10)
|
De volgende hoofdstukken C.27, C.28, C.29 en C.30 worden toegevoegd:
„C.27 TEST TER BEPALING VAN DE TOXICITEIT VOOR CHIRONOMIDEA IN SEDIMENT EN WATER M.B.V. VERRIJKT SEDIMENT
INLEIDING
1.
|
Deze testmethode is gelijkwaardig aan testrichtlijn 218 (2004) van de OESO (TG 218). Deze testmethode is bedoeld om de effecten te bepalen van langdurige blootstelling van in het sediment levende larven van tweevleugelige zoetwaterinsecten van Chironomus sp. aan stoffen. De methode is gebaseerd op bestaande toxiciteitstestprotocollen voor Chironomus riparius en Chironomus tentans die in Europa (1)(2)(3) en Noord-Amerika (4)(5)(6)(7)(8) zijn ontwikkeld en aan een ringonderzoek zijn onderworpen (1)(6)(9). Er kunnen ook andere goed gedocumenteerde Chironomidae worden gebruikt, bijvoorbeeld Chironomus yoshimatsui (10)(11).
|
2.
|
Bij het in deze testmethode gebruikte blootstellingsscenario wordt het sediment met de teststof verrijkt. De selectie van het juiste blootstellingsscenario hangt af van het beoogde doel van de test. Het scenario waarbij sediment wordt verrijkt, dient om accumulatie van persistente stoffen in het sediment na te bootsen. Bij dit blootstellingssysteem wordt het sediment van een testsysteem van sediment en water verrijkt.
|
3.
|
De stoffen die moeten worden getest voor in het sediment levende organismen zijn gewoonlijk gedurende lange tijd persistent in dit compartiment. De in het sediment levende organismen kunnen via een aantal routes worden blootgesteld. Het relatieve belang van elke blootstellingsroute en de tijd die voor de bijdrage aan de algehele toxische effecten via elke route wordt genomen, hangen af van de fysisch-chemische eigenschappen van de betrokken stof. Voor sterk adsorberende stoffen (bijvoorbeeld met log Kow > 5) of voor stoffen die een covalente binding met het sediment aangaan, kan ingestie van besmet voedsel een belangrijke blootstellingsroute zijn. Om de toxiciteit van zeer lipofiele stoffen niet te onderschatten, kan worden overwogen vóór aanbrenging van de teststof voedsel aan het sediment toe te voegen. Om rekening te houden met alle mogelijke blootstellingsroutes, ligt de nadruk bij deze testmethode op langdurige blootstelling. De testduur bedraagt 20-28 dagen voor C. riparius en C. yoshimatsui, en 28-65 dagen voor C. tentans. Als voor een specifiek doel, bijvoorbeeld om de effecten van een onstabiele stof te onderzoeken, kortetermijngegevens vereist zijn, kunnen na een periode van tien dagen aanvullende duplo’s worden verwijderd.
|
4.
|
De gemeten eindpunten zijn het totale aantal tot adult ontwikkelde dieren en de hiervoor benodigde tijd. Als aanvullende kortetermijngegevens vereist zijn, wordt aanbevolen de overleving en de groei van de larven pas te meten na een periode van tien dagen en zo nodig aanvullende duplo’s te gebruiken.
|
5.
|
Het gebruik van kunstmatig sediment wordt aanbevolen. Kunstmatig sediment heeft verschillende voordelen ten opzichte van natuurlijke sedimenten:
—
|
de experimentele variabiliteit wordt beperkt omdat het een reproduceerbare „genormaliseerde matrix” vormt en niet gezocht hoeft te worden naar niet-besmette schone sedimentbronnen;
|
—
|
het testsediment kent geen seizoensveranderingen en op ieder moment kunnen tests worden gestart; het sediment hoeft niet te worden voorbehandeld om inheemse fauna te verwijderen; het gebruik van kunstmatig sediment beperkt ook de kosten aangezien geen sediment in het veld hoeft te worden verzameld voor routinetests;
|
—
|
door het gebruik van kunstmatig sediment is de toxiciteit van stoffen vergelijkbaar en kunnen stoffen dienovereenkomstig worden gerangschikt.
|
|
6.
|
De gebruikte definities zijn opgenomen in aanhangsel 1.
|
PRINCIPE VAN DE TEST
7.
|
Larven in het eerste stadium van Chironomidae worden in sediment-watersystemen aan een concentratiebereik van de teststof blootgesteld. Het sediment wordt met de teststof verrijkt, waarna larven in het eerste stadium aan de gestabiliseerde concentraties sediment en water in de testglazen worden toegevoegd. Aan het eind van de test worden het uitkomstquotiënt en het ontwikkelingstempo van Chironomidae gemeten. Zo nodig kunnen tevens na tien dagen de overleving en het gewicht van de larven worden bepaald (hiervoor kunnen zo nodig aanvullende duplo’s worden gebruikt). Deze gegevens worden geanalyseerd door hetzij met een regressiemodel een schatting te maken van de concentratie die zou leiden tot een afname van het uitkomen, de overleving of de groei van larven met × % (bv. EC15, EC50 enz.), hetzij een statistische hypothese te toetsen om een NOEC/LOEC te bepalen. In het laatste geval worden de effectwaarden door middel van statistische toetsen met controlewaarden vergeleken.
|
GEGEVENS OVER DE TESTSTOF
8.
|
De oplosbaarheid in water van de teststof, de dampspanning ervan, de gemeten of berekende verdeling in sediment en de stabiliteit in water en sediment moeten bekend zijn. Er moet een betrouwbare analysemethode, met een bekende en gerapporteerde nauwkeurigheid en detectiegrens, beschikbaar zijn voor de kwantitatieve bepaling van de teststof in bovenliggend water, poriewater en sediment. Andere nuttige informatie zijn de structuurformule en de zuiverheid van de teststof. Ook het uiteindelijke chemische lot van de teststof (bv. dissipatie, niet-biologische en biologische afbraak enz.) is nuttige informatie. Nadere richtsnoeren voor het testen van stoffen met zodanige fysisch-chemische eigenschappen dat de uitvoering van de test problematisch is, zijn in (12) opgenomen.
|
REFERENTIESTOFFEN
9.
|
Er kunnen regelmatig tests met referentiestoffen worden uitgevoerd om de betrouwbaarheid van het testprotocol en de testomstandigheden te waarborgen. Voorbeelden van toxische referentiestoffen die met succes in ringonderzoek en valideringsstudies zijn gebruikt, zijn: lindaan, trifluralin, pentachloorfenol, cadmiumchloride en kaliumchloride (1)(2)(5)(6)(13).
|
GELDIGHEID VAN DE TEST
10.
|
De test is alleen geldig als aan de onderstaande voorwaarden wordt voldaan:
—
|
het uitkomstpercentage in de controlegroepen moet aan het eind van de test ten minste 70 % zijn (1)(6);
|
—
|
de ontwikkeling tot adult van de in de controlevaten gestopte C. riparius en C. yoshimatsui moet binnen 12 tot 23 dagen plaatsvinden; voor C. tentans is een periode van 20 tot 65 dagen nodig;
|
—
|
aan het eind van de test worden de pH en het gehalte aan opgeloste zuurstof in elk vat gemeten. Het zuurstofgehalte moet ten minste 60 % bedragen van de verzadigingswaarde van lucht (ASV) bij de heersende temperatuur en het bovenliggende water moet in alle testvaten een pH-waarde tussen 6 en 9 hebben;
|
—
|
de watertemperatuur mag niet met meer dan ± 1,0 °C afwijken. De watertemperatuur kan worden geregeld door een isotherme kamer te gebruiken; in dat geval wordt de kamertemperatuur met passende tussenpozen bevestigd.
|
|
BESCHRIJVING VAN DE METHODE
Testvaten
11.
|
De studie wordt uitgevoerd in bekerglazen met een inhoud van 600 ml en een diameter van 8 cm. Ook andere vaten kunnen geschikt zijn, mits zij voldoende diep zijn voor het bovenliggende water en het sediment. Het sedimentoppervlak moet ten minste 2 tot 3 cm2 per larve bedragen. De verhouding tussen de dikte van de sedimentlaag en de diepte van het bovenliggende water moet 1:4 zijn. Testvaten en andere apparatuur die in contact met het testsysteem komt, moeten volledig van glas of een ander chemisch inert materiaal zijn gemaakt (bv. teflon).
|
Keuze van de soorten
12.
|
Als testsoort heeft Chironomus riparius de voorkeur. Chironomus tentans is ook geschikt, maar is lastiger in het gebruik en vergt een lagere testperiode. Chironomus yoshimatsui mag ook worden gebruikt. Aanhangsel 2 bevat bijzonderheden over de kweekmethoden van Chironomus riparius. Er is ook informatie beschikbaar over de kweekomstandigheden van andere soorten, namelijk Chironomus tentans (4) en Chironomus yoshimatsui (11). Vóór de test moet de identificatie van de soorten worden bevestigd; als de organismen uit eigen kweek afkomstig zijn, is geen bevestiging voorafgaand aan iedere test nodig.
|
Sediment
13.
|
Er wordt bij voorkeur kunstmatig sediment gebruikt (ook wel bereid, gereconstitueerd of synthetisch sediment genoemd). Als echter natuurlijk sediment wordt gebruikt, moet dit worden gekarakteriseerd (ten minste pH en gehalte aan organische koolstof; bepaling van parameters als C/N-verhouding en korrelgrootteverdeling worden eveneens aanbevolen) en moet het vrij zijn van verontreinigingen en andere organismen die de Chironomidae zouden kunnen beconcurreren of consumeren. Ook wordt aanbevolen het natuurlijke sediment, voordat het in een test ter bepaling van de toxiciteit voor Chironomidae wordt gebruikt, zeven dagen te laten rusten onder dezelfde omstandigheden die ook in de test zullen heersen. Voor deze test wordt sediment aanbevolen dat op basis van de in testmethode C.8 (14) gebruikte kunstmatige grond als volgt is samengesteld (1)(15)(16):
a)
|
4-5 % (drooggewicht) turf: de pH moet zo dicht mogelijk bij 5,5 tot 6,0 liggen; het is belangrijk dat fijngemalen turf in poedervorm (deeltjesgrootte ≤ 1 mm) wordt gebruikt dat alleen aan de lucht is gedroogd;
|
b)
|
20 % (drooggewicht) kaolienklei (met bij voorkeur meer dan 30 % kaoliniet);
|
c)
|
75-76 % (drooggewicht) kwartszand (overwegend bestaande uit fijn zand; meer dan 50 % van de deeltjes moet een grootte tussen 50 en 200 μm hebben);
|
d)
|
er wordt gedeïoniseerd water toegevoegd om het uiteindelijke mengsel een vochtgehalte van 30-50 % te geven;
|
e)
|
er wordt chemisch zuiver calciumcarbonaat (CaCO3) toegevoegd om het uiteindelijke sedimentmengsel een pH van 7,0 ± 0,5 te geven. Het gehalte aan organische koolstof van het uiteindelijke mengsel moet 2 % (± 0,5 %) bedragen en moet worden aangepast door toevoeging van extra turf en zand overeenkomstig a) en c).
|
|
14.
|
De bron van de turf, de kaolienklei en het zand moet bekend zijn. De bestanddelen van het sediment moeten worden gecontroleerd op verontreiniging met chemische stoffen (bv. zware metalen, organische chloor- en fosforverbindingen enz.). In aanhangsel 3 wordt een voorbeeld gegeven van de bereiding van kunstmatig sediment. Menging van droge bestanddelen is ook aanvaardbaar, mits wordt aangetoond dat na toevoeging van het bovenliggende water geen scheiding van de bestanddelen van het sediment plaatsvindt (bv. door drijvende turfdeeltjes) en dat de turf of het sediment voldoende geconditioneerd is.
|
Water
15.
|
Elk water dat aan de in de aanhangsels 2 en 4 vermelde chemische eigenschappen van aanvaardbaar verdunningswater voldoet, is geschikt als testwater. Als kweek- en testwater is elk geschikt water, natuurlijk water (oppervlakte- of grondwater), synthetisch water (zie aanhangsel 2) of ontchloord kraanwater aanvaardbaar, mits de Chironomidae daarin gedurende het kweken en testen overleven zonder tekenen van stress te vertonen. Aan het begin van de test moet het testwater een pH-waarde tussen 6 en 9 hebben en mag de totale hardheid, uitgedrukt als CaCO3, niet hoger zijn dan 400 mg/l. Als echter een interactie tussen de hardheidsionen en de teststof wordt vermoed, moet water met een lagere hardheid worden gebruikt (en is Elendt-medium M4 dus ongeschikt). Voor de hele studie moet één soort water worden gebruikt. De in aanhangsel 4 vermelde kwaliteitskenmerken voor water moeten ten minste twee keer per jaar worden gemeten, of wanneer vermoed wordt dat een significante verandering heeft plaatsgevonden.
|
Stamoplossingen — Verrijkte sedimenten
16.
|
Verrijkte sedimenten worden gewoonlijk in de gekozen concentratie bereid door rechtstreeks een oplossing van de teststof aan het sediment toe te voegen. Een stamoplossing van de in gedeïoniseerd water opgeloste teststof wordt met het kunstmatige sediment gemengd met behulp van een wals of een voedermixer of door handmatig mengen. Indien de teststof slecht in water oplosbaar is, kan deze worden opgelost in een zo klein mogelijk volume van een geschikt organisch oplosmiddel (bv. hexaan, aceton of chloroform). Deze oplossing wordt vervolgens gemengd met 10 g fijn kwartszand per testvat. Laat het oplosmiddel verdampen, zodat het volledig uit het zand wordt verwijderd; vervolgens wordt het zand gemengd met een geschikte hoeveelheid sediment per testglas. Voor het oplossen, dispergeren of emulgeren van de teststof mogen alleen gemakkelijk verdampende oplosmiddelen worden gebruikt. Bij de bereiding van het sediment moet rekening worden gehouden met het zand dat in het mengsel van teststof en zand aanwezig is (het sediment wordt dus met minder zand bereid). De aan het sediment toegevoegde teststof moet zorgvuldig en gelijkmatig over het sediment worden verdeeld. Zo nodig kunnen deelmonsters worden geanalyseerd om de homogeniteit te bepalen.
|
TESTOPZET
17.
|
De testopzet heeft betrekking op het aantal testconcentraties en de factor waarmee ze van elkaar verschillen, het aantal vaten per concentratieniveau en het aantal larven per vat. Er wordt een beschrijving gegeven van testopzetten voor de puntschatting van de EC, de schatting van de NOEC en de uitvoering van een limiettest.
|
Opzet voor regressieanalyse
18.
|
De in de test gebruikte concentraties moeten de effectconcentratie (bv. EC15 en EC50) en het concentratiebereik waarbinnen het effect van de teststof van belang is, omvatten. In het algemeen nemen de nauwkeurigheid en in het bijzonder de geldigheid van schattingen van de effectconcentraties (ECx) toe als de effectconcentratie binnen het geteste concentratiebereik ligt. Extrapolaties ver onder de laagste positieve concentratie of boven de hoogste concentraties moeten worden vermeden. Om het concentratiebereik te kiezen, kan een preliminaire bereikbepalingstest worden uitgevoerd (zie punt 27).
|
19.
|
Als een ECx-schatting moet worden gemaakt, worden ten minste vijf concentraties in triplo getest. In alle gevallen is het raadzaam bij voldoende concentraties te testen om een goede modelschatting mogelijk te maken. Het verschil tussen de concentraties mag niet meer dan factor 2 bedragen (als de dosis-responscurve een geringe helling vertoont, kan hiervan worden afgeweken). Het aantal duplo’s voor elke testgroep kan worden verlaagd wanneer het aantal testconcentraties met een verschillende respons wordt verhoogd. Als het aantal duplo’s wordt verhoogd of de intervallen tussen de testconcentraties worden verkleind, worden de betrouwbaarheidsintervallen van de test gewoonlijk kleiner. Als een schatting van de overleving en de groei van larven na tien dagen moet worden gemaakt, zijn aanvullende duplo’s vereist.
|
Opzet voor de schatting van een NOEC/LOEC
20.
|
Als een LOEC- of NOEC-schatting moet worden gemaakt, worden vijf concentraties getest met ten minste vier duplo’s en mag het verschil tussen de concentraties niet meer dan factor 2 bedragen. Het aantal duplo’s moet toereikend zijn om voldoende onderscheidend vermogen te waarborgen om een verschil van 20 % met de controlegroep te kunnen vaststellen bij een significantieniveau van 5 % (p = 0,05). Het ontwikkelingstempo kan gewoonlijk worden bepaald met een variantieanalyse (ANOVA), zoals de toets van Dunnett of Williams (17)(18)(19)(20). Voor het uitkomstquotiënt kan de toets van Cochran-Armitage, de exacte toets van Fisher (met correctie van Bonferroni) of de toets van Mantel-Haenszel worden gebruikt.
|
Limiettest
21.
|
Als in de preliminaire bereikbepalingstest geen effecten zijn waargenomen, kan een limiettest worden uitgevoerd (één testconcentratie en controlegroep). Deze limiettest wordt uitgevoerd bij een concentratie die voldoende hoog is om de besluitvormers in staat te stellen mogelijke toxische effecten van de teststof uit te sluiten; deze concentratie wordt vastgesteld op een niveau dat zich naar verwachting in geen enkele situatie zal voordoen. Een concentratie van 1 000 mg/kg (drooggewicht) wordt aanbevolen. Gewoonlijk zijn zes duplo’s voor zowel de testgroep als de controlegroep nodig. Aangetoond moet worden dat het onderscheidend vermogen groot genoeg is om een verschil van 20 % met de controlegroep te kunnen vaststellen bij een significantieniveau van 5 % (p = 0,05). Voor de meetrespons (ontwikkelingstempo en gewicht) is de T-toets een geschikte statistische methode, mits de gegevens aan de voorwaarden van deze toets voldoen (normale verdeling, homogene variantie). Als niet aan die voorwaarden wordt voldaan, kan de T-toets voor ongelijke variantie of een verdelingsvrije toets, zoals de Wilcoxon-Mann-Whitney-toets, worden gebruikt. Voor het uitkomstquotiënt is de exacte toets van Fisher geschikt.
|
PROCEDURE
Blootstellingsomstandigheden
Voorbereiding van het verrijkt sediment-watersysteem
22.
|
Voor het aanbrengen van de teststof wordt de in testmethode C.8, Toxiciteit voor regenwormen, beschreven verrijkingsprocedure aanbevolen (14). De verrijkte sedimenten worden in de vaten aangebracht, waaraan voldoende bovenliggend water wordt toegevoegd om te zorgen voor een volumeverhouding van 1:4 tussen het sediment en het water (zie punten 11 en 15). De sedimentlaag moet een dikte van 1,5 tot 3 cm hebben. Om te voorkomen dat tijdens de toevoeging van testwater aan de waterkolom bestanddelen zich van het sediment afscheiden en fijn materiaal in suspensie wordt gebracht, kan het sediment tijdens het gieten worden afgedekt met een kunststof schijf, die onmiddellijk daarna wordt verwijderd. Ook andere middelen kunnen geschikt zijn.
|
23.
|
De testvaten worden (bijvoorbeeld met glasplaten) bedekt. Om verdampingsverliezen te compenseren, kan het waterniveau tijdens de studie worden aangevuld tot het oorspronkelijke volume. Om te voorkomen dat zouten ontstaan, moet hiervoor gedestilleerd of gedeïoniseerd water worden gebruikt.
|
Stabilisatie
24.
|
Nadat het verrijkte sediment met bovenliggend water is voorbereid, is het wenselijk de teststof zich te laten verdelen uit de waterfase naar het sediment (3)(4)(6)(13). Dit moet bij voorkeur gebeuren onder de in de test heersende temperatuur- en beluchtingsomstandigheden. De tijd die nodig is voor equilibratie hangt af van het sediment en de stof en kan variëren van enkele uren tot verscheidene dagen en soms zelfs weken (vier-vijf weken). Aangezien veel stoffen ondertussen zouden kunnen afbreken, wordt niet gewacht tot een evenwicht is ontstaan, maar wordt een equilibratieperiode van 48 uur aanbevolen. Aan het eind van deze nadere equilibratieperiode wordt in het bovenliggende water, het poriewater en het sediment, bij ten minste de hoogste en een lagere concentratie, de concentratie van de teststof gemeten (zie punt 38). Op basis van deze analysen van de teststof kan de massabalans worden berekend en kunnen de resultaten als gemeten concentraties worden uitgedrukt.
|
Toevoeging van testorganismen
25.
|
Vier tot vijf dagen voordat de testorganismen aan de testvaten worden toegevoegd, worden eipakketten uit de kweken genomen en in kleine vaten in een kweekmedium geplaatst. Er kan ouder medium uit de voorraadcultuur of vers bereid medium worden gebruikt. In het laatste geval wordt aan het kweekmedium een kleine hoeveelheid voedsel, zoals groene algen en/of enkele druppels filtraat uit een fijngemalen suspensie van visvoervlokken, toegevoegd (zie aanhangsel 2). Er worden alleen vers afgezette eipakketten gebruikt. Normaliter beginnen de larven enkele dagen nadat de eieren zijn gelegd (twee tot drie dagen voor Chironomus riparius bij 20 °C en één tot vier dagen voor Chironomus tentans bij 23 °C en Chironomus yoshimatsui bij 25 °C) uit te komen en vindt de groei van de larven plaats in vier stadia die elk vier-acht dagen duren. Voor de test worden larven in het eerste stadium (2-3 of 1-4 dagen na uitkomen) gebruikt. Het stadium van muggen kan mogelijk worden gecontroleerd aan de hand van de breedte van het epicranium (6).
|
26.
|
Twintig larven in het eerste stadium worden met een stompe pipet willekeurig verdeeld over de testvaten met verrijkt sediment en water. Tijdens het inbrengen van de larven in de testvaten en de eerste 24 uur daarna wordt de beluchting van het water uitgezet (zie de punten 25 en 32). Afhankelijk van de testopzet (zie de punten 19 en 20) bedraagt het aantal larven dat per concentratie wordt gebruikt ten minste 60 voor de EC-puntschatting en 80 voor de NOEC-bepaling.
|
Testconcentraties
27.
|
Om het concentratiebereik van de test te bepalen kan een bereikbepalingstest worden uitgevoerd. Daarvoor wordt een reeks sterk gespreide concentraties van de teststof gebruikt. Om te zorgen voor dezelfde oppervlaktedichtheid per Chironomus als in de eigenlijke test, worden de Chironomidae aan elke concentratie van de teststof blootgesteld gedurende een periode die een schatting van de wenselijke testconcentraties mogelijk maakt, en zijn geen duplo’s vereist.
|
28.
|
De testconcentraties voor de eigenlijke test worden gebaseerd op de uitkomsten van de bereikbepalingstest. Er moeten ten minste vijf concentraties worden gebruikt en geselecteerd, zoals beschreven in de punten 18 tot en met 20.
|
Controlegroep
29.
|
De test omvat controlevaten zonder teststof maar met sediment, met het vereiste aantal duplo’s (zie de punten 19 en 20). Indien voor het aanbrengen van de teststof een oplosmiddel is gebruikt (zie punt 16), wordt een controlegroep voor het oplosmiddel in het sediment toegevoegd.
|
Testsysteem
30.
|
Er worden statische systemen gebruikt. In uitzonderlijke gevallen kunnen semistatische of doorstroomsystemen met onderbroken of continue verversing van het bovenliggende water worden gebruikt, bijvoorbeeld als de kwaliteitsspecificaties voor het water niet geschikt zijn voor het testorganisme of het chemische evenwicht wordt aangetast (te laag gehalte opgeloste zuurstof, te hoge concentratie excretieproducten, uit het sediment vrijkomende mineralen, gewijzigde pH en/of waterhardheid enz.). Gewoonlijk kan de kwaliteit van het bovenliggende water echter met andere methoden, zoals beluchting, worden verbeterd; deze verdienen de voorkeur.
|
Voedsel
31.
|
De larven moeten, bij voorkeur dagelijks of ten minste drie keer per week, worden gevoerd. Voor jonge larven lijkt in de eerste tien dagen 0,25-0,5 mg visvoer (een suspensie in water of fijngemalen voedsel, bv. TetraMin of TetraPhyll; zie details in aanhangsel 2) per larve per dag voldoende te zijn (0,35-0,5 mg voor C. yoshimatsui). Oudere larven kunnen iets meer voedsel nodig hebben: tijdens de rest van de test zou 0,5-1 mg per larve per dag moeten volstaan. Als schimmelgroei wordt waargenomen of sterfte in de controlegroepen wordt geconstateerd, moet het voedselrantsoen in alle test- en controlegroepen worden verlaagd. Als de schimmelontwikkeling niet kan worden gestopt, moet de test worden herhaald. Voor sterk adsorberende stoffen (bijvoorbeeld met log Kow > 5) of voor stoffen die een covalente binding met het sediment aangaan, kan de voor de overleving en natuurlijke groei van de organismen vereiste hoeveelheid voedsel vóór de stabilisatieperiode aan het kunstmatige sediment worden toegevoegd. In dat geval wordt in plaats van visvoer plantaardig materiaal gebruikt, bv. 0,5 % (drooggewicht) fijngemalen bladeren van bv. brandnetel (Urtica dioica), witte moerbei (Morus alba), witte klaver (Trifolium repens), spinazie (Spinacia oleracea) of ander plantaardig materiaal (Cerophyl of alfacellulose).
|
Incubatieomstandigheden
32.
|
In het bovenliggende water in de testvaten wordt bij voorkeur 24 uur na toevoeging van de larven voorzichtige beluchting toegepast en gedurende de test voortgezet (waarbij erop moet worden gelet dat het gehalte aan opgeloste zuurstof niet lager wordt dan 60 % van de ASV). De beluchting vindt plaats via een glazen pasteurpipet die 2-3 cm boven de sedimentlaag wordt bevestigd (bv. één of enkele luchtbellen/s). Als vluchtige stoffen worden getest, kan worden overgewogen het sediment-watersysteem niet te beluchten.
|
33.
|
De test wordt verricht bij een constante temperatuur van 20 °C (± 2 °C). Voor C. tentans en C. yoshimatsui bedraagt de aanbevolen temperatuur respectievelijk 23 °C en 25 °C (± 2 °C). Er wordt een fotoperiode van 16 uur gebruikt bij een lichtintensiteit van 500 tot 1 000 lux.
|
Blootstellingsduur
34.
|
De blootstelling begint bij toevoeging van larven aan de verrijkte vaten en de controlevaten. De maximale blootstellingsduur bedraagt 28 dagen voor C. riparius en C. yoshimatsui, en 65 dagen voor C. tentans. Als eerder muggen uitkomen, kan de test worden beëindigd nadat minimaal vijf dagen zijn verstreken na verschijning van de laatste volwassen mug in de controlegroep.
|
Waarnemingen
Uitkomst van muggen
35.
|
De ontwikkelingstijd en het totale aantal volledig uitgekomen mannelijke en vrouwelijke muggen worden bepaald. Mannetjes zijn gemakkelijk te herkennen aan hun veerachtige antennes.
|
36.
|
De testvaten worden ten minste drie keer per week geobserveerd om een visuele beoordeling van eventueel afwijkend gedrag te verrichten (bv. verlating van het sediment, ongewoon zwemgedrag), waarbij met de controlegroep wordt vergeleken. In de periode waarin verwacht wordt dat de muggen uitkomen, moet dagelijks een telling van de uitgekomen muggen worden verricht. Dagelijks worden het aantal volledig uitgekomen muggen en hun geslacht geregistreerd. Na identificatie worden de muggen uit de vaten verwijderd. Als er voor het eind van de test eipakketten zijn afgezet, worden deze geregistreerd en vervolgens verwijderd om te voorkomen dat opnieuw larven in het sediment terechtkomen. Ook wordt geregistreerd hoeveel zichtbare poppen niet zijn uitgekomen. Aanhangsel 5 bevat aanwijzingen voor de meting van het uitkomen.
|
Groei en overleving
37.
|
Als gegevens over de overleving en groei van larven na tien dagen vereist zijn, wordt bij het begin gezorgd voor extra testvaten, die voor de voortzetting worden gebruikt. Het sediment van deze aanvullende vaten wordt door een 250 μm-zeef gevoerd, zodat de larven overblijven. De criteria voor „dood” zijn immobiliteit of geen reactie op een mechanische prikkel. Niet meer aangetroffen larven moeten als dode larven worden geteld (aan het begin van de test gestorven larven kunnen door microben zijn afgebroken). Het (asvrije) drooggewicht van de overlevende larven per testvat wordt bepaald en op grond daarvan wordt het gemiddelde individuele drooggewicht per vat berekend. Het is nuttig om te bepalen in welk stadium de overlevende larven zich bevinden; dit kan door de breedte van het epicranium van elk individu te meten.
|
Analytische bepalingen
Concentratie van de teststof
38.
|
Voor aanvang van de test (d.w.z. voordat de larven worden toegevoegd) worden uit ten minste één vat per behandeling monsters van het bulksediment genomen om de concentratie van de teststof in het sediment analytisch te bepalen. Aanbevolen wordt ten minste bij de hoogste en een lagere concentratie monsters van het bovenliggende water, het poriewater en het sediment te analyseren bij het begin (zie punt 24) en eind van de test. Deze bepalingen van de concentratie van de teststof leveren informatie op over het gedrag en de verdeling van de teststof in het water-sedimentsysteem.
|
39.
|
Wanneer tussenliggende metingen worden verricht (bv. op dag 7) en voor de analyse grotere monsters nodig zijn die niet uit de testvaten kunnen worden genomen zonder het testsysteem te beïnvloeden, worden analytische bepalingen verricht op monsters uit aanvullende testvaten die op dezelfde wijze zijn behandeld (inclusief toevoeging van testorganismen), maar niet voor biologische waarnemingen zijn gebruikt.
|
40.
|
Om het poriewater te isoleren, wordt aanbevolen te centrifugeren, bijvoorbeeld 30 minuten bij 10 000 g en een temperatuur van 4 °C. Filtratie kan ook aanvaardbaar zijn, mits aangetoond is dat de teststof niet aan filters adsorbeert. In sommige gevallen kan analyse van de concentraties in het poriewater onmogelijk zijn doordat het monster te klein is.
|
Fysisch-chemische eigenschappen
41.
|
De pH en temperatuur van de testvaten moeten op een geschikte wijze worden gemeten (zie punt 10). De hardheid en het ammoniagehalte moeten bij het begin en het eind van de test in de controlevaten en in één testvat worden gemeten bij de hoogste concentratie.
|
GEGEVENS EN RAPPORTAGE
Verwerking van de resultaten
42.
|
Doel van deze test is het bepalen van het effect van de teststof op het ontwikkelingstempo en het totale aantal volledig uitgekomen mannelijke en vrouwelijke muggen, of bij de tiendaagse test de effecten op de overleving en het gewicht van de larven. Als er geen aanwijzingen zijn voor een statistisch verschil in gevoeligheid tussen de geslachten, kunnen de resultaten voor mannetjes en vrouwtjes worden samengevoegd voor statistische analysen. Het verschil in gevoeligheid tussen de geslachten kan statistisch worden beoordeeld met bv. een χ2-r × 2-toets. Zo nodig worden na tien dagen de overleving en het gemiddelde individuele drooggewicht per vat van de larven bepaald.
|
43.
|
Bij voorkeur aan de hand van de bij het begin van de test gemeten sedimentconcentraties (zie punt 38) worden effectconcentraties berekend, die gebaseerd zijn op en uitgedrukt worden als drooggewicht.
|
44.
|
Voor de berekening van een puntschatting voor de EC50 of enige andere ECx kunnen de gegevens per vat als echte replicaties worden gebruikt. Bij de berekening van een betrouwbaarheidsinterval voor elke ECx moet rekening worden gehouden met de variabiliteit tussen vaten, tenzij wordt aangetoond dat deze verwaarloosbaar is. Wanneer voor het model de kleinstekwadratenmethode wordt toegepast, worden de gegevens per vat getransformeerd om de homogeniteit van de variantie te vergroten. Voordat de ECx-waarden worden berekend, moet de respons echter zijn teruggetransformeerd naar de oorspronkelijke waarde.
|
45.
|
Wanneer de statistische analyse dient om de NOEC/LOEC te bepalen door toetsing van een hypothese, moet rekening worden gehouden met de variabiliteit tussen vaten, bv. met een geneste ANOVA. Als de gebruikelijke ANOVA-aannamen niet opgaan, kunnen robuustere tests (21) wenselijk zijn.
|
Uitkomstquotiënt
46.
|
Het uitkomstquotiënt betreft een binaire respons en kan, wanneer een monotone dosisrespons wordt verwacht en de gegevens consistent zijn met die verwachting, worden geanalyseerd met de toets van Cochran-Armitage, toegepast met stapjes omlaag. Als dit niet het geval is, kan de exacte toets van Fisher of de toets van Mantel-Haenszel worden gebruikt, met volgens Bonferroni-Holm gecorrigeerde p-waarden. Als er aanwijzingen zijn dat de variabiliteit tussen duplo’s met dezelfde concentratie groter is dan een binomiale verdeling zou uitwijzen (zogeheten „extrabinomiale” variantie), moet een robuuste toets van Cochran-Armitage of een exacte toets van Fisher, zoals voorgesteld in punt 21, worden gebruikt.
|
47.
|
Het aantal uitgekomen muggen per vat, ne, wordt bepaald en gedeeld door het aantal in het vat gestopte larven, na:
waarbij:
ER
|
=
|
uitkomstquotiënt (emergence ratio);
|
ne
|
=
|
aantal uitgekomen muggen per vat;
|
na
|
=
|
aantal larven dat in één vat is gestopt.
|
|
48.
|
Bij wijze van alternatief, dat vooral voor grote monsters geschikt is, kan, wanneer een monotone dosisrespons wordt verwacht en de gegevens over het uitkomstquotiënt consistent zijn met die verwachting, het uitkomstquotiënt in geval van extrabinomiale variantie als een continue respons worden behandeld en kunnen procedures als de toets van Williams worden gebruikt. Wanneer er geen sprake is van een monotone dosisrespons, kan de toets van Dunnett geschikt zijn. Als „grote” monsters worden hier beschouwd monsters waarvan per duplo (vat) zowel het aantal uitgekomen als het aantal niet-uitgekomen muggen groter is dan vijf.
|
49.
|
Voordat ANOVA-methoden worden toegepast, moeten de waarden van het uitkomstquotiënt eerst een hoektransformatie of een Freeman-Tukey-transformatie ondergaan om een approximatieve normale verdeling te verkrijgen en de variantie te egaliseren. Wanneer de absolute frequenties worden gebruikt, kan de toets van Cochran-Armitage, de exacte toets van Fisher (Bonferroni) of de toets van Mantel-Haenszel worden gebruikt. De hoektransformatie wordt uitgevoerd door de arcsinus (sin–1) van de vierkantswortel van het uitkomstquotiënt te nemen.
|
50.
|
Voor uitkomstquotiënten worden de ECx-waarden berekend door middel van regressieanalyse (of bv. probit (22), logit, Weibull, geschikte commerciële software enz.). Als geen regressieanalyse mogelijk is (bv. als er minder dan twee partiële responsen zijn), worden andere niet-parametrische methoden, zoals voortschrijdend gemiddelde of eenvoudige interpolatie, gebruikt.
|
Ontwikkelingstempo
51.
|
Met de gemiddelde ontwikkelingstijd wordt bedoeld de gemiddelde tijd tussen het moment waarop de larven in het vat worden gestopt (dag 0 van de test) en het moment waarop de experimentele cohort muggen uitkomt (voor de berekening van de werkelijke ontwikkelingstijd moet rekening worden gehouden met de leeftijd van de larven op het moment van inbrengen). Het ontwikkelingstempo is de reciproke waarde van de ontwikkelingstijd (eenheid: dag–1) en staat voor het deel van de larvenontwikkeling dat per dag plaatsvindt. Het ontwikkelingstempo heeft de voorkeur voor de evaluatie van deze sedimenttoxiciteitsstudies, omdat deze in vergelijking met de ontwikkelingstijd een kleinere variantie en een grotere homogeniteit heeft en de normale verdeling beter benadert. Daarom kunnen sterke parametrische testprocedures beter op het ontwikkelingstempo dan op de ontwikkelingstijd worden toegepast. Voor het ontwikkelingstempo als continue respons kunnen ECx = waarden worden geschat door middel van regressieanalyse (bv. (23)(24)).
|
52.
|
Bij de volgende statistische tests wordt aangenomen dat het op inspectiedag x waargenomen aantal muggen is uitgekomen in het midden van het tijdsinterval tussen dag x en dag x-l (l = lengte van het inspectie-interval, doorgaans één dag). Het gemiddelde ontwikkelingstempo per vat (
) wordt als volgt berekend:
waarbij:
|
:
|
gemiddeld ontwikkelingstempo per vat;
|
i
|
:
|
index van het inspectie-interval;
|
m
|
:
|
maximumaantal inspectie-intervallen;
|
|
:
|
in inspectie-interval i uitgekomen aantal muggen;
|
ne
|
:
|
totaal aantal uitgekomen muggen aan het eind van de proef (= )
|
xi
|
:
|
ontwikkelingstempo van de in interval i uitgekomen muggen;
|
waarbij
dayi
|
:
|
inspectiedag (dagen na aanbrengen);
|
li
|
:
|
lengte van inspectie-interval i (dagen, gewoonlijk één dag).
|
|
Testverslag
53.
|
In het testverslag moet ten minste de volgende informatie worden opgenomen:
|
Teststof:
—
|
fysische toestand en, indien relevant, fysisch-chemische kenmerken (oplosbaarheid in water, dampspanning, verdelingscoëfficiënt in de bodem (of in sediment, indien beschikbaar), stabiliteit in water enz.);
|
—
|
identificatiegegevens van de stof (triviale naam, chemische naam, structuurformule, CAS-nummer enz.) met inbegrip van de zuiverheid en de analysemethode voor de kwantitatieve bepaling van de teststof.
|
|
|
Diersoort:
—
|
gebruikte proefdieren: soort, wetenschappelijke naam, bron van de organismen en kweekomstandigheden;
|
—
|
informatie over de hantering van eipakketten en larven;
|
—
|
leeftijd van de proefdieren op het moment waarop zij in de testvaten werden gestopt.
|
|
|
Testomstandigheden:
—
|
gebruikt sediment, d.w.z. natuurlijk of kunstmatig sediment;
|
—
|
voor natuurlijk sediment: de locatie en beschrijving van de sedimentmonsternemingsplaats inclusief, indien mogelijk, vervuilingsgeschiedenis; eigenschappen: pH, gehalte aan organische koolstof, C/N-verhouding en korrelgrootteverdeling (indien van toepassing);
|
—
|
bereiding van het kunstmatige sediment: ingrediënten en eigenschappen (gehalte aan organische koolstof, pH, vocht enz. bij het begin van de test);
|
—
|
bereiding van het testwater (bij gebruik van synthetisch water) en eigenschappen (zuurstofgehalte, pH, geleidbaarheid, hardheid enz. bij het begin van de test);
|
—
|
dikte van de sedimentlaag en diepte van het bovenliggende water;
|
—
|
volume van het bovenliggende en poriewater; gewicht van het natte sediment met en zonder poriewater;
|
—
|
testvaten (materiaal en afmetingen);
|
—
|
sedimentverrijkingsmethode: toegepaste testconcentraties, aantal duplo’s en eventueel gebruik van oplosmiddel;
|
—
|
evenwichtsstabiliseringsfase van het verrijkte sediment-watersysteem: duur en omstandigheden;
|
—
|
incubatieomstandigheden: temperatuur, lichtcyclus en -intensiteit, beluchting (frequentie en intensiteit);
|
—
|
details over het voedsel, met inbegrip van soort voedsel, bereiding, hoeveelheid en voederregime.
|
|
|
Resultaten:
—
|
de nominale testconcentraties, de gemeten testconcentraties en de resultaten van alle analysen die zijn verricht om de concentratie van de teststof in het testvat te bepalen;
|
—
|
kwaliteit van het water in de testvaten, d.w.z. pH, temperatuur, opgeloste zuurstof, hardheid en ammonia;
|
—
|
vervanging van verdampt testwater, indien van toepassing;
|
—
|
aantal uitgekomen mannelijke en vrouwelijke muggen per vat en per dag;
|
—
|
aantal niet tot mug ontwikkelde larven per vat;
|
—
|
gemiddeld individueel drooggewicht van de larven per vat, en per stadium, indien van toepassing;
|
—
|
percentage uitgekomen muggen per vat en testconcentratie (mannelijke en vrouwelijke muggen gecombineerd);
|
—
|
gemiddeld ontwikkelingstempo van volledig uitgekomen muggen per duplo en behandeling (mannelijke en vrouwelijke muggen gecombineerd);
|
—
|
schattingen van toxische eindpunten, bv. ECx (met bijbehorende betrouwbaarheidsintervallen), NOEC en/of LOEC, en de statistische methoden waarmee zij zijn bepaald;
|
—
|
bespreking van de resultaten, met inbegrip van een eventuele beïnvloeding van de resultaten van de test die een gevolg is van afwijkingen van deze testmethode.
|
|
|
LITERATUUR:
(1)
|
BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H. Köpp. Berlin 1995.
|
(2)
|
Fleming R et al. (1994). Sediment Toxicity Tests for Poorly Water-Soluble Substances. Final Report to them European Commission. Report No: EC 3738. August 1994. WRc, UK.
|
(3)
|
SETAC (1993). Guidance Document on Sediment toxicity Tests and Bioassays for Freshwater and Marine Environments. From the WOSTA Workshop held in the Netherlands.
|
(4)
|
ASTM International/E1706-00 (2002). Test Method for Measuring the Toxicity of Sediment-Associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. pp 1125-1241. In ASTM International 2002 Annual Book of Standards. Volume 11.05. Biological Effects and Environmental Fate;Biotechnology; Pesticides. ASTM. International, West Conshohocken, PA.
|
(5)
|
Environment Canada (1997). Test for Growth and Survival in Sediment using Larvae of Freshwater Midges (Chironomus tentans or Chironomus riparius). Biological Test Method. Report SPE 1/RM/32. December 1997.
|
(6)
|
US-EPA (2000). Methods for Measuring the Toxicity and Bioaccumulation of Sediment-associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. Second edition. EPA 600/R-99/064. March 2000. Revision to the first edition dated June 1994.
|
(7)
|
US-EPA/OPPTS 850.1735. (1996): Whole Sediment Acute Toxicity Invertebrates.
|
(8)
|
US-EPA/OPPTS 850.1790. (1996): Chironomid Sediment toxicity Test.
|
(9)
|
Milani D, Day KE, McLeay DJ, and Kirby RS (1996). Recent intra- and inter-laboratory studies related to the development and standardisation of Environment Canada’s biological test methods for measuring sediment toxicity using freshwater amphipods (Hyalella azteca) and midge larvae (Chironomus riparius). Technical Report. Environment Canada. National Water Research Institute. Burlington, Ontario, Canada.
|
(10)
|
Sugaya Y (1997). Intra-specific variations of the susceptibility of insecticides in Chironomus yoshimatsui. Jp. J. Sanit. Zool. 48 (4): 345-350.
|
(11)
|
Kawai K (1986). Fundamental studies on Chironomid allergy. I. Culture methods of some Japanese Chironomids (Chironomidae, Diptera). Jp. J. Sanit. Zool. 37(1): 47-57.
|
(12)
|
OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. OECD Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 23.
|
(13)
|
Environment Canada (1995). Guidance Document on Measurement of Toxicity Test Precision Using Control Sediments Spiked with a Reference Toxicant. Report EPS 1/RM/30. September 1995.
|
(14)
|
Testmethode C.8 van deze bijlage, Toxiciteit voor regenwormen.
|
(15)
|
Suedel BC and JH Rodgers (1994). Development of formulated reference sediments for freshwater and estuarine sediment testing. Environ. Toxicol. Chem. 13: 1163-1175.
|
(16)
|
Naylor C and C Rodrigues (1995). Development of a test method for Chironomus riparius using a formulated sediment. Chemosphere 31: 3291-3303.
|
(17)
|
Dunnett CW (1964). A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Amer. Statis. Assoc., 50: 1096-1121.
|
(18)
|
Dunnett CW (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics, 20: 482-491.
|
(19)
|
Williams DA (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics, 27: 103-117.
|
(20)
|
Williams DA (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics, 28: 510-531.
|
(21)
|
Rao JNK and Scott AJ (1992). A simple method for the analysis of clustered binary data. Biometrics 48: 577-585.
|
(22)
|
Christensen ER (1984). Dose-response functions in aquatic toxicity testing and the Weibull model. Water Research 18: 213-221.
|
(23)
|
Bruce and Versteeg (1992). A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry 11: 1485-1494.
|
(24)
|
Slob W (2002). Dose-response modelling of continuous endpoints. Toxicol. Sci. 66: 298-312.
|
Aanhangsel 1
DEFINITIES
Voor de toepassing van deze testmethode wordt verstaan onder:
|
kunstmatig sediment (ook wel bereid, gereconstitueerd of synthetisch sediment genoemd): een mengsel van materialen waarmee de fysische bestanddelen van natuurlijk sediment worden nagebootst;
|
|
„bovenliggend water”: het water dat in het testvat op het sediment wordt gegoten;
|
|
„poriewater” (ook wel interstitieel water genoemd): het water in de ruimten tussen de sediment- en bodemdeeltjes;
|
|
„verrijkt sediment”: sediment waaraan teststof is toegevoegd;
|
|
„teststof”: alle volgens deze testmethode geteste stoffen en mengsels.
|
Aanhangsel 2
Aanbevelingen voor de kweek van Chironomus riparius
1.
|
Larven van Chironomus kunnen worden gekweekt in kristalliseerschalen of grotere houders. Op de bodem van de houder wordt een 5 tot 10 mm dikke laag fijn kwartszand gestrooid. Ook kiezelgoer (bv. Merck, Art 8117) is geschikt gebleken als substraat (in dat geval volstaat een dunnere laag van slechts enkele mm). Vervolgens wordt een enkele cm diepe laag geschikt water toegevoegd. Om verdampingsverliezen te compenseren en uitdroging te voorkomen, worden de waterniveaus zo nodig aangevuld. Indien nodig kan het water worden vervangen. Er wordt voorzichtige beluchting toegepast. De larvenkweekvaten worden in een geschikte kooi geplaatst, zodat de volwassen muggen niet kunnen ontsnappen. De kooi moet groot genoeg zijn om de uitgekomen volwassen muggen te laten zwermen, omdat anders mogelijk niet wordt gecopuleerd (ten minste ca. 30 x 30 x 30 cm).
|
2.
|
De kooien worden op kamertemperatuur of in een kamer met een constant klimaat bij 20 ± 2 °C gehouden, met een lichtregime van 16 uur licht (intensiteit ca. 1 000 lux), 8 uur donker. Gerapporteerd is dat een relatieve luchtvochtigheid van minder dan 60 % de voortplanting kan belemmeren.
|
Verdunningswater
3.
|
Elk geschikt natuurlijk of synthetisch water kan worden gebruikt. Gebruikelijk zijn bronwater, ontchloord kraanwater en kunstmatige media (bv. Elendt-media M4 en M7, zie hieronder). Voor gebruik moet het water worden belucht. Indien nodig kan het kweekwater worden ververst door voorzichtig het gebruikte water uit de kweekvaten te gieten of hevelen zonder de larvenhulzen te beschadigen.
|
Toediening van voedsel aan larven
4.
|
De larven van Chironomus worden dagelijks gevoerd met ongeveer 250 mg visvoervlokken (TetraMin®, TetraPhyll® of een soortgelijk merk visvoer) per vat. Dit voer kan worden gegeven als droog gemalen poeder of als suspensie in water: aan 20 ml verdunningswater wordt 1,0 g voedervlokken toegevoegd en gemengd, zodat een homogeen mengsel ontstaat. Van dit mengsel kan ongeveer 5 ml per vat per dag worden gebruikt (schudden voor gebruik). Aan oudere larven kan meer voer worden gegeven.
|
5.
|
Het voedsel wordt aangepast op basis van de waterkwaliteit. Als het kweekmedium troebel wordt, wordt de hoeveelheid voedsel verminderd. De toediening van voedsel moet zorgvuldig worden geobserveerd. Als te weinig voer wordt gegeven, zullen de larven naar de waterkolom uitwijken; als te veel voer wordt gegeven, neemt de microbiële activiteit toe en daalt het zuurstofgehalte. Beide condities kunnen tot lagere groeisnelheden leiden.
|
6.
|
Wanneer nieuwe kweekvaten worden ingericht, kunnen ook enige cellen van groene algen (bv. Scenedesmus subspicatus, Chlorella vulgaris) worden toegevoegd.
|
Toediening van voedsel aan uitgekomen volwassen muggen
7.
|
Enkele onderzoekers hebben erop gewezen dat een in een sacharoseoplossing gedrenkt wattenschijfje als voedsel kan dienen voor uitgekomen volwassen muggen.
|
Uitkomst van muggen
8.
|
In de larvenkweekvaten zullen zich bij 20 ± 2 °C na ongeveer 13-15 dagen volwassen muggen ontwikkelen. Mannetjes zijn gemakkelijk te herkennen aan hun veerachtige antennes.
|
Eipakketten
9.
|
Zodra in de kweekkooi volwassen muggen aanwezig zijn, worden alle larvenkweekvaten drie keer per week gecontroleerd op afgezette geleiachtige eipakketten. Als eipakketten aanwezig zijn, worden zij voorzichtig verwijderd. Zij worden overgebracht naar een klein schaaltje met een monster van het kweekwater. De eipakketten worden gebruikt om een nieuw kweekvat te beginnen (bv. 2-4 eipakketten per vat) of worden voor toxiciteitstests gebruikt.
|
10.
|
Larven in het eerste stadium moeten na twee-drie dagen uitkomen.
|
Inrichting van nieuwe kweekvaten
11.
|
Zodra kweken zijn opgezet, moet het mogelijk zijn een keer per week, of minder vaak naargelang de testvoorschriften, een vers larvenkweekvat in te richten, waarbij de oudere vaten worden verwijderd nadat zich volwassen muggen hebben ontwikkeld. Dit systeem zorgt voor een regelmatige aanvoer van volwassen muggen met een minimum aan beheer.
|
Bereiding van de testoplossingen M4 en M7
12.
|
Elendt (1990) heeft het medium M4 beschreven. Het medium M7 wordt op dezelfde wijze als M4 bereid, maar met een vier keer zo lage concentratie van de in tabel 1 vermelde stoffen. Er is een publicatie over het medium M7 in voorbereiding (persoonlijk medegedeeld door Elendt). De testoplossing mag niet volgens Elendt en Bias (1990) worden bereid, omdat de voor de stamoplossingen vermelde concentraties van NaSiO3 5 H2O, NaNO3, KH2PO4 en K2HPO4 niet geschikt zijn.
|
Bereiding van het medium M7
13.
|
Elke stamoplossing (I) wordt apart bereid en met deze stamoplossingen (I) wordt een gecombineerde stamoplossing (II) bereid (zie tabel 1). Het medium M7 wordt bereid uit 50 ml gecombineerde stamoplossing (II) en de in tabel 2 vermelde hoeveelheden van elke stamoplossing van macronutriënten en tot 1 liter gedeïoniseerd water aangevuld. Een vitaminestamoplossing wordt bereid door overeenkomstig tabel 3 drie vitaminen toe te voegen aan gedeïoniseerd water; kort voor gebruik wordt 0,1 ml van de gecombineerde vitaminestamoplossing aan het definitieve medium M7 toegevoegd (de vitaminestamoplossing wordt in bevroren toestand in kleine porties bewaard.) Het medium wordt belucht en gestabiliseerd.
|
LITERATUUR:
BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H. Köpp. Berlin 1995.
Tabel 1
Stamoplossingen van spoorelementen voor de media M4 en M7
Stamoplossingen (I)
|
Hoeveelheid (mg) aangevuld tot 1 liter gedeïoniseerd water
|
Gecombineerde stamoplossing (II) bereiden door de volgende hoeveelheden (ml) van de stamoplossingen (I) te mengen en tot 1 liter gedeïoniseerd water aan te vullen
|
Uiteindelijke concentraties in testoplossingen (mg/l)
|
M4
|
M7
|
M4
|
M7
|
H3BO3
(15)
|
57 190
|
1,0
|
0,25
|
2,86
|
0,715
|
MnCl2 · 4 H2O (15)
|
7 210
|
1,0
|
0,25
|
0,361
|
0,090
|
LiCl (15)
|
6 120
|
1,0
|
0,25
|
0,306
|
0,077
|
RbCl (15)
|
1 420
|
1,0
|
0,25
|
0,071
|
0,018
|
SrCl2 · 6 H2O (15)
|
3 040
|
1,0
|
0,25
|
0,152
|
0,038
|
NaBr (15)
|
320
|
1,0
|
0,25
|
0,016
|
0,004
|
Na2MoO4 · 2 H2O (15)
|
1 260
|
1,0
|
0,25
|
0,063
|
0,016
|
CuCl2 · 2 H2O (15)
|
335
|
1,0
|
0,25
|
0,017
|
0,004
|
ZnCl2
|
260
|
1,0
|
1,0
|
0,013
|
0,013
|
CaCl2 · 6 H2O
|
200
|
1,0
|
1,0
|
0,010
|
0,010
|
KI
|
65
|
1,0
|
1,0
|
0,0033
|
0,0033
|
Na2SeO3
|
43,8
|
1,0
|
1,0
|
0,0022
|
0,0022
|
NH4VO3
|
11,5
|
1,0
|
1,0
|
0,00058
|
0,00058
|
Na2EDTA · 2 H2O (15)
(16)
|
5 000
|
20,0
|
5,0
|
2,5
|
0,625
|
FeSO4 · 7 H2O (15)
(16)
|
1 991
|
20,0
|
5,0
|
1,0
|
0,249
|
Tabel 2
Stamoplossingen van macronutriënten voor de media M4 en M7
|
Hoeveelheid aangevuld tot 1 liter gedeïoniseerd water
(mg)
|
Hoeveelheid stamoplossing van macronutriënten die wordt toegevoegd om de media M4 en M7 te bereiden
(ml/l)
|
Uiteindelijke concentraties in de testoplossingen M4 en M7
(mg/l)
|
CaCl2 · 2 H2O
|
293 800
|
1,0
|
293,8
|
MgSO4 · 7 H2O
|
246 600
|
0,5
|
123,3
|
KCl
|
58 000
|
0,1
|
5,8
|
NaHCO3
|
64 800
|
1,0
|
64,8
|
NaSiO3 · 9 H2O
|
50 000
|
0,2
|
10,0
|
NaNO3
|
2 740
|
0,1
|
0,274
|
KH2PO4
|
1 430
|
0,1
|
0,143
|
K2HPO4
|
1 840
|
0,1
|
0,184
|
Tabel 3
Vitaminestamoplossing voor de media M4 en M7. De drie vitamineoplossingen worden tot één vitaminestamoplossing samengevoegd
|
Hoeveelheid aangevuld tot 1 liter gedeïoniseerd water
(mg)
|
Hoeveelheid vitaminestamoplossing die wordt toegevoegd om de media M4 en M7 te bereiden
(ml/l)
|
Uiteindelijke concentraties in de testoplossingen M4 en M7
(mg/l)
|
Thiaminehydrochloride
|
750
|
0,1
|
0,075
|
Cyanocobalamine (B12)
|
10
|
0,1
|
0,0010
|
Biotine
|
7,5
|
0,1
|
0,00075
|
LITERATUUR:
Elendt, B.P. (1990). Selenium Deficiency in Crustacean. Protoplasma 154: 25-33.
Elendt, B.P. & W.-R. Bias (1990). Trace Nutrient Deficiency in Daphnia magna Cultured in Standard Medium for Toxicity Testing. Effects on the Optimization of Culture Conditions on Life History Parameters of D. magna. Water Research 24 (9): 1157-1167.
Aanhangsel 3
BEREIDING VAN KUNSTMATIG SEDIMENT
Samenstelling van het sediment
Het kunstmatige sediment wordt als volgt samengesteld:
Bestanddeel
|
Eigenschappen
|
% van het
sediment (drooggewicht)
|
Turf
|
Veenmosturf, zo dicht mogelijk bij pH 5,5-6,0, zonder zichtbare plantenresten, fijngemalen (deeltjesgrootte ≤ 1 mm) en aan de lucht gedroogd
|
4-5
|
Kwartszand
|
Korrelgrootte: > 50 % van de deeltjes moet binnen het bereik 50-200 μm liggen
|
75-76
|
Kaolienklei
|
Met ≥ 30 % kaoliniet
|
20
|
Organische koolstof
|
Aangepast door toevoeging van turf en zand
|
2 (± 0,5)
|
Calciumcarbonaat
|
CaCO3, poedervormig, chemisch zuiver
|
0,05-0,1
|
Water
|
Geleidbaarheid ≤ 10 μS/cm
|
30-50
|
Bereiding
De turf wordt aan de lucht gedroogd en tot een fijn poeder vermalen. Er wordt een suspensie van de vereiste hoeveelheid turfpoeder in gedeïoniseerd water bereid met een kwalitatief hoogwaardig homogeniseerapparaat. De pH van deze suspensie wordt met CaCO3 aangepast tot 5,5 ± 0,5. De suspensie wordt ten minste twee dagen lang onder zachtjes roeren bij 20 ± 2 °C geconditioneerd om de pH te stabiliseren en een stabiele microbiële component te verkrijgen. De pH wordt opnieuw gemeten en moet nu 6,0 ± 0,5 bedragen. Vervolgens wordt de turfsuspensie met de andere bestanddelen (zand en kaolienklei) en gedeïoniseerd water vermengd om een homogeen sediment te verkrijgen met een watergehalte van 30-50 % van het drooggewicht van het sediment. De pH van het uiteindelijke mengsel wordt nogmaals gemeten en zo nodig met CaCO3 tot 6,5-7,5 aangepast. Er worden monsters van het sediment genomen om het drooggewicht en het gehalte aan organische koolstof te bepalen. Aanbevolen wordt het kunstmatige sediment, voordat het in een test ter bepaling van de toxiciteit voor Chironomidae wordt gebruikt, zeven dagen te laten rusten onder dezelfde omstandigheden die ook in de test zullen heersen.
Opslag
De droge bestanddelen voor de bereiding van het kunstmatige sediment kunnen op een droge en koele plaats bij kamertemperatuur worden bewaard. Het kunstmatige (natte) sediment mag niet worden opgeslagen voordat het in de test wordt gebruikt. Het moet onmiddellijk na afloop van de zevendaagse conditioneringsperiode die de bereiding afsluit, worden gebruikt.
LITERATUUR:
Hoofdstuk C.8 van deze bijlage, Toxiciteit voor regenwormen.
Meller M, Egeler P, Rombke J, Schallnass H, Nagel R, Streit B (1998). Short-term Toxicity of Lindane, Hexachlorobenzene and Copper Sulfate on Tubificid Sludgeworms (Oligochaeta) in Artificial Media. Ecotox. and Environ. Safety 39: 10-20.
Aanhangsel 4
Chemische eigenschappen van aanvaardbaar verdunningswater
Stof
|
Concentraties
|
Vaste deeltjes
|
< 20 mg/l
|
Totaalgehalte aan organische koolstof
|
< 2 mg/l
|
Niet-geïoniseerde ammonia
|
< 1 μg/l
|
Hardheid uitgedrukt als CaCO3
|
< 400 mg/l (17)
|
Restchloorgehalte
|
< 10 μg/l
|
Totaalgehalte aan organofosfor-pesticiden
|
< 50 ng/l
|
Totaalgehalte aan organochloor-pesticiden en polychloorbifenylen
|
< 50 ng/l
|
Totaalgehalte aan organisch chloor
|
< 25 ng/l
|
Aanhangsel 5
Richtsnoeren voor de monitoring van het uitkomen van larven van chiromidae
Op de testglazen worden „emergence traps” geplaatst. Deze vallen zijn vanaf dag 20 tot het eind van de test nodig. Onderstaande tekening toont een voorbeeld van een gebruikte val:
A: nylon hor
B: omgekeerde kunststofbekers
C: bekerglas zonder tuit
D: openingen met hor voor wateruitwisseling
E: water
F: sediment
C.28. TEST TER BEPALING VAN DE TOXICITEIT VOOR CHIRONOMIDEA IN SEDIMENT EN WATER M.BV VERRIJKT WATER
INLEIDING
1.
|
Deze methode is gelijkwaardig aan testrichtlijn (TG) 219 (2004) van de OESO. De testmethode is bedoeld om de effecten te bepalen van langdurige blootstelling van in het sediment levende larven van tweevleugelige zoetwaterinsecten van Chironomus spp. aan stoffen. Zij berust hoofdzakelijk op de BBA-richtsnoeren en maakt gebruik van een testsysteem van sediment en water met kunstmatige grond en een blootstellingsscenario voor de waterkolom (1). De methode houdt ook rekening met de bestaande toxiciteitstestprotocollen voor Chironomus riparius en Chironomus tentans die in Europa en Noord-Amerika zijn ontwikkeld (2)(3)(4)(5)(6)(7)(8) en aan een ringonderzoek zijn onderworpen (1)(6)(9). Er kunnen ook andere goed gedocumenteerde Chironomidae worden gebruikt, bijvoorbeeld Chironomus yoshimatsui (10)(11).
|
2.
|
Bij het in deze testmethode gebruikte blootstellingsscenario wordt gebruikgemaakt van verrijkt water. De selectie van het juiste blootstellingsscenario hangt af van het beoogde doel van de test. Het waterblootstellingsscenario, waarbij de waterkolom wordt verrijkt, is bedoeld om een gebeurtenis na te bootsen waarbij een gespoten bestrijdingsmiddel overwaait; het scenario heeft betrekking op de initiële concentratiepiek in het poriewater. Dit scenario is ook bruikbaar voor andersoortige blootstelling (waaronder weglekkende chemische stoffen), maar niet voor accumulatieprocessen die langer duren dan de testperiode.
|
3.
|
De stoffen die moeten worden getest voor in het sediment levende organismen, zijn gewoonlijk gedurende lange tijd persistent in dit compartiment. De in het sediment levende organismen kunnen via een aantal routes worden blootgesteld. Het relatieve belang van elke blootstellingsroute en de tijd die voor de bijdrage aan de algehele toxische effecten via elke route wordt genomen, hangen af van de fysisch-chemische eigenschappen van de betrokken stof. Voor sterk adsorberende stoffen (bijvoorbeeld met log Kow > 5) of voor stoffen die een covalente binding met het sediment aangaan, kan ingestie van besmet voedsel een belangrijke blootstellingsroute zijn. Om de toxiciteit van zeer lipofiele stoffen niet te onderschatten, kan worden overwogen vóór aanbrenging van de teststof voedsel aan het sediment toe te voegen. Om rekening te houden met alle mogelijke blootstellingsroutes, ligt de nadruk bij deze testmethode op langdurige blootstelling. De testduur bedraagt 20-28 dagen voor C. riparius en C. yoshimatsui, en 28-65 dagen voor C. tentans. Als voor een specifiek doel, bijvoorbeeld om de effecten van onstabiele stoffen te onderzoeken, kortetermijngegevens vereist zijn, kunnen na een periode van tien dagen aanvullende duplo’s worden verwijderd.
|
4.
|
De gemeten eindpunten zijn het totale aantal tot adult ontwikkelde dieren en de hiervoor benodigde tijd. Als aanvullende kortetermijngegevens vereist zijn, wordt aanbevolen de overleving en de groei van de larven pas te meten na een periode van tien dagen en zo nodig aanvullende duplo’s te gebruiken.
|
5.
|
Het gebruik van kunstmatig sediment wordt aanbevolen. Kunstmatig sediment heeft verschillende voordelen ten opzichte van natuurlijke sedimenten:
—
|
de experimentele variabiliteit wordt beperkt omdat het een reproduceerbare „genormaliseerde matrix” vormt en niet gezocht hoeft te worden naar niet-besmette schone sedimentbronnen;
|
—
|
het testsediment kent geen seizoensveranderingen en op ieder moment kunnen tests worden gestart; het sediment hoeft niet te worden voorbehandeld om inheemse fauna te verwijderen; het gebruik van kunstmatig sediment beperkt ook de kosten aangezien geen sediment in het veld hoeft te worden verzameld voor routinetests;
|
—
|
door het gebruik van kunstmatig sediment is de toxiciteit van stoffen vergelijkbaar en kunnen stoffen dienovereenkomstig worden gerangschikt: voor verscheidene stoffen zijn de toxiciteitsgegevens uit tests met natuurlijk en kunstmatig sediment vergelijkbaar gebleken (2).
|
|
6.
|
De gebruikte definities zijn opgenomen in aanhangsel 1.
|
PRINCIPE VAN DE TEST
7.
|
Larven in het eerste stadium van Chironomidae worden in sediment-watersystemen aan een concentratiebereik van de teststof blootgesteld. De test begint op het moment waarop de larven in het eerste stadium in de testbekers met het sediment-watersysteem worden gestopt, waarna het water met de teststof wordt verrijkt. Aan het eind van de test worden het uitkomstquotiënt en het ontwikkelingstempo van Chironomidae gemeten. Zo nodig kunnen tevens na tien dagen de overleving en het gewicht van de larven worden bepaald (hiervoor kunnen zo nodig aanvullende duplo’s worden gebruikt). Deze gegevens worden geanalyseerd door hetzij met een regressiemodel een schatting te maken van de concentratie die zou leiden tot een afname van het uitkomen, de overleving of de groei van larven met x % (bv. EC15, EC50 enz.), hetzij een statistische hypothese te toetsen om een NOEC/LOEC te bepalen. In het laatste geval worden de effectwaarden door middel van statistische toetsen met controlewaarden vergeleken.
|
GEGEVENS OVER DE TESTSTOF
8.
|
De oplosbaarheid in water van de teststof, de dampspanning ervan, de gemeten of berekende verdeling in sediment en de stabiliteit in water en sediment moeten bekend zijn. Er moet een betrouwbare analysemethode, met een bekende en gerapporteerde nauwkeurigheid en detectiegrens, beschikbaar zijn voor de kwantitatieve bepaling van de teststof in bovenliggend water, poriewater en sediment. Andere nuttige informatie zijn de structuurformule en de zuiverheid van de teststof. Ook het uiteindelijke chemische lot van de teststof (bv. dissipatie, niet-biologische en biologische afbraak enz.) is nuttige informatie. Nadere richtsnoeren voor het testen van stoffen met zodanige fysisch-chemische eigenschappen dat de uitvoering van de test problematisch is, zijn in (12) opgenomen.
|
REFERENTIESTOFFEN
9.
|
Er kunnen regelmatig tests met referentiestoffen worden uitgevoerd om de betrouwbaarheid van het testprotocol en de testomstandigheden te waarborgen. Voorbeelden van toxische referentiestoffen die met succes in ringonderzoek en valideringsstudies zijn gebruikt, zijn: lindaan, trifluralin, pentachloorfenol, cadmiumchloride en kaliumchloride (1)(2)(5)(6)(13).
|
GELDIGHEID VAN DE TEST
10.
|
De test is alleen geldig als aan de onderstaande voorwaarden wordt voldaan:
—
|
het uitkomstpercentage in de controlegroepen moet aan het eind van de test ten minste 70 % zijn (1)(6);
|
—
|
de ontwikkeling tot adult van de in de controlevaten gestopte C. riparius en C. yoshimatsui moet binnen 12 tot 23 dagen plaatsvinden; voor C. tentans is een periode van 20 tot 65 dagen nodig;
|
—
|
aan het eind van de test worden de pH en het gehalte aan opgeloste zuurstof in elk vat gemeten. Het zuurstofgehalte moet ten minste 60 % bedragen van de verzadigingswaarde van lucht (ASV) bij de heersende temperatuur en het bovenliggende water moet in alle testvaten een pH-waarde tussen 6 en 9 hebben;
|
—
|
de watertemperatuur mag niet met meer dan ± 1,0 °C afwijken. De watertemperatuur kan worden geregeld door een isotherme kamer te gebruiken; in dat geval wordt de kamertemperatuur met passende tussenpozen bevestigd.
|
|
BESCHRIJVING VAN DE METHODE
Testvaten
11.
|
De studie wordt uitgevoerd in bekerglazen met een inhoud van 600 ml en een diameter van 8 cm. Ook andere vaten kunnen geschikt zijn, mits zij voldoende diep zijn voor het bovenliggende water en het sediment. Het sedimentoppervlak moet ten minste 2 tot 3 cm2 per larve bedragen. De verhouding tussen de dikte van de sedimentlaag en de diepte van het bovenliggende water moet 1:4 zijn. Testvaten en andere apparatuur die in contact met het testsysteem komt, moeten volledig van glas of een ander chemisch inert materiaal zijn gemaakt (bv. teflon).
|
Keuze van de soorten
12.
|
Als testsoort heeft Chironomus riparius de voorkeur. Chironomus tentans is ook geschikt maar is lastiger in het gebruik en vergt een lagere testperiode. Chironomus yoshimatsui mag ook worden gebruikt. Aanhangsel 2 bevat bijzonderheden over de kweekmethoden van Chironomus riparius. Er is ook informatie beschikbaar over de kweekomstandigheden van andere soorten, namelijk Chironomus tentans (4) en Chironomus yoshimatsui (11). Vóór de test moet de identificatie van de soorten worden bevestigd; als de organismen uit eigen kweek afkomstig zijn, is geen bevestiging voorafgaand aan iedere test nodig.
|
Sediment
13.
|
Er wordt bij voorkeur kunstmatig sediment gebruikt (ook wel bereid, gereconstitueerd of synthetisch sediment genoemd). Als echter natuurlijk sediment wordt gebruikt, moet dit worden gekarakteriseerd (ten minste pH en gehalte aan organische koolstof; bepaling van parameters als C/N-verhouding en korrelgrootteverdeling worden eveneens aanbevolen) en moet het vrij zijn van verontreinigingen en andere organismen die de Chironomidae zouden kunnen beconcurreren of consumeren. Ook wordt aanbevolen het natuurlijke sediment, voordat het in een test ter bepaling van de toxiciteit voor Chironomidae wordt gebruikt, zeven dagen te laten rusten onder dezelfde omstandigheden die ook in de test zullen heersen. Voor deze test wordt sediment aanbevolen dat op basis van de in testmethode C.8 (14) gebruikte kunstmatige grond als volgt is samengesteld (1)(15)(16):
a)
|
4-5 % (drooggewicht) turf: de pH moet zo dicht mogelijk bij 5,5 tot 6,0 liggen; het is belangrijk dat fijngemalen turf in poedervorm (deeltjesgrootte ≤ 1 mm) wordt gebruikt dat alleen aan de lucht is gedroogd;
|
b)
|
20 % (drooggewicht) kaolienklei (met bij voorkeur meer dan 30 % kaoliniet);
|
c)
|
75-76 % (drooggewicht) kwartszand (overwegend bestaande uit fijn zand; meer dan 50 % van de deeltjes moet een grootte tussen 50 en 200 μm hebben);
|
d)
|
er wordt gedeïoniseerd water toegevoegd om het uiteindelijke mengsel een vochtgehalte van 30-50 % te geven;
|
e)
|
er wordt chemisch zuiver calciumcarbonaat (CaCO3) toegevoegd om het uiteindelijke sedimentmengsel een pH van 7,0 ± 0,5 te geven.
|
f)
|
Het gehalte aan organische koolstof van het uiteindelijke mengsel moet 2 % (± 0,5 %) bedragen en moet worden aangepast door toevoeging van extra turf en zand overeenkomstig a) en c).
|
|
14.
|
De bron van de turf, de kaolienklei en het zand moet bekend zijn. De bestanddelen van het sediment moeten worden gecontroleerd op verontreiniging met chemische stoffen (bv. zware metalen, organische chloor- en fosforverbindingen enz.). In aanhangsel 3 wordt een voorbeeld gegeven van de bereiding van kunstmatig sediment. Menging van droge bestanddelen is ook aanvaardbaar, mits wordt aangetoond dat na toevoeging van het bovenliggende water geen scheiding van de bestanddelen van het sediment plaatsvindt (bv. door drijvende turfdeeltjes) en dat de turf of het sediment voldoende geconditioneerd is.
|
Water
15.
|
Elk water dat aan de in de aanhangsels 2 en 4 vermelde chemische eigenschappen van aanvaardbaar verdunningswater voldoet, is geschikt als testwater. Als kweek- en testwater is elk geschikt water, natuurlijk water (oppervlakte- of grondwater), synthetisch water (zie aanhangsel 2) of ontchloord kraanwater aanvaardbaar, mits de Chironomidae daarin gedurende het kweken en testen overleven zonder tekenen van stress te vertonen. Aan het begin van de test moet het testwater een pH-waarde tussen 6 en 9 hebben en mag de totale hardheid, uitgedrukt als CaCO3, niet hoger zijn dan 400 mg/l. Als echter een interactie tussen de hardheidsionen en de teststof wordt vermoed, moet water met een lagere hardheid worden gebruikt (en is Elendt-medium M4 dus ongeschikt). Voor de hele studie moet één soort water worden gebruikt. De in aanhangsel 4 vermelde kwaliteitskenmerken voor water moeten ten minste twee keer per jaar worden gemeten, of wanneer vermoed wordt dat een significante verandering heeft plaatsgevonden.
|
Stamoplossingen — verrijkt water
16.
|
De testconcentraties worden berekend op basis van de concentraties in de waterkolom, d.w.z. het boven het sediment liggende water. Testoplossingen van de gekozen concentraties worden gewoonlijk bereid door verdunning van een stamoplossing. De stamoplossingen worden bij voorkeur bereid door oplossing van de teststof in het testmedium. Het gebruik van oplosmiddelen of dispergeermiddelen kan in bepaalde gevallen nodig zijn om een stamoplossing van een passende concentratie te verkrijgen. Voorbeelden van geschikte oplosmiddelen zijn aceton, ethanol, methanol, ethyleenglycolmonoëthylether, ethyleenglycoldimethylether, dimethylformamide en triëthyleenglycol. Als dispergeermiddelen mogen Cremophor RH40, Tween 80, 0,01 % methylcellulose en HCO-40 worden gebruikt. De concentratie van de solubilisator in het uiteindelijke testmedium moet minimaal zijn (d.w.z. ≤ 0,1 ml/l) en moet in elke testgroep gelijk zijn. Indien een solubilisator wordt gebruikt, mag dit geen significante effecten op de overleving hebben, noch een zichtbaar negatief effect op de Chironomidae-larven hebben, hetgeen blijkt uit de controlegroep met uitsluitend oplosmiddel. Het gebruik van deze stoffen moet echter zo veel mogelijk worden vermeden.
|
TESTOPZET
17.
|
De testopzet heeft betrekking op het aantal testconcentraties en de factor waarmee ze van elkaar verschillen, het aantal vaten per concentratieniveau en het aantal larven per vat. Er wordt een beschrijving gegeven van testopzetten voor de puntschatting van de EC, de schatting van de NOEC en de uitvoering van een limiettest. Regressieanalyse heeft de voorkeur boven toetsing van een hypothese.
|
Opzet voor regressieanalyse
18.
|
De in de test gebruikte concentraties moeten de effectconcentratie (bv. EC15 en EC50) en het concentratiebereik waarbinnen het effect van de teststof van belang is omvatten. In het algemeen nemen de nauwkeurigheid en in het bijzonder de geldigheid van schattingen van de effectconcentraties (ECx) toe als de effectconcentratie binnen het geteste concentratiebereik ligt. Extrapolaties ver onder de laagste positieve concentratie of boven de hoogste concentraties moeten worden vermeden. Om het concentratiebereik te kiezen, kan een preliminaire bereikbepalingstest worden uitgevoerd (zie punt 27).
|
19.
|
Als een ECx-schatting moet worden gemaakt, worden ten minste vijf concentraties in triplo getest. In alle gevallen is het raadzaam bij voldoende concentraties te testen om een goede modelschatting mogelijk te maken. Het verschil tussen de concentraties mag niet meer dan factor 2 bedragen (als de dosis-responscurve een geringe helling vertoont, kan hiervan worden afgeweken). Het aantal duplo’s voor elke testgroep kan worden verlaagd wanneer het aantal testconcentraties met een verschillende respons wordt verhoogd. Als het aantal duplo’s wordt verhoogd of de intervallen tussen de testconcentraties worden verkleind, worden de betrouwbaarheidsintervallen van de test gewoonlijk kleiner. Als een schatting van de overleving en de groei van larven na tien dagen moet worden gemaakt, zijn aanvullende duplo’s vereist.
|
Opzet voor de schatting van een NOEC/LOEC
20.
|
Als een LOEC- of NOEC-schatting moet worden gemaakt, worden vijf concentraties getest met ten minste vier duplo’s en mag het verschil tussen de concentraties niet meer dan factor 2 bedragen. Het aantal duplo’s moet toereikend zijn om voldoende onderscheidend vermogen te waarborgen om een verschil van 20 % met de controlegroep te kunnen vaststellen bij een significantieniveau van 5 % (p = 0,05). Het ontwikkelingstempo kan gewoonlijk worden bepaald met een variantieanalyse (ANOVA), zoals de toets van Dunnett of Williams (17)(18)(19)(20). Voor het uitkomstquotiënt kan de toets van Cochran-Armitage, de exacte toets van Fisher (met correctie van Bonferroni) of de toets van Mantel-Haenszel worden gebruikt.
|
Limiettest
21.
|
Als in de preliminaire bereikbepalingstest geen effecten zijn waargenomen, kan een limiettest worden uitgevoerd (één testconcentratie en controlegroep). De limiettest dient om aanwijzingen te verzamelen dat de toxische waarde van de teststof groter is dan de geteste limietconcentratie. Er kan geen concentratie voor deze testmethode worden aanbevolen; die wordt aan het oordeel van de regelgever overgelaten. Gewoonlijk zijn zes duplo’s voor zowel de testgroep als de controlegroep nodig. Aangetoond moet worden dat het onderscheidend vermogen groot genoeg is om een verschil van 20 % met de controlegroep te kunnen vaststellen bij een significantieniveau van 5 % (p = 0,05). Voor de meetrespons (ontwikkelingstempo en gewicht) is de T-toets een geschikte statistische methode, mits de gegevens aan de voorwaarden van deze toets voldoen (normale verdeling, homogene variantie). Als niet aan die voorwaarden wordt voldaan, kan de T-toets voor ongelijke variantie of een verdelingsvrije toets, zoals de Wilcoxon-Mann-Whitney-toets, worden gebruikt. Voor het uitkomstquotiënt is de exacte toets van Fisher geschikt.
|
PROCEDURE
Blootstellingsomstandigheden
Voorbereiding van het verrijkt water-sedimentsysteem
22.
|
In de testvaten wordt voldoende kunstmatig sediment (zie de punten 13-14 en aanhangsel 3) aangebracht om een laag van ten minste 1,5 cm te vormen. Vervolgens wordt een 6 cm diepe laag water toegevoegd (zie punt 15). De verhouding tussen de dikte van de sedimentlaag en de diepte van het water mag niet groter zijn dan 1:4 en de sedimentlaag mag niet dikker zijn dan 3 cm. Laat het sediment-watersysteem onder voorzichtige beluchting zeven dagen rusten voordat de testorganismen worden toegevoegd (zie punt 14 en aanhangsel 3). Om te voorkomen dat tijdens de toevoeging van testwater aan de waterkolom bestanddelen zich van het sediment afscheiden en fijn materiaal in suspensie wordt gebracht, kan het sediment tijdens het gieten worden afgedekt met een kunststof schijf, die onmiddellijk daarna wordt verwijderd. Ook andere middelen kunnen geschikt zijn.
|
23.
|
De testvaten worden (bijvoorbeeld met glasplaten) bedekt. Om verdampingsverliezen te compenseren, kan het waterniveau tijdens de studie worden aangevuld tot het oorspronkelijke volume. Om te voorkomen dat zouten ontstaan, moet hiervoor gedestilleerd of gedeïoniseerd water worden gebruikt.
|
Toevoeging van testorganismen
24.
|
Vier tot vijf dagen voordat de testorganismen aan de testvaten worden toegevoegd, worden eipakketten uit de kweken genomen en in kleine vaten in een kweekmedium geplaatst. Er kan ouder medium uit de voorraadcultuur of vers bereid medium worden gebruikt. In het laatste geval wordt aan het kweekmedium een kleine hoeveelheid voedsel, zoals groene algen en/of enkele druppels filtraat uit een fijngemalen suspensie van visvoervlokken, toegevoegd (zie aanhangsel 2). Er worden alleen vers afgezette eipakketten gebruikt. Normaliter beginnen de larven enkele dagen nadat de eieren zijn gelegd (twee tot drie dagen voor Chironomus riparius bij 20 °C en één tot vier dagen voor Chironomus tentans bij 23 °C en Chironomus yoshimatsui bij 25 °C) uit te komen en vindt de groei van de larven plaats in vier stadia die elk vier-acht dagen duren. Voor de test worden larven in het eerste stadium (twee-drie of één-vier dagen na uitkomen) gebruikt. Het stadium van muggen kan mogelijk worden gecontroleerd aan de hand van de breedte van het epicranium (6).
|
25.
|
Twintig larven in het eerste stadium worden met een stompe pipet willekeurig verdeeld over de testvaten met verrijkt sediment en water. Tijdens het inbrengen van de larven in de testvaten en de eerste 24 uur daarna wordt de beluchting van het water uitgezet (zie de punten 24 en 32). Afhankelijk van de testopzet (zie de punten 19 en 20) bedraagt het aantal larven dat per concentratie wordt gebruikt ten minste 60 voor de EC-puntschatting en 80 voor de NOEC-bepaling.
|
26.
|
24 uur na toevoeging van de larven wordt de bovenliggende waterkolom met de teststof verrijkt, waarna weer lichte beluchting wordt toegepast. Onder het wateroppervlak worden met een pipet kleine hoeveelheden van de teststofoplossing ingebracht. Vervolgens wordt het bovenliggende water voorzichtig gemengd, zonder het sediment te verstoren.
|
Testconcentraties
27.
|
Om het concentratiebereik van de test te bepalen, kan een bereikbepalingstest worden uitgevoerd. Daarvoor wordt een reeks sterk gespreide concentraties van de teststof gebruikt. Om te zorgen voor dezelfde oppervlaktedichtheid per Chironomus als in de eigenlijke test, worden de Chironomidae aan elke concentratie van de teststof blootgesteld gedurende een periode die een schatting van de wenselijke testconcentraties mogelijk maakt, en zijn geen duplo’s vereist.
|
28.
|
De testconcentraties voor de eigenlijke test worden gebaseerd op de uitkomsten van de bereikbepalingstest. Er moeten ten minste vijf concentraties worden gebruikt en geselecteerd, zoals beschreven in de punten 18 tot en met 20.
|
Controlegroep
29.
|
De test omvat controlevaten zonder teststof maar met sediment, met het vereiste aantal duplo’s (zie de punten 19-20). Indien voor het aanbrengen van de teststof een oplosmiddel is gebruikt (zie punt 16), wordt een controlegroep voor het oplosmiddel in het sediment toegevoegd.
|
Testsysteem
30.
|
Er worden statische systemen gebruikt. In uitzonderlijke gevallen kunnen semistatische of doorstroomsystemen met onderbroken of continue verversing van het bovenliggende water worden gebruikt, bijvoorbeeld als de kwaliteitsspecificaties voor het water niet geschikt zijn voor het testorganisme of het chemische evenwicht wordt aangetast (te laag gehalte opgeloste zuurstof, te hoge concentratie excretieproducten, uit het sediment vrijkomende mineralen, gewijzigde pH en/of waterhardheid enz.). Gewoonlijk kan de kwaliteit van het bovenliggende water echter met andere methoden, zoals beluchting, worden verbeterd; deze verdienen de voorkeur.
|
Voedsel
31.
|
De larven moeten, bij voorkeur dagelijks of ten minste drie keer per week, worden gevoerd. Voor jonge larven lijkt in de eerste tien dagen 0,25-0,5 mg visvoer (een suspensie in water of fijngemalen voedsel, bv. TetraMin of TetraPhyll; zie details in aanhangsel 2) per larve per dag voldoende te zijn (0,35-0,5 mg voor C. yoshimatsui). Oudere larven kunnen iets meer voedsel nodig hebben: tijdens de rest van de test zou 0,5-1 mg per larve per dag moeten volstaan. Als schimmelgroei wordt waargenomen of sterfte in de controlegroepen wordt geconstateerd, moet het voedselrantsoen in alle test- en controlegroepen worden verlaagd. Als de schimmelontwikkeling niet kan worden gestopt, moet de test worden herhaald. Voor sterk adsorberende stoffen (bijvoorbeeld met log Kow > 5) of voor stoffen die een covalente binding met het sediment aangaan kan de voor de overleving en natuurlijke groei van de organismen vereiste hoeveelheid voedsel vóór de stabilisatieperiode aan het kunstmatige sediment worden toegevoegd. In dat geval wordt in plaats van visvoer plantaardig materiaal gebruikt, bv. 0,5 % (drooggewicht) fijngemalen bladeren van bv. brandnetel (Urtica dioica), witte moerbei (Morus alba), witte klaver (Trifolium repens), spinazie (Spinacia oleracea) of ander plantaardig materiaal (Cerophyl of alfacellulose).
|
Incubatieomstandigheden
32.
|
In het bovenliggende water in de testvaten wordt bij voorkeur 24 uur na toevoeging van de larven voorzichtige beluchting toegepast en gedurende de test voortgezet (waarbij erop moet worden gelet dat het gehalte aan opgeloste zuurstof niet lager wordt dan 60 % van de ASV). De beluchting vindt plaats via een glazen pasteurpipet die 2-3 cm boven de sedimentlaag wordt bevestigd (bv. één of enkele luchtbellen/s). Als vluchtige stoffen worden getest, kan worden overgewogen het sediment-watersysteem niet te beluchten.
|
33.
|
De test wordt verricht bij een constante temperatuur van 20 °C (± 2 °C). Voor C. tentans en C. yoshimatsui bedraagt de aanbevolen temperatuur respectievelijk 23 °C en 25 °C (± 2 °C). Er wordt een fotoperiode van 16 uur gebruikt bij een lichtintensiteit van 500 tot 1 000 lux.
|
Blootstellingsduur
34.
|
De blootstelling begint bij toevoeging van larven aan de verrijkte vaten en de controlevaten. De maximale blootstellingsduur bedraagt 28 dagen voor C. riparius en C. yoshimatsui, en 65 dagen voor C. tentans. Als eerder muggen uitkomen, kan de test worden beëindigd nadat minimaal vijf dagen zijn verstreken na verschijning van de laatste volwassen mug in de controlegroep.
|
WAARNEMINGEN
Uitkomst van muggen
35.
|
De ontwikkelingstijd en het totale aantal volledig uitgekomen mannelijke en vrouwelijke muggen worden bepaald. Mannetjes zijn gemakkelijk te herkennen aan hun veerachtige antennes.
|
36.
|
De testvaten worden ten minste drie keer per week geobserveerd om een visuele beoordeling van eventueel afwijkend gedrag te verrichten (bv. verlating van het sediment, ongewoon zwemgedrag), waarbij met de controlegroep wordt vergeleken. In de periode waarin verwacht wordt dat de muggen uitkomen, moet dagelijks een telling van de uitgekomen muggen worden verricht. Dagelijks worden het aantal volledig uitgekomen muggen en hun geslacht geregistreerd. Na identificatie worden de muggen uit de vaten verwijderd. Als er voor het eind van de test eipakketten zijn afgezet, worden deze geregistreerd en vervolgens verwijderd om te voorkomen dat opnieuw larven in het sediment terechtkomen. Ook wordt geregistreerd hoeveel zichtbare poppen niet zijn uitgekomen. Aanhangsel 5 bevat aanwijzingen voor de meting van het uitkomen.
|
Groei en overleving
37.
|
Als gegevens over de overleving en groei van larven na tien dagen vereist zijn, wordt bij het begin gezorgd voor extra testvaten, die voor de voortzetting worden gebruikt. Het sediment van deze aanvullende vaten wordt door een 250 μm-zeef gevoerd, zodat de larven overblijven. De criteria voor „dood” zijn immobiliteit of geen reactie op een mechanische prikkel. Niet meer aangetroffen larven moeten als dode larven worden geteld (aan het begin van de test gestorven larven kunnen door microben zijn afgebroken). Het (asvrije) drooggewicht van de overlevende larven per testvat wordt bepaald en op grond daarvan wordt het gemiddelde individuele drooggewicht per vat berekend. Het is nuttig om te bepalen in welk stadium de overlevende larven zich bevinden; dit kan door de breedte van het epicranium van elk individu te meten.
|
Analytische bepalingen
Concentratie van de teststof
38.
|
Er moeten ten minste bij de hoogste en een lagere concentratie monsters van het bovenliggende water, het poriewater en het sediment worden geanalyseerd bij het begin (bij voorkeur een uur na inbrenging van de teststof) en eind van de test. Deze bepalingen van de concentratie van de teststof leveren informatie op over het gedrag en de verdeling van de teststof in het water-sedimentsysteem. Aangezien bemonstering van het sediment bij het begin van de test van invloed kan zijn op het testsysteem (bv. doordat de testlarven worden verwijderd), moeten voor de analytische bepalingen bij het begin van de test en tijdens de test zo nodig aanvullende testvaten worden gebruikt (zie punt 39). Als in een water/sedimentstudie onder vergelijkbare omstandigheden (bv. verhouding sediment/water, soort toepassing, organischekoolstofgehalte van het sediment) de verdeling van de teststof tussen het water en het sediment duidelijk is bepaald, kunnen metingen in het sediment niet noodzakelijk zijn.
|
39.
|
Wanneer tussenliggende metingen worden verricht (bv. op dag 7) en voor de analyse grotere monsters nodig zijn die niet uit de testvaten kunnen worden genomen zonder het testsysteem te beïnvloeden, worden analytische bepalingen verricht op monsters uit aanvullende testvaten die op dezelfde wijze zijn behandeld (inclusief toevoeging van testorganismen), maar niet voor biologische waarnemingen zijn gebruikt.
|
40.
|
Om het poriewater te isoleren, wordt aanbevolen te centrifugeren, bijvoorbeeld 30 min bij 10 000 g en een temperatuur van 4 °C. Filtratie kan ook aanvaardbaar zijn, mits aangetoond is dat de teststof niet aan filters adsorbeert. In sommige gevallen kan analyse van de concentraties in het poriewater onmogelijk zijn doordat het monster te klein is.
|
Fysisch-chemische eigenschappen
41.
|
De pH, het gehalte aan opgeloste zuurstof in het testwater en de temperatuur van de testvaten moeten op een geschikte wijze worden gemeten (zie punt 10). De hardheid en het ammoniagehalte moeten bij het begin en het eind van de test in de controlevaten en in één testvat worden gemeten bij de hoogste concentratie.
|
GEGEVENS EN RAPPORTAGE
Verwerking van de resultaten
42.
|
Doel van deze test is het bepalen van het effect van de teststof op het ontwikkelingstempo en het totale aantal volledig uitgekomen mannelijke en vrouwelijke muggen, of bij de tiendaagse test de effecten op de overleving en het gewicht van de larven. Als er geen aanwijzingen zijn voor een statistisch verschil in gevoeligheid tussen de geslachten, kunnen de resultaten voor mannetjes en vrouwtjes worden samengevoegd voor statistische analysen. Het verschil in gevoeligheid tussen de geslachten kan statistisch worden beoordeeld met bv. een χ2-r × 2 -toets. Zo nodig worden na tien dagen de overleving en het gemiddelde individuele drooggewicht per vat van de larven bepaald.
|
43.
|
Bij voorkeur aan de hand van de bij het begin van de test gemeten concentraties (zie punt 38) worden effectconcentraties berekend, die als concentratie in het bovenliggende water worden uitgedrukt.
|
44.
|
Voor de berekening van een puntschatting voor de EC50 of enige andere ECx kunnen de gegevens per vat als echte replicaties worden gebruikt. Bij de berekening van een betrouwbaarheidsinterval voor elke ECx moet rekening worden gehouden met de variabiliteit tussen vaten, tenzij wordt aangetoond dat deze verwaarloosbaar is. Wanneer voor het model de kleinstekwadratenmethode wordt toegepast, worden de gegevens per vat getransformeerd om de homogeniteit van de variantie te vergroten. Voordat de ECx-waarden worden berekend, moet de respons echter zijn teruggetransformeerd naar de oorspronkelijke waarde.
|
45.
|
Wanneer de statistische analyse dient om de NOEC/LOEC te bepalen door toetsing van een hypothese, moet rekening worden gehouden met de variabiliteit tussen vaten, bv. met een geneste ANOVA. Als de gebruikelijke ANOVA-aannamen niet opgaan, kunnen robuustere tests (21) wenselijk zijn.
|
Uitkomstquotiënt
46.
|
Het uitkomstquotiënt betreft een binaire respons en kan, wanneer een monotone dosisrespons wordt verwacht en de gegevens consistent zijn met die verwachting, worden geanalyseerd met de toets van Cochran-Armitage, toegepast met stapjes omlaag. Als dit niet het geval is, kan de exacte toets van Fisher of de toets van Mantel-Haenszel worden gebruikt, met volgens Bonferroni-Holm gecorrigeerde p-waarden. Als er aanwijzingen zijn dat de variabiliteit tussen duplo’s met dezelfde concentratie groter is dan een binomiale verdeling zou uitwijzen (zogeheten „extrabinomiale” variantie), moet een robuuste toets van Cochran-Armitage of een exacte toets van Fisher, zoals voorgesteld in punt 21, worden gebruikt.
|
47.
|
Het aantal uitgekomen muggen per vat, ne, wordt bepaald en gedeeld door het aantal in het vat gestopte larven, na:
waarbij:
ER
|
=
|
uitkomstquotiënt (emergence ratio);
|
ne
|
=
|
aantal uitgekomen muggen per vat;
|
na
|
=
|
aantal larven dat in één vat is gestopt.
|
|
48.
|
Bij wijze van alternatief, dat vooral voor grote monsters geschikt is, kan, wanneer een monotone dosisrespons wordt verwacht en de gegevens over het uitkomstquotiënt consistent zijn met die verwachting, het uitkomstquotiënt in geval van extrabinomiale variantie als een continue respons worden behandeld en kunnen procedures als de toets van Williams worden gebruikt. Wanneer er geen sprake is van een monotone dosisrespons, kan de toets van Dunnett geschikt zijn. Als „grote” monsters worden hier beschouwd monsters waarvan per duplo (vat) zowel het aantal uitgekomen als het aantal niet-uitgekomen muggen groter is dan vijf.
|
49.
|
Voordat ANOVA-methoden worden toegepast, moeten de waarden van het uitkomstquotiënt eerst een hoektransformatie of een freeman-tukeytransformatie ondergaan om een approximatieve normale verdeling te verkrijgen en de variantie te egaliseren. Wanneer de absolute frequenties worden gebruikt, kan de toets van Cochran-Armitage, de exacte toets van Fisher (Bonferroni) of de toets van Mantel-Haenszel worden gebruikt. De hoektransformatie wordt uitgevoerd door de arcsinus (sin–1) van de vierkantswortel van het uitkomstquotiënt te nemen.
|
50.
|
Voor uitkomstquotiënten worden de ECx-waarden berekend door middel van regressieanalyse (of bv. probit (22), logit, Weibull, geschikte commerciële software enz.). Als geen regressieanalyse mogelijk is (bv. als er minder dan twee partiële responsen zijn), worden andere niet-parametrische methoden, zoals voortschrijdend gemiddelde of eenvoudige interpolatie, gebruikt.
|
Ontwikkelingstempo
51.
|
Met de gemiddelde ontwikkelingstijd wordt bedoeld de gemiddelde tijd tussen het moment waarop de larven in het vat worden gestopt (dag 0 van de test) en het moment waarop de experimentele cohort muggen uitkomt (voor de berekening van de werkelijke ontwikkelingstijd moet rekening worden gehouden met de leeftijd van de larven op het moment van inbrengen). Het ontwikkelingstempo is de reciproke waarde van de ontwikkelingstijd (eenheid: dag–1) en staat voor het deel van de larvenontwikkeling dat per dag plaatsvindt. Het ontwikkelingstempo heeft de voorkeur voor de evaluatie van deze sedimenttoxiciteitsstudies, omdat deze in vergelijking met de ontwikkelingstijd een kleinere variantie en een grotere homogeniteit heeft en de normale verdeling beter benadert. Daarom kunnen sterke parametrische testprocedures beter op het ontwikkelingstempo dan op de ontwikkelingstijd worden toegepast. Voor het ontwikkelingstempo als continue respons kunnen ECx = waarden worden geschat door middel van regressieanalyse (bv. (23)(24)).
|
52.
|
Bij de volgende statistische tests wordt aangenomen dat het op inspectiedag x waargenomen aantal muggen is uitgekomen in het midden van het tijdsinterval tussen dag x en dag x-l (l = lengte van het inspectie-interval, doorgaans één dag). Het gemiddelde ontwikkelingstempo per vat (
) wordt als volgt berekend:
waarbij:
|
:
|
gemiddeld ontwikkelingstempo per vat;
|
i
|
:
|
index van het inspectie-interval;
|
m
|
:
|
maximumaantal inspectie-intervallen;
|
|
:
|
in inspectie-interval i uitgekomen aantal muggen;
|
ne
|
:
|
totaal aantal uitgekomen muggen aan het eind van de proef ( )
|
xi
|
:
|
ontwikkelingstempo van de in interval i uitgekomen muggen;
|
waarbij:
dayi
|
:
|
inspectiedag (dagen na aanbrengen);
|
li
|
:
|
lengte van inspectie-interval i (dagen, gewoonlijk één dag).
|
|
Testverslag
53.
|
In het testverslag moet ten minste de volgende informatie worden opgenomen:
|
Teststof:
—
|
fysische toestand en, indien relevant, fysisch-chemische kenmerken (oplosbaarheid in water, dampspanning, verdelingscoëfficiënt in de bodem (of in sediment, indien beschikbaar), stabiliteit in water enz.);
|
—
|
identificatiegegevens van de stof (triviale naam, chemische naam, structuurformule, CAS-nummer enz.) met inbegrip van de zuiverheid en de analysemethode voor de kwantitatieve bepaling van de teststof.
|
|
|
Diersoort:
—
|
gebruikte proefdieren: soort, wetenschappelijke naam, bron van de organismen en kweekomstandigheden;
|
—
|
informatie over de hantering van eipakketten en larven;
|
—
|
leeftijd van de proefdieren op het moment waarop zij in de testvaten werden gestopt.
|
|
|
Testomstandigheden:
—
|
gebruikt sediment, d.w.z. natuurlijk of kunstmatig sediment;
|
—
|
voor natuurlijk sediment: de locatie en beschrijving van de sedimentmonsternemingsplaats inclusief, indien mogelijk, vervuilingsgeschiedenis; eigenschappen: pH, gehalte aan organische koolstof, C/N-verhouding en korrelgrootteverdeling (indien van toepassing);
|
—
|
bereiding van het kunstmatige sediment: ingrediënten en eigenschappen (gehalte aan organische koolstof, pH, vocht enz. bij het begin van de test);
|
—
|
bereiding van het testwater (bij gebruik van synthetisch water) en eigenschappen (zuurstofgehalte, pH, geleidbaarheid, hardheid enz. bij het begin van de test);
|
—
|
dikte van de sedimentlaag en diepte van het bovenliggende water;
|
—
|
volume van het bovenliggende en poriewater; gewicht van het natte sediment met en zonder poriewater;
|
—
|
testvaten (materiaal en afmetingen);
|
—
|
bereidingswijze van stamoplossingen en testconcentraties;
|
—
|
aanbrenging van de teststof: toegepaste testconcentraties, aantal duplo’s en eventueel gebruik van oplosmiddel;
|
—
|
incubatieomstandigheden: temperatuur, lichtcyclus en -intensiteit, beluchting (frequentie en intensiteit);
|
—
|
details over het voedsel, met inbegrip van soort voedsel, bereiding, hoeveelheid en voederregime.
|
|
|
Resultaten:
—
|
de nominale testconcentraties, de gemeten testconcentraties en de resultaten van alle analysen die zijn verricht om de concentratie van de teststof in het testvat te bepalen;
|
—
|
kwaliteit van het water in de testvaten, d.w.z. pH, temperatuur, opgeloste zuurstof, hardheid en ammonia;
|
—
|
vervanging van verdampt testwater, indien van toepassing;
|
—
|
aantal uitgekomen mannelijke en vrouwelijke muggen per vat en per dag;
|
—
|
aantal niet tot mug ontwikkelde larven per vat;
|
—
|
gemiddeld individueel drooggewicht van de larven per vat, en per stadium, indien van toepassing;
|
—
|
percentage uitgekomen muggen per vat en testconcentratie (mannelijke en vrouwelijke muggen gecombineerd);
|
—
|
gemiddeld ontwikkelingstempo van volledig uitgekomen muggen per duplo en behandeling (mannelijke en vrouwelijke muggen gecombineerd);
|
—
|
schattingen van toxische eindpunten, bv. ECx (met bijbehorende betrouwbaarheidsintervallen), NOEC en/of LOEC, en de statistische methoden waarmee zij zijn bepaald;
|
—
|
bespreking van de resultaten, met inbegrip van een eventuele beïnvloeding van de resultaten van de test die een gevolg is van afwijkingen van deze testmethode.
|
|
|
LITERATUUR:
(1)
|
BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H. Köpp. Berlin 1995.
|
(2)
|
Fleming R et al. (1994). Sediment Toxicity Tests for Poorly Water-Soluble Substances. Final Report to them European Commission. Report No: EC 3738. August 1994. WRc, UK.
|
(3)
|
SETAC (1993). Guidance Document on Sediment toxicity Tests and Bioassays for Freshwater and Marine Environments. From the WOSTA Workshop held in the Netherlands.
|
(4)
|
ASTM International/E1706-00 (2002). Test Method for Measuring the Toxicity of Sediment-Associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. pp 1125-1241. In ASTM International 2002 Annual Book of Standards. Volume 11.05. Biological Effects and Environmental Fate; Biotechnology; Pesticides. ASTM International, West Conshohocken, PA.
|
(5)
|
Environment Canada (1997). Test for Growth and Survival in Sediment using Larvae of Freshwater Midges (Chironomus tentans or Chironomus riparius). Biological Test Method. Report SPE 1/RM/32. December 1997.
|
(6)
|
US-EPA (2000). Methods for Measuring the Toxicity and Bioaccumulation of Sediment-associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. Second edition. EPA 600/R-99/064. March 2000. Revision to the first edition dated June 1994.
|
(7)
|
US-EPA/OPPTS 850.1735. (1996): Whole Sediment Acute Toxicity Invertebrates.
|
(8)
|
US-EPA/OPPTS 850.1790. (1996): Chironomid Sediment toxicity Test.
|
(9)
|
Milani D, Day KE, McLeay DJ, Kirby RS (1996). Recent intra- and inter-laboratory studies related to the development and standardisation of Environment Canada’s biological test methods for measuring sediment toxicity using freshwater amphipods (Hyalella azteca) and midge larvae (Chironomus riparius). Technical Report. Environment Canada. National Water Research Institute. Burlington, Ontario, Canada.
|
(10)
|
Sugaya Y (1997). Intra-specific variations of the susceptibility of insecticides in Chironomus yoshimatsui. Jp. J. Sanit. Zool. 48 (4): 345-350.
|
(11)
|
Kawai K (1986). Fundamental studies on Chironomid allergy. I. Culture methods of some Japanese Chironomids (Chironomidae, Diptera). Jp. J. Sanit. Zool. 37(1): 47-57.
|
(12)
|
OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. OECD Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 23.
|
(13)
|
Environment Canada (1995). Guidance Document on Measurement of Toxicity Test Precision Using Control Sediments Spiked with a Reference Toxicant. Report EPS 1/RM/30. September 1995.
|
(14)
|
Hoofdstuk C.8 van deze bijlage, Toxiciteit voor regenwormen.
|
(15)
|
Suedel BC and Rodgers JH (1994). Development of formulated reference sediments for freshwater and estuarine sediment testing. Environ. Toxicol. Chem. 13: 1163-1175.
|
(16)
|
Naylor C and Rodrigues C (1995). Development of a test method for Chironomus riparius using a formulated sediment. Chemosphere 31: 3291-3303.
|
(17)
|
Dunnett CW (1964). A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Amer. Statis. Assoc. 50: 1096-1121.
|
(18)
|
Dunnett CW (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics 20: 482-491.
|
(19)
|
Williams DA (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27: 103-117.
|
(20)
|
Williams DA (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics 28: 510-531.
|
(21)
|
Rao JNK and Scott AJ (1992). A simple method for the analysis of clustered binary data. Biometrics 48:577-585.
|
(22)
|
Christensen ER (1984). Dose-response functions in aquatic toxicity testing and the Weibull model. Water Research 18: 213-221.
|
(23)
|
Bruce and Versteeg (1992). A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry 11:1485-1494.
|
(24)
|
Slob W (2002). Dose-response modelling of continuous endpoints. Toxicol. Sci. 66: 298-312.
|
Aanhangsel 1
DEFINITIES
Voor de toepassing van deze methode wordt verstaan onder:
|
Kunstmatig sediment (ook wel bereid, gereconstitueerd of synthetisch sediment genoemd): een mengsel van materialen waarmee de fysische bestanddelen van natuurlijk sediment worden nagebootst.
|
|
Bovenliggend water: het water dat in het testvat op het sediment wordt gegoten.
|
|
Poriewater (ook wel interstitieel water genoemd): het water in de ruimten tussen de sediment- en bodemdeeltjes.
|
|
Verrijkt water: testwater waaraan teststof is toegevoegd.
|
|
Teststof: alle volgens deze testmethode geteste stoffen en mengsels.
|
Aanhangsel 2
Aanbevelingen voor de kweek van Chironomus riparius
1.
|
Larven van Chironomus kunnen worden gekweekt in kristalliseerschalen of grotere houders. Op de bodem van de houder wordt een 5 tot 10 mm dikke laag fijn kwartszand gestrooid. Ook kiezelgoer (bv. Merck, Art 8117) is geschikt gebleken als substraat (in dat geval volstaat een dunnere laag van slechts enkele mm). Vervolgens wordt een enkele cm diepe laag geschikt water toegevoegd. Om verdampingsverliezen te compenseren en uitdroging te voorkomen, worden de waterniveaus zo nodig aangevuld. Indien nodig kan het water worden vervangen. Er wordt voorzichtige beluchting toegepast. De larvenkweekvaten worden in een geschikte kooi geplaatst, zodat de volwassen muggen niet kunnen ontsnappen. De kooi moet groot genoeg zijn om de uitgekomen volwassen muggen te laten zwermen, omdat anders mogelijk niet wordt gecopuleerd (ten minste ca. 30 × 30 × 30 cm).
|
2.
|
De kooien worden op kamertemperatuur of in een kamer met een constant klimaat bij 20 ± 2 °C gehouden, met een lichtregime van 16 uur licht (intensiteit ca. 1 000 lux), 8 uur donker. Gerapporteerd is dat een relatieve luchtvochtigheid van minder dan 60 % de voortplanting kan belemmeren.
|
Verdunningswater
3.
|
Elk geschikt natuurlijk of synthetisch water kan worden gebruikt. Gebruikelijk zijn bronwater, ontchloord kraanwater en kunstmatige media (bv. Elendt-media M4 en M7, zie hieronder). Voor gebruik moet het water worden belucht. Indien nodig kan het kweekwater worden ververst door voorzichtig het gebruikte water uit de kweekvaten te gieten of hevelen zonder de larvenhulzen te beschadigen.
|
Toediening van voedsel aan larven
4.
|
De larven van Chironomus worden dagelijks gevoerd met ongeveer 250 mg visvoervlokken (TetraMin®, TetraPhyll® of een soortgelijk merk visvoer) per vat. Dit voer kan worden gegeven als droog gemalen poeder of als suspensie in water: aan 20 ml verdunningswater wordt 1,0 g voedervlokken toegevoegd en gemengd, zodat een homogeen mengsel ontstaat. Van dit mengsel kan ongeveer 5 ml per vat per dag worden gebruikt (schudden voor gebruik). Aan oudere larven kan meer voer worden gegeven.
|
5.
|
Het voedsel wordt aangepast op basis van de waterkwaliteit. Als het kweekmedium troebel wordt, wordt de hoeveelheid voedsel verminderd. De toediening van voedsel moet zorgvuldig worden geobserveerd. Als te weinig voer wordt gegeven, zullen de larven naar de waterkolom uitwijken; als te veel voer wordt gegeven, neemt de microbiële activiteit toe en daalt het zuurstofgehalte. Beide condities kunnen tot lagere groeisnelheden leiden.
|
6.
|
Wanneer nieuwe kweekvaten worden ingericht, kunnen ook enige cellen van groene algen (bv. Scenedesmus subspicatus, Chlorella vulgaris) worden toegevoegd.
|
Toediening van voedsel aan uitgekomen volwassen muggen
7.
|
Enkele onderzoekers hebben erop gewezen dat een in een sacharoseoplossing gedrenkt wattenschijfje als voedsel kan dienen voor uitgekomen volwassen muggen.
|
Uitkomst van muggen
8.
|
In de larvenkweekvaten zullen zich bij 20 ± 2 °C na ongeveer 13-15 dagen volwassen muggen ontwikkelen. Mannetjes zijn gemakkelijk te herkennen aan hun veerachtige antennes.
|
Eipakketten
9.
|
Zodra in de kweekkooi volwassen muggen aanwezig zijn, worden alle larvenkweekvaten drie keer per week gecontroleerd op afgezette geleiachtige eipakketten. Als eipakketten aanwezig zijn, worden zij voorzichtig verwijderd. Zij worden overgebracht naar een klein schaaltje met een monster van het kweekwater. De eipakketten worden gebruikt om een nieuw kweekvat te beginnen (bv. 2-4 eipakketten per vat) of worden voor toxiciteitstests gebruikt.
|
10.
|
Larven in het eerste stadium moeten na twee-drie dagen uitkomen.
|
Inrichting van nieuwe kweekvaten
11.
|
Zodra kweken zijn opgezet, moet het mogelijk zijn één keer per week, of minder vaak naargelang de testvoorschriften, een vers larvenkweekvat in te richten, waarbij de oudere vaten worden verwijderd nadat zich volwassen muggen hebben ontwikkeld. Dit systeem zorgt voor een regelmatige aanvoer van volwassen muggen met een minimum aan beheer.
|
Bereiding van de testoplossingen M4 en M7
12.
|
Elendt (1990) heeft het medium M4 beschreven. Het medium M7 wordt op dezelfde wijze als M4 bereid, maar met een vier keer zo lage concentratie van de in tabel 1 vermelde stoffen. Er is een publicatie over het medium M7 in voorbereiding (persoonlijk medegedeeld door Elendt). De testoplossing mag niet volgens Elendt en Bias (1990) worden bereid, omdat de voor de stamoplossingen vermelde concentraties van NaSiO3 5H2O, NaNO3, KH2PO4 en K2HPO4 niet geschikt zijn.
|
Bereiding van het medium M7
13.
|
Elke stamoplossing (I) wordt apart bereid en met deze stamoplossingen (I) wordt een gecombineerde stamoplossing (II) bereid (zie tabel 1). Het medium M7 wordt bereid uit 50 ml gecombineerde stamoplossing (II) en de in tabel 2 vermelde hoeveelheden van elke stamoplossing van macronutriënten en tot 1 liter gedeïoniseerd water aangevuld. Een vitaminestamoplossing wordt bereid door overeenkomstig tabel 3 drie vitaminen toe te voegen aan gedeïoniseerd water; kort voor gebruik wordt 0,1 ml van de gecombineerde vitaminestamoplossing aan het definitieve medium M7 toegevoegd (de vitaminestamoplossing wordt in bevroren toestand in kleine porties bewaard.) Het medium wordt belucht en gestabiliseerd.
Tabel 1
Stamoplossingen van spoorelementen voor de media M4 en M7
Stamoplossingen (I)
|
Hoeveelheid (mg) aangevuld tot 1 liter gedeïoniseerd water
|
Gecombineerde stamoplossing (II) bereiden door de volgende hoeveelheden (ml) van de stamoplossingen (I) te mengen en tot 1 liter gedeïoniseerd water aan te vullen
|
Uiteindelijke concentraties in testoplossingen (mg/l)
|
M4
|
M7
|
M4
|
M7
|
H3BO3
(18)
|
57 190
|
1,0
|
0,25
|
2,86
|
0,715
|
MnCl2 • 4 H2O (18)
|
7 210
|
1,0
|
0,25
|
0,361
|
0,090
|
LiCl (18)
|
6 120
|
1,0
|
0,25
|
0,306
|
0,077
|
RbCl (18)
|
1 420
|
1,0
|
0,25
|
0,071
|
0,018
|
SrCl2 • 6 H2O (18)
|
3 040
|
1,0
|
0,25
|
0,152
|
0,038
|
NaBr (18)
|
320
|
1,0
|
0,25
|
0,016
|
0,004
|
Na2MoO4 • 2 H2O (18)
|
1 260
|
1,0
|
0,25
|
0,063
|
0,016
|
CuCl2 • 2 H2O (18)
|
335
|
1,0
|
0,25
|
0,017
|
0,004
|
ZnCl2
|
260
|
1,0
|
1,0
|
0,013
|
0,013
|
CaCl2 • 6 H2O
|
200
|
1,0
|
1,0
|
0,010
|
0,010
|
KI
|
65
|
1,0
|
1,0
|
0,0033
|
0,0033
|
Na2SeO3
|
43,8
|
1,0
|
1,0
|
0,0022
|
0,0022
|
NH4VO3
|
11,5
|
1,0
|
1,0
|
0,00058
|
0,00058
|
Na2EDTA • 2 H2O (18)
(19)
|
5 000
|
20,0
|
5,0
|
2,5
|
0,625
|
FeSO4 • 7 H2O (18)
(19)
|
1 991
|
20,0
|
5,0
|
1,0
|
0,249
|
Tabel 2
Stamoplossingen van macronutriënten voor de media M4 en M7
|
Hoeveelheid aangevuld tot 1 liter gedeïoniseerd water
(mg)
|
Hoeveelheid stamoplossing van macronutriënten die wordt toegevoegd om de media M4 en M7 te bereiden
(ml/l)
|
Uiteindelijke concentraties in de testoplossingen M4 en M7
(mg/l)
|
CaCl2 • 2 H2O
|
293 800
|
1,0
|
293,8
|
MgSO4 • 7 H2O
|
246 600
|
0,5
|
123,3
|
KCl
|
58 000
|
0,1
|
5,8
|
NaHCO3
|
64 800
|
1,0
|
64,8
|
NaSiO3 • 9 H2O
|
50 000
|
0,2
|
10,0
|
NaNO3
|
2 740
|
0,1
|
0,274
|
KH2PO4
|
1 430
|
0,1
|
0,143
|
K2HPO4
|
1 840
|
0,1
|
0,184
|
Tabel 3
Vitaminestamoplossing voor de media M4 en M7
De drie vitamineoplossingen worden tot één vitaminestamoplossing samengevoegd.
|
Hoeveelheid aangevuld tot 1 liter gedeïoniseerd water
(mg)
|
Hoeveelheid vitaminestamoplossing die wordt toegevoegd om de media M4 en M7 te bereiden
(ml/l)
|
Uiteindelijke concentraties in de testoplossingen M4 en M7
(mg/l)
|
Thiaminehydrochloride
|
750
|
0,1
|
0,075
|
Cyanocobalamine (B12)
|
10
|
0,1
|
0,0010
|
Biotine
|
7,5
|
0,1
|
0,00075
|
|
LITERATUUR:
BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H. Köpp. Berlin 1995.
Elendt BP (1990). Selenium Deficiency in Crustacean. Protoplasma 154: 25-33.
Elendt BP and Bias W-R (1990). Trace Nutrient Deficiency in Daphnia magna Cultured in Standard Medium for Toxicity Testing. Effects on the Optimization of Culture Conditions on Life History Parameters of D. magna. Water Research 24 (9): 1157-1167.
Aanhangsel 3
BEREIDING VAN KUNSTMATIG SEDIMENT
Samenstelling van het sediment
Het kunstmatige sediment wordt als volgt samengesteld:
Bestanddeel
|
Eigenschappen
|
% van het sediment
(drooggewicht)
|
Turf
|
Veenmosturf, zo dicht mogelijk bij pH 5,5-6,0, zonder zichtbare plantenresten, fijngemalen (deeltjesgrootte ≤ 1 mm) en aan de lucht gedroogd
|
4-5
|
Kwartszand
|
Korrelgrootte: > 50 % van de deeltjes moet binnen het bereik 50-200 μm liggen
|
75-76
|
Kaolienklei
|
Met ≥ 30 % kaoliniet
|
20
|
Organische koolstof
|
Aangepast door toevoeging van turf en zand
|
2 (± 0,5)
|
Calciumcarbonaat
|
CaCO3, poedervormig, chemisch zuiver
|
0,05-0,1
|
Water
|
Geleidbaarheid ≤ 10 μS/cm
|
30-50
|
Bereiding
De turf wordt aan de lucht gedroogd en tot een fijn poeder vermalen. Er wordt een suspensie van de vereiste hoeveelheid turfpoeder in gedeïoniseerd water bereid met een kwalitatief hoogwaardig homogeniseerapparaat. De pH van deze suspensie wordt met CaCO3 aangepast tot 5,5 ± 0,5. De suspensie wordt ten minste twee dagen lang onder zachtjes roeren bij 20 ± 2 °C geconditioneerd om de pH te stabiliseren en een stabiele microbiële component te verkrijgen. De pH wordt opnieuw gemeten en moet nu 6,0 ± 0,5 bedragen. Vervolgens wordt de turfsuspensie met de andere bestanddelen (zand en kaolienklei) en gedeïoniseerd water vermengd om een homogeen sediment te verkrijgen met een watergehalte van 30-50 % van het drooggewicht van het sediment. De pH van het uiteindelijke mengsel wordt nogmaals gemeten en zo nodig met CaCO3 tot 6,5-7,5 aangepast. Er worden monsters van het sediment genomen om het drooggewicht en het gehalte aan organische koolstof te bepalen. Aanbevolen wordt het kunstmatige sediment, voordat het in een test ter bepaling van de toxiciteit voor Chironomidae wordt gebruikt, zeven dagen te laten rusten onder dezelfde omstandigheden die ook in de test zullen heersen.
Opslag
De droge bestanddelen voor de bereiding van het kunstmatige sediment kunnen op een droge en koele plaats bij kamertemperatuur worden bewaard. Het kunstmatige (natte) sediment mag niet worden opgeslagen voordat het in de test wordt gebruikt. Het moet onmiddellijk na afloop van de zevendaagse conditioneringsperiode die de bereiding afsluit, worden gebruikt.
LITERATUUR:
Hoofdstuk C.8 van deze bijlage, Toxiciteit voor regenwormen.
Meller M, Egeler P, Rombke J, Schallnass H, Nagel R, Streit B (1998). Short-term Toxicity of Lindane, Hexachlorobenzene and Copper Sulfate on Tubificid Sludgeworms (Oligochaeta) in Artificial Media. Ecotox. and Environ. Safety 39: 10-20.
Aanhangsel 4
Chemische eigenschappen van aanvaardbaar verdunningswater
Stof
|
Concentraties
|
Vaste deeltjes
|
< 20 mg/l
|
Totaalgehalte aan organische koolstof
|
< 2 mg/l
|
Niet-geïoniseerde ammonia
|
< 1 μg/l
|
Hardheid uitgedrukt als CaCO3
|
< 400 mg/l (20)
|
Restchloorgehalte
|
< 10 μg/l
|
Totaalgehalte aan organofosfor-pesticiden
|
< 50 ng/l
|
Totaalgehalte aan organochloor-pesticiden en polychloorbifenylen
|
< 50 ng/l
|
Totaalgehalte aan organisch chloor
|
< 25 ng/l
|
Aanhangsel 5
Richtsnoeren voor de monitoring van het uitkomen van larven van Chiromidae
Op de testglazen worden „emergence traps” geplaatst. Deze vallen zijn vanaf dag 20 tot het eind van de test nodig. Onderstaande tekening toont een voorbeeld van een gebruikte val:
A
|
:
|
nylon hor
|
B
|
:
|
omgekeerde kunststofbekers
|
C
|
:
|
bekerglas zonder tuit
|
D
|
:
|
openingen met hor voor wateruitwisseling
|
E
|
:
|
water
|
F
|
:
|
sediment
|
C.29. GEMAKKELIJKE BIOLOGISCHE AFBREEKBAARHEID — CO2 IN GESLOTEN VATEN (GASRUIMTETEST)
INLEIDING
1.
|
Deze testmethode is gelijkwaardig aan testrichtlijn 310 (2006) van de OESO (TG 310). Deze testmethode is een schiftingsproef voor de beoordeling van de gemakkelijke biologische afbreekbaarheid van chemische stoffen en biedt soortgelijke informatie als de zes testmethoden die in hoofdstuk C.4 A tot en met F van deze bijlage worden beschreven. Derhalve kan een chemische stof waarvoor bij deze testmethode positieve resultaten worden geregistreerd, worden beschouwd als gemakkelijk biologisch afbreekbaar en daarom ook als snel afbreekbaar in het milieu.
|
2.
|
De erkende koolstofdioxidemethode (CO2-methode) (1), op basis van de oorspronkelijke Sturm-test (2) voor het beoordelen van de biologische afbreekbaarheid van organische chemische stoffen, waarbij het door microbiële activiteit geproduceerde koolstofdioxide wordt gemeten, is gewoonlijk de eerste keuze voor het testen van slecht oplosbare chemische stoffen en sterk adsorberende stoffen. Deze test wordt ook gekozen voor oplosbare (maar niet vluchtige) chemische stoffen, aangezien de ontwikkeling van koolstofdioxide door velen wordt beschouwd als het enige ondubbelzinnige bewijs van microbiële activiteit. De verwijdering van opgeloste organische koolstof kan worden bereikt door fysisch-chemische processen — adsorptie, vervluchtiging, neerslaan, hydrolyse — evenals door microbiële activiteit. Ook vele niet-biologische reacties verbruiken zuurstof; slechts zelden wordt CO2 op een abiotische manier geproduceerd uit organische chemische stoffen. In de oorspronkelijke en gewijzigde Sturm-test (1)(2) wordt CO2 verwijderd uit de vloeibare fase naar de absorptievaten door middel van uitwassen (d.w.z. met luchtbellen die behandeld zijn om CO2 uit het vloeibare medium te verwijderen), terwijl CO2 in de versie van Larson (3)(4) wordt overgebracht van het reactievat naar de absorptievaten door CO2-vrije lucht door de gasruimte te blazen en daarbij het testvat continu te schudden. Enkel in de gewijzigde versie van Larson wordt het reactievat geschud, terwijl roeren uitsluitend wordt gespecificeerd voor onoplosbare stoffen in ISO 9439 (5) en in de oorspronkelijke Amerikaanse versie (6), waarbij beide versies uitwassen in plaats van gasruimtevervanging specificeren. In een andere officiële Amerikaanse EPA-methode (7) op basis van de methode van Gledhill (8) wordt het reactievat geschud en afgesloten voor de atmosfeer. Het geproduceerde CO2 wordt rechtstreeks uit de gasvormige fase verzameld in een interne alkalische afscheider, zoals in de klassieke respirometerkolven van Warburg/Barcroft.
|
3.
|
Echter, aangetoond is dat anorganische koolstof (IC) zich ophoopt in het medium tijdens de toepassing van de standaard-, gewijzigde Sturm-test bij een aantal chemische stoffen (9). Een IC-concentratie van niet minder dan 8 mg/l werd aangetroffen tijdens de afbraak van 20 mg C/l aniline. Dit betekent dat de verzameling van CO2 in de alkalische afscheiders geen waarheidsgetrouwe weerspiegeling was van de hoeveelheid CO2 die op microbiologische wijze werd geproduceerd op tussentijdse momenten tijdens de afbraak. Bijgevolg zal de specificatie dat > 60 % van de theoretische maximale CO2-productie (ThCO2) moet worden verzameld binnen een „tiendagenvenster” (de tien dagen die onmiddellijk volgen op het bereiken van de biologische afbreekbaarheid van 10 %) om een teststof in te delen als gemakkelijk biologisch afbreekbaar, niet bereikt worden voor bepaalde chemische stoffen die die indeling wel zouden krijgen bij toepassing van de verwijderingsmethode met opgeloste organische koolstof (DOC).
|
4.
|
Als het percentage afbraak lager is dan verwacht, is mogelijk sprake van opeenhoping van anorganische koolstof in de testoplossing. In dergelijke gevallen kan gebruik worden gemaakt van de andere tests op gemakkelijke biologische afbreekbaarheid.
|
5.
|
Andere nadelen van de Sturm-methodologie (omslachtig, tijdrovend, grotere kans op toevallige fouten en niet toepasbaar op vluchtige chemische stoffen) waren eerder aanleiding om te zoeken naar een techniek voor gesloten vaten, anders dan die van Gledhill, in plaats van doorblazen met gas (10)(11). Boatman et al. (12) hebben de vroegere methoden beoordeeld en gekozen voor een systeem met een gesloten gasruimte, waarin het CO2 aan het eind van de incubatie door middel van aanzuren van het medium vrijkwam in de gasruimte. CO2 werd gemeten door middel van gaschromatografie (GC)/IC-analyse in automatisch genomen monsters van de gasruimte, maar er werd geen rekening gehouden met opgeloste anorganische koolstof (DIC) in de vloeibare fase. Ook waren de gebruikte vaten zeer klein (20 ml) en bevatten ze slechts 10 ml medium, wat tot problemen leidde, bv. bij het toevoegen van de noodzakelijkerwijs zeer kleine hoeveelheden onoplosbare teststoffen. Ook is het mogelijk dat in het geënte medium onvoldoende of geen micro-organismen aanwezig waren die in staat waren om te zorgen voor de afbraak van de teststoffen.
|
6.
|
Deze moeilijkheden zijn overwonnen door de onafhankelijke onderzoeken van Struijs en Stoltenkamp (13) en van Birch en Fletcher (14), waarbij laatstgenoemden geïnspireerd werden door hun ervaringen met apparatuur die was gebruikt in de test op anaerobe biologische afbreekbaarheid (15). In de eerstgenoemde methode (13) werd CO2 gemeten in de gasruimte na aanzuren en equlibratie, terwijl in de laatstgenoemde methode (14) DIC werd gemeten in zowel de gas- als de vloeibare fase, zonder behandeling met teststof; meer dan 90 % van het geproduceerde IC was aanwezig in de vloeibare fase. Beide methoden hebben voordelen ten opzichte van de Sturm-test in de zin dat het testsysteem compacter en beter hanteerbaar is, ook vluchtige chemische stoffen getest kunnen worden en de mogelijkheid van vertraging in het meten van het geproduceerde CO2 wordt voorkomen.
|
7.
|
De twee methoden werden gecombineerd in de ISO-norm voor CO2 in gasruimten (16), die werd onderworpen aan een ringtest (17), en dit is de norm die de basis vormt van de onderhavige testmethode. Zo ook zijn de twee methoden in de Amerikaanse EPA-methode (18) toegepast. Twee methoden voor het meten van CO2 zijn aanbevolen, namelijk CO2 in de gasruimte na aanzuren (13) en IC in de vloeibare fase na toevoeging van een overmaat alkali. De laatstgenoemde methode werd geïntroduceerd door Peterson tijdens de CONCAWE-ringtest (19) van deze gasruimtemethode, in een gewijzigde vorm om inherente biologische afbreekbaarheid te meten. De wijzigingen die zijn doorgevoerd in de herziening van 1992 (20) van de in hoofdstuk C.4 van deze bijlage over gemakkelijke biologische afbreekbaarheid beschreven methoden zijn in de onderhavige testmethode geïntegreerd, zodat de omstandigheden (medium, duur enz.) voor het overige dezelfde zijn als in de herziene Sturm-test (20). Birch en Fletcher (14) hebben aangetoond dat met deze gasruimtetest testresultaten werden bereikt die zeer vergelijkbaar waren met de resultaten die werden behaald met dezelfde chemische stoffen in de OESO-ringtest (21) van de herziene testmethoden.
|
PRINCIPE VAN DE TEST
8.
|
De teststof, doorgaans 20 mg C/l, zijnde de enige bron van koolstof en energie, wordt geïncubeerd in een uit anorganische bufferzouten bestaand medium, dat geënt is met een gemengde populatie micro-organismen. De test wordt uitgevoerd in gesloten flessen met bovenin een gasruimte met lucht, die een reservoir van zuurstof voor aerobe biologische afbraak vormt. De CO2-ontwikkeling die het gevolg is van de totale aerobe biologische afbraak van de teststof wordt bepaald door de overmaat aan IC te meten die wordt geproduceerd in de testflessen in vergelijking met de hoeveelheid IC die wordt geproduceerd in blanco vaten die uitsluitend geënt medium bevatten. De mate van afbraak wordt uitgedrukt als een percentage van de theoretische maximale productie van anorganische koolstof (ThIC), op basis van de hoeveelheid teststof (als organische koolstof) die in eerste instantie werd toegevoegd.
|
9.
|
De verwijdering van DOC en/of de mate van primaire biologische afbraak van de teststof kan eveneens worden gemeten (20).
|
INFORMATIE OVER DE TESTSTOF
10.
|
Het gehalte aan organische koolstof (gewichtspercent) van de teststof moet bekend zijn, hetzij op basis van de chemische structuur ervan hetzij door het te meten, zodat de procentuele afbraak kan worden berekend. Voor vluchtige teststoffen is een gemeten of berekende constante van de wet van Henry nuttig voor het bepalen van een geschikte verhouding van de gasruimte tot het vloeistofvolume. Informatie over de toxiciteit van de teststof voor micro-organismen is nuttig voor het kiezen van de juiste testconcentratie en voor het interpreteren van resultaten die op slechte biologische afbreekbaarheid duiden: aanbevolen wordt om de inhibitietest uit te voeren, tenzij bekend is dat de teststof geen inhibitoir effect heeft op microbiële activiteiten (zie punt 24).
|
TOEPASBAARHEID VAN DE METHODE
11.
|
De test is toepasbaar op in water oplosbare en onoplosbare teststoffen, hoewel een goede dispersie van de teststof moet worden gewaarborgd. Met gebruikmaking van de aanbevolen verhouding tussen gasruimte en vloeistofvolume van 1:2 kunnen vluchtige chemische stoffen met een constante van de wet van Henry van maximaal 50 Pa.m3.mol–1 worden getest, aangezien het aandeel van de teststof in de gasruimte niet meer zal zijn dan 1 % (13). Een kleinere gasruimte kan worden gebruikt voor het testen van chemische stoffen met een hogere vluchtigheid, maar hun biobeschikbaarheid kan beperkend zijn, met name indien ze slecht oplosbaar zijn in water. Echter, gebruikers moeten waarborgen dat de verhouding tussen de gasruimte en het vloeistofvolume en de teststofconcentratie dusdanig zijn dat voldoende zuurstof beschikbaar is om volledige aerobe biologische afbraak te kunnen doen plaatsvinden (d.w.z. vermijd het gebruik van een hoge substraatconcentratie en een klein gasruimtevolume). Richtsnoeren hiervoor zijn te vinden in (13)(23).
|
REFERENTIESTOFFEN
12.
|
Ter controle van de testprocedure moet een referentiestof met een bekende biologische afbreekbaarheid tegelijkertijd worden getest. Hiervoor kunnen aniline, natriumbenzoaat of ethyleenglycol worden gebruikt bij het testen van in water oplosbare teststoffen en 1-octanol bij het testen van slecht oplosbare teststoffen (13). De biologische afbraak van deze stoffen moet binnen 14 dagen > 60 % ThIC bereiken.
|
REPRODUCEERBAARHEID
13.
|
In de ISO-ringtest van de methode (17) werden de volgende resultaten behaald met gebruikmaking van de aanbevolen omstandigheden, met inbegrip van 20 mg C teststof/l.
Teststof
|
Gemiddelde procentuele biologische afbraak
(28d)
|
Variatiecoëfficiënt
(%)
|
Aantal laboratoria
|
Aniline
|
90
|
16
|
17
|
1-octanol
|
85
|
12
|
14
|
De intertestvariabiliteit (repliceerbaarheid), met gebruikmaking van aniline, was laag met variabiliteitscoëfficiënten van maximaal 5 % in bijna iedere uitvoering van de test. In de twee gevallen waarin de repliceerbaarheid slechter was, was de grotere variabiliteit waarschijnlijk te wijten aan een hoge IC-productie in de blanco vaten. De repliceerbaarheid was slechter met 1-octanol, maar was nog steeds minder dan 10 % voor 79 % van de test-uitvoeringen. Deze grotere intertestvariabiliteit kan veroorzaakt zijn door doseerfouten, aangezien een klein volume (3 tot 4 μl) 1-octanol in afgesloten testflessen moest worden gespoten. Het gebruik van lagere concentraties teststof zou hebben geresulteerd in hogere variantiecoëfficiënten, in het bijzonder bij concentraties van minder dan 10 mg C/l. Dit kon gedeeltelijk worden verholpen door de concentratie van de totale hoeveelheid anorganische koolstof (TIC) in het entmateriaal te verminderen.
|
14.
|
In een EU-ringtest (24) van vijf oppervlakteactieve stoffen die werden toegevoegd in een concentratie van 10 mg C/l werden de volgende resultaten behaald:
Teststof
|
Gemiddelde procentuele biologische afbraak
(28d)
|
Variatiecoëfficiënt
(%)
|
Aantal laboratoria
|
Tetrapropyleen
Benzeensulfonaat
|
17
|
45
|
10
|
Di-iso-octylsulfo-succinaat
(anionisch)
|
72
|
22
|
9
|
Hexadecyl-trimethyl (21)
Ammoniumchloride
(kationisch)
|
75
|
13
|
10
|
Isononylfenol-(ethoxylaat)9
(niet-ionisch)
|
41
|
32
|
10
|
Cocoamidepropyl
Dimethylhydroxy
Sulfobetaïne
(amfoteer)
|
60
|
23
|
11
|
Uit de resultaten blijkt in het algemeen dat de variabiliteit hoger was voor de minder goed afgebroken oppervlakteactieve stoffen. De intertestvariabiliteit was minder dan 15 % voor meer dan 90 % van de gevallen, met als hoogste 30-40 %.
NOOT:
|
De meeste oppervlakteactieve stoffen zijn geen soorten die uit één molecuul bestaan, maar zijn mengsels van isomeren, homologen enz., die na verschillende vertragingsperioden worden afgebroken en met verschillende kinetische snelheden, wat resulteert in „vage”, uitgerekte curven, zodat de waarde van 60 % die nodig is om de test te doorstaan mogelijk niet gehaald wordt binnen „het tiendagenvenster”, ondanks het feit dat iedere individuele moleculaire soort binnen tien dagen > 60 % zou behalen, indien afzonderlijk getest. Dit kan ook worden waargenomen bij andere complexe mengsels.
|
|
BESCHRIJVING VAN DE METHODE
Apparatuur
15.
|
Gewone laboratoriumapparatuur en:
a)
|
glazen serumflessen, afgesloten met stoppen van butylrubber en aluminium krimpsluitingen. De aanbevolen maat is „125 ml” met een totaal volume van ongeveer 160 ml (in dit geval moet het bekende volume van elke fles 160 ± 1 ml zijn). Een kleinere maat fles mag worden gebruikt, indien de resultaten voldoen aan de in de punten 66 en 67 omschreven voorwaarden;
|
b)
|
koolstofanalyseapparaat of ander instrument (bv. gaschromatograaf) voor het meten van anorganische koolstof;
|
c)
|
hoogprecisie-injectienaalden voor gasvormige en vloeibare monsters;
|
d)
|
rondschudapparaat in een omgeving met temperatuurregeling;
|
e)
|
een voorraad CO2-vrije lucht — deze kan worden verkregen door lucht door natriumkalkkorrels te leiden of door gebruik te maken van een gasmengsel bestaande uit 80 % N2/20 % O2 (facultatief) (zie punt 28);
|
f)
|
membraanfiltratieapparaat met een porositeit van 0,20-0,45 μm (facultatief);
|
g)
|
analyseapparaat voor organische koolstof (facultatief).
|
|
Reagentia
16.
|
Er wordt steeds gebruikgemaakt van reagentia pro analysi.
|
Water
17.
|
Gedestilleerd of gedeïoniseerd water moet worden gebruikt met daarin een concentratie van ≤ 1 mg/l als totale organische koolstof. Dit vertegenwoordigt ≤ 5 % van het initiële gehalte aan organische koolstof dat werd geïntroduceerd door de aanbevolen dosis van de teststof.
|
Stamoplossingen voor het uit anorganische zouten bestaande medium
18.
|
De stamoplossingen en het uit anorganische zouten bestaande medium zijn vergelijkbaar met die in ISO 14593 (16) en de in C.4 beschreven tests op de „gemakkelijke biologische afbreekbaarheid” (20). Het gebruik van een hogere concentratie ammoniumchloride (2,0 g/l in plaats van 0,5 g/l) zou enkel in zeer uitzonderlijke gevallen nodig moeten zijn, bv. als de teststofconcentratie > 40 mg C/l is. Stamoplossingen moeten gekoeld worden bewaard en na zes maanden als afval worden verwijderd, tenzij bewijs van neerslaan of microbiële groei bestaat. De volgende stamoplossingen worden bereid:
a)
|
kaliumdiwaterstoffosfaat (KH2PO4) 8,50 g
dikaliumwaterstoffosfaat (K2HPO4) 21,75 g
dinatriumwaterstoffosfaatdihydraat (Na2HPO4.2H2O) 33,40 g
ammoniumchloride (NH4Cl) 0,50 g
In water oplossen en tot 1 liter aanvullen. De pH van deze oplossing moet 7,4 (± 0,2) zijn. Als dit niet het geval is, moet een nieuwe oplossing worden bereid;
|
b)
|
calciumchloridedihydraat (CaCl2.2H2O) 36,40 g
In water oplossen en tot 1 liter aanvullen;
|
c)
|
magnesiumsulfaatheptahydraat (MgSO4.7H2O) 22,50 g
In water oplossen en tot 1 liter aanvullen;
|
d)
|
ijzer(III)chloridehexahydraat (FeCl3.6H20) 0,25 g
In water oplossen en tot 1 liter aanvullen en één druppel geconcentreerde HCl toevoegen.
|
|
Bereiding van anorganisch medium
19.
|
10 ml van oplossing a) wordt gemengd met ongeveer 800 ml water (punt 17), daaraan wordt vervolgens 1 ml van de oplossingen b), c) en d) toegevoegd en het geheel wordt met water aangevuld tot 1 liter (punt 17).
|
Andere reagentia
20.
|
Geconcentreerd orthofosforzuur (H3PO4) (> 85 % massa per volume).
|
Natriumhydroxideoplossing 7M
21.
|
280 g natriumhydroxide (NaOH) wordt opgelost in 1 liter water (punt 17). De concentratie DIC van deze oplossing wordt bepaald en deze waarde wordt in acht genomen bij het berekenen van het testresultaat (zie de punten 55 en 61), met name in het licht van het geldigheidscriterium in punt 66, onder b). Indien de concentratie DIC te hoog is, wordt een verse oplossing bereid.
|
Teststof
22.
|
Er wordt een stamoplossing van een voldoende in water oplosbare teststof in water (punt 17) of in het testmedium (punt 19) bereid, in een concentratie die bij voorkeur 100 maal groter is dan de uiteindelijke concentratie die in de test zal worden gebruikt; het kan nodig zijn de pH van de stamoplossing aan te passen. De stamoplossing moet worden toegevoegd aan het anorganische medium om een definitieve concentratie organische koolstof tussen 2 en 40 mg C/l te bereiken, bij voorkeur 20 mg C/l. Als lagere concentraties worden gebruikt, kan de verkregen precisie onvoldoende zijn. Oplosbare en onoplosbare vloeibare chemische stoffen kunnen rechtstreeks aan de vaten worden toegevoegd met behulp van hoogprecisie-injectienaalden. Voor slecht oplosbare en onoplosbare teststoffen is mogelijk een speciale behandeling nodig (25). De keuzes zijn:
a)
|
rechtstreeks toevoegen van bekende gewogen hoeveelheden;
|
b)
|
ultrasone dispersie vóór toevoeging;
|
c)
|
dispersie met behulp van emulgeermiddelen, waarvan vóór toevoeging vastgesteld moet worden of ze inhibitoire of stimulerende effecten hebben op microbiële activiteit;
|
d)
|
adsorptie van vloeibare teststoffen of van een oplossing in een geschikt vluchtig oplosmiddel aan een inert medium of hulpmiddel (bv. glasvezelfilter), gevolgd door verdamping van het oplosmiddel, indien gebruikt, en rechtstreekse toevoeging van bekende hoeveelheden;
|
e)
|
toevoeging van een bekend volume van een oplossing van de teststof in een zeer vluchtig oplosmiddel aan een leeg testvat, gevolgd door verdamping van het oplosmiddel.
|
Agentia of oplosmiddelen die in c), d) en e) worden gebruikt, moeten worden getest op een eventueel stimulerend of inhibitoir effect op microbiële activiteit (zie punt 42, onder b)).
|
Referentiestof
23.
|
Een stamoplossing van de (oplosbare) referentiestof wordt bereid in water (punt 17) in een concentratie van bij voorkeur 100 maal de definitieve concentratie die zal worden gebruikt (20 mg C/l) in de test.
|
Inhibitiecontrole
24.
|
Teststoffen vertonen vaak geen significante afbraak onder de omstandigheden die heersen bij beoordelingen van de gemakkelijke biologische afbreekbaarheid. Een mogelijke oorzaak is dat de teststof in de in de test gebruikte concentratie een inhibitoir effect op het entmateriaal heeft. Een inhibitiecontrole kan in de testopzet worden opgenomen om de identificatie (achteraf) van inhibitie als een mogelijke oorzaak of bijdragende factor te vergemakkelijken. De inhibitiecontrole kan ook worden gebruikt om dergelijke interferenties uit te sluiten en aan te tonen dat de ontbrekende of geringe afbraak uitsluitend moet worden toegeschreven aan niet-vatbaarheid voor microbiële aanvallen onder de testomstandigheden. Om informatie te verkrijgen over de toxiciteit van de teststof voor (aerobe) micro-organismen wordt een oplossing bereid in het testmedium die de teststof en de referentiestof bevat (punt 19), elk in dezelfde respectieve concentraties als de toegevoegde concentraties (zie de punten 22 en 23).
|
Entmateriaal
25.
|
Het entmateriaal kan van diverse bronnen afkomstig zijn: actief slib; (chloorvrij) behandeld water; oppervlaktewater en grond; of een mengsel daarvan (20). De afbraakactiviteit van de bron moet worden gecontroleerd door gebruik te maken van een referentiestof. Ongeacht de bron mogen micro-organismen die eerder aan de teststof zijn blootgesteld niet worden gebruikt, indien de procedure gebruikt wordt als een test op de gemakkelijke biologische afbreekbaarheid.
Waarschuwing:
|
Actief slib, rioolwater en behandeld water bevatten ziekteverwekkende organismen en moeten voorzichtig worden gehanteerd.
|
|
26.
|
De ervaring leert dat het optimale volume voor het entmateriaal het volume is dat:
—
|
voldoende is om te zorgen voor toereikende biologische afbraakactiviteit;
|
—
|
de referentiestof afbreekt met het voorgeschreven percentage (zie punt 66);
|
—
|
resulteert in 102 tot 105 kolonievormende eenheden per milliliter in het uiteindelijke mengsel;
|
—
|
normaal resulteert in een concentratie van 4 mg/l gesuspendeerde vaste stoffen in het uiteindelijke mengsel bij het gebruik van actief slib; concentraties van maximaal 30 mg/l kunnen worden gebruikt, maar deze kunnen leiden tot een significant hogere productie van CO2 in de blanco vaten (26);
|
—
|
minder bijdraagt dan 10 % van de initiële concentratie van organische koolstof die door de teststof werd geïntroduceerd;
|
—
|
in het algemeen 1-10 ml entmateriaal is voor 1 liter testoplossing.
|
|
Actief slib
27.
|
Uit de beluchtingstank van een rioolwaterzuiveringsinstallatie of een laboratoriuminstallatie die hoofdzakelijk huishoudelijk afval verwerkt, wordt vers actief slib verzameld. Indien nodig kunnen grove deeltjes door te zeven worden verwijderd (bv. door gebruik te maken van een zeef met mazen van 1 mm2) en het slib moet aeroob worden gehouden, totdat het wordt gebruikt.
|
28.
|
Ook kan het slib, na verwijdering van eventuele grove deeltjes, worden bezonken of gecentrifugeerd (bv. 1 100 × g gedurende 10 minuten). De bovendrijvende vloeistof wordt als afval verwijderd. Het slib kan worden gewassen in de oplossing van mineralen. Het geconcentreerde slib wordt in anorganisch medium gesuspendeerd tot een concentratie van 3-5 g gesuspendeerde vaste stof/l en vervolgens belucht tot het tijdstip van gebruik.
|
29.
|
Slib moet afkomstig zijn van een correct werkende conventionele zuiveringsinstallatie. Als slib afkomstig is van een installatie met hoge omloopsnelheid, of geacht wordt remmers te bevatten, dient het te worden gewassen. Het opnieuw gesuspendeerde slib wordt na grondig mengen bezonken of gecentrifugeerd, de bovendrijvende vloeistof wordt als afval verwijderd en het gewassen slib wordt in een volgend volume anorganisch medium opnieuw gesuspendeerd. Deze procedure wordt herhaald totdat het slib geacht wordt vrij te zijn van overmaat substraat of remmer.
|
30.
|
Nadat het slib volledig opnieuw is gesuspendeerd, of bij niet-behandeld slib direct, wordt vlak voor gebruik een monster genomen voor de bepaling van het drooggewicht aan gesuspendeerde vaste stoffen.
|
31.
|
Een andere mogelijkheid is het homogeniseren van actief slib (3-5 g gesuspendeerde vaste stof per l). Het slib wordt twee minuten bij matige snelheid in een Waring-menger behandeld. Het gemengde slib wordt gedurende 30 minuten of zoveel langer als nodig bezonken en de vloeistof wordt gedecanteerd en gebruikt als entmateriaal in een hoeveelheid van 10 mg/l anorganisch medium.
|
32.
|
Een nog verdere vermindering van de blanco CO2-ontwikkeling kan worden bereikt door het slib een nacht te beluchten met CO2-vrije lucht. 4 mg/l vaste stof in het actief slib wordt gebruikt als de concentratie van het entmateriaal in deze test (13).
|
Secundair effluent van zuiveringsinstallaties
33.
|
Het entmateriaal kan ook worden betrokken van het secundaire effluent van een zuiveringsinstallatie of een laboratoriuminstallatie die hoofdzakelijk huishoudelijk afvalwater ontvangt. Het monster moet onder aerobe omstandigheden worden bewaard en moet worden gebruikt op de dag van verzameling of, indien nodig, worden gepreconditioneerd. Het effluent moet worden gefilterd met een grove filter om grove deeltjes te verwijderen en de pH-waarde wordt gemeten.
|
34.
|
Om het gehalte aan IC te verminderen, wordt het filtraat gedurende één uur uitgewassen met CO2-vrije lucht (punt 15, onder e)), waarbij de pH wordt gehandhaafd op 6,5 met gebruikmaking van orthofosforzuur (punt 20). De pH-waarde wordt met natriumhydroxide (punt 21) teruggebracht op de oorspronkelijke waarde en na ongeveer één uur bezinken wordt een geschikt volume van de bovendrijvende vloeistof genomen voor het enten. Deze uitwasprocedure vermindert het gehalte aan IC van het entmateriaal. Indien bijvoorbeeld het aanbevolen maximale volume van gefilterd, uitgewassen effluent (100 ml) per liter als entmateriaal werd gebruikt, bedroeg de hoeveelheid IC in de blanco controlevaten tussen 0,4 en 1,3 mg/l (14), wat overeenkomt met 2-6,5 % van teststof C in een concentratie van 20 mg C/l en 4-13 % in een concentratie van 10 mg C/l.
|
Oppervlaktewater
35.
|
Uit daarvoor geschikt oppervlaktewater wordt een monster genomen. Dit moet onder aerobe omstandigheden worden bewaard en worden gebruikt op de dag waarop het verzameld is. Indien nodig wordt het monster geconcentreerd door het te filteren of centrifugeren. Het volume van het in elk testvat te gebruiken entmateriaal moet voldoen aan de in punt 26 vermelde criteria.
|
Grond
36.
|
Op een diepte van maximaal 20 cm onder het grondoppervlak wordt een geschikt grondmonster genomen. Stenen, plantresten en ongewervelde dieren moeten worden verwijderd uit het grondmonster, waarna het wordt gezeefd door zeefmazen van 2 mm (als het monster te nat is om onmiddellijk te zeven, eerst gedeeltelijk aan de lucht laten drogen om het zeven te vergemakkelijken). Het monster moet onder aerobe omstandigheden worden bewaard en worden gebruikt op de dag waarop het werd genomen (als het monster wordt vervoerd in een niet helemaal dichtgeknoopte zwarte zak van polyethyleen, kan het bij 2 tot 4 °C maximaal een maand in de zak worden bewaard).
|
Preconditionering van het entmateriaal
37.
|
Entmateriaal kan op de proefomstandigheden worden gepreconditioneerd, maar mag niet vooraf aan de teststof worden aangepast. Preconditionering kan de blanco CO2-ontwikkeling verminderen. Preconditionering bestaat in het beluchten van actief slib na verdunning in testmedium tot 30 mg/l met vochtige CO2-vrije lucht gedurende vijf-zeven dagen bij testtemperatuur.
|
TESTPROCEDURE
Aantal flessen
38.
|
Het aantal flessen (punt 15, onder a)) dat nodig is voor een test, is afhankelijk van de analysefrequentie en de duur van de test.
|
39.
|
Aanbevolen wordt om flessen in drievoud te analyseren met een voldoende aantal tussenpozen, zodat het tiendagenvenster herkend kan worden. Ook moeten ten minste vijf testflessen (punt 15, onder a)) uit de sets a), b) en c) (zie punt 42) aan het eind van de test worden geanalyseerd om betrouwbaarheidsintervallen van 95 % te kunnen berekenen voor de gemiddelde procentuele biologische afbraak.
|
Geënt medium
40.
|
Het entmateriaal wordt gebruikt in een concentratie van 4 mg/l droge vaste stoffen in actief slib. Onmiddellijk voor het gebruik wordt voldoende geënt medium bereid door, bijvoorbeeld, 2 ml op passende wijze behandeld actief slib (punten 27 tot en met 32) in een concentratie van 2 000 mg/l toe te voegen aan 1 liter uit anorganische zouten bestaand medium (punt 19). Bij het gebruik van secundair effluent wordt maximaal 100 ml effluent (punt 33) toegevoegd aan 900 ml uit anorganische zouten bestaand medium (punt 19) en tot 1 liter verdund met medium.
|
Flessen prepareren
41.
|
Bekende hoeveelheden van het geënte medium worden verdeeld over duploflessen om een verhouding tussen gasruimte en vloeistof te bereiken van 1:2 (bv. 107 ml toevoegen aan flessen met een inhoud van 160 ml). Andere verhoudingen kunnen ook worden gebruikt, maar houd hierbij rekening met de waarschuwing in punt 11. Ongeacht het type entmateriaal dat wordt gebruikt, moet het geënte medium voldoende worden gemengd om te waarborgen dat het gelijk over de testflessen wordt verdeeld.
|
42.
|
Er worden flessensets (punt 15, onder a)) met de volgende inhoud voorbereid:
a)
|
testvaten (aangeduid als FT) met daarin de teststof;
|
b)
|
blanco controlevaten (aangeduid als FB) met daarin uitsluitend het testmedium plus het entmateriaal; eventuele chemische stoffen, oplosmiddelen, agentia of glasvezelfilters die nodig zijn om de teststof in de testvaten te brengen, moeten ook worden toegevoegd;
|
c)
|
vaten (aangeduid als FC) met de referentiestof voor het controleren van de procedure;
|
d)
|
indien nodig, vaten (aangeduid als FI) met daarin zowel de teststof als de referentiestof in dezelfde concentraties (punt 24) als in respectievelijk de flessen FT en FC, voor het controleren van een eventueel inhibitoir effect van de teststof;
|
e)
|
vaten (aangeduid als FS) voor het controleren van mogelijke abiotische afbraak, als a) plus 50 mg/l HgCl2 of op enige andere manier gesteriliseerd (bv. in een autoclaaf).
|
|
43.
|
In water oplosbare teststoffen en referentiestoffen worden toegevoegd als waterige stamoplossingen (punten 22, 23 en 24) om een concentratie van 10 tot 20 mg C/l te bereiken.
|
44.
|
Onoplosbare teststoffen en onoplosbare referentiestoffen worden op verschillende manieren (zie punt 22, onder a)-e)) aan flessen toegevoegd in overeenstemming met de aard van de teststof, hetzij voor hetzij na toevoeging van het geënte medium, afhankelijk van de behandelingsmethode van de teststof. Indien een van de in punt 22, onder a)-e), beschreven procedures wordt toegepast, moeten de blanco flessen FB (punt 42, onder b)) op een soortgelijke manier worden behandeld, maar zonder de teststof en de referentiestof.
|
45.
|
Vluchtige teststoffen moeten worden geïnjecteerd in gesloten flessen (punt 47) met behulp van een micro-injectienaald. De dosis wordt berekend op basis van het geïnjecteerde volume en de dichtheid van de teststof.
|
46.
|
Indien nodig moet water aan de vaten worden toegevoegd om in ieder vat hetzelfde vloeistofvolume te hebben. Er moet worden gewaarborgd dat de verhouding tussen gasruimte en vloeistof (gewoonlijk 1:2) en de concentratie van de teststof zodanig zijn dat voldoende zuurstof in de gasruimte aanwezig is om volledige biologische afbraak mogelijk te maken.
|
47.
|
Alle flessen worden vervolgens afgesloten, bijvoorbeeld met septa van butylrubber en aluminium doppen. Vluchtige teststoffen moeten in deze fase worden toegevoegd (punt 45). Voor het monitoren van de vermindering van de concentratie DOC in de testoplossing en voor het uitvoeren van tijdstip-nulanalysen voor de initiële concentratie IC (steriele controles, punt 42, onder e)) of andere determinanten wordt een daarvoor geschikt monster uit het testvat genomen. Het testvat en de inhoud ervan worden als afval verwijderd.
|
48.
|
De gesloten flessen worden op een rondschudapparaat geplaatst (punt 15, onder d)), met een schudsnelheid die voldoende is om de inhoud van de flessen goed te mengen en gesuspendeerd te houden (bv. 150 tot 200 tpm), en worden vervolgens in het donker geïncubeerd bij een temperatuur van 20 °C, die niet meer mag afwijken dan ± 1 °C.
|
Monstername
49.
|
Het patroon van de monstername is afhankelijk van de vertragingstijd en de kinetische snelheid van de biologische afbraak van de teststof. Flessen worden op de dag van de monstername weggenomen voor de analyse, die ten minste wekelijks of frequenter (bv. tweemaal per week) moet worden uitgevoerd indien een volledige afbraakcurve vereist is. Het vereiste aantal duploflessen wordt uit het schudapparaat genomen, overeenkomend met FT, FB en FC en, indien ze gebruikt worden, FI en FS (zie punt 42). De test duurt gewoonlijk 28 dagen. Indien de curve voor de biologische afbraak aangeeft dat een plateau is bereikt voordat de 28 dagen voorbij zijn, moet de test eerder dan na 28 dagen worden afgerond. De vijf flessen die voor de 28e dag van de test zijn gereserveerd, worden bemonsterd en de resultaten worden gebruikt om de betrouwbaarheidslimieten of de variatiecoëfficiënt van de procentuele biologische afbreekbaarheid te berekenen. De flessen die zijn bedoeld voor de controles op inhibitie en voor abiotische afbraak hoeven niet zo frequent te worden bemonsterd als de andere flessen; bemonstering op dag 1 en dag 28 is voldoende.
|
Analyse van anorganische koolstof (IC)
50.
|
De CO2-productie in de flessen wordt bepaald door de toename in de concentratie van anorganische koolstof (IC) tijdens incubatie te meten. Er zijn twee aanbevolen methoden beschikbaar voor het meten van de hoeveelheid in de test geproduceerde IC en deze worden hieronder beschreven. Aangezien de methoden enigszins verschillende resultaten kunnen opleveren, dient slechts één ervan in een testuitvoering te worden gebruikt.
|
51.
|
Methode a) wordt aanbevolen in gevallen waarin de kans bestaat dat het medium overblijfselen bevat van bijvoorbeeld glasvezelpapier en/of onoplosbare teststof. Indien een koolstofanalyseapparaat niet beschikbaar is, kan deze analyse worden uitgevoerd met een gaschromatograaf. Het is belangrijk dat de flessen (bijna) de testtemperatuur hebben, wanneer het gas in de gasruimte wordt geanalyseerd. Methode b) is mogelijk gemakkelijker voor laboratoria die koolstofanalyseapparaten gebruiken om IC te meten. Het is belangrijk dat de natriumhydroxideoplossing (punt 21) die wordt gebruikt om CO2 om te zetten in carbonaat vers bereid is of dat het IC-gehalte ervan bekend is, zodat hiermee rekening kan worden gehouden bij het berekenen van de testresultaten (zie punt 66, onder b)).
|
Methode a): aanzuren tot pH < 3
52.
|
Vóór iedere reeks analysen wordt het IC-analyseapparaat gekalibreerd met behulp van een geschikte IC-standaard (bv. 1 gewichtspercent CO2 in N2). Geconcentreerd fosforzuur (punt 20) wordt geïnjecteerd door het septum van iedere bemonsterde fles om de pH van het medium te verlagen tot < 3 (bv. 1 ml toevoegen aan 107 ml testmedium). De flessen worden teruggeplaatst op het schudapparaat. Nadat de flessen gedurende één uur bij testtemperatuur zijn geschud, worden ze van het schudapparaat genomen, waarna bekende hoeveelheden (bv. 1 ml) gas aan de gasruimte worden onttrokken en geïnjecteerd in het IC-analyseapparaat. De gemeten IC-concentraties worden geregistreerd als mg C/l.
|
53.
|
Het principe van deze methode is dat na aanzuring tot pH < 3 en equilibratie bij 20 °C, de evenwichtsconstante voor de verdeling van CO2 over de vloeibare en gasvormige fasen in de testflessen 1,0 is, indien gemeten als een concentratie (13). Dit moet voor het testsysteem minimaal eenmaal worden aangetoond, en wel als volgt:
Flessen met daarin 5 en 10 mg/l als IC, met gebruikmaking van een oplossing van watervrij natriumcarbonaat (Na2CO3) in CO2-vrij water dat is bereid door water aan te zuren tot pH 6,5 met geconcentreerd orthofosforzuur (punt 20), worden gedurende een nacht uitgewassen met CO2-vrije lucht en de pH wordt met alkali verhoogd tot neutraal. Er moet worden gewaarborgd dat de verhouding tussen het gasruimtevolume en het vloeistofvolume dezelfde is als in de tests (bv. 1:2). Vervolgens worden het aanzuren en de equilibratie uitgevoerd als beschreven in punt 52 en wordt de IC-concentratie van zowel de gasruimte als de vloeibare fasen gemeten. Er wordt gecontroleerd of de twee concentraties dezelfde zijn binnen de marge voor toevallige fouten. Zo niet, moet de gebruiker de procedures herzien. Deze controle op de verdeling van IC over de vloeibare en gasvormige fasen hoeft niet bij iedere uitvoering van de test te worden verricht, maar kan indien mogelijk tijdens het kalibreren worden verricht.
|
54.
|
Indien de verwijdering van DOC moet worden gemeten (uitsluitend teststoffen die in water oplosbaar zijn), moeten monsters worden genomen van de vloeibare fase uit afzonderlijke (niet aangezuurde) flessen, met een membraan worden gefilterd en worden geïnjecteerd in het DOC-analyseapparaat. Indien nodig kunnen deze flessen voor andere analysen worden gebruikt om de primaire biologische afbreekbaarheid te meten.
|
Methode b): omzetting van CO2 in carbonaat
55.
|
Voor iedere reeks analysen wordt het IC-analyseapparaat gekalibreerd met behulp van een geschikte standaard, bijvoorbeeld een oplossing van natriumbicarbonaat (NaHCO3) in CO2-vrij water (zie punt 53) binnen het bereik van 0 tot 20 mg/l, als IC. Een oplossing van natriumhydroxide (7M, punt 21) (bv. 1 ml op 107 ml medium) wordt geïnjecteerd door het septum van iedere bemonsterde fles en de flessen worden gedurende één uur bij testtemperatuur geschud. Gebruik dezelfde NaOH-oplossing voor alle flessen die op een bepaalde dag worden geanalyseerd, maar niet noodzakelijkerwijs bij alle monsternamen tijdens een test. Indien absolute blanco IC-waarden benodigd zijn bij alle monsternamen, moet het IC-gehalte van de NaOH-oplossing iedere keer wanneer deze wordt gebruikt, worden bepaald. De flessen worden van het schudapparaat genomen en men laat de inhoud bezinken. Geschikte volumes (bv. 50 tot 1 000 μl) worden met een injectienaald onttrokken aan de vloeibare fase in ieder vat. De monsters worden in het IC-analyseapparaat geïnjecteerd en de concentraties IC worden geregistreerd. Er moet worden gewaarborgd dat het gebruikte analyseapparaat geschikt is om de alkalinemonsters die bij deze methode geproduceerd worden, te verwerken.
|
56.
|
Het principe van deze methode is dat de concentratie IC na de toevoeging van alkali en het schudden verwaarloosbaar is. Dit moet voor het testsysteem ten minste eenmaal worden gecontroleerd door met gebruikmaking van IC-standaarden alkali toe te voegen en te laten equilibreren en vervolgens de concentratie IC in zowel de gasruimte als de vloeibare fasen te meten (zie punt 53). De concentratie in de gasruimte moet in de buurt van nul liggen. Deze controle op de nagenoeg volledige absorptie van CO2 hoeft niet bij iedere uitvoering van de test te worden verricht.
|
57.
|
Indien de verwijdering van DOC moet worden gemeten (uitsluitend teststoffen die in water oplosbaar zijn), moeten monsters worden genomen van de vloeibare fase uit afzonderlijke flessen (zonder toegevoegd alkali), waarna ze met een membraan worden gefilterd en worden geïnjecteerd in het DOC-analyseapparaat. Indien nodig kunnen deze flessen voor andere analysen worden gebruikt om de primaire biologische afbreekbaarheid te meten.
|
GEGEVENS EN RAPPORTAGE
Berekening van de resultaten
58.
|
Uitgaande van een mineralisatie van de teststof in CO2 van 100 %, is de overmaat aan ThIC die is geproduceerd in vergelijking met de ThIC die in de blanco controlevaten is geproduceerd gelijk aan de TOC die is toegevoegd aan iedere testfles aan het begin van de test, dat wil zeggen:
De totale massa (mg) anorganische koolstof (TIC) in elke fles is:
|
Vergelijking [1]
|
waarbij
VL
|
=
|
volume van vloeistof in de fles (liter);
|
CL
|
=
|
concentratie van IC in de vloeistof (mg/l als koolstof);
|
VH
|
=
|
volume van de gasruimte (liter);
|
CL
|
=
|
concentratie van IC in de gasruimte (mg/l als koolstof).
|
De berekeningen van TIC voor de twee analysemethoden die worden gebruikt voor het meten van IC in deze test, worden in de onderstaande punten 60 en 61 beschreven. De procentuele biologische afbraak (% D) is in alle gevallen het resultaat van:
|
Vergelijking [2]
|
waarbij
TICt
|
=
|
mg TIC in testfles op moment t;
|
TICb
|
=
|
gemiddelde mg TIC in blanco flessen op moment t;
|
TOC
|
=
|
mg TOC in eerste instantie toegevoegd aan het testvat.
|
De procentuele biologische afbraak % D wordt berekend voor de test (FT), referentie (FC) en, indien van toepassing, de controleflessen voor de inhibitiemonitoring (FI) op basis van de respectieve hoeveelheden TIC die zijn geproduceerd tot aan het moment van iedere monstername.
|
59.
|
Indien het TIC-gehalte van de steriele controles (FS) tijdens de testperiode significant is gestegen, kan worden geconcludeerd dat abiotische afbraak van de teststof opgetreden is en moet hiermee rekening worden gehouden bij de berekening van D in vergelijking [2].
|
Aanzuren tot pH < 3
60.
|
Aangezien het aanzuren tot pH < 3 en de equilibratie resulteert in een gelijke verdeling van de concentratie TIC in de vloeibare en gasvormige fasen, hoeft alleen de concentratie IC in de gasvormige fase te worden gemeten. Derhalve geldt op basis van vergelijking [1]:
, waarbij VB = volume van de serumfles. |
Omzetting van CO2 in carbonaat
61.
|
In deze methode worden de berekeningen verricht als in vergelijking [1], maar de verwaarloosbare hoeveelheid IC in de gasvormige fase wordt genegeerd, dat wil zeggen.
en
. |
Uitdrukking van de resultaten
62.
|
Een curve voor biologische afbraak wordt verkregen door de procentuele biologische afbraak, D, uit te zetten tegen de incubatietijd en indien mogelijk worden de aanloopfase, de biologischeafbraakfase, het tiendagenvenster en de plateaufase, dat wil zeggen de fase waarin de maximale afbraak bereikt is en de curve voor biologische afbraak afgevlakt is, aangegeven. Indien vergelijkbare resultaten worden behaald voor tegelijkertijd geteste testvaten FT (< 20 % afwijking), wordt een curve voor het gemiddelde getekend (zie aanhangsel 2, figuur 1); zo niet, wordt voor ieder vat een curve getekend. De gemiddelde waarde van de procentuele biologische afbraak in de plateaufase wordt bepaald of de hoogste waarde wordt genomen (bv. indien de curve in de plateaufase afneemt), maar in het laatste geval is het belangrijk om na te gaan of de waarde geen uitbijter is. Dit maximale niveau van biologische afbreekbaarheid moet in het testverslag als „mate van biologische afbraak van de teststof” worden vermeld. Indien het aantal testvaten onvoldoende was om een plateaufase aan te geven, worden de meetgegevens van de laatste dag van de test gebruikt om een gemiddelde waarde te berekenen. Deze laatste waarde, het gemiddelde van vijf duplovaten, dient als indicatie van de precisie waarmee de procentuele biologische afbreekbaarheid is bepaald. Ook moet de waarde die gemeten wordt aan het eind van het tiendagenvenster, worden gerapporteerd.
|
63.
|
Op dezelfde manier wordt een curve voor de referentiestof, FC, uitgezet en, indien van toepassing, voor de abiotische eliminatiecontrole, FS, en de inhibitiecontrole, FI.
|
64.
|
De hoeveelheden TIC die in de blanco controlevaten (FB) aanwezig zijn, worden vastgelegd evenals de hoeveelheden in de kolven FS (abiotische controle), voor zover deze vaten in de test werden opgenomen.
|
65.
|
Voor de vaten FI wordt D berekend, op basis van de theoretische IC-opbrengst die wordt verwacht van alleen het referentiebestanddeel van het mengsel. Indien op dag 28 [(DFC
(22) – DFI
(23))/DFC] × 100 > 25 %, kan worden aangenomen dat de teststof een inhibitoir effect op de activiteit van het entmateriaal heeft gehad en dit kan een verklaring zijn voor de lage waarden van DFT die zijn verkregen onder de testomstandigheden. In dit geval kan de test worden herhaald met een lagere testconcentratie en met bij voorkeur een vermindering van de DIC in het entmateriaal en de in de blanco controlevaten gevormde TIC, aangezien de lagere concentratie anders de nauwkeurigheid van de methode nadelig beïnvloedt. Als alternatief kan ander entmateriaal worden gebruikt. Indien in fles FS (abiotisch) een significante stijging (> 10 %) in de hoeveelheid TIC wordt waargenomen, zijn er mogelijk abiotische afbraakprocessen opgetreden.
|
Geldigheid van de resultaten
66.
|
Een test wordt geacht geldig te zijn, indien:
a)
|
de gemiddelde procentuele afbraak in de vaten FC met daarin de referentiestof > 60 % is op de 14e dag van de incubatie, en
|
b)
|
de gemiddelde hoeveelheid TIC die aanwezig is in de blanco controlevaten FB aan het eind van de test > 3 mg C/l is.
|
Als deze grenswaarden niet worden gehaald, moet de test worden herhaald met een uit een andere bron afkomstig entmateriaal en/of moeten de procedures worden herzien. Indien bijvoorbeeld hoge IC-productie in de blanco vaten een probleem is, moet de in de punten 27 tot en met 32 beschreven procedure worden gevolgd.
|
67.
|
Indien de teststof 60 % ThIC niet haalt en aangetoond is dat de teststof geen inhibitoir effect heeft (punt 65), kan de test worden herhaald met een hogere concentratie van het entmateriaal (maximaal 30 mg/l actief slib en 100 ml effluent/l) of entmaterialen uit andere bronnen, in het bijzonder indien de afbraak binnen het bereik van 20 tot 60 % lag.
|
Interpretatie van de resultaten
68.
|
Biologische afbraak > 60 % ThIC binnen het tiendagenvenster in deze test toont aan dat de teststof gemakkelijk biologisch afbreekbaar is onder aerobe omstandigheden.
|
69.
|
Als de waarde voor het doorstaan van de test van 60 % ThIC niet wordt gehaald, moet de pH-waarde worden bepaald in media in flessen waaraan geen zuur of alkaline is toegevoegd; een waarde lager dan 6,5 zou duiden op het optreden van nitrificatie. In een dergelijk geval moet de test worden herhaald met een bufferoplossing met een hogere concentratie.
|
Testverslag
70.
|
Een tabel wordt opgesteld met % D voor iedere testfles (FT), referentiefles (FC) en, indien van toepassing, inhibitiecontrolefles (FI) voor iedere monsternamedag. Indien vergelijkbare resultaten worden verkregen voor duploflessen, wordt een curve van gemiddelde % D uitgezet tegen de tijd. De hoeveelheid TIC in de blanco vaten (FB) wordt vastgelegd, alsmede de hoeveelheid DOC in de steriele controlevaten (FS) en/of andere determinanten en hun procentuele verwijdering.
|
71.
|
De gemiddelde waarde van % D in de plateaufase wordt bepaald of de hoogste waarde wordt gebruikt als de curve voor biologische afbraak in de plateaufase afneemt; deze waarde wordt gerapporteerd als de „mate van biologische afbraak van de teststof”. Het is belangrijk om in het laatstgenoemde geval te waarborgen dat de hoogste waarde geen uitbijter is.
|
72.
|
In het tesverslag worden de volgende gegevens opgenomen:
|
Teststof:
—
|
de triviale naam, de chemische naam, het CAS-nummer, de structuurformule en relevante fysisch-chemische eigenschappen;
|
—
|
de zuiverheid (verontreinigingen) van de teststof.
|
|
|
Testomstandigheden:
—
|
verwijzing naar deze testmethode;
|
—
|
een beschrijving van het gebruikte testsysteem (bv. volume van het vat, verhouding tussen gasruimte en vloeistof, roermethode enz.);
|
—
|
de manier waarop de teststof en de referentiestof aan het testsysteem zijn toegevoegd: de gebruikte testconcentratie en de hoeveelheid koolstof die als dosis aan elke testfles is toegevoegd, eventueel gebruik van oplosmiddelen;
|
—
|
nadere gegevens van het gebruikte entmateriaal, eventuele voorbehandeling en preconditionering;
|
—
|
validering van de principes van IC-analyse;
|
—
|
belangrijkste kenmerken van het gebruikte IC-analyseapparaat (en eventuele andere toegepaste analysemethoden);
|
—
|
aantal duplobepalingen.
|
|
|
Resultaten:
—
|
ruwe gegevens en berekende waarden van de biologische afbraak in tabelvorm;
|
—
|
de grafiek van de procentuele afbraak uitgezet tegen de tijd voor de test- en referentiestof, de aanloopfase, de afbreekfase, het tiendagenvenster en de richtingscoëfficiënt;
|
—
|
de procentuele verwijdering in de plateaufase, aan het eind van de test en na het tiendagenvenster;
|
—
|
eventuele redenen om de testresultaten te verwerpen;
|
—
|
eventuele andere omstandigheden die relevant zijn voor de gevolgde procedure;
|
—
|
een bespreking van de resultaten.
|
|
|
LITERATUUR:
(1)
|
Hoofdstuk C.4 van deze bijlage, Bepaling van de „gemakkelijke” biologische afbreekbaarheid — CO2-ontwikkelingstest (methode C.4-C).
|
(2)
|
Sturm RN (1973). Biodegradability of Nonionic surfactants: screening test for predicting rate and ultimate biodegradation. J.A,.Oil Chem Soc. 50: 159-167.
|
(3)
|
Larson RJ (1979). Estimation of biodegradation potential of xenobiotic organic chemicals. Appl Env. Microbiol. 38: 1153-1161.
|
(4)
|
Larson RJ, Hansmann MA and Bookland EA (1996). Carbon dioxide recovery in ready biodegradability tests: mass transfer and kinetic constants, Chemosphere 33: 1195-1210.
|
(5)
|
ISO 9439 (1990; revised 1999). Water Quality — Evaluation of ultimate aerobic biodegradability of organic compounds in aqueous medium — Carbon dioxide evolution Test (Sturm).
|
(6)
|
US EPA (1996). Fate, Transport and Transformation Test Guideline. 835. 3110 Carbon dioxide evolution test. Office, Prevention Pesticides and Toxic Substances Washington, DC.
|
(7)
|
US EPA (1996). Fate, Transport and Transformation Test Guideline. 835. 3100. Aerobic aquatic biodegradation. Office, Prevention Pesticides and Toxic Substances Washington, DC.
|
(8)
|
Gledhill WE (1975). Screening test for assessment of biodegradability: Linear alkyl benzene sulfonate. Appl Microbiol. 30: 922-929.
|
(9)
|
Weytjens D, Van Ginneken I and Painter HA (1994). The recovery of carbon dioxide in the Sturm test for ready biodegradability. Chemosphere 28: 801-812.
|
(10)
|
Ennis DM and Kramer A (1975). A rapid microtechnique for testing biodegradability of nylons and polyamides. J. Food Sci. 40: 181-185.
|
(11)
|
Ennis DM, Kramer A, Jameson CW, Mazzoccki PH and Bailey PH (1978). Appl. Env. Microbiol. 35: 51-53.
|
(12)
|
Boatman RJ, Cunningham SL and Ziegler DA (1986). A method for measuring the biodegradation of organic chemicals, Env. Toxicol. Chem. 5: 233-243.
|
(13)
|
Struijs J and Stoltenkamp J (1990). Head space determination of evolved carbon dioxide in a biodegradability screening test. Ecotox. Env. Safety 19: 204-211.
|
(14)
|
Birch RR and Fletcher RJ (1991). The application of dissolved inorganic carbon measurements to the study of aerobic biodegradability. Chemosphere 23: 507-524.
|
(15)
|
Birch RR, Biver C, Campagna R, Gledhill WE, Pagga U, Steber J, Reust H, and Bontinck WJ (1989). Screening of chemicals for anaerobic biodegradation. Chemosphere 19: 1527-1550.
|
(16)
|
ISO 14593, (1999) Water Quality — Evaluation of ultimate aerobic biodegradability of organic compounds in an aerobic medium-method by analysis of inorganic carbon in sealed vessels (C02 headspace test).
|
(17)
|
Battersby NS (1997). The ISO headspace C02 biodegradation test, Chemosphere 34: 1813-1822.
|
(18)
|
US EPA (1996). Fate, Transport and Transportation. 835.3120. Sealed vessel carbon dioxide production test. Office, Prevention Pesticides and Toxic Substance, Washington, DC.
|
(19)
|
Battersby NS, Ciccognani D, Evans MR, King D, Painter HA, Peterson DR and Starkey M (1999). An „inherent” biodegradability test for oil products: description and results of an international ring test. Chemosphere 38: 3219-3235.
|
(20)
|
Hoofdstuk C.4 van deze bijlage, Bepaling van de „gemakkelijke” biologische afbreekbaarheid.
|
(21)
|
OECD (1988). OECD Ring-test of methods for determining ready biodegradability: Chairman’s report (M. Hashimoto; MITI) and final report (M. Kitano and M. Takatsuki; CITI). Paris.
|
(22)
|
Hoofdstuk C.11 van deze bijlage, Test op de remming van de ademhaling van actief slib.
|
(23)
|
Struijs J, Stoltenkamp-Wouterse MJ and Dekkers ALM (1995). A rationale for the appropriate amount of inoculum in ready biodegradability tests. Biodegradation 6: 319-327.
|
(24)
|
EU (1999). Ring-test of the ISO Headspace CO2 method: application to surfactants: Surfactant Ring Test-1, Report EU4697, Water Research Centre, May 1999, Medmenham, SL7 2HD, UK.
|
(25)
|
ISO 10634 (1996) Water Quality — Guidance for the preparation and treatment of poorly water-soluble organic compounds for the subsequent evaluation of their biodegradability in an aqueous medium.
|
Aanhangsel 1
AFKORTINGEN EN DEFINITIES
IC: anorganische koolstof.
ThCO2: theoretische hoeveelheid kooldioxide (mg) is de hoeveelheid kooldioxide die volgens berekening uit het bekende of gemeten koolstofgehalte van de teststof wordt geproduceerd, wanneer deze volledig wordt gemineraliseerd; wordt ook uitgedrukt als mg ontwikkelde kooldioxide per mg teststof.
DOC: opgeloste organische koolstof is de organische koolstof die in de oplossing aanwezig is of die of door een filter van 0,45 μm gaat of na centrifugeren bij ongeveer 4 000 g (ongeveer 40 000 m s-2) gedurende 15 minuten in de bovenstaande vloeistof overblijft.
DIC: opgeloste anorganische koolstof.
ThIC: theoretische hoeveelheid anorganische koolstof.
TIC: totale hoeveelheid anorganische koolstof.
Gemakkelijk biologisch afbreekbaar: een arbitraire indeling van chemische stoffen die bepaalde schiftingsproeven op totale biologische afbreekbaarheid hebben doorstaan; deze proeven zijn zo streng dat geacht wordt dat dergelijke chemische stoffen in aquatisch milieu onder aerobe omstandigheden snel en volledig biologisch worden afgebroken.
Tiendagenvenster: de periode van tien dagen onmiddellijk na het bereiken van 10 % biologische afbraak.
Inherente biologische afbreekbaarheid: een indeling van chemische stoffen waarvoor elke test op biologische afbreekbaarheid een ondubbelzinnig bewijs van (primaire of totale) biologische afbraak levert.
Totale aerobe biologische afbraak: de mate van afbraak die wordt verkregen wanneer de teststof volledig door micro-organismen wordt omgezet tot kooldioxide, water, anorganische zouten en nieuwe microbiële celbestanddelen (biomassa).
Mineralisatie: mineralisatie is de volledige ontleding van een organische chemische stof in CO2 en H2O onder aerobe omstandigheden en in CH4, CO2 en H2O onder anaerobe omstandigheden.
Aanloopfase: de tijdsduur vanaf de aanvang van de test totdat acclimatisering en/of adaptatie van de afbrekende micro-organismen heeft plaatsgevonden en de biologische afbraak van een teststof of organisch materiaal tot een detecteerbaar niveau is gestegen (bv. 10 % van de theoretische maximale biologische afbraak, of lager, afhankelijk van de nauwkeurigheid van de meettechniek).
Afbreekfase: de tijd van het eind van de aanloopperiode tot het tijdstip waarop 90 % van de maximale afbraak is bereikt.
Plateaufase: de plateaufase is de fase waarin de maximale afbraak is bereikt en de curve voor de biologische afbreekbaarheid afgevlakt is.
Teststof: alle volgens deze testmethode geteste stoffen en mengsels.
Aanhangsel 2
Voorbeeld van een curve voor biologische afbreekbaarheid
Figuur 1
Biologische afbraak van 1-octanol in de CO2-gasruimtetest
Legenda:
biologische afbraak
afbreekfase
maximale biologische afbraak
plateaufase
tiendagenvenster
testperiode (dagen)
C.30. BIOACCUMULATIE IN TERRESTRISCHE OLIGOCHAETAE
INLEIDING
1.
|
Deze testmethode is gelijkwaardig aan testrichtlijn 317 (2010) van de OESO (TG 317). Testmethoden met betrekking tot het uiteindelijke lot in het milieu zijn onder meer Bioconcentratie: doorstroomtest met vissen (hoofdstuk C.13 van deze bijlage (49)) en de test voor „bioaccumulatie in in het sediment levende bentische Oligochaetae” (53), die in respectievelijk 1996 en 2008 werden gepubliceerd. Het is moeilijk, zo niet onmogelijk, om gegevens inzake aquatische bioaccumulatie te extrapoleren naar terrestrische organismen zoals regenwormen. Modelberekeningen op basis van de lipofiliciteit van een teststof, bv. (14)(37), worden op dit moment gebruikt voor de beoordeling van bioaccumulatie van chemische stoffen in de bodem, zoals bv. in de technische leidraad van de EU (19). Er is al ingegaan op de noodzaak van een compartimentspecifieke testmethode, zie bv. (55). Een dergelijke methode is met name belangrijk voor de evaluatie van secundaire vergiftiging in terrestrische voedselketens (4). Er zijn diverse nationale testmethoden voor bioaccumulatie in andere organismen dan vissen, bv. (2) en (72). Een methode voor het meten van bioaccumulatie uit verontreinigde grond in regenwormen (Eisenia fetida, Savigny) en potwormen is ontwikkeld door de American Society for Testing and Materials (3). Een internationaal erkende methode voor de bepaling van bioaccumulatie in verrijkte grond zal de risicoanalyse voor chemische stoffen in terrestrische ecosystemen verbeteren, bv. (25)(29).
|
2.
|
Ongewervelde dieren die grond opnemen, worden blootgesteld aan de chemische stoffen die zich in de grond bevinden. Onder deze dieren spelen terrestrische Oligochaetae (regenwormen) een belangrijke rol in de structuur en functie van grond (15)(20). Terrestrische Oligochaetae leven in de bodem en hoofdzakelijk aan het bodemoppervlak (met name in de strooisellaag); in biomassa uitgedrukt zijn ze vaak de meest voorkomende soort (54). Door bioturbatie van de bodem en door als prooi te dienen kunnen deze dieren een grote invloed hebben op de biobeschikbaarheid van chemische stoffen voor andere organismen zoals ongewervelde dieren (bv. roofmijten en kevers; bv. (64)) of gewervelde roofdieren (bv. vossen en meeuwen) (18)(62). In aanhangsel 5 zijn een aantal van de momenteel in ecotoxicologische tests gebruikte soorten terrestrische Oligochaetae beschreven.
|
3.
|
De ASTM Standard Guide for Conducting Laboratory Soil Toxicity or Bioaccumulation Tests with the Lumbricid Earthworm Eisenia fetida and the Enchytraeid Potworm Enchytraeus albidus (3) bevat vele essentiële en nuttige nadere gegevens met betrekking tot de uitvoering van de onderhavige testmethode ter bepaling van de bioaccumulatie in de bodem. Andere documenten waarnaar in deze testmethode wordt verwezen, zijn hoofdstuk C.13 van deze bijlage, Bioconcentratie: doorstroomtest met vissen (49) en TG 315 van de OESO: Bioaccumulation in Sediment-dwelling Benthic Oligochates (53). Praktijkervaring met onderzoek naar bioaccumulatie in de bodem en publicaties uit de literatuur, bv. (1)(5)(11)(12)(28)(40)(43)(45)(57)(59)(76)(78)(79), zijn eveneens belangrijke bronnen van informatie voor deze testmethode.
|
4.
|
Deze testmethode is voornamelijk van toepassing op stabiele, neutrale organische stoffen, die neigen naar adsorptie aan de grond. Deze testmethode kan worden gebruikt om te testen op bioaccumulatie van stabiele metallo-organische verbindingen die zich aan grond hechten. De methode kan tevens worden toegepast op metalen en andere spoorelementen.
|
VOORWAARDE
5.
|
Tests voor het meten van de bioaccumulatie van een chemische stof in terrestrische Oligochaetae zijn uitgevoerd met zware metalen (zie bv. (63)) en persistente, organische stoffen met bekende log Kow-waarden tussen 3,0 en 6,0, bv. (40). Dergelijke tests kunnen ook worden toegepast op:
—
|
chemische stoffen met een log Kow van meer dan 6,0 (superhydrofobe chemische stoffen);
|
—
|
chemische stoffen die behoren tot een klasse van organische stoffen waarvan bekend is dat ze kunnen bioaccumuleren in levende organismen, bv. oppervlakteactieve stoffen of stoffen met een hoog adsorptievermogen;
|
—
|
chemische stoffen met structuurkenmerken die wijzen op bioaccumulatiepotentieel, bv. analogen van stoffen waarvan het bioaccumulatiepotentieel bekend is, en
|
|
6.
|
Vóór het begin van de studie moet informatie over de teststof worden verzameld, zoals de triviale naam, de chemische naam (bij voorkeur de IUPAC-naam), de structuurformule, het CAS-registratienummer, de zuiverheid, voorzorgsmaatregelen, passende opslagomstandigheden en de analysemethoden. Daarnaast moet de volgende informatie bekend zijn:
a)
|
oplosbaarheid in water;
|
b)
|
verdelingscoëfficiënt octanol/water, Kow;
|
c)
|
verdelingscoëfficiënt grond/water, uitgedrukt als Koc;
|
e)
|
afbreekbaarheid (bv. in grond, water);
|
|
7.
|
Er kan gebruik worden gemaakt van radioactief gelabelde of niet radioactief gelabelde teststoffen. Om de analyse te vergemakkelijken wordt echter het gebruik van een radioactief gelabelde teststof aanbevolen. Deze keuze wordt gemaakt op basis van de aantoonbaarheidsgrenswaarden of een vereiste om de oorspronkelijke teststof en metabolieten te meten. Indien een radioactief gelabelde teststof wordt gebruikt en de totale hoeveelheid radioactieve residuen wordt gemeten, is het belangrijk dat de radioactief gelabelde residuen in zowel de grond als de testorganismen worden gekenmerkt op basis van de percentages van de oorspronkelijke teststof en de gelabelde niet-oorspronkelijke stof, bv. in monsters die zijn genomen in stationaire toestand of aan het eind van de opnamefase, zodat een bioaccumulatiefactor (BAF) kan worden berekend voor de oorspronkelijke teststof en voor de desbetreffende grondmetabolieten (zie punt 50). Mogelijk moet de hier beschreven methode worden aangepast, bv. om voor voldoende biomassa te zorgen, voor het meten van niet-radioactief gelabelde organische teststoffen of metalen. Indien de totale hoeveelheid radioactieve residuen wordt gemeten (door vloeistofscintillatietelling na extractie, verbranding of weefselsolubilisatie), wordt de bioaccumulatiefactor gebaseerd op de oorspronkelijke teststof en metabolieten. De berekening van de BAF moet bij voorkeur worden gebaseerd op de concentratie van de oorspronkelijke teststof in de organismen en de totale hoeveelheid radioactieve residuen. Vervolgens moet de voor het vetgehalte van de worm en het gehalte aan organische koolstof (OC) in de bodem genormaliseerde biota-grondaccumulatiefactor (BSAF) worden berekend op basis van de BAF, zodat de resultaten van verschillende bioaccumulatietests met elkaar kunnen worden vergeleken.
|
8.
|
De toxiciteit van de teststof voor de in de test gebruikte soort moet bekend zijn, bv. een effectconcentratie (ECx) of letale concentratie (LCx) voor de tijd van de opnamefase (bv. (19)). De geselecteerde concentratie van de teststof moet bij voorkeur ongeveer 1 % bedragen van de acute asymptotische LC50 en ten minste tien keer zo hoog zijn als de aantoonbaarheidsgrens van de stof in grond voor de gebruikte analysemethode. De voorkeur moet worden gegeven aan toxiciteitswaarden die zijn afgeleid uit langetermijnonderzoek naar subletale eindpunten (51)(52), voor zover beschikbaar. Indien dergelijke gegevens niet beschikbaar zijn, geeft een test op acute toxiciteit nuttige informatie (zie bv. (23)).
|
9.
|
Er moet een geschikte analysemethode met een bekende juistheid, precisie en gevoeligheid voor de kwantificering van de chemische stof in de testoplossingen, in de bodem en in het biologische materiaal beschikbaar zijn, alsook nadere gegevens met betrekking tot monsterbereiding en -opslag en veiligheidsinformatiebladen voor materialen. De analytische aantoonbaarheidsgrenzen van de teststof in de bodem en het wormweefsel moeten eveneens bekend zijn. Indien een met 14C gelabelde teststof wordt gebruikt, moeten de specifieke radioactiviteit (d.w.z. Bq mol–1) en het percentage van de met onzuiverheden verbonden radioactiviteit bekend zijn. De specifieke radioactiviteit van de teststof moet hoog genoeg zijn om analyse mogelijk te maken en de gebruikte testconcentraties mogen geen toxische effecten veroorzaken.
|
10.
|
De test kan worden uitgevoerd met kunstmatige grond of met natuurlijke grond. Informatie over kenmerken van de gebruikte natuurlijke grond, bv. de oorsprong van de grond of de bestanddelen ervan, de pH-waarde, het gehalte aan organische koolstof, de deeltjesgrootteverdeling (percentage zand, silt en klei) en het waterhoudend vermogen (WHC), moet bekend zijn vóór de start van de test (3)(48).
|
PRINCIPE VAN DE TEST
11.
|
De parameters die kenmerkend zijn voor de bioaccumulatie van een teststof zijn onder meer de bioaccumulatiefactor (BAF), de opnamesnelheidsconstante (ks) en de eliminatiesnelheidsconstante (ke). Definities worden gegeven in aanhangsel 1.
|
12.
|
De test bestaat uit twee fasen: de opnamefase (blootstelling) en de eliminatiefase (na blootstelling). Tijdens de opnamefase worden duplogroepen wormen blootgesteld aan grond die verrijkt is met de teststof. Naast deze testdieren worden groepen controlewormen onder identieke omstandigheden zonder de teststof gehouden. Het drooggewicht en het vetgehalte van de testorganismen worden gemeten. Dit kan worden gedaan met behulp van de wormen van de controlegroep. Analytische nuleffectmetingen (blanco) kunnen worden uitgevoerd door monsters van de controlewormen en -grond te analyseren. Voor de eliminatiefase worden de wormen overgebracht naar grond die vrij is van de teststof. Een eliminatiefase is altijd vereist, tenzij de opname van de teststof tijdens de blootstellingsfase niet significant was. Een eliminatiefase levert informatie op over de snelheid waarmee de teststof door de testorganismen wordt uitgescheiden (bv. (27)). Indien tijdens de opnamefase geen stationaire toestand is bereikt, moet de bepaling van de kinetische parameters — kinetische bioaccumulatiefactor BAFk, opname- en eliminatiesnelheidsconstante(n) — bij voorkeur gebaseerd zijn op simultane fitting van de resultaten van de opname- en de eliminatiefasen. De concentratie van de teststof in/op de wormen wordt gedurende beide fasen gemonitord.
|
13.
|
Tijdens de opnamefase worden metingen verricht op bemonsteringstijdstippen tot 14 dagen („Enchytraeidae”) of 21 dagen (regenwormen) totdat de stationaire toestand is bereikt (11)(12)(67). De stationaire toestand treedt op wanneer de tegen de tijd uitgezette concentratie in wormen evenwijdig loopt aan de tijdas en drie opeenvolgende concentratieanalysen van monsters die genomen zijn met intervallen van ten minste twee dagen, niet meer dan ± 20 % van elkaar variëren op basis van statistische vergelijkingen (bv. analyse van variantie, regressieanalyse).
|
14.
|
De eliminatiefase bestaat uit het overbrengen van de testorganismen naar vaten met hetzelfde substraat zonder de teststof. Tijdens de eliminatiefase worden metingen verricht op bemonsteringstijdstippen gedurende 14 dagen („Enchytraeidae”) of 21 dagen (regenwormen), tenzij uit eerdere analytische bepaling een vermindering van 90 % van de teststofresiduen in wormen is gebleken. De concentratie van de teststof in de wormen aan het eind van de eliminatiefase wordt gerapporteerd als niet-geëlimineerde residuen. De bioaccumulatiefactor in stationaire toestand (BAFSS) wordt bij voorkeur berekend op twee manieren: als de verhouding tussen de concentratie in wormen (Ca) en in de bodem (Cs) bij een kennelijke stationaire toestand, en als een kinetische bioaccumulatiefactor, BAFK, zijnde de verhouding tussen de snelheidsconstante van opname uit de bodem (ks) en de eliminatiesnelheidsconstante (ke) (zie aanhangsel 1 voor definities), uitgaande van een eersteordekinetiek (zie aanhangsel 2 voor berekeningen). Indien eersteordekinetiek duidelijk niet van toepassing is, moeten andere modellen worden gebruikt.
|
15.
|
De opnamesnelheidsconstante, de eliminatiesnelheidsconstante (of -constanten, indien andere modellen gebruikt worden), de kinetische bioaccumulatiefactor (BAFK) en, indien mogelijk, de betrouwbaarheidsgrenzen van elk van deze parameters worden berekend met behulp van gecomputeriseerde modelvergelijkingen (zie aanhangsel 2 voor richtsnoeren). De kwaliteit van de fitting van ieder model dat wordt gebruikt, kan worden bepaald aan de hand van bijvoorbeeld de correlatiecoëfficiënt of de determinatiecoëfficiënt (coëfficiënten die in de buurt van één liggen, duiden op een goede fitting) of chi-kwadraattest. Ook kan de grootte van de standaardfout of betrouwbaarheidsgrens rond de geschatte parameters een indicatie zijn van de kwaliteit van de fitting van het model.
|
16.
|
Ter vermindering van de variabiliteit in de testresultaten voor teststoffen met een hoge lipofiliciteit moeten de bioaccumulatiefactoren worden uitgedrukt in verhouding tot het vetgehalte en het gehalte aan organische koolstof (kg organische koolstof in de bodem (OC) kg–1 vetgehalte van worm). Deze aanpak is gebaseerd op het feit dat voor bepaalde chemische klassen een duidelijk verband bestaat tussen het bioaccumulatiepotentieel en de lipofiliciteit; dit is duidelijk vastgesteld voor vissen (47). Er is een verband tussen het vetgehalte van vissen en de bioaccumulatie van dergelijke stoffen. Voor bentische organismen zijn soortgelijke correlaties gevonden, bv. (30)(44). Ook voor terrestrische Oligochaetae is deze correlatie aangetoond, bv. (5)(6)(7)(14). Indien voldoende wormweefsel beschikbaar is, kan het vetgehalte van de testdieren op hetzelfde biologische materiaal worden bepaald als het materiaal dat gebruikt is om de concentratie van de teststof te bepalen. Als alternatief kunnen controledieren worden gebruikt om het vetgehalte te meten.
|
GELDIGHEID VAN DE TEST
17.
|
Voor een geldige test moeten zowel de controle- als de testgroepen aan de volgende criteria voldoen:
—
|
aan het eind van de test mag de totale sterfte tijdens de opname- en eliminatiefase niet hoger zijn dan 10 % (regenwormen) of 20 % („Enchytraeidae”) van het totale aantal ingebrachte wormen;
|
—
|
voor Eisenia fetida en Eisenia andrei mag het gemiddelde massaverlies, gemeten aan het eind van de opnamefase en aan het eind van de eliminatiefase, niet hoger zijn dan 20 % in vergelijking met het versgewicht aan het begin van iedere fase.
|
|
BESCHRIJVING VAN DE METHODE
Diersoort
18.
|
Diverse soorten terrestrische Oligochaetae worden aanbevolen voor tests op bioaccumulatie. In aanhangsel 5 zijn de meest gebruikte soorten beschreven, namelijk Eisenia fetida of Eisenia andrei („Lumbricidae”), of Enchytraeus albidus, Enchytraeus crypticus of Enchytraeus luxuriosus („Enchytraeidae”).
|
Apparatuur
19.
|
Voor alle onderdelen van de apparatuur moet het gebruik van materialen die de teststof kunnen oplossen of adsorberen of andere stoffen kunnen logen en die een schadelijk effect op de testdieren hebben, worden vermeden. Er kunnen rechthoekige of cilindervormige standaardvaten met een passend volume van een chemisch inert materiaal worden gebruikt, die geschikt zijn voor de densiteit, d.w.z. het aantal testwormen. Roestvrij staal, kunststof of glas kan worden gebruikt voor apparatuur die in contact komt met de testmedia. De testvaten moeten dusdanig zijn afgedekt dat de wormen niet kunnen ontsnappen, terwijl ze van voldoende lucht worden voorzien. Voor stoffen met een hoge adsorptiecoëfficiënt, zoals synthetische pyretroïden, kan het noodzakelijk zijn gesilaniseerd glas te gebruiken. In deze situaties moet de apparatuur na gebruik als afval worden verwijderd (49). Voorkomen moet worden dat radioactief gelabelde teststoffen en vluchtige chemische stoffen ontsnappen. Er moeten afscheiders (bv. gaswasflessen van glas) met geschikte absorptiemiddelen worden gebruikt om eventuele residuen die uit de testvaten verdampen, op te vangen.
|
Grond
20.
|
De testgrond moet van een dusdanige kwaliteit zijn dat de testorganismen kunnen overleven en, bij voorkeur, zich kunnen voortplanten gedurende de acclimatiserings- en testperioden, zonder een abnormaal uiterlijk te hebben of abnormaal gedrag te vertonen. De wormen moeten boortunnels in de grond maken.
|
21.
|
De kunstmatige grond die in hoofdstuk C.8 van deze bijlage (48) wordt beschreven, is het aanbevolen substraat in de tests. Aanhangsel 4 beschrijft de voorbereiding van de kunstmatige grond voor gebruik in de bioaccumulatietests en geeft aanbevelingen voor de opslag van kunstmatige grond. Luchtgedroogde kunstmatige grond kan bij kamertemperatuur tot gebruik worden bewaard.
|
22.
|
Natuurlijke grond van niet-verontreinigde terreinen kan echter ook als test- en/of kweeksubstraat dienen. Natuurlijke grond moet worden gekarakteriseerd met ten minste de oorsprong (plaats van verzameling), pH, gehalte aan organische koolstof, deeltjesgrootteverdeling (percentage zand, silt en klei), het maximale waterhoudende vermogen (WHCmax) en het procentuele watergehalte (3). Analyse van de grond of de bestanddelen ervan op microverontreinigingen vóór gebruik levert in dit verband nuttige informatie op. Indien grond van landbouwvelden wordt gebruikt, mag de grond gedurende ten minste één jaar niet met gewasbeschermingsproducten of met mest van behandelde dieren en gedurende ten minste zes maanden vóór de monstername niet met organische meststoffen behandeld zijn (50). Manipulatieprocedures voor natuurlijke grond vóór het gebruik ervan in ecotoxicologische tests met Oligochaetae in het laboratorium zijn beschreven in (3). Voor natuurlijke grond moet de opslagtijd in het laboratorium zo kort mogelijk worden gehouden.
|
Het aanbrengen van de teststof
23.
|
De teststof wordt in de grond gebracht. De fysisch-chemische eigenschappen van de teststof moeten in aanmerking worden genomen. Een in water oplosbare teststof moet volledig in water opgelost zijn voordat de stof met de grond wordt vermengd. Als verrijkingsprocedure voor moeilijk in water oplosbare teststoffen wordt aanbevolen een laag teststof aan te brengen op één of meer bestanddelen van de (kunstmatige) grond. Zo kan (een deel van) het kwartszand worden doordrenkt met een oplossing van de teststof in een geschikt organisch oplosmiddel, dat vervolgens langzaam wordt ingedampt. Vervolgens kan het met een laag van de teststof bedekte deel met de vochtige grond worden gemengd. Het grote voordeel van deze procedure is dat geen oplosmiddel in de grond terechtkomt. Bij gebruik van natuurlijke grond kan de teststof op de hierboven voor kunstmatige grond beschreven wijze worden toegevoegd aan een luchtgedroogd deel van de grond of door de vochtige grond worden geroerd, met vervolgens verdamping indien een solubilisator wordt gebruikt. In het algemeen moet zo veel mogelijk worden vermeden dat de vochtige grond in contact komt met oplosmiddelen. Er moet rekening worden gehouden met de volgende overwegingen (3):
—
|
indien een ander oplosmiddel dan water wordt gebruikt, moet dit een middel zijn dat mengbaar is met water en/of kan worden afgedreven (bijvoorbeeld verdampt), waardoor alleen de teststof op de grond achterblijft;
|
—
|
indien een oplosmiddelcontrolegroep wordt gebruikt, is een negatieve controle niet nodig. De oplosmiddelcontrolegroep moet de hoogste concentratie oplosmiddel bevatten die aan de grond is toegevoegd en het gebruikte oplosmiddel moet afkomstig zijn van dezelfde partij die voor het bereiden van de stamoplossing is gebruikt. De toxiciteit en vluchtigheid van het oplosmiddel alsmede de oplosbaarheid van de teststof in het gekozen oplosmiddel moeten de voornaamste criteria zijn op basis waarvan een geschikte solubilisator wordt gekozen.
|
|
24.
|
Voor chemische stoffen die slecht in water en in organische oplosmiddelen oplosbaar zijn, kan, bijvoorbeeld met behulp van een vijzel en stamper, 2,0-2,5 g fijn gemalen kwartszand per testvat worden gemengd met de hoeveelheid teststof die nodig is om de gewenste testconcentratie te verkrijgen. Het mengsel van kwartszand en teststof wordt toegevoegd aan de vooraf bevochtigde grond en grondig gemengd met een passende hoeveelheid gedeïoniseerd water om het vereiste vochtgehalte te verkrijgen. Het uiteindelijke mengsel wordt over de testvaten verdeeld. De procedure wordt voor iedere testconcentratie herhaald en tevens wordt een passende controlegroep met 2,0-2,5 g fijn gemalen kwartszand per testvat bereid.
|
25.
|
De concentratie van de teststof in de grond moet na verrijking worden bepaald. De homogene verdeling van de teststof in de grond moet worden gecontroleerd voordat de testorganismen worden toegevoegd. De verrijkingsmethode en de redenen voor het kiezen van een specifieke verrijkingsprocedure moeten worden gerapporteerd (24).
|
26.
|
Idealiter moet een evenwicht tussen de grond- en de poriënwaterfase zijn bereikt voordat de organismen worden toegevoegd; een periode van vier dagen bij 20 °C wordt aanbevolen. Voor vele slecht in water oplosbare organische stoffen kan de tijd die nodig is om een echt evenwicht tussen geadsorbeerde en opgeloste fracties te bereiken, worden geteld in dagen of maanden. Afhankelijk van het doel van de studie, bijvoorbeeld wanneer de milieuomstandigheden moeten worden nagebootst, kan de verrijkte grond gedurende een langere periode „gerijpt” worden, bv. voor metalen drie weken bij 20 °C (22).
|
Kweken van de testorganismen
27.
|
Wormen moeten bij voorkeur in een permanente laboratoriumcultuur worden gehouden. Richtsnoeren voor de laboratoriumkweekmethoden voor Eisenia fetida en Eisenia andrei en voor soorten „Enchytraeidae” zijn opgenomen in aanhangsel 5 (zie ook (48)(51)(52)).
|
28.
|
De in de tests gebruikte wormen moeten vrij zijn van waarneembare ziekten, abnormaliteiten en parasieten.
|
UITVOERING VAN DE TEST
29.
|
De testorganismen worden tijdens de opnamefase aan de teststof blootgesteld. De opnamefase duurt 14 dagen („Enchytraeidae”) of 21 dagen (regenwormen), tenzij aangetoond is dat een stationaire toestand is bereikt.
|
30.
|
Voor de eliminatiefase worden de wormen overgebracht naar grond die vrij is van teststof. Het eerste monster moet 4 tot 24 uur na het begin van de eliminatiefase worden genomen. Voorbeelden van bemonsteringsschema’s voor een opnamefase van 21 dagen en een eliminatiefase van 21 dagen zijn opgenomen in aanhangsel 3.
|
Testorganismen
31.
|
Voor vele soorten terrestrische „Enchytraeidae” is het individuele gewicht zeer laag (bv. 5-10 mg natgewicht voor Enchytraeus albidus en minder voor Enchytraeus crypticus of Enchytraeus luxuriosus); om de gewichtsmetingen en chemische analyse uit te voeren, kan het nodig zijn om de wormen van de duplotestvaten in een gezamenlijke groep te bundelen (d.w.z. alle wormen in een duplovat worden gebruikt om één analytisch meetresultaat voor het weefsel te verkrijgen). 20 individuele „Enchytraeidae” worden aan ieder duplovat toegevoegd en ten minste drie duplovaten moeten worden gebruikt. Als de analytische aantoonbaarheidsgrens van de teststof hoog is, zijn mogelijk meer wormen nodig. Voor testsoorten met een hoger individueel gewicht (Eisenia fetida en Eisenia andrei) kunnen duplovaten met één individu worden gebruikt.
|
32.
|
De regenwormen die in een test worden gebruikt, moeten een vergelijkbaar gewicht hebben (bv. Eisenia fetida en Eisenia andrei moeten een individueel gewicht hebben van 250-600 mg). „Enchytraeidae” (bv. Enchytraeus albidus) moeten een lengte hebben van ongeveer 1 cm. Alle wormen die in een bepaalde test worden gebruikt, moeten van dezelfde bron afkomstig zijn en moeten volwassen dieren met een clitellum zijn (zie aanhangsel 5). Aangezien het gewicht en de leeftijd van een dier een effect kunnen hebben op de BAF-waarden (bv. vanwege een variërend vetgehalte en/of de aanwezigheid van eieren), moeten deze parameters nauwkeurig geregistreerd worden en in aanmerking worden genomen bij het interpreteren van de resultaten. Daarnaast kunnen tijdens de blootstellingsperiode cocons worden gevormd, die eveneens van invloed zullen zijn op de BAF-waarden. Het verdient aanbeveling vóór de test een deelsteekproef van de testwormen te wegen om een schatting van het gemiddelde nat- en drooggewicht te verkrijgen.
|
33.
|
Om de afname van de teststofconcentratie in de grond tijdens de opnamefase te beperken, moet een grote grond-wormverhouding worden toegepast. Voor Eisenia fetida en Eisenia andrei wordt een minimale hoeveelheid van 50 g drooggewicht aan grond per worm aanbevolen en voor „Enchytraeidae” minimaal 10-20 g drooggewicht per testvat. De vaten moeten een grondlaag van 2-3 cm („Enchytraeidae”) of 4-5 cm (regenwormen) bevatten.
|
34.
|
De in een test gebruikte wormen worden uit de cultuur verwijderd („Enchytraeidae” bijvoorbeeld met behulp van een juwelierspincet). Volwassen dieren worden overgebracht naar onbehandelde testgrond om te acclimatiseren en worden gevoed (zie punt 36). Als de testomstandigheden verschillen van de cultuuromstandigheden, moet een acclimatiseringsfase van 24-72 uur volstaan om de wormen aan de testomstandigheden te laten wennen. Na acclimatisering worden de regenwormen gespoeld door ze naar glazen schalen (bv. petrischalen) met schoon water over te brengen, waarna ze worden gewogen en aan de testgrond worden toegevoegd. Voordat ze worden gewogen, moet overtollig water van de wormen worden verwijderd door ze voorzichtig tegen de rand van het schaaltje te houden of door ze voorzichtig droog te deppen met een licht bevochtigd papieren doekje.
|
35.
|
Het graafgedrag van de testorganismen moet worden geobserveerd en geregistreerd. In tests met regenwormen beginnen de dieren (controle- en testgroep) gewoonlijk binnen enkele uren tunnels te graven; dit moet binnen 24 uur na inbrenging van de wormen in de testvaten worden gecontroleerd. Indien de regenwormen geen tunnels in de grond graven (bv. meer dan 10 % gedurende meer dan de helft van de opnamefase), duidt dit erop dat de testomstandigheden niet passend zijn of dat de testorganismen niet gezond zijn. In een dergelijk geval moet de test worden stopgezet en herhaald. „Enchytraeidae” leven voornamelijk in de interstitiële poriën van de grond en vaak komt hun integument slechts gedeeltelijk in aanraking met het omringende substraat; de blootstelling van gravende en niet gravende „Enchytraeidae” wordt verondersteld equivalent te zijn en indien de „Enchytraeidae” niet graven, wil dat niet noodzakelijkerwijs zeggen dat de test moet worden herhaald.
|
Voeding
36.
|
Als grond met een laag totaal gehalte aan organische koolstof wordt gebruikt, moet worden overwogen voeding toe te dienen. Bij gebruik van kunstmatige grond wordt een wekelijks rantsoen (d.w.z. de wormen moeten eenmaal per week worden gevoed) van 7 mg gedroogde mest per g grond (drooggewicht) voor regenwormen en een wekelijks rantsoen van 2-2,5 mg gemalen havervlokken per g grond (drooggewicht) voor „Enchytraeidae” aanbevolen (11). Het eerste rantsoen moet net voordat de testorganismen worden toegevoegd, met de grond worden vermengd. Bij voorkeur moet dezelfde soort voeding worden gebruikt als de voeding die in de culturen wordt gebruikt (zie aanhangsel 5).
|
Licht en temperatuur
37.
|
De tests moeten worden uitgevoerd bij een gecontroleerde cyclus van 16 uur licht en 8 uur donker, met bij voorkeur 400 tot 800 lux in het gebied van de testvaten (3). De testtemperatuur moet gedurende de gehele test 20 ± 2 °C zijn.
|
Testconcentraties
38.
|
Er wordt gebruikgemaakt van één concentratie. Situaties waarin één of meer aanvullende concentraties nodig zijn, moeten worden gemotiveerd. Indien de toxiciteit (ECx) van de teststof dicht bij de analytische aantoonbaarheidsgrens ligt, verdient het aanbeveling om een radioactief gelabelde teststof met een hoge specifieke radioactiviteit te gebruiken. Voor metalen moet de concentratie hoger zijn dan het achtergrondniveau in weefsel en grond.
|
Duplo’s
39.
|
Voor de kinetische metingen (opname- en eliminatiefase) moeten er per bemonsteringspunt minimaal drie behandelde duplovaten zijn. Het totale aantal bereide duplo’s moet voldoende zijn voor alle bemonsteringstijdstippen tijdens de opname- en eliminatiefase.
|
40.
|
Voor de biologische waarnemingen en metingen (bv. de verhouding tussen nat- en drooggewicht, het vetgehalte) en voor de analyse van achtergrondconcentraties in wormen en grond moeten ten minste twaalf duplovaten van een negatieve controlegroep (vier monsternamen aan het begin, vier aan het eind van de opnamefase en vier aan het eind van de eliminatiefase) beschikbaar zijn, indien geen ander oplosmiddel dan water wordt gebruikt. Indien een solubilisator wordt gebruikt om de teststof aan te brengen, moet in aanvulling op de met teststof behandelde duplo’s een oplosmiddelcontrole worden uitgevoerd (vier duplovaten moeten aan het begin worden bemonsterd, vier aan het eind aan de opnamefase en vier aan het eind van de eliminatiefase) waarbij alle bestanddelen behalve de teststof worden gebruikt. In dat geval kan ook worden gezorgd voor vier aanvullende duplovaten van een negatieve controlegroep (geen oplosmiddel) voor facultatieve monstername aan het eind van de opnamefase. Deze duplo’s kunnen biologisch worden vergeleken met de oplosmiddelcontrolegroep om informatie te verkrijgen over een mogelijk effect van het oplosmiddel op de testorganismen. Het verdient aanbeveling te zorgen voor een voldoende aantal aanvullende reserveduplovaten (bv. acht) voor zowel de testgroep als de controlegroep(en).
|
Frequentie van de metingen van de grondkwaliteit
41.
|
Aan het begin en aan het eind van de opname- en eliminatiefase worden de pH van de grond, het vochtgehalte van de grond en de temperatuur (continu) in de testruimte gemeten. Eenmaal per week wordt het vochtgehalte van de grond gecontroleerd door de testvaten te wegen en de meetwaarden met het initiële gewicht aan het begin van de test te vergelijken. Waterverliezen moeten worden gecompenseerd door gedeïoniseerd water toe te voegen.
|
Bemonstering en analyse van de wormen en de grond
42.
|
Een voorbeeld van een schema voor de opname- en eliminatiefasen van bioaccumulatietests met regenwormen en „Enchytraeidae” is opgenomen in aanhangsel 3.
|
43.
|
De grond in de testvaten wordt bemonsterd om de concentratie teststof vóór toevoeging van de wormen en tijdens de opname- en eliminatiefasen te bepalen. Tijdens de test worden de concentraties teststof in de wormen en de grond bepaald. In het algemeen worden totale grondconcentraties gemeten. Facultatief kunnen concentraties in poriënwater worden gemeten; in dat geval moeten voor aanvang van het onderzoek een motivering en passende methoden worden opgegeven, die tevens in het verslag worden opgenomen.
|
44.
|
De wormen en grond worden tijdens de opname- en eliminatiefasen op minimaal zes momenten bemonsterd. Indien de stabiliteit van een teststof is aangetoond, kan het aantal grondanalysen worden verminderd. Het verdient aanbeveling om ten minste drie duplo’s aan het begin en aan het eind van de opnamefase te analyseren. Als de concentratie in de grond die aan het eind van de opnamefase wordt gemeten, meer dan 30 % afwijkt van de initiële concentratie, moeten de grondmonsters die op andere dagen zijn genomen ook worden geanalyseerd.
|
45.
|
De wormen van een duplo moeten bij iedere monstername uit de grond worden verwijderd (bv. door de grond van een duplovat over een ondiepe schaal te verspreiden en de wormen met een zacht juwelierspincet op te pakken) en vervolgens snel met water worden gespoeld in een ondiepe glazen of stalen schaal. Overtollig water moet worden verwijderd (zie punt 34). De wormen worden vervolgens voorzichtig overgebracht naar een van tevoren gewogen vat en onmiddellijk gewogen, inclusief darminhoud.
|
46.
|
De regenwormen (Eisenia spp.) ontlasten vervolgens 's nachts hun darmen, bv. op een vochtig stuk filterpapier in een afgedekte petrischaal (zie punt 34). Nadat de wormen hun darmen hebben ontlast, wordt het gewicht van de wormen bepaald om een eventuele vermindering van biomassa tijdens de test te beoordelen (zie geldigheidscriteria in punt 17). Het wegen en de weefselanalyse van „Enchytraeidae” wordt uitgevoerd zonder dat de dieren hun darmen hebben ontlast, aangezien dit in technisch opzicht moeilijk is vanwege de geringe omvang van deze wormen. Nadat het uiteindelijke gewicht is bepaald, moeten de wormen onverwijld worden gedood door middel van de meest passende methode (bv. met gebruikmaking van vloeibare stikstof of door bevriezen bij temperaturen onder – 18 °C).
|
47.
|
Tijdens de eliminatiefase vervangen de wormen verontreinigde darminhoud met schone grond. Dit betekent dat onmiddellijk vóór de eliminatiefase genomen monsters van wormen die zich niet hebben ontlast („Enchytraeidae” in dit geval) verontreinigde darminhoud bevatten. Voor aquatische Oligochaetae wordt aangenomen dat het merendeel van de verontreinigde darminhoud na de eerste 4 tot 24 uur van de eliminatiefase door schoon sediment is vervangen, zie bv. (46). In studies naar de accumulatie van radioactief gelabeld cadmium en zink zijn vergelijkbare bevindingen voor regenwormen gerapporteerd (78). In de „Enchytraeidae” die zich niet hebben ontlast, kan de concentratie van dit eerste monster van de eliminatiefase worden beschouwd als de weefselconcentratie na ontlasting van de darm. Om rekening te houden met de verdunning van de teststofconcentratie door opname van niet-verontreinigde grond tijdens de eliminatiefase, kan het gewicht van de darminhoud worden geschat op basis van de verhouding natgewicht/asgewicht van de worm of de verhouding drooggewicht/asgewicht van de worm.
|
48.
|
De grond- en wormmonsters moeten bij voorkeur onmiddellijk na verwijdering (d.w.z. binnen één-twee dagen) worden geanalyseerd om ontbinding of andere verliezen te voorkomen en het verdient aanbeveling om de opname- en eliminatiesnelheden bij benadering te berekenen naarmate de test vordert. Als de analyse met vertraging plaatsvindt, moeten de monsters op passende wijze worden bewaard, bv. diepgevroren (≤ – 18 °C).
|
49.
|
Gecontroleerd moet worden of de precisie en reproduceerbaarheid van de chemische analyse alsmede de recovery van de teststof uit de grond- en wormmonsters toereikend zijn voor de gebruikte methode; de extractie-efficiëntie, de aantoonbaarheidsgrens (LOD) en de bepaalbaarheidsgrens (LOQ) moeten worden gerapporteerd. Ook moet worden gecontroleerd of de teststof in de controlevaten niet detecteerbaar is in hogere concentraties dan de achtergrondconcentratie. Indien bij de controlewormen de concentratie van de teststof in het testorganisme Ca > 0, moet hiermee rekening worden gehouden bij de berekening van de kinetische parameters (zie aanhangsel 2). Alle monsters moeten tijdens de gehele test dusdanig worden gehanteerd dat verontreiniging en verlies (bv. ten gevolge van adsorptie van de teststof aan het bemonsteringshulpmiddel) tot een minimum worden beperkt.
|
50.
|
Bij gebruik van radioactief gelabelde teststoffen is het mogelijk om de oorspronkelijke stof en de metabolieten te analyseren. Kwantificering van de oorspronkelijke teststof en de metabolieten in stationaire toestand of aan het eind van de opnamefase levert belangrijke informatie op. De monsters worden vervolgens „opgeschoond”, zodat de oorspronkelijke teststof afzonderlijk kan worden gekwantificeerd. Indien individuele metabolieten een radioactiviteit van meer dan 10 % van de totale radioactiviteit hebben, wordt aanbevolen deze metabolieten te identificeren.
|
51.
|
De totale recovery en de teststofrecovery in wormen, grond en, indien gebruikt, in afscheiders met absorptiemiddelen om verdampte teststof op te vangen, moeten worden geregistreerd en gerapporteerd.
|
52.
|
Bundeling van de bemonsterde individuen uit een bepaald testvat is aanvaardbaar voor „Enchytraeidae” die kleiner zijn dan regenwormen. Indien door de bundeling het aantal duplo’s afneemt, beperkt dit de statistische procedures die op de gegevens kunnen worden toegepast. Indien het nodig is een specifieke statistische procedure toe te passen of een bepaald statistisch onderscheidingsvermogen te bereiken, moet de test, rekening houdend met die bundeling, die procedure en dat onderscheidingsvermogen, met een voldoende aantal duplotestvaten worden uitgevoerd.
|
53.
|
Het verdient aanbeveling om de BAF uit te drukken als functie van het totale drooggewicht en, indien nodig (d.w.z. voor zeer hydrofobe chemische stoffen), als functie van het vetgehalte. Er moeten geschikte methoden worden toegepast om het vetgehalte te bepalen (sommige bestaande methoden — bv. (31)(58) — moeten hiervoor worden aangepast). Bij deze methoden wordt gebruikgemaakt van een chloroform/methanol-extractietechniek. Om het gebruik van gechloreerde oplosmiddelen te vermijden, moet echter een aangepaste versie van de methode van Bligh en Dyer (9), als beschreven in (17), worden gebruikt. Aangezien de verschillende methoden verschillende resultaten kunnen opleveren, is het van belang dat bijzonderheden over de gebruikte methode worden verstrekt. De vetanalyse moet, indien mogelijk, d.w.z. als voldoende wormweefsel voorhanden is, worden uitgevoerd op hetzelfde monster of extract als voor de analyse van de teststof wordt gebruikt — de vetten moeten immers meestal toch worden verwijderd alvorens het extract chromatografisch kan worden geanalyseerd (49). Als alternatief kunnen controledieren worden gebruikt om het vetgehalte te meten, dat vervolgens gebruikt kan worden om de BAF-waarden te normaliseren. Deze laatstgenoemde aanpak vermindert de verontreiniging van apparatuur met de teststof.
|
GEGEVENS EN RAPPORTAGE
Verwerking van de resultaten
54.
|
De opnamecurve van de teststof wordt verkregen door de concentratie in/op de wormen tijdens de opnamefase uit te zetten tegen de tijd in een lineair coördinatenstelsel. Wanneer de curve een plateau, of stationaire toestand, heeft bereikt (zie definities in aanhangsel 1), wordt de bioaccumulatiefactor in stationaire toestand, BAFss, berekend op basis van:
Ca is de concentratie van teststof in het testorganisme
Cs is de concentratie van teststof in de grond
|
55.
|
Indien geen stationaire toestand wordt bereikt, moet in plaats van de BAFss de BAFK op basis van de snelheidsconstanten worden bepaald, en wel als volgt:
—
|
de accumulatiefactor (BAFK) wordt bepaald als de verhouding ks/ke;
|
—
|
de opname- en eliminatiesnelheden worden bij voorkeur tegelijkertijd bepaald (zie vergelijking [11] in aanhangsel 2);
|
—
|
de eliminatiesnelheidsconstante (ke) wordt gewoonlijk bepaald op basis van de eliminatiecurve (d.w.z. de uitgezette concentratie van de teststof in de wormen tijdens de eliminatiefase). De opnamesnelheidsconstante ks wordt vervolgens berekend met de bekende ke en een waarde van Ca die wordt afgeleid van de opnamecurve — zie aanhangsel 2 voor een beschrijving van deze methoden. Het verdient de voorkeur BAFK en de snelheidsconstanten ks en ke te berekenen met behulp van een gecomputeriseerde niet-lineaire parameterschattingstechniek. Als de eliminatie duidelijk niet van de eerste orde is, moeten complexere modellen worden toegepast.
|
|
Testverslag
56.
|
In het testverslag moet de volgende informatie worden opgenomen:
|
Teststof:
—
|
alle beschikbare informatie met betrekking tot acute toxiciteit of toxiciteit op lange termijn (bv. ECx, LCx, NOEC) van de teststof voor in de bodem levende Oligochaetae;
|
—
|
zuiverheid, fysische aard en fysisch-chemische eigenschappen, bv. log Kow, oplosbaarheid in water;
|
—
|
chemische identificatiegegevens, bron van de teststof, identiteit en concentratie van eventueel gebruikte oplosmiddelen;
|
—
|
indien radioactief gelabelde teststof wordt gebruikt, de precieze positie van de gelabelde atomen, de specifieke radioactiviteit en de radiochemische zuiverheid.
|
|
|
Diersoort:
—
|
wetenschappelijke naam, stam, oorsprong, eventuele voorafgaande behandeling, acclimatisatie, leeftijd, grootte-interval enz.
|
|
|
Testomstandigheden:
—
|
gebruikte testprocedure;
|
—
|
aard en kenmerken van de gebruikte verlichting en de fotoperiode(s);
|
—
|
testopzet (bv. aantal en grootte van de testvaten, grondmassa en hoogte van de grondlaag, aantal duplo’s, aantal wormen per duplo, aantal testconcentraties, duur van de opname- en de eliminatiefase, frequentie van de bemonstering);
|
—
|
motivering van de keuze van het testvatmateriaal;
|
—
|
methode voor het bereiden en aanbrengen van de teststof en de redenen voor het kiezen van een specifieke methode;
|
—
|
de nominale testconcentraties, de gemiddelden en standaardafwijkingen van de in de testvaten gemeten waarden en de methode waarmee deze waarden zijn bepaald;
|
—
|
bron van de bestanddelen van de kunstmatige grond of — bij gebruik van natuurlijke media — oorsprong van de grond, beschrijving van eventuele voorbehandeling, resultaten van de controles (overleven, biomassaontwikkeling, voortplanting), grondkenmerken (pH, totale gehalte aan organische koolstof, deeltjesgrootteverdeling (percentage zand, silt en klei), het maximale waterhoudende vermogen (WHCmax), het procentuele watergehalte aan het begin en aan het eind van de test en eventuele andere verrichte metingen);
|
—
|
gedetailleerde informatie over de verwerking van grond- en wormmonsters, met inbegrip van details van de bereiding, opslag, verrijkingsprocedures, extractie en analyseprocedures (en -precisie) voor de teststof in wormen en grond alsmede het vetgehalte (indien gemeten) en de recovery van de teststof.
|
|
|
Resultaten:
—
|
sterfte van de controlewormen en de wormen in elk testvat alsmede ieder waargenomen abnormaal gedrag (bv. vermijding van de grond, uitblijven van voortplanting in een bioaccumulatietest met „Enchytraeidae”);
|
—
|
de verhouding tussen drooggewicht en natgewicht van de grond en de testorganismen (nuttig voor normalisatie);
|
—
|
het natgewicht van de wormen op ieder bemonsteringstijdstip; voor regenwormen, het natgewicht bij het begin van de test en op ieder bemonsteringstijdstip voor en na het ontlasten van de darm;
|
—
|
het vetgehalte van de testorganismen (indien bepaald);
|
—
|
grafieken van de opname- en eliminatiekinetiek van de teststof in de wormen en van de tijd tot de stationaire toestand;
|
—
|
Ca en Cs (met standaardafwijking en bereik, indien van toepassing) voor alle bemonsteringstijdstippen (Ca uitgedrukt in g kg–1 nat- en drooggewicht van het hele lichaam, Cs uitgedrukt in g kg–1 nat- en drooggewicht van de grond). Indien een biota-grondaccumulatiefactor (BSAF) nodig is (bv. om de resultaten van twee of meer tests die met dieren met een ander vetgehalte zijn uitgevoerd, te kunnen vergelijken), kan Ca aanvullend worden uitgedrukt in g kg–1 vetgehalte van het organisme en kan Cs worden uitgedrukt in g kg–1 organische koolstof (OC) van de grond;
|
—
|
BAF (uitgedrukt in kg grond·kg–1 worm), de grondopnamesnelheidsconstante ks (uitgedrukt in g grond kg–1 van worm dag–1) en de eliminatiesnelheidsconstante ke (uitgedrukt in dag–1); BSAF (uitgedrukt in kg OC in de grond kg–1 vetgehalte van de worm) kan aanvullend worden gerapporteerd;
|
—
|
indien gemeten: percentages van de oorspronkelijke stof, metabolieten en gebonden residuen (d.w.z. het percentage van de teststof dat niet geëxtraheerd kan worden met normale extractiemethoden) die in grond en testdieren zijn aangetoond;
|
—
|
methoden die zijn gebruikt voor de statistische analyse van gegevens.
|
|
|
Evaluatie van de resultaten:
—
|
overeenstemming van de resultaten met de in punt 17 vermelde geldigheidscriteria;
|
—
|
onverwachte of ongewone resultaten, bv. onvolledige eliminatie van de teststof uit de testdieren.
|
|
|
LITERATUUR:
(1)
|
Amorim M (2000). Chronic and toxicokinetic behavior of Lindane (γ-HCH) in the Enchytraeid Enchytraeus albidus. Master thesis, University Coimbra.
|
(2)
|
ASTM (2000). Standard guide for the determination of the bioaccumulation of sediment-associated contaminants by benthic invertebrates. American Society for Testing and Materials, E 1688-00a.
|
(3)
|
ASTM International (2004). Standard guide for conducting laboratory soil toxicity or bioaccumulation tests with the Lumbricid earthworm Eisenia fetida and the Enchytraeid potworm Enchytraeus albidus. ASTM International, E1676-04: 26 pp.
|
(4)
|
Beek B, Boehling S, Bruckmann U, Franke C, Joehncke U, Studinger G (2000). The assessment of bioaccumulation. In Hutzinger, O. (editor), The Handbook of Environmental Chemistry, Vol. 2 Part J (Vol. editor: B. Beek): Bioaccumulation — New Aspects and Developments. Springer-Verlag Berlijn Heidelberg: 235-276.
|
(5)
|
Belfroid A, Sikkenk M, Seinen W, Van Gestel C, Hermens J (1994). The toxicokinetic behavior of chlorobenzenes in earthworms (Eisenia andrei): Experiments in soil. Environ. Toxicol. Chem. 13: 93-99.
|
(6)
|
Belfroid A, Van Wezel A, Sikkenk M, Van Gestel C, Seinen W & Hermens J (1993). The toxicokinetic behavior of chlorobenzenes in earthworms (Eisenia andrei): Experiments in water. Ecotox. Environ. Safety 25: 154-165.
|
(7)
|
Belfroid A, Meiling J, Drenth H, Hermens J, Seinen W, Van Gestel C (1995). Dietary uptake of superlipophilic compounds by earthworms (Eisenia andrei). Ecotox. Environ. Safety 31: 185-191.
|
(8)
|
Bell AW (1958). The anatomy of Enchytraeus albidus, with a key to the species of the genus Enchytraeus. Ann. Mus. Novitat. 1902: 1-13.
|
(9)
|
Bligh EG and Dyer WJ (1959). A rapid method of total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Pysiol. 37: 911-917.
|
(10)
|
Bouche M (1972). Lombriciens de France. Ecologie et Systematique. INRA, Annales de Zoologie-Ecologie animale, Parijs, 671 p.
|
(11)
|
Bruns E, Egeler Ph, Moser T, Römbke J, Scheffczyk A, Spörlein P (2001a). Standardisierung und Validierung eines Bioakkumulationstests mit terrestrischen Oligochaeten. Report to the German Federal Environmental Agency (Umweltbundesamt Berlin), R&D No.: 298 64 416.
|
(12)
|
Bruns E, Egeler Ph, Römbke J Scheffczyk A, Spörlein P (2001b). Bioaccumulation of lindane and hexachlorobenzene by the oligochaetes Enchytraeus luxuriosus and Enchytraeus albidus (Enchytraeidae, Oligochaeta, Annelida). Hydrobiologia 463: 185-196.
|
(13)
|
Conder JM and Lanno RP (2003). Lethal critical body residues as measures of Cd, Pb, and Zn bioavailability and toxicity in the earthworm Eisenia fetida. J. Soils Sediments 3: 13-20.
|
(14)
|
Connell DW and Markwell RD (1990). Bioaccumulation in the Soil to Earthworm System. Chemosphere 20: 91-100.
|
(15)
|
Didden WAM (1993). Ecology of Terrestrial Enchytraeidae. Pedobiologia 37: 2-29.
|
(16)
|
Didden W (2003). Oligochaeta, In: Bioindicators and biomonitors. Markert, B.A., Breure, A.M. & Zechmeister, H.G. (eds.). Elsevier Science Ltd, Nederland, pp. 555-576.
|
(17)
|
De Boer J, Smedes F, Wells D, Allan A (1999). Report on the QUASH interlaboratory study on the determination of total-lipid in fish and shellfish. Round 1 SBT-2, Exercise 1000, EU, Standards, Measurement and Testing Programme.
|
(18)
|
Dietrich DR, Schmid P, Zweifel U, Schlatter C, Jenni-Eiermann S, Bachmann H, Bühler U, Zbinden N (1995). Mortality of birds of prey following field application of granular carbofuran: A Case Study. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 29: 140-145.
|
(19)
|
Verordening (EG) nr. 1907/2006 van het Europees Parlement en de Raad van 18 december 2006 inzake de registratie en beoordeling van en de autorisatie en beperkingen ten aanzien van chemische stoffen (REACH), tot oprichting van een Europees Agentschap voor chemische stoffen, houdende wijziging van Richtlijn 1999/45/EG en houdende intrekking van Verordening (EEG) nr. 793/93 van de Raad en Verordening (EG) nr. 1488/94 van de Commissie alsmede Richtlijn 76/769/EEG van de Raad en de Richtlijnen 91/155/EEG, 93/67/EEG, 93/105/EG en 2000/21/EG van de Commissie (PB L 396 van 30.12.2006, blz. 1).
|
(20)
|
Edwards CA and Bohlen PJ (1996). Biology and ecology of earthworms. Third Edition, Chapman & Hall, London, 426 pp.
|
(21)
|
OECD (2008), Bioaccumulation in Sediment-dwelling Benthic Oligochates, Test Guideline No. 315, Guidelines for the testing of chemicals, OECD, Paris
|
(22)
|
Egeler Ph, Gilberg D, Scheffczyk A, Moser Th and Römbke J (2009). Validation of a Soil Bioaccumulation Test with Terrestrial Oligochaetes by an International Ring Test (Validierung einer Methode zur standardisierten Messung der Bioakkumulation mit terrestrischen Oligochaeten). Report to the Federal Environmental Agency (Umweltbundesamt Dessau-Rosslau), R&D No.: 204 67 458: 149 pp. Kan worden gedownload op: http://www.oecd.org/dataoecd/12/20/42552727.pdf.
|
(23)
|
Elmegaard N and Jagers op Akkerhuis GAJM (2000). Safety factors in pesticide risk assessment, Differences in species sensitivity and acute-chronic relations. National Environmental Research Institute, NERI Technical Report 325: 57 pp.
|
(24)
|
Environment Canada (1995). Guidance document on measurement of toxicity test precision using control sediments spiked with a reference toxicant. Environmental Protection Series Report EPS 1/RM/30.
|
(25)
|
EPPO (2003). Environmental Risk Assessment scheme for plant protection products. Soil organisms and functions, EPPO (European Plant Protection Organization) Standards, Bull, OEPP/EPPO 33: 195-208.
|
(26)
|
Franke C (1996). How meaningful is the bioconcentration factor for risk assessment? Chemosphere 32: 1897-1905.
|
(27)
|
Franke C, Studinger G, Berger G, Böhling S, Bruckmann U, Cohors-Fresenborg D, Jöhncke U (1994). The assessment of bioaccumulation. Chemosphere 29: 1501-1514.
|
(28)
|
Füll C (1996). Bioakkumulation und Metabolismus von -1,2,3,4,5,6-Hexachlorcyclohexan (Lindan) und 2-(2,4-Dichlorphenoxy)-propionsäure (Dichlorprop) beim Regenwurm Lumbricus rubellus (Oligochaeta, Lumbricidae). Dissertation University Mainz, 156 pp.
|
(29)
|
Füll C, Schulte C, Kula C (2003). Bewertung der Auswirkungen von Pflanzenschutzmitteln auf Regenwürmer. UWSF — Z. Umweltchem, Ökotox. 15: 78-84.
|
(30)
|
Gabric A.J, Connell DW, Bell PRF (1990). A kinetic model for bioconcentration of lipophilic compounds by oligochaetes. Wat. Res. 24: 1225-1231.
|
(31)
|
Gardner WS, Frez WA, Cichocki EA, Parrish CC (1985). Micromethods for lipids in aquatic invertebrates. Limnology and Oceanography 30: 1099-1105.
|
(32)
|
Hawker DW and Connell DW (1988). Influence of partition coefficient of lipophilic compounds on bioconcentration kinetics with fish. Wat. Res. 22: 701-707.
|
(33)
|
Hund-Rinke K and Wiechering H (2000). Earthworm avoidance test for soil assessments: An alternative for acute and reproduction tests. J. Soils Sediments 1: 15-20.
|
(34)
|
Hund-Rinke K, Römbke J, Riepert F, Achazi R (2000). Beurteilung der Lebensraumfunktion von Böden mit Hilfe von Regenwurmtests. In: Toxikologische Beurteilung von Böden. Heiden, S., Erb, R., Dott, W. & Eisentraeger, A. (eds.), Spektrum Verl., Heidelberg, 59-81.
|
(35)
|
ISO 11268-2 (1998) Soil Quality — Effects of pollutants on earthworms (Eisenia fetida). Part 2: Determination of effects on reproduction.
|
(36)
|
Jaenike J (1982). „Eisenia foetida” is two biological species. Megadrilogica 4: 6-8.
|
(37)
|
Jager T (1998). Mechanistic approach for estimating bioconcentration of organic chemicals in earthworms (Oligochaeta). Environ. Toxicol. Chem. 17: 2080-2090.
|
(38)
|
Jager T, Sanchez PA, Muijs B, van der Welde E, Posthuma L (2000). Toxicokinetics of polycyclic aromatic hydrocarbons in Eisenia andrei (Oligochaeta) using spiked soil. Environ. Toxicol. Chem. 19: 953-961.
|
(39)
|
Jager T, Baerselman R, Dijkman E, De Groot AC, Hogendoorn EA, DeJong A, Kruitbosch JAW, Peijnenburg W J G. M (2003a). Availability of polycyclic aromatic hydrocarbons to earthworms (Eisenia andrei, Oligochaeta) in field-polluted soils and soil-sediment mixtures. Environ. Toxicol. Chem. 22: 767-775.
|
(40)
|
Jager T, Fleuren RLJ, Hoogendoorn E, de Korte G (2003b). Elucidating the routes of exposure for organic chemicals in the earthworm, Eisenia andrei (Oligochaeta). Environ. Sci. Technol. 37: 3399-3404.
|
(41)
|
Janssen MPM, Bruins A, De Vries TH, Van Straalen NM (1991). Comparison of cadmium kinetics in four soil arthropod species. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 20: 305-312.
|
(42)
|
Kasprzak K (1982). Review of enchytraeid community structure and function in agricultural ecosystems. Pedobiologia 23: 217-232.
|
(43)
|
Khalil AM (1990). Aufnahme und Metabolismus von 14C-Hexachlorbenzol und 14C-Pentachlornitrobenzol in Regenwürmern. Dissertation University München, 137 pp.
|
(44)
|
Landrum PF (1989). Bioavailability and toxicokinetics of polycyclic aromatic hydrocarbons sorbed to sediments for the amphipod Pontoporeia hoyi. Environ. Sci. Toxicol. 23: 588-595.
|
(45)
|
Marinussen MPJC, Van der Zee SEATM, De Haan FA (1997). Cu accumulation in Lumbricus rubellus under laboratory conditions compared with accumulation under field conditions. Ecotox. Environ. Safety 36: 17-26.
|
(46)
|
Mount DR, Dawson TD, Burkhard LP (1999). Implications of gut purging for tissue residues determined in bioaccumulation testing of sediment with Lumbriculus variegates. Environ. Toxicol. Chem. 18: 1244-1249.
|
(47)
|
Nendza M (1991). QSARs of bioaccumulation: Validity assessment of log Kow/log BCF correlations, In: R. Nagel and R. Loskill (eds.): Bioaccumulation in aquatic systems, Contributions to the assessment, Proceedings of an international workshop, Berliin 1990, VCH, Weinheim.
|
(48)
|
Hoofdstuk C.8 van deze bijlage, Toxiciteit voor regenwormen.
|
(49)
|
Hoofdstuk C.13 van deze bijlage, Bioconcentratie: doorstroomtest met vissen.
|
(50)
|
Hoofdstuk C.21 van deze bijlage, Micro-organismen in de bodem: bepaling van de omzetting van stikstof.
|
(51)
|
OECD (2004a), Enchytraeid reproduction test, Test Guideline No. 220, Guidelines for the testing of chemicals, OECD, Paris.
|
(52)
|
OECD (2004b), Earthworm reproduction test (Eisenia fetida/Eisenia Andrei), Test Guideline No. 222, Guidelines for the testing of chemicals, OECD, Paris.
|
(53)
|
OECD (2008), Bioaccumulation in Sediment-dwelling Benthic Oligochates, Test Guideline No. 315, Guidelines for the testing of chemicals, OECD, Paris.
|
(54)
|
Petersen H and Luxton M (1982). A comparative analysis of soil fauna populations and their role in decomposition processes. Oikos 39: 287-388.
|
(55)
|
Phillips DJH (1993). Bioaccumulation. In: Handbook of Ecotoxicology Vol. 1. Calow P. (ed.). Blackwell Scientific Publ., Oxford. 378-396.
|
(56)
|
Pflugmacher J (1992). Struktur-Aktivitätsbestimmungen (QSAR) zwischen der Konzentration von Pflanzenschutzmitteln und dem Octanol-Wasser-Koeffzienten UWSF- Z. Umweltchem. Ökotox. 4: 77-81.
|
(57)
|
Posthuma L, Weltje L, Anton-Sanchez FA (1996). Joint toxic effects of cadmium and pyrene on reproduction and growth of the earthworm Eisenia fetida. RIVM Report No. 607506001, Bilthoven.
|
(58)
|
Randall RC, Lee II H, Ozretich RJ, Lake JL, Pruell RJ (1991). Evaluation of selected lipid methods for normalising pollutant bioaccumulation. Environ.Toxicol. Chem. 10: 1431-1436.
|
(59)
|
Römbke J, Egele, P, Füll C (1998). Literaturstudie über Bioakkumulationstests mit Oligochaeten im terrestrischen Medium. UBA-Texte 28/98, 84 S.
|
(60)
|
Römbke J and Moser Th (1999). Organisation and performance of an international ring-test for the validation of the Enchytraeid reproduction test. UBA-Texte 4/99: 373 pp.
|
(61)
|
Römbke J, Riepert F, Achazi R (2000). Enchytraeen als Testorganismen, In: Toxikologische Beurteilung von Böden. Heiden, S., Erb, R., Dott, W. & Eisentraeger, A. (eds.). Spektrum Verl., Heidelberg. 105-129.
|
(62)
|
Romijn CA.FM, Luttik R, Van De Meent D, Slooff W,Canton JH (1993). Presentation of a General Algorithm to Include Effect Assessment on Secondary Poisoning in the Derivation of Environmental Quality Criteria, Part 2: Terrestrial food chains. Ecotox. Envir. Safety 27: 107-127.
|
(63)
|
Sample BE, Suter DW, Beauchamp JJ, Efroymson RA (1999). Literature-derived bioaccumulation models for earthworms: Development and validation. Environ. Toxicol. Chem. 18: 2110-2120.
|
(64)
|
Schlosser H-J and Riepert F (1992). Entwicklung eines Prüfverfahrens für Chemikalien an Bodenraubmilben (Gamasina), Teil 2: Erste Ergebnisse mit Lindan und Kaliumdichromat in subletaler Dosierung. Zool. Beitr. NF 34: 413-433.
|
(65)
|
Schmelz R and Collado R (1999). Enchytraeus luxuriosus sp. nov., a new terrestrial oligochaete species (Enchytraeide, Clitellata, Annelida). Carolinea 57: 93-100.
|
(66)
|
Sims R W and Gerard BM (1985). Earthworms, In: Kermack, D. M. & Barnes, R. S. K. (Hrsg.): Synopses of the British Fauna (New Series) No. 31. 171 S. London: E. J. Brill/Dr. W. Backhuys.
|
(67)
|
Sousa JP, Loureiro S, Pieper S, Frost M, Kratz W, Nogueira AJA, Soares AMVM (2000). Soil and plant diet exposure routes and toxicokinetics of lindane in a terrestrial isopod. Environ. Toxicol. Chem. 19: 2557-2563.
|
(68)
|
Spacie A and Hamelink JL (1982). Alternative models for describing the bioconcentration of organics in fish. Environ. Toxicol. Chem. 1, 309-320.
|
(69)
|
Stephenson GL, Kaushik A, Kaushik NK, Solomon KR, Steele T, Scroggins RP (1998). Use of an avoidance-response test to assess the toxicity of contaminated soils to earthworms. In: Advances in earthworm ecotoxicology. S. Sheppard, J. Bembridge, M. Holmstrup, L. Posthuma (eds.). Setac Press, Pensacola, 67-81.
|
(70)
|
Sterenborg I, Vork NA, Verkade SK, Van Gestel CAM, Van Straalen NM (2003). Dietary zinc reduces uptake but not metallothionein binding and elimination of cadmium in the springtail Orchesella cincta. Environ. Toxicol. Chemistry 22: 1167-1171.
|
(71)
|
UBA (Umweltbundesamt) (1991). Bioakkumulation — Bewertungskonzept und Strategien im Gesetzesvollzug. UBA-Texte 42/91. Berlin.
|
(72)
|
US EPA (2000). Methods for measuring the toxicity and bioaccumulation of sediment-associated contaminants with freshwater invertebrates. Second Edition, EPA 600/R-99/064, US, Environmental Protection Agency, Duluth, MN, maart 2000.
|
(73)
|
Van Brummelen TC and Van Straalen NM (1996). Uptake and elimination of benzo(a)pyrene in the terrestrial isopod Porcellio scaber. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 31: 277-285.
|
(74)
|
Van Gestel CAM. (1992). The influence of soil characteristics on the toxicity of chemicals for earthworms; a review, In: Ecotoxicology of Earthworms (Ed. Becker, H, Edwards, PJ, Greig-Smith, PW & Heimbach, F). Intercept Press, Andover (GB).
|
(75)
|
Van Gestel CA and Ma W-C (1990). An approach to quantitative structureactivity relationships (QSARs) in earthworm toxicity studies. Chemosphere 21: 1023-1033.
|
(76)
|
Van Straalen NM, Donker MH, Vijver MG, van Gestel CAM (2005). Bioavailability of contaminants estimated from uptake rates into soil invertebrates. Environmental Pollution 136: 409-417.
|
(77)
|
Venter JM and Reinecke AJ (1988). The life-cycle of the compost-worm Eisenia fetida (Oligochaeta). South African J. Zool. 23: 161-165.
|
(78)
|
Vijver MG, Vink JPM, Jager T, Wolterbeek HT, van Straalen NM, van Gestel CAM (2005). Biphasic elimination and uptake kinetics of Zn and Cd in the earthworm Lumbricus rubellus exposed to contaminated floodplain soil. Soil Biol, Biochem. 37: 1843-1851.
|
(79)
|
Widianarko B and Van Straalen NM (1996). Toxicokinetics-based survival analysis in bioassays using nonpersistent chemicals, Environ. Toxicol. Chem. 15: 402-406.
|
Aanhangsel 1
DEFINITIES
|
Bioaccumulatie is de toename van de concentratie van de teststof in of op een organisme ten opzichte van de concentratie van de teststof in het omringende medium. Bioaccumulatie is het gevolg van zowel bioconcentratie- als biomagnificatieprocessen (zie hieronder).
|
|
Bioconcentratie is de toename van de concentratie van de teststof in of op een organisme ten gevolge van de opname van de chemische stof uit uitsluitend het omringende medium (d.w.z. via het lichaamsoppervlak en ingenomen grond) ten opzichte van de concentratie van de teststof in het omringende medium.
|
|
Biomagnificatie is de toename van de concentratie van de teststof in of op een organisme ten gevolge van voornamelijk de opname van verontreinigde voeding of prooi ten opzichte van de concentratie van de teststof in de voeding of prooi. Biomagnificatie kan leiden tot een overdracht of accumulatie van de teststof binnen voedselketens.
|
|
De eliminatie van een teststof is het verlies van die stof uit het weefsel van het testorganisme door actieve of passieve processen die optreden ongeacht of de teststof in het omringende medium aanwezig is.
|
|
De bioaccumulatiefactor (BAF) op enig moment van de opnamefase van deze bioaccumulatietest, is de verhouding tussen de concentratie van de teststof in of op het testorganisme (Ca in g kg–1 drooggewicht van worm) en de concentratie van die stof in het omringende medium (Cs in g kg–1 drooggewicht van grond); de BAF heeft als eenheden kg grond·kg–1 worm.
|
|
De bioaccumulatiefactor in stationaire toestand (BAFss) is de BAF in stationaire toestand en ondergaat gedurende langere tijd geen significante wijzigingen als de concentratie van de teststof in het omringende medium (Cs in g kg–1 drooggewicht van grond) constant blijft tijdens deze periode.
|
|
Bioaccumulatiefactoren die rechtstreeks op basis van de verhouding tussen de grondopnamesnelheidsconstante en de eliminatiesnelheidsconstante (ks en ke, zie hieronder) worden berekend, worden aangeduid met de term kinetische bioaccumulatiefactor (BAFK).
|
|
De biota-grondaccumulatiefactor (BSAF) is de verhouding tussen de voor vetgehalte genormaliseerde concentratie van de teststof in of op het testorganisme en de voor organische koolstof genormaliseerde concentratie van de teststof in de grond in stationaire toestand. Ca wordt vervolgens uitgedrukt als g kg–1 vetgehalte van het organisme en Cs als g kg–1 organisch materiaal in de grond; de BSAF heeft als eenheden kg OC·kg–1 vet.
|
|
Een plateau of stationaire toestand wordt gedefinieerd als het evenwicht tussen de opname- en eliminatieprocessen die gelijktijdig optreden tijdens de blootstellingsfase. De stationaire toestand wordt bereikt wanneer in een grafiek van de BAF als functie van de tijd de curve evenwijdig gaat lopen met de tijdas en drie opeenvolgende bepalingen van BAF op monsters die met tussenpozen van ten minste twee dagen worden genomen, niet meer dan 20 % van elkaar verschillen en er bovendien geen statistisch significant verschil bestaat tussen de waarden verkregen op de drie bemonsteringstijdstippen. Voor teststoffen die langzaam worden opgenomen, verdient het de voorkeur om intervallen van zeven dagen te gebruiken (49).
|
|
De organischekoolstof-water-verdelingscoëfficiënt (Koc) is de verhouding tussen de concentratie van een stof in of op de fractie organische koolstof van een substraat en de concentratie van die stof in water in een toestand van evenwicht.
|
|
De octanol-water-verdelingscoëfficiënt (Kow) is de verhouding tussen de oplosbaarheid van een stof in n-octanol en water bij evenwicht; deze verhouding wordt soms ook uitgedrukt als Pow. Het logaritme van Kow (log Kow) wordt gebruikt als een indicatie van het bioaccumulatiepotentieel van een chemische stof door in het water levende organismen.
|
|
De blootstellings- of opnamefase is de periode gedurende welke de testorganismen aan de teststof worden blootgesteld.
|
|
De grondopnamesnelheidsconstante (ks) is de numerieke waarde die aangeeft hoe snel de concentratie van de teststof in of op de testorganismen toeneemt ten gevolge van de opname uit de grondfase. ks wordt uitgedrukt in g grond kg–1 van worm d–1.
|
|
De eliminatiefase is de periode die begint op het moment waarop de testorganismen van een medium dat de teststof bevat worden overgebracht naar een medium dat die stof niet bevat, en gedurende welke de eliminatie (of het nettoverlies) van de teststof uit het testorganisme wordt bestudeerd.
|
|
De eliminatiesnelheidsconstante (ke) is de numerieke waarde die de snelheid aangeeft waarmee de concentratie van de teststof in of op het testorganisme afneemt na overbrenging van de testorganismen uit een medium dat de teststof bevat naar een medium dat de teststof niet bevat; ke wordt uitgedrukt in d–1.
|
|
Teststof: alle volgens deze testmethode geteste stoffen en mengsels.
|
Aanhangsel 2
Berekening van opname- en eliminatieparameters
Het belangrijkste eindpunt van een bioaccumulatietest is de bioaccumulatiefactor, BAF. De gemeten BAF kan worden berekend door de concentratie in het testorganisme, Ca, te delen door de concentratie in de grond, Cs, in stationaire toestand. Indien de stationaire toestand tijdens de opnamefase niet wordt bereikt, wordt de BAFK berekend op basis van de snelheidsconstanten in plaats van BAFSS. Er dient echter opgetekend te worden of de BAF al dan niet gebaseerd is op concentraties in stationaire toestand.
De gangbare manier voor het verkrijgen van de kinetische bioaccumulatiefactor (BAFK), de grondopnamesnelheidsconstante (ks) en de eliminatiesnelheidsconstante (ke) is om gebruik te maken van gecomputeriseerde niet-lineaire parameterschattingstechnieken, bv. op basis van de in (68) beschreven modellen. Op basis van de aan de tijd gerelateerde concentratiegegevens en modelvergelijkingen:
|
0 < t < tc
|
(Vergelijking [1])
|
of
|
t > tc
|
(Vergelijking [2])
|
waarbij
Ca
|
=
|
concentratie van de chemische stof in wormen [g kg–1 nat- of drooggewicht];
|
ks
|
=
|
opnamesnelheidsconstante in weefsel [g grond kg–1 worm d–1];
|
Cs
|
=
|
concentratie van de chemische stof in grond [g kg–1 nat- of drooggewicht];
|
ke
|
=
|
eliminatiesnelheidsconstante [d–1];
|
tc
|
=
|
tijd aan het eind van de opnamefase,
|
berekenen deze computerprogramma’s waarden voor BAFK, ks en ke.
Indien de achtergrondconcentratie in de niet-blootgestelde wormen bijvoorbeeld op dag 0 significant afwijkt van nul (dit kan bv. het geval zijn voor metalen), moet met deze achtergrondconcentratie (Ca,0) rekening worden gehouden in deze vergelijkingen, zodat ze aldus luiden:
|
0 < t < tc
|
(Vergelijking [3])
|
en
|
t > tc
|
(Vergelijking [4])
|
In gevallen waarin een significante afname van concentratie van de teststof in de grond wordt waargenomen gedurende het verloop van de opnamefase, kunnen de volgende modellen worden gebruikt, bv. (67)(79):
|
(Vergelijking [5])
|
waarbij
Cs
|
=
|
concentratie van de chemische stof in grond [g kg–1 nat- of drooggewicht];
|
k0
|
=
|
afbraaksnelheidsconstante in grond [d–1];
|
C0
|
=
|
initiële concentratie van de chemische stof in grond [g kg–1 nat- of drooggewicht];
|
|
0 < t < tc
|
(Vergelijking [6])
|
|
t > tc
|
(Vergelijking [7])
|
waarbij
Ca
|
=
|
concentratie van de chemische stof in wormen [g kg–1 nat- of drooggewicht];
|
ks
|
=
|
opnamesnelheidsconstante in weefsel [g grond kg–1 worm d–1];
|
k0
|
=
|
afbraaksnelheidsconstante in grond [d–1];
|
ke
|
=
|
eliminatiesnelheidsconstante [d–1];
|
tc
|
=
|
tijd aan het eind van de opnamefase.
|
Indien de stationaire toestand wordt bereikt tijdens de opnamefase (d.w.z. t = ∞), kan vergelijking [1]
|
0 < t < tc
|
(Vergelijking [1])
|
worden gereduceerd tot:
of
|
(Vergelijking [8])
|
Hierbij benadert ks/ke × Cs de concentratie van de teststof in het wormweefsel in stationaire toestand (Ca,ss).
De biota-grondaccumulatiefactor (BSAF) kan als volgt worden berekend:
|
(Vergelijking [9])
|
waarbij foc de fractie organische koolstof in de grond is en flip de fractie wormvet, beide bij voorkeur bepaald op monsternamen tijdens de test en op basis van respectievelijk droog- of natgewicht.
De eliminatiekinetiek kan worden gemodelleerd met gebruikmaking van de gegevens uit de eliminatiefase en door de volgende modelvergelijking en een gecomputeriseerde niet-lineaire parameterschattingsmethode toe te passen. Als de tegen de tijd uitgezette gegevens wijzen op een constante exponentiële afname van de concentratie van de teststof in de dieren, kan een een-compartimentmodel (vergelijking [9]) worden gebruikt om het tijdverloop van de eliminatie te beschrijven.
|
(Vergelijking [10])
|
Eliminatieprocessen lijken soms uit twee fasen te bestaan in de zin dat ze tijdens de eerste fasen een snelle afname van Ca vertonen, waarna dit verandert in een langzamer verlies van teststoffen in de latere fasen van de eliminatie, bv. (27)(68). De twee fasen kunnen worden verklaard aan de hand van de aanname dat er twee verschillende compartimenten in het organisme zijn, waaruit de teststof met verschillende snelheden verloren gaat. In deze gevallen moet specifieke literatuur worden bestudeerd, bv. (38)(39)(40)(78).
Met gebruikmaking van de bovenstaande modelvergelijkingen kunnen de kinetische parameters (ks en ke) ook worden berekend in één uitvoering van de test door het eersteordekinetiekmodel op alle gegevens van zowel de opname- als de eliminatiefase tegelijk toe te passen. Voor een beschrijving van een methode die een dergelijke gecombineerde berekening van opname- en eliminatiesnelheidsconstanten mogelijk maakt, kunnen (41), (73) en (70) worden geraadpleegd.
|
(Vergelijking [11])
|
Noot:
|
Bij gelijktijdige schatting van de opname- en eliminatieparameters op basis van de gecombineerde opname- en eliminatiegegevens is „m” in vergelijking [11] een descriptor waarmee het computerprogramma de deeltermen van de vergelijking kan toewijzen aan de datasets van de desbetreffende fase en de vergelijking correct kan uitvoeren (m = 1 voor opnamefase; m = 2 voor eliminatiefase).
|
Deze modelvergelijkingen moeten echter met voorzichtigheid worden gebruikt, in het bijzonder indien tijdens de test de biobeschikbaarheid van de teststof verandert of (biologische) afbraak optreedt (zie bv. (79)).
Aanhangsel 3
VOORBEELDEN VAN SCHEMA’S VOOR TESTS OP BIOACCUMULATIE IN DE BODEM
Regenwormtest
a)
|
Opnamefase met 8 bemonsteringsdata die voor de berekening van de kinetiek worden gebruikt
Dag
|
Activiteit
|
– 6
|
Voorbereide grond gedurende 48 uur conditioneren.
|
– 4
|
De grondfractie verrijken met de oplossing met de teststof; eventueel oplosmiddel verdampen; grondbestanddelen vermengen; grond over de testvaten verdelen; equilibratie bij testomstandigheden gedurende vier dagen (drie weken voor met metaal verrijkte grond).
|
– 3 tot – 1
|
Testorganismen uit de cultuur nemen voor acclimatisering; grondbestanddelen bereiden en bevochtigen.
|
0
|
Temperatuur en pH van de grond meten; grondmonsters uit testvaten en oplosmiddelcontrolevaten nemen om de concentratie van de teststof te bepalen; voedingsrantsoen toevoegen; wormen wegen en gerandomiseerd over de testvaten verdelen; voldoende deelmonsters van wormen achterhouden voor de bepaling van analytische achtergrondwaarden, nat- en drooggewicht en vetgehalte; alle testvaten wegen om het vochtgehalte in de grond te controleren; luchttoevoer regelen indien een gesloten testsysteem wordt gebruikt.
|
1
|
Luchttoevoer regelen, wormgedrag en temperatuur registreren, grond- en wormmonsters nemen om de concentratie van de teststof te bepalen.
|
2
|
Zelfde als dag 1.
|
3
|
Luchttoevoer regelen, wormgedrag en temperatuur registreren.
|
4
|
Zelfde als dag 1.
|
5-6
|
Zelfde als dag 3.
|
7
|
Zelfde als dag 1; voedingsrantsoen toevoegen, vochtgehalte van de grond regelen door de testvaten opnieuw te wegen en verdampt water te compenseren.
|
8-9
|
Zelfde als dag 3.
|
10
|
Zelfde als dag 1.
|
11-13
|
Zelfde als dag 3.
|
14
|
Zelfde als dag 1; voedingsrantsoen toevoegen, vochtgehalte van de grond regelen door de testvaten opnieuw te wegen en verdampt water te compenseren.
|
15-16
|
Zelfde als dag 3.
|
17
|
Zelfde als dag 1.
|
18-20
|
Zelfde als dag 3.
|
21
|
Zelfde als dag 1; temperatuur en pH van de grond meten; vochtgehalte regelen door de testvaten opnieuw te wegen; opnamefase beëindigen; wormen van resterende blootgestelde duplo’s overbrengen naar vaten met schone grond voor de eliminatiefase (geen ontlasting van de darm); grond- en wormmonsters uit de oplosmiddelcontrolevaten nemen.
|
|
Bij de planning van activiteiten die aan de blootstelling voorafgaan (equilibratiefase), moet rekening worden gehouden met de eigenschappen van de teststof.
|
|
De voor dag 3 beschreven activiteiten moeten dagelijks worden uitgevoerd (althans op werkdagen).
|
|
b)
|
Eliminatiefase
Dag
|
Activiteit
|
– 6
|
Grondbestanddelen bereiden en bevochtigen; bereide grond gedurende 48 uur conditioneren.
|
– 4
|
Grondbestanddelen mengen; grond over de testvaten verdelen; incubatie bij testomstandigheden gedurende vier dagen.
|
0 (eind van de opnamefase)
|
Temperatuur en pH van de grond meten; wormen wegen en gerandomiseerd over de testvaten verdelen; voedingsrantsoen toevoegen; wormen uit resterende blootgestelde duplo’s overbrengen naar vaten met schone grond; na 4-6 uur grond- en wormmonsters nemen om de concentratie van de teststof te bepalen.
|
1
|
Luchttoevoer regelen, wormgedrag en temperatuur registreren, grond- en wormmonsters nemen om de concentratie van de teststof te bepalen.
|
2
|
Zelfde als dag 1.
|
3
|
Luchttoevoer regelen, wormgedrag en temperatuur registreren.
|
4
|
Zelfde als dag 1.
|
5-6
|
Zelfde als dag 3.
|
7
|
Zelfde als dag 1; voedingsrantsoen toevoegen, vochtgehalte van de grond regelen door de testvaten opnieuw te wegen en verdampt water te compenseren.
|
8-9
|
Zelfde als dag 3.
|
10
|
Zelfde als dag 1.
|
11-13
|
Zelfde als dag 3.
|
14
|
Zelfde als dag 1; voedingsrantsoen toevoegen, vochtgehalte van de grond regelen door de testvaten opnieuw te wegen en verdampt water te compenseren.
|
15-16
|
Zelfde als dag 3.
|
17
|
Zelfde als dag 1.
|
18-20
|
Zelfde als dag 3.
|
21
|
Zelfde als dag 1; temperatuur en pH van de grond meten, vochtgehalte van de grond regelen door de testvaten opnieuw te wegen; grond- en wormmonsters uit oplosmiddelcontrolevaten nemen.
|
|
De grond wordt voor aanvang van de eliminatiefase op dezelfde manier voorbereid als voor de opnamefase.
|
|
De voor dag 3 beschreven activiteiten moeten dagelijks worden uitgevoerd (althans op werkdagen).
|
|
„Enchytraeidae”-test
a)
|
Opnamefase met 8 bemonsteringsdata die voor de berekening van de kinetiek worden gebruikt
Dag
|
Activiteit
|
– 6
|
Voorbereide grond gedurende 48 uur conditioneren.
|
– 4
|
De grondfractie verrijken met de oplossing met de teststof; eventueel oplosmiddel verdampen; grondbestanddelen vermengen; grond over de testvaten verdelen; equilibratie bij testomstandigheden gedurende vier dagen (drie weken voor met metaal verrijkte grond).
|
– 3 tot – 1
|
Testorganismen uit de cultuur nemen voor acclimatisering; grondbestanddelen bereiden en bevochtigen.
|
0
|
Temperatuur en pH van de grond meten; grondmonsters uit testvaten en oplosmiddelcontrolevaten nemen om de concentratie van de teststof te bepalen; voedingsrantsoen aan de grond toevoegen; wormen wegen en gerandomiseerd over de testvaten verdelen; voldoende deelmonsters van wormen achterhouden voor de bepaling van analytische achtergrondwaarden, nat- en drooggewicht en vetgehalte; alle testvaten wegen om het vochtgehalte in de grond te controleren; luchttoevoer regelen indien een gesloten testsysteem wordt gebruikt.
|
1
|
Luchttoevoer regelen, wormgedrag en temperatuur registreren, grond- en wormmonsters nemen om de concentratie van de teststof te bepalen.
|
2
|
Zelfde als dag 1.
|
3
|
Luchttoevoer regelen, wormgedrag en temperatuur registreren.
|
4
|
Zelfde als dag 1.
|
5-6
|
Zelfde als dag 3.
|
7
|
Zelfde als dag 1; voedingsrantsoen aan de grond toevoegen, vochtgehalte van de grond regelen door de testvaten opnieuw te wegen en verdampt water te compenseren.
|
9
|
Zelfde als dag 1.
|
10
|
Zelfde als dag 3.
|
11
|
Zelfde als dag 1.
|
12-13
|
Zelfde als dag 3.
|
14
|
Zelfde als dag 1; voedingsrantsoen aan de grond toevoegen; temperatuur en pH van de grond meten; vochtgehalte van de grond regelen door de testvaten opnieuw te wegen; opnamefase beëindigen; wormen van resterende blootgestelde duplo’s overbrengen naar vaten met schone grond voor de eliminatiefase (geen ontlasting van de darm); grond- en wormmonsters uit de oplosmiddelcontrolevaten nemen.
|
|
Bij de planning van activiteiten die aan de blootstelling voorafgaan (equilibratiefase), moet rekening worden gehouden met de eigenschappen van de teststof.
|
|
De voor dag 3 beschreven activiteiten moeten dagelijks worden uitgevoerd (althans op werkdagen).
|
|
Aanhangsel 4
Kunstmatige grond — Aanbevelingen voor de voorbereiding en opslag
Aangezien natuurlijke grond uit een bepaalde bron mogelijk niet het hele jaar beschikbaar is en inheemse organismen alsook de aanwezigheid van microverontreinigingen de test kunnen beïnvloeden, wordt de in hoofdstuk C.8 van deze bijlage, Toxiciteit voor regenwormen (48), beschreven kunstmatige grond aanbevolen voor gebruik in deze test. In deze grond kunnen meerdere testsoorten overleven, groeien en zich voortplanten en er wordt gezorgd voor maximale standaardisatie en intra- en interlaboratoriumvergelijkbaarheid van test- en cultuuromstandigheden.
Grondbestanddelen:
Turf:
|
10 %
|
veenmosturf, overeenkomstig OESO-richtlijn 207 (48);
|
Kwartszand:
|
70 %
|
industrieel kwartszand (luchtgedroogd); korrelgrootte: meer dan 50 % van de deeltjes moet in het bereik 50-200 μm zijn, maar alle deeltjes moeten ≤ 2 mm zijn;
|
Kaolienklei:
|
20 %
|
met kaoliengehalte ≥ 30 %;
|
Calciumcarbonaat:
|
≤ 1 %
|
CaCO3, verpulverd, chemisch zuiver.
|
Desgewenst kan het gehalte organische koolstof van de kunstmatige grond worden verlaagd, bv. door het turfgehalte te verminderen tot 4-5 % van de droge grond en de hoeveelheid zand dienovereenkomstig te verhogen. Door een dergelijke verlaging van het gehalte organische koolstof kan de hechting van de teststof aan de grond (organische koolstof) afnemen en kan de beschikbaarheid van de teststof voor de wormen toenemen (74). Aangetoond is dat Enchytraeus albidus en Eisenia fetida kunnen voldoen aan de geldigheidscriteria voor de voortplanting bij tests in veldgrond met een lager gehalte organische koolstof, bv. 2,7 % (33)(61), en de ervaring leert dat dit ook bereikt kan worden in kunstmatige grond met 5 % turf.
Voorbereiding
De droge bestanddelen van de grond worden grondig gemengd (bv. in een grote laboratoriummenger). Dit moet ongeveer één week voor aanvang van de test worden gedaan. De gemengde droge grondbestanddelen moeten ten minste 48 uur voordat de teststof wordt aangebracht, worden bevochtigd met gedeïoniseerd water om de zuurgraad te equilibreren/stabiliseren. Voor de bepaling van de pH moet een mengsel van grond en een oplossing van 1 M KCl in een verhouding van 1:5 worden gebruikt. Indien de pH-waarde niet binnen het vereiste bereik (6,0 ± 0,5) valt, wordt een voldoende hoeveelheid CaCO3 aan de grond toegevoegd of wordt een nieuwe partij grond voorbereid.
Het maximale waterhoudende vermogen (WHC) van de kunstmatige grond wordt bepaald overeenkomstig ISO 11268-2 (35). Minimaal twee dagen voor aanvang van de test wordt de droge kunstmatige grond bevochtigd door genoeg gedeïoniseerd of synthetisch water toe te voegen om ongeveer de helft van het uiteindelijke watergehalte te verkrijgen. Het uiteindelijke watergehalte moet tussen 40 % en 60 % van het maximale waterhoudende vermogen (WHC) liggen. Bij aanvang van de test wordt de voorbevochtigde grond verdeeld in zoveel porties als het aantal testconcentraties en controles die voor de test gebruikt worden en wordt het vochtgehalte aangepast tot 40-60 % van WHCmax door de oplossing van de teststof te gebruiken en/of gedeïoniseerd of synthetisch water toe te voegen. Het vochtgehalte wordt aan het begin en aan het eind van de test (bij 105 °C) bepaald. Het moet optimaal zijn voor de behoeften van de diersoort (het vochtgehalte kan ook als volgt worden gecontroleerd: wanneer men de grond lichtjes in de hand knijpt, moeten kleine druppels water tussen de vingers verschijnen).
Opslag
De droge bestanddelen van de kunstmatige grond kunnen tot gebruik bij kamertemperatuur worden bewaard. De voorbereide, voorbevochtigde grond kan voorafgaand aan de verrijking maximaal drie dagen op een koele plaats worden bewaard; hierbij moet de verdamping van water tot een minimum worden beperkt. Grond die met de teststof verrijkt is, moet onverwijld worden gebruikt, tenzij informatie beschikbaar is die erop duidt dat de grond in kwestie bewaard kan worden zonder dat dit van invloed is op de toxiciteit en biobeschikbaarheid van de teststof. Monsters van verrijkte grond kunnen vervolgens tot de analyse onder de voor de desbetreffende teststof aanbevolen omstandigheden worden bewaard.
Aanhangsel 5
Aanbevolen soorten terrestrische Oligochaetae voor tests op bioaccumulatie in de bodem
Regenwormen
De aanbevolen testsoort is Eisenia fetida (Savigny 1826), die behoort tot de familie „Lumbricidae”. Deze soort wordt sinds 1972 onderverdeeld in twee ondersoorten (Eisenia fetida and Eisenia andrei (10)). Volgens Jaenicke (36) gaat het om twee echte, afzonderlijke soorten. Eisenia fetida is gemakkelijk herkenbaar dankzij zijn felgele strepen tussen de segmenten, terwijl Eisenia andrei een egale, donkerrode kleur heeft. Oorspronkelijk zijn ze waarschijnlijk afkomstig uit het gebied rond de Zwarte Zee, maar tegenwoordig zijn ze wereldwijd verspreid, in het bijzonder in door de mens aangepaste habitats zoals composthopen. Beide soorten kunnen voor zowel ecotoxicologische als bioaccumulatietests worden gebruikt.
Eisenia fetida en Eisenia andrei zijn in de handel verkrijgbaar, bv. als visaas. In vergelijking met andere lumbricidenregenwormen hebben ze een korte levenscyclus en bereiken ze volwassenheid binnen ca. twee-drie maanden (bij kamertemperatuur). Hun optimale temperatuur is ongeveer 20-24 °C. Ze geven de voorkeur aan relatief vochtige substraten met een nagenoeg neutrale pH en een hoog gehalte aan organisch materiaal. Aangezien deze soorten al 25 jaar veelvuldig worden gebruikt in gestandaardiseerde ecotoxicologische tests, zijn hun kweekmethoden uitvoerig beschreven (48)(77).
Beide soorten kunnen worden gekweekt in een grote diversiteit aan dierlijke afvalstoffen. Het door de ISO (35) aanbevolen kweekmedium is een 50:50-mengsel van paarden- of rundermest en turf. Het medium moet een pH-waarde van ongeveer 6 tot 7 hebben (gereguleerd met calciumcarbonaat), een lage ionische geleidbaarheid (minder dan 6 mS/cm of minder dan 0,5 % zoutconcentratie) en mag niet overmatig verontreinigd zijn met ammonia of dierlijke urine. Tevens kan in de handel verkrijgbare tuinaarde die vrij is van additieven of kunstmatige grond overeenkomstig OESO (48) of een mengsel van beide in een verhouding van 50:50 worden gebruikt. Het substraat dient vochtig maar niet te nat te zijn. Kweekbakken met een volume van 10 tot 50 liter zijn geschikt.
Om wormen met een standaardleeftijd en -massa te verkrijgen kan de kweek het beste worden begonnen met cocons. Daartoe worden volwassen wormen in een kweekbak met vers substraat gestopt om cocons te produceren. De praktijk wijst uit dat een populatiedichtheid van ongeveer 100 volwassen wormen per kg substraat (natgewicht) tot goede voortplantingssnelheden leidt. Na 28 dagen worden de volwassen wormen verwijderd. De uit de cocons gekomen regenwormen worden na minimaal twee maanden, maar minder dan twaalf maanden, wanneer ze volwassen zijn, voor de tests gebruikt.
Wormen van de hierboven beschreven soorten kunnen als gezond worden beschouwd als ze zich door het substraat voortbewegen, niet proberen om het substraat te verlaten en zich voortdurend voortplanten. Zeer traag voortbewegen of een geel uiteinde aan de achterkant van de worm (in het geval van Eisenia fetida) duidt op uitputting van het substraat. In dat geval wordt vers substraat en/of een kleiner aantal dieren per bak aanbevolen.
Selectie van aanvullende literatuur
Gerard BM (1964). Synopsis of the British fauna. No. 6 Lumbricidae. Linnean Soc. London, 6: 1-58.
Graff O (1953). Die Regenwürmer Deutschlands. Schr. Forsch. Anst. Landwirtsch. 7: 1-81.
Römbke J, Egeler P, Füll C (1997). Literaturstudie über Bioakkumulationstests mit Oligochaeten im terrestrischen Medium. Bericht für das UBA F + E 206 03 909, 86 S.
Rundgren S (1977). Seasonality of emergence in lumbricids in southern Sweden. Oikos 28: 49-55.
Satchell JE (1955). Some aspects of earthworm ecology. Soil Zoology (Kevan): 180-201.
Sims RW and Gerard BM (1985). A synopsis of the earthworms. Linnean Soc. London 31: 1-171.
Tomlin AD (1984). The earthworm bait market in North America. In: Earthworm Ecology — from Darwin to vermiculture. Satchell, J.E. (ed.), Chapman & Hall, London. 331-338 pp.
„Enchytraeidae”
De aanbevolen testsoort is Enchytraeus albidus Henle 1837 (witte potworm). Enchytraeus albidus is een van de grootste soorten (tot 15 mm) van de tot de gelede wormen behorende Oligochaetae-familie van de „Enchytraeidae” en is wereldwijd verspreid, bv. (8). Enchytraeus albidus wordt aangetroffen in mariene, limnische en terrestrische habitats, hoofdzakelijk in ontbindend organisch materiaal (zeewier, compost) en zelden in weiden (42). Deze brede ecologische tolerantie en een aantal morfologische variaties duiden erop dat er mogelijk verschillende rassen voor deze soort bestaan.
Enchytraeus albidus is in de handel verkrijgbaar als voeding voor vissen. Gecontroleerd dient te worden of de cultuur verontreinigd is door andere, gewoonlijk kleinere soorten (60). Indien verontreiniging optreedt, moeten alle wormen met water worden gewassen in een petrischaal. Grote volwassen exemplaren van Enchytraeus albidus worden vervolgens geselecteerd (met behulp van een stereomicroscoop) om een nieuwe cultuur te beginnen. Alle andere wormen worden verwijderd. De levenscyclus van de worm is kort, aangezien volwassenheid wordt bereikt tussen 33 dagen (bij 18 °C) en 74 dagen (bij 12 °C). Enkel culturen die zonder problemen gedurende ten minste vijf weken (één generatie) in het laboratorium zijn gehouden, mogen voor een test worden gebruikt.
Andere soorten van het geslacht Enchytraeus zijn ook geschikt, in het bijzonder Enchytraeus luxuriosus. Deze soort is een echte bodembewoner, zoals recentelijk is beschreven in (65). Indien andere soorten van het geslacht Enchytraeus worden gebruikt, moeten ze duidelijk worden geïdentificeerd en moet de motivering van de keuze van de soort worden gerapporteerd.
Enchytraeus crypticus (Westheide & Graefe 1992) is een soort die tot dezelfde groep behoort als Enchytraeus luxuriosus. Het staat niet vast dat deze soort in het veld voorkomt, aangezien de soort alleen in regenwormculturen en composthopen is beschreven (Römbke 2003). De oorspronkelijk ecologische behoeften van de soort zijn derhalve onbekend. Recent laboratoriumonderzoek met diverse veldsubstraten heeft echter bevestigd dat deze soort een ruime tolerantie heeft voor grondeigenschappen als pH en textuur (Jänsch et al. 2005). In de afgelopen jaren is deze soort vaak gebruikt in ecotoxicologische studies vanwege de eenvoud van kweken en testen, bv. Kuperman et al. 2003. De soort is echter klein (3-12 mm; gemiddeld 7 mm (Westheide & Müller 1996)) en dit maakt de hantering moeilijker in vergelijking met Enchytraeus albidus. Bij gebruik van deze soort in plaats van Enchytraeus albidus kan de omvang van het testvat kleiner zijn, maar dat hoeft niet. Daarnaast moet in overweging worden genomen dat deze soort zich zeer snel voortplant met een generatietijd van minder dan 20 dagen bij 20 ± 2 °C (Achazi et al. 1999) en zelfs sneller bij hogere temperaturen.
„Enchytraeidae” van de soort Enchytraeus albidus (alsmede andere Enchytraeus-soorten) kunnen worden gekweekt in grote plastic bakken (bv. 30 × 60 × 10 cm of voor een cultuur van kleine wormen 20 × 12 × 8 cm) die gevuld zijn met een mengsel van kunstmatige grond en in de handel verkrijgbare, niet verontreinigde tuinaarde zonder additieven. Compostmateriaal moet worden vermeden, aangezien dat toxische stoffen zoals zware metalen zou kunnen bevatten. Voordat de kweekgrond wordt gebruikt, moet fauna eruit worden verwijderd door driemaal diepvriezen. Zuiver kunstmatige grond kan ook worden gebruikt, maar de voortplantingssnelheid zou langzamer kunnen zijn in vergelijking met gemengde substraten. Het substraat moet een pH van 6,0 ± 0,5 hebben. De cultuur wordt bij een temperatuur van 15 °C ± 2 °C bewaard in een kweekbak zonder licht. In ieder geval moet een hogere temperatuur dan 23 °C worden vermeden. De kunstmatige/natuurlijke grond moet vochtig zijn, maar niet nat. Wanneer zachtjes met de hand in de grond wordt geknepen, zouden slechts kleine waterdruppels moeten verschijnen. In ieder geval moeten anoxische omstandigheden worden vermeden (als bijvoorbeeld een deksel wordt gebruikt, moet het aantal gaten in het deksel groot genoeg zijn om voldoende luchtverversing te waarborgen). De kweekgrond moet worden belucht door de grond eenmaal per week zorgvuldig te mengen.
De wormen moeten minimaal eenmaal per week ad libitum worden gevoederd met havervlokken die in een holte in het grondoppervlak worden geplaatst en met grond worden bedekt. Indien voedsel van het laatste voedertijdstip in de bak achterblijft, moet de hoeveelheid voedsel dienovereenkomstig worden aangepast. Als er schimmels op het achtergebleven voedsel groeien, moet het worden vervangen door een nieuwe hoeveelheid havervlokken. Om de voortplanting te stimuleren kunnen de havervlokken om de twee weken worden verrijkt met in de handel verkrijgbaar proteïnepoeder met toegevoegde vitaminen. Na drie maanden worden de dieren overgebracht naar een vers voorbereide cultuur of kweeksubstraat. De havervlokken, die in een afgesloten verpakking moeten worden bewaard, moeten voor gebruik in een autoclaaf worden gesteriliseerd of verhit om infecties door meelmijten (bv. Glycyphagus sp., Astigmata, Acarina) of roofmijten (bv. Hypoaspis (Cosmolaelaps) miles, Gamasida, Acarina) te voorkomen. Na desinfectie wordt het voedsel vermalen, zodat het gemakkelijk op het grondoppervlak kan worden verspreid. Andere mogelijke voedingsbronnen zijn bakkersgist of het visvoer TetraMin®.
In het algemeen zijn de cultuuromstandigheden toereikend als de wormen niet proberen het substraat te verlaten, zich snel door de grond voortbewegen, een glanzend buitenoppervlak hebben waaraan geen gronddeeltjes kleven en een min of meer wittige kleur hebben en als wormen van verschillende leeftijden zichtbaar zijn. In feite kunnen wormen als gezond worden beschouwd als ze zich voortdurend voortplanten.
Selectie van aanvullende literatuur
Achazi RK, Fröhlich E, Henneken M, Pilz C (1999). The effect of soil from former irrigation fields and of sewage sludge on dispersal activity and colonizing success of the annelid Enchytraeus crypticus (Enchytraeidae, Oligochaeta). Newsletter on Enchytraeidae 6: 117-126.
Jänsch S, Amorim MJB, Römbke J (2005). Identification of the ecological requirements of important terrestrial ecotoxicological test species. Environ. Reviews 13: 51-83.
Kuperman RG, Checkai RT, Simini M, Phillips CT, Kolakowski JE, Kurnas CW, Sunahara GI (2003). Survival and reproduction of Enchytraeus crypticus (Oligochaeta, Enchytraeidae) in a natural sandy loam soil amended with the nitro-heterocyclic explosives RDX and HMX. Pedobiologia 47: 651-656.
Römbke J (2003). Ecotoxicological laboratory tests with enchytraeids: A review. Pedobiologia 47: 607-616.
Westheide W and Graefe U (1992). Two new terrestrial Enchytraeus species (Oligochaeta, Annelida). J. Nat. Hist. 26: 479 – 488.
Westheide W and Müller MC (1996). Cinematographic documentation of enchytraeid morphology and reproductive biology. Hydrobiologia 334: 263-267.”.
” |