32000L0032

Id-Direttiva tal-Kummissjoni 2000/32/KE

tad-19 ta' Mejju 2000

li taddatta għall-progress tekniku għas-26 darba d-Direttiva tal-Kunsill 67/548/KEE rigward l-approssimazzjoni tal-liġijiet, tar-regolamenti u tad-disposizzjonijiet amministrattivi dwar il-klassifikazzjoni, l-imballaġġ u l-ittikkettjar ta'sustanzi perikolużi [1]

(Test b'rilevanza għaż-ZEE)

IL-KUMMISSJONI TAL-KOMUNITAJIET EWROPEJ,

Wara li kkunsidrat it-Trattat li jistabbilixxi l-Komunità Ewropea,

Wara li kkunsidrat id-Direttiva tal-Kunsill 67/548/KEE tas-27 ta' Gunju 1967 rigward l-approssimazzjoni tal-liġijiet, tar-regolamenti u tad-disposizzjonijiet amministrattivi dwar il-klassifikazzjoni, l-imballaġġ u l-ittikkettjar ta'sustanzi perikolużi [2], kif l-aħħar emendata mill-Parlament Ewropew u d-Direttiva tal-Kunsill 1999/33/KE [3], u partikolarment l-Artikolu 28 tagħha,

Billi:

(1) L-Anness I tad-Direttiva 67/548/KEE għandu lista ta' sustanzi perikolużi, flimkien ma' dettalji tal-klassifikazzjoni u l-ittikkettjar ta' kull sustanza. L-għarfien xjentifiku u tekniku preżenti wera li l-lista ta' sustanzi perikolużi f'dak l-Anness għandha tkun adattata. Certi versjonijiet lingwistiċi tad-Direttiva jeħtieġu korrezzjonijiet f'sezzjonijiet speċifiċi tad-daħla u tat-Tabella A fl-Anness I.

(2) L-Anness III tad-Direttiva 67/548/KEE għandu lista ta' frażijiet li tindika n-natura ta' riskji speċjali attribwiti lis-sustanzi u preparazzjonijiet perikolużi. L-Anness IV tad-Direttiva 67/548/KEE għandu lista ta' frażijiet li tindika pariri fuq is-sigurtà dwar sustanzi u preparazzjonijiet perikolużi. L-Anness VI tad-Direttiva 67/548/KEE għandu gwida għall-klassifikazzjoni u l-ittikkettjar ta' sustanzi u preparazzjonijiet perikolużi. Certi versjonijiet lingwistiċi tad-Direttiva jeħtieġu korrezzjonijiet f'sezzjonijiet speċifiċi ta' l-Anness III, IV u VI.

(3) L-Anness V tad-Direttiva 67/548/KEE tistipula l-metodi għad-determinazzjoni tal-proprjetajiet fisiko-kimiċi, tat-tossiċità u l-ekotossiċità ta' sustanzi u preparazzjonijiet. Jeħtieġ li dak l-Anness ikun adattat għall-progress tekniku.

(4) L-Anness IX tad-Direttiva 67/548/KEE għandu d-disposizzjonijiet dwar il-qfil li ma jistax jinfetaħ mit-tfal. Dawk id-disposizzjonijiet għandhom ikunu addattati u aġġornati. Jeħtieġ li jkun estiż l-iskop ta' l-użu ta' qfil li ma jistax jinfetaħ mit-tfal.

(5) Il-miżuri previsti f'din id-Direttiva huma skond l-opinjoni tal-Kumitat għall-Addattament għall-Progress Tekniku tad-Direttivi għat-Tneħħija ta' Ostakoli Tekniċi għall-Kummerċ fis-Sustanzi u Preparazzjonijiet Perikolużi.

ADOTTAT DIN ID-DIRETTIVA:

Artikolu 1

Id-Direttiva 67/548/KEE hija b'dan emendata kif ġej:

1. L-Anness I huwa emendat kif ġej:

(a) In-Nota Q fl-Anness 1A ta' din id-Direttiva tieħu post in-nota korrispondenti fid-Daħla.

(b) Ir-ringieli fl-Anness 1B ta' din id-Direttiva jieħdu post ir-ringieli korrispondenti fit-Tabella A.

(ċ) L-iskrizzjonijiet fl-Anness 1C ta' din id-Direttiva jieħdu post l-iskrizzjonijiet korrispondenti.

(d) Jiżdiedu l-iskrizzjonijiet fl-Anness 1D ta' din id-Direttiva;

2. Il-frażi tar-riskju fl-Anness 2 ta' din id-Direttiva tieħu post il-frażi korrispondenti fl-Anness III.

3. L-Anness IV huwa emendat kif ġej:

(a) Il-frażijiet ta' sigurtà fl-Anness 3 A ta' din id-Direttiva jieħdu post il-frazijiet korrispondenti fl-Anness IV.

(b) Il-frażijiet ta' sigurtà kombinati fl-Anness 3 B ta' din id-Direttiva jieħdu post il-frazijiet korrispondenti fl-Anness IV.

4. Parti B ta' l-Anness V hija emendat kif ġej:

(a) It-test fl-Anness 4A f'din id-Direttiva jieħu post il-Kapitolu B.10.

(b) It-test fl-Anness 4B f'din id-Direttiva jieħu post il-Kapitolu B.11.

(ċ) It-test fl-Anness 4C f'din id-Direttiva jieħu post il-Kapitolu B0.12.

(d) It-test fl-Anness 4D f'din id-Direttiva jieħu post il-Kapitolu B.13. u B.14.

(e) It-test fl-Anness 4E f'din id-Direttiva jieħu post il-Kapitolu B.17.

(f) It-test fl-Anness 4F f'din id-Direttiva jieħu post il-Kapitolu B.23. It-Titolu tal-Kapitolu B.23 fin-nota spjegattiva jinbidel kif xieraq.

(g) Jiżdied it-test fl-Anness 4G f'din id-Direttiva.

5. Jitħassar ir-raba' inċiż ta' l-introduzzjoni ġenerali fil-Parti C ta' L-Anness V.

6. (a) It-testi fl-Anness 5 ta' din id-Direttiva jieħdu post it-testi korrispondenti fl-Anness VI.

7. L-Anness IX huwa emendat kif provdut fl-Anness 6 ta' din id-Direttiva.

Artikolu 2

1. L-Istati Membri għandhom idaħħlu fis-seħħ il-liġijiet, ir-regolamenti u d-disposizzjonijiet amministrattivi meħtieġa sabiex jikkonformaw ma' din id-Direttiva mhux aktar tard mill-1 ta' Ġunju 2001. Għandhom jinfurmaw lill-Kummissjoni b'dan minnufih.

Meta l-Istati Membri jadottaw dawn il-miżuri, għandu jkollhom riferenza għal din id-Direttiva jew għandhom ikunu akkumpanjati b'riferenza bħal din fl-okkażjoni tal-pubblikazzjoni uffiċjali tagħhom. L-Istati Membri għandhom jistabbilixxu kif għandha ssir din ir-referenza.

2. L-Istati Membri għandhom jikkomunikaw lill-Kummissjoni id-disposizzjonijiet prinċipali tal-liġi nazzjonali li huma jadottaw fil-qasam kopert minn din id-Direttiva u tabella ta' korrelazzjoni bejn din id-Direttiva u d-disposizzjonijiet nazzjonali adottati.

Artikolu 3

Din id-Direttiva għandha tidħol fis-seħħ fit-tielet jum ta' wara l-pubblikazzjoni tagħha fil-Ġurnal Uffiċjali tal-Komunitajiet Ewropej.

Artikolu 4

Din id-Direttiva hija indirizzata lill-Istati Membri.

Magħmula fi Brussel, fid-19 ta' Mejju 2000.

Għall-Kummissjoni

Margot Wallström

Membru tal-Kummissjoni

[1] Adottata wara is-27 adattament.

[2] ĠU C 196, tas-16.8.1967, pġ. 1.

[3] ĠU L 199, tat-30.7.1999, pġ. 57.

--------------------------------------------------

Anness 1A

KELMTEJN TA' QABEL L-ANNESS I

Spjegazzjoni tan-noti li għandhom x'jaqsmu ma' l-identifikazzjoni, il-klassifikazzjoni u t-tikkettjar ta' sustanzi

DA:

Nota Q:

- en kortvarig biopersistensprøve ved inhalation har vist, at fibre, der er længere end 20 μm, har en vægtet halveringstid på mindre end 10 dage

- en kortvarig biopersistensprøve ved intratrakeal instillation har vist, at fibre, der er længere end 20 μm, har en vægtet halveringstid på mindre end 40 dage

- en egnet intra-peritoneal prøve ikke har vist kræftfremkaldende virkning, eller

- en egnet langvarig inhalationsprøve ikke har vist relevante sygdomsfremkaldende virkninger eller neoplastiske forandringer.

SV:

Nota Q:

- ett korttidstest för att bestämma den biologiska beständigheten vid inhalation har visat att fibrer längre än 20 μm har en viktad halveringstid på mindre än 10 dagar

- ett korttidstest för att bestämma den biologiska beständigheten vid intratrakeal instillation har visat att fibrer längre än 20 μm har en viktad halveringstid på mindre än 40 dagar

- ett lämpligt intraperitonealt test har inte givit belägg för förhöjd cancerogenitet

- frånvaro av relevant patogenitet eller neoplastiska förändringar i ett lämpligt långtids inhalationstest.

(M'għandux x'jaqsam mal-verżjoni ES)

(M'għandux x'jaqsam mal-verżjoni DE)

(M'għandux x'jaqsam mal-verżjoni EL)

(M'għandux x'jaqsam mal-verżjoni EN)

(M'għandux x'jaqsam mal-verżjoni FR)

(M'għandux x'jaqsam mal-verżjoni IT)

(M'għandux x'jaqsam mal-verżjoni NL)

(M'għandux x'jaqsam mal-verżjoni PT)

(M'għandux x'jaqsam mal-verżjoni FI)

--------------------------------------------------

ANNESS 1B

"TABELLA A

Z | Simbolu | ES | DA | DE | EL | EN | FI | FR | IT | NL | PT | SV |

18 | Ar | Argón | Argon | Argon | Αργό | Argon | Argon | Argon | Argon | Argon | Árgon | Argon |

64 | Gd | Gadolinio | Gadolinium | Gadolinium | Γαδολίνιο | Gadolinium | Gadolinium | Gadolinium | Gadolinio | Gadolinium | Gadolínio | Gadolinium" |

--------------------------------------------------

ANNESS 1Ċ

Numru ta' l-indiċi | Isem kimiku | Noti li għandhom x'jaqsmu ma' sustanzi | Nru. KE | Nru SAK | Klassifikazzjoni | Tikkettjar | Limiti tal-konċentrazzjoni | Noti li għandhom x'jaqsmu mal-preparazzjonijiet |

006-011-00-7 | Karbaril (ISO) 1-naftil -metilkarbamat | | 200-555-0 | 63-25-2 | Karċ.kat. 3; R40 Xn; R22 N; R50 | Xn; N R: 22-40-50 S: (2-)22-24-36/37-46-61 | | |

006-013-00-8 | Sodju tal-metam (ISO) Sodju tal-metilditjokarbamat | | 205-293-0 | 137-42-8 | Xn; R22 R31 C; R34 R43 N; R50-53 | C; N R: 22-31-34-43-50/53 S: (1/2-)26-36/37/39-45-60-61 | | |

006-015-00-9 | Djuron (ISO) 3-(3,4-diklorofenil)-1,1-dimetilurea | | 206-354-4 | 330-54-1 | Karc. Kat. 3; R40 Mut. Kat. 3; R40 Xn< R22-48/22 N; R50-53 | Xn; N R: 22-40-48/22-50/53 S: (2-)13-22-23-37-46-60-61 | | |

006-016-00-4 | Propoxur (ISO) 2-izopropossifenil N-metilkarbamat2- izopropossifenil metilkarbamat | | 204-043-8 | 114-26-1 | T; R25 N; R50-53 | T; N R: 25-50/53 S: (1/2-)37-45-60-61 | | |

006-017-00-X | Aldikarb (ISO) 2-metil-2-(metiltjo)propanol-O-(N-metilkarbamojl)ossim | | 204-123-2 | 116-06-3 | T+; R26/28 T; R24 N; R50-53 | T+; N R: 24-26/28-50/53 S: (1/2-)22-36/37-45-60-61 | | |

006-018-00-5 | Aminokarb (ISO) 4-Dimetilamino-3-tolil-metil-karbamat | | 217-990-7 | 2032-59-9 | T; R24/25 N; R50-53 | T; N R: 24/25-50/53 S: (1/2-)28-36/37-45-60-61 | | |

006-019-00-0 | Dijallat (ISO) S-(2,3-diklorallil)-N,N-diisopropiltijokarbamat | | 218-961-1 | 2303-16-4 | Karc. Kat. 3; R40 Xn; R22 N; R50-53 | Xn; N R: 22-40-50/53 S: (2-)25-36/37-60-61 | | |

006-020-00-6 | Barban (ISO) 4-klorbut-2-inil-N-(3-klorfenil)karbamat | | 202-930-4 | 101-27-9 | Xn; R22 R43 N; R50-53 | Xn; N R: 22-43-50/53 S: (2-)24-36/37-60-61 | | |

006-023-00-2 | merkaptodimetur (ISO) metjokarb 3,5-dimetil-4-metiltjofenil N-metilkarbamat | | 217-991-2 | 2032-65-7 | T; R25 N; R50-53 | T; N R: 25-50/53 S: (1/2-)22-37-45-60-61 | | |

006-024-00-8 | Proxan-sodju (ISO) Sodju O-isopropilditjokarbamat | | 205-443-5 | 140-93-2 | Xn; R22 Xi; R38 N; R51-53 | Xn; N R: 22-38-51/53 S: (2-)13-61 | | |

006-026-00-9 | Karbofuran (ISO) 2,3-dijidro-2,2-dimetilbenzofuran-7-il N-metilkarbamat | | 216-353-0 | 1563-66-2 | T+; R26/28 N; R50-53 | T+; N R: 26/28-50/53 S: (1/2-)36/37-45-60-61 | | |

006-028-00-X | Dinobuton (ISO) Karbonat 2-(1-Metilpropil)-4,6-dinitrofenil–isopropil | | 213-546-1 | 973-21-7 | T; R25 N; R50-53 | T; N R: 25-50/53 S: (1/2-)37-45-60-61 | | |

006-029-00-5 | Dijossakarb (ISO) 2-(1,3-dijossolan-2-il)fenil N-metilkarbamat | | 230-253-4 | 6988-21-2 | T; R25 N; R51-53 | T; N R: 25-51/53 S: (1/2-)37-45-61 | | |

006-033-00-7 | Metossuron (ISO) 3-(3-Kloro-4-metossifenil)-1,1-dimetilurea | | 243-433-2 | 19937-59-8 | N; R50-53 | N R: 50/53 S: 60/61 | | |

006-034-00-2 | Pebulat (ISO) N-Butil-N-etil-S-propiltijokarbamat | | 214-215-4 | 1114-71-2 | Xn; R22 N; R51-53 | Xn; N R: 22-51/53 S: (2-)23-61 | | |

006-035-00-8 | Pirimikarb (ISO) 5,6-Dimetil-2-dimetilamino-pirimidin-4-il-N,N-dimetilkarbamat | | 245-430-1 | 23103-98-2 | T; R25 N; R50-53 | T; N R: 25-50/53 S: (1/2-)22-37-45-60-61 | | |

006-037-00-9 | Promekarb (ISO) 3-isopropil-5-metilfenil N-metilkarbamat | | 220-113-0 | 2631-37-0 | T; R25 N; R50-53 | T; N R: 25-50/53 S: (1/2-)24-37-45-60-61 | | |

006-038-00-4 | Sulfallat (ISO) 2-klorallil –N,N-dimetilditijokarbamat | | 202-388-9 | 95-06-7 | Karc. Kat. 2; R45 Xn; R22 N; R50-/53 | T; N R: 45-22-50/53 S: 53-45-60-61 | | |

006-039-00-X | Tri-allat (ISO) S-(2,3,3-triklorallil)- dijisopropil-tijokarbamat | | 218-962-7 | 2303-17-5 | Xn; R22-48/22 R43 N; R50-53 | Xn; N R: 22-43-48/22-50/53 S: (2-)24-37-60-61 | | |

006-042-00-6 | Monuron (ISO) 3-(4-Klorfenil)-1,1-dimetilurea | | 205-766-1 | 150-68-5 | Karc. Kat. 3; R40 Xn; R22 N; R50-53 | Xn; N R: 22-40-50/53 S: (2-)36/37-60-61 | | |

006-043-00-1 | Monuron-TCA 3-(4-Klorfenil)-1,1-dimetiluronju trikloroaċetat | | — | 140-41-0 | Xi; R36/38 Karc. Kat. 3; R40 N; R50-53 | Xn; N R: 36/38-40-50/53 S: (2-)36/37-60-61 | | |

006-045-00-2 | Metomil (ISO) 1-(metiltjo)etilideneamino N-metilkarbamat | | 240-815-0 | 16752-77-5 | T+; R28 N: R50-53 | T+; N R: 28-50/53 S: (1/2-)22-36/37-45-60-61 | | |

006-046-00-8 | Bendjokarb (ISO) 2,2-Dimetil-1,3-benżodjossol-4-il-N-metilkarbamat | | 245-216-8 | 22781-23-3 | T; R23/25 Xn; R21 N; R50-53 | T; N R: 21-23/25-50/53 S: (1/2-)22-36/37-45-60-61 | | |

006-047-00-3 | Bufenkarb (ISO) Taħlita ta' 3-(1-Metilbutil)fenil-N-metilkarbamat u 3-(1-Etilpropil)fenil-N-metilkarbamat | | — | 8065-36-9 | T; R24/25 N; R50-53 | T; N R: 24/25-50/53 S: (1/2-)28-36/37-45-60-61 | | |

006-048-00-9 | Etjofenkarb (ISO) 2-(Etiltjometil)fenil-N-metilkarbamat | | 249-981-9 | 29973-13-5 | Xn; R22 N; R50-53 | Xn; N R: 22-50/53 S: (2-)60-61 | | |

006-050-00-X | Fenuron-TCA 1,1-Dimetil-3-feniluronju trikloroaċetat | | — | 4482-55-7 | Xi; R38 N; R50-53 | Xi; N R: 38-50/53 S: (2-)60-61 | | |

006-053-00-6 | Isoprokarb (ISO) 2-isopropilfenil-N-metilkarbamat | | 220-114-6 | 2631-40-5 | Xn; R22 N; R50-53 | Xn; N R: 22-50/53 S: (2-)60-61 | | |

006-054-00-1 | Messakarbat (ISO) 3,5-Dimetil-4-dimetilaminofenil N-metilkarbamat | | 206-249-3 | 315-18-4 | T+; R28 Xn; R21 N; R50-53 | T+; N R: 21-28-50/53 S: (1/2-)36/37-45-60-61 | | |

006-057-00-8 | Nitrapirin (ISO) 2-Kloru-6-triklorometilpiridina | | 217-682-2 | 1929-82-4 | Xn; R22 N; R51-53 | Xn; N R: 22-51/53 S: (2-)24-61 | | |

006-060-00-4 | Ossikarbossin (ISO) 2,3-Dijidro-6-metil-5-(N-fenilkarbamojl)-1-4-ossotijina 4,4-dijossidu | | 226-066-2 | 5259-88-1 | Xn; R22 R52-53 | Xn; R: 22-52/53 S: (2-)61 | | |

006-069-00-3 | Tijofanat-metil (ISO) 1,2-di(3-metossikarbonil-2-tijourejdo)benżina | | 245-740-7 | 23564-05-8 | Muta. Kat, 3; R40 N; R50-53 | Xn; N R: 40-50/53 S: (2-)36/37-60-61 | | |

006-070-00-9 | Furmeċikloss N-Cikloessil-N-metossi-2,5-dimetil-3-furamid | | 262-302-0 | 60568-05-0 | Karc. Kat. 3; R40 N; R50-53 | Xn; N R: 40-50/53 S: (2-)36/37-60-61 | | |

006-088-00-7 | Benfurakarb (ISO) Etil-N-(2,3-dijidro-2,2-dimetilbenżofuran-7-il-ossikarbonil(metil)aminotjo)-N-isopropil-ß-alalinat | | — | 82560-54-1 | T; R23/25 N; 50-53 | T; N R: 23/25-50/53 S: (1/2-)36/37-45-60-61 | | |

007-012-00-5 | N,N-Dimetilidrażina 1,1-Dimetilidrażina | E | 200-316-0 | 57-14-7 | F; R11 Karc. Kat. 2; R45 T; R23/25 C; R34 N; R51-53 | F; T; N R: 45-11-23/25-34-51/53 S: 53-45-61 | | |

007-013-00-0 | N,N-Dimetilidrażina 1,2-Dimetilidrażina | E | — | 540-73-8 | Karc. Kat. 2; R45 T; R23/24/25 N; R51-53 | T; N R: 45-23/24/25-51/53 S: 53-45-61 | C≥25 %: T; R45-23/24/25 3 %≤C<25 %: T; R45-20/21/22 0,01 %≤C<3 %: T; R45 | |

009-003-00-1 | Aċidu idrofloworiku…% | B | 231-634-8 | 7664-39-3 | T+; R26/27/28 C; R35 | T+; C R: 26/27/28-35 S: (1/2-)7/9-26-36/37-45 | C≥7 %: T+; C; R26/27/28-35 1 %≤C<7 %: T; R23/24/25-34 0,1 %≤C<1 %: Xn; R20/21/22-36/37/38 | |

015-039-00-9 | Ażinfos-metil (ISO) O,O-Dimetil 4-ossobenżotrijażin-3-ilmetil fosforoditjoat | | 201-676-1 | 86-50-0 | T+; R26/28 T; R24 R43 N; R50-53 | T+; N R: 24-26/28-43-50/53 S: (1/2-)28-36/37-45-60-61 | | |

015-048-00-8 | Fentjon (ISO) O,O-dimetil-O-(4-metiltio-m-tolil)fosforotijoat | | 200-231-9 | 55-38-9 | Muta. Kat. 3; R40 T; R23-48/25 Xn; R21/22 N; R50-53 | T; N R: 21/22-23-40-48/25-50/53 S: (1/2-)36/37-45-60-61 | | |

015-056-00-1 | Ażinfos-etil (ISO) O,O-dietil 4-ossobenżotrijażin-3-ilmetilfosforoditijoat | | 220-147-6 | 2642-71-9 | T+; R28 T: R24 N; R50-53 | T+; N R: 24-28-50/53 S: (1/2-)28-36/37-45-60-61 | | |

015-140-00-8 | Trijażofos (ISO) O,O-dietil-O-(1-fenil-1H-1,2,4-trijażol-3-ilfosforotijoat | | 245-986-5 | 24107-47-8 | T; R23/25 Xn; R21 N; R50-53 | T; N R: 21-23/25-50/53 S: (1/2-)36/37-45-60-61 | | |

016-013-00-X | Dikloridu sulfuriku | | 234-129-0 | 10545-99-0 | R14 C: R34 N:R50 | C; N R: 14-34-50 S: (1/2-)26-36/37/39-45-61 | C≥10 %: C; R34 5 %≤C<10 %: Xi; R36/37/38 | |

016-014-00-5 | Tetrakloridu sulfuriku | | — | 13451-08-6 | R14 C; R34 N; R50 | C; N R: 14-34-50 S: (1/2-)26-36/37/39-45-61 | C≥10 %: C; R34 5 %≤C<10 %: Xi; R36/37/38 | |

016-023-00-4 | Sulfat tad-dimetil | E | 201-058-1 | 77-78-1 | Karc. Kat. 2; R45 Muta. Kat. 3; R40 T+; R26 T; R25 C; R24 R43 | T+ R: 45-25-26-34-43 S: 53-45 | C≥25 %: T+; R45-25-26-34-43 10 %≤C<25 %: T+; R45-22-26-34-43 7 %≤C<10 %: T+; R45-22-26-36/37/38-43 5 %≤C<7 %: T; R45-22-23-36/37/38-43 3 %≤C<5 %: T; R45-22-23-43 1 %≤C<3 %: T; R45-23-43 0,1 %≤C<1 %: T; R45-20 0,01 %≤C<0,1 %: T; R45 | |

016-024-00-X | Dimessanu (ISO) Bis(metossitijokarbonil)-disulfid | | 215-993-8 | 1468-37-7 | Xn; R22 N; R50-53 | Xn; N R: 22-50/53 S: (2-)60-61 | | |

016-071-00-6 | Trisodju-3-amino-6,13-dikloro-10-((3-((4-kloro-6-(sulfofenilamino)-1,3,5-trijażin-2-il)-amino)propil)amino)-4,11-trifenossidijossażinedisulfonat | | 410-130-3 | 136248-03-8 | R43 | Xi R: 43 S: (2-)22-24-37 | | |

022-001-00-5 | Tetraklorid tat-tintanju | | 231-441-9 | 7550-45-0 | R14 C; R34 | C R: 14-34 S: (1/2-)7/8-26-36/37/39-45 | C≥10 %: C; R34 5 %≤C<10 %: Xi; R36/37/38 | |

030-004-00-8 | Żingu dimetil (1) Żingu dijetil (2) | | 208-884-1 209-161-3 | 544-97-8 557-20-0 | R14 F; R17 C; R34 N; R50-53 | F; C; N R: 14-17-34-50/53 S: (1/2-)16-43-45-60-61 | | |

050-002-00-0 | Ċjessatin (ISO) idrossitriċikloessilstannan tri(ċikloessil)tin idrossidu | | 236-049-1 | 13121-70-5 | Xn; R20/21/22 N; R50-53 | Xn; N R: 20/21/22-50/53 S: (2-)13-60-61 | | |

050-012-00-5 | Tetraċikloessilstannan (1) Klorotriċikloessilstannan (2) Butiltriċikloessilstannan (3) | | 215-910-5 221-437-5 230-358-5 | 1449-55-4 3091-32-5 7067-44-9 | Xn; R20/21/22 N; R50-53 | Xn; N R: 20/21/22-50/53 S: (2-)26-28-60-61 | C≥1 %: Xn; R20/21/22 | 1 |

050-017-00-2 | Ossidu tal-fenbutatin (ISO) bis(tris(2-metil-2-fenilpropil)żingu)ossidu | | 236-407-7 | 13356-08-6 | T+; R26 Xi; R36/38 N; R50/53 | T+; N R: 26-36/38-50/53 S: (1/2-)28-36/37-45-60-61 | | |

082-009-00-X | ċomb sulfokromat, isfar C.I. Pigment Isfar 34 (Din is-sustanza hi identifikata fl-Indiċi tal-Kulur bin-Numru tal-Kostituzzjoni ta' l-Indiċi tal-Kulur C.I.77603) | | 215-693-7 | 1344-37-2 | Karc. Kat. 3; R40 Repr. Kat. 1; R61 Repr. Kat. 3; R62 R33 N; R50-53 | T; N R: 61-33-40-50/53-62 S: 53-45-60-61 | | 1 |

082-010-00-5 | Ċomb kromat molibdat sulfat aħmar C.I. Pigment aħmar 104 (Din is-sustanza hi identifikata fl-Indiċi tal-Kulur bin-Numru tal-Kostituzzjoni ta' l-Indiċi tal-Kulur C.I.77605) | | 235-759-9 | 12656-85-8 | Karc. Kat. 3; R40 Repr. Kat. 1; R61 Repr. Kat. 3; R62 R33 N; R50-53 | T; N R: 61-33-40-50/53-62 S: 53-45-60-61 | | 1 |

601-024-00-X | Kumina (1) Propilbenżina (2) | | 202-704-5 203-132-9 | 98-82-8 103-65-1 | R10 Xn; R65 Xi; R37 N; R51-53 | Xn; N R: 10-37-51/53-65 S: (2-)24-37-61-62 | | 4 |

601-032-00-3 | Benżo(a)pirene Benżo(def)kriżene | | 200-028-5 | 50-32-8 | Karc. Kat. 2; R45 Muta. Kat. 2; R46 Repr. Kat. 2; R60-61 N; R50-53 | T; N R: 45-46-60-61-50/53 S: 53-45-60-61 | | |

601-034-00-4 | Benżo(e)aċefenantrilena | | 205-911-9 | 205-99-2 | Karc. Kat. 2; R45 N; R50-53 | T; N R: 45-50/53 S: 53-45-60-61 | | |

602-035-00-2 | 1,4-Diklorobenżina p-Diklorobenżina | | 203-400-5 | 106-46-7 | Xi; R36 N; R50-53 | Xi; N R: 36-50/53 S: (2-)24/25-46-60-61 | | |

602-054-00-6 | 3-Jodproprna Allil-jodid | | 209-130-4 | 556-56-9 | R10 C; R34 | C R: 10-34 S: (1/2-)7-26-45 | | |

603-076-00-9 | But-2-ine-1,4-djol 2-Butine-1,4-djol | | 203-788-6 | 110-65-6 | T: R23/25 Xn; R21-48/22 C; R34 | T R: 21-23/25-34-48/22 S: (1/2-)26-36/37/39-45 | C≥50 %: T; R21-23/25-34-48/22 25 %≤C<50 %: T; R21-23/25-36/38-48/22 10 %≤C<25 %: Xn; R20/22-48/22 3 %≤C<10 %: Xn; R20/22 | |

603-091-00-0 | esso-1-Metil-4-(1-metiletil)-7-ossabi-ċiklo(2.2.1)eptan-2-ol | | 402-470-6 | 87172-89-2 | O; R8 Xn; R22 Xi; R36 | O; Xn R: 8-22-36 S: (2-)26 | | |

603-093-00-1 | Esso-(+/-)metil-4-(1-metiletil)-2-((2-metilfenil)metossi)-7-ossabiċiklo(2.2.1)eptan | | 402-410-9 | 87818-31-3 | Xn; R20 N; R51-53 | Xn; N R: 20-51/53 S: (2-)23-61 | | |

603-097-00-3 | 1,1',1″-Nitrilotripropan-2-ol, 1,1',1″-trijisoprapolamina | | 204-528-4 | 122-20-3 | Xi; R36 R52-53 | Xi R: 36-52/53 S: (2-)26-61 | | |

603-117-00-0 | Propan-2-ol Isopropil-alkohol Isopropanol | | 200-661-7 | 67-63-0 | F; R11 Xi; R36 R67 | F; Xi R: 11-36-67 S: (2-)7-16-24/25-26 | | 6 |

604-020-00-6 | Bifenil-2-ol 2-iidrossibifenil 2-Fenilfenol (ISO) | | 201-993-5 | 90-43-7 | Xi; R36/37/38 N; R50 | Xi; N R: 36/37/38-50 S: (2-)22-61 | | |

604-021-00-1 | Melħ tas-sodju 2-Fenilfenol Sodju 2-bifenilat | | 205-055-6 | 132-27-4 | Xn; R22 Xi: R37/38-41 N; R50 | Xn; N R: 37/38-41-50 S: (2-)22-26-61 | | |

604-024-00-8 | 4,4'-Isobutiletilidenedifenol (alt.): 2,2-bis(4'iidrossifenil)-4-metilpentan | | 401-720-1 | 6807-17-6 | Repr. Kat. 2; R60 Xi; R36 N; R50-53 | T; N R: 60-36-50/53 S: 53-45-60-61 | | |

604-041-00-0 | ċcifluworfen (1) sodju ta' l-aċifluworfen (2) 5-(2-Kloro-4-(trifluwormetil)fenoxi)-aċidu 2-nitrobenżojiku (1) sodju-5-(2-kloro-4-(trifluwormetil) fenoxi)-2-nitrobenżoat (2) | | 256-634-5 263-560-7 | 50594-66-6 62476-59-9 | Xn; R22 Xi;R38-41 N; R50-53 | Xn; N R: 22-38-41-50/53 S: (2-)24-39-60-61 | | |

604-043-00-1 | Monobenżon Etere 4-idrossifenil-benżil Etere idrokwinone monobenżil | | 203-083-3 | 103-16-2 | Xi; R36 R43 | Xi R: 36-43 S: (2-)24/25-26–37 | | |

604-044-00-7 | mekwinol 4-Metossifenol Etere idrokwinone monometil | | 205-769-8 | 150-76-5 | Xn; R22 Xi; R36 R43 | Xn R: 22-36-43 S: (2-)24/25-26-377/39-46 | | |

605-016-00-7 | Glijossal …% Etandijal …% | B | 203-474-9 | 107-22-2 | Muta. Kat. 3; R40 Xn; R20 Xi; R36/38 R43 | Xn R: 20-36/38-40-43 S: (2-)36/37 | C≥10 %: Xn; R20-36/38-40-43 1 %≤C<10 %: Xn; R40-43 | |

606-016-00-X | Pindon (ISO) 2-Pivalojlindan-1,3-djon | | 201-462-8 | 83-26-1 | T; R25-48/25 N; R50-53 | T; N R: 25-48/25-50/53 S: (1/2-)37-45-60-61 | | |

606-018-00-0 | Diklon (ISO) 2,3-Dikloro-1,4-naftokwinone | | 204-210-5 | 117-80-6 | Xn; R22 Xi; R36/38 N; R50-53 | Xn; N R: 22-36/38-50/53 S: (2-)26-60-61 | | |

606-019-00-6 | Klordekone (ISO) Perkloropentaċiklo(5,3,0,02,6,03,9,04,8)dekan-5-one dekakloropentaċiklo(5,2,1,02,6,03,9,05,8)dekan-4-one | | 205-601-3 | 143-50-0 | Karc. Kat. 3; R40 T; R24/25 N; R50-53 | T; N R: 24/25-40-50/53 S: (1/2-)22-36/37-45-60-61 | | |

606-034-00-8 | Metribużin (ISO) 4-Amino-6-tert-butil-3-metiltio-1,2,4-trijażin-5(4H)-one 4-amino-4,5-dijidro-6-(1,1-dimetiletil)-3-metiltjo-1,2,4-trijażin-5-one | | 244-209-7 | 21087-64-9 | Xn; R22 N; R50-53 | Xn; N R: 22-50/53 S: (2-)60-61 | | |

606-035-00-3 | Kloridażon (ISO) 5-Amino-4-kloro-2-fenilpiridażin-3(2H)-one pirażon | | 216-920-2 | 1698-60-8 | R43 N; R50-53 | Xi; N R: 43-50/53 S: (2-)24-37-60-61 | | |

606-036-00-9 | kwinometjonat kinometjonat (ISO) 6-metil-1,3-ditjolo(4,5-b)kwinossalin-2-one | | 219-455-3 | 2439-01-2 | Repr. Kat. 3; R62 Xn; R20/21/22-48/22 Xi; R36 R43 N; R50-53 | Xn; N R: 20/21/22-36-43-48/22-50/53-62 S: (2-)24-37-60-61 | | |

606-037-00-4 | Trijadimefon (ISO) 1-(4-Klorfenossi)-3,3-dimetil-1-(1,2,4-trijażol-1-il)butanone | | 256-103-8 | 43121-43-3 | Xn; R22 N; R51-53 | Xn; N R: 22-51/53 S: (2-)61 | | |

606-044-00-2 | 2,4,6-Trimetilbenżofenone | | 403-150-9 | 954-16-5 | Xn; R22 Xi; R36 N; R50-53 | Xn; N R: 22-36-50/53 S: (2-)26-60-61 | | |

607-043-00-X | dikamba (ISO) aċidu 2,5-Dikloro-6-metossibenżojku aċidu 3,6-Dikloro-2-metossibenżojku | | 217-635-6 | 1918-00-9 | Xn; R22 Xi; R41 R52-53 | Xn; N R: 22-41-52/53 S: (2-)26-61 | | |

607-057-00-6 | Kumaklor (ISO) 3-(1-(4-Klorfenil)-3-ossobutil)-4-idrossi-kumarin | | 201-378-1 | 81-82-3 | Xn; R48/22 R52-53 | Xn R: 48/22-52/53 S: (2-)37-61 | | |

607-058-00-1 | Kumafuril (ISO) fumarin (RS)-3-(1-(2-Furil)-3-ossibutil)-4-idrossi-kumarin 4-idrossi-3-(3-osso-1-(2-furil)butil)kumarin | | 204-195-5 | 117-52-2 | T; R25-48/25 R52-53 | T R: 25-48/25-52/53 S: (1/2-)37-45-61 | | |

607-079-00-6 | Kelevan (ISO) Etil-5-(perkloro-5-idrossipentaċiklo (5,3,0,02,6,03,9,04,8)dekan-5-il)-4-ossopentanoat etil-5-(1,2,3,5,6,7,8,9,10-dekakloro-4-idrossipentaċiklo(5,2,1,02,6,03,9,05,8)deċ-4-il)-4-ossovalerat | | — | 4234-79-1 | T; R24 Xn R22 N; R51-53 | T; N R: 22-24-51/53 S: (1/2-)36/37-45-61 | | |

607-097-00-4 | Benżina-1,2,4-trikarbossiliku aċidu 1,2-anidrid Anidrid Trimellitiku | | 209-008-0 | 552-30-7 | Xi; R37-41 R42/43 | Xn R: 37-41-42/43 S: (2-)22-26-36/37/39 | | |

607-143-00-3 | Aċidu valeriku | | 203-677-2 | 109-52-4 | C; R34 R52-53 | C R: 34-52/53 S: (1/2-)26-36-45-61 | | |

607-152-00-2 | 2,3,6-TBA (ISO) aċidu 2,3,6-triklorobenżoiku | | 200-026-4 | 50-31-7 | Xn; R22 N; R51-53 | Xn; N R: 22-51/53 S: (2-)61 | | |

607-153-00-8 | Benażolin (ISO) 4-kloro-2,3-dijidro-2-osso-1,3-benżotijażol-aċidu 3-ilaċediku | | 223-297-0 | 3813-05-6 | Xi; R36/38 R52-53 | Xi R: 36/38-52/53 S: (2-)22-61 | | |

607-156-00-4 | Klorfenson (ISO) 4-Klorofenil-4-klorobenżenesulfonat | | 201-270-4 | 80-33-1 | Xn; R22 Xi; R38 N; R50-53 | Xn; N R: 22-38-50/53 S: (2-)37-60-61 | | |

607-158-00-5 | Melħ tas-sodju ta' l-aċidu kloroaċetiku Sodju kloroaċetat | | 223-498-3 | 3926-62-3 | T; R25 Xi; R38 N; R50 | T; N R: 25-38-50 S: (1/2-)22-37-45-61 | | |

607-159-00-0 | Klorobenżilat (ISO) Etil-2,2-di(4-klorofenil)-2-idrossiaċetat Etil-4,4'-diklorobenżilat | | 208-110-2 | 510-15-6 | Xn; R22 N; R50-53 | Xn; N R: 22-50/53 S: (2-)60-61 | | |

607-176-00-3 | Taħlita ta: ά-3-(3-(2H-Benżotrjażol-2-il)-5-tert-butil-4-idrossifenil)-propjonil-ώ-idrossipoli(ossietilena); ά-3-(3-(2H-benżotrijażol-2-il)-5-tert-butil-4-idrossifenil)propjonil-ώ -3-(3-(2H-benżotrijażol-2-il)-5-tert-butil-4-idrossifenil)-propjonilossipoli(ossietilena) | | 400-830-7 | — | R43 N; R51-53 | Xi; N R: 43-51/53 S: (2-)36/37-61 | | |

607-188-00-9 | Sodju ta' l-ideo(enu N-karbossilatoetil-N-ottadek-9-enilmaleamat | | 402-970-4 | — | R43 N; R51-53 | Xi; N R: 43-51/53 S: (2-)24/37-61 | | |

607-209-00-1 | Taħlita ta: 0,0'-di(1-metiletil)tritijo-bis-tijoformat; O,O'-di(1-metiletil)tetratijo-bis-ditijoformat; O,O'-di(1-metiletil)pentatjo)-bis-ditijoformat | | 403-030-6 | — | Xn; R22 R43 N; R50-53 | Xn; N R: 22-43-50/53 S: (2-)36/37-60-61 | | |

607-213-00-3 | Etil-3,3-bis((1,1-dimetilpropil)perossi) butirat | | 403-320-2 | 67567-23-1 | E; R2 O; R7 R10 N; R51-53 | E; N R: 2-7-10-51/53 S: (2-)3/7-14-33-36/37/39-61 | | |

607-217-00-5 | 2-Etossijetil-2-(4-(2,6-dijidro-2,6-djosso-7-fenil-1,5-dijossajndaċen-3-il)fenossi)aċetat | | 403-960-2 | — | R43 R53 | Xi R: 43-53 S: (2-)24-37-61 | | |

607-243-00-7 | Sodju 3,6-dikloro-o-aniżat (1) Aċidu 3,6-dikloro-o-aniżiku, kompost ma' 2,2'-iminodijetanol (1:1) (2) aċidu 3,6-dikloro-o-aniżiku, kompost ma' 2-aminoetanol(1:1) (3) | | 217-846-3 246-590-5 258-527-9 | 1982-69-0 25059-78-3 53404-28-7 | R52-53 | R: 52/53 S: 61 | | |

607-248-00-4 | Sodju tan-naftalam Sodju N-naft-1-ilftalamat | | 205-073-4 | 132-67-2 | Xn; R22 | Xn R: 22 S: (2) | | |

607-249-00-X | (1-metil-1,2-etandeijil)bis(ossi(metil-2,1-etanedijil)dijakrilat tripropilena glikol dijakrilat TPGDA | | 256-032-2 | 42978-66-5 | Xi; R36/37/38 R43 N; R51-53 | Xi; N R: 36/37/38-43-51/53 S: (2-)24-37-61 | C≥10 %; Xi; R36/37/38-43 1 %≤C<10 %: Xi; R43 | |

607-252-00-6 | Lambda-sijalotrin (ISO) Taħlita 1:1 ta' (S)- ά -ċijano-3-fenossibenżil-(Z)-(1R)-ċis-3-(2-kloro-3,3,3-trifluworopropenil)-2,2-dimetilċiklopropanekarbossilat u (R)- ά -ċijano-3-fenossibenżil-(Z)-(1S)-ċis-3-(2-kloro-3,3,3-trifluworopropenil)-2,2-dimetilċiklopropanekarbossilat | | 415-130-7 | 91465-08-6 | T+; R26 T: R25 Xn; R21 N; R50-53 | T+; N R: 21-25-26-50/53 S: (1/2-)28-36/37/39-38-45-60-61 | | |

607-255-00-2 | flurossipir (ISO) 4-amino-3,5-dikloro-6-fluworo-aċidu 2-piridilossjaċetiku | | — | 69377-81-7 | R52-53 | R: 52/53 S: 61 | | |

608-003-00-4 | Akrilonitril | D E | 203-466-5 | 107-13-1 | F; R11 Karc. Kat. 2; R45 T; R23/24/25 Xi< R37/38-41 R43 N; R51-53 | F; T; N R: 45-11-23-/24/25-37/38-41-43-51/53 S: 9-16-53-45-61 | C≥20 %: T; R45-23/24/25-37/38-41-43 10 %≤C<20 %: T; R45-23/24/25-41-43 5 %≤C<10 %: T; R45-23/24/25-36-43 1 %≤C<5 %: T; R45-23/24/25-43 0,2 %≤C<1 %: T; R45-20/21/22 0,1 %≤C<0,2 %: T; R45 | |

608-016-00-5 | 1,4-Diċijano-2,3,5,6-tetra-kloro-benżina | | 401-550-8 | 1897-41-2 | R43 N; R50-53 | Xi; N R: 43-50/53 S: (2-)24-37-60-61 | | |

609-030-00-4 | Dinoterb (ISO) 2-tert-Butil-4,6-dinitrofenol | E | 215-813-8 | 1420-07-1 | Repr. Kat. 2; R61 T+; R28 T; R24 R44 N; R50-53 | T+; N R: 61-24-28-44-50/53 S: 53-45-60-61 | | |

609-040-00-9 | Nitrofen (ISO) Etere 2,4-Diklorofenil-4-nitrofenil | E | 217-406-0 | 1836-75-5 | Karc. Kat. 2; R45 Repr. Kat. 2; R61 Xn; R22 N; R50-53 | T; N R: 45-61-22-50/53 S: 53-45-60-61 | | |

609-044-00-0 | Teknażen (ISO) 1,2,4,5-Tetrakloro-3-nitrobenżina | | 204-178-2 | 117-18-0 | Xn; R22 R43 N; R50-53 | Xn; N R: 22-43-50/53 S: (2-)24-37-60-61 | | |

611-008-00-4 | 4-Aminoażobenżina 4-Fenilażoanilina | | 200-453-6 | 60-09-3 | Karc. Kat. 2; R45 N; R50-53 | T; N R: 45-50/53 S: 53-45-60-61 | | |

611-013-00-1 | trilitiu 1-idrossi-7-(3-sulfonatoanilin)-2-(3-metil-4-(2-metossi-4-(3-sulfonatofenilażo)fenilażo)fenilażo)naftalina-3-sulfonat | | 403-650-7 | 117409-78-6 | E; R2 N; R51-53 | E; N R: 2-51/53 S: (2-)35-61 | | |

611-031-00-X | 4,4'-(4-Imonoċikloessa-2,5-dijenilidenmetilena) dianilina-idroklorid C.I. Aħmar Bażiku 9 | | 209-321-2 | 569-61-9 | Karc. Kat. 2; R45 | T R: 45 S: 53-45 | | |

612-035-00-4 | 2-Metossianilina o-Anisidina | E | 201-963-1 | 90-04-0 | Karc. Kat. 2; R45 Muta. Kat. 3; R40 T; R23/24/25 | T R: 45-23/24/25 S: 53-45 | | |

612-042-00-2 | Benżidina 1,1'-Bifenil-4,4'-dijamina 4,4'-Djaminobifenil Bifenil-4,4'-ilenedjamina | E | 202-199-1 | 92-87-5 | Karc. Kat. 1; R45 Xn; R22 N; R50-53 | T; N R: 45-22-50/53 S: 53-45-60-61 | C≥25 %: T; R45-22 0,01 %≤C<25 %: T; R45 | |

612-051-00-1 | 4,4'-Dijaminodifenilmetan 4,4'-Metilenedjanilina | E | 202-974-4 | 101-77-9 | Karc. Kat. 2; R45 Muta. Kat. 3; R40 T;R39/23/24/25 Xn; R48/20/21/22 R43 N; R51-53 | T; N R: 45-39/23/24/25-43-48/20/21/22-51/53 S: 53-45-61 | | |

612-081-00-5 | Mluħ ta' 4,4'-di-o-tolujdina Mluħ ta' 3,3'-dimetilbenżidina Mluħ ta' o-tolidina | A E | 210-322-5 265-294-7 277-985-0 | 612-82-8 64969-36-4 74753-18-7 | Karc. Kat. 2; R45 Xn; R22 N; R51-53 | T; N R: 45-22-51/53 S: 53-45-61 | | |

612-099-00-3 | 4-metil-m-fenilenedjamina 2,4-tolouenedjamina | E | 202-453-1 | 95-80-7 | Karc. Kat. 2; R45 T; R25 Xn; R21 Xi; R36 R43 N; R51-53 | T; N R: 45-21-25-36-43-51/53 S: 53-45-61 | | |

612-105-00-4 | 2-Piperażin-1-iletilamina | | 205-411-0 | 140-31–8 | Xn; R21/22 C; R34 R43 R52-53 | C R: 21/22-34-43-52/53 S: (1/2-)26-36/37/39-45-61 | | |

612-111-00-7 | 2-Metil-m-fenilenedjamina 2,6-Toluoldjamina | | 212-513-9 | 823-40-5 | Muta. Kat. 3; R40 Xn; R21/22 R43 N; R51-53 | Xn; N R: 21/22-40-43-51/53 S: (2-)24-36/37-61 | | |

612-125-00-3 | 2-Metil-p-fenilenedjamina 2,5- Toluoldjamina | | 202-442-1 | 95-70-5 | T; R25 Xn; R20/21 R43 N; R51-53 | T; N R: 20/21-25-43-51/53 S: (1/2-)24-37-45-61 | | |

612-144-00-7 | Flumetralin (ISO) N-(2-Kloro-6-fluworobenżil)-N-etil-α,α,α-trifluworo-2,6-dinitro-p-toluidina | | — | 62924-70-3 | Xi; R36/38 R43 N; R50-53 | Xi; N R: 36/38-43-50/53 S: (2-)36/37-60-61 | | |

612-151-00-5 | Djaminotoluena | E | 246-910-3 | 25376-45-8 | Karc. Kat. 2; R45 T; R25 Xn; R20/21 Xi; R36 R43 N; R51-53 | T; N R: 45-20/21-25-36-43-51/53 S: 53-45-61 | | |

613-018-00-4 | Morfamkwat (ISO) 1,1'-Bis(3,5-dimetilmorfolinokarbonil-metil)-4,4'-bipiridilju jon | | — | 7411-47-4 | Xn; R22 Xi; R36/37/38 R52-53 | Xn R: 22-36/37/38-52/53 S: (2-)22-36-61 | | |

613-031-00-5 | Simklożene Aċidu triklorojsoċjanuriku trikloro-1,3,5-trijażinetrjon | | 201-782-8 | 87-90-1 | O; R8 Xn; R22 R31 Xi; R36/37 N; R50-53 | O; Xn; N R: 8-22-31-36/37-50/53 S: (2-)8-26-41-60-61 | | |

613-038-00-3 | 6-Fenil-1,3,5-trijażina-2,4-dijildjamina 6-Fenil-1,3,5-trijażina-2,4 dijamina Benżogwanamina | | 202-095-6 | 91-76-9 | Xn; R22 R52-53 | Xn R: 22-52/53 S: (2-)61 | | |

613-042-00-5 | Imażalil (ISO) 1-(2-(Allilossi)-2-(2,4-diklorofenil)etil)-1H-imidażol | | 252-615-0 | 35554-44-0 | Xn; R20/22 N; R41 N; R50-53 | Xn; N R: 20/22-41-50/53 S: (2-)26-39-60-61 | | |

613-043-00-0 | Sulfat ta' l-imażalil (ISO) 1-(2-(Allilossi)etil-2-(2,4-diklorofenil))- 1H-imidażolju sulfat ta' l-idroġenu (±)-1-(2-(Allilossi)etil-2-(2,4-diklorofenil))-1H-imidażolju sulfat ta' l-idroġenu | | 261-351-5 281-291-3 | 58594-72-2 83918-57-4 | Xn; R20/22 Xi; R41 N; R50-53 | Xn; N R: 20/22-41-50/53 S: (2-)26-39-60-61 | | |

613-066-00-6 | Terbumeton (ISO) 2-tert-butilamino-4-etilamino-6-metossi-1,3,5-triażin | | 251-637-8 | 33693-04-8 | Xn; R22 N; R50-53 | Xn; N R: 22-50/53 S: (2-)60-61 | | |

613-091-00-2 | Dikloridu tal-morfamkwat (1) Sulfat tal-morfamkwat (2) | | 225-062-8 | 4636-83-3 29873-36-7 | Xn; R22 Xi; R36/37/38 R52-53 | Xn; R: 22-36/37/38-52/53 S: (2-)22-36-61 | | |

613-098-00-0 | 1-Oktil-2-pirrolidon | | 403-700-8 | 2687-94-7 | C; R34 N; R51-53 | C; N R: 34-51/53 S: (1/2-)23-26-36/37/39-45-61 | | |

613-130-00-3 | Essakonażol (ISO) (RS)-2-(2,4-Diklorofenil)-1-(1H-1,2,4-triajżol-1-il)essan-2-ol | | — | 79983-71-4 | R43 N; R51-53 | Xi; N R: 43-51/53 S: (2-)24-37-61 | | |

613-131-00-9 | Pirokwilon (ISO) 1,2,5,6-Tetrajdropirrolo(3,2,1-ij)kwinolin-4-on | | — | 57369-32-1 | Xn; R22 R52-53 | Xn R: 22-52/53 S: (2-)61 | | |

613-134-00-5 | Miklobutanil (ISO) 2-(4-Klorofenil)-2-(1H-1,2,4-trijażol-1-ilmetil)essanenitril | | — | 88671-89-0 | Repr. Kat. 3; R63 Xn; R22 Xi; R36 N; R51-53 | Xn; N R: 22-36-51/53-63 S: (2-)36/37-46-61 | | |

613-137-00-1 | Metabenżtijażuron (ISO) 1-(1,3-Benżotijażol-2-il) 1,3-dimetilurea | | 242-505-0 | 18691-97-9 | N; R50-53 | N R: 50/53 S: 60–61 | | |

613-139-00-2 | Metsulfuron-metil metil 2-(4-Metossi-6-metil-1,3,5-trijażin-2-ilkarbomojl-sulfamojl) benżoat | | — | 74223-64-6 | N; R50-53 | N R: 50/53 S: 60–61 | | |

614-001-00-4 | Nikotina (ISO) (S)-3-(1-Metil-2-pirrolidinil)piridin | | 200-193-3 | 54-11-5 | T+; R27 T; R25 N; R51-53 | T+; N R: 25-27-51/53 S: (1/2-)36/37-45–61 | | |

614-006-00-1 | Bruċina 2,3-Dimetossi-striknina | | 206-614-7 | 357-57-3 | T+; R26/28 R52-53 | T+ R: 26/28-52/53 S: (1/2-)13-45-61 | | |

614-007-00-7 | Sulfat tal-bruċina (1) Nitrat tal-bruċina (2) 2,3-Dimetossi-striknidina-10-one-mono((R)-1-metileptil-1,2-benżenedikarbossilat (3) 2,3-Dimetossi-striknidina-10-one compost ma' (S)mono((R)-1-metileptil-1,2-benżenedikarbossilat (1:1) | | 225-432-9 227-317-9 269-439-5 269-710-8 | 4845-99-2 5786-97-0 68239-26-9 68310-42-9 | T+; R26/28 R52-53 | T+ R: 26/28-52/53 S: (1/2-)13-45-61 | | |

615-006-00-4 | 2-Metil-m-fenilina dijisoċjanat (1) 4- Metil-m-fenilina dijisoċjanat (2) m-Tolilidina dijisoċjanat (3) Toluene 2,6-di-isoċjanat (1) Toluene 2,4-di- isoċjanat (2) Toluene dijisoċjanat (3) | C | 202–039-0 (1) 209-544-5 247-722-4 | 91–08-7 (1) 584-84-9 26471-62-5 | Karc. Kat. 3; R40 T+; R26 Xi; R36/37/38 R42/43 R52-53 | T+ R: 26-36/37/38-40-42/43-52/53 S: (1/2-)23-36/37-45-61 | C≥20 %: T+; R26-36/37/38-40-42/43 7 %≤C<20 %: T+; R26-40-42/43 1 %≤C<7 %: T; R23-40-42/43 0,1 %≤C<1 %: Xn; R20-42 | 2 |

616-010-00-9 | Sodju tat-tosilkloramide | | 204-854-7 | 127-65-1 | Xn; R22 R31 C; R34 R42 | C R: 22-31-34-42 S: (1/2-)7-22-26-36/37/39-45 | | |

616-034-00-X | Pirakarbolid (ISO) 3,4-Dijidro-6-metil-2H-piran-5-karbossanilide | | 246-419-4 | 24691-76-6 | R52-53 | R: 52/53 S: 61 | | |

616-035-00-5 | Ċimossanil 2-ċjano-N((etilamino)karbonil)-2-(metossijimino)aċetamide | | 261-043-0 | 57966-95-7 | Xn; R22 R43 N; R50-53 | Xn; N R: 22-43-50/53 S: (2-)36/37-60-61 | | |

617-004-00-9 | 1,2,3,4-Tetraidro-1-naftil-idroperossidu | | 212-230-0 | 771-29-9 | O; R7 Xn; R22 C; R34 N; R50-53 | O; C; N R: 7-22-34-50/53 S: (1/2-)3/7-14-26-36/37/39-45-60-61 | C≥25 %: C; R22-34 10 %≤C<25 %: C; R34 5 %≤C<10 %: Xi; R36/37/38 | |

617-006-00-X | Bisz(α,α-dimetilbenżil) perossidu | | 201-279-3 | 80-43-3 | O; R7 Xi; R36/38 N; R51-53 | O; Xi; N R: 7-36/38-51/53 S: (2-)3/7-14-36/37/39-61 | | |

617-008-00-0 | Persoosidu tad-dibenżojl Perossidu tal-benzojl | | 202-327-6 | 94-36-0 | E; R2 Xi; R36 R43 | E; Xi; R: 2-36-43 S: (2-)3/7-14-36/37/39 | | |

650-007-00-3 | Klordimeform (ISO) N'-(4-Kloro-2-o-tolil)-N',N'-dimetil-formamidina | | 228-200-5 | 6164-98-3 | Karc. Kat. 3; R40 Xn; R21/22 N; R50-53 | Xn; N R: 21/22-40-50/53 S: (2-)22-36/37-60-61 | | |

650-008-00-9 | Drażossolon (ISO) 4-(2-klorfenilidrażon)-3-metil-5-iżossażalon | | 227-197-8 | 5707-69-7 | T; R25 N; R50-53 | T; N R: 25-50/53 S: (1/2-)22–24-36/37-45-60-61 | | |

650-009-00-4 | Idrokloridu tal-klordimeform N'-(4-klór-o-tolil)-N,N- dimetilformamidinemonojdrokloridu N2-(4-kloro-o-tolil)-N1,N1-dimetilformamidinejdrokloridu | | 243-269-1 | 19750-95-9 | Karc. Kat. 3; R40 Xn; R22 N; R50-53 | Xn; N R: 22-40-50/53 S: (2-)22-36/37-60-61 | | |

650-033-00-5 | Esfenvalerat (ISO) (S)-α-ċjano-3-fenossibenżil-(S)-2-(4-klorofenil)-3-metilbutirat | | — | 66230-04-4 | T; R23/25 R43 N; R50-53 | T; N R: 23/25-43-50/53 S: (1/2-)24-36/37/39-45-60-61 | | |

650-041-00-9 | Trijasulfuron (ISO) 1-(2-(2-Kloroetossi)fenilsulfonil)-3-(4-metossi-6-metil-1,3,5-trjażin-2-il) urea | | — | 82097-50-5 | N; R50-53 | N R: 50/53 S: 60-61 | | |

--------------------------------------------------

Anness 1D

Numru ta' l-indiċi | Isem kimiku | Noti li għandhom x'jaqsmu ma' sustanzi | Nru. KE | Nru SAK | Klassifikazzjoni | Tikkettjar | Limiti tal-konċentrazzjoni | Noti li għandhom x'jaqsmu mal-preparazzjonijiet |

006-090-00-8 | 2-(3-jodprop-2-in-1-ilossi)etil fenilkarbamat | | 408-010-0 | 88558-41-2 | Xn; R20 Xi; R41 R52–53 | Xn R: 20-41-52/53 S: (2-)22-26-39-61 | | |

014-016-00-0 | Taħlita ta': 1,3-dihess-5-en-1-il-1,1,3,3-tetrametil-disilossan; 1,3-dihess-n-en-1-il-1,1,3,3-tetrametildisilossan | | 406-490-6 | — | N; R51-53 | N R: 51/53 S: 61 | | |

015-164-00-9 | Kalċju-P,P'-(1-idrossjetilena)bis(idroġenufosfonat)dijidrat | | 400-480-5 | 36669-85-9 | R52-53 | R: 52/53 S: 61 | | |

015-165-00-4 | Taħlita ta; tijobis(4,1-fenilena)-S,S,S',S'-tetrafenil-disulfonju-bisessafluworo-fosfat; difenil (4-feniltjofenil)sulfonju essafluworofosfat | | 404-986-7 | — | Xi; R41 N; R50-53 | Xi; N R: 41-50/53 S: (2-)15-26-39-60-61 | | |

015-166-00-X | 3,9-bis(2,6-di-tert-butil-4-metilfenossi)-2,4,8,10-tetraossa-3,9-difosfaspiro(5,5) undekan | | 410-290-4 | 80693-00-1 | R53 | R: 53 S: 61 | | |

015-167-00-5 | 3-(idrossifenilfosfinil) aċidu propanojku | | 411-200-6 | 14657-64-8 | Xi; R41 | Xi R: 41 S: (2-)26-39 | | |

601-050-00-1 | Benżina, C10-13-derivati ta' l-a;kil | | 267-051-0 | 67774-74-7 | N; R50 | N R: 50 S: 61 | | |

601-051-00-7 | 4-fenilbut-1-ene | | 405-980-7 | 768-56-9 | Xi; R38 N; R51-53 | Xi; N R: 38-51/53 S: (2-)37-61 | | |

602-083-00-4 | Etere difenil, pentabromu Etere derivate mill-pentabromodifenil | | 251-084-2 | 32534-81-9 | Xn; R48/21/22 R64 N; R50-53 | Xn; N R: 48/21/22-50/53-64 S: (1/2-)36/37-45-60–61 | | |

602-084-00-X | 1,1-Dikloro-1-fluworetan | | 404-080-1 | 1717-00-6 | N; R52-53-59 | N R: 52/53-59 S: 59-61 | | |

603-128-00-0 | 2-(fenilmetossi)naftalina | | 405-490-3 | 613-62-7 | R53 | R: 53 S: 61 | | |

603-129-00-6 | 1-tert-butossipropan-2-ol | | 406-180-0 | 57018-52-7 | R10 Xi; R41 | Xi R: 10-41 S: (2-)26-39 | | |

603-130-00-1 | Taħ;lita ta' isomeri ta': α-((dimetil)bifenil)-ω-idrosspoli (ossjetilena) | | 406-325-8 | — | Xn; R22 R52-53 | Xn R: 22-52/53 S: (2-)39-61 | | |

603-131-00-7 | Taħlita 3:1 ta': 1-deossi-1-(metil-(1-ossododeċil)amino)-D-gluċitol; 1-deossi-1-(metil-(1-ossotetradeċil) amino)-D-gluċitol | | 407-290-1 | — | Xi; R41 | Xi R:41 S: (2-)26-39 | | |

603-132-00-2 | 2-idrossimetil-9-metil-6-(1-metiletil)-1,4-dijossaspirol(4,5)dekan | | 408-200-3 | 63187-91-7 | Xi; R38-41 R52-53 | Xi R: 38-41-52/53 S: (2-)26-37/39-61 | | |

603-133-00-8 | Taħlita ta': 3-(4-amino-2-kloro-5-nitrofenil)amino)-propan-1,2-djol; 3,3'-(2-kloro-5-nitro-1,4-fenilenedijimino)bis(propan-1,2-djol) | | 408-240-1 | — | Xn; R22 R52-53 | Xn R: 22-52/53 S: (2-)22-36-61 | | |

603-134-00-3 | Taħlita ta' eteri difenil sostituti dodeċil u/jew tetradeċil. Is-sustanza tinkiseb bir-reazzjoni tal-Friedel Crafts. Il-katalist jitneħħa mill-prodott tar-reazzjoni. Etere tad-difenil jiġi sostitwit bi gruppi ta' l-alkil C1-C10. Il-gruppi ta' l-alkil jingħaqdu flimkien mingħajr metodu bejn C1 u C6. Tintuża l-lineari C12 u C14, 50/50. | | 410-450-3 | — | R53 | R: 53 S: 61 | | |

603-135-00-9 | bis((2,2',2″-nitrilotris(etanolat))-1-N,O)bis(2-(2-metossietossi)etossi)-titanju | | 410-500-4 | — | Xi; R41 N; R51-53 | Xi; N R: 41-51/53 S: (2-)26-39-61 | | |

603-136-00-4 | 3-((4-bis(2-idrossietil)amino)-2-nitrofenil)amino)-1-propanol | | 410-910-3 | 104226-19-9 | R43 R52-53 | Xi R: 43-52/53 S: (2-)24-37-61 | | |

603-137-00-X | Taħlita ta': 1-deossi-1-(metil-(1-ossohessadeċil(amino)-D-gluċitol; 1-deossi-1-(metil-(1-ossooktadeċil)amino)-D-gluċitol | | 411-130-6 | — | Xi; R41 | Xi R: 41 S: (2-)26-39 | | |

603-138-00-5 | 3-(2,2-dimetil-3-idrossipropil)toluene alt.): 2,2-dimetil-3-(3-metilfenil)propanol | | 403-140-4 | 103694-68-4 | R52-53 | R: 52/53 S: 61 | | |

604-050-00-X | 4-kloro-o-kreżol 4-kloro-2-metil fenol | | 216-381-3 | 1570-64-5 | T; R23 C; R35 N; R50 | T; C; N R: 23-35-50 S: (1/2-)26-36/37/39-45-61 | C≥25 %:T;C;R23-35 10 %≤C<25 %: C; R20-35 5 %≤C<10 %: C; R20-34 3 %≤C<5 %: Xn; R20-36/37/38 1 %≤C<3 %: Xi; R36/37/38 | |

604-051-00-5 | 3,5-bis((3,5-di-tertr-butil-4-idrossi) benżil)-2,4,6-trimetilfenol | | 401-110-5 | 87113-78-8 | R52-53 | R: 52/53 S: 61 | | |

604-052-00-0 | 2,2'-metilenbis(5-(2H-benżotrijażol-2-il)-4-(1,1,3,3-tetrametil-butil)fenol | | 403-800-1 | 103597-45-1 | R53 | R: 53 S: 61 | | |

604-053-00-6 | 2-metil-4-(1,1-dimetiletil)-6-(1-metil-pentadeċil)-fenol | | 410-760-9 | 1577661-93-3 | Xi; R38 R43 N; R50-53 | Xi; N R: 38-43-50/53 S: (2-)24-37-60-61 | | |

604-054-00-1 | Taħlita ta': 2-metossi-4-(tetraidro-4-metilena-2H-piran-2-il)-fenol; 4-(3,6-dijidro-4-metil-2H-piran-2-il)-2-metossifenol | | 412-020-0 | — | R43 R52-53 | Xi R: 43-52/53 S: (2-)22-36-37 | | |

604-055-00-7 | 2,2'-((3,5',5,5'-tetrametil-(1,1'-bifenil)-4,4'-dijil)-bis(ossimetilena))-bis-ossiran | | 413-900-7 | 85954-11-6 | Muta. Kat. 3; R40 | Xn R: 40 S: (2-)22-36-37 | | |

605-027-00-7 | Taħlita ta': 3a,4,5,6,7,7a-essaidro-4,7-metano-1H-indene-6-karbossaldejid; 3a,4,5,6,7,7a-essaidro-4,7-metano-1H-indene-5-karbossaldejid | | 410-480-7 | — | R43 N; R51-53 | Xi; N R: 43-51/53 S: (2-)24-37-61 | | |

606-051-00-0 | 4-pentilċikloessanon | | 406-670-4 | 61203-83-6 | N; R51-53 | N R: 51/53 S: 61 | | |

606-052-00-6 | 4-(N,N-dibutilamino)-2-idrossi-2'-karbossibenżofenone | | 410-410-5 | 54574-82-2 | R52-53 | R: 52/53 S: 61 | | |

607-272-00-5 | fluworossipir-meptil (ISO) (1) fluworossipir -butometil (ISO) (2) metileptil, O-((4-amino-3,5-dikloro-6-fluworo-2-piridilossi) aċetat (1) 2-butossi-1-metiletil, O-(4-amino-3,5-dikloro-6-fluworo-2-piridilossi) aċetat (2) | | 279-752-9 (1) — | 81406-37-3 (1) 154486-27-8 (2) | N; R50-53 | N R: 50/53 S: 60-61 | | |

607-273-00-0 | ammonju-7-(2,6-dimetil-8-(2,2-dimetil-butirilossi)-1,2,6,7,8,8a-essaidro-1-naftil)-3,5-dijidrossi-eptanoat | | 404-520-2 | — | R52-53 | R: 52/53 S: 61 | | |

607-274-00-6 | 2-(N-benżil-N-metilamino)etil-3-amino-2-butanoat | | 405-350-1 | 54527-73-0 | R43 N; R51-53 | Xi; N R: 43-51/53 S: (2-)24-37-61 | | |

607-275-00-1 | Sodju benżojlossibenżina-4-szulfonat | | 405-450-5 | 66531-87-1 | R43 | Xi R: 43 S: (2-)24-37 | | |

607-276-00-7 | bis(1-metilimidażol)-(2-etilessanoat)), kumpless taż-żingu | | 405-635-0 | — | Xi; R38-41 N; R50-53 | Xi; N R: 38-41-50/53 S: (2-)26-37/39-60-61 | | |

607-277-00-2 | Taħlita ta': 2-(essiltjo)etilamin idrokloridu; sodju tal-propjonat | | 405-720-2 | — | Xn R22 Xi; R41 R43 N; R51-53 | Xn; N R: 22-41-43-51/53 S: (2-)24-26-37/39-61 | | |

607-278-00-8 | Taħlita ta' isomeri tas-sodju fenetilnaftalinasulfonat; sodju naftiletilbenżenesulfonat | | 405-760-0 | — | Xi; R41 R43 R52-53 | Xi R: 41-43-52/53 S: (2-)24-26-37/39-61 | | |

607-279-00-3 | Taħlita ta' n-ottadeċilaminodijetil bis(idroġenu maleat); n-ottadeċilaminodietil idroġenu maleat idroġenu ftalat | | 405-960-8 | — | R43 N; R51–53 | Xi; N R: 43-51/53 24-37-61 | | |

607-280-00-9 | Sodju 4-kloro-1-idrossibutan-1-sulfonat | | 406-190-5 | 54322-20-2 | Xn; R22 Xi; R36 R43 | Xn R: 22-36-43 S: (2-)22-26-36/37 | | |

607-281-00-4 | Taħlita ta' alkil C7-C9 minn fieg)i u lineari 3-(3-(2H-benżotrijażol-2-il)-5-(1,1-dimetil-etil)-4-idrossifenil)propjonati | | 407-000-3 | 127519-17-9 | N; R51-53 | N R: 51/53 S: 61 | | |

607-282-00-X | 2-aċetossimetil-4-benżilossibut-1-il aċetat | | 407-140-5 | 131266-10-9 | R52-53 | R: 52/53 S: 61 | | |

607-283-00-5 | E-etil-4-osso-4-fenilkrotonat | | 408-040-4 | 15121-89-8 | Xn; R21/22 Xi; R38-41 R43 N; R50-53 | Xn; N R: 21/22-38-41-43-50/53 S: (2-)26-36-37/39-60-61 | | |

607-284-00-0 | Taħlita 9:1 ta': sodju 3,3'-(1,4-fenilenebis(karbonilimino-3,1-propane-dijilimino))bis(10-amino-6,13-dikloro)-4,11-trifenodijossażinedisulfonat): litju 3,3'-(1,4-fenilenebis-(karbomilimino-3,1-propanedijil-imino))bis(10-amino-6,13-dikloro)-4-11-trifenodijossażinediszulfonat | | 410-040-4 | 136213-76-8 | N; R51-53 | N R: 51/53 S: 61 | | |

607-285-00-6 | Taħlita ta': 7-(((3-aminofenil)sulfonil)amino)-naftalina-1,3-aċidu disulfoniku; sodju 7-(((3-aminofenil)sulfonil)amino)-naftalina-1,3-disulfonat; potassju 7-(((3-aminofenil)sulfonil)amino)-naftalina-1,3-disulfonat | | 410-065-0 | — | R43 | Xi R: 43 S: (2-)22-24-37 | | |

607-286-00-1 | Taħlita ta': sodju/potassju 7-(((3-((4-((2-idrossi-naftil)ażo)fenil)ażo) fenil)sulfonil)amino)-naftalina-1,3-disulfonat | | 410-070-8 | 141880-36-6 | R43 R52-53 | Xi R: 43-52/53 S: (2-)22-24-37-61 | | |

607-287-00-7 | O'-metil O-(1-metil-2-metakrilojlossietil)-1,2,3,6-tetraidro-ftalat | | 410-140-8 | — | R52-53 | R: 52/53 S: 61 | | |

607-288-00-2 | Tetrasodju (c-(3-(1-(3-(e-6-dikloro-5-ċjano-pirimidin-f-il(metil)amino)propil-1,6-dijidro-2-idrossi-4-metil-6-osso-3-piridilażo)-4-sulfonatofenilsulfamojl) ftaloċjanina-a,b,d-trisulfonato(6-)) nikelato (II), fejn a huwa 1 jew 2, jew 3 jew 4, b huwa 8 jew 9 jew 10 jew 11, c huwa 15 jew 16 jew 17 jew 18, d huwa 22 jew 23 jew 24 jew 25 u fejn e u f flimkien huma 2 u 4, jew 4 u 2, rispettivament. | | 410-160-7 | 148732-74-5 | Xi; R36 R43 R52-53 | Xi R: 36-43-52/53 S: (2-)22-26-36/37-61 | | |

607-288-00-8 | 3-(3-(4-(2,4-bis(1,1-dimetilpropil)fenossi) butilaminokarbonil-4-idrossi-1-naftalinil) tijo) aċidu propanojku | | 410-370-9 | 105488-33-3 | R53 | R: 53 S: 61 | | |

607-290-00-3 | Taħlita (proporzjoni mhiex magħrufa) ta': ammonju 1-C14-C18-alkilossikarbonil-2-(3-allilossi-2-idrossipropossikarbonil)etan-1-sulfonat; ammonju 2-C14-C18-akilossikarbonil-1-(3-allilossi-2-idrossipropossikarbonil)etan-1-sulfonat | | 410-540-2 | — | Xi; R38 R43 N; R50-53 | Xi; N R: 38-43-50/53 S: (2-)24-37-60-61 | | |

607-291-00-9 | Dodeċil-ω-(C5/6-ċikloalkil)alkil karbossilat | | 410-630-1 | 104051-92-5 | R53 | R: 53 S: 61 | | |

607-292-00-4 | Taħlita ta': (1-(metossimetil)-2-(C12-alkossi)-etossi) aċidu aċetiku; (1-(metossimetil)-2-(C14-alkossi)-etossi) aċidu aċetiku | | 410-640-6 | — | Xi; R38-41 N; R50-53 | Xi; N R: 38-41-50/53 S: (2-)26-37/39-60-61 | | |

607-293-00-X | Taħlita ta': N-aminoetilpiperażonju mono-2,4-6-trimetilnonildifenil etere di-sulfonat; N-aminoetilpiperażonju di-2,4,6-trimetil-nonildifenil etere disulfonat | | 410-650-0 | — | XI; R41 R43 N; R51-53 | Xi; N R: 41-43-51/53 S: (2-)26-36/37/39-61 | | |

607-294-00-5 | sodju-2-benżojlossi-1-idrossjetan-sulfonat | | 410-680-4 | — | R43 | Xi R: 43 S: (2-)24-37 | | |

607-295-00-0 | Taħlita ta': tetrasodju fosfonoetan-1,2-dikarbossilat; essasodju fosfonobutan-1,2,3,4-tetrakarbossilat | | 410-800-5 | — | R43 N; R51-53 | Xi; N R: 43-51/53 S: (2-)24-37-61 | | |

607-296-00-6 | Taħlita ta': tetraesteri tal-pentaeritrol ma' aċidu eptanojku u aċidu 2-etilessanojku | | 410-830-9 | — | R53 | R: 53 S: 61 | | |

607-297-00-1 | (E-E)-3,3'-(1,4-fenilenedimetilidena)bis (2-ossobornan-10-aċidu sulfoniku) | | 410-960-6 | 92761-26-7 | Xi; R41 | Xi R: 41 S: (2-)26-39 | | |

607-298-00-7 | 2-(trimetilammonju)etossikarbossibenżina-4-sulfonat | | 411-010-3 | — | R43 | Xi R: 43 S: (2-)22-36/37 | | |

607-299-00-2 | metil 3-(aċetiltjo)-2-metil-propanoat | | 411-040-7 | 97101-46-7 | Xn; R22 R43 N; R50-53 | Xn; N R: 22-43-50/53 S: (2-)24-37-60-61 | | |

607-300-00-6 | trisodju (2-(5-kloro-2,6-difluworpirimidin-4-ilamino)-5-(b-sulfamojl-c,d-sulfonat-ftaloċjanin-a-il-K4,N29,N30,N31,N32-sufonilamino)benzoato(5-)(kuprat (II) fejn a = 1, 2, 3, 4 b = 8, 9, 10, 11 c = 15, 16, 17, 18 d = 22, 23, 24, 25 | | 411-430-7 | — | R43 | Xi R: 43 S: (2-)22-24-37 | | |

607-301-00-1 | Taħlita ta': aċidu dodekanojku; esters poli(1-7)laktat ta' aċidu dodekanojku | | 411–860-5 | — | Xi; R38-41 R43 N; R51-53 | Xi; N R: 38-41-43-51/53 S: (2-)24-26-37/39-61 | | |

607-302-00-7 | Taħlita ta': aċidu tetradekanojku; esters poli(1-7)laktat ta' aċidu tetradekanojku | | 411-910-6 | — | Xi; R38-41 R43 N; R51-53 | Xi; N R: 38-41-43-51/53 S: (2-)24-26-37/39-61 | | |

607-303-00-2 | 1-ċiklopropil-6,7-difluworo-1,4-dijidro-4-ossikwinolin-aċidu 3-karbossil | | 413-760-7 | 931077-30-3 | Szap. Kat. 3; R62 R52-53 | Xn R: 62-52/53 S: (2-)22-36/37-61 | | |

608-023-00-3 | 4-(4-klorofenil)-2-fenil-2-((1H-1,2,4-trijażol-1-il)metil)butanenitril | | 406-140-2 | 114369-43-6 | N; R50-53 | N R: 50/53 S: 60-61 | | |

608-024-00-9 | 2-(4-(N-butil-N-fenetilamino)fenil)etilene-1,1,2-trikarbonitril | | 407-650-8 | 97460-76-9 | R53 | R: 53 S: 61 | | |

608-025-00-4 | 2-nitro-4,5-bis(benżilossi)fenilaċetonitril | | 410-970-0 | 117568-27-1 | R53 | R: 53 S: 61 | | |

609-053-00-X | Idrażin-tri-nitrometan | | 414-850-9 | — | E; R3 O; R8 Karc. Kat. 2; R45 T; R23/25 R43 | E; T R: 45-3-8-23/25-43 S: 53-45 | | |

610-010-00-2 | 2-bromo-1-(2-furil)-2-nitroetilene | | 406-110-9 | 35950-52-8 | Xn; R22-48/22 C; R34 R43 N; R50-53 | C; N R: 22-34-43-48/22-50/53 S: (1/2-)22-26-36/37/39-45-60-61 | | |

611-043-00-5 | Taħlita 2:1:1 ta' trisodju N(1')-N(2):N(1″)-N(2″)-η-6-(2-amino-4-(jew 6)-idrossi-(jew 4-amino-2-idrossi) fenilażo)-6″(1-karbanilojl-2-idrossiprop-1-enilażo)-5',5‴-disulfamojl-3,3″-disulfonato-bis(naftalina-2,1'-ażobenzżina-1,2'-diolato-O(1),O(2'))-kromat; trisodju N(1')-N(2):N(1‴)-N(2″)-η-6,6″-bis(1-karbanilojl-2-idrossiprop-1–eni-lażo)-5',5‴-disulfamojl-3,3″-disulfonato-bis(naftalina-2,1' ażobenżina-1,2'-dijolato O(1),O(2'))-kromat; trisodju N(1')-N(2):N(1‴)-N(2″)-η-6,6″-bis(2-amino-4-(jew 6)-idrossi-(jew 4-amino-2-idrossi)fenilażo)5,5‴-disulfamojl-3,3″-disulfonatobis(naftalina-2,1'-ażobenżina-1,2'-dijolato-O(1),O(2'))-kromat | | 402-850-1 | | Xi; R41 52-53 | Xi R: 41-52/53 S: (2-)26-39-61 | | |

611-044-00-0 | Taħlita ta': tert-alkil (C12-C14)ammonju-bis(1-((2-idrossi-5-nitrofenil)ażo)-2-naftalinolato(2-))-kromat(1-); tert alkil (C12-C14) ammonju bis(1-((2-idrossi-4-nitrofenil) ażo)-2-naftalinolato(2-))-kromat(1-); tert-alkil(C12-C14)ammonju (1-((5(1,1-dimetilpropil)-2-idrossi-3-nitrofenil)ażo)-2-naftalinolato(2-))-kromat (1-); tert alkil(C12-C14)ammonju-((1-((2-idrossi-5-nitrofenil)ażo)-2-naftalinolato(2-))-(1(2-idrossi-5-nitrofenil) ażo)-2-naftalinolato(2-)))-kromat(1-); tert-alkil(C12-C14)ammonju-((1-((5-(1,1-dimetilpropil)-2-idrossi-3-nitrofenil) ażo)-2-naftalinolato(2-))-(1-(2-idrossi-5-nitrofenil)ażo)-2-naftalinolato(2-)))-kromat (1-); tert-alkil(C12-C14)ammonju ((1-4(jew 5)-nitro-2-ossidofenilażo)-2-naftolato) (1-(3-nitro-2-ossido-5-pentil-fenilażo)-2-naftolato))kromat(1-) | | 403-720-7 | 117527-94-3 | N; R51-53 | N R: 51/53 S:61 | | |

611-045-00-6 | 2-(4-(N-(4-aċetossibutil)-N-etil)amino-2-metilfenilażo)-3-eċetil-5-nitrotjofene | | 404-830-8 | — | R53 | R: 53 S: 61 | | |

611-046-00-1 | 4,4'-diamino-2-metilażobenżina | | 407-590-2 | 43151-99-1 | T; R25 Xn; R48/22 R43 N; R50-53 | T; N R: 25-43-48/22-50/53 S: (1/2-)22-28-36/37-45–60-61 | | |

611-047-00-7 | Taħlita 1:1 ta': 2-((4-(N-etil-N-(2-aċetossjetil)amino)fenil) ażo)-5,6-diklorobenżotijażol; 2-((4-(N-etil-N-(2-aċetossjetil)amino)fenil)ażo)-6,7-diklorobenżotijażol | | 407-890-3 | 111381-11-4 | R53 | R: 53 S: 61 | | |

611-048-00-2 | Taħlita 1:1 ta': 2-((4-(bis(2-aċetossjetil)amino)fenil)ażo)-5,6-diklorobenżotijażol; 2-((4-(bis(2-aċetossjetil)amino)fenil)ażo)-6,7-diklorobenżotijażol | | 407-900-6 | 111381-12-5 | R53 | R: 53 S: 61 | | |

611-049-00-8 | 7-(4-(3-dijetilaminopropilamino)-6-(3-dijetilammonjopropilamino)-1,3,5-trijażin-2-ilamino)-4-idrossi-3-(4-fenilażofanilażo)-naftalina-2-sufonat, aċidu aċetiku, aċidu lattiku (2:1:1) | | 408-000-6 | 118658-98-3 | Xn; R48/22 R43 R52-53 | Xn R: 43-48/22-52/53 S: (2-)22-36/37-61 | | |

611-051-00-9 | 2-(4-N-etil-N-(2-idrossi)etil)amino-2-metilfenil)ażo-6-metossi-3-metilbenżotijażolju kloridu | | 411-110-7 | 136213-74-6 | N; R50-53 | N R: 50/53 S: 60-61 | | |

611-052-00-4 | Monosodju aqua-(5-((2,4-dijidrossi-5-((2-idrossi-3,5-dinitrofenil)ażo)fenil)ażo)-2-naftalenesulfonat) kumpless tal-ħadid | | 400-720-9 | — | R52-53 | R: 52/53 S: 61 | | |

612-156-00-2 | Taħlita ta': trijessadeċilmetilammonju kloridu; dijessadeċildimetilammonju kloridu | | 405-620-9 | — | Xi; R41 N; R50-53 | Xi; N R: 41-50/53 S: (2-)26-39-60-61 | | |

612-157-00-8 | (Z)-1-benżo(b)tijen-2-iletanon ossim idrokloridu | | 410-780-8 | — | Xn; R22-48/22 Xi; R41 R43 N; R51-53 | Xn; N R: 22-41-43-48/22-51/53 S: (2-)22-26-36/37/39-61 | | |

612-158-00-3 | Taħlita ta': bis(5-dodeċil-2-idrossibenzaldossimat) ramm (II) grupp C12-alkil huwa maqsum f'fergħat; 4-dodeċilsaliċilaldossim | | 410-820-4 | — | R53 | R: 53 S: 61 | | |

612-159-00-9 | Prodotti min trazzjoni ta': dijamina ta' trimetilessametilena (taħlita ta' 2,2,4-trimetil-1,6-essandijamina u 2,4,4-trimetil-1,6-essadijamina, elenkati fl-EINECS), Epossidi 8 (mono((C10-C16-alkilossi)metil) derivati ta' l-ossiran) u p-toluene aċidu sulfoniku | | 410-880-1 | — | Xn; R22 C; R34 N; R50-53 | C; N R: 22-34-50/53 S: (1/2-)23-26-36/37/39-45-60-61 | | |

613-149-00-7 | 2-tert-butil-5-(4-tert-butilbenżiltjo)-4-kloropiridażin-3(2H)-one | | 405-700-3 | 96489-71-3 | T; R23/25 N; R50-53 | T; N R: 23/25-50/53 S: (1/2-)36/37-45-60-61 | | |

613-150-00-2 | 2,2'-(3,3'-(piperażina-1,4-dijil)dipropil)bis (1H-benżimidażo(2,1-b)benżo(1,m,n) (3,8) fenantrolina-1,3,6-trijon | | 406-295-6 | — | R53 | R: 53 S: 61 | | |

613-151-00-8 | 1-(3-mesilossi-5-tritilossimetil-2-D-treofuril) timina | | 406-360-9 | 104218-44-2 | R53 | R: 53 S: 61 | | |

613-152-00-3 | fenil N-(4,6-dimetossipirimidin-2-il) karbama | | 406-600-2 | 89392-03-0 | R43 N; R51-53 | Xi; N R: 43-51/53 S: (2-)24-37-61 | | |

613-153-00-9 | 2,3,5-trikloroidina | | 407-270-2 | 16063-70-0 | R52-53 | R: 52/53 S: 61 | | |

613-154-00-4 | 2-amino-4-kloro-6-metossipirimidina | | 410-050-9 | 5734-64-5 | Xn; R22 | Xn R: 22 S: (2-)22 | | |

613-155-00-X | 5-kloro-2,3-difluworopiridina | | 410-090-7 | 89402-43-7 | R10 Xn; R22 R52-53 | Xn R: 10-22-52/53 S: (2-)23-36-61 | | |

613-156-00-5 | 2-butil-4-kloro-5-formilimidażol | | 410-260-0 | 83857-96-9 | R43 N; R51-53 | Xi; N R: 43-51/53 S: (2-)24-37-61 | | |

613-157-00-0 | 2,4-dijamino-5-metossimetilpirimidina | | 410-330-0 | 54236-98-5 | Xn; R22-48/22 Xi; R36 | Xn R: 22-36-48/22 S: (2-)22-26-36 | | |

613-158-00-6 | 2,3-dikloro-5-trifluworometilpiridina | | 410-340-5 | 69045-84-7 | Xn; R20/22 Xi; R41 R43 N; R51-53 | Xn; N R: 20/22-41-43-51/53 S: (2-)24-26-37/39-61 | | |

613-159-00-1 | 4-(2-(4-(1,1-dimetiletil)fenil)-etossi) kwinażolina | | 410-580-0 | 120928-09-8 | T; R25 Xn; R20 N; R50-53 | T; N R: 20-25-50/53 S: (1/2-)37-45-60-61 | | |

613-160-00-7 | (IS)-2-metil-2,5-dijażobiċiklo(2,2,1)eptan dijidrobromid | | 411-000-9 | 125224-62-6 | R43 | Xi R: 43 S: (2-)24-37 | | |

615-022-00-1 | metil 3-isoċjanatosulfonil-2-tiofene-karbossilat | | 410-550-7 | 79277-18-2 | E; R2 R14 Xn; R48/22 R42/43 | E; Xn R: 2-14-42/43-48/22 S: (2-)22-30-35-36/37 | | |

615-023-00-7 | 2-(isoċjanátosulfonilmetil) aċidu benżojku ester metil; (alt.): metil 2-(isoċjanatosulfonilmetil)benzoat | | 410-900-9 | 83056-32-0 | R10 R14 Muta. Kat. 3; R40 Xn; R20-48/22 Xi; R41 R42 | Xn R: 10-14–20-40-41-42-48/22 S: (2-)23-26-36/37/39 | | |

616-044-00-4 | N-(3,5-dikloro-4-etil-2-idrossifenil)-2-(3-pentadeċilfenossi)-butanamide | | 402-510-2 | — | N; R51-53 | N R: 51/53 S: 61 | | |

616-045-00-X | 2'-(4-kloro-3-ċjano-5-formil-2-tijenilażo)-5'-dijetilamino-2-metossiaċetanilide | | 405-190-2 | 122371-93-1 | R43 R53 | Xi R: 43-53 S: (2-)22-24-37-61 | | |

616-046-00-5 | N-(2-(6-kloro-7-metilpirażolo(1,5-b)-1,2,4-trijażol-4-il)propil)-2-(2,4-di-tert-pentilfenossi)ottanamide | | 406-390-2 | — | N; R50-53 | N R: 50/53 S: 60-61 | | |

616-047-00-0 | Taħlita ta': 2,2',2″,2‴-(etilenedinitrilotetrakis-N-N-di(C16) alkilaċetamide; 2,2',2″-2‴-etilenedinitrilotetrakis-N,N-di(C18) alkilaċetamide | | 406-640-0 | — | R43 | Xi R: 43 S: (2-)24-37 | | |

616-048-00-6 | 3'-trifluwormetilidrobutilanilide | | 406-740-4 | 1939-27-1 | Xn; R48/22 N; R51-53 | Xn; N R: 48/22-51/53 S: (2-)22-36-61 | | |

616-049-00-1 | 2-(2,4-bis(1,1-dimetiletil)fenossi)-N-(3,5-dikloro-4-etil-2-idrossifenil)-essanamide | | 408-150-2 | 99141-89-6 | R53 | R: 53 S: 61 | | |

616-050-00-7 | N-(2,5-dikloro-4-(1,1,2,3,3,3-essafluworo-propossi)-fenil-aminokarbonil)-2,6-difluworobenżamide | | 410-690-9 | 103055-07-8 | R43 N; R50-53 | Xi; N R: 43-50/53 S: (2-)24-37-60-61 | | |

616-051-00-2 | Taħlita ta': 2,4-bis(N'-(4-metilfenil)-urejdo)-toluene; 2,6-bis(N'-(4-metilfenil)-urejdo)-toluene | | 411-070-0 | — | R53 | R: 53 S: 61 | | |

617-015-00-9 | Perossidu bis(4-metilbenżojl) | | 407-950-9 | 895-85-2 | E; R2 O; R7 N; R50-53 | E; N R: 2-7-50/53 S: (2-)7-14-36/37/39-47–60-61 | | |

650-032-00-X | ċiprokonażol (ISO) (2RS,3RS;2RS,3SR)-2-(4-klorofenil)-3-ċiklopropil-1-(1H-1,2,4-trijażol-1-il)butan-2-ol | | — | 94361-06-5 | Szap. Kat. 3; R63 Xn; R22 N; R50-53 | Xn; N R: 22-50/53-63 S: (2-)36/37-60-61 | | |

--------------------------------------------------

ANNESS 2

Ara d-Direttiva tal-Kummisjoni 2001/59/KE, ĠU L 332, tat-28.12.2000, p.

--------------------------------------------------

ANNESS 3A

Ara d-Direttiva tal-Kummisjoni 2001/59/KE, ĠU L 332, tat-28.12.2000, p.

--------------------------------------------------

ANNESS 3B

Ara d-Direttiva tal-Kummisjoni 2001/59/KE, ĠU L 332, tat-28.12.2000, p.

--------------------------------------------------

Anness 4A

"B.10. MUTAĠENIĊITÀ - TEST IN VITRO DWAR ANORMALITÀ FIL-KROMOŻOMI TAL-MAMMIFERI

1. METODU

Dan il-metodu huwa replika tat-Test OECD TG 473, Test in Vitro dwar Anormalità fil-Kromożomi tal-Mammiferi (1997).

1.1. INTRODUZZJONI

L-għan tat-test in vitro dwar anormalità fil-kromożomi huwa biex jiġu identifikati aġenti li jikkawżaw anormalitajiet strutturali fil-kromożomi f'kulturi ta' ċelluli tal-mammiferi (1) (2) (3). Anormalitajiet strutturali jistgħu jkunu ta' żewġ tipi, kromożomi jew kromatidi. Fil-maġġoranza ta' mutaġeni kimiċi, anormalitajiet imġiegħela huma tat-tip kromatidu, iżda jirrikorru wkoll anormalitajiet tat-tip ta' kromożomi. Żieda fil-poliplojdi tista' tindika li kimika għandha l-potenzal li ġġib magħha anormalitajiet numeriċi. Madankollu, dan il-metodu mhux maħsub biex iqis anormalitajiet numeriċi u ma jintużax normalment għal dak il-għan. Mutazzjonijiet fil-kromożomi u ġrajjiet relatati huma l-kawża ta' ħafna mard ġenetiku fil-bniedem u hemm xhieda sostanzjali li mutazzjonijiet fil-kromożomi u ġrajjiet relatati li jikkawżaw alterazzjonijiet f'onkoġeni u f'ġeni ta' ċelluli somatiċi li jrażżnu t-tumuri huma involuti fil-ħolqien tal-kanċer fil-bniedem u annimali sperimentali.

It-test in vitro ta' anormalità fil-kromożomi jista' jagħmel użu minn kulturi ta' linji ta' ċelluli stabbiliti, tipi ta' ċelluli, jew kulturi ta' ċelluli primarji. Iċ-ċelluli jingħażlu fuq bażi ta' kemm jistgħu jikbru fil-kultura, l-istabbilità tal-karjotip, għadd ta' kromożomi, diversità ta' kromożomi u frekwenza spontanea ta' anormalitajiet fil-kromożomi.

Testijiet magħmula in vitro ġeneralment jeħtieġu l-użu ta' għejun essoġenu ta' attivazzjoni metabolika. Din is-sistema ta' attivazzjoni metabolika ma tistax kompletament tkun bħall-kondizzjonijiet in vivo tal-mammiferi. Għandha tingħata attenzjoni biex jiġu evitati kondizzjonijiet li jwasslu għal riżultati pożittivi li ma jirriflettux mutaġeneċità intrinsika u jistgħu jinħolqu minn bidliet fil-pH, osmolalità jew livelli għoljin ta' ċitotossiċità (4) (5).

It-test jintuża biex jiġi kontrollat hemmx mutaġeni jew karċinoġeni fil-mammiferi. Ħafna komposti li huma pożittivi f'dan it-test huma karċinoġeni fil-mammiferi; madankollu ma hemmx korrelazzjoni perfetta bejn dan it-test u l-karċinoġeniċità. Il-korrelazzjoni tiddependi fuq il-klassi kimika u hemm xiedha dejjem tikber li jeżistu karċinoġeni li ma jiġux żvelati b'dan it-test għax jidher li jaġixxu permezz ta' mekkaniżmi li huma differenti minn ħsara diretta fid-DNA.

Ara ukoll l-Introduzzjoni Ġenerali Taqsima B.

1.2. TIFSIRIET

Anormalità tat-tip kromatidu : ħsara strutturali fil-kromożomi espressa bħala ksur ta' kromatidi singoli jew ksur u għaqda mill-ġdid bejn kromatidi.

Anormalità tat-tip tal-kromożomi : ħsara strutturali fil-kromożomi espressa bħala ksur, jew ksur u għaqda mill-ġdid, taż-żewġ kromatidi f'sit identiku.

Endoreduplikazzjoni : proċess li fih wara perjodu S ta' replikazzjoni ta' DNA, in-nukleu ma jispiċċax f'mitożi iżda jerġa' jibda perjodu ieħor S. Ir-riżultat hu kromożomi bi 4, 8, 16,… kromatidi.

Vojt : leżjoni akromatika iżgħar mill-wisgħa ta' kromatid wieħed, u b'misallinjament minimu tal-kromatidi.

Indiċi mitotiku : il-paragun ta' ċelluli fil-metafażi diviżi min-numru totali ta' ċelluli osservati f'popolazzjoni ta' ċelluli; indikazzjoni tal-livell ta' profilerazzjoni ta' dik il-popolazzjoni.

Anormalità numerika : bidla fin-numru ta' kromożomi min-numru karatteristku normali ta' ċelluli utilizzati.

Poliplojdi : multiplu tan-numru aplojdu ta' kromożomi (n) minbarra n-numru diplojdu (jiġifieri 3n, 4n, eċċetera).

Anormalità strutturali : bidla fl-istruttura tal-kromożomi li wieħed jinduna biha bl-eżami mikroskopiku ta' l-istadju metafażiku tad-diviżjoni ta' ċelluli, osservati bħala tħassir u biċċiet, bidliet minn ġewwa u bidliet bejniethom.

1.3. PRINĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST

Kulturi ta' ċelluli huma esposti għas-sustanza tat-test kemm bl-attivazzjoni metabolika kif ukoll mingħajrha. F'intervalli predeterminati wara l-esposizzjoni ta' kulturi ta' ċelluli għas-sustanza tat-test, jiġu ttrattati b'sustanza li twaqqaf il-metafażi (eż. Colcemid® jew kolċiċina), ċelluli maħsudin, mtebbgħin u matafażiċi jiġu analizzati taħt mikroskopju għall-preżenza ta' anormalitajiet fil-kromożomi.

1.4. DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST

1.4.1. Preparazzjonijiet

1.4.1.1. Ċelluli

Jistgħu jintużaw varjetà ta' linji ta' ċelluli, tipi ta' ċelluli jew kulturi primarji ta' ċelluli, inklużi ċelluli umani (eż. fibroblasti ta' Chinese hamster, limfoċiti tad-demm umani jew periferali mal-mammiferi oħrajn).

1.4.1.2. Il-kondizzjonijiet tal-medjum u tal-kulturi

Għandhom jintużaw medjum xieraq ta' kulturi, u kondizzjonijiet ta' inkubazzjoni (kontenituri għall-kulturi, konċentrazzjoni CO2, temperatura u umdità) sabiex jinżammu l-kulturi. Linji u tipi ta' ċelluli stabbiliti għandhom jiġu kontrollati kull tant żmien għall-istabbilità fl-għadd ta' kromożomi modali u għan-nuqqas ta' kontaminazzjoni minn mikoplasma u m'għandhomx jintużaw jekk ikunu kontaminati. Għandu jkun magħruf ukoll il-perjodu normali ta' ċiklu ta' ċellula għaċ-ċelluli u għall-kondizzjonijiet tal-kulturi.

1.4.1.3. Preparazzjoni tal-kulturi

Linji u tipi ta' ċelluli stabbiliti: iċ-ċelluli huma mnisslin minn ħażniet ta' kulturi, miżrugħa f'medjum ta' kulturi f'dik id-densità li tiżgura li l-kulturi ma jilħqux konfluwenza qabel il-ħsad, u inkubati f'teperatura ta' 37 °Ċ.

Limfoċiti: demm sħiħ trattat b'antikoagulant (eż. heparin) jew limfoċiti separati miksubin minn suġġetti b'saħħithom jiżdiedu mal-madju tal-kulturi li jkun fih mitoġenu (eż. fitohaemagglutinin) u inkubati f'temperatura ta' 37 °Ċ.

1.4.1.4. Attivazzjoni metabolika

Iċ-ċelluli għandhom jiġu esposti għas-sustanza tat-test kemm fil-preżenza kif ukoll fin-nuqqas ta' sistema xierqa ta' attivazzjoni metabolika. Is-sistema li l-aktar tintuża huja dik tal-cofactor-supplemented post-mitochondrial fraction (S9) preparata mill-fwied ta' annimali gerriema trattat b'aġenti li jġibu l-enżimi bħal ma huma l-Aroclor 1254 (6) (7) (8) (9), jew taħlita ta' fenobarbitone u β-naftoflavone (10) (11) (12).

Il-frazzjon post-mitochondrial tintuża ġeneralment f'konċentrazzjonijiet fil-medda minn 1-10 % v/v fil-medju finali tat-test. Is-sistema ta' attivazzjoni metabolika tista' tiddependi fuq il-klassi tal-kimika li qed tiġi ttestjata. F'ċerti każijiet jista' jkun xieraq li tintuża aktar minn konċentrazzjoni waħda għall-frazzjon post-mitochondrial.

Numru ta' żviluppi, inkluż il-ħolqien ta' linji ta' ċelluli ġenetikament iġġenerati li jesprimu enżimi attivanti speċifiċi, jistgħu jkunu ta' potenzal għal attivazzjoni endoġenea. L-għażla tal-linji ta' ċelluli użati għandha tkun ġustifikata xjentifikament (eż. bir-rilevanza tal-ċitikromu P450 isoenzim għall-metaboliżmu tas-sustanza tat-test).

1.4.1.5. Sustanza tat-test/Preparazzjoni

Sustanzi tat-test solidi għandhom jiġu mdewwbin jew sospiżi f'solventi jew kontenituri xierqa u dilwiti, jekk ikun xieraq, qabel it-trattament taċ-ċelluli. Jistgħu jiżdiedu sustanzi likwidi tat-test direttament mas-sistemi tat-test u/jew dilwiti qabel it-trattament. Għandhom jintużaw preparazzjonijiet ġodda għas-sustanza tat-test kemm-il darba l-informazzjoni dwar l-istabbilità ma turix l-aċċettabbilità tal-ħażna.

1.4.2. Kondizzjonijiet tat-test

1.4.2.1. Solvent/mezz

Ma għandu jkun hemm l-ebda suspett ta' reazzjoni kimika bejn is-solvent/mezz u s-sustanza tat-test, u s-solvent/mezz għandu jkun kompatibbli mas-sopravivenza taċ-ċelluli u l-attività S9. Jekk jintużaw solventi/mezzi oħra minflok dawk l-aktar magħrufa, l-inklużjoni tagħhom għandha tkun appoġġata b'informazzjoni li tindika l-kompatibilità tagħhom. Hu rakkomandat li kemm jista' jkun, l-ewwel jiġi kkunsidrat l-użu ta' solvent/mezz akwuż. Meta jiġu ttestjati sustanzi li mhumiex stabbli fl-ilma, is-solventi organiċi li jintużaw għandhom jkunu mingħajr ilma. L-ilma jista' jitneħħa billi jintuża passatur molekulari.

1.4.2.2. Konċentrazzjonijiet ta' esposizzjoni

Fost il-kriterji li għandhom jitqiesu biex tiġi stabbilita l-ogħla konċentrazzjoni hemm iċ-ċitotossiċità, is-solubbilità fis-sistema tat-test u bidliet fil-pH jew osmolalità.

Iċ-ċitossiċità għandha tiġi stabbilita kemm b'attivazzjoni metabolika, kif ukoll mingħajrha, fl-esperiment prinċipali billi tintuża indikazzjoni xierqa ta' l-integrità u tkabbir taċ-ċelluli, bħal ma huma gradi ta' konfluwenza, għadd ta' ċelluli vijabbli, jew indiċi mitotiku. Jista' jkun utli li jiġu stabbiliti ċ-ċitossiċità u s-solubbilità f'esperiment preliminari.

Għandhom jintużaw għall-inqas tliet konċentrazzjonijiet analizzabbli. Fejn ikun hemm iċ-ċitossiċità, dawn il-konċentrazzjonijiet għandhom ikopru medda mill-massimu għal ftit tossiċità jew xejn; ġeneralment dan ifisser li l-konċentrazzjonijiet għandhom jiġu separati b'xejn aktar minn fattur bejn 2 u√10. Fiż-żmien tal-ħsad, l-ogħla konċentrazzjoni għandha turi riduzzjoni sinjifikanti fil-livell ta' konfluwenza, fgħadd ta' ċelluli jew indiċi mitotiku (kollha ogħla minn 50 %). L-indiċi mitotiku huwa biss miżura indiretta ta' l-effetti ċitotossiċi/ċitostatiċi u jiddependi fuq il-ħin wara t-trattament. Madankollu, l-indiċi mitotiku huwa aċċettabbli għal kulturi ta' sospensjoni li fihom qisien tossiċi oħra jistgħu jkunu diffiċli u mhux prattiċi. Bħala informazzjoni supplimentari tista' tintuża informazzjoni dwar kinetika taċ-ċiklu taċ-ċelluli, bħal ma huwa ż-żmien medju ta' ġenerazzjoni (AGT). Iżda l-AGT huwa medja totali li mhux dejjem tiżvela l-eżistenza ta' subpopolazzjonijiet li għadhom ma jidhrux, u żidiet minimi wkoll fiż-żmien medju ta' ġenerazzjoni jistgħu jiġu assoċjati ma' dewmien sostanzjali fil-ħin ta' l-aħjar riżultati dwar anormalitajiet.

Għal sustanzi li relativament mhumiex ċitotossiċi, l-konċentrazzjoni massima tat-test għandha tkun 5μl/ml, 5 mg/ml jew 0,01 M, liema minnhom ikun l-anqas.

Għal sustanzi li relativament mhumiex solubbli li mhumiex tossiċi f'konċentrazzjonijiet anqas mill-konċentrazzjoni li mhix solubbli,, l-ogħla doża li tintuża għandha tkun konċentrazzjoni ogħla mil-limitu ta' solubbilità fil-medjum finali tal-kultura fl-aħħar tal-perjodu ta' trattament. F'ċerti każijiet (eż. meta t-tossiċità tirrikorri biss fuq livell ogħla mill-anqas konċentrazzjoni li mhix solubbli), hu tajjeb li jsir test b'aktar minn konċentrazzjoni waħda bi preċipitazzjoni viżibbli. Jista' jkun utli li ssir stima tas-solubbilità fil-bidu u fl-aħħar tat-trattament, għax is-solubbilità tista' tinbidel waqt l-esposizzjoni fis-sistema tat-test minħabba fil-preżenza ta' ċelluli, serum S9, eċċ. L-insolubbilità tista' tintnebah bil-vista mingħajr ebda għajnuna. Dak li jippreċipita m'għandux ifixkel l-għadd.

1.4.2.3. Kontrolli negattivi u pożittivi

Għandhom jiġu inklużi f'kull esperiment kontrolli pożittivi u negattivi fl-isterss ħin (solvent jew mezz), kemm b'attivazzjoni metabolika kif ukoll mingħajrha. Meta tintuża l-attivazzjoni metabolika, l-kimika ta' kontroll pożittiv għandha tkun dik li teħtieġ l-attivazzjoni biex tagħti riżultati mutaġeniċi.

Il-kontrolli pożittivi għandhom jagħmlu użu minn elastoġen magħruf f'livelli ta' esposizzjoni li huma mistennija li jagħtu żieda riproduċibbli u li tingħaraf fuq l-isfond li juri s-sensitività tas-sistema tat-test.

Għandhom jingħażlu konċentrazzjonijiet ta' kontrolli pożittivi sabiex l-effetti jkunu ċari iżda ma jiżvelawx immedjatament l-identità tad-dijappożittivi kodifikati għal min jaqrahom. Eżempji ta' sustanzi pożittivi ta' kontroll jinkludu:

Kondizzjoni ta' attivazzjoni metabolika | Sustanza | Nru SAK | Nru Einecs |

Nuqqas ta' attivazzjoni essoġenea metabolika | Metil metanesulfonat | 66-27-3 | 200-625-0 |

Etil metanesulfonat | 62-50-0 | 200-536-7 |

Etil nitrosourea | 759-73-9 | 212-072-2 |

Mitomiċina C | 50-07-7 | 200-008-6 |

4-Nitrokwinolina-N-ossidu | 56-57-5 | 200-281-1 |

Preżenza ta' attivazzjoni essoġenea metabolika | Benżo(a)pirene | 50-32-8 | 200-028-5 |

Ċiklofosfamide | 50-18-0 | 200-015-4 |

Ċiklofosfamide monojdrat | 6055-19-2 | |

Jistgħu jintużaw sustanzi oħra ta' kontroll pożittiv xieraq. Għandu jiġi kkunsidrat l-użu ta' kimiċi ta' kontroll pożittiv li huma relatati mal-klassi tal-kimika, meta dan hu disponibbli.

F'kull żmien ta' ħsad għandhom jiġu inklużi kontrolli negattivi, li jikkonsistu f'soilvent jew mezz biss fil-medjum tat-trattament, u ttrattati bl-istess mod bħal kulturi ta' trattament. Barra minn dan, għandhom jintużaw ukoll kontrolli mhux trattati sakemm ikun hemm informazzjoni storika ta' kontrolli li turi li ma jkunx hemm effetti ta' ħsara jew mutaġeniċi mill-użu tas-solvent magħżul.

1.4.3. Procedura

1.4.3.1. Trattament bis-sustanza tat-test

Celluli li jipproliferaw huma ttrattati bis-sustanza tat-test fil-preżenza u fin-nuqqas ta' sistema ta' attivazzjoni metabolika. It-trattament ta' limfoċiti għandu jibda madwar 487 siegħa wara l-istimulazzjoni mitoġenika.

1.4.3.2. Normalment jintużaw kulturi duplikati f'kull konċentrazzjoni, u dan huwa rakkomandat bil-qawwi għal kulturi ta' kontroll negattiv/solvent. Billi varjazzjoni minima bejn kulturi duplikati tista' tidher (13) (14), mill-informazzjoni storika, jista' jkun aċċettabbli li jintużaw kulturi singoli f'kull konċentrazzjoni.

Sustanzi gassużi jew volatili għandhom jiġu ttestjati b'metodi xierqa, bħal ma huma mezzi ta' kulturi magħluqin (15) (16).

1.4.3.3. Żmien tal-ħsad tal-kulturi

Fl-ewwel esperiment, iċ-ċelluli għandhom jiġu esposti għas-sustanza tat-test, kemm bl-attivazzjoni metabolika kif ukoll mingħajrha, għal 3-6 siegħat, u jittieħed kampjun f'ħin ekwivalenti għal madwar 1,5 it-tul taċ-ċiklu ta' ċellula normali wara li jkun beda t-trattament (12). Jekk dan il-protokoll jagħti riżultati negattivi kemm bl-attivazzjoni kif ukoll mingħajrha, għandu jsir esperiment addizzjonali mingħajr attivazzjoni, bi trattament kontinwu sakemm jittieħed kampjun f'ħin ekwivalenti għal 1,5 it-tul taċ-ċiklu ta' ċellula normali. Ċerti kimiċi jistgħu jintnebħu aktar faċilment b'ħinijiet ta' trattament/teħid ta' kampjuni itwal minn 1,5 it-tul taċ-ċiklu. Riżultati negattivi b'attivazzjoni metabolika għandhom jiġu konfermati għal kull każ partikolari. F'dawk il-każijiet fejn mhux meqjus neċessarju li jkun hemm konferma tar-riżultati negattivi, għandha tingħata ġustifikazzjoni.

1.4.3.4. Preparazzjoni tal-kromożomi

Il-kulturi taċ-ċelluli jiġu ttrattati bi Colcemid® jew kolċiċina normalment għal 1-3 siegħat qabel il-ħsad. Kull kultura ta' ċellula tinħasad u tiġi proċessata separatament għall-preparazzjoni tal-kromożomi. Il-preparazzjoni tal-kromożomi tinvolvi t-trattament ipotoniku ta' ċelluli, il-fissazzjoni u li jingħataw kulur.

1.4.3.5. Analiżi

Id-dijapożittivi kollha, inklużi dawk ta' kontrolli pożittivi u negattivi, għandhom jiġu kodifikati indipendentement qabel l-analiżi mikroskopika. Peress li l-proċeduri ta' fissazzjoni ta' spiss jirriżultaw fil-ksur ta' għadd ta' ċelluli metafażiċi bit-telf ta' kromożomi, iċ-ċelluli li jingħaddu għandu għalhekk ikollhom numru ta' ċentromeri ekwivalenti għan-numru modali ≠ 2 għat-tipi kollha ta' ċelluli. Għandhom jingħaddu għall-inqas 200 metafażi mifruxa sew għal kull konċentrazzjoni u kontroll, maqsumin b'mod ugwali bejn id-duplikati, jekk ikun applikabbli. Dan in-numru jista' jitnaqqas meta jiġi osservat numru akbar ta' anormalitajiet.

Għalkemm l-għan tat-test huwa biex jinkixfu anormalitajiet strutturali fil-kromożomi, u importanti li wieħed jirreġistra poliplojdi u endoreduplikazzjoni meta wieħed jinduna b'dawn.

2. INFORMAZZJONI

2.1. TRATTAMENT TAR-RIŻULTATI

L-unità sperimentali hija ċ-ċellula, u għalhekk għandha ssir valutazzjoni tal-perċentwali ta' ċelluli b'anormalità (jiet) strutturali fil-kromożomi. Għandhom jiġu elenkati t-tipi differenti ta' anormalitajiet strutturali fil-kromożomi bl-għadd u l-frekwenzi tagħhom għal kulturi ta' esperimenti u ta' kontroll. Il-vojt jiġi reġistrat separatament u jsir rapport dwaru iżda ġeneralment ma jiġix inkluż fil-frekwenza totali ta' l-anormalità.

Għandhom jiġu reġistrati ukoll miżuri ta' ċitotossiċità li jittieħdu fl-istess ħin għall-kulturi kollha ta' kontroll trattati u negattivi fl-esperimenti prinċipali dwar l-anormalitajiet.

Għandha tingħata l-informazzjoni dwar kultura individwali. Barra minn dan, l-informazzjoni għandha tingħata sommarjament f'forma ta' tabella.

Ma hemm l-ebda ħtieġa għall-verifika ta' riżultat pożittiv ċar. Riżultati ekwivoċi għandhom jiġu ċċarati b'testijiet oħra preferibbilment billi jkun hemm modifika tal-kondizzjonijiet sperimentali. Il-ħtieġa li riżultati negattivi jiġu konfermati ġiet diskussa fi 1.4.3.3. Il-modifika ta' parametri ta' studju biex tiġi estiża l-medda tal-kondizzjonijiet stmati għandha tiġi kkunsidrata f'esperimenti li jsiru wara. Il-parametri ta' studju li jistgħu jiġu modifikati jinkludu l-ispazju tal-konċentrazzjoni u l-kondizzjonijiet ta' attivazzjoni metabolika.

2.2. VALUTAZZJONI U INTERPRETAZZJONI TAR-RIŻULTATI

Hemm ħafna kriterji biex jiġi stabbilit riżultat pożittiv, bħal ma hi żieda relatata mal-konċentrazzjoni jew żieda riproduċibbli f'għadd ta' ċelluli b'anormalitajiet fil-kromożomi. L-ewwel għandha tiġi kkunsidrata r-rilevanza bijoloġika tar-riżultati. Bħala għajnuna fil-valutazzjoni tar-riżultati tat-testijiet (3) (13), jistgħu jintużaw metodi ta' statistika. L-importanza ta' l-istatistika ma għandhiex tkun l-uniku fattur determinanti għal riżultat pożittiv.

Żieda fin-numru ta' ċelluli poliplojdi tista' tindika li s-sustanza tat-test għandha l-potenzal li twaqqaf il-proċessi mitotiċi u li twassal għal anormalitajiet numeriċi fil-kromożomi. Żieda fl-għadd ta' ċelluli bi kromożomi endoreduplikati tista' tindika li s-sustanza tat-test għandha l-potenzal li twaqqaf il-progressjoni taċ-ċiklu taċ-ċelluli (17) (18).

Sustanza ta' test li dwarha r-riżultati ma jilħqux il-kriterji fuq imsemmija titqies bħala mhux mutaġenika f'din is-sistema.

Għalkemm kważi l-esperimenti kollha jagħtu riżultati ċari pożittivi jew negattivi, f'każijiet rari l-informazzjoni ssettjata ma tippermettix li jsir ġudizzju definittiv dwar l-attività ta' sustanza tat-test. Ir-riżultati jistgħu jibqgħu ekwivoċi u inċerti irrispettivament min-numru ta' drabi li jirrepeti ruħu l-esperiment.

Ir-riżultati pożittivi minn test in vitro ta' anormalitajiet fil-kromożomi jindikaw li s-sustanza tat-test toħloq anormalitajiet strutturali fil-kromożomi f'ċelluli somatiċi ta' kulturi ta' mammiferi. Ir-riżultati negattivi jindikaw li, taħt il-kondizzjonijiet tat-test, is-sustanza tat-test ma toħloqx anormalitajiet fil-kromożomi f'ċelluli somatiċi ta' kulturi ta' mammiferi.

3. RAPPURTAR

RAPPORT TAT-TEST

Ir-rapport tat-test għandu jkun fih l-informazzjoni li ġejja:

Solvent/mezz:

- ġustifikazzjoni dwar l-għażla tal-mezz,

- solubbilità u stabbilità tas-sustanza tat-test fis-solvent/mezz, jekk magħrufa.

Ċelluli:

- tip u għejun taċ-ċelluli,

- karatteristiċi karjotipiċi u adattibilità tat-tip ta' ċellula użata,

- nuqqas ta' mikoplasma, jekk ikun applikabbli,

- informazzjoni dwar it-tul taċ-ċiklu taċ-ċellula,

- sess ta' min jagħti d-demm, demm sħiħ jew limfoċiti separati, nitroġenu użat,

- numru ta' passaġġi, jekk ikun applikabbli,

- metodi għall-manutenzjoni tal-kulturi taċ-ċelluli, jekk jkun applikabbli,

- għadd modali ta' kromożomi.

Kondizzjonijiet tat-test:

- identità tas-sustanza li twaqqaf il-metafażi, il-konċentrazzjoni tagħha u kemm iddum l-esposizzjoni taċ-ċellula,

- raġuni prinċipali għall-għażla tal-konċentrazzjonijiet u għadd ta' kulturi inklużi, eż. informazzjoni dwar ċitotossiċità u limitazzjonijiet dwar solubbilità, jekk ikunu disponibbli,

- komposizzjoni tal-medja, konċentrazzjoni CO2 jekk tkun applikabbli,

- konċentrazzjoni tas-sustanza tat-test,

- volum tal-mezz u sustanza tat-test miżjuda,

- temperatura ta' l-inkubazzjoni,

- perjodu ta' inkubazzjoni,

- kemm idum it-trattament,

- densità taċ-ċellula fiż-żriegħ, jekk ikun xieraq,

- tip u komposizzjoni tas-sistema ta' attivazzjoni metabolika, inklużi krierji ta' aċċettabilità,

- kontrolli pożittivi u negattivi,

- metodi ta' preparazzjoni ta' dijapożitivi,

- kriterji għall-għadd ta' anormalitajiet,

- numru ta' metafażijiet analizzati,

- metodi biex titqies it-tossiċità,

- kriterji biex l-istudji jitqiesu bħala pożittivi, negattivi jew ekwivoċi,

Riżultati:

- sinjali ta' tossiċità, eż. grad ta' konfluwenza, informazzjoni dwar iċ-ċiklu taċ-ċellula, għadd ta' ċelluli, indiċi mitotiku,

- sinjali ta' preċipitazzjoni,

- informazzjoni dwar pH u l-osmolalità tal-medjum tat-trattament, jekk ikun stabbilit,

- definizzjoni għall-anormalitajiet, inkluż il-vojt,

- numru ta' ċelluli b'anormalitajiet fil-kromożomi u tip ta' anormalitajiet fil-kromożomi mogħtija separatament għal kull kultura trattata u ta' kontroll,

- bidliet fil-plojdi, jekk jidhru,

- relazzjoni bejn id-doża u r-rispons, fejn ikun possibbli,

- analiżi statistiċi, jekk ikun hemm,

- informazzjoni dwar kontroll fl-istess ħin negattiv (solvent/mezz) u pożittiv,

- informazzjoni storika dwar kontroll negattiv (solvent/mezz) u pożittiv, bil-meded, mezzi u devjazzjonijiet standard.

Diskussjoni dwar ir-riżultati.

Konklużjonijiet.

4. REFERENZI

(1) Evans, H. J. (1976), Cytological Methods for Detecting Chemical Mutagens, in: Chemical mutagens, Principles and Methods for their Detection, Vol. 4, Hollaender, A. (ed) Plenum Press, New York and London, pp. 1-29.

(2) Ishidate, M. Jr. and Sofumi, T. (1985), The In Vitro Chromosomal Aberration Test Using Chinese Hamster Lung (CHL) Fibroblast Cells in Culture, in: Progress in Mutation Research, Vol. 5, Ashby, J. et al., (eds) Elsevier Science Publishers, Amsterdam-New York-Oxford, pp. 427-432.

(3) Galloway, S. M., Armstrong, M. J., Reuben, C., Colman, S., Brown, B., Cannon, C., Bloom, A. D., Nakamura, F., Ahmed, M., Duk, S., Rimpo, J., Margolin, G. H., Resnick, M. A., Anderson, G. and Zeiger E. (1978), Chromosome aberration and sister chromatic exchanges in Chinese hamster ovary cells: Evaluation of 108 chemicals, Environs, Molec. Mutagen 10 (suppl.10), pp. 1-175.

(4) Scott, D., Galloway, S. M., Marshall, R. R., Ishidate, M. Jr., Brusick, D., Ashby, J. and Myhr, B. C. (1991), Genotoxicity under Extreme Culture Conditions. A report from ICPEMC Task Group 9, Mutation Res., 257, pp. 147-204.

(5) Morita, T., Nagaki, T., Fukuda, I. and Okumura, K., (1992), Clastogenicity of low pH to Various Cultured Mammalian Cells, Mutation Res., 268, pp. 297-305.

(6) Ames, B. N., McCann, J. and Yamasaki, E. (1975), Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian Microsome Mutagenicity Test, Mutation Res., 31, pp. 347-364.

(7) Maron, D. M. and Ames, B. N. (1983), Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test, Mutation Res., 113, pp. 173-215.

(8) Natarajan, A. T., Tates, A. D., van Buul, P. P. W., Meijers, M. and de Vogel, N. (1976), Cytogenetic Effects of Mutagen/Carcinogens after Activation in a Mircrosomal System In Vitro, I. Induction of Chromosome Aberrations and Sister Chromatid Exchange by Diethylnitrosamine (DEN) and Dimethylnitrosamine (DMN) in CHO Cells in the Presence of Rat-Liver Microsomes, Mutation Res., 37, pp. 83-90.

(9) Matsuoka, A., Hayashi, M. and Ishidate, M. Jr. (1979), Chromosomal Aberration Tests on 29 Chemicals Combined with S9 Mix In Vitro, Mutation Res., 66, pp. 277-290.

(10) Elliot, B. M., Combes, R. D., Elcombe, C. R., Gatehouse, D. G., Gibson, G. G., Mackay, J. M. and Wolf, R. C. (1992), Report of UK Environmental Mutagen Society Working Party. Alternative to Aroclor 1254-induced S9 in In Vitro Genotoxicity Assays, Mutagenesis, 7, pp. 175-177.

(11) Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. (1976), A. Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems, in: de Serres, F. J. Fouts, J. R. Bend, J. R. and Philpot, R. M. (eds), In VitroMetabolic Activation in Mutagenesis Testing, Elsevier, North-Holland, pp. 85-88.

(12) Galloway, S. M., Aardema, M. J., Ishidate, M. Jr., Ivett, J. L., Kirkland, D. J. Morita, T., Mosesso, P., Sofumi, T. (1994), Report from Working Group on in In Vitro Tests for Chromosomal Aberrations, Mutation Res., 312, pp. 241-261.

(13) Richardson, C., Williams, D. A., Allen, J.A., Amphlett, G., Chanter, D. O. and Phillips, B. (1989), Analysis of Data from In Vitro Cytogenetic Assays, in: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Kirkland, D. J., (cd) Cambridge University Press, Cambridge, pp. 141-154.

(14) Soper, K. A. and Galloway, S. M. (1994), Replicate Flasks are not Necessary for In Vitro Chromosome Aberration Assays in CHO Cells, Mutation Res., 312, pp. 139-149.

(15) Krahn, D. F., Barsky, F. C. and McCooey, K. T. (1982), CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids, in: Tice, R. R., Costa, D. L., Schaich, K. M. (eds), Genotoxic Effects of Airborne Agents, New York, Plenum, pp. 91-103.

(16) Zamora, P. O., Benson, J. M., Li, A. P. and Brooks, A. L. (1983), Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown on Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in the CHO/HGPRT Mutation Assay, Environmental Mutagenesis, 5, pp. 795-801.

(17) Locke-Huhle, C. (1983), Endoreduplication in Chinese hamster cells during alpha-radiation induced G2 arrest, Mutation Res., 119, pp. 403-413.

(18) Huang, Y., Change, C. and Trosko, J. E. (1983), Aphidicolin-induced endoreduplication in Chinese hamster cells, Cancer Res., 43, pp. 1362-1364."

--------------------------------------------------

ANNESS 4B

"B.11. MUTAĠENIĊITÀ - TEST IN VIVO DWAR ANORMALITÀ FIL-KROMOŻOMI TAL-MUDULLUN TAL-MAMMIFERI

1. METODU

Dan il-metodu huwa replika tat-Test OECD TG 475, Test dwar Anormalità fil-Kromożomi tal-Mudullun tal-Mammiferi (1997).

1.1. INTRODUZZJONI

It-test in vivo dwar anormalitajiet fil-kromożomi tal-mammiferi jintuża biex jinstabu anormalitajiet strutturali fil-kromożomi miġjuba mis-sustanza tat-test fiċ-ċelluli tal-mudullun ta' annimali, normalment annimali gerriema (1) (2) (3)(4). Anormalitajiet strutturali fil-kromożomi jistgħu jkunu ta' żewġ tipi, kromożomi jew kromatidi. Żieda fil-poliplojdi tista' tindika li kimika għandha l-potenzal li ġġib magħha anormalitajiet numeriċi. Fil-maġġoranza ta' mutaġeni kimiċi, anormalitajiet imġiegħela huma tat-tip kromatidu, iżda jirrikorru wkoll anormalitajiet tat-tip ta' kromożomi. Mutazzjonijiet fil-kromożomi u ġrajjiet relatati huma l-kawża ta' ħafna mard ġenetiku fil-bniedem u hemm xhieda sostanzjali li mutazzjonijiet fil-kromożomi u ġrajjiet relatati li jikkawżaw alterazzjonijiet f'onkoġeni u f'ġeni li jrażżnu t-tumuri huma involuti fil-ħolqien tal-kanċer fil-bniedem u sistemi sperimentali.

Annimali gerriema jintużaw generalment f'dan it-test. Il-mudullun huwa t-tessut immirat f'dan it-test, għax huwa tessut vaskularizzat immense, u fih popolazzjoni ta' ċelluli li jiċċiklaw rapidament li jistgħu jkunu faċilment iżolati u proċessati. Speċi oħra u tessuti mmirati mhumiex is-suġġett ta' dan il-metodu.

Dan it-test ta' anormalitajiet fil-kromożomi huwa rilevanti speċjalment fil-valutazzjoni ta' perikli mutaġeniċi għax jippermetti l-konsiderazzjoni ta' fatturi ta' metaboliżmu in vivo, farmakokinetika u proċessi ta' tiswija ta' DNA għalkemm dawn jistgħu jvarjaw fost l-ispeċi u fost it-tessuti. Test in vivo huwa utli ukoll għal investigazzjoni ulterjuri ta' effett mutaġeniku żvelat minn test in vitro.

Jekk hemm xiedha li s-sustanza tat-test, jew metabolit reattiv, ma jwasslux għat-tessut immirat, mhux xieraq li jintuża dan it-test.

Ara ukoll Introduzzjoni ġenerali Taqsima B.

1.2. TIFSIRIET

Anormalità tat-tip kromatidu : ħsara strutturali fil-kromożomi espressa bħala ksur ta' kromatidi singoli jew ksur u għaqda mill-ġdid bejn kromatidi.

Anormalità tat-tip tal-kromożomi : ħsara strutturali fil-kromożomi espressa bħala ksur, jew ksur u għaqda mill-ġdid, taż-żewġ kromatidi f'sit identiku.

Endoreduplikazzjoni : proċess li fih wara perjodu S ta' replikazzjoni ta' DNA, in-nukleu ma jispiċċax f'mitożi iżda jerġa' jibda perjodu ieħor S. Ir-riżultat hu kromożomi bi 4, 8, 16,… kromatidi.

Vojt : leżjoni akromatika iżgħar mill-wisgħa ta' kromatid wieħed, u b'misallinjament minimu tal-kromatidi.

Anormalità numerika : bidla fin-numru ta' kromożomi min-numru karatteristku normali ta' ċelluli utilizzati.

Poliplojdi : multiplu tan-numru aplojdu ta' kromożomi (n) minbarra n-numru diplojdu (jiġifieri 3n, 4n, eċċetera).

Anormalità strutturali : bidla fl-istruttura tal-kromożomi li wieħed jinduna biha bl-eżami mikroskopiku ta' l-istadju metafażiku tad-diviżjoni ta' ċelluli, osservati bħala tħassir u biċċiet, bidliet minn ġewwa u bidliet bejniethom.

1.3. PRINĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST

Annimali huma esposti għas-sustanza tat-test b'rotta xierqa ta' esposizzjoni u huma sakrifikati f'ħinijiet xierqa wara t-trattament. Qabel ma jiġu sakrifikati, l-annimali huma ttrattati b'aġent li jwaqqaf l-metafażi (eż. kolċiċina jew Colcemid®). Imbagħad isiru preparazzjonijiet ta' kromożomi miċ-ċelluli tal-mudullun u jiġu mtebbgħin, u ċ-ċelluli metafażiċi jiġu analizzati għal anormalitajiet fil-kromożomi.

1.4. DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST

1.4.1. Preparazzjonijiet

1.4.1.1. Selezzjoni ta' l-ispeċi ta' l-annimali

Normalment jintużaw far, ġrieden u Chinese hamsters, iżda jista' jintuża kull annimal xieraq ta' l-ispeci tal-mammiferi. Għandhom jintużaw razez, li komunement jintużaw fil-laboratorji, ta' annimali adulti b'saħħithom u żgħar. Fil-bidu ta' l-istudju, il-varjazzjoni fil-piż ta' l-annimali għandha tkun minima u ma teċċedix ± 20 % tal-medja tal-piż ta' kull sess.

1.4.1.2. Kondizzjonijiet ta' fejn jinżammu u x'jieklu

Għandhom japplikaw il-kondizzjonijiet ġenerali msemmija fl-Introduzzjoni ġenerali għat-Taqsima B iżda l-mira dwar l-umdità għandha tkun 50-60 %.

1.4.1.3. Preparazzjoni ta' l-annimali

Annimali adulti żgħar u b'saħħithom jiġu assenjati mingħajr skema għall-gruppi ta' kontroll u trattament. Il-gaġeġ għandhom jitqiegħdu b'tali mod li jiġu minimizzati effetti possibbli li jirriżultaw minn kif jitqiegħdu l-gaġeġ. L-annimali jiġu identifikati wieħed wieħed. L-annimali jiġu akklimatizzati għall-kondizzjonijiet tal-laboratorju għall-inqas għal ħamest ijiem.

1.4.1.4. Preparazzjoni tad-dożi

Sustanzi tat-test solidi għandhom jiġu mdewwbin jew sospiżi f'solventi jew kontenituri xierqa u dilwiti, jekk ikun xieraq, qabel it-trattament ta' l-annimali. Sustanzi likwidi tat-test jistgħu jiġu ttrattati direttament jew dilwiti qabel it-trattament. Għandhom jintużaw preparazzjonijiet ġodda għas-sustanza tat-test kemm-il darba l-informazzjoni dwar l-istabbilità ma turix l-aċċettabbilità tal-ħażna.

1.4.2. Kondizzjonijiet tat-test

1.4.2.1. Solvent/mezz

Is-solvent/mezz ma għandux jipproduċi effetti tossiċi fil-livelli ta' doża użata, u ma għandu jkun hemm l-ebda suspett ta' reazzjoni kimika mas-sustanza tat-test. Jekk jintużaw solventi/mezzi oħra minflok dawk l-aktar magħrufa, l-inklużjoni tagħhom għandha tkun appoġġata b'informazzjoni li tindika l-kompatibilità tagħhom. Hu rakkomandat li kemm jista' jkun, l-ewwel jiġi kkunsidrat l-użu ta' solvent/mezz akwuż.

1.4.2.2. Kontrolli

Għandhom jiġu inklużi għal kull wieħed mis-sessi f'kull test kontrolli pożittivi u negattivi fl-isterss ħin (solvent/mezz). Ħlief għat-trattament bis-sustanza tat-test, l-annimali fil-gruppi tal-kontroll għandhom jiġu trattati bl-istess mod bħall-annimali fil-grupp ta' trattament.

Il-kontrolli pożittivi għandhom jipproduċu anormalitajiet strutturali in vivo f'livelli ta' esposizzjoni li huma mistennija li jagħtu żieda li tkun tidher fuq l-isfond. Trattamenti ta' kontroll pożittiv għandhom jingħażlu sabiex l-effetti jkunu ċari iżda ma jiżvelawx l-identità tad-dijapożitivi kodifikati lil min jaqrahom. Huwa aċċettat li l-kontroll pożittiv jiġi somministrat minn rotta differenti minn dik tas-sustanza tat-test u jittieħed kampjun darba waħda biss. Jista' jiġi kkunsidrat l-użu ta' kimiċi ta' kontroll pożittivi relatati mal-klassi ta' kimiċi, meta dawn ikunu disponibbli. Eżempji ta' sustanzi ta' kontroll pożittivi jinkludu:

Sustanza | Nru SAK | Nru Einecs |

Etil metansulfonat | 62-50-0 | 200-536-7 |

Etil nitrosourea | 759-73-9 | 212-072-2 |

Mitomiċina C | 50-07-7 | 200-008-6 |

Ciklofosfamide | 50-18-0 | 200-015-4 |

Ciklofosfamide monojdrat | 6055-19-2 | |

Trijetilenemelamina | 51-18-3 | 200-083-5 |

Il-kontrolli negattivi, trattati biss bis-solvent jew bil-mezz, u mod ieħor trattati bl-istess mod bħall-gruppi tat-trattament, għandhom jiġu inklużi għal kull perjodu ta' teħid ta' kampjuni, sakemm ma jkunux disponibbli varjabbilità aċċettabbli bejn l-annimali u frekwenżi ta' ċelluli b'anormalitajiet fil-kromożomi mill-informazzjoni storika tal-kontroll. Jekk jiġi applikat it-teħid ta' kampjun singolu, l-aktar żmien xieraq huwa l-ewwel darba li jittieħed il-kampjun. Barra minn dan, għandhom jintużaw ukoll kontrolli mhux trattati sakemm ma jkunx hemm informazzjoni ta' kontroll pubblikata u storika li turi li jkun hemm effetti ta' ħsara u mutaġeniċi bl-uzu tas-solvent/mezz magħżul.

1.5. PROĊEDURA

1.5.1. Numru u sess ta' l-annimali

Kull grupp ta' trattament u ta' kontroll għandu jinkludi fih għall-inqas ħames annimali analizzabbli għal kull sess. Jekk fiż-żmien ta' l-istudju jkun hemm informazzjoni disponibbli minn studji fl-istess speċi u bl-użu ta' l-istess rotta ta' esposizzjoni li juru li ma hemm l-ebda differenzi sostanzjali fit-tossiċità bejn is-sessi, allura jkun suffiċjenti li l-ittestjar isir fuq sess wieħed. Fejn l-esposizzjoni umana għall-kimiċi tista' tiddependi fuq is-sess, bħal per eżempju b'ċerti aġenti farmaċewtiċi, it-test għandu jitwettaq b'annimali tas-sess xieraq.

1.5.2. Skeda tat-trattament

Is-sustanzi tat-test huma preferibbilment somministrati bħala trattament singolu. Is-sustanzi tat-test jistgħu wkoll jiġu somministrati bħala doża maqsuma, jiġifieri żewġ trattamenti fl-istess ġurnata separati b'mhux aktar minn ftit sigħat, biex tiġi faċilitata s-somministrazzjoni ta' volum qawwi ta' materjal. Reġimi ta' dożi oħra għandhom ikunu ġustifikati xjentifikament.

Il-kampjuni għandhom jittieħdu f'żewġ ħinijiet separati wara t-trattament f'ġurnata waħda. Għal annimali ġerriema l-ewwel intervall bejn it-teħid ta' kampjuni huwa ta' tul ta' 1,5 iċ-ċiklu normali ta' ċellula (dan ta' l-aħħar huwa normalment ta' 12-18-il siegħa) wara t-trattament. Ladarba l-ħin meħtieġ għall-bidu u l-metaboliżmu tas-sustanza tat-test kif ukoll l-effetti tiegħu fuq il-kinetika taċ-ċikli taċ-ċelluli jistgħu jaffettwaw iż-żmien ottimali biex wieħed jintnebaħ bl-anormalitajiet fil-kromożomi, huwa rakkomandat li jittieħed kampjun ieħor 24 siegħa wara li jkun ttieħed l-ewwel kampjun. Jekk jintużaw metodi ta' dożi ta' aktar minn ġurnata waħda, għandu jkun hemm ħin ta' teħid ta' kampjun wieħed f'tulijiet ta' 1,5 iċ-ċikli normali ta' ċellula wara l-aħħar trattament.

Qabel is-sagrifiċċju, l-annimali huma injettati intraperitonalment b'doża xierqa ta' aġent li jwaqqaf l-metafażi (eż. Colcemid® jew kolċiċina). Wara dan, jittieħed kampjun mill-annimali f'intervalli xierqa. Għall-ġrieden dan l-intervall huwa ta' madwar 3-5-il-siegħa; għal Chinese hamsters dan l-intervall huwa ta' madwar 4-5-il siegħa. Iċ-ċelluli jinħasdu mill-mudullun u jiġu analizzati għal anormalitajiet fil-kromożomi.

1.5.3. Livelli ta' doża

Jekk jitwettaq studju biex tiġi skoperta l-medda għax ma jkunx hemm disponibbli informazzjoni xierqa, dan għandu jsir fl-istess laboratorju, jintużaw l-istess speċi, razza, sess u metodu ta' trattament li għandhom jintużaw fl-istudju prinċipali (5). Jekk ikun hemm tossiċità, jintużaw tliet livelli ta' doża għall-ewwel perjodu ta' teħid ta' kampjuni. Dawn il-livelli ta' doża għandhom jkopru medda mill-massimu għal ftit jew l-ebda tossiċità. L-ogħla doża hija mfissra bħala s-sinjali ta' tossiċità li jipproduċu d-dożi hekk li livelli ogħla tad-doża, bbażati fuq l-istess reġim ta' dożaġġ, huma mistennija li jikkawżaw il-mewt. Is-sustanzi b'attivitajiet bijoloġiċi speċifiċi f'dożi baxxi mhux tossiċi (bħal ma huma ormoni u nitroġeni) jistgħu jkunu eċċezzjonijiet għall-kriterji ta' l-issettjar tad-dożi u għandhom jiġu valutati fuq bażi ta' każ b'każ. L-ogħla doża tista' ukoll tfisser id-doża li tipproduċi xi indikazzjoni ta' tossiċità fil-mudullun (eż. ogħla minn riduzzjoni ta' 50 % fl-indiċi mitotiku).

1.5.4. Test tal-limitu

Jekk test ta' doża waħda ta' livell ta' għall-inqas 2000 mg/kg piż tal-ġisem meta jitwettaq trattament wieħed, jew bħala żewġ trattamenti fl-istess ġurnata, ma jipproduċix effetti tossiċi li wieħed jinduna bihom, u jekk ma tkun mistennija l-ġenotossiċità fuq il-bażi ta' l-informazzjoni minn sustanzi strutturalment relatati, allura ma jitqiesx li jkun neċessarju li jsir studju komplet bl-użu ta' tliet livelli ta' dożaġġ. Għal studji li jdumu aktar, il-limitu tad-doża huwa 2000 mg/kg/piż tal-ġisem/jum għal trattament sa 14-il ġurnata, u 1000 mg/kg/piż tal-ġisem/jum għal trattament ta' aktar minn 14-il ġurnata. L-esposizzjoni umana mistennija tista' tindika l-ħtieġa ta' livell ogħla ta' doża li għandu jintuża fit-test tal-limitu.

1.5.5. Somministrazzjoni ta' dożi

Normalment is-sustanza tat-test tiġi somministrata b'gavage billi jintuża tubu għall-istonku jew cannula xierqa ta' intubazzjoni, jew bl-injezzjoni intraperitonali. Fejn ikunu ġustifikati, jistgħu jiġu aċċettati rotot oħra ta' esposizzjoni. Il-volum massimu ta' likwidu li jista' jiġi somministrat b'gavage jew b'injezzjoni f'ħin wieħed jiddependi fuq il-qies ta' l-annimal tat-test. Il-volum m'għandux ikun aktar minn 2 ml/100g piż tal-ġisem. L-użu ta' volumi ogħla minn dawn għandu jkun ġustifikat. Ħlief fil-każ ta' sustanzi li jirritaw jew korrożivi li normalment juru effetti aggravati b'konċentrazzjonijiet ogħla, il-varjabbilita fil-volum tat-test għandha titnaqqas bl-aġġustament tal-konċentrazzjoni biex jiġi żgurat volum kostanti fuq il-livelli kollha tad-doża.

1.5.6. Preparazzjoni tal-kromożomi

Minnufih wara s-sagrifiċċju, il-mudullun jiġi miksub, espost għal soluzzjoni ipotonika u ffissat. Iċ-ċelluli imbagħad jinfirxu fuq dijapożitivi u jingħataw kulur.

1.5.7. Analiżi

L-indiċi mitotiku għandu jiġi stabbilit bħala miżura ta' ċitotossiċita f'għall-inqas 1000 ċellula għal kull annimal għal kull annimal trattat (inklużi kontrolli pożittivi) u annimali kontrollati negativament mhux trattati.

Għandhom jiġu analizzati għall-inqas 100 ċellula għal kull annimal. Dan in-numru jista' jitnaqqas meta jiġi nnotat għadd kbir ta' anormalitajiet. Id-dijapożitivi kollha, inklużi dawk ta' kontrolli pożittivi u negattivi, għandhom jiġu kodifikati indipendentement qabel l-analiżi mikroskopika. Billi l-proċeduri tal-preparazzjoni ta' dijapożitivi jirriżultaw ħafna drabi fil-ksur ta' għadd ta' metafażi bit-telf ta' kromożomi, iċ-ċelluli li jingħaddu għandu għalhekk ikun fihom numru ta' ċentromeri ugwali għan-numru 2n ± 2.

2. INFORMAZZJONI

2.1. TRATTAMENT TAR-RIŻULTATI

L-informazzjoni dwar annimali individwali għandha tingħata f'forma ta' tabella. L-unità sperimentali hija l-annimal. Għal kull annimal għandhom jiġu valutati n-numru ta' ċelluli li jingħaddu, in-numru ta' anormalitajiet f'kull ċellula u l-perċentwali ta' ċelluli b'anormalità (jiet) strutturali fil-kromożomi. Għandhom jiġu elenkati t-tipi differenti ta' anormalitajiet strutturali fil-kromożomi bl-għadd u l-frekwenzi tagħhom għal gruppi ta' trattament u ta' kontroll. Il-vojt jiġi reġistrat separatament u jsir rapport dwaru iżda ġeneralment ma jiġix inkluż fil-frekwenza totali ta' l-anormalità. Jekk ma hemmx xiehda ta' differenza fir-riżultat bejn iż-żewġ sessi, l-informazzjoni dwar iż-żewġ sessi tista' tingħaqad għall-analiżi statistika.

2.2. VALUTAZZJONI U INTERPRETAZZJONI TAR-RIŻULTATI

Hemm ħafna kriterji biex jiġi stabbilit riżultat pożittiv, bħal ma hi żieda relatata mad-doża fl-għadd relattiv ta' ċelluli b'anormalitajiet fil-kromożomi jew żieda ċara fin-numru ta' ċelluli b'anormalitajiet fi grupp singolu ta' trattament fi żmien singolu ta' teħid ta' kampjuni. L-ewwel għandha tiġi kkunsidrata r-rilevanza bijoloġika tar-riżultati. Bħala għajnuna fil-valutazzjoni tar-riżultati tat-testijiet (6), jistgħu jintużaw metodi ta' statistika. L-importanza ta' l-istatistika ma għandhiex tkun l-uniku fattur determinanti għal riżultat pożittiv. Riżultati ekwivoċi għandhom jiġu ċċarati b'testijiet ulterjuri preferibilment billi tintuża modifika tal-kondizzjonijiet ta' l-esperiment.

Żieda fil-poliplojdi tista' tindika li s-sustanza tat-test għandha l-potenzal li twassal għal anormalitajiet numeriċi fil-kromożomi. Żieda fl-endoreduplikazzjoni tista' tindika li s-sustanza tat-test għandha l-potenzal li twaqqaf il-progressjoni taċ-ċiklu taċ-ċelluli (7) (8).

Sustanza ta' test li dwarha r-riżultati ma jilħqux il-kriterji fuq imsemmija titqies bħala mhux mutaġenika f'dan it-test.

Għalkemm kważi l-esperimenti kollha jagħtu riżultati ċari pożittivi jew negattivi, f'każijiet rari l-informazzjoni ssettjata ma tippermettix li jsir ġudizzju definittiv dwar l-attività ta' sustanza tat-test. Ir-riżultati jistgħu jibqgħu ekwivoċi u inċerti irrispettivament min-numru ta' drabi li jirrepeti ruħu l-esperiment.

Ir-riżultati pożittivi minn test in vivo ta' anormalitajiet fil-kromożomi jindikaw li s-sustanza tat-test toħloq anormalitajiet strutturali fil-kromożomi fil-mudullun ta' l-ispeċi ttestjata. Ir-riżultati negattivi jindikaw li, taħt il-kondizzjonijiet tat-test, is-sustanza tat-test ma toħloqx anormalitajiet fil-mudullun ta' l-ispeċi ttestjata.

Għandha tiġi diskussa l-probabilità li s-sustanza tat-test jew il-metaboliti tagħha jilħqu ċ-ċirkolazzjoni ġenerali jew speċifikatament it-tessut immirat (eż. tossiċità sistemika).

3. RAPPURTAR

RAPPORT TAT-TEST

Ir-rapport tat-test għandu jkun fih l-informazzjoni li ġejja:

Solvent/mezz:

- ġustifikazzjoni dwar l-għażla tal-mezz,

- solubbilità u stabbilità tas-sustanza tat-test fis-solvent/mezz, jekk magħrufa.

Annimali ttestjati:

- speċi/razza użati,

- numru, età u sess ta' l-annimali,

- għejun, kondizzjonijiet dwar fejn jinżammu, dieta, eċċ.,

- piż individwali ta' l-annimali fil-bidu tat-test, inkluża l-medda ta' piż tal-ġisem, mezzi u devjazzjoni standard għal kull grupp.

Kondizzjonijiet tat-test:

- kontrolli pożittivi u negattivi (mezz/solvent),

- informazzjoni mill-istudju dwar il-medda, jekk ikun sar,

- raġuni prinċipali għall-għażla tad-doża,

- dettalji dwar il-preparazzjoni tas-sustanza tat-test,

- dettalji dwar is-somministrazzjoni tas-sustanza tat-test,

- raġuni prinċipali dwar ir-rotta ta' somministrazzjoni,

- metodi biex jiġi verifikat li s-sustanza tat-test waslet għaċ-ċirkolazzjoni ġenerali jew it-tessut immirat,

- konverżjoni mill-konċentrazzjoni (ppm) tas-sustanza tat-test dieta/ilma għax-xorb għad doża attwali (mg/kg piż tal-ġisem/jum) jekk tkun applikabbli,

- dettalji dwar il-kwalità ta' l-ikel u l-ilma,

- deskrizzjoni dettaljata dwar l-iskedi ta' trattament u teħid ta' kampjuni,

- metodi biex titqies it-tossiċità,

- identità tas-sustanza li twaqqaf il-metafażi, il-konċentrazzjoni tagħha u kemm idum it-trattament,

- metodi tal-preparazzjoni tad-dijapożitivi,

- kriterji għall-għadd ta' anormalitajiet,

- numru ta' ċelluli analizzati kull annimal,

- kriterji biex l-istudji jitqiesu bħala pożittivi, negattivi jew ekwivoċi,

Riżultati:

- sinjali ta' tossiċità,

- indiċi mitotiku,

- tip u numru ta' anormalitajiet, mogħtija separatament għal kull annimal,

- numru totali ta' anormalitajiet għal kull grupp bil-mezzi u devjazzjonijiet standard,

- numru ta' ċelluli b'anormalitajiet f'kull grupp bil-mezzi u devjazzjonijiet standard,

- bidliet fil-plojdi, jekk jidhru,

- relazzjoni bejn id-doża u r-rispons, fejn ikun possibbli,

- analiżi statistiċi, jekk ikun hemm,

- informazzjoni dwar kontroll fl-istess ħin negattiv,

- informazzjoni storika dwar kontroll negattiv (solvent/mezz), bil-meded, mezzi u devjazzjonijiet standard,

- informazzjoni dwar kontroll fl-istess ħin pożittiv

Diskussjoni dwar ir-riżultati.

Konklużjonijiet.

4. REFERENZI

(1) Adler, I. D. (1984), Cytogenetic Tests in Mammals, in: Mutagenicity Testing: a Practical Approach, S. Venitt and J. M. Parry (eds), IRL Press, Oxford, Washington D.C., pp. 275-306.

(2) Preston, R. J., Dean, B. J., Galloway, S., Holden, H., McFee, A. F. and Shelby, M. (1987), Mammalian In Vivo Cytogenetic Assays: Analysis of Chromosome Aberrations in Bone Marrow Cells, Mutation Res., 189, pp. 157-165.

(3) Richold, M., Chandley, A., Ashby, J., Gatehouse, D. G., Bootman, J. and Henderson, L. (1990), In vivo Cytogenetic Assays, in: D. J. Kirkland (ed.), Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report, Part I revised, Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 115-141.

(4) Tice, R. R., Hayashi, M., MacGregaro, J. T., Anderson, D., Blakey, D. H., Holden, H. E., Kirsch-Volders, M., Oleson Jr., F. B., Pacchierotti, F., Preston, R. J., Romagna, F., Shimada, H., Sutou, S. and Vannier, B. (1994), Report from the Working Group on the in Vivo Mammalian Bone Marrow Chromosomal Aberration Test, Mutation Res., 312, pp. 305-312.

(5) Fielder, R. J., Allen, J. A., Boobis, A. R., Botham, P. A., Doe, J., Esdaile, D. J., Gatehouse, D. G., Hodson-Walker, G., Morton, D. B., Kirkland, D. J. and Richold, M. (1992), Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group: Dose setting in In Vivo Mutagenicity Assays, Mutagenesis, 7, pp. 313-319.

(6) Lovell, D. P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G. E., Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D. G. and Savage, J. R. K. (1989), Statistical Analysis of In Vivo Cytogenetic Assays, in: UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing, Report Part III. Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, D. J. Kirkland (ed.) Cambridge University Press, Cambridge, pp. 184-232.

(7) Locke-Huhle, C. (1983), Endoreduplication in Chinese hamster cells during alpha-radiation-induced G2 arrest, Mutation Res., 119, pp. 403-413.

(8) Huang, Y., Change, C. and Trosko, J. E. (1983), Aphidicolin-induced endoreduplication in Chinese hamster cells, Cancer Res., 43, pp. 1362-1364."

--------------------------------------------------

ANNESS 4Ċ

"B.12. MUTAĠENIĊITÀ - TEST MIKRONUKLEU IN VIVO GĦAL ERITROĊITE FIL-MAMMIFERI

1. METODU

Dan il-metodu huwa replika tat-Test OECD TG 474, Test Mikronukleu għal Eritroċite fil-Mammiferi (1997).

1.1. INTRODUZZJONI

It-test mikronukleu in vivo fil-mammiferi jintuża biex jinstab jekk hemmx ħsara li tinġieb mis-sustanza tat-test lill-kromożomi jew l-apparat mitotiku ta' eritroblasti bl-analiżi ta' eritroċiti meħuda bħala kampjuni fil-mudullun u/jew ċelluli periferali tad-demm ta' annimali, ġeneralment annimali gerriema.

L-għan tat-test mikronukleu huwa biex jiġu identifikati sustanzi li jikkawżaw ħsara ċitoġenetika li tirriżulta fil-formazzjoni ta' mikronukleji li jkun fihom biċċiet ta' residwi ta' kromożomi jew kromożomi sħaħ.

Meta eritroblast tal-mudullun jiżviluppa f'eritroċite polikromatika, joħroġ in-nukleu prinċipali; kull mikronukleu li jkun ġie ffurmat jista' jibqa' lura fiċ-ċitoplasma mod ieħor anukleat. Il-viżwalizzazzjoni tal-mikronukleji hija faċilitata f'dawn iċ-ċelluli għax ma għandhomx nukleu prinċipali. Żieda fil-frekwenza ta' eritroċiti polikromatiċi mikronukleati fl-annimali trattati hija indikazzjoni ta' ħsara miġjuba fil-kromożomi.

Ġeneralment f'dan it-test jiġi użat il-mudullun ta' annimali gerriema għax l-eritroċiti polikromatiċi huma prodotti f'dak it-tessut. Il-qisien ta' eritroċiti mikronukleati immaturi (polikromatiċi) fid-demm periferali huwa ugwalment aċċettat f'kull speċi li fiha ġiet murija l-inabbiltà tal-milsa li tneħħi eritroċiti mikronukleati, jew li tkun uriet sensittività adegwata biex tiskopri aġenti li jikkawżaw anormalitajiet fil-kromożomi strutturali jew numeriċi. Il-mikronukleji jistgħu differenzati b'għadd ta' kriterji. Dawn jinkludu l-identifikazzjoni tal-preżenza jew nuqqas ta' DNA kinetoċoru jew ċentromeriku fil-mikronukleji. Il-frekwenza ta' eritroċiti mikronukleati immaturi (polikromatiċi) hija l-punt prinċipali ta' konklużjoni. L-għadd ta' eritroċiti maturi (normokromatiċi) fid-demm periferali li jkun fihom mikronukleji fost numru stabbilit ta' eritroċiti maturi jista' jintuża ukoll bħala l-punt ta' konklużjoni tal-valutazzjoni meta l-annimali jiġu ttrattati għal erba' ġimgħat jew aktar.

Dan it-test mikronukleu in vivo fil-mammiferi huwa speċjalment rilevanti fil-valutazzjoni ta' perikli mutaġeniċi għax jippermetti l-konsiderazzjoni ta' fatturi ta' metaboliżmu in vivo, farmakokinetika u proċessi ta' tiswija tad-DNA għalkemm dawn jistgħu jvarjaw fost l-ispeċi, fost it-tessuti u fost il-punti ġenetiċi ta' konklużjoni. Eżami in vivo huwa utli ukoll għal investigazz ulterjuri ta' effett mutaġeniku żvelat b'sistema in vitro.

Jekk ikun hemm xiedha li s-sustanza tat-test, jew metabolit reattiv, ma jilħaqx it-tessut immirat, mhux xieraq li jintuża dan it-test.

Ara ukoll l-Introduzzjoni ġenerali Taqsima B.

1.2. TIFSIRIET

Ċentromeru (Kinetoċoru) : reġjun(i) ta' kromożomu li magħha huma assoċjati fibri irqaq waqt d-diviżjoni taċ-ċellula, li jippermettu l-moviment b'ċertu ordni ta' kromożomi sekondarji għat-truf ta' ċelluli sekondarji.

Mikronukleji : nukleji żgħar, separate minn u addizzjonali għan-nukleji prinċipali ta' ċelluli, prodotti waqt it-telofażi ta' mitożi (mejożi) permezz ta' biċċiet ta' residwi ta' kromożomi jew kromożomi sħaħ.

Eritroċite normokromatika : eritroċite matura li ma għandhiex ribosomi u li tista' tiġi differenzata minn eritroċiti polikromatiċi immaturi bit-tebgħat selettivi għal ribosomi.

Entroċite polikromatika : eritroċite immatura, fi stadju intermedju ta' żvilupp, li xorta waħda fiha ribosomi u għalhekk tista' tiġi differenzata minn eritroċiti normokromatiċi maturi bit-tebgħat selettivi għal ribosomi.

1.3. PRINĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST

L-annimali huma esposti għas-sustanza tat-test permezz ta' rotta xierqa. Jekk jintuża l-mudullun, l-annimali jiġu sakrifikati fi żminijiet xierqa wara t-trattament, jitneħħa l-mudullun, u l-preparazzjonijiet jsiru u jingħataw il-kulur (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7). Meta jintuża demm periferali, id-demm jinġabar f'ħinijiet xierqa wara t-trattament u wara li jsiru l-preparazzjonijiet u jingħataw il-kulur (4) (8) (9) (10). Għal studji b'demm periferali, għandu jgħaddi perjodu kemm jista' jkun żgħir bejn l-aħħar esposizzjoni u l-ħsad taċ-ċellula. Il-preparazzjonijiet jiġu analizzati għall-preżenza ta' mikronukleji.

1.4. DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST

1.4.1. Preparazzjonijiet

1.4.1.1. Għażla ta' l-ispeċi ta' l-annimali

Hu rakkomandat li jintużaw ġrieden jew far, jekk jintuża l-mudullun, iżda jista' jintuża kull annimal xieraq ta' l-ispeci tal-mammiferi. Meta jintuża demm periferali, hu rakkomandat li jintużaw ġrieden. Iżda kull speċi xierqa ta' mammiferi tista' tintuża sakemm tkun speċi li fiha l-milsa ma tneħħix eritroċiti mikronukleati, jew speċi li tkun uriet sensittività adegwata biex tiskopri aġenti li jikkawżaw anormalitajiet fil-kromożomi strutturali jew numeriċi. Għandhom jintużaw razez, li komunement jintużaw fil-laboratorji, ta' annimali adulti b'saħħithom u żgħar. Fil-bidu ta' l-istudju, il-varjazzjoni fil-piż ta' l-annimali għandha tkun minima u ma teċċedix ± 20 % tal-medja tal-piż ta' kull sess.

1.4.1.2. Kondizzjonijiet ta' fejn jinżammu u x'jieklu

Għandhom japplikaw il-kondizzjonijiet ġenerali msemmija fl-Introduzzjoni ġenerali għat-Taqsima B iżda l-mira dwar l-umdità għandha tkun 50-60 %.

1.4.1.3. Preparazzjoni ta' l-annimali

Annimali adulti żgħar u b'saħħithom jiġu assenjati mingħajr skema għall-gruppi ta' kontroll u trattament. L-annimali jiġu identifikati wieħed wieħed. L-annimali jiġu akklimatizzati għall-kondizzjonijiet tal-laboratorju għall-inqas għal ħamest ijiem.. Il-gaġeġ għandhom jitqiegħdu b'tali mod li jiġu minimizzati effetti possibbli li jirriżultaw minn kif jitqiegħdu l-gaġeġ.

1.4.1.4. Preparazzjoni tad-dożi

Sustanzi tat-test solidi għandhom jiġu mdewwbin jew sospiżi f'solventi jew kontenituri xierqa u dilwiti, jekk ikun xieraq, qabel it-trattament ta' l-annimali. Sustanzi likwidi tat-test jistgħu jiġu ttrattati direttament jew dilwiti qabel it-trattament. Għandhom jintużaw preparazzjonijiet ġodda għas-sustanza tat-test kemm-il darba l-informazzjoni dwar l-istabbilità ma turix l-aċċettabbilità tal-ħażna.

1.4.2. Kondizzjonijiet tat-test

1.4.2.1. Solvent/mezz

Is-solvent/mezz ma għandux jipproduċi effetti tossiċi fil-livelli ta' doża użata, u ma għandu jkun hemm l-ebda suspett ta' reazzjoni kimika mas-sustanza tat-test. Jekk jintużaw solventi/mezzi oħra minflok dawk l-aktar magħrufa, l-inklużjoni tagħhom għandha tkun appoġġata b'informazzjoni li tindika l-kompatibilità tagħhom. Hu rakkomandat li kemm jista' jkun, l-ewwel jiġi kkunsidrat l-użu ta' solvent/mezz akwuż.

1.4.2.2. Kontrolli

Għandhom jiġu inklużi għal kull wieħed mis-sessi f'kull test kontrolli pożittivi u negattivi fl-isterss ħin (solvent/mezz). Ħlief għat-trattament bis-sustanza tat-test, l-annimali fil-gruppi tal-kontroll għandhom jiġu trattati bl-istess mod bħall-annimali fil-gripp ta' trattament.

Il-kontrolli pożittivi għandhom jipproduċu mikronukleji in vivo f'livelli ta' esposizzjoni li huma mistennija li jagħtu żieda li tkun tidher fuq l-isfond. Trattamenti ta' kontroll pożittiv għandhom jingħażlu sabiex l-effetti jkunu ċari iżda ma jiżvelawx l-identità tad-dijapożitivi kodifikati lil min jaqrahom. Huwa aċċettat li l-kontroll pożittiv jiġi somministrat minn rotta differenti minn dik tas-sustanza tat-test u jittieħed kampjun darba waħda biss. Barra minn dan, jista' jiġi kkunsidrat l-użu ta' kimiċi ta' kontroll pożittivi relatati mal-klassi ta' kimiċi, meta dawn ikunu disponibbli. Eżempji ta' sustanzi ta' kontroll pożittivi jinkludu:

Sustanza | Nru SAK | Nru Einecs |

Etil metansulfonat | 62-50-0 | 200-536-7 |

N-etil-N-nitrosourea | 759-73-9 | 212-072-2 |

Mitomiċina C | 50-07-7 | 200-008-6 |

Ciklofosfamide | 50-18-0 | 200-015-4 |

ciklofosfamide monojdrat | 6055-19-2 | |

Trijetilenemelamina | 51-18-3 | 200-083-5 |

Il-kontrolli negattivi, trattati biss bis-solvent jew bil-mezz, u mod ieħor trattati bl-istess mod bħall-gruppi tat-trattament, għandhom jiġu inklużi għal kull perjodu ta' teħid ta' kampjuni, sakemm ma jkunux disponibbli varjabbilità aċċettabbli bejn l-annimali u frekwenżi ta' ċelluli b'mikronuleji mill-informazzjoni storika tal-kontroll. Jekk jiġi applikat it-teħid ta' kampjun singolu, l-aktar żmien xieraq huwa l-ewwel darba li jittieħed il-kampjun. Barra minn dan, għandhom jintużaw ukoll kontrolli mhux trattati sakemm ma jkunx hemm informazzjoni ta' kontroll pubblikata u storika li turi li jkun hemm effetti ta' ħsara u mutaġeniċi bl-uzu tas-solvent/mezz magħżul.

Jekk jintuża demm periferali, ħampjun ta' qabel it-trattament jista' jkun aċċettabbli bħala kontroll negattiv fl-istess ħin, iżda fi studji qosra ta' demm periferali biss (eż. 1-3 trattament(i)) meta l-informazzjoni li tirriżulta tkun fil-medda mistennija għall-kontroll storiku.

1.5. PROĊEDURA

1.5.1. Numru u sess ta' l-annimali

Kull grupp ta' trattament u ta' kontroll għandu jinkludi fih għall-inqas ħames annimali analizzabbli għal kull sess (11). Jekk fiż-żmien ta' l-istudju jkun hemm informazzjoni disponibbli minn studji fl-istess speċi u bl-użu ta' l-istess rotta ta' esposizzjoni li juru li ma hemm l-ebda differenzi sostanzjali fit-tossiċità bejn is-sessi, allura jkun suffiċjenti li l-ittestjar isir fuq sess wieħed. Fejn l-esposizzjoni umana għall-kimiċi tista' tiddependi fuq is-sess, bħal per eżempju b'ċerti aġenti farmaċewtiċi, it-test għandu jitwettaq b'annimali tas-sess xieraq

1.5.2. Skeda tat-trattament

Ma jista' jiġi rakkomandat l-ebda trattament standard (jiġifieri trattament wieħed, żewġ trattament jew aktar b'intervalli ta' 24 siegħa). Il-kampjuni minn reġimi ta' dożi estiżi huma aċċettabbli sakemm ikun ġie muri effett pożittiv għal dan l-istudju jew, għal studju negattiv, sakemm tkun ġiet murija tossiċità sakemm tintuża d-doża sal-limitu, u tingħata doża sal-ħin tat-teħid ta' kampjuni. Is-sustanzi tat-test jistgħu ukoll jiġu somministrati bħala doża maqsuma, jiġifieri żewġ trattament fl-istess ġurnata separati b'mhux aktar minn ftit sigħat, biex tiġi faċilitata s-somministrazzjoni ta' volum kbir ta' materjal.

It-test jista' jsir f'żewġ modi:

(a) l-annimali jiġu ttrattati bis-sustanza tat-test darba. Il-kampjuni tal-mudullun jittieħdu għall-inqas darbtejn, l-ewwel wieħed mhux qabel 24 siegħa wara t-trattament, iżda mhux aktar minn 48 siegħa wara t-trattament b'intervalli xierqa bejn it-teħid ta' kampjuni. It-teħid ta' kampjuni qabel 24 siegħa wara t-trattament għandu jkun ġustifikat. Il-kampjuni ta' demm periferali jittieħdu għall-inqas darbtejn, l-ewwel wieħed mhux qabel 36 siegħa wara t-trattament, b'intervalli xierqa wara t-teħid ta' l-ewwel kampjun, iżda mhux aktar minn 72 siegħa. Meta jiġi rikonoxxut riżultat pożittiv wara t-teħid wieħed ta' kampjuni, ma jkunx meħtieġ aktar teħid ta' kampjuni;

(b) Jekk jintużaw żewġ trattament jew aktar kuljum (eż. żewġ trattamenti jew aktar f'intervalli ta' 24 siegħa), għandhom jinġabru kampjuni darba bejn 18 u 24 siegħa wara l-aħħar trattament riward il-mudullun u darba bejn 36 u 48 siegħa wara l-aħħar trattament rigward demm periferali (12).

Jistgħu jintużaw metodi oħra ta' teħid ta' kampjuni, fejn dawn ikunu rilevanti.

1.5.3. Livelli ta' doża

Jekk jitwettaq studju biex tiġi skoperta l-medda għax ma jkunx hemm disponibbli informazzjoni xierqa, dan għandu jsir fl-istess laboratorju, jintużaw l-istess speċi, razza, sess u metodu ta' trattament li għandhom jintużaw fl-istudju prinċipali (13). Jekk ikun hemm tossiċità, jintużaw tliet livelli ta' doża għall-ewwel perjodu ta' teħid ta' kampjuni. Dawn il-livelli ta' doża għandhom jkopru medda mill-massimu għal ftit jew l-ebda tossiċità. Fil-ħin ta' l-aħħat teħid ta' kampjuni, l-ogħla doża biss hi meħtieġa li tintuża. L-ogħla doża hija mfissra bħala d-doża li tipproduċi sinjali ta' tossiċità hekk li livelli ogħla tad-doża, bbażati fuq l-istess reġim ta' dożaġġ, huma mistennija li jikkawżaw il-mewt. Is-sustanzi b'attivitajiet bijoloġiċi speċifiċi f'dożi baxxi mhux tossiċi (bħal ma huma ormoni u nitroġeni) jistgħu jkunu eċċezzjonijiet għall-kriterji ta' l-issettjar tad-dożi u għandhom jiġu valutati fuq bażi ta' każ b'każ. L-ogħla doża tista' ukoll tfisser id-doża li tipproduċi xi indikazzjoni ta' tossiċità fil-mudullun (eż. tnaqqqis fil-proporzjon ta' eritroċiti immaturi fost l-eritroċiti totali fil-mudullun jew demm periferali).

1.5.4. Test tal-limitu

Jekk test ta' doża waħda ta' livell ta' għall-inqas 2000 mg/kg piż tal-ġisem meta jitwettaq trattament wieħed, jew bħala żewġ trattamenti fl-istess ġurnata, ma jipproduċix effetti tossiċi li wieħed jinduna bihom, u jekk ma tkunx mistennija l-ġenotossiċità fuq il-bażi ta' l-informazzjoni minn sustanzi strutturalment relatati, allura ma jitqiesx li jkun neċessarju li jsir studju komplet bl-użu ta' tliet livelli ta' dożaġġ. Għal studji li jdumu aktar, il-limitu tad-doża huwa 2000 mg/kg/piż tal-ġisem/jum għal trattament sa 14-il ġurnata, u 1000 mg/kg/piż tal-ġisem/jum għal trattament ta' aktar minn 14-il ġurnata. L-esposizzjoni umana mistennija tista' tindika l-ħtieġa ta' livell ogħla ta' doża li għandu jintuża fit-test tal-limitu.

1.5.5. Somministrazzjoni ta' dożi

Normalment is-sustanza tat-test tiġi somministrata b'gavage billi jintuża tubu għall-istonku jew cannula xierqa ta' intubazzjoni, jew bl-injezzjoni intraperitonali. Fejn ikunu ġustifikati, jistgħu jiġu aċċettati rotot oħra ta' esposizzjoni. Il-volum massimu ta' likwidu li jista' jiġi somministrat b'gavage jew b'injezzjoni f'ħin wieħed jiddependi fuq il-qies ta' l-annimal tat-test. Il-volum m'għandux ikun aktar minn 2 ml/100g piż tal-ġisem. L-użu ta' volumi ogħla minn dawn għandu jkun ġustifikat. Ħlief fil-każ ta' sustanzi li jirritaw jew korrożivi li normalment juru effetti aggravati b'konċentrazzjonijiet ogħla, il-varjabbilità fil-volum tat-test għandha titnaqqas bl-aġġustament tal-konċentrazzjoni biex jiġi żgurat volum kostanti fuq il-livelli kollha tad-doża.

1.5.6. Preparazzjoni tal-mudullun/demm

Iċ-ċelluli tal-mudullun ġeneralment jinkisbu mill-wirk jew mill-qasba tas-sieq minnufih wara s-sagrifiċċju. Komunement, iċ-ċelluli jitneħħew mill-wirk jew mit-qasba tas-sieq, preparati u mogħtija kulur permezz ta' metodi stabbiliti. Demm periferali jinkiseb mill-vina tad-denb jew arterja/vina oħra xierqa. Iċ-ċelluli tad-demm huma minnufih mogħtija kulur supravitalment (8) (9) (10) jew isiru preparazzjonijiet biex jingħataw il-kulur. L-użu ta' kulur speċifiku ta' DNA (eż. oranġjo akridin (14) jew Hoechst 33258 plus pyronin-Y (15)) jista' jelimina xi uħud mill-prodotti assoċjati ma' l-użu ta' kulur mhux speċifiku DNA. Dan il-vantaġġ ma jipprekludix l-użu ta' kuluri konvenzjonali (eż, Giemsa). Jistgħu jintużaw ukoll sistemi addizzjonali (eż. kolonni ta' ċelluloża biex jitneħħu ċelluli nukleati (16)) iżda dawn is-sistemi intwerew li jaħdmu adegwatament għall-preparazzjoni ta' mikronukleji fil-laboratorju.

1.5.7. Analiżi

Il-proporzjon ta' eritroċiti immaturi fost l-eritroċiti totali (immaturi + maturi) tiġi stabbilita għal kull annimal billi jingħaddu għall-inqas 200 eritroċiti għall-mudullun u 1000 eritroċiti għad-demm periferali (17). Id-dijapożitivi kollha, inklużi dawk ta' kontrolli pożittivi u negattivi, għandhom jiġu kodifikati indipendentement qabel l-analiżi mikroskopika. Jingħaddu għall-inqas 2000 eritroċiti immaturi għall-inċidenza ta' eritroċiti immaturi mikronukleati. Tista' tinkiseb iktar informazzjoni billi jingħaddu eritroċiti maturi għal mikronukleji. Meta jiġu analizzati d-dijapożitivi, il-proporzjon ta' eritroċiti immaturi fost l-eritroċiti totali ma għandhiex tkun inqas minn 20 % tal-valur ta' kontroll. Meta l-annimali jiġu ttrattati kontinwament għal erba' ġimgħat jew aktar, jistgħu jingħaddu ukoll għall-inqas 2000 eritroċiti maturi għal kull annimal għall-inċidenza ta' mikronukleji. Is-sistemi ta' analiżi awtomatizzata (analiżi ta' l-immaġini u analiżi tal-fluss ċitometriku ta' sospensjonijiet ta' ċelluli) huma aċċettabbli bħala alternattivi għall-valutazzjoni manwali jekk ikunu ġustifikati u validati kif xieraq.

2. INFORMAZZJONI

2.1. TRATTAMENT TAR-RIŻULTATI

L-informazzjoni dwar annimali individwali għandha tingħata f'forma ta' tabella. L-unità sperimentali hija l-annimal. Għal kull annimal li jiġi analizzat għandhom jiġu elenkati separatament in-numru ta' eritroċiti immaturi li jingħaddu, in-numru ta' eritroċiti immaturi mikronukleati, u n-numru ta' eritroċiti immaturi fost l-eritroċiti totali. Meta l-annimali jiġu ttrattati kontinwament għal erba' ġimgħat jew aktar, għandha tingħata wkoll l-informazzjoni dwar l-eritroċiti maturi jekk din tinġabar. Għal kull annimal tingħata l-proporzjon ta' eritroċiti immaturi fost l-eritroċiti totali u, jekk jitqies applikabbli, il-perċentwali ta' eritroċiti mikronukleati. Jekk ma hemmx xiehda ta' differenza fir-riżultat bejn iż-żewġ sessi, l-informazzjoni dwar iż-żewġ sessi tista' tingħaqad għall-analiżi statistika.

2.2. EVALWAZZJONI U INTERPRETAZZJONI TAR-RIŻULTATI

Hemm ħafna kriterji biex jiġi stabbilit riżultat pożittiv, bħal ma hi żieda relatata mad-doża fl-għadd relattiv ta' ċelluli mikronukleati jew żieda ċara fin-numru ta' ċelluli mikronukleati fi grupp singolu ta' trattament fi żmien singolu ta' teħid ta' kampjuni. L-ewwel għandha tiġi kkunsidrata r-rilevanza bijoloġika tar-riżultati. Bħala għajnuna fil-valutazzjoni tar-riżultati tat-testijiet (18) (19), jistgħu jintużaw metodi ta' statistika. L-importanza ta' l-istatistika ma għandhiex tkun l-uniku fattur determinanti għal riżultat pożittiv. Riżultati ekwivoċi għandhom jiġu ċċarati b'testijiet ulterjuri preferibilment billi tintuża modifika tal-kondizzjonijiet ta' l-esperiment.

Sustanza ta' test li dwarha r-riżultati ma jilħqux il-kriterji fuq imsemmija titqies bħala mhux mutaġenika f'dan it-test.

Għalkemm kważi l-esperimenti kollha jagħtu riżultati ċari pożittivi jew negattivi, f'każijiet rari l-informazzjoni ssettjata ma tippermettix li jsir ġudizzju definittiv dwar l-attività ta' sustanza tat-test. Ir-riżultati jistgħu jibqgħu ekwivoċi u inċerti irrispettivament min-numru ta' drabi li jirrepeti ruħu l-esperiment.

Ir-riżultati pożittivi minn test mikronukleu jindikaw li s-sustanza tat-test toħloq mikronukleji li huma r-riżultat ta' ħsara fil-kromożomi jew ħsara lill-apparat mitotiku fl-eritroblasti ta' l-ispeċi ttestjata. Ir-riżultati negattivi jindikaw li, taħt il-kondizzjonijiet tat-test, is-sustanza tat-test ma toħloqx mikronukleji fl-eritroċiti immaturi ta' l-ispeċi ttestjata.

Għandha tiġi diskussa l-probabilità li s-sustanza tat-test jew il-metaboliti tagħha jilħqu ċ-ċirkolazzjoni ġenerali jew speċifikatament it-tessut immirat (eż. tossiċità sistemika).

3. RAPPURTAR

RAPPORT TAT-TEST

Ir-rapport tat-test għandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja:

Solvent/mezz:

- ġustifikazzjoni dwar l-għażla tal-mezz,

- solubbilità u stabbilità tas-sustanza tat-test fis-solvent/mezz, jekk magħrufa.

Annimali ttestjati:

- speċi/razza użati,

- numru, età u sess ta' l-annimali,

- għejun, kondizzjonijiet dwar fejn jinżammu, dieta, eċċ.,

- piż individwali ta' l-annimali fil-bidu tat-test, inkluża l-medda ta' piż tal-ġisem, mezzi u devjazzjoni standard għal kull grupp.

Kondizzjonijiet tat-test:

- kontrolli pożittivi u negattivi (mezz/solvent),

- informazzjoni mill-istudju dwar il-medda, jekk ikun sar,

- raġuni prinċipali għall-għażla ta' livell tad-doża,

- dettalji dwar il-preparazzjoni tas-sustanza tat-test,

- dettalji dwar is-somministrazzjoni tas-sustanza tat-test,

- raġuni prinċipali dwar ir-rotta ta' somministrazzjoni,

- metodi biex jiġi verifikat li s-sustanza tat-test waslet għaċ-ċirkolazzjoni ġenerali jew it-tessut immirat, jekk tkun applikabbli

- konverżjoni mill-konċentrazzjoni (ppm) tas-sustanza tat-test dieta/ilma għax-xorb għad doża attwali (mg/kg piż tal-ġisem/jum) jekk tkun applikabbli,

- dettalji dwar il-kwalità ta' l-ikel u l-ilma,

- deskrizzjoni dettaljata dwar l-iskedi ta' trattament u teħid ta' kampjuni,

- metodi tal-preparazzjoni tad-dijapożitivi,

- metodi biex titqies it-tossiċità,

- kriterji għall-għadd ta

- eritroċiti immaturi mikronukleati,

- numru ta' ċelluli analizzati kull annimal,

- kriterji biex l-istudji jitqiesu bħala pożittivi, negattivi jew ekwivoċi,

Riżultati:

- sinjali ta' tossiċità,

- proporzjon ta' eritroċiti immaturi fost l-eritroċiti totali,

- numru ta' eritroċiti immaturi mikronukleati, mogħtija separatament għal kull annimal,

- devjazzjoni standard medja ± ta' eritroċiti immaturi mikronukleati għal kull grupp,

- relazzjoni bejn id-doża u r-rispons, fejn ikun possibbli,

- analiżi statistiċi u metodi applikati,

- informazzjoni negattiva kurrenti u storika,

- informazzjoni dwar kontroll fl-istess ħin pożittiv

Diskussjoni dwar ir-riżultati.

Konklużjonijiet.

4. REFERENZI

(1) Heddle, J. A. (1973), A Rapid In Vivo Test for Chromosomal Damage, Mutation Res., 18, pp. 187-190.

(2) Schmid, W. (1975), The Micronucleus Test, Mutation Res., 31, pp. 9-15.

(3) Heddle, J. A., Salamone, M. F., Hite, M., Kirkhart, B., Mavournin, K., MacGregor, J. G. and Newell, G. W. (1983), The Induction of Micronuclei as a Measure of Genotoxicity, Mutation Res. 123, pp. 61-118.

(4) Mavournin, K. H., Blakey, D. H., Cimino, M. C., Salamone, M. F. and Heddle, J. A. (1990), The In Vivo Micronucleus Assay in Mammalian Bone Marrow and Peripheral Blood. A report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program, Mutation Res., 239, pp. 29-80.

(5) MacGregor, J. T., Schlegel, R., Choy, W. N. and Wehr, C. M. (1983), Micronuclei in Circulating Erythrocytes: A Rapid Screen for Chromosomal Damage During Routine Toxicity Testing in Mice, in: Developments in Science and Practice of Toxicology, ed. A. W. Hayes, R. C. Schnell and T. S. Miya. Elsevier, Amsterdam, pp. 555-558.

(6) MacGregor, J. T., Heddle, J. A. Hite, M., Margolin, G. H., Ramel, C., Salamone, M. F., Tice, R. R., and Wild, D. (1987), Guidelines for the Conduct of Micronucleus Assays in Mammalian Bone Marrow Erythrocytes, Mutation Res., 189, pp. 103-112.

(7) MacGregor, J. T., Wehr, C. M., Henika, P. R. and Shelby, M. E. (1990), The in vivo Erythrocyte Micronucleus Test: Measurement at Steady State Increases Assay Efficiency and Permits Integration with Toxicity Studies, Fund. Appl. Toxicol. 14, pp. 513-522.

(8) Hayashi, M., Morita, T., Kodama, Y., Sofumi, T. and Ishidate, M. Jr. (1990), The Micronucleus Assay with Mouse Peripheral Blood Reticulocytes Using Acridine Orange-Coated Slides, Mutation Res., 245, pp. 245-249.

(9) The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test (1992). Micronucleus Test with Mouse Peripheral Blood Erythrocytes by Acridime Orange Supravital Staining: The Summary Report of the 5th Collaborative Study by CSGMT/JEMMS, MMS, Mutation Res., 278, pp. 83-98.

(10) The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test (CSGMT/JEMMS, MMS: The Mammalian Mutagenesis Study Group of the Environmental Mutagen Society of Japan) (1995), Protocol recommended for the short-term mouse peripheral blood micronucleus test, Mutagenesis, 10, pp. 53-159.

(11) Hayashi, M., Tice, R. R., MacGregor, J. T., Anderson, D., Blackey, D. H., Kirsch-Volders, M., Oleson, Jr. F. B., Pacchicrotti, F., Romagna, F., Shimada, H. Sutou, S. and Vannier, B. (1994), in Vivo Rodent Erythrocyte Micronucleus Assay, Mutation Res., 312, pp. 293-304.

(12) Higashikuni, N. and Sutou, S. (1995), An optimal, generalised sampling time of 30 ± 6 h after double dosing in the mouse peripheral micronucleus test, Mutagenesis, 10, pp. 313-319.

(13) Fielder, R. J., Allen, J. A., Boobis, A. R., Botham, P. A., Doe, J., Esdaile, D. J., Gatehouse, D. G., Hodson-Walker, G., Morton, D. B., Kirkland, D. J. and Rochold, M. (1992), Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group: Dose Setting in In Vivo Mutagenicity Assays, Mutagenesis, 7, pp. 313-319.

(14) Hayashi, M., Sofumi, T. and Ishidate, M. Jr. (1983), An Application of Acridine Orange Fluorescent Staining to the Micronucleus Test, Mutation Res., 120, pp. 241-247.

(15) MacGregor, J. T., Wehr, C. M. and Langlois, R. G. (1983), A Simple Fluorescent Staining Procedure for Micronuclei and RNA in Erythrocytes Using Hoechst 33258 and Pyromin Y, Mutation Res., 120, pp. 269-275.

(16) Romagna, F. and Staniforth, C. D. (1989), The automated bone marrow micronucleus test, Mutation Res., 213, pp. 91-104.

(17) Gollapudi, B. and McFadden, L. G. (1995), Sample size for the estimation of polychromatic to normochromatic erythrocyte ratio in the bone marrow micronucleus test, Mutation Res., 347, pp. 97-99.

(18) Richold, M., Ashby, J., Bootman, J., Chandley, A., Gatehouse, D. G. and Henderson, L. (1990), In Vivo Cytogenetics Assay, in: D. J. Kirkland (ed.), Basic Mutagenicity tests, UKEMS Recommended Procedures, UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report, Part 1, revised, Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 115-141.

(19) Lovell, D. P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G. E., Clare, G., Ferguson R., Richold, M., Papworth, D. G. and Savage, J. R. K. (1989), Staticical Analysis of In Vivo Cytogenetic Assays, in: D. J. Kirkland (ed.), Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report, Part III, Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 184-232."

--------------------------------------------------

ANNESS 4D

"B.13/14. MUTAĠENIĊITÀ - TEST TA' MUTAZZJONI RIVERSIVA TA' BATTERJI

1. METODU

Dan il-metodu huwa replika tat-Test OECD TG 471, Test ta' Mutazzjoni Riversiva ta' Batterji (1997).

1.1. INTRODUZZJONI

It-test ta' mutazzjoni riversiva ta' batterji juża aċidu amino li jeħtieġ kondizzjonijiet ta' Salmonella typhimurium u Escherichia coli biex jiġu żvelati mutazzjonijiet f'punti, li jinvolvu sostituzzjoni, żjieda jew tħassir ta' par wieħed jew aktar ta' bażijiet DNA (1) (2) (3). Il-prinċipju tat-test ta' mutazzjoni riversiva ta' batterji huwa li jiskopri mutazzjonijiet li jirrivertu mutazzjonijiet preżenti fil-kondizzjonijiet tat-test u jirrestitwixxu l-kapaċità funzjonali tal-batterja biex tissintesizza aċidu amino essenzali. Il-batterji li jiġu lura jiġu skoperti mill-kapaċità tagħhom li jikbru fl-assenza ta' l-aċidu amino meħtieġ mill-kondizzjonijiet tal-ġenitur tat-test.

Mutazzjonijiet f'punti huma l-kawża ta' ħafna mard ġenetiku fil-bniedem u hemm xiehda sostanzjali li mutazzjonijiet f'punt f'onkoġeni u fil-ġeni ta' ċelluli somatiċi li jrażżnu t-tumuri huma involuti fil-formazzjoni ta' tumuri fil-bniedem u f'annimali ta' esperimenti. It-test ta' mutazzjoni riversiva ta' batterji huwa rapidu, mhux għali u relattivament faċli biex jitwettaq. Ħafna mill-kondizzjonijiet tat-test għandhom diversi karatteristiċi li jagħmuluhom aktar sensittivi għall-iskoperta ta' mutazzjonijiet inklużi sekwenzi DNA responsivi fis-siti ta' reversjoni, permeabilità miżjuda ta' ċelluli għal molekuli kbar u l-eliminazzjoni ta' sistemi ta' riparazzjoni ta' DNA jew titjib ta' proċessi ta' riparazzjoni ta' DNA li huma suxxettibbli għall-iżbalji. L-ispeċifiċità tal-kondizzjonijiet tat-test jistgħu jipprovdu informazzjoni utli dwar it-tipi ta' mutazzjonijiet li huma kkawżati mill-aġenti ġenotossiċi. Bażi ta' informazzjoni kbira ħafna ta' riżultati għal varjetà wiesgħa ta' strutturi hija disponibbli għal testijiet ta' mutazzjoni riversiva ta' batterji u ġew żviluppati metodoloġiji stabbiliti sew biex jittestjaw il-kimiċi b'karatteristiċi diversi fiżiko kimiċi, inklużi komposti li jiżvintaw.

Ara wkoll l-Introduzzjoni ġenerali Taqsima B.

1.2. TIFSIRIET

Test ta' mutazzjoni riversiva jew fi Salmonella typhimurium jew f'Escherichia coli jiżvela mutazzjoni f'amino aċidu li jeħtieġ karatteristika (histidine jew tryptophan, rispettivament) biex jipproduċi karatteristika indipendenti minn fornitura minn barra ta' aċidu amino.

Mutaġeni li jġibu s-sostituzzjoni ta' koppji ta' bażijiet huma aġenti li jikkawżaw bidla fil-bażi tad-DNA. F'test reversiv din il-bidla tista' tirrikorri fil-lok tal-mutazzjoni oriġinali, jew f'xi tieni lok fil-genome batteriku.

Mutaġeni li jġibu l-mutazzjoni tal-fażi tal-qari huma aġenti li jikkawżaw iż-żieda jew it-tħassir ta' pari ta' bażi waħda jew aktar fid-DNA, u b'hekk jibdlu l-fażi tal-qari tar-RNA.

1.3. KONSIDERAZZJONIJIET TAL-BIDU

It-test tal-mutazzjoni batterika reversiva jutilizza ċelluli prokarijotiċi, li huma differenti minn ċelluli tal-mammiferi fil-karatteristiċi bħal ma huma l-assorbiment, il-metaboliżmu, l-istruttura tal-kromożomi u l-proċessi ta' riparazzjoni tad-DNA. It-testijiet li jitwettqu in vitro ġeneralment jeħtieġu l-użu ta' għejun esoġenu għall-attivazzjoni metabolika. Sistemi ta' attivazzjoni metabolika in vitro ma jistgħux jissimulaw kompletament il-kondizzjonijiet in vivo fil-mammiferi. Għalhekk it-test ma jagħtix informazzjoni diretta fuq il-qawwa mutaġenika u karċinoġenika ta' sustanza fil-mammiferi.

It-test tal-mutazzjoni riversiva batterika normalment jintuża bħala l-ewwel pass għall-attività ġenolossika u, b'mod partikolari, għall-attività li toħloq mutazzjoni puntiformi. Informazzjoni estensiva wriet li ħafna kimiċi li huma posittivi f'dan it-test juru wkoll attività mutaġenika f'testijiet oħra. Hemm eżempji ta' aġenti mutaġeniċi li ma jiġux żvelati b'dan it-test; ir-raġunijiet għal dawn in-nuqqasijiet jistgħu jkunu attribwiti għan-natura speċifika tal-punt ta' l-aħħar żvelat, differenzi fl-attivazzjoni metabolika, jew differenzi fil-bijodisponibbilità. Min-naħa l-oħra, l-fatturi li jsaħħu s-sensitività tat-test tal-mutazzjoni riversiva batterika jistgħu jwasslu għal sopravalutazzjoni ta' l-attivita mutaġenika.

It-test tal-mutazzjoni riversiva batterika jista' ma jkunx xieraq għall-valutazzjoni ta' ċerti klassijiet ta' kimiċi, per eżempju komposti b'qawwa kbira batteriċida (eż. ċerti antibijotiċi) li dawk li huma maħsuba (jew huma magħrufa) li jiddisturbaw speċifikatament is-sitema ta' replika ta' ċelluli fil-mammiferi (eż inibituri tat-topojsomerasi u ċerti analogi nukleosidi). F'dawn il-każijiet jistgħu jkunu aktar xierqa testijiet fuq mutazzjoni fil-mammiferi.

Minkejja li ħafna mill-komposti li huma posittivi f'dan it-test huna karċinoġeni tal-mammiferi, il-korrelazzjoni mhijiex assoluta. Tiddependi fuq il-klassi tal-kimika u hemm karċinoġeni li ma jiġux żvelati b'dan it-test għax jaġixxu permezz ta' mekkaniżmi oħra li mhumiex ġenotossiċi jew mekkaniżmi li ma jeżistux f'ċelluli batteriċi.

1.4. PRINĊIPJI TAL-METODU TAT-TEST

Is-sospensjonijiet taċ-ċelluli batteriċi jiġu esposti għas-sustanza tat-test fil-presenza u fl-assenza ta' sistema ta' attivazzjoni metabolika esoġenea. Fil-metodu ta' inkorporazzjonmi fuq bażi, dawn is-sospensjonijiet jitħalltu ma' agar ta' kopertura u jitqiegħdu fuq il-bażi minnufih fuq medjum minimu. Fil-metodu ta' qabel l-inkubazzjoni, it-taħlita tat-trattament tiġi inkubata u imbagħad imħallta ma' agar ta' kopertura qabel titqiegħed fuq bażi fuq medjum minimu. Għaż-żewġ metodi ta' teknika, wara jumejn ta' inkubazzjoni jew tlieta, jingħaddu l-kolonji revertanti u jiġu mqabbla man-numru ta' kolonji revertanti spontanji fuq il-bażijiet ta' kontroll tas-solvent.

Ġew deskritti ħafna proċeduri għat-twettiq tat-test tal-mutazzjoni riversiva batterika. Fost dawk li ġeneralment jintużaw hemm il-metodu ta' inkorporazzjoni fuq bażi (1) (2) (3) (4), il-metodu ta' qabel l-inkubazzjoni (2) (3) (5) (6) (7) (8), il-metodu ta' fluttwazzjoni (9) (10), u l-metodu tas-sospensjoni (11). Ġew deskritti modifiki għall-ittestjar ta' gassijiet jew fwar (12).

Il-proċeduri deskritti fil-metodu jappartjenu primarjament għall-metodi ta' l-inkorporazzjoni fuq bażi u ta' qabel l-inkubazzjoni. Kull wieħed minnhom huwa aċċettabbli biex isiru esperimenti kemm bl-attivazzjoni metabolika kif ukoll mingħajrha. Ċerti sustanzi jistgħu jiġu żvelati b'mod aktar effiċjenti meta jintuża l-metodu ta' qabel l-inkubazzjoni. Dawn is-sustanzi jappartjenu għal klassijiet kimiċi li jinkludu nitrosamini alifatiċi short chain, metalli divalenti, aldejidi, komposti ta' koloranti ażo u dijażo, alkalojdi pirolliżidini, komposti allil u nitro komposti (3). Hu rikonoxxut ukoll li ċerti klassijiet ta' mutaġeni mhux dejjem jiġu żvelati meta jintużaw proċeduri standard bħal ma huma l-metodu ta' inkorporazzjoni fuq bażi u l-metodu ta' qabel l-inkubazzjoni. Dawn għandhom jitqiesu bħala "każijiet speċjali" hu huwa bil-qawwa rakkomandat li jintużaw proċeduri alternattivi biex jiġu żvelati. Il-"każijiet speċjali" li ġejjin jistgħu jiġu identifikati (flimkien ma' eżempji ta' proċeduri li jistgħu jintuiżaw biex jiġu żvelati): komposti ta' koloranti ażo u dijażo (3) (5) (6) (13), kimiċI ta' gasssijiet u fwar (12) (14) (15) (16) u glikosidi (17) (18). Kull devjazzjoni mill-proċedura standard teħtieġ li tkun ġustifikata xjentifikament.

1.5. DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST

1.5.1. Preparazzjonijiet

1.5.1.1. Batterja

Kulturi friski ta' batterja għandhom jitħallew jiżviluppaw sal-fażi esponenzali tardiva jew il-fażi bikrija stazzjonarja ta' l-Iżvilupp (madwar 109 ċelluli kull ml). Ma għandhomx jintużaw kulturi fil-fażi stazzjonarja tardiva. Huwa essenzali li l-kulturi li jintużaw fl-esperiment ikun fihom titolu għoli ta' batterja vijabbli. It-titolu jista' jintwera jew mill-informazzjoni storika ta' kontroll fuq il-fażijiet ta' żvilupp, jew minn kull analiżi permezz tad-determinazzjoni ta' l-għadd ta' ċelluli vijabbli bl-esperiment tal-bażi.

It-temperatuta rakkomandata għall-inkubazzjoni hi ta' 37 °Ċ.

Għandhom jintużaw għallinqas ħames karatteristiċi ta' batterji. Dawn għandhom jinkludu erba' karatteristiċi ta' S. typhimurium (TA 1535; TA 1537 jew TA97a jew TA97; TA98; u TA100) li ġew pruvati li huma ta' min wieħed jorbot fuqhom u responsivi għar-riproduzzjoni bejn laboratorji. Dawn l-erba' karatteristiċi S. typhimurium għandhom pari bażiċi GC fuq il-lok ta' reversjoni primarja u huwa magħruf li jistgħu ma jiżvelawx ċerti mutaġeni ossidanti, aġenti li jipprovokaw il-cross-linking u idrażini. Dawn is-sustanzi jistgħu jiġu żvelati bil-karatteristiċi ta' E. coli WP2 jew S. typhimurium TA102 (19) li jkollhom par ta' bażi AT fil-lok primarju ta' reversjoni. Għalhekk it-tagħqid rakkomandat ta' karatteristiċi huwa:

- S. typhimurium TA1535, u

- S. typhimurium TA1537 jew TA97 jew TA97a, u

- S. typhimurium TA98, u

- S. typhimurium TA100, u

- E. coli WP2 uvrA, jew E. coli WP2 uvrA (pKM101), jew S. typhimurium TA102.

Biex jiġu żvelati mutaġeni cross-linking jista' jkun preferibbli li wieħed jinkludi TA102 jew li tiżdied karatteristika ta' riparazzjoni tad-DNA ta' E. coli (eż. E. coli WP2 jew E. coli WP2 (pKM101)).

Għandhom jintużaw proċeduri stabbiliti għall-preparazzjoni ta' kulturi primarji, verifika ta' l-immarkar u l-ħażna. Għandha tintwera l-ħtieġa ta' l-amino aċidu għall-Iżvilupp għal kull kultura primarja ffriżata (istidina għal karatteristiċi ta' S. typhimurium, u triptofan għal karatteristiċi ta' E. coli). Karatteristiċi oħra fenotipiċi għandhom jiġu verifikati bl-istess mod, jiġfieri: il-presenza jew l-assenza ta' plasmidi tal-fattur R fejn ikun xieraq (jiġifieri r-resistenza għall-ampiċillina fil-karatteristiċi ta' TA98, TA100, u TA97a jew TA97, WP2 uvrA u WP2 uvrA (pKM101), u resistenza għall-ampiċillina + tetraċiklina fil-karatteristika TA 102); il-presenza ta' mutazzjonijiet karatteristiċi (jiġifieri mutazzjoni rfa mutation fi S. typhimurium permezz ta' senmsitività għal kristalvjola, u mutazzjoni uvrA fi E. coli jew mutazzjoni uvrB mutation fi S. typhimurium, permezz ta' sensitività għal dawl ultravjola) (2) (3). Il-karatteristiċi għandhom ukoll jipproduċu numru ta' bażijiet ta' kolonji revertanti spontanji fi ħdan il-meddiet ta' frekwenza mistennija mill-informazzjoni storika ta' kontroll tal-laboratorji u preferibbilment fil-medda msemmija fil-letteratura.

1.5.1.2. Medjum

Jintuża agar minimu xieraq (eż. li jkun fih medjum E minimu ta' Vogel-Bonner u glukożju), u agar ta' kopertura li jkun fih istidina u bijotin jew triptofan biex jippermetti ftit diviżjonijiet ta' ċelluli (1) (2) (9).

1.5.1.3. Attivazzjoni metabolika

Il-batterja għandha tiġi esposta għas-sustanza tat-test kemm fil-presenza kif ukoll fl-assenza ta' sistema ta' attivazzjoni metabolika xierqa. Is-sistema li normalment l-aktar tintuża hija frazzjoni post mitokondrijali integrata ta' kofattur (S9) ippreparata mill-fwied ta' annimali gerriema trattata b'aġenti li jipprokuraw l-enżimi bħal ma huma l-Aroclor 1254 (1) (2) jew komposizzjoni ta' phenobarbitone u β-naphthoflavone (18) (20) (21). Il-frazzjoni post mitokondrijali normalment tintuża f'konċentrazzjonijiet fil-medda minn 5 sa 30 % v/v fit-taħlita S9. L-għażla u l-kondizzjoni tas-sistema ta' attivazzjoni metabolika tista' tiddependi fuq il-klassi tal-kimika li tintuża. F'ċerti każijiet, jista' jkun xieraq li jintużaw aktar minn konċentrazzjoni waħda ta' frazzjon post mitokondrijali. Għal komposti ta' koloranti ażo u dijażo, jista' jkun aktar xieraq li tintuża sistema ta' attivazzjoni metabolika (6) (13).

1.5.1.4. Sustanza/preparazzjoni tat-test

Sustanzi solidi tat-test għandhom jiddewbu jew jiġu sospiżi f'solventi jew mezzi xierqa u dilwiti kif ikun xieraq qabel ma tiġi ttrattata l-batterja. Sustanzi likwidi tat-test jistgħu jiżdiedu direttament mas-sistemi tat-test u/jew dilwiti qabel it-trattament. Għandhom jintużaw preparazzjonijiet ġodda sakemm l-informazzjoni ta' l-istabbilità ma turix li jistgħu jinħażnu.

Ma għandhux jkun hemm suspett ta' reazzjoni kimika tas-solvent/mezz mas-sustanza tat-test u dan is-solvent/mezz għandu jkun kompatibbli mas-sopravvivenza tal-batterja u ma' l-attività S9 (22). Jekk jintużaw solventi/mezzi oħra magħrufa, l-inklużjoni tagħhom għandha tkun appoġġata b'informazzjoni li tindika l-kompattibilità tagħhom. Huwa rakkomandat li kull fejn ikun possibbli għandu l-ewwel jiġi kkunsidrat l-użu ta' solvent/mezz akkwuż. Meta jiġu ttestjati sustanzi li mhumiex stabbli fl-ilma, is-solventi organiċi li jintużaw ma għandux ikollhom ilma.

1.5.2. Kondizzjonijiet tat-test

1.5.2.1. Karatteristiċi tat-test (Ara 1.5.1.1)

1.5.2.2. Konċentrazzjoni ta' l-esposizzjoni

Fost il-kriterji li għandhom jitqiesu meta jiġi determinat l-ogħla ammont tas-sustanza tat-test li għandha tintuża hemm il-ċitotossiċità u s-solubbilità fit-taħlita ta' trattament finali.

Jista' jkun utli li jiġu stabbiliti t-tossiċità u l-insolubbilità f'esperiment preliminari. Iċ-ċitossiċità tista' tiġi żvelata b'riduzzjoni fl-għadd ta' konolonji revertanti, bid-dehra ta' żvilupp a normali tal-fond, jew bil-grad ta' sopravivenza tal-kulturi ttratati. Iċ-ċitossiċità ta' sustanza tista' tinbidel fil-preżenza ta' sistemi ta' attivazzjoni metabolika. L-insolubbilità għandha tiġi stmata bħala preċipitazzjoni fit-taħlita finali taħt il-kondizzjonijiet attwali tat-test u tkun evidenti għall-għajn mingħajr għanjuna.

Il-konċentrazzjoni massima rakkomandata għat-test għal sustanzi solubbli li mhumiex ċitotossiċi hija 5mg/bażi jew 5μl/bażi. Għal sustanzi li mhumiex ċitotossiċi u li ma jinħallux fuq 5mg/bażi jew 5 μl/bażi u waħda mill-konċentrazzjonijiet ittestjati jew aktar għandha tkun mhux solubbli fit-taħlita finali tat-trattament. Sustanzi tat-test li huma diġà ċitotossiċi taħt il-5mg/bażi jew 5 μl/bażi għandhom jiġu ttestjati sa konċentrazzjoni ċitotossika. Dak li jippreċipita ma għandux jiddisturba l-għadd.

Għandhom jintużaw għallinqas ħames konċentrazzjonijiet differenti analizzabbli tas-sustanza tat-test b'madwar intervalli ta' semi logarittmi (jiġifieri √10) bejn punti tat-test għal esperiment inizjali. Jistgħu ikunu xierqa intervalli iqsar meta jkun qed jiġi investigat rispons ta' konċentrazzjoni. Testjar għola mill-ċonċentrazzjoni ta' 5mg/bażi jew 5 μl/bażi jista' jiġi kkunsidrat meta ssir il-valutazzjoni ta' sustanzi li jkollhom ammonti sostanzjali ta' impuritajiet potenzalment mutaġeniċi.

1.5.2.3. Kontrolli negattivi u pożittivi

Kontrolli (solvent jew mezz) pożittivi u negattivi konkurrenti speċifiċi għall-kwalitajiet, kemm b'attivazzjoni metabolika jew mingħajr, għandhom jiġu inklużi f'kull eżami. Għandhom jintgħażlu konċentrazzjonijiet ta' kontrolli pożittivi li juru l-prestazzjoni effettiva ta' kull eżami.

Għal eżamijiet li jagħmlu użu minn sistema ta' attivazzjoni metabolika, is-sustanza (i) ta' referenza ta' kontoll pożittiv għandha (hom) tingħażel fuq bażi tat-tip tal-kwalitajiet ta' batterja użati.

Is-sustanzi li ġejjin huma eżemmpji ta' kontrolli pożittivi xierqa għal eżamijiet ta' attivazzjoni metabolika:

Sustanza | Nru SAK | Nru Einecs |

9,10-Dimetil-antraċena | 781-43-1 | 212-308-4 |

7,12-Dimetilbenż(a)antraċena | 57-97-6 | 200-359-5 |

Benzo(a)pirena | 50-32-8 | 200-028-5 |

2-Amino-antraċena | 613-13-8 | 210-330-9 |

Ċiklofosfamida | 50-18-0 | 200-015-4 |

Monoidrat taċ-ċiklofosfamida | 6055-19-2 | |

Is-sustanza li ġejja hija kontroll pożittiv xieraq għall-metodu ta' attivazzjoni metabolika riduttiva:

Sustanza | Nru SAK | Nru Einecs |

Congo Red | 573-58-0 | 209-358-4 |

Il-2-Aminoantraċena ma għandhiex tintuża bħala l-uniku indikatur ta' l-effikaċja tat-taħlita S9. Jekk tintuża l-2-aminoantraċena, kull lott ta' S9 għandu jkun karatteriżat b'mutaġen li jeħtieġ l-attivazzjoni metabolika b'enżimi mikrosomali, eż benzo(a)pirena, dimetilbenzantraċena.

Is-sustanzi li ġejjin huma eżempji ta' kontrolli pożittivi skond karatteristiċi speċifiċi għal eżamijiet imwettqa mingħajr is-sistema ta' attivazzjoni metabolika essoġena:

Sustanza | Nru SAK | Nru Einecs | Karatteristika |

Ażidu tas-sodju | 26628-22-8 | 247-852-1 | TA 1535 u TA 100 |

2-Mikro-fluworena | 607-57-8 | 210-138-5 | TA 98 |

9-Amino-akridina | 90-45-9 | 201-995-6 | TA 1537, TA 97 u TA 97a |

ICR 191 | 17070-45-0 | 241-129-4 | TA 1537, TA 97 u TA 97a |

Iperossidu tal-Kumena | 80-15-9 | 201-254-7 | TA 102 |

Mitomiċina C | 50-07-7 | 200-008-66 | WP2 uvrA u TA 102 |

N-etil-N-nitro-3-nitro-N-nitrosogwanidina | 70-25-7 | 200-730-1 | WP2, WP2uvrA u WP2uvrA (pKM101) |

4-Nitrokwinolina-1-ossidu | 56-57-5 | 200-281-1 | WP2, WP2uvrA u WP2uvrA (pKM101) |

Furilfuramida (AF2) | 3688-53-7 | | Karatteristiċi li fihom il-plasmid |

Jistgħu jintużaw sustanzi ta' referenza ta' kontroll pożittiv xierqa oħra. Għandu jiġi kkunsidrat l-użu ta' kimiċi ta' kontroll pożittiv li huma relatati ma' klassijiet ta' kimiċi, meta dan ikun possibbli.

Għandhom jiġu inklużi kontrolli negattivi, li jikkonsistu biss f'solvent jew mezz, mingħajr sustanza tat-test, u mod ieħor ittrattati bl-istess mod bħal gruppi ta' trattament. B'żieda ma dan, għandhom jintużaw ukoll kontrolli mhux trattati sakamm ma jkunx hemm informazzjoni storika ta' kontroll li turi li s-solvent magħżul ma jġibx effetti ta' ħsara jew mutaġeniċi.

1.5.3. Proċedura

Għall-metodu ta' inkorporazzjoni fuq bażi (1) (2) (3) (4), mingħajr l-attivazzjoni metabolika, normalment 0,05 jew 0,1 ml tas-soluzzjonijiet tat-test, 0,1 ml ta' kulturi friski ta' batterja (li jkun fihom madwar 108 ċelloli vijabbli u 0,5 ml ta' tarka sterili jitħalltu ma' 2,0 ml ta' agar ta' kopertura. Għall-eżami bl-attivazzjoni metabolika, normalment 0,5 ml tat-taħlita ta' l-attivazzjoni metabolika li jkun fiha ammont adegwat ta' frazzjoni post mitokondrijali (fil-medda ta' 5 sa 30 % v/v fit-taħlita ta' l-attivazzjoni metabolika) jitħalltu ma' agar ta' kopertura (2,0 ml) flimkien mal-batterja u mas-sustanza tat-test/soluzzjoni tat-test. Il-kontenut ta' kull tubu jiġi mħallat u jitferra fuq superfiċi ta' bażi b'agar minimu. L-agar ta' kopertura jitħalla jsir solidu qabel l-inkubazzjoni.

Għall-metodu ta' qabel l-inkubazzjoni (2) (3) (5) (6), is-sutanza tat-test/soluzzjoni tat-test tiġi inkubata minn qabel mal-karatteristika tat-test (li jkun fiha madwar 108 ċelluli vijabbli u t-tarka sterili jew is-sistema ta' attivazzjoni metabolika, 0,5ml) ġeneralment għal 20 minuta jew aktar f'temperatura ta' 30- 37Ċ qabel ma titħallat ma' l-agar ta' kopertura u titferra fuq superfiċi ta' bażi ta' agar minimu. Ġeneralment 0,05 jew 0,1 ml tas-sustanza tat-test/soluzzjoni tat-test, 0,1 ml ta' batterja u 0,5ml ta' taħlita S9 jew tarka sterili jitħalltu ma' 2,0 ml ta' agar ta' kopertura. It-tubi għandhom jitħallew li tidħol l-arja fihom fl-istadju ta' qabel l-inkubazzjoni billi jintuża aġitatur.

Biex issir stima xierqa tal-varjazzjoni, għandhom jintużaw tarki ittriplikati għal kull livell ta' doża. L-użu ta' tarka duplikata hija aċċettabbli meta xjentement ġustifikata. It-telfa ta' kull tant ta' bażi ma tinvalidax it-test neċessarjament.

Sustanzi gassużi jew volatili għandhom jiġu ttestjati b'metodi xierqa, bħalma huma mezzi magħluqa (12) (14) (15) (16).

1.5.4. Inkubazzjoni

Il-bażijiet kollha f'eżami partikolari għandhom jiġu inkubati ta' 37 °Ċ għal 48-72 siegħa. Wara l-perjodu ta' inkubazzjoni, għandu jingħadd in-numru ta' konolji revertanti kull bażi.

2. INFORMAZZJONI

2.1. TRATTAMENT TAR-RIŻULTATI

Informazzjoni għandha tiġi preżentata bħala numru ta' kolonji revertanti kull bażi. Għandu jingħata wkoll in-numru ta' kolonji revertanti kemm dwar bażijiet ta' kontroll negattivi (kontroll tas-solvent, u kontroll mhux trattat, jekk ikun ġie użat) kif ukoll bażijiet ta' kontroll pożittivi. L-għadd ta' bażijiet individwali, in-numru medju ta' kolonji revertanti kull bażi u d-devjazzjoni standard għandhom jiġu preżentati għas-sustanza tat-test u għall-kontrolli pożittivi u negattivi (mhux trattati u/jew tas-solvent).

Ma hemmx ħtieġa ta' verifika għal rispons pożittiv ċar. Riżultati ambigwi għandhom jiġu ċċarati b'permezz ta' aktar testijiet preferibbilment billi jkun hemm modifika fil-kondizzjonijiet ta' l-esperiment. Riżultati negattivi għandhom jiġu konfermati fuq il-bażi ta' każ b'każ. F'dawk il-każijiet fejn il-konferma ta' riżultati negattivi mhiex ikkunsidrata bħala negattiva, trid tingħata ġustifikazzjoni. Modifikazzjonijiet ta' parametri ta' studju sabiex tiġi estiża l-medda tal-kondizzjonijiet stmati għandha tiġi kkonsidrata f'esperimenti ta' wara. Parametri ta' studju li jisgħu jiġu modifikati jinkludu l-ispazjar tal-konċentrazzjoni, il-metodu ta' trattament (inkorporazzjoni mal-bażi jew qabel l-inkubazzjoni fil-likwidu), u kondizzjonijiet ta' attivazzjoni metabolika.

2.2. VALUTAZZJONI U INTERPRETAZZJONI TA' RIŻULTATI

Hemm diversi kriterji sabiex jiġi determinat riżultat pożittiv, bħal żieda ta' relata mal-konċentrazzjoni matul il-medda ttestjata u/jew żieda riproduċibbli f'konċentrazzjoni waħda jew aktar fin-numru ta' kolonji revertanti kull bażi f'mill-inqas karatteristika waħda b'sistema ta' attivazzjoni metabolika jew mingħajrha (23). Għandha tiġi kunsidrata l-ewwel ir-rilevanza bijoloġika tar-riżultati. Jistgħu jintużaw metodi ta' statistika bħala għanjuna għal valutazzjoni tar-riżultati tat-test (24). Madankollu, is-sinjifikanza statistika ma għandhiex tkun l-uniku fattur determinanti għal rispons pożittiv.

Sustanza ta' test li dwarha r-riżultati ma josservawx il-kriterji fuq imsemmija hija kkunsidrata bħala mhux mutaġenika f'dan it-test.

Minkejja li ħafna esperimenti jagħtu riżultati ċari, pożittivi jew negattivi, f'każijiet rari l-informazzjoni mogħtija ma tippermettix li jsir ġudizzju definittiv dwar l-attività tas-sustanza tat-test. Ir-riżultati jistgħu jibqgħu ambigwi jew dubbjużi rrispettivament min-numru ta' drabi li jiġi ripetut l-esperiment.

Riżultati pożittivi mit-test ta' mutazzjoni reversibbli batterika jindikaw li s-sustanza tiġġenera mutazzjonijiet mal-punt permezz ta' sostituzzjonijiet fuq il-bażi jew tibdiliet fil-parametri tal-ġenomu ta' jew Salmonella typhimurium u/jew Escherichia coli. Riżultati negattivi jindikaw li taħt il-kondizzjonijiet tat-test is-sustanza tat-test mhix mutaġenika fl-ispeċi ttestjati.

3. RAPPURTAR

RAPPORT TAT-TEST

Ir-rapport tat-test għandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja:

Solvent/mezz:

- ġustifikazzjoni għall-għażla tas-solvent/mezz

- solubbilità u stabbilità tas-sustanza tat-test fis-solvent/mezz, jekk magħrufa.

Karatteristiċi:

- Karatteristiċi użati,

- numru ta' ċelluli kull kultura

- dettalji tal-karatteristiċi.

Kondizzjonijiet tat-Test

- ammont tas-sustanza tat-test kull bażi (mg/bażi jew μl/bażi) flimkien mar-raġuni bażija għall-għażla tad-doża u n-numru ta' bażijiet kull konċentrazzjoni.

- medja użata,

- tip u komposizzjoni ta' sistema ta' attivazzjoni metabolika, inklużi l-kriterji ta' aċċettazzjoni,

- proċeduri tat-trattament

Riżultati:

- sinjali ta' tossiċità,

- sinjali ta' preċipitazzjoni,

- għadd ta' bażijiet individwali,

- in-numru medju ta' kolonji rivertanti kull bażi u devjazzjoni standard,

- ir-relazzjoni bejn id-doża u r-rispons, fejn ikun possibbli,

- analiżi statistiċi, jekk ikun hemm,

- informazzjoni dwar kontroll negattiv (solvent/mezz) u pożittiv, fl-istess ħin, bil-meded, mezzi, u devjazzjonjiet standard.

- informazzjoni dwar kontroll negattiv (solvent/mezz) u pożittiv, storiċi, bil-meded, mezzi, u devjazzjonjiet standard.

Diskussjoni tar-riżultati

Konklużjonijiet.

4. REFERENZI

(1) Ames, B. N., McCann, J. and Yamasaki E. (1975), Methods of Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian-Microsome Mutagenicity Test, Mutation Res., 31, pp. 347-364.

(2) Maron, D. M. and Ames, B. N. (1983), Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test, Mutation Res., 113, pp. 173-215.

(3) Gatehouse, D., Haworth, S., Cebula, T., Gocke, E., Kier, L., Matsushima, T., Melcion, C., Nohmi, T., Venitt, S. and Zeiger, E. (1994), Recommendations for the Performance of Bacterial Mutation Assays, Mutation Res., 312, pp. 217-233.

(4) Kier, L. D., Brusick D. J., Auletta, A. E., Von Halle, E. S., Brown, M. M., Simmon, V. F., Dunkel, V., McCann, J., Mortelmans, K., Prival, M., Rao, T. K. and Ray V. (1986), The Salmonella typhimurium/Mammalian Microsomal Assay: A Report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program, Mutation Res., 168, pp. 69-240.

(5) Yahagi, T., Degawa, M., Seino, Y. Y., Matsushima, T., Nagao, M., Sugimura, T. and Hashimoto, Y. (1975), Mutagenicity of Carcinogen Azo Dyes and their Derivatives, Cancer Letters 1, pp. 91-96.

(6) Matsushima, M., Sugimura, T., Nagao, M., Yahagi, T., Shirai, A. and Sawamura, M. (1980), Factors Modulating Mutagenicity Microbial Tests, in: Short-term Test Systems for Detecting Carcinogens, ed. Norpoth K. H. and Garner, R. C., Springer, Berlin-Heidelberg-New York, pp. 273-285.

(7) Gatehouse, D. G., Rowland, I. R., Wilcox, P., Callender, R. D. and Foster, R. (1980), Bacterial Mutation Assays, in: Basic Mutagenicity Tests: UKEMS Part 1 Revised, ed. D. J. Kirkland, Cambridge University Press, pp. 13-61.

(8) Aeschacher, H. U., Wolleb, U. and Porchet, L. (1987), Liquid Preincubation Mutagenicity Test for Foods, J. Food Safety, 8, pp. 167-177.

(9) Green, M. H. L., Muriel, W. J. and Bridges, B. A. (1976), Use of a simplified fluctuation test to detect low levels of mutagens, Mutation Res., 38, pp. 33-42.

(10) Hubbard, S. A., Green, M. H. L., Gatehouse, D. and Bridges, J. W. (1984), The Fluctuation Test in Bacteria, in: Handbook of Mutagenicity Test Procedures, 2nd Edition, ed. Kilbey, B. J., Legator, M., Nichols, W. and Ramel, C., Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, pp. 141-161.

(11) Thompson, E. D. and Melampy, P. J. (1981), An Examination of the Quantitative Suspension Assay for Mutagenesis with Strains of Salmonella typhimurium, Environmental Mutagenesis, 3, pp. 453-465.

(12) Araki, A., Noguchi, T., Kato, F. and Matsushima, T. (1994), Improved Method for Mutagenicity Testing of Gaseous Compounds by Using a Gas Sampling Bag, Mutation Res., 307, pp. 335-344.

(13) Prival, M. J., Bell, S. J., Mitchell, V. D., Reipert, M. D. and Vaughan, V. L. (1984), Mutagenicity of Benzidine and Benzidine-Congener Dyes and Selected Monoazo Dyes in a Modified Salmonella Assay, Mutation Res., 136, pp. 33-47.

(14) Zeiger, E., Anderson, B. E., Haworth, S., Lawlor, T. and Mortelmans, K. (1992), Salmonella Mutagenicity Tests. V. Results from the Testing of 311 Chemicals, Environ. Mol. Mutagen., 19, pp. 2-141.

(15) Simmon, V., Kauhanen, K. and Tardiff, R. G. (1977), Mutagenic Activity of Chemicals Identified in Drinking Water, in Progress in Genetic Toxicology, D. Scott, B. Bridges and F., Sobels (eds.) Elsevier, Amsterdam, pp. 249-258.

(16) Hughes, T. J., Simmons, D. M., Monteith, I. G. and Claxton, L. D. (1987), Vaporisation Technique to Measure Mutagenic Activity of Volatile Organic Chemicals in the Ames /Salmonella Assay, Environmental Mutagenesis, 9, pp. 421-441.

(17) Matsushima, T., Matsumoto, A., Shirai, M., Sawamura, M., and Sugimura, T. (1979), Mutagenicity of the Naturally Occurring Carcinogen Cycasin and Synthetic Methylazoxy Methane Conjugates in Salmonella typhimurium, Cancer Res., 39, pp. 3780-3782.

(18) Tamura, G., Gold, C., Ferro-Luzzi, A. and Ames, B. N. (1980), Fecalase: A Model for Activation of Dietary Glycosides to Mutagens by Intestinal Flora, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, pp. 4961-4965.

(19) Wilcox, P., Naidoo, A., Wedd, D. J. and Gatehouse, D. G. (1990), Comparison of Salmonella typhimurium TA 102 with Escherichia coli WP2 Tester strains, Mutagenesis, 5, pp. 285-291.

(20) Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. (1976), A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer or Metabolic Activation Systems, in: In vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, eds. F. J. de Serres et al. Elsevier, North Holland, pp. 85-88.

(21) Elliot, B. M., Combes, R. D., Elcombe, C. R., Gatehouse, D. G., Gibson, G. G., Mackay, J. M. and Wolf, R. C. (1992), Alternatives to Aroclor 1254-induced S9 in in vitro Genotoxicity Assays, Mutagenesis, 7, pp. 175-177.

(22) Maron, D., Katzenellenbogen, J. and Ames, B. N. (1981), Compatibility of Organic Solvents with the Salmonella/Microsome Test, Mutation Res., 88, pp. 343-350.

(23) Claxton, L. D., Allen, J., Auletta, A., Mortelmans, K., Nestmann, E. and Zeiger, E. (1987), Guide for the Salmonella typhimurium/Mammalian Microsome Tests for Bacterial Mutagenicity, Mutation Res., 189, pp. 83-91.

(24) Mahon, G. A. T., Green, M. H. L., Middleton, B., Mitchel, I., Robinson, W. D. and Tweats, D. J. (1989), Analysis of Data from Microbial Colony Assays, in: UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing, Part II. Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, ed. Kirkland, D. J., Cambridge University Press, pp. 28-65."

--------------------------------------------------

ANNESS 4E

"B.17. MUTAĠENEĊITÀ – TEST TAL-MUTAZZJONI TAL-ĠENE TAĊ-ĊELLULA TAL-MAMMIFERI IN VITRO

1. METODU

Dan il-metodu huwa replika tal-OECD TG 476, Test tal-Mutazzjoni tal-Ġene taċ-Ċellula tal-Mammiferi In Vitro (1997).

1.1. INTRODUZZJONI

It-test tal-mutazzjoni tal-ġene taċ-ċellula tal-mammiferi in vitro jista' jintuża biex jiġu żvelati mutazzjonijiet tal-ġene miġjuba minn sustanzi kimiċi. Il-linji ta' ċelluli xierqa jinkludu L5178Y ċelluli mouse lymphoma, il-linji CHO, CHO-AS52 u V79 ta' ċelluli ta' Chinese hamster, u ċ-ċelluli umani lymphoblastoid TK6 (1). F'dawn il-linji ta' ċelluli l-punti tat-truf ġenetiċi li l-aktar jintużaw ikejlu l-mutazzjoni fi thymidine kinase (TK) u hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase (HPRT), u transġene ta' xanthine-guanine phosphoribosyl transferase (XPRT). It-testijiet ta' mutazzjoni TK, HPRT u XPRT jiżvelaw dehriet differenti ta' ġrajjiet ġenetiċi. Il-lok awtosomali ta' l-TK u l-XPRT jista' jippermetti l-iżvelar ta' ċerti ġrajjiet ġenetiċi (eż. ħafna tħassir) li mhumiex żvelati fil-locus HPRT locus fuq kromożomi X (2)(3)(4)(5)(6).

Fit-test tal-mutazzjoni tal-ġene taċ-ċellula tal-mammiferi in vitro, jistgħu jintużaw kulturi ta' linji ta' ċelluli jew karatteristiċi ta' ċelluli. Iċ-ċelluli li jintużaw jingħażlu fuq il-bażi tal-kapaċità tagħhom li jiżviluppaw f'kultura u l-istabbilità fil-frekwenza ta' mutazzjoni spontanea.

Ġeneralment it-testijiet imwettqa in vitro jeħtieġu l-użu ta' għejun esoġeneu ta' attivazzjoni metabolika. Din is-sistema ta' attivazzjoni metabolika ma tistax tikkopja kompletament il-kondizzjonijiet in vivo fil-mammiferi. Wieħed għandu jevita kondizzjonijiet li jistgħu jwasslu għal riżultati li ma jirriflettux mutaġeneċità intrinsika. Jista' jkun hemm riżultati posittivi li ma jirriflettux mutaġeneċità intrinsika minn bidliet fil-pH, osmolalità jew livelli għolja ta' ċitotossiċità (7).

Dan it-test jintuża biex tiġi individwata l-possibbiltà ta' mutaġeni u karċinoġeni fil-mammiferi. Ħafna komposti li huma posittivi f'dan it-test huma karċinoġeni fil-mammiferi; madankollu, m'hemmx korrelazzjoni perfetta bejn dan it-test u l-karċinoġeniċità. Il-korrelazzjoni tiddependi fuq il-klassi kimika u hemm evidenza dejjem tiżdied li jeżistu karċinoġeni li ma jiġux żvelati b'dan it-test għax jidhru li jaġixxu permezz ta' mekkaniżmi oħra mhux ġenotossiċi jew mekkaniżmi li ma jeżistux f'ċelluli batteriċi (6).

Ara ukoll l-Introduzzjoni Ġenerali Taqsima B:

1.2. TIFSIRIET

Mutazzjoni 'l quddiem : mutazzjoni tal-ġene mit-tip parental ital-forma mutanti li toħloq alterazzjoni jew telf ta' l-attività enżimatika tal-funzjoni tal-proteina kodifikata.

Mutaġeni li jġibu s-sostituzzjoni tal-koppji tal-bażi : sustanzi li jikkawżaw is-sostituzzjoni ta' koppji tal-bażi waħda jew aktar fid-DNA.

Mutaġeni li jġibu l-mutazzjoni tal-fażi tal-qari : sustanzi li jikkawżaw iż-żieda jew it-tħassir ta' pari ta' bażi waħda jew multipli fil-molekula tad-DNA.

Ħin ta' espressjoni fenotipika : perjodu li fih prodotti ta' ġene mhux mibdula jitneħħew mill-għadd ta' ċelluli vijabbli.

Frekwenza mutanti : l-għadd ta' ċelluli mutanti osservati diviżi bl-għadd ta' ċelluli vijabbli.

Żvilupp totali relattiv : żieda fl-għadd taċ-ċelluli tul iż-żmien komparata ma' popolazzjoni ta' ċelluli ta' kontroll; kalkolat bħala l-prodott ta' l-iżvilupp tas-sospensjoni relattiv għaż-żminijiet ta' kontroll negattiv għall-effiċjenza tal-klonazzjoni relattiva għall-kontroll negattiv.

Żvilupp tas-sospensjoni relattiv : żieda fl-għadd taċ-ċelluli tul il-perjodu ta' espressjoni relattiv għall-kontroll negattiv.

Vijabilità : l-effiċjenza tal-klonazzjoni taċ-ċelluli trattati fil-ħin ta' meta jitqiegħdu fuq bażi f'kondizzjonijiet selettivi wara l-perjodu ta' espressjoni.

Sopravivenza : l-effiċjenza tal-klonazzjoni taċ-ċelluli trattati meta jitqiegħdu fuq bażi wara li jintemm il-perjodu ta' trattament; ġeneralment is-sopravivenza hija espresso paragunata mas-sopravivenza tal-popolazzjoni taċ-ċelluli ta' kontroll.

1.3. PRINĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST

Iċ-ċelluli li għandhom nuqqas ta' thymidine kinase (TK) minħabba fil-mutazzjoni TK+/- → TK-/- huma reżistenti għall-effetti ċitotossiċi tal-pyrimidine analogue trifluorothymidine (TFT). Iċ-ċelluli profiċenti tat-Thymidine kinase huma sensittivi għat-TFT, li joħloq l-inibizzjoni tal-metaboliżmu ċellulari u jwaqqaf aktar diviżjoni fiċ-ċelluli. B'hekk ċelluli mutanti jistgħu jipproliferaw fil-presenza tat-TFT, waqt li ċelluli normali, li jkun fihom it-thymidine kinase, ma jistgħux. Bl-istess mod, ċelluli li għandhom nuqqas ta' HPRT jew XPRT jingħażlu skond ir-reżistenza għal 6-thioguanine (TG) jew 8-azaguanine (AG). Il-karatteristiċi tas-sustanza tat-test għandhom jiġu meqjusa sew jekk jiġi ttestjat analogu tal-bażi jew compost relatat ma' l-aġent selettiv f'xi wieħed mit-testijiet tal-mutazzjoni tal-ġene taċ-ċellula fil-mammiferi. Bħala eżempju, għandha tiġi investigata kull tossiċità selettiva suspettata bis-sustanza tat-test għal ċelluli mutanti u mhux mutanti. Għalhekk, il-prestazzjoni tas-sistema/aġent tas-selezzjoni għandha tiġi konfermata meta jiġu ttestjati kimiċi li huma strutturalment relatati ma' l-aġent selettiv (8).

Iċ-ċelluli f'sospensjoni jew kultura monostrata huma esposti għas-sustanza tat-test, kemm bl-attivazzjoni metabolika kif ukoll mingħajrha, gġal perjodu ta' żmien xieraq u subkulturati biex jippermettu l-espressjoni fenotipika qwabel is-selezzjoni mutanti (9) (10) (11) (12) (13). Normalment iċ-ċitossiċità tiġi stabbilita billi titkejjel l-effiċjenza ta' klonazzjoni relattiva (sopravivenza) jew l-iżvilupp totali relattiv tal-kulturi wara l-perjodu ta' trattament. Il-kulturi ttrattati jinżammu f'medjum ta' żvilupp għal perjodu ta' żmien suffiċjenti, karatteristiku ta' kull locus magħżul u tip ta' ċellula, biex jippermetti l-espressjoni fenotipika kważi ottimali tal-mutazzjonijiet magħmula. Il-frekwenza mutanti tiġi stabbilita bl-inseminazzjoni ta; għadd magħruf ta' ċelluli f'medjum li jkun fih l-aġent selettiv biex jiġu żvelati ċelluli mutanti u f'medjum mingħajr aġent selettiv biex tiġi żvelata l-effiċjenza tal-klonazzjoni (vijabilità). Wara perjodu xieraq ta' inkubazzjoni, jingħaddu l-kolonji. Il-frekwenza mutanti hi derivate mill-għadd ta' kolonji mutanti f'medjum selettiv u l-għadd ta' kolonji f'medjum mhux selettiv.

1.4. DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST

1.4.1. Preparazzjonijiet

1.4.1.1. Ċelluli

Hemm varjetà ta' ċelluli disponibbli għall-użu għal dan it-test inklużi subkloni ta' ċelluli ta' L5171Y, CHO, CHO-AS52, V79 jew TK6. It-tipi ta' ċelluli wżati f'dan it-test għandhom ikunu ddimostraw sensitività għal mutaġeni kimiċi, effiċjenza għolja ta' klonazzjoni u frekwenza mutanti spontanea stabbli. Iċ-ċelluli għandhom jiġu kontrollati għal kontaminazzjoni mill-mikoplasma u m'għandhomx jintużaw jekk ikunu kontaminati.

It-test għandu jkun iddisinjat biex ikollu sensitività u qawwa prederterminata. L-għadd ta' ċelluli, kulturi u konċentrazzjonijiet tas-sustanza tat-test użati għandhom jirriflettu dawn il-parametri definiti (14). L-għadd minimu ta' ċelluli vijabbli li jinqgħu ħajjin wara it-trattament u li jintużaw f'kull stadju tat-test għandu jkun msejjes fuq il-frekwenza tal-mutazzjoni spontanea. Gwida ġenerali hija li jintuża għadd ta' ċelluli li hu għall-inqas 10 darbiet l-invers tal-frekwenza tal-mutazzjoni spontanea. Madankollu, huwa rakkomandat li jiġu utilizzati għall-inqas 106 ċelluli. Informazzjoni storika xierqa dwar is-sistema taċ-ċellula użata għandha tkun disponibbli biex tindika l-prestazzjoni konsistenti tat-test.

1.4.1.2. Postijiet u kondizzjonijiet tal-kulturi

Għandhom jintużaw postijiet tal-kulturi xierqa, u kondizzjonijiet ta' inkubazzjoni (kontenituri tal-kulturi, temperatura, konċentrazzjoni ta' CO2 u umdità). Il-postijiet għandhom jingħażlu skond is-sistemi selettivi u t-tip ta' ċellula użati f'dan it-test. Huwa partikolarment importanti li l-kondizzjonijiet tal-kulturi jingħażlu hekk li jiżguraw l-iżvilupp ottimali taċ-ċelluli waqt il-perjodu ta' espressjoni u l-kapaċità tal-formazzjoni ta' kolonji ta' kemm iċ0ċelluli mutanti kif ukoll dawk mhux mutanti.

1.4.1.3. Preparazzjoni tal-kulturi

Iċ-ċelluli huma propagati minn ħażniet ta' kulturi, inseminati f'medjum ta' kultura u inkubati f'temperatura ta' 37 °Ċ. Qabel ma jintużaw f'dan it-test, il-kulturi għandhom jitnaddfu minn ċelluli mutanti pre-eżistenti.

1.4.1.4. Attivazzjoni metabolika

Iċ-ċelluli għandhom jiġu esposti għas-sustanza tat-test kemm fil-preżenza kif ukoll fl-assenza ta' sistema ta' attivazzjoni metabolika xierqa. Is-sistema l-aktar użata hija frazzjoni post mitokondrijali supplimentata b'kofattur (S9) preparata mill-fwied ta' annimali gerriema trattat b'aġenti li jġibu l-enżimi bħal ma huma l-Aroklor 1254 (15) (16) (17) (18) jew taħlita ta' phenobarbitone u β-naphthoflavone (19) (20).

Normalment il-frazzjon post mitokondrijali tintuża f'konċentrazzjonijiet fil-medda minn 1-10 % v/v fil-medjum finali tat-test. L-għażla u l-kondizzjoni ta' sistema ta' attivazzjoni metabolika tista' tiddependi fuq il-klassi tal-kimika li tkun qed tiġi ttestjata. F'ċerti każijiet jista' jkun xieraq li tiġi utilizzata iktar minn konċentrazzjoni waħda tal-frazzjon post mitokondrijali.

Numru ta' żviluppi, inkluża l-kostruzzjoni ta' linji ta' ċelluli ta' inġinerija ġenetika li jesprimu enżimi ta' attivazzjoni speċifika, jistgħu jipprovdu l-potenzal għall-attivazzjoni endoġenea. L-għażla tal-linji taċ-ċelluli użati għandha tkun ġustifikata xjentifikament (eż. bir-rilevanza ta' l-isoenżim ċitokromu P450 għall-metaboliżmu tas-sustanza tat-test).

1.4.1.5. Preparazzjoni tas-sustanza tat-test

Sustanzi tat-test solidi għandhom jiġu mdewba jew sospiżi f'solventi jew mezzi xierqa u dilwiti jekk ikun xieraq qabel it-trattament taċ-ċelluli. Sustanzi tat-test likwidi jistgġu jiżdiedu direttament mas-sistemi tat-test u/jew dilwiti qabel it-trattament. Għandhom jintużaw preparazzjonijiet ġodda tas-sustanza tat-test sakemm l-informazzjoni dwar l-istabbilità ma turix l-aċċettabbilità tal-ħażna.

1.4.2. Kondizzjonijiet tat-test

1.4.2.1. Solvent/mezz

Ma għandux jkun hemm suspett ta' reazzjoni kimika tas-solvent/mezz mas-sustanza tat-test u s-solvent/mezz għandu jkun kompatibbli mas-sopravivenza taċ-ċelluli u l-attività S9. Jekk jintużaw solventi/mezzi oħra magħrufa, l-inklużjoni tagħhom għandha tkun sostnuta b'informazzjoni li tindika l-kompatibilità tagħhom. Huwa rakkomandat li kull fejn ikun possibbli l-ewwel jiġi kkunsidrat l-użu ta' solvent/mezz akkwuż. Meta jiġu testjati sustanzi li mhumiex stabbli fl-ilma, is-solventi organiċi li jintużaw ma għandhux ikollhom ilma. L-ilma jista' jitneħħa billi jiżdied passatur molekulari.

1.4.2.2. Konċentrazzjonijiet ta' esposizzjoni

Fost il-kriterji li għandhom jitqiesu biex tiġi stabbilita l-ogħla konċentrazzjoni hemm iċ-ċitossiċità, is-solubbilità fis-sistema tat-test u bidliet fil-pH jew osmolalità.

Iċ-ċitossiċita għandha tiġi stabbilita bl-attività metabolika jew mingħajrha fl-esperiment prinċipali bl-użu ta' indikazzjoni xierqa ta' integrità u żvilupp taċ-ċelluli, bħal ma huma l-effiċjenza tal-klonazzjoni relattiva (sopravivenza) jew l-iżvilupp totali relattiv. Jista' jkun utli li jiġu determinati ċ-ċitossiċità u s-solubbilità f'esperiment preliminari.

Għandhom jintużaw għall-inqas erba' konċentrazzjonijiet analizzabbli. Fejn ikun hemm iċ-ċitossiċità, dawn il-konċentrazzjonijiet għandhom ikopru medda mill-massimu għal ftit jew l-ebda ċitossiċità. Dan normalment ifisser li l-livelli ta' ċitossiċità għandhom jiġu separati b'mhux iżjed minn fattur bejn 2 u √10. Jekk il-konċentrazzjoni massima hi msejsa fuq iċ-ċitossiċità allura għandha tirriżulta f'madwar 10-20 % (iżda mhux inqas minn 10 %) sopravivenza relattiva (effiċjenza ta' klonazzjoni relattiva) jew żvilupp totali relattiv. Għal sustanzi relattivament mhux tossiċi, il-konċentrazzjoni massima tat-test għandha tkun 5 mg/ml, 5 μl/ml, jew 1,01 M, liema minnhom ikun l-anqas.

Sustanzi relattivament mhux solubbli għandhom jiġu ttestjati sa jew lil hinn mil-limitu tagħhom ta' solubilità taħt kondizzjonijiet ta' kulturi. Il-prova tas-solubbilità għandha tiġi stabbilita fil-medjum tat-trattament finali li għalih huma esposti ċ-ċelluli. Jista' jkun utli li tiġi valutata s-solubilità fil-bidu u fl-aħħar tat-trattament, għax is-solubilità tista' tinbidel waqt il-kors ta' l-esposizzjoni fis-sistema tat-test minħabba fil-preżenza ta' ċelluli, S9, serum eċċ. L-insolublità tista' tiġi żvelata mingħajr għajnuna lill-għajn. Il-preċipitat m'għandux jostakola l-għadd.

1.4.2.3. Kontrolli

Għandhom jiġu inklużi f'kull esperiment kontrolli posittivi u negattivi fl-istess ħin (solvent jew mezz), kemm bl-attivazzjoni metabolika kif ukoll mingħajrha. Meta tintuża l-attivazzjoni metabolika, il-kimika ta' kontroll posittiva għandha tkun dik lit eħtieġ li l-attivazzjoni tagħti rispons mutaġeniku.

Eżempji ta' sustanzi ta' kontroll posittiv jinkludu:

Kondizzjoni ta' attivazzjoni metabolika | Post | Sustanza | Nru SAK | Nru Einecs |

Assenza ta' attivazzjoni metabolika essoġenea | HPRT | Metansulfonat ta' l-etil | 62-50-0 | 200-536-7 |

Nitrosourea ta' l-etil | 759-73-9 | 212-072-2 |

TK (kolonji żgħar u kbar) | Metansulfonat tal-metil | 66-27-3 | 200-625-0 |

XPRT | Metanesulfonat ta' l-etil | 62-50-0 | 200-536-7 |

Nitrosourea ta' l-etil | 759-73-9 | 212-072-2 |

Preżenza ta' attivazzjoni metabolika essoġenea | HPRT | 3-Metilkolantrena | 56-49-5 | 200-276-4 |

N-nitrosodimetilamina | 62-75-9 | 200-549-8 |

7,12-Dimetilbenżantraċena | 57-97-6 | 200-359-5 |

TK (kolonji żgħar u kbar) | Ċiklofosfamida | 50-18-0 | 200-015-4 |

Ċiklofosfamidmonojidrat | 6055-19-2 | |

Benżo(a)pirena | 50-32-8 | 200-028-5 |

3-Metilkolantrena | 56-49-5 | 200-276-5 |

XPRT | N-nitrosodimetilamina (għal livelli għoljin ta' S9) | 62-75-9 | 200-549-8 |

Benżo(a)pirena | 50-32-8 | 200-028-5 |

Jistgħu jintużaw sustanzi ta' referenza ta' kontroll posittiv oħra xierqa, eż. jekk laboratorju jkollu bażi ta' informazzjoni storika fuq 5-bromo 2'-deoxyuridine (Nru SAK 59-14-3, Nru Einecs 200-415-9), tista' tintuża ukoll din is-sustanza ta' referenza. Meta jkunu disponibbli, għandu jiġi kkunsidrat l-użu ta' kimiċi ta' kontroll posittiv relatat ma' klassi ta' kimika.

Għandhom jiġu inklużi kontrolli negattivi, li jikkonsistu biss f'solvent jew mezz fil-medjum ta' trattament, u trattati bl-istess mod bħall-gruppi ta' trattament. B'żieda ma' dan għandhom jintużaw ukoll kontrolli mhux trattati sakemm l-informazzjoni storika ta' kontroll turi li ma jkunx hemm effetti dannużi jew mutaġeniċi kkawżati mis-solvent magħżul.

1.4.3. Procedura

1.4.3.1. Trattament bis-sustanza tat-test

Iċ-ċelluli li jipproliferaw għandhom jiġu esposti għas-sustanza tat-test kemm bl-attivazzjoni metabolika kif ukoll mingħajrha. L-esposizzjoni għandha tkun għal perjodu xieraq ta' żmien (normalment 3-6 sigħat hu effettiv). Il-ħin ta' l-esposizzjoni jista' jittawwal fuq ċiklu ta' ċelluli wieħed jew aktar.

Jistgħu jintużaw kulturi ttrattati duplikati jew singoli ma' kull konċentrazzjoni ttestjata. Meta jintużaw kulturi singoli, l-għadd ta' konċentrazzjonijiet għandu jiżdied biex jiġi żgurat li jkun hemm numru adegwat ta' kulturi għall-analiżi (eż. għall-inqas tmien konċentrazzjonijiet analizzabbli). Għandhom jintużaw kulturi ta' kontroll negattivi duplikati (solvent).

Sustanzi gassużi jew volatili għandhom jiġu ttestjati b'metodi xierqa, bħal ma huma f'kontenituri magħluqa ta' kulturi (21) (22).

1.4.3.2. Tkejjil ta' sopravivanza, vijabbilita u frekwenza tal-mutazzjonijiet

Fl-aħħar tal-perjodu ta' esposizzjoni, iċ-ċelluli jinħaslu u jitqiegħdu f'kulturi biex tiġi determinata s-sopravivenza u biex jippermettu l-espressjoni tal-fenotip mutanti. It-tkejjil taċ-ċitossiċità billi tiġi determinata l-effiċjenza tal-klonazzjoni relattiva (sopravivenza) jew l-iżvilupp totali relattiv tal-kulturi normalment jinbeda wara l-perjodu ta' trattament.

Kull locus għandu ħtieġa ta' żmien minimu definit biex jippermetti l-espressjoni fenotipika kważi ottimali tal-mutanti ġodda li jkunu nħolqu (HPRT u XPRT jeħtieġu għall-inqas 6-8 ijiem, u TK għall-inqas jumejn). Iċ-ċelluli jitkabbru f'medjum b'aġent(i) selettiv(i) jew mingħajru(hom) għad-determinazzjoni ta' l-għadd ta' mutanti u l-effiċjenza tal-klonazzjoni, rispettivament. It-tkejjil tal-vijabilità (li jintuża biex tiġi kalkolata l-frekenza tal-mutazzjonijiet) jinbeda fl-aħħar tal-perjodu ta' espressjoni billi jitqiegħdu fuq bażi fil-medjum mhux selettiv.

Jekk is-sustanza tat-test tkun posittiva fit-test tal-L5178Y TK+/-, il-qies tal-kolonji għandu jiġi rilevat fuq għall-inqas waħda mill-kulturi tat-test (l-ogħla konċentrazzjoni posittiva) u fuq il-kontrolli negattivi u posittivi. Jekk is-sustanza tat-test hi negattiva fit-test L5178Y TK+/-, il-qies tal-kolonji għandu jiġi rilevat fuq il-kontrolli negattivi u posittivi. Fi studji li jużaw il-TK6TK+/-, għandu jitwettaq ukoll il-qies tal-kolonji.

2. INFORMAZZJONI

2.1. TRATTAMENT TAR-RIŻULTATI

L-informazzjoni għandha tinkludi d-determinazzjoni taċ-ċitossiċità u l-vijabilità, l-għadd ta' kolonji, u l-frekwenzi ta' mutazzjonijiet għall-kulturi ta' trattament u ta' kontroll. Fil-każ ta' rispons posittiv fit-test tal-L5178Y TK+/-, il-kolonji jingħaddu billi jintuża l-kriterju ta' kolonji żgħar u kbar f'għall-inqas konċentrazzjoni waħda tas-sustanza tat-test (l-ogħla konċentrazzjoni posittiva) u fuq il-kontroll negattiv u posittiv. In-natura molekulari u ċitoġenetika ta' kolonji ta' mutazzjonijiet kemm kbar kif ukoll żgħar ġiet esplorata fid-dettall (23) (24). Fit-test tat-TK+/-, il-kolonji jingħaddu billi jintuża l-kriterju ta' tkabbir normali (kbar) u tkabbir bil-mod (żgħar) ta' kolonji. (25). Iċ-ċelluli ta' mutazzjoni li jkunu sofrew l-aktar ħsara ġenetika estensiva għandhom żminijiet ta' duplikazzjoni aktar prolongati u għalhekk jiffurmaw kolonji żgħar. Din il-ħsara tipikament tinfirex fl-iskala mit-telf tal-ġene intier għal devjazzjonijiet viżibbli karjotipikament tal-kromożomi. Il-presenza ta' kolonji żgħar mutanti ġiet assoċjata ma' kimiċi li jipproduċu alterazzjonijiet kbar fil-kromożomi (26). Ċelluli mutanti li jkunu ġew affettwati anqas serjament jikbru b'rati simili għal dawk ta' ċelluli parentali u jifformaw kolonji kbar.

Għandu jingħata l-ammont ta' sopravivenza (effiċjenzi ta' klonazzjoni relattivi) jew l-iżvilupp totali relattiv. Il-frekwenza tal-mutazzjoni għandha tiġi espressa bħala n-numru ta' ċelluli mutanti paragunat man-numru ta' ċelluli li jibqgħu ħajjin.

Għandha tingħata l-informazzjoni dwar il-kulturi differenti. B'żieda ma' dan, għandu jingħata sommarju ta' l-informazzjoni kollha fil-forma ta' tabella.

Ma hemm l-ebda ħtieġa għall-verifika ta' rispons posittiv ċar. Ir-riżultati dubbjużi għandhom jiġu ċċarati bżaktar testijiet preferibbilment billi jkun hemm modifika fil-kondizzjonijiet ta' l-esperiment. Riżultati negattivi għandhom jiġu konfermati fuq bażi ta' każ b'każ. F'dawk il-każijiet fejn il-konferma ta' riżultati negattivi mhijiex kkunsidrata bħala meħtieġa, għandha tingħata ġustifikazzjoni. Għandha tiġi kkunsidrata l-modifika tal-parametri ta' studju biex tkabbar il-medda tal-kondizzjonijiet valutati f'esperimenti li jsiru wara minħabba f'riżultati dubbjużi jew negattivi. Parametri ta' studju li jistgħu jiġu modifikati jinkludu l-intervall bejn id-dożi valutati u l-kondizzjonijiet ta' attivazzjoni metabolika.

2.2. VALUTAZZJONI U INTERPRETAZZJONI TAR-RIŻULTATI

Hemm ħafna kriterji biex jiġi stabbilit risultat posittiv, bħal żieda relatata mal-konċentrazzjoni jew żieda riproduċibbli fil-frekwenza ta' mutazzjonijiet. L-ewwel għandha titqies ir-rilevanza bijoloġika tar-risultati. Jistgħu jintużaw metodi ta' statistika bħala għajnuna fil-valutazzjoni tar-risultati tat-test. Is-sinjifikanza statistika ma għandhiex tkun l-uniku fattur determinanti għal rispons posittiv.

Sustanza ta' test li dwarha ir-risultati ma jilħqux l-kriterji fuq imsemmija hija meqjusa bħala mhux mutaġenika f'din is-sistema.

Għalkemm il-biċċa l-kbira ta' l-istudji jagħtu risultati ċari posittivi jew negattivi, f'każijiet rari l-informazzjoni mogħtija ma tippermettix li jsir ġudizzju definittiv dwar l-attività tas-sustanza tat-test. Ir-risultati jistgħu jibqgħu dubbjużi jew mhux ċari minkejja n-numru ta' drabi li jiġi ripetut l-esperiment.

Risultati posittivi mit-test tal-mutazzjoni tal-ġene taċ-ċellula tal-mammiferi in vitro jindikaw li s-sustanza tat-test toħloq mutazzjonijiet tal-ġene fiċ-ċelluli ta' kulturi ta' mammiferi wżati. Rispons popsittiv dwar il-konċentrazzjoni li huwa riproduċibbli huwa ta' valur kbir. Risultati negattivi jindikaw li, taħt il-kondizzjonijiet tat-test, is-sustanza tat-test ma toħloqx mutazzjonijiet tal-ġene fiċ-ċelluli ta' kulturi ta' mammiferi wżati.

3. RAPPURTAR

RAPPORT TAT-TEST

Ir-rapport tat-test għandu jkun fih l-informazzjoni li ġejja:

Solvent/mezz:

- ġustifikazzjoni dwar l-għażla tal-mezz,

- solubbilità u stabbilità tas-sustanza tat-test fis-solvent/mezz, jekk magħrufa.

Ċelluli:

- tip u għejun taċ-ċelluli,

- numru ta' kulturi taċ-ċelluli,

- numru ta' passaġġi, jekk ikun applikabbli,

- metodi għall-manutenzjoni tal-kulturi taċ-ċelluli, jekk jkun applikabbli,

- assenza tal-mikoplasma.

Kondizzjonijiet tat-test:

- raġuni prinċipali għall-għażla tal-konċentrazzjonijiet u għadd ta' kulturi inklużi, eż. informazzjoni dwar ċitotossiċità u limitazzjonijiet dwar solubbilità, jekk ikunu disponibbli,

- komposizzjoni tal-medja, konċentrazzjoni CO2,

- konċentrazzjoni tas-sustanza tat-test,

- volum tal-mezz u sustanza tat-test miżjuda,

- temperatura ta' l-inkubazzjoni,

- perjodu ta' inkubazzjoni,

- kemm idum it-trattament,

- densità taċ-ċellula waqt it-trattament,

- tip u komposizzjoni tas-sistema ta' attivazzjoni metabolika, inklużi krierji ta' aċċettabilità,

- kontrolli pożittivi u negattivi,

- tul tal-perjodu ta' espressjoni (inkluż in-numru ta' ċelluli fiż-żriegħ, u skedi ta' subkulturi u alimentazzjoni, jekk ikun xieraq),

- aġenti selettivi,

- kriterji biex it-testijiet jitqiesu bħala pożittivi, negattivi jew ekwivoċi,

- metodi wżati biex jingħadd in-numru ta' ċelluli viabbli u mutanti,

- tifsira ta' kolonji li dwarhom jitqiesu l-qies u t-tip (inklużi kriterji għal kolonji "żgħar" u "kbar", kif xieraq).

Riżultati:

- sinjali ta' tossiċità,

- sinjali ta' preċipitazzjoni,

- informazzjoni dwar pH u l-osmolalità waqt l-esposizzjoni għas-sustanza tat-test, jekk ikun stabbilit,

- qies tal-kolonja jekk reġistrat għall-inqas għall-kontrolli negattivi u posittivi,

- adegwatezza tal-laboratorju biex jiġu żvelati mutazzjonijiet f'kolonji żgħar bis sistema L5178Y TK+/-, fejn ikun xieraq,

- relazzjoni bejn id-doża u r-rispons, fejn ikun possibbli,

- analiżi statistiċi, jekk ikun hemm,

- informazzjoni dwar kontroll fl-istess ħin negattiv (solvent/mezz) u pożittiv,

- informazzjoni storika dwar kontroll negattiv (solvent/mezz) u pożittiv, bil-meded, mezzi u devjazzjonijiet standard,

- frekwenza ta' mutazzjonijiet.

Diskussjoni dwar ir-riżultati.

Konklużjonijiet.

4. REFERENZI

(1) Moore, M.M., DeMarini, D.M., DeSerres, F.J. and Tindal, K.R. (eds.) (1987), Banbury Report 28; Mammalian Cell Mutagenesis, Cold Spring Harbor Laboratory, New York.

(2) Chu, E.H.Y. and Malling H.V. (1968), Mammalian Cell Genetics. II. Chemical Induction of Specific Locus Mutations in Chinese Hamster Cells In Vitro, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 61, pp. 1306-1312.

(3) Liber, H.L. and Thilly, W.G. (1982), Mutation Assay at the Thymidine Kinase Locus in Diploid Human Lymphoblasts, Mutation Res. 94, pp. 467-485.

(4) Moore, M.M., Harington-Brock, K., Doerr, C.L. and Dearfield, K.L. (1989), Differential Mutant Quantitation at the Mouse Lymphoma TK and CHO HGPRT Loci, Mutagenesis, 4, pp. 394-403.

(5) Aaron, C.S., and Stankowski, Jr. L.F., (1989), Comparison of the AS52/XPRT and the CHO/HPRT Assays: Evaluation of Six Drug Candidates, Mutation Res. 223, pp. 121-128.

(6) Aaron, C.S., Bolcsfoldi, G., Glatt, H.R., Moore, M., Nishi, Y., Stankowski, Jr. L.F., Theiss, J. and Thompson, E. (1994), Mammalian Cell Gene Mutation Assays Working Group Report. Report of the International Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Procedures. Mutation Res. 312, pp. 235-239.

(7) Scott, D., Galloway, S. M., Marshall, R. R., Ishidate, M., Brusick, D., Ashby, J. and Myhr, B.C. (1991), Genotoxicity Under Extreme Culture Conditions. A report from ICPEMC Task Group 9, Mutation Res. 257, pp. 147-204.

(8) Clive, D., McCuen, R., Spector, J. F. S., Piper, C. and Mavournin, K. H. (1983), Specific Gene Mutations in L5178Y Cells in Culture. A Report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program, Mutation Res., 115, pp. 225-251.

(9) Li, A. P., Gupta, R. S., Heflich, R. H. and Wasson, J. S. (1988), A Review and Analysis of the Chinese Hamster Ovary/Hypoxanthine Guanine Phosphoribosyl Transferase System to Determine the Mutagenicity of Chemical Agents: A Report of Phase III of the U.S. Environmental Protections Agency Gene-Tox Program, Mutation Res., 196, pp. 17-36.

(10) Li, A. P., Carver, J. H., Choy, W. N., Hsie, A. W., Gupta, R. S., Loveday, K. S., ÓNeill, J. P., Riddle, J. C., Stankowski, L. F. Jr. and Yang, L. L. (1987), A Guide for the Performance of the Chinese Hamster Ovary Cell/Hypoxanthine-Guanine Phosphoribosyl Transferase Gene Mutation Assay, Mutation Res., 189, pp. 135-141.

(11) Liber, H. L., Yandell, D. W. and Little, J. B. (1989), A Comparison of Mutation Induction at the TK and HPRT Loci in Human Lymphoblastoid Cells: Quantitative Differences are Due to an Additional Class of Mutations at the Autosomal TK Locus, Mutation Res., 216, pp. 9-17.

(12) Stankowski, L. F. Jr., Tindal,, K. R., and Hsie, A. W. (1986), Quantitative and Molecular Analyses of Ethyl Methanosulphonate - and ICR 191-Induced Molecular Analyses of Ethyl Methanosulphonate - and ICR 191 Induced Mutation in AS52 Cells, Mutation Res., 160, pp. 133-147.

(13) Turner, N. T., Batson, A. G. and Clive, D. (1984), Procedure for the L5178Y/TK+/- - TK+/- Mouse Lymphoma Cell Mutagenicity Assay, in: Kilbey, B. J. et al (eds.) Handbook of Mutagenicity Test Procedures, Elsevier Science Publishers, New York, pp. 239-268.

(14) Arlett, C. F., Smith, D. M., Clarke, G. M., Green, M. H. L., Cole, J., McGregor, D. B. and Asquith S. C. (1989), Mammalian Cell Gene Mutation Assays Based upon Colony Formation, in: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Kirkland, D. J., ed., Cambirdge University Press, pp. 66-101.

(15) Abbondandolo, A., Bonatti, S., Corti, G., Fiorio, R., Loprieno, N. and Mazzaccoro, A. (1977), Induction of 6-Thioguanine-Resistant Mutants in V79 Chinese Hamster Cells by Mouse-Liver Microsome- Activated Dimethylnitrosamine, Mutation Res. 46, pp. 365-373.

(16) Ames, B. N., McCann, J. and Yamasaki, E. (1975), Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian-Microsome Mutagenicity Test, Mutation Res. 31, pp. 347-364.

(17) Clive, D., Johnson, K. O., Spector, J. F. S., Batson A. G. and Brown M. M. M. (1979), Validation and Characterisation of the L5178Y/TK+/- - Mouse Lymphoma Mutagen Assay System, Mutat. Res. 59, pp. 61-108.

(18) Maron, D. M. and Ames, B. N. (1983), Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test, Mutation Res. 113, pp. 173-215.

(19) Elliott, B. M., Combes, R. D., Elcombe, C. R., Gatehouse, D. G., Gibson, G. G., Mackay, J. M. and Wolf, R. C. (1992), Alternatives to Aroclor 1254-Induced S9 in: In Vitro Genotoxicity Assays, Mutagenesis 7, pp. 175-177.

(20) Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. (1976), A Safe Substitute for Polycholrinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems, in: In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, de Serres, F. J., Fouts, J. R., Bend, J. R. and Philpot, R. M. (eds), Elsevier, North-Holland, pp. 85-88.

(21) Krahn, D. F., Barsky, F. C. and McCooey, K. T. (1982), CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids, in: Ticc, R. R., Costa, D. L., Schaich, K. M. (eds), Genotoxic Effects of Airborne Agents, New York, Plenum, pp. 91-103.

(22) Zamora, P. O., Benson, J. M., Li, A. P. and Brooks, A. L. (1983), Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown on Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in the CHO/HGPRT Mutation Assay, Environmental Mutagenesis, 5, pp. 795-801.

(23) Applegate, M. L., Moore, M. M., Broder, C. B., Burrell, A. and Hozier, J. C. (1990), Molecular Dissection of Mutations at the Heterozygous Thymidine Kinase Locus in Mouse Lymphoma Cells, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, pp. 51-55.

(24) Moore, M. M., Clive, D. Hozier, J. C., Howard, B. E., Batson, A. G., Turner, N. T. and Sawyer, J. (1985), Analysis of Trifluoronthymidine, Resistant (TFT+) Mutants of L5178Y/TK+/- - Mouse Lymphoma Cells, Mutation Res. 151, pp. 161-174.

(25) Yandell, D. W., Dryja, T. P. and Little, J. B. (1990), Molecular Genetic Analysis of Recessive Mutations at a Heterozygous Autosomal Locus in Human Cells, Mutation Res. 229, pp. 89-102.

(26) Moore, M. M. and Doerr, C. L. (1990), Comparison of Chromosome Aberration Frequency and Small Colony TK-Deficient Mutant Frequency in L5178Y/TK+/- - 3.7.2C Mouse Lymphoma Cells, Mutagenesis, 5, pp. 609-614."

--------------------------------------------------

ANNESS 4F

"'B.23. TEST DWAR ANORMALITÀ FIL-KROMOŻOMI SPERMATOGONI TAL-MAMMIFERI

1. METODU

Dan il-metodu huwa replika tat-Test OECD TG 483, Test dwar Anormalità fil-Kromożomi Spermatogoni tal-Mammiferi (1997).

1.1. INTRODUZZJONI

L-għan tat-test in vivo dwar anormalitajiet fil-kromożomi spermatogoni tal-mammiferi huwa biex jiġu identifikati sustanzi li jikkawżaw anormalitajiet strutturali fil-kromożomi fiċ-ċelluli spermatogoni tal-mammiferi (1) (2) (3) (4) (5). Anormalitajiet strutturali jistgħu jkunu ta' żewġ tipi, kromożomi jew kromatidi. Fil-maġġoranza ta' mutaġeni kimiċi, anormalitajiet imġiegħela huma tat-tip kromatidu, iżda jirrikorru wkoll anormalitajiet tat-tip ta' kromożomi. Dan il-metodu mhux intiż biex jitkejlu l-anormalitajiet numeriċi u ma jintużax bħala rutina għal dak il-għan. Mutazzjonijiet fil-kromożomi u ġrajjiet relatati huma l-kawża ta' ħafna mard ġenetiku fil-bniedem.

Dan it-test ikejjel l-ġrajjiet tal-kromożomi fiċ-ċelluli spermatogoni u, għalhekk, hu maħsub li jipprevedi l-mutazzjonijiet ġenetiċi fiċ-ċelluli ġerminali.

Annimali gerriema jintużaw generalment f'dan it-test. Dan it-test ċitoġenetiku jiżvela anormalitajiet fil-kromożomi f'mitosi spermatogoni. Ċelluli oħra mmirati mhumix l-oġġett ta' dan il-metodu.

Sabiex jiġu żvelati anormalitajiet tat-tip kromatid f'ċelluli spermatogoni, għandha tiġi eżaminata l-ewwel diviżjoni taċ-ċellula mitotika qabel ma jintilfu dawn il-leżjonijiet f'diviżjonijiet sussegwenti taċ-ċelluli. Tista' tinkiseb informazzjoni addizzjonali minn ċelluli spermatogoni trattati bl-analisi tal-kromożomi mejotiċi għal anormalitajiet tat-tip tal-kromożomi fil-metafażi tad-dijakinesis I meta ċ-ċelluli ttrattati jsiru spermatoċiti.

Dan it-test in vivo huwa intiż biex jinvestiga jekk mutaġeni ta' ċelluli somatiċi jkunux attivi f'ċelluli ġerminali. B'żieda ma' dan, it-test spermatogonu huwa rilevanti fil-valutazzjoni ta' perikli mutaġeniċi għax jippermetti l-konsiderazzjoni ta' fatturi ta' metaboliżmu in vivo, farmakokinetika u proċessi ta' tiswija ta' DNA.

Jeżisti numru ta' ġenerazzjonijiet ta' spermatogoni fit-testikoli bi spettru ta' sensitività għat-trattament kimiku. Għalhekk, l-anormalitajiet żvelati jirrappreżentaw rispons medju ta' popolazzjonijiet ta' ċelluli spermatogoni ttrattati, bi predominanza ta' ċelluli spermatogoni differenzati li jkunu aktar numerużi. Skond il-posizzjoni tagħhom fit-testikoli, ġenerazzjonijiet differenti ta' spermatogoni jistgħu jew ma jistgħux ikunu esposti għal ċirkolazzjoni ġenerali, minħabba fil-barriera fiżika u fiżjoloġika ta' ċelluli Sertoli u l-barriera ematotestikolari.

Jekk hemm xiedha li s-sustanza tat-test, jew metabolit reattiv, ma jwasslux għat-tessut immirat, mhux xieraq li jintuża dan it-test.

Ara ukoll Introduzzjoni ġenerali Taqsima B.

1.2. TIFSIRIET

Anormalità tat-tip kromatidu : ħsara strutturali fil-kromożomi espressa bħala ksur ta' kromatidi singoli jew ksur u għaqda mill-ġdid bejn kromatidi.

Anormalità tat-tip tal-kromożomi : ħsara strutturali fil-kromożomi espressa bħala ksur, jew ksur u għaqda mill-ġdid, taż-żewġ kromatidi f'sit identiku.

Vojt : leżjoni akromatika iżgħar mill-wisgħa ta' kromatid wieħed, u b'misallinjament minimu tal-kromatidi.

Anormalità numerika : bidla fin-numru ta' kromożomi min-numru karatteristku normali ta' ċelluli utilizzati.

Poliplojdi : multiplu tan-numru aplojdu ta' kromożomi (n) minbarra n-numru diplojdu (jiġifieri 3n, 4n, eċċetera).

Anormalità strutturali : bidla fl-istruttura tal-kromożomi li wieħed jinduna biha bl-eżami mikroskopiku ta' l-istadju metafażiku tad-diviżjoni ta' ċelluli, osservati bħala tħassir u biċċiet, bidliet minn ġewwa u bidliet bejniethom.

1.3. PRINĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST

Annimali huma esposti għas-sustanza tat-test b'rotta xierqa ta' esposizzjoni u huma sakrifikati f'ħinijiet xierqa wara t-trattament. Qabel ma jiġu sakrifikati, l-annimali huma ttrattati b'sustanza li twaqqaf il-metafażi (eż. kolċiċina jew Colcemid®). Imbagħad isiru preparazzjonijiet ta' kromożomi miċ-ċelluli ġerminali u jiġu mtebbgħin, u ċ-ċelluli metafażiċi jiġu analizzati għal anormalitajiet fil-kromożomi.

1.4. DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST

1.4.1. Preparazzjonijiet

1.4.1.1. Selezzjoni ta' l-ispeċi ta' l-annimali

Normalment jintużaw Chinese hamsters u ġrieden. Madankollu, jistgħu jintużaw l-annimali maskili ta' speċi oħra ta' mammiferi xierqa. Għandhom jintużaw razez, li komunement jintużaw fil-laboratorji, ta' annimali adulti b'saħħithom u żgħar. Fil-bidu ta' l-istudju, il-varjazzjoni fil-piż ta' l-annimali għandha tkun minima u ma teċċedix ± 20 % tal-medja tal-piż.

1.4.1.2. Kondizzjonijiet ta' fejn jinżammu u x'jieklu

Għandhom japplikaw il-kondizzjonijiet ġenerali msemmija fl-Introduzzjoni ġenerali għat-Taqsima B iżda l-mira dwar l-umdità għandha tkun 50-60 %.

1.4.1.3. Preparazzjoni ta' l-annimali

Annimali adulti żgħar u b'saħħithom jiġu assenjati mingħajr skema għall-gruppi ta' kontroll u trattament. Il-gaġeġ għandhom jitqiegħdu b'tali mod li jiġu minimizzati effetti possibbli li jirriżultaw minn kif jitqiegħdu l-gaġeġ. L-annimali jiġu identifikati wieħed wieħed. L-annimali jiġu akklimatizzati għall-kondizzjonijiet tal-laboratorju għall-inqas għal ħamest ijiem qabel ma jibda l-istudju.

1.4.1.4. Preparazzjoni tad-dożi

Sustanzi tat-test solidi għandhom jiġu mdewwbin jew sospiżi f'solventi jew kontenituri xierqa u dilwiti, jekk ikun xieraq, qabel it-trattament ta' l-annimali. Sustanzi likwidi tat-test jistgħu jiġu ttrattati direttament jew dilwiti qabel it-trattament. Għandhom jintużaw preparazzjonijiet ġodda għas-sustanza tat-test kemm-il darba l-informazzjoni dwar l-istabbilità ma turix l-aċċettabbilità tal-ħażna.

1.4.2. Kondizzjonijiet tat-test

1.4.2.1. Solvent/mezz

Is-solvent/mezz ma għandux jipproduċi effetti tossiċi fil-livelli ta' doża użata, u ma għandu jkun hemm l-ebda suspett ta' reazzjoni kimika mas-sustanza tat-test. Jekk jintużaw solventi/mezzi oħra minflok dawk l-aktar magħrufa, l-inklużjoni tagħhom għandha tkun appoġġata b'informazzjoni li tindika l-kompatibilità tagħhom. Hu rakkomandat li kemm jista' jkun, l-ewwel jiġi kkunsidrat l-użu ta' solvent/mezz akkwuż.

1.4.2.2. Kontrolli

Għandhom jiġu inklużi f'kull test kontrolli pożittivi u negattivi fl-isterss ħin (solvent/mezz). Ħlief għat-trattament bis-sustanza tat-test, l-annimali fil-gruppi tal-kontroll għandhom jiġu trattati bl-istess mod bħall-annimali fil-grupp ta' trattament.

Il-kontrolli pożittivi għandhom jipproduċu anormalitajiet strutturali fil-kromożomi in vivo fiċ-ċelluli spermatogoni meta jiġu somministrati f'livelli ta' esposizzjoni li huma mistennija li jagħtu żieda li tkun tidher fuq l-isfond.

Dożi ta' kontroll pożittiv għandhom jingħażlu sabiex l-effetti jkunu ċari iżda ma jiżvelawx immedjatament l-identità tad-dijapożitivi kodifikati lil min jaqrahom. Huwa aċċettat li l-kontroll pożittiv jiġi somministrat minn rotta differenti minn dik tas-sustanza tat-test u jittieħed kampjun darba waħda biss. Barra minn dan, jista' jiġi kkunsidrat l-użu ta' kimiċi ta' kontroll pożittivi relatati mal-klassi ta' kimiċi, meta dawn ikunu disponibbli. Eżempji ta' sustanzi ta' kontroll pożittivi jinkludu:

Sustanza | Nru SAK | Nru Einecs |

Ċiklofosfamid | 50-18-0 | 200-015-4 |

Monojdrat taċ-ċiklofosfamid | 6055-19-2 | |

Ċiklohessilamina | 108-91-8 | 203-629-0 |

Mitomiċin-C | 50-07-7 | 200-008-6 |

Akrilamid monomeriku | 79-06-1 | 201-173-7 |

Trietilenemelamina | 51-18-3 | 200-083-5 |

Il-kontrolli negattivi, trattati biss bis-solvent jew bil-mezz, u mod ieħor trattati bl-istess mod bħall-gruppi tat-trattament, għandhom jiġu inklużi għal kull perjodu ta' teħid ta' kampjuni, sakemm ma jkunux disponibbli varjabbilità aċċettabbli bejn l-annimali u frekwenżi ta' ċelluli b'anormalitajiet fil-kromożomi mill-informazzjoni storika tal-kontroll. Barra minn dan, għandhom jintużaw ukoll kontrolli mhux trattati sakemm ma jkunx hemm informazzjoni ta' kontroll pubblikata u storika li turi li jkun hemm effetti ta' ħsara u mutaġeniċi bl-uzu tas-solvent/mezz magħżul.

1.5. PROĊEDURA

1.5.1. Numru ta' l-annimali

Kull grupp ta' trattament u ta' kontroll għandu jinkludi fih għall-inqas ħames annimali maskili analizzabbli

1.5.2. Skeda tat-trattament

Is-sustanzi tat-test huma preferibbilment somministrati darba jew tnejn (jiġifieri bħala trattament singolu jew żewġ trattamenti). Is-sustanzi tat-test jistgħu wkoll jiġu somministrati bħala doża maqsuma, jiġifieri żewġ trattamenti fl-istess ġurnata separati b'mhux aktar minn ftit sigħat, biex tiġi faċilitata s-somministrazzjoni ta' volum qawwi ta' materjal. Reġimi ta' dożi oħra għandhom ikunu ġustifikati xjentifikament.

Fil-grupp ta' l-ogħla doża jittieħdu żewġ kampjuni wara t-trattament. Ladarba l-kinetika taċ-ċikli taċ-ċelluli tista' tiġi influwenzata bis-sustanza tat-test, jintużaw ħinijiet għat-teħid ta' kampjuni wieħed bikri u l-ieħor tard madwar 24 u 48 siegħa wara t-trattament. Għal dożi ogħla mill-l-ogħla doża għandu jittieħed żin ta' teħid ta' kampjun ta' 24 siegħa jew ta' 1,5 it-tul taċ-ċiklu ta' ċellula wara t-trattament, sakemm ma jkunx magħruf li jkun hemm ħin ta' teħid ta' kampjun ieħor aktar xieraq għall-iżvelar ta' l-effetti.

B'żieda ma' dan, jistgħu jintużaw ħinijiet ta' teħid ta' kampjun oħra. Per eżempju fil-każ ta' kimiċi li jistgħu jikkawżaw telf ta' kromożomi, jew jistgħu jkollhom effetti indipendenti mill-fażi S, kull wieħed mill-ħinijiet ta' teħid ta' kampjuni huwa xieraq.

Il-konvenjenza ta' skeda ta' trattament ripetut għandha tiġi identifikata fuq bażi ta' każ b'każ. Wara skeda ta' trattament ripetut l-annimali għandhom imbagħad jiġu sakrifikati 24 siegħa (1,5 tul ta' ċiklu ta' ċellula) wara l-aħħar trattament. Jistgħu jintużaw ħinijiet ta' teħid ta' kampjun addizzjonali meta jkun xieraq.

Qabel is-sagrifiċċju, l-annimali huma injettati intraperitonalment b'doża xierqa ta' sustanza li twaqqaf l-metafażi (eż. Colcemid® jew kolċiċina). Wara dan, jittieħed kampjun mill-annimali f'intervalli xierqa. Għall-ġrieden dan l-intervall huwa ta' madwar 3-5-il-siegħa; għal Chinese hamsters dan l-intervall huwa ta' madwar 4-5-il siegħa.

1.5.3. Livelli ta' doża

Jekk jitwettaq studju biex tiġi skoperta l-medda għax ma jkunx hemm disponibbli informazzjoni xierqa, dan għandu jsir fl-istess laboratorju, jintużaw l-istess speċi, razza, sess u metodu ta' trattament li għandhom jintużaw fl-istudju prinċipali (7). Jekk ikun hemm tossiċità, jintużaw tliet livelli ta' doża għall-ewwel perjodu ta' teħid ta' kampjuni. Dawn il-livelli ta' doża għandhom jkopru medda mill-massimu għal ftit jew l-ebda tossiċità. L-ogħla doża hija mfissra bħala s-sinjali ta' tossiċità li jipproduċu d-dożi hekk li livelli ogħla tad-doża, bbażati fuq l-istess reġim ta' dożaġġ, huma mistennija li jikkawżaw il-mewt.

Is-sustanzi b'attivitajiet bijoloġiċi speċifiċi f'dożi baxxi mhux tossiċi (bħal ma huma ormoni u nitroġeni) jistgħu jkunu eċċezzjonijiet għall-kriterji ta' l-issettjar tad-dożi u għandhom jiġu valutati fuq bażi ta' każ b'każ. L-ogħla doża tista' ukoll tfisser id-doża li tipproduċi xi indikazzjoni ta' tossiċità fiċ-ċelluli spermatogoni (eż. riduzzjoni fil-paragun bejn mitosi spermatogoni u l-ewwel jew it-tieni metafasi mejotika; din ir-riduzzjoni ma għandhiex teċċedi 50 %).

1.5.4. Test tal-limitu

Jekk test ta' doża waħda ta' livell ta' għall-inqas 2000 mg/kg piż tal-ġisem/ġurnata meta jitwettaq trattament wieħed, jew bħala żewġ trattamenti fl-istess ġurnata, ma jipproduċix effetti tossiċi li wieħed jinduna bihom, u jekk ma tkun mistennija l-ġenotossiċità fuq il-bażi ta' l-informazzjoni minn sustanzi strutturalment relatati, allura ma jitqiesx li jkun neċessarju li jsir studju komplet bl-użu ta' tliet livelli ta' dożaġġ. L-esposizzjoni umana mistennija tista' tindika l-ħtieġa ta' livell ogħla ta' doża li għandu jintuża fit-test tal-limitu.

1.5.5. Somministrazzjoni ta' dożi

Normalment is-sustanza tat-test tiġi somministrata b'gavage billi jintuża tubu għall-istonku jew cannula xierqa ta' intubazzjoni, jew bl-injezzjoni intraperitonali. Fejn ikunu ġustifikati, jistgħu jiġu aċċettati rotot oħra ta' esposizzjoni. Il-volum massimu ta' likwidu li jista' jiġi somministrat b'gavage jew b'injezzjoni f'ħin wieħed jiddependi fuq il-qies ta' l-annimal tat-test. Il-volum m'għandux ikun aktar minn 2 ml/100g piż tal-ġisem. L-użu ta' volumi ogħla minn dawn għandu jkun ġustifikat. Ħlief fil-każ ta' sustanzi li jirritaw jew korrożivi li normalment juru effetti aggravati b'konċentrazzjonijiet ogħla, il-varjabbilita fil-volum tat-test għandha titnaqqas bl-aġġustament tal-konċentrazzjoni biex jiġi żgurat volum kostanti fuq il-livelli kollha tad-doża.

1.5.6. Preparazzjoni tal-kromożomi

Minnufih wara s-sagrifiċċju, jinkisbu s-sospensjonijiet taċ-ċelluli minn test wieħed jew miż-żewġ testijiet, esposti għal soluzzjoni ipotonika u ffissati. Iċ-ċelluli imbagħad jinfirxu fuq dijapożitivi u jingħataw kulur.

1.5.7. Analiżi

Għandhom jiġu analizzati għall-inqas 100 metafażi mferxin sew għal kull annimal (jiġifieri minimu ta' 500 metafażi kull grupp). Dan in-numru jista' jitnaqqas meta jiġi nnotat għadd kbir ta' anormalitajiet. Id-dijapożitivi kollha, inklużi dawk ta' kontrolli pożittivi u negattivi, għandhom jiġu kodifikati indipendentement qabel l-analiżi mikroskopika. Billi l-proċeduri ta' fissazzjoni jirriżultaw ħafna drabi fil-ksur ta' għadd ta' metafażi bit-telf ta' kromożomi, iċ-ċelluli li jingħaddu għandu għalhekk ikun fihom numru ta' ċentromeri ugwali għan-numru 2n ± 2.

2. INFORMAZZJONI

2.1. TRATTAMENT TAR-RIŻULTATI

L-informazzjoni dwar annimali individwali għandha tingħata f'forma ta' tabella. L-unità sperimentali hija l-annimal. Għal kull annimal għandhom jiġu valutati n-numru ta' ċelluli b'anormalitajiet strutturali tal-kromożomi u in-numru ta' anormalitajiet fil-kromożomi f'kull ċellula. Għandhom jiġu elenkati t-tipi differenti ta' anormalitajiet strutturali fil-kromożomi bl-għadd u l-frekwenzi tagħhom għal gruppi ta' trattament u ta' kontroll. Il-vojt jiġi reġistrat separatament u jsir rapport dwaru iżda ġeneralment ma jiġix inkluż fil-frekwenza totali ta' l-anormalità.

Jekk tiġi osservata l-mitosi kif ukoll il-mejosi, il-paragun bejn mitosi spermatogoni u l-ewwel u t-tieni metafażi mejotiċi għandu jiġI determinat bħala misura ta' ċitossiċità għall-annimali kollha trattati u ta' kontroll negattiv f'kampjun totali ta' 100 ċellula divisibbli għal kull annimal biex jiġi stabbilit l-effett ċitotossiku possibbli. Jekk tiġi osservata mitosi biss, l-indiċi tal-mitosi għandu jiġI determinat f'għall-inqas 1000 ċellula għal kull annimal.

2.2. VALUTAZZJONI U INTERPRETAZZJONI TAR-RIŻULTATI

Hemm ħafna kriterji biex jiġi stabbilit riżultat pożittiv, bħal ma hi żieda relatata mad-doża fl-għadd relattiv ta' ċelluli b'anormalitajiet fil-kromożomi jew żieda ċara fin-numru ta' ċelluli b'anormalitajiet fi grupp singolu ta' trattament fi żmien singolu ta' teħid ta' kampjuni. L-ewwel għandha tiġi kkunsidrata r-rilevanza bijoloġika tar-riżultati. Bħala għajnuna fil-valutazzjoni tar-riżultati tat-testijiet (8), jistgħu jintużaw metodi ta' statistika. L-importanza ta' l-istatistika ma għandhiex tkun l-uniku fattur determinanti għal riżultat pożittiv. Riżultati ekwivoċi għandhom jiġu ċċarati b'testijiet ulterjuri preferibilment billi tintuża modifika tal-kondizzjonijiet ta' l-esperiment.

Sustanza ta' test li dwarha r-riżultati ma jilħqux il-kriterji fuq imsemmija titqies bħala mhux mutaġenika f'dan it-test.

Għalkemm kważi l-esperimenti kollha jagħtu riżultati ċari pożittivi jew negattivi, f'każijiet rari l-informazzjoni ssettjata ma tippermettix li jsir ġudizzju definittiv dwar l-attività ta' sustanza tat-test. Ir-riżultati jistgħu jibqgħu ekwivoċi u inċerti irrispettivament min-numru ta' drabi li jirrepeti ruħu l-esperiment.

Ir-riżultati pożittivi minn test in vivo ta' anormalitajiet fil-kromożomi spermatogoni jindikaw li s-sustanza tat-test toħloq anormalitajiet strutturali fiċ-ċelluli ġerminali ta' l-ispeċi ttestjata. Ir-riżultati negattivi jindikaw li, taħt il-kondizzjonijiet tat-test, is-sustanza tat-test ma toħloqx anormalitajiet fiċ-ċelluli ġerminali ta' l-ispeċi ttestjata.

Għandha tiġi diskussa l-probabilità li s-sustanza tat-test jew il-metaboliti tagħha jilħqu t-tessut immirat.

3. RAPPURTAR

RAPPORT TAT-TEST

Ir-rapport tat-test għandu jkun fih l-informazzjoni li ġejja:

Solvent/mezz:

- ġustifikazzjoni dwar l-għażla tal-mezz,

- solubbilità u stabbilità tas-sustanza tat-test fis-solvent/mezz, jekk magħrufa.

Annimali ttestjati:

- speċi/razza użati,

- numru u età ta' l-annimali,

- għejun, kondizzjonijiet dwar fejn jinżammu, dieta, eċċ.,

- piż individwali ta' l-annimali fil-bidu tat-test, inkluża l-medda ta' piż tal-ġisem, mezzi u devjazzjoni standard għal kull grupp.

Kondizzjonijiet tat-test:

- informazzjoni mill-istudju dwar il-medda, jekk ikun sar,

- raġuni prinċipali għall-għażla ta' livell tad-doża,

- raġuni prinċipali dwar ir-rotta ta' somministrazzjoni,

- dettalji dwar il-preparazzjoni tas-sustanza tat-test,

- dettalji dwar is-somministrazzjoni tas-sustanza tat-test,

- raġjuni prinċipali għall-ħinijiet tas-sagrifiċċju,

- konverżjoni mill-konċentrazzjoni (ppm) tas-sustanza tat-test dieta/ilma għax-xorb għad doża attwali (mg/kg piż tal-ġisem/jum) jekk tkun applikabbli,

- dettalji dwar il-kwalità ta' l-ikel u l-ilma,

- deskrizzjoni dettaljata dwar l-iskedi ta' trattament u teħid ta' kampjuni,

- metodi biex titqies it-tossiċità,

- identità tas-sustanza li twaqqaf il-metafażi, il-konċentrazzjoni tagħha u kemm idum it-trattament,

- metodi tal-preparazzjoni tad-dijapożitivi,

- kriterji għall-għadd ta' anormalitajiet,

- numru ta' ċelluli analizzati kull annimal,

- kriterji biex l-istudji jitqiesu bħala pożittivi, negattivi jew ekwivoċi,

Riżultati:

- sinjali ta' tossiċità,

- indiċi mitotiku,

- paragun bejn mitosi spermnatogoni u l-ewwel u t-tieni metafasi mejotiċi,

- tip u numru ta' anormalitajiet, mogħtija separatament għal kull annimal,

- numru totali ta' anormalitajiet għal kull grupp,

- relazzjoni bejn id-doża u r-rispons, fejn ikun possibbli,

- analiżi statistiċi, jekk ikun hemm,

- informazzjoni dwar kontroll fl-istess ħin negattiv,

- informazzjoni storika dwar kontroll negattiv (solvent/mezz), bil-meded, mezzi u devjazzjonijiet standard,

- informazzjoni dwar kontroll fl-istess ħin pożittiv,

- bidliet fil-plojdi, jekk jidhru.

Diskussjoni dwar ir-riżultati.

Konklużjonijiet.

4. REFERENZI

(1) Adler, I. D., (1986), Clastogenic Potential in Mouse Spermatogonia of Chemical Mutagens Related to their Cell-Cycle Specifications, in: Genetic Toxicology of Environmental Chemicals, Part B: Genetic Effects and Applied Mutagenesis, Ramel, C., Lambert, B. and Magnusson, J. (eds) Liss, New York, pp. 477-484.

(2) Adler, I. D., (1984), Cytogenetic tests in Mammals, in: Mutagenicity Testing: a Practical Approach, (ed.) S. Venitt and J. M. Parry, IRL Press, Oxford, Washington DC, pp. 275-306.

(3) Evans, E. P., Breckon, G. and Ford, C. E. (1964), An Air-drying Method for Meiotic Preparations from Mammalian Testes, Cytogenetics and Cell Genetics, 3, pp. 289-294.

(4) Richold, M., Ashby, J., Chandley, A., Gatehouse, D. G. and Henderson, L. (1990), In Vivo Cytogenetic Assays, in: D. J. Kirkland (ed.), Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Subcommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report. Part I revised, Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 115-141.

(5) Yamamoto, K. and Kikuchi, Y. (1978), A New Method for Preparation of Mammalian Spermatogonial Chromosomes, Mutation Res., 52, pp. 207-209.

(6) Adler, I. D., Shelby M. D., Bootman, J., Favor, J., Generoso, W., Pacchierotti, F., Shibuya, T. and Tanaka N. (1994), International Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Procedures. Summary Report of the Working Group on Mammalian Germ Cell Tests, Mutation Res., 312, pp. 313-318.

(7) Fielder, R. J., Allen, J. A., Boobis, A. R., Botham, P. A., Doe, J., Esdaile, D. J., Gatehouse, D. G., Hodson-Walker, G., Morton, D. B., Kirkland, D. J. and Richold, M. (1992), Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group: Dose setting in In Vivo Mutagenicity Assays, Mutagenesis, 7, pp. 313-319.

(8) Lovell, D. P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G. E., Clarc, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D. G. and Savage J. R. K. (1989), Statistical Analysis of In Vivo Cytogenetic Assays, in: D. J. Kirkland (ed.), Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. UKEMS Subcommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing, report, Part III. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 184-232."

--------------------------------------------------

ANNESS 4G

"B.39. TEST IN VIVO TA' SINTESI MHUX PROGRAMMATA TA' DNA (UDS) FUQ ĊELLULI TAL-FWIED TAL-MAMMIFERI

1. METODU

Dan il-metodu huwa replika tat-Test OECD TG 486 In Vivo ta' Sintesi Mhux Programmata ta' DNA (UDS) fuq Ċelluli tal-Fwied tal-Mammiferi (1997).

1.1. INTRODUZZJONI

L-għan tat-test in vivo ta' sintesi mhux programmata ta' DNA (UDS) fuq ċelluli tal-fwied tal-mammiferi huwa biex jiġu identifikati sustanzi tat-test li joħolqu t-tiswija tad-DNA f'ċelluli tal-fwied ta' annimali ttrattati (1), (2), (3), (4).

Dan it-testr in vivo jipprovdi metodu għall-investigazzjoni ta' l-effetti ġenotossiċi ta' kimiċi fil-fwied. Il-punt ta' l-aħħar imkejjel jagħti indikazzjoni tal-ħsara fid-DNA u t-tiswija sussegwenti fiċ-ċelluli tal-fwied. Il-fwied ġeneralment huwa l-lok maġġuri tal-metabolismu ta' komposti assorbiti. Għalhekk huwa l-lok xieraq biex titkejjel il-ħsara fid-DNA in vivo.

Jekk ikun hemm prova li s-sustanza tat-test mhix ser tilħaq it-tessut immirat, mhuwiex xieraq li jintuża dan it-test.

L-aħħar punt ta' sintesi DNA (UDS) mhux programmata jitkejjel billi jiġi stabbilit l-assorbiment ta' nukleosidi mmarkati f'ċelluli li ma jkunux għaddejin minn sintesi tad-DNA programmata (fasi S). Il-metodu ta' teknika l-aktar użat huwa d-determinazzjoni ta' l-assorbiment ta' tritium thymidine immarkat (3H-TdR) bl-awtoradjografija. Preferibbilment jintużaw il-fwied tal-far għat-testijiet in vivo. Jistgħu jintużaw tessuti oħra minklok il-fwied, iżda mhumiex is-suġġett ta' dan il-metodu.

L-iżvelar ta' rispons UDS jiddependi fuq in-numru ta' bażi DNA exxissi u mibdula fuq il-lok tal-ħsara. Għalhell, it-test UDS huwa partikolarment ta' valur biex tiġi żvelata r-riparazzjoni ta' segwenzi twal li jiġu mis-sustanza (20 sa 30 bażijiet). Bħala kuntrast, ir-riparazzjoni ta' segwenzi qosra (minn bażi waħda sa tlieta) tiġi żvelata b'sensitività anqas qawwija. Barra minn dan, jistgħu jirriżultaw ġrajjiet mutaġeniċi minħabba fin-nuqqas ta' riparazzjoni, riparazzjoni ħażina jew replikazzjoni ħażina tal-leżjonijiet fid-DNA. L-estensjoni tar-rispons tal-UDS ma tagħtix indikazzjoni dwar il-fedeltà tal-proċess ta' riparazzjoni. B'żieda ma' dan, huwa possibbli li li mutaġen jirreaġixxi mad-DNA iżda l-ħsara fid-DNA ma tissewwix permezz ta' proċess ta' riparazzjoni exissa. In-nuqqas ta' informazzjoni speċifika dwar l-attività mutaġenika mogħtija mit-test tal-UDS huwa kompensat bis-sensitività potenzali ta' dan il-punt aħħari għax jiġi mkejjel fil-ġenomu sħiħ.

Ara ukoll l-Introduzzjoni Ġenerali Taqsima B.

1.2. TIFSIRIET

Ċelluli li qed jissewwew : ċelluli li l-numru ta' grani nukleari netti tagħhom (NNG) huwa ogħla minn valur determinat minn qabel, li għandu jiġi ġustifikat fil-laboratorju li fih jitwettaq it-test.

Grani nukleari netti (NNG) : miżura kwantitattiva għall-attività UDS taċ-ċelluli f'testijiet UDS awtoradjografiċi, kalkolati billi jitnaqqas in-numru medju ta' grani ċitoplasmiċi f'arei ċitoplasmiċi nukei ekwivalenti (CG) min-numru ta' grani nukleari (NG): NNG = NG - CG. L-għadd ta' NNG huma kalkolati għal ċelluli individwali u imbagħad addizzjonati ma' ċelluli f'kultura, f'kulturi paralleli, eċċ.

Sintesi DNA mhux skedata (UDS) : sintesi ta' riparazzjoni DNA wara l-exissjoni u t-tneħħija ta' biċċa mid-DNA li jkun fiha reġjun ta' ħsara miġjuba minn sustanzi kimiċi njew aġenti fiżiċi.

1.3. PRINĊIPJI TA' DAN IL-METODU TA' TEST

It-test tal-UDS b'ċelluli tal-fwied ta' mammiferi in vivo jindika sintesi ta' riparazzjoni DNA wara l-exissjoni u t-tneħħija ta' biċċa mid-DNA li jkun fiha reġjun ta' ħsara miġjuba minn sustanzi kimiċi njew aġenti fiżiċi. It-test hu normalment msejjes fuq l-inkorporazzjoni ta' 3H-TdR fiċ-ċelluli DNA tal-fwied li għandhom frekwenza baxxa ta' ċelluli fil-fasi S taċ-ċiklu taċ-ċelluli. It-teħid ta' 3H-TdR jiġi normalment stabbilit bl-awdjoradjografija, għax dan il-metodu ta' teknika mhuwiex suxxettibbli għal indħil minn ċelluli fil-fasi S bħal, per eżempju, konteġġ ta' xintillazzjoni fil-fasi likwida.

1.4. DESKRIZZJONI TAL-METODU

1.4.1. Preparazzjonijiet

1.4.1.1. Selezzjonijiet ta' l-ispeċi ta' annimali

Normalment jintuża l-far, minkejja li tista' tintuża kull speċI xierqa ta' mammiferi. Għandhom jintużaw partijiet ġeneralment użati fil-laboratorju ta' annimali zgħar b'saħħithom adulti. Fil-bidu ta' l-istudju l-varjazzjoni fil-piż ta' l-annimali għandha tkun minima u ma tkunx iżjed minn ± 20 % tal-piż medju għal kull wieħed mis-sessi.

1.4.1.2. Kondizzjoinijiet ta' fejn jinżammu u x'jieklu

Jiġu applikati l-kondizzjonijiet ġenerali msemmija fl-Introduzzjoni ġenerali għat-Taqsima B għalhemm il-mira għall-umdità għandha tkun ta' 50 sa 60 %.

1.4.1.3. Preparazzjoni ta' l-annimali

Annimali b'saħħithom żgħar adulti jiġu assenjati mingħajr ordni għall-gruppi ta' kontroll u ta' trattament. Il-gaġeġ għandhom ikunu rranġati b'tali mod li jitnaqqsu l-effetti possibbli mil-fatt li jitqiegħdu f'gaġeġ. L-annimali jiġu identifikati wieħed wieħed u jinżammu fil-gaġeġ tagħhom għallinqas għal ħamest ijiem qabel ma jibda l-istudju biex jippermetti żmien biex jidraw il-kondizzjonijiet fil-laboratorju.

1.4.1.4. Sustanza tat-test/preparazzjoni

Sustanzi tat-test solidi għandhom jiġu mdewwbin jew sospiżi f'solventi jew kontenituri xierqa u dilwiti, jekk ikun xieraq, qabel it-trattament ta' l-annimali. Sustanzi likwidi tat-test jistgħu jiġu ttrattati direttament jew dilwiti qabel it-trattament. Għandhom jintużaw preparazzjonijiet ġodda għas-sustanza tat-test kemm-il darba l-informazzjoni dwar l-istabbilità ma turix l-aċċettabbilità tal-ħażna.

1.4.2. Kondizzjonijiet tat-test

1.4.2.1. Solvent/mezz

Is-solvent/mezz ma għandux jipproduċi effetti tossiċi fil-livelli ta' doża użata, u ma għandu jkun hemm l-ebda suspett ta' reazzjoni kimika mas-sustanza tat-test. Jekk jintużaw solventi/mezzi oħra minflok dawk l-aktar magħrufa, l-inklużjoni tagħhom għandha tkun appoġġata b'informazzjoni li tindika l-kompatibilità tagħhom. Hu rakkomandat li kemm jista' jkun, l-ewwel jiġi kkunsidrat l-użu ta' solvent/mezz akkwuż.

1.4.2.2. Kontrolli

Għandhom jiġu inklużi f'kull parti indipendenti ta' l-esperiment kontrolli pożittivi u negattivi fl-isterss ħin (solvent/mezz). Ħlief għat-trattament bis-sustanza tat-test, l-annimali fil-gruppi tal-kontroll għandhom jiġu trattati bl-istess mod bħall-annimali fil-grupp ta' trattament.

Il-kontrolli pożittivi għandhom ikunu sustanzi magħrufa li jipproduċu UDS meta somministrati f'livelli ta' esposizzjoni li huma meqjusa li jagħtu żieda li wieħed jista' jinnota fuq l-isfond. Kontrolli pożittivi li jeħtieġu attivazzjoni metabolika għandhom jintużaw f'dożi li joħolqu rispons moderat (4). Id-dożi jistgħu jingħażlu sabiex l-effetti jkunu ċari iżda ma jiżvelawx immedjatament l-identità tad-dijapożitivi kodifikati lil min jaqrahom. Eżempji ta' sustanzi ta' kontroll pożittivi jinkludu:

Ħinijiet ta' teħid ta' kampjuni | Sustanza | Nru SAK | Nru Einecs |

Teħid ta' kampjuni kmieni (2 sa 4 sigħat) | N-nitrosodimetilamina | 62-75-9 | 200-249-8 |

Teħid ta' kampjuni tard (12 sa 16-il siegħa) | N-2-fluworenilaċetamide (2-AAF) | 53-96-3 | 200-188-6 |

Jistgħu jintużaw kontrolli pożittivi oħra xierqa. Huwa aċċettabbli li l-kontroll pożittiv għandu jiġI somministrat minn rotta differenti mis-sustanza tat-test.

1.5. PROĊEDURA

1.5.1. Numru u sess ta' l-annimali

Għandu jintuża numru adegwat ta' annimali biex titqies il-varjazzjoni bijoloġika naturali f'rispons ta' test. In-numru ta' annimali għandu jkun għall-inqas tliet annimali analizzabbli kull grupp. Fejn ikun ġie akkumulat database storiku sinjifikattiv, annimal wieħed jew tnejn biss jkunu meħtieġa għall-gruppi ta' kontroll pożittivi u negattivi fl-istess ħin.

Jekk fil-ħin li jsir l-istudju jkun hemm informazzjoni disponibbli minn studji fl-istess speċje u li jużaw l-istess rotta ta' esposizzjoni li juru li ma hemms differenzi sostanzjali fit-tossiċità bejn is-sessi, allura jkun biżżejjed li t-test isir fuq sess wieħed, preferibbilment dak maskil. Fejn l-esposizzjoni umana għall-kimiċi tista' tkun speċifika skond is-sess, bħal ma hu per eżempju għal ċerti aġenti farmaċewtiċi, it-test għandu jsir b'annimali tas-sess xieraq.

1.5.2. Skeda tat-trattament

Is-sustanzi tat-test ġeneralment jiġu somministrati fi trattament singolu.

1.5.3. Livelli tad-doża

Normalment, jintużaw għall-inqas żewġ livelli ta' doża. L-ogħla doża hija mfissra bħala d-doża li tipproduċi sinjali ta' tossiċità hekk li livelli ogħla tad-doża, bbażati fuq l-istess reġim ta' dożaġġ, huma mistennija li jikkawżaw il-mewt. Ġeneralment, l-inqas doża għandha tkun minn 50 % sa 25 % ta' l-ogħla doża.

Is-sustanzi b'attivitajiet bijoloġiċi speċifiċi f'dożi baxxi mhux tossiċi (bħal ma huma ormoni u nitroġeni) jistgħu jkunu eċċezzjonijiet għall-kriterji ta' l-issettjar tad-dożi u għandhom jiġu valutati fuq bażi ta' każ b'każ. Jekk isir studju biex tinstab il-medda għax ma jkunx hemm disponibbli informazzjoni xierqa, dan għandu jsir fl-istess laboratorju, billi jintużaw l-istess speċji, karatteristiċi, sess u dożaġġ ta' trattament li jintuża fl-istudju prinċipali.

L-ogħla doża tista' ukoll tfisser id-doża li tipproduċi xi indikazzjoni ta' tossiċità fil-fwied (eż. nukleji piknotiċi).

1.5.4. Test tal-limitu

Jekk test ta' doża waħda ta' livell ta' għall-inqas 2000 mg/kg piż tal-ġisem, meta jitwettaq trattament wieħed, jew bħala żewġ trattamenti fl-istess ġurnata, ma jipproduċix effetti tossiċi li wieħed jinduna bihom, u jekk ma tkunx mistennija l-ġenotossiċità fuq il-bażi ta' l-informazzjoni minn sustanzi strutturalment relatati, allura ma jitqiesx li jkun neċessarju li jsir studju komplet. L-esposizzjoni umana mistennija tista' tindika l-ħtieġa ta' livell ogħla ta' doża li għandu jintuża fit-test tal-limitu.

1.5.5. Somministrazzjoni ta' dożi

Normalment is-sustanza tat-test tiġi somministrata b'gavage billi jintuża tubu għall-istonku jew cannula xierqa ta' intubazzjoni. Fejn ikunu ġustifikati, jistgħu jiġu aċċettati rotot oħra ta' esposizzjoni. Madankollu r-rotta intraperitonali mhix rakkomandata għax tista' tesponi l-fwied direttament għas-sustanza tat-test minflok permezz tas-sistema ċirkolatorja. Il-volum massimu ta' likwidu li jista' jiġi somministrat b'gavage jew b'injezzjoni f'ħin wieħed jiddependi fuq il-qies ta' l-annimal tat-test. Il-volum m'għandux ikun aktar minn 2 ml/100g piż tal-ġisem. L-użu ta' volumi ogħla minn dawn għandu jkun ġustifikat. Ħlief fil-każ ta' sustanzi li jirritaw jew korrożivi li normalment juru effetti aggravati b'konċentrazzjonijiet ogħla, il-varjabbilità fil-volum tat-test għandha titnaqqas bl-aġġustament tal-konċentrazzjoni biex jiġi żgurat volum kostanti fuq il-livelli kollha tad-doża.

1.5.6. Preparazzjoni taċ-ċelluli tal-fwied

Iċ-ċelluli tal-fwied huma ppreparati minn annimali ttrattati normalment 12 sa 16-il siegħa wara t-teħid tad-doża. Ġeneralment ikun meħtieġ teħid ta' kampjuni ieħor addizzjonali u aktar kmieni (normalmeny sagħtejn sa erba' sigħat wara t-trattament) kemm-il darba ma jkunx hemm rispons pożittiv ċar fi 12 sa 16-il siegħa. Madankollu t-teħid ta' kampjuni jista' jsir f'ħinijiet oħra meta jkun ġustifikat fuq il-bażi ta' informazzjoni tossikokinetika.

Normalment il-kulturi ta' perjodu qasir ta' ċelluli ta' manniferi jiġu stabbiliti billi l-fwied jitgħatta fil-post bil-kollaġenas u billi ċelluli tal-fwied dissoċjati ġodda jitħallew jingħaqdu ma' superfiċji xierqa. Ċelluli tal-fwied minn annimali ta' kontroll negattiv għandu jkollhom vijabilità ta' għall-inqas 50 %.

1.5.7. Determinazzjoni ta' UDS

Iċ-ċelluli tal-fwied iżolati ġodda tal-mammiferi huma inkubati normalment b'medjum li jkun fih 3H-TdR għal tul ta' żmien xieraq, eż. tliet sigħat sa tmienja. Fl-aħħar tal-perjodu ta' inkubazzjoni, il-medjum għandu jitneħħa miċ-ċelluli, li imbagħad jistgħu jiġu inkubati b'medjum li jkun fih eċċess ta' timidina mhux ittikkettjata biex tnaqqas r-radjuattività mhux inkorporata ('cold chase'). Imbagħad iċ-ċelluli jiġu mlaħalħa, ffissati u mnixxfin. Għal ħinijiet ta' inkubazzjoni itwal, il-cold chase jista' ma jkunx neċessarju. Id-dijapożittivi jixxarbu b'emulsjoni awtoradjografika, jiġu esposti fid-dlam (eż. imkessħin għal sebat ijiem sa erbatax-il ġurnata), żviluppati, mogħtika l-kulur, u jingħaddu il-grani tal-fidda esposti. Jiġu ppreparati żewġ jew tliet dijapożittivi minn kull annimal.

1.5.8. Analiżi

Il-preparazzjonijiet tad-dijapożittivi għandu jkollhom biżżejjed ċelluli ta' morfoloġija normali li jippermettu valutazzjoni xierqa tal-UDS. Il-preparazzjonijiet jiġu eżaminati mikroskopikament għal sinjali ta' tossiċita qawwija (eż. piknożi, livelli ridotti ta' radjutikkettjar).

Id-dijapożittivi għandhom jiġu kodifikati qabel ma jibda l-għadd tal-grani. Normalment jingħaddu 100 ċellula minn kull annimal minn għall-inqas żewġ dijapożittivi; l-għadd ta' inqas minn 100 ċellula/annimal għandu jkun ġustifikat. In-numru ta' grani ma jingħaddx għan-nuklei tal-fasi S, iżda tista' tiġi reġistrata l-proporzjon ta' ċelluli tal-fasi S.

L-ammont ta' inkorporazzjoni ta' 3H-TdR fin-nuklei u ċ-ċitoplasma ta' ċelluli morfoloġikament normali, kif ppruvat bid-deposizzjoni ta' grani tal-fidda, għandu jiġi stabbilit b'metodi xierqa.

2. INFORMAZZJONI

2.1. TRATTAMENT TAR-RIŻULTATI

Għandha tingħata informazzjoni individwali dwar dijapożittivi u annimali. Barra minn dan. L-informazzjoni kollha għandha titqassar f'forma ta' tabella. L-għadd ta' g rani nukleari netti (NNG) għandu jiġi kalkolat għal kull ċellula, għal kull annimal u għal kull doża u ħin billi jitnaqqsu l-għadd ta' CG mill-għadd ta' NG. Jekk jingħaddu "iċ-ċelluli li qed jissewwew", il-kriterji għaċ-ċelluli li qed jissewwew għandhom ikunu ġustifikati u msejsa fuq informazzjoni storika u ta' kontroll negattiv fl-istess ħin. Riżultati numeriċi jistgħu jiġu valutati b'metodi statistiċi. Jekk jintużaw, it-testijiet statistiċi għandhom jingħażlu u jkunu ġustifikati qabel ma jitwettaq l-istudju.

2.2. VALUTAZZJONI U INTERPRETAZZJONI TAR-RIŻULTATI

Eżempji ta' kriterji għal rispons pożittiv/negattiv jinkludu:

pożittiv | (i) | il-valuri NNG ogħla minn limitu determinat minn qabel li hu ġustifikat fuq il-bażi ta' informazzjoni storika tal-laboratorju; |

jew | (ii) | il-valuri NNG sinjifikatament ogħla minn kontroll fl-istess ħin; |

negattiv | (i) | il-valuri NNG fil-limitu/taħt il-limitu ta' kontroll storiku; |

jew | (ii) | il-valuri NNG mhux sinjifikatament ogħla minn kontroll fl-istess ħin. |

Għandha tiġi kkunsidrata r-rilevanza bijoloġika ta' l-informazzjoni: jiġifieri għandhom jitqiesu l-parametri bħal ma huma l-varjazzjoni bejn l-annimali, r-relazzjoni għar-rispons għad-doża u ċ-ċitossiċità. Bħala għajnuna fil-valutazzjoni tar-riżultati tat-testijiet, jistgħu jintużaw metodi ta' statistika. Madankollu, s-sinjifikanza statistika ma għandhiex tkun l-uniku fattur għal rispons pożittiv.

Għalkemm kważi l-esperimenti kollha jagħtu riżultati ċari pożittivi jew negattivi, f'każijiet rari l-informazzjoni ssettjata ma tippermettix li jsir ġudizzju definittiv dwar l-attività ta' sustanza tat-test. Ir-riżultati jistgħu jibqgħu ekwivoċi u inċerti irrispettivament min-numru ta' drabi li jirrepeti ruħu l-esperiment.

Riżultat pożittiv minn test UDS b'ċelluli tal-fwied tal-mammiferi in vivo jindika li s-sustanza tat-test toħloq ħsara fid-DNA taċ-ċelluli tal-fwied tal-mammiferi in vivo li tista' tissewwa b'sintesi tad-DNA mhux skedata in vitro. Riżultat negattiv jindika li, taħt il-kondizzjonijiet tat-test, is-sustanza tat-test ma toħloqx ħsara fid-DNA li tiġI żvelata b'dan it-test.

Għandha tiġi diskussa l-probabilità li s-sustanza tat-test tilħaq iċ-ċirkolazzjoni ġenerali jew speċifikatament it-tessut immirat (eż. tossiċità sistemika).

3. RAPPURTAR

RAPPORT TAT-TEST

Ir-rapport tat-test għandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja:

Solvent/mezz:

- ġustifikazzjoni dwar l-għażla tal-mezz,

- solubbilità u stabbilità tas-sustanza tat-test fis-solvent/mezz, jekk magħrufa.

Annimali ttestjati:

- speċi/razza użati,

- numru, età u sess ta' l-annimali,

- għejun, kondizzjonijiet dwar fejn jinżammu, dieta, eċċ.,

- piż individwali ta' l-annimali fil-bidu tat-test, inkluża l-medda ta' piż tal-ġisem, mezzi u devjazzjoni standard għal kull grupp.

Kondizzjonijiet tat-test:

- kontrolli pożittivi u negattivi (mezz/solvent),

- informazzjoni mill-istudju dwar il-medda, jekk ikun sar,

- raġuni prinċipali għall-għażla ta' livell tad-doża,

- dettalji dwar il-preparazzjoni tas-sustanza tat-test,

- dettalji dwar is-somministrazzjoni tas-sustanza tat-test,

- raġuni prinċipali dwar ir-rotta ta' somministrazzjoni,

- metodi biex jiġi verifikat li s-sustanza tat-test waslet għaċ-ċirkolazzjoni ġenerali jew it-tessut immirat, jekk tkun applikabbli

- konverżjoni mill-konċentrazzjoni (ppm) tas-sustanza tat-test dieta/ilma għax-xorb għad doża attwali (mg/kg piż tal-ġisem/jum) jekk tkun applikabbli,

- dettalji dwar il-kwalità ta' l-ikel u l-ilma,

- deskrizzjoni dettaljata dwar l-iskedi ta' trattament u teħid ta' kampjuni,

- metodi biex titqies it-tossiċità,

- metodu tal-preparazzjoni u kultura taċ-ċelluli tal-fwied.

- teknika awtoradjografika użata,

- numru ta' dijapożitivi ppreparati u numru ta' ċelluli li jingħaddu,

- kriterji ta' valutazzjoni,

- kriterji biex l-istudji jitqiesu bħala pożittivi, negattivi jew ekwivoċi,

Riżultati:

- valuri medji individwali tad-dijapożittivi, ta' l-annimali u ta' gruppi għal grani nuklei, grani ċitoplasmiċi, u grani nukleari netti,

- relazzjoni bejn id-doża u r-rispons, jekk tkun disponibbli

- valutazzjoni statistika, jekk ikun hemm,

- sinjali ta' tossiċità,

- informazzjoni dwar kontroll pożittiv u negattiv (solvent/mezz) fl-istess ħin,

- informazzjoni dwar kontroll pożittiv u negattiv (solvent/mezz) storika bil-medda, mezzi u devjazzjonijiet standard,

- numru ta' ċelluli li qed jissewwew, jekk magħruf,

- numru ta' ċelluli tal-fasi S, jekk magħruf,

- vijabilità taċ-ċelluli.

Diskussjoni dwar ir-riżultati.

Konklużjonijiet.

4. REFERENZI

(1) Ashby, J. Lefevre, P. A., Burlinson, B. and Penman, M. G. (1985), An Assessment of the In Vivo Rat. Hepatocyte DNA Repair Assay, Mutation Res., 156, pp. 1-18.

(2) Butterworth, B. E., Ashby, J., Bermudez, E., Casciano, D., Mirsalis, J., Probst, G. and Williams, G. (1987), A Protocol and Guide for the In Vivo Rat Hepatocyte DNA Repair Assay, Mutation Res., 189, pp. 123-133.

(3) Kennelly, J. C., Waters, R., Ashby, J., Lefevre, P. A., Burlinson, B., Benford, D. J., Dean, S. W. and Mitchell, I. de G. (1993), In Vivo Rat Liver UDS Assay, in: Kirkland D. J. and Fox M., (eds), Supplementary Mutagenicity Tests: UKEM Recommended Procedures. UKEMS Subcommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report. Part II revised, Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 52-77.

(4) Madle, S., Dean, S. W., Andrac, U., Brambilla. G., Burlinson, B., Doolittle, D. J., Furihata, C., Hertner, T., McQueen, C. A. and Mori, H. (1993), Recommendations for the Performance of UDS Tests In Vitro and In Vivo, Mutation Res., 312, pp. 263-285.

(5) Fautz, R., Hussain, B., Efstathiou, E. and Hechenberger-Freudl. C. (1993), Assessment of the Relation Between the Initial Viability and the Attachment of Freshly Isolated Rat Hepatocytes Used for the In Vivo/In Vitro DNA Repair Assay (UDS), Mutation Res., 291, pp. 21-27.

(6) Mirsalis, J. C., Tyson, C. K. and Butterworth, B. E. (1982), Detection of Genotoxic Carcinogens in the In Vivo/In Vitro Hepalocyte DNA Repair Assay, Environ. Mutagen, 4, pp. 553-562."

--------------------------------------------------

ANNESS 5

Ara d-Direttiva tal-Kummisjoni 2001/59/KE, ĠU L 332, tat-28.12.2000, p.

--------------------------------------------------

ANNESS 6

Anness IX

Taqsima A

Disposizzjonijiet dwar qafliet li ma jistgħux jinfetħu mit-tfal

B'żieda mad-disposizzjonijiet ta' l-Artikolu 22(1)(e) ta' din id-Direttiva, kontenituri ta' kull qies li jkun fihom sustanzi li fihom periklu ta' aspirazzjoni (Xn; R65) u klassifikati u ttikkettjati skond il-paragrafu 3.2.3 ta' l-Anness VI ta' din id-Direttiva, bl-eċċezzjoni ta' sustanzi li jitqiegħdu fis-suq fil-forma ta' aerosoli jew f'kontenitur li jkollu tagħmir magħluq ta' l-ispray, għanu jkollhom qafliet li ma jistgħux jinfetħu mit-tfal.

1. Pakki li jistgħu jerġgħu jingħalqu

Il-qafliet li ma jistgħux jinfetħu mit-tfal użati f'pakki li jistgħu jerġgħu jingħalqu għandhom josservaw l-ISO standard 8317 (edizzjoni ta' l-1 ta' Lulju 1989) rigward "Pakki li mhumiex ta' periklu għat-tfal - Ħtiġiet u metodi għall-ittestjar ta' pakki li jerġgħu jingħalqu" adottat mill-International Standard Organisation (ISO).

2. Pakki li ma jistgħux jerġgħu jingħalqu

Qafliet li ma jistgħux jinfetħu mit-tfal f'pakki li ma jistgħux jerġgħu jingħalqu għandhom josservaw is-CEN standard EN 862 (edizzjoni ta' Marzu 1997) rigward "Pakki - Pakki li mhumiex ta' periklu għat-tfal - Ħtiġiet u proċeduri ta' ttestjar għal pakki li ma jerġgħux jingħalqu għal prodotti mhux farmaċewtiċi" adottat mill-European Committee for Standardisation (CEN).

3. Noti

1. Il-prova ta' konformità ma' l-istandards fuq imsemmija tista' tingħata biss minn laboratorji li josservaw il-European Standards Series EN 45000.

2. Każijiet speċifiċi

Jekk hu ovvju li l-ippakkjar hu suffiċjentement bla periklu għat-tfal għax ma għandhom aċċess għall-kontenut mingħajr l-għajnuna ta' xi għodda, ma hemmx bżonn li jsir it-test.

Fil-każijiet l-oħra kollha u fejn hemm raġunijiet suffiċjenti biex wieħed jiddubita s-sigurezza ta' qafla rigward it-tfal, l-awtorità nazzjonali tista' titlob lill-persuna responsabbli għat-tqegħid tal-prodott fis-suq biex tagħtiha ċertifikat minn laboratorju, imfisser fi 3.1, li jiddikjara li jew:

- it-tip ta' għeluq hu tali li mhux neċessarju li jiġi ttestjat skond l-istandards ISO u CEN fuq imsemmija,

jew

- l-għeluq ġie ttestjat u nstab li josserva l-istandards fuq imsemmija.

TAQSIMA B

Disposizzjonijiet dwar mezzi ta' twissija kontra li wieħed imiss

L-ispeċifikazzjonijiet tekniċi għal mezzi ta' twissija kontra li wieħed imiss għandhom josservaw l-EN ISO standard 11683 (edizzjoni ta' l-1997) rigward "Pakki - Twissija ta' periklu jekk jintmiss - Ħtiġiet".

--------------------------------------------------