02009R0152 — PL — 16.11.2020 — 007.001

---

Dokument ten służy wyłącznie do celów informacyjnych i nie ma mocy prawnej. Unijne instytucje nie ponoszą żadnej odpowiedzialności za jego treść. Autentyczne wersje odpowiednich aktów prawnych, włącznie z ich preambułami, zostały opublikowane w Dzienniku Urzędowym Unii Europejskiej i są dostępne na stronie EUR-Lex. Bezpośredni dostęp do tekstów urzędowych można uzyskać za pośrednictwem linków zawartych w dokumencie

►B	ROZPORZĄDZENIE KOMISJI (WE) nr 152/2009 z dnia 27 stycznia 2009 r. ustanawiające metody pobierania próbek i dokonywania analiz do celów urzędowej kontroli pasz (Tekst mający znaczenie dla EOG) (Dz.U. L 054 z 26.2.2009, s. 1)

zmienione przez:

		Dziennik Urzędowy
		nr	strona	data
M1	ROZPORZĄDZENIE KOMISJI (UE) NR 278/2012 z dnia 28 marca 2012 r.	L 91	8	29.3.2012
►M2	ROZPORZĄDZENIE KOMISJI (UE) NR 51/2013 z dnia 16 stycznia 2013 r.	L 20	33	23.1.2013
►M3	ROZPORZĄDZENIE KOMISJI (UE) NR 691/2013 z dnia 19 lipca 2013 r.	L 197	1	20.7.2013
M4	ROZPORZĄDZENIE KOMISJI (UE) NR 709/2014 z dnia 20 czerwca 2014 r.	L 188	1	27.6.2014
M5	ROZPORZĄDZENIE KOMISJI (UE) 2017/645 z dnia 5 kwietnia 2017 r.	L 92	35	6.4.2017
►M6	ROZPORZĄDZENIE KOMISJI (UE) 2017/771 z dnia 3 maja 2017 r.	L 115	22	4.5.2017
►M7	ROZPORZĄDZENIE WYKONAWCZE KOMISJI (UE) 2020/1560 z dnia 26 października 2020 r.	L 357	17	27.10.2020

---

▼B

ROZPORZĄDZENIE KOMISJI (WE) nr 152/2009

z dnia 27 stycznia 2009 r.

ustanawiające metody pobierania próbek i dokonywania analiz do celów urzędowej kontroli pasz

(Tekst mający znaczenie dla EOG)

▼M3

Artykuł 1

Pobieranie próbek do celów urzędowej kontroli pasz, w szczególności w zakresie oznaczania składników, w tym materiału zawierającego organizmy zmodyfikowane genetycznie, składającego się z nich lub produkowanego z nich, dodatków paszowych zdefiniowanych w rozporządzeniu (WE) nr 1831/2003 Parlamentu Europejskiego i Rady ( 1 ) oraz niepożądanych substancji zdefiniowanych w dyrektywie 2002/32/WE Parlamentu Europejskiego i Rady ( 2 ) przeprowadzane jest zgodnie z metodami opisanymi w załączniku I.

Metoda pobierania próbek opisana w załączniku I ma zastosowanie do kontroli pasz w zakresie oznaczania pozostałości pestycydów zgodnie z definicją w rozporządzeniu (WE) nr 396/2005 Parlamentu Europejskiego i Rady ( 3 ) oraz do kontroli zgodności z rozporządzeniem (UE) nr 619/2011.

▼B

Artykuł 2

Przygotowanie próbek do analizy i wyrażanie wyników odbywa się zgodnie z metodami opisanymi w załączniku II.

Artykuł 3

Badania do celów urzędowej kontroli pasz przeprowadzane są z wykorzystaniem metod określonych w załącznikach III (Metody analizy składu materiałów i mieszanek paszowych), IV (Metody analizy do celów kontroli poziomu dopuszczonych dodatków w paszach), V (Metody analizy do celów kontroli zawartości niepożądanych substancji w paszach) oraz VI (Metody analizy dotyczące oznaczania składników pochodzenia zwierzęcego do celów urzędowej kontroli pasz).

Artykuł 4

Wartość energetyczna mieszanek paszowych dla drobiu obliczana jest zgodnie z załącznikiem VII.

Artykuł 5

Określone w załączniku VIII metody analizy mające na celu kontrolę nielegalnej obecności w paszach dodatków, które już nie są dopuszczone, stosowane są do celów potwierdzania.

Artykuł 6

Dyrektywy 71/250/EWG, 71/393/EWG, 72/199/EWG, 73/46/EWG, 76/371/EWG, 76/372/EWG, 78/633/EWG, 81/715/EWG, 84/425/EWG, 86/174/EWG, 93/70/EWG, 93/117/WE, 98/64/WE, 1999/27/WE, 1999/76/WE, 2000/45/WE, 2002/70/WE i 2003/126/WE tracą moc.

Odesłania do uchylonych dyrektyw rozumiane są jako odesłania do niniejszego rozporządzenia i interpretuje zgodnie z tabelami korelacji w załączniku IX.

Artykuł 7

Niniejsze rozporządzenie wchodzi w życie dwudziestego dnia po jego opublikowaniu w Dzienniku Urzędowym Unii Europejskiej.

Niniejsze rozporządzenie stosuje się od dnia 26 sierpnia 2009 r.

Niniejsze rozporządzenie wiąże w całości i jest bezpośrednio stosowane we wszystkich państwach członkowskich.

▼M3

---

ZAŁĄCZNIK I

METODY POBIERANIA PRÓBEK

1.   CEL I ZAKRES

Próbki przeznaczone do urzędowej kontroli pasz pobierane są zgodnie z metodami opisanymi poniżej. Próbki otrzymane w ten sposób uważa się za reprezentatywne dla kontrolowanych części.

Celem reprezentatywnego pobierania próbek jest uzyskanie niewielkiej frakcji partii w sposób gwarantujący, że oznaczenie jakiejkolwiek cechy szczególnej tej frakcji stanowi średnią cech całej partii. Próbki danej partii można pobierać poprzez wielokrotne pobieranie próbek pierwotnych w różnych miejscach partii. Próbki pierwotne są łączone poprzez ich zmieszanie w celu stworzenia próbki zbiorczej, z której przygotowuje się reprezentatywne próbki końcowe poprzez podział reprezentatywny.

Jeżeli kontrola wzrokowa wskazuje, że części paszy, z której mają być pobrane próbki, różnią się jakością od pozostałej części paszy z tej samej partii, części te oddziela się od pozostałej części paszy i traktuje jako oddzielną podpartię. Jeżeli podział paszy na oddzielne podpartie nie jest możliwy, należy pobrać próbki z paszy jako z jednej partii. W takim przypadku informację o tym należy umieścić w sprawozdaniu z pobierania próbek.

Jeżeli pasza, z której pobrano próbki zgodnie z przepisami niniejszego rozporządzenia, zostaje uznana za niespełniającą wymogów UE, i jest ona częścią partii paszy tej samej klasy lub o takim samym opisie, uznaje się, że cała pasza należąca do tej partii nie spełnia tych wymogów, chyba że z przeprowadzonej szczegółowej oceny wynika, że nie ma dowodów wykazujących, że pozostała część partii nie spełnia wymogów UE.

2.   DEFINICJE

—

Partia : określona ilość paszy mająca wspólne cechy, takie jak pochodzenie, odmiana, rodzaj opakowania, pakujący, wysyłający lub etykietowanie, a w przypadku procesu produkcyjnego – jednostka produkcyjna wytworzona w jednym zakładzie z wykorzystaniem jednolitych parametrów produkcyjnych lub pewna ilość takich jednostek, w przypadku gdy są one produkowane w sposób ciągły i przechowywane razem.

—	Kontrolowana część : partia lub określona część partii lub podpartii.

—	Próbka zapieczętowana : próbka zapieczętowana w sposób uniemożliwiający dostęp do niej bez złamania lub usunięcia pieczęci.

—	Próbka pierwotna : ilość pobrana z jednego miejsca kontrolowanej części.

—	Próbka zbiorcza : sumaryczna ilość pierwotnych próbek pobranych z tej samej kontrolowanej części.

—	Próbka zredukowana : część próbki zbiorczej otrzymana z niej w procesie reprezentatywnej redukcji.

—	Próbka końcowa : część zredukowanej próbki lub zhomogenizowanej próbki zbiorczej.

—	Próbka laboratoryjna : próbka przeznaczona do celów laboratoryjnych (otrzymana przez laboratorium), która może być próbką końcową, zredukowaną lub zbiorczą.

3.   PRZEPISY OGÓLNE

4.   SPRZĘT

4.1.	Sprzęt do pobierania próbek musi być wykonany z materiałów, które nie zanieczyszczą kontrolowanego produktu. Sprzęt przeznaczony do wielokrotnego użytku musi być łatwy do utrzymania w czystości w celu uniknięcia zanieczyszczenia krzyżowego.

4.2.

Sprzęt zalecany do pobierania próbek pasz stałych 4.2.1.    Ręczne pobieranie próbek 4.2.1.1.   Szufelka o płaskim dnie i prostopadłych ściankach bocznych. 4.2.1.2. Ostrze probiercze z długą szczeliną lub z przegródkami. Wymiary ostrza probierczego muszą być dostosowane do charakterystyki kontrolowanej części (głębokość pojemnika, wymiary worka itp.) i do wielkości cząstek paszy. Jeżeli ostrze probiercze ma kilka otworów, w celu zagwarantowania pobierania próbek w różnych miejscach wzdłuż ostrza, należy oddzielić je przegródkami lub zastosować naprzemienne otwory rozmieszczone sekwencyjnie. 4.2.2.    Mechaniczne pobieranie próbek Stosowne urządzenie mechaniczne może być użyte do pobierania próbek paszy w ruchu. „Stosowne” oznacza, że próbki zostają pobrane co najmniej z całego odcinka przepływu. Pobieranie próbek paszy w ruchu (przy dużym natężeniu przepływu) może być prowadzone przy użyciu automatycznych urządzeń. 4.2.3.    Rozdzielacz Jeżeli jest to możliwe i stosowne, w celu przygotowania próbek zredukowanych w sposób reprezentatywny powinien być stosowany sprzęt przeznaczony do rozdzielania próbki na w przybliżeniu równe części.

5.   WYMOGI ILOŚCIOWE DOTYCZĄCE LICZBY PRÓBEK PIERWOTNYCH

5.1.    Wymogi ilościowe dotyczące próbek pierwotnych w odniesieniu do kontroli substancji lub produktów jednolicie rozmieszczonych w paszy

5.1.1.    Pasze stałe luzem

5.1.2.    Pasze płynne luzem

5.1.3.    Pasze opakowane

Pasze (stałe i płynne) mogą być pakowane w torby, worki, puszki, beczki itd., określone w tabeli jako „jednostki”. Duże jednostki (≥ 500 kg lub litrów) muszą być kontrolowane zgodnie z przepisami dotyczącymi paszy luzem (zob. pkt 5.1.1 i 5.1.2).

5.1.4.    Bloki paszy i lizawki mineralne

Kontroli należy poddać co najmniej jeden blok lub jedną lizawkę na kontrolowaną część 25 jednostek, maksymalnie do czterech bloków lub lizawek.

W przypadku bloków lub lizawek ważących maksymalnie 1 kg próbką pierwotną jest zawartość jednego bloku lub jednej lizawki.

5.1.5.    Pasze objętościowe i włókniste

5.2.    Wymogi ilościowe dotyczące próbek pierwotnych w odniesieniu do kontroli składników lub substancji, które mogą nie być jednolicie rozmieszczone w paszy

Wymogi ilościowe dotyczące próbek pierwotnych należy stosować w następujących przypadkach:

Jeżeli organ kontrolny podejrzewa, że niejednolite rozmieszczenie ma miejsce również w przypadku zanieczyszczenia krzyżowego przez składnik lub substancję w mieszankach paszowych, można zastosować wymogi ilościowe określone w tabeli poniżej.

5.3.    Wymogi ilościowe dotyczące próbek pierwotnych w przypadku bardzo dużych partii

W przypadku dużych kontrolowanych części (> 500 ton) liczba próbek pierwotnych, które należy pobrać, wynosi 40 próbek pierwotnych + √ ton w odniesieniu do kontroli substancji lub produktów jednolicie rozmieszczonych w paszy lub 100 próbek pierwotnych + √ ton w odniesieniu do kontroli składników lub substancji, które mogą nie być jednolicie rozmieszczone w materiałach paszowych.

6.   WYMOGI ILOŚCIOWE DOTYCZĄCE PRÓBKI ZBIORCZEJ

7.   WYMOGI ILOŚCIOWE DOTYCZĄCE PRÓBEK KOŃCOWYCH

Próbki końcowe

Wymagana jest analiza co najmniej jednej próbki końcowej. Ilość próbki końcowej potrzebnej do analizy jest nie mniejsza niż:

8.   METODA POBIERANIA PRÓBEK W PRZYPADKU BARDZO DUŻYCH PARTII LUB PARTII PRZECHOWYWANYCH LUB TRANSPORTOWANYCH W SPOSÓB POWODUJĄCY, ŻE POBIERANIE PRÓBEK Z CAŁEJ PARTII NIE JEST MOŻLIWE

8.1.    Zasady ogólne

Jeżeli sposób transportu lub przechowywania partii nie zezwala na pobieranie próbek pierwotnych z całej partii, próbki powinny w miarę możliwości być pobierane z partii w ruchu.

W przypadku dużych magazynów przeznaczonych do przechowywania paszy podmioty należy zachęcać do instalowania w nich sprzętu umożliwiającego (automatyczne) pobieranie próbek z całej przechowywanej partii.

W przypadku stosowania procedury pobierania próbek przewidzianej w niniejszym rozdziale 8 podmiot działający na rynku pasz lub jego przedstawiciel jest informowany o procedurze pobierania próbek. Jeżeli procedura ta zostanie zakwestionowana przez podmiot działający na rynku pasz lub jego przedstawiciela, umożliwiają oni właściwemu organowi pobieranie próbek w całej partii na koszt podmiotu lub jego przedstawiciela.

8.2.    Duże partie transportowane statkiem

8.2.1.    Dynamiczne pobieranie próbek z dużych partii transportowanych statkiem

Próbki z dużych partiach na statkach powinny być w miarę możliwości pobierane, gdy produkt jest w ruchu (dynamiczne pobieranie próbek).

Próbki pobiera się w podziale na ładownie (jednostkę, którą można fizycznie rozdzielić). Ładownie są jednak opróżniane częściowo jedna po drugiej, więc początkowy podział fizyczny nie występuje po przetransportowaniu do miejsca przechowywania. Próbki można zatem pobierać w ramach początkowego podziału fizycznego lub w ramach podziału po transporcie do miejsca przechowywania.

Rozładunek statku może trwać kilka dni. Próbki należy zazwyczaj pobierać w regularnych odstępach czasu podczas całego rozładunku. Jednakże nie zawsze jest możliwe lub stosowne, aby urzędowy inspektor był obecny przy pobieraniu próbek podczas całego rozładunku. Dlatego zezwala się na pobieranie próbek (kontrolowanej) części partii. Liczbę próbek pierwotnych ustala się przy uwzględnieniu rozmiaru kontrolowanej części.

W przypadku pobierania próbek części partii paszy tej samej klasy lub o takim samym opisie, jeżeli część ta zostaje uznana za niespełniającą wymogów UE, uznaje się, że cała pasza należąca do tej partii nie spełnia tych wymogów, chyba że z przeprowadzonej szczegółowej oceny wynika, że nie ma dowodów wykazujących, że pozostała część partii nie spełnia wymogów UE.

Nawet jeżeli oficjalna próbka jest pobierana automatycznie, obecność inspektora jest wymagana. Jednakże jeżeli próbki pobierane są automatycznie przy wcześniejszym ustawieniu parametrów, których nie można zmienić w procesie pobierania próbek, zaś próbki pierwotne zbierane są do zapieczętowanego pojemnika, uniemożliwiając ewentualne oszustwa, wówczas obecność inspektora jest wymagana tylko na początku pobierania próbek, przy każdej zmianie pojemnika i pod koniec pobierania próbek.

8.2.2.    Statyczne pobieranie próbek z partii transportowanych statkiem

Jeżeli pobieranie próbek odbywa się w sposób statyczny, należy zastosować procedurę przewidzianą dla miejsc przechowywania (silosów) dostępnych od góry (zob. pkt 8.4.1).

Próbki muszą być pobierane z dostępnej części partii/ładowni (od góry). Liczbę próbek pierwotnych określa się poprzez uwzględnienie rozmiaru kontrolowanej części. W przypadku pobierania próbek części partii paszy tej samej klasy lub o takim samym opisie, jeżeli część ta zostaje uznana za niespełniającą wymogów UE, uznaje się, że cała pasza należąca do tej partii nie spełnia tych wymogów, chyba że z przeprowadzonej szczegółowej oceny wynika, że nie ma dowodów wykazujących, że pozostała część partii nie spełnia wymogów UE.

8.3.    Pobieranie próbek z dużych partii przechowywanych w magazynach

Próbki muszą być pobierane z dostępnej części partii. Liczbę próbek pierwotnych określa się poprzez uwzględnienie rozmiaru kontrolowanej części. W przypadku pobierania próbek części partii paszy tej samej klasy lub o takim samym opisie, jeżeli część ta zostaje uznana za niespełniającą wymogów UE, uznaje się, że cała pasza należąca do tej partii nie spełnia tych wymogów, chyba że z przeprowadzonej szczegółowej oceny wynika, że nie ma dowodów wykazujących, że pozostała część partii nie spełnia wymogów UE.

8.4.    Pobieranie próbek z miejsc przechowywania (silosów)

8.4.1.    Pobieranie próbek z silosów (łatwo) dostępnych od góry

Próbki muszą być pobierane z dostępnej części partii. Liczbę próbek pierwotnych określa się poprzez uwzględnienie rozmiaru kontrolowanej części. W przypadku pobierania próbek części partii paszy tej samej klasy lub o takim samym opisie, jeżeli część ta zostaje uznana za niespełniającą wymogów UE, uznaje się, że cała pasza należąca do tej partii nie spełnia tych wymogów, chyba że z przeprowadzonej szczegółowej oceny wynika, że nie ma dowodów wykazujących, że pozostała część partii nie spełnia wymogów UE.

8.4.2.    Pobieranie próbek z silosów niedostępnych od góry (silosów zamkniętych)

8.4.2.1.    Silosy niedostępne od góry (zamknięte) o rozmiarze > 100 ton

Pasze przechowywane w takich silosach nie mogą być kontrolowane w sposób statyczny. Jeżeli muszą być pobrane próbki z paszy przechowywanej w silosie i nie ma możliwości jej przeniesienia, należy uzgodnić z podmiotem, że poinformuje on inspektora o rozładunku silosu w celu umożliwienia pobrania próbek paszy w ruchu.

8.4.2.2.    Silosy niedostępne od góry (zamknięte) o rozmiarze < 100 ton

Procedura pobierania próbek polega na umieszczeniu 50–100 kg w pojemniku i pobraniu z niego próbek. Wielkość próbki zbiorczej odpowiada wielkości całej partii, a liczba próbek pierwotnych odpowiada ilości pobranej z silosu do pojemnika w celu pobrania próbek. W przypadku pobierania próbek części partii paszy tej samej klasy lub o takim samym opisie, jeżeli część ta zostaje uznana za niespełniającą wymogów UE, uznaje się, że cała pasza należąca do tej partii nie spełnia tych wymogów, chyba że z przeprowadzonej szczegółowej oceny wynika, że nie ma dowodów wykazujących, że pozostała część partii nie spełnia wymogów UE.

8.5.    Pobieranie próbek z paszy luzem w dużych zamkniętych pojemnikach

Próbki z takich partii mogą być pobrane jedynie po rozładunku. W niektórych przypadkach nie jest możliwy rozładunek w miejscu przywozu lub kontroli, w związku z czym próbki powinny zostać pobrane w momencie rozładunku takich pojemników.

9.   INSTRUKCJE POBIERANIA, PRZYGOTOWANIA I PAKOWANIA PRÓBEK

9.1.    Uwagi ogólne

Próbki należy pobierać i przygotowywać bez zbędnej zwłoki, przy zachowaniu środków ostrożności gwarantujących, że produkt nie ulegnie zmianie lub zanieczyszczeniu. Stosowany sprzęt, a także powierzchnie i pojemniki przeznaczone na próbki muszą być czyste i suche.

9.2.    Próbki pierwotne

Próbki pierwotne należy pobrać losowo z całej partii przy zachowaniu w przybliżeniu jednakowej ich wielkości.

Rozmiar próbki pierwotnej wynosi co najmniej 100 g lub 25 g w przypadku pasz objętościowych i włóknistych o niskim ciężarze właściwym.

Jeżeli, zgodnie z procedurą pobierania próbek ustanowioną w pkt 8, pobranych ma zostać mniej niż 40 próbek pierwotnych, rozmiar próbek pierwotnych ustala się na podstawie wymaganej wielkości próbki zbiorczej, jaką należy osiągnąć (zob. pkt 6).

W przypadku pobierania próbek z małych partii opakowanej paszy, jeżeli zgodnie z wymogami ilościowymi pobrana ma zostać ograniczona liczba próbek pierwotnych, próbką pierwotną jest zawartość jednej oryginalnej jednostki, nieprzekraczająca 1 kg lub litra.

W przypadku pobierania próbek paszy opakowanej, składającej się z małych jednostek (np. < 250 g), rozmiar próbki pierwotnej zależy od rozmiaru jednostki.

9.2.1.    Pasze luzem

W stosownych przypadkach próbki mogą być pobierane, gdy kontrolowana partia paszy jest w ruchu (załadunek lub wyładunek).

9.2.2.    Pasze opakowane

Po wybraniu wymaganej liczby jednostek w celu pobrania próbek zgodnie z rozdziałem 5, część zawartości każdej jednostki należy usunąć przy użyciu próbnika lub szufli. W miarę potrzeby próbki należy pobierać po opróżnieniu każdej jednostki oddzielnie.

9.2.3.    Homogeniczne lub nadające się do homogenizacji pasze płynne lub półpłynne

Po wybraniu wymaganej liczby jednostek w celu pobrania próbek zgodnie z rozdziałem 5, należy w razie potrzeby zhomogenizować zawartość i pobrać próbkę z każdej jednostki.

Próbki pierwotne mogą być pobierane w trakcie opróżniania zawartości pojemnika.

9.2.4.    Nienadające się do homogenizacji pasze płynne lub półpłynne

Po wybraniu wymaganej liczby jednostek w celu pobrania próbek zgodnie z rozdziałem 5, należy pobrać próbki z różnych poziomów.

Próbki mogą być także pobierane w trakcie opróżniania pojemników, przy czym pierwszą frakcję należy odrzucić.

W każdym przypadku całkowita pobrana objętość nie może być mniejsza niż 10 litrów.

9.2.5.    Bloki paszy i lizawki mineralne

Po wybraniu wymaganej liczby bloków i lizawek w celu pobrania próbek zgodnie z rozdziałem 5, należy pobrać część każdego bloku lub lizawki. Jeżeli podejrzewa się, że blok lub lizawka nie są homogeniczne, jako próbkę można pobrać cały blok lub lizawkę.

W przypadku bloków lub lizawek ważących maksymalnie 1 kg próbką pierwotną jest zawartość jednego bloku lub jednej lizawki.

9.3.    Przygotowanie próbek zbiorczych

Próbki pierwotne miesza się w jedną próbkę zbiorczą.

9.4.    Przygotowanie próbek końcowych

Materiał zawarty w próbce zbiorczej należy dokładnie wymieszać ( 4 ).

9.5.    Opakowanie próbek

Pojemniki lub opakowania są zapieczętowane i opatrzone etykietą w sposób uniemożliwiający otwarcie bez zniszczenia pieczęci. Całość etykiety musi być opieczętowana.

9.6.    Wysyłka próbek do laboratorium

Próbkę wysyła się bezzwłocznie do wyznaczonego laboratorium analitycznego wraz z informacjami niezbędnymi dla analityka.

10.   PROTOKÓŁ POBIERANIA PRÓBEK

Po każdym pobraniu próbek należy sporządzić protokół umożliwiający jednoznaczną identyfikację każdej kontrolowanej części i jej wielkości.

W protokole należy zapisać wszelkie przypadki odejścia od procedury pobierania próbek przewidzianej w niniejszym rozporządzeniu.

Oprócz udostępnienia protokołu urzędowemu laboratorium kontrolnemu zostaje on również udostępniony podmiotowi działającemu na rynku pasz i/lub laboratorium wyznaczonemu przez ten podmiot.

---

ZAŁĄCZNIK II

PRZEPISY OGÓLNE DOTYCZĄCE METODYKI ANALIZY PASZ

A.   PRZYGOTOWANIE PRÓBEK DO ANALIZY

1.    Cel

Poniżej opisane procedury dotyczą przygotowania do badań próbek przesyłanych do laboratoriów kontrolnych po pobraniu zgodnie z przepisami określonymi w załączniku I.

Próbki te muszą być przygotowane w taki sposób, aby odważone ilości, jak przewidziano w metodyce analizy, były homogeniczne i reprezentatywne w odniesieniu do próbek końcowych.

2.    Niezbędne środki ostrożności

Wybór procedury przy przygotowaniu próbek zależy od stosowanych metod analizy oraz składników lub substancji, które mają zostać poddane kontroli. Z tego względu bardzo ważne jest upewnienie się, czy wybrana procedura przygotowania próbki jest właściwa w odniesieniu do stosowanej metody analizy oraz składników lub substancji, które mają zostać poddane kontroli.

Wszystkie konieczne czynności należy wykonywać w taki sposób, aby zapobiec zanieczyszczeniu i zmianie składu próbki do badań.

Rozdrabnianie, mieszanie i przesiewanie należy wykonywać bezzwłocznie, przy ograniczonym dostępie powietrza i światła do próbki. Nie należy stosować młynków i rozdrabniaczy, które podczas pracy powodują znaczące nagrzewanie próbki do badań.

W przypadku pasz szczególnie wrażliwych na ciepło zaleca się ręczne rozdrabnianie. Ponadto zastosowany sprzęt nie może stanowić źródła zanieczyszczenia.

Jeżeli przygotowanie próbki do badań nie może być przeprowadzone bez znacznych zmian poziomu wilgotności próbki, poziom jej wilgotności oznacza się przed przygotowaniem i po przygotowaniu próbki do badań zgodnie z metodą, o której mowa w załączniku III część A.

3.    Procedura

3.1.    Procedura ogólna

Podwielokrotność do badań pobiera się z próbki końcowej. Stożkowanie i dzielenie na ćwiartki nie są zalecane, ponieważ może to skutkować podwielokrotnościami do badań o dużym błędzie podziału.

3.1.1.    Pasze, które mogą być zmielone

3.1.2.    Pasze, które mogą być zmielone po wysuszeniu

3.1.3.    Pasze płynne lub półpłynne

3.1.4.    Inne pasze

3.2.    Procedura szczególna w przypadku badania metodą inspekcji wzrokowej lub mikroskopowej lub w przypadku gdy cała próbka zbiorcza jest zhomogenizowana

4.    Przechowywanie próbek

Próbki należy przechowywać w temperaturze, która nie spowoduje zmiany ich składu. Próbki przeznaczone do badania witamin lub substancji, które są szczególnie wrażliwe na światło, należy przechowywać w warunkach gwarantujących, że światło nie wywrze na nie niekorzystnego wpływu.

B.   PRZEPISY DOTYCZĄCE ODCZYNNIKÓW I APARATURY UŻYWANEJ W METODYCE ANALIZY

C.   STOSOWANIE METODYKI ANALIZY I WYRAŻANIE WYNIKÓW

1.    Postępowanie ekstrakcyjne

W kilku metodach określono konkretne postępowanie ekstrakcyjne. Z reguły można zastosować inne postępowanie ekstrakcyjne niż to, o którym mowa w danej metodyce, pod warunkiem że dowiedziono, iż w porównaniu z postępowaniem określonym w metodyce stosowane postępowanie ma równoważną wydajność ekstrakcji w odniesieniu do analizowanej matrycy.

2.    Postępowanie oczyszczające

W kilku metodach określono konkretne postępowanie oczyszczające. Z reguły można zastosować inne postępowanie oczyszczające niż to, o którym mowa w danej metodyce, pod warunkiem że dowiedziono, iż w porównaniu z postępowaniem określonym w metodyce stosowane postępowanie daje równoważne wyniki analityczne w odniesieniu do analizowanej matrycy.

3.    Liczba oznaczeń

W przypadku analizy substancji niepożądanych, jeżeli wynik pierwszego oznaczenia jest znacznie (o > 50 %) niższy niż wartość ustalona w specyfikacji, nie są konieczne dodatkowe oznaczenia, pod warunkiem że stosowane jest odpowiednie postępowanie w odniesieniu do jakości. W innych przypadkach konieczna jest druga analiza (drugie oznaczenie) w celu wykluczenia możliwości wewnętrznego zanieczyszczenia krzyżowego lub przypadkowego wymieszania się próbek. Do weryfikacji zgodności stosuje się średnią z dwóch oznaczeń przy uwzględnieniu niepewności pomiaru.

W przypadku kontroli deklarowanej zawartości substancji lub składnika, jeżeli wynik pierwszego oznaczenia potwierdza deklarowaną zawartość, tj. wyniki analizy mieszczą się w dopuszczalnym zakresie zmienności co do deklarowanej zawartości, nie są konieczne dodatkowe oznaczenia, pod warunkiem że stosowane jest odpowiednie postępowanie w odniesieniu do jakości. W innych przypadkach konieczna jest druga analiza (drugie oznaczenie) w celu wykluczenia możliwości wewnętrznego zanieczyszczenia krzyżowego lub przypadkowego wymieszania się próbek. Do weryfikacji zgodności stosuje się średnią z dwóch oznaczeń przy uwzględnieniu niepewności pomiaru.

W niektórych przypadkach dopuszczalny zakres zmienności określono w prawodawstwie, np. w rozporządzeniu Parlamentu Europejskiego i Rady (WE) nr 767/2009 z dnia 13 lipca 2009 r. w sprawie wprowadzania na rynek i stosowania pasz, zmieniającym rozporządzenie (WE) nr 1831/2003 Parlamentu Europejskiego i Rady i uchylającym dyrektywę Rady 79/373/EWG, dyrektywę Komisji 80/511/EWG, dyrektywy Rady 82/471/EWG, 83/228/EWG, 93/74/EWG, 93/113/WE i 96/25/WE oraz decyzję Komisji 2004/217/WE ( 7 ).

4.    Podawanie zastosowanych metod analizy w sprawozdaniu

W sprawozdaniu z analizy określa się zastosowaną metodykę.

5.    Podawanie wyników analizy

Wynik analizy wyraża się w sposób podany w metodyce analizy, zawiera on odpowiednią liczbę cyfr znaczących i, jeżeli to konieczne, musi być korygowany do wilgotności próbki końcowej przed przygotowaniem.

6.    Niepewność pomiaru i stopień odzysku w przypadku analizy substancji niepożądanych

W odniesieniu do substancji niepożądanych w rozumieniu dyrektywy 2002/32/WE uznaje się, że produkt przeznaczony na paszę jest niezgodny pod względem ustalonej zawartości maksymalnej, w przypadku gdy wynik analizy dotyczący paszy o zawartości wilgoci wynoszącej 12 % wskazuje na przekroczenie zawartości maksymalnej z uwzględnieniem rozszerzonej niepewności pomiaru i poprawki na stopień odzysku. Badane stężenie po uwzględnieniu poprawki na stopień odzysku i odjęciu rozszerzonej niepewności pomiaru od wyniku stanowi podstawę oceny zgodności. Procedura ta ma zastosowanie jedynie w przypadkach, gdy stosowana metoda analizy pozwala na ustalenie wartości niepewności pomiaru i stopnia odzysku (nie jest to możliwe np. w przypadku analizy mikroskopowej).

Wynik analizy przedstawia się w sposób następujący (o ile stosowana metoda analizy pozwala na ustalenie wartości niepewności pomiaru i stopnia odzysku):

Jeżeli wynik analizy jest jednak znacznie (o > 50 %) niższy niż wartość ustalona w specyfikacji oraz pod warunkiem że stosowane jest odpowiednie postępowanie w odniesieniu do jakości, a analiza wykonywana jest jedynie do celów sprawdzenia zgodności z przepisami prawnymi, wynik analizy można podać bez korekty na odzysk; w takim przypadku można pominąć podawanie stopnia odzysku i niepewności pomiaru.

▼B

---

ZAŁĄCZNIK III

METODY ANALIZY SKŁADU MATERIAŁÓW I MIESZANEK PASZOWYCH

A.   OZNACZANIE WILGOTNOŚCI

1.   Cel i zakres stosowania metody

Metoda służy do oznaczania wilgotności pasz. Należy zauważyć, że w przypadku pasz zawierających substancje lotne, np. kwasy organiczne, podczas oznaczania wilgotności oznaczana jest również znaczna ilość substancji lotnych.

Metody nie stosuje się do badania produktów mlecznych występujących jako materiały paszowe, związków mineralnych, mieszanin składających się głównie ze związków mineralnych, tłuszczów i olejów pochodzenia zwierzęcego i roślinnego oraz nasion i owoców roślin oleistych.

2.   Sposób przeprowadzenia metody

Próbka jest suszona w warunkach dostosowanych do właściwości pasz. Obniżenie masy jest określane przez ważenie. Jeżeli pasze stałe zawierają duże ilości wilgotności, konieczne jest przeprowadzenie wstępnego suszenia.

3.   Aparatura i sprzęt

4.   Sposób postępowania

Uwaga

:

Czynności opisane w tej części należy wykonywać natychmiast po otworzeniu opakowania próbki. Analizę należy wykonać co najmniej w 2 powtórzeniach.

4.1.   Przygotowanie

4.1.1.    Pasze inne niż określone w pkt 4.1.2 i pkt 4.1.3

Pobrać co najmniej 50 g próbki. Jeżeli to konieczne, rozdrobnić lub podzielić w taki sposób, aby zapobiec jakimkolwiek zmianom zawartości wilgotności (zob. pkt 6).

4.1.2.    Zboża i kasze

Pobrać co najmniej 50 g próbki. Rozdrobnić na cząstki, które przechodzą przez oczka sita o średnicy 0,5 mm co najmniej w 50 % i pozostają w ilości nie wyższej niż 10 % na sicie o oczkach o średnicy 1 mm.

4.1.3.    Pasze ciekłe lub w postaci pasty, pasze z przewagą olejów lub tłuszczów

Pobrać 25 g próbki, zważyć z dokładnością do 10 mg, dodać odpowiednią ilość bezwodnego piasku odważonego z dokładnością do 10 mg i zmieszać do uzyskania homogennego produktu.

4.2.   Suszenie

4.2.1.    Pasze inne niż określone w pkt 4.2.2 i 4.2.3

Zważyć, z dokładnością do 1 mg, naczynko z przykrywką (pkt 3.3). Do naczynka odważyć, z dokładnością do 1 mg, około 5 g próbki i równo rozmieścić. Wstawić naczynko bez przykrywki do suszarki podgrzanej do temperatury 103 oC. Aby zapobiec nadmiernemu spadkowi temperatury, umieścić naczynko w suszarce tak szybko, jak to możliwe. Suszyć przez cztery godziny od czasu, gdy suszarka ponownie osiągnie temperaturę 103 oC. Nałożyć przykrywkę na naczynko, wyjąć je z suszarki, pozostawić do schłodzenia w eksykatorze (pkt 3.6) na 30 do 45 minut i zważyć z dokładnością do 1 mg.

Pasze z przeważającym udziałem oleju lub tłuszczu suszyć ponownie w suszarce przez 30 minut w temperaturze 130 oC. Różnica pomiędzy dwoma ważeniami nie może przekraczać 0,1 % wilgotności.

4.2.2.    Zboża, mąki, kasze i mączki

Zważyć, z dokładnością do 0,5 mg, naczynko z przykrywką (pkt 3.3). Do naczynka odważyć, z dokładnością do 1 mg, około 5 g rozdrobnionej próbki i równo rozmieścić. Wstawić naczynko bez przykrywki do suszarki podgrzanej do temperatury 130 oC. Aby zapobiec nadmiernemu spadkowi temperatury, umieścić naczynko w suszarce tak szybko, jak to możliwe. Suszyć przez dwie godziny od czasu, gdy suszarka ponownie osiągnie temperaturę 130 oC. Nałożyć przykrywkę na naczynko, wyjąć je z suszarki, pozostawić do schłodzenia w eksykatorze (pkt 3.6) na 30 do 45 minut i zważyć z dokładnością do 1 mg.

Zważyć, z dokładnością do 0,5 mg, naczynko z przykrywką (pkt 3.3). Do naczynka odważyć, z dokładnością do 1 mg, około 5 g próbki i równo rozmieścić. Wstawić naczynko bez przykrywki do suszarki próżniowej (pkt 3.5), podgrzanej do temperatury od 80 do 85 oC. Aby zapobiec nadmiernemu spadkowi temperatury, umieścić naczynko w suszarce tak szybko, jak to możliwe.

Podwyższyć ciśnienie do 100 Torr i pozostawić w celu wysuszenia na cztery godziny pod działaniem tego ciśnienia, w strumieniu gorącego, suchego powietrza albo stosując czynnik suszący (ok. 300 g na 20 próbek). W drugim przypadku odłączyć pompę próżniową po uzyskaniu odpowiedniego ciśnienia. Czas suszenia liczyć od chwili, gdy suszarka ponownie osiągnie temperaturę od 80 do 85 oC. Ostrożnie zrównać ciśnienie w suszarce z ciśnieniem atmosferycznym. Otworzyć suszarkę, szybko nałożyć przykrywkę na naczynko, wyjąć je z suszarki, pozostawić do schłodzenia w eksykatorze (pkt 3.6) na 30–45 minut i zważyć z dokładnością do 1 mg. Suszyć ponownie w suszarce próżniowej przez 30 minut o temperaturze od 80 do 85 oC i zważyć powtórnie. Różnica pomiędzy dwoma ważeniami nie może przekraczać 0,1 % wilgotności.

4.3.   Suszenie wstępne

4.3.1.    Pasze inne niż określone w pkt 4.3.2

Pasze stałe o wysokim poziomie wilgotności, trudne do rozdrabniania, należy poddać wstępnemu suszeniu w następujący sposób:

Odważyć 50 g, z dokładnością do 10 mg, nierozdrobnionej próbki (pasze sprasowane lub zbrylone można w razie potrzeby wstępnie rozdzielić) do odpowiedniego naczynia (np. płytka aluminiowa o wymiarach 20 cm × 12 cm z obwódką o wysokości 0,5 cm). Suszyć w suszarce o temperaturze od 60 do 70 oC, aż poziom wilgotności obniży się do 8–12 %. Wyjąć próbkę z suszarki, pozostawić bez przykrycia do schłodzenia w laboratorium przez godzinę i zważyć z dokładnością do 10 mg. Szybko rozdrobnić, postępując w sposób określony w pkt 4.1.1, i suszyć w sposób określony w pkt 4.2.1 lub 4.2.3, w zależności od rodzaju paszy.

4.3.2.    Zboża

Ziarno zbóż o wilgotności wyższej niż 17 % należy poddać wstępnemu suszeniu w następujący sposób:

Odważyć, z dokładnością do 10 mg, 50 g nierozdrobnionego ziarna do odpowiedniego naczynia (np. płytka aluminiowa o wymiarach 20 × 12 cm z obwódką o wysokości 0,5 cm). Suszyć w suszarce od 5 do 7 minut w temperaturze 130 oC. Wyjąć próbkę z suszarki, pozostawić bez przykrycia do schłodzenia w laboratorium przez dwie godziny i zważyć z dokładnością do 10 mg. Szybko rozdrobnić, postępując w sposób określony w pkt 4.1.2, i suszyć w sposób określony w pkt 4.2.2.

5.   Obliczanie wyników

Wilgotność (X) jako udział procentowy w próbce obliczana jest według następujących wzorów:

5.1.   Suszenie bez wstępnego podsuszania

gdzie:

m

=

początkowa masa w g badanej próbki

m0

=

masa w g badanej próbki po wysuszeniu

5.2.   Suszenie z podsuszaniem

gdzie:

m

=

początkowa masa w g badanej próbki

m1

=

masa w g badanej próbki po wstępnym podsuszaniu

m2

=

masa w g badanej próbki po rozdrobnieniu

m0

=

masa w g badanej próbki po wysuszeniu

5.3.   Powtarzalność

Różnica pomiędzy wynikami dwóch równoległych oznaczeń wykonanych dla tej samej próbki nie może przekraczać 0,2 % bezwzględnej wartości wilgotności.

6.   Objaśnienia

Jeżeli rozdrabnianie próbki jest konieczne i wpływa na poziom wilgotności w produkcie, wyniki analizy składników paszowych należy skorygować o poziom wilgotności w początkowym stanie próbki.

B.   OZNACZANIE WILGOTNOŚCI OLEJÓW I TŁUSZCZÓW POCHODZENIA ZWIERZĘCEGO I ROŚLINNEGO

1.   Cel i zakres stosowania metody

Metoda służy do oznaczania zawartości wody i substancji lotnych w tłuszczach i olejach pochodzenia zwierzęcego oraz roślinnego.

2.   Sposób przeprowadzenia metody

Próbka jest suszona w temperaturze 103 oC do uzyskania stałej masy (ubytek masy między dwoma kolejnymi ważeniami musi być równy lub mniejszy niż 1 mg). Ubytek masy jest określany metodą wagową.

3.   Aparatura i sprzęt

4.   Sposób postępowania

Odważyć, z dokładnością do 1 mg, około 20 g homogennej próbki do suchego, zważonego naczynia (3.1), zawierającego termometr (3.2). Ogrzewać na łaźni piaskowej lub płycie grzewczej (3.3) ciągle mieszając termometrem, tak aby uzyskać wzrost temperatury do 90 oC w czasie około 7 minut.

Zmniejszyć ogrzewanie, obserwując częstotliwość odrywania się pęcherzyków powietrza od dna naczynia. Temperatura nie może przekroczyć 105 oC. Kontynuować mieszanie, pocierając dno naczynia do czasu, aż przestaną się tworzyć pęcherzyki.

W celu całkowitego odparowania wilgotności, ogrzewać próbkę kilka razy do temperatury 103 oC ± 2 oC, schładzając do 93 oC pomiędzy kolejnymi ogrzewaniami. Następnie schłodzić próbkę do temperatury pokojowej w eksykatorze (3.4) i zważyć. Powtarzać ogrzewanie, dopóki ubytek masy pomiędzy dwoma kolejnymi ważeniami nie będzie większy niż 2 mg.

Uwaga

:

Wzrost masy próbki po powtórnym ogrzewaniu wskazuje na utlenienie się tłuszczu. W takim przypadku do obliczenia wyniku wziąć ostatnią masę próbki, przed wzrostem jej masy.

5.   Obliczanie wyników

Wilgotność (X) jako udział procentowy w próbce obliczana jest według następującego wzoru:

gdzie:

m

=

masa w g badanej próbki

m1

=

masa w g naczynia z zawartością przed ogrzewaniem

m2

=

masa w g naczynia z zawartością po ogrzewaniu

Wyniki oznaczania niższe niż 0,05 % należy zapisać, używając określenia „niższe niż 0,05 %”.

Powtarzalność

Różnica wilgotności pomiędzy wynikami dwóch równoległych oznaczeń wykonanych dla tej samej próbki nie może przekraczać 0,05 % wartości bezwzględnej.

C.   OZNACZANIE ZAWARTOŚCI BIAŁKA SUROWEGO

1.   Cel i zakres stosowania metody

Metoda służy do oznaczania zawartości białka surowego w paszach na podstawie zawartości azotu oznaczonego metodą Kjeldahla.

2.   Sposób przeprowadzenia metody

Próbka jest mineralizowana kwasem siarkowym w obecności katalizatora. Kwaśny roztwór jest alkalizowany z użyciem roztworu wodorotlenku sodu. Amoniak destyluje się i zbiera w znanej ilości roztworu kwasu siarkowego, którego nadmiar jest miareczkowany mianowanym roztworem wodorotlenku sodu.

Ewentualnie uwolniony amoniak jest destylowany do nadmiaru roztworu kwasu borowego, a następnie miareczkowany roztworem kwasu chlorowodorowego lub siarkowego.

3.   Odczynniki i roztwory

Przy stosowaniu kolorymetrycznego punktu końcowego do roztworów kwasu borowego należy dodać wskaźniki czerwieni metylowej i zieleni bromokrezolowej. Jeżeli przygotowuje się 1 l roztworu kwasu borowego, przed dostosowaniem objętości należy dodać 7 ml roztworu czerwieni metylowej (3.16) i 10 ml roztworu zieleni bromokrezolowej (3.17).

Odczyn pH roztworu kwasu borowego może różnić się między seriami w zależności od użytej wody. Często do uzyskania pozytywnej próby ślepej konieczne jest dostosowanie pH przy pomocy małej objętości zasady.

Uwaga

:

Dodanie ok. 3–4 ml NaOH (3.11) do 1 l kwasu borowego o stężeniu 10 g/l zwykle zapewnia dobre dostosowanie. Roztwór należy przechowywać w temperaturze pokojowej oraz chronić przed światłem i źródłami oparów amoniaku.

Uwaga

:

Można zastosować inne stężenia roztworów objętościowych (3.5, 3.6, 3.7, 3.10, 3.11 i 3.19), jeżeli zostanie to uwzględnione w obliczeniach. Stężenie należy podawać zawsze z dokładnością do czterech miejsc po przecinku.

4.   Aparatura i sprzęt

Aparatura i sprzęt odpowiedni do przeprowadzenia mineralizacji, destylacji i miareczkowania według metody Kjeldahla.

5.   Sposób postępowania

5.1.   Mineralizacja

Odważyć, z dokładnością do 0,001 g, 1g próbki i przenieść do kolby aparatu do mineralizacji. Dodać 15 g siarczanu potasu (3.1), odpowiednią ilość katalizatora (3.2) (od 0,3 do 0,4 g tlenku miedzi(II) lub od 0,9 do 1,2 g pentahydratu siarczanu miedzi(II)), 25 ml kwasu siarkowego (3.4) oraz, w razie potrzeby, kilka granulek pumeksu (3.12) i zamieszać.

Początkowo ogrzewać kolbę ostrożnie, w razie konieczności mieszając od czasu do czasu, aż do zwęglenia substancji i zaniku piany; następnie zwiększyć intensywność ogrzewania aż do trwałego wrzenia roztworu. Ogrzewanie jest właściwe, jeżeli wrzący kwas kondensuje się na ściankach kolby. Zapobiegać przegrzewaniu się ścianek i przylepianiu do nich organicznych cząstek.

Od chwili gdy roztwór stanie się klarowny i przyjmie jasnozieloną barwę, kontynuować ogrzewanie przez dwie godziny, a następnie pozostawić do schłodzenia.

5.2.   Destylacja

Ostrożnie dodać do kolby ilość wody wystarczającą do całkowitego rozpuszczenia siarczanów. Pozostawić do schłodzenia, a następnie w razie potrzeby dodać kilka granulek cynku (3.3). Postępować zgodnie z pkt 5.2.1 lub 5.2.2.

5.2.1.    Destylacja do kwasu siarkowego

Umieścić w odbieralniku aparatu destylacyjnego odmierzone 25 ml kwasu siarkowego (3.5 lub 3.7), zależnie od przewidywanej zawartości azotu. Dodać kilka kropli wskaźnika czerwieni metylowej (3.8).

Podłączyć kolbę mineralizacyjną do chłodnicy aparatu destylacyjnego i zanurzyć koniec chłodnicy w cieczy znajdującej się w kolbie odbieralnika na głębokość co najmniej 1 cm (zob. objaśnienia pkt 8.3). Powoli wlać 100 ml roztworu wodorotlenku sodu (3.9) do kolby mineralizacyjnej, nie dopuszczając do strat amoniaku (zob. objaśnienia pkt 8.1). Ogrzewać kolbę aż do całkowitego oddestylowania amoniaku.

5.2.2.    Destylacja do kwasu borowego

Jeżeli miareczkowanie zawartości amoniaku w destylacie wykonywane jest ręcznie, zastosowanie ma poniższe postępowanie. Jeżeli aparat destylacyjny jest w pełni zautomatyzowany i obejmuje miareczkowanie zawartości amoniaku w destylacie, należy stosować się do instrukcji producenta aparatu.

Umieścić kolbę odbieralnika zawierającą od 25 do 30 ml roztworu kwasu borowego (3.18) pod ujściem chłodnicy w taki sposób, aby rurka doprowadzająca znajdowała się pod powierzchnią nadmiaru roztworu kwasu borowego. Ustawić aparat destylacyjny, aby podał 50 ml roztworu wodorotlenku sodu (3.9). Obsługiwać aparat destylacyjny zgodnie z instrukcjami producenta i oddestylować amoniak uwolniony w wyniku dodania roztworu wodorotlenku sodu. Zebrać destylat w roztworze kwasu borowego. Ilość destylatu (czas destylacji z parą wodną) zależy od zawartości azotu w próbce. Postępować zgodnie z instrukcjami producenta.

Uwaga

:

W przypadku półautomatycznego aparatu destylacyjnego dodawanie nadmiaru wodorotlenku sodu i destylacja z parą wodną przeprowadzane są automatycznie.

5.3.   Miareczkowanie

Postępować zgodnie z pkt 5.3.1 lub 5.3.2.

5.3.1.    Kwas siarkowy

Miareczkować nadmiar kwasu siarkowego w kolbie odbieralnika roztworem wodorotlenku sodu (pkt 3.10 lub 3.11), w zależności od stężenia zastosowanego kwasu siarkowego, do uzyskania punktu końcowego.

5.3.2.    Kwas borowy

Miareczkować zawartość kolby odbieralnika mianowanym roztworem objętościowym kwasu chlorowodorowego (3.19) lub kwasu siarkowego (3.6) przy pomocy biurety i odczytać ilość zużytego titrantu.

Przy stosowaniu kolorymetrycznego punktu końcowego punkt końcowy osiąga się w momencie pojawienia się pierwszego śladu różowego zabarwienia cieczy. Określić odczyt biurety z dokładnością do 0,05 ml. W wizualizacji punktu końcowego pomocna jest podświetlana płyta mieszadła magnetycznego lub detektor fotometryczny.

Można to przeprowadzić automatycznie za pomocą parowego aparatu destylacyjnego z funkcją automatycznego miareczkowania.

Przy obsłudze konkretnego aparatu destylacyjnego lub aparatu do miareczkowania stosować się do instrukcji producenta.

Uwaga

:

Jeżeli stosowany jest system automatycznego miareczkowania, rozpoczyna się ono bezpośrednio po destylacji i stosowany jest 1 % roztwór kwasu borowego (3.18). Jeżeli stosowany jest w pełni automatyczny aparat destylacyjny, automatyczne miareczkowanie amoniaku można przeprowadzić również z wykryciem punktu końcowego przy pomocy potencjometrycznego systemu pH. W tym przypadku stosowany jest automatyczny aparat do miareczkowania z pehametrem. Pehametr musi być odpowiednio skalibrowany w zakresie od pH 4 do pH 7 za pomocą zwykłych laboratoryjnych metod kalibracji pH. Punkt końcowy pH w miareczkowaniu osiąga się przy wartości pH równej 4,6 , co stanowi najwyższy punkt krzywej miareczkowania (punkt przegięcia).

5.4.   Ślepa próba

W celu potwierdzenia, że zastosowane odczynniki nie zawierają azotu, przeprowadzić ślepą próbę (mineralizację, destylację i miareczkowanie), stosując 1 g sacharozy (3.14) zamiast próbki.

6.   Obliczanie wyników

Obliczenia wykonywane są zgodnie z pkt 6.1 lub 6.2.

6.1.   Obliczenia do miareczkowania zgodnie z pkt 5.3.1

Zawartość białka surowego jako udział procentowy w masie obliczana jest według następującego wzoru:

gdzie:

V0

=

objętość w ml NaOH (3.10 lub 3.11) zużytego do ślepej próby

V1

=

objętość w ml NaOH (3.10 lub 3.11) zużytego do miareczkowania próbki

c

=

stężenie w mol/l wodorotlenku sodu (3.10 lub 3.11)

m

=

masa w g próbki

6.2   Obliczenia do miareczkowania zgodnie z pkt 5.3.2

6.2.1.    Miareczkowanie kwasem chlorowodorowym

Zawartość białka surowego jako udział procentowy w masie obliczana jest według następującego wzoru:

gdzie:

m

=

masa naważki w g

c

=

stężenie w mol/l mianowanego roztworu objętościowego kwasu chlorowodorowego (3.19)

V0

=

objętość w ml kwasu chlorowodorowego użytego do próby ślepej

V1

=

objętość w ml kwasu chlorowodorowego użytego do naważki

6.2.2.    Miareczkowanie kwasem siarkowym

Zawartość białka surowego jako udział procentowy w masie obliczana jest według następującego wzoru:

gdzie:

m

=

masa naważki w g

c

=

stężenie w mol/l mianowanego roztworu objętościowego kwasu siarkowego (3.6)

V0

=

objętość w ml kwasu siarkowego (3.6) użytego do próby ślepej

V1

=

objętość w ml kwasu siarkowego (3.6) użytego do naważki

7.   Sprawdzenie metody

7.1.   Powtarzalność

Różnica między wynikami dwóch równoległych oznaczeń wykonanych dla tej samej próbki nie może przekraczać:

7.2.   Dokładność

Przeprowadzić analizę (mineralizację, destylację i miareczkowanie), stosując od 1,5 do 2,0 g acetanilidu (3.13) w obecności 1 g sacharozy (3.14); 1 g acetanilidu zużywa 14,80 ml kwasu siarkowego (3.5). Stopień odzysku musi wynosić co najmniej 99 %.

8.   Objaśnienia

D.   OZNACZANIE MOCZNIKA

1.   Cel i zakres stosowania metody

Metoda służy do oznaczania zawartości mocznika w paszach.

2.   Sposób przeprowadzenia metody

Próbka ze środkiem klarującym tworzy w wodzie zawiesinę. Zawiesina jest filtrowana. Zawartość mocznika w filtracie jest oznaczana po dodaniu 4-dwumetyloaminobenzaldehydu (4-DMAB) poprzez pomiar gęstości optycznej przy długości fali 420 nm.

3.   Odczynniki i roztwory

4.   Aparatura i sprzęt

5.   Sposób postępowania

5.1.   Analiza próbki

Odważyć, z dokładnością do 1 mg, 2 g próbki i umieścić razem z 1 g aktywnego węgla (3.4) w kolbie miarowej o pojemności 500 ml. Dodać 400 ml wody i 5 ml roztworu Carreza I (3.2), mieszać przez ok. 30 sekund, a następnie dodać 5 ml roztworu Carreza II (3.3). Mieszać przez 30 minut w mikserze. Uzupełnić do pełnej objętości kolby wodą, wstrząsnąć i przefiltrować.

Do probówek ze szklanymi szlifowanymi korkami przenieść po 5 ml przezroczystego, bezbarwnego filtratu, dodać 5 ml roztworu 4-DMAB (3.1) i zamieszać. Wstawić probówki do łaźni wodnej ustawionej na temperaturę 20 oC (+/- 4 oC). Po 15 minutach zmierzyć gęstość optyczną roztworu próbki spektrofotometrem przy długości fali 420 nm. Pomiar porównać ze ślepą próbą odczynnikową.

5.2.   Krzywa kalibracyjna

Do kolb miarowych o pojemności 100 ml nalać 1, 2, 4, 5 i 10 ml roztworu mocznika (3.5) i uzupełnić do pełnej objętości kolb wodą. Odlać 5 ml każdego z roztworów, dodać do każdej kolby po 5 ml roztworu 4-DMAB (3.1), wymieszać i zmierzyć gęstość optyczną w podany wyżej sposób, porównując z roztworem kontrolnym zawierającym 5 ml 4-DMAB i 5 ml wody pozbawionej mocznika. Wykreślić krzywą kalibracyjną.

6.   Obliczanie wyników

Na podstawie krzywej kalibracyjnej oznaczyć zawartość mocznika w próbce.

Wynik wyrazić jako udział procentowy w próbce.

7.   Objaśnienia

E.   OZNACZANIE LOTNYCH ZWIĄZKÓW AZOTOWYCH

I.   METODA MIKRODYFUZYJNA

1.   Cel i zakres stosowania metody

Metoda służy do oznaczania w paszach zawartości lotnych związków azotowych, w przeliczeniu na amoniak.

2.   Sposób przeprowadzenia metody

Próbka jest ekstrahowana wodą, a roztwór – klarowany i filtrowany. Lotne związki azotowe są oddzielane metodą mikrodyfuzji z użyciem roztworu węglanu potasu, zbierane w roztworze kwasu borowego i miareczkowane kwasem siarkowym.

3.   Odczynniki i roztwory

4.   Aparatura i sprzęt

5.   Sposób postępowania

Odważyć, z dokładnością do 1 mg, 10 g próbki do kolby miarowej o pojemności 200 ml i dodać 100 ml wody. Miksować w mikserze przez 30 minut. Dodać 50 ml roztworu kwasu trójchlorooctowego (3.1), uzupełnić do pełnej objętości kolby wodą, energicznie wstrząsnąć i przefiltrować przez karbowany filtr.

Pipetą wprowadzić 1 ml roztworu kwasu borowego (3.3) do środkowej części naczynka Conwaya i 1 ml filtratu próbki na obrzeże naczynka. Częściowo przykryć nasmarowaną przykrywką. Szybko dodać kroplami 1 ml nasyconego roztworu węglanu potasu (3.4) na obrzeże naczynka i zamknąć pokrywką, tak aby naczynko było hermetyczne. Obracać ostrożnie naczynkiem w płaszczyźnie poziomej, aby doprowadzić do zmieszania dwóch odczynników. Inkubować przez co najmniej cztery godziny w temperaturze pokojowej lub godzinę w temperaturze 40 oC.

Mikrobiuretą (4.3) miareczkować lotne związki zaabsorbowane w kwasie borowym, stosując roztwór kwasu siarkowego (3.5).

Ślepą próbę przeprowadzić w ten sam sposób, lecz bez próbki przeznaczonej do analizy.

6.   Obliczanie wyników

1 ml H2SO4 o stężeniu 0,01 mol/l odpowiada 0,34 mg amoniaku.

Przedstawić wynik jako udział procentowy w próbce.

Powtarzalność

Różnica pomiędzy wynikami dwóch równoległych oznaczeń wykonanych dla tej samej próbki nie może przekraczać:

7.   Objaśnienia

Jeżeli zawartość amoniaku w próbce przekracza 0,6 %, rozcieńczyć filtrat.

II.   METODA DESTYLACYJNA

1.   Cel i zakres stosowania metody

Metoda służy do oznaczania zawartości lotnych związków azotowych, w przeliczeniu na amoniak, w mączkach rybnych niezawierających mocznika. Metoda ma zastosowanie dla zawartości amoniaku niższej niż 0,25 %.

2.   Sposób przeprowadzenia metody

Próbka jest ekstrahowana wodą, a uzyskany roztwór klarowany i filtrowany. Lotne związki azotowe są oddzielane w punkcie wrzenia poprzez dodanie tlenku magnezu i zbierane w określonej ilości kwasu siarkowego, którego nadmiar jest miareczkowany z użyciem roztworu wodorotlenku sodu.

3.   Odczynniki i roztwory

4.   Aparatura i sprzęt

5.   Sposób postępowania

Odważyć, z dokładnością do 1 mg, 10 g próbki do kolby miarowej o pojemności 200 ml i dodać 100 ml wody. Miksować w mikserze przez 30 minut. Dodać 50 ml roztworu kwasu trójchlorooctowego (3.1), uzupełnić do pełnej objętości kolby wodą, energicznie wstrząsnąć i filtrować przez karbowany filtr.

Pobrać taką ilość klarownego filtratu, która odpowiada spodziewanej zawartości lotnych związków azotowych, co zwykle odpowiada objętości 100 ml. Rozcieńczyć do 200 ml, dodać 2 g tlenku magnezu (3.2) i kilka kropli emulsji zapobiegającej spienieniu (3.3). Roztwór musi wykazywać alkaliczność wobec papierka lakmusowego, w przeciwnym razie dodać nieco tlenku magnezu (3.2). Postępować zgodnie z pkt 5.2 i 5.3 metody analitycznej dotyczącej oznaczania zawartości białka surowego (część C niniejszego załącznika).

Ślepą próbę przeprowadzić w ten sam sposób, lecz bez próbki przeznaczonej do analizy.

6.   Obliczanie wyników

1 ml H2SO4 o stężeniu 0,05 mol/l odpowiada 1,7 mg amoniaku.

Wynik wyrazić jako udział procentowy w próbce.

Powtarzalność

Różnica pomiędzy wynikami dwóch równoległych oznaczeń, wykonanych dla tej samej próbki, nie może przekraczać 10 % wartości względnej amoniaku.

F.   OZNACZANIE AMINOKWASÓW (Z WYJĄTKIEM TRYPTOFANU)

1.   Cel i zakres stosowania metody

Metoda służy do oznaczania zawartości wolnych (syntetycznych i naturalnych) oraz całkowitych (związanych i wolnych peptydów) aminokwasów w paszach z użyciem analizatora aminokwasów. Metoda ma zastosowanie do następujących aminokwasów: cystyny (cysteiny), metioniny, lizyny, treoniny, alaniny, argininy, kwasu asparaginowego, kwasu glutaminowego, glicyny, histydyny, izoleucyny, leucyny, fenyloalaniny, proliny, seryny, tyrozyny i waliny.

Metoda nie pozwala odróżnić soli aminokwasów, a także form D i L aminokwasów. Nie można jej stosować do oznaczania tryptofanu lub hydroksyanalogów aminokwasów.

2.   Sposób przeprowadzenia metody

2.1.   Wolne aminokwasy

Wolne aminokwasy są ekstrahowane rozcieńczonym kwasem chlorowodorowym. Wyekstrahowane jednocześnie makrocząsteczki związków azotowych są wytrącane kwasem sulfosalicylowym i usuwane przez filtrowanie. Filtrowany roztwór jest dostosowany do pH 2,20 . Aminokwasy są oddzielane w drodze chromatografii jonowymiennej i oznaczane z zastosowaniem reakcji z ninhydryną, poprzez fotometryczną detekcję przy 570 nm.

2.2.   Aminokwasy całkowite

Wybór sposobu postępowania zależy od oznaczanych aminokwasów. Cystynę (cysteinę) i metioninę przed hydrolizą poddać utlenianiu, odpowiednio do kwasu cysteinowego i sulfonu metioniny. Tyrozyna musi być oznaczana w hydrolizatach próbek niepoddanych utlenieniu. Pozostałe aminokwasy wymienione w pkt 1 mogą być oznaczane w próbce utlenionej albo niepoddanej utlenianiu.

Utlenianie jest przeprowadzane w temperaturze 0 oC z użyciem mieszaniny kwasu nadmrówkowego i fenolu. Nadmiar odczynnika utleniającego jest rozkładany z użyciem dwusiarczku sodu. Utleniona albo niepoddana utlenianiu próbka jest hydrolizowana kwasem chlorowodorowym (3.20) przez 23 godziny. Hydrolizat jest dostosowany do pH 2,20 . Aminokwasy są oddzielane w drodze chromatografii jonowymiennej i oznaczane na drodze reakcji z ninhydryną, przez fotometryczną detekcję przy 570 nm (440 nm w przypadku proliny).

3.   Odczynniki i roztwory

Należy stosować wodę podwójnie destylowaną lub podobnej jakości (przewodność < 10 μS).

Rozpuścić 300 g NaOH (3.5) w wodzie i uzupełnić kolbę do objętości 1 l wodą.

Rozpuścić 40 g NaOH (3.5) w wodzie i uzupełnić kolbę do objętości 1 l wodą.

Zmieszać 889 g kwasu mrówkowego (3.2) z 111 g wody i dodać 4,73 g fenolu (3.3).

Dodać 1 g fenolu (3.3) do 492 ml HCl (3.7) i uzupełnić kolbę do objętości 1 l wodą.

Rozpuścić 60 g kwasu 5-sulfosalicylowego (3.6) w wodzie i uzupełnić kolbę do objętości 1 l wodą.

Zmieszać w małej zlewce 0,5 ml nadtlenku wodoru (3.1) z 4,5 ml roztworu kwasu mrówkowego i fenolu (3.19). Inkubować w temperaturze od 20 do 30 oC przez godzinę w celu utworzenia kwasu nadmrówkowego, następnie schłodzić w lodowej łaźni wodnej (15 minut) przed dodaniem tej mieszaniny do próbki.

Uwaga: Unikać kontaktu ze skórą i nosić odzież ochronną.

Rozpuścić 19,61 g cytrynianu trisodu (3.8), 5 ml tiodwuglikolu (3.9), 1 g fenolu (3.3) i 16,50 ml HCl (3.7) w około 800 ml wody. Dostosować pH do 2,20 . Uzupełnić do objętości 1 l wodą.

Każdy o stężeniu c = 2,5 μmol/ml, w kwasie chlorowodorowym.

Mogą być otrzymane w handlu.

Rozpuścić 0,2115 g kwasu cysteinowego (3.16.2) i 0,2265 g sulfonu metioniny (3.16.3) w buforze cytrynianowym (3.24) w kolbie miarowej o pojemności 1 l i uzupełnić do pełnej objętości kolby buforem cytrynianowym. Przechowywać w temperaturze niższej niż 5 oC nie dłużej niż przez 12 miesięcy. Roztworu nie stosuje się, jeżeli podstawowy wzorcowy roztwór (3.27.1) zawiera kwas cysteinowy i sulfon metioniny.

Rozpuścić 0,6560 g norleucyny (3.13) w buforze cytrynianowym (3.24) w kolbie miarowej i uzupełnić kolbę do objętości 250 ml buforem cytrynianowym. Przechowywać w temperaturze niższej niż 5 oC nie dłużej niż przez 6 miesięcy.

Przenieść ilościowo do kolby miarowej o pojemności 50 ml, uzupełnić do pełnej objętości kolby buforem cytrynianowym (3.24) i zmieszać.

Przechowywać w temperaturze niższej niż 5 oC nie dłużej niż przez 3 miesiące.

Zob. również objaśnienia pkt 9.1.

Przechowywać w temperaturze niższej niż 5 oC nie dłużej niż przez 3 miesiące.

4.   Aparatura i sprzęt

Kolumna jest wypełniona sulfonowaną żywicą polistyrenową mającą zdolność rozdziału aminokwasów od siebie i od innych składników reagujących z ninhydryną. Przepływ buforu i ninhydryny jest przeprowadzany przez pompy o stabilności przepływu 0,5 % w czasie testowania kalibracyjnych roztworów, jak i analizy próbek.

W niektórych analizatorach aminokwasów mogą być stosowane metody hydrolizy, w których hydrolizat zawiera stężenie sodu c = 0,8 mol/l i całą pozostałość kwasu mrówkowego z etapu utleniania. Inne analizatory nie dają zadowalającego rozdziału niektórych aminokwasów, jeżeli hydrolizat zawiera nadmiar kwasu mrówkowego lub wysokie stężenie jonów sodowych. W tym przypadku objętość kwasu jest zmniejszana przez odparowanie do objętości około 5 ml, które wykonuje się po hydrolizie i przed dostosowaniem pH. Odparowywanie należy prowadzić w warunkach próżni w temperaturze nie wyższej niż 40 oC.

5.   Sposób postępowania

5.1.   Przygotowanie próbki

Rozdrobnić próbkę, tak aby przesiewała się przez oczka sita o średnicy 0,5 mm. Próbki o dużej zawartości wilgotności przed rozdrobnieniem należy wysuszyć albo suchym powietrzem o temperaturze nieprzekraczającej 50 oC, albo przez zamrożenie. Próbki o wysokiej zawartości tłuszczu przed rozdrobnieniem należy poddać ekstrakcji eterem naftowym (3.12).

5.2.   Oznaczanie wolnych aminokwasów w paszach i premiksach

Odważyć, z dokładnością do 0,2 mg, odpowiednią ilość (1–5 g) próbki przygotowanej w sposób określony w pkt 5.1 do kolby stożkowej i dodać 100 ml mieszaniny ekstrakcyjnej (3.21). Wstrząsać mieszaninę przez 60 minut, używając mechanicznej wytrząsarki lub mieszadła magnetycznego (4.8). Odstawić do sedymentacji osadu i pobrać pipetą 10 ml supernatantu roztworu do zlewki o objętości 100 ml.

Dodać, mieszając, 5,0 ml roztworu kwasu sulfosalicylowego (3.22) i kontynuować mieszanie z użyciem mieszadła magnetycznego przez 5 minut. Przefiltrować lub odwirować supernatant w celu usunięcia osadu. Umieścić 10,0 ml otrzymanego roztworu w zlewce o objętości 100 ml, dostosować pH do 2,20 z użyciem roztworu wodorotlenku sodu (3.18), przenieść do wolumetrycznej kolby o odpowiedniej pojemności, z użyciem buforu cytrynianowego (3.24) i uzupełnić roztworem buforu cytrynianowego do pełnej objętości tej kolby (3.24).

Jeżeli jest stosowany wzorzec wewnętrzny, dodać 1,00 ml podstawowego wzorcowego roztworu wzorca wewnętrznego (3.27.3) na każde 100 ml końcowego roztworu i uzupełnić roztworem buforu cytrynianowego (3.24) do pełnej objętości kolby.

Przeprowadzić rozdział chromatograficzny w sposób określony w pkt 5.4.

Jeżeli ekstrakty nie będą oznaczane tego samego dnia, należy przechowywać je w temperaturze niższej niż 5 oC.

5.3.   Oznaczanie całkowitej zawartości aminokwasów

5.3.1.    Utlenianie

Odważyć, z dokładnością do 0,2 mg, od 0,1 do 1 g próbki przygotowanej w sposób określony w pkt 5.1 do:

Odważona próbka musi zawierać około 10 mg azotu, a poziom wilgotności nie może przekraczać 100 mg.

Umieścić kolbę lub butelkę w lodowej łaźni wodnej i oziębić do temperatury 0 oC, dodać 5 ml mieszaniny utleniającej (3.23) i zamieszać, używając szklanej bagietki z wygiętym końcem. Uszczelnić kolbę/butelkę wraz z bagietką, stosując hermetyczny film, umieścić wraz z lodową łaźnią wodną w lodówce o temperaturze 0 oC i pozostawić na 16 godzin. Po 16 godzinach wyjąć z lodówki i rozłożyć nadmiar odczynnika utleniającego przez dodanie 0,84 g dwusiarczynu sodu (3.4).

Następnie postępować w sposób określony w pkt 5.3.2.1.

5.3.2.    Hydroliza

5.3.2.1.    Hydroliza próbek utlenionych

Do utlenionej próbki, przygotowanej w sposób określony w pkt 5.3.1, dodać 25 ml mieszaniny hydrolizującej (3.20), zwracając uwagę, aby zmyć pozostałości próbki przywierające do bocznych ścianek naczynia i bagietki.

W zależności od sposobu przeprowadzonej hydrolizy postępować w sposób określony w pkt 5.3.2.3 lub 5.3.2.4.

5.3.2.2.    Hydroliza próbek nieutlenionych

Odważyć, z dokładnością do 0,2 mg, od 0,1 do 1 g próbki przygotowanej w sposób określony w pkt 5.1 do kolby okrągłodennej o pojemności 100 lub 250 ml (4.1) lub do butelki o pojemności 100 ml z nakrętką (4.2). Odważona próbka musi zawierać około 10 mg azotu. Ostrożnie dodać 25 ml mieszaniny hydrolizującej (3.20) i zmieszać z próbką. Następnie postępować w sposób określony w pkt 5.3.2.3 lub 5.3.2.4.

5.3.2.3.    Hydroliza otwarta

Do kolby z mieszaniną, przygotowaną w sposób określony w pkt 5.3.2.1 lub 5.3.2.2, dodać 3 szklane perełki i gotować, utrzymując stan wrzenia ze zwrotem skroplin przez 23 godziny. Po zakończonej hydrolizie przemyć chłodnicę od dołu 5 ml buforu cytrynianowego (3.24). Odłączyć kolbę i schłodzić w łaźni lodowej.

Następnie postępować w sposób określony w pkt 5.3.3.

5.3.2.4.    Hydroliza zamknięta

Umieścić butelkę zawierającą mieszaninę, przygotowaną w sposób określony w pkt 5.3.2.1 lub 5.3.2.2, w suszarce (4.3) w temperaturze 110 oC. W czasie 1 godziny hydrolizy, aby uniknąć gwałtownego wzrostu ciśnienia w wyniku powstawania substancji gazowych i wybuchu, umieścić nakrętkę na naczyniu. Nie zamykać naczynia korkiem. Po godzinie dokręcić nakrętkę i pozostawić w suszarce (4.3) przez 23 godziny. Po zakończeniu hydrolizy wyjąć butelkę z suszarki, ostrożnie odkręcić nakrętkę i umieścić butelkę w lodowej łaźni wodnej. Pozostawić do schłodzenia.

W zależności od sposobu dostosowania pH (5.3.3) przenieść ilościowo zawartość butelki do zlewki lub kolby okrągłodennej o pojemności 250 ml, stosując bufor cytrynianowy (3.24).

Następnie postępować w sposób określony w pkt 5.3.3.

5.3.3.    Dostosowanie pH

W zależności od tolerancji analizatora aminokwasów (4.9) na sód pH dostosowuje się w sposób określony w pkt 5.3.3.1 lub 5.3.3.2.

5.3.3.1.    Dla systemów chromatograficznych (4.9) wymagających niskiego stężenia sodu

Wskazane jest zastosowanie podstawowego wzorcowego roztworu wzorca wewnętrznego (3.27.3), gdy analizatory aminokwasów wymagają niskiego stężenia sodu, w przypadku gdy należy zredukować objętość kwasu.

W tym przypadku dodać 2,00 ml podstawowego roztworu wzorca wewnętrznego (3.27.3) do hydrolizatu przed odparowaniem.

Dodać 2 krople 1-oktanolu (3.15) do hydrolizatu otrzymanego w sposób określony w pkt 5.3.2.3 lub 5.3.2.4.

Stosując obrotową wyparkę próżniową (4.7) zmniejszyć w warunkach próżni i w temperaturze 40 oC objętość do 5–10 ml. Jeżeli objętość roztworu zostanie przypadkowo zredukowana poniżej 5 ml, hydrolizat należy wyrzucić i powtórzyć analizę.

Dostosować pH do 2,20 z użyciem roztworu wodorotlenku sodu (3.18) i postępować w sposób określony w pkt 5.3.4.

5.3.3.2.    Dla pozostałych analizatorów aminokwasów (4.9)

Pobrać hydrolizaty otrzymane w sposób określony w pkt 5.3.2.3 lub 5.3.2.4 i częściowo je zneutralizować poprzez mieszanie, ostrożnie dodając 17 ml roztworu wodorotlenku sodu (3.17), zwracając uwagę, aby temperatura roztworu nie była wyższa niż 40 oC.

Dostosować pH do 2,20 w temperaturze pokojowej, dodając roztwór wodorotlenku sodu (3.17), a pod koniec roztwór wodorotlenku sodu (3.18). Następnie postępować w sposób określony w pkt 5.3.4.

5.3.4.    Roztwór próbki do analizy chromatograficznej

Przenieść ilościowo hydrolizaty o dostosowanym pH (5.3.3.1 lub 5.3.3.2) z użyciem buforu cytrynianowego (3.24) do kolby miarowej o pojemności 200 ml i uzupełnić do pełnej objętości kolby buforem cytrynianowym (3.24).

Jeżeli wcześniej nie dodawano wzorca wewnętrznego, dodać 2,00 ml podstawowego wzorcowego roztworu wzorca wewnętrznego (3.27.3) i uzupełnić buforem cytrynianowym (3.24) do pełnej objętości kolby. Dokładnie zmieszać.

Przejść do analizy chromatograficznej (5.4).

Jeżeli roztwory próbek nie będą analizowane tego samego dnia, należy przechowywać je w temperaturze niższej niż 5 oC.

5.4.   Chromatografia

Przed analizą chromatograficzną doprowadzić ekstrakt (5.2) lub hydrolizat (5.3.4) do temperatury pokojowej. Wstrząsnąć mieszaniną i przefiltrować jej odpowiednią ilość przez filtr membranowy 0,22 μm (4.5). Otrzymany klarowny roztwór jest poddawany chromatografii jonowymiennej przy wykorzystaniu analizatora aminokwasów (4.9).

Dozowanie wykonuje się ręcznie lub automatycznie. Ważne jest, aby na kolumnę nanieść takie same ilości roztworów z dokładnością ± 0,5 % zarówno w przypadku analizy wzorców, jak i badanych próbek, z wyjątkiem gdy jest stosowany wzorzec wewnętrzny, oraz aby stosunek sodu do aminokwasu w roztworze badanej próbki był jak najbardziej zbliżony do tego w roztworze wzorcowym.

Zasadniczo częstość przeprowadzania kalibracji zależy od stabilności odczynnika ninhydrynowego i od systemu analitycznego. Wzorzec lub próbka są wymywane buforem cytrynianowym (3.24), tak aby powierzchnia piku wzorca odpowiadała od 30 do 200 % powierzchni piku badanej próbki aminokwasu.

Analiza chromatograficzna aminokwasów będzie różnić się nieznacznie w zależności od typu stosowanego analizatora i żywicy. Wybrany system musi mieć zdolność oddzielenia od siebie aminokwasów oraz od innych substancji dających z ninhydryną reakcje. W badanym zakresie stosowany system chromatograficzny musi dawać liniową odpowiedź na zmiany ilości aminokwasów dodawanych na kolumnę.

W czasie analizy chromatograficznej opisany poniżej stosunek doliny do wysokości piku odnosi się do przypadku, gdy jest analizowany równomolowy roztwór oznaczanego aminokwasu. Równomolowy roztwór aminokwasu musi zawierać co najmniej 30 % maksymalnej zawartości każdego aminokwasu, który można aktualnie oznaczyć z użyciem danego analizatora aminokwasów (4.9).

Dla oddzielenia treoniny od seryny stosunek doliny do wysokości piku niższego z pokrywających się aminokwasów na chromatografie nie może przekraczać 2:10, w przypadku gdy oznaczane są tylko cystyna (cysteina), metionina, treonina i lizyna, niewystarczające oddzielenie od sprzężonych pików będzie ujemnie wpływało na oznaczenie. Dla wszystkich innych aminokwasów rozdział musi być lepszy niż 1:10.

System musi zapewniać oddzielenie lizyny od „artefaktów lizyny” i od ornityny.

6.   Obliczanie wyników

Powierzchnię pików próbki i wzorca mierzy się dla każdego pojedynczego aminokwasu i obliczana jest zawartość aminokwasu (X) w g/kg próbki.

Jeżeli jest stosowany wzorzec wewnętrzny, wyrażenie należy pomnożyć przez:

gdzie:

A

=

powierzchnia piku hydrolizatu lub ekstraktu

B

=

powierzchnia piku wzorcowego roztworu kalibracyjnego

C

=

powierzchnia piku wzorca wewnętrznego w hydrolizacie lub ekstrakcie

D

=

powierzchnia piku wzorca wewnętrznego w roztworze wzorcowym kalibracyjnym

M

=

masa cząsteczkowa oznaczanego aminokwasu

c

=

stężenie wzorca w μmol/ml

m

=

masa próbki w g przeliczona na masę oryginalnej próbki w przypadku odtłuszczania lub podsuszania

V

=

hydrolizat ogółem w ml (5.3.4) lub obliczona ogólna objętość w ml rozcieńczonego ekstraktu (6.1)

Cystyna i cysteina są oznaczane jako kwas cysteinowy w hydrolizatach utlenionej próbki, ale są obliczane jak cystyna (C6H12N2O4S2, M 240,30 g/mol), stosując M 120,15 g/mol (= 0,5 × 240,30 g/mol).

Metionina jest oznaczana jako sulfon metioniny w hydrolizatach utlenionej próbki, ale jest obliczana jak metionina, stosując M metioniny: 149,21 g/mol.

Dodana wolna metionina jest oznaczana po ekstrakcji jako metionina, przy czym dla obliczeń stosowana jest taka sama wartość M.

V

=

objętość końcowego

7.   Ocena metody

Międzynarodowe badania porównawcze metody były przeprowadzone w 1990 r. z użyciem czterech pasz (mieszanki paszowej dla świń, mieszanki paszowej dla brojlerów, koncentratu białkowego i premiksu). Po odrzuceniu wyników odbiegających, średnie wyniki i odchylenia standardowe są przedstawione w tabelach zawartych w niniejszym punkcie:

7.1.   Powtarzalność

Powtarzalność wyrażona jako „odchylenie standardowe wewnątrz laboratorium” omawianego powyżej porównawczego badania jest przedstawiona w poniższych tabelach:

7.2.   Odtwarzalność

Wyniki odchylenia standardowego między laboratoriami otrzymane w wyniku przeprowadzenia omawianego powyżej porównawczego badania są przedstawione w poniższej tabeli:

8.   Stosowanie materiałów odwoławczych

Prawidłowe stosowanie metody należy weryfikować przez wykonywanie powtarzalnych oznaczeń certyfikowanych materiałów odwoławczych, jeżeli takie są dostępne. Zalecana jest także kalibracja z zastosowaniem certyfikowanych kalibracyjnych roztworów aminokwasów.

9.   Objaśnienia

Zakres liniowej odpowiedzi aparatu należy sprawdzić dla wszystkich aminokwasów.

Roztwór wzorcowy jest rozcieńczany buforem cytrynianowym, tak aby otrzymać powierzchnię piku o średnim zasięgu.

G.   OZNACZANIE TRYPTOFANU

1.   Cel i zakres stosowania metody

Metoda służy do oznaczania zawartości całkowitego i wolnego tryptofanu w paszach. Metoda nie wyróżnia form D i L.

2.   Sposób przeprowadzenia metody

W celu oznaczenia całkowitego tryptofanu próbka jest hydrolizowana w środowisku zasadowym z użyciem nasyconego roztworu wodorotlenku baru i ogrzewana do 110 oC przez 20 godzin. Po hydrolizie dodawany jest wzorzec wewnętrzny.

W celu oznaczenia wolnego tryptofanu próbka jest ekstrahowana w warunkach lekko kwaśnych w obecności wzorca wewnętrznego.

Tryptofan i wzorzec wewnętrzny w hydrolizacie lub w ekstrakcie jest oznaczony metodą HPLC z detekcją fluorescencyjną.

3.   Odczynniki i roztwory

Rozpuścić 40,0 g NaOH (3.5) w wodzie i uzupełnić do objętości 1 l wodą (3.1).

Odmierzyć 492 ml HCl (3.7) i uzupełnić do objętości 1 l wodą.

Odmierzyć 82 ml HCl (3.7) i uzupełnić do objętości 1 l wodą.

Odmierzyć 8,2 ml HCl (3.7) i uzupełnić do objętości 1 l wodą.

Odmierzyć 34 ml kwasu ortofosforowego (3.6) i uzupełnić do objętości 1 l wodą (3.1).

W kolbie miarowej o pojemności 500 ml rozpuścić 0,2553 g tryptofanu (3.2) w kwasie chlorowodorowym (3.13) i uzupełnić do pełnej objętości kolby kwasem chlorowodorowym (3.13). Przechowywać w temperaturze - 18 oC nie dłużej niż przez 4 tygodnie.

W kolbie miarowej o pojemności 500 ml rozpuścić 0,2728 g α-metylo-tryptofanu (3.3) w kwasie chlorowodorowym (3.13) i uzupełnić do pełnej objętości kolby kwasem chlorowodorowym (3.13). Przechowywać w temperaturze - 18 oC nie dłużej niż przez 4 tygodnie.

Odmierzyć 2,00 ml stężonego roztworu tryptofanu (3.15) i 2,00 ml stężonego roztworu wzorca wewnętrznego (α-metylo-tryptofanu) (3.16). Rozcieńczyć wodą (3.1) i metanolem (3.8) w przybliżeniu do tej samej objętości i tego samego stężenia metanolu (10–30 %) jak w końcowym hydrolizacie.

Roztwór należy przygotować bezpośrednio przed użyciem.

Chronić przed bezpośrednim działaniem światła podczas przygotowywania.

4.   Aparatura i sprzęt

5.   Sposób postępowania

5.1.   Przygotowanie próbek

Rozdrobnić próbkę tak, aby przesiewała się przez oczka sita o średnicy 0,5 mm. Próbki o dużej zawartości wilgotności przed rozdrobnieniem wysuszyć albo na powietrzu w temperaturze nieprzekraczającej 50 oC, albo przez wymrażanie. Próbki o wysokiej zawartości tłuszczu przed rozdrobnieniem należy poddać ekstrakcji eterem naftowym (3.9).

5.2.   Oznaczanie wolnego tryptofanu (ekstrakt)

Odważyć, z dokładnością do 1 mg, odpowiednią ilość (1–5 g) próbki przygotowanej w sposób określony w 5.1 do kolby stożkowej. Dodać 100,0 ml kwasu chlorowodorowego (3.13) i 5,00 ml stężonego roztworu wzorca wewnętrznego (3.16). Wstrząsać lub mieszać przez 60 minut z użyciem wstrząsarki mechanicznej lub mieszadła magnetycznego (4.7). Pozostawić do oddzielenia się osadu i przenieść pipetą 10,0 ml supernatantu roztworu do zlewki. Dodać 5 ml kwasu ortofosforowego (3.14). Dostosować pH do 3 z użyciem roztworu wodorotlenku sodu (3.10). Dodać odpowiednią ilość metanolu (3.8), aby uzyskać stężenie od 10 do 30 % metanolu w końcowej objętości. Przenieść do kolby miarowej o odpowiedniej pojemności i rozcieńczyć wodą do objętości właściwej dla chromatografii (objętość zbliżona do objętości kalibracyjnego roztworu wzorcowego (3.17)).

Przefiltrować kilka ml roztworu przez filtr membranowy 0,45 μm (4.5) przed dozowaniem na kolumnę HPLC. Przeprowadzić chromatografię w sposób określony w pkt 5.4.

Roztwór wzorcowy i ekstrakty chronić przed bezpośrednim działaniem światła słonecznego. Jeżeli jest niemożliwe dokonanie analizy ekstraktów tego samego dnia, ekstrakty można przechowywać w temperaturze 5 oC nie dłużej niż przez 3 dni.

5.3.   Oznaczanie całkowitego tryptofanu (hydrolizat)

Odważyć, z dokładnością do 0,2 mg, od 0,1 do 1 g próbki przygotowanej w sposób określony w pkt 5.1 do kolby propylenowej (4.4). Odważona próbka musi zawierać około 10 mg azotu. Dodać 8,4 g oktahydratu wodorotlenku baru (3.4) i 10 ml wody. Mieszać z użyciem mieszadła Vortex (4.8) lub mieszadła magnetycznego (4.7). Pozostawić osłonięty teflonem magnes w mieszaninie. Spłukać ściany naczynia z użyciem 4 ml wody. Nałożyć nakrętkę i zamknąć luźno naczynie. Przenieść kolbę do autoklawu (4.6) z wrzącą wodą i parą i utrzymywać ją w czasie od 30 do 60 minut. Zamknąć autoklaw i autoklawować w temperaturze 110 oC (±2) oC przez 20 godzin.

Przed otwarciem autoklawu obniżyć temperaturę nieco poniżej 100 oC. W celu uniknięcia krystalizacji Ba(OH)2 · 8H2O dodać do ciepłej mieszaniny 30 ml wody o temperaturze pokojowej. Łagodnie wstrząsać lub mieszać. Dodać 2,00 ml stężonego roztworu wzorca wewnętrznego (α-metylo-tryptofanu) (3.16). Studzić naczynia w łaźni wodnej lub lodowej przez 15 minut.

Następnie dodać 5 ml kwasu ortofosforowego (3.14). Utrzymując naczynie w zimnej łaźni, zobojętnić z użyciem HCl (3.11), mieszając, i dostosować pH do 3,0 z HCl (3.12). Dodać ilość metanolu konieczną do uzyskania stężenia od 10 do 30 % metanolu w końcowej objętości. Przenieść do kolby miarowej o odpowiedniej pojemności i rozcieńczyć wodą do objętości, koniecznej dla chromatografii (np. 100 ml). Dodanie metanolu nie może powodować wytrącania.

Przefiltrować kilka ml roztworu przez filtr membranowy 0,45 μm (4.5) przed dozowaniem na kolumnę HPLC. Przeprowadzić chromatografię w sposób określony w 5.4.

Roztwór wzorcowy i produkty hydrolizy chronić przed bezpośrednim działaniem światła słonecznego. Jeżeli jest niemożliwe dokonanie analizy produktów hydrolizy tego samego dnia, można je przechowywać w temperaturze 5 oC nie dłużej niż przez 3 dni.

5.4.   Oznaczanie HPLC

Poniższe parametry izokratycznej elucji są przykładowe. Dopuszczalne jest zastosowanie innych parametrów gwarantujących uzyskanie równoważnych wyników (zob. objaśnienia 9.1 i 9.2):

6.   Obliczanie wyników

Zawartość tryptofanu (X) w g na 100 g próbki obliczana jest według poniższego wzoru:

A

=

powierzchnia piku wzorca wewnętrznego, kalibracyjny roztwór wzorcowy (3.17)

B

=

powierzchnia piku tryptofanu, ekstraktu (5.2) lub hydrolizatu (5.3)

V1

=

objętość w ml (2 ml) stężonego roztworu tryptofanu (3.15) dodanego do roztworu kalibracyjnego (3.17)

c

=

stężenie w μmol/ml (= 2,50 ) stężonego roztworu tryptofanu (3.15) dodanego do roztworu kalibracyjnego (3.17)

V2

=

objętość w ml stężonego roztworu wzorca wewnętrznego (3.16) dodanego przy ekstrakcji (5.2) (= 5,00 ml) lub do hydrolizatu (5.3) (= 2,00 ml)

C

=

powierzchnia piku wzorca wewnętrznego, ekstraktu (5.2) lub hydrolizatu (5.3)

D

=

powierzchnia piku tryptofanu, kalibracyjnego roztworu wzorcowego (3.17)

V3

=

objętość w ml (= 2,00 ml) stężonego roztworu wzorca wewnętrznego (3.16) dodanego do kalibracyjnego roztworu wzorcowego (3.17)

m

=

naważka próbki w g (skorygowana względem masy wyjściowej, jeżeli była podsuszana lub odtłuszczana)

M

=

ciężar cząsteczkowy tryptofanu (= 204,23 g/mol)

7.   Powtarzalność

Różnica pomiędzy wynikami dwóch równoległych oznaczeń wykonanych dla tej samej próbki nie może przekraczać 10 % względem najwyższego wyniku.

8.   Wyniki badań porównawczych

We Wspólnocie Europejskiej przeprowadzono badania porównawcze (czwarte porównanie wyników różnych laboratoriów), w których trzy próbki były analizowane przez maksymalnie 12 laboratoriów w celu sprawdzenia metody hydrolizy. Na każdej próbce powtórzono analizy pięciokrotnie. Ich wyniki są przedstawione w poniższej tabeli:

L

=

liczba laboratoriów

n

=

liczba pojedynczych zachowanych wyników eliminujących wartości oddalone (według Cochrana, próba wartości oddalonych Dixona)

sr

=

odchylenie standardowe powtarzalności

SR

=

odchylenie standardowe odtwarzalności

r

=

powtarzalność wyników

R

=

odtwarzalność wyników

CVr

=

współczynnik zmienności powtarzalności, w %

CVR

=

współczynnik zmienności odtwarzalności, w %

W innym badaniu porównawczym przeprowadzonym we Wspólnocie Europejskiej (trzecie porównanie wyników różnych laboratoriów) dwie próbki były analizowane przez maksymalnie 13 laboratoriów w celu sprawdzenia metody ekstrakcji wolnego tryptofanu. Na każdej próbce powtórzono analizy pięciokrotnie. Ich wyniki są przedstawione w poniższej tabeli:

L

=

liczba laboratoriów

n

=

liczba pojedynczych zachowanych wyników eliminujących wartości oddalone (według Cochrana, próba wartości oddalonych Dixona)

sr

=

odchylenie standardowe powtarzalności

SR

=

odchylenie standardowe odtwarzalności

r

=

powtarzalność wyników

R

=

odtwarzalność wyników

CVr

=

współczynnik zmienności powtarzalności, w %

CVR

=

współczynnik zmienności odtwarzalności, w %

W kolejnym badaniu porównawczym przeprowadzonym we Wspólnocie Europejskiej cztery próbki były analizowane przez maksymalnie 7 laboratoriów w celu sprawdzenia metody hydrolizy tryptofanu. Na każdej próbce powtórzono analizy pięciokrotnie. Ich wyniki są przedstawione w poniższej tabeli.

L

=

liczba laboratoriów

n

=

liczba pojedynczych zachowanych wyników eliminujących wartości oddalone (według Cochrana, próba wartości oddalonych Dixona)

sr

=

odchylenie standardowe powtarzalności

SR

=

odchylenie standardowe odtwarzalności

r

=

powtarzalność wyników

R

=

odtwarzalność wyników

CVr

=

współczynnik zmienności powtarzalności, w %

CVR

=

współczynnik zmienności odtwarzalności, w %

9.   Objaśnienia

Izokratyczna elucja po gradientowym czyszczeniu kolumny:

W zakresie badanych stężeń układ chromatograficzny musi zapewniać liniową odpowiedź. Liniową odpowiedź należy mierzyć przy stałym (normalnym) stężeniu wzorca wewnętrznego i zmieniających się stężeniach tryptofanu. Ważne jest, aby wielkość pików tryptofanu i wzorca wewnętrznego zawierała się w liniowym zakresie układu HPLC z detekcją fluorescencyjną. Jeżeli piki tryptofanu lub wzorca wewnętrznego są zbyt małe lub zbyt duże, analizę należy powtórzyć przy zmienionej wielkości próbki lub jej objętości końcowej.

Fakt, że wodorotlenek baru z czasem jest coraz trudniejszy do rozpuszczenia, wpływa na nieklarowność roztworu do oznaczania HPLC, która może być przyczyną zaniżania wyników oznaczania tryptofanu.

H.   OZNACZANIE SUROWEGO OLEJU I TŁUSZCZU

1.   Cel i zakres stosowania metody

Metoda służy do oznaczania zawartości surowych olejów i tłuszczów w paszach. Nie stosuje się jej do analizy nasion i owoców roślin oleistych.

Zastosowanie dwóch sposobów postępowania opisanych poniżej zależy od rodzaju i składu paszy oraz celu prowadzenia analizy.

1.1.   Postępowanie A – Bezpośrednio ekstrahowane oleje i tłuszcze

Postępowanie ma zastosowanie do materiałów paszowych pochodzenia roślinnego, z wyjątkiem tych, które zostały objęte zakresem postępowania B.

1.2.   Postępowanie B – Całkowite surowe oleje i tłuszcze

Postępowanie ma zastosowanie do materiałów paszowych pochodzenia zwierzęcego i wszystkich mieszanek paszowych. Jest stosowane do wszystkich materiałów, z których oleje i tłuszcze nie mogą być w całości wyekstrahowane bez uprzedniej hydrolizy (np. gluten, drożdże, białka ziemniaczane i produkty przetworzone np. poprzez ekstruzję, płatkowanie i ogrzewanie).

1.3.   Interpretacja wyników

We wszystkich przypadkach, w których wynik otrzymany przy zastosowaniu postępowania B jest wyższy od wyniku otrzymanego przy zastosowaniu postępowania A, wynik otrzymany przy zastosowaniu postępowania B należy traktować jako rzeczywisty.

2.   Sposób przeprowadzenia metody

2.1.   Postępowanie A

Próbka jest poddawana ekstrakcji eterem naftowym. Roztwór jest oddestylowany, a pozostałość jest suszona i ważona.

2.2.   Postępowanie B

Próbka jest ogrzewana kwasem chlorowodorowym. Mieszanina jest oziębiana i filtrowana. Pozostałość jest przemywana i suszona, a następnie poddawana oznaczaniu przy zastosowaniu postępowania A.

3.   Odczynniki i roztwory

4.   Aparatura i sprzęt

5.   Sposób postępowania

5.1.   Postępowanie A (zob. pkt 8.1)

Odważyć, z dokładnością do 1 mg, 5 g próbki, przenieść do gilzy ekstrakcyjnej (4.2) i przykryć beztłuszczowym zwitkiem waty bawełnianej.

Umieścić gilzę w aparacie do ekstrakcji (4.1) i ekstrahować przez sześć godzin eterem naftowym (3.1). Zebrać ekstrakt eterowy do suchej, zważonej kolby zawierającej kawałki pumeksu ( 9 ).

Oddestylować rozpuszczalnik. Suszyć pozostałość, umieszczając kolbę w suszarce (4.3) na półtorej godziny. Schłodzić w eksykatorze i zważyć. Suszyć ponownie przez 30 minut w celu zapewnienia stałej masy olejów i tłuszczów (ubytek masy między dwoma kolejnymi ważeniami nie może przekraczać 1 mg).

5.2.   Postępowanie B

Odważyć, z dokładnością do 1 mg, 2,5 g próbki (zob. pkt 8.2), umieścić w zlewce o pojemności 400 ml lub w kolbie stożkowej o pojemności 300 ml i dodać 100 ml kwasu chlorowodorowego (3.3) oraz kawałki pumeksu. Przykryć zlewkę szkiełkiem zegarkowym lub dopasować kolbę stożkową z chłodnicą zwrotną. Doprowadzić mieszaninę do spokojnego wrzenia w małym płomieniu palnika lub na płytce grzewczej i utrzymywać wrzenie przez godzinę. Nie dopuszczać do osadzania się produktu na ścianach naczynia.

Schłodzić i dodać materiał wspomagający filtrację (3.4) w ilości zapobiegającej jakimkolwiek stratom oleju i tłuszczu podczas filtracji. Przefiltrować przez zwilżony, beztłuszczowy podwójny filtr papierowy. Przemywać pozostałość zimną wodą do uzyskania obojętnego filtratu. Sprawdzić, czy filtrat nie zawiera śladów olejów lub tłuszczów. Ich obecność wskazuje na konieczność przeprowadzenia przed hydrolizą ekstrakcji eterem naftowym, przy zastosowaniu postępowania A.

Umieścić na szkiełku zegarkowym podwójny filtr papierowy z pozostałością i suszyć przez 1,5 godziny w suszarce nawiewnej (4.3) w temperaturze 100 ± 3 oC.

Umieścić podwójny filtr papierowy zawierający suchą pozostałość w gilzie ekstrakcyjnej (4.2) i przykryć zwitkiem beztłuszczowej waty bawełnianej. Umieścić gilzę w aparacie do ekstrakcji (4.1) i postępować w sposób określony w pkt 5.1, akapity drugi i trzeci.

6.   Wyrażenie wyników

Masę pozostałości wyrazić jako procent wagowy próbki.

7.   Powtarzalność

Różnica pomiędzy wynikami dwóch równoległych oznaczeń wykonanych dla tej samej próbki nie może przekraczać:

8.   Objaśnienia

Odważyć, z dokładnością do 1 mg, 20 g próbki i zmieszać z co najmniej 10 g bezwodnego siarczanu sodu (3.2). Ekstrahować eterem naftowym (3.1) w sposób określony w pkt 5.1. Otrzymany ekstrakt uzupełnić do objętości 500 ml eterem naftowym (3.1) i zmieszać. Pobrać 50 ml roztworu i przenieść do małej, suchej i zważonej kolby zawierającej kawałki pumeksu. Oddestylować rozpuszczalnik, suszyć i postępować, jak wskazano w pkt 5.1 akapit ostatni.

Usunąć rozpuszczalnik z pozostałości po ekstrakcji w gilzie, rozdrobnić pozostałość na 1 mm cząstki, ponownie umieścić w gilzie (nie dodawać siarczanu sodu) i postępować, jak wskazano w pkt 5.1 akapity drugi i trzeci.

Zawartość oleju i tłuszczu obliczyć w procentach wagowych próbki, według następującego wzoru:

(10 m1 + m2) × 5

gdzie:

m1

=

masa w g pozostałości po pierwszej ekstrakcji, podzielnej części ekstraktu

m2

=

masa w g pozostałości po drugiej ekstrakcji

I.   OZNACZANIE WŁÓKNA SUROWEGO

1.   Cel i zakres stosowania metody

Metoda służy do oznaczania w paszach zawartości nietłuszczowych substancji organicznych, które nie rozpuszczają się ani w środowisku kwaśnym, ani zasadowym i które zwyczajowo określa się mianem włókna surowego.

2.   Sposób przeprowadzenia metody

Próbkę, w razie konieczności odtłuszczoną, gotuje się w roztworach kwasu siarkowego i wodorotlenku potasu o odpowiednim stężeniu. Pozostałość jest rozdzielana przez filtrację na filtrze ze szklanego spieku, przemywana, suszona, ważona i spopielana w temperaturze od 475 do 500 oC. Ubytek masy po spopielaniu odpowiada zawartości włókna surowego w badanej próbce.

3.   Odczynniki i roztwory

4.   Aparatura i sprzęt

5.   Sposób postępowania

Odważyć, z dokładnością do 1 mg, 1 g przygotowanej próbki do tygla (4.2) (zob. objaśnienia 8.1, 8.2 i 8.3) i dodać 1 g materiału wspomagającego filtrowanie (3.3).

Połączyć urządzenie grzewcze (4.1) z tyglem filtracyjnym (4.2), a następnie dołączyć cylinder (4.3) do tygla. Wlać 150 ml wrzącego kwasu siarkowego (3.1) do cylindra połączonego z tyglem i, w razie potrzeby, dodać kilka kropli odczynnika przeciwpieniącego (3.2).

Doprowadzić ciecz do wrzenia w czasie 5 ± 2 minut i gotować przez dokładnie 30 minut.

Otworzyć kran rurki odprowadzającej (4.1) i w warunkach próżni filtrować kwas siarkowy przez tygiel filtracyjny i przemywać pozostałość trzykrotnie 30 ml porcjami wrzącej wody, upewniając się, że pozostałość przefiltrowano do sucha po każdym przemyciu.

Zamknąć ujście kranu i wlać 150 ml wrzącego roztworu wodorotlenku potasu (3.7) do cylindra połączonego z tyglem i dodać kilka kropli odczynnika przeciwpieniącego (3.2). Doprowadzić ciecz do punktu wrzenia w czasie 5 ± 2 minut i gotować przez 30 minut. Przefiltrować i powtórzyć procedurę przemywania wykorzystaną w odniesieniu do kwasu siarkowego.

Po ostatnim przemyciu i wysuszeniu odłączyć tygiel i jego zawartość i podłączyć go do urządzenia do zimnej ekstrakcji (4.6). W warunkach próżni przemywać pozostałość w tyglu trzema kolejnymi porcjami 25 ml acetonu (3.4), upewniając się, że pozostałość przefiltrowano do sucha po każdym przemyciu.

Wysuszyć tygiel do stałej masy w suszarce o temperaturze 130 oC. Po każdym suszeniu schłodzić w eksykatorze i niezwłocznie zważyć. Umieścić tygiel w piecu muflowym i spopielać do stałej masy (ubytek masy między dwoma kolejnymi ważeniami musi być równy lub mniejszy niż 2 mg) w temperaturze od 475 do 500 oC przez co najmniej 30 minut.

Przed ważeniem, po każdym ogrzewaniu, najpierw schłodzić w piecu, a następnie w eksykatorze.

Przeprowadzić test ślepej próby bez próbki. Ubytek masy po spopielaniu nie może przekraczać 4 mg.

6.   Obliczanie wyników

Procentową zawartość włókna surowego w próbce oblicza się według następującego wzoru:

gdzie:

m

=

masa próbki w g

m0

=

ubytek masy po spopieleniu w trakcie oznaczania, w g

m1

=

ubytek masy po spopieleniu w trakcie ślepej próby, w g

7.   Powtarzalność

Różnica pomiędzy wynikami dwóch równoległych oznaczeń wykonanych dla tej samej próbki nie może przekraczać:

8.   Objaśnienia

J.   OZNACZANIE CUKRÓW

1.   Cel i zakres stosowania metody

Metoda służy do oznaczania zawartości cukrów redukujących i całkowitej zawartości cukrów po inwersji, wyrażonych jako glukoza lub w razie potrzeby jako sacharoza, z zastosowaniem współczynnika 0,95 . Metodę stosuje się do mieszanek paszowych. Dla innych pasz stosuje się specjalne metody. W razie potrzeby laktozę należy mierzyć oddzielnie, uwzględniając ją w obliczeniach.

2.   Sposób przeprowadzenia metody

Cukry ekstrahuje się w rozcieńczonym etanolu. Otrzymany roztwór klaruje się roztworami Carreza I i Carreza II. Po wyeliminowaniu etanolu zawartość cukrów przed i po inwersji oznacza się metodą Luff-Schoorla.

3.   Odczynniki i roztwory

Ostrożnie mieszając, dodać roztwór kwasu cytrynowego (3.8.2) do roztworu węglanu sodu (3.8.3). Następnie dodać roztwór siarczanu miedzi (3.8.1) i uzupełnić do objętości 1 l wodą. Zostawić na noc do osadzenia i przefiltrować.

Sprawdzić normalność otrzymanego odczynnika (Cu 0,05 mol/l; Na2 CO3 1 mol/l). Zob. pkt 5.4, ostatni akapit. pH roztworu musi wynosić około 9,4 .

4.   Aparatura i sprzęt

Mikser (tumbler): ok. 35–40 obr./min.

5.   Sposób postępowania

5.1.   Ekstrakcja próbki

Odważyć, z dokładnością do 1 mg, 2,5 g próbki i umieścić w kolbie miarowej o pojemności 250 ml. Dodać 200 ml etanolu (3.1) i mieszać w mikserze przez godzinę. Dodać 5 ml roztworu Carreza I (3.2) i mieszać przez ok. 30 sekund. Dodać 5 ml roztworu Carreza II (3.3), i ponownie mieszać przez minutę. Uzupełnić do pełnej objętości kolby etanolem (3.1), homogenizować i przefiltrować. Pobrać 200 ml filtratu i odparować do około połowy objętości w celu usunięcia większości etanolu. Przenieść ilościowo pozostałość po odparowaniu do kolby miarowej o pojemności 200 ml z użyciem ciepłej wody, schłodzić, uzupełnić do pełnej objętości kolby wodą, homogenizować i, jeżeli to konieczne, przefiltrować. Roztwór ten będzie użyty do oznaczenia zawartości cukrów redukujących i, po inwersji, całkowitej zawartości cukrów.

5.2.   Oznaczanie cukrów redukujących

Używając pipety, pobrać nie więcej niż 25 ml roztworu zawierającego mniej niż 60 mg cukrów redukujących wyrażonych jako glukoza. Jeżeli to konieczne, uzupełnić do objętości 25 ml wodą destylowaną i oznaczyć zawartość cukrów redukujących metodą Luff-Schoorla. Wynik wyrazić jako procentową zawartość glukozy w próbce.

5.3.   Oznaczanie całkowitej zawartości cukru po inwersji

Używając pipety, pobrać 50 ml roztworu i przenieść go do kolby miarowej o pojemności 100 ml. Dodać kilka kropli roztworu oranżu metylowego (3.4), i następnie, ostrożnie mieszając, dodać kwas chlorowodorowy (3.5), aż do zmiany barwy cieczy na czerwoną. Dodać 15 ml kwasu chlorowodorowego (3.6) i zanurzyć kolbę we wrzącej łaźni wodnej na 30 minut. Szybko schłodzić do temperatury około 20 oC i dodać 15 ml roztworu wodorotlenku sodu (3.7). Uzupełnić kolbę do objętości 100 ml wodą i homogenizować. Pobrać nie więcej niż 25 ml roztworu zawierającego mniej niż 60 mg cukrów redukujących wyrażonych jako glukoza. Jeżeli to konieczne, uzupełnić do objętości 25 ml wodą destylowaną i oznaczyć zawartość cukrów redukujących metodą Luff-Schoorla. Wynik wyrazić jako procentową zawartość glukozy lub, w stosownych przypadkach, sacharozy, mnożąc przez współczynnik 0,95 .

5.4.   Miareczkowanie metodą Luff-Schoorla

Używając pipety, pobrać 25 ml odczynnika Luff-Schoorla (3.8), przenieść go do kolby Erlenmeyera o pojemności 300 ml i dodać dokładnie 25 ml klarownego roztworu cukru. Dodać dwie granulki pumeksu (3.13), ogrzewać nad średnim płomieniem, ręcznie mieszając, i doprowadzić ciecz do wrzenia w czasie około dwóch minut. Natychmiast postawić kolbę Erlenmeyera na siatce azbestowej z otworem o średnicy około 6 cm, pod którym pali się płomień. Płomień należy ustawić tak, aby ogrzewane było tylko dno kolby. Dopasować chłodnicę zwrotną do kolby Erlenmeyera. Gotować dokładnie dziesięć minut. Schłodzić natychmiast zimną wodą i po około pięciu minutach miareczkować w następujący sposób:

Dodać 10 ml roztworu jodku potasu (3.12) i od razu po tej czynności (zachowując ostrożność ze względu na ryzyko powstania piany) dodać 25 ml kwasu siarkowego (3.11). Miareczkować roztworem tiosiarczanu(VI) sodu (3.9) do pojawienia się mętnej żółtej barwy, dodać wskaźnik skrobiowy (3.10) i dokończyć miareczkowanie.

Przeprowadzić takie samo miareczkowanie na mieszaninie 25 ml odczynnika Luff-Schoorla (3.8) i 25 ml wody, po dodaniu 10 ml roztworu jodku potasu (3.12) i 25 ml kwasu siarkowego (3.11), bez gotowania.

6.   Obliczanie wyników

Wykorzystując tabelę, określić ilość glukozy w mg, która odpowiada różnicy między wynikami dwóch miareczkowań, wyrażonych w mg tiosiarczanu(VI) sodu 0,1 mol/l. Wynik wyrazić jako udział procentowy w próbce.

7.   Postępowanie specjalne

Homogenizować i przefiltrować. Usunąć etanol w sposób określony w pkt 5.1. Jeżeli nie ma dekstrynowanej skrobi, uzupełnić do pełnej objętości kolby wodą destylowaną.

8.   Objaśnienia

W obu przypadkach ilość cukru jest oznaczana metodą Luff-Schoorla i przeliczana na mg glukozy Jedna wartość jest odejmowana od drugiej, a różnica jest wyrażana jako udział procentowy w próbce.

Przykład

Dwie pobrane objętości odpowiadają próbce o masie próbki 250 mg dla każdego oznaczenia.

W pierwszym przypadku 17 ml roztworu tiosiarczanu(VI) sodu o stężeniu 0,1 mol/l odpowiada 44,2 mg zużytej glukozy, w drugim przypadku 11 ml odpowiada 27,6 mg glukozy.

Różnica wynosi 16,6 mg glukozy.

Zawartość cukrów redukujących (z wyłączeniem laktozy), w przeliczeniu na glukozę, wynosi zatem:

K.   OZNACZANIE LAKTOZY

1.   Cel i zakres stosowania metody

Metoda służy do oznaczania zawartości laktozy w paszach zawierających ponad 0,5 % laktozy.

2.   Sposób przeprowadzenia metody

Cukry są rozpuszczane w wodzie. Roztwór jest poddawany fermentacji w obecności drożdży Saccharomyces cerevisiae, które nie rozkładają laktozy. Po sklarowaniu i przefiltrowaniu zawartość laktozy w filtracie jest oznaczana metodą Luff-Schoorla.

3.   Odczynniki i roztwory

Ostrożnie mieszając, dodać roztwór kwasu cytrynowego (3.4.2) do roztworu węglanu sodu (3.4.3). Następnie dodać roztwór siarczanu miedzi (3.4.1) i uzupełnić kolbę do objętości 1 l wodą. Zostawić na noc do osadzenia i przefiltrować. Sprawdzić normalność otrzymanego odczynnika (Cu 0,05 mol/l; Na2 CO3 1 mol/l). Wartość pH roztworu musi wynosić około 9,4 .

4.   Aparatura i sprzęt

Łaźnia wodna z termostatem umożliwiającym utrzymanie temperatury od 38 do 40 oC.

5.   Sposób postępowania

Odważyć, z dokładnością do 1 mg, 1 g próbki i umieścić w kolbie miarowej o pojemności 100 ml. Dodać od 25 do 30 ml wody. Umieścić kolbę we wrzącej łaźni wodnej na 30 minut, a następnie schłodzić do temperatury około 35 oC. Dodać 5 ml zawiesiny drożdży (3.1) i homogenizować. Pozostawić kolbę na dwie godziny w łaźni wodnej o temperaturze od 38 do 40 oC. Schłodzić do temperatury około 20 oC.

Dodać 2,5 ml roztworu Carreza I (3.2) i mieszać przez 30 sekund, następnie dodać 2,5 ml roztworu Carreza II (3.3) i ponownie mieszać przez 30 sekund. Uzupełnić kolbę do objętości 100 ml wodą, zmieszać i przefiltrować. Używając pipety, pobrać nie więcej niż 25 ml filtratu, który zawiera od 40 do 80 mg laktozy, i umieścić go w kolbie Erlenmeyera o pojemności 300 ml. W miarę potrzeby uzupełnić do objętości 25 ml wodą.

W ten sam sposób przeprowadzić test ślepej próby z 5 ml suspensji drożdżowej (3.1). Oznaczyć zawartość laktozy według Luff-Schoorla, w następujący sposób: dodać 25 ml odczynnika Luff-Schoorla (3.4) i dwie granulki pumeksu (3.5). Ogrzewać nad średnim płomieniem, ręcznie mieszając, i doprowadzić ciecz do wrzenia w czasie około 2 minut. Natychmiast postawić kolbę Erlenmeyera na siatce azbestowej z otworem o średnicy około 6 cm, pod którym pali się płomień. Płomień należy ustawić tak, aby ogrzewane było tylko dno kolby Erlenmeyera. Dopasować chłodnicę zwrotną do kolby Erlenmeyera. Gotować dokładnie 10 minut. Schłodzić natychmiast zimną wodą i po około 5 minutach miareczkować w następujący sposób:

Dodać 10 ml roztworu jodku potasu (3.6) i niezwłocznie (zachowując ostrożność ze względu na ryzyko powstania piany) dodać 25 ml kwasu siarkowego (3.7). Miareczkować roztworem tiosiarczanu sodowego (3.8) do pojawienia się mętnej żółtej barwy, dodać wskaźnik skrobiowy (3.9) i dokończyć miareczkowanie.

Przeprowadzić takie samo miareczkowanie na mieszaninie 25 ml odczynnika Luff-Schoorla (3.4) i 25 ml wody, po dodaniu 10 ml roztworu jodku potasu (3.6) i 25 ml kwasu siarkowego (3.7), bez gotowania.

6.   Obliczanie wyników

Wykorzystując załączoną tabelę, określić ilość laktozy w mg, która odpowiada różnicy między wynikami dwóch miareczkowań, wyrażonych w ml roztworu tiosiarczanu sodu 0,1 mol/l.

Wynik wyrazić jako udział procentowy bezwodnej laktozy w próbce.

7.   Objaśnienia

W przypadku produktów zawierających ponad 40 % fermentujących cukrów dodać więcej niż 5 ml zawiesiny drożdży (3.1).

L.   OZNACZANIE SKROBI

METODA POLARYMETRYCZNA

1.   Cel i zakres stosowania metody

Metoda służy do polarymetrycznego oznaczania zawartości skrobi i wysokocząsteczkowych produktów jej rozkładu w paszach, w celu sprawdzenia zgodności z zadeklarowaną wartością energetyczną (przepisy zawarte w załączniku VII) oraz dyrektywą Rady 96/25/WE ( 10 ).

2.   Sposób przeprowadzenia metody

Metoda składa się z dwóch oznaczeń. W pierwszym oznaczeniu próbka jest traktowana rozcieńczonym kwasem chlorowodorowym. Po sklarowaniu i przefiltrowaniu mierzy się polarymetrycznie skręcalność optyczną roztworu.

W drugim oznaczeniu próbka jest ekstrahowana 40 % etanolem. Po zakwaszeniu filtratu kwasem chlorowodorowym, sklarowaniu i przefiltrowaniu mierzy się skręcalność optyczną, tak jak w pierwszym oznaczeniu.

Różnica pomiędzy dwoma pomiarami, pomnożona przez znany współczynnik, daje zawartość skrobi w próbce.

3.   Odczynniki i roztwory

Stężenie należy sprawdzić poprzez miareczkowanie przy użyciu roztworu wodorotlenku sodu 0,1 mol/l w obecności czerwieni metylowej 0,1 % (w/V) w 94 % (v/v) etanolu. Do neutralizacji 10 ml potrzeba 30,94 ml NaOH 0,1 mol/l.

4.   Aparatura i sprzęt

5.   Sposób postępowania

5.1.   Przygotowanie próbki

Rozdrobnić próbkę tak, aby przesiewała się przez oczka sita o średnicy 0,5 mm.

5.2.   Oznaczanie całkowitej skręcalności optycznej (P lub S) (zob. objaśnienia 7.1)

Odważyć, z dokładnością do 1 mg, 2,5 g rozdrobnionej próbki i umieścić w kolbie miarowej o pojemności 100 ml. Dodać 25 ml kwasu chlorowodorowego (3.2), wstrząsnąć do równomiernego rozprowadzenia próbki i dodać następną porcję 25 ml kwasu chlorowodorowego (3.2). Kolbę zanurzyć we wrzącej łaźni wodnej. Aby zapobiec aglomeracji, przez pierwsze 3 minuty nieprzerwanie i energicznie wstrząsać kolbą. Ilość wody w łaźni wodnej musi być wystarczająca, aby pozostała ona w stanie wrzenia, kiedy kolba zostanie do niej włożona. Nie należy wyjmować kolby z wody w trakcie wstrząsania. Dokładnie po 15 minutach wyjąć kolbę z łaźni wodnej, dodać 30 ml zimnej wody i natychmiast schłodzić do temperatury 20 oC.

Dodać 5 ml roztworu Carreza I (3.3) i wstrząsać przez ok. 30 sekund. Następnie dodać 5 ml roztworu Carreza II (3.4) i ponownie wstrząsać przez ok. 30 sekund. Uzupełnić do pełnej objętości kolby wodą, zmieszać i przefiltrować. W przypadku gdy filtrat nie jest idealnie klarowny (co zdarza się rzadko), powtórzyć oznaczanie z użyciem większej ilości roztworów Carreza I i II, np. 10 ml.

Zmierzyć skręcalność optyczną roztworu w 200 mm rurce przy zastosowaniu polarymetru lub sacharymetru.

5.3.   Oznaczanie skręcalności optycznej (P' lub S') produktów rozpuszczonych w 40 % etanolu

Odważyć, z dokładnością do 1 mg, 5 g próbki, umieścić w kolbie miarowej o pojemności 100 ml i dodać około 80 ml etanolu (3.5) (zob. objaśnienia 7.2). Pozostawić kolbę na godzinę w temperaturze pokojowej, sześciokrotnie energicznie wstrząsając w tym czasie kolbą tak, aby próbka została dobrze zmieszana z etanolem. Uzupełnić do pełnej objętości kolby etanolem (3.5), zmieszać i przefiltrować.

Pobrać pipetą 50 ml filtratu, co jest równe 2,5 g próbki, do kolby Erlenmeyera o pojemności 250 ml, dodać 2,1 ml kwasu chlorowodorowego (3.1) i energicznie wstrząsnąć. Przymocować chłodnicę zwrotną do kolby Erlenmeyera i kolbę tę zanurzyć we wrzącej łaźni wodnej. Po dokładnie 15 minutach wyjąć kolbę Erlenmeyera z łaźni, przenieść zawartość do kolby miarowej o pojemności 100 ml, spłukując kolbę Erlenmeyera niewielką ilością zimnej wody, i schłodzić do temperatury 20 oC.

Sklarować z użyciem roztworów Carreza I (3.3) i Carreza II (3.4), uzupełnić do pełnej objętości kolby wodą, zmieszać, przefiltrować i zmierzyć skręcalność optyczną, w sposób określony w drugim i trzecim akapicie pkt 5.2.

6.   Obliczanie wyników

Zawartość skrobi (w %) oblicza się według następujących wzorów:

6.1.   Pomiary z użyciem polarymetru

P

=

całkowita skręcalność optyczna w stopniach kątowych

P'

=

skręcalność optyczna w stopniach kątowych substancji rozpuszczonych w 40 % (V/V) etanolu

=

określona skręcalność optyczna czystej skrobi. Umowne wartości liczbowe przyjęte dla tego współczynnika są następujące: +185,9 o: skrobia ryżowa +185,7 o: skrobia ziemniaczana +184,6 o: skrobia kukurydziana +182,7 o: skrobia pszenna +181,5 o: skrobia jęczmienna +181,3 o: skrobia owsiana +184,0 o: inne typy skrobi i jej mieszaniny w mieszankach paszowych

6.2.   Pomiary z użyciem sacharymetru

S

=

całkowita skręcalność optyczna w stopniach sacharymetru

S'

=

skręcalność optyczna w stopniach sacharymetru substancji rozpuszczonych w 40 % (v/v) etanolu

N

=

masa w g sacharozy w 100 ml wody ulegająca skręcalności optycznej 100 stopni sacharymetrycznych, podczas pomiaru z użyciem rurki o długości 200 mm 16,29 g dla sacharymetrów francuskich 26,00 g dla sacharymetrów niemieckich 20,00 g dla sacharymetrów połączonych

P

=

całkowita skręcalność optyczna w stopniach kątowych

P'

=

skręcalność optyczna w stopniach kątowych substancji rozpuszczonych w 40 % (V/V) etanolu

=

określona skręcalność optyczna czystej skrobi (zob. pkt 6.1)

6.3.   Powtarzalność

Różnica pomiędzy wynikami dwóch równoległych oznaczeń wykonanych dla tej samej próbki nie może przekraczać 0,4 w wartości bezwzględnej dla zawartości skrobi niższej niż 40 % i 1 % względem zawartości skrobi równej lub wyższej niż 40 %.

7.   Objaśnienia

M.   OZNACZANIE POPIOŁU SUROWEGO

1.   Cel i zakres stosowania metody

Metoda służy do oznaczania zawartości popiołu surowego w paszach.

2.   Sposób przeprowadzenia metody

Próbka jest spopielana w temperaturze 550 oC, a pozostałość jest ważona.

3.   Odczynniki i roztwory

20 % roztwór azotanu amonu (w/v).

4.   Aparatura i sprzęt

5.   Sposób postępowania

Odważyć, z dokładnością do 1 mg, około 5 g próbki (2,5 w przypadku substancji pęczniejących), i umieścić w tyglu do spalań, który został podgrzany do temperatury 550 oC, schłodzony i wytarowany. Tygiel postawić na płycie grzewczej i ogrzewać stopniowo aż do zwęglenia substancji. Spopielić zgodnie z pkt 5.1 lub 5.2.

6.   Obliczanie wyników

Obliczyć masę pozostałości, odejmując tarę.

Wynik wyrazić jako udział procentowy w próbce.

7.   Objaśnienia

N.   OZNACZANIE POPIOŁU NIEROZPUSZCZALNEGO W KWASIE CHLOROWODOROWYM

1.   Cel i zakres stosowania metody

Metoda służy do oznaczania zawartości substancji mineralnych nierozpuszczalnych w kwasie chlorowodorowym w paszach. W zależności od rodzaju próbki stosuje się dwie metody.

2.   Sposób przeprowadzenia metody

3.   Odczynniki i roztwory

4.   Aparatura i sprzęt

5.   Sposób postępowania

5.1.   Metoda A

Spopielić próbkę metodą opisaną w odniesieniu do oznaczania popiołu surowego. Popiół uzyskany w wyniku zastosowanej analizy może być także wykorzystany do badania.

Popiół przenieść do zlewki o pojemności od 250 do 400 ml z użyciem 75 ml kwasu chlorowodorowego (3.1). Powoli doprowadzić do wrzenia i gotować ostrożnie przez 15 minut. Przefiltrować gorący roztwór przez bibułę bez popiołu i przemywać pozostałość gorącą wodą, aż reakcja z kwasem przestanie być widoczna. Filtr z osadem wysuszyć i spopielić w uprzednio wytarowanym tyglu w temperaturze nie niższej niż 550 oC i nie wyższej niż 700 oC. Ostudzić w eksykatorze i zważyć.

5.2.   Metoda B

Odważyć, z dokładnością do 1 mg, 5 g próbki i umieścić w zlewce o pojemności od 250 do 400 ml. Dodać kolejno 25 ml wody i 25 ml kwasu chlorowodorowego (3.1), wymieszać i odczekać, aż roztwór przestanie się burzyć. Dodać kolejne 50 ml kwasu chlorowodorowego (3.1). Odczekać do ulotnienia się gazu, następnie umieścić zlewkę we wrzącej łaźni wodnej i trzymać ją tam przez co najmniej 30 minut, w celu całkowitej hydrolizy skrobi. Gorący roztwór przefiltrować przez bibułę bez popiołu i przemyć 50 ml gorącej wody (zob. objaśnienia pkt 7). Filtr z osadem umieścić w tyglu do spalań, wysuszyć i spopielać w temperaturze nie niższej niż 550 oC i nie wyższej niż 700 oC. Popiół umieścić w zlewce o pojemności od 250 do 400 ml z użyciem 75 ml kwasu chlorowodorowego (3.1). Postępować w sposób określony w drugim akapicie pkt 5.1.

6.   Obliczanie wyników

Masę pozostałości obliczyć, odejmując tarę. Wynik wyrazić jako udział procentowy w próbce.

7.   Objaśnienia

Jeżeli filtracja ma trudny przebieg, zaleca się powtórne przeprowadzenie analizy, zastępując 50 ml kwasu chlorowodorowego (3.1) 50 ml 20 % kwasu trichlorooctowego (3.2) i przemywając filtr ciepłym 1 % roztworem kwasu trichlorooctowego (3.3).

O.   OZNACZANIE WĘGLANÓW

1.   Cel i zakres stosowania metody

Metoda służy do oznaczania zawartości węglanów, umownie wyrażanych jako węglan wapnia, w większości pasz.

Jednakże w niektórych przypadkach (np. węglan żelaza) należy stosować szczególną metodę.

2.   Sposób przeprowadzenia metody

Węglany rozkłada się kwasem chlorowodorowym. Powstały dwutlenek węgla zbiera się do probówki miarowej, a jego objętość jest porównywana z objętością uwolnioną ze znanej ilości węglanu wapnia w tych samych warunkach.

3.   Odczynniki i roztwory

4.   Aparatura i sprzęt

Zestaw Scheiblera-Dietriecha (zob. rysunek) lub podobny.

5.   Sposób postępowania

W zależności od zawartości węglanów w próbce, zważyć próbkę o masie:

Próbkę umieścić w specjalnej kolbie aparatu (4) wyposażonej w małą probówkę wykonaną z nietłukącego się szkła zawierającą 10 ml kwasu chlorowodorowego (pkt 3.1) i podłączyć kolbę do aparatury. Kran trójdrożny (5) ustawić tak, aby rurka (1) była podłączona z wyjściem. Używając ruchomej rurki (2) wypełnionej barwnym kwasem siarkowym (pkt 3.3) i połączonej z wykalibrowaną rurką (1), doprowadzić poziom cieczy do znaku zero, który wyznaczony jest na podziałce. Przekręcić kran (5) tak, aby połączyć rurki (1) i (3), i sprawdzić, czy poziom cieczy doprowadzony został do znaku 0.

Przechylając kolbę (4), powoli wlewać kwas chlorowodorowy (3.1) do próbki. Wyrównać ciśnienie, obniżając rurkę (2). Potrząsać kolbą (4), dopóki nie ustanie wydzielanie dwutlenku węgla.

Przywrócić ciśnienie, doprowadzając ciecz w rurkach (1) i (2) do tego samego poziomu. Po kilku minutach, kiedy ustali się objętość gazu, wykonać odczyt.

Przeprowadzić test kontrolny w tych samych warunkach z 0,5 g węglanu wapnia (3.2).

6.   Obliczanie wyników

Wyrażoną jako węglan wapnia zawartość węglanów oblicza się według następującego wzoru:

gdzie:

X

=

zawartość w % (w/w) węglanów w próbce wyrażona jako węglan wapnia

V

=

ilość CO2 w ml uwolniona z próbki

V1

=

ilość CO2 w ml uwolniona z 0,5 g CaCO3

m

=

masa w g próbki.

7.   Objaśnienia

P.   OZNACZANIE CAŁKOWITEJ ZAWARTOŚCI FOSFORU

METODA FOTOMETRYCZNA

1.   Cel i zakres stosowania metody

Metoda służy do oznaczania całkowitej zawartości fosforu w paszach. Metodę należy stosować do analizy pasz o niskiej zawartości fosforu. W niektórych przypadkach (produkty bogate w fosfor) dopuszcza się stosowanie metody wagowej.

2.   Sposób przeprowadzenia metody

Próbka jest mineralizowana poprzez suche spalanie (w przypadku pasz organicznych) lub przez rozpuszczenie kwasem (w przypadku związków mineralnych i pasz ciekłych), a następnie wprowadzona do kwaśnego roztworu. Roztwór jest traktowany odczynnikiem molibdenowanadowym. Gęstość optyczna utworzonego żółtego roztworu jest mierzona w spektrofotometrze przy 430 nm.

3.   Odczynniki i roztwory

4.   Aparatura i sprzęt

5.   Sposób postępowania

5.1.   Przygotowanie roztworu

W zależności od rodzaju próbki przygotować roztwór w sposób określony w pkt 5.1.1 lub 5.1.2.

5.1.1.    Zwykły sposób postępowania

Odważyć, z dokładnością do 1 mg, co najmniej 1 g próbki. Umieścić próbkę w kolbie Kjeldahla, dodać 20 ml kwasu siarkowego (3.5), wstrząsnąć do całkowitego nasycenia kwasem i nie dopuścić do przyklejania cząstek do ścianek kolby, podgrzać i utrzymywać w stanie wrzenia przez 10 minut. Nieznacznie schłodzić, dodać 2 ml kwasu azotowego (3.4), ostrożnie podgrzać, ponownie nieznacznie schłodzić i dodać nieco więcej kwasu azotowego (3.4), a następnie ponownie doprowadzić do wrzenia. Powtarzać tę czynność aż do uzyskania bezbarwnego roztworu. Schłodzić, dodać trochę wody, zdekantować ciecz do kolby miarowej o pojemności 500 ml, spłukać kolbę Kjeldahla gorącą wodą. Schłodzić, uzupełnić do pełnej objętości kolby wodą, homogenizować i przefiltrować.

5.1.2.    Próbki zawierające substancje organiczne, wolne od dwuwodorofosforanu magnezu i wapnia

Odważyć, z dokładnością do 1 mg, około 2,5 g próbki i umieścić w tyglu do spopielania. Zmieszać dokładnie próbkę z 1 g węglanu wapnia (3.1). Spopielać w piecu w temperaturze 550 oC do uzyskania popiołu o białej lub szarej barwie (niewielka ilość węgla drzewnego nie ma znaczenia). Przenieść popiół do zlewki o pojemności 250 ml. Dodać 20 ml wody i kwasu chlorowodorowego (3.2) aż do zaprzestania pienienia się. Następnie dodać kolejne 10 ml kwasu chlorowodorowego (3.2). Umieścić zlewkę na łaźni piaskowej i odparować do sucha do powstania nierozpuszczalnej krzemionki. Pozostałość rozpuścić w 10 ml kwasu azotowego (3.3) i gotować na łaźni piaskowej lub płycie przez 5 minut, nie doprowadzając do zupełnego odparowania cieczy. Przenieść ciecz do kolby miarowej o pojemności 500 ml, spłukując kilkakrotnie zlewkę gorącą wodą. Pozostawić do schłodzenia, uzupełnić do pełnej objętości kolby wodą, homogenizować i przefiltrować.

5.2.   Wywołanie zabarwienia i gęstości optycznej

Rozcieńczyć podzielną część filtratu otrzymanego w sposób określony w pkt 5.1.1 lub 5.1.2 do uzyskania stężenia fosforu nie większego niż 40 μg/ml. Umieścić 10 ml tego roztworu w probówce (4.6) i dodać 10 ml odczynnika molibdenowanadowego (3.6). Homogenizować i pozostawić co najmniej na 10 minut w temperaturze 20 oC. Zmierzyć gęstość optyczną w spektrofotometrze przy 430 nm w stosunku do roztworu otrzymanego przez dodanie 10 ml odczynnika molibdenowanadowego (3.6) do 10 ml wody.

5.3.   Krzywa kalibracyjna

Z roztworu wzorcowego fosforu (3.7) przygotować roztwory zawierające odpowiednio 5, 10, 20, 30 i 40 μg fosforu w 1 ml. Pobrać 10 ml każdego z tych roztworów i dodać do nich po 10 ml odczynnika molibdenowanadowego (3.6). Homogenizować i pozostawić co najmniej na 10 minut w temperaturze 20 oC. Zmierzyć gęstość optyczną w sposób określony w pkt 5.2. Wykreślić krzywą kalibracyjną, odkładając wartości gęstości optycznej w stosunku do odpowiadających jej ilości fosforu. W zakresie stężeń od 0 do 40 μg/ml krzywa jest liniowa.

6.   Obliczanie wyników

Określić zawartość fosforu w badanej próbce z zastosowaniem krzywej kalibracyjnej.

Wynik wyrazić jako udział procentowy w próbce.

Powtarzalność

Różnica pomiędzy wynikami dwóch równoległych oznaczeń wykonanych dla tej samej próbki nie może przekraczać:

Q.   OZNACZANIE CHLORU Z CHLORKÓW

1.   Cel i zakres stosowania metody

Metoda służy do oznaczania zawartości chloru w chlorkach rozpuszczalnych w wodzie, umownie wyrażanego jako chlorku sodu w paszach. Metodę tę stosuje się do wszystkich pasz.

2.   Sposób przeprowadzenia metody

Chlorki są rozpuszczane w wodzie. Jeżeli badany produkt zawiera substancje organiczne, roztwór jest klarowany. Po nieznacznym zakwaszeniu kwasem azotowym chlorki strąca się w postaci chlorku srebra przy użyciu roztworu azotanu srebra. Nadmiar azotanu srebra jest miareczkowany roztworem tiocyjanianu amonu według metody Volharda.

3.   Odczynniki i roztwory

4.   Aparatura i sprzęt

Mikser (tumbler): ok. 35–40 obr./min.

5.   Sposób postępowania

5.1.   Przygotowanie roztworu

Zależnie od rodzaju próbki, przygotować roztwór w sposób określony w pkt 5.1.1, 5.1.2 lub 5.1.3.

W tym samym czasie przeprowadzić ślepą próbę, pomijając analizowaną próbkę.

5.1.1.    Próbki niezawierające substancji organicznej

Odważyć, z dokładnością do 1 mg, nie więcej niż 10 g próbki zawierającej nie więcej niż 3 g chloru w postaci chlorków. Odważkę umieścić z 400 ml wody o temperaturze około 20 oC w kolbie miarowej o pojemności 500 ml. Mieszać przez 30 minut w mikserze, uzupełnić do pełnej objętości kolby, homogenizować i przefiltrować.

5.1.2.    Próbki zawierające substancje organiczne, z wyłączeniem produktów opisanych w pkt 5.1.3

Odważyć, z dokładnością do 1 mg, około 5 g próbki i wraz z 1 g węgla aktywnego umieścić w kolbie miarowej o pojemności 500 ml. Dodać 400 ml wody o temperaturze około 20 oC i 5 ml roztworu Carreza I (3.7), mieszać przez 30 sekund i dodać 5 ml roztworu Carreza II (3.8). Mieszać przez 30 minut w mikserze, uzupełnić do pełnej objętości kolby, homogenizować i przefiltrować.

5.1.3.    Pasze po obróbce cieplnej, makuchy lniane, mączka lniana, produkty bogate w mączkę lnianą i inne produkty bogate w śluz lub substancje koloidalne (np. dekstryna skrobi)

Przygotować roztwór w sposób określony w pkt 5.1.2, ale nie filtrować. Zdekantować (w razie potrzeby odwirować), pobrać 100 ml płynnego supernatantu i przenieść go do kolby miarowej o pojemności 200 ml. Zmieszać z acetonem (3.6) i uzupełnić do pełnej objętości kolby tym samym rozpuszczalnikiem, homogenizować i przefiltrować.

5.2.   Miareczkowanie

W zależności od przewidywanej zawartości chlorku przenieść pipetą do kolby Erlenmeyera od 25 do 100 ml filtratu, otrzymanego w sposób określony w pkt 5.1.1, 5.1.2 lub 5.1.3. Podzielna część nie może zawierać więcej niż 150 mg chloru (Cl). Rozcieńczyć w razie potrzeby wodą do objętości nie mniejszej niż 50 ml, dodać 5 ml kwasu azotowego (3.4), 20 ml nasyconego roztworu siarczanu amonu i żelaza (3.3) i 2 krople roztworu tiocyjanianu amonu (3.1) przeniesionego z zastosowaniem biurety wypełnionej do znaku 0. Stosując biuretę, przenieść roztwór azotanu srebra (3.2), tak aby nadmiar wyniósł 5 ml. Dodać 5 ml eteru dwuetylowego (3.5) i mocno wstrząsać do skoagulowania się osadu. Nadmiar azotanu srebra miareczkować roztworem tiocyjanianu amonu (3.1), aż do uzyskania czerwonobrązowego odcienia utrzymującego się przez minutę.

6.   Obliczanie wyników

Ilość chlorku (X), wyrażonego jako udział procentowy chlorku sodu, oblicza się według następującego wzoru:

gdzie:

V1

=

fobjętość w ml dodanego roztworu azotanu srebra o stężeniu 0,1 mol/l

V2

=

objętość w ml użytego do miareczkowania roztworu tiocyjanku amonu o stężeniu 0,1 mol/l

m

=

masa próbki

Jeżeli ślepa próba wykaże, że roztwór azotanu srebra o stężeniu 0,1 mol/l został zużyty, odjąć jego objętość od objętości (V1 – V2).

7.   Objaśnienia

---

ZAŁĄCZNIK IV

METODY ANALIZY DO CELÓW KONTROLI POZIOMU DOPUSZCZONYCH DODATKÓW W PASZACH

A.   OZNACZANIE WITAMINY A

1.   Cel i zakres stosowania metody

Metoda służy do oznaczania zawartości witaminy A (retinolu) w paszach i premiksach. Metoda pozwala na oznaczenie witaminy A obejmującej wszystkie formy alkoholowe trans-retinolu i wszystkie jej izomery cis. Zawartość witaminy A jest wyrażana w jednostkach międzynarodowych (IU) na kg. Jedna IU odpowiada aktywności 0,300 μg wszystkich form alkoholowych trans-witaminy A lub 0,344 μg wszystkich form octanowych trans-witaminy A lub 0,550 μg wszystkich form palmitynianowych trans-witaminy A.

Granica oznaczalności metody wynosi 2 000 IU witaminy A/kg.

2.   Sposób przeprowadzenia metody

Próbka jest hydrolizowana w etanolowym roztworze wodorotlenku potasu, a witamina A ekstrahowana eterem naftowym. Rozpuszczalnik jest usuwany przez odparowanie, a pozostałość rozpuszczana w metanolu i, w razie konieczności, rozcieńczana do wymaganego stężenia. Zawartość witaminy A jest oznaczana metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej z fazą odwróconą (RP-HPLC) z wykorzystaniem detektora UV lub detektora fluorescencyjnego. Parametry chromatograficzne zostały tak dobrane, że nie zachodzi rozdział pomiędzy wszystkimi formami alkoholowymi trans-witaminy A i jej cis izomerami.

3.   Odczynniki i roztwory

4.   Aparatura i sprzęt

5.   Sposób postępowania

Uwaga:

Witamina A jest wrażliwa na światło (UV) i utlenianie. Wszystkie czynności należy przeprowadzać bez dostępu światła (z zastosowaniem szkła oranżowego lub szkła zabezpieczonego folią aluminiową) i bez dostępu tlenu (płukanie strumieniem azotu). Podczas ekstrakcji powietrze znad cieczy należy zastąpić azotem (zapobiegać zbyt wysokiemu ciśnieniu, zwalniając od czasu do czasu korek).

5.1.   Przygotowanie próbki

Rozdrobnić próbkę tak, aby przesiewała się przez oczka sita o średnicy 1 mm, uważając, aby podczas rozdrabniania nie wydzielało się ciepło. Rozdrabnianie musi być przeprowadzone tuż przed ważeniem i zmydlaniem, gdyż w przeciwnym razie mogą wystąpić straty witaminy A.

5.2.   Zmydlanie

W zależności od zawartości witaminy A zważyć, z dokładnością do 1 mg, od 2 do 25 g próbki do kolby płaskodennej lub stożkowej o pojemności 500 ml (4.2.1). Dodać kolejno, mieszając, 130 ml etanolu (3.1), około 100 mg BHT (3.13), 2 ml roztworu askorbinianu sodu (3.5) i 2 ml roztworu siarczku sodu (3.6). Założyć chłodnicę (4.3) na kolbę i umieścić kolbę w łaźni wodnej z mieszadłem magnetycznym (4.7). Ogrzać do wrzenia i skraplać przez 5 minut. Następnie dodać 25 ml roztworu wodorotlenku potasu (3.4) przez chłodnicę (4.3) i skraplać przez 25 minut, mieszając w trakcie powolnego przepływu azotu. Następnie spłukać chłodnicę około 20 ml wody i schłodzić zawartość kolby do temperatury pokojowej.

5.3.   Ekstrakcja

Przenieść, dekantując, zmydlony roztwór, ilościowo spłukując 250 ml wody, do rozdzielacza o pojemności 1 000 ml (4.2.3) lub do aparatu do ekstrakcji (4.8). Spłukać kolbę po zmydlaniu kolejno 25 ml etanolu (3.1) i 100 ml eteru naftowego (3.2) i przenieść popłuczyny do rozdzielacza lub do zestawu do ekstrakcji. Proporcja wody i etanolu w łączonych roztworach musi wynosić około 2:1. Wstrząsać energicznie przez 2 minuty i pozostawić w celu wytrącenia osadu na 2 minuty.

5.3.1.    Ekstrakcja z użyciem rozdzielacza stożkowego (4.2.3)

Po rozdzieleniu warstw (zob. objaśnienia pkt 7.3) przenieść warstwę eteru naftowego do innego rozdzielacza (4.2.3). Powtórzyć ekstrakcję dwukrotnie, używając 100 ml eteru naftowego (3.2) i dwukrotnie używając 50 ml eteru naftowego (3.2).

Przemyć dwukrotnie połączone ekstrakty w rozdzielaczu stożkowym 100 ml porcjami wody, ostrożnie mieszając, aby zapobiec powstawaniu zawiesiny, a następnie, wielokrotnie wstrząsając, powtórzyć przemywanie kolejnymi 100 ml porcjami wody, aż woda pozostanie bezbarwna po dodaniu roztworu fenoloftaleiny (3.7) (wystarczy zwykle czterokrotne przemycie). W celu usunięcia suspensji wodnej filtrować przemyty ekstrakt przez suchy karbowany filtr do rozdzielania faz (4.4) do kolby miarowej o pojemności 500 ml (4.2.2). Spłukać rozdzielacz i filtr przy użyciu 50 ml eteru naftowego (3.2), uzupełnić eterem naftowym (3.2) do pełnej objętości kolby i dobrze zmieszać.

5.3.2.    Ekstrakcja z użyciem aparatu do ekstrakcji (4.8)

Gdy warstwy zostaną rozdzielone (zob. objaśnienia pkt 7.3) zastąpić korek szklanego cylindra (4.8.1) nasadką szklaną ze szlifem (4.8.2) i ustawić niższy koniec rurki w kształcie litery U tak, aby znajdował się tuż ponad granicą rozdziału faz. Przez aplikację ciśnienia azotu dopływającego przez nasadkę przenieść górną warstwę eteru naftowego do rozdzielacza o pojemności 1 000 ml (4.2.3). Do szklanego cylindra dodać 100 ml eteru naftowego (3.2), zamknąć i dobrze wstrząsnąć. Pozostawić do rozdzielenia się faz i przenieść górną warstwę do rozdzielacza w sposób opisany powyżej. Powtórzyć postępowanie ekstrakcyjne, stosując kolejną porcję 100 ml eteru naftowego (3.2), a następnie stosując dwukrotnie porcje 50 ml eteru naftowego (3.2) i dodać warstwy eteru naftowego do rozdzielacza.

Przemyć połączone ekstrakty eteru naftowego w sposób określony w pkt 5.3.1 i dalej postępować w sposób tam określony.

5.4.   Przygotowanie roztworu próbki do HPLC

Pobrać pipetą podzielną część roztworu eteru naftowego (z pkt 5.3.1 lub 5.3.2) do kolby gruszkowej o pojemności 250 ml (4.2.4). Odparować rozpuszczalnik prawie do sucha na rotacyjnej wyparce próżniowej (4.1) przy obniżonym ciśnieniu na łaźni wodnej w temperaturze nie wyższej niż 40 oC. Przywrócić ciśnienie atmosferyczne przez wpuszczenie azotu (3.10) i zdjąć kolbę z rotacyjnej wyparki próżniowej. Usunąć pozostały rozpuszczalnik strumieniem azotu (3.10) i szybko rozpuścić pozostałość w znanej objętości metanolu (10–100 ml) (3.3) (stężenie witaminy A musi wynosić od 5 IU/ml do 30 IU/ml).

5.5.   Oznaczanie HPLC

Witamina A jest rozdzielana na kolumnie z fazą odwróconą C18 (4.5.1), a stężenie jest mierzone z użyciem detektora UV (325 nm) lub detektora fluorescencyjnego (wzbudzanie: 325 nm; emisja 475 nm) (4.5.2).

Zadozować podzielną część roztworu metanolowego (np. 20 μl), otrzymanego w sposób określony w pkt 5.4 i wymywać fazą ruchomą (3.9). Obliczyć średnią wysokość (powierzchnię) piku kilku kolejnych dozowań tego samego roztworu próbki i średnie wysokości (powierzchnie) pików kilku dozowań kalibracyjnych roztworów (5.6.2).

Warunki HPLC

Poniższe parametry podano jako przykładowe; inne parametry mogą być zastosowane, o ile gwarantują otrzymanie równoważnych wyników.

5.6.   Kalibracja

5.6.1.    Przygotowanie roboczych roztworów wzorcowych

Pobrać pipetą 20 ml podstawowego roztworu octanowej witaminy A (3.11.1) lub 20 ml podstawowego roztworu palmitynianowej witaminy A (3.12.1) do kolby płaskodennej lub stożkowej o pojemności 500 ml (4.2.1) i hydrolizować w sposób określony w pkt 5.2, lecz bez dodawania BHT. Następnie ekstrahować eterem naftowym (3.2) w sposób określony w pkt 5.3 i uzupełnić do objętości 500 ml eterem naftowym (3.2). Odparować prawie do sucha 100 ml tego ekstraktu na rotacyjnej wyparce próżniowej (zob. pkt 5.4), usunąć pozostały rozpuszczalnik strumieniem azotu (3.10) i ponownie rozpuścić pozostałość w 10,0 ml metanolu (3.3). Nominalne stężenie tego roztworu wynosi 560 IU witaminy A na 1 ml. Oznaczyć dokładną zawartość ekstraktu w sposób określony w pkt 5.6.3.3. Roboczy roztwór wzorcowy przygotować bezpośrednio przed użyciem.

Przenieść pipetą 2,0 ml tego roboczego roztworu wzorcowego do kolby miarowej o pojemności 20 ml, uzupełnić metanolem (3.3) do pełnej objętości kolby i zmieszać. Nominalne stężenie tego rozcieńczonego roboczego roztworu wzorcowego wynosi 56 IU witaminy A na 1 ml.

5.6.2.    Przygotowanie kalibracyjnych roztworów i krzywej kalibracyjnej

Przenieść 1,0 , 2,0 , 5,0 i 10,0 ml rozcieńczonego roboczego roztworu wzorcowego do partii kolb miarowych o pojemności 20 ml, uzupełnić do pełnej objętości kolb metanolem (3.3) i zmieszać. Nominalne stężenia tych roztworów wynoszą 2,8 , 5,6 , 14,0 i 28,0 IU witaminy A na 1 ml.

Zadozować kilka razy 20 μl każdego z roztworów kalibracyjnych i określić średnie wysokości (powierzchnie) piku. Wykorzystując średnie wysokości (powierzchnie) piku, wykreślić krzywą kalibracyjną, uwzględniając wyniki kontroli UV (5.6.3.3).

5.6.3.    Standaryzacja UV wzorcowych roztworów

5.6.3.1.    Roztwór podstawowy octanowej witaminy A

Pobrać pipetą 2,0 ml roztworu podstawowego octanowej witaminy A (3.11.1) do kolby miarowej o pojemności 50 ml (4.2.2) i uzupełnić do pełnej objętości kolby 2-propanolem (3.8). Nominalne stężenie tego roztworu wynosi 56 IU witaminy A na 1 ml. Pobrać pipetą 3,0 ml tego rozcieńczonego roztworu octanowej witaminy A do kolby miarowej o pojemności 25 ml i uzupełnić do pełnej objętości kolby 2-propanolem (3.8). Nominalne stężenie tego roztworu wynosi 6,72 IU witaminy A na ml. Zmierzyć spektrum UV tego roztworu względem 2-propanolu (3.8) w spektrofotometrze (4.6) pomiędzy 300 nm a 400 nm. Maksimum wygaśnięcia musi znajdować się pomiędzy 325 nm a 327 nm.

Obliczenie zawartości witaminy A:

IU witaminy A/ml = E326 × 19,0

(

dla octanowej witaminy A = 1 530 przy 326 nm w 2-propanolu)

5.6.3.2.    Roztwór podstawowy palmitynianowej witaminy A

Pobrać pipetą 2,0 ml roztworu podstawowego palmitynianowej witaminy A (3.12.1) do kolby miarowej o pojemności 50 ml (4.2.2) i uzupełnić do pełnej objętości kolby 2-propanolem (3.8). Nominalne stężenie tego roztworu wynosi 56 IU witaminy A na 1 ml. Pobrać pipetą 3,0 ml tego rozcieńczonego roztworu palmitynianowej witaminy A do kolby miarowej o pojemności 25 ml i uzupełnić do pełnej objętości kolby 2-propanolem (3.8). Nominalne stężenie tego roztworu wynosi 6,72 IU witaminy A na 1 ml. Zmierzyć spektrum UV tego roztworu względem 2-propanolu (3.8) w spektrofotometrze (4.6) pomiędzy 300 nm a 400 nm. Maksimum wygaśnięcia musi znajdować się pomiędzy 325 nm a 327 nm.

Obliczenie zawartości witaminy A:

IU witaminy A/ml = E326 × 19,0

(

palmitynianowej witaminy A = 957 przy 326 nm w 2- propanolu)

5.6.3.3.    Roboczy roztwór wzorcowy witaminy A

Pobrać pipetą 3,0 ml nierozcieńczonego roboczego roztworu wzorcowego witaminy A, przygotowanego w sposób określony w pkt 5.6.1, do kolby miarowej o pojemności 50 ml (4.2.2) i uzupełnić 2-propanolem (3.8) do pełnej objętości kolby. Pobrać pipetą 5,0 ml tego roztworu do kolby miarowej o pojemności 25 ml i uzupełnić do pełnej objętości kolby 2-propanolem (3.8). Nominalne stężenie tego roztworu wynosi 6,72 IU witaminy A na 1 ml. Zmierzyć spektrum UV tego roztworu względem 2-propanolu (3.8) w spektrofotometrze (4.6) pomiędzy 300 nm a 400 nm. Maksimum wygaśnięcia musi znajdować się pomiędzy 325 nm a 327 nm.

Obliczenie zawartości witaminy A:

IU witaminy A/ml = E325 × 18,3

(

dla alkoholowej formy witaminy A = 1 821 przy 325 nm w 2-propanolu)

6.   Obliczanie wyników

Na podstawie średniej wysokości (powierzchni) pików witaminy A roztworu próbki określić stężenie roztworu próbki w IU/ml, odnosząc się do krzywej kalibracyjnej (5.6.2).

Zawartość witaminy A w IU/kg próbki oblicza się według następującego wzoru:

[UI/kg]

gdzie:

c

=

stężenie w IU/ml witaminy A w roztworze próbki (5.4)

V1

=

objętość w ml roztworu próbki (5.4)

V2

=

objętość w ml pobranej podzielnej części z roztworu próbki, o którym mowa w pkt 5.4

m

=

masa naważki w g

7.   Objaśnienia

Aby sprawdzić, czy zastosowana metoda analizy daje wiarygodne wyniki w odniesieniu do tej konkretnej matrycy (preparat mlekozastępczy), na dodatkowej naważce należy przeprowadzić test odzysku. Jeżeli stopień odzysku jest niższy niż 80 %, wyniki analizy należy skorygować o odzysk.

8.   Powtarzalność

Różnica pomiędzy wynikami dwóch równoległych oznaczeń wykonanych dla tej samej próbki nie może przekraczać 15 % względem wyższego wyniku.

9.   Wyniki badań międzylaboratoryjnych ( 11 )

L

=

liczba laboratoriów

n

=

liczba pojedynczych wartości

sr

=

odchylenie standardowe powtarzalności

sR

=

odchylenie standardowe odtwarzalności

r

=

powtarzalność wyników

R

=

odtwarzalność wyników

CVr

=

współczynnik zmienności powtarzalności

CVR

=

współczynnik zmienności odtwarzalności

B.   OZNACZANIE WITAMINY E

1.   Cel i zakres stosowania metody

Metoda służy do oznaczania zawartości witaminy E w paszach i premiksach. Zawartość witaminy E jest wyrażana w mg octanu DL-α-tokoferolu na kg. 1 mg octanu DL-α-tokoferolu odpowiada 0,91 mg DL-α-tokoferolu (witamina E).

Granica oznaczalności metody wynosi 2 mg witaminy E/kg. Granica oznaczalności jest osiągalna jedynie przy pomocy detektora fluorescencyjnego. W przypadku detektora UV granica oznaczalności wynosi 10 mg/kg.

2.   Sposób przeprowadzenia metody

Próbka jest hydrolizowana etanolowym roztworem wodorotlenku potasu, a witamina E jest ekstrahowana eterem naftowym. Rozpuszczalnik jest usuwany przez odparowanie, a pozostałość rozpuszczana w metanolu i, w razie konieczności, rozcieńczana do wymaganego stężenia. Zawartość witaminy E jest oznaczana metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej z fazą odwróconą (RP-HPLC) przy wykorzystaniu detektora UV lub detektora fluorescencyjnego.

3.   Odczynniki i roztwory

4.   Aparatura i sprzęt

5.   Sposób postępowania

Uwaga:

Witamina E jest wrażliwa na światło (UV) i utlenianie. Wszystkie czynności należy przeprowadzać bez dostępu światła (z zastosowaniem szkła oranżowego lub szkła zabezpieczonego folią aluminiową) i bez dostępu tlenu (płukanie strumieniem azotu). Podczas ekstrakcji powietrze znad cieczy należy zastąpić azotem (zapobiegać zbyt wysokiemu ciśnieniu, zwalniając od czasu do czasu korek).

5.1.   Przygotowanie próbki

Rozdrobnić próbkę tak, aby przesiewała się przez oczka sita o średnicy 1 mm, uważając, aby podczas rozdrabniania nie wydzielało się ciepło. Rozdrabnianie musi być przeprowadzone tuż przed ważeniem i zmydlaniem, gdyż w przeciwnym razie mogą wystąpić straty witaminy E.

5.2.   Zmydlanie

W zależności od zawartości witaminy E odważyć, z dokładnością do 0,01 g, od 2 do 25 g próbki do kolby płaskodennej lub stożkowej o pojemności 500 ml (4.2.1). Dodać kolejno, mieszając, 130 ml etanolu (3.1), około 100 mg BHT (3.12), 2 ml roztworu askorbinianu sodu (3.5) i 2 ml roztworu siarczku sodu (3.6). Założyć chłodnicę (4.3) na kolbę i umieścić kolbę na łaźni wodnej z mieszadłem magnetycznym (4.7). Ogrzać do wrzenia i skraplać przez 5 minut. Następnie dodać 25 ml roztworu wodorotlenku potasu (3.4) przez chłodnicę (4.3) i skraplać przez 25 minut, mieszając pod powolnym przepływem azotu. Następnie spłukać chłodnicę około 20 ml wody i schłodzić zawartość kolby do temperatury pokojowej.

5.3.   Ekstrakcja

Przenieść, dekantując, zmydlony roztwór, ilościowo spłukując 250 ml wody, do rozdzielacza o pojemności 1 000 ml (4.2.3) lub do aparatu do ekstrakcji (4.8). Spłukać kolbę po zmydlaniu kolejno 25 ml etanolu (3.1) i 100 ml eteru naftowego (3.2) i przenieść popłuczyny do rozdzielacza lub do aparatu do ekstrakcji. Proporcja wody i etanolu w łączonych roztworach musi wynosić około 2:1. Wstrząsać energicznie przez 2 minuty i pozostawić na 2 minuty.

5.3.1.    Ekstrakcja przy użyciu rozdzielacza stożkowego (4.2.3)

Po rozdzieleniu warstw (zob. objaśnienia pkt 7.3) przenieść warstwę eteru naftowego do innego rozdzielacza (4.2.3). Powtórzyć ekstrakcję dwukrotnie, używając 100 ml eteru naftowego (3.2) i używając dwukrotnie 50 ml eteru naftowego (3.2).

Przemyć dwukrotnie połączone ekstrakty w rozdzielaczu stożkowym 100 ml porcjami wody, ostrożnie mieszając, aby zapobiec powstawaniu zawiesiny, a następnie, wielokrotnie wstrząsając, powtórzyć przemywanie kolejnymi 100 ml porcjami wody, aż woda pozostanie bezbarwna po dodaniu roztworu fenoloftaleiny (3.7) (wystarczy zwykle czterokrotne przemycie). Aby usunąć suspensję wodną, filtrować przemyty ekstrakt przez suchy karbowany filtr do rozdzielania faz (4.4) do kolby miarowej o pojemności 500 ml (4.2.2). Spłukać rozdzielacz i filtr przy użyciu 50 ml eteru naftowego (3.2), uzupełnić do pełnej objętości kolby eterem naftowym (3.2) i dobrze zmieszać.

5.3.2.    Ekstrakcja przy użyciu aparatu do ekstrakcji (4.8)

Gdy warstwy zostaną rozdzielone (zob. objaśnienia pkt 7.3), zastąpić korek szklanego cylindra (4.8.1) nasadką szklaną ze szlifem (4.8.2) i ustawić niższy koniec rurki w kształcie litery U tak, aby znajdował się tuż ponad granicą rozdziału faz. Przez aplikację ciśnienia azotu dopływającego przez nasadkę przenieść górną warstwę eteru naftowego do rozdzielacza o pojemności 1 000 ml (4.2.3). Do szklanego cylindra dodać 100 ml eteru naftowego (3.2), zamknąć i dobrze wstrząsnąć. Pozostawić do rozdzielenia się faz i przenieść górną warstwę do rozdzielacza w sposób opisany powyżej. Powtórzyć postępowanie ekstrakcyjne, stosując kolejną porcję 100 ml eteru naftowego (3.2), a następnie stosując dwukrotnie porcję 50 ml eteru naftowego (3.2), i dodać warstwy eteru naftowego do rozdzielacza.

Przemyć połączone ekstrakty eteru naftowego, w sposób określony w pkt 5.3.1 i postępować w sposób tam określony.

5.4.   Przygotowanie roztworu próbki do HPLC

Pobrać pipetą podzielną część roztworu eteru naftowego (z pkt 5.3.1 lub 5.3.2) do kolby gruszkowej o pojemności 250 ml (4.2.4). Odparować rozpuszczalnik prawie do sucha na rotacyjnej wyparce próżniowej (4.1) przy obniżonym ciśnieniu na łaźni wodnej w temperaturze nie wyższej niż 40 oC. Przywrócić ciśnienie atmosferyczne przez wpuszczenie azotu (3.9) i zdjąć kolbę z rotacyjnej wyparki próżniowej. Usunąć pozostały rozpuszczalnik strumieniem azotu (3.9) i szybko rozpuścić pozostałość w znanej objętości metanolu (10–100 ml) (3.3) (stężenie DL-α-tokoferolu musi wynosić od 5 μg/ml do 30 μg/ml).

5.5.   Oznaczanie HPLC

Witamina E jest rozdzielana na kolumnie z fazą odwróconą C18 (4.5.1), a stężenie jest mierzone przy użyciu detektora fluorescencyjnego (wzbudzanie: 295 nm; emisja: 330 nm) lub detektora UV (292 nm) (4.5.2).

Zadozować podzielną część roztworu metanolowego (np. 20 μl), otrzymanego w sposób określony w pkt 5.4, i wymywać fazą ruchomą (3.8). Obliczyć średnie wysokości (powierzchnie) pików kilku kolejnych dozowań tego samego roztworu próbki i średnie wysokości (powierzchnie) pików kilku dozowań kalibracyjnych roztworów (5.6.2).

Warunki HPLC

Poniższe parametry podano jako przykładowe; inne parametry mogą być zastosowane, o ile gwarantują otrzymanie równoważnych wyników.

5.6.   Kalibracja (octan DL-α-tokoferolu lub DL-α-tokoferol)

5.6.1.    Wzorzec octanu DL-α-tokoferolu

5.6.1.1.    Przygotowanie roboczego roztworu wzorcowego

Pobrać pipetą 25 ml podstawowego roztworu octanu DL-α-tokoferolu (3.10.1) do kolby płaskodennej lub stożkowej o pojemności 500 ml (4.2.1) i hydrolizować w sposób określony w pkt 5.2. Następnie ekstrahować eterem naftowym (3.2) w sposób określony w pkt 5.3 i uzupełnić do pełnej objętości kolby 500 ml eterem naftowym. Odparować prawie do sucha 25 ml tego ekstraktu na rotacyjnej wyparce próżniowej (zob. pkt 5.4), usunąć pozostały rozpuszczalnik strumieniem azotu (3.9) i ponownie rozpuścić pozostałość w 25,0 ml metanolu (3.3). Nominalne stężenie tego roztworu wynosi 45,5 μg DL-α-tokoferolu na 1 ml, co odpowiada 50 μg octanu DL-α-tokoferolu na 1 ml. Roztwór wzorcowy roboczy należy przygotować bezpośrednio przed użyciem.

5.6.1.2.    Przygotowanie kalibracyjnych roztworów i krzywej kalibracyjnej

Przenieść 1,0 , 2,0 , 4,0 i 10,0 ml roboczego roztworu wzorcowego do kolb miarowych o pojemności 20 ml, uzupełnić do pełnej objętości kolby metanolem (3.3) i zmieszać. Nominalne stężenia tych roztworów wynoszą 2,5 , 5,0 , 10,0 i 25,0 μg/ml octanu DL-α-tokoferolu, co odpowiada 2,28 , 4,55 , 9,10 i 22,8 μg/ml DL-α-tokoferolu.

Zadozować kilka razy 20 μl każdego roztworu kalibracyjnego i określić średnie wysokości (powierzchnie) pików. Wykorzystując średnie wysokości (powierzchnie) pików, wykreślić krzywą kalibracyjną.

5.6.1.3.    Standaryzacja UV roztworu podstawowego octanu DL-α-tokoferolu (3.10.1)

Rozcieńczyć 5,0 ml roztworu podstawowego octanu DL-α-tokoferolu (3.10.1) w 25,0 ml etanolu i zmierzyć spektrum UV tego roztworu względem etanolu (3.1) w spektrofotometrze (4.6) pomiędzy 250 nm i 320 nm.

Maksimum absorpcji musi wystąpić przy 284 nm:

= 43,6 przy 284 nm w etanolu

Przy tym rozcieńczeniu wartość wygaśnięcia musi wynosić od 0,84 do 0,88 .

5.6.2.    Wzorzec DL-α-tokoferolu

5.6.2.1.    Przygotowanie roboczego roztworu wzorcowego

Pobrać pipetą 2 ml podstawowego roztworu wzorcowego DL-α-tokoferolu (3.11.1) do kolby miarowej o pojemności 50 ml, rozpuścić w metanolu (3.3) i uzupełnić do pełnej objętości kolby metanolem. Nominalne stężenie tego roztworu wynosi 40 μg DL-α-tokoferolu na 1 ml, co odpowiada 44,0 μg octanu DL-α-tokoferolu na 1 ml. Wzorcowy roztwór roboczy przygotowuje się bezpośrednio przed użyciem.

5.6.2.2.    Przygotowanie kalibracyjnych roztworów i krzywej kalibracyjnej

Przenieść 1,0 , 2,0 , 4,0 i 10,0 ml roboczego roztworu wzorcowego do kolb miarowych o pojemności 20 ml, uzupełnić do pełnej objętości kolb metanolem (3.3) i zmieszać. Nominalne stężenia tych roztworów wynoszą 2,0 , 4,0 , 8,0 i 20,0 μg/ml DL-α-tokoferolu, czyli 2,20 , 4,40 , 8,79 i 22,0 μg/ml octanu DL-α-tokoferolu.

Zadozować kilka razy 20 μl każdego roztworu kalibracyjnego i określić średnie wysokości (powierzchnie) pików. Wykorzystując średnie wysokości (powierzchnie) pików, wykreślić krzywą kalibracyjną.

5.6.2.3.    Standaryzacja UV roztworu podstawowego DL-α-tokoferolu (3.11.1)

Rozcieńczyć 2,0 ml roztworu podstawowego DL-α-tokoferolu (3.11.1) w 25,0 ml etanolu i zmierzyć spektrum UV tego roztworu względem etanolu (3.1) w spektrofotometrze (4.6) pomiędzy 250 nm i 320 nm. Maksimum absorpcji musi wystąpić przy 292 nm:

= 75,8 przy 292 nm w etanolu

Przy tym rozcieńczeniu wartość wygaśnięcia musi wynosić 0,6 .

6.   Obliczanie wyników

Na podstawie średniej wysokości (powierzchni) pików witaminy E roztworu próbki określić stężenie roztworu próbki w μg/ml (obliczonego jako octan DL-α-tokoferolu) z krzywej wzorcowej (5.6.1.2 lub 5.6.2.2).

Zawartość witaminy E w mg/kg próbki oblicza się według następującego wzoru:

[mg/kg]

gdzie:

c

=

stężenie w μg/ml witaminy E (jako octan DL-α-tokoferolu) w roztworze próbki (5.4)

V1

=

objętość w ml roztworu próbki (5.4)

V2

=

objętość w ml podzielnej części pobranej z roztworu próbki, o którym mowa w pkt 5.4

m

=

masa naważki w g

7.   Objaśnienia

8.   Powtarzalność

Różnica pomiędzy wynikami dwóch równoległych oznaczeń wykonanych dla tej samej próbki nie może przekraczać 15 % względem wyższego wyniku.

9.   Wyniki badań międzylaboratoryjnych ( 12 )

L

=

liczba laboratoriów

n

=

liczba pojedynczych wartości

sr

=

odchylenie standardowe powtarzalności

sR

=

odchylenie standardowe odtwarzalności

r

=

powtarzalność wyników

R

=

odtwarzalność wyników

CVr

=

współczynnik zmienności powtarzalności

CVR

=

współczynnik zmienności odtwarzalności

C.   OZNACZANIE PIERWIASTKÓW ŚLADOWYCH: ŻELAZA, MIEDZI, MANGANU I CYNKU

1.   Cel i zakres stosowania metody

Metoda służy do oznaczania zawartości pierwiastków śladowych żelaza, miedzi, manganu i cynku w paszach. Dolne granice oznaczalności metody wynoszą dla:

2.   Sposób przeprowadzenia metody

Próbkę wprowadza się do roztworu kwasu chlorowodorowego po zniszczeniu ewentualnej substancji organicznej. Pierwiastki śladowe: żelazo, miedź, mangan i cynk są oznaczane, po odpowiednim rozcieńczeniu, z użyciem spektrometrii absorpcji atomowej.

3.   Odczynniki i roztwory

Uwagi wstępne

Do przygotowania odczynników i roztworów używanych w postępowaniu analitycznym stosuje się wodę wolną od oznaczanych kationów, otrzymaną w drodze podwójnej destylacji w destylarce ze szkła borokrzemowego lub kwarcowego lub w wyniku podwójnego traktowania na żywicy jonowymiennej.

Stosować odczynniki o czystości co najmniej analitycznej. Nieobecność oznaczanych pierwiastków w stosowanych odczynnikach i roztworach należy sprawdzać poprzez ślepą próbę. Odczynnik, jeżeli to konieczne, poddaje się oczyszczeniu przed zastosowaniem.

Zamiast przygotowania wzorcowych roztworów opisanych poniżej dopuszcza się stosowanie innych dostępnych wzorcowych roztworów, pod warunkiem że mają one gwarancję i zostały sprawdzone przed użyciem.

4.   Aparatura i sprzęt

5.   Sposób postępowania ( 13 )

5.1.   Próbki zawierające substancję organiczną

5.1.1.    Spopielanie i przygotowanie roztworu do analizy ( 14 )

Zwilżyć spopielałe pozostałości wodą i przenieść do zlewki o pojemności 250 ml. Przemyć tygiel z użyciem około 5 ml kwasu chlorowodorowego (3.1) i dodawać kwas powoli i ostrożnie do zlewki (może zajść gwałtowna reakcja w wyniku powstania CO2). Dodawać kroplami kwas chlorowodorowy (3.1) mieszając do zaniku burzenia się mieszaniny. Odparować do sucha, od czasu do czasu mieszając szklaną bagietką.

Następnie dodać do pozostałości 15 ml kwasu chlorowodorowego o stężeniu 6 mol/l (3.2), a następnie około 120 ml wody. Zamieszać szklaną bagietką, którą należy pozostać w zlewce, i przykryć zlewkę szkiełkiem zegarkowym. Doprowadzić ostrożnie do wrzenia i pozostawić w tym stanie aż do całkowitego rozpuszczenia rozpuszczalnych cząstek popiołu. Przefiltrować przez bezpopiołowy filtr i zebrać filtrat w kolbie miarowej o pojemności 250 ml. Spłukać zlewkę i filtr z użyciem 5 ml gorącego kwasu chlorowodorowego o stężeniu 6 mol/l (3.2) i dwukrotnie wrzącą wodą. Uzupełnić kolbę miarową do pełnej objętości wodą tak, aby uzyskać stężenie HCl około 0,5 mol/l.

Uwagi:

5.1.2.    Spektrofotometryczne oznaczanie

5.1.2.1.    Przygotowanie roztworów do kalibracji

Dla każdego z oznaczanych pierwiastków śladowych przygotować, z roboczych roztworów wzorcowych określonych w pkt 3.7.1, 3.8.1, 3.9.1 i 3.10.1, roztwory do kalibracji o stężeniu kwasu chlorowodorowego około 0,5 mol/l i – w przypadku żelaza, manganu i cynku – chlorek lantanu o stężeniu 0,1 % La (w/v).

Wybrane stężenia pierwiastków śladowych muszą mieścić się w zakresie czułości stosowanego spektrofotometru. W poniższych tabelach podano przykładowy skład typowych zakresów stężeń kalibracyjnych roztworów; w zależności od typu i czułości stosowanego spektrofotometru może zachodzić konieczność wyboru innych stężeń.

Żelazo

Miedź

Mangan

Cynk

5.1.2.2.    Przygotowanie roztworu do analizy

W przypadku oznaczania miedzi może być wykorzystany roztwór przygotowany w sposób określony w pkt 5.1.1. W przypadku konieczności dostosowania jego stężenia do zakresu stężeń kalibracyjnych roztworów, pobrać pipetą podzielną część roztworu do kolby miarowej o pojemności 100 ml i uzupełnić do pełnej objętości kolby kwasem chlorowodorowym o stężeniu 0,5 mol/l (3.3).

Przy oznaczaniu żelaza, manganu i cynku pobrać pipetą podzielną część roztworu przygotowanego w sposób określony w pkt 5.1.1 do kolby miarowej o pojemności 100 ml, dodać 10 ml roztworu chlorku lantanu (3.11) i uzupełnić do pełnej objętości kolby kwasem chlorowodorowym o stężeniu 0,5 mol/l (3.3) (zob. objaśnienia pkt 8).

5.1.2.3.    Ślepa próba

Ślepą próbę przeprowadzić zgodnie z kolejnością wykonywania czynności metody, pomijając te czynności, w których materiał próbki został pominięty. Nie stosować roztworu kalibracyjnego „0” jako ślepej próby.

5.1.2.4.    Pomiar absorpcji atomowej

Zmierzyć absorpcję atomową kalibracyjnych roztworów i badanego roztworu z użyciem utleniającego płomienia powietrzno-acetylenowego przy następujących długościach fal:

Każdy pomiar przeprowadzić czterokrotnie.

5.2.   Pasze mineralne

Jeżeli próbka paszy nie zawiera substancji organicznych, wcześniejsze spopielanie nie jest konieczne. Postępować w sposób określony w pkt 5.1.1.1, poczynając od akapitu drugiego. Można pominąć etap odparowania z kwasem fluorowodorowym.

6.   Obliczanie wyników

Przy zastosowaniu krzywej kalibracyjnej obliczyć zawartość oznaczanego pierwiastka śladowego w roztworze do analizy i wyrazić wynik w mg pierwiastka śladowego na kg próbki (ppm).

7.   Powtarzalność

Różnica pomiędzy wynikami dwóch równoległych oznaczeń wykonanych dla tej samej próbki nie może przekraczać:

8.   Objaśnienia

Obecność znacznych ilości fosforanów może interferować przy oznaczaniu żelaza, manganu i cynku. Takie interferencje należy skorygować przez dodanie chlorku lantanu (3.11). Jeżeli jednak w próbce stosunek wagowy Ca + Mg/P jest > 2, to dodanie roztworu chlorku lantanu (3.11) do analizowanego roztworu i kalibracyjnych roztworów może być pominięte.

D.   OZNACZANIE HALOFUGINONU

DL-trans-7-bromo-6-chloro-3-[3-(3-hydroksy-2-piperydylo)acetonylo]-chinazoliny-4-(3H)-1 bromowodorek

1.   Cel i zakres stosowania metody

Metoda służy do oznaczania zawartości halofuginonu w paszach. Dolna granica oznaczalności wynosi 1 mg/kg.

2.   Sposób przeprowadzenia metody

Po potraktowaniu gorącą wodą halofuginon ekstrahuje się w postaci wolnej zasady w octanie etylowym, a następnie rozdziela jako chlorowodorek w wodnym roztworze kwasu. Ekstrakt jest oczyszczany z wykorzystaniem chromatografii jonowymiennej. Zawartość halofuginonu określa się metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej w układzie faz odwróconych (HPLC) przy użyciu detektora UV.

3.   Odczynniki i roztwory

Odważyć, z dokładnością do 0,1 mg, 50 mg halofuginonu (3.6) do kolby miarowej o pojemności 500 ml, rozpuścić w roztworze buforu octanu amonu (3.18), uzupełnić do pełnej objętości kolby roztworem buforu i zmieszać. Roztwór zachowuje stabilność do 3 tygodni, jeżeli jest przechowywany bez dostępu światła w temperaturze 5 oC.

Do partii kolb miarowych o pojemności 100 ml przenieść kolejno 1,0 , 2,0 , 3,0 , 4,0 i 6,0 ml roztworu wzorcowego podstawowego halofuginonu (3.6.1). Uzupełnić do pełnej objętości kolb fazą ruchomą (3.21) i zmieszać. Roztwory te odpowiadają odpowiednio 1,0 , 2,0 , 3,0 , 4,0 i 6,0 μg/ml halofuginonu. Roztwory te przygotować bezpośrednio przed użyciem.

Rozpuścić 50 g węglanu sodu (3.11) w wodzie, rozcieńczyć do objętości 1 l i dodać chlorek sodu (3.12), aż do otrzymania roztworu nasyconego.

Rozcieńczyć 10 ml HCI (3.7) wodą do objętości 1 l.

Rozpuścić 19,3 g octanu amonu (3.3) i 30 ml kwasu octowego (3.5) w wodzie (3.14), i rozcieńczyć do objętości 1 l.

Żywicę (3.2) przemywać odpowiednią ilością wody aż do zaniku wszystkich jonów chlorku, co sprawdza się roztworem azotanu srebra (3.20) w odrzucanej fazie wodnej. Następnie przemyć żywicę 50 ml metanolu (3.8), odrzucić metanol i przechowywać żywicę w świeżym metanolu.

Rozpuścić 0,17 g azotanu srebra (3.9) w 10 ml wody.

Zmieszać 500 ml acetonitrylu (3.1) z 300 ml roztworu buforu octanu amonu (3.18) i 1 200 ml wody (3.14). Przy użyciu kwasu octowego (3.5) dostosować pH do 4,3 . Przefiltrować przez filtr membranowy 0,22 μm (4.8), a następnie odgazować roztwór (np. przy zastosowaniu łaźni ultradźwiękowej przez 10 minut). Roztwór zachowuje stabilność do miesiąca, jeżeli jest przechowywany w zamkniętym naczyniu, bez dostępu światła.

4.   Aparatura i sprzęt

5.   Sposób postępowania

Uwaga:

Halofuginon w formie wolnej zasady jest niestabilny w roztworach zasadowych i octanu etylowego. Nie może on pozostawać w octanie etylu dłużej niż przez 30 minut.

5.1.   Wskazówki ogólne

Uwaga:

dla celów niniejszej metody ślepa próba paszy musi być podobna do badanej próbki, a jej analiza nie może potwierdzać obecności halofuginonu.

5.2.   Ekstrakcja

Odważyć, z dokładnością do 0,1 g, 10 g przygotowanej próbki i umieścić w probówce wirówkowej o pojemności 200 ml. Dodać 0,5 g askorbinianu sodu (3.10), 0,5 g EDTA (3.13), 20 ml wody i zmieszać. Probówkę umieścić na 5 minut w łaźni wodnej o temperaturze 80 oC. Po schłodzeniu do temperatury pokojowej dodać 20 ml roztworu węglanu sodu (3.15) i zmieszać. Niezwłocznie dodać 100 ml octanu etylowego (3.4) i ręcznie, energicznie wstrząsać przez 15 sekund. Następnie umieścić probówkę w łaźni ultradźwiękowej (4.1) na 3 minuty i odkorkować. Wirować przez 2 minuty i zdekantować fazę octanu etylowego przez filtr z włóknem szklanym (4.6) do rozdzielacza o pojemności 500 ml. Powtórzyć ekstrakcję tej próbki drugą porcją 100 ml octanu etylowego. Przemywać połączone ekstrakty przez minutę 50 ml roztworu chlorku sodu nasyconego węglanem sodu (3.16) i odrzucić warstwę wodną.

Warstwę organiczną ekstrahować przez minutę 50 ml kwasu chlorowodorowego (3.17). Dolną kwasową warstwę spuścić do rozdzielacza o pojemności 250 ml. Przez 1,5 minuty powtarzać ekstrakcję warstwy organicznej przy użyciu kolejnej ilości 50 ml kwasu chlorowodorowego i połączyć z ekstraktem uzyskanym z pierwszego procesu. Przemyć połączone ekstrakty kwasu, wirując z 10 ml octanu etylowego (3.4) przez około 10 sekund.

Warstwę wodną przenieść ilościowo do kolby okrągłodennej o pojemności 250 ml i odrzucić warstwę organiczną. Znajdujący się jeszcze w roztworze kwasu octan etylowy odparować na rotacyjnej wyparce warstwowej (4.2). Temperatura wody w łaźni nie może przekraczać 40 oC. Pozostały octan etylu zostanie usunięty w próżni o ciśnieniu około 25 mbar i temperaturze 38 oC, w czasie 5 minut.

5.3.   Oczyszczanie

5.3.1.    Przygotowanie kolumny z Amberlitem

Dla każdej próbki ekstraktu przygotować kolumnę XAD-2. Przygotowany Amberlit o masie 10 g (3.19) umieścić w szklanej kolumnie (4.5) z metanolem (3.8). Wprowadzić mały zwitek szklanej waty w górną część podłoża żywicy. Wydrenować metanol z kolumny, a następnie przemyć żywicę 100 ml wody, zatrzymując proces, gdy ciecz dosięgnie górnej części powierzchni żywicy. Pozostawić kolumnę do ustabilizowania na 10 minut przed użyciem. Nie dopuścić do osuszenia kolumny.

5.3.2.    Oczyszczanie próbki

Uzyskany ekstrakt (5.2) przenieść ilościowo na górną powierzchnię kolumny z Amberlitem (5.3.1) i eluować, odrzucając eluent. Prędkość elucji nie może przekraczać 20 ml/min. Przemyć kolbę okrągłodenną 20 ml kwasu chlorowodorowego (3.17). Użyć tego kwasu do przemycia kolumny z żywicą. Usunąć pozostałości roztworu kwasu strumieniem powietrza. Wylać popłuczyny. Dodać 100 ml metanolu (3.8) na kolumnę i pozostawić od 5 do 10 ml w celu wymycia, zebrać eluent w kolbę okrągłodenną o pojemności 250 ml. Pozostawić pozostały metanol na 10 minut w celu ustabilizowania z żywicą, a następnie kontynuować elucję, której prędkość nie może przekraczać 20 ml/min, zbierając eluent do tej samej kolby okrągłodennej. Odparować metanol na rotacyjnej wyparce (4.2), przy czym temperatura wody w łaźni nie może być wyższa niż 40 oC. Za pomocą fazy ruchomej (3.21) przenieść ilościowo pozostałość do kolby miarowej o pojemności 10 ml. Uzupełnić do pełnej objętości kolb fazą ruchomą i zmieszać. Podzielna część jest filtrowana przez filtr membranowy (4.7). Roztwór zastosować do oznaczania HPLC (5.4).

5.4.   Oznaczanie HPLC

5.4.1.    Parametry

Poniższe parametry podano jako przykładowe; inne parametry mogą być zastosowane, o ile gwarantują otrzymanie równoważnych wyników.

Kolumna do chromatografii cieczowej (4.4.1)

Faza ruchoma do HPLC (3.21)

Prędkość przepływu: od 1,5 do 2 ml/min

Długość fali przy detekcji: 243 nm

Dozowana objętość: od 40 do 100 μl

Sprawdzić stabilność systemu chromatograficznego, dozując kilka razy roztwór kalibracyjny (3.6.2) o stężeniu 3 μg/ml, aż do uzyskania stałych wysokości (powierzchni) piku i czasów retencji.

5.4.2.    Krzywa kalibracyjna

Zadozować kilka razy każdy z roztworów kalibracyjnych (3.6.2) i określić wysokości (powierzchnie) piku dla każdego stężenia. Wykreślić krzywą kalibracyjną, odkładając średnie wysokości (powierzchnie) pików kalibracyjnych roztworów na osi rzędnych oraz odpowiadające im stężenia w μg/ml na osi odciętych.

5.4.3.    Roztwór próbki

Zadozować kilka razy ekstrakt próbki (5.3.2) stosując taką samą objętość jak przy kalibracyjnych roztworach, i określić średnią wysokość (powierzchnię) piku dla pików halofuginonu.

6.   Obliczanie wyników

Na podstawie średniej wysokości (powierzchni) pików halofuginonu roztworu próbki, określić stężenie roztworu próbki w μg/ml, odnosząc się do krzywej kalibracyjnej (5.4.2).

Zawartość halofuginonu w mg/kg w próbce oblicza się według następującego wzoru:

gdzie:

c

=

stężenie w μg/ml halofuginonu w roztworze próbki

m

=

masa naważki w g

7.   Sprawdzenie wyników

7.1.   Sprawdzanie tożsamości

Tożsamość analitu może być potwierdzona przez kochromatografię lub zastosowanie detektora diodowego, przy użyciu którego porównuje się widma ekstraktu próbki i roztworu kalibracyjnego (3.6.2) zawierającego 6,0 μg/ml.

7.1.1.    Kochromatografia

Ekstrakt próbki jest fortyfikowany przez dodanie odpowiedniej ilości roztworu kalibracyjnego (3.6.2). Ilość dodanego halofuginonu musi być podobna do tej w ekstrakcie próbki.

Po uwzględnieniu zarówno dodanej ilości, jak i stopnia rozcieńczenia ekstraktu, zwiększyć się może tylko wysokość piku halofuginonu. Szerokość piku w połowie jego wysokości musi mieścić się w granicach ±10 % pierwotnej szerokości.

7.1.2.    Detekcja diodowa

Wyniki sprawdza się według następujących kryteriów:

Jeżeli jedno z tych kryteriów nie jest spełnione, obecność analitu nie jest potwierdzona.

7.2.   Powtarzalność

Różnica pomiędzy wynikami 2 równoległych oznaczeń wykonanych dla tej samej próbki nie może przekraczać 0,5 mg/kg dla zawartości halofuginonu do 3 mg/kg.

7.3.   Odzysk

W przypadku fortyfikowanej ślepej próby odzysk nie może być mniejszy niż 80 %.

8.   Wyniki badań międzylaboratoryjnych

W ramach współpracy ośmiu laboratoriów przeprowadzono analizę ( 15 ) trzech próbek.

N.W.

=

nie wykryto

SR

=

odchylenie standardowe powtarzalności

CVR

=

współczynnik zmienności powtarzalności (%)

Odzysk (%)

=

odzysk (%)

E.   OZNACZANIE ROBENIDYNY

Chlorowodorek 1,3-bis[(4-chlorobenzylideno)amino]guanidyny

1.   Cel i zakres stosowania metody

Metoda służy do oznaczania zawartości robenidyny w paszach. Granica oznaczalności wynosi 5 mg/kg.

2.   Sposób przeprowadzenia metody

Próbkę poddaje się ekstrakcji zakwaszonym metanolem. Ekstrakt osusza się, a podzielną część oczyszcza na kolumnie z tlenkiem glinu. Robenidynę z kolumny wymywa się metanolem, zatęża i uzupełnia do odpowiedniej objętości fazą ruchomą. Robenidynę oznacza się metodą chromatografii cieczowej (HPLC) z odwróconymi fazami przy użyciu detektora UV.

3.   Odczynniki i roztwory

W kolbie miarowej o pojemności 500 ml umieścić 4 ml kwasu chlorowodorowego (ρ 20 = 1,18 g/ml), uzupełnić do pełnej objętości kolby metanolem (3.1) i zmieszać. Roztwór należy przygotować bezpośrednio przed użyciem.

Typ 3A, granulki 8–12 mesh (granulki z glinokrzemianu krystalicznego 1,6 –2,5 mm, średnica porów 0,3 mm).

100 g tlenku glinu umieścić w naczyniu i dodać 2 ml wody. Naczynie zakorkować i wstrząsać przez około 20 minut. Przechowywać w dobrze zamkniętym naczyniu.

Rozpuścić 3,40 g dwuwodorofosforanu potasu w wodzie do HPLC w kolbie miarowej o pojemności 1 000 ml, uzupełnić do pełnej objętości kolby i zmieszać.

Rozpuścić 3,55 g bezwodnego lub 4,45 g dwuhydratu, lub 8,95 g dekahydratu wodorofosforanu dwusodu w wodzie do HPLC w kolbie miarowej o pojemności 1 l, uzupełnić do pełnej objętości kolby wodą do HPLC i zmieszać.

Zmieszać razem:

Filtrować przez filtr 0,22 μm (4.6) i odgazować roztwór, np. poprzez zastosowanie ultradźwięków przez 10 minut.

Czysta robenidyna: chlorowodorek 1,3 -bis[(4-chlorobenzylideno)amino]guanidyny.

Odważyć, z dokładnością do 0,1 mg, 30 mg substancji wzorcowej robenidyny (3.9). Rozpuścić w zakwaszonym metanolu (3.2) w kolbie miarowej o pojemności 100 ml, uzupełnić do pełnej objętości kolby tym rozpuszczalnikiem i zmieszać. Kolbę owinąć folią aluminiową i przechowywać w ciemnym miejscu.

Przenieść 10,0 ml roztworu wzorcowego podstawowego (3.9.1) do kolby miarowej o pojemności 250 ml, uzupełnić do pełnej objętości kolby fazą ruchomą (3.8) i zmieszać. Kolbę owinąć folią aluminiową i przechowywać w ciemnym miejscu.

Do kolb miarowych o pojemności 50 ml przenieść 5,0 , 10,0 , 15,0 , 20,0 i 25,0 ml roztworu wzorcowego pośredniego robenidyny (3.9.2). Uzupełnić do pełnej objętości kolb fazą ruchomą (3.8) i zmieszać. Roztwory te odpowiadają odpowiednio 1,2 , 2,4 , 3,6 , 4,8 i 6,0 μg/ml robenidyny. Roztwory te przygotować bezpośrednio przed użyciem.

4.   Aparatura i sprzęt

Przygotować kolumnę ze szkła oranżowego o średnicy wewnętrznej od 10 do 15 mm i długości 250 mm, wyposażoną w kran i zbiorniczek o pojemności około 150 ml.

5.   Sposób postępowania

Uwaga:

Robenidyna jest wrażliwa na światło. Wszystkie czynności należy przeprowadzać z zastosowaniem szkła oranżowego.

5.1.   Wskazówki ogólne

Uwaga:

Ślepa próba paszy musi być podobna do badanej próbki, a jej analiza nie może potwierdzać obecności robenidyny.

5.2.   Ekstrakcja

Odważyć, z dokładnością do 0,01 g, 15 g wcześniej przygotowanej próbki. Odważkę umieścić w kolbie stożkowej o pojemności 250 ml i dodać 100,0 ml zakwaszonego metanolu (3.2), zakorkować i wstrząsać przez godzinę na wytrząsarce (4.2). Roztwór filtrować przez filtr szklany (4.5), a filtrat zebrać do kolby stożkowej o pojemności 150 ml. Dodać 7,5 g sita molekularnego (3.4), zamknąć i wstrząsać przez 5 minut. Natychmiast filtrować przez filtr szklany. Roztwór poddać oczyszczaniu, w sposób określony w pkt 5.3.

5.3.   Oczyszczanie

5.3.1.    Przygotowanie kolumny z tlenkiem glinu

Umieścić w dolnym końcu szklanej kolumny chromatograficznej (4.1) zwitek szklanej waty i wbić ją, używając szklanego pręcika. Odważyć 11,0 g tlenku glinu (3.5) i przenieść do kolumny. Czynność tę należy wykonywać tak, aby ograniczyć do minimum działanie powietrza atmosferycznego. Delikatnie postukać w napełnioną kolumnę od strony dna w celu osadzenia tlenku glinu.

5.3.2.    Oczyszczanie próbki

Używając pipety, przenieść do kolumny 5,0 ml ekstraktu próbki otrzymanego w sposób określony w pkt 5.2. Zakończenie pipety przyłożyć blisko do ścianki kolumny i pozwolić, aby roztwór został wchłonięty przez tlenek glinu. Wymyć robenidynę z kolumny przy użyciu 100 ml metanolu (3.1) przy prędkości przepływu od 2 do 3 ml na minutę, a eluent zebrać do kolby okrągłodennej o pojemności 250 ml. Na rotacyjnej wyparce warstwowej (4.3) odparować roztwór metanolu do sucha, przy pomniejszonym ciśnieniu w temperaturze 40 oC. Pozostałość ponownie rozpuścić w od 3 do 4 ml fazy ruchomej (3.8) i przenieść ilościowo do kolby miarowej o pojemności 10 ml. Kolbę przemyć kilkakrotnie od 1 do 2 ml porcjami fazy ruchomej, a popłuczyny wlać do kolby miarowej. Uzupełnić do pełnej objętości kolby tym samym rozpuszczalnikiem i zmieszać. Podzielna część jest filtrowana przez filtr membranowy 0,45 μm (4.7). Roztwór zastosować do oznaczania HPLC (5.4).

5.4.   Oznaczanie HPLC

5.4.1.    Parametry

Poniższe parametry podano jako przykładowe; inne parametry mogą być zastosowane, o ile gwarantują otrzymanie równoważnych wyników:

Kolumna do chromatografii cieczowej (4.4.1),

Faza ruchoma do HPLC (3.8),

Prędkość przepływu: 1,5 do 2 ml/min.,

Długość fali przy detekcji: 317 nm,

Dozowana objętość: 20 do 50 μl.

Sprawdzić stabilność systemu chromatograficznego, dozując kilka razy roztwór kalibracyjny (3.9.3) zawierający 3,6 μg/ml, aż do uzyskania stałych wysokości (powierzchni) piku i czasów retencji.

5.4.2.    Krzywa kalibracyjna

Zadozować kilka razy każdy z roztworów kalibracyjnych (3.9.3) i określić wysokości (powierzchnie) piku dla każdego stężenia. Wykreślić krzywą kalibracyjną, odkładając średnie wysokości (powierzchnie) pików kalibracyjnych roztworów na osi rzędnych oraz odpowiadające im stężenia w μg/ml na osi odciętych.

5.4.3.    Roztwór próbki

Zadozować kilka razy ekstrakt próbki (5.3.2), stosując taką samą objętość jak przy roztworach kalibracyjnych, i określić średnią wysokość (powierzchnię) piku dla pików robenidyny.

6.   Obliczanie wyników

Na podstawie średniej wysokości (powierzchni) pików robenidyny roztworu próbki określić stężenie roztworu próbki w μg/ml, odnosząc się do krzywej kalibracyjnej (5.4.2).

Zawartość robenidyny (w mg/kg) w próbce oblicza się według następującego wzoru:

gdzie:

c

=

stężenie w μg/ml robenidyny w roztworze próbki

m

=

masa naważki w g

7.   Sprawdzenie wyników

7.1.   Sprawdzanie tożsamości

Tożsamość analitu może być potwierdzona przez kochromatografię lub zastosowanie detektora diodowego, przy użyciu którego porównuje się widma ekstraktu próbki i roztworu kalibracyjnego (3.9.3) zawierającego 6 μg/ml.

7.1.1.    Kochromatografia

Ekstrakt próbki jest fortyfikowany przez dodanie odpowiedniej ilości roztworu kalibracyjnego (3.9.3). Ilość dodanej robenidyny musi być porównywalna do ilości robenidyny w ekstrakcie próbki.

Po uwzględnieniu zarówno dodanej ilości, jak i rozcieńczenia ekstraktu, zwiększyć się może tylko wysokość piku robenidyny. Szerokość piku w połowie jego maksymalnej wysokości musi mieścić się w granicach ± 10 % pierwotnej szerokości.

7.1.2.    Detekcja diodowa

Wyniki sprawdza się według następujących kryteriów:

Jeżeli jedno z tych kryteriów nie jest spełnione, obecność analitu nie jest potwierdzona.

7.2.   Powtarzalność

Różnica pomiędzy wynikami dwóch równoległych oznaczeń wykonanych dla tej samej próbki nie może przekraczać 10 % najwyższego wyniku dla zawartości robenidyny powyżej 15 mg/kg.

7.3.   Odzysk

W przypadku fortyfikowanej ślepej próby paszy odzysk nie może być mniejszy niż 85 %.

8.   Wyniki badań międzylaboratoryjnych

W ramach prowadzonej z inicjatywy Wspólnoty współpracy 12 laboratoriów przeprowadzono analizę 4 próbek paszy dla drobiu i królików, w postaci mączki lub granulatu. Analizę każdej próbki przeprowadzono dwukrotnie. W poniższej tabeli podano wyniki przeprowadzonych badań:

sr

=

odchylenie standardowe powtarzalności

CVr

=

współczynnik zmienności powtarzalności, %

SR

=

odchylenie standardowe odtwarzalności

CVR

=

współczynnik zmienności odtwarzalności, %

F.   OZNACZANIE DIKLAZURILU

(+)-4-chlorofenylo[2,6-dwuchloro-4-(2,3,4,5-tetrahydro-3,5-diokso-1,2,4-triazyno-2-yl)fenylo]acetonitryl

1.   Cel i zakres stosowania metody

Metoda służy do oznaczania zawartości diklazurilu w paszach i premiksach. Granica wykrywalności wynosi 0,1 mg/kg, granica oznaczalności 0,5 mg/kg.

2.   Sposób przeprowadzenia metody

Po dodaniu wzorca wewnętrznego próbka jest ekstrahowana zakwaszonym metanolem. W przypadku pasz podzielna część ekstraktu zostaje oczyszczona na wypełnieniu ekstrakcyjnym fazy stałej C18. Diklazuril jest eluowany z wypełnienia mieszaniną zakwaszonego metanolu i wody. Po odparowaniu pozostałość jest rozpuszczana w DMF/woda. W przypadku premiksów ekstrakt jest odparowywany, a pozostałość rozpuszczana w DMF/woda. Zawartość diklazurilu jest oznaczana w układzie podwójnego gradientu faz odwróconych wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) z zastosowaniem detektora UV.

3.   Odczynniki i roztwory

Odważyć, z dokładnością do 0,1 mg, 25 mg substancji wzorcowej (3.8), do kolby miarowej o pojemności 50 ml. Rozpuścić w DMF (3.6), uzupełnić do pełnej objętości kolby tym samym DMF (3.6) i zmieszać. Kolbę owinąć folią aluminiową lub użyć kolby ze szkła oranżowego i przechowywać w lodówce. W temperaturze ≤ 4 oC roztwór zachowuje stabilność do miesiąca.

Przenieść 5,00 ml roztworu wzorcowego podstawowego (3.8.1) do kolby miarowej o pojemności 50 ml, uzupełnić do pełnej objętości kolby DMF (3.6) i zmieszać. Kolbę owinąć folią aluminiową lub użyć kolby ze szkła oranżowego i przechowywać w lodówce. W temperaturze ≤ 4 oC roztwór zachowuje stabilność do miesiąca.

Odważyć, z dokładnością do 0,1 mg, 25 mg substancji wzorcowej wewnętrznej (3.9), do kolby miarowej o pojemności 50 ml. Rozpuścić w DMF (3.6), uzupełnić do pełnej objętości kolby tym samym DMF (3.6) i zmieszać. Kolbę owinąć folią aluminiową lub użyć kolby ze szkła oranżowego i przechowywać w lodówce. W temperaturze ≤ 4 oC roztwór zachowuje stabilność przez miesiąc.

Przenieść 5,00 ml roztworu wewnętrznego wzorca podstawowego (3.9.1) do kolby miarowej o pojemności 50 ml, uzupełnić do pełnej objętości kolby DMF (3.6) i zmieszać. Kolbę owinąć folią aluminiową lub użyć kolby ze szkła oranżowego i przechowywać w lodówce. W temperaturze ≤ 4 oC roztwór zachowuje stabilność przez miesiąc.

(p = nominalna zawartość diklazurilu w premiksie w mg/kg)

Odważyć, z dokładnością do 0,1 mg, p/10 mg substancji wzorca wewnętrznego do kolby miarowej o pojemności 100 ml, rozpuścić w DMF (3.6) w łaźni ultradźwiękowej (4.6), uzupełnić do pełnej objętości kolby tym samym DMF i zmieszać. Kolbę owinąć folią aluminiową lub użyć kolby ze szkła oranżowego i przechowywać w lodówce. W temperaturze ≤ 4 oC roztwór zachowuje stabilność przez miesiąc.

Odmierzyć pipetą 2,00 ml roztworu wzorcowego diklazurilu (3.8.2) i 2,00 ml roztworu wzorca wewnętrznego (3.9.2) do kolby miarowej o pojemności 50 ml. Dodać 16 ml DMF (3.6), uzupełnić do pełnej objętości kolby wodą i zmieszać. Roztwór sporządzać bezpośrednio przed użyciem.

Odmierzyć pipetą 5,0 ml kwasu chlorowodorowego (3.7) do 1 000 ml metanolu (3.5) i zmieszać.

Rozpuścić 5 g octanu amonu (3.2) i 3,4 g TBHS (3.3) w 1 000 ml wody (3.1) i zmieszać.

4.   Aparatura i sprzęt

5.   Sposób postępowania

5.1.   Wskazówki ogólne

5.1.1.    Ślepa próba paszy

Należy przeprowadzić analizę ślepej próby paszy w celu sprawdzenia, czy nie zawiera ona diklazurilu ani substancji interferujących. Ślepa próba paszy musi być podobna do badanej próbki, a jej analiza nie może potwierdzać obecności diklazurilu i substancji interferujących.

5.1.2.    Badanie odzysku

Badanie odzysku należy przeprowadzić, analizując ślepą próbę paszy, fortyfikowaną przez dodanie znanej ilości diklazurilu, o wadze zbliżonej do tej, która znajduje się w próbce. Aby fortyfikować na poziomie 1 mg/kg, dodać 0,1 ml roztworu wzorcowego podstawowego (3.8.1) do 50 g ślepej próby paszy, zmieszać i pozostawić na 10 minut, kilkakrotnie mieszając, przed przejściem do etapu ekstrakcji (5.2).

Jeżeli nie można przeprowadzić badania ślepej próby paszy podobnej do badanej próbki (zob. pkt 5.1.1), badanie odzysku można przeprowadzić stosując metodę dodawania wzorca. W tym przypadku przeznaczona do analizy próbka jest fortyfikowana przez dodanie znanej ilości diklazurilu o wadze zbliżonej do tej, która znajduje się w analizowanej próbce. Próbkę tę poddaje się analizie wraz z niefortyfikowaną próbką, a odzysk może być obliczony przez odjęcie od próbki fortyfikowanej masy próbki niefortyfikowanej.

5.2.   Ekstrakcja

5.2.1.    Pasze

Odważyć, z dokładnością do 0,01 g, 50 g próbki. Przenieść do kolby stożkowej o pojemności 500 ml, dodać 1 ml roztworu wzorca wewnętrznego (3.9.2), 200 ml rozpuszczalnika ekstrakcyjnego (3.12) i zamknąć kolbę korkiem. Wstrząsać mieszaninę na wstrząsarce (4.1) przez noc. Pozostawić na 10 minut do odstania. Przelać 20 ml podzielnej części supernatantu do odpowiedniego szklanego naczynia i rozcieńczyć 20 ml wody. Przenieść ten roztwór na wypełnienie ekstrakcyjne (3.11) i przepuścić przez to wypełnienie, stosując rozdzielnik próżni (4.5). Przepłukać wypełnienie 25 ml mieszaniny rozpuszczalnika ekstrakcyjnego (3.12) i wody, 65 + 35 (V + V). Odrzucić zebrane frakcje i eluować związki, stosując 25 ml mieszaniny rozpuszczalnika ekstrakcyjnego (3.12) i wody, 80 + 20 (V + V). Odparować tę frakcję do osuszenia przy zastosowaniu rotacyjnej wyparki (4.3) w temperaturze 60 oC. Rozpuścić suchą pozostałość w 1,0 ml DMF (3.6), dodać 1,5 ml wody (3.1) i zmieszać. Przefiltrować przez filtr membranowy (4.4). Przystąpić do oznaczania HPLC (5.3).

5.2.2.    Premiksy

Odważyć, z dokładnością do 0,001 g, 1 g próbki. Przenieść do kolby stożkowej o pojemności 500 ml, dodać 1,00 ml roztworu wzorca wewnętrznego (3.9.3), 200 ml rozpuszczalnika ekstrakcyjnego (3.12) i zamknąć kolbę korkiem. Wstrząsać mieszaninę na wstrząsarce (4.1) przez noc. Pozostawić na 10 minut do odstania. Przenieść podzielną część 10 000 /p ml (p = nominalna zawartość diklazurilu w premiksie w mg/kg) supernatantu do kolby okrągłodennej o odpowiedniej pojemności. Odparować do osuszenia, pod obniżonym ciśnieniem, w temperaturze 60 oC przy użyciu rotacyjnej wyparki (4.3). Ponownie rozpuścić suchą pozostałość w 10,0 ml DMF (3.6), dodać 15,0 ml wody (3.1) i zmieszać. Przystąpić do oznaczania HPLC (5.3).

5.3.   Oznaczanie HPLC

5.3.1.    Parametry

Poniższe parametry podano jako przykładowe; inne parametry mogą być zastosowane, o ile gwarantują otrzymanie równoważnych wyników.

Sprawdzić stabilność systemu chromatograficznego, dozując kilka razy roztwór kalibracyjny (3.10) zawierający 2 μg/ml, aż do uzyskania stałych wysokości (powierzchni) piku i czasów retencji.

5.3.2.    Roztwór kalibracyjny

Zadozować kilka razy 20 μl roztworu kalibracyjnego (3.10) i określić średnią wysokość (powierzchnię) piku diklazurilu i wewnętrzne wzorcowe pików.

5.3.3.    Roztwór próbki

Zadozować kilka razy 20 μl roztworu próbki (5.2.1 lub 5.2.2) i określić średnią wysokość (powierzchnię) piku diklazurilu i wewnętrzne wzorcowe pików.

6.   Obliczanie wyników

6.1.   Pasze

Zawartość diklazurilu w próbce (w mg/kg) oblicza się według następującego wzoru:

[mg/kg]

gdzie:

hd,s

=

wysokość (powierzchnia) piku diklazurilu w roztworze próbki (5.2.1)

hi,s

=

wysokość (powierzchnia) piku wzorca wewnętrznego w roztworze próbki (5.2.1)

hd,c

=

wysokość (powierzchnia) piku diklazurilu w roztworze kalibracyjnym (3.10)

hi,c

=

wysokość (powierzchnia) piku wzorca wewnętrznego w roztworze kalibracyjnym (3.10)

cd,c

=

stężenie w μg/ml diklazurilu w roztworze kalibracyjnym (3.10)

m

=

masa naważki w g

V

=

objętość ekstraktu próbki zgodna z pkt 5.2.1 (tj. 2,5 ml)

6.2.   Premiksy

Zawartość diklazurilu w próbce (w mg/kg) obliczyć według następującego wzoru:

[mg/kg]

gdzie:

hd,c

=

wysokość (powierzchnia) piku diklazurilu w roztworze kalibracyjnym (3.10)

hi,c

=

wysokość (powierzchnia) piku wzorca wewnętrznego w roztworze kalibracyjnym (3.10)

hd,s

=

wysokość (powierzchnia) piku diklazurilu w roztworze próbki (5.2.2)

hi,s

=

wysokość (powierzchnia) piku wzorca wewnętrznego w roztworze próbki (5.2.2)

cd,c

=

stężenie w μg/ml diklazurilu w roztworze kalibracyjnym (3.10)

m

=

masa naważki w g

V

=

objętość ekstraktu próbki zgodna z pkt 5.2.2 (tj. 25 ml)

p

=

nominalna zawartość w mg/kg diklazurilu w premiksie

7.   Sprawdzenie wyników

7.1.   Sprawdzenie tożsamości

Tożsamość analitu może być potwierdzona przez kochromatografię lub zastosowanie detektora diodowego, przy użyciu którego porównuje się widma ekstraktu próbki (5.2.1 lub 5.2.2) i roztworu kalibracyjnego (3.10).

7.1.1.    Kochromatografia

Ekstrakt próbki (5.2.1 lub 5.2.2) fortyfikuje się przez dodanie odpowiedniej ilości roztworu kalibracyjnego (3.10) Ilość dodanego diklazurilu musi odpowiadać ilości diklazurilu znajdującej się w ekstrakcie próbki.

Po uwzględnieniu zarówno dodanej ilości, jak i stopnia rozcieńczenia ekstraktu, zwiększyć się może tylko wysokość piku diklazurilu i piku wzorca wewnętrznego. Szerokość piku w połowie jego wysokości musi mieścić się w granicach ± 10 % pierwotnej szerokości piku diklazurilu lub piku wzorca wewnętrznego niefortyfikowanego ekstraktu próbki.

7.1.2.    Detekcja diodowa

Wyniki sprawdza się według następujących kryteriów:

Jeżeli jedno z tych kryteriów nie jest spełnione, obecność analitu nie jest potwierdzona.

7.2.   Powtarzalność

Różnica pomiędzy wynikami dwóch równoległych oznaczeń wykonanych dla tej samej próbki nie może przekraczać:

7.3.   Odzysk

W przypadku fortyfikacji ślepej próby lub próby paszy odzysk musi wynosić co najmniej 80 %.

8.   Wyniki badań międzylaboratoryjnych

W ramach współpracy 11 laboratoriów przeprowadzono analizę 5 próbek. Były to próbki z dwóch premiksów; jeden był wymieszany z głównym składnikiem organicznym (O 100), a drugi z głównym składnikiem nieorganicznym (A 100). Zawartość teoretyczna diklazurilu wynosiła 100 mg/kg, trzy mieszanki pasz dla drobiu zostały sporządzone przez 3 różnych producentów (NL) (L1/Z1/K1). Teoretyczna zawartość diklazurilu wynosiła 1 mg/kg. Analizę każdej próbki przeprowadzono raz lub dwukrotnie. (Bardziej szczegółowe informacje dotyczące tej analizy można znaleźć w Journal of AOAC International, tom 77, nr 6, 1994, s. 1359–1361). W poniższej tabeli podano wyniki przeprowadzonych badań.

L

=

liczba laboratoriów

n

=

liczba pojedynczych wartości

Sr

=

odchylenie standardowe powtarzalności

CVr

=

współczynnik zmienności powtarzalności

SR

=

odchylenie standardowe odtwarzalności

CVR

=

współczynnik zmienności odtwarzalności

9.   Objaśnienia

Należy uprzednio wykazać, że reakcja diklazurilu jest liniowa w zakresie mierzonych stężeń.

G.   OZNACZANIE SOLI SODOWEJ LASALOCIDU

Sól sodowa polieterowego monokarboksylowego kwasu wytwarzanego przez Streptomyces lasaliensis

1.   Cel i zakres stosowania metody

Metoda służy do oznaczania zawartości soli sodowej lasalocidu w paszach i premiksach. Granica wykrywalności wynosi 5 mg/kg, granica oznaczalności 10 mg/kg.

2.   Sposób przeprowadzenia metody

Sól sodowa lasalocidu jest ekstrahowana z próbki zakwaszonym metanolem i oznaczana metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej z fazą odwróconą (HPLC) przy wykorzystaniu detektora spektrofluorometrycznego.

3.   Odczynniki i roztwory

Rozcieńczyć 23,5 ml kwasu ortofosforowego (3.2) wodą do objętości 100 ml.

Rozpuścić 1,36 g KH2PO4 (3.1), w 500 ml wody (3.11), dodać 3,5 ml kwasu ortofosforowego (3.2) i 10,0 ml 6-metylo-2-heptyloaminy (3.4). Dostosować pH do 4,0 przy użyciu roztworu kwasu ortofosforowego (3.3) i rozcieńczyć wodą (3.11) do objętości 1 000 ml.

Przenieść 5,0 ml kwasu chlorowodorowego (3.6) do kolby miarowej o pojemności 1 000 ml, uzupełnić do pełnej objętości kolby metanolem (3.5) i zmieszać. Roztwór przygotować bezpośrednio przed użyciem.

Zmieszać 5 ml roztworu buforu fosforanowego (3.7) i 95 ml metanolu (3.5).

Zważyć, z dokładnością do 0,1 mg, 50 mg soli sodowej lasalocidu (3.10) do kolby miarowej o pojemności 100 ml, rozpuścić w zakwaszonym metanolu (3.8), uzupełnić do pełnej objętości kolby tym samym rozpuszczalnikiem i zmieszać. Roztwór przygotować bezpośrednio przed użyciem.

Przenieść pipetą 10,0 ml podstawowego roztworu wzorcowego soli sodowej lasalocidu (3.10.1) do kolby miarowej o pojemności 100 ml, uzupełnić do pełnej objętości kolby zakwaszonym metanolem (3.8) i zmieszać. Roztwór przygotować bezpośrednio przed użyciem.

Do kolb miarowych o pojemności 50 ml przenieść 1,0 , 2,0 , 4,0 , 5,0 i 10,0 ml roztworu wzorcowego pośredniego (3.10.2). Uzupełnić do pełnej objętości kolb zakwaszonym metanolem (3.8) i zmieszać. Roztwory te odpowiadają odpowiednio 1,0 , 2,0 , 4,0 , 5,0 i 10,0 μg soli sodowej lasalocidu w 1 ml. Roztwory przygotować bezpośrednio przed użyciem.

4.   Aparatura i sprzęt

5.   Sposób postępowania

5.1.   Objaśnienia

5.1.1.    Ślepa próba

W celu przeprowadzenia badania odzysku (5.1.2) należy przeprowadzić analizę ślepej próby paszy w celu sprawdzenia, czy badana pasza nie zawiera lasalocidu ani substancji interferujących. Pasza użyta do ślepej próby musi być podobna do próbki paszy badanej i nie może zawierać lasalocidu sodu ani interferujących substancji.

5.1.2.    Badanie odzysku

Badanie odzysku należy przeprowadzić, analizując ślepą próbę paszy fortyfikowaną przez dodanie znanej ilości soli sodowej lasalocidu, o wadze zbliżonej do tej, która znajduje się w próbce. Aby fortyfikować na poziomie 100 mg/kg, dodać 10,0 ml podstawowego roztworu wzorcowego (3.10.1) do kolby stożkowej o pojemności 250 ml i odparować roztwór do objętości około 0,5 ml. Dodać 50 g ślepej próby paszy, zmieszać i pozostawić na 10 minut, a następnie kilkakrotnie zamieszać i przejść do etapu ekstrakcji (5.2).

Jeżeli nie można przeprowadzić badania ślepej próby paszy podobnej do badanej próbki (zob. pkt 5.1.1), badanie odzysku można przeprowadzić, stosując metodę dodawania wzorca. W tym przypadku przeznaczona do analizy próbka jest fortyfikowana przez dodanie znanej ilości soli sodowej lasalocidu, o wadze zbliżonej do tej, która znajduje się w analizowanej próbce. Próbkę tę poddaje się analizie wraz z niefortyfikowaną próbką, a odzysk może być obliczony przez odjęcie od próbki fortyfikowanej masy próbki niefortyfikowanej.

5.2.   Ekstrakcja

5.2.1.    Pasze

Zważyć, z dokładnością do 0,01 g, od 5 g do 10 g próbki do wyposażonej w korek kolby stożkowej o pojemności 250 ml. Dodać przy użyciu pipety 100,0 ml zakwaszonego metanolu (3.8). Zamknąć luźno korkiem i zamieszać w celu rozproszenia. Umieścić kolbę w łaźni ultradźwiękowej (4.1) w temperaturze około 40 oC na 20 minut, następnie wyjąć i schłodzić do temperatury pokojowej. Pozostawić kolbę na około godzinę, dopóki suspensja nie opadnie, następnie przefiltrować podzielną część przez filtr membranowy 0,45 μm (4.2) do odpowiedniego naczynia. Przystąpić do oznaczania HPLC (5.3).

5.2.2.    Premiksy

Odważyć, z dokładnością do 0,001 g, około 2 g nierozdrobnionego premiksu do kolby miarowej o pojemności 250 ml. Dodać 100,0 ml zakwaszonego metanolu (3.8) i zamieszać w celu rozproszenia. Umieścić kolbę z zawartością w łaźni ultradźwiękowej (4.1) w temperaturze około 40 oC na 20 minut, następnie wyjąć i schłodzić do temperatury pokojowej. Uzupełnić do pełnej objętości kolb zakwaszonym metanolem (3.8) i dokładnie zmieszać. Pozostawić kolbę na około godzinę, dopóki suspensja nie opadnie, następnie przefiltrować podzielną część przez filtr membranowy 0,45 μm (4.2). Rozcieńczyć odpowiednią objętość klarownego filtratu przy użyciu zakwaszonego metanolu (3.8) w celu otrzymania finalnego testowego roztworu zawierającego około 4 μg/ml soli sodowej lasalocidu. Przystąpić do oznaczania HPLC (5.3).

5.3.   Oznaczanie HPLC

5.3.1.    Parametry

Poniższe parametry podano jako przykładowe; inne parametry mogą być zastosowane, o ile gwarantują otrzymanie równoważnych wyników:

Sprawdzić stabilność systemu chromatograficznego, dozując kilkakrotnie roztwór kalibracyjny (3.10.3) zawierający 4 μg/ml, aż do uzyskania stałych wysokości (powierzchni) piku i czasów retencji.

5.3.2.    Krzywa kalibracyjna

Zadozować kilka razy każdy z kalibracyjnych roztworów (3.10.3) i określić średnie wysokości (powierzchnie) piku dla każdego stężenia. Wykreślić krzywą kalibracyjną, odkładając średnie wysokości (powierzchnie) piku na osi rzędnych oraz odpowiadające im stężenia w μg/ml na osi odciętych.

5.3.3.    Roztwór próbki

Zadozować kilka razy ekstrakt próbki (5.2.1 lub 5.2.2) stosując taką samą objętość jak przy kalibracyjnych roztworach, i określić średnią wysokość (powierzchnię) piku dla pików soli sodowej lasalocidu.

6.   Obliczanie wyników

Na podstawie średniej wysokości (powierzchni) piku otrzymanej po zadozowaniu roztworu próbki (5.3.3) określić stężenie soli sodowej lasalocidu w μg/ml, odnosząc się do krzywej kalibracyjnej.

6.1.   Pasze

Zawartość soli sodowej lasalocidu w mg/kg w próbce oblicza się według następującego wzoru:

[mg/kg]

gdzie:

c

=

stężenie w μg/ml soli sodowej lasalocidu w roztworze próbki (5.2.1)

V1

=

objętość w ml ekstraktu próbki (5.2.1) (tj. 100 ml)

m

=

masa naważki w g

6.2.   Premiksy

Zawartość soli sodowej lasalocidu, w mg/kg, w próbce obliczyć według następującego wzoru:

[mg/kg]

gdzie:

c

=

stężenie w μg/ml soli sodowej lasalocidu w roztworze próbki (5.2.2)

V2

=

objętość w ml ekstraktu próbki zgodny z pkt 5.2.2 (tj. 250 ml)

f

=

współczynnik rozcieńczania zgodny z pkt 5.2.2

m

=

masa naważki w g

7.   Sprawdzenie wyników

7.1.   Sprawdzenie tożsamości

Metody bazujące na detekcji spektrofluorometrycznej są mniej podatne na interferencje niż metody z zastosowaniem detekcji UV. Tożsamość analitu może być potwierdzona przez kochromatografię.

7.1.1.    Kochromatografia

Ekstrakt próbki (5.2.1 lub 5.2.2) jest fortyfikowany przez dodanie odpowiedniej ilości roztworu kalibracyjnego (3.10.3). Ilość dodanej soli sodowej lasalocidu musi odpowiadać ilości soli sodowej lasalocidu w ekstrakcie próbki. Po uwzględnieniu ilości dodanej soli sodowej lasalocidu i rozcieńczenia ekstraktu zwiększyć się może tylko wysokość piku soli sodowej lasalocidu. Szerokość piku w połowie wysokości musi mieścić się w zakresie ± 10 % oryginalnej szerokości piku niefortyfikowanego ekstraktu.

7.2.   Powtarzalność

Różnica pomiędzy wynikami dwóch równoległych oznaczeń wykonanych dla tej samej próbki nie może przekraczać:

7.3.   Odzysk

W przypadku fortyfikowanej (ślepej) próby paszy lub próby paszy odzysk nie może być niższy niż 80 %. W przypadku fortyfikowanych próbek premiksów odzysk nie może być niższy niż 90 %.

8.   Wyniki badań międzylaboratoryjnych

W ramach współpracy 12 laboratoriów ( *1 ) przeprowadzono analizę 2 premiksów (próbki 1 i 2) oraz 5 pasz (próbki 3–7). Analizę każdej próbki przeprowadzono dwukrotnie. W poniższej tabeli podane są wyniki przeprowadzonych badań:

L

=

liczba laboratoriów

n

=

liczba poszczególnych wyników

sr

=

standardowe odchylenie powtarzalności

sR

=

odchylenie standardowe odtwarzalności

CVr

=

odchylenie standardowe zmienne powtarzalności, %

CVR

=

odchylenie standardowe zmienne odtwarzalności, %

---

ZAŁĄCZNIK V

METODY ANALIZY DO CELÓW KONTROLI NIEPOŻĄDANYCH SUBSTANCJI W PASZACH

A.   OZNACZANIE WOLNEGO I CAŁKOWITEGO GOSSYPOLU

1.   Cel i zakres stosowania metody

Metoda służy do oznaczania zawartości wolnego gossypolu, całkowitego gossypolu i chemicznie związanych substancji w nasionach bawełny, w makuchach, w mączce z nasion bawełny i w mieszankach paszowych zawierających te materiały paszowe, w których zawartość wolnego gossypolu, całkowitego gossypolu i chemicznie związanych substancji przekracza 20 mg/kg.

2.   Sposób przeprowadzenia metody

Gossypol ekstrahuje się w obecności 3-aminopropan-1-olu lub mieszaniny propan-2-olu i heksanu w przypadku oznaczania wolnego gossypolu lub dwumetyloformamidem w przypadku oznaczenia całkowitego gossypolu. Gossypol, reagując z aniliną, tworzy gossypol-dianilinę, której gęstość optyczna mierzona jest przy 440 nm.

3.   Odczynniki i roztwory

Wzorcowe roztwory gossypolu A i B nadają się do użycia przez 24 godziny, jeżeli są chronione przed światłem.

4.   Aparatura i sprzęt

5.   Sposób postępowania

5.1.    Analiza próbki

Masa próbki pobrana do analizy zależy od przewidywanej zawartości gossypolu w próbce. Zalecana jest praca na małych ilościach próby i stosunkowo dużej ilości filtratu po to, aby otrzymać wystarczającą ilość gossypolu do precyzyjnego oznaczenia fotometrycznego. W przypadku oznaczania wolnego gossypolu w nasionach bawełny, w makuchach i mączce z nasion bawełny masa próbki do analizy nie może przekraczać 1 g. W przypadku mieszanek paszowych może wynosić do 5 g. W większości przypadków wystarczające jest 10 ml podzielnej części filtratu. Musi on zawierać od 50 do 100 μg gossypolu. Jeżeli oznaczamy całkowity gossypol, ilość badanej próbki musi wynosić od 0,5 do 5 g, wówczas 2 ml podzielnej części filtratu będzie zawierać od 40 do 200 μg gossypolu.

Analizę należy przeprowadzać w temperaturze pokojowej, za którą uważa się temperaturę około 20 oC.

5.2.    Oznaczanie wolnego gossypolu

Umieścić próbkę w kolbie ze szlifowaną szyjką o pojemności 250 ml. Dno kolby pokryć pokruszonym szkłem. Przy użyciu pipety dodać 50 ml rozpuszczalnika A (3.2), zamknąć kolbę korkiem i mieszać przez godzinę w mikserze. Filtrować przez suchy filtr, a filtrat zebrać do małej kolby ze szlifowaną szyjką. Podczas filtracji przykryć lejek szkiełkiem zegarkowym.

Odmierzyć pipetą identyczne podzielne części filtratu zawierające od 50 do 100 μg gossypolu i umieścić w 2 kolbach miarowych o pojemności 25 ml (A i B). Jeżeli to konieczne, uzupełnić zawartość kolby do 10 ml rozpuszczalnikiem A (3.2). Następnie uzupełnić zawartość kolby (A) do pełnej objętości kolby mieszaniną propan-2-ol-heksanu (3.1). Roztwór ten będzie użyty jako roztwór odniesienia względem pomiaru roztworu próbki.

Przenieść pipetą po 10 ml rozpuszczalnika A (3.2) do 2 następnych kolb miarowych o pojemności 25 ml (C i D). Zawartość kolby (C) uzupełnić do pełnej objętości kolby mieszaniną propan-2-ol-heksanu (3.1). Roztwór ten będzie używany jako roztwór odniesienia względem pomiaru roztworu ślepej próby.

Dodać po 2 ml aniliny (3.4) do każdej z kolb (D) i (B). Ogrzewać na wrzącej łaźni przez 30 minut, do wywołania reakcji barwnej. Schłodzić do temperatury pokojowej, uzupełnić do pełnej objętości kolby mieszaniną propan-2-ol-heksanu (3.1), homogenizować i odstawić na godzinę.

Oznaczyć gęstość optyczną roztworu ślepej próby (D), używając odpowiedniego roztworu (C) jako roztworu odniesienia, oraz gęstość optyczną roztworu próbki (B) przez porównanie z odpowiednim roztworem (A), jako roztworem odniesienia w spektrofotometrze przy 440 nm, stosując 1-centymetrowe szklane kuwety.

Od odpowiadającej gęstości optycznej wartości roztworu próbki odjąć wartość gęstości optycznej roztworu ślepej próby (= skorygowana gęstość optyczna). Z użyciem tej różnicy obliczyć zawartość wolnego gossypolu, w sposób określony w pkt 6.

5.3.    Oznaczanie całkowitego gossypolu

Próbkę zawierającą od 1 do 5 mg gossypolu umieścić w kolbie miarowej o pojemności 50 ml i dodać 10 ml rozpuszczalnika B (3.3). W tym samym czasie przygotować ślepą próbę, umieszczając 10 ml rozpuszczalnika B (3.3) w następnej kolbie miarowej o pojemności 50 ml. Ogrzewać obie kolby przez 30 minut na wrzącej łaźni wodnej. Następnie schłodzić do temperatury pokojowej i uzupełnić do pełnej objętości kolby mieszaniną propan-2-ol-heksanu (3.1). Homogenizować i odstawić na 10 do 15 minut. Następnie filtrować, a filtrat zebrać do kolb ze szlifowaną szyjką.

Przenieść pipetą po 2 ml filtratu próbki do każdej z dwóch kolb miarowych o pojemności 25 ml i oraz po 2 ml filtratu do próby ślepej do pozostałych dwóch kolb. Uzupełnić zawartość jednej kolby z każdej partii do objętości 25 ml mieszaniną 1-propan-2-ol-heksanu (3.1). Roztwory te będą używane jako roztwory odniesienia.

Dodać po 2 ml aniliny (3.4) do 2 następnych kolb miarowych. Ogrzewać obie kolby przez 30 minut na wrzącej łaźni wodnej do wywołania reakcji barwnej. Schłodzić do temperatury pokojowej, uzupełnić do objętości 25 ml mieszaniną propan-2-ol-heksanu (3.1), homogenizować i odstawić na godzinę.

Oznaczyć gęstość optyczną, tak jak dla wolnego gossypolu (5.2). Używając tej wartości, obliczyć zawartość całkowitego gossypolu, w sposób określony w pkt 6.

6.   Obliczanie wyników

Wyniki mogą być obliczone na podstawie określonej gęstości optycznej (6.1) lub na podstawie odniesienia do krzywej kalibracyjnej (6.2).

6.1.    Wyniki obliczane na podstawie określonej gęstości optycznej

W podanych warunkach określone gęstości optyczne są następujące:

Zawartość wolnego lub całkowitego gossypolu w próbce oblicza się według następującego wzoru:

gdzie:

E

=

skorygowana gęstość optyczna określona w pkt 5.2

p

=

masa próbki w g

a

=

podzielna część filtratu w ml

6.2.    Wyniki obliczane na podstawie krzywej kalibracyjnej

6.2.1.    Wolny gossypol

Przygotować 2 partie po 5 kolb miarowych o pojemności 25 ml. Do każdej partii kolb wprowadzić pipetą odpowiednio 2,0 , 4,0 , 6,0 , 8,0 i 10,0 ml roztworu A wzorcowego gossypolu (3.5). Uzupełnić do objętości 10 ml rozpuszczalnikiem A (3.2). Uzupełnić każdą partię kolbą miarową o pojemności 25 ml zawierającą jedynie 10 ml rozpuszczalnika A (3.2) (próba ślepa).

Uzupełnić do objętości 25 ml kolby w pierwszej partii, włączając kolbę ślepej próby, mieszaniną propan-2-ol-heksanu (3.1) (partia odniesienia).

Dodać po 2 ml aniliny (3.4) do każdej kolby drugiej partii, stanowiącej partię wzorcową, włączając kolbę ślepej próby. Ogrzewać przez 30 minut na wrzącej łaźni wodnej do wywołania reakcji barwnej. Schłodzić do temperatury pokojowej, uzupełnić do pełnej objętości kolby mieszaniną propan-2-ol-heksanu (3.1), homogenizować i odstawić na godzinę.

Oznaczyć w sposób określony w 5.2 gęstość optyczną roztworów w partii wzorcowej przez porównanie z odpowiadającymi im roztworami w partii odniesienia. Wykreślić krzywą kalibracyjną, nanosząc gęstości optyczne względem ilości gossypolu (w μg).

6.2.2.    Całkowity gossypol

Przygotować 6 kolb miarowych o pojemności 50 ml. Do pierwszej kolby dodać 10 ml rozpuszczalnika B (3.3), a do pozostałych odpowiednio 2,0 , 4,0 , 6,0 , 8,0 i 10,0 ml roztworu B wzorcowego gossypolu (3.6). Każdą kolbę uzupełnić do objętości 10 ml rozpuszczalnikiem B (3.3). Ogrzewać przez 30 minut na wrzącej łaźni wodnej. Schłodzić do temperatury pokojowej, uzupełnić do pełnej objętości kolby mieszaniną propan-2-olheksanu (3.1) i homogenizować.

Do każdej z 2 partii po 6 kolb miarowych o pojemności 25 ml wprowadzić po 2,0 ml wyżej wspomnianych roztworów. 6 kolb pierwszej partii uzupełnić do objętości 25 ml mieszaniną propan-2-ol-heksanu (3.1) (partia odniesienia).

Do każdej kolby drugiej partii, stanowiącej partię wzorcową, dodać po 2 ml aniliny (3.4). Ogrzewać przez 30 minut na wrzącej łaźni wodnej. Schłodzić do temperatury pokojowej, uzupełnić do pełnej objętości kolby mieszaniną propan-2-ol-heksanu (3.1), homogenizować i odstawić na godzinę (partia standardowa).

Oznaczyć w sposób określony w pkt 5.2 gęstość optyczną roztworów w partii wzorcowej przez porównanie z odpowiadającymi im roztworami w partii odniesienia. Wykreślić krzywą kalibracyjną, nanosząc gęstości optyczne względem ilości gossypolu (w μg).

6.3.    Powtarzalność

Różnica pomiędzy wynikami 2 równoległych oznaczeń wykonanych dla tej samej próbki nie może przekraczać:

▼M6

B.   OZNACZANIE POZIOMÓW DIOKSYN (PCDD/PCDF) I PCB

ROZDZIAŁ I

Metody pobierania próbek i interpretacja wyników analitycznych

1.    Zakres i definicje

Próbki przeznaczone do urzędowej kontroli poziomów polichlorowanych dibenzo-p-dioksyn (PCDD), polichlorowanych dibenzofuranów (PCDF), dioksynopodobnych polichlorowanych bifenyli (PCB) ( 16 ) oraz niedioksynopodobnych PCB w paszy pobiera się zgodnie z przepisami załącznika I. Należy stosować wymagania ilościowe w stosunku do kontroli substancji lub produktów jednorodnie rozmieszczonych w paszy, zgodnie z załącznikiem I pkt 5.1. Otrzymane w ten sposób próbki zbiorcze uznaje się za próbki reprezentatywne dla partii lub podpartii, z których zostały pobrane. Zgodność z najwyższymi dopuszczalnymi poziomami ustanowionymi w dyrektywie 2002/32/WE ustala się na podstawie poziomów oznaczonych w próbkach laboratoryjnych.

Do celów niniejszej części B znajdują zastosowanie definicje określone w załączniku I do decyzji Komisji 2002/657/WE ( 17 ).

Oprócz tych definicji do celów niniejszej części B stosuje się następujące definicje:

2.    Zgodność partii lub podpartii z najwyższym dopuszczalnym poziomem

2.1.    W odniesieniu do niedioksynopodobnych PCB

Partia lub podpartia są zgodne z najwyższym dopuszczalnym poziomem, jeżeli suma PCB 28, PCB 52, PCB 101, PCB 138, PCB 153 i PCB 180 (zwanych dalej niedioksynopodobnymi PCB) nie przekracza, przy uwzględnieniu niepewności rozszerzonej pomiaru ( 18 ), najwyższego dopuszczalnego poziomu ustanowionego w dyrektywie 2002/32/WE. Partia lub podpartia nie są zgodne z najwyższym dopuszczalnym poziomem ustanowionym w dyrektywie 2002/32/WE, jeżeli średnia dwóch wyników analizy uzyskanych metodą granicy oznaczalności ( 19 ) z wykorzystaniem analizy powtórnej ( 20 ) z uwzględnieniem niepewności rozszerzonej pomiaru przekracza ponad wszelką wątpliwość najwyższy dopuszczalny poziom, tj. do oceny zgodności wykorzystywane jest przeanalizowane stężenie po odjęciu niepewności rozszerzonej pomiaru.

Niepewność rozszerzoną oblicza się przy zastosowaniu współczynnika rozszerzenia 2, który daje poziom ufności około 95 %. Partia lub podpartia są niezgodne z wymogami, jeśli średnia mierzonych wartości po odjęciu niepewności rozszerzonej średniej jest wyższa niż najwyższy dopuszczalny poziom.

Zasady wymienione w akapitach powyżej mają zastosowanie do wyniku analitycznego otrzymanego z próbki pobranej do celów kontroli urzędowej. W przypadku analizy do celów obrony praw lub arbitrażu zastosowanie mają przepisy krajowe.

2.2.    W odniesieniu do PCDD/F i dioksynopodobnych PCB

Partia lub podpartia jest zgodna z wymaganiami dotyczącymi najwyższego dopuszczalnego poziomu, jeżeli wynik pojedynczej analizy:

Dla badań przesiewowych należy ustalić wartość odcięcia dla decyzji o zgodności próbki z odpowiednimi najwyższymi dopuszczalnymi poziomami ustanowionymi albo dla PCDD/F, albo dla sumy PCDD/F i dioksynopodobnych PCB.

Partia lub podpartia nie są zgodne z najwyższym dopuszczalnym poziomem ustanowionym w dyrektywie 2002/32/WE, jeżeli średnia dwóch wyników analizy uzyskanych metodą granicy oznaczalności ( 21 ) z wykorzystaniem analizy powtórnej ( 22 ) przy zastosowaniu metody potwierdzającej z uwzględnieniem niepewności rozszerzonej pomiaru przekracza ponad wszelką wątpliwość najwyższy dopuszczalny poziom, tj. do oceny zgodności wykorzystywane jest przeanalizowane stężenie po odjęciu niepewności rozszerzonej pomiaru.

Niepewność rozszerzoną oblicza się przy zastosowaniu współczynnika rozszerzenia 2, który daje poziom ufności około 95 %. Partia lub podpartia są niezgodne z wymogami, jeśli średnia mierzonych wartości po odjęciu niepewności rozszerzonej średniej jest wyższa niż najwyższy dopuszczalny poziom.

Należy zastosować sumę szacowanych niepewności rozszerzonych dla odrębnych wyników analitycznych dla PCDD/F i dioksynopodobnych PCB w odniesieniu do sumy PCDD/F i dioksynopodobnych PCB.

Zasady wymienione w akapitach powyżej mają zastosowanie do wyniku analitycznego otrzymanego z próbki pobranej do celów kontroli urzędowej. W przypadku analizy do celów obrony praw lub arbitrażu zastosowanie mają przepisy krajowe.

3.    Wyniki przekraczające poziomy reagowania ustanowione w załączniku II do dyrektywy 2002/32/WE

Progi podejmowania działań są narzędziem wyboru próbek w przypadkach wymagających zidentyfikowania źródła zanieczyszczeń i podjęcia odpowiednich działań, aby je zredukować lub zlikwidować. Metody przesiewowe powinny ustanowić odpowiednie wartości odcięcia dla wyboru tych próbek. Jeśli zidentyfikowanie źródła i zredukowanie lub usunięcie zanieczyszczenia wymaga znacznego wysiłku, należy potwierdzić przekroczenie poziomu reagowania powtórną analizą przy zastosowaniu metody potwierdzającej i przy uwzględnieniu niepewności rozszerzonej pomiaru ( 23 ).

ROZDZIAŁ II

Przygotowanie próbek i wymagania dotyczące metod analizy stosowanych w urzędowej kontroli poziomów dioksyn (PCDD/F) i dioksynopodobnych PCB w paszy

1.    Zakres stosowania

Wymogi ustanowione w niniejszym rozdziale należy stosować w przypadku paszy analizowanej do celów urzędowych kontroli poziomów PCDD/F z atomami chloru w pozycjach 2,3,7,8 oraz dioksynopodobnych PCB oraz w odniesieniu do przygotowywania próbek oraz wymogów analitycznych do innych celów regulacyjnych, co obejmuje kontrole wykonywane przez podmiot działający na rynku pasz w celu zapewnienia zgodności z przepisami rozporządzenia (WE) nr 183/2005 Parlamentu Europejskiego i Rady ( 24 ).

Monitorowanie obecności PCDD/F i dioksynopodobnych PCB w paszy można przeprowadzać przy wykorzystaniu dwóch różnych typów metod analitycznych:

2.    Informacje podstawowe

W celu obliczenia stężeń wyrażonych jako stężenia TEQ należy pomnożyć stężenia poszczególnych substancji w danej próbce przez ich odpowiednie współczynniki równoważne toksyczności (TEF) (zob. rozdział I przypis 1), a następnie zsumować je, co da łączne stężenie związków dioksynopodobnych wyrażone jako TEQ.

Do celów niniejszej części B przyjęta swoista granica oznaczalności danego kongeneru jest to najniższa zawartość analitu, którą można zmierzyć z istotną pewnością statystyczną przy spełnieniu kryteriów identyfikacji opisanych w normach uznanych międzynarodowo, na przykład w normie EN 16215:2012 (Pasze – Oznaczanie dioksyn i dioksynopodobnych PCB metodą GC-HRMS oraz wskaźnikowych PCB metodą GC-HRMS) lub w najnowszych wersjach metod EPA 1613 i 1668.

Granicę oznaczalności danego kongeneru można określić jako:

Bioanalityczne metody przesiewowe nie dają wyników na poziomie kongenerów, a jedynie wskazanie ( 25 ) poziomu TEQ wyrażonego w BEQ, aby uwzględnić fakt, że nie wszystkie związki obecne w ekstrakcie próbki, które wywołują odpowiedź w badaniu, spełniają wszystkie wymagania zasady TEQ.

Metody przesiewowe i potwierdzające mogą być stosowane tylko do kontroli niektórych matryc, jeżeli metody te są dostatecznie czułe, aby w sposób wiarygodny wykrywać substancje na poziomie reagowania lub najwyższym dopuszczalnym poziomie.

3.    Wymagania dotyczące zapewniania jakości

3.1.	Należy podjąć niezbędne środki w celu uniknięcia zanieczyszczenia krzyżowego na każdym etapie pobierania i analizy próbek.

3.2.	Próbki należy przechowywać i transportować w pojemnikach szklanych, aluminiowych, polipropylenowych lub polietylenowych nadających się do tego celu i nie mających wpływu na poziomy PCDD/F i dioksynopodobnych PCB w próbkach. Pojemnik na próbki należy oczyścić z pyłu papierowego.

3.3.	Przechowywanie i przewożenie próbek należy przeprowadzać w sposób zachowujący integralność próbki paszy.

3.4.	W razie potrzeby każdą próbkę laboratoryjną należy drobno zmielić i dokładnie wymieszać w sposób gwarantujący pełną homogenizację (np. w sposób umożliwiający przesianie przez sito o oczku 1 mm). Jeżeli zawartość wilgoci jest zbyt wysoka, próbki muszą zostać osuszone przed mieleniem.

3.5.	Należy przeprowadzić kontrolę odczynników, aparatury i szkła laboratoryjnego pod kątem ewentualnego wpływu na wyniki oparte na TEQ lub BEQ.

3.6.	Należy wykonać analizę ślepej próby, obejmującą przeprowadzenie pełnej procedury analitycznej, ale bez próbki.

3.7.

W przypadku metod bioanalitycznych należy upewnić się, że szkło laboratoryjne i rozpuszczalniki stosowane podczas analizy są wolne od związków przeszkadzających w wykrywaniu związków docelowych w zakresie roboczym. Szkło należy przemyć rozpuszczalnikami lub ogrzać do temperatur, w których z powierzchni usuwane są pozostałości PCDD/F, związków dioksynopodobnych i związków przeszkadzających.

3.8.	Ilość próbki stosowanej do ekstrakcji musi być wystarczająca do spełnienia wymogów dotyczących wystarczająco niskiego zakresu roboczego, obejmującego stężenia na najwyższym dopuszczalnym poziomie lub na poziomie reagowania.

3.9.	Konkretne procedury przygotowania próbki stosowane do badanych produktów powinny być zgodne z międzynarodowymi wytycznymi.

4.    Wymagania dotyczące laboratoriów

4.1.

Zgodnie z przepisami rozporządzenia (WE) nr 882/2004 laboratoria muszą być akredytowane przez uznany organ działający zgodnie z wytyczną ISO 58, aby zapewnić, że przy przeprowadzaniu analiz stosują system zapewniania jakości. Laboratoria muszą posiadać akredytację zgodną z normą EN ISO/IEC 17025. W stosownych przypadkach należy stosować zasady opisane w wytycznych technicznych dotyczących szacowania niepewności pomiaru i granic oznaczalności w odniesieniu do analizy PCDD/F i PCB ( 26 ).

4.2.	Biegłość laboratoriów należy udowadniać stałym uczestnictwem w międzylaboratoryjnych badaniach oznaczania PCDD/F i dioksynopodobnych PCB w odpowiednich matrycach paszy i zakresach stężeń.

4.3.	Laboratoria stosujące przesiewowe metody analityczne do rutynowej kontroli próbek powinny nawiązać ścisłą współpracę z laboratoriami stosującymi metody potwierdzające, zarówno w celach kontroli jakości, jak i potwierdzania wyników analitycznych podejrzanych próbek.

5.    Podstawowe wymagania dotyczące procedury analitycznej dla dioksyn (PCDD/F) i dioksynopodobnych PCB

5.1.    Niski zakres roboczy i granica oznaczalności

W przypadku PCDD/F wykrywalne ilości muszą osiągnąć wysokie poziomy rzędu femtogramów (10– 15 g) z uwagi na ekstremalną toksyczność niektórych spośród tych związków. W przypadku większości kongenerów PCB granica oznaczalności rzędu nanogramów (10– 9 g) jest już wystarczająca. W przypadku oznaczania bardziej toksycznych kongenerów dioksynopodobnych PCB (w szczególności kongenerów podstawionych w pozycji non-orto), dolna granica zakresu roboczego musi osiągnąć niskie poziomy rzędu pikogramów (10– 12 g). W przypadku wszystkich pozostałych kongenerów PCB granica oznaczania rzędu nanogramów (10– 9 g) jest już wystarczająca.

5.2.    Wysoka selektywność (swoistość)

5.2.1.

Konieczne jest rozróżnienie PCDD/F i dioksynopodobnych PCB od wielu innych współekstrahowanych i ewentualnie interferujących związków występujących w stężeniach do kilku razy wyższych od stężeń interesujących analitów. W przypadku metod GC-MS konieczne jest rozróżnienie między różnymi kongenerami, takimi jako kongenery toksyczne (np. siedemnaście PCDD/F z atomami chloru w pozycjach 2,3,7,8 oraz dwanaście dioksynopodobnych PCB) i pozostałe kongenery.

5.2.2.

Metody bioanalityczne muszą być w stanie wykrywać docelowe związki jako sumę PCDD/F lub dioksynopodobnych PCB. Oczyszczanie próbki ma na celu usunięcie związków dających wyniki fałszywie dodatnie lub związków, które mogą zmniejszać odpowiedź, powodując wyniki fałszywie ujemne.

5.3.    Wysoka dokładność (prawdziwość i precyzja, odzysk testu biologicznego)

5.3.1.

W przypadku metod GC-MS oznaczenie musi dostarczyć wiarygodnych szacunków rzeczywistego stężenia w próbce. Wysoka dokładność jest konieczna, aby uniknąć odrzucenia wyniku analizy próbki z powodu słabej wiarygodności oznaczonego poziomu TEQ. Dokładność jest wyrażona jako prawdziwość (różnica między średnią wartością mierzoną w odniesieniu do analitu w certyfikowanym materiale a jego certyfikowaną wartością, wyrażona w procentach) i precyzja (RSDR względne odchylenie standardowe obliczone na podstawie wyników osiągniętych w warunkach odtwarzalności).

5.3.2.

W przypadku metod bioanalitycznych należy oznaczyć odzysk testu biologicznego. Odzysk testu biologicznego jest to poziom BEQ obliczony z krzywej wzorcowej TCDD lub PCB 126, skorygowany o wynik dla próbki ślepej, a następnie podzielony przez poziom TEQ oznaczony metodą potwierdzającą. Jego celem jest korekta takich czynników, jak strata PCDD/F i związków dioksynopodobnych podczas ekstrakcji i oczyszczania, związki współekstrahowane zwiększające lub zmniejszające odpowiedź (efekt agonistyczny lub antagonistyczny), jakość dopasowania krzywej lub różnice między wartościami TEF a wartościami względnego potencjału działania (REP). Odzysk testu biologicznego jest obliczany na podstawie wyników badania odpowiednich próbek referencyjnych zawierających reprezentatywny profil kongenerów na poziomie zainteresowania.

5.4.    Walidacja w zakresie najwyższego dopuszczalnego poziomu oraz środki ogólnej kontroli jakości

5.4.1.

Laboratoria muszą wykazać skuteczność metody w zakresie najwyższego dopuszczalnego poziomu, np. 0,5-, 1- i 2-krotność najwyższego dopuszczalnego poziomu wraz z akceptowalną wartością współczynnika zmienności obliczonego dla wielokrotnych powtórzeń analizy podczas procedury walidacji oraz podczas rutynowej analizy.

5.4.2.

W ramach wewnątrzlaboratoryjnej kontroli jakości należy regularnie przeprowadzać ślepe próby i badania z wykorzystaniem próby wzbogaconej lub analizy próbek kontrolnych (zwłaszcza certyfikowanych materiałów referencyjnych, jeżeli materiały takie są dostępne). Wykresy kontroli jakości dla ślepych prób, badań z wykorzystaniem próby wzbogaconej lub analiz próbek kontrolnych należy rejestrować i kontrolować, aby upewnić się, że skuteczność analityczna jest zgodna z wymaganiami.

5.5.    Granica oznaczalności

5.5.1.

W przypadku bioanalitycznej metody przesiewowej ustanowienie granicy oznaczalności (LOQ) nie jest niezbędnym wymogiem, ale należy dowieść, że metoda pozwala na rozróżnienie między ślepą próbą a wartością odcięcia. Podając poziom BEQ, należy ustalić poziom zgłaszania, aby uwzględnić próbki wykazujące odpowiedź poniżej tego poziomu. Należy wykazać, że poziom zgłaszania jest różny od procedury ślepej próby co najmniej o współczynnik 3 przy odpowiedzi poniżej zakresu roboczego. W związku z powyższym należy go obliczyć z próbek zawierających związki docelowe w granicach wymaganego poziomu minimalnego, a nie ze współczynnika S/N lub ze ślepej próby.

5.5.2.

Granica oznaczalności (LOQ) dla metody potwierdzającej powinna wynosić ok. jednej piątej najwyższego dopuszczalnego poziomu.

5.6.    Kryteria analityczne

Dla uzyskania wiarygodnych wyników metodą potwierdzającą lub przesiewową, w zakresie najwyższego dopuszczalnego poziomu należy spełnić poniższe kryteria dla wartości, odpowiednio, TEQ lub BEQ, niezależnie od tego, czy są oznaczane jako całkowita wartość TEQ czy całkowita wartość BEQ (jako suma PCDD/F i dioksynopodobnych PCB), czy oddzielnie dla PCDD/F i dioksynopodobnych PCB:

5.7.    Szczegółowe wymagania dotyczące metod przesiewowych

5.7.1.

W metodach przesiewowych można stosować zarówno metody GC-MS, jak i metody bioanalityczne. W przypadku metod GC-MS zastosowanie mają wymagania ustanowione w pkt 6. W przypadku metod bioanalitycznych opierających się na oznaczeniach komórkowych zastosowanie mają szczegółowe wymogi ustanowione w pkt 7.

5.7.2.

Laboratoria stosujące metody przesiewowe do rutynowej kontroli próbek muszą nawiązać ścisłą współpracę z laboratoriami stosującymi metodę potwierdzającą.

5.7.3.

Weryfikacja skuteczności metody przesiewowej jest wymagana podczas rutynowej analizy w drodze kontroli jakości analizy i walidacji metody podczas analizy. Należy prowadzić ciągły program kontroli wyników ujemnych.

5.7.4.

Należy sprawdzać, czy nie zachodzi ewentualne tłumienie odpowiedzi komórek i cytotoksyczności: 20 % ekstraktów próbek należy analizować rutynowo metodą przesiewową z dodanym 2,3,7,8-TCDD i bez, zgodnym z najwyższym dopuszczalnym poziomem lub poziomem reagowania, aby sprawdzić, czy odpowiedź jest ewentualnie tłumiona przez substancje przeszkadzające obecne w ekstrakcie próbki. Zmierzone stężenie próbki wzbogaconej należy porównać do sumy stężenia ekstraktu próbki niewzbogaconej i stężenia wzbogacenia. Jeżeli zmierzone stężenie jest o ponad 25 % niższe niż obliczone (zsumowane) stężenie, wskazuje to na ewentualne tłumienie sygnału, a odpowiednia próbka musi zostać przekazana do analizy metodą potwierdzającą GC/HRMS. Wyniki należy monitorować na wykresach kontroli jakości.

5.7.5.

Kontrola jakości próbek ujemnych Około 2–10 % próbek ujemnych, zależnie od matrycy próbki i doświadczenia laboratorium, należy potwierdzić metodą GC/HRMS.

5.7.6.

Oznaczenie wskaźnika ilości wyników fałszywie ujemnych z danych kontroli jakości Należy oznaczyć wskaźnik ilości wyników fałszywie ujemnych z badań przesiewowych próbek poniżej i powyżej najwyższego dopuszczalnego poziomu lub poziomu reagowania. Wskaźnik rzeczywistej ilości wyników fałszywie ujemnych nie może przekraczać 5 %. Po uzyskaniu co najmniej 20 potwierdzonych wyników na matrycę/grupę matryc z kontroli jakości próbek ujemnych należy z tej bazy danych wyciągnąć wnioski dotyczące wskaźnika ilości wyników fałszywie ujemnych. Do tych 20 wyników w celu oceny wskaźnika ilości wyników fałszywie ujemnych można także włączyć wyniki uzyskane na próbkach analizowanych w badaniach biegłości lub podczas przypadków wystąpienia zanieczyszczenia, obejmujące zakres stężeń do np. 2-krotności najwyższego dopuszczalnego poziomu. Próbki powinny obejmować najczęstsze profile kongenerów, reprezentujące różne źródła. Chociaż badania przesiewowe powinny mieć na celu wykrywanie próbek przekraczających poziom reagowania, kryterium określania wskaźnika ilości wyników fałszywie ujemnych jest najwyższy dopuszczalny poziom, przy uwzględnieniu niepewności rozszerzonej pomiaru metody potwierdzającej.

5.7.7.

Ewentualne dodatnie wyniki próbek z badania przesiewowego muszą zawsze zostać zweryfikowane za pomocą pełnej ponownej analizy oryginalnej próbki laboratoryjnej z zastosowaniem metody potwierdzającej. Próbki te mogą być też zastosowane do oceny odsetka wyników fałszywie dodatnich. W przypadku metod przesiewowych częstość wyników fałszywie dodatnich to odsetek wyników potwierdzonych jako ujemne metodą potwierdzającą, które we wcześniejszych badaniach przesiewowych były uznane za potencjalnie dodatnie. Ocena korzyści metody przesiewowej powinna być oparta na porównaniu próbek fałszywie dodatnich z całkowitą liczbą sprawdzonych próbek. Częstość ta musi być na tyle niska, aby stosowanie narzędzia przesiewowego było korzystne.

5.7.8.

Metody bioanalityczne w warunkach walidacji muszą dostarczyć wiarygodnego wskazania poziomu TEQ, obliczonego i wyrażonego jako BEQ. Także w przypadku metod bioanalitycznych przeprowadzanych w powtarzalnych warunkach wewnątrzlaboratoryjny RSDr byłby zwykle niższy niż w warunkach odtwarzalności RSDR.

6.    Szczegółowe wymagania dotyczące technik GC-MS w metodach przesiewowych lub potwierdzających

6.1.    Dopuszczalne różnice między wynikami WHO-TEQ uzyskanymi metodą granicy oznaczalności i metodą zerową

Do celów potwierdzenia, że zostały przekroczone najwyższe dopuszczalne poziomy lub, w razie potrzeby, poziomy reagowania, różnica między wynikiem uzyskanym metodą granicy oznaczalności a wynikiem uzyskanym metodą zerową nie powinna przekraczać 20 %.

6.2.    Kontrola poziomów odzysku

6.2.1.

Rozpoczynając analizę, np. przed ekstrakcją, należy dodać wzorce wewnętrzne PCDD/F z atomami chloru w pozycjach 2,3,7,8 i znakowanych izotopem węgla 13C, oraz wzorce wewnętrzne dioksynopodobnych PCB znakowanych izotopem węgla 13C w celu walidacji procedury analitycznej. Dodaje się co najmniej jeden kongener dla każdej grupy homologicznej, od tetra- do oktachlorowanego PCDD/F oraz co najmniej 1 kongener dla każdej grupy homologicznej dioksynopodobnych PCB (alternatywnie, co najmniej 1 kongener na każdy wyselekcjonowany jon widma masowego, rejestrujący funkcję służącą do monitorowania PCDD/F i dioksynopodobnych PCB). W przypadku metod potwierdzających należy zastosować wszystkie siedemnaście wzorców wewnętrznych PCDD/F z atomami chloru w pozycjach 2,3,7,8 i znakowanych izotopem węgla 13C oraz wszystkie dwanaście wzorców wewnętrznych dioksynopodobnych PCB znakowanych izotopem węgla 13C.

6.2.2.

Dla tych kongenerów, dla których nie zastosowano analogów znakowanych izotopem węgla 13C, należy również oznaczyć względne współczynniki odpowiedzi przez zastosowanie odpowiednich roztworów kalibracyjnych.

6.2.3.

W przypadku paszy pochodzenia roślinnego i paszy pochodzenia zwierzęcego zawierających mniej niż 10 % tłuszczu dodawanie wzorców wewnętrznych przed ekstrakcją jest obowiązkowe. W przypadku paszy pochodzenia zwierzęcego zawierającej więcej niż 10 % tłuszczu wzorce wewnętrzne mogą zostać dodane przed albo po ekstrakcji tłuszczu. Zależnie od etapu, na którym wprowadza się wzorce wewnętrzne, należy dokonać właściwej walidacji skuteczności ekstrakcji.

6.2.4.

Przed analizą GC-MS należy dodać 1 lub 2 wzorce odzysku.

6.2.5.

Konieczna jest kontrola odzysku. W przypadku metody potwierdzającej odzysk poszczególnych wzorców wewnętrznych musi mieścić się w zakresie od 60 do 120 %. Dopuszczalne są niższe lub wyższe wartości odzysku dla poszczególnych kongenerów, w szczególności dla niektórych hepta- i oktachlorowanych dibenzo-p-dioksyn i dibenzofuranów, jeżeli ich udział w wartości TEQ nie przekracza 10 % całkowitej wartości TEQ (na podstawie PCDD/F oraz dioksynopodobnych PCB). W przypadku metod przesiewowych GC-MS odzysk powinien miesić się w zakresie od 30 do 140 %.

6.3.    Usuwanie substancji przeszkadzających

6.4.    Kalibracja przy zastosowaniu krzywej wzorcowej

Zakres krzywej wzorcowej musi obejmować odpowiednie zakresy najwyższych dopuszczalnych poziomów lub poziomów reagowania.

6.5.    Szczegółowe kryteria dla metod potwierdzających

7.    Szczegółowe wymagania dotyczące metod bioanalitycznych

Metody bioanalityczne są to metody oparte na zasadach biologicznych, np. oznaczenia wykorzystujące hodowle komórkowe, receptor lub testy immunologiczne. W pkt 7 ustanowiono ogólne wymogi dla metod bioanalitycznych.

Metoda przesiewowa zasadniczo pozwala zaklasyfikować próbkę jako ujemną lub podejrzaną o bycie dodatnią. W tym celu obliczony poziom BEQ jest porównywany z wartością odcięcia (zob. pkt 7.3). Próbki poniżej wartości odcięcia są uznawane za ujemne, a próbki równe wartości odcięcia lub ją przekraczające – za podejrzane o bycie dodatnimi i wymagające analizy metodą potwierdzającą. W praktyce poziom BEQ odpowiadający 2/3 najwyższego dopuszczalnego poziomu może posłużyć jako wartość odcięcia, pod warunkiem że zapewnione są: wskaźnik liczby wyników fałszywie ujemnych poniżej 5 % i dopuszczalny wskaźnik wyników fałszywie dodatnich. Przy odrębnych najwyższych dopuszczalnych poziomach dla PCDD/F i dla sumy PCDD/F i dioksynopodobnych PCB sprawdzanie zgodności próbek bez frakcjonowania wymaga odpowiednich wartości odcięcia testu biologicznego dla PCDD/F. Jako wartość odcięcia do sprawdzenia próbek przekraczających poziomy reagowania wystarcza odpowiedni odsetek danego poziomu reagowania.

Jeśli orientacyjny poziom jest wyrażony w BEQ, wyniki próbek muszą być w zakresie roboczym i przekraczać poziom zgłaszania (zob. pkt 7.1.1 i 7.1.6).

7.1.    Ocena czułości badania

7.1.1.    Wymagania ogólne

7.1.2.    Kalibracja

7.1.2.1.   Kalibracja przy zastosowaniu krzywej wzorcowej

7.1.2.2.   Kalibracja przy zastosowaniu próbek referencyjnych

Alternatywnie można zastosować krzywą wzorcową przygotowaną na co najmniej 4 próbkach referencyjnych (zob. pkt 7.2.4): jedna ślepa próbka matrycowa plus trzy próbki referencyjne o wartości 0,5-, 1- i 2-krotnego najwyższego dopuszczalnego poziomu lub poziomu reagowania), eliminując potrzebę korekty o próbkę ślepą i odzysk, jeżeli właściwości matrycy próbek referencyjnych odpowiadają właściwościom nieznanych próbek. W takim przypadku czułość badania odpowiadającą 2/3 najwyższego dopuszczalnego poziomu (zob. pkt 7.3) można obliczyć bezpośrednio z tych próbek i zastosować jako wartość odcięcia. Dla sprawdzenia próbek przekraczających poziomy reagowania jako wartość odcięcia wystarcza odpowiedni odsetek tych poziomów reagowania.

7.1.3.    Oddzielne oznaczanie PCDD/F i dioksynopodobnych PCB

Ekstrakty można rozdzielać na frakcje zawierające PCDD/F i dioksynopodobne PCB, umożliwiając oddzielne oznaczanie poziomów TEQ dla PCDD/F i dioksynopodobnych PCB (wyrażonych w BEQ). Do oceny wyników dla frakcji zawierającej dioksynopodobne PCB najlepiej zastosować standardową krzywą wzorcową PCB 126.

7.1.4.    Odzysk testu biologicznego

„Odzysk testu biologicznego” należy obliczyć na odpowiednich próbkach referencyjnych z reprezentatywnymi profilami kongenerów w granicach najwyższego dopuszczalnego poziomu lub poziomu reagowania i wyrazić jako odsetek poziomu BEQ w porównaniu do poziomu TEQ. Zależnie od typu badania i zastosowanych TEF ( 27 ) różnice między czynnikami TEF i REP dla dioksynopodobnych PCB mogą spowodować niski odzysk dla dioksynopodobnych PCB w porównaniu z PCDD/F. Dlatego, jeżeli przeprowadzane jest odrębne oznaczenie PCDD/F i dioksynopodobnych PCB, odzysk testu biologicznego powinien wynosić: dla dioksynopodobnych PCB: 20–60 %, dla PCDD/F: 50–130 % (zakresy stosowane są do krzywej wzorcowej TCDD). Ponieważ udział dioksynopodobnych PCB w sumie PCDD/F i dioksynopodobnych PCB może różnić się zależnie od różnych matryc i próbek, odzyski testu biologicznego dla sumy PCDD/F i dioksynopodobnych PCB odzwierciedlają te zakresy i powinny wynosić od 30 do 130 %. Każda znaczna zmiana wartości TEF w przepisach unijnych w odniesieniu do PCDD/F i dioksynopodobnych PCB wymaga zmiany tych zakresów.

7.1.5.    Kontrola poziomów odzysku na potrzeby oczyszczania

Podczas walidacji należy sprawdzić stratę związków podczas oczyszczania. Ślepą próbkę wzbogaconą mieszaniną różnych kongenerów należy przekazać do oczyszczania (co najmniej n = 3), a odzysk i zmienność sprawdzić metodą potwierdzającą. Odzysk powinien wynosić od 60 do 120 % szczególnie dla kongenerów mających ponad 10 % udział w poziomie TEQ w różnych mieszaninach.

7.1.6.    Poziom zgłaszania

Przy zgłaszaniu poziomów BEQ należy określić poziom zgłaszania na odpowiednich próbkach matrycy, obejmujących typowe profile kongenerów, ale nie z krzywej wzorcowej wzorców ze względu na niską precyzję w dolnym zakresie krzywej. Należy uwzględnić wpływy z ekstrakcji i oczyszczania. Poziom zgłaszania należy ustalić co najmniej o współczynnik 3 powyżej ślepej próbki proceduralnej.

7.2.    Stosowanie próbek referencyjnych

7.2.1.

Próbki referencyjne reprezentują matrycę próbki, profile kongenerów i zakresy stężeń dla PCDD/F i dioksynopodobnych PCB w granicach najwyższego dopuszczalnego poziomu lub poziomu reagowania.

7.2.2.

Do każdej serii badań włącza się ślepą próbę matrycową lub, jeżeli to niemożliwe, ślepą próbę proceduralną oraz próbkę referencyjną na najwyższym dopuszczalnym poziomie lub na poziomie reagowania. Próbki te muszą zostać ekstrahowane i zbadane w tym samym czasie w identycznych warunkach. Próbka referencyjna musi dawać wyraźnie podwyższoną odpowiedź w porównaniu ze ślepą próbą, gwarantując w ten sposób przydatność badania. Próbki te można zastosować do korekty ślepej próby i korekty odzysku.

7.2.3.

Próbki referencyjne wybrane do przeprowadzenia korekty odzysku muszą być reprezentatywne dla próbek badanych, co oznacza, że profile kongenerów nie mogą prowadzić do niedoszacowania poziomów.

7.2.4.

Można włączyć dodatkowe próbki referencyjne zawierające np. 0,5- i 2-krotność najwyższego dopuszczalnego poziomu lub poziomu reagowania, aby wykazać właściwą skuteczność badania – w zakresie zainteresowania – do celów kontroli najwyższego dopuszczalnego poziomu lub poziomu reagowania. Próbki te można zastosować łącznie do obliczania poziomów BEQ w próbkach badanych (zob. pkt 7.1.2.2).

7.3.    Oznaczenie wartości odcięcia

Należy ustalić relację między wynikami bioanalitycznymi wyrażonymi w BEQ a wynikami metody potwierdzającej wyrażonymi w TEQ (np. w drodze eksperymentów kalibracji przy zastosowaniu dopasowanej matrycy, z użyciem próbek referencyjnych wzbogaconych o 0-, 0,5-, 1- i 2-krotność najwyższego dopuszczalnego poziomu przy 6 powtórzeniach na każdym poziomie (n = 24). Z tej relacji można oszacować współczynniki korekcji (ślepa próba i odzysk), jednak należy je sprawdzić zgodnie z pkt 7.2.2.

Wartości odcięcia należy ustalić dla decyzji o zgodności próbki z najwyższymi dopuszczalnymi poziomami lub dla celów kontroli poziomów reagowania, jeżeli ma to znaczenie, przy odpowiednich najwyższych dopuszczalnych poziomach lub poziomach reagowania ustanowionych dla PCDD/F i dla dioksynopodobnych PCB osobno albo dla sumy PCDD/F i dioksynopodobnych PCB. Są one reprezentowane przez dolną granicę rozkładu wyników bioanalitycznych (skorygowaną o wynik badania próbki ślepej i odzysk), odpowiadającą decyzyjnej wartości granicznej metody potwierdzającej w oparciu o 95 % poziom ufności, zakładając wskaźnik liczby wyników fałszywie ujemnych na poziomie < 5 % oraz RSDR < 25 %. Decyzyjna wartość graniczna metody potwierdzającej to najwyższy dopuszczalny poziom, przy uwzględnieniu niepewności rozszerzonej pomiaru.

Wartość odcięcia (w BEQ) można obliczyć według jednego ze sposobów podanych w pkt 7.3.1, 7.3.2 oraz 7.3.3 (zob. rysunek 1).

7.3.1.

Zastosowanie dolnego pasma 95 % przedziału predykcji przy decyzyjnej wartości granicznej metody potwierdzającej gdzie: BEQDL wartość BEQ odpowiadająca decyzyjnej wartości granicznej metody potwierdzającej będącej najwyższym dopuszczalnym poziomem, przy uwzględnieniu niepewności rozszerzonej pomiaru sy,x odchylenie standardowe reszt t α,f = m-2 czynnik Studenta (α = 5 %, f = stopnie swobody, jednostronne) m całkowita liczba punktów kalibracji (indeks j) n liczba powtórzeń na każdym poziomie xi stężenie próbki (w TEQ) w punkcie kalibracji i określone metodą potwierdzającą średnia stężeń (w TEQ) wszystkich próbek kalibracji parametr kwadratu sumy, i = indeks punktu kalibracji i

7.3.2.

Obliczenie z wyników bioanalitycznych (skorygowanych o próbkę ślepą i odzysk) wielokrotnych analiz próbek (n≥ 6) zanieczyszczonych na poziomie decyzyjnej wartości granicznej metody potwierdzającej, jako dolna granica dystrybucji danych przy odpowiadającej średniej wartości BEQ: Wartość odcięcia = BEQDL – 1,64 × SDR gdzie: SDR odchylenie standardowe wyników testu biologicznego przy BEQDL, mierzone w warunkach odtwarzalności wewnątrzlaboratoryjnej

7.3.3.

Obliczenie jako średniej wartości wyników bioanalitycznych (w BEQ, skorygowanych o próbę ślepą i odzysk) z wielokrotnej analizy próbek (n ≥ 6) zanieczyszczonych na poziomie 2/3 najwyższego dopuszczalnego poziomu lub poziomu reagowania, oparte na obserwacji, że ten poziom będzie mieścił się w granicach odcięcia oznaczonych zgodnie z pkt 7.3.1 lub 7.3.2: Obliczenie wartości odcięcia w oparciu o 95 % przedział ufności przy założeniu wskaźnika ilości wyników fałszywie ujemnych na poziomie < 5 % oraz RSDR < 25 %: 1)  z dolnego pasma 95 % przedziału predykcji przy poziomie decyzyjnej wartości granicznej metody potwierdzającej; 2)  z wielokrotnych analiz próbek (n ≥ 6) zanieczyszczonych na poziomie decyzyjnej wartości granicznej metody potwierdzającej, jako dolna granica dystrybucji danych (reprezentowana na rysunku przez krzywą dzwonową) przy odpowiadającej średniej wartości BEQ. Rysunek 1

7.3.4.

Ograniczenia wartości odcięcia: Wartości odcięcia oparte na BEQ obliczone z RSDR uzyskanego podczas walidacji przy zastosowaniu ograniczonej liczby próbek o różnych profilach matryc/kongenerów mogą przekraczać najwyższe dopuszczalne poziomy lub poziomy reagowania oparte na TEQ ze względu na lepszą precyzję niż precyzja osiągana rutynowo, kiedy trzeba kontrolować nieznane spektrum możliwych profili kongenerów. W takich przypadkach wartości odcięcia należy obliczać z RSDR = 25 % lub należy wybrać 2/3 wartości najwyższego dopuszczalnego poziomu lub poziomu reagowania.

7.4.    Parametry skuteczności metody

7.4.1.

Ponieważ w metodach bioanalitycznych niemożliwe jest stosowanie wzorców wewnętrznych, należy przeprowadzić badania powtarzalności metod bioanalitycznych pozwalające na uzyskanie informacji o odchyleniu standardowym w obrębie jednej serii badań i między tymi seriami. Powtarzalność powinna być na poziomie poniżej 20 %, a odtwarzalność wewnątrzlaboratoryjna – poniżej 25 %. Wyniki te powinny opierać się na obliczonych poziomach w BEQ po korekcie próby ślepej i odzysku.

7.4.2.

Jako część procesu walidacji należy wykazać, że badania pozwalają na odróżnienie między próbą ślepą a poziomem wartości odcięcia, umożliwiając identyfikację próbek powyżej odpowiadającej wartości odcięcia (zob. pkt 7.1.2).

7.4.3.

Należy zdefiniować docelowe związki, możliwe interferencje oraz najwyższy dopuszczalny poziom sygnału próby ślepej.

7.4.4.

Procent odchylenia standardowego w odpowiedzi lub stężeniu obliczonym z odpowiedzi (możliwy tylko w zakresie roboczym) potrójnego oznaczenia ekstraktu próbki nie może przekraczać 15 %.

7.4.5.

Do oceny skuteczności metody bioanalitycznej w stałym okresie należy zastosować nieskorygowane wyniki próbek referencyjnych wyrażone w BEQ (próbka ślepa i najwyższy dopuszczalny poziom lub poziom reagowania).

7.4.6.

Wykresy kontroli jakości dla ślepej próbki proceduralnej i każdego typu próbki referencyjnej należy zarejestrować i sprawdzić, aby upewnić się, że skuteczność analityczna jest zgodna z wymogami, w szczególności ślepych próbek proceduralnych w odniesieniu do wymaganej minimalnej różnicy między dolną granicą zakresu roboczego oraz dla próbek referencyjnych w odniesieniu do odtwarzalności wewnątrzlaboratoryjnej. Ślepe próbki proceduralne muszą być dobrze kontrolowane, aby uniknąć wyników fałszywie ujemnych podczas odejmowania.

7.4.7.

Należy zgromadzić wyniki z analizy metodami potwierdzającymi podejrzanych próbek oraz 2–10 % próbek ujemnych (co najmniej 20 próbek na matrycę) i zastosować je do oceny skuteczności metody przesiewowej oraz związku między BEQ i TEQ. Tę bazę danych można zastosować do ponownej oceny wartości odcięcia stosowanej do rutynowych próbek dla zwalidowanych matryc.

7.4.8.

Skuteczność metody można także wykazać przez uczestnictwo w badaniach biegłości. Wyniki z próbek analizowanych w badaniach biegłości, obejmujących zakres stężeń do np. 2-krotności najwyższego dopuszczalnego poziomu, mogą zostać włączone do oceny wskaźnika ilości wyników fałszywie ujemnych, jeżeli laboratorium jest w stanie wykazać skuteczność metody. Próbki powinny obejmować najczęstsze profile kongenerów, reprezentujące różne źródła.

7.4.9.

Podczas incydentów można ponownie ocenić wartości odcięcia odzwierciedlające konkretne profile matryc i kongenerów danego incydentu.

8.    Przedstawianie wyników

8.1.    Metody potwierdzające

8.1.1.

Wyniki analiz muszą zawierać poziomy poszczególnych kongenerów PCDD/F i dioksynopodobnych PCB, przy czym podaje się wartości TEQ zgodnie z metodą zerową, metodą granicy oznaczalności i metodą połowy granicy oznaczalności, aby zawrzeć w sprawozdaniu na temat wyników maksymalną ilość informacji i umożliwić tym samym dokonanie interpretacji wyników zgodnie z konkretnymi wymaganiami.

8.1.2.

Sprawozdanie takie musi zawierać opis metody zastosowanej do ekstrakcji PCDD/F i dioksynopodobnych PCB.

8.1.3.

Należy udostępnić poziomy odzysku poszczególnych wzorców wewnętrznych, jeżeli te poziomy odzysku znajdują się poza zakresem, o którym mowa w pkt 6.2.5, lub gdy przekroczono najwyższy dopuszczalny poziom (w tym przypadku wartości odzysku dla jednej z dwóch analiz powtórnych), a w pozostałych przypadkach na żądanie.

8.1.4.

Ponieważ przy ustalaniu zgodności próbki uwzględnia się niepewność rozszerzoną pomiaru, należy podać ten parametr. W związku z powyższym wyniki badań należy podawać jako x +/– U, gdzie x oznacza wynik analizy, a U niepewność rozszerzoną pomiaru, przy zastosowaniu współczynnika rozszerzenia 2, co daje poziom ufności około 95 %. W przypadku odrębnego oznaczania PCDD/F i dioksynopodobnych PCB należy zastosować sumę szacowanej niepewności rozszerzonej dla odrębnych wyników analitycznych dla PCDD/F i dioksynopodobnych PCB w odniesieniu do sumy PCDD/F i dioksynopodobnych PCB.

8.1.5.

Wyniki należy wyrazić w tych samych jednostkach i z co najmniej tą samą liczbą cyfr znaczących, co najwyższe dopuszczalne poziomy określone w dyrektywie 2002/32/WE.

8.2.    Bioanalityczne metody przesiewowe

8.2.1.

Wynik badań przesiewowych wyrażany jest jako ujemny lub podejrzany o bycie dodatnim („podejrzany”).

8.2.2.

Ponadto można podać orientacyjny wynik dla PCDD/F lub dla dioksynopodobnych PCB wyrażony w BEQ, a nie w TEQ.

8.2.3.

Próbki dające odpowiedź poniżej poziomu zgłaszania należy oznaczyć jako „poniżej poziomu zgłaszania”. Próbki dające odpowiedź powyżej zakresu roboczego wskazuje się jako „przekraczające zakres roboczy”, a poziom odpowiadający górnej granicy zakresu roboczego podaje się w BEQ.

8.2.4.

W sprawozdaniu, dla każdego typu matrycy próbki, należy podać najwyższy dopuszczalny poziom lub poziom reagowania, na którym opiera się ocena.

8.2.5.

W sprawozdaniu należy podać zastosowany rodzaj badania, podstawowe zasady badania i rodzaj kalibracji.

8.2.6.

Sprawozdanie takie musi zawierać opis metody zastosowanej do ekstrakcji PCDD/F i dioksynopodobnych PCB.

8.2.7.

W przypadku próbek podejrzanych o bycie dodatnimi, sprawozdanie musi zawierać uwagę o działaniach, jakie należy podjąć. Stężenie PCDD/F oraz sumy PCDD/F i dioksynopodobnych PCB w próbkach, które zawierają ich podwyższone poziomy, trzeba oznaczyć lub potwierdzić przy zastosowaniu metody potwierdzającej.

8.2.8.

Wyniki dodatnie zgłasza się wyłącznie w wyniku analizy potwierdzającej.

8.3.    Fizykochemiczne metody przesiewowe

8.3.1.

Wynik badań przesiewowych wyrażany jest jako ujemny lub podejrzany o bycie dodatnim („podejrzany”).

8.3.2.

W sprawozdaniu, dla każdego typu matrycy próbki, należy podać najwyższy dopuszczalny poziom lub poziom reagowania, na którym opiera się ocena.

8.3.3.

Ponadto można podać poziomy poszczególnych kongenerów PCDD/F i dioksynopodobnych PCB oraz wartości TEQ przedstawione zgodnie z metodą zerową, metodą granicy oznaczalności i metodą połowy granicy oznaczalności. Wyniki należy wyrazić w tych samych jednostkach i z co najmniej tą samą liczbą cyfr znaczących, co najwyższe dopuszczalne poziomy określone w dyrektywie 2002/32/WE.

8.3.4.

Należy udostępnić poziomy odzysku poszczególnych wzorców wewnętrznych, jeżeli te poziomy odzysku znajdują się poza zakresem, o którym mowa w pkt 6.2.5, lub gdy przekroczono najwyższy dopuszczalny poziom (w tym przypadku wartości odzysku dla jednej z dwóch analiz powtórnych), a w pozostałych przypadkach na żądanie.

8.3.5.

W sprawozdaniu należy podać zastosowaną metodę GC-MS.

8.3.6.

Sprawozdanie takie musi zawierać opis metody zastosowanej do ekstrakcji PCDD/F i dioksynopodobnych PCB.

8.3.7.

W przypadku próbek podejrzanych o bycie dodatnimi, sprawozdanie musi zawierać uwagę o działaniach, jakie należy podjąć. Stężenie PCDD/F oraz sumy PCDD/F i dioksynopodobnych PCB w próbkach, które zawierają ich podwyższone poziomy, trzeba oznaczyć lub potwierdzić przy zastosowaniu metody potwierdzającej.

8.3.8.

Niezgodność można stwierdzić dopiero po przeprowadzeniu analizy potwierdzającej.

ROZDZIAŁ III

Przygotowanie próbek i wymagania dotyczące metod analizy stosowanych w urzędowej kontroli poziomów niedioksynopodobnych PCB w paszy

1.    Zakres stosowania

Wymogi ustanowione w niniejszym rozdziale należy stosować w przypadku paszy analizowanej do celów urzędowych kontroli poziomów niedioksynopodobnych PCB oraz w odniesieniu do przygotowywania próbek oraz wymogów analitycznych do innych celów regulacyjnych, co obejmuje kontrole wykonywane przez podmiot działający na rynku pasz w celu zapewnienia zgodności z przepisami rozporządzenia (WE) nr 183/2005.

2.    Możliwe metody oznaczania

Chromatografia gazowa/detekcja wychwytu elektronów (GC-ECD), GC-LMRS, GC-MS/MS, GC-HRMS lub metody równoważne.

3.    Identyfikacja i potwierdzenie analitów będących przedmiotem zainteresowania

3.1.	Względny czas retencji w stosunku do wzorców wewnętrznych lub referencyjnych (akceptowane odchylenia +/– 0,25 %).

3.2.	Rozdzielenie metodą chromatografii gazowej niedioksynopodobnych PCB od substancji przeszkadzających, przede wszystkich wymywających PCB, w szczególności jeżeli poziomy próbek mieszczą się w zakresie granic ustanowionych w przepisach i jeżeli należy potwierdzić niezgodność ( 28 ).

3.3.

Wymagania dla technik GC-MS Monitorowanie co najmniej następującej liczby jonów molekularnych lub jonów charakterystycznych w klastrze molekularnym: a)  dwóch jonów o specyficznej wartości dla HRMS; b)  trzech jonów o specyficznej wartości dla LRMS; c)  dwóch określonych jonów macierzystych, z których każdy posiada jeden określony odpowiadający mu przejściowy jon potomny dla MS-MS. Najwyższa dopuszczalna tolerancja dla stosunków nadmiaru dla wybranych fragmentów mas: Względne odchylenie stosunku nadmiaru wybranych fragmentów mas z teoretycznego nadmiaru lub wzorca kalibracji dla jonu docelowego (monitorowany najbardziej nadmiarowy jon) i jonów kwalifikowanych: ± 15 %.

3.4.	Wymagania dla technik GC-ECD Potwierdzenie wyników przekraczających najwyższy dopuszczalny poziom przy pomocy dwóch kolumn GC z fazami stacjonarnymi o różnej polarności.

4.    Wykazanie skuteczności metody

Walidacja skuteczności metody w zakresie najwyższego dopuszczalnego poziomu (0,5- do 2-krotności najwyższego dopuszczalnego poziomu) przy akceptowanym współczynniku zmienności dla powtarzanej analizy (zob. wymagania dotyczące precyzji pośredniej w pkt 9).

5.    Granica oznaczalności

Suma LOQ ( 29 ) niedioksynopodobnych PCB nie może być wyższa niż jedna trzecia najwyższego dopuszczalnego poziomu ( 30 ).

6.    Kontrola jakości

Regularne analizy próbki ślepej, analiza próbek wzbogaconych, próbki do kontroli jakości, uczestnictwo w międzylaboratoryjnych badaniach odpowiednich matryc.

7.    Kontrola poziomów odzysku

7.1.	Stosowanie właściwych wzorców wewnętrznych o właściwościach fizycznych i chemicznych porównywalnych z właściwościami analitów będących przedmiotem zainteresowania.

7.2.	Dodanie wzorców wewnętrznych: dodanie do produktów (przed ekstrakcją i oczyszczaniem).

7.3.

Wymagania dla metod z wykorzystaniem wszystkich sześciu kongenerów niedioksynopodobnych PCB znakowanych izotopowo: a)  korekta wyników dla poziomów odzysku wzorców wewnętrznych; b)  poziomy odzysku wzorców wewnętrznych znakowanych izotopowo muszą mieścić się między 60 a 120 %; c)  akceptuje się niższe lub wyższe poziomy odzysku dla poszczególnych kongenerów, których udział w sumie niedioksynopodobnych PCB wynosi poniżej 10 %.

7.4.

Wymagania dla metod niewykorzystujących wszystkich sześciu wzorców wewnętrznych znakowanych izotopowo ani innych wzorców wewnętrznych: a)  kontrola odzysku wzorców wewnętrznych dla każdej próbki; b)  poziomy odzysku wzorców wewnętrznych między 60 a 120 %; c)  korekta wyników dla poziomów odzysku wzorców wewnętrznych.

7.5.	Poziomy odzysku kongenerów nieznakowanych należy sprawdzić przez próbki wzbogacone lub kontrolę jakości próbek o stężeniach w zakresie najwyższego dopuszczalnego poziomu. Poziomy odzysku tych kongenerów należy uznać za akceptowalne, jeżeli mieszczą się pomiędzy 60 a 120 %.

8.    Wymagania dotyczące laboratoriów

Zgodnie z przepisami rozporządzenia (WE) nr 882/2004 laboratoria muszą być akredytowane przez uznany organ działający zgodnie z wytyczną ISO 58, aby zapewnić, że przy przeprowadzaniu analiz stosują system zapewniania jakości. Laboratoria muszą posiadać akredytację zgodną z normą EN ISO/IEC 17025. Ponadto w stosownych przypadkach należy stosować zasady opisane w wytycznych technicznych dotyczących szacowania niepewności pomiaru i granic oznaczalności w odniesieniu do analizy PCB ( 31 ).

9.    Parametry skuteczności metody: kryteria dla sumy niedioksynopodobnych PCB na najwyższym dopuszczalnym poziomie

10.    Przedstawianie wyników

10.1.

Wyniki analiz muszą zawierać poziomy poszczególnych niedioksynopodobnych PCB oraz sumę kongenerów tych PCB przedstawionych zgodnie z metodą zerową, metodą granicy oznaczalności i metodą połowy granicy oznaczalności, aby zawrzeć w sprawozdaniu na temat wyników maksymalną ilość informacji i umożliwić tym samym dokonanie interpretacji wyników zgodnie z konkretnymi wymaganiami.

10.2.

Sprawozdanie takie musi zawierać opis metody zastosowanej do ekstrakcji PCB.

10.3.

Należy udostępnić poziomy odzysku poszczególnych wzorców wewnętrznych, jeżeli te poziomy odzysku znajdują się poza zakresem, o którym mowa w pkt 7, lub gdy przekroczono najwyższy dopuszczalny poziom, a w pozostałych przypadkach na żądanie.

10.4.

Ponieważ przy ustalaniu zgodności próbki uwzględnia się niepewność rozszerzoną pomiaru, należy podać również ten parametr. W związku z powyższym wyniki badań należy podawać jako x +/– U, gdzie x oznacza wynik analizy, a U niepewność rozszerzoną pomiaru, przy zastosowaniu współczynnika rozszerzenia 2, co daje poziom ufności około 95 %.

10.5.

Wyniki należy wyrazić w tych samych jednostkach i z co najmniej tą samą liczbą cyfr znaczących, co najwyższe dopuszczalne poziomy określone w dyrektywie 2002/32/WE.

▼M2

---

ZAŁĄCZNIK VI

METODY ANALIZY DOTYCZĄCE OZNACZANIA SKŁADNIKÓW POCHODZENIA ZWIERZĘCEGO DO CELÓW URZĘDOWEJ KONTROLI PASZ

1.   CEL I ZAKRES

Składniki pochodzenia zwierzęcego w paszach oznacza się metodą mikroskopii świetlnej lub łańcuchową reakcją polimerazy (PCR), zgodnie z przepisami określonymi w niniejszym załączniku.

Te dwie metody umożliwiają wykrycie występowania składników pochodzenia zwierzęcego w materiałach paszowych i mieszankach paszowych. Nie umożliwiają one jednak obliczenia ilości takich składników w materiałach paszowych i mieszankach paszowych. W przypadku obu metod granica wykrywalności wynosi poniżej 0,1 % (w/w).

Metoda PCR umożliwia określenie grupy taksonomicznej składników pochodzenia zwierzęcego obecnych w materiałach paszowych i mieszankach paszowych.

Metody te stosuje się do kontroli stosowania zakazów ustanowionych w art. 7 ust. 1 i w załączniku IV do rozporządzenia (WE) nr 999/2001 oraz w art. 11 ust. 1 rozporządzenia (WE) nr 1069/2009.

W zależności od rodzaju badanej paszy metody te mogą być stosowane, w ramach jednego protokołu operacyjnego, samodzielnie albo wspólnie, zgodnie ze standardowymi procedurami operacyjnymi, ustanowionymi przez laboratorium referencyjne UE ds. białek zwierzęcych w paszach (EURL-AP) i opublikowanymi na jego stronie internetowej ( 32 ).

2.   METODY

2.1.    Metoda mikroskopii świetlnej

2.1.1.    ►M7  Zasada

Składniki pochodzenia zwierzęcego, które mogą być obecne w materiałach paszowych i mieszankach paszowych przesłanych do analizy, są identyfikowane na podstawie typowych i mikroskopowo identyfikowalnych cech charakterystycznych, np. włókien mięśniowych i innych cząstek tkanki mięsnej, chrząstki, kości, rogów, włosów, szczeciny, krwi, globulek mleka, kryształów laktozy, piór, skorup jaj, ości ryb i łusek. ◄

2.1.2.    Odczynniki i sprzęt

2.1.2.1.   Odczynniki

2.1.2.1.1.   Odczynnik zagęszczający

2.1.2.1.1.1.   Tetrachloroetylen (gęstość 1,62)

2.1.2.1.2.   Odczynnik barwiący

2.1.2.1.2.1.

Roztwór czerwieni alizarynowej (rozcieńczyć 2,5 ml 1 M kwasu chlorowodorowego w 100 ml wody i dodać do tego roztworu 200 mg czerwieni alizarynowej)

2.1.2.1.3.   Środki zamykające

2.1.2.1.3.1.   Ług (NaOH 2,5 %, w/v lub KOH 2,5 %, w/v)

2.1.2.1.3.2.    ►M7  Glicerol (nierozcieńczony, lepkość: 1 490 cP) lub środek zamykający o równoważnych właściwościach do przygotowania nietrwałych preparatów mikroskopowych ◄

2.1.2.1.3.3.   Norland ® Optical Adhesive 65 (lepkość: 1 200 cP) lub żywica o równoważnych właściwościach do przygotowania trwałych preparatów mikroskopowych

2.1.2.1.4.   Środki zamykające o właściwościach barwiących

2.1.2.1.4.1.

Płyn Lugola (rozpuścić 2 g jodku potasu w 100 ml wody i dodać 1 g jodu, często wstrząsając)

2.1.2.1.4.2.

Odczynnik cystynowy (2 g octanu ołowiu, 10 g NaOH/100 ml wody)

2.1.2.1.4.3.

Odczynnik Fehlinga (sporządzony przed użyciem z równych części (1/1) roztworów podstawowych A i B. Roztwór A: rozpuścić 6,9 g pentahydratu siarczanu miedzi(II) w 100 ml wody. Roztwór B: rozpuścić 34,6 g tetrahydratu winianu potasowo-sodowego i 12 g NaOH w 100 ml wody)

2.1.2.1.4.4.

Tetrametylobenzydyna/nadtlenek wodoru. (rozpuścić 1 g 3,3’,5,5’ tetrametylobenzydyny (TMB) w 100 ml kwasu octowego lodowatego i 150 ml wody. Przed użyciem zmieszać 4 części tego roztworu TMB z 1 częścią 3 % nadtlenku wodoru)

2.1.2.1.5.   Odczynniki chemiczne do płukania

2.1.2.1.5.1.   Etanol ≥ 96 % (techniczny)

2.1.2.1.5.2.   Aceton (techniczny)

2.1.2.1.6.   Odczynnik bielący

2.1.2.1.6.1.   Handlowy roztwór podchlorynu sodowego (9–14 % aktywnego chloru)

2.1.2.2.   Sprzęt

2.1.2.2.1.   Waga analityczna ważąca z dokładnością do 0,001 g

2.1.2.2.2.    ►M7  Sprzęt do rozdrabniania: nóż lub młynek wirnikowy. Jeżeli stosowany jest młynek wirnikowy, sita do młynka ≤ 0,5 mm są zakazane ◄

2.1.2.2.3.    ►M7  Sita o kwadratowych oczkach o szerokości 0,25 mm i 1 mm. Z wyjątkiem wstępnego przesiewu próbki średnica sit nie powinna przekraczać 10 cm, aby uniknąć strat materiałów. Kalibracja sit nie jest wymagana ◄

2.1.2.2.4.

Szklany stożkowy rozdzielacz o pojemności 250 ml z kranem z teflonu lub szkła szlifowanego u podstawy stożka. Średnica otworu kranu musi wynosić ≥ 4 mm. Alternatywnie można użyć zlewki osadowej ze stożkowym dnem, pod warunkiem że laboratorium wykazało, iż poziomy wykrywalności są równoważne z poziomami uzyskanymi przy użyciu szklanego rozdzielacza. Rozdzielacz

2.1.2.2.5.

Mikroskop stereoskopowy umożliwiający powiększenie końcowe w zakresie co najmniej 6,5×–40×

2.1.2.2.6.

Mikroskop złożony, z jasnym polem widzenia, umożliwiający powiększenie końcowe w zakresie co najmniej 100×–400×. Dodatkowo można wykorzystać światło spolaryzowane i kontrast interferencyjno-różniczkowy

2.1.2.2.7.

Standardowe szkło laboratoryjne

2.1.2.2.8.

Sprzęt do przygotowania preparatów mikroskopowych: podstawowe szkiełka mikroskopowe, szkiełka podstawowe z wgłębieniem, szkiełka nakrywkowe (20 × 20 mm), pincety, cienka łopatka

▼M7

2.1.2.2.9.

Suszarka laboratoryjna

2.1.2.2.10.

Wirówka

2.1.2.2.11.

Bibuła filtracyjna: filtr celulozowy jakościowy (rozmiar porów 4–11 μm)

▼M2

2.1.3.    Pobieranie i przygotowywanie próbek

2.1.3.1.    ►M7  Pobieranie próbek

Należy użyć reprezentatywnej próbki, pobranej zgodnie z przepisami określonymi w załączniku I do niniejszego rozporządzenia. ◄

2.1.3.2.   Niezbędne środki ostrożności

W celu uniknięcia w laboratorium zanieczyszczenia krzyżowego wszelki sprzęt wielokrotnego użytku należy starannie czyścić przed użyciem. Części rozdzielacza muszą być demontowane przed czyszczeniem. Części rozdzielacza oraz szkło laboratoryjne należy wstępnie wymyć ręcznie, a następnie wymyć w zmywarce. Sita czyści się z użyciem szczotki o twardym syntetycznym włosiu. Po przesianiu substancji tłuszczowej, np. mączki rybnej, zaleca się ostateczne czyszczenie sit acetonem i sprężonym powietrzem.

2.1.3.3.   Przygotowanie próbek innych niż tłuszczu lub oleju

2.1.3.3.1.

►M7  Suszenie próbek: próbki o wilgotności > 14 % muszą być przed obróbką wysuszone zgodnie z załącznikiem III do niniejszego rozporządzenia. ◄

2.1.3.3.2.

►M7  Wstępny przesiew próbki: w celu zebrania informacji na temat możliwego zanieczyszczenia środowiskowego pasz zaleca się wstępne przesianie pasz granulowanych i ziarnistych przez sito o oczkach 1 mm, a następnie przygotowanie i analizę dwóch uzyskanych frakcji, które należy traktować jako odrębne próbki, i przedstawienie wyników dotyczących tych dwóch frakcji. ◄

2.1.3.3.3.

Pobieranie podpróbek i rozdrabnianie: z co najmniej 50 g próbki należy utworzyć podpróbkę do analizy, a następnie rozdrobnić.

2.1.3.3.4.

Ekstrakcja i przygotowanie osadu: porcję rozdrobnionej podpróbki o masie 10 g (z dokładnością do 0,01 g) umieszcza się w rozdzielaczu lub zlewce osadowej ze stożkowym dnem i dodaje się 50 ml tetrachloroetylenu. Porcję umieszczoną w rozdzielaczu ogranicza się do 3 g w przypadku mączki rybnej lub innych czystych produktów zwierzęcych, składników mineralnych lub premiksów, które wytwarzają więcej niż 10 % osadu. Mieszaniną należy wstrząsać energicznie przez co najmniej 30 s i ostrożnie dodać co najmniej kolejne 50 ml tetrachloroetylenu, zmywając wewnętrzną powierzchnię rozdzielacza, aby usunąć wszelkie przylegające cząstki. Otrzymaną mieszaninę należy pozostawić na co najmniej 5 minut przed oddzieleniem osadu poprzez otwarcie kranu. W przypadku użycia zlewki osadowej ze stożkowym dnem mieszaninę należy energicznie mieszać przez co najmniej 15 sekund, a wszelkie cząstki przylegające do ścianek zlewki należy ostrożnie zmyć z wewnętrznej powierzchni, stosując co najmniej 10 ml czystego tetrachloroetylenu. Mieszaninę należy pozostawić na 3 minuty, a następnie mieszać ponownie przez 15 sekund, a wszelkie cząstki przylegające do ścianek zlewki należy ostrożnie zmyć z wewnętrznej powierzchni, stosując co najmniej 10 ml czystego tetrachloroetylenu. Otrzymaną mieszaninę należy pozostawić na co najmniej 5 minut, a następnie usunąć płynną frakcję poprzez staranną dekantację, przy czym należy uważać, aby nie utracić części osadu. ▼M7 Osad należy zebrać na bibule filtracyjnej umieszczonej w lejku, aby umożliwić oddzielenie pozostałego trójchloroetylenu, unikając osadzania się tłuszczu w osadzie. Osad należy osuszyć. Zaleca się następnie zważyć osad (z dokładnością do 0,001 g) w celu kontroli etapu sedymentacji. Na koniec osad należy przesiać przez sito o oczkach 0,25 mm i zbadać dwie uzyskane frakcje, chyba że przesiewania nie uznaje się za konieczne. ▼M2

2.1.3.3.5.

Ekstrakcja i przygotowanie flotatu: po odzyskaniu osadu metodą opisaną powyżej, w rozdzielaczu powinny pozostać dwie fazy: faza płynna składająca się z tetrachloroetylenu oraz faza stała utworzona z materiału flotacyjnego. Ta faza stała jest flotatem i należy ją odzyskać poprzez całkowite odlanie tetrachloroetylenu z rozdzielacza przez otwarcie kranu. Poprzez odwrócenie rozdzielacza flotat przenosi się na dużą płytkę Petriego i suszy powietrzem w okapie wyciągowym. Jeżeli więcej niż 5 % flotatu stanowią cząstki > 0,50 mm, należy go przesiać przez sito o oczkach 0,25 mm i zbadać dwie uzyskane frakcje.

2.1.3.3.6.

Przygotowanie surowca: należy przygotować co najmniej 5 g porcję rozdrobnionej podpróbki. Jeżeli więcej niż 5 % materiału stanowią cząstki > 0,50 mm, należy go przesiać przez sito o oczkach 0,25 mm i zbadać dwie uzyskane frakcje.

2.1.3.4.   Przygotowanie próbek składających się z tłuszczu lub oleju

Do przygotowania próbek składających się z tłuszczu lub oleju stosuje się następujący protokół:

2.1.3.5.   Stosowanie odczynników barwiących

W celu ułatwienia poprawnej identyfikacji składników pochodzenia zwierzęcego, podczas przygotowania próbki laborant może używać odczynników barwiących zgodnie z wytycznymi wydanymi przez EURL-AP i opublikowanymi na jego stronie internetowej.

W przypadku użycia do barwienia osadu roztworu czerwieni alizarynowej stosuje się następujący protokół:

2.1.4.    Badanie mikroskopowe

2.1.4.1.   Przygotowanie preparatów

▼M7

Preparaty mikroskopowe przygotowuje się z osadu i, w zależności od wyboru laboranta, z flotatu albo z surowca.

▼M2

Należy przygotować wystarczającą liczbę preparatów w celu zapewnienia pełnej realizacji protokołu badawczego określonego w pkt 2.1.4.2.

Preparaty mikroskopowe montuje się przy użyciu odpowiedniego środka zamykającego zgodnie ze standardową procedurą operacyjną ustaloną przez EURL-AP i opublikowaną na jego stronie internetowej. Preparaty należy przykryć szkiełkami nakrywkowymi.

▼M7

2.1.4.2.   Diagram obserwacji w celu wykrycia cząstek zwierzęcych w mieszankach paszowych i materiałach paszowych

Preparaty mikroskopowe bada się zgodnie z diagramami obserwacji określonymi na schematach 1 i 2.

Przy użyciu mikroskopu złożonego przeprowadza się obserwację mikroskopową osadu i, w zależności od wyboru laboranta, flotatu lub surowca. W przypadku frakcji gruboziarnistych poza mikroskopem złożonym można dodatkowo użyć mikroskopu stereoskopowego. Każdy preparat należy obserwować w całości, stosując różne powiększenia. Szczegółowe wyjaśnienia dotyczące sposobu korzystania z diagramów obserwacji są szczegółowo określone w standardowej procedurze operacyjnej ustalonej przez EURL-AP i opublikowanej na jego stronie internetowej.

Należy ściśle przestrzegać minimalnej liczby preparatów, jakie zgodnie z diagramami obserwacji należy obserwować na każdym etapie, chyba że cały podzielony na frakcje materiał nie pozwala osiągnąć wymaganej liczby preparatów, na przykład w przypadku, gdy nie uzyskano osadu. Nie można stosować więcej niż 6 preparatów na jedno oznaczenie do rejestrowania liczby cząstek stałych.

Jeżeli sporządza się dodatkowe preparaty na flotacie lub na surowcu z zastosowaniem bardziej specyficznego środka zamykającego o właściwościach barwiących, określonego w pkt 2.1.2.1.4, aby dokładniej scharakteryzować struktury (np. pióra, włosy, cząstki tkanki mięsnej i krwi), które wykryto przy pomocy innych środków zamykających, określonych w pkt 2.1.2.1.3, liczba cząstek stałych jest liczona na podstawie liczby preparatów na jedno oznaczenie, nieprzekraczającej 6, z uwzględnieniem dodatkowych preparatów z bardziej specyficznym środkiem zamykającym.

W celu ułatwienia identyfikacji rodzaju oraz pochodzenia cząstek laborant może wykorzystać narzędzia pomocnicze, takie jak systemy wspomagające podejmowanie decyzji, biblioteki obrazów oraz próbki referencyjne.

Schemat 1
Diagram obserwacji w celu wykrycia cząstek zwierzęcych w mieszankach paszowych i materiałach paszowych na potrzeby pierwszego oznaczenia
(D1 i D2 odnoszą się do pierwszego i drugiego oznaczenia; *: kręgowce lądowe, ryby)

Schemat 2
Diagram obserwacji w celu wykrycia cząstek zwierzęcych w mieszankach paszowych i materiałach paszowych na potrzeby drugiego oznaczenia
(D1 i D2 odnoszą się do pierwszego i drugiego oznaczenia; *: kręgowce lądowe, ryby)

▼M2

2.1.4.3.    ►M7  Liczba oznaczeń

Oznaczenia wykonuje się na różnych podpróbkach o masie po 50 g każda.

Jeżeli w wyniku pierwszego oznaczenia wykonanego zgodnie z diagramem obserwacji przedstawionym na schemacie 1 nie wykryto żadnej cząstki zwierzęcej, dodatkowe oznaczanie nie jest konieczne, a wynik analizy przekazuje się, stosując terminologię określoną w pkt 2.1.5.1.

Jeżeli w wyniku pierwszego oznaczenia wykonanego zgodnie z diagramem obserwacji przedstawionym na schemacie 1 wykryto cząstkę zwierzęcą lub cząstki zwierzęce danego rodzaju (tj. kręgowca lądowego lub ryby), a rodzaj wykrytych cząstek potwierdza deklarowaną zawartość próbki, drugie oznaczenie nie jest konieczne. Jeżeli liczba cząstek zwierzęcych danego rodzaju wykrytych podczas pierwszego oznaczenia jest wyższa niż 5, wynik analizy przekazuje się dla każdego rodzaju zwierzęcia oddzielnie, stosując terminologię określoną w pkt 2.1.5.3. W przeciwnym wypadku wynik analizy przekazuje się dla każdego rodzaju zwierzęcia oddzielnie, stosując terminologię określoną w pkt 2.1.5.2.

W innych przypadkach, w tym gdy do laboratorium nie dostarczono żadnej deklaracji zawartości, przeprowadza się drugie oznaczenie z nowej podpróbki.

Jeżeli w wyniku drugiego oznaczenia wykonanego zgodnie z diagramem obserwacji przedstawionym na schemacie 2 suma cząstek zwierzęcych danego rodzaju wykrytych podczas dwóch oznaczeń jest wyższa niż 10, wynik analizy przekazuje się dla każdego rodzaju zwierzęcia oddzielnie, stosując terminologię określoną w pkt 2.1.5.3. W przeciwnym wypadku wynik analizy przekazuje się dla każdego rodzaju zwierzęcia oddzielnie, stosując terminologię określoną w pkt 2.1.5.2. ◄

2.1.5.    ►M7  Przedstawianie wyników

Przekazując wyniki, laboratorium musi podać, jakiego typu materiał poddano analizie (osad, flotat czy surowiec). W sprawozdaniu należy wyraźnie wskazać, ile oznaczeń wykonano oraz czy nie przeprowadzono przesiewu frakcji przed sporządzeniem preparatu zgodnie z pkt 2.1.3.3.4 akapit ostatni.

Sprawozdanie laboratoryjne musi zawierać co najmniej informacje o występowaniu składników pochodzących z kręgowców lądowych i z ryb.

Sprawozdania dotyczące poszczególnych przypadków należy składać w następujący sposób.

2.2.    PCR

2.2.1.    Zasada

Fragmenty kwasu deoksyrybonukleinowego (DNA) pochodzenia zwierzęcego, które mogą się znajdować w materiałach paszowych i mieszankach paszowych, wykrywa się techniką amplifikacji genów stosując metodę PCR skierowaną na sekwencje DNA charakterystyczne dla określonych gatunków.

Metoda PCR wymaga w pierwszej kolejności etapu ekstrakcji DNA. Otrzymany w ten sposób ekstrakt DNA poddaje się później amplifikacji w celu wykrycia gatunków zwierząt uwzględnianych w badaniu.

2.2.2.    Odczynniki i sprzęt

2.2.2.1.   Odczynniki

2.2.2.1.1.   Odczynniki stosowane na etapie ekstrakcji DNA

Można stosować wyłącznie odczynniki zatwierdzone przez EURL-AP i wymienione na jego stronie internetowej.

2.2.2.1.2.   Odczynniki stosowane na etapie amplifikacji genów

2.2.2.1.2.1.   Startery i sondy

Można stosować wyłącznie startery i sondy z sekwencjami oligonukleotydów zatwierdzone przez EURL-AP ( 34 ).

2.2.2.1.2.2.   Master Mix

Można stosować wyłącznie roztwory Master Mix niezawierające odczynników, które mogłyby prowadzić do fałszywych wyników z uwagi na obecność DNA zwierzęcego ( 35 ).

2.2.2.1.2.3.   Odczynniki odkażające

2.2.2.1.2.3.1.   Roztwór kwasu chlorowodorowego (0,1 N).

2.2.2.1.2.3.2.   Środek bielący (roztwór podchlorynu sodowego zawierający 0,15 % aktywnego chloru)

2.2.2.1.2.3.3.   Odczynniki niewykazujące działania żrącego do odkażania kosztownych urządzeń, takich jak wagi analityczne (np. DNA EraseTM produkowany przez MP Biomedicals)

2.2.2.2.   Sprzęt

2.2.2.2.1.   Waga analityczna ważąca z dokładnością do 0,001 g

2.2.2.2.2.   Sprzęt do rozdrabniania

2.2.2.2.3.   Termocykler do przeprowadzania PCR w czasie rzeczywistym,

2.2.2.2.4.   Mikrowirówka do mikroprobówek

2.2.2.2.5.   Zestaw mikropipet umożliwiających odmierzanie od 1 μl do 1 000 μl

2.2.2.2.6.

Standardowe wyroby z tworzywa sztucznego stosowane w laboratorium biologii molekularnej: mikroprobówki, końcówki z tworzywa sztucznego do mikropipet, z filtrem, płytki nadające się do termocyklera.

2.2.2.2.7.

Zamrażarki do przechowywania próbek i odczynników

2.2.3.    Pobieranie i przygotowywanie próbek

2.2.3.1.   Pobieranie próbek

Należy użyć reprezentatywnej próbki, pobranej zgodnie z przepisami określonymi w załączniku I.

2.2.3.2.   Przygotowanie próbek

Przygotowanie próbek laboratoryjnych do ekstrakcji DNA musi być zgodne z wymaganiami określonymi w załączniku II. Z co najmniej 50 g próbki należy utworzyć podpróbkę do analizy, a następnie rozdrobnić.

Próbki przygotowuje się w pomieszczeniu innym niż przeznaczone do ekstrakcji DNA i reakcji amplifikacji genów zgodnie z opisem w normie ISO 24276.

Należy przygotować dwie naważki o wadze co najmniej 100 mg każda.

2.2.4.    Ekstrakcja DNA

Ekstrakcję DNA przeprowadza się dla każdej naważki zgodnie ze standardową procedurą operacyjną ustaloną przez EURL-AP i opublikowaną na jego stronie internetowej.

Dla każdej serii ekstrakcji należy przygotować dwa kontrolne roztwory ekstrakcyjne zgodnie z opisem w normie ISO 24276.

2.2.5.    Amplifikacja genów

Amplifikację genów przeprowadza się przy użyciu metod zatwierdzonych dla każdego gatunku wymagającego identyfikacji. Metody te określono w standardowej procedurze operacyjnej ustalonej przez EURL-AP i opublikowanej na jego stronie internetowej. Każdy ekstrakt DNA powinien być analizowany w dwóch różnych rozcieńczeniach w celu oceny inhibicji.

Dwa kontrolne roztwory amplifikacji przygotowuje się dla każdego gatunku docelowego, zgodnie z opisem w normie ISO 24276.

2.2.6.    Interpretacja i przedstawianie wyników

Przekazując wyniki laboratorium musi podać co najmniej wagę użytych naważek, zastosowaną metodę ekstrakcji, liczbę wykonanych oznaczeń oraz granicę wykrywalności metody.

Wyniki nie mogą być interpretowane i przekazywane jeżeli dodatni kontrolny roztwór ekstrakcyjny DNA i dodatnie kontrolne roztwory docelowego DNA nie dają dodatnich wyników w odniesieniu do badanego celu, podczas gdy kontrolny roztwór odczynnika do amplifikacji jest ujemny.

W przypadku gdy wyniki otrzymane z dwóch naważek nie są zgodne, należy powtórzyć co najmniej etap amplifikacji genów. Jeżeli laboratorium podejrzewa, że powodem niezgodności mogą być ekstrakty DNA, przeprowadza się ponowną ekstrakcję DNA, a przed interpretacją wyników należy przeprowadzić amplifikację genów.

Ostateczne wyrażenie wyników należy oprzeć na integracji i interpretacji wyników otrzymanych z dwóch naważek zgodnie ze standardową procedurą operacyjną ustaloną przez EURL-AP i opublikowaną na jego stronie internetowej.

2.2.6.1.   Wynik ujemny

Wynik ujemny przekazuje się w następujący sposób:

W badanej próbce nie wykryto DNA X (gdzie X oznacza gatunek zwierząt lub grupę gatunków zwierząt, które stanowią przedmiot analizy).

2.2.6.2.   Wynik dodatni

Wynik dodatni przekazuje się w następujący sposób:

W badanej próbce wykryto DNA X (gdzie X oznacza gatunek zwierząt lub grupę gatunków zwierząt, które stanowią przedmiot analizy).

▼B

---

ZAŁĄCZNIK VII

METODA OBLICZANIA WARTOŚCI ENERGETYCZNEJ PASZ DLA DROBIU

1.   Metoda obliczania i wyrażania wartości energetycznej

Wartość energetyczna mieszanek paszowych dla drobiu musi być obliczana zgodnie ze wzorem określonym poniżej, na podstawie procentowej zawartości niektórych składników analitycznych paszy. Wartość ta musi być wyrażana w megadżulach (MJ) energii metabolicznej (EM), skorygowanej azotem, na kilogram mieszanki paszowej:

MJ/kg EM = 0,1551 × % białka surowego + 0,3431 × % tłuszczu surowego + 0,1669 × % skrobi + 0,1301 × % całkowitej zawartości cukru (wyrażonego jako sacharoza).

2.   Tolerancje mające zastosowanie do podawanych wartości

Jeżeli urzędowa kontrola wykaże rozbieżność (wyższą lub niższą wartość energetyczną paszy) między wynikiem kontroli a podaną wartością energetyczną, dopuszczalna jest tolerancja minimalna wynosząca 0,4 MJ/kg EM.

3.   Wyrażanie wyników

Wynik otrzymany po zastosowaniu podanego powyżej wzoru należy podawać z dokładnością do jednego miejsca po przecinku.

4.   Pobieranie próbek i metody analizy

Pobieranie próbek mieszanki paszowej oraz określanie zawartości składników analitycznych wskazanych w metodzie obliczania muszą odbywać się odpowiednio zgodnie ze wspólnotowymi metodami pobierania próbek oraz metodami analizy dla urzędowej kontroli pasz.

Należy stosować następujące metody:

---

ZAŁĄCZNIK VIII

METODY ANALIZY DO CELÓW KONTROLI NIELEGALNEJ OBECNOŚCI W PASZACH DODATKÓW, KTÓRE JUŻ NIE SĄ DOPUSZCZONE

A.   OZNACZANIE METYLOBENZOQUATU

7-benzyloksy-6-butylo-3-metoksykarbonylo-4-chinolon

1.   Cel i zakres stosowania metody

Metoda służy do oznaczania zawartości metylobenzoquatu w paszach. Granica oznaczalności wynosi 1 mg/kg.

2.   Sposób przeprowadzenia metody

Metylobenzoquat ekstrahuje się z próbki metanolowym roztworem kwasu metanosulfonowego. Ekstrakt oczyszcza się dwuchlorometanem metodą chromatografii jonowymiennej, a następnie ponownie dwuchlorometanem. Zawartość metylobenzoquatu jest oznaczana metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej z odwróconą fazą (HPLC) z użyciem detektora UV.

3.   Odczynniki i roztwory

Mieszanina metanolu, o którym mowa w 3.2, i wody do HPLC, w stosunku 75 + 25 (v+v).

Przefiltrować przez filtr 0,22 μm (4.5) i odgazować roztwór, np. przy zastosowaniu ultradźwięków przez 10 minut.

Rozcieńczyć 20,0 ml kwasu metanosulfonowego metanolem (3.2) do objętości 1 000 ml.

Rozcieńczyć 100 ml kwasu chlorowodorowego (ρ20 = 1,18 g/ml) wodą do objętości 1 000 ml.

Żywicę częściowo przygotowuje się przed użyciem, sporządzając zawiesinę ze 100 g żywicy i 500 ml roztworu kwasu chlorowodorowego (3.5), i ogrzewa na płycie grzewczej do wrzenia, ciągle mieszając. Pozostawić do schłodzenia i zdekantować kwasem. Przefiltrować w warunkach próżni na filtrze z bibuły. Żywicę przemyć dwukrotnie 500 ml porcjami wody, a następnie 250 ml metanolu (3.2). Żywicę przemyć ponownie 250 ml metanolu i wysuszyć, przepuszczając powietrze przez warstwę żywicy na filtrze. Wysuszoną żywicę przechowywać w zakorkowanej butelce.

Odważyć, z dokładnością do 0,1 mg, 50 mg substancji wzorcowej (3.7), rozpuścić w roztworze kwasu metanosulfonowego (3.4) w kolbie miarowej o pojemności 100 ml, uzupełnić do pełnej objętości kolby kwasem i zmieszać.

Do kolby miarowej o pojemności 50 ml przenieść 5,0 ml podstawowego roztworu wzorcowego metylobenzoquatu (3.7.1) uzupełnić do pełnej objętości kolby metanolem (3.2) i zmieszać.

Do kolb miarowych o pojemności 25 ml przenieść kolejno 1,0 , 2,0 , 3,0 , 4,0 i 5,0 ml roztworu wzorcowego pośredniego metylobenzoquatu (3.7.2). Uzupełnić do pełnej objętości kolb fazą ruchomą (3.3) i zmieszać. Roztwory te mają odpowiednio stężenia 2,0 , 4,0 , 6,0 , 8,0 i 10,0 μg/ml metylobenzoquatu. Roztwory te przygotować bezpośrednio przed użyciem.

4.   Aparatura i sprzęt

5.   Sposób postępowania

5.1.   Wskazówki ogólne

Ślepa próba paszy musi być podobna do badanej próbki, a jej analiza nie może potwierdzać obecności metylobenzoquatu.

5.2.   Ekstrakcja

Odważyć, z dokładnością do 0,01 g, 20 g przygotowanej próby i umieścić w kolbie stożkowej o pojemności 250 ml. Dodać 100,0 ml roztworu kwasu metanosulfonowego (3.4) i wstrząsać mechanicznie przy zastosowaniu wstrząsarki (4.1) przez 30 minut. Roztwór filtrować przez filtr z bibuły i zachować filtrat do rozdziału w układzie ciecz-ciecz (5.3).

5.3.   Rozdział w układzie ciecz-ciecz

Do rozdzielacza o pojemności 500 ml zawierającego 100 ml roztworu kwasu chlorowodorowego (3.5) wprowadzić 25,0 ml otrzymanego wcześniej filtratu (5.2). Dodać 100 ml dwuchlorometanu (3.1) i wstrząsać przez minutę. Pozostawić do rozdzielenia się warstw, a następnie dolną warstwę (dwuchlorometanową) spuścić do kolby okrągłodennej o pojemności 500 ml. Powtórzyć ekstrakcję fazy wodnej, dodając 2 porcje 40 ml dwuchlorometanu, i połączyć je z pierwszym ekstraktem w kolbie okrągłodennej. Odparować ekstrakt dwuchlorometanu do sucha na próżniowej wyparce rotacyjnej (4.2) przy zmniejszonym ciśnieniu w temperaturze 40 oC. Pozostałość rozpuścić w 20 do 25 ml metanolu (3.2), zamknąć kolbę i zachować całość ekstraktu do chromatografii jonowymiennej (5.4).

5.4.   Chromatografia jonowymienna

5.4.1.    Przygotowanie kolumny kationowowymiennej

Dolny koniec kolumny szklanej (4.3) zatkać zwitkiem waty szklanej. Przygotować zawiesinę 5,0 g żywicy kationitowowymiennej (3.6) i 50 ml roztworu kwasu chlorowodorowego (3.5). Wlać ją do kolumny i pozostawić do ustabilizowania się. Zlać nadmiar kwasu znad powierzchni żywicy i przemywać kolumnę wodą do obojętnego odczynu wycieku wobec lakmusu. Przenieść 50 ml metanolu (3.2) do kolumny i pozwolić, aby przesączył się do powierzchni żywicy.

5.4.2.    Chromatografia kolumnowa

Filtrat uzyskany w sposób, o którym mowa w pkt 5.3, przenieść ostrożnie pipetą do kolumny. Kolbę okrągłodenną przemyć 2 porcjami od 5 do 10 ml metanolu (3.2), a następnie roztwór z przemycia nanieść na kolumnę. Poczekać aż ekstrakt dojdzie do powierzchni żywicy, następnie przemyć kolumnę 50 ml metanolu, tak aby prędkość wzbierania ekstraktu nie była wyższa niż 5 ml na minutę. Wyciek odrzucić. Metylobenzoquat wymyć z kolumny przy użyciu 150 ml roztworu kwasu metanosulfonowego (3.4) i zebrać eluent w kolbie stożkowej o pojemności 250 ml.

5.5.   Rozdział w układzie ciecz-ciecz

Eluent otrzymany w sposób określony w pkt 5.4.2 przenieść do rozdzielacza o pojemności 1 l. Przemyć kolbę stożkową od 5 do 10 ml metanolu (3.2) i roztwór po przemyciu dołączyć do zawartości rozdzielacza. Dodać 300 ml roztworu kwasu chlorowodorowego (3.5) i 130 ml dwuchlorometanu (3.1). Wstrząsać przez minutę i pozostawić do rozdzielenia faz. Dolną warstwę (dwuchlorometan) przenieść do kolby okrągłodennej o pojemności 500 ml. Powtórzyć ekstrakcję fazy wodnej następnymi 2 porcjami 70 ml dwuchlorometanu i ekstrakty dołączyć do zawartości pierwszej kolby okrągłodennej.

Ekstrakt dwuchlorometanu odparować do sucha na próżniowej wyparce rotacyjnej (4.2) przy zmniejszonym ciśnieniu w temperaturze 40 oC. Pozostałość rozpuścić w kolbie zawierającej około 5 ml metanolu (3.2) i roztwór przenieść ilościowo do kolby miarowej o pojemności 10 ml. Przemyć dwa razy kolbę okrągłodenną następnymi 2 porcjami od 1 do 2 ml metanolu, a następnie przenieść do kolby miarowej. Uzupełnić do pełnej objętości kolby metanolem i zmieszać. Podzielna część jest filtrowana przez filtr membranowy (4.6). Roztwór zachować do oznaczania HPLC (5.6).

5.6.   Oznaczanie HPLC

5.6.1.    Parametry

Poniższe parametry podano jako przykładowe; inne parametry mogą być zastosowane, o ile gwarantują otrzymanie równoważnych wyników:

Sprawdzić stabilność układu chromatograficznego, dozując kilkakrotnie roztwór kalibracyjny (3.7.3) zawierający 4 μg/ml, aż do ustalenia stałych wysokości (powierzchni) piku i czasów retencji.

5.6.2.    Krzywa kalibracyjna

Zadozować kilka razy każdy z kalibracyjnych roztworów (3.7.3) i określić wysokości (powierzchnie) piku dla każdego stężenia. Wykreślić krzywą kalibracyjną, odkładając średnie wysokości (powierzchnie) pików kalibracyjnych roztworów na osi rzędnych oraz odpowiadające im stężenia w μg/ml na osi odciętych.

5.6.3.    Badany roztwór próbki

Zadozować kilka razy ekstrakt próbki (5.5) stosując taką samą objętość jak przy roztworach kalibracyjnych, i wyznaczyć średnią wysokość (powierzchnię) piku metylobenzoquatu.

6.   Obliczanie wyników

Na podstawie średniej wysokości (powierzchni) pików metylobenzoquatu roztworu próbki określić stężenie roztworu próbki w μg/ml, odnosząc się do krzywej kalibracyjnej (5.6.2).

Zawartość metylobenzoquatu w (mg/kg) w próbce oblicza się według następującego wzoru:

gdzie:

c

=

stężenie metylobenzoquatu w g/ml w roztworze próbki

m

=

masa naważki w g

7.   Sprawdzenie metody

7.1.   Sprawdzanie tożsamości

Tożsamość analitu może być potwierdzona przez kochromatografię lub zastosowanie detektora diodowego, przy użyciu którego porównuje się widma ekstraktu próbki i roztworu kalibracyjnego (3.7.3) zawierającego 10 μg/ml metylobenzoquatu.

7.1.1.    Kochromatografia

Ekstrakt próbki jest fortyfikowany przez dodanie odpowiedniej ilości pośredniego roztworu wzorcowego (3.7.2). Ilość dodanego metylobenzoquatu musi być podobna do ilości metylobenzoquatu w ekstrakcie próbki.

Po uwzględnieniu zarówno dodanej ilości, jak i stopnia rozcieńczenia ekstraktu, zwiększyć się może tylko wysokość piku metylobenzoquatu. Szerokość piku w połowie jego wysokości nie może przekraczać około 10 % pierwotnej szerokości.

7.1.2.    Detekcja diodowa

Wyniki sprawdza się według następujących kryteriów:

Jeżeli jedno z tych kryteriów nie jest spełnione, obecność analitu nie jest potwierdzona.

7.2.   Powtarzalność

Różnica pomiędzy wynikami dwóch równoległych oznaczeń wykonanych dla tej samej próbki nie może przekraczać: 10 % względem wyższego wyniku, dla zawartości metylobenzoquatu od 4 do 20 mg/kg.

7.3.   Odzysk

W przypadku fortyfikowanej ślepej próby odzysk nie może być mniejszy niż 90 %.

8.   Wyniki badań międzylaboratoryjnych

W ramach współpracy 10 laboratoriów przeprowadzono analizę pięciu próbek. Analizę każdej próbki przeprowadzono dwukrotnie.

n.w.

=

nie wykryto

sr

=

odchylenie standardowe powtarzalności

CVr

=

współczynnik zmienności powtarzalności w %

sR

=

odchylenie standardowe odtwarzalności

CVR

=

współczynnik zmienności odtwarzalności w %

B.   OZNACZANIE OLAQUINDOKSU

2-[N-2'-(hydroksyetyl)karbamoil]-3-metylochinoksalino-N1,N4-dioksyd

1.   Cel i zakres stosowania metody

Metoda służy do oznaczania zawartości olaquindoksu w paszach. Granica oznaczalności wynosi 5 mg/kg.

2.   Sposób przeprowadzenia metody

Próbka jest ekstrahowana mieszaniną wody i metanolu. Zawartość olaquindoksu jest oznaczana metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) z fazą odwróconą przy użyciu detektora UV.

3.   Odczynniki i roztwory

Mieszanina wody (3.3) i metanolu (3.2) w stosunku 900 + 100 (V + V).

Odważyć, z dokładnością do 0,1 mg, 50 mg olaquindoksu (3.5) do kolby miarowej o pojemności 200 ml i dodać około 190 ml wody. Następnie umieścić kolbę w łaźni ultradźwiękowej (4.1) na 20 minut. Po zastosowaniu ultradźwięków roztwór doprowadzić do temperatury pokojowej, uzupełnić do pełnej objętości kolby wodą i zmieszać. Przykryć kolbę folią aluminiową i przechowywać w lodówce. Roztwór należy przygotowywać raz w miesiącu.

Przenieść 10,0 ml roztworu wzorcowego podstawowego (3.5.1) do kolby miarowej o pojemności 100 ml, uzupełnić do pełnej objętości kolby fazą ruchomą (3.4) i zmieszać. Przykryć kolbę folią aluminiową i przechowywać w lodówce. Roztwór należy przygotowywać codziennie.

Do kolb miarowych o pojemności 50 ml przenieść 1,0 , 2,0 , 5,0 , 10,0 , 15,0 i 20,0 ml roztworu wzorcowego pośredniego (3.5.2). Uzupełnić do pełnej objętości kolb fazą ruchomą (3.4) i zmieszać. Przykryć kolbę folią aluminiową. Roztwory te odpowiadają odpowiednio 0,5 , 1,0 , 2,5 , 5,0 , 7,5 , i 10,0 μg olaquindoksu/ml.

Roztwory należy przygotowywać codziennie.

4.   Aparatura i sprzęt

5.   Sposób postępowania

Uwaga:

Olaquindoks jest wrażliwy na światło. Wszystkie czynności należy przeprowadzać przy ograniczonym dostępie światła lub z zastosowaniem szkła oranżowego.

5.1.   Wskazówki ogólne

Uwaga:

Ślepa próba paszy musi być podobna do badanej próbki, a jej analiza nie może potwierdzać obecności olaquindoksu.

5.2.   Ekstrakcja

Odważyć, z dokładnością do 0,01 g, 50 g próbki. Przenieść do kolby stożkowej o pojemności 1 000 ml, dodać 100 ml metanolu (3.1) i umieścić kolbę na 5 minut w łaźni ultradźwiękowej (4.1). Dodać 410 ml wody i pozostawić w łaźni ultradźwiękowej na 15 minut. Wyjąć kolbę z łaźni i wstrząsać nią przez 30 minut z użyciem wstrząsarki mechanicznej (4.2), następnie przefiltrować przez pofałdowany filtr. Przenieść 10,0 ml filtratu do kolby miarowej o pojemności 20 ml, uzupełnić do pełnej objętości kolby wodą i zmieszać. Przefiltrować podzielną część przez filtr membranowy (4.4) (zob. objaśnienia pkt 9). Przystąpić do oznaczania HPLC (5.3).

5.3.   Oznaczanie HPLC

5.3.1.    Parametry:

Poniższe parametry podano jako przykładowe; inne parametry mogą być zastosowane, o ile gwarantują otrzymanie równoważnych wyników.

Sprawdzić stabilność systemu chromatograficznego, dozując kilkakrotnie roztwór kalibracyjny (3.5.3) zawierający 2,5 μg/ml, aż do uzyskania stałych wysokości piku i czasów retencji.

5.3.2.    Krzywa kalibracyjna

Zadozować kilka razy każdy z roztworów kalibracyjnych (3.5.3) i określić średnie wysokości (powierzchnie) piku dla każdego stężenia. Wykreślić krzywą kalibracyjną, odkładając średnie wysokości (powierzchnie) pików roztworów kalibracyjnych na osi rzędnych oraz odpowiadające im stężenia w μg/ml na osi odciętych.

5.3.3.    Roztwór próbki

Zadozować kilka razy ekstrakt próbki (5.2) stosując taką samą objętość jak przy roztworach kalibracyjnych, i określić średnią wysokość (powierzchnię) piku dla pików olaquindoksu.

6.   Obliczanie wyników

Na podstawie średniej wysokości (powierzchni) pików olaquindoksu roztworu próbki określić stężenie roztworu próbki w μg/ml, odnosząc się do krzywej kalibracyjnej (5.3.2).

Zawartość olaquindoksu w próbce w mg/kg oblicza się według następującego wzoru:

gdzie:

c

=

stężenie olaquindoksu w μg/ml w ekstrakcie próbki (5.2)

m

=

masa naważki w g/ml (5.2)

7.   Sprawdzenie metody

7.1.   Sprawdzenie tożsamości

Tożsamość analitu może być potwierdzona przez kochromatografię lub zastosowanie detektora diodowego, przy użyciu którego porównuje się widma ekstraktu próbki (5.2) i roztworu kalibracyjnego (3.5.3) zawierającego 5 μg/ml olaquidoksu.

7.1.1.    Kochromatografia

Ekstrakt próbki (5.2) fortyfikuje się przez dodanie odpowiedniej ilości roztworu kalibracyjnego (3.5.3). Ilość dodanego olaquindoksu musi odpowiadać ilości olaquindoksu w ekstrakcie próbki.

Po uwzględnieniu zarówno dodanej ilości, jak i rozcieńczenia ekstraktu, zwiększyć się może tylko wysokość piku olaquindoksu. Szerokość piku w połowie jego wysokości musi mieścić się w granicach ± 10 % pierwotnej szerokości piku niefortyfikowanego ekstraktu próbki.

7.1.2.    Detekcja diodowa

Wyniki ocenia się według następujących kryteriów:

Jeżeli jedno z tych kryteriów nie jest spełnione, obecność analitu nie jest potwierdzona.

7.2.   Powtarzalność

Różnica pomiędzy wynikami dwóch równoległych oznaczeń wykonanych dla tej samej próbki nie może przekraczać 15 % najwyższego wyniku, dla zawartości olaquindoksu od 10 do 200 mg/kg.

7.3.   Odzysk

Odzysk olaquindoksu dodanego do ślepej próby paszy nie może być niższy niż 90 %.

8.   Wyniki badań międzylaboratoryjnych

We Wspólnocie Europejskiej przeprowadzono badania porównawcze, w których cztery próbki pasz dla prosiąt, w tym jedna ślepa, były analizowane przez maksymalnie 13 laboratoriów. Wyniki są podane poniżej:

L

=

liczba laboratoriów

n

=

liczba pojedynczych wartości

Sr

=

odchylenie standardowe powtarzalności

SR

=

odchylenie standardowe odtwarzalności

CVr

=

współczynnik zmienności powtarzalności

CVR

=

współczynnik zmienności odtwarzalności

9.   Objaśnienia

Metoda nie była sprawdzana dla pasz zawierających więcej niż 100 mg/kg olaquindoksu, zakłada się jednak otrzymanie zadowalających wyników poprzez zmniejszenie odważki analitycznej lub rozcieńczenie ekstraktu (5.2) w celu otrzymania stężenia w zakresie krzywej kalibracyjnej (5.3.2).

C.   OZNACZANIE AMPROLIUM

chlorowodorek chlorku 1-[(4-amino-2-propylopirymidyno-5-yl)metyl]-2-metylo-pirydyny

1.   Cel i zakres stosowania metody

Metoda służy do oznaczania zawartości amprolium w paszach i premiksach. Granica wykrywalności wynosi 1 mg/kg, granica oznaczalności wynosi 5 mg/kg.

2.   Sposób przeprowadzenia metody

Próbka jest ekstrahowana mieszaniną metanolu i wody. Po rozcieńczeniu fazą ruchomą i filtrowaniu przez filtr membranowy zawartość amprolium jest oznaczana metodą kationowo wymienną wysokosprawnej chromatografii cieczowej HPLC przy wykorzystaniu detektora UV.

3.   Odczynniki i roztwory

Rozpuścić 13,80 g monohydratu dwuwodorofosforanu sodu w wodzie (3.3) w kolbie miarowej o pojemności 1 000 ml, uzupełnić do pełnej objętości kolby wodą (3.3) i zmieszać.

Rozpuścić 224,74 g monohydratu nadchloranu sodu w wodzie (3.3) w kolbie miarowej o pojemności 1 000 ml, uzupełnić do pełnej objętości kolby wodą (3.3) i zmieszać.

Mieszanina, w stosunku 450+450+100 (v+v+v): acetonitrylu (3.2), roztworu dwuwodorofosforanu sodu (3.4), oraz roztworu nadchloranu sodu (3.5). Przed użyciem przefiltrować przez filtr membranowy 0,22 μm (4.3) i odgazować roztwór, np. przy zastosowaniu łaźni ultradźwiękowej (4.4) co najmniej przez 15 minut.

Odważyć, z dokładnością do 0,1 mg, 50 mg amprolium (3.7) do kolby miarowej o pojemności 100 ml, rozpuścić w 80 ml metanolu (3.1) i umieścić kolbę na 10 minut w łaźni ultradźwiękowej (4.4). Następnie doprowadzić roztwór do temperatury pokojowej, uzupełnić do pełnej objętości kolby wodą i zmieszać. Roztwór przechowywany w temperaturze ≤ 4 oC zachowuje stabilność nie dłużej niż miesiąc.

Przenieść pipetą 5,0 ml roztworu wzorcowego podstawowego (3.7.1) do kolby miarowej o pojemności 50 ml, uzupełnić do pełnej objętości kolby roztworem do ekstrakcji (3.8) i zmieszać. Roztwór przechowywany w temperaturze ≤ 4 oC zachowuje stabilność nie dłużej niż miesiąc.

Przenieść 0,5 , 1,0 i 2,0 ml pośredniego wzorcowego roztworu (3.7.2) do partii kolb miarowych o pojemności 50 ml. Uzupełnić do pełnej objętości kolb fazą ruchomą (3.6) i zmieszać. Roztwory odpowiadają odpowiednio 0,5 , 1,0 i 2,0 μg/ml amprolium. Roztwory sporządzić bezpośrednio przed użyciem.

Mieszanina metanolu (3.1) i wody, 2 + 1 (v + v)

4.   Aparatura i sprzęt

5.   Sposób postępowania

5.1.   Wskazówki ogólne

5.1.1.    Ślepa próba paszy

W celu zbadania odzysku (5.1.2) należy przeprowadzić analizę ślepej próby paszy, aby sprawdzić, czy nie zawiera ona amprolium ani substancji interferujących. Ślepa próba paszy musi być podobna do badanej próbki, a jej analiza nie może potwierdzać obecności amprolium lub substancji interferujących.

5.1.2    Badanie odzysku

Badanie odzysku należy przeprowadzić, analizując ślepą próbę paszy fortyfikowaną przez dodanie znanej ilości amprolium, o wadze zbliżonej do tej, która znajduje się w analizowanej próbce. Aby fortyfikować na poziomie 100 mg/kg, dodać 10,0 ml roztworu wzorcowego podstawowego (3.7.1) do kolby stożkowej o pojemności 250 ml i odparować roztwór do objętości około 0,5 ml. Dodać 50 g ślepej próby paszy, zmieszać i pozostawić na 10 minut, mieszając kilkakrotnie przed przejściem do etapu ekstrakcji (5.2).

Jeżeli nie można przeprowadzić badania ślepej próby paszy podobnej do badanej próbki (5.1.1), badanie odzysku można przeprowadzić, stosując metodę dodawania wzorca. W tym przypadku przeznaczona do analizy próbka jest fortyfikowana przez dodanie znanej ilości amprolium, o wadze zbliżonej do tej, która znajduje się w analizowanej próbce. Próbkę tę poddaje się analizie wraz z niefortyfikowaną próbką, a odzysk może być obliczony przez odjęcie od próbki fortyfikowanej masy próbki niefortyfikowanej.

5.2.   Ekstrakcja

5.2.1.    Premiksy (zawartość amprolium < 1 %) i pasze

Odważyć, z dokładnością do 0,01 g, od 5 do 40 g próbki, w zależności od zawartości amprolium, do kolby stożkowej o pojemności 500 ml i dodać 200 ml rozpuszczalnika ekstrakcyjnego (3.8). Umieścić kolbę w łaźni ultradźwiękowej (4.4) na 15 minut. Wyjąć kolbę z łaźni i wstrząsać nią przez godzinę na wstrząsarce lub mieszadle magnetycznym (4.5). Rozcieńczyć podzielną część ekstraktu fazą ruchomą (3.6) do zawartości amprolium od 0,5 do 2 μg/ml i zmieszać (zob. objaśnienia pkt 9.3). Przefiltrować od 5 do 10 ml rozcieńczonego roztworu przez filtr membranowy (4.2). Przystąpić do oznaczania HPLC (5.3).

5.2.2.    Premiksy (zawartość amprolium ≥ 1 %)

Odważyć, z dokładnością do 0,001 g, od 1 do 4 g premiksu, w zależności od zawartości amprolium, do kolby stożkowej o pojemności 500 ml, dodać 200 ml rozpuszczalnika ekstrakcyjnego (3.8). Umieścić kolbę w łaźni ultradźwiękowej (4.4) na 15 minut. Wyjąć kolbę z łaźni i wstrząsać nią przez godzinę na wstrząsarce lub mieszadle magnetycznym (4.5). Rozcieńczyć podzielną część ekstraktu fazą ruchomą (3.6) do zawartości amprolium od 0,5 do 2 μg/ml i zmieszać. Przefiltrować od 5 do 10 ml rozcieńczonego roztworu przez filtr membranowy (4.2). Przystąpić do oznaczania HPLC (5.3).

5.3.   Oznaczanie HPLC

5.3.1.    Parametry:

Poniższe parametry podano jako przykładowe; inne parametry mogą być zastosowane, o ile gwarantują otrzymanie równoważnych wyników.

Sprawdzić stabilność systemu chromatograficznego, dozując kilkakrotnie roztwór kalibracyjny (3.7.3) zawierający 1,0 μg/ml, aż do uzyskania stałych wysokości piku i czasów retencji.

5.3.2.    Krzywa kalibracyjna

Zadozować kilka razy każdy z roztworów kalibracyjnych (3.7.3) i określić średnie wysokości (powierzchnie) piku dla każdego stężenia. Wykreślić krzywą kalibracyjną, odkładając średnie wysokości (powierzchnie) pików roztworów kalibracyjnych na osi rzędnych i odpowiadające im stężenia w μg/ml na osi odciętych.

5.3.3.    Roztwór próbki

Zadozować kilka razy ekstrakt próbki (5.2), stosując taką samą objętość jak przy kalibracyjnych roztworach, i określić średnią wysokość (powierzchnię) piku dla pików amprolium.

6.   Obliczanie wyników

Na podstawie średniej wysokości (powierzchni) pików amprolium roztworu próbki określić stężenie roztworu próbki w μg/ml, odnosząc się do krzywej kalibracyjnej (5.3.2).

Zawartość amprolium w mg/kg próbki obliczyć według następującego wzoru:

[mg/kg]

gdzie:

V

=

objętość rozpuszczalnika ekstrakcyjnego w ml (3.8); zgodnie z pkt 5.2 (np. 200 ml)

c

=

stężenie amprolium w μg/ml w ekstrakcie próbki (5.2)

f

=

współczynnik rozcieńczania zgodny z pkt 5.2

m

=

masa naważki w g

7.   Sprawdzanie metody

7.1.   Sprawdzenie tożsamości

Tożsamość analitu może być potwierdzona przez kochromatografię lub zastosowanie detektora diodowego, przy użyciu którego porównuje się widma ekstraktu próbki (5.2) i roztworu kalibracyjnego (3.7.3) zawierającego 2,0 μg/ml.

7.1.1.    Kochromatografia

Ekstrakt próbki (5.2) fortyfikuje się przez dodanie odpowiedniej ilości roztworu kalibracyjnego (3.7.3). Ilość dodanego amprolium musi odpowiadać ilości amprolium znajdującego się w ekstrakcie próbki.

Po uwzględnieniu zarówno dodanej ilości, jak i rozcieńczenia ekstraktu, zwiększyć się może tylko wysokość piku amprolium. Szerokość piku w połowie jego wysokości musi mieścić się w granicach ± 10 % pierwotnej szerokości piku amprolium niefortyfikowanego ekstraktu próbki.

7.1.2.    Detekcja diodowa

Wyniki sprawdza się według następujących kryteriów:

Jeżeli jedno z tych kryteriów nie jest spełnione, obecność analitu nie jest potwierdzona.

7.2.   Powtarzalność

Różnica pomiędzy wynikami dwóch równoległych oznaczeń wykonanych dla tej samej próbki nie może przekraczać:

7.3.   Odzysk

W przypadku fortyfikacji (ślepej) próby paszy odzysk musi wynosić co najmniej 90 %.

8.   Wyniki badań międzylaboratoryjnych

W ramach współpracy kilku laboratoriów przeprowadzono analizę 3 pasz dla drobiu (próbki 1–3), paszy mineralnej (próbka 4) i premiksu (próbka 5). W poniższej tabeli podano wyniki przeprowadzonych badań.

L

=

liczba laboratoriów

n

=

liczba pojedynczych oznaczeń

sr

=

odchylenie standardowe powtarzalności

CVr

=

współczynnik zmienności powtarzalności

sR

=

odchylenie standardowe odtwarzalności

CVR

=

współczynnik zmienności odtwarzalności

9.   Objaśnienia

D.   OZNACZANIE KARBADOKSU

Metylo 3-(2-chinoksalinylometyleno)pikrynian N 1 ,N 4 -dwutlenek

1.   Cel i zakres stosowania metody

Metoda służy do oznaczania zawartości karbadoksu w paszach, premiksach i preparatach. Granica wykrywalności wynosi 1 mg/kg. Granica oznaczalności wynosi 5 mg/kg.

2.   Sposób przeprowadzenia metody

Próbka jest równoważona wodą i poddawana ekstrakcji przy użyciu mieszaniny metanolu i acetonitrylu. W przypadku pasz podzielną część przefiltrowanego ekstraktu zostaje oczyszczona na kolumnie z tlenkiem glinu. W przypadku premiksów i preparatów podzielną część przefiltrowanego ekstraktu zostaje rozcieńczona do odpowiedniego stężenia wodą, metanolem i acetonitrylem. Zawartość karbadoksu oznacza się metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej w układzie faz odwróconych (HPLC) przy użyciu detektora UV.

3.   Odczynniki i roztwory

Zmieszać 500 ml metanolu (3.1) z 500 ml acetonitrylu (3.2).

Rozcieńczyć 10 ml kwasu octowego (3.3) wodą do objętości 100 ml.

Rozpuścić 0,82 g octanu sodu (3.7) w 700 ml wody (3.8) i dostosować pH do 6 kwasem octowym (3.6). Przenieść do kolby miarowej o pojemności 1000 ml, uzupełnić do pełnej objętości kolby wodą (3.8) i zmieszać.

Zmieszać 825 ml roztworu buforu octanowego (3.9) i 175 ml acetonitrylu (3.2).

Przefiltrować przez filtr 0,22 μm (4.5) i odgazować roztwór, np. przy zastosowaniu łaźni ultradźwiękowej przez 10 minut.

Czysty karbadoks: Metylo 3-(2-chinoksalinylometyleno)pikrynianN1, N4-dwutlenek, E 850.

Odważyć, z dokładnością do 0,1 mg, 25 mg substancji wzorcowej (3.11) do kolby miarowej o pojemności 250 ml. Rozpuścić w mieszaninie metanolu i acetonitrylu (3.5) na łaźni ultradźwiękowej (4.7). Po zastosowaniu ultradźwięków doprowadzić roztwór do temperatury pokojowej, uzupełnić do pełnej objętości kolby mieszaniną metanolu i acetonitrylu (3.5) i zmieszać. Kolbę owinąć folią aluminiową lub zastosować oranżowe szklane naczynie laboratoryjne i przechowywać w lodówce. Roztwór w temperaturze ≤ 4 oC zachowuje stabilność do miesiąca.

Przenieść 2,0 , 5,0 , 10,0 i 20,0 ml roztworu wzorcowego podstawowego karbadoksu (3.11.1) do partii kolb miarowych o pojemności 100 ml. Dodać 30 ml wody, uzupełnić mieszaniną metanolu i acetonitrylu (3.5) do pełnej objętości kolb i zmieszać. Kolby owinąć folią aluminiową. Roztwory te odpowiadają odpowiednio 2,0 , 5,0 , 10,0 i 20,0 μg/ml karbadoksu.

Roztwory kalibracyjne sporządza się bezpośrednio przed użyciem.

Uwaga:

Do oznaczenia karbadoksu w paszach zawierających mniej niż 10 mg/kg sporządza się roztwory kalibracyjne o stężeniu niższym niż 2,0 μg/ml.

Zmieszać 300 ml wody z 700 ml mieszaniny metanolu i acetonitrylu (3.5).

4.   Aparatura i sprzęt

Uwaga:

Dopuszcza się użycie szklanej kolumny z kurkiem lub ze ściętym końcem i w takim przypadku w dolnym końcu umieszcza się zwitek waty szklanej, ubity szklanym prętem.

5.   Sposób postępowania

Uwaga:

Karbadoks jest wrażliwy na światło. Wszystkie czynności należy przeprowadzać przy ograniczonym dostępie światła lub z zastosowaniem szkła oranżowego lub szkła zabezpieczonego folią aluminiową.

5.1.   Wskazówki ogólne

5.1.1.    Ślepa próba paszy

Do badania odzysku (5.1.2) należy przeprowadzić analizę ślepej próby paszy w celu sprawdzenia, czy nie zawiera ona karbadoksu i substancji interferujących. Ślepa próba paszy musi być podobna do badanej próbki, a jej analiza nie może potwierdzać obecności karbadoksu i substancji interferujących.

5.1.2.    Badanie odzysku

Badanie odzysku należy przeprowadzić, analizując ślepą próbę paszy (5.1.1) fortyfikowaną przez dodanie znanej ilości karbadoksu, o wadze zbliżonej do tej, która znajduje się w próbce. Aby fortyfikować na poziomie 50 mg/kg, dodać 5,0 ml roztworu wzorcowego podstawowego karbadoksu (3.11.1) do kolby stożkowej o pojemności 200 ml. Odparować roztwór w strumieniu azotu do objętości około 0,5 ml. Dodać 10 g ślepej próby paszy, zmieszać i pozostawić na 10 minut przed przejściem do etapu ekstrakcji (5.2).

Jeżeli nie można przeprowadzić badania ślepej próby paszy podobnej do badanej próbki (zob. pkt 5.1.1) badanie odzysku można przeprowadzić, stosując metodę dodawania wzorca. W tym przypadku przeznaczona do analizy próbka jest fortyfikowana przez dodanie znanej ilości karbadoksu, o wadze zbliżonej do tej, która znajduje się w analizowanej próbce. Próbkę tę poddaje się analizie wraz z niefortyfikowaną próbką, a odzysk może być obliczony przez odjęcie od próbki fortyfikowanej masy próbki niefortyfikowanej.

5.2.   Ekstrakcja

5.2.1.    Pasze

Odważyć, z dokładnością do 0,01 g, 10 g próbki i przenieść do kolby stożkowej o pojemności 200 ml. Dodać 15,0 ml wody, zmieszać i równoważyć przez 5 minut. Dodać 35,0 ml mieszaniny metanolu i acetonitrylu (3.5), zamknąć korkiem i wstrząsać przez 30 minut z zastosowaniem wstrząsarki lub mieszadła magnetycznego (4.1). Przefiltrować roztwór przez bibułę filtracyjną z włóknem szklanym (4.2). Roztwór zachowuje się do etapu oczyszczania (5.3).

5.2.2.    Premiksy (zawartość karbadoksu od 0,1 do 2 %)

Odważyć, z dokładnością do 0,001 g, 1 g niezmielonej próbki i przenieść do kolby stożkowej o pojemności 200 ml. Dodać 15,0 ml wody, zmieszać i równoważyć przez 5 minut. Dodać 35,0 ml mieszaniny metanolu i acetonitrylu (3.5), zamknąć korkiem i wstrząsać przez 30 minut z użyciem wstrząsarki lub mieszadła magnetycznego (4.1). Przefiltrować ten roztwór przez bibułę filtracyjną z włóknem szklanym (4.2).

Pipetą przenieść podzielną część filtratu do kolby miarowej o pojemności 50 ml. Dodać 15,0 ml wody, uzupełnić do pełnej objętości kolby mieszaniną metanolu z acetonitrylem (3.5) i zmieszać. Stężenie karbadoksu w roztworze końcowym musi wynieść około 10 μg/ml. Podzielną część roztworu przefiltrować przez filtr 0,45 μm (4.6).

Przystąpić do oznaczania HPLC (5.4).

5.2.3.    Preparaty (zawartość karbadoksu > 2 %)

Odważyć, z dokładnością do 0,001 g, 0,2 g niezmielonej próbki i przenieść do kolby stożkowej o pojemności 250 ml. Dodać 45,0 ml wody, zmieszać i równoważyć przez 5 minut. Dodać 105,0 ml mieszaniny metanolu z acetonitrylem (3.5), zamknąć korkiem i homogenizować. Poddać próbkę działaniu ultradźwięków przez 15 minut (4.7), a następnie wstrząsać z zastosowaniem wstrząsarki lub mieszadła magnetycznego (4.1) przez 15 minut. Przefiltrować roztwór przez bibułę filtracyjną z włóknem szklanym (4.2).

Rozcieńczyć podzielną część filtratu mieszaniną wody i mieszaniną metanolu z acetonitrylem (3.12), aby uzyskać ostateczne stężenie karbadoksu od 10 do 15 μg/ml (w przypadku preparatów 10 %, współczynnik rozcieńczania wynosi 10). Podzielną część przefiltrować przez filtr (4.6).

Przystąpić do analizy HPLC (5.4).

5.3.   Oczyszczanie

5.3.1.    Przygotowanie kolumny tlenku glinu

Odważyć 4 g tlenku glinu (3.4) i przenieść do szklanej kolumny (4.3).

5.3.2.    Czyszczenie próbki

Umieścić 15 ml odfiltrowanego ekstraktu (5.2.1) w kolumnie z tlenkiem glinu i usunąć pierwsze 2 ml eluentu. Następnie zebrać kolejne 5 ml i przefiltrować podzielną część przez filtr 0,45 μm (4.6).

Przystąpić do oznaczania HPLC (5.4).

5.4.   Oznaczanie HPLC

5.4.1.    Parametry

Poniższe parametry podano jako przykładowe; inne parametry mogą być zastosowane, o ile gwarantują otrzymanie równoważnych wyników:

Sprawdzić stabilność systemu chromatograficznego, dozując kilka razy roztwór kalibracyjny (3.11.2) zawierający 5,0 μg/ml, aż do uzyskania stałych wysokości (powierzchni) piku i czasów retencji.

5.4.2.    Krzywa kalibracyjna

Zadozować kilka razy każdy z roztworów kalibracyjnych (3.11.2) i określić wysokości (powierzchnie) piku dla każdego stężenia. Wykreślić krzywą kalibracyjną, odkładając średnie wysokości (powierzchnie) pików kalibracyjnych roztworów na osi rzędnych oraz odpowiadające im stężenia w μg/ml na osi odciętych.

5.4.3.    Roztwór próbki

Zadozować kilka razy ekstrakt próbki otrzymany dla pasz (5.3.2), dla premiksów (5.2.2) oraz dla preparatów (5.2.3), i określić średnią wysokość (powierzchnię) piku dla pików karbadoksu.

6.   Obliczanie wyników

Na podstawie średniej wysokości (powierzchni) pików karbadoksu roztworu próbki, określić stężenie karbadoksu w roztworze próbki w μg/ml, odnosząc się do krzywej kalibracyjnej (5.4.2).

6.1.   Pasze

Zawartość karbadoksu w próbce, wyrażoną w mg/kg, oblicza się według następującego wzoru:

[mg/kg]

gdzie:

c

=

stężenie karbadoksu w ekstrakcie próbki w μg/ml (5.3.2)

V1

=

objętość ekstraktu w ml (np. 50 ml)

m

=

masa naważki w g

6.2.   Premiksy i preparaty

Zawartość karbadoksu w próbce, wyrażoną w mg/kg, oblicza się według następującego wzoru:

[mg/kg]

gdzie:

c

=

stężenie karbadoksu w ekstrakcie próbki w μg/ml (5.2.2 lub 5.2.3)

V2

=

objętość ekstraktu w ml (np. 50 ml w przypadku premiksów lub 150 ml w przypadku preparatów)

f

=

współczynnik rozcieńczenia zgodny z pkt 5.2.2 (premiksy) lub z pkt 5.2.3 (preparaty)

m

=

masa naważki w g

7.   Sprawdzenie metody

7.1.   Sprawdzenie tożsamości

Tożsamość analitu może być potwierdzona przez kochromatografię lub zastosowanie detektora diodowego, przy użyciu którego porównuje się widma ekstraktu próbki i roztworu kalibracyjnego (3.11.2) zawierającego 10,0 μg/ml karbadoksu.

7.1.1.    Kochromatografia

Ekstraky próbki fortyfikuje się przez dodanie odpowiedniej ilości roztworu kalibracyjnego (3.11.2). Ilość dodanego karbadoksu musi odpowiadać ilości karbadoksu w ekstrakcie próbki.

Po uwzględnieniu zarówno dodanej ilości, jak i stopnia rozcieńczenia ekstraktu, zwiększyć się może tylko wysokość piku karbadoksu. Szerokość piku w połowie jego wysokości musi mieścić się w granicach ok. 10 % pierwotnej szerokości.

7.1.2.    Detekcja diodowa

Wyniki ocenia się według następujących kryteriów:

Jeżeli jedno z tych kryteriów nie jest spełnione, obecność analitu nie jest potwierdzona.

7.2.   Powtarzalność

Dla zawartości karbadoksu równej lub wyższej niż 10 mg/kg różnica pomiędzy wynikami dwóch równoległych oznaczeń wykonanych dla tej samej próbki nie może przekraczać 15 % najwyższego wyniku.

7.3.   Odzysk

W przypadku fortyfikacji (ślepej) próby paszy odzysk musi wynosić co najmniej 90 %.

8.   Wyniki badań międzylaboratoryjnych

W ramach współpracy 8 laboratoriów przeprowadzono analizę 6 próbek pasz, 4 premiksów i 3 preparatów. Analizę każdej próbki przeprowadzono dwukrotnie. (Bardziej szczegółowe informacje dotyczące tych badań można znaleźć w Journal of the AOAC, tom 71, 1988, s. 484–490). Wyniki (z wyłączeniem wartości oddalonych) podano poniżej:

L

=

liczba laboratoriów

n

=

liczba pojedynczych wartości

Sr

=

odchylenie standardowe powtarzalności

CVr

=

współczynnik zmienności powtarzalności

SR

=

odchylenie standardowe odtwarzalności

CVR

=

współczynnik zmienności odtwarzalności

---

ZAŁĄCZNIK IX

TABELE KORELACJI, O KTÓRYCH MOWA W ART. 6

1.   Dyrektywa 71/250/EWG

2.   Dyrektywa 71/393/EWG

3.   Dyrektywa 72/199/EWG

4.   Dyrektywa 73/46/EWG

5.   Dyrektywa 76/371/EWG

6.   Dyrektywa 76/372/EWG

7.   Dyrektywa 78/633/EWG

8.   Dyrektywa 81/715/EWG

9.   Dyrektywa 84/425/EWG

10.   Dyrektywa 86/174/EWG

11.   Dyrektywa 93/70/EWG

12.   Dyrektywa 93/117/WE

13.   Dyrektywa 98/64/WE

14.   Dyrektywa 1999/27/WE

15.   Dyrektywa 1999/76/WE

16.   Dyrektywa 2000/45/WE

17.   Dyrektywa 2002/70/WE

18.   Dyrektywa 2003/126/WE

---

( 1 ) Dz.U. L 268 z 18.10.2003, s. 29.

( 2 ) Dz.U. L 140 z 30.5.2002, s. 10.

( 3 ) Dz.U. L 70 z 16.3.2005, s. 1.;

( 4 ) Jakiekolwiek zbrylenia muszą być rozbite (jeśli to konieczne, poprzez odseparowanie i zwrócenie do próbki).

( 5 ) Z wyjątkiem pasz objętościowych i włóknistych o niskim ciężarze właściwym.

( 6 ) Z wyjątkiem pasz objętościowych i włóknistych o niskim ciężarze właściwym.

( 7 ) Dz.U. L 229 z 1.9.2009, s. 1.

( 7 ) Do suszenia roślin zbożowych, mąki, kaszy i mączki piec musi mieć pojemność cieplną taką, żeby po wstępnym nastawieniu na temperaturę 131 oC powrócił do tej temperatury w czasie krótszym niż 45 minut po umieszczeniu w nim maksymalnej liczby próbek do jednoczesnego wysuszenia. Wentylacja musi być taka, aby wyniki suszenia przez dwie godziny maksymalnej liczby próbek pszenicy zwyczajnej nie różniły się od wyników suszenia przez cztery godziny o więcej niż o 0,15 %.

( 7 ) Jeśli olej lub tłuszcz musi zostać poddany późniejszym próbom badania jakości, kawałki pumeksu należy zastąpić paciorkami szklanymi.

( 7 ) Dz.U. L 125 z 23.5.1996, s. 35.

( 7 ) Przeprowadzone przez grupę roboczą ds. pasz Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs- und Forschungsanstalten (VDLUFA).

( 7 ) Przeprowadzone przez grupę roboczą ds. pasz Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs- und Forschungsanstalten (VDLUFA).

( 7 ) Inne metody rozkładu mogą być stosowane, pod warunkiem, iż wykazano, że zapewniają podobne wyniki (np. rozkład mikrofalami).

( 7 ) Zielonki świeże lub suszone mogą zawierać duże ilości krzemionki roślinnej, która może zawierać pierwiastki śladowe i którą trzeba usunąć. Dlatego też w przypadku analizy próbek takich pasz należy zastosować następujące, zmodyfikowane postępowanie. Postępować w sposób określony w pkt 5.1.1.1 do etapu filtrowania. Następnie należy dwukrotnie wrzącą wodą przemyć filtr papierowy zawierający nierozpuszczalną pozostałość i umieścić w platynowym lub kwarcowym tyglu. Należy włączyć piec muflowy (4.1), nastawić temperaturę poniżej 550 oC i poczekać, aż całkowicie zniknie wszelki materiał zawierający węgiel. Pozostawić do ostygnięcia, dodać kilka kropli wody, a następnie 10–15 ml kwasu fluorowodorowego (3.4) i odparować do osiągnięcia suchości w temperaturze około 150 oC. Jeśli w pozostałościach pozostanie krzemionka, to należy ponownie rozpuścić tę pozostałość w kilku mililitrach kwasu fluorowodorowego (3.4) i odparować aż do osiągnięcia suchości. Dodać pięć kropli kwasu siarkowego (3.5) i podgrzewać do momentu pokazania się białego dymu. Po dodaniu 5 ml kwasu solnego o stężeniu 6 mol/l (3.2) i około 30 ml wody podgrzać, przefiltrować roztwór do kolby miarowej o pojemności 250 ml i dopełnić wodą do pełnej objętości (stężenie HCl około 0,5 mol/l). Następnie należy wykonać oznaczenie zgodnie z pkt 5.1.2.

( 7 ) „The Analyst” 108 z 1983 r., s. 1 252–1 256

( *1 ) „The Analyst” nr 120 z 1995 r., s. 2175–2180.

( 8 ) Tabela TEF (= współczynnik równoważny toksyczności) dla PCDD, PCDF i dioksynopodobnych PCB: WHO-TEF dla oceny zagrożenia dla ludzi, na podstawie konkluzji Światowej Organizacji Zdrowia (WHO) – spotkanie ekspertów Międzynarodowego Programu Bezpieczeństwa Chemicznego (IPCS), które odbyło się w Genewie w czerwcu 2005 r. (Martin van den Berg et al., „The 2005 World Health Organization Re-evaluation of Human and Mammalian Toxic Equivalency Factors for Dioxins and Dioxin-like Compounds” (Ponowna ocena współczynników równoważnych toksyczności dla ludzi i ssaków w odniesieniu do dioksyn i związków dioksynopodobnych, przeprowadzona w 2005 r. przez Światową Organizację Zdrowia), Toxicological Sciences 93(2), 223–241 (2006)).

Zastosowane skróty: „T” = tetra (cztero); „P” = penta (pięcio); „Hx” = heksa (sześcio); „Hp” = hepta (siedmio); „O” = okta (ośmio); „CDD” = chlorodibenzodioksyna; „CDF” = chlorodibenzofuran; „CB” = chlorobifenyl.

( 9 ) Decyzja Komisji 2002/657/WE z dnia 14 sierpnia 2002 r. wykonująca dyrektywę Rady 96/23/WE dotyczącą wyników metod analitycznych i ich interpretacji (Dz.U. L 221 z 17.8.2002, s. 8).

( 10 ) W stosownych przypadkach należy przestrzegać zasad opisanych w „Guidance Document on Measurement Uncertainty for Laboratories performing PCDD/F and PCB Analysis using Isotope Dilution Mass Spectrometry” (Wytyczne dotyczące niepewności pomiaru dla laboratoriów wykonujących analizę PCDD/F i PCB z zastosowaniem spektrometrii mas z rozcieńczeniem izotopowym) (http://ec.europa.eu/food/safety/animal-feed_en).

( 11 ) Koncepcja „metody granicy oznaczalności” (ang. upper-bound) zakłada przyjęcie wartości równej granicy oznaczalności dla wszystkich nieoznaczonych ilościowo kongenerów. Koncepcja „metody zerowej” (ang. lower-bound) zakłada przyjęcie wartości równej zero dla wszystkich nieoznaczonych ilościowo kongenerów. Koncepcja „połowy granicy oznaczalności” (ang. medium-bound) zakłada przyjęcie wartości równej połowie granicy oznaczalności dla wszystkich nieoznaczonych ilościowo kongenerów.

( 12 ) Analiza powtórna: Odrębna analiza interesujących analitów przy użyciu drugiej podwielokrotnej części tej samej zhomogenizowanej próbki. Generalnie zastosowanie mają wymagania dotyczące powtórnej analizy określone w załączniku II rozdział C pkt 3. W przypadku metod przy użyciu wzorca wewnętrznego znakowanego izotopem węgla 13C dla odpowiednich analitów powtórna analiza jest konieczna tylko wtedy, gdy w pierwszym oznaczeniu z wykorzystaniem takich metod potwierdzających uzyskano wynik niezgodny z wymogami. Powtórna analiza jest konieczna do wykluczenia możliwości wewnętrznego zanieczyszczenia krzyżowego lub przypadkowego wymieszania się próbek. W razie przeprowadzania analizy w ramach przypadku wystąpienia zanieczyszczenia można zrezygnować z potwierdzenia wyników w drodze powtórnej analizy, jeżeli próbki wybrane do analizy można powiązać z przypadkiem wystąpienia zanieczyszczenia na podstawie identyfikowalności produktu, a stwierdzony poziom jest znacznie wyższy od najwyższego dopuszczalnego poziomu.

( 13 ) Koncepcja „metody granicy oznaczalności” zakłada przyjęcie wartości równej granicy oznaczalności dla wszystkich nieoznaczonych ilościowo kongenerów przy obliczaniu ich wkładu w równoważniku toksyczności (TEQ). Koncepcja „metody zerowej” zakłada przyjęcie wartości równej zero dla wszystkich nieoznaczonych ilościowo kongenerów przy obliczaniu ich wkładu w TEQ. Koncepcja „metody połowy granicy oznaczalności” zakłada przyjęcie wartości równej połowie granicy oznaczalności dla wszystkich nieoznaczonych ilościowo kongenerów przy obliczaniu ich wkładu w TEQ.

( 14 ) Generalnie zastosowanie mają wymagania dotyczące powtórnej analizy określone w załączniku II rozdział C pkt 2. W przypadku metod potwierdzających przy użyciu wzorca wewnętrznego znakowanego izotopem węgla 13C dla odpowiednich analitów powtórna analiza jest konieczna tylko wtedy, gdy w pierwszym oznaczeniu uzyskano wynik niezgodny z wymogami. Powtórna analiza jest konieczna do wykluczenia możliwości wewnętrznego zanieczyszczenia krzyżowego lub przypadkowego wymieszania się próbek. W razie przeprowadzania analizy w ramach przypadku wystąpienia zanieczyszczenia można zrezygnować z potwierdzenia wyników w drodze powtórnej analizy, jeżeli próbki wybrane do analizy można powiązać z przypadkiem wystąpienia zanieczyszczenia na podstawie identyfikowalności produktu, a stwierdzony poziom jest znacznie wyższy od najwyższego dopuszczalnego poziomu.

( 15 ) Identyczne wyjaśnienie i wymagania dla powtórnej analizy w celu kontroli poziomów reagowania jak w przypisie 2 powyżej dla najwyższych dopuszczalnych poziomów.

( 16 ) Rozporządzenie (WE) nr 183/2005 Parlamentu Europejskiego i Rady z dnia 12 stycznia 2005 r. ustanawiające wymagania dotyczące higieny pasz (Dz.U. L 35 z 8.2.2005, s. 1).

( 17 ) Metody bioanalityczne nie są swoiste dla kongenerów objętych schematem TEF. W ekstrakcie próbki mogą być obecne inne związki strukturalnie podobne do związków aktywujących receptor AhR, co przyczynia się do ogólnej odpowiedzi. Dlatego wyniki uzyskane metodami bioanalitycznymi nie mogą być traktowane jako szacunki, ale raczej jako wskazanie poziomu TEQ w próbce.

( 18 ) „Guidance Document on Measurement Uncertainty for Laboratories performing PCDD/F and PCB Analysis using Isotope Dilution Mass Spectrometry” (Wytyczne dotyczące niepewności pomiaru dla laboratoriów wykonujących analizę PCDD/F i PCB z zastosowaniem spektrometrii mas z rozcieńczeniem izotopowym) (http://ec.europa.eu/food/safety/animal-feed_en), „Guidance Document on the Estimation of LOD and LOQ for Measurements in the Field of Contaminants in Feed and Food” (Wytyczne dotyczące szacowania LOD i LOQ na potrzeby pomiarów w dziedzinie zanieczyszczeń w paszy i żywności) (http://ec.europa.eu/food/safety/animal-feed_en).

( 19 ) Aktualne wymogi są oparte na TEF opublikowanych w: M. Van den Berg et al, Toxicol Sci 93 (2), 223–241 (2006).

( 20 ) Kongenery, które są często wymywane, to np. PCB 28/31, PCB 52/69 oraz PCB 138/163/164. W przypadku GC-MS należy rozważyć także ewentualne interferencje z fragmentów wyżej chlorowanych kongenerów.

( 21 ) W stosownych przypadkach korzysta się z zasad opisanych w dokumencie „Guidance Document on the Estimation of LOD and LOQ for Measurements in the Field of Contaminants in Feed and Food” (Wytyczne dotyczące szacowania LOD i LOQ na potrzeby pomiarów w dziedzinie zanieczyszczeń w paszy i żywności) (http://ec.europa.eu/food/safety/animal-feed_en).

( 22 ) Zaleca się, aby w próbce znajdował się niższy poziom odczynnika próbki ślepej względem poziomu zanieczyszczenia. Laboratorium odpowiada za kontrolowanie zróżnicowania poziomów próbki ślepej, w szczególności jeżeli poziomy próbki ślepej są odejmowane.

( 23 ) Zob. przypis 12.

( 24 ) http://eurl.craw.eu/

( 25 ) http://eurl.craw.eu/

( 26 ) Wykaz tych starterów i sond dla każdego gatunku zwierząt uwzględnianego w badaniu jest dostępny na stronie internetowej EURL-AP.

( 27 ) Przykłady odpowiednich roztworów Master Mix są dostępne na stronie internetowej EURL-AP.