32001R0213

Verordening (EG) nr. 213/2001 van de Commissie

van 9 januari 2001

houdende uitvoeringsbepalingen van Verordening (EG) nr. 1255/1999, wat betreft de referentiemethoden voor de analyse en de kwaliteitsbeoordeling van melk en zuivelproducten, en houdende wijziging van de Verordeningen (EG) nr. 2771/1999 en (EG) nr. 2799/1999

DE COMMISSIE VAN DE EUROPESE GEMEENSCHAPPEN,

Gelet op het Verdrag tot oprichting van de Europese Gemeenschap,

Gelet op Verordening (EG) nr. 1255/1999 van de Raad van 17 mei 1999 houdende een gemeenschappelijke ordening der markten in de sector melk en zuivelproducten(1), en met name op de artikelen 10 en 15, artikel 26, lid 3, artikel 29, lid 1, en artikel 31, lid 14,

Overwegende hetgeen volgt:

(1) Bij de Verordeningen (EEG) nr. 1216/68, (EEG) nr. 3942/92, (EG) nr. 86/94, (EG) nr. 2721/95, (EG) nr. 1080/96, (EG) nr. 1081/96, (EG) nr. 1082/96, (EG) nr. 1854/96, (EG) nr. 880/98 en (EG) nr. 1459/98 van de Commissie, waarvan de volledige referenties in bijlage XXVI bij deze verordening zijn vermeld, zijn de referentie- en routinemethoden voor de analyse en de kwaliteitsbeoordeling van melk en zuivelproducten en de toepassingsgebieden en -regels voor die methoden vastgesteld. Om redenen van duidelijkheid en om de marktdeelnemers in de betrokken sector één enkel corpus met de genoemde toepassingsmethoden en -regels te verstrekken, moeten de bovengenoemde verordeningen worden herschreven en worden samengebracht in één tekst. Met hetzelfde doel moeten Verordening (EG) nr. 2771/1999 van de Commissie van 16 december 1999 houdende uitvoeringsbepalingen van Verordening (EG) nr. 1255/1999 van de Raad ten aanzien van de interventiemaatregelen op de markt voor boter en room(2), en Verordening (EG) nr. 2799/1999 van 17 december 1999 houdende uitvoeringsbepalingen van Verordening (EG) nr. 1255/1999 van de Raad ten aanzien van de toekenning van steun voor ondermelk en mageremelkpoeder voor voederdoeleinden en de verkoop van voornoemd mageremelkpoeder(3), worden gewijzigd om de bijlagen over analysemethoden te kunnen opnemen in deze verordening.

(2) De samenstellings- en kwaliteitskenmerken van melk en zuivelproducten die zijn vastgesteld in het kader van de regelingen van Verordening (EG) nr. 1255/1999, moeten worden geverifieerd om te garanderen dat zij strikt beantwoorden aan de vastgestelde eisen.

(3) Vaak wordt bepaald dat de referentiemethoden voor dergelijke controles de methoden zijn die worden bekendgemaakt door internationale organisaties zoals CEN, IDF, ISO en AOAC, en die regelmatig door die organisaties worden bijgewerkt. In bepaalde gevallen is een communautaire referentiemethode vastgesteld. In andere gevallen is in de communautaire wetgeving geen referentiemethode gespecificeerd. Om uniforme toepassing van de referentiemethoden te garanderen, is het dienstig jaarlijks een lijst van referentiemethoden vast te stellen en te bepalen dat de toe te passen referentiemethode op die lijst moeten voorkomen.

(4) De toepassing van routinemethoden mag niet worden uitgesloten; derhalve moeten de voorwaarden voor de toepassing van dergelijke methoden nader worden bepaald.

(5) Om te komen tot een uniforme praktijk voor de beoordeling van de analyseresultaten, moeten ook terzake gemeenschappelijke methoden worden vastgesteld. Dit geldt ook voor de sensorische beoordeling van de betrokken producten en voor heronderzoek bij betwisting van resultaten.

(6) Voor bepaalde analyses bestaan momenteel geen internationaal aanvaarde en gevalideerde referentiemethodes; als gevolg daarvan zijn geen gegevens beschikbaar over de verschillen in analyseresultaten tussen laboratoria. Derhalve moeten op communautair niveau methoden worden vastgesteld die volgens internationaal vastgestelde regels zijn gevalideerd en die als referentiemethode worden toegepast.

(7) In Verordening (EG) nr. 2571/97 van de Commissie van 15 december 1997 betreffende de verkoop van boter tegen verlaagde prijs en de toekenning van steun voor room, boter en boterconcentraat voor de vervaardiging van banketbakkerswerk, consumptie-ijs en andere voedingsmiddelen(4), laatstelijk gewijzigd bij Verordening (EG) nr. 635/2000(5), is bepaald dat in sommige omstandigheden verklikstoffen aan room, boter of boterconcentraat moeten worden toegevoegd om te garanderen dat deze producten de voorgeschreven eindbestemming krijgen. Gezien het belang van de toevoeging van verklikstoffen voor het deugdelijk functioneren van de regeling en om gelijke behandeling van de marktdeelnemers die van die regeling gebruik maken te garanderen, is het dienstig, voor zover mogelijk, gemeenschappelijke methoden vast te stellen voor de kwantitatieve bepaling van sommige van die verklikstoffen;

(8) De toevoeging van verklikstoffen aan boterconcentraat moet worden gecontroleerd overeenkomstig Verordening (EEG) nr. 3143/85 van de Commissie van 11 november 1985 betreffende de afzet tegen verlaagde prijs van interventieboter bestemd voor onmiddellijk verbruik in de vorm van boterconcentraat(6), laatstelijk gewijzigd bij Verordening (EG) nr. 101/1999(7), overeenkomstig Verordening (EG) nr. 429/90 van de Commissie van 20 februari 1990 betreffende de toekenning, via openbare inschrijving, van steun voor boterconcentraat voor rechtstreekse consumptie in de Gemeenschap(8), laatstelijk gewijzigd bij Verordening (EG) nr. 124/1999(9), en overeenkomstig Verordening (EG) nr. 2571/97. De strikte naleving van de bepalingen voor het gebruik van verklikstoffen in boterconcentraat is essentieel om fraude te voorkomen. Het is derhalve dienstig een gemeenschappelijke methode vast te stellen voor het opsporen van deze verklikstoffen.

(9) Op grond van artikel 9 van Verordening (EG) nr. 1255/1999 mag steun voor de particuliere opslag van uit schapenmelk vervaardigde kaas worden verleend. Op grond van artikel 31 van diezelfde verordening kan voor diezelfde producten een bijzondere restitutie worden toegekend. Verder is bepaald dat uit bepaalde derde landen onder preferentiële voorwaarden kaas van schapen-, geiten- of buffelmelk of van mengsels van schapen-, geiten- en buffelmelk in de Gemeenschap wordt ingevoerd. Met het oog op de bovenstaande bepalingen moet via adequate controles worden geverifieerd of in de betrokken producten geen koemelk is verwerkt. Derhalve dient een communautaire referentiemethode voor het opsporen van koemelk te worden vastgesteld, hetgeen geen beletsel mag zijn voor de toepassing van routinemethoden, mits die aan bepaalde criteria beantwoorden.

(10) In Verordening (EEG) nr. 2921/90 van de Commissie van 10 oktober 1990 betreffende de steunverlening voor ondermelk die tot caseïne en caseïnaten wordt verwerkt(10), laatstelijk gewijzigd bij Verordening (EG) nr. 2654/1999(11), is bepaald dat de afwezigheid van colibacteriën moet worden aangetoond. De internationaal aanvaarde referentiemethode voor het onderzoek van melk en zuivelproducten op colibacteriën is de internationale norm FIL73A: 1985. Voor het opsporen van colibacteriën in een bepaalde hoeveelheid product kan deze norm evenwel slechts in een gewijzigde vorm worden toegepast. Derhalve wordt een op bovengenoemde norm gebaseerde communautaire referentiemethode voor het onderzoek op colibacteriën vastgesteld.

(11) In Verordening (EEG) nr. 2658/87 van de Raad van 23 juli 1987 met betrekking tot de tarief- en statistieknomenclatuur en het gemeenschappelijk douanetarief(12), laatstelijk gewijzigd bij Verordening (EG) nr. 254/2000(13), is de hoogte van de invoerrechten voor mengvoeders van GN-code 2309 gedifferentieerd volgens het gehalte aan zuivelproducten. Om ervoor te zorgen dat de betrokken bepalingen uniform worden toegepast, moet een voor alle lidstaten verplichte methode voor de analyse van het gehalte aan lactose worden vastgesteld, waarbij voor een algemeen aanvaarde methode moet worden gekozen.

(12) In Verordening (EG) nr. 1255/1999 is bepaald dat boter en mageremelkpoeder voor interventie, en mageremelkpoeder voor vervoedering aan bepaalde kwaliteitseisen moeten voldoen. Derhalve moeten referentiemethoden voor de toetsing aan die eisen worden vastgesteld.

(13) Voor de tenuitvoerlegging van sommige van de methoden die bij deze verordening worden ingevoerd, is een aanpassingsperiode nodig. De toepassing van die methoden moet derhalve worden uitgesteld.

(14) Het Comité van beheer voor melk en zuivelproducten heeft geen advies uitgebracht binnen de door zijn voorzitter vastgestelde termijn,

HEEFT DE VOLGENDE VERORDENING VASTGESTELD:

HOOFDSTUK I

ALGEMENE BEPALINGEN

Artikel 1

Doel en toepassingsgebied

In deze verordening worden de regels vastgesteld voor de toepassing van de in de regelingen in het kader van Verordening (EG) nr. 1255/1999 houdende een gemeenschappelijke ordening der markten in de sector melk en zuivelproducten vastgestelde methoden voor chemische, fysische en microbiologische analyse en voor sensorische evaluatie van melk en zuivelproducten, alsmede sommige van die methoden.

Artikel 2

Lijst van methoden

1. De lijst van referentiemethoden die van toepassing zijn op de in artikel 1 bedoelde analyses is in bijlage I vastgesteld.

2. Ten minste eenmaal per jaar werkt de Commissie de lijst bij overeenkomstig de procedure van artikel 42 van Verordening (EG) nr. 1255/1999.

Artikel 3

Routinemethoden

Voor de op grond van de communautaire regelgeving uit te voeren analyses mogen routinemethoden worden toegepast, op voorwaarde dat deze goed worden geijkt en regelmatig aan de referentiemethode worden getoetst.

De in bijlage II vervatte procedure kan worden toegepast ter controle van de met routinemethoden verkregen resultaten die de in de betrokken verordeningen vastgestelde grenswaarden benaderen.

Bij geschillen gelden de uitkomsten volgens de referentiemethode.

Artikel 4

Validatie van referentiemethoden

1. Een referentiemethode wordt gevalideerd als zij overeenstemt met vooraf vastgestelde precisiecriteria betreffende de herhaalbaarheids- en de reproduceerbaarheidsgrens.

2. Als een in de betrokken verordeningen vastgestelde referentiemethode niet gevalideerd is, stellen de lidstaten een voorlopige reproduceerbaarheidsgrens vast.

Deze grens wordt bepaald overeenkomstig de procedure van bijlage III, onder b). Gedurende de eerste achttien maanden na de inwerkingtreding van deze verordening mogen de lidstaten echter een gelijkwaardige procedure toepassen.

Ten minste eenmaal per jaar wordt geverifieerd of de vastgestelde grens wordt gehaald.

3. Wanneer uit de resultaten van de toepassing van gevalideerde referentiemethoden of methoden met voorlopige precisiecijfers blijkt dat een grens is overschreden, wordt de in bijlage IV beschreven methode ter evaluatie van de analyseresultaten gebruikt om het kritische verschil ten opzichte van die grens te bepalen.

Artikel 5

Aanvaardbaarheid van analyseresultaten

1. De analyses worden uitgevoerd in laboratoria die een interne kwaliteitscontroleprocedure toepassen conform de in bijlage V, onder a), beschreven methode of een methode van een vergelijkbaar niveau.

Een gedetailleerde beschrijving van de toegepaste methode moet in de laboratoria voorhanden zijn.

2. De laboratoria stellen hun eigen precisienormen binnen een reeks voor alle methoden vast volgens:

a) de in bijlage V, onder b), vastgestelde methode, of

b) een gevalideerde en gepubliceerde methode waarvan de herhaalbaarheid vaststaat.

Of de reproduceerbaarheidsgrens wordt gehaald, moet tenminste eenmaal per jaar worden geverifieerd overeenkomstig de procedure van bijlage III, onder a).

Het bepaalde in de tweede alinea wordt niet toegepast als het laboratorium in de loop van het jaar heeft deelgenomen aan een expertisetestprogramma.

3. Het laboratoriumverslag over de analyseresultaten moet voldoende gegevens bevatten om de resultaten aan de hand van de bijlagen IV en VIII te kunnen beoordelen.

4. De resultaten van een analyse worden aanvaardbaar geacht als zij zijn verkregen overeenkomstig de aanvaardbaarheidscriteria die zijn aangegeven in de in lid 1 bedoelde interne kwaliteitscontroleprocedure en beantwoorden aan de in lid 2 bedoelde eigen precisienormen.

Artikel 6

Sensorische evaluatie

1. Voor boter worden de procedures van bijlage VI toegepast om het werk van de beoordelaars en de betrouwbaarheid van de resultaten te controleren. De in bijlage VII beschreven procedure wordt toegepast als referentiemethode voor de sensorische evaluatie.

2. Voor melk en andere zuivelproducten dan boter gebruiken de lidstaten als referentiemethode voor de sensorische evaluatie hetzij norm FIL 99C/1997, hetzij vergelijkbare andere methodes, die zij aan de Commissie meedelen.

De methodes van bijlage VI kunnen worden toegepast om het werk van de beoordelaars en de betrouwbaarheid van de resultaten te controleren.

Artikel 7

Bemonstering; betwisting van de analyseresultaten

1. Voor de op grond van de communautaire regelgeving vereiste analyses moeten monsters in duplo worden genomen.

2. De in bijlage VIII vastgestelde procedure wordt toegepast in gevallen waarin de resultaten van een analyse niet door de betrokken marktdeelnemer worden geaccepteerd.

HOOFDSTUK II

ANALYSEMETHODEN

Artikel 8

Vocht-, drogestof- en vetgehalte van boter

1. De in bijlage IX beschreven analysemethode geldt als referentiemethode voor de bepaling van het vochtgehalte van boter.

2. De in bijlage X beschreven analysemethode geldt als referentiemethode voor de bepaling van het gehalte aan vetvrije droge stof van boter.

3. De in bijlage XI beschreven analysemethode geldt als referentiemethode voor de bepaling van het vetgehalte van boter.

Artikel 9

Verklikstoffen

1. De in bijlage XII beschreven analysemethode wordt toegepast als referentiemethode voor de bepaling van het vanillinegehalte van boterconcentraat, boter of room.

2. De in bijlage XIII beschreven analysemethode wordt toegepast als referentiemethode voor de kwantitatieve bepaling van de ethylester van β-apo-8'-caroteenzuur in boterconcentraat of boter.

3. De in bijlage XIV beschreven analysemethode wordt toegepast als referentiemethode voor de bepaling van het gehalte aan stigmasterol of β-sitosterol van boterconcentraat of boter.

4. Boterconcentraat, boter of room worden geacht overeenkomstig de betrokken communautaire regelgeving van verklikstoffen te zijn voorzien, als de behaalde analyseresultaten overeenstemmen met de specificaties van punt 8 van de in de leden 1, 2 en 3 bedoelde bijlagen.

Artikel 10

Opsporing van koemelkcaseïne

1. De in bijlage XV opgenomen referentieanalysemethode wordt toegepast om te garanderen dat kaas die uitsluitend uit schapen-, geiten- of buffelmelk of uit een mengsel van schapen-, geiten- en buffelmelk mag zijn vervaardigd, geen koemelkcaseïne bevat.

Koemelkcaseïne wordt geacht aanwezig te zijn, als het schijnbare gehalte aan koemelkcaseïne van het geanalyseerde monster gelijk is aan of hoger is dan het betrokken gehalte van het referentiemonster van bijlage XV, dat 1 % koemelk bevat.

2. Voor de opsporing van koemelkcaseïne in de in lid 1 bedoelde kaassoorten mogen onder de volgende voorwaarden routinemethoden worden gebruikt:

a) met de methode moet een gehalte van 0,5 % of minder opgespoord kunnen worden,

b) de methode mag geen vals-positieve resultaten geven,

c) de koemelkcaseïne moet ook na lange rijpingsperiodes, zoals die in de handel gebruikelijk kunnen zijn, met de vereiste gevoeligheid kunnen worden opgespoord.

Als niet aan de onder b) genoemde voorwaarde wordt voldaan, moet ieder positief bevonden monster met gebruikmaking van de referentiemethode worden geanalyseerd.

Als voor een van de in lid 1 bedoelde kaassoorten niet aan de onder c) bedoelde eis wordt voldaan, moet deze kaas worden geanalyseerd met gebruikmaking van de referentiemethode.

Artikel 11

Opsporing van colibacteriën

1. De in bijlage XVI beschreven referentieanalysemethode geldt voor het onderzoek op colibacteriën van boter, mageremelkpoeder, caseïne en caseïnaten.

2. Routinemethodes voor het onderzoek op colibacteriën mogen worden gebruikt, op voorwaarde dat de verkregen resultaten vergelijkbaar zijn met die van de in de genoemde bijlage beschreven referentiemethode. De routinemethodes moeten met name een afdoende detectiegrens hebben. Vals-negatieve resultaten mogen niet voorkomen. Als vals-positieve resultaten niet kunnen worden uitgesloten, moet elk positief resultaat aan de hand van de referentiemethode worden bevestigd.

Artikel 12

Lactosegehalte

De methode voor het bepalen van het gehalte aan lactose (melksuiker) van de producten van GN-code 2309 is beschreven in bijlage XVII.

Artikel 13

Opsporing van lebwei

1. De methode voor het opsporen van lebwei in voor openbare opslag bestemde mageremelkpoeder is beschreven in bijlage XVIII.

2. De methode voor het opsporen van lebwei in mageremelkpoeder en in mengvoeders is beschreven in bijlage XIX.

Artikel 14

Opsporing van karnemelk

De methode voor het opsporen van karnemelk in mageremelkpoeder is beschreven in bijlage XX.

Artikel 15

Antibioticaresiduen

De methode voor het opsporen van antibiotica- en sulfonamide/dapsonresiduen in mageremelkpoeder is beschreven in bijlage XXI.

Artikel 16

Gehalte aan mageremelkpoeder

De methode voor het bepalen van het gehalte aan mageremelkpoeder van mengvoeders is beschreven in bijlage XXII.

Artikel 17

Opsporing van zetmeel

De methode voor het opsporen van zetmeel in mageremelkpoeder, in gedenatureerd mageremelkpoeder en in mengvoeder, is beschreven in bijlage XXIII.

Artikel 18

Vochtgehalte van zurekarnemelkpoeder

De methode voor het bepalen van het vochtgehalte van voor gebruik in mengvoeders bestemd zurekarnemelkpoeder is beschreven in bijlage XXIV.

Artikel 19

Opsporing van vreemd vet

De methode voor de opsporing van vreemd vet in melkvet is beschreven in bijlage XXV.

HOOFDSTUK III

SLOTBEPALINGEN

Artikel 20

Wijziging van Verordening (EG) nr. 2771/1999

Verordening (EG) nr. 2771/1999 wordt als volgt gewijzigd:

1. In artikel 4, lid 1, wordt de eerste zin vervangen door: "De bevoegde autoriteiten controleren de boterkwaliteit volgens de in bijlage I bedoelde analysemethoden aan de hand van monsters die op de in bijlage IV aangegeven wijze zijn genomen.".

2. In bijlage I wordt voetnoot 2 vervangen door "Zie bijlage I bij Verordening (EG) nr. 213/2001.".

3. De bijlagen II en III worden geschrapt.

4. In bijlage IV worden in punt 2, voorlaatste regel, de woorden "van bijlage III" vervangen door de woorden "van bijlage VII bij Verordening (EG) nr. 213/2001.".

Artikel 21

Wijziging van Verordening (EG) nr. 2799/1999

Verordening (EG) nr. 2799/1999 wordt als volgt gewijzigd:

1. In artikel 20 worden de leden 1, 2, 3 en 4 vervangen door: "1. Het gehalte aan mageremelkpoeder van de mengsels en de mengvoeders wordt geverifieerd door middel van een ten minste in duplo verrichte analyse volgens de in bijlage XXII bij Verordening (EG) nr. 213/2001 beschreven methode, aangevuld met de in artikel 17, lid 3, van deze verordening genoemde controlemaatregelen. Indien de resultaten van deze verificaties niet met elkaar overeenstemmen, is het resultaat van de controles ter plaatse doorslaggevend.

2. De afwezigheid van lebwei wordt aangetoond volgens de in bijlage XIX bij Verordening (EG) nr. 213/2001 beschreven methode.

3. Het zetmeelgehalte van de mengvoeders wordt bepaald door middel van de in artikel 17, lid 3, van deze verordening genoemde controlemaatregelen, ter aanvulling waarvan de in bijlage XXIII bij Verordening (EG) nr. 213/2001 beschreven analysemethode moet worden toegepast.

4. Het vochtgehalte van zurekarnemelkpoeder wordt bepaald volgens de in bijlage XXIV bij Verordening (EG) nr. 213/2001 beschreven analysemethode.".

2. De bijlagen III, IV, V en VI worden geschrapt.

Artikel 22

Intrekking

De Verordeningen (EEG) nr. 1216/68, (EEG) nr. 3942/92, (EEG) nr. 86/94, (EG) nr. 2721/95, (EG) nr. 1854/96, (EG) nr. 1080/96, (EG) nr. 1081/96, (EG) nr. 1082/96, (EG) nr. 880/98 en (EG) nr. 1459/98 worden ingetrokken.

Verwijzingen naar de ingetrokken verordeningen gelden als verwijzingen naar deze verordening.

Artikel 23

Inwerkingtreding

Deze verordening treedt in werking op de zevende dag volgende op die van haar bekendmaking in het Publicatieblad van de Europese Gemeenschappen.

De methoden van de bijlagen III, IV, punt 4, V, VI, en VIII worden echter achttien maanden na de inwerkingtreding van deze verordening van toepassing.

Deze verordening is verbindend in al haar onderdelen en is rechtstreeks toepasselijk in elke lidstaat.

Gedaan te Brussel, 9 januari 2001.

Voor de Commissie

Franz Fischler

Lid van de Commissie

(1) PB L 160 van 26.6.1999, blz. 48.

(2) PB L 333 van 24.12.1999, blz. 11.

(3) PB L 340 van 31.12.1999, blz. 3.

(4) PB L 350 van 20.12.1997, blz. 3.

(5) PB L 76 van 25.3.2000, blz. 9.

(6) PB L 298 van 12.11.1985, blz. 9.

(7) PB L 11 van 16.1.1999, blz. 14.

(8) PB L 45 van 21.2.1990, blz. 8.

(9) PB L 16 van 21.1.1999, blz. 19.

(10) PB L 279 van 11.10.1990, blz. 22.

(11) PB L 325 van 17.12.1999, blz. 10.

(12) PB L 256 van 7.9.1987, blz. 1.

(13) PB L 28 van 3.2.2000, blz. 16.

BIJLAGE I

(Artikel 2)

LIJST VAN REFERENTIEMETHODENOpmerking bij de lijst van EU-referentiemethoden:

Opmerking 1: Isolatie melkvet: volgens IDF-norm 6B:1989 (donker bewaren).

Opmerking 2: Er is geen referentiemethode vastgesteld.

Opmerking 3: Monsterbereiding overeenkomstig IDF-norm 122C:1996 of overeenkomstig IDF-norm 73A:1985.

Opmerking 4: Incubatie gedurende 48 uur bij een temperatur van 55 °C, uitdroging van het kweekmedium moet worden tegengegaan.

Opmerking 5: Percentage vetvrije vaste stof = percentage droge stof - percentage vet.

Opmerking 6: De boter moet voldoen aan de in bijlage V bij Verordening (EG) nr. 2771/1999 van de Commissie bedoelde nationale kwaliteitsklasse van de producerende lidstaat.

Opmerking 7: Richtlijn 84/4/EEG van de Commissie.

Opmerking 8: Verordening (EG) nr. 1758/94 van de Commissie (PB L 183 van 19.7.1994, blz. 14).

Opmerking 9: Richtlijn 78/633/EEG van de Commissie.

>RUIMTE VOOR DE TABEL>

>RUIMTE VOOR DE TABEL>

BIJLAGE II

(Artikel 3)

CONTROLE VAN MET ROUTINEMETHODEN VERKREGEN RESULTATEN DIE DE IN DE VERORDENINGEN VASTGESTELDE GRENSWAARDEN VOOR DE SAMENSTELLINGS- EN KWALITEITSKENMERKEN BENADEREN

Als mo een in een verordening vastgestelde grens voor de samenstellings- en kwaliteitskenmerken is, dan is de beslisgrens

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

als RRout/RRef <= 1.RRout: Reproduceerbaarheidsyrens van de routinemethode

RRef: Reproduceerbaarheidsgrens van de referentiemethode

Als mo een bovengrens is en RRout/Rref > 1, dan wordt de beslisgrens verkregen met de formule

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

Als mo onder dezelfde omstandigheden een ondergrens is, dan wordt de beslisgrens verkregen door

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

waarin CrD95: kritisch verschil met de referentiemethode, zie bijlage IV

Wanneer mo een bovengrens is, moet een met een routinemethode verkregen eindresultaat dat boven de beslisgrens ligt, door een met de referentiemethode verkregen eindresultaat worden vervangen. Dat eindresultaat moet ten minste op hetzelfde aantal analyses/monsters gebaseerd zijn als het eindresultaat van de routinemethode.

Wanner mo een ondergrens is, moet dezelfde procedure worden gevolgd voor een met een routinemethode verkregen eindresultaat dat onder de beslisgrens ligt.

Opmerking

De bovenbeschreven procedure kan worden gehanteerd als er geen detecteerbare matrixeffecten zijn.

Matrixeffecten kunnen op de volgende wijze worden gedetecteerd: voor elk voor ijking gebruikt monster wordt het verschil (wi) tussen de met de refentiemethode en de met de routinemethode verkregen resultaten bepaald.

De met de formule:

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

m: aantal voor ijking gebruikte monsters

berekende standaarddeviatie wordt vergeleken met het rekenkundig gemiddelde van de herhaalbaarheidsstandaarddeviatie van de referentie- en de routinemethode.

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

Een matrixeffect kan niet worden uitgesloten als

>PIC FILE= "L_2001037NL.001502.EPS">

waarin:

f= m (f: aantal vrijheidsgraden)

α= kans op fout; α = 0,05.

In dit geval zijn verdere onderzoekingen nodig voordat een beslisgrens kan worden vastgesteld.

BIJLAGE III

(Artikelen 4 en 5)

a) Procedure ter bepaling van de handhaving van een vastgestelde reproduceerbaarheidsgrens (chemische analyse)

Of aan de reproduceerbaarheidsgrens de hand wordt gehouden, wordt gecontroleerd door de laboratoriumresultaten te vergelijken met de resultaten van een ervaren laboratorium(1) die met een identiek monster zijn verkregen. In beide laboratoria wordt een dubbele bepaling uitgevoerd en de resultaten worden geëvalueerd aan de hand van de formule:

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

waarin:

CrD95: kritisch verschil (P = 0,95)

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>: rekenkundig gemiddelde van twee in laboratorium 1 verkregen resultaten

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>: rekenkundig gemiddelde van twee in laboratorium 2 verkregen resultaten

R: reproduceerbaarheidsgrens: door interpolatie te bepalen,

r: herhaalbaarheidsgrens: als precisie met concentratie varieert.

Als het kritische verschil wordt overschreden, moet binnen twee maanden een nieuwe proef worden uitgevoerd. Ingeval bij deze tweede proef niet aan de reproduceerbaarheidsgrens de hand wordt gehouden, moeten de bevoegde autoriteiten de nodige maatregelen nemen.

b) Procedure om aan een voorlopige reproduceerbaarheidsgrens te komen (chemische analyse)

Een voorlopige reproduceerbaarheidsgrens (Rprov) wordt verkregen door de volgende vergelijking te gebruiken:

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

waarin:

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>: rekenkundig gemiddelde van twee in laboratorium 1 verkregen resultaten

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>: gemiddelde van twee in laboratorium 2 verkregen resultaten (zie bijlage IIIa)

r: herhaalbaarheidsgrens of voorlopige herhaalbaarheidsgrens.

Opmerkingen:

1. Rprov kan worden gebruikt om het kritische verschil te berekenen (zie bijlage VI).

2. Rprov wordt gesteld op 2r als de voor Rprov berekende waarde lager is dan 2r.

3. Als de berekende waarde hoger is dan 3r of hoger dan tweemaal de met de vergelijking van Horwitz(2) voorspelde R-waarde, dan is Rprov onaanvaardbaar hoog en kan die niet ter berekening van het kritische verschil worden gebruikt.

4. Rprov dient minstens eenmaal per jaar te worden bepaald op grond van de in twee laboratoria verkregen resultaten (zie bijlage IV).

5. De gemiddelde waarde van Rprov dient te worden gebruikt ter berekening van kritische verschillen. De onder de punten 2 en 3 gegeven regels gelden voor de gemiddelde waarde van Rprov.

De reproduceerbaarheidsgrens (R-waarde) wordt verkregen uit de berekende RSDR-waarde als

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

(>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

= rekenkundig gemiddelde van de verkregen resultaten.)

Enkele voorbeelden van berekende RSDR-waarden

>RUIMTE VOOR DE TABEL>

Een concentratie van de te analyseren stof van 1 g/100 g geeft het volgende resultaat:

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>.

(1) In het algemeen moet het ervaren laboratorium een laboratorium zijn dat met succes heeft deelgenomen hetzij aan een validatie van de testmethode, hetzij aan een expertisetest.

(2) Vergelijking van Hortwitz:

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

waarin:

RSDR: Relatieve standaardafwijking van de reproduceerbaarheid

c: als decimale fractie uitgedrukte concentratie (voorbeeld: 10 g/100 g = 0,1).

Referentie:

Peeler, J. T., Horwitz, W. en Albert, R.

J. Ass. Off. Anal. Chem.

72 (5), 784-806 (1989).

BIJLAGE IV

(Artikel 4)

EVALUATIE VAN MET GEVALIDEERDE METHODEN VERKREGEN ANALYSERESULTATEN

Blijkt uit het analyseresultaat dat een grens is overschreden, dan wordt het rekenkundig gemiddelde van twee of meer resultaten berekend. De volgende procedure is van toepassing:

1. In gevallen waarin het analyseresultaat een eenmalig resultaat betreft, moet een tweede analyse onder herhaalbare omstandigheden worden uitgevoerd. Als de twee analyses niet onder herhaalbare omstandigheden kunnen worden uitgevoerd, moet in duplo onder herhaalbare omstandigheden nog een analyse worden uitgevoerd en moeten die resultaten worden gebruikt om na te gaan of aan het kritische verschil wordt voldaan.

2. De absolute waarde van het verschil tussen het rekenkundig gemiddelde van de onder herhaalbare omstandigheden verkregen resultaten en de grens wordt bepaald. Een absolute waarde van het verschil hoger dan het kritische verschil betekent dat het monster dat geanalyseerd is, niet aan de eisen voldoet.

Het kritische verschil wordt bepaald aan de hand van de volgende formule:

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

waarin:

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>: rekenkundig gemiddelde van de verkregen resultaten

mo: grenswaarde

n: aantal analyses/monster

Als de precisie met de concentratie varieert, kan het nodig zijn r en R door interpolatie te bepalen.

Normaliter moet uit een voor een monster gemeld eindresultaat blijken dat aan een grens is voldaan.

Eindresultaten:

- binnen de spreiding

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

en

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>, als de grens een maximum is;

- binnen de spreiding

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

en

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>, als de grens een minimum is;

dienen derhalve slechts bij uitzondering voor te komen.

Eindresultaten binnen de genoemde spreidingen zijn alleen aanvaardbaar als ze hoogstens eenmaal op de vijf per zending geanalyseerde monsters voorkomen. Als minder dan vijf monsters per zending worden geanalyseerd, is één resultaat binnen de genoemde spreiding aanvaardbaar. Aan de regel dat slechts één resultaat binnen de genoemde spreidingen per vijf geanalyseerde monsters wordt verkregen, moet echter de hand worden gehouden als een producent herhaaldelijk zendingen aanbiedt.

3. Als het eindresultaat x wordt berekend met een formule van de vorm x = y1 +/- y2 (voorbeeld: water + gehalte aan vetvrije droge stof in boter om het vetgehalte te berekenen) waarin y1 en y2 de eindresultaten van het type eenmalige analyse zijn, dan worden de totale herhaalbaarheids- en reproduceerbaarheidsgrenzen rx en Rx van de eindresultaten x berekend als:

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

waarin r1 respectievelijk r2 de herhaalbaarheidsgrenzen, en R1 respectievelijk R2 de reproduceerbaarheidsgrenzen zijn van y1 respectievelijk y2.

x wordt met de grens mo vergeleken volgens de in punt 1 en punt 2 gespecificeerde regels. Het kritische verschil wordt bepaald aan de hand van de formule:

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

waarin x het rekenkundig gemiddelde van de verkregen resultaten xi is.

4. Als het eindresultaat wordt berekend aan de hand van een formule van de vorm:

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

(voorbeeld: vet in gehalte aan droge stof van kaas)

waarin y1 en y2 de eindresultaten van het type eenmalige analyse zijn, dan worden de totale herhaalbaarheids- en reproduceerbaarheidsgrenzen rx en Rx berekend als:

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

μ1: grens- of doelwaarde voor y1 (voorbeeld: vet)

μ2: grens- of doelwaarde voor y2 (voorbeeld: droge stof)

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

waarin:

r1: herhaalbaarheidsgrens, y1

r2: herhaalbaarheidsgrens, y2

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

waarin:

R1: reproduceerbaarheidsgrens, y1

R2: reproduceerbaarheidsgrens, y2

De procedures ter berekening van rx en Rx zijn uitsluitend van toepassing als de relatieve herhaalbaarheids- en reproduceerbaarheidsgrenzen (r*1; r*2; R*1; R*2) lager zijn dan of gelijk zijn aan 0,15.

x wordt vergeleken met de grens μx volgens de in punt 1 en punt 2 gespecificeerde regels. Het kritische verschil wordt bepaald aan de hand van de formule:

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

waarin x het rekenkundig gemiddelde is van de in chronologische volgorde verkregen resultaten x(1).

(1) NB:

Als bijvoorbeeld de resultaten y11, y12, y21 en y22 zijn verkregen, moet het rekenkundig gemiddelde van y11/y21 en y12/y22 worden berekend.

BIJLAGE V

INTERNE CONTROLE

(Artikel 5)

a) Procedure voor interne kwaliteitscontrole (IKC) (chemische analyse)

Definitie van controlemateriaal

Een materiaal dat voor IKC-doeleinden wordt gebruikt en geheel of gedeeltelijk aan dezelfde procedure wordt onderworpen als de onderzochte materialen.

Een controlemateriaal kan bijvoorbeeld zijn:

- gecertificeerd referentiemateriaal,

- eigen referentiemateriaal,

- door interlaboratoriumonderzoek gevalideerd materiaal,

- aanvullend materiaal.

Procedure voor de invoering van IKC

Het laboratorium dient een IKC in te voeren overeenkomstig de in het IUPAC-document "Harmonized Guidelines for Internal Quality Control in analytical laboratories"(1) (Geharmoniseerde richtlijnen voor interne kwaliteitscontrole in analytische laboratoria) beschreven procedure.

IKC wordt uitgevoerd door bij de analytische procedure controlematerialen te betrekken of door herhaalde analyse van het proefmonster. De scheikundige samenstelling van de controlematerialen moet overeenkomen met die van de proefmonsters en de materialen moeten gedurende de desbetreffende periode voldoende stabiel zijn. Aangetoond moet worden dat ze voor analyse goed in identieke porties kunnen worden verdeeld en dat de concentratie van de te analyseren stof voor het beoogde doel geschikt is.

Een controlemateriaal moet minstens eenmaal in elke analysereeks worden opgenomen en de verkregen waarde moet op een controlekaart worden uitgezet teneinde de fouten op lange termijn te kunnen meten. Daarnaast moet het laboratorium periodiek aantonen dat binnen de reeks aan de herhaalbaarheidsvoorwaarden wordt voldaan. Dit wordt bereikt door analyse in duplo van controle- en/of proefmaterialen. De resultaten van deze analyses dienen met eventueel gepubliceerde herhaalbaarheidsgrenzen en bestaande gegevens over eigen precisie te worden vergeleken.

Bij gebruik van controlematerialen moeten de bij de analyse van het controlemateriaal verkregen waarden tussen de analysereeksen op een kaart volgens Shewhart (ISO 8258 (1991)) met adequate controlegrenzen worden uitgezet. De actiegrenzen worden vastgesteld op:

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

worden gesteld, waarbij st de totale standaarddeviatie is,

en de waarschuwingsgrenzen worden vastgesteld op:

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

Totale standaarddeviatie:

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

waarin:

sb: standaarddeviatie tussen analysereeksen

sw: standaarddeviatie binnen analysereeks

n: aantal bepalingen.

In gevallen waarin geen controlematerialen worden gebruikt (b.v. omdat ze niet houdbaar zijn), moet minstens een van de proefmaterialen in elke reeks in duplo worden geanalyseerd.

De absolute veschillen die binnen een reeks door analyses in duplo aan het licht komen (zie bijlage III), moeten worden uitgezet. De middelste lijn is 1,128 sw, de ondergrens is 0 en de bovengrens (actiegrens) is 3,686 sw, waarbij sw de standaarddeviatie binnen een analysereeks is.

De controleprocedure dient materialen in lage en hoge concentraties te omvatten als de concentratiespreiding breed is.

Als de proefmaterialen een grote concentratiespreiding van de te analyseren stoffen omvatten, dient het laboratorium het verband tussen precisie en concentratie vast te stellen. Is de precisie evenredig aan de concentratie, dan moet de volgende controle worden uitgevoerd op basis van relatieve precisie (d.w.z. absoluut verschil als percentage van de gemiddelde waarde).

Er is sprake van een toestand waarin de analyse niet onder controle is als zich een van onderstaande mogelijkheden voordoet:

A. de huidige waarde van de "plot" valt buiten de actiegrenzen,

B. de huidige waarde en de vorige waarde vallen buiten de waarschuwingsgrenzen maar binnen de actiegrenzen,

C. in het geval dat controlematerialen worden gebruikt, vallen negen opeenvolgende waarden aan dezelfde zijde van de gemiddeldenlijn.

Het laboratorium dient op een niet onder controle zijnde toestand te reageren door:

A. de analyse te staken hangende diagnostisch onderzoek en maatregelen ter correctie en

B. de resultatenreeks af te keuren en de proefmaterialen hernieuwd te analyseren.

b) Procedure ter selectie van eigen controlemateriaal en ter bepaling van "eigen" precisiegrenzen (chemische analyse)

Gegevens over de precisie binnen een laboratorium kunnen worden verkregen door herhaalde analyse van controlematerialen en/of door herhaalde analyse van proefmonsters.

De volgende methode dient als richtlijn voor laboratoria die precisieparameters gaan invoeren voor variaties binnen en tussen reeksen die daarna worden gebruikt voor het ontwerpen van controlekaarten. Laboratoria mogen alternatieve procedures hanteren mits ze afdoende kunnen aantonen dat er nauwkeurige precisiegegevens mee kunnen worden verkregen.

1. Selectie van controlematerialen

Wanneer het voor het laboratorium gewenst is een controlemateriaal te gebruiken, moeten eerst gegevens worden verzameld om grenzen vast te stellen. Zo mogelijk dienen Gecertificeerde Referentiematerialen (GRM's) te worden gebruikt. In aanmerking komende controlematerialen dienen binnen een reeks onder herhaalbare omstandigheden te worden geanalyseerd, waaronder geschikte GRM's, en zij moeten worden onderworpen aan herhaling en randomisatie. Als deze methode niet bruikbaar is, dienen de laboratoria te trachten aan expertisetests deel te nemen en te komen tot consensusgemiddelden (toegekende waarden), die kunnen worden beschouwd als een conventioneel juist gemiddelde, waaraan een zinvolle (betekenis-hebbende) onzerkerheid zou kunnen worden verbonden. Andere procedures zijn bijvoorbeeld het toekennen van een juiste waarde door formulering of het gebruik van controlematerialen waaraan een bekende hoeveelheid van de te analyseren stof is toegevoegd.

Wanneer het laboratorium regelmatig dit type analyse uitvoert, en al statistische controle heeft ingesteld, moeten daarnaast eventuele nieuwe controlematerialen (die bijvoorbeeld nodig zijn omdat de voorraad uitgeput raakt) worden verkregen met betrekking tot onder controle zijnde analyses met gebruikmaking van de bestaande materialen.

2. Vaststelling van grenswaarden

Na selectie van een controlemateriaal moet het laboratorium voor dit materiaal precisiegetallen binnen en tussen reeksen vaststellen.

Als minimumeis bij de vaststelling van de precisie binnen een reeks dient het controlemateriaal bij 12 gelegenheden in duplo te worden geanalyseerd. Analyse in duplo dient onder herhaalbare omstandigheden te worden uitgevoerd, d.w.z. dezelfde persoon, dezelfde reagentia enz. Analyse in duplo van het controlemateriaal dient binnen een analysereeks gerandomiseerd plaats te vinden. Elke analyse in duplo dient over een bepaalde periode op een aparte dag te worden uitgevoerd om inzicht te krijgen in een redelijke variatie van reeks tot reeks, rekening houdend met normale variaties, b.v. reagentia, herijking van instrumenten en, indien van toepassing, verschillende personen.

N.B.:

Men dient te bedenken dat het gebruik van gegevens die niet geheel representatief zijn voor de variatie tussen reeksen, overbodige herhaling van analyses met zich kan brengen doordat er te enge grenzen worden vastgesteld. Omgekeerd is een laboratorium dat precisiegegevens aanlevert die te onnauwkeurig zijn, mogelijk niet in staat aan de in referentiemethoden voorgeschreven grenzen te voldoen, kan het mogelijk slecht presteren in vergelijking met vergelijkbare laboratoria en levert het mogelijk geen gegevens aan die voor het beoogde doel bruikbaar zijn.

2.1. Bepaling van de precisie binnen reeksen

2.1.1. Precisie binnen reeksen wanneer controlemateriaal beschikbaar is

De gegevens over analyses in duplo (minimaal 12 duplo's) dienen eerst aan de test op maximale variantie van Cochran te worden onderworpen. Bij die test wordt het maximale interval van duplobepalingen in het kwadraat vergeleken met de som van gekwadrateerde intervallen.

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

waarin

di= het verschil tussen analyses in duplo.

De waarde van Cochrans criterium C, wordt met waarden in de tabellen vergeleken (ISO 5725 (1994)). Wanneer een waarde als onbetrouwbaar of als uitbijter kan worden geclassificeerd, dient het resultaat te worden gecontroleerd om tot een verklaring te komen, b.v. een technische fout, een rekenfout, een vergissing bij de uitvoering van de test, analyse van het verkeerde monster. Als de verklaring voor de technische fout zodanig is dat het onmogelijk blijkt het omstreden resultaat te vervangen, dient het als een echte uitbijter te worden geëcarteerd. Als er eventuele onbetrouwbare waarden of uitbijters overblijven die niet te verklaren zijn, worden de onbetrouwbare waarden als juist gehandhaafd en worden de statistische uitbijters geëcarteerd. Het laboratorium dient te trachten aan vervangende waarden te komen.

Zodra het laboratorium meent dat de gegevens vrij van uitbijters zijn, wordt de standaarddeviatie binnen een analysereeks sw als volgt verkregen:

Voor ieder paar xi1, x i2 van de p duplogegevens worden de som van de duplo's,

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

en het verschil van de duplo's,

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

berekend en opgeteld tot

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

Een schatting van de standaarddeviatie binnen een analysereeks is

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

De eigen precisiegrens is 2,8 sw.

Als een referentiemethode wordt gebruikt, dient de eigen precisiegrens met de gepubliceerde herhaalbaarheidsgrens te worden vergeleken. Het laboratorium dient aan de eis van de referentiemethode te voldoen. Voldoet het laboratorium hier niet aan, dan moet een onderzoek worden ingesteld.

De gestelde grenzen moeten als voorlopig worden beschouwd en moeten kunnen worden herzien.

2.1.2. Precisie binnen de reeks wanneer geen controlemateriaal beschikbaar is.

Het laboratorium kan er de voorkeur aan geven de precisie binnen de reeks vast te stellen door analyse in duplo van representatieve proefmonsters (minimaal 12 duplobepalingen). In gevallen waarin het niet mogelijk is controlematerialen te gebruiken, bijvoorbeeld vanwege de instabiliteit ervan, moeten door middel van deze methode duplogegevens worden verzameld.

N.B.:

Er wordt van uitgegaan dat de analyses een relatief beperkte serie waarden omvatten en dat derhalve voor alle monsters één enkele waarde kan worden gehanteerd. In gevallen waarin de spreiding van de resultaten groter is, bijvoorbeeld boven een orde van grootte, en de precisie van de concentratie afhangt, dienen de laboratoria het gebruik van relatieve standaarddeviaties te onderzoeken.

De gegevens dienen aan de toets van Cochran te worden onderworpen, zoals in 2.1.1 Zodra het laboratorium meent dat de gegevens vrij van uitbijters zijn, kunnen de standaarddeviatie binnen een analysereeks en de eigen precisiegrens worden verkregen als in paragraaf 2.1.1.

De standaarddeviatie binnen een reeks sw kan worden gebruikt om controlekaarten te maken (zie bijlage II). De gestelde grenzen dienen als voorlopig te worden beschouwd en kunnen worden herzien.

2.2. Bepaling van precisie tussen analysereeksen

Bereken de gemiddelde waarde (s1/2) per paar en onderwerp die aan de toets van Grubb (ISO 5725 (1994)). De criteria voor afkeuring/aanvaarding van uitbijters of onbetrouwbare waarden zijn zoals in 2.1.1 beschreven. Het laboratorium dient te trachten aan een vervangende waarde te komen voor elk geëcarteerd resultaat. Zodra het laboratorium meent dat de gegevens vrij van uitbijters zijn, wordt de standaarddeviatie tussen analysereeksen sb berekend.

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

of 0 als de uitdrukking onder het vierkantswortelteken negatief is.

De totale standaarddeviatie st wordt gebruikt voor het aanmaken van controlekaarten voor het gemiddelde van n bepalingen (zie bijlage II). De gestelde grenzen dienen als voorlopig te worden beschouwd en kunnen worden herzien.

3. Herziening van initiële grenzen

Vastgestelde controlegrenzen als hierboven beschreven moeten als eerste schattingen worden beschouwd.

Teneinde de grenzen die zijn gesteld op basis van aanvaardbare precisie binnen een analysereeks (paragraaf 2.1.2), up-to-date te brengen, dienen meer duplogegevens over proefmonsters te worden verzameld. Het tijdsverloop vóór een herziening hangt tot op zekere hoogte van de analysefrequentie af. Als richtlijn geldt dat de gegevens dienen te worden herzien nadat nog eens 10 analyses in duplo zijn verkregen. Al die gegevens dienen dan aan de toest van Cochran te worden onderworpen en de grenzen dienen op grond van het nieuwe standaarddeviatiegetal opnieuw te worden vastgesteld. Volgende beslissingen over de validiteit van controlegrenzen moeten in het licht van nadere gegevens worden genomen.

De herziening van de eerste over de precisie tussen analysereeksen verkregen gegevens hangt ook van de analysefrequentie af. Als richtlijn geldt dat het nodig is de eerste uitgangspunten met betrekking tot de standaarddeviatie en het gemiddelde te herzien, nadat nog eens 10 uitkomsten van de analyse van het conrolemateriaal zijn verkregen met een frequentie van één analyse per charge.

Al deze gegevens dienen aan de toets van Grubb voor uitbijters te worden onderworpen. Het gemiddelde en de standaarddeviatie dienen op grond van de nieuwe gegevens te worden herberekend.

Daarnaast dient het laboratorium in dit stadium een Cusum-kaart (BS S700: (1984) en amendement 5480 (1987)) toe te passen om eventuele problemen die bijvoorbeeld met de veroudering van reagentia kunnen samenhangen, te onderzoeken. Alle enkele resultaten die buiten de grenzen van het Cusum "V-masker" vallen, moeten worden onderzocht.

De nieuwe grenzen (gemiddelde en standaarddeviatie) moeten met behulp van de Cusumtechniek regelmatig worden gecontroleerd. Iedere aanwijzing dat de validiteit van het controlemateriaal in twijfel wordt getrokken, moet grondig worden onderzocht.

4. Melding van precisiegegevens

De volgende inlichtingen dienen aan het bevoegde nationale gezag ter beschikking te worden gesteld:

- gebruikte methode,

- standaarddeviatie binnen analysereeks, sw, en eigen precisiegrens,

- standaarddeviatie tussen analysereeksen, sb,

- totale standaarddeviatie, s1,

- aantal ter verkrijging van precisiegegevens benodigde analyses.

(1) M. Thompson en R. Wood: "Pure and Applied Chemistry" 67 (4), 649-666 (1995).

BIJLAGE VI

(Artikel 6)

EVALUATIE VAN DE BEOORDELAARS EN DE BETROUWBAARHEID VAN DE RESULTATEN BIJ SENSORISCHE ANALYSES

De volgende procedures zijn van toepassing als methoden van puntentoekenning worden gebruikt (IDF-norm 99C/1997).

a) Bepaling van de "herhaalbaarheidsindex"

Over een periode van 12 maanden moet een beoordelaar minstens tien monsters als blinde duplo's analyseren. Dit zal meestal tijdens verscheidene sessies plaatsvinden. De resultaten voor de afzonderlijke productkenmerken worden geëvalueerd aan de hand van onderstaande formule:

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

waarin

wI: herhaalbaarheidsindex

xi1: score voor de eerste evaluatie van monster xi

xi2: score voor de tweede evaluatie van monster xi

n: aantal monsters

De te evalueren monsters dienen voor een grote kwaliteitsspreiding representatief te zijn. wI mag niet hoger zijn dan 1,5 (vijfpuntsschaal).

b) Bepaling van de "deviatie-index"

Deze index dient te worden gebruikt om na te gaan of een beoordelaar dezelfde schaal voor de evaluatie van de kwaliteit gebruikt als een ervaren groep beoordelaars. De door de beoordelaar verkregen scores worden met het gemiddelde van de door de groep beoordelaars verkregen scores vergeleken.

Onderstaande formule wordt gebruikt ter evaluatie van de resultaten:

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

waarin:

xil; xi2: zie onder a)

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>;

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>: Gemiddelde score van de groep beoordelaars voor de eerste rescpectievelijk de tweede evaluatie van monster xi.

n: aantal monsters (minstens 10 per 12 maanden).

De te evalueren monsters moeten representatief zijn voor een grote kwaliteitsspreiding. D1 mag niet hoger zijn dan 1,5 (vijfpuntsschaal).

De lidstaten moeten moeilijkheden met de toepassing van deze procedure aangeven.

c) Vergelijking van de in verschillende regio's van een lidstaat en in verschillende lidstaten verkregen resultaten

Indien van toepassing, moet minstens eenmaal per jaar een toets worden georganiseerd die het mogelijk maakt de door beoordelaars uit verschillende regio's verkregen resultaten onderling te vergelijken. Als significante verschillen worden geconstateerd, moeten de nodige maatregelen worden genomen om de oorzaak ervan te achterhalen en om tot vergelijkbare resultaten te komen.

De lidstaten mogen toetsten organiseren waarmee de door hun eigen beoordelaars en door beoordelaars van naburige lidstaten verkregen resultaten kunnen worden vergeleken. Significante verschillen dienen tot een diepgaand onderzoek te leiden met de bedoeling tot vergelijkbare resultaten te komen.

De lidstaten moeten de uitslag van de vergelijkingen aan de Commissie meedelen.

BIJLAGE VII

(Artikel 6)

SENSORISCHE EVALUATIE VAN BOTER

1. Doel

Het doel van deze procedure voor de sensorische evaluatie van boter is een uniforme methode vast te stellen die in alle lidstaten van toepassing is.

2. Definities

Sensorische evaluatie (beoordeling): het onderzoek naar de eigenschappen van een product door middel van de zintuigen.

Panel: een groep geselecteerde beoordelaars die tijdens de beoordeling, zonder onderling contact en zonder elkaar te beïnvloeden, hun werk doen.

Toekennen van punten: de sensorische evaluatie door een panel met gebruikmaking van een cijferschaal. Er moet een nomenclatuur voor de afwijkingen worden gehanteerd.

Classificeren: een classificatie van de kwaliteit op grond van het toekennen van punten.

Controledocumenten: documenten die worden gebruikt om de individuele punten per eigenschap en de eindclassificatie van het product te noteren. (Dit document kan ook worden gebruikt om de chemische samenstelling te noteren.)

3. Onderzoekruimte

3.1. Er moeten voorzorgen worden getroffen opdat de beoordelaars in de onderzoekruimte niet door uitwendige factoren worden beïnvloed.

3.2. De onderzoekruimte moet vrij van vreemde geuren en gemakkelijk schoon te houden zijn. De muren moeten licht van kleur zijn.

3.3. De onderzoekruimte en verlichting ervan moeten zodanig zijn dat ze de eigenschappen van de te beoordelen producten niet beïnvloeden. De ruimte moet van een behoorlijke temperatuurbeheersing zijn voorzien.

4. Keuze der beoordelaars

De beoordelaar moet met boterproducten vertrouwd zijn en deskundig zijn om een sensorische evaluatie uit te voeren. Zijn deskundigheid moet regelmatig (minstens eens per jaar) door de bevoegde autoriteit worden nagegaan.

5. Eisen aan het panel

Het aantal beoordelaars in het panel moet oneven zijn met als minimum een aantal van drie. Zij moeten in meerderheid werknemers van de bevoegde autoriteit of bevoegde deskundigen zijn.

Om panelleden tot optimale prestatie te bewegen, moet vóór de beoordeling met verscheidene factoren rekening worden gehouden:

- de panelleden mogen niet aan een ziekte lijden die hun prestaties nadelig beïnvloeden. Indien een dergelijke situatie zich voordoet, moet een ander lid in het panel worden opgenomen;

- de panelleden moeten op tijd komen om te kunnen deelnemen aan de beoordeling en zich ervan vergewissen dat zij voldoende tijd voor de beoordeling hebben uitgetrokken;

- de panelleden moeten het gebruik van sterk geurende producten als parfums, lotions, aftershaves en deodorants vermijden, evenals het nuttigen van sterk gearomatiseerde (gekruide) producten enz.;

- de panelleden mogen een half uur voor het begin van de beoordelingssessie niet roken, eten, of iets anders dan water drinken.

6. Beoordeling van de waarde per eigenschap

6.1. De sensorische evaluatie moet met het oog op onderstaande drie eigenschappen worden uitgevoerd: uiterlijk, consistentie en geur en smaak.

Uiterlijk betreft de volgende kenmerken: kleur, zichtbare zuiverheid, schimmelgroei en waterdispersie. De waterdispersie wordt onderzocht volgens IDF-norm 112A/1989.

Consistentie betreft de volgende kenmerken: vastheid en smeerbaarheid.

Voor de evaluatie van de boterconsistentie kunnen fysische methoden worden gebruikt. De Commissie is voornemens die methoden te harmoniseren.

Geur en smaak betreffen de volgende kenmerken: smaak en geur.

Een belangrijke afwijking van de aanbevolen temperatuur staat een betrouwbare evaluatie van de consistentie, geur en smaak in de weg. De temperatuur is van uitermate groot belang.

6.2. Elke eigenschap moet apart sensorisch worden geëvalueerd. Het toekennen van punten moet volgens tabel 1 plaatsvinden.

6.3. Het kan wenselijk zijn dat de beoordelaars, voordat ze aan de beoordeling beginnen, een of meer referentiemonsters gezamenlijk beoordelen op uiterlijk, consistentie en geur en smaak teneinde uniformiteit te bereiken.

6.4. Voor toekenning van punten voor goedkeuring van de boter geldt het volgende:

>RUIMTE VOOR DE TABEL>

Als de vereiste punten niet worden gehaald, moet een omschrijving van de afwijking worden gegeven. De door iedere beoordelaar per eigenschap toegekende punten moeten in het controledocument worden genoteerd. Het product wordt op grond van een meerderheidsbesluit goed- of afgekeurd. Gevallen waarin verschillen tussen de afzonderlijke punten per eigenschap groter zijn dan 1 punt, mogen niet vaak voorkomen (hoogstens eenmaal per 20 monsters). Als dat wel zo is, dient de panelleider de deskundigheid van het panel te controleren.

7. Toezicht

Een panelleider, die een officiële werknemer van de bevoegde autoriteit moet zijn en lid van het panel mag zijn, is verantwoordelijk voor de hele gang van zaken. Hij moet de individuele punten per eigenschap in het controledocument noteren en vastleggen of het product goed- of afgekeurd is.

8. Bemonstering en bereiding van het monster

8.1. - Het is, om vooroordeel te vermijden, gewenst dat de identiteit van de monsters tijdens de evaluatie geheim blijft.

- De panelleider moet een en ander vóór de evaluatie organiseren zonder de aanwezigheid van de overige panelleden.

8.2. Wanneer de sensorische evaluatie in het koelhuis wordt uitgevoerd, wordt het monster met een boterboor genomen. Als de sensorische evaluatie op een andere plaats dan het koelhuis wordt uitgevoerd, moet een monster van minstens 500 g worden genomen.

8.3. Tijdens de evaluatie moet de boter een temperatuur van 10-12 °C hebben. Grote afwijkingen moeten koste wat het kost worden vermeden.

9. Nomenclatuur

Zie tabel 2.

Tabel 1: Puntenwaardering boter

>RUIMTE VOOR DE TABEL>

>RUIMTE VOOR DE TABEL>

>RUIMTE VOOR DE TABEL>

Tabel 2: Tabel van boterafwijkingen

I. Uiterlijk

1. waterig (vrij vocht)

2. niet uniform, twee kleuren

3. streperig

4. gevlekt, gemarmerd

5. vlekkerig

6. olieafscheiding

7. te sterk gekleurd

8. slap (open structuur)

9. korrelig

10. vreemde stoffen

11. beschimmeld

12. onopgelost

II. Consistentie

14. kort, brokkelig, kruimelig

15. deegachtig, vettig

16. kleverig

17. hard

18. zacht

III. Geur en smaak

20. ontbreken

21. onzuiver(1)

22. vreemde smaak

23. muf

24. kazig, kaasgeur

25. zuur

26. gistachtig

27. a) kooksmaak

b) branderig

28. schimmelsmaak

29. ranzig

30. olieachtig, visachtig

31. talkachtig

32. a) oxidatiesmaak

b) metaalsmaak

33. voersmaak

34. ruw, bitter

35. te zout

36. goor, bedorven

37. moutachtig

38. chemische smaak

(1) Deze aanduiding moet zo weinig mogelijk worden gebruikt en alleen wanneer de afwijking niet nauwkeuriger kan worden beschreven.

BIJLAGE VIII

(Artikel 7)

TOE TE PASSEN PROCEDURE ALS ANALYSERESULTATEN WORDEN BETWIST (CHEMISCHE ANALYSE)

1. Op verzoek van de marktdeelnemer wordt binnen 7 werkdagen volgende op de mededeling van de resultaten van de eerste analyse een nadere analyse uitgevoerd, mits verzegelde duplo-monsters van het product beschikbaar zijn en mits deze behoorlijk zijn bewaard.

2. De bevoegde instantie stuurt deze monsters op verzoek en op kosten van de marktdeelnemer naar een tweede laboratorium. Dat laboratorium moet gemachtigd zijn officiële analyses uit te voeren en moet bewezen hebben over de bekwaamheid te beschikken om de betrokken analyses uit te voeren. Die bekwaamheid dient te blijken uit een succesvolle deelneming aan gezamenlijke studies, expertisetests of vergelijkingen tussen laboratoria. Het tweede laboratorium moet de referentiemethode gebruiken. De door de twee laboratoria verkregen resultaten worden als volgt beoordeeld:

a) Als beide laboratoria aan de herhaalbaarheidseis en de reproduceerbaarheidseis voldoen

Het rekenkundig gemiddelde van de door beide laboratoria verkregen resultaten wordt als eindresultaat opgegeven. Dit eindresultaat wordt beoordeeld rekening houdend met het kritische verschil, aan de hand van onderstaande formule:

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

waarin:

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>: rekenkundig gemiddelde van alle door beide laboratoria verkregen resultaten

mo: grenswaarde

R: reproduceerbaarheid

r: herhaalbaarheid

n1: aantal door laboratorium 1 verkregen resultaten

n2: aantal door laboratorium 2 verkregen resultaten.

Opmerking:

Als het eindresultaat wordt berekend aan de hand van de formule:

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

of

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

(zie respectievelijk bijlage IV, punt 3 en punt 4) dan moeten R2x en r2x in de formules worden ingevoerd in plaats van R2 et r2.

b) Als beide laboratoria aan de herhaalbaarheidseis voldoen maar niet aan de reproduceerbaarheidseis

Als de tweede analyse de eerste bevestigt, wordt de ter analyse aangeboden hoeveelheid afgewezen als niet aan de eisen voldoend. Zoniet wordt de hoeveelheid aanvaard.

c) Als slechts één laboratorium aan de herhaalbaarheidseis voldoet

Bij de beslissing of de zending wordt aanvaard, wordt rekening gehouden met het eindresultaat van het laboratorium dat aan de herhaalbaarheidseis voldoet.

d) Als geen van de laboratoria aan de herhaalbaarheidseis voldoet maar wel aan de reproduceerbaarheidseis wordt voldaan

Punt a) is van toepassing.

e) Als geen van de laboratoria aan de herhaalbaarheidseis noch aan de reproduceerbaarheidseis voldoet

De ter analyse aangeboden hoeveelheid wordt aanvaard, als de door één laboratorium verkregen resultaten tot deze conclusie leiden.

f) Als de resultaten met behulp van niet-gevalideerde methoden zijn verkregen

De ter analyse aangeboden hoeveelheid wordt aanvaard, als de door één laboratorium verkregen resultaten tot deze conclusie leiden.

3. De resultaten van de tweede analyse worden op zo kort mogelijke termijn door de bevoegde autoriteit aan de marktdeelnemer meegedeeld. De kosten van de tweede analyse moeten door de marktdeelnemer worden gedragen, als de ter analyse aangeboden hoeveelheid wordt afgewezen.

4. Indien de marktdeelnemer het bewijs levert dat de bemonsteringsprocedure niet correct is uitgevoerd, moet de bemonstering zo mogelijk binnen 5 werkdagen na de monsterneming worden overgedaan. Wanneer niet opnieuw een monster kan worden genomen, wordt de ter analyse aangeboden hoeveelheid aanvaard.

BIJLAGE IX

(Artikel 8)

BEPALING VAN HET VOCHTGEHALTE VAN BOTER

1. Onderwerp en toepassingsgebied

Deze referentiemethode beschrijft de werkwijze voor de bepaling van het vochtgehalte van boter.

2. Referentie

IDF-norm 50 C: 1995 - Melk en melkproducten - Bemonsteringsmethodes.

3. Definitie

Vochtgehalte van boter: het massaverlies na uitvoering van het verwarmingsproces beschreven in deze norm. Het vochtgehalte wordt uitgedrukt in gram per 100 gram.

4. Principe

Verdamping van het vocht uit een testportie in aanwezigheid van puimsteen bij een temperatuur van 102 °C in een droogstoof.

5. Apparatuur en materiaal

Gebruikelijke laboratoriumuitrusting, en in het bijzonder:

5.1. Analytische balans, tot 1 mg nauwkeurig.

5.2. Exsiccator met een goed droogmiddel (bijvoorbeeld, goed voorgedroogde silicagel met een vochtindicator).

5.3. Geventileerde, thermostatisch geregelde droogstoof waarvan de temperatuur kan worden gehandhaafd op 102 ± 2 °C.

5.4. Glazen, porseleinen of niet corrodeerbare metalen schalen, ongeveer 20 mm hoog met een diameter van 60 tot 80 mm.

5.5. Korrelige, gewassen puimsteen met een diameter van 0,8-10 mm.

6. Bemonstering

Zie IDF 50 C: 1995.

7. Procedure

7.1. Klaarmaken van het testmonster

Verwarm het monster in een gesloten pot van glas of van een daartoe geschikte kunststof, voor de helft tot tweederde gevuld, tot een temperatuur waarop het monster voldoende zacht is om het goed te kunnen mengen tot een homogeen geheel (met een mechanische shaker of met de hand). De temperatuur bij het mengen mag normaal gezien de 35 °C niet overschrijden. Laat het monster tot omgevingstemperatuur afkoelen. Open de monsterpot zo snel mogelijk na het afkoelen en roer kort (niet langer dan 10 s) met een daartoe geschikt voorwerp, bijvoorbeeld een lepel of een spatel, alvorens te wegen.

7.2. Bepaling van het vochtgehalte

7.2.1. Leg ongeveer 10 g puimsteen in de schaal (5.4).

7.2.2. Droog de schaal met de puimsteen in de droogstoof (5.3) op 102 ± 2 °C gedurende ten minste 1 uur.

Opmerking:

de droogtijden vermeld onder 7.2.2, 7.2.5 en 7.2.7 gelden vanaf het ogenblik waarop de temperatuur van de droogstoof 102 ± 2 °C bereikt.

7.2.3. Laat de schaal afkoelen in de exsiccator (5.2) tot de temperatuur van de balans en weeg tot op 1 mg.

7.2.4. Weeg in de schaal, tot op 1 mg, een testportie van ongeveer 5 g van het monster.

7.2.5. Zet de schaal in de droogstoof op 102 ± 2 °C gedurende 3 uur.

7.2.6. Laat de schaal afkoelen in de exsiccator tot de temperatuur van de balans en weeg tot op 1 mg.

7.2.7. Herhaal het droogproces gedurende bijkomende periodes van 1 uur, waarbij telkens wordt gekoeld en gewogen zoals beschreven onder punt 7.2.6 tot een constante massa bereikt wordt (massaverandering niet meer dan 1 mg).

Als de massa toeneemt, de laagst geregistreerde massa gebruiken voor de berekening.

8. Weergave van resultaten

8.1. Berekeningsmethode en formule

Bereken het vochtgehalte, W, in massaprocenten met behulp van de volgende formule:

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

waarin:

m0: massa van de schaal met de puimsteen (7.2.3), in g

m1: massa van de testportie, de schaal en de puimsteen voor verhitting (7.2.4), in g

m2: massa van de testportie, de schaal en de puimsteen na verhitting (7.2.7), in g.

Rond het resultaat af tot één cijfer na de komma.

8.2. Herhaalbaarheid

Het absolute verschil tussen de resultaten van twee enkelvoudige bepalingen, die gelijktijdig of kort na elkaar zijn uitgevoerd door dezelfde persoon onder dezelfde omstandigheden op identiek testmateriaal mag niet meer dan 0,2 % bedragen.

8.3. Reproduceerbaarheid

Het absolute verschil tussen de resultaten van twee enkelvoudige en onafhankelijke bepalingen, die zijn uitgevoerd door twee personen in verschillende laboratoria op identiek testmateriaal mag niet meer dan 0,3 % bedragen.

9. Verslag van het onderzoek

Het verslag van het onderzoek dient de gebruikte methode en de verkregen resultaten te vermelden. Het dient tevens alle details te vermelden die niet gespecificeerd worden in deze internationale norm of die naar keuze zijn, evenals de details inzake omstandigheden die de resultaten hebben kunnen beïnvloeden. Het verslag van het onderzoek moet alle noodzakelijke informatie bevatten voor volledige identificatie van het monster.

BIJLAGE X

(Artikel 8)

BEPALING VAN HET GEHALTE AAN VETVRIJE DROGE STOF VAN BOTER

1. Onderwerp en toepassingsgebied

Deze norm beschrijft de methode voor de bepaling van het gehalte aan vetvrije droge stof van boter.

2. Referentie

IDF-norm 50 C: 1995 - Melk en melkproducten - Bemonsteringsmethodes.

3. Definities

Gehalte aan vetvrije droge stof van boter: het massapercentage bepaald volgens de gespecificeerde procedure. Het gehalte wordt uitgedrukt in gram per 100 gram.

4. Principe

Verdamping van het vocht uit een bekende massa boter, extractie van het vet met petroleumether en wegen van het residu.

5. Reagens

Petroleumether met een kooktraject tusen 30 en 60 °C. Het reagens mag niet meer dan 1 mg residu overlaten na verdamping van 100 ml.

6. Apparatuur en materiaal

6.1. Analytische balans, tot 1 mg nauwkeurig.

6.2. Exsiccator met een goed droogmiddel (bijvoorbeeld, goed voorgedroogde silicagel met een vochtindicator).

6.3. Geventileerde, thermostatisch geregelde droogstoof waarvan de temperatuur kan worden gehandhaafd op 102 +- 2 °C.

6.4. Glazen, porseleinen of niet corrodeerbare metalen schalen, met een tuit van ongeveer 20 mm hoog en een diameter van 60 tot 80 mm, voorzien van een glanzen roerstaaf.

6.5. Filterkroes, met glasfilter, poriënwijdte 16 tot 40 μm, met afzuigkolf.

7. Bemonstering

Zie IDF-norm 50 C: 1995.

8. Procedure

8.1. Klaarmaken van het testmonster

Verwarm het monster in de gesloten pot van glas of van een daarvoor geschikte kunststof, voor de helft tot tweederde gevuld, tot een temperatuur waarop het monster voldoende zacht is om het goed te kunnen mengen tot een homogeen geheel (met een mechanische shaker of met de hand). De temperatuur bij het mengen mag normaal gezien de 35 °C niet overschrijden. Laat het monster tot ongevingstemperatuur afkoelen. Open de monsterpot zo snel mogelijk na het afkoelen en roer kort (niet langer dan 10 s) met een daartoe geschikt voorwerp, bijvoorbeeld een lepel of een spatel, alvorens te wegen.

8.2. Bepaling

8.2.1. Droog de schaal met de staaf (6.4) en de kroes (6.5) in de droogstoof (6.3) gedurende 1 uur. Laat deze voorwerpen afkoelen in de exsiccator en weeg ze samen (d.w.z. schaal, staaf en kroes) tot op 1 mg (m0).

Opmerking:

- Als regel kan men stellen dat een koeltijd van 45 min volstaat.

- Het is belangrijk dat dezelfde combinatie van schaal, staaf en kroes wordt gebruikt voor elke testportie wanneer meer dan één testportie wordt geanalyseerd.

8.2.2. Verwijder de kroes en weeg de schaal en de staaf samen tot op 1 mg (m1).

8.2.3. Weeg in de schaal, tot op 1 mg, een testportie van ongeveer 5 g van het monster (8.1) (m2).

8.2.4. Zet de schaal (met daarin de staaf en de boter) in de droogstoof op 102 +- 2 °C en laat een nacht staan.

8.2.5. Laat de schaal (8.2.3) afkoelen tot kamertemperatuur.

8.2.6. Voeg 15 ml warm (ongeveer 25 °C) petroleumether toe in de schaal en maak zo veel mogelijk sediment los van de schaal met behulp van de glasstaaf. Breng de oplossing over in de kroes en laat ze filtreren in de afzuigkolf.

8.2.7. Herhaal de onder punt 8.2.6 beschreven handeling nog vier maal. Als het oppervlak van de schaal geen vetsporen vertoont, breng dan tijdens de vierde spoeling zo veel mogelijk sediment over in de kroes. Als er wel vetsporen zijn, herhaal dan de onder punt 8.2.6 beschreven handeling tot al het vet is verwijderd.

8.2.8. Spoel het sediment in de kroes met 25 ml warm petroleumether.

8.2.9. Droog de schaal samen met de glasstaaf en de kroes gedurende 30 minuten in de droogstoof op 102 +- 2 °C.

8.2.10. Laat afkoelen in de exsiccator tot kamertemperatuur en weeg tot op 1 mg.

8.2.11. Herhaal de onder de punten 8.2.9 en 8.2.10 beschreven handelingen tot voor de schaal, de staaf en de kroes samen (m3) een constante massa is bereikt (massaverandering niet meer dan 1 mg).

9. Weergave van resultaten

9.1. Berekening van het gehalte aan vetvrije droge stof

Bereken het gehalte aan vetvrije droge stof, SNF, in massaprocenten met behulp van de volgende formule:

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

waarin:

m0 massa van de lege schaal, de glasstaaf en de kroes (8.2.1), in g

m1 massa van de lege schaal en de glasstaaf (8.2.2), in g

m2 massa van de testportie en de schaal met de glasstaaf (8.2.3), in g

m3 eindmassa, in g, in de schaal met de glasstaaf en de kroes met het sediment (8.2.11).

Rond het resultaat af tot één cijfer na de komma.

9.2. Herhaalbaarheid

Het absolute verschil tussen de resultaten van twee enkelvoudige bepalingen, die gelijktijdig of kort na elkaar zijn uitgevoerd door dezelfde persoon onder dezelfde omstandigheden op identiek testmateriaal mag niet meer dan 0,1 % bedragen.

9.3. Reproduceerbaarheid

Het absolute verschil tussen de resultaten van twee enkelvoudige en onafhankelijke bepalingen, die zijn uitgevoerd door twee personen in verschillende laboratoria op identiek testmateriaal mag niet meer dan 0,2 % bedragen.

10. Verslag van het onderzoek

Het verslag van het onderzoek dient de gebruikte methode en de verkregen resultaten te vermelden. Het dient tevens alle details te vermelden die niet gespecificeerd worden in deze internationale norm of die naar keuze zijn, evenals de details inzake omstandigheden die de resultaten hebben kunnen beïnvloeden. Het verslag van het onderzoek moet alle noodzakelijke informatie bevatten voor volledige identificatie van het monster.

Opmerking:

>RUIMTE VOOR DE TABEL>

Geconcludeerd kan worden dat de betrouwbaarheidswaarden die zijn verkregen voor de bepaling van het gehalte aan vetvrije droge stof van boter ook gelden voor de bepaling van het gehalte aan vetvrije droge stof van melk.

BIJLAGE XI

(Artikel 8)

BEPALING VAN HET VETGEHALTE VAN BOTER

Het vetgehalte wordt indirect vastgesteld door de bepaling van het vochtgehalte en het gehalte aan vetvrije droge stof overeenkomstig bijlage IX, respectievelijk bijlage X. Het massapercentage van vet is gelijk aan

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

waarin:

W: het massapercentage van water

SNF: het massapercentage van vetvrije droge stof.

>RUIMTE VOOR DE TABEL>

BIJLAGE XII

(Artikel 9)

BEPALING VAN HET VANILLINEGEHALTE IN BOTERCONCENTRAAT, BOTER OF ROOM MET BEHULP VAN HOGEDRUKVLOEISTOFCHROMATOGRAFIE (HPLC)

1. Doel en toepassingsgebied

In deze methode wordt een werkwijze beschreven voor de kwantitatieve bepaling van vanilline in boter, boterconcentraat of room.

2. Principe

Extractie van een bekende hoeveelheid monster met een mengsel van isopropanol/ethanol/acetonitril (1:1:2). Neerslaan van het grootste gedeelte van het vet door afkoelen tussen - 15 en - 20 °C, gevolgd door centrifugeren.

Na verdunnen met water, bepaling van het vanillinegehalte met behulp van hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC).

3. Apparatuur

Gebruikelijke laboratoriumapparatuur en in het bijzonder:

3.1. Diepvriezer met een temperatuurbereik van - 15 tot - 20 °C

3.2. Wegwerpinjectiespuiten van 2 ml

3.3. Membraanmicrofilters met een poriëngrootte van 0,45 μm en bestand tegen een oplossing met 5 % extractie-oplossing (4.4)

3.4. Vloeistofchromatografiesysteem, bestaande uit een pomp (stroomsnelheid 1,0 ml/min.), een injector (20 μl injectie, automatisch of manueel), een UV-detector (ingesteld op 306 nm, 0,01 AU full scale), recorder of integrator, en een kolomthermostaat ingesteld op 25 °C

3.5. Analysekolom (250 mm x 4,6 mm I.D.), gepakt met LiChrospher RP 18 (Merck, 5 m) of equivalent

3.6. Voorkolom (ong. 20 mm x 3 mm I.D.), droog gepakt met Perisorb RP 18 (30-40 m) of equivalent

4. Reagentia

Alle gebruikte reagentia moeten van analysekwaliteit zijn.

4.1. Isopropanol

4.2. Ethanol 96 % (v/v)

4.3. Acetonitril

4.4. Extractievloeistof

Meng isopropanol (4.1), ethanol (4.2) en acetonitrile (4.3) in de verhouding 1:1:2 (v/v).

4.5. Vanilline (4-hydroxy-3-methoxybenzaldehyde)

4.5.1. Stockoplossing vanilline (= 500 μg/ml)

Weeg tot op 0,1 mg nauwkeurig ongeveer 50 mg (CM mg) vanilline (4.5) af in een maatkolf van 100 ml; voeg 25 ml extractieoplossing (4.4) toe en vul aan met water.

4.5.2. Standaardoplossing vanilline (= 10 μg/ml)

Pipetteer 5,00 ml van de stockoplossing vanilline (4.5.1) in een maatkolf van 250 ml en vul aan met water.

4.6. Methanol, HPLC-kwaliteit

4.7. IJsazijn

4.8. Water, HPLC-kwaliteit

4.9. HPLC-loopvloeistof

Meng 300 ml methanol (4.6), ongeveer 500 ml water (4.8) en 20,0 ml azijnzuur (4.7) in een maatkolf van 1000 ml en vul aan met water (4.8). Filtreer door een filter van 0,45 μm (3.3).

5. Werkwijze

5.1. Bereiding van het testmonster

5.1.1. Boter

Verwarm het monster totdat dit begint te smelten. Vermijd plaatselijke oververhitting boven 40 °C. Homogeniseer het monster door het te schudden, wanneer het zacht genoeg is. Roer de boter 15 s en neem daarna een testmonster. Weeg tot op 1 mg nauwkeurig ongeveer 5 g (SM g) boter af in een maatkolf van 100 ml. (SM = de massa van het testmonster)

5.1.2. Boterconcentraat

Plaats direct voor de monsterneming de verpakking met het boterconcentraat in een oven bij 40-50 °C totdat het product volledig gesmolten is. Meng het monster door zwenken of roeren, maar voorkom dat luchtbellen ontstaan doordat te hard wordt geroerd. Weeg tot op 1 mg nauwkeurig ongeveer 4 g (SM g) boterconcentraat af in een maatkolf van 100 ml.

5.1.3. Room

Verwarm het monster in een waterbad of broedstoof bij een temperatuur van 35-40 °C. Verdeel het vet homogeen door zwenken en, indien nodig, door roeren. Koel het monster snel af tot 20 +- 2 °C. Het monster moet er homogeen uitzien, anders moet de werkwijze worden herhaald. weeg tot op 1 mg nauwkeurig ongeveer 10 g (SM g) room af in een maatkolf van 100 ml.

5.2. Bereiding van de testoplossing

Voeg ongeveer 75 ml extractieoplossing (4.4) toe aan het testmonster (5.1.1, 5.1.2 of 5.1.3), roer of schud ongeveer 15 min. krachtig en vul aan met extractieoplossing (4.4). Breng ongeveer 10 ml van dit extract over in een reageerbuis, die afgesloten wordt met een stop. Plaats de reageerbuis in de diepvriezer (3.1) en wacht ongeveer 30 min.. Centrifugeer het koude extract 5 min. bij ongeveer 2000 op en giet onmiddellijk af. Laat de afgegoten oplossing op kamertemperatuur komen. Pipetteer 5 ml van de afgegoten oplossing in een maatkolf van 100 ml en vul aan met water. Filtreer een fractie door een membraanmicrofilter (3.3). Het filtraat is gereed voor de bepaling met behulp van HPLC.

5.3. Kalibrering

Pipetteer 5 ml van de standaardoplossing vanilline (4.5.2) in een maatkolf van 100 ml. Voeg 5 ml extractieoplossing (4.4) toe en vul tot de merkstreep aan met water. Deze oplossing bevat 0,5 μg/ml vanilline.

5.4. Bepaling met behulp van HPLC

Laat het chromatografische systeem ongeveer 30 min stabiliseren. Injecteer de standaardoplossing (5.3). Herhaal dit totdat het verschil in piekoppervlakte of piekhoogte tussen twee opeenvolgende injecties kleiner is dan 2 %. Onder de beschreven omstandigheden bedraagt de retentietijd van vanilline ongeveer 9 min. Analyseer de standaardoplossing (5.3) in duplo door injectie van 20 μl. Injecteer 20 μl van de testoplossingen (5.2). Bepaal de oppvervlakte of de hoogte van de vanillinepiek. Herhaal de duplobepaling van de standaardoplossing (5.3) na tien injecties van de testoplossingen (5.2).

6. Berekening van de resultaten

Bereken de gemiddelde oppervlakte (of de gemiddelde hoogte) (AC) van de vanillinepieken die horen bij de duplo-injecties van de standaardoplossingen vóór en na iedere reeks testoplossingen (vier oppervlakken of piekhoogtes in totaal).

Bereken de responsfactor (R):

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

waarin CM gelijkstaat met de massa van de vanilline in mg (4.5.1).

Het gehalte (mg/kg) van vanilline (C) in het testmonster wordt verkregen door:

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

waarin:

AS= de piekoppervlakte van de vanillinepiek van het testmonster;

SM= de massa van het testmonster in g (5.1.1, 5.1.2 of 5.1.3).

Bij analyse van vanilline in room wordt de concentratie van de verklikstof uitgedrukt in mg/verklikstof/kg melkvet. Hiertoe wordt C vermenigvuldigd met 100/f. f is het vetgehalte van de room in procenten (m/m).

20= de factor die gebaseerd is op de verdunningen van de standaard en het testmonster;

0,96= de correctiefactor voor het vetgehalte in de eerste verdunning van het testmonster.

Opmerking:

In plaats van de piekoppervlakken kunnen piekhoogtes worden gebruikt (zie 8.3).

7. Nauwkeurigheid van de methode

7.1. Herhaalbaarheid (r)

Het verschil tussen de resultaten van twee bepalingen die binnen een zo kort mogelijke tijd door dezelfde persoon met dezelfde apparatuur zijn uitgevoerd op identiek monstermateriaal, mag niet groter zijn dan 16 mg/kg.

7.2. Reproduceerbaarheid (R)

Het verschil tussen de resultaten van twee bepalingen die door verschillende personen in verschillende laboratoria met verschillende apparatuur zijn uitgevoerd op identiek monstermateriaal, mag niet groter zijn dan 27 mg/kg.

8. Tolerantiegrenzen

8.1. Voor de controle op de homogene verdeling van de verklikstof in het product moeten drie monsters van het gemerkte product worden genomen.

8.2. Uit vanille of synthetische vanille vervaardigde verklikstof.

8.2.1. Het bijmengingsgehalte van 4-hydroxy-3-methoxybenzaldehyde bedraagt 250 g per ton boterconcentraat of boter. Bij toevoeging van verklikstoffen aan room bedraagt het bijmengingsgehalte 250 g per ton melkvet.

8.2.2. De uit analyse van het product verkregen resultaten van de drie monsters worden gebruikt om het gehalte aan en de homogene toevoeging van de verklikstof te verifiëren, en het laagste resultaat wordt vergeleken met de volgende waarden (kritisch verschil bij een waarschijnlijkheid van 95 % (CrD95)):

- 221,0 mg/kg (95 % van het minimum-bijmengingsgehalte);

- 159,0 mg/kg (70 % van het minimum-bijmengingsgehalte).

De concentratie van de verklikstof in het monster dat het laagste resultaat oplevert, wordt gebruikt in combinatie met interpolatie tussen 221,0 mg/kg en 159,0 mg/kg.

8.3. Uitsluitend uit vanillepeulen of integrale extracten daarvan vervaardigde verklikstof:

8.3.1. Het bijmengingsgehalte van 4-hydroxy-3-methoxybenzaldehyde bedraagt 100 g per ton boterconcentraat of boter. Bij toevoeging van verklikstoffen aan room bedraagt het bijmengingsgehalte 100 g per ton melkvet.

8.3.2. De uit analyse van het product verkregen resultaten van de drie monsters worden gebruikt om het gehalte aan en de homogene toevoeging van de verklikstof te verifiëren, en het laagste resultaat wordt vergeleken met de volgende waarden (kritisch verschil bij een waarschijnlijkheid van 95 % (CrD95)):

- 79,0 mg/kg (95 % van het minimum-bijmengingsgehalte);

- 54,0 mg/kg (70 % van het minimum-bijmengingsgehalte).

De concentratie van de verklikstof in het monster dat het laagste resultaat oplevert, wordt gebruikt in combinatie met interpolatie tussen 79,0 mg/kg en 54,0 mg/kg.

9. Aantekeningen

9.1. De herhaalbaarheid r is de waarde waaronder met een gespecificeerde waarschijnlijkheid het absolute verschil ligt tussen de resultaten die met dezelfde methode onder dezelfde omstandigheden (dezelfde apparatuur, hetzelfde laboratorium, en kort na elkaar) zijn verkregen bij twee enkelvoudige bepalingen uitgevoerd met identiek monstermateriaal; tenzij anders aangegeven, bedraagt die waarschijnlijkheid 95 %.

9.2. De reproduceerbaarheid R is de waarde waaronder met een gespecificeerde waarschijnlijkheid het absolute verschil ligt tussen de resultaten die met dezelfde methode onder verschillende omstandigheden (verschillende personen, verschillende laboratoria en/of verschillende tijdstippen) zijn verkregen bij twee enkelvoudige bepalingen uitgevoerd met identiek monstermateriaal; tenzij anders aangegeven, bedraagt die waarschijnlijkheid 95 %.

9.3. De recovery van toegevoegd vanilline bij een gehalte van 250 mg/kg butteroil varieert van 97,0 tot 103,8 %. Het gemiddelde gehalte dat gevonden werd, bedroeg 99,9 % met een standaardafwijking van 2,7 %.

9.4. De standaardoplossing bevat 5 % extractieoplossing ter compensatie van de piekverbreding als gevolg van de aanwezigheid van 5 % van de extractieoplossing van de testmonsters. Hierdoor is een kwantificering via de piekhoogte mogelijk.

9.5. De analyse is gebaseerd op een lineaire ijklijn door de oorsprong.

Door gebruikmaking van geschikte verdunningen van de standaardoplossing (4.5.2), moet de eerste keer dat de analyse wordt uitgevoerd en verder met regelmatige tussenpozen en na veranderingen in of herstel van de HPLC-apparatuur, de lineariteit worden gecontroleerd.

BIJLAGE XIII

(Artikel 9)

BEPALING VAN DE ETHYLESTER VAN β-APO-8'-CAROTEENZUUR IN BOTERCONCENTRAAT EN BOTER MET BEHULP VAN SPECTROMETRIE

1. Doel en toepassingsgebied

In deze methode wordt een werkwijze beschreven voor de kwantitatieve bepaling van de ethylester van β-apo-8'-caroteenzuur (apocaroteenzuurester) in boterconcentraat en boter. Onder apocaroteenzuurester wordt verstaan de totale hoeveelheid van alle stoffen in een extract van monsters, verkregen op de in de methode beschreven wijze, die bij 400 nm licht absorberen.

2. Principe

Het botervet wordt opgelost in petroleumether en vervolgens wordt de absorptie bij 440 nm gemeten. Het gehalte aan apocaroteenzuurester wordt met behulp van een externe standaard bepaald.

3. Apparatuur

3.1. Meetpipetten, 0,25, 0,50, 0,75 en 1,0 ml

3.2. Spectrofotometer, geschikt voor meting bij 440 nm (en 447-449 nm) en voorzien van cuvetten met een optische weglengte van 1 cm.

3.3. Maatkolven, 20 ml en 100 ml

3.4. Analytische balans, tot 1 mg nauwkeurig.

4. Reagentia

Alle reagentia moeten van analysekwaliteit zijn.

4.1. Suspensie van apocaroteenzuurester (ongeveer 20 %)

4.1.1. Bepaal het gehalte van deze suspensie als volgt:

Weeg nauwkeurig ongeveer 400 mg af in een maatkolf van 100 ml, los 20 ml chloroform op (4.4) en vul aan tot het gewenste volume met cyclohexaan (4.5). Vul 5 ml van deze oplossing aan tot 100 ml met cyclohexaan (oplossing A). Vul 5 ml van oplossing A aan tot 100 ml met cyclohexaan. Meet de absorptie bij 447-449 nm (meer het maximum door cyclohexaan als blanco te nemen en door bakjes van 1 cm optische weglengte te nemen.

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

Hierbij is:

Amax= maximale absorptie van de meetoplossing;

A= gewicht van het monster in gram;

2550= absorptie van een referentieoplossing (1 %, 1 cm);

P= het gehalte van de suspensie in %.

Opmerking:

Een suspensie van apocaroteenzuurester is gevoelig voor lucht, warmte en licht. Een ongeopende oorspronkelijke verpakking (luchtdicht onder stikstof) kan op een koele plaats gedurende ongeveer twaalf maanden worden bewaard. Na opening moet de inhoud binnen een korte periode worden gebruikt.

4.1.2. Standaardoplossing van apocaroteenzuurester, ongeveer 0,2 mg/ml

Weeg ongeveer 0,100 g suspensie van apocaroteenzuurester (4.1.1) (Wg) tot op 0,1 mg nauwkeurig af. Los op in petroleumether (4.2) en breng de oplossing kwantitatief over in een maatkolf van 100 ml en vul aan met petroleumether tot de maatstreep.

Deze oplossing bevat (W.P)/10 mg apocaroteenzuurester/ml.

Opmerking:

De oplossing moet op een koele donkere plaats worden bewaard. Na een maand is zij niet meer bruikbaar.

4.2. Petroleumether (40-60 °C).

4.3. Natriumsulfaat (watervrije korrels), vooraf gedurende twee uur gedroogd bij 102 °C.

4.4. Chloroform.

4.5. Cyclohexaan.

5. Procedure

5.1. Bereriding van het te analyseren monster

5.1.1. Boterconcentraat.

Smelt het monster in een oven bij ongeveer 45 °C.

5.1.2. Boter

Smelt het monster in een oven bij ongeveer 45 °C en filtreer een representatieve hoeveelheid in een omgeving zonder sterk natuurlijk of kunstlicht bij 45 °C over een filter dat 10 g watervrij natriumsulfaat (4.3) bevat. Vang een bruikbare hoeveelheid botervet op.

5.2. Analyse

Weeg ongeveer 1 g boterconcentraat of geëxtraheerd botervet (5.1.2) tot op 1 mg nauwkeurig af (Mg). Breng deze hoeveelheid met behulp van petroleumether (4.2) kwantitatief over in een maatkolf van 20 ml (V), vul aan tot de maatstreep en meng goed.

Breng een hoeveelheid hiervan over in een cuvet van 1 cm en meet de absorptie bij 440 nm met petroleumether als blanco. Lees de concentratie van apocaroteenzuurester in de oplossing af uit de ijkcurve (C μg/ml).

5.3. IJkcurve

Pipetteer 0, 0,25, 0,5, 0,75 en 1,0 ml van de standaardoplossing van apocaroteenzuurester (4.1.2) in vijf maatkolven van 100 ml. Vul met petroleumether (4.2) aan tot de maatstreep en meng.

De concentraties van de oplossingen liggen ongeveer tussen 0 en 2 μg/ml en worden nauwkeurig berekend aan de hand van de concentratie van de standaardoplossing (4.1.2): W.P/10 mg/ml. Meet de absorptie bij 440 nm met petroleumether als blanko.

Zet de absorptie op de y-as uit tegen de concentratie van apocaroteenzuurester op de x-as.

6. Berekening van de resultaten

6.1. Het gehalte aan apocaroteenzuurester, uitgedrukt als mg/kg product, is:

(C.V)/M voor boterconcentraat en

0,82 (C.V)/M voor boter

waarin:

C= het gehalte aan apocaroteenzuurester in μg/ml, afgelezen uit de ijkcurve (5.3)

V= volume (ml) van de testoplossing (5.2)

M= de massa van het geanalyseerde monster in gram (5.2)

0,82= een correctiefactor voor het gehalte van boter aan botervet.

7. Nauwkeurigheid van de methode

7.1. Herhaalbaarheid

7.1.1. Analyse van boter

Het verschil tussen de resultaten van twee bepalingen, binnen een zo kort mogelijke tijd uitgevoerd door dezelfde persoon met dezelfde apparatuur op hetzelfde monster, mag niet groter zijn dan 1,4 mg/kg.

7.1.2. Analyse van boterconcentraat

Het verschil tussen de resultaten van twee bepalingen, binnen een zo kort mogelijke tijd uitgevoerd door dezelfde persoon met dezelfde apparatuur op hetzelfde monster, mag niet groter zijn dan 1,6 mg/kg.

7.2. Reproduceerbaarheid.

7.2.1. Analyse van boter

Het verschil tussen de resultaten van twee bepalingen, uitgevoerd door personen in verschillende laboratoria met verschillende apparatuur op hetzelfde monster, mag niet groter zijn dan 4,7 mg/kg.

7.2.2. Analyse van boterconcentraat

Het verschil tussen de resultaten van twee bepalingen, uitgevoerd door personen in verschillende laboratoria met verschillende apparatuur op hetzelfde monster, mag niet groter zijn dan 5,3 mg/kg.

7.3. Herkomst van de precisiegegevens

De precisiegegevens zijn vastgesteld op basis van een experiment dat in 1995 in elf laboratoria werd uitgevoerd met twaalf monsters met verklikstoffen (zes blinde duplo's) voor boter en twaalf monsters met verklikstoffen (zes blinde duplo's) voor boterconcentraat.

8. Tolerantiegrenzen

8.1. Om na te gaan of de toevoeging van verklikstoffen aan het product op correcte wijze is gebeurd, moeten van dit product drie monsters worden genomen.

8.2. Boter

8.2.1. Het bijmengingsgehalte voor boter bedraagt, rekening houdend met de achtergrondabsorptie, 22 mg/kg.

8.2.2. De uit analyse van het product verkregen resultaten van de drie monsters worden gebruikt om het gehalte aan en de homogene toevoeging van de verklikstof te verifiëren, en het laagste resultaat wordt vegeleken met de volgende waarden (kritisch verschil bij een waarschijnlijkheid van 95 % (CrD95)):

- 18,0 mg/kg (95 % van het minimum-bijmengingsgehalte);

- 13,0 mg/kg (70 % van het minimum-bijmengingsgehalte).

De concentratie van de verklikstof in het monster dat het laagste resultaat oplevert, wordt gebruikt in combinatie met interpolatie tussen 18,0 mg/kg en 13,0 mg/kg.

8.3. Boterconcentraat

8.3.1. Het bijmengingsgehalte voor boterconcentraat bedraagt, rekening houdend met de achtergrondabsorptie, 24 mg/kg.

8.3.2. De uit analyse van het product verkregen resultaten van de drie monsters worden gebruikt om het gehalte aan en de homogene toevoeging van de verklikstof te verifiëren, en het laagste resultaat wordt vergeleken met de volgende waarden (kritisch verschil bij een waarschijnlijkheid van 95 % (CrD95)):

- 20,0 mg/kg (95 % van het minimum-bijmengingsgehalte);

- 14,0 mg/kg (70 % van het minimum-bijmengingsgehalte).

De concentratie van de verklikstof in het monster dat het laagste resultaat oplevert, wordt gebruikt in combinatie met interpolatie tussen 20,0 mg/kg en 14,0 mg/kg.

BIJLAGE XIV

(Artikel 9)

BEPALING VAN SITOSTEROL OF STIGMASTEROL IN BOTERCONCENTRAAT OF IN BOTER MET BEHULP VAN CAPILLAIRE GASCHROMATOGRAFIE

1. Doel en toepassingsgebied

In deze methode wordt een werkwijze beschreven voor de kwantitatieve bepaling van sitosterol of stigmasterol in boterconcentraat en boter. Onder sitosterol wordt verstaan de totale hoeveelheid (β-sitosterol en 22-dihydro-β-sitosterol; overige sitosterolen gelden als te verwaarlozen.

2. Uitgangspunt

Het boterconcentraat of de boter wordt verzeept met ethanolische kaliumhydroxide-oplossing, waarna de onverzeepbare bestanddelen worden geëxtraheerd met diethylether.

De sterolen worden omgezet in trimethylsilylethers en met behulp van capillaire gaschromatografie kwantitatief bepaald, waarbij betulinol als interne standaard wordt gebruikt.

3. Apparatuur

3.1. Kolf, 150 ml, voorzien van een refluxkoeler met slijpstukken.

3.2. Scheitrechters, 500 ml.

3.3. Kolven, 250 ml.

3.4. Tegendrukscheitrechters, 250 ml, of soortgelijke apparatuur voor het opvangen van gebruikte diethylether.

3.5. Glazen kolom, 350 mm x 20 mm, met een filterplaat van gesinterd glas.

3.6. Waterbad of verwarmingsmantel.

3.7. Reactieflesjes, 2 ml.

3.8. Gaschromatograaf, geschikt voor het werken met een capillaire kolom, bestaande uit:

3.8.1. een oven waarmee de kolommen op de gewenste temperatuur kunnen worden gehouden met een nauwkeurigheid van +- 1 °C;

3.8.2. een injector met regelbare temperatuur;

3.8.3. een vlamionisatiedetector met elektronische versterker;

3.8.4. elektronische rekenapparatuur (integrator), geschikt voor gebruik met een elektronische versterker (3.8.3).

3.9. Een fused-silica capillaire kolom, inwendig gecoat met BP1 of equivalent met een uniforme dikte van 0,25 μm; met deze kolom moet resolutie van de trimethylsilylderivaten van lanosterol en sitosterol mogelijk zijn. Hiervoor kan een BP1-kolom met een lengte van 12 m en een inwendige diameter van 0,2 mm worden gebruikt.

3.10. Injectiespuit, van ten hoogste 1 μl, geschikt voor de injector.

4. Reagentia

Alle reagentia dienen van analysekwaliteit te zijn. Het gebruikte water dient gedestilleerd water of water van gelijkwaardige zuiverheid te zijn.

4.1. Ethanol, minimaal 95 % zuiver.

4.2. Kaliumhydroxide, oplossing van 60 %. Los 600 g kaliumhydroxide (minimaal 85 %) op in water en vul aan met water tot 1 liter.

4.3. Betulinol, minimaal 99 % zuiver.

4.3.1. Oplossingen van betulinol in diethylether (4.4):

4.3.1.1. De concentratie van de betulinol-oplossing voor de bepaling van sitosterol moet 1,0 mg/ml zijn.

4.3.1.2. De concentratie van de betulinol-oplossing voor de bepaling van stigmasterol moet 0,4 mg/ml zijn.

4.4. Diethylether, van analysekwaliteit (peroxide- en restvrij).

4.5. Natriumsulfaat, watervrij, 2 uur gedroogd bij 102 °C.

4.6. Silyleringsreagens, b.v. TRI-SIL (verkrijgbaar bij Pierce Chemical Co, Cat. nr. 49001) of gelijkwaardig. (Waarschuwing: TRI-SIL is ontvlambaar, toxisch, bijtend en mogelijkerwijs carcinogeen. Het laboratoriumpersoneel moet op de hoogte zijn van de veiligheidsvoorschriften voor TRI-SIL en de nodige voorzorgsmaatregelen nemen.)

4.7. Lanosterol.

4.8. Sitosterol, bekende zuiverheid (P) minimaal 90 %.

Opmerking 1:

De zuiverheid van het voor de ijking gebruikte standaardmateriaal moet volgens de interne normalisatiemethode worden bepaald. Aangenomen wordt dat alle in het monster aanwezige sterolen in het chromatogram voorkomen, dat het totale piekoppervlak overeenkomt met 100 % van de sterol-bestanddelen en dat de detector voor alle sterolen dezelfde respons geeft. Gecontroleerd moet worden of het systeem op het bij de analyse gebruikte concentratiebereik lineair is.

4.8.1. Sitosterol-standaardoplossing: bereid een oplossing die, tot op 0,001 mg/ml nauwkeurig, ongeveer 0,5 mg/ml (W1) sitosterol (4.8) in diethylether (4.4) bevat.

4.9. Stigmasterol, bekende zuiverheid (P) minimaal 90 %.

4.9.1. Stigmasterol-standaardoplossing: bereid een oplossing die, tot op 0,001 mg/ml nauwkeurig, ongeveer 0,2 mg/ml (W1) stigmasterol (4.9) in diethylether (4.4) bevat.

4.10. Mengsel voor controle van de resolutie: bereid een oplossing die 0,05 mg/ml lanosterol (4.7) en 0,5 mg/ml sitosterol (4.8) in diethylether (4.4) bevat.

5. Werkwijze

5.1. Bereiding van de standaardoplossingen voor chromatografie: de interne standaardoplossing (4.3.1.) moet op hetzelfde moment aan de desbetreffende standaardoplossing met sterolen en aan het verzeepte monster (5.2.2.) worden toegevoegd.

5.1.1. Standaardoplossing sitosterol voor chromatografie: breng 1 ml van de standaardoplossing sitosterol (4.8.1) in elk van twee reactieflesjes (3.7) en verdamp de diethylether met een stikstofstroom. Voeg 1 ml interne standaardoplossing (4.3.1.1) toe en verdamp de diethylether met een stikstofstroom.

5.1.2. Standaardoplossing stigmasterol voor chromatografie: breng 1 ml van de standaardoplossing stigmasterol (4.9.1 ) in elk van de twee reactieflesjes (3.7) en verdamp de diethylether met een stikstofstroom. Voeg 1 ml interne standaardoplossing (4.3.1.2) toe en verdamp de diethylether met een stikstofstroom.

5.2. Bereiding van de onverzeepbare bestanddelen

5.2.1. Laat het botermonster smelten door verwarming tot ten hoogste 35 °C, meng het monster zorgvuldig door het te roeren.

Weeg tot op 1 mg nauwkeurig ongeveer 1 g boter (W2) of boterconcentraat (W2) af in een kolf van 150 ml (3.1). Voeg 50 ml ethanol (4.1) en 10 ml kaliumhydroxide-oplossing (4.2) toe. Bevestig de refluxkoeler, verwarm tot ongeveer 75 °C en handhaaf deze temperatuur gedurende 30 minuten. Verwijder de koeler en laat de kolf afkoelen tot kamertemperatuur.

5.2.2. Voeg 1,0 ml interne standaardoplossing toe (4.3.1.1 als sitosterol wordt bepaald of 4.3.1.2 als stigmasterol wordt bepaald). Meng zorgvuldig en breng de inhoud van de kolf kwantitatief over in een scheitrechter van 500 ml (3.2), waarna de kolf achtereenvolgens wordt gewassen met 50 ml water en 250 ml diethylether (4.4). Schud de scheitrechter krachtig gedurende 2 minuten en wacht tot de fasen gescheiden zijn. Laat de waterige onderlaag weglopen en was de etherlaag door viermaal te schudden met 100 ml water.

Opmerking 2:

Om emulsievorming te voorkomen moet het wassen met water de eerste tweemaal voorzichtig gebeuren (tienmaal omkeren). De derde maal kan gedurende 30 seconden krachtig worden geschud. Indien er een emulsie ontstaat, kan deze worden afgebroken door 5-10 ml ethanol toe te voegen. Indien ethanol wordt toegevoegd, moet er nog eens tweemaal krachtig met water worden gewassen.

5.2.3. Laat de heldere zeepvrije etherlaag door een glazen kolom (3.5) met 30 g watervrij natriumsulfaat (4.5) lopen. Vang de ether op in een kolf van 250 ml (3.3). Voeg een kooksteentje toe en damp de oplossing vrijwel droog op een waterbad of met een verwarmingsmantel. Zorg er daarbij voor dat het verdampte oplosmiddel wordt opgevangen.

Opmerking 3:

Als de vloeistof bij een te hoge temperatuur volledig wordt ingedampt, is het mogelijk dat er ook sterolen verloren gaan.

5.3. Bereiding van de trimethylsilylethers

5.3.1. Breng de in de kolf resterende etheroplossing over in een reactieflesje van 2 ml (3.7) met 2 ml diethylether en verdamp de ether met een stikstofstroom. Was de kolf tweemaal als volgt: breng 2 ml diethylether in de kolf, breng deze over naar het reactieflesje en verdamp de ether met stikstof.

5.3.2. Silyleer het monster door 1 ml TRI-SIL (4.6) toe te voegen. Sluit het vat af en schud krachtig om de sterolen op te lossen. Verwarm, als de sterolen niet volledig oplossen, tot 65-70 °C. Laat de oplossing gedurende ten minste 5 minuten staan alvorens deze in de gaschromatograaf te injecteren. Silyleer de standaardoplossing en het mengsel om de resolutie op dezelfde manier te controleren als de monsters (4.10).

Opmerking 4:

Het silyleren moet in een watervrije omgeving gebeuren. Wanneer betulinol onvolledig is gesilyleerd, verschijnt er vlak bij de betulinol-piek een tweede piek.

Het silyleringsproces wordt gestoord door de aanwezigheid van ethanol in de oplossing, die een gevolg kan zijn van onvoldoende wassen na de extractie. Indien dit probleem aanhoudt, was dan na de extractie een vijfde maal, waarbij gedurende 30 seconden krachtig wordt geschud.

5.4. Gaschromatografie

5.4.1. Keuze van de werkomstandigheden:

Volg voor de instelling van de gaschromatograaf de instructies van de fabrikant op.

Voor de werkomstandigheden gelden de volgende richtlijnen:

- kolomtemperatuur: 265 °C

- injectortemperatuur: 280 °C

- detectortemperatuur: 300 °C

- stroomsnelheid draaggas: 0,6 ml/min.

- waterstofdruk: 84 kPa

- luchtdruk: 155 kPa

- splitverhouding: van 10: 1 tot 50: 1; de splitverhouding moet volgens de instructies van de fabrikant worden geoptimaliseerd en vervolgens moet worden gecontroleerd of de respons van de detector op het gebruikte concentratiebereik lineair is.

Opmerking 5:

Het is vooral belangrijk dat de liner van de injector regelmatig wordt schoongemaakt.

- geïnjecteerde hoeveelheid: 1 μl TMSE-oplossing.

Laat het systeem equilibreren en begin niet met de analyse voordat de respons voldoende stabiel is.

Stel de omstandigheden, die afhankelijk van de kenmerken van de kolom en de gaschromatograaf zijn, zodanig in, dat er chromatogrammen worden verkregen die aan de volgende eisen voldoen:

- de resolutie tussen de sitosterol-piek en de lanosterol-piek moet afdoende zijn. Bij een gesilyleerd mengsel voor controle op de resolutie (4.10) moet een soortgelijk chromatogram worden verkregen als in figuur 1 is weergegeven,

- voor onderstaande sterolen moet ongeveer de daarbij vermelde relatieve retentietijd worden verkregen:

cholesterol: 1,0

stigmasterol: 1,3

sitosterol: 1,5

betulinol: 2,5

- de retentietijd voor betulinol moet ongeveer 24 minuten zijn.

5.4.2. Analyse:

Injecteer 1 μl gesilyleerde standaardoplossing (stigmasterol of sitosterol) en stel de kalibratieparameters van de integrator in.

Injecteer 1 μl gesilyleerde standaardoplossing om de responsfactor in vergelijking met betulinol te bepalen.

Injecteer 1 μl gesilyleerde monsteroplossing en meet de piekoppervlakken. Voor en na elke chromatografische reeks moet er 1 μl standaardoplossing worden geïnjecteerd.

Als leidraad kan worden gesteld dat vóór en na elke reeks van 6 monsteroplossingen de standaardoplossing wordt geïnjecteerd.

Opmerking 6:

Bij de integratie van de stigmasterol-piek moet ook het oppervlak van eventuele staarten, zoals aangegeven bij de punten 1, 2 en 3 in figuur 2b, worden meegerekend.

Wanneer de totale hoeveelheid sitosterol wordt bepaald, moet bij de integratie van de sitosterol-piek ook het oppervlak van de piek van 22-dihydro-β-sitosterol (stigmastanol), dat vlak na sitosterol evolueert, worden meegerekend.

6. Berekening van de resultaten

6.1. Bepaal het oppervlak van de sterol-pieken en de betulinol-pieken bij de standaardoplossingen voor en na een reeks en bereken R1:

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

Bepaal het oppervlak van de sterol-piek (stigmasterol en sitosterol) en de betulinolpiek in de monsteroplossing en bereken R2:

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

W1= sterolconcentratie van de standaard in de standaardoplossing (4.8.1 of 4.9.1) in mg/ml;

W2= gewicht van het monster in gram (5.2.1);

P= zuiverheid van de standaard-sterol (4.8 of 4.9);

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

7. Nauwkeurigheid van de methode

7.1. Boter

7.1.1. Herhaalbaarheid

7.1.1.1. Stigmasterol

Het verschil tussen de resultaten van twee bepalingen, binnen een zo kort mogelijke tijd uitgevoerd door dezelfde persoon met dezelfde apparatuur op hetzelfde monster, mag niet groter zijn dan 19,3 mg/kg.

7.1.1.2. Sitosterol

Het verschil tussen de resultaten van twee bepalingen, binnen een zo kort mogelijke tijd uitgevoerd door dezelfde persoon met dezelfde apparatuur op hetzelfde monster, mag niet groter zijn dan 23,0 mg/kg.

7.1.2. Reproduceerbaarheid

7.1.2.1. Stigmasterol

Het verschil tussen de resultaten van twee bepalingen, uitgevoerd door personen in verschillende laboratoria met verschillende apparatuur op hetzelfde monster, mag niet groter zijn dan 31,9 mg/kg.

7.1.2.2. Sitosterol

Het verschil tussen de resultaten van twee bepalingen, uitgevoerd door personen in verschillende laboratoria met verschillende apparatuur op hetzelfde monster, mag niet groter zijn dan 8,7 % van het gemiddelde van de bepalingen.

7.1.3. Herkomst van de precisiegegevens

De precisiegegevens zijn vastgesteld op basis van een experiment dat in 1992 in acht laboratoria werd uitgevoerd met zes monsters (drie blinde duplo's) voor stigmasterol en zes monsters (drie blinde duplo's) voor sitosterol.

7.2. Boterconcentraat

7.2.1. Herhaalbaarheid

7.2.1.1. Stigmasterol

Het verschil tussen de resultaten van twee bepalingen, binnen een zo kort mogelijke tijd uitgevoerd door dezelfde persoon met dezelfde apparatuur op hetzelfde monster, mag niet groter zijn dan 10,2 mg/kg.

7.2.1.2. Sitosterol

Het verschil tussen de resultaten van twee bepalingen, binnen een zo kort mogelijke tijd uitgevoerd door dezelfde persoon met dezelfde apparatuur op hetzelfde monster, mag niet groter zijn dan 3,6 % van het gemiddelde van de bepalingen.

7.2.2. Reproduceerbaarheid

7.2.2.1. Stigmasterol

Het verschil tussen de resultaten van twee bepalingen, uitgevoerd door personen in verschillende laboratoria met verschillende apparatuur op hetzelfde monster, mag niet groter zijn dan 25,3 mg/kg.

7.2.2.2. Sitosterol

Het verschil tussen de resultaten van twee bepalingen, uitgevoerd door personen in verschillende laboratoria met verschillende apparatuur op hetzelfde monster, mag niet groter zijn dan 8,9 % van het gemiddelde van de bepalingen.

7.2.3. Herkomst van de precisiegegevens

De precisiegegevens zijn vastgesteld op basis van een experiment dat in 1991 in negen laboratoria werd uitgevoerd met zes monsters (drie blinde duplo's) voor stigmasterol en zes monsters (drie blinde duplo's) voor sitosterol.

8. Tolerantiegrenzen

8.1. Om na te gaan of de toevoeging van verklikstoffen aan het product op correcte wijze is gebeurd, moeten van dit product drie monsters worden genomen.

8.2. Boter

8.2.1. Stigmasterol

8.2.1.1. Het bijmengingsgehalte voor stigmasterol bedraagt 150 g met een zuiverheid van ten minste 95 % per ton boter, d.w.z. 142,5 mg/kg, of 170 g met een zuiverheid van ten minste 85 % per ton boter, d.w.z. 144,5 mg/kg.

8.2.1.2. De uit analyse van het product verkregen resultaten van de drie monsters worden gebruikt om het gehalte aan en de homogene toevoeging van de verklikstof te verifiëren, en het laagste resultaat wordt vergeleken met de volgende waarden (kritisch verschil bij een waarschijnlijkheid van 95 % (CrD95)):

- 116,0 mg/kg (95 % van het minimum-bijmengingsgehalte voor 95 % zuiver stigmasterol);

- 118,0 mg/kg (95 % van het minimum-bijmengingsgehalte voor 95 % zuiver stigmasterol);

- 81,0 mg/kg (70 % van het minimum-bijmengingsgehalte voor 95 % zuiver stigmasterol);

- 82,0 mg/kg (70 % van het minimum-bijmengingsgehalte voor 85 % zuiver stigmasterol).

De concentratie van de verklikstof in het monster dat het laagste resultaat oplevert, wordt gebruikt in combinatie met interpolatie tussen 116,0 mg/kg en 81,0 mg/kg, respectievelijk 118,0 mg/kg en 82,0 mg/kg.

8.2.2. Sitosterol

8.2.2.1. Het bijmengingsgehalte voor sitosterol bedraagt 600 g met ten minste 90 % zuiver sitosterol per ton boter, d.w.z. 540 mg/kg.

8.2.2.2. De uit analyse van het product verkregen resultaten van de drie monsters worden gebruikt om het gehalte aan en de homogene toevoeging van de verklikstof te verifiëren, en het laagste resultaat wordt vergeleken met de volgende waarden (kritisch verschil bij een waarschijnlijkheid van 95 % (CrD95)):

- 486,0 mg/kg (95 % van het minimum-bijmengingsgehalte voor 90 % zuiver sitosterol);

- 358,0 mg/kg (70 % van het minimum-bijmengingsgehalte voor 90 % zuiver sitosterol).

De concentratie van de verklikstof in het monster dat het laagste resultaat oplevert, wordt gebruikt in combinatie met interpolatie tussen 486,0 mg/kg en 358,0 mg/kg.

8.3. Boterconcentraat

8.3.1. Stigmasterol

8.3.1.1. Het bijmengingsgehalte voor stigmasterol bedraagt 150 g met een zuiverheid van ten minste 95 % per ton boterconcentraat, d.w.z. 142,5 mg/kg of 170 g met een zuiverheid van ten minste 85 % per ton boterconcentraat, d.w.z. 144,5 mg/kg.

8.3.1.2. De uit analyse van het product verkregen resultaten van de drie monsters worden gebruikt om het gehalte aan en de homogene toevoeging van de verklikstof te verifiëren, en het laagste resultaat wordt vergeleken met de volgende waarden (kritisch verschi1 bij een waarschijnlijkheid van 95 % (CrD95)):

- 120,0 mg/kg (95 % van het minimum-bijmengingsgehalte voor 95 % zuiver stigmasterol);

- 122,0 mg/kg (95 % van het minimum-bijmengingsgehalte voor 85 % zuiver stigmasterol);

- 84,0 mg/kg (70 % van het minimum-bijmengingsgehalte voor 95 % zuiver stigmasterol);

- 86,0 mg/kg (70 % van het minimum-bijmengingsgehalte voor 85 % zuiver stigmasterol).

De concentratie van de verklikstof in het monster dat het laagste resultaat oplevert, wordt gebruikt in combinatie met interpolatie tussen 120,0 mg/kg en 84,0 mg/kg, respectievelijk 122,0 mg/kg en 86,0 mg/kg.

8.3.2. Sitosterol

8.3.2.1. Het bijmengingsgehalte voor sitosterol bedraagt 600 g met ten minste 90 % zuiver sitosterol per ton boterconcentraat, d.w.z. 540 mg/kg.

8.3.2.2. De uit analyse van het product verkregen resultaten van de drie monsters worden gebruikt om het gehalte aan en de homogene toevoeging van de verklikstof te verifiëren, en het laagste resultaat wordt vergeleken met de volgende waarden (kritisch verschil bij een waarschijnlijkheid van 95 % (CrD95)):

- 486,0 mg/kg (95 % van het minimum-bijmengingsgehalte voor 90 % zuiver sitosterol);

- 358,0 mg/kg (70 % van het minimum-bijmengingsgehalte voor 90 % zuiver sitosterol).

De concentratie van de verklikstof in het monster dat het laagste resultaat oplevert, wordt gebruikt in combinatie met interpolatie tussen 486,0 mg/kg en 358,0 mg/kg.

>PIC FILE= "L_2001037NL.004801.EPS">

>PIC FILE= "L_2001037NL.004901.EPS">

>PIC FILE= "L_2001037NL.005001.EPS">

BIJLAGE XV

(Artikel 10)

REFERENTIEMETHODE VOOR DE OPSPORING VAN KOEMELK EN KOEMELKCASEÏNAAT IN KAAS VAN SCHAPEN-, GEITEN- OF BUFFELMELK OF VAN MENGSELS VAN SCHAPEN-, GEITEN- EN BUFFELMELK

1. Doel

Detectie van koemelk en koemelkcaseïnaat in kaas van schapen-, geiten- of buffelmelk of mengsels van schapen-, geiten- en buffelmelk door middel van iso-elektrische focussering van γ-caseïnen na plasminolyse.

2. Toepassingsgebied

De methode is bruikbaar voor een gevoelige specifieke detectie van niet-warmtebehandelde en warmtebehandelde koemelk, alsmede van koemelkcaseïnaat in verse en gerijpte kaas die is gemaakt van schapen-, geiten- of buffelmelk of mengsels van schapen-, geiten- en buffelmelk. Zij is niet geschikt voor de opsporing van melk- en kaasvervalsing door gebruik van warmtebehandelde concentraten van eiwit uit wei van runderen.

3. Principe van de methode

3.1. Isoleren van caseïnen uit kaas en uit de standaarden.

3.2. De geïsoleerde caseïnen worden opgelost en geïncubeerd met plasmine (EC.3.4.21.7).

3.3. De met plasmine behandelde caseïnen worden iso-elektrisch gefocusseerd in aanwezigheid van ureum en de eiwitten worden gekleurd.

3.4. De gekleurde patronen van γ3-caseïne en γ-caseïne (aanwijzing voor koemelk) worden beoordeeld door vergelijken van het met het monster verkregen patroon met het patroon dat in dezelfde gel van de standaarden met 0 % en 1 % koemelk is verkregen.

4. Reagentia

Tenzij anders aangegeven, worden chemicaliën van analysekwaliteit gebruikt. Water is tweemaal gedestilleerd of van gelijkwaardige zuiverheid.

Opmerking:

De onderstaande bijzonderheden zijn van toepassing op in eigen laboratorium vervaardigde ureum bevattende polyacrylamide-gels van 265 x 125 x 0,25 mm. Bij gebruik van gels van een ander type of met andere afmetingen worden de scheidingsomstandigheden zo nodig aangepast.

Iso-elektrische focussering

4.1. Reagentia voor de bereiding van de ureum bevattende polyacrylamide-gels

4.1.1. Voorraad-geloplossing

Los op in water:

4,85 g acrylamide

0,15 g N, N'-methyleen-bis-acrylamide (BIS)

48,05 g ureum

15,00 g glycerol (87 % m/m),

en vul aan tot 100 ml. Bewaar de oplossing in een bruine glazen fles in de koelkast.

Opmerking:

In plaats van de genoemde afgewogen hoeveelheden van de neurotoxische acrylamiden kan een in de handel verkrijgbare gerede oplossing van acrylamide/BIS worden gebruikt. Indien een dergelijke oplossing 30 % m/v acrylamide en 0,8 % m/v BIS bevat, wordt een volume van 16,2 ml gebruikt in plaats van de aangegeven gewichten. De houdbaarheid van de voorraadoplossing is maximaal tien dagen; indien de geleidbaarheid meer dan 5 μS bedraagt wordt gedeïoniseerd door 30 minuten roeren met 2 g Amberlite MB-3, gevolgd door filtreren door een 0,45 μm membraan.

4.1.2. Geloplossing

Een geloplossing wordt bereid door mengen van chemicaliën en amfolyten met de voorraad-geloplossing (zie 4.1.1).

9,0 ml voorraadoplossing

24 mg β-alanine

500 μl amfolyt pH 3,5-9,5(1)

250 μl amfolyt pH 5-7(2)

250 μl amfolyt pH 6-8(3).

De geloplossing wordt gemengd en 2 tot 3 minuten in een ultrasoon bad of onder verminderde druk ontgast.

Opmerking:

De geloplossing wordt vlak voor het gieten van de gel (zie 6.2) bereid.

4.1.3. Katalysatoroplossingen

4.1.3.1. N, N, N', N'-tetramethyl-ethyleendiamine (TEMED)

4.1.3.2. 40 % m/v ammoniumpersulfaat (PER):

800 mg PER wordt opgelost in 2 ml water.

Opmerking:

Er wordt altijd een vers bereide PER-oplossing gebruikt.

4.2. Contactvloeistof

Petroleum of vloeibare paraffine

4.3. Anodeoplossing

5,77 g fosforzuur (85 % m/m) wordt met water tot 100 ml aangevuld.

4.4. Kathodeoplossing

2,00 g natriumhydroxide wordt in water opgelost en tot 100 ml met water verdund.

Monstervoorbereiding

4.5. Reagentia voor eiwitisolatie

4.5.1. Verdund azijnzuur (25,0 ml ijsazijn verdund met water tot 100 ml).

4.5.2. Dichloormethaan

4.5.3. Aceton

4.6. Eiwitoplossende buffer

5,75 g glycerol (87 % m/m)

24,03 g ureum

250 mg dithiotreïtol

worden in gedestilleerd water opgelost en tot 50 ml aangevuld.

Opmerking:

Wordt in de koelkast bewaard; houdbaarheid één week.

4.7. Reagentia voor plasminesplitsing van caseïnen

4.7.1. Ammoniumcarbonaatbuffer

Een 0,2 mol/l oplossing van ammoniumwaterstofcarbonaat (1,58 g/100 ml water) bevattende 0,05 mol/l ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA, 1,46 g/100 ml), wordt tot pH 8 getitreerd met een 0,2 mol/l oplossing van ammoniumcarbonaat (1,92 g/100 ml water) bevattende 0,05 mol/l EDTA.

4.7.2. Runderplasmine (EC. 3.4.21.7), activiteit ten minste 5 U/ml

4.7.3. ε-aminocapronzuur voor enrymremming

2,624 g ε-aminocapronzuur (6-amino-n-hexaanzuur) wordt opgelost in 100 ml 40 % (v/v) ethanol.

4.8. Standaarden

4.8.1. Gecertificeerde standaarden van een mengsel van gestremde magere geitenmelk met 0 % en 1 % koemelk, zijn verkrijgbaar bij het Instituut voor referentiematerialen en -metingen van de Commissie, B-2440 Geel, België.

4.8.2. Bereiding van voorlopige laboratoriumstandaarden van gestremde buffelmelk met 0 % en 1 % koemelk.

Magere melk wordt bereid door 20 minuten losse rauwe buffelmelk, of koemelk bij 37 °C bij 2500 g te centrifugeren. Nadat de buis met inhoud snel tot 6-8 °C is afgekoeld, wordt de bovendrijvende vetlaag volledig verwijderd. Voor de bereiding van de standaard van 1 % wordt in een bekerglas van 1 liter 5,00 ml magere koemelk aan 495 ml magere buffelmelk toegevoegd, waarna de pH door toevoeging van verdund melkzuur (10 % m/v) op 6,4 wordt gebracht. De temperatuur wordt op 35 °C ingesteld, waarna 100 μl kalfsstremsel (1:10000, circa 3000 U/ml) wordt toegevoegd, één minuut wordt geroerd en de beker één uur afgedekt met aluminiumfolie op 35 °C wordt gehouden zodat de wrongel zich kan vormen. Nadat de wrongel is gevormd, wordt de gestremde melk in zijn geheel gevriesdroogd, zonder voorafgaand homogeniseren of aftappen van de wei. Na het vriesdrogen wordt het product fijngemalen tot een homogeen poeder. Voor de bereiding van de 0 % standaard wordt dezelfde werkwijze gevolgd, met gebruikmaking van zuivere magere buffelmelk. De standaarden moeten bij - 20 °C worden opgeslagen.

Opmerking:

Het verdient aanbeveling de zuiverheid van de buffelmelk voor de bereiding van de standaarden te controleren door middel van iso-elektrische focussering van de met plasmine behandelde caseïnen.

Reagentia voor eiwitkleuring

4.9. Fixeeroplossing

150 ml trichloorazijnzuur wordt opgelost in water en tot 1000 ml aangevuld.

4.10. Ontkleuroplossing

500 ml methanol en 200 ml ijsazijn worden met gedestilleerd water tot 2000 ml aangevuld.

Opmerking:

De ontkleuroplossing wordt dagelijks vers bereid; dit kan gebeuren door gelijke volumes van de voorraadoplossing van 50 % (v/v) methanol en 20 % (v/v) ijsazijn met elkaar te mengen.

4.11. Kleuroplossingen

4.11.1. Kleuroplossing (voorraadoplossing 1)

3,0 g Coomassie briljantblauw G 250 (Color Index 42655) wordt met behulp van een magneetroerder in ongeveer 45 minuten opgelost in 1000 ml 90 % (v/v) methanol, waarna wordt afgefiltreerd door twee middelsnelle vouwfilters.

4.11.2. Kleuroplossing (voorraadoplossing 2)

5,0 g kopersulfaat-pentahydraat wordt opgelost in 1000 ml 20 % (v/v) azijnzuur.

4.11.3. Kleuroplossing (werkoplossing)

125 ml van elk van de voorraadoplossingen (4.11.1, 4.11.2) wordt vlak voor de kleurreactie gemengd.

Opmerking:

De kleuroplossing dient te worden bereid op de dag van gebruik.

5. Apparatuur

5.1. Glasplaten (265 x 125 x 4 mm); rubberen rol (breedte 15 cm); vlakke tafel

5.2. Gel-dragerfolie (265 x 125 mm)

5.3. Afdekfolie (280 x 125 mm). Langs beide zijden wordt een strook plakband (280 x 6 x 0,25 mm) gehecht (zie figuur 1).

5.4. Elektrofocusseringskamer met koelplaat (bv. 265 x 125 mm) met geschikte spanningsbron (>= 2,5 kV) of automatische elektroforese-inrichting.

5.5. Rondpompcryostaat, gethermostatifeerd op 12 +- 0,5 °C

5.6. Centrifuge, instelbaar op 3000 g

5.7. Elektrodestroken (>= 265 mm lang)

5.8. Plastic druppelflessen voor anodeoplossing en kathodeoplossing

5.9. Monsterdragers (10 x 5 mm viscose of weinig eiwitabsorberend filtreerpapier)

5.10. Roestvast stalen schaar, mes en pincet

5.11. Roestvast stalen of glazen kleurings- en ontkleuringsschalen (bv. instrumentbakjes van 280 x 150 mm)

5.12. Instelbare staafhomogenisator (schachtdiameter 10 mm), snelheidsregeling tussen 8000 en 20000 tpm

5.13. Magneetroerder

5.14. Ultrasoonbad

5.15. Filmlasapparaat

5.16. Micropipetten van 5-25 μl

5.17. Vacuümverdamper of vriesdroger

5.18. Thermostatisch geregeld waterbad, instelbaar op 35 en 40 +- 1 °C, met schudinrichting

5.19. Densitometer met aflezing bij λ = 634 nm

6. Werkwijze

6.1. Monstervoorbereiding

6.1.1. Isoleren van caseïnen

Een met 5 g droge massa overeenkomende hoeveelheid kaas of standaard wordt afgewogen in een centrifugebuis van 100 ml, er wordt 60 ml gedestilleerd water toegevoegd en gehomogeniseerd met een staafhomogenisator (8000-10000 tpm). De pH wordt met verdund azijnzuur (4.5.1) op 4,6 gebracht en het geheel wordt gecentrifugeerd (5 minuten, 3000 g). Het vet en de wei worden gedecanteerd, het residu wordt in 40 ml gedestilleerd water (met verdund azijnzuur (4.5.1) op pH 4,5 gebracht) gehomogeniseerd (20000 tpm), er wordt 20 ml dichloormethaan (4.5.2) toegevoegd, waarna opnieuw wordt gehomogeniseerd en wordt gecentrifugeerd (5 minuten, 3000 g). De caseïnelaag, die tussen de waterfase en de organische fase drijft (zie figuur 2), wordt met een spatel opgetrokken en beide fasen worden afgeschonken. De caseïne wordt opnieuw gehomogeniseerd in 40 ml gedestilleerd water (zie boven) en 20 ml dichloormethaan (4.5.2) en gecentrifugeerd. Deze bewerkingen worden herhaald totdat de beide extractiefasen kleurloos zijn (2 tot 3 maal). Het eiwitresidu wordt gehomogeniseerd met 50 ml droge aceton (4.5.3) en door een middelsnel vouwfilterpapier gefiltreerd. Het residu op het filter wordt tweemaal met telkens 25 ml aceton gewassen, aan de lucht of onder een stikstofstroom gedroogd en in een mortier verpoederd.

Opmerking:

Droge geïsoleerde caseïnen moeten bij - 20 °C worden bewaard.

6.1.2. Plasminesplitsing van β-caseïnen ter versterking van γ-caseïnen

25 mg geïsoleerde caseïne (6.1.1) wordt gesuspendeerd in 0,5 ml ammoniumcarbonaat-buffer (4.7.1) en 20 minuten gehomogeniseerd, in een ultrasone behandeling. Na verwarming tot 40 °C wordt 10 μl plasmine (4.7.2) toegevoegd, gemengd en één uur bij 40 °C onder voortdurend schudden geïncubeerd. Hierna wordt ter remming van het enzym 20 μl ε-aminocapronzuuroplossing (4.7.3) toegevoegd, waarna 200 mg vast ureum en 2 mg dithiotreïtol worden toegevoegd.

Opmerking:

Teneinde meer symmetrie in de gefocusseerde caseïnebanden te verkrijgen verdient het aanbeveling de oplossing na de toevoeging van het ε-aminocapronzuur te vriesdrogen en de residuen vervolgens in 0,5 ml ureumbuffer (4.6) op te lossen.

6.2. Bereiding van de ureumhoudende acrylamidegels

Het gel-dragerfolie (5.2) wordt met behulp van enkele druppels water op een glasplaat (5.1) gerold, waarna eventueel overtollig water met een papieren handdoek of een tissue wordt verwijderd. Het afdekfolie (5.3) wordt op dezelfde wijze met afstandhouders (0,25 mm) op een tweede glasplaat gerold. De plaat wordt horizontaal op een vlakke tafel gelegd.

Aan de bereide en ontluchte geloplossing (4.1.2) wordt van elk van de katalysatoroplossingen van TEMED en PER (4.1.3.2) 10 μl toegevoegd, waarna het geheel kort wordt gemengd en gelijkmatig over het midden van het dekblad uitgegoten. Plaats de plaat met het gel-dragerfolie op een smalle kant en met de bladkant naar beneden op het afdekfolie en laat de plaat met het gel-dragerfolie langzaam zakken, zodat zich tussen de bladen een gelfilm vormt die zich gelijkmatig en zonder bellen verspreidt (zie figuur 3). De plaat met het gel-dragerfolie wordt helemaal naar beneden gelaten, waarbij een dunne spatel wordt gebruikt, en bij wijze van gewicht worden nog drie glasplaten op de plaat gelegd. Wanneer de polymerisatie is voltooid (ongeveer 60 minuten), wordt de op de plaat met het gel-dragerfolie gepolymeriseerde gel samen met het afdekfolie door tikken op de glasplaten verwijderd. De achterkant van de plaat met het gel-dragerfolie wordt zorgvuldig van gelresten en ureum ontdaan. De "gel-sandwich" wordt in plasticfolie gelast en bewaard in de koelkast (maximaal zes weken).

Opmerking:

De afdekfolie met afstandhouders kan opnieuw worden gebruikt. De polyacrylamidegel kan in kleinere stukken worden gesneden, hetgeen aanbeveling verdient wanneer er weinig monsters zijn of wanneer een automatische elektroforese-inrichting wordt gebruikt (twee gels, afmetingen 4,5 x 5 cm).

6.3. Iso-elektrische focussering

De koelthermostaat wordt op 12 °C ingesteld. De achterkant van het gel-dragerfolie wordt met petroleum afgeveegd, waarna midden op het koelblok enkele druppels petroleum (4.2) worden aangebracht. De gel-sandwich wordt met de dragerzijde naar beneden op het koelblok gelegd, waarbij ervoor wordt gezorgd dat er geen bellen ontstaan. Eventuele overtollige petroleum wordt weggeveegd en het afdekfolie wordt verwijderd. De elektrodestroken worden in de elektrodeoplossingen (4.3, 4.4) nat gemaakt, op de lengte van de gel afgeknipt en op de in aanmerking komende posities aangebracht (afstand tussen de elektroden 9,5 cm).

De focussering wordt uitgevoerd onder de onderstaande omstandigheden:

6.3.1. Gelformaat: 265 x 125 x 0,25 mm

>RUIMTE VOOR DE TABEL>

Opmerking:

Indien de dikte of de breedte van de gels wordt veranderd, dienen de waarden voor de stroomsterkte en het vermogen te worden aangepast (bv. tweemaal zo hoge waarden voor de stroomsterkte en voor het vermogen bij gebruik van een gel van 265 x 125 x 0,5 mm).

6.3.2. Voorbeeld van een voltageprogramma voor een automatische elektroforese-inrichting (twee gels van 5,0 x 4,5 cm), elektroden zonder stroken rechtstreeks op de gel aangebracht

>RUIMTE VOOR DE TABEL>

De monsterdrager wordt in stap 2 bij 0 Vh aangebracht.

De monsterdrager wordt in stap 2 bij 30 Vh verwijderd.

6.4. Eiwitkleuring

6.4.1. Eiwit-fixering

Direct na het uitschakelen van de stroom worden de elektrodestroken verwijderd en wordt de gel in een kleurings-/ontkleuringsschaal met 200 ml fixeermiddel (4.9) gebracht; 15 minuten laten staan onder voortdurend schudden.

6.4.2. Wassen en kleuren van de gelplaat

Giet het fixeermiddel volledig af en was de gelplaat tweemaal telkens 30 seconden met 100 ml ontkleuroplossing (4.10). De ontkleuroplossing wordt afgegoten en de schaal wordt met 250 ml kleuroplossing (4.11.3) gevuld; de kleur wordt onder zachtjes schudden in 45 minuten ontwikkeld.

6.4.3. Ontkleuren van de gelplaat

De kleuroplossing wordt afgegoten en de gelplaat wordt tweemaal telkens met 100 ml ontkleuroplossing (4.10) gewassen en ten minste 2 of 3 x 15 minuten met 200 ml ontkleuroplossing geschud, totdat de achtergrond schoon en ongekleurd is. Vervolgens wordt de gelplaat gespoeld met gedestilleerd water (2 x 2 minuten) en aan de lucht in 2 tot 3 uur of met een föhn in 10 tot 15 minuten gedroogd.

Opmerking 1:

Het fixeren, wassen, kleuren en ontkleuren wordt uitgevoerd bij 20 °C. Geen hogere temperaturen toepassen.

Opmerking 2:

Indien de voorkeur wordt gegeven aan zilverkleuring (bv. Silver Staining Kit, Protein, Pharmacia Biotech, Code nr. 17-1150-01), moeten de met plasmine behandelde caseïnemonsters tot 5 mg/ml worden verdund.

7. Beoordeling

De beoordeling vindt plaats door vergelijking van de eiwitpatronen van het onbekende monster met die van referentiemonsters op dezelfde gel. Detectie van koemelk in kaas van schapen-, geiten- en buffelmelk of mengsels van schapen-, geiten- en buffelmelk geschiedt aan de hand van de γ2- en γ3-caseïnen, waarvan het iso-elektrisch punt ligt tussen pH 6,5 en pH 7,5 (zie de figuren 4a, 4b en 5). De detectiegrens ligt beneden 0,5 %.

7.1. Visuele beoordeling

Voor een visuele beoordeling van de hoeveelheid koemelk verdient het aanbeveling de concentraties van monsters en standaarden aan te passen zodat vergelijkbare intensiteiten van de schapen-, geiten- en/of buffel-γ2-caseïnen en -γ3-caseïnen worden verkregen (zie "γ2 E,G,B" en "γ3 E,G,B" in de figuren 4a, 4b en 5). Daarna kan de hoeveelheid koemelk (minder dan, gelijk aan of meer dan 1 %) in het onbekende monster rechtstreeks worden bepaald door vergelijking van de intensiteit van de runder-γ3- en -γ2-caseïnen (zie "γ3C" en "γ2C" in de figuren 4a, 4b en 5) met die van 0 % en 1 % referentiestandaarden (schapen, geiten) of voorlopige laboratoriumstandaarden (buffel).

7.2. Densitometrische beoordeling

Zo mogelijk wordt voor de bepaling van de verhouding van het piekoppervlak van runder- tot schapen-, geiten- en/of buffel-γ2- en -γ3-caseïnen (zie figuur 5) densitometrie (5.19) toegepast. De hiermee verkregen waarde wordt vergeleken met de verhouding van γ2- en γ3-caseïnen in de op dezelfde gel geanalyseerde 1 %-standaard (schapen, geiten) of voorlopige laboratoriumstandaarden (buffel).

Opmerking:

De methode werkt bevredigend wanneer er in de standaard van 1 % een duidelijk positief signaal is voor zowel runder-γ2- als γ3-caseïnen, maar niet in de standaard van 0 %. Is dat anders, dan dient de procedure aan de hand van de bijzonderheden van de methode te worden verbeterd.

Een monster wordt als positief beoordeeld, als zowel de runder-γ2- als -γ3-caseïnen of de bijbehorende piekoppervlakken gelijk zijn aan of groter dan in de 1 % standaard.

8. Literatuurverwijzingen

1. Addeo F., Moio L., Chianese L., Stingo C., Resmini P., Berner I., Krause I., Di Luccia A., Bocca A.: Use of plasmin to increase the sensitivity of the detection of bovine milk in ovine and/or caprine cheese by gel isoelectric focusing of γ2-caseins, Milchwissenschaft 45, blz. 708-711 (1990).

2. Addeo F., Nicolai M.A., Chianese L., Moio L., Spagna Musso S., Bocca A., Del Giovine L.: A control method to detect bovine milk in ewe and water buffallo cheese using immunoblotting, Milchwissenschaft 50, blz. 83-85 (1995).

3. Krause I., Berner I., Klostermeyer H.: Sensitive detection of cow milk in ewe and goal milk and cheese by carrier ampholyte - and carrier ampholyte/immobilized pH gradient - isoelectric focusing of γ-caseins using plasmin as signal amplifier, Electrophoresis-Forum '89 (B. J. Radola, ed.) blz. 389-393, Bode-Verlag, München (1989).

4. Krause I., Belitz H.-D., Kaiser K.-P.: Nachweis von Kuhmilch in Schaf- und Ziegenmilch bzw. -käse durch isoelektrische Fokussierung in harnstoffhaltigen Polyacrylamidgelen, Z. Lebensm. Unters. Forsch. 174, blz. 195-199 (1982).

5. Radola B.J.: Ultrathin-layer isoelectric focusing in 50-100 μm polyacrylamide gels on silanised glass plates or polyester films, Electrophoresis 1, blz. 43-56 (1980).

Figuur 1: Schematische tekening van het dekblad

>PIC FILE= "L_2001037NL.005701.EPS">

Figuur 2: Caseïnelaag die na centrifugering tussen de waterlaag en de organische laag drijft

>PIC FILE= "L_2001037NL.005702.EPS">

Figuur 3: Opklapmethode voor het gieten van ultradunne polyacrylamidegels

>PIC FILE= "L_2001037NL.005703.EPS">

a = afstandsband (0,25 mm); b = dekblad (5.3); c, e = glasplaten (5.1 ); d = geloplossing (4.1.2); f = gel-draagblad (5.2)

Figuur 4a: Iso-elektrische focussering van met plasmine behandelde caseïnen van kaas van schapen- en geitenmelk met verschillende hoeveelheden koemelk.

>PIC FILE= "L_2001037NL.005801.EPS">

% CM = percentage koemelk; C = koe; E = schaap; G = geit.

Bovenste helft van de IEF-gel.

Figuur 4b: Iso-elektrische focussering van met plasmine behandelde caseïnen van kaas van mengsels van schapen-, geiten- en buffelmelk met verschillende hoeveelheden koemelk.

>PIC FILE= "L_2001037NL.005802.EPS">

% CM = percentage koemelk; 1 + = monster met 1 % koemelk en waaraan halfweg zuivere rundercaseïne is toegevoegd; C = koe; E = schaap; G = geit; B = buffel.

Totale scheidingsafstand van de IEF-gel.

Figuur 5: Superpositie van densitogrammen van standaarden (STD) en van monsters kaas van een mengsel van schapen- en geitenmelk na iso-elektrische focussering.

>PIC FILE= "L_2001037NL.005901.EPS">

a, b = standaarden met 0 en 1 % koemelk; c-g = kaasmonsters met 0,1,2,3 en 7 % koemelk. C = koe; E = schaap; G = geit.

De bovenste helft van de IEF-gel is onderzocht bij λ = 634 nm.

(1) De producten Ampholine® pH 3,5-9,5 (Pharmacia) en Resolyte® pH 5-7 en pH 6-8 (BDH, Merck) blijken bijzonder geschikt voor het bewerkstelligen van de gewenste scheiding van γ-caseïnen.

(2) De producten Ampholine® pH 3,5-9,5 (Pharmacia) en Resolyte® pH 5-7 en pH 6-8 (BDH, Merck) blijken bijzonder geschikt voor het bewerkstelligen van de gewenste scheiding van γ-caseïnen.

(3) De producten Ampholine® pH 3,5-9,5 (Pharmacia) en Resolyte® pH 5-7 en pH 6-8 (BDH, Merck) blijken bijzonder geschikt voor het bewerkstelligen van de gewenste scheiding van γ-caseïnen.

BIJLAGE XVI

(Artikel 11)

REFERENTIEMETHODE VOOR HET ONDERZOEK VAN BOTER, MAGEREMELKPOEDER EN CASEÏNE/CASEÏNATEN OP COLIBACTERIËN

Bij onderzoek van boter op de aanwezigheid van colibacteriën worden monsters van 1 g geënt in het kweekmedium.

Bij onderzoek van mageremelkpoeder of caseïne/caseïnaten op de aanwezigheid van colibacteriën worden monsters van 0,1 g geënt in het kweekmedium.

IDF-Norm 73A/1985, methode B, wordt toegepast met de volgende wijzigingen:

1. De monstervoorbereiding gebeurt overeenkomstig IDF-Norm 122B/1992. Voor aangezuurde caseïne mag de monstervoorbereiding ook gebeuren volgens IDF-Norm 73A/1985.

2. Alleen geënte buizen, met 1 g boter of 0,1 g mageremelkpoeder of caseïne/caseïnaten worden geïncubeerd en beoordeeld. Er worden geen verdunningen gemaakt.

Beoordeling van de resultaten

>RUIMTE VOOR DE TABEL>

Opmerking

Aantal colibacteriën: gemiddeld 1/10 gram voor boter, 1/gram voor mageremelkpoeder, caseïne of caseïnaten.

De resultaten die aangeven dat aan de vereisten is voldaan, worden verkregen met een waarschijnlijkheidsgraad van 93 %.

Aantal colibacteriën: gemiddeld 1/gram voor boter, 1/0,1 gram voor mageremelkpoeder, caseïne of caseïnaten.

De resultaten die aangeven dat niet aan de vereisten is voldaan, worden verkregen met een waarschijnlijkheidsgraad van 91 %.

(Veronderstelling: Poisson-verdeling.)

BIJLAGE XVII

(Artikel 12)

DE ANALYSEMETHODE VOOR HET BEPALEN VAN HET LACTOSEGEHALTE (MELKSUIKERGEHALTE) VAN PRODUCTEN VAN CODE 2309 VAN DE GECOMBINEERDE NOMENCLATUUR(1)

DEEL 1

1. Toepassingsgebied

De methode kan worden toegepast bij een lactosegehalte van meer dan 0,5 %.

2. Principe

De suikers oplossen in water. De gist (Saccharomyces cerevisiae) die de lactose intact laat, laten inwerken. Het lactosegehalte van de oplossing bepalen volgens de methode Luff-Schoorl na klaring en filtering.

3. Reagentia

Natriumthiosulfaat 0,1 N.

Indicator: zetmeeloplossing. Een mengsel van 5 g oplosbaar zetmeel (als conserveermiddel eventueel 10 mg kwikjodide toevoegen) en 30 ml water wordt gevoegd bij 1 liter kokend water; dit mengsel 3 minuten laten koken. Laat vervolgens afkoelen.

Oplossing van kaliumjodide van analysekwaliteit van 30 % (g/v).

Oplossing van zwavelzuur 6 N.

Reagens volgens Luff-Schoorl:

a) 25 g ijzervrij kopersulfaat van analysekwaliteit (CuSO45H2O) oplossen in 100 ml water;

b) 50 g citroenzuur van analysekwaliteit (C6H8O7.H2O) oplossen in 50 ml water;

c) 143,8 g watervrij natriumcarbonaat van analysekwaliteit (Na2CO2) oplossen in 300 ml warm water.

b) bij c) gieten (na afkoeling) en voorzichtig roeren en vervolgens a) toevoegen. Tot 1 liter aanvullen, het geheel één nacht laten staan en affiltreren. De normaliteit van het aldus verkregen reagens dient te worden gecontroleerd (0,1 N in Cu, 2 N in Na2CO3). De pH moet in de buurt van 9,4 liggen.

Oplossing Carrez I: 23,8 g Zn (C2H3O2)2.2H2O en 3 g ijsazijn oplossen in water en aanvullen tot 100 ml.

Oplossing Carrez II: 10,6 g K4F2 (CN)6.3H2O oplossen in water en aanvullen tot 100 ml.

Puimsteenkorrels behandeld door koken met zoutzuur, gewassen met water en gedroogd. Suspensie van Saccharomyces cerevisiae: 25 g verse gist in 100 ml water (niet langer dan een week in de koelkast bewaren).

4. Werkwijze

Tot op 1 mg nauwkeurig 1 g van het te analyseren monster wegen en dit in een maatkolf van 100 ml brengen. 25-30 ml water bijvoegen. De kolf gedurende 30 minuten in een kokend waterbad plaatsen; daarna afkoelen tot ongeveer 35 °C.

5 ml van de gistsuspensie(2) toevoegen en omroeren. De maatkolf met inhoud moet 2 uur in het waterbad op een temperatuur van 38-40 °C blijven.

Na gisting afkoelen tot een temperatuur van ongeveer 20 °C. 2,5 ml van de oplossing Carez I bijvoegen en roeren gedurende 30 seconden; vervolgens 2,5 ml van de oplossing Carrez II toevoegen en opnieuw roeren gedurende 30 seconden. Aanvullen met water tot 100 ml, mengen en filtreren. Een hoeveelheid filtraat van ten hoogste 25 ml, dat bij voorkeur 40-80 mg lactose bevat, pipetteren; zo nodig aanvullen met water tot 25 ml en het gehalte aan watervrije lactose volgens Luff-Schoorl bepalen.

Alleen met de gist een volledige blanco-proef uitvoeren.

DEEL II

1. Bepaling van het lactosegehalte volgens de methode Luff-Schoorl

25 ml reagens volgens Luff-Schoorl pipetteren en dit in een Erlenmeyerkolf van 300 ml brengen; 25 ml, nauwkeurig gemeten, van de geklaarde oplossing toevoegen.

Twee korrels puimsteen toevoegen, vervolgens met de hand roerend boven een open vlam van middelmatige hoogte verwarmen, en de vloeistof binnen ongeveer 2 minuten aan de kook brengen. De Erlenmeyerkolf onmiddellijk plaatsen op een metaalgaasje voorzien van een asbestplaatje waaronder tevoren een vlam is aangestoken. Deze vlam wordt zodanig geregeld dat de Erlenmeyerkolf alleen onder de bodem wordt verwarmd; daarop een refluxkoeler aansluiten. Vervolgens precies 10 minuten laten doorkoken. Onmiddellijk afkoelen in koud water en na ongeveer 5 minuten als volgt titreren:

Aan de vloeistof 10 ml kaliumjodide toevoegen en onmiddellijk daarna, doch voorzichtig (met het oog op de overvloedige schuimvorming), 25 ml zwavelzuur 6 N.

Vervolgens titreren met het natriumthiosulfaat totdat een zwakgele kleur ontstaat en tegen het einde van de titratie de zetmeelindicator bijvoegen.

Op dezelfde wijze een nauwkeurig gemeten mengsel van 25 ml reagens volgens Luff-Schoorl en 25 ml water titreren, na 10 ml kaliumjodide en 25 ml zwavelzuur 6 N te hebben bijgevoegd, ditmaal echter zonder de vloeistof aan de kook te brengen.

Aan de hand van de navolgende tabel de hoeveelheid lactose in mg bepalen, die overeenkomt met het verschil tussen de uitkomsten van beide titraties (uitgedrukt in ml natriumthiosulfaat 0,1 N).

TABEL

Tabel voor 25 ml reagens volgens Luff-Schoorl

(zie in de tekst aangegeven voorwaarden)

1. Natriumthiosulfaat 0,1 N.

2. Lactose C12H22O11

>RUIMTE VOOR DE TABEL>

(1) Verordening (EEG) nr. 222/88, PB L 28 van 1.2.1988, blz. 1.

(2) Bij producten die meer dan 40 % fermenteerbare suikers bevatten verhoge men de hoeveelheid van de gistoplossing.

BIJLAGE XVIII

(Artikel 13)

OPSPORING VAN LEBWEI IN MAGEREMELKPOEDER BESTEMD VOOR OPENBARE OPSLAG DOOR BEPALING VAN GLYCOMACROPEPTIDEN MET BEHULP VAN HOGEDRUKVLOEISTOFCHROMATOGRAFIE (HPLC)

1. Doel en toepassingsgebied

Met deze methode kan de aanwezigheid van lebwei in mageremelkpoeder, bestemd voor openbare opslag, worden aangetoond door middel van de bepaling van glycomacropeptiden.

2. Referenties

Internationale norm ISO 707 - Melk en zuivelproducten - Monstermethoden, overeenkomstig de in bijlage I, punt 2, onder c), vermelde voorschriften.

3. Definitie

Gehalte aan glycomacropeptiden in mageremelkpoeder: het gehalte aan bestanddelen, bepaald volgens onderstaande methode en uitgedrukt in massaprocenten.

4. Beginsel

- Reconstitutie van het mageremelkpoeder, verwijdering van vetten en eiwitten door neerslaan met trichloorazijnzuur en afcentrifugeren;

- bepaling van de hoeveelheid glycomacropeptiden (GMP) in het supernatant met behulp van hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC);

- beoordeling van het verkregen resultaat aan de hand van standaardmonsters bestaande uit mageremelkpoeder waaraan al dan niet een bekend percentage weipoeder is toegevoegd.

5. Reagentia

Alle reagentia dienen van analysekwaliteit te zijn. Onder water wordt verstaan gedistilleerd water of water van ten minste dezelfde zuiverheid.

5.1. Trichloorazijnzuuroplossing

Los 240 g trichloorazijnzuur (Cl3CCOOH) op in water en vul aan tot 1000 ml.

5.2. Loopvloeistof, pH 6,0

In ongeveer 700 ml water wordt 1,74 g dikaliumfosfaat (K2HPO4), 12,37 g monokaliumfosfaat (KH2PO4) en 21,41 g natriumsulfaat (Na2SO4) opgelost. Zo nodig wordt de pH met een fosforzuuroplossing dan wel met een kaliumhydroxideoplossing op 6,0 gebracht.

De oplossing wordt met water tot 1000 ml aangevuld en gehomogeniseerd.

Vóór gebruik wordt de loopvloeistof door een membraanfilter met poriëngrootte van 0,45 μm gefiltreerd.

5.3. Oplossing voor het spoelen en conserveren van de kolommen

Eén deel acetonitril (CH3CN) wordt met negen delen water gemengd. Vóór gebruik wordt het mengsel over een membraanfilter met poriëngrootte van 0,45 μm gefiltreerd.

Opmerking:

Voor het spoelen van de kolom kan elke andere oplossing worden gebruikt die een bacteriëndodende werking heeft en het scheidend vermogen van de kolom niet aantast.

5.4. Standaardmonsters

5.4.1. Mageremelkpoeder dat voldoet aan de eisen van deze verordening of wel [0].

5.4.2. Hetzelfde mageremelkpoeder dat is vermengd met 5 % (m/m) weipoeder type leb van gemiddelde samenstelling, of wel [5].

6. Apparatuur

6.1. Analytische balans.

6.2. Centrifuge, centrifugaalkracht tot 2200 g, voorzien van centrifugebuizen met stop met een inhoud van ongeveer 25 ml.

6.3. Mechanisch schudapparaat.

6.4. Magneetroerder.

6.5. Glazen trechters, doorsnede ongeveer 7 cm.

6.6. Filtreerpapier, normaal, doorsnede ongeveer 12,5 cm.

6.7. Glazen filtreerapparaat met filtermembraan met poriëngrootte van 0,45 μm.

6.8. Meetpipet geschikt voor 10 ml, overeenkomstig de norm ISO 648, klasse A, of ISO/R 835.

6.9. Waterbad met thermostaat, ingesteld op 25 +- 0,5 °C.

6.10. HPLC-apparatuur bestaande uit:

6.10.1. pomp;

6.10.2. injector, al of niet automatisch, capaciteit 15 tot 30 μl;

6.10.3. twee kolommen TSK 2000 SW (lengte 30 cm, inwendige doorsnede 0,75 cm) of gelijkwaardige kolommen in serie en een voorgeschakelde kolom (3 cm x 0,3 cm) gepakt met I 125 of gelijkwaardig materiaal;

6.10.4. kolomoven met thermostaat, ingesteld op 35 +- 1 °C;

6.10.5. UV-detector met variabele golflengte, instelbaar op 205 nm, en een gevoeligheid van 0,08 A;

6.10.6. Integrator waarmee van dal tot dal kan worden geïntegreerd.

Opmerking:

Zo nodig kan met kolommen op kamertemperatuur worden gewerkt, maar het scheidend vermogen daarvan is iets lager. In dergelijke gevallen mogen de temperatuurschommelingen binnen een analyseserie niet meer dan +- 5 °C bedragen.

7. Monsterneming

7.1. Internationale norm ISO 707 - Melk en zuivelproducten - Monstermethoden, overeenkomstig de in bijlage I, punt 2, onder c), vermelde voorschriften.

7.2. Het monster wordt zodanig bewaard dat geen bederf of wijziging van samenstelling kan optreden.

8. Werkwijze

8.1. Bereiding van het testmonster

Het melkpoeder wordt overgebracht in een vat met een inhoud van ongeveer het dubbele van het volume van het poeder, voorzien van een luchtdicht deksel. Het vat wordt onmiddellijk gesloten. Meng het melkpoeder grondig door herhaald omkeren van het vat.

8.2. Testhoeveelheid

In een centrifugebuis (punt 6.2) wordt 2,000 g testmonster tot op ca. 0,001 g afgewogen.

8.3. Verwijdering van vetten en eiwitten

8.3.1. Voeg aan de testhoeveelheid 20,0 g warm water (50 °C) toe. Los het poeder op door gedurende vijf minuten te schudden op het schudapparaat (punt 6.3). Breng de buis op 25 °C.

8.3.2. In twee minuten wordt onder magnetisch roeren (punt 6.4) 10,0 ml trichloorazijnzuuroplossing (punt 5,1) toegevoegd. De buis wordt vervolgens gedurende één uur in het waterbad (punt 6.9) gehouden.

8.3.3. De buis wordt gedurende tien minuten bij 2200 g gecentrifugeerd (punt 6.2). In plaats daarvan kan worden gefiltreerd door papier (punt 6.6), waarbij de eerste 5 ml filtraat wordt weggeworpen.

8.4. Chromatografische bepaling

8.4.1. Bij een snelheid van 1,0 ml loopvloeistof (punt 5.2) per minuut wordt in het HPLC-apparaat (punt 6.10) een nauwkeurig afgemeten hoeveelheid tusen 15 en 30 μl van de bovenstaande vloeistof of het filtraat (punt 8.3.3) geïnjecteerd.

Opmerkingen:

1. De temperatuur van de loopvloeistof (punt 5.2) wordt gedurende de gehele chromatografische analyse op 85 °C gehouden om de vloeistof te ontgassen en bacteriegroei te voorkomen. Andere maatregelen met hetzelfde effect mogen ook worden toegepast.

2. Bij elke onderbreking worden de kolommen met water gespoeld. De kolommen mogen nooit met de loopvloeistof (punt 5.2) blijven staan.

Voordat de apparatuur langer dan 24 uur buiten gebruik wordt gesteld, worden de kolommen eerst met water en vervolgens gedurende ten minste drie uur met een snelheid van 0,2 ml per minuut met de wasoplossing (punt 5.3) gespoeld.

8.4.2. De resultaten van de chromatografische analyse van het testmonster [E] worden verkregen in de vorm van een chromatogram, waarin elke piek wordt geïdentificeerd door zijn retentietijd en wel:

>RUIMTE VOOR DE TABEL>

De kwaliteit van de kolommen is van invloed op de verschillende retentietijden.

De integrator (punt 6.10.6) rekent de oppervlakte A van elke piek automatisch uit:

>RUIMTE VOOR DE TABEL>

Om eventuele onregelmatigheden als gevolg van slecht werkende apparatuur of kolommen, dan wel als gevolg van de herkomst of de gesteldheid van het geanalyseerde monster op te sporen, moet, voordat tot kwantitatieve interpretatie wordt overgegaan, worden nagegaan of het algemene beeld van het chromatogram klopt.

In geval van twijfel wordt de analyse herhaald.

8.5. IJking

8.5.1. Op de standaardmonsters (punt 5.4) wordt nauwgezet de werkwijze van de punten 8.2 tot en met 8.4.2 toegepast.

Er worden versbereide oplossingen gebruikt omdat de GMP in 8 % trichloorazijnzuur niet stabiel zijn: het gehalte loopt namelijk per uur bij 30 °C met ongeveer 0,2 % terug.

8.5.2. Voorafgaand aan de chromatografische bepaling van de monsters worden de kolommen geconditioneerd door herhaald inspuiten van de oplossing (punt 8.5.1) van het standaardmonster (punt 5.4.2) totdat de oppervlakte en de retentietijd van de GMP-piek constant zijn.

8.5.3. De responsfactoren R worden bepaald door injectie van hetzelfde volume filtraat (punt 8.5.1) als er van de monsters wordt geïnjecteerd.

9. Weergave van de resultaten

9.1. Berekeningswijze en formules

9.1.1. Berekening van de responsfactoren R:

>RUIMTE VOOR DE TABEL>

waarin:

RII en RIV= respectievelijk de responsfactoren voor de pieken II en IV,

AII [0] en AIV [0]= respectievelijk de oppervlakten voor de pieken II en IV van het standaardmonster [0] verkregen bij punt 8.5.3;

>RUIMTE VOOR DE TABEL>

waarin:

RIII= de responsfactor voor piek III,

AIII [0] en AIII [0]= respectievelijk de oppervlakten van piek III in de standaardmonsters [0] en [5] verkregen bij punt 8.5.3,

W= de hoeveelheid wei aanwezig in het standaardmonster [5] of wel 5.

9.1.2. Berekening van de relatieve oppervlakten van de pieken van het monster [E]:

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

Waarin:

SII [E], SIII [E], SIV [E]= respectievelijk de relatieve oppervlakten van de pieken II, III en IV van het monster [E],

AII [E], AIII [E], AIV [E]= respectievelijk de oppervlakten van de pieken II, III en IV van het monster [E] verkregen bij punt 8.4.2,

RII, RIII, RIV= respectievelijk de responsfactoren berekend bij punt 9.1.1.

9.1.3. Berekening van de relatieve retentietijd van piek III van het monster [E]:

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

waarin:

RRTIII [E]= de relatieve retentietijd van piek III van het monster [E],

RTIII [E]= de retentietijd van piek III van het monster [E], verkregen bij punt 8.4.2,

RTIII [5]= de retentietijd van piek III van het standaardmonster [5], verkregen bij punt 8.5.3.

9.1.4. Experimenteel is aangetoond dat er tussen de relatieve retentietijd van piek III, of wel RRTIII [E], en het toegevoegde percentage weipoeder tot 10 % een rechtlijnig verband bestaat:

- bij een gehalte > 5 %, is RRTIII [E] < 1,000;

- bij een gehalte <= 5 %, is RRTIII [E] >= 1,000.

De toegestane onzekerheid voor de waarde RRTIII is +- 0,002.

Doorgaans verschilt de waarde RRTIII [0] weinig van 1,034. Naar gelang van de toestand van de kolommen kan deze waarde in de richting van 1,000 gaan, maar zij moet daar wel altijd boven blijven.

9.2. Bereken het percentage lebweipoeder in het monster uit:

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

waarin:

W= het massapercentage lebwei in het monster [E],

SIII [E]= het relatieve oppervlak van piek III van het monster [E], verkregen in punt 9.1.2,

1,3= het gemiddelde relatieve oppervlak van piek III, uitgedrukt in g wei per 100 g, bepaald in onverdachte mageremelkpoeders van verschillende herkomst. Deze waarde is experimenteel vastgesteld,

SIII [0]= het relatieve oppervlak van piek III dat gelijk is aan RIII x AIII [0]. Deze waarden zijn verkregen respectievelijk in punt 9.1.1 en punt 8.5.3,

(SIII [0] - 0,9)= de aan te brengen correctie voor het gemiddelde relatieve oppervlak van 1,3 indien de waarde SIII [0] afwijkt van 0,9. Het gemiddelde relatieve oppervlak van piek III van standaardmonster [0] is experimenteel vastgesteld op 0,9.

9.3. Nauwkeurigheid van de methode

9.3.1. Herhaalbaarheid

Het verschil tussen de resultaten van twee bepalingen gelijktijdig of kort na elkaar door dezelfde persoon met dezelfde apparatuur op hetzelfde monster verkregen, mag niet groter zijn dan 0,2 % m/m.

9.3.2. Reproduceerbaarheid

Het verschil tussen twee afzonderlijke en onafhankelijke resultaten verkregen door twee verschillende laboratoria op hetzelfde monster mag niet groter zijn dan 0,4 % m/m.

9.4. Interpretatie

9.4.1. Wei wordt geacht afwezig te zijn indien het relatieve oppervlak van piek III, SIII [E], uitgedrukt in gram lebwei per 100 g, <=

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

is,

waarin:

>RUIMTE VOOR DE TABEL>

9.4.2. Wanneer het relatieve oppervlak van piek III,

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

is en het relatieve oppervlak van piek II, SII [E] <= 160 is, bepaal dan het lebweigehalte zoals aangegeven in punt 9.2.

9.4.3. Wanneer het relatieve oppervlak van piek III,

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

is en het relatieve oppervak van piek II, SII [E] > 160 is, bepaal dan het totaal eiwitgehalte (P %); daarna de grafieken 1 en 2 bestuderen.

9.4.3.1. De resultaten van de ontleding van de monsters mageremelkpoeder van goede kwaliteit en met een hoog totaal eiwitgehalte, worden weergegeven in de grafieken 1 en 2.

De volle lijn stelt de lineaire regressielijn voor, waarvan de coëfficiënten worden berekend aan de hand van de methode van de kleinste kwadraten.

De streeplijn is de bovengrens van het relatieve oppervlak van piek III (waarschijnlijkheidsdrempel 90 %).

De respectieve vergelijkingen van de streeplijnen in de grafieken 1 en 2 zijn:

>RUIMTE VOOR DE TABEL>

waarin:

>RUIMTE VOOR DE TABEL>

Deze vergelijkingen zijn gelijkwaardig met het in punt 9.2 vermelde getal 1,3.

De afwijking (T1 en T2) tussen het relatieve oppervlak SIII [E] en het relatieve oppervlak SIII wordt weergegeven door de volgende betrekkingen:

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

9.4.3.2.

>RUIMTE VOOR DE TABEL>

De hoeveelheid lebwei wordt berekend aan de hand van de volgende formule:

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

waarin:

0,91 de afstand op de verticale as tussen de volle en de streeplijn weergeeft.

>PIC FILE= "L_2001037NL.006801.EPS">

BIJLAGE XIX

(Artikel 13)

OPSPORING VAN LEBWEIPOEDER IN MAGEREMELKPOEDER EN MENGSELS, ALS BEDOELD IN VERORDENING (EEG) Nr. 2799/1999

1. Doel: Opsporen of lebweipoeder is toegevoegd aan

a) mageremelkpoeder, als gedefinieerd in artikel 2 van Verordening (EEG) nr. 2799/1999.

b) Mengsels, als bedoeld in artikel 4 van Verordening (EEG) nr. 2799/1999.

2. Referenties: Internationale norm ISO 707

3. Begripsomschrijving

Het gehalte aan lebweipoeder is het gehalte dat is bepaald volgens onderstaande methode uitgedrukt in massaprocenten.

4. Principe

Bepaling van de hoeveelheid glycomacropeptide A volgens de in bijlage XVIII vastgestelde methode. De monsters waarvoor positieve resultaten zijn verkregen, worden onderzocht op de aanwezigheid van glycomacropeptide A (GMPA) met reversed phase hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC). Beoordeling van het verkregen resultaat aan de hand van standaardmonsters bestaande uit mageremelkpoeder waaraan al dan niet een bekend percentage weipoeder is toegevoegd. Resultaten hoger dan 1 % (m/m) geven aan dat lebweipoeder aanwezig is.

5. Reagentia

Alle reagentia dienen van analysekwaliteit te zijn. Onder water wordt verstaan gedistilleerd water of water van ten minste dezelfde zuiverheid. Het acetonitril moet een zodanige kwaliteit hebben dat het geschikt is voor spectroscopie of HPLC.

De reagentia die nodig zijn voor de methode zijn in bijlage XVIII bij deze verordening beschreven.

Reagentia voor reversed phase HPLC:

5.1. Trichloorazijnzuuroplossing

Los 240 g trichloorazijnzuur (CC13COOH) op in water en vul aan tot 1000 ml.

5.2. Eluenten A en B

Eluent A: breng 150 ml acetonitril (CH3CN), 20 ml isopropanol (CH3CHOHCH3) en 1,00 ml trifluorazijnzuur (TFA, CF3COOH) in water. Vul aan met water tot 1000 ml. Eluent B: Breng 550 ml acetonitril, 20 ml isopropanol en 1,00 ml TFA in water. Vul aan met water tot 1000 ml. Filtreer de loopvloeistof vóór gebruik door een membraanfilter met poriëngrootte van 0,45 μm.

5.3. Conserveren van de kolommen

Na de analyse wordt de kolom gespoeld met eluent B (via een gradiënt) en vervolgens met acetonitril (via een gradiënt in 30 minuten). De kolom wordt bewaard in acetonitril.

5.4. Standaardmonsters

5.4.1. Mageremelkpoeder dat voldoet aan de eisen voor openbare opslag, of wel (0).

5.4.2. Hetzelfde mageremelkpoeder dat is vermengd met 5 % (m/m) weipoeder type leb van gemiddelde samenstelling, of wel (5).

5.4.3. Hetzelfde mageremelkpoeder dat is vermengd met 50 % (m/m) weipoeder type leb van gemiddelde samenstelling, of wel (50)(1).

6. Apparatuur

De voor deze werkwijze benodigde apparatuur is beschreven in bijlage XVIII bij deze verordening.

6.1.1. Analytische balans.

6.2. Centrifuge, centrifugaalkracht tot 2200 g, voorzien van centrifugebuizen met stop met een inhoud van ongeveer 50 ml.

6.3. Mechanisch schudapparaat geschikt om bij 50 °C te werken.

6.4. Magneetroerder.

6.5. Glazen trechters, doorsnede ongeveer 7 cm.

6.6. Filtreerpapier, normaal, doorsnede ongeveer 12,5 cm.

6.7. Glazen filtreerapparaat met filtermembraan met poriëngrootte van 0,45 μm.

6.8. Meetpipetten geschikt voor 10 ml (ISO-648 norm, klasse A, of ISO/R 835) of een systeem geschikt om in twee minuten 10,0 ml af te geven.

6.9. Waterbad met thermostaat, ingesteld op 25 +- 0,5 °C.

6.10. HPLC-apparatuur bestaande uit:

6.10.1. Pompsysteem met voorzieningen voor het creëren van binaire gradiënten;

6.10.2. Injector, al of niet automatisch, capaciteit 100 μl;

6.10.3. Een Dupont Protein Plus-kolom (25 x 0,46 cm I.D.) of een gelijkwaardige kolom gevuld met silica met grote poriën voor reversed phase;

6.10.4. Kolomoven met thermostaat, ingesteld op 35 +- 1 °C;

6.10.5. UV-detector met variabele golflengte, instelbaar op 210 nm (indien nodig, mag met een golflengte tot 220 nm worden gewerkt) met een gevoeligheid van 0,02Å;

6.10.6. Integrator waarmee van dal tot dal kan worden geïntegreerd.

Opmerking

Met de kolommen kan bij kamertemperatuur worden gewerkt op voorwaarde dat de temperatuurschommelingen tot maximaal 1 °C beperkt blijven, anders gaat de retentietijd van GMPÅ teveel variëren.

7. Monsterneming

7.1. De monsters worden getrokken volgens de procedure van de internationale norm ISO 707. De lidstaten kunnen evenwel voor de monsterneming een andere methode toepassen, voor zover die methode overeenstemt met de beginselen van de vorengenoemde internationale norm.

7.2. Het monster wordt zodanig bewaard dat geen bederf of wijziging van samenstelling kan optreden.

8. Werkwijze

8.1. Bereiding van het testmonster

Breng het melkpoeder in een vat met een inhoud van ongeveer het dubbele van het volume van het poeder en voorzien van een luchtdicht deksel. Sluit het vat onmiddellijk. Meng het melkpoeder grondig door herhaald omkeren van het vat.

8.2. Af te wegen hoeveelheid analysemateriaal

Weeg 2,00 g +- 0,001 g van het testmonster in een centrifugebuis (punt 6.2) of in een andere daartoe geschikte fles met stop (50 ml).

8.3. Verwijdering van vetten en eiwitten

8.3.1. Voeg aan de testhoeveelheid 20,0 g warm water (50 °C) toe. Los het poeder op door gedurende vijf minuten, of in geval van zure karnemelk 30 minuten, te schudden op het schudapparaat (punt 6.3). Breng de buis in het waterbad (punt 6.9) om de temperatuur ervan op 25 °C te brengen.

8.3.2. Voeg gelijkmatig in twee minuten onder krachtig roeren met behulp van de magneetroerder (punt 6.4) 10,0 ml trichloorazijnzuuroplossing van 25 °C (punt 5.1) toe. Plaats de buis gedurende 60 minuten in het waterbad (punt 6.9).

8.3.3. Centrifugeer (punt 6.2) bij 2200 g gedurende tien minuten of filtreer door papier (punt 6.6) en werp de eerste 5 ml filtraat weg.

8.4. Chromatografie

8.4.1. Voer een HPLC-analyse uit overeenkomstig bijlage XVIII. Als een negatief resultaat wordt verkregen, bevat het geanalyseerde monster geen lebweipoeder in aantoonbare hoeveelheden. In geval van positieve resultaten moet de hieronder beschreven reversed phase HPLC-analyse worden uitgevoerd. De aanwezigheid van zurekarnemelkpoeder kan immers aanleiding geven tot valspositieve resultaten. Deze mogelijkheid kan worden uitgesloten door toepassing van de reversed phase HPLC-methode.

8.4.2. Voordat de reversed phase HPLC-analyse wordt uitgevoerd, moeten de gradiëntvoorwaarden worden geoptimaliseerd. Voor gradiëntsystemen met een dood volume van ongeveer 6 ml (d.w.z. het volume vanaf het punt waar de twee loopvloeistoffen samenkomen tot en met het volume in de monsterlus) is een retentietijd van 26 minuten +- 2 minuten optimaal voor GMPA. Voor gradiëntsystemen met een kleiner dood volume (bv. 2 ml) moet worden gewerkt met een optimale retentietijd van 22 minuten.

Neem de oplossingen van de standaardmonsters (punt 5.4) met en zonder 50 % lebwei.

Injecteer 100 μl van het supernatans of het filtraat (punt 8.3.3) in het HPLC-apparaat dat functioneert onder de voorwaarden voor de verkennende gradiënt, als aangegeven in tabel 1.

Tabel 1

Voorwaarden voor de verkennende gradiënt om de chromatografische analyse te optimaliseren

>RUIMTE VOOR DE TABEL>

Door de twee chromatogrammen te vergelijken kan de plaats van de GMPA-piek worden bepaald.

Met onderstaande formule kan de beginsamenstelling van de loopvloeistof die voor de normale gradiënt (punt 8.4.3) moet worden gebruikt, worden berekend:

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

waarin

RTgmpA de retentietijd van GMPA in de verkennende gradiënt;

10 % B van de verkennende gradiënt bij het begin;

2,5 % B halfweg min % B bij het begin van de normale gradiënt;

13,5 tijdstip halfweg de verkennende gradiënt;

26 vereiste retentietijd voor GMPA;

6 verhouding van de hellingen van de verkennende gradiënt en de normale gradiënt;

30 % B bij het begin van de verkennende gradiënt min % B 27 minuten later;

27 looptijd van de verkennende gradiënt.

8.4.3. Maak oplossingen van de testmonsters:

Injecteer 100 μl nauwkeurig afgemeten supernatants of filtraat (punt 8.3.3) in het HPLC-apparaat waarin het eluent (punt 5.2) met een snelheid van 1,0 ml per minuut stroomt.

De samenstelling van het eluent bij het begin van de analyse wordt overeenkomstig punt 8.4.2 bepaald. Normaliter is de samenstelling ongeveer A: B = 76: 24 (punt 5.2). Onmiddellijk na het injecteren wordt een lineaire gradiënt gestart die het percentage B in 27 minuten met 5 % doet toenemen. Vervolgens wordt een nieuwe lineaire gradiënt gestart die het percentage B in vijf minuten op 90 % brengt. Deze samenstelling wordt gehandhaafd gedurende vijf minuten, waarna de samenstelling wordt gewijzigd en via een lineaire gradiënt in vijf minuten tijd terug op de beginsamenstelling wordt gebracht. Afhankelijk van het interne volume van het pompsysteem kan 15 minuten nadat de beginvoorwaarden weer zijn bereikt, opnieuw worden geinjecteerd.

Opmerkingen

1. De retentietijd van het glycomacropeptide moet 26 minuten +- 2 minuten bedragen. Dit kan worden bereikt door de begin- en eindvoorwaarden van de eerste gradiënt te variëren. Het verschil tussen de percentages B van de begin- en eindvoorwaarden van de eerste gradiënt moet echter 5 % blijven bedragen.

2. De eluenten moeten voldoende zijn ontgast en gezorgd moet worden dat zij in die toestand blijven. Dit is essentieel voor een goede werking van het gradiëntsysteem. De standaardafwijking voor de retentietijd van de GMP-piek moet kleiner zijn dan 0,1 minuut (n = 10).

3. Om de vijf monsters moet een referentiemonster [5] worden geïnjecteerd en een nieuwe responsfactor R (punt 9.1.1) worden berekend.

8.4.4. De resultaten van de chromatografische analyse van het testmonster [E] worden verkregen in de vorm van een chromatogram waarop de GMP-piek kan wordt geïdentificeerd door zijn retentietijd, namelijk ongeveer 26 minuten.

De integrator (punt 6.10.6) berekent automatisch de piekhoogte H van de GMP-piek. Op ieder chromatogram moet de plaats van de basislijn worden gecontroleerd. Als de basislijn zich niet op de juiste plaats bevindt, moet de analyse of de integratie worden overgedaan.

Het is noodzakelijk het chromatogram, voordat het kwalitatief wordt geinterpreteerd, te controleren om eventuele afwijkingen door een slechte werking van het apparaat of de kolom of door de oorsprong en de aard van het geanalyseerde monster op te sporen. Bij twijfel moet de analyse worden overgedaan.

8.5. IJking

8.5.1. Pas de werkwijze van de punten 8.2 tot en met 8.4.4 nauwgezet toe op de standaardmonsters (punten 5.4.1 en 5.4.2). Maak gebruik van vers bereide oplossingen, aangezien GMP in 8 % trichloorazijnzuur bij kamertemperatuur wordt afgebroken. Bij 4 °C blijft de oplossing gedurende 24 uur stabiel. Voor grote series analyses is het gebruik van een gekoelde monsterhouder in de automatische injector gewenst.

Opmerking

Punt 8.4.2 kan worden weggelaten als het % B dat bij het begin moet worden gebruikt, bekend is van vroegere analyses.

Het referentiemonster [5] moet eenzelfde chromatogram geven als figuur 1. In deze figuur wordt de GMPA-piek voorafgegaan door twee kleine pieken. Het is essentieel dat eenzelfde scheiding wordt verkregen.

8.5.2. Injecteer 100 μl van het standaardmonster zonder lebwei [0] (punt 5.4.1) voordat de chromatografische bepaling op de monsters begint.

Op het resulterende chromatogram mag geen piek optreden voor de retentietijd van de GMPA-piek.

8.5.3. Bepaal de responsfactoren R door injectie van hetzelfde volume filtraat (punt 8.5.1) als er voor de monsters wordt geïnjecteerd.

9. Weergave van de resultaten

9.1. Berekeningswijze en formules

9.1.1. Berekening van de responsfactor R

GMP-piek: R = W/Hwaarin:

R= de responsfactor voor de GMP-piek;

H= de hoogte van de GMP-piek;

W= de hoeveelheid wei in het standaardmonster [5].

9.2. Berekening van het percentage lebweipoeder in het monster

W [E] = R x H [E]waarin:

W (E]= het percentage (m/m) van lebwei in het monster [E];

R= de responsfactor van de GMP-piek (punt 9.1.1);

H [E]= de hoogte van de GMP-piek van het monster [E].

Er is lebweipoeder aanwezig als W [E] hoger is dan 1 % en als het verschil tussen de retentietijd van het monster en die van het standaardmonster [5] kleiner is dan 0,2 minuut.

9.3. Nauwkeurigheid van de methode

9.3.1. Herhaalbaarheid:

Het verschil tussen de resultaten van twee bepalingen gelijktijdig of kort na elkaar door dezelfde persoon met dezelfde apparatuur op hetzelfde monster verkregen, mag niet groter zijn dan 0,2 m/m.

9.3.2. Reproduceerbaarheid:

Nog niet gedefinieerd.

9.3.3. Lineariteit:

Vanaf 0 tot en met 16 % lebwei moet een lineaire functie worden verkregen met een correlatiecoëfficiënt > 0,99.

9.4. Interpretatie

9.4.1. Wei wordt geacht aanwezig te zijn als het in punt 9.2 verkregen resultaat groter is dan 1 % m/m en als het verschil tussen de retentietijd van de GMP-piek en die van het standaardmonster [5] kleiner is dan 0,2 minuut. De grenswaarde van 1 % is bepaald overeenkomstig de bepalingen van Verordening (EEG) nr. 625/78, bijlage V, punten 9.2 en 9.4.1.

>PIC FILE= "L_2001037NL.007301.EPS">

(1) Weipoeder type leb van standaardsamenstelling al dan niet gemengd met mageremelkpoeder kan worden verkregen bij het NIZO, Kernhemseweg 2, Postbus 20, NL-6710 BA Ede. Poeders die dezelfde resultaten geven als de NIZO-poeders, mogen evenwel ook worden gebruikt.

BIJLAGE XX

(Artikel 14)

BEPALING VAN HET GEHALTE AAN FOSFATIDILSERINE EN FOSFATITILETHANOLAMINE VAN MAGEREMELKPOEDER MET BEHULP VAN HOGGEDRUKVLOEISTOFCHROMATOGRAFIE

Methode HPLC in tegenfase

1. Doel en meetbereik

De methode beschrijft een procedure voor de kwantitatieve bepaling van fosfatidilserine (PS) en fosfatidilethanolamine (PE) in mageremelkpoeder (MMP) en is geschikt voor de bepaling van vaste stoffen uit karnemelk in MMP.

2. Begripsomschrijving

Het gehalte aan PS + PE: de massafractie van de met de hier beschreven methode bepaalde substantie. Het resultaat wordt uitgedrukt in milligram fosfatidilethanolamine-dipalmietolie (PEDP) per 100 g poeder.

3. Principe

Extractie van aminofosfolipiden uit opgelost melkpoeder met behulp van methanol. Bepaling van PS en PE als o-ftaaldialdehyde(OPA)derivaten met behulp van HPLC in tegenfase en fluorescentiedetectie. Kwantificering van het gehalte aan PS en PE in het proefmonster door vergelijking met een standaardmonster met een bekend gehalte aan PEDP.

4. Reagentia

Alle reagentia dienen van analysekwaliteit te zijn. Onder water wordt verstaan gedestilleerd water of water van ten minste dezelfde zuiverheid.

4.1. Standaardmateriaal: PEDP met een zuiverheid van ten minste 99 %

NB:

Het standaardmateriaal moet worden bewaard bij - 18 °C.

4.2. Reagentia voor de aanmaak van het standaardmonster en het proefmonster

4.2.1. Methanol, HPLC-kwaliteit

4.2.2. Chloroform, HPLC-kwaliteit

4.2.3. Tryptamine-monohydrochloride

4.3. Reagentia voor de derivatie van o-ftaaldialdehyde

4.3.1. Natriumhydroxide, opgelost in water. Sterkte 12M

4.3.2. Boorzuur, opgelost in water. Sterkte 0,4M. Aangevuld met natriumhydroxide (punt 4.3.1) tot een pH 10,0

4.3.3. 2-mercapto-ethanol

4.3.4. o-ftaaldialdehyde (OPA).

4.4. Loopvloeistoffen voor gebruik bij HPLC

Alle loopvloeistoffen moeten worden verkregen door gebruikmaking van reagentia van HPLC-zuiverheid.

4.4.1. Water van HPLC-zuiverheid

4.4.2. Methanol van fluorimetrisch bepaalde zuiverheid

4.4.3. Tetrahydrofuraan

4.4.4. Mononatriumfosfaat

4.4.5. Natriumacetaat

4.4.6. Azijnzuur

5. Apparatuur

5.1. Analytische balans

5.2. Bekerglazen met een inhoud van 25 resp. 100 ml

5.3. Pipetten met een inhoud van 1 resp. 10 ml

5.4. Magneetroerder

5.5. Pipetten met maatverdeling met een inhoud van 0,2, 0,5 en 5 ml

5.6. Maatkolven van 10, 50 en 100 ml

5.7. Injectors met een inhoud van 20 resp. 100 μl

5.8. Ultrasoonbad

5.9. Centrifuge die 27000 g kan leveren

5.10. Glazen flesjes met een inhoud van ongeveer 5 ml

5.11. Maatcilinder met een inhoud van 25 ml

5.12. Een pH-meter

5.13. HPLC-apparatuur

5.13.1. Gradiëntpompsysteem van 1,0 ml/min. bij 200 bar

5.13.2. Automatische bemonsteraar met mogelijkheid van derivatie

5.13.3. Kolomverwarming die is afgesteld op 30 °C

5.13.4. Fluorescentiedetector die is afgesteld op een excitatiegolflengte van 330 nm en een emissiegolflengte van 440 nm

5.13.5. Integrator of software voor dataverwerking die geschikt is voor piekoppervlaktemetingen

5.13.6. Een kolom Lichrosfeer - 100 (250 x 4,6 mm) of een daaraan gelijkwaardige kolom die gepakt is met octadecylsilaan (C 18) met een korrelgrootte van 5 μm

6. Monsterneming

De monsterneming moet in overeenstemming zijn met de IDF-norm 50B-1985.

7. Werkwijze

7.1. Bereiding van de inwendige standaardoplossing

Weeg 30,0 +- 0,1 mg tryptamine-monohydrochloride (punt 4.2.3) af in een maatkolf van 100 ml (punt 5.6) en vul aan tot de merkstreep met methanol (punt 4.2.1). Pipetteer 1 ml (punt 5.3) van deze oplossing in een maatkolf van 10 ml (punt 5.6) en vul aan tot de merkstreep met methanol (punt 4.2.1) om een oplossing te maken met een sterkte van 0,15 mM tryptamine.

7.2. Bereiding van de proefmonsteroplossing

Weeg 1,000 +- 0,001 g van het MMP-monster af in een bekerglas van 25 ml (punt 5.2). Voeg met een pipet (punt 5.3) 10 ml gedestilleerd water van 40° toe en roer gedurende 30 minuten met een magneetroerder (punt 5.4) om eventuele klontjes op te lossen. Pipetteer 0,2 ml (punt 5.5) van de melkpoederoplossing in een maatkolf van 10 ml (punt 5.6), voeg 100 μl toe van de 0,15 mM tryptamine-oplossing (punt 7.1) met behulp van een injector (punt 5.7) en vul aan tot de merkstreep met methanol (punt 4.2.1). Zorgvuldig mengen door omkeren en gebruik van ultrageluid gedurende 15 minuten. Centrifugeer (punt 5.9) gedurende tien minuten bij 27000 g en verzamel de bovenstaande vloeistof in een glazen flesje (punt 5.10).

NB:

De oplossing van het proefmonster moet worden bewaard bij 4 °C totdat de HPLC-bepaling wordt uitgevoerd.

7.3. Bereiding van de uitwendige standaardoplossing

Weeg 55,4 mg PEDP (punt 4.1) af in een maatkolf van 50 ml (punt 5.6) en voeg ongeveer 25 ml chloroform (punt 4.2.2) toe met behulp van een maatcilinder (punt 5.11). Verwarm de kolf, die nu van een stop moet zijn voorzien, tot 50 °C en meng zorgvuldig tot het PEDP oplost. Koel de kolf af tot 20 °C, vul tot de merkstreep aan met methanol (punt 4.2.1) en meng door middel van omkeren. Pipetteer 1 ml (punt 5.3) van deze oplossing in een maatkolf van 100 ml (punt 5.6) en vul het volume aan tot de merkstreep met methanol (punt 4.2.1). Pipetteer 1 ml (punt 5.3) van deze oplossing in een maatkolf van 10 ml (punt 5.6), voeg 100 μl (punt 5.7) van de 0,15 mM tryptamine-oplossing (punt 7.1) toe en vul het volume aan tot de merkstreep met methanol 1 (punt 4.2.1). Meng door middel van omkeren.

NB:

De oplossing van het standaardmonster moet worden bewaard bij 4 °C totdat de HPLC-bepaling wordt uitgevoerd.

7.4. Bereiding van het derivaatvormend reagens

Weeg 25,0 +- 0,1 mg OPA (punt 4.3.4) af in een maatkolf van 10 ml (punt 5.6), voeg 0,5 ml (punt 5.5) methanol (punt 4.2.1) toe en meng zorgvuldig om OPA op te lossen. Vul de vloeistof tot de merkstreep aan met boorzuuroplossing (punt 4.3.2) en voeg 20 μl 2-mercaptoethanol (punt 4.3.3) toe met een injector (punt 5.7).

NB:

Het derivaatvormend mengsel moet worden bewaard in een donkere fles bij 4 °C en is gedurende één week stabiel.

7.5. Bepaling met behulp van HPLC

7.5.1. Loopvloeistoffen (punt 4.4)

Vloeistof A:

0,3 mM mononatriumfosfaat en 3 mM natriumacetaatoplossing (op een pH 6,5 gebracht met behulp van azijnzuur) methanol: tetrahydrofuraan = 558: 440: 2 (volumetrisch).

Vloeistof B:

methanol.

7.5.2. Aanbevolen loopsnelheid:

>RUIMTE VOOR DE TABEL>

NB:

De loopsnelheid moet soms enigszins gewijzigd worden om het oplossend vermogen van figuur 1 te krijgen.

De temperatuur van de kolom moet 30 °C zijn.

7.5.3. Injectievolume: 50 μl derivaatvormend reagens en 50 μl monstervloeistof.

7.5.4. Het kolomevenwicht

Bij dagelijks gebruik moet iedere dag begonnen worden met spoelen van de kolom gedurende 15 minuten met 100 % oplosmiddel B; vervolgens wordt de verhouding A: B op 40: 60 gebracht en evenwicht gemaakt bij 1 ml/min. gedurende 15 minuten. Voer een blancobepaling uit door het injecteren van methanol (punt 4.2.1)

NB:

Voordat het toestel voor lange tijd buiten bedrijf wordt gesteld, moet de kolom gedurende 30 minuten worden gespoeld met methanol: chloroform = 80: 20 (volumetrisch).

7.5.5. Bepaling van het gehalte aan PS en PE in het proefmonster.

7.5.6. Voer de opeenvolgende chromatografische analyses uit waarbij de analysetijd constant moet worden gehouden om constante retentietijden te krijgen. Injecteer de uitwendige standaardoplossing (punt 7.3) na iedere vijf tot tien proefmonsteroplossingen om de responsfactor te kunnen beoordelen.

NB:

Na iedere 20 tot 25 analyses moet de kolom worden gereinigd met 100 % oplossing B (punt 7.5.1) gedurende ten minste 30 minuten.

7.6. Integratiegedeelte

7.6.1. PEDP-piek

PEDP wordt uitgespoeld met een enkele piek. Bepaal het piekoppervlak door dal-tot-dal-integratie.

7.6.2. Tryptamine-piek

Tryptamine wordt uitgespoeld met een enkele piek (figuur 1). Bepaal het piekoppervlak door dal-tot-dal-integratie.

7.6.3. PS- en PE-piekgroepen

Onder de beschreven omstandigheden (figuur 1) spoelt PS uit met twee grote, gedeeltelijk gescheiden pieken die vooraf worden gegaan door een kleine piek. PE spoelt uit met drie grote, gedeeltelijk gescheiden pieken. Bepaal het oppervlak van iedere piekenverzameling waarbij de basislijn gedefinieerd wordt zoals in figuur 1.

8. Berekening en weergave van de resultaten

Het gehalte aan PS en PE in het proefmonster moet als volgt worden berekend:

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

waarin:

C= gehalte aan PS of PE (mg/100 g poeder) in het proefmonster;

A1= PEDP-piekoppervlak van de standaardoplossing (punt 7.3);

A2= PS- of PE-piekoppervlak van de proefmonsteroplossing (punt 7.2);

T1= tryptamine-piekoppervlak van de standaardoplossing (punt 7.3);

T2= tryptamine-piekoppervlak van de proefmonsteroplossing (punt 7.2).

9. Nauwkeurigheid

NB:

De waarden voor herhaalbaarheid werden berekend volgens de internationale IDF-norm(1). Deze grens wordt verkregen overeenkomstig de procedure van bijlage III, onder b).

9.1. Herhaalbaarheid

De relatieve standaarddeviatie van de herhaalbaarheid, d.w.z. de variatie van onafhankelijke analyseresultaten van dezelfde persoon bij gebruik van hetzelfde apparaat onder dezelfde omstandigheden en met hetzelfde proefmonster binnen een korte tijdsperiode, mag niet groter zijn dan 2 %. Als twee bepalingen onder deze omstandigheden worden uitgevoerd, mag het relatieve verschil tussen de twee resultaten niet groter zijn dan 6 % van het rekenkundig gemiddelde van de resultaten.

9.2. Reproduceerbaarheid

Als twee resultaten zijn verkregen door personen die in verschillende laboratoria werken en die verschillende apparatuur gebruiken onder verschillende omstandigheden voor onderzoek van hetzelfde proefmonster, mag het relatieve verschil tussen die resultaten niet groter zijn dan 11 % van het rekenkundig gemiddelde van die resultaten.

10. Literatuurverwijzingen

10.1. Resmini P., Pellegrino L., Hogenboom J.A., Sadini V., Rampilli M., Detection of buttermilk solids in skimmilk powder by HPLG quantification of aminophospholipids, Sci.Tecn. Latt.-Cas., 39, 395 (1988).

Figuur 1: HPLC-patroon van OPA-derivaten van fosfatidilserine (PS) en fosfatidilethanolamine (PE) in methanolextract van opgelost mageremelkpoeder. De integratiewijze voor de pieken van PS, PE en tryptamine (interne standaard) is vermeld.

>PIC FILE= "L_2001037NL.007801.EPS">

(1) Internationale IDF-standaard (135B/1991). Melk en melkproducten. Nauwkeurigheid van analysemethoden. Outline of collaborative study procedure (een overzicht van een gezamenlijke studie).

BIJLAGE XXI

(Artikel 15)

OPSPORING VAN ANTIBIOTISCHE EN SULFONAMIDE/DAPSON-RESIDUEN IN MAGEREMELKPOEDER

Er wordt een test op bacterieremmende stoffen uitgevoerd waarbij Bacillus stearothermophilus var. Calidolactis C953 als testorganisme wordt gebruikt en die gevoelig genoeg is om 4 μg benzylpenicilline per liter melk en 100 μg sulfadimidine per liter melk aan te tonen. Er zijn commerciële pakketten verkrijgbaar die gebruikt kunnen worden als zij de vereiste gevoeligheid voor benzylpenicilline en sulfadimidine hebben(1).

Voor de test opgelost mageremelkpoeder worden gebruikt (1 g poeder en 9 ml gedestilleerd water). De test moet worden uitgevoerd als beschreven in het IDF-bulletin nr. 258/1991, deel 1, hoofdstuk 2, of volgens aanwijzingen van de fabrikant van het testpakket.

Positieve resultaten moeten als volgt worden geïnterpreteerd:

1. Herhaal de test, waarbij penicillinase aan het testsysteem wordt toegevoegd.

Positief resultaat: De remmende stof kan op deze wijze niet worden aangetoond.

Negatief resultaat: De remmende stof in een β-lactam antibioticum.

2. Herhaal de test, waarbij p-aminobenzoëzuur aan het testsysteem wordt toegevoegd.

Positief resultaat: De remmende stof kan op deze wijze niet worden aangetoond.

Negatief resultaat: De remmende stof is een sulfonamide/dapson.

3. Herhaal de test, waarbij penicillinase en p-aminobenzoëzuur aan het testsysteem worden toegevoegd.

Positief resultaat: De remmende stof kan op deze wijze niet worden aangetoond.

Negatief resultaat: De remmende stoffen zijn een β-lactam antibioticum en een sulfonamide/dapson.

(1) Belangrijke opmerking:

Als mageremelkpoeder wordt onderzocht, kunnen valse positieve resultaten voorkomen. Het is daarom van belang om vast te stellen dat het testsysteem geen valse positieve resultaten geeft.

BIJLAGE XXII

(Artikel 16)

BEPALING VAN DE HOEVEELHEID MAGEREMELKPOEDER IN MENGVOEDERS, DOOR ENZYMATISCHE COAGULATIE VAN PARACASEÏNE

1. Doel

Bepaling van de hoeveelheid mageremelkpoeder in mengvoeders, door enzymatische coagulatie van de paracaseïne.

2. Toepassingsgebied

Deze methode is van toepassing voor mengvoeders die ten minste 10 % mageremelkpoeder bevatten; de aanwezigheid van belangrijke hoeveelheden karnemelk en/of van bepaalde niet-melkeiwitten kan storend werken.

3. Principe van de methode

3.1. Oplossen van de caseïne aanwezig in het mengvoeder door extractie met natriumcitraatoplossing.

3.2. Herstellen van de voor het neerslaan van de paracaseïne vereiste concentratie aan calciumionen; omzetting van de caseïne in paracaseïne door de werking van het lebstremsel.

3.3. Bepaling van de paracaseïnestikstof volgens de Kjeldahl-methode, beschreven in IDF 20A 1986; berekening van de hoeveelheid mageremelkpoeder op basis van een minimumgehalte aan caseïne van 27,5 (zie punt 9.1).

4. Reagentia

De gebruikte reagentia zijn van pro-analysekwaliteit. Gebruik gedestilleerd water of water van een gelijkwaardige zuiverheid. Met uitzondering van het lebstremsel (punt 4.5), dienen alle gebruikte reagentia en oplossingen vrij te zijn van stikstofhoudende stoffen.

4.1. Trinatriumcitraat-dihydraat (oplossing van 1 % g/v).

4.2. Calciumchloride (2M-oplossing). Weeg 20,18 g CA-CO3 (pro-analysekwaliteit) af in een porseleinen capsule van vereiste grootte (150-200 ml) of in een bekerglas. Bedek met gedestilleerd water en breng over naar een kokendwaterbad. Voeg langzaam 50-60 ml HCl-oplossing toe (concentratie HCl: water = 1:1) om het carbonaat volledig op te lossen. Laat het kokendwaterbad staan totdat de CACl2 is gedroogd, teneinde de HCl die niet heeft gereageerd, af te scheiden. Decanteer met gedestilleerd water in een maatfles van 100 ml en verdun tot aan het merkteken. Controleer de pH-waarde, die niet lager mag zijn dan 4,0. Bewaar de oplossing in een koelkast.

4.3. Natriumhydroxide 0,1 N.

4.4. Zoutzuur 0,1 N.

4.5. Gestandaardiseerde lebstremseloplossing, sterkte 1: 10000 (extract van kalverlebmagen); bewaring in koelkast bij 4 tot 6 °C.

4.6. Reagentia voor de bepaling van stikstof volgens de Kjeldahl-methode, beschreven in IDF 20A 1986.

5. Apparatuur

Gebruikelijk laboratoriummateriaal, met name:

5.1. mortier of mengmolen;

5.2. analytische balans;

5.3. tafelcentrifuge (2000 tot 3000 omw./min.), met centrifugebuizen van 50 ml;

5.4. magnetische roerder met staafjes van 10 tot 15 mm;

5.5. bekerglazen van 150 tot 200 ml;

5.6. kolven van 250 ml en 500 ml;

5.7. glazen trechters met een diameter van 60 tot 80 mm;

5.8. asvrije rondfilters, snel filtrerend, met een diameter van 150 mm (S.S. 5892, S.S. 595 1/2);

5.9. pipetten van verschillende inhoud;

5.10. waterbad, met thermostaat geregeld op 37 °C;

5.11. pH-meter;

5.12. destructie- en destillatie-apparaat voor de Kjeldahl-methode;

5.13. gegradueerde buret van 25 ml;

5.14. plastic spuitfles voor gedestilleerd water;

5.15. spatels van roestvrij staal;

5.16. thermometer;

5.17. droogstoof met thermostaat.

6. Uitvoering

6.1. Bereiding van het monster

Wrijf 10 tot 20 g van het monster fijn in een mortier of meng in een mengmolen teneinde een homogeen mengsel te bekomen.

6.2. Oplossen van het melkpoeder en afscheiden van het onoplosbare deel

6.2.1. Weeg 1,000 +- 0,002 g van het gehomogeniseerde mengvoeder (punt 6.1) direct in een centrifugebuis van 50 ml. Voeg hieraan 30 ml van de trinatriumcitraatoplossing (punt 4.1) voorafgaandelijk verwarmd tot 45 °C toe. Roer met een magnetische roerder gedurende ten minste vijf minuten.

6.2.2. Centrifugeer bij 500 g (2000 tot 3000 omw.min.) gedurende tien minuten en decanteer de bovenstaande vloeistof in een bekerglas van 150 tot 200 ml. Zorg ervoor dat geen losse onopgeloste deeltjes overgaan bij het decanteren van de bovenstaande vloeistof.

6.2.3. Verricht nog twee extracties op het residu volgens dezelfde werkwijze; voeg de drie waterige extracten samen.

6.2.4. Indien er zich een olielaag vormt op deze extracten, koel dan in een koelkast totdat het vet stolt en verwijder de vetlaag met behulp van een spatel.

6.3. Coagulatie van de caseïne door de enzymen van het stremsel

6.3.1. Voeg aan het totale waterige extract (ongeveer 100 ml), al roerend, druppelsgewijs 3,4 ml verzadigde oplossing calciumchloride (punt 4.2) toe. Stel de pH in op 6,4 tot 6,5 met verdunde oplossingen van NaOH (punt 4.3) of HCl (punt 4.4). PLaats de oplossing in het thermostaatbad bij 37 °C gedurende 15 tot 20 minuten zodat het zoutevenwicht zich kan instellen. De oplossing wordt hierbij melkachtig wit.

6.3.2. Breng de vloeistof over in één (of twee) centrifugebuizen en centrifugeer bij 2000 g gedurende tien minuten, teneinde neerslag te verwijderen. Decanteer het supernatans, zonder de neerslag te wassen, in één (of twee) centrifugebuizen.

6.3.3. Breng de temperatuur van het supernatans opnieuw op 37 °C. Voeg aan het extract, al roerend, druppelsgewijs 0,5 ml vloeibaar stremsel (punt 4.5) toe. Coagulatie treedt op binnen één of twee minuten.

6.3.4. Plaats het monster opnieuw in het waterbad bij 37 °C gedurende 15 minuten. Neem het monster uit het bad en breek dan het coagulum door roeren. Centrifugeer bij 2000 g gedurende tien minuten. Filtreer de bovenstaande vloeistof op een geschikt filtreerpapier(1), Whatman nr. 541 of dergelijke; bewaar het filteerpapier. Was de neerslag in de centrifugebuis met 50 ml water bij ongeveer 35 °C door de neerslag te roeren.

Centrifugeer opnieuw bij 2000 g gedurende tien minuten. Filtreer de bovenstaande vloeistof op het bewaarde filtreerpapier.

6.4. Bepaling van caseïnestikstof

6.4.1. Breng de neerslag na het wassen kwantitatief over op het filtreerpapier dat is bewaard van punt 6.3.4, met gebruik van gedestilleerd water. Breng het filtreerpapier over naar de Kjeldahl-kolf. Bepaal de stikstof volgens de Kjeldahl-methode, beschreven in IDF 20A 1986.

7. Blancobepaling

7.1. Verricht regelmatig een blancobepaling door een asvrije filter (punt 5.8), bevochtigd met een mengsel van 90 ml van de trinatriumoplossing (punt 4.1), 1 ml van de verzadigde calciumchlorideoplossing (4.2), 0,5 ml stremsel (punt 4.5), en gewassen met 3 x 15 ml water. Bepaal de stikstof volgens de Kjeldahl-methode beschreven in IDF 20A 1986.

7.2. Verminder het volume zuur (punt 4.4), verbruikt bij de titratie van het onderzochte monster, met de verbruikte hoeveelheid bij de blancobepaling.

8. Controleproef

8.1. Voer, ter controle van de werkwijze en van de gebruikte reagentia, een bepaling uit op een mengvoeder van normale samenstelling waarvan het gehalte aan mageremelkpoeder in een ringonderzoek is vastgesteld. Het gemiddelde resultaat van een bepaling in tweevoud mag niet meer dan 1 % afwijken van het resultaat van het ringonderzoek.

9. Uitdrukking van de resultaten

9.1. Het percentage mageremelkpoeder in het mengvoeder wordt berekend aan de hand van de volgende formule:

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

waarin N het percentage paracaseïnestikstof is en 27,5 de omzettingsfactor om de bepaalde caseïne om te zetten in het percentage mageremelkpoeder; 2,81 en 0,908 zijn correctiefactoren die bij regressieanalye zijn verkregen.

10. Nauwkeurigheid van de methode

10.1. Herhaalbaarheid

In ten minste 95 % van de bestudeerde gevallen was het verschil tussen twee individuele resultaten verkregen door één analyst in één laboratorium bij onderzoek van eenzelfde monster niet meer dan 2,3 g mageremelkpoeder op 10 g onderzocht mengvoeder.

10.2. Reproduceerbaarheid

In ten minste 95 % van de bestudeerde gevallen was het verschil tussen de in twee laboratoria op eenzelfde monster verkregen resultaten niet meer dan 6,5 g mageremelkpoeder op 100 g onderzocht mengvoeder.

11. Tolerantiegrens

De CrD95-waarde (kritisch verschil; 95 % betrouwbaarheidsgrens) wordt berekend aan de hand van de formule (ISO 5725):

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

(R: reproduceerbaarheid; r: herhaalbaarheid).

Dubbele bepaling: CrD95 = 4,5 g.

Wanneer het verschil tussen de uitkomst van de chemische analyse en de opgegeven hoeveelheid mageremelkpoeder niet meer dan 4,5 g bedraagt (dubbele bepaling), wordt de partij mengvoeder geacht te voldoen aan het betrokken voorschrift.

12. Opmerkingen

12.1. De toevoeging van een aanzienlijk percentage niet-melkeiwitten, met name van soja, indien deze met de melk werden verwarmd, geeft aanleiding tot te hoge resultaten, door coprecipitatie met de paracaseïne van de melk.

12.2. In sommige gevallen kan de toevoeging van karnemelk aanleiding geven tot te lage cijfers, doordat de analyse slechts betrekking heeft op het ontvette extract. Bij toevoeging van sommige karnemelkpoeders van zure room kunnen aanzienlijk lagere cijfers worden gevonden doordat deze poeders niet volledig oplossen in de citraatoplossing.

12.3. De toevoeging van ten minste 0,5 % lecithine kan eveneens tot te lage resultaten aanleiding geven.

12.4. De verwerking van mageremelkpoeder, gedroogd op hoge temperatuur (high-heat), kan te hoge waarden geven, te wijten aan de coprecipitatie van wei-eiwitten met de paracaseïne.

(1) Er dient een snelfiltrerend asvrij papier te worden gebruikt.

BIJLAGE XXIII

(Artikel 17)

KWALITATIEVE BEPALING VAN ZETMEEL IN MAGEREMELKPOEDER, GEDENATUREERD MELKPOEDER EN MENGVOEDERS

1. Toepassingsgebied

Deze methode beoogt de opsporing van zetmeel dat in gedenatureerde melkpoeders als merkstof wordt gebruikt.

De onderste detectiegrens van de methode is ongeveer 0,05 g zetmeel per 100 g monster.

2. Principe van de methode

De reactie is gebaseerd op die welke in de jodometrie wordt gebruikt:

- binding door de colloïden van het vrije jodium in een waterige oplossing,

- absorptie door de zetmeelmicellen en door kleurvorming.

3. Reagentia

3.1. Jodiumoplossing:

- Jodium: 1 g.

- Kaliumjodide: 2 g.

- Gedestilleerd water: 100 ml.

4. Apparatuur

4.1. Analytische balans.

4.2. Waterbad.

4.3. Proefbuizen, 25 mm x 200 mm.

5. Uitvoering

Weeg 1 g van het monster en doe deze hoeveelheid in de proefbuis (punt 4.3).

Voeg 20 ml gedestilleerd water toe en schud om het monster te dispergeren.

Plaats de proefbuis in het warmwaterbad (punt 4.2) op kooktemperatuur en laat vijf minuten staan.

Neem de proefbuis uit het warmwaterbad en koel af tot kamertemperatuur.

Voeg 0,5 ml toe van de jodiumoplossing (punt 3.1), schud en observeer de resulterende kleur.

6. Uitdrukking van de resultaten

Een blauwe verkleuring wijst op de aanwezigheid van niet-gemodificeerd zetmeel in het monster.

Wanneer het monster gemodificeerd zetmeel bevat, is de kleur niet noodzakelijkerwijs blauw.

7. Opmerkingen

De kleur, de intensiteit van de kleur en het uitzicht van het zetmeel onder de microscoop zullen variëren naar gelang van de grondstof van het niet-gemodificeerde zetmeel (bv. maïs of aardappel) en de soort gemodificeerd zetmeel in het monster.

Als het monster gemodificeerd zetmeel bevat, is er naar gelang van de mate waarin de kristallijne structuur van niet-gemodificeerd zetmeel is gewijzigd, een verkleuring naar paars, rood of bruin.

BIJLAGE XXIV

(Artikel 18)

BEPALING VAN HET VOCHTGEHALTE IN ZUREKARNEMELKPOEDER

1. Doel

Bepaling van het vochtgehalte in voor diervoeder bestemd zurekarnemelkpoeder.

2. Beginsel

Het monster wordt onder vacuüm gedroogd. Het gewichtsverlies wordt bepaald door wegen.

3. Apparatuur

3.1. Analytische balans.

3.2. Vochtdozen van roestvrij metaal of van glas met luchtdicht afsluitende deksels en met een zodanig nuttig oppervlak dat het monster kan worden verdeeld naar rata van ongeveer 0,3 g per cm2.

3.3. Elektrische vacuümdroogstoof met oliepomp, voorzien van een inrichting voor toevoer van gedroogde, warme lucht of voorzien van een droogmiddel (bv. calciumoxide).

3.4. Exsiccator met een efficiënt droogmiddel.

3.5. Droogoven met ventilator en thermostaat op 102 +- 2 °C.

4. Werkwijze

Verwarm een vochtdoos (punt 3.2) met deksel ten minste één uur in de droogstoof (punt 3.5). Plaats het deksel op de vochtdoos, breng deze onmiddellijk over in de exsiccator (punt 3.4), laat afkoelen tot kamertemperatuur en weeg tot op 0,5 mg nauwkeurig.

Weeg een vochtdoos met deksel tot op 0,5 mg nauwkeurig. Breng ongeveer 5 g van het monster, tot op 1 mg nauwkeurig gewogen, in de getarreerde vochtdoos en spreid gelijkmatig uit. Plaats de vochtdoos zonder deksel in de vooraf op 83 °C gebrachte vacuümdroogstoof (punt 3.3). Om te voorkomen dat de temperatuur teveel daalt, dient de vochtdoos zo snel mogelijk in de droogstoof te worden gebracht.

Stel de druk in op 100 Torr (13,3 kPa) en droog het monster gedurende vier uur bij deze druk hetzij onder toevoer van droge warme lucht, hetzij met behulp van een droogmiddel (ongeveer 300 g voor 20 monsters). In het laatste geval wordt bij het bereiken van de voorgeschreven druk de verbinding met de vacuümpomp verbroken. Reken de droogtijd uit vanaf het tijdstip dat de droogstoof weer op een temperatuur van 83 °C is. Laat de druk in de stoof voorzichtig weer komen op die van de buitenlucht. Open de vacuümdroogstoof en sluit onmiddellijk de vochtdoos met het deksel. Neem de vochtdoos uit de stoof, laat gedurende 30 à 45 minuten afkoelen in de exsiccator (punt 3.4) en weeg op 1 mg nauwkeurig. Droog nog gedurende 30 minuten in de vacuümstoof (punt 3.3) op 83 °C en weeg opnieuw. Het verschil tussen de resultaten van beide wegingen mag niet meer bedragen dan 0,1 % vocht.

5. Berekening van de resultaten

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

waarin:

E= massa in g van het oorspronkelijke analysemateriaal;

m= massa in g van het gedroogde analysemateriaal.

6. Nauwkeurigheid van de methode

6.1. Herhaalbaarheid

Het verschil tussen de resultaten van twee bepalingen binnen een zo kort mogelijke tijd, uitgevoerd door dezelfde persoon met dezelfde apparatuur op hetzelfde monster, mag niet groter zijn dan 0,4 g vocht/100 g zurekarnemelkpoeder.

6.2. Reproduceerbaarheid

Het verschil tussen de resultaten van twee bepalingen, uitgevoerd door personen in verschillende laboratoria met verschillende apparatuur op hetzelfde monster, mag niet groter zijn dan 0,6 mg vocht/100 g zurekarnemelkpoeder.

6.3. Herkomst van de precisiegegevens

De precisiegegevens zijn vastgesteld op basis van een experiment dat in 1995 in acht laboratoria werd uitgevoerd met twaalf monsters (zes blinde duplo's).

BIJLAGE XXV

(Artikel 19)

REFERENTIEMETHODE VOOR DE DETECTIE VAN VREEMDE VETTEN IN MELKVET DOOR GASCHROMATOGRAFISCHE ANALYSE VAN TRIGLYCERIDEN - REVISIE 1

1. Doel en toepassingsgebied

Met deze norm wordt een methode vastgesteld voor de detectie van vreemde vetten, zowel plantaardige als dierlijke zoals rund- en varkensvet, in melkvet van melk en melkproducten door analyse van triglyceriden door middel van gaschromatografie.

Aan de hand van gedefinieerde triglyceridenformules worden plantaardige en dierlijke vetten kwalitatief en kwantitatief in zuiver melkvet bepaald ongeacht de invloed van voedering of lactatie.

Opmerking 1:

Hoewel het uitsluitend in melkvet voorkomende boterzuur (C4) en kwantitatieve schatting van geringe tot gemiddelde hoeveelheden melkvet in plantaardige vetten mogelijk maakt, kan kwalitatieve en kwantitatieve informatie nauwelijks worden verkregen bij toevoeging tot minstens 20 % (gewichtspercentage) vreemd vet aan zuiver melkvet wegens de grote variatie van C4 die ligt tussen ongeveer 3,5 en 4,5 %.

Opmerking 2:

Kwantitatieve resultaten kunnen vrijwel uitsluitend worden verkregen door analyse van triglyceriden, omdat het sterolgehalte van de plantaardige vetten uiteenloopt als functie van de productie en de behandeling.

2. Definitie

Vreemde vetten in melkvet: de in deze norm gedefinieerde vreemde vetten zijn alle plantaardige en dierlijke vetten behalve melkvet.

3. Principe van de methode

Na extractie van het melkvet wordt een stamoplossing bereid. Aan de hand van deze oplossing worden de triglyceriden (totale koolstofnummers) gaschromatografisch bepaald in gevulde kolommen. Door het gewichtspercentage van de vetmoleculen van verschillende grootte (C24 - C54 - alleen even nummers) in de triglyceridenformule in te voeren, worden de vreemde vetten hetzij kwalitatief gedetecteerd hetzij kwantitatief bepaald.

Opmerking:

Wanneer de hier beschreven evaluatie in acht wordt genomen, kan van capillaire gaschromatografie gebruik worden gemaakt als gegarandeerd wordt dat vergelijkbare resultaten worden verkregen(1).

4. Reagentia

Er moeten chemicaliën van analysekwaliteit worden gebruikt.

4.1. Draaggas: stikstof, zuiverheidsgraad [gE ] 99,996 %.

4.2. Standaardtriglyceriden(2), zowel verzadigde als cholesterol voor standaardisatie van een standaardmelkvet volgens paragraaf 6.5.4.

4.3. Methanol, watervrij.

4.4. n-hexaan.

4.5. n-heptaan.

4.6. Tolueen.

4.7. Dimethylchloorsilaanoplossing: 50 ml dimethylchloorsilaan wordt in 283 ml tolueen opgelost.

4.8. Verbrandingsgas: waterstof en synthetische lucht.

4.9. Stationaire fase, 3 % OV-1 op 125/150 μm (100/120 maaswijdte) GasChromQ(3).

4.10. 10 % cacaoboteroplossing.

5. Instrumentarium

Normale laboratoriumapparatuur, met name de volgende:

5.1. Gaschromatograaf geschikt voor hoge temperaturen van minstens 400-450 °C, uitgerust met een vlamionisatiedetector (VID) en constante massastroomregelaar voor het draaggas. Verbrandingsgas: 30 ml/min H2, 270 ml/min synthetische lucht.

Gezien de sterke draaggasstroom moet de vlam bijzonder breed zijn.

Opmerking:

Gezien de hoge temperaturen die tijdens de triglyceridenanalyses optreden, moeten de glazen geleidebuisjes in de VID of in het injectorsysteem vaak worden gereinigd.

De gaschromatograaf moet zijn voorzien van septa die tegen hoge temperaturen bestand zijn, vaak kunnen worden gebruikt en over het algemeen een geringe "lekkage" vertonen.

Opmerking:

Chromblue TM-septa (Chrompack) zijn geschikt.

De septa moeten op gezette tijden worden vervangen, bijvoorbeeld na ruwweg 100 injecties of zodra de resolutie achteruitgaat (zie figuur 4).

5.2. Chromatografiekolom

U-vormige glazen kolom (invoerdiameter 2 mm, 50 cm lang), die eerst volgens paragraaf 6.1 wordt gesilaneerd met dimethylchloorsilaan teneinde het glasoppervlak te inactiveren.

Opmerking:

Iets langere gevulde kolommen (80-200 cm lang) zijn ook bruikbaar. Hiermede kan een iets betere reproduceerbaarheid van de resultaten worden bereikt. De stationaire fase vertoont daarentegen na gebruik van enkele maal breuken, die op hun beurt tot slechtere kwantitatieve resultaten aanleiding kunnen geven. Verder gaat de VID-vlam gemakkelijk uit als gevolg van de bijzonder sterke gasstroom van 75-85 ml/min die nodig is.

5.3. Opstelling voor het vullen van de kolom (zie figuur 1)

Figuur 1

Vullen van de kolom

>PIC FILE= "L_2001037NL.008701.EPS">

5.3.1. Plastic kolom voorzien van twee schroefdoppen en een merkstreepje tot waar de benodigde hoeveelheid stationaire fase kan worden gevuld.

5.3.2. Fijne zeef (maaswijdte ongeveer 100 μm) met schroefdop, geschikt voor afsluiting van de glazen kolom volgens figuur 1.

5.3.3. Geïnactiveerde, gesilaneerde glaswol.

5.3.4. Vibrator voor gelijkmatige verdeling van de stationaire fase tijdens het vullen.

5.4. 1 tot 3 ml Extrelut-kolom(4) met silicagel. Deze kolom kan als alternatief voor de extractie worden gebruikt om melkvet te verkrijgen.

5.5. Grafietpakking 6,4 mm (1/4") met een boring van 6 mm.

5.6. Inrichting voor het silaneren van het glasoppervlak van de kolom volgens paragraaf 6.1.

5.6.1. Woulff-fles.

5.6.2. Waterzuigpomp.

5.7. Waterbad, instelbaar op (50 +- 2) °C.

5.8. Droogkast, instelbaar op (50 +- 2) °C en (100 +- 2) °C.

5.9. μl-pipet.

5.10. 5 ml-pipet met schaalindeling voor het doseren van 1,5 ml methanol.

5.11. 50 ml-rondbodemkolf.

5.12. Erlenmeyerkolf, nominaal volume 50 ml.

5.13. Trechter.

5.14. Filter met fijne poriën.

5.15. Rotatieverdamper.

5.16. Ampullen, nominaal volume 1 ml, afsluitbaar met aluminiumdop, met een septum in het inwendige.

5.17. Injectiespuit; de zuiger van de gebruikte spuit mag niet tot in de naaldpunt reiken.

Opmerking:

Met zulke spuiten is een betere reproduceerbaarheid van de te behalen resultaten mogelijk.

Teneinde achteruitgang van het septum te voorkomen, dient de naaldpunt op gezette tijden te worden gecontroleerd (bijvoorbeeld met een stereomicroscoop).

6. Procedure

6.1. Klaarmaken van de kolom (silaneren).

Na aansluiting van de Woulff-fles, als aangegeven in figuur 2, op de waterzuigpomp, wordt slang 2 in de oplossing volgens paragraaf 4.7 gehangen. Door de afsluiter te sluiten, wordt de kolom gevuld; daarna worden de beide slangen verwijderd.

Figuur 2

Opstelling voor silaneren

>PIC FILE= "L_2001037NL.008801.EPS">

De kolom wordt op een statief bevestigd en met behulp van een pipet geheel met de dimethyldichloorsilaanoplossing gevuld.

Na 20-30 min. wordt de Woulff-fles door een zuigfles vervangen en de kolom geleegd door haar op de waterzuigpomp aan te sluiten (zie figuur 3).

6.2. Vullen van de kolom

Dit wordt gevolgd door het achtereenvolgens spoelen met 75 ml tolueen en 50 ml methanol; daarna wordt de geleegde kolom in de droogkast gedurende ongeveer 30 min. bij 100 °C gedroogd.

Figuur 3

Opstelling voor spoelen

>PIC FILE= "L_2001037NL.008901.EPS">

Voor het vullen van de kolom wordt de opstelling als in figuur 1 weergegeven, aangehouden. De stationaire fase volgens paragraaf 4.9 wordt in de plastic kolom tot aan het merkstreepje afgevuld. Het ondereinde van de te vullen glazen kolom wordt afgesloten met een ongeveer 1 cm lange prop glaswol, die van tevoren is gesilaneerd en met een stalen staaf wordt aangedrukt. Het uiteinde van de kolom wordt dan met de zeef volgens paragraaf 5.3.2 gesloten.

De kolom wordt onder druk (3 bar, met N2) met de stationaire fase gevuld. Om een gelijkmatige, continue en stevige vulling te verkrijgen, wordt tijdens het vullen een vibrator in de glazen kolom op en neer bewogen.

Na het vullen wordt een stevige prop gesilaneerde glaswol in het andere uiteinde van de gevulde kolom geduwd, de uitstekende einden worden weggesneden en de prop wordt met een spatel een paar millimeter in de kolom geduwd.

6.3. Bereiding van de monsters

Ter bereiding van de monsters wordt een van de drie onderstaande methoden gebruikt:

6.3.1. Isolering van het melkvet uit boter

5-10 kg boter wordt bij 50 °C in een geschikt bakje in een waterbad volgens paragraaf 5.7 gesmolten.

Een erlenmeyerkolf van 50 ml en een trechter met daarin een filter volgens paragraaf 5.14 worden in de droogkast tot 50 °C verwarmd. De vetlaag van het gesmoltenbotermonster wordt met behulp van het voorverwarmde toestel gefilterd.

Een dergelijk melkvet is vrijwel vrij van fosfolipiden.

6.3.2. Extractie van de vetfractie volgens de methode Röse-Gottlieb.

Extractie vindt plaats volgens IDF-norm IC: 1987, 16C: 1987, 116A: 1987 of 22B: 1987.

Met zo'n melkvet maken de fosfolipiden het mogelijk een cholesterolpiek te verkrijgen die met ongeveer 0,1 % verhoogd is.

Het triglyceridenspectrum dat op 100 gestandaardiseerd is met het cholesterol wordt daardoor niet noemenswaardig beïnvloed.

6.3.3. Extractie van melk met behulp van silicagelkolommen

0,7 ml van een tot 20 °C getemperd melkmonster wordt met een μl pipet volgens paragraaf 5.4 op een 1-3 ml Extrelut-kolom gebracht; laat het zich gedurende ongeveer 5 min. gelijkmatig over de silicagel verdelen.

Voor denaturering van de eiwit-lipidecomplexen wordt 1,5 ml methanol met een pipet toegevoegd. Vervolgens wordt het monster met 20 ml n-hexaan geëxtraheerd. Het n-hexaan wordt langzaam in kleine hoeveelheden toegevoegd en het oplosmiddel wordt opgevangen in een rondbodemkolf van 50 ml die tot een constant, bekend gewicht was gedroogd.

Laat de kolom na extractie geheel leeglopen.

De oplosmiddelen worden van het eluaat afgedestilleerd op een rotatieverdamper bij een waterbadtemperatuur tussen 40 en 50 °C.

De fles wordt gedroogd en de vetopbrengst wordt door weging vastgesteld.

Opmerking:

Vetextracties volgens Gerber, Weibull-Berntrop, Schmid-Bondzynski-Ratzlaff of isolering van melkvet met behulp van detergentia (BDI-methode) zijn voor analyse van triglyceriden niet geschikt, omdat bij deze methoden min of meer grote hoeveelheden partiële glyceriden of fosfolipiden in de vetfase kunnen overgaan.

6.4. Bereiding van de monsteroplossing

Voor gaschromatografie wordt een 5 %-ige oplossing van het vet in n-heptaan verkregen volgens paragraaf 6.3 gebruikt. Ter bereiding van deze monsteroplossing worden overeenkomstige hoeveelheden van het volgens de paragrafen 6.3.1 en 6.3.2 verkregen monstermateriaal gewogen en in overeenkomstige hoeveelheden n-heptaan opgelost.

Met het monsterpreparaat volgens paragraaf 6.3.3 wordt de hoeveelheid aan het monstermateriaal in de fles toe te voegen n-heptaan berekend door middel van weging en de rest wordt erin opgelost.

Ongeveer 1 ml van de monsteroplossing wordt in een ampul volgens paragraaf 5.16 afgevuld.

6.5. Chromatografische bepaling van triglyceriden

Bij de hoge temperaturen tot 350 °C voor de eluering van de triglyceriden C52-C56 met lange ketens treedt gemakkelijk een verhoging van de basislijn op, vooral als de kolommen in het begin niet behoorlijk zijn geconditioneerd. Deze stijging van de basislijn bij hoge temperaturen kan geheel worden vermeden door twee kolommen te combineren of door aftrekken van de basislijn.

Bij de compensatoire modus of het gebruik van enkele kolommen alsook voor de glazen geleidebuisjes in de injector en in de detector moeten de grafietpakkingen volgens paragraaf 5.5 worden gebruikt.

6.5.1. Correctie van de basislijn

Ter voorkoming van verhoging van de basislijn kan een van deze vier methoden worden gebruikt:

6.5.1.1. Combinatie van kolommen

Er worden in de compensatoire modus twee gevulde kolommen gebruikt.

6.5.1.2. Correctie van de basislijn door de gaschromatograaf

Door de gaschromatograaf in werking te stellen zonder injectie van een vetoplossing gevolgd door aftrekken van de opgeslagen basislijn kan verhoging van de basislijn worden voorkomen.

6.5.1.3. Correctie van de basislijn door integratieprogrammatuur

Door toepassing van een reeks met het integratiesysteem zonder injectie van een vetoplossing gevolgd door aftrekken van de opgeslagen basislijn kan verhoging van de basislijn worden voorkomen.

6.5.1.4. Correctie van de basislijn door goede conditionering

Door een goede initiële conditionering van de kolom en ongeveer 20 injecties met melkvetoplossingen in de basislijnverhoging bij hoge temperaturen dikwijls zo gering dat basislijncorrecties niet nodig zijn.

6.5.2. Injectietechniek

Ter vermijding van discriminatie-effecten wordt de "hete-injectie"-techniek toegepast om met de triglyceridecomponenten met een hoog kookpunt betere kwantitatieve resultaten te verkrijgen. Hierbij wordt de vetoplossing in de spuit opgezogen en wordt de koude naald van de spuit vóór injectie ongeveer drie seconden in de injectorkop verwarmd. Daarna wordt de inhoud van de spuit snel geïnjecteerd.

Opmerking:

Met deze injectietechniek wordt het risico van fractioneringsverschijnselen binnen de spuit of het injectieblok verkleind. Er wordt geen gebruik gemaakt van rechtstreekse injectie in het bovenste, verwarmde uiteinde van de kolom, omdat de fragmenten van het septum, die zich daar ophopen, alsmede verontreinigende stoffen met de gebruikte techniek gemakkelijk kunnen worden verwijderd door een injectorgeleidebuisje regelmatig te vervangen zonder de kolom te demonteren.

Verbuiging van de naaldpunt ten gevolge van contact met de bodem van de monsterbeker (zelfs als zulks nauwelijks met het oog waarneembaar is) moet absoluut worden vermeden teneinde het septum niet te beschadigen.

Figuur 4

Triglyceridenchromatogram van een melkvetmonster

>PIC FILE= "L_2001037NL.009101.EPS">

6.5.3. Conditionering van een gevulde kolom

Tijdens stadium a) tot c) wordt de bovenzijde van de kolom niet met de detector verbonden om verontreiniging te voorkomen.

De volgens paragraaf 6.2 gevulde kolommen worden als volgt geconditioneerd:

a) 15 min 40 ml/min N2-stroom bij 50 °C,

b) verhitting met 1 K/min tot 355 °C bij ml N2/min,

c) 12-15 h op 355 °C houden,

d) twee injecties à 1 μl van de cacaoboteroplossing volgens paragraaf 4.10 en het desbetreffende temperatuurprogramma,

e) 20 injecties à 0,5 μl van een melkvetoplossing gedurende twee tot drie dagen volgens paragraaf 6.4.

Opmerking:

Cacaoboter bestaat bijna volledig uit C50 tot C56-triglyceriden met een hoog kookpunt. Het doel van injectie met cacaoboter is speciale conditionering in deze reeks met lange ketens. Met de triglyceriden C50 tot C54 met een hoog kookpunt kunnen zich gedeeltelijk responsfactoren tot ongeveer 1,20 voordoen. Normaliter valt met herhaalde injecties van een melkvetoplossing een vermindering van de aanvankelijk hoge responsfactoren voor C50 tot C54 te verwachten. De factoren benaderen 1 met triglyceriden met een laag acyl-c-getal.

Er worden respectievelijk drie paar van de volgens paragraaf 6.2 gevulde kolommen klaargemaakt. De geconditioneerde paren worden respectievelijk gecontroleerd door bij wijze van routine een melkvetanalyse uit te voeren. Het paar met de beste kwantitatieve resultaten (responsfactoren bijna 1) wordt gebruikt voor het volgende. Bij responsfactoren > 1,20 wordt de kolom niet gebruikt.

6.5.4. IJking

Voor ijking dienen de responsfactoren van de overeenkomstige triglyceriden evenals van het cholesterol van een melkvet (gestandaardiseerd vet) te worden bepaald met behulp van de gestandaardiseerde triglyceriden (ten minste de verzadigde triglyceriden C24, C30, C36, C42, C48 en C54 alsmede cholesterol; nog beter ook C50 en C52). Tussenliggende reponsfactoren kunnen door wiskundige interpolatie worden gevonden.

Met het gestandaardiseerde vet moeten dagelijks twee tot drie ijkingen worden verricht. Als vrijwel identieke resultaten worden verkregen, zullen met de analyse van triglyceriden in de monsters goed reproduceerbare kwantitatieve resultaten worden behaald.

Het gestandaardiseerde melkvet heeft bij een bewaartemperatuur van maximaal -18 °C een houdbaarheid van verscheidene maanden en kan derhalve als norm worden gehanteerd.

Opmerking:

De responsfactor van elk bestanddeel kan ook worden vastgesteld door een gestandaardiseerd vet te gebruiken met een gecertificeerde triglyceridensamenstelling, zoals CRM 519 (watervrij melkvet) dat op de markt wordt gebracht door het "Instituut voor referentiematerialen en -metingen" (IRMM) te Geel, België.

6.5.5. Temperatuurprogramma, draaggas en andere voorwaarden voor analyse van triglyceriden

Temperatuurprogramma: aanvankelijke kolomtemperatuur 210 °C, 1 min. aanhouden, daarna op 6 °C/min. tot 350 °C programmeren en 5 min. op de eindtemperatuur houden.

Temperatuur van detector en injector: respectievelijk 370 °C.

Opmerking:

Detector-, injector- en oventemperaturen (aanvankelijke temperatuur) moeten op een constant niveau worden gehouden (ook 's nachts, tijdens weekeinden en vakanties).

Draaggas: stikstof, stroomsnelheid 40 ml/min.

Opmerking:

Als kolommen van 80 cm worden gebruikt, moet de stroomsnelheid minstens 75 ml/min N2 bedragen. De draaggasstroom moet constant worden gehouden (ook 's nachts alsmede tijdens weekeinden en vakanties). De juiste draaggasstroom moet zodanig worden gereguleerd dat C54, ongeacht de kolomlengte, bij 341 °C wordt geëlueerd.

Duur der analyse: 29,3 min.

Injectievolume: 0,5 μl.

Opmerking:

De spuit moet na injectie verscheidene malen met zuiver heptaan worden gespoeld.

VID-omstandigheden: volgens paragraaf 5.1.

Opmerking:

De vlamionisatiedetector wordt respectievelijk aan het begin van elke werkdag aangestoken.

7. Integratie, evaluatie en beheersing van de meetomstandigheden

Triglyceriden met een oneven acyl-c-getal (2n + 1) worden met de voorgaande triglyceriden met even nummers (2n) gecombineerd. De minder reproduceerbare lage gehalten van C56 worden buiten beschouwing gelaten. De resterende triglyceriden (pieken) in het chromatogram, met inbegrip van cholesterol (piek dichtbij C24), worden met de respectieve responsfactoren van het standaardvet vermenigvuldigd (laatste ijking) en samen op 100 genormaliseerd. Behalve vrij cholesterol worden zodoende de triglyceriden C24, C26, C28, C30, C32, C34, C36, C38, C40, C42, C44, C46, C48, C50, C52 en C54 geëvalueerd. De resultaten worden uitgedrukt in gewichtspercenten (g/100 g).

De evaluatie van de chromatogrampieken moet met een integrator worden uitgevoerd, waarmee de basislijn kan worden uitgezet. Herintegratie met geoptimaliseerde integratieparameters dient mogelijk te zijn.

Figuur 5 en figuur 6 laten twee voorbeelden van triglyceridenchromatogrammen zien. Figuur 5 toont een chromatogram dat goed te evalueren is, terwijl figuur 6 een sporadische fout in de reeks C50 tot C54 laat zien, waarbij de basislijn in vergelijking met figuur 5 onjuist verloopt. Dergelijke fouten kunnen met een hoge mate van zekerheid worden ontdekt en alleen worden vermeden door gebruikmaking van een integrator waarmee de basislijn wordt uitgezet.

Figuur 5

Gemakkelijk te evalueren triglyceridenchromatogram van een melkvet met ingetekende basislijn

>PIC FILE= "L_2001037NL.009201.EPS">

Figuur 6

Foutief geïntegreerd chromatogram van melkvet

>PIC FILE= "L_2001037NL.009301.EPS">

Ter beheersing van de meetomstandigheden kan gebruik worden gemaakt van de in tabel 1 aangegeven relatieve standaarddeviaties (RSD: variatiecoëfficiënt x 100) voor de verschillende triglyceriden. Deze zijn berekend op basis van 19 opeenvolgende analyses van hetzelfde melkvet.

Tabel 1

Relatieve standaarddeviaties (RSD) van de triglyceridengehalten (n=19)

>RUIMTE VOOR DE TABEL>

Wanneer de RSD's duidelijk hoger uitvallen dan de waarden van tabel 1, zijn de chromatogrammen niet geschikt, en moeten de septa en de stroomsnelheid van het draaggas worden geverifieerd. Bovendien kunnen deeltjes van het septum een neerslag op de glaswol bovenaan de kolom hebben gevorm of kan de kolom ongeschikt voor gebruik zijn geworden door veroudering, temperatuurinvloeden enz. (zie figuur 3).

Opmerking:

De waarden van tabel 1 zijn niet bindend en vormen slechts een richtsnoer voor de kwaliteitscontrole. Wanneer hogere RSD's worden aanvaard, moet wel worden voldaan aan de in punt 11 vermelde herhaalbaarheids- en reproduceerbaarheidsgrenzen.

8. Kwalitatieve detectie van vreemd vet

Voor de detectie van vreemde vetten zijn triglyceridenformules (tabel 2) met grenzen S (tabel 3) ontwikkeld, waarin de S-waarden van zuivere melkvetten kunnen schommelen. Als die grenzen worden overschreden, kan worden aangenomen dat er een vreemd vet aanwezig is.

De gevoeligste formule voor de detectie van toegevoegd varkensvet is bijvoorbeeld:

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

Opmerking:

Aan de hand van 755 verschillende melkvetmonsters werd voor monsters van zuiver melkvet een 99 % betrouwbaarheid van S = 97,96 - 102,04 vastgesteld met een standaarddeviatie voor alle S-waarden SD = 0,39897.

Uitgaande van de triglyceridensamenstelling van een onbekend vetmonster maakt zo'n formule het zonder inschakeling van een computer mogelijk op eenvoudige wijze na te gaan of de som van de hier met de overeenkomstige factoren vermelde triglyceridengehalten buiten de spreiding van 97,96 - 102,04 valt en dan heeft men hoogstwaarschijnlijk met toevoeging van een vreemd vet te maken.

Voor de detectie van verschillende vreemde vetten geeft tabel 2 verschillende triglyceridenformules. Ter detectie van de vreemde vetten sojaolie, zonnebloemolie, olijfolie, koolzaadolie, lijnzaadolie, tarwekiemolie, maïskiemolie, katoenzaadolie en gehydrogeneerde visolie, voor de plantaardige vetten kokosvet en palmpitvet alsmede voor palmolie en rundvet kan respectievelijk een gemeenschappelijke formule worden gebruikt.

Aangezien de triglyceridensamenstelling van de vreemde vetten ook aan schommelingen onderhevig is, werden niet minder dan vier verschillende, experimenteel gemeten gegevens van triglyceriden in vreemde vetten van hetzelfde type gebruikt. (Voor dezelfde typen vreemd vet is respectievelijk de minst gunstige grens in aanmerking genomen (zie tabel 4).

Met de volgende "totale formule" kunnen even goede resultaten worden bereikt voor alle vreemde vetten:

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

Berekeningen ter detectie van een willekeurige combinatie van vreemde vetten in melkvet hebben bijvoorbeeld uitgewezen dat, hoewel volgens de in tabel 2 gegeven formule voor varkensvet de grens voor dat vreemde vet laag is, namelijk 2,7 %, andere vetten, zoals kokosvet, palmolie en palmpitvet, met detectiegrenzen van respectievelijk 26,8, 12,5 en 19,3 %, met deze formule slechts kunnen worden gedetecteerd als ze in bijzonder grote hoeveelheden aan melkvet zijn toegevoegd. Dit geldt ook voor andere formules in tabel 2.

Tabel 2

Triglyceridenformules ter detectie van verschillende vreemde vetten in melkvet met opgave van de standaarddeviaties SD voor S

Formule voor soja-, zonnebloem-, olijf-, koolzaad-, lijnzaad-, tarwekiem-, maïskiem-, katoenzaad- en visolie

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

Formule voor kokos- en palmpitvet

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

Formule voor palmolie en rundvet

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

Formule voor varkensvet

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

Ter controle van een onbekend vetmonster moeten derhalve alle in tabel 2 gegeven formules en de totale formule (2) worden gebruikt, als waarschijnlijk is dat het monster een mengsel van melkvet en een van de 14 verschillende vreemde vetten is of een combinatie van die vreemde vetten. Als door invoering van de triglyceriden van een te analyseren vetmonster een S-waarde wordt verkregen die buiten de spreiding van tabel 3 van slechts een van de vijf formules valt, dan is het monster hoogstwaarschijnlijk een gemodificeerd melkvet. Detectie van een vreemd vet in melkvet door middel van een van de vier formules in tabel 2 laat geen conclusies toe met betrekking tot het type bijgemengd vreemd vet.

Tabel 3

S-grenzen voor melkvetten

>RUIMTE VOOR DE TABEL>

In tabel 4 worden de detectiegrenzen voor de verschillende vreemde vetten gegeven met een betrouwbaarheid van 99 %. In de eerste kolom staan de minimale detectiegrenzen voor de beste melkvetformules in tabel 2. In de tweede kolom staan de detectiegrenzen voor de totale formule. Hoewel de grenzen enigszins hoger liggen, is alleen deze formule nodig om iets grotere hoeveelheden vreemde vetten op te sporen. Met alle formules kunnen eveneens combinaties van de verschillende vreemde vetten worden opgespoord. De variatiebreedte van de triglyceriden van verschillende vreemde vetten van een bepaald type heeft op de detectiegrenzen geen belangrijke invloed.

Tabel 4

99 % detectiegrenzen door toevoeging van vreemd vet aan melkvet in %

>RUIMTE VOOR DE TABEL>

Opmerking:

De S-spreidingsbreedten worden zodanig berekend dat de aanwezigheid van een vreemd vet slechts wordt aangenomen als de grenzen van de afzonderlijke formules worden overschreden (zie tabel 4).

9. Kwantitatieve bepaling van vreemd vet

Teneinde kwantitatieve informatie over de concentratie aan vreemd vet in een melkvet te verkrijgen, wordt de volgende formule gebruikt:

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>, waarin X de hoeveelheid onbekend vreemd vet of bijmenging van vreemd vet in een onbekend melkvet voorstelt. S is het gevolg van de toevoeging van een onbekend vreemd vet door invoering van de triglyceriden van het vreemde vet/melkvetmengsel in bovenstaande totale triglyceridenformule. Als aan melkvet een onbekend vet wordt toegevoegd, wordt voor SF de gemiddelse S-waarde van de verschillende vreemde vetten voor de totale formule gekozen; deze gemiddelde S-waarde wordt verkregen door de triglyceridengegevens van de zuivere vreemde vetten in die formule in te voeren en door een gemiddelde waarde te berekenen (SF = 7,46). Er worden ook goede kwantitatieve resultaten met betrekking tot eventueel toegevoegde vreemde vetten verkregen door gebruik te maken van de palmolie/rundvetformule (tabel 2) en een gemiddelde SF-waarde van 10,57.

In geval van bekende typen vreemde vetten moeten de volgende SF-waarden in bovenstaande formule worden ingevoerd en moet de desbetreffende vreemdvetformule uit tabel 2 worden gekozen:

Tabel 5

SF-waarden van diverse vreemde vetten

>RUIMTE VOOR DE TABEL>

10. Toepassing van de detectiemethode

De beschreven methode geldt voor losse melk en berust op de representativiteit van de melkvetmonsters.

Een uiterst specifieke detectie zou mogelijk zijn als voor een representatief aantal melkvetten formules zoals boven beschreven voor verschillende landen zouden worden opgesteld.

Er zouden bijzonder geschikte detectiemogelijkheden kunnen worden gecreëerd als in de verschillende landen formules, zoals hier beschreven, zouden worden opgesteld voor een representatief aantal melkvetten. In dat geval is het gebruik van ingewikkelde computerprogramma's niet nodig, indien de in tabel 2 gehanteerde triglyceridencombinaties worden gebruikt en de factoren opnieuw worden bepaald door middel van de methode der kleinste kwadraten.

Door toepassing van de in tabel 3 weergegeven S-spreidingsbreedten zijn de formules, onder bijzondere voederingsomstandigheden, zoals ondervoeding of het voeren van koeien met voedergist of Ca-zepen, in het algemeen geldig. Alleen in geval van extreme voederingsomstandigheden (bijvoorbeeld hoge opname van zuivere voederoliën, flinke toediening van Ca-zepen in combinatie met voedervet enz.) wijzen de formules gedeeltelijk op een gemodificeerd melkvet.

Opmerking:

Gefractioneerde melkvetten worden over het algemeen als ongemodificeerd melkvet herkend, als een modificatie alleen wanneer de grenzen worden overschreden, wordt aangenomen. Slechts bij gefractioneerde melkvetten met een ongewone melkvetsamenstelling, zoals bijvoorbeeld het geval is met een harde fractie, die verkregen is door fractionering met fysische methoden bij hoge temperaturen van ongeveer 30 °C met een lage opbrengst van enkele procenten of door fractionering met overkritisch CO2, wijzen de formules op een modificatie.

Melkvetfractionering kan echter met andere procedures, bijvoorbeeld differentiëlescanningcalorimetrie, worden gedetecteerd.

11. Nauwkeurigheid van de methode

Wordt bepaald met melkvet aan de hand van de formules uit tabel 2 en de S-spreidingsbreedten in tabel 3.

11.1. Herhaalbaarheid

Het verschil van de S-waarden van twee door één persoon binnen de kortst mogelijke tijd uitgevoerde bepalingen door gebruikmaking van dezelfde procedure in identiek monstermateriaal onder dezelfde omstandigheden (zelfde persoon, zelfde instrumenten/zelfde inrichting, zelfde laboratorium):

Tabel 6

Herhaalbaarheidsgrenzen (r) voor de verschillende formules

>RUIMTE VOOR DE TABEL>

11.2. Reproduceerbaarheid

Het verschil van de S-waarden van twee door laboranten in verschillende laboratoria uitgevoerde bepalingen, volgens dezelfde procedure met gebruikmaking van identiek monstermateriaal onder verschillende omstandigheden (andere persoon, andere instrumenten) op verschillende tijdstippen.

Tabel 7

Reproduceerbaarheidsgrenzen (R) voor de verschillende formules

>RUIMTE VOOR DE TABEL>

11.3. Kritisch verschil

Met de herhaalbaarheids- (r) en de reproduceerbaarheidsgrenzen (R) kunnen de kritische verschillen voor alle S-spreidingsbreedten van tabel 3 worden berekend (analyses in duplo). De desbetreffende waarden worden in tabel 8 gegeven.

Tabel 8

Kritische verschillen voor alle triglyceridenformules

>RUIMTE VOOR DE TABEL>

11.4. Aanvaardbaarheid van de resultaten

Alle geijkte op twee decimalen afgeronde, berekende triglyceridengehalten van C24, C26, C28 tot C54 alsmede het cholesterol moeten precies op 100 genormaliseerd worden.

De resultaten van de analyse in duplo worden gebruikt ter controle van de herhaalbaarheid. Als de absolute verschillen tussen de beide S-resultaten voor alle vijf triglyceridenformules de herhaalbaarheidsgrenzen r in tabel 6 niet overschrijden, dan wordt aan het herhaalbaarheidsvereiste voldaan.

Ter controle van de optimale gaschromatografische omstandigheden en met name van de kwaliteit van de kolom dient te worden gegarandeerd dat bij tien herhalingen het verschil tussen de maximale en minimale S-waarden van alle vijf triglyceridenformules de spreiding x· r, waarbij x = 1,58 (voor tien reeksen, zie referentie 16), en de herhaalbaarheidsgrenzen r voor de verschillende formules in tabel 6 niet overschrijdt.

12. Geciteerde normen

>RUIMTE VOOR DE TABEL>

13. Referenties

1. Commissie van de Europese Gemeenschappen: Detection of foreign fats in milk fat by means of gas chromatographic triglyceride analysis; document VI/5202/90-EN, VI/2645/91.

2. Commissie van de Europese Gemeenschappen: Control of butter fat purity of 100 different samples of different feeding periods from 11 EEC countries; document VI/4577/93.

3. Commissie van de Europese Gemeenschappen: Consideration of results from the first, second, third, fourth, fifth and sixth EEC collaborative trial: Determination of triglycerides in milk fat; documenten VI/2644/91, VI/8.11.91, VI/1919/92, VI/3842/92, VI/5317/92 en VI/4604/93.

4. Timms, R. E.: Detection and quantification of non-milk fat in mixtures of milk and non-milk fats. Dairy Research 47 295-303 (1980).

5. Precht, D., Heine, K.: Nachweis von modifiziertem Milchfett mit der Triglyceridanalyse. 2. Fremdfettnachweis im Milchfett mit Hilfe von Triglyceridkombinationen 41 406-410 (1986).

6. Luf, W., Stock, A., Brandl, E.: Zum Nachweis von Fremdfett in Milchfett über die Triglyceridanalyse. Österr. Milchwirtsch. Wissensch. Beilage 5, 42 29-35 (1987).

7. Precht, D.: Bestimmung von pflanzlichen Fetten oder tierischen Depotfetten in Milchfett. Kieler Milchwirtsch. Forschungsber. 42 143/157 (1989).

8. Precht, D.: Schnelle Extraktion von Milchfett, Kieler Milchwirtsch. Forschungsber. 42 119-128 (1990).

9. Precht, D.: Schnelle gaschromatographische Triglyceridanalyse von Milchfett. Kieler Milchwirtsch. Forschungsber. 42 139-154 (1900).

10. Precht, D.: Control of milk fat purity by gas chromatographic triglyceride analysis. Kieler Milchwirtsch. Forschungsber. 43 (3) 219-242 (1991).

11. Precht, D.: Detection of adulterated milk fat by fatty acid and triglyceride analysis. Fat Sci. Technol. 93 538-544 (1991).

12. Precht, D.: Detection for foreign fat in milk fat. I. Qualitative detection by triacylglycerol formulae. II. Quantitative evaluation of foreign fat mixtures. Z. Lebensm. Unters. Forsch. 194 1-8, 107-114 (1992).

13. Precht, D.: "Gas chromatography of triacylglycerols and other lipids on packed columns" in CRC Handbook of Chromatography: Analysis of lipids, blz. 123-138, Ed. K.D. Mukherjee, N. Weber, J. Sherma, CRC Press, Boca Raton (1993).

14. Precht, D., Molkentin, J.: Quantitative triglyceride analysis using short capillary columns, Chrompack News 4 16-17 (1993).

15. Molkentin, J., Precht, D.: Comparison of packed and capillary columns for quantitative gas chromatography of triglycerides in milk fat. Chromatographia 39 (5/6) 265-270 (1994).

16. Stange, K.: Angewandte Statistik, Erster Teil, Eindimensionale Probleme, Springer-Verlag, Berlin, blz. 378 (1970).

(1) Er zijn al geschikte methoden beschreven; zie D. Precht en J. Molkentin: Quantitative triglyceride analysis using short capillary columns, Chrompack News 4, 16-17 (1993).

(2) Er zijn geschikte producten in de handel.

(3) Handelsnamen zoals Extrelut, Gas ChromQ, Chrompack, zijn voorbeelden van geschikte producten die in speciaalzaken verkrijgbaar zijn. De bedoeling van deze informatie is de hantering van de norm door de gebruiker te vergemakkelijken en ze houdt geen requisitie van het product in. De aanduiding "grain" werd volgens BS 410: 1988 "British Standard Specification for test sieves" in de SI-eenheid μm omgerekend.

(4) Zie voetnoot 3 van blz. 86.

BIJLAGE XXVI

LIJST VAN DE IN DE EERSTE OVERWEGING BEDOELDE VERORDENINGEN

- Verordening (EEG) nr. 1216/68 van de Commissie van 9 augustus 1968 houdende vaststelling van de methode ter bepaling van het gehalte aan lactose (melksuiker) van uit derde landen ingevoerd mengvoeder(1), zoals gewijzigd bij Verordening (EEG) nr. 222/88 van de Commissie van 22 december 1987 tot wijziging van bepaalde besluiten met betrekking tot de sector melk en zuivelproducten als gevolg van de invoering van de gecombineerde nomenclatuur(2);

- Verordening (EEG) nr. 3942/92 van de Commissie van 22 december 1992 houdende vaststelling van een referentiemethode voor de bepaling van sitosterol en stigmasterol in boterolie(3), laatstelijk gewijzigd bij Verordening (EG) nr. 175/1999 van de Commissie houdende wijziging van de Verordeningen (EEG) nr. 3942/92, (EG) nr. 86/94, (EG) nr. 1082/96 en (EG) nr. 1459/98 tot vaststelling van referentiemethoden voor de bepaling van verklikstoffen in boter, butteroil of room(4);

- Verordening (EG) nr. 86/94 van de Commissie van 19 januari 1994 houdende vaststelling van een referentiemethode voor de bepaling van sitosterol en stigmasterol in boter(5), zoals gewijzigd bij Verordening (EG) nr. 175/1999;

- Verordening (EG) nr. 2721/95 van de Commissie van 24 november 1995 tot vaststelling van regels voor de toepassing van referentie- en routinemethoden voor de analyse en de kwaliteitsbeoordeling van melk en zuivelproducten in het kader van de gemeenschappelijke marktordening(6);

- Verordening (EG) nr. 1080/96 van de Commissie van 14 juni 1996 tot vaststelling van een referentiemethode voor het onderzoek van boter, mageremelkpoeder en caseïne/caseïnaten op colibacteriën(7);

- Verordening (EG) nr. 1081/96 van de Commissie van 14 juni 1996 tot vaststelling van een referentiemethode voor de opsporing van koemelk en koemelkcaseïnaat in kaas van schapen-, geiten- of buffelmelk of mengsels van schapen-, geiten- en buffelmelk en tot intrekking van Verordening (EEG) nr. 690/92(8);

- Verordening (EG) nr. 1082/96 van de Commissie van 14 juni 1996 houdende vaststelling van een referentiemethode voor de bepaling van de ethylester van β-apo-8'-caroteenzuur in boterconcentraat en boter(9), zoals gewijzigd bij Verordening (EG) nr. 175/1999;

- Verordening (EG) nr. 1854/96 van de Commissie van 26 september 1996 tot vaststelling van een lijst van referentiemethoden voor de analyse en de kwaliteitsbeoordeling van melk en zuivelproducten in het kader van de gemeenschappelijke marktordening(10), gewijzigd bij Verordening (EG) nr. 881/1999(11);

- Verordening (EG) nr. 880/98 van de Commissie van 24 april 1998 tot vaststelling van referentiemethoden voor de bepaling van het vochtgehalte, het gehalte aan vetvrije droge stof en het vetgehalte van boter(12);

- Verordening (EG) nr. 1459/98 van de Commissie van 8 juli 1998 tot vaststelling van een referentiemethode voor de bepaling van het vanillinegehalte in boterconcentraat, boter of room(13), zoals gewijzigd bij Verordening (EG) nr. 175/1999.

(1) PB L 198 van 10.8.1968, blz. 13.

(2) PB L 28 van 1.2.1988, blz. 1.

(3) PB L 399 van 31.12.1992, blz. 29.

(4) PB L 20 van 27.1.1999, blz. 22.

(5) PB L 17 van 20.1.1994, blz. 7.

(6) PB L 283 van 25.11.1995, blz. 7.

(7) PB L 142 van 15.6.1996, blz. 13.

(8) PB L 142 van 15.6.1996, blz. 15.

(9) PB L 142 van 15.6.1996, blz. 26.

(10) PB L 246 van 27.9.1996, blz. 5.

(11) PB L 111 van 29.4.1999, blz. 24.

(12) PB L 124 van 25.4.1998, blz. 16.

(13) PB L 193 van 9.7.1998, blz. 16.