02009R0152 — PT — 16.11.2020 — 007.001

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Este texto constitui um instrumento de documentação e não tem qualquer efeito jurídico. As Instituições da União não assumem qualquer responsabilidade pelo respetivo conteúdo. As versões dos atos relevantes que fazem fé, incluindo os respetivos preâmbulos, são as publicadas no Jornal Oficial da União Europeia e encontram-se disponíveis no EUR-Lex. É possível aceder diretamente a esses textos oficiais através das ligações incluídas no presente documento

►B	REGULAMENTO (CE) N.o 152/2009 DA COMISSÃO de 27 de Janeiro de 2009 que estabelece os métodos de amostragem e análise para o controlo oficial dos alimentos para animais (Texto relevante para efeitos do EEE) (JO L 054 de 26.2.2009, p. 1)

Alterado por:

		Jornal Oficial
		n.°	página	data
M1	REGULAMENTO (UE) N.o 278/2012 DA COMISSÃO de 28 de março de 2012	L 91	8	29.3.2012
►M2	REGULAMENTO (UE) N.o 51/2013 DA COMISSÃO de 16 de janeiro de 2013	L 20	33	23.1.2013
►M3	REGULAMENTO (UE) N.o 691/2013 DA COMISSÃO de 19 de julho de 2013	L 197	1	20.7.2013
M4	REGULAMENTO (UE) N.o 709/2014 DA COMISSÃO de 20 de junho de 2014	L 188	1	27.6.2014
M5	REGULAMENTO (UE) 2017/645 DA COMISSÃO de 5 de abril de 2017	L 92	35	6.4.2017
►M6	REGULAMENTO (UE) 2017/771 DA COMISSÃO de 3 de maio de 2017	L 115	22	4.5.2017
►M7	REGULAMENTO DE EXECUÇÃO (UE) 2020/1560 DA COMISSÃO de 26 de outubro de 2020	L 357	17	27.10.2020

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REGULAMENTO (CE) N.o 152/2009 DA COMISSÃO

de 27 de Janeiro de 2009

que estabelece os métodos de amostragem e análise para o controlo oficial dos alimentos para animais

(Texto relevante para efeitos do EEE)

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Artigo 1.o

A amostragem para efeitos de controlo oficial de alimentos para animais, em especial no que se refere à determinação de constituintes, incluindo material que contenha ou consista em ou que seja produzido a partir de organismos geneticamente modificados (OGM), de aditivos para a alimentação animal, como definidos pelo Regulamento (CE) n.o 1831/2003 do Parlamento Europeu e do Conselho ( 1 ), ou de substâncias indesejáveis, na aceção da Diretiva 2002/32/CE do Parlamento Europeu e do Conselho ( 2 ), é efetuada em conformidade com os métodos indicados no anexo I.

O método de amostragem estabelecido no anexo I é aplicável para o controlo de alimentos para animais no que se refere à determinação de resíduos de pesticidas, como definidos no Regulamento (CE) n.o 396/2005 do Parlamento Europeu e do Conselho ( 3 ), e para o controlo da conformidade com o Regulamento (UE) n.o 619/2011.

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Artigo 2.o

A preparação das amostras para análise e a expressão dos resultados efectuam-se de acordo com os métodos descritos no anexo II.

Artigo 3.o

As análises para efeitos de controlo oficial dos alimentos para animais efectuam-se de acordo com os métodos descritos no anexo III (Métodos de análise para o controlo da composição das matérias-primas para a alimentação animal e dos alimentos compostos para animais), no anexo IV (Métodos de análise para o controlo do teor dos aditivos autorizados nos alimentos para animais), no anexo V (Métodos de análise para o controlo das substâncias indesejáveis nos alimentos para animais) e no anexo VI (Métodos de análise para a determinação dos constituintes de origem animal para o controlo oficial dos alimentos para animais).

Artigo 4.o

O valor energético dos alimentos compostos destinados a aves de capoeira é calculado em conformidade com o disposto no anexo VII.

Artigo 5.o

Usam-se, para efeitos de confirmação, os métodos de análise descritos no anexo VIII para o controlo da presença ilegal de aditivos que já não estão autorizados nos alimentos para animais.

Artigo 6.o

São revogadas as Directivas 71/250/CEE, 71/393/CEE, 72/199/CEE, 73/46/CEE, 76/371/CEE, 76/372/CEE, 78/633/CEE, 81/715/CEE, 84/425/CEE, 86/174/CEE, 93/70/CEE, 93/117/CE, 98/64/CE, 1999/27/CE, 1999/76/CE, 2000/45/CE, 2002/70/CE e 2003/126/CE.

As referências às directivas revogadas devem entender-se como sendo feitas para o presente regulamento e devem ser lidas de acordo com os quadros de correspondência constantes do anexo IX.

Artigo 7.o

O presente regulamento entra em vigor no vigésimo dia seguinte ao da sua publicação no Jornal Oficial da União Europeia.

É aplicável a partir de 26 de Agasto de 2009.

O presente regulamento é obrigatório em todos os seus elementos e directamente aplicável em todos os Estados-Membros.

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ANEXO I

MÉTODOS DE AMOSTRAGEM

1.   OBJETO E ÂMBITO DE APLICAÇÃO

As amostras destinadas ao controlo oficial de alimentos para animais são recolhidas de acordo com os métodos seguidamente indicados. As amostras assim obtidas serão consideradas representativas das porções amostradas.

O objetivo das amostras representativas é obter uma pequena fração de um lote, correspondendo a determinação de quaisquer características particulares dessa fração ao valor médio das características do lote. O lote é amostrado colhendo repetidamente amostras elementares em várias posições únicas do lote. Essas amostras elementares são combinadas misturando-as de forma a obter uma amostra global a partir da qual são preparadas amostras finais representativas por divisão representativa.

Se a inspeção visual revelar uma diferença de qualidade entre as porções amostradas do alimento para animais e o resto do alimento para animais do mesmo lote, essas porções devem ser separadas do resto do alimento para animais e ser tratadas como sublote separado. Se não for possível dividir o alimento para animais em sublotes separados, o produto em causa é amostrado como lote único. Nesses casos, esse facto será mencionado no relatório de amostragem.

Sempre que um alimento para animais amostrado em conformidade com as disposições do presente regulamento não satisfaça os requisitos da UE e faça parte de um lote de alimentos para animais da mesma categoria ou descrição, presume-se que todos os alimentos para animais desse lote se encontram afetados da mesma forma, a menos que, na sequência de uma avaliação rigorosa, não sejam detetados indícios de que o resto do lote não cumpre os requisitos da UE.

2.   DEFINIÇÕES

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Lote : quantidade identificada de alimentos para animais que se presume ter características uniformes, nomeadamente a origem, a variedade, o tipo de embalagem, o embalador, o expedidor ou a rotulagem; no caso de um processo de produção, uma quantidade do produto fabricada por uma unidade de produção de uma única unidade fabril que utilize parâmetros de produção uniformes ou por várias dessas unidades, quando produzida em ordem sequencial e armazenada em conjunto.

—	Porção amostrada : lote ou uma parte identificada do lote ou sublote.

—	Amostra selada : amostra selada de modo a impedir qualquer acesso à amostra sem quebrar ou remover o selo.

—	Amostra elementar : quantidade colhida num ponto da porção amostrada.

—	Amostra global : conjunto de amostras elementares colhidas da mesma porção amostrada.

—	Amostra reduzida : parte da amostra global, obtida a partir desta através de um processo de redução representativa.

—	Amostra final : parte da amostra reduzida ou da amostra global homogeneizada.

—	Amostra laboratorial : amostra destinada ao laboratório (como recebida pelo laboratório), que pode ser uma amostra final, reduzida ou global.

3.   DISPOSIÇÕES GERAIS

4.   EQUIPAMENTO

4.1.	O equipamento destinado à colheita de amostras deve ser fabricado com materiais que não contaminem os produtos amostrados. O equipamento destinado a ser utilizado várias vezes tem ser fácil de limpar para evitar contaminações cruzadas.

4.2.

Equipamento recomendado para a amostragem dos alimentos sólidos 4.2.1.    Amostragem manual 4.2.1.1.   Pá de fundo plano e bordos verticais 4.2.1.2. Sonda de fenda longa ou compartimentada. As dimensões da sonda têm de ser adequadas às características da porção amostrada (profundidade do recipiente, dimensões do saco, etc.) e ao tamanho das partículas que compõem o alimento. Se a sonda tiver várias aberturas, para garantir que a amostra é colhida em diferentes sítios, as aberturas devem ser separadas por compartimentos ou por aberturas sequenciais. 4.2.2.    Amostragem mecânica Podem ser utilizados aparelhos mecânicos apropriados para a amostragem de alimentos em movimento. Neste contexto, «apropriados» significa que, pelo menos, toda a secção do caudal é amostrada. A amostragem de alimentos em movimento (em caudais elevados) pode ser efetuada por sistemas automáticos de recolha de amostras. 4.2.3.    Divisor Quando possível e apropriado, devem ser utilizados aparelhos destinados a dividir a amostra em partes aproximadamente iguais, para a preparação de amostras reduzidas de uma forma representativa.

5.   REQUISITOS QUANTITATIVOS QUANTO AO NÚMERO DE AMOSTRAS ELEMENTARES

5.1.    Requisitos quantitativos das amostras elementares respeitantes ao controlo de substâncias ou produtos repartidos uniformemente nos alimentos para animais

5.1.1.    Alimentos sólidos a granel

5.1.2.    Alimentos líquidos a granel

5.1.3.    Alimentos embalados

Os alimentos para animais (sólidos e líquidos) podem ser embalados em sacos, latas, barricas, etc., que são referidos no quadro enquanto unidades. As unidades de grande dimensão (≥ 500 kg ou litros) têm de ser amostradas em conformidade com as disposições estabelecidas para os alimentos a granel (ver pontos 5.1.1 e 5.1.2).

5.1.4.    Alimentos em blocos e pedras minerais para lamber

Será considerado, no mínimo, um bloco ou pedra para lamber por cada porção amostrada de 25 unidades e, no máximo, quatro destes produtos.

Para blocos ou pedras para lamber cujo peso unitário não exceda 1 kg, a amostra elementar é composta pelo conteúdo de um bloco ou pedra para lamber.

5.1.5.    Forragens e outros alimentos grosseiros

5.2.    Requisitos quantitativos das amostras elementares respeitantes ao controlo de constituintes ou substâncias suscetíveis de não estar repartidos uniformemente nos alimentos para animais

Estes requisitos quantitativos das amostras elementares devem ser aplicados nas seguintes situações:

Sempre que a autoridade de controlo suspeitar fortemente de que essa distribuição não uniforme também se verifica em caso de contaminação cruzada por um constituinte ou substância em alimentos compostos, podem ser aplicados os requisitos quantitativos previstos no quadro abaixo.

5.3.    Requisitos quantitativos das amostras elementares no caso de lotes muito grandes

No caso de porções amostradas muito grandes (porções amostradas > 500 toneladas), o número de amostras elementares a colher = 40 amostras elementares + √ toneladas em relação ao controlo das substâncias ou produtos repartidos uniformemente nos alimentos para animais, ou 100 amostras elementares + √ toneladas em relação ao controlo de constituintes ou substâncias suscetíveis de não estar distribuídos uniformemente nas matérias-primas para alimentação animal.

6.   REQUISITOS QUANTITATIVOS DA AMOSTRA GLOBAL

7.   REQUISITOS QUANTITATIVOS DAS AMOSTRAS FINAIS

Amostras finais

É exigida a análise de, pelo menos, uma amostra final. A dimensão da amostra final destinada a análise não pode ser inferior às quantidades seguintes:

8.   MÉTODO DE AMOSTRAGEM PARA LOTES MUITO GRANDES OU LOTES ARMAZENADOS OU TRANSPORTADOS DE MODO A NÃO PERMITIR UMA AMOSTRAGEM DE TODO O LOTE

8.1.    Princípios gerais

Sempre que o tipo de transporte ou armazenagem de um lote não permita colher amostras elementares em todo o lote, a amostragem deve ser, de preferência, efetuada enquanto o lote estiver em movimento.

No caso de grandes armazéns destinados a alimentos para animais, os operadores devem ser incentivados a instalar equipamentos nos armazéns que permitam uma amostragem (automática) em todo o lote armazenado.

Em caso de aplicação dos procedimentos de amostragem previstos no presente capítulo 8, o operador da empresa do setor de alimentos para animais ou o seu representante são informados acerca desses procedimentos. Se os referidos procedimentos de amostragem forem questionados pelo operador ou pelo seu representante, o operador ou o seu representante deve permitir que a autoridade competente proceda à amostragem em todo o lote a suas expensas.

8.2.    Lotes grandes transportados por navio

8.2.1.    Amostragem dinâmica de lotes grandes transportados por navio

A amostragem de lotes grandes nos navios deve ser preferencialmente realizada enquanto o produto está em movimento (amostragem dinâmica).

A amostragem é feita por porão, podendo os porões estar fisicamente separados. Todavia, os porões são esvaziados parcialmente um após outro, deixando essa separação física inicial de existir após a transferência para as instalações de armazenamento. A amostragem pode, portanto, ser efetuada em função da separação física inicial ou da separação existente após transferência para as referidas instalações.

A descarga de um navio pode durar vários dias. Normalmente, as amostras têm de ser colhidas a intervalos regulares durante todo o período de descarga. Contudo, nem sempre é possível ou apropriado para um inspetor oficial estar presente para amostragem durante toda a operação de descarga. Por conseguinte, é permitida a amostragem de uma parte (porção amostrada) da totalidade do lote. O número de amostras elementares é determinado em função da dimensão da porção amostrada.

Sempre que seja amostrada uma parte de um lote de alimentos para animais da mesma categoria ou descrição e seja considerado que essa parte do lote não satisfaz os requisitos da UE, presume-se que todos os alimentos para animais desse lote se encontram afetados da mesma forma, a menos que, na sequência de uma avaliação rigorosa, não sejam detetados indícios de que o resto do lote não cumpre os requisitos da UE.

Mesmo quando a amostragem oficial é efetuada de forma automática, é necessária a presença de um inspetor. Contudo, se a amostragem automática utilizar parâmetros preestabelecidos que não possam ser alterados durante a amostragem e se as amostras elementares forem recolhidas num recipiente selado, impedindo qualquer possível fraude, a presença de um inspetor só é exigida no início da amostragem, de cada vez que tenha de ser mudado o recipiente das amostras, e no final da amostragem.

8.2.2.    Amostragem estática de lotes transportados por navio

No caso de a amostragem ser realizada de forma estática, têm de ser aplicados os procedimentos previstos para as instalações de armazenagem (silos) acessíveis pelo topo (ver ponto 8.4.1).

A amostragem tem de ser efetuada através da parte acessível (do topo) do lote/porão. O número de amostras elementares é determinado em função da dimensão da porção amostrada. Sempre que seja amostrada uma parte de um lote de alimentos para animais da mesma categoria ou descrição e seja considerado que essa parte do lote não satisfaz os requisitos da UE, presume-se que todos os alimentos para animais desse lote se encontram afetados da mesma forma, a menos que, na sequência de uma avaliação rigorosa, não sejam detetados indícios de que o resto do lote não cumpre os requisitos da UE.

8.3.    Amostragem de lotes grandes armazenados em armazéns

A amostragem tem de ser efetuada através da parte acessível do lote. O número de amostras elementares é determinado em função da dimensão da porção amostrada. Sempre que seja amostrada uma parte de um lote de alimentos para animais da mesma categoria ou descrição e seja considerado que essa parte do lote não satisfaz os requisitos da UE, presume-se que todos os alimentos para animais desse lote se encontram afetados da mesma forma, a menos que, na sequência de uma avaliação rigorosa, não sejam detetados indícios de que o resto do lote não cumpre os requisitos da UE.

8.4.    Amostragem de instalações de armazenagem (silos)

8.4.1.    Amostragem de silos (facilmente) acessíveis pelo topo

A amostragem tem de ser efetuada através da parte acessível do lote. O número de amostras elementares é determinado em função da dimensão da porção amostrada. Sempre que seja amostrada uma parte de um lote de alimentos para animais da mesma categoria ou descrição e seja considerado que essa parte do lote não satisfaz os requisitos da UE, presume-se que todos os alimentos para animais desse lote se encontram afetados da mesma forma, a menos que, na sequência de uma avaliação rigorosa, não sejam detetados indícios de que o resto do lote não cumpre os requisitos da UE.

8.4.2.    Amostragem de silos não acessíveis pelo topo (silos fechados)

8.4.2.1.    Silos não acessíveis pelo topo (silos fechados) com dimensão > 100 toneladas

Os alimentos para animais armazenados neste tipo de silos não podem ser amostrados de forma estática. Por conseguinte, sempre que os alimentos para animais no silo tenham de ser amostrados e não exista possibilidade de movê-los, é estabelecido um acordo com o operador no sentido de informar o inspetor sobre o momento em que o silo será descarregado, para que possa ser realizada uma amostragem dinâmica dos alimentos.

8.4.2.2.    Silos não acessíveis pelo topo (silos fechados) com dimensão < 100 toneladas

O procedimento de amostragem envolve a introdução num recipiente de uma quantidade de 50 kg a 100 kg e a recolha de uma amostra a partir dessa quantidade. A dimensão da amostra global corresponde a todo o lote e o número de amostras elementares é determinado em função da quantidade libertada do silo para o recipiente de amostragem. Sempre que seja amostrada uma parte de um lote de alimentos para animais da mesma categoria ou descrição e seja considerado que essa parte do lote não satisfaz os requisitos da UE, presume-se que todos os alimentos para animais desse lote se encontram afetados da mesma forma, a menos que, na sequência de uma avaliação rigorosa, não sejam detetados indícios de que o resto do lote não cumpre os requisitos da UE.

8.5.    Amostragem de alimentos a granel em contentores grandes fechados

Muitas vezes, estes lotes só podem ser amostrados quando descarregados. Por vezes, não é possível proceder à descarga no ponto de importação ou de controlo, devendo a amostragem ter lugar quando os contentores são descarregados.

9.   INSTRUÇÕES RELATIVAS À COLHEITA, À PREPARAÇÃO E AO ACONDICIONAMENTO DAS AMOSTRAS

9.1.    Disposições gerais

As amostras devem ser colhidas e preparadas tão rapidamente quanto possível, tendo em conta as precauções necessárias para evitar que o produto seja alterado ou contaminado. Os instrumentos assim como as superfícies e os recipientes destinados a receber as amostras têm de estar limpos e secos.

9.2.    Amostras elementares

As amostras elementares têm de ser colhidas aleatoriamente em toda a porção de amostragem e apresentar dimensões aproximadamente equivalentes.

As amostras elementares têm uma dimensão mínima de 100 g ou 25 g em caso de alimentos grosseiros ou de forragem com baixa densidade relativa.

Sempre que, em conformidade com as regras dos procedimentos de amostragem estabelecidas no ponto 8, tenham de ser colhidas menos de 40 amostras elementares, a dimensão dessas amostras é determinada em função da dimensão exigida para a amostra global (ver ponto 6).

No caso de amostragem de pequenos lotes de alimentos embalados relativamente aos quais, de acordo com os requisitos quantitativos, tenha de ser colhido um número limitado de amostras elementares, cada amostra elementar será composta pelo conteúdo de uma unidade de origem cujo conteúdo não exceda 1 kg ou 1 litro.

Em caso de amostragem de alimentos embalados constituídos por pequenas unidades (p. ex., < 250 g), a dimensão das amostras elementares depende da dimensão de cada unidade.

9.2.1.    Alimentos a granel

Sempre que adequado, a amostragem pode ser efetuada aquando da movimentação do lote (carga ou descarga).

9.2.2.    Alimentos embalados

Após seleção do número requerido de unidades amostradas, como indicado no capítulo 5, procede-se à colheita de uma parte do conteúdo de cada unidade com o auxílio de uma sonda ou pá. Sempre que necessário, as amostras são colhidas depois de se esvaziar separadamente as unidades.

9.2.3.    Alimentos líquidos ou semilíquidos homogéneos ou homogeneizáveis

Após seleção do número requerido de unidades amostradas, como indicado no capítulo 5, procede-se à colheita de uma quantidade em cada unidade após se ter homogeneizado o conteúdo, se necessário.

As amostras elementares podem ser colhidas aquando da descarga do produto.

9.2.4.    Alimentos líquidos ou semilíquidos não homogeneizáveis

Após seleção do número requerido de unidades amostradas, como indicado no capítulo 5, procede-se à colheita das amostras a diferentes níveis.

As amostras podem igualmente ser colhidas aquando da descarga do produto, mas rejeitando as primeiras frações.

Nos dois casos, o volume total colhido não pode ser inferior a 10 litros.

9.2.5.    Alimentos em blocos e pedras minerais para lamber

Após seleção do número requerido de blocos ou pedras para lamber amostradas, como indicado no capítulo 5, pode ser colhida uma parte de cada bloco ou pedra. Em caso de suspeita de bloco ou pedra não homogéneo, todo o bloco ou pedra pode ser colhido como amostra.

Para os blocos ou pedras para lamber cujo peso unitário não exceda 1 kg, cada amostra elementar é composta pelo conteúdo de um bloco ou pedra.

9.3.    Preparação das amostras globais

As amostras elementares devem ser misturadas para formar uma só amostra global.

9.4.    Preparação das amostras finais

O material da amostra global deve ser misturado cuidadosamente ( 4 ):

9.5.    Acondicionamento das amostras

Os recipientes são selados e rotulados de forma a impedir a sua abertura sem danificação do selo. O rótulo deve estar totalmente incorporado no selo.

9.6.    Envio das amostras para o laboratório

As amostras são enviadas sem atrasos desnecessários para o laboratório de análises designado, juntamente com a informação necessária para proceder à análise.

10.   REGISTO DA AMOSTRAGEM

Tem de ser efetuado um registo de cada amostra, identificando claramente cada porção amostrada e respetiva dimensão.

O registo deve igualmente mencionar qualquer desvio do procedimento de amostragem previsto no presente regulamento.

Além de disponibilizado ao laboratório de controlo oficial, o registo deve ser facultado ao operador da empresa do setor de alimentos para animais e/ou ao laboratório designado pelo operador.

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ANEXO II

DISPOSIÇÕES GERAIS RELATIVAS AOS MÉTODOS DE ANÁLISE DOS ALIMENTOS PARA ANIMAIS

A.   PREPARAÇÃO DE AMOSTRAS PARA ANÁLISE

1.    Objeto

Os procedimentos descritos infra referem-se à preparação para análise das amostras enviadas aos laboratórios de controlo, após uma amostragem efetuada segundo o disposto no anexo I.

As amostras laboratoriais têm de ser preparadas de forma que as quantidades colhidas, como previsto nos métodos de análise, sejam homogéneas e representativas das amostras finais.

2.    Precauções a tomar

O procedimento de preparação da amostra adotado depende dos métodos de análise a utilizar e dos constituintes ou substâncias a controlar. Importa, pois, garantir que o procedimento aplicado se adequa ao método de análise utilizado e aos constituintes ou substâncias a controlar.

Todas as operações têm de ser efetuadas de forma a evitar tanto quanto possível a contaminação da amostra ou a alteração da sua composição.

Todas as triturações, misturas e peneiramentos devem ser efetuados rapidamente, evitando ao máximo expor a amostra ao ar e à luz. Não se devem usar moinhos ou trituradores suscetíveis de aquecer demasiado a amostra.

Recomenda-se a trituração manual para os alimentos particularmente sensíveis ao calor. Deve ainda garantir-se que o equipamento não seja uma fonte de contaminação.

Caso a amostra não possa ser preparada sem uma variação significativa do seu teor em humidade, esse teor deve ser determinado antes e depois da preparação pelo método estabelecido na parte A do anexo III.

3.    Procedimento

3.1.    Procedimento geral

A alíquota de teste é colhida da amostra final. Não se recomenda o uso do método dos quartos, dado que pode dar origem a alíquotas de teste com uma elevada margem de erro de divisão.

3.1.1.    Alimentos que podem ser moídos tal como se encontram

3.1.2.    Alimentos que podem ser moídos após secagem

3.1.3.    Alimentos líquidos ou semilíquidos

3.1.4.    Outros alimentos

3.2.    Procedimento específico em caso de análise por inspeção visual ou por microscopia ou quando toda a amostra global esteja homogeneizada

4.    Armazenamento das amostras

Conservar as amostras a uma temperatura que não altere a sua composição. As amostras destinadas a análise de vitaminas ou substâncias particularmente sensíveis à luz devem ser armazenadas em condições que impeçam que a amostra seja adversamente afetada pela luz.

B.   DISPOSIÇÕES RELATIVAS AOS REAGENTES E EQUIPAMENTOS REQUERIDOS PELOS MÉTODOS DE ANÁLISE

C.   APLICAÇÃO DOS MÉTODOS DE ANÁLISE E EXPRESSÃO DOS RESULTADOS

1.    Procedimento de extração

Vários métodos determinam um procedimento de extração específico. Regra geral, podem ser usados procedimentos de extração diferentes do indicado no método de análise, desde que o procedimento usado tenha dado provas de que proporciona, para a matriz em causa, a mesma eficiência de extração que o procedimento mencionado no método de análise.

2.    Procedimento de purificação

Vários métodos determinam um procedimento de purificação específico. Regra geral, podem ser usados procedimentos de purificação diferentes do indicado no método de análise, desde que o procedimento usado tenha dado provas de que proporciona, para a matriz em causa, resultados analíticos equivalentes aos do procedimento mencionado no método de análise.

3.    Número de determinações

No caso de análise de substâncias indesejáveis, se o resultado da primeira determinação for significativamente (> 50 %) inferior à especificação a controlar, não são necessárias determinações adicionais, desde que se tenham aplicado os procedimentos de qualidade adequados. Nos outros casos, é necessário um ensaio em duplicado (segunda determinação) para se excluir a possibilidade de contaminação cruzada interna ou de uma troca acidental de amostras. Para verificar a conformidade é utilizada a média das duas determinações, tendo em conta a incerteza de medição.

Nos casos em que o controlo incide sobre o teor declarado de uma substância ou ingrediente, se o resultado da primeira determinação confirmar o teor declarado, ou seja, se o resultado analítico se situar dentro da gama de variação aceitável desse teor, não são necessárias mais determinações, desde que se tenham aplicado os procedimentos de qualidade adequados. Nos outros casos, é necessário um ensaio em duplicado (segunda determinação) para se excluir a possibilidade de contaminação cruzada interna ou de uma troca acidental de amostras. Para verificar a conformidade, é utilizada a média das duas determinações, tendo em conta a incerteza de medição.

Em certos casos, a gama de variação aceitável encontra-se estabelecida na legislação, nomeadamente no Regulamento (CE) n.o 767/2009 do Parlamento Europeu e do Conselho, de 13 de julho de 2009, relativo à colocação no mercado e à utilização de alimentos para animais, que altera o Regulamento (CE) n.o 1831/2003 do Conselho e revoga as Diretivas 79/373/CEE do Conselho, 80/511/CEE da Comissão, 82/471/CEE do Conselho, 83/228/CEE do Conselho, 93/74/CEE do Conselho, 93/113/CE do Conselho e 96/25/CE do Conselho e a Decisão 2004/217/CE da Comissão ( 7 ).

4.    Notificação do método de análise utilizado

O relatório de análise deve mencionar o método de análise utilizado.

5.    Notificação do resultado analítico

O resultado analítico, que deve ser expresso em conformidade com as indicações dadas no método de análise e conter o devido número de algarismos significativos, pode, caso necessário, ser corrigido em função do teor de humidade apresentado pela amostra final antes da sua preparação para análise.

6.    Incerteza de medição e taxa de recuperação no caso da análise de substâncias indesejáveis

No que diz respeito às substâncias indesejáveis na aceção da Diretiva 2002/32/CE, um produto destinado à alimentação animal é considerado não conforme com o limite máximo fixado se se considerar que o resultado analítico, relativo a um alimento com um teor de humidade de 12 %, ultrapassará o limite máximo tendo em conta a incerteza expandida de medição e a correção em função da recuperação. Para avaliar a conformidade, usa-se a concentração analisada, corrigida em função da recuperação, e subtrai-se a incerteza expandida de medição. Este procedimento só é aplicável nos casos em que o método de análise permita estimar a incerteza da medição e a correção em função da recuperação (por exemplo, não é possível no caso da análise microscópica).

O resultado analítico será apresentado do seguinte modo (na medida em que o método de análise utilizado permita estimar a incerteza de medição e a taxa de recuperação):

Todavia, se o resultado da análise for significativamente (> 50 %) inferior à especificação a controlar e se a análise se destinar exclusivamente a verificar a observância das disposições legislativas, desde que se tenham aplicado os procedimentos de qualidade adequados, o resultado analítico pode ser notificado sem correção em função da recuperação e, nestes casos, não é necessário transmitir os valores da taxa de recuperação nem da incerteza de medição.

▼B

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ANEXO III

MÉTODOS DE ANÁLISE PARA O CONTROLO DA COMPOSIÇÃO DAS MATÉRIAS-PRIMAS PARA A ALIMENTAÇÃO ANIMAL E DOS ALIMENTOS COMPOSTOS PARA ANIMAIS

A.   DETERMINAÇÃO DA HUMIDADE

1.   Objecto e âmbito de aplicação

Este método permite determinar o teor de humidade dos alimentos para animais. Se os alimentos contiverem substâncias voláteis, como por exemplo ácidos orgânicos, deve ter-se em conta que, a par do teor de humidade, também se mede uma quantidade significativa de substâncias voláteis.

O método não abrange a análise dos produtos lácteos enquanto matérias-primas para a alimentação animal, a análise das substâncias minerais e das misturas essencialmente compostas de substâncias minerais, a análise das gorduras e óleos animais e vegetais nem a análise das sementes e frutos oleaginosos.

2.   Princípio

A amostra é dessecada em condições definidas que variam em função da natureza do alimento. A perda de massa é determinada por pesagem. É necessário proceder a uma pré-dessecação sempre que se trate de alimentos sólidos com um elevado teor de humidade.

3.   Equipamento

4.   Procedimento

N.B.

:

As operações descritas nesta secção devem ser efectuadas imediatamente após a abertura das embalagens que contêm as amostras. As análises devem ser efectuadas pelo menos em duplicado.

4.1.   Preparação

4.1.1.    Alimentos com excepção dos mencionados nos pontos 4.1.2 e 4.1.3

Tomar pelo menos 50 g da amostra. Se for necessário, triturar ou dividir de maneira apropriada para evitar qualquer variação do teor de humidade (ver ponto 6).

4.1.2.    Cereais e sêmolas grossas

Tomar pelo menos 50 g da amostra. Moer em partículas, das quais pelo menos 50 % passem por uma peneira de malhas de 0,5 mm e não deixem mais de 10 % de resíduos sobre outro crivo de malhas redondas de 1 mm.

4.1.3.    Alimentos líquidos ou pastosos, alimentos constituídos essencialmente de matérias gordas

Tomar e pesar, com uma aproximação de 10 mg, cerca de 25 g da amostra, adicionar-lhe uma quantidade apropriada de areia anidra, com uma aproximação de 10 mg, misturar até à obtenção de um produto homogéneo.

4.2.   Dessecação

4.2.1.    Alimentos com excepção dos mencionados nos pontos 4.2.2 e 4.2.3

Tarar, com uma aproximação de 1 mg, um recipiente (3.3) com a tampa. Pesar dentro dele, com uma aproximação de 1 mg, cerca de 5 g da amostra repartindo-a uniformemente. Colocar o recipiente destapado na estufa previamente aquecida a 103 oC. Introduzir o recipiente o mais rapidamente possível, para evitar que a temperatura da estufa desça demasiado. Deixar secar durante quatro horas, a partir do momento em que a estufa tiver atingido de novo a temperatura de 103 oC. Colocar a tampa no recipiente, retirar este da estufa, deixar arrefecer 30 a 45 minutos no exsicador (3.6) e pesar com uma aproximação de 1 mg.

No caso de alimentos constituídos essencialmente de matérias gordas, efectuar uma dessecação suplementar de 30 minutos na estufa a 130 oC. A diferença entre as duas pesagens não deve exceder o valor correspondente a 0,1 % de humidade.

4.2.2.    Cereais, farinhas, sêmolas grossas e finas

Tarar, com uma aproximação de 0,5 mg, um recipiente (3.3) com a tampa. Pesar dentro dele, com uma aproximação de 1 mg, cerca de 5 g da amostra triturada, repartindo-a uniformemente. Colocar o recipiente destapado na estufa previamente aquecida a 130 oC. Introduzir o recipiente o mais rapidamente possível, para evitar que a temperatura da estufa desça demasiado. Deixar secar durante duas horas, a partir do momento em que a estufa tiver atingido de novo a temperatura de 130 oC. Colocar a tampa no recipiente, retirar este da estufa, deixar arrefecer 30 a 45 minutos no exsicador (3.6) e pesar com uma aproximação de 1 mg.

Tarar, com uma aproximação de 0,5 mg, um recipiente (3.3) com a tampa. Pesar dentro dele, com uma aproximação de 1 mg, cerca de 5 g da amostra repartindo-a uniformemente. Colocar o recipiente destapado na estufa de vácuo (3.5) previamente aquecida a uma temperatura entre 80 e 85 oC. Introduzir o recipiente o mais rapidamente possível, para evitar que a temperatura da estufa desça demasiado.

Elevar a pressão a 100 Torr e deixar secar a esta pressão durante quatro horas, quer sob uma corrente de ar seco e quente, quer por meio de um agente desidratante (cerca de 300 g para 20 amostras). Neste último caso, desligar a bomba de vácuo quando a pressão indicada tiver sido atingida. Contar o tempo de secagem a partir do momento em que a estufa tiver atingido de novo a temperatura de 80 a 85 oC. Reduzir cuidadosamente a pressão no interior da estufa até à pressão atmosférica. Abrir a estufa, tapar imediatamente o recipiente, retirá-lo da estufa, deixar arrefecer durante 30 a 45 minutos no exsicador (3.6) e pesar com uma aproximação de 1 mg. Proceder a uma dessecação complementar de 30 minutos na estufa de vácuo a uma temperatura entre 80 e 85 oC e pesar novamente. A diferença entre as duas pesagens não deve exceder o valor correspondente a 0,1 % de humidade.

4.3.   Pré-dessecação

4.3.1.    Alimentos, com excepção dos mencionados no ponto 4.3.2

Os alimentos sólidos cujo teor de humidade é elevado e torna a trituração difícil devem ser pré-dessecados como se segue:

Pesar, com uma aproximação de 10 mg, 50 g de amostra não triturada (pode efectuar-se uma divisão grosseira, se necessário, no caso dos alimentos comprimidos ou aglomerados) num recipiente apropriado (por exemplo, numa placa de alumínio de 20 × 12 cm com um bordo de 0,5 cm). Deixar secar numa estufa a uma temperatura entre 60 e 70 oC até que o teor de humidade seja reduzido para um valor entre 8 e 12 %. Retirar da estufa, deixar arrefecer a descoberto no laboratório durante uma hora e pesar com uma aproximação de 10 mg. Triturar imediatamente, como indicado no ponto 4.1.1 e efectuar a dessecação como indicado nos pontos 4.2.1 ou 4.2.3 segundo a natureza do alimento.

4.3.2.    Cereais

Os grãos com uma taxa de humidade superior a 17 % devem ser pré-dessecados como se segue:

Pesar, com uma aproximação de 10 mg, 50 g de grãos não moídos num recipiente apropriado (por exemplo, numa placa de alumínio de 20 × 12 cm com bordo de 0,5 cm). Deixar secar numa estufa durante 5 a 7 minutos, à temperatura de 130 oC. Retirar da estufa, deixar arrefecer a descoberto no laboratório durante duas horas e pesar, com uma aproximação de 10 mg. Moer imediatamente, como indicado no ponto 4.1.2 e efectuar a dessecação, como indicado no ponto 4.2.2.

5.   Cálculo dos resultados

O teor de humidade (X), em percentagem da amostra, é dado pelas seguintes fórmulas:

5.1.   Dessecação sem pré-dessecação

em que:

m

=

massa inicial da amostra, em gramas,

m0

=

massa da amostra seca, em gramas.

5.2.   Dessecação com pré-dessecação

em que:

m

=

massa inicial da amostra, em gramas,

m1

=

massa da amostra, depois da pré-dessecação, em gramas,

m2

=

massa da amostra depois da trituração ou moagem, em gramas,

m0

=

massa da amostra seca, em gramas.

5.3.   Repetibilidade

A diferença entre os resultados de duas determinações paralelas efectuadas com a mesma amostra não deve exceder 0,2 % do valor absoluto da humidade.

6.   Observações

Se for necessária uma trituração e dela resultar uma variação do teor de humidade do produto, os resultados da análise que dizem respeito aos componentes do alimento devem ser corrigidos de acordo com o teor de humidade da amostra inicial.

B.   DETERMINAÇÃO DA HUMIDADE NAS MATÉRIAS GORDAS ANIMAIS E VEGETAIS

1.   Objecto e âmbito de aplicação

O método permite determinar o teor em humidade (água e outras matérias voláteis) das gorduras e dos óleos animais e vegetais.

2.   Princípio

A amostra é seca a 103 oC até peso constante (a perda de peso entre duas pesagens sucessivas deve ser inferior a 1 mg). A perda de peso é determinada por pesagem.

3.   Equipamento

4.   Procedimento

Pesar, com uma aproximação de 1 mg, cerca de 20 g da amostra homogeneizada na cápsula (3.1) seca e com tara calculada, contendo o termómetro (3.2). Aquecer em banho de areia ou placa de aquecimento (3.3), agitando constantemente com a ajuda do termómetro, de modo a que a temperatura atinja 90 oC em cerca de 7 minutos.

Reduzir a intensidade do aquecimento, atendendo à frequência com que as bolhas sobem do fundo do recipiente. A temperatura não deverá ultrapassar 105 oC. Continuar a agitar, raspando o fundo da cápsula até que cesse a formação de bolhas.

A fim de assegurar a eliminação total da humidade, repetir várias vezes o aquecimento a 103 oC ± 2oC, arrefecendo até 93 oC entre aquecimentos sucessivos. Em seguida deixar arrefecer no exsicador (3.4) até que atinja a temperatura ambiente e pesar. Repetir esta operação até que a perda de massa entre duas pesagens sucessivas não exceda 2 mg.

N.B.

:

Um aumento de massa da amostra após aquecimento repetido indica uma oxidação da gordura. Neste caso, calcular o resultado a partir da pesagem efectuada imediatamente antes do começo do aumento de massa.

5.   Cálculo dos resultados

O teor de humidade (X) em percentagem da amostra é dado pela fórmula:

em que:

m

=

massa da amostra em ensaio, em gramas,

m1

=

massa da cápsula com o respectivo conteúdo, antes do aquecimento, em gramas,

m2

=

massa da cápsula com o respectivo conteúdo, após aquecimento, em gramas.

Os resultados inferiores a 0,05 % devem ser registados com a referência «inferior a 0,05 %».

Repetibilidade

A diferença entre os resultados obtidos em duas determinações paralelas efectuadas com a mesma amostra não deve exceder 0,05 % em valor absoluto.

C.   DETERMINAÇÃO DO TEOR DE PROTEÍNA BRUTA

1.   Objecto e âmbito de aplicação

O presente método permite determinar o teor de proteína bruta dos alimentos para animais com base no teor de azoto, determinado pelo método de Kjeldahl.

2.   Princípio

A amostra é mineralizada com ácido sulfúrico, na presença de um catalisador. A solução ácida é alcalinizada por adição de uma solução de hidróxido de sódio. O amoníaco é destilado e recolhido numa quantidade determinada de ácido sulfúrico, cujo excesso é titulado com uma solução-padrão de hidróxido de sódio.

Alternativamente, o amoníaco libertado é destilado numa solução de ácido bórico em excesso, seguido de titulação com uma solução de ácido clorídrico ou sulfúrico.

3.   Reagentes

Se se aplicar a detecção colorimétrica do ponto final, deve adicionar-se os indicadores vermelho de metilo e bromocresol às soluções de ácido bórico. Se se preparar um litro de solução de ácido bórico, adicionam-se, antes de ajustar o volume, 7 ml de solução de indicador vermelho de metilo (3.16) e 10 ml de solução de verde de bromocresol (3.17).

O pH das soluções de ácido bórico preparadas pode diferir em função da água usada. Por vezes, é necessário efectuar um ajuste com um pequeno volume de uma solução alcalina a fim de obter um resultado positivo no ensaio em branco.

Nota:

Com a adição de cerca de 3 a 4 ml de NaOH (3.11) a um litro de ácido bórico 10 g/l consegue-se normalmente um bom ajuste. A solução deve ser armazenada à temperatura ambiente e ao abrigo da luz e de fontes de vapores de amoníaco.

Nota:

Podem usar-se outras concentrações das soluções volumétricas (3.5, 3.6, 3.7, 3.10, 3.11, e 3.19) desde que se efectue a respectiva correcção no cálculo dos resultados. As concentrações devem sempre ser expressas com quatro casas decimais.

4.   Equipamento

Equipamento adequado para efectuar a mineralização, a destilação e a titulação pelo método de Kjeldahl.

5.   Procedimento

5.1.   Mineralização

Pesar, com uma aproximação de 0,001 g, 1 g de amostra e transferi-la para o recipiente do aparelho de mineralização. Adicionar 15 g de sulfato de potássio (3.1), uma quantidade adequada de catalisador (3.2) [0,3 a 0,4 g de óxido de cobre (II) ou 0,9 a 1,2 g de sulfato de cobre (II) penta-hidratado], 25 ml de ácido sulfúrico (3.4) e, se necessário, alguns grânulos de pedra-pomes (3.12), misturando.

Começar por aquecer moderadamente a mistura, agitando ocasionalmente se necessário, até à carbonização completa da massa e o desaparecimento da espuma. Aquecer seguidamente de um modo mais vigoroso até à ebulição; o aquecimento é adequado quando se observar a condensação do ácido nas paredes do recipiente. Evitar o sobreaquecimento lateral e a adesão de partículas orgânicas às paredes.

Quando a solução ficar límpida e assumir um tom verde claro, continuar a ebulição durante mais duas horas, arrefecendo de seguida.

5.2.   Destilação

Adicionar cuidadosamente uma quantidade de água adequada para a dissolução completa dos sulfatos. Deixar arrefecer e adicionar, se necessário, alguns grânulos de zinco (3.3). Proceder de acordo com o disposto nos pontos 5.2.1 ou 5.2.2.

5.2.1.    Destilação com recolha em ácido sulfúrico

Colocar no balão de recolha do dispositivo de destilação 25 ml, rigorosamente medidos, de ácido sulfúrico (3.5) ou (3.7), em função do teor presumido de azoto. Adicionar algumas gotas de vermelho de metilo (3.8).

Adaptar o recipiente de mineralização ao refrigerante do dispositivo de destilação, imergindo a extremidade do refrigerante no líquido contido no balão de recolha, até uma profundidade mínima de 1 cm (ver a observação 8.3). Juntar cuidadosamente 100 ml de solução de hidróxido de sódio (3.9) ao recipiente de mineralização, evitando perdas de amoníaco (ver a observação 8.1). Aquecer o recipiente até à destilação completa do amoníaco.

5.2.2.    Destilação com recolha em ácido bórico

Sempre que a titulação do teor de amoníaco no destilado for realizada manualmente, aplica-se o procedimento mencionado a seguir. Se a unidade de destilação for totalmente automatizada e incluir a titulação do teor de amoníaco no destilado, seguir as instruções do fabricante.

Colocar um balão de recolha com 25 a 30 ml da solução de ácido bórico (3.18) sob a saída do refrigerante de forma que o tubo de saída se situe sob a superfície da solução de ácido bórico em excesso. Regular a unidade de destilação de forma a adicionar 50 ml da solução de hidróxido de sódio (3.9). Colocar a unidade de destilação em funcionamento de acordo com as instruções do fabricante e destilar o amoníaco libertado com a adição da solução de hidróxido de sódio. Recolher o destilado na solução de ácido bórico. A quantidade de destilado (duração da destilação por arrastamento de vapor) depende da quantidade de azoto na amostra. Seguir as instruções do fabricante.

Nota

:

Numa unidade de destilação semiautomática, a adição de hidróxido de sódio em excesso e a destilação por arrastamento de vapor são realizadas automaticamente.

5.3.   Titulação

Proceder de acordo com o disposto nos pontos 5.3.1 ou 5.3.2.

5.3.1.    Ácido sulfúrico

Titular o excesso de ácido sulfúrico existente no balão de recolha com a solução de hidróxido de sódio (3.10) ou (3.11), em função da concentração de ácido sulfúrico utilizada, até atingir o ponto final.

5.3.2.    Ácido bórico

Com o auxílio de uma bureta, titular o conteúdo do balão de recolha com a solução volumétrica padrão de ácido clorídrico (3.19) ou com a solução volumétrica padrão de ácido sulfúrico (3.6) e registar o volume de solução titulante usada.

Se se aplicar a detecção colorimétrica do ponto final, este é atingido assim que a solução começa a mudar de cor para rosa. A leitura da bureta é feita com uma aproximação de 0,05 ml. A visualização do ponto final pode ser facilitada pelo uso de uma placa de agitação magnética dotada de iluminação ou de um detector fotométrico.

Esta operação pode ser feita automaticamente se se usar um dispositivo de destilação por arrastamento de vapor com titulação automática.

Para o funcionamento do destilador ou destilador/titulador, seguir as instruções do fabricante.

Nota:

Quando se usa um sistema de titulação automática, a titulação começa assim que se dá início à destilação e usa-se a solução de ácido bórico a 1 % (3.18). Se se recorrer a uma unidade de destilação totalmente automatizada, a titulação do amoníaco também se pode fazer com a detecção do ponto final através de um sistema potenciométrico de medição do pH. Neste caso, usa-se um titulador automático com um medidor de pH. O medidor de pH deve estar devidamente calibrado no intervalo de pH 4 a 7, segundo procedimentos laboratoriais normais. O ponto final da titulação é atingido a um pH de 4,6 , correspondente ao ponto de inflexão da curva de titulação (ponto de maior declive).

5.4.   Ensaio em branco

Com vista a confirmar a ausência de azoto nos reagentes, efectuar um ensaio em branco (mineralização, destilação e titulação) utilizando 1 g de sacarose (3.14) em vez da amostra.

6.   Cálculo dos resultados

Os cálculos efectuam-se em conformidade com o referido nos pontos 6.1 ou 6.2.

6.1.   Cálculo para a titulação efectuada segundo o método exposto em 5.3.1

O teor de proteína bruta, expresso em percentagem em massa, é dado pela fórmula seguinte:

em que:

V0

=

Volume, expresso em ml, de NaOH (3.10 ou 3.11) utilizado no ensaio em branco.

V1

=

Volume, expresso em ml, de NaOH (3.10 ou 3.11) utilizado na titulação da amostra.

c

=

Concentração, expressa em mol/l, da solução de hidróxido de sódio (3.10 ou 3.11).

m

=

Massa da amostra, expressa em gramas.

6.2.   Cálculo para a titulação efectuada segundo o método exposto em 5.3.2

6.2.1.    Titulação com ácido clorídrico

O teor de proteína bruta, expresso em percentagem em massa, é dado pela fórmula seguinte:

em que:

m

=

Massa da amostra, expressa em gramas.

c

=

Concentração, expressa em mol/l, da solução volumétrica padrão de ácido clorídrico (3.19).

V0

=

Volume, em ml, de ácido clorídrico utilizado no ensaio em branco.

V1

=

Volume, em ml, de ácido clorídrico utilizado na titulação da amostra.

6.2.2.    Titulação com ácido sulfúrico

O teor de proteína bruta, expresso em percentagem em massa, é dado pela fórmula seguinte:

em que:

m

=

Massa da amostra, expressa em gramas.

c

=

Concentração, expressa em mol/l, da solução volumétrica padrão de ácido sulfúrico (3.6).

V0

=

Volume, em ml, de ácido sulfúrico (3.6) utilizado no ensaio em branco.

V1

=

Volume, em ml, de ácido sulfúrico (3.6) utilizado na titulação da amostra.

7.   Verificação do método

7.1.   Repetibilidade

A diferença entre os resultados de duas determinações paralelas efectuadas com a mesma amostra não deve exceder:

7.2.   Exactidão

Efectuar a análise (mineralização, destilação e titulação) de 1,5 a 2,0 g de acetanilida (3.13), na presença de 1 g de sacarose (3.14); 1 g de acetanilida deverá consumir 14,80 ml de ácido sulfúrico (3.5). A taxa de recuperação deve ser de, pelo menos, 99 %.

8.   Observações

D.   DETERMINAÇÃO DA UREIA

1.   Objecto e âmbito de aplicação

Esta técnica permite determinar o teor de ureia em alimentos para animais.

2.   Princípio

Suspende-se a amostra em água juntamente com um agente clarificante e filtra-se. Determina-se o teor de ureia do filtrado, após a adição de 4-dimetilaminobenzaldeído (4-DMAB), medindo a densidade óptica a um comprimento de onda de 420 nm.

3.   Reagentes

4.   Equipamento

5.   Procedimento

5.1.   Análise da amostra

Pesar, com uma aproximação de 1 mg, 2 g de amostra, introduzi-la com 1 g de carvão activado (3.4) num balão volumétrico de 500 ml. Juntar 400 ml de água e 5 ml de solução de Carrez I (3.2), agitar durante cerca de 30 segundos e juntar em seguida 5 ml de solução de Carrez II (3.3). Misturar durante 30 minutos no misturador. Completar o volume com água, agitar e filtrar.

Recolher 5 ml de filtrado límpido e incolor e transferi-los para os tubos de ensaio de tampa esmerilada, juntar 5 ml de solução de 4-DMAB (3.1) e misturar. Colocar os tubos em banho-maria a 20 oC (± 4 oC). Decorridos 15 minutos, medir a densidade óptica da solução de amostra, com o espectrofotómetro a 420 nm. Comparar com a solução de reagentes feita no ensaio em branco.

5.2.   Curva de calibração

Recolher volumes de 1, 2, 4, 5 e 10 ml de solução de ureia (3.5), introduzi-los em balões volumétricos de 100 ml, completando os volumes com água. De cada um dos balões, retirar 5 ml de solução e juntar 5 ml de solução de 4-DMAB, homogeneizar e medir a densidade óptica, como referido, por comparação com uma solução de referência com 5 ml de 4-DMAB e 5 ml de água, isenta de ureia. Traçar a curva de calibração.

6.   Cálculo dos resultados

A partir da curva de calibração, determinar a quantidade de ureia na amostra.

Exprimir o resultado em percentagem da amostra.

7.   Observações

E.   DETERMINAÇÃO DAS BASES AZOTADAS VOLÁTEIS

I.   POR MICRODIFUSÃO

1.   Objecto e âmbito de aplicação

O método permite determinar o teor de bases azotadas voláteis, expressas em amoníaco, dos alimentos para animais.

2.   Princípio

A amostra é extraída com água, a solução é clarificada e filtrada. As bases azotadas voláteis são separadas por microdifusão com uma solução de carbonato de potássio, recolhidas numa solução de ácido bórico e tituladas com ácido sulfúrico.

3.   Reagentes

4.   Equipamento

5.   Procedimento

Pesar, com uma aproximação de 1 mg, 10 g de amostra e introduzir num balão volumétrico de 200 ml com 100 ml de água. Misturar ou agitar durante 30 minutos no misturador basculante. Adicionar 50 ml de solução de ácido tricloroacético (3.1), completar o volume com água, agitar vigorosamente e filtrar num filtro de pregas.

Introduzir com a pipeta, na parte central da célula de Conway, 1 ml de solução de ácido bórico (3.3) e, na parte periférica, 1 ml do filtrado da amostra. Cobrir parcialmente com a tampa com silicone. Introduzir rapidamente na parte periférica 1 ml de solução saturada de carbonato de potássio (3.4) e fechar hermeticamente a tampa. Agitar suavemente a célula dando-lhe um movimento de rotação num plano horizontal, para misturar os dois reagentes. Deixar incubar durante quatro horas, pelo menos, à temperatura ambiente, ou, então, durante uma hora a 40 oC.

Titular as bases voláteis na solução de ácido bórico por meio de ácido sulfúrico (3.5), utilizando uma microbureta (4.3).

Efectuar um ensaio em branco aplicando o mesmo método, na ausência de amostra a analisar.

6.   Cálculo dos resultados

1 ml de H2SO40,01 mol/l corresponde a 0,34 mg de amoníaco.

Exprimir o resultado em percentagem da amostra.

Repetibilidade

A diferença entre os resultados de duas determinações paralelas efectuadas com a mesma amostra não deve exceder:

7.   Observações

Se o teor de amoníaco da amostra for superior a 0,6 %, diluir o filtrado inicial.

CONWAY CELL

Scale 1/1

II.   POR DESTILAÇÃO

1.   Objecto e âmbito de aplicação

Este método permite determinar o teor de bases azotadas voláteis, expressas em amoníaco, das farinhas de peixe que praticamente não contêm ureia. Só pode ser utilizado para os teores de amoníaco inferiores a 0,25 %.

2.   Princípio

A amostra é extraída com água, a solução é clarificada e filtrada. As bases azotadas voláteis são separadas, no ponto de ebulição, por adição de óxido de magnésio e recolhidas numa quantidade determinada de ácido sulfúrico cujo excesso é titulado por meio de uma solução de hidróxido de sódio.

3.   Reagentes

4.   Equipamento

5.   Procedimento

Pesar, com uma aproximação de 1 mg, 10 g da amostra e introduzir num balão volumétrico de 200 ml com 100 ml de água. Misturar ou agitar durante 30 minutos no misturador basculante. Adicionar 50 ml de solução de ácido tricloroacético (3.1), completar o volume com água, agitar vigorosamente e filtrar num filtro de pregas.

Recolher uma quantidade do filtrado límpido que seja adequada em função da concentração presumida de bases azotadas voláteis (geralmente 100 ml). Diluir para 200 ml e adicionar 2 g de óxido de magnésio (3.2) e algumas gotas de emulsão antiespuma (3.3). O pH da solução deve ser alcalino quando verificado com papel tornesol; se não o for, adicionar mais óxido de magnésio (3.2). Proceder de acordo com o disposto nos pontos 5.2 e 5.3 da parte C do presente anexo relativa ao método de determinação do teor de proteína bruta.

Efectuar um ensaio em branco aplicando o mesmo método, na ausência de amostra a analisar.

6.   Cálculo dos resultados

1 ml de H2SO40,05 mol/l corresponde a 1,7 mg de amoníaco.

Exprimir o resultado em percentagem da amostra.

Repetibilidade

A diferença entre os resultados de duas determinações paralelas efectuadas com a mesma amostra não deve exceder, em valor relativo, 10 % de amoníaco.

F.   DETERMINAÇÃO DOS AMINOÁCIDOS (COM EXCEPÇÃO DO TRIPTOFANO)

1.   Objecto e âmbito de aplicação

O presente método destina-se à determinação do teor de aminoácidos livres (naturais e de síntese) e aminoácidos totais (ligados e livres) em alimentos para animais, utilizando um analisador de aminoácidos. O método é aplicável ao doseamento dos seguintes aminoácidos: cistina/cisteína, metionina, lisina, treonina, alanina, arginina, ácido aspártico, ácido glutâmico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, fenilalanina, prolina, serina, tirosina e valina.

O método não permite distinguir as formas D e L, nem os sais de aminoácidos. Não é aplicável ao doseamento do triptofano nem de derivados hidroxilados de aminoácidos.

2.   Princípio

2.1.   Aminoácidos livres

Os aminoácidos livres são extraídos com ácido clorídrico diluído. As macromoléculas azotadas co-extraídas são precipitadas com ácido sulfossalicílico e removidas por filtração. O pH do filtrado é ajustado a 2,20 . Os aminoácidos são separados por cromatografia de troca iónica e determinados fotometricamente a 570 nm, após reacção com ninidrina.

2.2.   Aminoácidos totais

O procedimento a adoptar depende dos aminoácidos a dosear. A cistina/cisteína e a metionina necessitam de oxidação a ácido cisteico e a metionina sulfona, respectivamente, antes da hidrólise. A tirosina é determinada nos hidrolisados de amostras não oxidadas. Todos os restantes aminoácidos referidos no ponto 1 podem ser determinados a partir de amostras oxidadas ou não oxidadas.

A oxidação é realizada a 0 oC, com uma mistura ácido perfórmico/fenol. O excesso de reagente de oxidação é decomposto com bissulfito de sódio. A amostra, oxidada ou não, é hidrolisada com ácido clorídrico (3.20) durante 23 horas. O pH do hidrolisado é ajustado a 2,20 . Os aminoácidos são separados por cromatografia de troca iónica e determinados fotometricamente a 570 nm (440 nm no caso da prolina), após reacção com ninidrina.

3.   Reagentes

Deve utilizar-se água bidestilada ou de qualidade equivalente (condutividade inferior a 10 μS).

Dissolver 300 g de NaOH (3.5) em água, e perfazer o volume de 1 litro.

Dissolver 40 g de NaOH (3.5) em água e perfazer o volume de 1 litro.

Misturar 889 g de ácido fórmico (3.2) com 111 g de água e adicionar 4,73 g de fenol (3.3).

Adicionar 1 g de fenol (3.3) a 492 ml de HCl (3.7) e perfazer com água o volume de 1 litro.

Dissolver 60 g de ácido 5-sulfossalicílico (3.6) em água, e perfazer o volume de 1 litro.

Misturar, num pequeno matraz, 0,5 ml de peróxido de hidrogénio (3.1) com 4,5 ml de solução de ácido fórmico/fenol (3.19). Tapar e manter a 20-30 oC durante uma hora, de modo a obter ácido perfórmico. Arrefecer num banho de gelo (15 minutos) e adicionar à amostra.

Cuidado: evitar o contacto com a pele e utilizar vestuário de protecção.

Dissolver 19,61 g de citrato de sódio (3.8), 5 ml de tiodiglicol (3.9), 1 g de fenol (3.3) e 16,50 ml de HCl (3.7) em cerca de 800 ml de água. Ajustar o pH a 2,20 . Perfazer o volume de 1 l com água.

c = 2,5 μmol/ml de cada aminoácido em ácido clorídrico.

Disponíveis no comércio.

Dissolver, num balão volumétrico de 1 litro, 0,2115 g de ácido cisteico (3.16.2) e 0,2265 g de metionina sulfona (3.16.3) em tampão citrato (3.24), completando o volume com o mesmo tampão. Armazenar a uma temperatura inferior a 5 oC, por um período não superior a 12 meses. Esta solução não é necessária no caso de a solução-mãe padrão (3.27.1) conter ácido cisteico e metionina sulfona.

Dissolver, num balão volumétrico de 250 ml, 0,6560 g de norleucina (3.13) em tampão citrato (3.24), completando o volume com o mesmo tampão. Armazenar a uma temperatura inferior a 5 oC, por um período não superior a 6 meses.

Transferir quantitativamente para um balão volumétrico de 50 ml, completar o volume com tampão citrato (3.24) e homegeneizar.

Armazenar a uma temperatura inferior a 5 oC, por um período não superior a 3 meses.

Ver igualmente a observação do ponto 9.1.

Armazenar a uma temperatura inferior a 5 oC, por um período não superior a 3 meses.

4.   Equipamento

O enchimento da coluna é de resinas de poliestireno sulfonado que permitem separar os aminoácidos entre si, bem como de outros produtos com reacção positiva à ninidrina. A estabilidade do fluxo das bombas que controlam o caudal do tampão de eluição e do reagente de ninidrina deve ser de cerca de ±0,5 %, quer durante o ensaio de calibração, quer durante a execução da análise.

Em alguns analisadores de aminoácidos, é possível utilizar procedimentos de hidrólise cujos hidrolisados contenham uma concentração de sódio superior a 0,8 mol/l, bem como a totalidade do ácido fórmico residual do processo de oxidação. Noutros analisadores, a separação de determinados aminoácidos não é satisfatória caso os produtos de hidrólise contenham um excesso de ácido fórmico e/ou uma concentração elevada de ião sódio. Nestes casos, o volume de ácido é reduzido, por evaporação, a cerca de 5 ml, após a hidrólise e antes do ajuste do pH. A evaporação deve ser realizada sob vácuo, a uma temperatura não superior a 40 oC.

5.   Procedimento

5.1.   Preparação da amostra

A amostra é moída a uma granulometria inferior a 0,5 mm. As amostras com elevado teor de humidade devem ser secas ao ar, a uma temperatura não superior a 50 oC, ou liofilizadas, antes da moagem. Se o seu teor de matérias gordas for elevado, as amostras terão de ser submetidas a uma extracção com éter de petróleo (3.12) antes da moagem.

5.2.   Determinação de aminoácidos livres em alimentos para animais e pré-misturas

Pesar num erlenmeyer, com uma aproximação de 0,2 mg, uma quantidade adequada (1-5 g) de amostra preparada de acordo com o ponto 5.1 e adicionar 100,0 ml de mistura de extracção (3.21). Agitar durante 60 minutos em agitador mecânico ou magnético (4.8). Deixar sedimentar e pipetar 10,0 ml de solução sobrenadante para um matraz de 100 ml.

Adicionar, sob agitação, 5,0 ml de solução de ácido sulfossalicílico (3.22), mantendo a agitação durante 5 minutos. Filtrar ou centrifugar o sobrenadante, de modo a remover qualquer precipitado. Colocar 10,0 ml da solução resultante num matraz de 100 ml e ajustar o pH a 2,20 com solução de hidróxido de sódio (3.18). Transferir para um balão volumétrico de volume adequado e completar até à marca com tampão citrato (3.24).

Caso se utilize um padrão interno, adicionar 1,00 ml (3.27.3) por cada 100 ml de solução final, antes de completar até à marca com tampão (3.24).

Efectuar a análise cromatográfica de acordo com o ponto 5.4.

Se os extractos não forem sujeitos a cromatografia no mesmo dia, devem ser armazenados a uma temperatura inferior a 5 oC.

5.3.   Determinação dos aminoácidos totais

5.3.1.    Oxidação

Pesar, com uma aproximação de 0,2 mg, entre 0,1 e 1 g de amostra preparada (5.1):

A toma de amostra para ensaio deve ter um teor aproximado de azoto de 10 mg e um teor de humidade não superior a 100 mg.

Colocar o balão ou o frasco num banho de gelo, arrefecer a 0 oC, adicionar 5 ml de mistura oxidante (3.23) e misturar com uma vareta de vidro de ponta recurva. Tapar o balão ou o frasco contendo a vareta com película impermeável ao ar, e colocar o conjunto constituído pelo recipiente tapado e o banho de gelo no frigorífico, a 0 oC, durante 16 horas. Após este período, retirar do frigorífico e decompor o excesso de oxidante por adição de 0,84 g de bissulfito de sódio (3.4).

Continuar de acordo com o descrito no ponto 5.3.2.1.

5.3.2.    Hidrólise

5.3.2.1.    Hidrólise de amostras oxidadas

À amostra oxidada como descrito no ponto 5.3.1, adicionar 25 ml de mistura de hidrólise (3.20) tendo o cuidado de arrastar quaisquer resíduos de amostra das paredes do recipiente e da vareta.

Proceder em conformidade com o ponto 5.3.2.3 ou 5.3.2.4, em função do tipo de hidrólise.

5.3.2.2.    Hidrólise de amostras não oxidadas

Pesar num balão de fundo redondo de 100 ml ou 250 ml (4.1) ou num frasco munido de tampa de rosca (4.2), com uma aproximação de 0,2 mg, 0,1 a 1 g de amostra preparada (5.1). A toma de amostra para ensaio deve ter um teor aproximado de azoto de 10 mg. Adicionar cuidadosamente 25 ml da mistura de hidrólise (3.20) e misturar. Proceder de acordo com o descrito no ponto 5.3.2.3 ou 5.3.2.4.

5.3.2.3.    Hidrólise em sistema aberto

Juntar 3 pérolas de vidro como reguladores de ebulição à mistura preparada de acordo com o ponto 5.3.2.1 ou 5.3.2.2 e manter em ebulição contínua, sob refluxo, durante 23 horas. Após a hidrólise, lavar o condensador pelo topo, com 5 ml de tampão citrato (3.24). Desmontar o conjunto e arrefecer o balão num banho de gelo.

Proceder de acordo com o ponto 5.3.3.

5.3.2.4.    Hidrólise em sistema fechado

Colocar o frasco que contém a mistura preparada de acordo com o ponto 5.3.2.1 ou 5.3.2.2 numa estufa (4.3) a 110 oC. Durante a primeira hora, colocar a tampa de rosca no topo do frasco sem contudo o vedar, de modo a evitar um aumento da pressão devido aos gases libertados e o consequente risco de explosão. Em seguida, vedar o frasco com a tampa de rosca e manter em estufa (4.3) durante 23 horas. Após a hidrólise, remover o frasco da estufa, abri-lo cuidadosamente e colocá-lo num banho de gelo, até arrefecer.

Com o auxílio de tampão citrato (3.24), transferir quantitativamente o conteúdo do frasco para um matraz ou um balão de fundo redondo de 250 ml, em função do procedimento de ajuste do pH a utilizar (ponto 5.3.3).

Proceder de acordo com o ponto 5.3.3.

5.3.3.    Ajuste do pH

Para o ajuste do pH, proceder de acordo com o ponto 5.3.3.1 ou 5.3.3.2, em função da tolerância do analisador de aminoácidos (4.9) ao sódio.

5.3.3.1.    Sistemas cromatográficos que necessitem de um teor reduzido de sódio

É aconselhável utilizar uma solução-mãe de padrão interno (3.27.3), no caso de analisadores de aminoácidos que necessitem de um teor reduzido de sódio (uma vez que o volume de ácido deve ser reduzido).

Neste caso, adicionar 2,00 ml de solução-mãe de padrão interno (3.27.3) ao hidrolisado, antes da evaporação.

Adicionar 2 gotas de 1-octanol (3.15) ao hidrolisado obtido de acordo com os pontos 5.3.2.3 ou 5.3.2.4.

Em evaporador rotativo (4.7), reduzir o volume a 5-10 ml, sob vácuo, a 40 oC. Se, acidentalmente, o volume for reduzido a menos de 5 ml, o produto deve ser rejeitado e a análise recomeçada.

Ajustar o pH a 2,20 com solução de hidróxido de sódio (3.18), e proceder de acordo com o referido no ponto 5.3.4.

5.3.3.2.    Restantes analisadores de aminoácidos (4.9)

Neutralizar parcialmente o hidrolisado obtido de acordo com 5.3.2.3 ou 5.3.2.4 mediante a adição cuidadosa, sob agitação, de 17 ml de solução de hidróxido de sódio (3.17), mantendo a temperatura inferior a 40 oC.

Ajustar o pH a 2,20 , à temperatura ambiente, com as soluções de hidróxido de sódio (3.17) e (3.18). Proceder de acordo com o ponto 5.3.4.

5.3.4.    Solução de amostra para cromatografia

Com o auxílio de tampão citrato (3.24), transferir quantitativamente o produto de hidrólise com o pH ajustado (5.3.3.1 ou 5.3.3.2) para um balão volumétrico de 200 ml, completando até à marca com o mesmo tampão.

No caso de não se ter adicionado ainda um padrão interno, juntar 2,00 ml da solução-mãe de padrão interno (3.27.3) e completar até à marca com tampão citrato (3.24). Homogeneizar.

Efectuar a análise cromatográfica de acordo com o ponto 5.4.

Se as soluções de amostra não forem analisadas no mesmo dia, devem ser conservadas a uma temperatura inferior a 5 oC.

5.4.   Cromatografia

Antes de iniciar a análise cromatográfica, deixar estabilizar o extracto (5.2) ou o produto de hidrólise (5.3.4) à temperatura ambiente. Agitar a mistura e filtrar uma quantidade adequada com filtro de membrana de 0,22 μm (4.5). A solução límpida resultante é sujeita a cromatografia de troca iónica no analisador de aminoácidos (4.9).

A injecção pode ser manual ou automática. A quantidade de solução utilizada na análise dos padrões e das amostras deve ser constante, com uma aproximação de ± 0,5 %, excepto no caso de se utilizar um padrão interno; a razão entre as concentrações de sódio e de aminoácidos na solução-padrão e na amostra deve ser tão próxima quanto possível.

Em geral, a frequência dos ensaios de calibração depende da estabilidade do reagente de ninidrina e do sistema analítico. O padrão ou a amostra são diluídos com tampão citrato (3.24), de modo a que a área dos picos dos aminoácidos produzidos pelo padrão seja 30-200 % da área dos correspondentes picos dos aminoácidos da amostra.

A cromatografia dos aminoácidos varia ligeiramente em função do tipo de analisador e da resina utilizada. O sistema escolhido deve permitir a separação dos aminoácidos entre si, bem como dos restantes produtos com reacção positiva à ninidrina. Além disso, o sistema deverá dar uma resposta linear à alteração das quantidades de aminoácidos injectadas, na gama das concentrações utilizadas.

Durante a cromatografia, as razões entre a altura do vale e a altura do pico referidas infra aplicam-se na análise de uma solução equimolar (dos aminoácidos a determinar). A solução equimolar de aminoácidos deve conter, pelo menos, 30 % da quantidade máxima de cada aminoácido que pode ser determinada com exactidão no analisador de aminoácidos (4.9).

Para a separação treonina-serina, se os respectivos picos estiverem parcialmente sobrepostos, a razão entre a altura do vale e a altura do menor dos dois picos sobrepostos no cromatograma não deve exceder 2:10. Caso se pretenda determinar apenas a cistina/cisteína, a metionina, a treonina e a lisina, a má resolução de dois picos adjacentes afecta a quantificação. No que respeita aos restantes aminoácidos, a separação deve ser superior a 1:10.

O sistema deve assegurar a separação da lisina das substâncias afins e da ornitina.

6.   Cálculo dos resultados

Procede-se à determinação da área do pico correspondente a cada aminoácido presente na amostra e no padrão, sendo o respectivo teor (X), expresso em g por kg de amostra, calculado pela fórmula:

Caso tenha sido utilizado um padrão interno, multiplicar pelo factor:

A

=

área do pico do hidrolisado ou do extracto

B

=

área do pico da solução-padrão de calibração

C

=

área do pico do padrão interno, no hidrolisado ou no extracto

D

=

área do pico do padrão interno, na solução-padrão de calibração

M

=

massa molecular do aminoácido doseado

c

=

concentração da solução-padrão, expressa em μmol/ml

m

=

massa da amostra, corrigida em caso de secagem ou desengorduramento, expressa em g

V

=

volume do hidrolisado (5.3.4) ou volume de diluição total do extracto (6.1), expressos em ml

A cistina e a cisteína são determinadas na forma de ácido cisteico, no hidrolisado da amostra oxidada, sendo expressas em cistina (C6H12N2O4S2, M = 240,30 g/mol), considerando M = 120,15 g/mol (0,5 × 240,30 g/mol).

A metionina é determinada na forma de metionina sulfona, no hidrolisado da amostra oxidada, sendo expressa em metionina, considerando M = 149,21 g/mol.

A metionina livre adicionada é determinada na forma de metionina, após extracção, utilizando o mesmo valor de massa molecular.

V

=

em que V representa o volume do extracto final.

7.   Avaliação do método

O método foi testado num estudo internacional de comparação interlaboratorial realizado em 1990 com base em quatro tipos de alimentos para animais (alimento misto para suínos, alimento composto para frangos, concentrado proteico e pré-mistura). Após eliminação dos valores anómalos, obtiveram-se para a média e o desvio-padrão os valores que se apresentam nos quadros seguintes:

7.1.   Repetibilidade

Apresentam-se de seguida os valores relativos à repetibilidade, expressos em termos de desvio-padrão intralaboratorial, obtidos na comparação interlaboratorial mencionada, para os aminoácidos em estudo:

7.2.   Reprodutibilidade

Apresentam-se no quadro seguinte os valores do desvio-padrão interlaboratorial obtidos na comparação interlaboratorial mencionada:

8.   Utilização de materiais de referência

Deve verificar-se a aplicação correcta do método mediante a realização de ensaios em duplicado com materiais de referência certificados, quando disponíveis. Recomenda-se a calibração com soluções de calibração de aminoácidos certificadas.

9.   Observações

A zona de resposta linear do aparelho deve ser verificada para todos os aminoácidos.

A solução-padrão é diluída com tampão citrato de modo que os picos surjam no meio dessa zona.

G.   DETERMINAÇÃO DO TRIPTOFANO

1.   Objecto e âmbito de aplicação

O método permite determinar o triptofano livre e total em alimentos para animais. As formas D e L não são distinguidas.

2.   Princípio

Para a determinação do triptofano total, procede-se à hidrólise da amostra em condições alcalinas com uma solução saturada de hidróxido de bário que se aquece em seguida a 110 oC durante 20 horas. Depois de concluída a hidrólise, adiciona-se um padrão interno.

Para a determinação do triptofano livre, efectua-se uma extracção da amostra em condições moderadamente ácidas na presença de um padrão interno.

O triptofano e o padrão interno no hidrolisado ou no extracto são determinados por cromatografia líquida de alta resolução (HPLC) com detecção por fluorescência.

3.   Reagentes

Dissolver 40,0 g de NaOH (3.5) em água e completar o volume com água (3.1) até perfazer 1 litro.

Misturar 492 ml de HCl (3.7) com água (3.1) até perfazer 1 litro.

Misturar 82 ml de HCl (3.7) com água (3.1) até perfazer 1 litro.

Misturar 8,2 ml de HCl (3.7) com água (3.1) até perfazer 1 litro.

Misturar 34 ml de ácido ortofosfórico (3.6) com água (3.1) até perfazer 1 litro.

Em balão volumétrico de 500 ml, dissolver 0,2553 g de triptofano (3.2) em ácido clorídrico (3.13) e completar o volume com o mesmo ácido até ao traço. Conservar a -18 oC no máximo durante quatro semanas.

Em balão volumétrico de 500 ml, dissolver 0,2728 g de α-metiltriptofano (3.3) em ácido clorídrico (3.13) e completar o volume com o mesmo ácido até ao traço. Conservar a -18 oC no máximo durante quatro semanas.

Tomar 2,00 ml da solução concentrada de triptofano (3.15) e 2,00 ml da solução concentrada de padrão interno (α-metiltriptofano) (3.16). Diluir com água (3.1) e metanol (3.8) até obter aproximadamente o mesmo volume e aproximadamente a mesma concentração de metanol (10-30 %) que o hidrolisado pronto.

Esta solução é preparada imediatamente antes da sua utilização.

Proteger da luz solar directa durante a preparação.

4.   Equipamento

5.   Procedimento

5.1.   Preparação da amostra

A amostra é moída a uma granulometria inferior a 0,5 mm. As amostras com elevado teor de humidade devem ser secas ao ar, a uma temperatura não superior a 50 oC, ou liofilizadas, antes da moagem. Se o seu teor de matérias gordas for elevado, as amostras terão de ser submetidas a uma extracção com éter de petróleo (3.9) antes da moagem.

5.2.   Determinação do triptofano livre (extracção)

Pesar num erlenmeyer, com uma aproximação de 1 mg, uma quantidade adequada (1-5 g) de amostra preparada de acordo com o ponto 5.1. Adicionar 100,0 ml de ácido clorídrico (3.13) e 5,00 ml da solução concentrada de padrão interno (3.16). Agitar durante 60 minutos em agitador mecânico ou magnético (4.7). Deixar sedimentar e pipetar 10,0 ml da solução sobrenadante para um matraz. Adicionar 5 ml de ácido ortofosfórico (3.14). Ajustar o pH a 3 com a solução de hidróxido de sódio (3.10). Adicionar metanol (3.8) em quantidade suficiente para obter uma concentração de metanol no volume final compreendida entre 10 % e 30 %. Transferir para um balão volumétrico de capacidade adequada e diluir com água até ao volume necessário para a cromatografia [aproximadamente o mesmo volume que a solução-padrão de calibração (3.17).

Filtrar alguns mililitros da solução por filtro de membrana de 0,45 μm (4.5) antes de proceder à injecção na coluna de HPLC. Efectuar a análise cromatográfica de acordo com o ponto 5.4.

Proteger a solução-padrão e os extractos da luz solar directa. Se os extractos não puderem ser analisados no mesmo dia, podem ser conservados a 5 oC durante um máximo de três dias.

5.3.   Determinação do triptofano total (hidrólise)

Pesar em frasco de polipropileno (4.4), com uma aproximação de 0,2 mg, 0,1 g a 1 g da amostra preparada de acordo com o ponto 5.1. A toma de amostra para ensaio deve ter um teor aproximado de azoto de 10 mg. Adicionar 8,4 g de hidróxido de bário octa-hidratado (3.4) e 10 ml de água. Agitar em agitador vortex (4.8) ou magnético (4.7) (deixar o magnete revestido a teflon no frasco). Lavar as paredes do frasco com 4 ml de água. Colocar a tampa de rosca e fechar o frasco sem enroscar muito a tampa. Colocar na autoclave (4.6) com água em ebulição e manter sob a acção do vapor durante 30-60 minutos. Fechar a autoclave e manter a 110 (± 2)oC durante 20 horas.

Antes de abrir a autoclave, reduzir a temperatura a um pouco menos de 100 oC. Para evitar a cristalização do Ba(OH)2·8H2O, adicionar à mistura quente 30 ml de água à temperatura ambiente. Agitar com cuidado. Adicionar 2,00 ml da solução concentrada de padrão interno (α-metiltriptofano) (3.16). Arrefecer o recipiente num banho de gelo durante 15 minutos.

Adicionar, em seguida, 5 ml de ácido ortofosfórico (3.14). Manter o recipiente no banho de arrefecimento e neutralizar com HCl (3.11), sob agitação; ajustar o pH a 3,0 com HCl (3.12). Adicionar metanol em quantidade suficiente para obter uma concentração de metanol no volume final compreendida entre 10 % e 30 %. Transferir para um balão volumétrico de capacidade adequada e diluir com água até ao volume necessário para a cromatografia (por exemplo, 100 ml). A adição de metanol não deve produzir precipitação.

Filtrar alguns mililitros da solução por um filtro de membrana de 0,45 μm (4.5) antes de proceder à injecção na coluna de HPLC. Efectuar a análise cromatográfica de acordo com o ponto 5.4.

Proteger a solução-padrão e o hidrolisado da luz solar directa. Se o hidrolisado não puder ser analisado no mesmo dia, pode ser conservado a 5 oC durante um máximo de três dias.

5.4.   Análise por HPLC

As condições a seguir especificadas para a eluição isocrática são-no a título indicativo. Poderão escolher-se outras condições, desde que produzam resultados equivalentes (ver igualmente as observações dos pontos 9.1 e 9.2):

6.   Cálculo dos resultados

A quantidade de triptofano (X), expressa em gramas, por 100 gramas de amostra, é calculada através da fórmula seguinte:

A

=

área do pico do padrão interno na solução-padrão de calibração (3.17)

B

=

área do pico do triptofano no extracto (5.2) ou no hidrolisado (5.3)

V1

=

volume em ml (2 ml) de solução concentrada de triptofano (3.15) adicionado à solução de calibração (3.17)

c

=

concentração, em μmol/ml (= 2,50 ), da solução concentrada de triptofano (3.15) adicionada à solução de calibração (3.17)

V2

=

volume, em ml, da solução concentrada de padrão interno (3.16) adicionado na extracção (5.2) (= 5,00 ml) ou na hidrólise (5.3) (= 2,00 ml)

C

=

área do pico do padrão interno no extracto (5.2) ou no hidrolisado (5.3)

D

=

área do pico do triptofano na solução-padrão de calibração (3.17)

V3

=

volume em ml (= 2,00 ml) de solução concentrada de padrão interno (3.16) adicionado à solução-padrão de calibração (3.17)

m

=

massa, em g, da amostra (corrigida para a massa original se tiver sido submetida a secagem e/ou desengorduramento)

M

=

massa molecular do triptofano (= 204,23 g/mol)

7.   Repetibilidade

A diferença entre os resultados de duas determinações paralelas efectuadas com a mesma amostra não deve exceder 10 % do maior dos valores.

8.   Resultados de um estudo interlaboratorial

Tendo em vista a certificação do método de hidrólise, foi organizado um estudo interlaboratorial comunitário (quarta comparação interlaboratorial), no âmbito do qual foram analisadas três amostras em 12 laboratórios. Cada amostra foi analisada em quintuplicado. Os resultados obtidos figuram no quadro seguinte:

L

=

número de laboratórios que apresentaram resultados

n

=

número de resultados individuais considerado (com excepção dos valores anómalos, identificados pelo teste de Cochran, Dixon)

sr

=

desvio-padrão da repetibilidade

SR

=

desvio-padrão da reprodutibilidade

r

=

repetibilidade

R

=

reprodutibilidade

CVr

=

coeficiente de variação da repetibilidade (%)

CVR

=

coeficiente de variação da reprodutibilidade (%)

Tendo em vista a certificação do método de extracção do triptofano livre, foi organizado um outro estudo interlaboratorial comunitário (terceira comparação interlaboratorial), no âmbito do qual foram analisadas duas amostras em 13 laboratórios. Cada amostra foi analisada em quintuplicado. Os resultados obtidos figuram no quadro seguinte:

L

=

número de laboratórios que apresentaram resultados

n

=

número de resultados individuais considerado (com excepção dos valores anómalos, identificados pelo teste de Cochran, Dixon)

sr

=

desvio-padrão da repetibilidade

SR

=

desvio-padrão da reprodutibilidade

r

=

repetibilidade

R

=

reprodutibilidade

CVr

=

coeficiente de variação da repetibilidade (%)

CVR

=

coeficiente de variação da reprodutibilidade (%)

Tendo em vista a certificação do triptofano para a hidrólise, foi organizado um outro estudo interlaboratorial comunitário, no âmbito do qual foram analisadas quatro amostras em sete laboratórios. Os resultados obtidos figuram no quadro seguinte. Cada amostra foi analisada em quintuplicado.

L

=

número de laboratórios que apresentaram resultados

n

=

número de resultados individuais considerado (com excepção dos valores anómalos, identificados pelo teste de Cochran, Dixon)

sr

=

desvio-padrão da repetibilidade

SR

=

desvio-padrão da reprodutibilidade

r

=

repetibilidade

R

=

reprodutibilidade

CVr

=

coeficiente de variação da repetibilidade (%)

CVR

=

coeficiente de variação da reprodutibilidade (%)

9.   Observações

Eluição isocrática seguida de lavagem da coluna com aplicação de um gradiente:

O sistema cromatográfico deve produzir uma resposta linear nas condições de trabalho. A linearidade da resposta deve ser determinada com uma concentração constante (normal) do padrão interno e concentrações variáveis de triptofano. É importante que o tamanho dos picos do triptofano e do padrão interno esteja dentro da zona de linearidade do sistema de HPLC/fluorescência. Se o(s) pico(s) do triptofano e/ou do padrão interno for(em) muito grande(s) ou muito pequeno(s), haverá que repetir a análise com outra dimensão de amostra e/ou um volume final devidamente ajustado.

Com o tempo, a dissolução do hidróxido de bário torna-se mais difícil. Daí resulta uma solução turva para a análise por HPLC, a qual pode produzir resultados por defeito para o triptofano.

H.   DETERMINAÇÃO DAS MATÉRIAS GORDAS BRUTAS

1.   Objecto e âmbito de aplicação

Este método tem por objectivo o doseamento das matérias gordas brutas nos alimentos para animais. Não diz respeito à análise das sementes e frutos oleaginosos.

A utilização dos dois processos a seguir descritos depende da natureza e da composição do alimento e da razão pela qual a análise é realizada.

1.1.   Processo A — Matérias gordas brutas extraíveis directamente

Este método é aplicável a matérias-primas para a alimentação animal de origem vegetal, com excepção daquelas a que é aplicável o processo B.

1.2.   Processo B — Matérias gordas brutas totais

Este método é aplicável a matérias-primas para a alimentação animal de origem animal e a todos os alimentos compostos para animais. Deve ser utilizado para todas as matérias-primas das quais não se possam extrair completamente as matérias gordas sem hidrólise prévia, como, por exemplo, glúten, leveduras, proteínas de batata e produtos submetidos a processos como a extrusão, transformação em flocos e aquecimento.

1.3.   Interpretação dos resultados

Sempre que pelo processo B for obtido um resultado de valor mais elevado do que o obtido pelo processo A, o resultado obtido com o processo B será considerado como o verdadeiro valor.

2.   Princípio

2.1.   Processo A

A amostra é extraída com éter de petróleo. O solvente é destilado e o resíduo é seco e pesado.

2.2.   Processo B

A amostra é tratada a quente com ácido clorídrico. A mistura é arrefecida e filtrada. Depois de ter sido lavado e seco, o resíduo é submetido a análise segundo o processo A.

3.   Reagentes

4.   Equipamento

5.   Procedimento

5.1.   Processo A (ver ponto 8.1)

Pesar 5 g de amostra, com uma aproximação de 1 mg, introduzi-los num cartucho de extracção (4.2) e cobri-los com um tampão de algodão isento de matéria gorda.

Colocar o cartucho num extractor (4.1) e proceder à extracção durante 6 horas com éter de petróleo (3.1). Recolher o extracto de éter de petróleo num balão seco, contendo fragmentos de pedra-pomes ( 9 ) e pesado.

Eliminar o solvente por destilação. Secar o resíduo, colocando o balão durante uma hora e meia numa estufa (4.3). Deixar arrefecer num exsicador e pesar. Secar de novo durante 30 minutos para ter a certeza de que o peso da matéria gorda permanece constante (a perda de peso entre duas pesagens sucessivas deve ser igual ou inferior a 1 mg).

5.2.   Processo B

Pesar, com uma aproximação de 1 mg, 2,5 g de amostra (ver ponto 8.2), introduzi-los num copo de 400 ml ou num erlenmeyer de 300 ml e juntar 100 ml de ácido clorídrico (3.3) e alguns fragmentos de pedra-pomes. Cobrir o copo com um vidro de relógio ou munir o erlenmeyer de um condensador de refluxo. Deixar ferver suavemente durante uma hora, à chama fraca ou sobre uma placa de aquecimento. Evitar que o produto adira às paredes do recipiente.

Arrefecer e adicionar uma quantidade de adjuvante de filtração (3.4) suficiente para evitar qualquer perda de matéria gorda na filtração. Filtrar num filtro de papel duplo, humidificado e isento de matérias gordas. Lavar o resíduo com água fria até à neutralização do filtrado. Verificar que o filtrado não contém matérias gordas. A presença destas indica que, antes da hidrólise, deve ser efectuada uma extracção da amostra com éter de petróleo, segundo o processo A.

Colocar o papel de filtro duplo contendo o resíduo num vidro de relógio e secar durante uma hora e meia na estufa (4.3) a 100 oC ± 3 oC.

Introduzir o papel de filtro duplo contendo o resíduo seco num cartucho de extracção (4.2) e cobrir com um tampão de algodão isento de matéria gorda. Colocar o cartucho num extractor (4.1) e prosseguir como indicado nos segundo e terceiro parágrafos do ponto 5.1.

6.   Expressão dos resultados

Exprimir o peso do resíduo em percentagem da amostra.

7.   Repetibilidade

A diferença entre os resultados de duas determinações paralelas efectuadas com a mesma amostra pelo mesmo analista não deve exceder:

8.   Observações

Pesar, com uma aproximação de 1 mg, 20 g de amostra e misturá-los com 10 g ou mais de sulfato de sódio anidro (3.2). Extrair com éter de petróleo (3.1) como indicado no ponto 5.1. Completar o extracto obtido com éter de petróleo (3.1) até perfazer 500 ml e misturar. Introduzir 50 ml de solução num pequeno matraz seco, contendo alguns fragmentos de pedra-pomes e pesado. Eliminar o solvente por destilação, secar e prosseguir como indicado no último parágrafo do ponto 5.1.

Eliminar o solvente do resíduo de extracção que se encontra no cartucho de extracção, triturar o resíduo até atingir uma granulometria de 1 mm, colocá-lo novamente no cartucho de extracção (não adicionar sulfato de sódio) e prosseguir como indicado nos segundo e terceiro parágrafos do ponto 5.1.

O teor de matérias gordas brutas em percentagem da amostra é dado pela fórmula:

(10m1 + m2) × 5

em que:

m1

=

massa, em gramas, do resíduo da primeira extracção (alíquota do extracto),

m2

=

massa, em gramas, do resíduo da segunda extracção.

I.   DETERMINAÇÃO DA FIBRA BRUTA

1.   Objecto e âmbito de aplicação

O presente método permite efectuar o doseamento, em alimentos para animais, de substâncias orgânicas isentas de gordura e insolúveis em meio ácido e em meio alcalino, convencionalmente designadas por fibra bruta.

2.   Princípio

A amostra, eventualmente desengordurada, é tratada sucessivamente com soluções de ácido sulfúrico e hidróxido de potássio em ebulição, de concentrações determinadas. O resíduo é separado por filtração num cadinho de vidro sinterizado, lavado, seco, pesado e calcinado a uma temperatura compreendida entre 475 e 500 oC. A perda de massa resultante da calcinação corresponde à fibra bruta presente na amostra em estudo.

3.   Reagentes

4.   Equipamento

5.   Procedimento

Pesar, com uma aproximação de 1 mg, 1 g de amostra, previamente preparada, transferindo-a para o cadinho de filtração (4.2) (ver observações nos pontos 8.1, 8.2 e 8.3) e adicionar 1 g de adjuvante de filtração (3.3).

Montar a unidade de aquecimento (4.1) e o cadinho de filtração (4.2), adaptando em seguida o balão (4.3) ao cadinho e adicionar 150 ml de ácido sulfúrico (3.1), em ebulição, juntando algumas gotas de agente antiespuma (3.2), se necessário.

Levar o líquido à ebulição em 5 ± 2 minutos, deixando ferver vigorosamente durante exactamente 30 minutos.

Abrir a torneira do tubo de descarga (4.1) e filtrar, sob vácuo, o ácido sulfúrico através do cadinho de filtração. Ainda sob vácuo, lavar o resíduo no filtro com três porções sucessivas, de 30 ml cada, de água em ebulição. Assegurar que o resíduo fica seco por aspiração, após cada lavagem.

Fechar a torneira e adicionar mais 150 ml de hidróxido de potássio (3.7) em ebulição. Juntar algumas gotas de agente antiespuma (3.2). Levar o líquido à ebulição em 5 ± 2 minutos, deixando ferver vigorosamente durante exactamente 30 minutos. Filtrar o resíduo, lavando-o de modo idêntico ao descrito no tratamento com ácido sulfúrico.

Após a última lavagem e secagem, retirar o cadinho com o seu conteúdo e adaptá-lo à unidade de extracção a frio (4.6). Ligar o vácuo e lavar o resíduo com três porções sucessivas, de 25 ml cada, de acetona (3.4), secando o resíduo por aspiração, após cada lavagem.

Secar o cadinho de filtração até massa constante, na estufa, a 130 oC. Após cada secagem, arrefecer no exsicador e pesar de imediato. Colocar o cadinho na mufla, calcinando entre 475 e 500 oC, durante pelo menos 30 minutos, até peso constante (a perda de peso entre duas pesagens sucessivas deve ser igual ou inferior a 2 mg).

Após cada calcinação, proceder ao arrefecimento na mufla e, em seguida no exsicador, antes de pesar.

Efectuar um ensaio em branco. A perda de massa resultante da calcinação não deverá, neste caso, exceder 4 mg.

6.   Cálculo dos resultados

O teor de fibra bruta, expresso em percentagem da amostra, é dado pela expressão:

em que:

m

=

massa da amostra, em g.

m0

=

perda de massa após calcinação, durante o doseamento, em g.

m1

=

perda de massa após calcinação, durante o ensaio em branco, em g.

7.   Repetibilidade

A diferença entre os resultados de duas determinações paralelas efectuadas com a mesma amostra não deve exceder:

8.   Observações

J.   DETERMINAÇÃO DOS AÇÚCARES

1.   Objecto e âmbito de aplicação

Esta técnica permite dosear os açúcares redutores e os açúcares totais após inversão, expressos sob a forma de glucose ou eventualmente sob a forma de sacarose, utilizando 0,95 como factor de conversão. Este doseamento é aplicável aos alimentos compostos. Existem técnicas especiais para outros alimentos para animais. Se for necessário, poderá dosear-se separadamente a lactose, não sem ter em conta o respectivo valor no cálculo dos resultados.

2.   Princípio

Os açúcares são extraídos com etanol diluído e a solução é clarificada com soluções de Carrez I e II. Uma vez eliminado o etanol, efectuam-se os doseamentos, antes e depois da inversão, aplicando o método de Luff-Schoorl.

3.   Reagentes

Deitar, agitando lentamente, a solução de ácido cítrico (3.8.2) na solução de carbonato de sódio (3.8.3). Juntar em seguida a solução de sulfato de cobre (3.8.1) e perfazer o volume de 1 litro com água. Deixar repousar uma noite e filtrar.

Verificar a concentração do reagente assim obtido (Cu 0,05 mol/l; Na2CO3 1 mol/l) (ver o último parágrafo do ponto 5.4). O pH da solução deverá ser cerca de 9,4 .

4.   Equipamento

Misturador basculante: cerca de 35 a 40 rotações por minuto.

5.   Procedimento

5.1.   Extracção da amostra

Pesar, com uma aproximação de 1 mg, 2,5 g de amostra e introduzi-la num balão volumétrico de 250 ml. Juntar 200 ml de etanol (3.1) e misturar durante uma hora no misturador. Juntar 5 ml de solução de Carrez I (3.2) e agitar durante cerca de 30 segundos. Juntar em seguida 5 ml de solução de Carrez II (3.3) e tornar a agitar, durante um minuto. Completar o volume com etanol (3.1), homogeneizar e filtrar. Recolher 200 ml de filtrado e evaporá-lo até cerca de metade do volume a fim de eliminar a maior parte do etanol. Transferir quantitativamente o resíduo da evaporação com água quente para um balão volumétrico de 200 ml, deixar arrefecer, completar o volume com água, homogeneizar e, se necessário, filtrar. Esta será a solução utilizada para o doseamento dos açúcares redutores e, após inversão, para o doseamento dos açúcares totais.

5.2.   Determinação dos açúcares redutores

Com uma pipeta, recolher uma quantidade de solução, não superior a 25 ml, que contenha menos de 60 mg de açúcares redutores, expressos em glucose. Se necessário, perfazer o volume de 25 ml com água destilada e determinar o teor de açúcares redutores pelo método de Luff-Schoorl. O resultado é expresso em percentagem de glucose na amostra.

5.3.   Determinação dos açúcares totais após a inversão

Com a pipeta, recolher 50 ml de solução e deitá-la num balão volumétrico de 100 ml. Juntar algumas gotas de solução de alaranjado de metilo (3.4) e em seguida ácido clorídrico (3.5) lentamente e mexendo sempre, até que haja uma viragem nítida para vermelho. Juntar 15 ml de ácido clorídrico (3.6) e mergulhar o balão durante 30 minutos em água fervendo abundantemente. Arrefecer rapidamente até cerca de 20 oC e juntar 15 ml de solução de hidróxido de sódio (3.7). Perfazer o volume de 100 ml com água e homogeneizar. Recolher uma quantidade não superior a 25 ml e que contenha menos de 60 mg de açúcares redutores expressos em glucose. Se necessário, perfazer o volume de 25 ml com água destilada e determinar o teor de açúcares redutores pelo método de Luff-Schoorl. O resultado deverá ser expresso em percentagem de glucose, ou eventualmente sacarose, multiplicando pelo factor 0,95 .

5.4.   Titulação pelo método de Luff-Schoorl

Recolher com uma pipeta 25 ml de reagente de Luff-Schoorl (3.8) e deitá-lo num erlenmeyer de 300 ml; juntar 25 ml exactos da solução de açúcares já clarificada. Juntar dois pedaços de pedra-pomes granulada (3.13), aquecer, agitando manualmente sobre uma chama aberta de altura média, e levar o líquido à ebulição em cerca de dois minutos. Colocar imediatamente o erlenmeyer sobre uma placa com rede de amianto com uma abertura de cerca de 6 cm de diâmetro, sob a qual terá sido previamente acendida uma chama, regulada de forma a aquecer apenas o fundo do erlenmeyer. Ajustar ao erlenmeyer um condensador de refluxo. Deixar em ebulição durante exactamente 10 minutos. Arrefecer imediatamente em água fria durante cerca de cinco minutos e titular como segue:

Juntar 10 ml de solução de iodeto de potássio (3.12) e, imediatamente depois e com cuidado (dado o risco de formação de espuma abundante), adicionar 25 ml de ácido sulfúrico (3.11). Titular seguidamente com a solução de tiossulfato de sódio (3.9) até ao aparecimento de uma coloração amarelada, juntar o indicador de amido (3.10) e completar a titulação.

Efectuar a mesma titulação numa mistura, medida com exactidão, de 25 ml de reagente de Luff-Schoorl (3.8) e 25 ml de água, a que se juntam 10 ml de solução de iodeto de potássio (3.12) e 25 ml de ácido sulfúrico (3.11), sem levar à ebulição.

6.   Cálculo dos resultados

Calcular por meio da tabela a quantidade de glucose, expressa em mg, correspondente à diferença entre os valores das duas titulações, expressos em ml de tiossulfato de sódio 0,1 mol/l. Exprimir o resultado em percentagem da amostra.

7.   Procedimentos especiais

Homogeneizar e filtrar. Eliminar o etanol como se descreve no ponto 5.1. Na ausência de amido dextrinizado, completar o volume até à marca com água destilada.

8.   Observações

Em ambos os casos, a quantidade de açúcar presente determina-se pelo método de Luff-Schoorl e o respectivo cálculo faz-se em mg de glucose, subtraindo um valor do outro e exprimindo o resultado em termos percentuais relativamente à amostra.

Exemplo

Os volumes recolhidos correspondem ambos, em cada um dos doseamentos, a uma amostra de 250 mg.

No primeiro caso, são gastos 17 ml de solução de tiossulfato de sódio 0,1 mol/l, o que corresponde a 44,2 mg de glucose, e no segundo são gastos 11 ml, o que corresponde a 27,6 mg de glucose.

A diferença é de 16,6 mg de glucose.

O teor de açúcares redutores (excepto a lactose), calculado como glucose, será portanto de:

K.   DETERMINAÇÃO DA LACTOSE

1.   Objecto e âmbito de aplicação

Esta técnica permite determinar o teor de lactose em alimentos para animais que a contenham em mais de 0,5 %.

2.   Princípio

Dissolvem-se os açúcares em água. Submete-se a solução a uma fermentação pela levedura Saccharomyces cerevisiae, que não modifica a lactose. Após clarificação e filtração, determina-se o teor de lactose do filtrado pelo método Luff-Schoorl.

3.   Reagentes

Deitar a solução de ácido cítrico (3.4.2) na de carbonato de sódio (3.4.3), agitando com precaução. Juntar em seguida a solução de sulfato de cobre (3.4.1) e perfazer o volume de 1 litro com água. Deixar repousar uma noite e filtrar. Verificar a concentração do reagente assim obtido (Cu 0,05 mol/l; Na2CO3 1 mol/l). O pH da solução deverá ser cerca de 9,4 .

4.   Equipamento

Tina de banho-maria, com termóstato regulado para 38-40 oC.

5.   Procedimento

Pesar, com uma aproximação de 1 mg, 1 g de amostra e introduzi-la num balão volumétrico de 100 ml. Juntar 25 a 30 ml de água, colocar o balão durante trinta minutos em banho-maria a ferver, deixando arrefecer em seguida até cerca de 35 oC. Juntar 5 ml da suspensão de levedura (3.1) e homogeneizar. Deixar o balão durante duas horas em banho-maria a uma temperatura de 38 a 40oC e deixar arrefecer em seguida até cerca de 20 oC.

Juntar 2,5 ml de solução de Carrez I (3.2) e agitar durante 30 segundos; adicionar seguidamente 2,5 ml de solução de Carrez II (3.3), agitando novamente durante 30 segundos. Perfazer o volume de 100 ml com água, misturar e filtrar. Com uma pipeta, recolher uma quantidade de filtrado não superior a 25 ml, que contenha, de preferência, entre 40 e 80 mg de lactose, e introduzi-lo num erlenmeyer de 300 ml. Se necessário, perfazer o volume de 25 ml com água.

Efectuar segundo o mesmo processo um ensaio em branco com 5 ml de suspensão de levedura (3.1). Determinar o teor de lactose em conformidade com o método de Luff-Schoorl, como se indica a seguir: juntar a 25 ml exactos de reagente de Luff-Schoorl (3.4) dois grânulos de pedra-pomes (3.5). Aquecer, agitando manualmente sobre uma chama aberta de altura média e levar o líquido à ebulição em cerca de dois minutos. Colocar imediatamente o erlenmeyer sobre uma placa com rede de amianto com uma abertura de cerca de 6 cm de diâmetro, sob a qual terá sido previamente acendida uma chama, regulada de forma a aquecer apenas o fundo do erlenmeyer. Ajustar ao erlenmeyer um condensador de refluxo. Deixar em ebulição durante exactamente 10 minutos. Arrefecer imediatamente em água fria durante cerca de cinco minutos e titular como segue:

Juntar 10 ml de solução de iodeto de potássio (3.6) e, imediatamente depois e com cuidado (dado o risco de formação de espuma abundante), adicionar 25 ml de ácido sulfúrico (3.7). Titular seguidamente com a solução de tiossulfato de sódio (3.8) até ao aparecimento de uma coloração amarelada, juntar o indicador de amido (3.9) e completar a titulação.

Efectuar a mesma titulação numa mistura, medida com exactidão, de 25 ml de reagente de Luff-Schoorl (3.4) e 25 ml de água, a que se juntam 10 ml de solução de iodeto de potássio (3.6) e 25 ml de ácido sulfúrico (3.7), sem levar à ebulição.

6.   Cálculo dos resultados

Utilizando a tabela, determinar a quantidade de lactose, em mg, correspondente à diferença entre os resultados das duas titulações, expressos em ml de tiossulfato de sódio 0,1 mol/l.

Exprimir o resultado obtido para a lactose anidra em percentagem da amostra.

7.   Observações

Para os produtos que contenham mais de 40 % de açúcares fermentáveis, utilizar mais de 5 ml de suspensão de levedura (3.1).

L.   DETERMINAÇÃO DO AMIDO

MÉTODO POLARIMÉTRICO

1.   Objecto e âmbito de aplicação

O presente método permite determinar o teor de amido e dos seus produtos de degradação de elevado peso molecular em alimentos para animais, tendo em vista verificar o cumprimento do valor energético declarado (disposições do anexo VII) e da Directiva 96/25/CE do Conselho ( 10 ).

2.   Princípio

O método inclui duas determinações. Na primeira, a amostra é tratada com ácido clorídrico diluído. Depois de clarificada e filtrada, mede-se o poder rotatório da solução por polarimetria.

Na segunda, a amostra é submetida a extracção com etanol a 40 %. Depois de acidificado o filtrado com ácido clorídrico, clarificação e filtração, mede-se o poder rotatório tal como na primeira determinação.

A diferença entre as duas medições, multiplicada por um factor conhecido, dá o teor de amido da amostra.

3.   Reagentes

A concentração é verificada por titulação com uma solução 0,1 mol/l de hidróxido de sódio, na presença de vermelho de metilo a 0,1 % (m/v) em etanol a 94 % (v/v). Para a neutralização de 10 ml, são necessários 30,94 ml de NaOH 0,1 mol/l.

4.   Equipamento

5.   Procedimento

5.1.   Preparação da amostra

Triturar a amostra de maneira a passar a totalidade da mesma por um crivo de malha redonda de 0,5 mm de diâmetro.

5.2.   Determinação do poder rotatório total (P ou S) (ver observação 7.1)

Pesar, com uma aproximação de 1 mg, 2,5 g da amostra triturada para um balão volumétrico de 100 ml. Adicionar 25 ml de ácido clorídrico (3.2), agitar, para homogeneizar a amostra, e adicionar mais 25 ml de ácido clorídrico (3.2). Introduzir o balão num banho de água em ebulição e agitar enérgica e regularmente durante três minutos, para evitar a formação de aglomerados. A quantidade de água no banho deve ser suficiente para que este se mantenha em ebulição quando o balão for introduzido. O balão não pode ser retirado do banho durante a agitação. Decorridos 15 minutos exactos, retirar o balão do banho, adicionar 30 ml de água fria e arrefecer imediatamente a 20 oC.

Juntar 5 ml de solução de Carrez I (3.3) e agitar durante cerca de 30 segundos. Adicionar em seguida 5 ml da solução de Carrez II (3.4) e agitar de novo durante cerca de 30 segundos. Completar o volume com água, homogeneizar e filtrar. Se o filtrado não ficar perfeitamente límpido (o que é pouco frequente), recomeçar a análise utilizando uma quantidade maior das soluções de Carrez I e II, por exemplo, 10 ml.

Medir, em seguida, o poder rotatório da solução num tubo de 200 mm com o polarímetro ou o sacarímetro.

5.3.   Determinação do poder rotatório (P' ou S') de substâncias solúveis em etanol a 40 %

Introduzir, num balão volumétrico de 100 ml, 5 g de amostra, pesada com uma aproximação de 1 mg, e adicionar cerca de 80 ml de etanol (3.5) (ver a observação 7.2). Deixar o balão em repouso à temperatura ambiente durante uma hora; durante esse lapso de tempo, agitar energicamente por seis vezes, para que a amostra fique bem misturada com o etanol. Perfazer o volume de 100 ml com etanol (3.5), homogeneizar e filtrar.

Pipetar 50 ml de filtrado (correspondentes a 2,5 g de amostra) para um erlenmeyer de 250 ml, adicionar 2,1 ml de ácido clorídrico (3.1) e agitar energicamente. Adaptar um condensador de refluxo ao erlenmeyer e mergulhar este num banho de água em ebulição. Decorridos exactamente 15 minutos, retirar o erlenmeyer do banho, transferir o conteúdo para um balão volumétrico de 100 ml, lavar com um pouco de água fria e arrefecer a 20 oC.

Clarificar, em seguida, com as soluções de Carrez I (3.3) e II (3.4), completar o volume com água, homogeneizar, filtrar e medir o poder rotatório como indicado nos segundo e terceiro parágrafos do ponto 5.2.

6.   Cálculo dos resultados

O teor percentual de amido é calculado como segue:

6.1.   Medições polarimétricas

P

=

poder rotatório total, em graus de arco

P'

=

poder rotatório, em graus de arco, das substâncias solúveis em etanol a 40 %

=

poder rotatório específico do amido puro. Os valores convencionalmente admitidos para este factor são os seguintes: +185,9 o: amido de arroz +185,7 o: amido de batata +184,6 o: amido de milho +182,7 o: amido de trigo +181,5 o: amido de cevada +181,3 o: amido de aveia +184,0 o: outros tipos de amido e misturas de amidos em alimentos compostos para animais.

6.2.   Medições sacarimétricas

S

=

poder rotatório total, em graus sacarimétricos

S'

=

poder rotatório, em graus sacarimétricos, das substâncias solúveis em etanol a 40 %

N

=

peso, em gramas, de sacarose dissolvida em 100 ml de água, correspondente a um poder rotatório de 100o sacarimétricos, quando medido com um tubo de 200 mm 16,29 g para os sacarímetros franceses 26,00 g para os sacarímetros alemães 20,00 g para os sacarímetros mistos. = Poder rotatório específico do amido puro (ver ponto 6.1).

6.3.   Repetibilidade

A diferença entre os resultados de duas determinações paralelas efectuadas com a mesma amostra não deve exceder 0,4 , em valor absoluto, para teores de amido inferiores a 40 %, ou 1 %, em valor relativo, para teores de amido iguais ou superiores a 40 %.

7.   Observações

M.   DETERMINAÇÃO DAS CINZAS BRUTAS

1.   Objecto e âmbito de aplicação

Esta técnica permite determinar o teor de cinzas brutas em alimentos para animais.

2.   Princípio

Incinera-se amostra a 550 oC e pesa-se o resíduo.

3.   Reagentes

Nitrato de amónio, solução a 20 % (m/v).

4.   Equipamento

5.   Procedimento

Pesar, com uma aproximação de 1 mg, cerca de 5 g de amostra (2,5 g para os produtos com tendência para aumentar de volume) num cadinho para incineração previamente aquecido a 550 oC, arrefecido e tarado. Colocar o cadinho na placa de aquecimento e aquecer progressivamente até à carbonização da matéria. Proceder à incineração de acordo com o disposto no ponto 5.1 ou 5.2.

6.   Cálculo dos resultados

Calcular o peso do resíduo subtraindo-lhe o peso da tara.

Exprimir o resultado em percentagem da amostra.

7.   Observações

N.   DETERMINAÇÃO DAS CINZAS INSOLÚVEIS EM ÁCIDO CLORÍDRICO

1.   Objecto e âmbito de aplicação

Esta técnica permite determinar o teor de substâncias minerais insolúveis em ácido clorídrico existentes nos alimentos para animais. Podem utilizar-se dois processos, em função do tipo de amostra:

2.   Princípio

3.   Reagentes

4.   Equipamento

5.   Procedimento

5.1.   Processo A

Incinerar a amostra de acordo com o método indicado para a determinação do teor de cinzas brutas. Podem igualmente utilizar-se as cinzas obtidas nessa determinação.

Introduzir as cinzas num copo de 250 a 400 ml com 75 ml de ácido clorídrico (3.1). Levar cuidadosamente o líquido a uma ebulição suave mantendo-a durante 15 minutos. Filtrar a solução quente com papel de filtro isento de cinzas e lavar o resíduo com água quente até desaparecer a reacção ácida. Secar o filtro que contém o resíduo e incinerá-lo, num cadinho tarado, a uma temperatura entre 550 oC (min.) e 700 oC (máx.). Arrefecer num exsicador e pesar.

5.2.   Processo B

Pesar, com uma aproximação de 1 mg, 5 g de amostra e introduzi-la num copo de 250 a 400 ml. Juntar sucessivamente 25 ml de água e 25 ml de ácido clorídrico (3.1), misturar e deixar que acabe a efervescência. Juntar mais 50 ml de ácido clorídrico (3.1). Caso se verifique libertação de gás, aguardar que esta cesse completamente, colocar em seguida o copo num banho-maria em ebulição durante 30 minutos ou mais, se necessário, para hidrolisar completamente o amido eventualmente presente. Filtrar a quente com um filtro isento de cinzas e lavar o filtro com 50 ml de água quente (ver observação 7). Colocar o filtro com o resíduo num cadinho para incineração, secar e incinerar a uma temperatura entre 550 oC (mín.) e 700 oC (máx.). Introduzir as cinzas num copo de 250 a 400 ml com 75 ml de ácido clorídrico (3.1); prosseguir como indicado no segundo parágrafo do ponto 5.1.

6.   Cálculo dos resultados

Calcular o peso do resíduo subtraindo-lhe o peso da tara. Exprimir o resultado em percentagem da amostra.

7.   Observações

Se a filtração for difícil, repetir o doseamento substituindo os 50 ml de ácido clorídrico (3.1) por 50 ml de ácido tricloracético a 20 % (3.2), lavando o filtro com uma solução quente de ácido tricloracético a 1 % (3.3).

O.   DETERMINAÇÃO DOS CARBONATOS

1.   Objecto e âmbito de aplicação

Esta técnica permite dosear os carbonatos, convencionalmente expressos em carbonato de cálcio, na maior parte dos alimentos para animais.

No entanto, para certos casos (carbonato de ferro, por exemplo) é necessário utilizar uma técnica especial.

2.   Princípio

Decompõe-se os carbonatos com ácido clorídrico e recolhe-se o dióxido de carbono que se liberta da reacção para um tubo graduado, comparando-se o seu volume com o do dióxido de carbono que se libertar, nas mesmas condições, a partir de uma quantidade conhecida de carbonato de cálcio.

3.   Reagentes

4.   Equipamento

Aparelho de Scheibler-Dietrich (v. esquema) ou aparelho equivalente.

5.   Procedimento

Em função do teor de carbonatos da amostra, pesar uma porção da amostra para ensaio como a seguir se indica:

Introduzir a amostra de ensaio num frasco especial (4) equipado com um pequeno tubo de matéria inquebrável, contendo 10 ml de ácido clorídrico (3.1), e ligar o frasco ao aparelho. Rodar a torneira de três vias (5) de maneira a que o tubo (1) comunique com o exterior. Com o tubo móvel (2) cheio de ácido sulfúrico corado (3.3) e ligado ao tubo graduado (1), acertar o nível de líquido para a graduação zero. Rodar a torneira (5) de maneira a estabelecer a comunicação entre os tubos (1) e (3) e certificar-se de que o nível está em zero.

Deixar cair lentamente o ácido clorídrico (3.1) sobre a amostra de ensaio, inclinando o frasco (4). Nivelar a pressão, baixando o tubo (2). Agitar o frasco (4) até à cessação completa da libertação de dióxido de carbono.

Tornar a nivelar a pressão colocando o líquido ao mesmo nível em ambos os tubos (1) e (2). Esperar alguns minutos até que o volume do gás se estabilize, fazendo então a leitura.

Efectuar nas mesmas condições um ensaio comparativo com 0,5 g de carbonato de cálcio (3.2).

6.   Cálculo dos resultados

O teor de carbonatos, expresso em carbonato de cálcio, é dado pela seguinte fracção:

em que:

X

=

% (m/m) de carbonatos na amostra, expresso em carbonato de cálcio

V

=

ml de CO2 libertados pela amostra de ensaio

V1

=

ml de CO2 libertados por 0,5 g de CaCO3

m

=

massa, em gramas, da amostra de ensaio.

7.   Observações

P.   DETERMINAÇÃO DO FÓSFORO TOTAL

MÉTODO FOTOMÉTRICO

1.   Objecto e âmbito de aplicação

Este método permite determinar o teor de fósforo total dos alimentos para animais. É particularmente indicado para a análise de produtos pobres em fósforo. Nalguns casos (produtos ricos em fósforo), pode ser aplicado um método gravimétrico.

2.   Princípio

A amostra é mineralizada, quer por via seca (para os alimentos orgânicos) quer por via húmida (para os compostos minerais e os alimentos líquidos) e colocada em solução ácida. A solução é tratada pelo reagente vanadomolíbdico. A densidade óptica da solução amarela assim obtida é medida em espectrofotómetro a 430 nm.

3.   Reagentes

4.   Equipamento

5.   Procedimento

5.1.   Preparação da solução

Consoante a natureza da amostra, preparar uma solução tal como indicado nos pontos 5.1.1 ou 5.1.2.

5.1.1.    Caso geral

Pesar 1 g ou mais de amostra, com uma aproximação de 1 mg. Introduzir a amostra num balão Kjeldahl, adicionar 20 ml de ácido sulfúrico (3.5) agitar para impregnar completamente a substância com ácido e evitar que adira às paredes do balão, aquecer e manter em ebulição durante 10 minutos. Deixar arrefecer ligeiramente, adicionar 2 ml de ácido nítrico (3.4), aquecer lentamente, deixar arrefecer ligeiramente, juntar de novo um pouco de ácido nítrico (3.4) e levar à ebulição. Repetir estas operações até à obtenção de uma solução incolor. Arrefecer, juntar um pouco de água, transferir o líquido para um balão volumétrico de 500 ml, enxaguando o balão de Kjeldahl com água quente. Deixar arrefecer, completar o volume com água, homogeneizar e filtrar.

5.1.2.    Amostras contendo substâncias orgânicas e isentas de di-hidrogenofosfatos de cálcio e de magnésio

Pesar, com uma aproximação de 1 mg, cerca de 2,5 g de amostra num cadinho de incineração. Misturar intimamente a amostra com 1 g de carbonato de cálcio (3.1). Calcinar na mufla a 550oC até à obtenção de cinzas brancas ou cinzentas (uma pequena quantidade de carvão não prejudica). Transferir as cinzas para um copo de precipitação de 250 ml. Juntar 20 ml de água e ácido clorídrico (3.2) até que cesse a efervescência. Juntar mais 10 ml de ácido clorídrico (3.2). Colocar o copo num banho de areia e evaporar até à secura para insolubilizar a sílica. Redissolver o resíduo em 10 ml de ácido nítrico (3.3) e levar a ebulição, durante 5 minutos num banho de areia, sem evaporar até à secura. Transferir o líquido para um balão volumétrico de 500 ml, enxaguando o copo de precipitação várias vezes com água quente. Deixar arrefecer, completar o volume com água, homogeneizar e filtrar.

5.2.   Desenvolvimento da coloração e medição da densidade óptica

Diluir uma alíquota do filtrado obtido no ponto 5.1.1 ou 5.1.2 de modo a obter uma concentração em fósforo não superior a 40 μg/ml. Introduzir 10 ml desta solução num tubo de ensaio (4.6) e adicionar 10 ml do reagente vanadomolíbdico (3.6). Homogeneizar e deixar repousar 10 minutos, pelo menos, à temperatura de 20 oC. Medir a densidade óptica em espectrofotómetro a 430 nm por comparação com uma solução obtida por adição de 10 ml do reagente vanadomolíbdico (3.6) a 10 ml de água.

5.3.   Curva de calibração

A partir da solução-padrão (3.7) preparar soluções contendo respectivamente 5, 10, 20, 30 e 40 μg de fósforo por ml. Tomar 10 ml de cada uma destas soluções e adicionar 10 ml do reagente vanadomolíbdico (3.6). Homogeneizar e deixar repousar 10 minutos, pelo menos, à temperatura de 20 oC. Medir a densidade óptica como indicado no ponto 5.2. Traçar a curva de calibração representado em ordenadas os valores da densidade óptica e, em abcissas, as quantidades correspondentes de fósforo. A curva é linear para concentrações compreendidas entre 0 e 40 μg/ml.

6.   Cálculo dos resultados

Recorrendo à curva de calibração, determinar a quantidade de fósforo na amostra.

Exprimir o resultado em percentagem da amostra.

Repetibilidade

A diferença entre os resultados de duas determinações paralelas efectuadas com a mesma amostra não deve exceder:

Q.   DETERMINAÇÃO DO CLORO SOB A FORMA DE CLORETOS

1.   Objecto e âmbito de aplicação

Esta técnica permite dosear o cloro dos cloretos solúveis em água, convencionalmente expressos como cloreto de sódio, e é aplicável a todos os alimentos para animais.

2.   Princípio

Dissolvem-se os cloretos em água. Se o produto contiver matérias orgânicas, procede-se à sua clarificação. Acidifica-se ligeiramente a solução com ácido nítrico e os cloretos precipitam sob a forma de cloreto de prata com uma solução de nitrato de prata. Titula-se o excesso de nitrato de prata com uma solução de tiocianato de amónio segundo o método de Volhard.

3.   Reagentes

4.   Equipamento

Misturador basculante: cerca de 35 a 40 rotações por minuto.

5.   Procedimento

5.1.   Preparação da solução

Conforme o tipo de amostra, preparar uma solução como se indica no ponto 5.1.1, 5.1.2 ou 5.1.3.

Efectuar ao mesmo tempo, sem a amostra, um «ensaio em branco».

5.1.1.    Amostras sem matéria orgânica

Pesar, com uma aproximação de 1 mg, uma amostra de ensaio não superior a 10 g, que não contenha mais de 3 g de cloro sob a forma de cloretos, e introduzi-la, com 400 ml de água, num balão volumétrico de 500 ml, a cerca de 20 oC. Misturar durante 30 minutos no misturador, completar o volume, homogeneizar e filtrar.

5.1.2.    Amostras com matéria orgânica, à excepção dos produtos mencionados no ponto 5.1.3

Pesar, com uma aproximação de 1 mg, cerca de 5 g de amostra e introduzi-la com 1 g de carvão activado num balão volumétrico de 500 ml. Adicionar 400 ml de água a cerca de 20 oC e 5 ml de solução de Carrez I (3.7), agitar durante 30 segundos e juntar em seguida 5 ml de solução de Carrez II (3.8). Misturar durante 30 minutos no misturador, completar o volume, homogeneizar e filtrar.

5.1.3.    Alimentos cozidos, bagaços e farinha de linhaça, produtos ricos em farinha de linhaça e outros produtos ricos em mucilagens ou substâncias coloidais (amido dextrinado, por exemplo)

Preparar a solução como se indica no ponto 5.1.2 mas sem filtrar. Decantar (se necessário, centrifugar), recolher 100 ml do líquido sobrenadante e introduzi-lo num balão volumétrico de 200 ml. Adicionar acetona (3.6), completando o volume, homogeneizar e filtrar.

5.2.   Titulação

Com uma pipeta, transferir para um erlenmeyer 25 a 100 ml do filtrado (dependendo do teor presumido de cloro) obtido no ponto 5.1.1, 5.1.2 ou 5.1.3. A alíquota não deverá conter mais de 150 mg de cloro (Cl). Se for necessário, diluir com água, para obter, pelo menos, 50 ml de filtrado, juntar 5 ml de ácido nítrico (3.4), 20 ml de solução saturada de sulfato férrico de amónio (3.3) e duas gotas de solução de tiocianato de amónio (3.1), que se deitam com uma bureta cheia até à marca zero. Em seguida, juntar-lhe a solução de nitrato de prata (3.2) com uma bureta até obter um excesso de 5 ml. Adicionar 5 ml de éter dietílico (3.5) e agitar fortemente para formar o precipitado. Titular o excesso de nitrato de prata com a solução de tiocianato de amónio (3.1) até a viragem para vermelho acastanhado se manter durante um minuto.

6.   Cálculo dos resultados

O teor de cloro (X), expresso em percentagem de cloreto de sódio, é dado pela seguinte fórmula:

em que:

V1

=

ml de solução de nitrato de prata 0,1 mol/l adicionada

V2

=

ml da solução de tiocianato de amónio 0,1 mol/l gasta na titulação.

m

=

massa da amostra.

Se o ensaio em branco revelar que houve consumo de solução de nitrato de prata 0,1 mol/l, subtrair o valor da quantidade consumida ao volume (V1 – V2).

7.   Observações

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ANEXO IV

MÉTODOS DE ANÁLISE PARA O CONTROLO DO TEOR DE ADITIVOS AUTORIZADOS NOS ALIMENTOS PARA ANIMAIS

A.   DETERMINAÇÃO DA VITAMINA A

1.   Objecto e âmbito de aplicação

Este método permite determinar o teor de vitamina A (retinol) em alimentos para animais e pré-misturas. A vitamina A determinada pelo presente método abrange o álcool retinílico totalmente trans e os seus isómeros cis. O teor de vitamina A é expresso em unidades internacionais (UI) por quilograma. Uma unidade internacional corresponde à actividade de 0,300 μg de vitamina A totalmente trans na forma de álcool ou 0,344 μg de vitamina A totalmente trans na forma de acetato ou 0,550 μg de vitamina A totalmente trans na forma de palmitato.

O limite de quantificação é 2 000 UI de vitamina A por kg.

2.   Princípio

Hidrólise da amostra com solução etanólica de hidróxido de potássio e extracção da vitamina A com éter de petróleo. Remoção do solvente por evaporação e dissolução do resíduo em metanol; se necessário, diluição até à concentração requerida. Determinação do teor de vitamina A por cromatografia líquida de alta resolução (HPLC) de fase reversa, com um detector de UV ou de fluorescência. Os parâmetros cromatográficos são escolhidos de forma a não haver separação entre a vitamina A na forma de álcool totalmente trans e os seus isómeros cis.

3.   Reagentes

4.   Equipamento

5.   Procedimento

Nota:

A vitamina A é sensível à luz (ultravioleta) e à oxidação. Efectuar todas as operações na ausência de luz (utilizando material de vidro ambarizado ou protegido com folha de alumínio) e de oxigénio (sob corrente de azoto). Durante a extracção, o ar acima do líquido deve ser substituído por azoto (para evitar excessos de pressão, soltar a tampa de vez em quando).

5.1.   Preparação da amostra

Moer a amostra de forma a poder passá-la por um crivo de 1 mm, tomando as devidas precauções para evitar a geração de calor. Efectuar a moagem imediatamente antes da pesagem e saponificação; caso contrário, pode haver perdas de vitamina A.

5.2.   Saponificação

Em função do teor de vitamina A, pesar, com uma aproximação de 1 mg, 2 g a 25 g de amostra num balão de 500 ml de fundo plano ou erlenmeyer (4.2.1). Adicionar sucessivamente, sob agitação, 130 ml de etanol (3.1), aproximadamente 100 mg de BHT (3.13), 2 ml da solução de ascorbato de sódio (3.5) e 2 ml da solução de sulfureto de sódio (3.6). Adaptar o condensador (4.3) ao balão e mergulhar este último no banho de água equipado com um agitador magnético (4.7). Aquecer até à ebulição e deixar em refluxo durante 5 minutos. Adicionar em seguida, pelo condensador (4.3), 25 ml da solução de hidróxido de potássio (3.4) e deixar em refluxo durante mais 25 minutos, com agitação e sob uma corrente ligeira de azoto. Lavar o condensador com cerca de 20 ml de água e arrefecer o conteúdo do balão até à temperatura ambiente.

5.3.   Extracção

Transferir quantitativamente a solução de saponificação para uma ampola de decantação de 1 000 ml (4.2.3) ou para o aparelho de extracção (4.8), lavando com um volume total de 250 ml de água. Lavar o balão de saponificação sucessivamente com 25 ml de etanol (3.1) e 100 ml de éter de petróleo (3.2) e transferir os líquidos de lavagem para a ampola de decantação ou o aparelho de extracção. A proporção de água e etanol na solução combinada assim constituída deve ser aproximadamente 2:1. Agitar vigorosamente durante 2 minutos e deixar em repouso durante 2 minutos.

5.3.1.    Extracção com uma ampola de decantação (4.2.3)

Depois da separação das fases (ver as observações do ponto 7.3), transferir a fase etérea para outra ampola de decantação (4.2.3). Repetir duas vezes a operação de extracção com 100 ml de éter de petróleo (3.2) e mais duas vezes com 50 ml de éter de petróleo (3.2).

Lavar os extractos combinados na ampola de decantação por duas vezes, com volumes de 100 ml de água cada, agitando suavemente por rotação (para evitar a formação de emulsões), e, em seguida, agitar vigorosamente com mais volumes de 100 ml de água até esta permanecer incolor à solução de fenolftaleína (3.7) (quatro lavagens são normalmente suficientes). Filtrar o extracto lavado com um filtro de pregas de separação de fases (4.4) seco para um balão volumétrico de 500 ml (4.2.2), para remover alguma água ainda em suspensão. Lavar a ampola de decantação e o filtro com 50 ml de éter de petróleo (3.2), completar o volume com éter de petróleo (3.2) até ao traço e homogeneizar.

5.3.2.    Extracção com aparelho de extracção (4.8)

Depois da separação das fases (ver as observações do ponto 7.3), substituir a tampa do cilindro de vidro (4.8.1) pelo dispositivo de vidro com esmerilado (4.8.2) e colocar a extremidade inferior em U do tubo ajustável de modo a que fique imediatamente acima do nível da interface. Aumentar a pressão por alimentação de azoto através da tubuladura lateral e transferir a fase etérea superior para uma ampola de decantação de 1 000 ml (4.2.3). Adicionar 100 ml de éter de petróleo (3.2) ao cilindro, tapar e agitar vigorosamente. Depois da separação das fases, transferir a fase superior para a ampola de decantação conforme descrito acima. Repetir a operação de extracção com mais 100 ml de éter de petróleo (3.2) e duas vezes com volumes de 50 ml de éter de petróleo (3.2), transferindo as fases etéreas para a ampola de decantação.

Lavar os extractos etéreos combinados conforme descrito no ponto 5.3.1 e proceder conforme descrito no mesmo ponto.

5.4.   Preparação da solução de amostra para a HPLC

Pipetar uma alíquota da solução de éter de petróleo (obtida no ponto 5.3.1 ou 5.3.2) para um balão em forma de pêra de 250 ml (4.2.4). Evaporar o solvente quase até à secura no evaporador rotativo (4.1), sob pressão reduzida, num banho a uma temperatura não superior a 40 oC. Restabelecer a pressão atmosférica com uma alimentação de azoto (3.10) e retirar o balão do evaporador rotativo. Remover o solvente restante sob uma corrente de azoto (3.10) e dissolver imediatamente o resíduo com um volume conhecido (10 ml-100 ml) de metanol (3.3) (a concentração de vitamina A deve estar compreendida entre 5 UI/ml e 30 UI/ml).

5.5.   Determinação por HPLC

Procede-se à separação da vitamina A numa coluna de fase reversa C18 (4.5.1) e determina-se a sua concentração com um detector de UV (325 nm) ou de fluorescência (excitação: 325 nm; emissão: 475 nm) (4.5.2).

Injectar uma alíquota (por exemplo, 20 μl) da solução metanólica obtida no ponto 5.4 e eluir com a fase móvel (3.9). Calcular a altura ou área média dos picos correspondentes a várias injecções da mesma solução de amostra e a altura ou área média dos picos correspondentes a várias injecções das soluções de calibração (5.6.2).

Condições da HPLC

As condições a seguir especificadas são-no a título indicativo. Poderão escolher-se outras condições, desde que produzam resultados equivalentes.

5.6.   Calibração

5.6.1.    Preparação das soluções-padrão de trabalho

Pipetar 20 ml da solução-mãe de vitamina A na forma de acetato (3.11.1) ou 20 ml da solução-mãe de vitamina A na forma de palmitato (3.12.1) para um balão de 500 ml de fundo plano ou erlenmeyer (4.2.1) e efectuar a hidrólise conforme descrito no ponto 5.2, mas sem adicionar BHT. Proceder, em seguida, à extracção com éter de petróleo (3.2) conforme descrito no ponto 5.3 e completar o volume com éter de petróleo (3.2) até perfazer 500 ml. Evaporar 100 ml do extracto obtido no evaporador rotativo (ver ponto 5.4) quase até à secura, remover o solvente restante sob uma corrente de azoto (3.10) e redissolver o resíduo com 10,0 ml de metanol (3.3). A concentração nominal desta solução é de 560 UI de vitamina A por ml. A concentração exacta é determinada conforme descrito no ponto 5.6.3.3. Preparar a solução-padrão de trabalho imediatamente antes da sua utilização.

Pipetar 2,0 ml desta solução-padrão de trabalho para um balão volumétrico de 20 ml, completar o volume com metanol (3.3) até ao traço e homogeneizar. A concentração nominal desta solução-padrão de trabalho diluída é de 56 UI de vitamina A por ml.

5.6.2.    Preparação das soluções de calibração e traçado da curva de calibração

Pipetar 1,0 , 2,0 , 5,0 e 10,0 ml da solução-padrão de trabalho diluída para uma série de balões volumétricos de 20 ml, completar o volume com metanol (3.3) até ao traço e homogeneizar. A concentração nominal destas soluções é de 2,8 , 5,6 , 14,0 e 28,0 UI de vitamina A por ml.

Injectar vários volumes de 20 μl de cada solução de calibração e determinar as alturas (ou áreas) médias dos picos. Traçar uma curva de calibração com base nas alturas (ou áreas) médias dos picos e nos resultados obtidos na padronização no ultravioleta (5.6.3.3).

5.6.3.    Padronização no UV das soluções-padrão

5.6.3.1.    Solução-mãe de vitamina A na forma de acetato

Pipetar 2,0 ml da solução-mãe de vitamina A na forma de acetato (3.11.1) para um balão volumétrico de 50 ml (4.2.2) e completar o volume com 2-propanol (3.8) até ao traço. A concentração nominal desta solução é de 56 UI de vitamina A por ml. Pipetar 3,0 ml desta solução diluída de vitamina A na forma de acetato para um balão volumétrico de 25 ml e completar o volume com 2-propanol (3.8) até ao traço. A concentração nominal desta solução é de 6,72 UI de vitamina A por ml. Traçar o espectro de UV desta solução no espectrofotómetro (4.6), entre 300 nm e 400 nm, em relação ao 2-propanol (3.8). O máximo de extinção deve estar compreendido entre 325 nm e 327 nm.

Cálculo do teor de vitamina A:

UI de vitamina A/ml = E326 × 19,0

(

da vitamina A na forma de acetato = 1 530 a 326 nm, em 2-propanol)

5.6.3.2.    Solução-mãe de vitamina A na forma de palmitato

Pipetar 2,0 ml da solução-mãe de vitamina A na forma de palmitato (3.12.1) para um balão volumétrico de 50 ml (4.2.2) e completar o volume com 2-propanol (3.8) até ao traço. A concentração nominal desta solução é de 56 UI de vitamina A por ml. Pipetar 3,0 ml desta solução diluída de vitamina A na forma de palmitato para um balão volumétrico de 25 ml e completar o volume com 2-propanol (3.8) até ao traço. A concentração nominal desta solução é de 6,72 UI de vitamina A por ml. Traçar o espectro de UV desta solução no espectrofotómetro (4.6), entre 300 nm e 400 nm, em relação ao 2-propanol (3.8). O máximo de extinção deve estar compreendido entre 325 nm e 327 nm.

Cálculo do teor de vitamina A:

UI de vitamina A/ml = E326 × 19,0

(

da vitamina A na forma de palmitato = 957 a 326 nm, em 2-propanol)

5.6.3.3.    Solução-padrão de trabalho de vitamina A

Pipetar 3,0 ml da solução-padrão de trabalho não diluída de vitamina A, preparada conforme descrito no ponto 5.6.1, para um balão volumétrico de 50 ml (4.2.2) e completar o volume com 2-propanol (3.8) até ao traço. Pipetar 5,0 ml desta solução para um balão volumétrico de 25 ml e completar o volume com 2-propanol (3.8) até ao traço. A concentração nominal desta solução é de 6,72 UI de vitamina A por ml. Traçar o espectro de UV desta solução no espectrofotómetro (4.6), entre 300 nm e 400 nm, em relação ao 2-propanol (3.8). O máximo de extinção deve estar compreendido entre 325 nm e 327 nm.

Cálculo do teor de vitamina A:

UI de vitamina A/ml = E325 × 18,3

(

da vitamina A na forma de álcool = 1 821 a 325 nm, em 2-propanol)

6.   Cálculo dos resultados

A partir da altura ou área média dos picos da vitamina A da solução de amostra, determinar a concentração desta em UI/ml, com base na curva de calibração (5.6.2).

O teor de vitamina A, w, da amostra, expresso em UI/kg, é dado pela seguinte fórmula:

[UI/kg]

em que:

c

=

concentração, em UI/ml, de vitamina A da solução de amostra (5.4)

V1

=

volume, em ml, de solução de amostra (5.4)

V2

=

volume, em ml, da alíquota tomada no ponto 5.4

m

=

massa, em g, da toma analisada

7.   Observações

Para verificar se o método de análise utilizado produz resultados fiáveis nesta matriz específica (substituto do leite) deve realizar-se um ensaio de recuperação com uma toma de ensaio adicional. Se a taxa de recuperação for inferior a 80 %, o resultado analítico tem de ser corrigido em função da recuperação.

8.   Repetibilidade

A diferença entre os resultados de duas determinações paralelas efectuadas com a mesma amostra não deve exceder 15 % do maior dos valores.

9.   Resultados de um estudo interlaboratorial ( 11 )

L

=

número de laboratórios

n

=

número de valores individuais

sr

=

desvio-padrão da repetibilidade

sR

=

desvio-padrão da reprodutibilidade

r

=

repetibilidade

R

=

reprodutibilidade

CVr

=

coeficiente de variação da repetibilidade

CVR

=

coeficiente de variação da reprodutibilidade

B.   DETERMINAÇÃO DA VITAMINA E

1.   Objecto e âmbito de aplicação

Este método permite determinar o teor de vitamina E em alimentos para animais e pré-misturas. O teor de vitamina E é expresso em mg de acetato de DL-α-tocoferol por quilograma. 1 mg de acetato de DL-α-tocoferol corresponde a 0,91 mg de DL-α- -tocoferol (vitamina E).

O limite de quantificação é de 2 mg de vitamina E por kg e só pode ser alcançado com um detector de fluorescência. Com um detector de UV, o limite de quantificação é de 10 mg/kg.

2.   Princípio

Hidrólise da amostra com solução etanólica de hidróxido de potássio e extracção da vitamina E com éter de petróleo. Remoção do solvente por evaporação e dissolução do resíduo em metanol; se necessário, diluição até à concentração requerida. Determinação do teor de vitamina E por cromatografia líquida de alta resolução (HPLC) de fase reversa, com um detector de fluorescência ou de UV.

3.   Reagentes

4.   Equipamento

5.   Procedimento

Nota

A vitamina E é sensível à luz (ultravioleta) e à oxidação. Efectuar todas as operações na ausência de luz (utilizando material de vidro ambarizado ou protegido com folha de alumínio) e de oxigénio (sob corrente de azoto). Durante a extracção, o ar acima do líquido deve ser substituído por azoto (para evitar excessos de pressão, soltar a tampa de vez em quando).

5.1.   Preparação da amostra

Moer a amostra de forma a poder passá-la por um crivo de 1 mm, tomando as devidas precauções para evitar a geração de calor. Efectuar a moagem imediatamente antes da pesagem e da saponificação; caso contrário, pode haver perdas de vitamina E.

5.2.   Saponificação

Em função do teor de vitamina E, pesar com uma aproximação de 0,01 g, 2 g a 25 g de amostra num balão de fundo plano ou erlenmeyer de 500 ml (4.2.1). Adicionar sucessivamente, sob agitação, 130 ml de etanol (3.1), aproximadamente 100 mg de BHT (3.12), 2 ml da solução de ascorbato de sódio (3.5) e 2 ml da solução de sulfureto de sódio (3.6). Adaptar o condensador (4.3) ao balão e mergulhar este último no banho de água equipado com um agitador magnético (4.7). Aquecer até à ebulição e deixar em refluxo durante 5 minutos. Adicionar em seguida, pelo condensador (4.3), 25 ml da solução de hidróxido de potássio (3.4) e deixar em refluxo durante mais 25 minutos, com agitação e sob uma corrente ligeira de azoto. Lavar o condensador com cerca de 20 ml de água e arrefecer o conteúdo do balão até à temperatura ambiente.

5.3.   Extracção

Transferir quantitativamente a solução de saponificação para uma ampola de decantação de 1 000 ml (4.2.3) ou para o aparelho de extracção (4.8), lavando com um volume total de 250 ml de água. Lavar o balão de saponificação sucessivamente com 25 ml de etanol (3.1) e 100 ml de éter de petróleo (3.2) e transferir os líquidos de lavagem para a ampola de decantação ou o aparelho de extracção. A proporção de água e etanol na solução combinada assim constituída deve ser aproximadamente 2:1. Agitar vigorosamente durante 2 minutos e deixar em repouso durante 2 minutos.

5.3.1.    Extracção com uma ampola de decantação (4.2.3)

Depois da separação das fases (ver as observações do ponto 7.3), transferir a fase etérea para outra ampola de decantação (4.2.3). Repetir duas vezes a operação de extracção com 100 ml de éter de petróleo (3.2) e mais duas vezes com 50 ml de éter de petróleo (3.2).

Lavar os extractos combinados na ampola de decantação por duas vezes, com volumes de 100 ml de água cada, agitando suavemente por rotação (para evitar a formação de emulsões), e, em seguida, agitar vigorosamente com mais volumes de 100 ml de água até esta permanecer incolor à solução de fenolftaleína (3.7) (quatro lavagens são normalmente suficientes). Filtrar o extracto lavado com um filtro de pregas de separação de fases (4.4) seco para um balão volumétrico de 500 ml (4.2.2), para remover alguma água ainda em suspensão. Lavar a ampola de decantação e o filtro com 50 ml de éter de petróleo (3.2), completar o volume com éter de petróleo (3.2) até ao traço e homogeneizar.

5.3.2.    Extracção com aparelho de extracção (4.8)

Depois da separação das fases (ver as observações do ponto 7.3), substituir a tampa do cilindro de vidro (4.8.1) pelo dispositivo de vidro com esmerilado (4.8.2) e colocar a extremidade inferior em U do tubo ajustável de modo a que fique imediatamente acima do nível da interface. Aumentar a pressão por alimentação de azoto através da tubuladura lateral e transferir a fase etérea superior para uma ampola de decantação de 1 000 ml (4.2.3). Adicionar 100 ml de éter de petróleo (3.2) ao cilindro, tapar e agitar vigorosamente. Depois da separação das fases, transferir a fase superior para a ampola de decantação conforme descrito acima. Repetir a operação de extracção com mais 100 ml de éter de petróleo (3.2) e duas vezes com volumes de 50 ml de éter de petróleo (3.2), transferindo as fases etéreas para a ampola de decantação.

Lavar os extractos etéreos combinados conforme descrito no ponto 5.3.1 e proceder conforme descrito no mesmo ponto.

5.4.   Preparação da solução de amostra para a HPLC

Pipetar uma alíquota da solução de éter de petróleo (obtida no ponto 5.3.1 ou 5.3.2) para um balão em forma de pêra de 250 ml (4.2.4). Evaporar o solvente quase até à secura no evaporador rotativo (4.1), sob pressão reduzida, num banho a uma temperatura não superior a 40 oC. Restabelecer a pressão atmosférica com uma alimentação de azoto (3.9) e retirar o balão do evaporador rotativo. Remover o solvente restante sob uma corrente de azoto (3.9) e dissolver imediatamente o resíduo com um volume conhecido (10 ml — 100 ml) de metanol (3.3) (a concentração de DL-α-tocoferol deve estar compreendida entre 5 μg/ml e 30 μg/ml).

5.5.   Determinação por HPLC

Procede-se à separação da vitamina E numa coluna de fase reversa C18 (4.5.1) e determina-se a sua concentração com um detector de fluorescência (excitação: 295 nm; emissão: 330 nm) ou de UV (292 nm) (4.5.2).

Injectar uma alíquota (por exemplo, 20 μl) da solução metanólica obtida no ponto 5.4 e eluir com a fase móvel (3.8). Calcular a altura ou área média dos picos correspondentes a várias injecções da mesma solução de amostra e a altura ou área média dos picos correspondentes a várias injecções das soluções de calibração (5.6.2).

Condições da HPLC

As condições a seguir especificadas são-no a título indicativo. Poderão escolher-se outras condições, desde que produzam resultados equivalentes.

5.6.   Calibração (acetato de DL-α-tocoferol ou DL-α-tocoferol)

5.6.1.    Padrão de acetato de DL-α-tocoferol

5.6.1.1.    Preparação da solução-padrão de trabalho

Pipetar 25 ml da solução-mãe de acetato de DL-α-tocoferol (3.10.1) para um balão de 500 ml de fundo plano ou erlenmeyer (4.2.1) e efectuar a hidrólise conforme descrito no ponto 5.2. Proceder, em seguida, à extracção com éter de petróleo (3.2) conforme descrito no ponto 5.3 e completar o volume com éter de petróleo até perfazer 500 ml. Evaporar 25 ml do extracto obtido no evaporador rotativo (ver ponto 5.4) quase até à secura, remover o solvente restante sob uma corrente de azoto (3.9) e redissolver o resíduo com 25,0 ml de metanol (3.3). A concentração nominal desta solução é 45,5 μg de DL-α-tocoferol/ml, equivalente a 50 μg de acetato de DL-α-tocoferol/ml. Preparar a solução-padrão de trabalho imediatamente antes da sua utilização.

5.6.1.2.    Preparação das soluções de calibração e traçado da curva de calibração

Pipetar 1,0 , 2,0 , 4,0 e 10,0 ml da solução-padrão de trabalho para uma série de balões volumétricos de 20 ml, completar o volume com metanol (3.3) até ao traço e homogeneizar. A concentração nominal destas soluções é de 2,5 , 5,0 , 10,0 e 25,0 μg de acetato de DL-α-tocoferol/ml, equivalentes a 2,28 , 4,55 , 9,10 e 22,8 μg de DL-α-tocoferol/ml.

Injectar vários volumes de 20 μl de cada solução de calibração e determinar as alturas (ou áreas) médias dos picos. Traçar uma curva de calibração com base nas alturas (ou áreas) médias dos picos.

5.6.1.3.    Padronização no UV da solução-mãe de acetato de DL-α- -tocoferol (3.10.1)

Diluir, com etanol, 5,0 ml da solução-mãe de acetato de DL-α-tocoferol (3.10.1) até perfazer 25,0 ml e traçar o espectro de UV desta solução no espectrofotómetro (4.6), entre 250 nm e 320 nm, em relação ao etanol (3.1).

O máximo de absorção deve situar-se nos 284 nm:

= 43,6 a 284 nm, em etanol

Para esta diluição, deve obter-se uma extinção compreendida entre 0,84 e 0,88 .

5.6.2.    Padrão de DL-α-tocoferol

5.6.2.1.    Preparação da solução-padrão de trabalho

Pipetar 2 ml da solução-mãe de DL-α-tocoferol (3.11.1) para um balão volumétrico de 50 ml, dissolver com metanol (3.3) e completar o volume com metanol até ao traço. A concentração nominal desta solução é 40 μg de DL-α-tocoferol/ml, equivalente a 44,0 μg de acetato de DL-α-tocoferol/ml. Preparar a solução-padrão de trabalho imediatamente antes da sua utilização.

5.6.2.2.    Preparação das soluções de calibração e traçado da curva de calibração

Pipetar 1,0 , 2,0 , 4,0 e 10,0 ml da solução-padrão de trabalho para uma série de balões volumétricos de 20 ml, completar o volume com metanol (3.3) até ao traço e homogeneizar. A concentração nominal destas soluções é de 2,0 , 4,0 , 8,0 e 20,0 μg de DL-α- -tocoferol/ml, equivalentes a 2,20 , 4,40 , 8,79 e 22,0 μg de acetato de DL-α-tocoferol/ml.

Injectar vários volumes de 20 μl de cada solução de calibração e determinar as alturas (ou áreas) médias dos picos. Traçar uma curva de calibração com base nas alturas (ou áreas) médias dos picos.

5.6.2.3.    Padronização no UV da solução-mãe de DL-α-tocoferol (3.11.1)

Diluir, com etanol, 2,0 ml da solução-mãe de DL-α-tocoferol (3.11.1) até perfazer 25,0 ml e traçar o espectro de UV desta solução no espectrofotómetro (4.6), entre 250 nm e 320 nm, em relação ao etanol (3.1). O máximo de absorção deve situar-se nos 292 nm:

= 75,8 a 292 nm, em etanol

Para esta diluição, deve obter-se uma extinção de 0,6 .

6.   Cálculo dos resultados

A partir da altura ou área média dos picos da vitamina E da solução de amostra, determinar a concentração desta em μg/ml (expressa em acetato de α-tocoferol) com base na curva de calibração (5.6.1.2 ou 5.6.2.2).

O teor de vitamina E, w, da amostra, expresso em mg/kg, é dado pela seguinte fórmula:

[mg/kg]

em que:

c

=

concentração, em μg/ml, de vitamina E (expressa em acetato de α-tocoferol) da solução de amostra (5.4)

V1

=

volume, em ml, de solução de amostra (5.4)

V2

=

volume, em ml, da alíquota tomada no ponto 5.4

m

=

massa, em g, da toma analisada

7.   Observações

8.   Repetibilidade

A diferença entre os resultados de duas determinações paralelas efectuadas com a mesma amostra não deve exceder 15 % do maior dos valores.

9.   Resultados de um estudo interlaboratorial ( 12 )

L

=

número de laboratórios

n

=

número de valores individuais

sr

=

desvio-padrão da repetibilidade

SR

=

desvio-padrão da reprodutibilidade

r

=

repetibilidade

R

=

reprodutibilidade

CVr

=

coeficiente de variação da repetibilidade

CVR

=

coeficiente de variação da reprodutibilidade

(C)   DETERMINAÇÃO DOS OLIGOELEMENTOS FERRO, COBRE, MANGANÊS E ZINCO

1.   Objecto e âmbito de aplicação

Esta técnica permite dosear os oligoelementos ferro, cobre, manganês e zinco nos alimentos para animais. Os limites de quantificação são os seguintes:

2.   Princípio

A amostra é colocada em solução em ácido clorídrico, após a destruição da matéria orgânica eventualmente presente. Os elementos ferro, cobre, manganês e zinco são determinados, após uma diluição apropriada, por espectrometria de absorção atómica.

3.   Reagentes

Observações prévias

A água utilizada na preparação dos reagentes e das soluções necessárias ao processo de análise deverá estar isenta dos catiões a determinar, devendo obter-se mediante dupla destilação num aparelho em borossilicato ou quartzo, ou por tratamento duplo com uma resina de permuta iónica.

Os reagentes devem ser, pelo menos, da qualidade «para análise». A ausência do elemento a determinar deve ser verificada por um ensaio em branco. Os reagentes podem, se necessário, ser submetidos a uma maior purificação.

As soluções-padrão adiante descritas poderão ser substituídas por soluções-padrão comerciais, desde que venham garantidas e sejam testadas antes da sua utilização.

4.   Equipamento

5.   ProcedimentO ( 13 )

5.1.   Amostras com matéria orgânica

5.1.1.    Incineração e preparação da solução a analisar ( 14 )

Humedecer as cinzas com água a transferi-las em seguida para um copo de 250 ml. Lavar o cadinho com cerca de 5 ml de ácido clorídrico (3.1) e transferir, lentamente e com precaução, a solução de lavagem para o copo (poderá produzir-se uma reacção violenta pela formação de CO2). Em seguida adicionar ácido clorídrico (3.1) gota a gota, com agitação, até que cesse a efervescência. Evaporar até à secura, mexendo regularmente com uma vareta de vidro.

Juntar ao resíduo 15 ml de ácido clorídrico 6 mol/l (3.2) e, em seguida, aproximadamente 120 ml de água. Agitar com vareta de vidro, que deve ser deixada no copo, e tapar com um vidro de relógio. Levar lentamente a ebulição e ferver em lume brando até que a dissolução das cinzas deixe de ser visível. Filtrar com papel de filtro, isento de cinzas, e recolher o filtrado num balão volumétrico de 250 ml. Lavar o copo e o filtro com 5 ml de ácido clorídrico 6 mol/l (3.2) quente e duas vezes com água a ferver. Completar o volume com água (a concentração em HCl é aproximadamente de 0,5 mol/l).

Notas:

5.1.2.    Determinação espectrofotométrica

5.1.2.1.    Preparação das soluções de calibração

A partir das soluções-padrão de trabalho 3.7.1, 3.8.1, 3.9.1 e 3.10.1, preparar, para cada oligoelemento a dosear, uma gama de soluções de calibração, apresentando cada uma delas uma concentração em HC1 de aproximadamente 0,5 mol/l e, no caso do ferro, do manganês e do zinco, uma concentração em cloreto de lantânio correspondente a 0,1 % de lantânio (m/v).

As concentrações de oligoelementos escolhidas deverão situar-se na zona de sensibilidade do espetrofotómetro utilizado. Os quadros adiante apresentados indicam, a título de exemplo, as composições de gamas típicas de soluções de calibração; poderá ser necessário, conforme o tipo e a sensibilidade do espectrofotómetro utilizado, optar por outras concentrações.

Ferro

Cobre

Manganês

Zinco

5.1.2.2.    Preparação da solução para análise

Para o doseamento do cobre, a solução preparada como indicado no ponto 5.1.1 poderá, regra geral, ser utilizada directamente. Se for necessário diluir a solução de forma a que a sua concentração se situe na gama de concentrações das soluções de calibração, poderá pipetar-se uma alíquota para um balão volumétrico de 100 ml e completar o volume com ácido clorídrico 0,5 mol/l (3.3).

Para a determinação do ferro, manganês e zinco, pipetar uma alíquota da solução preparada como indicado no ponto 5.1.1 para um balão volumétrico de 100 ml, adicionar 10 ml de solução de cloreto de lantânio (3.11) e completar o volume com ácido clorídrico 0,5 mol/l (3.3) (ver também o ponto 8 «Observações»).

5.1.2.3.    Ensaio em branco

Efectuar sem a amostra um ensaio em branco que inclua todas as etapas constantes do método. A solução de calibração «0» não deve ser utilizada como «branco».

5.1.2.4.    Medição da absorção atómica

Medir a absorção atómica das soluções de calibração e da solução a analisar utilizando uma chama oxidante ar-acetileno aos seguintes comprimentos de onda:

Repetir quatro vezes cada medição.

5.2.   Alimentos minerais

Na ausência de matérias orgânicas é inútil a incineração prévia. Seguir o método a partir do segundo parágrafo do ponto 5.1.1.1. Pode ser dispensada a evaporação em presença de ácido fluorídrico.

6.   Cálculo dos resultados

Calcular a concentração do oligoelemento na solução a analisar, por meio de uma curva de calibração, e exprimir o resultado em mg de oligoelemento por kg de amostra (ppm).

7.   Repetibilidade

A diferença entre os resultados de duas determinações paralelas efectuadas com a mesma amostra pelo mesmo analista não deve exceder:

8.   Observações

A presença de grandes quantidades de fosfatos poderá interferir com a determinação do ferro, manganês e zinco. Esta interferência deve ser corrigida por adição de uma solução de cloreto de lantânio (3.11). Se, no entanto, a amostra apresentar uma razão ponderal [(Ca + Mg)/P] > 2, pode ser dispensada a adição da solução de cloreto de lantânio (3.11) à solução a analisar e às soluções de calibração.

(D)   DETERMINAÇÃO DA HALOFUGINONA

Bromidrato de DL-trans-7-bromo-6-cloro-3-[3-(3-hidroxi-2-piperidil)acetonil]-quinazolin-4(3H)-ona

1.   Objecto e âmbito de aplicação

O presente método destina-se à determinação da halofuginona em alimentos para animais. O limite de quantificação é 1 mg/kg.

2.   Princípio

Após tratamento com água quente, a halofuginona é extraída com acetato de etilo sob a forma de base livre e posteriormente transferida por partição, sob a forma de cloridrato, para uma solução aquosa de ácido acético. O extracto é purificado por cromatografia de troca iónica, sendo o teor de halofuginona determinado por cromatografia líquida de alta resolução (HPLC) de fase reversa, com um detector de ultravioleta.

3.   Reagentes

Pesar, com uma aproximação de 0,1 mg, 50 mg de halofuginona (3.6) num balão volumétrico de 500 ml. Dissolver com solução-tampão de acetato de amónio (3.18), perfazer o volume com a mesma solução e agitar. Esta solução mantém-se estável durante três semanas, a 5 oC, na ausência de luz.

Transferir, respectivamente, 1,0 , 2,0 , 3,0 , 4,0 e 6,0 ml de solução-mãe padrão de halofuginona (3.6.1) para uma série de balões volumétricos de 100 ml. Completar até ao traço com a fase móvel (3.21) e agitar. As soluções resultantes possuem concentrações de halofuginona de 1,0 , 2,0 , 3,0 , 4,0 e 6,0 μg/ml, respectivamente. Estas soluções têm que ser preparadas antes de cada utilização.

Dissolver 50 g de carbonato de sódio (3.11) em água, diluir para 1 litro e adicionar cloreto de sódio (3.12) até obter uma solução saturada.

Diluir 10 ml de HCl (3.7) em água e perfazer o volume de 1 litro.

Dissolver 19,3 g de acetato de amónio (3.3) e 30 ml de ácido acético (3.5) em água (3.14), perfazendo o volume de 1 litro.

Lavar com água uma quantidade adequada de Amberlite (3.2), até à remoção completa dos iões cloreto, verificada através da realização do teste com nitrato de prata (3.20) com a fase aquosa recolhida. Seguidamente, lavar a resina com 50 ml de metanol (3.8), rejeitar o metanol e armazenar a resina numa nova porção de metanol fresco.

Dissolver 0,17 g de nitrato de prata (3.9) em 10 ml de água.

Misturar 500 ml de acetonitrilo (3.1) com 300 ml de solução-tampão de acetato de amónio (3.18) e 1 200 ml de água (3.14). Ajustar o pH a 4,3 com ácido acético (3.5). Filtrar com um filtro de 0,22 μm (4.8) e desgaseificar a solução (por exemplo por aplicação de ultra-sons durante 10 minutos). A solução permanece estável durante um mês, se for armazenada na ausência de luz e num recipiente fechado.

4.   Equipamento

5.   Procedimento

Nota:

Sob a forma de base livre, a halofuginona é instável em soluções alcalinas e em acetato de etilo, não devendo permanecer neste último durante mais de 30 minutos.

5.1.   Generalidades

Nota:

Para os fins do presente método, a amostra para o ensaio em branco deve ter composição semelhante à da amostra em análise e não deve acusar a presença de halofuginona.

5.2.   Extracção

Pesar, com uma aproximação de 0,1 g, 10 g da amostra previamente preparada para um tubo de centrífuga de 200 ml. Adicionar 0,5 g de ascorbato de sódio (3.10), 0,5 g de EDTA (3.13) e 20 ml de água, agitando. Colocar o tubo num banho de água a 80 oC, durante 5 minutos. Após arrefecimento à temperatura ambiente, adicionar 20 ml de solução de carbonato de sódio (3.15), agitando. Adicionar imediatamente 100 ml de acetato de etilo (3.4) e agitar manualmente com vigor durante 15 segundos. Colocar o tubo durante três minutos num banho de ultra-sons (4.1), desenroscando a rolha. Centrifugar durante dois minutos e decantar a fase de acetato de etilo, através de um filtro de fibra de vidro (4.6), para uma ampola de decantação de 500 ml. Repetir a extracção da amostra com uma segunda porção de 100 ml de acetato de etilo. Lavar os extractos combinados durante um minuto com 50 ml de solução de carbonato de sódio saturada com cloreto de sódio (3.16), rejeitando a fase aquosa.

Extrair a fase orgânica durante um minuto com 50 ml de ácido clorídrico (3.17). Transferir a camada inferior de ácido para uma ampola de decantação de 250 ml. Extrair novamente a fase orgânica durante 1,5 minutos com uma nova porção de 50 ml de ácido clorídrico, combinando este extracto com o primeiro. Lavar os extractos ácidos combinados por agitação com 10 ml de acetato de etilo (3.4), durante cerca de 10 segundos.

Transferir quantitativamente a fase aquosa para um balão de fundo redondo de 250 ml, rejeitando a fase orgânica. Evaporar o acetato de etilo remanescente da solução ácida, por recurso a um evaporador rotativo (4.2). A temperatura do banho de água não deve exceder 40 oC. A uma pressão aproximada de 25 mbar, todo o acetato de etilo residual deverá ser removido em 5 minutos, a 38 oC.

5.3.   Purificação

5.3.1.    Preparação da coluna de Amberlite

Deve preparar-se uma coluna de XAD-2 para cada extracto de amostra. Com o auxílio de metanol (3.8), transferir para uma coluna de vidro (4.5) 10 g de Amberlite preparada (3.19). Colocar um pequeno tampão de lã de vidro no topo do leito de resina. Remover o metanol da coluna e lavar a resina com 100 ml de água, suspendendo o fluxo quando o nível de líquido atingir o topo do leito de resina. Deixar a coluna estabilizar durante 10 minutos antes da utilização. Não permitir, em caso algum, a secagem da coluna.

5.3.2.    Purificação da amostra

Transferir quantitativamente o extracto (5.2) para o topo da coluna de Amberlite preparada (5.3.1) e eluir, desprezando o eluato. O caudal de eluição não deverá exceder 20 ml/min. Lavar o balão de fundo redondo com 20 ml de ácido clorídrico (3.17), aproveitando a solução residual para lavar a coluna de resina. Remover quaisquer resíduos de solução ácida por recurso a uma corrente de ar. Rejeitar os resíduos de lavagem. Adicionar à coluna 100 ml de metanol (3.8) e deixar eluir 5 a 10 ml, recolhendo o eluato num balão de fundo redondo de 250 ml. Estabilizar a resina com o metanol remanescente durante 10 minutos e continuar a eluição a um caudal não superior a 20 ml/min, recolhendo o eluato no mesmo balão de fundo redondo. Evaporar o metanol no evaporador rotativo (4.2); a temperatura do banho de água não deverá exceder 40 oC. Com o auxílio da fase móvel (3.21), transferir quantitativamente o resíduo para um balão volumétrico de 10 ml. Perfazer o volume com fase móvel e agitar. Filtrar uma alíquota num filtro de membrana (4.7), destinando esta solução à análise por HPLC (5.4).

5.4.   Análise por HPLC

5.4.1.    Parâmetros

As condições a seguir especificadas são-no a titulo indicativo. Poderão escolher-se outras condições, desde que produzam resultados equivalentes.

Coluna para cromatografia líquida (4.4.1)

Fase móvel para HPLC (3.21)

Caudal: 1,5 a 2 ml/minuto

Comprimento de onda de detecção: 243 nm

Volume injectado: 40 to 100 μl.

Verificar a estabilidade do sistema cromatográfico mediante a injecção repetida da solução de calibração (3.6.2), que contém 3,0 μg/ml de halofuginona, até obter picos com alturas (ou áreas) e tempos de retenção reprodutíveis.

5.4.2.    Curva de calibração

Injectar várias vezes cada solução de calibração (3.6.2) e medir a altura (ou área) dos picos correspondentes a cada concentração. Traçar uma curva de calibração, colocando a altura (ou área) média dos picos das soluções de calibração em ordenadas e as concentrações correspondentes, expressas em μg/ml, em abcissas.

5.4.3.    Solução de amostra

Injectar várias vezes o extracto de amostra (5.3.2), utilizando o mesmo volume utilizado para as soluções de calibração, e determinar a altura (ou área) média dos picos correspondentes à halofuginona.

6.   Cálculo dos resultados

A partir da altura (ou área) média dos picos da halofuginona da solução de amostra, determinar a concentração desta em μg/ml, com base na curva de calibração (5.4.2).

O teor de halofuginona da amostra, w, expresso em mg/kg, é dado pela fórmula:

em que:

c

=

concentração de halofuginona da solução de amostra, expressa em μg/ml,

m

=

massa da toma de ensaio, expressa em gramas.

7.   Validação dos resultados

7.1.   Identidade

A identidade do analito pode ser confirmada por co-cromatografia ou por recurso a um detector de díodos, comparando os espectros do extracto de amostra e da solução de calibração (3.6.2) que contém 6,0 μg/ml de halofuginona.

7.1.1.    Co-cromatografia

Fortificar um extracto de amostra com a adição de uma quantidade adequada de uma solução de calibração (3.6.2). A quantidade de halofuginona adicionada deve ser idêntica à quantidade de halofuginona presumida no extracto de amostra.

Apenas se deverá verificar um aumento da altura do pico correspondente à halofuginona, atendendo à quantidade adicionada e à diluição do extracto. A largura do pico a meia altura não poderá diferir mais de 10 % da largura inicial.

7.1.2.    Detecção com um detector de díodos

Os resultados são avaliados de acordo com os seguintes critérios:

Se algum destes critérios não for satisfeito, a presença do analito não pode ser confirmada.

7.2.   Repetibilidade

A diferença entre os resultados de duas determinações paralelas efectuadas com a mesma amostra não deve exceder 0,5 mg/kg, para teores de halofuginona até 3 mg/kg.

7.3.   Recuperação

A taxa de recuperação da amostra em branco fortificada deve ser de, pelo menos, 80 %.

8.   Resultados de um estudo interlaboratorial

Num estudo interlaboratorial ( 15 ), procedeu-se à análise de três amostras por oito laboratórios.

ND

=

não detectado

SR

=

desvio-padrão da reprodutibilidade

CVR

=

coeficiente de variação da reprodutibilidade ( %)

Rec.

=

recuperação ( %)

E.   DETERMINAÇÃO DA ROBENIDINA

Cloridrato de 1,3-bis[(4-clorobenzilideno)amino]guanidina

1.   Objecto e âmbito de aplicação

Este método destina-se à determinação da robenidina em alimentos para animais. O limite de quantificação é 5 mg/kg.

2.   Princípio

A amostra é extraída com metanol acidificado. O extracto é seco, sendo uma alíquota submetida a purificação numa coluna de óxido de alumínio. A robenidina é eluída da coluna com metanol, concentrada e posteriormente diluída com fase móvel para um volume adequado. O teor de robenidina é determinado por cromatografia líquida de alta resolução (HPLC) de fase reversa, utilizando um detector de ultravioleta.

3.   Reagentes

Transferir 4,0 ml de ácido clorídrico (ρ 20 = 1,18 g/ml) para um balão volumétrico de 500 ml, completar até ao traço com metanol (3.1) e agitar. A solução deve ser preparada antes de cada uso.

Tipo 3A, partículas 8-12 mesh (partículas de aluminossilicato cristalino com 1,6 -2,5 mm de diâmetro e poros com 0,3 mm de diâmetro).

Transferir 100 g de óxido de alumínio para um recipiente adequado e adicionar 2,0 ml de água. Tapar e agitar durante cerca de 20 minutos. Guardar num recipiente bem rolhado.

Dissolver, num balão volumétrico de 1 000 ml, 3,40 g de di-hidrogenofosfato de potássio em água de qualidade para HPLC, perfazer o volume e agitar.

Dissolver, num balão volumétrico de 1 000 ml, 3,55 g de hidrogenofosfato dissódico anidro (ou 4,45 g de hidrogenofosfato dissódico di-hidratado, ou ainda 8,95 g de hidrogenofosfato dissódico dodeca-hidratado) em água de qualidade equivalente para HPLC, completar até ao traço e agitar.

Misturar os seguintes reagentes:

Filtrar com um filtro de 0,22 μm (4.6) e desgaseificar a solução (por exemplo por aplicação de ultra-sons durante 10 minutos).

Robenidina pura: cloridrato de 1,3 -bis[(4-clorobenzilideno)amino]guanidina.

Pesar, com uma aproximação de 0,1 mg, 30 mg de robenidina padrão (3.9). Dissolver em metanol acidificado (3.2) num balão volumétrico de 100 ml, perfazer o volume com o mesmo solvente e agitar. Envolver o balão em folha de alumínio e armazenar ao abrigo da luz.

Transferir 10,0 ml de solução-mãe padrão (3.9.1) para um balão volumétrico de 250 ml, completar o volume com fase móvel (3.8) e agitar. Envolver o balão em folha de alumínio e armazenar ao abrigo da luz.

Transferir, respectivamente, 5,0 , 10,0 , 15,0 , 20,0 e 25,0 ml de solução-padrão intermédia (3.9.2) para balões volumétricos de 50 ml. Perfazer o volume com a fase móvel (3.8) e agitar. As soluções obtidas contêm, respectivamente, 1,2 , 2,4 , 3,6 , 4,8 e 6,0 μg/ml de robenidina e devem ser preparadas imediatamente antes da utilização.

4.   Equipamento

Coluna de vidro ambarizado, equipada com torneira e reservatório de cerca de 150 ml, possuindo 10-15 mm de diâmetro interno e 250 mm de comprimento.

5.   Procedimento

Nota:

A robenidina é fotossensível, devendo utilizar-se material de vidro ambarizado para todas as operações.

5.1.   Generalidades

Nota:

Para os fins do presente método, a amostra para o ensaio em branco deve ter composição semelhante à da amostra em análise e não deve acusar a presença de robenidina.

5.2.   Extracção

Pesar, com uma aproximação de 0,01 g, cerca de 15 g de amostra preparada. Transferi-la para um erlenmeyer de 250 ml e adicionar 100,0 ml de metanol acidificado (3.2). Tapar e agitar durante uma hora no agitador (4.2). Filtrar a solução num filtro de fibra de vidro (4.5) e recolher a totalidade do filtrado num erlenmeyer de 150 ml. Adicionar 7,5 g de peneiro molecular (3.4), tapar e agitar durante cinco minutos. Filtrar imediatamente num filtro de fibra de vidro. Guardar esta solução para as operações de purificação (5.3).

5.3.   Purificação

5.3.1.    Preparação da coluna de óxido de alumínio

Colocar um pequeno tampão de fibra de vidro na extremidade inferior da coluna de vidro (4.1), comprimindo-o com o auxílio de uma vareta de vidro. Pesar 11,0 g de óxido de alumínio preparado de acordo com o descrito no ponto 3.5 e transferi-lo para a coluna. Devem tomar-se precauções no sentido de minimizar a exposição ao ar no decurso destas operações. Bater levemente na extremidade inferior da coluna para que o óxido de alumínio assente.

5.3.2.    Purificação da amostra

Pipetar para a coluna 5,0 ml de extracto de amostra preparado de acordo com o ponto 5.2. Colocar a ponta da pipeta junto da parede da coluna e esperar que a solução seja absorvida pelo óxido de alumínio. Eluir a robenidina da coluna por recurso a 100 ml de metanol (3.1), a um caudal de 2-3 ml/minuto, recolhendo o eluato num balão de fundo redondo de 250 ml. Evaporar até à secura a solução de metanol, sob pressão reduzida, a 40oC, com o auxílio de um evaporador rotativo (4.3). Dissolver o resíduo em 3-4 ml de fase móvel (3.8) e transferir quantitativamente para um balão volumétrico de 10 ml. Lavar o balão de fundo redondo com diversas porções de 1-2 ml de fase móvel, transferindo as mesmas para o balão volumétrico. Perfazer o volume com o mesmo solvente e agitar. Filtrar uma alíquota com um filtro de membrana de 0,45 μm (4.7). Guardar esta solução para a análise por HPLC (5.4).

5.4.   Análise por HPLC

5.4.1.    Parâmetros

As condições a seguir especificadas são-no a titulo indicativo. Poderão escolher-se outras condições, desde que produzam resultados equivalentes.

Coluna para cromatografia líquida (4.4.1)

Fase móvel para HPLC (3.8)

Caudal: 1,5 a 2 ml/minuto

Comprimento de onda de detecção: 317 nm

Volume injectado: 20 a 50 μl

Verificar a estabilidade do sistema cromatográfico mediante a injecção repetida da solução de calibração (3.9.3), que contém 3,6 μg/ml de robenidina, até obter picos com alturas (ou áreas) e tempos de retenção reprodutíveis.

5.4.2.    Curva de calibração

Injectar várias vezes cada solução de calibração (3.9.3) e medir a altura (ou área) dos picos correspondentes a cada concentração. Traçar uma curva de calibração, colocando a altura (ou área) média dos picos das soluções de calibração em ordenadas e as concentrações correspondentes, expressas em μg/ml, em abcissas.

5.4.3.    Solução de amostra

Injectar várias vezes o extracto de amostra (5.3.2), utilizando o mesmo volume utilizado para as soluções de calibração, e determinar a altura (ou área) média dos picos correspondentes à robenidina.

6.   Cálculo dos resultados

A partir da altura (ou área) média dos picos da robenidina da solução de amostra, determinar a concentração desta em μg/ml, com base na curva de calibração (5.4.2).

O teor de robenidina da amostra, w, expresso em mg/kg, é dado pela fórmula:

em que:

c

=

concentração de robenidina da solução de amostra, expressa em μg/ml

m

=

massa da toma de ensaio, expressa em gramas.

7.   Validação dos resultados

7.1.   Identidade

A identidade do analito pode ser confirmada por co-cromatografia ou por recurso a um detector de díodos, comparando os espectros do extracto de amostra e da solução de calibração (3.9.3) que contém 6 μg/ml de robenidina.

7.1.1.    Co-cromatografia

Fortificar um extracto de amostra com a adição de uma quantidade adequada de solução de calibração (3.9.3). A quantidade de robenidina adicionada deve ser idêntica à quantidade de robenidina presumida no extracto de amostra.

Apenas se deverá verificar um aumento da altura do pico correspondente à robenidina, atendendo à quantidade adicionada e à diluição do extracto. A largura do pico a meia altura não poderá diferir mais de 10 % da largura inicial.

7.1.2.    Detecção com um detector de díodos

Os resultados são avaliados de acordo com os seguintes critérios:

Se algum destes critérios não for satisfeito, a presença do analito não pode ser confirmada.

7.2.   Repetibilidade

A diferença entre os resultados de duas determinações paralelas efectuadas com a mesma amostra não deve exceder 10 % do maior dos valores, para teores de robenidina superiores a 15 mg/kg.

7.3.   Recuperação

A taxa de recuperação de uma amostra em branco fortificada deve ser de, pelo menos, 85 %.

8.   Resultados de um estudo interlaboratorial

Num estudo interlaboratorial promovido a nível comunitário, procedeu-se à análise por 12 laboratórios de quatro amostras de alimentos para aves de capoeira e coelhos, sob a forma de farinha e granulado. Para cada amostra, foram efectuadas análises em duplicado. Os resultados obtidos foram os seguintes:

sr

=

desvio-padrão da repetibilidade

CVr

=

coeficiente de variação da repetibilidade ( %)

SR

=

desvio-padrão da reprodutibilidade

CVR

=

coeficiente de variação da reprodutibilidade ( %)

(F)   DETERMINAÇÃO DO DICLAZURIL

(+)-4-clorofenil[2,6-dicloro-4-(2,3,4,5-tetra-hidro-3,5-dioxo-1,2,4-triazin-2-il)fenil]-acetonitrilo

1.   Objecto e âmbito de aplicação

Este método permite determinar o teor de diclazuril em alimentos para animais e pré-misturas. O limite de detecção é de 0,1 mg/kg; o limite de quantificação é de 0,5 mg/kg.

2.   Princípio

Depois de adicionado um padrão interno, submete-se a amostra a uma operação de extracção com metanol acidificado. No caso dos alimentos para animais, purifica-se uma alíquota do extracto num cartucho de extracção com fase sólida C18, elui-se o diclazuril do cartucho com uma mistura de metanol acidificado e água, evapora-se e dissolve-se o resíduo em DMF/água. No caso das pré-misturas, evapora-se o extracto e dissolve-se o resíduo em DMF/água. O teor de diclazuril é determinado por cromatografia líquida de alta resolução (HPLC) de fase reversa com gradiente ternário, com um detector de UV.

3.   Reagentes

Num balão volumétrico de 50 ml, pesar, com uma aproximação de 0,1 mg, 25 mg de diclazuril-padrão (3.8). Dissolver em DMF (3.6), completar o volume com DMF (3.6) e homogeneizar. Envolver o balão com folha de alumínio ou utilizar material de vidro ambarizado e guardar no frigorífico. A temperaturas não superiores a 4 oC, a solução mantém- -se estável durante um mês.

Transferir 5,00 ml da solução-mãe padrão (3.8.1) para um balão volumétrico de 50 ml, completar o volume com DMF (3.6) e homogeneizar. Envolver o balão com folha de alumínio ou utilizar material de vidro ambarizado e guardar no frigorífico. A temperaturas não superiores a 4 oC a solução mantém-se estável durante um mês.

Num balão volumétrico de 50 ml, pesar, com uma aproximação de 0,1 mg, 25 mg de padrão interno (3.9). Dissolver em DMF (3.6), completar o volume com DMF (3.6) e homogeneizar. Envolver o balão com folha de alumínio ou utilizar material de vidro ambarizado e guardar no frigorífico. A temperaturas não superiores a 4 oC, a solução mantém-se estável durante um mês.

Transferir 5,00 ml da solução-mãe de padrão interno (3.9.1) para um balão volumétrico de 50 ml, completar o volume com DMF (3.6) e homogeneizar. Envolver o balão com folha de alumínio ou utilizar material de vidro ambarizado e guardar no frigorífico. A temperaturas não superiores a 4 oC, a solução mantém-se estável durante um mês.

(p = teor nominal, em mg/kg, de diclazuril na pré-mistura)

Num balão volumétrico de 100 ml, pesar, com uma aproximação de 0,1 mg, p/10 mg do padrão interno, dissolver em DMF (3.6) num banho de ultra-sons (4.6), completar o volume com DMF e homogeneizar. Envolver o balão com folha de alumínio ou utilizar material de vidro ambarizado e guardar no frigorífico. A temperaturas não superiores a 4 oC, a solução mantém-se estável durante um mês.

Pipetar 2,00 ml da solução-padrão de diclazuril (3.8.2) e 2,00 ml da solução de padrão interno (3.9.2) para um balão volumétrico de 50 ml. Adicionar 16 ml de DMF (3.6), completar o volume com água e homogeneizar. Esta solução é preparada imediatamente antes da sua utilização.

Pipetar 5,0 ml de ácido clorídrico (3.7) para um recipiente com 1 000 ml de metanol (3.5) e homogeneizar.

Dissolver 5 g de acetato de amónio (3.2) e 3,4 g de TBHS (3.3) em 1 000 ml de água (3.1) e homogeneizar.

4.   Equipamento

5.   Procedimento

5.1.   Generalidades

5.1.1.    Amostra de alimento para animais para o ensaio em branco

De modo a comprovar a ausência de diclazuril e outras substâncias susceptíveis de interferir no processo, deve proceder-se à análise de uma amostra em branco de um alimento para animais (ensaio em branco). Essa amostra em branco deve ser de tipo similar ao da amostra em análise e não devem ser detectados diclazuril nem substâncias susceptíveis de interferir no processo.

5.1.2.    Ensaio de recuperação

Deve efectuar-se um ensaio de recuperação utilizando a amostra do ensaio em branco, fortificada com uma quantidade conhecida de diclazuril semelhante à quantidade presente na amostra. Para obter uma fortificação a um nível de 1 mg/kg, adicionar 0,1 ml da solução-mãe padrão (3.8.1) a 50 g da amostra para o ensaio em branco, misturar bem e deixar em repouso durante 10 minutos, misturando de novo várias vezes antes de prosseguir (5.2).

Caso não se disponha de um alimento para animais para o ensaio em branco de tipo similar ao da amostra (ver 5.1.1), pode determinar-se a recuperação pelo método da adição de padrão. Nesse caso, adiciona-se à amostra a analisar uma quantidade de diclazuril semelhante à que já se encontra presente e analisa-se a amostra assim obtida juntamente com a amostra sem adição. A recuperação é calculada por subtracção.

5.2.   Extracção

5.2.1.    Alimentos para animais

Pesar, com uma aproximação de 0,01 g, cerca de 50 g de amostra. Transferir a quantidade pesada para um erlenmeyer de 500 ml, adicionar 1,00 ml da solução de padrão interno (3.9.2) e 200 ml do solvente de extracção (3.12) e tapar. Colocar o erlenmeyer no agitador (4.1) e deixar a agitar de um dia para o outro. Deixar assentar durante 10 minutos. Transferir uma alíquota de 20 ml do líquido sobrenadante para um recipiente de vidro adequado e diluir com 20 ml de água. Verter esta solução num cartucho de extracção (3.11) e forçar a passagem por aplicação de vácuo (4.5). Lavar o cartucho com 25 ml de uma mistura 65+35 (v+v) de solvente de extracção (3.12) e água. Rejeitar as fracções recolhidas e eluir os compostos retidos com 25 ml de uma mistura 80+20 (v+v) de solvente de extracção (3.12) e água. Evaporar esta fracção a 60 oC num evaporador rotativo (4.3), suspendendo a operação logo que seja atingida a secura. Dissolver o resíduo em 1,0 ml de DMF (3.6), adicionar 1,5 ml de água (3.1) e homogeneizar. Filtrar por um filtro de membrana (4.4). Efectuar em seguida a análise por HPLC (5.3).

5.2.2.    Pré-misturas

Pesar, com uma aproximação de 0,001 g, cerca de 1 g de amostra. Transferir a quantidade pesada para um erlenmeyer de 500 ml, adicionar 1,00 ml da solução de padrão interno (3.9.3) e 200 ml do solvente de extracção (3.12) e tapar. Colocar o erlenmeyer no agitador (4.1) e deixar a agitar de um dia para o outro. Deixar assentar durante 10 minutos. Transferir uma aliquota de 10 000 /p ml (p = teor nominal, em mg/kg, de diclazuril na pré-mistura) do líquido sobrenadante para um balão de vidro de fundo redondo de volume adequado. Evaporar a 60 oC, sob pressão reduzida, num evaporador rotativo (4.3), suspendendo a operação logo que seja atingida a secura. Redissolver o resíduo em 10,0 ml de DMF (3.6), adicionar 15,0 ml de água (3.1) e homogeneizar. Efectuar em seguida a análise por HPLC (5.3).

5.3.   Análise por HPLC

5.3.1.    Parâmetros

As condições a seguir especificadas são-no a título indicativo. Poderão escolher-se outras condições, desde que produzam resultados equivalentes.

Para verificar a estabilidade do sistema cromatográfico, injectar várias vezes a solução de calibração (3.10), de concentração 2,0 μg/ml, até se obterem alturas de pico e tempos de retenção constantes.

5.3.2.    Solução de calibração

Injectar várias vezes 20 μl da solução de calibração (3.10) e determinar a altura ou área média dos picos do diclazuril e do padrão interno.

5.3.3.    Solução de amostra

Injectar várias vezes 20 μl da solução da amostra (5.2.1 ou 5.2.2) e determinar a altura ou área média dos picos do diclazuril e do padrão interno.

6.   Cálculo dos resultados

6.1.   Alimentos para animais

O teor de diclazuril, w, da amostra, expresso em mg/kg, é dado pela seguinte fórmula:

[mg/kg]

em que:

hd,s

=

altura ou área do pico do diclazuril da solução de amostra (5.2.1)

hi,s

=

altura ou área do pico do padrão interno da solução de amostra (5.2.1)

hd,c

=

altura ou área do pico do diclazuril da solução de calibração (3.10)

hi,c

=

altura ou área do pico do padrão interno da solução de calibração (3.10)

cd,c

=

concentração de diclazuril, em μg/ml, da solução de calibração (3.10)

m

=

massa, em g, da toma analisada

V

=

volume, em ml, do extracto de amostra, de acordo com 5.2.1 (ou seja, 2,5 ml).

6.2.   Pré-misturas

O teor de diclazuril, w, da amostra, expresso em mg/kg, é dado pela seguinte fórmula:

[mg/kg]

em que:

hd,c

=

altura ou área do pico do diclazuril da solução de calibração (3.10)

hi,c

=

altura ou área do pico do padrão interno da solução de calibração (3.10)

hd,s

=

altura ou área do pico do diclazuril da solução de amostra (5.2.1)

hi,s

=

altura ou área do pico do padrão interno da solução de amostra (5.2.1)

cd,c

=

concentração de diclazuril, em μg/ml, da solução de calibração (3.10)

m

=

massa, em g, da toma analisada

V

=

volume, em ml, do extracto de amostra, de acordo com 5.2.2 (isto é, 25 ml)

p

=

teor nominal, em mg/kg, de diclazuril na pré-mistura.

7.   Validação dos resultados

7.1.   Identidade

A identidade do analito pode ser confirmada por co-cromatografia ou com um detector de díodos que permita comparar os espectros do extracto de amostra (5.2.1 ou 5.2.2) e da solução de calibração (3.10).

7.1.1.    Co-cromatografia

Adiciona-se uma quantidade apropriada da solução de calibração (3.10) a um extracto da amostra (5.2.1 ou 5.2.2). A quantidade de diclazuril adicionada deve ser semelhante à existente no extracto de amostra.

Apenas se deverá verificar um aumento da altura dos picos correspondentes ao diclazuril e ao padrão interno, atendendo à quantidade adicionada e à diluição do extracto. A largura desses picos a meia altura não poderá diferir mais de 10 % da largura inicial do pico do diclazuril e do pico do padrão interno, respectivamente, do extracto de amostra não fortificado.

7.1.2.    Detecção com um detector de díodos

Os resultados são avaliados de acordo com os seguintes critérios:

Se algum destes critérios não for satisfeito, a presença do analito não pode ser confirmada.

7.2.   Repetibilidade

A diferença entre os resultados de duas determinações paralelas efectuadas com a mesma amostra não deve exceder:

7.3.   Recuperação

Utilizando uma amostra (em branco) fortificada, a recuperação deve ser, pelo menos, de 80 %.

8.   Resultados de um estudo interlaboratorial

Num estudo interlaboratorial, procedeu-se à análise de cinco amostras em 11 laboratórios. Foram analisadas duas amostras de pré-misturas (uma, O 100, misturada com uma matriz orgânica; a outra, A 100, com uma matriz inorgânica) com um teor teórico de diclazuril de 100 mg/kg, e três amostras (L1, Z1 e K1) de misturas alimentares para aves de capoeira de três produtores distintos dos Países Baixos, com um teor teórico de diclazuril de 1 mg/kg. Os laboratórios receberam instruções para analisarem cada amostra uma vez ou em duplicado. (No Journal of AOAC International, Volume 77, n.o 6, 1994, p. 1359-1361 podem ser encontrados elementos mais pormenorizados sobre o estudo interlaboratorial efectuado.) Os resultados obtidos figuram no quadro seguinte:

L

=

número de laboratórios

n

=

número de valores individuais

Sr

=

desvio-padrão da repetibilidade

CVr

=

coeficiente de variação da repetibilidade

SR

=

desvio-padrão da reprodutibilidade

CVR

=

coeficiente de variação da reprodutibilidade

9.   Observações

É necessário comprovar previamente a linearidade da resposta do diclazuril em toda a gama de concentrações objecto das determinações.

(G)   DETERMINAÇÃO DO LASALOCIDO DE SÓDIO

Sal sódico de um ácido monocarboxílico polieterificado produzido por Streptomyces lasaliensis

1.   Objecto e âmbito de aplicação

Este método permite determinar o teor de lasalocido de sódio em alimentos para animais e pré-misturas. O limite de detecção é de 5 mg/kg; o limite de quantificação é de 10 mg/kg.

2.   Princípio

O lasalocido de sódio é extraído da amostra com metanol acidificado e doseado por cromatografia líquida de alta resolução (HPLC) de fase reversa, com um detector espectrofluorimétrico.

3.   Reagentes

Diluir 23,5 ml de ácido ortofosfórico (3.2) para 100 ml, com água.

Dissolver 1,36 g de KH2PO4 (3.1) em 500 ml de água (3.11); adicionar 3,5 ml de ácido ortofosfórico (3.2) e 10,0 ml de 6-metil-2-heptilamina (3.4). Ajustar o pH para 4,0 com solução de ácido ortofosfórico (3.3) e diluir para 1 000 ml com água (3.11).

Transferir 5,0 ml de ácido clorídrico (3.6) para um balão volumétrico de 1 000 ml, perfazer o volume com metanol (3.5) e agitar. Esta solução deve ser preparada imediatamente antes da sua utilização.

Misturar 5 ml de solução de tampão fosfato (3.7) com 95 ml de metanol (3.5).

Num balão volumétrico de 100 ml, pesar, com uma aproximação de 0,1 mg, 50 mg de lasalocido de sódio (3.10) e dissolver em metanol acidificado (3.8). Completar o volume com o mesmo solvente e homogeneizar. A solução deve ser preparada imediatamente antes da utilização.

Pipetar 10,0 ml da solução-mãe padrão (3.10.1) para um balão volumétrico de 100 ml, completar o volume com metanol acidificado (3.8) e homogeneizar. A solução deve ser preparada imediatamente antes da utilização.

Transferir 1,0 , 2,0 , 4,0 , 5,0 e 10,0 ml da solução-padrão intermédia (3.10.2) para uma série de balões volumetricos de 50 ml. Perfazer o volume com metanol acidificado (3.8) e homogeneizar. As soluções obtidas contêm 1,0 , 2,0 , 4,0 , 5,0 e 10,0 μg de lasalocido de sódio por ml, respectivamente, e são preparadas imediatamente antes da utilização.

4.   Equipamento

5.   Procedimento

5.1.   Generalidades

5.1.1.    Amostra de alimento para animais para o ensaio em branco

Para a realização do ensaio de recuperação (5.1.2) analisa-se uma amostra em branco de um alimento para animais para comprovar a ausência de lasalocido de sódio e de substâncias susceptíveis de interferir no processo. Essa amostra em branco deve ser de tipo similar ao da amostra em análise e não devem ser detectados lasalocido de sódio nem substâncias susceptíveis de interferir no processo.

5.1.2.    Ensaio de recuperação

Deve efectuar-se um ensaio de recuperação utilizando a amostra do ensaio em branco, fortificada com uma quantidade conhecida de lasalocido de sódio semelhante à quantidade presente na amostra. Para obter uma fortificação a um nível de 100 mg/kg, transferir 10,0 ml da solução-mãe padrão (3.10.1) para um erlenmeyer de 250 ml e concentrar por evaporação até cerca de 0,5 ml. Adicionar 50 g da amostra em branco, misturar bem e deixar em repouso durante 10 minutos, misturando de novo várias vezes antes de proceder à extracção (5.2).

Caso não se disponha de um alimento para animais para o ensaio em branco de tipo similar ao da amostra (ver 5.1.1), pode determinar-se a recuperação pelo método da adição de padrão. Nesse caso, adiciona-se à amostra a analisar uma quantidade de lasalocido de sódio semelhante à que já se encontra presente e analisa-se a amostra assim obtida juntamente com a amostra sem adição. A recuperação é calculada por subtracção.

5.2.   Extracção

5.2.1.    Alimentos para animais

Num erlenmeyer de 250 ml, pesar, com uma aproximação de 0,01 g, 5 a 10 g de amostra. Com uma pipeta, adicionar 100,0 ml de metanol acidificado (3.8). Tapar o erlenmeyer, homogeneizar e colocar no banho de ultra-sons (4.1) a cerca de 40 oC, durante 20 minutos. Retirar o erlenmeyer do banho e arrefecer à temperatura ambiente. Deixar repousar durante cerca de uma hora, até à deposição das matérias em suspensão, e filtrar uma alíquota com um filtro de membrana de 0,45 μm (4.2) para um recipiente adequado. Efectuar em seguida a análise por HPLC (5.3).

5.2.2.    Pré-misturas

Num erlenmeyer de 250 ml, pesar, com uma aproximação de 0,001 g, cerca de 2 g da pré-mistura. Adicionar 100,0 ml de metanol acidificado (3.8), homogeneizando por agitação. Colocar no banho de ultra-sons (4.1) a cerca de 40 oC, durante 20 minutos. Retirar o erlenmeyer do banho e arrefecer à temperatura ambiente. Diluir até ao traço com metanol acidificado (3.8) e agitar. Deixar repousar durante cerca de uma hora, até à deposição das matérias em suspensão, e filtrar uma alíquota com um filtro de membrana de 0,45 μm (4.2). Diluir um volume adequado do filtrado com metanol acidificado (3.8), de modo a obter uma solução de ensaio com cerca de 4 μg/ml de lasalocido de sódio. Efectuar em seguida a análise por HPLC (5.3).

5.3.   Análise por HPLC

5.3.1.    Parâmetros

As condições a seguir especificadas são-no a título indicativo. Poderão escolher-se outras condições, desde que produzam resultados equivalentes.

Para verificar a estabilidade do sistema cromatográfico, injectar várias vezes a solução de calibração (3.10.3) com 4,0 μg/ml até se obterem alturas (ou áreas) de pico e tempos de retenção constantes.

5.3.2.    Curva de calibração

Injectar várias vezes cada solução de calibração (3.10.3) e determinar a altura ou área média dos picos para cada concentração. Traçar uma curva de calibração, colocando a altura (ou área) média dos picos das soluções de calibração em ordenadas e as concentrações correspondentes, expressas em μg/ml, em abcissas.

5.3.3.    Solução de amostra

Injectar várias vezes volumes dos extractos de amostra obtidos em 5.2.1 e 5.2.2, idênticos ao volume utilizado para as soluções de calibração e determinar a altura ou a área média dos picos do lasalocido de sódio.

6.   Cálculo dos resultados

A partir da altura ou área média dos picos obtidos por injecção da solução da amostra (5.3.3), determinar a concentração de lasalocido de sódio em μg/ml com base na curva de calibração.

6.1.   Alimentos para animais

O teor de lasalocido de sódio, w, da amostra, expresso em mg/kg, é dado pela seguinte fórmula:

[mg/kg]

em que:

c

=

concentração de lasalocido de sódio, em μg/ml, do extracto da amostra (5.2.1)

V1

=

volume, em ml, do extracto, de acordo com 5.2.1 (isto é, 100 ml)

m

=

massa, em g, da toma analisada.

6.2.   Pré-misturas

O teor de lasalocido de sódio, w, da amostra, expresso em mg/kg, é dado pela seguinte fórmula:

[mg/kg]

em que:

c

=

concentração de lasalocido de sódio, em μg/ml, do extracto da amostra (5.2.2)

V2

=

volume, em ml, do extracto, de acordo com 5.2.2 (isto é, 250 ml)

f

=

factor de diluição, de acordo com 5.2.2

m

=

massa, em g, da toma analisada.

7.   Validação dos resultados

7.1.   Identidade

Os métodos baseados na espectrofluorimetria estão menos sujeitos a interferências que os métodos que utilizam um detector de UV. A identidade do analito pode ser confirmada por co-cromatografia.

7.1.1.    Co-cromatografia

Adiciona-se uma quantidade apropriada da solução de calibração (3.10.3) a um extracto da amostra (5.2.1 ou 5.2.2). A quantidade de lasalocido de sódio adicionada deve ser semelhante à existente no extracto da amostra. Apenas se deverá verificar um aumento da altura do pico correspondente ao lasalocido de sódio, atendendo à quantidade adicionada e à diluição do extracto. A largura do pico a meia altura não poderá diferir mais de 10 % da largura inicial do pico do lasalocido de sódio do extracto da amostra não fortificado.

7.2.   Repetibilidade

A diferença entre os resultados de duas determinações paralelas efectuadas com a mesma amostra não deve exceder:

7.3.   Recuperação

Utilizando uma amostra (em branco) fortificada, a recuperação deve ser pelo menos de 80 %. No respeitante às amostras de pré-misturas fortificadas, a recuperação deve ser pelo menos de 90 %.

8.   Resultados de um estudo interlaboratorial

Apresentam-se no quadro seguinte os resultados das análises efectuadas a duas pré-misturas (amostras 1 e 2) e cinco alimentos para animais (amostras 3 a 7) no âmbito de um estudo interlaboratorial ( *1 ) com 12 laboratórios. Para cada amostra, foram efectuadas análises em duplicado. Os resultados obtidos figuram no quadro seguinte:

L

=

número de laboratórios

n

=

número de valores individuais

sr

=

desvio-padrão da repetibilidade

SR

=

desvio-padrão da reprodutibilidade

CVr

=

coeficiente de variação da repetibilidade ( %)

CVR

=

coeficiente de variação da reprodutibilidade ( %)

---

ANEXO V

MÉTODOS DE ANÁLISE PARA O CONTROLO DE SUBSTÂNCIAS INDESEJÁVEIS NOS ALIMENTOS PARA ANIMAIS

A.   DETERMINAÇÃO DO GOSSIPOL LIVRE E TOTAL

1.   Objecto e âmbito de aplicação

Este método permite dosear o gossipol livre, o gossipol total e as substâncias quimicamente aparentadas, nas sementes, farinhas e bagaços de algodão, assim como nos alimentos compostos que os contêm em teor superior a 20 mg/kg.

2.   Princípio

O gossipol é extraído em presença de 3-aminopropan-1-ol, quer com uma mistura de propan-2-ol e hexano para o doseamento do gossipol livre, quer com dimetilformamida, para o doseamento do gossipol total. Por meio de anilina, procede-se à conversão do gossipol em gossipol-dianilina, cuja densidade óptica é medida a 440 nm.

3.   Reagentes

Conservadas ao abrigo da luz, as soluções-padrão A e B de gossipol são estáveis durante 24 horas.

4.   Equipamento

5.   Procedimento

5.1.    Amostra para ensaio

A dimensão da amostra para ensaio depende do teor presumido de gossipol na amostra. É preferível trabalhar com uma pequena amostra para ensaio e com uma alíquota do filtrado relativamente importante, de maneira a obter uma quantidade de gossipol suficiente para efectuar uma medida fotométrica precisa. Para o doseamento do gossipol livre nas sementes, nas farinhas e nos bagaços de algodão, a amostra para ensaio não deve exceder 1 g; para os alimentos compostos poderá atingir 5 g. Na maioria dos casos, uma alíquota de 10 ml do filtrado é conveniente: deverá conter 50 a 100 μg de gossipol. Para o doseamento do gossipol total, a amostra para ensaio poderá variar de 0,5 a 5 g para que uma alíquota de 2 ml do filtrado contenha 40 a 200 μg de gossipol.

A análise deve ser feita a uma temperatura ambiente próxima de 20 oC.

5.2.    Doseamento do gossipol livre

Introduzir a amostra para ensaio num balão de colo esmerilado de 250 ml, com o fundo coberto de vidro moído. Com uma pipeta, adicionar 50 ml de solvente A (3.2) rolhar o balão e misturar durante uma hora no misturador basculante. Filtrar num filtro seco e recolher o filtrado num pequeno balão de colo esmerilado. Durante a filtração, cobrir o funil com um vidro de relógio.

Pipetar alíquotas idênticas de filtrado contendo 50 a 100 μg de gossipol para dois balões volumétricos de 25 ml (A e B). Completar eventualmente o volume para 10 ml com o solvente A (3.2). Em seguida, perfazer o volume de 25 ml do balão A com a mistura de propan-2-ol-hexano (3.1). Esta solução será utilizada como solução de referência para a medição da solução da amostra.

Para dois outros balões volumétricos de 25 ml (balões C e D) pipetar 10 ml do solvente A (3.2). Completar o volume do balão C com a mistura de propan-2-ol-hexano (3.1). Esta solução será utilizada como solução de referência para a medição do ensaio em branco.

A cada um dos balões B e D, adicionar 2 ml de anilina (3.4). Aquecer durante 30 minutos num banho-maria em ebulição para fazer desenvolver a coloração. Arrefecer até à temperatura ambiente, perfazer o volume de 25 ml com a mistura de propan-2-ol-hexano (3.1), homogeneizar e deixar repousar durante uma hora.

Determinar em espectrofotómetro a 440 nm, em células de vidro de 1 cm, a densidade óptica da solução do ensaio em branco (D), por comparação com a solução de referência (C) e a densidade óptica da solução da amostra (B) por comparação com a solução de referência (A).

Subtrair a densidade óptica da solução do ensaio em branco da densidade óptica da solução da amostra (= densidade óptica corrigida). Calcular, a partir deste valor, o teor de gossipol livre, com indicado no ponto 6.

5.3.    Doseamento do gossipol total

Introduzir uma amostra para ensaio contendo de 1 a 5 mg de gossipol num balão volumétrico de 50 ml e adicionar 10 ml de solvente B (3.3). Preparar simultaneamente um ensaio em branco, introduzindo 10 ml de solvente B (3.3) noutro balão volumétrico de 50 ml. Aquecer os dois balões durante 30 minutos num banho-maria em ebulição. Arrefecer até à temperatura ambiente e perfazer o volume de cada balão com a mistura de propan-2-ol-hexano (3.1). Homogeneizar e deixar assentar durante 10 a 15 minutos, filtrar em seguida e recolher os filtrados em balões de colo esmerilado.

Para dois balões volumétricos de 25 ml, pipetar 2 ml do filtrado da amostra e para dois outros balões de 25 ml, pipetar 2 ml do filtrado do ensaio em branco. Para um balão de cada série, perfazer o volume de 25 ml com a mistura de propan-2-ol-hexano (3.1). Estas soluções serão utilizadas como soluções de referência.

A cada um dos dois outros balões, adicionar 2 ml de anilina (3.4). Aquecer durante 30 minutos num banho-maria em ebulição para fazer desenvolver a coloração. Arrefecer até à temperatura ambiente, perfazer o volume de 25 ml com a mistura de propan-2-ol-hexano (3.1), homogeneizar e deixar repousar durante uma hora.

Determinar a densidade óptica, como indicado no ponto 5.2 para o gossipol livre. Calcular, a partir deste valor, o teor de gossipol total, como indicado no ponto 6.

6.   Cálculo dos resultados

O cálculo dos resultados pode fazer-se quer a partir da densidade óptica específica (6.1) quer por referência a uma curva de calibração (6.2).

6.1.    A partir da densidade óptica específica

Nas condições descritas, as densidades ópticas específicas são as seguintes:

O teor de gossipol livre ou total da amostra é dado pela seguinte fórmula:

em que:

E

=

densidade óptica corrigida, determinada como indicado no ponto 5.2

p

=

massa, em g, da amostra para ensaio

a

=

alíquota do filtrado, em ml.

6.2.    A partir de uma curva de calibração

6.2.1.    Gossipol livre

Preparar duas séries de cinco balões volumétricos de 25 ml. Em cada série, pipetar para os balões, respectivamente, 2,0 , 4,0 , 6,0 , 8,0 e 10,0 ml da solução-padrão A de gossipol (3.5). Completar o volume de 10 ml com o solvente A (3.2). Completar cada série com um balão volumétrico de 25 ml contendo unicamente 10 ml de solvente A (3.2) (ensaio em branco).

Nos balões da primeira série (incluindo o do ensaio em branco), perfazer o volume de 25 ml com a mistura propan-2-ol-hexano (3.1) (série de referência).

A cada balão da segunda série (incluindo o do ensaio em branco) adicionar 2 ml de anilina (3.4). Aquecer durante 30 minutos num banho-maria em ebulição para fazer desenvolver a coloração. Arrefecer até à temperatura ambiente, perfazer o volume de 25 ml com a mistura de propan-2-ol-hexano (3.1), homogeneizar e deixar repousar durante uma hora (série-padrão).

Tal como se indica no ponto 5.2, determinar a densidade óptica das soluções da série-padrão, por comparação com as soluções correspondentes da série de referência. Traçar a curva de calibração representado os valores da densidade óptica em função das quantidades correspondentes de gossipol (em μg).

6.2.2.    Gossipol total

Preparar 6 balões volumétricos de 50 ml. No primeiro balão, introduzir 10 ml de solvente B (3.3) e nos outros, respectivamente, 2,0 , 4,0 , 6,0 , 8,0 e 10,0 ml da solução-padrão B de gossipol (3.6). Completar o conteúdo de cada balão para 10 ml com solvente B (3.3). Aquecer durante 30 minutos num banho-maria em ebulição. Arrefecer até à temperatura ambiente, completar o volume com a mistura de propan-2-ol-hexano (3.1) e homogeneizar.

Introduzir 2,0 ml de cada uma destas soluções em, respectivamente, duas séries de seis balões volumétricos de 25 ml. Nos balões da primeira série, perfazer o volume de 25 ml com a mistura propan-2-ol-hexano (3.1) (série de referência).

A cada balão da segunda série adicionar 2 ml de anilina (3.4). Aquecer durante 30 minutos num banho-maria em ebulição. Arrefecer até à temperatura ambiente, perfazer o volume de 25 ml com a mistura de propan-2-ol-hexano (3.1), homogeneizar e deixar repousar durante uma hora (série-padrão).

Tal como se indica no ponto 5.2, determinar a densidade óptica das soluções da série-padrão, por comparação com as soluções correspondentes da série de referência. Traçar a curva de calibração representado os valores da densidade óptica em função das quantidades correspondentes de gossipol (em μg).

6.3.    Repetibilidade

A diferença entre os resultados de duas determinações paralelas efectuadas com a mesma amostra não deve exceder:

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B.   DETERMINAÇÃO DOS TEORES DE DIOXINAS (PCDD/PCDF) E DE PCB

CAPÍTULO I

Métodos de amostragem e interpretação dos resultados analíticos

1.    Âmbito de aplicação e definições

As amostras destinadas ao controlo oficial dos teores de dibenzo-p-dioxinas policloradas (PCDD), dibenzofuranos policlorados (PCDF), bifenilos policlorados (PCB) sob a forma de dioxina ( 16 ) e PCB não semelhantes a dioxinas nos alimentos para animais devem ser colhidas em conformidade com os métodos descritos no anexo I. Devem aplicar-se as exigências quantitativas respeitantes ao controlo de substâncias ou produtos repartidos uniformemente nos alimentos, tal como se estabelece no ponto 5.1 do anexo I. As amostras globais assim obtidas são consideradas representativas dos lotes ou sublotes dos quais foram colhidas. A observância dos teores máximos fixados pela Diretiva 2002/32/CE deve ser estabelecida com base nos teores determinados nas amostras de laboratório.

Para efeitos da presente parte B, aplicam-se as definições estabelecidas no anexo I da Decisão 2002/657/CE da Comissão ( 17 ).

Para além destas definições, para efeitos do disposto na presente parte B são aplicáveis as seguintes definições:

«Métodos de pré-seleção» : os métodos utilizados para a seleção de amostras com teores de PCDD/F e PCB sob a forma de dioxina que excedam os teores máximos ou os limiares de intervenção. Devem apresentar uma elevada capacidade de processamento de amostras com uma boa relação custo-eficácia, aumentando assim a oportunidade de descobrir novos incidentes com elevada exposição e riscos para a saúde dos consumidores. Os métodos de pré-seleção devem basear-se em métodos bioanalíticos ou em GC-MS. Os resultados de amostras que excedem o valor-limite utilizado para verificar a conformidade com o teor máximo devem ser verificados por uma reanálise completa da amostra inicial utilizando um método de confirmação.

«Métodos de confirmação» : os métodos que fornecem informações completas ou complementares que permitem a identificação e quantificação inequívocas de PCDD/F e de PCB sob a forma de dioxina no teor máximo ou, em caso de necessidade, no limiar de intervenção. Estes métodos utilizam a cromatografia gasosa/espectrometria de massa de alta resolução (GC-HRMS) ou a cromatografia gasosa/espectrometria de massa em tandem (GC-MS/MS).

2.    Conformidade do lote ou do sublote com o teor máximo

2.1.    No que se refere a PCB não semelhantes a dioxinas

O lote ou sublote está conforme com o teor máximo se o resultado analítico para a soma de PCB 28, PCB 52, PCB 101, PCB 138, PCB 153 e PCB 180 (a seguir referidos como PCB não semelhantes a dioxinas) não for superior ao teor máximo estabelecido na Diretiva 2002/32/CE, tomando em consideração a incerteza expandida de medição ( 18 ). O lote ou sublote não está conforme com o teor máximo estabelecido na Diretiva 2002/32/CE se a média dos dois limites superiores ( 19 ) dos resultados analíticos obtidos a partir de uma análise em duplicado ( 20 ), tendo em conta a incerteza expandida de medição, for superior ao teor máximo com um grau de confiança elevado, ou seja, utiliza-se, para avaliar a conformidade, a concentração analisada após dedução da incerteza expandida de medição.

A incerteza expandida de medição é calculada utilizando um fator de expansão de 2, que permite obter um nível de confiança de cerca de 95 %. Um lote ou sublote não está conforme se a média dos valores medidos menos a incerteza expandida da média for superior ao teor máximo.

As regras descritas no presente ponto são aplicáveis ao resultado analítico obtido na amostra para controlo oficial. No caso de análises para efeitos de direito de recurso ou de procedimentos de arbitragem, são aplicáveis as normas nacionais.

2.2.    No que se refere a PCDD/F e a PCB sob a forma de dioxina

O lote ou sublote está conforme com o teor máximo se o resultado de uma única análise,

Em relação aos ensaios de pré-seleção, deve ser estabelecido um valor-limite para decidir da conformidade da amostra com os respetivos teores máximos fixados quer para PCDD/F, quer para a soma de PCDD/F e PCB sob a forma de dioxina.

O lote ou sublote não está conforme com o teor máximo estabelecido na Diretiva 2002/32/CE se a média dos dois limites superiores ( 21 ) dos resultados analíticos obtidos com uma análise em duplicado ( 22 ) utilizando um método de confirmação, tendo em conta a incerteza expandida de medição, for superior ao teor máximo com um grau de confiança elevado, ou seja, utiliza-se, para avaliar a conformidade, a concentração analisada, após dedução da incerteza expandida de medição.

A incerteza expandida de medição é calculada utilizando um fator de expansão de 2, que permite obter um nível de confiança de cerca de 95 %. Um lote ou sublote não está conforme se a média dos valores medidos menos a incerteza expandida da média for superior ao teor máximo.

Para a soma dos PCDD/F e dos PCB sob a forma de dioxina, deve utilizar-se a soma das incertezas expandidas estimadas dos resultados analíticos obtidos separadamente para PCDD/F e PCB sob a forma de dioxina.

As regras descritas no presente ponto são aplicáveis ao resultado analítico obtido na amostra para controlo oficial. No caso de análises para efeitos de direito de recurso ou de procedimentos de arbitragem, são aplicáveis as normas nacionais.

3.    Resultados superiores aos limiares de intervenção estabelecidos no Anexo II da Diretiva 2002/32/CE

Os limiares de intervenção servem de instrumento para a seleção de amostras nos casos em que é necessário identificar uma fonte de contaminação e adotar medidas com vista à sua redução ou eliminação. Os métodos de pré-seleção devem estabelecer os valores-limite adequados para a seleção daquelas amostras. Caso sejam necessários esforços significativos para identificar a fonte e reduzir ou eliminar a contaminação, é adequado confirmar a superação dos limiares de intervenção por uma análise em duplicado mediante um método de confirmação e tendo em conta a incerteza expandida de medição ( 23 ).

CAPÍTULO II

Preparação das amostras e requisitos respeitantes aos métodos de análise utilizados no controlo oficial dos teores de dioxinas (PCDD/PCDF) e de PCB sob a forma de dioxina em alimentos para animais

1.    Âmbito de aplicação

Os requisitos estabelecidos no presente capítulo devem ser aplicados quando se analisam alimentos para animais para efeitos de controlo oficial dos teores de PCDD/F substituídos nas posições 2,3,7 e 8 e de PCB sob a forma de dioxina, bem como no que se refere à preparação das amostras e aos requisitos analíticos para outros fins regulamentares, incluindo os controlos efetuados pelos operadores das empresas do setor dos alimentos para animais para assegurar a conformidade com o disposto no Regulamento (CE) n.o 183/2005 do Parlamento Europeu e do Conselho ( 24 ).

A monitorização da presença de PCDD/F e PCB sob a forma de dioxina nos alimentos para animais pode ser realizada com dois tipos diferentes de métodos analíticos:

2.    Contexto

Para o cálculo de concentrações de TEQ, as concentrações de cada substância numa determinada amostra devem ser multiplicadas pelos respetivos fatores de equivalência tóxica (FET) (ver nota de rodapé 1 do capítulo I), sendo subsequentemente somadas para darem a concentração total de compostos sob a forma de dioxina expressa em TEQ.

Para efeitos da presente parte B, por limite de quantificação específico aceite de um congénere individual, entende-se o teor mais baixo do analito que pode ser medido com uma certeza estatística razoável, cumprindo os critérios de identificação tal como descritos em normas reconhecidas internacionalmente, por exemplo, na norma EN 16215:2012 (Alimentação animal — determinação de dioxinas e de PCB sob a forma de dioxina por GC-HRMS e de PCB indicadores por GC-HRMS) e/ou nos métodos EPA 1613 e 1668, na sua forma revista.

O limite de quantificação de um congénere individual pode ser identificado como:

Os métodos de pré-seleção bioanalíticos não darão resultados ao nível dos congéneres, mas apenas uma indicação ( 25 ) do valor TEQ, expresso em BEQ para ter em conta o facto de que nem todos os compostos presentes num extrato de amostra que produz uma resposta no teste podem cumprir todos os requisitos do princípio de TEQ.

Os métodos de pré-seleção e de confirmação apenas podem ser aplicados para o controlo de uma determinada matriz se forem suficientemente sensíveis para detetar fiavelmente os teores no limiar de intervenção ou no teor máximo.

3.    Requisitos de garantia da qualidade

3.1.	Devem ser tomadas medidas para evitar a contaminação cruzada em cada etapa do procedimento de amostragem e de análise.

3.2.

As amostras devem ser conservadas e transportadas em recipientes de vidro, alumínio, polipropileno ou polietileno, adequados para o armazenamento sem qualquer influência nos teores de PCDD/F e PCB sob a forma de dioxina das amostras. Devem ser removidos do recipiente da amostra os vestígios de poeiras de papel.

3.3.	O armazenamento e o transporte das amostras devem ser realizados de modo a manter a integridade da amostra de alimentos para animais.

3.4.

Desde que relevante, cada amostra de laboratório deve ser finamente triturada e cuidadosamente misturada, mediante um processo que tenha demonstrado alcançar uma homogeneização completa (por exemplo, trituração que permita passar por um crivo de 1 mm). As amostras devem ser exsicadas antes da trituração, caso o teor em humidade seja demasiado elevado.

3.5.	Deve proceder-se ao controlo dos reagentes, do material de vidro e do equipamento relativamente a uma eventual influência nos resultados baseados em TEQ ou em BEQ.

3.6.	Deve ser efetuada uma análise em branco através da realização de todo o procedimento analítico, omitindo apenas a amostra.

3.7.

Relativamente aos métodos bioanalíticos, devem testar-se todo o material de vidro e os solventes utilizados na análise para verificar se estão isentos de compostos que interfiram com a deteção de compostos-alvo na gama de trabalho. O material de vidro deve ser enxaguado com solventes ou aquecido a temperaturas adequadas para remover da sua superfície vestígios de PCDD/F, de compostos sob a forma de dioxina e de compostos interferentes.

3.8.	A quantidade da amostra utilizada para a extração deve ser suficiente para cumprir os requisitos relativos a uma gama de trabalho suficientemente baixa, incluindo as concentrações dos teores máximos ou do limiar de intervenção.

3.9.	Os procedimentos específicos de preparação de amostras utilizados para os produtos em causa devem seguir orientações aceites internacionalmente.

4.    Requisitos aplicáveis aos laboratórios

4.1.

Em conformidade com o disposto no Regulamento (CE) n.o 882/2004, os laboratórios devem ser acreditados por um organismo reconhecido que opere em conformidade com o Guia ISO 58, a fim de assegurar que aplicam a garantia de qualidade analítica. Os laboratórios devem ser acreditados em conformidade com a norma EN ISO/IEC/17025. Devem seguir-se, quando aplicáveis, os princípios descritos nas orientações técnicas relativas à estimativa da incerteza de medição e dos limites de quantificação para a análise de PCDD/F e PCB ( 26 ).

4.2.	A competência de um laboratório deve ser comprovada mediante uma participação contínua e bem-sucedida em estudos interlaboratoriais para a determinação de PCDD/F e de PCB sob a forma de dioxina nas matrizes de alimentos para animais e gamas de concentrações relevantes.

4.3.	Os laboratórios que aplicam métodos de pré-seleção para o controlo de rotina de amostras devem estabelecer uma estreita cooperação com os laboratórios que aplicam o método de confirmação, tanto para o controlo da qualidade como para a confirmação do resultado analítico de amostras suspeitas.

5.    Requisitos básicos a cumprir pelo procedimento analítico para determinação de dioxinas (PCDD/F) e de PCB sob a forma de dioxina

5.1.    Gama de trabalho e limites de quantificação reduzidos

Para os PCDD/F, as quantidades detetáveis devem situar-se na gama alta dos femtogramas (10– 15 g) devido à extrema toxicidade de alguns destes compostos. Para a maioria dos congéneres de PCB, o limite de quantificação na gama dos nanogramas (10– 9 g) já é suficiente. Quanto à medição dos congéneres de PCB sob a forma de dioxina mais tóxicos (designadamente, os congéneres não-orto substituídos), o limite inferior da gama de trabalho deve atingir os valores inferiores dos picogramas (10– 12 g). Para todos os restantes congéneres de PCB, é suficiente um limite de quantificação na gama dos nanogramas (10– 9 g).

5.2.    Seletividade (especificidade) elevada

5.2.1.

É necessário estabelecer uma distinção entre PCDD/F e PCB sob a forma de dioxina e inúmeros outros compostos coextraídos e eventualmente interferentes, que estão presentes em concentrações superiores em várias ordens de grandeza às dos analitos requeridos. Nos métodos de GC-MS, é necessária uma diferenciação entre vários congéneres, nomeadamente entre congéneres tóxicos (por exemplo, os dezassete PCDD/F substituídos nas posições 2,3,7 e 8 e os doze PCB sob a forma de dioxina) e outros congéneres.

5.2.2.

Os métodos bioanalíticos devem ser capazes de detetar os compostos-alvo como a soma de PCDD/F e/ou de PCB sob a forma de dioxina. A limpeza (clean-up) das amostras destina-se à remoção de compostos conducentes a falsos resultados não conformes ou compostos que possam diminuir a resposta, provocando falsos resultados conformes.

5.3.    Exatidão elevada (rigor e precisão, recuperação aparente do bioensaio)

5.3.1.

Para os métodos GC-MS, a determinação deve fornecer uma estimativa válida da verdadeira concentração numa amostra. É necessária uma exatidão elevada para se evitar a rejeição do resultado da análise de uma amostra devido à reduzida fiabilidade do valor TEQ determinado. A exatidão é expressa em termos de rigor (diferença entre o valor médio medido para um analito num material certificado e o respetivo valor certificado, expresso em percentagem deste valor) e de precisão (RSDR, desvio-padrão relativo, calculado a partir de resultados obtidos em condições de reprodutibilidade).

5.3.2.

Para métodos bioanalíticos, deve ser determinada a recuperação aparente do bioensaio. Por recuperação aparente do bioensaio, entende-se o valor BEQ calculado a partir da curva de calibração de TCDD ou do PCB 126 corrigido em função do resultado do ensaio em branco e, em seguida, dividido pelo valor TEQ determinado pelo método de confirmação. Visa corrigir fatores como a perda de PCDD/F e de compostos sob a forma de dioxina durante as fases de extração e de limpeza, compostos coextraídos que aumentam ou diminuem a resposta (efeitos agonistas e antagonistas), a qualidade do ajustamento da curva, ou diferenças entre os valores FET e os valores da potência relativa (REP). A recuperação aparente do bioensaio é calculada a partir de amostras de referência apropriadas com padrões de congéneres representativos próximos do teor requerido.

5.4.    Validação na gama do teor máximo e medidas gerais de controlo de qualidade

5.4.1.

Os laboratórios devem demonstrar o desempenho de um método na gama do teor máximo (por exemplo, 0,5 vezes, uma vez e duas vezes o teor máximo) com um coeficiente de variação aceitável para análises repetidas, durante o procedimento de validação e durante a análise de rotina.

5.4.2.

Devem realizar-se controlos regulares com ensaios em branco e com amostras enriquecidas ou análises de amostras de controlo (de preferência, se disponível, material de referência certificado) como medidas internas de controlo da qualidade. Devem registar-se e verificar-se os gráficos de controlo da qualidade para ensaios em branco, com amostras enriquecidas ou análises de amostras de controlo, a fim de garantir que o desempenho analítico está em conformidade com os requisitos.

5.5.    Limite de quantificação

5.5.1.

No que diz respeito ao método bioanalítico de pré-seleção, o estabelecimento do limite de quantificação (LOQ) não é um requisito indispensável, mas deve provar-se que o método consegue fazer a diferenciação de todos os valores situados entre o valor do ensaio em branco e o valor-limite. Quando se transmite um valor BEQ, deve ser estabelecido um nível de notificação para lidar com amostras com uma resposta abaixo desse nível. Deve demonstrar-se que o nível de notificação é diferente, pelo menos por um fator de três, das amostras em branco do procedimento, com uma resposta inferior à gama de trabalho. Por conseguinte, deve ser calculado a partir de amostras que contenham os compostos-alvo próximo do teor mínimo exigido, e não a partir de um rácio S/R ou de um ensaio em branco.

5.5.2.

O LOQ de um método de confirmação deve ser de cerca de um quinto do teor máximo.

5.6.    Critérios analíticos

Para se obterem resultados fiáveis de métodos de confirmação ou de pré-seleção, devem ser satisfeitos os seguintes critérios na gama do teor máximo para o valor TEQ ou o valor BEQ, respetivamente, quer determinado como valor TEQ total ou valor BEQ total (como a soma de PCDD/F e PCB sob a forma de dioxina) quer separadamente para PCDD/F e PCB sob a forma de dioxina.

5.7.    Requisitos específicos para métodos de pré-seleção

5.7.1.

Na pré-seleção podem ser utilizados tanto GC-MS como métodos bioanalíticos. Em relação aos métodos GC-MS, devem respeitar-se os requisitos descritos no ponto 6. Para os métodos bioanalíticos baseados em células, os requisitos específicos estão descritos no ponto 7.

5.7.2.

Os laboratórios que aplicam métodos de pré-seleção para o controlo de rotina de amostras devem estabelecer uma estreita cooperação com os laboratórios que aplicam o método de confirmação.

5.7.3.

A verificação do desempenho do método de pré-seleção é necessária durante a análise de rotina, por controlo da qualidade analítica e validação contínua do método. Deve existir um programa contínuo para o controlo dos resultados conformes.

5.7.4.

Controlo da eventual supressão da resposta das células e da citotoxicidade: 20 % dos extratos de amostras devem ser medidos em pré-seleção de rotina com e sem adição de 2,3,7,8-TCDD, correspondente ao teor máximo ou ao limiar de intervenção, a fim de verificar se a resposta é eventualmente suprimida por substâncias interferentes presentes no extrato da amostra. A concentração medida da amostra enriquecida deve ser comparada com a soma da concentração do extrato não enriquecido mais a concentração do enriquecimento. Se esta concentração medida for inferior, em mais de 25 %, à concentração (soma) calculada, tal é uma indicação de uma potencial supressão do sinal e a respetiva amostra deve ser submetida a análise de confirmação por GC-HRMS. Os resultados devem ser monitorizados através de gráficos de controlo de qualidade.

5.7.5.

Controlo da qualidade de amostras conformes: Aproximadamente 2 % a 10 % das amostras conformes, dependendo da matriz da amostra e da experiência adquirida no laboratório, devem ser confirmadas por GC/HRMS.

5.7.6.

Determinação das taxas de falsos resultados conformes a partir de dados de controlo da qualidade: Deve determinar-se a taxa de falsos resultados conformes obtidos na pré-seleção de amostras abaixo e acima do teor máximo ou do limiar de intervenção. As taxas reais de falsos resultados conformes devem ser inferiores a 5 %. Quando o controlo da qualidade de amostras conformes revelar, pelo menos, 20 resultados confirmados por matriz/grupo de matrizes, devem ser retiradas conclusões sobre a taxa de falsos resultados conformes a partir dessa base de dados. Os resultados das amostras analisadas em ensaios interlaboratoriais ou durante incidentes de contaminação, abrangendo uma gama de concentrações que pode atingir, por exemplo, duas vezes o teor máximo (TM), podem também ser incluídos no mínimo de 20 resultados para a avaliação da taxa de falsos resultados conformes. As amostras devem abranger os padrões de congéneres mais frequentes, que representem diferentes fontes. Embora os testes de pré-seleção devam, de preferência, ter como objetivo a deteção de amostras que excedem o limiar de intervenção, o critério para determinar as taxas de falsos resultados conformes é o teor máximo, tendo em conta a incerteza de medição do método de confirmação.

5.7.7.

As amostras potencialmente não conformes na pré-seleção devem ser sempre verificadas por uma reanálise completa da amostra inicial por um método de análise de confirmação. Estas amostras podem também servir para avaliar a taxa de falsos resultados não conformes. Relativamente aos métodos de pré-seleção, a taxa de falsos resultados não conformes é a fração dos resultados que foram confirmados como conformes por análises de confirmação, quando na pré-seleção anterior a amostra tinha sido declarada potencialmente não conforme. A avaliação das vantagens do método de pré-seleção deve basear-se na comparação das amostras com falsos resultados não conformes com o número total de amostras verificadas. Esta taxa deve ser suficientemente baixa para tornar vantajoso o uso do instrumento de pré-seleção.

5.7.8.

Nas condições de validação, os métodos bioanalíticos devem fornecer uma indicação válida do valor TEQ, calculado e expresso em BEQ. Também em relação aos métodos bioanalíticos levados a cabo em condições de repetibilidade, a RSDr intralaboratorial é tipicamente mais baixa do que em condições de reprodutibilidade (RSDR).

6.    Requisitos específicos aplicáveis aos métodos GC-MS a respeitar para efeitos de pré-seleção ou de confirmação

6.1.    Diferenças aceitáveis entre o limite superior e o limite inferior dos resultados TEQ-OMS

A diferença entre o limite superior e o limite inferior não deve exceder 20 % no caso de confirmação da superação do teor máximo ou, em caso de necessidade, dos limiares de intervenção.

6.2.    Controlo das recuperações

6.2.1.

Logo no início do método analítico, por exemplo antes da extração, deve proceder-se à adição de padrões internos de PCDD/F marcados com 13C e substituídos com cloro nas posições 2,3,7 e 8 e de padrões internos de PCB sob a forma de dioxina marcados com 13C, por forma a validar o procedimento analítico. Deve ser adicionado, pelo menos, um congénere para cada grupo homólogo de PCDD/F tetra a octa-clorado e, pelo menos, um congénere para cada grupo homólogo de PCB sob a forma de dioxina (alternativamente, deve ser utilizado para o controlo de PCDD/F e de PCB sob a forma de dioxina, pelo menos, um congénere para cada função de registo de iões selecionados por espetrometria de massa). No caso dos métodos de confirmação, deve utilizar-se a totalidade dos 17 padrões internos de PCDD/F substituídos nas posições 2,3,7 e 8 e marcados com 13C e a totalidade dos 12 padrões internos de PCB sob a forma de dioxina marcados com 13C.

6.2.2.

Também devem ser determinados fatores de resposta relativos no caso dos congéneres para os quais não se adiciona um composto análogo marcado com 13C, através da utilização de soluções de calibração adequadas.

6.2.3.

Em relação aos alimentos para animais de origem vegetal e aos alimentos para animais de origem animal que contenham menos de 10 % de gorduras, a adição de padrões internos é obrigatória antes da extração. Em relação aos alimentos para animais de origem animal que contenham mais de 10 % de gorduras, os padrões internos são adicionados antes ou após a extração de gorduras. Deve ser efetuada uma validação adequada da eficiência da extração, dependendo da fase em que são introduzidos os padrões internos.

6.2.4.

Antes da análise por GC-MS, devem ser adicionados 1 ou 2 padrões de recuperação (substitutos).

6.2.5.

É necessário efetuar o controlo da recuperação. Para os métodos de confirmação, as recuperações de cada padrão interno devem situar-se no intervalo de 60 % a 120 %. São aceitáveis recuperações inferiores ou superiores para congéneres individuais, nomeadamente para algumas dibenzo-p-dioxinas e alguns dibenzofuranos hepta- e octa-clorados, desde que o seu contributo para o valor TEQ não exceda 10 % do valor TEQ total (com base na soma de PCDD/F e PCB sob a forma de dioxina). Para os métodos de pré-seleção GC-MS, as recuperações devem situar-se no intervalo de 30 % a 140 %.

6.3.    Remoção de substâncias interferentes

6.4.    Calibração com curva padrão

A gama da curva de calibração deve abranger a gama relevante do teor máximo ou dos limiares de intervenção.

6.5.    Critérios específicos para métodos de confirmação

7.    Requisitos específicos para métodos bioanalíticos

Os métodos bioanalíticos são métodos baseados na utilização de princípios biológicos, como ensaios com células, ensaios com recetores ou imunoensaios. O presente ponto 7 estabelece requisitos para os métodos bioanalíticos em geral.

Um método de pré-seleção, em princípio, classifica uma amostra como conforme ou suspeita de ser não conforme. Para tal, o valor BEQ calculado é comparado com o valor-limite (ver ponto 7.3). As amostras abaixo do valor-limite são declaradas conformes, as amostras iguais ou acima do valor-limite são declaradas suspeitas de ser não conformes e necessitam de uma análise por um método de confirmação. Na prática, um valor BEQ correspondente a dois terços do limite máximo pode servir como valor-limite, desde que se assegure uma taxa de falsos resultados conformes inferior a 5 % e uma taxa aceitável de falsos resultados não conformes. Com teores máximos distintos para os PCDD/F e para a soma dos PCDD/F e dos PCB sob a forma de dioxina, a verificação da conformidade das amostras sem fracionamento requer valores-limite de bioensaio adequados para os PCDD/F. Para a verificação de amostras que excedam os limiares de intervenção, uma percentagem adequada do respetivo limiar de intervenção servirá como valor-limite.

Se um teor indicativo for expresso em BEQ, os resultados da amostra devem ser apresentados na gama de trabalho e devem exceder o limite de notificação (ver pontos 7.1.1 e 7.1.6).

7.1.    Avaliação da resposta do teste

7.1.1.    Requisitos gerais

7.1.2.    Calibração

7.1.2.1.   Calibração com curva padrão

7.1.2.2.   Calibração com amostras de referência

Em alternativa, pode utilizar-se uma curva de calibração preparada a partir de, pelo menos, quatro amostras de referência (ver ponto 7.2.4): podem usar-se um ensaio em branco da matriz e três amostras de referência com 0,5 vezes, uma vez e duas vezes o teor máximo ou o limiar de intervenção, eliminando a necessidade de correção em função do ensaio em branco e da recuperação se as propriedades da matriz das amostras de referência corresponderem às das amostras com teor desconhecido. Neste caso, a resposta do teste correspondente a dois terços do teor máximo (ver ponto 7.3) pode ser calculada diretamente a partir destas amostras e servir de valor-limite. Para a verificação de amostras que excedam os limiares de intervenção, o valor-limite poderá ser uma percentagem adequada destes limiares de intervenção.

7.1.3.    Determinação em separado de PCDD/F e PCB sob a forma de dioxina

Os extratos podem ser divididos em frações contendo PCDD/F e PCB sob a forma de dioxina, permitindo uma indicação separada dos valores TEQ (em BEQ) de PCDD/F e de PCB sob a forma de dioxina. Convém utilizar, de preferência, uma curva de calibração-padrão do PCB 126 para avaliar os resultados da fração que contém PCB sob a forma de dioxina.

7.1.4.    Recuperações aparentes do bioensaio

A «recuperação aparente do bioensaio» deve ser calculada a partir de amostras de referência adequadas com padrões de congéneres representativos próximos do teor máximo ou do limiar de intervenção e expressa em percentagem do valor BEQ em comparação com o valor TEQ. Em função do tipo de ensaio e dos FET utilizados ( 27 ), as diferenças entre os fatores FET e REP relativos aos PCB sob a forma de dioxina podem causar recuperações aparentes baixas para os PCB sob a forma de dioxina em comparação com os PCDD/F. Por conseguinte, no caso de uma determinação em separado de PCDD/F e de PCB sob a forma de dioxina, as recuperações aparentes do bioensaio devem ser: para os PCB sob a forma de dioxina, de 20 % a 60 %, para os PCDD/F, de 50 % a 130 % (as gamas aplicam-se à curva de calibração de TCDD). Como o contributo dos PCB sob a forma de dioxina para a soma de PCDD/F e PCB sob a forma de dioxina pode variar entre diferentes matrizes e amostras, as recuperações aparentes do bioensaio para a soma de PCDD/F e PCB sob a forma de dioxina refletem estas gamas e devem situar-se entre 30 % e 130 %. Qualquer implicação que a revisão substancial dos valores FET tenha para a legislação da União relativa aos PCDD/F e PCB sob a forma de dioxina exige a revisão destas gamas.

7.1.5.    Controlo das recuperações para a limpeza (clean-up)

A perda de compostos durante a limpeza deve ser verificada durante a validação. Uma amostra em branco enriquecida com uma mistura dos diferentes congéneres deve ser submetida a limpeza (pelo menos, n = 3) e a recuperação e a variabilidade verificadas por um método de confirmação. A recuperação deve situar-se entre 60 % e 120 %, em especial para congéneres que contribuam mais de 10 % para o valor TEQ em várias misturas.

7.1.6.    Limite de notificação

Ao notificar valores BEQ, deve ser determinado um limite de notificação a partir de amostras de matriz pertinentes que envolvam padrões de congéneres típicos, mas não a partir da curva de calibração dos padrões, devido à baixa precisão na gama inferior da curva. Devem ser tidos em conta os efeitos da extração e da limpeza. O limite de notificação deve ser estabelecido em, pelo menos, três vezes o valor dos ensaios em branco do procedimento.

7.2.    Utilização de amostras de referência

7.2.1.

As amostras de referência devem representar a matriz da amostra, os padrões de congéneres e as gamas de concentrações dos PCDD/F e dos PCB sob a forma de dioxina próximos do teor máximo ou do limiar de intervenção.

7.2.2.

Cada série de testes deve comportar um ensaio em branco da matriz e, caso tal não seja possível, um ensaio em branco do procedimento, bem como uma amostra de referência com o teor máximo ou o limiar de intervenção. Estas amostras devem ser extraídas e testadas ao mesmo tempo e em condições idênticas. A amostra de referência deve apresentar uma resposta claramente elevada em comparação com a amostra em branco, assegurando assim a adequação do teste. Essas amostras podem ser utilizadas para as correções em função do ensaio em branco e da recuperação.

7.2.3.

As amostras de referência escolhidas para efetuar uma correção em função da recuperação devem ser representativas das amostras de ensaio, o que significa que os padrões dos congéneres não podem conduzir a uma subestimação dos teores.

7.2.4.

Podem incluir-se amostras de referência suplementares com, por exemplo, teores 0,5 vezes e duas vezes superiores ao teor máximo ou ao limiar de intervenção, para demonstrar o desempenho correto do teste dentro da gama requerida para o controlo do teor máximo ou do limiar de intervenção. Combinadas, estas amostras podem ser utilizadas para calcular os valores BEQ das amostras de ensaio (ver ponto 7.1.2.2).

7.3.    Determinação de valores-limite

A relação entre os resultados bioanalíticos em BEQ e os resultados do método de confirmação em TEQ deve ser estabelecida, por exemplo através de experiências de calibração ajustadas em função da matriz, envolvendo amostras de referência enriquecidas a 0, 0,5 vezes, uma vez e duas vezes o TM, com seis repetições em cada teor (n = 24). Os fatores de correção (do ensaio em branco e da recuperação) podem ser estimados a partir desta relação, mas devem ser verificados em conformidade com o ponto 7.2.2.

Devem ser estabelecidos valores-limite para decidir da conformidade da amostra com os teores máximos ou para verificar se os limiares de intervenção, se relevantes, estão conformes aos respetivos teores máximos ou limiares de intervenção fixados tanto para os PCDD/F e os PCB sob a forma de dioxina, isoladamente, como para a soma dos PCDD/F e dos PCB sob a forma de dioxina. São representados pela extremidade inferior da distribuição dos resultados bioanalíticos (corrigidos em função do ensaio em branco e da recuperação) correspondendo ao limite de decisão do método de confirmação com base num nível de confiança de 95 %, o que implica uma taxa de falsos resultados conformes < 5 %, e uma RSDR < 25 %. O limite de decisão do método de confirmação é o teor máximo, tendo em conta a incerteza expandida de medição.

O valor-limite (em BEQ) pode ser calculado em conformidade com uma das abordagens mencionadas nos pontos 7.3.1, 7.3.2 e 7.3.3. (ver figura 1).

7.3.1.

Utilização da faixa inferior do intervalo de previsão de 95 % no limite de decisão do método de confirmação em que: BEQDL BEQ correspondente ao limite de decisão do método de confirmação, trata-se do teor máximo, tendo em conta a incerteza expandida de medição sy,x desvio-padrão residual t α,f = m-2 fator de Student (α = 5 %, f = graus de liberdade, unilateral) m número total de pontos de calibração (índice j) n número de repetições para cada teor xi concentração da amostra (em TEQ) do ponto de calibração i, determinada por um método de confirmação média das concentrações (em TEQ) de todas as amostras de calibração parâmetro do quadrado da soma, i = índice do ponto de calibração i

7.3.2.

Cálculo a partir dos resultados bioanalíticos (corrigidos em função do ensaio em branco e da recuperação) de múltiplas análises de amostras (n ≥ 6), contaminadas no limite de decisão do método de confirmação, como a extremidade inferior da distribuição dos dados no valor BEQ médio correspondente: Valor-limite = BEQDL – 1,64 × SDR em que: SDR desvio-padrão dos resultados do bioensaio no BEQDL, medidos em condições de reprodutibilidade intralaboratorial

7.3.3.

Cálculo como valor médio dos resultados bioanalíticos (em BEQ, corrigido em função do ensaio em branco e da recuperação) a partir de análises múltiplas de amostras (n > 6) contaminadas a dois terços do teor máximo ou do limiar de intervenção, com base na observação de que este teor estará próximo do valor-limite determinado em conformidade com o ponto 7.3.1 ou com o ponto 7.3.2: Cálculo dos valores-limite com base num nível de confiança de 95 %, o que implica uma taxa de falsos resultados conformes < 5 %, e uma RSDR < 25 %: 1)  a partir da faixa inferior do intervalo de previsão de 95 % no limite de decisão do método de confirmação, 2)  a partir de análises múltiplas de amostras (n ≥ 6) contaminadas no limite de decisão do método de confirmação, como a extremidade inferior da distribuição dos dados (representado na figura por uma curva em forma de sino) no valor BEQ médio correspondente. Figura 1

7.3.4.

Restrições aos valores-limite Os valores-limite baseados no valor BEQ, calculados a partir da RSDR obtida durante a validação utilizando um número limitado de amostras com diferentes padrões de matrizes/congéneres, podem ser superiores aos teores máximos ou aos limiares de intervenção baseados no valor TEQ, devido a uma melhor precisão do que a que é possível em análises de rotina quando tem de ser controlado um espetro desconhecido de possíveis padrões de congéneres. Em tais casos, os valores-limite devem ser calculados a partir de uma RSDR = 25 %, ou, de preferência, a dois terços do teor máximo ou do limiar de intervenção.

7.4.    Características de desempenho

7.4.1.

Uma vez que não se podem utilizar padrões internos nos métodos bioanalíticos, devem ser realizados testes de repetibilidade de métodos bioanalíticos para se obter informações sobre o desvio-padrão numa série de testes e entre séries de testes. A repetibilidade deve ser inferior a 20 % e a reprodutibilidade intralaboratorial inferior a 25 %. Tal deve basear-se nos valores calculados em BEQ após correção em função do ensaio em branco e da recuperação.

7.4.2.

Como parte do processo de validação, o teste deve demonstrar que discrimina entre uma amostra em branco e um teor no valor-limite, permitindo a identificação de amostras acima do valor-limite correspondente (ver ponto 7.1.2).

7.4.3.

Devem ser definidos os compostos-alvo, as possíveis interferências e os teores máximos toleráveis para a amostra em branco.

7.4.4.

O desvio-padrão percentual na resposta ou concentração calculada a partir da resposta (apenas possível na gama de trabalho) de uma determinação em triplicado de um extrato da amostra não pode ser superior a 15 %.

7.4.5.

Os resultados não corrigidos das amostras de referência expressos em BEQ (no ensaio em branco e no teor máximo ou limiar de intervenção) devem ser utilizados para a avaliação do desempenho do método bioanalítico durante um período de tempo constante.

7.4.6.

Devem registar-se e verificar-se os gráficos de controlo da qualidade para os ensaios em branco do procedimento e para cada tipo de amostra de referência, a fim de garantir que o desempenho analítico está em conformidade com os requisitos, nomeadamente, no tocante aos ensaios em branco do procedimento, no que respeita à diferença mínima requerida em relação à extremidade inferior da gama de trabalho, e, no tocante às amostras de referência, no que respeita à reprodutibilidade intralaboratorial. Os ensaios em branco do procedimento devem ser controlados de modo a evitar falsos resultados conformes quando subtraídos.

7.4.7.

Os resultados dos métodos de confirmação de amostras suspeitas e 2 % a 10 % das amostras conformes (mínimo de 20 amostras por matriz) devem ser recolhidos e utilizados para avaliar o desempenho do método de pré-seleção e a relação entre BEQ e TEQ. Esta base de dados pode ser utilizada para efeitos de reavaliação dos valores-limite aplicáveis às amostras de rotina para as matrizes validadas.

7.4.8.

Os bons desempenhos do método podem também ser demonstrados pela participação em ensaios interlaboratoriais. Os resultados de amostras analisadas em ensaios interlaboratoriais, abrangendo uma gama de concentrações que pode atingir, por exemplo, duas vezes o teor máximo, podem ser incluídos na avaliação da taxa de falsos resultados conformes, se um laboratório estiver em condições de demonstrar os seus bons desempenhos. As amostras devem abranger os padrões de congéneres mais frequentes, que representem diferentes fontes.

7.4.9.

Em caso de incidentes, os valores-limite podem ser reavaliados, refletindo a matriz e os padrões de congéneres específicos para cada incidente.

8.    Notificação dos resultados

8.1.    Métodos de confirmação

8.1.1.

Os resultados analíticos devem conter os teores de cada congénere de PCDD/F e PCB sob a forma de dioxina e os valores TEQ devem ser notificados em termos de limite inferior, limite superior e limite médio, a fim de incluir o máximo de informações possível na notificação dos resultados e, deste modo, permitir a interpretação dos resultados de acordo com requisitos específicos.

8.1.2.

O relatório deve incluir o método utilizado para a extração dos PCDD/F e dos PCB sob a forma de dioxina.

8.1.3.

As recuperações de cada padrão interno devem ser disponibilizadas no caso de as recuperações estarem fora da gama mencionada no ponto 6.2.5, se o teor máximo for excedido (neste caso, as recuperações para uma das duas análises em duplicado) e noutros casos mediante pedido.

8.1.4.

Como a incerteza expandida de medição deve ser tida em conta ao decidir da conformidade de uma amostra, este parâmetro deve ser disponibilizado. Assim, os resultados analíticos devem ser notificados enquanto x ± U, em que x é o resultado analítico e U é a incerteza expandida de medição, utilizando um fator de expansão de 2, o que permite obter um nível de confiança de cerca de 95 %. No caso de uma determinação em separado dos PCDD/F e dos PCB sob a forma de dioxina, a soma da incerteza expandida estimada dos resultados analíticos separados dos PCDD/F e dos PCB sob a forma de dioxina deve ser utilizada para a soma dos PCDD/F e dos PCB sob a forma de dioxina.

8.1.5.

Os resultados devem ser expressos nas mesmas unidades e com, pelo menos, o mesmo número de algarismos significativos que os teores máximos definidos na Diretiva 2002/32/CE.

8.2.    Métodos bioanalíticos de pré-seleção

8.2.1.

O resultado da pré-seleção deve ser expresso como «conforme» ou «suspeito de ser não conforme» («suspeito»).

8.2.2.

Além disso, pode ser dado um resultado indicativo de PCDD/F e/ou de PCB sob a forma de dioxina expresso em BEQ, e não TEQ.

8.2.3.

As amostras com uma resposta inferior ao limite de notificação devem ser indicadas como «inferiores ao limite de notificação». As amostras com uma resposta acima da gama de trabalho devem ser indicadas como «excedendo a gama de trabalho» e o teor correspondente à extremidade superior da gama de trabalho deve ser dado em BEQ.

8.2.4.

Para cada tipo de matriz da amostra, o relatório deve mencionar o teor máximo ou o limiar de intervenção em que se baseia a avaliação.

8.2.5.

O relatório deve mencionar o tipo de teste aplicado, o princípio de base do teste e o tipo de calibração.

8.2.6.

O relatório deve incluir o método utilizado para a extração dos PCDD/F e dos PCB sob a forma de dioxina.

8.2.7.

Em caso de amostras suspeitas de não conformidade, o relatório deve incluir uma nota sobre as medidas a adotar. A concentração de PCDD/F e a soma de PCDD/F e de PCB sob a forma de dioxina nas amostras com teores elevados tem de ser determinada/confirmada por um método de confirmação.

8.2.8.

Os resultados não conformes só devem ser notificados a partir de análises de confirmação.

8.3.    Métodos físico-químicos de pré-seleção

8.3.1.

O resultado da pré-seleção deve ser expresso como «conforme» ou «suspeito de ser não conforme» («suspeito»).

8.3.2.

Para cada tipo de matriz da amostra, o relatório deve mencionar o teor máximo ou o limiar de intervenção em que se baseia a avaliação.

8.3.3.

Além disso, podem ser indicados os teores de cada congénere de PCDD/F e/ou PCB sob a forma de dioxina e os valores TEQ notificados em termos de limite inferior, limite superior e limite médio. Os resultados devem ser expressos nas mesmas unidades e com, pelo menos, o mesmo número de algarismos significativos que os teores máximos definidos na Diretiva 2002/32/CE.

8.3.4.

As recuperações de cada padrão interno devem ser disponibilizadas no caso de as recuperações estarem fora da gama mencionada no ponto 6.2.5, se o teor máximo for excedido (neste caso, as recuperações para uma das duas análises em duplicado) e noutros casos mediante pedido.

8.3.5.

O relatório deve mencionar o método GC-MS aplicado.

8.3.6.

O relatório deve incluir o método utilizado para a extração dos PCDD/F e dos PCB sob a forma de dioxina.

8.3.7.

Em caso de amostras suspeitas de não conformidade, o relatório deve incluir uma nota sobre as medidas a adotar. A concentração de PCDD/F e a soma de PCDD/F e de PCB sob a forma de dioxina nas amostras com teores elevados tem de ser determinada/confirmada por um método de confirmação.

8.3.8.

Só se pode decidir que existe incumprimento após a realização de análises de confirmação.

CAPÍTULO III

Preparação das amostras e requisitos respeitantes aos métodos de análise utilizados no controlo oficial dos teores de PCB não semelhantes a dioxinas em alimentos para animais

1.    Âmbito de aplicação

Os requisitos expostos no presente capítulo devem ser aplicados quando se analisam alimentos para animais para efeitos de controlo oficial dos teores de PCB não semelhantes a dioxinas, bem como no que se refere à preparação das amostras e aos requisitos analíticos para outros fins regulamentares, incluindo os controlos efetuados pelos operadores das empresas do setor dos alimentos para animais para assegurar a conformidade com o disposto no Regulamento (CE) n.o 183/2005.

2.    Métodos de deteção aplicáveis

Cromatografia gasosa/Deteção por captura de eletrões (GC-ECD), GC-LRMS, GC-MS/MS, GC-HRMS ou métodos equivalentes.

3.    Identificação e confirmação dos analitos requeridos

3.1.	Tempo de retenção relativo em relação a padrões internos ou padrões de referência (desvio aceitável de ± 0,25 %).

3.2.	Separação, por cromatografia gasosa, dos PCB não semelhantes a dioxinas das substâncias interferentes, especialmente PCB coeluídos, em especial se os teores das amostras se situarem na gama dos limites legais e for necessário confirmar a não conformidade ( 28 ).

3.3.

Requisitos aplicáveis a técnicas GC-MS Verificação de, pelo menos, o seguinte número de iões moleculares ou de iões característicos do grupo dentro da molécula: a)  dois iões específicos, para a HRMS; b)  três iões específicos, para a LRMS; c)  dois iões precursores específicos, cada um com um ião-produto de transição correspondente, para a MS-MS. Tolerâncias máximas permitidas para os rácios de abundância de fragmentos de massa selecionados: Desvio relativo do rácio de abundância de fragmentos de massa selecionados em relação à abundância teórica ou ao padrão de calibração para o ião-alvo (ião mais abundante controlado) e os iões qualificadores: ± 15 %

3.4.	Requisitos para técnicas de GC-ECD Devem confirmar-se os resultados que excedem o teor máximo por meio de duas colunas de GC com fases estacionárias de polaridade diferente.

4.    Demonstração do desempenho do método

Deve validar-se o desempenho do método na gama do teor máximo (0,5 a duas vezes o teor máximo) com um coeficiente de variação aceitável para análises repetidas (ver requisitos aplicáveis à precisão intermédia mencionados no ponto 9).

5.    Limite de quantificação

A soma dos LOQ ( 29 ) dos PCB não semelhantes a dioxinas não pode ser superior a um terço do teor máximo ( 30 ).

6.    Controlo da qualidade

Controlos regulares com ensaios em branco, análise de amostras enriquecidas, amostras de controlo da qualidade, participação em estudos interlaboratoriais em matrizes relevantes.

7.    Controlo das recuperações

7.1.	Devem utilizar-se padrões internos adequados, com propriedades físico-químicas comparáveis às dos analitos requeridos.

7.2.	Adição de padrões internos: Adição a produtos (antes do processo de extração e limpeza).

7.3.

Requisitos para os métodos que utilizem os seis congéneres de PCB não semelhantes a dioxinas marcados com isótopos: a)  os resultados devem ser corrigidos em função das recuperações de padrões internos; b)  as recuperações de padrões internos marcados com isótopos devem situar-se entre 60 % e 120 %; c)  são aceitáveis recuperações inferiores ou superiores para congéneres individuais cujo contributo para a soma dos PCB não semelhantes a dioxinas seja inferior a 10 %.

7.4.

Requisitos para os métodos que não utilizem os seis padrões internos marcados com isótopos ou que utilizem outros padrões internos: a)  a recuperação de padrões internos deve ser controlada para cada amostra; b)  as recuperações de padrões internos devem situar-se entre 60 % e 120 %; c)  os resultados devem ser corrigidos em função das recuperações de padrões internos.

7.5.	As recuperações de congéneres não marcados devem ser verificadas por amostras enriquecidas ou amostras de controlo da qualidade com concentrações na gama do teor máximo. Consideram-se aceitáveis as recuperações destes congéneres se se situarem entre 60 % e 120 %.

8.    Requisitos aplicáveis aos laboratórios

Em conformidade com o disposto no Regulamento (CE) n.o 882/2004, os laboratórios devem ser acreditados por um organismo reconhecido que opere em conformidade com o Guia ISO 58, a fim de assegurar que aplicam a garantia de qualidade analítica. Os laboratórios devem ser acreditados em conformidade com a norma EN ISO/IEC/17025. Além disso, devem seguir-se, quando aplicáveis, os princípios descritos nas orientações técnicas relativas à estimativa da incerteza de medição e dos limites de quantificação para a análise de PCB ( 31 ).

9.    Características de desempenho: critérios aplicáveis à soma dos PCB não semelhantes a dioxinas no teor máximo

10.    Notificação dos resultados

10.1.

Os resultados analíticos devem conter os teores de cada congénere de PCB não semelhantes a dioxinas e da soma desses congéneres de PCB, indicados em termos de limite inferior, limite superior e limite médio, a fim de incluir o máximo de informações possível na notificação dos resultados e, deste modo, permitir a interpretação dos resultados de acordo com requisitos específicos.

10.2.

O relatório deve incluir o método utilizado para a extração dos PCB.

10.3.

As recuperações de cada padrão interno devem ser disponibilizadas no caso de as recuperações estarem fora da gama mencionada no ponto 7, se o teor máximo for excedido e noutros casos mediante pedido.

10.4.

Como a incerteza expandida de medição deve ser tida em conta ao decidir da conformidade de uma amostra, este parâmetro deve igualmente ser disponibilizado. Assim, os resultados analíticos devem ser notificados enquanto x ± U, em que x é o resultado analítico e U é a incerteza expandida de medição, utilizando um fator de expansão de 2, o que permite obter um nível de confiança de cerca de 95 %.

10.5.

Os resultados devem ser expressos nas mesmas unidades e com, pelo menos, o mesmo número de algarismos significativos que os teores máximos definidos na Diretiva 2002/32/CE.

▼M2

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ANEXO VI

MÉTODOS DE ANÁLISE PARA A DETERMINAÇÃO DE CONSTITUINTES DE ORIGEM ANIMAL NO QUADRO DO CONTROLO OFICIAL DOS ALIMENTOS PARA ANIMAIS

1.   OBJETIVO E CAMPO DE APLICAÇÃO

A determinação de constituintes de origem animal nos alimentos para animais deve ser feita por microscopia ótica ou por reação de polimerização em cadeia (PCR), em conformidade com as disposições constantes do presente anexo.

Estes dois métodos tornam possível detetar a presença de constituintes de origem animal nas matérias-primas para alimentação animal e nos alimentos compostos para animais. No entanto, não permitem calcular a quantidade desses constituintes nas matérias-primas para alimentação animal e nos alimentos compostos para animais. Ambos os métodos têm um limite de deteção inferior a 0,1 % (m/m).

O método PCR permite identificar o grupo taxonómico dos constituintes de origem animal presentes nas matérias-primas para alimentação animal e nos alimentos compostos para animais.

Estes métodos devem aplicar-se para efeitos do controlo do cumprimento das proibições estabelecidas no artigo 7, n.o 1, e no anexo IV do Regulamento (CE) n.o 999/2001 e no artigo 11.o, n.o 1, do Regulamento (CE) n.o 1069/2009.

Em função do tipo de alimento para animais a ser testado, estes métodos podem ser usados, no âmbito de um único protocolo operacional, quer isoladamente, quer combinados, em conformidade com os procedimentos operativos normalizados (PON) estabelecidos pelo laboratório de referência da UE no domínio das proteínas animais em alimentos para animais (LRUE-PA) e publicados no respetivo sítio web ( 32 ).

2.   MÉTODOS

2.1.    Microscopia ótica

2.1.1.    ►M7  Princípio

Os constituintes de origem animal suscetíveis de estar presentes em matérias-primas para a alimentação animal e alimentos compostos para animais enviados para análise são identificados com base em características típicas e detetáveis por exame microscópico (por exemplo, fibras musculares e outras partículas de carne, cartilagens, ossos, chifres, pelos, cerdas, sangue, glóbulos de leite, cristais de lactose, penas, cascas de ovos, espinhas e escamas). ◄

2.1.2.    Reagentes e equipamento

2.1.2.1.   Reagentes

2.1.2.1.1.   Agente de concentração

2.1.2.1.1.1.   Tetracloroetileno (densidade específica: 1,62).

2.1.2.1.2.   Reagente de coloração

2.1.2.1.2.1.

Solução de vermelho de alizarina (diluir 2,5 ml de ácido clorídrico 1 M em 100 ml de água e adicionar a esta solução 200 mg de vermelho de alizarina).

2.1.2.1.3.   Meio de montagem

2.1.2.1.3.1.   Solução alcalina (solução a 2,5 %, m/v, de NaOH ou solução a 2,5 %, m/v, de KOH)

2.1.2.1.3.2.    ►M7  Glicerol (não diluído, viscosidade: 1 490 cP) ou um meio de montagem com propriedades equivalentes para preparação de lâminas não permanentes ◄

2.1.2.1.3.3.   Adesivo Ótico 65 Norland ® (viscosidade: 1 200 cP) ou resina com propriedades equivalentes para preparação de lâminas permanentes

2.1.2.1.4.   Meio de montagem com propriedades de coloração

2.1.2.1.4.1.

Solução de Lugol (dissolver 2 g de iodeto de potássio em 100 ml de água e adicionar 1 g de iodo, agitando com frequência)

2.1.2.1.4.2.

Reagente de cistina (2 g de acetato de chumbo, 10 g de NaOH/100 ml de água)

2.1.2.1.4.3.

Reagente de Fehling [preparado antes de usar a partir de partes iguais (1/1) de duas soluções-mãe A e B. Solução A: dissolver 6,9 g de sulfato de cobre (II) penta-hidratado em 100 ml de água. Solução B: dissolver 34,6 g de tartarato de potássio e sódio tetra-hidratado e 12 g de NaOH em 100 ml de água]

2.1.2.1.4.4.

Tetrametilbenzidina/peróxido de hidrogénio [dissolver 1 g de 3,3’,5,5’ tetrametilbenzidina (TMB) em 100 ml de ácido acético glacial e 150 ml de água. Antes de usar, misturar 4 partes desta solução de TMB com uma parte de peróxido de hidrogénio a 3 %]

2.1.2.1.5.   Agentes de lavagem

2.1.2.1.5.1.   Etanol ≥ 96 % (p.a.)

2.1.2.1.5.2.   Acetona (p.a.)

2.1.2.1.6.   Reagente descolorante

2.1.2.1.6.1.   Solução comercial de hipoclorito de sódio (9-14 % de cloro ativo)

2.1.2.2.   Equipamento

2.1.2.2.1.   Balança analítica com uma precisão de 0,001 g

2.1.2.2.2.    ►M7  Equipamento de moagem: Moinho de facas ou moinho rotativo Se for utilizado um moinho rotativo, são proibidos os peneiros com furos ≤ 0,5 mm ◄

2.1.2.2.3.    ►M7  Peneiros de malha quadrada com 0,25 mm e 1 mm de lado. Com exceção do pré-peneiramento de amostras, o diâmetro dos peneiros não deve exceder 10 cm para evitar perdas de materiais. Não é necessário calibrar os peneiros ◄

2.1.2.2.4.

Ampola de decantação cónica de vidro com capacidade de 250 ml com torneira de Teflon ou de vidro esmerilado na base do cone. O diâmetro de abertura da torneira deve ser ≥ 4 mm. Em alternativa, pode usar-se um vaso de decantação de fundo cónico desde que o laboratório tenha demonstrado que os níveis de deteção são equivalentes aos obtidos com a ampola de decantação cónica de vidro. Ampola de decantação

2.1.2.2.5.

Microscópio estereoscópico que contemple, pelo menos, um intervalo de amplificação de 6,5 a 40 vezes

2.1.2.2.6.

Microscópio composto de campo claro com luz transmitida que contemple, pelo menos, um intervalo de amplificação de 100 a 400 vezes. Pode também usar-se luz polarizada e contraste de interferência diferencial

2.1.2.2.7.

Material de vidro de uso laboratorial corrente

2.1.2.2.8.

Equipamento para preparação de lâminas: lâminas de microscópio, lâminas côncavas, lamelas (20 x 20 mm), pinças, espátulas finas

▼M7

2.1.2.2.9.

Forno de laboratório

2.1.2.2.10.

Centrifugadora

2.1.2.2.11.

Papel de filtro: filtro de celulose qualitativo (tamanho dos poros 4-11 μm)

▼M2

2.1.3.    Colheita e preparação das amostras

2.1.3.1.    ►M7  Amostragem

Utilizar uma amostra representativa, colhida de acordo com o disposto no anexo I do presente regulamento. ◄

2.1.3.2.   Precauções a tomar

A fim de evitar contaminação cruzada no laboratório, limpar cuidadosamente todos os equipamentos reutilizáveis antes de os usar. Desmontar as peças das ampolas de decantação antes de as limpar. Pré-lavar manualmente as ampolas de decantação e os instrumentos de vidro e, de seguida, lavá-los na máquina de lavar. Limpar os peneiros com uma escova sintética rija. Recomenda-se a limpeza final dos peneiros com acetona e ar comprimido após o peneiramento de materiais gordurosos como farinhas de peixe

2.1.3.3.   Preparação de amostras que não óleos ou gorduras

2.1.3.3.1.

►M7  Secagem de amostras: Secar as amostras com teor de humidade superior a 14 % antes do manuseamento, em conformidade com o anexo III do presente regulamento. ◄

2.1.3.3.2.

►M7  Pré-peneiramento de amostras: A fim de recolher informações sobre uma possível contaminação ambiental dos alimentos para animais, recomenda-se peneirar previamente em rede de 1 mm os alimentos para animais em granulado e os grãos, procedendo-se subsequentemente à preparação, análise e comunicação dos resultados separadamente para as duas frações resultantes, que devem ser consideradas amostras distintas. ◄

2.1.3.3.3.

Subamostragem e moagem: proceder à subamostragem para análise de pelo menos 50 g da amostra e à sua subsequente moagem.

2.1.3.3.4.

Extração e preparação do sedimento: Transferir uma porção de 10 g (com uma aproximação de 0,01 g) da subamostra moída para a ampola de decantação ou para o vaso de decantação de fundo cónico e adicionar 50 ml de tetracloroetileno. Limitar a porção transferida para a ampola a 3 g no caso da farinha de peixe ou outros produtos de origem animal puros, ingredientes minerais ou pré-misturas que gerem mais de 10 % de sedimento. Agitar vigorosamente a mistura no mínimo 30 segundos e acrescentar cuidadosamente pelo menos mais 50 ml de tetracloroetileno, lavando a superfície interior da ampola para remover eventuais partículas aderentes. Deixar assentar a mistura resultante durante pelo menos 5 minutos antes de separar o sedimento, abrindo a torneira. Se for usado um vaso de decantação de fundo cónico, agitar vigorosamente a mistura no mínimo 15 segundos, lavando cuidadosamente eventuais partículas aderentes aos lados interiores do vaso com pelo menos 10 ml de tetracloroetileno fresco. Deixar assentar a mistura 3 minutos e agitar novamente 15 segundos, lavando cuidadosamente eventuais partículas aderentes aos lados interiores do vaso com pelo menos 10 ml de tetracloroetileno fresco. Deixar assentar a mistura resultante pelo menos 5 minutos, retirar e rejeitar a fração líquida, decantando cuidadosamente para não perder nenhuma parte do sedimento. ▼M7 Recolher o sedimento em papel de filtro colocado num funil para permitir a separação do restante TCE, evitando ao mesmo tempo a deposição de gordura no sedimento. Secar o sedimento. Recomenda-se a subsequente pesagem do sedimento (com uma aproximação de 0,001 g) para controlar a etapa da sedimentação. Por último, peneirar o sedimento em rede de 0,25 mm e examinar as duas frações resultantes, a menos que o peneiramento não seja considerado necessário. ▼M2

2.1.3.3.5.

Extração e preparação do sobrenadante: Após a recuperação do sedimento pelo método anteriormente descrito, duas fases restam na ampola de decantação: uma líquida composta por tetracloroetileno e uma sólida, o sobrenadante. Recuperar o sobrenadante, esvaziando completamente o tetracloroetileno da ampola pela abertura da torneira. Invertendo a ampola de decantação, depositar o sobrenadante numa placa de Petri grande e secá-lo ao ar numa hotte de extração. Se mais de 5 % do sobrenadante for composto por partículas superiores a 0,50 mm, peneirar em rede de 0,25 mm e analisar as duas frações resultantes.

2.1.3.3.6.

Preparação das matérias-primas: Preparar uma toma de pelo menos 5 g da subamostra moída. Se mais de 5 % do material for composto por partículas superiores a 0,50 mm, peneirar em rede de 0,25 mm e analisar as duas frações resultantes.

2.1.3.4.   Preparação de amostras compostas por óleos ou gorduras

Na preparação de amostras compostas por óleos ou gorduras deve seguir-se o seguinte protocolo:

2.1.3.5.   Uso de reagentes de coloração

Para facilitar a correta identificação dos constituintes de origem animal, o operador pode usar reagentes de coloração na preparação de amostra, de acordo com as orientações emitidas pelo LRUE-PA e publicadas no respetivo sítio web.

Se for usada solução de vermelho de alizarina para corar o sedimento, deve aplicar-se o seguinte protocolo:

2.1.4.    Exame microscópico

2.1.4.1.   Preparação da lâmina

▼M7

Preparar as lâminas de microscópio com o sedimento e, em função da opção do operador, com o sobrenadante ou a matéria-prima.

▼M2

Preparar um número suficiente de lâminas, a fim de garantir a possibilidade de realização de um protocolo de exame completo, tal como previsto no ponto 2.1.4.2.

Preparar as lâminas de microscópio com o meio de montagem adequado, de acordo com o PON estabelecido pelo LRUE-PA e publicado no respetivo sítio web. Cobrir as lâminas com lamelas.

▼M7

2.1.4.2.   Fluxograma de observação para a deteção de partículas de origem animal nas matérias-primas para a alimentação animal e nos alimentos compostos para animais

As lâminas de microscópio preparadas devem ser observadas de acordo com os fluxogramas de observação constantes dos diagramas 1 e 2.

Proceder às observações microscópicas utilizando o microscópio composto no sedimento e, em função da opção do operador, no sobrenadante ou na matéria-prima. Para as frações de maior granulometria, para além do microscópio composto pode também ser usado o microscópio estereoscópico. Observar inteiramente cada lâmina em várias ampliações. São dadas explicações precisas sobre a utilização dos fluxogramas de observação num PON estabelecido pelo LRUE-PA e publicado no seu sítio Web.

Respeitar estritamente o número mínimo de lâminas a observar em cada fase do fluxograma de observação, a menos que a totalidade do material que compõe a fração não permita chegar ao número estipulado de lâminas, por exemplo se não se obtiver qualquer sedimento. Para o registo do número de partículas, não devem ser utilizadas mais de 6 lâminas por determinação.

Quando forem preparadas lâminas adicionais com o sobrenadante ou a matéria-prima utilizando um meio de montagem mais específico com propriedades de coloração, tal como previsto no ponto 2.1.2.1.4, para caracterizar estruturas (por exemplo, penas, pelos, músculos ou partículas de sangue) que tenham sido detetadas em lâminas preparadas com outros meios de montagem, conforme previstos no ponto 2.1.2.1.3, o número de partículas deve ser contado com base em não mais de 6 lâminas por determinação, incluindo as lâminas adicionais com um meio de montagem mais específico.

A fim de facilitar a identificação da natureza e origem das partículas, o operador pode usar instrumentos de apoio como sistemas de apoio à decisão, bibliotecas de imagens e amostras de referência.

Diagrama 1
Fluxograma de observação para a deteção de partículas de origem animal em alimentos compostos para animais e matérias-primas para a alimentação animal — primeira determinação
(D1 e D2 referem-se à primeira e à segunda determinações; *: vertebrados terrestres, peixes)

Diagrama 2
Fluxograma de observação para a deteção de partículas de origem animal em alimentos compostos para animais e matérias-primas para a alimentação animal - segunda determinação
(D1 e D2 referem-se à primeira e à segunda determinações; *: vertebrados terrestres, peixes)

▼M2

2.1.4.3.    ►M7  Número de determinações

As determinações devem ser efetuadas em subamostras diferentes de 50 g cada.

Se, após a primeira determinação efetuada segundo o fluxograma de observação estabelecido no diagrama 1, não forem detetadas partículas de origem animal, não é necessário proceder a uma determinação adicional e o resultado da análise deve ser comunicado usando a terminologia constante do ponto 2.1.5.1.

Se, após a primeira determinação efetuada segundo o fluxograma de observação estabelecido no diagrama 1, for detetada uma ou mais partículas de origem animal de um determinado tipo (isto é, vertebrado terrestre ou peixe) e o tipo das partículas detetadas confirmar o teor declarado da amostra, não é necessária uma segunda determinação. Se o número das partículas de origem animal de um determinado tipo detetadas durante esta primeira determinação for superior a 5, o resultado da análise deve ser comunicado por tipo de animal, usando a terminologia constante do ponto 2.1.5.3. Caso contrário, o resultado da análise deve ser comunicado por tipo de animal usando a terminologia constante do ponto 2.1.5.2.

Noutros casos, incluindo quando não tiver sido fornecida ao laboratório uma declaração do teor, deve ser efetuada uma segunda determinação a partir de uma nova subamostra.

Se, após a segunda determinação efetuada segundo o fluxograma de observação estabelecido no diagrama 2, a soma das partículas de origem animal de um determinado tipo detetadas nas duas determinações for superior a 10, o resultado da análise deve ser comunicado por tipo de animal, usando a terminologia constante do ponto 2.1.5.3. Caso contrário, o resultado da análise deve ser comunicado por tipo de animal usando a terminologia constante do ponto 2.1.5.2. ◄

2.1.5.    ►M7  Expressão dos resultados

Ao comunicar os resultados, o laboratório deve indicar em que tipo de material foi efetuada a análise (sedimento, sobrenadante ou matéria-prima). A comunicação deve indicar claramente quantas determinações foram efetuadas e se não foi realizado o peneiramento das frações antes da preparação das lâminas, em conformidade com o último parágrafo do ponto 2.1.3.3.4.

O relatório do laboratório deve conter, no mínimo, informações sobre a presença de constituintes originários de vertebrados terrestres e de peixe.

As diversas situações possíveis devem ser descritas do seguinte modo:

2.2.    PCR

2.2.1.    Princípio

Os fragmentos de ácido desoxirribonucleico (ADN) de origem animal suscetíveis de estar presentes nas matérias-primas para a alimentação animal e em alimentos compostos para animais são detetados segundo uma técnica de amplificação genética de PCR, que tem como alvo sequências de ADN específicas de cada espécie.

O método por PCR implica primeiramente uma fase de extração de ADN. O extrato de ADN assim obtido é então submetido à fase de amplificação, a fim de determinar a espécie animal alvo do ensaio.

2.2.2.    Reagentes e equipamento

2.2.2.1.   Reagentes

2.2.2.1.1.   Reagentes para a fase de extração de ADN

Usar apenas reagentes aprovados pelo LRUE-PA e publicados no respetivo sítio web.

2.2.2.1.2.   Reagentes para a fase de amplificação genética

2.2.2.1.2.1.    Primers e sondas

Usar apenas primers e sondas com sequências de oligonucleótidos validados pelo LRUE-PA ( 34 ).

2.2.2.1.2.2.   Master Mix

Usar apenas soluções Master Mix que não contenham reagentes suscetíveis de conduzir a resultados falsos devido à presença de ADN animal ( 35 ).

2.2.2.1.2.3.   Reagentes de descontaminação

2.2.2.1.2.3.1.   Solução de ácido clorídrico (0,1 N)

2.2.2.1.2.3.2.   Descolorante (solução de hipoclorito de sódio a 0,15 % de cloro ativo)

2.2.2.1.2.3.3.   Reagentes não corrosivos para descontaminar dispositivos onerosos como balanças analíticas (por exemplo, DNA Erase TM da MP Biomedicals)

2.2.2.2.   Equipamento

2.2.2.2.1.   Balança analítica com uma precisão de 0,001 g

2.2.2.2.2.   Equipamento de moagem

2.2.2.2.3.   Termociclador que permita a realização de PCR em tempo real

2.2.2.2.4.   Microcentrifugadora para tubos de microcentrifugação

2.2.2.2.5.   Conjunto de micropipetas com capacidades de 1 μl a 1 000 μl

2.2.2.2.6.

Equipamento em plástico de uso corrente em biologia molecular: tubos de microcentrifugação, pontas em plástico com filtro para micropipetas, placas adequadas ao termociclador.

2.2.2.2.7.

Congeladores para armazenar amostras e reagentes

2.2.3.    Colheita e preparação das amostras

2.2.3.1.   Amostragem

Utilizar uma amostra representativa, colhida de acordo com o disposto no anexo I.

2.2.3.2.   Preparação da amostra

Preparar as amostras de laboratório até à fase de extração de ADN de acordo com os requisitos estabelecidos no anexo II. Proceder à subamostragem para análise de, pelo menos, 50 g da amostra e depois moer.

Preparar a amostra numa sala diferente das dedicadas à extração de ADN e às reações de amplificação genética, tal como descrito na norma ISO 24276.

Preparar duas tomas de ensaio de, pelo menos, 100 mg cada.

2.2.4.    Extração de ADN

Efetuar a extração de ADN em cada toma de ensaio preparada usando o PON estabelecido pelo LRUE-PA e publicado no respetivo sítio web.

Preparar dois controlos de extração para cada série de extração, tal como descrito na norma ISO 24276.

2.2.5.    Amplificação genética

Realizar a amplificação genética segundo os métodos validados para cada espécie que exige identificação. Estes métodos estão descritos no PON estabelecido pelo LRUE-PA e publicado no respetivo sítio web. Analisar cada extrato de ADN com pelo menos duas diluições diferentes a fim de avaliar a inibição.

Preparar dois controlos de amplificação por espécie, tal como descrito na norma ISO 24276.

2.2.6.    Interpretação e expressão dos resultados

Ao comunicar os resultados, o laboratório deve indicar pelo menos o peso das tomas de ensaio usadas, a técnica de extração usada, o número de determinações efetuadas e o limite de deteção do método.

Não devem ser interpretados e comunicados resultados se o controlo positivo para a extração do ADN e os controlos positivos do ADN-alvo não derem resultados positivos para a espécie alvo do ensaio e o controlo do reagente de amplificação deve ser negativo.

Caso os resultados das duas tomas de ensaio não forem coerentes, repetir pelo menos a fase de amplificação genética. Se o laboratório suspeitar que os extratos de ADN podem estar na origem da incoerência, efetuar uma nova extração de ADN e uma subsequente amplificação genética antes de interpretar os resultados.

Basear a expressão final dos resultados na integração e na interpretação dos resultados das duas tomas de ensaio de acordo com o PON estabelecido pelo LRUE-PA e publicado no respetivo sítio web.

2.2.6.1.   Resultado negativo

Comunicar um resultado negativo do seguinte modo:

Não foi detetado ADN de X na amostra apresentada (sendo X a espécie animal ou o grupo de espécies animais alvo do ensaio).

2.2.6.2.   Resultado positivo

Comunicar um resultado positivo do seguinte modo:

Foi detetado ADN de X na amostra apresentada (sendo X a espécie animal ou o grupo de espécies animais alvo do ensaio).

▼B

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ANEXO VII

MÉTODO DE CÁLCULO DO VALOR ENERGÉTICO DOS ALIMENTOS COMPOSTOS DESTINADOS ÀS AVES DE CAPOEIRA

1.   Modo de cálculo e expressão do valor energético

O valor energético dos alimentos compostos destinados às aves de capoeira é calculado segundo a fórmula adiante indicada, a partir da percentagem de determinados componentes analíticos dos alimentos. Esse valor é expresso em megajoules (MJ), de energia metabolizável (EM), corrigida para o azoto, por quilograma de alimento composto tal que:

MJ/kg de EM = 0,1551 × % de proteína bruta + 0,3431 × % de matérias gordas brutas + 0,1669 × % de amido + 0,1301 × % de açúcares totais (expressos em sacarose).

2.   Tolerâncias aplicáveis aos valores declarados

Se, na sequência de um controlo oficial, for constatada uma diferença entre o resultado do controlo e o valor declarado (valor energético do alimento superior ou inferior) é aplicada uma tolerância mínima de 0,4 MJ/kg de EM.

3.   Expressão do resultado

Após a aplicação da fórmula pré-citada, o resultado obtido é expresso com uma casa decimal.

4.   Métodos de amostragem e de análise

A colheita da amostra do alimento composto e a determinação do teor dos componentes analíticos indicados no método de cálculo são realizados segundo os métodos comunitários de amostragem e análise para o controlo oficial dos alimentos para animais.

São aplicáveis:

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ANEXO VIII

MÉTODOS DE ANÁLISE PARA O CONTROLO DA PRESENÇA ILEGAL DE ADITIVOS QUE JÁ NÃO ESTÃO AUTORIZADOS NOS ALIMENTOS PARA ANIMAIS

(A)   DETERMINAÇÃO DO METILBENZOQUATO

7-benziloxi-6-butil-3-metoxicarbonil-4-quinolona

1.   Objecto e âmbito de aplicação

O presente método destina-se à determinação do teor de metilbenzoquato em alimentos para animais. O limite de quantificação é 1 mg/kg.

2.   Princípio

O metilbenzoquato é extraído da amostra por recurso a uma solução metanólica de ácido metanossulfónico. O extracto é purificado com diclorometano e por cromatografia de permuta iónica, seguindo-se nova purificação com diclorometano. O teor de metilbenzoquato é determinado por cromatografia líquida de alta resolução (HPLC) de fase reversa, utilizando um detector de ultravioleta.

3.   Reagentes

Mistura de metanol (3.2) e água (qualidade equivalente para HPLC) 75 + 25 (v + v).

Filtrar com um filtro de 0,22 μm (4.5) e desgaseificar a solução (por exemplo por aplicação de ultra-sons durante 10 minutos).

Diluir 20,0 ml de ácido metanossulfónico em metanol (3.2) de modo a perfazer o volume de 1 000 ml.

Diluir 100 ml de ácido clorídrico (ρ20 = 1,18 g/ml) em água de modo a perfazer o volume de 1 000 ml.

Tratamento da resina antes do uso: misturar 100 g de resina em 500 ml de solução de ácido clorídrico (3.5) e aquecer em placa até à ebulição, agitando continuamente. Deixar arrefecer e decantar o ácido. Filtrar num filtro de papel, sob vácuo. Lavar a resina com duas porções de 500 ml de água, seguidas de 250 ml de metanol (3.2). Lavar a resina com uma nova porção de 250 ml de metanol e secar, mediante a passagem de uma corrente de ar através do bolo de filtração. Guardar a resina seca num recipiente rolhado.

Pesar, com uma aproximação de 0,1 mg, 50 mg de substância-padrão (3.7). Dissolver em solução de ácido metanossulfónico (3.4), num balão volumétrico de 100 ml, perfazer o volume e agitar.

Transferir 5,0 ml de solução-mãe padrão de metilbenzoquato (3.7.1) para um balão volumétrico de 50 ml. Perfazer o volume com metanol (3.2) e agitar.

Transferir, respectivamente, 1,0 , 2,0 , 3,0 , 4,0 e 5,0 ml de solução-padrão intermédia de metilbenzoquato (3.7.2) para uma série de balões volumétricos de 25 ml. Perfazer o volume com fase móvel (3.3) e agitar. As soluções obtidas contêm, respectivamente, 2,0 , 4,0 , 6,0 , 8,0 e 10,0 μg/ml de metilbenzoquato e devem ser preparadas imediatamente antes da utilização.

4.   Equipamento

5.   Procedimento

5.1.   Generalidades

Nota: Para os fins do presente método, a amostra para o ensaio em branco deve ter composição semelhante à da amostra em análise e não deve acusar a presença de benzoquato de metilo.

5.2.   Extracção

Pesar, com uma aproximação de 0,01 g, cerca de 20 g de amostra preparada e transferir para um erlenmeyer de 250 ml. Adicionar 100,0 ml de solução de ácido metanossulfónico (3.4) e agitar durante 30 minutos com o agitador mecânico (4.1). Filtrar a solução num filtro de papel e guardar o filtrado para a operação de partição líquido-líquido (5.3).

5.3.   Partição líquido-líquido

Transferir 25,0 ml do filtrado obtido no ponto 5.2 para uma ampola de decantação de 500 ml contendo 100 ml de solução de ácido clorídrico (3.5). Adicionar 100 ml de diclorometano (3.1) e agitar a ampola durante 1 minuto. Esperar a separação das fases e transferir a camada inferior (diclorometano) para um balão de fundo redondo de 500 ml. Repetir a extracção da fase aquosa com duas novas porções de 40 ml de diclorometano e combinar os extractos resultantes com o primeiro extracto, no balão de fundo redondo. Evaporar o extracto de diclorometano até à secura, no evaporador rotativo (4.2), a 40 oC, sob pressão reduzida. Dissolver o resíduo em 20-25 ml de metanol (3.2), tapar o balão e guardar a totalidade do extracto para a cromatografia de permuta iónica (5.4).

5.4.   Cromatografia de permuta iónica

5.4.1.    Preparação da coluna de permuta catiónica

Colocar um tampão de fibra de vidro na extremidade inferior de uma coluna de vidro (4.3). Preparar uma suspensão de 5,0 g de resina de permuta catiónica tratada (3.6) em 50 ml de ácido clorídrico (3.5), verter na coluna de vidro e deixar assentar. Escoar o excesso de ácido, até o nível deste último se situar ligeiramente acima da superfície da resina, e lavar a coluna com água até o efluente apresentar reacção neutra ao papel de tornesol. Verter na coluna 50 ml de metanol (3.2) e deixar escoar até à superfície da resina.

5.4.2.    Cromatografia em coluna

Com o auxílio de uma pipeta, transferir cuidadosamente para a coluna o extracto obtido no ponto 5.3. Lavar o balão de fundo redondo com duas porções de 5-10 ml de metanol (3.2), transferindo as mesmas para a coluna. Deixar impregnar o extracto até à superfície da resina. Lavar a coluna com 50 ml de metanol, tomando precauções para que o caudal não exceda 5 ml por minuto. Rejeitar o efluente. Eluir o metilbenzoquato com 150 ml de solução de ácido metanossulfónico (3.4), recolhendo o eluato num erlenmeyer de 250 ml.

5.5.   Partição líquido-líquido

Transferir para uma ampola de decantação de 1 litro o eluato obtido no ponto 5.4.2. Lavar o erlenmeyer com 5-10 ml de metanol (3.2) que se adicionam ao conteúdo da ampola de decantação. Adicionar 300 ml de solução de ácido clorídrico (3.5) e 130 ml de diclorometano (3.1). Agitar durante um minuto e esperar a separação das fases. Escoar a camada inferior (diclorometano) para um balão de fundo redondo de 500 ml. Repetir a extracção da fase aquosa com duas novas porções de 70 ml de diclorometano, combinando estes extractos com o primeiro, no balão de fundo redondo.

Evaporar até à secura o extracto de diclorometano, no evaporador rotativo (4.2), a 40 oC, sob pressão reduzida. Dissolver o resíduo do balão em cerca de 5 ml de metanol (3.2) e transferir quantitativamente esta solução para um balão volumétrico de 10 ml. Lavar o balão de fundo redondo com duas novas porções de 1-2 ml de metanol e transferir para o balão volumétrico. Perfazer o volume com metanol e agitar. Filtrar uma alíquota através de um filtro de membrana (4.6). Guardar esta solução para a análise por HPLC (5.6).

5.6.   Análise por HPLC

5.6.1.    Parâmetros

As condições a seguir especificadas são-no a título indicativo. Poderão escolher-se outras condições, desde que produzam resultados equivalentes.

Verificar a estabilidade do sistema cromatográfico mediante a injecção repetida da solução de calibração (3.7.3), que contém 4 μg/ml de metilbenzoquato, até obter picos com alturas (ou áreas) e tempos de retenção reprodutíveis.

5.6.2.    Curva de calibração

Injectar várias vezes cada solução de calibração (3.7.3) e medir a altura (ou área) dos picos correspondentes a cada concentração. Traçar uma curva de calibração, colocando a altura (ou área) média dos picos das soluções de calibração em ordenadas e as concentrações correspondentes, expressas em μg/ml, em abcissas.

5.6.3.    Solução de amostra

Injectar várias vezes o extracto de amostra (5.5), utilizando o mesmo volume utilizado para as soluções de calibração e determinar a altura (ou área) média dos picos correspondentes ao metilbenzoquato.

6.   Cálculo dos resultados

A partir da altura (ou área) média dos picos do metilbenzoquato da solução de amostra, determinar a concentração desta em μg/ml, com base na curva de calibração (5.6.2).

O teor de metilbenzoquato da amostra, w, expresso em mg/kg, é dado pela fórmula:

em que:

c

=

concentração de metilbenzoquato da solução da amostra, expressa em μg/ml,

m

=

massa da toma de ensaio, expressa em gramas.

7.   Validação dos resultados

7.1.   Identidade

A identidade do analito pode ser confirmada por co-cromatografia ou por recurso a um detector de díodos, comparando os espectros do extracto de amostra e da solução de calibração (3.9.3) que contém 10 μg/ml de metilbenzoquato.

7.1.1.    Co-cromatografia

Fortificar um extracto da amostra com a adição de uma quantidade adequada de solução-padrão intermédia (3.7.2). A quantidade de metilbenzoquato adicionada deve ser idêntica à quantidade de metilbenzoquato presumida no extracto de amostra.

Apenas a altura do pico correspondente ao metilbenzoquato deverá exibir um aumento adequado, tendo em conta a quantidade adicionada e a diluição do extracto. A largura do pico a meia altura não poderá diferir mais de 10 % da largura inicial.

7.1.2.    Detecção com um detector de díodos

Os resultados são avaliados de acordo com os seguintes critérios:

Se algum destes critérios não for satisfeito, a presença do analito não pode ser confirmada.

7.2.   Repetibilidade

A diferença entre os resultados de duas determinações paralelas efectuadas com a mesma amostra não deve exceder: 10 %, em valor relativo, em relação ao maior dos valoress, para os teores de metilbenzoquato compreendidos entre 4 e 20 mg/kg.

7.3.   Recuperação

A taxa de recuperação de uma amostra em branco fortificada deve ser de, pelo menos, 90 %.

8.   Resultados de um estudo interlaboratorial

Procedeu-se à análise de cinco amostras por 10 laboratórios. Para cada amostra, foram efectuadas análises em duplicado.

n.d.

=

não detectado

sr

=

desvio-padrão da repetibilidade

CVr

=

coeficiente de variação da repetibilidade ( %)

SR

=

desvio-padrão da reprodutibilidade

CVR

=

coeficiente de variação da reprodutibilidade ( %)

(B)   DETERMINAÇÃO DO OLAQUINDOX

N1,N4-dióxido de 2-(N-2'-(hidroxietil)carbamoíl)-3-metilquinoxalina

1.   Objecto e âmbito de aplicação

Esta técnica permite determinar o teor de olaquindox em alimentos para animais. O limite de quantificação é 5 mg/kg.

2.   Princípio

A amostra é submetida a extracção com uma mistura metanol-água. O teor de olaquindox é determinado por cromatografia líquida de alta resolução (HPLC) de fase reversa, utilizando um detector de ultravioleta.

3.   Reagentes

Mistura água (3.3)-metanol (3.2), 900 + 100 (v + v).

Pesar, com uma aproximação de 0,1 mg, 50 mg de olaquindox (3.5) num balão volumétrico de 200 ml e acrescentar aproximadamente 190 ml de água. Colocar o balão num banho de ultra-sons (4.1) durante 20 minutos. Depois do tratamento ultra-sónico, levar a solução à temperatura ambiente, perfazer o volume com água e agitar. Envolver o balão com uma folha de alumínio e colocá-lo no frigorífico. Esta solução deve ser renovada mensalmente.

Transferir 10,0 ml de solução-mãe padrão (3.5.1) para um balão volumétrico de 100 ml, perfazer o volume com a fase móvel e agitar. Envolver o balão com uma folha de alumínio e colocá-lo no frigorífico. Esta solução deve ser renovada diariamente.

Transferir para uma série de balões volumétricos de 50 ml: 1,0 , 2,0 , 5,0 , 10,0 , 15,0 e 20,0 ml da solução-padrão intermédia (3.5.2). Perfazer o volume com fase móvel (3.4) e agitar. Envolver os balões com folha de alumínio. Estas soluções contêm, respectivamente, 0,5 , 1,0 , 2,5 , 5,0 , 7,5 e 10,0 μg de olaquindox por ml.

Devem ser renovadas diariamente.

4.   Equipamento

5.   Procedimento

Nota:

o olaquindox é sensível à luz. Efectuar todas as operações sob luz difusa ou utilizar material de vidro ambarizado.

5.1.   Generalidades

Nota:

Para os fins do presente método, a amostra para o ensaio em branco deve ter composição semelhante à da amostra em análise e não deve acusar a presença de olaquindox.

5.2.   Extracção

Pesar, com uma aproximação de 0,01 g, cerca de 50 g da amostra. Transferir para um erlenmeyer de 1 000 ml, acrescentar 100 ml de metanol (3.1) e colocar o balão durante cinco minutos num banho de ultra-sons (4.1). Acrescentar 410 ml de água e deixar no banho de ultra-sons durante mais 15 minutos. Retirar o erlenmeyer do banho de ultra-sons, agitá-lo durante 30 minutos no agitador (4.2) e filtrar através de um filtro dobrado. Transferir 10,0 ml do filtrado para um balão volumétrico de 20 ml, perfazer o volume com água e agitar. Filtrar uma alíquota através de um filtro de membrana (4.4) (ver ponto 9). Efectuar em seguida a análise por HPLC (5.3).

5.3.   Análise por HPLC

5.3.1.    Parâmetros:

As condições a seguir especificadas são-no a título indicativo. Poderão escolher-se outras condições, desde que produzam resultados equivalentes.

Verificar a estabilidade do sistema cromatográfico mediante a injecção repetida da solução de calibração (3.5.3) que contém 2,5 μg/ml, até obter picos com alturas (ou áreas) e tempos de retenção reprodutíveis.

5.3.2.    Curva de calibração

Injectar várias vezes cada solução de calibração (3.5.3) e determinar a altura ou área média dos picos para cada concentração. Traçar uma curva de calibração, colocando a altura (ou área) média dos picos das soluções de calibração em ordenadas e as concentrações correspondentes, expressas em μg/ml, em abcissas.

5.3.3.    Solução de amostra

Injectar o extracto de amostra (5.2) várias vezes, utilizando o mesmo volume usado para as soluções de calibração, e determinar a altura (ou área) média dos picos do olaquindox.

6.   Cálculo dos resultados

A partir da altura (ou área) média dos picos do olaquindox da solução de amostra, determinar a concentração desta em μg/ml, com base na curva de calibração (5.3.2).

O teor de olaquindox, w, expresso em mg/kg de amostra, é dado pela fórmula seguinte:

em que:

c

=

concentração de olaquindox do extracto da amostra (5.2) em μg/ml

m

=

massa da toma para análise em g.

7.   Validação dos resultados

7.1.   Identidade

A identidade do analito pode ser confirmada por co-cromatografia ou pela utilização de um detector de díodos que permita comparar os espectros do extracto de amostra (5.2) e da solução de calibração (3.5.3) que contém 5,0 μg/ml.

7.1.1.    Co-cromatografia

Fortificar um extracto de amostra (5.2) com a adição de uma quantidade adequada de uma solução de calibração (3.5.3). A quantidade de olaquindox adicionada deve ser semelhante à quantidade de olaquindox presente no extracto de amostra.

Apenas se deverá verificar um aumento da altura do pico correspondente ao olaquindox, atendendo à quantidade adicionada e à diluição do extracto. A largura do pico a meia altura não poderá diferir mais de 10 % da largura inicial do pico do olaquindox do extracto de amostra não fortificado.

7.1.2.    Detecção com um detector de díodos

Os resultados são avaliados de acordo com os seguintes critérios:

Se algum destes critérios não for satisfeito, a presença do analito não pode ser confirmada.

7.2.   Repetibilidade

A diferença entre os resultados de duas determinações paralelas efectuadas com a mesma amostra não deve exceder 15 % do maior dos valores, para teores de olaquindox entre 10 e 200 mg/kg.

7.3.   Recuperação

A taxa de recuperação de uma amostra em branco fortificada deve ser de, pelo menos, 90 %.

8.   Resultados de um estudo interlaboratorial

Foi organizado um estudo interlaboratorial a nível comunitário, no âmbito do qual foram analisadas, em 13 laboratórios, quatro amostras de alimento para leitões, incluindo uma amostra em branco. Os resultados desse estudo são apresentados em seguida:

L

=

número de laboratórios

n

=

número de valores individuais

sr

=

desvio-padrão da repetibilidade

SR

=

desvio-padrão da reprodutibilidade

CVr

=

coeficiente de variação da repetibilidade

CVR

=

coeficiente de variação da reprodutibilidade

9.   Observações

Embora não tenha sido validado em alimentos para animais com teores de olaquindox superiores a 100 mg/kg, o método pode ser utilizado satisfatoriamente mediante uma redução da toma de ensaio e/ou diluição do extracto da amostra (5.2), de forma a obter uma concentração no intervalo da curva de calibração (5.3.2).

(C)   DETERMINAÇÃO DO AMPROLIUM

Cloridrato de cloreto de 1-[(4-amino-2-propil-5-pirimidinil)metil]-2-picolínio

1.   Objecto e âmbito de aplicação

Este método permite determinar o teor de amprolium em alimentos para animais e pré-misturas. O limite de detecção é de 1 mg/kg; o limite de quantificação de 5 mg/kg.

2.   Princípio

Extracção da amostra com uma mistura metanol-água. Diluição com a fase móvel, filtração com um filtro de membrana e determinação do teor de amprolium por cromatografia líquida de alta resolução (HPLC) de permuta catiónica, com um detector de UV.

3.   Reagentes

Num balão volumétrico de 1 000 ml, dissolver em água (3.3) 13,80 g de di-hidrogenofosfato de sódio mono-hidratado, completar o volume com água (3.3) e homogeneizar.

Num balão volumétrico de 1 000 ml, dissolver em água (3.3) 224,74 g de perclorato de sódio mono-hidratado, completar o volume com água (3.3) e homogeneizar.

Mistura 450 + 450 + 100 (v + v + v) de acetonitrilo (3.2), solução de di-hidrogenofosfato de sódio (3.4) e solução de perclorato de sódio (3.5). Antes de utilizar a fase móvel, filtrar por um filtro de membrana de 0,22 μm (4.3) e desgaseificar a solução [por exemplo, num banho de ultra-sons (4.4) durante pelo menos 15 minutos].

Num balão volumétrico de 100 ml, pesar, com uma aproximação de 0,1 mg, 50 mg de amprolium (3.7) e dissolver em 80 ml de metanol (3.1), colocando depois o balão durante 10 minutos no banho de ultra-sons (4.4). Depois do tratamento por ultra-sons, levar a solução à temperatura ambiente, perfazer o volume com água e homogeneizar. A temperaturas não superiores a 4 oC, a solução mantém-se estável durante um mês.

Pipetar 5,0 ml da solução-mãe padrão (3.7.1) para um balão volumétrico de 50 ml, completar o volume com solvente de extracção (3.8) e homogeneizar. A temperaturas não superiores a 4 oC, a solução mantém-se estável durante um mês.

Transferir 0,5 , 1,0 e 2,0 ml da solução-padrão intermédia (3.7.2) para uma série de balões volumétricos de 50 ml. Perfazer o volume com fase móvel (3.6) e agitar. As soluções obtidas contêm 0,5 , 1,0 e 2,0 μg de amprolium por ml, respectivamente, e são preparadas imediatamente antes da utilização.

Mistura 2:1 (v+v) de metanol (3.1) e água.

4.   Equipamento

5.   Procedimento

5.1.   Generalidades

5.1.1.    Amostra de alimento para animais para o ensaio em branco

Para a realização do ensaio de recuperação (5.1.2), analisa-se uma amostra em branco de um alimento para animais, para comprovar a ausência de amprolium e de substâncias susceptíveis de interferir no processo. Essa amostra em branco deve ser de tipo similar ao da amostra em análise e não devem ser detectados amprolium nem substâncias susceptíveis de interferir no processo.

5.1.2    Ensaio de recuperação

Deve efectuar-se um ensaio de recuperação utilizando a amostra do ensaio em branco, fortificada com uma quantidade conhecida de amprolium semelhante à quantidade presente na amostra. Para obter uma fortificação a um nível de 100 mg/kg, transferir 10,0 ml da solução-mãe padrão de amprolium (3.7.1) para um erlenmeyer de 250 ml e concentrar por evaporação até cerca de 0,5 ml. Acrescentar 50 g da amostra em branco, misturar cuidadosamente e esperar 10 minutos misturando de novo várias vezes antes de proceder à extracção (5.2).

Caso não se disponha de um alimento para animais para o ensaio em branco de tipo similar ao da amostra (ver ponto 5.1.1), pode determinar-se a recuperação pelo método da adição de padrão. Nesse caso, adiciona-se à amostra a analisar uma quantidade de amprolium semelhante à que já se encontra presente na amostra. A amostra assim obtida é analisada juntamente como a amostra não fortificada e a recuperação é calculada por subtracção.

5.2.   Extracção

5.2.1.    Pré-misturas (teor de amprolium < 1 %) e alimentos para animais

Num erlenmeyer de 500 ml, pesar, com uma aproximação de 0,01 g, 5 a 40 g da amostra, em função do teor de amprolium, e adicionar 200 ml do solvente de extracção (3.8). Colocar o erlenmeyer no banho de ultra-sons (4.4) e deixar actuar durante 15 minutos. Retirar o erlenmeyer do banho e agitar durante uma hora em agitador mecânico ou magnético (4.5). Tomar uma alíquota do extracto e diluir com a fase móvel (3.6), de modo a obter um teor de amprolium de 0,5 a 2 μg/ml, e homogeneizar (ver a observação 9.3). Filtrar 5 a 10 ml desta solução diluída por um filtro de membrana (4.2). Efectuar em seguida a análise por HPLC (5.3).

5.2.2.    Pré-misturas (teor de amprolium ≥ 1 %)

Num erlenmeyer de 500 ml, pesar, com uma aproximação de 0,001 g, 1 a 4 g da pré-mistura, em função do teor de amprolium, e adicionar 200 ml do solvente de extracção (3.8). Colocar o erlenmeyer no banho de ultra-sons (4.4) e deixar actuar durante 15 minutos. Retirar o erlenmeyer do banho e agitar durante uma hora em agitador mecânico ou magnético (4.5). Tomar uma alíquota do extracto e dilui-la com a fase móvel (3.6), de modo a obter um teor de amprolium de 0,5 a 2 μg/ml, e homogeneizar. Filtrar 5 a 10 ml desta solução diluída por um filtro de membrana (4.2). Efectuar em seguida a análise por HPLC (5.3).

5.3.   Análise por HPLC

5.3.1.    Parâmetros:

As condições a seguir especificadas são-no a título indicativo. Poderão escolher-se outras condições, desde que produzam resultados equivalentes.

Para verificar a estabilidade do sistema cromatográfico, injectar várias vezes a solução de calibração (3.7.3) com 1,0 μg/ml até se obterem alturas de pico e tempos de retenção constantes.

5.3.2.    Curva de calibração

Injectar várias vezes cada solução de calibração (3.7.3) e determinar a altura (ou área) média dos picos para cada concentração. Traçar uma curva de calibração, colocando a altura (ou área) média dos picos das soluções de calibração em ordenadas e as concentrações correspondentes, expressas em μg/ml, em abcissas.

5.3.3.    Solução de amostra

Injectar várias vezes um volume de extracto de amostra (5.2) idêntico ao utilizado para as soluções de calibração e determinar a altura (ou área) média dos picos do amprolium.

6.   Cálculo dos resultados

A partir da altura (ou área) média dos picos do amprolium da solução de amostra, determinar a concentração desta em μg/ml com base na curva de calibração (5.3.2).

O teor de amprolium, w, da amostra, expresso em mg/kg, é dado pela seguinte fórmula:

[mg/kg]

em que:

V

=

volume, em ml, do solvente de extracção (3.8), de acordo com o ponto 5.2 (isto é, 200 ml)

c

=

concentração de amprolium, em μg/ml, do extracto de amostra (5.2)

f

=

factor de diluição, de acordo com o ponto 5.2

m

=

massa, em g, da toma analisada.

7.   Validação dos resultados

7.1.   Identidade

A identidade do analito pode ser confirmada por co-cromatografia ou com um detector de díodos que permita comparar os espectros do extracto de amostra (5.2) e da solução de calibração (3.7.3) com 2,0 μg/ml.

7.1.1.    Co-cromatografia

Fortificar um extracto de amostra (5.2) com a adição de uma quantidade adequada de uma solução de calibração (3.7.3). A quantidade de amprolium adicionada deve ser semelhante à existente no extracto de amostra.

Apenas se deverá verificar um aumento da altura do pico correspondente ao amprolium, atendendo à quantidade adicionada e à diluição do extracto. A largura do pico a meia altura não poderá diferir mais de 10 % da largura inicial do pico do amprolium do extracto de amostra não fortificado.

7.1.2.    Detecção com um detector de díodos

Os resultados são avaliados de acordo com os seguintes critérios:

Se algum destes critérios não for satisfeito, a presença do analito não pode ser confirmada.

7.2.   Repetibilidade

A diferença entre os resultados de duas determinações paralelas efectuadas com a mesma amostra não deve exceder:

7.3.   Recuperação

Utilizando uma amostra (em branco) fortificada, a recuperação deve ser, pelo menos, de 90 %.

8.   Resultados de um estudo interlaboratorial

Apresentam-se no quadro seguinte os resultados das análises efectuadas a três alimentos para aves de capoeira (amostras 1 a 3), um suplemento mineral (amostra 4) e uma pré-mistura (amostra 5) no âmbito de um estudo interlaboratorial.

L

=

número de laboratórios

n

=

número de valores individuais

sr

=

desvio-padrão da repetibilidade

CVr

=

coeficiente de variação da repetibilidade

SR

=

desvio-padrão da reprodutibilidade

CVR

=

coeficiente de variação da reprodutibilidade

9.   Observações

(D)   DETERMINAÇÃO DO CARBADOX

N1,N4-Dióxido-3-(2-quinoxalinilmetileno)carbazato de metilo

1.   Objecto e âmbito de aplicação

Este método permite determinar o teor de carbadox em alimentos para animais, pré-misturas e preparações. O limite de detecção é de 1 mg/kg; o limite de quantificação de 5 mg/kg.

2.   Princípio

Adição de água à amostra, estabilização e extracção com uma mistura metanol-acetonitrilo. No caso dos alimentos para animais, limpeza de uma alíquota do extracto filtrado numa coluna de óxido de alumínio. No caso das pré-misturas e preparações, diluição apropriada de uma alíquota do extracto filtrado com água, metanol e acetonitrilo. Determinação do teor de carbadox por cromatografia líquida de alta resolução (HPLC) de fase reversa, com um detector de UV.

3.   Reagentes

Misturar 500 ml de metanol (3.1) com 500 ml de acetonitrilo (3.2).

Diluir 10 ml de ácido acético (3.3) para 100 ml com água.

Dissolver 0,82 g de acetato de sódio (3.7) em 700 ml de água (3.8) e ajustar o pH a 6,0 com ácido acético (3.6). Transferir para um balão volumétrico de 1 000 ml, perfazer o volume com água (3.8) e homogeneizar.

Misturar 825 ml de tampão acetato (3.9) com 175 ml de acetonitrilo (3.2).

Filtrar com um filtro de 0,22 μm (4.5) e desgaseificar a solução (por exemplo por aplicação de ultra-sons durante 10 minutos).

Carbadox puro: N1,N4-dióxido-3-(2-quinoxalinilmetileno)carbazato de metilo, E 850.

Num balão volumétrico de 250 ml, pesar, com uma aproximação de 0,1 mg, 25 mg de carbadox-padrão (3.11). Dissolver em metanol-acetonitrilo (3.5) por aplicação de ultra-sons (4.7). Depois do tratamento ultrassónico, levar a solução à temperatura ambiente, perfazer o volume com metanol-acetonitrilo (3.5) e homogeneizar. Envolver o balão com folha de alumínio ou utilizar material de vidro ambarizado e guardar no frigorífico. A temperaturas não superiores a 4 oC, a solução mantém-se estável durante um mês.

Transferir 2,0 , 5,0 , 10,0 e 20,0 ml da solução-mãe padrão (3.11.1) para uma série de balões volumétricos de 100 ml. Adicionar 30 ml de água, perfazer o volume com a mistura metanol-acetonitrilo (3.5) e homogeneizar. Envolver os balões com folha de alumínio. As soluções obtidas contêm, respectivamente, 2,0 , 5,0 , 10,0 e 20,0 μg de carbadox por ml.

Estas soluções de calibração devem ser preparadas antes de cada utilização.

Nota:

Para a determinação de teores de carbadox inferiores a 10 mg/kg em alimentos para animais, preparar soluções de calibração com concentração inferior a 2,0 μg/ml.

Misturar 300 ml de água com 700 ml da mistura metanol-acetonitrilo (3.5).

4.   Equipamento

Nota:

Também pode utilizar-se uma coluna de vidro com torneira ou uma coluna de vidro com uma das extremidades afunilada; neste caso, inserir um tampão de fibra de vidro com uma vareta de vidro e comprimir contra o fundo.

5.   Procedimento

Nota:

O carbadox é sensível à luz. Trabalhar com luz difusa ou utilizar material de vidro ambarizado ou envolvido em folha de alumínio.

5.1.   Generalidades

5.1.1.    Amostra de alimento para animais para o ensaio em branco

Na determinação da recuperação (5.1.2), analisa-se uma amostra em branco de um alimento para animais, para comprovar a ausência de carbadox e de substâncias susceptíveis de interferir no processo. Essa amostra em branco deve ser de tipo similar ao da amostra em análise e não devem ser detectados carbadox nem substâncias susceptíveis de interferir no processo.

5.1.2.    Ensaio de recuperação

Deve efectuar-se um ensaio de recuperação utilizando a amostra do ensaio em branco (5.1.1), fortificada com uma quantidade conhecida de carbadox semelhante à quantidade presente na amostra. Para obter uma fortificação a um nível de 50 mg/kg, transferir 5,0 ml de solução-mãe padrão (3.11.1) para um erlenmeyer de 200 ml. Evaporar a solução sob uma corrente de azoto até obter um volume aproximado de 0,5 ml. Adicionar 10 g de amostra para o ensaio em branco, misturar e esperar 10 minutos antes de iniciar a extracção (5.2).

Caso não se disponha de um alimento para animais para o ensaio em branco de tipo similar ao da amostra (ver ponto 5.1.1), pode determinar-se a recuperação pelo método da adição de padrão. Nesse caso, adiciona-se à amostra a analisar uma quantidade de carbadox semelhante à que já se encontra presente e analisa-se a amostra assim obtida juntamente com a amostra sem adição. A recuperação é calculada por subtracção.

5.2.   Extracção

5.2.1.    Alimentos para animais

Pesar, com uma aproximação de 0,01 g, cerca de 10 g de amostra. Transferir a quantidade pesada para um erlenmeyer de 200 ml, adicionar 15,0 ml de água, homogeneizar e deixar estabilizar durante cinco minutos. Adicionar 35,0 ml da mistura metanol-acetonitrilo (3.5), tapar e agitar ou misturar durante 30 minutos no agitador mecânico ou magnético (4.1). Filtrar a solução obtida com um papel de filtro de fibra de vidro (4.2). Guardar esta solução para as operações de purificação (5.3).

5.2.2.    Pré-misturas (0,1 -2,0 %)

Pesar, com uma aproximação de 0,001 g, cerca de 1 g de amostra não triturada. Transferir a quantidade pesada para um erlenmeyer de 200 ml, adicionar 15,0 ml de água, homogeneizar e deixar estabilizar durante cinco minutos. Adicionar 35,0 ml da mistura metanol-acetonitrilo (3.5), tapar e agitar ou misturar durante 30 minutos no agitador mecânico ou magnético (4.1). Filtrar a solução obtida com um papel de filtro de fibra de vidro (4.2).

Pipetar uma alíquota do filtrado para um balão volumétrico de 50 ml. Adicionar 15,0 ml de água, perfazer o volume com a mistura metanol-acetonitrilo (3.5) e homogeneizar. A concentração de carbadox na solução final deve ser próxima de 10 μg/ml. Filtrar uma alíquota com um filtro de 0,45 μm (4.6).

Efectuar em seguida a análise por HPLC (5.4).

5.2.3.    Preparações (> 2 %)

Pesar, com uma aproximação de 0,001 g, cerca de 0,2 g de amostra não triturada. Transferir a quantidade pesada para um erlenmeyer de 200 ml, adicionar 45,0 ml de água, homogeneizar e deixar estabilizar durante cinco minutos. Adicionar 105,0 ml da mistura metanol-acetonitrilo (3.5), tapar e homogeneizar. Aplicar ultra-sons (4.7) à amostra durante 15 minutos e agitar ou misturar durante mais 15 minutos (4.1). Filtrar a solução obtida com um papel de filtro de fibra de vidro (4.2).

Diluir uma alíquota do filtrado com a mistura água-metanol-acetonitrilo (3.12) de modo a obter uma concentração final de carbadox de 10-15 μg/ml (para uma preparação a 10 %, o factor de diluição é 10). Filtrar uma alíquota com um filtro de 0,45 μm (4.6).

Efectuar em seguida a análise por HPLC (5.4).

5.3.   Purificação

5.3.1.    Preparação da coluna de óxido de alumínio

Pesar 4 g de óxido de alumínio (3.4) e transferir a quantidade pesada para a coluna de vidro (4.3).

5.3.2.    Purificação da amostra

Transferir 15 ml do extracto filtrado (5.2.1) para a coluna de óxido de alumínio e rejeitar os primeiros 2 ml de eluato. Recolher os 5 ml seguintes e filtrar uma alíquota através de um filtro de 0,45 μm (4.6).

Efectuar em seguida a análise por HPLC (5.4).

5.4.   Análise por HPLC

5.4.1.    Parâmetros

As condições a seguir especificadas são-no a titulo indicativo. Poderão escolher-se outras condições, desde que produzam resultados equivalentes.

Para verificar a estabilidade do sistema cromatográfico, injectar várias vezes a solução de calibração (3.11.2) com 5,0 μg/ml até se obterem alturas (ou áreas) de pico e tempos de retenção constantes.

5.4.2.    Curva de calibração

Injectar várias vezes cada solução de calibração (3.11.2) e determinar as alturas (ou áreas) dos picos para cada concentração. Traçar uma curva de calibração, colocando a altura (ou área) média dos picos das soluções de calibração em ordenadas e as concentrações correspondentes, expressas em μg/ml, em abcissas.

5.4.3.    Solução de amostra

Injectar várias vezes o extracto de amostra [(5.3.2) no caso dos alimentos para animais, (5.2.2) no caso das pré-misturas e (5.2.3) no caso das preparações] e determinar a altura (ou área) média dos picos do carbadox.

6.   Cálculo dos resultados

A partir da altura (ou área) média dos picos do carbadox da solução de amostra, determinar a concentração desta em μg/ml com base na curva de calibração (5.4.2).

6.1.   Alimentos para animais

O teor de carbadox, w, da amostra, expresso em mg/kg, é dado pela seguinte fórmula:

[mg/kg]

em que:

c

=

concentração de carbadox, em μg/ml, no extracto de amostra (5.3.2),

V1

=

volume de extracção, em ml (isto é, 50 ml),

m

=

massa da toma analisada, em gramas.

6.2.   Pré-misturas e preparações

O teor de carbadox, w, da amostra, expresso em mg/kg, é dado pela seguinte fórmula:

[mg/kg]

em que:

c

=

concentração de carbadox, em μg/ml, no extracto de amostra (5.2.2 ou 5.2.3),

V2

=

volume de extracção, em ml (isto é, 50 ml no caso das pré-misturas e 150 ml no caso das preparações),

f

=

factor de diluição, de acordo com 5.2.2 (pré-misturas) ou 5.2.3 (preparações),

m

=

massa da toma analisada, em gramas.

7.   Validação dos resultados

7.1.   Identidade

A identidade do analito pode ser confirmada por co-cromatografia ou com um detector de díodos que permita comparar os espectros do extracto da amostra e da solução de calibração (3.11.2) com 10,0 μg/ml.

7.1.1.    Co-cromatografia

Adiciona-se uma quantidade apropriada da solução de calibração (3.11.2) a um extracto de amostra. A quantidade de carbadox adicionada deve ser semelhante à que se prevê existir no extracto de amostra.

Apenas se deverá verificar um aumento da altura do pico correspondente ao carbadox, atendendo à quantidade adicionada e à diluição do extracto. A largura do pico a meia altura não poderá diferir mais de 10 % da largura inicial.

7.1.2.    Detecção com um detector de díodos

Os resultados são avaliados de acordo com os seguintes critérios:

Se algum destes critérios não for satisfeito, a presença do analito não pode ser confirmada.

7.2.   Repetibilidade

Para teores iguais ou superiores a 10 mg/kg, a diferença entre os resultados de duas determinações paralelas efectuadas com a mesma amostra não deve exceder 15 % do maior dos valores.

7.3.   Recuperação

Utilizando uma amostra (em branco) fortificada, a recuperação deve ser, pelo menos, de 90 %.

8.   Resultados de um estudo interlaboratorial

Foi organizado um estudo interlaboratorial, que envolveu a análise de seis alimentos para animais, quatro pré-misturas e três preparações em oito laboratórios. Para cada amostra, foram efectuadas análises em duplicado. (No Journal of the AOAC, Volume 71, 1988, p. 484-490, podem ser encontrados elementos mais pormenorizados sobre o estudo interlaboratorial efectuado). Os resultados obtidos (com excepção dos valores anómalos) são apresentados no quadro seguinte:

L

=

número de laboratórios

n

=

número de valores individuais

Sr

=

desvio-padrão da repetibilidade

CVr

=

coeficiente de variação da repetibilidade

SR

=

desvio-padrão da reprodutibilidade

CVR

=

coeficiente de variação da reprodutibilidade

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ANEXO IX

QUADROS DE CORRESPONDÊNCIA REFERIDOS NO ARTIGO 6.o

1.   Directiva 71/250/CEE

2.   Directiva 71/393/CEE

3.   Directiva 72/199/CEE

4.   Directiva 73/46/CEE

5.   Directiva 76/371/CEE

6.   Directiva 76/372/CEE

7.   Directiva 78/633/CEE

8.   Directiva 81/715/CEE

9.   Directiva 84/425/CEE

10.   Directiva 86/174/CEE

11.   Directiva 93/70/CEE

12.   Directiva 93/117/CE

13.   Directiva 98/64/CE

14.   Directiva 1999/27/CE

15.   Directiva 1999/76/CE

16.   Directiva 2000/45/CE

17.   Directiva 2002/70/CE

18.   Directiva 2003/126/CE

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( 1 ) JO L 268 de 18.10.2003, p. 29.

( 2 ) JO L 140 de 30.5.2002, p. 10.

( 3 ) JO L 70 de 16.3.2005, p. 1..

( 4 ) Se necessário, esmagar os aglomerados (separando-os eventualmente da massa e reconstituindo em seguida o todo).

( 5 ) Exceto no caso de alimentos grosseiros ou forragem com baixa densidade relativa.

( 6 ) Exceto no caso de alimentos grosseiros ou forragem com baixa densidade relativa.

( 7 ) JO L 229 de 1.9.2009, p. 1.

( 7 ) Para a dessecação dos cereais, assim como das farinhas e sêmolas grossas e finas, a estufa deve ter uma capacidade térmica tal que, regulada previamente à temperatura de 131 oC, possa atingir de novo esta temperatura menos de 45 minutos após a colocação do número máximo de amostras a secar simultaneamente. A estufa deverá ainda ter uma ventilação tal que, secando durante 2 horas todas as amostras de trigo mole que pode conter, os resultados apresentem uma diferença inferior a 0,15 % relativamente aos resultados obtidos após quatro horas de dessecação.

( 7 ) Substituir os fragmentos de pedra-pomes por pérolas de vidro sempre que a matéria gorda deva ser objecto de exames qualitativos posteriores.

( 7 ) JO L 125 de 23.5.1996, p. 35.

( 7 ) Organizado pelo grupo de trabalho «Alimentos para animais» do Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs-und Forschungsanstalten (VDLUFA).

( 7 ) Organizado pelo grupo de trabalho «Alimentos para animais» do Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs-und Forschungsanstalten (VDLUFA).

( 7 ) Poderão ser utilizados outros métodos de mineralização desde que se tenha demonstrado terem resultados semelhantes (por exemplo, a mineralização por microondas sob pressão).

( 7 ) As forragens verdes (frescas ou desidratadas) são susceptíveis de conter grandes quantidades de sílica vegetal que pode reter oligoelementos e deve ser eliminada. As amostras destes alimentos devem ser submetidas ao seguinte procedimento modificado: efectuar a operação do ponto 5.1.1.1 até ao estádio da filtração. Lavar duas vezes em água a ferver o papel de filtro que contém o resíduo insolúvel e colocá-lo num cadinho de quartzo ou platina. Incinerar na mufla (4.1) a uma temperatura inferior a 550 oC até desaparecer completamente toda a substância carbonosa. Deixar arrefecer, juntar algumas gotas de água, deitar em seguida 10 a 15 ml de ácido fluorídrico (3.4) e evaporar até à secura, a aproximadamente 150 oC. Se o resíduo ainda contiver sílica, dissolvê-la em alguns ml de ácido fluorídrico (3.4) e evaporar até à secura. Juntar 5 gotas de ácido sulfúrico (3.5) e aquecer até ao desaparecimento do fumo branco. Juntar 5 ml de ácido clorídrico 6 mol/l (3.2) e aproximadamente 30 ml de água, aquecer, filtrar a solução para um balão volumétrico de 250 ml e completar o volume com água (a concentração em HC1 é aproximadamente de 0,5 mol/l). Prosseguir a operação a partir do ponto 5.1.2.

( 7 ) The Analyst 108, 1983, pp. 1 252-1 256.

( *1 ) Analyst, 1995, 120, 2 175-2 180.

( 8 ) Quadro dos FET (fatores de equivalência tóxica) para PCDD, PCDF e PCB sob a forma de dioxina. FET-OMS para avaliação dos riscos para o ser humano com base nas conclusões da reunião de peritos do Programa Internacional de Segurança Química (IPCS) da OMS realizada em Genebra, em junho de 2005 [Martin van den Berg et al., The 2005 World Health Organization Re-evaluation of Human and Mammalian Toxic Equivalency Factors for Dioxins and Dioxin-like Compounds (Reavaliação de 2005 pela OMS dos fatores de equivalência tóxica (FET) em humanos e mamíferos respeitantes às dioxinas e aos compostos sob a forma de dioxina). Toxicological Sciences 93(2), 223–241 (2006)].

Abreviaturas utilizadas: «T» = tetra; «Pe» = penta; «Hx» = hexa; «Hp» = hepta; «O» = octa; «CDD» = clorodibenzodioxina; «CDF» = clorodibenzofurano; «CB» = clorobifenilo.

( 9 ) Decisão 2002/657/CE da Comissão, de 14 de agosto de 2002, que dá execução ao disposto na Diretiva 96/23/CE do Conselho relativamente ao desempenho de métodos analíticos e à interpretação de resultados (JO L 221 de 17.8.2002, p. 8).

( 10 ) Devem seguir-se, quando aplicáveis, os princípios descritos no Guidance Document on Measurement Uncertainty for Laboratories performing PCDD/F and PCB Analysis using Isotope Dilution Mass Spectrometry (Documento de orientação sobre a incerteza de medição para laboratórios que efetuam análises de PCDD/F e PCB utilizando espetrometria de massa de diluição de isótopos) (http://ec.europa.eu/food/safety/animal-feed_en).

( 11 ) O conceito de «limite superior» preconiza que o contributo de cada congénere não quantificado seja igual ao limite de quantificação. O conceito de «limite inferior» preconiza que o contributo de cada congénere não quantificado seja igual a zero. O conceito de «limite médio» preconiza que o contributo de cada congénere não quantificado seja igual a metade do limite de quantificação.

( 12 ) Análise em duplicado: uma análise separada dos analitos pertinentes utilizando uma segunda alíquota da mesma amostra homogeneizada. De forma geral, aplicam-se os requisitos relativos à análise em duplicado previstos no anexo II, capítulo C, ponto 3. No entanto, para métodos que utilizem padrões internos marcados com 13C para os analitos pertinentes, a análise em duplicado só é necessária se o resultado da primeira determinação não for conforme. A análise em duplicado é necessária para se excluir a possibilidade de contaminação cruzada interna ou de uma troca acidental de amostras. No caso de a análise ser realizada no contexto de um incidente de contaminação, a confirmação através de uma análise em duplicado pode ser omitida se as amostras selecionadas para análise estiverem associadas, através da rastreabilidade, a esse incidente de contaminação e o teor obtido for significativamente superior ao teor máximo.

( 13 ) O conceito de «limite superior» preconiza que o contributo para os equivalentes de toxicidade (TEQ) de cada congénere não quantificado seja igual ao limite de quantificação. O conceito de «limite inferior» preconiza que o contributo para os TEQ de cada congénere não quantificado seja igual a zero. O conceito de «limite médio» preconiza que o contributo para os TEQ de cada congénere não quantificado seja igual a metade do limite de quantificação.

( 14 ) De forma geral, aplicam-se os requisitos relativos à análise em duplicado previstos no anexo II, capítulo C, ponto 2. No entanto, para métodos de confirmação que utilizem padrões internos marcados com 13C para os analitos pertinentes, a análise em duplicado só é necessária se o resultado da primeira determinação não for conforme. A análise em duplicado é necessária para se excluir a possibilidade de contaminação cruzada interna ou de uma troca acidental de amostras. No caso de a análise ser realizada no contexto de um incidente de contaminação, a confirmação através de uma análise em duplicado pode ser omitida se as amostras selecionadas para análise estiverem associadas, através da rastreabilidade, a esse incidente de contaminação e o teor obtido for significativamente superior ao teor máximo.

( 15 ) A explicação e os requisitos para as análises em duplicado para efeitos de controlo dos limiares de intervenção são idênticos aos referidos na nota de rodapé 2 para os teores máximos.

( 16 ) Regulamento (CE) n.o 183/2005 do Parlamento Europeu e do Conselho, de 12 de janeiro de 2005, que estabelece requisitos de higiene dos alimentos para animais (JO L 35 de 8.2.2005, p. 1).

( 17 ) Os métodos bioanalíticos não são específicos para os congéneres incluídos no sistema de FET. Podem estar presentes no extrato de amostra outros compostos estruturalmente relacionados ativos como AhR (recetor aril-hidro-carboneto) que contribuem para a resposta global. Por conseguinte, os resultados bioanalíticos não podem ser uma estimativa, mas sim uma indicação do nível TEQ na amostra.

( 18 ) Documento de orientação sobre a incerteza de medição para laboratórios que efetuam análises de PCDD/F e PCB utilizando espetrometria de massa de diluição de isótopos (Guidance Document on Measurement Uncertainty for Laboratories performing PCDD/F and PCB Analysis using Isotope Dilution Mass Spectrometry) (http://ec.europa.eu/food/safety/animal-feed_en), Documento de orientação sobre a estimativa de LOD e LOQ para medições no domínio dos contaminantes nos géneros alimentícios e alimentos para animais (Guidance Document on the Estimation of LOD and LOQ for Measurements in the Field of Contaminants in Feed and Food) (http://ec.europa.eu/food/safety/animal-feed_en).

( 19 ) Os requisitos atuais baseiam-se nos FET publicados em: M. Van den Berg et al, Toxicol Sci 93 (2), 223-241 (2006).

( 20 ) Os congéneres que coeluem frequentemente são, por exemplo, os PCB 28/31, PCB 52/69 e PCB 138/163/164. Em relação à GC-MS, devem também ter-se em conta as eventuais interferências de fragmentos de congéneres mais fortemente clorados.

( 21 ) Quando aplicável, devem seguir-se os princípios descritos no «Documento de orientação sobre a estimativa de LOD e LOQ para medições no domínio dos contaminantes nos géneros alimentícios e alimentos para animais» (http://ec.europa.eu/food/safety/animal-feed_en).

( 22 ) Recomenda-se vivamente que o contributo do teor do reagente no ensaio em branco seja inferior ao do teor de um contaminante na amostra. Compete ao laboratório controlar a variação dos valores do branco, especialmente se esses valores forem subtraídos.

( 23 ) Os requisitos atuais baseiam-se nos FET publicados em: M. Van den Berg et al, Toxicol Sci 93 (2), 223-241 (2006).

( 24 ) http://eurl.craw.eu/

( 25 ) http://eurl.craw.eu/

( 26 ) A lista destes iniciadores e sondas para cada espécie animal visada pelo ensaio está disponível no sítio web do LRUE-PA.

( 27 ) Exemplos de Master Mix funcionais encontram-se disponíveis no sítio web do LRUE-PA.