1)

A dalis papildoma šiuo skyriumi:

„A.25   DISOCIACIJOS VANDENYJE KONSTANTOS (TITRAVIMO METODAS. SPEKTROFOTOMETRINIS METODAS. KONDUKTOMETRINIS METODAS)

ĮVADAS

Šis bandymų metodas atitinka EBPO bandymų gaires (TG) 112 (1981 m.).

Būtinos sąlygos

Nurodomoji informacija

Tikslinamieji pareiškimai

Tipiniai dokumentai

Šis bandymo metodas pagrįstas metodais, pateiktais skirsnyje Literatūra išvardytose nuorodose ir EPA priešgamybinio pranešimo preliminariniame vadovo projekte, 1978 m. rugpjūčio 18 d.

METODAS. BANDYMO ĮVADAS, TIKSLAS, TAIKYMO SRITIS, SVARBA, TAIKYMAS IR RIBOS

Cheminės medžiagos disociacija vandenyje yra svarbi vertinant jos poveikį aplinkai. Ji daro įtaką medžiagos formai, kuri savo ruožtu lemia jos elgseną ir transportavimą. Ji gali veikti cheminės medžiagos adsorbciją dirvožemyje ir nuosėdose bei jos absorbciją į biologines ląsteles.

Apibrėžtys ir vienetai

Disociacija yra grįžtamasis skilimas į dvi ar daugiau cheminių dalelių, kurios gali būti joninės. Procesas paprastai žymimas taip:

RX ⇌ R ++ X –

reakciją apibūdinanti koncentracijos pusiausvyros konstanta yra:

pavyzdžiui, konkrečiu atveju, kai R yra vandenilis (medžiaga yra rūgštis), konstanta yra

arba

Etaloninės medžiagos

Šias etalonines medžiagas nebūtina naudoti kiekvienu atveju, kai tiriama nauja cheminė medžiaga. Jos pirmiausia pateiktos tam, kad retkarčiais būtų galima atlikti metodo kalibravimą ir būtų galimybė palyginti rezultatus, jei taikomas kitas metodas.

Būtų naudinga turėti kelias pK vertes turinčią cheminę medžiagą, kaip toliau nurodyta skirsnyje Bandymo metodo principas. Tokia medžiaga galėtų būti:

Bandymo metodo principas

Aprašytas cheminis procesas paprastai tik šiek tiek priklauso nuo temperatūros aplinkai būdingame temperatūros intervale. Reikia išmatuoti cheminės medžiagos disocijavusios ir nedisocijavusios formų koncentraciją, kad būtų galima nustatyti disociacijos konstantą. Žinant Apibrėžčių ir vienetų skyriuje nurodytos disociacijos reakcijos stechiometriją, galima nustatyti atitinkamą konstantą. Šiame bandymo metode aprašytu konkrečiu atveju cheminė medžiaga elgiasi kaip rūgštis ar bazė, todėl patogiausias nustatymo būdas – jonizuotos ir nejonizuotos formų santykinės koncentracijos ir tirpalo pH nustatymas. Santykis tarp šių pKa lygties narių pateiktas pirmiau Apibrėžčių ir vienetų skirsnyje. Kai kurios cheminės medžiagos turi daugiau kaip vieną disociacijos konstantą ir galima sukurti panašias lygtis. Kai kurie iš čia aprašytų metodų taip pat tinka vykstant nerūgštinei / bazinei disociacijai.

Kokybės kriterijai

Pakartojamumas

Reikėtų atlikti kartotinį disociacijos konstantos nustatymą (ne mažiau kaip tris kartus) ± 0,1 log vienetų tikslumu.

BANDYMO PROCEDŪRŲ APRAŠYMAS

Yra du pagrindiniai pKa. nustatymo būdai. Taikant vieną, žinomas cheminės medžiagos kiekis titruojamas etaloniniu rūgšties arba bazės tirpalu; pagal kitą nustatoma jonizuotos ir nejonizuotos formų santykinė koncentracija ir jų priklausomybė nuo pH.

Parengiamieji darbai

Šiais principais pagrįsti metodai gali būti klasifikuojami kaip titravimo, spektrofotometrinės ir konduktometrinės procedūros.

Bandymo tirpalai

Taikant titravimo ir konduktometrinį metodą, cheminė medžiaga turėtų būti ištirpinta distiliuotame vandenyje. Taikant spektrofotometrinį ir kitus metodus, naudojami buferiniai tirpalai. Bandomosios cheminės medžiagos koncentracija neturėtų būti didesnė nei 0,01 mol/l arba viena antroji soties koncentracijos, jei ši mažesnė, o tirpalams ruošti turėtų būti naudojama gryniausia turima medžiagos forma. Jei medžiagos tirpumas vidutinis, ją galima ištirpinti mažame tūryje su vandeniu maišaus tirpiklio prieš padidinant iki pirmiau nurodytų koncentracijos verčių.

Tirpalus reikėtų tikrinti dėl emulsijos susidarymo naudojant Tindalio šviesos pluoštą, ypač jei buvo naudojamas kitas tirpiklis tirpumui padidinti. Jei naudojami buferiniai tirpalai, jų koncentracija neturėtų būti didesnė kaip 0,05 mol/l.

Bandymo sąlygos

Temperatūra

Temperatūra turėtų būti kontroliuojama bent ± 1°C tikslumu. Nustatymą pageidautina atlikti 20 °C temperatūroje.

Jei yra įtarimų dėl reikšmingos priklausomybės nuo temperatūros, nustatymą reikėtų atlikti esant mažiausiai dar dviem temperatūros vertėms. Šiuo atveju temperatūros intervalai turėtų būti 10 °C, o temperatūra kontroliuojama ± 0,1 °C tikslumu.

Analizės

Dėl metodo bus sprendžiama atsižvelgiant į bandomosios cheminės medžiagos tipą. Jis turi būti pakankamai jautrus, kad būtų galima nustatyti skirtingas daleles esant kiekvienai bandymo tirpalo koncentracijai.

Bandymo eiga

Titravimo metodas

Bandymo tirpalas matuojamas titruojant reikiamu etaloniniu bazės ar rūgšties tirpalu ir matuojant pH po kiekvieno titranto pridėjimo. Iki ekvivalentinio taško titrantą reikėtų įpilti ne mažiau kaip per 10 kartų. Jei pusiausvyra pasiekiama pakankamai greitai, galima naudoti savirašį potenciometrą. Taikant šį metodą nebūtina tiksliai žinoti suminį medžiagos kiekį ir jos koncentraciją. Turi būti imtasi priemonių anglies dioksidui pašalinti. Daugiau informacijos apie procedūrą, atsargumo priemones ir skaičiavimą pateikta tipinių bandymų aprašymuose, pvz., (1), (2), (3), (4) nuorodos.

Spektrofotometrinis metodas

Nustatomas bangos ilgis, kuriam esant cheminės medžiagos jonizuotos ir nejonizuotos formų ekstinkcijos koeficientai žymiai skiriasi. Gaunamas pastovios koncentracijos tirpalų UV/VIS absorbcijos spektras, esant pH vertei, kai medžiaga yra iš esmės nejonizuota ir visiškai jonizuota bei kelioms tarpinėms pH vertėms. Tai galima atlikti nedidelius koncentruotos rūgšties (bazės) kiekius dedant į palyginti didelį cheminės medžiagos daugiakomponenčio buferinio tirpalo tūrį, iš pradžių esant didelei (mažai) pH vertei (nuor. 5), arba pridedant vienodus cheminės medžiagos pradinio tirpalo, pvz., vandenyje, metanolyje, tūrius į pastovius tūrius įvairių buferinių tirpalų, apimančių reikiamą pH intervalą. Pagal pH ir optinio tankio vertes, esant pasirinktam bangos ilgiui, apskaičiuojamas pakankamas pKa verčių skaičius, naudojant duomenis, gautus bent penkioms pH vertėms, kai cheminė medžiaga yra ne mažiau kaip 10 procentų ir mažiau kaip 90 procentų jonizuota. Papildomi bandymų duomenys ir skaičiavimo metodas pateikti (1) nuorodoje.

Konduktometrinis metodas

Naudojant žinomos mažos konstantos celę, matuojamas maždaug 0,1 mol/l cheminės medžiagos tirpalo laidžiui matuoti skirtame vandenyje laidis. Taip pat matuojamos kelių šio tirpalo tiksliai praskiestų tirpalų laidžio vertės. Kiekvieną kartą koncentracija mažinama pusiau, o tirpalų serija turi aprėpti bent vieną koncentracijos dydžių eilę. Ribinis laidis esant begaliniam praskiedimui nustatomas atliekant panašų bandymą su Na druska ir ekstrapoliuojant. Taikant Onzagerio lygtį, pagal kiekvieno tirpalo laidį galima apskaičiuoti disociacijos laipsnį, taigi taikant Ostvaldo praskiedimo dėsnį galima apskaičiuoti disociacijos konstantą kaip K = α2C/(1 – α), kai C yra koncentracija moliais litre, o α – disociacijos laipsnis. Turi būti imtasi priemonių CO2 pašalinti. Daugiau informacijos apie bandymo duomenis ir skaičiavimą pateikta tipinių bandymų aprašymuose ir (1), (6) bei (7) nuorodose.

DUOMENYS IR ATASKAITOS RENGIMAS

Rezultatų apdorojimas

Titravimo metodas

pKa apskaičiuojamas 10 matavimo taškų titravimo kreivėje. Apskaičiuojamas tokių pKa verčių vidurkis ir standartinis nuokrypis. Reikėtų įtraukti pH priklausomybės nuo etaloninio bazės ar rūgšties tirpalo tūrio grafiką ir duomenis lentelių pavidalu.

Spektrofotometriniai metodai

Į lenteles įrašomos kiekvienam spektrui gautos optinio tankio ir pH vertės. Pagal tarpinius spektrinių duomenų taškus apskaičiuojamos ne mažiau kaip penkios pKa vertės, taip pat apskaičiuojamas šių rezultatų vidurkis ir standartinis nuokrypis.

Konduktometrinis metodas

Ekvivalentinis laidis Λ apskaičiuojamas kiekvienai rūgšties koncentracijai ir kiekvienai mišinio, sudaryto iš vieno ekvivalento rūgšties ir 0,98 ekvivalento karbonato neturinčio natrio hidroksido, koncentracijai. Rūgšties perteklius imamas tam, kad nebūtų OH– pertekliaus dėl hidrolizės. Gaunamas 1/Λ kaip √C funkcijos grafikas, o druskos Λo gali būti nustatytas atliekant ekstrapoliavimą į nulinę koncentraciją.

Rūgšties Λo gali būti apskaičiuotas, naudojant literatūroje pateiktas H+ ir Na+ vertes. Kiekvienos koncentracijos pKa gali būti apskaičiuota pagal α = Λi /Λo ir Ka = α2C/(1 – α). Tikslesnės Ka vertės gali būti gautos darant judrumo ir aktyvumo pataisas. Reikėtų apskaičiuoti pKa verčių vidurkį ir standartinius nuokrypius.

Bandymo ataskaita

Reikėtų pateikti visus neapdorotus duomenis, apskaičiuotas pKa vertes kartu su skaičiavimo metodu (pageidautina lentelės pavidalu, koks siūlomas nuor. 1), taip pat pirmiau aprašytus statistinius parametrus. Jei taikomi titravimo metodai, reikėtų pateikti titrantų standartizavimo duomenis.

Jei taikomas spektrofotometrinis metodas, reikėtų pateikti visus spektrus. Jei taikomas konduktometrinis metodas, ataskaitoje reikėtų pateikti celės konstantos nustatymo duomenis. Reikėtų pateikti informaciją apie naudojamą įrangą, analizės metodus ir visų naudotų buferinių tirpalų tipą.

Reikėtų pateikti bandymo temperatūros vertę (-es).

LITERATŪRA

2)

B dalies B.5 skyrius pakeičiamas taip:

„B.5   ŪMUS AKIŲ DIRGINIMAS IR (ARBA) ĖSDINIMAS

ĮVADAS

Šis bandymų metodas atitinka EBPO bandymų gaires (TG) 405 (2012). EBPO cheminėms medžiagoms bandyti skirtos bandymų gairės periodiškai peržiūrimos, siekiant, kad jose būtų atsižvelgta į geriausius turimus mokslinius duomenis. Anksčiau peržiūrint šias gaires, ypatingas dėmesys buvo kreipiamas į galimus pagerinimo būdus, įvertinant visą turimą informaciją apie bandomąją cheminę medžiagą, kad būtų išvengta nebūtinų bandymų su laboratoriniais gyvūnais ir taip būtų sprendžiamos jų gerovės problemos. Į TG 405 (priimtas 1981 m. ir atnaujintas 1987, 2002 ir 2012 m.) įtraukta rekomendacija, kad prieš atliekant aprašytą ūmaus akių dirginimo ar ėsdinimo in vivo bandymą, reikėtų atlikti esamų atitinkamų duomenų įrodomosios vertės analizę (1). Jei duomenų nepakanka, rekomenduojama jų gauti atliekant nuosekliuosius bandymus (2)(3). Bandymų strategiją, pateiktą kaip šio bandymų metodo priedėlis, sudaro patvirtinti ir priimti in vitro bandymai. Reglamento (EB) Nr. 1907/2006 dėl cheminių medžiagų registracijos, įvertinimo, autorizacijos ir apribojimų (REACH) (2) taikymo tikslu kompleksinių bandymų strategija taip pat įtraukta į atitinkamą ECHA rekomendaciją (21). Bandymus su gyvūnais reikėtų atlikti tik tais atvejais, kai nustatoma, kad jie yra būtini, išnagrinėjus turimus alternatyvius metodus, ir taikyti tik tuos metodus, kurie nustatyti kaip tinkami. Tuo metu, kai buvo rengiamas šio atnaujinto bandymo metodo projektas, pagal kai kurias reglamentavimo sistemas vis dar buvo būtina arba reikalaujama taikyti šį metodą.

Vėliausiame atnaujinime daugiausia dėmesio skiriama analgetikų ir anestetikų naudojimui, nedarant įtakos pagrindinei bandymų gairių koncepcijai ir struktūrai. ICCVAM (3) ir tarptautinė mokslinė nepriklausomų ekspertų grupė peržiūrėjo vietinių anestetikų ir sisteminių analgetikų įprastinio naudojimo naudą bei apribojimus ir humaniško poveikio vertinamąsias baigtis, atliekant in vivo akių dirginimo saugos bandymus (12). Peržiūros išvada yra ta, kad, naudojant vietinius anestetikus ir sisteminius analgetikus, dažniausiai arba visiškai būtų galima išvengti skausmo ir kančių, nedarant įtakos bandymo rezultatui, ir rekomenduojama, kad šios medžiagos būtų visuomet naudojamos. Šiame bandymo metode atsižvelgta į šią peržiūrą. Atliekant ūmaus akių dirginimo ir ėsdinimo in vivo bandymus, įprastai reikėtų naudoti vietinius anestetikus, sisteminius analgetikus ir humaniško poveikio vertinamąsias baigtis. Jų naudojimo išimtys turėtų būti pagrįstos. Šiame metodo aprašyme nurodyti patobulinimai iš esmės sumažins gyvūnų skausmą ir kančias arba jų bus išvengta atliekant daugelį bandymų, kai vis dar yra būtinas in vivo akių saugos bandymas.

Subalansuotą prevencinį skausmo valdymą turėtų sudaryti (i) įprastinis išankstinis apdorojimas vietiniu anestetiku (pvz., proparakainu ar tetrakainu) ir sisteminiu analgetiku (pvz., buprenorfinu), (ii) įprastinio paskesnio nuskausminimo sisteminiais analgetikais (pvz., buprenorfinu ir meloksikamu) planas, (iii) planinis gyvūnų stebėjimas, monitoringas ir registravimas dėl klinikinių skausmo ir (arba) kančių požymių ir (iv) planinis visų akių pažeidimo tipų, rimtumo ir eigos stebėjimas, monitoringas ir registravimas. Papildoma informacija pateikta toliau aprašytose atnaujintose procedūrose. Po veikimo bandomąja chemine medžiaga nereikėtų naudoti papildomų vietinių anestetikų ar analgetikų, kad būtų išvengta tyrimo trukdžių. Analgetikų su priešuždegiminiu veikimu (pvz., meloksikamo) nereikėtų naudoti kaip vietinių analgetikų, o sisteminio naudojimo dozės neturėtų trukdyti akių poveikiui.

Apibrėžtys aprašytos bandymo metodo priedėlyje.

PRADINIAI ASPEKTAI

Siekiant užtikrinti duomenų mokslinį patikimumą ir gyvūnų gerovę, in vivo bandymai neturėtų būti numatomi tol, kol atliekant duomenų įrodomosios vertės analizę nebus įvertinti visi turimi duomenys, apibūdinantys galimą cheminės medžiagos ėsdinamąjį ar dirginamąjį poveikį akims. Tokius duomenis sudaro turimų tyrimų su žmonėmis ir (arba) laboratoriniais gyvūnais rezultatai, ėsdinimo ar dirginimo duomenys, gauti apie vieną arba kelias medžiagas, turinčias giminingą struktūrą, arba jų mišinius, duomenys, patvirtinantys cheminės medžiagos stiprias rūgštines arba šarmines savybes (4)(5), be to, patvirtintų ir priimtų in vitro arba ex vivo odos ėsdinimo ir dirginimo bandymų rezultatai (6) (13) (14) (15) (16) (17). Tyrimai gali būti daromi prieš duomenų įrodomosios vertės analizę arba kaip jos rezultatas.

Tokia tam tikrų cheminių medžiagų analizė gali parodyti, kad reikia atlikti cheminės medžiagos akių ėsdinimo ar dirginimo gebos in vivo tyrimus. Visais šiais atvejais prieš svarstant in vivo akių bandymo atlikimą, pageidautina prieš tai atlikti cheminės medžiagos in vitro ir (arba) odos ėsdinimo in vivo padarinių tyrimą ir ją įvertinti taikant B.4 bandymų metodo (7) nuosekliųjų bandymų strategiją arba kompleksinių bandymų strategiją, aprašytą ECHA rekomendacijoje (21).

Nuosekliųjų bandymų strategija, kurią sudaro patvirtintų in vitro ar ex vivo akių ėsdinimo ar dirginimo bandymų atlikimas, yra įtraukta į šį bandymo metodą kaip priedėlis ir, dėl REACH, į ECHA rekomendaciją (21). Prieš pradedant in vivo bandymus, rekomenduojama laikytis šios bandymų strategijos. Naujoms cheminėms medžiagoms rekomenduojamas nuosekliųjų bandymų metodas, siekiant gauti moksliškai pagrįstus cheminės medžiagos ėsdinimo ar dirginimo duomenis. Esamoms cheminėms medžiagoms, apie kurių odos ir akių ėsdinimo ar dirginimo savybes duomenų nepakanka, ši strategija gali būti taikoma trūkstamiems duomenims gauti. Kitokios bandymo strategijos arba procedūros taikymas arba sprendimas netaikyti nuosekliųjų bandymų metodo turėtų būti pagrįstas.

IN VIVO BANDYMO METODO PRINCIPAS

Po parengtinio apdorojimo sisteminiu analgetiku ir suleidus atitinkamo vietinio anestetiko, viena iš bandymo gyvūno akių veikiama vienkartine bandomosios cheminės medžiagos doze, neapdorota akis naudojama kaip kontrolinė. Akių dirginimo ir (arba) ėsdinimo geba nustatoma tam tikrais laiko tarpais balais įvertinant junginės, ragenos ir rainelės pažeidimus. Be to, siekiant išsamiai įvertinti poveikį, aprašomas bet koks kitas poveikis ir neigiamas sisteminis poveikis. Tyrimo trukmė turi būti pakankama, kad būtų galima įvertinti, ar poveikis yra grįžtamas ar negrįžtamas.

Gyvūnai, kuriems bet kurioje bandymo stadijoje pasireiškia stiprus skausmas, kančios arba pažeidimai, atitinkantys šiame bandymų metode aprašytas humaniško poveikio vertinamąsias baigtis (žr. 26 pastraipą), turi būti humaniškai numarinami, o cheminė medžiaga atitinkamai įvertinta. Sprendimo dėl gaištančių ir stipriai kenčiančių gyvūnų humaniško numarinimo priėmimo kriterijai yra nagrinėjami EBPO rekomendaciniame dokumente (8).

IN VIVO BANDYMO METODO PARENGIAMIEJI DARBAI

Rūšių parinkimas

Tinkamiausias laboratorinis gyvūnas – baltasis triušis; naudojami sveiki, jauni suaugę triušiai. Kitų rūšių ar veislių naudojimas turi būti pagrįstas.

Gyvūnų paruošimas

Abi kiekvieno bandymui numatyto gyvūno akys turėtų būti patikrintos per 24 h iki bandymo pradžios. Gyvūnai, kuriems nustatomas akių dirginimas, akių defektai arba prieš tai buvęs ragenos pažeidimas, neturėtų būti naudojami.

Laikymo ir šėrimo sąlygos

Gyvūnai turėtų būti laikomi atskirai. Patalpos, kurioje laikomi bandymo triušiai, temperatūra turėtų būti 20 °C (± 3 °C). Nors santykinė oro drėgmė turėtų būti mažiausiai 30 % ir pageidautina ne didesnė kaip 70 %, išskyrus patalpos plovimo laiką, reikėtų siekti, kad ji būtų 50–60 %. Apšvietimas turėtų būti dirbtinis, taikant 12 h šviesos ir 12 h tamsos seką. Reikėtų vengti per didelio šviesos stiprio. Gyvūnams šerti tinka įprastas laboratorijoje naudojamas pašaras, neribojant geriamojo vandens kiekio.

BANDYMO PROCEDŪRA

Vietinių anestetikų ir sisteminių analgetikų naudojimas

Rekomenduojamos šios procedūros, kad atliekant saugos akims bandymo procedūras būtų išvengta skausmo ir kančių arba jos būtų kiek įmanoma mažesnės. Jas galima pakeisti alternatyviomis procedūromis, jei būtų nustatyta, kad jos vienodai arba labiau padeda išvengti skausmo ir kančių.

Bandomosios cheminės medžiagos įterpimas

Bandomoji cheminė medžiaga dedama į kiekvieno gyvūno vienos akies junginės maišelį, švelniai atitraukiant apatinį voką nuo akies obuolio. Vokai švelniai suspaudžiami maždaug vienai sekundei, kad medžiaga neištekėtų. Kita neapdorota akis naudojama kontrolei.

Drėkinimas

Įdėjus bandomosios cheminės medžiagos, bandymo gyvūno akių nereikėtų plauti mažiausiai 24 h, išskyrus kietąsias medžiagas (žr. 18 pastraipą) ir jei iš karto pasireiškia ėsdinimo arba dirginimo poveikis. Po 24 h akis galima plauti, jei manoma, kad tai reikia daryti.

Nerekomenduojama naudoti pagalbinės gyvūnų grupės plovimo įtakai tirti, išskyrus atvejus, kai tai yra moksliškai pagrįsta. Prireikus pagalbinės grupės, reikėtų naudoti du triušius. Plovimo sąlygos turėtų būti išsamiai dokumentuotos, pvz., plovimo laikas; plovimo tirpalo sudėtis ir temperatūra; plovimo trukmė, tirpalo tūris ir srautas.

Dozės dydis

(1)   Skysčių bandymas

Bandant skysčius, naudojama 0,1 ml dozė. Nereikėtų naudoti purškiklio cheminei medžiagai tiesiai į akį įlašinti. Prieš įlašinant 0,1 ml į akį, skystasis purškiklis išpurškiamas į indą ir surenkamas.

(2)   Kietųjų medžiagų bandymas

Bandant kietąsias, pastos ir dalelių pavidalo chemines medžiagas, naudojamos medžiagos tūris turėtų būti 0,1 ml arba masė – ne didesnė kaip 100 mg. Bandomoji cheminė medžiaga turėtų būti sumalta į smulkias dulkes. Kietosios medžiagos tūrį reikėtų matuoti ją švelniai sutankinus, pvz., tapšnojant matavimo indą. Jei stebint pirmą kartą, praėjus 1 h po akies apdorojimo, kieta bandomoji cheminė medžiaga nepasišalino iš bandymo gyvūno akies veikiant fiziologiniams mechanizmams, akį galima praplauti fiziologiniu tirpalu arba distiliuotu vandeniu.

(3)   Aerozolių bandymas

Prieš įlašinant į akį rekomenduojama visas purškiamąsias medžiagas ir aerozolius iš pradžių surinkti į indą. Viena išimtis taikoma slėginiuose aerozolių purkštuvuose esančioms cheminėms medžiagoms, kurių negalima surinkti dėl garavimo. Tokiais atvejais akis laikoma atverta ir bandomoji cheminė medžiaga maždaug vieną sekundę purškiama tiesiai į akį stačiu kampu iš 10 cm atstumo. Šis atstumas gali skirtis, atsižvelgiant į purkštuvo ir jo turinio slėgį. Reikia imtis atsargumo priemonių nepažeisti akies veikiant purškimo slėgiui. Atitinkamais atvejais gali tekti įvertinti mechaninio akies pažeidimo srauto jėga tikimybę.

Aerozolio dozės įvertį būtų galima gauti modeliuojant bandymą taip: cheminė medžiaga purškiama ant sveriamojo popieriaus pro triušio akies dydžio angą, esančia tiesiai prieš popierių. Popieriaus masės padidėjimas naudojamas apytikriam į akį įpurkšto kiekio įvertinimui. Lakiųjų cheminių medžiagų dozė gali būti įvertinta pasveriant indą su chemine medžiaga prieš įpurškimą ir po jo.

Pradinis bandymas (akies dirginimo ar ėsdinimo bandymas in vivo su vienu gyvūnu)

Griežtai rekomenduojama atlikti in vivo bandymą iš pradžių su vienu gyvūnu (žr. šio bandymo priedėlį Nuosekliųjų bandymų strategija akių dirginimui ir ėsdinimui nustatyti). Stebėjimai turėtų padėti nustatyti rimtumą ir grįžtamumą prieš atliekant patvirtinamąjį bandymą su antruoju gyvūnu.

Jei šio bandymo rezultatai rodo, kad taikant aprašytąją procedūrą cheminė medžiaga yra akis ėsdinanti arba stipriai jas dirginanti, kitų akies dirginimo bandymų nereikėtų atlikti.

Patvirtinamasis bandymas (in vivo akies dirginimo bandymas su papildomais gyvūnais)

Jei atliekant pradinį bandymą ėsdinantis poveikis nestebimas, dirginamąjį poveikį arba neigiamą atsaką reikėtų patvirtinti naudojant ne daugiau kaip du papildomus gyvūnus. Jei atliekant pradinį bandymą ėsdinantis poveikis stebimas, patvirtinamąjį bandymą rekomenduojama atlikti nuosekliuoju būdu su vienu gyvūnu, o ne veikiant abu papildomus gyvūnus vienu metu. Jei antrajam gyvūnui pasireiškia ėsdinamasis arba stiprus dirginamasis poveikis, bandymas nutraukiamas. Jei antrajam gyvūnui gautų rezultatų pakanka klasifikavimui nustatyti, kiti papildomi bandymai neatliekami.

Stebėjimo periodas

Stebėjimo laikotarpio trukmės turėtų pakakti stebimo poveikio dydžiui ir grįžtamumui visiškai įvertinti. Tačiau bandymą reikėtų baigti bet kuriuo momentu, kai tik gyvūnui pasireiškia stipraus skausmo arba kančios požymiai (8). Poveikio grįžtamumui nustatyti gyvūnai paprastai stebimi 21 parą po bandomosios cheminės medžiagos davimo. Jei grįžtamumas pastebimas anksčiau nei 21 parą, bandymas nutraukiamas tuo momentu.

Klinikiniai stebėjimai ir akių reakcijos įvertinimas balais

Reikėtų išsamiai įvertinti, ar akys pažeistos ar ne, praėjus vienai valandai po TCA, vėliau įvertinant ne rečiau kaip kasdien. Pirmąsias 3 paras gyvūnus reikėtų įvertinti kelis kartus per dieną, siekiant užtikrinti, kad sprendimai dėl nutraukimo būtų priimti laiku. Bandymo gyvūnai turėtų būti įprastiniu būdu įvertinami visą tyrimo trukmę skausmo ir (arba) kančių klinikiniams požymiams (pvz., kartotinio akies lietimo letena arba trynimo, per dažno mirkčiojimo, per didelio ašarojimo) (9) (10) (11) nustatyti ne rečiau kaip du kartus per dieną, esant ne mažesniam kaip 6 h intervalui tarp stebėjimų, arba dažniau, jei būtina. Tai yra būtina siekiant (i) tinkamai įvertinti gyvūnus dėl skausmo ir kančių požymių buvimo, kad būtų priimti pagrįsti sprendimai, ar reikia padidinti analgetikų dozes, ir (ii) įvertinti gyvūnus dėl nustatytų humaniško poveikio vertinamųjų baigčių buvimo, kad būtų galima priimti pagrįstus sprendimus, ar reikia humaniškai numarinti gyvūnus, ir užtikrinti, kad tokie sprendimai būtų priimti laiku. Paprastai reikėtų dažyti fluoresceinu ir naudoti biologinį mikroskopą su plyšine lempa, jei manoma, kad to reikia (pvz., žaizdos gyliui įvertinti, esant ragenos išopėjimui) kaip priemonės akių pažaidai aptikti bei išmatuoti ir įvertinti, ar pasiekti humaniško numarinimo vertinamųjų baigčių kriterijai. Galima kaupti stebimų pažeidimų skaitmenines nuotraukas, kurios būtų naudojamos palyginimui ir kaip nuolatinis akių pažaidų laipsnio registravimas. Gyvūnai turėtų būti bandomi ne ilgiau nei būtina galutinei informacijai gauti. Gyvūnai, kuriems pasireiškia stiprus skausmas arba kančia, turi būti iš karto humaniškai numarinti, o cheminė medžiaga atitinkamai įvertinta.

Turėtų būti humaniškai numarinami gyvūnai, kuriems po įlašinimo atsiranda šie pažeidimai (žr. 1 lentelę dėl pažeidimo balų aprašymo): ragenos pradūrimas arba didelės ragenos opos, įskaitant stafilomą; kraujo atsiradimas priekinėje akies kameroje; 4 balų ragenos drumstumas; šviesos reflekso nebuvimas (2 balų rainelės atsakas) ilgiau kaip 72h; junginės membranos opos; junginės arba mirksimosios membranos nekrozė, arba nekrozinio audinio lupimasis. Numarinti reikia todėl, kad tokie pažeidimai paprastai yra negrįžtami. Be to, rekomenduojama toliau nurodytus akių pažeidimus naudoti kaip humaniško poveikio vertinamąsias baigtis tyrimui užbaigti anksčiau nei 21 paros stebėjimo laikotarpiu. Sunkių dirginimo ar ėsdinimo sužeidimų ir sužeidimų, kurie, kaip manoma, nebūtų visiškai grįžtami baigiantis 21 paros stebėjimo periodui, numatomaisiais pažeidimais laikomi šie: didelis žaizdos gylis (pvz., ragenos opa išplinta giliau nei paviršiniai ragenos medžiagos sluoksniai), ragenos krašto suirimas > 50 % (rodo junginės audinio blukimas), ir stipri akių infekcija (pūlių išsiskyrimas). Ragenos paviršiaus vaskuliarizacijos (t. y. panuso), nudažyto fluoresceinu ploto nemažėjimo per kasdieniniam vertinimui nustatytą trukmę ir (arba) reepitelizacijos nebuvimo, praėjus 5 paroms nuo cheminės medžiagos įterpimo, derinys taip pat galėtų būti laikomas potencialiai naudingu kriterijumi priimant klinikinį sprendimą dėl pirmalaikio tyrimo nutraukimo. Tačiau vien tik šių duomenų nepakanka pirmalaikiam tyrimo nutraukimui pagrįsti. Nustačius stiprų poveikį akims, reikėtų pasikonsultuoti su gydančiuoju arba kvalifikuotu laboratorijos veterinaru arba su klinikinius pažeidimus nustatyti apmokytu personalu, kad būtų galima nustatyti, ar šių poveikių derinys pateisina pirmalaikį tyrimo nutraukimą. Turėtų būti gauti akių (junginės, ragenos ir rainelės) pažeidimai balais ir užrašyti praėjus 1, 24, 48 ir 72 h po bandomosios cheminės medžiagos uždėjimo (1 lentelė). Jei gyvūnų akių pažeidimų neatsiranda, bandymas gali būti baigtas ne anksčiau kaip 3 paros po įlašinimo. Gyvūnus su nedideliais pažeidimais reikėtų stebėti tol, kol tie pažeidimai pranyksta, arba 21 parą, kai tyrimas baigiamas. Stebėjimai turi būti atliekami ir registruojami ne rečiau kaip po 1 h, 24 h, 48 h, 72 h, 7 parų, 14 parų ir 21 paros, kad būtų galima nustatyti pažeidimų būseną ir jų grįžtamumą ar negrįžtamumą. Prireikus stebima dažniau, kad būtų galima nustatyti, ar bandymų gyvūną reikėtų numarinti iš humaniškų paskatų ar pašalinti iš tyrimo dėl neigiamų rezultatų.

Akių pažeidimų vertinimo balai (1 lentelė) turėtų būti užrašomi kiekvieno tikrinimo metu. Taip pat reikėtų pranešti apie visus kitus akių pažeidimus (pvz., panusą, dėmių atsiradimą, priekinės kameros pokyčius) arba neigiamą sisteminį poveikį.

Reakcijos tikrinimą galima palengvinti naudojant binokulinę lupą, rankinę plyšinę lempą, biologinį mikroskopą arba kitokį tinkamą įtaisą. Užrašius 24 h stebėjimus, akys gali būti toliau tiriamos naudojant fluoresceiną.

Akių reakcijos įvertinimas balais neišvengiamai yra subjektyvus. Siekiant labiau suderinti akių reakcijos įvertinimą balais ir padėti bandymo laboratorijoms ir visiems, kurie vykdo ir aiškina stebėjimus, juos vykdantis personalas turi būti atitinkamai išmokytas taikyti įvertinimo balais sistemą.

DUOMENYS IR ATASKAITOS RENGIMAS

Rezultatų įvertinimas

Akių dirginimo balus reikėtų įvertinti atsižvelgiant į pažeidimų tipą ir rimtumą bei į poveikio grįžtamumą arba negrįžtamumą. Atskiri balai nėra cheminės medžiagos dirginamųjų savybių absoliutusis įvertis, kadangi dar įvertinamas kitas bandomosios cheminės medžiagos poveikis. Į šiuos atskirai gautus balus reikėtų žiūrėti kaip į palyginamąsias vertes, reikšmingas tik tais atvejais, kai jas patvirtina išsamus visų kitų stebėjimų aprašymas ir įvertinimas.

Bandymo ataskaita

Į bandymo ataskaitą turėtų būti įtraukta ši informacija:

Rezultatų aiškinimas

Su laboratoriniais gyvūnais atliktų akių dirginimo tyrimų rezultatų ekstrapoliavimas žmonėms tinka tik tam tikru mastu. Daugeliu atvejų baltieji triušiai yra jautresni akis dirginančioms arba ėsdinančioms medžiagoms nei žmonės.

Aiškinant rezultatus turi būti stengiamasi neįtraukti antrinės infekcijos sukelto dirginimo.

LITERATŪRA

1 lentelė

Akių pažeidimo vertinimo balais skalė

B.5 BANDYMŲ METODO PRIEDĖLIS  (4)

NUOSEKLIŲJŲ BANDYMŲ STRATEGIJA AKIŲ DIRGINIMUI IR ĖSDINIMUI NUSTATYTI

Bendrieji aspektai

Siekiant gauti nuodugnių mokslinių rezultatų ir rūpinantis gyvūnų gerove, svarbu be reikalo nenaudoti gyvūnų ir kiek įmanoma mažinti visus bandymus, kurie gyvūnams gali sukelti stiprius atsakus. Visa informacija apie cheminę medžiagą dėl jos galimo ėsdinamojo ar dirginamojo poveikio odai turėtų būti įvertinta prieš sprendžiant dėl in vivo bandymų. Jei jau yra pakankamai duomenų galimam bandomosios cheminės medžiagos ėsdinamajam arba dirginamajam odos poveikiui klasifikuoti, su laboratoriniais gyvūnais bandymų atlikti nereikia. Taigi, taikant duomenų įrodomosios vertės analizę ir nuosekliųjų bandymų strategiją, iki minimumo sumažėja būtinybė atlikti in vivo bandymus, ypač jei tikėtina, kad cheminė medžiaga gali sukelti stiprias reakcijas.

Turimai informacijai apie cheminių medžiagų dirginamąjį ir ėsdinamąjį poveikį akims įvertinti rekomenduojama taikyti duomenų įrodomosios vertės analizę, kuri leistų spręsti, ar tokio poveikio galimybei apibūdinti reikia atlikti papildomus tyrimus, išskyrus in vivo akių tyrimus. Jei reikia papildomų tyrimų, atitinkamiems eksperimentiniams duomenims gauti, rekomenduojama taikyti nuosekliųjų bandymų strategiją. Jei nėra medžiagų bandymo duomenų jų ėsdinamajam ar dirginamajam poveikiui odai įvertinti, reikėtų taikyti nuosekliųjų bandymų strategiją. Šiame priedėlyje aprašyta pradinių bandymų strategija sukurta EBPO praktiniame seminare (1). Vėliau ji buvo patvirtinta bei išplėsta kaip integruota darnioji pavojų dėl cheminių medžiagų poveikio žmonių sveikatai ir aplinkai klasifikavimo sistema, 1998 m. lapkričio mėn. priimta 28-ame jungtiniame cheminių medžiagų komiteto ir cheminių medžiagų darbo grupės posėdyje (2) ir 2011 m. atnaujinta EBPO ekspertų grupės.

Nors ši bandymų strategija nėra sudėtinė B.5 bandymo metodo dalis, ji yra rekomenduojamas akių dirginimo ar ėsdinimo savybių nustatymo būdas. Šis būdas atitinka geriausią praktiką ir yra akių dirginimo ar ėsdinimo in vivo bandymų etikos etalonas. Bandymo metode pateikiamos in vivo bandymų rekomendacijos ir apibendrinami veiksniai, į kuriuos reikėtų atkreipti dėmesį prieš pradedant tokį bandymą. Nuosekliųjų bandymų strategijoje siūlomas duomenų įrodomosios vertės analizės būdas, kuris leistų įvertinti turimus duomenis apie bandomųjų cheminių medžiagų akių dirginimo ar ėsdinimo savybes, kad būtų galima nuosekliai gauti reikiamų duomenų apie chemines medžiagas, kurias reikia papildomai ištirti arba kurios nebuvo tirtos. Taikant strategiją iš pradžių atliekami patvirtinti ir priimti in vitro ar ex vivo bandymai ir tada TM B.4 tyrimai specifinėmis aplinkybėmis (3) (4).

Nuosekliųjų bandymų strategijos aprašymas

Siekiant nustatyti in vivo akių bandymų reikalingumą, prieš atliekant bandymus, kurie būtų nuosekliųjų bandymų strategijos dalis (schema), reikėtų įvertinti visą turimą informaciją. Nors reikšmingos informacijos galima būtų gauti vertinant atskirus parametrus (pvz., ribines pH vertes), turėtų būti nagrinėjama visa turima informacija. Priimant įrodomosios vertės analizės sprendimą, turėtų būti įvertinti visi atitinkami duomenys apie konkrečios cheminės medžiagos ir jos struktūrinių analogų poveikį, ir turėtų būti pateiktas sprendimo priėmimo pagrindimas. Didžiausias dėmesys turėtų būti kreipiamas į turimus duomenis apie cheminę medžiagą, gautus tiriant žmones ir gyvūnus, o vėliau tirti in vitro arba ex vivo bandymų rezultatus. Ėsdinančiųjų medžiagų in vivo tyrimų reikėtų kiek įmanoma vengti. Toliau pateikiami bandymų strategijos veiksniai.

AKIŲ DIRGINIMO AR ĖSDINIMO BANDYMO IR ĮVERTINIMO STRATEGIJA

LITERATŪRA

3)

B dalies B.10 skyrius pakeičiamas taip:

„B.10   Žinduolių chromosomų aberacijų in vitro bandymas

ĮVADAS

Šis bandymų metodas atitinka EBPO bandymų gaires (TG) 473 (2016). Jis yra genetinės toksikologijos metodų serijos dalis. Yra parengtas EBPO dokumentas, kuriame glaustai pateikiama informacijos apie genetinės toksikologijos bandymus ir naujausių šių gairių pakeitimų apžvalga (1).

Chromosomų aberacijų tyrimo in vitro tikslas – identifikuoti chemines medžiagas, sukeliančias žinduolių ląstelių kultūros chromosomų aberacijas (2) (3) (4). Struktūrinės aberacijos gali būti 2 tipų: chromosominės ar chromatidinės. Atliekant chromosomų aberacijų tyrimus in vitro galėtų atsirasti poliploidija (įskaitant endoreduplikaciją). Nors aneugeninės cheminės medžiagos gali sukelti poliploidiją, pati poliploidija nerodo aneugeninio potencialo ir gali tiesiog rodyti ląstelių ciklo sutrikimą arba citotoksiškumą (5). Šis bandymas nenumatytas aneuploidijai matuoti. Aneuploidijai aptikti būtų galima rekomenduoti in vitro mikrobranduolių bandymą (6).

Tiriant chromosomų aberacijas in vitro, galima naudoti gerai žinomų ląstelių linijų arba žmogaus ar graužikų kilmės pirminių ląstelių kultūras. Naudojamas ląsteles reikėtų pasirinkti pagal jų gebėjimą augti kultūroje, kariotipo stabilumą (įskaitant chromosomų skaičių) ir chromosomų aberacijų spontaninį dažnumą. Atsižvelgiant į šiuo metu turimus duomenis, neįmanoma pateikti patikimų rekomendacijų, bet svarbu patarti, kad, įvertinant cheminius pavojus, reikėtų atsižvelgti į bandymams pasirinktų ląstelių p53 būseną, genetinį (kariotipo) stabilumą, DNR atkūrimo gebą ir kilmę (graužikų, palyginti su žmogaus). Todėl šio bandymo metodo naudotojai raginami atsižvelgti į šių ir kitų ląstelių charakteristikų įtaką ląstelių linijos savybėms aptinkant chromosomų aberacijų atsiradimą, nes šios srities žinių visą laiką daugėja.

Vartojamų terminų apibrėžtys pateiktos 1 priedėlyje.

PRADINIAI ASPEKTAI IR APRIBOJIMAI

Bandymus atliekant in vitro paprastai reikia naudoti egzogeninį metabolinio aktyvinimo šaltinį, išskyrus atvejus, kai ląstelės yra metaboliškai pajėgios bandomųjų cheminių medžiagų atžvilgiu. Egzogeninė metabolinio aktyvinimo sistema nevisiškai atkartoja in vivo sąlygas. Reikėtų stengtis išvengti sąlygų, kurioms esant būtų gauti dirbtinai teigiami rezultatai, t. y. chromosomos būtų pažeistos ne dėl tiesioginės sąveikos tarp bandomųjų cheminių medžiagų ir chromosomų; tokias sąlygas sudaro pH ar osmolialumo pokyčiai (8) (9) (10), sąveika su terpės komponentais (11) (12) ar per didelis citotoksiškumo lygis (13) (14) (15) (16).

Šis bandymas naudojamas aptikti chromosomų aberacijas, kurios gali atsirasti dėl klastogeninio poveikio reiškinių. Chromosomų aberacijos atsiradimo analizė turėtų būti atliekama naudojant metafazės ląsteles. Todėl svarbu, kad įvyktų apdorotos ir neapdorotos kultūrų ląstelių mitozė. Pramoninėms nanomedžiagoms gali prireikti tam tikro šio bandymų metodo pakeitimų, kurie šiame bandymų metode neaprašyti.

Prieš taikant bandymų metodą mišiniui, kad būtų gauti numatomo reglamentavimo tikslui skirti duomenys, reikėtų panagrinėti, ar metodu galima pasiekti tą tikslą atitinkančius rezultatus ir, jei taip, dėl kokios priežasties. Tokie svarstymai nereikalingi, kai yra reglamentavimo reikalavimas bandyti mišinį.

BANDYMO PRINCIPAS

Žmogaus arba kitų žinduolių kilmės ląstelių kultūros veikiamos bandomąja chemine medžiaga naudojant egzogeninį metabolinio aktyvinimo šaltinį ar jo nenaudojant, jei naudojamos reikiamą metabolinę gebą turinčios ląstelės (žr. 13 pastraipą). Tam tikrais iš anksto nustatytais tarpais nuo ląstelių kultūrų veikimo bandomąja chemine medžiaga pradžios ląstelės apdorojamos metafazę stabdančia chemine medžiaga (pvz., kolcemidu arba kolchicinu), surenkamos, dažomos, o metafazės ląstelės tiriamos mikroskopu, kad būtų nustatytos chromatidinės ir chromosominės aberacijos.

METODO APRAŠYMAS

Parengiamieji darbai

Ląstelės

Galima naudoti įvairias ląstelių linijas (pvz., kiniškojo žiurkėno kiaušidžių (CHO), kiniškojo žiurkėno plaučių V79, kiniškojo žiurkėno plaučių (CHL)/IU, TK6 ląsteles) arba pirmines ląstelių kultūras, įskaitant žmogaus ar kitų žinduolių periferinio kraujo limfocitus (7). Naudojamų ląstelių linijų pasirinkimą reikėtų moksliškai pagrįsti. Naudojant pirmines ląsteles, dėl gyvūnų gerovės priežasčių reikėtų atsižvelgti į galimybę naudoti, jei įmanoma, žmogiškos kilmės pirmines ląsteles, ir ėminius imti atsižvelgiant į žmonių etikos principus ir taisykles. Žmogaus periferinio kraujo limfocitus reikėtų gauti iš jaunų (maždaug 18–35 metų amžiaus), nerūkančių žmonių, kurie nesirgtų ar kurie nebūtų neseniai paveikti genotoksiniais agentais (pvz., cheminėmis medžiagomis, jonizuojančiąja spinduliuote) tokiu mastu, kad tai padidintų chromosomų aberacijų foninį dažnumą. Tai užtikrintų, kad chromosomų aberacijų foninis dažnumas būtų mažas ir pastovus. Chromosomų aberacijų dažnumo atskaitos vertė didėja senstant ir ši tendencija labiau pasireiškia moterims nei vyrams (17) (18). Jei naudojamos ląstelės paimamos daugiau kaip iš vieno donoro, turėtų būti nurodytas donorų skaičius. Būtina įrodyti, kad ląstelės dalijosi nuo ląstelių ėminio apdorojimo bandomąja chemine medžiaga pradžios. Ląstelių kultūros laikomos eksponentinio ląstelių augimo fazėje (ląstelių linijos) arba stimuliuojamos dalytis (pirminės limfocitų kultūros), kad ląstelės būtų veikiamos skirtingose ląstelės ciklo stadijose, nes ląstelių stadijų jautris bandomosioms cheminėms medžiagoms gali būti nežinomas. Pirminės ląstelės, kurias reikia stimuliuoti mitogeniniais agentais, kad jos pradėtų dalytis, paprastai daugiau nesinchronizuojamos jas veikiant bandomąja chemine medžiaga (pvz., žmogaus limfocitai po 48 h mitogeninio stimuliavimo). Naudoti sinchronizuotas ląsteles apdorojimo metu nerekomenduojama, bet gali būti priimtina, jei būtų pagrįsta.

Terpės ir kultūros sąlygos

Prižiūrimoms kultūroms reikėtų naudoti reikiamą kultūros terpę ir inkubavimo sąlygas (kultūros indus, drėkinamąją 5 % CO2 atmosferą, jei tinka, inkubavimo temperatūrą – 37 °C). Ląstelių linijos turėtų būti reguliariai tikrinamos, ar nesikeičia modalinis chromosomų skaičius ir nėra mikoplazmos užkrato (7) (19), o užkrėstos arba pakitusio modalinio chromosomų skaičiaus ląstelės neturėtų būti naudojamos. Turėtų būti nustatyta bandymo laboratorijoje naudojamų ląstelių linijų ar pirminių kultūrų normalaus ląstelių ciklo trukmė ir ji turėtų atitikti paskelbtas ląstelių charakteristikas (20).

Kultūrų paruošimas

Ląstelių linijos: ląstelės yra dauginamos iš kamieninių kultūrų, sėjamos kultūros terpėje tokiu tankiu, kad ląstelių suspensijos ar monosluoksniai visą laiką iki pat surinkimo momento augtų eksponentiškai (pvz., reikėtų vengti monosluoksniuose augančių ląstelių susiliejimo).

Limfocitai: viso kraujo ėminys, apdorotas antikoaguliantu (pvz., heparinu), ar iš to kraujo atskirti limfocitai auginami (pvz., žmogaus limfocitai – 48 h) esant mitogeno (pvz., žmogaus limfocitams – fitohemagliutinino (PHA)), kad ląstelės pradėtų dalytis prieš jas paveikiant bandomąja chemine medžiaga.

Metabolinis aktyvinimas

Kai naudojamos nepakankamos endogeninės metabolinės gebos ląstelės, reikėtų naudoti egzogenines metabolizavimo sistemas. Jei nebūtų pagrįsta kita sistema, dažniausiai kaip numatytoji rekomenduojama sistema yra kofaktoriumi papildyta pomitochondrinė frakcija (S9), ruošiama iš graužikų (paprastai žiurkių) kepenų, apdorotų fermentų aktyvumą skatinančiais agentais, pvz,. Aroclor 1254 (21) (22) (23) ar fenobarbitalio ir β-naftoflavono derinys (24) (25) (26) (27) (28) (29). Pastarasis derinys neprieštarauja Stokholmo konvencijai dėl patvariųjų organinių teršalų (30) ir pasirodė esąs toks pat veiksmingas kaip Aroclor 1254 mišrių funkcijų oksidazėms skatinti (24) (25) (26) (28). S9 frakcija paprastai naudojama nuo 1 % iki 2 % (tūrio) koncentracijos, bet galutinio bandymo terpėje gali būti padidinta iki 10 % (tūrio). Apdorojant reikėtų vengti naudoti produktus, kurie mažina mitozinį indeksą, ypač su kalciu kompleksus sudarančius produktus (31). Naudojamos egzogeninės metabolinio aktyvinimo sistemos ar metabolizmo skatinimo priemonės tipo ir koncentracijos pasirinkimui įtakos gali turėti bandomų cheminių medžiagų klasė.

Bandomosios cheminės medžiagos ruošimas

Prieš apdorojant ląsteles, kietąsias chemines medžiagas reikėtų ištirpinti atitinkamuose tirpikliuose ir, jei reikia, praskiesti (žr. 23 pastraipą). Skystąsias chemines medžiagas galima dėti tiesiogiai į bandymo sistemą ir (arba) praskiesti prieš apdorojant bandymo sistemą. Dujos ar lakiosios bandomosios cheminės medžiagos turėtų būti bandomos atitinkamai pakeitus standartinius protokolus, pvz., apdorojimas sandariuose kultūros induose (32) (33) (34). Bandomųjų cheminių medžiagų preparatus reikėtų ruošti prieš pat apdorojimą, išskyrus atvejus, kai stabilumo duomenys rodo galimybę laikyti.

Bandymo sąlygos

Tirpikliai

Tirpiklį reikėtų pasirinkti taip, kad būtų optimizuotas bandomosios cheminės medžiagos tirpumas, bet nebūtų daroma neigiama įtaka tyrimo eigai, pvz., kistų ląstelių augimas, būtų paveiktas bandomosios cheminės medžiagos vientisumas, vyktų reakcija su kultūros indais, būtų pakenkta metabolinio aktyvinimo sistemai. Jei įmanoma, rekomenduojama naudoti vandeninį tirpiklį (ar kultūros terpę). Gerai ištirti tirpikliai yra, pvz., vanduo ar dimetilsulfoksidas. Paprastai organinio tirpiklio koncentracija galutinio apdorojimo terpėje neturėtų būti didesnė kaip 1 % (tūrio), o vandeninių tirpiklių (natrio chlorido tirpalo ar vandens) – 10 % (tūrio). Jei naudojami tinkamai neištirti tirpikliai (pvz., etanolis ar acetonas), jų naudojimas turėtų būti pagrįstas duomenimis, rodančiais, kad tirpiklis yra suderinamas su bandomosiomis cheminėmis medžiagomis bei bandymo sistema ir kad naudojama koncentracija nesukelia genetinio toksiškumo. Jei tokių patvirtinančių duomenų nebūtų, svarbu įtraukti neapdorotus kontrolinius ėminius (žr. 1 priedėlį), kurie įrodytų, kad pasirinktas tirpiklis nesukelia žalingo arba klastogeninio poveikio.

Ląstelių proliferacijos bei citotoksiškumo matavimas ir apdorojimo koncentracijos verčių parinkimas

Nustatant didžiausią bandymui naudojamą bandomosios cheminės medžiagos koncentraciją reikėtų vengti koncentracijos, galinčios sukelti dirbtinį teigiamą atsaką, pvz., kuri sukeltų per didelį citotoksiškumą (žr. 22 pastraipą), nuosėdų kultūros terpėje (žr. 23 pastraipą) ar žymius pH arba osmolialumo pokyčius (žr. 5 pastraipą). Jei bandomosios cheminės medžiagos pridėjimo metu žymiai pakinta terpės pH vertė, ją būtų galima reguliuoti buferuojant galutinio apdorojimo terpę, kad būtų išvengta dirbtinių teigiamų rezultatų ir būtų užtikrintos tinkamos kultūros sąlygos.

Ląstelių proliferacija matuojama siekiant įsitikinti, ar bandymo metu pakankamas apdorotų ląstelių skaičius pasiekė mitozę ir ar apdorojama esant reikiamam citotoksiškumo lygiui (žr. 18 ir 22 pastraipas). Citotoksiškumą reikėtų nustatyti pagrindinio bandymo metu pagal atitinkamus ląstelių žūties ir augimo rodiklius, esant ir nesant metaboliniam aktyvinimui. Nors citotoksiškumo įvertinimas atliekant pradinį bandymą gali būti naudingas pagrindinio bandymo koncentracijos vertėms geriau apibrėžti, pradinis bandymas nėra privalomas. Jei jis būtų atliekamas, jis neturėtų pakeisti citotoksiškumo matavimo atliekant pagrindinį bandymą.

Santykinis populiacijos padvigubėjimas (RPD) ar santykinis ląstelių skaičiaus padidėjimas (RICC) yra tinkami metodai citotoksiškumui įvertinti atliekant citogenetinius bandymus (13) (15) (35) (36) (55) (formules žr. 2priedėlyje). Jei apdorojimas yra ilgalaikis, o ėminių ėmimo laikas nuo apdorojimo pradžios yra daugiau kaip 1,5 karto ilgesnis nei normalaus ląstelių ciklo trukmė (t. y. iš viso yra daugiau kaip 3 kartus ilgesnis nei ląstelių ciklo trukmė), citotoksiškumo įvertis taikant RPD galėtų būti per mažas (37). Šiomis aplinkybėmis geresnis matas galėtų būti RICC arba naudingas įvertis galėtų būti ir RPD, citotoksiškumą įvertinant praėjus laikui, kuris būtų 1,5 karto ilgesnis nei normalaus ląstelių ciklo trukmė.

Jei kaip pirminė kultūra naudojami limfocitai, kurių citotoksinio ar citostatinio poveikio matas yra mitozinis indeksas (MI), jam įtaką daro matavimo laikas po apdorojimo, naudojamas mitogenas ir galimas ląstelių ciklo nutrūkimas. Tačiau MI yra priimtinas, nes kiti citotoksiškumo matavimai gali būti sudėtingi ir praktiškai neįmanomi bei gali netikti stimuliuojant PHA augančiai limfocitų tikslinei populiacijai.

Nors rekomenduojami ląstelių linijų citotoksiškumo parametrai yra RICC ir RPD, o pirminės limfocitų kultūros – MI, kiti rodikliai (pvz., ląstelių vientisumas, apoptozė, nekrozė, ląstelių ciklas) galėtų suteikti naudingos papildomos informacijos.

Reikėtų įvertinti ne mažiau kaip tris bandymo koncentracijos vertes (neįskaitant tirpiklio ir teigiamų kontrolinių ėminių), kurios atitinka priimtinumo kriterijus (reikiamas citotoksiškumas, ląstelių skaičius ir kt.). Neatsižvelgiant į ląstelių tipą (ląstelių linijos ar pirminės limfocitų kultūros), galima naudoti kiekvienos bandymo koncentracijos kartotines ar pavienes apdorotas kultūras. Nors patariama naudoti kartotines kultūras, pavienės kultūros taip pat priimtinos, jei vertinamas vienodas suminis pavienės ar kartotinės kultūros ląstelių skaičius. Naudoti pavienę kultūrą ypač tinka, kai vertinamos daugiau kaip 3 koncentracijos vertės (žr. 31 pastraipą). Nepriklausomoms kartotinėms kultūroms gauti tam tikros koncentracijos rezultatai gali būti sutelkti bendrai duomenų analizei (38). Jei bandomoji cheminė medžiaga rodo mažą citotoksiškumą arba jo visai nėra, paprastai tiktų maždaug nuo 2 iki 3 kartų besiskiriančios koncentracijos intervalai. Jei citotoksiškumas nustatomas, pasirinktos koncentracijos vertės turėtų aprėpti intervalą nuo koncentracijos, kuriai esant citotoksiškumas pasireiškia, kaip aprašyta 22 pastraipoje, įtraukiant koncentracijos vertes, kurioms esant gaunamas vidutinis citotoksiškumas ar jo visai nėra. Daugelio bandomųjų cheminių medžiagų koncentracijos atsako kreivės kyla staigiai, todėl norint gauti mažo arba vidutinio citotoksiškumo duomenis arba išsamiai ištirti dozės ir atsako santykį, būtina naudoti arčiau išdėstytas ir (arba) daugiau kaip tris koncentracijos vertes (pavienių ar kartotinių kultūrų), ypač tomis aplinkybėmis, kai reikia atlikti kartotinį bandymą (žr. 47 pastraipą).

Jei maksimali koncentracija pagrįsta citotoksiškumu, didžiausiai koncentracijai reikėtų pasiekti 55 ± 5 % citotoksiškumą, taikant rekomenduotus citotoksiškumo parametrus (t. y. ląstelių linijų RICC bei RPD sumažėjimą ir pirminių limfocitų kultūrų MI sumažėjimą iki 45 ± 5 % vienalaikio neigiamo kontrolinio ėminio). Reikėtų atsargiai aiškinti teigiamus rezultatus, kurie būtų gauti tik viršutiniam šio 55 ± 5 % citotoksiškumo intervalo galui (13).

Jei mažai tirpios bandomosios cheminės medžiagos nėra citotoksiškos, kai koncentracija yra mažesnė nei mažiausia netirpumo koncentracija, paveikimo bandomąja chemine medžiaga pabaigoje, esant didžiausiai analizuojamai koncentracijai, turėtų atsirasti drumstumas arba nuosėdos, matomos plika akimi arba per inversinį mikroskopą. Netgi jei citotoksiškumas pasireiškia, kai koncentracija yra didesnė nei mažiausia netirpumo koncentracija, patartina bandyti tik esant vienai drumstumą ar matomas nuosėdas sukeliančiai koncentracijai, nes nuosėdos gali daryti dirbtinį poveikį. Esant koncentracijai, kurioje susidaro nuosėdos, reikėtų imtis priemonių užtikrinti, kad nuosėdos netrukdytų atlikti bandymą (pvz., dažymą ar įvertinimą). Gali padėti tirpumo nustatymas kultūros terpėje prieš atliekant bandymą.

Jei nuosėdų ar ribinio citotoksiškumo nestebima, didžiausia bandymo koncentracija turėtų atitikti 10 mmol/l, 2 mg/ml ar 2 μl/ml, pasirenkant mažiausią (39) (40) (41). Jei bandomoji cheminė medžiaga yra neapibrėžtos sudėties, pvz., nežinomos ar kintamos sudėties medžiaga, sudėtingųjų reakcijų produktai ar biologinė medžiaga (UVCB) (42), iš aplinkos ekstrahuojamas ėminys ir kt., nesant pakankamam citotoksiškumui, gali prireikti didesnės didžiausios koncentracijos (pvz., 5 mg/ml), kad būtų didesnė kiekvieno iš komponentų koncentracija. Reikėtų pažymėti, kad žmonėms skirtiems vaistiniams preparatams šie reikalavimai gali būti skirtingi (43).

Kontroliniai ėminiai

Kiekvieną kartą surenkant kultūrą, reikėtų įtraukti vienalaikius neigiamus kontrolinius ėminius (žr. 15 pastraipą), sudarytus vien tik iš tirpiklio apdorojimo terpėje ir apdorotus taip pat, kaip apdorojamos kultūros.

Vienalaikiai teigiami kontroliniai ėminiai yra būtini siekiant įrodyti laboratorijos gebėjimą naudojamo bandymų protokolo sąlygomis identifikuoti klastogenus ir egzogeninės metabolinio aktyvinimo sistemos efektyvumą, jei tinka. Teigiamų kontrolinių ėminių pavyzdžiai pateikiami toliau 1 lentelėje. Galima naudoti alternatyvias teigiamas kontrolines chemines medžiagas, jei tai būtų pagrįsta. Kadangi žinduolių ląstelių genetinio toksiškumo in vitro bandymai yra pakankamai standartizuoti, teigiamų kontrolinių ėminių naudojimas gali apsiriboti klastogenais, kuriems būtinas metabolinis aktyvinimas. Jei jis atliekamas vienu metu su neaktyvinto ėminio bandymu naudojant vienodą apdorojimo trukmę, šis vienas teigiamos kontrolės atsakas įrodys metabolinio aktyvinimo sistemos aktyvumą ir bandymo sistemos jautrį. Tačiau ilgalaikiam apdorojimui (be S9) reikėtų turėti savo teigiamą kontrolinį ėminį, nes apdorojimo trukmė skirsis nuo metabolinį aktyvinimą naudojančio bandymo trukmės. Kiekvienas teigiamas kontrolinis ėminys turėtų būti naudojamas vienos arba kelių koncentracijos verčių, kurioms esant būtų galima tikėtis gauti atkuriamą ir aptinkamą didesnį nei fonas atsaką, kad būtų galima įrodyti bandymo sistemos jautrį (t. y. poveikis yra aiškus, bet tyrėjui ne iš karto atskleidžiama užkoduotų objektinių stiklelių tapatybė), ir atsako neturėtų sutrikdyti citotoksiškumas, kuris viršytų bandymo metodui nustatytas ribas.

1 lentelė.

Etaloninės cheminės medžiagos, rekomenduojamos laboratorijos kvalifikacijai vertinti ir teigiamiems kontroliniams ėminiams pasirinkti.

PROCEDŪRA

Paveikimas bandomąja chemine medžiaga

Proliferuojančios ląstelės veikiamos bandomąja chemine medžiaga esant metabolinio aktyvinimo sistemai arba jos nesant.

Kultūrų surinkimo laikas

Siekiant atlikti išsamų įvertinimą, kurio prireiktų neigiamam rezultatui patvirtinti, visos šios trys Bandymo sąlygos turėtų būti įgyvendintos, taikant trumpalaikį apdorojimą su metaboliniu aktyvinimu ir be jo bei ilgalaikį apdorojimą be metabolinio aktyvinimo (žr. 43, 44 ir 45 pastraipas):

Jei esant kuriai nors vienai iš pirmiau nurodytų bandymo sąlygų gaunamas teigiamas atsakas, gali būti nebūtina tirti kurią nors kitą apdorojimo schemą.

Chromosomų paruošimas

Paprastai likus 1–3 h iki surinkimo ląstelių kultūros yra veikiamos kolcemidu ar kolchicinu. Kiekviena ląstelių kultūra surenkama ir atskirai apdorojama chromosomoms paruošti. Ruošiant chromosomas ląstelės apdorojamos hipotoniniu tirpalu, fiksuojamos ir dažomos. 3–6 h trukmės apdorojimo pabaigoje monosluoksniuose gali būti mitozinių ląstelių (atpažįstamų iš apvalios formos ir atsiskyrimo nuo paviršiaus). Kadangi šios mitozinės ląstelės lengvai atsiskiria, jos gali būti prarastos šalinant terpę su bandomąja chemine medžiaga. Jei yra įrodymų dėl esminio mitozinių ląstelių skaičiaus padidėjimo palyginti su kontroliniais ėminiais, rodančio galimą ląstelių sulaikymą mitozės etape, ląsteles reikėtų surinkti centrifugavimu ir grąžinti į kultūras, kad surinkimo metu nebūtų prarastos mitozės etapo ląstelės, kurioms kyla chromosomų aberacijos rizika.

Analizė

Prieš atliekant chromosomų aberacijų mikroskopinę analizę, visi objektiniai stikleliai turėtų būti nepriklausomai užkoduoti, įskaitant teigiamų ir neigiamų kontrolinių ėminių stiklelius. Kadangi fiksavimo metu dalis metafazės ląstelių praranda chromosomas, todėl suskaičiuotos ląstelės turės tam tikrą skaičių centromerų, lygų modaliniam skaičiui ± 2.

Ne mažiau kaip 300 gerai matomų metafazių turėtų būti suskaičiuotos kiekvienai koncentracijai ir kontroliniam ėminiui, norint padaryti išvadą, kad bandomoji cheminė medžiaga yra aiškiai neigiama (žr. 45 pastraipą). 300 ląstelių turėtų būti vienodai paskirstytos tarp kartotinių ėminių, jei naudojami kartotiniai kultūrų ėminiai. Kai vienai koncentracijai naudojama pavienė kultūra (žr. 21 pastraipą), šioje pavienėje kultūroje turėtų būti suskaičiuota ne mažiau kaip 300 gerai matomų metafazių. 300 ląstelių skaičiaus pranašumas – padidėja bandymo statistinė galia, be to, retai būtų stebimos nulinės vertės (manoma, kad jos sudarytų tik 5 %) (44). Skaičiuojamų metafazių skaičių galima sumažinti, kai stebimas didelis ląstelių su chromosomų aberacijomis skaičius ir bandomoji cheminė medžiaga laikoma aiškiai teigiama.

Reikėtų skaičiuoti ląsteles su chromosomų struktūrine (-ėmis) aberacija (-omis), įskaitant plyšius ir jų neįskaitant. Trūkiai ir plyšiai apibrėžti 1 priedėlyje pagal (45) (46). Chromatidinė ir chromosominė aberacijos turėtų būti registruojamos atskirai ir klasifikuojamos pagal potipius (trūkius, mainus). Laboratorijoje taikomos procedūros turėtų užtikrinti, kad chromosomų aberacijų analizę atlieka tinkamai apmokyti skaičiuotojai ir, jei reikia, ją peržiūrėtų ekspertai.

Nors tyrimo tikslas yra nustatyti chromosomų struktūrines aberacijas, svarbu registruoti poliploidijos bei endoduplikacijos dažnumą, kai šie įvykiai yra matomi (žr. 2 pastraipą).

Laboratorijos kvalifikacija

Siekdama įgyti pakankamos bandymo atlikimo patirties prieš jį taikydama įprastiniams tyrimams, laboratorija turėtų būti atlikusi etaloninių teigiamų cheminių medžiagų bandymų seriją, joms veikiant pagal skirtingus mechanizmus ir su įvairiais neigiamais kontroliniais ėminiais (naudojant įvairius tirpiklius ir nešiklius). Šių teigiamų ir neigiamų kontrolinių ėminių atsakas turėtų atitikti literatūros duomenis. Tai netaikoma patirties turinčioms laboratorijoms, t. y. kurios turi istorinių duomenų bazę, prieinamą kaip apibrėžta 37 pastraipoje.

Teigiamų kontrolinių cheminių medžiagų rinkinį (žr. 26 pastraipos 1 lentelę) reikėtų tirti atliekant trumpalaikį ir ilgalaikį apdorojimą be metabolinio aktyvinimo, taip pat trumpalaikį apdorojimą esant metaboliniam aktyvinimui, kad būtų galima įrodyti kvalifikaciją aptikti klastogenines chemines medžiagas ir nustatyti metabolinio aktyvinimo sistemos efektyvumą. Pasirinktų cheminių medžiagų koncentracijos verčių intervalas turėtų būti pasirinktas taip, kad, siekiant įrodyti bandymo sistemos jautrį ir dinaminį diapazoną, būtų gautas atkuriamas ir su koncentracija susijęs padidėjimas palyginti su fonu.

Istorinių kontrolinių ėminių duomenys

Laboratorija turėtų nustatyti:

Pirmą kartą gaunant duomenis, skirtus istorinių neigiamų kontrolinių ėminių pasiskirstymui, vienalaikiai neigiami kontroliniai ėminiai turėtų atitikti paskelbtus kontrolinius duomenis, jei jie yra. Kontrolinių ėminių pasiskirstymą papildant vis didesniu bandymų duomenų kiekiu, būtų gerai, kad vienalaikiai neigiami kontroliniai ėminiai patektų į to skirstinio 95 % kontrolines ribas (44) (47). Laboratorijos istorinių neigiamų kontrolinių ėminių duomenų bazę iš pradžių turėtų sudaryti ne mažiau kaip 10 bandymų, bet būtų geriau, jei tokių palyginamosiomis Bandymo sąlygomis atliktų bandymų skaičius būtų ne mažesnis kaip 20. Laboratorijos turėtų taikyti kokybės kontrolės metodus, tokius kaip kontrolinės diagramos (pvz., C tipo ar X juostinės diagramos (48)), kad galėtų nustatyti savo teigiamų ir neigiamų kontrolinių ėminių duomenų kintamumą ir įrodyti metodikos „valdomumą“ savo laboratorijoje (44). Papildomas rekomendacijas, kaip kurti ir naudoti istorinius duomenis (t. y. duomenų įtraukimo ir pašalinimo iš istorinių duomenų kriterijus ir tam tikro bandymo priimtinumo kriterijus) galima rasti literatūroje (47).

Į visus bandymų protokolo pakeitimus reikėtų žiūrėti atsižvelgiant į jų suderinamumą su esamomis laboratorijos istorinių kontrolinių ėminių duomenų bazėmis. Esant didesnėms neatitiktims, turėtų būti kuriama nauja istorinių kontrolinių ėminių duomenų bazė.

Neigiamų kontrolinių ėminių duomenis turėtų sudaryti pavienės kultūros ląstelių su chromosomų aberacijomis skaičius arba kartotinių kultūrų skaičių suma, kaip aprašyta 21 pastraipoje. Būtų gerai, kad vienalaikiai neigiami kontroliniai ėminiai patektų į laboratorijos istorinių neigiamų kontrolinių ėminių duomenų bazės skirstinio 95 % kontrolines ribas (44) (47). Jei vienalaikių neigiamų kontrolinių ėminių duomenys nepatenka į 95 % kontrolines ribas, jie gali būti tinkami įtraukti į istorinių kontrolinių ėminių skirstinį, jei nėra kraštiniai riktai ir yra įrodymų, kad bandymo sistema „valdoma“ (žr. 37 pastraipą) ir kad nėra techninių ar žmogaus klaidų.

DUOMENYS IR ATASKAITOS RENGIMAS

Rezultatų pateikimas

Turėtų būti gautas ląstelių, turinčių struktūrines chromosomų aberacijas, įvertis procentais. Bandymo ir kontrolinių ėminių kultūrų chromatidinė ir chromosominė aberacijos, klasifikuojamos pagal potipius (trūkius, mainus), turėtų būti registruojamos atskirai, nurodant jų skaičių ir dažnumą. Plyšiai registruojami ir pateikiami ataskaitoje atskirai, bet neįtraukiami į suminį aberacijų buvimo dažnumą. Ataskaitoje pateikiama poliploidinių ir (arba) endoreduplikuotų ląstelių, kai matomos, procentinė dalis.

Turėtų būti registruojami vienalaikiai visų apdorotų, neigiamų ir teigiamų kontrolinių ėminių citotoksiškumo duomenys, gauti atliekant pagrindinį (-ius) aberacijos bandymą (-us).

Turėtų būti pateikti atskiri kiekvienos kultūros duomenys. Be to, visi duomenys turi būti suvesti į lenteles.

Priimtinumo kriterijai

Bandymo priimtinumas pagrįstas šiais kriterijais:

Rezultatų įvertinimas ir aiškinimas

Jei įvykdomi visi priimtinumo kriterijai, bandomoji cheminė medžiaga laikoma aiškiai teigiama, jei, esant kuriai nors ištirtai bandymo sąlygai (žr. 28 pastraipą):

Atitinkant visus šiuos kriterijus, laikoma, kad bandomoji cheminė medžiaga gali sukelti šios bandymų sistemos žinduolių ląstelių kultūros chromosomų aberacijas. Rekomendacijų dėl tinkamiausių statistinių metodų galima rasti literatūroje (49) (50) (51).

Jei įvykdomi visi priimtinumo kriterijai, bandomoji cheminė medžiaga laikoma aiškiai neigiama, jei visomis ištirtomis bandymo sąlygomis (žr. 28 pastraipą):

Tada laikoma, kad bandomoji cheminė medžiaga negali sukelti šios bandymų sistemos žinduolių ląstelių kultūros chromosomų aberacijų.

Nėra reikalavimo patikrinti aiškų teigiamą ar neigiamą atsaką.

Jei atsakas nėra aiškiai neigiamas ar aiškiai teigiamas, kaip apibūdinta pirmiau, arba, siekiant padėti nustatyti rezultato biologinę svarbą, duomenys turėtų būti įvertinti pateikiant ekspertų nuomonę ir (arba) atliekant papildomus tyrimus. Galėtų būti naudingas papildomų ląstelių skaičiavimas (jei tinka) arba kartotinis bandymas galbūt modifikuotomis bandymo sąlygomis (pvz., tarpai tarp koncentracijos verčių, kitos metabolinio aktyvinimo sąlygos (t. y. S9 koncentracija ar S9 kilmė)).

Retais atvejais, kai netgi atlikus papildomus tyrimus, gautų duomenų rinkinio nepakaks padaryti išvadą, ar rezultatai yra teigiami ar neigiami, bus priimtas sprendimas, kad cheminės medžiagos atsakas yra dviprasmis.

Poliploidinių ląstelių skaičiaus padidėjimas gali rodyti, kad bandomoji cheminė medžiaga gali slopinti mitozinius procesus ir sukelti kiekybines chromosomų aberacijas (52). Ląstelių su endoreduplikuotomis chromosomomis skaičiaus padidėjimas gali rodyti, kad bandomosios cheminės medžiagos gali slopinti ląstelių ciklo eigą (53) (54) (žr. 2 pastraipą). Todėl poliploidinių ląstelių ir ląstelių su endoreduplikuotomis chromosomomis dažnumas turėtų būti registruojamas atskirai.

Bandymo ataskaita

Į bandymo ataskaitą turėtų būti įtraukta ši informacija:

LITERATŪRA

4)

B dalies B.11 skyrius pakeičiamas taip:

„B.11   Žinduolių kaulų čiulpų chromosomų aberacijų bandymas

ĮVADAS

Šis bandymų metodas atitinka EBPO bandymų gaires (TG) 475 (2014). Jis yra genetinės toksikologijos metodų serijos dalis. Yra parengtas EBPO dokumentas, kuriame glaustai pateikiama informacijos apie genetinės toksikologijos bandymus ir naujausių šių gairių pakeitimų apžvalga (1).

Žinduolių kaulų čiulpų chromosomų aberacijų bandymas in vivo ypač tinka genotoksiškumui vertinti, nes, nors skirtingų gyvūnų rūšių chromosomos gali skirtis, in vivo metabolizmo veiksniai, farmakokinetika ir DNR atkūrimo procesai yra aktyvūs ir prisideda prie atsakų. Tyrimas in vivo taip pat naudingas toliau tiriant in vitro sistemoje nustatytą genotoksiškumą.

Žinduolių chromosomų aberacijų tyrimas in vivo naudojamas nustatant struktūrines chromosomų aberacijas, kurias bandomoji cheminė medžiaga sukelia žinduolių, paprastai graužikų, kaulų čiulpų ląstelėse (2) (3) (4) (5). Struktūrinės chromosomų aberacijos gali būti dviejų tipų – chromosominės arba chromatidinės. Nors dauguma genotoksinių cheminių medžiagų sukeltų aberacijų yra chromatidinės, tačiau pasitaiko ir chromosominių aberacijų. Chromosomų pažeidimas ir su juo susiję reiškiniai yra daugumos genetiškai paveldimų žmonių ligų priežastis ir yra esminių įrodymų, kad, kai šie pažeidimai ir susiję reiškiniai sukelia onkogenų bei navikų supresorinių genų pokyčius, jie prisideda prie žmonių ir bandymų sistemų vėžio atsiradimo. Atliekant chromosomų aberacijų tyrimus in vivo galėtų atsirasti poliploidija (įskaitant endoreduplikaciją). Tačiau pati padidėjusi poliploidija nerodo aneugeninio potencialo ir ji tiesiog gali rodyti ląstelių ciklo sutrikimą ar citotoksiškumą. Šis bandymas nenumatytas aneuploidijai matuoti. Žinduolių eritrocitų mikrobranduolių bandymas in vivo (šio priedo B.12 skyrius) arba žinduolių ląstelių mikrobranduolių bandymas in vitro (šio priedo B.49 skyrius) būtų in vivo ir in vitro bandymai, rekomenduojami aneuploidijai aptikti.

Vartojamų terminų apibrėžtys pateiktos 1 priedėlyje.

PRADINIAI ASPEKTAI

Šiam bandymui atlikti paprastai naudojami graužikai, bet kai kuriais atvejais gali tikti kitos rūšys, jei jų naudojimas būtų moksliškai pagrįstas. Šio bandymo tikslinis audinys yra kaulų čiulpai, kadangi jis yra gausiai vaskuliarizuotas audinys ir turi sparčiai besidauginančių ląstelių, kurias galima atskirti ir apdoroti, populiaciją. Kitų nei žiurkės ar pelės rūšių naudojimas turėtų būti moksliškai pagrįstas ataskaitoje. Jei naudojamos kitos nei graužikai rūšys, rekomenduojama kaulų čiulpų chromosomų aberacijos matavimą įtraukti į kitą tinkamą toksiškumo bandymą.

Jei yra duomenų, kad bandomoji (-osios) cheminė (-ės) medžiaga (-os) ar jos arba jų metabolitas (-ai) nepasieks tikslinio audinio, jis gali būti netinkamas naudoti šiame bandyme.

Prieš šiuo bandymų metodu bandant mišinį, siekiant gauti duomenų numatomo reglamentavimo tikslais, reikėtų apsvarstyti, ar metodu galima pasiekti tą tikslą atitinkančius rezultatus, ir, jei taip, dėl kokios priežasties. Tokie svarstymai nereikalingi, kai yra reglamentavimo reikalavimas bandyti mišinį.

BANDYMŲ METODO PRINCIPAS

Gyvūnai veikiami bandomąja chemine medžiaga tinkamu veikimo būdu ir reikiamu momentu po paveikimo humaniškai numarinami. Prieš numarinant gyvūnai paveikiami agentu, stabdančiu metafazę (pvz., kolchicinu ar kolcemidu). Tada iš kaulų čiulpų ląstelių ruošiami chromosomų preparatai, jie dažomi, ir metafazės ląstelės tiriamos mikroskopu chromosomų aberacijoms nustatyti.

LABORATORIJOS KVALIFIKACIJOS TIKRINIMAS

Kvalifikacijos tyrimai

Siekdama įgyti pakankamos tyrimo atlikimo patirties prieš jį taikydama įprastiniams bandymams, laboratorija turėtų įrodyti gebėjimą atkurti paskelbtų duomenų (pvz., (6)) tikėtinus chromosomų aberacijų dažnumo rezultatus, naudodama ne mažiau kaip dvi teigiamas kontrolines chemines medžiagas (įskaitant mažos dozės teigiamų kontrolinių ėminių sukeltus silpnus atsakus), pvz., išvardytas 1 lentelėje, ir suderinamų tirpiklių ir (arba) nešiklių kontrolinius ėminius (žr. 22 pastraipą). Atliekant šiuos bandymus, reikėtų naudoti dozes, kurioms esant tiriamajame audinyje (kaulų čiulpuose) gaunami atkuriami ir su doze susiję padidėjimai, ir įrodyti bandymų sistemos jautrį ir dinaminį diapazoną, pasitelkiant laboratorijoje taikomą vertinimo metodą. Šis reikalavimas netaikomas patirties turinčioms laboratorijoms, t. y. toms, kurios turi istorinių duomenų bazę, prieinamą kaip apibrėžta 10–14 pastraipose.

Istorinių kontrolinių ėminių duomenys

Atlikdama kvalifikacijos tyrimus, laboratorija turėtų nustatyti:

Pirmą kartą gaunant duomenis, skirtus istorinių neigiamų kontrolinių ėminių pasiskirstymui, vienalaikiai neigiami kontroliniai ėminiai turėtų atitikti paskelbtus kontrolinius duomenis, jei jie yra. Istorinių kontrolinių ėminių pasiskirstymą papildant vis didesniu bandymų duomenų kiekiu, būtų gerai, kad vienalaikiai neigiami kontroliniai ėminiai patektų į to skirstinio 95 % kontrolines ribas. Laboratorijos istorinių neigiamų kontrolinių ėminių duomenų bazė turėtų būti statistiškai patikima, kad būtų užtikrintas laboratorijos gebėjimas vertinti savo neigiamų kontrolinių ėminių duomenų pasiskirstymą. Literatūroje daroma prielaida, kad gali prireikti ne mažiau kaip 10 bandymų, bet būtų geriau, jei palyginamosiomis Bandymo sąlygomis atliktų bandymų skaičius būtų ne mažesnis kaip 20. Laboratorijos turėtų taikyti kokybės kontrolės metodus, tokius kaip kontrolinės diagramos (pvz., C tipo ar X juostinės diagramos (7)), kad galėtų nustatyti savo duomenų kintamumą ir įrodyti metodikos „valdomumą“ savo laboratorijoje. Papildomas rekomendacijas, kaip kurti ir naudoti istorinius duomenis (t. y. duomenų įtraukimo ir pašalinimo iš istorinių duomenų kriterijus ir tam tikro bandymo priimtinumo kriterijus) galima rasti literatūroje (8).

Jei, atliekant 9 skirsnyje aprašytus kvalifikacijos tyrimus, laboratorijai nepakanka bandymų skaičiaus statistiškai patikimam neigiamų kontrolių ėminių skirstiniui gauti (žr. 11 pastraipą), priimtina skirstinį papildyti atliekant pirmuosius įprastinius bandymus. Taikant šį būdą, reikėtų laikytis literatūroje nurodytų rekomendacijų (8), o atliekant šiuos bandymus gauti neigiamų kontrolinių ėminių rezultatai turėtų būti suderinami su paskelbtais neigiamų kontrolinių ėminių duomenimis.

Į visus bandymų protokolo pakeitimus reikėtų žiūrėti atsižvelgiant į jų poveikį gaunamiems duomenims, kurie turi likti suderinami su esamomis laboratorijos istorinių kontrolinių ėminių duomenų bazėmis. Tik esant didesnėms neatitiktims turėtų būti kuriama nauja istorinių kontrolinių ėminių duomenų bazė, jei, atsižvelgiant į ekspertų nuomonę, nustatoma, kad ji skiriasi nuo ankstesnio skirstinio (žr. 11 pastraipą). Atkūrimo metu atliekamam bandymui gali neprireikti visos neigiamų kontrolinių ėminių duomenų bazės, jei laboratorija gali įrodyti, kad vienalaikių neigiamų kontrolinių ėminių vertės ir toliau yra suderinamos su ankstesne duomenų baze arba su atitinkamais paskelbtais duomenimis.

Neigiamų kontrolinių ėminių duomenis turėtų sudaryti kiekvieno gyvūno struktūrinės chromosomų aberacijos dažnumas (išskyrus plyšius). Būtų gerai, kad vienalaikiai neigiami kontroliniai ėminiai patektų į laboratorijos istorinių neigiamų kontrolinių ėminių duomenų bazės skirstinio 95 % kontrolines ribas. Jei vienalaikių neigiamų kontrolinių ėminių duomenys nepatenka į 95 % kontrolines ribas, jie gali būti tinkami įtraukti į istorinių kontrolinių ėminių skirstinį, jei jie nėra kraštiniai riktai ir yra įrodymų, kad bandymo sistema yra „valdoma“ (žr. 11 pastraipą) ir kad nėra techninių ar žmogaus klaidų.

METODO APRAŠYMAS

Parengiamieji darbai

Gyvūnų rūšies parinkimas

Reikėtų tirti dažniausiai naudojamas sveikų jaunų suaugusių gyvūnų laboratorines veisles. Paprastai naudojamos žiurkės, nors taip pat gali tikti pelės. Galima naudoti kitas tinkamas žinduolių rūšis, jei ataskaitoje tai būtų moksliškai pagrįsta.

Gyvūnų laikymo ir šėrimo sąlygos

Temperatūra graužikų patalpoje turėtų būti 22 °C (± 3 °C). Nors geriausia būtų užtikrinti 50–60 % drėgmę, ji neturėtų būti mažesnė kaip 40 % ir būtų gerai, jei ji nebūtų didesnė kaip 70 %, išskyrus patalpos valymo laiką. Apšvietimas turėtų būti dirbtinis, taikant 12 h šviesos ir 12 h tamsos seką. Gyvūnams šerti tinka įprastas laboratorijose naudojamas pašaras, neribojant geriamojo vandens kiekio. Pašaro pasirinkimui gali turėti įtakos būtinybė užtikrinti tinkamą bandomosios cheminės medžiagos sumaišymą su pašaru, kai ji duodama tokiu būdu. Jei nesitikima agresyvaus elgesio, graužikus reikėtų laikyti nedidelėmis vienos lyties vienodai apdorojamomis grupėmis (ne daugiau kaip po penkis viename narvelyje), pageidautina narveliuose su kietomis grindimis ir esant atitinkamai pagerintai aplinkai. Tik moksliškai pagrįstais atvejais gyvūnus galima laikyti atskirai.

Gyvūnų paruošimas

Paprastai naudojami sveiki, jauni suaugę gyvūnai (geriausias graužikų amžius apdorojimo pradžioje yra 6–10 savaičių, nors leidžiama naudoti šiek tiek vyresnius gyvūnus), kurie atsitiktinai paskirstomi į kontrolines ir apdorojamas grupes. Kiekvienas gyvūnas humanišku minimaliai invaziniu būdu paženklinamas unikaliu ženklu (pvz., žieduojant, kabinant etiketę, naudojant mikrolustą ar biometrinį identifikavimą, bet ne ausų ar pėdų spaustukus) ir aklimatizuojami laboratorinėmis sąlygomis ne trumpiau kaip 5 paras. Narvelius reikėtų įrengti taip, kad jų išdėstymo poveikis būtų minimalus. Reikėtų vengti teigiamo kontrolinio ėminio ir bandomosios cheminės medžiagos kryžminės taršos. Tyrimo pradžioje gyvūnų masės skirtumas turėtų būti minimalus ir neviršyti ± 20 % kiekvienos lyties vidutinės gyvūno masės.

Dozių ruošimas

Kietąsias bandomąsias chemines medžiagas prieš dozuojant gyvūnams reikėtų ištirpinti atitinkamuose tirpikliuose ar nešikliuose, paruošti jų suspensiją arba įmaišyti į pašarą ar geriamąjį vandenį. Skystąsias bandomąsias chemines medžiagas galima dozuoti tiesiogiai arba prieš tai praskiesti. Jei bandomoji cheminė medžiaga patenka per kvėpavimo takus, ją, atsižvelgiant į jos fizikines ir chemines savybes, galima duoti dujų, garų arba kietojo ar skystojo aerozolio pavidalu. Reikėtų naudoti tik iš naujo paruoštus bandomosios cheminės medžiagos preparatus, nebent stabilumo duomenys rodo, kad laikymas priimtinas ir yra apibrėžtos tinkamos laikymo sąlygos.

Tirpiklis ir (arba) nešiklis

Neturėtų būti tirpiklio ar nešiklio toksinio poveikio, esant naudojamiems dozių dydžiams, ir neturėtų kilti įtarimų, kad galėtų vykti jų cheminė reakcija su bandomosiomis cheminėmis medžiagomis. Jei naudojami kiti nei gerai žinomi tirpikliai ar nešikliai, juos galima įtraukti tik pateikus suderinamumą rodančius etaloninius duomenis. Rekomenduojama visuomet iš pradžių atsižvelgti į galimybę naudoti vandeninį tirpiklį arba nešiklį. Dažniausiai naudojamų suderinamų tirpiklių ar nešiklių pavyzdžiai yra vanduo, fiziologinis tirpalas, metilceliuliozės tirpalas, karboksimetilceliuliozės natrio druskos tirpalas, alyvuogių ir kukurūzų aliejus. Jei nėra istorinių arba paskelbtų kontrolinių duomenų, kurie rodo, kad pasirinktas netipinis tirpiklis ar nešiklis nesukelia struktūrinių aberacijų ar kitokio žalingo poveikio, reikėtų atlikti pradinį tyrimą tirpiklio ar nešiklio kontrolinio ėminio priimtinumui nustatyti.

Kontroliniai ėminiai

Teigiami kontroliniai ėminiai

Paprastai į kiekvieną bandymą reikėtų įtraukti grupę gyvūnų, apdorotų teigiama kontroline chemine medžiaga. To galima atsisakyti, jei bandymų laboratorija įrodė kvalifikaciją atlikti bandymą ir nustatė istorinių teigiamų kontrolinių ėminių intervalą. Jei vienalaikių teigiamų kontrolinių ėminių grupė neįtraukiama, į kiekvieną bandymą reikėtų įtraukti vertinimo kontrolinius ėminius (fiksuotus ir nedažytus objektinius stiklelius). Juos galima gauti į tyrimo vertinimą įtraukiant atitinkamus etaloninius ėminius, kurie būtų gauti bandymų laboratorijoje periodiškai (pvz., kas 6–18 mėnesių) atliekant atskirą teigiamo kontrolinio ėminio bandymą, pvz., kvalifikacijos tyrimo metu ir reguliariai vėliau, jei būtina, ir tuos ėminius laikyti.

Teigiamos kontrolinės cheminės medžiagos turėtų patikimai sukelti ląstelių su struktūrinėmis chromosomų aberacijomis aiškų dažnumo padidėjimą, palyginti su savaiminiu lygiu. Reikėtų pasirinkti tokias teigiamų kontrolinių ėminių dozes, kad poveikis būtų ryškus, bet skaičiuotojui ne iškarto atsiskleistų užkoduotų ėminių tapatybė. Teigiamą kontrolinę cheminę medžiagą galima duoti kitu nei bandomoji cheminė medžiaga būdu, taikant skirtingą apdorojimo planą ir ėminius imant tik vienu laiko momentu. Be to, jei tinka, galima atsižvelgti į tos pačios cheminės klasės teigiamų kontrolinių cheminių medžiagų naudojimą. Teigiamų kontrolinių cheminių medžiagų pavyzdžiai pateikti 1 lentelėje.

1 lentelė

Teigiamų kontrolinių cheminių medžiagų pavyzdžiai

Neigiami kontroliniai ėminiai

Neigiamos kontrolinės grupės gyvūnus reikėtų įtraukti kiekvieną kartą imant ėminį ir su jais elgtis kaip su apdorojama grupe, išskyrus tai, kad gyvūnai nepaveikiami bandomąja chemine medžiaga. Jei bandomajai cheminei medžiagai duoti naudojamas tirpiklis ar nešiklis, kontrolinė grupė turėtų gauti šio tirpiklio ar nešiklio. Tačiau jei kiekvienam ėminių ėmimo laikui bandymų laboratorijos istorinių neigiamų kontrolinių ėminių duomenys rodo pastovų kintamumą tarp gyvūnų ir ląstelių su struktūrinėmis aberacijomis dažnumą, gali pakakti paimti tik vieną neigiamą kontrolinį ėminį. Jei imamas tik vienas neigiamas kontrolinis ėminys, jis turėtų būti imamas pirmą kartą imant atliekamo tyrimo ėminį.

PROCEDŪRA

Gyvūnų skaičius ir lytis

Apskritai, vyriškos ir moteriškos lyties gyvūnų mikrobranduolių atsakas yra panašus (9) ir tikėtina, kad taip atsitiks tiriant struktūrines chromosomų aberacijas, todėl daugumą tyrimų būtų galima atlikti su bet kurios lyties gyvūnais. Jei duomenys rodytų esminius skirtumus tarp patinų ir patelių (pvz., sisteminio toksiškumo, metabolizmo, biologinio įsisavinamumo, toksiškumo kaulų čiulpams ir kt. skirtumus, įskaitant, pvz., intervalo nustatymo tyrimą), tai paskatintų naudoti abiejų lyčių gyvūnus. Šiuo atveju galbūt reikėtų atlikti tyrimą su abiejų lyčių gyvūnais, pvz., kaip kartotinės dozės toksiškumo tyrimo dalį. Jei naudojamos abi lytys, galbūt tiktų taikyti faktorinės analizės schemą. Išsami informacija, kaip analizuoti duomenis taikant šią schemą, pateikta 2 priedėlyje.

Reikėtų nustatyti grupių dydį tyrimo pradžioje, turint tikslą vienai grupei gauti ne mažiau kaip 5 analizei tinkamus vienos lyties gyvūnus arba kiekvienos lyties gyvūnus, jei naudojami abiejų lyčių gyvūnai. Jei cheminių medžiagų poveikis žmonėms gali priklausyti nuo lyties, pvz., kai kurių vaistų atveju, bandymas turėtų būti atliekamas su atitinkamos lyties gyvūnais. Atliekant kaulų čiulpų tyrimą, kai trijų dozių grupių ir vienos vienalaikio neigiamo kontrolinio ėminio grupės ėminiai imami du kartus, ir dar yra teigiamo kontrolinio ėminio grupė (kiekvieną grupę sudaro penki vienos lyties gyvūnai), rekomenduojamas tipinis maksimalus gyvūnų poreikis būtų 45 gyvūnai.

Dozių dydžiai

Jei atliekamas parengiamasis intervalo nustatymo tyrimas, nes nėra tinkamų duomenų, kurie padėtų pasirinkti dozę, jį reikėtų atlikti toje pačioje laboratorijoje, naudojant pagrindiniam tyrimui naudoti numatytą rūšį, veislę, lytį ir apdorojimo schemą (10). Tyrimo tikslas – nustatyti didžiausią toleruojamą dozę (MTD), apibrėžiamą kaip didžiausia dozė, kuri būtų toleruojama nesant tyrimą ribojančio toksiškumo požymių, susijusių su tyrimo laikotarpio trukme (pvz., sukeliant kūno masės sumažėjimą arba hematopoetinės sistemos citotoksiškumą, bet ne žūtį ar skausmo, kančių ar išsekimo požymius, dėl kurių gyvūną reikėtų humaniškai numarinti (11)).

Didžiausią dozę taip pat būtų galima apibrėžti kaip dozę, kuri būtų tam tikras toksiškumo kaulų čiulpams rodiklis.

Cheminės medžiagos, kurios rodo toksikokinetinių savybių prisotinimą arba po ilgalaikio veikimo sukelia detoksifikavimo procesus, galinčius mažinti poveikį, gali būti dozės nustatymo kriterijų išimtys ir turėtų būti įvertinamos kiekvienu atveju atskirai.

Siekiant gauti informacijos apie dozės ir atsako priklausomybę, į išsamų tyrimą reikėtų įtraukti neigiamo kontrolinio ėminio grupę ir ne mažiau kaip tris dozes, kurių dydžio skirtumo faktorius būtų 2, bet ne didesnis kaip 4. Jei cheminė medžiaga nerodo toksiškumo atliekant intervalo nustatymo tyrimą arba atsižvelgiant į turimus duomenis, didžiausia vienkartinio davimo dozė turėtų būti 2 000 mg/kg kūno masės. Tačiau jei bandomoji cheminė medžiaga yra toksiška, didžiausia duodama dozė turėtų būti MTD, o naudojami dozių dydžiai turėtų aprėpti intervalą nuo didžiausios dozės iki mažo toksiškumo arba visiškai jo nesukeliančios dozės. Kai toksiškumas tiksliniam audiniui (kaulų čiulpams) stebimas visiems bandomiems dozės dydžiams, patartina toliau tirti netoksines dozes. Tyrimams, kurių tikslas būtų išsamiau apibūdinti kiekybinę dozės ir atsako priklausomybės informaciją, gali prireikti papildomų dozių grupių. Tam tikrų tipų bandomųjų cheminių medžiagų (pvz., vaistų žmonėms), kurioms taikomi specifiniai reikalavimai, šios ribos gali skirtis.

Ribinis bandymas

Jei dozės intervalo nustatymo bandymai arba esami susijusių gyvūnų veislių duomenys rodo, kad apdorojimo režimu bent ribinė dozė (aprašyta toliau) nesukelia jokio toksinio poveikio (įskaitant tai, kad nėra kaulų čiulpų proliferacijos slopinimo ar kitų citotoksiškumo tiksliniam audiniui požymių) ir, jei atsižvelgiant in vitro genotoksiškumo tyrimus arba į giminingos struktūros cheminėms medžiagoms gautus duomenis, genotoksiškumo nereikėtų tikėtis, visas bandymas naudojant trijų dydžių dozes gali būti nebūtinas, jei būtų įrodyta, kad bandomoji (-osios) cheminė (-ės) medžiaga (-os) pasiekia tikslinį audinį (kaulų čiulpus). Tokiais atvejais gali pakakti vienos ribinio dydžio dozės. Jei davimo laikotarpis > 14 parų, ribinė dozė yra 1 000 mg/kg kūno masės per parą. Jei davimo laikotarpis – 14 parų arba trumpesnis, ribinė dozė yra 2 000 mg/kg kūno masės per parą.

Dozių davimas

Rengiant bandymo schemą, reikėtų atsižvelgti į numatomą poveikio žmogui būdą. Todėl galima pasirinkti pagrįstus veikimo būdus, pvz., duoti su pašaru, geriamuoju vandeniu, atlikti vietinę poodinę arba intraveninę injekciją, duoti per burną (per zondą), kvėpavimo takus, intubacinį vamzdelį ar implantuoti. Visais atvejais turėtų būti pasirinktas būdas, kuris užtikrintų reikiamą tikslinio (-ių) audinio (-ių) veikimą. Injekcija į pilvo ertmę paprastai nerekomenduojama, nes tai nėra numatytas poveikio žmogui būdas ir jį reikėtų naudoti, tik jei būtų specialiai moksliškai pagrįstas. Jei bandomoji cheminė medžiaga įmaišoma į pašarą ar į geriamąjį vandenį, ypač vienkartinio dozavimo atveju reikėtų imtis priemonių, kad laiko tarpas nuo maisto bei vandens vartojimo iki ėminių ėmimo būtų pakankamas poveikiui aptikti (žr. 33–34 pastraipas). Skysčio, kurį galima duoti per zondą arba įšvirkšti per vieną kartą, maksimalus tūris priklauso nuo bandymo gyvūno dydžio. Tūris neturėtų būti didesnis kaip 1 ml/100 g kūno masės, išskyrus vandeninius tirpalus, kurių galima duoti ne daugiau kaip po 2 ml/100 g kūno masės. Didesnio nei šis tūrio naudojimą reikėtų pagrįsti. Išskyrus dirginančias ar ėsdinančias bandomąsias chemines medžiagas, kurios, būdamos didesnės koncentracijos, paprastai sukeltų sunkesnį poveikį, bandymo tūrio kintamumas turėtų būti kuo mažesnis reguliuojant koncentraciją, kad būtų užtikrintas visų dydžių dozių tūrio pastovumas kūno masės atžvilgiu.

Apdorojimo planas

Paprastai bandomosios cheminės medžiagos duodamos per vieną kartą, bet, siekiant palengvinti didelių tūrių davimą, dozę galima padalyti (t. y. per vieną dieną apdoroti du arba daugiau kartų, tarp apdorojimų esant ne ilgesniam kaip 2–3 h tarpui). Šiomis aplinkybėmis arba tais atvejais, kai bandomoji cheminė medžiaga duodama ją įkvepiant, ėminių ėmimo tvarkaraštį reikėtų sudaryti atsižvelgiant į paskutinės dozės davimo arba veikimo pabaigos laiką.

Turima mažai duomenų apie kartotinės dozės protokolo tinkamumą šiam bandymui. Tačiau jei šį bandymą norima sujungti su kartotinės dozės toksiškumo bandymu, reikėtų imtis priemonių išvengti mitozinių ląstelių su pažeistomis chromosomomis nuostolių, kurių gali būti esant toksinėms dozėms. Toks sujungimas yra priimtinas, kai didžiausia dozė yra lygi ribinei dozei arba didesnė (žr. 29 pastraipą) ir dozės grupei duodama ribinė dozė visą apdorojimo laikotarpio trukmę. Į mikrobranduolių bandymą (B.12 bandymų metodas) galima žiūrėti kaip į geriausią chromosomų aberacijų bandymą in vivo, kai siekiama jungti su kitais tyrimais.

Kaulų čiulpų ėminiai turėtų būti imami atskirai du kartus po vienkartinio apdorojimo. Graužikų pirmasis ėminių ėmimo intervalas turėtų būti laikas, kuris yra būtinas, kad galėtų baigtis laikotarpis, 1,5 karto ilgesnis nei normalaus ląstelių ciklo trukmė (pastaroji paprastai yra 12–18 h po apdorojimo laikotarpio). Kadangi bandomosios (-ųjų) cheminės (-ių) medžiagos (-ų) sugertis ir metabolizmas, taip pat medžiagos (-ų) įtaka ląstelių ciklo kinetikai gali paveikti optimalų chromosomų aberacijos aptikimo laiką, rekomenduojama antrąjį ėminį paimti praėjus 24 h nuo pirmojo ėminio paėmimo. Imant ėminį pirmą kartą, visos dozių grupės turėtų būti apdorotos ir ėminiai paimti analizei, tačiau, imant ėminį kitą (-us) kartą (-us), duoti reikia tik didžiausią dozę. Jei moksliškai yra pagrįstos daugiau kaip vienos paros dozės davimo schemos, paprastai ėminius reikėtų imti vieną kartą, po galutinio apdorojimo praėjus laikui, maždaug 1,5 ilgesniam nei normalaus ląstelių ciklo trukmė.

Po apdorojimo ir prieš ėminių surinkimą gyvūnams suleidžiama injekcija į pilvo ertmę su metafazę stabdančios medžiagos (pvz., kolchicino ar kolcemido) reikiama doze, ir ėminiai surenkami po reikiamo laiko tarpo. Pelėms šis laiko tarpas prieš surinkimą yra maždaug 3–5 h, žiurkėms – 2–5 h. Ląstelės surenkamos iš kaulų čiulpų, brinkinamos, fiksuojamos, dažomos ir analizuojamos chromosomų aberacijoms nustatyti (12).

Stebėjimai

Reikėtų atlikti bendruosius bandymo gyvūnų klinikinius stebėjimus ir bent kartą per dieną registruoti klinikinius požymius, pageidautina kartą ar kelis kartus kasdien tuo pačiu laiku, atsižvelgiant į didžiausio numatomo poveikio laiką po dozės davimo. Mažiausiai du kartus per dieną dozavimo laikotarpiu visus gyvūnus reikėtų apžiūrėti siekiant nustatyti liguistumo ir gaištamumo požymius. Visi gyvūnai turėtų būti sveriami tyrimo pradžioje, bent kartą per savaitę kartotinės dozės tyrimų metu ir numarinant. Jei tyrimai atliekami ne trumpiau kaip vieną savaitę, bent kartą per savaitę reikėtų matuoti pašaro suvartojimą. Jei bandomoji cheminė medžiaga duodama su geriamuoju vandeniu, suvartoto vandens kiekį reikėtų išmatuoti kaskart, kai vanduo keičiamas, ir bent kartą per savaitę. Gyvūnus, kuriems pasireiškia nemirtini pernelyg didelio toksiškumo požymiai, reikėtų humaniškai numarinti dar nesibaigus bandymo laikotarpiui (11).

Tikslinio audinio veikimas

Reikiamu laiku vieną ar kelis kartus reikėtų paimti kraujo ėminį bandomųjų cheminių medžiagų koncentracijai plazmoje nustatyti, siekiant įsitikinti, ar kaulų čiulpai buvo paveikti, jei reikalaujama ir jei nėra kitų poveikio duomenų (žr. 44 pastraipą).

Kaulų čiulpų ir chromosomų preparatai

Iš karto po humaniško numarinimo gaunamos kaulų čiulpų ląstelės iš gyvūnų šlaunikaulių ar blauzdikaulių, veikiamos hipotoniniu tirpalu ir fiksuojamos. Metafazės ląstelės paskleidžiamos ant objektinių stiklelių ir dažomos nustatytais būdais (žr. (3) (12)).

Analizė

Visi objektiniai stikleliai, įskaitant teigiamų ir neigiamų kontrolinių ėminių, prieš analizę turėtų būti atskirai koduojami ir randomizuojami, kad skaičiuotojas nežinotų apdorojimo sąlygų.

Reikėtų nustatyti mitozinį indeksą kaip citotoksiškumo matą, įvertinant citotoksiškumą mažiausiai 1 000 ląstelių vienam gyvūnui, jį nustatant visiems apdorotiems gyvūnams (įskaitant teigiamus kontrolinius ėminius), neapdorotiems gyvūnams arba tirpiklio ar nešiklio neigiamų kontrolinių ėminių gyvūnams.

Reikėtų ištirti ne mažiau kaip 200 metafazės kiekvieno gyvūno ląstelių, kad būtų nustatytos struktūrinės chromosomų aberacijos, įtraukiant ir neįtraukiant plyšių (6). Tačiau jei istorinių neigiamų kontrolinių ėminių duomenų bazė rodo, kad bandymo laboratorijos vidutinis foninis struktūrinių chromosomų aberacijų dažnumas yra < 1 %, reikėtų atsižvelgti į galimybę skaičiuoti papildomas ląsteles. Chromatidinė ir chromosominė aberacijos turėtų būti registruojamos atskirai ir klasifikuojamos pagal potipius (trūkius, mainus). Laboratorijoje taikomos procedūros turėtų užtikrinti, kad chromosomų aberacijų analizę atlieka tinkamai apmokyti skaičiuotojai ir, jei reikia, ją peržiūrėtų ekspertai. Atsižvelgiant į tai, kad objektinių stiklelių ruošimo procedūrų dažnas rezultatas dėl gautų chromosomų nuostolių pakeičia metafazės ląstelių dalį, skaičiuojamų ląstelių centromerų skaičius turėtų būti ne mažesnis kaip 2n ± 2, kai n yra tos rūšies haploidinis chromosomų skaičius.

DUOMENYS IR ATASKAITOS RENGIMAS

Rezultatų apdorojimas

Kiekvieno gyvūno bandymų rezultatai turėtų būti pateikiami lentelėse. Reikėtų įvertinti kiekvieno gyvūno mitozinį indeksą, suskaičiuotų metafazės ląstelių skaičių, aberacijų vienai metafazės ląstelei skaičių ir ląstelių su strūktūrine (-ėmis) chromosomų aberacija (-omis) procentinę dalį. Turėtų būti išvardyti apdorotų ir kontrolinių grupių gyvūnų skirtingi struktūrinių chromosomų aberacijų tipai, nurodant jų skaičių bei dažnumą. Plyšiai, taip pat poliploidinės ląstelės ir ląstelės su endoreduplikuotomis chromosomomis yra registruojamos atskirai. Plyšių dažnumas pateikiamas ataskaitoje, bet paprastai neįtraukiamas į suminio struktūrinių aberacijų dažnumo analizę. Jei nėra atsako skirtumo dėl lyties įrodymų, atliekant statistinę analizę duomenis galima apjungti. Ataskaitoje taip pat reikėtų pateikti toksiškumo gyvūnams ir klinikinių požymių duomenis.

Priimtinumo kriterijai

Apie bandymo priimtinumą sprendžiama pagal šiuos kriterijus:

Rezultatų įvertinimas ir aiškinimas

Jei įvykdomi visi priimtinumo kriterijai, bandomoji cheminė medžiaga laikoma aiškiai teigiama, jei:

Jei tam tikru ėminio ėmimo laiku tiriama tik didžiausia dozė, bandomoji cheminė medžiaga laikoma aiškiai teigiama, jei yra statistiškai reikšmingas padidėjimas, palyginti su vienalaikiu neigiamu kontroliniu ėminiu, o rezultatai yra už istorinių neigiamų kontrolinių ėminių duomenų skirstinio ribų (pvz., Puasono skirstinio 95 % kontrolinių ribų). Rekomendacijų dėl tinkamų statistinių metodų galima rasti literatūroje (13). Atliekant dozės ir atsako priklausomybės analizę, reikėtų analizuoti ne mažiau kaip tris dozę gavusias grupes. Taikant statistinius kriterijus, bandymo vienetu turėtų būti gyvūnas. Teigiami chromosomų aberacijų bandymo rezultatai rodo, kad bandomoji cheminė medžiaga sukelia bandomųjų rūšių kaulų čiulpų struktūrines chromosomų aberacijas.

Jei įvykdomi visi priimtinumo kriterijai, bandomoji cheminė medžiaga laikoma aiškiai neigiama, jei visomis ištirtomis bandymo sąlygomis:

Rekomendacijų dėl tinkamiausių statistinių metodų galima rasti literatūroje (13). Kaulų čiulpų veikimo bandomąja chemine medžiaga įrodymu gali būti mitozinio indekso sumažėjimas arba bandomosios (-ųjų) cheminės (-ių) medžiagos (-ų) koncentracijos verčių plazmoje ar kraujyje matavimas. Jei cheminė medžiaga leidžiama į veną, įrodyti poveikio nebūtina. Siekiant įrodyti, kad kaulų čiulpai buvo paveikti, taip pat galima naudoti ADME (absorbcijos, pasiskirstymo, metabolizmo, šalinimo) duomenis, gautus atliekant nepriklausomą tyrimą, kuriame būtų naudojamas tas pats davimo būdas ir ta pati rūšis. Neigiami rezultatai rodo, kad tyrimo sąlygomis bandomoji cheminė medžiaga nesukelia chromosomų aberacijų bandytos gyvūnų rūšies kaulų čiulpuose.

Nėra reikalavimo patikrinti aiškų teigiamą ar aiškų neigiamą atsaką.

Tais atvejais, kai atsakas nėra aiškiai neigiamas ar teigiamas, ir siekiant padėti nustatyti rezultato biologinę svarbą (pvz., mažas ar tarpinis padidėjimas), duomenys turėtų būti įvertinti pateikiant ekspertų nuomonę ir (arba) papildomai tiriant esamus atliktus bandymus. Kai kuriais atvejais galėtų būti naudinga analizuoti didesnį ląstelių skaičių arba pakartoti bandymą šiek tiek pakeistomis bandymo sąlygomis.

Retais atvejais, netgi atlikus papildomus tyrimus, nepakaks duomenų padaryti išvadą, ar gauti bandomosios cheminės medžiagos rezultatai yra teigiami ar neigiami, todėl bus priimtas sprendimas, kad tyrimas yra dviprasmis.

Poliploidinių ir endoreduplikuotų metafazės ląstelių dažnumas turėtų būti registruojamas atskirai. Poliploidinių ar endoreduplikuotų ląstelių skaičiaus padidėjimas gali rodyti, kad bandomoji cheminė medžiaga gali slopinti mitozinius procesus ar ląstelių ciklo eigą (žr. 3 pastraipą).

Bandymo ataskaita

Į bandymo ataskaitą turėtų būti įtraukta ši informacija:

Santrauka

LITERATŪRA

5)

B dalies B.12 skyrius pakeičiamas taip:

„B.12   Žinduolių eritrocitų mikrobranduolių bandymas

ĮVADAS

Šis bandymų metodas atitinka EBPO bandymų gaires (TG) 474 (2014). Jis yra genetinės toksikologijos metodų serijos dalis. Yra parengtas EBPO dokumentas, kuriame glaustai pateikiama informacijos apie genetinės toksikologijos bandymus ir naujausių šių gairių pakeitimų apžvalga (1).

Žinduolių mikrobranduolių bandymas in vivo ypač tinka genotoksiškumui vertinti, nes, nors skirtingų gyvūnų rūšių mikrobranduoliai gali skirtis, metabolizmo in vivo veiksniai, farmakokinetika ir DNR atkūrimo procesai yra aktyvūs ir prisideda prie atsakų. Tyrimas in vivo taip pat yra naudingas toliau tiriant genotoksiškumą, aptiktą in vitro sistema.

Žinduolių mikrobranduolių bandymas in vivo yra naudojamas aptikti pažaidoms, kurias bandomoji cheminė medžiaga sukelia chromosomoms ar eritroblastų mitoziniam aparatui. Atliekant bandymą įvertinamas mikrobranduolių susidarymas eritrocituose, imant gyvūnų, paprastai graužikų, kaulų čiulpų arba periferinio kraujo ląstelių ėminius.

Mikrobranduolių bandymo tikslas – identifikuoti chemines medžiagas, sukeliančias citogenetinius pažeidimus, dėl kurių susiformuoja mažieji branduoliai, turintys atsilikusių chromosomų fragmentų ar ištisas chromosomas.

Kai kaulų čiulpų eritroblastas virsta nesubrendusiu eritrocitu (kartais vadinamu polichrominiu eritrocitu ar retikulocitu), pagrindinis branduolys yra išstumiamas; susiformavęs mikrobranduolys gali likti citoplazmoje. Matyti ar aptikti mikrobranduolius šiose ląstelėse nėra sunku, nes jos neturi pagrindinio branduolio. Nesubrendusių eritrocitų su mikrobranduoliais dažnumo padidėjimas apdorotuose gyvūnuose rodo sukeltas struktūrines arba kiekybines chromosomų aberacijas.

Naujai susidarę eritrocitai su mikrobranduoliais nustatomi ir kiekybiškai įvertinami juos dažant ir vizualiai skaičiuojant pro mikroskopą arba atliekant automatizuotą analizę. Nepakankamai subrendusių eritrocitų suaugusių gyvūnų periferiniame kraujyje ar kaulų čiulpuose suskaičiavimą labai palengvina automatizuota kompiuterinė skaičiavimo sistema. Tokios sistemos yra priimtinos vertinimo rankiniu būdu alternatyvos (2). Palyginamieji tyrimai parodė, kad, naudojant atitinkamus kalibravimo etalonus, tokiais metodais galima gauti geresnį laboratorinį ir tarplaboratorinį atkuriamumą ir jautrį, palyginti su skaičiavimu rankiniu būdu (3) (4). Automatizuotos sistemos, kurios gali matuoti eritrocitų su mikrobranduoliais dažnumą, yra tėkmės citometrai (5), vaizdo analizės sistemos (6) (7) ir lazeriniai skenuojantys citometrai (8), tačiau gali būti ir kitų sistemų.

Nors paprastai tai neatliekama kaip bandymo dalis, chromosomų fragmentus galima atskirti nuo ištisų chromosomų pagal kelis kriterijus. Tai yra kinetochorų ar centromerinių DNR buvimo ar nebuvimo nustatymas, nes abu dalykai yra nepažeistų chromosomų charakteristika. Kai kinetochorų ar centromerinių DNR nėra, tai rodo, kad mikrobranduoliai turi tik chromosomų fragmentus, o kai jų yra – chromosomų praradimą.

Taikomų terminų apibrėžtys pateiktos 1 priedėlyje.

PRADINIAI ASPEKTAI

Jaunų suaugusių graužikų kaulų čiulpai yra šio bandymo genetinių pažeidimų tikslinis audinys, nes eritrocitai gaminami šiame audinyje. Galima vertinti kitų rūšių žinduolių mikrobranduolius periferinio kraujo nesubrendusiuose eritrocituose, jei įrodyta (mikrobranduolių indukcijos nesubrendusiuose eritrocituose būdu), kad jie pakankamai jautrūs, kad būtų galima išsiaiškinti, ar cheminės medžiagos sukelia struktūrines chromosomų ar jų skaičiaus aberacijas tose ląstelėse, ir jei pateiktas mokslinis pagrindimas. Nesubrendusių eritrocitų su mikrobranduoliais dažnumas yra pagrindinė vertinamoji baigtis. Rūšims be stiprios ląstelių su mikrobranduoliais atrankos blužnyje ir gyvūnus nuolat apdorojant laikotarpiu, kurio trukmė yra didesnė nei naudojamos gyvūnų rūšies eritrocitų gyvavimo trukmė (pvz., pelių – 4 savaitės arba ilgiau) kaip vertinamoji baigtis taip pat gali būti naudojamas periferinio kraujo subrendusių eritrocitų, turinčių mažuosius branduolius, dažnumas.

Jei yra duomenų, kad bandomoji (-osios) cheminė (-ės) medžiaga (-os) ar jos arba jų metabolitas (-ai) nepasieks tikslinio audinio, šis metodas gali būti netinkamas.

Prieš taikant bandymų metodą mišiniui, kad būtų gauti duomenys numatomo reglamentavimo tikslu, reikėtų panagrinėti, ar metodu galima pasiekti tą tikslą atitinkančius rezultatus ir, jei taip, dėl kokios priežasties. Tokie svarstymai nereikalingi, kai yra reglamentavimo reikalavimas bandyti mišinį.

BANDYMŲ METODO PRINCIPAS

Gyvūnai veikiami bandomąja chemine medžiaga reikiamu būdu. Jei naudojami kaulų čiulpai, gyvūnai humaniškai numarinami reikiamu (-ais) momentu (-ais) po apdorojimo, kaulų čiulpai išimami ir ruošiami bei dažomi jų preparatai (9) (10) (11) (12) (13) (14) (15). Kai naudojamas periferinis kraujas, jis imamas reikiamu (-ais) momentu (-ais) po apdorojimo ir ruošiami bei dažomi jo preparatai (12) (16) (17) (18). Jei apdorojama ūmiu būdu, svarbu pasirinkti tokį kaulų čiulpų ar kraujo surinkimo laiką, kuriuo būtų galima aptikti su apdorojimu susijusią nesubrendusių eritrocitų su mikrobranduoliais indukciją. Imant periferinio kraujo ėminius taip pat turi praeiti pakankamai laiko, kad šie reiškiniai pasireikštų cirkuliuojančiame kraujyje. Preparatai analizuojami mikrobranduolių buvimui nustatyti vizualiai pro mikroskopą, naudojant vaizdo analizę, tėkmės citometriją ar lazerinę skenuojančią citometriją.

LABORATORIJOS KVALIFIKACIJOS TIKRINIMAS

Kvalifikacijos tyrimai

Siekdama įgyti pakankamos tyrimo atlikimo patirties prieš jį taikydama įprastiniams bandymams, laboratorija turėtų įrodyti gebėjimą atkurti paskelbtų duomenų (17) (19) (20) (21) (22) tikėtinus mikrobranduolių dažnumo rezultatus, naudodama ne mažiau kaip dvi teigiamas kontrolines chemines medžiagas (įskaitant mažos dozės teigiamų kontrolinių ėminių sukeltus silpnus atsakus), pvz., išvardytas 1 lentelėje, ir suderinamų tirpiklių ir (arba) nešiklių kontrolinius ėminius (žr. 26 pastraipą). Atliekant šiuos bandymus, reikėtų naudoti dozes, kurioms esant tiriamajame audinyje (kaulų čiulpuose ar periferiniame kraujyje) gaunami atkuriami ir su doze susiję padidėjimai, bei įrodyti bandymo sistemos jautrį ir dinaminį diapazoną, pasitelkiant laboratorijoje taikomą vertinimo metodą. Šis reikalavimas netaikomas patirties turinčioms laboratorijoms, t. y. kurios turi istorinių duomenų bazę, prieinamą kaip apibrėžta 14–18 pastraipose.

Istorinių kontrolinių ėminių duomenys

Atlikdama kvalifikacijos tyrimus, laboratorija turėtų nustatyti:

Pirmą kartą gaunant istorinių neigiamų kontrolinių ėminių pasiskirstymo duomenis, vienalaikiai neigiami kontroliniai ėminiai turėtų atitikti paskelbtus kontrolinius duomenis, jei jie yra. Istorinių kontrolinių ėminių pasiskirstymą papildant vis didesniu bandymų duomenų kiekiu, būtų gerai, kad vienalaikiai neigiami kontroliniai ėminiai patektų į to skirstinio 95 % kontrolines ribas. Laboratorijos istorinių neigiamų kontrolinių ėminių duomenų bazė turėtų būti statistiškai patikima, kad būtų užtikrinta laboratorijos gebėjimas vertinti savo neigiamų kontrolinių ėminių duomenų pasiskirstymą. Literatūroje daroma prielaida, kad gali prireikti ne mažiau kaip 10 bandymų, bet būtų geriau, jei palyginamosiomis Bandymo sąlygomis atliktų bandymų skaičius būtų ne mažesnis kaip 20. Laboratorijos turėtų taikyti kokybės kontrolės metodus, tokius kaip kontrolinės diagramos (pvz., C tipo ar X juostinės diagramos (23)), kad galėtų nustatyti savo duomenų kintamumą ir įrodyti metodikos „valdomumą“ savo laboratorijoje. Papildomas rekomendacijas, kaip kurti ir naudoti istorinius duomenis (t. y. duomenų įtraukimo ir pašalinimo iš istorinių duomenų kriterijus ir tam tikro bandymo priimtinumo kriterijus) galima rasti literatūroje (24).

Jei atliekant 13 skirsnyje aprašytus kvalifikacijos tyrimus laboratorijai nepakanka bandymų skaičiaus statistiškai patikimam neigiamų kontrolių ėminių skirstiniui gauti (žr. 15 pastraipą), priimtina skirstinį papildyti atliekant pirmuosius įprastinius bandymus. Taikant šį būdą, reikėtų laikytis literatūroje nurodytų rekomendacijų (24), o atliekant šiuos bandymus gauti neigiamų kontrolinių ėminių rezultatai turėtų būti suderinami su paskelbtais neigiamų kontrolinių ėminių duomenimis.

Į visus bandymų protokolo pakeitimus reikėtų žiūrėti atsižvelgiant į jų poveikį gaunamiems duomenims, kurie turi likti suderinami su esamomis laboratorijos istorinių kontrolinių ėminių duomenų bazėmis. Tik esant didesnėms neatitiktims turėtų būti kuriama nauja istorinių kontrolinių ėminių duomenų bazė, jei atsižvelgiant į ekspertų nuomonę nustatoma, kad ji skiriasi nuo ankstesnio skirstinio (žr. 15 pastraipą). Atkūrimo metu atliekamam bandymui gali neprireikti visos neigiamų kontrolinių ėminių duomenų bazės, jei laboratorija gali įrodyti, kad vienalaikių neigiamų kontrolinių ėminių vertės ir toliau yra suderinamos su ankstesne duomenų baze arba su atitinkamais paskelbtais duomenimis.

Neigiamų kontrolinių ėminių duomenis turėtų sudaryti kiekvieno gyvūno nesubrendusių, mažųjų branduolių turinčių eritrocitų dažnumas. Būtų gerai, kad vienalaikiai neigiami kontroliniai ėminiai patektų į laboratorijos istorinių neigiamų kontrolinių ėminių duomenų bazės skirstinio 95 % kontrolines ribas. Jei vienalaikių neigiamų kontrolinių ėminių duomenys nepatenka į 95 % kontrolines ribas, jie gali būti tinkami įtraukti į istorinių kontrolinių ėminių skirstinį, jei nėra kraštiniai riktai ir yra įrodymų, kad bandymo sistema „valdoma“ (žr. 15 pastraipą) ir kad nėra techninių ar žmogaus klaidų.

METODO APRAŠYMAS

Parengiamieji darbai

Gyvūnų rūšies parinkimas

Reikėtų tirti dažniausiai naudojamas sveikų jaunų suaugusių gyvūnų laboratorines veisles. Galima naudoti peles, žiurkes ar kitas tinkamas žinduolių rūšis. Kai naudojamas periferinis kraujas, turi būti nustatyta, ar indukuotų mikrobranduolių aptikimas netrikdomas, pasirinktos rūšies gyvūno blužniai iš apytakos šalinant ląsteles su mikrobranduoliais. Tai buvo aiškiai įrodyta pelių ir žiurkių periferiniam kraujui (2). Kitų nei žiurkės ar pelės rūšių naudojimas turėtų būti moksliškai pagrįstas ataskaitoje. Jei naudojamos kitos nei graužikai rūšys, rekomenduojama indukuotų mikrobranduolių matavimą įtraukti į kitą tinkamą toksiškumo bandymą.

Gyvūnų laikymo ir šėrimo sąlygos

Temperatūra graužikų patalpoje turėtų būti 22 °C (± 3 °C). Nors geriausia būtų užtikrinti 50–60 % drėgmę, ji neturėtų būti mažesnė kaip 40 % ir būtų gerai, jei ji nebūtų didesnė kaip 70 %, išskyrus patalpos valymo laiką. Apšvietimas turėtų būti dirbtinis, taikant 12 h šviesos ir 12 h tamsos seką. Gyvūnams šerti tinka įprastas laboratorijose naudojamas pašaras, neribojant geriamojo vandens kiekio. Pašaro pasirinkimui gali turėti įtakos būtinybė užtikrinti tinkamą bandomosios cheminės medžiagos sumaišymą su pašaru, kai ji duodama tokiu būdu. Jei nesitikima agresyvaus elgesio, graužikus reikėtų laikyti nedidelėmis vienos lyties vienodai apdorotomis grupėmis (ne daugiau kaip po penkis viename narvelyje), pageidautina narveliuose su kietomis grindimis ir esant atitinkamai pagerintai aplinkai. Tik moksliškai pagrįstais atvejais gyvūnus galima laikyti atskirai.

Gyvūnų paruošimas

Paprastai naudojami sveiki jauni suaugę gyvūnai (geriausias graužikų amžius apdorojimo pradžioje yra 6–10 savaičių, nors leidžiama naudoti šiek tiek vyresnius gyvūnus), kurie atsitiktinai paskirstomi į kontrolines ir apdorotas grupes. Atskiri gyvūnai unikaliai paženklinami humanišku minimaliai invaziniu būdu (pvz., žieduojant, kabinant etiketę, naudojant mikrolustą ar biometrinį identifikavimą, bet ne ausų ar pėdų spaustukus) ir aklimatizuojami laboratorinėmis sąlygomis ne trumpiau kaip 5 paras. Narvelius reikėtų įrengti taip, kad jų išdėstymo poveikis būtų minimalus. Reikėtų vengti teigiamo kontrolinio ėminio ir bandomosios cheminės medžiagos kryžminės taršos. Tyrimo pradžioje gyvūnų masės skirtumas turėtų būti kuo mažesnis ir neviršyti ± 20 % kiekvienos lyties gyvūno masės.

Dozių ruošimas

Kietąsias bandomąsias chemines medžiagas, prieš dozuojant gyvūnams, reikėtų ištirpinti atitinkamuose tirpikliuose ar nešikliuose, paruošti jų suspensiją arba įmaišyti į pašarą ar geriamąjį vandenį. Skystąsias bandomąsias chemines medžiagas galima dozuoti tiesiogiai arba prieš tai praskiesti. Jei bandomoji cheminė medžiaga patenka per kvėpavimo takus, ją galima duoti dujų, garų arba kietojo ar skystojo aerozolio pavidalu, atsižvelgiant į jos fizikines ir chemines savybės. Reikėtų naudoti tik iš naujo paruoštus bandomosios cheminės medžiagos preparatus, nebent stabilumo duomenys rodo, kad laikymas priimtinas ir šiuo atveju apibrėžiamos tinkamos laikymo sąlygos.

Bandymo sąlygos

Tirpiklis ir (arba) nešiklis

Neturėtų būti tirpiklio ar nešiklio toksinio poveikio, esant naudojamiems dozių dydžiams, ir negalėtų vykti jų cheminė reakcija su bandomosiomis cheminėmis medžiagomis. Jei naudojami kiti nei gerai žinomi tirpikliai ar nešikliai, juos galima įtraukti, pateikus suderinamumą rodančius nuorodų duomenis. Rekomenduojama visuomet iš pradžių atsižvelgti į galimybę naudoti vandeninį tirpiklį arba nešiklį. Dažniausiai naudojamų suderinamų tirpiklių ar nešiklių pavyzdžiai yra vanduo, fiziologinis tirpalas, metilceliuliozės tirpalas, karboksimetilceliuliozės natrio druskos tirpalas, alyvuogių ir kukurūzų aliejus. Jei nėra istorinių arba paskelbtų kontrolinių duomenų, kurie rodo, kad pasirinktas netipinis tirpiklis ar nešiklis nesukelia mikrobranduolių atsiradimo ir kitokio žalingo poveikio, reikėtų atlikti pradinį tyrimą tirpiklio ar nešiklio kontrolinio ėminio priimtinumui nustatyti.

Kontroliniai ėminiai

Teigiami kontroliniai ėminiai

Paprastai į kiekvieną bandymą reikėtų įtraukti grupę gyvūnų, apdorotų teigiama kontroline chemine medžiaga. To galima atsisakyti, jei bandymų laboratorija įrodė turinti kvalifikaciją atlikti bandymą ir nustatė istorinių teigiamų kontrolinių ėminių intervalą. Jei vienalaikių teigiamų kontrolinių ėminių grupė neįtraukiama, į kiekvieną bandymą reikėtų įtraukti vertinimo kontrolinius ėminius (fiksuotus ir nedažytus objektinius stiklelius arba ląstelių suspensijos ėminius, atsižvelgiant į vertinimo metodą). Juos galima gauti į tyrimo vertinimą įtraukiant atitinkamus etaloninius ėminius, kurie būtų gauti periodiškai (pvz., kas 6–18 mėnesių) atliekant atskirą teigiamo kontrolinio ėminio bandymą, pvz., kvalifikacijos tyrimo metu ir reguliariai vėliau, jei būtina, ir tuos ėminius laikyti.

Teigiamos kontrolinės cheminės medžiagos turėtų patikimai sukelti aiškų mikrobranduolių dažnumo padidėjimą palyginti su savaiminiu lygiu. Kai skaičiuojama rankiniu būdu žiūrint pro mikroskopą, reikėtų pasirinkti tokias teigiamų kontrolinių ėminių dozes, kad poveikis būtų ryškus, bet skaičiuotojui ne iškarto atsiskleistų užkoduotų ėminių tapatybė. Teigiamą kontrolinę cheminę medžiagą galima duoti kitu nei bandomoji cheminė medžiaga būdu, taikant skirtingą apdorojimo planą ir ėminius imant tik vienu laiko momentu. Be to, jei tinka, galima atsižvelgti į tos pačios cheminės klasės teigiamų kontrolinių cheminių medžiagų naudojimą. Teigiamų kontrolinių cheminių medžiagų pavyzdžiai pateikti 1 lentelėje.

1 lentelė.

Teigiamų kontrolinių cheminių medžiagų pavyzdžiai

Cheminės medžiagos ir CAS Nr.

Etilmetansulfonatas [CAS Nr. 62-50-0]

Metilmetansulfonatas [CAS Nr. 66-27-3]

Etilnitrozokarbamidas [CAS Nr. 759-73-9]

Mitomicinas C [CAS Nr. 50-07-7]

Ciklofosfamidas (monohidratas) [CAS Nr. 50-18-0 (CAS Nr. 6055-19-2)]

Trietilenmelaminas [CAS Nr. 51-18-3]

Kolchicinas [CAS Nr. 64-86-8] ar vinblastinas [CAS Nr. 865-21-4] – kaip aneugenai

Neigiami kontroliniai ėminiai

Neigiamos kontrolinės grupės gyvūnus reikėtų įtraukti kiekvieną kartą imant ėminį ir su jais elgtis kaip su apdorota grupe, išskyrus tai, kad gyvūnai nepaveikiami bandomąja chemine medžiaga. Jei bandomajai cheminei medžiagai duoti naudojamas tirpiklis ar nešiklis, kontrolinė grupė turėtų gauti šio tirpiklio ar nešiklio. Tačiau jei kiekvienam ėminių ėmimo laikui bandymų laboratorijos istorinių neigiamų kontrolinių ėminių duomenys rodo pastovų kintamumą tarp gyvūnų ir ląstelių su mikrobranduoliais dažnumą, gali pakakti paimti tik vieną neigiamą kontrolinį ėminį. Jei imamas tik vienas neigiamas kontrolinis ėminys, jis turėtų būti imamas pirmą kartą imant atliekamo tyrimo ėminį.

Jei naudojamas periferinis kraujas, vietoj vienalaikio neigiamo kontrolinio ėminio atliekant trumpalaikius tyrimus galima naudoti parengtinio apdorojimo ėminį, kai gauti duomenys yra suderinami su bandymų laboratorijos istorinių kontrolinių ėminių duomenų baze. Naudojant žiurkes buvo įrodyta, kad mažo tūrio parengtinio ėminio ėmimas (pvz., mažesnio kaip 100 μl/parai) turi minimalų poveikį mikrobranduolių foniniam dažnumui (25).

PROCEDŪRA

Gyvūnų skaičius ir lytis

Apskritai, vyriškos ir moteriškos lyties gyvūnų mikrobranduolių atsakas yra panašus, todėl daugumą tyrimų būtų galima atlikti su bet kurios lyties gyvūnais (26). Jei duomenys rodytų esminius skirtumus tarp patinų ir patelių (pvz., sisteminio toksiškumo, metabolizmo, biologinio įsisavinamumo, toksiškumo kaulų čiulpams ir kt. skirtumus, įskaitant, pvz., intervalo nustatymo tyrimą), tai paskatintų naudoti abiejų lyčių gyvūnus. Šiuo atveju galbūt reikėtų atlikti tyrimą su abiejų lyčių gyvūnais, pvz., kaip kartotinės dozės toksiškumo tyrimo dalį. Jei naudojamos abi lytys, galbūt tiktų taikyti faktorinės analizės schemą. Išsami informacija, kaip analizuoti duomenis taikant šią schemą, pateikta 2 priedėlyje.

Reikėtų nustatyti grupių dydį tyrimo pradžioje, turint tikslą vienai grupei gauti ne mažiau kaip 5 analizei tinkamus vienos lyties gyvūnus arba kiekvienos lyties gyvūnus, jei naudojami abiejų lyčių gyvūnai. Jei cheminių medžiagų poveikis žmonėms gali priklausyti nuo lyties, pvz., kai kurių vaistų atveju, bandymas turėtų būti atliekamas su atitinkamos lyties gyvūnais. Atliekant kaulų čiulpų tyrimą pagal 37 pastraipoje nustatytus parametrus, kai yra trys dozių grupės ir vienalaikio neigiamo ir teigiamo kontrolinių ėminių grupės (kiekvieną grupę sudaro penki vienos lyties gyvūnai), rekomenduojamas tipinis maksimalus gyvūnų poreikis būtų nuo 25 iki 35 gyvūnų.

Dozės dydžiai

Jei atliekamas parengiamasis intervalo nustatymo tyrimas, nes nėra tinkamų duomenų, kurie padėtų pasirinkti dozę, jį reikėtų atlikti toje pačioje laboratorijoje, naudojant pagrindiniam tyrimui naudoti numatytą rūšį, veislę, lytį ir apdorojimo schemą (27). Tyrimo tikslas – nustatyti didžiausią toleruojamą dozę (MTD), apibrėžiamą kaip didžiausia dozė, kuri būtų toleruojama nesant tyrimą ribojančio toksiškumo požymių, susijusių su tyrimo laikotarpio trukme (pvz., sukeliant kūno masės sumažėjimą arba hematopoetinės sistemos citotoksiškumą, bet ne žūtį ar skausmo, kančių ar išsekimo požymius, dėl kurių reikėtų humaniškai numarinti (28)).

Didžiausią dozę taip pat būtų galima apibrėžti kaip dozę, kuri sukeltų toksiškumą kaulų čiulpams (pvz., kaulų čiulpų arba periferinio kraujo nesubrendusių eritrocitų dalies sumažėjimas suminio eritrocitų skaičiaus atžvilgiu daugiau kaip 50 %, bet iki ne mažiau kaip 20 % kontrolinės vertės). Tačiau analizuojant periferinės kraujotakos CD71 teigiamas ląsteles (t. y. tėkmės citometrijos metodu), ši labai jauna nesubrendusių eritrocitų frakcija gali reaguoti į toksinius veiksnius labiau nei didesnė RNR teigiama nesubrendusių eritrocitų grupė. Todėl didesnis akivaizdus toksiškumas gali būti matomas naudojant ūmaus paveikimo schemas, kai tiriama CD71 teigiamų nesubrendusių eritrocitų frakcija, palyginti su schemomis, pagal kurias nustatomi nesubrendę eritrocitai pagal RNR kiekį. Todėl, kai bandant apdorojama penkias paras arba mažiau, didžiausia toksiškumą sukeliančių cheminių medžiagų dozė gali būti apibrėžta kaip dozė, kuri sukelia statistiškai reikšmingą CD71 teigiamų nesubrendusių eritrocitų sumažėjimą suminio eritrocitų skaičiaus atžvilgiu, bet ne mažesnį kaip 5 % kontrolinės vertės (29).

Cheminės medžiagos, kurios rodo toksikokinetinių savybių prisotinimą arba po ilgalaikio davimo sukelia detoksifikavimo procesus, galinčius mažinti veikimą, gali būti dozės nustatymo kriterijų išimtys ir turėtų būti įvertinamos kiekvienu atveju atskirai.

Siekiant gauti informacijos apie dozės ir atsako priklausomybę, į išsamų tyrimą reikėtų įtraukti neigiamo kontrolinio ėminio grupę ir ne mažiau kaip tris dozes, kurių dydžio skirtumo faktorius būtų 2, bet ne didesnis kaip 4. Jei cheminė medžiaga nėra toksiška atliekant intervalo nustatymo tyrimą arba atsižvelgiant į turimus duomenis, 14 parų ar ilgesnio laikotarpio didžiausia davimo dozė turėtų būti 1 000 mg/kg kūno masės per parą arba 2 000 mg/kg kūno masės per parą, jei laikotarpis trumpesnis kaip 14 parų. Tačiau, jei bandomoji cheminė medžiaga yra toksiška, didžiausia duodama dozė turėtų būti MTD, o naudojami dozių dydžiai turėtų aprėpti intervalą nuo didžiausios dozės iki mažo toksiškumo arba visiškai jo nesukeliančios dozės. Kai toksiškumas tiksliniam audiniui (kaulų čiulpams) stebimas naudojant visus bandomus dozės dydžius, patartina toliau tirti netoksines dozes. Tyrimams, kurių tikslas būtų išsamiau apibūdinti kiekybinę dozės ir atsako priklausomybės informaciją, gali prireikti papildomų dozių grupių. Tam tikrų tipų bandomųjų cheminių medžiagų (pvz., vaistų žmonėms), kurioms taikomi specifiniai reikalavimai, šios ribos gali skirtis.

Ribinis bandymas

Jei dozės intervalo nustatymo bandymai arba esami susijusių gyvūnų veislių duomenys rodo, kad apdorojimo režimu bent ribinė dozė (aprašyta toliau) nesukelia jokio toksinio poveikio (įskaitant tai, kad nėra kaulų čiulpų proliferacijos slopinimo ar kitų citotoksiškumo tiksliniam audiniui požymių) ir, jei atsižvelgiant į in vitro genotoksiškumo tyrimus arba į giminingos struktūros cheminėms medžiagoms gautus duomenis, genotoksiškumo nereikėtų tikėtis, visas bandymas naudojant trijų dydžių dozes gali būti nebūtinas, jei būtų įrodyta, kad bandomoji (-osios) cheminė (-ės) medžiaga (-os) pasiekia tikslinį audinį (kaulų čiulpus). Tokiais atvejais gali pakakti vienos ribinio dydžio dozės. Jei davimo laikotarpis – 14 parų arba ilgesnis, ribinė dozė yra 1 000 mg/kg kūno masės per parą. Jei davimo laikotarpis yra trumpesnis kaip 14 parų, ribinė dozė yra 2 000 mg/kg kūno masės per parą.

Dozių davimas

Rengiant bandymo schemą, reikėtų atsižvelgti į numatomą poveikio žmogui būdą. Todėl galima pasirinkti pagrįstus poveikio būdus, pvz., duoti su pašaru, geriamuoju vandeniu, atlikti vietinę poodinę arba intraveninę injekciją, duoti per burną (per zondą), kvėpavimo takus, intubacinį vamzdelį ar implantuoti. Visais atvejais turėtų būti pasirinktas būdas, kuris užtikrintų reikiamą tikslinio (-ių) audinio (-ių) veikimą. Injekcija į pilvo ertmę paprastai nerekomenduojama, nes tai nėra numatytas poveiko žmogui būdas ir jį reikėtų naudoti, tik, jei būtų specialiai moksliškai pagrįstas. Jei bandomoji cheminė medžiaga įmaišoma į pašarą ar į geriamąjį vandenį, ypač vienkartinio dozavimo atveju, reikėtų imtis priemonių, kad laiko tarpas nuo maisto bei vandens vartojimo iki ėminių ėmimo būtų pakankamas poveikiui aptikti (žr. 37 pastraipą). Skysčio, kurį galima duoti per zondą arba įšvirkšti per vieną kartą, maksimalus tūris priklauso nuo bandymo gyvūno dydžio. Tūris neturėtų būti didesnis kaip 1 ml/100 g kūno masės, išskyrus vandeninius tirpalus, kurių galima duoti ne daugiau kaip po 2 ml/100 g kūno masės. Didesnio nei šis tūrio naudojimą reikėtų pagrįsti. Išskyrus dirginančias ar ėsdinančias bandomąsias chemines medžiagas, kurios, būdamos didesnės koncentracijos, paprastai sukeltų sunkinantį poveikį, bandymo tūrio kintamumas turėtų būti kuo mažesnis reguliuojant koncentraciją, kad būtų užtikrintas visų didžių dozių tūrio pastovumas kūno masės atžvilgiu.

Apdorojimo planas

Pageidautina apdoroti 2 kartus arba daugiau, duodant kas 24 h, ypač kai šis bandymas įtraukiamas į kitus toksiškumo tyrimus. Arba galima apdoroti duodant vieną kartą, jei tai būtų moksliškai pagrįsta (pvz., žinoma, kad bandomosios cheminės medžiagos stabdo ląstelių ciklą). Bandomąsias chemines medžiagas galima duoti kaip padalytą dozę (t. y. siekiant palengvinti didelių tūrių davimą, per vieną dieną apdorojama du kartus arba daugiau, tarp apdorojimų esant ne ilgesniam kaip 2–3 h tarpui). Šiomis aplinkybėmis arba tais atvejais, kai bandomoji cheminė medžiaga duodama ją įkvepiant, ėminių ėmimo tvarkaraštį reikėtų sudaryti atsižvelgiant į paskutinės dozės davimo arba veikimo pabaigos laiką.

Bandymą su pelėmis arba žiurkėmis galima atlikti vienu iš trijų būdų:

Galima naudoti kitas dozavimo ar ėminių ėmimo schemas, siekiant palengvinti sujungimą su kitais toksiškumo bandymais, jei jos būtų tinkamos ir moksliškai pagrįstos.

Stebėjimai

Reikėtų atlikti bendruosius bandymo gyvūnų klinikinius stebėjimus ir bent kartą per dieną registruoti klinikinius požymius, pageidautina kartą ar kelis kartus kasdien tuo pačiu laiku, atsižvelgiant į didžiausio numatomo poveikio laiką po dozės davimo. Mažiausiai du kartus per dieną, siekiant nustatyti liguistumo ir gaištamumo požymius, dozavimo laikotarpiu visus gyvūnus reikėtų apžiūrėti. Visi gyvūnai turėtų būti sveriami tyrimo pradžioje, bent kartą per savaitę kartotinės dozės tyrimų metu ir numarinant. Jei tyrimai atliekami ne trumpiau kaip vieną savaitę, bent kartą per savaitę reikėtų matuoti pašaro suvartojimą. Jei bandomoji cheminė medžiaga duodama su geriamuoju vandeniu, suvartoto vandens kiekį reikėtų išmatuoti kaskart, kai vanduo keičiamas, ir bent kartą per savaitę. Gyvūnus, kuriems pasireiškia nemirtini pernelyg didelio toksiškumo požymiai, reikėtų humaniškai numarinti iki bandymo laikotarpio pabaigos (28). Tam tikromis aplinkybėmis būtų galima kontroliuoti gyvūnų kūno temperatūrą, nes apdorojimo sukelta hipertermija ir hipotermija prisidėjo gaunant klaidingus rezultatus (32) (33) (34).

Tikslinio audinio veikimas

Reikiamu laiku vieną ar kelis kartus reikėtų paimti kraujo ėminį bandomųjų cheminių medžiagų koncentracijai plazmoje nustatyti, siekiant įsitikinti, ar kaulų čiulpai buvo paveikti, jei reikalaujama ir jei nėra kitų poveikio duomenų (žr. 48 pastraipą).

Kaulų čiulpų ar kraujo paruošimas

Kaulų čiulpų ląstelės gaunamos iš gyvūnų šlaunikaulių ar blauzdikaulių iš karto po humaniško numarinimo. Paprastai ląstelės yra išskiriamos, paruošiamos ir dažomos nustatytais būdais. Maži periferinio kraujo tūriai gali būti gauti pagal atitinkamus gyvūnų gerovės reikalavimus, taikant metodą, kuris užtikrintų bandymų gyvūno išgyvenamumą, pvz., imant kraują iš uodeginės venos ar kito tinkamo kraujo indo, atliekant širdies punkciją ar imant ėminį iš didelio kraujo indo gyvūną numarinus. Atsižvelgiant į analizės metodą, kaulų čiulpų ar iš periferinio kraujo gautų eritrocitų ląstelės gali būti nedelsiant supravitaliai dažomos (16) (17) (18), daromi tepinėliai ir tada dažomi mikroskopijai arba fiksuojami ir tinkamai dažomi tėkmės citometrinei analizei atlikti. Naudojant DNR specifinius dažus, pvz., akridino oranžinį (35) ar Hoechst 33258 ir pironiną Y (36), galima pašalinti kai kuriuos artefaktus, susijusius su DNR atžvilgiu nespecifinių dažų naudojimu. Šis privalumas netrukdo naudoti įprastinių dažų (pvz., Giemsa dažus mikroskopinei analizei atlikti). Taip pat galima naudoti papildomas sistemas (pvz., celiulioze užpildytas kolonėles, skirtas branduolius turinčioms ląstelėms pašalinti (37) (38)), jei būtų įrodyta, kad šios sistemos yra suderinamos su ėminių paruošimu laboratorijoje.

Jei taikomi šie metodai, mikrobranduolių tipui identifikuoti (chromosomų ar chromosomų fragmentų), kad būtų galima nustatyti, ar mikrobranduolių indukcijos mechanizmas susijęs su klastogeniniu ir (arba) aneugeniniu aktyvumu, gali būti naudojami antikinetochoro antikūnai (39), FISH analizė ir pancentromeriniai DNR zondai (40) arba in situ ženklinimas pancentromerų specifiniais užpildais kartu su atitinkamu DNR priešpriešiniu dažymu (41). Gali būti taikomi kiti metodai klastogenams ir aneugenams atskirti, jei jie pasirodytų efektyvūs.

Analizė (rankiniu būdu ir automatizuota)

Prieš atliekant bet kurio tipo analizę visi objektiniai stikleliai ar ėminiai, įskaitant teigiamus ir neigiamus kontrolinius ėminius, turėtų būti nepriklausomai užkoduoti ir randomizuoti, kad skaičiuotojas rankiniu būdu nežinotų apdorojimo sąlygų; toks kodavimas nebūtinas, kai naudojamos automatizuotos skaičiavimo sistemos, kurios nepriklauso nuo vizualios apžiūros ir negali būti paveiktos veiklos vykdytojo šališkumo. Nustatomas kiekvieno gyvūno nesubrendusių eritrocitų kiekis kaip visų eritrocitų (subrendusių ir nesubrendusių) skaičiaus dalis, suskaičiuojant ne mažiau kaip 500 kaulų čiulpų eritrocitų ir 2 000 periferinio kraujo eritrocitų (42). Reikėtų suskaičiuoti ne mažiau kaip 4 000 nesubrendusių eritrocitų vienam gyvūnui, kad būtų galima nustatyti nesubrendusių eritrocitų su mikrobranduoliais dažnumą (43). Jei istorinių neigiamų kontrolinių ėminių duomenų bazė rodo, kad bandymo laboratorijos vidutinis foninis nesubrendusių eritrocitų su mikrobranduoliais dažnumas yra < 0,1 %, reikėtų atsižvelgti į galimybę skaičiuoti papildomas ląsteles. Analizuojant ėminius, apdorotų gyvūnų nesubrendusių eritrocitų dalis visų eritrocitų atžvilgiu neturėtų būti mažesnė kaip 20 % nešiklio ar tirpiklio kontrolinių ėminių dalies, kai skaičiuojama mikroskopu, ir ne mažesnė kaip maždaug 5 % nešiklio ar tirpiklio kontrolinių ėminių dalies, kai CD71+ nesubrendę eritrocitai skaičiuojami citometriniais metodais (žr. 31 pastraipą) (29). Pvz., jei atliekant kaulų čiulpų tyrimą mikroskopu, kontrolinio ėminio kaulų čiulpų nesubrendusių eritrocitų dalis yra 50 %, viršutinė toksiškumo riba būtų 10 % nesubrendusių eritrocitų.

Kadangi žiurkių blužnis atskiria ir suardo eritrocitus su mikrobranduoliais, siekiant užtikrinti didelį tyrimo jautrį, kai analizuojamas žiurkių periferinis kraujas, atliekant nesubrendusių eritrocitų su mikrobranduoliais analizę pageidautina apsiriboti jauniausia frakcija. Kai taikomi automatizuotos analizės metodai, šiuos labiausiai nesubrendusius eritrocitus galima nustatyti pagal jų didelį RNR kiekį arba jų paviršiuje ekspresuotų transferino receptorių (CD71+) didelį lygį (31). Tačiau tiesioginis daugelio dažymo būdų palyginimas parodė, kad priimtinus rezultatus galima gauti taikant įvairius būdus, įskaitant įprastinį dažymą akridino oranžiniu (3) (4).

DUOMENYS IR ATASKAITOS RENGIMAS

Rezultatų apdorojimas

Kiekvienam gyvūnui gauti rezultatai turėtų būti pateikiami lentelėse. Turėtų būti atskirai įrašytas kiekvieno tirto gyvūno suskaičiuotų nesubrendusių eritrocitų skaičius, nesubrendusių eritrocitų su mikrobranduoliais skaičius bei nesubrendusių ir subrendusių eritrocitų skaičiaus santykis. Kai pelės apdorojamos nuolat 4 savaites ar ilgiau, taip pat reikėtų pateikti subrendusių eritrocitų skaičiaus ir subrendusių eritrocitų su mikrobranduoliais dalies duomenis, jei renkami. Ataskaitoje taip pat reikėtų pateikti toksiškumo gyvūnams ir klinikinių požymių duomenis.

Priimtinumo kriterijai

Apie bandymo priimtinumą sprendžiama pagal šiuos kriterijus:

Rezultatų įvertinimas ir aiškinimas

Jei įvykdomi visi priimtinumo kriterijai, bandomoji cheminė medžiaga laikoma aiškiai teigiama, jei:

Jei tam tikru ėminio ėmimo laiku tiriama tik didžiausia dozė, bandomoji cheminė medžiaga laikoma aiškiai teigiama, jei yra statistiškai reikšmingas padidėjimas palyginti su vienalaikiu neigiamu kontroliniu ėminiu, o rezultatai yra už istorinių neigiamų kontrolinių ėminių duomenų skirstinio ribų (pvz., Puasono skirstinio 95 % kontrolinių ribų). Rekomendacijų dėl tinkamiausių statistinių metodų galima rasti literatūroje (44) (45) (46) (47). Atliekant dozės ir atsako priklausomybės analizę, reikėtų analizuoti ne mažiau kaip tris dozę gavusias grupes. Statistiniai kriterijai turėtų naudoti gyvūną kaip bandymo vienetą. Atliekant mikrobranduolių bandymą gauti teigiami rezultatai rodo, kad bandomoji cheminė medžiaga sukelia mažųjų branduolių atsiradimą dėl bandymo rūšies gyvūnų chromosomų ar eritroblastų mitozinio aparato pažeidimų. Jei bandymas atliekamas centromeroms mikrobranduoliuose aptikti, bandomoji cheminė medžiaga, kuri gamina centromeras turinčius mikrobranduolius (centromeros DNR ar kinetochoras, kurie rodo ištisos chromosomos praradimą), akivaizdžiai yra aneugenas.

Jei įvykdomi visi priimtinumo kriterijai, bandomoji cheminė medžiaga laikoma aiškiai neigiama, jei visomis ištirtomis bandymo sąlygomis:

Rekomendacijų dėl tinkamiausių statistinių metodų galima rasti literatūroje (44) (45) (46) (47). Kaulų čiulpų paveikimo bandomąja chemine medžiaga įrodymu gali būti nesubrendusių ir subrendusių eritrocitų santykio sumažėjimas arba bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos verčių plazmoje ar kraujyje matavimas. Jei cheminė medžiaga leidžiama į veną, poveikio įrodyti nebūtina. Siekiant įrodyti, kad kaulų čiulpai buvo paveikti, taip pat galima naudoti ADME (absorbcijos, pasiskirstymo, metabolizmo, šalinimo) duomenis, gautus atliekant nepriklausomą tyrimą, kuriame būtų naudojamas tas pats davimo būdas ir ta pati rūšis. Neigiami rezultatai rodo, kad bandymo sąlygomis bandomoji cheminė medžiaga nesukelia mažųjų branduolių atsiradimo bandymo rūšies gyvūnų nesubrendusiuose eritrocituose.

Nėra reikalavimo patikrinti aiškų teigiamą ar neigiamą atsaką.

Tais atvejais, kai atsakas nėra aiškiai neigiamas ar teigiamas, ir siekiant padėti nustatyti rezultato biologinę svarbą (pvz., mažas ar fono padidėjimas), duomenys turėtų būti įvertinti pateikiant ekspertų nuomonę ir (arba) atliekant papildomus baigtų bandymų tyrimus. Kai kuriais atvejais galėtų būti naudinga analizuoti didesnį ląstelių skaičių arba pakartoti bandymą, naudojant modifikuotas bandymo sąlygas.

Retais atvejais, netgi atlikus papildomus tyrimus, duomenų nepakaks padaryti išvadą, ar bandomajai cheminei medžiagai gauti rezultatai yra teigiami ar neigiami, todėl bus priimtas sprendimas, kad tyrimas yra dviprasmis.

Bandymo ataskaita

Į bandymo ataskaitą turėtų būti įtraukta ši informacija:

LITERATŪRA

6)

B dalies B.15 skyrius išbraukiamas.

7)

B dalies B.16 skyrius išbraukiamas.

8)

B dalies B.18 skyrius išbraukiamas.

9)

B dalies B.19 skyrius išbraukiamas.

10)

B dalies B.20 skyrius išbraukiamas.

11)

B dalies B.24 skyrius išbraukiamas.

12)

B dalies B.47 skyrius pakeičiamas taip:

„B.47   Galvijų ragenos drumstumo ir pralaidumo bandymo metodas, skirtas identifikuoti i) chemines medžiagas, sukeliančias smarkų akių pažeidimą, ir ii) chemines medžiagas, kurių nereikia klasifikuoti kaip dirginančias akis ar sukeliančias smarkų akių pažeidimą

ĮVADAS

Šis bandymo metodas atitinka EBPO bandymo gaires (TG) 437 (2013). Galvijų ragenos drumstumo ir pralaidumo (angl. Bovine Corneal Opacity and Permeability, BCOP) bandymo metodą 2006 m. ir 2010 m. įvertino Alternatyvių metodų patvirtinimo tarpžinybinio koordinavimo komitetas (angl. Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods, ICCVAM) kartu su Europos alternatyvių metodų patvirtinimo centru (angl. European Centre for the Validation of Alternative Methods, ECVAM) ir Japonijos alternatyvių metodų patvirtinimo centru (angl. Japanese Centre for the Validation of Alternative Methods, JaCVAM) (1)(2). Atliekant pirmąjį įvertinimą, buvo tiriama, ar BCOP bandymo metodas tinka nustatant chemines medžiagas (medžiagas ir mišinius), kurios sukelia smarkų akių pažeidimą (1). Atliekant antrąjį įvertinimą, buvo tiriama, ar BCOP bandymų metodas tinka nustatant chemines medžiagas (medžiagas ir mišinius), kurios neklasifikuojamos kaip dirginančios akis ar sukeliančios smarkų akių pažeidimą (2). BCOP tinkamumo patvirtinimo duomenų bazę iš viso sudarė 113 medžiagų ir 100 mišinių (2)(3). Atsižvelgiant į šiuos įvertinimus ir jų ekspertizę buvo padaryta išvada, kad taikant bandymų metodą galima tinkamai identifikuoti chemines medžiagas (medžiagas ir mišinius), sukeliančias smarkų akių pažeidimą (1 kategorijos), taip pat medžiagas, kurių nereikia klasifikuoti kaip dirginančias akis ar sukeliančias smarkų akių pažeidimą, kaip apibrėžta Jungtinių Tautų (JT) visuotinai suderintoje cheminių medžiagų klasifikavimo ir ženklinimo sistemoje (GHS) (4) ir Reglamente (EB) Nr. 1272/2008 dėl cheminių medžiagų ir mišinių klasifikavimo, ženklinimo ir pakavimo (CLP) (7), todėl jis buvo patvirtintas kaip moksliškai tinkamas abiem tikslams. Smarkus akių pažeidimas – tai akies audinio pažeidimas arba smarkus fizinis regėjimo pablogėjimas, ant išorinio akies paviršiaus uždėjus bandomosios cheminės medžiagos, kuris ne visiškai praeina per 21 dieną nuo uždėjimo. Bandomosios cheminės medžiagos, kurios sukelia smarkų akių pažeidimą, pagal JT GHS klasifikuojamos kaip 1 kategorijos medžiagos. Cheminės medžiagos, neklasifikuojamos kaip dirginančios akis ar sukeliančios smarkų akių pažeidimą, apibrėžiamos kaip medžiagos, kurios neatitinka JT GHS 1 ar 2 kategorijos (2A ar 2B) klasifikavimo reikalavimų, t. y. jos nurodomos kaip JT GHS be kategorijos. Į šį bandymų metodą įtrauktas BCOP bandymų metodo rekomenduojamas taikymas ir apribojimai, pagrįsti jo įvertinimo darbais. Pagrindiniai skirtumai tarp EBPO bandymų gairių originalios 2009 m. versijos ir atnaujintos 2013 m. versijos yra susiję su šiais dalykais (tačiau ne tik): BCOP metodo taikymas nustatant chemines medžiagas, kurių nereikia klasifikuoti pagal JT GHS (2 ir 7 pastraipos); pateikti paaiškinimai dėl BCOP bandymo metodo taikomumo bandant alkoholius, ketonus ir kietąsias medžiagas (6 ir 7 pastraipos) bei medžiagas ir mišinius (8 pastraipa); paaiškinta, kaip reikėtų bandyti paviršinio aktyvumo medžiagas ir jų turinčius mišinius (28 pastraipa); atnaujintas ir paaiškintas teigiamų kontrolinių ėminių naudojimas (39 ir 40 pastraipos); atnaujinti BCOP bandymų metodo sprendimo priėmimo kriterijai (47 pastraipa); atnaujinti tyrimo priimtinumo kriterijai (48 pastraipa); atnaujinti bandymo ataskaitos elementai (49 pastraipa); atnaujintos 1 priedėlio apibrėžtys; papildytas 2 priedėlis dėl BCOP bandymų metodo tinkamumo prognozėms daryti pagal skirtingas klasifikavimo sistemas; atnaujintas 3 priedėlio kvalifikacijai tikrinti naudojamų cheminių medžiagų sąrašas ir atnaujintas 4 priedėlis dėl BCOP ragenos laikiklio (1 pastraipa) ir drumstumo matuoklio (2 ir 3 pastraipos).

Šiuo metu visuotinai pripažįstama, kad artimiausioje ateityje joks vienas in vitro akių dirginimo bandymas negalės pakeisti Draize akių bandymo in vivo siekiant prognozuoti skirtingų cheminių klasių visą dirginimo gebos intervalą. Tačiau kelių alternatyvių bandymų metodų strateginiai deriniai taikant (nuosekliųjų) bandymų strategiją galėtų pakeisti Draize akių bandymą (5). Žemynkryptis metodas (5) skirtas taikyti tada, kai, atsižvelgiant į esamą informaciją, daroma prielaida apie didelę cheminės medžiagos dirginamojo poveikio gebą, o aukštynkryptis metodas (5) skirtas taikyti tada, kai, atsižvelgiant į esamą informaciją, daroma prielaida, kad cheminė medžiaga nepakankamai dirgina akis, kad ją reikėtų klasifikuoti. BCOP bandymų metodas – bandymų metodas in vitro, kuris su tam tikrais apribojimais ir tam tikromis aplinkybėmis gali būti taikomas klasifikuoti ir ženklinti cheminėms medžiagoms, keliančioms pavojų akims. Nors kaip atskiras metodas BCOP metodas nelaikomas tinkamu pakeisti triušių akių bandymą in vivo, jis rekomenduojamas kaip pirmas bandymų strategijos etapas, pvz., žemynkryptis metodas, pasiūlytas Scott et al. (5), be papildomų bandymų nustatant chemines medžiagas, sukeliančias smarkų akių pažeidimą, t. y. chemines medžiagas, kurias reikia klasifikuoti kaip JT GHS 1 kategorijos medžiagas (4). BCOP bandymų metodas taip pat rekomenduojamas, kai reikia identifikuoti chemines medžiagas, kurių nereikia klasifikuoti kaip dirginančias akis ar sukeliančias smarkų akių pažeidimą, kaip apibrėžta JT GHS (JT GHS be kategorijos) (4), taikant bandymų strategiją, pvz., aukštynkryptį metodą (5). Tačiau cheminė medžiaga, kuri pagal BCOP bandymų metodą nelaikoma galinčia sukelti smarkų akių pažeidimą arba neklasifikuojama dėl akių dirginimo ar smarkaus akių pažeidimo, turėtų būti bandoma papildomai (in vitro ir (arba) in vivo) galutinei klasifikavimo kategorijai nustatyti.

Šio bandymo metodo tikslas – aprašyti procedūras, taikomas įvertinant bandomosios cheminės medžiagos keliamo pavojaus akims galimybę, matuojant jos gebą sukelti atskirai paimtos galvijo ragenos drumstumą ir padidėjusį pralaidumą. Toksinis poveikis ragenai vertinamas pagal: (i) sumažėjusį šviesos pralaidumą (drumstumą) ir ii) padidėjusią fluoresceino natrio druskos dažiklio skverbtį (pralaidumą). Bandomąja chemine medžiaga paveiktos ragenos drumstumo ir pralaidumo vertinimo rezultatai bendrinami, kad būtų gautas in vitro dirginimo balas (angl. In Vitro Irritancy Score, IVIS), kuris naudojamas bandomosios cheminės medžiagos dirginimo gebos lygiui klasifikuoti.

Apibrėžtys pateiktos 1 priedėlyje.

PRADINIAI ASPEKTAI IR APRIBOJIMAI

Šis bandymų metodas pagrįstas ICCVAM BCOP bandymo metodo protokolu (6)(7), kuris iš pradžių buvo sukurtas pagal informaciją, gautą iš In vitro bandymų metodų instituto (angl. Institute for In Vitro Sciences, IIVS) protokolo ir iš INVITTOX protokolo Nr. 124 (8). Pastarasis atitinka protokolą (10), kuris buvo naudojamas 1997–1998 m. atliekant Europos bendrijos finansuotą preliminaraus patvirtinimo tyrimą. Abu šie protokolai buvo pagrįsti BCOP bandymų metodu, kurį pirmasis paskelbė Gautheron et al. (9).

BCOP bandymų metodas gali būti taikomas nustatant chemines medžiagas, kurios sukelia smarkų akių pažeidimą, kaip apibrėžta JT GHS, t. y. chemines medžiagas, kurias reikia priskirti JT GHS 1 kategorijai (4). Kai taikomas šiuo tikslu, BCOP bandymų metodo visuminis tikslumas – 79 % (150/191), klaidingai teigiamų rezultatų dalis – 25 % (32/126), klaidingai neigiamų rezultatų dalis – 14 % (9/65), palyginti su triušio akies bandymo metodo in vivo duomenimis, klasifikuojamais pagal JT GHS klasifikavimo sistemą (3) (žr. 2 priedėlio 1 lentelę). Kai tam tikrų cheminių (t. y. alkoholių, ketonų) ar fizikinių (t. y. kietųjų medžiagų) klasių bandomosios cheminės medžiagos pašalinamos iš duomenų bazės, BCOP bandymo metodo bendras tikslumas pagal JT GHS klasifikavimo sistemą siekia 85 % (111/131), klaidingai teigiamų rezultatų dalis – 20 % (16/81), klaidingai neigiamų rezultatų dalis – 8 % (4/50) (3). Galimi BCOP bandymo metodo trūkumai, kai jis taikomas nustatant chemines medžiagas, kurios sukelia smarkų akių pažeidimą (JT GHS 1 kategorijos), susiję su didele klaidingai teigiamų rezultatų dalimi bandant alkoholius bei ketonus ir didele klaidingai neigiamų rezultatų dalimi bandant kietąsias medžiagas, kaip nurodyta tinkamumo patvirtinimo duomenų bazėje (1)(2)(3). Tačiau kadangi taikant BCOP bandymų metodą neteisingai įvertinami ne visi alkoholiai ar ketonai, o kai kurie tiksliai nustatomi kaip JT GHS 1 kategorijos, šios dvi organinės funkcinės grupės nelaikomos nepatenkančiomis į bandymo metodo taikymo sritį. Šio bandymo metodo naudotojas turi nuspręsti, ar galimas alkoholio arba ketono pervertinimas yra priimtinas ar reikia atlikti papildomus bandymus taikant įrodomosios duomenų galios metodą. Kalbant apie klaidingai neigiamų rezultatų dalį, reikėtų pažymėti, kad atliekant kietųjų medžiagų Draize akių dirginimo bandymą in vivo, gali susidaryti kintamos ir ribinės veikimo sąlygos, todėl gali būti gautos netinkamos jų tikrosios dirginamosios gebos prognozės (10). Taip pat reikėtų pažymėti, kad, identifikuojant chemines medžiagas, sukeliančias smarkų akių pažeidimą (JT GHS 1 kategorijos), nė vienai ICCVAM tinkamumo įvertinimo duomenų bazėje (2)(3) nurodytai klaidingai neigiamai cheminei medžiagai nebuvo gauta IVIS ≤ 3 vertė, kuri naudojama kaip kriterijus cheminę medžiagą identifikuojant kaip JT GHS be kategorijos. Be to, BCOP klaidingai neigiamas rezultatas šiame kontekste esmės nekeičia, nes, priklausomai nuo reglamentavimo reikalavimų, visos bandomosios cheminės medžiagos, kurioms gaunama 3 < IVIS ≤ 55 vertė, vėliau būtų bandomos atliekant tinkamai patvirtintus bandymus in vitro arba, blogiausiu atveju, atliekant bandymą su triušiais pagal įrodomosios duomenų galios metodą taikant nuosekliųjų bandymų strategiją. Kadangi taikant BCOP bandymų metodą kai kurios kietosios medžiagos yra tiksliai nustatomos kaip JT GHS 1 kategorijos medžiagos, ši agregatinė būsena taip pat nelaikoma nepatenkančia į bandymo metodo taikymo sritį. Tyrėjai galėtų spręsti, ar taikyti šį bandymų metodą visų tipų cheminėms medžiagoms, o IVIS > 55 turėtų būti priimta kaip smarkų akių pažeidimą sukeliančio atsako rodiklis ir cheminę medžiagą reikėtų klasifikuoti kaip JT GHS 1 kategorijos be papildomų bandymų. Tačiau, kaip buvo nurodyta pirmiau, alkoholiams ar ketonams gautus teigiamus rezultatus dėl galimo pervertinimo reikėtų aiškinti atsargiai.

BCOP bandymo metodą taip pat galima taikyti nustatant chemines medžiagas, kurių nereikia klasifikuoti kaip dirginančių akis arba sukeliančių smarkų akių pažeidimą pagal JT GHS klasifikavimo sistemą (4). Kai taikomas šiuo tikslu, BCOP bandymų metodo bendras tikslumas – 69 % (135/196), klaidingai teigiamų rezultatų dalis – 69 % (61/89), klaidingai neigiamų rezultatų dalis – 0 % (0/107) palyginti su triušio akies bandymo metodo in vivo duomenimis, klasifikuojamais pagal JT GHS klasifikavimo sistemą (3) (žr. 2 priedėlio 2 lentelę). Gauta klaidingai teigiamų rezultatų dalis (in vivo JT GHS be kategorijos cheminės medžiagos, kurių IVIS > 3, žr. 47 pastraipą) yra labai didelė, bet šiame kontekste ji esmės nekeičia, nes, priklausomai nuo reglamentavimo reikalavimų, visos bandomosios cheminės medžiagos, kurioms gaunama 3 < IVIS ≤ 55 vertė, vėliau būtų bandomos atliekant tinkamai patvirtintus bandymus in vitro arba, blogiausiu atveju, atliekant bandymą su triušiais, pagal įrodomosios duomenų galios metodą taikant nuosekliųjų bandymų strategiją. BCOP bandymų metodas neturi specifinių trūkumų bandant alkoholius, ketonus ir kietąsias medžiagas, kai tikslas yra identifikuoti chemines medžiagas, kurių nereikia klasifikuoti kaip dirginančių akis arba sukeliančių smarkų akių pažeidimą (JT GHS be kategorijos) (3). Tyrėjai galėtų pamąstyti apie šio bandymo metodo taikymą visų tipų cheminėms medžiagoms, o neigiamas rezultatas (IVIS ≤ 3) turėtų būti laikomas kaip rodiklis, kad nereikia klasifikuoti (JT GHS be kategorijos). Kadangi BCOP bandymų metodu galima tiksliai identifikuoti tik 31 % cheminių medžiagų, kurių nereikia klasifikuoti kaip dirginančių akis arba sukeliančių smarkų akių pažeidimą, šis bandymų metodas neturėtų būti pirmoji pasirinktis pradedant taikyti aukštynkryptį metodą (5), jei yra kitų patvirtintų ir priimtų panašaus didelio jautrumo ir dar didesnio specifiškumo in vitro metodų.

BCOP tinkamumo patvirtinimo duomenų bazę iš viso sudarė 113 medžiagų ir 100 mišinių (2)(3). Todėl BCOP bandymų metodas laikomas tinkamu bandyti medžiagas ir mišinius.

BCOP bandymų metodas nerekomenduojamas, kai reikia identifikuoti bandomąsias chemines medžiagas, kurias reikėtų klasifikuoti kaip akis dirginančias (JT GHS 2 kategorija ar 2A kategorija), arba bandomąsias chemines medžiagas, kurias reikėtų klasifikuoti kaip akis nestipriai dirginančias (JT GHS 2B kategorija), dėl gana didelio skaičiaus JT GHS 1 kategorijos cheminių medžiagų, klaidingai priskiriamų JT GHS 2, 2A ar 2B kategorijai, ir JT GHS be kategorijos cheminių medžiagų, klaidingai priskiriamų JT GHS 2, 2A ar 2B kategorijai (2)(3). Šiuo tikslu gali prireikti papildomų bandymų taikant kitą tinkamą metodą.

Visos procedūros su galvijų akimis ir galvijų ragenomis turėtų būti atliekamos pagal bandymų laboratorijos taisykles ir procedūras, taikytinas gyvūninės kilmės medžiagoms, įskaitant audinius ir audinių skysčius, bet neapsiribojant tik jais. Rekomenduojama laikytis bendrųjų laboratorijose taikytinų atsargumo priemonių (11).

Nors taikant šį BCOP bandymų metodą neatsižvelgiama į akies junginės ir rainelės pažeidimus, tiriamas poveikis ragenai, kuris yra pagrindinis rodiklis, klasifikuojant in vivo pagal JT GHS klasifikavimą. Taikant BCOP bandymų metodą, ragenos pažeidimų grįžtamumas negali būti tiesiogiai įvertintas. Atsižvelgiant į triušio akies tyrimus, buvo pasiūlyta ragenos žaizdos pradinį gylį naudoti kaip galimą būdą kai kuriems negrįžtamo poveikio tipams nustatyti (12). Tačiau reikia turėti papildomų mokslinių duomenų, kad būtų galima suprasti, kaip atsiranda negrįžtamas poveikis, kuris nėra susijęs su dideliu pradinio pažeidimo lygiu. Galiausiai, taikant BCOP bandymų metodą, negalima įvertinti su poveikiu akims susijusio sisteminio toksiškumo galimybės.

Šis bandymų metodas bus periodiškai atnaujinamas, kai tik bus išnagrinėta nauja informacija ir duomenys. Pvz., histopatologija gali būti naudinga, kai reikia išsamiau apibūdinti ragenos pažeidimus. Kaip aprašyta EBPO rekomendaciniame dokumente Nr. 160 (13), naudotojai skatinami konservuoti ragenas ir ruošti histopatologinius bandinius, kuriuos galima naudoti kuriant duomenų bazę ir sprendimo priėmimo kriterijus, galinčius pagerinti šio bandymų metodo tikslumą.

Kiekviena laboratorija, kuri pradėtų taikyti šį bandymo metodą, turėtų naudoti 3 priedėlyje nurodytas kvalifikacijai tikrinti skirtas chemines medžiagas. Laboratorija gali naudoti šias chemines medžiagas, norėdama įrodyti savo techninę kompetenciją taikyti BCOP bandymų metodą, prieš pateikdama BCOP bandymo duomenis teisės aktuose numatytais pavojų klasifikavimo tikslais.

BANDYMO PRINCIPAS

BCOP bandymo metodas yra tipinis konkretaus organo tyrimo modelis, pagal kurį galima išsaugoti normalų trumpalaikį fiziologinį ir biocheminį galvijų ragenos funkcionavimą in vitro. Pagal šį bandymo metodą bandomosios cheminės medžiagos sukeltas pažeidimas nustatomas kiekybiškai įvertinant ragenos drumstumo ir pralaidumo pokyčius drumstumo matuokliu ir regimosios šviesos spektrofotometru. Abu matavimai naudojami siekiant apskaičiuoti IVIS, kuri naudojama in vitro dirginimo pavojaus klasifikavimo kategorijai nustatyti, kad būtų galima prognozuoti bandomosios cheminės medžiagos gebą dirginti akis in vivo (žr. 48 pastraipą Sprendimo priėmimo kriterijai).

Pagal BCOP bandymo metodą naudojamos atskirtos ragenos, paimtos iš ką tik paskerstų galvijų akių. Ragenos drumstumas kiekybiškai įvertinamas matuojant ragenos praleidžiamos šviesos kiekį. Ragenos pralaidumas kiekybiškai įvertinamas kaip per visą ragenos storį prasiskverbusio fluoresceino natrio druskos dažiklio kiekis, nustatytas užpakalinės kameros terpėje. Bandomosios cheminės medžiagos uždedamos ant ragenos epitelio paviršiaus jų įdedant į ragenos laikiklio priekinę kamerą. 4 priedėlyje pateiktas ragenos laikiklio, naudojamo taikant BCOP bandymo metodą, aprašymas ir schema. Ragenų laikiklių galima įsigyti iš įvairių šaltinių arba pasidaryti.

Galvijų akių šaltinis bei amžius ir gyvūnų rūšies pasirinkimas

Į skerdyklas atvežti galvijai paprastai skerdžiami žmonių maistui arba kitais komerciniais tikslais. BCOP bandymo metodui skirtų ragenų šaltinis gali būti tik sveiki gyvūnai, kurie laikomi tinkamais naudoti žmonių maisto grandinėje. Kadangi galvijų masės intervalas gana didelis ir priklauso nuo veislės, amžiaus bei lyties, nėra nustatyta rekomenduojama skerdžiamo gyvūno masė.

Ragenų matmenys gali skirtis dėl gyvūnų amžiaus skirtumo. Ragenos, kurių horizontalus skersmuo > 30,5 mm ir ragenos storio per vidurį vertės ≥ 1 100 μm, paprastai gaunamos iš senesnių kaip aštuonerių metų galvijų, o ragenos, kurių horizontalus skersmuo < 28,5 mm ir ragenos storis per vidurį < 900 μm, paprastai gaunamos iš jaunesnių kaip penkerių metų galvijų (14). Dėl šios priežasties senesnių kaip 60 mėnesių galvijų akys paprastai nenaudojamos. Jaunesnių kaip 12 mėnesių galvijų akys paprastai nenaudojamos, nes jos vis dar vystosi, o jų ragenos storis ir skersmuo yra gerokai mažesni nei suaugusių galvijų. Tačiau jaunų gyvūnų (t. y. 6–12 mėnesių) ragenas naudoti leidžiama, nes jų naudojimas turi tam tikrų pranašumų, pvz., jų lengviau gauti, amžiaus intervalas yra nedidelis ir yra mažiau pavojų, susijusių su galimu galvijų spongiforminės encefalopatijos poveikiu darbuotojams (15). Kadangi būtų naudinga papildomai įvertinti ragenos matmenų arba storio įtaką atsako į ėsdinančias ir dirginančias chemines medžiagas jautriui, naudotojai prašomi pateikti duomenis apie gyvūnų, iš kurių gautos per tyrimą naudotos ragenos, apytikrį amžių ir (arba) masę.

Akių paėmimas ir transportavimas į laboratoriją

Akis surenka skerdyklų darbuotojai. Siekiant, kad mechaninis ir kitoks akių pažeidimas būtų kuo mažesnis, jas iš paskersto gyvulio reikėtų išimti kiek įmanoma greičiau, nedelsiant atšaldyti ir atšaldytas vežti. Skerdyklų darbuotojai neturėtų naudoti valiklių gyvulio galvai nuplauti, kad į akis nepatektų galinčių dirginti cheminių medžiagų.

Akis reikėtų visiškai panardinti į atvėsintą Hankso subalansuotą druskos tirpalą (angl. Hanks' Balanced Salt Solution, HBSS), supiltą į tinkamo dydžio talpyklą, ir į laboratoriją jos turėtų būti vežamos taip, kad būtų kuo mažiau pažeistos ir (arba) užkrėstos bakterijomis. Kadangi akys imamos skerdžiant, jos gali būti išteptos krauju ir kitomis biologinėmis medžiagomis, įskaitant bakterijas ir kitus mikroorganizmus. Todėl svarbu užtikrinti kuo mažesnį užkrėtimo pavojų (pvz., surenkant ir vežant indą su akimis laikyti ant drėgno ledo ir į joms vežti naudojamą HBSS tirpalą įdėti antibiotikų, pvz., 100 IU/ml penicilino ir 100 μg/ml streptomicino).

Laiko tarpas nuo akių surinkimo iki ragenų panaudojimo taikant BCOP bandymų metodą turėtų būti kuo trumpesnis (paprastai jos surenkamos ir naudojamos tą pačią dieną) ir reikėtų įrodyti, kad dėl to neigiamos įtakos tyrimo rezultatams nepadaryta. Šie rezultatai yra pagrįsti akių atrankos kriterijais ir teigiamų bei neigiamų kontrolinių ėminių atsaku. Visos tyrimui naudojamos akys turėtų būti iš tos pačios tam tikrą dieną surinktų akių grupės.

Taikant BCOP bandymo metodą naudojamų akių atrankos kriterijai

Į laboratoriją atvežtos akys atidžiai apžiūrimos, ar jos neturi defektų, įskaitant padidėjusį drumstumą, įbrėžimus ir neovaskuliarizaciją. Turėtų būti naudojamos tik tokių defektų neturinčių akių ragenos.

Be to, kiekvienos ragenos kokybė įvertinama vėlesniais tyrimo etapais. Ragenos, kurių drumstumas po pradinio vienos valandos trukmės pusiausvirinimo laikotarpio yra didesnis kaip septyni drumstumo vienetai arba lygiavertis, naudojant kitą drumstumo matuoklį ir ragenos laikiklį, atmetamos (PASTABA. Drumstumo matuoklis turėtų būti kalibruotas pagal drumstumo etalonus, naudojamus drumstumo vienetams nustatyti, žr. 4 priedėlį).

Kiekvieną apdorojimo grupę (bandomosios cheminės medžiagos, vienalaikių neigiamų ir teigiamų kontrolinių ėminių) sudaro ne mažiau kaip trys akys. Taikant BCOP bandymų metodą, neigiamam kontroliniam ėminiui reikėtų naudoti tris ragenas. Kadangi visos ragenos yra išpjaunamos iš viso akies obuolio ir įdedamos į ragenų kameras, dėl tvarkymo veiksmų gali būti ragenų drumstumo ir pralaidumo verčių artefaktų (įskaitant neigiamą kontrolinį ėminį). Be to, drumstumo ir pralaidumo vertės, gautos neigiamų kontrolinių ėminių ragenoms, yra naudojamos bandomąja chemine medžiaga apdorotų ir teigiamų kontrolinių ėminių ragenų drumstumo ir pralaidumo vertėms koreguoti, atliekant IVIS skaičiavimus.

PROCEDŪRA

Akių paruošimas

Stengiantis nepažeisti ragenos epitelio ir endotelio, defektų neturinčios ragenos išpjaunamos kartu su 2–3 mm pločio odenos žiedu, kuris paliekamas tam, kad vėliau būtų patogiau tvarkyti rageną. Atskirtos ragenos įdedamos į specialios konstrukcijos ragenų laikiklius, sudarytus iš priekinės ir užpakalinės kamerų, kurios liečiasi su ragenos epitelio ir endotelio pusėmis. Abi kameros iki viršaus pripildomos pašildyta Eagle'o minimalia pagrindine terpe (angl. Eagle's Minimum Essential Medium, EMEM) be fenolio raudonojo (pirmiau užpakalinė kamera) taip, kad nesusidarytų burbulų. Tada ne trumpiau kaip vieną valandą įtaisas pusiausvirinamas 32 ± 1 °C temperatūroje, kad susilygintų ragenų bei terpės temperatūra ir būtų gautas kiek įmanoma normalus metabolinis aktyvumas (apytikrė ragenos paviršiaus temperatūra in vivo yra 32 °C).

Pasibaigus pusiausvirinimo laikotarpiui, abi kameros pripildomos naujos pašildytos EMEM be fenolio raudonojo, ir registruojami kiekvienos ragenos pradinio drumstumo rodmenys. Visos ragenos, turinčios makroskopinių audinio pažeidimų (pvz., įbrėžimų, pigmentinių dėmių, neovaskuliarizacijos požymių) arba kurių drumstumas yra didesnis kaip septyni drumstumo vienetai arba lygiavertis, naudojant kitą drumstumo matuoklį ir ragenos laikiklį, atmetamos. Ne mažiau kaip trys ragenos pasirenkamos kaip neigiamo (arba tirpiklio) kontrolinio ėminio ragenos. Likusios ragenos padalijamos į paveikimo bandomąja chemine medžiaga grupę ir teigiamo kontrolinio ėminio grupę.

Kadangi vandens šiluminė talpa didesnė už oro, vanduo užtikrina stabilesnes inkubavimo temperatūros sąlygas. Todėl ragenos laikiklį ir jo turinį rekomenduojama laikyti vandens vonioje, kurioje būtų palaikoma 32 ± 1 °C temperatūra. Tačiau gali būti naudojami ir oro inkubatoriai, jei būtų imtasi priemonių temperatūros stabilumui užtikrinti (pvz., iš anksto pašildant laikiklius ir terpę).

Bandomosios cheminės medžiagos įterpimas

Taikomi du skirtingi apdorojimo protokolai: vienas – skysčiams ir paviršinio aktyvumo medžiagoms (kietosioms medžiagoms arba skysčiams), kitas – kietosioms ne paviršinio aktyvumo medžiagoms.

Skysčiai bandomi neskiesti. Pusiau kietosios medžiagos, tepalai ir vaškai paprastai bandomi kaip skysčiai. Grynos paviršinio aktyvumo medžiagos bandomos naudojant 10 % m/V koncentracijos tirpalą 0,9 % natrio chlorido tirpale, distiliuotame vandenyje arba kitame tirpiklyje, kuris, kaip buvo įrodyta, neturi neigiamo poveikio bandymo sistemai. Reikėtų tinkamai pagrįsti kitas praskiestų tirpalų koncentracijos vertes. Paviršinio aktyvumo medžiagų turinčius mišinius galima bandyti neskiestus arba praskiestus iki reikiamos koncentracijos, atsižvelgiant į atitinkamą veikimo scenarijų in vivo. Bandyme naudojamą koncentraciją reikėtų tinkamai pagrįsti. Ragenos veikiamos skysčiais ir paviršinio aktyvumo medžiagomis 10 min. Jei taikoma kitokia veikimo trukmė, ją reikėtų tinkamu būdu moksliškai pagrįsti. Žr. 1 priedėlį, kuriame pateiktos paviršinio aktyvumo medžiagų ir paviršinio aktyvumo medžiagų turinčio mišinio apibrėžtys.

Ne paviršinio aktyvumo kietosios medžiagos paprastai bandomos kaip 20 % m/V koncentracijos tirpalai ar suspensijos 0,9 % natrio chlorido tirpale, distiliuotame vandenyje arba kitame tirpiklyje, kuris, kaip įrodyta, neturi neigiamo poveikio bandymo sistemai. Tam tikromis aplinkybėmis ir pateikus reikiamą mokslinį pagrindimą, kietąsias medžiagas taip pat būtų galima bandyti grynas, jas tiesiogiai uždedant ant ragenos paviršiaus taikant atvirosios kameros metodą (žr. 32 skirsnį). Ragenos veikiamos kietosiomis medžiagomis keturias valandas, tačiau skysčiams ir paviršinio aktyvumo medžiagoms gali būti taikoma kitokia veikimo trukmė, pateikus reikiamą mokslinį pagrindimą.

Atsižvelgiant į bandomosios cheminės medžiagos fizikinę būseną ir chemines savybes (pvz., kietoji medžiaga, skystis, klampus arba neklampus skystis), galima taikyti įvairius apdorojimo būdus. Pagrindinis veiksnys – užtikrinti, kad bandomoji cheminė medžiaga tinkamai padengtų epitelio paviršių ir būtų gerai pašalinta atliekant plovimo veiksmus. Neklampios ir nedidelės klampos bandomosios cheminės medžiagos paprastai bandomos uždarosios kameros metodu, o pusiau klampios ir klampios skystosios bandomosios cheminės medžiagos bei grynos kietosios medžiagos – atvirosios kameros metodu.

Taikant uždarosios kameros metodą, bandomosios cheminės medžiagos kiekis, kurio pakanka ragenos epitelio paviršiui padengti (750 μl), įterpiamas į priekinę kamerą per jos viršutiniame paviršiuje esančią dozavimo angą, veikimo metu užkemšama kamščiu. Svarbu užtikrinti, kad reikiamą laiko tarpą kiekvieną rageną veiktų bandomoji cheminė medžiaga.

Taikant atvirosios kameros metodą, prieš apdorojimą iš priekinės kameros išimamas lango fiksavimo žiedas ir stiklinis langas. Kontrolinė arba bandomoji cheminė medžiaga (750 μl arba toks bandomosios cheminės medžiagos kiekis, kurio pakaktų visai ragenai padengti) tiesiogiai užlašinama ant ragenos epitelio paviršiaus mikropipete. Jei bandomąją cheminę medžiagą sunku įlašinti pipete, dozavimui palengvinti bandomoji cheminė medžiaga gali būti įšvirkšta į stūmoklinę pipetę. Stūmoklinės pipetės antgalis įstatomas į švirkšto dozavimo galą taip, kad medžiagą būti galima įšvirkšti į stūmoklinės pipetės galą. Švirkšto stūmoklis stumiamas, tuo pat metu pipetės stūmoklis traukiamas į viršų. Jei antgalyje atsiranda oro burbuliukų, bandomoji cheminė medžiaga pašalinama (išstumiama), ir procedūra kartojama tol, kol antgalis užpildomas be oro burbuliukų. Prireikus gali būti naudojamas paprastas švirkštas (be adatos), kadangi jį naudojant galima tiksliai išmatuoti bandomosios cheminės medžiagos kiekį ir lengviau padengti ragenos epitelio paviršių. Baigus dozuoti, stiklinis langas įdedamas atgal į priekinę kamerą, taip vėl atkuriant uždarąją sistemą.

Inkubavimas po paveikimo

Pasibaigus veikimo laikotarpiui, bandomoji cheminė medžiaga, neigiama kontrolinė medžiaga arba teigiama kontrolinė cheminė medžiaga pašalinama iš priekinės kameros, epitelis plaunamas ne mažiau kaip tris kartus (arba kol nelieka matomų bandomosios cheminės medžiagos žymių) naudojant EMEM (kurios sudėtyje yra fenolio raudonojo). Plovimui naudojama terpė su fenolio raudonuoju, nes galima stebėti fenolio raudonojo spalvos kitimą, kad būtų galima nustatyti rūgštinių ar šarminių bandomųjų cheminių medžiagų nuplovimo efektyvumą. Jei fenolio raudonasis vis dar keičia spalvą (į geltoną ar į raudonai violetinę) arba jei bandomoji cheminė medžiaga vis dar yra matoma, ragenos plaunamos daugiau kaip tris kartus. Iš terpės pašalinus bandomąją cheminę medžiagą, ragenos paskutinį kartą plaunamos EMEM (be fenolio raudonojo). Paskutinį kartą plaunama EMEM (be fenolio raudonojo) tam, kad prieš drumstumo matavimą fenolio raudonasis būtų visiškai pašalintas iš priekinės kameros. Tada priekinė kamera iš naujo pripildoma nauja EMEM be fenolio raudonojo.

Jei bandomi skysčiai arba paviršinio aktyvumo medžiagos, nuplautos ragenos dar dvi valandas laikomos 32 ± 1 °C temperatūroje. Tam tikromis aplinkybėmis gali būti naudinga ilgesnė laikymo po paveikimo trukmė ir dėl jos būtų galima spręsti kiekvienu konkrečiu atveju. Pasibaigus keturių valandų veikimo laikotarpiui, kietosiomis medžiagomis apdorotos ragenos kruopščiai nuplaunamos, bet papildomai inkubuoti jų nereikia.

Pasibaigus skysčių ir paviršinio aktyvumo medžiagų inkubaciniam laikotarpiui po veikimo ir keturių valandų trukmės ne paviršinio aktyvumo kietųjų medžiagų veikimo laikotarpiui, matuojamas kiekvienos ragenos drumstumas ir pralaidumas. Be to, kiekviena ragena apžiūrima ir registruojamos susijusios pastabos (pvz., audinio lupimasis, bandomosios cheminės medžiagos likučiai, nevienodo drumstumo vaizdai). Šios pastabos galėtų būti svarbios, nes jos gali paaiškinti drumstumo matuoklio rodmenų svyravimus.

Kontrolinės cheminės medžiagos

Atliekant kiekvieną bandymą, naudojami vienalaikiai neigiami kontroliniai ėminiai arba tirpiklis ar nešiklis ir teigiami kontroliniai ėminiai.

Kai pagal BCOP bandymo metodą bandoma 100 % grynumo skystoji cheminė medžiaga, naudojamas vienalaikis neigiamas kontrolinis ėminys (pvz., 0,9 % natrio chlorido tirpalas arba distiliuotas vanduo), kad bandymo sistemoje būtų galima aptikti netipinius pokyčius ir gauti bandymo vertinamųjų baigčių atskaitos vertę. Taip pat užtikrinama, kad tyrimo sąlygos nesukeltų netinkamo dirginamojo atsako.

Kai bandomas atskiestas skystis, paviršinio aktyvumo arba kietoji cheminė medžiaga, taikant BCOP bandymo metodą, įtraukiama vienalaikių tirpiklio ar nešiklio kontrolinių ėminių grupė, kad būtų galima aptikti nebūdingus bandymo sistemos pokyčius ir gauti bandymo vertinamųjų baigčių atskaitos vertę. Galima naudoti tik tokį tirpiklį ar nešiklį, kurie, kaip buvo įrodyta, neturi neigiamos įtakos bandymo sistemai.

Cheminė medžiaga, kuri žinoma kaip sukelianti teigiamą atsaką, yra įtraukiama į kiekvieną bandymą kaip vienalaikis teigiamas kontrolinis ėminys, kad būtų patikrintas bandymo sistemos vientisumas ir jos tinkamas veikimas. Tačiau siekiant užtikrinti galimybę užtikrinti teigiamo kontrolinio ėminio atsako kintamumą per tam tikrą laiką, atsakas į dirginimą neturėtų būti per stiprus.

Skystųjų bandomųjų cheminių medžiagų teigiamų kontrolinių ėminių pavyzdžiai yra 100 % etanolis ar 100 % dimetilformamidas. Kietųjų bandomųjų cheminių medžiagų teigiamo kontrolinio ėminio pavyzdys yra 20 % m/V imidazolo tirpalas 0,9 % natrio chlorido tirpale.

Palyginamosios cheminės medžiagos yra naudingos, kai reikia įvertinti tam tikros cheminių medžiagų ar produktų klasės nežinomų cheminių medžiagų gebą dirginti akis arba akis dirginančios medžiagos santykinę dirginamąją gebą tam tikrame atsako į dirginimą intervale.

Matuojamos vertinamosios baigtys

Drumstumas nustatomas pagal ragenos praleidžiamą šviesos kiekį. Ragenos drumstumas kiekybiškai matuojamas drumstumo matuokliu, kuriuo gaunamos drumstumo vertės tolydžioje skalėje.

Pralaidumas nustatomas pagal fluoresceino natrio druskos dažiklio kiekį, prasiskverbusį per visus ragenos ląstelių sluoksnius (t. y. nuo išorinio ragenos paviršiaus epitelio per vidinio ragenos paviršiaus endotelį). Į priekinę ragenos laikiklio kamerą, kuri liečiasi su ragenos epitelio paviršiumi, įpilamas 1 ml fluoresceino natrio druskos tirpalo (4 arba 5 mg/ml, kai bandomos skystosios, paviršinio aktyvumo medžiagos arba ne paviršinio aktyvumo medžiagos), o į užpakalinę kamerą, kuri liečiasi su ragenos endotelio paviršiumi, pripilama naujos EMEM. Laikiklis laikomas 90 ± 5 min horizontalioje padėtyje 32 ± 1 °C temperatūroje. UV/VIS spektrofotometrijos metodu matuojamas į užpakalinę kamerą patekusios fluoresceino natrio druskos kiekis. Spektrofotometrinio matavimo duomenys registruojami kaip optinio tankio esant 490 nm bangos ilgiui (OD490) arba sugerties vertės, išmatuotos tolydžioje skalėje. Fluoresceino pralaidumo vertės nustatomos naudojant OD490 vertes, išmatuotas regimosios šviesos spektrofotometru, taikant standartinį 1 cm storio sluoksnį.

Taip pat galima naudoti 96 duobučių mikrotitravimo plokštelės skaitytuvą, jei: i) gali būti nustatytas plokštelės skaitytuvo, naudojamo fluoresceino OD490 vertėms nustatyti, tiesinis intervalas ir ii) į 96 duobučių plokštelės duobutes įpilamas reikiamas tūris, kad būtų gautos OD490 vertės, atitinkančios standartinį 1 cm storio sluoksnį (gali prireikti visiškai pripildyti duobutę (įprastas kiekis – 360 μl)).

DUOMENYS IR ATASKAITOS RENGIMAS

Duomenų įvertinimas

Drumstumo ir vidutinio pralaidumo (OD490) vertes pakoregavus pagal foninio drumstumo ir neigiamo kontrolinio ėminio pralaidumo OD490 vertes, kiekvienos paveiktos bandomąja chemine mežiaga grupės vidutinės drumstumo ir pralaidumo OD490 vertes reikėtų įrašyti į empiriniu būdu gautą formulę, skirtą kiekvienos apdorotų ėminių grupės in vitro dirginimo skaitinei vertei (IVIS) apskaičiuoti:

IVIS = vidutinė drumstumo vertė + (15 × vidutinė pralaidumo OD490 vertė).

Sina et al. (16) paskelbė, kad ši formulė buvo gauta atliekant laboratorinius ir tarplaboratorinius tyrimus. Buvo atlikta duomenų, gautų atlikus 36 junginių serijos tarplaboratorinį tyrimą, daugiafaktorinė analizė, kad būtų gauta geriausiai in vivo ir in vitro duomenis atitinkanti lygtis. Šią analizę atliko dviejų atskirų bendrovių mokslininkai, kurie gavo beveik vienodas lygtis.

Drumstumo ir pralaidumo vertės taip pat turėtų būti įvertintos atskirai, siekiant nustatyti, ar bandomoji cheminė medžiaga sukėlė ėsdinimą arba stiprų dirginimą tik pagal vieną iš dviejų vertinamųjų baigčių (žr. Sprendimo priėmimo kriterijai).

Sprendimo priėmimo kriterijai

IVIS ribinės vertės, pagal kurias bandomosios cheminės medžiagos identifikuojamos kaip sukeliančios smarkų akių pažeidimą (JT GHS 1 kategorija) ir bandomosios cheminės medžiagos, kurių nereikia klasifikuoti dėl akių dirginimo ar smarkaus akių pažeidimo (JT GHS be kategorijos), pateiktos toliau:

Tyrimo priimtinumo kriterijai

Bandymas laikomas priimtinu, jei teigiamam kontroliniam ėminiui gaunama IVIS, kuri patenka į dabartinio istorinio vidurkio dviejų standartinių nuokrypių intervalą, vidurkį atnaujinant ne rečiau kaip kartą per tris mėnesius arba kiekvieną kartą laboratorijose atliekant priimtiną bandymą, kai bandymai atliekami nedažnai (t. y. rečiau kaip kartą per mėnesį). Vertinant atsaką į neigiamą kontrolinę medžiagą arba tirpiklį ar nešiklį, gautos drumstumo ir pralaidumo vertės neturėtų viršyti foninio drumstumo ir pralaidumo verčių viršutinių ribų, nustatytų galvijų ragenoms, apdorotoms atitinkama neigiama kontroline medžiaga arba tirpikliu ar nešikliu. Jei klasifikavimas nedviprasmis, bandomajai cheminei medžiagai turėtų pakakti vieno bandymo, bandant ne mažiau kaip tris ragenas. Tačiau jei atliekant pirmąjį bandymą gaunami tarpiniai rezultatai, reikėtų spręsti klausimą dėl antrojo bandymo (bet jo nebūtinai reikia), taip pat, esant prieštaringiems pirmų dviejų bandymų IVIS vidutiniams rezultatams, – dėl trečiojo bandymo. Šiuo atveju pirmojo bandymo rezultatas laikomas tarpine verte, jei bandymų su 3 ragenomis gautos prognozės nesutapo taip, kad:

Bandymo ataskaita

Į bandymo ataskaitą turėtų būti įtraukta ši informacija, jei ji yra svarbi atliekant tyrimą: