31975L0084

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COMMISSIONE

SESTA DIRETTIVA DELLA COMMISSIONE

del 20 dicembre 1974

che fissa i metodi d ' analisi comunitari per i controlli ufficiali degli alimenti per gli animali

LA COMMISSIONE DELLE COMUNITÀ EUROPEE ,

visto il trattato che istituisce la Comunità economica europea ,

vista la direttiva del Consiglio , del 20 luglio 1970 , concernente l ' introduzione di modi di prelevamento dei campioni e di metodi d ' analisi comunitari per il controllo ufficiale degli alimenti per gli animali ( 1 ) , modificata per ultimo dall ' atto ( 2 ) allegato al trattato relativo all ' adesione di nuovi Stati membri alla Comunità economica europea e alla Comunità europea dell ' ernergia atomica ( 3 ) , firmato a Bruxelles il 22 gennaio 1972 , in particolare l ' articolo 2 .

considerando che la suddetta direttiva prevede che i controlli ufficiali degli alimenti per gli animali destinati a constatare l ' osservanza delle condizioni prescritte in virtù delle disposizioni legislative , regolamentari o amministrative concernenti le qualità e la composizione degli alimenti per gli animali , siano effettuati secondo i modi di prelevamento di campioni ed i metodi di analisi comunitari ;

considerando che le direttive 71/250/CEE , 71/393/CEE , 72/199/CEE , 73/46/CEE e 74/203/CEE della Commissione , del 15 giugno 1971 ( 4 ) , del 18 novembre 1971 ( 5 ) , del 27 aprile 1972 ( 6 ) , del 5 dicembre 1972 ( 7 ) e del 25 marzo 1974 ( 8 ) hanno già fissato un certo numero di metodi di analisi comunitari ; che , tenuto conto dello stato d ' avanzamento dei lavori sin qui effettuati , è necessario adottare una sesta serie di metodi ;

considerando che le misure previste dalla presente direttiva sono conformi al parere del comitato permanente per gli alimenti per gli animali ,

HA ADOTTATO LA PRESENTE DIRETTIVA :

Articolo 1

Gli Stati membri prescrivono che le analisi per i controlli ufficiali degli alimenti per gli animali , per quanto riguarda il loro contenuto in buchinolato , sulfachinossalina è furazolidone , siano effettuate secondo i metodi descritti nell ' allegato della presente direttiva .

Le diposizioni generali di cui alla prima parte ( introduzione ) dell ' allegato della prima direttiva 71/250/CEE della Commissione , del 15 giugno 1971 , eccetto la parte relativa alla preparazione del campione da analizzare , si applicano al metodi descritti nell ' allegato della presente direttiva .

Articolo 2

Gli Stati membri curano l ' entrata in vigore , non oltre il 1° novembre 1975 , delle disposizioni legislative , regolamentari e amministrative necessarie per conformarsi alle disposizioni della presente direttiva e ne informano immediatamente la Commissione .

Articolo 3

Gli Stati membri sono destinatari della presente direttiva .

Fatto a Bruxelles , il 20 dicembre 1974 .

Per la Commissione

Il Presidente

François-Xavier ORTOLI

( 1 ) GU n . L 170 del 3 . 8 . 1970 , pag . 2 .

( 2 ) GU n . L 73 del 27 . 3 . 1972 , pag . 14 .

( 3 ) GU n . L 73 del 27 . 3 . 1972 , pag . 5 .

( 4 ) GU n . L 155 del 12 . 7 . 1971 ; pag . 13 .

( 5 ) GU n . L 279 del 20 . 12 . 1971 , pag . 7 .

( 6 ) GU n . L 123 del 29 . 5 . 1972 , pag . 6 .

( 7 ) GU n . L 83 del 30 . 3 . 1973 , pag . 21 .

( 8 ) GU n . L 108 del 22 . 4 . 1974 , pag . 7 .

ALLEGATO

1 . DETERMINAZIONE DEL BUCHINOLATO

( etil-4-idrossi-6 , 7-diisobutossi-3-chinolin carbossilato )

1 . Oggetto e campo d ' applicazione

Il metodo permette di determinare il contenuto di buchinolato negli alimenti , nei concentrati e nelle premiscele . Il limite inferiore d ' applicabilità è 10 ppm . Il decochinato interferisce nella determinazione .

2 . Principio

Il campione è sottoposto ad estrazione con cloroformio . L ' estratto è evaporato a secco , il residuo e ripreso con cloroformio e la soluzione viene quindi sottoposta a una cromatografia su stratto sottile . Il buchinolato è eluito con l ' etanolo e determinato spettrofotofluorimetricamente i confronto con soluzioni di riferimento . 3 . Reattivi

3.1 . Clorofornio p.a .

3.2 . Etanolo 96 % ( v/v ) p.a .

3.3 . Miscela di cloroformio e etanolo : mescolare 10 volumi di cloroformio ( 3.1 ) e 1 volume di etanolo ( 3.2 ) .

3.4 . Etanolo 80 % ( v/v ) p.a .

3.5 . Gel di silice G per cromatografia su strato sottile .

3.6 . Sostanza tipo : buchinolato puro .

3.7 . Soluzioni di riferimento :

3.7.1 . Soluzione di riferimento contenente 0,2 mg di buchinolato per ml :

Pesare , con l ' approssimazione di 0,1 mg , 50 mg di sostanze tipo ( 3.6 ) . Sciogliere in cloroformio ( 3.1 ) in un pallone tarato da 250 ml , riscaldando su bagno d ' acqua a 50° C . Lasciar raffreddare a temperatura ambiente , portare a volume con cloroformio ( 3.1 ) e omogeneizzare .

3.7.2 . Soluzioni di riferimento di lavoro : Prelevare volumi di 5,0 - 10,0 - 15,0 - 20,0 e 25,0 ml della soluzione ( 3.7.1 ) e introdurli in palloncini tarati da 25 ml . Portare a volume con il cloroformio ( 3.1 ) e omogeneizzare . Preparare al momento dell ' impiego . Questo soluzioni contengono rispettivamente 0,04 - 0,08 - 0,12 - 0,16 e 0,20 mg di buchinolato per ml .

4 . Apparecchiature

4.1 . Beute da 50 e 250 ml , con tappo a smeriglio .

4.2 . Agitatore .

4.3 . Centrifuga , con provette da 15 ml , munite di tappi .

4.4 . Bagno d ' acqua a 50° C .

4.5 . Apparecchiatura per cromatografia su strato sottile .

4.6 . Lastre di vetro per cromatografia su strato sottile , 200 × 200 mm , preparate come segue : Stendere uniformemente sulle lastre uno strato di 0,5 mm di spessore di gel di silice G ( 3.5 ) e lasciar asciugare per 15 minuti all ' aria . Indi tenere le lastre per 2 ore nella stufa ( 4.11 ) , e trasferirle in un essiccatore munito di gel di silice disidratante . Le lastre in commercio , già pronte all ' impiego , sono convenienti nella misura in cui danno risultati simili a quelli delle lastre trattate come indicato qui sopra .

4.7 . Micropipette da 0,50 ml .

4.8 . Raccoglitore di zone per la cromatografia su strato sottile .

4.9 . Lampada UV a onde corte .

4.10 . Spettrofotofluorimetro munito di una lampada a Xeno e di due monocromatori .

4.11 . Stufa munita di un ventilatore e regolata a 100° C .

4.12 . Evaporatore rotativo ad evaporazione sotto vuoto con palloni da 250 ml .

5 . Modo di operare

5.1 . Preparazione del campione

Macinare il campione in modo che passi totalmente attraverso un setaccio a maglie di 1 mm ( conforme alla raccomandazione ISO R 565 ) .

5.2 . Estrazione

Pesare , con l ' approssimazione di 1 mg , una quantità del campione suddivisa e omogeneizzata che contenga circa 1,25 mg di buchinolato . Introdurre la quantità prelevate in una beuta da 250 ml ( 4.1 ) e aggiungere 100,0 ml di cloroformio ( 3.1 ) . Mescolare , tappare la beuta e agitare per un ' ora mediante l ' agiatore ( 4.2 ) . Lasciare decantare , filtrare ed eliminare i primi ml del filtrato .

Introdurre 80,0 ml del filtrato limpido in un becher da 150 ml , o in un pallone di evaporatore rotativo ( 4.12 ) . Evaporare quasi a secco su bagno d ' acqua ( 4.4 ) , riprendere il residuo olcoso più volte con alcuni ml di cloroformio ( 3.1 ) e travasare quantitativamente i liquidi in un palloncino tarato a 10 ml con l ' aiuto di un imbuto a gambo sottile . Portare a volume col cloroformio ( 3.1 ) ed omogeneizzare . Se la soluzione non è limpida , centrifugare per tre minuti a 3 000 giri al minuto in provette munite di tappo .

5.3 . Cromatografia su strato sottile

Deporre sotto forma di punti su una lastra per cromatografia su strato sottile ( 4,6 ) mediante una micropipetta ( 4,7 ) , a distanze rispettive di 2 cm , volumi di 0,25 ml dell ' estratto ottenuto in 5.2 e delle cinque soluzioni di riferimento di lavoro ( 3.7.2 ) .

Sviluppare il cromatogramma mediante il cloroformio ( 3.1 ) fino a che il fronte del solvente raggiunga praticamente il bordo superiore della lastra , indi essiccare con l ' aiuto di una corrente d ' aria . Sviluppare con la miscela cloroformio/etanolo ( 3.3 ) fino a che il fronte del liquido solvente sia migrato di circa 12 cm . Lasciare evaporare i solventi . Irradiare il cromatogramma con la luce UV ( 4,9 ) e delimitare le macchie di buchinolato ( valore Rf : 0,4 - 0,6 ) con l ' aiuto di un ago .

5.4 . Eluizione

Raccogliere la silice di ognuna delle zone delimitate , mediante un raccoglitore di zone ( 4.8 ) , in provette da centrifuga ( 4.3 ) . Aggiungere in ogni provetta 10,0 ml d ' etanolo ( 3.4 ) , agitare per 20 minuti , indi centrifugare per 5 minuti a 3 000 giri al minuto . Decantare le soluzioni limpide in beute da 50 ml ( 4.1 ) .

5.5 . Misura della fluorescenza

Regolare a 100 la scala dello spettrofluorimetro ( 4.10 ) con l ' aiuto dell ' eluato ( 5.4 ) proveniente dalla soluzione di riferimento più concentrata , utilizzando per l ' eccitazione quella lunghezza d ' onda compresa tra 200 e 280 nm che dà la fluorescenza più intensa , e per l ' emissione la lunghezza d 'onda di 375 nm .

Misurare in queste condizioni l ' intensità della fluorescenza degli altri eluati ( 5.4 ) . Determinare dai valori trovati la quantità ( A ) di buchinolato in mg contenuta nei 10 ml d ' eluato proveniente del campione .

6 . Calcolo dei risultati

La concentrazione del buchinolato in mg per kg di campione è data dalla formula

A/P . 50 000

in cui

A = quantità in mg di buchinolato determinata con la misura spettrofluorimetrica ,

P = peso in grammi del campione prelevato per l ' analisi .

7 . Ripetibilità

La differenza tra i risultati di due determinazioni effettuate in parallelo sullo stesso campione non deve superare :

50 % del risultato più elevato per concentrazioni di buchinolato comprese tra 10 e 20 ppm ;

10 ppm , in valore assoluto , per le concentrazioni comprese tra 20 e 100 ppm ;

10 % del risultato più elevato per le concentrazioni comprese tra 100 e 5 000 ppm ;

500 ppm , in valore assoluto , per le concentrazioni comprese tra 5 000 e 10 000 ppm ;

5 % del risultato più elevato per le concentrazioni superiori a 10 000 ppm

2 . DETERMINAZIONE DELLA SULFACHINOSSALINA

( 2-sulfanilammidochinossalina )

1 . Oggetto e campo di applicazione

Il metodo permette di determinare il contenuto di sulfachinossalina negli alimenti , nei concentrati e nelle premiscele . Il limite inferiore di applicabilità è di 20 ppm . Le altre solfonammidi e l ' acido arsanilico interferiscono nel dosaggio .

2 . Principio

Il campione è sottoposto all ' estrazione con la dimetilformammide ed il cloroformio . la sulfachinossalina è idrolizzata in mezzo alcalino . Dopo neutralizzazione , il derivato amminico che si forma viene diazotato e copulato con la N -( 1 , naftil ) etilendiammina . La densità ottica della soluzione è misurata a 545 nm .

3 . Reattivi

3.1 . N , N-dimetilformammide p.a .

3.2 . Cloroformio p.a .

3.3 . Etanolo assoluto .

3.4 . Soluzione alcalina : Sciogliere nell ' acqua 10 g d ' idrossido di sodio p.a . e 25 g di cloruro p.a . Portare a 500 ml con acqua e mescolare .

3.5 . Acido cloridrico concentrato p.a . ( d = 1,18 ) .

3.6 . Soluzione 0,1 per cento ( p/v ) di nitrito di sodio : Sciogliere nell ' acqua 100 mg di nitrito di sodio p.a . , portare a 100 ml con acqua e mescolare . Da preparare immediatamente prima dell ' impiego .

3.7 . Soluzione 0,5 per cento ( p/v ) di solfammato d ' ammonio : Sciogliere in acqua 500 mg di solfammato d ' ammonio p.a . , portare a 100 ml con acqua e mescolare . Da preparate immediatamente prima dell ' impiego .

3.8 . Soluzione 0,1 per cento ( p/v ) di dicloridrato di N - ( 1-naftil ) etilendiammina : Sciogliere in acido cloridrico p.a . allo 0,1 per cento ( v/v ) 100 mg di dicloridrato di N - ( 1 naftil ) etilendiammina p.a . , portare a 100 ml con lo stesso acido e mescolare . Da preparare immediatamente prima dell ' impiego .

3.9 . Sostanza tipo : sulfachinossalina pura .

3.10 . Soluzione di riferimento : Pesare , con l ' approssimazione di 0,1 mg , 250 mg di sostanza tipo ( 3.9 ) . Sciogliere in 50 ml di una soluzione di idrossido di sodio ( 25 ml di soluzione 0,1 N di idrossido di sodio p.a . + 25 ml d ' acqua ) , portare a 500 ml con acqua e mescolare . 5 ml di questa soluzione vengono portati a 100 ml con acqua . 1 ml di questa soluzione contiene 25 g di sulfachinossalina .

4 . Apparecchiatura

4.1 . Beute da 250 ml , con tappo a smeriglio normalizzato .

4.2 . Agitatore .

4.3 . Crogiolo filtrante , porosità 3 , diametro : 80 mm , con beuta da vuoto .

4.4 . Imbuti separatori da 250 ml .

4.5 . Palloai tarati da 50 , 100 , 250 e 500 ml .

4.6 . Provette , 150 mm × 25 mm .

4.7 . Bagno d ' acqua bollente .

4.8 . Spettrofotometro , con vaschette di 20 mm di spessore .

5 . Modo di operare

5.1 . Preparazione del campione

Macinare il campione in modo che passi totalmente attraverso un setaccio a maglie di 1 mm ( conforme alia raccomandazione ISO R 565 ) .

5.2 . Estrazione

Pesare , con l ' approssimazione di 1 mg , una quantità del campione suddiviso e omogeneizzato che contenga da 0,25 a 1,25 mg di sulfachinossalina . Introdurre la quantità prelevata in una beuta da 250 ml ( 4.1 ) e aggiungere 20 ml di N , N-dimetilformammide ( 3.1 ) . Mescolare e riscaldare per 20 minuti su bagno d ' acqua ( 4.7 ) . Raffreddare sotto una corrente d ' acqua fredda . Aggiungere 60 ml di cloroformio ( 3.2 ) , tappare la beuta e agitare per 30 minuti mediante l ' agitatore ( 4.2 ) . Filtrare il liquido attraverso un crogiolo filtrante ( 4.3 ) , sotto leggera aspirazione . Lavare la beuta per quattro volte con 5 ml di cloroformio ( 3.2 ) e versare i liquidi nel crogiolo filtrante . Travasare indi il filtrato dal recipiente di raccolta in un imbuto separatore ( 4.4 ) , lavare il recipiente di raccolta con circa 15 ml di cloroformio ( 3.2 ) che vanno poi versati anch ' essi nell ' imbuto separatore .

5.3 . Idrolisi

Versare nell ' imbuto separatore 50 ml di soluzione alcalina ( 3.4 ) e 5 ml di etanolo ( 3.3 ) . Mescolare completamente sia capovolgendo l ' imbuto una ventina di volte , sia facendolo girare attorno all ' asse orizzontale passante dal gambo al tappo evitando la formazione di emulsione . Lasciare quindi riposare fino alla separazione della fase ( la separazione è generalmente completa dopo circa 15 minuti ) .

Travasare la fase superiore ( fase acquosa ) in un pallone tarato da 250 ml ( 4.5 ) . Estrarre di nuovo la fase cloroformica con tre porzioni di 50 ml di soluzione alcalina ( 3.4 ) e travasare dopo ogni estrazione l ' estratto acquoso nel pallone tarato . Portare a volume con acqua e omogeneizzare .

Introdurre 25,0 ml della soluzione in un pallone tarato da 50 ml ( 4.5 ) , aggiungere 5,0 ml d ' acido cloridrico ( 3.5 ) , portare a volume con acqua ed omogeneizzare . Se necessario , filtrare ed eliminare i 15 primi ml del filtrato . Introdurre 10,0 ml della soluzione rispettivamente in due provette ( 4.6 ) A e B .

5.4 . Sviluppo della colorazione e misura della densità ottica

Aggiungere in ciascuna delle provette 2,0 ml di soluzione di nitrito di sodio ( 3.6 ) , agitare e lasciar riposare tre minuti . Aggiungere 2,0 ml di soluzione di solfammato d ' ammonio ( 3.7 ) agitare e lasciare riposare due minuti . Aggiungere quindi 1,0 ml di soluzione di dicloridrato di N - ( 1-naftil - etilendiammina ( 3.8 ) nella provetta A e 1,0 ml di acqua nella provetta B . Mescolare intimamente il contenuto di ciascuna provetta . Collegare le provette a una pompa ad acqua mediante giunti di gomma e fare un debole vuoto per eliminare l ' azoto disciolto .

Misurare dopo 10 minuti le densità ottiche EA ed EB delle soluzioni allo spettrofotometro ( 4.8 ) a 545 mm per confronto con l ' acqua .

Determinare dal valore EA - EB la quantità ( A ) di sulfachinossalina presente nella soluzione del campione , riferendosi alla curva di taratura ( 5.5 ) disegnata preliminarmente .

5.5 . Curva di taratura

Introdurre in palloncini tarati da 100 ml ( 4.5 ) ml 2,0 - 4,0 - 6,0 - 8,0 e 10,0 della soluzione di riferimento ( 3.10 ) corrispondenti rispettivamente a 50 , 100 , 150 , 200 e 250 microgrammi di sulfachinossalina . Aggiungere 8 ml d ' acido cloridrico ( 3.5 ) in ogni palloncino , portare a volume con acqua e omogeneizzare .

Prelevare 10,0 ml di ogni soluzione ( ciò che corrisponde a prelevate rispettivamente 5 , 10 , 15 , 20 , 25 microgrammi di sulfachinossalina ) e introdurli in provette ( 4.6 ) . Sviluppare la colorazione come indicato in 5.4 , primo paragrafo . Indi misurare le densità ottiche a 545 nm in confronto con l ' acqua . Tracciare la curva di taratura portando in ordinata i valori della densità ottica e in ascissa le quantità corrispondenti di sulfachinossalina in microgrammi .

6 . Calcolo dei risultati

Il contenuto di sulfachinossalina in mg per kg di campione è dato dalla formula

A/P . 50

dove

A = quantità in microgrammi di sulfachinossalina , determinata con la misurazione fotometrica ,

P = peso in grammi del campione prelevato per l ' analisi .

7 . Ripetibilità

La differenza tra i risultati di due determinazioni effettuate in parallelo sullo stesso campione non deve superare :

10 ppm , in valore assoluto , per concentrazioni di sulfachinossalina comprese tra 20 e 100 ppm ;

10 % del risultato più elevato per le concentrazioni comprese tra 100 e 5 000 ppm ;

500 ppm , in valore assoluto , per concentrazioni comprese tra 5 000 e 10 000 ppm ;

5 % del risultato più elevato per le concentrazioni superiori a 10 000 ppm .

3 . DETERMINAZIONE DEL FURAZOLIDONE

[ N - ( 5-nitro-2-furfurilidene ) -3-ammino-2-ossazolidone ]

oppure

[ 3 - ( 5-nitrofurfurilideneammino ) -ossazolidina-2-one ]

1 . Oggetto e campo d ' applicazione

Il metodo permette di determinare il contenuto di furazolidone negli alimenti , nei concentrati e nelle premiscele . Il limite inferiore di applicabilità è di 10 ppm .

2 . Principio

Il furazolidone è estratto con acetone , dopo sgrassatura del campione con etere di petrolio . L ' estratto viene purificato per cromatografia su colonna di ossido di alluminio e il furazolidone è eluito con l ' acetone . L ' eluato viene evaporato a secco e il residuo è ripreso con l ' alcole amilico . Si estrae quindi il furazolidone puro con una soluzione di urea e la densità ottica dell ' estratto è misurata a 375 nm .

3 . Reattivi

3.1 . Acetone p.a .

3.2 . Ossido di alluminio per cromatografia , neutro , grado di attività 1 , granulometria da 100 a 240 mesh , preparato come segue ; mescolare 500 g di ossido d ' alluminio con 1 l di acqua distillata calda e separare il liquido di superficie . Ripetere due volte l ' operazione e filtrare quindi su Buchner . Essiccare l ' ossido di alluminio a 105° C fino a peso costante .

3.3 . Acetato di amile p.a .

3.4 . Alcole amilico p.a . ( sono idonee le miscele di isomeri ) .

3.5 . Etere di petrolio , eb . 40 - 60° C .

3.6 . Soluzione di urea : mescolare 90 g di urea p.a . con 100 ml d ' acqua , riscaldare leggermente per ottenere lo scioglimento completo .

3.7 . Sostanza tipo : furazolidone paro .

3.8 . Soluzione di riferimento : pesare , con l ' approssimazione di 0,1 mg , 25 mg di sostanza tipo ( 3.7 ) . Sciogliere nell ' acetone ( 3.1 ) in un pallone tarato da 250 ml ( 4.1 ) , portare a volume con acetone ( 3.1 ) e omogeneizzare . La soluzione contiene 100 g di furazolidone per ml .

4 . Apparecchiature

4.1 . Palloni tarati di vetro bruno , da 100 e 250 ml .

4.2 . Imbuti separatori di vetro bruno , da 100 ml .

4.3 . Estrattori , ad esempio del tipo Soxhlet o Txisselmann .

4.4 . Cartucce da estrazione da 25 × 80 mm o 28 × 100 mm .

4.5 . Colonne per cromatografia , di vetro , del diametro interno di 10 mm e della lunghezza di circa 300 mm .

4.6 . Bagno d ' acqua bollente .

4.7 . Spettrofotometro , con vaschette di 10 mm di spessore .

5 . Modo di operare

N.B . Tutte le operazioni devono essere effettuate al riparo della luce diretta .

5.1 . Preparazione del campione

Macinare il campione in modo che passi totalmente attraverso un setaccio a maglie di 1 mm ( conforme alla raccomandazione ISO R 565 ) .

5.2 . Estrazione

Pesare , con l ' approssimazione di 1 mg , da 5 a 20 g del campione suddiviso e omogeneizzato ( contenente al massimo 1 mg di furazolidone ) in una cartuccia da estrazione ( 4.4 ) , introdurre la cartuccia in un estrattore ( 4.3 ) ed estrarre con l ' etere di petrolio ( 3.5 ) . Con l ' apparecchio di Soxhlet sono necessari da 13 a 17 cicli di solvente ; con altri apparecchi , la durata di estrazione non deve essere inferiore a 30 minuti . Ritirare quindi la cartuccia dall ' apparecchio , eliminare il solvente residuo ed asciugare la cartuccia e il contenuto in corrente d ' aria calda .

Porre la cartuccia e il contenuto in un estrattore pulito ed estrarre con l ' acetone ( 3.1 ) . Con l ' apparecchio di Soxhlet necessari almeno 25 cicli di solvente ; con altri apparecchi occorre determinare preventivamente le condizioni necessarie per ottenere un ' estrazione completa . Evaporare l ' estratto acetonico sul bagno d ' acqua ( 4.6 ) fino a un volume di 5 - 10 ml . Lasciar raffreddare fino a temperatura ambiente .

5.3 . Cromatografia

Introdurre un tampone di lana di vetro nell ' estremità inferiore di una colonna per cromatografia ( 4.5 ) e comprimere il tampone con una bacchetta adeguata fino ad ottenere uno spessore di 2-3 mm . Preparare una sospensione di ossido di alluminio ( 3.2 ) nell ' acetone ( 3.1 ) , introdurre la sospensione nella colonna e lasciar posare . La colonna così ottenuta deve avere un ' altezza di circa 200 mm . Lasciar scendere l ' acetone fino alla superficie superiore della colonna .

Travasare nella colonna l ' estratto acetonico ottenuto come descritto sub 5.2 , lavare il flacone a più riprese con acetone ( 3.1 ) e travasare i liquidi nella colonna . Porre la colonna sopra un flacone adeguato ed eluire il furazolidone con acetone ( 3.1 ) . Il volume totale di acetone da utilizzare , compreso quello impiegato per il lavaggio , dev ' essere di circa 150 ml .

5.4 . Estrazione e misura della densità ottica

Evaporare l ' eluato , ottenuto secondo quanto indicato sub 5.3 , fino a secco su bagno d ' acqua ( 4.6 ) . ( Occasionalmente si ottiene una piccola quantità di diacetone-alcole , prodotti per condensazione di acetone sull ' ossido di alluminio , che tuttavia non impedisce le estrazioni successive ) . Sciogliere il residuo in 10 ml di alcole amilico ( 3.4 ) e travasare la soluzione in un imbuto separatore ( 4.2 ) . Lavare il flacone con 10 ml di acetato di amile ( 3.3 ) e successivamente con 10 ml di soluzione di urea ( 3.6 ) , travasare le soluzioni nell ' imbuto separatore e agitare vigorosamente per 2 minuti .

Lasciar riposare per 3-4 minuti e raccogliere quindi la fase acquosa in un pallone tarato da 100 ml ( 4.1 ) . Ripetere il lavaggio e l ' estrazione con quattro porzioni di 10 ml di soluzione di urea ( 3.6 ) e raccogliere ogni volta la fase acquosa del pallone tarato . Portare il contenuto del pallone a 100 ml con la soluzione di urea ( 3.6 ) e omogeneizzare . Misurare la densità ottica della soluzione allo spettrofotometro ( 4.7 ) a 375 nm per confronto con la soluzione di urea ( 3.6 ) . Determinare la quantità di furazolidone riferendosi alla curva di taratura ( 5.5 ) ;

5.5 . Curva di taratura

Preparare quattro colonne cromatografiche secondo il modo di operare indicato sub 5.3 , primo comma . Introdurre con la pipetta nelle colonne volumi rispettivi di 2,5 - 5,0 - 7,5 e 10,0 ml della soluzione di riferimento ( 3.8 ) . Eluire ogni colonna con 150 ml di acetone ( 3.1 ) e continuare ad operare come indicato sub 5.4 . Tracciare la curva di taratura portando in ordinata i valori della densità ottica e in ascissa le quantità corrispondenti di furazolidone in microgrammi .

6 . Calcolo dei risultati

Il contenuto di furazolidone in mg per kg di campione è dato dalla formula

A/P

dove

A = quantità in microgrammi di furazolidone determinata fotometricamente ,

P = peso in grammi del campione prelevato per l ' analisi .

7 . Ripetibilità

La differenza tra i risultati di due determinazioni effettuate in parallelo sullo stesso campione non deve superare :

50 % del risultato più elevato per concentrazioni di furazolidone comprese tra 10 e 20 ppm ;

10 ppm , in valore assoluto , per le concentrazioni comprese tra 20 e 100 ppm ;

10 % del risultato più elevato per le concentrazioni comprese tra 100 e 5 000 ppm ;

500 ppm in valore assoluto , per le concentrazioni comprese tra 5 000 e 10 000 ppm ;

5 % del risultato più elevato per le concentrazioni superiori a 10 000 ppm .