31981L0715

Id-Disa’ Direttiva tal-Kummissjoni

tal-31 ta’ Lulju 1981

li tistaBbilixxi metodi Komunitarji ta’ analiżi għall-kontroll uffiċjali ta’ affarijiet ta’ l-ikel għall-annimali

(81/715/KEE)

IL-KUMMISSJONI TAL-KOMUNITAJIET EWROPEJ,

Wara li kkunsidrat it-Trattat li jistabbilixxi l-Komunità Ekonomika Ewropea,

Wara li kkunsidrat id-Direttiva tal-Kunsill 70/373/KEE ta’ l-20 ta’ Lulju 1970 dwar l-introduzzjoni ta’ metodi Komunitarji biex jittieħdu l-kampjuni u għall-analiżi tal-kontroll uffiċjali ta’ affarijiet ta’ l-ikel għall-annimali [1], kif l-aħħar emendata mill-Att ta’ l-Adeżjoni tal-Greċja, u b’mod partikolari l-Artikolu 2 tagħha,

Billi dik id-Direttiva teħtieġ li l-kontroll ufiċjali ta’ l-affarijiet ta’ l-ikel għall-annimali bl-iskop tal-kontroll ta’ konformità mal-ħtiġiet taħt id-dispożizzjonijiet stabbiliti bil-liġi, b’regolament jew b’azzjoni amministrattiva li jikkonċernaw il-kwalità u l-kompożizzjoni ta’ affarijiet ta’ l-ikel għall-annimali jitwettaq bl-użu ta’ metodi Komunitarji biex jittieħdu l-kampjuni u ta’ analiżi;

Billi d-Direttivi tal-Kummissjoni 71/250/KEE [2], 71/393/KEE [3], 72/199/KEE [4], 73/46/KEE [5], 74/203/KEE [6], 75/84/KEE [7], 76/372/KEE [8] u 78/633/KEE [9], kif l-aħħar emendati bid-Direttiva tat-30 ta’ Lulju 1981, diġà stabbilixxew numru ta’ metodi Komunitarji ta’ analiżi; billi l-progress tax-xogħol minn dak iż-żmien jagħmlu ideali li jiġi adottat id-disa’ grupp ta’ metodi;

Billi l-miżuri previsti f’din id-Direttiva huma skond l-opinjoni tal-Kumitat Permanenti għall-Affarijiet ta’ l-Ikel għall-Annimali,

ADDOTTAT DIN ID-DIRETTIVA:

L-Artikolu 1

L-Istati Membri għandhom jeħtieġu li l-analiżi għall-kontrolli uffiċjali ta’ affarijiet ta’ l-ikel għall-annimali, fir-rigward tal-kontenut tagħhom ta’ avoparċina u sodju tal-monensin, jitwettqu skond il-metodi deskritti fl-Anness.

L-Artikolu 2

L-Istati Membri għandhom iġibu fis-seħħ il-liġijiet, ir-regolamenti u d-dispożizzjonijiet amministrattivi neċessarji biex jikkonformaw ma’ din id-Direttiva fl-1 ta’ Diċembru 1981 u għandhom minnufih jinfurmaw lill-Kummissjoni bihom.

L-Artikolu 3

Din id-Direttiva hija indirizzata lill-Istati Membri.

Magħmula fi Brussel, fil-31 ta’ Lulju 1981.

Għall-Kummissjoni

Gaston Thorn

Il-President

[1] ĠU L 170, tat-3.8.1970, p. 2.

[2] ĠU L 155, tat-12.7.1971, p. 13.

[3] ĠU L 279, ta’ l-20.12.1971, p. 7.

[4] ĠU L 123, tad-29.5.1972, p. 6.

[5] ĠU L 83, tat-30.3.1973, p. 21.

[6] ĠU L 108, tat-22.4.1974, p. 7.

[7] ĠU L 32, tal-5.2.1975, p. 26.

[8] ĠU L 102, tal-15.4.1976, p. 8.

[9] ĠU L 206, tad-29.7.1978, p. 43.

--------------------------------------------------

L-ANNESS

1. ID-DETERMINAZZJONI TA’ L-AVOPARĊINA PERMEZZ TA’ TIXRID F’MEDIUM TA’ L-AGAR

1. L-ISKOP U L-QASAM TA’ APPLIKAZZJONI

Il-metodu huwa għad-determinazzjoni ta’ l-avoparċina fl-affarijiet ta’ l-ikel għall-annimali u f’ taħlitiet minn qabel. Il-limitu l-iktar baxx tad-determinazzjoni huwa 2mg/kg (2 ppm). Il-preżenza ta’ antibijotiċi polieteri tista tinterferixxi fid-determinazzjoni.

2. IL-PRINĊIPJU

Il-kampjun hu estratt b’taħlita ta’ l-aċetun/ta’ l-ilma/ta’ l-aċidu idrokloriku. L-attività antibijotika ta’ l-estratt hi determinata billi jitkejjel it-tixrid ta’ l-avoparċina f’medium ta’ l-agar bil-Bacilus subtilis. It-tixrid jintwera permezz tal-formazzjoni ta’ żoni ta’ inibizzjoni tal-mikro-organiżmu. Id-djametru ta’ dawn iż-żoni jitqies bħala fi proporzjon dirett għall-logaritmu tal-konċentrazzjoni antibijotika tul il-firxa ta’ konċentrazzjonijiet antibijotiċi impjegati.

3. IL-MIKRO-ORGANIŻMU: IL-BACILLUS SUBTILIS ATCC 6633 (NCIB 8054)

3.1. Biex tinżamm il-kultura prinċipali

Laqqam tubi li jikkontjenu inklinazzjonijiet ta’ medium tal-kultura (4.1) bil-Bacillus subtilis u inkubahom tul il-lejl f’30 °C. Aħżen il-kultura fi friġġ f’madwar 4 °C. Erġa laqqam kull xahar.

3.2. Il-preparazzjoni tas-sospensjoni ta’ l-ispori [1]

Iġbor il-patina minn inklinazzjoni ta’ l-agar ippreparata riċentement (3.1) permezz ta’ 2 ml sa 3 ml ta’ ilma sterili. Uża din is-sospensjoni biex tlaqqam 300ml tal-medium tal-kultura (4.1) kontenut fi fjasketta Roux u inkuba għal bejn tlett ijiem sa ħamsa f’30 °C. Iġbor l-ispori fi 15 ml ta’ etanol (4.2) wara kontroll ta’ l-isporulazzjoni taħt mikroskopju, u ħallat sew. Din is-sospensjoni tista’ tinżamm għal mill-inqas ħames xhur f’madwar 4 °C.

4. IL-MEDJA TAL-KULTURA U R-RIAĠENTI

4.1. Il-medium tal-kultura [2]

Peptun | 6·0g |

Truptun | 4·0g |

Estratt tal-ħmira | 3·0g |

Estratt tal-laħam | 1·5g |

Glukosju | 1·0g |

Agar | 15·0g |

Ilma | 1000 ml |

pH 6·5 (wara l-isterilizzazzjoni) | |

4.2. Etanol 20 % (v/v): żid 200 ml ta’ l-etanol ma’ 800 ml ilma.

4.3. Aċidu idrokloriku, d: 1·18 sa 1·19.

4.4. L-idrossidu tas-sodju, soluzzjoni 2 M.

4.5. Newtralizzant tal-fosfat, 0 ·1 M:

Il-fosfat tad-didroġenu tal-potassju, KH2PO4:13 ·6 g.

Ilma sa 1000 ml.

Aġġusta l-pH sa 4·5.

4.6. Taħlita ta’ aċetun/ilma/aċidu idrokloriku (4.3): 65/32 ·5/2·5 (v/v/v).

4.7. Sustanza standard: sulfat ta’ l-avoparċina ta’ attività magħrufa.

5. SOLUZZJONIJIET STANDARD

Ħoll kwantità peżata b’mod eżatt ta’ bejn wieħed u ieħor 10 mg tas-sustanza standard(4.7) f’newtralizzant tal-fosfat (4.5) u żid ma’ dan in-newtralizzant biex tagħti soluzzjoni prin ċipali li tikkontjeni 100 μg avoparċina għal kull millilitru. Maħżuna fi fjasketta magħluqa f 4 °C, din is-soluzzjoni hi stabbli għal sa sebat ijiem.

5.1. Għal taħlitiet minn qabel

Minn din is-soluzzjoni prinċipali ipprepara b’dilwizzjoni suċċessiva b’newtralizzant (4.5) is-soluzzjonijiet li ġejjin:

S8 | 4·0 μg/ml |

S4 | 2·0 μg/ml |

S2 | 1·0 μg/ml |

S1 | 0·5 μg/ml |

5.2. Għal affarijiet ta’ l-ikel għall-annimali

Mis-soluzzjoni prinċipali ipprepara b’dilwizzjoni suċċessiva bin-newtralizzant (4.5) is-soluzzjonijiet li ġejjin:

S8 | 2·0 μg/ml |

S4 | 1·0 μg/ml |

S2 | 0·5 μg/ml |

S1 | 0·25 μg/ml |

6. IL-PREPARAZZJONI TA’ L-ESTRATT U TAS-SOLUZZJONIJIET TA’ ANALIŻI

6.1. Taħlitiet minn qabel

Taħlitiet minn qabelIppeża, sa l-eqreb 10 mg, kampjun biżżejjed biex jikkontjeni 10 sa 100 mg avoparċina. Ittrasferixxi għal fjasketta ggradwata ta’ 100 ml b’60 ml tat-taħlita (4.6) u ħawwad għal 15-il minuta fuq shaker mekkaniku. Ikkontrolla l-pH u aġġusta sa pH 2, jekk neċessarju, bl-aċidu idrokloriku (4.3). Żid sal-volum bit-taħlita (4.6) u ħallat sew. Iffiltra porzjon minn karta filtranti addattata (eż, Whatman Nru 1), billi tarmi l-ewwel 5 ml tal-filtrat. Ħu alikwot u aġġusta l-pH sa 4.5 b’soluzzjoni ta’ l-idrossidu tas-sodju (4.4). Iddiluwixxi din is-soluzzjoni b’newtralizzant (4.5) biex tottjeni konċentrazzjoni mistennija ta’ l-avoparċina ta’ 4 μg/ml (= U8).

Minn din is-soluzzjoni ipprepara soluzzjonijiet U4 (kontenut mistenni: 2 μg/ml), U2 (kontenut mistenni: 1 μg/ml) u U1 (kontenut mistenni: 0 75 μg/ml) permezz ta’ dilwizzjoni suċċessiva (1 + 1) b’newtralizzant (4.5).

6.2. Affarijiet għall-ikel għall-annimali

Ippeża kwantità ta’ kampjun ta’ 50 g u ħallat 100 ml tat-taħlita (4.6) għal 30 minuta fuq shaker mekkaniku. Iċċara l-estratt b’ċentrifugazzjoni (bl-użu ta’ tubi magħluqa ċentrifugi), ħu alikwot ta’ l-estratt iċċarat (ara t-tabella hawn taħt) u aġġusta l-pH għal 4.5 b’soluzzjoni ta’ l-idrossidu tas-sodju (4.4). Iddilwixxi dan l-alikwot b’newtralizzant (4.5) biex tipprvodi U8 (ara t-tabella hawn taħt).

Minn din is-soluzzjoni ipprepara soluzzjonijiet U4 (il-kontenut mistenni: 1 μg/ml), U2 (il-kontenut mistenni: 0.5 μg/ml) u U1 (l-kontenut mistenni: 0.25 μg/ml) permezz ta’ dilwizzjoni suċċessiva (1 + 1) b’newtralizzant (4.5).

Il-livell presunt ta’ avoparċina (mg/kg) | 5 | 7.5 | 10 | 15 | 20 | 40 |

Il-piż ta’ kampjun (g(+/- 0·1g)) | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 |

Il-volum tat-taħlita (4.6 (ml) | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |

Il-volum ta’ l-estratt ikkjarifikat (ml) | 20 | 15 | 20 | 15 | 20 | 10 |

Il-volum finali (ml): U8 | 25 | 25 | 50 | 50 | 100 | 100 |

Il-konċentrazzjoni mistennija U8 (μg/ml) | 2 | bejn wieħed u ieħor 2 | 2 | bejn wieħed u ieħor 2 | 2 | 2 |

7. PROĊEDURA TA’ ANALIŻI

7.1. L-inokulazzjoni tal-medium ta’ analiżi

Laqqam il-medium ta’ analiżi (4.1) bis-sospensjoni ta’ l-ispora (3.2) f’50 sa 60 °C. Permezz ta’ provi preliminari fuq pjanċi b’medium ta’ analiżi (4.1) iddetermina l-kwantità tas-sospensjoni ta’ l-ispora meħtieġa biex tagħti l-akbar u l-iktar żoni ċari ta’ inibizzjoni bil-varji konċentrazzjonijiet ta’ avoparċina.

7.2. Il-preparazzjoni tal-pjanċi

It-tixrid permezz ta’ l-agar hu mwettaq fi pjanċi bl-erba’ konċentrazzjonijiet tas-soluzzjoni (S8, S4, S2, S1) u bl-erba konċentrazzjonijiet tas-soluzzjoni ta’ l-analiżi (U8, U4, U2, U1). Dawn l-erba’ konċentrazzjonijiet ta’ l-estratt u standard għandhom neċessarjament jitqiegħdu f’kull pjanċa. B’dan l-iskop, għażel pjanċi kbar biżżejjed biex jippermettu mill-inqas tmien toqbiet b’dijametru ta’ 10 sa 13-il mm u mhux inqas minn 30 mm bejn ċentri li għandhom isiru fil-medium ta’ l-agar. It-test jista jitwettaq fuq pjanċi li jikkonsistu f’folja tal-ħġieġ b’ċirku ta’ superfiċi ta’ l-aluminju jew tal-plastik imqiegħed fuq 200 mm f’dijametru u 20 mm għoli.

Ferra’ fil-pjanċi kwantità tal-medium (4.), imlaqqam bħal f’7.1, biex tagħti saff oħxon madwar 2 mm (60ml għal pjanċa ta’ 200 mm djametru). Ħallih joqgħod f’pożizzjoni livell, taqqab it-toqob u qegħidhom f’volumi mkejla eżatti ta’ analiżi u soluzzjonijiet standard (bejn 0.10 u 0.15 ml għal kull toqba, skond id-dijametru). Applika kull konċentrazzjoni mill-inqas erba darbiet sabiex kull determinazzjoni hi soġġetta għal evalwazzjoni ta’ 32 żona ta’ inibizzjoni.

7.3. L-inkubazzjoni

Inkuba l-pjanċi għal 16 sa 18-il siegħa fi 30 °C.

8. IL-VALUTAZZJONI

Kejjel id-djametru taż-żoni ta’ inibizzjoni sa l-eqreb 0 71 mm. Irreġistra l-kejl medju għal kull konċentrazzjoni fuq karta grafika semi-logaritmika li turi l-logaritmu tal-konċentrazzjonijiet meta mqabbla mad-djametri taż-żoni ta’ inibizzjoni. Immarka l-linji ta’ "l-aħjar qagħda" ta’ kemm is-soluzzjoni standard u kemm l-estratt, per eżempju bħal hawn taħt.

Iddetermina l-punt ta’ "l-aħjar qagħda" għall-ogħla livell standard (SL) bl-użu tal-formula:

SL =

10

Iddetermina l-punt ta’ "l-aħjar qagħda" għall-ogħla livell standard (SH) bl-użu tal-formula:

SH =

10

Bl-istess mod ikkalkula l-punti ta’ "l-aħjar qagħda" għal-livell l-iktar baxx ta’ l-estratt u l-livell l-iktar għoli ta’ l-estratt billi tissostitwixxi U1, U2, U3, U4 u U8 għal S1, S2, S4 u S8 fil-formula ta’ hawn fuq.

Irreġistra l-valuri kkalkolati SL u SH fuq l-istess karta grafika u għaqqadhom biex tagħti l-linja ta’ "l-aħjar qagħda" għas-soluzzjoni standard. Bl-istess mod, irreġistra l-UL u l-UH u għaqqadhom biex tagħtihom il-linja ta’ "l-aħjar qagħda" għall-estratt.

Fl-assenza ta’ linji ta’ interferenza l-linji għandhom ikunu paralleli. Għal skopijiet prattiċi l-linji jistgħu jiġu kkunsidrati paralleli jekk il-valuri (SH-SL) u (UH-UL) ma jvarjawx b’iktar minn 10 % mill-valur medju tagħhom.

Jekk il-linji jinstab li mhumiex paralleli, jew l-U1 u s-S1 jew l-U8 u s-S8 jistgħu jitwarrbu u l-SL, l-SH, il-UL u l-UH ikkalkulati, bl-użu tal-formula alternattiva, biex jagħtu linji alternattivi ta’ "l-aħjar qagħda":

a′)SL = 5 S1 + 2 S2 − S46 | või | 5 S2 + 2 S4 − S86 |

b′)SH = 5 S4 +2 S2 − S16 | jew | 5 S8 +2 S4 − S26 |

u bl-istess mod għall-UL u l-UH. Il-linji alternattivi ta’ "l-aħjar qagħda" għandhom jiġu kkontrollati għall-paralelliżmu bħal qabel. Il-fatt li r-riżultat ġie kkalkulat minn tliet livelli għandu jiġi nnutat fir-rapport finali.

Meta l-linji huma kkunsidrati bħala li huma paralleli, ikkalkula l-logaritmu tal-log ta’ l-attività relattiva.(log A) permezz ta’ waħda mill-formuli li ġejjin:

Għal erba’ livelli

log A =

U

+ U

+ U

+ U

− S

− S

− S

− S

8 × 0,602U4 + U8 + S4 + S8 − U1 − U2 − S1 − S2

Għal erba’ livelli

log A =

U

+ U

+ U

− S

− S

− S

4 × 0,401U4 + S4 − U1 − S1

Għal tliet livelli

log A =

U

+ U

+ U

– S

– S

– S

8 × 0,401U8 + S8 – U2 – S2

Attività reali = attività presupposta × attività relattiva.

Jekk l-attività relattiva jinstab li hi barra l-firxa ta’ 0 75 sa 2 70, imbagħad irrepeti l-analiżi billi tagħmel aġġustamenti approprjati għall-konċentrazzjonijiet ta’ l-estratt jew, jekk dan mhuwiex possibbli, għas-soluzzjonijiet standard. Meta l-attività relattiva ma tistax tinġieb fil-firxa adegwata, kull riżultat ottenut għandu jiġi kkunsidrat bħala approprjat u dan għandu jiġi nnutat fir-rapport finali.

Meta l-linji huma kkunsidrati bħala mhux paralleli, irrepeti d-determinazzjoni. Jekk il-paralelliżmu ikun għadu ma ntlaħaqx, id-determinazzjoni għandha tiġi kkunsidrata bħala insodisfaċenti.

9. IR-RATA TA’ REPETIZZJONI

Id-differenza bejn ir-riżultati taż-żewġ determinazzjonijiet imwettqa fuq l-istess kampjun, mill-istess analist, m’għandhiex teċċedi:

- 2 mg/kg, f’valur assolut, għal kontenuti ta’ avoparċina minn 2 u sa 10 mg/kg,

- 20 % relata ma’ l-ogħla valur għal kontenuti ta’ 10 sa 25 mg/kg,

- 5 mg/kg, f’valur assolut, għal kontenuti ta’ 25 sa 50 mg/kg,

- 10 % relatati ma’ l-ogħla valur għal kontenuti l fuq minn 50 mg/kg.

2. ID-DETERMINAZZJONI TA’ SODJU TA’ MONENSIN PERMEZZ TA’ TIXRID F’MEDIUM TA’ L-AGAR

1. L-ISKOP U L-QASAM TA’ APPLIKAZZJONI

Il-metodu huwa għad-determinazzjoni tas-sodju ta’ monesin f’affarijiet għall-ikel għall-annimali u taħlitiet minn qabel. Il-limitu ta’ determinazzjoni ’l iktar baxx huwa 10 mg/kg (10 ppm) [3].

2 IL-PRINĊIPJU

Il-kampjun hu estratt b’ 90 % metanol L-estratt hu sottomess għal proċeduri approprjati skond il-kontneut tas-sodju tal-monesin tal-kampjun. L-attività antibijotika hi ddeterminata billi jitkejjel it-tixrid tas-sodju tal-monesin f medium ta’ l-agar inokulat bil-Baciluus subtilis. Id-dijametru ta’ dawn iż-żoni għandu jiġi meqjus bi proporzjon dirett għall-logaritmu tal-konċentrazzjoni antibijotika tul il-firxa tal-konċentrazzjonijiet antibijotiċi impjegati. Is-sistema ta’ din is-sistema ta’ analiżi hi mnaqqsa fil-preżenza ta’ jonji tas-sodju.

3. MIKRO-ORGANIŻMU: BACILLUS SUBTILIS ATCC 6633 (NCIB 8054)

3.1. Biex tinżamm il-kultura prinċipali

Laqqam it-tubi li jikkontjenu inklinazzjonijiet tal-medium ta’ l-agar (4.1) bil-Bacillus subtilis u inkubahom tul il-lejl fi 30 °C. Aħżen il-kultura fi friġġ f’madwar 4 °C. Erġa laqqam kull xahar.

3.2. Il-preparazzjoni tas-sospensjoni ta’ l-ispori [4]

Iġbor il-patina minn inklinazzjoni ta’ l-agar ippreparata riċentement (3.1) permezz ta’ 2 sa 3 ml ta’ ilma sterili. Uża din is-sospensjoni biex tlaqqam 300 ml ta’ medium tal-kultura (4.1) kontenut fi fjasketta Roux u inkuba għal tlieta sa ħamest ijiem fi 30 °C. Iġbor l-ispori fi 15-il ml ta’ 20 % ta’ etanol (4.3), wara kontroll ta’ l-isporulazzjoni taħt il-mikroskopju u ħallat sewwa. Din is-sospensjoni għandha tinżamm għal mill-inqas ħames xhur f’madwar 4 °C

4. IL-MEDJA TAL-KULTURA U R-RIAĠENTI

4.1. Il-medium tal-kultura [5]

Triptun | 10·0g |

Estratt tal-ħmira | 3·0g |

Estratt tal-laħam | 1·5g |

Glukosju | 1·0g |

Agar (skond il-kwalità) | 10·0 sa 20·0g |

Ilma | 1000 ml |

pH 6·5 (wara l-isterilizzazzjoni). | |

4.2. Il-medium ta’ l-analiżi

Glukosju | 10·0g |

Estratt tal-ħmira | 2·5g |

Fosfat tad-dipotassju ta’ l-idroġenu, K2HPO4 | 0·69g |

Fosfat tad-dipotassju ta’ l-idroġenu, KH2PO4 | 0·45g |

Agar (skond il-kwalità) | 10·0 sa 20·0g |

Ilma | 1000 ml |

pH 6 (wara l-isterilizzazzjoni). | |

4.3. Etanol 20 % (v/v): żid 200 ml ta’ l-etanol ma’ 800 ml ilma.

4.4. Metanol, anidridu.

4.5. Metanol 90 % (v/v): żid 900 ml ta’ metanol (4.4) ma’ 100 ml ilma.

4.6. Metanol 50 % (v/v): żid 500 ml tal-metanol (4.4) ma’ 500 ml ilma.

4.7. Ossidu ta’ l-aluminju, ggranulat (alcoa F, 20 mesh alumina attivata UG 1: F. Lancaster and Co., jew ekwivalenti).

4.8. Sustanzi standard: sodju tal-monensin ta’ attività magħrufa (eż. mil-Laboratorju Internazzjonali għal Standards Bijoloġiċi.. Central Veterinary Laboratory, Weybridge, UK —Surrey KT 15 3NB).

5. L-APPARAT

5.1. Evaporatur dawwari ta’ vakwu, bi fjasketta biż-żaqq tond ta’ 250 ml.

5.2. Tubu tal-ħġieġ għall-kromatografija, djametru intern 25 mm, tul: 400 mm, b’tarf miftuħ ta’ 2 mm dijametru.

5.3. Tubu tal-ħġieġ għall-kromatografija, djametru intern: 11-il mm, tul: bejn wieħed u ieħor 300 mm, b’tarf miftuħ ta’ 2 mm dijametru.

6. SOLUZZJONIJIET STANDARD

Ħoll kwantità peżata b’mod eżatt tas-sustanza standard (4.8) fil-metanol (4.4) u żid biex tagħti soluzzjoni prinċipali li tikkontjeni 800 μg. Maħżuna fi fjasketti magħluqa bit-tapp f’4 °C, din is-soluzzjoni hi stabbli għal sa ġimagħtejn.

Minn din is-soluzzjoni prinċipali ipprepara b’dilwizzjoni suċċessiva b’50 % metanol (4.6) is-soluzzjonijiet li ġejjin:

S8 | 8·0 μg/ml |

S4 | 4·0 μg/ml |

S2 | 2·0 μg/ml |

S1 | 1·0 μg/ml |

7. IL-PREPARAZZJONI TA’ L-ESTRATT

7.1. L-estrazzjoni

7.1.1. It-taħlitiet minn qabel

Iżen kwantità ta’ kampjun ta’ 2 gm, żid 100 ml ta’ 90 % metanol (4.5), omoġenizza u ċċentrifuga għal ftit minuti. Iddilwixxi s-soluzzjoni supernatanti ma’ 50 % metanol (4.6) biex tottjeni kontenut tas-sodju monensin mistenni ta’ 8 μg/ml (= U8).

7.1.2. Affarijiet ta’ l-ikel għall-annimali b’livell ta’ sodju monensin mhux iktar baxx minn 50 ppm

Ippeża kwantità ta’ kampjun ta’ 10 sa 20 g, żid 100 ml ta’ 90 % metanol (4.5), omoġenizza għal 15-il minuta u ħalliha toqgħod.

Inserixxi għeluq tat-tajjar fit-tarf dejjaq ta’ tubu tal-ħġieġ (5.2) u żid l-ossidu ta’ l-aluminju (4.7) b’daqqiet ħfief sakemm il-kolonna tilħaq 75 sa 80 mm għoli.

Ferra’ l-estratt għal fuq il-kolonna ta’ l-ossidu ta’ l-aluminju u iġbor il-filtrat. Żid 30 ml tal-filtrat ma 50 ml ilma. Agħmel diluwizzjonijiet sussegwenti ma’ 50 % metanol (4.6) biex tottjeni kontenut mistenni ta’ sodju tal-monensin 8 μg/ml (= U8).

7.1.3. Affarijiet ta’ l-ikel għall-annimali b’livell tas-sodju tal-monensin iktar baxx minn 50 ppm (sa limitu ta’ 10 ppm)

Ippeża kwantità ta’ kampjun ta’ 10 sa 20 g, żid 100 ml ta’ 90 % metanol (4.5) u omoġeniżża għal 15-il minuta. Iċċentrifuga sakemm ċar.

Għal kampjun li jikkontjeni 20 ppm ta’ sodju tal-monensin, ħu 40 ml tal-likwidu supernatanti. Għal kampjunli jikkontjeni 10 ppm, ħu 80 ml u evapora san-nixfa taħt vakwu fuq evaporatur dawwari (5.1) u mhux iktar minn 40 °C. Ħoll ir-residwu f’10 ml ta’ 90 % metanol (4.5).

Inserixxi għeluq tat-tajjar fit-tarf dejjaq tat-tubu tal-ħġieġ (5.3) u żid ossidu ta’ l-aluminju (4.7) b’daqqiet ħfief sakemm il-kolonna tilħaq 75 sa 80 mm għoli.

Ferra s-soluzzjoni metanolika tar-residwu għal fuq il-kolonna ta’ l-ossidu ta’ l-aluminju u iġbor il-filtrat. Aħsel il-kolonna b 10 ml ta’ 90 % metanol (4.5) u kkombina l-ħasliet mal-filtrat.

Evapora s-soluzzjoni għal nixfa taħt vakwu fuq evaporatur dawwari (5.1) b’inqas minn 40 °C. Ħoll ir-residwu f’10 ml ta’ metanol anidruż (4.4) u żid sa 20 ml bl-ilma. Iċċentrifuga s-soluzzjoni f’mill-inqas 4000 r/min għal mill-inqas ħames minuti. Agħmel dilwizzjonijiet sussegwenti b’ 50 % metanol (4.6) biex tottjeni kontenut ta’ sodu ta’ monensin ta’ 8 μg/ml (= U8).

7.2. Soluzzjonijiet ta’ analiżi

Mis-soluzzjoni U8 ipprepara soluzzjonijiet U4 (kontenut mistenni: 4 μg/ml), U2 (kontenut mistenni: 2 μg/ml) u U1 (kontenut mistenni: 1 μg/ml) permezz ta’ dilwizzjoni suċċessiva (1 + 1) b’50 % metanol (4.6).

8. PROĊEDURA TA’ ANALIŻI

8.1. It-tilqim tal-medium ta’ analiżi

Laqqam il-medium ta’ analiżi (4.2) bis-sospensjoni ta’ l-ispora (3.2) f’50 sa 60 °C. Permezz ta’provi preliminari fuq pjanċi b’medium ta’ analiżi (4.2) iddetermina l-kwantità tas-sospensjoni ta l-ispora meħtieġa biex tagħtihom l-akbar żoni u dawk l-iktar ċari ta’ inibizzjoni bil-varji konċentrazzjonijiet ta’ sodju ta’ monensin.

8.2. Il-preparazzjoni tal-pjanċi

It-tixrid permezz ta’ agar jitwettaq fi pjanċi bl-erba’ konċentrazzonijiet tas-soluzzjoni standard (S8, S4, S2, S1) u bl-erba konċentrazzjonijiet tas-soluzzjoni ta’ analiżi (U8, U4, U2, U1). Dawn l-erba’ konċentrazzjonijiet ta’ estratt u standard għandhom neċessarjament jitqiegħdu f’kull pjanċa. Għal dan l-iskop, agħżel pjanċi kbar biżżejjed biex jippermettu mill-inqas tmien toqbiet b’dijametru ta’ 10 sa 13-il mm u mhux inqas minn 30 mm bejn iċ-ċentri li għandhom isiru fil-medium ta’ l-agar. It-test jista jitwettaq fuq pjanċi li jikkonsistu f’folja tal-ħġieġ b’ċirku ta’ superfiċi ta’ l-aluminju jew tal-plastik imqiegħed fuq, 200 mm fi djametru u 20 mm għoli.

Ferra’ fil-pjanċi kwantità tal-medium (4.2), imlaqqma bħal f’8.1, biex tagħti saff madwar 2 mm oħxon (60 ml għal pjanċa ta’ dijametru ta’ 200 mm) Ħalliha toqgħod f’pożizzjoni livell, taqqab it-toqob u qiegħed fihom volumi mkejla eżatt ta’ soluzzjonijiet ta’ analiżi u standard (bejn 0710 u 0715 ml għal kull toqba, skond id-dijametru). Applika kull konċentrazzjoni mill-inqas erba darbiet sabiex kull determinazzjoni hi soġġetta għal evalwazzjoni ta’ 32 żona ta’ inibizzjoni.

8.3. L-inkubazzjoni

Inkuba l-pjanċi għal bejn wieħed u ieħor 18-il siegħa f’35 sa 37 °C.

9. IL- VALUTAZZJONI

Kejjel id-djametru taż-żoni ta’ inibizzjoni sa l-eqreb 0· 1 mm. Irreġistra l-kejl medju għal kull konċentrazzjoni fuq karta grafika semilogaritimika li turi l-logaritmu tal-konċentrazzjonijiet f’relazzjoni mad-djametri taż-żoni ta’ inibizzjoni. Pinġi l-linji ta’ "l-aħjar qagħda" ta’ kemm is-soluzzjoni standard u l-estratt, per eżempju bħal taħt.

Iddetermina l-punt ta’ "l-aħjar qagħda" għal-livell standard l-iktar baxx (SL) bl-użu tal-formula:

SL =

10

Iddetermina l-punt ta’ "l-aħjar qagħda" għal-livell standard l-iktar għoli (SH) bl-użu tal-formula:

SH =

10

Bl-istess mod, ikkalkula l-punti ta’ "l-aħjar qagħda" għal-livell ta’ l-estratt l-iktar baxx (UL) u l-livell l-iktar għoli ta’ l-estratt (UH) billi tissostitwixxi U1, U2, U4 uU8 għal S1, S2, S4 u S8 fil-formuli ta’ hawn fuq.

Irreġistra l-valuri kkalkolati SL u SH fuq listess karta grafika u għaqqadhom biex tagħti l-linja ta’ "l-aħjar qagħda" għas-soluzzjoni standard. Bl-istess mod, irreġistra UL u UH u għaqqadhom biex tagħti l-linja ta’ "l-aħjar qagħda" għall-estratt.

Fl-assenza ta’ xi interferenza l-linji għandhom ikunu paralleli. Għal skopijiet prattiċi l-linji jistgħu jiġu kkunsidrati paralleli jekk il-valuri (SH-SL) u (UH-UL) ma jvarjawx b’iktar minn 10 % mill-valur medju tagħhom

Jekk il-linji jinstab li mhumiex paralleli, jew l-U1 u s-S1 jew l-U8 u s-S8 jistgħu jitwarrbu u s-Sl, s-SH, l-UL u l-UH ikkalkulati, bl-użu tal-formuli alternattivi, biex jagħtu l-linji alternattivi ta’ "l-aħjar qagħda":

a')SL = 5 S1 + 2 S2 − S46 | jew | 5 S2 + 2 S4 − S86 |

a')SL = 5 S1 + 2 S2 − S46 | jew | 5 S2 + 2 S4 − S86 |

u bl-istess mod għal UL u UH. Il-linji alternattivi ta’ "l-aħjar qagħda" għandhom jiġu kkontrollati għal paralelliżmu qabel. Il-fatt li r-riżultat ġie kkalkolat minn tliet livelli għandu jiġi nnutat fir-rapport finali.

Meta l-linji huma kkunsidrati bħala paralleli, ikkalkula l-logaritmu tal-log relattiv ta’ attività.

(log. A) permezz ta’ waħda mill-formuli li ġejjin:

log A =

U

+ U

+ U

+ U

– S

– S

– S

– S

8 × 0,602U4 + U8 + S4 + S8 – U1 – U2 – S1 – S2

Għal tliet livelli

log A =

U

+ U

+ U

– S

– S

– S

4 × 0,401U4 + S4 – U1 – S1

jew

log A =

U

+ U

+ U

– S

– S

– S

8 × 0,401U8 + S8 – U2— S2

L-attività reali = l-attività mistennija × l-attività relattiva.

Jekk l-attività relattiva tinstab barra l-firxa ta’ 0· 5 sa 2 ·0, imbagħad irrepeti l-analiżi b’aġġustamenti approprjati għall-konċentrazzjonijiet ta’ l-estratt jew, jekk dan mhuwiex possibbli, għas-soluzzjoni standard. Meta l-attività relattiva ma tistax tinġjieb fil-firxa meħtieġa, kull riżultat ottenut għandu jiġi kkunsidrat bħala approssimat u dan għandu jiġi nnutat fir-rapport finali.

Meta l-linji huma kkunsidrati bħala li mhumiex paralleli, irrepeti d-determinazzjoni. Jekk il-paraelliżmu xorta ma jintlaħaqx, id-determinazzjoni għandha tiġi kkunsidrata bħala insodisfaċenti.

10. IR-RATA TA’ REPETIZZJONI

Id-differenza bejn ir-riżultati ta’ żewġ determinazzjonijiet imwettqa fuq l-istess kampjun, mill-istess analist, m’għandhiex tinqabeż:

- 20 % relatat ma’ l-ogħla valur għal kontenuti ta’ sodju monensin minn 10 sa 25 mg/kg,

- 5 mg/kg, f’valur assolut, għal kontenuti ta’ 25 sa 50 mg/kg,

- 10 % relatat ma’ l-ogħla valur għal kontenuti l fuq minn 50 mg/kg.

[1] Jistgħu jintużaw metodi oħrajn sakemm ikun ġie stabbilit li jagħtu sospensjonijiet simili ta’ l-ispori.

[2] Kull medium kummerċjali tal-kultura ta’ kompożizzjoni simili u li jagħti l-istess riżultati jista’ jintuża..

[3] 1 mg tas-sodju tal-monensin hija ekwivalenti għal 1000 UK unità..

[4] Jistgħu jintużaw metodi oħrajn sakemm ikun ġie stabbilit li jagħtu sospensjonijiet simili ta’ l-ispori.

[5] Kull medium kummerċjali tal-kultura ta’ komposizzjoni simili u li jagħti l-istess riżultati jista’ jintuża.

--------------------------------------------------