1.

Šī testēšanas metode ir līdzvērtīga Ekonomiskās sadarbības un attīstības organizācijas (ESAO) Testēšanas norādījumiem 105 (TG) (1995. gads). Šī testēšanas metode ir sākotnējo 1981. gadā pieņemto TG 105 pārskatīta versija. Nav būtiskas atšķirības starp pašreizējo versiju un 1981. gada versiju. Galvenokārt ir mainīta forma. Pārskatīšanas pamatā bija ES testēšanas metode “Šķīdība ūdenī” (1).

2.

Vielas šķīdību ūdenī var būtiski ietekmēt piemaisījumi. Ar šo testēšanas metodi nosaka praktiski tīru, ūdenī stabilu un negaistošu vielu šķīdību ūdenī. Pirms noteic šķīdību ūdenī, ir lietderīgi iegūt provizorisku informāciju par testējamo vielu, piemēram, par struktūrformulu, tvaika spiedienu, disociācijas konstanti un hidrolīzi atkarībā no pH līmeņa.

3.

Šis testēšanas metožu apraksts aptver divas metodes, proti, kolonnas eluēšanas metodi un kolbas metodi, kas attiecas uz šķīdību, kura ir attiecīgi mazāka un lielāka par 10–2 g/l. Ir aprakstīts arī vienkāršots provizorisks tests. Tajā var aptuveni noteikt, kādam jābūt galīgajā testā izmantotā parauga apjomam un cik daudz laika vajag, lai sasniegtu piesātinājumu.

4.

Vielas šķīdība ūdenī ir vielas piesātinājuma masas koncentrācija ūdenī attiecīgajā temperatūrā.

5.

Šķīdību ūdenī izsaka ar izšķīdušās vielas masu uz vienu šķīduma tilpuma vienību. SI mērvienība ir kg/m3, bet var izmantot arī g/l.

6.

Pētot testējamo vielu, nav vajadzības izmantot ķīmiskās standartvielas.

7.

Testu vēlams veikt 20 ± 0,5 °C temperatūrā. Izraudzītā temperatūra pastāvīgi jāuztur visās attiecīgajās iekārtas daļās.

8.

Aptuveni 0,1 gramam parauga (cietas testējamās vielas ir jāsaberž pulverī) 10 ml mērcilindrā ar stikla aizbāzni pakāpeniski pieaugošā daudzumā pievieno ūdeni istabas temperatūrā. Pēc katras kāda ūdens daudzuma pievienošanas maisījumu 10 minūtes krata un vizuāli pārbauda, vai tajā vēl ir neizšķīdušas parauga daļiņas. Ja pēc 10 ml ūdens pievienošanas viss paraugs vai tā daļas nav izšķīdušas, noteikšanu atkārto 100 ml mērcilindrā. Aptuvenā šķīdība ir norādīta 1. tabulā zem pievienotā ūdens daudzuma, kurā notiek parauga pilnīga izšķīšana. Testējamām vielām ar zemu šķīdību pilnīgai izšķīšanai var būt vajadzīgs ilgs laiks un būtu jāļauj šķīst vismaz 24 stundas. Ja pēc 24 stundām viela joprojām nav izšķīdusi, būtu jāļauj šķīst ilgāku laiku (līdz 96 stundām) vai jāturpina atšķaidīšana, lai noskaidrotu, vai šķīdības noteikšanu vēlams veikt pēc kolonnas eluēšanas metodes vai kolbas metodes.

1.   tabula

9.

Šīs metodes pamatā ir testējamās vielas eluēšana ar ūdeni no mikrokolonnas, kurā ir inerts nesējs, kas iepriekš ir bagātīgi pārklāts ar testējamo vielu (2). Šķīdību ūdenī izsaka kā eluāta masas koncentrāciju brīdī, kad šī koncentrācija kā laika funkcija ir sasniegusi plato.

10.

Iekārta sastāv no mikrokolonnas (1. attēls), ko uztur nemainīgā temperatūrā. Tā ir savienota vai nu ar recirkulācijas sūkni (2. attēls), vai ar spiediena izlīdzināšanas trauku (3. attēls). Mikrokolonnā ir inerts nesējs, ko vietā notur neliels stikla vates tampons, kurš vienlaikus aiztur neizšķīdušās daļiņas. Par nesēju var izmantot, piemēram, stikla lodītes, irdeno diatomītu vai citus inertus materiālus.

11.

Turpmāk 1. attēlā parādītā mikrokolonna ir piemērota recirkulācijas sūkņa uzstādīšanai. Tai ir brīvais tilpums, kurā ietilpst pieci slāņa tilpumi (no kuriem testa sākumā atbrīvojas) un piecu paraugu tilpums (ko testa laikā atvelk analīzes veikšanai). Pastāv arī iespēja izmērus samazināt, ja testa laikā sistēmai var pievienot ūdeni, ar ko aizvieto sākotnējos piecus slāņa tilpumus, kuri tikuši izvadīti kopā ar piemaisījumiem. Ar inerta materiāla caurulīti kolonna ir pievienota recirkulācijas sūknim, ar kuru var piegādāt aptuveni 25 ml/h. Par recirkulācijas sūkni var izmantot, piemēram, peristaltisko sūkni vai membrānas sūkni. Jāizvairās no piesārņošanas ar caurulīšu materiālu un/vai attiecīgas adsorbcijas.

12.

Turpmāk 3. attēlā ir parādīta shematiskā sistēma, kurā izmantots spiediena izlīdzināšanas trauks. Šajā sistēmā mikrokolonna ir aprīkota ar vienvirziena krānu. Spiediena izlīdzināšanas trauks ir pievienots ar pieslīpēta stikla savienojumu un inerta materiāla caurulīti. Spiediena izlīdzināšanas traukā ieteicams izmantot plūsmas ātrumu aptuveni 25 ml/h.

1.   attēls

Izmēri milimetros

2.   attēls

3.   attēls

13.

Apaļkolbā (50 ml) ievieto aptuveni 600 mg nesējmateriāla. Vajadzīgo testējamās vielas daudzumu izšķīdina analītiski tīrā gaistošā šķīdinātājā, un attiecīgu šā šķīduma daudzumu pievieno nesējam. Šķīdinātāju pilnībā iztvaicē, piemēram, izmantojot rotācijas ietvaicētāju, tāpēc ka pretējā gadījumā eluēšanas laikā netiek panākta nesēja piesātināšanās ar ūdeni, jo notiek sadalīšanās uz virsmas. Sagatavoto nesējmateriālu divas stundas mērcē aptuveni 5 ml ūdens un suspensiju iepilda mikrokolonnā. Var arī sausu sagatavotu nesējmateriālu iebērt mikrokolonnā, kurā iepildīts ūdens, un divas stundas nostādināt.

14.

Nesējmateriāla uzpildīšana var radīt problēmas, tādēļ iegūtie rezultāti var būt kļūdaini, piemēram, ja testējamā viela eļļveidīgi nogulsnējas. Šādas problēmas jāizskata, un rezultāti jāatspoguļo ziņojumā.

15.

Caur kolonnu sāk laist plūsmu. Tās ieteicamais ātrums ir apmēram 25 ml/h, kas atbilst aprakstītās kolonnas 10 slāņa tilpumiem stundā. Vismaz no pieciem pirmajiem slāņa tilpumiem atbrīvojas, lai atdalītu ūdenī šķīstošos piemaisījumus. Tad iedarbina sūkni, līdz iestājas līdzsvars, par ko liecina pieci secīgi paraugi, kuru koncentrācijas nejaušās atšķirības nepārsniedz ± 30 %. Šos paraugus ņem ar tādu laika intervālu, kurā izplūstošais daudzums atbilst vismaz 10 kolonnas slāņa tilpumiem. Atkarībā no izmantotās analītiskās metodes var būt vēlams izveidot koncentrācijas/laika līkni, pēc kuras varētu pārliecināties, ka ir sasniegts līdzsvars.

16.

Pēc secīgu eluāta frakciju ievākšanas tās analizē, izmantojot izraudzīto metodi. Šķīdības noteikšanai izmanto eluāta vidējās frakcijas, kurās vielas koncentrācija vismaz piecās secīgās frakcijās nemainīgi ir ± 30 %.

17.

Ieteicamais eluents ir bidestilēts ūdens. Var izmantot arī dejonizētu ūdeni ar pretestību vairāk nekā 10 megaomi uz centimetru un kopējo organiskā oglekļa saturu zem 0,01 %.

18.

Abās procedūrās otro sēriju veic ar plūsmas ātrumu, kas ir uz pusi mazāks par pirmās sērijas plūsmas ātrumu. Ja pēc abām sērijām iegūtie rezultāti sakrīt, uzskata, ka noteikšanas rezultāti ir apmierinoši. Ja ar mazāku plūsmas ātrumu noteiktā šķīdība ir lielāka, tad plūsmas ātrums divkārt jāsamazina tik ilgi, kamēr pēc divām secīgām sērijām iegūtie šķīdības rezultāti sakrīt.

19.

Abos gadījumos jāpārbauda, vai frakcijas nesatur koloīdus, par ko liecina Tindala efekts. Šādu daļiņu klātbūtne padara rezultātus neizmantojamus, un noteikšana jāatkārto pēc kolonnas filtrācijas spējas uzlabošanas.

20.

Jānosaka katra parauga pH līmenis, vēlams, izmantojot speciālas indikatorstrēmeles.

21.

Testējamo vielu (cietvielas ir jāsaberž pulverī) izšķīdina ūdenī temperatūrā, kas nedaudz pārsniedz temperatūru, kuru izmanto noteikšanai. Kad ir panākta piesātināšanās, maisījumu atdzesē un glabā tādā temperatūrā, kādā tiks veikta noteikšana. Vai arī, ja pienācīga paraugu ņemšanas programma liecina, ka ir sasniegts piesātinājuma līdzsvars, mērījumu (noteikšanas temperatūrā) var veikt nekavējoties. Pēc tam ar piemērotu analītisko metodi (3) nosaka testējamās vielas masas koncentrāciju ūdens šķīdumā, kas nedrīkst saturēt neizšķīdušas daļiņas.

22.

Ir vajadzīgi šādi materiāli:

23.

Vispirms provizoriskā testā nosaka, kāds testējamās vielas daudzums nepieciešams vajadzīgā ūdens tilpuma piesātināšanai. Katrā no trijiem stikla traukiem ar stikla aizbāzni (piemēram, centrifūgas mēģenēs vai kolbās) iesver apmēram piecreiz lielāku minēto vielas daudzumu. Katrā traukā pievieno tik ūdens, cik vajadzīgs atkarībā no analītiskās metodes un šķīdības diapazona. Pēc tam traukus cieši noslēdz un saturu kustina 30 °C temperatūrā. Jāizmanto kratītājs vai maisītājs, kas var darboties nemainīgā temperatūrā, piemēram, jāmaisa ar magnētisko maisītāju termostatējamā ūdens vannā. Pēc vienas dienas vienu no traukiem 24 stundas testēšanas temperatūrā nostādina, to periodiski sakratot. Pēc tam trauka saturu centrifugē testēšanas temperatūrā un ar piemērotu analītisko metodi nosaka testējamās vielas koncentrāciju dzidrajā ūdens fāzē. Pēc attiecīgas divu un triju dienu nostādināšanas 30 °C temperatūrā tāpat rīkojas ar pārējām divām kolbām. Ja vismaz divos pēdējos traukos noteiktās koncentrācijas neatšķiras vairāk kā par 15 %, uzskata, ka tests ir izdevies. Ja ar pirmo, otro un trešo trauku iegūto rezultātu vērtībai ir tendence paaugstināties, tests pilnībā jāatkārto, izmantojot ilgāku nostādināšanas laiku.

24.

Testu var veikt arī bez iepriekšējas inkubēšanas 30 °C temperatūrā. Lai noteiktu, cik ātri iestājas piesātinājuma līdzsvars, paraugus ņem līdz brīdim, kamēr maisīšanas ilgums vairs neietekmē noteikto koncentrāciju.

25.

Jānosaka katra parauga pH līmenis, vēlams, izmantojot īpašas indikatorstrēmeles.

26.

Ir ieteicams izmantot metodi, kas piemērota konkrētai vielai, jo pat neliels daudzums šķīstošu piemaisījumu šķīdības mērījumu rezultātos var radīt nopietnas kļūdas. Šādu metožu piemēri ir gāzhromatogrāfija vai šķidrumhromatogrāfija, titrēšana, fotometrija un voltametrija.

27.

Katrā sērijā jāaprēķina vidējā vērtība un standartnovirze, izmantojot vismaz piecus secīgus piesātinājuma plato fāzē ņemtus paraugus. Vidējās vērtības, kas iegūtas divos testos ar dažādām plūsmām, nedrīkst atšķirties vairāk kā par 30 %.

28.

Aprēķina vidējo vērtību no visu triju kolbu atsevišķajiem rezultātiem, kas nedrīkst atšķirties vairāk kā par 15 %.

29.

Testēšanas pārskatā jāiekļauj šāda informācija:

30.

Testēšanas pārskatā jāiekļauj šāda informācija:

(1)

Komisijas 1992. gada 31. jūlija Direktīva 92/69/EEK, ar ko septiņpadsmito reizi tehnikas attīstībai pielāgo Padomes Direktīvu 67/548/EEK par normatīvo un administratīvo aktu tuvināšanu attiecībā uz bīstamu vielu klasifikāciju, iepakošanu un marķēšanu (OV L 383, 29.12.1992., 54. lpp.).

(2)

NF T 20-045 (AFNOR) (September 1985). Chemical products for industrial use – Determination of water solubility of solids and liquids with low solubility – Column elution method.

(3)

NF T 20-046 (AFNOR) (September 1985). Chemical products for industrial use – Determination of water solubility of solids and liquids with high solubility – Flask method.”;

1.

Šī testēšanas metode ir līdzvērtīga ESAO Testēšanas norādījumiem 123 (TG) (2006). 1-oktanola/ūdens sadalījuma koeficienta (POW) vērtības līdz log POW 8,2 ir precīzi noteiktas ar lēnās maisīšanas metodi (1). Tāpēc šī eksperimentālā pieeja ir piemērota izteikti hidrofobisku vielu POW tiešai noteikšanai.

2.

Citas metodes 1-oktanola/ūdens sadalījuma koeficienta (POW) noteikšanai ir “kolbu kratīšanas metode” (2) un POW noteikšana pēc apgrieztās fāzes HPLC aiztures dinamikas (3). “Kolbu kratīšanas metode” mēdz radīt artefaktus, un tā cēlonis ir oktanola mikropilienu nonākšana ūdens fāzē. Ja POW vērtības palielinās, šo pilienu klātbūtne ūdens fāzē noved pie tā, ka testējamās vielas koncentrācija ūdenī aizvien vairāk tiek novērtēta par augstu. Tāpēc to var izmantot tikai vielām ar log POW < 4. Ar otro metodi, izmantojot stabilus datus par tieši noteiktām POW vērtībām, kalibrē sakarību starp HPLC aiztures dinamiku un noteiktajām POW vērtībām. Agrāk projekta veidā bija pieejami ESAO norādījumi par jonizējamu vielu 1-oktanola/ūdens sadalījuma koeficientu noteikšanu (4), bet tos vairs neizmantos.

3.

Šī testēšanas metode ir izstrādāta Nīderlandē. Šeit aprakstīto metožu precizitāte ir validēta un optimizēta ar starplaboratoriju salīdzinošu testēšanu veiktā validējošā pētījumā, kurā piedalījās 15 laboratorijas (5).

4.

Inertām organiskajām vielām ir konstatētas ļoti būtiskas sakarības starp 1-oktanola/ūdens sadalījuma koeficientiem (POW) un šo vielu bioakumulāciju zivīs. Turklāt ir pierādīts, ka POW korelē ar toksiskumu zivīm, kā arī ar ķīmisko vielu sorbciju uz tādām cietvielām kā augsne un nogulumieži. Plašs pārskats par šīm sakarībām sniegts norādītajā avotā (6).

5.

Ir konstatēts daudz dažādu sakarību starp 1-oktanola/ūdens sadalījuma koeficientu un citām vielu īpašībām, kas attiecas uz vides toksikoloģiju un ķīmiju. Rezultātā 1-oktanola/ūdens sadalījuma koeficients ir kļuvis par vienu no galvenajiem parametriem, novērtējot ķīmisko vielu radīto risku videi, kā arī prognozējot ķīmisko vielu apriti vidē.

6.

Uzskata, ka lēnās maisīšanas eksperimentā no 1-oktanola pilieniem ūdens fāzē mazāk veidojas mikropilieni. Tas novērš ietekmi, ko rada testējamās vielas molekulu piesaistīšanās šādiem pilieniem, un attiecīgi ūdens koncentrācija netiek novērtēta pārāk augstu. Tāpēc lēnās maisīšanas metode ir īpaši piemērota POW noteikšanai vielām, kuru paredzamā log POW vērtība ir 5 un augstāka un kurām “kolbu kratīšanas metode” (2) var sniegt kļūdainus rezultātus.

7.

Vielas sadalījuma koeficients starp ūdeni un lipofilu šķīdinātāju (1-oktanolu) raksturo ķīmiskās vielas līdzsvara sadalījumu starp abām fāzēm. Sadalījuma koeficientu starp ūdeni un 1-oktanolu (POW) definē kā attiecību starp divām testējamās vielas līdzsvara koncentrācijām – ar ūdeni piesātinātā 1-oktanolā (CO) un ar 1-oktanolu piesātinātā ūdenī (CW).

Kā koncentrāciju attiecība šis koeficients ir bezdimensijas lielums. Visbiežāk to izsaka kā decimāllogaritmu (log POW). POW ir atkarīgs no temperatūras, un ziņojumā ietvertajos datos ir jānorāda temperatūra mērījumu laikā.

8.

Lai noteiktu sadalījuma koeficientu, ūdenim, 1-oktanolam un testējamajai vielai ļauj sasniegt savstarpēja līdzsvara stāvokli nemainīgā temperatūrā. Pēc tam nosaka testējamās vielas koncentrāciju abās fāzēs.

9.

Eksperimentālās grūtības, kas kolbu kratīšanas testā saistītas ar mikropilienu veidošanos, var samazināt ar šeit ieteikto lēnās maisīšanas testu. Lēnās maisīšanas testā ūdenim, 1-oktanolam un testējamajai vielai ļauj nostāvēties termostatējamā reaktorā ar maisītāju. Apmaiņu starp fāzēm paātrina ar maisīšanu. Ar maisīšanu tiek nodrošināta neliela turbulence, kas uzlabo 1-oktanola un ūdens apmaiņu, novēršot mikropilienu veidošanos (1).

10.

Tā kā citu vielu klātbūtne varētu ietekmēt testējamās vielas aktivitātes koeficientu, testējamā viela ir jātestē kā tīra viela. 1-oktanola/ūdens sadalījuma testā ir jāizmanto viela ar tirdzniecībā pieejamo augstāko tīrību.

11.

Šī metode piemērojama tīrām vielām, kas nedisociējas vai neasociējas un kam nepiemīt būtiska starpfāžu aktivitāte. To var izmantot, lai noteiktu šādu vielu un maisījumu 1-oktanola/ūdens sadalījuma attiecību. Ja metodi izmanto maisījumiem, noteiktās 1-oktanola/ūdens sadalījuma attiecības ir atkarīgas no testējamā maisījuma ķīmiskā sastāva un no izmantotās ūdens fāzes elektrolītu sastāva. Ar nosacījumu, ka tiek veikti papildu pasākumi, metodi var piemērot arī savienojumiem, kas disociējas vai asociējas (12. punkts).

12.

Tā kā ūdenī un 1-oktanolā, kas iesaistīti disociējošos vielu (piemēram, organisko skābju un fenolu, organisko bāzu un metālorganisko vielu) 1-oktanola/ūdens sadalījumā, ir vairāki sadalījuma līdzsvari, 1-oktanola/ūdens sadalījuma attiecība ir nosacījuma konstante, kura ir lielā mērā atkarīga no elektrolītu sastāva (7) (8). Tāpēc 1-oktanola/ūdens sadalījuma attiecības noteikšanai ir vajadzīgs, lai pH un elektrolītu sastāvs testā tiktu regulēts un arī norādīts ziņojumā. Šo sadalījuma attiecību izvērtēšanā jāizmanto ekspertu atzinumi. Izmantojot disociācijas konstantes(-šu) vērtību, jāizraugās tādas piemērotas pH vērtības, lai sadalījuma attiecība tiktu noteikta katram jonizācijas stāvoklim. Testējot metālorganiskos savienojumus, jāizmanto buferšķīdumi, kas nav kompleksveidotāji (8). Ņemot vērā esošās zināšanas par ūdens ķīmiju (kompleksu veidošanās konstantēm, disociācijas konstantēm), jāizraugās tādi eksperimenta apstākļi, lai varētu aprēķināt testējamās vielas sastāvu ūdens fāzē. Visos eksperimentos jābūt vienādam jonu spēkam, ko panāk, izmantojot fona elektrolītu.

13.

Sarežģījumi testā var rasties, ja tiek testētas vielas ar zemu šķīdību ūdenī vai augstu POW, jo tādā gadījumā koncentrācijas ūdenī ir ļoti zemas un ir grūti tās precīzi noteikt. Šī testēšanas metode sniedz norādījumus, kā risināt šo problēmu.

14.

Ķīmiskajiem reaģentiem jābūt analītiski tīriem vai vēl tīrākiem. Ieteicams lietot neiezīmētas testējamās vielas ar zināmu ķīmisko sastāvu un, vēlams, vismaz 99 % tīrību vai radioaktīvi iezīmētas testējamās vielas ar zināmu ķīmisko sastāvu un radioķīmisko tīrību. Ja iezīmēšanai izmantoti izotopi ar īsu pussabrukšanas periodu, dati attiecīgi jākoriģē. Ja iezīmēšanai izmantoti izotopi ar īsu pussabrukšanas periodu, jāveic attiecīga korekcija. Izmantojot iezīmētas testējamās vielas, jāizmanto attiecīgajai ķīmiskajai vielai specifiska analītiskā metode, lai nodrošinātu, ka izmērītā radioaktivitāte ir tieši saistīta ar testējamo vielu.

15.

Log POW vērtību var aptuveni aprēķināt ar komerciāli pieejamu programmatūru log POW aplēšanai vai arī pēc attiecības starp vielas šķīdību vienā un otrā šķīdinātājā.

16.

Pirms veic lēnās maisīšanas eksperimentu, lai noteiktu POW, par testējamo vielu jābūt pieejamai šādai informācijai:

17.

Vajadzīgs laboratorijas standartaprīkojums, it sevišķi šāds:

18.

Traukiem jābūt izgatavotiem no inerta materiāla, lai adsorbcija uz trauku virsmām būtu niecīga.

19.

POW jānoteic, izmantojot 1-oktanolu ar augstāko komerciāli pieejamo tīrību (vismaz + 99 %). 1-oktanolu ieteicams attīrīt, izmantojot ekstrakciju ar skābi, bāzi un ūdeni un pēc tam žāvēšanu. Papildus tam 1-oktanola attīrīšanā var izmantot destilāciju. Testējamo vielu standartšķīdumu sagatavošanā ir jāizmanto attīrīts 1-oktanols. Ūdenim, ko izmanto POW noteikšanā, jābūt destilētam stikla vai kvarca aparātā vai iegūtam attīrīšanas sistēmā, vai arī var izmantot ūdeni ar HPLC klases tīrību. Destilēts ūdens ir jāfiltrē caur 0,22 μm filtru, un ir jāizmanto arī tukšie paraugi, lai pārliecinātos, ka koncentrētajos ekstraktos nav piemaisījumu, kas varētu interferēt ar testējamo vielu. Ja izmanto stikla šķiedru filtru, tas jāsterilizē, vismaz trīs stundas to karsējot 400 °C temperatūrā.

20.

Pirms eksperimenta abus šķīdinātājus savstarpēji piesātina, pietiekami lielā traukā tos līdzsvarojot. To izdara, divfāžu sistēmu divas dienas lēni maisot.

21.

Attiecīgi izraugās testējamās vielas koncentrāciju, un vielu šādā koncentrācijā izšķīdina 1-oktanolā (kas piesātināts ar ūdeni). Vielas šķīdumiem 1-oktanolā un ūdenī jānosaka 1-oktanola/ūdens sadalījuma koeficients. Tāpēc testējamās vielas koncentrācija nedrīkst pārsniegt 70 % no tās šķīdības ar maksimālo koncentrāciju 0,1 M jebkurā no fāzēm (1). 1-oktanola šķīdumos, ko izmanto eksperimentā, nedrīkst būt neizšķīdušu suspendētu testējamās cietvielas daļiņu.

22.

Attiecīgu testējamās vielas daudzumu izšķīdina 1-oktanolā (kas piesātināts ar ūdeni). Ja log POW aplēse pārsniedz 5, jāraugās, lai 1-oktanola šķīdumos, ko izmanto eksperimentā, nebūtu suspendētu testējamās cietvielas daļiņu. Šajā nolūkā ar ķīmiskām vielām, kam aplēstā log POW vērtība ir > 5, rīkojas šādi:

23.

Testējamās vielas analizēšanai jāizmanto validēta analītiskā metode. Pētniekiem jāsniedz dati, kas pierāda, ka koncentrācija gan ar ūdeni piesātinātā 1-oktanolā, gan arī ar 1-oktanolu piesātinātā ūdens fāzē testa laikā pārsniedz ar analītiskajās procedūrās izmantoto metodi saistīto kvantificēšanas robežu. Gadījumos, kuros nepieciešams izmantot ekstrakcijas metodes, pirms eksperimenta jānosaka testējamās vielas analītiskā atgūstamība no ūdens fāzes un no 1-oktanola fāzes. Analītiskais signāls jākoriģē pēc tukšiem paraugiem un jāraugās, lai nenotiek analīta pārnese no parauga uz paraugu.

24.

Pirms analīzes, visticamāk, būs jāveic ūdens fāzes ekstrakcija ar organisku šķīdinātāju, kā arī ekstrakta priekškoncentrēšana, jo hidrofobām testējamām vielām ūdens fāzē ir samērā zema koncentrācija. Tā paša iemesla dēļ ir jāsamazina iespējamās koncentrācijas tukšajiem paraugiem. Šajā nolūkā ir jāizmanto šķīdinātāji ar augstu tīrību, vislabāk šķīdinātāji, kas paredzēti vielu atlieku analīzei. Turklāt, strādājot ar iepriekš rūpīgi sagatavotiem (piemēram, ar šķīdinātājiem mazgātiem vai augstā temperatūrā karsētiem) stikla priekšmetiem, vieglāk ir izvairīties no piesārņojuma izplatīšanās.

25.

Gaidāmās log POW vērtības aplēsi var iegūt ar aplēšanas programmu vai pēc ekspertu vērtējuma. Ja šī vērtība ir augstāka par 6, rūpīgi jākontrolē korekcijas pēc tukšajiem paraugiem un analīta iespējamā pārnese. Tāpat, ja log POW aplēse pārsniedz 6, atgūstamības koriģēšanā obligāti jāizmanto kāds surogātstandarts, lai varētu sasniegt augstus priekškoncentrēšanas koeficientus. Komerciāli pieejamas vairākas POW aplēšanas datorprogrammas (1), piemēram, Clog P (16), KOWWIN (17), ProLogP (18) un ACD log P (19). Aplēšanas pieeju apraksti atrodami avotos, kas norādīti atsaucēs (20–22).

26.

To, kādās kvantificēšanas robežās (LOQ) iespējams noteikt testējamas vielas daudzumu 1-oktanolā un ūdenī, novērtē, izmantojot atzītas metodes. Ar metodi saistīto kvantificēšanas robežu aptuveni var noteikt kā to koncentrāciju ūdenī vai 1-oktanolā, kurai signāla un trokšņa attiecība ir 10. Jāizraugās piemērota ekstrakcijas un priekškoncentrēšanas metode, kā arī jānosaka analītiskā atgūstamība. Lai analītiskajā noteikšanā iegūtu vajadzīgā lieluma signālu, izraugās piemērotu priekškoncentrēšanas koeficientu.

27.

Pamatojoties uz analītiskās metodes parametriem un gaidāmajām koncentrācijas vērtībām, aptuveni nosaka, cik liels paraugs vajadzīgs, lai precīzi noteiktu savienojuma koncentrāciju. Nedrīkst izmantot tādus ūdens paraugus, kas ir pārāk mazi, lai iegūtu pietiekamu analītisko signālu. Tāpat jāizvairās no pārāk lielu ūdens paraugu izmantošanas, jo tad ūdens varētu pietrūkt minimālajam nepieciešamajam analīžu skaitam (n = 5). 1. papildinājumā ir norādīts parauga minimālais tilpums atkarībā no trauka tilpuma, testējamās vielas LOD un testējamās vielas šķīdības.

28.

Testējamo vielu kvantificē, mērījumu rezultātus salīdzinot ar attiecīgajam savienojumam atbilstošām kalibrēšanas līknēm. Iekavās aiz analizēto paraugu koncentrācijām jānorāda standartu koncentrācijas.

29.

Tādu testējamo vielu šķīdumi, kurām log POW aplēse ir augstāka par 6, pirms ekstrakcijas jāpastiprina, tiem pievienojot surogātstandartu, lai reģistrētu zudumus, kas rodas ekstrakcijas un ūdens paraugu priekškoncentrēšanas laikā. Lai varētu precīzi koriģēt atgūstamību, surogātstandartiem jābūt ar tādām pašām vai ļoti līdzīgām īpašībām kā testējamajai vielai. Šajā nolūkā vēlams izmantot ar stabiliem izotopiem iezīmētus attiecīgo vielu analogus (piemēram, deiterētus vai ar 13C iezīmētus). Ja analogus, kas iezīmēti ar stabiliem izotopiem, t. i., 13C vai 2H, nav iespējams izmantot, ar drošiem literatūras datiem jāparāda, ka surogātstandarta fizikālķīmiskās īpašības ir ļoti līdzīgas testējamās vielas īpašībām. Ūdens fāzes šķidruma–šķidruma ekstrakcijas laikā var veidoties emulsijas. Tās var samazināt, pievienojot sāli un līdz nākamajai dienai nostādinot. Ziņojumā jānorāda paraugu ekstrakcijai un priekškoncentrēšanai izmantotās metodes.

30.

No 1-oktanola fāzes iegūtos paraugus pirms analīzes, ja nepieciešams, var atšķaidīt ar piemērotu šķīdinātāju. Turklāt vielām, kurām konstatēta liela atgūstamības izkliede (relatīvā standartnovirze > 10 %), atgūstamības korekcijai ieteicams izmantot surogātstandartus.

31.

Ziņojumā jāsniedz sīka informācija par izmantoto analītisko metodi. Tajā jāietver ziņas par ekstrakcijas metodi, priekškoncentrēšanas un atšķaidījuma koeficientiem, instrumentu parametriem, kalibrēšanas procesu, kalibrēšanas diapazonu, testējamās vielas analītisko atgūstamību no ūdens fāzes, atgūstamības korekcijai izmantotajiem surogātstandartiem, tukšo paraugu vērtībām, kā arī noteikšanas un kvantificēšanas robežām.

32.

Izvēloties ūdens un 1-oktanola tilpumus, jāņem vērā vielas LOQ 1-oktanolā un ūdenī, ūdens paraugiem izmantotie priekškoncentrēšanas koeficienti, ņemto 1-oktanola un ūdens fāzes paraugu tilpumi, kā arī gaidāmās koncentrācijas. 1-oktanola tilpums lēnās maisīšanas sistēmā eksperimentam jāizvēlas tāds, lai 1-oktanola slānis būtu pietiekami biezs (> 0,5 cm) un lai 1-oktanola fāzē paraugus varētu ņemt, to nesajaucot.

33.

Parasti fāžu attiecība, ko izmanto, testējot savienojumus, kuriem log POW ir 4,5 un augstāks, ir 20 līdz 50 ml 1-oktanola un 950 līdz 980 ml ūdens viena litra traukā.

34.

Testēšanas laikā reakcijas trauku termostatē, temperatūras svārstības samazinot līdz mazāk nekā 1 °C. Noteikšana jāveic 25 °C temperatūrā.

35.

Eksperimentālā sistēma jāaizsargā no dienasgaismas, testēšanu izdarot tumšā telpā vai arī reakcijas trauku pārklājot ar alumīnija foliju.

36.

Eksperiments jāveic no putekļiem tīrā vidē (ciktāl tas iespējams).

37.

1-oktanola un ūdens sistēmu maisa, līdz iestājies līdzsvars. Ievadeksperimentā līdzsvarošanās perioda ilgumu novērtē, veicot lēnās maisīšanas eksperimentu, kurā periodiski ņem ūdens un 1-oktanola paraugus. Starp paraugu ņemšanas reizēm jābūt vismaz piecām stundām.

38.

Katru POW skaitlisko vērtību nosaka pēc vismaz triju neatkarīgu lēnās maisīšanas eksperimentu rezultātiem.

39.

Pieņem, ka līdzsvars ir sasniegts, kad 1-oktanola/ūdens koncentrāciju attiecības regresija pret laiku četros laika punktos veido līniju, kuras slīpums ar ticamības līmeni 0,05 būtiski neatšķiras no nulles. Minimālais līdzsvarošanās laiks, pēc kura var sākt paraugu ņemšanu, ir viena diena. Parasti vielām, kuru log POW aplēse ir zemāka par 5, paraugu ņemšanu var veikt otrajā un trešajā dienā. Hidrofobiskākiem savienojumiem līdzsvarošanas laiku var nākties pagarināt. Savienojumam ar log POW 8,23 (dekahlorobifenols) līdzsvarošanai pietika ar 144 stundām. Līdzsvaru novērtē, paraugus no tā paša trauka ņemot atkārtoti.

40.

Eksperimenta sākumā reakcijas trauku uzpilda ar ūdeni, kas piesātināts ar 1-oktanolu. Jāatvēl pietiekams laiks, lai sasniegtu termostatā iestatīto temperatūru.

41.

Reakcijas trauka saturam uzmanīgi pievieno vēlamo daudzumu testējamās vielas (kas izšķīdināta vajadzīgajā daudzumā ar ūdeni piesātināta 1-oktanola). Šis ir ļoti atbildīgs testa posms, jo ir jāizvairās no abu fāžu turbulentas sajaukšanās. Šajā nolūkā 1-oktanola fāzi var lēnām iepilināt ar pipeti, tās galu vēršot pret eksperimenta trauka sienu tuvu ūdens virsmai. Šķidrums noplūdīs pa stikla sienu un izveidos plēvi virs ūdens fāzes. Nedrīkst 1-oktanolu dekantēt tieši kolbā; 1-oktanola pilieni nedrīkst krist tieši ūdenī.

42.

Maisīšanu sākot, maisīšanas ātrums jāpalielina pakāpeniski. Ja maisītāja motoru nav iespējams attiecīgi regulēt, varbūt jāizmanto transformators. Maisīšanas ātrums jāiestata tā, lai robežšķirtnē starp ūdeni un 1-oktanolu rastos 0,5 līdz 2,5 cm dziļš virpulis. Maisīšanas ātrums ir jāsamazina, ja virpuļa dziļums pārsniedz 2,5 cm; pretējā gadījumā ūdens fāzē no 1-oktanola pilieniem var izveidoties mikropilieni, kas noved pie testējamas vielas koncentrācijas ūdenī pārvērtēšanas. Ņemot vērā validācijas pētījumu rezultātus, kas iegūti starplaboratoriju salīdzinošās testēšanas programmā (5), ieteicamais maksimālais maisīšanas ātrums ir 2,5 cm. Tas ir kompromiss: maisot ar šādu ātrumu, fāžu līdzsvars iestājas pietiekami ātri, 1-oktanola mikropilieniem veidojoties ierobežoti.

43.

Pirms paraugu ņemšanas maisītājs jāizslēdz un jānogaida, līdz apstājas šķidrumu kustība. Kad paraugu ņemšana pabeigta, maisītāju atkal lēnām palaiž, kā aprakstīts iepriekš, un tad maisīšanas ātrumu pakāpeniski palielina.

44.

Ūdens fāzes paraugu ņem no krāna reakcijas trauka apakšā. Pirms tam no krāna izlaiž ūdens “mirušo” tilpumu (kas 2. papildinājumā attēlotajam traukam ir apmēram 5 ml). Ūdens krānā netiek maisīts un tādēļ nav līdzsvarā ar pārējo šķidrumu. Reģistrē paraugu tilpumu un raugās, lai izlaistajā ūdenī esošās testējamās vielas daudzums tiktu ņemts vērā masas bilancē. Iztvaikošanas zudumi iespējami jāsamazina, ļaujot ūdenim mierīgi plūst tādā dalāmajā piltuvē, lai neizjuktu ūdens/1-oktanola slānis.

45.

1-oktanola paraugus iegūst, ar 100 mikrolitru šļirci, kas izgatavota no stikla un metāla, ievelkot nelielu alikvotu (apm. 100 μl) no 1-oktanola slāņa. Jārīkojas rūpīgi, lai neizjauktu fāžu robeža. Ņemtā parauga tilpumu reģistrē. Ar nelielu alikvotu pietiek, jo 1-oktanola paraugu atšķaidīs.

46.

Jāizvairās no nevajadzīgas paraugu pārnešanas. Tāpēc parauga tilpums jānosaka gravimetriski. Ūdens paraugiem tas izdarāms, ūdens paraugu ņemot dalāmajā piltuvē, kurā jau iepildīts vajadzīgais daudzums šķīdinātāja.

47.

Saskaņā ar šo testēšanas metodi POW nosaka, ar pētāmo savienojumu identiskos apstākļos veicot trīs lēnās maisīšanas eksperimentus (trīs eksperimentālas vienības). Regresijai, ko izmanto līdzsvara iegūšanas pierādīšanai, jābūt balstītai uz vismaz četru CO/CW noteikšanu rezultātiem secīgos laikos. Tādējādi ir iespējams aprēķināt dispersiju kā katrā eksperimenta vienībā iegūtās vidējās vērtības nenoteiktības mēru.

48.

POW var raksturot ar katrai eksperimenta vienībai iegūto datu dispersiju. Šo informāciju izmanto, lai aprēķinātu POW kā atsevišķu eksperimenta vienību rezultātu vidējo svērto vērtību. Šajā nolūkā izsvēršanai izmanto eksperimentālo vienību rezultātu dispersijas apgriezto vērtību. Tādējādi dati ar lielām svārstībām (ko izsaka kā dispersiju) un tātad mazāku ticamību mazāk ietekmē rezultātu nekā dati ar nelielu dispersiju.

49.

Analoģiski aprēķina svērto standartnovirzi. Tā raksturo POW mērījuma atkārtojamību. Maza svērtā standartnovirze norāda, ka POW noteikšanas rezultātiem ir laba atkārtojamība vienā laboratorijā. Datu formāla statistiskā apstrāde ir aprakstīta turpmāk tekstā.

50.

Testējamās vielas koncentrāciju 1-oktanolā un ūdenī attiecības logaritmu (log (CO/Cw)) aprēķina katram paraugu ņemšanas laikam. Ķīmiskā līdzsvara sasniegšanu demonstrē ar šīs attiecības un laika sakarības grafiku. Šā grafika plato, ko nosaka vismaz pēc četriem secīgiem laika punktiem, norāda, ka līdzsvars ir sasniegts un ka savienojums ir patiešām izšķīdis 1-oktanolā. Ja tā nav, tests jāturpina, līdz četri secīgi laika punkti veido līniju, kuras slīpums ar ticamības līmeni 0,05 būtiski neatšķiras no nulles, norādot, ka log Co/Cw nav atkarīgs no laika.

51.

Eksperimentālās vienības log POW vērtību aprēķina kā vidējo svērto log Co/Cw vērtību tai log Co/Cw un laika sakarības grafika daļai, kurā ir pierādīts fāžu līdzsvars. Vidējo svērto vērtību aprēķina, datus izsverot pēc dispersijas apgrieztās vērtības, lai datu ietekme uz galīgo rezultātu būtu apgriezti proporcionāla datu nenoteiktībai.

52.

Dažādu eksperimentālo vienību vidējo log POW aprēķina kā vidējo vērtību no atsevišķu eksperimentālo vienību rezultātiem, kas izsvērti pēc to attiecīgajām dispersijām.

Aprēķinus veic pēc formulas:

kur:

Log POW,i dispersijas apgriezto lielumu izmanto kā wi ().

53.

Log POW vidējās vērtības kļūdu aprēķina kā log Co/Cw atkārtojamību, ko laikā pēc fāžu līdzsvara sasniegšanas nosaka individuālajām eksperimenta vienībām. To izsaka kā log POW,Av (σlog Pow,Av) svērto standartnovirzi, kas savukārt ir ar log POW,Av saistītās kļūdas mērs. Svērto standartnovirzi no svērtās dispersijas (varlog Pow,Av) var aprēķināt šādi:

Ar n apzīmē eksperimentālo vienību skaitu.

54.

Testēšanas ziņojumā jāsniedz šāda informācija:

(1)

De Bruijn JHM, Busser F, Seinen W, Hermens J. (1989). Determination of octanol/water partition coefficients with the “slow-stirring’ method. Environ. Toxicol. Chem. 8: 499-512.

(2)

Šā pielikuma A.8. nodaļa “Sadalījuma koeficients”.

(3)

Šā pielikuma A.8. nodaļa “Sadalījuma koeficients”.

(4)

OECD (2000). OECD Draft Guideline for the Testing of Chemicals: 122 Partition Coefficient (n-Octanol/Water): pH-Metric Method for Ionisable Substances. Paris.

(5)

Tolls J (2002). Partition Coefficient 1-Octanol/Water (Pow) Slow-Stirring Method for Highly Hydrophobic Chemicals, Validation Report. RIVM contract-Nrs 602730 M/602700/01.

(6)

Boethling RS, Mackay D (eds.) (2000). Handbook of property estimation methods for chemicals. Lewis Publishers Boca Raton, FL, USA.

(7)

Schwarzenbach RP, Gschwend PM, Imboden DM (1993). Environmental Organic Chemistry. Wiley, New York, NY.

(8)

Arnold CG, Widenhaupt A, David MM, Müller SR, Haderlein SB, Schwarzenbach RP (1997). Aqueous speciation and 1-octanol-water partitioning of tributyl- and triphenyltin: effect of pH and ion composition. Environ. Sci. Technol. 31: 2596-2602.

(9)

OECD (1981) OECD Guidelines for the Testing of Chemicals: 112 Dissociation Constants in Water. Paris.

(10)

Šā pielikuma A.6. nodaļa “Šķīdība ūdenī”.

(11)

Šā pielikuma C.7. nodaļa “Noārdīšanās – abiotiska noārdīšanās hidrolīze atkarībā no pH”.

(12)

Šā pielikuma C.4. nodaļa – II–VII daļa (A–F metode) “Vieglas bionoārdīšanās spējas noteikšana”.

(13)

Šā pielikuma A.4. nodaļa “Tvaika spiediens”.

(14)

Pinsuwan S, Li A and Yalkowsky S.H. (1995). Correlation of octanol/water solubility ratios and partition coefficients, J. Chem. Eng. Data. 40: 623-626.

(15)

Lyman WJ (1990). Solubility in water. In: Handbook of Chemical Property Estimation Methods: Environmental Behavior of Organic Compounds, Lyman WJ, Reehl WF, Rosenblatt DH, Eds. American Chemical Society, Washington, DC, 2-1 to 2-52.

(16)

Leo A, Weininger D (1989). Medchem Software Manual. Daylight Chemical Information Systems, Irvine, CA.

(17)

Meylan W (1993). SRC-LOGKOW for Windows. SRC, Syracuse, N.Y.

(18)

Compudrug L (1992). ProLogP. Compudrug, Ltd, Budapest.

(19)

ACD. ACD logP; Advanced Chemistry Development: Toronto, Ontario M5H 3V9, Canada, 2001.

(20)

Lyman WJ (1990). Octanol/water partition coefficient. In Lyman WJ, Reehl WF, Rosenblatt DH, eds, Handbook of chemical property estimation, American Chemical Society, Washington, D.C.

(21)

Rekker RF, de Kort HM (1979). The hydrophobic fragmental constant: An extension to a 1 000 data point set. Eur. J. Med. Chem. Chim. Ther. 14: 479-488.

(22)

Jübermann O (1958). Houben-Weyl, ed, Methoden der Organischen Chemie: 386-390.

1.

Šī testēšanas metode ir līdzvērtīga ESAO Testēšanas norādījumiem 403 (2009. gads) (1). Akūtajai inhalācijas toksicitātei veltītos Testēšanas norādījumus 403 (TG 403) pieņēma 1981. gadā. Šī pārskatītā B.2. testēšanas metode (kā pārskatīto TG 403 ekvivalents) ir izstrādāta tā, lai tā būtu elastīgāka, samazinātu dzīvnieku izmantošanu un nodrošinātu regulatīvās vajadzības. Pārskatītā testēšanas metode aptver divu veidu pētījumus, proti, tradicionālo LC50 protokolu un koncentrācija × laiks (C × t) protokolu. Šīs testēšanas metodes galvenās iezīmes ir iespēja nodrošināt koncentrācijas un atbildes reakcijas sakarību diapazonā no neletāliem līdz letāliem iznākumiem, lai uzzinātu vidējo letālo koncentrāciju (LC50), neletālo sliekšņa koncentrāciju (piemēram, LC01) un sakarības slīpumu un noteiktu iespējamu uzņēmības atkarību no dzimuma. C × t protokols ir jāizmanto gadījumos, kad pastāv konkrēta regulatīva vai zinātniska vajadzība, kuras dēļ ir nepieciešami testi ar dzīvniekiem ar vairākiem ilgumiem, piemēram, plānošanai attiecībā uz reaģēšanu ārkārtas situācijās (piemēram, akūtas ekspozīcijas norāžu līmeņu (AEGL) iegūšana, norādījumi plānošanai attiecībā uz reaģēšanu ārkārtas situācijās (ERPG) vai akūtas ekspozīcijas robežlīmeņu (AETL) vērtības) vai zemes izmantošanas plānošanai.

2.

Norādījumi par šīs testēšanas metodes pētījumu veikšanu un interpretēšanu ir pieejami Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing (GD 39) (2).

3.

Šīs testēšanas metodes kontekstā izmantotās definīcijas ir sniegtas šīs nodaļas beigās un GD 39 (2).

4.

Šī testēšanas metode ļauj raksturot testējamās ķīmiskās vielas un kvantitatīvi novērtēt risku, kā arī ļauj novērtēt un klasificēt testējamās ķīmiskās vielas saskaņā ar Regulu (EK) Nr. 1272/2008 (3). GD 39 (2) ir sniegti norādījumi, kā izvēlēties attiecīgu testēšanas metodi akūtās toksicitātes testēšanai. Ja ir vajadzīga vienīgi informācija par klasifikāciju un marķējumiem, parasti ieteicams izmantot šā pielikuma B.52. nodaļu (4) (sk. GD 39 (2)). Šī B.2. testēšanas metode nav īpaši paredzēta specializētu materiālu, piemēram, mazšķīstošu izometrisku materiālu vai šķiedrmateriālu, vai rūpnieciski ražotu nanomateriālu, testēšanai.

5.

Lai līdz minimumam samazinātu dzīvnieku izmantošanu testos, testēšanas laboratorijai, pirms tā apsver, vai testēšanu neveikt saskaņā ar šo metodi, ir jāizskata visa pieejamā informācija par testējamo ķīmisko vielu, arī līdzšinējie pētījumi (piemēram, šā pielikuma B.52. nodaļa (4)), kuru dati palīdzētu izvairīties no papildu testēšanas. Informācija, kas varētu palīdzēt piemērotāko sugu, līniju, dzimuma, ekspozīcijas režīma un attiecīgu testa koncentrāciju izvēlē, ietver testējamās ķīmiskās vielas identitāti, ķīmisko struktūru un fizikālķīmiskās īpašības; jebkādu in vitro vai in vivo toksicitātes testu rezultātus; paredzētos lietošanas veidus un cilvēka ekspozīcijas iespējamību; pieejamos (Q)SAR datus un toksikoloģiskos datus par strukturāli radniecīgām vielām (sk. GD 39 (2)).

6.

Ciktāl iespējams, ir jāizvairās no testiem ar kodīgām un/vai kairinošām testējamām ķīmiskām vielām koncentrācijās, kas, visticamāk, radīs stipras sāpes un/vai ciešanas. Kodīguma/kairinājuma potenciāls ir jānovērtē ekspertiem, izmantojot tādas liecības kā pieredze ar cilvēkiem un dzīvniekiem (piemēram, no atkārtotas devas pētījumiem, kas veikti ar nekodīgām/nekairinošām koncentrācijām), esošie in vitro dati (piemēram, no šā pielikuma B.40. nodaļas (5), B.40.a nodaļas (6) vai ESAO TG 435 (7)), pH vērtības, informācija par līdzīgām vielām vai jebkādi citi derīgi dati, lai noskaidrotu, vai varētu neveikt turpmākus testus. Tā kā šī testēšanas metode pētījuma vadītājam vai galvenajam pētniekam nodrošina mērķkoncentrāciju izvēles kontrolēšanas iespēju, šo metodi var izmantot, lai pakļautu dzīvniekus šādu materiālu iedarbībai sakarā ar konkrētām regulatīvām vajadzībām (piemēram, ārkārtas situāciju plānošanai). Tomēr mērķkoncentrācijā nedrīkst būt smaga kairinoša/kodīga iedarbība, lai gan tai jābūt pietiekamai, lai koncentrācijas un atbildes reakcijas līkne pagarinātos līdz līmeņiem, kas sasniedz testa regulatīvo un zinātnisko mērķi. Šīs koncentrācijas ir jāizvēlas katrā gadījumā atsevišķi, kā arī jāsniedz koncentrāciju izvēles pamatojums (sk. GD 39 (2)).

7.

Šī pārskatītā B.2. testēšanas metode ir paredzēta tam, lai attiecībā uz vienu vai abiem dzimumiem, kā nepieciešams kvantitatīvajos riska novērtējumos, iegūtu testējamās ķīmiskās vielas klasificēšanai pietiekamu informāciju par tās akūto toksicitāti, kā arī datus par mirstību (piemēram, LC50, LC01 un slīpums). Šis testēšanas metožu apraksts piedāvā divas metodes. Pirmā metode ir tradicionālais protokols, kurā dzīvnieku grupas tiek pakļautas robežkoncentrācijai (pieļaujamā daudzuma tests) vai koncentrāciju sērijai vairākpakāpju procedūrā uz iepriekš noteiktu ilgumu, kas parasti ir četras stundas. Konkrētām regulatīvām vajadzībām var izmantot citus ekspozīcijas ilgumus. Otrā metode ir (C × t) protokols, kurā dzīvnieku grupas tiek pakļautas vienai koncentrācijai (robežkoncentrācijai) vai vairāku koncentrāciju sērijai vairākos periodos.

8.

Mirstoši dzīvnieki, kā arī dzīvnieki, kas acīm redzami cieš sāpes vai pārdzīvo stipras un ilgstošas ciešanas, ir humāni jānonāvē, un, interpretējot testa rezultātus, tie jāuzlūko tāpat kā testā nobeigušies dzīvnieki. Kritēriji, pēc kuriem pieņem lēmumu nonāvēt mirstošus dzīvniekus un dzīvniekus, kam ir smagas ciešanas, kā arī norādījumi par paredzamu vai neizbēgamu nobeigšanos ir sniegti ESAO Guidance Document No. 19 on Humane Endpoints (8).

9.

Ir jāizmanto jauni un veseli pieauguši dzīvnieki, kas pieder pie laboratorijās parasti izmantotajām līnijām. Ieteicamā suga ir žurka. Ja tiek izmantotas citas sugas, tas jāpamato.

10.

Mātītes nedrīkst būt iepriekš dzemdējušas vai grūsnas. Ekspozīcijas dienā dzīvniekiem jābūt jauniem pieaugušiem (8–12 nedēļas veciem) dzīvniekiem ar ķermeņa svaru, kas nepārsniedz ± 20 % no jebkādu iedarbībai iepriekš pakļautu tāda paša vecuma abu dzimumu dzīvnieku vidējā ķermeņa svara. Dzīvniekus izvēlas nejaušināti un marķē individuālai identificēšanai. Dzīvniekus līdz testa sākumam vismaz piecas dienas tur būros, lai tie aklimatizētos laboratorijas apstākļos. Dzīvnieki īsu laiku pirms testa sākšanas ir jāaklimatizē arī attiecībā uz testa aprīkojumu, jo tas samazinās jaunās vides radīto stresu.

11.

Temperatūrai testa dzīvnieku turēšanas telpā jābūt 22 ± 3 °C. Relatīvo mitrumu vēlams uzturēt 30–70 % diapazonā, lai gan tas var būt neiespējami, ja par nesējvielu izmanto ūdeni. Pirms un pēc ekspozīcijām dzīvnieki parasti ir jātur būros grupās pēc dzimuma un koncentrācijas, bet dzīvnieku skaits būrī nedrīkst traucēt katra dzīvnieka novērošanu, kā arī dzīvnieku skaitam jābūt tādam, lai iespējami mazāki būtu zudumi kanibālisma un kaušanās dēļ. Ja tiek izmantota vienīgi dzīvnieka deguna ekspozīcija, var būt vajadzīgs dzīvniekus aklimatizēt fiksācijas caurulēm. Fiksācijas caurules nedrīkst dzīvniekiem radīt nevajadzīgu fizisku, termisku vai imobilizācijas risku. Fiksācija var ietekmēt fizioloģiskos beigupunktus, piemēram, ķermeņa temperatūru (hipertermija) un/vai plaušu minūtes tilpumu. Ja ir pieejami vispārīgi dati, kas apliecina, ka nekādas šādas pārmaiņas nerodas vērā ņemamā apmērā, iepriekšēja pielāgošanās fiksācijas caurulēm nav vajadzīga. Ja tiek izmantota visa ķermeņa ekspozīcija aerosolam, dzīvnieki ekspozīcijas laikā ir jātur atsevišķi, lai tie nevarētu uzņemt testējamo aerosolu no citu būra dzīvnieku apmatojuma. Izņemot ekspozīcijas laiku, var izmantot tradicionālu un sertificētu laboratorijas uzturu, ko papildina ar neierobežotu daudzumu krāna dzeramā ūdens. Dzīvniekus 12 stundas diennaktī tur mākslīgā apgaismojumā, bet 12 stundas tumsā.

12.

Izvēloties inhalācijas kameru, jāņem vērā testējamās ķīmiskās vielas īpašības un testa mērķis. Visieteicamākā metode ir dzīvnieka deguna ekspozīcija (šis termins aptver dzīvnieka galvas, deguna vai snuķa ekspozīciju). Dzīvnieka deguna ekspozīcija ir parasti ieteicama šķidro vai cieto aerosolu pētījumiem un tvaikiem, kas var kondensēties un veidot aerosolu. Pētījuma konkrētos mērķus, iespējams, var labāk sasniegt, izmantojot visa ķermeņa ekspozīciju, bet tas ir jāpamato pētījuma ziņojumā. Lai nodrošinātu atmosfēras stabilitāti, izmantojot visa ķermeņa kameru, testa dzīvnieku kopējais apjoms nedrīkst pārsniegt 5 % no kameras tilpuma. Deguna un visa ķermeņa ekspozīcijas paņēmienu principi un to konkrētās priekšrocības un trūkumi ir aprakstīti GD 39 (2).

13.

Deguna ekspozīcija žurkām var ilgt līdz sešām stundām. Ja deguna ekspozīciju veic pelēm, ekspozīcijām parasti nevajadzētu ilgt vairāk par četrām stundām. Ja ir vajadzīgi ilgāki pētījumi, tas jāpamato (sk. GD 39 (2)). Dzīvnieki, kas aerosola iedarbībai tiek pakļauti visa ķermeņa kamerās, ir jātur atsevišķi, lai nepieļautu, ka citi būra dzīvnieki testējamo ķīmisko vielu uzņem, laizot eksponētos dzīvniekus. Ekspozīcijas periodā dzīvniekus nevajadzētu barot. Visa ķermeņa ekspozīcijas laikā var pastāvīgi nodrošināt ar ūdeni.

14.

Dzīvnieki tiek pakļauti testējamās ķīmiskās vielas iedarbībai gāzes, tvaiku, aerosola vai to sajaukuma veidā. Testējamais agregātstāvoklis ir atkarīgs no testējamās ķīmiskās vielas fizikālķīmiskajām īpašībām, izraudzītās koncentrācijas un/vai fizikālās formas, kas testējamās ķīmiskās vielas apstrādes un izmantošanas laikā ir visvarbūtīgākā. Higroskopiskas un ķīmiski reaģējošas testējamās ķīmiskās vielas ir jātestē sausa gaisa apstākļos. Jāuzmanās, lai izvairītos no sprādzienbīstamu koncentrāciju ģenerēšanas.

15.

Daļiņu sadalījums pēc lieluma jānoteic visiem aerosoliem un tvaikiem, kas var kondensēties un veidot aerosolu. Lai nodrošinātu visu elpošanas sistēmas attiecīgo rajonu ekspozīciju, ir ieteicami aerosoli ar masas vidējo aerodinamisko diametru (MMAD) diapazonā no 1 līdz 4 μm ar ģeometrisko standartnovirzi (σg) diapazonā no 1,5 līdz 3,0 (2) (9) (10). Iespēju robežās ir jācenšas nodrošināt atbilstību šim standartam, bet, ja tas nav iespējams, ir jāsniedz eksperta atzinums. Piemēram, metālu izgarojumu daļiņas var būt mazākas par šo standartu, savukārt lādētas daļiņas, šķiedrmateriāli un higroskopiski materiāli (kas elpošanas sistēmas mitrajā vidē izplešas) šo standartu var pārsniegt.

16.

Lai ģenerētu testējamās ķīmiskās vielas attiecīgu koncentrāciju un daļiņu lielumu atmosfērā, var izmantot nesējvielu. Ieteicamā nesējviela visos gadījumos noteikti ir ūdens. Lai panāktu vajadzīgo daļiņu sadalījumu pēc lieluma, daļiņu materiālu var pakļaut mehāniskiem procesiem, tomēr jānodrošina, lai testējamā ķīmiskā viela nesadalītos un nepārmainītos. Gadījumos, kad uzskata, ka mehāniski procesi ir mainījuši testējamās ķīmiskās vielas sastāvu (pārāk augstās temperatūrās, ko pārāk intensīvā malšanā radījusi berze), testējamās ķīmiskās vielas sastāvs ir analītiski jāpārbauda. Jāievēro attiecīga piesardzība, lai testējamo ķīmisko vielu nepiesārņotu. Nav nepieciešams testēt nedrūpošus graudveida materiālus, kas ir izstrādāti tā, lai būtu neieelpojami. Jāveic berzes tests, lai pierādītu, ka, graudveida materiālus apstrādājot, nerodas ieelpojamas daļiņas. Ja berzes testā tiek iegūtas ieelpojamas daļiņas, jāveic inhalācijas toksicitātes tests.

17.

Līdztekus veiktas negatīvas (gaisa) kontroles grupa nav vajadzīga. Ja testa atmosfēras ģenerēšanā izmanto nesējvielu, kas nav ūdens, nesējvielas kontroles grupa jāizmanto tikai tad, ja nav pieejami vēsturiski inhalācijas toksicitātes dati. Ja nesējvielā iestrādātas testējamās ķīmiskās vielas toksicitātes pētījums toksicitāti neatklāj, secina, ka nesējviela pārbaudītajā koncentrācijā nav toksiska; tādējādi nesējvielas kontroles grupa nav nepieciešama.

18.

Katras ekspozīcijas laikā ir rūpīgi jākontrolē, nepārtraukti jāmonitorē un vismaz reizi stundā jāreģistrē gaisa plūsma caur kameru. Testa atmosfēras koncentrācijas (vai stabilitātes) monitorings ir visu dinamisko parametru integrāla mērīšana, kas dod iespēju netieši kontrolēt visus attiecīgos dinamiskos atmosfēras ģenerēšanas parametrus. Īpaši jāraugās, lai deguna ekspozīcijas kamerās nenotiktu izelpotā gaisa ieelpošana gadījumos, kur gaisa plūsma ekspozīcijas sistēmā nav pietiekama, lai nodrošinātu testējamās ķīmiskās vielas atmosfēras dinamisku plūsmu. Ir pieejamas metodikas, ko var izmantot, lai pierādītu, ka konkrētos darbības apstākļos atkārtota ieelpošana nenotiek (2) (11). Skābekļa koncentrācijai jābūt vismaz 19 %, un oglekļa dioksīda koncentrācija nedrīkst pārsniegt 1 %. Ja ir pamats uzskatīt, ka nav iespējams nodrošināt atbilstību šiem standartiem, skābekļa un oglekļa dioksīda koncentrācijas ir jāizmēra.

19.

Temperatūra kamerā jāuztur 22 ± 3 °C robežās. Relatīvais mitrums dzīvnieku inhalācijas zonā gan deguna, gan visa ķermeņa ekspozīciju gadījumā ir jāmonitorē un jāreģistrē vismaz trīs reizes, ja tests ilgst līdz četrām stundām, un reizi stundā, ja tas ir īsāks. Relatīvo mitrumu vēlams uzturēt 30–70 % diapazonā, bet tas var nebūt izdarāms (piemēram, kad tiek testēti maisījumi uz ūdens bāzes) vai izmērāms, jo testējamā ķīmiskā viela interferē ar testēšanas metodi.

20.

Kad vien iespējams, ir jāaprēķina un jāreģistrē nominālā koncentrācija ekspozīcijas kamerā. Nominālā koncentrācija ir ģenerētās testējamās ķīmiskās vielas masa, ko dala ar kameras sistēmai cauri izlaistā gaisa kopējo tilpumu. Nominālo koncentrāciju neizmanto, lai raksturotu dzīvnieku ekspozīciju, taču nominālās koncentrācijas un faktiskās koncentrācijas salīdzinājums sniedz norādes par testa sistēmas ģenerēšanas efektivitāti, tādējādi to var izmantot, lai atklātu ģenerēšanas problēmas.

21.

Faktiskā koncentrācija ir testējamās ķīmiskās vielas koncentrācija dzīvnieku inhalācijas zonā inhalācijas kamerā. Faktiskās koncentrācijas var uzzināt ar specifiskām metodēm (piemēram, tiešo paraugu ņemšanu, adsorbcijas vai ķīmiskās reaģēšanas metodēm un turpmāku analītisko raksturošanu) vai ar tādām nespecifiskām metodēm kā gravimetriskā filtra analīze. Gravimetriskās analīzes izmantošana ir pieņemama tikai attiecībā uz vienas sastāvdaļas pulvera aerosoliem vai aerosoliem ar zemas gaistamības šķidrumiem, turklāt šī analīze ir jābalsta uz attiecīgiem testējamās ķīmiskās vielas raksturojumiem pirms pētījuma veikšanas. Koncentrācijas noteikšanu ar gravimetrisko analīzi var veikt arī vairāku sastāvdaļu pulvera aerosoliem. Tomēr tam ir vajadzīgi analītiskie dati, kas pierāda, ka gaisā pārnestajam materiālam ir tāds pats sastāvs kā sākotnējam materiālam. Ja šāda informācija nav pieejama, pētījuma laikā var būt nepieciešams ar regulāriem intervāliem atkārtoti analizēt testējamo ķīmisko vielu (vēlams, kad tā tiek pārnēsāta gaisā). Attiecībā uz aerosola preparātiem, kas var iztvaikot vai sublimēties, ir jāpierāda, ka visas fāzes tika ievāktas ar izraudzīto metodi. Mērķkoncentrācija, nominālā un faktiskā koncentrācija ir jānorāda pētījuma ziņojumā, bet statistiskajā analīzē, kurā aprēķina letālo koncentrāciju vērtības, izmanto vienīgi faktiskās koncentrācijas.

22.

Ja iespējams, jāizmanto vienas sērijas testējamā ķīmiskā viela, un testējamais paraugs ir jāglabā apstākļos, kas uztur tā tīrību, homogenitāti un stabilitāti. Pirms pētījuma sākšanas ir jābūt noteiktām testējamās ķīmiskās vielas īpašībām, arī tās tīrībai un, ja tehniski iespējams, identitātei, un konstatēto piesārņotāju un piemaisījumu daudzumam. To var pierādīt ar šādiem datiem (bet ne tikai): aiztures laiks un relatīvā maksimuma zona, molekulmasa no masspektrometrijas vai gāzhromatogrāfijas analīzes, vai citām aplēsēm. Lai gan testēšanas laboratorija nav atbildīga par testējamā parauga identitāti, tai būtu ieteicams vismaz zināmā mērā pārliecināties par sponsora sniegto raksturojumu (piemēram, krāsa, fizikālās īpašības utt.).

23.

Ekspozīcijas atmosfēru uztur iespējami nemainīgu un nepārtraukti un/vai periodiski monitorē atkarībā no analīzes metodes. Ja paraugus ņem periodiski, četru stundu pētījuma laikā kameras atmosfēras paraugi ir jāņem vismaz divas reizes. Ja sakarā ar ierobežotu gaisa caurplūdumu vai zemu koncentrāciju tas nav iespējams, visā ekspozīcijas periodā var paņemt vienu paraugu. Ja tiek konstatētas ievērojamas svārstības starp paraugiem, nākamo koncentrāciju testēšanā katras ekspozīcijas laikā jāņem četri paraugi. Atsevišķiem kameras koncentrācijas paraugiem no vidējās koncentrācijas nevajadzētu atšķirties vairāk kā par ± 10 % gāzēm un tvaikiem vai vairāk kā par ± 20 % šķidriem vai cietiem aerosoliem. Ir jāaprēķina un jāreģistrē laiks, kas vajadzīgs, līdz kamerā iestājas līdzsvara stāvoklis (t95). Ekspozīcijas ilgums atbilst visam laikam, kad testējamā ķīmiskā viela tiek ģenerēta, ieskaitot laiku, kas vajadzīgs, lai sasniegtu t95. Norādījumi par t95 aplēsēm ir sniegti GD 39 (2).

24.

Ļoti sarežģītiem maisījumiem, kas sastāv no gāzēm/tvaikiem, un aerosoliem (piemēram, degšanas atmosfērām un testējamām ķīmiskām vielām, kuru izplūde notiek no konkrētam galalietojumam paredzētiem izstrādājumiem/ierīcēm) katra fāze inhalācijas kamerā var izturēties atšķirīgi, tāpēc katrai fāzei (gāze/tvaiki un aerosols) ir jāizvēlas vismaz viena indikatorviela (analīts), kas parasti ir maisījuma galvenā aktīvā viela. Ja testējamā ķīmiskā viela ir maisījums, analītiskā koncentrācija ir jānorāda maisījumam, nevis tikai aktīvajai vielai vai komponentam (analītam). Papildu informācija par faktiskajām koncentrācijām ir pieejama GD 39 (2).

25.

Katras četru stundu ekspozīcijas laikā aerosolu daļiņu sadalījums pēc lieluma jānosaka vismaz divas reizes, izmantojot kaskādes impaktoru vai alternatīvu instrumentu, piemēram, aerodinamisko daļiņu mērītāju. Ja var pierādīt, ka ar kaskādes impaktoru vai alternatīvo instrumentu iegūtie rezultāti ir līdzvērtīgi, alternatīvo instrumentu var izmantot visā pētījumā. Lai iegūtu apstiprinājumu, ka galvenais ievākšanas instruments nodrošina pietiekamu vākšanas efektivitāti, paralēli šim galvenajam instrumentam ir jāizmanto otra iekārta, piemēram, gravimetriskais filtrs vai atsitējs/gāzes barbotieris. Daļiņu lieluma analīzē iegūtajai masas koncentrācijas vērtībai jābūt saprātīgās robežās salīdzinājumā ar filtra analīzē iegūto masas koncentrācijas vērtību (sk. GD 39 (2)). Ja pētījuma agrīnā posmā var pierādīt līdzvērtību, turpmāki apstiprinoši mērījumi nav vajadzīgi. Dzīvnieku labturības nolūkos jāveic pasākumi, kas iespējami mazinātu nepārliecinošu datu ieguvi, kuru dēļ var būt nepieciešams atkārtot ekspozīciju. Ir jānosaka daļiņu lielums tādiem tvaikiem, kuru kondensāts varētu izveidot aerosolu vai kuru veidotā atmosfērā tiek konstatētas daļiņas, kas liek domāt par jauktu fāžu iespējamību (sk. 15. punktu).

26.

Turpmāk ir aprakstīti divu veidu pētījumi, proti, tradicionālais protokols un C × t protokols. Abos protokolos var ietilpt devu diapazona pētījums, galvenais pētījums un/vai pieļaujamā daudzuma tests (tradicionālais protokols) vai testēšana ar robežkoncentrāciju (C × t). Ja ir zināms, ka viens no dzimumiem ir uzņēmīgāks, pētījuma vadītājs var izvēlēties veikt šos pētījumus tikai ar uzņēmīgo dzimumu. Ja deguna ekspozīcijai tiek pakļauti grauzēji, kas nav žurkas, maksimālos ekspozīcijas ilgumus var koriģēt tā, lai iespējami mazinātu attiecīgajai sugai raksturīgās ciešanas. Lai dzīvnieku izmantošanu samazinātu līdz minimumam, pirms testa sākšanas jāizskata visi pieejamie dati. Piemēram, dati, kas iegūti, izmantojot šā pielikuma B.52. nodaļu (4), var nozīmēt, ka nav vajadzīgs devu diapazona pētījums, kā arī var parādīt, vai kāds no dzimumiem ir uzņēmīgāks (sk. GD 39 (2)).

27.

Tradicionālajā pētījumā dzīvnieku grupas iepriekš noteiktu laiku (parasti četras stundas) tiek pakļautas testējamās ķīmiskās vielas iedarbībai vai nu deguna ekspozīcijas, vai visa ķermeņa ekspozīcijas kamerā. Dzīvnieki tiek pakļauti vai nu robežkoncentrācijai (pieļaujamā daudzuma tests), vai vismaz trijām koncentrācijām vairākpakāpju procedūrā (galvenais pētījums). Pirms galvenā pētījuma var veikt devu diapazona pētījumu, ja vien kaut kāda apjoma informācija par testējamo ķīmisko vielu, piemēram, iepriekš veikts B.52. nodaļas pētījums (sk. GD 39 (2)), nav jau pieejama.

28.

Devu diapazona pētījumu izmanto, lai noteiktu testējamās ķīmiskās vielas iedarbīgumu, konstatētu uzņēmīguma atšķirības starp dzimumiem un palīdzētu izvēlēties ekspozīcijas koncentrācijas līmeņus galvenajam pētījumam vai pieļaujamā daudzuma testam. Izvēloties koncentrācijas līmeņus devu diapazona pētījumam, jāizmanto visa pieejamā informācija, arī pieejamie (Q)SAR dati un dati par līdzīgām ķīmiskām vielām. Katras koncentrācijas iedarbībai nevajadzētu pakļaut vairāk kā trīs tēviņus un trīs mātītes (lai noteiktu atšķirības starp dzimumiem, var būt vajadzīgi tris dzīvnieki no katra dzimuma). Devu diapazona pētījumā var izmantot vienu koncentrāciju, bet vajadzības gadījumā var testēt vairākas koncentrācijas. Devu diapazona pētījumā nevajag testēt tik daudz dzīvnieku un koncentrāciju, it kā tas būtu galvenais pētījums. Devu diapazona pētījuma vietā var izmantot iepriekš veiktu B.52. nodaļas pētījumu (4) (sk. GD 39 (2)).

29.

Pieļaujamā daudzuma testu izmanto gadījumos, kad par testējamo ķīmisko vielu ir zināms vai sagaidāms, ka tā faktiski būs netoksiska, t. i., tā izraisīs toksisku atbildes reakciju tikai tad, ja koncentrācija pārsniegs regulatīvo robežkoncentrāciju. Pieļaujamā daudzuma testā testējamās ķīmiskās vielas robežkoncentrācijas iedarbībai pakļauj vienu grupu, kurā ir trīs tēviņi un trīs mātītes. Informāciju par testējamās ķīmiskās vielas toksiskumu var iegūt no zināšanām par līdzīgām pārbaudītām ķīmiskām vielām, ņemot vērā to sastāvdaļu identitāti un procentuālo saturu, par kurām ir zināms, ka tās ir toksikoloģiski būtiskas. Situācijās, kad nav informācijas par toksiskumu vai tā ir nepietiekama, vai arī ir paredzams, ka testējamā ķīmiskā viela būs toksiska, ir jāveic galvenais tests.

30.

Robežkoncentrāciju izvēle parasti ir atkarīga no regulatīvajām prasībām. Ja piemēro Regulu (EK) Nr. 1272/2008, gāzu, tvaiku un aerosolu robežkoncentrācijas ir attiecīgi 20 000 ppm, 20 mg/l un 5 mg/l (vai maksimālā sasniedzamā koncentrācija) (3). Tehniski var būt grūti ģenerēt dažu testējamo ķīmisko vielu, it sevišķi tvaiku un aerosolu, robežkoncentrācijas. Testējot aerosolus, galvenajam mērķim jābūt ieelpojama lieluma daļiņu iegūšanai (1–4 μm MMAD). Ar lielāko daļu testējamo ķīmisko vielu tas ir iespējams koncentrācijā 2 mg/l. Testus ar aerosoliem koncentrācijā, kas pārsniedz 2 mg/l, drīkst veikt tikai tad, ja var iegūt ieelpojama lieluma daļiņas (sk. GD 39 (2)). Regulā (EK) Nr. 1272/2008 dzīvnieku labturības apsvērumu dēļ iesaka izvairīties no testiem ar koncentrācijām, kas pārsniedz robežkoncentrācijas (3). Vai neveikt testēšanu ar robežkoncentrāciju, būtu jāapsver tikai tad, ja ļoti iespējams, ka šāda testa rezultāti būtu tieši nozīmīgi cilvēku veselības aizsardzībai (3), un pētījuma ziņojumā tas jāpamato. Sprādzienbīstamu testējamo ķīmisko vielu gadījumā ir jācenšas izvairīties no apstākļiem, kuros var izraisīties sprādziens. Lai lieki neizmantotu dzīvniekus, pirms pieļaujamā daudzuma testa ir jāveic tests bez dzīvniekiem, nodrošinot, ka pieļaujamā daudzuma testa kameras apstākļi ir sasniedzami.

31.

Ja ar robežkoncentrāciju tiek novērota mirstība (nāve un/vai pirmsnāves stāvoklis), pieļaujamā daudzuma testa rezultātus var izmantot par devu diapazona pētījumu turpmākai testēšanai ar citām koncentrācijām (sk. galveno pētījumu). Ja testējamās ķīmiskās vielas fizikālās vai ķīmiskās īpašības neļauj sasniegt robežkoncentrāciju, tests jāveic ar maksimālo sasniedzamo koncentrāciju. Ja ar maksimālo sasniedzamo koncentrāciju nesasniedz 50 %, turpmāka testēšana nav vajadzīga. Ja robežkoncentrāciju sasniegt nav bijis iespējams, pētījuma ziņojumā jāsniedz paskaidrojums un pamatojoši dati. Ja maksimālā sasniedzamā tvaika koncentrācija nerada toksisku reakciju, var būt vajadzīgs ģenerēt testējamo ķīmisko vielu kā šķidru aerosolu.

32.

Galveno pētījumu parasti veic, izmantojot piecus tēviņus un piecas mātītes (vai piecus uzņēmīgā dzimuma dzīvniekus, ja tas ir zināms) katram koncentrācijas līmenim un vismaz trīs koncentrācijas līmeņus. Jāizmanto pietiekami koncentrācijas līmeņi, lai iegūtu drošu statistisku analīzi. Laika intervāls starp ekspozīcijas grupām ir atkarīgs no toksicitātes pazīmju parādīšanās, ilguma un smaguma. Nākamā koncentrācijas līmeņa iedarbībai dzīvnieki jāpakļauj tikai tad, kad gūta pietiekama pārliecība par iepriekšējā testā izdzīvojušajiem dzīvniekiem. Tas pētījuma vadītājam dod iespēju koriģēt mērķkoncentrāciju nākamajai ekspozīcijas grupai. Tā kā inhalācijas pētījumos tiek izmantotas sarežģītas tehnoloģijas, tas ne vienmēr būs iespējams, tāpēc dzīvnieku pakļaušana nākamā koncentrācijas līmeņa iedarbībai jāpamato uz iepriekšējo pieredzi un zinātnisku loģiku. Testējot maisījumus, jāņem vērā GD 39 (2).

33.

Inhalācijas toksicitātes vērtēšanā par tradicionālā protokola alternatīvu var uzskatīt C × t vairākpakāpju pētījumu (12) (13) (14). Šī pieeja ļauj dzīvniekus pakļaut testējamās ķīmiskās vielas iedarbībai vairākos koncentrācijas līmeņos un ar vairākiem ilgumiem. Testus veic tikai deguna ekspozīcijas kamerā (visa ķermeņa ekspozīcijas kameras šim protokolam praktiski nav izmantojamas). Plūsmas diagramma 1. papildinājumā attēlo šo protokolu. Simulācijas analīze ir parādījusi, ka gan tradicionālais protokols, gan C × t protokols var nodrošināt uzticamas LC50 vērtības, bet C × t protokols parasti labāk spēj nodrošināt uzticamas LC01 un LC10 vērtības (15).

34.

Simulācijas analīze ir parādījusi, ka divu dzīvnieku izmantošana katrā C × t intervālā (viens no katra dzimuma, ja izmanto abus dzimumus, vai divi no uzņēmīgākā dzimuma) parasti ir pietiekams skaits galvenajā pētījumā, kurā testē četrus koncentrācijas un piecus ekspozīcijas ilgumus. Dažos gadījumos pētījuma vadītājs var izvēlēties izmantot divas žurkas no katra dzimuma katrā C × t intervālā (15). Uz katru koncentrācijas un laika kombināciju izmantojot divus dzīvniekus no katra dzimuma, var mazināt aplēses sistemātisko kļūdu un izkliedi, palielināt aplēses sekmīguma koeficientu un uzlabot ticamības intervāla segumu. Tomēr, ja pietiekami līdzīgi dati nav pieejami, noteikšanai (kurā izmanto vienu dzīvnieku no katra dzimuma vai divus no uzņēmīgākā dzimuma) var pietikt ar piekto ekspozīcijas koncentrāciju. Turpmāki norādījumi par C × t pētījumā izmantojamo dzīvnieku un koncentrāciju skaitu ir pieejamas GD 39 (2).

35.

Devu diapazona pētījumu izmanto, lai noteiktu testējamās ķīmiskās vielas iedarbīgumu un lai labāk izraudzītos ekspozīcijas koncentrācijas līmeņus galvenajam pētījumam. Lai izvēlētos attiecīgu sākumkoncentrāciju galvenajam pētījumam un iespējami samazinātu izmantoto dzīvnieku skaitu, var būt vajadzīgs devu diapazona pētījums, izmantojot līdz trijiem dzīvniekiem/dzimumiem/koncentrācijām (sīkāka informācija pieejama GD 39 III papildinājumā (2)). Lai noteiktu atšķirības starp dzimumiem, var būt nepieciešams izmantot trīs dzīvniekus no katra dzimuma. Šie dzīvnieki ir jāpakļauj iedarbībai vienu ilgumu, parasti 240 minūtes. Tas, vai ir iespējams ģenerēt vajadzīgās testa atmosfēras, jānovērtē pirmstesta tehniskās testēšanas laikā bez dzīvniekiem. Ja mirstības dati ir pieejami no B.52. nodaļas pētījuma (4), devu diapazona pētījumu parasti nav vajadzīgs veikt. B.2. nodaļas pētījumā izvēloties sākotnējo mērķkoncentrāciju, pētījuma vadītājam ir jāņem vērā mirstības ainas, kas attiecībā uz abiem dzimumiem un visām testa koncentrācijām novērotas jebkādos pieejamos B.52. nodaļas pētījumos (4) (sk. GD 39 (2)).

36.

Sākotnējā koncentrācija (I ekspozīcijas seanss) (1. papildinājums) būs vai nu robežkoncentrācija, vai koncentrācija, ko izvēlējies pētījuma vadītājs, pamatojoties uz devu diapazona pētījumu. Grupas, kurā ir pa dzīvniekam no katra dzimuma, šīs koncentrācijas iedarbībai tiek pakļautas vairākus ilgumus (piemēram, 15, 30, 60, 120 vai 240 minūtes), tādējādi kopā izmantojot 10 dzīvniekus (I ekspozīcijas seanss) (1. papildinājums).

37.

Robežkoncentrāciju izvēle parasti ir atkarīga no regulatīvajām prasībām. Ja piemēro Regulu (EK) Nr. 1272/2008, gāzu, tvaiku un aerosolu robežkoncentrācijas ir attiecīgi 20 000 ppm, 20 mg/l un 5 mg/l (vai maksimālā sasniedzamā koncentrācija) (3). Dažu testējamo ķīmisko vielu, it sevišķi tvaiku un aerosolu, robežkoncentrācijas var būt tehniski grūti ģenerēt. Testējot aerosolus, mērķim jābūt ieelpojama lieluma daļiņu iegūšanai (t. i., 1–4 μm MMAD) ar robežkoncentrāciju 2 mg/l. Ar lielāko daļu ķīmisko vielu tas ir iespējams. Testus ar aerosoliem koncentrācijā, kas pārsniedz 2 mg/l, drīkst veikt tikai tad, ja var iegūt ieelpojama lieluma daļiņas (sk. GD 39 (2)). Regulā (EK) Nr. 1272/2008 dzīvnieku labturības apsvērumu dēļ iesaka izvairīties no testiem ar koncentrācijām, kas pārsniedz robežkoncentrācijas (3). Vai neveikt testus ar koncentrācijām, kas pārsniedz robežkoncentrācijas, ir jāapsver tikai tad, ja ļoti iespējams, ka šāda testa rezultāti būtu tieši nozīmīgi cilvēku veselības aizsardzībai (3), un pētījuma ziņojumā tas jāpamato. Sprādzienbīstamu testējamo ķīmisko vielu gadījumā ir jācenšas izvairīties no apstākļiem, kuros var izraisīties sprādziens. Lai lieki neizmantotu dzīvniekus, pirms testa ar sākotnējo koncentrāciju ir jāveic tests bez dzīvniekiem, nodrošinot, ka šādai koncentrācijai atbilstošie kameras apstākļi ir sasniedzami.

38.

Ja ar sākotnējo koncentrāciju tiek novērota mirstība vai agonijas stāvoklis, rezultātus ar šo koncentrāciju var izmantot par devu sākumpunktu turpmākai testēšanai ar citām koncentrācijām (sk. galveno pētījumu). Ja testējamās ķīmiskās vielas fizikālās vai ķīmiskās īpašības neļauj sasniegt robežkoncentrāciju, tests jāveic ar maksimālo sasniedzamo koncentrāciju. Ja ar maksimālo sasniedzamo koncentrāciju mirstība nesasniedz 50 %, turpmāka testēšana nav vajadzīga. Ja robežkoncentrāciju sasniegt nav bijis iespējams, pētījuma ziņojumā jāsniedz paskaidrojums un pamatojoši dati. Ja maksimālā sasniedzamā tvaika koncentrācija nerada toksisku reakciju, var būt vajadzīgs ģenerēt testējamo ķīmisko vielu kā šķidru aerosolu.

39.

Galvenajā pētījumā testētā sākotnējā koncentrācija (I ekspozīcijas seanss) (1. papildinājums) būs vai nu robežkoncentrācija, vai koncentrācija, ko izvēlējies pētījuma vadītājs, pamatojoties uz devu diapazona pētījumu. Ja I ekspozīcijas seansa laikā vai pēc tās ir novērota mirstība, minimālā ekspozīcija (C × t), kas izraisa mirstību, tiks uzskatīta par orientieri, pēc kura noteikt II ekspozīcijas seansa koncentrāciju un ekspozīcijas periodus. Katrs nākamais ekspozīcijas seanss būs atkarīgs no iepriekšējā seansa (sk. 1. papildinājumu).

40.

Lai noteiktu C × t sakarību ar mirstību, daudzām testējamām ķīmiskajām vielām pietiks ar rezultātiem, kas iegūti ar sākotnējo koncentrāciju un papildus vēl trijos ekspozīcijas seansos ar smalkāku ilguma režģi (t. i., ekspozīcijas ilgumu ģeometriskais solis, ko raksturo ar koeficientu starp secīgiem ilgumiem (parasti √2)) (15), bet dažus ieguvumus var dot piektās ekspozīcijas koncentrācijas izmantošana (sk. 1. papildinājumu un GD 39 (2)). Par C × t rezultātu matemātisko apstrādi sk. 1. papildinājumu.

41.

Ekspozīcijas perioda laikā dzīvnieki ir regulāri klīniski jānovēro. Pēc ekspozīcijas klīniskie novērojumi ekspozīcijas dienā jāveic vismaz divreiz vai biežāk, ja to indicē dzīvnieku reakcija uz vielas saņemšanu, un vismaz reizi dienā nākamās 14 dienas. Novērošanas perioda ilgums nav noteikts, bet tas ir jānosaka atkarībā no vērojamām klīniskajām pazīmēm, no to iestāšanās laika un no atveseļošanās perioda ilguma. Ir svarīgi, kādos laikos parādās un izzūd toksicitātes pazīmes, it sevišķi, ja to izpausmei ir tendence aizkavēties. Visus novērojumus regulāri reģistrē, par katru dzīvnieku glabājot atsevišķus pierakstus. Visi mirstošie dzīvnieki un dzīvnieki, kam vērojamas lielu sāpju un/vai ilgstošu ciešanu pazīmes, dzīvnieku labturības nolūkos ir humāni jānonāvē. Veicot pārbaudes, lai pamanītu klīniskas toksicitātes pazīmes, ir jāuzmanās, lai sākotnējs savārgums un tādas pārejošas pārmaiņas elpošanā, kuru izraisījusi ekspozīcijas procedūra, netiktu kļūdaini uzskatītas par testējamās ķīmiskās vielas toksicitāti, sakarā ar ko būtu vajadzīga dzīvnieku priekšlaicīga nonāvēšana. Jāņem vērā principi un kritēriji, kas apkopoti Guidance Document on Humane Endpoints (GD 19) (7). Ja dzīvnieki ir nonāvēti humānu apsvērumu dēļ vai atrasti miruši, iespējami precīzi ir jāreģistrē nāves iestāšanās laiks.

42.

Novērojot dzīvniekus būros, ir jāpievērš uzmanība ādas un apmatojuma, acu un gļotādas, kā arī elpošanas, asinsrites, veģetatīvās un centrālās nervu sistēmas, somatomotorikas un uzvedības reakcijas pārmaiņām. Ja iespējams, uzmanība jāpievērš jebkādām atšķirībām starp lokālo un sistēmisko ietekmi. Jāpievērš uzmanība novērojumiem attiecībā uz drebuļiem, krampjiem, siekalošanos, caureju, letarģiju, miegu un komu. Rektāli temperatūras mērījumi var nodrošināt papildu liecības par reflektorisku bradipnoju vai hipotermiju/hipertermiju, kas saistīta ar vielas saņemšanu vai kustību ierobežošanu.

43.

Katra dzīvnieka svars ir jāreģistrē vienu reizi aklimatizēšanās periodā, ekspozīcijas dienā pirms ekspozīcijas (0. diena) un vismaz pirmajā, trešajā un septītajā dienā (un reizi nedēļā pēc tam), kā arī nāves vai eitanāzijas brīdī, ja tas notiek pēc pirmās dienas. Ķermeņa svaru uzskata par ļoti svarīgu toksicitātes pazīmi, tādēļ dzīvnieki, kam vērojams noturīgs ≥ 20 % dekrements salīdzinājumā ar vērtībām, kuras iegūtas priekšizpētē, ir cieši jāmonitorē. Izdzīvojušos dzīvniekus nosver un humāni nonāvē pēcekspozīcijas perioda beigās.

44.

Visiem testa dzīvniekiem, arī tiem, kas testa laikā nobeigušies vai kam dzīvnieku labturības apsvērumu dēļ izdarīta eitanāzija un tie izņemti no pētījuma, ir jāveic pilna autopsija. Ja autopsiju nevar izdarīt tūlīt pēc mirušā dzīvnieka atklāšanas, dzīvnieks ir jāievieto ledusskapī (bez sasaldēšanas) temperatūrā, kas ir pietiekami zema, lai iespējami mazinātu autolīzi. Autopsijas jāveic iespējami drīz, parasti dienas vai divu dienu laikā. Par katru dzīvnieku ir jāreģistrē visas smagās patoloģiskās pārmaiņas, īpašu uzmanību pievēršot jebkādām pārmaiņām elpošanas sistēmā.

45.

Lai paplašinātu pētījuma interpretējošo vērtību, var apsvērt, vai apriori neparedzēt papildu pārbaudes, piemēram, izdzīvojušo žurku plaušu svara noteikšanu un/vai tādas liecības par kairinājumu, ko gūst elpošanas sistēmas mikroskopiskā izmeklēšanā. Tāpat var izmeklēt tādus orgānus, kas liecina par smagām patoloģiskām pārmaiņām dzīvniekos, kuri izdzīvojuši 24 vai vairāk stundas, un orgānus, par ko ir zināms vai gaidāms, ka tie tiks skarti. Visas elpošanas sistēmas mikroskopiska izmeklēšana var nodrošināt lietderīgu informāciju par testējamām ķīmiskajām vielām, kas reaģē ar ūdeni, piemēram, skābēm un higroskopiskām testējamām ķīmiskām vielām.

46.

Ir jāsniedz dati par katra dzīvnieka svaru un autopsijas atradi. Klīnisko novērojumu dati jāapkopo tabulā, par katru testa grupu norādot to dzīvnieku skaitu, kas izmantoti, to dzīvnieku skaitu, kuriem parādījušās noteiktas toksicitātes pazīmes, to dzīvnieku skaitu, kuri testa laikā atrasti nobeigušies vai ir nonāvēti humānu apsvērumu dēļ, atsevišķu dzīvnieku nāves iestāšanās laiku, toksiskās ietekmes raksturu, norisi laikā un atgriezeniskumu, kā arī autopsijas atradi.

47.

Testēšanas pārskatā jāiekļauj šāda informācija:

(1)

OECD (2009). Acute Inhalation Toxicity Testing. OECD Guideline for Testing of Chemicals No. 403, OECD, Paris. Pieejams: http://www.oecd.org/env/testguidelines.

(2)

OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 39, OECD, Paris. Pieejams: http://www.oecd.org/env/testguidelines.

(3)

Eiropas Parlamenta un Padomes 2008. gada 16. decembra Regula (EK) Nr. 1272/2008 par vielu un maisījumu klasificēšanu, marķēšanu un iepakošanu un ar ko groza un atceļ Direktīvas 67/548/EEK un 1999/45/EK un groza Regulu (EK) Nr. 1907/2006 (OV L 353, 31.12.2008., 1. lpp.).

(4)

Šā pielikuma B.52. nodaļa “Akūtā inhalācijas toksicitāte: akūtās toksicitātes klases metode”.

(5)

Šā pielikuma B.40. nodaļa “In vitro ādas erozija: transkutānās elektriskās pretestības (TEP) tests”.

(6)

Šā pielikuma B.40.a nodaļa “Ādas erozijas in vitro tests: cilvēka ādas modeļa tests”.

(7)

OECD (2005). In Vitro Membrane Barrier Test Method For Skin Corrosion. OECD Guideline for Testing of Chemicals No. 435, OECD, Paris. Pieejams: http://www.oecd.org/env/testguidelines.

(8)

OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 19, OECD, Paris. Pieejams: http://www.oecd.org/env/testguidelines.

(9)

SOT (1992). Technical Committee of the Inhalation Specialty Section, Society of Toxicology (SOT). Recommendations for the Conduct of Acute Inhalation Limit Tests. Fund. Appl. Toxicol. 18: 321-327.

(10)

Phalen RF (2009). Inhalation Studies: Foundations and Techniques. (2nd Edition) Informa Healthcare, New York.

(11)

Pauluhn J and Thiel A (2007). A Simple Approach to Validation of Directed-Flow Nose-Only Inhalation Chambers. J. Appl. Toxicol. 27: 160-167.

(12)

Zwart JHE, Arts JM, ten Berge WF, Appelman LM (1992). Alternative Acute Inhalation Toxicity Testing by Determination of the Concentration-Time-Mortality Relationship: Experimental Comparison with Standard LC50 Testing. Reg. Toxicol. Pharmacol. 15: 278-290.

(13)

Zwart JHE, Arts JM, Klokman-Houweling ED, Schoen ED (1990). Determination of Concentration-Time-Mortality Relationships to Replace LC50 Values. Inhal. Toxicol. 2: 105-117.

(14)

Ten Berge WF and Zwart A (1989). More Efficient Use of Animals in Acute Inhalation Toxicity Testing. J. Haz. Mat. 21: 65-71.

(15)

OECD (2009). Performance Assessment: Comparison of 403 and C × t Protocols via Simulation and for Selected Real Data Sets. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 104, OECD, Paris. Pieejams: http://www.oecd.org/env/testguidelines.

(16)

Finney DJ (1977). Probit Analysis, 3rd ed. Cambridge University Press, London/New York.

1.

Šī testēšanas metode ir līdzvērtīga ESAO Testēšanas norādījumiem 407 (2008. gads). Sākotnējos Testēšanas norādījumus 407 pieņēma 1981. gadā. Savukārt 1995. gadā pieņēma pārskatītu versiju, lai no pētījumā izmantota dzīvnieka iegūtu papildu informāciju, it sevišķi par neirotoksicitāti un imūntoksicitāti.

2.

ESAO 1998. gadā uzsāka prioritāru rīcību, lai pārskatītu esošos testēšanas norādījumus un izstrādātu jaunus testēšanas norādījumus par potenciālu endokrīnās sistēmas traucējumu izraisītāju noteikšanu un testēšanu (8). Viens no minētās rīcības elementiem bija esošo ESAO norādījumu “Atkārtotas devas 28 dienu orālās toksicitātes pētījums ar grauzējiem” (TG 407) atjaunināšana ar parametriem, kas būtu piemēroti, lai noteiktu testējamo ķīmisko vielu endokrīno aktivitāti. Šai procedūrai īstenoja plašu starptautisku programmu, lai pārbaudītu papildu parametru būtiskumu un praktisko piemērojamību, šo parametru lietderīgumu attiecībā uz ķīmiskām vielām ar (anti)estrogēnisku, (anti)androgēnisku un (anti)tireoidālu iedarbību, rezultātu atkārtojamību laboratorijā un starp laboratorijām un jauno parametru ietekmi uz parametriem, kuri bija noteikti iepriekšējos TG 407. Tādējādi iegūtie apjomīgie dati ir apkopoti un detalizēti novērtēti vispusīgā ESAO ziņojumā (9). Šī atjauninātā B.7. testēšanas metode (kas ir līdzvērtīga TG 407) ir starptautiskās testēšanas programmas pieredzes un rezultātu kopsavilkums. Šī testēšanas metode ļauj noteiktu endokrīni pastarpinātu iedarbību aplūkot citas toksikoloģiskas iedarbības kontekstā.

3.

Pārbaudot un izvērtējot ķīmiskas vielas toksiskās īpašības, orālo toksicitāti ar atkārtotām devām var noteikt pēc tam, kad akūtās toksicitātes testos ir iegūta sākotnējā informācija par toksicitāti. Šīs testēšanas metodes mērķis ir izpētīt, kā tiek skarts organisms ļoti daudzveidīgos toksicitātes aspektos. Šī metode sagādā informāciju par iespējamiem veselības apdraudējumiem, ko varbūtīgi radīt atkārtotai ekspozīcijai relatīvi ierobežotā laikā, arī par ietekmi uz nervu sistēmu, imūnsistēmu un endokrīno sistēmu. Attiecībā uz šiem konkrētajiem beigupunktiem ar šo metodi ir jānosaka ķīmiskas vielas ar tādām neirotoksiskām īpašībām, kuru dēļ varētu būt nepieciešams padziļināti izpētīt šo aspektu, un ķīmiskas vielas, kas ietekmē vairogdziedzera fizioloģiju. Tāpat ar šo metodi var iegūt datus par ķīmiskām vielām, kas ietekmē jaunu pieaugušo dzīvnieku vīrišķos un/vai sievišķos reproduktīvos orgānus, kā arī norādes par imunoloģisku ietekmi.

4.

Šīs B.7. testēšanas metodes rezultāti ir jāizmanto apdraudējuma noteikšanai un riska novērtēšanai. Rezultāti, par ko liecina ar endokrīno sistēmu saistīti parametri, ir jāaplūko ESAO Conceptual Framework for Testing and Assessment of Endocrine Disrupting Chemicals kontekstā (11). Metodē ietilpst atkārtotas devas toksicitātes pamatpētījums, ko var izmantot ķīmiskām vielām, kurām nav nepieciešams veikt 90 dienu pētījumu (piemēram, ja ražošanas apjoms nepārsniedz noteiktas robežas), vai par provizorisku testu ilgtermiņa pētījumam. Ekspozīcijas ilgumam jābūt 28 dienām.

5.

Starptautiskā programma, ko īstenoja, lai validētu parametrus, kuri būtu piemēroti testējamo ķīmisko vielu endokrīnās aktivitātes iespējamai noteikšanai, apliecināja, ka ar testēšanas metodi iegūto datu kvalitāte lielā mērā būs atkarīga no testēšanas laboratorijas pieredzes. Tas attiecas tieši uz ciklisko pārmaiņu histopatoloģisko noteikšanu mātīšu reproduktīvajos orgānos un uz tādu nelielu hormonatkarīgu orgānu svara noteikšanu, kuru secēšana ir apgrūtināta. Ir izstrādāti norādījumi par histopatoloģiju (19). Tie ir pieejami ESAO publiskajā testēšanas norādījumu vietnē. To mērķis ir atbalstīt patologus pārbaužu veikšanā un palīdzēt paaugstināt testa jutību. Tika konstatēti vairāki parametri, kas liecina par toksicitāti, kura saistīta ar endokrīno sistēmu, un šie parametri ir ietverti šajā testēšanas metodē. Parametrus, par kuriem pieejamie dati pietiekami nepierādīja to lietderību vai kuri validēšanas programmā sevišķi izteikti neliecināja par noderīgumu endokrīnās sistēmas traucējumu izraisītāju noteikšanā, ir ierosināts izmantot par neobligātiem beigupunktiem (sk. 2. papildinājumu).

6.

Pamatojoties uz validēšanas procesā iegūtajiem datiem, jāuzsver, ka šī testa jutība nav pietiekama, lai noteiktu visas vielas ar (anti)estrogēnisku un (anti)androgēnisku iedarbību (9). Testēšanas metodi neīsteno tādā mūža posmā, kad jutība pret endokrīnās sistēmas traucējumiem ir visaugstākā. Tomēr validēšanas procesa laikā ar šo testēšanas metodi konstatēja vielas, kas vāji vai stipri ietekmē vairogdziedzera darbību, kā arī stipri un mēreni endokrīni aktīvas vielas, kas iedarbojas ar estrogēnu vai androgēnu receptoru starpniecību, bet lielākajā daļā gadījumu nespēja konstatēt endokrīni aktīvas vielas, kas vāji ietekmē estrogēnu vai androgēnu receptorus. Tādēļ to nevar uzskatīt pat endokrīnās aktivitātes noteikšanas testu.

7.

Tas, ka šādas iedarbības sekas neizpaužas, vēl neliecina, ka iedarbība uz endokrīno sistēmu nenotiek. Tāpēc attiecībā uz endokrīni pastarpinātu iedarbību vielas raksturošanu nedrīkst balstīt uz šīs testēšanas metodes rezultātiem vien, tie ir jāizmanto uz apliecinājumiem balstītā pieejā, iespējamas endokrīnas aktivitātes raksturošanai apkopojot visus esošos datus par konkrēto ķīmisko vielu. Iepriekš aprakstītā iemesla dēļ regulatīviem lēmumiem par endokrīno aktivitāti (vielas raksturošana) jābalstās uz plašu pieeju, nevis tikai šīs testēšanas metodes piemērošanas rezultātiem.

8.

Ir atzīts, ka visām procedūrām, kurās izmanto dzīvniekus, ir jāatbilst vietējiem dzīvnieku labturības standartiem. Turpmāk ir izklāstīti labturības un testu obligātie standarti, kurus aizstāj vietējie noteikumi, ja tie ir stingrāki. Papildu norādījumus par humānu attieksmi pret dzīvniekiem ir sniegusi ESAO (14).

9.

Definīcijas dotas 1. papildinājumā.

10.

Testējamo ķīmisko vielu pakāpeniski pieaugošās devās katru dienu orāli ievada vairākām eksperimenta dzīvnieku grupām, vienu devas līmeni katrai grupai 28 dienu periodā. Vielas ievadīšanas laikā katru dienu rūpīgi novēro, vai dzīvniekiem neparādās toksicitātes pazīmes. Dzīvniekiem, kas nobeidzas vai ko eitanazē testa laikā, izdara autopsiju, un testa beigās izdzīvojušos dzīvniekus eitanazē, un arī tiem izdara autopsiju. 28 dienu pētījums sniedz informāciju par atkārtotas orālas ekspozīcijas iedarbību un var norādīt uz nepieciešamību veikt turpmākus ilgtermiņa pētījumus. Tas var arī sniegt informāciju par koncentrāciju izvēli ilgāka termiņa pētījumiem. No šīs testēšanas metodes izmantošanas iegūtajiem datiem jānodrošina iespēja raksturot testējamās ķīmiskās vielas toksicitāti, norādīt devas un atbildes reakcijas sakarību un noteikt nenovērojamās nelabvēlīgās ietekmes līmeni (NOAEL).

11.

Ieteicamā grauzēju suga ir žurka, bet var izmantot citas grauzēju sugas. Ja šajā B.7. testēšanas metodē noteiktie parametri tiek pētīti citās grauzēju sugās, tas sīki jāpamato. Lai gan bioloģiski ir iespējams, ka citas sugas uz toksiskajām vielām reaģēs līdzīgi žurkām, mazāku sugu izmantošana var palielināt mainību, jo mazāku orgānu secēšana ir tehniski sarežģīta. Starptautiskajā validēšanas programmā endokrīnās sistēmas traucējumu izraisītāju noteikšanai izmantoja tikai žurkas. Ir jāizmanto jauni un veseli pieauguši dzīvnieki, kas pieder pie laboratorijās parasti izmantotajām līnijām. Mātītes nedrīkst būt iepriekš dzemdējušas vai grūsnas. Devu došana jāsāk iespējami drīz pēc tam, kad dzīvniekus beigts zīdīt, un noteikti pirms tie sasnieguši deviņu nedēļu vecumu. Pētījuma sākumā dzīvnieku svara atšķirībām jābūt minimālām un tās nedrīkst pārsniegt ± 20 % no katra dzimuma vidējā svara. Ja atkārtotas devas orālo pētījumu veic kā ilgāka termiņa pētījuma provizorisko testu, vēlams abos pētījumos izmantot vienas līnijas un izcelsmes dzīvniekus.

12.

Visām procedūrām ir jāatbilst vietējiem laboratorijas dzīvnieku labturības standartiem. Temperatūrai telpās, kurās tur eksperimenta dzīvniekus, jābūt 22 °C (± 3 °C). Lai gan relatīvajam mitrumam jābūt vismaz 30 % un, izņemot telpu uzkopšanas laiku, vēlams, ne vairāk par 70 %, jācenšas nodrošināt mitrumu 50–60 % robežās. Dzīvniekus 12 stundas diennaktī tur mākslīgā apgaismojumā, bet 12 stundas – tumsā. Var izmantot parasto laboratorijas barību ar neierobežotu piekļuvi dzeramajam ūdenim. Uztura izvēli var ietekmēt vajadzība nodrošināt piemērotu testējamās ķīmiskās vielas piejaukšanu, ja vielu ievada ar šādu metodi. Dzīvniekus vajadzētu turēt nelielās viendzimuma grupās. Ja tas ir zinātniski pamatoti, dzīvniekus var turēt atsevišķi. Turot dzīvniekus grupās, skaits vienā būrī nedrīkstētu pārsniegt 5.

13.

Barība ir regulāri jāanalizē, lai noteiktu piesārņotāju klātbūtni. Barības paraugs ir jāglabā līdz ziņojuma pabeigšanai.

14.

Veselus un jaunus pieaugušus dzīvniekus nejaušināti sadala kontroles un testa grupās. Būrus izvieto tā, lai iespējami samazinātu būru novietojuma varbūtējo ietekmi. Dzīvniekiem piešķir unikālu identifikāciju un līdz testa sākumam tos vismaz piecas dienas tur būros, lai tie aklimatizētos laboratorijas apstākļos.

15.

Testējamo ķīmisko vielu ievada ar mākslīgo barošanu vai ar uzturu vai dzeramo ūdeni. Orālās ievadīšanas metode ir atkarīga no pētījuma mērķa un no testējamās ķīmiskās vielas fizikālajām/ķīmiskajām/toksiskajām un kinētiskajām īpašībām.

16.

Ja vajadzīgs, testējamo ķīmisko vielu izšķīdina vai suspendē piemērotā nesējvielā. Ir ieteicams, ja vien iespējams, vispirms apsvērt ūdens šķīduma/suspensijas izmantošanu, pēc tam eļļas (piemēram, kukurūzas eļļas) šķīdumu/suspensiju un pēc tam iespējamu šķīdināšanu citās nesējvielās. Ja nesējviela nav ūdens, ir jāzina šīs nesējvielas toksiskās īpašības. Ir jānosaka testējamās ķīmiskās vielas stabilitāte nesējvielā.

17.

Katram devas līmenim jāizmanto vismaz 10 dzīvnieki (piecas mātītes un pieci tēviņi). Ja dzīvnieku eitanāzija paredzēta arī testa laikā, to skaits ir jāpalielina par to dzīvnieku skaitu, kurus paredzēts eitanazēt pirms pētījuma pabeigšanas. Jāapsver iespēja izmantot papildu 10 dzīvnieku satelītgrupas (pieci no katra dzimuma) iekļaušanu kontrolgrupā un lielākās devas grupā, lai vismaz 14 dienas pēc vielas ievadīšanas novērotu toksiskās iedarbības atgriezeniskumu, noturību vai aizkavētu parādīšanos.

18.

Parasti ir jāizmanto vismaz trīs testa grupas un viena kontrolgrupa, bet, ja no pieejamajiem datiem izriet, ka 1 000 mg/kg bw/d deva nekādu iedarbību neradīs, var veikt pieļaujamā daudzuma testu. Ja piemēroti dati nav pieejami, var izdarīt diapazona noteikšanas pētījumu (ar vienas līnijas un izcelsmes dzīvniekiem), kas palīdzētu noteikt izmantojamās devas. Ar kontrolgrupas dzīvniekiem jārīkojas tāpat kā ar testa grupu dzīvniekiem, tie tikai nesaņem testējamo ķīmisko vielu. Ja testējamo ķīmisko vielu ievada kopā ar nesējvielu, kontrolgrupa saņem maksimālo izmantoto nesējvielas daudzumu.

19.

Devu līmeņi jāizvēlas, ņemot vērā esošos toksicitātes un toksikokinētiskos vai kinētiskos datus, kas ir pieejami par testējamo ķīmisko vielu vai tai radniecīgajām ķīmiskajām vielām. Augstākais devas līmenis ir jāizvēlas ar mērķi izraisīt toksisku iedarbību, bet ne nobeigšanos vai smagas ciešanas. Pēc tam jāizvēlas devu līmeņi tādā lejupejošā secībā, lai pierādītu jebkādas ar devām saistītas atbildes reakcijas un zemāko devas līmeni, kurā nav novērojama nelabvēlīga ietekme (NOAEL). Lejupejošo devu līmeņu noteikšanai bieži optimāli ir divkārši līdz četrkārši intervāli, un nereti ir ieteicamāks pievienot ceturto testa grupu, nevis izmantot ļoti lielus intervālus (piemēram, pārsniedzot koeficientu 10) starp devu došanu.

20.

Ja ir novērota vispārīga toksiska reakcija (piemēram, samazināts ķermeņa svars, ietekme uz aknām, sirdi, plaušām vai nierēm utt.) vai citas pārmaiņas, kas var nebūt toksiskas atbildes reakcijas (piemēram, samazināts barības patēriņš, aknas palielināšanās), ir jābūt piesardzīgiem, interpretējot novēroto iedarbību uz imunoloģiskajiem, neiroloģiskajiem vai endokrīnajiem beigupunktiem.

21.

Ja, izdarot testu vienā devas līmenī, kas ir vismaz 1 000 mg uz kg ķermeņa svara dienā vai – attiecībā uz vielu, kas ievadīta ar uzturu vai dzeramo ūdeni, – līdzvērtīgs procentuālais daudzums uzturā vai dzeramajā ūdenī (aprēķināts pēc noteiktajiem ķermeņa svariem) un izmantojot šim pētījumam paredzētās procedūras, novērojama toksiska ietekme nerodas un ja, pamatojoties uz datiem par strukturāli radniecīgām vielām, toksicitāte nav paredzama, var uzskatīt, ka pilns pētījums ar trīs devu līmeņiem nav vajadzīgs. Izņemot gadījumu, kur iedarbība uz cilvēku norāda, ka jāizmanto augstāks devas līmenis, piemēro pieļaujamā daudzuma testu.

22.

Testējamo ķīmisko vielu dzīvniekiem dod ik dienu septiņas dienas nedēļā 28 dienu ilgā laikā. Ja testējamo ķīmisko vielu ievada ar mākslīgo barošanu, viela ar kuņģa zondi vai piemērotu intubācijas cauruli dzīvniekiem jāievada vienreizējā devā. Maksimālais šķidruma tilpums, ko vienā paņēmienā var ievadīt, ir atkarīgs no testējamā dzīvnieka lieluma. Tilpums nedrīkst pārsniegt 1 ml uz 100 g ķermeņa svara, izņemot ūdens šķīdumus, kad var lietot 2 ml uz 100 g ķermeņa svara. Izņemot kairinošas vai kodīgas ķīmiskās vielas, kuru iedarbība lielākās koncentrācijās parasti ir izteiktāka, ir iespējami jāsamazina testā lietotā tilpuma mainība, koriģējot koncentrāciju tā, lai ar visiem devu līmeņiem tilpums būtu vienāds.

23.

Ir svarīgi nodrošināt, lai ķīmiskajām vielām, kuras ievada ar uzturu vai dzeramo ūdeni, testējamās ķīmiskās vielas daudzumi neizjauktu parasto uztura vai ūdens līdzsvaru. Ja testējamo ķīmisko vielu ievada ar uzturu, var izmantot nemainīgu koncentrāciju uzturā (ppm) vai nemainīgu devas līmeni attiecībā pret dzīvnieka ķermeņa svaru. Ir jānorāda izmantotā alternatīva. Ja ķīmisko vielu ievada ar mākslīgo barošanu, deva katru dienu jāievada līdzīgā laikā un pēc vajadzības jākoriģē, lai uzturētu nemainīgu devas līmeni attiecībā pret dzīvnieka ķermeņa svaru. Ja atkārtotas devas pētījumu izmanto par ilgtermiņa pētījuma provizorisko testu, abos pētījumos jāizmanto tāds pats uzturs.

24.

Novērošanas periodam jābūt 28 dienām. Satelītgrupas dzīvnieki, kam paredzēti papildu novērojumi, ir jātur vismaz 14 dienas bez vielas saņemšanas, lai noteiktu toksiskas ietekmes aizkavētu parādīšanos, noturību vai izveseļošanos no tās.

25.

Vismaz reizi dienā ir jāizdara vispārīgi klīniski novērojumi, vēlams, vienādos laikos katru dienu, ņemot vērā paredzamās ietekmes maksimuma laiku pēc vielas došanas. Dzīvnieku veselības stāvoklis ir jāreģistrē. Vismaz divreiz dienā visus dzīvniekus novēro attiecībā uz saslimstību un mirstību.

26.

Vienu reizi pirms pirmās ekspozīcijas (lai varētu izdarīt salīdzināšanu vienam un tam pašam dzīvniekam) un pēc tam vismaz reizi nedēļā jāveic detalizēti klīniskie novērojumi visiem dzīvniekiem. Šie novērojumi jāizdara ārpus dzīvnieka turēšanas būra standartnožogojumā, ieteicams, katru reizi vienā un tajā pašā dienas laikā. Novērojumi ir rūpīgi jāreģistrē, vēlams, izmantojot vērtēšanas sistēmu, ko skaidri noteikusi testēšanas laboratorija. Ir jācenšas nodrošināt, lai testēšanas apstākļu mainība būtu minimāla un lai novērošanu izdarītu novērotāji, kas nav informēti par vielas ievadīšanu. Protokolējamās pazīmēs jāiekļauj (bet ne tikai) pārmaiņas ādā, apmatojumā, acīs, gļotādā, sekrēcija un izdalījumi, kā arī veģetatīvā aktivitāte (piemēram, asarošana, piloarekcija, acs zīlītes diametrs un neraksturīga elpošana). Jāreģistrē arī pārmaiņas gaitā, stājā un atbildes reakcijās uz manipulācijām, kā arī klonisko un tonisko kustību klātesamība, stereotipiska (piemēram, pārmērīga apmatojuma laizīšana, atkārtota riņķošana) vai savāda uzvedība (piemēram, sakropļošanās, staigāšana atmuguriski) (2).

27.

Ceturtajā ekspozīcijas nedēļā ir jānovērtē sensoriskās reakcijas uz dažāda veida (2) kairinājumiem (piemēram, dzirdes, redzes un proprioceptīvajiem kairinātājiem) (3) (4) (5), kā arī jānovērtē satveršanas stiprums (6) un motoriskā aktivitāte (7). Sīkāki dati par procedūrām, kuras var izmantot, ir sniegti attiecīgajos atsauču avotos. Tomēr var izmantot alternatīvas procedūras, nevis tikai tās, kuras minētas atsauču avotos.

28.

Funkcionālos novērojumus, kurus veic 4. ekspozīcijas nedēļā, var neveikt, ja pētījumu veic kā turpmāka subhroniskās toksicitātes (90 dienu) pētījuma provizorisko pētījumu. Tādā gadījumā funkcionālie novērojumi ir jāiekļauj šajā turpmākajā pētījumā. Tomēr atkārtotas devas pētījumā iegūtie funkcionālo novērojumu dati var atvieglot devu līmeņu izvēli turpmākajam subhroniskās toksicitātes pētījumam.

29.

Izņēmuma gadījumos funkcionālos novērojumus var arī neveikt tām dzīvnieku grupām, kurām arī bez šādiem novērojumiem izpaužas tādas toksicitātes pazīmes, kas ievērojami traucētu funkcionālā testa norisi.

30.

Veicot autopsiju, visām mātītēm pēc vaginālajām uztriepēm var noteikt (pēc izvēles) estrālo ciklu. Šie novērojumi nodrošinās informāciju par estrālā cikla posmu nonāvēšanas laikā un palīdzēs histoloģiski izvērtēt pret estrogēniem jutīgus audus (sk. norādījumus par histopatoloģiju (19)).

31.

Visi dzīvnieki jānosver vismaz reizi nedēļā. Barības patēriņa mērījumi ir jāizdara vismaz reizi nedēļā. Ja testējamo ķīmisko vielu ievada ar dzeramo ūdeni, arī ūdens patēriņš ir jāmēra vismaz reizi nedēļā.

32.

Testa laika beigās ir jāizdara šādi hematoloģiskie izmeklējumi: hematokrīts, hemoglobīna koncentrācijas, eritrocītu skaits, retikulocīti, leikocītu kopējais un diferenciālais skaits, trombocītu skaits un asins recēšanas laiks/spēja. Ja testējamajai ķīmiskajai vielai vai tās vispārpieņemtiem metabolītiem ir vai varētu būt oksidējošas īpašības, jānosaka arī methemoglobīna koncentrācija un Heinca ķermenīši.

33.

Asins paraugi jāņem no precīzi norādītas vietas tieši pirms dzīvnieku eitanāzijas procedūras vai tās laikā un jāglabā piemērotos apstākļos. Pirms eitanāzijas dzīvniekus iepriekšējā naktī nebaro (7).

34.

Klīniski bioķīmiskā noteikšana, kurā pēta būtisku toksisko ietekmi uz audiem un, konkrētāk, ietekmi uz nierēm un aknām, jāveic ar tiem asins paraugiem, kuri paņemti no katra dzīvnieka tieši pirms dzīvnieka eitanāzijas vai tās laikā (tas neattiecas uz dzīvniekiem, kuri atrasti mirstoši un/vai eitanazēti pirms pētījuma beigām). Plazmā vai serumā nosaka nātriju, kāliju, glikozi, kopējo holesterīnu, urīnvielu, kreatinīnu, kopējo olbaltumu un albumīnu un vismaz divus fermentus, kas norāda uz hepatocelulāro ietekmi (piemēram, alanīna aminotransferāze, aspartāta aminotransferāze, alkalīnfosfatāze, γ-glutamiltranspeptidāze un glutamīna dehidrogenāze), kā arī žultsskābes. Noteiktos apstākļos noderīgu informāciju var sniegt papildu fermentu (aknu fermentu vai citu fermentu) un bilirubīna noteikšana.

35.

Pēdējā pētījuma nedēļā pēc izvēles var izdarīt šādas urīnanalīzes, izmantojot urīna savākšanu iepriekš noteiktā laika periodā: izskats, tilpums, osmolalitāte vai īpatnējais svars, pH, olbaltumvielas, glikoze un asinis/asins šūnas.

36.

Turklāt jāapsver, vai neveikt pētījumus par audu vispārīgu bojājumu marķieriem plazmā vai serumā. Ja testējamās ķīmiskās vielas zināmās īpašības ietekmē vai varētu ietekmēt attiecīgos metaboliskos profilus, jānoteic kalcijs, fosfāti, triglicerīdi, atsevišķi hormoni un holīnesterāze. Šie faktori ir jānosaka konkrētu klašu ķīmiskajām vielām vai katrā gadījumā atsevišķi.

37.

Lai gan starptautiskā izvērtēšanā par beigupunktiem, kas saistīti ar endokrīno sistēmu, nevarēja pierādīt, ka tos būtu izdevīgi izmantot vairogdziedzera hormonu (T3, T4) un TSH noteikšanā, ja ir liecības par ietekmi uz hipofīzes un vairogdziedzera asi, varētu būt lietderīgi saglabāt plazmas vai seruma paraugus, lai varētu izmērīt T3, T4 un TSH (nav obligāti). Šos paraugus uzglabāšanas nolūkos var sasaldēt – 20 °C. Turpmāk norādītie faktori var ietekmēt noteikto hormonu mainību un absolūtās koncentrācijas:

Vairogdziedzera aktīvo ķīmisko vielu galīgā noteikšana ir ticamāka ar histopatoloģisko analīzi, nevis pēc hormonu līmeņiem.

38.

Plazmas paraugi, kas paredzēti tieši hormonu noteikšanai, ir jāiegūst salīdzināmā dienas laikā. Ieteicams apsvērt iespēju noteikt T3, T4 un TSH, pamatojoties uz histopatoloģiski konstatētām vairogdziedzera pārmaiņām. Skaitliskās vērtības, ko iegūst, analizējot hormonu koncentrācijas, atšķiras atkarībā no tirdzniecībā pieejamajiem testēšanas komplektiem. Tādējādi var nebūt iespējams nodrošināt tādus snieguma kritērijus, kuru pamatā ir vienoti vēsturiski dati. Tā vietā laboratorijām jācenšas nodrošināt, ka T3 un T4 mainības kontroles koeficienti nepārsniedz 25, savukārt TSH – 35. Visas koncentrācijas ir jāreģistrē, izsakot tās ng/ml.

39.

Ja vēsturiskie izejdati ir nepietiekami, jāapsver iespēja noteikt hematoloģiskos un klīniski bioķīmiskos mainīgos lielumus pirms devu došanas sākšanas vai, ieteicams, dzīvniekiem, kas nav ietverti eksperimentālajās grupās.

40.

Visiem pētījumā izmantotajiem dzīvniekiem veic pilnu, detalizētu autopsiju, ieskaitot ķermeņa ārējās virsmas, visu atveru un galvaskausa dobumu, torakālā dobuma, vēdera dobuma, kā arī šo dobumu satura rūpīgu apskati. Visu dzīvnieku (tas neattiecas uz dzīvniekiem, kas atrasti mirstoši un/vai eitanazēti pirms pētījuma beigām) aknas, nieres, virsnieru dziedzeri, sēklinieki, sēklinieku piedēkļi, prostata un sēklas pūslīši kopā ar koagulācijas dziedzeri, tīms, liesa, smadzenes un sirds ir jāatbrīvo no visiem apkārtējiem audiem, un, lai izvairītos no izžūšanas, iespējami drīz pēc secēšanas jānoteic to natīvais svars. Atbrīvojot no audiem prostatu, ir jāuzmanās, lai nepārspiestu ar šķidrumu pildītos sēklas pūslīšus. Sēklas pūslīšus un prostatu var arī atbrīvot no audiem un nosvērt pēc fiksācijas.

41.

Vēl divus cita veida audus var pēc izvēles nosvērt iespējami drīz pēc secēšanas, lai izvairītos no izžūšanas: abas olnīcas (natīvais svars) un dzemdi, arī dzemdes kaklu (norādījumi par dzemdes audu izņemšanu un sagatavošanu nosvēršanai ir sniegti ESAO TG 440 (18)).

42.

Vairogdziedzera svaru (pēc izvēles) var noteikt pēc fiksācijas. Tas jāatbrīvo no audiem ļoti uzmanīgi un tikai pēc fiksācijas, lai audus nesabojātu. Audu bojājumi var apgrūtināt histopatoloģijas analīzi.

43.

Fiksācijas šķīdumā, kas ir vispiemērotākais gan konkrētā veida audiem, gan paredzētajai turpmākajai histopatoloģiskajai izmeklēšanai (sk. 47. punktu), ir jāsaglabā turpmāk minētie audi: visi audi ar makroskopiskiem bojājumiem, smadzenes (reprezentatīvi apgabali, tostarp lielās smadzenes, smadzenītes un iegarenās smadzenes / smadzeņu tilts), muguras smadzenes, acis, kuņģis, tievās un resnās zarnas (arī kopu limfātiskie jeb Peijera mezgliņi), aknas, nieres, virsnieru dziedzeri, liesa, sirds, tīms, vairogdziedzeris, traheja un plaušas (konservētas, piepūšot ar fiksācijas šķīdumu un pēc tam iegremdējot), gonādas (sēklinieki un olnīcas), papildu dzimumorgāni (dzemde un dzemdes kakls, sēklinieku piedēkļi, prostata un sēklas pūslīši kopā ar koagulācijas dziedzeri), maksts, urīnpūslis, limfmezgli (saskaņā ar laboratorijas pieredzi papildus proksimālam drenējošam limfmezglam ir jāņem vēl viens limfmezgls (15)), perifērais nervs (sēžas nervs vai tibiālais nervs), vēlams, tiešā muskuļa tuvumā, skeleta muskulis un kauls ar kaula smadzenēm (izgriezums vai, alternatīvi, svaigs kaula smadzeņu aspirāts). Ieteicama sēklinieku fiksācija, tos iegremdējot Buina fiksācijas šķīdumā vai Davidsona modificētā fiksācijas šķīdumā (16) (17). Bālganais apvalks ir uzmanīgi un sekli jāpārdur ar adatu abos orgāna galos, lai fiksācijas šķīdums varētu tajā ātri iekļūt. Jāsaglabā arī orgāni, ko, pamatojoties uz zināmām testējamās ķīmiskās vielas īpašībām, uzskata par iespējamiem mērķorgāniem.

44.

Vērtīgas norādes par endokrīnu iedarbību var gūt no šādiem audiem: gonādas (olnīcas un sēklinieki), papildu dzimumorgāni (dzemde un dzemdes kakls, sēklinieku piedēkļi, sēklas pūslīši ar koagulācijas dziedzeri, muguras un vēdera prostata), maksts, hipofīze, tēviņu krūts dziedzeris, vairogdziedzeris un virsnieru dziedzeris. Tēviņu krūts dziedzeru pārmaiņas nav pietiekami dokumentētas, taču šis parametrs var būt ļoti jutīgs pret vielām ar estrogēnisku iedarbību. To orgānu/audu novērojumi, kas nav uzskaitīti 43. punktā, nav obligāti (sk. 2. papildinājumu).

45.

Norādījumos par histopatoloģiju (19) ir sīki izklāstīta papildu informācija par endokrīno audu secēšanu, fiksāciju un histopatoloģiju.

46.

Starptautiskajā testēšanas programmā tika iegūts apliecinājums tam, ka neizteiktu endokrīno ietekmi, ko rada ķīmiskās vielas ar zemu spēju ietekmēt dzimumhormonu homeostāzi, var labāk noteikt pēc estrālā cikla sinhronizācijas traucējumiem dažādos audos, nevis histopatoloģiski konstatētām mātīšu dzimumorgānu pārmaiņām. Lai gan galīgi pierādījumi par šādu iedarbību netika iegūti, interpretējot olnīcu (folikulārās šūnas, teka šūnas un granulozās šūnas), dzemdes, dzemdes kakla un maksts histopatoloģiju, ir ieteicams ņemt vērā liecības par estrālā cikla iespējamu asinhroniju. Ja tās tiek novērtētas, šajā salīdzinājumā varētu aplūkot arī cikla posmus, kas noteikti ar vaginālajām uztriepēm.

47.

Visu kontrolgrupas un lielāko devu grupu dzīvnieku saglabātajiem orgāniem un audiem ir jāizdara pilna histopatoloģiskā izmeklēšana. Ja lielākās devas grupā ir novērotas ar vielas saņemšanu saistītas pārmaiņas, minētā izmeklēšana jāveic visu citu devu grupu dzīvniekiem.

48.

Jāizmeklē visi makroskopiskie bojājumi.

49.

Ja izmanto satelītgrupu, histopatoloģiskā izmeklēšana jāizdara audiem un orgāniem, uz kuriem vielu saņēmušajās grupās ir konstatēta ietekme.

50.

Jānorāda dati par atsevišķiem dzīvniekiem. Turklāt visi dati jāapkopo tabulā, attiecībā uz katru testa grupu norādot dzīvnieku skaitu testa sākumā, to dzīvnieku skaitu, kas testa laikā ir nobeigušies vai humānu apsvērumu dēļ eitanazēti, un katras nobeigšanās vai eitanāzijas laiku, to dzīvnieku skaitu, kam novērotas toksicitātes pazīmes, novēroto toksicitātes pazīmju aprakstu, ieskaitot toksiskās ietekmes sākuma laiku, ilgumu un smagumu, to dzīvnieku skaitu, kam novēroti audu bojājumi, bojājumu veidus, to smagumu un to dzīvnieku procentuālo īpatsvaru, kuriem parādījušies katra tipa bojājumi.

51.

Ja iespējams, skaitliskie rezultāti jānovērtē ar piemērotu un vispārpieņemtu statistikas metodi. Dažādu diapazona devu ietekmes salīdzināšanā jāizvairās no vairāku ilgumu testiem. Statistikas metodes ir jāizvēlas pētījuma plānošanas laikā.

52.

Lai kontrolētu kvalitāti, ir ierosināts apkopot vēsturiskus kontroldatus un skaitliskajiem datiem, it sevišķi parametriem, kas saistīti ar endokrīnās sistēmas traucējumu izraisītāju noteikšanu, aprēķināt variācijas koeficientus. Šos datus var izmantot salīdzināšanas nolūkos, kad tiek novērtēti faktiskie pētījumi.

53.

Testēšanas pārskatā jāiekļauj šāda informācija:

(1)

OECD (Paris, 1992). Chairman’s Report of the Meeting of the ad hoc Working Group of Experts on Systemic Short-term and (Delayed) Neurotoxicity.

(2)

IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity Associated with Exposure to Chemicals. Environmental Health Criteria Document No. 60.

(3)

Tupper DE, Wallace RB (1980). Utility of the Neurologic Examination in Rats. Acta Neurobiol. Exp. 40: 999-1003.

(4)

Gad SC (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxicology. J. Toxicol Environ. Health 9: 691-704.

(5)

Moser VC, McDaniel KM, Phillips PM (1991). Rat Strain and Stock Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of Amitraz. Toxicol. Appl. Pharmacol. 108: 267-283.

(6)

Meyer OA, Tilson HA, Byrd WC, Riley MT (1979). A Method for the Routine Assessment of Fore- and Hindlimb Grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxicol. 1: 233-236.

(7)

Crofton KM, Howard JL, Moser VC, Gill MW, Reiter LW, Tilson HA, MacPhail RC (1991). Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol. 13: 599-609.

(8)

OECD (1998). Report of the First Meeting of the OECD Endocrine Disrupter Testing and Assessment (EDTA) Task Force, 10th-11th March 1998, ENV/MC/CHEM/RA(98)5.

(9)

OECD (2006). Report of the Validation of the Updated Test Guideline 407: Repeat Dose 28-day Oral Toxicity Study in Laboratory Rats. Series on Testing and Assessment No 59, ENV/JM/MONO(2006)26.

(10)

OECD (2002). Detailed Review Paper on the Appraisal of Test Methods for Sex Hormone Disrupting Chemicals. Series on Testing and Assessment No 21, ENV/JM/MONO(2002)8.

(11)

OECD (2012).Conceptual Framework for Testing and Assessment of Endocrine Disrupting Chemicals. http://www.oecd.org/document/58/0,3343,fr_2649_37407_2348794_1_1_1_37407,00.html

(12)

OECD (2006). Final Summary report of the meeting of the Validation Management Group for mammalian testing. ENV/JM/TG/EDTA/M(2006)2.

(13)

OECD. Draft Summary record of the meeting of the Task Force on Endocrine Disrupters Testing and Assessment. ENV/JM/TG/EDTA/M(2006)3.

(14)

OECD (2000). Guidance document on the recognition, assessment and use of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluation. Series on Testing and Assessment No 19. ENV/JM/MONO(2000)7.

(15)

Haley P, Perry R, Ennulat D, Frame S, Johnson C, Lapointe J-M, Nyska A, Snyder PW, Walker D, Walter G (2005). STP Position Paper: Best Practice Guideline for the Routine Pathology Evaluation of the Immune System. Toxicol Pathol 33: 404-407.

(16)

Hess RA, Moore BJ (1993). Histological Methods for the Evaluation of the Testis. In: Methods in Reproductive Toxicology, Chapin RE and Heindel JJ (eds). Academic Press: San Diego, CA, pp. 52-85.

(17)

Latendresse JR, Warbrittion AR, Jonassen H, Creasy DM.(2002) Fixation of testes and eyes using a modified Davidson’s fluid: comparison with Bouin’s fluid and conventional Davidson’s fluid. Toxicol. Pathol. 30, 524-533.

(18)

OECD (2007). OECD Guideline for Testing of Chemicals N°440: Uterotrophic Bioassay in Rodents: A short-term screening test for oestrogenic properties.

(19)

OECD (2009). Guidance Document 106 on Histologic evaluation of Endocrine and Reproductive Tests in Rodents ENV/JM/Mono(2009)11.

1.

Šī testēšanas metode ir līdzvērtīga ESAO Testēšanas norādījumiem 412 (2009. gads). Subakūtajai inhalācijas toksicitātei veltīto Testēšanas norādījumu 412 (TG 412) sākotnējā versija tika pieņemta 1981. gadā (1). Šī B.8. testēšanas metode (kas ir līdzvērtīga pārskatītajiem TG 412) ir atjaunināta, lai atspoguļotu zinātniskos atklājumus un lai nodrošinātu atbilstību pašreizējām un turpmākajām regulatīvajām vajadzībām.

2.

Šī metode ļauj raksturot nelabvēlīgo ietekmi pēc katru dienu atkārtotas inhalatīvās ekspozīcijas testējamajai ķīmiskajai vielai 28 dienu laikā. Datus, ko iegūst 28 dienu subakūtās inhalācijas toksicitātes pētījumos, var izmantot kvantitatīviem riska novērtējumiem (ja tiem neseko 90 dienu subhroniskās inhalācijas toksicitātes pētījums (šā pielikuma B.29. nodaļa)). Dati var arī sniegt informāciju par koncentrāciju izvēli ilgāka termiņa pētījumiem, piemēram, 90 dienu subhroniskās inhalācijas toksicitātes pētījumam. Šī testēšanas metode nav īpaši paredzēta nanomateriālu testēšanai. Šīs testēšanas metodes kontekstā izmantotās definīcijas ir sniegtas šīs nodaļas beigās un Norādījumu dokumentā Nr. 39 (2).

3.

Lai uzlabotu pētījuma kvalitāti un līdz minimumam samazinātu dzīvnieku izmantošanu, testēšanas laboratorijai ir jāizskata visa pieejamā informācija par testējamo ķīmisko vielu. Informācija, kas palīdzēs izvēlēties attiecīgas testa koncentrācijas, var ietvert testējamās ķīmiskās vielas identitāti, ķīmisko struktūru un fizikālķīmiskās īpašības; jebkādu in vitro vai in vivo toksicitātes testu rezultātus; paredzētos lietošanas veidus un iespējamo cilvēka ekspozīciju; pieejamos (Q)SAR datus un toksikoloģiskos datus par strukturāli radniecīgām vielām; kā arī datus, kas iegūti no akūtās inhalācijas toksicitātes testiem. Ja tiek paredzēta vai pētījuma gaitā novērota neirotoksicitāte, pētījuma vadītājs var izmantot attiecīgus izvērtējumus, piemēram, funkcionālo novērojumu sēriju (FOB) un motoriskās aktivitātes mērījumus. Lai gan ekspozīciju laika pieskaņošanai konkrētiem izmeklējumiem var būt izšķiroša nozīme, šo papilddarbību īstenošana nedrīkst traucēt pamatpētījuma plānam.

4.

Kairinošu vai kodīgu testējamo ķīmisko vielu atšķaidījumus var testēt koncentrācijās, kas nodrošinās vajadzīgo toksicitātes pakāpi (sk. GD 39 (2)). Pakļaujot dzīvniekus šo materiālu iedarbībai, mērķkoncentrācijām jābūt pietiekami zemām, lai neradītu izteiktas sāpes un ciešanas, tomēr tām jābūt pietiekamām, lai koncentrācijas un atbildes reakcijas līknes pagarinātu līdz līmeņiem, kas sasniedz testa regulatīvo un zinātnisko mērķi. Šīs koncentrācijas ir jāizvēlas katrā gadījumā atsevišķi, vēlams, pamatojoties uz attiecīgi izplānotu diapazona noteikšanas pētījumu, kas sniedz informāciju par kritisko beigupunktu, kairinājuma slieksni un ietekmes sākumu (sk. 11.–13. punktu). Izraudzītās koncentrācijas jāpamato.

5.

Mirstoši dzīvnieki, kā arī dzīvnieki, kas acīm redzami cieš sāpes vai pārdzīvo stipras un ilgstošas ciešanas, ir humāni jānonāvē. Mirstošos dzīvniekus ņem vērā tāpat kā testa laikā mirušos dzīvniekus. Kritēriji, pēc kuriem pieņem lēmumu nonāvēt mirstošus dzīvniekus un dzīvniekus, kam ir smagas ciešanas, kā arī norādījumi par paredzamu vai neizbēgamu nobeigšanos ir sniegti ESAO Guidance Document on Humane Endpoints (3).

6.

Ir jāizmanto jauni un veseli pieauguši grauzēji, kas pieder pie laboratorijās parasti izmantotajām līnijām. Ieteicamā suga ir žurka. Ja tiek izmantotas citas sugas, tas jāpamato.

7.

Mātītes nedrīkst būt iepriekš dzemdējušas vai grūsnas. Dienā, kad veic nejaušinātu izvēli, dzīvniekiem jābūt jauniem pieaugušiem dzīvniekiem 7–9 nedēļu vecumā. Ķermeņa svaram jābūt ± 20 % no katra dzimuma vidējā ķermeņa svara. Dzīvniekus izvēlas nejaušināti, marķē individuālai identificēšanai un līdz testa sākumam vismaz piecas dienas tur būros, lai tie aklimatizētos laboratorijas apstākļos.

8.

Lai atvieglotu novērojumu veikšanu un izvairītos no pārpratumiem, dzīvnieki ir individuāli jāidentificē, ja iespējams, ar zemādas retranslatoriem. Temperatūrai eksperimenta dzīvnieku turēšanas telpā jābūt 22 ± 3 °C. Relatīvo mitrumu vēlams uzturēt 30–70 % diapazonā, lai gan tas var būt neiespējami, ja par nesējvielu izmanto ūdeni. Pirms un pēc ekspozīcijām dzīvnieki parasti ir jātur būros grupās pēc dzimuma un koncentrācijas, bet dzīvnieku skaits būrī nedrīkst traucēt katra dzīvnieka novērošanu, kā arī dzīvnieku skaitam ir jābūt tādam, lai iespējami mazāki būtu zudumi kanibālisma un kaušanās dēļ. Ja tiek izmantota vienīgi dzīvnieku deguna ekspozīcija, var būt vajadzīgs dzīvniekus aklimatizēt fiksācijas caurulēm. Fiksācijas caurules nedrīkst dzīvniekiem radīt nevajadzīgu fizisku, termisku vai ar imobilizāciju saistītu stresu. Fiksācija var ietekmēt fizioloģiskos beigupunktus, piemēram, ķermeņa temperatūru (hipertermija) un/vai plaušu minūtes tilpumu. Ja ir pieejami vispārīgi dati, kas apliecina, ka nekādas šādas pārmaiņas nerodas vērā ņemamā apmērā, iepriekšēja pielāgošanās fiksācijas caurulēm nav vajadzīga. Ja tiek izmantota visa ķermeņa ekspozīcija aerosolam, dzīvnieki ekspozīcijas laikā ir jātur atsevišķi, lai tie nevarētu uzņemt testējamo aerosolu no citu būra dzīvnieku apmatojuma. Izņemot ekspozīcijas laiku, var izmantot tradicionālu un sertificētu laboratorijas uzturu, ko papildina ar neierobežotu daudzumu krāna dzeramā ūdens. Dzīvniekus 12 stundas diennaktī tur mākslīgā apgaismojumā, bet 12 stundas – tumsā.

9.

Izvēloties inhalācijas kameru, jāņem vērā testējamās ķīmiskās vielas veids un testa priekšmets. Visieteicamākā metode ir dzīvnieka deguna ekspozīcija (šis termins aptver dzīvnieka galvas, deguna vai snuķa ekspozīciju). Dzīvnieka deguna ekspozīcija ir parasti ieteicama šķidro vai cieto aerosolu pētījumiem un tvaikiem, kas var kondensēties un veidot aerosolu. Pētījuma konkrētos mērķus, iespējams, var labāk sasniegt, izmantojot visa ķermeņa ekspozīciju, bet tas ir jāpamato pētījuma ziņojumā. Lai nodrošinātu atmosfēras stabilitāti, izmantojot visa ķermeņa kameru, testa dzīvnieku kopējais apjoms nedrīkst pārsniegt 5 % no kameras tilpuma. Deguna un visa ķermeņa ekspozīcijas paņēmienu principi un to konkrētās priekšrocības un trūkumi ir aprakstīti GD 39 (2).

10.

Pretēji akūtās toksicitātes pētījumiem 28 dienu subakūtās inhalācijas toksicitātes pētījumiem nav noteiktu robežkoncentrāciju. Nosakot maksimālās testa koncentrācijas, jāņem vērā: 1) maksimālā sasniedzamā koncentrācija; 2) cilvēka ekspozīcijas līmeņa “sliktākais scenārijs”; 3) nepieciešamība saglabāt pietiekamu skābekļa padevi; un/vai 4) dzīvnieku labturības apsvērumi. Ja nav pieejami ar datiem pamatoti ierobežojumi, var izmantot Regulā (EK) Nr. 1272/2008 (13) noteiktās akūtās toksicitātes robežkoncentrācijas (t. i., līdz maksimālajai koncentrācijai 5 mg/l aerosoliem, 20 mg/l tvaikiem un 20 000 ppm gāzēm) (sk. GD 39 (2)). Ja, testējot gāzes vai ļoti gaistošas testējamās ķīmiskās vielas (piemēram, aukstumaģentus), ir nepieciešams pārsniegt šīs robežvērtības, tas jāpamato. Robežkoncentrācijai ir jāizraisa nepārprotama toksicitāte, neradot nevajadzīgu stresu dzīvniekiem un neskarot to mūža ilgumu (3).

11.

Pirms galvenā pētījuma sākšanas var būt nepieciešams veikt diapazona noteikšanas pētījumu. Diapazona noteikšanas pētījums ir vispusīgāks par devu diapazona pētījumu, jo tas neattiecas tikai uz koncentrāciju izvēli. Diapazona noteikšanas pētījumā iegūtās zināšanas var palīdzēt sekmīgi īstenot galveno pētījumu. Piemēram, diapazona noteikšanas pētījuma rezultātā var iegūt tehnisku informāciju par analītiskajām metodēm, daļiņu lieluma noteikšanu un toksisku mehānismu atklāšanu, klīniskās patoloģijas un histopatoloģijas datus, kā arī aplēses par to, kādas varētu būt galvenā pētījuma NOAEL un MTC koncentrācijas. Pētījuma vadītājs var izvēlēties izmantot diapazona noteikšanas pētījumu, lai noteiktu elpošanas sistēmas kairinājuma slieksni (piemēram, ar elpošanas sistēmas histopatoloģiju, plaušu funkcijas testēšanu vai bronhoalveolāru lavāžu), augstāko koncentrāciju, kas ir panesama, neradot dzīvniekiem nevajadzīgu stresu, un parametrus, kuri vislabāk raksturos testējamās ķīmiskās vielas toksiskumu.

12.

Diapazona noteikšanas pētījumā var aplūkot vienu vai vairākus koncentrācijas līmeņus. Katra koncentrācijas līmeņa iedarbībai nevajadzētu pakļaut vairāk kā trīs tēviņus un trīs mātītes. Diapazona noteikšanas pētījumam jāilgst vismaz piecas dienas un parasti ne vairāk kā 14 dienas. Pētījuma ziņojumā tas jāpamato galvenā pētījuma koncentrāciju izvēlei. Galvenā pētījuma mērķis ir parādīt koncentrācijas un atbildes reakcijas sakarību, pamatojoties uz prognozēto jutīgāko beigupunktu. Par zemāko koncentrāciju ieteicams izvēlēties koncentrāciju, ar kuru nav novērojama nelabvēlīga ietekme, savukārt augstākajai koncentrācijai ir jāizraisa nepārprotama toksicitāte, neradot dzīvniekiem nevajadzīgu stresu un neietekmējot to mūža ilgumu (3).

13.

Izvēloties koncentrācijas līmeņus diapazona noteikšanas pētījumam, jāņem vērā visa pieejamā informācija, tostarp struktūras un aktivitātes sakarības un dati par līdzīgām ķīmiskajām vielām (sk. 3. punktu). Diapazona noteikšanas pētījumā var verificēt/atspēkot viedokļus par jutīgākajiem mehāniskajiem beigupunktiem, tādiem kā holīnesterāzes inhibēšana ar organofosfātiem, methemoglobīna veidošanās ar eritrocītiem toksiskiem preparātiem, vairogdziedzerim toksisku vielu ietekme uz vairogdziedzera hormoniem (T3, T4), bronhoalveolārā lavāžā konstatētas olbaltumvielas, LDH vai neitrofīli attiecībā uz inertām mazšķīstošām daļiņām vai plaušas kairinošiem aerosoliem.

14.

Subakūtās toksicitātes galvenais pētījums parasti aptver trīs koncentrācijas līmeņus, kā arī pēc vajadzības līdztekus veiktu negatīvu (gaisa) un/vai nesējvielas kontroli (sk. 17. punktu). Izvēloties attiecīgus ekspozīcijas līmeņus, ir jāizmanto visi pieejamie dati, tostarp sistēmiskās toksicitātes pētījumu, metabolisma un kinētikas rezultāti (īpaši jācenšas izvairīties no augstiem koncentrācijas līmeņiem, kas piesātina kinētiskos procesus). Katrā testa grupā ir vismaz 10 grauzēji (pieci tēviņi un piecas mātītes), ko pakļauj testējamās ķīmiskās vielas iedarbībai sešas stundas dienā piecas dienas nedēļā četras nedēļas pēc kārtas (kopējais pētījuma ilgums ir 28 dienas). Dzīvniekus var iedarbībai pakļaut arī septiņas dienas nedēļā (piemēram, testējot ieelpojamus farmaceitiskos preparātus). Ja ir zināms, ka kāds no dzimumiem pret attiecīgo testējamo ķīmisko vielu ir uzņēmīgāks, dzimumus var pakļaut dažādu koncentrācijas līmeņu iedarbībai, lai optimizētu koncentrācijas un atbildes reakcijas sakarību, kā aprakstīts 15. punktā. Ja deguna ekspozīcijai tiek pakļauti grauzēji, kas nav žurkas, maksimālos ekspozīcijas ilgumus var koriģēt tā, lai iespējami mazinātu attiecīgajai sugai raksturīgās ciešanas. Ja ekspozīcijas ilgums dienā ir mazāks par sešām stundām vai ja ir jāveic liela ilguma (piemēram, 22 stundas dienā) visa ķermeņa ekspozīcijas pētījums, tas jāpamato (sk. GD 39 (2)). Ekspozīcijas laikā dzīvniekus nevajadzētu barot, ja vien ekspozīcija neilgst vairāk par sešām stundām. Visa ķermeņa ekspozīcijas laikā var pastāvīgi nodrošināt ar ūdeni.

15.

Ar izraudzītajām mērķkoncentrācijām ir jānoskaidro mērķorgāns(-i) un jāparāda skaidra koncentrācijas un atbildes reakcijas sakarība:

16.

Satelītgrupas (atgriezeniskuma grupas) pētījumu var izmantot, lai novērotu toksicitātes atgriezeniskumu, noturību vai aizkavētu parādīšanos attiecīgā laikā (bet ne mazāk kā 14 dienas) pēc vielas ievadīšanas. Satelītgrupās (atgriezeniskuma grupās) ir pieci tēviņi un piecas mātītes, ko eksponē vienlaikus ar galvenā pētījuma eksperimentālajiem dzīvniekiem. Satelītgrupas (atgriezeniskuma grupas) ir jāpakļauj testējamās ķīmiskās vielas iedarbībai augstākajā koncentrācijas līmenī, kā arī pēc vajadzības līdztekus jāizmanto gaisa un/vai nesējvielas kontrolgrupas (sk. 17. punktu).

17.