1991R2568 — HU — 09.08.2012 — 024.001

---

Ez a dokumentum kizárólag tájékoztató jellegű, az intézmények semmiféle felelősséget nem vállalnak a tartalmáért

►B	A BIZOTTSÁG 2568/91/EGK RENDELETE (1991. július 11.) az olívaolaj és az olívamaradék-olaj jellemzőiről és az ezekre vonatkozó elemzési módszerekről (HL L 248, 5.9.1991, p.1)

Módosította:

		Hivatalos Lap
		No	page	date
►M1	A Bizottság 3682/91/EGK rendelete (1991. december 17.)	L 349	36	18.12.1991
►M2	A Bizottság 1429/92/EGK rendelete (1992. május 26.)	L 150	17	2.6.1992
M3	Commission Regulation (EEC) No 1683/92 of 29 June 1992 (*)	L 176	27	30.6.1992
M4	Commission Regulation (EEC) No 1996/92 of 15 July 1992 (*)	L 199	18	18.7.1992
►M5	A Bizottság 3288/92/EGK rendelete (1992. november 12.)	L 327	28	13.11.1992
►M6	A Bizottság 183/93/EGK rendelete (1993. január 29.)	L 22	58	30.1.1993
M8	Commission Regulation (EEC) No 620/93 of 17 March 1993 (*)	L 66	29	18.3.1993
M9	A Bizottság 177/94/EK rendelete (1994. január 28.)	L 24	33	29.1.1994
M10	Commission Regulation (EC) No 2632/94 of 28 October 1994 (*)	L 280	43	29.10.1994
►M11	A Bizottság 656/95/EK rendelete (1995. március 28.)	L 69	1	29.3.1995
M12	Commission Regulation (EC) No 2527/95 of 27 October 1995 (*)	L 258	49	28.10.1995
►M13	Commission Regulation (EC) No 2472/97 of 11 December 1997 (*)	L 341	25	12.12.1997
►M14	A Bizottság 282/98/EK rendelete (1998. február 3.)	L 28	5	4.2.1998
M15	Commission Regulation (EC) No 2248/98 of 19 October 1998 (*)	L 282	55	20.10.1998
M16	A Bizottság 379/1999/EK rendelete (1999. február 19.)	L 46	15	20.2.1999
►M17	Commission Regulation (EC) No 455/2001 of 6 March 2001 (*)	L 65	9	7.3.2001
M18	Commission Regulation (EC) No 2042/2001 of 18 October 2001 (*)	L 276	8	19.10.2001
►M19	Commission Regulation (EC) No 796/2002 of 6 May 2002 (*)	L 128	8	15.5.2002
►M20	A Bizottság 1989/2003/EK rendelete (2003. november 6.)	L 295	57	13.11.2003
►M21	A Bizottság 702/2007/EK rendelete (2007. június 21.)	L 161	11	22.6.2007
►M22	A Bizottság 640/2008/EK rendelete (2008. július 4.)	L 178	11	5.7.2008
►M23	A Bizottság 61/2011/EU rendelete (2011. január 24.)	L 23	1	27.1.2011
M24	A Bizottság 661/2012/EU végrehajtási rendelete (2012. július 19.)	L 192	3	20.7.2012

(*)	Ez a jogi aktus sosem jelent meg magyar nyelven.

---

▼B

A BIZOTTSÁG 2568/91/EGK RENDELETE

(1991. július 11.)

az olívaolaj és az olívamaradék-olaj jellemzőiről és az ezekre vonatkozó elemzési módszerekről

▼M20

1. cikk

(1)  Azok az olajok, amelyeknek jellemzői megegyeznek az e rendelet I. mellékletének 1. és 2. pontja szerintiekkel, szűz olívaolajnak minősülnek a 136/66/EGK rendelet mellékletének 1. a) és b) pontja értelmében.

(2)  Az az olaj, amelynek jellemzői megegyeznek az e rendelet I. mellékletének 3. pontja szerintiekkel, lampante olívaolajnak minősül a 136/66/EGK rendelet melléklete 1. c) pontja értelmében.

(3)  Az az olaj, amelynek jellemzői megegyeznek az e rendelet I. mellékletének 4. pontja szerintiekkel, finomított olívaolajnak minősül a 136/66/EGK rendelet mellékletének 2. pontja értelmében.

(4)  Az az olaj, amelynek jellemzői megegyeznek az e rendelet I. mellékletének 5. pontja szerintiekkel, finomított olívaolajokból és szűz olívaolajokból álló olívaolajnak minősül a 136/66/EGK rendelet mellékletének 3. pontja értelmében.

(5)  Az az olaj, amelynek jellemzői megegyeznek az e rendelet I. mellékletének 6. pontja szerintiekkel, nyers olívamaradék-olajnak minősül a 136/66/EGK rendelet mellékletének 4. pontja értelmében.

(6)  Az az olaj, amelynek jellemzői megegyeznek az e rendelet I. mellékletének 7. pontja szerintiekkel, finomított olívamaradék-olajnak minősül a 136/66/EGK rendelet mellékletének 5. pontja értelmében.

(7)  Az az olaj, amelynek jellemzői megegyeznek az e rendelet I. mellékletének 8. pontja szerintiekkel, olívamaradék-olajnak minősül a 136/66/EGK rendelet mellékletének 6. pontja értelmében.

▼B

2. cikk

(1)  Az olajok I. melléklet szerinti jellemzőinek megállapítása a következő elemzési módszerekkel történik:

▼M19

▼B

▼M21

▼M20 —————

▼B

▼M20 —————

▼M11

▼M13

▼M19

▼M23

▼M19

(2)  Verification by national authorities or their representatives of the organoleptic characteristics of virgin oils shall be effected by tasting panels approved by the Member States.

The organoleptic characteristics of an oil as referred to in the first subparagraph shall be deemed consonant with the category declared if a panel approved by the Member State confirms the grading.

Should the panel not confirm the category declared as regards the organoleptic characteristics, at the interested party's request the national authorities or their representatives shall have two counter-assessments carried out by other approved panels, at least one by a panel approved by the producer Member State concerned. The characteristics concerned shall be deemed consonant with the characteristics declared if at least two of the counter-assessments confirm the declared grade. If that is not the case, the interested party shall be responsible for the cost of the counter-assessments.

▼M17

(3)  When the national authorities or their representatives verify the characteristics of the oil as provided for in paragraph 1, samples shall be taken in accordance with international standards EN ISO 661 on the preparation of test samples and EN ISO 5555 on sampling. However, notwithstanding point 6.8 of standard EN ISO 5555, in the case of batches of such oils in immediate packaging not exceeding 100 litres, the sample shall be taken in accordance with Annex Ia to this Regulation.

▼M19

Without prejudice to standard EN ISO 5555 and Chapter 6 of standard EN ISO 661, the samples taken shall be put in a dark place away from strong heat as quickly as possible and sent to the laboratory for analysis no later than:

▼M17

(4)   ►M20  A (3) bekezdésben említett ellenőrzések céljára a II., III., IX., X. és XII. mellékletben említett elemzéseket és – ha a nemzeti törvények előírják – az ellenvizsgálatokat a minimális eltarthatósági idő előtt kell elvégezni. Amennyiben a mintavétel több mint négy hónappal a lejárati idő előtt történik, az elemzéseket legkésőbb a mintavételt követő negyedik hónapban el kell végezni. Az említett rendeletben előírt egyéb elemzések vonatkozásában semmiféle határidőt nem kell alkalmazni. ◄

Unless the sample was taken less than one month before the minimum durability date, if the results of the analyses do not match the characteristics of the category of olive oil or olive-residue oil declared, the party concerned shall be notified no later than one month before the end of the period laid down in the first subparagraph.

▼M19

(5)  For the purpose of determining the characteristics of olive oils by the methods provided for in paragraph 1, the analysis results shall be directly compared with the limits laid down in this Regulation.

▼M20

2a. cikk

A nemzeti hatóságok és képviselőik a következőképpen vizsgálhatják meg, hogy egy minta megfelel-e a bejelentett kategóriának:

▼M19 —————

▼M5

►M19  3. ◄ cikk

Amennyiben megállapítást nyer, hogy egy olaj érzékszervekkel meghatározható jellemzői nem felelnek meg az olaj leírásának, az érintett tagállam az egyéb szankciók sérelme nélkül a feltárt szabálytalanság mértékének megfelelő közigazgatási pénzügyi szankciót állapít meg.

A szabálytalanság mértékének megállapítása során figyelembe kell venni különösen a megfelelő körülmények között tárolt olaj jellemzőinek természetes változásait.

A tagállamok minden félév elején tájékoztatják a Bizottságot a megelőző félév során feltárt szabálytalanságok számáról és jellegéről, valamint az alkalmazott szankciókról.

▼M5

4. cikk

▼M19

(1)  The Member States may approve assessment panels so that national authorities or their representatives can assess and verify organoleptic characteristics.

The terms of approval shall be set by Member States and ensure that:

Member States shall notify to the Commission a list of approved panels and the action taken under this paragraph.

▼M5

(2)  Amennyiben a tagállamok számára problémát jelent ezeknek a csoportoknak a felállítása a saját területükön, felkérhetnek egy másik tagállamban elfogadott kóstolói csoportot.

(3)  Valamennyi tagállam listát készít a szakmai- vagy ágazati szervezetek által az (1) bekezdésben meghatározott feltételekkel összhangban felállított kóstolói csoportokról, továbbá biztosítja e feltételek betartását.

▼M19 —————

▼B

6. cikk

(1)  Az olívaolaj kinyeréséből származó olajpogácsa és egyéb maradékanyagok (KN-kód: 2306 90 11 és 2306 90 19) olajtartalmának meghatározása a XV. mellékletben szabályozott módszerrel történik.

(2)  Az (1) bekezdésben említett olajtartalmat az olaj súlyának a szárazanyag súly százalékos arányában fejezik ki.

▼M20

7. cikk

A szennyező anyagok jelenlétére vonatkozó közösségi rendelkezéséket alkalmazni kell.

A halogénezett oldószerek esetében a következő határértékek vonatkoznak minden olívaolaj-kategóriára:

▼B

8. cikk

(1)  A tagállamok értesítik a Bizottságot az e rendelet végrehajtására hozott intézkedéseikről.

(2)  A tagállamok minden félév elején egy, a megelőző félévben végrehajtott tesztek elemzési adatait tartalmazó beszámolót küldenek a Bizottságnak.

Az eredményeket az Olaj- és Zsírpiaci Irányítóbizottság a 136/66/EGK rendelet 39. cikkében szabályozott eljárásnak megfelelően veszi tekintetbe.

9. cikk

A 1058/77/EGK rendelet hatályát veszti.

10. cikk

(1)  Ez a rendelet az Európai Közösségek Hivatalos Lapjában való kihirdetését követő harmadik napon lép hatályba.

A XII. melléklet szerinti módszer azonban ►M1  1992. november 1. ◄ -jétől hatályos, kivéve az intervenciós rendszer működésével kapcsolatos műveleteket.

▼M5

Ez a módszer nem vonatkozik az 1992. november 1. előtti forgalombahozatal céljára készített szűz olívaolajra.

▼B

(2)  E rendeletet nem kell alkalmazni a hatálybalépését megelőzően csomagolt és 1992. október 31-ig forgalomba hozott olívaolajra és olívamaradék-olajra.

Ez a rendelet teljes egészében kötelező és közvetlenül alkalmazandó valamennyi tagállamban.

---

MELLÉKLETEK

ÖSSZEFOGLALÁS

▼M23

---

I. MELLÉKLET

AZ OLÍVAOLAJ JELLEMZŐI

▼M20

---

I. A. MELLÉKLET

A 100 LITERT MEG NEM HALADÓ KÖZVETLEN CSOMAGOLÁSBAN SZÁLLÍTOTT OLÍVAOLAJBÓL ÉS OLÍVAMARADÉK-OLAJBÓL TÖRTÉNŐ MINTAVÉTEL

Ezt a mintavételi módszert olyan, 125 000 litert meg nem haladó olívaolaj- vagy olívamaradékolaj-szállítmányokra kell alkalmazni, amelyek közvetlen csomagolása nem haladja meg a 100 litert.

Amennyiben a szállítmány meghaladja a 125 000 litert, azt 125 000 litert meg nem haladó tételekre kell osztani. Amennyiben a szállítmány nem éri el a 125 000 litert, azt egy tételnek kell tekinteni. A módszert azután minden egyes tételre alkalmazni kell.

A vételezendő elsődleges minták minimális számát a tétel mérete határozza meg, az 1. pontban szereplő táblázatnak megfelelően.

Az elsődleges minta méretét a közvetlen csomagolás űrtartalma határozza meg, a 2.1. pontban szereplő táblázatnak megfelelően.

A szállítmány, az elsődleges minta és a laboratóriumi minta fogalmát az EN ISO 5555 szabvány határozza meg.

A tétel az értékesítési egységek olyan csoportját jelenti, amelyeket olyan körülmények között termeltek, gyártottak és csomagoltak, hogy az egyes értékesítési egységekben lévő olaj minden analitikai jellemző vonatkozásában homogénnek tekinthető.

1.   A VÉTELEZENDŐ ELSŐDLEGES MINTÁK SZÁMA

A vételezendő elsődleges minták minimális számát a tétel mérete határozza meg az alábbi táblázatnak megfelelően:

Az elsődleges mintákhoz kiválasztott közvetlen csomagoknak egymás mellett kell elhelyezkedniük a tételben.

Kétség esetén a tagállamok megnövelik a vételezendő elsődleges minták számát.

2.   AZ ELSŐDLEGES MINTÁK TARTALMA

2.1.

Az elsődleges mintáknak a következőket kell tartalmazniuk: Amennyiben a közvetlen csomagolás űrtartalma: Az elsődleges minta az alábbi számú közvetlen csomagból származó olajat tartalmaz: a)  5 liter vagy annál nagyobb a)  3 közvetlen csomag b)  3 liter vagy annál nagyobb, de kisebb, mint 5 liter b)  3 közvetlen csomag c)  2 liter vagy annál nagyobb, de kisebb, mint 3 liter c)  3 közvetlen csomag d)  1 liter vagy annál nagyobb, de kisebb, mint 2 liter d)  6 közvetlen csomag e)  0,75 liter vagy annál nagyobb, de kisebb, mint 1 liter e)  6 közvetlen csomag f)  kisebb, mint 0,75 liter f)  a több mint 1,5 liter össztérfogatot kitevő minimális számú csomagokban lévő olaj háromszorosa

2.2.

Az elsődleges mintákat az elemzés idejéig a közvetlen csomagolásban kell tartani. Az elsődleges mintákban lévő olajat ezután – adott esetben – három laboratóriumi mintára kell bontani, hogy elvégezzék: a) a II., III., IX. és X. mellékletben említett elemzéseket; b) a XII. mellékletben említett elemzéseket; c) az egyéb elemzéseket.

2.3.	Az elsődleges mintát képező csomagokat a nemzeti jogban előírt ellenőrzési eljárásokkal összhangban kell felosztani.

3.   ELEMZÉSEK ÉS EREDMÉNYEK

▼M20

---

I. B. MELLÉKLET

DÖNTÉSI FA ANNAK ELLENŐRZÉSÉRE, HOGY EGY OLÍVAOLAJ-MINTA MEGFELEL-E A BEJELENTETT KATEGÓRIÁNAK

Az elemzést, amely azt ellenőrzi, hogy egy olívaolaj vagy olívamaradék-olaj megfelel-e a bejelentett kategóriának, az alábbiak szerint lehet elvégezni:

A szennyező anyagokra vonatkozóan az Európai Közösség szabványainak való megfelelés ellenőrzéséhez megkövetelt elemzéseket külön kell elvégezni.

A döntési fa az olívaolaj és olívamaradék-olaj minden kategóriájára vonatozik. 1–11-ig számozott táblákból áll, amelyeket az érintett olaj bejelentett kategóriája alapján az áttekintő táblán megállapított sorrendben kell alkalmazni.

Magyarázat az áttekintő táblához és az 1–11. táblához:

---

1. FÜGGELÉK

Ekvivalenciatáblázat e rendelet mellékletei és a döntési fában meghatározott elemzések között

---

2. FÜGGELÉK

1. tábla

2. tábla

3. tábla

4. tábla

7. tábla

8. tábla

11. tábla

▼B

---

II. MELLÉKLET

▼M21

A SZABAD ZSÍRSAVAK MEGHATÁROZÁSA HIDEG INJEKTÁLÁSOS MÓDSZERREL

▼B

1.   A SAVASSÁG MEGHATÁROZÁSA

A szabad zsírsavak meghatározása az olívaolajban. A szabad zsírsavtartalmat a hagyományosan számított savasság alapján adják meg.

1.1.   Alapelv

A mintát feloldják oldószerek keverékében és a jelen lévő szabad zsírsavakat kálium-hidroxid etanolos oldatával titrálják.

1.2.   Reagensek

Minden esetben elismert analitikai minőségű reagenseket és desztillált vagy hasonló minőségű vizet kell használni.

1.2.1.

Dietil-éter; 95 % etanol (v/v), azonos térfogatarányú keveréke. Megjegyzés: A dietil-éter kiemelten tűzveszélyes és robbanó peroxidokat képezhet. Használata során különleges óvatosságra van szükség. Semlegesítse pontosan a felhasználás pillanatában kálium-hidroxid oldattal (1.2.2.), 100 ml keverékenként 0,3 ml fenolftalein oldat (1.2.3.) hozzáadásával. Megjegyzés: Amennyiben nincs mód dietil-étert használatára, etanolt és metil-benzolt tartalmazó oldószerkeverék használható. Szükség esetén az etanol propanol–2-vel helyettesíthető.

1.2.2.

Kálium-hidroxid, titrált etanolos oldat, c(KOH), megközelítőleg 0,1 mol/l vagy szükség esetén c(KOH), megközelítőleg 0,5 mol/l. A kálium-hidroxid etanolos oldatának pontos töménységét ismerni és ellenőrizni kell közvetlenül a felhasználás előtt. Használjon a felhasználás előtt legalább öt nappal korábban készült, barna üvegben tárolt és gumidugóval lezárt oldatot. Az oldatnak színtelennek vagy szalmaszínűnek kell lennie. Megjegyzés: A kálium-hidroxid stabil színtelen oldatát a következő módon lehet elkészíteni. Forraljon fel 1 000 ml etanolt 8 g kálium-hidroxiddal és 0,5 g alumíniumreszelékkel és folytassa a forralást egy órán keresztül. Közvetlenül ezután desztillálja. A desztillátumban oldjon fel szükséges mennyiségű kálium-hidroxidot. Hagyja néhány napig állni, majd öntse le az átlátszó felső folyadékot a leülepedett kálium-karbonátról. Az oldat desztilláció nélkül is elkészíthető a következő módon: 1 000 ml etanolhoz adjon 4 ml alumínium-butilátot és hagyja állni a keveréket néhány napig. Öntse le a felül lévő folyadékot és oldja fel a kívánt mennyiségű kálium-hidroxidot. Az oldat használatra készen áll.

1.2.3.

Fenolftalein 10 g/l oldata 95-96 % (v/v) etanolban vagy alkáli-kékben (erősen színezett zsírok esetén 20 g/l oldat 95-96 % (v/v) etanolban.

1.3.   Berendezés

Szokványos laboratóriumi berendezés, beleértve a következőket:

1.3.1.

analitikai mérleg;

1.3.2.

250 ml-es kúpos fenekű lombik;

1.3.3.

10 ml-es büretta 0,05 ml-es beosztással.

1.4.   Eljárás

1.4.1.

A minta előkészítése a tesztre (Végezze el a tesztet a leszűrt mintán. Amennyiben a nedvesség és a szennyeződések együttesen nem haladják meg az 1 %-ot, a mintát használja további kezelés nélkül; amennyiben meghaladják az 1 %-ot, le kell szűrni).

1.4.2.

Mintavételezés A mintavételezést a várható savszámnak megfelelően végezze, a következő táblázat szerint: Várható savszám Minta tömege (g) Mérési pontosság (g) < 1 20 0,05 1–4 10 0,02 4–15 2,5 0,01 15–75 0,5 0,001 > 75 0,1 0,0002 Mérje meg a mintát a kúpos fenekű lombikban (1.3.2.).

1.4.3.

Meghatározás Oldja fel a mintát (1.4.2.) dietil-éter és etanol (1.2.1.) 50-150 ml korábban semlegesített keverékében. Keverés közben végezzen titrálást 0,1 mol/l kálium-hidroxid oldattal (1.2.2.) (lásd a 2. megjegyzést), amíg az indikátor változni kezd (a fenolftalein rózsaszín színe legalább 10 másodpercig nem múlik el). 1. megjegyzés: A kálium-hidroxid etanolos titrált oldata (1.2.2.) helyett kálium vagy nátrium hidroxid vizes oldata is használható, amennyiben a hozzáadott víz mennyisége nem vált ki fázisszétválást. 2. megjegyzés: Amennyiben a szükséges 0,1 mol/l kálium-hidroxid oldat mennyisége meghaladja a 10 ml-t, használjon 0,5 mól/l oldatot. 3. megjegyzés: Amennyiben az oldat titrálás közben átlátszatlanná válik, adjon hozzá megfelelő mennyiségű oldószert (1.2.1.), hogy átlátszó oldatot kapjon.

1.5.   Savasság: az olajsav százalékában kifejezve

A savasság súlyszázaléka a következő:

ahol:

V

=

a felhasznált titrált kálium-hidroxid oldat térfogata ml-ben;

c

=

a felhasznált titrált kálium-hidroxid oldat pontos koncentrációja mol/l-ben;

M

=

a használt sav molsúlya g/mol-ban az eredmény kifejezésére (= 282);

m

=

a minta súlya g-ban.

Eredményként ►M6  két számítás ◄ számtani közepét kell venni.

---

III. MELLÉKLET

A PEROXIDSZÁM MEGHATÁROZÁSA

1.   CÉL

Ez az előírás olajok és zsírok peroxidszámának meghatározását írja le.

2.   ALKALMAZÁSITERÜLET

Az előírás állati és növényi eredetű olajokra és zsírokra alkalmazható.

3.   MEGHATÁROZÁS

A peroxidszám a mintában található azon anyagok mennyisége aktív oxigén/kg milliekvivalensben kifejezve, amelyek kálium-jodidot oxidálnak a megadott üzemi körülmények között.

4.   ALAPELV

A vizsgált mennyiség ecetsavas és kloroformos oldatának kezelése kálium-jodid oldattal. A felszabadított jód titrálása standardizált nátrium-tioszulfát oldattal.

5.   BERENDEZÉS

Minden felhasznált berendezésnek redukáló- vagy oxidálóanyagoktól mentesnek kell lennie.

Megjegyzés: Ne zsírozza be a csiszolt felületeket.

5.1.	3 ml-es üvegkanál.

5.2.	Megközelítőleg 250 ml térfogatú lombikok csiszolt nyakkal és dugókkal, előzetesen kiszárítva és tiszta, száraz inert gázzal (nitrogénnel vagy lehetőleg széndioxiddal) feltöltve.

5.3.	25 vagy 50 ml-es büretta 0,1 ml-es beosztással.

6.   REAGENSEK

6.1.	Analitikai reagens minőségű kloroform, amelyet mentesítettek az oxigéntől a rajta átbuborékoltatott tiszta, száraz inert gázárammal.

6.2.	Analitikai reagens minőségű jégecet, amelyet mentesítettek az oxigéntől a rajta átbuborékoltatott tiszta, száraz inert gázárammal.

6.3.	Kálium-jodid frissen készített, jódtól és jódsavaktól mentes, telített vizes oldata.

6.4.	Nátrium-tioszulfát 0,01 vagy 0,002 mol/l pontosan standardizált vizes oldata, közvetlenül a felhasználás előtt standardizálva.

6.5.	Keményítőoldat, 10 g/l vizes diszperzió, frissen készítve természetes oldható keményítőből.

7.   MINTA

Figyeljen, Hogy a minta vételezése és tárolása fénytől védve történjen, és hidegben, teljesen megtöltött üvegedényekben, csiszolt üveg vagy parafadugóval lezárva legyen tárolva.

8.   ELJÁRÁS

A tesztet szórt nappali fény vagy mesterséges megvilágítás mellett kell végezni. A minta tömegét mérje meg üvegkanálban (5.1.) vagy ennek hiányában lombikban (5.2.) a legközelebbi 0,001 g-ra kerekítve, a várt peroxidszámnak megfelelően a következő táblázat szerint:

Vegye le a lombik (5.2.) dugóját és tegye bele a vizsgált mennyiséget tartalmazó üvegkanalat. Adjon hozzá 10 ml kloroformot (6.1.). Keveréssel oldja fel gyorsan a vizsgált mennyiséget. Adjon hozzá 15 ml ecetsavat (6.2.), majd 1 ml kálium-jodid oldatot (6.3.). Tegye rá gyorsan a dugót, rázza egy percen keresztül, majd hagyja állni pontosan öt percig fénytől védve, 15–25 °C hőmérsékleten.

Adjon hozzá megközelítőleg 75 ml desztillált vizet. Titrálja a felszabadított jódot a nátrium-tioszulfát oldattal (6.4.) (0,002 Mol/l oldat a várhatóan 12-nél alacsonyabb peroxidszám esetén és 0,01 Mol/l a várhatóan 12-nél magasabb peroxidszám esetén), miközben erőteljesen rázza, indikátorként keményítőoldatot (6.5.) használva.

Egy tesztminta esetén végezzen két meghatározást.

Ezzel egyidejűleg végezzen ellenőrző tesztet. Amennyiben az ellenőrző teszt eredménye meghaladja a 0,05 ml 0,01 mol/l nátrium-tioszulfát (6.4.) értéket, cserélje ki az elszennyeződött reagenseket.

9.   AZ EREDMÉNYEK KIFEJEZÉSE

A peroxidszám (PV) aktív oxigén/kg milliekvivalensben kifejezve a következő képlettel határozható meg:

ahol:

V

=

a teszthez felhasznált standardizált nátrium-tioszulfát oldat (6.4.) ml-jeinek száma, az ellenőrző teszt figyelembevételével korrigálva;

T

=

a felhasznált nátrium-tioszulfát oldat (6.4.) pontos moláris koncentrációja;

m

=

a vizsgált adag súlya g-ban;

Eredményként a két elvégzett meghatározás számtani közepét kell venni.

▼M21

---

IV. MELLÉKLET

A VIASZTARTALOM MEGHATÁROZÁSA KAPILLÁRIS GÁZKROMATOGRÁFIÁVAL

1.   CÉL

Ez a módszer az olívaolajok viasztartalmának meghatározására szolgáló eljárást írja le. A viaszok leválasztása a szénatomok száma alapján történik. A módszer alkalmas a sajtolással és az extrakcióval kinyert olívaolajok (olívamaradék-olajok) megkülönböztetésére.

2.   ALAPELV

A zsírszerű anyag oszlopkromatográfiás elválasztása, a megfelelő belső standard hozzáadásával, hidratáltszilikagél-oszlopon; a tesztkörülmények között elsőként eluálódott (a trigliceridekénél kisebb polaritású) frakció leválasztása, majd kapilláris gázkromatográfia segítségével történő analízise.

3.   BERENDEZÉS

3.1.	25 ml-es térfogatú Erlenmeyer-lombik.

3.2.	15,0 mm belső átmérőjű, 30–40 cm hosszú kromatográfiás üvegoszlop csappal.

3.3.

Gázkromatográf kapilláris oszloppal történő használatra, a következőkből álló, közvetlenül az oszlopra történő injektálásra alkalmas rendszerrel felszerelve: 3.3.1. Termosztatikus kamra az oszlopok számára (oszlopkemence), hőmérséklet-programozott fűtéssel. 3.3.2. Közvetlenül az oszlopba vezetett, hideg befecskendező rendszer. 3.3.3. Láng-ionizációs detektor és konverter erősítő. 3.3.4. Regisztráló-integrátor berendezés a konverter erősítővel (3.3.3.) történő használatra, amelynek a válaszideje nem haladja meg az egy másodpercet, és változtatható papírsebességű. (Lehetséges olyan informatizált rendszerek használata is, amelyek alkalmasak a gázkromatográfiai adatok számítógépes feldolgozására.) 3.3.5. Üvegből vagy ömlesztett szilícium-dioxidból készült 8–12 mm hosszúságú, 0,25–0,32 mm belső átmérőjű kapilláris oszlop, belülről egyenletesen 0,10–0,30 μm rétegvastagságú folyadékfázissal borítva. (a folyadékfázis a célnak megfelelő, kereskedelmi forgalomban SE–52 vagy SE–54 jelzésű lehet.)

3.4.	10 μl térfogatú mikrofecskendő közvetlenül az oszlopra történő injektáláshoz, keményített tűvel.

3.5.	Vibráló elektromos keverő.

3.6.	Forgó párologtató.

3.7.	Görgős kemence.

3.8.	Analitikai mérleg, + 0,1 mg-os mérési pontossággal.

3.9.	Szokványos laboratóriumi üvegeszközök.

4.   REAGENSEK

4.1.

60 és 200 μm közötti szemcsenagyságú szilikagél. A szilikagélt 500 °C-on legalább négy órán keresztül melegíteni kell a kemencében. A kihűlést követően a felhasznált szilikagél-mennyiséghez képest 2 % vizet kell hozzáadni. Keverje át a keveréket megfelelő módon, amíg egyenletes masszát kap. Felhasználás előtt legalább 12 órán keresztül tartsa sötét helységben.

4.2.	n-hexán, kromatográfiai minőségű.

4.3.	Etil-éter, kromatográfiai minőségű.

4.4.	n-heptán, kromatográfiai minőségű.

4.5.	Hexános lauril-arachidát standardoldat, 0,1 % (m/V) oldat (belső standard). (Palmitil palmitát vagy mirisztil sztearát is megfelel.) 4.5.1. Szudán 1 (1-fenilazo-2-naftol).

4.6.	Vivőgáz: hidrogén és hélium, gázkromatográfiai felhasználáshoz megfelelő tisztaságú.

4.7.	Segédgázok: — hidrogén, gázkromatográfiai felhasználáshoz megfelelő tisztaságú, — levegő, gázkromatográfiai felhasználáshoz megfelelő tisztaságú.

5.   ELJÁRÁS

5.1.   A kromatográfiás oszlop előkészítése

Szuszpendáljon 15 g szilikagélt (4.1.) az n-hexánban (4.2.), és töltse az oszlopba (3.2.). A teljes ülepedés után elektromos rázóberendezéssel (3.5.) tömörítse, hogy homogénebb kromatográfiás réteget kapjon. 30 ml n-hexánnal mossa át az oszlopot, az esetleges szennyeződések eltávolítása érdekében. Mérjen le pontosan a mérleggel (3.8.) 500 mg-ot a mintából a 25 ml térfogatú Erlenmeyer-lombikba (3.1.), majd adja hozzá a megfelelő mennyiségű belső standardot (4.5.), a feltételezett viasztartalomnak megfelelően. Például olívaolaj esetében 0,1 mg lauril-arachidát oldatot, olívamaradék-olaj esetében 0,25–0,5 mg lauril-arachidát oldatot adjon hozzá. Az ily módon előkészített mintát 2 x 2 ml n-hexán segítségével vigye fel a kromatográfiás oszlopra (4.2.).

Hagyja lefutni az oldatot 1 mm-rel az abszorbens felszíne fölé, majd további 70 ml n-hexánnal mossa át az oszlopot, a természetesen jelen lévő n-alkánok eltávolítása érdekében. Kezdje el a kromatográfiás eluálást, és gyűjtsön össze 180 ml 99:1 arányú n-hexán-etil-éter elegyet úgy, hogy 10 másodpercenként megközelítőleg 15 csepp folyjon át. A minta eluálását 22 + 4 °C -os szobahőmérsékleten kell elvégezni.

Megjegyzések:

Az így kapott frakciót a rotációs bepárlóban (3.6.) párolja szárazra, amíg az oldószer gyakorlatilag teljesen eltűnik belőle. Az oldószer utolsó 2 ml-ét gyenge nitrogénárammal távolítsa el; majd adjon hozzá 2–4 ml n-heptánt.

5.2.   Gázkromatográfiás elemzés

5.2.1.   Előzetes műveletek

A kapilláris oszlopot illessze be a gázkromatográfba (3.3) úgy, hogy az oszlop bemenetét az oszlopra szerelt („on-column”) rendszerhez, az oszlop kimenetét pedig a detektorhoz csatlakoztassa. Végezze el a gázkromatográfiai rendszer összeszerelésének általános ellenőrzését (gázszerelvények szorossága, a detektor hatékonysága, a regisztráló rendszer hatékonysága stb.).

Az első alkalommal használt kapilláris oszlopokat kondicionálni kell. Fúvasson át egy kevés vivőgázt a kapilláris oszlopon, majd kapcsolja be a gázkromatográfiás berendezést. Melegítse fokozatosan addig, amíg körülbelül 4 óra elteltével eléri a 350 °C hőmérsékletet. Ezt a hőmérsékletet tartsa legalább két órán keresztül, majd hozza a berendezést üzemi körülmények közé (gázáram szabályozása, bontóláng begyújtása, csatlakoztatás az elektronikus íróhoz (3.3.4.), a kapilláris oszlop kemencéje, a detektor hőmérsékletének beállítása stb.) és állítsa be a jelet az analízis során tervezett legmagasabb szintnél legalább kétszer nagyobb érzékenységre. Az alapvonalnak lineárisnak kell lennie, illetve mindennemű csúcstól és ingadozástól mentesnek.

A negatív egyenes vonalú drift az oszlop illesztékeinek tökéletlen tömítettségét, míg a pozitív drift az oszlop nem megfelelő kondicionálását jelzi.

5.2.2.   Az üzemi körülmények megválasztása

Általában véve az irányadó üzemi körülmények a következők:

A fenti feltételek az oszlop és a gázkromatográf jellemzőinek megfelelően módosíthatók, hogy a kapott kromatogramok lehetővé tegyék valamennyi viasz leválasztását, a csúcsok kielégítő felbontásban láthatók legyenek (lásd az ábrát), miközben a C32 belső standard retenciós ideje 18 ± 3 perc. A viaszok legreprezentatívabb csúcsa a teljes skálaérték minimum 60 %-a legyen.

A csúcsok integrálásához a paramétereket úgy kell beállítani, hogy az lehetővé tegye az érintett csúcsok területeinek pontos becslését.

Megjegyzés:Tekintettel a magas véghőmérsékletre, pozitív drift előfordulása elfogadható, amely azonban nem haladhatja meg a teljes skálaérték 10 %-át.

5.3.   Az elemzés végrehajtása

A 10 μl térfogatú mikrofecskendő segítségével szívjon fel 1 μl oldatot; a mikrofecskendő dugattyúját felfelé mozgatva ürítse ki a tűt. A tűt vezesse be a befecskendező berendezés válaszfalán, majd egy-két másodperc elmúltával fecskendezze be gyorsan az oldatot, és öt másodperc múlva lassan húzza ki a tűt.

Addig folytassa a rögzítést, ameddig a viaszok teljesen eluálódtak.

Az alapvonalnak minden esetben meg kell felelnie az előírt feltételeknek.

5.4.   A csúcsok azonosítása

Az egyes csúcsok azonosítását a retenciós idő alapján és az azonos körülmények között analizált, ismert retenciós idejű viaszkeverékekkel összehasonlítva végezze.

A szűz olívaolajban található viaszok kromatogramja az ábrán látható.

5.5.   Mennyiségi értékelés

A belső standard és a nyílt szénláncú C40–C46 észterek csúcsainak területét elektronikus integrálással számítsa ki.

Az egyes észterek mg/kg zsírszerű anyagban kifejezett viasztartalmát a következő képlet segítségével lehet kiszámítani:

ahol:

Ax

=

az egyes észterek csúcsának területe négyzetmilliméterben;

As

=

a belső standard csúcsának területe négyzetmilliméterben;

ms

=

a hozzáadott belső standard tömege milligrammban;

m

=

a meghatározni kívánt minta tömege grammban.

6.   AZ EREDMÉNYEK KIFEJEZÉSE

Jegyezze fel a különböző C40–C46 viasztartalmak összegét mg/kg zsírszerű anyagban megadva (ppm).

Megjegyzés:A meghatározandó összetevők a C40-es és a C46-os észterek közötti tartományban lévő páros szénatomok csúcsainak felelnek meg, az alábbi ábrán látható olívaolajviasz-kromatogram példájának megfelelően. Ha a C46-os észter duplán jelenik meg, az azonosítás érdekében tanácsos elvégezni egy olyan olívamaradék-olaj viaszfrakcióinak az analízisét, amelyen a C46-os csúcs könnyen felismerhető, mivel tisztán kiemelkedik.

Az eredményeket egy tizedesjegy pontosságig kell megadni.

Ábra

Egy olívaolaj viasztartalmainak kromatogramja ( 5 )

Jelmagyarázat::

I.S.

=

Lauril-arachidát

1.

=

Diterpén észterek

2 + 2′

=

C40 -es észterek

3 + 3′

=

C42 -es észterek

4 + 4′

=

C44 -es észterek C44

5.

=

C46 -os észterek

6.

=

Szterinészterek és triterpénes alkohol.

---

Függelék

A gáz lineáris sebességének meghatározása

Fecskendezzen be 1–3 μ metánt (vagy propánt) a normál üzemi körülményekre beállított gázkromatográfba. Stopperóra segítségével mérje meg a metán vagy propán oszlopon történő átáramlásának idejét, a befecskendezés pillanatától a csúcs eluálásának pillanatáig (tM).

A lineáris sebességet – cm/s-ben – az L/tM összefüggés adja meg, ahol L az oszlop hosszúsága cm-ben, tM pedig a stopperórával mért idő másodpercben.

▼B

---

V. MELLÉKLET

A SZTERINEK ÖSSZETÉTELÉNEK ÉS MENNYISÉGÉNEK MEGHATÁROZÁSA KAPILLÁRIS-OSZLOP GÁZKROMATOGRÁFIÁVAL

1.   CÉL

A módszer a zsírszerű anyagok egyedi és összes szterintartalmának meghatározását írja le.

2.   A MÓDSZER ALAPELVE

A zsírszerű anyagot, amelyhez belső standardként β-kolesztanint adnak, etanolos kálium-hidroxid oldattal szappanosítják, majd a nem szappanosítható anyagot dietil-éterrel kivonják.

A szterin frakciót kromatográfia segítségével leválasztják a nem szappanosítható anyagról egy bázikus szilikagél rétegen. A szilikagélből visszanyert szterineket trimetil-szilil-éterré alakítják és kapilláris-oszlop gázkromatográfia segítségével elemzik.

3.   BERENDEZÉS

3.1.	250 ml térfogatú gömbölyű fenekű lombik visszafolyós hűtővel és csiszolt üveg csatlakozásokkal.

3.2.	500 ml térfogatú választótölcsérek.

3.3.	250 ml térfogatú lombikok.

3.4.	Komplett elemzőberendezés vékonyréteg kromatográfiához, 20 × 20 cm nagyságú üveg tárgylemezekkel.

3.5.	366 vagy 254 nm hullámhosszúságú ultraibolya lámpa.

3.6.	100 μl és 500 μl térfogatú mikrofecskendő.

3.7.	Hengeres szűrőtölcsér G 3 porózus válaszfallal (15–40 μm porozitás), megközelítőleg 2 cm átmérőjű és megközelítőleg 5 cm magas, vákuum alatti szűrésre alkalmas, 12/21 csiszolt üveg apacsatlakozóval.

3.8.	50 ml térfogatú vákuum lombik 12/21 csiszolt üveg anyacsatlakozóval a szűrőtölcsérrel (3.7.) való használathoz.

3.9.	10 ml térfogatú kúpos fenekű kémcső dugóval.

3.10.

Gázkromatográf kapilláris oszloppal történő használatra, a következőkből álló bontórendszerrel felszerelve: 3.10.1. termosztatikus kamra az oszlopok számára (oszlopkemence) a kívánt hőmérséklet ± 1 °C pontosságon belüli tartásához; 3.10.2. szabályozható hőmérsékletű gőzölögtető berendezés perszilán borítású üveggel; 3.10.3. láng-ionizációs detektor és konverter erősítő; 3.10.4. regisztráló-integrátor berendezés a konverter erősítővel (3.10.3.) történő használatra, amelynek a válaszideje nem haladja meg az egy másodpercet, változtatható papírsebességű.

3.11.

Üvegből vagy ömlesztett szilícium-dioxidból készült 20–30 m hosszúságú, 0,25–0,32 mm belső átmérőjű kapilláris oszlop SE–52 vagy SE–54, illetve azzal egyenértékű folyadékfázissal teljesen és egyenletesen bevonva, amelynek rétegvastagsága 0,10–0,30 μm.

3.12.

10 μl térfogatú mikrofecskendő gázkromatográfiához, keményített tűvel.

4.   REAGENSEK

4.1.	Kálium-hidroxid, megközelítőleg 2 mol/L etanolos oldat: 130 g kálium-hidroxid (minimum 85 % koncentrációjú) hűtés közben feloldva 200 ml desztillált vízben, majd etanollal feltöltve egy liter mennyiségűre. Az oldatot jól lezárt, sötét színű üvegben kell tárolni.

4.2.	Analízishez megfelelő tisztaságú dietil-éter.

4.3.	Analízishez megfelelő tisztaságú vízmentes nátrium-szulfát.

4.4.	Szilikagél bevonatú, 0,25 mm vastagságú üveg tárgylemezek, fluoreszencia indikátor nélkül (kereskedelmi fogalomban kapható).

4.5.	Kálium-hidroxid, megközelítőleg 2 mol/L etanolos oldat: 13 g kálium-hidroxid feloldva 20 ml desztillált vízben, majd etanollal feltöltve egy liter mennyiségűre.

4.6.	Benzol a kromatográfiához (lásd 5.2.2.).

4.7.	Aceton a kromatográfiához (lásd 5.2.2.).

4.8.	Hexán a kromatográfiához (lásd 5.2.2.).

4.9.	Dietil-éter a kromatográfiához (lásd 5.2.2.).

4.10.

Analízishez megfelelő tisztaságú kloroform (lásd 5.2.2.).

4.11.

Referenciaoldat a vékonyréteg-kromatográfiához: koleszterin vagy fitoszterinek ►M6  2 % ◄ -os oldata kloroformban.

4.12.

2,7–dikloro-fluoreszcein 0,2 %-os oldata etanolban. Ez egy kissé bázikussá téve néhány csepp 2 mól/L alkoholos kálium-hidroxid oldat hozzáadásával.

4.13.

Vízmentes piridin a kromatográfiához.

4.14.

Hexametil-diszilizán.

4.15.

Trimetil-kloroszilán.

4.16.

Szterin-trimetilszil-éterek referenciaoldatai. A felhasználáskor kell előállítani az azokat tartalmazó olajokból származó tiszta szterinekből vagy szterinek keverékéből.

4.17.

β–kolesztanin, 0,2 % (m/V) oldata kloroformban (belső standard).

4.18.

Vivőgázok: hidrogén és hélium, gázkromatográfiai felhasználáshoz megfelelő tisztaságú.

4.19.

Segédgázok: — hidrogén, gázkromatográfiai felhasználáshoz megfelelő tisztaságú, — levegő, gázkromatográfiai felhasználáshoz megfelelő tisztaságú.

5.   ELJÁRÁS

5.1.

Nem szappanosítható anyag készítése. 5.1.1. Egy 500 μl mikrofecskendő segítségével tegyen a 250 ml-es lombikba olyan mennyiségű 0,2 %-os β–kolesztanin kloroformos oldatot (4.17.), amelyben a kolesztanin mennyisége az analízishez vett minta szterintartalmának megközelítőleg 10 %-a. Például 5 g mintához adjon 500 μl 0,2 %-os β–kolesztanin oldatot, ha olívaolajat analizál, és 1 500 μl-t, ha ►M6  ————— ◄ olívaolajpogácsa- olajat analizál. Nitrogénáramban való párologtatással szárítsa ki, mérjen pontosan 5 g-ot a száraz, szűrt mintából ugyanabba a lombikba. Az észlelhető mennyiségű koleszterint tartalmazó ►M6  olajok ◄ esetében olyan csúcsok jelennek meg, amelyek retenciós ideje megegyezik a kolesztaninével. Ennek előfordulása esetén a szterinfrakciót kétszer kell elemezni, egyszer belső standard nélkül, egyszer pedig belső standarddal ►M6  vagy betulinolt kell használni a kolesztanol helyett ◄ . 5.1.2. Adjon hozzá 50 ml 2 mol/L etanolos kálium-hidroxid oldatot, csatlakoztassa a visszafolyós hűtőt és vízfürdőben fokozatosan hevítse forrásig, a melegítés során erőteljesen keverve, amíg a szappanképződés meg nem indul (az oldat tisztává válik). Folytassa a melegítést további 20 percen keresztül, majd adjon hozzá 50 ml desztillált vizet a kondenzátor tetején keresztül, ezután szerelje le a kondenzátort és hűtse le a lombikot megközelítőleg 30 °C-ra. 5.1.3. A lombik tartalmát töltse át egy 500 ml térfogatú választótölcsérbe többszöri, összesen megközelítőleg 50 ml desztillált vízzel történő öblítés mellett. Adjon hozzá megközelítőleg 80 ml dietil-étert és 30 másodpercen keresztül rázza erőteljesen, majd hagyja a két fázist szétválni (1. megjegyzés). Válassza le az alsó vizes fázist, és gyűjtse össze egy másik választótölcsérbe. Végezzen két további kivonást a vizes fázison hasonló módon, esetenként 60–70 ml etil-éter felhasználásával. 1. megjegyzés: Az emulziók megszüntethetők permetszerűen hozzáadott kis mennyiségű etilalkohol vagy metilalkohol segítségével. 5.1.4. Az éter-kivonatokat keverje össze egy közös választótölcsérben, majd mossa át desztillált vízzel (50 ml-enként), amíg a mosóvíz semleges reakciót nem mutat. A mosóvíz eltávolítását követően szárítsa meg az éterfázist vízmentes nátrium-szulfáttal, szűrje át vízmentes nátrium-szulfáton egy 250 ml térfogatú lombikba, amelynek súlyát előzőleg lemérte, a tölcsért és a szűrőt mossa ki kis mennyiségű dietil-éterrel. 5.1.5. Párologtassa el az étert néhány ml mennyiségűre, majd gyenge vákuum vagy nitrogénáram alatt szárítsa ki; a szárítást kemencében fejezze be 100 °C hőmérsékleten, megközelítőleg negyed órán keresztül, majd egy szárítóberendezésben történő lehűtés után mérje meg a súlyát.

5.2.

A szterinfrakciók elkülönítése. 5.2.1. Készítsen elő bázikus lapokat. Merítse be a szilikagél lapokat (4.4.) teljesen 0,2 mol/L etanolos kálium-hidroxid oldatba (4.5.) 10 másodpercre, majd hagyja őket füstszekrényben száradni két óráig, végül helyezze őket 100 °C hőmérsékletű kemencébe egy órára. Vegye ki a lapokat a kemencéből és felhasználásig tegye őket kalcium-klorid szárítóberendezésbe. Az így kezelt lapokat 15 napon belül fel kell használni. 2. megjegyzés: Amennyiben bázikus szilikagél lapokat használ a szterin-frakció leválasztásához, akkor nincsen szükség a nem-szappanosítható anyagok timfölddel történő kezelésére. Ebből az következik, hogy minden savas jellegű komponens (zsírsavak és egyéb savak) visszamarad a kiindulásnál és a szterinek sávja egyértelműen elválik a nyílt szénláncú alkohol- és a triterpénalkohol sávoktól. 5.2.2. Benzol és aceton 95:5 térfogatarányú (v/v) oldatát vezesse be egy lemezkifejlesztő kamrába megközelítőleg 1 cm mélységben. Az előbbi helyett használhatja hexán és etil-éter 65:35 térfogatarányú (v/v) oldatát is. Zárja le a tartályt és hagyja megközelítőleg egy fél órán keresztül, hogy beálljon az egyensúly a gőz és a folyadék között. Eluálószerbe mártott szűrőpapírcsíkok erősíthetők a tartály belső felületére, hogy megközelítőleg egyharmadával csökkenjen a kifejlesztési idő és egyenletesebb legyen az összetevők leoldása. 3. megjegyzés: A kifejlesztő keveréket minden analízishez cserélni kell, hogy reprodukálható leoldási körülmények álljanak fenn. 5.2.3. Készítsen a nem szappanosítható anyagból (5.1.5.) megközelítőleg 5 %-os kloroformos oldatot és a 100 μl térfogatú mikrofecskendő segítségével ebből 300 μl-t kenjen fel a lehető legegyenletesebb és lehető legvékonyabb csíkokban, minimális vastagságban egy kromatográf lapra (5.2.1.), a lap valamely végétől megközelítőleg 2 cm-re. A szterinsáv kifejlesztés utáni azonosítására a csíkokhoz igazodva vigyen fel 2–3 μl szterin referenciaoldatot (4.11.). 5.2.4. A lemezt helyezze az 5.2.2. pont szerint előkészített kifejlesztő tartályba. A környezeti hőmérsékletet 15–20°C között kell tartani. A tartályt azonnal fedéllel zárja le és a mintát hagyja eluálódni, ameddig az oldószer eleje el nem éri a lemez felső élétől számított 1 cm távolságot. Ekkor vegye ki a lemezt a kifejlesztő tartályból és meleglevegő-áram segítségével vagy rövid időre az elszívófülkébe helyezve párologtassa el az oldószert. 5.2.5. Kismértékben és egyenletesen permetezze be a lemezt 2,7–diklorofluoreszcein oldattal. Mikor ultraibolya fényben nézi a lapot, a szterinsávot a referenciaoldat elszíneződésével történő összehasonlítás alapján lehet felismerni. A fluoreszkáló terület mentén jelölje be a sáv határait fekete ceruzával. 5.2.6. A kijelölt területen található szilikagélt kaparja le egy fémspatulával. Az eltávolított és apróra zúzott anyagot tegye egy szűrőtölcsérbe (3.7.). Adjon hozzá 10 ml forró kloroformot és alaposan keverje össze fémspatula segítségével, majd vákuumban szűrje le, a szűrletet gyűjtse össze a kúpos fenekű lombikban (3.8.), amely a szűrőtölcsérhez van csatlakoztatva. A tölcsérben bennmaradó anyagot mossa ki háromszor dietil-éterrel (minden alkalommal megközelítőleg 10 ml-rel), a szüredéket gyűjtse ugyanabba a tölcsérhez csatlakoztatott lombikba. Párolja be a szüredéket megközelítőleg 4–5 ml térfogatúra, és a maradék oldatot töltse egy 10 ml térfogatú kémcsőbe (3.9.), amelynek súlyát előzőleg lemérte; a kémcsövet gyenge nitrogénáramban kismértékű melegítéssel párolja be. Oldja fel ismét a maradékot néhány csepp acetonnal, ismét szárítsa meg, párolja, majd helyezze egy kemencébe 105 °C hőmérsékletre 10 percre, ezután vegye ki, hűtse le szárítóberendezésben és mérje meg a súlyát. A kémcsőben maradt anyag a szterinfrakció.

5.3.

Trimetilsziles éterek készítése 5.3.1. Töltse a szterinfrakciót tartalmazó kémcsőbe a szililesedés reagensét, amely 9:3:1 térfogatarányú (v/v/v) (4. megjegyzés) piridin-hexametildiszilizin-trimetilkloroszilán keverékből áll, a szterinek minden milligrammjához 50 μl-nyi mennyiségben úgy, hogy közben ne vegyen fel nedvességet (5. megjegyzés). 4. megjegyzés: A használatra kész oldatok kereskedelmi forgalomban kaphatók. Egyéb szilanizációs reagensek, mint például trimetilszilil, trifluoroacetamid + 1 % trimetilkloroszilán, amelyet azonos térfogatú víztelen piridinnel kell hígítani, szintén kaphatók. 5.3.2. Dugózza le a kémcsövet, és óvatosan (felfordítás nélkül) rázza addig, amíg a szterinek teljesen feloldódnak. Ezután hagyja legalább 15 percig szobahőmérsékleten állni, majd ezt követően centrifugálja néhány percig. A tiszta oldat gázkromatográfiás vizsgálatra kész. 5. megjegyzés: Kismértékű opálosság kialakulása, ami normális jelenség, nem okoz problémát. A fehér csomók kialakulása vagy a rózsaszín elszíneződés megjelenése a nedvesség jelenlétét, illetve a reagens elhasználódását jelzik. Ebben az esetben a tesztet meg kell ismételni.

5.4.

Gázkromatográfiás elemzés. 5.4.1. Előzetes műveletek és az oszlop tömítése. 5.4.1.1. A kapilláris oszlopot illessze be a gázkromatográfba úgy, hogy az oszlop bemenetét csatlakoztassa ahhoz a párologtatóhoz, amely a bontórendszerhez csatlakozik, az oszlop kimenetét pedig a detektorhoz. Végezze el a gázkromatográfiás berendezés általános ellenőrzését (gázszerelvények szivárgása, a detektor hatásfoka, a hasítórendszer és a felvevő rendszer hatásfoka stb.). 5.4.1.2. Amennyiben első alkalommal használja az oszlopot, célszerű azt kondicionálni. Fúvasson át egy kevés vivőgázt a kapilláris oszlopon, majd kapcsolja be a gázkromatográfiás berendezést, és kezdje el fokozatosan melegíteni addig, amíg a hőmérséklet legalább 20 °C-kal meghaladja az üzemi hőmérsékletet (6. megjegyzés). Ezt a hőmérsékletet tartsa legalább két órán keresztül, majd helyezze az egész berendezést üzemi körülmények közé (gázáramok és a bontás szabályozása, bontóláng begyújtása, csatlakoztatás az elektronikus íróhoz, az oszlopkamra beszabályozása, a detektor és az injektor hőmérséklete stb.) és rögzítse a jelet az analízis során tervezett legmagasabb szintnél legalább kétszer nagyobb érzékenységgel. Az alapvonalnak lineárisnak kell lennie, illetve mindennemű csúcstól és ingadozástól mentesnek. A negatív egyenes vonalú drift az oszlop csatlakozásainak tökéletlen tömítettségét jelzi, míg a pozitív drift az oszlop nem megfelelő kondicionálását jelzi. 6. megjegyzés: A kondicionálás hőmérsékletének legalább 20 °C-kal alacsonyabbnak kell lennie, mint az alkalmazott stacioner fázis esetén várható maximális hőmérséklet. 5.4.2. Az üzemi körülmények megválasztása. 5.4.2.1. Az irányadó üzemi körülmények a következők: — oszlophőmérséklet: 260 °C ± 5 °C, — a párologtató hőmérséklete: 280 °C, — a detektor hőmérséklete: 290 °C, — a vivőgáz lineáris sebessége: hélium 20–35 cm/s, hidrogén 30–50 cm/s, — bontási tényező: 1:50–1:100, — a berendezés érzékenysége: a minimális elnyelés 4–16-szorosa, — a rögzítés érzékenysége: 1–2 mV fs, — papírsebesség: 30–60 cm/h, — a befecskendezett anyag mennyisége: 0,5–1 μl TMSE oldat. A fenti feltételek az oszlop és a gázkromatográf jellemzőinek megfelelően módosíthatók, hogy a kapott kromatogramok megfeleljenek a következő feltételeknek: — a β–szitoszterin retenciós idejének 20 ± 5 percnek kell lennie, — a kampeszterin csúcsnak olívaolaj esetén (átlagos tartalom 3 %) a teljes skála 15 ± 5 %-ának, szójaolaj esetén (átlagos tartalom 20 %) a teljes skála 80 ± 10 %-ának kell lennie, — minden jelenlévő szterint szét kell választani. A szétválasztáson túl minden csúcsot teljesen fel kell bontani, azaz a csúcs vonalának a következő csúcs kezdete előtt vissza kell térnie az alapvonalhoz. Azonban a nem teljes felbontás elfogadható abban az esetben, ha a TRR 1,02-nél lévő csúcs a függőleges segítségével kiszámítható. 5.4.3. Az elemzési eljárás. 5.4.3.1. A 10 μl térfogatú mikrofecskendő segítségével szívjon fel 1 μl hexánt majd 0,5 μl levegőt, ezt követően pedig 0,5-1 μl mintaoldatot. A mikrofecskendő dugattyúját felfelé mozgatva ürítse ki a tűt. A tűt vezesse be a befecskendező berendezés válaszfalán, majd 1–2 másodperc elmúltával fecskendezze be gyorsan az oldatot és 5 másodperc múlva lassan húzza ki a tűt. 5.4.3.2. Folytassa a rögzítést, ameddig a jelenlévő szterinek TMSE keveréke teljesen eluálódott. Az alapvonalnak továbbra is meg kell felelnie az előírásoknak (5.4.1.2.). 5.4.4. A csúcsok azonosítása Az egyes csúcsok azonosítását a retenciós idő alapján és az azonos körülmények között analizált szterin TMSE keverékkel összehasonlítva végezze. A szterinek a következő sorrendben eluálódnak: koleszterin, brasszikaszterin, 24–metilén koleszterin, kampeszterin, kampesztanin, sztigmaszterin, Δ 7–kampeszterin, Δ 5,23–sztigmasztadienol, kleroszterin, β–szisztoszterin, szisztosztanin, Δ 5–avenaszterin, Δ 5, 24–sztigmasztadienol, Δ 7–sztigmaszterin, Δ 7–avenaszterin. Az SE–52 és SE–54 oszlopok szitoszterinjének retenciós ideje az 1. táblázatban látható. Az 1. ábrán és a 2. ábrán néhány olaj jellegzetes kromatogramja látható. 5.4.5. Mennyiségi értékelés. 5.4.5.1. Az β–kolesztanol és a szterin csúcsainak területét az integrátor segítségével számítsa ki. Ne vegye figyelembe az 1. táblázat felsorolásában nem szereplő vegyületektől származó csúcsokat. Az β–kolesztanol reakció együtthatójának értékét vegye 1-nek. 5.4.5.2. Az egyes szterinek mg/100 g zsírszerű anyagban megadott koncentrációját a következő módon lehet kiszámítani: ahol: Ax = az x szterin csúcsának területe ►M6  ————— ◄ ; As = a β–kolesztanin csúcsának területe ►M6  ————— ◄ ; ms = a hozzáadott β–kolesztanin tömege milligrammban; m = a meghatározni kívánt minta tömege grammban.

6.   AZ EREDMÉNYEK KIFEJEZÉSE

6.1.	Jegyezze fel az egyes szterinek mg/100 g zsírszerű anyagban megadott mennyiségét, illetve összegüket az „összes szterin” mennyiségeként.

6.2.	Az egyes szterinek koncentrációját a vonatkozó csúcs területének és az összes szterincsúcs területének hányadosából határozza meg. ahol Ax = az x szterin csúcsának területe, A = az összes szterincsúcs alatti terület.

---

FÜGGELÉK

A gáz lineáris sebességének meghatározása

Fecskendezzen 1–3 μl metánt vagy propánt a normál üzemi körülményekre beállított gázkromatográfba, és mérje meg a metán vagy propán oszlopon történő átáramlásának idejét a befecskendezés pillanatától a csúcs megjelenésének pillanatáig (tM).

A cm/s-ben megadott lineáris sebesség az L/tM kifejezésből adódik, ahol az L az oszlop hossza centiméterben, a tM pedig a stopperórával mért idő másodpercben.

1. ábra

Egy nyers olívaolaj szterinfrakciójának gázkromatogramja

2. ábra

Egy finomított olívaolaj szterinfrakciójának gázkromatogramja

---

VI. MELLÉKLET

AZ ERITRODIOL ÉS AZ UVAOL MEGHATÁROZÁSA

BEVEZETÉS

Az eritrodiol (gyakran az eritrodiolt és az uvaolt közösen glikoloknak nevezik) néhány zsírszerű anyagra jellemző, a nem szappanosítható frakció egy összetevője. Az oldószeresen extrahált olívaolajban lényegesen magasabb koncentrációban található, mint egyéb olajokban, mint például a sajtolt olívaolajban és a szőlőmagolajban, ami szintén tartalmazza, így az eritrodiol jelenléte az oldószeresen extrahált olívaolajra utalhat.

1.   CÉL

A módszer az eritrodiol kimutatását írja le zsírszerű anyagokban.

2.   A MÓDSZER ALAPELVE

A zsírszerű anyagot kálium-hidroxid etanolos oldatával szappanosítják. Ezután a nem szappanosítható frakciót dietil-éterrel kivonják és timföldoszlopon történő átvezetéssel tisztítják.

A nem szappanosítható anyagokat szilikagél lapokon vékonyréteg-kromatográfiás vizsgálattal elemzik, míg szét nem válnak a szterin- és az eritrodiol-frakciónak megfelelő sávok. A lapról visszanyert szterint és eritrodiolt feloldják trimetilszil-éterekben, majd a keveréket gázkromatográfiás eljárással elemzik.

Az eredményt az eritrodiol és szterinek keverékében található eritrodiol százalékában adják meg.

3.   BERENDEZÉS

3.1.	Az v. mellékletben (a szterintartalom meghatározása) szereplő berendezés.

4.   REAGENSEK

4.1.	Az v. mellékletben (a szterintartalom meghatározása) szereplő reagensek.

4.2.	Eritrodiol referenciaoldata, 0,5 %-os oldat kloroformban.

5.   ELJÁRÁS

5.1.   A nem szappanosítható anyagok előkészítése.

Az V. melléklet 5.1.2. bekezdése szerint.

5.2.   Az eritrodiol és a szterinek leválasztása.

5.2.1.

Lásd az V. melléklet 5.2.1. bekezdését.

5.2.2.

Lásd az V. melléklet 5.2.2. bekezdését.

5.2.3.

Készítsen a nem szappanosítható anyagból 5 %-os kloroformos oldatot. A 0,1 ml térfogatú mikrofecskendő segítségével ebből az oldatból 0,3 ml-t kenjen fel a lehető legegyenletesebb és lehető legvékonyabb csíkokban egy kromatográflapra, a lap alsó végétől megközelítőleg 1,5 cm-re. A lap egyik végére helyezzen néhány mikroliter koleszterin- és eritrodiololdatot referenciaként.

5.2.4.

A lemezt helyezze az 5.2.1. szerint előkészített kifejlesztő tartályba. A környezeti hőmérsékletet megközelítőleg 20 °C körül kell tartani. A tartályt azonnal zárja le a fedéllel, és a mintát hagyja eluálódni, ameddig az oldószer eleje el nem éri a lemez felső élétől számított 1 cm távolságot. Ekkor vegye ki a lemezt a kifejlesztő tartályból, és meleglevegő-áram segítségével párologtassa el az oldószert.

5.2.5.

Kismértékben és egyenletesen permetezze be a lemezt 2,7–diklorofluoroszcein alkoholos oldattal. Ultraibolya fényben nézve a lapot, a szterin és az eritrodiol sávot a referenciaoldat elszíneződésével történő összehasonlítás alapján lehet felismerni. A fluoreszkáló terület mentén jelölje be a sáv határait.

5.2.6.

A kijelölt területen található szilikagélt kaparja le egy fémspatulával. A lapról eltávolított anyagot tegye egy 50 ml térfogatú lombikba. Adjon hozzá 15 ml forró kloroformot, rázza össze és szűrje át egy szinterelt-üveg szűrőlapú tölcséren, hogy a szilikagél átkerüljön a szűrőre. Mossa ki háromszor (minden alkalommal 10 ml) forró kloroformmal, és gyűjtse össze a szűrletet egy 100 ml térfogatú lombikba. A szűrletet párolja 4-5 ml térfogatúra, öntse át egy kalibrált 10 ml térfogatú kúpos fenekű centrifugakémcsőbe, nitrogénáramban gyengén hevítve szárítsa ki, majd mérje meg a súlyát.

5.3.   A trimetilszil-észterek készítése.

Az V. melléklet 5.3. bekezdése szerint.

5.4.   Gázkromatográfiás analízis.

A fenti eljárás 5.4. bekezdése szerint. A gázkromatográf üzemi körülményeinek az analízis során olyanoknak kell lenniük, hogy elvégezhető legyen a szterinek elemzése, és leválasztható legyen az eritrodiolból és az uvaolból a TMSE.

A minta befecskendezését követően addig folytassa a rögzítést, amíg a szterinek jelen vannak, illetve az eritrodiol és az uvaol eluálódott. Ezután azonosítsa a csúcsokat (az eritrodiol és az uvaol β-szitoszterinhez képest meghatározott retenciós ideje megközelítőleg 1,45, illetve 1,55), majd számítsa ki a területeket.

6.   AZ EREDMÉNYEK KIFEJEZÉSE

ahol:

A1

=

az eritrodiolcsúcs területe ►M6  ————— ◄ ;

A2

=

az uvaolcsúcs területe ►M6  ————— ◄ ;

Aszterinek

=

az összes szterincsúcs alatti terület ►M6  ————— ◄ .

Az eredményt egy tizedesjegy pontosságig kell megadni.

▼M21

---

VII. MELLÉKLET

A 2-GLICERIL MONOPALMITÁT SZÁZALÉKÁNAK MEGHATÁROZÁSA

1.   CÉL ÉS ALKALMAZÁSI TERÜLET

Ez a módszer a palmitinsav-tartalom meghatározásának analitikus eljárását írja le a trigliceridek 2-pozícióján, a 2-gliceril monopalmitát százalékának értékelésének segítségével.

A módszer a szobahőmérsékletű (20 °C), folyékony növényi olajokra alkalmazható.

2.   ALAPELV

Az előkészítés után az olajminta reakcióba lép a pankreatin-lipázzal: a triglicerid molekula 1- és 3-pozícióján végbemenő részleges és specifikus hidrolízis nyomán elválasztódnak a 2-pozíción lévő monogliceridek. A monoglicerid-frakción belül a 2-gliceril monopalmitát százalékát – a szililesedés után – kapilláris gázkromatográfia segítségével határozzuk meg.

3.   BERENDEZÉS ÉS LABORATÓRIUMI ESZKÖZÖK

3.1.	25 ml térfogatú Erlenmeyer-lombik

3.2.	100, 250 és 300 ml térfogatú főzőpoharak

3.3.	21–23 mm belső átmérőjű, 400 mm hosszú kromatográfiás üvegoszlop összesütött üveglemezzel a csapnál

3.4.	10, 50, 100 és 200 ml térfogatú kalibrált kémcsövek

3.5.	100 és 250 ml térfogatú gömbölyű fenekű lombik

3.6.	Forgó párologtató

3.7.	10 ml térfogatú, kúpos aljú centrifugakémcső csiszolt üvegdugóval

3.8.	Laboratóriumi centrifuga 10 és 100 ml térfogatú kémcsövekkel

3.9.	A hőmérsékletet 40 °C + 0,5 °C-on tartó termosztát

3.10.

1 és 2 ml térfogatú mérőpipetták

3.11.

1 ml-es fecskendő

3.12.

100 μl-es mikrofecskendő

3.13.

1 000 ml-es tölcsér

3.14.

Gázkromatográf kapilláris oszloppal, az alábbiakból álló, közvetlenül az oszlopra történő injektálásra alkalmas„on column” rendszerrel, valamint a kiválasztott hőmérsékletet 1 °C pontossággal tartó kemencével felszerelve

3.15.

Közvetlenül az oszlopba vezetett, „on column” hideg befecskendező rendszer

3.16.

Lángionizációs detektor és elektrométer

3.17.

Regisztráló-integrátor berendezés az elektrométerrel történő használatra, amelynek a válaszideje nem haladja meg az egy másodpercet, és változtatható papírsebességű

3.18.

Üvegből vagy ömlesztett szilícium-dioxidból készült, 8–12 méter hosszúságú, 0,25–0,32 mm belső átmérőjű, 5 % 0,10–0,30 μm rétegvastagságú metil-polisziloxánnal vagy fenil-metil-polisziloxánnal bélelt kapilláris oszlop, amely 370 °C-on használható

3.19.

10 μl-es, legalább 7,5 cm hosszú mikrofecskendő keményített tűvel, közvetlenül az oszlopra történő injektáláshoz.

4.   REAGENSEK

4.1.

0,063 és 0,200 mm közötti szemcsenagyságú szilikagél (70/280 mesh), a következőképpen elkészítve: helyezze a szilikagélt egy porcelán csészébe, 160 °C-os kemencében szárítsa ki 4 órán keresztül, majd hagyja kihűlni szobahőmérsékleten egy szárítóban. Adjon hozzá a szilikagél súlya 5 %-ának megfelelő vízmennyiséget a következőképpen: egy 500 ml térfogatú Erlenmeyer-lombikban mérjen le 152 g szilikagélt, adjon hozzá 8 g desztillált vizet, dugaszolja be, majd óvatosan rázza fel, hogy a víz egyenletesen oszoljon el. Felhasználás előtt hagyja állni legalább 12 óráig.

4.2.	n-hexán (kromatográfiai minőségű)

4.3.	Izopropanol

4.4.	Izopropanol, vízoldat 1/1 (V/V)

4.5.	Pankreatin lipáz. A felhasznált lipáznak 2,0 és 10 lipáz egység/mg lipáztevékenységet kell mutatnia (Kereskedelmi forgalomban is kaphatók 2 és 10 lipáz egység/enzim mg lipáztevékenységet mutató pankreatin lipázok.)

4.6.	Tris-hidroximetilaminometán-pufferoldat: 1 M vizes oldatát állítsa be pH 8 értékűre koncentrált HCl (sósav) (1/1 V/V) hozzáadásával (ellenőrizze potenciométerrel)

4.7.	Nátrim-kolát (enzim minőségű), 0,1 %-os vizes oldat (ezt az oldatot az elkészítését követő 2 héten belül fel kell használni)

4.8.	Kalcium-klorid, 22 %-os vizes oldat

4.9.	Dietil-éter kromatográfiához

4.10.

Kifejlesztőoldat: n-hexán/dietil-éter keverék (87/13) (V/V)

4.11.

Nátrium-hidroxid, (súlyra) 12 %-os oldat

4.12.

Fenolftalein, 1 %-os etanol oldat

4.13.

Vivőgáz: hidrogén vagy hélium, gázkromatográfiai felhasználáshoz megfelelő tisztaságú

4.14.

Segédgázok: hidrogén, minimum 99 %-os, nedvességtől és szerves szennyeződésektől mentes, illetve levegő, szintén gázkromatográfiai felhasználáshoz megfelelő tisztaságú

4.15.

Szilanizációs reagensek: 9/3/1 (V/V/V) arányú piridin-hexametildiszilizin-trimetilkloroszilán keverék. A használatra kész oldatok kereskedelmi forgalomban kaphatók; egyéb szilanizációs reagensek is felhasználhatók, mint például N, 0–bis (trimetilszilil) trifluoroacetamid + 1 % trimetilkloroszilán azonos térfogatú víztelen piridinnel való keveréshez.

4.16.

Referenciaminták: tiszta monogliceridek, vagy olyan monoglicerid-keverékek, amelyeknek ismert, a mintához hasonló százalékos összetételük van.

5.   ELJÁRÁS

5.1.   A minta előkészítése

5.1.1.

A 3 %-nál kisebb szabad savasságú olajokat nem szükséges semlegesíteni a szilikagéllel elvégzett oszlopkromatográfia előtt. A 3 %-nál nagyobb szabad savasságú olajokat az 5.1.1.1. pontnak megfelelően semlegesíteni kell. 5.1.1.1. Töltsön az 1 000 ml-es tölcsérbe (3.13.) 50 g olajat és 200 ml n-hexánt. Adjon hozzá 100 ml izopropanolt, és az olaj 5 %-kal megemelt szabad savasságának megfelelő mennyiségű 12 %-os nátrium-hidroxid oldatot (4.11.). Egy percen keresztül rázza erőteljesen. Adjon hozzá 100 ml desztillált vizet, majd rázza fel ismét, ezután hagyja leülepedni. A leválasztást követően távolítsa el az alsó szappanréteget. Távolítsa el az esetleges többi réteget (nyálka, oldhatatlan anyag) is. Mossa át a semlegesített olaj hexánoldatát többször 50–60 ml 1/1 (V/V) izopropanol/víz oldatban (4.4.), amíg a fenolftalein rózsaszín árnyalata el nem tűnik. A hexán nagyobbik részét távolítsa el vákuum alatt végzett bepárlással (használjon például forgó párologtatót), és töltse át az olajat egy 100 ml-es gömbölyű lombikba (3.5.). Szárítsa ki az olajat vákuumban, amíg az oldószer teljesen el nem távozik. Az eljárás végén az olaj savasságának 0,5 %-nál alacsonyabbnak kell lennie.

5.1.2.

A fent leírtak szerint előkészített olajból 1,0 g-ot töltsön egy 25 ml térfogatú Erlenmeyer-lombikba (3.1.), és oldja fel 10 ml kifejlesztőoldatban (4.10.). Hagyja leülepedni az oldatot legalább 15 percen keresztül, a szilikagéllel végzett oszlop-kromatográfia előtt. Ha az oldat zavaros, centrifugázza ki, a kromatográfiához szükséges optimális feltételeket teremtve. (Használatra kész, 500 mg-os SPE szilikagél hüvelyek is felhasználhatók a célra).

5.1.3.

A kromatográfiás oszlop előkészítése Öntsön az oszlopba (3.3.) megközelítőleg 30 ml kifejlesztőoldatot (4.10.), helyezzen az oszlop alsó felébe üvegrúd segítségével egy vattadarabot; nyomkodja meg, hogy a levegő távozzon belőle. Egy főzőpohárban készítsen szuszpenziót, 25 g szilikagélt (4.1.) megközelítőleg 80 ml kifejlesztőoldatban feloldva, és egy tölcsér segítségével öntse az oszlopba. Ellenőrizze, hogy az egész szilikagél be lett töltve az oszlopba; mossa át a kifejlesztőoldattal (4.10.), nyissa ki a csapot, és hagyja, hogy a folyadék szintje érjen fel megközelítőleg 2 mm-rel a szilikagél felső szintje fölé.

5.1.4.

Oszlopkromatográfia Egy 25 ml térfogatú Erlenmeyer-lombikban (3.1.) mérjen le pontosan 1,0 g, az 5.1. pontnak megfelelően előkészített mintát. Oldja fel a mintát 10 ml kifejlesztőoldatban (4.10.). Az így kapott oldatot öntse az 5.1.3. pontnak megfelelően előkészített kromatográfiás oszlopba. Kerülje az oszlop felszínének mozgatását. Nyissa meg a csapot, és hagyja átfolyni a mintaoldatot, amíg az el nem éri a szilikagél szintjét. Fejlessze ki 150 ml kifejlesztőoldattal. Állítsa a térfogatáramot 2 ml/percre (úgy, hogy körülbelül 60–70 perc alatt 150 ml oldat folyjon át az oszlopba). Az eluátumot fogja fel egy előzetesen lemért, 250 ml térfogatú gömbölyű lombikban. Vákuum alatt párologtassa el az oldószert, az utolsó nyomokat nitrogénáram segítségével távolítva el. Mérje le a gömbölyű lombikot, és számítsa ki a kinyert kivonatot. (Használatra kész SPE szilikagél hüvelyek használata esetén a következőképpen járjon el: Öntsön 1 ml oldatot (5.1.2.) az előzetesen 3 ml n-hexánnal előkészített hüvelyekbe.) Az átmosás után fejlessze ki az oldatot 4 ml 9/1 (V/V) arányú n-hexán/dietil-éter keverékkel. Fogja fel az eluátumot egy 10 ml térfogatú kémcsőben, és párologtassa el nitrogénáram segítségével a teljes kiszáradásig. A kiszárított maradékot tegye ki a pankreatin-lipáz hatásának (5.2.). Rendkívül fontos, hogy SPE hüvelyen való áthaladás előtt, illetve után egyaránt ellenőrizze a zsírsavösszetételt).

5.2.   Hidrolízis pankreatin-lipázzal

5.2.1.

Mérjen a centrifugakémcsőbe 0,1 g, az 5.1. pontnak megfelelően előkészített olajat. Adjon hozzá 2 ml pufferoldatot (4.6.), 0,5 ml nátrium-kolát-oldatot (4.7.) és 0,2 ml kalcium-klorid-oldatot; minden hozzáadás után alaposan rázza fel a keveréket. Zárja le a kémcsövet a csiszolt dugóval, majd tegye a 40 ± 0,5 °C hőmérsékleten tartott termosztátba (4.17.).

5.2.2.

Adjon hozzá 20 mg lipázt, rázza fel alaposan (kerülje a dugó benedvesedését), majd tegye a kémcsövet a termosztátba pontosan 2 percre. Ezután vegye ki, rázza fel erőteljesen pontosan 1 percig, és hagyja kihűlni.

5.2.3.

Adjon hozzá 1 ml dietil-étert, zárja le a dugóval és erőteljesen rázza fel, majd centrifugálás után az éteroldatot mikrofecskendő segítségével öntse át egy tiszta és száraz kémcsőbe.

5.3.   A szilanizált származékok és a gázkromatográfia előkészítése

5.3.1.

Egy mikrofecskendő segítségével töltsön 100 μl oldatot (5.2.3.) egy 10 ml térfogatú kúpos fenekű kémcsőbe.

5.3.2.

Enyhe nitrogénárammal párologtassa el az oldószert, adjon hozzá 200 μl szilanizációs reagenst (4.15.), dugaszolja be a kémcsövet, és hagyja ülepedni 20 percig.

5.3.3.

A 20 perc leteltével adjon hozzá 1–5 ml n-hexánt (a kromatográfiai körülmények függvényében): az így kapott oldat készen áll a gázkromatográfiás eljárásra.

5.4.   Gázkromatográfia

Az üzemi körülmények a következők:

5.4.1.   A csúcsok azonosítása

Az egyes monogliceridek azonosítását a retenciós idők alapján, és az azonos körülmények között analizált standard monoglicerid-keverékek retenciós idejével összehasonlítva kell elvégezni.

5.4.2.   Mennyiségi értékelés

Az egyes csúcsok területét elektronikus integrálással számítsa ki.

6.   AZ EREDMÉNYEK KIFEJEZÉSE

A gliceril monopalmitát százalékát az ehhez tartozó csúcs területe, illetve az összes monoglicerid csúcsok területének összege közötti arány alapján számítsa ki (lásd a 2. ábrát), a következő képlet alapján:

ahol:

Ax

=

a gliceril monopalmitáthoz tartozó csúcs területe

ΣA

=

az összes monogliceridcsúcs területének összege

Az eredményt egy tizedesjegy pontosságig kell megadni.

7.   ANALÍZIS JEGYZŐKÖNYV

Az analízis jegyzőkönyvnek a következőket kell tartalmaznia:

1.    ábra

A 20 % észterezett olajjal (100 %) kevert finomított olívaolajra kifejtett lipázhatás nyomán keletkezett szilanizációs reakciótermékek kromatogramja.

2.    ábra

Kromatogram:

(A)

nem észterezett olívaolaj, a lipázreakció után; a szilanizáció után; ilyen körülmények között (8–12 m-es kapilláris oszlop) a viaszfrakció a digliceridfrakcióval egy időben, vagy kevéssel utána eluálódik. A lipázreakció után a triglicerid-tartalom nem haladhatja meg a 15 %-ot. Jelmagyarázat:: 1 = Szabad zsírsavak 2 = Monogliceridek 3 = Digliceridek 4 = Trigliceridek * = 2-monopalmitin ** = C54 triglicerid

Kromatogram:

(B)

észterezett olaj a lipázreakció után; a szilanizáció után; ilyen körülmények között (8–12 m-es kapilláris oszlop) a viaszfrakció a digliceridfrakcióval egy időben, vagy kevéssel utána eluálódik. A lipázreakció után a triglicerid-tartalom nem haladhatja meg a 15 %-ot. Jelmagyarázat: 1 = Szabad zsírsavak 2 = Monogliceridek 3 = Digliceridek 4 = Trigliceridek * = 2-monopalmitin ** = C54 triglicerid

8.   MEGJEGYZÉSEK

A LIPÁZ ELKÉSZÍTÉSE

Kielégítő lipázaktivitású lipázok kaphatók kereskedelmi forgalomban, de lehetséges laboratóriumi elkészítésük is a következők szerint:

Hűtsön le 5 kg friss sertés-hasnyálmirigyet 0 °C hőmérsékletre. Távolítsa el a környező szilárd zsiradékot és a kötőszövetet, majd dörzsölje szét egy keverőgépben, hogy pépes folyadékot kapjon. A keverővel keverje össze a pépet 2,5 l vízmentes acetonnal 4–6 órán keresztül, majd centrifugálja. Extrahálja a maradékot még háromszor, azonos mennyiségű acetonnal, majd két alkalommal aceton és dietil-éter 1/1 (V/V) keverékével, majd kétszer dietil-éterrel.

Szárítsa a maradékot in vacuo 48 órán keresztül, hogy stabil port kapjon, amely hűtőszekrényben és nedvességtől védve hosszan tárolható.

A LIPÁZ AKTIVITÁSÁNAK BEÁLLÍTÁSA

Készítsen olívaolaj-emulziót a következőképpen:

Megfelelő keverőben 10 percen keresztül rázza össze a 165 ml 100 g/l-es gumiarábikum-oldatból, 15 g jégzúzalékból és 20 ml előzetesen semlegesített olívaolajból álló keveréket.

Egy főzőpohárba tegyen 10 ml-t ebből az emulzióból, majd ezután 0,3 ml 0,2 g/ml-es nátrium-kolát oldatot és 20 ml desztillált vizet.

Tegye a főzőpoharat egy 37 °C hőmérsékleten tartott termosztátba; helyezze bele egy pH-mérő elektródáit és egy keverőspirált.

Egy büretta segítségével cseppenként adagoljon nátrium-hidroxid-oldatot (0,1 N), amíg a pH-érték 8,3 nem lesz.

Adjon hozzá megfelelő mennyiséget a lipáz vizes szuszpenziójából (0,1 g/ml lipáz). Amint a pH-mérő 8,3-at mutat, indítsa el a stopperórát, és olyan sebességgel csepegtesse a nátrium-hidroxid-oldatot, hogy a 8,3 pH-érték megmaradjon. Minden percben olvassa le a felhasznált lúgoldat térfogatát.

A megfigyeléseket rögzítse grafikonon, az időértékeket használva abszcisszaként, az állandó pH-érték fenntartásához szükséges 0,1 N-es lúgoldat ml-ben kifejezett térfogatát pedig ordinátaként. Lineáris grafikont kell kapnia.

A felhasznált por lipáz egység/mg-ban kifejezett aktivitása a következő képlettel határozható meg:

ahol:

A	a lipáz egység/mg-ban kifejezett aktivitása,

V	a percenként felhasznált nátrium-hidroxid-oldat ml-ek száma (a grafikonból kiszámítva),

N	a nátrium-hidroxid-oldat moláris koncentrációja,

m	a lipáz por vizsgált mennyiségének tömege mg-ban.

A lipázegység definíciója a következő: az az enzimmennyiség, amely percenként 10 μ–savekvivalenst szabadít fel.

▼M20 —————

▼B

---

IX. MELLÉKLET

SPEKTROFOTOMETRIKUS VIZSGÁLAT ULTRAIBOLYA FÉNYBEN

ELŐSZÓ

Az ultraibolya fény alatt végzett spektrofotometriás vizsgálat segítségével a zsír minőségével, tartósítási állapotával és a technológiai folyamatok által benne okozott változásokkal kapcsolatos információk állapíthatók meg.

A módszernél megadott hullámhossz elnyelése a jelen lévő konjugált dién- és triénrendszereknek köszönhető. Ezeket az abszorpciókat fajlagos kioltásban E1 % 1cm (kioltás a zsír meghatározott 1 %-os oldatában, 1 cm vastagságban) fejezik ki, amelyet egyezményesen K-val („kioltási tényezőnek” is nevezik) jelölnek.

1.   CÉL

A módszer az olívaolajok ultraibolya fényben történő spektrofotometrikus vizsgálatának eljárását írja le.

2.   A MÓDSZER ALAPELVE

A kérdéses zsírt feloldják a szükséges oldószerben, majd az adott hullámhossztartományban meghatározzák az oldat kioltását a tiszta oldathoz viszonyítva. A fajlagos kioltást a spektrofotométer által mutatott értékből számítják ki.

3.   BERENDEZÉS

3.1.	Spektrofotométer a 220-360 nm hullámhosszúságú ultraibolya tartományban a kioltás mérésére, az egyes nanométerértékek leolvasásának lehetőségével.

3.2.	1 cm optikai hosszúságú szögletes kvarcküvetták fedéllel. Vízzel vagy más megfelelő oldószerrel feltöltve a küvetták között nem lehet nagyobb eltérés, mint 0,01 kioltási egység.

3.3.	25 ml térfogatú, beosztásos lombikok.

▼M6

3.4.	Kromatográfiás oszlop, felső része 270 mm hosszú, 35 mm átmérőjű, az alsó rész 270 mm hosszú és az átmérője megközelítőleg 10 mm.

▼B

4.   REAGENSEK

4.1.

Spektrofotometriailag tiszta izo-oktán (2,2,4–trimetilpentán). A desztillált vízhez képest ennek a transzmissziós tényezője legalább 60 % a 220 nm hullámhosszon és legalább 95 % a 250 nm hullámhosszon, vagy — spektrofotometriailag tiszta ciklohexán: a desztillált vízhez képest ennek a transzmissziós tényezője legalább 40 % a 220 nm hullámhosszon és legalább 95 % a 250 nm hullámhosszon. ▼M6 ————— ▼B

4.2.	Lúgos timföld az oszlop-kromatográfiához, az I. függelék szerint előkészítve és ellenőrizve.

4.3.	n-hexán a kromatográfiához.

5.   ELJÁRÁS

5.1.

A kérdéses mintának teljesen homogénnek kell lennie és nem lehetnek benne feltételezett szennyeződések. A szobahőmérsékleten folyékony olajokat megközelítőleg 30 °C hőmérsékleten át kell szűrni papíron, a kemény zsírokat homogenizálni kell, és át kell szűrni az olvadáspontjukat legfeljebb 10 °C-kal meghaladó hőmérsékleten.

5.2.

Mérje meg pontosan a súlyát megközelítőleg 0,25 g ilyen módon előkészített mintának, tegye egy 25 ml térfogatú beosztásos lombikba és töltse fel a jelig a megadott oldószerrel, majd homogenizálja. A kapott oldatnak teljesen tisztának kell lennie. Amennyiben opálosság vagy zavarosság lép fel, gyorsan szűrje át papíron.

5.3.

Töltsön meg egy küvettát a kapott oldattal, majd a referenciaként használt oldat segítségével mérje meg a kioltást a megfelelő hullámhosszon a 232–276 nm-es tartományban. A kapott kioltási értékeknek a 0,1–0,8 tartományba kell esniük. Amennyiben ettől eltérnek, a mérést meg kell ismételni sűrűbb, illetve hígabb oldattal.

5.4.

Amennyiben a fajlagos kioltást timföldön való átvezetést követően kell meghatározni, a következők szerint járjon el. Tegyen a kromatográfiás oszlopba 30 g lúgos timföld–hexán szuszpenziót. Az adszorbens leülepedését követően távolítsa el a felesleges hexánt, a timföld fölött megközelítőleg 1 cm magasságig. Oldjon fel az 5.1. pont szerint homogenizált és szűrt zsírból 10 g-ot 100 ml hexánban és öntse az oldatot az oszlopba. Gyűjtse össze az eluátumot, párologtassa el az összes oldószert vákuum alatt megközelítőleg 25 °C hőmérsékleten. Az így kapott zsírral azonnal járjon el az 5.2. pont szerint.

6.   AZ EREDMÉNYEK KIFEJEZÉSE

6.1.

Jegyezze fel a Különböző hullámhosszokon a következő módon kiszámított fajlagos kioltásokat (kioltási tényezőket): ahol: Kλ = fajlagos kioltás a λ hullámhosszon; Eλ = a mért kioltás a λ hullámhosszon; c = az oldat koncentrációja g/100 ml-ben; s = a küvetta vastagsága cm-ben. Az eredményeket két tizedesjegyig adja meg.

6.2.

Az olívaolajok spektrofotometriás elemzése az EGK-rendeleteknek megfelelő hivatalos módszer szerint kiterjed a fajlagos kioltás izo-oktán oldatban 232 és 270 nm hullámhosszon történő meghatározására, illetve a K meghatározására, amely a következő képlettel számítható ki: ahol Km az m – maximális elnyelésű – 270 nm körüli hullámhosszon mért fajlagos kioltás.

---

I. FÜGGELÉK

A timföld előkészítése és aktivitásának ellenőrzése

A.1.1.   A timföld előkészítése

Tegyen egy hermetikusan lezárt tartályba előzőleg kemencében három órán keresztül 380-400 °C hőmérsékleten kiszárított timföldet, adjon hozzá minden 100 g timföldhöz 5 ml desztillált vizet, zárja le azonnal a tartályt, rázza fel többször, majd használat előtt legalább 12 óráig hagyja állni.

A.1.2.   A timföld aktivitásának ellenőrzése

Készítsen elő egy kromatográfiás oszlopot 30 g timfölddel. Az 5.4. pontban leírtak szerint vezesse keresztül az oszlopon a következő keveréket:

hullámhosszon a fajlagos kioltása legalább 4.

Amennyiben az oszlopon történő átvezetést követően a keverék fajlagos kioltása 268 nm hullámhosszon több, mint 0,11, akkor a timföld megfelelő, ha kevesebb, akkor növelni kell a dehidratációs szintet.

---

II. FÜGGELÉK

A spektrofotométer kalibráLása

A.2.	A berendezést időközönként (legalább hathavonta) ellenőrizni kell hullámhossz-átvitel, illetve átviteli pontosság szempontjából.

A.2.1.

A hullámhossz ellenőrizhető higanygőzlámpa vagy megfelelő szűrők segítségével.

A.2.2.

A fotocella és a fénysokszorozó átvitelének ellenőrzéséhez a következők szerint járjon el: mérjen ki 0,2000 g kálium-kromátot a spektrofotometriához és oldja fel 0,05 N kálium-hidroxid oldatban egy 1 000 ml térfogatú beosztásos lombikban, majd töltse fel a jelölésig. Az így kapott oldatból vegyen pontosan 25 ml-t, tegye át egy 500 ml térfogatú beosztásos lombikba, majd ugyanazzal a kálium-hidroxid oldattal töltse fel ismét a jelig. Mérje meg az így kapott oldat kioltását a 275 nm hullámhosszon, referenciaként a kálium-hidroxid oldatot használva. Az 1 cm-es küvettával mért kioltásnak 0,200 ± 0, 005 értékűnek kell lennie.

---

X. A. MELLÉKLET

A ZSÍRSAVAK METIL-ÉSZTEREINEK GÁZKROMATOGRÁFIÁS ELEMZÉSE

1.   CÉL

Ez a módszer általános iránymutatót ad a töltetes vagy kapilláris oszlopokat használó gázkromatográfiás vizsgálat alkalmazására, a X. B. mellékletben megállapított módszer segítségével kapott zsírsavakból és metil-észterekből álló keverék minőségi és mennyiségi jellemzőinek meghatározására.

A módszer nem alkalmazható polimerizált zsírsavak esetében.

2.   REAGENSEK

2.1.   Vivőgáz

Inert gáz (nitrogén, hélium, argon, hidrogén stb.), alaposan kiszárítva, az oxigéntartalma kevesebb, mint 10 mg/kg.

1. megjegyzés:

A hidrogén, amelyet csak a kapilláris oszlopokban használnak vivőgázként, megkétszerezheti az elemzés sebességét, de veszélyes. Rendelkezésre állnak a védőfelszerelések.

2.2.   Segédgázok

2.2.1.

Hidrogén (tisztaság ≥ 99,9 %), szerves szennyeződésektől mentes.

2.2.2.

Levegő vagy oxigén, szerves szennyeződésektől mentes.

2.3.   Referenciaminta

Tiszta zsírsavak metil-észtereinek, illetve ismert összetételű zsírok metil-észtereinek keveréke, lehetőség szerint a vizsgált zsíros anyaghoz hasonló.

Meg kell akadályozni a politelítetlen zsírsavak oxidációját.

3.   BERENDEZÉS

A következő útmutató A betétes és/vagy kapilláris oszlopokat és láng-ionizációs detektort alkalmazó gázkromatográfiához használt szokásos felszerelésre vonatkozik. Minden berendezés megfelelő, amely a 4.1.2. pontban meghatározott hatásfokot és felbontást biztosítja.

3.1.   Gázkromatográf

A gázkromatográf a következő elemekből áll:

3.1.1.   Befecskendező rendszer

A befecskendező rendszert használhatja

2. megjegyzés:

Amennyiben nem fordulnak elő 16 szénatomnál kevesebbet tartalmazó zsírsavak, mozgó tűs injektor használható.

3.1.2.   Kemence

A kemencének képesnek kell lennie az oszlop legalább 260 °C hőmérsékletre történő hevítésére, illetve a kívánt hőmérséklet tartására betétes oszlop esetében 1 °C-on belüli pontossággal, kapilláris oszlop esetében 0,1 °C pontossággal. Az utóbbi követelmény különösen fontos ömlesztett szilícium-dioxid csövek használata esetén.

A hőmérséklet-programozott fűtés használata minden esetben ajánlatos, különösen a 16-nál kevesebb szénatomot tartalmazó zsírsavak esetén.

3.1.3.   Betétes oszlop

3.1.3.1.

Az elemezni kívánt anyaggal szemben semleges anyagból (úgymint üveg vagy rozsdamentes acél) készült oszlop, a következő méretekkel: a) hossz: 1–3 m. Hosszú láncú zsírsavak jelenléte esetén (C20 felett) viszonylag rövid oszlopot kell használni. A 4 vagy 6 szénatomú savak elemzésekor ajánlatos 2 m hosszú oszlopot kell használni; b) belső átmérő: 2–4 mm. 3. megjegyzés: Amennyiben több, mint három kettős kötést tartalmazó politelítetlen komponens van jelen, azok rozsdamentes acél oszlopban elbomolhatnak. 4. megjegyzés: Használható betétes ikeroszlopból álló rendszer is.

3.1.3.2.

Betét a következő összetevőkből: a)  talapzat: savazott és szilanizált kovaföld vagy egyéb megfelelő semleges talapzat, kis tartományon belüli szemcsemérettel (125–200 μm határértékek között 25 μm-es tartományon belül), az átlagos szemcseméret arányos az oszlop belső átmérőjével és hosszával; b)  stacionerfázis: poliészter típusú poláris folyadék (például dietilén-glikol-poliszukcinát, butándiol-poliszukcinát, etilénglikol-poliadipát stb.), cianoszilikonok vagy egyéb olyan folyadék, amely lehetővé teszi a kívánt kromatográfiás leválasztást (lásd a 4. pontot). A stacionerfázisnak a betét 5–20 %-át (m/m) kell kitennie. A nem-poláris stacionerfázis felhasználható bizonyos leválasztásokhoz.

3.1.3.3.

Az oszlop kondicionálása Amennyiben lehetséges, az oszlop detektorról leválasztott állapotában fokozatosan hevítse a kemencét 185 °C hőmérsékletre és a frissen előkészített oszlopon vezessen keresztül inert gáz áramot 20–60 ml/perc sebességgel ezen a hőmérsékleten legalább 16 órán keresztül, majd további 2 órán keresztül 195 °C hőmérsékleten.

3.1.4.   Kapilláris oszlop

3.1.4.1.

A vizsgált anyagok tekintetében semleges anyagból (általában üveg vagy szilícium-dioxid) készült cső. A belső átmérője 0,2–0,8 mm. A belső felületét a stacionerfázisból álló bevonat felvitele előtt megfelelően kezelni kell (például felületkikészítés, inaktiválás). A legtöbb esetben a 25 mm hosszúság elegendő.

3.1.4.2.

Stacionerfázis, rendszerint poliglikol (poli(etilén glikol) 20 000), poliészter (butándiol-poliszukcinát) vagy poláris polisziloxán (cianoszilikonok) típusú. A kötött (keresztbe kapcsolt) oszlopok használhatók. 5. megjegyzés: Fennáll a veszélye, hogy a poláris polisziloxánok megnehezítik a linolénsav és a C20 savak azonosítását és leválasztását. A bevonatoknak vékonyak, azaz 0,1–0,2 μm-eseknek kell lenniük.

3.1.4.3.

Az oszlop összeszerelése és kondicionálása Tartsa be a kapillárisoszlopok összeszerelésének normál szabályait, vagyis az oszlopok elrendezése a kemencén (talapzaton), szerelvények kiválasztása és összeszerelése (szivárgásmentesség), az oszlop végének elhelyezése a befecskendező rendszerben és a detektorban (a holtterek csökkentése). Helyezze az oszlopot vivőgáz árama alá (például 0,3 bar (30 kPa) 25 mm hosszú és 0,3 mm belső átmérőjű oszlop esetén). Kondicionálja az oszlopot a kemence környezeti hőmérsékletéről induló, a stacioner fázis lebomlási határa alatti 10 °C-ig terjedő, 3 °C/perc sebességű felfűtésével. Tartsa a kemencét ezen a hőmérsékleten egy órán keresztül, a nullapont stabilizálódásáig. Az izotermikus körülmények között történő munkához állítsa vissza 180 °C hőmérsékletre. 6. megjegyzés: A megfelelően kondicionált oszlopok kereskedelmi forgalomban kaphatók.

3.1.5.

Olyan detektor, amelyet fel lehet hevíteni az oszlop hőmérséklete fölé.

3.2.   Fecskendő

A fecskendő maximális térfogata 10 μl, 0,1 μl-es beosztásokkal.

3.3.   Íróberendezés

Amennyiben a vizsgált keverék összetételének kiszámítása regisztrálógörbe alapján történik, szükség van egy nagypontosságú, a használt berendezésekkel kompatibilis elektronikus íróberendezésre. Az íróberendezésnek a következő jellemzőkkel kell rendelkeznie:

3.4.   Integrátor

Egy elektronikus integrátor segítségével gyors és pontos számítások végezhetők. Az integrátornak megfelelő érzékenységűnek kell lennie, lineáris válaszjelet kell adnia, és a nullpont-eltérés korrekciónak megfelelőnek kell lennie.

4.   ELJÁRÁS

A 4.1–4.3. pontban leírt műveletek a láng-ionizációs detektor használatára vonatkoznak.

Választható a hővezetőképesség-mérő detektort alkalmazó (a hővezetési képesség változásának elvén működő) gázkromatográf is. Ekkor az üzemi körülmények a 6. pontban leírtak szerint módosulnak.

4.1.   Tesztkörülmények

4.1.1.

Az optimális üzemi körülmények megválasztása 4.1.1.1. Betétes oszlop A tesztkörülmények megválasztása során a következő változókat kell figyelembe venni: a) az oszlop hossza és átmérője; b) a stacionerfázis jellege és mennyisége; c) az oszlop hőmérséklete; d) a vivőgáz térfogatárama; e) a kívánt felbontás; f) a vizsgált adag mennyisége, amelyet úgy kell megválasztani, hogy a detektorból és az elektrométerből álló berendezés lineáris válaszjelet adjon; g) az elemzés időtartama. Az 1. táblázatban és a 2. táblázatban megadott értékek általában a kívánt eredményekhez vezetnek, azaz metil-sztearát és eluátuma esetén az oszlop métereiként legalább 2 000 elvi lap 15 percen belül. Amennyiben a berendezés lehetővé teszi, a befecskendező rendszernek megközelítőleg 200 °C hőmérsékletűnek kell lennie, a detektor hőmérsékletének meg kell egyeznie vagy magasabbnak kell lennie az oszlopénál. Rendszerint a láng-ionizációs detektorba bevezetett hidrogén és a vivőgáz térfogatáramának aránya 1:2–1:1 között változik, az oszlop átmérőjének függvényében. Az oxigén térfogatárama a hidrogén térfogatáramának 5–10-szerese. 1.  táblázat Az oszlop belső átmérője mm A vivőgáz térfogatárama ml/perc 2 15–25 3 20–40 4 40–60 2.  táblázat A stacionerfázis koncentrációja % (m/m) Az oszlop hőmérséklete °C 5 175 10 180 15 185 20 185 4.1.1.2. Kapilláris oszlop A kapilláris oszlopok hatásfok- és permeabilitási jellemzői azt jelentik, hogy az összetevők közötti szétválasztás és az elemzés időtartama nagymértékben függ a vivőgáz oszlopbeli sebességétől. Ezért az üzemi körülmények optimalizálására van szükség ennek a paraméternek (egyszerűbben az oszlop fejveszteségének) a változtatásával, attól függően, hogy a leválasztást szeretnénk növelni vagy gyorsabb analízist szeretnénk végezni.

4.1.2.

Az elméleti lapok számának (hatásfok), valamint a felbontásnak a meghatározása (lásd az 1. ábrát). Végezze el az azonos mennyiségű metil-sztearátból és metil-oleátból álló keverék elemzését (például metil-észterek kakaóvajból). Úgy válassza meg az oszlop és a vivőgáz-áram hőmérsékletét, hogy a metil-sztearátcsúcs maximuma az oldószercsúcs után megközelítőleg 15 perccel jelentkezzen. Olyan mennyiségű metil-észter keveréket használjon, amennyi ahhoz kell, hogy a metil-sztearátcsúcs a teljes skála háromnegyedét foglalja el. A következő képlet segítségével számítsa ki az elméleti lapok n számát (hatásfok): illetve az R felbontást, a következő képlet segítségével: ahol: dr1 a retenciós távolság mm-ben, a kromatogram kezdetétől a metil-sztearát csúcs maximumáig; ω1 és ω2: a metil-sztearát és a metil-oleát csúcsok szélessége mm-ben, a görbék inflexiós pontjaiban vett érintőinek az alapvonallal való metszéspontjai között mérve; Δ: a metil-sztearát és a metil-oleát csúcsok maximumai közötti távolság mm-ben; ▼M2 és az lr felbontási együtthatót, az alábbi képlet segítségével: ahol: a = a legkisebb csúcs magassága az alapvonaltól mérve; b = két egymás melletti csúcs közötti völgy legalacsonyabb pontjának magassága az alapvonaltól mérve. ▼B 1. ábra Kromatogram az elméleti lapok (hatásfok) számának és a felbontás meghatározásához Olyan üzemi körülményeket kell választani, amelyek metil-sztearát esetén az oszlop hosszának egy méterére legalább 2 000 elméleti lapot és legalább 1,25 felbontást eredményeznek.

4.2.   Vizsgált adag

A fecskendővel (3.2.) szívjon fel 0,1–0,2 μl, a X. B. melléklet szerint elkészített metil-észter oldatot és fecskendezze az oszlopba.

A nem oldott észterek esetén készítsen megközelítőleg 100 mg/ml kromatografikus tisztaságú heptánoldatot, és ebből fecskendezzen be 0,1–1 ml mennyiséget.

Amennyiben a csak nyomokban jelenlévő összetevőket elemzi, a vizsgált mennyiség növelhető (legfeljebb a 10-szereséig).

4.3.   Elemzés

Az üzemi körülményeknek rendszerint a 4.1.1. pontban meghatározottak szerintieknek kell lenniük.

A 12-nél kevesebb szénatomot tartalmazó zsírsavak meghatározása esetén azonban alacsonyabb, a 20-nál több szénatomot tartalmazó zsírsavak meghatározásánál pedig magasabb oszlophőmérsékletet lehet alkalmazni. Alkalmanként hőmérséklet-programozást lehet alkalmazni mindkét esetben. Például amennyiben a minta 12-nél kevesebb szénatomot tartalmazó zsírsavak metil-észtereit tartalmazza, a mintát 100 °C hőmérsékleten fecskendezze be (vagy 50–60°C hőmérsékleten, amennyiben vajsav is jelen van), és azonnal kezdje meg a hőmérséklet emelését percenként 4–8 °C-kal az optimális értékre. Bizonyos esetekben a két eljárás kombinálható.

A programozott melegítést követően folytassa az eluálást állandó hőmérsékleten, ameddig mindegyik komponens eluálódik. Amennyiben a berendezés nem rendelkezik programozható fűtéssel, akkor használja 100 °C és 195 °C között beállított két fix hőmérsékleten.

Amennyiben szükséges, javasolt, hogy végezzen elemzést két különböző polaritású rögzített fázison a fedett csúcsok kizárhatóságának igazolására, például abban az esetben, mikor a C18:3 és C20:0, vagy C18:3 és C18:2 konjugáltak egyszerre vannak jelen.

4.4.   A referenciakromatogram és a referenciagrafikonok elkészítése

Elemezze a standard referenciakeveréket (2.3.) ugyanazon üzemeltetési körülmények mellett, mint a mintát, és mérje meg az alkotó zsírsavak retenciós idejeit vagy retenciós távolságait. Féllogaritmikus papíron szerkessze meg minden telítetlenségi fokhoz a retenciós idő vagy távolság logaritmusának és a szénatomok számának grafikonját. Izotermikus körülmények között az azonos telítetlenségi fokú egyenes láncú savak grafikonjainak egyeneseknek, valamint megközelítőleg párhuzamosaknak kell lenniük.

El kell kerülni az olyan körülményeket, mint például a „fedett csúcsok jelenléte”, azaz amikor a felbontás nem elegendő a két összetevő elválasztásához.

5.   AZ EREDMÉNYEK KIFEJEZÉSE

5.1.   Minőségi elemzés

Azonosítsa a minta metil-észter csúcsait a 4.4. pont szerint grafikonokból, amennyiben szükséges, interpolálással.

5.2.   Mennyiségi elemzés

5.2.1.   Az összetétel meghatározása

Eltekintve a kivételes esetektől, használja a belső normalizációs módszert, azaz induljon ki abból, hogy a minta minden összetevője szerepel a kromatogramon, így a csúcsok alatti összes terület az összetevők 100 %-át jelenti (teljes eluálás).

Amennyiben a berendezések között integrátor is van, használja az abból származó adatokat. Amennyiben nincsen, határozza meg az egyes csúcsok alatti területeket úgy, hogy a csúcsok magasságát szorozza meg a közepes magasságukban mérhető szélességükkel, és amennyiben szükséges, vegye figyelembe a rögzítés során használt különféle csillapításokat.

5.2.2.   A számítási módszer

5.2.2.1.

Általános eset Számítsa ki egy adott i összetevő esetében a mennyiséget a metil-észterek tömegének százalékában kifejezve úgy, hogy meghatározza az adott összetevő csúcsa alatti terület nagyságát az összes csúcs alatti területhez képest, a következő képlet segítségével: ahol: Ai az i komponensnek megfelelő csúcs alatti terület; A az összes csúcs alatt található területek összege. Az eredményt egy tizedes pontosságig adja meg. 7. megjegyzés: Ebben az általános esetben a relatív területeken alapuló számítások eredményét súlyszázaléknak tekintjük. Azokban az esetekben, mikor ez a feltevés nem alkalmazható, lásd az 5.2.2.2. pontot.

5.2.2.2.

A korrekciós tényezők használata Bizonyos esetekben, például nyolcnál kevesebb szénatomot tartalmazó zsírsavak vagy másodlagos csoportokat tartalmazó savak jelenlétében, hővezetőképesség-detektorok használatakor vagy amikor kifejezetten a legnagyobb pontosságra van szükség, korrekciós tényezőket kell használni a csúcsterületek százalékarányainak az összetevők tömegszázalékára történő átváltásához. A korrekciós tényezőket a metil-észterek ismert összetételű referenciakeverékének a mintáéval megegyező üzemi körülmények mellett végzett elemzése során kapott kromatogramja segítségével határozza meg. Ennél a referenciakeveréknél az i összetevő tömegszázaléka a következő képlet segítségével adható meg: ahol: mi az i összetevő tömege a referenciakeverékben; m a referenciakeverékben lévő különböző összetevők összes tömege. A referenciakeverék (4.4.) kromatogramjából számítsa ki az i összetevő (terület/terület) százalékát a következő képlet segítségével: ahol: Ai az i komponensnek megfelelő csúcs alatti terület; A az összes csúcs alatt található területek összege. A korrekciós tényező ezután a következő módon számítható ki: A korrekciós tényezőt általában a KC16 - hoz viszonyítva szokták megadni, így a relatív tényező a következő: A minta esetén az egyes i komponensekre, a metil-észterek tömegének százalékában kifejezve: Az eredményeket egy tizedes pontosságig adja meg.

5.2.2.3.

A belső standard használata Bizonyos elemzések esetén (például amikor nem mindegyik zsírsav mennyiségét határozzuk meg, amikor négy és hat szénatomot tartalmazó savak vannak jelen a 16 és 18 szénatomos savak mellett, vagy ha egy mintában az egyik zsírsav pontos mennyiségét kell meghatározni) belső standardot kell használni. Leggyakrabban az 5, 15 vagy 17 szénatomos zsírsavakat használják. A belső standardhoz (amennyiben szükséges) meg kell határozni a korrekciós tényezőt. Az i összetevő metil-észterekhez viszonyított tömegszázalékát a következő képlet segítségével lehet kiszámítani: ahol: Ai az iösszetevő csúcsa alatti terület; As a belső standard csúcsa alatti terület; K′i az i összetevő korrekciós tényezője (a KC16-ra vonatkoztatva); K′s a belső standard korrekciós tényezője (a KC16-ra vonatkoztatva); m a vizsgált mennyiség tömege grammban; ms a belső standard tömege grammban. Az eredményeket egy tizedes pontosságig adja meg.

▼M2

6.   KÜLÖNLEGES ESET – A TRANSZ-IZOMEREK MEGHATÁROZÁSA

A zsírsavak különböző, 10 – 24 szénatomot tartalmazó transz-izomerjei mennyiségének meghatározása a metil-észterek meghatározott polaritású gázkromatográfiás kapillárisoszlopok segítségével történő leválasztásával lehetséges.

6.1.	A kapillárisoszlop szilícium-dioxidból készült, belső átmérője 0,25 – 0,32 mm, hossza 50 m, cianopropiszilíciummal bevont, a bevonat vastagsága 0,1 – 0,3 μm (típus: SP 2380, C. P. sil 88, silor 10 és az ehhez hasonló típusok).

▼M21

6.2.	A metil-észterek előkészítése a X B. mellékletben leírt B eljárás szerint történik. A 3 %-nál magasabb szabad savtartalmú zsírszerű anyagokat előzetesen semlegesíteni kell a VII. melléklet 5.1.1. pontjában meghatározott módszer szerint.

▼M2

6.3.

A gázkromatográfiás eljárás általános üzemi körülményei az alábbiak: — az oszlophőmérséklet beállítása 150 oC és 230 oC között (például 165 oC hőmérséklet 15 percig, majd percenként 5 oC-ként emelve 200 oC-ig), — befecskendező hőmérséklete 250 oC bontórendszer használata esetén vagy az oszlop kiindulási hőmérséklete, ha oszlopra szerelt rendszert használnak, — detektor hőmérséklete: 260 oC, — a vivőgáz (hélium és hidrogén) térfogatárama: 1,2 ml percenként. Akkora mennyiséget kell befecskendezni, hogy az alkalmazott érzékenység mellett az arachidén-sav metil-észteréhez tartozó csúcs magassága a skálán legalább 20 % legyen.

6.4.

A különböző metil-észterek azonosítása a retenciós idők szerint történik, a referenciakeverékkel történő összehasonlítás alapján (a 2.3. pontban bemutatottak szerint). A transz-zsírsavak észtereinek elúciója a megfelelő cisz-izomerek előtt történik. A 2. ábrán látható egy példa a kromatogrammra. 2. ábra: Zsírsav transz-izomerjeinek kapillárisoszloppal készített gázkromatogrammja

6.5.	Az oszlop 4.1.2. pont szerint meghatározott hatásfoka akkora legyen, hogy lehetővé tegye egyes kritikus párok szétválasztását, például a transz-izolén savak és az olajsavak tömbjében lévő párokét, C18:1/cisz C18:1, 2-nél nagyobb felbontási tényező mellett.

6.6.

A különböző transz-zsírsavak arányát a hozzájuk tartozó csúcsok területeinek és az összes jelenlévő csúcs területének viszonya alapján kell kiszámítani. A következőket kell figyelembe venni: — e rendelet I. mellékletében szereplő transz-oktadekán savak (T 18:1) aránya, mint a transzolaj izomerek összege, — e rendelet I. mellékletében szereplő transz-cisz-oktadekadién sav [(CT/TC) 18:2] aránya, mint a transzlinol izomerek összege, — e rendelet I. mellékletében szereplő transz-cisz-transz, cisz-cisz-transz, cisz-transz-cisz, transz-cisz-cisz oktadekatrién savak aránya [(TCT + CCT + CTC + TCC) 18:1] mint a transzlinolén izomerek összege. Megjegyzés 8:Figyelembe véve e módszer sajátosságait, az eredményeket 2 tizedesjegy pontossággal adja meg.

▼B

7.   KÜLÖNLEGES ESET – (A HŐVEZETŐKÉPESSÉG VÁLTOZÁSÁNAK ELVÉN MŰKÖDŐ) HŐVEZETŐKÉPESSÉG-MÉRŐ DETEKTOR HASZNÁLATA

A zsírsavak és metil-észterek keveréke minőségi és mennyiségi összetételének meghatározásához a hővezetőképesség változásának elvén működő detektorral (hővezetőképesség-mérő) felszerelt gázkromatográf is használható. Ilyen berendezés használatakor a 3. és a 4. pontban meghatározott körülményeket a 3. táblázatnak megfelelően módosítani kell.

A mennyiségi elemzéshez használja az 5.2.2.2. pontban megadott korrekciós tényezőket.

8.   VIZSGÁLATI JEGYZŐKÖNYV

A vizsgálati jegyzőkönyvnek tartalmaznia kell a Metil-észterek és a gázkromatográfiás elemzés előkészítésének módszerét, valamint a kapott eredményeket. Meg kell említeni benne minden, e Nemzetközi Szabványban nem szereplő vagy opcionálisnak tekinthető üzemi körülményt vagy az eredményekre esetlegesen hatással lévő bármilyen eseményt.

A vizsgálati jegyzőkönyvben szerepelnie kell a minta azonosításához szükséges összes adatnak.

▼M19

---

ANNEX X B

PREPARATION OF THE FATTY ACID METHYL ESTERS FROM OLIVE OIL AND OLIVE-POMACE OIL

The following two methods are recommended for preparing the fatty acid methyl esters from olive oils and olive-pomace oils:

Method A

:

Trans-esterification with cold methanolic solution of potassium hydroxide

Method B

:

Methylation by heating with sodium methylate in methanol followed by esterification in acid medium.

Each method will be applied according to the analytical parameter to be determined and the oil category as indicated below:

PURIFICATION OF OIL SAMPLES

When necessary, the samples will be purified by passing the oil through a silica gel column, eluting with hexane/diethyl ether (87:13, v/v) as described in IUPAC method 2.507.

Alternatively, solid-phase extraction on silica gel phase cartridges can be used. A silica gel cartridge (1 g, 6 ml) is placed in a vacuum elution apparatus and washed with 6 ml of hexane. The vacuum is released to prevent the column from becoming dry and then a solution of the oil (0,12 g approximately) in 0,5 ml of hexane is loaded into the column and vacuum is applied. The solution is pulled down and then eluted with 10 ml of hexane/diethyl ether (87:13 v/v) under vacuum. The combined eluates are homogenised and divided in two similar volumes. An aliquot is evaporated to dryness in a rotary evaporator under reduced pressure at room temperature. The pomace is dissolved in 1 ml of heptane and the solution is ready for fatty acid analysis by GC. The second aliquot is evaporated and the pomace is dissolved in 1 ml of acetone for triglyceride analysis by HPLC, if necessary.

METHODS FOR PREPARING THE FATTY ACID METHYL ESTERS

1.   Method A: Trans-esterification with cold methanolic solution of potassium hydroxide

1.1.   Purpose

This rapid method is applicable to olive oils and olive-pomace oils with a free fatty acid content of less than 3,3 %. Free fatty acids are not esterified by potassium hydroxide. Fatty acid ethyl esters are trans-esterified at a lower rate than glyceridic esters and may be only partially methylated.

1.2.   Principle

Methyl esters are formed by trans-esterification with methanolic potassium hydroxide as an intermediate stage before saponification takes place (title 5 in ISO-5509:2000, title 5 in IUPAC method 2.301).

1.3.   Reagents

Methanol containing not more than 0,5 % (m/m) water.

Heptane, chromatographic quality.

Potassium hydroxide, approximately 2 N methanolic solution: dissolve 11,2 g of potassium hydroxide in 100 ml of methanol.

1.4.   Apparatus

Screw-top test tubes (5 ml volume) with cap fitted with a PTFE joint.

Graduated or automatic pipettes, 2 ml and 0,2 ml

1.5.   Procedure

In a 5 ml screw-top test tube weigh approximately 0,1 g of the oil sample. Add 2 ml of heptane, and shake. Add 0,2 ml of 2 N methanolic potassium hydroxide solution, put on the cap fitted with a PTFE joint, tighten the cap, and shake vigorously for 30 seconds. Leave to stratify until the upper solution becomes clear. Decant the upper layer containing the methyl esters. The heptane solution is suitable for injection into the gas chromatograph. It is advisable to keep the solution in the refrigerator until gas chromatographic analysis. Storage of the solution for more than 12 hours is not recommended.

2.   Method B: Methylation by heating with sodium methylate in methanol followed by esterification in acid medium

2.1.   Purpose

This method is applicable to olive oils and olive-pomace oils with a free fatty acid content of more than 3,3 %.

2.2.   Principle

Neutralisation of the free fatty acids and alkaline methanolysis of the glycerides, followed by esterification of the fatty acids in acid medium (title 4.2. in IUPAC method 2.301).

2.3.   Reagents

2.4.   Apparatus

2.5.   Procedure

Transfer about 0,25 g of the oil sample into a 50 ml ground-necked volumetric flask. With the aid of a funnel, add 10 ml of 0,2 N sodium methylate in methanol and the boiling chips. Fit a reflux condenser, shake, and bring to the boil. The solution should become clear, which usually occurs in about 10 minutes. The reaction is complete after 15 minutes. Remove the flask from the source of heat, wait until the reflux stops, remove the condenser, and add two drops of phenolphthalein solution. Add a few ml of 1 N sulphuric acid in methanol solution until the solution becomes colourless and then add 1 ml in excess. Fit the condenser and boil again for 20 minutes. Withdraw from the source of heat and cool the flask under running water. Remove the condenser, add 20 ml of saturated sodium chloride solution, and shake. Add 5 ml of heptane, plug the flask, and shake vigorously for 15 seconds.

Leave to settle until the two phases have separated. Add saturated sodium chloride solution again until the aqueous layer reaches the lower end of the flask neck. The upper layer containing the methyl esters fills the flask neck. This solution is ready to be injected in the GC.

Caution: Methylation by method B must be done under a hood.

2.6.   Alternatives to methylation Method B

2.6.1.   Method C

2.6.1.1.   Principle

The fatty matter undergoing analysis is treated with methanol-hydrochloric acid, in a sealed vial, at 100 °C.

2.6.1.2.   Apparatus

2.6.1.3.   Reagents

Solution of hydrochloric acid in 2 % methanol. This is prepared from gaseous hydrochloric acid and anhydrous methanol (Note 1).

Hexane, chromatographic quality.

Commercial solutions of hydrogen chloride in methanol can be used. Small amounts of gaseous hydrochloric acid can easily be prepared in the laboratory by simple displacement from the commercial solution (p = 1,18) by dripping concentrated sulphuric acid. Since hydrochloric acid is very rapidly absorbed by methanol, it is advisable to take the usual precautions when dissolving it, e.g. introduce the gas through a small inverted funnel with the rim just touching the surface of the liquid. Large quantities of methanolic hydrochloric acid solution can be prepared in advance, as it keeps perfectly in glass-stoppered bottles stored in the dark. Alternatively, this reagent can be prepared by dissolution of acetyl chloride in anhydrous methanol.

2.6.1.4.   Procedure

2.6.2.   Method D

2.6.2.1.   Principle

The fatty matter undergoing analysis is heated under reflux with methanol-hexane-sulphuric acid. The methyl esters obtained are extracted with petroleum ether.

2.6.2.2.   Apparatus

2.6.2.3.   Reagents

2.6.2.4.   Procedure

Place 0,1 g of oil in the 20 ml test tube and add 5 ml of methylation reagent.

Fit the reflux condenser and heat for 30 minutes in a boiling water bath (Note 2).

Transfer quantitatively the mixture into a 50 ml separating funnel, with the aid of 10 ml distilled water and 10 ml petroleum ether. Shake vigorously, and allow the phases to separate, remove the aqueous phase and wash the ether layer twice with 20 ml distilled water. Add to the separating funnel a small quantity of anhydrous sodium sulphate, shake, allow to settle for a few minutes and filter, collecting the filtrate in a 15 ml test tube with a conical base.

Evaporate the solvent over a water bath in a current of nitrogen.

Note 2: To control boiling, insert a glass rod into the test tube and limit the temperature of the water bath to 90 °C.

3.   Precision parameters

The statistical evaluation of the precision of methods A and B was published by the International Olive Oil Council in its method COI/T.20/CO. No 24.

RECOMMENDATIONS FOR GAS CHROMATOGRAPHIC ANALYSIS OF THE FATTY ACID ESTERS FROM OLIVE OIL AND OLIVE-POMACE OIL

1.   Procedure

The gas chromatographic analysis of solutions of fatty esters in heptane is to be carried out according to standard ISO-5508 using a capillary column (50 m length x 0,25 or 0,32 mm i.d.) impregnated with cyanopropylsilicone phase as indicated for the determination of fatty acid trans-isomers (COI/T.20/Doc. no. 17).

Figure 1 gives the typical gas chromatographic profile of an olive-pomace oil containing methyl and ethyl esters of fatty acids, and trans-isomers of methyl esters.

2.   Calculations

2.1.

For the calculation of the fatty acid composition and ΔECN42, all the following fatty acids will be taken into account: Myristic (C14:0). Palmitic (C16:0). Sum of the areas of the peaks corresponding to the methyl and ethyl esters. Palmitoleic (C16:1). Sum of the areas of the peaks corresponding to the ω9 and ω7 isomers of the methyl ester. Margaric (C17:0). Margaroleic (C17:1). Stearic (C18:0). Oleic (C18:1). Sum of the areas of the peaks corresponding to the ω9 and ω7 isomers of the methyl ester, ethyl ester, and trans-isomers of the methyl ester. Linoleic (C18:2). Sum of the areas of the peaks corresponding to the methyl and ethyl esters, and the trans-isomers of the methyl ester. Arachidic (C20:0). Linolenic (C18:3). Sum of the areas of the methyl ester and the trans-isomers of the methyl ester. Eicosenoic (C20:1). Behenic (C22:0). Lignoceric (C24:0). Squalene will not be taken into account for the calculation of the total area.

2.2.

For the calculation of the percentage of trans-C18:1 the peak corresponding to the methyl esters of this fatty acid is to be used. For the sum [trans-C18:2 + trans-C18:3], all the peaks corresponding to the trans-isomers of these two fatty acids are to be added together. For the calculation of the total area, all the peaks mentioned in 2.1. are to be taken into account (see COI/T.20/Doc. No. 17). The calculation of the percentage of each fatty acid will be carried out according to the formula: Figure 1: Gas chromatographic profile obtained by the cold methylation method from olive-pomace oil. The chromatographic peaks correspond to the methyl and ethyl esters except where otherwise indicated.

▼B

---

XI. MELLÉKLET

AZ OLÍVAOLAJ ILLÉKONY HALOGÉNEZETT OLDÓSZEREINEK MEGHATÁROZÁSA

1.   MÓDSZER

A gőztér-mintavételezési technikán alapuló gázkromatográfiás elemzés.

2.   BERENDEZÉS

2.1.	Elektronbefogásos detektorral (ecd) felszerelt gázkromatográfiás berendezés.

2.2.	Gőztér-mintavételező berendezés.

2.3.	Üvegből készült 2 m hosszú, 2 mm átmérőjű gázkromatográfiás oszlop, stacioner fázis. OV101 10 % vagy avval egyenértékű a kalcinált, savazott, szilanizált és 80–100 szemcsenagyságú kovaföld impregnálásához.

2.4.	Vivő- és segédgázok: az elektronbefogásos detektáláshoz alkalmas nitrogén a gázkromatográfiás eljáráshoz.

2.5.	10 ml és 15 ml térfogatú teflonborítású üveglombikok alumíniumdugóval, a fecskendő bevezetésére alkalmas kialakítással.

2.6.	Hermetikus zárású bilincsek.

2.7.	0,5–2,0 ml térfogatú gázfecskendő.

3.   REAGENSEK

Standard: a gázkromatográfiás eljáráshoz megfelelő tisztaságú halogénezett oldószerek.

4.   ELJÁRÁS

4.1.

Mérjen pontosan 3 g olajat egy üveglombikba (újból nem felhasználható); zárja le hermetikusan. Tegye egy termosztátban 70 °C hőmérsékletre egy óra hosszára. Egy fecskendő segítségével óvatosan szívjon ki a gőztérből 0,2-0,5 ml-t. A fecskendő tartalmát fecskendezze be a következő módon beállított gázkromatográfiás berendezés oszlopába: — injektor hőmérséklete: 150 °C, — oszlop hőmérséklete: 70–80 °C, — detektor hőmérséklete: 200–250 °C. Ettől eltérő hőmérsékletek is beállíthatók, amennyiben az eredmények egyenértékűek lesznek.

4.2.	Referenciaoldatok: készítsen a mintában feltételezett tartalomnak megfelelő 0,05–1 ppm (mg/kg) töménységű standard oldatokat olyan finomított olívaolajból, amelyben oldószerek nyomokban sem találhatók meg. A halogénezett oldószerek pentán segítségével hígíthatók.

4.3.

Mennyiségi becslés: hasonlítsa össze a minta, illetve a feltételezett töménységhez legközelebb álló standard oldat csúcsainak magasságát vagy területét. Amennyiben az eltérés 10 %-nál nagyobb mértékű, akkor az elemzést meg kell ismételni egy másik standard oldattal történő összehasonlítással, egészen addig, ameddig az eltérés 10 %-on belüli nem lesz. A tartalmazott mennyiség meghatározása az elemi befecskendezések átlaga alapján történik.

4.4.	Az eredmények kifejezése: ppm-ben (mg/kg). Az eljárás érzékelési korlátja 0,01 mg/kg.

▼M22

---

XII. MELLÉKLET

A NEMZETKÖZI OLÍVAOLAJ-TANÁCSNAK A SZŰZ OLÍVAOLAJOK ÉRZÉKSZERVI ÉRTÉKELÉSÉRE SZOLGÁLÓ MÓDSZERE

1.   TÁRGY ÉS ALKALMAZÁSI TERÜLET

Ez a módszer a Nemzetközi Olívaolaj-tanácsnak a szűz olívaolaj érzékszervi értékelésére alkalmazott módszerét módosító 2007. november 16-i, DEC-21/95-V/2007 számú határozatán alapszik. A módszer célja, hogy megállapítsa az 1234/2007/EK rendelet XVI. mellékletének 1. pontja szerinti szűz olívaolaj érzékszervi jellemzőinek értékelési eljárását, és létrehozza az e jellemzők alapján történő osztályozásukra szolgáló módszert. A módszer a fakultatív címkézésre vonatkozó útmutatást is tartalmaz.

Az ismertetett módszer csak a szűz olívaolajokra alkalmazandó, valamint azok osztályozására vagy címkézésére az érzékelt hibák intenzitása, a gyümölcsösség és az egyéb pozitív tulajdonságok szerint, egy válogatott, képzett és vizsgáztatott kóstolókból álló, értékelő bizottságként működő csoport által meghatározott módon.

2.   ÁLTALÁNOS RÉSZ

Az általános alapszókészlet, a vizsgálóterem, az olajkóstoló pohár és az e módszerrel kapcsolatos egyéb kérdések vonatkozásában ajánlatos a Nemzetközi Olívaolaj-tanács előírásait követni, különösen annak a szűz olívaolaj érzékszervi értékelésére alkalmazott módszerét módosító, 2007. november 16-i, DEC-21/95-V/2007 számú határozatát.

3.   SZAKKIFEJEZÉSEK

3.1.   Pozitív tulajdonságok

Gyümölcsös :

az olajra jellemző mindazon – olajbogyófajta szerint változó – szagérzetek, amelyek az egészséges és friss, zöld vagy érett gyümölcs közvetlen vagy retronazális úton való szaglásából származnak.

A gyümölcsös tulajdonság a zöld minősítést akkor kapja meg, ha az érzékszervi érzetek a zöld gyümölcsöt idézik fel, ami a zöld olajbogyóból származó olaj jellemzője.

A gyümölcsös tulajdonság az érett minősítést akkor kapja meg, ha az érzékszervi érzetek az érett gyümölcsöt idézik fel, ami az érett zöld olajbogyóból származó olaj jellemzője.

Keserű : a zöld vagy az érési folyamat kezdetén lévő olajbogyóból nyert olívaolaj jellegzetes alapíze, amelyet a nyelven V alakban elhelyezkedő kehelyformájú ízlelőbimbók érzékelnek.

Csípős : az egész szájüregben, de különösen a torokban érzékelhető kaparó érzés, amely elsősorban a még zöld olivabogyóból, a gazdasági év elején termelt olaj sajátossága.

3.2.   Negatív tulajdonságok

Dohos/seprős : az olyan olajbogyókból sajtolt olaj jellegzetes zamata, amelyek az egymásra halmozás, illetve a tárolási körülmények miatt a légmentes erjedés előrehaladott állapotában vannak, vagy olyan olajé, amely az olajtároló medencékben és kádakban a légmentes erjedés folyamatában lévő fejtési „üledékkel” érintkezett.

Penészes–nedves : a több napon keresztül nedves helyen történt tárolás következtében, a penész és élesztőgombák által megtámadott olajbogyóból nyert olaj jellegzetes zamata.

Boros–ecetes/Savanyú-fanyar : némely olajnak a borra vagy ecetre emlékeztető jellegzetes zamata. Ez a zamat alapvetően az olajbogyóknak, illetve a nem megfelelően lemosott sajtolószitán maradt olajbogyó-pépnek a levegőn való erjedési folyamatából származik, amelynek eredményeként ecetsav, etil-acetát és etanol képződik.

Fémes : fémekre emlékeztető zamat. Az olyan olaj jellegzetessége, amely a zúzás, a keverés, a sajtolás vagy a tárolás során hosszabb ideig fémfelületekkel érintkezett.

Avas : olyan olajok zamata, amelyek intenzív oxidációs folyamaton mentek keresztül.

Sült vagy égett : olyan olajok jellegzetes zamata, amelyek előállításuk során – és különösen az olajbogyópép termikus keverése alatt – túlzott mértékben és/vagy túl hosszú ideig lettek felmelegítve, ha ez nem megfelelő hőmérsékleti körülmények között történt.

Szénás–fás : a kiszáradt olajbogyóból kinyert bizonyos olajok jellegzetes zamata.

Nyers : sűrű, kásás érintési érzet a szájban, amelyet bizonyos régi olajok keltenek.

Kenőzsíros : a gázolajra, gépzsírra vagy ásványi olajra emlékeztető zamat.

Vizes : erjedt növényi nedvekkel hosszabb ideig érintkezésben maradt olajok által szerzett zamat.

Sós : a sós páclében tartósított olajbogyóból nyert olajok jellegzetes zamata.

Eszpartó : új, eszpartófű-szitán átsajtolt olajbogyóból előállított olaj jellegzetes zamata. A zamat változhat attól függően, hogy a sajtolószitát zöld vagy száraz eszpartófűből készítették-e.

Földes : a földdel vagy sárral együtt fölszedett, meg nem mosott olajbogyóból előállított olaj zamata.

Férges : az olajbogyó-fúrólégy (Bactrocera Oleae) lárváitól erősen megtámadott olivabogyóból származó olaj zamata.

Uborkás : a hermetikusan lezárt állapotban, például bádogtartályban túl hosszú ideig tartott olaj jellegzetes zamata, amely a 2,6-nonadienal képződésének tulajdonítható.

Nedves fás : az olajfán fagyásnak kitett olajbogyókból kivont olajok jellegzetes zamata.

3.3.   A címkézésnél alkalmazható fakultatív kifejezések

Kérelemre az értékelő csoport elnöke tanúsíthatja, hogy az értékelt olajok a tulajdonságok érzékelhetősége és intenzitása szerint kielégítik a következő kifejezéseknek és jelzőknek megfelelő meghatározásokat és fokozatokat:

4.   KÓSTOLÓI CSOPORT

A kóstolói csoport egy elnökből, valamint nyolc–tizenkét kóstolóból áll.

A csoport elnökének alapos szakképzettséggel kell rendelkeznie, és a különféle típusú olívaolajok ismerőjének és tapasztalt szakértőjének kell lennie. Az elnök felel a csoportért, a csoport szervezetéért és működéséért, a mintáknak az előkészítéséért, megjelöléséért és a kóstolók elé kerüléséért, valamint az adatok összegyűjtéséért és statisztikai kezelésükért.

A csoport elnöke kiválasztja a kóstolókat, felügyeli képzésüket és – képességük megfelelő szinten tartása érdekében – ellenőrzi teljesítményüket.

Az olívaolaj érzékszervi ellenőrzését végző kóstolókat a hasonló minták között való különbségtételi képességük szerint kell kiválasztani és képezni, a Nemzetközi Olívaolaj-tanács által a szűz olívaolaj képzett kóstolóinak kiválasztásáról, képzéséről és ellenőrzéséről kiadott iránymutatás szerint.

A csoportok az érzékelési kritériumok rendszeres ellenőrzése és harmonizálása érdekében kötelesek a tagállami, közösségi és nemzetközi szinten előírt érzékszervi értékelésekben részt venni. Ezenkívül az e rendelet 4. cikkének (1) bekezdésében foglalt rendelkezéseknek megfelelően engedélyezett csoportok kötelesek az érintett tagállamnak évente teljes körű tájékoztatást nyújtani összetételükről és feljogosított csoportként végrehajtott értékeléseik számáról.

5.   AZ ÉRZÉKSZERVI ÉRTÉKELÉS ÉS AZ OSZTÁLYOZÁS ELJÁRÁSA

5.1.   Hogyan használja a kóstoló az értékelőlapot

A kóstoló által használandó értékelőlap e módszer A. függelékében található.

A csoportban részt vevő minden kóstolónak meg kell szagolnia, majd meg kell kóstolnia a megvizsgálandó olajat. Ezt követően a rendelkezésére álló értékelőlap 10 cm-es skáláján be kell jelölnie, hogy mekkora intenzitással érzékeli az egyes negatív és pozitív tulajdonságokat ( 6 ). Ha a gyümölcsös tulajdonság zöld vagy érett jellegét érzékeli, a kóstoló az értékelőlapon bejelöli a megfelelő rovatot.

Abban az esetben, ha az értékelőlapon fel nem tüntetett negatív tulajdonságokat érzékelne, azokat – a meghatározással ellátott kifejezések közül a legpontosabban körülíró kifejezést, illetve kifejezéseket alkalmazva – feljegyzi az „egyéb” rovatba.

5.2.   Hogyan dolgozza fel az értékelő csoport elnöke az adatokat

Az értékelő csoport elnöke összegyűjti az egyes kóstolók által kitöltött értékelőlapokat; ellenőrzi a különféle tulajdonságokhoz rendelt intenzitási fokozatokat; ha úgy véli, hogy rendellenességet észlel, felkéri a kóstolót az értékelőlap felülvizsgálatára, és – szükség esetén – a vizsgálat megismétlésére.

Az értékelő csoport elnöke beviheti az egyes kóstolók által megállapított adatokat a medián statisztikai kiszámításának a B. függelékben található módszerét alkalmazó számítógépes programba. Az egy mintára vonatkozó adatok feldolgozása egy mátrix segítségével történik, amely a 9 érzéki tulajdonságnak megfelelő 9 oszlopból és a csoport n számú kóstolójának megfelelő n számú sorból áll.

Ha egy, az értékelő csoportnak legalább 50 %-a által érzékelt tulajdonság az „egyéb” rovatba tartozik, ki kell számítani e hiba mediánját, és az olajat ennek megfelelően kell osztályozni.

A csoport elnöke csak akkor tanúsíthatja, hogy az értékelt olaj a „zöld” és „érett” minősítést illetően megfelel a 3.3. pont a) alpontjában említett feltéteknek, ha a csoport legalább 50 %-a jelezte, hogy érzékelte a gyümölcsös tulajdonság zöld és érett jellegét.

A megfelelőségi ellenőrzések keretében végzett elemzések esetében egy próbát végeznek. Egymásnak ellentmondó elemzések esetén a csoport elnökének gondoskodnia kell arról, hogy a vizsgálatot kétszer végezzék el. Érvénytelen elemzések esetén az értékelést háromszor kell elvégezni. Ezekben az esetekben a tulajdonságok mediánját a mediánok átlaga alapján számolják ki. Az elemzések megismétlését minden esetben külön vizsgálat során kell elvégezni.

5.3.   Az olajok osztályozása

Az olajat a hibák és a gyümölcsös tulajdonság mediánjának függvényében az alábbi osztályokba sorolják be. A hibamediánt a legnagyobb intenzitással észlelt hiba mediánja határozza meg. A hibamediánt és gyümölcsösség mediánját egyetlen tizedes számjegy fejezi ki, és az azokat meghatározó, nagy jóságfokú variációs együttható értéke 20 %-nál kisebb vagy azzal egyenlő.

Az olaj osztályozása a hibák és a gyümölcsösség medián értékeinek az alább bemutatott referenciaintervallumokkal való összehasonlítása alapján történik. Ezen intervallumok határai a módszer hibájának figyelembevételével lettek megállapítva, ezért abszolút értékeknek tekinthetők. A számítógépes programok táblázatba foglalt statisztikai adatok, illetve grafikus ábrázolás útján lehetővé teszik az osztályozás vizuális megjelenítését.

a)	Extra szűz olívaolaj : a hibamedián nullával egyenlő, és a gyümölcsösség mediánja nullánál nagyobb.

b)	Szűz olívaolaj : a hibamedián nullánál nagyobb, de 3,5-nél kisebb vagy azzal egyenlő, és a gyümölcsösség mediánja nullánál nagyobb.

c)	Lampante olívaolaj : a hibamedián 3,5-nél nagyobb, vagy a hibamedián 3,5-nél kisebb vagy azzal egyenlő, és a gyümölcsösség mediánja nullával egyenlő.

5.4.   Sajátos esetek

Ha a gyümölcsösségen kívüli egyéb pozitív tulajdonság mediánja meghaladja az 5,0-öt, a csoport elnöke ezt bejegyzi az olaj vizsgálati jegyzőkönyvébe.

---

A. függelék

A szűz olívaolaj értékelőlapja

---

B. függelék

A MEDIÁN ÉS A KONFIDENCIAINTERVALLUMOK KISZÁMÍTÁSÁRA HASZNÁLT MÓDSZER

Medián

A medián az az Xm valós szám, amelyre egyszerre igaz, hogy az eloszlás értékei 0,5 vagy annál kisebb valószínűséggel (P) kisebbek ennél a számnál (Xm), és hogy az eloszlás értékei 0,5 vagy annál nagyobb valószínűséggel (P) kisebbek vagy egyenlők ezzel a számmal (Xm). Egy másik meghatározás szerint a medián a növekvő sorozatba rendezett számok 50. centilisének felel meg. Egyszerűbben kifejezve, a medián a páratlan számú sorrendbe rendezett sorozat középső értéke, vagy a páros számú sorrendbe rendezett sorozat két középső értékének átlaga.

Nagy jóságfokú szórás

A medián körüli szóródás megbízható becslése érdekében a Stuart és Kendall szerinti nagy jóságfokú szórás becslésére vonatkozó módszert kell alkalmazni. A következő képlet az aszimptotikus szórást fejezi ki, azaz a megfigyelt adatok medián körüli szóródásának olyan, nagy jóságfokú becslését, ahol N a megfigyelések száma, az IQR az interkvartilis terjedelem, és amely a valószínű eloszlás eseteinek pontosan 50 %-át foglalja magában.

Az interkvartilis terjedelem kiszámításához meg kell határozni a 75. és a 25. centilis közötti eltérés nagyságát.

IQR = 75. centilis – 25. centilis

A centilis az az Xpc érték, amelyre egyszerre igaz, hogy eloszlási értékei egy meghatározott századrésznek megfelelő vagy annál kisebb valószínűséggel (P) kisebbek Xpc-nél, és hogy eloszlási értékei egy meghatározott századrésznek megfelelő vagy annál nagyobb valószínűséggel (P) kisebbek vagy egyenlők mint Xpc. A századrész az eloszlás kiválasztott hányadát fejezi ki. A medián esetében ez 50/100-dal egyenlő.

A gyakorlatban a centilis az az eloszlási érték, amely egy, az eloszlási vagy sűrűségi görbe által behatárolt meghatározott területnek felel meg. Például a 25. centilis azt az elosztási értéket jelenti, amely megfelel egy 0,25 vagy 25/100 nagyságú területnek

Nagy jóságfokú variációs együttható %-ban kifejezve

A VEj% egy olyan tiszta, azaz mértékegység nélküli szám, amely a vizsgált számok sorozatának szóródási százalékát jelöli. Ez az együttható ezért igen alkalmas a csoporttagok megbízhatóságának ellenőrzésére.

A medián 95 %-os konfidenciaintervalluma

A 95 %-os konfidenciaintervallum (az elsőfajú hiba értéke 0,05, azaz 5 %) azt az értéktartományt jelenti, amelynek értékeit – feltételezve, hogy a vizsgálatot végtelen sokszor meg lehet ismételni – a medián felveheti. A gyakorlatban az említett intervallum a vizsgálatok szóródási tartományát adja meg az elfogadott működési körülmények között, feltételezve, hogy a vizsgálatokat többször el lehet végezni. Az intervallum, éppúgy, mint a Vej %, segít a vizsgálatok megbízhatóságának értékelésében.

KIfelső = Me + (c.S*)

KIalsó = Me – (c.S*)

Ahol a c értéke 95 %-os konfidenciaintervallum esetén 1,96-tal egyenlő.

▼M20 —————

▼M19 —————

▼B

---

XV. MELLÉKLET

1.   AZ OLÍVAMARADÉK OLAJTARTALMA

1.1.   Berendezés

1.2.   Reagens

Műszaki fokozatú közönséges hexán, amely elpárolgását követően kevesebb, mint 0,002 g/100 ml maradékot hagy.

2.   ELJÁRÁS

2.1.   A tesztminta előkészítése

A minta megőrlésére szükség esetén használja az előzőleg megfelelően megtisztított mechanikus őrlőt, hogy olyan méretű részecskéket kapjon, amelyek maradék nélkül átjutnak a szitán.

Az őrlő tisztítására használja fel a minta megközelítőleg huszadrészét, ezt az őrleményt öntse ki, őrölje meg a fennmaradó mennyiséget, keverje össze óvatosan, majd késedelem nélkül elemezze.

2.2.   A vizsgálati anyag mennyisége

Közvetlenül az őrlés befejezését követően a teszthez mérjen meg a mintából megközelítőleg 10 g mennyiséget 0,01 g pontossággal.

2.3.   Az extraháló hüvely

Tegye a vizsgált mennyiséget a hüvelybe és pamutvattával dugózza le. Amennyiben szűrőpapírt használ, csomagolja bele az anyagot.

2.4.   Előzetes szárítás

Amennyiben az olívamaradék nagyon nedves (azaz a nedvességtartalma és az illóanyagtartalma meghaladja a 10 %-ot), helyezze a betöltött hüvelyt (vagy szűrőpapírt) megfelelő időre egy legfeljebb 80 °C hőmérsékletre felfűtött kemencébe és végezzen előzetes szárítást, hogy a nedvességtartalmat és az illóanyag-tartalmat 10 % alá csökkentse.

2.5.   A gömbölyű fenekű lombik előkészítése

Mérje meg a korábban egy 103 ± 2 °C hőmérsékletű kemencében kiszárított és szárítóban legalább 1 órán keresztül hűtött, 1-2 darab habkövet tartalmazó lombikot 1 mg pontossággal.

2.6.   Előzetes extrahálás

Helyezze be a vizsgált anyagot tartalmazó hüvelyt (vagy szűrőpapírt) az extraháló berendezésbe. Öntse a lombikba a szükséges mennyiségű hexánt. Illessze a lombikot az extraháló berendezésbe, és helyezze ezt az összeállítást az elektromos fűtésű fürdőre. Állítsa be úgy a fűtési sebességet, hogy a visszaáramlás sebessége másodpercenként legalább 3 csepp legyen (mérsékelt, nem heves forrás). Négyórás extrahálást követően hagyja lehűlni. Vegye ki a hüvelyt az extraháló berendezésből és helyezze levegőáramba, hogy kihajtsa a beleivódott oldószert.

2.7.   Második kivonás

Öntse a hüvely tartalmát a mikroőrlőbe és őrölje meg a lehető legfinomabbra. Öntse vissza a megőrölt keveréket veszteség nélkül a hüvelybe és helyezze vissza az extraháló berendezésbe.

Ugyanannak a kezdeti kivonatot tartalmazó lombiknak a segítségével folytassa az extrahálást további két órán keresztül.

A lombikban így kapott oldatnak tisztának kell lennie. Amennyiben mégse, szűrje át szűrőpapíron, és mossa át néhányszor az eredeti lombikot és a szűrőpapírt hexánnal. A szűrletet és a mosáshoz használt hexánt gyűjtse egy másik gömbölyű fenekű lombikba, amelyet előzőleg kiszárított és 1 mg pontossággal megmért.

2.8.   Az oldószer eltávolítása és a kivonat mérése

Az oldószer nagyobbik részét desztillálással távolítsa el elektromos fűtésű fürdőn. Az oldószer többi részét a lombik 103 ± 2 °C hőmérsékletű kemencében történő 20 perces hevítésével távolítsa el. Az oldószer eltávolítását rendszeres légbefúvással vagy lehetőleg inertgáz-befúvással, illetve a nyomás csökkentésével segítse.

Hagyja a lombikot a szárítóberendezésben legalább egy órán keresztül lehűlni, majd mérje meg 1 mg pontossággal.

Melegítse ismét 10 percen keresztül a fenti módszerrel és hűtse le a szárítóberendezésben, majd mérje meg újra.

A két mérés közötti különbség nem haladhatja meg a 10 mg-ot. Amennyiben meghaladja, végezzen 10 perces melegítéseket és hűtéseket mindaddig, amíg az eltérés 10 mg vagy kevesebb. Jegyezze fel a lombik utoljára mért tömegét.

Végezzen ismételt meghatározást a vizsgálati mintán.

3.   AZ EREDMÉNYEK KIFEJEZÉSE

3.1.   A számítási módszer és képlet

3.2.   Megismételhetőség

Az egyidőben vagy az ugyanazon elemző által gyors egymásutánban megismételt meghatározással kapott két eredmény közötti különbség nem haladhatja meg a 0,2 g hexán kivonat/100 g mintaértéket.

Amennyiben ez a feltétel nem teljesül, ismételje meg az elemzést két újabb vizsgálati anyagon. Amennyiben a különbség ebben az esetben is meghaladja a 0,2 g-ot, akkor a négy meghatározás számtani középértékét tekintse eredménynek.

---

XVI. MELLÉKLET

A JÓDSZÁM MEGHATÁROZÁSA

1.   CÉL

Ez a nemzetközi szabvány az állati és növényi zsírok és olajok, a továbbiakban: zsírok, jódszáma megállapításának módszerét írja le.

2.   MEGHATÁROZÁS

E nemzetközi szabvány alkalmazásában a következő meghatározások érvényesek:

2.1.	jódszám: a minta által e nemzetközi szabványban meghatározott üzemi körülmények mellett abszorbeált jód tömege. A jódszámot g jód/100 g minta mértékegységben fejezik ki.

3.   ALAPELV

A minta feloldása oldószerben, majd wijs reagens hozzáadása. egy meghatározott idő elteltével kálium-jodid oldat és víz hozzáadása, majd a felszabadított jód titrálása nátrium-tioszulfát oldattal.

4.   REAGENSEK

Minden reagensnek elismert analitikai minőségűnek kell lennie:

4.1.	víz, az ISO 3696 előírásainak megfelelő, 3. fokozat.

4.2.	kálium-jodid, 100 g/l oldat, nem tartalmaz jódsavat vagy szabad jódot.

4.3.	keményítő, oldat. Keverjen el 5 g oldható keményítőt 30 ml vízben, adja ezt a keveréket 1 000 ml forrásban lévő vízhez, forralja három percig, majd hagyja lehűlni.

4.4.	nátrium-tioszulfát, standard volumetrikus oldat, c (Na2S2O3.5H2O) = 0,1 mol/l, használat előtt hét napnál nem régebben standardizálva.

4.5.	oldószer, azonos térfogatú ciklohexán és ecetsav összekeverésével készült,

4.6.	Wijs reagens, jód-monoklorid ecetsavban. Használható a kereskedelmi forgalomban kapható Wijs reagens.

5.   BERENDEZÉS

A szokásos laboratóriumi berendezés, valamint a következők:

5.1.	üveg mérőkanalak, a vizsgált mennyiséghez és a lombikba történő benyúláshoz megfelelőek (6.2.),

5.2.	kúpos fenekű lombikok, 500 ml térfogatúak, csiszolt üvegdugóval ellátva, teljesen szárazak.

6.   A VIZSGÁLATI MINTA ELŐKÉSZÍTÉSE

Szárítsa ki a homogenizált mintát nátrium-szulfáton, majd szűrje le.

7.   ELJÁRÁS

7.1.

Vizsgált mennyiség A vizsgált mennyiség tömege a várható jódszám függvényében változik az 1. táblázat szerint. 1.  táblázat Várható jódszám A vizsgált mennyiség tömege (g) kevesebb, mint 5 3,00 5–20 1,00 21–50 0,40 51–100 0,20 101–150 0,13 151–200 0,10 Mérje meg a vizsgált mennyiséget egy üveg mérőkanállal (5.1.) 0,1 mg pontossággal.

7.2.

Meghatározás Helyezze a vizsgált mennyiséget az 500 ml térfogatú kémcsőbe (6.2.). Adjon hozzá 20 ml oldószert (4.5.), hogy feloldja a zsírt. Adjon hozzá pontosan 25 ml Wijs reagenst (4.6.), tegye be a dugót, forgassa össze a lombik tartalmát, és tegye a lombikot sötét helyre. A Wijs reagenshez ne használjon pipettát. Készítsen vakpróbát hasonlóképpen az oldószerrel és reagenssel, de a vizsgált anyag kihagyásával. A 150-nél alacsonyabb jódszámú minták esetén egy óráig, a 150-nél magasabb jódszámú minták, illetve a polimerizált termékek, és a jelentős mértékben oxidálódott termékek esetén két óráig hagyja a lombikot a sötétben. A fenti idő elteltével adjon mindegyik kémcsőhöz 20 ml kálium-jodid oldatot (4.2.) és 150 ml vizet (4.1.). Végezzen titrálást a standard volumetrikus nátrium-tioszulfát oldattal (4.4.), ameddig a jód miatt kialakult sárga szín majdnem teljesen eltűnik. Adjon hozzá néhány csepp keményítőoldatot (4.3.), és folytassa a titrálást, ameddig a kék szín heves rázás mellett el nem tűnik. Megjegyzés: Megengedett a végpont potenciometrikus meghatározása.

7.3.	A meghatározások száma Végezzen a mintán két meghatározást.

8.   AZ EREDMÉNYEK KIFEJEZÉSE

A jódszám a következő képlettel adható meg:

ahol:

c

=

a felhasznált standard volumetrikus nátrium-tioszulfát oldat (4.4.) pontos töménységének számértéke mól/l-ben;

V1

=

a vakpróbához felhasznált standard volumetrikus nátrium-tioszulfát oldat (4.4.) térfogata ml-ben;

V2

=

a meghatározáshoz felhasznált standard volumetrikus nátrium-tioszulfát oldat (4.4.) térfogata ml-ben;

m

=

a vizsgált anyag (7.1.) tömege g-ban.

A két meghatározás számtani középértéket tekintse eredményként, amennyiben teljesül a megismételhetőség követelménye (9.2.).

▼M11

---

XVII. MELLÉKLET

A NÖVÉNYI OLAJOK SZTIGMASZTADIÉN-ÖSSZETÉTELÉNEK MEGHATÁROZÁSA

1.   CÉL

A sztigmasztadiének meghatározása az e szénhidrogéneket alacsony koncentrációban tartalmazó növényi olajokban, különösen szűz olajban és nyers olívamaradék-olajban.

2.   HATÁLY

Ez a szabvány minden növényi olajra alkalmazható, viszont a mérések csak abban az esetben megbízhatóak, ha ezeknek a szénhidrogéneknek a mennyisége 0,01–4,0 mg/kg között van. A módszer különösen alkalmas a finomított növényi olajok (olíva, olívamaradék, napraforgó, pálma stb.) jelenlétének szűz olívaolajban történő kimutatására, mivel a finomított olajok tartalmaznak sztigmasztadiéneket, a szűz olajok pedig nem.

3.   ALAPELV

A nem szappanosítható anyag leválasztása. A szteroidos szénhidrogén frakció szilikagélen történő leválasztása oszlopkromatográfiás módszer segítségével és elemzése gázkromatográfiás módszer segítségével.

4.   BERENDEZÉS

4.1.	Visszafolyós hűtőben való felhasználásra alkalmas 250 ml térfogatú lombikok.

4.2.	500 ml térfogatú választótölcsérek.

4.3.	100 ml térfogatú kerek aljú lombikok.

4.4.	Forgó bepárló.

4.5.

Üveg kromatográfiás oszlop (1,5–2,0 cm belső átmérő, 50 cm hossz) tefloncsappal, üveggyapot dugóval vagy szinterelt üveglappal az alján. A szilikagél oszlop előkészítéséhez öntsön hexánt a kromatográfiás oszlopba megközelítőleg 5 cm mélységben, majd töltse fel hexánban eloszlatott szilikagélből (15 g szilikagél 40 ml hexánban) álló iszappal, további hexán hozzáadása mellett. Hagyja leülepedni, az ülepedés befejezését kismértékű rázással segítse. Adjon hozzá vízmentes nátrium-szulfátot megközelítőleg 0,5 cm magasságban, majd végül eluálja a feleslegben lévő hexánt.

4.6.	Gázkromatográfiás berendezés lángionizációs detektorral, az oszlopra szerelt osztott vagy hideg befecskendezővel és ± 1 °C pontossággal programozható kemence.

4.7.	Ömlesztett kovaföld kapillárisoszlop gázkromatográfiás eljáráshoz (0,25 vagy 0,32 mm belső átmérőjű, 25 m hosszú), 0,25 mm rétegvastagságban 5 % fenil-metil-szilikon fázis bevonatú. 1. megjegyzés: Használhatók egyéb, azonos vagy alacsonyabb polaritású oszlopok is.

4.8.	Integráló-rögzítő berendezés, lehetőleg völgy-völgy integrálási módszer elvégzésére képes.

4.9.	5–10 ml térfogatú mikrofecskendő a gázkromatográfiás eljáráshoz, cementált tűvel.

4.10.

Elektromos fűtőpalást vagy főzőlap.

5.   REAGENSEK

Minden reagensnek analitikai minőségűnek kell lennie, kivéve ha másként nincs előírva. A felhasznált víznek desztillált víznek vagy legalább hasonló tisztaságú víznek kell lennie.

5.1.	Hexán vagy alkánok keveréke 65–70°C, rektifikáló oszlopon lepárolva. 2. megjegyzés: A szennyeződések eltávolítása céljából az oldószert desztillálni kell.

5.2.	96 v/v etanol.

5.3.	Vízmentes nátrium-szulfát.

5.4.

Kálium-hidroxid 10 %-os alkoholos oldata. Adjon 10 ml vizet 50 g kálium-hidroxidhoz, keverje el, majd öntse fel a keveréket etanollal 500 ml-re. 3. megjegyzés: A kálium-hidroxid alkoholos oldatának színe állás közben barnává változik. Mindennap frissen kell készíteni, és jól lezárt sötét üvegpalackban kell tárolni.

5.5.

Szilikagél 60 a kromatográfiás oszlophoz, 70–230 nyílásméretű (Merck, 7734 referenciaszámú vagy azzal megegyező). 4. megjegyzés: A szilikagél rendszerint közvetlenül felhasználható, mindennemű kezelés nélkül. Néhány szilikagél adag azonban alacsony aktivitású lehet, ami rossz kromatográfiás szétválasztást eredményez. Ilyen körülmények mellett a szilikagélt az alábbi módon kell kezelni: aktiválja a szilikagélt legalább négy órán keresztül tartó, 550 °C hőmérsékleten történő hevítéssel. A felmelegítést követően tegye a szilikagélt szárítóberendezésbe, amíg a szilikagél le nem hűl, ekkor töltse be egy zárható lombikba. Adjon hozzá 2 % vizet, és rázza addig, amíg a por csomómentes nem lesz és szabadon folyik. Amennyiben a szilikagéladagok a kromatogramokon zavaró csúcsokat eredményeznek, a szilikagélt a fenti módon kell kezelni. Egy másik lehetőség az extra tisztaságú szilikagél 60 használata (Merck, 7754 referenciaszám).

5.6.	Koleszta-3, 5-dién (Sigma, 99 % tisztaságú) (200 ppm töménységű) törzsoldata hexánban (10 mg 50 ml-ben).

5.7.	Koleszta-3, 5-dién 20 ppm töménységű standard oldata hexánban, a fenti oldat hígításából. 5. megjegyzés: Az 5.6. és az 5.7. oldatok legalább 4 hónapon keresztül stabilak, amennyiben 4 °C-nál alacsonyabb hőmérsékleten tárolják.

5.8.	n-nonakozán megközelítőleg 100 ppm töménységű hexánoldata.

5.9.	Vivőgáz a kromatográfiás eljáráshoz: 99,9990 % tisztaságú hélium vagy hidrogén.

5.10.

Segédgázok a lángionizációs detektorhoz: 99,9990 % tisztaságú hidrogén és tisztított levegő.

6.   ELJÁRÁS

6.1.   A nem szappanosítható anyag készítése

6.1.1.

Mérjen 20 ± 0, 1 g olajat egy 250 ml térfogatú lombikba (4.1.), adjon hozzá 1 ml-t a koleszta-3, 5-dién standard oldatából (20 μg) és 75 ml-t a nátrium-hidroxid 10 %-os alkoholos oldatából, szerelje fel a visszafolyós hűtőt, és harminc percen keresztül forralja gyengén. Vegye le a fűtőeszközről a mintát tartalmazó lombikot, és hagyja kissé lehűlni az oldatot (ne hagyja, hogy teljesen lehűljön, mert a minta megköt). Adjon hozzá 100 ml vizet, majd 100 ml hexán felhasználásával öntse a mintát a választótölcsérbe (4.2.). Rázza a mintát hevesen 30 másodpercen keresztül, majd hagyja szétválni. 6. megjegyzés: Amennyiben olyan emulzió keletkezik, amely nem tűnik el gyorsan, adjon hozzá kis mennyiségű etanolt.

6.1.2.

Öntse az alsó vizes fázist egy másik választótölcsérbe, és 100 ml hexán segítségével végezzen ismét extrahálást. Engedje ki még egyszer az alsó fázist, és mossa át háromszor a hexánkivonatokat (másik választótölcsérben vegyítve) mindhárom alkalommal etanol–víz (1: 1) keverékével, amíg semleges pH-értéket nem ér el.

6.1.3.

Vezesse át a hexánoldatot vízmentes nátrium-szulfáton (50 g), mossa át 20 ml hexánnal, és párolja be a forgó bepárlóban 30 °C hőmérsékleten csökkentett nyomás mellett, amíg ki nem szárad.

6.2.   A szteroidos szénhidrogén-frakció leválasztása

6.2.1.

A maradékot két 1 ml-es hexánadag segítségével öntse a frakcionáló oszlopba, engedje a mintát az oszlopba addig, ameddig az oldat szintje a nátrium-szulfátig süllyed, és kezdje meg a kromatográfiás elúciót a hexánnal megközelítőleg 1 ml/perc sebességgel. Az eluátum első 25–30 ml-jét öntse ki, majd gyűjtse össze a következő 40 ml-nyi frakciót. Az összegyűjtést követően öntse át ezt a frakciót egy 100 ml térfogatú kerek aljú lombikba (4.3.). 7. megjegyzés: Az első frakció a telített szénhidrogéneket tartalmazza (lásd az 1a. ábrát), a második a szteroidosakat. A további elúció eredményeképpen szkvalén és rokonvegyületei keletkeznek. A telített és a szteroidos szénhidrogének jó szétválasztása érdekében szükség van a frakciók térfogatainak optimalizálására. Ehhez az első frakció térfogatát úgy kell beállítani, hogy a második frakció elemzésekor a telített szénhidrogéneket jelentő csúcsok alacsonyak legyenek (lásd az 1c. ábrát); amennyiben nem jelennek meg, de a standard csúcs intenzitása alacsony, csökkenteni kell a térfogatot. Az első és a második frakció összetevői közötti szétválasztásra máskülönben nincs szükség, mivel amennyiben a gázkromatográfiás körülmények a 6.3.1. pontnak megfelelően vannak beállítva, akkor a gázkromatográfiás elemzési eljárás során nem fordul elő a csúcsok átfedése. A második frakció térfogatának optimalizálására általában nincsen szükség, mivel a további komponensek szétválasztása megfelelő. A standard oldatnál 1,5 perccel alacsonyabb retenciós időnél megfigyelhető nagyméretű csúcs jelenléte azonban a szkvalénnek köszönhető és a rossz felbontás jele.

6.2.2.

Párolja be a második fázist a forgó bepárlóban 30 °C hőmérsékleten csökkentett nyomás mellett, amíg ki nem szárad, majd ezután azonnal oldja fel a maradékot 0,2 ml hexánban. Az elemzés megkezdéséig tartsa az oldatot hűtőszekrényben. 8. megjegyzés: A 6.1.3. és a 6.2.2. maradék nem tartható szárazon és szobahőmérsékleten. A keletkezésüket követően azonnal hozzá kell adni az oldószert, és hűtőszekrényben kell tárolni.

6.3.   Gázkromatográfiás eljárás

6.3.1.

Az osztott befecskendezés üzemi körülményei: — injektor hőmérséklete: 300 °C, — detektor hőmérséklete: 320 °C, — integráló-rögzítő berendezés: az integrálás paramétereit úgy kell rögzíteni, hogy a területek pontos becslését eredményezze. Javasolható a völgy-völgy módszer használata, — érzékenység: a minimális hígítás 16-szorosa, — a befecskendezett oldat mennyisége: 1 μl, — a kemence beprogramozott hőmérséklete: 235 °C kiindulási hőmérséklet 6 percen keresztül, majd percenként 2 °C-os hőmérséklet-emelkedés 285 °C hőmérsékletig, — injektor 1:15 arányú áramlásosztóval, — vivőgáz: hélium vagy hidrogén megközelítőleg 120 kPa nyomással. Ezek a körülmények a kromatográfiás berendezés és az oszlop jellemzőinek megfelelően szabályozhatók be úgy, hogy a kromatogramok megfeleljenek az alábbi követelményeknek: belső standard csúcsa megközelítőleg a 6.3.2. pontban megadott időn belül öt perccel; a belső standard csúcsa a teljes skálának legalább 80 %-a. A gázkromatográfiás rendszert a kolesztadién törzsoldatának (5.6.) és az n-nonakozán oldat (5.8.) befecskendezésével kell ellenőrizni. A koleszta-3, 5-dién csúcsnak az n-nonakozán csúcs előtt kell jelentkeznie (1c. ábra); amennyiben nem ez történik, két dolgot tehet: csökkenti a kemence hőmérsékletét és/vagy kevésbé poláris oszlopot használ.

6.3.2.

A csúcsok azonosítása A belső standard csúcsa megközelítőleg 19 percnél jelentkezik, és a 3,5-sztigmasztadiéné pedig ehhez képest megközelítőleg 1,29 perc retenciós időnél (lásd az 1b. ábrát). A 3,5-sztigmasztadién rendszerint egy kis mennyiségű izomerrel együtt fordul elő, és a kettő együtt eluálódik egyetlen kromatografikus csúcsként. Ha azonban az oszlop túlságosan poláris vagy magas felbontóképességet mutat, az izomer egy kis csúcsként jelentkezik a 3,5-sztigmasztadién csúcsa előtt és ahhoz közel (lásd 2. ábra). Annak biztosítására, hogy a sztigmasztadiének egyetlen csúcsként eluálódjanak, javasolható egy kevésbé poláris vagy nagyobb belső átmérőjű oszlop használata. 9. megjegyzés: Referenciaként sztigmasztadiéneket finomított növényi olaj elemzéséből lehet nyerni, kisebb mennyiségű minta használatával (1-2 g). A sztigmasztadiének egy kimagasló és könnyen azonosítható csúcsot eredményeznek.

6.3.3.

Mennyiségi elemzés A sztigmasztadién-tartalom az alábbi képlet alapján határozható meg: sztigmasztadiének mennyisége mg/kg-ban = ahol: As = a sztigmasztadién-csúcs területe (amennyiben a csúcs két izomerre bomlik fel, a két csúcs területének összege), Ac = a belső standard területe (kolesztadién), Mc = a hozzáadott standard tömege, mikrogrammban, Mo = a felhasznált olaj tömege grammban. Érzékelési korlát: megközelítőleg 0,01 mg/kg.

1. ábra

Az ömlesztett kovaföld kapilláris oszlopon (0,25 mm belső átmérő, 25 m, 5 % fenilmetil-szilikon bevonat 0,25 μm rétegvastagságban) elemzett olívaolaj-mintákból kapott gázkromatogramok.

2. ábra

DB-5 oszlopon elemzett finomított olívaolaj gázkromatogramja, amelyen látszik a 3,5-sztigmasztadién izomerje.

▼M13

---

ANNEX XVIII

DETERMINATION OF TRIACYLGLYCEROLS WITH ECN 42 (DIFFERENCE BETWEEN HPLC DATA AND THEORETICAL CONTENT)

1.   Scope

Determination of the composition of triacylglycerols (TAGs) in olive oils, in terms of their equivalent carbon number by differences between the analytical results obtained by high performance liquid chromatography (HPLC) and the theoretical content, calculated starting from the fatty acid composition.

2.   Field application

The standard is applicable to olive oils. The method is applicable to the detection of the presence of small amounts of seed oils (rich in linoleic acid) in every class of olive oils.

3.   Principle

The content of triacylglycerols with ECN42 determined by HPLC analysis and the theoretical content of triacylglycerols with ECN42 (calculated on the basis of GLC determination of fatty acid composition) correspond within a certain limit for pure oils. A difference larger than the values stated in the Regulation for each type of oil points out that the oil contains seed oils.

4.   Method

The method for calculation of theoretical content of triacylglycerols with ECN42 and of the difference between the HPLC data and this one essentially is made by the coordination of analytical data obtained by means of other methods: it is possible to distinguish three phases: determination of fatty acid composition by capillary gas chromatography, calculation of theoretical composition of triacylglycerols with ECN42, HPLC determination of ECN42 triacylglycerols

4.1.   Apparatus

4.1.1.

Round bottom flasks, 250 and 500 ml.

4.1.2.

Beakers 100 ml.

4.1.3.

Glass chromatographic column, 21 mm internal diameter, 450 mm length, with cock and normalized cone (female) at the top.

4.1.4.

Separator funnels, 250 ml, with normalized cone (male) at the bottom, suitable to be connected with the top of the column.

4.1.5.

Glass rod, 600 mm length.

4.1.6.

Glass funnel, 80 mm diameter.

4.1.7.

Volumetric flasks, 50 ml.

4.1.8.

Volumetic flasks, 20 ml.

4.1.9.

Rotative evaporator.

4.1.10.

High performance liquid chromatography, allowing thermostatic control of column temperature.

4.1.11.

Injection units for 10 μl delivery.

4.1.12.

Detector: differential refractometer. The full scale sensitivity should be at least 10-4 units of refractive index.

4.1.13.

Column: stainless steel tube 250 mm length and 4,5 mm internal diameter packed with 5 μm diameter particles of slica with 22 to 23 % carbon in the form of octadecylsilane (note 2).

4.1.14.

Recorder and/or integrator.

4.2.   Reagents

The reagents should be of analytical purity. Elution solvents should be de-gassed, and may be recycled several times without effect on the separations.

4.2.1.

Petroleum ether 40 to 60 °C chromatographic grade.

4.2.2.

Ethil ether, peroxides free, freshly distilled.

4.2.3.

Glass chromatographic elution solvent: mixture petroleum ether/ethil ether 87/13 (v/v).

4.2.4.

Silicagel, 70-230 mesh, type Merck 7734, with water content standardized at 5 % (w/w).

4.2.5.

Glass wool.

4.2.6.

Acetone.

4.2.7.

Acetonitrile.

4.2.8.

HPLC elution solvent: acetonitrile + acetone (proportions to be adjusted to obtain the desired separation; begin with 50:50 mixture).

4.2.9.

Solubilization solvent: acetone.

4.2.10.

Reference triglycerides commercial triglycerides tripalmitin, triolein, etc.) may be used and the retention times thence plotted in accordance with the equivalent carbon number, or alternatively reference chromatograms obtained from soya oil, mixture 30:70 soya oil/olive oil and pure olive oil (see notes 3 and 4 and figure 1, 2, 3, 4).

4.3.   Sample preparation

As a number of interfering substances can rise false positive results, the sample must always be purified according to IUPAC method 2.507, used for determination of polar substances in oxidised oils.

4.3.1.   Chromatographic column preparation

Fill the column (4.1.3) with about 30 ml of elution solvent (4.2.3), then introduce inside the column some glass wool (4.2.5) pushing it to the bottom of the column by means of the glass rod (4.1.5).

In a 100 ml beaker, suspend 25 g of silicagel (4.2.4) in 80 ml of elution mixture (4.2.3), then transfer it inside the column, by means of a glass funnel (4.1.6).

To ensure the complete transfer of silicagel inside the column, wash the beaker with the elution mixture and transfer the washing portions inside the column, too.

Open the cock and let solvent elute from the column until its level is about 1 cm over the silicagel.

4.3.2.   Column chromatography

Weigh with the accuracy of 0,001 g, 2,5 ± 0,1 g of oil, previously filtered, homogenized and anhydrified, if necessary, in a 50 ml volumetric flask (4.1.7). Solve it in about 20 ml of elution solvent (4.2.3), if necessary, slightly heat it to make the dissolution easily. Cool at room temperature and adjust the volume with elution solvent.

By means of a volumetric pipette, introduce 20 ml of solution inside the column prepared according to 4.3.1, open the cock and let solvent elute to the silicagel layer level.

Then elute with 150 ml of elution solvent (4.2.3), adjusting the solvent rate at about 2 ml/min (150 ml will take about 60 to 70 minutes to pass through the column).

The eluated is recovered in a 250 ml round bottom flask (4.1.1) previously tared in an oven and exactly weighted. Eliminate solvent at reduce pressure (Rotavapor) and weigh the residue that will be used to prepare the solution for HPLC analysis and for methyl ester preparation.

The sample recovery from the column must be 90 % at least for extra virgin, virgin, ordinary refined and olive oil categories, and a minimum of 80 % for lampante and residue olive oils.

4.4.   HPLC analysis

4.4.1.   Preparation of the samples for chromatographic analysis

A 5 % solution of the sample to be analysed is prepared by weighing 0,5 ± 0,001 g of the sample into a 10 ml graduated flask and making up to 10 ml with the solubilization solvent (4.2.9).

4.4.2.   Procedure

Set up the chromatographic system. Pump elution solvent (4.2.8) at a rate of 1,5 ml/min to purge the entire system. Wait until a stable base line is obtained. Inject 10 μl of the sample prepared as in 4.3.

4.4.3.   Calculation and expression of results

Use the area normalization method, i.e. assume that the sum of the areas of the peaks corresponding to TAGs from ECN42 up to ECN52 is equal to 100 %. Calculate the relative percentage of each triglyceride using the formula:

% triglyceride = area of peak × 100/ sum of peak areas.

The results are to be given to within at least two decimal places.

Note 1: The elution order can be determined by calculating the equivalent carbon numbers, often defined by the relation ECN = CN-2n, where CN is the carbon number and n is the number of double bounds, it can be calculated more precisely by taking into account the origin of the double bond. If no, nl and nln are the numbers of double bonds attributed to oleic, linoleic and linolenic acids respectively, the equivalent carbon number can be calculated by means of the relation of the formula:

where the coefficient do, dl and dln can be calculated by means of the reference triglycerides. Under the conditions specified in this method, the relation obtained will be close in:

Note 2:

Note 3: With several reference triglycerides, it is also possible to calculate the resolution with respect to triolein:

by use of the reduced retention time RT' = RT - RT solvent.

The graph of log α against f (number of double bonds) enables the retention values to be determined for all the triglycerides of fatty acids contained in the reference triglycerides — see figure 2.

Note 4: The efficiency of the column should permit clear separation of the peak of trilinoein from the peaks of the triglycerides with an adjacent RT. The elution is carried out up to ECN52 peak.

Note 5: A correct measure of the areas of all peaks of interest for the present determination is ensured if the second peak corresponding to ECN50 is 50 % of full scale of the recorder.

4.5.   Calculation of triacylglycerols composition

4.5.1.   Determination of fatty acid composition

Fatty acid composition is carried out by means of the EEC gas chromatographic method reported in Annex X A of Regulation (EEC) No 2568/91, by means of a capillary column. The methyl esters preparation is carried out according to Annex X B (sodium methylate alcohol solution).

4.5.2.   Fatty acids for calculation

Glycerides are grouped by their equivalent carbon number (ECN), taking into account the following equivalencies between ECN and fatty acids. Only fatty acids with 16 and 18 carbon atoms were taken in consideration, because only these are important for olive oil.

4.5.3.   Conversion of area % into moles for all fatty acids

4.5.4.   Normalization of fatty acids to 100 %

The result gives the percentage of each fatty acid in moles % in the overall (1,2,3-) position of the TAGs.

Then the sum of the saturated fatty acids P and S (SFA) and the unsaturated fatty acids Po, O, L and Ln (UFA) are calculated:

4.5.5.   Calculation of the fatty acid composition in 2- and 1,3- positions of TAGs

The fatty acids are distributed to three pools as follows: two identical for 1- and 3- positions and one for 2- position, with different coefficients for the saturated (P and S) and unsaturated acids (Po, O, L and Ln).

4.5.5.1.

Saturated fatty acids in 2- position [P(2) and S(2)] moles % P(2) = moles % P (1,2,3) * 0,06 (4) moles % S(2) = moles % S (1,2,3) * 0,06

4.5.5.2.

Unsaturated fatty acids in 2- position [Po(2), O(2), L(2) and Ln(2)]: moles % Po2 = moles % Po1,2,3moles % UFA * 100 - moles % P2 - moles % S2 (5) moles % O2 =moles % O1,2,3moles % UFA * 100 - moles % P2 - mol % S2 moles % L2 =moles % L1,2,3moles % UFA * 100 - moles % P2 - moles % S2 moles % Ln2 =moles % Ln1,2,3moles % UFA * 100 - moles % P2 - moles % S2

4.5.5.3.

Fatty acids in 1,3-positions [P(1,3), S(1,3), Po(1,3) O(1,3), L(1,3) and Ln(1,3)]: moles % P1,3 =moles % P1,2,3 - moles % P22 + moles % P1,2,3 (6) moles % S1,3 =moles % S1,2,3 - moles % S22 + moles % S1,2,3 moles % Po1,3 =moles % Po1,2,3 - moles % Po22 + moles % Po1,2,3 moles % O1,3 = moles % O1,2,3 - moles % O22 + moles % O1,2,3 moles % L1,3 =moles % L1,2,3 - moles % L22 + moles % L1,2,3 moles % Ln1,3 =moles % Ln1,2,3 - moles % Ln22 + moles % Ln1,2,3

4.5.6.   Calculation of triacylglycerols

4.5.6.1.

TAGs with one fatty acid (AAA, here LLL, PoPoPo) moles % AAA = moles % A1,3 * moles % A2 * moles % A1,310 000 (7)

4.5.6.2.

TAGs with two fatty acids (AAB, here PoPoL, PoLL) moles % AAB = moles % A1,3 * moles % A2 * moles % B1,3 * 210 000 (8) moles % ABA = moles % A1,3 * moles % B2 * moles % A1,310 000

4.5.6.3.

TAGs with three different fatty acids (ABC, here OLLn, PLLn, PoOLn, PPoLn) moles % ABC =moles % A1,3 * moles % B2 * moles % C1,3 * 210 000 (9) moles % BCA = moles % B1,3 * moles % C2 * moles % A1,3 * 210 000 moles % CAB = moles % C1,3 * moles % A2 * moles % B1,3 * 210 000

4.5.6.4.

Triacylglycerides with ECN42 The following triglycerides with ECN42 are calculated according equation 7, 8 and 9 in order of expected elution in HPLC (normally only three peaks). LLL PoLL and the positional isomer LPoL OLLn and the positional isomers OLnL and LnOL PoPoL and the positional isomer PoLPo PoOLn and the positional isomers OPoLn and OLnPo PLLn and the positional isomers LLnP and LnPL PoPoPo SLnLn and the positional isomer LnSLn PPoLn and the positional isomers PLnPo and PoPLn The triacylglycerides with ECN42 are given by the sum of the nine triacylglycerols including their positional isomers. The results to be given with at least two decimal places.

5.   Evaluation of the results

The calculated theoretical content and the content determined by the HPLC analysis are compared. If the difference between HLPC data minus theoretical data is greater than the values states for the appropriate oil category in the Regulation, the sample contains seed oil.

Note:Results are given to within one decimal figure.

6.   Example (The numbers refer to the sections in the text of the method)

4.5.1.   Calculation of moles % fatty acids from GLC data (area %)

The following data are obtained for the fatty acid composition by GLC:

4.5.3.   Conversion of area % into moles for all fatty acids

4.5.4.   Normalization of fatty acids to 100 %

Sum of the saturated and unsaturated fatty acids in the 1,2,3- position of TAGs

4.5.5.   Calculation of the fatty acid composition in 2- and 1,3- positions of the TAGs

4.5.5.1.

Saturated fatty acids in 2- position [P(2) and S(2)] moles % P(2) = 10,888 % * 0,06 = 0,653 moles % See formula (4) moles % S(2) = 2,944 % * 0,06 = 0,177 moles % See formula (4)

4.5.5.2.

Unsaturated fatty acids in 1,3-position [Po(1,3), O(1,3), L(1,3) and Ln(1,3)] moles % Po2 =1,097 %86,169 %* 100 - - 0,659 - 0,177 = 1,263 moles % See formula (5) moles % O2 =74,113 %86,169 %* 100 - - 0,659 - 0,177 = 85,295 moles % See formula (5) moles % L2 =9,956 %86,169 %* 100 - - 0,659 - 0,177 = 11,458 moles % See formula (5) moles % Ln2 =1,003 %86,169 %* 100 - - 0,659 - 0,177 = 1,154 moles % See formula (5)

4.5.5.3.

Fatty acids in 1,3-positions [P(1,3), S(1,3), Po(1,3), O(1,3), L(1,3) and Ln(1,3)] moles % P1,3 = 10,888 - 0,6592 10,888 = 16,005 moles % See formula (6) moles % S1,3 = 2,944 - 0,1772 2,944 = 4,327 moles % See formula (6) moles % Po1,3 = 1,097 - 1,2632 1,097 = 1,015 moles % See formula (6) moles % O1,3 =74,113 - 85,2952 74,113 = 68,522 moles % See formula (6) moles % L1,3 =9,956 - 11,4582 9,956 = 9,205 moles % See formula (6) moles % Ln1,3 =1,003 - 1,1542 1,003 = 0,927 moles % See formula (6)

4.5.6.   Calculation of triacylglycerols

From the calculated fatty acid composition in sn-2- and sn-1,3- positions (see above):

the following triacylglycerols are calculated:

4.5.6.1.

TAGs with one fatty acid (LLL, PoPoPo) See formula (7) mol % LLL = 9,205 % * 11,458 % * 9,205 %10 000 = 0,09708 mol LLL mol % PoPoPo = 1,015 % * 1,263 % * 1,015 %10 000 = 0,00013 mol PoPoPo

4.5.6.2.

TAGs with two fatty acids (PoLL, SLnLn, PoPoL) See formula (8) mol % PoLL + LLPo = 1,015 % * 11,458 % * 9,205 % * 210 000 = 0,02141 mol % LPoL = 9,205 % * 1,263 % * 9,205 %10 000 = 0,01070   0,03211 mol PoLL mol % SLnLn + LnLnS = 4,327 % * 1,154 % * 0,927 % * 210 000 = 0,00093 mol % LnSLn = 0,927 % * 0,177 % * 0,927 %10 000 = 0,00002   0,00095 mol SLnLn mol % PoPoL + LPoPo = 1,015 % * 1,263 % * 9,205 % * 210 000 = 0,00236 mol % PoLPo = 1,015 % * 11,458 % * 1,015 %10 000 = 0,00118   0,00354 mol PoPoL

4.5.6.3.

TAGs with three different fatty acids (PoPLn, OLLn, PLLn, PoOLn) See formula (9) mol % PPoLn = 16,005 % * 1,263 % * 0,927 % * 210 000 = 0,00375 mol % LnPPo = 0,927 % * 0,653 % * 1,015 % * 210 000 = 0,00012 mol % PoLnP = 1,015 % * 1,154 % * 16,005 % * 210 000 = 0,00375   0,00762 mol PPoLn mol % OLLn = 68,522 % * 11,458 % * 0,927 % * 210 000 = 0,14577 mol % LnOL = 0,927 % * 85,295 % * 9,205 % * 210 000 = 0,14577 mol % LLnO = 9,205 % * 1,154 % * 68,522 % * 210 000 = 0,14577   0,43671 mol OLLn mol % PLLn = 16,005 % * 11,458 % * 0,927 % * 210 000 = 0,03400 mol % LnPL = 0,927 % * 0,653 % * 9,205 % * 210 000 = 0,00111 mol % LLnP = 9,205 % * 1,154 % * 16,005 % * 210 000 = 0,03400   0,06911 mol PLLn mol % PoOLn = 1,015 % * 85,295 % * 0,927 % * 210 000 = 0,01605 mol % LnPoO = 0,927 % * 1,263 % * 68,522 % * 210 000 = 0,01605 mol % OLnPo = 68,522 % * 1,154 % * 1,015 % * 210 000 = 0,01605   0,04815 mol PoOLn ECN42 = 0,69540 mol TAGs

▼M14

1. ábra: A log α és f (kettõs kötések száma) grafikonja

Megjegyzés:

La= laurinsav, My = mirisztinsav, P = palmitinsav, St = sztearinsav, O = olajsav, L = linolsav, Ln = linolénsav.

2. ábra: Szójababolaj

3. ábra: Szójababolaj/olívaolaj 30/70

4. ábra: Olívaolaj

▼M19

---

ANNEX XIX

DETERMINATION OF ALIPHATIC ALCOHOLS CONTENT BY CAPILLARY GAS CHROMATOGRAPHY

1.   OBJECT

The procedure describes a method for the determination of aliphatic alcohols content in oils and fats.

2.   PRINCIPLE OF THE METHOD

The fatty substance, with 1-eicosanol added as internal standard, is saponified with ethanolic potassium hydroxide and then the unsaponifiable matter extracted with ethyl ether. The alcoholic fraction is separated from the unsaponifiable matter by chromatography on a basic silica gel plate; the alcohols recovered from the silica gel are transformed into trimethylsilyl ethers and analysed by capillary gas chromatography.

3.   EQUIPMENT

4.   REAGENTS

5.   PROCEDURE

5.1.   Preparation of the unsaponifiables

5.1.1.

Using a 500 μl microsyringe place, into a 250 ml round-bottom flask, a volume of 0,1 % 1-eicosanol solution in chloroform (4.17) containing a quantity of 1-eicosanol approximately equal to 10 % of the aliphatic alcohols content in that portion of sample to be taken for analysis. For example, to 5 g of sample add 250 μl of the 0,1 % 1-eicosanol solution if olive oil and 1 500 μl if olive pomace oil. Evaporate to dryness in current of nitrogen and then weigh accurately 5 g of the dry filtered sample into the same flask.

5.1.2.

Add 50 ml of 2 N potassium hydroxide ethanolic solution, fit the reflux condenser and heat the apparatus to slight boiling on a steam bath, stirring continuously throughout the heating process until saponification has taken place (the solution becomes clear). Continue heating for a further 20 minutes and then add 50 ml of distilled water through the condenser. The condenser is then disconnected and the flask cooled to approximately 30 °C.

5.1.3.

The contents of the flask are quantitatively transferred to a separating funnel of 500 ml capacity by adding distilled water several times, using a total of around 50 ml distilled water. Add approximately 80 ml of ethyl ether, shake vigorously for approximately 30 seconds and allow to settle (Note 1). Separate off the lower aqueous phase collecting it in a second separating funnel. Two further extractions are effected on the aqueous phase, in the same manner, using each time 60 to 70 ml ethyl ether. Note 1: Emulsions may be eliminated by adding, using as a spray, small quantities of ethyl alcohol or methyl alcohol.

5.1.4.

The ethyl ether extracts are combined in a separating funnel and washed with distilled water (50 ml at a time) until the washing water gives a neutral reaction. Discard the washing water, dry with anhydrous sodium sulphate and filter, into a flask of 250 ml capacity which has been weighed beforehand, the funnel and filter being washed with small quantities of ethyl ether which are added to the total.

5.1.5.

Distil the ether down to a few ml, then bring to dryness under a slight vacuum or in a current of nitrogen, completing drying in an oven at 100 °C for approximately a quarter of an hour, and then weigh after cooling in a desiccator.

5.2.   Separation of alcoholic fractions

5.2.1.

Preparation of basic TLC plates: the silica gel plates (4.4) are immersed completely, in 0,2 N potassium hydroxide solution (4.5) for 10 seconds, and then left to dry for two hours under an extractor hood and finally placed in an oven at 100 °C for one hour. Remove from the oven and keep in a calcium chloride desiccator until required for use (plates treated in this way must be used within 15 days). Note 2: When basic silica gel plates are used to separate the alcoholic fraction there is no need to treat the unsaponifiables with alumina. It follows that all acid compounds (fatty acids and others) are retained at the origin thereby obtaining both aliphatic alcohol and terpenic alcohol bands which are both separated distinctly from the sterol band.

5.2.2.

Place a 65/35 by volume hexane/ethyl ether mixture in the plate-developing chamber to a depth of approximately 1 cm ( 7 ). Close the chamber using an appropriate cover and leave for half an hour to allow equilibration between vapour and liquid. Strips of filter paper dipping into the eluent may be affixed to the inside surfaces of the tank to reduce the development time by approximately one third and obtain more uniform, regular elution of the components. Note 3: The developing solution must be replaced for each analysis in order to obtain reproducible developing conditions.

5.2.3.

An approximately 5 % solution of unsaponifiable matter (5.1.5) in chloroform is prepared and 0,3 ml of the solution is streaked as a uniform strip of minimum thickness, using the 100 μl microsyringe, on a TLC plate at approximately 2 cm from the bottom of the TLC plate. Aligned with the origin, 2 to 3 μl of the aliphatic alcohols reference solution (4.11) are spotted for the identification of the aliphatic alcohols band after development has been completed.

5.2.4.

Place the plate inside the development tank as stated in 5.2.2. The ambient temperature should be maintained between 15 and 20 °C. Immediately close the chamber with the cover and allow to elute until the solvent front reaches approximately 1 cm from the upper edge of the plate. The plate is then removed from the development chamber and the solvent evaporated under a hot air current or the plate is left for a while under the extractor hood.

5.2.5.

The plate is sprayed lightly and evenly with the solution of 2', 7'-dichlorofluorescein when the plate is observed under ultra violet light. The aliphatic alcohols band can be identified through being aligned with the stain obtained from the reference solution: mark the limits of the band with a black pencil; outlining the band of aliphatic alcohols and the band immediately above that, which is the terpenic alcohols band, together. Note 4: The aliphatic alcohols band and the terpenic alcohols band are to be grouped together in view of the possible migration of some aliphatic alcohols into the triterpenic alcohols band.

5.2.6.

Using a metal spatula scrape off the silica gel in the marked area. Place the finely comminuted material removed into the filter funnel (3.7). Add 10 ml of hot chloroform, mix carefully with the metal spatula and filter under vacuum, collecting the filtrate in the conical flask (3.8) attached to the filter funnel. Wash the pomace in the flask three times with ethyl ether (approximately 10 ml each time) collecting the filtrate in the same flask attached to the funnel. Evaporate the filtrate to a volume of 4 to 5 ml, transfer the residual solution to the previously weighed 10 ml test tube (3.9), evaporate to dryness by mild heating in a gentle flow of nitrogen, make up again using a few drops of acetone, evaporate again to dryness, place in an oven at 105 °C for approximately 10 minutes and then allow to cool in a desiccator and weigh. The pomace inside the test tube is composed of the alcoholic fraction.

5.3.   Preparation of the trimethylsilyl ethers

5.3.1.

The reagent for silylation, consisting of a mixture of 9:3:1 by volume (Note 5) of pyridine-hexamethyldisilazane-trimethylchlorosilane in the proportion of 50 μl for each milligram of aliphatic alcohols, is added to the test tube containing the alcoholic fraction, avoiding all absorption of moisture (Note 6). Note 5: Solutions which are ready for use are available commercially. Other silanising reagents such as, for example, bis-trimethylsilyl, trifluor acetamide + 1 % trimethyl chlorosilane, which has to be diluted with an equal volume of anhydrous pyridine, are also available. Note 6: The slight opalescence which may form is normal and does not cause any interference. The formation of a white floc or the appearance of a pink colour are indicative of the presence of moisture or deterioration of the reagent. If these occur the test must be repeated.

5.3.2.

Stopper the test tube, shake carefully (without overturning) until the aliphatic alcohols are completely dissolved. Stand for at least 15 minutes at ambient temperature and then centrifuge for a few minutes. The clear solution is ready for gas chromatographic analysis.

5.4.   Gas chromatography analysis

5.4.1.   Preliminary operations, column packing

5.4.1.1.

Fit the column in the gas chromatograph, attaching the inlet end to the injector connected to the splitting system and the outlet end to the detector. Carry out a general check of the gas chromatography assembly (tightness of gas fittings, efficiency of the detector, efficiency of the splitting system and of the recording system, etc.).

5.4.1.2.

If the column is being used for the first time it is recommended that it should be subjected to conditioning. A little carrier gas is passed through the capillary column and then the gas chromatography assembly is switched on and gradually heated until a temperature not less than 20 °C above the operating temperature (see Note 7) is attained. That temperature is held for not less than two hours and then the assembly is brought to the operating conditions (regulation of gas flow, split flame ignition, connection to the electronic recorder, adjustment of the temperature of the capillary column oven, the detector and the injector, etc.) and the signal is adjusted to a sensitivity not less than twice the highest level contemplated for the execution of the analysis. The course of the base line must be linear, without peaks of any kind, and must not drift. A negative straight-line drift indicates leakage from the column connections; a positive drift indicates inadequate conditioning of the column. Note 7: The conditioning temperature shall be at least 20 °C less than the maximum temperature contemplated for the liquid phase employed.

5.4.2.   Choice of operating conditions

5.4.3.   Analytical procedure

5.4.4.   Peak identification

The identification of individual peaks is effected according to the retention times and by comparison with the standard TMSE mixture, analysed under the same conditions.

A chromatogram of the alcoholic fraction of a virgin olive oil is shown in Figure 1.

5.4.5.   Quantitative evaluation

6.   EXPRESSION OF THE RESULTS

The contents of the individual aliphatic alcohols in mg/1 000 g of fatty substance and the sum of the ‘total aliphatic alcohols’ are reported.

---

APPENDIX

Determination of the linear velocity of the gas

1 to 3 μl of methane or propane are injected into the gas chromatograph set at normal operating conditions and the time taken for the methane or propane to flow through the column from the instant of injection to the instant the peak elutes (tM) is measured using a stop clock.

The linear velocity in cm/s is given by L/tM, where L is the length of the column in centimetres and tM is the measured time in seconds.

Figure 1 — Chromatogram of the alcoholic fraction of virgin oil

1

=

Eicosanol

2

=

Decosanol

3

=

Tricosanol

4

=

Tetracosanol

5

=

Pentacosanol

6

=

Hexacosanol

7

=

Heptacosanol

8

=

Octacosanol

▼M23

---

XX. MELLÉKLET

A viasz-, valamint a zsírsav-metilészter-és zsírsav-etilészter-tartalom kapilláris gázkromatográfiával történő meghatározásának módszere

1.   A MÓDSZER CÉLJA

A módszer célja az olívaolaj viasz-, zsírsav-metilészter- és zsírsav-etilészter-tartalmának meghatározása. Az egyes viaszok és alkilészterek elválasztása a szénatomszám alapján történik. Javasolt a módszer alkalmazása az olívaolaj és az olívapogácsa-olaj megkülönböztetésére, valamint az extra szűz olívaolaj minőségének meghatározására, mivel alkalmas az extra szűz olívaolajból és alacsonyabb minőségű olajból – legyen az szűz, lampante vagy valamely szagtalanított olaj – megtévesztő szándékkal létrehozott keverékek azonosítására.

2.   ALAPELV

Megfelelő belső standardok hozzáadása az olajhoz, majd frakcionálás kromatográfiás eljárás segítségével hidratáltszilikagél-oszlopon. A vizsgálati körülmények között eluált (a triacilglicerineknél kisebb polaritású) frakció leválasztása, majd kapilláris gázkromatográfia segítségével történő közvetlen elemzése.

3.   ESZKÖZÖK

3.1.	25 ml-es térfogatú Erlenmeyer-lombik,

3.2.	15,0 mm belső átmérőjű, 30–40 cm hosszú folyadékkromatográfiás üvegoszlop megfelelő csappal,

3.3.

kapillárisoszloppal történő használatra alkalmas gázkromatográf, közvetlenül az oszlopra történő injektálásra alkalmas rendszerrel, amely a következő részekből áll: 3.3.1. termosztátvezérlésű kemence hőmérséklet-programozással, 3.3.2. közvetlenül az oszlopra történő injektálásra alkalmas hideg befecskendező rendszer, 3.3.3. lángionizációs detektor és konverter-erősítő, 3.3.4. regisztráló-integráló berendezés (1. megjegyzés) a konverter-erősítővel (3.3.3. pont) történő használatra, melynek válaszideje nem haladja meg az egy másodpercet, és változtatható papírsebességű, 1. megjegyzés:  Lehetséges olyan informatizált rendszerek használata is, amelyek alkalmasak a gázkromatográfiai adatok számítógépes feldolgozására. 3.3.5. ömlesztett szilícium-dioxidból készült, 8–12 m hosszúságú, 0,25–0,32 mm belső átmérőjű, belülről egyenletesen 0,10–0,30 μm rétegvastagságú folyadékfázissal (2. megjegyzés) borított (a viaszok, zsírsav-metilészterek és zsírsav-etilészterek elemzésére szolgáló) kapillárisoszlop, 2. megjegyzés:  E célra használhatók a kereskedelmi forgalomban lévő megfelelő folyadékfázisok, mint az SE52, SE54 stb.

3.4.	10 μl térfogatú mikrofecskendő közvetlenül az oszlopra történő injektáláshoz, keményített tűvel,

3.5.	elektromos rázóberendezés,

3.6.	rotációs bepárló,

3.7.	tokos kemence,

3.8.	analitikai mérleg, ± 0,1 mg-os mérési pontossággal,

3.9.	szokványos laboratóriumi üvegeszközök.

4.   REAGENSEK

4.1.

szilikagél, 60–200 μm mesh. Helyezze a szilikagélt az 500 °C hőmérsékletű tokos kemencébe legalább négy óra hosszára. Hagyja lehűlni, majd adjon hozzá a felhasznált szilikagél mennyisége 2 %-ának megfelelő vízmennyiséget. Alaposan rázza fel a sűrű szuszpenziót, hogy homogénné váljék, majd használat előtt legalább 12 órán keresztül tartsa a szárítóberendezésben.

4.2.

n-hexán, kromatográfia vagy maradékvizsgálat céljára alkalmas (a tisztaságot ellenőrizni kell). FIGYELEM! Gőzei a levegővel keveredve gyúlékony elegyet alkotnak! A vizsgálathoz távolítson el minden gyújtóforrást (hőforrás, szikra, nyílt láng)! Győződjön meg róla, hogy az üvegek mindig jól le legyenek zárva! Használat során gondoskodjon megfelelő szellőzésről! Előzze meg a gőzfelhalmozódást és távolítson el minden tűzveszélyes tárgyat, pl. a nem éghetetlen anyagokból készült fűtőberendezéseket és elektromos készülékeket! Az anyag belélegezve idegsejt-károsodást okozhat. Ne lélegezze be a gőzt! Szükség esetén használjon megfelelő lélegeztető berendezést! Szembe és bőrre ne kerüljön!

4.3.

Etil-éter, kromatográfia céljára alkalmas. FIGYELEM! Kiemelten tűzveszélyes és közepesen toxikus anyag! Bőrrel érintkezve irritációt okoz. Belégzése káros. Szemkárosodást okozhat. Késleltetett káros hatásokat okozhat. Robbanó peroxidokat képezhet. Gőzei a levegővel keveredve gyúlékony elegyet alkothatnak. A vizsgálathoz távolítson el minden gyújtóforrást (hőforrás, szikra, nyílt láng)! Győződjön meg róla, hogy az üvegek mindig jól le legyenek zárva! Használat során gondoskodjon megfelelő szellőzésről! Előzze meg a gőzfelhalmozódást és távolítson el minden tűzveszélyes tárgyat, pl. a nem éghetetlen anyagokból készült fűtőberendezéseket és elektromos készülékeket! Ne párolja szárazra, illetve majdnem teljesen szárazra! Víz vagy más megfelelő redukálószer hozzáadásával mérsékelhető a peroxidképződés. Ne igya meg az anyagot! Ne lélegezze be a gőzt! Kerülje a hosszan tartó vagy ismételt bőrkontaktust!

4.4.

n-heptán, kromatográfia céljára alkalmas, vagy izo-oktán. FIGYELEM! Tűzveszélyes anyag! Belégzése káros. A vizsgálathoz távolítson el minden gyújtóforrást (hőforrás, szikra, nyílt láng)! Győződjön meg róla, hogy az üvegek mindig jól le legyenek zárva! Használat során gondoskodjon megfelelő szellőzésről! Ne lélegezze be a gőzt! Kerülje a hosszan tartó vagy ismételt bőrkontaktust!

4.5.	Lauril-arachidát 0,05 % (m/v) standard oldata (3. megjegyzés) heptánban (belső standard viaszhoz). 3. megjegyzés:  Palmitil-palmitát, mirisztil-sztearát és arachidil-laureát egyaránt használható.

4.6.	Metil-heptadekanoát 0,02 % (m/v) standard oldata heptánban (belső standard metil- és etilészterekhez).

4.7.	Szudán 1 (1-fenilazo-2-naftol).

4.8.

Vivőgáz: hidrogén vagy hélium, gázkromatográfia céljára alkalmas tisztaságban. FIGYELMEZTETÉS Hidrogén. Nyomás alatt kiemelten tűzveszélyes. A vizsgálathoz távolítson el minden gyújtóforrást (hőforrás, szikra, nyílt láng) és a nem éghetetlen anyagokból készült elektromos készülékeket! Győződjön meg róla, hogy a használaton kívüli palack szelepe zárva legyen! Mindig használjon nyomáscsökkentőt! Mielőtt kinyitná a szelepet, csökkentse a nyomáscsökkentő rugójának feszességét! A szelep nyitásakor ne álljon a kieresztőnyílás elé! Használat során gondoskodjon megfelelő szellőzésről! Ne vezessen hidrogént egyik palackból a másikba! Ne keverje a palackban lévő gázt! Gondoskodjon róla, hogy a palack ne borulhasson fel! Ne tegye ki a palackot napfénynek vagy egyéb hőforrásnak! Tartsa a palackot rozsdamentes környezetben! Ne használjon sérült vagy címke nélküli palackot! Hélium. Nagy nyomáson sűrített gáz. Csökkenti a belélegezhető oxigén koncentrációját. Tartsa zárva a palackot! Használat során gondoskodjon megfelelő szellőzésről! Nem megfelelő szellőzés esetén ne menjen a tárolótérbe! Mindig használjon nyomáscsökkentőt! Mielőtt kinyitná a szelepet, csökkentse a nyomáscsökkentő rugójának feszességét! Ne vezessen gázt egyik palackból a másikba! Gondoskodjon róla, hogy a palack ne borulhasson fel! A szelep nyitásakor ne álljon a kieresztőnyílás elé! Ne tegye ki a palackot napfénynek vagy egyéb hőforrásnak! Tartsa a palackot rozsdamentes környezetben! Ne használjon sérült vagy címke nélküli palackot! Ne lélegezze be a gázt! Kizárólag ipari céllal használható fel.

4.9.

Segédgázok: — Hidrogén, gázkromatográfia céljára alkalmas tisztaságban. — Levegő, gázkromatográfia céljára alkalmas tisztaságban. FIGYELMEZTETÉS Levegő. Nagy nyomáson sűrített gáz. Éghető anyagok jelenlétében óvatosan kezelendő, mivel nagy nyomáson a levegőben található legtöbb szerves vegyület öngyulladási hőmérséklete jelentősen csökken. Győződjön meg róla, hogy a használaton kívüli palack szelepe zárva legyen! Mindig használjon nyomáscsökkentőt! Mielőtt kinyitná a szelepet, csökkentse a nyomáscsökkentő rugójának feszességét! A szelep nyitásakor ne álljon a kieresztőnyílás elé! Ne vezessen gázt egyik palackból a másikba! Ne keverje a palackban lévő gázt! Gondoskodjon róla, hogy a palack ne borulhasson fel! Ne tegye ki a palackot napfénynek vagy egyéb hőforrásnak! Tartsa a palackot rozsdamentes környezetben! Ne használjon sérült vagy címke nélküli palackot! Az ipari felhasználásra szánt levegőt nem szabad belélegezni és lélegeztető berendezésekben alkalmazni.

5.   ELJÁRÁS

5.1.    A kromatográfiás oszlop előkészítése

Készítsen szuszpenziót 15 g szilikagélből (4.1. pont) és n-hexánból (4.2. pont), és töltse az oszlopba (3.2. pont). Hagyja magától leülepedni. Teljes ülepedés után elektromos rázóberendezéssel tömörítse, hogy homogénebb kromatográfiás réteget kapjon. Az esetleges szennyeződések eltávolítása érdekében 30 ml n-hexánnal mossa át az oszlopot. Az analitikai mérleg (3.8. pont) segítségével mérjen pontosan 500 mg mintát a 25 ml térfogatú lombikba (3.1. pont), majd a feltételezett viasztartalom függvényében adjon hozzá megfelelő mennyiségű belső standardot (4.5. pont), azaz adjon hozzá olívaolaj esetén 0,1 mg, olívapogácsa-olaj esetén 0,25–0,5 mg lauril-arachidátot, az olívaolajokhoz pedig 0,05 mg metil-heptadekanoátot (4.6. pont).

Az ily módon előkészített mintát 2 x 2 ml n-hexán (4.2. pont) segítségével vigye fel a kromatográfiás oszlopra.

Hagyja lefutni az oldatot 1 mm-rel az abszorbens felszíne fölé. Ismét mossa át az oszlopot 99:1 arányú n-hexán/etil-éter eleggyel, és gyűjtsön össze 220 ml-t úgy, hogy 10 másodpercenként megközelítőleg 15 csepp folyjon át. (Az így kapott frakció tartalmazza a metil- és etilésztereket és viaszokat.) (4. megjegyzés) (5. megjegyzés).

Az így kapott frakciókat a rotációs bepárlóban párolja szárazra, amíg az oldószer majdnem teljesen eltűnik belőle. Az oldószer utolsó 2 ml-ét gyenge nitrogénárammal távolítsa el. Gyűjtse össze a metil- és etilésztereket tartalmazó frakciót 2–4 ml n-heptánnal vagy izo-oktánnal hígítva.

5.2.    Gázkromatográfiás elemzés

5.2.1.    Előzetes műveletek

Az oszlopot illessze be a gázkromatográfba (3.3. pont) úgy, hogy az oszlop bemenetét az oszlopra szerelt („on-column”) rendszerhez, az oszlop kimenetét pedig a detektorhoz csatlakoztatja. Ellenőrizze a gázkromatográfiás berendezést (gázszerelvények szorossága, a detektor hatékonysága, a regisztráló rendszer hatékonysága stb.).

Az első alkalommal használt kapillárisoszlopokat ajánlatos kondicionálni. Fúvasson át egy kevés gázt az oszlopon, majd kapcsolja be a gázkromatográfiás berendezést. Melegítse fokozatosan addig, amíg körülbelül 4 óra elteltével el nem éri a 350 °C hőmérsékletet.

Ezt a hőmérsékletet tartsa legalább két órán keresztül, majd hozza a berendezést üzemi körülmények közé (gázáram szabályozása, bontóláng begyújtása, csatlakoztatás az elektronikus regisztráló berendezéshez [3.3.4 pont], az oszlophőmérséklet szabályozása a kemencén, a detektor szabályozása stb.). Rögzítse a jelet az elemzés elvégzéséhez szükségesnél legalább kétszer nagyobb érzékenység mellett. Az alapvonalnak lineárisnak, mindennemű csúcstól és drifttől mentesnek kell lennie.

A negatív egyenes vonalú drift az oszlop illesztékeinek tökéletlenségét, míg a pozitív drift az oszlop nem megfelelő kondicionálását jelzi.

5.2.2.    Az üzemi körülmények megválasztása a viaszok, valamint a metil- és etilészterek esetében (6. megjegyzés)

Az üzemi körülmények általában az alábbiak:

—	Oszlophőmérséklet : 20 °C/perc 5 °C/perc kiindulási hőmérséklet 80 °C (1′) 140 °C 335 °C (20)

—	Detektor hőmérséklete : 350 °C.

—	Befecskendezett anyag mennyisége : 1 μl n-heptán-oldat (2–4 ml).

—	Vivőgáz : hélium vagy hidrogén, a kiválasztott gáz számára optimális lineáris sebességgel (lásd az A. függeléket).

—	Berendezés érzékenysége : a fenti körülményeknek megfelelően.

A fenti feltételek az oszlop és a gázkromatográf jellemzőinek megfelelően módosíthatók, hogy a kapott kromatogramok lehetővé tegyék valamennyi viasz, illetve zsírsav-metilészter és zsírsav-etilészter leválasztását, valamint hogy a csúcsok kielégítően elkülöníthetőek legyenek (lásd a 2., 3. és 4. ábrát), miközben a lauril-arachidát belső standard retenciós ideje 18 ± 3 perc. A viaszok legreprezentatívabb csúcsának a teljes skálaérték 60 %-ánál nagyobbnak kell lennie, míg a metil- és etilészterek esetében a metil-heptadekanoát belső standardnak el kell érnie a teljes skálaértéket.

A csúcsok integrálási paramétereit úgy kell meghatározni, hogy lehetővé váljon az érintett csúcsok alatti területek pontos becslése.

5.3.    Az elemzés menete

A 10 μl térfogatú mikrofecskendő segítségével szívjon fel 10 μl oldatot, majd a mikrofecskendő dugattyúját felfelé mozgatva ürítse ki a tűt. A tűt vezesse be a befecskendező rendszerbe, majd egy-két másodperc elmúltával gyorsan fecskendezze be az oldatot. Körülbelül öt másodperc elteltével finoman húzza ki a tűt.

Addig folytassa a rögzítést, ameddig a viaszok vagy sztigmasztadiének teljesen eluálódtak, attól függően, hogy melyik frakció analízisét végzi.

Az alapvonalnak minden esetben meg kell felelnie az előírt feltételeknek.

5.4.    A csúcsok azonosítása

Az egyes csúcsok azonosítását a retenciós idő alapján, az azonos körülmények között analizált, ismert retenciós idejű viaszkeverékekkel összehasonlítva kell végezni. Az alkilészterek azonosítása az olívaolajokban található főbb zsírsavak (palmitinsav és olajsav) metil- és etilésztereinek keverékei alapján történik.

Az 1. ábrán egy szűz olívaolaj viaszkromatogramja látható. A 2. és a 3. ábrán két, kiskereskedelmi forgalomban kapható extra szűz olívaolaj kromatogramja látható, metil- és etilészterekkel, illetve azok nélkül. A 4. ábra egy csúcsminőségű extra szűz olívaolaj és egy 20 %-ban szagtalanított olajjal kevert ugyanilyen olaj kromatogramját mutatja.

5.5.    A viasztartalom mennyiségi értékelése

Az integráló berendezés segítségével határozza meg a lauril-arachidát belső standardnak és a nyílt szénláncú C40–C46-os észtereknek megfelelő csúcsok alatti területet.

A teljes viasztartalom mg/kg zsír alakban történő meghatározásához adja össze az egyes viaszok mennyiségét, az alábbiak szerint:

ahol

Ax

=

az egyes észterek csúcsa alatti terület, a számítógép által használt mértékegységben

As

=

a lauril-arachidát belső standard csúcsa alatti terület, a számítógép által használt mértékegységben

ms

=

a hozzáadott lauril-arachidát belső standard tömege milligrammban

m

=

a meghatározni kívánt minta tömege grammban.

5.5.1.    A metil- és etilészterek mennyiségi értékelése

Az integráló berendezés segítségével határozza meg a metil-heptadekanoát belső standardnak, a C16-os és a C18-os zsírsavak metilésztereinek és etilésztereinek megfelelő csúcsok alatti területet.

Határozza meg az egyes alkilészterek mennyiségét mg/kg zsír alakban, az alábbiak szerint:

ahol

Ax

=

az egyes C16-os és C18-as észterek csúcsa alatti terület, a számítógép által használt mértékegységben

As

=

a metil-heptadekanoát belső standard csúcsa alatti terület, a számítógép által használt mértékegységben

ms

=

a hozzáadott metil-heptadekanoát belső standard tömege milligrammban

m

=

a meghatározni kívánt minta tömege grammban.

6.   AZ EREDMÉNYEK KIFEJEZÉSE

A különböző C40–C46-os viasztartalmak összegét (7. megjegyzés) mg/kg zsír alakban tüntesse fel.

Tüntesse fel a teljes C16–C18-as metilészter- és etilészter-tartalmat, valamint a kettő összegét.

Az eredményeket a közelebbi mg/kg értékre kell kerekíteni.

Tüntesse fel a jelen lévő etil- és metilészterek arányát.

1.    ábra

Gázkromatogram-minta egy olívaolaj viaszfrakciójáról ( 8 )

Jelmagyarázat:

Az 5–8 perc retenciós idejű zsírsav-metilészterek és zsírsav-etilészterek csúcsai

I.S.

=

lauril-arachidát

1

=

diterpén észterek

2+2′

=

C40-es észterek

3+3′

=

C42-es észterek

4+4′

=

C44-es észterek

5

=

C46-os észterek

6

=

szterinészterek és triterpén alkoholok

2.    ábra

Egy szűz olívaolajban található metilészterek, etilészterek és viaszok

Jelmagyarázat:

1

–

metil C16

2

–

etil C16

3

–

metil-heptadekanoát

4

–

metil C18

5

–

etil C18

6

–

szkvalén

7

–

lauril-arachidát I.S.

A

–

diterpén észterek

B

–

viaszok

C

–

szterinészterek és triterpén észterek

3.    ábra

Egy extra szűz olívaolajban található metilészterek, etilészterek és viaszok

Jelmagyarázat:

1

–

metil-heptadekanoát

2

–

metil C18

3

–

etil C18

4

–

szkvalén

5

–

lauril-arachidát I.S.

A

–

diterpén észterek

B

–

viaszok

C

–

szterinészterek és triterpén észterek

4.    ábra

Egy extra szűz olívaolaj és egy szagtalanított olajjal kevert ugyanilyen olaj kromatogramjának részlete

Jelmagyarázat:

1

–

metil-mirisztát I.S.

2

–

metil-palmitát

3

–

etil-palmitát

4

–

metil-heptadekanoát I.S.

5

–

metil-linoleát

6

–

metil-oleát

7

–

metil-sztearát

8

–

etil-linoleát

9

–

etil-oleát

10

–

etil-sztearát

---

A. függelék

A gáz lineáris sebességének meghatározása

Fecskendezzen 1–3 μl metánt (vagy propánt) a normál üzemi körülményekre beállított gázkromatográfiás berendezésbe. Mérje meg a gáz oszlopon történő átáramlásának idejét a befecskendezés pillanatától a csúcs kiemelkedésének pillanatáig (tM).

A lineáris sebességet (cm/mp) az L/tM képlettel kell meghatározni, ahol L az oszlop cm-ben megadott hosszúsága, tM pedig a másodpercben mért idő.

---

( 1 ) HL L 353., 1990.12.17., 23. o.

( 2 ) HL 172., 1966.9.30., 3025/66. o.

( 3 ) HL L 166., 1988.7.1., 10. o.

( 4 ) HL L 128., 1977.5.24., 6. o.

( 5 ) A szterinészterek eluálódása után a kromatográfiás vonalon nem mutatkozhatnak jelentős csúcsok (trigliceridek).

( 6 ) A kóstolónak nem kell megkóstolnia az olajat, ha azt közvetlenül megszagolva valamely negatív tulajdonságot különösen intenzíven érzékel. Ilyen esetben e kivételes körülményt feljegyzi az értékelő lapra.

( 7 ) In these cases in particular, a 95/5 by volume benzene/acetone eluent mixture must be used to obtain distinct band separation.

( 8 ) A szterinészterek eluálódása után a kromatográfiás vonalon nem mutatkozhatnak jelentős csúcsok (triacilglicerinek).