA DOS MÉTODOS DE REFERÊNCIANotas respeitantes à lista dos métodos de referência da União Europeia:

Nota 1: Isolamento da matéria gorda do leite de acordo com a descrição da Norma FIL 6B:1989 (protecção contra a luz).

Nota 2: Não foi estabelecido qualquer método de referência.

Nota 3: A amostra deve ser preparada em conformidade com a Norma FIL 122C:1996 ou a Norma FIL 73A:1985.

Nota 4: Incubação durante 48 horas a 55 °C, precauções a adoptar contra a secagem do meio de cultura.

Nota 5: % m.s.n.g. = % matéria seca - % matéria gorda.

Nota 6: A manteiga deve corresponder à classe nacional de qualidade do Estado de produção incluído no anexo V do Regulamento (CE) n.o 2771/99 da Comissão.

Nota 7: Directiva (CEE) n.o 4/84 da Comissão.

Nota 8: Regulamento (CE) n.o 1758/94 da Comissão (JO L 183 de 19.7.1994, p. 14).

Nota 9: Directiva 78/633/CEE da Comissão.

>POSIÇÃO NUMA TABELA>

>POSIÇÃO NUMA TABELA>

ANEXO II

(artigo 3.o)

VERIFICAÇÃO DOS RESULTADOS OBTIDOS POR MÉTODOS DE ROTINA QUE SE SITUAM PRÓXIMO DOS LIMITES ESTABELECIDOS PARA AS CARACTERÍSTICAS DE COMPOSIÇÃO E DE QUALIDADE ESPECIFICADAS NOS REGULAMENTOS

Seja mo um limite das características de composição e de qualidade especificadas num regulamento. O limite de decisão (L) é

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

se RRout/RRef <= 1RRout: Limite de reprodutibilidade do método de rotina

RRef: Limite de reprodutibilidade do método de reférência

Se mo for um limite superior e RRout/RRef > 1, o limite de decisão é dado pela fómula:

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

Se, nas mesmas condições, mo for um limite inferior, o limite de decisão é dado pela fórmula:

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

em que CrD95 representa a diferença crítica do método de referência (ver anexo IV).

Se mo for um limite superior, os resultados finais superiores ao limite de decisão obtidos por um método de rotina devem ser substituídos por resultados finais obtidos pelo método de referência. Esses resultados finais devem basear-se, pelo menos, no mesmo número de análises/amostra que os resultados finais obtidos pelo método de rotina.

Se mo for um limite inferior, deve aplicar-se ao mesmo procedimento aos resultados finais inferiores ao limite de decisão obtidos por um método de rotina.

Nota

O procedimento descrito supra pode ser aplicado na ausência de efeitos detectáveis devidos à matriz.

Esses efeitos podem ser detectados da seguinte forma: calcula-se, para cada amostra utilizada na calibração, a diferença (wi) entre os resultados obtidos pelo método de referência e pelo método de rotina.

O desvio-padrão, dado pela fórmula:

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

m: número de amostras utilizadas na calibração,

é comparado com a média aritmética do desvio-padrão de repetibilidade do método de referência e do método de rotina

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

Não é de excluir um efeito devido à matriz se

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em que:

f= m (f: número de graus de liberdade)

α= probabilidade de erro; α = 0,05.

Neste caso, é necessária uma investigação complementar para estabelecer o limite de decisão.

ANEXO III

(Artigos 4.o e 5.o)

a) Procedimento de determinação da conformidade com um limite de reprodutibilidade estabelecido (análise química)

A conformidade com o limite de reprodutibilidade é verificada por comparação dos resultados do laboratório em causa com os resultados de um laboratório experimentado(1), obtidos com uma amostra idêntica. Efectua-se uma determinação dupla em ambos os laboratórios, sendo os resultados avaliados de acordo com a fórmula:

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

em que:

CrD95: diferença crítica (P = 0,95)

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>: média aritmética de dois resultados obtidos no laboratório 1

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>: média aritmética de dois resultados obtidos no laboratório 2

R: limite de reprodutibilidade: a estabelecer por interpolação,

r: limite de repetibilidade: se a precisão variar em função da concentração.

Se for excedida a diferença crítica, deve realizar-se outro ensaio no prazo de dois meses. Se os resultados do segundo ensaio não forem conformes ao limite de reprodutibilidade, as autoridades competentes adoptam as medidas necessárias.

b) Procedimento para a obtenção de um limite de reprodutibilidade provisório (análise química)

O limite de reprodutibilidade provisório (Rprov) é estabelecido por recurso à seguinte equação:

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

em que:

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>: média de dois resultados obtidos no laboratório 1

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>: média de dois resultados obtidos no laboratório 2 (ver parte a) do anexo III)

r: limite de repetibilidade ou limite de repetibilidade provisório.

Notas:

1. Rprov pode ser utilizado para calcular as diferenças críticas (ver anexo VI).

2. Rprov é fixado em 2r se o valor calculado para Rprov for inferior a 2r.

3. Se o valor calculado for superior a 3r ou superior ao dobro do valor de R calculado através da equação de Horwitz(2), o valor de Rprov é excessivamente elevado e não pode ser utilizado para calcular a diferença crítica.

4. Rprov deve ser calculado pelo menos uma vez por ano, com base nos resultados obtidos em dois laboratórios (cf. anexo IV).

5. Se o valor médio de Rprov tiver de ser utilizado para calcular as diferenças críticas. As normas estabelecidas nos pontos 2 e 3 são aplicáveis ao valor médio de Rprov.

O limite de reprodutibilidade (valor R) é obtido a partir do valor RSDR calculado do seguinte modo:

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

(>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

= média aritmética dos resultados obtidos)

Exemplos de valores RSDR calculados

>POSIÇÃO NUMA TABELA>

Para uma concentração da substância a analisar de 1 g/100 g, obtém-se:

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>.

(1) Em geral, o laboratório experimentado deve ter participado com êxito tanto à validação do método de ensaio como a um ensaio de adequação.

(2) Equação de Horwitz:

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

em que:

RSDR: desvio-padrão relativo da reprodutibilidade

c: concentração expressa em fracção decimal (exemplo: 10 g/100 g = 0,1).

Referência:

Peeler, J.T., Horwitz, W. and Albert, R.

J. Ass. Off. Anal. Chem.

72 (5), 784-806 (1989).

ANEXO IV

(Artigo 4.o)

AVALIAÇÃO DOS RESULTADOS DE ANÁLISE OBTIDOS POR MÉTODOS VALIDADOS

Se o resultado de uma análise exceder um determinado limite, calcula-se a média aritmética de dois ou mais resultados, aplicando o procedimento seguinte:

1. Se a análise produzir um único resultado, efectua-se uma segunda análise em condições de repetibilidade. Se as duas análises não puderem ser efectuadas nessas condições, efectua-se uma nova análise em duplo em condições de repetibilidade, sendo os resultados obtidos utilizados para avaliar a conformidade com a diferença crítica.

2. Calcula-se o valor absoluto da diferença entre a média aritmética dos resultados obtidos em condições de repetibilidade e o limite. Une um valor absoluto da diferença, superior à diferença crítica, significa que a amostra analisada não satisfaz as condições requeridas.

A diferença crítica é calculada por recurso à seguinte fórmula:

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

em que:

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>: média aritmética dos resultados obtidos

mo: limite

n: número de análises/amostra.

Se a precisão variar em função da concentração, pode ser necessário calcular r e R por interpolação.

Em geral, os resultados finais obtidos numa amostra deve indicar o limite que foi considerado.

Apenas deverão ocorrer excepcionalmente resultados finais incluídos:

- no intervalo compreendido entre

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

e

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>, se o limite for um valor máximo;

- no intervalo compreendido entre

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

e

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>, se o limite for um valor mínimo.

Os resultados finais compreendidos nos intervalos mencionados só são aceitáveis se ocorrerem, no máximo, uma vez em cada cinco amostras analisadas por lote. Caso sejam analisadas menos de cinco amostras por remessa, um resultado compreendido no intervalo mencionado é aceitável. No entanto, a norma segundo a qual apenas um resultado compreendido nos intervalos mencionados deve ser obtido em cada cinco amostras analisadas deve ser respeitada caso as remessas sejam sistematicamente oferecidas por um produtor.

3. Caso o resultado final x seja calculado utilizando a fórmula x = y1 +- y2 (exemplo: água + teor de matéria seca isenta de gordura na manteiga, para calcular o teor de matéria gorda), sendo y1 e y2 os resultados finais de um único tipo de análise, a repetibilidade global e os limites de reprodutibilidade rx e Rx dos resultados finais x são calculados da seguinte forma:

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

sendo r1 e r2 os limites de repetibilidade e R1 e R2 os limites de reprodutibilidade de y1 e y2, respectivamente.

O valor x é comparado com o limite mo de acordo com as normas especificadas nos pontos 1 e 2. A diferença crítica é determinada através da fórmula:

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

sendo x a média aritmética dos resultados xi obtidos.

4. Caso o resultado final seja calculado utilizando uma fórmula do tipo:

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

(exemplo: teor de gordura na matéria seca do queijo)

sendo y1 e y2 os resultados finais de um único tipo de análise, a repetibilidade global e os limites de reprodutibilidade rx e Rx podem ser calculados da seguinte forma:

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

μ1: limite ou valor a atingir para y1 (exemplo: gordura)

μ2: limite ou valor a atingir para y2 (exemplo: matéria seca)

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

em que:

r1: limite de repetibilidade, y1

r2: limite de repetibilidade y2

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

em que:

R1: limite de repetibilidade, y1

R2: limite de repetibilidade y2

Os processos utilizados para calcular rx e Rx só são aplicáveis caso os limites de repetibilidade e de reprodutibilidade relativas (r*1 r*2; R*1; R*2) sejam inferiores ou iguais a 0,15.

O valor x deve ser comparado com o limite μx tal como indicado nos pontos 1 e 2. A diferença crítica é determinada utilizando a fórmula:

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

sendo

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

a média aritmética dos resultados x obtidos por ordem cronológica(1).

(1) N.B.:

Se a ordem de obtenção dos resultados for, por exemplo, y11, y12, y21, y22, e y22, deve ser calculada a média aritmética de y11/y21 e y12/y22.

ANEXO V

CONTROLO INTERNO

(Artigo 5.o)

a) Procedimento de controlo de qualidade interno (CQI) (análise química)

Definição de material de controlo

Material utilizado para o CQI e submetido, total ou parcialmente, ao mesmo processo que os materiais testados.

O material de controlo pode ser, por exemplo:

- material de referência certificado,

- material de referência interno,

- um material aprovado através de um ensaio interlaboratorial,

- um material marcado.

Processo de estabelecimento do CQI

O laboratório deve estabelecer o CQI em conformidade com o processo descrito no documento da IUPAC intitulado "Directrizes harmonizadas para o controlo interno da qualidade em laboratórios analíticos"(1).

O CQI é realizado inserindo materiais de controlo numa sequência analítica ou repetindo análise da amostra. Os materiais de controlo devem ser semelhantes, na sua composição química, às amostras a ensaiar, e ser suficientemente estáveis durante o período necessário. Deve ser demonstrado que podem ser convenientemente divididos em porções idênticas, para análise, e que a espécie a analisar se encontra numa concentração adequada para o intervalo em estudo.

Deve inserir-se material de controlo pelo menos uma vez em cada série analítica, devendo o valor obtido ser inscrito num gráfico de controlo, a fim de permitir a medição de erros a longo prazo. Além disso, o laboratório deve demonstrar, periodicamente, que respeita as condições de repetibilidade na mesma determinação. Para tal, pode repetir-se as condições de repetibilidade na mesma determinação. Para tal, pode repetir-se a análise de materiais de controlo e/ou de ensaio. Os resultados destas análises devem ser comparados com limites de repetibilidade publicados e com os dados existentes relativos à precisão no laboratório.

Quando se utilizam materiais de controlo, os valores obtidos para a análise entre determinações do material de controlo devem ser inscritos num gráfico Shewhart [ISO 8258 (1991)] utilizando limites de controlo adequados. Os limites de actuação devem ser fixados em

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>,

sendo st o desvio-padrão total,

e os limites de vigilância em

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>.

Desvio-padrão total:

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

em que:

sb: desvio-padrão entre determinações

sw: desvio-padrão na mesma determinação

n: número de determinações.

Caso não sejam utilizados materiais de controlo (p. ex., devido a uma estabilidade insuficiente), pelo menos um dos materiais de ensaio deve ser analisado em duplicado em cada determinação.

Far-se-á então um gráfico das diferenças absolutas dos resultados das análises efectuadas em duplicado na mesma determinação (ver anexo III). A curva central corresponde a 1,128 sw, o limite mínimo é 0 e o limite máximo (limite de actuação) é 3,686 sw, sendo sw o desvio-padrão na mesma determinação.

Quando existir uma grande amplitude de concentrações, o procedimento de controlo deve incluir materiais de alta e baixa concentração.

Caso exista uma grande diversidade de concentrações da espécie analisada nos materiais submetidos a ensaio, o laboratório deve estabelecer a relação entre precisão e concentração. Caso a precisão seja proporcional à concentração, o controlo deve ser realizado com base na precisão relativa (isto é, diferença absoluta expressa em percentagem do valor médio).

O sistema analítico será considerado fora de controlo caso se verifique qualquer das seguintes condições:

A. O valor actual, no gráfico, situa-se para além dos limites de actuação,

B. O valor actual e o valor anterior situam-se para além dos limites de vigilância, mas aquém dos limites de actuação,

C. Caso sejam utilizados materiais de controlo, foram registados nove valores sucessivos do mesmo lado da curva média.

Caso se verifique tal situação, o laboratório deve reagir da seguinte forma:

A. Interrupção das análises até que sejam realizados testes de diagnóstico e que sejam tomadas medidas de correcção e

B. Rejeição da série de resultados e repetição da análise dos materiais de ensaio.

b) Método de selecção do material de controlo a utilizar no laboratório e método de determinação dos limites de precisão do laboratório (análise química)

A precisão interna do laboratório pode ser determinada por repetição da análise de materiais de controlo e/ou por repetição da análise de amostras.

O processo que a seguir se indica, a título de orientação, poderá ser utilizado pelos laboratórios para estabelecer parâmetros de precisão para a variação dentro da mesma determinação e entre determinações, parâmetros que serão depois utilizados no estabelecimento de gráficos de controlo. Os laboratórios podem optar por processos alternativos, desde que possam demonstrar a fiabilidade dos dados obtidos quanto à precisão.

1. Selecção dos materiais de controlo

Caso seja indicada, num laboratório, a utilização de um material de controlo, é necessário primeiramente reunir dados que permitam o estabelecimento de limites. Sempre que possível, devem ser utilizados materiais de referência certificados (MRC). Os materiais de controlo a ensaiar devem ser analisados em condições de repetibilidade na mesma determinação, devendo incluir-se MRC adequados, com repetições e casualização. Os MRC devem ser adequados tanto no que se refere à composição da matriz como à concentração de espécie a analisar. Quando tal não for possível, os laboratórios devem tentar participar em testes de aptidão e estabelecer médias consensuais (valores atribuídos) que possam ser considerados como uma média verdadeira convencional à qual possa corresponder uma incerteza significativa. Outros processos incluem a atribuição de um valor verdadeiro através de formulação ou a utilização de materiais de controlo marcados.

Além disso, quando se tratar de um laboratório experiente na análise em questão, dispondo já de um controlo estatístico, os novos materiais de controlo (na sequência, por exemplo, do esgotamento das existências) devem ser obtidos utilizando como referência análises nas quais seja utilizado como controlo o material existente.

2. Atribuição de limites

Uma vez seleccionado o material de controlo, o laboratório deve estabelecer valores de precisão na mesma determinação e entre determinações, utilizando o material seleccionado.

A precisão na mesma determinação deve ser estabelecida analisando o material de controlo em duplicado, por doze vezes, no mínimo. A análise em duplicado deve ser realizada em condições de repetibilidade, isto é, pelo mesmo operador, com os mesmos reagentes, etc. A análise em duplicado dos materiais de controlo deve ser casualizada em cada série analítica. Cada análise em duplicado deve ser realizada num dia diferente, durante um período suficiente para a obtenção de uma variação razoável entre determinações, tendo em conta as fontes normais de variação, tais como reagentes, recalibração de instrumentos e, se for o caso, diferentes analistas.

Nota:

Chama-se a atenção para o facto de a utilização de dados que não representem adequadamente a variação entre determinações poder resultar na duplicação desnecessária de análises, devido ao estabelecimento de limites demasiado próximos. Inversamente, um laboratório que apresente dados de precisão demasiado imprecisos pode vir a ser incapaz de satisfazer os limites exigidos por métodos de referência, revelar-se insatisfatório quando comparado com laboratórios equivalentes e produzir dados inadequados para o fim pretendido.

2.1. Determinação da precisão na mesma determinação

2.1.1. Precisão na mesma determinação caso disponha de um material de controlo

Fazer primeiro um teste de variância máxima de Cochran com dados duplicados (12 duplicados, no mínimo). Neste teste é feita a comparação entre o quadrado da diferença máxima entre duplicados e a soma dos quadrados das diferenças:

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

sendo

di= diferença entre duplicados.

O valor do critério de Cochran, C, é depois comparado com valores tabelados [ISO 5725 (1994)]. Caso um valor possa ser classificado como isolado ou aberrante, deve investigar-se a razão de tal resultado: erro técnico, erro informático, engano na realização do teste, engano na amostra analisada. Se a explicação do erro técnico for tal que se verifique ser impossível substituir o resultado suspeito, esse resultado deve ser considerado como realmente aberrante, devendo ser rejeitado. Caso subsistam resultados isolados ou aberrantes para os quais não se encontre explicação, os resultados isolados devem ser considerados correctos e conservados e os resultados estatisticamente aberrantes devem ser rejeitados. O laboratório deve procurar obter valores que os substituam.

Quando p laboratório estiver seguro de que os dados não incluem resultados aberrantes, o desvio-padrão na mesma determinação, Sw, obtém-se do seguinte modo:

Para cada par p de dados duplicados Xi1, Xi2, calcular a soma dos duplicados,

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

e a diferença dos duplicados,

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

e adicioná-los.

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

A estimativa do desvio-padrão na mesma determinação será:

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

O limite de precisão do laboratório é 2,8 sw.

Caso se utilize um método de referência, o limite de precisão do laboratório deve ser comparado com o limite de repetibilidade publicado. O laboratório deve satisfazer as exigências do método de referência; se assim não for, as causas devem ser investigadas.

Os limites estabelecidos nesse caso devem ser considerados provisórios e passíveis de alteração.

2.1.2. Precisão na mesma determinação caso ao se disponha de um material de referência

O laboratório pode decidir estabelecer a precisão na mesma determinação através da análise em duplicado de amostras de ensaio representativas (12 análises duplicadas no mínimo). Caso não seja possível utilizar materiais de controlo, por razões de instabilidade, por exemplo, devem reunir-se dados duplicados obtidos por este método.

Nota:

Parte-se do princípio de que as análises abrangem uma gama de valores relativamente reduzida e que, por conseguinte, pode ser aplicado um valor único a todas as amostras. Caso a amplitude de resultados seja maior - por exemplo, mais de uma ordem de grandeza - e a precisão seja dependente do nível, os laboratórios devem analisar a utilização de desvios-padrão relativos.

Deve ser feito um teste de Cochran tal como indicado em 2.1.1. Caso o laboratório esteja seguro de que os dados não contêm resultados aberrantes, o desvio-padrão na mesma determinação e o limite de precisão no laboratório podem ser calculados como indicado no ponto 2.1.1.

O desvio-padrão na mesma determinação, Sw, pode ser utilizado para elaborar gráficos de controlo (ver anexo II). Os limites estabelecidos devem ser considerados provisórios e passíveis de alteração.

2.2. Determinação da precisão entre séries de leitura

Calcular o valor médio (S1/2) para cada par e submeter os valores encontrados a um teste de Grubbs [ISO 5725 (1994)]. O critério de rejeição ou aceitação de valores aberrantes ou isolados é o descrito no ponto 2.1.1. O laboratório deve tentar obter valores que substituam os resultados eliminados. Caso o laboratório esteja seguro de que os dados não contêm resultados aberrantes, o desvio-padrão entre determinações, sb, é calculado da seguinte forma:

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

ou considerado nulo caso o radicando seja negativo.

O desvio-padrão total, st, é utilizado para elaborar gráficos de controlo de média de n determinações (ver anexo II). Os limites estabelecidos devem ser considerados provisórios e passíveis de alteração.

3. Revisão dos limites estabelecidos inicialmente

Os limites de controlo estabelecidos da forma indicada supra devem ser considerados como estimativas iniciais.

Para a actualização de limites estabelecidos com base num valor aceitável de precisão na mesma determinação (ponto 2.1.2) deve repetir-se a análise de amostras em duplicado. O intervalo para a revisão dos limites dependerá, em certa medida, da frequência das análises. A título de orientação, deve proceder-se a uma revisão dos dados após obtenção de 10 duplicados adicionais. Todos os dados devem então ser submetidos a um teste de Cochran, estabelecendo-se novos limites com base no novo valor de desvio-padrão. Qualquer decisão posterior quanto à validade dos limites de controlo deve basear-se em novos dados.

A revisão dos valores inicialmente estabelecidos para a precisão entre determinações dependerá também da frequência das análises. A título de indicação, após a obtenção de 10 pontos adicionais resultantes da análise de material de controlo, com uma frequência de 1 análise por lote, deve proceder-se à revisão a estimativa inicial do desvio-padrão e da média.

Todos os dados devem ser submetidos ao teste de Grubbs para detecção de valores aberrantes. A média e o desvio-padrão devem ser novamente calculados com base nos novos dados.

Além disso, o laboratório deve, nessa altura, utilizar um gráfico de somas acumuladas [BS S700: (1984) e alteração 5480 (1987)] para detectar eventuais problemas ligados, por exemplo, ao envelhecimento dos reagentes. Qualquer resultado que exceda os limites da máscara em forma de V deve ser investigado.

Os novos limites (média e desvio-padrão) devem ser regularmente analisados pelo método das somas acumuladas. Qualquer indício de que a validade do material de controlo deva ser posta em questão deve ser investigado de forma exaustiva.

4. Apresentação dos dados de precisão

Devem ser fornecidas as seguintes informações à autoridade nacional competente:

- método utilizado

- desvio-padrão na mesma determinação, sw, e limite de precisão do laboratório

- desvio-padrão entre determinações, sb

- desvio-padrão total, s1

- número de análises utilizadas na obtenção dos dados relativos à precisão.

(1) M. Thompson and R. Wood: "Pure and Applied Chemistry" 67 (4), 649-666 (1995).

ANEXO VI

(Artigo 6.o)

AVALIAÇÃO DE PROVADORES E FIABILIDADE DOS RESULTADOS DE EXAMES ORGANOLÉPTICOS

Indicam-se a seguir os processos aplicáveis caso se utilizem métodos que incluam um sistema de pontuação (IDF - norma 99C/1997).

a) Determinação do "índice de repetibilidade"

Pelo menos dez amostras devem ser analisadas em duplicado por um provador, em teste cego, num período de 12 meses. Normalmente, a análise será feita em várias sessões. Os resultados respeitantes às características individuais do produto são avaliados utilizando a seguinte fórmula:

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

em que:

wI: índice de repetibilidade

xi1: pontuação da primeira avaliação da amostra xi

xi2: pontuação da segunda avaliação da amostra xi

n: número de amostras.

Nas amostras a avaliar deve estar representada uma grande variedade em termos de qualidade. O valor wI não deve exceder 1,5 (numa escala de 5 pontos).

b) Determinação do "índice de desvio"

Este índice deve ser utilizado para verificar se um provador utiliza a mesma escala de avaliação da qualidade que um grupo de provadores experientes. As pontuações atribuídas pelo provador são comparadas com a média das pontuações atribuídas pelo grupo de provadores.

A avaliação dos resultados é feita utilizando a seguinte fórmula:

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

em que:

xi1; xi2: ver alínea a)

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>;

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>: pontuação média atribuída pelo grupo de provadores na primeira e segunda avaliação da amostra xi, respectivamente

n: número de amostras (pelo menos 10 amostras em 12 meses).

Nas amostras a avaliar deve estar representada uma grande variedade em termos de qualidade. O valor D1 não deve exceder 1,5 (numa escala de 5 pontos).

Pede-se aos Estados-Membros que comuniquem as dificuldades que encontraram na aplicação deste método.

c) Comparação dos resultados obtidos em diferentes regiões do mesmo Estado-Membro e em diferentes Estados-Membros

Pelo menos uma vez por ano será organizado um ensaio que permita comparar os resultados obtidos pelos provadores de diferentes regiões, se for o caso. Caso sejam detectadas diferenças significativas, devem ser tomadas as medidas necessárias para identificar as razões dessas diferenças e para conseguir resultados comparáveis.

Os Estados-Membros são encorajados a organizar ensaios comparativos dos resultados obtidos pelos seus próprios provadores e pelos provadores de Estados-Membros vizinhos. Caso sejam detectadas diferenças significativas deve ser efectuado um estudo aprofundado, a fim de conseguir resultados comparáveis.

Pede-se aos Estados-Membros que notifiquem a Comissão dos resultados dos referidos ensaios comparativos.

ANEXO VII

(Artigo 6.o)

EXAME ORGANOLÉPTICO DA MANTEIGA

1. Objectivo

O presente método tem por objectivo estabelecer um método uniforme de exame organoléptico da manteiga aplicável em todos os Estados-Membros.

2. Definições

Entende-se por:

Exame organoléptico (avaliação), a apreciação das características de um produto pelos órgãos dos sentidos.

Júri, um grupo de provadores seleccionados que trabalha, durante a avaliação, sem comunicar e sem exercer quaisquer influências entre si.

Pontuação, a avaliação organoléptica pelo júri, utilizando uma escala numérica. Deve ser utilizada a nomenclatura relativa aos defeitos.

Classificação, uma avaliação qualitativa realizada com base na pontuação.

Controlo documental, os documentos utilizados para registar as pontuações individuais respeitantes a cada atributo e a classificação final do produto. (Este documento pode ser também utilizado para registar a composição química).

3. Sala de prova

3.1. Devem ser enviados esforços para que os provadores na sala de prova não sejam influenciados por factores externos.

3.2. A sala de prova deve estar isenta de cheiros estranhos e ser de fácil limpeza. As paredes devem ser de cor clara.

3.3. A sala de prova e a respectiva iluminação devem ser tais que as propriedades dos produtos a examinar não sejam afectadas. A sala deve estar equipada com um dispositivo adequado de controlo da temperatura.

4. Selecção dos provadores

O provador deve estar familiarizado com produtos à base de manteiga e ter competência para realizar o exame organoléptico. Essa competência deve ser avaliada regularmente (pelo menos uma vez por ano) pela autoridade competente.

5. Exigências relativas ao júri

O número de provadores do júri deve ser ímpar, não podendo ser inferior a três. Os provadores, na sua maioria, devem ser funcionários da autoridade competente. Após um período de transição de dois anos, o júri deve consistir em, pelo menos, três provadores oficiais.

Antes da avaliação, deve atender-se a diversos factores, de modo a optimizar o desempenho dos provadores:

- Os provadores não devem padecer de nenhuma doença que possa afectar o seu desempenho. No caso contrário, é conveniente incluir outro provador no painel.

- Os provadores devem apresentar-se com pontualidade para participar na avaliação e assegurar-se de que dispõem de tempo suficiente para efectuar a mesma.

- Os provadores devem evitar a utilização de produtos fortemente odoríferos, tais como perfumes, loções aftershave, desodorizantes, e comer alimentos fortemente aromatizados, tais como especiarias.

- Os provadores não podem fumar, comer, nem beber qualquer líquido, com excepção de água, na meia-hora que precede a avaliação.

6. Avaliação do valor de cada atributo

6.1. O exame organoléptico deve ser realizado relativamente aos três atributos seguintes: aspecto, consistência e flavour.

O aspecto abrange as seguintes características: cor, pureza aparente, desenvolvimento de fungos e dispersão de água.

A consistência abrange as seguintes características: firmeza e aptidão para barrar.

Podem ser utilizados métodos físicos na avaliação da consistência da manteiga. A Comissão prevê a harmonização futura destes métodos.

O "flavour" envolve as seguintes características: sabor e cheiro.

Um desvio significativo da temperatura recomendada impossibilita uma avaliação fiável da consistência e do flavour. Por conseguinte, a temperatura é de importância capital.

6.2. Cada atributo deve ser examinado organolepticamente de forma separada. A pontuação é atribuída de acordo com o quadro 1.

6.3. Pode ser desejável que os provadores atribuam pontuação em conjunto, antes de iniciar o exame, relativamente a uma ou mais amostras de referência quanto ao aspecto, consistência e flavour, de modo a obter uniformidade.

6.4. A pontuação para a aceitação é a seguinte:

>POSIÇÃO NUMA TABELA>

Quando não seja obtida a pontuação necessária, deve ser apresentada uma descrição dos defeitos verificados. A pontuação atribuída por cada provador relativamente a cada atributo deve ser registada num documento de controlo. O produto é aceite ou rejeitado com base num decisão adoptada por maioria. Não podem ocorrer frequentemente casos em que as diferenças entre a pontuação individual relativa a cada atributo seja superior a um ponto (uma vez por vinte amostras, no máximo). Neste caso, a competência do júri deve ser verificada pelo leader do júri.

7. Controlo

O leader do júri deve ser um funcionário oficial da autoridade competente; deve ser um membro do júri, responsabilizando-se de forma geral por todo o processo. Compete-lhe registar as pontuações individuais para cada atributo no documento de controlo e verificar se o produto é aceite ou rejeitado.

8. Amostragem e preparação da amostra

8.1. - É aconselhável que a identidade das amostras não seja divulgada durante a avaliação, de forma a evitar qualquer eventual influência.

- esta tarefa deve ser organizada pelo leader do júri, antes da avaliação, sem que estejam presentes os restantes membros do júri.

8.2. Quando o exame organoléptico é efectuado no armazém frigorífico, a amostra é colhida utilizando uma sonda para manteiga. Se o exame organoléptico for efectuado noutro local que não o armazém frigorífico, devem ser colhidos, pelo menos, 500 g de amostra.

8.3. Durante o exame, a manteiga deve estar a uma temperatura compreendida entre 10 e 12 °C. É fundamental evitar grandes desvios.

9. Nomenclatura

Ver quadro 2 em anexo.

Quadro 1: pontuação da manteiga

>POSIÇÃO NUMA TABELA>

>POSIÇÃO NUMA TABELA>

>POSIÇÃO NUMA TABELA>

Quadro 2: Nomenclatura dos defeitos da manteiga

I. Aspecto

1. Aquosa, gotas de água visíveis

2. Não homogénea, bicolor

3. Raiada

4. Marmoreada

5. Manchada

6. Separação de óleo

7. Coloração demasiado intensa

8. Inclusão de ar aparente

9. Granulosa

10. Matérias estranhas

11. Bolorenta

12. Sal mal dissolvido

II. Consistência

14. Pasta, quebradiça, grumosa

15. Pastosa, pomada

16. Colante

17. Dura

18. Mole

III. Flavour

20. Falta de aroma

21. Impura(1)

22. Sabor estranho

23. Sabor a velho

24. Sabor a queijo

Sabor a queijo ácido

25. Ácida

26. Fermentada

27. a) Sabor a cozido

b) Sabor a queimado

28. Sabor a bolor

29. Rançosa

30. Sabor a óleo de peixe

31. Sebosa

32. a) Sabor a oxidado

b) Sabor metálico

33. Sabor a forragem

34. Acre, amarga

35. Demasiado salgada

36. Sabor a bolor, pútrido

37. Sabor a malte

38. Sabor a produtos químicos

(1) Esta designação deve ser utilizada o mais raramente possível e apenas quando não seja possível uma definição mais precisa.

ANEXO VIII

(Artigo 7.o)

MÉTODO APLICÁVEL EM CASOS DE CONTESTAÇÃO DE RESULTADOS ANALÍTICOS (ANÁLISE QUÍMICA)

1. Pode ser efectuada uma nova análise a pedido do operador nos 7 dias úteis seguintes à comunicação dos resultados da primeira análise, desde que existam duplicados das amostras, selados e armazenados de forma adequada por organismos competentes.

2. O operador pode enviar as referidas amostras a um segundo laboratório. Esse laboratório deve estar autorizado a efectuar análises oficiais e ser reconhecido como competente para a realização das análises em questão. A competência do laboratário deve ser reconhecida com base na participação bem sucedida em estudos interlaboratoriais, em testes de aptidão ou em comparações interlaboratoriais. O segundo laboratório deve utilizar o método de referência. Os resultados obtidos pelos dois laborátoios são avaliados do seguinte modo:

a) Se os dois laboratórios satisfizerem as exigências de repetibilidade e de reprodutibilidade

O resultado final registado será a média aritmética dos resultados do ensaio obtidos pelos dois laboratórios. Este resultado final é avaliado tendo em conta a diferença crítica, utilizando a seguinte fórmula:

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

em que:

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>: média aritmética de todos os resultados obtidos por ambos os laboratórios

mo: limite

R: reprodutibilidade

r: repetibilidade

n1: número de resultados obtidos pelo laboratório 1

n2: número de resultados obtidos pelo laboratório 2.

Nota:

Caso o resultado final seja calculado utilizando as fórmulas

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

ou

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

ver, (respectivamente, pontos 3 e 4 do anexo IV), deve substituir-se, nas fórmulas, R2 e r2 por R2x e r2x.

b) Se ambos os laboratórios satisfazerem as exigências de repetibilidade mas não estiverem satisfeitas as exigências de reprodutibilidade

A remessa é rejeitada, caso os resultados de ambos os laboratórios conduzam a tal decisão. Caso contrário, o lote é aceite.

c) Se apenas um laboratório satisfizer as exigências de repetibilidade

A decisão de aceitação do lote basear-se-á no resultado final do laboratório que satisfaz as exigências de repetibilidade.

d) Se nenhum dos laboratórios satisfizer as exigências de repetibilidade mas estiverem preenchidas as exigências de reprodutibilidade

Aplica-se o disposto na alínea a).

e) Se nenhum dos laboratórios satisfizer as exigências de repetibilidade e não estiverem preenchidas as exigências de reprodutibilidade

A remessa é aceite, caso os resultados obtidos por um dos laboratórios conduzam a tal conclusão.

f) Se os resultados tiverem sido obtidos utilizando métodos não validados

A remessa é aceite, caso os resultados obtidos por um dos laboratórios conduzam a tal conclusão.

3. Os resultados da segunda análise são comunicados ao operador pela autoridade competente, num prazo tão curto quanto possível. Caso a quantidade sujeita a análise seja rejeitada, o custo da segunda análise é suportado pelo operador.

4. Se o operador provar a inadequação do processo de amostragem utilizado, a amostragem deve ser repetida nos cinco dias úteis seguintes à recolha das amostras iniciais, na medida do possível. Caso não seja possível proceder a uma nova amostragem, a quantidade sujeita a análise é aceite.

ANEXO IX

(Artigo 8.o)

DETERMINAÇÃO DO TEOR DE ÁGUA DA MANTEIGA

1. Objecto e campo de aplicação

Este método de referência descreve um processo de determinação do teor de água na manteiga.

2. Referência

Norma IDF 50 C: 1995 - Milk and milk products - Methods of sampling.

3. Definições

Teor de água da manteiga: perda de massa depois de completado o processo de aquecimento descrito nesta norma. É expresso em gramas por 100 g.

4. Resumo do processo

Evaporação da água de uma toma da amostra numa estufa, na presença de pedra-pomes, à temperatura de 102 °C.

5. Aparelhos e utensílios

Material corrente de laboratório e, especificamente:

5.1. Balança analítica (sensibilidade: 1 mg).

5.2. Exsicador, com um agente exsicante eficaz (por exemplo, síliga-gel com um indicador higroscópico, recentemente desidratada).

5.3. Estufa de secagem com ventilação, termostatizada e funcionamento a 102 °C ± 2 °C em todo o espaço de trabalho.

5.4. Cápsulas de vidro, porcelana ou metal não corrosivo com cerca de 20 mm de altura e 60 a 80 mm de diâmetro.

5.5. Pedra-pomes granulada, lavada, com 0,8-10 mm de diâmetro.

6. Colheita de amostras

Ver a norma IDF 50 C: 1995.

7. Técnica

7.1. Preparação da amostra

Aquecer ligeiramente a amostra num recipiente adequado de plástico ou vidro, fechado, com metade a dois terços da sua capacidade ocupados, até uma temperatura à qual a manteiga esteja suficientemente amolecida para poder ser bem homogeneizada por agitação mecânica ou manual vigorosa. A temperatura a que decorre a agitação não será normalmente superior a 35 °C. Arrefecer a amostra até à temperatura ambiente. Uma vez concluído o arrefecimento, abrir o recipiente que contém a amostra e remexer brevemente (no máximo durante 10 s) a manteiga com um utensílio apropriado (por exemplo, colher ou espátula) antes de pesagem.

7.2. Determinação do teor de água

7.2.1. Colocar aproximadamente 10 g de pedra-pomes na cápsula (5.4).

7.2.2. Secar a cápsula com a pedra-pomes na estufa (5.3) a 102 ° ± 2 °C durante pelo menos 1 h.

Nota:

Os períodos de secagem referidos em 7.2.2, 7.2.5 e 7.2.7 começam a ser contados quando a temperatura na estufa atinge 102 °C ± 2 °C.

7.2.3. Deixar a cápsula arrefecer no exsicador (5.2) até à temperatura do compartimento das balanças e pesar com a precisão de 1 mg.

7.2.4. Depositar na cápsula uma toma da amostra de aproximadamente 5 g, pesada com a precisão de 1 mg.

7.2.5. Secar a cápsula na estufa a 102 °C ± 2 °C durante 3 h.

7.2.6. Deixar a cápsula arrefecer no exsicador até à temperatura do compartimento das balanças e pesar com a precisão de 1 mg.

7.2.7. Repetir o processo de secagem durante períodos suplementares de 1 h, arrefecendo e pesando de cada vez como descrito em 7.2.6 até massa constante (variação de massa não superior a 1 mg).

Se a massa aumentar, utilizar nos cálculos a menor das massas registadas.

8. Resultados

8.1. Método e fórmula de cálculo

O teor de água, W, em percentagem mássica é calculado pela seguinte fórmula:

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

em que:

>POSIÇÃO NUMA TABELA>

8.2. Repetibilidade

A diferença absoluta entre os resultados de duas determinações singelas, efectuadas em simultâneo ou uma imediatamente a seguir à outra pelo mesmo analista, nas mesmas condições e com o mesmo material, não deve exceder 0,2 %.

8.3. Reprodutibilidade

A diferença absoluta entre dois resultados singelos independentes, obtidos por dois analistas em laboratórios diferentes com material idêntico, não deve exceder 0,3 %.

9. Relatório

O relatório deve especificar o método utilizado e os resultados obtidos e fazer refêrencia a todos os aspectos operacionais não mencionados nesta norma internacional ou entendidos como opcionais. Também devem ser referidos todos os incidentes que possam ter influenciado os resultados. O relatório deve conter ainda todos os elementos necessários à identificação completa da amostra.

ANEXO X

(Artigo 8.o)

DETERMINAÇÃO DO TEOR DE RESÍDUO SECO ISENTO DE MATÉRIA GORDA DA MANTEIGA

1. Objecto e campo de aplicação

Esta norma descreve um processo de determinação do teor de resíduo seco isento de matéria gorda na manteiga.

2. Referências

Norma IDF 50 C: 1995 - Milk and milk products - Methods of sampling.

3. Definições

Teor de resíduo seco isento de matéria gorda da manteiga: percentagem mássica das substâncias determinadas pelo método descrito. É expresso em gramas por 100 g.

4. Resumo do processo

Evaporação da água de uma massa conhecida de manteiga, extracção da matéria gorda com éter de petróleo e pesagem do resíduo.

5. Reagentes

Éter de petróleo com intervalo de destilação entre 30 °C e 60 °C. A evaporação de 10 ml deste reagente não deve produzir mais de 1 mg de resíduos.

6. Aparelhos e utensílios

6.1. Balança analítica (sensibilidade: 1 mg).

6.2. Exsicador, comum agente exsicante eficaz (por exemplo, sílica-gel com um indicador higroscópico, recentemente desidratada).

6.3. Estufa de secagem com ventilação, termostatizada e funcionamento a 102 °C +- 2 °C em todo o espaço de trabalho.

6.4. Cápsulas de vidro, porcelana ou metal não corrosivo com cerca de 20 mm de altura e 60 a 80 mm de diâmetro, acompanhadas de uma vareta de vidro.

6.5. Cadinho filtrante de vidro sinterizado e diâmetro dos poros compreendido entre 16 e 40 μm, equipado com um frasco de sucção.

7. Colheita de amostras

Ver a norma IDF 50 C:1995.

8. Técnica

8.1. Preparação da amostra

Aquecer ligeiramente a amostra num recipiente adequado de plástico ou vidro, fechado, com metade a dois terços da sua capacidade ocupados, até uma temperatura à qual a manteiga esteja suficientemente amolecida para poder ser bem homogeneizada por agitação mecânica ou manual vigorosa. A temperatura a que decorre a agitação não será normalmente superior a 35 °C. Arrefecer a amostra até à temperatura ambiente. Uma vez concluído o arrefecimento, abrir o recipiente que contém a amostra e remexer brevemente (no máximo durante 10 s) a manteiga com um utensílio apropriado (por exemplo, colher ou espátula) antes da pesagem.

8.2. Determinação

8.2.1. Secar a cápsula com a vareta (6.4) e o cadinho (6.5) na estufa (6.3) durante 1 h. Deixar arrefecer no exsicador e pesar todos estes objectos (cápsula, vareta e cadinho) em conjunto com a precisão de 1 mg (m0).

Notas:

- Regra geral, é suficiente um período de arrefecimento de 45 minutos.

- Se forem analisadas em conjunto mais do que uma toma, é importante que seja utilizada a mesma combinação cápsula, vareta e cadinho para cada toma de amostra.

8.2.2. Retirar o cadinho e registar a massa da cápsula e da vareta em conjunto, com a precisão de 1 mg (m1).

8.2.3. Depositar na cápsula uma toma de amostra (8.1) de aproximadamente 5 g, pesada com a precisão de 1 mg (m2).

8.2.4. Secar a cápsula (com a vareta e a toma de manteiga) na estufa a 102 °C +- 2 °C durante uma noite.

8.2.5. Deixar a cápsula (8.2.3) arrefecer até à temperatura ambiente.

8.2.6. Deitar 15 ml de éter de petróleo ligeiramente aquecido (aproximadamente 25 °C) na cápsula e, com a vareta de vidro, destacar o máximo de sedimento possível que esteja aderente à cápsula. Transferir o solvente para o cadinho e filtrar para o frasco de sucção.

8.2.7. Efectuar quatro vezes a operação descrita em 8.2.6 Se, durante a quarta lavagem, já não houver vestígios de matéria gorda na superfície da cápsula, transferir quantitativamente o máximo possível de sedimento para o cadinho. Caso contrário, repetir a operação descrita em 8.2.6 até eliminação completa de todos os vestígios de matéria gorda.

8.2.8. Lavar o sedimento retido no cadinho com 25 ml de éter de petróleo ligeiramente aquecido.

8.2.9. Secar a cápsula, a vareta de vidro e o cadinho, em conjunto, na estufa a 102 °C +- 2 °C durante 30 minutos.

8.2.10. Deixar arrefecer no exsicador até à temperatura ambiente e pesar com a precisão de 1 mg.

8.2.11. Repetir as operações descritas em 8.2.9 e 8.2.10 até massa constante (m3) - variação da massa conjunta da cápsula, da vareta e do cadinho não superior a 1 mg.

9. Resultados

9.1. Cálculo do teor de resíduo seco isento de matéria gorda

O teor de resíduo seco isento de matéria gorda, SNF, em percentagem mássica é calculado pela seguinte fórmula:

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

em que:

m é a massa, em grama, da cápsula vazia com a vareta de vidro e o cadinho (8.2.1)

m1 é a massa, em grama, da cápsula vazia com a vareta de vidro (8.2.2)

m2 é a massa, em grama, da toma de amostra, da cápsula e da vareta de vidro (8.2.3)

m3 é a massa final, em grama, da cápsula, da vareta de vidro e do cadinho com o sedimento retido (8.2.11 )

Os resultados são arredondados às décimas.

9.2. Repetibilidade

A diferença absoluta entre os resultados de duas determinações singelas, efectuadas em simultâneo ou uma imediatamente a seguir à outra pelo mesmo analista, nas mesmas condições e com o mesmo material, não deve exceder 0,1 %.

9.3. Reprodutibilidade

A diferença absoluta entre dois resultados singelos independentes, obtidos por dois analistas em laboratórios diferentes com material idêntico, não deve exceder 0,2 %.

10. Relatório

O relatório deve especificar o método utilizado e os resultados obtidos e fazer referência a todos os aspectos operacionais não mencionados nesta norma internacional ou entendidos como opcionais. Também devem ser referidos todos os incidentes que possam ter influenciado os resultados. O relatório deve conter ainda todos os elementos necessários à identificação completa da amostra.

Nota:

>POSIÇÃO NUMA TABELA>

Os valores dos parâmetros de precisão obtidos para o método de determinação do teor de resíduo seco isento de matéria gorda são, portanto, válidos para o método de determinação do teor de resíduo seco isento de matéria gorda lácteo.

ANEXO XI

(Artigo 8.o)

DETERMINAÇÃO DO TEOR DE MATÉRIA GORDA DA MANTEIGA

O teor de matéria gorda é obtido indirectamente a partir dos valores determinados para os teores de água e de resíduo seco isento de matéria gorda pelos métodos descritos nos anexos IX e X, respectivamente. A percentagem mássica de matéria gorda é igual a:

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

>POSIÇÃO NUMA TABELA>

>POSIÇÃO NUMA TABELA>

ANEXO XII

(Artigo 9.o)

DETERMINAÇÃO DO TEOR DE VANILINA NA MANTEIGA CONCENTRADA, NA MANTEIGA OU NA NATA POR CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA

1. Objecto e campo de aplicação

O presente método descreve um procedimento para a determinação quantitativa de vanilina na manteiga, na manteiga concentrada e na nata.

2. Princípio

Extracção de uma determinada quantidade de amostra com uma mistura isopropanol/etanol/acetonitrilo (1:1:2). Precipitação da maior parte da matéria gorda por refrigeração (temperatura compreendida entre - 15 e - 20 °C), seguida de centrifugação.

Após diluição com água, determinação do teor de vanilina por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC).

3. Equipamento

Material de laboratório de uso corrente, nomeadamente o seguinte:

3.1. Congelador adequado a uma amplitude de temperatura compreendida entre - 15 e - 20 °C.

3.2. Seringas descartáveis de 2 ml.

3.3. Microfiltros de membranas (diâmetro dos poros: 0,45 μm), resistentes a uma solução que contenha 5 % de solução de extracção (4.4).

3.4. Sistema de cromatografia líquida constituído por uma bomba (caudal 1,0 ml/min), um injector (injecção automática ou manual de porções de 20 μl,), um detector de ultravioletas (para funcionamento a 306 nm, 0,01 AU totalidade da escala), um registador ou integrador, bem como uma câmara termostática para funcionamento a 25 °C.

3.5. Coluna analítica (250 mm x 4,6 mm ID) preenchida com a fase LiChrospher RP 18 (Merck, 5 μm) ou equivalente.

3.6. Pré-coluna (cerca de 20 mm x 3 mm ID) preenchida, a seco, com a fase Perisorb RP 18 (30 à 40 μm) ou equivalente.

4. Reagentes

Todos os reagentes utilizados devem ser de qualidade analítica reconhecida.

4.1. Isopropanol.

4.2. Etanol a 96 % (v/v).

4.3. Acetonitrilo.

4.4. Solução de extracção.

Misturar isopropanol (4.1), etanol (4.2) e acetonitrilo (4.3) na proporção 1:1:2 (v/v).

4.5. Vanilina (4-hidroxi-3-metoxibenzaldeído).

4.5.1. Solução-mãe de vanilina (= 500 μg/ml).

Pesar, com aproximação a 0,1 mg, cerca de 50 mg (mg CM) de vanilina (4.5) num balão aferido de 100 ml, adicionar 25 ml de solução de extracção (4.4) e completar com água.

4.5.2. Solução-padrão de vanilina (= 10 μg/ml).

Através de uma pipeta, introduzir 5 ml de solução-mãe de vanilina (4.5.1) num balão aferido de 250 ml e completar com água.

4.6. Metanol de qualidade para HPLC.

4.7. Ácido acético glacial.

4.8. Água de qualidade para HPLC.

4.9. Fase móvel para HPLC.

Misturar 300 ml de metanol (4.6) com cerca de 500 ml de água (4.8) e 20 ml de ácido acético (4.7) num balão aferido de 1000 ml, completando o volume com água (4.8). Filtrar com um filtro de 0,45 μm (3.3).

5. Procedimento

5.1. Preparação da amostra de ensaio

5.1.1. Manteiga

Aquecer a amostra até a mesma começar a fundir. Evitar o sobreaquecimento parcial da amostra a mais de 40 °C. Quando a amostra se tornar suficientemente plástica, homogenizá-la por agitação. Mexer a manteiga durante 15 s antes de tomar uma porção. Introduzir num balão aferido de 100 ml uma porção de cerca de 5 g (g SM) de manteiga e pesar com aproximação a 1 mg.

5.1.2. Manteiga concentrada

Imediatamente antes da amostragem, colocar numa estufa a 40-50 °C o recipiente que contém a manteiga concentrada até à fusão completa da mesma. Misturar a amostra agitando-a ou mexendo-a; evitar a formação de bolhas de ar. Introduzir num balão aferido de 100 ml cerca de 4 g (g SM) de manteiga concentrada e pesar com aproximação a 1 mg.

5.1.3. Nata

Aquecer a amostra em banho-maria ou numa estufa a uma temperatura de 35 à 40 °C. Repartir a gordura de forma homogénea por agitação e, se necessário, mexendo-a. Arrefecer a amostra rapidamente (20 +- 2 °C). A amostra deve apresentar um aspecto homogéneo; em caso contrário, recomeçar a operação. Introduzir num balão aferido de 100 ml cerca de 10 g (g SM) de nata e pesar com aproximação a 1 mg.

5.2. Preparação da solução de ensaio

Adicionar cerca de 75 ml de solução de extracção (4.4) à toma de ensaio (5.1.1, 5.1.2 ou 5.1.3), agitar ou sacudir vigorosamente durante cerca de 15 min e completar o volume com a solução de extracção (4.4). Transferir cerca de 10 ml do extracto obtido para um tubo de ensaio munido de rolha. Colocar o tubo de ensaio no congelador (3.1) e deixar repousar durante cerca de 30 min. Centrifugar o extracto frio durante cerca de 5 minutos a cerca de 2000 rpm e decantar de imediato. Deixar arrefecer à temperatura ambiente a solução decantada. Introduzir com uma pipeta 5 ml da solução decantada num balão aferido de 100 ml e completar o volume com água. Filtrar uma alíquota com um microfiltro de membrana (3.3). O filtrado encontra-se pronto para a determinação por HPLC.

5.3. Calibração

Introduzir com uma pipeta 5 ml de solução-padrão de vanilina (4.5.2) num balão aferido de 100 ml. Adicionar 5 ml de solução de extracção (4.4) e completar com água até à marca. A solução resultante contém 0,5 μg/ml de vanilina.

5.4. Determinação por HPLC

Estabilizar o sistema cromatográfico durante cerca de 30 minutos. Injectar a solução-padrão (5.3) e repetir o processo até que a diferença entre as áreas ou as alturas dos picos correspondentes a duas injecções consecutivas seja inferior a 2 %. Nas condições descritas, o tempo de retenção da vanilina é cerca de 9 minutos. Analisar a solução-padrão (5.3) em duplicado, injectando um volume de 20 μl. Injectar 20 μl das soluções a analisar (5.2). Determinar a área ou a altura de cada pico de vanilina obtido. Repetir o duplicado da solução-padrão (5.3) após 10 injecções de soluções a analisar (5.2).

6. Cálculo dos resultados

Calcular a área (ou a altura) média (AC) dos picos da vanilina correspondentes às injecções em duplicado que delimitam cada lote de soluções a analisar (quatro áreas no total).

Calcular o factor de resposta (R):

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

em que CM representa a massa de vanilina expressa em mg (4.5.1).

O teor (mg/kg) de vanilina (C) da amostra de ensaio é dado pela seguinte fórmula:

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

em que:

AS= superfície do pico correspondente à vanilina da amostra de ensaio,

SM= massa da amostra de ensaio expressa em g (5.1.1, 5.1.2 ou 5.1.3).

Na análise da nata para a determinação de vanilina, deve exprimir-se a concentração do marcador em mg/kg de matéria gorda butírica, multiplicando C por 100/f, sendo f o teor de matéria gorda da nata, expresso em % (m/m)

20= factor que toma em conta as diluições do padrão e da amostra de ensaio,

0,96= factor de correcção do teor de matéria gorda na primeira diluição da amostra de ensaio.

Nota:

Podem utilizar-se as alturas dos picos em vez da respectiva área (ver ponto 8.3).

7. Precisão do método

7.1. Repetibilidade (r)

A diferença entre os resultados de duas determinações efectuadas num intervalo tão breve quanto possível por um único operador, utilizando o mesmo equipamento, com material de ensaio idêntico, não deve exceder 16 mg/kg.

7.2. Reprodutibilidade (R)

A diferença entre os resultados de duas determinações efectuadas por operadores de laboratórios diferentes, utilizando equipamento diferente, com material de ensaio idêntico, não deve exceder 27 mg/kg.

8. Limites e tolerância

8.1. Devem colher-se três amostras do produto marcado, de modo a verificar a respectiva homogeneidade.

8.2. Marcador obtido a partir de baunilha ou de vanilina sintética.

8.2.1. A taxa de incorporação de 4-hidroxi-3-metoxibenzaldeído é de 250 g por tonelada de manteiga concentrada ou de manteiga. No caso da nata marcada, a taxa de incorporação é de 250 g por tonelada de matéria gorda butírica.

8.2.2. Para verificar a taxa e a homogeneidade da incorporação do marcador, utilizam-se os resultados obtidos para as três amostras na análise do produto, comparando o menor dos resultados em causa com os seguintes limites [tendo em conta a diferença crítica, para uma probabilidade de 95 % (DCr95)]:

- 221,0 mg/kg (95 % da taxa de incorporação mínima),

- 159,0 mg/kg (70 % da taxa de incorporação mínima).

A concentração do marcador na amostra que origina o resultado mais reduzido é utilizada por interpolação entre 221,0 mg/kg e 159,0 mg/kg.

8.3. Marcador obtido exclusivamente a partir de vagens de baunilha ou de extractos integrais das mesmas.

8.3.1. A taxa de incorporação de 4-hidroxi-3-metoxibenzaldeído é de 100 g por tonelada de manteiga concentrada ou de manteiga. No caso da nata marcada, a taxa de incorporação é de 100 g por tonelada de matéria gorda butírica.

8.3.2. Utilizam-se os resultados obtidos para as três amostras na análise do produto para verificar a taxa e a homogeneidade da incorporação do marcador, comparando o menor dos resultados com os seguintes limites [tendo em conta a diferença crítica, para uma probabilidade de 95 % (DCr95)]:

- 79,0 mg/kg (95 % da taxa de incorporação mínima),

- 54,0 mg/kg (70 % da taxa de incorporação mínima).

A concentração do marcador na amostra que origina o resultado mais reduzido é utilizada por interpolação entre 79,0 mg/kg e 54,0 mg/kg.

9. Notas

9.1. A repetibilidade r é o valor abaixo do qual a diferença absoluta entre dois resultados analíticos obtidos por aplicação do mesmo método à mesma amostra nas mesmas condições (mesmos aparelhos, mesmo laboratório, num curto intervalo de tempo) tem uma determinada probabilidade de se situar; salvo indicação em contrário, essa probabilidade é de 95 %.

9.2. A reprodutibilidade R é o valor abaixo do qual a diferença absoluta entre dois resultados analíticos obtidos por aplicação do mesmo método à mesma amostra em condições diferentes (analistas diferentes, aparelhos diferentes, laboratórios diferentes e/ou momentos diferentes) tem uma determinada probabilidade de se situar; salvo indicação em contrário, essa probabilidade é de 95 %.

9.3. Para uma taxa de incorporação de 250 mg/kg de buteroil a taxa de recuperação de vanilina adicionada varia entre 97,0 e 103,8 %. O teor médio determinado foi de 99,9 %, com desvio-padrão de 2,7 %.

9.4. A solução-padrão contém 5 % de solução de extracção para compensar o alargamento dos picos provocado pela presença de 5 % da solução de extracção das tomas para análise. Tal permite que se proceda à quantificação com base na altura dos picos.

9.5. A análise baseia-se numa curva de calibração linear com ordenada na origem zero.

Utilizando para o efeito diluições apropriadas da solução-padrão (4.5.2), deve confirmar-se a linearidade na primeira vez que se efectuem as análises e, posteriormente, a intervalos regulares e depois de qualquer modificação ou reparação do equipamento de HPLC.

ANEXO XIII

(Artigo 9.o)

DETERMINAÇÃO ESPECTROMÉTRICA DO TEOR DE ÉSTER ETÍLICO DO ÁCIDO β-APO-8'-CAROTÉNICO NA MANTEIGA CONCENTRADA E NA MANTEIGA

1. Objectivo e campo de aplicação

O método descreve um processo para a determinação quantitativa do éster etílico do ácido β-apo-8'-caroténico (éster apocaroténico) na manteiga e na manteiga concentrada. O éster apocaroténico é a soma de todas as substâncias que absorvem a luz a 440 nm presentes num extracto de amostras obtidas nas condições descritas no método.

2. Princípio

A matéria gorda da manteiga é dissolvida em éter de petróleo e a absorvância medida a 440 nm. O teor de éster apocaroténico é determinado por referência a um padrão externo.

3. Equipamento

3.1. Pipetas graduadas de 0,25, 0,50, 0,75 e 1,0 ml.

3.2. Espectrofotómetro adequado para utilização a 440 nm (e 447-449 nm) e equipado com células de 1 cm de percurso óptico.

3.3. Balões volumétricos de 20 ml e 100 ml.

3.4. Balança analítica com sensibilidade 0,1 mg.

4. Reagentes

Todos os reagentes devem ser de qualidade analítica reconhecida.

4.1. Suspensão de éster apo-caroténico (aproximadamente 20 %).

4.1.1. Determinar o teor da suspensão do seguinte modo:

Pesar com precisão cerca de 400 mg num balão aferido de 100 ml, dissolver em 20 ml de clorofórmio (4.4) e acertar o volume com ciclo-hexano (4.5). Diluir 5 ml desta solução para 100 ml com ciclo-hexano (solução A). Diluir 5 ml de solução A para 100 ml com ciclo-hexano. Medir a absorvância a 447-449 nm (medir o máximo por recurso a um branco de ciclo-hexano, utilizando células de 1 cm de percurso óptico). -i

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

Amax= absorvância máxima da solução de medida

A= massa da amostra (g)

2550= valor de referência A (1 %, 1 cm)

P exprime a pureza da suspensão ( %).

Nota:

A suspensão de éster apocaroténico é sensível ao ar, ao calor e à luz. Pode ser armazenada durante cerca de doze meses num local fresco, no recipiente original fechado (selado em atmosfera de azoto). Após abertura, o conteúdo deve ser utilizado num prazo curto.

4.1.2. Solução-padrão de éster apo-caroténico, aproximadamente 0,2 mg/ml

Pesar com uma aproximação de 0,1 mg cerca de 0,100 g de suspensão de éster apo-caroténico (4.1.1 ) (Wg), dissolver em éter de petróleo (4.2), transferir quantitativamente para um balão volumétrico de 100 ml e completar o volume até à marca com éter de petróleo.

A solução contém (W.P) 10 mg/ml de éster apo-caroténico.

Nota:

A solução deve ser armazenada num local fresco, ao abrigo da luz. Eliminar a solução que não tenha sido utilizada no prazo de um mês.

4.2. Éter de petróleo (40-60 °C).

4.3. Sulfato de sódio anidro cristalizado, previamente seco a 102 °C durante duas horas.

4.4. Clorofórmio.

4.5. Ciclo-hexano.

5. Procedimento

5.1. Preparação da amostra de ensaio

5.1.1. Manteiga concentrada

Derreter a amostra numa estufa a cerca de 45 °C.

5.1.2. Manteiga

Derreter a amostra numa estufa a cerca de 45 °C e filtrar uma quantidade representativa com um filtro que contenha cerca de 10 g de sulfato de sódio anidro (4.3), num meio ao abrigo de luz natural ou artificial forte mantido à temperatura de 45 °C. Recolher uma quantidade adequada de matéria gorda da manteiga.

5.2. Determinação

Pesar com uma aproximação de 1 mg cerca de 1 g de manteiga concentrada ou de matéria gorda da manteiga extraída (5.1.2). Transferir quantitativamente para um balão volumétrico de 20 ml (Vml) utilizando éter de petróleo (4.2), completar até à marca e misturar cuidadosamente.

Transferir uma alíquota para uma célula de 1 cm e medir a absorvância a 440 nm, relativamente a um branco de éter de petróleo. Obter a concentração de éster apocaroténico na solução a partir do gráfico de calibração (C μg/ml).

5.3. Gráfico de calibração

Pipetar 0, 0,25, 0,5, 0,75 e 1,0 ml de solução-padrão de éster apocaroténico (4.1.2) para cinco balões volumétricos de 100 ml. Diluir com éter de petróleo (4.2) até perfazer o volume e misturar.

As concentrações aproximadas das soluções variam de 0 a 2 μg/ml e são calculadas rigorosamente a partir da concentração da solução-padrão (4.1.2) (W.P)/100 mg/ml. Medir as absorvâncias a 440 nm relativamente a um branco de éter de petróleo.

Traçar um gráfico com os valores da absorvância no eixo das ordenadas e as concentrações do éster apocaroténico no eixo das abcissas.

6. Cálculo dos resultados

6.1. O teor de éster apocaroténico, expresso em mg/kg de produto, é dado por:

Manteiga concentrada (C.V)/M

Manteiga: 0,82 (C.V)M

em que:

C= teor de éster apocaroténico, em μg/ml, obtido a partir do gráfico de calibração (5.3)

V= volume (ml) da solução de ensaio (5.2)

M= massa (g) da toma de ensaio (5.2)

0,82= factor de correcção devido ao teor de matéria gorda da manteiga.

7. Precisão do método

7.1. Repetitividade

7.1.1. Análise da manteiga

A diferença entre os resultados de duas determinações efectuadas imediatamente uma após outra pelo mesmo operador, utilizando o mesmo equipamento e uma amostra idêntica, não deve exceder 1,4 mg/kg.

7.1.2. Análise da manteiga concentrada

A diferença entre os resultados de duas determinações efectuadas imediatamente uma após outra pelo mesmo operador, utilizando o mesmo equipamento e uma amostra idêntica, não deve exceder 1,6 mg/kg.

7.2. Reprodutibilidade

7.2.1. Análise da manteiga

A diferença entre os resultados de duas determinações efectuadas por operadores diferentes em laboratórios diferentes, com equipamento diferente e uma amostra idêntica, não deve exceder 4,7 mg/kg.

7.2.2. Análise da manteiga concentrada

A diferença entre os resultados de duas determinações efectuadas por operadores diferentes em laboratórios diferentes, com equipamento diferente e uma amostra idêntica, não deve exceder 5,3 mg/kg.

7.3. Origem dos dados relativos à precisão

Os dados relativos à precisão foram determinados com base num teste efectuado em 1995, que envolveu onze laboratórios, doze amostras marcadas para a manteiga (seis duplicados em teste cego) e doze amostras marcadas para a manteiga concentrada (seis duplicados em teste cego).

8. Limites de tolerância

8.1. Devem ser colhidas três amostras do produto marcado para verificar se a marcação foi efectuada correctamente.

8.2. Manteiga

8.2.1. A taxa de incorporação para a manteiga, tendo em conta a absorvância de fundo, é de 22 mg/kg.

8.2.2. Utilizam-se os resultados obtidos para as três amostras na análise do produto para verificar a taxa e a homogeneidade da incorporação do marcador, comparando o menor dos resultados em causa com os seguintes limites [tendo em conta a diferença crítica para uma probabilidade de 95 % (DCr95)]:

- 18,0 mg/kg (95 % da taxa de incorporação mínima),

- 13,0 mg/kg (70 % da taxa de incorporação mínima).

A concentração do marcador na amostra que dá o resultado mais baixo é utilizado por interpolação entre 18,0 mg/kg e 13,0 mg/kg.

8.3. Manteiga concentrada

8.3.1. Tendo em conta a absorvância de fundo, a taxa de incorporação da manteiga concentrada é de 24 mg/kg.

8.3.2. Utilizam-se os resultados obtidos para as três amostras na análise do produto para verificar a taxa e a homogeneidade da incorporação do marcador, comparando o menor dos resultados em causa com os seguintes limites [tendo em conta a diferença crítica para uma probabilidade de 95 % (DCr95)]:

- 20,0 mg/kg (95 % da taxa de incorporação mínima),

- 14,0 mg/kg (70 % da taxa de incorporação mínima),

A concentração do marcador na amostra que dá o resultado mais baixo é utilizada por interpolação entre 20,0 mg/kg e 14,0 mg/kg.

ANEXO XIV

(Artigo 9.o)

DETERMINAÇÃO DO SITOSTEROL OU DO ESTIGMASTEROL NA MANTEIGA CONCENTRADA E NA MANTEIGA POR CROMATOGRAFIA EM FASE GASOSA COM COLUNA CAPILAR

1. Objecto e campo de aplicação

O método descreve um processo para a determinação quantitativa do sitosterol ou do estigmasterol na manteiga. Considera-se o sitosterol como sendo a soma do β-sitosterol e do 22-di-hidro-β-sitosterol; os outros sitosteróis são considerados insignificantes.

2. Princípio

A manteiga é saponificada com uma solução etanólica de hidróxido de potássio; os insaponificáveis são extraídos com éter etílico.

Os esteróis são convertidos em éteres trimetilsilílicos e analisados por cromatografia em fase gasosa com coluna capilar, tomando como referência um padrão interno de betulina.

3. Equipamento

3.1. Balão de saponificação de 150 ml munido de um refrigerante de refluxo com juntas esmeriladas.

3.2. Ampolas de decantação de 500 ml.

3.3. Balões de 250 ml.

3.4. Balões de 250 mililitros ou uma capacidade similar, para equilíbrio da pressão, para a recolha do éter etílico evaporado.

3.5. Coluna de vidro, com 350 mm x 20 mm, munida de tampa de vidro sinterizado.

3.6. Banho-maria ou manta de aquecimento.

3.7. Tubos de ensaio de 2 ml.

3.8. Cromatógrafo de fase gasosa utilizável com coluna capilar, que disponha de um sistema de divisão da amostra sendo constituído por:

3.8.1. Câmara termostática para colunas com a possibilidade de manter a temperatura desejada com uma precisão de +- 1 °C.

3.8.2. Unidade de vaporização com regulação de temperatura.

3.8.3. Detector de ionização de chama com conversor-amplificador.

3.8.4. Integrador-registador adequado ao conversor-amplificador (3.8.3).

3.9. Coluna capilar de sílica fundida totalmente revestida com BP1 ou equivalente, com uma espessura uniforme de 0,25 μm; a coluna deve permitir a resolução dos picos dos derivados trimetilsilílicos do lanosterol e do sitosterol. É adequada uma coluna com 0,2 mm de diâmetro interno e 12 m de comprimento, revestida com BP1.

3.10. Microsseringa de 1μl com agulha de aço temperado, para cromatografia em fase gasosa.

4. Reagentes

Todos os reagentes devem ser de grau analítico reconhecido. A água utilizada deve ser água destilada ou água de grau de pureza pelo menos equivalente.

4.1. Etanol de pureza mínima 95 %.

4.2. Solução de hidróxido de potássio a 60 %. Dissolver 600 g de hidróxido de potássio (pureza mínima 85 %) em água e completar com água até perfazer 1 l.

4.3. Betulina de pureza mínima 99 %.

4.3.1. Soluções de betulina em éter etílico (4.4).

4.3.1.1. A concentração da solução de betulina utilizada para a determinação do sitosterol deve ser de 1,0 mg/ml.

4.3.1.2. A concentração da solução de betulina utilizada para a determinação do estigmasterol deve ser de 0,4 mg/ml.

4.4. Éter etílico de pureza analítica (isento de peróxidos e resíduos).

4.5. Sulfate de sódio anidro granulado, previamente seco a 102 °C durante duas horas.

4.6. Reagente de sililação, por exemplo, TRI-SIL (comercializado, nomeadamente, por Pierce Chemical Co, Cat n.o 49001 ), ou equivalente (Atenção: o TRI-SIL é inflamável, tóxico, corrosivo e, possivelmente, cancerígeno. O pessoal do laboratório deve estar familiarizado com os cuidados a ter com o TRI-SIL e tomar as precauções apropriadas).

4.7. Lanosterol.

4.8. Sitosterol, de grau de pureza conhecido, não inferior a 90 % (P).

Nota 1:

O grau de pureza dos padrões utilizados na calibração deve ser determinado pelo método da normalização. Considerar que todos os esteróis presentes na amostra figuram no cromatograma, que a área total dos picos representa 100 % dos componentes esteróis e que todos os esteróis produzem a mesma resposta do detector. A linearidade do sistema deve ser assegurada para a gama de concentrações utilizada.

4.8.1. Solução-padrão de sitosterol: preparar uma solução aproximadamente 0,5 mg/ml (W1) de sitosterol (4.8) em éter etílico (4.4), com a precisão de 0,001 mg/ml.

4.9. Estigmasterol de grau de pureza (P) conhecido, não inferior a 90 %.

4.9.1. Solução-padrão de estigmasterol: preparar uma solução aproximadamente 0,2 mg/ml (W1) de estigmasterol (4.9) em éter etílico (4.4), com a precisão de 0,001 mg/ml.

4.10. Solução para teste da resolução: preparar uma solução que contenha 0,05 mg de lanosterol (4.7) e 0,5 mg de sitosterol (4.8) por mililitro, em éter etílico (4.4).

5. Técnica

5.1. Preparação das soluções-padrão para cromatografia: o padrão interno (4.3.1) deve ser adicionado à solução-padrão do esterol apropriado ao mesmo tempo que for adicionado à amostra saponificada (5.2.2).

5.1.1. Solução-padrão cromatográfica de sitosterol: transferir um mililitro da solução-padrão de sitosterol (4.8.1) para dois tubos de ensaio (3.7) e remover o éter etílico com uma corrente de azoto. Adicionar um mililitro do padrão interno (4.3.1.1 ) e remover o éter etílico com uma corrente de azoto.

5.1.2. Solução-padrão cromatográfica de estigmasterol: transferir um mililitro da solução-padrão de estigmasterol (4.9.1) para dois tubos de ensaio (3.7) e remover o éter etílico com uma corrente de azoto. Adicionar um mililitro do padrão interno (4.3.1.2) e remover o éter etílico com uma corrente de azoto.

5.2. Preparação dos insaponificáveis

5.2.1. Fundir a amostra de manteiga por aquecimento a uma temperatura não superior a 35 °C, misturando por agitação.

Pesar para um balão de 150 ml (3.1), com a precisão de 1 mg, cerca de 1 g de manteiga (W2). Adicionar 50 mililitros de etanol (4.1) e 10 mililitros da solução de hidróxido de potássio (4.2). Adaptar o condensador de refluxo e aquecer a cerca de 75 °C, durante 30 minutos. Retirar o condensador e arrefecer o balão até à temperatura ambiente, aproximadamente.

5.2.2. Adicionar ao balão 1,0 ml do padrão interno (4.3.1.1) caso se pretenda determinar o sitosterol, ou 1,0 ml de (4.3.1.2), caso se pretenda determinar o estigmasterol. Homogeneizar completamente. Transferir quantitativamente o conteúdo do balão para uma ampola de decantação de 500 mililitros (3.2), procedendo a lavagens com 50 mililitros de água e 250 mililitros de éter etílico (4.4). Agitar a ampola de decantação vigorosamente, durante dois minutos, e deixar as fases separarem-se. Escoar a fase aquosa inferior e proceder à lavagem da fase etérea, agitando a ampola com quatro alíquotas sucessivas de 100 mililitros de água.

Nota 2:

Para evitar a formação de uma emulsão e essencial que as duas primeiras lavagens com água sejam efectuadas com precaução (procedendo a 10 inversões). Na terceira lavagem, pode-se agitar vigorosamente durante 30 segundos. No caso de se formar uma emulsão, esta pode ser eliminada através da adição de 5 a 10 mililitros de etanol. Se se adicionar etanol, é essencial proceder a mais duas lavagens vigorosas com água.

5.2.3. Passar a fase etérea, límpida e isenta de sabões, por uma coluna de vidro (3.5), contendo 30 gramas de sulfato de sódio anidro (4.5). Recolher a fase etérea num balão de 250 mililitros (3.3). Introduzir um regularizador de ebulição e evaporar quase até à secura por recurso a um banho de água ou a uma manta de aquecimento; recolher os solventes evaporados.

Nota 3:

Se o extracto que contém a amostra for levado à secura total, a temperaturas muito elevadas, podem ocorrer perdas de esteróis.

5.3. Preparação dos éteres trimetilsilílicos

5.3.1. Como o auxílio de 2 ml de éter etílico, transferir do balão para um tubo de ensaio de 2 ml (3.7) a solução etérea remanescente e remover o éter com uma corrente de azoto. Lavar o balão com mais duas alíquotas de 2 ml de éter etílico, transferindo-as para o tubo de ensaio e removendo o éter, cada uma das vezes, com uma corrente de azoto.

5.3.2. Proceder à sililação da amostra, adicionando um mililitro de TRI-SIL (4.6). Tapar o tubo de reacção e agitar vigorosamente, para dissolver. No caso de a dissolução ser incompleta, aquecer a 65-70 °C. Deixar em repouso durante, pelo menos, cinco minutos antes de proceder à injecção no cromatógrafo de fase gasosa. Proceder à sililação dos padrões do mesmo modo que as amostras. Proceder à sililação da solução para testes da resolução (4.10) do mesmo modo que as amostras.

Nota 4:

A sililação deve ser efectuada na ausência de água. A sililação incompleta da betulina é revelada pela presença de um segundo pico, próximo do pico correspondente à betulina.

A presença de etanol durante a sililação interfere no processo podendo resultar de lavagem inadequada na etapa de extracção. Se este problema persistir, poderá ser efectuada uma quinta lavagem, com agitação vigorosa durane 30 segundos, na etapa de extracção.

5.4. Análise por cromatografia em fase gasosa

5.4.1. Selecção das condições operatórias.

Programar o cromatógrafo de fase gasosa de acordo com as instruções do fabricante.

Apresentam-se a seguir as condições operacionais indicativas:

- temperatura da coluna: 265 °C

- temperatura do injector: 280 °C

- temperatura do detector: 300 °C

- caudal do gás-vector: 0,6 ml/min.

- pressão de hidrogénio: 84 kPa

- pressão de ar: 155 kPa

- divisão da amostra: 10: 1 a 50: 1; esta relação deve ser optimizada em função das instruções do fabricante devendo, de seguida, assegurar-se a linearidade da resposta do detector em toda a gama de concentrações utilizada.

Nota 5:

É de especial importância que a câmara de vaporização seja limpa com regularidade.

- quantidade de substância injectada: 1 μl de solução de TMSE.

Deixar que o sistema atinja o equilíbrio e obter uma resposta suficientemente estável antes de iniciar as análises.

As condições indicadas podem ser alteradas em função das características da coluna e do cromatógrafo de fase gasosa, de modo a obter cromatogramas que obedeçam às seguintes condições:

- o pico do sitosterol deve distinguir-se claramente do pico do lanosterol. A figura 1 mostra o cromatograma típico que deve ser obtido com a solução para teste da resolução (4.10), depois de submetida a sililação.

- os tempos de retenção relativos dos esteróis a seguir referidos devem ser, aproximadamente:

colesterol: 1,0

estigmasterol: 1,3

sitosterol: 1,5

betulina: 2,5

- o tempo de retenção da betulina deve ser, aproximadamente, de 24 minutos.

5.4.2. Execução da análise:

Injectar 1 μl da solução-padrão sililada (estigmasterol ou sitosterol) e ajustar os parâmetros de calibração do integrador.

Injectar novo volume de 1 μl da solução-padrão sililada para determinar os factores de resposta da betulina.

Injectar 1 μl da solução-amostra sililada e medir as áreas dos picos. Intercalar cada série de amostras com a injecção dos padrões.

A título de orientação, proceder a seis injecções de amostra em cada série limitada pelos padrões.

Nota 6:

A integração do pico do estigmasterol deve incluir as caudas respectivas, definidas pelos pontos 1, 2 e 3 da figura 2b.

Incluir na integração do pico do sitosterol a área do 22-dihidro-β-sitosterol (estigmastanol), que é eluído imediatamente a seguir ao sitosterol (ver a figura 3 b).

6. Cálculo dos resultados

6.1. Determinar as áreas dos picos do esterol e da betulina nos padrões que delimitam cada série de amostras e calcular R1:

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

Determinar a área do pico do esterol (estigmasterol e sitosterol) e do pico da betulina na amostra e calcular R2:

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

W1= teor de esterol do padrão (mg) em 1 ml de solução-padrão (4.8.1 ou 4.9.1)

W2= massa da amostra (g) (5.2.1)

P= pureza do padrão de esterol (4.8 ou 4.9)

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

7. Precisão do método

7.1. Manteiga

7.1.1. Repetibilidade

7.1.1.1. Estigmasterol

A diferença entre os resultados de duas determinações, efectuadas com o menor intervalo de tempo possível pelo mesmo operador, utilizando o mesmo equipamento e testando o mesmo material, não deve exceder 19,3 mg/kg.

7.1.1.2. Sitosterol

A diferença entre os resultados de duas determinações, efectuadas com o menor intervalo de tempo possível pelo mesmo operador, utilizando o mesmo equipamento e testando o mesmo material, não deve exceder 23,0 mg/kg.

7.1.2. Reprodutibilidade

7.1.2.1. Estigmasterol

A diferença entre os resultados de duas determinações efectuadas por operadores de laboratórios diferentes, utilizando equipamento diferente e testando o mesmo material, não deve exceder 31,9 mg/kg.

7.1.2.2. Sitosterol

A diferença entre os resultados de duas determinações efectuadas por operadores de laboratórios diferentes, utilizando equipamento diferente e testando o mesmo material, não deve exceder 8,7 % da média das determinações.

7.1.3. Origem dos dados relativos à precisão

Os dados relativos à precisão foram determinados com base num ensaio efectuado em 1992, que envolveu oito laboratórios, seis amostras (três duplicados em teste cego) de estigmasterol e seis amostras (três duplicados em teste cego) para o sitosterol.

7.2. Manteiga concentrada

7.2.1. Repetibilidade

7.2.1.1. Estigmasterol

A diferença entre os resultados de duas determinações, efectuadas com o menor intervalo de tempo possível pelo mesmo operador, utilizando o mesmo equipamento e testando o mesmo material, não deve exceder 10,2 mg/kg.

7.2.1.2. Sitosterol

A diferença entre os resultados de duas determinações, efectuadas com o menor intervalo de tempo possível pelo mesmo operador, utilizando o mesmo equipamento e testando o mesmo material, não deve exceder 3,6 % relativamente à média das determinações.

7.2.2. Reprodutibilidade

7.2.2.1. Estigmasterol

A diferença entre os resultados de duas determinações efectuadas por operadores de laboratórios diferentes, utilizando equipamento diferente e testando o mesmo material, não deve exceder 25,3 mg/kg.

7.2.2.2. Sitosterol

A diferença entre os resultados de duas determinações, efectuadas com o menor intervalo de tempo possível pelo mesmo operador, utilizando o mesmo equipamento e testando o mesmo material, não deve exceder 8,9 % relativamente à média das determinações.

7.2.3. Fonte de dados de precisão

Os dados relativos à precisão foram determinados com base num ensaio efectuado em 1992, que envolveu oito laboratórios, seis amostras (três duplicados em teste cego) de estigmasterol e seis amostras (três duplicados em teste cego) para o sitosterol.

8. Tolerâncias

8.1. Para verificar se o produto foi marcado de forma adequada, devem colher-se três amostras do produto marcado.

8.2. Manteiga

8.2.1. Estigmasterol

8.2.1.1. A taxa de incorporação de estigmasterol é de 150 gramas de estigmasterol com grau de pureza de, pelo menos, 95 % por tonelada de manteiga, isto é, 142,5 mg/kg; ou 170 gramas de estigmasterol com grau de pureza de, pelo menos, 85 % por tonelada de manteiga, isto é, 144,5 mg/kg.

8.2.1.2. O menor dos resultados obtidos na análise do produto é utilizado para verificar a homogeneidade da distribuição do marcador. Tal é efectuado por comparação com os seguintes limites [tendo em conta a diferença crítica para uma probabilidade de 95 % (DCr95)]

- 116,0 mg/kg (95 % da taxa de incorporação mínima para o estigmasterol com grau de pureza 95 %),

- 118,0 mg/kg (95 % da taxa de incorporação mínima para o estigmasterol com grau de pureza 85 %),

- 81,0 mg/kg (70 % da taxa de incorporação mínima para o estigmasterol com grau de pureza 95 %),

- 82,0 mg/kg (70 % da taxa de incorporação mínima para o estigmasterol com grau de pureza 85 %).

A concentração de marcador na amostra com o menor dos resultados é obtida por interpolação entre 116,0 mg/kg e 81,0 mg/kg ou entre 118,0 mg/kg et 82,0 mg/kg, respectivamente.

8.2.2. Sitosterol

8.2.2.1. A taxa de incorporação do sitosterol é de 600 g de sitosterol com grau de pureza de, pelo menos, 90 % por tonelada de manteiga, isto é, 540 mg/kg.

8.2.2.2. O menor dos resultados obtidos na análise do produto é utilizado para verificar a homogeneidade da distribuição do marcador. Tal é efectuado por comparação com os seguintes limites [tendo em conta a diferença crítica para uma probabilidade de 95 % (DCr95)]

- 486,0 mg/kg (95 % da taxa de incorporação mínima para o sitosterol com grau de pureza 90 %),

- 358,0 mg/kg (70 % da taxa de incorporação mínima para o sitosterol com grau de pureza 90 %).

A concentração de marcador na amostra com o menor dos resultados é obtida por interpolação entre 486,0 mg/kg e 358,0 mg/kg.

8.3. Manteiga concentrada

8.3.1. Estigmasterol

8.3.1.1. A taxa de incorporação de estigmasterol é de 150 g de estigmasterol com grau de pureza de, pelo menos, 95 % por tonelada de manteiga concentrada, isto é, 142,5 mg/kg; ou 170 g de estigmasterol com grau de pureza de, pelo menos, 85 % por tonelada de manteiga concentrada, isto é, 144,5 mg/kg.

8.3.1.2. O menor dos resultados obtidos na análise do produto é utilizado para verificar a homogeneidade da distribuição do marcador. Tal é efectuado por comparação com os seguintes limites [tendo em conta a diferença crítica para uma probabilidade de 95 % DCr95)]

- 120,0 mg/kg (95 % da taxa de incorporação mínima para o stigmasterol com grau de pureza 95 %),

- 122,0 mg/kg (95 % da taxa de incorporação mínima para o stigmasterol com grau de pureza 85 %),

- 84,0 mg/kg (70 % da taxa de incorporação mínima para o stigmasterol com grau de pureza 95 %),

- 86,0 mg/kg (70 % da taxa de incorporação mínima para o stigmasterol com grau de pureza 85 %).

A concentração de marcador na amostra com o menor dos resultados é obtida por interpolação entre 120,0 mg/kg e 84,0 mg/kg ou entre 122,0 mg/kg e 86,0 mg/kg, respectivamente.

8.3.2. Sitosterol

8.3.2.1. A taxa de incorporação do sitosterol é de 600 g de sitosterol com grau de pureza de, pelo menos, 90 % por tonelada de manteiga concentrada, isto é, 540 mg/kg.

8.3.2.2. O menor dos resultados obtidos na análise do produto é utilizado para verificar a homogeneidade da distribuição do marcador. Tal é efectuado por comparação com os seguintes limites [tendo em conta a diferença crítica para uma probabilidade de 95 % (DCr95)]

- 486,0 mg/kg (95 % da taxa de incorporação mínima para o sistosterol com grau de pureza 90 %),

- 358,0 mg/kg (70 % da taxa de incorporação mínima para o sistosterol com grau de pureza 90 %).

A concentração de marcador na amostra com o menor dos resultados é obtida por interpolação entre 486,0 mg/kg e 358,0 mg/kg.

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ANEXO XV

Artigo 10.o

MÉTODO DE REFERÊNCIA PARA DETECÇÃO DE LEITE DE VACA E CASEINATOS EM QUEIJOS DE LEITE DE OVELHA, LEITE DE CABRA, LEITE DE BÚFALA OU DE MISTURAS DE LEITE DE OVELHA, DE CABRA E DE BÚFALA

1. Objectivo

Detecção de leite de vaca e caseinatos em queijos produzidos com leite de ovelha, de cabra, de búfala ou com misturas de leite de ovelha, de cabra e de búfala por focalização isoeléctrica de γ(caseínas) após plasminólise.

2. Campo de aplicação

O método é adequado para uma detecção sensível e específica da caseína de leite de vaca nativa e tratada pelo calor em queijos frescos e curados produzidos com leite de ovelha, leite de cabra, leite de búfala ou com misturas de leite de ovelha, de cabra e de búfala. Não é adequado para a detecção de leite e queijo adulterados por concentrados proteicos de soro bovino tratados pelo calor.

3. Fundamento do método

3.1. Isolamento das caseínas do queijo e dos padrões de referência.

3.2. Dissolução das caseínas isoladas e clivagem pela plasmina (EC.3.4.21.7).

3.3. Focalização isoeléctrica das caseínas tratadas com plasmina na presença de ureia e coloração das proteínas.

3.4. Avaliação da disposição de bandas coradas das γ2 e γ3-caseínas (indício da presença de leite de vaca) através de comparação entre a disposição relativa na amostra e a disposição relativa no mesmo gel a partir de padrões com 0 % e 1 % de leite de vaca.

4. Reagentes

Salvo outra indicação, devem ser utilizados reagentes de qualidade analítica. A água deve ser bidestilada ou de pureza equivalente.

Nota:

As especificações seguintes aplicam-se a géis de poliacrilamida que contenham ureia, de dimensões 265 x 125 x 0,25 mm preparados em laboratório. Em caso de utilização de outras dimensões e tipos de gel, as condições de separação devem ser ajustadas.

Focalização isoeléctrica

4.1. Reagentes para produção de géis de poliacrilamida que contenham ureia

4.1.1. Solução de base de gel

Dissolver:

4,85 g de acrilamida

0,15 g N,N'-metileno-bis-acrilamida (BIS)

48,05 g de ureia

15,00 g de glicerol (87 % p/p),

em água e perfazer até 100 ml. Armazenar em recipiente de vidro de cor âmbar no frigorífico.

Nota:

Pode de ser usada, de preferência, uma solução disponível no comércio de acrilamida/BIS previamente misturada em vez das acrilamidas neurotóxicas com as massas fixadas referidas. Caso essa solução contenha 30 % (p/v) de acrilamida e 0,8 % (p/v) de BIS, deve ser utilizado na formulação um volume de 16,2 ml em vez das massas fixadas. A solução pode ser armazenada durante um período máximo de 10 dias. Se a sua condutividade for superior a 5 μS, proceder a uma desionização por agitação com 2 g de Amberlite MB-3 durante 30 minutos, seguida de filtração através de membrana de 0,45 μm.

4.1.2. Solução de gel

Preparar uma solução de gel misturando aditivos e anfólitos com a solução-mãe de gel (4.1.1.):

9,0 ml de solução-mãe

24 mg de β- alanina

500 μl de anfólito pH 3,5-9,5(1)

250 μl de anfólito pH 5-7(2)

250 μl de anfólito pH 6-8(3).

Misturar a solução de gel e desgaseificar durante 2 a 3 minutos num banho de ultra-sons ou no vácuo.

Nota:

Preparar a solução de gel imediatamente antes da sua utilização (ver 6.2).

4.1.3. Soluções catalizadoras

4.1.3.1. N, N, N, N'-tetrametilenodiamina (TEMED)

4.1.3.2. 40 % p/v de persulfato de amónio (PER)

Dissolver 800 mg de PER em água e levar até 2 ml.

Nota:

utilizar sempre solução de PER recentemente preparada.

4.2. Fluido de contacto

Querosene ou parafina líquida

4.3. Solução anódica

Dissolver 5,77 g de ácido fosfórico (85 % m/m) em água e diluir para 100 ml.

4.4. Solução catódica

Dissolver 2,00 g de hidróxido de sódio em água e perfazer o volume de 100 ml com água.

Preparação das amostras

4.5. Reagentes para o isolamento das proteínas

4.5.1. Ácido acético diluído (25,0 ml de ácido acético glacial diluído até perfazer 100 ml com água)

4.5.2. Diclorometano

4.5.3. Acetona

4.6. Solução-tampão para dissolução das proteínas

Dissolver:

5,75 g de glicerol (87 % p/p)

24,03 g de ureia

250 mg de ditiotreitol

em água destilada até perfazer 50 ml.

Nota:

Conservar no frigorífico durante um período máximo de uma semana.

4.7. Reagentes para a clivagem da caseína pela plasmina

4.7.1. Solução-tampão de carbonato de amónio

Titular uma solução de 0,2 mol/1 de hidrogenocarbonato de amónio (1,58 g/100 ml de água) contendo 0,05 mol/l de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA, 1,46 g/100 ml/l) com uma solução de 0,2 mol/l (1,92 g/100 ml de água) contendo 0,05 mol/l EDTA até pH 8.

4.7.2. Plasmina de bovino (E.C.3.4.21.7), com uma actividade de pelo menos SU/ml

4.7.3. Solução de ácido ε-aminocapróico para inibição de enzimas

Dissolver 2,624 g de ácido ε-aminocapróico (ácido 6-amino-n-hexanóico) em 100 ml de etanol a 40 % (v/v).

4.8. Padrões

4.8.1. Padrões de referência certificados de uma mistura de leite desnatado e coagulado de ovelha e de cabra com 0 % e 1 % de leite de vaca estão disponíveis no Instituto de Materiais e Medidas de Referência da Comissão, B-2440 Geel.

4.8.2. Preparação de padrões laboratoriais provisórios de leite de búfala coagulado com 0 % e 1 % de leite de vaca.

O leite desnatado é preparado por centrifugação de leite cru de búfala ou de vaca a 37 °C a 2500 g durante 20 minutos. Após arrefecimento rápido do tubo e do seu conteúdo para 6-8 °C, a camada superior de gordura é totalmente retirada. Para a preparação do padrão a 1 %, adicionar 5,00 ml de leite de vaca desnatado a 495 ml de leite desnatado de búfala num copo de 1 litro, ajustar o pH a 6,4 através da adição de ácido láctico diluído (10 % p/v). Ajustar a temperatura a 35 °C e adicionar 100 μl de coalho de vitelo (actividade do coalho: 1: 10000, c. 3000 U/ml), agitar durante um minuto e deixar o copo coberto com uma folha de alumínio a 35 °C durante uma hora a fim de permitir a formação de requeijão. Após a coagulação, todo o leite coalhado é liofilizado sem homogeneização prévia ou escorrimento do soro de leite. Após liofilizada, a amostra é moída finamente a fim de produzir um pó homogéneo. Para a preparação do padrão a 0 %, proceder do mesmo modo, com leite desnatado puro de búfala. Os padrões devem ser conservados a - 20 °C.

Nota:

É aconselhável verificar a pureza do leite de búfala através da focalização isoeléctrica das caseínas tratadas com plasmina antes da preparação dos padrões.

Reagentes para coloração das proteínas

4.9. Fixador

Dissolver 150 g de ácido tricloroacético em água e perfazer até 1000 ml.

4.10. Solução descoloração

Misturar 500 ml de metanol e 200 ml de ácido acético glacial e perfazer até 2000 ml com água destilada.

Nota:

Preparar a solução de descoloração todos os dias; esta pode ser facilmente preparada misturando volumes iguais de soluções-mãe de metanol a 50 % (v/v) e de acético glacial a 20 % (v/v).

4.11. Soluções de coloração

4.11.1. Solução de coloração (solução-mãe 1)

Dissolver 3,0 g de azul de Comassie G 250 (Color Index 42655) em 1000 ml de metanol a 90 % (v/v), utilizando um agitador magnético (aproximadamente 45 minutos) e filtrar através de dois filtros de pregas de velocidade média.

4.11.2. Solução de coloração (solução-mãe 2)

Dissolver 5,0 g de sulfato de cobre pentahidratado em 1000 ml de ácido acético a 20 % (v/v).

4.11.3. Solução de coloração (solução de trabalho)

Misturar 125 ml de cada uma das soluções-mãe (4.11.1, 4.11.2) imediatamente antes da coloração.

Nota:

A solução de coloração deve ser preparada no dia da sua utilização.

5. Aparelhos e utensílios

5.1. Placas de vidro (265 x 125 x 4 mm) rolos de borracha (espessura: 15 cm); mesa de nivelamento

5.2. Folha de suporte do gel (265 x 125 mm)

5.3. Folha de cobertura (280 x 125 mm). Colar uma faixa de fita adesiva (280 x 6 x 0,25 mm) a cada uma das margens mais longas (ver figura 1).

5.4. Câmara de electrofocalização com placa de arrefecimento (por exemplo 265 x 125 mm) com um gerador de potência adequada (>= 2,5 kV) ou aparelho automático de electroforese

5.5. Crióstato de circulação, controlado termostaticamente a 12 +- 0,5 °C

5.6. Centrifugadora ajustável a 3000 g

5.7. Eléctrodos em placa (>= 265 mm de comprimento)

5.8. Frascos conta-gotas para as soluções anódica e catódica

5.9. Aplicadores de amostra (10 x 5 mm, viscose ou papel de filtro com baixa absorção de proteínas)

5.10. Tesouras, bisturis e pinças de aço inoxidável

5.11. Tinas de aço inoxidável ou de vidro para coloração e descoloração (por exemplo, tabuleiros de instrumentos com 280 x 150 mm)

5.12. Homogeneizador de vareta ajustável (vareta com 10 mm de diâmetro), de 8000 a 20000 rpm

5.13. Agitador magnético

5.14. Banho de ultra-sons

5.15. Soldador de folhas

5.16. Micropipetas de 5 a 25 μl

5.17. Concentrador de vácuo ou liofilizador

5.18. Banho-maria controlado termostaticamente, ajustável a 35 e 40 +- 1 °C, com agitador

5.19. Densitómetro, com leitura a λ = 634 mm

6. Técnica

6.1. Preparação das amostras

6.1.1. Isolamento das caseínas

Pesar a quantidade correspondente a 5 g de matéria seca de queijo ou padrões de referência para um tubo de centrifugação de 100 ml, adicionar 60 ml de água destilada e homogeneizar com um homogeneizador de vareta (8000 a 10000 rpm). Ajustar o pH a 4,6 com ácido acético diluído (4.5.1) e centrifugar (durante 5 minutos a 3000 g). Decantar a gordura e o soro de leite, homogeneizar o resíduo a 20000 rpm em 40 ml de água destilada ajustada a um pH 4,5 com ácido acético diluído (4.5.1), adicionar 20 ml de diclorometano (4.5.2), homogeneizar novamente e centrifugar (durante 5 minutos a 3000 g). Retirar a camada de caseína que se encontra entre as fases aquosa e orgânica (ver figura 2) com uma espátula e decantar ambas as fases. Homogeneizar de novo a caseína em 40 ml de água destilada (ver supra) e 20 ml de diclorometano (4.5.2) e centrifugar. Repetir este processo até que ambas as fases extraídas sejam incolores (2 a 3 vezes). Homogeneizar o resíduo proteico com 50 ml de acetona (4.5.3) e filtrar através de papel de filtro com pregas de velocidade média. Lavar o resíduo do filtro com duas porções diferentes de 25 ml de acetona de cada vez e secar ao ar ou numa corrente de azoto. Εm seguida pulverizar finamente em almofariz.

Nota:

Os isolados de caseína secos devem ser conservados a -20 °C.

6.1.2. Clivagem pela plasmina das β-caseínas a fim de intensificar as γ-caseínas

Suspender 25 mg de caseína isolada (6.1.1) em 0,5 ml de tampão de carbonato de amónio (4.7.1) e homogeneizar durante 20 minutos, usando, por exemplo, um banho de ultra-sons. Aquecer a 40 °C e adicionar 10 μl de plasmina (4.7.2), misturar e incubar durante 1 hora a 40 °C com agitação contínua. A fim de inibir as enzimas, adicionar 20 μl de solução de ácido ε-aminocapróico (4.7.3) e adicionar em seguida 200 mg de ureia sólida e 2 mg de ditiotreitol.

Nota:

A fim de obter mais simetria nas bandas de caseína focalizadas é aconselhável liofilizar a solução depois de adicionar o ácido ε-aminocapróico e dissolver em seguida os resíduos em 0,5 ml de solução-tampão para dissolução das proteínas (4.6).

6.2. Preparação de géis de poliacrilamida contendo ureia

Com a ajuda de algumas gotas de água, estender, com um rolo, a folha de suporte de gel (5.2) numa placa de vidro (5.1) e retirar toda a água remanescente com um toalhete ou um lenço de papel. Estender, da mesma forma, a folha de cobertura (5.3) com separadores (0,25 mm) noutra placa de vidro. Colocar a placa horizontalmente numa mesa de nivelamento.

Adicionar 10 μl da solução TEMED (4.1.3.1) à solução de gel preparada à qual foi retirado o ar (4,1,2), agitar e adicionar 10 μl de solução PER (4.1.3.2), misturar rapidamente e deitar uniformemente para o centro da folha de cobertura. Colocar uma extremidade da placa de suporte do gel (folha virada para baixo) sobre a placa de cobertura e rebatê-la lentamente de modo a que se forme um filme de gel entre as folhas, distribuído regularmente e sem bolhas de ar (figura 3). Com cuidado, rebater completamente a placa de suporte do gel utilizando uma espátula fina e colocar por cima mais três placas de vidro que servirão como pesos. Depois de terminada a polimerização (cerca de 60 minutos) retirar o gel polimerizado para a placa de suporte do gel juntamente com a folha de cobertura inclinando as placas de vidro. Limpar cuidadosamente o reverso da placa de suporte do gel a fim de remover os resíduos do gel e ureia. Unir os bordos da "sanduíche de gel" enrolada de modo a formar um tubo e guardá-la em frigorífico (durante, no máximo, 6 semanas).

Nota:

A folha de cobertura com os separadores pode ser reutilizada. O gel de poliacrilamida pode ser cortado em dimensões mais pequenas, cuja utilização é recomendada quando se disponha de poucas amostras ou se for empregue um aparelho automático de electroforese (dois geís, dimensão 4,5 x 5 cm).

6.3. Focalização isoeléctrica

Ligar o termóstato de arrefecimento a 12 °C. Limpar o reverso da folha de suporte do gel com querosene e, em seguida, deitar algumas gotas de querosene (4.2) para o centro do bloco de arrefecimento. Aplicar a sanduíche de gel (desenrolada), com o lado de suporte para baixo e para dentro, tendo o cuidado de evitar bolhas de ar. Limpar qualquer excesso de querosene e retirar a folha de cobertura. Impregnar os eléctrodos com as soluções de electrólise (4.3, 4.4), cortar segundo o comprimento do gel e colocar nas posições previstas (a distância dos eléctrodos deve ser de 9,5 cm).

Condições de focalização isoeléctrica

6.3.1. Formato do gel: 265 x 125 x 0,25 mm

>POSIÇÃO NUMA TABELA>

Nota:

Se a espessura ou largura dos géis forem alteradas, os valores da corrente eléctrica e da potência têm de ser devidamente adaptados (por exemplo, duplicar os valores da corrente eléctrica e da potência se for utilizado um gel de 265 x 125 x 0,5 mm).

6.3.2. Exemplo de um programa de voltagem para um aparelho automático de electroforese (dois géis de 5,0 x 4,5 cm), eléctrodos sem placas aplicados directamente no gel

>POSIÇÃO NUMA TABELA>

Colocar o aplicador de amostras na fase 2 a 0 Vh.

Retirar aplicador de amostras na fase 2 a 30 Vh.

6.4. Coloração das proteínas

6.4.1. Fixação das proteínas

Retirar os eléctrodos de placas imediatamente após desligar a corrente e colocar logo o gel numa placa de coloração/descoloração cheia com 200 ml de fixador (4.9); deixar durante 15 minutos, agitando continuamente.

6.4.2. Lavagem e coloração da placa de gel

Escorrer a totalidade do fixador e lavar a placa de gel duas vezes, durante 30 segundos de cada vez, com 100 ml da solução de descoloração (4.10). Decantar a solução de descoloração e encher a placa com 250 ml de solução de coloração (4.11.3); deixar corar durante 45 minutos agitando suavemente.

6.4.3. Descoloração da placa de gel

Decantar a solução de coloração, lavar a placa de gel duas vezes com 100 ml de solução de descoloração (4.10) de cada vez e, em seguida, agitar durante 15 minutos com 200 ml de solução de descoloração, repetindo o passo da descoloração pelo menos duas ou três vezes até que o fundo se encontre claro e incolor. Lavar a placa de gel com água destilada (2 x 2 minutos) e secar ao ar (2 a 3 horas) ou com secador de cabelo (10 a 15 minutos).

Nota 1:

Proceder à fixação, lavagem, coloração e descoloração a 20 °C. Não utilizar temperaturas elevadas.

Nota 2:

No caso de se preferir uma coloração pela prata de maior sensibilidade (por exemplo Silver Staining Kit, Protein, Pharmacia Biotech, código n.o 17-1150-01) as amostras de caseína tratadas com plasmina devem ser diluídas a 5 mg/ml.

7. Avaliação

A avaliação é efectuada por comparação da disposição das bandas da amostra com as das amostras de referência no mesmo gel. A detecção de leite de vaca nos queijos produzidos com leite de ovelha, leite de cabra e leite de búfala ou com misturas de leites de ovelha, de cabra e de búfala é efectuada através das γ2 e γ3-caseínas, cujos pontos isoeléctricos variam entre pH 6,5 e pH 7,5 (figuras 4a, 4b e figura 5). O limite de detecção é inferior a 0,5 %.

7.1. Avaliação visual

Para a avaliação visual da quantidade de leite de bovino, é aconselhável ajustar as concentrações das amostras e dos padrões a fim de obter o mesmo nível de intensidade das γ2 e γ3-caseínas dos ovinos, caprinos e/ou de búfalos ("ver γ2 E, G, B" e "γ3 E, G, B" nas figuras 4a, 4b e 5). Em seguida, a quantidade de leite de bovino (inferior, igual ou superior a 1 %) na amostra desconhecida poderá ser directamente avaliada por comparação da intensidade das caseínas γ2 e γ3 bovinas ("ver γ2 C" e γ3 C nas figuras 4a, 46 e 5) com a dos padrões de referência com 0 % e 1 % (ovelha, cabra) ou com padrões provisórios de laboratório (búfala).

7.2. Avaliação densnométrica

Se possível, aplicar a densitometria (5.19) para determinação da razão das áreas dos picos das caseínas γ2 e γ3 e γ3 bovinas e das ovinas, caprinas e/ou de búfalo (ver figura 5). Comparar este valor com a razão das áreas dos picos das caseínas γ2 e γ3 nos padrões de referência de 1 % (ovelha, cabra) ou com padrões provisórios de laboratório (búfala) analisados no mesmo gel.

Nota:

O método funciona satisfatoriamente, caso exista um sinal positivo claro das caseínas γ2 e γ3 bovinas no padrão de referência a 1 %, mas não no padrão de referência a 0 %. Caso contrário, optimizar o procedimento seguindo os pormenores do método com exactidão.

Considera-se uma amostra positiva de ambas as caseínas γ2 e γ3 bovinas ou as razões das áreas dos picos correspondentes foram iguais ou superiores ao nível do padrão de referência a 1 %.

8. Referências

1. Addeo F., Moio L., Chianese L., Stingo C., Resmini P., Berner I., Krause I., Di Luccia A., Bocca A.: Use of plasmin to increase the sensitivity of the detection of bovine milk in ovine and/or caprine cheese by gel isoelectric focusing of γ2-caseins. Milchwissenschaft 45, 708-711 (1990).

2. Addeo F., Nicolai M.A., Chianese L., Moio L., Spagna Musso S., Bocca A., Del Giovine L.: A control method to detect bovine milk in ewe and water buffallo cheese ussing immunoblotting. Milchwissenschaft 50, 83-85 (1995).

3. Krause I., Berner I., Klostermeyer H.: "Sensitive detection of cow milk in ewe and goat milk and cheese by carrier ampholyte/immobilised pH gradient - isoelectric focusing of γ-caseins using plasmin as signal amplifier" in: Electrophoresis-Forum 89 (B. J. Radola Ed.) pp. 389-393, Bode-Verlag, München (1989).

4. Krause I., Belitz H.-D., Kaiser K.-P.: Nachweiss von Kuhmilch in Schaf- und Ziegenmilch bzw. -käse durch isoelektrische Fokussierung in harnstoffhaligen Polyacrylamidgelen. Z. Lebensm. Unters. Forsch. 174, 195-199 (1982).

5. Radola B.J.: Ultrathin-layer isoelectric focusing in 50-1001 μm polyacrylamide gels on silanised glass plates or polyester films. Electrophoresis 1, 43-56 (1980).

Figura 1: Esquema da folha de cobertura

>PIC FILE= "L_2001037PT.005701.EPS">

Figura 2: Camada de caseína a flutuar entre as fases aquosas e orgânica após centrifugação

>PIC FILE= "L_2001037PT.005702.EPS">

Figura 3: Técnica de flapping para distribuição de géis ultrafinos de poliacrilamida

>PIC FILE= "L_2001037PT.005703.EPS">

a = separador (0,25 mm); b = folha de cobertura (5.3); c, e = placas de vidro (5.1); d = solução de gel (4.1.2); f = folha de suporte de gel (5.2)

Figura 4a: Focalização isoeléctrica (FIE) das caseínas tratadas com plasmina de queijo produzido com leite de ovelha e de cabra com diferentes quantidades de leite de vaca

>PIC FILE= "L_2001037PT.005801.EPS">

% CM = percentagem de leite de vaca; C = vaca; E = ovelha; G =cabra.

Apresenta-se a metade superior do gel de FIE.

Figura 4b: Focalização isoeléctrica (FIE) das caseínas tratadas com plasmina de queijo produzido com mistura de leite de ovelha, de cabra e de búfala com diferentes quantidades de leite de vaca.

>PIC FILE= "L_2001037PT.005802.EPS">

% CM = percentagem de leite de vaca; 1 + = amostra com 1 % de leite de vaca e com adição de caseína bovina pura e meio de percurso; C = vaca; E = ovelha; G = cabra; B = búfala.

Apresenta-se a distância de separação total do gel de FIE.

Figura 5: Sobreposição de densitogramas de amostras de padrões (STD) e de queijo produzido com uma mistura de leite de ovelha e de cabra após focalização isoeléctrica.

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a,b = padrões com 0 e 1 % de leite de vaca; c-g = amostras de queijo que contêm 0,1,2,3 e 7 % de leite vaca; C = vaca; E = ovelha; G = cabra.

A metade superior do gel foi examinada a γ = 634 nm.

(1) Os produtos Ampholine® pH 3,5-9,5 (Pharmacia) e Resolyte® pH 5-7 e pH 6-8 (BDH, Merck) mostraram-se especialmente adequados para a obtenção da necessária separação das γ-caseínas.

(2) Os produtos Ampholine® pH 3,5-9,5 (Pharmacia) e Resolyte® pH 5-7 e pH 6-8 (BDH, Merck) mostraram-se especialmente adequados para a obtenção da necessária separação das γ-caseínas.

(3) Os produtos Ampholine® pH 3,5-9,5 (Pharmacia) e Resolyte® pH 5-7 e pH 6-8 (BDH, Merck) mostraram-se especialmente adequados para a obtenção da necessária separação das γ-caseínas.

ANEXO XVI

(Artigo 11.o)

MÉTODO DE REFERÊNCIA PARA A DETECÇÃO DE COLIFORMES NA MANTEIGA, NO LEITE EM PÓ DESNATADO, NA CASEÍNA E NOS CASEINATOS

No caso de a manteiga ser testada para a detecção da presença de coliformes, inocular-se-ão no meio de cultura amostras correspondentes a 1 g de manteiga.

No caso de o leite em pó desnatado ou a caseína/caseinatos serem testados para a detecção da presença de coliformes, inocular-se-ão no meio de cultura amostras correspondentes a 0,1 g.

É aplicável a norma FIL 73A/1985, método B, com as seguintes alterações:

1) A amostra é preparada segundo a norma FIL 122B:1992. Para a caseína ácida, pode, em alternativa, recorrer-se ao processo de preparação da amostra descrito na norma FIL 73A/1985.

2) Apenas são submetidos a incubação e avaliados os tubos inoculados com amostras de 1 g (manteiga) ou de 0,1 g (leite em pó desnatado, caseína/caseinatos). Não são feitas diluições decimais.

Avaliação dos resultados

>POSIÇÃO NUMA TABELA>

Observação

Teor de coliformes: 1/10 g de manteiga, 1/g de leite em pó desnatado ou de caseína/caseinatos em média:

Os resultados que indicam que a exigência é satisfeita são obtidos com uma probabilidade de 93 %.

Teor de coliformes: 1/g de manteiga, 1/0,1 g p de leite em pó desnatado ou de caseína/caseinatos em média:

Os resultados que indicam que a exigência não é satisfeita são obtidos com uma probabilidade de 91 %.

(Hipótese: Distribuição de Poisson)

ANEXO XVII

(Artigo 12.o)

MÉTODO DE ANÁLISE PARA A DETERMINAÇÃO DO TEOR DE LACTOSE DOS PRODUTOS DA POSIÇÃO 2309 DA NOMENCLATURA COMBINADA(1)

PARTE I

1. Domínio de aplicação

O método é aplicável quando o teor de lactose é superior a 0,5 %.

2. Princípio

Dissolver os açúares em água. Fazer actuar a levedura (Saccharomyces cerevisiae) que não altera a lactose. Determinar o teor de lactose da solução, segundo o método de Luff-Schoorl, após decantação e filtração.

3. Reagentes

Tiossulfato de sódio 0,1 N

Indicador: solução de amido. Adicionar a 1 litro de água ebuliente uma mistura de 5 g de amido solúvel (juntar, eventualmente, 10 mg de iodeto de mercúrio como agente de conservação) e de 30 ml de água; manter esta mistura em ebulição durante 3 minutos; deixar arrefecer.

Solução de iodeto de potássio p.a. a 30 % (m/v).

Solução de ácido sulfúrico 6 N

Reagente de Luff-Schoorl:

a) Dissolver 25 g de sulfato de cobre p.a. isento de ferro (CuSO45H2O) em 100 ml de água;

b) Dissolver 50 g de ácido cítrico p.a. (C6H8O7H2O) em 50 ml de água:

c) Dissolver, em cerca de 300 ml de água quente, 143,8 g de carbonato de sódio p.a. anidro (Na2CO2).

Deitar b) em c) (após arrefecimento), agitando cuidadosamente, e juntar de seguida a). Completar até 1 litro, deixar repousar durante uma noite e filtrar. Verificar a normalidade do reagente assim obtido (0,1 N em Cu, 2 N em Na2CO3). O pH deve ser próximo de 9,4.

Solução de Carrez I: dissolver 23,8 g de Zn (C2H3O2)2.2H2O e 3 g de ácido acético glacial em água e completar até 100 ml.

Solução de Carrez II: dissolver 10,6 g de K4Fe(CN)6.3H2O em água e completar até 100 ml.

Grânulos de pedra-pomes, fervidos em ácido clorídrico, lavados em água e secos; suspensão de Saccharomyces cerevisiae: 25 g de levedura fresca em 100 ml de água (não conservar mais de uma semana no frigorífico).

4. Modo operatório

Pesar, com rigor ao mg, 1 g da amostra a analisar, introduzir esta quantidade num balão aferido de 100 ml. Juntar 25 a 30 ml de água. Colocar o balão, em banho-maria, em ebulição, durante 30 minutos; arrefecer, seguidamente, até cerca de 35 °C.

Juntar 5 ml da suspensão da levedura e agitar. Manter o balão aferido e o seu conteúdo, em banho-maria, à temperatura de 38 a 40 °C.

Após a fermentação, arrefecer até cerca de 20 °C. Juntar 2,5 ml de solução de Carrez I e agitar durante 30 segundos; juntar seguidamente 2,5 ml da solução de Carrez II e agitar novamente durante 30 segundos. Completar, até 100 ml, com água, misturar e filtrar. Pipetar uma quantidade de filtrado que não exceda 25 ml e que contenha, de preferência 40 a 80 mg de lactose; se necessário, completar, até 25 ml, com água e determinar o teor em lactose anidro segundo Luff-Schoorl.

Proceder a um ensaio em branco só com a levedura.

PARTE II

1. Determinação do teor de lactose segundo o método de Luff-Schoorl

Pipetar 25 ml de reagente de Luff-Schoorl para um erlenmeyer de 300 ml; juntar 25 ml, medidos com rigor, da solução decantada.

Juntar dois grânulos de pedra-pomes, aquecer, agitando à mão, sobre uma chama livre de altura média e deixar ferver cerca de 2 minutos. Colocar imediatamente o erlenmeyer sobre uma rede metálica, com tela de amianto, sob a qual se acendeu previamente uma chama. Esta é regulada de forma a só aquecer a base do erlenmeyer; adaptar de seguida um refrigerador de refluxo. Fazer, imediatamente, ferver durante 10 minutos exactos. Arrefecer imediatamente em água fria e passados cerca de 5 minutos, titular do seguinte modo:

Juntar ao líquido 10 ml de iodeto de potássio e, logo de seguida, mas com cuidado (devido à formação abundante de espuma) 25 ml de ácido sulfúrico 6 N.

Titular seguidamente com o tiossulfato de sódio até à aparição de uma cor amarelo claro e, no fim da titulação, juntar o indicador de amido.

Efectuar a mesma titulação numa mistura, medida rigorosamente, de 25 ml de reagente de Luff-Schoorl e 25 ml de água, depois de ter juntado 10 ml de iodeto de potássio e 25 ml de ácido sulfúrico 6 n, desta vez sem levar à fervura.

Estabelecer, através da tabela que segue, a quantidade em mg de lactose correspondente à diferença dos resultados das duas titulações (expressos em ml de tiossulfato de sódio 0,1 N).

TABELA

Tabela para 25 ml de reagente de Luff-Schorrl

(ver condições no texto)

1. Tiossulfato de sódio 0,1 N

2. Lactose C12H22O11

>POSIÇÃO NUMA TABELA>

(1) Regulamento (CEE) n.o 222/88.

ANEXO XVIII

(Artigo 13.o)

PESQUISA DE LACTOSSORO NO LEITE EM PÓ DESNATADO DESTINADO AO ARMAZENAMENTO PÚBLICO POR DOSEAMENTO DOS GLICOMACROPÉPTIDOS ATRAVÉS DA CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUÇÃO (CLAR)

1. Objecto e campo de aplicação

Este método permite colocar em evidência a presença de lactossoro no leite em pó desnatado destinado ao armazenamento público através do doseamento dos glicomacropéptidos.

2. Referência

Norma internacional ISO 707 - Leite e produtos lácteos - Métodos de amostragem, conformes às indicações contidas no n.o 2, alínea c), último parágrafo, do anexo I.

3. Definição

Teor em glicomacropéptidos no leite em pó desnatado: teor em substâncias determinado de acordo com o método a seguir descrito e expresso em percentagem em massa.

4. Princípio

- Reconstituição do leite em pó desnatado, eliminação das gorduras e proteínas com ácido tricloroacético e centrifugação,

- determinação da quantidade de glicomacropéptidos (GMP) presentes no sobrenadante por cromatografia líquida de alta resolução (CLAR),

- avaliação dos resultados obtidos nas amostras por comparação com amostras-padrão constituídas por leite em pó desnatado com ou sem adição de uma percentagem conhecida de lactossoro em pó.

5. Reagentes

Todos os reagentes devem ser de qualidade analítica reconhecida. A água utilizada deve ser destilada ou água de pureza pelo menos equivalente.

5.1. Solução de ácido tricloroacético

Dissolver 240 g de ácido tricloroacético (Cl3CCOOH) em água e completar até perfazer 1000 ml.

5.2. Solução eluente, pH 6,0

Dissolver 1,74 g de fosfato dipotássico (K2HPO4), 12,37 g de fosfato monopotássico (KH2PO4) e 21,41 g de sulfato de sódio (Na2SO4) em aproximadamente 700 ml de água. Se necessário, ajustar o pH a 6,0 utilizando uma solução de ácido fosfórico ou hidróxido de potássio.

Completar com água até fazer 1000 ml e homogeneizar.

Filtrar a solução eluente antes de a utilizar, através de uma membrana filtrante de porosidade 0,45 μm.

5.3. Solução de lavagem e conservação das colunas

Misturar um volume de acetonitrilo (CH3CN) com nove volumes de água. Filtrar a mistura antes de a utilizar, através de uma membrana filtrante de porosidade 0,45 μm.

Nota:

Pode ser utilizada qualquer outra solução de lavagem que tenha um efeito bactericida e que não altera o poder de resolução das colunas.

5.4. Amostras-padrão

5.4.1. Leite em pó desnatado que satisfaz as exigências do presente regulamento, seja [0].

5.4.2. Idêntico leite em pó desnatado adulterado com 5 % (m/m) de lactossoro e pó de tipo coalhado e composição padrão, seja [5].

6. Aparelhos

6.1. Balança analítica.

6.2. Centrifugadora susceptível de atingir uma força centrífuga de 2200 g dotada de tubos de centrifugação rolhados, com uma capacidade aproximada de 25 ml.

6.3. Agitador mecânico.

6.4. Agitador magnético.

6.5. Funis de vidro com cerca de 7 cm de diâmetro.

6.6. Papéis de filtro, filtração média, diâmetro aproximado de 12,5 cm.

6.7. Dispositivo de filtração em vidro, dotado de uma membrana filtrante de porosidade 0,45 μm.

6.8. Pipeta graduada que permite deitar 10 ml, em conformidade com a norma ISO 648, classe A ou ISO/R 835.

6.9. Banho de água com um termóstato regulado a 25 +- 0,5 °C.

6.10. Equipamento CLAR incluindo:

6.10.1. bomba;

6.10.2. injector manual ou automático, com uma capacidade de 15 a 30 μl;

6.10.3. duas colunas em série TSK 2000 SW (comprimento 30 cm, diâmetro interior 0,75 cm) ou colunas de eficácia equivalente e uma precoluna anterior (3 cm x 0,3 cm) provida de I 125 ou um material de eficácia equivalente;

6.10.4. estufa com coluna, com um termóstato regulado a 35 +- 1 °C;

6.10.5. detector de UV de comprimento de onda variável, permitindo efectuar medições a 205 nm com uma sensibilidade de 0,008 Å;

6.10.6. integrador susceptível de integrar de vale a vale.

Nota:

É possível com colunas mantidas à temperatura ambiente, mas o seu poder de resolução é ligeiramente inferior. Neste caso, as variações de temperatura ao longo de uma mesma série de análises devem ser inferiores a +- 5 °C.

7. Amostragem

7.1. Norma internacional ISO 707 - Leite e produtos lácteos - Métodos de amostragem, coforme às indicações contidas no n.o 2, alínea c), último parágrafo, do anexo I.

7.2. Conservar a amostra de modo a que não possa ocorrer qualquer deterioração ou alteração da mesma.

8. Metodologia

8.1. Preparação da amostra para análise

Transvasar o leite em pó para um recipiente de capacidade aproximadamente dupla da do volume do pó, munido de uma tampa impermeável ao ar. Fechar imediatamente o recipiente. Misturar bem o leite em pó, invertendo sucessivas vezes o recipiente.

8.2. Tomada da amostra para a análise

Pesar 2,000 +- 0,001 g da amostra para análise, para um tubo de centrifugação (6.2).

8.3. Eliminação das gorduras e proteínas

8.3.1. Adicionar 20,0 g de água tépida (50 °C) à tomada para análise. Dissolver o pó agitando durante cinco minutos com o auxílio de um agitador (6.3). Arrefecer o tubo até 25 °C.

8.3.2. Adicionar em dois minutos 10,0 ml da solução de ácido tricoloracético (5.1), ao mesmo tempo que a solução é agitada pelo agitador magnético (6.4). Colocar o tubo no banho de água (6.9), onde deve permanecer durante 60 minutos.

8.3.3. Centrifugar (6.2) durante 10 minutos a 2200 g, ou filtrar através de papel (6.6), rejeitando os 5 primeiros ml de filtrado.

8.4. Determinação cromatográfica

8.4.1. Injectar de 15 a 30 μl medidos com exactidão, de sobreadante ou de filtrado (8.3.3) no aparelho CLAR (6.10) com caudal de 1,0 ml de solução eluente por minuto.

Notas:

1. Manter a solução eluente (5.2) a 85 °C durante toda a análise cromatográfica a fim de conservar o eluente desgaseificado e evitar qualquer proliferação bacteriana. Pode ser utilizada qualquer precaução tendo um efeito semelhante.

2. A cada interrupção, passar as colunas por água. Nunca deixar solução eluente nas colunas (5.2).

Antes de qualquer interrupção superior a 24 horas, passar as colunas por água e em seguida lavá-las com a solução (5.3) durante pelo menos 3 horas, com um caudal de 0,2 ml por minuto.

8.4.2. Os resultados de análise cromatográfica da amostra a testar [E] são obtidos sob a forma de um cromatograma onde cada pico é identificado pelo respectivo tempo de retenção TR, ou seja:

>POSIÇÃO NUMA TABELA>

A qualidade das colunas pode influenciar o tempo de retenção dos diferentes picos.

O integrador (6.10.6) calcula automaticamente a superfície A de cada pico, ou seja:

>POSIÇÃO NUMA TABELA>

Para detectar as eventuais anomalias devidas quer a um funcionamento deficiente do aparelho ou das colunas, quer à natureza de amostra analisada, é necessário observar o aspecto de cada cromatograma antes de qualquer interpretação quantitativa.

Em caso de dúvida, repetir a análise.

8.5. Calibração

8.5.1. Aplicar exactamente às amostras-padrão (5.4) a metodologia descrita da alínea 8.2 à alínea 8.4.2.

Utilizar soluções recentemente preparadas pois os GMP degradam-se em meio tricloroacético a 8 %. Com efeito o seu teor baixa aproximadamente 0,2 % por hora a 30 °C.

8.5.2. Antes de proceder a qualquer determinação cromatográfica das amostras, condicionar as colunas mediante injecções sucessivas de solução (8.5.1) da amostra-padrão (5.4.2) até que a superfície e o tempo de retenção do pico correspondentes ao GMP sejam constantes.

8.5.3. Determinar os coeficientes de resposta R injectando um volume de filtrados (8.5.1) idêntico ao que foi utilizado nas amostras.

9. Expressão dos resultados

9.1. Proceso de cálculo e fórmulas

9.1.1. Cálculo dos coeficientes de resposta R:

>POSIÇÃO NUMA TABELA>

em que:

RII e RIV= coeficientes de resposta dos picos II e IV respectivamente,

AII [0] e AIV [0]= superfícies dos picos II e IV respectivamente da amostra-padrão [0], obtidas na alínea 8.5.3

>POSIÇÃO NUMA TABELA>

em que:

RIII= coeficientes de resposta do pico III,

AIII [0] e AIII [5]= superfícies do pico III nas amostras-padrão [0] e [5] respectivamente, obtidas na alínea 8.5.3,

W= quantidade de lactossoro presente na amostra-padrão [5], ou seja, 5.

9.1.2. Cálculo da superfície relativa dos picos da amostra [E]

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

em que:

SII [E], SIII [E], SIV [E]= superfícies relativas dos picos II, III e IV respectivamente da amostra [E],

AII [E], AIII [E], AIV [E]= superfícies relativas dos picos II, III e IV da amostra [E], obtidas na alínea 8.4.2,

RII, RIII, RIV= coeficientes de resposta calculados na alínea 9.1.1.

9.1.3. Cálculo do tempo de retenção relativo ao pico III da amostra [E]:

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

em que:

TRRIII [E]= tempo de retenção relativo ao pico III da amostra [E],

TRIII [E]= tempo de retenção do pico III da amostra [E] obtido na alínea 8.4.2,

TRIII [5]= tempo de retenção do pico III da amostra-padrão [5] obtido na alínea 8.5.3.

9.1.4. Foi experimentalmente demonstrado que existe uma relação linear entre o tempo de retenção relativo ao pico III, ou seja TRRIII [E], e a percentagem de soro em pó adicionada até 10 %:

- TRRIII [E] é < 1,000 quando o teor em soro é > 5 %,

- o TRRIII [E] é >= 1,000 quando o teor em soro é <= 5 %.

O grau de incerteza admissível relativamente aos valores TRRIII é de +- 0,002.

Normalmente, o valor de TRRIII [0] difere pouco de 1,034. Consoante o estado das colunas, este valor pode aproximar-se de 1,000, mas deve ser sempre superior.

9.2. Cálculo da percentagem do lactossoro em pó presente na amostra, ou seja:

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

em que:

W= percentagen m/m de lactorosso presente na amostra [E],

SIII [E]= superfície relativa do pico III da amostra a testar [E] obtido na alínea 9.1.2,

1,3= superfície relativa média do pico III, expressa em g por cada 100 g de lactossoro determinada nos leites em pó desnatados não adulterados, de origens diversas. Este valor foi obtido experimentalmente,

SIII [0]= superfície relativa do pico III, que é igual a RIII x AIII [0]. Estes valores são obtidos respectivamente nas alíneas 9.1.1 e 8.5.3,

(SIII [0] - 0,9)= correcção a introduzir na superfície relativa média 1,3 quando o valor SIII [0] se afasta de 0,9. Experimentalmente, a superfície relativa média do pico III da amostra-padrão [0] é de 0,9.

9.3. Precisão do método

9.3.1. Repetibilidade

A diferença entre os resultados de duas determinações efectuadas simultaneamente ou num certo espaço de tempo, pelo mesmo analista utilizando o mesmo aparelho, na mesma amostra para análise não deve ultrapassar 0,2 % m/m.

9.3.2. Reprodutibilidade

A diferença entre dois resultados individuais e independentes obtidos em dois laboratórios diferentes, na mesma amostra para análise, não deve ultrapassar 0,4 % m/m.

9.4. Interpretação

9.4.1. Concluir que não há presença de soro se a superfície relativa ao pico III, SIII [E], expressa em gramas de soro coalhado por 100 g de produto, for <=

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

em que

>POSIÇÃO NUMA TABELA>

9.4.2. Se a superfície relativa do pico III, SIII [E] for >

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

e a superfície relativa do pico II, SII [E] <= 160, calcular o teor em lactossoro presente do modo indicado no ponto 9.2.

9.4.3. Se a superfície relativa do pico III,SIII [E] for >

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

e a superfície relativa do pico II, SII [E] <= 160, determinar o teor em matérias proteicas totais (P %); examinar seguidamente os gráficos 1 e 2.

9.4.3.1. Os datos obtidos após análise de amostras de leites desnatados em pó não adulterados, com um teor em matérias proteicas totais elevado, estão reunidos nos gráficos 1 e 2.

A recta representada a traço cheio representa a recta de regressão linear, cujos coeficientes são calculados pelo método dos mínimos quadrados.

A recta representada a tracejado fixa o limite superior relativa do pico III, com uma probabilidade de 90 % de não ser ultrapassado.

As equações das rectas a tracejado dos gráficos 1 e 2 são respectivamente iguais a:

>POSIÇÃO NUMA TABELA>

em que

>POSIÇÃO NUMA TABELA>

Estas equações são equivalentes ao valor 1,3 mencionado no ponto 9.2.

A diferença (T1 e T2) entre a superfície relativa SIII [E] calculada e a superfície relativa SIII é dada pelas expressões seguintes:

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

9.4.3.2.

>POSIÇÃO NUMA TABELA>

O teor em soro presente é calculado por meio da expressão seguinte:

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

em que

0,91 representa a diferença, medida no eixo vertical, entre as rectas, a cheio e a tracejado.

>PIC FILE= "L_2001037PT.006801.EPS">

ANEXO XIX

(Artigo 13.o)

DETERMINAÇÃO DE SORO DE COAGULAÇÃO DESIDRATADO NO LEITE EM PÓ DESNATADO E NAS MISTURAS REFERIDAS NO REGULAMENTO (CΕE) N.o 2799/1999

1. Objectivo: Detecção da adição de soro de coagulação desidratado aos seguintes produtos

a) Leite em pó desnatado definido no artigo 2.o do Regulamento (CE) n.o 2799/1999

b) Misturas definidas no artigo 4.o do Regulamento (CE) n.o 2799/1999

2. Referências: Norma internacional ISO 707

3. Definição

O teor de soro de coagulação desidratado é definido em percentagem ponderal, determinada pelo procedimento descrito.

4. Fundamento do método

Determinação da quantidade de glicomacropéptido A (GMPΑ) de acordo com o anexo XVIII. As amostras que apresentem resultados positivos são analisadas em relação ao glicomacropéptido A por um método de cromatografia líquida de alta resolução em fase inversa (processo CLAR). Avaliação do resultado obtido por comparação com amostras-padrão de leite em pó desnatado com e sem uma percentagem conhecida de soro de leite em pó. A obtenção de resultados superiores a 1 % (m/m) prova a presença de soro de coagulação desidratado.

5. Reagentes

Todos os reagentes devem ser de qualidade analítica. A água utilizada deve ser destilada ou, pelo menos, de pureza equivalente. O acetonitrilo deve ser de qualidade para espectroscopia ou HPLC.

Os reagentes utilizados são descritos no anexo XVIII do presente regulamento.

Reagentes para HPLC de fase reversa.

5.1. Solução de ácido tricloroacético

Dissolver 240 g de ácido tricloroacético (CCI3CCOOH) em água e completar 1000 ml.

5.2. Eluentes A e B

Eluente A: misturar 150 ml de acetonitrilo (CH3CN), 20 ml de Isopropanol (CH3CHOHCH3) e 1,00 ml de ácido trifluoroacético (TFA, CF3 COOH) com água até perfazer 1000 ml. Eluente B: misturar 550 ml de acetonitrilo, 20 ml de isopropanol e 1,00 ml de ácido trifluoroacético com água até perfazer 1000 ml. Antes da utilização, filtrar a solução eluente numa membrana de filtração com poros de 0,45 μm de diâmetro.

5.3. Conservação da coluna

Após as análises, a coluna é lavada com o eluente B (via um gradiente) e, posteriormente, com acetonitrilo (via um gradiente em 30 minutos). A coluna é conservada em acetonitrilo.

5.4. Soluções-padrão

5.4.1. Leite em pó desnatado que satisfaça as exigências aplicáveis à armazenagem pública, ou seja (0).

5.4.2. O mesmo leite em pó desnatado adulterado com 5 % (m/m) de soro de coagulação desidratado de composição-padrão (5).

5.4.3. O mesmo leite em pó desnatado adulterado com 50 % (m/m) de soro de coagulação desidratado de composição-padrão (50)(1)

6. Equipamento

O equipamento necessário é descrito no anexo XVIII do presente regulamento.

6.1.1. Balança analítica.

6.2. Centrifugadora que possa atingir uma força centrífuga de 2200 g equipada com tubos de centrifugação fechados de cerca de 50 ml.

6.3. Agitador mecânico para funcionamento a 50 °C.

6.4. Agitador magnético.

6.5. Funis de vidro com cerca de 7 cm de diâmetro.

6.6. Papel de filtro para filtração média, com cerca de 12,5 cm de diâmetro.

6.7. Dispositivo de filtração de vidro munido de membrana de filtração com poros de 0,45 μm de diâmetro.

6.8. Pipetas graduadas de 10 ml (ISO 648, classe A ou ISO/R 835) ou sistema que possa debitar 10,0 ml em dois minutos.

6.9. Banho-maria termostático regulado para 25 +- 0,5 °C.

6.10. Equipamento de HPLC, incluindo:

6.10.1. Bomba de gradiente binário,

6.10.2. Injector, manual ou automático, de 100 μl de capacidade,

6.10.3. Coluna Dupont Protein Plus (comprimento: 25 cm, diâmetro interior: 0,46 cm) ou coluna equivalente de fase reversa, à base de sílica, de poros largos,

6.10.4. Câmara termostática para colunas regulada para 35 +- 1 °C,

6.10.5. Detector UV de comprimento de onda variável, que permita efectuar medições a 210 nm (se necessário, pode ser utilizado um comprimento de onda superior, até 220 nm) com uma sensibilidade de 0,02 Å.

6.10.6. Integrador com possibilidade de integração entre mínimos consecutivos.

Nota:

É possível o funcionamento da coluna à temperatura ambiente, desde que a flutuação desta última não exceda 1 °C; caso contrário, registam-se demasiadas variações do tempo de retenção do GMP.

7. Amostragem

7.1. A colheita das amostras é efectuada de acordo com o procedimento previsto na norma internacional ISO 707. Todavia, os Estados-Membros podem utilizar outro método, desde que o mesmo seja conforme aos princípios estabelecidos pela norma supracitada.

7.2. Conservar a amostra em condições que evitem qualquer deterioração ou alteração da composição.

8. Procedimento

8.1. Preparação da amostra de ensaio

Colocar o leite em pó num recipiente de capacidade aproximadamente dupla do volume do produto pulverulento, equipado com uma tampa estanque ao ar. Fechar de imediato o recipiente. Misturar bem o leite em pó através da inversão repetida do recipiente.

8.2. Toma de ensaio

Pesar 2,00 +- 0,001 g de amostra a analisar para um tubo de centrifugação (ponto 6.2) ou um balão rolhado (50 ml).

8.3. Eliminação da matéria gorda e das proteínas

8.3.1. Juntar à toma de ensaio 20,0 g de água quente (50 °C). Dissolver o pó agitando durante 5 minutos ou durante 30 minutos no caso do leitelho ácido, utilizando um agitador mecânico (6.3). Colocar o tubo em banho-maria (6.9) e deixar equilibrar à temperatura de 25 °C.

8.3.2. Juntar 10,0 ml de solução de ácido tricloroacético a 25 °C (5.1) de uma forma constante durante 2 minutos enquanto se agita vigorosamente por meio de um agitador magnético (6.4). Colocar o tubo num banho-maria (6.9) e deixar em repouso durante 60 minutos.

8.3.3. Centrifugar (6.2) durante 10 minutos a 22000 g ou filtrar através de papel (6.6), rejeitando os primeiros 5 ml de filtrado.

8.4. Análise cromatográfica

8.4.1. Proceder à análise por HPLC como descrito no anexo XVIII. No caso de ser obtido um resultado negativo, a amostra analisada não contém soro de coagulação desidratado em quantidade detectável. No caso de ser obtido um resultado positivo, é necessário proceder ao método CLAR de fase inversa anteriormente descrito. A presença de pó de leitelho ácido pode originar falsos resultados positivos. O método CLAR de fase inversa infirma essa possibilidade.

8.4.2. Antes de se proceder à análise CLAR de fase inversa, devem ser optimizadas as condições de gradiente. Para os sistemas de gradiente com um volume morto de cerca de 6 ml (volume a partir do ponto em que os solventes se juntam até ao volume da ansa do injector, inclusive), é óptimo um tempo de retenção de 26 minutos +- 2 minutos para o GMPA. Os sistemas de gradiente com um volume morto inferior (por exemplo 2 ml) devem utilizar 22 minutos como tempo óptimo de retenção.

Tomar as soluções de amostras-padrão (5.4) sem e com 50 % de soro de coalho.

Injectar 100 μl do sobrenadante ou filtrado (8.3.3) no aparelho de CLAR, que deve funcionar nas condições de gradiente de aferição indicadas no quadro 1.

Quadro 1

Condições de grandiente de aferição para optimização da cromatografia

>POSIÇÃO NUMA TABELA>

A comparação dos dois cromatogramas deve revelar a localização do pico de GMPA.

Utilizando as fórmulas a seguir indicadas, pode ser calculada a composição inicial de solvente a utilizar para o gradiente normal (ver 8.4.3):

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

Em que:

TRgmpA: tempo de retenção do GMPA com o gradiente de aferição

10: % B inicial do gradiente de aferição

2,5: % B no ponto médio menos % B no início do gradiente normal

13,5: tempo médio do gradiente de aferição

26: tempo de retenção necessário do GMPA

6: razão entre os declives do gradiente de aferição e do gradiente normal

30: % B no início menos % B após 27 minutos no gradiente de aferição

27: tempo decorrido do gradiente de aferição

8.4.3. Colheita de soluções das amostras a testar

Injectar 100 μl de sobrenadante ou filtrado medidos rigorosamente (8.3.3) no aparelho de CLAR, que deve funcionar com um caudal de 1,0 ml da solução eluente (5.2) por minuto.

A composição de eluente no início da análise é obtida a partir de 8.4.2, sendo normalmente próxima de A:B = 76:24 (5.2). Imediatamente após a injecção, é iniciado um gradiente linear, que dá origem a uma percentagem de B 5 % mais elevada após 27 minutos. Em seguida, é iniciado um gradiente linear, o que leva a composição de eluente a 90 % de B em 5 minutos. Esta composição é mantida durante 5 minutos mudando seguidamente, via um gradiente linear em 5 minutos para a composição inicial. Em função do volume interno do sistema de bomba, a injecção seguinte pode ser feita 15 minutos após a obtenção das condições iniciais.

Observações

1. O tempo de retenção do glicomacropéptido deve ser de 26 minutos +- 2 minutos. Este pode ser conseguido através da variação das condições iniciais e finais do primeiro gradiente. Todavia, a diferença entre a percentagem de B das condições iniciais e finais do primeiro gradiente deve permanecer 5 % de B.

2. Os eluentes devem ser suficientemente desgaseificados e permanecer nesse estado. Tal é essencial para o funcionamento adequado do sistema de bomba de gradiente. O desvio-padrão do tempo de retenção do pico de GPM deve ser inferior a 0,1 minutos (n = 10).

3. Devem ser injectadas as cinco amostras de referência (5) e utilizadas para calcular um novo factor R de resposta (9.1.1).

8.4.4. Os resultados de análise cromatográfica da amostra a testar (E) são obtidos na forma de um cromatograma em que o pico de GMP é identificado pelo seu tempo de retenção de cerca de 26 minutos.

O integrador (6.10.6) calcula automaticamente a altura A do pico de GMP. Em todos os cromatogramas, deve ser verificada a localização da linha de base. A análise ou a integração devem ser repetidas se a linha de base estiver localizada dum modo incorrecto.

Para detectar quaisquer anomalias devidas quer a um funcionamento deficiente do aparelho ou da coluna quer à origem e natureza da amostra analisada, é necessário observar o aspecto de cada cromatograma antes de proceder a qualquer interpretação quantitativa.

8.5. Calibração

8.5.1. Aplicar exactamente às amostras-padrão (5.4.1-5.4.2) a técnica descrita desde o ponto 8.2 até ao ponto 8.4.4. Utilizar soluções recentemente preparadas, pois o GMP é degradado à temperatura ambiente, em meio de ácido tricloroacético a 8 %. A 4 °C, a solução permanece estável durante 24 horas. No caso de séries longas de análises, é desejável a utilização de um recipiente arrefecido para amostras no injector automático.

Nota

O ponto 8.4.2. pode ser suprimido se a percentagem de B nas condições iniciais for conhecida das análises anteriores.

O cromatograma da amostra de referência (5) deve ser idêntico à figura 1, onde o pico de GMPA é antecedido de dois picos pequenos. É essencial obter uma separação semelhante.

8.5.2. Antes da determinação cromatográfica das amostras, injectar 100 μl da amostra-padrão sem soro de coalho (0) (5.4.1).

O cromatograma não deve apresentar um pico com um tempo de retenção do pico de GMPA.

8.5.3. Determinar os factores R de resposta por injecção do mesmo volume de filtrado (8.5.1), como utilizado para as amostras.

9. Resultados

9.1. Método de cálculo e fórmulas

9.1.1. Cálculo do factor R de resposta:

Pico de GMP: R = SL/AEm que:

R= factor de resposta do pico de GMP

A= altura do pico de GMP

SL= quantidade de soro de leite na amostra-padrão (5).

9.2. Cálculo da percentagem de soro em pó de coalho na amostra:

SL(E) = R x A (E)Em que:

SL(E)= percentagem (m/m) de soro de coalho na amostra (E)

R= factor de resposta do pico GMP (9.1.1)

A(E)= altura do pico de GMP da amostra (E).

Se SL(E) for superior a 1 % e a diferença entre o tempo de retenção e o da amostra-padrão (5) for inferior a 0,2 minutos, conclui-se que o soro sólido de coalho está presente.

9.3. Exactidão do método

9.3.1. Repetibilidade

A diferença entre os resultados de duas determinações efectuadas simultaneamente ou com um curto intervalo de tempo pelo mesmo analista, utilizando os mesmos aparelhos e utensílios, no mesmo material de teste, não deve exceder 0,2 % mim.

9.3.2. Reprodutibilidade

Por determinar.

9.3.3. Linearidade

A partir de 0 até 16 % de soro de coalho, deve ser obtida uma relação linear com um coeficiente de correlação superior a 0,99.

9.4. Interpretação

9.4.1. Considera-se que o soro de leite está presente se o resultado obtido no ponto 9.2 for superior a 1 % m/m e se o tempo de retenção do pico de GMP diferir em menos de 0,2 minutos do obtido com a amostra-padrão (5). É fixado o limite de 1 % de acordo com o disposto no Regulamento (CEE) n.o 625/78, anexo 5, pontos 9.2 e 9.4.1.

>PIC FILE= "L_2001037PT.007301.EPS">

(1) O soro de coagulação desidratado de composição-padrão, bem como o leite em pó desnatado adulterado são comercializados por NIZO, Kernhemseweg 2, PO Box 20, NL-6710 BA. Todavia, podem também ser utilizados produtos que forneçam resultados idênticos aos dos produtos da NIZO.

ANEXO XX

(Artigo 14.o)

LEITE EM PÓ DESNATADO: DOSEAMENTO DA FOSFATIDILSERINA E DA FOSFATIDILETANOLAMINA

Método HPLC de fase reversa

1. Âmbito e domínio de aplicação

O método descreve um processo de determinação quantitativa da fosfatidilserina (PS) e da fosfatidiletanolamina (PE) no leite em pó desnatado, e pode ser utilizado para a detecção de sólidos de leitelho no leite em pó desnatado.

2. Definição

Teor de PS + PE: a fracção, em massa, da substância determinada pelo processo especificado abaixo. O resultado é expresso em miligramas de dipalmitato de fosfatidiletanolamina (PEDP) por 100 g de pó.

3. Princípio

Extracção pelo metanol de aminofosfolípidos do leite em pó reconstituído. Determinação da PS e da PE na forma de derivados o-ftaldialdeídicos (OPA) por cromatografia líquida de alta resolução com inversão de fase [(RP) HULC] e detecção de fluorescência. Quantificação do teor de PS e de PE na amostra de ensaio por referência a uma amostra padrão contendo uma quantidade conhecida de PEDP.

4. Reagentes

Todos os reagentes devem ser de grau analítico reconhecido. A água deve ser destilada ou de pureza pelo menos equivalente, salvo indicação em contrário.

4.1. Substância-padrão: PEDP, de pureza mínima 99 %.

Nota:

A substância-padrão deve ser armazenada - 18 °C.

4.2. Reagentes para a preparação da amostra-padrão e da amostra de ensaio

4.2.1. Metanol para HPLC

4.2.2. Clorofórmio para HPLC

4.2.3. Monocloridrato de triptamina

4.3. Reagentes para a preparação de derivados de o-ftaldialdeído

4.3.1. Solução aquosa de hidróxido de sódio 12 M

4.3.2. Solução aquosa de ácido bórico 0,4 M com o pH ajustado para 10,0 com hidróxido de sódio (4.3.1)

4.3.3. 2-Mercaptoetanol

4.3.4. o-Ftaldialdeído (OPA)

4.4. Solventes e eluição para HPLC

Preparar os solventes de eluição com reagentes de qualidade para HPLC.

4.4.1. Água para HPLC

4.4.2. Metanol de pureza fluorimétrica comprovada

4.4.3. Tetra-hidrofurano

4.4.4. Fosfato de sódio di-hidrogenado

4.4.5. Acetato de sódio

4.4.6. Ácido acético

5. Equipamento

5.1. Balança analítica

5.2. Copos de 25 e 100 ml

5.3. Pipetas de 1 e 10 ml

5.4. Agitador magnético

5.5. Pipetas graduadas de 0,2, 0,5 e 5 ml

5.6. Balões aferidos de 10, 50 e 100 ml

5.7. Seringas de 20 e 100 μl

5.8. Banho de ultrassons

5.9. Centrifugadora para funcionamento a 27000 x g

5.10. Balões de vidro de cerca de 5 ml

5.11. Proveta de 25 ml

5.12. Medidor de pH

5.13. Equipamento para HPLC

5.13.1. Sistema de bombagem regulável, adequado a um caudal de 1,0 ml/min a 200 bar

5.13.2. Sistema de auto-amostragem com possibilidade de derivação

5.13.3. Sistema de aquecimento de colunas regulado para 30 °C

5.13.4. Detector de fluorescência regulado para um comprimento de onda de excitação de 330 nm e um comprimento de onda de emissão de 440 nm

5.13.5. Integrador ou software de tratamento de dados para a determinação da área dos picos

5.13.6. Coluna Ichrosphère - 100 (250 x 4,6 mm) ou coluna equivalente preenchida com octadecilsilano (C 18) de 5 μm de granulometria

6. Amostragem

Efectuar a amostragem de acordo com a Norma IDF 50B.1985.

7. Procedimento

7.1. Preparação da solução do padrão interno

Pesar 30,0 +- 0,1 mg de monocloridrato de triptamina (4.2.3) num balão aferido de 100 ml (5.6) e ajustar o volume até ao traço com metanol (4.2.1). Pipetar 1 ml (5.3) desta solução para um balão aferido de 10 ml (5.6) e ajustar o volume até ao traço com metanol (4.2.1), de forma a obter uma concentração de triptamina de 0,15 mM.

7.2. Preparação da solução de amostra a dosear

Pesar 1,000 +- 0,001 g da amostra de leite em pó desnatado num copo de 25 ml (5.2). Utilizando uma pipeta (5.3) adicionar 10 ml de água destilada a 40 °C e agitar com um agitador magnético (5.4) durante 30 min., para dissolver eventuais agregados. Pipetar 0,2 ml (5.5) do leite reconstituído para um balão aferido de 10 ml (5.6), adicionar 100 μl da solução de triptamina 0,15 mM (7.1) com uma seringa (5.7) e completar o volume até ao traço com metanol (4.2.1). Misturar cuidadosamente por inversão e passar num aparelho de ultrassons (5.8) durante 15 min. Centrifugar (5.9) a 27000 x g durante 10 min., e recolher o sobrenadante num frasco de vidro (5.10).

Nota:

A solução de ensaio deve ser armazenada a 4 °C até que seja realizada a análise por HPLC.

7.3. Preparação da solução padrão

Pesar 55,4 mg de PEDP (4.1) num balão aferido de 50 ml (5.6) e adicionar cerca de 25 ml de clorofórmio (4.2.2) utilizando uma proveta graduada (5.11 ). Aquecer o balão selado até uma temperatura de 50 °C e misturar cuidadosamente até dissolver o PEDP. Arrefecer o balão até 20 °C, completar o volume com metanol (4.2.1 ) e misturar por inversão. Pipetar 1 ml (5.3) desta solução para um balão aferido de 100 ml (5.6) e completar o volume com metanol (4.2.1). Pipetar 1 ml (5.3) desta solução para um balão aferido de 10 ml (5.6), adicionar 100 μl (5.7) da solução de triptamina 0,15 mM (7.1) e completar o volume com metanol (4.2.1). Misturar por inversão.

Nota:

A solução-padrão deve ser armazenada a 4 °C até que seja realizada a análise por HPLC.

7.4. Preparação do reagente para a obtenção de derivados

Pesar 25,0 +- 0,1 mg OPA (4.3.4) num balão aferido de 10 ml (5.6), adicionar 0,5 ml (5.5) de metanol (4.2.1) e misturar cuidadosamente para dissolver o OPA. Ajustar o volume até ao traço com solução de ácido bórico (4.3.2) e adicionar 20 μl de 2-mercaptoetanol (4.3.3) com uma seringa (5.7).

Nota:

O reagente para a obtenção de derivados deve ser armazenado a 4 °C num frasco protegido da luz, mantendo-se estável durante uma semana.

7.5. Determinação por HPLC

7.5.1. Solventes de eluição (4.4)

Solvente A:

Solução 0,3 mM de fosfato de sódio di-hidrogenado e 3 mM de acetato de sódio (com pH ajustado a 6,5 por adição de ácido acético): de metanol: de tetra-hidrofurano = 558: 440: 2 (v/v/v)

Solvente B:

Metanol

7.5.2. Gradiente de eluição sugerido:

>POSIÇÃO NUMA TABELA>

Nota:

Pode ser necessário alterar ligeiramente o gradiente de eluição de modo a conseguir a resolução indicada na figura 1.

Temperatura da coluna: 30 °C

7.5.3. Volume a injectar: 50 μl de reagente para obtenção de derivados e 50 μl de solução de amostra.

7.5.4. Condicionamento da coluna

Diariamente, ao pôr o sistema em funcionamento, lavar a coluna com 100 % de solvente B durante 15 min., depois ajustar para uma proporção A: B = 40: 60 e equilibrar a 1 ml/min. durante 15 min. Fazer uma passagem em branco injectando metanol (4.2.1).

Nota:

Antes de um armazenamento prolongado, lavar a coluna com uma mistura metanol: clorofórmio 80: 20 (v/v) durante 30 min.

7.5.5. Doseamento dos PS + PE na amostra a analisar

7.5.6. Realizar a sequência de análises cromatográficas mantendo um intervalo constante entre passagens de forma a obter tempos de retenção constantes. Injectar a solução do padrão externo (7.3) entre cada 5-10 amostras da solução a ensaiar a fim de avaliar o factor de resposta.

Nota:

A coluna deve ser limpa efectuando uma lavagem com 100 % de solvente B (7.5.1) durante pelo menos 30 min., após cada 20-25 passagens.

7.6. Modo de integração

7.6.1. Pico PEDP

O PEDP é eluído num único pico. Determinar a área do pico procedendo à integração entre dois mínimos consecutivos da curva.

7.6.2. Pico da triptamina

A triptamina é eluída num único pico (figura 1). Determinar a área do pico procedendo à integração entre dois mínimos consecutivos da curva.

7.6.3. Grupos de picos da PS e da PE

Nas condições descritas (figura 1), a PS é eluída em dois picos principais parcialmente não resolvidos, precedidos de um pico secundário. A PE é eluída em 3 picos principais parcialmente não resolvidos. Determinar a área total de cada grupo de picos, estabelecendo a linha de base conforme indicado na figura 1.

8. Cálculo e expressão dos resultados

Os teores de PS e PE da amostra são calculados do seguinte modo:

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

sendo

C= teor de PS ou PE (mg/100 g de amostra pulverulenta a dosear)

A1= área do pico de PEDP da solução-padrão da amostra (7.3)

A2= área do pico de PS ou PE da solução de amostra a analisar (7.2)

T1= área do pico da triptamina da solução-padrão da amostra (7.3)

T2= área do pico da triptamina da solução de amostra a analisar (7.2).

9. Precisão

Nota:

Os valores relativos à repetibilidade foram calculados em conformidade com a norma internacional IDF(1). O limite de reprodutibilidade provisório foi calculado em conformidade com a alínea b) do anexo III.

9.1. Repetibilidade

O desvio-padrão relativo da repetibilidade, que exprime a variabilidade de resultados analíticos independentes obtidos pelo mesmo operador utilizando o mesmo aparelho nas mesmas condições, com a mesma amostra, num intervalo curto, não deve exceder 2 %. Se duas determinações forem obtidas nestas condições, a diferença relativa entre os dois resultados não deve ser superior a 6 % da média aritmética dos resultados.

9.2. Reprodutibilidade

Se foram efectuadas duas determinações por operadores em laboratórios diferentes, utilizando aparelhos diferentes, em condições diferentes, na análise da mesma amostra, a diferença relativa entre os dois resultados não deve exceder 11 % da média aritmética dos resultados.

10. Bibliografia

10.1. Resmini (P.), Pellegrino (L.), Hogenboom (J.A.), Sadini (V.), Rampilli (M.), "Détection des solides du babeurre dans le lait écrémé en poudre par dosage des aminophospholipides à la CLHP", Sci. Tecn. Latt.-Cas., 39, 395 (1988).

Figura 1: Curva resultante da HPLC de derivados OPA da fosfatidilserina (PS) e da fosfatidiletanolamina (PE) obtidas por extracção com metanol de leite em pó desnatado reconstituído. O modo de integração dos picos de PS, PE e triptamina (padrão interno) encontra-se indicado.

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(1) International IDF Standard 135B/1991. Milk and milk products. Precision charachteristics of analytical methods. Outline of collaborative study procedure (esquema de um método de estudo em colaboração).

ANEXO XXI

(Artigo 15.o)

PESQUISA DE RESÍDUOS DE ANTIBIÓTICO E DE SULFONAMIDA/DAPSONA EM LEITE EM PÓ DESNATADO

Utilizar um teste de selecção com inibidor microbiano, usando Bacillus stearothermophilus var. calidolactis C953 como microrganismo de ensaio, devendo o teste ter uma sensibilidade suficiente para detectar 4 μg de benzilpenicilina por litro de leite e 100 μg de sulfadimidina por litro de leite. Podem ser utilizados kits de ensaio existentes no comércio, desde que tenham a sensibilidade exigida no que repeita à benzilpenicilina e à sulfadimidina(1).

No ensaio é utilizado leite em pó desnatado reconstituído (1 g de pó + 9 ml aqua dest). O ensaio é efectuado conforme descrito no Boletim IDF n.o 258/1991, secção 1, capítulo 2 ou de acordo com as instruções do fabricante do kit de ensaio.

A interpretação dos resultados positivos é feita do seguinte modo:

1. Repetir o ensaio adicionando penicilinase ao sistema de ensaio:

Resultado positivo: A substância inibidora não pode ser identificada por este método.

Resultado negativo: A substância inibidora é um antibiótico do grupo de β-lactame.

2. Repetir o teste adicionado ácido p-aminobenzóico ao sistema de ensaio:

Resultado positivo: A substância inibidora não pode ser identificada por este método.

Resultado negativo: A substância inibidora é uma sulfonamida/dapsona.

3. Repetir o teste adicionando penicilinase + ácido p-aminobenzóico ao sistema de ensaio:

Resultado positivo: A substância inibidora não pode ser identificada por este método.

Resultado negativo: As substâncias inibidoras são um antibiótico do grupo do β-lactame e uma sulfonamida/dapsona.

(1) Aviso importante:

a análise de leite em pó desnatado pode produzir resultados positivos falsos. É importante, por conseguinte, verificar que o sistema de ensaio utilizado não produz resultados positivos falsos.

ANEXO XXII

(Artigo 16.o)

DETERMINAÇÃO DA QUANTIDADE DE LEITE EM PÓ DESNATADO PRESENTE NOS ALIMENTOS COMPOSTOS PARA ANIMAIS POR COAGULAÇÃO ENZIMÁTICA DA PARA-CASEÍNA

1. Objectivo

Determinação da quantidade de leite em pó desnatado presente num alimento composto para animais por coagulação enzimática da para-caseína.

2. Domínio de aplicação

O método é aplicável aos alimentos compostos para animais que contenham pelo menos 10 % de leite em pó desnatado; a presença de quantidades importantes de leitelho e/ou de certas proteínas não lácteas pode provocar interferências.

3. Princípio do método

3.1. Solubilização da caseína contida no alimento composto para animais por extracção com uma solução de citrato de sódio.

3.2. Restabelecimento da concentração de iões cálcio necessária à precipitação da para-caseína; transformação da caseína em para-caseína por acção do coalho.

3.3. Determinação do azoto da para-caseína, após mineralização, pelo método de Kjeldahl (norma FIL 20A 1986); cálculo da quantidade de leite em pó desnatado presente, com base num teor mínimo de caseína de 27,5 % (ver o ponto 9.1).

4. Reagentes

São utilizados reagentes para análise e água destilada ou de pureza equivalente. Com excepção do coalho (4.5), todos os reagentes e soluções utilizados devem estar isentos de substâncias azotadas.

4.1. Citrato trissódico di-hidratado (solução a 1 % m/v)

4.2. Cloreto de cálcio (solução 2M). Pesar 20,018 g de CaCO3 (pureza para análise) numa cápsula de porcelana de capacidade adequada (150-200 ml) ou num copo. Cobrir com água destilada e transferir para um banho-maria. Adicionar lentamente 50-60 ml de uma solução de HCl (concentração de HCl: água = 1:1), para dissolver completamente o carbonato. Manter o recipiente no banho-maria até à secagem do CaCl2, para eliminar o HCl que não tenha reagido. Transferir com água destilada para um balão graduado de 100 ml e diluir até à marca. Verificar o valor do pH, que não deve ser inferior a 4,0. Guardar a solução em frigorífico.

4.3. Hidróxido de sódio 0,1 N.

4.4. Ácido clorídrico 0,1 N.

4.5. Solução de coalho estandardizada 1:10000 (extracto de coalheira de vitelo); conservar em frigorífico a 4-6 °C

4.6. Reagentes para o doseamento do azoto segundo o método de Kjeldahl (norma FIL 20A 1986).

5. Aparelhagem

Material corrente de laboratório, nomeadamente:

5.1. Almofariz ou moinho homogeneizador.

5.2. Balança analítica.

5.3. Centrífuga de bancada (2000 rpm a 3000 rpm), equipada com tubos de centrifugação de 50 ml.

5.4. Agitador magnético com barras de 10-15 mm.

5.5. Copos de 150-200 ml.

5.6. Matrazes de 250 ml e de 500 ml.

5.7. Funis de vidro com diâmetro de 60-80 mm.

5.8. Filtros circulares sem cinzas, de filtração rápida, com diâmetro de 150 mm (S.S. 5892 S.S. 595 1/2).

5.9. Pipetas de diversos tamanhos.

5.10. Banho-maria termostatizado regulado a 37 °C.

5.11. Medidor de pH.

5.12. Mineralizador e destilador para o método de Kjeldahl, com os acessórios respectivos.

5.13. Bureta graduada de 25 ml para titulação.

5.14. Esguicho, de plástico, para água destilada.

5.15. Espátulas de aço inoxidável.

5.16. Termómetro.

5.17. Estufa de temperatura regulável.

6. Técnica

6.1. Preparação da amostra.

Moer 10-20 g de amostra num almofariz ou agitar a mesma quantidade num homogeneizador-misturador, de modo a obter uma mistura homogénea.

6.2. Dissolução do leite em pó e separação do resíduo insolúvel.

6.2.1. Pesar 1,000 +- 0,002 g de alimento composto para animais bem homogeneizado (6.1) directamente para um tubo de centrifugação de 50 ml. Juntar 30 ml de solução de citrato trissódico (4.1), previamente aquecida a 45 °C. Dispersar o pó por agitação magnética durante pelo menos cinco minutos.

6.2.2. Centrifugar a 500 g (2000 rpm a 3000 rpm) durante 10 minutos e recolher o sobrenadante aquosa para um copo de 150-200 ml. Evitar a perda de partículas insolúveis durante a transferência do sobrenadante.

6.2.3. Submeter o resíduo a duas novas extracções, procedendo da mesma forma e misturando os três extractos aquosos.

6.2.4. Se ocorrer uma subida de matéria gorda, arrefecer até à solidificação da fase gorda, que será, em seguida, retirada com uma espátula.

6.3. Coagulação da caseína pelas enzimas do coalho.

6.3.1. Juntar, gota a gota, ao extracto aquoso total (cerca de 100 ml), sob agitação, 3,4 ml da solução saturada de cloreto de cálcio (4.2). Ajustar o pH a 6,4-6,5 com solução diluída de NaOH (4.3) ou HCl (4.4). Colocar a solução num banho termostatizado a 37 °C, durante 15 a 20 minutos, para permitir que se estabeleça o equilíbrio salino. Este manifesta-se pela aparição de um aspecto leitoso.

6.3.2. Transferir o líquido para um (ou dois) tubo(s) de centrifugação e centrifugar a 2000 g durante 10 minutos, para remover o precipitado. Transferir o sobrenadante, sem lavar o sedimento, para um (ou dois) tubo(s) de centrifugação.

6.3.3. Levar de novo a temperatura do sobrenadante a 37 °C. Adicionar gota a gota ao extracto, sob agitação, 0,5 ml de coalho líquido (4.5). A coagulação ocorre em um ou dois minutos.

6.3.4. Recolocar a amostra no banho-maria e manter a 37 °C durante 15 minutos. Retirar a amostra do banho e agitar, para romper o coagulado. Centrifugar a 2000 g durante 10 minutos. Filtrar o sobrenadante com um papel de filtro adequado(1). (Whatman n.o 541 ou equivalente) e guardar o papel de filtro. Lavar o sedimento no tubo de centrifugação, utilizando 50 ml de água a cerca de 35 °C e mexendo o sedimento.

Centrifugar novamente a 2000 g, durante 10 minutos. Filtrar o sobrenadante com o papel de filtro que fora guardado.

6.4. Determinação do azoto da caseína.

6.4.1. Lavar e transferir quantitativamente o sedimento para o papel de filtro no balão de Kjeldahl. Determinar o teor de azoto pelo método de Kjeldahl, conforme descrito na norma FIL 20A 1986.

7. Determinação em branco

7.1. Efectuar sistematicamente uma determinação em branco, utilizando um filtro sem cinzas (5.8) humedecido com uma mistura composta por 90 ml da solução de citrato de sódio (4.1), 1 ml da solução saturada de cloreto de cálcio (4.2) e 0,5 ml de coalho líquido (4.5) e lavado com 3 x 15 ml de água antes de ser mineralizado pelo método de Kjeldahl (norma FIL 20A 1986).

7.2. Deduzir ao volume de ácido (4.4) utilizado na titulação da amostra analisada o volume necessário para a determinação em branco.

8. Determinação de controlo

8.1. Para manter sob controlo o processo analítico e os reagentes mencionados, efectuar uma determinação com um alimento composto para animais de composição padrão, cujo teor de leite em pó desnatado, conhecido, tenha sido determinado por análise interlaboratorial. O resultado médio de uma determinação em duplicado não deve afastar-se mais de 1 % do resultado obtido na analise interlaboratorial.

9. Expressão dos resultados

9.1. A percentagem de leite em pó desnatado no alimento composto é calculada pela fórmula seguinte:

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

em que N é a percentagem de azoto da para-caseína, 27,5 é o factor de conversão da caseína determinada em percentagem de leite em pó desnatado e 2,81 e 0,908 são factores de correcção obtidos por análise de regressão.

10. Precisão do método

10.1. Repetibilidade

Em pelo menos 95 % dos casos estudados, a diferença entre dois resultados individuais, obtidos para a mesma amostra, no mesmo laboratório, pelo mesmo operador, não deve exceder 2,3 g de leite em pó desnatado por 100 g de alimento composto para animais analisado.

10.2. Reprodutibilidade

Em pelo menos 95 % dos casos estudados, a diferença entre os resultados obtidos por dois laboratórios para a mesma amostra não devem exceder 6,5 g de leite em pó desnatado por 100 g de alimento composto para animais analisado.

11. Limite de tolerância

O valor da CrD95 (diferença crítica para um limite de confiança de 95 %) é calculado pela fórmula seguinte (ISO 5725):

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

(R: reprodutibilidade; r: repetibilidade)

Dupla determinação: CRD95 = 4,5 g

Se o resultado da análise química não diferir do teor declarado de leite em pó desnatado em mais de 4,5 g (dupla determinação), considera-se que o lote de alimento composto está em conformidade com a presente disposição do regulamento.

12. Observações

12.1. A adição de uma percentagem importante de certas proteínas não lácteas, nomeadamente de soja, que tenham sido aquecidas juntamente com o leite em pó desnatado conduz a resultados demasiado elevados, devido à co-precipitação dessas proteínas com a para-caseína do leite.

12.2. A adição de leitelho pode conduzir, por vezes, a valores demasiado baixos, dado que a determinação só se referirá a extracto magro. A adição de certos leitelhos de nata ácida pode conduzir a valores bastantes inferiores, por ser incompleta a sua dissolução na solução de citrato.

12.3. A adição de 0,5 % ou mais de lecitina pode igualmente conduzir a resultados demasiado baixos.

12.4. A incorporação de leite em pó aquecido a alta temperatura (high-heat) pode conduzir a valores demasiado elevados, devido à co-precipitação de certas proteínas do soro lácteo com a para-caseína do leite.

(1) Utilizar um papel de filtro sem cinzas de filtração rápida.

ANEXO XXIII

(Artigo 17.o)

DETERMINAÇÃO QUALITATIVA DO AMIDO NO LEITE EM PÓ DESNATADO, NO LEITE EM PÓ DESNATURADO E NOS ALIMENTOS COMPOSTOS PARA ANIMAIS

1. Objectivo

O presente método destina-se à detecção do amido utilizado como marcador no pó de leite desnaturado.

O limite inferior de detecção do método é de, aproximadamente, 0,05 g de amido por 100 g de amostra.

2. Fundamento

A reacção é a mesma da utilizada iodometria:

- fixação por colóides do iodo livre numa solução aquosa,

- absorção pelas micelas de amido e formação de cor.

3. Reagentes

3.1. Solução de iodo

- iodo: 1 g,

- iodeto de potássio: 2 g,

- água destilada: 100 ml.

4. Aparelhos e utensílios

4.1. Balança analítica.

4.2. Banho-maria.

4.3. Tubos de ensaio de 25 mm x 200 mm.

5. Técnica

Pesar 1 g de amostra e transferi-la para o tubo de ensaio (ponto 4.3).

Adicionar a 20 ml de água destilada e agitar a fim de dispersar a amostra.

Colocar no banho-maria em ebolição (ponto 4.2) e deixar durante cinco minutos.

Retirar do banho-maria e arrefecer à temperatura ambiente.

Adicionar 0,5 ml de solução de iodo (ponto 3.1), agitar e observar a cor resultante.

6. Expressão dos resultados

Uma coloração azul indica a presença de amido nativo na amostra.

Quando a amostra contenha amido modificado, a cor pode não ser azul.

7. Observações

A cor, a intensidade da cor e o aspecto microscópico do amido variam em função da origem do amido nativo (por exemplo de milho ou batata) e do tipo de amido modificado presente na amostra.

Na presença de amido modificado, a cor produzida muda para violeta, vermelho ou castanho, de acordo com o grau de modificação da estrutura cristalina do amido nativo.

ANEXO XXIV

(Artigo 18.o)

DETERMINAÇÃO DO TEOR DE ÁGUA DO LEITELHO ÁCIDO EM PÓ

1. Domínio de aplicação

Determinar o teor de humidade de leitelho ácido em pó destinado à preparação de alimentos para animais.

2. Princípio

A amostra é seca no vácuo. A perda de massa é determinada por pesagem.

3. Instrumentos

3.1. Balança analítica.

3.2. Recipientes secos de metal inoxidável ou de vidro, munidos de uma tampa hermética; superfície útil que permita obter uma repartição da amostra da ordem dos 0,3 g/cm2.

3.3. Estufa de vácuo, com aquecimento eléctrico regulável, equipada de uma bomba de óleo e, quer de um dispositivo de introdução de ar quente desidratado, quer de um desidratante (por exemplo, óxido de cálcio).

3.4. Exsicador, contendo um desidratante eficaz.

3.5. Estufa de dessecação ventilada, munida de um termostato, regulada a 102 +- 2 °C.

4. Modo operatório

Aquecer um recipiente (3.2) e a respectiva tampa na estufa de dessecação (3.5) durante pelo menos 1 hora. Tapar o recipiente, transferi-lo imediatamente para um exsicador (3.4), deixar arrefecer até à temperatura ambiente e pesar com uma aproximação de 0,5 mg.

Tarar, com uma aproximação de 0,5 mg, o recipiente (3.2) com a tampa. Pesar dentro dele, com uma aproximação de 1 mg, cerca de 5 g da amostra, repartindo-a uniformemente. Colocar o recipiente destapado na estufa de vácuo (3.3) previamente aquecida a 83 °C. Introduzir o recipiente o mais rapidamente possível, para evitar que a temperatura da estufa desça demasiado.

Diminuir a pressão até atingir 100 Torr (13,3 kPa) e deixar secar a essa pressão durante quatro horas, quer numa corrente de ar quente, quer utilizando um desidratante (cerca de 300 g para 20 amostras). Neste último caso, desligar a bomba de vácuo quando a pressão indicada tiver sido atingida. Contar o tempo de secagem a partir do momento em que a temperatura da estufa voltar a atingir 83 °C. Restabelecer cuidadosamente a pressão atmosférica na estufa. Abrir a estufa, tapar imediatamente o recipiente, retirá-lo da estufa, deixar arrefecer durante 30 a 45 minutos no exsicador (3.4) e pesar com uma aproximação de 1 mg. Secar por mais 30 minutos na estufa de vácuo (3.3) a 83 °C e repetir a pesagem. A diferença entre as duas pesagens não deve exceder o valor correspondente a 0,1 % de humidade.

5. Cálculo dos resultados

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

sendo:

E= massa inicial da amostra, em gramas,

m= massa da amostra seca, em gramas.

6. Precisão

6.1. Limite de repetibilidade

A diferença entre os resultados de duas determinações efectuadas no mínimo intervalo de tempo possível, pelo mesmo operador, utilizando os mesmos instrumentos e material de ensaio idêntico, não deve exceder 0,4 g de água por 100 g de leitelho ácido em pó.

6.2. Limite de reprodutibilidade

A diferença entre os resultados de duas determinações efectuadas por operadores em laboratórios diferentes, utilizando instrumentos diferentes e material de ensaio idêntico não deve exceder 0,6 g de água por 100 g de leitelho ácido em pó.

6.3. Fonte dos parâmetros de precisão

Os parâmetros de precisão foram determinados num ensaio realizado em 1995 com a participação de oito laboratórios e com 12 amostras (6 duplicados em teste cego).

ANEXO XXV

(Artigo 19.o)

MÉTODO DE REFERÊNCIA PARA DETECÇÃO DE MATÉRIA GORDA ESTRANHA EM MATÉRIA GORDA LÁCTEA POR ANÁLISE DOS TRIGLICÉRIDOS ATRAVÉS DE CROMATOGRAFIA EM FASE GASOSA - REVISÃO 1

1. Objecto e domínio de aplicação

A presente norma estabelece um método de detecção de matéria gorda estranha, quer vegetal quer animal, como a gordura de bovino e a banha, em matéria gorda do leite ou dos produtos lácteos, por análise dos triglicéridos através de cromatografia em fase gasosa.

A utilização de fórmulas definidas de triglicéridos permite a detecção qualitativa e quantitativa de matérias gordas vegetais e animais na matéria gorda láctea pura, independentemente das condições de alimentação ou de lactação.

Nota 1:

Apesar de o ácido butírico (C4), que apenas ocorre na matéria gorda láctea, permitir a estimativa quantitativa de pequenas a médias quantidades de matérias gordas lácteas e matérias gordas vegetais, é difícil a obtenção de informações qualitativas e quantitativas em caso de adição até, pelo menos, 20 % (% em peso) de matéria gorda estranha à matéria gorda láctea pura, atendendo à ampla variação de C4, que oscila aproximadamente entre 3,5 e 4,5 (% em peso).

Nota 2:

Só podem praticamente ser obtidos resultados quantitativos com a análise de triglicéridos, dado que o teor de esteróis das matérias gordas vegetais é diferente consoante as condições de produção e de tratamento.

2. Definição

Na presente norma, entende-se por matéria gorda estranha na matéria gorda láctea toda a gordura vegetal e animal, excluindo a gordura láctea.

3. Fundamento do método

Após extracção da matéria gorda láctea, é preparada uma solução-padrão. A partir desta solução, são determinados os triglicéridos (números de carbono total) por cromatografia em fase gasosa em colunas de enchimento. Introduzindo o peso percentual das moléculas de gordura de diferentes dimensões (C24-C54-unicamente números pares) na fórmula do triglicérido, as matérias gordas estranhas são detectadas qualitativamente ou quantitativamente.

Nota:

Mediante o respeito do processo descrito, é possível utilizar a cromatografia em fase gasosa em colunas capilares, se se tiver garantias quanto à obtenção de resultados comparáveis(1).

4. Reagentes

Devem ser utilizados produtos químicos de qualidade analítica.

4.1. Gás de arrastamento: azoto, grau de pureza [gE ]99,996 %

4.2. Triglicéridos-padrão(2), saturados, bem como colesterol para normalizar a matéria gorda láctea padrão, de acordo com o ponto 6.5.4.

4.3. Metanol, isento de água

4.4. n-Hexano

4.5. n-Heptano

4.6. Tolueno

4.7. Solução de dimetilclorossilano: são dissolvidos 50 ml de dimetilclorossilano em 283 ml de tolueno

4.8. Gás combustível: hidrogénio e ar artificial

4.9. Fase estacionária: 3 % de OV-1 em 125/150 μm (100/120 mesh) de GasChromQ(3).

4.10. Solução a 10 % de manteiga de cacau

5. Aparelhos e utensílios

Equipamento normal de laboratório e, em especial, o seguinte:

5.1. Cromatógrafo de fase gasosa de temperatura elevada, adequado para funcionar a, pelo menos, 400 a 450 °C, equipado com um detector de ionização de chama (DIC) e um regulador do fluxo mássico do gás de arrastamento. Gás de combustão: 30 ml de H2/min, 270 ml de ar artificial/min.

Atendendo ao elevado fluxo do gás de arrastamento, o jacto da chama deve ser especialmente amplo.

Nota:

Devido às temperaturas elevadas que ocorrem durante a análise dos triglicéridos, as cabeças de vidro do DIC ou do sistema de injecção devem ser limpas frequentemente.

O cromatógrafo de fase gasosa deve estar equipado com septos, resistentes a elevadas temperaturas, que possam ser utilizados frequentemente e que apresentem, em geral, um grau muito reduzido de fugas.

Nota:

São adequados os septos Chromblue (tm) [Chrompach]

Os septos devem ser mudados periodicamente, por exemplo após cerca de 100 injecções ou quando a resolução se deteriorar (ver figura 4).

5.2. Coluna de cromatografia

Coluna de vidro em forma de U (2 mm de diâmetro interno e 500 mm de comprimento), previamente silanizada de acordo com o ponto 6.1 com dimetilclorossilano, a fim de desactivar a superfície de vidro.

Nota:

São também adequadas as colunas de enchimento um tanto mais compridas (800-2000 mm de comprimento). Com estas colunas, podem ser obtidos resultados com uma reprodutibilidade ligeiramente superior. Por um lado, a fase estacionária apresenta ocasionalmente fracturas após a operação, o que pode conduzir, por seu turno, a piores resultados quantitativos. Além disso, a chama do DIC pode ser facilmente apagada na sequência fluxo extremamente elevado do gás de arrastamento, de 75 a 85 ml/min.

5.3. Processo de enchimento de coluna (ver figura 1)

Figura 1

Enchimento da coluna

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5.3.1. Coluna plástica com extremidades com tampas de atarrachar, que disponha de uma marca até à qual pode ser vertida a quantidade necessária de fase estacionária.

5.3.2. Peneira fina (dimensão de malha de, aproximadamente, 100 μm) com uma tampa de atarrachar, adequada para fechar a coluna de vidro, de acordo com a figura 1.

5.3.3. Lã de vidro desactivada, silanizada.

5.3.4. Vibrador para distribuição uniforme de fase estacionário durante o enchimento.

5.4. Coluna de Extrelut de 1 a 3 ml(4), com sílica gel. Esta coluna pode ser utilizada, alternativamente, para extracção com vista à obtenção da matéria gorda láctea.

5.5. Juntas de grafite de 6,4 mm (1/4"), com uma perfuração de 6 mm.

5.6. Dispositivos para silanizar a superfície de vidro da coluna, de acordo com o ponto 6.1

5.6.1. Garrafa de Woulff

5.6.2. Bomba de sucção de água

5.7. Banho de água, ajustável a (50 +- 2) °C

5.8. Estufa, ajustável a (50 +- 2) °C e (100 +- 2) °C

5.9. Micropipeta

5.10. Pipeta graduada de 5 ml, para dosagem de 1,5 ml de metanol

5.11. Balão de gargalo redondo, de 50 ml

5.12. Balão de Erlenmeyer, com um volume nominal de 50 ml

5.13. Funtil

5.14. Filtro de poros finos

5.15. Evaporador rotativo

5.16. Ampolas, de volume nominal de 1 ml, que possam ser fechadas com uma tampa de alumínio, com um septo no interior.

5.17. Seringa de injecção, cujo êmbolo não deve atingir a extremidade da agulha.

Nota:

As seringas deste tipo permitem uma melhor reprodutibilidade dos resultados obtidos.

Para evitar a deterioração do septo, a extremidade da agulha deve ser controlada regularmente (por exemplo, com um estereomicroscópio).

6. Técnica

6.1. Preparação da coluna (silanização)

Depois de ligar a garrafa de Woulff, como indicado na figura 2, à bomba de sucção de água, o tubo 2 é mergulhado na solução, de acordo com o ponto 4.7. Ao fechar a torneira, a coluna é enchida; em seguida, são retirados os dois tubos.

Figura 2

Processo de silanização

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A coluna é fixada num suporte e completamente enchida com a solução de dimetildiclorossilano, através de uma pipeta.

Após 20 a 30 minutos, a garrafa de Woulff é substituída por um balão de filtração, e a coluna é enchida ligando-a à bomba de sucção de água (ver figura 3).

6.2. Enchimento da coluna

Este processo é seguido de lavagens sucessivas, utilizando 75 ml de tolueno e 50 ml de metanol; em seguida, a coluna esvaziada é seca na estufa a 100 °C durante, aproximadamente, 30 minutos.

Figura 3

Processo de lavagem

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Para o enchimento da coluna, é utilizado o processo da figura 1. A fase estacionária, de acordo com o ponto 4.9, é vertida para a coluna de plástico até à marca.

A extremidade inferior da coluna de vidro a encher é fechada com uma rolha, de fibra de vidro, com cerca de 1 cm de comprimento, previamente silanizada, e que é introduzida por meio de uma vareta metálica. Em seguida, a extremidade da coluna é fechada com a peneira de acordo com o ponto 5.3.2.

O enchimento da coluna é feito sob pressão (com azoto a 3 bares) com a fase estacionária. Para obter um empacotamento uniforme, contínuo e firme, o vibrador é deslocado para cima e para baixo ao longo da coluna de vidro, durante o enchimento. Após o enchimento, introduz-se uma rolha sólida de fibra de vidro silanizada na outra extremidade da coluna cheia, as extremidades protuberantes são cortadas e a rolha é empurrada para o interior da coluna mais alguns milímetros, por meio de uma espátula.

6.3. Preparação das amostras

Para a preparação das amostras, é utilizado um dos seguintes três métodos:

6.3.1. Isolamento da matéria gorda láctea da manteiga

São fundidos 5 a 10 g de manteiga num recipiente adequado num banho de água a 50 °C, de acordo com o ponto 5.7.

Numa estufa a 50 °C, são aquecidos um balão de Erlenmeyer de 50 ml e um funil, equipado com um filtro, de acordo com o ponto 5.14. A camada de matéria gorda da amostra de manteiga fundida é filtrada através do equipamento pré-aquecido.

Essa matéria gorda láctea está praticamente isenta de fosfolípidos.

6.3.2. Extracção da fracção gorda de acordo com o método de Röse-Gottlieb

A extracção é realizada de acordo com a norma FIL 1C: 1987, 16C: 1987, 116A: 1987 ou 22B: 1987.

Com esta matéria gorda láctea, os fosfolípidos permitem a obtenção de um pico de colesterol aumentado em aproximadamente 0,1 %.

O cromatograma dos triglicéridos normalizados a 100 com colesterol é, assim, influenciado apenas de uma forma negligenciável.

6.3.3. Extracção de matéria gorda láctea utilizando coluna de sílica gel

Com uma pipeta de microlitro, introduzem-se 0,7 ml de amostra de leite, a 20 °C, numa coluna de Extrelut de 1 a 3 ml; de acordo com o ponto 5.4 deixa-se distribuir uniformemente na sílica gel durante, aproximadamente, 5 minutos.

Para desnaturar os complexos proteína-lípidos, são adicionados, com uma pipeta, 1,5 ml de metanol. Em seguida, a amostra é extraída com 20 ml de n-hexano. O n-hexano é adicionado lentamente, em pequenas quantidades, e o solvente resultante é recolhido num balão de gargalo redondo de 50 ml, que foi objecto de secagem, até obtenção de um peso constante e conhecido.

Após extracção, deixa-se drenar a coluna até que esta fique vazia.

A partir do eluído, os solventes são destilados num evaporador rotativo num banho de água a uma temperatura compreendida entre 40 e 50 °C.

O balão é seco e a gordura obtida determinada por pesagem.

Nota:

As extracções de matéria gorda de acordo com os processos de Gerber, Weibull-Berntrop, Schmid-Bondzynski-Ratzlaff, ou o isolamento da matéria gorda láctea utilizando detergentes (método BDI) não são adequados para a análise dos triglicéridos, uma vez que estes métodos permitem a passagem para a fase gorda de quantidades mais ou menos elevadas de fosfolípidos ou glicéridos parciais.

6.4. Preparação da solução de teste

Para a cromatografia em fase gasosa, é utilizada uma solução, a 5 %, de matéria gorda em n-heptano, obtida de acordo com o ponto 6.3. Para a preparação desta solução de amostra são pesadas e dissolvidas quantidades correspondentes de material de amostra obtido em conformidade com os pontos 6.3.1 e 6.3.2 em quantidades correspondentes de n-heptano.

Na preparação de amostras de acordo com o ponto 6.3.3, a quantidade de n-heptano a adicionar ao material de amostra no balão é calculada com base na pesagem, e o restante é dissolvido na mesma.

De acordo com o ponto 5.16, é vertido aproximadamente 1 ml de solução de amostra numa ampola.

6.5. Determinação cromatográfica dos triglicéricos

Com as elevadas temperaturas até 350 °C para a eluição dos triglicéridos de cadeia longa C52-C56, ocorre facilmente um aumento da linha de base, em especial se as colunas não tiverem sido, de início, devidamente condicionadas.

O aumento da linha de base a altas temperaturas pode ser totalmente evitado combinando duas colunas ou mediante subtracção da linha de base. Com o método de compensação ou a utilização de colunas simples, bem como para as cabeças de vidro do injector e do detector, devem ser utilizadas juntas de grafite de acordo com o ponto 5.5.

6.5.1. Correcção da linha de base

Para evitar o aumento da linha de base, é utilizado um dos quatro métodos seguintes:

6.5.1.1. Combinação de colunas

São utilizadas duas colunas de enchimento de uma forma compensada.

6.5.1.2. Cromatografia em fase gasosa

Com a utilização do cromatógrafo de fase gasosa sem injecção da solução de matéria gorda e subsequente subtracção da linha de base registada, pode ser evitado o aumento da linha de base.

6.5.1.3. Integração de software

Com a utilização de um sistema de integração sem injecção de solução de matéria gorda e subsequente subtracção da linha de base registada, pode ser evitado o aumento da linha de base.

6.5.1.4. Condicionamento adequado

Com um condicionamento inicial adequado da coluna e aproximadamente 20 injecções com soluções com matéria gorda láctea, o aumento da linha de base e altas temperaturas é, frequentemente, tão reduzido que são desnecessárias as correcções da linha de base.

6.5.2. Técnica de injecção

Para evitar efeitos de discriminação, é utilizada a técnica da "injecção a quente" para alcançar melhores resultados quantitativos com os componentes dos triglicéridos de elevado ponto de fusão. Neste caso, a solução de matéria gorda é aspirada para a seringa e a agulha fria desta é aquecida antes da injecção durante aproximadamente 3 segundos na cabeça do injector. Em seguida, o conteúdo da seringa é rapidamente injectado.

Nota:

Com esta técnica de injecção, o risco de fenómenos de fraccionamento no interior da seringa ou no bloco de injecção é reduzido. Não é aplicada uma injecção directa na parte superior e aquecida da coluna dado que os fragmentos do septo, que aqui se acumulam, bem como contaminantes, podem ser facilmente eliminados com a técnica utilizada através da mudança regular da cabeça do injector, sem desmontar a coluna.

Para não danificar o septo, deve-se evitar curvar a extremidade da agulha devido ao contacto com o fundo do recipiente que contém a amostra (mesmo que tal seja dificilmente visível a olho nu).

Figura 4

Cromatograma dos triglicéridos de uma amostra de matéria gorda láctea

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6.5.3. Condicionamento da coluna de enchimento

Durante as fases referidas nas alíneas a) a c), o cimo da coluna não está ligado ao detector, para evitar a contaminação.

As colunas objecto de enchimento de acordo com o ponto 6.2 são condicionadas do seguinte modo:

a) 15 min. 40 ml de N2/min - fluxo a 50 °C

b) Aquecimento com 1 K/min até 355 °C, a 10 ml de N2/min

c) Manutenção durante 12 a 15 h a 355 °C

d) Duas injecções de 1 μl de solução de manteiga de cacau, de acordo com o ponto 4.10 e respectivo programa de temperatura.

e) 20 injecções de 0,5 μl de uma solução de matéria gorda láctea durante 2 a 3 dias, de acordo com o ponto 6.4.

Nota:

A manteiga de cacau consiste, quase exclusivamente, em triglicéridos C50 a C56 com elevado ponto de fusão. A injecção de manteiga de cacau é adequada ao condicionamento especial destes compostos de cadeia longa. Com os triglicéridos em C50 a C54 de elevado ponto de fusão, podem ocorrer factores de resposta parciais até, aproximadamente, 1.20. Normalmente, com a injecção repetida de solução de matéria gorda láctea, é de prever uma redução dos factores de resposta inicialmente elevados para os C50 a C54. Com os triglicéridos com um reduzido número de grupos c-acilo, os factores aproximam-se de 1.

São preparados três pares, respectivamente, de colunas objecto de enchimento de acordo com o ponto 6.2. Os pares condicionados são verificados, respectivamente, com uma análise da matéria gorda láctea para teste de rotina. O par com os melhores resultados quantitativos (factores de resposta quase de 1) é utilizado no processo seguinte. Com factores de resposta superiores a 1,20, a coluna não é utilizada.

6.5.4. Calibração

Para efeitos de calibração, os factores de resposta dos triglicéridos correspondentes, bem como do colesterol, da matéria gorda láctea (matéria gorda normalizada) devem ser determinados utilizando os triglicéridos normalizados (pelo menos, os triglicéridos C24, C30, C36, C42, C48 e C54, bem como o colesterol; é conveniente usar também C50 e C52). Os factores de resposta intermédios podem ser determinados por interpolação matemática.

Em caso de utilização de matéria gorda normalizada, devem ser realizadas, diariamente, duas a três calibrações. Se os resultados forem praticamente idênticos, serão obtidos resultados quantitativos com uma reprodutibilidade adequada a partir da análise dos triglicéridos das amostras.

A matéria gorda láctea normalizada tem um período de conservação de vários meses, a uma temperatura de armazenagem de, no máximo, -18 °C e, assim, pode ser utilizada como padrão.

Nota:

O factor de resposta de cada componente pode também ser determinado por recurso a uma matéria gorda de referência cuja composição de triglicéridos seja certificada, nomeadamente CRM 519 (matéria gorda láctea anidra), comercializada pelo Instituto dos Materiais de Referência e das Medidas, em Geel (Bélgica).

6.5.5. Programa de temperatura, gás de arrastamento e outras condições para a análise dos triglicéridos

Programa de temperatura: temperatura inicial da coluna 210 °C, mantida durante 1 minuto; em seguida programar para 6 °C/minuto até 350 °C e manter à temperatura final durante 5 minutos.

Temperatura do detector e do injector: 370 °C.

Nota:

As temperaturas do detector, injector e estufa (temperaturas iniciais) devem ser mantidas a um nível constante (igualmente durante a noite, fins-de-semana e férias).

Gás de arrastamento: azoto, fluxo de 40 ml/min.

Nota:

Se forem utilizadas colunas com 80 cm, o fluxo deve ser de, pelo menos, 75 ml de N2/min. O fluxo do gás de arrastamento deve ser mantido constante (igualmente durante a noite, fins-de-semana e férias). O fluxo exacto do gás de arrastamento deve ser ajustado de modo a eluir a 341 °C, independentemente do comprimento da coluna, um triglicérido C54.

Duração da análise: 29,3 minutos.

Volume de injecção: 0,5 μl.

Nota:

A seringa deve ser lavada diversas vezes com heptano puro, após cada injecção.

Condições - DIC de acordo com o ponto 5.1.

Nota:

O detector de ionização de chama deve ser posto em funcionamento no princípio de cada dia de trabalho.

7. Integração, avaliação e controlo das condições de medição

Os triglicéridos com um número ímpar de grupos c-acilo (2n + 1) são combinados com os triglicéridos anteriores de número par (2n). Não são tidos em conta os teores de baixa reprodutibilidade de C56. Os restantes triglicéridos (área dos picos) do cromatograma, incluindo o colesterol (pico próximo de C24), são multiplicados pelos respectivos factores de resposta de uma matéria gorda padrão (última calibração), sendo todos normalizados a 100. Junto do colesterol livre, os triglicéridos C24, C26, C28, C30, C32, C34, C36, C38, C40, C42, C44, C46, C48, C50, C52 e C54 são, por conseguinte, avaliados. Os resultados são apresentados em percentagem em peso (g/100 g).

A avaliação dos picos do cromatograma deve ser feita com um integrador, que permite delinear a linha de base. Deve ser possível a reintegração com parâmetros de integração optimizados.

As figuras 5 e 6 ilustram dois exemplos de cromatogramas de triglicéridos. A figura 5 mostra um cromatograma que pode ser bem avaliado, enquanto a figura 6 apresenta um erro esporádico na gama de C50 a C54, com a linha de base incorrectamente traçada em comparação com a figura 5. Estes erros típicos podem ser detectados com um elevado grau de certeza e evitados unicamente através da utilização de um integrador que permita delinear a linha de base.

Figura 5

Cromatograma dos triglicéridos de matéria gorda láctea de fácil avaliação, com a linha de base traçada

>PIC FILE= "L_2001037PT.009201.EPS">

Figura 6

Cromatograma dos triglicéridos de matéria gorda láctea, incorrectamente integrado

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Para o controlo das condições de medida, podem utilizar-se os desvios-padrão relativos (RSD: coeficiente de variação x 100) que se apresentam no quadro 1 para os diversos triglicéridos. Os desvios-padrão em causa foram calculados com base em 19 análises consecutivas da mesma matéria gorda láctica.

Quadro 1

Desvios-padrão relativos (RSD) dos teores de triglicéridos (n=19)

>POSIÇÃO NUMA TABELA>

Se os RSD forem consideravelmente superiores aos valores apresentados no quadro 1, as condições cromatográficas não são adequadas, devendo verificar-se os septos e o caudal do gás vector. Além disso, podem depositar-se pequenas partículas de septo na lã de vidro presente no topo da coluna. Por vezes, a coluna não é utilizável devido a factores tais como o seu desgaste e a influência da temperatura (ver figura 3).

Nota:

Os valores que se apresentam no quadro 1 não possuem carácter obrigatório, proporcionado apenas uma orientação para o controlo de qualidade. Caso se aceitem RSD mais elevados, é necessário respeitar os limites de repetibilidade e reprodutibilidade apresentados no ponto 11.

8. Detecção qualitativa de matéria gorda estranha

Para a detecção de matéria gorda estranha foram desenvolvidas fórmulas de triglicéridos (quadro 2) com limites S (quadro 3), nas quais os valores S de matéria gorda láctea pura podem flutuar. Se estes limites forem ultrapassados, conclui-se que existe matéria gorda estranha.

A fórmula mais adequada para a detecção de adição de banha é, por exemplo:

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

Nota:

Utilizando 755 amostras diferentes de matéria gorda láctea, o intervalo de confiança corresponde a 99 % entre S = 97,96 e 102,04 para amostras puras de matéria gorda láctea; o desvio-padrão para todos os valores S é de 0,39897.

A partir de uma composição de triglicéridos de uma amostra de matéria gorda desconhecida, essa fórmula permite, sem usar um computador, verificar de uma forma simples se a soma do teor de triglicéridos assim estabelecida, com os factores correspondentes, sai do intervalo de 97,96-102,04 e se, provavelmente, se trata de uma adição de matéria gorda estranha.

Para a detecção de diferentes matérias gordas estranhas, o quadro 2 apresenta diferentes fórmulas de triglicéridos. Para a detecção de matérias gordas estranhas como o óleo de soja, óleo de girassol, azeite, óleo de colza, óleo de linhaça, óleo de gérmen de trigo, óleo de gérmen de milho, óleo de semente de algodão e óleo de peixe hidrogenado, gorduras vegetais de coco e óleo de palmiste, bem como para o óleo de palma a gordura de bovino, pode ser utilizada uma fórmula comum.

Dado que a composição de triglicéridos das matérias gordas estranhas também está sujeita a flutuações, foram usadas até 4 dados diferentes, avaliados experimentalmente, respeitantes a triglicéridos de matérias gordas estranhas. [Com os mesmos tipos de matéria gorda estranha, foi considerado o limite menos favorável, respectivamente (ver quadro 4)].

Com a seguinte "fórmula total" podem ser obtidos bons resultados semelhantes para todas as gorduras vegetais:

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

Os cálculos para a detecção de qualquer combinação de matéria gorda estranha em matéria gorda de leite mostraram que, por exemplo, apesar de com a fórmula para a banha indicada no quadro 2 o limite para a matéria gorda estranha ser baixo, nomeadamente 2,7 %, outras matérias gordas como a gordura de coco, o óleo de palma ou o óleo de palmiste, com limites de detecção de, respectivamente, 26,8, 12,5 e 19,3 %, só podem, com esta fórmula, ser detectadas se tiverem sido adicionadas quantidades muito elevadas à matéria gorda láctea. O mesmo se aplica a outras fórmulas do quadro 2.

Quadro 2

Fórmulas de triglicéridos para detecção de diversas matérias gordas estranhas em matéria gorda láctea e que indicam os desvios-padrão para S

Fórmula para o óleo de soja, girassol, colza, linhaça, gérmen de trigo, gérmen de milho, sementes de algodão e peixe e para o azeite

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

Fórmula para a gordura de coco e o óleo de palmiste

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

Fórmula para o óleo de palma e a gordura de bovino

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

Fórmula para a banha

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

Por conseguinte, para a verificação de uma amostra de matéria gorda desconhecida, devem ser utilizadas todas as fórmulas indicadas no quadro 2 e a fórmula total (2), se for provável que a amostra consista numa mistura de matéria gorda láctea e de uma das catorze diferentes matérias gordas estranhas ou numa combinação destas últimas. Se, através da análise de triglicéridos de uma amostra de matéria gorda, for obtido um valor S não abrangido pelos intervalos do quadro 3 para apenas uma das cinco fórmulas, poder-se-à concluir que é provável que a amostra consista numa matéria gorda láctea modificada. A detecção de uma matéria gorda estranha na gordura do leite através de uma das quatro fórmulas do quadro 2 não permite tirar conclusões quanto ao tipo de mistura de matéria gorda estranha.

Quadro 3

Limites-S para matérias gordas lácteas

>POSIÇÃO NUMA TABELA>

O quadro 4 indica os limites de detecção para as diferentes matérias gordas estranhas, com intervalo de confiança de 99 %. Da primeira coluna constam os limites de detecção mínimos para as melhores fórmulas respeitantes às matérias gordas lácteas do quadro 2. A segunda coluna indica os limites de detecção para a fórmula total. Apesar de estes limites serem ligeiramente superiores, só é necessária esta fórmula para detectar quantidades ligeiramente mais elevadas de matérias gordas estranhas. Com todas as fórmulas, podem também ser detectadas combinações de diferentes matérias gordas estranhas. Os intervalos de variação dos triglicéridos das diferentes matérias gordas estranhas de um tipo não têm influência considerável nos limites de detecção.

Quadro 4

Limites de detecção, em %, para adição de gordura estranha à matéria gorda láctea, com um intervalo de confiança de 99 %

>POSIÇÃO NUMA TABELA>

Nota:

Os intervalos-S são calculados de modo a que a preseença de uma matéria gorda estranha só pode ser estabelecida se os limites das fórmulas individuais forem superadas (ver quadro 4).

9. Determinação quantitativa de matéria gorda estranha

Para obter informações quantitativas quanto à concentração de matéria gorda estranha numa amostra de matéria gorda láctea, é utilizada a seguinte fórmula:

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>, em que X é a quantidade de matéria gorda estranha desconhecida ou de uma mistura de matéria gorda estranha numa matéria gorda láctea desconhecida. S resulta da adição de uma gordura desconhecida, inserindo os triglicéridos da matéria gorda estranha/mistura de matéria gorda láctea na fórmula total de triglicéridos anteriormente indicada. Se for adicionada uma gordura estranha desconhecida à matéria gorda láctea, escolhe-se para SF o valor médio S das diferentes matérias gordas estranhas para a fórmula total; este valor médio S é obtido adicionando os dados dos triglicéridos de matérias gordas estranhas puras a esta fórmula e calculando o valor médio (SF = 7,46). São também obtidos resultados quantitativos adequados respeitantes a qualquer adição de matéria gorda estranha utilizando a fórmula relativa ao óleo de palma/gordura de bovino (quadro 2) e um valor médio SF de 10,57.

A partir de tipos de matéria gorda estranha conhecidos, devem ser adicionados os seguintes valores SF na fórmula anterior, devendo ser escolhida a fórmula respectiva de matéria gorda estranha do quadro 2:

Quadro 5

Valores de SF de diversas matérias gordas estranhas

>POSIÇÃO NUMA TABELA>

10. Campo de aplicação do método de detecção

O método descrito aplica-se a leite a granel e baseia-se na representatividade das amostras da matéria gorda láctea.

Seria possível uma detecção altamente específica se, para um número representativo de matérias gordas lácteas, as fórmulas anteriormente descritas fossem provenientes de diferentes países.

A probabilidade de detecção seria mais elevada se fosse estabelecido, para um número representativo de matérias gordas lácteas, fórmulas para diferentes países, como as anteriormente descritas. Neste caso, não é necessário a utilização de programas complexos de informática caso as combinações de triglicéridos usadas no quadro 2 sejam aplicadas e os factores redeterminados utilizando o método dos mínimos quadrados.

Através da aplicação dos intervalos S como indicado no quadro 3, as fórmulas são geralmente aplicáveis, em condições especiais de alimentação como, por exemplo, a subalimentação ou a alimentação de bovinos com alimentos fermentados ou sais de cálcio. Só no caso de condições extremas de alimentação (por exemplo, administração de grandes quantidades de óleos alimentares puros ou de sais de cálcio combinados com alimentos gordos, etc.), as fórmulas indicam parcialmente uma matéria gorda láctea modificada.

Nota:

As matérias gordas fraccionadas são geralmente consideradas matérias gordas não modificadas, e só se conclui que existe uma modificação se forem superados os limites. As fórmulas só indicam uma modificação com matérias gordas lácteas fraccionadas que apresentem uma composição de gordura inabitual como, por exemplo, no caso de uma fracção dura obtida através do fraccionamento, por métodos físicos a altas temperaturas de aproximadamente 30 °C, com baixos rendimentos de poucos pontos percentuais ou com o fraccionamento em condições supercríticas de dióxido de carbono.

O fraccionamento da matéria gorda láctea pode, no entanto, ser detectado utilizando outros processos, como por exemplo, a análise calorimétrica diferencial.

11. Precisão do método

Determinada utilizando matéria gorda láctea com base nas fórmulas do quadro 2 e nos intervalos-S do quadro 3.

11.1. Repetibilidade

A diferença entre os valores-S de duas determinações realizadas com o menor intervalo de tempo possível, por um operador, utilizando a mesma técnica e material de amostra idêntico, nas mesmas condições (mesmo operador, mesmo equipamento/instrumentos, mesmo laboratório).

Quadro 6

Limites de repetibilidade (r) para as diferentes fórmulas

>POSIÇÃO NUMA TABELA>

11.2. Reprodutibilidade

A diferença dos valores-S de duas determinações realizadas por operadores em laboratórios diferentes, utilizando a mesma técnica e material de amostra idêntico, em condições diferentes (operador diferente, diferente equipamento/instrumentos) em ocasiões diferentes.

Quadro 7

Limites de reprodutibilidade (R) para as diferentes fórmulas

>POSIÇÃO NUMA TABELA>

11.3. Diferença crítica

A partir dos limites de repetibilidade (r) e de reprodutibilidade (R) podem ser calculadas as diferenças críticas para todos os intervalos-S do quadro 3 (análises duplicadas). Os respectivos valores são indicados no quadro 8.

Quadro 8

Diferenças críticas para todas as fórmulas de triglicéridos

>POSIÇÃO NUMA TABELA>

11.4. Aceitabilidade dos resultados

Todos os teores de triglicéridos de C24, C26, C28 a C54 calculados com duas casas decimais, bem como o colesterol devem ser normalizados a 100.

Os resultados das análises duplicadas são utilizados para controlar a repetibilidade. Se a diferença absoluta entre dois resultados S para as cinco fórmulas de triglicéridos não excederem os limites de repetibilidade (r) do quadro 6, considera-se que estão satisfeitos os critérios de repetibilidade.

Para o controlo das condições óptimas de cromatografia em fase gasosa e, em especial, da qualidade da coluna, deve garantir-se que em dez repetições, a diferença entre os valores S máximos e mínimos das cinco fórmulas de triglicéridos não excede o intervalo x· r com x = 1,58 (para 10 utilizações, ver ponto 16 das referências bibliográficas), e os limites de repetibilidade r para as diferentes fórmulas do quadro 6.

12. Normas consideradas

>POSIÇÃO NUMA TABELA>

13. Referências bibliográficas

1. Comissão das Comunidades Europeias: Detection of foreign fats in milk fat by means of gas chromatographic triglyceride analysis; Doc. n.o VI/5202/90-EN, VI/2645/91.

2. Comissão das Comunidades Europeias: Control of butter fat purity of 100 different samples of different feeding periods from 11 EEC countries; Doc. n.o VI/4577/93.

3. Comissão das Comunidades Europeias: Consideration of results from the first, second, third, fourth, fifth and sixth EEC collaborative trial: Determination of triglycerides in milk fat; Doc. n.o VI/2644/91, VI/8.11.91, VI/1919/92, VI/3842/92, VI/5317/92 e VI/4604/93.

4. Timms, R. E.: Detection and quantification of non-milk fat in mixtures of milk and non-milk fats. Dairy Research 47 295-303 (1980).

5. Precht, D., Heine, K.: Nachweis von modifiziertem Milchfett mit der Triglyceridanalyse. 2. Fremdfettnachweis im Milchfett mit Hilfe von Triglyceridkombinationen 41 406-410 (1986).

6. Luf. W., Stock, A., Brandl, E.: Zum Nachweis von Fremdfett in Milchfett über die Triglyceridanalyse. Österr. Milchwirtsch. Wissensch. Beilage 5, 42 20-35 (1987).

7. Precht, D.: Bestimmung von pflanzlichen Fetten oder tierischen Depotfetten in Milchfett. Kieler Milchwirtsch. Forschungsber. 42 143/157 (1989).

8. Precht D.: Schnelle Extraktion von Milchfett, Kieler Milchwirtsch. Forschungsber. 42 119-128 (1990).

9. Precht, D.: Schnelle gaschromatographische Triglyceridanalyse von Milchfett. Kieler Milchwirtsch. Forschungsber. 42 139-154 (1900).

10. Precht, D.: Control of milk fat purity by gas chromatographic triglyceride analysis. Kieler Milchwirtsch. Forschungsber. 43 (3) 219-242 (1991).

11. Precht, D.: Detection of adulterated milk fat by fatty acid and triglyceride analysis. Fat Sci. Technol. 93 538-544 (1991).

12. Precht, D.: Detection for foreign fat in milk fat. I. Qualitative dtection by triacylglycerol formulae. II. Quantitative evaluation of foreign fat mixtures. Z. Lebensm. Unters. Forsch. 194 1-8, 107-114 (1992).

13. Precht, D.: Gas chromatography of triacylglycerols and other lipids on packed columns in CRC Handbook of Chromatography: Analysis of Lipids, p. 123-138, Ed. K.D. Mukherjee, N. Weber, J. Sherma, CRC Press, Boca Raton (1993).

14. Precht, D., Molkentin, J.: Quantitative triglyceride analysis using short capillary columns, Chrompack News 4 16-17 (1993).

15. Molkentin, J., Precht, D.: Comparison of packed and capillary columns for quantitative gas chromatography of triglycerides in milk fat. Chromatographia 39 (5/6) 265-270 (1994).

16. Stange, K.: Angewandte Statistik, Erster Teil, Eindimensionale Probleme, Springer-Verlag, Berlin, p. 378 (1970).

(1) Foram já descritos métodos adequados (ver D. Precht e J. Molkentin: Quantitative triglyceride analysis using short capillary columns, Chrompack News 4 16-17 (1993).

(2) Encontram-se no comércio produtos adequados.

(3) As designações comerciais como, por exemplo, Extrelut, GasChromQ, Chrompack, correspondem a produtos adequados disponíveis no comércio especializado. Esta informação serve para facilitar ao utilizador a preparação do padrão, mas não representa a obrigatoriedade de utilização deste produto. A indicação do grão foi transferida para unidades do sistema internacional μm, de acordo com BS 410: 1988 "British Standard Specification for test sieves".

(4) Ver nota 3 da página 86.

ANEXO XXVI

LISTA DOS REGULAMENTOS REFERIDOS NO PRIMEIRO CONSIDERANDO

- Regulamento (CEE) n.o 1216/68 da Comissão, de 9 de Agosto de 1968, que determina o método de verificação do teor em lactose dos alimentos compostos para animais importados em proveniência de países terceiros(1) alterado pelo Regulamento (CEE) n.o 222/88 da Comissão, de 22 de Dezembro de 1987, que altera certos actos relativos à aplicação da organização comum de mercado no sector do leite e dos produtos lácteos(2),

- Regulamento (CEE) n.o 3942/92 da Comissão, de 22 de Dezembro de 1992, que estabelece o método de referência para a determinação do sitosterol e do estigmasterol no butteroil(3), com a última redacção que lhe foi dada pelo Regulamento (CE) n.o 175/1999 da Comissão alterado pelos Regulamentos (CEE) n.o 3942/92, (CE) n.o 86/94, (CE) n.o 1082/96 e (CE) n.o 1459/98, que estabelecem métodos de referência para a determinação de marcadores na manteiga, no butteroil e na nata(4),

- Regulamento (CE) n.o 86/94 da Comissão, de 19 de Janeiro de 1994, que estabelece o método de referência para a determinação do sitosterol e do estigmasterol na manteiga(5), alterado pelo Regulamento (CE) n.o 175/1999,

- Regulamento (CE) n.o 2721/95 da Comissão, de 24 de Novembro de 1995, que estabelece as normas de execução dos métodos de referência e dos métodos de rotina a utilizar na análise e na avaliação qualitativa do leite e dos produtos lácteos no âmbito da organização comum de mercado(6),

- Regulamento (CE) n.o 1080/96 da Comissão, de 14 de Junho de 1996,que estabelece um método de referência para a detecção de coliformes na manteiga, leite em pó desnatado e caseina/caseinatos(7),

- Regulamento (CE) n.o 1081/96 da Comissão, de l4 de Junho de 1996, que estabelece um método de referência para a detecção de caseína de leite de vaca em queijos de leite de ovelha, de cabra ou de búfala ou de misturas de leites de ovelha, cabra e búfala e que revoga o Regulamento (CEE) n.o 690/92(8),

- Regulamento (CE) n.o 1082/96 da Comissão de 14 de Junho de 1996 que estabelece um método de referência para a determinação do éster etílico do ácido β-apo-8'- caroténico na manteiga e na manteiga concentrada(9), alterado pelo Regulamento (CE) n.o 175/1999,

- Regulamento (CE) n.o 1854/96 da Comissão de 26 de Setembro de 1996, que estabelece uma lista dos métodos de referência a utilizar na análise e avaliação qualitativa do leite e dos produtos lácteos no âmbito da organização comum de mercado(10) alterado pelo Regulamento (CE) n.o 881/1999(11),

- Regulamento (CE) n.o 880/98 da Comissão, de 24 de Abril de 1998, que estabelece métodos de referência para a determinação dos teores de água, resíduo seco isento de matéria gorda e matéria gorda da manteiga(12),

- Regulamento (CE) n.o 1459/98 da Comissão, de 8 de Julho de 1998, que estabelece um método de referência para a determinação do teor de vanilina na manteiga concentrada, na manteiga ou na nata(13), alterado pelo Regulamento (CE) n.o 175/1999.

(1) JO L 198 de 10.8.1968, p. 13.

(2) JO L 28 de 1.2.1988, p. 1.

(3) JO L 399 de 31.12.1992, p. 29.

(4) JO L 20 de 27.1.1999, p. 22.

(5) JO L 17 de 20.1.1994, p. 7.

(6) JO L 283 de 25.11.1995, p. 7.

(7) JO L 142 de 15.6.1996, p. 13.

(8) JO L 142 de 15.6.1996, p. 15.

(9) JO L 142 de 15.6.1996, p. 26.

(10) JO L 246 de 27.9.1996, p. 5.

(11) JO L 111 de 29.4.1999, p. 24.

(12) JO L 124 de 25.4.1998, p. 16.

(13) JO L 193 de 9.7.1998, p. 16.