02009R0152 — HR — 16.11.2020 — 007.001

---

Ovaj je tekst namijenjen isključivo dokumentiranju i nema pravni učinak. Institucije Unije nisu odgovorne za njegov sadržaj. Vjerodostojne inačice relevantnih akata, uključujući njihove preambule, one su koje su objavljene u Službenom listu Europske unije i dostupne u EUR-Lexu. Tim službenim tekstovima može se izravno pristupiti putem poveznica sadržanih u ovom dokumentu.

►B	UREDBA KOMISIJE (EZ) br. 152/2009 od 27. siječnja 2009. o utvrđivanju metoda uzorkovanja i analize za službenu kontrolu hrane za životinje (Tekst značajan za EGP) ( L 054 26.2.2009, 1)

Koju je izmijenila:

		br.	stranica	datum
M1	UREDBA KOMISIJE (EU) br. 278/2012 od 28. ožujka 2012.	L 91	8	29.3.2012
►M2	UREDBA KOMISIJE (EU) br. 51/2013 od 16. siječnja 2013.	L 20	33	23.1.2013
►M3	UREDBA KOMISIJE (EU) br. 691/2013 оd 19. srpnja 2013.	L 197	1	20.7.2013
M4	UREDBA KOMISIJE (EU) br. 709/2014 оd 20. lipnja 2014.	L 188	1	27.6.2014
M5	UREDBA KOMISIJE (EU) 2017/645 оd 5. travnja 2017.	L 92	35	6.4.2017
►M6	UREDBA KOMISIJE (EU) 2017/771 оd 3. svibnja 2017.	L 115	22	4.5.2017
►M7	PROVEDBENA UREDBA KOMISIJE (EU) 2020/1560 оd 26. listopada 2020.	L 357	17	27.10.2020

---

▼B

UREDBA KOMISIJE (EZ) br. 152/2009

od 27. siječnja 2009.

o utvrđivanju metoda uzorkovanja i analize za službenu kontrolu hrane za životinje

(Tekst značajan za EGP)

▼M3

Članak 1.

Uzorkovanje za službenu kontrolu hrane za životinje, posebno u vezi s određivanjem sastojaka, uključujući materijal koji sadržava genetski modificirane organizme (GMO) ili se od njih sastoji ili proizvodi, dodataka u hrani za životinje kako su utvrđeni Uredbom (EZ) br. 1831/2003 Europskog parlamenta i Vijeća ( 1 ), nepoželjnih tvari kako su definirane Direktivom 2002/32/EZ Europskog parlamenta i Vijeća ( 2 ), provodi se u skladu s metodama iz Priloga I.)

Metoda uzorkovanja iz Priloga I. primjenjuje se za kontrolu hrane za životinje u vezi s određivanjem ostataka pesticida kako su utvrđeni Uredbom (EZ) br. 396/2005 Europskog parlamenta i Vijeća ( 3 ). i kontrolu sukladnosti s Uredbom (EU) br. 619/2011.

▼B

Članak 2.

Priprema uzoraka za analizu i prikazivanje rezultata izvode se u skladu s metodama iz Priloga II.

Članak 3.

Analiza za službenu kontrolu hrane za životinje izvodi se pomoću metoda iz Priloga III. (Analitičke metode za kontrolu sastava hrane za životinje i krmnih smjesa), Priloga IV. (Analitičke metode za kontrolu količine dopuštenih krmnih dodataka), Priloga V. (Analitičke metode za kontrolu nepoželjnih tvari u hrani za životinje) i Priloga VI. (Analitičke metode za određivanje sastojaka životinjskog podrijetla u okviru službene kontrole hrane za životinje).

Članak 4.

Energetska vrijednost krmnih smjesa za perad izračunava se u skladu s Prilogom VII.

Članak 5.

U svrhu potvrđivanja koriste se metode analize za kontrolu nedopuštenih krmnih dodataka iz Priloga VIII.

Članak 6.

Direktive 71/250/EEZ, 71/393/EEZ, 72/199/EEZ, 73/46/EEZ, 76/371/EEZ, 76/372/EEZ, 78/633/EEZ, 81/715/EEZ, 84/425/EEZ, 86/174/EEZ, 93/70/EEZ, 93/117/EZ, 98/64/EZ, 1999/27/EZ, 1999/76/EZ, 2000/45/EZ, 2002/70/EZ i 2003/126/EZ stavljaju se izvan snage.

Upućivanja na Direktive stavljene izvan snage smatraju se upućivanjima na ovu Uredbu i tumače u skladu s korelacijskim tablicama iz Priloga IX.

Članak 7.

Ova Uredba stupa na snagu dvadesetog dana od dana objave u Službenom listu Europske unije.

Ona se primjenjuje od 26. kolovoza 2009.

Ova je Uredba u cijelosti obvezujuća i izravno se primjenjuje u svim državama članicama.

▼M3

---

PRILOG I.

METODE UZORKOVANJA

1.   SVRHA I PODRUČJE PRIMJENE

Uzorci za službenu kontrolu hrane za životinje uzimaju se u skladu s metodama opisanima u nastavku. Tako dobiveni uzorci smatraju se reprezentativnima za uzorkovane dijelove.

Svrha reprezentativnog uzorkovanja dobivanje je manje količine iz serije na način da određivanje bilo koje posebne osobine te količine predstavlja srednju vrijednost osobine serije. Serija se uzorkuje ponovljenim uzimanjem pojedinačnih uzoraka pri različitim jedinstvenim položajima u seriji. Ti pojedinačni uzorci kombiniraju se miješanjem kako bi se stvorio skupni uzorak iz kojeg se reprezentativnim dijeljenjem pripremaju reprezentativni konačni uzorci.

Ako se vizualnom inspekcijom utvrdi razlika u kvaliteti dijelova hrane za životinje namijenjene uzorkovanju u odnosu na preostali dio iste serije, takvi dijelovi razdvajaju se od ostatka hrane za životinje te se s njima postupa kao s odvojenom podserijom. Ako nije moguće razdijeliti hranu za životinje u odvojene podserije, hrana za životinje uzorkuje se kao jedna serija. Tada se to navodi u izvješću o uzorkovanju.

Ako se utvrdi da hrana za životinje, uzorkovana u skladu s odredbama ove Uredbe ne ispunjava uvjete EU-a i dio je jedne serije istovrsnog razreda ili opisa, smatra se da sva hrana za životinje iz te serije također ne ispunjava zahtjeve EU-a, osim ako se detaljnom analizom utvrdi da nema dokaza da ostatak serije ne ispunjava zahtjeve sigurnosti EU-a.

2.   DEFINICIJE POJMOVA

—

Serija : identificirana količina hrane za životinje za koju je utvrđeno da posjeduje zajedničke osobine kao što je podrijetlo, sorta, način pakiranja, poduzeće koje pakira proizvode, pošiljatelj ili označivanje, a u slučaju proizvodnog postupka, proizvodna jedinica iz jedinstvenog postrojenja koja se koristi jedinstvenim proizvodnim parametrima ili nekoliko takvih jedinica pri neprekinutoj proizvodnji i skupnom skladištenju.

—	Uzorkovani dio : serija ili identificirani dio serije ili podserije.

—	Zapečaćeni uzorak : uzorak zapečaćen na način da uzorku nije moguće pristupiti bez lomljenja ili uklanjanja pečata.

—	Pojedinačni uzorak : količina koja se uzima iz jedne točke uzorka.

—	Skupni uzorak : skup pojedinačnih uzoraka uzetih iz istog uzorkovanog dijela.

—	Reducirani uzorak : dio skupnog uzorka dobiven postupkom reprezentativnog smanjivanja skupnog uzorka.

—	Konačni uzorak : dio reduciranog uzorka ili homogeniziranog skupnog uzorka.

—	Laboratorijski uzorak : uzorak namijenjen za laboratorij (zaprimljen u laboratorij) koji može biti konačan, smanjeni ili skupni uzorak.

3.   OPĆE ODREDBE

4.   OPREMA

4.1	Oprema za uzorkovanje mora biti izrađena od materijala koji ne mogu kontaminirati proizvode namijenjene uzorkovanju. Oprema namijenjena višestrukoj uporabi mora biti jednostavna za čišćenje kako bi se izbjegla križna kontaminacija.

4.2

Preporučena oprema za uzorkovanje krute hrane za životinje. 4.2.1    Ručno uzorkovanje 4.2.1.1   Lopatica s ravnim dnom i okomitim stranicama. 4.2.1.2 Sonda za uzorkovanje s dugim procjepom ili pregradama. Dimenzije sonde za uzorkovanje moraju odgovarati osobinama uzorka (dubina posude, veličina vreće itd.) i veličini čestica hrane za životinje. Ako sonda za uzorkovanje ima nekoliko otvora, oni se odvajaju pregradama ili raspoređenim otvorima kako bi se osiguralo da se uzorak uzima na različitim mjestima uzduž sonde. 4.2.2    Mehaničko uzorkovanje Za uzorkovanje hrane za životinje koja se kreće može se koristiti odgovarajuća mehanička oprema. Odgovarajuća mehanička oprema znači da se uzorkuje najmanje čitav dio protoka. Uzorkovanje hrane za životinje u pokretu (pri velikim brzinama protoka) može se provesti automatskim uzorkivačima. 4.2.3    Razdjelnik Ako je moguće i prikladno, oprema namijenjena za razdvajanje uzorka na približno jednake dijelove treba se koristiti za pripremu reduciranih uzoraka na reprezentativan način.

5.   KOLIČINSKI ZAHTJEVI U VEZI S BROJEM POJEDINAČNIH UZORAKA

5.1    Količinski zahtjevi u vezi s pojedinačnim uzorcima pri kontroli tvari ili proizvoda ravnomjerno raspodijeljenih u hrani za životinje

5.1.1    Kruta hrana za životinje u rasutom stanju

5.1.2    Tekuća hrana za životinje u rasutom stanju

5.1.3    Pakirana hrana za životinje

Hrana za životinje (u krutom ili tekućem stanju) može se pakirati u vreće, limenke, bačve itd. koje su u tablici označene kao jedinice. Velike jedinice (≥ 500 kg ili litara) moraju se uzorkovati u skladu s odredbama predviđenima za hranu za životinje u rasutom stanju (više o tome u točkama 5.1.1. i 5.1.2.).

5.1.4    Krmni blokovi ili kameni za lizanje

Najmanje 1 blok ili kamen za lizanje za uzorkovanje po uzorkovanom dijelu od 25 jedinica, do najviše 4 bloka ili kamena za lizanje.

Za četiri bloka ili kamena za lizanje kojima pojedinačna težina nije veća od 1 kg, pojedinačni uzorak sadržaj je jednog bloka ili jednog kamena za lizanje.

5.1.5    Vlaknasta krma/krmivo

5.2    Količinski zahtjevi u vezi s pojedinačnim uzorcima pri kontroli tvari ili proizvoda ravnomjerno raspodijeljenih u hrani za životinje

Ti količinski zahtjevi u pogledu pojedinačnih uzoraka koriste se u sljedećim situacijama:

Ako kontrolno tijelo utemeljeno sumnja u postojanje takve neujednačene distribucije i u slučaju križne kontaminacije sastojkom ili tvari u krmnoj smjesi, primjenjuju se količinski zahtjevi navedeni u tablici u nastavku.

5.3    Količinski zahtjevi u vezi s pojedinačnim uzorcima kod vrlo velikih serija

U slučaju velikih uzorkovanih dijelova (uzorkovani dijelovi > 500 tona), broj pojedinačnih uzoraka namijenjenih uzorkovanju = 40 pojedinačnih uzoraka + kvadratni korijen iz količine tona pri kontroli tvari ili proizvoda ravnomjerno raspoređenih u cijelom uzorku ili 100 pojedinačnih uzoraka + kvadratni korijen iz količine tona pri kontroli sastojaka ili tvari vjerojatno neravnomjerno raspoređenih u hrani za životinje.

6.   KOLIČINSKI ZAHTJEVI U VEZI SA SKUPNIM UZORKOM

7.   KOLIČINSKI ZAHTJEVI U VEZI S KONAČNIM UZORCIMA

Konačni uzorci

Potrebna je analiza najmanje jednog konačnog uzorka. Količina konačnog uzorka za analizu ne smije biti manja od:

8.   METODE UZORKOVANJA ZA VRLO VELIKE SERIJE ILI SERIJE KOJE SE SKLADIŠTE ILI PREVOZE NA NAČIN DA UZORKOVANJE U ČITAVOJ SERIJI NIJE MOGUĆE

8.1    Opća načela

Ako način prijevoza ili skladištenja serije onemogućuje uzimanje pojedinačnih uzoraka u čitavoj seriji, uzorkovanje takvih serija treba se provoditi kada je serija u protoku.

Kod velikih skladišta namijenjenih skladištenju hrane za životinje, nositelje djelatnosti treba se poticati da ugrade opremu u skladištu koja omogućuje (automatsko) uzorkovanje u čitavoj skladištenoj seriji.

Kod primjene postupaka uzorkovanja predviđenih u poglavlju 8. nositelj djelatnosti u poslovanju s hranom za životinje ili njihov predstavnik obavještava se o postupku uzorkovanja. Ako nositelj djelatnosti u poslovanju s hranom za životinje ili njegov predstavnik dovede u pitanje taj postupak uzorkovanja, nositelj djelatnosti u poslovanju s hranom za životinje ili njegov predstavnik omogućuje nadležnom tijelu uzrokovanje u čitavoj seriji na vlastiti trošak.

8.2    Velike serije koje se prevoze brodom

8.2.1    Dinamičko uzorkovanje velikih serija koje se prevoze brodom

Uzorkovanje velikih serija u brodovima provodi se po mogućnosti dok je proizvod u protoku (dinamičko uzorkovanje).

Uzorkovanje se vrši po brodskom skladištu (subjekt koji se može fizički odvojiti). Međutim, brodska skladišta djelomično se prazne jedno za drugim tako da početno fizičko odvajanje više ne postoji nakon prijenosa u skladišnim objektima. Uzorkovanje se stoga može provesti u funkciji početnog fizičkog razdvajanja ili u funkciji razdvajanja nakon prijenosa u skladišne objekte.

Istovar broda može trajati nekoliko dana. Obično se uzorkovanje mora provesti u redovnim intervalima tijekom trajanja istovara. Međutim, nije uvijek moguće ili prikladno da službeni inspektor bude prisutan na uzorkovanju tijekom čitavog trajanja istovara. Stoga je dopušteno provesti uzorkovanje za dio (uzorkovani dio) čitave serije. Broj pojedinačnih uzoraka određuje se uzimanjem u obzir uzorkovanog dijela.

Ako se uzorkuje dio serije hrane za životinje istovrsnog razreda ili opisa i utvrdi se da taj dio serije ne odgovara zahtjevima EU-a, smatra se da sva hrana za životinje iz te serije također ne ispunjava zahtjeve EU-a, osim ako se detaljnom analizom utvrdi da nema dokaza da ostatak serije ne ispunjava zahtjeve EU-a.

Prisutnost inspektora potrebna je čak i kada je službeni uzorak uzet automatski. Međutim, ako se automatsko uzorkovanje provodi s unaprijed zadanim parametrima koji se ne mogu mijenjati tijekom uzorkovanja, a pojedinačni uzorci se skupljaju u zapečaćeni prijamni spremnik čime se sprječava svaka moguća prijevara, tada je prisutnost inspektora potrebna samo na početku uzorkovanja, pri svakoj promjeni prijamnog spremnika za uzorak i na kraju uzorkovanja.

8.2.2    Statičko uzorkovanje serija koje se prevoze brodom

Ako se uzorkovanje provodi statičkim uzorkovanjem, primjenjuje se istovjetni postupak koji je predviđen za skladišne objekte (silose) kojima se pristupa s gornje strane (vidjeti točku 8.4.1.).

Uzorkovanje se mora provesti na pristupačnom dijelu (odozgo) serije/brodskog skladišta. Broj pojedinačnih uzoraka određuje se vodeći računa o veličini uzorkovanog dijela. Ako se uzorkuje dio serije hrane za životinje istovrsnog razreda ili opisa i utvrdi se da taj dio serije ne ispunjava zahtjeve EU-a, smatra se da sva hrana za životinje iz te serije ne ispunjava zahtjeve EU-a, osim ako se detaljnom analizom utvrdi da nema dokaza da ostatak serije ne ispunjava zahtjeve EU-a.

8.3    Uzorkovanje velikih serija koje se skladište u skladištima

Uzorkovanje se mora provesti na pristupačnom dijelu serije. Broj pojedinačnih uzoraka određuje se uzimajući u obzir veličinu uzorkovanog dijela. Ako se uzorkuje dio serije hrane za životinje istovrsnog razreda ili opisa i utvrdi se da taj dio serije ne odgovara zahtjevima EU-a, smatra se da sva hrana za životinje iz te serije također ne ispunjava zahtjeve EU-a, osim ako se detaljnom analizom utvrdi da nema dokaza da ostatak serije ne ispunjava zahtjeve EU-a.

8.4    Uzorkovanje skladišnih objekata (silosa)

8.4.1    Uzorkovanje silosa kojima se (jednostavno) pristupa odozgo

Uzorkovanje se mora provesti na pristupačnom dijelu serije. Broj pojedinačnih uzoraka određuje se vodeći računa o veličini uzorkovanog dijela. Ako se uzorkuje dio serije hrane za životinje istovrsnog razreda ili opisa i utvrdi se da taj dio serije ne odgovara zahtjevima EU-a, smatra se da sva hrana za životinje iz te serije također ne ispunjava zahtjeve EU-a, osim ako se detaljnom analizom utvrdi da nema dokaza da ostatak serije ne ispunjava zahtjeve EU-a.

8.4.2    Uzorkovanje silosa kojima se ne pristupa odozgo (zatvoreni silosi)

8.4.2.1    Silosi kojima se ne pristupa odozgo (zatvoreni silos) veličine > 100 tona

Hrana za životinje u tim silosima ne može se uzorkovati na statički način. Prema tome, ako se hrana za životinje u silosu mora uzorkovati i ne postoji mogućnost premještanja pošiljke, potrebno je s nositeljem djelatnosti sklopiti dogovor prema kojem je on ili ona dužan obavijestiti inspektora o tome kada će se silos istovariti kako bi se omogućilo uzorkovanje u trenutku kada je hrana za životinje u protoku.

8.4.2.2    Silos kojemu se ne pristupa odozgo (zatvoreni silos) veličine < 100 tona

Postupak uzorkovanja uključuje ispuštanje u prijamni spremnik količine od 50 do 100 kg i uzimanje uzorka iz njega. Veličina skupnog uzorka odgovara čitavoj seriji, a broj pojedinačnih uzoraka odnosi se na količinu iz silosa puštenu u prijamni spremnik za uzorkovanje. Ako se uzorkuje dio serije hrane za životinje istovrsnog razreda ili opisa i utvrdi se da taj dio serije ne odgovara zahtjevima EU-a, smatra se da sva hrana za životinje iz te serije također ne ispunjava zahtjeve EU-a, osim ako se detaljnom analizom utvrdi da nema dokaza da ostatak serije ne ispunjava zahtjeve EU-a.

8.5    Uzorkovanje hrane za životinje u rasutom stanju u zatvorenim posudama

Takve serije često se mogu uzorkovati samo nakon istovara. U određenim slučajevima nije moguće obaviti istovar na mjestu utovara ili kontrole stoga se uzorkovanje obavlja pri istovaru tih posuda.

9.   UPUTE ZA UZIMANJE, PRIPREMANJE I PAKIRANJE UZORAKA

9.1    Općenito

Uzorci se moraju uzimati i pripremiti bez nepotrebnog odlaganja uz pridržavanje mjera opreza kojima se sprečava promjena sastava ili kontaminacija proizvoda. Instrumenti, radne površine i posude za prihvat uzoraka moraju biti čisti i suhi.

9.2    Pojedinačni uzorci

Pojedinačni uzorci moraju se uzeti nasumično iz cijeloga uzorka i moraju biti približno jednake veličine.

Veličina pojedinačnog uzorka iznosi najmanje 100 grama ili 25 grama za vlaknastu krmu ili krmivo niske specifične težine.

Ako se u skladu s pravilima postupka uzorkovanja utvrđenima u točki 8. mora uzeti manje od 40 pojedinačnih uzoraka, veličina pojedinačnih uzoraka određuje se u funkciji potrebne veličine skupnog uzorka koji se mora postići (vidjeti točku 6).

U slučaju uzorkovanja malih serija pakirane hrane za životinje gdje je prema količinskim zahtjevima potrebno uzeti ograničen broj pojedinačnih uzoraka, pojedinačni uzorak je sadržaj jedne izvorne jedinice čiji sadržaj ne prelazi 1 kg ili jednu litru.

U slučaju uzorkovanja pakirane hrane za životinje sastavljene od malih jedinica (npr. < 250 g), veličina pojedinačnog uzorka ovisi o veličini jedinice.

9.2.1    Hrana za životinje u rasutom stanju

Prema potrebi uzorkovanje se može izvesti pri premještanju uzorka (pri utovaru ili istovaru).

9.2.2    Pakirana hrana za životinje

Nakon odabira potrebnog broja jedinica za uzorkovanje u skladu s poglavljem 5., sondom ili lopaticom uzima se dio sadržaja svake jedinice. Prema potrebi, uzorci se mogu uzeti nakon odvojenog pražnjenja jedinica.

9.2.3    Homogenizirana ili za homogeniziranje primjerena tekuća ili polutekuća hrana za životinje

Nakon odabira potrebnog broja jedinica za uzorkovanje iz poglavlja 5., njihov se udio prema potrebi homogenizira i iz svake se jedinice uzima određena količina.

Pojedinačni se uzorci mogu uzimati pri pražnjenju sadržaja spremnika.

9.2.4    Tekuća ili polutekuća hrana za životinje koja nije prikladna za homogeniziranje

Nakon odabira traženog broja jedinica za uzorkovanje iz poglavlja 5., uzorci se uzimaju s različitih razina.

Uzorci se mogu uzeti i za vrijeme pražnjenja udjela, ali se prva količina mora odbaciti.

U oba slučaja ukupni obujam ne smije biti manji od 10 litara.

9.2.5    Krmni blokovi ili kameni za lizanje

Nakon odabira traženog broja blokova ili kamena za lizanje namijenjenih uzorkovanju iz poglavlja 5. može se uzeti dio svakog bloka ili kamena za lizanje. U slučaju sumnje da blok ili kamen za lizanje nije prikladan za homogeniziranje, čitav blok ili kamen za lizanje može se uzeti kao uzorak.

Za četiri bloka ili kamena za lizanje kojima pojedinačna težina nije veća od 1 kg, pojedinačni uzorak je sadržaj jednog bloka ili jednog kamena za lizanje.

9.3    Priprema skupnih uzoraka

Pojedinačni uzorci pomiješaju se tako da tvore skupni uzorak.

9.4    Priprema konačnih uzoraka

Materijal skupnog uzorka mora se pažljivo izmiješati ( 4 ).

9.5    Pakiranje uzoraka

Posude ili pakiranja zapečaćeni su i označeni tako da ih nije moguće otvoriti bez oštećivanja pečata. Cijela etiketa mora biti uključena u pečat.

9.6    Slanje uzoraka u laboratorij

Uzorak se bez nepotrebnog odlaganja šalje u određeni analitički laboratorij, zajedno s podacima potrebnima analitičaru.

10.   PODACI O UZORKOVANJU

O svakom uzorku moraju se voditi evidencije kako bi se svaki uzorkovani dio i njegova veličina mogao nedvojbeno prepoznati.

U evidencijama se također navodi svako odstupanje od postupka uzorkovanja predviđenog ovom Uredbom.

Osim stavljanja evidencija na raspolaganje službenom kontrolnom laboratoriju, evidencije se stavljaju na raspolaganje nositelju djelatnosti u poslovanju s hranom za životinje i/ili laboratoriju koji je odredio nositelj djelatnosti u poslovanju s hranom za životinje.

---

PRILOG II.

OPĆE ODREDBE O ANALITIČKIM METODAMA ZA HRANU ZA ŽIVOTINJE

A.   PRIPREMA UZORAKA ZA ANALIZU

1.    Svrha

U navedenim postupcima opisuje se priprema uzoraka za analizu, koji se šalju nadzornim laboratorijima nakon uzorkovanja provedenog u skladu s odredbama iz Priloga I.

Ti se laboratorijski uzorci moraju pripremiti tako da izvagane količine budu homogene i reprezentativne za konačne uzorke, kako su predviđene za metode analize.

2.    Mjere opreza

Postupak pripremanja uzoraka ovisi o analitičkim metodama koje se koriste te proizvodima i tvarima koji se kontroliraju. Stoga je vrlo važno osigurati da primijenjeni postupak za pripremanje uzorka bude primjeren analitičkoj metodi koja se koristi te proizvodima ili tvarima koji se kontroliraju.

Svi potrebni postupci moraju se provesti na način kojim se u najvećoj mogućoj mjeri sprečava kontaminacija i promjena sastava uzorka.

Mljevenje, miješanje i prosijavanje mora se vršiti bez odlaganja kako bi se uzorak čim manje izlagao zraku i svjetlu. Ne smiju se koristiti mlinovi i drobilice koji bi mogli znatno zagrijati uzorak.

Preporuča se ručno mljevenje hrane za životinje koja je posebno osjetljiva na toplinu. Treba se pobrinuti da sama oprema ne bude izvor kontaminacije.

Ako se priprema ne može obaviti bez znatne promjene udjela vlage u uzorku, određuje se udio vode prije i nakon pripreme, u skladu s metodom utvrđenom u dijelu A Priloga III.

3.    Postupak

3.1    Opći postupci

Testni alikvot uzima se iz konačnog uzorka. Ne preporuča se dijeljenje uzoraka metodom stožaste hrpe i četvrtanja jer se na taj način mogu dobiti testni alikvoti s visokom pogreškom dijeljenja.

3.1.1    Hrana za životinje koja se može samljeti bez dodatne obrade

3.1.2    Hrana za životinje koja se može samljeti nakon sušenja

3.1.3    Tekuća ili polutekuća hrana za životinje

3.1.4    Ostala hrana za životinje

3.2    Posebni postupak pri provjeri vizualnom inspekcijom ili mikroskopijom ili kada je čitav skupni uzorak homogeniziran

4.    Pohranjivanje uzoraka

Uzorci se moraju pohraniti na temperaturi koja neće promijeniti njihov sastav. Uzorci namijenjeni za analizu vitamina ili tvari posebno osjetljivih na svjetlost moraju se pohraniti u uvjetima u kojima uzorak nije pod štetnim utjecajem svijetla.

B.   ODREDBE O REAGENSIMA I OPREMI KOJI SE KORISTE U ANALITIČKIM METODAMA

C.   PRIMJENA ANALITIČKIH METODA I PRIKAZ REZULTATA

1.    Postupak ekstrakcije

U nekoliko metoda utvrđen je poseban postupak ekstrakcije. U pravilu se, osim postupka navedenog u metodi, mogu koristiti i drugi postupci ekstrakcije, pod uvjetom da je učinkovitost korištenog postupka ekstrakcije za analiziranu matricu dokazano jednakovrijedna postupku navedenom u metodi.

2.    Postupak pročišćivanja

U nekoliko metoda utvrđen je poseban postupak pročišćivanja. U pravilu se, osim postupka navedenog u metodi, mogu koristiti i drugi postupci pročišćivanja, pod uvjetom da se korištenim postupkom pročišćivanja za analiziranu matricu dokazano postižu analitički rezultati jednakovrijedni postupku navedenom u metodi.

3.    Broj postupaka određivanja

Kod analize nepoželjnih tvari, ako je rezultat prvog određivanja znatno (> 50 %) niži od specifikacije koja se kontrolira, nisu potrebni dodatni postupci određivanja pod uvjetom da su korišteni primjereni postupci za osiguranje kvalitete. U ostalim slučajevima potrebna je dvostruka analiza (sekundarno određivanje) kako bi se isključila mogućnost unutarnje križne kontaminacije ili slučajne zamjene uzoraka. Za potvrdu sukladnosti koristi se srednja vrijednost dvaju određivanja, uzimajući u obzir nesigurnost mjerenja.

Pri kontroli označenog udjela tvari ili sastojka, ako se rezultatom prvog određivanja potvrdi označeni udio, tj. ako je rezultat analize unutar prihvatljivih granica odstupanja od označenog udjela, nisu potrebni dodatni postupci određivanja pod uvjetom da su korišteni primjereni postupci za osiguranje kvalitete. U ostalim slučajevima potrebna je dvostruka analiza (sekundarno određivanje) kako bi se isključila mogućnost unutarnje križne kontaminacije ili slučajne zamjene uzoraka. Za potvrdu sukladnosti koristi se srednja se vrijednost dvaju određivanja, uzimajući u obzir nesigurnost mjerenja.

U nekim slučajevima ta prihvatljiva granica odstupanja definirana je u zakonodavstvu kao što je Uredba (EZ) br. 767/2009 Europskog parlamenta i Vijeća od 13. srpnja 2009. o stavljanju na tržište i korištenju hrane za životinje, izmjeni Uredbe (EZ) br. 1831/2003 Europskog parlamenta i Vijeća i stavljanju izvan snage Direktive Vijeća 79/373/EEZ, Direktive Komisije 80/511/EEZ, Direktive Vijeća 82/471/EEZ, 83/228/EEZ, 93/74/EEZ, 93/113/EZ i 96/25/EZ te Odluke Komisije 2004/217EZ ( 7 ).

4.    Izvješćivanje o korištenoj analitičkoj metodi

Korištena analitička metoda navodi se u izvješću o analizi.

5.    Izvješćivanje o rezultatima analize

Rezultat analize prikazuje se na način utvrđen analitičkom metodom, s primjerenim brojem značajnih znamenki, a prema potrebi se korigira s obzirom na udio vode u konačnom uzorku prije priprave.

6.    Nesigurnost mjerenja i stupanj iskorištenja pri analizi nepoželjnih tvari

U vezi s nepoželjnim tvarima u smislu Direktive 2002/32/EZ, smatra se da proizvod namijenjen za hranu za životinje nije u skladu s najvećom dopuštenom količinom ako je rezultat analize, u odnosu na hranu za životinje s udjelom vode od 12 %, veći od najveće dopuštene količine, uzimajući u obzir proširenu nesigurnost mjerenja i korekciju za iskorištenje. Za ocjenu usklađenosti koristi se analizirana koncentracija nakon korekcije za iskorištenje i nakon oduzimanja proširene nesigurnosti mjerenja. Taj se postupak primjenjuje samo u slučajevima kada analitička metoda omogućuje procjenu nesigurnosti mjerenja i korekciju za iskorištenje (na primjer, nije moguć u slučaju mikroskopske analize).

Rezultati analize iskazuju se na sljedeći način (ako korištena analitička metoda omogućuje ocjenu nesigurnosti mjerenja i korekciju za iskorištenje):

Međutim, ako je rezultat analize znatno (> 50 %) niži od specifikacije koja se kontrolira i pod uvjetom da su korišteni primjereni postupci za osiguranje kvalitete, a svrha analize je samo provjera usklađenosti sa zakonskim odredbama, rezultat analize može se iskazati bez korekcije za iskorištenje i u tim se slučajevima korekcija za iskorištenje i nesigurnost mjerenja mogu izostaviti.

▼B

---

PRILOG III.

ANALITIČKE METODE ZA KONTROLU SASTAVA SIROVINA ZA HRANU ZA ŽIVOTINJE I KRMNIH SMJESA

A.   ODREĐIVANJE VLAGE

1.    Svrha i područje primjene

Ovom se metodom omogućuje određivanje udjela vlage u hrani za životinje. Kada hrana za životinje sadrži hlapljive tvari, poput organskih kiselina, treba uzeti u obzir da se pri određivanju vlage obuhvaća i znatna količina hlapljivih tvari.

Ova metoda ne obuhvaća analizu mliječnih proizvoda kao sirovina za hranu za životinje, analizu mineralnih tvari i smjesa sastavljenih uglavnom od mineralnih tvari, analizu životinjskih i biljnih masti i ulja ili analizu sjemenki uljarica i uljanog voća.

2.    Načelo

Uzorak se osuši pod određenim uvjetima koji se mijenjaju ovisno o vrsti hrane za životinje. Gubitak mase utvrđuje se vaganjem. Kod krute hrane za životinje s visokim udjelom vode potrebno je prethodno sušenje.

3.    Oprema

4.    Postupak

Napomena

:

Postupci opisani u ovom odjeljku moraju se provesti odmah po otvaranju pakovina s uzorcima. Analiza se mora provesti najmanje dvaput zaredom.

4.1.    Priprema

4.1.1.    Hrana za životinje osim one iz točaka 4.1.2 i 4.1.3

Uzme se najmanje 50 g uzorka. Prema potrebi se usitni ili razdijeli tako da se spriječi promjena udjela vlage (vidjeti točku 6).

4.1.2.    Žitarice i gruba krupica

Uzme se najmanje 50 g uzorka. Uzorak se samelje tako da najmanje 50 % čestica prolazi kroz sito s očicama veličine 0,5 mm, a na situ s okruglim očicama veličine 1 mm ostane najviše 10 % čestica.

4.1.3.    Tekuća ili kašasta hrana za životinje i hrana za životinje koja se sastoji uglavnom od ulja i masti

Odvagne se približno 25 g uzorka s preciznošću od 10 mg, doda se primjerena količina bezvodnog pijeska izvagana s preciznošću od 10 mg te se miješa dok se ne dobije homogena masa.

4.2.    Sušenje

4.2.1.    Hrana za životinje, osim one iz točaka 4.2.2. i 4.2.3.

Izvaže se posuda (točka 3.3.) s poklopcem s preciznošću od 1 mg. U izvaganu se posudu odvagne približno 5 g uzorka s preciznošću od 1 mg i ravnomjerno raširi. Posuda se bez poklopca stavi u sušilo prethodno zagrijano na 103 °C. Posuda se stavi u sušilo što je moguće brže kako bi se spriječio prevelik pad temperature. Sušenje traje četiri sata od trenutka kada temperatura u sušilu ponovno dosegne 103 °C. Posuda se pokrije poklopcem, izvadi iz sušila, ostavi hladiti u eksikatoru (točka 3.6.) 30 do 45 minuta i izvaže s preciznošću od 1 mg.

Hrana za životinje koja se sastoji uglavnom od ulja i masti suši se u sušilu dodatnih 30 minuta na 130 °C. Razlika između dvaju vaganja ne smije biti veća od 0,1 % vlage.

4.2.2.    Žitarice, brašno, gruba krupica i sitna krupica

Izvaže se posuda (točka 3.3.) s poklopcem s preciznošću od 0,5 mg. U izvaganu se posudu odvagne približno 5 g usitnjenog uzorka s preciznošću od 1 mg i ravnomjerno raširi. Posuda se bez poklopca stavi u sušilo prethodno zagrijano na 130 °C. Posuda se stavi u sušilo što je moguće brže kako bi se spriječio prevelik pad temperature. Sušenje traje 2 sata od trenutka kada temperatura u sušilu ponovno dosegne 130 °C. Posuda se pokrije poklopcem, izvadi iz sušila, ostavi hladiti u eksikatoru (točka 3.6.) 30 do 45 minuta i izvaže s preciznošću od 1 mg.

Izvaže se posuda (točka 3.3.) s poklopcem s preciznošću od 0,5 mg. U izvaganu se posudu odvagne približno 5 g uzorka s preciznošću od 1 mg i ravnomjerno raširi. Posuda se bez poklopca stavi u vakuumsko sušilo (točka 3.5.) prethodno zagrijano na 80 – 85 °C. Posuda se stavi u sušilo što je moguće brže kako bi se spriječio prevelik pad temperature.

Tlak se poveća na 100 torra i na tom se tlaku ostavi sušiti četiri sata na vrućem suhom zraku ili upotrebom sredstva za isušivanje (približno 300 g za 20 uzoraka). U potonjem se slučaju vakuumska crpka isključi kad se dosegne traženi tlak. Vrijeme sušenja računa se od trenutka kada temperatura u sušilu ponovno dosegne 80 – 85 °C. Oprezno se izjednači tlak u sušilu s atmosferskim tlakom. Sušilo se otvori, posuda se odmah pokrije poklopcem i izvadi iz sušila, ostavi se hladiti 30 do 45 minuta u eksikatoru (točka 3.6.) i izvaže s preciznošću od 1 mg. Suši se dodatnih 30 minuta u vakuumskom sušilu na 80 – 85 °C i ponovo važe. Razlika između dvaju vaganja ne smije biti veća od 0,1 % vlage.

4.3.    Prethodno sušenje

4.3.1.    Hrana za životinje, osim one iz točke 4.3.2.

Kruta hrana za životinje s visokim udjelom vode koja se teško drobi mora se prethodno sušiti na sljedeći način:

U prikladnu se posudu (npr. aluminijski tanjur veličine 20 × 12 cm s rubom 0,5 cm) odvagne 50 g neusitnjenog uzorka s preciznošću od 10 mg (sabijena ili zgusnuta hrana za životinje može se prema potrebi grubo razdijeliti). Ostavi se sušiti u sušilu na 60 – 70 °C, sve dok se udio vode ne smanji na 8 – 12 %. Posuda se izvadi iz sušila i jedan sat hladi bez poklopca u laboratoriju, zatim se izvaže s preciznošću od 10 mg. Hrana za životinje se odmah usitni, u skladu s točkom 4.1.1., i suši, u skladu s točkom 4.2.1. ili 4.2.3., ovisno o vrsti hrane za životinje.

4.3.2.    Žitarice

Zrna sa udjelom vode većim od 17 % moraju se prethodno sušiti na sljedeći način:

U prikladnu se posudu (npr. aluminijski tanjur veličine 20 × 12 cm s rubom 0,5 cm) odvagne 50 g neusitnjenog zrnja s preciznošću od 10 mg. Ostavi se sušiti 5 do 7 minuta u sušilu na 130 °C. Posuda se izvadi iz sušila i 2 sata hladi bez poklopca u laboratoriju, zatim se izvaže s preciznošću od 10 mg. Odmah se usitni, u skladu s točkom 4.1.2., i osuši, u skladu s točkom 4.2.2.

5.    Izračun rezultata

Udio vode (X), iskazan kao postotni dio uzorka, izračunava se sljedećom formulom:

5.1.    Sušenje bez prethodnog sušenja

pri čemu je:

m

=

početna masa uzorka u gramima,

m0

=

masa suhog uzorka u gramima.

5.2.    Sušenje s prethodnim sušenjem

pri čemu je:

m

=

početna masa uzorka u gramima,

m1

=

masa uzorka nakon prethodnog sušenja u gramima,

m2

=

masa uzorka nakon usitnjavanja ili mljevenja u gramima,

m0

=

masa suhog uzorka u gramima.

5.3.    Ponovljivost

Razlika između rezultata dvaju usporednih postupaka određivanja, izvedenih na istom uzorku, ne smije prelaziti 0,2 % apsolutne vrijednosti vode.

6.    Napomena

U slučaju kada je potrebno mljevenje za koje se pokaže da mijenja udio vode u proizvodu, potrebno je korigirati rezultate analize sastojaka hrane za životinje s obzirom na udio vode u uzorku u početnom stanju.

B.   ODREĐIVANJE VODE U MASTIMA I ULJIMA ŽIVOTINJSKOG I BILJNOG PODRIJETLA

1.    Svrha i područje primjene

Ova se metoda koristi za određivanje udjela vode i hlapljivih tvari u mastima i uljima životinjskog i biljnog podrijetla.

2.    Načelo

Uzorak se osuši do konstantne mase (gubitak mase između dvaju uzastopnih vaganja ne smije prijeći 1 mg) na 103 °C. Gubitak mase utvrđuje se vaganjem.

3.    Oprema

4.    Postupak

Odvagne se približno 20 g homogeniziranog uzorka s preciznošću od 1 mg i prenese u suhu izvaganu posudu (točka 3.1.) u kojoj se nalazi termometar (točka 3.2.). Zagrijava se na pješčanoj kupelji ili grijaćoj ploči (točka 3.3.) uz stalno miješanje termometrom, tako da temperatura dosegne 90 °C u približno 7 minuta.

Smanji se unos topline, pri čemu se nadzire učestalost podizanja mjehurića s dna posude. Temperatura ne smije prijeći 105 °C. Nastavi se miješati uz struganje dna posude sve dok ne prestane stvaranje mjehurića.

Kako bi se osiguralo potpuno uklanjanje vode, nekoliko puta se zagrije na 103 ± 2 °C uz hlađenje na 93 °C između uzastopnih zagrijavanja. Zatim se uzorak ostavi hladiti na sobnu temperaturu u eksikatoru (točka 3.4.) i izvaže. Postupak se ponavlja sve dok gubitak mase između dvaju uzastopnih vaganja ne bude manji od 2 mg.

Napomena

:

Povećanje mase uzorka nakon uzastopnog zagrijavanja upućuje na oksidaciju masti i u tom se slučaju rezultat izračunava na temelju vaganja izvedenog neposredno prije početka povećavanja mase.

5.    Izračun rezultata

Udio vode (X), iskazan kao postotni dio uzorka, izračunava se sljedećom formulom:

pri čemu je:

m

=

masa uzorka u gramima,

m1

=

masa posude sa sadržajem prije zagrijavanja, u gramima,

m2

=

masa posude sa sadržajem nakon zagrijavanja, u gramima.

Rezultati manji od 0,05 % navode se kao „manji od 0,05 %”.

Ponovljivost

Razlika između rezultata dvaju usporednih postupaka određivanja, izvedenih na istom uzorku, ne smije prijeći 0,05 % apsolutne vrijednosti.

C.   ODREĐIVANJE UDJELA SIROVIH BJELANČEVINA

1.    Svrha i područje primjene

Ova se metoda koristi za određivanje udjela sirovih bjelančevina u hrani za životinje na temelju udjela dušika određenog Kjeldahlovom metodom.

2.    Postupak

Uzorak se mineralizira sumpornom kiselinom u prisutnosti katalizatora. Kisela se otopina prevede u bazičnu dodavanjem otopine natrijevog hidroksida. Amonijak se destilira i prikupi u odmjerenoj količini sumporne kiseline, višak koje se titrira standardnom otopinom natrijevog hidroksida.

Druga je mogućnost destilacija oslobođenog amonijaka u višku otopine borne kiseline, nakon čega slijedi titriranje otopinom klorovodične ili sumporne kiseline.

3.    Reagensi

Kod metode kolorimetrijskog određivanja točke ekvivalencije, otopinama borne kiseline moraju se dodati indikatori metil crvenilo i bromkrezol zelenilo. Kod pripreme 1 litre otopine borne kiseline, prije prilagodbe volumena, doda se 7 ml otopine indikatora metil crvenila (točka 3.16.) i 10 ml otopine bromkrezol zelenila (točka 3.17.).

Ovisno o vodi koja se koristi, pH vrijednost otopine borne kiseline može se razlikovati od serije do serije. Za dobivanje pozitivne slijepe probe često treba izvesti prilagodbu malim volumenom alkalija.

Napomena

:

Obično je dovoljno dodati 3 do 4 ml NaOH (točka 3.11.) u 1 litru borne kiseline 10 g/l. Otopina se pohrani na sobnoj temperaturi i zaštiti od svjetla i para amonijaka.

Napomena

:

Mogu se koristiti i druge koncentracije volumetrijskih otopina (točka 3.5., 3.6., 3.7., 3.10., 3.11. i 3.19.), ako se to uzima u obzir u izračunima. Koncentracije se uvijek navode na četiri decimalna mjesta.

4.    Oprema

Uređaj prikladna za izvođenje postupaka mineralizacije, destilacije i titracije prema Kjeldahlovoj metodi.

5.    Postupak

5.1.    Razgradnja

Odvagne se 1 g uzorka s preciznošću od 0,001 g i prenese u tikvicu naprave za mineralizaciju. Doda se 15 g kalijevog sulfata (točka 3.1.), prikladna količina katalizatora (točka 3.2.) (0,3 – 0,4 g bakrovog(II) oksida ili 0,9 – 1,2 g bakrovog(II) sulfat pentahidrata), 25 ml sumporne kiseline (točka 3.4.), prema potrebi nekoliko zrnaca plovućca (točka 3.12.) i promiješa.

Tikvica se prvo umjereno zagrijava i prema potrebi povremeno trese, sve dok masa potpuno ne pougljeni i nestane pjena; zatim se jače zagrijava do ravnomjernog vrenja tekućine. Zagrijavanje je primjereno ako se vrela kiselina kondenzira na stijenkama tikvice. Treba spriječiti pregrijavanje stijenki i prianjanje organskih čestica na njih.

Kada se otopina razbistri i postane svijetlozelena, ostavi se da ključa još 2 sata, a zatim se ostavi da se ohladi.

5.2.    Destilacija

Oprezno se doda dovoljna količina vode kako bi se sulfati potpuno otopili. Ostavi se da se ohladi i prema potrebi doda nekoliko zrnaca cinka (točka 3.3.). Nastavlja se u skladu s točkom 5.2.1. ili 5.2.2.

5.2.1.    Destilacija u sumpornoj kiselini

U tikvicu za prikupljanje naprave za destilaciju doda se točno odmjerena količina od 25 ml sumporne kiseline (točka 3.5.) ili (točka 3.7.) ovisno o pretpostavljenom udjelu dušika. Doda se nekoliko kapi indikatora metil crvenila (točka 3.8.).

Tikvica za mineralizaciju priključi se na kondenzator naprave za destilaciju i vršak kondenzatora uroni u tekućinu u tikvici za prikupljanje, najmanje do dubine od 1 cm (vidjeti napomenu pod točkom pod točkom 8.3.). U tikvicu za mineralizaciju polagano se ulije 100 ml otopine natrijevog hidroksida (točka 3.9.) bez gubitka amonijaka (vidjeti napomenu pod točkom pod točkom 8.1.). Tikvica se zagrijava do potpune destilacije amonijaka.

5.2.2.    Destilacija u bornoj kiselini

Kod ručne titracije amonijaka iz destilata koristi se dolje navedeni postupak. Kod destilacijskih jedinica koje su u potpunosti automatizirane i obuhvaćaju titraciju amonijaka iz destilata, postupa se prema uputama proizvođača za rukovanje destilacijskom jedinicom.

Tikvica za prikupljanje s 25 – 30 ml otopine borne kiseline (točka 3.18.) postavi se ispod izlaznog otvora kondenzatora tako da ispusna cijev bude ispod površine viška otopine borne kiseline. Destilacijska se jedinica namjesti tako da isporučuje 50 ml otopine natrijevog hidroksida (točka 3.9.). Destilacijskom se jedinicom rukuje u skladu s uputama proizvođača, a oslobođeni se amonijak destilira dodavanjem otopine natrijevog hidroksida. Destilat se prikupi u otopini borne kiseline. Količina destilata (vrijeme parne destilacije) ovisi o količini dušika u uzorku. Treba se pridržavati uputa proizvođača.

Napomena

:

U poluautomatskoj destilacijskoj jedinici dodavanje viška natrijevog hidroksida i parna destilacija automatizirani su postupci.

5.3.    Titracija

Postupa se u skladu s točkom 5.3.1. ili 5.3.2.

5.3.1.    Sumporna kiselina

VIšak sumporne kiseline titrira se u tikvici za prikupljanje do točke ekvivalencije otopinom natrijevog hidroksida (točka 3.10. ili 3.11.), ovisno o koncentraciji korištene sumporne kiseline.

5.3.2.    Borna kiselina

Udio tikvice za prikupljanje titrira se standardnom volumetrijskom otopinom klorovodične kiseline (točka 3.19.) ili standardnom volumetrijskom otopinom sumporne kiseline (točka 3.6.), pri čemu se koristi bireta i očita se količina korištenog titranta.

Kod metode kolorimetrijskog određivanja točke ekvivalencije, točka ekvivalencije se dostiže kod prve pojave ružičastog obojenja udjela. Očita se obujam birete s preciznošću od 0,05 ml. Za pomoć kod vizualizacije točke ekvivalencije mogu se koristiti magnetna mješalica s osvjetljenjem ili fotometrijski detektor.

Ovaj se postupak može izvesti automatski upotrebom parnog destilatora s automatskom titracijom.

Kod rukovanja određenim tipom destilatora ili destilatora/titratora treba se pridržavati uputa proizvođača.

Napomena

:

Kod automatskog sustava titriranja, titracija započinje odmah po početku destilacije, a koristi se otopina borne kiseline 1 % (točka 3.18.). Kod potpuno automatizirane destilacijske jedinice, postupak automatske titracije amonijaka može se izvoditi i određivanjem točke ekvivalencije metodom potenciometrijske titracije pH. U tom se slučaju koristi automatski titrator s pH-metrom. Pravilno baždarenje pH metra izvodi se u području vrijednosti pH 4 do pH 7 uobičajenim laboratorijskim postupcima za baždarenje pH-metra. Točka ekvivalencije pH titracije dosiže se pri pH 4,6, kada je nagib titracijske krivulje najviši (točka infleksije).

5.4.    Slijepa proba

Kao potvrda da reagensi ne sadrže dušik koristi se slijepa proba (mineralizacija, destilacija i titracija), u kojoj se umjesto uzorka koristi 1 g saharoze (točka 3.14).

6.    Izračun rezultata

Izračuni se izvode u skladu s točkom 6.1. ili 6.2.

6.1.    Izračun za titraciju u skladu s točkom 5.3.1.

Udio sirovih bjelančevina, iskazan kao maseni postotak, izračunava se sljedećom formulom:

pri čemu je:

V0

=

volumen (ml) NaOH (točka 3.10. ili 3.11.) korišten u slijepoj probi,

V1

=

volumen (ml) NaOH (točka 3.10. ili 3.11.) korišten kod titracije uzorka,

c

=

koncentracija (mol/l) natrijevog hidroksida (točka 3.10. ili 3.11.),

m

=

masa (g) uzorka.

6.2.    Izračun za titraciju u skladu s točkom 5.3.2.

6.2.1.    Titracija klorovodičnom kiselinom

Udio sirovih bjelančevina, iskazan kao maseni postotak, izračunava se sljedećom formulom:

pri čemu je:

m

=

masa (g) uzorka,

c

=

koncentracija (mol/l) standardne volumetrijske otopine klorovodične kiseline (točka 3.19.),

V0

=

volumen (ml) klorovodične kiseline korišten u slijepoj probi,

V1

=

volumen (ml) klorovodične kiseline korišten u uzorkovanom dijelu.

6.2.2.    Titracija sa sumpornom kiselinom

Udio sirovih bjelančevina, iskazan kao maseni postotak, izračunava se sljedećom formulom:

pri čemu je:

m

=

masa (g) uzorka,

c

=

koncentracija (mol/l) standardne volumetrijske otopine sumporne kiseline (točka 3.6.),

V0

=

volumen (ml) sumporne kiseline (točka 3.6.) korišten u slijepoj probi,

V1

=

volumen (ml) sumporne kiseline (točka 3.6.) korišten u uzorkovanom dijelu.

7.    Provjera metode

7.1.    Ponovljivost

Razlika između rezultata dvaju usporednih postupaka određivanja, izvedenih na istom uzorku, ne smije prijeći:

7.2.    Točnost

Za analizu (mineralizacija, destilacija, titracija) koristi se 1,5 do 2,0 g acetanilida (točka 3.13.) u prisutnosti 1 g saharoze (točka 3.14.); za 1 g acetanilida koristi se 14,80 ml sumporne kiseline (točka 3.5.). Iskorištenje mora iznositi najmanje 99 %.

8.    Napomene

D.   ODREĐIVANJE UREE

1.    Svrha i područje primjene

Ovom se metodom omogućuje određivanje razine uree u hrani za životinje.

2.    Načelo

Uzorak se suspendira u vodi u prisutnosti tvari za bistrenje. Suspenzija se filtrira. Udio uree u filtratu određuje se nakon dodavanja 4-dimetilaminobenzaldehida (4-DMAB) mjerenjem optičke gustoće na valnoj duljini od 420 nm.

3.    Reagensi

4.    Oprema

5.    Postupak

5.1.    Analiza uzorka

Odvagne se 2 g uzorka s preciznošću od 1 mg i prenese s 1 g aktivnog uglja (točka 3.4.) u graduiranu tikvicu obujma 500 ml. Doda se 400 ml vode i 5 ml otopine Carrez I (točka 3.2.), miješa približno 30 sekundi i doda 5 ml otopine Carrez II (točka 3.3.). Miješa se 30 minuta u mješalici. Dopuni se vodom do oznake, protrese i filtrira.

Uzme se 5 ml prozirnog bezbojnog filtrata i prenese u epruvete s ubrušenim čepovima, doda se 5 ml otopine 4-DMAB (točka 3.1.) i promiješa. Epruvete se postave u vodenu kupelj na 20 °C (+/- 4 °C). Nakon 15 minuta spektrofotometrom se izmjeri optička gustoća otopine uzorka na 420 nm. Rezultat se usporedi s otopinom reagensa iz slijepe probe.

5.2.    Kalibracijska krivulja

Uzme se 1, 2, 4, 5 i 10 ml otopine uree (točka 3.5.) i prenese u odmjerne tikvice obujma 100 ml koje se dopune vodom do oznake. Iz svake se otopine odstrani 5 ml, te se u svaku doda 5 ml otopine 4-DMAB (točka 3.1.), homogenizira i izmjeri optička gustoća, kako je gore navedeno, u usporedbi s kontrolnom otopinom koja sadrži 5 ml 4-DMAB i 5 ml vode bez uree. Pripremi se kalibracijska krivulja.

6.    Izračun rezultata

Količina uree u uzorku određuje se iz kalibracijske krivulje.

Rezultat se iskazuje kao postotni udio uzorka.

7.    Napomene

E.   ODREĐIVANJE HLAPLJIVIH DUŠIKOVIH BAZA

I.    MIKRODIFUZIJA

1.    Svrha i područje primjene

Ova se metoda koristi za određivanje udjela hlapljivih dušikovih baza u hrani za životinje iskazanog kao amonijak.

2.    Načelo

Uzorak se ekstrahira vodom, a otopina se izbistri i filtrira. Hlapljive dušične baze istiskuju se mikrodifuzijom uporabom otopine kalijevog karbonata, prikupe u otopinu borne kiseline i titriraju sumpornom kiselinom.

3.    Reagensi

4.    Oprema

5.    Postupak

Odvagne se 10 g uzorka s preciznošću od 1 mg i prenese sa 100 ml vode u graduiranu tikvicu obujma 200 ml. Trese se ili miješa 30 minuta u rotacijskoj mješalici. Doda se 50 ml otopine trikloroctene kiseline (točka 3.1.), dopuni vodom do oznake, snažno protrese i filtrira kroz nabrani filtar.

Pipetom se doda 1 ml otopine borne kiseline (točka 3.3.) u srednji dio Conwayevog članka i 1 ml filtrata uzorka u gornji dio članka. Djelomično se pokrije namašćenim poklopcem. U gornji dio članka brzo se nakapa 1 ml zasićene otopine kalijevog karbonata (točka 3.4.) i poklopac hermetički zatvori. Članak se oprezno okreće u vodoravnoj ravnini tako da se reagensi pomiješaju. Ostavi se najmanje četiri sata na sobnoj temperaturi ili jedan sat na temperaturi 40 °C.

Mikrobiretom (točka 4.3.) se hlapljive baze u otopini borne kiseline titriraju sumpornom kiselinom (točka 3.5.).

Slijepa se proba izvodi istim postupkom, ali bez uzorka za analizu.

6.    Izračun rezultata

1 ml H2SO4 0,01 mol/l odgovara 0,34 mg amonijaka.

Rezultat analize iskazuje se kao postotni udio uzorka.

Ponovljivost

Razlika između rezultata dvaju usporednih postupaka određivanja, izvedenih na istom uzorku, ne smije prijeći:

7.    Napomena

Ako je udio amonijaka u uzorku veći od 0,6 % početni se filtrat razrijedi.

CONWAYEV ČLANAK

Omjer 1/1

II.    DESTILACIJA

1.    Svrha i područje primjene

Ova se metoda koristi za određivanje udjela hlapljivih dušikovih baza, iskazanih kao amonijak, u ribljem brašnu koje praktično ne sadrži ureu. Koristi se samo za udio amonijaka niži od 0,25 %.

2.    Načelo

Uzorak se ekstrahira vodom, a otopina izbistri i filtrira. Hlapljive dušične baze se istisnu na temperaturi vrelišta dodavanjem magnezijevog oksida i prikupe u određenoj količini sumporne kiseline, višak koje se titrira otopinom natrijevog hidroksida.

3.    Reagensi

4.    Oprema

5.    Postupak

Odvagne se 10 g uzorka s preciznošću od 1 mg i prenese sa 100 ml vode u graduiranu tikvicu obujma 200 ml. Trese se ili miješa 30 minuta u rotacijskoj mješalici. Doda se 50 ml otopine trikloroctene kiseline (točka 3.1.), dopuni vodom do oznake, snažno protrese i filtrira kroz nabrani filtar papir.

Pipetom se prenese količina bistrog filtrata koja odgovara očekivanom sadržaju hlapljivih dušikovih baza (obično je dovoljno 100 ml). Razrijedi se na 200 ml, doda se 2 g magnezijevog oksida (točka 3.2.) i nekoliko kapljica emulzije protiv pjenjenja (točka 3.3.). Otopina mora biti alkalna pri pokusu s lakmusovim papirom; ako to nije slučaj, doda se magnezijev oksid (točka 3.2.). Postupa se u skladu s točkama 5.2. i 5.3. metode analize za određivanje udjela sirovih bjelančevina (dio C ovog Priloga).

Slijepa se proba izvodi istim postupkom, ali bez uzorka za analizu.

6.    Izračun rezultata

1 ml H2SO4 0,05 mol/l odgovara 1,7 mg amonijaka.

Rezultat se iskazuje kao postotni udio uzorka.

Ponovljivost

Razlika između rezultata dvaju usporednih postupaka određivanja, izvedenih na istom uzorku, ne smije prijeći 10 % relativne vrijednosti amonijaka.

F.   ODREĐIVANJE AMINOKISELINA (OSIM TRIPTOFANA)

1.    Svrha i područje primjene

Ova se metoda koristi za određivanje slobodnih (sintetičkih i prirodnih) i ukupnih (vezanih na peptide i slobodnih) aminokiselina u hrani za životinje pomoću analizatora aminokiselina. Koristi se za sljedeće aminokiseline: cist(e)in, metionin, lizin, treonin, alanin, arginin, aspartatna kiselina, glutaminska kiselina, glicin, histidin, izoleucin, leucin, fenilalanin, prolin, serin, tirozin i valin.

Ovom se metodom ne mogu razlikovati soli aminokiselina niti je moguće utvrditi razliku između oblika D i L aminokiselina. Ova metoda nije primjerena za određivanje triptofana ili hidroksi-analoga aminokiselina.

2.    Načelo

2.1.    Slobodne aminokiseline

Slobodne aminokiseline ekstrahiraju se razrijeđenom klorovodičnom kiselinom. Koekstrahirane dušične makromolekule istalože se sulfosalicilnom kiselinom i uklone filtriranjem. Vrijednost pH filtrirane otopine podesi se na 2,20. Aminokiseline se razdvoje ionsko-izmjenjivačkom kromatografijom i odrede reakcijom s ninhidrinom fotometrijskom detekcijom na 570 nm.

2.2.    Ukupne aminokiseline

Odabir postupka ovisi o ispitivanim aminokiselinama. Cist(e)in i metionin se prije hidrolize moraju oksidirati u cisteinsku kiselinu i metionin-sulfon. Tirozin se mora odrediti u hidrolizatima neoksidiranih uzoraka. Sve druge aminokiseline navedene u točki 1 mogu se odrediti u oksidiranom ili neoksidiranom uzorku.

Oksidacija se izvodi na 0 °C mješavinom peroksimravlje kiseline i fenola. Višak oksidacijskog reagensa razgradi se natrijevim disulfitom. Oksidirani ili neoksidirani uzorak se 23 sata hidrolizira klorovodičnom kiselinom (točka 3.20.). Vrijednost pH hidrolizata podesi se na 2,20. Aminokiseline se razdijele ionsko-izmjenjivačkom kromatografijom i odrede reakcijom s ninhidrinom fotometrijskom detekcijom na 570 nm (440 nm za prolin).

3.    Reagensi

Obvezno se koristi dvostruko destilirana voda ili voda jednake kakvoće (provodljivost < 10 μS)

U vodi se otopi 300 g NaOH (točka 3.5.) i dopuni vodom do 1 litre.

U vodi se otopi 40 g NaOH (točka 3.5.) i dopuni vodom do 1 litre.

Pomiješa se 889 g mravlje kiseline (točka 3.2.) sa 111 g vode i doda 4,73 g fenola (točka 3.3.).

Doda se 1 g fenola (točka 3.3.) u 492 ml HCl (točka 3.7.) i dopuni vodom do 1 litre.

U vodi se otopi 60 g 5-sulfosalicilne kiseline (točka 3.6.) i dopuni vodom do 1 litre.

Pomiješa se 0,5 ml vodikovog peroksida (točka 3.1.) s 4,5 ml otopine mravlje kiseline i fenola (točka 3.19.) u maloj čaši. Inkubira se 1 sat na 20 – 30 °C kako bi se dobila peroksimravlja kiselina, zatim se hladi u ledenoj kupelji (15 min) prije dodavanja u uzorak.

Upozorenje: Izbjegavati dodir s kožom i nositi zaštitnu odjeću.

U približno 800 ml vode otopi se 19,61 g natrijevog citrata (točka 3.8.), 5 ml tiodiglikola (točka 3.9.), 1 g fenola (točka 3.3.) i 16,50 ml HCl (točka 3.7.). Vrijednost pH se podesi na 2,20. Dopuni se vodom do 1 litre.

c = 2,5 μmol/ml za svaku u klorovodičnoj kiselini.

Može se nabaviti u slobodnoj prodaji.

U odmjernoj tikvici obujma 1 l otopi se 0,2115 g cisteinske kiseline (točka 3.16.2.) i 0,2265 g metionin-sulfona (točka 3.16.3.) u citratnom puferu (točka 3.24.) i dopuni citratnim puferom do oznake. Može se pohraniti najviše 12 mjeseci na temperaturi nižoj od 5 °C. Ova se otopina ne koristi ako osnovna standardna otopina (točka 3.27.1.) sadrži cisteinsku kiselinu i metionin-sulfon.

U odmjernoj se tikvici otopi 0,6560 g norleucina (točka 3.13.) u citratnom puferu (točka 3.24.) i dopuni citratnim puferom do 250 ml. Može se pohraniti najviše 6 mjeseci na temperaturi nižoj od 5 °C.

Udio se kvantitativno prenese u graduiranu tikvicu obujma 50 ml, dopuni citratnim puferom (točka 3.24.) do oznake i promiješa.

Pohrani se najviše 3 mjeseca na temperaturi nižoj od 5 °C.

Vidjeti također napomenu pod točkom 9.1.

Pohrani se najviše 3 mjeseca na temperaturi nižoj od 5 °C.

4.    Oprema

Kolona se napuni smolama sulfoniranog polistirena koje mogu razdvajati aminokiseline jedne od drugih i od drugih materijala koji reagiraju na ninhidrin. Tok u puferskoj i ninhidrinskoj liniji osigurava se crpkama s tokom stabilnosti ± 0,5 % u vremenu koje obuhvaća izvođenje standardnog kalibriranja i analizu uzorka.

Kod nekih analizatora aminokiselina mogu se koristiti postupci hidrolize kod kojih je koncentracija natrija u hidrolizatu c = 0,8 mol/l, a hidrolizat sadrži svu ostatnu mravlju kiselinu iz oksidacije. Drugim metodama ne postiže se zadovoljavajuće razdvajanje nekih aminokiselina ako se u hidrolizatu nalazi višak mravlje kiseline i/ili visoka koncentracija natrijevih iona. U tom se slučaju obujam kiseline nakon hidrolize i prije podešavanja pH smanjuje isparavanjem na približno 5 ml. Isparavanje se vrši pod vakuumom na najviše 40 °C.

5.    Postupak

5.1.    Priprema uzorka

Uzorak se samelje tako da prolazi kroz sito veličine 0,5 mm. Uzorci s visokim udjelom vode moraju se prije mljevenja osušiti na zraku na temperaturi koja ne prelazi 50 °C ili smrzavanjem. Uzorci s visokim sadržajem masti ekstrahiraju se laganim petrolejem (točka 3.12.) prije mljevenja.

5.2.    Određivanje slobodnih aminokiselina u hrani za životinje i premiksima

Odvagne se primjerena količina (1 – 5 g) pripravljenog uzorka (točka 5.1.) s preciznošću od 0,2 mg i prenese u konusnu tikvicu, te se doda 100,0 ml smjese za ekstrakciju (točka 3.21.). Smjesa se 60 minuta trese mehaničkom tresilicom ili magnetskom mješalicom (točka 4.8.). Pričeka se da talog padne na dno i pipetom prenese 10,0 ml supernatanta u čašu obujma 100 ml.

Tijekom miješanja doda se 5,0 ml otopine sulfosalicilne kiseline (točka 3.22.) i nastavi 5 minuta miješati magnetskom mješalicom. Supernatant se filtrira ili centrifugira kako bi se uklonio cjelokupni talog. U čašu obujma 100 ml izlije se 10,0 ml dobivene otopine i vrijednost pH podesi na 2,20 otopinom natrijevog hidroksida (točka 3.18.), prenese citratnim puferom (točka 3.24.) u graduiranu tikvicu primjerenog obujma i dopuni otopinom pufera (točka 3.24.) do oznake.

Ako se koristi interni standard, za svakih 100 ml konačne otopine doda se 1,00 ml internog standarda (točka 3.27.3.) i dopuni otopinom pufera (točka 3.24.) do oznake.

Nastavlja se s kromatografijom u skladu s točkom 5.4.

Ako se ekstrakti ne pregledavaju isti dan, moraju se pohraniti na temperaturi nižoj od 5 °C.

5.3.    Određivanje ukupnih aminokiselina

5.3.1.    Oksidacija

Odvagne se 0,1 – 1 g pripravljenog uzorka (točka 5.1.) s preciznošću od 0,2 mg i prenese u:

U odvaganom dijelu uzorka udio dušika mora iznositi približno 10 mg, a udio vode ne smije biti veći od 100 mg.

Tikvica/boca se postavi u ledenu kupelj i ohladi na 0 °C, doda se 5 ml oksidacijske smjese (točka 3.23.) i miješa staklenom lopaticom sa zakrivljenim vrhom. Tikvica/boca s lopaticom se hermetički zatvori filmom, a ledena kupelj s hermetički zatvorenom posudom stavi u hladnjak na 0 °C i ostavi 16 sati. Nakon 16 sati posuda se izvadi iz hladnjaka, a višak oksidacijskog reagensa se razgradi dodavanjem 0,84 g natrijevog disulfita (točka 3.4.).

Nastavlja se u skladu s točkom 5.3.2.1.

5.3.2.    Hidroliza

5.3.2.1.    Hidroliza oksidiranih uzoraka

U oksidirani uzorak, pripravljen u skladu s točkom 5.3.1., doda se 25 ml smjese za hidrolizu (točka 3.20.), pri čemu treba brižljivo isprati sve ostatke uzorka sa stijenke posude i lopatice.

Nastavlja se u skladu s točkom 5.3.2.3. ili 5.3.2.4., ovisno o korištenom postupku hidrolize.

5.3.2.2.    Hidroliza neoksidiranih uzoraka

U tikvicu s okruglim dnom obujma 100 ml ili 250 ml (točka 4.1.) ili u bocu s navojnim čepom obujma 100 ml (točka 4.2.) odvagne se 0,1 – 1 g pripravljenog uzorka (točka 5.1.) s preciznošću od 0,2 mg. U odvaganom dijelu uzorka udio dušika mora iznositi približno 10 mg. Oprezno se doda 25 ml smjese za hidrolizu (točka 3.20.) i pomiješa s uzorkom. Nastavlja se u skladu s točkom 5.3.2.3. ili 5.3.2.4.

5.3.2.3.    Otvorena hidroliza

U smjesu koja se nalazi u tikvici (pripremljenu u skladu s točkom 5.3.2.1. ili 5.3.2.2.) dodaju se 3 staklene kuglice, zatim se ostavi ključati 23 sata uz stalno vrenje pod refluksom. Po završetku hidrolize kondenzator ispere se s 5 ml citratnog pufera (točka 3.24.). Tikvica se odvoji i ohladi u ledenoj kupelji.

Nastavlja se u skladu s točkom 5.3.3.

5.3.2.4.    Zatvorena hidroliza

Boca sa smjesom pripravljenom u skladu s točkom 5.3.2.1. ili 5.3.2.2. postavi se u sušilo (točka 4.3.) na temperaturi od 110 °C. Kako bi se tijekom prvog sata spriječilo povećanje tlaka i eksplozija (zbog nastanka plinovitih tvari), poklopac s navojem treba postavi na vrh posude. Posuda se ne smije zatvoriti poklopcem. Nakon jednog sata posuda se zatvori poklopcem i ostavi 23 sata u sušilu (točka 4.3.). Po završetku hidrolize boca se izvadi iz sušila, oprezno se otvori poklopac boce i boca položi u ledenu kupelj. Ostavi se da se ohladi.

Ovisno o postupku podešavanja pH (točka 5.3.3.) udio posude se citratnim puferom (točka 3.24.) kvantitativno prenese u čašu obujma 250 ml ili tikvicu s okruglim dnom obujma 250 ml.

Nastavlja se u skladu s točkom 5.3.3.

5.3.3.    Podešavanje pH

Ovisno o odstupanju analizatora aminokiselina (točka 4.9.) za natrij, podešavanje pH se provodi u skladu s točkom 5.3.3.1. ili 5.3.3.2.

5.3.3.1.    Kromatografski sustavi (točka 4.9.) koji zahtijevaju nisku koncentraciju natrija

Pri upotrebi analizatora aminokiselina koji zahtijevaju nisku koncentraciju natrija (kada treba smanjiti volumen kiseline) preporučuje se uporaba otopine internog osnovnog standarda (točka 3.27.3.).

U tom se slučaju hidrolizatu prije otparivanja dodaje 2,00 ml otopine internog osnovnog standarda (točka 3.27.3.).

U hidrolizat dobiven postupkom u skladu s točkom 5.3.2.3. ili 5.3.2.4. dodaje se 2 kapljice 1-oktanola (točka 3.15.).

Obujam se smanji na 5 – 10 ml rotacijskim otparivačem (točka 4.7.) pod vakuumom na 40 °C. Ako se obujam slučajno smanji na manje od 5 ml, hidrolizat se mora odbaciti i iznova započeti analizu.

Otopinom natrijevog hidroksida (točka 3.18.) vrijednost pH podesi se na 2,20 i zatim nastavi u skladu s točkom 5.3.4.

5.3.3.2.    Za sve druge analizatore aminokiselina (točka 4.9.)

Hidrolizati dobiveni u skladu s točkom 5.3.2.3. ili 5.3.2.4. djelomično se neutraliziraju opreznim dodavanjem, uz miješanje, 17 ml otopine natrijevog hidroksida (točka 3.17.), pri čemu se temperatura mora održavati na manje od 40 °C.

Na sobnoj temperaturi podesi se vrijednost pH na 2,20 otopinom natrijevog hidroksida (točka 3.17.) i zatim otopinom natrijevog hidroksida (točka 3.18.). Nastavlja se u skladu s točkom 5.3.4.

5.3.4.    Otopina uzorka za kromatografiju

Hidrolizat (točka 5.3.3.1. ili 5.3.3.2.) s podešenom vrijednosti pH, citratnim se puferom (točka 3.24.) kvantitativno prenese u graduiranu tikvicu obujma 200 ml i dopuni puferom (točka 3.24.) do oznake.

Ako dotada nije korišten interni standard, doda se 2,00 ml internog standarda (točka 3.27.3.) i zatim dopuni citratnim puferom (točka 3.24.) do oznake. Temeljito se promiješa.

Nastavlja se s kromatografijom (točka 5.4.).

Ako se otopine uzorka ne pregledavaju isti dan, moraju se pohraniti na temperaturi nižoj od 5 °C.

5.4.    Kromatografija

Prije kromatografije temperaturu ekstrakta (točka 5.2.) ili hidrolizata (točka 5.3.4.) treba izjednačiti sa sobnom temperaturom. Smjesa se protrese i prikladna količina filtrira kroz membranski filtar 0,22 μm (točka 4.5.). Dobivena bistra otopina se podvrgne kromatografiji s izmjenom iona uporabom analizatora aminokiselina (točka 4.9.).

Ubrizgavanje se može izvesti ručno ili automatski. Važno je na kolonu za analizu standarda i uzoraka dodati istu količinu otopine (± 0,5 %) osim kada se koristi interni standard, a omjeri natrija i aminokiselina u otopinama standarda i uzorka trebaju biti što je moguće sličniji.

Općenito učestalost kalibriranja ovisi o stabilnosti reagensa ninhidrina i sustava za analizu. Standard ili uzorak se razrijede citratnim puferom (točka 3.24.) tako da površina vršaka standarda dostiže 30 – 200 % površine vršaka aminokiselina u uzorku.

Kromatografija aminokiselina neznatno se razlikuje s obzirom na vrstu korištenog analizatora i smole. Odabrani sustav mora imati mogućnost razdvajanja aminokiselina međusobno i od drugih materijala koji reagiraju na ninhidrin. U radnom području kromatografski sustav mora imati linearan odziv na promjene količina aminokiselina dodanih u kolonu.

U fazi kromatografije primjenjuju se dolje navedeni omjeri između najnižih i najviših vrijednosti kod analize ekvimolarnih otopina (aminokiselina koje se određuju). Ekvimolarna otopina mora sadržavati najmanje 30 % maksimalnog udjela svake aminokiseline koji se može točno izmjeriti sustavom za analizu aminokiselina (točka 4.9.).

Kod postupka razdvajanja treonina od serina, omjer između najniže i najviše vrijednosti za aminokiselinu s nižom vrijednosti između dviju aminokiselina koje se preklapaju na kromatogramu ne smije prijeći 2:10. (Ako se određuju samo cist(e)in, metionin, treonin i lizin, nedovoljno razdvajanje između susjednih vršaka štetno će djelovati na postupak određivanja). Za sve druge aminokiseline razdvajanje mora biti veće od 1:10.

Sustav mora jamčiti razdvajanje lizina od „lizinskih artefakata” i ornitina.

6.    Izračun rezultata

Za svaku pojedinačnu aminokiselinu izmjeri se površina vršaka uzorka i standarda, a količina (X), iskazana u g aminokiseline na kg uzorka, izračunava se na sljedeći način:

Ako se koristi interni standard pomnoži se s:

A

=

površina vršaka hidrolizata ili ekstrakta

B

=

površina vršaka standardne kalibracijske otopine

C

=

površina vršaka hidrolizata ili ekstrakta kao internog standarda

D

=

površina vršaka standardne kalibracijske otopine kao internog standarda

M

=

molarna masa aminokiseline koja se određuje

c

=

koncentracija standarda u μmol/ml

m

=

masa uzorka u gramima (ispravljena na početnu masu ako je uzorak isušen ili odmašćen)

V

=

ml ukupnog hidrolizata (točka 5.3.4.) ili izračunani ukupni volumen otopine ekstrakta (točka 6.1.) u ml

Cistin i cistein se određuju kao cisteinska kiselina u hidrolizatima oksidiranog uzorka, ali se izračunavaju kao cistin (C6H12N2O4S2, M 240,30 g/mol) uporabom molarne mase 120,15 g/mol (= 0,5 × 240,30 g/mol).

Metionin se određuje kao metionin-sulfon u hidrolizatima oksidiranog uzorka, ali se izračunava kao metionin uporabom molarne mase metionina: 149,21 g/mol.

Dodani slobodni metionin određuje se nakon ekstrakcije kao metionin, a za izračun se koristi ista molekulska masa.

V

=

volumen konačnog ekstrakta

7.    Vrednovanje metode

Metoda je provjerena u međulaboratorijskom ispitivanju na međunarodnoj razini provedenom 1990. na četiri različite vrste hrane za životinje (miješana hrana za svinje, smjesa za brojlere, proteinski koncentrat, premiks). Rezultati srednjih vrijednosti i standardnih devijacija, bez ekstremnih vrijednosti, prikazani su u tablicama u ovoj točki:

7.1.    Ponovljivost

Ponovljivost gore navedene međulaboratorijske usporedbe, iskazana kao „unutarlaboratorijska standardna devijacija”, prikazana je u donjim tablicama:

7.2.    Ponovljivost

Rezultati gore navedene međulaboratorijske usporedbe, iskazani kao standardna devijacija između laboratorija, prikazani su u donjoj tablici:

8.    Upotreba referentnih materijala

Pravilna primjena metode provjerava se ponovljenim mjerenjima na certificiranim referentnim materijalima, kada su dostupni. Preporučuje se izvršiti kalibraciju upotrebom certificirane otopine za kalibraciju aminokiselina.

9.    Napomene

Za sve aminokiseline treba provjeriti područje linearnog odziva uređaja.

Standardna se otopina razrijedi citratnim puferom tako da se površine vršaka nalaze u sredini područja.

G.   ODREĐIVANJE TRIPTOFANA

1.    Svrha i područje primjene

Ovom se metodom omogućuje određivanje ukupnog i slobodnog triptofana u hrani za životinje. Njom se ne omogućuje razlikovanje između oblika D i L.

2.    Načelo

Za određivanje ukupnog triptofana uzorak se hidrolizira u bazičnim uvjetima zasićenom otopinom barijevog hidroksida i 20 sati grije na 110 °C. Nakon hidrolize dodaje se interni standard.

Za određivanje slobodnog triptofana uzorak se ekstrahira u lagano kiselim uvjetima u prisutnosti internog standarda.

Triptofan i interni standard u hidrolizatu ili ekstraktu određuju se postupkom HPLC s fluorescentnom detekcijom.

3.    Reagensi

U vodi se otopi 40,0 g NaOH (točka 3.5.) i dopuni vodom do 1 litre (točka 3.1.).

Uzme se 492 ml HCl (točka 3.7.) i dopuni vodom do 1 litre.

Uzme se 82 ml HCl (točka 3.7.) i dopuni vodom do 1 litre.

Uzme se 8,2 ml HCl (točka 3.7.) i dopuni vodom do 1 litre.

Uzme se 34 ml ortofosforne kiseline (točka 3.6.) i dopuni vodom (točka 3.1.) do 1 litre.

U odmjernoj tikvici obujma 500 ml otopi se 0,2553 g triptofana (točka 3.2.) u klorovodičnoj kiselini (točka 3.13.) i dopuni klorovodičnom kiselinom (točka 3.13.) do oznake. Pohrani se najviše 4 tjedna na –18 °C.

U odmjernoj tikvici obujma 500 ml otopi se 0,2728 g α-metil-triptofana (točka 3.3.) u klorovodičnoj kiselini (točka 3.13.) i dopuni klorovodičnom kiselinom (točka 3.13.) do oznake. Pohrani se najviše 4 tjedna na –18 °C.

Pripremi se 2,00 ml koncentrirane otopine triptofana (točka 3.15.) i 2,00 ml koncentrirane otopine internog standarda (α-metil-triptofan) (točka 3.16.). Razrijedi se vodom (točka 3.1.) i metanolom (točka 3.8.) na približno jednak obujam i približno jednaku koncentraciju metanola (10 – 30 %) kao kod konačnog hidrolizata.

Ta se otopina mora pripremiti svježa prije uporabe.

Tijekom pripreme treba je zaštiti od izravnog sunčevog svjetla.

4.    Oprema

5.    Postupak

5.1.    Priprema uzoraka

Uzorak se samelje tako da prolazi kroz sito veličine 0,5 mm. Uzorci s visokim udjelom vode moraju se prije usitnjavanja osušiti na zraku na temperaturi koja ne prelazi 50 °C ili liofilizacijom. Uzorci s visokim sadržajem masti ekstrahiraju se laganim petrolejem (točka 3.9.) prije usitnjavanja.

5.2.    Određivanje slobodnog triptofana (ekstrakt)

Odvagne se primjerena količina (1 – 5 g) pripravljenog uzorka (točka 5.1.) s preciznošću od 1 mg i prenese u konusnu tikvicu. Doda se 100,0 ml klorovodične kiseline (točka 3.13.) i 5,00 ml koncentrirane otopine internog standarda (točka 3.16.). Trese se ili miješa 60 minuta mehaničkom tresilicom ili magnetskom mješalicom (točka 4.7.). Pričeka se da talog padne na dno i pipetom prenese 10,0 ml supernatanta u čašu. Doda se 5 ml ortofosforne kiseline (točka 3.14.). Natrijevim hidroksidom (točka 3.10.) se pH vrijednost otopine podesi na 3. Doda se dovoljno metanola (točka 3.8.) kako bi u konačnom volumenu koncentracija metanola iznosila 10 – 30 %. Prenese se u graduiranu tikvicu primjerenog volumena i razrijedi vodom na volumen potreban za kromatografiju (približno jednak volumen kao kod standardne kalibracijske otopine (točka 3.17.)).

Prije ubrizgavanja na kolonu za HPLC filtrira se nekoliko ml otopine kroz membranski filtar 0,45 μm (točka 4.5.). Nastavlja se s kromatografijom u skladu s točkom 5.4.

Standardna otopina i ekstrakti se zaštite od izravnog sunčevog svjetla. Ako se ekstrakti ne mogu analizirati istog dana, mogu se pohraniti na temperaturi od 5 °C na razdoblje od najviše 3 dana.

5.3.    Određivanje ukupnog triptofana (hidrolizat)

Odvagne se 0,1 – 1 g pripravljenog uzorka (točka 5.1.) s preciznošću od 0,2 mg i prenese u polipropilensku tikvicu (točka 4.4.). Udio dušika u odvaganom dijelu uzorka mora iznositi približno 10 mg. Doda se 8,4 mg barijevog hidroksid oktahidrata (točka 3.4.) i 10 ml vode. Miješa se vrtložnom mješalicom (točka 4.8.) ili magnetskom mješalicom (točka 4.7.). U smjesi se ostavi magnet obložen teflonom. Stijenke posude se isperu s 4 ml vode. Tikvica se poklopi navojnim čepom i lagano zatvori. Prenese se u autoklav (točka 4.6.) s vrelom vodom i ostavi u pari 30 – 60 minuta. Autoklav se zatvori i 20 sati autoklavira na 110 (± 2) °C.

Prije otvaranja autoklava, temperatura se snizi na malo ispod 100 °C. Kako bi se spriječila kristalizacija Ba(OH)2.8 H2O, u toplu se smjesu doda 30 ml vode temperature okoliša. Lagano se protrese ili promiješa. Doda se 2,00 ml koncentrirane otopine internog standarda (α-metil-triptofana) (točka 3.16.). Posude se 15 minuta hlade u vodenoj/ledenoj kupelji.

Zatim se doda 5 ml ortofosforne kiseline (točka 3.14.). Posuda se drži u rashladnoj kupki i uz miješanje neutralizira s HCl (točka 3.11.), a pH vrijednost se podesi na 3,0 s HCl (točka 3.12.). Doda se dovoljno metanola kako bi u konačnom obujmu koncentracija metanola iznosila 10 – 30 %. Prenese se u graduiranu tikvicu primjerenog obujma i razrijedi vodom do obujma potrebnog za kromatografiju (na primjer, 100 ml). Dodavanje metanola ne smije izazvati taloženje.

Prije ubrizgavanja na HPLC kolonu nekoliko ml otopine se filtrira kroz membranski filtar 0,45 μm (točka 4.5.). Nastavlja se s kromatografijom u skladu s točkom 5.4.

Standardna otopina i hidrolizati se zaštite od izravnog sunčevog svjetla. Ako se ekstrakti ne mogu analizirati istog dana, mogu se pohraniti na temperaturi od 5 °C na razdoblje od najviše 3 dana.

5.4.    Određivanje HPLC-om

Za izokratsko se eluiranje kao smjernice predlažu sljedeći uvjeti; mogu se koristiti i drugi uvjeti ako se njima jamče jednakovrijedni rezultati (vidjeti također napomene pod točkama 9.1. i 9.2.).

6.    Izračun rezultata

Količina triptofana (X), iskazana u g na 100 g uzorka, izračunava se sljedećom formulom:

A

=

površina vrška internog standarda, standardna kalibracijska otopina (točka 3.17.)

B

=

površina vrška triptofana, ekstrakt (točka 5.2.) ili hidrolizat (točka 5.3.)

V1

=

obujam, u ml (2 ml), koncentrirana otopina triptofana (točka 3.15.) dodana kalibracijskoj otopini (točka 3.17.)

c

=

koncentracija, u μmol/ml (= 2,50), koncentrirana otopina triptofana (točka 3.15.) dodana kalibracijskoj otopini (točka 3.17.)

V2

=

obujam, u ml, koncentrirana otopina internog standarda (točka 3.16.) dodana pri ekstrakciji (točka 5.2.) (= 5,00 ml) ili hidrolizat (točka 5.3.) (= 2,00 ml)

C

=

površina vrška internog standarda, ekstrakt (točka 5.2.) ili hidrolizat (točka 5.3.)

D

=

površina vrška triptofana, standardna kalibracijska otopina (točka 3.17.)

V3

=

obujam, u ml (= 2,00 ml), koncentrirane otopine internog standarda (točka 3.16.), dodana standardnoj kalibracijskoj otopini (točka 3.17.)

m

=

masa uzorka u g (korigirana na izvornu masu ako je uzorak isušen i/ili odmašćen)

M

=

molarna masa triptofana (= 204,23 g/mol).

7.    Ponovljivost

Razlika između rezultata dvaju usporednih postupka određivanja, izvedenih na istom uzorku, ne smije prijeći 10 % u odnosu na najviši rezultat.

8.    Rezultati međulaboratorijske studije

Provedena je međulaboratorijska studija na razini EZ-a (četvrta međulaboratorijska usporedba), u kojoj se u 12 laboratorija analiziralo 3 uzorka za potvrđivanje metode za hidrolizu. Svaki se uzorak analizirao pet puta. Rezultati su prikazani u donjoj tablici:

L

=

broj laboratorija koji su dostavili rezultate

n

=

broj korištenih pojedinačnih rezultata bez ekstremnih vrijednosti (identificiranih Cochran-Dixonovim testom za ekstremne vrijednosti)

sr

=

standardna devijacija ponovljivosti

SR

=

standardna devijacija obnovljivosti

r

=

ponovljivost

R

=

obnovljivost

CVr

=

koeficijent varijacije ponovljivosti u %

CVR

=

koeficijent varijacije obnovljivosti u %.

Provedena je još jedna međulaboratorijska studija na razini EZ-a (treća međulaboratorijska usporedba), u kojoj se u 13 laboratorija analiziralo 2 uzorka za potvrđivanje metode za ekstrakciju slobodnog triptofana. Svaki se uzorak analizirao pet puta. Rezultati su prikazani u donjoj tablici:

L

=

broj laboratorija koji su dostavili rezultate

n

=

broj korištenih pojedinačnih rezultata bez ekstremnih vrijednosti (identificiranih Cochran-Dixonovim testom za ekstremne vrijednosti)

sr

=

standardna devijacija ponovljivosti

SR

=

standardna devijacija obnovljivosti

r

=

ponovljivost

R

=

obnovljivost

CVr

=

koeficijent varijacije ponovljivosti u %

CVR

=

koeficijent varijacije obnovljivosti u %.

Provedena je još jedna međulaboratorijska studija na razini EZ-a u kojoj se u 7 laboratorija analiziralo 4 uzorka za potvrđivanje triptofana za hidrolizu. Rezultati su prikazani dolje. Svaki se uzorak analizirao pet puta.

L

=

broj laboratorija koji su dostavili rezultate

n

=

broj korištenih pojedinačnih rezultata bez ekstremnih vrijednost (identificiranih Cochran-Dixonovim testom za ekstremne vrijednosti

sr

=

standardna devijacija ponovljivosti

SR

=

standardna devijacija obnovljivosti

r

=

ponovljivost

R

=

obnovljivost

CVr

=

koeficijent varijacije ponovljivosti u %

CVR

=

koeficijent varijacije obnovljivosti u %.

9.    Napomene

Izokratsko eluiranje, nakon kojeg slijedi gradijentno pročišćivanje kolone:

U radnom području kromatografski sustav mora imati linearni odziv. Linearni se odziv mjeri s konstantnom (uobičajenom) koncentracijom internog standarda i različitim koncentracijama triptofana. Važno je da veličine vršaka triptofana i internog standarda budu u linearnom području sustava za HPLC/fluorescenciju. Ako su vršci triptofana i/ili internog standarda preniski ili previsoki, analizu treba ponoviti s drugom količinom uzorka i/ili drugim konačnim obujmom.

S vremenom se topljivost barijevog hidroksida smanjuje. Posljedica toga je mutna otopina za HPLC, što može dovesti do niskih rezultata za triptofan.

H.   ODREĐIVANJE SIROVIH ULJA I MASTI

1.    Svrha i područje primjene

Ovom se metodom omogućuje određivanje udjela sirovih ulja i masti u hrani za životinje. Ona ne obuhvaća analizu sjemenki uljarica i uljnog voća.

Primjena dolje navedenih postupaka ovisi o vrsti i sastavu hrane za životinje i razlogu za provedbu analize.

1.1.    Postupak A – Sirova ulja i masti koje se ekstrahiraju izravno

Ova se metoda koristi za hranu za životinje biljnog podrijetla, osim one koja je obuhvaćena područjem primjene postupka B.

1.2.    Postupak B –Ukupna sirova ulja i masti

Ova se metoda koristi za hranu za životinje životinjskog podrijetla i za sve krmne smjese. Koristi se za sve sirovine za dobivanje životinjske hrane iz kojih se bez prethodne hidrolize ne mogu potpuno ekstrahirati ulja i masti (npr. gluteni, kvasac, krumpirovi proteini i proizvodi koji se podvrgavaju postupcima poput istiskivanja, pahuljičanja i zagrijavanja).

1.3.    Tumačenje rezultata

Kada je rezultat dobiven postupkom B viši od rezultata dobivenog postupkom A uvijek se kao točna vrijednost uzima rezultat dobiven postupkom B.

2.    Načelo

2.1.    Postupak A

Uzorak se ekstrahira laganim petrolejem. Otapalo se ukloni destilacijom, a ostatak osuši i izvaže.

2.2.    Postupak B

Uzorak se uz zagrijavanje obradi klorovodičnom kiselinom. Smjesa se ohladi i filtrira. Ostatak se ispere i osuši, a zatim se provede određivanje u skladu s postupku A.

3.    Reagensi

4.    Oprema

5.    Postupak

5.1.    Postupak A (vidjeti točku 8.1.)

Odvagne se 5 g uzorka s preciznošću od 1 mg, prenese u kartušu za ekstrakciju (točka 4.2.) i pokrije čepom od vate koji ne sadrži masti.

Kartuša se postavi u ekstraktor (točka 4.1.) i šest sati ekstrahira laganim petrolejem (točka 3.1.). Ekstrakt laganog petroleja se prikupi u suhu, izvaganu tikvicu koja sadrži krhotine plovućca ( 9 ).

Otapalo se ukloni destilacijom. Ostatak se osuši tako da se tikvica sat i pol drži u sušilu (točka 4.3.). Ostavi se da se ohladi u eksikatoru te se izvaže. Ponovo se suši 30 minuta kako bi se osigurala konstantna masa ulja i masti (gubitak mase između dvaju uzastopnih vaganja ne smije prijeći 1 mg).

5.2.    Postupak B

Odvagne se 2,5 g uzorka s preciznošću od 1 mg (vidjeti točku 8.2.), prenese u čašu obujma 400 ml ili konusnu tikvicu obujma 300 ml i doda 100 ml klorovodične kiseline (točka 3.3.) i krhotine plovućca. Čaša se pokrije satnim staklom ili se konusna tikvica spoji s kondenzatorom s povratnim protokom. Smjesa se polagano dovede do ključanja iznad niskog plamena ili na električnoj grijaćoj ploči i tamo ostavi jedan sat. Treba paziti da se uzorak ne zalijepi za stijenke posude.

Ohladi se i doda onoliko sredstva za filtriranje (točka 3.4.) koliko je potrebno da tijekom filtriranja ne dođe do gubitka ulja i masti. Filtrira se kroz navlažen dvostruki filtar papir koji ne sadrži masti. Ostatak se ispire hladnom vodom sve dok filtrat ne postane neutralan. Treba provjeriti da filtrat ne sadrži nikakva ulja ili masti. Njihova prisutnost znači da se uzorak prije hidrolize mora ekstrahirati laganim petrolejem primjenom postupka A.

Dvostruki filtar papir na kojem je ostatak prenese se na satno staklo i sat i pol suši u sušilu (točka 4.3.) na 100 °C ± 3 °C.

Dvostruki filtar papir sa suhim ostatkom se prenese u kartušu za ekstrahiranje (točka 4.2.) i pokrije čepom od vate koji ne sadrži masti. Kartuša se postavi u ekstraktor (točka 4.1.) i postupak nastavi kako je navedeno u drugom i trećem stavku točke 5.1.

6.    Prikaz rezultata

Masa ostatka iskazuje se kao postotni udio uzorka.

7.    Ponovljivost

Razlika između rezultata dvaju usporednih postupaka određivanja koja na istom uzorku izvodi isti analitičar ne smije prijeći:

8.    Napomene

Odvagne se 20 g uzorka s preciznošću od 1 mg i pomiješa s 10 g ili više bezvodnog natrijevog sulfata (točka 3.2.). Ekstrahira se laganim petrolejem (točka 3.1.) u skladu s točkom 5.1. Ekstrakt se dopuni laganim petrolejem (točka 3.1.) do 500 ml i promiješa. Uzme se 50 ml otopine i prenese u malenu, suhu, izvaganu tikvicu s krhotinama plovućca. Destilacijom se ukloni otapalo, osuši se i nastavi u skladu s zadnjem stavku točke 5.1.

Iz ostatka ekstrakcije koji se nalazi u tuljcu ukloni se otapalo, ostatak se usitni do veličine čestica 1 mm i vrati u tuljac za ekstrakciju (ne dodaje se natrijev sulfat), zatim se nastavi kako je navedeno u drugom i trećem stavku točke 5.1.

Ucio ulja i masti kao postotni udio uzorka izračunava se sljedećom formulom:

(10 m1 + m2) × 5

pri čemu je:

m1

=

masa ostatka nakon prve ekstrakcije (alikvotni dio ekstrakta) u gramima,

m2

=

masa ostatka nakon druge ekstrakcije u gramima.

I.   ODREĐIVANJE SIROVE VLAKNINE

1.    Svrha i područje primjene

Ovom se metodom omogućuje određivanje bezmasnih organskih tvari u hrani za životinje koje su netopljive u kiselim i baznim medijima i uobičajeno se nazivaju sirove vlaknine.

2.    Načelo

Uzorak se prema potrebi odmasti i uzastopno obradi vrelim otopinama sumporne kiseline i kalijevog hidroksida u navedenim koncentracijama. Ostatak se odvaja filtracijom kroz filtar od sinteriranog stakla, ispere, osuši, izvaže i žari na 475 – 500 °C. Gubitak mase zbog žarenja odgovara udjelu sirove vlaknine u pokusnom uzorku.

3.    Reagensi

4.    Oprema

5.    Postupak

Odvagne se 1 g pripravljenog uzorka s preciznošću od 1 mg i prenese u lončić (točka 4.2.) (vidjeti napomene pod točkama 8.1., 8.2. i 8.3.) te se doda 1 g sredstva za filtriranje (točka 3.3.).

Najprije se sklopi grijaća jedinica (točka 4.1.) i filtarski lončić (točka 4.2.), a zatim se valjak (točka 4.3.) priključi na lončić. U sklopljeni valjak i lončić nalije se 150 ml vrele sumporne kiseline (točka 3.1) i prema potrebi nekoliko kapi sredstva protiv pjenjenja (točka 3.2.).

Tekućina se zagrijava do ključanja u 5 ± 2 minuta i ostavi snažno ključati točno 30 minuta.

Otvori se slavina na ispusnoj cijevi (točka 4.1.), sumporna kiselina se pod vakuumom filtrira kroz filtarski lončić i ostatak se triput uzastopno ispere s po 30 ml vrele vode, pri čemu treba provjeriti da se nakon svakog ispiranja ostatak filtrira do suhog.

Ispusna se slavina zatvori, u sklop valjak-lončić nalije se 150 ml vrele otopine kalijevog hidroksida (točka 3.7.) i doda se nekoliko kapi sredstva protiv pjenjenja (točka 3.2). Tekućina se zagrijava do točke ključanja u 5 ± 2 minuta i ostavi snažno ključati točno 30 minuta. Filtrira se i ponovi postupak ispiranja kako je navedeno za postupak sa sumpornom kiselinom.

Nakon konačnog ispiranja i sušenja, odspoji se lončić sa sadržajem i priključi na jedinicu za hladnu ekstrakciju (točka 4.6.). Ostatak u lončiću se pod vakuumom triput uzastopno ispere s po 25 ml acetona (točka 3.4.), pri čemu treba provjeriti da se nakon svakog ispiranja ostatak filtrira do suhog.

Lončić se osuši u sušilu na 130 °C do konstantne mase. Nakon svakog sušenja ohladi se u eksikatoru i brzo izvaže. Lončić se postavi u mufolnu peć i žari najmanje 30 minuta na 475 – 500 °C do konstantne mase (gubitak mase između dvaju uzastopnih vaganja ne smije prijeći 2 mg).

Nakon svakoga grijanja i prije vaganja, lončić se prvo ohladi u peći, a zatim u eksikatoru.

Izvodi se slijepa proba bez uzorka. Gubitak mase pri žarenju ne smije prijeći 4 mg.

6.    Izračun rezultata

Udio sirovih vlakana, iskazan kao postotni udio uzorka, izračunava se sljedećom formulom:

pri čemu je:

m

=

masa uzorka u gramima,

m0

=

gubitak mase nakon žarenja tijekom postupka određivanja, u gramima,

m1

=

gubitak mase nakon žarenja tijekom slijepe probe, u gramima.

7.    Ponovljivost

Razlika između rezultata dvaju usporednih postupaka određivanja, izvedenih na istom uzorku, ne smije prijeći:

8.    Napomene

J.   ODREĐIVANJE ŠEĆERA

1.    Svrha i područje primjene

Ovom se metodom omogućuje određivanje količine reducirajućih šećera i ukupnih šećera nakon inverzije, iskazanih kao glukoza ili, ovisno o slučaju, kao saharoza, s faktorom konverzije 0,95. Primjenjuje se za krmne smjese. Za drugu hranu za životinje primjenjuju se posebne metode. Prema potrebi, laktoza se određuje odvojeno i uzima u obzir pri izračunu rezultata.

2.    Načelo

Šećeri se ekstrahiraju razrijeđenim etanolom; otopina se izbistri otopinama Carrez I i Carrez II. Nakon uklanjanja etanola određuju se količine prije i nakon inverzije Luff-Schoorlovom metodom.

3.    Reagensi

Uz oprezno miješanje, u otopinu natrijevog karbonata (točka 3.8.3.) ulije se otopina limunske kiseline (točka 3.8.2.). Doda se otopina bakrovog sulfata (točka 3.8.1.) i dopuni vodom do 1 litre. Ostavi se preko noći i filtrira.

Provjeri se koncentracija tako dobivenog reagensa (Cu 0,05 mol/l; Na2 CO3 1 mol/l), vidjeti zadnji stavak točke 5.4. pH vrijednost otopine je približno 9,4.

4.    Oprema

Mješalica (rotacijska): približno 35 do 40 okr./min.

5.    Postupak

5.1.    Ekstrakcija uzorka

Odvagne se 2,5 g uzorka s preciznošću od 1 mg i prenese u graduiranu tikvicu obujma 250 ml. Doda se 200 ml etanola (točka 3.1.) i 1 sat miješa u mješalici. Doda se 5 ml otopine Carrez I (točka 3.2.) i miješa približno 30 sekunda. Doda se 5 ml otopine Carrez II (točka 3.3.) i ponovo miješa 1 minutu. Dopuni se do oznake etanolom (točka 3.1), homogenizira i filtrira. Uzme se 200 ml filtrata i otpari približno polovica kako bi se uklonila većina etanola. Toplom vodom se ostatak nakon otparivanja kvantitativno prenese u graduiranu tikvicu obujma 200 ml, ohladi, dopuni vodom do oznake, homogenizira i prema potrebi filtrira. Ta se otopina koristi za određivanje količine reducirajućih šećera, a nakon inverzije, ukupnih šećera.

5.2.    Određivanje reducirajućih šećera

Pipetom se prenese najviše 25 ml otopine koja sadrži manje od 60 mg reducirajućih šećera, iskazanih kao glukoza. Prema potrebi se dopuni destiliranom vodom do 25 ml i Luff-Schoorlovom metodom odredi udio reducirajućih šećera. Rezultat se iskazuje kao postotak glukoze sadržan u uzorku za analizu.

5.3.    Određivanje ukupnih šećera nakon inverzije

Pipetom se prenese 50 ml otopine u graduiranu tikvicu obujma 100 ml. Doda se nekoliko kapi otopine metiloranža (točka 3.4.), zatim se oprezno, uz stalno miješanje, dodaje klorovodična kiselina (točka 3.5.) sve dok tekućina na postane potpuno crvena. Doda se 15 ml klorovodične kiseline (točka 3.6.), tikvica se uroni u vodenu kupelj koja snažno ključa i u njoj ostavi 30 minuta. Brzo se ohladi na približno 20 °C i doda 15 ml otopine natrijevog hidroksida (točka 3.7.). Dopuni se vodom do 100 ml i homogenizira. Pipetom se prenese najviše 25 ml otopine koja sadrži manje od 60 mg reducirajućih šećera, iskazanih kao glukoza. Prema potrebi se dopuni destiliranom vodom do 25 ml i Luff-Schoorlovom metodom odredi udio reducirajućih šećera. Rezultat se iskazuje kao postotni udio glukoze ili, prema potrebi, saharoze što se dobije množenjem s faktorom 0,95.

5.4.    Titracija prema Luff-Schoorlovoj metodi

Pipetom se prenese 25 ml Luff-Schoorlovog reagensa (točka 3.8.) u Erlenmeyerovu tikvicu obujma 300 ml; doda se točno 25 ml izbistrene otopine šećera. Doda se 2 zrnca plovućca (točka 3.13.), zagrijava nad otvorenim plamenom srednje jačine, uz ručno miješanje, tako da tekućina proključa za približno dvije minute. Erlenmeyerova se tikvica odmah postavi na žičanu mrežicu presvučenu azbestom s otvorom promjera 6 cm, ispod kojeg se upali plamen. Plamen se namjesti tako da se zagrijava samo dno Erlenmeyerove tikvice. Na Erlenmeyerovu se tikvicu priključi kondenzator s povratnim protokom. Ostavi se da ključa točno 10 minuta. Odmah se ohladi u hladnoj vodi i nakon približno pet minuta titrira na sljedeći način:

Doda se 10 ml otopine kalijevog jodida (točka 3.12.) i odmah nakon toga (oprezno, zbog opasnosti od snažnog pjenjenja) 25 ml sumporne kiseline (točka 3.11.). Titrira se otopinom natrijevog tiosulfata (točka 3.9.) do pojave mutno žute boje, doda se indikator škroba (točka 3.10.) i dovrši titracija.

Jednaka se titracija izvede bez ključanja na točno izmjerenoj smjesi 25 ml Luff-Schoorlovog reagensa (točka 3.8.) i 25 ml vode, nakon dodavanja 10 ml otopine kalijevog jodida (točka 3.12.) i 25 ml sumporne kiseline (točka 3.11.).

6.    Izračun rezultata

Iz tablice se odredi količina glukoze u mg koja odgovara razlici između vrijednosti obje titracije, iskazanih u mg natrijevog tiosulfata 0,1 mol/l. Rezultat se iskazuje kao postotni udio uzorka.

7.    Posebni postupci

Homogenizira se i filtrira. Etanol se ukloni u skladu s točkom 5.1. Ako nema dekstriniranog škroba, dopuni se destiliranom vodom do oznake.

8.    Napomene

U oba se slučaja količina šećera određuje Luff-Schoorlovom metodom i izračunava u mg glukoze. Jedna se vrijednost oduzme od druge i razlika iskazuje kao postotni udio uzorka.

Primjer:

Dva korištena volumena odgovaraju, za svaki postupak određivanja, uzorku od 250 mg.

U prvom se slučaju potroši 17 ml otopine natrijevog tiosulfata 0,1 mol/l, što odgovara 44,2 mg glukoze; u drugom se potroši 11 ml, što odgovara 27,6 mg glukoze.

Razlika je 16,6 mg glukoze.

Udio reducirajućih šećera (osim laktoze), izračunan kao glukoza, dakle iznosi:

K.   ODREĐIVANJE LAKTOZE

1.    Svrha i područje primjene

Ovom se metodom omogućuje određivanje razine laktoze u hrani za životinje koja sadrži više od 0,5 % laktoze.

2.    Načelo

Šećeri se otope u vodi. Otopina se fermentira kvascem vrste Saccharomyces cerevisiae koji ne mijenja laktozu. Nakon bistrenja i filtriranja, udio laktoze u filtratu određuje se Luff-Schoorlovom metodom.

3.    Reagensi

Uz oprezno miješanje, u otopinu natrijevog karbonata (točka 3.4.3.) ulije se otopina limunske kiseline (točka 3.4.2.). Doda se otopina bakrovog sulfata (točka 3.4.1.) i dopuni vodom do 1 litre. Ostavi se preko noći i filtrira. Provjeri se koncentracija tako dobivenog reagensa (Cu 0,05 mol/l, Na2 CO3 1 mol/l). pH vrijednost otopine je približno 9,4.

4.    Oprema

Vodena kupelj s termostatom postavljenim na 38 – 40 °C

5.    Postupak

Odvagne se 1 g uzorka s preciznošću od 1 mg i prenese u graduiranu tikvicu obujma 100 ml. Doda se 25 – 30 ml vode. Tikvica se potopi u ključajuću vodenu kupelj i u njoj ostavi 30 minuta, zatim se ohladi na približno 35 °C. Doda se 5 ml suspenzije kvasca (točka 3.1.) i homogenizira. Tikvica se ostavi 2 sata u vodenoj kupelji na temperaturi 38 – 40 °C. Ohladi se na približno 20 °C.

Doda se 2,5 ml otopine Carrez I (točka 3.2.) i miješa 30 sekundi, zatim 2,5 ml otopine Carrez II (točka 3.3.) i ponovo miješa 30 sekundi. Dopuni se vodom do 100 ml, promiješa i filtrira. Dio filtrata ne veći od 25 ml, koji poželjno sadrži 40 do 80 mg laktoze, pipetom se prenese u Erlenmeyerovu tikvicu obujma 300 ml. Prema potrebi se dopuni vodom do 25 ml.

Na isti se način izvodi slijepa proba s 5 ml suspenzije kvasca (točka 3.1.). Udio laktoze se određuje Luff-Schoorlovom metodom na sljedeći način: doda se točno 25 ml Luff-Schoorlovog reagensa (točka 3.4.) i 2 zrna plovućca (točka 3.5.). Uz ručno miješanje zagrijava se iznad otvorenog plamena srednje jakosti tako da tekućina proključa za približno dvije minute. Erlenmeyerova se tikvica odmah postavi na žičanu mrežicu presvučenu azbestom s otvorom promjera 6 cm, ispod kojeg se upali plamen. Plamen se namjesti tako da se zagrijava samo dno Erlenmeyerove tikvice. Na Erlenmeyerovu se tikvicu priključi kondenzator s povratnim protokom. Ostavi se da vrije točno 10 minuta. Odmah se ohladi u hladnoj vodi i nakon približno pet minuta titrira na sljedeći način:

Doda se 10 ml otopine kalijevog jodida (točka 3.6.) i odmah nakon toga (oprezno, zbog opasnosti od snažnog pjenjenja) 25 ml sumporne kiseline (točka 3.7.). Titrira se otopinom natrijevog tiosulfata (točka 3.8.) do pojave mutno žute boje, doda se indikator škroba (točka 3.9.) i dovrši titracija.

Jednaka se titracija izvede bez ključanja na točno izmjerenoj smjesi 25 ml Luff-Schoorlovog reagensa (točka 3.4.) i 25 ml vode, nakon dodavanja 10 ml otopine kalijevog jodida (točka 3.6.) i 25 ml sumporne kiseline (točka 3.7.).

6.    Izračun rezultata

Iz tablice se odredi količina laktoze u mg koja odgovara razlici između vrijednosti dviju titracija, iskazanih u ml natrijevog tiosulfata 0,1 mol/l.

Rezultat se iskazuje kao postotak udjela bezvodne laktoze u uzorku.

7.    Napomena

Za proizvode koji sadrže više od 40 % fermentiranog šećera koristi se više od 5 ml suspenzije kvasca (točka 3.1.).

L.   ODREĐIVANJE ŠKROBA

POLARIMETRIJSKA METODA

1.    Svrha i područje primjene

Ovom se metodom omogućuje određivanje razine škroba i visokomolekularnih produkata razgradnje škroba u hrani za životinje, za provjeru usklađenosti s deklariranom energetskom vrijednosti (odredbe iz Priloga VII.) i Direktivom Vijeća 96/25/EZ ( 10 ).

2.    Načelo

Metoda obuhvaća dva postupka određivanja. U prvom se postupku uzorak obradi razrijeđenom klorovodičnom kiselinom. Nakon bistrenja i filtriranja, polarimetrijom se izmjeri optička rotacija otopine.

U drugom se postupku uzorak ekstrahira s 40 %-tnim etanolom. Nakon zakiseljavanja filtrata klorovodičnom kiselinom, bistrenja i filtriranja, izmjeri se optička rotacija na isti način kao u prvom postupku određivanja.

Razlika između dvaju mjerenja, pomnožena s poznatim faktorom, daje udio škroba u uzorku.

3.    Reagensi

Koncentracija se mora provjeriti titracijom s otopinom natrijevog hidroksida 0,1 mol/l u prisutnosti metil crvenila 0,1 % (m/v) u etanolu 94 % (v/v). Za neutralizaciju 10 ml potrebno je 30,94 ml NaOH 0,1 mol/l.

4.    Oprema

5.    Postupak

5.1.    Priprema uzorka

Uzorak se usitni tako da sve čestice mogu proći kroz sito s okruglim očicama promjera 0,5 mm.

5.2.    Određivanje ukupne optičke rotacije (P ili S) (vidjeti napomenu pod točkom pod točkom 7.1.)

Odvagne se 2,5 g usitnjenog uzorka s preciznošću od 1 mg i prenese u graduiranu tikvicu obujma 100 ml. Doda se 25 ml klorovodične kiseline (točka 3.2.), protrese tako da se pokusni uzorak ravnomjerno raspodijeli i doda još 25 ml klorovodične kiseline (točka 3.2.). Tikvica se potopi u ključajuću vodenu kupelj i prve 3 minute snažno i ravnomjerno trese kako bi se spriječilo nastajanje aglomerata. U vodenoj kupelji mora biti toliko vode da kada se u nju potopi tikvica kupelj ostane na točki ključanja. Tikvica se tijekom tresenja ne smije vaditi iz kupelji. Nakon točno 15 minuta, tikvica se izvadi iz kupelji, doda se 30 ml hladne vode i odmah ohladi na 20 °C.

Doda se 5 ml otopine Carrez I (točka 3.3.) i trese približno 30 sekundi. Zatim se doda 5 ml otopine Carrez II (točka 3.4.) i ponovo trese 30 sekundi. Dopuni se vodom do oznake, promiješa i filtrira. Ako filtrat nije potpuno bistar (što se rijetko događa), ponovi se postupak određivanja uz korištenje veće količine otopina Carrez I i II, na primjer 10 ml.

Polarimetrom ili saharimetrom se izmjeri optička rotacija otopine u epruveti obujma 200 ml.

5.3.    Određivanje optičke rotacije (P’ ili S’) tvari topljivih u etanolu 40 %

Odvagne se 5 g uzorka s preciznošću od 1 mg, prenese u graduiranu tikvicu obujma 100 ml i doda približno 80 ml etanola (točka 3.5.) (vidjeti napomenu pod točkom 7.2.). Tikvica se ostavi 1 sat na sobnoj temperaturi; u tom se vremenskom razdoblju šest puta snažno protrese kako bi se pokusni uzorak temeljito promiješao s etanolom. Dopuni se etanolom (točka 3.5.) do oznake, promiješa i filtrira.

Pipetom se prenese 50 ml filtrata (što odgovara količini od 2,5 g uzorka) u Erlenmeyerovu tikvicu obujma 250 ml, doda se 2,1 ml klorovodične kiseline (točka 3.1.) i snažno protrese. Kondenzator s povratnim protokom se priključi na Erlenmeyerovu tikvicu i uroni u ključajuću vodenu kupelj. Nakon točno 15 minuta, Erlenmeyerova se tikvica izvadi iz kupelji, a njezin udio prenese u graduiranu tikvicu obujma 100 ml, ispere s malo hladne vode i ohladi na 20 °C.

Izbistri se otopinama Carrez I (točka 3.3.) i II (točka 3.4.), dopuni vodom do oznake, promiješa i filtrira, a zatim se izmjeri optička rotacija, kako je navedeno u drugom i trećem stavku točke 5.2.

6.    Izračun rezultata

Udio škroba (%) izračunava se na sljedeći način:

6.1.    Mjerenje polarimetrom Udio škroba (%)

P

=

ukupna optička rotacija u kutnim stupnjevima

P’

=

optička rotacija tvari topljivih u etanolu 40 % (v/v) etanolu, u kutnim stupnjevima

=

specifična optička rotacija čistog škroba. Brojčane vrijednosti koje se smatraju uobičajeno prihvaćenima za ovaj faktor su: +185,9 o: rižin škrob; +185,7 o: krumpirov škrob; +184,6 o: kukuruzni škrob; +182,7 o: pšenični škrob; +181,5 o: ječmeni škrob; +181,3 o: zobeni škrob; +184,0 o: druge vrste škroba i škrobnih smjesa u krmnim smjesama.

6.2    Mjerenje saharimetrom Udio škroba (%)

S

=

ukupna optička rotacija u stupnjevima saharimetra

S’

=

optička rotacija tvari topljivih u 40 %-tnom etanolu (v/v), u stupnjevima saharimetra

N

=

masa (g) saharoze u 100 ml vode pri kojoj je optička rotacija 100 saharimetarskih stupnjeva, kada se mjeri upotrebom epruvete od 200 mm 16,29 g za francuske saharimetre 26,00 g za njemačke saharimetre 20,00 g za mješovite saharimetre.

=

specifična optička rotacija čistog škroba (vidjeti 6.1.)

6.3.    Ponovljivost

Razlika između rezultata dvaju usporednih postupaka određivanja, izvedenih na istom uzorku, ne smije prijeći 0,4 apsolutne vrijednosti za udio škroba niži od 40 % i 1 % relativne vrijednosti za udio škroba jednak ili veći od 40 %.

7.    Napomene

M.   ODREĐIVANJE SIROVOG PEPELA

1.    Svrha i područje primjene

Ovom se metodom omogućuje određivanje udjela sirovog pepela u hrani za životinje.

2.    Načelo

Uzorak se spali na 550 °C; ostatak se izvaže.

3.    Reagensi

Amonijev nitrat, 20 %-tna (m/v).

4.    Oprema

5.    Postupak

Odvagne se približno 5 g uzorka s preciznošću od 1 mg (2,5 g kod proizvoda koji lako nabubre) i prenese u lončić za spaljivanje koji se prethodno zagrije na 550 °C, ohladi i tarira. Lončić se postavi na grijaću ploču i postupno zagrijava sve dok tvar ne pougljeni. Spali se u skladu s točkom 5.1. ili 5.2.

6.    Izračun rezultata

Masa ostatka se izračuna tako da se oduzme tara.

Rezultat se iskazuje kao postotni udio uzorka.

7.    Napomene

N.   ODREĐIVANJE PEPELA NETOPLJIVOG U KLOROVODIČNOJ KISELINI

1.    Svrha i područje primjene

Ovom se metodom omogućuje određivanje razine mineralnih tvari u hrani za životinje, netopljivih u klorovodičnoj kiselini. Uzimajući u obzir prirodu uzorka mogu se primijeniti dvije metode.

2.    Načelo

3.    Reagensi

4.    Oprema

5.    Postupak

5.1.    Metoda A

Uzorak se spali u skladu s metodom za određivanje sirovog pepela. Može se koristiti i pepeo dobiven tijekom navedene analize.

Pepeo se prenese u čašu obujma 250 ml do 400 ml sa 75 ml klorovodične kiseline (točka 3.1.). Polako se zagrije do ključanja i petnaest minuta ostavi lagano ključati. Topla otopina se filtrira kroz papir za filtriranje bez pepela, ostatak se ispire toplom vodom sve do prestanka kisele reakcije. Filtar s ostatkom i pepelom se osuši u tariranom lončiću za spaljivanje na 550 – 700 °C. Ohladi se u eksikatoru i izvaže.

5.2.    Metoda B

Odvagne se 5 g uzorka s preciznošću od 1 mg i prenese u čašu obujma 250 ml do 400 ml. Doda se 25 ml vode, zatim 25 ml klorovodične kiseline (točka 3.1.), promiješa i pričeka da se reakcija umiri. Doda se još 50 ml klorovodične kiseline (točka 3.1.). Pričeka se dok potpuno ne prestane ispuštanje plina, zatim se čaša stavi u ključajuću vodenu kupelj i tamo drži 30 minuta ili prema potrebi dulje kako bi se potpuno hidrolizirao sav eventualno prisutan škrob. Udio se filtrira dok je topao kroz filtar bez pepela, a filtar se ispere s 50 ml tople vode (vidjeti napomenu pod točkom 7.). Filtar koji sadrži ostatak prenese se u lončić za spaljivanje, osuši i spali na 550 – 700 °C. Pepeo se prenese u čašu obujma 250 ml do 400 ml sa 75 ml klorovodične kiseline (točka 3.1.); nastavi se kako je opisano u drugom podstavku točke 5.1.

6.    Izračun rezultata

Masa ostatka se izračuna tako da se oduzme tara. Rezultat se iskazuje kao postotni udio uzorka.

7.    Napomena

Ako pri filtriranju nastupe poteškoće, analiza se ponovi, pri čemu se 50 ml klorovodične kiseline (točka 3.1.) zamijeni s 50 ml trikloroctene kiseline 20 % (točka 3.2.), a filtar ispere toplom otopinom trikloroctene kiseline 1 % (točka 3.3.).

O.   ODREĐIVANJE KARBONATA

1.    Svrha i područje primjene

Ovom se metodom omogućuje određivanje količine karbonata u većini hrane za životinje, koji se uobičajeno iskazuju kao kalcijev karbonat.

Međutim, u nekim se slučajevima (na primjer, kod željezovog karbonata) mora primijeniti posebna metoda.

2.    Načelo

Karbonati se razlažu u klorovodičnoj kiselini; oslobođeni se ugljikov dioksid prikupi u graduiranu epruvetu, a njegov obujam usporedi s obujmom koji se pod istim uvjetima oslobađa iz poznate količine kalcijevog karbonata.

3.    Reagensi

4.    Oprema

Scheibler-Dietrichova naprava (vidjeti sliku) ili druga jednakovrijedna naprava.

5.    Postupak

Ovisno o sadržaju karbonata u uzorku odvagne se dio uzorka, kako je navedeno dalje u tekstu:

Odvagnuti se dio uzorka prenese u posebnu tikvicu (slika 4.) naprave, opremljenu malom epruvetom od nelomljivog materijala u kojoj se nalazi 10 ml klorovodične kiseline (točka 3.1.) te se tikvica spoji s napravom. Trosmjerni se pipac (5) okrene tako da je epruveta (1) otvorena prema van. Pomičnom epruvetom (2), napunjenom obojenom sumpornom kiselinom (točka 3.3.) i povezanom s graduiranom epruvetom (1), razina tekućine dovede se do oznake nula. Pipac (5) se okrene tako da se spoje epruvete (1) i (3), zatim se provjeri je li razina na oznaci nula.

Naginjanjem tikvice (4) klorovodična se kiselina (točka 3.1.) polako prelijeva preko uzorka. Tlak se izjednači spuštanjem epruvete (2). Tikvica (4) se trese sve dok potpuno ne prestane oslobađanje ugljikovog dioksida.

Ponovo se uspostavi tlak vraćanjem razine tekućina u epruvetama (1) i (2) na istu razinu. Rezultat se očita nakon nekoliko minuta kada se ustali obujam plina.

U istim se uvjetima izvede kontrolni pokus s 0,5 g kalcijevog karbonata (točka 3.2.).

6.    Izračun rezultata

Udio karbonata, iskazanih kao kalcijev karbonat, izračunava se sljedećom formulom:

pri čemu je:

X

=

% (m/m) karbonata u uzorku, iskazanih kao kalcijev karbonat

V

=

ml oslobođenog CO2 iz dijela uzorka

V1

=

ml oslobođenog CO2 iz 0,5 g CaCO3

m

=

masa dijela uzorka u gramima.

7.    Napomene

P.   ODREĐIVANJE UKUPNOG FOSFORA

FOTOMETRIJSKA METODA

1.    Svrha i područje primjene

Ovom se metodom omogućuje određivanje ukupnog udjela fosfora u hrani za životinje. Osobito je primjerena za analizu proizvoda s niskim sadržajem fosfora. U nekim se slučajevima (kod proizvoda bogatih fosforom) može primijeniti i gravimetrijska metoda.

2.    Načelo

Uzorak se mineralizira bilo suhim sagorijevanjem (kod organske hrane za životinje) bilo digestijom kiselinom (kod mineralnih mješavina i tekuće hrane za životinje) i prenese u kiselu otopinu. Otopina se obradi molibdovanadatnim reagensom. Optička gustoća tako dobivene žute otopine mjeri se spektrofotometrom na 430 nm.

3.    Reagensi

4.    Oprema

5.    Postupak

5.1.    Priprema otopine

Uzimajući u obzir prirodu uzorka, otopina se pripravlja u skladu s točkom 5.1.1. ili 5.1.2.

5.1.1.    Standardni postupak

Odvagne se 1 g uzorka ili više s preciznošću od 1 mg. Uzorak se prenese u Kjeldahlovu tikvicu, doda se 20 ml sumporne kiseline (točka 3.5.) i protrese kako bi se uzorak u potpunosti natopio kiselinom i spriječilo njegovo prianjanje na stijenke tikvice, zatim se zagrije i ostavi ključati 10 minuta. Ostavi se da se ohladi, doda se 2 ml dušične kiseline (točka 3.4), lagano se zagrije, malo se ohladi, doda se još malo dušične kiseline (točka 3.4.) i ponovo zagrije do ključanja. Postupak se ponavlja sve dok se ne dobije bezbojna otopina. Ohladi se, doda malo vode, tekućina se odlije u graduiranu tikvicu obujma 500 ml, a Kjeldahlova tikvica ispere vrućom vodom. Ostavi se da se ohladi, dopuni vodom do oznake, homogenizira i filtrira.

5.1.2.    Uzorci koji sadrže organske tvari i ne sadrže kalcijeve i magnezijeve dihidrogen fosfate

Odvagne se i prenese u lončić za spaljivanje 2,5 g uzorka s preciznošću od 1 mg. Doda se 1 g kalcijevog karbonata (točka 3.1.) i miješa dok se tvari u potpunosti ne izmiješaju. Spaljuje se u pećnici pri 550 °C do nastanka bijelog ili sivog pepela (mala količina ugljena ne predstavlja problem). Pepeo se prenese u čašu obujma 250 ml. Doda se 20 ml vode i klorovodične kiseline (točka 3.2.) sve dok ne prestane pjenjenje. Doda se još 10 ml klorovodične kiseline (točka 3.2.). Čaša se stavi u pješčanu kupelj i ostavi da se otpari do suhog, kako bi kvarcni pijesak postao netopljiv. Ostatak se ponovo otopi u 10 ml dušične kiseline (točka 3.3.) i ostavi ključati 5 minuta u pješčanoj kupelji ili na grijaćoj ploči, ali se ne smije potpuno otpariti. Tekućina se odlije u graduiranu tikvicu obujma 500 ml, čaša se više puta ispere vrućom vodom. Ostavi se da se ohladi, dopuni vodom do oznake, homogenizira i filtrira.

5.2.    Nastanak obojenja i mjerenje optičke gustoće

Razrijedi se alikvot filtrata iz točke 5.1.1. ili 5.1.2. do koncentracije fosfora ne veće od 40 μg/ml. U epruvetu (točka 4.6.) se prenese 10 ml te otopine i doda 10 ml molibdovanadatnog reagensa (točka 3.6.). Homogenizira se i ostavi najmanje 10 minuta na 20 °C. Spektrofotometrom se izmjeri optička gustoća na 430 nm usporedbom s otopinom dobivenom dodavanjem 10 ml molibdovanadatnog reagensa (točka 3.6.) u 10 ml vode.

5.3.    Kalibracijska krivulja

Iz standardne otopine (točka 3.7.) priprave se otopine koje sadrže 5, 10, 20, 30 i 40 μg fosfora na ml. Uzme se po 10 ml od svake navedene otopine i doda 10 ml molibdovanadatnog reagensa (točka 3.6.). Homogenizira se i ostavi najmanje 10 minuta na 20 °C. Izmjeri se optička gustoća u skladu s točkom 5.2. Kalibracijska se krivulja pripremi tako da se u dijagram unesu izmjerene optičke gustoće odgovarajućih količina fosfora. Za koncentracije u rasponu od 0 – 40 μg/ml krivulja je linearna.

6.    Izračun rezultata

Količina fosfora u pokusnom uzorku određuje se iz kalibracijske krivulje.

Rezultat se iskazuje kao postotni udio uzorka.

Ponovljivost

Razlika između rezultata dvaju usporednih postupaka određivanja, izvedenih na istom uzorku, ne smije prijeći:

Q.   ODREĐIVANJE KLORA IZ KLORIDA

1.    Svrha i područje primjene

Ovom se metodom omogućuje određivanje količine klora u kloridima topljivima u vodi koji se uobičajeno iskazuju kao natrijev klorid. Primjenjuje se za svu hranu za životinje.

2.    Načelo

Kloridi se otope u vodi. Ako proizvod sadrži organske tvari, koristi se postupak bistrenja. Otopina se lagano zakiseli dušičnom kiselinom, a kloridi istalože u obliku srebrovog klorida, upotrebom otopine srebrovog nitrata. Višak srebrovog nitrata titrira se otopinom amonijevog tiocijanata po Volhardovoj metodi.

3.    Reagensi

4.    Oprema

Mješalica (rotacijska): približno 35 do 40 okr./min.

5.    Postupak

5.1.    Priprema otopine

Uzimajući u obzir prirodu uzorka, otopina se pripravlja prema točki 5.1.1., 5.1.2. ili 5.1.3.

Istodobno se izvodi slijepa proba bez uzorka koji se analizira.

5.1.1.    Uzorci bez organskih tvari

Odvagne se najviše 10 g uzorka koji sadrži najviše 3 g klora u obliku klorida s preciznošću od 1 mg. Prenese se u graduiranu tikvicu obujma 500 ml s 400 ml vode na približno 20 °C. Miješa se 30 minuta u rotacijskoj mješalici, dopuni do oznake, homogenizira i filtrira.

5.1.2.    Uzorci koji sadrže organske tvari, osim proizvoda iz točke 5.1.3.

Odvagne se približno 5 g uzorka s preciznošću od 1 mg i prenese zajedno s 1 g aktivnog uglja u graduiranu tikvicu obujma 500 ml. Doda se 400 ml vode temperature približno 20 °C i 5 ml otopine Carrez I (točka 3.7.), miješa se 30 sekundi i doda 5 ml otopine Carrez II (točka 3.8.). Miješa se 30 minuta u rotacijskoj mješalici, dopuni do oznake, homogenizira i filtrira.

5.1.3.    Kuhana hrana za životinje, lanene pogače i brašno, proizvodi bogati lanenim brašnom i drugi proizvodi bogati sluzima ili koloidnim tvarima (na primjer, dekstrinirani škrob)

Otopina se pripravi u skladu s točkom 5.1.2., ali se ne filtrira. Dekantira se (prema potrebi centrifugira), uzme se 100 ml supernatanta i prenese u graduiranu tikvicu obujma 200 ml. Pomiješa se s acetonom (točka 3.6.) i s tim otapalom dopuni do oznake, homogenizira i filtrira.

5.2.    Titracija

Pipetom se u Erlenmeyerovu tikvicu prenese 25 – 100 ml filtrata (uzimajući u obzir pretpostavljeni udio klora) dobivenog postupkom iz točke 5.1.1., 5.1.2. ili 5.1.3. Alikvotni dio ne smije sadržavati više od 150 mg klora (Cl). Prema potrebi se razrijedi vodom na najmanje 50 ml, doda se 5 ml dušične kiseline (točka 3.4), 20 ml zasićene otopine amonij-željezovog sulfata (točka 3.3.) i 2 kapi otopine amonijevog tiocijanata (točka 3.1.), koji se prenese iz birete napunjene do nulte oznake. Biretom se prenese otopina srebrovog nitrata (točka 3.2.) tako da nastane 5 ml viška. Doda se 5 ml dietiletra (točka 3.5.) i dobro protrese tako da se talog zgruša. Višak srebrovog nitrata titrira se otopinom amonijevog tiocijanata (točka 3.1.) sve dok crvenkasto-smeđe obojenje ne potraje 1 minutu.

6.    Izračun rezultata

Količina klora (X), iskazana kao postotni udio natrijevog klorida, izračunava se sljedećom formulom:

pri čemu je:

V1

=

ml dodane otopine srebrovog nitrata 0,1 mol/l;

V2

=

ml otopine amonijevog tiocijanata 0,1 mol/l korištene za titraciju;

m

=

masa uzorka.

Ako se pri slijepoj probi potroši otopina srebrovog nitrata 0,1 mol/l, ta se vrijednost oduzme od obujma (V1 – V2).

7.    Napomene

---

PRILOG IV.

ANALITIČKE METODE ZA KONTROLU RAZINE DOPUŠTENIH KRMNIH DODATAKA

A.   ODREĐIVANJE VITAMINA A

1.    Svrha i područje primjene

Ovom se metodom omogućuje određivanje razine vitamina A (retinola) u hrani za životinje i premiksima. Vitamin A uključuje trans-retinil alkohol i njegove cis izomere koji se određuju ovom metodom. Udio vitamina A iskazuje se u međunarodnim jedinicama (IU) na kg. Jedna IU odgovara djelovanju 0,300 μg trans-vitamin A alkohola ili 0,344 μg trans-vitamin A acetata ili 0,550 μg trans-vitamin A palmitata.

Granica kvantifikacije je 2 000 IU vitamina A/kg.

2.    Načelo

Uzorak se hidrolizira otopinom etanolnog kalijevog hidroksida, a vitamin A se ekstrahira laganim petrolejem. Otapalo se ukloni otparivanjem, a ostatak otopi u metanolu i prema potrebi razrijedi do tražene koncentracije. Udio vitamina A se određuje visoko djelatnom tekućinskom kromatografijom reverznih faza (RP–HPLC) s UV ili fluorescencijskim detektorom. Odaberu se oni kromatografski parametri koji omogućuju da se trans-vitamin A alkohol i njegovi cis izomeri ne razdvoje.

3.    Reagensi

4.    Oprema

5.    Postupak

Napomena

:

Vitamin A je osjetljiv na UV svjetlo i oksidaciju. Svi se postupci izvode bez prisutnosti svjetla (u laboratorijskom posuđu od smeđeg stakla ili u staklenim posudama zaštićenim aluminijskom folijom) i kisika (ispire se dušikom). Tijekom ekstrakcije zrak iznad tekućine zamijeni se dušikom (povremenim popuštanjem čepa izbjegava se previsoki tlak).

5.1.    Priprema uzorka

Uzorak se samelje tako da prolazi kroz sito veličine očice 1 mm, pri čemu treba izbjegavati stvaranje topline. Mljevenje se mora izvršiti neposredno prije vaganja i saponifikacije, inače može doći do gubitka vitamina A.

5.2.    Saponifikacija

Ovisno o sadržaju vitamina A, odvagne se 2 – 25 g uzorka s preciznošću od 1 mg i prenese u tikvicu s ravnim dnom ili koničnu tikvicu obujma 500 ml (točka 4.2.1.). Uz stalno vrtloženje, jedno za drugim dodaje se 130 ml etanola (točka 3.1.), približno 100 mg BHT-a (točka 3.13.), 2 ml otopine natrijevog askorbata (točka 3.5.) i 2 ml otopine natrijevog sulfida (točka 3.6.). Na tikvicu se priključi kondenzator (točka 4.3.) i tikvica potopi u vodenu kupelj s magnetnom mješalicom (točka 4.7.). Zagrije se do ključanja i 5 minuta ostavi uz refluks. Zatim se kroz kondenzator doda 25 ml otopine kalijevog hidroksida (točka 3.4.) i ostavi uz refluks (točka 4.3.) sljedećih 25 minuta, uz miješanje pod laganom strujom dušika. Zatim se kondenzator ispere s približno 20 ml vode, a udio tikvice ohladi na sobnu temperaturu.

5.3.    Ekstrakcija

Otopina za saponifikaciju kvantitativno se prenese dekantiranjem u lijevak za odjeljivanje obujma 1 000 ml (točka 4.2.3.) ili u napravu za ekstrakciju (točka 4.8.), tako što se ispere s ukupno 250 ml vode. Zatim se tikvica za saponifikaciju ispere s 25 ml etanola (točka 3.1.) i 100 ml laganog petroleja (točka 3.2.), a isprane tekućine prenesu u lijevak za odjeljivanje ili uređaj za ekstrakciju. Omjer vode i etanola u pomiješanim otopinama mora biti približno 2:1. Snažno se trese 2 minute i zatim ostavi 2 minute da se slegne.

5.3.1.    Ekstrakcija lijevkom za odjeljivanje (točka 4.2.3.)

Kad se slojevi razdvoje (vidjeti napomenu pod točkom pod točkom 7.3.), sloj laganog petroleja prenese se u drugi lijevak za odjeljivanje (točka 4.2.3.). Ekstrakcija se ponovi dvaput sa 100 ml laganog petroleja (točka 3.2.) i dvaput s 50 ml laganog petroleja (točka 3.2.).

Pomiješani se ekstrakti u lijevku za odjeljivanje dvaput isperu sa 100 ml vode, uz lagano vrtloženje (kako bi se spriječio nastanak emulzija), zatim uz ponavljano protresivanje s dodatnim obrocima od po 100 ml vode, sve dok voda pri dodavanju otopine fenolftaleina (točka 3.7.) ne ostane bezbojna (obično je dovoljno četiri ispiranja). Isprani se ekstrakt filtrira kroz suhi nabrani filtar za odjeljivanje faza (točka 4.4) u graduiranu tikvicu obujma 500 ml (točka 4.2.2.) kako bi se uklonila preostala voda. Lijevak za odjeljivanje i filtar se isperu s 50 ml laganog petroleja (točka 3.2.), dopuni se laganim petrolejem do oznake (točka 3.2.) i dobro promiješa.

5.3.2.    Ekstrakcija napravom za ekstrakciju (točka 4.8.)

Kada se slojevi razdvoje (vidjeti napomenu pod točkom 7.3.), čep staklenog valjka (točka 4.8.1.) se zamijeni uloškom od brušenog stakla (točka 4.8.2.), a donji dio prilagodljive cijevi u obliku slova U postavi se odmah iznad razine veznog sklopa. Tlakom koji tvori dušik u bočnoj ručici, gornji se sloj laganog petroleja prenese u lijevak za odjeljivanje obujma 1 000 ml (točka 4.2.3.). U stakleni se valjak doda 100 ml laganog petroleja (točka 3.2.), začepi i dobro protrese. Pričeka se do razdvajanja slojeva, a gornji se sloj prenese u lijevak za odjeljivanje kao i prije. Postupak ekstrakcije se ponovi sa 100 ml laganog petroleja (točka 3.2.), zatim dvaput s po 50 ml laganog petroleja (točka 3.2.), a slojevi laganog petroleja dodaju u lijevak za odjeljivanje.

Pomiješani se ekstrakti laganog petroleja isperu, u skladu s točkom 5.3.1., a zatim se nastavi u skladu s navedenom točkom.

5.4.    Priprema otopine uzorka za HPLC

Alikvotni dio otopine laganog petroleja (iz točke 5.3.1. ili 5.3.2.) prenese se pipetom u kruškastu tikvicu obujma 250 ml (točka 4.2.4.). Otapalo se otpari skoro do suhog u rotacijskom otparivaču (točka 4.1.) pri sniženom tlaku i temperaturi kupelji do 40 °C. Dovođenjem dušika uspostavi se atmosferski tlak (točka 3.10.), a tikvica se izvadi iz rotacijskog otparivača. Preostalo se otapalo otpari u struji dušika (točka 3.10.), a ostatak odmah otopi u poznatom volumenu (10 – 100 ml) metanola (točka 3.3.) (koncentracija vitamina A mora biti u rasponu od 5 do 30 IU/ml).

5.5.    Određivanje HPLC-om

Vitamin A se razdvaja na koloni C18 s reverznim fazama (točka 4.5.1.), koncentracija se izmjeri UV detektorom (325 nm) ili fluorescencijskim detektorom (ekscitacija: 325 nm, emisija: 475 nm) (točka 4.5.2.).

Ubrizga se alikvotni dio (npr. 20 μl) otopine metanola dobivene u točki 5.4. i eluira mobilnom fazom (točka 3.9.). Izračuna se srednja vrijednost visine (površine) vršaka za više ubrizgavanja iste otopine uzorka i srednje vrijednosti visina (površina) vršaka za više ubrizgavanja kalibracijskih otopina (točka 5.6.2.).

Uvjeti za HPLC

Sljedeći uvjeti predlažu se kao smjernice; mogu se koristiti i drugi uvjeti ako se njima jamče jednakovrijedni rezultati.

5.6.    Kalibracija

5.6.1.    Priprema radnih standardnih otopina

Pipetom se prenese 20 ml osnovne otopine acetata vitamina A (točka 3.11.1.) ili 20 ml osnovne otopine palmitata vitamina A (točka 3.12.1.) u tikvicu s ravnim dnom ili konusnu tikvicu obujma 500 ml (točka 4.2.1.) i hidrolizira u skladu s točkom 5.2., ali bez dodatka BHT-a. Zatim se ekstrahira s laganim petrolejem (točka 3.2.) u skladu s točkom 5.3. i dopuni laganim petrolejem (točka 3.2.) do 500 ml. U rotacijskom se otparivaču (vidjeti 5.4.) otpari 100 ml ovog ekstrakta gotovo do suhog, strujom dušika (točka 3.10.) ukloni preostalo otapalo, a ostatak ponovno otopi u 10,0 ml metanola (točka 3.3.). Nominalna koncentracija ove otopine je 560 IU vitamina A na ml. Točan udio se određuje u skladu s točkom 5.6.3.3. Radna standardna otopina mora se pripremiti svježa prije upotrebe.

Pipetom se prenese 2,0 ml ove radne standardne otopine u graduiranu tikvicu obujma 20 ml, dopuni metanolom (točka 3.3.) do oznake i promiješa. Nominalna koncentracija takve razrijeđene radne standardne otopine iznosi 56 IU vitamina A na ml.

5.6.2.    Priprema kalibracijske otopine i kalibracijske krivulje

Prenese se 1,0, 2,0, 5,0 i 10,0 ml razrijeđene radne standardne otopine u seriju graduiranih tikvica obujma 20 ml, dopuni metanolom (točka 3.3.) do oznake i promiješa. Nominalne koncentracije ovih otopina iznose 2, 8, 5, 6, 14,0 i 28,0 IU vitamina A na ml.

Više se puta ubrizga 20 μl svake kalibracijske otopine i odrede srednje vrijednosti visina (površina) vršaka. Iz srednjih se vrijednosti visina (površina) vršaka nacrta kalibracijska krivulja uzimajući u obzir rezultate UV kontrole (točka 5.6.3.3.).

5.6.3.    UV standardizacija standardnih otopina

5.6.3.1.    Osnovna otopina acetata vitamina A

Pipetom se prenese 2,0 ml osnovne otopine acetata vitamina A (točka 3.11.1.) u graduiranu tikvicu obujma 50 ml (točka 4.2.2.) i dopuni 2-propanolom (točka 3.8.) do oznake. Nominalna koncentracija ove otopine je 56 IU vitamina A na ml. Pipetom se prenese 3,0 ml ove razrijeđene otopine acetata vitamina A u graduiranu tikvicu obujma 25 ml i dopuni 2-propanolom (točka 3.8.) do oznake. Nominalna koncentracija ove otopine je 6,72 IU vitamina A na ml. Izmjeri se UV spektar ove otopine prema 2-propanolu (točka 3.8.) u spektrofotometru (točka 4.6.) između 300 i 400 nm. Maksimalna ekstinkcija mora biti između 325 i 327 nm.

Izračun udjela vitamina A:

IU vitamina A/ml = E326 × 19,0

(E1 % 1 cm za acetat vitamina A = 1 530 na 326 nm u 2-propanolu)

5.6.3.2.    Osnovna otopina palmitata vitamina A

Pipetom se prenese 2,0 ml osnovne otopine palmitata vitamina A (točka 3.12.1.) u graduiranu tikvicu obujma 50 ml (točka 4.2.2.) i dopuni 2-propanolom (točka 3.8.) do oznake. Nominalna koncentracija ove otopine je 56 IU vitamina A na ml. Pipetom se prenese 3,0 ml ove razrijeđene otopine palmitata vitamina A u graduiranu tikvicu obujma 25 ml i dopuni 2-propanolom (točka 3.8.) do oznake. Nominalna koncentracija ove otopine je 6,72 IU vitamina A na ml. Izmjeri se UV spektar ove otopine prema 2-propanolu (točka 3.8.) u spektrofotometru (točka 4.6.) između 300 i 400 nm. Maksimalna ekstinkcija mora biti između 325 i 327 nm.

Izračun udjela vitamina A:

IU vitamina A/ml = E326 × 19,0

(E1 % 1 cm za palmitat vitamina A = 957 na 326 nm u 2-propanolu)

5.6.3.3.    Radna standardna otopina vitamina A

Pipetom se prenese 3,0 ml nerazrijeđene radne standardne otopine vitamina A, pripravljene u skladu s točkom 5.6.1., u graduiranu tikvicu obujma 50 ml (točka 4.2.2.) i dopuni 2-propanolom (točka 3.8.) do oznake. Pipetom se prenese 5,0 ml ove otopine u graduiranu tikvicu obujma 25 ml i dopuni 2-propanolom (točka 3.8.) do oznake. Nominalna koncentracija ove otopine je 6,72 IU vitamina A na ml. Izmjeri se UV spektar ove otopine prema 2-propanolu (točka 3.8.) u spektrofotometru (točka 4.6.) između 300 i 400 nm. Maksimalna ekstinkcija mora biti između 325 i 327 nm.

Izračun udjela vitamina A:

IU vitamina A/ml = E325 × 18,3

(E1 % 1 cm za vitamin A alkohol = 1 821 na 325 nm u 2-propanolu)

6.    Izračun rezultata

Iz srednje vrijednosti visine (površine) vršaka vitamina A iz otopine uzorka, određuje se koncentracija otopine uzorka u IU/ml iz kalibracijske krivulje (točka 5.6.2.).

Udio vitamina A (w) u uzorku, iskazan u IU/kg, izračunava se sljedećom formulom:

pri čemu je:

c

=

koncentracija vitamina A (točka 5.4.) u otopini uzorka, iskazana u IU/ml

V1

=

obujam otopine uzorka (točka 5.4.) u ml

V2

=

obujam alikvota korištenog u točki 5.4., u ml

m

=

masa pokusnog uzorka u gramima

7.    Napomene

Za provjeru pouzdanosti rezultata dobivenih korištenom analitičkom metodom na ovoj specifičnoj matrici (nadomjestak mlijeka) treba na dodatnom pokusnom uzorku izvesti test iskorištenja. Ako je iskorištenje manje od 80 %, rezultat analize treba korigirati za iskorištenje.

8.    Ponovljivost

Razlika između rezultata dvaju usporednih postupaka određivanja, izvedenih na istom uzorku, ne smije prijeći 15 % u odnosu na najviši rezultat.

9.    Rezultati međulaboratorijske studije ( 11 )

L

=

broj laboratorija

n

=

broj pojedinačnih vrijednosti

sr

=

standardna devijacija ponovljivosti

SR

=

standardna devijacija obnovljivosti

r

=

ponovljivost

R

=

obnovljivost

CVr

=

koeficijent varijacije ponovljivosti

CVR

=

koeficijent varijacije obnovljivosti.

B.   ODREĐIVANJE VITAMINA E

1.    Svrha i područje primjene

Ovom se metodom omogućuje određivanje razine vitamina E u hrani za životinje i premiksima. Udio vitamina E iskazuje se u mg DL-α-tokoferol acetata na kg. Količina od 1 mg DL-α-tokoferol acetata odgovara količini od 0,91 mg DL-α-tokoferola (vitamina E).

Granica kvantifikacije je 2 mg vitamina E/kg. Ova se granica kvantifikacije može dosegnuti samo fluorescencijskim detektorom. Granica kvantifikacije za UV detektor iznosi 10 mg/kg.

2.    Načelo

Uzorak se hidrolizira otopinom etanolnog kalijevog hidroksida, a vitamin E se ekstrahira laganim petrolejem. Otapalo se ukloni otparivanjem, a ostatak otopi u metanolu i prema potrebi razrijedi do tražene koncentracije. Udio vitamina E određuje se tekućinskom kromatografijom visoke učinkovitosti reverznih faza (RP–HPLC) i UV ili fluorescencijskim detektorom.

3.    Reagensi

4.    Oprema

5.    Postupak

Napomena

:

Vitamin E osjetljiv je na (UV) svjetlo i oksidaciju. Svi se postupci izvode bez svjetla (u laboratorijskom posuđu od smeđeg stakla ili u staklenim posudama zaštićenim aluminijskom folijom) i kisika (ispire se dušikom). Tijekom ekstrakcije zrak iznad tekućine zamijeni se dušikom (povremenim popuštanjem čepa izbjegava se previsoki tlak).

5.1.    Priprema uzorka

Uzorak se samelje tako da prolazi kroz sito veličine očice 1 mm, pri čemu treba izbjegavati stvaranje topline. Mljevenje se mora izvesti neposredno prije vaganja i saponifikacije, inače može doći do gubitka vitamina E.

5.2.    Saponifikacija

Ovisno o udjelu vitamina E, odvagne se 2 – 25 g uzorka s preciznošću od 0,01 g i prenese u tikvicu s ravnim dnom ili konusnu tikvicu obujma 500 ml (točka 4.2.1.). Uz stalno vrtloženje, jedno za drugim se dodaje 130 ml etanola (točka 3.1.), približno 100 mg BHT-a (točka 3.12.), 2 ml otopine natrijevog askorbata (točka 3.5.) i 2 ml otopine natrijevog sulfida (točka 3.6.). Na tikvicu se priključi kondenzator (točka 4.3.) i tikvica potopi u vodenu kupelj s magnetnom mješalicom (točka 4.7.). Zagrije se do ključanja i 5 minuta ostavi uz refluks. Kroz kondenzator (točka 4.3.) se doda 25 ml otopine kalijevog hidroksida (točka 3.4.) i ostavi uz refluks sljedećih 25 minuta, uz miješanje pod laganom strujom dušika. Zatim se kondenzator ispere s približno 20 ml vode, a udio tikvice ohladi na sobnu temperaturu.

5.3.    Ekstrakcija

Otopina za saponifikaciju kvantitativno se prenese dekantiranjem u lijevak za odjeljivanje kapaciteta 1 000 ml (točka 4.2.3.) ili u napravu za ekstrakciju (točka 4.8.), tako što se ispere s ukupno 250 ml vode. Zatim se tikvica za saponifikaciju ispere s 25 ml etanola (točka 3.1.) i 100 ml laganog petroleja (točka 3.2.) i isprane tekućine prenesu u lijevak za odjeljivanje ili napravu za ekstrakciju. Omjer vode i etanola u pomiješanim otopinama mora biti približno 2:1. Snažno se trese 2 minute, zatim ostavi stajati 2.

5.3.1.    Ekstrakcija lijevkom za odjeljivanje (točka 4.2.3.)

Kad se slojevi razdvoje (vidjeti napomenu pod točkom 7.3.), sloj laganog petroleja se prenese u drugi lijevak za odjeljivanje (točka 4.2.3). Ekstrakcija se ponovi dvaput sa 100 ml laganog petroleja (točka 3.2.) i dvaput s 50 ml laganog petroleja (točka 3.2.).

Pomiješani ekstrakti u lijevku za odjeljivanje isperu se dvaput sa 100 ml vode, uz lagano vrtloženje (kako bi se spriječio nastanak emulzija), zatim uz ponavljano protresivanjem s dodatnim obrocima od po 100 ml vode, sve dok voda pri dodavanju otopine fenolftaleina (točka 3.7.) ne ostane bezbojna (obično je dovoljno četiri ispiranja). Isprani se ekstrakt filtrira kroz suhi nabrani filtar za odjeljivanje faza (točka 4.4.) u graduiranu tikvicu obujma 500 ml (točka 4.2.2.) kako bi se uklonila preostala voda. Lijevak za odjeljivanje i filtar se isperu s 50 ml laganog petroleja (točka 3.2.), dopuni se laganim petrolejem (točka 3.2.) do oznake i dobro promiješa.

5.3.2.    Ekstrakcija napravom za ekstrakciju (točka 4.8.)

Kada se slojevi razdvoje (vidjeti napomenu pod točkom 7.3.), zamijeni se čep staklenog valjka (točka 4.8.1.) uloškom od brušenog stakla (točka 4.8.2.), a donji dio prilagodljive cijevi u obliku slova U postavi odmah iznad razine veznog sklopa. Tlakom koji tvori dušik u bočnoj ručici gornji se sloj laganog petroleja prenese u lijevak za odjeljivanje kapaciteta 1 000 ml (točka 4.2.3.). U stakleni se valjak doda 100 ml laganog petroleja (točka 3.2.), začepi i dobro protrese. Pričeka se do razdvajanja slojeva, te se gornji sloj prenese u lijevak za odjeljivanje kao i prije. Postupak ekstrakcije se ponovi sa 100 ml laganog petroleja (točka 3.2.), zatim dvaput s 50 ml laganog petroleja (točka 3.2.), a slojevi laganog petroleja dodaju u lijevak za odjeljivanje.

Pomiješani se ekstrakti laganog petroleja isperu, u skladu s točkom 5.3.1., zatim se nastavi u skladu s uputama u navedenoj točki.

5.4.    Priprema otopine uzorka za HPLC

Alikvotni dio otopine laganog petroleja (iz točke 5.3.1. ili 5.3.2.) prenese se pipetom u kruškastu tikvicu obujma 250 ml (točka 4.2.4.). Otapalo se otpari skoro do suhog u rotacijskom otparivaču (točka 4.1.) pri sniženom tlaku i temperaturi kupelji do 40 °C. Dovođenjem dušika (točka 3.9.) uspostavi se atmosferski tlak, a tikvica izvadi iz rotacijskog otparivača. Preostalo se otapalo ukloni strujom dušika (točka 3.9.), a ostatak odmah otopi u poznatom obujmu (10 – 100 ml) metanola (točka 3.3.) (koncentracija DL-α-tokoferola mora biti u području 5 μ/ml do 30 μ/ml).

5.5.    Određivanje putem HPLC-a

Vitamin E se razdvaja na koloni C18 s reverznim fazama (točka 4.5.1.), a koncentracija izmjeri fluorescencijskim detektorom (ekscitacija: 295 nm, emisija: 330 nm) ili UV detektorom (292 nm) (točka 4.5.2.).

Ubrizga se alikvotni dio (npr. 20 μl) otopine metanola dobivene u točki 5.4. i eluira mobilnom fazom (točka 3.8.). Izračuna se srednja vrijednost visina (površina) vršaka za više ubrizgavanja iste otopine uzorka i srednje vrijednosti visina (površina) vršaka za više ubrizgavanja kalibracijskih otopina (točka 5.6.2.).

Uvjeti za HPLC

Sljedeći uvjeti predlažu se kao smjernice; mogu se koristiti i drugi uvjeti ako se njima jamče jednakovrijedni rezultati.

5.6    Kalibracija (DL-α-tokoferol acetat ili DL-α-tokoferol)

5.6.1    Standardni DL-α-tokoferol acetat

5.6.1.1    Priprema radne standardne otopine

Pipetom se prenese 25 ml osnovne otopine DL-α-tokoferol acetata (točka 3.10.1.) u tikvicu s ravnim dnom ili konusnu tikvicu obujma 500 ml (točka 4.2.1.) i hidrolizira, u skladu s točkom 5.2. Zatim se ekstrahira laganim petrolejem (točka 3.2.) u skladu s točkom 5.3. i laganim petrolejem dopuni do 500 ml. U rotacijskom se otparivaču (vidjeti točku 5.4.) otpari 25 ml tog ekstrakta gotovo do suhog, strujom dušika ukloni preostalo otapalo (točka 3.9.), a ostatak se ponovo otopi u 25,0 ml metanola (točka 3.3.). Nominalna koncentracija te otopine iznosi 45,5 μg DL-α-tokoferola na ml, što je jednakovrijedno 50 μg DL-α-tokoferol acetata na ml. Radna standardna otopina treba se pripremiti svježa prije upotrebe.

5.6.1.2.    Priprema kalibracijske otopine i kalibracijske krivulje

Prenese se 1,0, 2,0, 4,0 i 10,0 ml radne standardne otopine u seriju graduiranih tikvica obujma 20 ml, metanolom (točka 3.3.) dopuni do oznake i promiješa. Nominalne koncentracije ovih otopina iznose 2,5, 5,0, 10,0 i 25,0 μg/ml DL-α-tokoferol acetata, tj. 2,28, 4,55, 9,10 i 22,8 μg/ml DL-α-tokoferola.

Više puta se ubrizga 20 μl svake kalibracijske otopine i odrede srednje vrijednosti visina (površina) vršaka. Iz srednjih se vrijednosti visina (površina) vršaka pripremi kalibracijska krivulja.

5.6.1.3.    UV standardizacija osnovne otopine DL-α-tokoferol acetata (točka 3.10.1.)

Etanolom se razrijedi 5,0 ml osnovne otopine DL-α-tokoferol acetata (točka 3.10.1.) na 25,0 ml i izmjeri UV spektar te otopine prema etanolu (točka 3.1.) u spektrofotometru (točka 4.6.) između 250 i 320 nm.

Maksimalna apsorpcija je na 284 nm:

E1 % 1 cm = 43,6 na 284 nm u etanolu

Za tu se razrijeđenost mora dobiti vrijednost ekstinkcije u rasponu od 0,84 do 0,88.

5.6.2.    Standard DL-α-tokoferola

5.6.2.1    Priprema radne standardne otopine

Pipetom se prenese 2 ml osnovne otopine DL-α-tokoferola (točka 3.11.1.) u graduiranu tikvicu obujma 50 ml, otopi u metanolu (točka 3.3.) i dopuni do oznake metanolom. Nominalna koncentracija ove otopine iznosi 40 μg DL-α-tokoferola na ml, što je jednakovrijedno 44,0 μg DL-α-tokoferol acetata na ml. Radna standardna otopina mora se pripremiti svježa prije upotrebe.

5.6.2.2.    Priprema kalibracijske otopine i kalibracijske krivulje

Prenese se 1,0, 2,0, 4,0 i 10,0 ml radne standardne otopine u seriju graduiranih tikvica obujma 20 ml, metanolom (točka 3.3.) dopuni do oznake i promiješa. Nominalne koncentracije ovih otopina iznose 2,0, 4,0, 8,0 i 20,0 μg/ml DL-α-tokoferola, tj. 2,20, 4,40, 8,79 i 22,0 μg/ml DL-α-tokoferol acetata.

Više puta se ubrizga 20 μl svake kalibracijske otopine i odrede srednje vrijednosti visina (površina) vršaka. Iz srednjih se vrijednosti visina (površina) vršaka pripremi kalibracijska krivulja.

5.6.2.3.    UV standardizacija osnovne otopine DL-α-tokoferola (točka 3.11.1.)

Etanolom se razrijedi 2,0 ml osnovne otopine DL-α-tokoferola (točka 3.11.1.) na 25,0 ml te se izmjeri UV spektar ove otopine prema etanolu (točka 3.1.) u spektrofotometru (točka 4.6.) između 250 i 320 nm. Maksimalna apsorpcija je na 292 nm:

E1 % 1 cm = 75,8 na 292 nm u etanolu

Za tu se razrijeđenost mora dobiti vrijednost ekstinkcije od 0,6.

6.    Izračun rezultata

Iz srednje se vrijednosti visine (površine) vršaka vitamina E iz otopine uzorka određuje koncentracija otopine uzorka u μg/ml (izračunana kao α-tokoferol acetat) iz kalibracijske krivulje (točka 5.6.1.2. ili 5.6.2.2.).

Udio vitamina E (w) u mg/kg u uzorku izračunava se sljedećom formulom:

pri čemu je:

c

=

koncentracija vitamina E (kao α-tokoferol acetata) u otopini uzorka (točka 5.4.) u μg/ml;

V1

=

obujam otopine uzorka (točka 5.4.) u ml;

V2

=

obujam alikvota korištenog u točki 5.4., u ml;

m

=

masa pokusnog uzorka u gramima.

7.    Napomene

8.    Ponovljivost

Razlika između rezultata dvaju usporednih postupaka određivanja, izvedenih na istom uzorku, ne smije prijeći 15 % najvišeg rezultata.

9.    Rezultati međulaboratorijske studije ( 12 )

L

=

broj laboratorija

n

=

broj pojedinačnih vrijednosti

Sr

=

standardna devijacija ponovljivosti

SR

=

standardna devijacija obnovljivosti

r

=

ponovljivost

R

=

obnovljivost

CVr

=

koeficijent varijacije ponovljivosti

CVR

=

koeficijent varijacije obnovljivosti.

C.   ODREĐIVANJE ŽELJEZA, BAKRA, MANGANA I CINKA U TRAGOVIMA

1.    Svrha i područje primjene

Ovom se metodom omogućuje određivanje željeza, bakra, mangana i cinka u tragovima u hrani za životinje. Granice za kvantifikaciju su:

2.    Načelo

Nakon razgradnje eventualno prisutnih organskih tvari uzorak se otopi u klorovodičnoj kiselini. Nakon primjerenog razrjeđivanja, atomskom se apsorpcijskom spektrometrijom određuju elementi željezo, bakar, mangan i cink.

3.    Reagensi

Uvodne napomene

Za pripremanje reagensa i otopina za analizu koristi se voda bez kationa koje treba odrediti, dobivena dvostrukim destiliranjem vode u destilatoru od borosilikatnog ili kvarcnog stakla ili dvostrukom obradom ionsko-izmjenjivačkom smolom.

Reagensi moraju biti najmanje analitičke čistoće. Odsutnost elementa koji se određuje provjerava se slijepom probom. Prema potrebi se reagensi moraju dodatno pročistiti.

Umjesto dolje navedenih standardnih otopina mogu se koristiti komercijalne standardne otopine pod uvjetom da imaju jamstvo i da se prije upotrebe provjere.

4.    Oprema

5.    Postupak ( 13 )

5.1.    Uzorci koji sadrže organske tvari

5.1.1.    Spaljivanje i priprema otopine za analizu ( 14 )

Pepeo se navlaži vodom i prenese u čašu obujma 250 ml. Lončić se ispere s ukupno približno 5 ml klorovodične kiseline (točka 3.1.), a udio se polako i oprezno prenese u čašu (može doći do burne reakcije zbog tvorbe CO2). U kapljicama se dodaje klorovodična kiselina (točka 3.1.), uz stalno miješanje dok ne prestane pjenjenje. Otpari se do suhog, uz povremeno miješanje staklenim štapićem.

Zatim se u ostatak doda 15 ml klorovodične kiseline 6 mol/l (točka 3.2.) i približno 120 ml vode. Promiješa se staklenim štapićem, koji se ostavi u čaši, a čaša se pokrije satnim staklom. Polako se zagrijava do ključanja i ostavi ključati do potpunog otapanja pepela. Filtrira se kroz filtar koji ne sadrži pepeo i prikupi u odmjernoj tikvici obujma 250 ml. Čaša i filtar se isperu s 5 ml vruće klorovodične kiseline 6 mol/l (točka 3.2.) i dvaput vrelom vodom. Odmjerna se tikvica napuni vodom do oznake (koncentracija HCl približno 0,5 mol/l).

Napomene:

5.1.2.    Određivanje spektrofotometrijom

5.1.2.1.    Priprema kalibracijske otopine

Za svaki element koji se određuje pripremi se serija kalibracijskih otopina iz standardnih radnih otopina iz točaka 3.7.1., 3.8.1., 3.9.1. i 3.10.1., pri čemu koncentracija HCl u svakoj iznosi približno 0,5 mol/l (i (kod željeza, mangana i cinka) koncentracija lantanovog klorida koja odgovara 0,1 % La (m/v)).

Odabrane koncentracije elemenata u tragovima moraju biti unutar područja osjetljivosti korištenog spektrofotometra. U donjim se tablicama kao primjer navode sastavi tipičnih područja kalibracijskih otopina; međutim, ovisno o vrsti i osjetljivosti korištenog spektrofotometra možda će trebati odabrati drukčije koncentracije.

Željezo

Bakar

Mangan

Cink

5.1.2.2.    Priprema otopine za analizu

Za određivanje bakra, otopina pripravljena u skladu s točkom 5.1.1. obično se može koristiti izravno. Ako je koncentraciju potrebno prilagoditi tako da bude u području kalibracijskih otopina, pipetom se prenese alikvotni dio u graduiranu tikvicu obujma 100 ml i dopuni do oznake klorovodičnom kiselinom 0,5 mol/l (točka 3.3.).

Za određivanje željeza, mangana i cinka, pipetom se u graduiranu tikvicu obujma 100 ml prenese alikvotni dio otopine pripravljene u skladu s točkom 5.1.1., doda 10 ml otopine lantanovog klorida (točka 3.11.) i dopuni do oznake klorovodičnom kiselinom 0,5 mol/l (točka 3.3.) (vidjeti također točku 8. „Napomena”).

5.1.2.3.    Slijepa proba

Slijepa proba mora obuhvaćati sve propisane korake postupka, osim što se izostavlja uzorak. Kao otopina za slijepu probu ne smije se koristiti kalibracijska otopina „0”.

5.1.2.4.    Mjerenje atomske apsorpcije

Oksidacijskim plamenom zrak-acetilen, izmjeri se atomska apsorpcija kalibracijskih otopina i otopine koju treba analizirati, na sljedećim valnim duljinama:

Svako se mjerenje izvodi četiri puta.

5.2.    Mineralna hrana za životinje

Ako uzorak ne sadrži organske tvari, nije potrebno prethodno spaljivanje. Nastavlja se kako je opisano u točki 5.1.1.1. počevši od drugog stavka. Može se izostaviti otparivanje u prisutnosti fluoridne kiseline.

6.    Izračun rezultata

Koncentracija elementa u tragovima u otopini koja se analizira izračuna se iz kalibracijske krivulje, a rezultat se iskazuje u miligramima elementa u tragovima na kilogram uzorka (ppm).

7.    Ponovljivost

Razlika između rezultata dvaju usporednih postupaka određivanja koje na istom uzorku izvodi isti analitičar ne smije prijeći:

8.    Napomena

Prisutnost velike količine fosfata može ometati postupak određivanje željeza, mangana i cinka. Takve se smetnje moraju korigirati dodavanjem otopine lantanovog klorida (točka 3.11.). Ako je, međutim, maseni omjer u uzorku (Ca + Mg/P) > 2, može se izostaviti dodavanje otopine lantanovog klorida (točka 3.11.) u otopinu za analizu i u kalibracijsku otopinu.

D.   ODREĐIVANJE HALOFUGINONA

DL-trans-7-brom-6-klor-3-[3-(3-hidroksi-2-piperidil)acetonil]-kinazolin-4-(3H)-on hidrobromid

1.    Svrha i područje primjene

Ovom se metodom omogućuje određivanje razine halofuginona u hrani za životinje. Granica kvantifikacije je 1 mg/kg.

2.    Načelo

Nakon obrade vrućom vodom halofuginon se ekstrahira u obliku slobodne baze u etil acetatu, zatim razdvoji kao hidroklorid u vodenoj otopini kiseline. Ekstrakt se pročisti ionsko-izmjenjivačkom kromatografijom. Udio halofuginona određuje se tekućinskom kromatografijom visoke učinkovitosti (HPLC) reverznih faza uz upotrebu UV detektora.

3.    Reagensi

Odvagne se 50 mg halofuginona (točka 3.6.) s preciznošću od 0,1 mg i prenese u graduiranu tikvicu obujma 500 ml, otopi u puferskoj otopini amonijevog acetata (točka 3.18.), dopuni puferskom otopinom do oznake i promiješa. Ta je otopina stabilna tri tjedna na na temperaturi od 5 °C ako se pohrani u tamnom prostoru.

U seriju graduiranih tikvica obujma 100 ml prenese se 1,0, 2,0, 3,0, 4,0 i 6,0 ml osnovne standardne otopine (točka 3.6.1.). Dopuni se do oznake mobilnom fazom (točka 3.21.) i promiješa. U tim otopinama koncentracija halofuginona iznosi 1,0, 2,0, 3,0, 4,0 i 6,0 μg/ml. Ove se otopine moraju pripremiti svježe prije uporabe.

U vodi se otopi 50 g natrijevog karbonata (točka 3.11.), razrijedi do 1 litre, zatim se dodaje natrijev klorid (točka 3.12.) do zasićenja otopine.

Vodom se razrijedi 10 ml HCl (točka 3.7.) do 1 litre.

U vodi (točka 3.14) se otopi 19,3 g amonijevog acetata (točka 3.3.) i 30 ml octene kiseline (točka 3.5.) i razrijedi do 1 litre.

Vodom se ispere primjerena količina Amberlita (točka 3.2.) dok se ne uklone svi kloridni ioni, što se pokazuje pokusom sa srebrovim nitratom (točka 3.20.) u odbačenoj vodenoj fazi. Zatim se smola ispere s 50 ml metanola (točka 3.8.), metanol se odbaci, a smola pohrani u svježem metanolu.

Otopi se 0,17 g srebrovog nitrata (točka 3.9.) u 10 ml vode.

Pomiješa se 500 ml acetonitrila (točka 3.1.) s 300 ml puferske otopine amonijevog acetata (točka 3.18.) i 1 200 ml vode (točka 3.14.). Octenom kiselinom (točka 3.5.) se vrijednost pH podesi na 4,3. Filtrira se kroz filtar 0,22 μm (točka 4.8.), otopina se otplini (npr. 10 minuta u ultrazvučnoj kupelji). Ta je otopina stabilna mjesec dana ako se drži u zatvorenoj posudi u tamnom prostoru.

4.    Oprema

5.    Postupak

Napomena

:

Halofuginon kao slobodna baza je nestabilan u bazičnim i etil-acetatnim otopinama. Ne smije se ostaviti u etil acetatu dulje od 30 minuta.

5.1.    Općenito

Napomena

:

U provedbi ove metode slijepa proba hrane za životinje treba biti slična uzorku, a analizom se mora potvrditi odsutnost halofuginona.

5.2.    Ekstrakcija

Odvagne se 10 g pripravljenog uzorka s preciznošću od 0,1 g i prenese u epruvetu za centrifugiranje obujma 200 ml, doda se 0,5 g natrijevog askorbata (točka 3.10.), 0,5 g EDTA (točka 3.13.) i 20 ml vode i promiješa. Epruveta se 5 minuta drži u vodenoj kupelji (80 °C). Nakon hlađenja na sobnu temperaturu doda se 20 ml otopine natrijevog karbonata (točka 3.15.) i promiješa. Odmah se doda 100 ml etilacetata (točka 3.4.) i 15 sekundi snažno protrese rukom. Zatim se epruveta 3 minute drži u ultrazvučnoj kupelji (točka 4.1.) i otpusti slavina. Centrifugira se 2 minute, te se faza etilacetata dekantira kroz filtar od staklenih vlakana (točka 4.6.) u lijevak za odjeljivanje obujma 500 ml. Ponovi se ekstrakcija uzorka s dodatnih 100 ml etilacetata. Pomiješani se ekstrakti ispiru 1 minutu s 50 ml otopine natrijevog karbonata zasićene natrijevim kloridom (točka 3.16.), a vodeni se sloj odbaci.

Organski se sloj ekstrahira 1 minutu s 50 ml klorovodične kiseline (točka 3.17.). Donji se kiselinski sloj prenese u lijevak za odjeljivanje obujma 250 ml. Organski se sloj ponovo ekstrahira 1,5 minutu s dodatnih 50 ml klorovodične kiseline i pomiješa s prvim ekstraktom. Pomiješani se kiselinski ekstrakti približno 10 sekunda ispiru protresivanjem s 10 ml etilacetata (točka 3.4.).

Vodeni se sloj kvantitativno prenese u tikvicu s okruglim dnom obujma 250 ml, a organska faza se odbaci. Iz kisele se otopine u rotacijskom otparivaču (točka 4.2.) otpari sav preostali etilacetat. Temperatura vodene kupelji ne smije prijeći 40 °C. Pod vakuumom na približno 25 milibara, odstrani se sav preostali etilacetat u 5 minuta na 38 °C.

5.3.    Pročišćivanje

5.3.1.    Priprema kolone s Amberlitom

Pripremi se kolona XAD-2 za svaki ekstrakt uzorka. Metanolom (točka 3.8.) se prenese 10 g pripravljenog Amberlita (točka 3.19.) u staklenu kolonu (točka 4.5.). Na vrh posteljice od smole postavi se tampon od staklene vune. Metanol se ispusti iz kolone, a smola ispere sa 100 ml vode tako da se dotok vode zaustavi kada tekućina dosegne vrh posteljice od smole. Prije upotrebe kolona se ostavi 10 minuta kako bi se uravnotežila. Kolona se nikad ne smije isušiti.

5.3.2.    Čišćenje uzorka

Ekstrakt (točka 5.2.) se kvantitativno prenese na vrh pripravljene kolone s Amberlitom (točka 5.3.1.) i eluira, a eluat se odbaci. Brzina eluiranja ne smije biti veća od 20 ml/min. Tikvica s okruglim dnom se ispere s 20 ml klorovodične kiseline (točka 3.17.), a udio iskoristi za ispiranje kolone sa smolom. Preostala se kiselinska otopina ukloni propuhivanjem zraka. Odbaci se tekućina od ispiranja. U kolonu se doda 100 ml metanola (točka 3.8.), 5 – 10 ml se eluira, a eluat se prikupi u tikvicu s okruglim dnom obujma 250 ml. Preostali se metanol ostavi 10 minuta kako bi se uravnotežio sa smolom te se nastavi eluiranje brzinom koja ne prelazi 20 ml/min, a eluat se prikuplja u istoj tikvici s okruglim dnom. Metanol se otpari na rotacijskom otparivaču (točka 4.2.), pri čemu temperatura vodene kupelji ne smije prijeći 40 °C. Ostatak se upotrebom mobilne faze (točka 3.21.) kvantitativno prenese u graduiranu tikvicu obujma 10 ml. Dopuni se mobilnom fazom do oznake i promiješa. Alikvot se filtrira kroz membranski filtar (točka 4.7.). Ta se otopina pohrani za određivanje putem HPLC-a (točka 5.4.).

5.4.    Određivanje putem HPLC-a

5.4.1.    Parametri

Sljedeći se uvjeti predlažu kao smjernice; mogu se koristiti i drugi uvjeti ako se njima jamče jednakovrijedni rezultati.

Kolona za tekućinsku kromatografiju (točka 4.4.1.)

Mobilna faza HPLC-a (točka 3.21.)

Brzina protoka: 1,5 – 2 ml/min

Valna duljina detekcije: 243 nm

Volumen za ubrizgavanje: 40 do 100 μl

Provjeri se stabilnost kromatografskog sustava višekratnim ubrizgavanjem kalibracijske otopine (točka 3.6.2) koncentracije 3,0 μg/ml, sve dok se ne dobiju konstantne visine (ili površine) vršaka i konstantna vremena retencije.

5.4.2.    Kalibracijska krivulja

Svaka se kalibracijska otopina (točka 3.6.2.) ubrizga više puta i za svaku se koncentraciju izmjere srednje vrijednosti visina (površina) vršaka. Kalibracijska krivulja se pripremi tako da se na ordinatu nanose srednje vrijednosti visina ili površina vršaka kalibracijskih otopina, a na apscisu odgovarajuće koncentracije u μg/ml.

5.4.3.    Otopina uzorka

Više puta se ubrizga ekstrakt uzorka (točka 5.3.2.), pri čemu se koriste jednaki volumeni kao za kalibracijsku otopinu, a zatim se odredi srednja vrijednost visina (površina) vršaka halofuginona.

6.    Izračun rezultata

Koncentracija otopine uzorka u μg/ml određuje se iz srednjih vrijednosti visina (površina) vršaka halofuginona u otopini uzorka iz kalibracijske krivulje (točka 5.4.2.).

Udio halofuginona (w) (mg/kg) u uzorku izračunava se sljedećom formulom:

pri čemu je:

c

=

koncentracija halofuginona u otopini uzorka u μg/ml,

m

=

masa pokusnog uzorka u gramima.

7.    Vrednovanje rezultata

7.1.    Identifikacija

Identifikacija analita može se potvrditi ko-kromatografijom ili upotrebom detektora s nizom dioda kojim se uspoređuje spektar ekstrakta uzorka i spektar kalibracijske otopine (točka 3.6.2.) koncentracije 6,0 μg/ml.

7.1.1.    Ko-kromatografija

U ekstrakt uzorka doda se primjerena količina kalibracijske otopine (točka 3.6.2.). Količina dodanog halofuginona mora biti slična procijenjenoj količini halofuginona u ekstraktu uzorka.

Dopušteno je povećanje samo visine vrška halofuginona uzimajući u obzir dodane količine i razrjeđenje ekstrakta. Širina vrška na polovici maksimalne visine mora biti unutar ± 10 % početne širine.

7.1.2.    Detektor s nizom dioda

Rezultati se ocjenjuju u skladu sa sljedećim mjerilima:

Ako nije ispunjeno jedno od navedenih mjerila, prisutnost analita nije potvrđena.

7.2.    Ponovljivost

Razlika između rezultata dvaju usporednih postupaka određivanja, izvedenih na istom uzorku, ne smije prijeći 0,5 mg/kg za udio halofuginona do 3 mg/kg.

7.3.    Iskorištenje

Za obogaćeni slijepi uzorak hrane za životinje iskorištenje mora iznositi najmanje 80 %.

8.    Rezultati međulaboratorijske studije

Provedena je međulaboratorijska studija ( 15 ) u kojoj se u osam laboratorija analiziralo tri uzorka.

ND

=

nije pronađeno

SR

=

standardna devijacija obnovljivosti

CVR

=

koeficijent varijacije obnovljivosti (%)

Rec.

=

iskorištenje (%).

E.   ODREĐIVANJE ROBENIDINA

1,3-bis [(4-klorbenziliden)amino]gvanidin – hidroklorid

1.    Svrha i područje primjene

Ovom se metodom omogućuje određivanje razine robenidina u hrani za životinje. Granica kvantifikacije je 5 mg/kg.

2.    Načelo

Uzorak se ekstrahira zakiseljenim metanolom. Ekstrakt se osuši i alikvotni dio pročisti na koloni aluminijevog oksida. Robenidin se eluira metanolom iz kolone, koncentrira i dopuni mobilnom fazom do prikladnog obujma. Udio robenidina se određuje tekućinskom kromatografijom visoke učinkovitosti (HPLC) s reverznim fazama uz upotrebu UV detektora.

3.    Reagensi

U graduiranu tikvicu obujma 500 ml prenese se 4,0 ml klorovodične kiseline (ρ20 = 1,18 g/ml), dopuni metanolom (točka 3.1.) do oznake i promiješa. Ta se otopina mora pripremiti svježa prije uporabe.

Tip 3A, očice mreže od 8 do 12 (očice promjera 1,6 – 2,5 mm, kristalni aluminijev silikat, promjer pora 0,3 mm).

U prikladnu se posudu prenese 100 g aluminijevog oksida i doda 2,0 ml vode. Začepi se i trese približno 20 minuta. Drži se u čvrsto zatvorenoj posudi.

U vodi se otopi 3,40 g kalijevog dihidrogenfosfata (za HPLC) u odmjernoj tikvici obujma 1 000 ml, dopuni do oznake i promiješa.

U vodi se otopi 3,55 g bezvodnog dinatrijevog hidrogenfosfata (ili 4,45 g dihidrata ili 8,95 g dodekahidrata) (za HPLC) u odmjernoj tikvici obujma 1 000 ml, dopuni do oznake i promiješa.

Pomiješaju se sljedeći reagensi:

Filtrira se kroz filtar 0,22 μm (točka 4.6.), otopina se zatim otplini (npr. 10 minuta u ultrazvučnoj kupelji).

Čisti robenidin: 1,3-bis[4-klorbenziliden)amino]gvanidin – hidroklorid.

Odvagne se 30 mg standardnog robenidina (točka 3.9.) s preciznošću od 0,1 mg. Otopi se u zakiseljenom metanolu (točka 3.2.) u odmjernoj tikvici obujma 100 ml, dopuni istim otapalom do oznake i promiješa. Tikvica se omota aluminijskom folijom i pohrani na tamno mjesto.

U graduiranu tikvicu obujma 250 ml prenese se 10,0 ml osnovne standardne otopine robenidina (točka 3.9.1.), dopuni mobilnom fazom (točka 3.8.) do oznake i promiješa. Tikvica se omota aluminijskom folijom i pohrani na tamno mjesto.

U seriju graduiranih tikvica obujma 50 ml prenese se 5,0, 10,0, 15,0, 20,0 i 25,0 ml intermedijarne standardne otopine (točka 3.9.2.). Dopuni se mobilnom fazom (točka 3.8.) do oznake i promiješa. Te otopine odgovaraju koncentracijama robenidina od 1,2, 2,4, 3,6, 4,8 i 6,0 μg/ml. Te se otopine moraju pripremiti svježe prije uporabe.

4.    Oprema

Od smeđeg stakla, s pipcem i spremnikom obujma približno 150 ml, unutarnjeg promjera 10 – 15 mm, dužine 250 mm

5.    Postupak

Napomena

:

Robenidin je osjetljiv na svjetlo. U svim se postupcima mora koristiti posuđe od smeđeg stakla.

5.1.    Općenito

Napomena

:

U provedbi ove metode slijepa proba hrane za životinje mora biti slična uzorku, a analizom se mora potvrditi odsutnost robenidina.

5.2.    Ekstrakcija

Odvagne se približno 15 g uzorka s preciznošću od 0,01 g. Prenese se u konusnu tikvicu obujma 250 ml, doda 100,0 ml zakiseljenog metanola (točka 3.2.), začepi i trese jedan sat u tresilici (točka 4.2.). Otopina se filtrira kroz filtar papir od staklenih vlakana (točka 4.5.) u koničnu tikvicu obujma 150 ml. Doda se 7,5 g molekularnog sita (točka 3.4.), začepi i trese pet minuta. Odmah se filtrira kroz filtar papir od staklenih vlakana. Ova se otopina pohrani za fazu pročišćivanja (točka 5.3.).

5.3.    Pročišćivanje

5.3.1.    Priprema kolone s aluminijevim oksidom

U donji dio staklene kolone (točka 4.1.) postavi se mali čep od staklene vune i nabije staklenim štapićem. Odvagne se 11,0 g pripravljenog aluminijevog oksida (točka 3.5.) i prenese u kolonu. Pri tom treba paziti da izloženost zraku tijekom navedenog postupka bude što je moguće manja. Laganim udarcima po donjem dijelu napunjene kolone istaloži se aluminijev oksid.

5.3.2.    Pročišćivanje uzorka

U kolonu se pipetom prenese 5,0 ml ekstrakta uzorka pripravljenog u (točka 5.2.). Vrh pipete se nasloni na stijenku kolone, zatim se pusti da aluminijev oksid apsorbira otopinu. Robenidin se eluira iz kolone sa 100 ml metanola (točka 3.1.) uz brzinu protoka od 2 – 3 ml/min, a eluat se prikupi u tikvicu s okruglim dnom obujma 250 ml. Otopina metanola se otpari u rotacijskom otparivaču (točka 4.3.) do suhog pri sniženom tlaku, na 40 °C. Ostatak se ponovo otopi u 3 – 4 ml mobilne faze (točka 3.8.) i prenese u graduiranu tikvicu obujma 10 ml. Tikvica se nekoliko puta ispere s obrocima od 1 – 2 ml mobilne faze, a isprana tekućina prenese u graduiranu tikvicu. Dopuni se istim otapalom do oznake i promiješa. Alikvot se filtrira kroz membranski filtar 0,45 μm (točka 4.7.). Ova se otopina pohrani za određivanje putem HPLC-a (točka 5.4.).

5.4.    Određivanje putem HPLC-a

5.4.1    Parametri

Sljedeći se uvjeti predlažu kao smjernice; mogu se koristiti i drugi uvjeti ako se njima jamče jednakovrijedni rezultati:

kolona za tekućinsku kromatografiju (točka 4.4.1.),

Mobilna faza HPLC (točka 3.8.),

brzina protoka: 1,5 – 2 ml/min,

valna duljina detekcije: 317 nm,

ubrizgani volumen: 20 – 50 μl.

Stabilnost kromatografskog sustava se provjerava višekratnim ubrizgavanjem kalibracijske otopine (točka 3.9.3.) koncentracije 3,6 μg/ml, sve dok se ne dobiju konstantne visine vršaka i konstantna vremena retencije.

5.4.2.    Kalibracijska krivulja

Više puta se ubrizga svaka kalibracijska otopina (točka 3.9.3.) i za svaku koncentraciju izmjere vrijednosti visina (površina) vršaka. Kalibracijska se krivulja pripremi tako da se na ordinatu nanose srednje vrijednosti visina ili površina vršaka kalibracijskih otopina, a na apscisu odgovarajuće koncentracije u μg/ml.

5.4.3.    Otopina uzorka

Više puta se ubrizga ekstrakt uzorka (točka 5.3.2.), pri čemu se koriste jednaki volumeni kao za kalibracijske otopine, zatim se odredi srednja vrijednost visina (površina) vršaka robenidina.

6.    Izračun rezultata

Koncentracija otopine uzorka u μg/ml određuje se iz srednje vrijednosti visina (površina) vršaka robenidina u otopini uzorka iz kalibracijske krivulje (točka 5.4.2.).

Udio robenidina (w) (mg/kg) u uzorku izračunava se sljedećom formulom:

pri čemu je:

c

=

koncentracija robenidina u otopini uzorka u μg/ml,

m

=

masa pokusnog uzorka u gramima.

7.    Vrednovanje rezultata

7.1.    Identifikacija

Identifikacija analita može se potvrditi ko-kromatografijom ili detektorom s nizom dioda kojim se uspoređuje spektar ekstrakta uzorka i spektar kalibracijske otopine (točka 3.9.3.) koncentracije 6 μg/ml.

7.1.1.    Ko-kromatografija

U ekstrakt uzorka doda se primjerena količina kalibracijske otopine (točka 3.9.3.). Količina dodanog robenidina mora biti slična procijenjenoj količini robenidina u ekstraktu uzorka.

Dopušteno je povećanje samo visine vrška robenidina uzimajući u obzir dodane količine i razrjeđenje ekstrakta. Širina vrška na polovici maksimalne visine mora biti unutar približno 10 % početne širine.

7.1.2.    Detektor s nizom dioda

Rezultati se ocjenjuju u skladu sa sljedećim mjerilima:

Ako nije ispunjeno jedno od navedenih mjerila, prisutnost analita nije potvrđena.

7.2.    Ponovljivost

Razlika između rezultata dvaju usporednih postupaka određivanja, izvedenih na istom uzorku, ne smije prijeći 10 % vrijednosti višeg rezultata za udio robenidina viši od 15 mg/kg.

7.3.    Iskorištenje

Za obogaćeni slijepi uzorak hrane za životinje iskorištenje mora iznositi najmanje 85 %.

8.    Rezultati međulaboratorijske studije

Provedena je međulaboratorijska studija na razini EZ-a u kojoj se u 12 laboratorija analiziralo četiri uzorka hrane za perad i kuniće u obliku brašna i peleta. Svaki se uzorak analizirao dvaput. Rezultati su prikazani u donjoj tablici:

sr

=

standardna devijacija ponovljivosti,

CVr

=

koeficijent varijacije ponovljivosti u %,

SR

=

standardna devijacija obnovljivosti,

CVR

=

koeficijent varijacije obnovljivosti u %.

F.   ODREĐIVANJE DIKLAZURILA

(+)-4-klorfenil [2,6-diklor-4-(2,3,4,5-tetrahidro-3,5-diokso-1,2,4-triazin-2-il)fenil] acetonitril

1.    Svrha i područje primjene

Ovom se metodom omogućuje određivanje razine diklazurila u hrani za životinje i premiksima. Granica detekcije iznosi 0,1 mg/kg, a granica kvantifikacije 0,5 mg/kg.

2.    Načelo

Nakon dodavanja internog standarda, uzorak se ekstrahira zakiseljenim metanolom. Kod hrane za životinje alikvotni se dio ekstrakta pročisti na kartuši C18 za ekstrakciju u krutoj fazi. Diklazuril se eluira iz kartuše smjesom zakiseljenog metanola i vode. Nakon otparivanja, ostatak se otopi u smjesi DMF/voda. Kod premiksa, ekstrakt se otpari, a ostatak otopi u smjesi DMF/voda. Udio diklazurila određuje se tekućinskom kromatografijom visoke učinkovitosti (HPLC) s reverznom fazom i ternarnim gradijentom uz upotrebu UV detektora.

3.    Reagensi

Odvagne se 25 mg standardne tvari diklazurila (točka 3.8.) s preciznošću od 0,1 mg i prenese u graduiranu tikvicu obujma 50 ml. Otopi se u DMF-u (točka 3.6.), tikvica se dopuni DMF-om (točka 3.6.) do oznake i promiješa. Tikvica se omota aluminijskom folijom ili se koristi tikvica od smeđeg stakla i pohrani u hladnjaku. Pri temperaturi ≤ 4 °C otopina je stabilna 1 mjesec.

U graduiranu tikvicu obujma 50 ml prenese se 5,00 ml osnovne standardne otopine (točka 3.8.1.), dopuni DMF-om (točka 3.6.) do oznake i promiješa. Tikvica se omota aluminijskom folijom ili se koristi tikvica od smeđeg stakla i pohrani u hladnjaku. Na temperaturi ≤ 4 °C otopina je stabilna 1 mjesec.

Odvagne se 25 mg internog standarda (točka 3.9.) s preciznošću od 0,1 mg i prenese u graduiranu tikvicu obujma 50 ml. Otopi se u DMF-u (točka 3.6.), tikvica se dopuni DMF-om (točka 3.6.) do oznake i promiješa. Tikvica se omota aluminijskom folijom ili se koristi tikvica od smeđeg stakla i pohrani u hladnjaku. Na temperaturi ≤ 4 °C otopina je stabilna 1 mjesec.

U graduiranu tikvicu obujma 50 ml prenese se 5,00 ml osnovne otopine internog standarda (točka 3.9.1.), dopuni DMF-om (točka 3.6.) do oznake i promiješa. Tikvica se omota aluminijskom folijom ili se koristi tikvica od smeđeg stakla i pohrani u hladnjaku. Na temperaturi ≤ 4 °C otopina je stabilna 1 mjesec.

(p = nominalni udio diklazurila u premiksu, u mg/kg)

Odvagne se p/10 mg internog standarda s preciznošću od 0,1 mg i prenese u graduiranu tikvicu obujma 100 ml, otopi u DMF-u (točka 3.6.) u ultrazvučnoj kupelji (točka 4.6.), dopuni DMF-om do oznake i promiješa. Tikvica se omota aluminijskom folijom ili se koristi tikvica od smeđeg stakla i pohrani u hladnjaku. Na temperaturi ≤ 4 °C otopina je stabilna 1 mjesec.

Pipetom se prenese 2,00 ml standardne otopine diklazurila (točka 3.8.2.) i 2,00 ml otopine internog standarda (točka 3.9.2.) u graduiranu tikvicu obujma 50 ml. Doda se 16 ml DMF (točka 3.6.), tikvica se dopuni vodom do oznake i promiješa. Ova se otopina mora pripremiti svježa prije uporabe.

Pipetom se prenese 5,0 ml klorovodične kiseline (točka 3.7.) u 1 000 ml metanola (točka 3.5.) i promiješa.

Otopi se 5 g amonijevog acetata (točka 3.2.) i 3,4 g TBHS-a (točka 3.3.) u 1 000 ml vode (točka 3.1.) i promiješa.

4.    Oprema

5.    Postupak

5.1.    Općenito

5.1.1.    Slijepa proba hrane za životinje

Analizom slijepe probe hrane za životinje treba potvrditi da nije prisutan niti diklazuril niti interferentne tvari. Slijepa proba hrane za životinje mora biti slična uzorku, a analizom se mora potvrditi odsutnost diklazurila ili interferentnih tvari.

5.1.2.    Test iskorištenja

Test iskorištenja izvodi se analizom slijepe probe hrane za životinje kojoj se doda količina diklazurila slična količini u uzorku. Za dobivanje koncentracije 1 mg/kg doda se 0,1 ml osnovne standardne otopine (točka 3.8.1.) u 50 g slijepe probe hrane za životinje, temeljito promiješa i ostavi 10 minuta, a prije nastavka (točka 5.2.) se miješanje više puta ponovi.

Ako nije dostupna slijepa probe hrane za životinje slična uzorku (vidjeti točku 5.1.1.), test iskorištenja može se provesti metodom dodavanja standarda. U tom se slučaju uzorku za analizu doda količina diklazurila slična onoj koja se već nalazi u uzorku. Taj se uzorak analizira zajedno s uzorkom bez dodanog diklazurila, a iskorištenje se izračuna oduzimanjem.

5.2.    Ekstrakcija

5.2.1.    Hrana za životinje

Odvagne se približno 50 g uzorka s preciznošću od 0,01 g. Prenese se u konusnu tikvicu obujma 500 ml, doda 1,00 ml otopine internog standarda (točka 3.9.2.) i 200 ml ekstrakcijskog otapala (točka 3.12.), zatim se tikvica zatvori. Smjesa se tijekom noći protresa u tresilici (točka 4.1.). Ostavi se 10 minuta da se istaloži. U primjerenu staklenu posudu prenese se alikvot 20 ml supernatanta i razrijedi s 20 ml vode. Ta se otopina prenese u ekstrakcijsku kartušu (točka 3.11.) i filtrira pod vakuumom (točka 4.5.). Kartuša se ispere s 25 ml smjese ekstrakcijskog otapala (točka 3.12.) i vode, 65 + 35 (V + V). Prikupljene se frakcije odbace, a spojevi eluiraju s 25 ml smjese ekstrakcijskog otapala (točka 3.12.) i vode, 80 + 20 (V + V). Ova se frakcija isparava u rotacijskom otparivaču (točka 4.3) pri 60 °C dok se ne počne sušiti. Ostatak se otopi u 1,0 ml DMF-a (točka 3.6), doda se 1,5 ml vode (točka 3.1.) i promiješa. Filtrira se kroz membranski filtar (točka 4.4.). Prelazi se na postupak određivanja putem HPLC-a (točka 5.3.).

5.2.2.    Premiksi

Odvagne se približno 1 g uzorka s preciznošću od 0,001 g. Prenese se u konusnu tikvicu obujma 500 ml, doda se 1,00 ml otopine internog standarda (točka 3.9.3.) i 200 ml ekstrakcijskog otapala (točka 3.12.), zatim se tikvica zatvori. Smjesa se tijekom noći protresa u tresilici (točka 4.1.). Ostavi se 10 minuta da se istaloži. U primjereno veliku staklenu tikvicu s okruglim dnom prenese se alikvot (10 000 /p ml, p = nominalna udio diklazurila u mg/kg u premiksu) supernatanta. Otparava se pod sniženim tlakom na 60 °C u rotacijskom otparivaču (točka 4.3.) dok se ne počne sušiti. Ostatak se ponovno otopi u 10,0 ml DMF-a (točka 3.6.), doda se 15,0 ml vode (točka 3.1.) i promiješa. Prelazi se na postupak određivanja putem HPLC-a (točka 5.3.).

5.3.    Određivanje putem HPLC-a

5.3.1.    Parametri

Sljedeći se uvjeti predlažu kao smjernice; mogu se koristiti i drugi uvjeti ako se njima jamče jednakovrijedni rezultati.

Stabilnost kromatografskog sustava se provjerava višekratnim ubrizgavanjem kalibracijske otopine koncentracije 2,0 μg/ml (točka 3.10.) sve dok se ne dobiju konstantne visine vršaka i konstantna vremena retencije.

5.3.2.    Kalibracijska otopina

Više puta se ubrizga kalibracijska otopina (točka 3.10.) i odredi srednja vrijednost visine (površine) vršaka diklazurila i internog standarda.

5.3.3.    Otopina uzorka

Više puta se ubrizga 20 μl kalibracijske otopine (točka 5.2.1. ili 5.2.2.) i odredi srednja vrijednost visine (površine) vršaka diklazurila i internog standarda.

6.    Izračun rezultata

6.1.    Hrana za životinje

Udio diklazurila (w) (mg/kg) u uzorku izračunava se sljedećom formulom:

pri čemu je:

hd,s

=

visina (površina) vrška diklazurila u otopini uzorka (točka 5.2.1.)

hi,s

=

visina (površina) vrška internog standarda u otopini uzorka (točka 5.2.1.)

hd,c

=

visina (površina) vrška diklazurila u kalibracijskoj otopini (točka 3.10.)

hi,c

=

visina (površina) vrška internog standarda u kalibracijskoj otopini (točka 3.10.)

cd,c

=

koncentracija diklazurila u kalibracijskoj otopini u μg/ml (točka 3.10.)

m

=

masa pokusnog uzorka u gramima

V

=

volumen ekstrakta uzorka u skladu s točkom 5.2.1 (tj. 2,5 ml).

6.2.    Premiksi

Udio diklazurila (w) (mg/kg) u uzorku izračunava se sljedećom formulom:

pri čemu je:

hd,c

=

visina (površina) vrška diklazurila u kalibracijskoj otopini (točka 3.10.)

hi,c

=

visina (površina) vrška internog standarda u kalibracijskoj otopini (točka 3.10.)

hd,s

=

visina (površina) vrška diklazurila u otopini uzorka (točka 5.2.2.)

hi,s

=

visina (površina) vrška internog standarda u otopini uzorka (točka 5.2.2.)

cd,c

=

koncentracija diklazurila u kalibracijskoj otopini u μg/ml (točka 3.10.)

m

=

masa pokusnog uzorka u gramima

V

=

volumen ekstrakta uzorka u skladu s točkom 5.2.2 (tj. 25 ml)

p

=

nominalna udio diklazurila u mg/kg u premiksu.

7.    Vrednovanje rezultata

7.1.    Identifikacija

Identifikacija analita može se potvrditi ko-kromatografijom ili detektorom s nizom dioda kojim se uspoređuje spektar ekstrakta uzorka (točka 5.2.1. ili 5.2.2.) i spektar kalibracijske otopine (točka 3.10.).

7.1.1.    Ko-kromatografija

U ekstrakt uzorka (točka 5.2.1. ili 5.2.2.) doda se primjerena količina kalibracijske otopine (točka 3.10.). Količina dodanog diklazurila mora biti slična količini diklazurila određenoj u ekstraktu uzorka.

Dopušteno je povećanje samo visine vršaka diklazurila i internog standarda uzimajući u obzir dodane količine i razrjeđenje ekstrakta. Širina vrška na polovici visine mora biti unutar ± 10 % početne širine vrška diklazurila ili vrška internog standarda ekstrakta uzorka bez dodatka.

7.1.2.    Detekcija s nizom dioda

Rezultati se ocjenjuju u skladu sa sljedećim mjerilima:

Ako nije ispunjeno jedno od navedenih mjerila, prisutnost analita nije potvrđena.

7.2.    Ponovljivost

Razlika između rezultata dvaju usporednih postupaka određivanja, izvedenih na istom uzorku, ne smije prijeći:

7.3.    Iskorištenje

Za obogaćeni (slijepi) uzorak hrane za životinje iskorištenje mora iznositi najmanje 80 %.

8.    Rezultati međulaboratorijske studije

Provedena je međulaboratorijska studija u kojoj se u 11 laboratorija analiziralo 5 uzoraka. Ti su se uzorci sastojali od dva premiksa; jedan je bio pomiješan s organskom matricom (O 100), a drugi s anorganskom matricom (A 100). Teoretski udio iznosi 100 mg diklazurila na kg. Tri različita proizvođača (NL) (L1/Z1/K1) proizvela su 3 mješavine hrane za perad. Teoretski udio iznosi 1 mg diklazurila na kg. Od laboratorija je zatraženo da svaki uzorak analiziraju jedanput ili dvaput. (Detaljnije informacije o navedenoj međulaboratorijskoj studiji mogu se pronaći u Journal of AOAC International, svezak 77, br. 6, 1994., str. 1 359 . – 1 361 .). Rezultati su prikazani u donjoj tablici.

L

=

broj laboratorija

n

=

broj pojedinačnih vrijednosti

Sr

=

standardna devijacija ponovljivosti

CVr

=

koeficijent varijacije ponovljivosti

SR

=

standardna devijacija obnovljivosti

CVR

=

koeficijent varijacije obnovljivosti.

9.    Napomena

Prethodno treba dokazati da je odziv diklazurila linearan u području koncentracija koje se mjere.

G.   ODREĐIVANJE LASALOCID NATRIJA

Natrijeva sol polieter monokarboksilne kiseline koju proizvodi Streptomyces lasaliensis

1.    Svrha i područje primjene

Ovom se metodom omogućuje određivanje razine lasalocid natrija u hrani za životinje i premiksima. Granica detekcije iznosi 5 mg/kg, a granica kvantifikacije 10 mg/kg.

2.    Načelo

Lasalocid natrij se ekstrahira iz uzorka u zakiseljeni metanol i određuje tekućinskom kromatografijom visoke učinkovitosti (HPLC) s reverznom fazom uz upotrebu spektrofluorimetrijskog detektora.

3.    Reagensi

23,5 ml ortofosforne kiseline (točka 3.2.) razrijedi se vodom do 100 ml.

Otopi se 1,36 g KH2PO4 (točka 3.1.) u 500 ml vode (točka 3.11.), doda se 3,5 ml ortofosforne kiseline (točka 3.2.) i 10,0 ml 6-metil-2-heptilamina (točka 3.4.). Otopinom ortofosforne kiseline (točka 3.3.) pH vrijednost se podesi na 4,0 i razrijedi vodom (točka 3.11.) do 1 000 ml.

U graduiranu tikvicu obujma 1 000 ml prenese se 5,0 ml klorovodične kiseline (točka 3.6.), dopuni metanolom (točka 3.5.) do oznake i promiješa. Ova se otopina mora pripremiti svježa prije uporabe.

Pomiješa se 5 ml otopine fosfatnog pufera (točka 3.7.) s 95 ml metanola (točka 3.5.).

Odvagne se 50 mg lasalocid natrija (točka 3.10.) s preciznošću od 0,1 mg i prenese u graduiranu tikvicu obujma 100 ml, otopi u zakiseljenom metanolu (točka 3.8.) i istim otapalom dopuni do oznake i promiješa. Ova se otopina mora pripremiti svježa prije uporabe.

Pipetom se prenese 10,0 ml osnovne standardne otopine (točka 3.10.1.) u graduiranu tikvicu obujma 100 ml i zakiseljenim metanolom (točka 3.8.) dopuni do oznake i promiješa. Ova se otopina mora pripremiti svježa prije uporabe.

U seriju graduiranih tikvica obujma 50 ml prenese se 1,0, 2,0, 4,0, 5,0 i 10,0 ml intermedijarne standardne otopine (točka 3.10.2.). Zakiseljenim se metanolom dopuni do oznake (točka 3.8.) i promiješa. Ove otopine odgovaraju 1,0, 2,0, 4,0, 5,0 i 10,0 μg lasalocid natrija na ml. Ove se otopine moraju pripremiti svježe prije uporabe.

4.    Oprema

5.    Postupak

5.1.    Općenito

5.1.1.    Slijepa proba hrane za životinje

Za provedbu testa iskorištenja (točka 5.1.2.) analizira se slijepa proba hrane za životinje kako bi se potvrdilo da nisu prisutni niti lasalocid natrij, niti interferentne tvari. Slijepa proba hrane za životinje mora biti slična uzorku, a analizom se mora potvrditi odsutnost lasalocid natrija i interferentnih tvari.

5.1.2.    Test iskorištenja

Test iskorištenja izvodi se analizom slijepe probe hrane za životinje koja se obogaćuje dodavanjem količine lasalocid natrija slične količini u uzorku. Za dobivanje koncentracije 100 mg/kg prenese se 10,0 ml osnovne standardne otopine (točka 3.10.1.) u konusnu tikvicu obujma 250 ml i otopina otpari do približno 0,50 ml. Doda se 50 g slijepe probe hrane za životinje, temeljito promiješa i ostavi 10 minuta, a prije koraka ekstrakcije miješanje se više puta ponovi (točka 5.2.).

Ako nije dostupna slijepa probe hrane za životinje slična uzorku (vidjeti točku 5.1.1.), test iskorištenja može se provesti metodom dodavanja standarda. U tom se slučaju uzorku za analizu doda količina lasalocid natrija slična onoj koja se već nalazi u uzorku. Ovaj se uzorak analizira zajedno s uzorkom bez dodanog lasalocid natrija, a iskorištenje se izračuna oduzimanjem.

5.2.    Ekstrakcija

5.2.1.    Hrana za životinje

Odvagne se 5 – 10 g uzorka s preciznošću od 0,01 g i prenese u konusnu tikvicu obujma 250 ml s čepom. Pipetom se doda 100,0 ml zakiseljenog metanola (točka 3.8.). Poklopac se lagano zatvori i tikvica protrese radi disperzije uzorka. Tikvica se drži 20 minuta u ultrazvučnoj kupelji (točka 4.1.) na približno 40 °C, zatim se izvadi iz kupelji i ohladi na sobnu temperaturu. Ostavi se približno 1 sat dok se suspenzija ne istaloži, zatim se alikvotni dio filtrira kroz membranski filtar 0,45 μm (točka 4.2.) u prikladnu posudu. Prelazi se na postupak određivanja putem HPLC-a (točka 5.3.).

5.2.2.    Premiksi

Odvagne se približno 2 g neusitnjenog premiksa s preciznošću od 0,001 g i prenese u graduiranu tikvicu obujma 250 ml. Doda se 100,0 ml zakiseljenog metanola (točka 3.8.), tikvica se protrese radi disperzije uzorka. Tikvica se sa sadržajem drži 20 minuta u ultrazvučnoj kupelji (točka 4.1.) na približno 40 °C, zatim se izvadi iz kupelji i ohladi na sobnu temperaturu. Zakiseljenim se metanolom (točka 3.8.) razrijedi do oznake i dobro promiješa. Ostavi se 1 sat dok se suspenzija ne istaloži, zatim se alikvotni dio filtrira kroz membranski filtar 0,45 μm (točka 4.2.). Prikladan obujam čistog filtrata razrijedi se zakiseljenim metanolom (točka 3.8.), čime se dobiva konačna pokusna otopina koncentracije približno 4 μg/ml lasalocid natrija. Prelazi se na postupak određivanja putem HPLC-a (točka 5.3.).

5.3.    Određivanje putem HPLC-a

5.3.1.    Parametri

Sljedeći uvjeti predlažu se kao smjernice; mogu se koristiti i drugi uvjeti ako se njima jamče jednakovrijedni rezultati:

Stabilnost kromatografskog sustava provjerava se višekratnim ubrizgavanjem kalibracijske otopine koncentracije 4,0 μg/ml (točka 3.10.3.) sve dok se ne postignu konstantne visine (ili površine) vršaka i konstantna vremena retencije.

5.3.2.    Kalibracijska krivulja

Više puta se ubrizga svaka kalibracijska otopina (točka 3.10.3.) i za svaku koncentraciju izmjere srednje vrijednosti visina (površina) vršaka. Kalibracijska se krivulja pripremi tako da se na ordinatu nanose srednje vrijednosti visina (površina) vršaka kalibracijskih otopina, a na apscisu odgovarajuće koncentracije u μg/ml.

5.3.3.    Otopina uzorka

Više puta se ubrizgaju ekstrakti uzorka dobiveni u točki 5.2.1. ili 5.2.2., pri čemu se koristi jednak obujam kao za kalibracijsku otopinu i odrede srednje vrijednosti visina (površina) vršaka lasalocid natrija.

6.    Izračun rezultata

Iz srednjih se vrijednosti visina (površina) vršaka dobivenih ubrizgavanjem otopine uzorka (točka 5.3.3.) određuje koncentracija lasalocid natrija (μg/ml) iz kalibracijske krivulje.

6.1.    Hrana za životinje

Udio lasalocid natrija (w) (mg/kg) u uzorku izračunava se sljedećom formulom:

pri čemu je:

c

=

koncentracija lasalocid natrija u otopini uzorka (točka 5.2.1.) u μg/ml

V1

=

volumen ekstrakta uzorka u skladu s točkom 5.2.1. u ml (tj. 100)

m

=

masa pokusnog uzorka u gramima.

6.2.    Premiksi

Udio lasalocid natrija (w) (mg/kg) u uzorku izračunava se sljedećom formulom:

pri čemu je:

c

=

koncentracija lasalocid natrija u otopini uzorka (točka 5.2.2.) u μg/ml

V2

=

volumen ekstrakta uzorka u skladu s točkom 5.2.2. u ml (tj. 250)

f

=

faktor razrjeđenja u skladu s 5.2.2.

m

=

masa pokusnog uzorka u gramima.

7.    Vrednovanje rezultata

7.1.    Identifikacija

Metode koje se temelje na spektrofluorometriji manje su podložne interferencijama od metoda kod kojih se koristi UV detekcija. Identifikacija analita može se potvrditi ko-romatografijom.

7.1.1.    Ko-kromatografija

Ekstraktu uzorka (točka 5.2.1. ili 5.2.2.) doda se primjerena količina kalibracijske otopine (točka 3.10.3.). Količina dodanog lasalocid natrija mora biti slična količini lasalocid natrija u ekstraktu uzorka. Smije se povećati samo visina vrška lasalocid natrija uzimajući u obzir količine dodanog lasalocid natrija i razrjeđenje ekstrakta. Širina vrha, na polovici visine, mora biti unutar ± 10 % početne vrijednosti širine vrha dobivene iz ekstrakta uzorka bez dodanog lasalocid natrija.

7.2.    Ponovljivost

Razlika između rezultata dvaju usporednih postupaka određivanja, izvedenih na istom uzorku, ne smije prijeći:

7.3.    Iskorištenje

Za obogaćeni (slijepi) uzorak hrane za životinje iskorištenje mora iznositi najmanje 80 %. Za obogaćene uzorke premiksa iskorištenje mora iznositi najmanje 90 %.

8.    Rezultati međulaboratorijske studije

Provedena je međulaboratorijska studija ( *1 ) u kojoj se u 12 laboratorija analiziralo 2 premiksa (uzorci 1 i 2) i 5 uzoraka hrane za životinje (uzorci 3 – 7). Svaki se uzorak analizirao dva puta. Rezultati su prikazani u donjoj tablici:

L

=

broj laboratorija;

n

=

broj pojedinačnih vrijednosti

sr

=

standardna devijacija ponovljivosti

sR

=

standardna devijacija obnovljivosti

CVr

=

koeficijent varijacije ponovljivosti u %

CVR

=

koeficijent varijacije obnovljivosti u %.

---

PRILOG V.

ANALITIČKE METODE ZA KONTROLU NEPOŽELJNIH TVARI U HRANI ZA ŽIVOTINJE

A.   ODREĐIVANJE SLOBODNOG I UKUPNOG GOSIPOLA

1.    Svrha i područje primjene

Ovom se metodom omogućuje određivanje razine slobodnog i ukupnoga gosipola te kemijski srodnih tvari u sjemenu pamuka i u brašnu i pogači od pamukovog sjemena te u krmnim smjesama koje sadrže navedene sirovine za hranu za životinje, kada je koncentracija slobodnog i ukupnoga gosipola te kemijski srodnih tvari veća od 20 mg/kg.

2.    Načelo

Gosipol se ekstrahira u prisutnosti 3-aminopropan-1-ola, bilo smjesom propan-2-ola i heksana kod određivanja slobodnoga gosipola, bilo dimetilformamidom kod određivanja ukupnoga gosipola. Gosipol se anilinom pretvori u gosipol-dianilin, čija se optička gustoća mjeri na 440 nm.

3.    Reagensi

Ako se zaštite od svjetla, standardne su otopine gosipola A i B stabilne 24 sata.

4.    Oprema

5.    Postupak

5.1.    Pokusni uzorak

Količina korištenog pokusnog uzorka ovisi o očekivanom udjelu gosipola u uzorku. Poželjno je koristiti mali pokusni uzorak i relativno velik alikvot filtrata tako da se dobije dovoljna količina gosipola za točna fotometrijska mjerenja. Kod određivanja slobodnoga gosipola u sjemenu pamuka i brašnu i pogači od pamukovog sjemena, količina pokusnog uzorka ne prelazi 1 g; za krmnu smjesu količina može biti do 5 g. U većini je primjera prikladan alikvot filtrata od 10 ml; isti sadrži 50 – 100 μg gosipola. Kod određivanja ukupnoga gosipola, pokusni uzorak iznosi 0,5 – 5 g, tako da alikvot filtrata od 2 ml sadrži 40 – 200 μg gosipola.

Analiza se provodi na sobnoj temperaturi od približno 20 °C.

5.2.    Određivanje slobodnoga gosipola

Pokusni se uzorak prenese u tikvicu s brušenim vratom obujma 250 ml, čije je dno prekriveno drobljenim staklo. Pipetom se doda 50 ml otapala A (točka 3.2.), tikvica se zatvori i miješa jedan sat u mješalici. Filtrira se kroz suhi filtar i filtrat prikupi u maloj tikvici s brušenim vratom. Tijekom filtriranja lijevak se prekrije satnim staklom.

Pipetom se u svaku od dvije odmjerene tikvice obujma 25 ml (A i B) prenesu jednaki alikvoti filtrata, koji sadrže 50 – 100 μg gosipola. Prema potrebi se dopune otapalom A (točka 3.2.) do 10 ml. Tikvica (A) se do oznake dopuni smjesom propan-2-ol-heksana (točka 3.1.). Ova se otopina koristi kao referentna otopina za mjerenje otopine uzorka.

Pipetom se u svaku od dvije ostale odmjerene tikvice obujma 25 ml (C i D) prenese 10 ml otapala A (točka 3.2.). Tikvica (C) se do oznake dopuni smjesom propan-2-ol-heksana (točka 3.1.). Ova se otopina koristi kao referentna otopina za mjerenje otopine slijepe probe.

U tikvice (D) i (B) se doda po 2 ml anilina (točka 3.4.). Grije se 30 minuta nad vrelom vodenom kupelji, do obojenja. Ohladi se na sobnu temperaturu, dopuni do oznake smjesom propan-2-ol-heksana (točka 3.1.), homogenizira i ostavi jedan sat.

Optička gustoća otopine iz slijepe probe (D) odredi se usporedbom s referentnom otopinom (C), a optička gustoća otopine uzorka (B) usporedbom s referentnom otopinom (A) u spektrofotometru na 440 nm sa staklenim kivetama veličine 1 cm.

Oduzme se optička gustoća otopine slijepe probe od optičke gustoće otopine uzorka (= korigirana optička gustoća). Iz te se vrijednosti izračunava udio slobodnoga gosipola, u skladu s točkom 6.

5.3.    Određivanje ukupnoga gosipola

U odmjernu se tikvicu obujma 50 ml prenese pokusni uzorak s 1 – 5 mg gosipola i doda 10 ml otapala B (točka 3.3.). Istodobno se pripremi slijepa proba, tako da se u drugu graduiranu tikvicu obujma 50 ml prenese 10 ml otapala B (točka 3.3.). Obje se tikvice griju 30 minuta iznad vrele vodene kupelji. Ohlade se na sobnu temperaturu, svaka se tikvica dopuni do oznake smjesom propan-2-ola i heksana (točka 3.1.). Homogenizira se i ostavi 10 – 15 minuta da se istaloži, zatim se filtrira u tikvicu s brušenim vratom.

U dvije se odmjerne tikvice obujma 25 ml pipetom prenese po 2 ml filtrata uzorka, a u druge dvije odmjerne tikvice obujma 25 ml po 2 ml filtrata slijepe probe. Po jedna se tikvica iz svake serije dopuni do 25 ml smjesom propan-2-ol-heksana (točka 3.1.). Ove se otopine koriste kao referentne otopine.

U svaku od preostalih dviju tikvica doda se 2 ml anilina (točka 3.4.). Zagrijavaju se 30 minuta iznad vrele vodene kupelji do nastanka obojenja. Ohladi se na sobnu temperaturu, dopuni smjesom propan-2-ola i heksana (točka 3.1.) do 25 ml, homogenizira i ostavi jedan sat.

Optička gustoća slobodnoga gosipola određuje se u skladu s točkom 5.2. Iz te se vrijednosti izračunava udio ukupnoga gosipola, u skladu s točkom 6.

6.    Izračun rezultata

Rezultati se mogu izračunani bilo iz specifične optičke gustoće (točka 6.1.) ili iz kalibracijske krivulje (točka 6.2.).

6.1.    Iz specifične optičke gustoće

Specifične optičke gustoće, pri opisanim uvjetima, su sljedeće:

Udio slobodnog ili ukupnoga gosipola u uzorku izračunava se sljedećom formulom:

pri čemu je:

E

=

korigirana optička gustoća određena u skladu s točkom 5.2.,

p

=

masa pokusnog uzorka u gramima,

a

=

alikvot filtrata u mililitrima.

6.2.    Iz kalibracijske krivulje

6.2.1.    Slobodni gosipol

Pripreme se 2 serije po pet graduiranih tikvica obujma 25 ml. U svaku seriju tikvica pipetom se prenesu alikvoti od 2,0, 4,0, 6,0, 8,0 i 10,0 ml standardne otopine gosipola A (točka 3.5.). Otapalom A (točka 3.2.) se dopuni do 10 ml. Svaka se serija dopuni jednom odmjernom tikvicom obujma 25 ml koja sadrži samo 10 ml otapala A (točka 3.2.) (slijepa proba).

Tikvice iz prve serije (uključujući tikvicu za slijepu probu) dopune se do 25 ml smjesom propan-2-ola i heksana (točka 3.1.) (referentna serija).

U svaku tikvicu iz druge serije (uključujući tikvicu za slijepu probu) doda se 2 ml anilina (točka 3.4.). Zagrijava se 30 minuta iznad vrele vodene kupelji do nastanka obojenja. Ohladi se na sobnu temperaturu, dopuni do oznake smjesom propan-2-ol-heksana (točka 3.1.), homogenizira i ostavi jedan sat (standardna serija).

Optička gustoća otopina iz standardne serije i odgovarajućih otopina iz referentne serije odredi se u skladu s točkom 5.2. Kalibracijska se krivulja pripremi tako da se u dijagram unesu izmjerene optičke gustoće u odnosu na količine gosipola (u μg).

6.2.2.    Ukupni gosipol

Pripremi se šest graduiranih tikvica obujma 50 ml. U prvu se tikvicu prenese 10 ml otapala B (točka 3.3.), a u ostale 2,0, 4,0, 6,0, 8,0 i 10,0 ml standardne otopine gosipola B (točka 3.6.). Svaka se tikvica dopuni do 10 ml otapalom B (točka 3.3.). Zagrijava se 30 minuta iznad vrele vodene kupelji. Ohladi se na sobnu temperaturu, dopuni do oznake smjesom propan-2-ol-heksana (točka 3.1.) i homogenizira.

Prenese se po 2,0 ml svake od navedenih otopina u svaku od dvije serije od po šest graduiranih tikvica obujma 25 ml. Tikvice iz prve serije dopune se do 25 ml smjesom propan-2-ol-heksana (točka 3.1.) (referentna serija).

U svaku tikvicu iz druge serije doda se 2 ml anilina (točka 3.4.). Zagrijava se 30 minuta iznad vrele vodene kupelji. Ohladi se na sobnu temperaturu, dopuni do oznake smjesom propan-2-ol-heksana (točka 3.1.), homogenizira i ostavi jedan sat (standardna serija).

Optička gustoća otopina iz standardne serije i odgovarajućih otopina iz referentne serije odredi se u skladu s točkom 5.2. Kalibracijska se krivulja pripremi tako da se u dijagram unesu izmjerene optičke gustoće u odnosu na količine gosipola (u μg).

6.3.    Ponovljivost

Razlika između rezultata dvaju usporednih postupaka određivanja, izvedenih na istom uzorku, ne smije prijeći:

▼M6

B.   ODREĐIVANJE RAZINA DIOKSINA (PCDD/PCDF) I PCB-ova

POGLAVLJE I.

Metode uzorkovanja i tumačenje analitičkih rezultata

1.    Područje primjene i definicije

Uzorci za službenu kontrolu razina polikloriranih dibenzo-p-dioksina (PCDD-ovi), polikloriranih dibenzofurana (PCDF-ovi), polikloriranih bifenila sličnih dioksinima (PCB-ovi) ( 16 ) i PCB-ova koji nisu slični dioksinima u hrani za životinje uzimaju se u skladu s odredbama Priloga I. Primjenjuju se količinski zahtjevi za kontrolu tvari ili proizvoda ravnomjerno raspoređenih u hrani za životinje kako je predviđeno točkom 5.1. Priloga I. Skupni uzorci dobiveni na taj način smatraju se reprezentativnima za serije ili podserije iz kojih su uzeti. Sukladnost s najvišim dopuštenim količinama određenima Direktivom 2002/32/EZ utvrđuje se na temelju količina utvrđenih na laboratorijskim uzorcima.

Za potrebe ovog dijela B primjenjuju se definicije utvrđene u Prilogu I. Odluci Komisije 2002/657/EZ ( 17 ).

Uz te definicije, za potrebe ovog dijela B primjenjuju se i sljedeće definicije:

2.    Sukladnost serije ili podserije s najvećom dopuštenom količinom

2.1.    PCB-ovi koji nisu slični dioksinima

Serija ili podserija u skladu je s najvećom dopuštenom količinom ako analitički rezultat za zbroj tvari PCB 28, PCB 52, PCB 101, PCB 138, PCB 153 i PCB 180 (u nastavku: PCB-ovi koji nisu slični dioksinima) ne prelazi najveću dopuštenu količinu utvrđenu Direktivom 2002/32/EZ, uzimajući u obzir proširenu mjernu nesigurnost ( 18 ). Serija ili podserija nije u skladu s najvećom dopuštenom količinom kako je utvrđena Direktivom 2002/32/EZ ako srednja vrijednost dvaju gornjih ( 19 ) analitičkih rezultata dobivena dvostrukom analizom ( 20 ), uzimajući u obzir proširenu mjernu nesigurnost, bez sumnje prelazi najveću dopuštenu količinu, odnosno za ocjenu sukladnosti upotrebljava se analizirana koncentracija nakon oduzimanja proširene mjerne nesigurnosti.

Proširena mjerna nesigurnost izračunava se upotrebom čimbenika pokrivanja 2, što daje razinu pouzdanosti od približno 95 %. Serija ili podserija nije sukladna ako srednja vrijednost izmjerenih vrijednosti, umanjena za proširenu nesigurnost srednje vrijednosti, prelazi najveću dopuštenu količinu.

Pravila koja su navedena u prethodnim stavcima ove točke primjenjuju se na analitički rezultat dobiven na uzorku za službenu kontrolu. U slučaju analize za potrebe sudskih sporova ili upućivanja primjenjuju se nacionalni propisi.

2.2.    PCDD/F-ovi i dioksinima slični PCB-ovi

Serija ili podserija u skladu je s najvećom dopuštenom količinom ako rezultat pojedinačne analize

Za orijentacijske testove potrebno je odrediti cut-off vrijednost za odluke o sukladnosti uzorka s odgovarajućim najvećim dopuštenim količinama određenima za PCDD/PCDF-ove ili za zbroj PCDD/PCDF-ova i dioksinima sličnih PCB-ova.

Serija ili podserija nije u skladu s najvećom dopuštenom količinom kako je utvrđena Direktivom 2002/32/EZ ako srednja vrijednost dvaju gornjih ( 21 ) analitičkih rezultata dobivena dvostrukom analizom ( 22 ) upotrebom potvrdne metode, uzimajući u obzir proširenu mjernu nesigurnost, bez sumnje prelazi najveću dopuštenu količinu, odnosno za ocjenu sukladnosti upotrebljava se analizirana koncentracija nakon oduzimanja proširene mjerne nesigurnosti.

Proširena mjerna nesigurnost izračunava se upotrebom čimbenika pokrivanja 2, što daje razinu pouzdanosti od približno 95 %. Serija ili podserija nije sukladna ako srednja vrijednost izmjerenih vrijednosti, umanjena za proširenu nesigurnost srednje vrijednosti, prelazi najveću dopuštenu količinu.

Zbroj procijenjenih proširenih nesigurnosti za odvojene analitičke rezultate PCDD/PCDF-ova i dioksinima sličnih PCB-ova upotrebljava se za zbroj PCDD/PCDF-ova i dioksinima sličnih PCB-ova.

Pravila koja su navedena u prethodnim stavcima ove točke primjenjuju se na analitički rezultat dobiven na uzorku za službenu kontrolu. U slučaju analize za potrebe sudskih sporova ili upućivanja primjenjuju se nacionalni propisi.

3.    Rezultati koji prelaze pragove za pokretanje postupka kako je utvrđeno u Prilogu II. Direktivi 2002/32/EZ

Pragovi za pokretanje postupka predstavljaju alat za odabir uzoraka u onim slučajevima u kojima je potrebno utvrditi izvor kontaminacije i poduzeti mjere za njezino smanjenje ili uklanjanje. Orijentacijskim metodama uspostavljaju se odgovarajuće cut-off vrijednosti za odabir tih uzoraka. Ako su potrebni znatni napori za otkrivanje izvora i za smanjenje ili uklanjanje kontaminacije, primjereno je potvrditi prelazak pragova za pokretanje postupka dvostrukom analizom koristeći potvrdnu metodu i uzimajući u obzir proširenu mjernu nesigurnost ( 23 ).

POGLAVLJE II.

Priprema uzorka i zahtjevi za metode analize koje se koriste za službenu kontrolu količina dioksina (PCDD/PCDF-ovi) i dioksinima sličnih PCB-ova u hrani za životinje

1.    Područje primjene

Zahtjevi iz ovog poglavlja primjenjuju se kad se hrana za životinje analizira za službenu kontrolu količina 2,3,7,8-supstituiranih PCDD/PCDF-ova i PCB-ova koji nisu slični dioksinima te u pogledu pripreme uzoraka i analitičkih zahtjeva za druge regulatorne svrhe, uključujući kontrole koje provodi subjekt u poslovanju s hranom za životinje za osiguranje sukladnosti s odredbama Uredbe (EZ) br. 183/2005 Europskog parlamenta i Vijeća ( 24 ).

Prisutnost PCDD/PCDF-ova i dioksinima sličnih PCB-ova u hrani za životinje može se pratiti s pomoću dvije različite vrste analitičkih metoda:

2.    Pozadina

Za izračun koncentracija ekvivalenata toksičnosti (TEQ), koncentracije pojedinačnih tvari u danom uzorku pomnože se s odgovarajućim faktorom ekvivalentne toksičnosti (TEF) (vidjeti bilješku 1. poglavlja I.), a zatim zbroje kako bi se dobila ukupna koncentracija dioksinima sličnih spojeva izraženih kao TEQ.

Za potrebe ovog dijela B, prihvaćena posebna granica kvantifikacije pojedinog kongenera znači najmanji udio analita koji se može izmjeriti s razumnom statističkom sigurnošću i koji ispunjuje kriterije identifikacije kako su opisani u međunarodno priznatim normama, na primjer u normi EN 16215:2012 (Animal feed – Determination of dioxins and dioxin-like PCBs by GC-HRMS and of indicator PCBs by GC-HRMS) i/ili u metodama EPA 1613 i 1668 kako su revidirane.

Granica kvantifikacije pojedinog kongenera može se odrediti na sljedeći način:

Bioanalitičke orijentacijske metode ne daju rezultate na razini kongenera, već samo navode ( 25 ) vrijednosti TEQ izražene u bioanalitičkim ekvivalentima (BEQ), s obzirom na to da svi spojevi prisutni u izolatu uzorka koji proizvedu odgovor pri ispitivanju možda ne ispunjavaju sve zahtjeve načela TEQ.

Orijentacijske i potvrdne metode mogu se koristiti za kontrolu određene matrice samo ako su metode dovoljno osjetljive za pouzdano otkrivanje količine koja dosegne prag za pokretanje postupka ili razinu najveće dopuštene količine.

3.    Zahtjevi za osiguranje kvalitete

3.1.	Mjere za sprečavanje uzajamne kontaminacije poduzimaju se u svakoj fazi uzorkovanja i analize.

3.2.	Uzorci se čuvaju i prevoze u spremnicima od stakla, aluminija, polipropilena ili polietilena koji su primjereni za čuvanje i ne utječu na količine PCDD/PCDF-ova i dioksinima sličnih PCB-ova u uzorcima. Tragovi papirne prašine uklanjaju se iz spremnika za uzorke.

3.3.	Skladištenje i prijevoz uzorka provode se tako da se očuva cjelovitost uzorka hrane za životinje.

3.4.	Gdje je to primjenjivo, svaki se laboratorijski uzorak sitno melje i dobro promiješa s pomoću postupka kojim se postiže potpuna homogenizacija (npr. prosijavanjem samljevenog uzorka kroz sito otvora 1 mm). Ako je sadržaj vlage u uzorku previsok, uzorak se prije mljevenja mora osušiti.

3.5.	Provodi se kontrola reagensa, staklenog pribora i opreme zbog mogućeg utjecaja na rezultate izražene u TEQ ili BEQ.

3.6.	Slijepu probu treba obaviti provedbom cijelog analitičkog postupka, ali bez uzorka.

3.7.

Za bioanalitičke metode sav stakleni pribor i otapala koji se koriste u analizi ispituju se da ne sadržavaju spojeve koji utječu na detekciju ciljnih spojeva u radnom rasponu. Stakleni pribor treba isprati otapalima ili grijati na temperaturama koje su primjerene za otklanjanje tragova PCDD/PCDF-ova, dioksinima sličnih spojeva te interferirajućih spojeva s njihove površine.

3.8.	Količina uzorka za ekstrakciju dovoljna je za ispunjavanje zahtjeva u pogledu dovoljno niskog radnog raspona uključujući koncentracije na razini najveće dopuštene količine ili pragova za pokretanje postupka.

3.9.	U posebnim postupcima pripreme uzorka koji se koriste za dotične proizvode moraju se slijediti međunarodno priznate smjernice.

4.    Zahtjevi za laboratorije

4.1.

U skladu s odredbama Uredbe (EZ) br. 882/2004, laboratorije akreditiraju priznata tijela koja rade u skladu sa smjernicom ISO 58 kako bi se osiguralo da primjenjuju analitičko osiguranje kvalitete. Laboratoriji se akreditiraju prema normi EN ISO/IEC 17025. Načela opisana u tehničkim smjernicama za procjenu mjerne nesigurnosti i granica kvantifikacije za analizu PCDD/PCDF-ova i PCB-ova poštuju se ako su primjenjiva ( 26 ).

4.2.	Sposobnost laboratorija dokazuje se kontinuiranim uspješnim sudjelovanjem u međulaboratorijskim studijama za određivanje PCDD/PCDF-ova i dioksinima sličnih PCB-ova u relevantnim matricama hrane za životinje i rasponima koncentracija.

4.3.	Laboratoriji koji provode orijentacijske metode pri rutinskim kontrolama uzoraka moraju uspostaviti blisku suradnju s laboratorijima koji provode potvrdne metode, i radi kontrole kvalitete i radi potvrde analitičkih rezultata sumnjivih uzoraka.

5.    Osnovni zahtjevi za analitičke postupke za dioksine (PCDD/PCDF-ovi) i dioksinima slične PCB-ove

5.1.    Nizak radni raspon i granice kvantifikacije

Za PCDD/PCDF-ove osjetljivost određivanja u gornjem je femtogramskom (10– 15 g) rasponu zbog iznimno visoke toksičnosti nekih od tih spojeva. Za većinu PCB kongenera dovoljna je granica kvantifikacije u nanogramskom (10– 9 g) rasponu. Za mjerenje toksičnijih kongenera dioksinima sličnih PCB-ova (posebno ne-orto supstituiranih kongenera) donji dio radnog raspona doseže donje pikogramsko područje (10– 12 g). Za sve druge kongenere PCB-ova, dovoljna je granica kvantifikacije u nanogramskom rasponu (10– 9 g).

5.2.    Visoka selektivnost (specifičnost)

5.2.1.

Potrebno je praviti razliku između PCDD/PCDF-ova i dioksinima sličnih PCB-ova i mnogobrojnih drugih istodobno ekstrahiranih i vjerojatno interferirajućih spojeva prisutnih u koncentracijama koje su za nekoliko redova veličine veće od koncentracija predmetnih analita. Kod metoda GC-MS potrebno je praviti razliku između različitih kongenera, npr. između toksičnih (primjerice sedamnaest 2,3,7,8-supstituiranih PCDD/PCDF-ova i dvanaest dioksinima sličnih PCB-ova) i drugih kongenera.

5.2.2.

Bioanalitičke metode moraju moći otkriti ciljne spojeve kao zbroj PCDD/PCDF-ova i/ili dioksinima sličnih PCB-ova. Čišćenje uzorka ima za cilj uklanjanje spojeva koji uzrokuju lažnu nesukladnost rezultata ili spojeva koji mogu smanjiti odgovor i prouzročiti lažno sukladne rezultate.

5.3.    Visoka točnost (istinitost i preciznost, očito iskorištenje pri biološkim testovima)

5.3.1.

Kod metoda GC-MS određivanjem se mora osigurati valjana procjena prave koncentracije u uzorku. Visoka točnost potrebna je da bi se izbjeglo odbijanje rezultata analize uzorka na temelju niske pouzdanosti utvrđene vrijednosti TEQ. Točnost se izražava kao istinitost (razlika između izmjerene srednje vrijednosti za analit u certificiranome materijalu i njegove certificirane vrijednosti, izražene kao postotak te vrijednosti) i preciznost (RSDR relativna standardna devijacija izračunana iz rezultata dobivenih u uvjetima ponovljivosti).

5.3.2.

Kod bioanalitičkih metoda potrebno je odrediti očito iskorištenje pri biološkim testovima. Očito iskorištenje pri biološkim testovima znači vrijednost BEQ izračunana iz kalibracijske krivulje za TCDD ili PCB 126, korigirana za vrijednost slijepe probe i zatim podijeljena s vrijednošću TEQ određenom potvrdnom metodom. Tom se metodom pokušavaju korigirati faktori kao što su gubitak PCDD/PCDF-ova i dioksinima sličnih spojeva tijekom ekstrakcije i čišćenja, koekstrakcijski spojevi koji povećavaju ili smanjuju odgovor (agonistički i antagonistički učinci), kvaliteta prilagodbe krivulje ili razlike između vrijednosti TEF-a i REP-a (relativne učinkovitosti). Očito iskorištenje pri biološkim testovima izračunava se iz odgovarajućih referentnih uzoraka koji imaju reprezentativno raspoređene kongenere u blizini predmetne količine.

5.4.    Validacija u rasponu najveće dopuštene količine i opće mjere za kontrolu kvalitete

5.4.1.

Laboratoriji moraju dokazati učinkovitost izvedbe metode u određenom rasponu najveće dopuštene količine, npr. 0,5 puta, 1 puta i 2 puta većom količinom od najveće dopuštene količine, s prihvatljivim koeficijentom varijacije ponovljene analize tijekom validacijskog postupka i rutinske analize.

5.4.2.

Redovite slijepe probe i pokusi s dodavanjem ili analize kontrolnih uzoraka (ako je dostupan, poželjan je certificirani referentni materijal) provode se kao mjere unutarnje kontrole kvalitete. Dijagrami kontrole kvalitete za slijepe probe, pokuse s dodavanjem ili analize kontrolnih uzoraka bilježe se i provjeravaju kako bi se osiguralo da je provedba analiza u skladu sa zahtjevima.

5.5.    Granica kvantifikacije

5.5.1.

Za bioanalitičku orijentacijsku metodu određivanje granice kvantifikacije (LOQ) nije nužno, ali je potrebno dokazati da metoda može razlikovati slijepu vrijednost od cut-off vrijednosti. Pri određivanju vrijednosti BEQ određuje se prag izvještavanja zbog postupanja s uzorcima za koje je odgovor ispod te razine. Za prag izvještavanja potrebno je dokazati da se razlikuje najmanje za tri puta od postupka sa slijepim uzorcima s odgovorom ispod radnog raspona. Stoga ga se izračunava na temelju uzoraka koji sadrže ciljne spojeve blizu najniže zahtijevane količine, a ne na temelju omjera između signala i šuma ili slijepe probe.

5.5.2.

Granica određivanja (LOQ) za potvrdnu metodu mora biti približno jedna petina najveće dopuštene količine.

5.6.    Analitički kriteriji

Za pouzdane rezultate potvrdnih ili orijentacijskih metoda moraju se ispuniti sljedeći kriteriji u rasponu najveće dopuštene količine za vrijednosti TEQ ili BEQ, koje se određuju kao ukupna vrijednost TEQ ili ukupna vrijednost BEQ (kao zbroj PCDD/PCDF-ova i dioksinima sličnih PCB-ova), ili odvojeno za PCDD/PCDF-ove i dioksinima slične PCB-ove.

5.7.    Posebni zahtjevi za orijentacijske metode

5.7.1.

Mogu se koristiti GC-MS metode i bioanalitičke metode. Za GC-MS metode primjenjuju se zahtjevi utvrđeni u točki 6. Za stanične bioanalitičke metode primjenjuju se posebni zahtjevi utvrđeni u točki 7.

5.7.2.

Laboratoriji koji provode orijentacijske metode za rutinsku kontrolu uzoraka moraju uspostaviti blisku suradnju s laboratorijima koji provode potvrdnu metodu.

5.7.3.

Tijekom rutinske analize potrebno je provesti provjeru mogućnosti orijentacijske metode s pomoću kontrole analitičke kvalitete i stalnog vrednovanja metoda. Mora se kontinuirano provoditi program za kontrolu sukladnih rezultata.

5.7.4.

Provjera mogućeg smanjenja staničnog odgovora i citotoksičnosti: 20 % izolata uzoraka mjeri se u rutinskom orijentacijskom pregledu bez dodane tvari 2,3,7,8-TCDD i s njom, koja odgovara najvećoj dopuštenoj količini ili pragu za pokretanje postupka kako bi se provjerilo je li odgovor možda smanjen zbog interferirajućih tvari prisutnih u izolatu uzorka. Izmjerena koncentracija uzorka s dodatkom uspoređuje se sa zbrojem koncentracija izolata bez dodatka i koncentracije za dodavanje. Ako je ta izmjerena koncentracija za više od 25 % manja od izračunane (zbirne) koncentracije, to ukazuje na moguće smanjenje signala i dotični rezultat podvrgava se potvrdnoj analizi GC-HRMS. Rezultati se prate na dijagramima kontrole kvalitete.

5.7.5.

Kontrola kvalitete sukladnih uzoraka: Približno 2 do 10 % sukladnih uzoraka, ovisno o matrici uzorka i iskustvu laboratorija, potvrđuje se primjenom GC/HRMS-a.

5.7.6.

Određivanje učestalosti lažno sukladnih rezultata na temelju podataka kontrole kvalitete: Određuje se učestalost lažno sukladnih rezultata dobivenih orijentacijskim metodama analize uzoraka ispod i iznad najveće dopuštene količine ili praga za pokretanje postupka. Stvarna učestalost lažno sukladnih rezultata mora biti ispod 5 %. Kada je najmanje 20 potvrđenih rezultata po matrici/skupini matrica dostupno iz kontrole kvalitete sukladnih uzoraka, donose se zaključci o učestalosti lažno sukladnih rezultata iz te baze podataka. Rezultati uzoraka analiziranih prstenastim probama ili tijekom incidenata kontaminacije koji pokrivaju raspon koncentracije do npr. 2 puta najveće dopuštene količine, mogu se uključiti i u minimum od 20 rezultata za procjenu učestalosti lažno sukladnih rezultata. Uzorci moraju uključivati najčešće uzorke kongenera koji predstavljaju različite izvore. Iako su orijentacijske metode usmjerene prvenstveno na otkrivanje uzoraka koji prelaze prag za pokretanje postupka, kriterij za određivanje lažno sukladnih rezultata jest najveća dopuštena količina, uzimajući u obzir proširenu mjernu nesigurnost potvrdne metode.

5.7.7.

Mogući nesukladni uzorci iz orijentacijske metode moraju se uvijek provjeriti cijelom ponovljenom analizom na originalnom uzorku potvrdnom metodom analize. Ti se uzorci mogu koristiti i za procjenu učestalosti lažno nesukladnih rezultata. Kod orijentacijskih metoda učestalost lažnih nesukladnih rezultata dio je rezultata za koje je potvrdnom analizom potvrđeno da su sukladni, dok je prethodnom orijentacijskom metodom analize za uzorak izražena sumnja da nije sukladan. Procjena prednosti orijentacijske metode temelji se na usporedbi lažno nesukladnih uzoraka s ukupnim brojem pregledanih uzoraka. Ta učestalost mora biti dovoljno niska da uporaba orijentacijske metode bude korisna.

5.7.8.

Bioanalitičke metode moraju u uvjetima validacije valjano pokazati količinu TEQ, izračunanu i izraženu kao BEQ. I kod bioanalitičkih metoda provedenih u ponovljenim uvjetima interna laboratorijska ponovljivost RSDr uobičajeno je manja nego u uvjetima ponovljivosti RSDR.

6.    Posebni zahtjevi koje moraju ispunjavati GC-MS metode za potrebe orijentacije ili potvrđivanja

6.1.    Prihvatljive razlike između gornje i donje granice razina WHO-TEQ

Razlika između gornje i donje granice ne smije biti veća od 20 % da bi se potvrdio prelazak najveće dopuštene količine ili, u slučaju potrebe, prelazak praga za pokretanje postupka.

6.2.    Kontrola iskorištenja

6.2.1.

Dodavanje 13C-označenih 2,3,7,8-klor supstituiranih unutarnjih standarda za PCDD/PCDF-ove i 13C-označenih unutarnjih standarda za dioksinima slične PCB-ove provodi se na samom početku analitičke metode, na primjer prije ekstrakcije, kako bi se vrednovao analitički postupak. Dodaje se najmanje po jedan kongener za sve tetra- do okta-klorirane homologne skupine za PCDD/PCDF-ove i najmanje po jedan kongener za svaku homolognu skupinu za dioksinima slične PCB-ove (odnosno najmanje po jedan kongener za svaki izabrani ion u masenoj spektrometriji koja se koristi za praćenje PCDD/PCDF-ova i dioksinima sličnih PCB-ova). U slučaju potvrdnih metoda koristi se svih 17 13C-označenih 2,3,7,8-supstituiranih unutarnjih standarda za PCDD/PCDF-ove i svih 12 13C-označenih unutarnjih standarda za dioksinima slične PCB-ove.

6.2.2.

Relativne faktore odgovora treba utvrditi i za one kongenere za koje se ne dodaje ni jedan 13C-označen analog, i to upotrebom odgovarajuće kalibracijske otopine.

6.2.3.

Za hranu za životinje biljnog i životinjskog podrijetla koja sadržava manje od 10 % masti, interni se standardi obavezno dodaju prije ekstrakcije. Za hranu za životinje životinjskoga podrijetla u kojoj je udio masti veći od 10 %, interni se standardi mogu dodati prije ili poslije ekstrakcije masti. Provodi se odgovarajuće vrednovanje učinkovitosti ekstrakcije, što ovisi o fazi kada se dodaju interni standardi.

6.2.4.

Prije GC-MS analize dodaje se 1 ili 2 (surogat) standarda za iskorištenje.

6.2.5.

Potrebno je kontrolirati iskorištenje. Za potvrdne metode iskorištenje pojedinačnih internih standarda mora biti u rasponu između 60 % i 120 %. Manje ili veće iskorištenje za pojedinačne kongenere, a posebno za neke hepta- i okta-klorirane dibenzo-p-dioksine i dibenzofurane, prihvatljivo je pod uvjetom da je njihov doprinos TEQ vrijednosti manji od 10 % ukupne TEQ vrijednosti (dobivene na temelju zbroja PCDD/PCDF-ova i dioksinima sličnih PCB-ova). Za orijentacijske metode GC-MS iskorištenje je u rasponu između 30 % i 140 %.

6.3.    Uklanjanje interferirajućih tvari

6.4.    Kalibracija sa standardnom krivuljom

Raspon kalibracijske krivulje obuhvaća relevantni raspon najvećih dopuštenih količina ili pragova za pokretanje postupka.

6.5.    Posebni kriteriji za potvrdne metode

7.    Posebni zahtjevi za bioanalitičke metode

Bioanalitičke metode su metode koje se temelje na uporabi bioloških načela kao što su testovi na staničnoj osnovi, testovi na temelju receptora ili imunološki testovi. U ovoj točki 7. utvrđuju se općeniti zahtjevi za bioanalitičke metode.

Orijentacijskom metodom u načelu se uzorak klasificira kao sukladan ili kao uzorak sa sumnjom na nesukladnost. U tu svrhu izračunana vrijednost BEQ uspoređuje se s cut-off vrijednošću (vidjeti točku 7.3.). Uzorci ispod cut-off vrijednosti smatraju se sukladnima, za uzorke jednake ili iznad cut-off vrijednosti sumnja se da nisu sukladni, što zahtijeva analizu potvrdnom metodom. U praksi BEQ vrijednost koja odgovara dvjema trećinama najveće dopuštene količine može se koristiti kao najprimjerenija cut-off vrijednost, uz uvjet da se osigura učestalost lažno sukladnih rezultata ispod 5 % i prihvatljiva učestalost lažno nesukladnih rezultata. Kako su najveće dopuštene količine odvojene za PCDD/PCDF-ove i za zbroj PCDD/PCDF-ova i dioksinima sličnih PCB-ova, provjera sukladnosti uzoraka bez frakcioniranja zahtijeva odgovarajuće cut-off vrijednosti za PCDD/PCDF-ove kod bioloških testova. Za provjeru uzoraka koji prelaze pragove za pokretanje postupka kao cut-off vrijednost upotrebljava se odgovarajući postotak dotičnog praga za pokretanje postupka.

Ako je okvirna vrijednost izražena u BEQ, rezultati uzorka moraju biti u radnom rasponu i prelaziti prag izvještavanja (vidjeti točke 7.1.1. i 7.1.6.)

7.1.    Procjena odgovora na ispitivanje

7.1.1.    Opći zahtjevi

7.1.2.    Kalibracija

7.1.2.1.   Kalibracija sa standardnom krivuljom

7.1.2.2.   Kalibracija s referentnim uzorcima

Druga mogućnost jest da se upotrijebi kalibracijska krivulja pripremljena od barem četiri referentna uzorka (vidjeti točku 7.2.4.): jedna slijepa matrica te tri referentna uzorka s 0,5 puta, 1 puta i 2 puta većom vrijednosti od najveće dopuštene količine ili praga za pokretanje postupka, zbog čega korekcija vrijednosti slijepih proba i iskorištenja više nije potrebna ako značajke matrice referentnih uzoraka odgovaraju onima nepoznatih uzoraka. U tom se slučaju odgovor na ispitivanje koji odgovara dvije trećine najveće dopuštene količine (vidjeti točku 7.3.) može izračunati neposredno iz tih uzoraka i upotrijebiti kao cut-off vrijednost. Za provjeru uzoraka koji prelaze pragove za pokretanje postupka, odgovarajući postotak tih pragova za pokretanje postupka koristi se kao cut-off vrijednost.

7.1.3.    Odvojeno određivanje PCDD/PCDF-ova i dioksinima sličnih PCB-ova

Izolati se mogu podijeliti u frakcije koje sadržavaju PCDD/PCDF-ove i dioksinima slične PCB-ove, omogućujući odvojeno iskazivanje vrijednosti TEQ za PCDD/PCDF-ove i dioksinima slične PCB-ove (u BEQ). Za procjenu rezultata za frakciju koja sadržava dioksinima slične PCB-ove po mogućnosti se koristi standardna kalibracijska krivulja PCB 126.

7.1.4.    Očito iskorištenje pri biološkim testovima

„Očito iskorištenje pri biološkim testovima” izračunava se iz odgovarajućih referentnih uzoraka s reprezentativnim uzorcima kongenera u području oko najveće dopuštene količine ili praga za pokretanje postupka i izražava se kao postotak vrijednosti BEQ u usporedbi s vrijednošću TEQ. Ovisno o vrsti ispitivanja i upotrijebljenih TEF-ova ( 27 ), razlike između faktora TEF i REP za dioksinima slične PCB-ove mogu prouzročiti manje očito iskorištenje za dioksinima slične PCB-ove u usporedbi s PCDD/PCDF-ovima. Stoga, ako se provodi odvojeno određivanje PCDD/PCDF-ova i dioksinima sličnih PCB-ova, očito iskorištenje pri biološkim testovima iznosi: za dioksinima slične PCB-ove 20 % do 60 %, za PCDD/PCDF-ove od 50 % do 130 % (rasponi vrijede za TCDD kalibracijsku krivulju). S obzirom na to da doprinos dioksinima sličnih PCB-ova zbroju PCDD/PCDF-ova i dioksinima sličnih PCB-ova može varirati kod različitih matrica i uzoraka, očito iskorištenje pri biološkim testovima za zbroj PCDD/PCDF-ova i dioksinima sličnih PCB-ova odražava te raspone koji iznose od 30 % do 130 %. Bilo koja implikacija bitno revidiranih vrijednosti TEF-a na zakonodavstvo Unije za PCDD/PCDF-ove i dioksinima slične PCB-ove zahtijeva reviziju tih raspona.

7.1.5.    Kontrola iskorištenja pri čišćenju

Gubitak spojeva tijekom čišćenja provjerava se tijekom validacije. Slijepa proba s dodatkom mješavine različitih kongenera podvrgava se čišćenju (najmanje n = 3), a iskorištenje i varijabilnost provjeravaju se potvrdnom metodom. Iskorištenje iznosi od 60 % do 120 % naročito za kongenere koji doprinose više od 10 % vrijednosti TEQ u različitim mješavinama.

7.1.6.    Prag izvještavanja

Za izvještavanje o vrijednostima BEQ prag izvještavanja određuje se na temelju odgovarajućih uzoraka matrica koji uključuju tipične uzorke kongenera, ali ne na temelju kalibracijske krivulje standarda zbog niske preciznosti u donjem rasponu krivulje. Učinci ekstrakcije i čišćenja moraju se uzeti u obzir. Prag izvještavanja određuje se u mjeri najmanje tri puta većoj od postupka sa slijepim uzorcima.

7.2.    Korištenje referentnih uzoraka

7.2.1.

Referentni uzorci predstavljaju uzorke matrica, uzorke kongenera i raspone koncentracija za PCDD/PCDF-ove i dioksinima slične PCB-ove oko najveće dopuštene količine ili praga za pokretanje postupka.

7.2.2.

Uz svaku seriju uzoraka koja se ispituje uključuje se jedna slijepa matrica ili, gdje to nije moguće, postupak sa slijepim uzorcima i jedan referentni uzorak s najvećom dopuštenom količinom ili na pragu za pokretanje postupka. Ti se uzorci ekstrahiraju i ispituju istodobno u istovjetnim uvjetima. Referentni uzorak pokazuje izrazito veći odgovor od slijepog uzorka, čime se osigurava primjerenost ispitivanja. Ti se uzorci mogu koristiti za korekciju slijepe probe i iskorištenja.

7.2.3.

Referentni uzorci koji se odabiru za korekciju iskorištenja reprezentativni su za pokusne uzorke, što znači da uzorci kongenera ne uzrokuju preniske procjene vrijednosti.

7.2.4.

Dodatnim referentnim uzorcima kojima su, npr., količine 0,5x i 2x veće od najveće dopuštene količine ili praga za pokretanje postupka mogu se uključiti radi dokazivanja ispravnosti ispitivanja u rasponu propisanih količina za kontrolu najveće dopuštene količine ili praga za pokretanje postupka. Ako se kombiniraju, ti se uzorci mogu koristiti za izračun vrijednosti BEQ u pokusnim uzorcima (vidjeti točku 7.1.2.2.).

7.3.    Određivanje cut-off vrijednosti

Utvrđuje se odnos između bioanalitičkih rezultata u BEQ-u i rezultata potvrdne metode u TEQ-u, npr. kalibracijskim pokusima u matrici, koji uključuju referentne uzorke s dodatkom 0, 0,5 puta, 1 puta i 2 puta najveće dopuštene količine sa šest ponavljanja na svakoj razini (n = 24). Faktori korekcije (slijepa proba i iskorištenje) mogu se procijeniti iz ovog odnosa, ali ih se mora provjeravati u skladu s točkom 7.2.2.

Cut-off vrijednosti određuju se za donošenje odluka o sukladnosti uzorka s najvećim dopuštenim količinama ili za kontrolu pragova za pokretanje postupka, ako je relevantno, s obzirom na dotične najveće dopuštene količine ili prag za pokretanje postupka određene posebno za PCDD/PCDF-ove i za dioksinima slične PCB-ove ili za zbroj PCDD/PCDF-ova i dioksinima sličnih PCB-ova. Prikazuje ih donja krajnja točka distribucije bioanalitičkih rezultata (korigirano za vrijednost slijepe probe i za iskorištenje), što odgovara odlučujućoj granici potvrdne metode na temelju 95 % razine pouzdanosti, što podrazumijeva da je udio lažno sukladnih rezultata < 5 % i na temelju RSDR < 25 %. Odlučujuća granica potvrdne metode najveća je dopuštena količina uzimajući u obzir proširenu mjernu nesigurnost.

U praksi se cut-off vrijednost (u BEQ) može izračunati u skladu s jednim od pristupa navedenih u točkama 7.3.1., 7.3.2. i 7.3.3. (vidjeti sliku 1.).

7.3.1.

Korištenje donjeg raspona 95 % intervala predviđanja pri odlučujućoj granici potvrdne metode pri čemu je: BEQDL BEQ koji odgovara odlučujućoj granici potvrdne metode, koja je najveća dopuštena količina uzimajući u obzir proširenu mjernu nesigurnost sy,x standardna devijacija rezidua t α,f = m – 2 student faktor (α = 5 %, f = stupnjevi slobode, jednostrani) m ukupan broj kalibracijskih točaka (indeks j) n broj ponavljanja na svakoj razini xi koncentracija uzorka (u TEQ) kalibracijske točke i određena potvrdnom metodom srednja vrijednost koncentracija (u TEQ) svih kalibriranih uzoraka parametar zbroja kvadrata, i = indeks za kalibracijsku točku i

7.3.2.

Izračun iz bioanalitičkih rezultata (korigirano za vrijednost slijepe probe i za iskorištenje) višestrukih analiza uzoraka (n ≥ 6) kontaminiranih na odlučujućoj granici potvrdne metode, kao donja krajnja točka distribucije podataka pri odgovarajućoj srednjoj BEQ vrijednosti: Cut-off vrijednost = BEQDL – 1,64 × SDR pri čemu je: SDR standardna devijacija rezultata bioloških testova pri BEQDL, izmjereno u uvjetima unutarnje laboratorijske ponovljivosti.

7.3.3.

Izračun kao srednja vrijednost bioanalitičkih rezultata (u BEQ, korigirano za vrijednost slijepe probe i za iskorištenje) iz višestrukih analiza uzoraka (n ≥ 6) kontaminiranih na dvije trećine najveće dopuštene količine ili praga za pokretanje postupka, na temelju zapažanja da će se ta vrijednost kretati oko cut-off vrijednosti određene u točkama 7.3.1. ili 7.3.2.: Izračun cut-off vrijednosti na temelju 95 % razine pouzdanosti, što znači da je udio lažno sukladnih rezultata < 5 % i na temelju RSDR < 25 %: 1.  iz donjeg raspona 95 % intervala predviđanja pri odlučujućoj granici potvrdne metode; 2.  iz višestrukih analiza uzoraka (n ≥ 6) kontaminiranih na odlučujućoj granici potvrdne metode kao donja krajnja točka distribucije podataka (na slici prikazana s krivuljom u obliku zvona) pri odgovarajućoj srednjoj BEQ vrijednosti. Slika 1.

7.3.4.

Ograničenja cut-off vrijednosti Cut-off vrijednosti na temelju BEQ, izračunane iz RSDR postignute tijekom validacije koristeći ograničen broj uzoraka s različitim uzorcima matrice/kongenera mogu biti veće od najveće dopuštene količine ili praga za pokretanje postupka na temelju TEQ zbog veće preciznosti od one rutinski dobivene kada je potrebno kontrolirati nepoznati spektar mogućih uzoraka kongenera. U takvim se slučajevima cut-off vrijednosti izračunavaju iz RSDR = 25 %, ili se daje prednost dvjema trećinama najveće dopuštene količine ili praga za pokretanje postupka.

7.4.    Karakteristike izvedivosti

7.4.1.

S obzirom na to da se u bioanalitičkim metodama ne mogu koristiti interni standardi, moraju se provoditi ispitivanja ponovljivosti bioanalitičkih metoda kako bi se dobili podaci o standardnoj devijaciji unutar i između serija ispitivanja. Ponovljivost mora biti manja od 20 %, a interna laboratorijska ponovljivost manja od 25 %. To se temelji na razinama izračunatima u BEQ nakon korekcije za vrijednost slijepe probe i za iskorištenja.

7.4.2.

U postupku validacije mora se dokazati da se u ispitivanju pravi razlika između slijepe probe i razine na cut-off vrijednosti omogućujući identifikaciju uzoraka iznad odgovarajuće cut-off vrijednosti (vidjeti točku 7.1.2.).

7.4.3.

Moraju se utvrditi ciljni spojevi, moguće interferencije i najveće prihvatljive količine za slijepe probe.

7.4.4.

Postotak standardne devijacije u odgovoru ili koncentraciji izračunan iz odgovora (moguće samo u radnom rasponu) pri trostrukom određivanju izolata uzorka ne smije biti iznad 15 %.

7.4.5.

Nekorigirani rezultati referentnih uzoraka izraženi u BEQ (vrijednost slijepe probe i pri najvećoj dopuštenoj količini ili pragu za pokretanje postupka) koriste se za ocjenu izvedivosti bioanalitičke metode kroz kontinuirano vremensko razdoblje.

7.4.6.

Dijagrami kontrole kvalitete za postupke sa slijepim uzorcima i svaka vrsta referentnog uzorka bilježe se i provjeravaju kako bi se osiguralo da je izvedivost analiza u skladu sa zahtjevima, a posebno za postupak sa slijepim uzorcima u pogledu zahtijevane najmanje razlike do donjeg dijela radnog raspona i za referentne uzorke u pogledu unutarlaboratorijske obnovljivosti. Postupke sa slijepim uzorcima potrebno je kontrolirati tako da se izbjegnu lažno sukladni rezultati kada se oduzimaju.

7.4.7.

Rezultati analiza potvrdnim metodama sumnjivih uzoraka i 2 do 10 % sukladnih uzoraka (najmanje 20 uzoraka po matrici) prikupljaju se i koriste za procjenu izvedivosti orijentacijske metode i odnosa između BEQ-a i TEQ-a. Ova baza podataka može se koristiti za ponovljenu evaluaciju cut-off vrijednosti koje se primjenjuju na rutinske uzorke za validirane matrice.

7.4.8.

Uspješna izvedivost metode može se dokazati i prstenastim probama. Rezultati uzoraka analiziranih prstenastim probama koje obuhvaćaju raspon koncentracija do npr. 2 puta najveće dopuštene količine mogu biti uključeni u procjenu učestalosti lažno sukladnih rezultata ako laboratorij može dokazati uspješnu izvedivost. Uzorci moraju uključivati najčešće uzorke kongenera koji predstavljaju različite izvore.

7.4.9.

Tijekom incidenata se mogu ponovo procijeniti cut-off vrijednosti uzimajući u obzir posebne uzorke matrica i kongenera koji se pojavljuju u tom incidentu.

8.    Izvještavanje o rezultatima

8.1.    Potvrdne metode

8.1.1.

Analitički rezultati moraju sadržavati količine pojedinačnih PCDD/PCDF-ova i kongenera dioksinima sličnih PCB-ova, a o TEQ vrijednostima se izvještava kao o donjima, gornjima ili srednjima kako bi se u izvješće uključilo što više podataka o rezultatima i na taj način omogućilo tumačenje rezultata prema posebnim zahtjevima.

8.1.2.

U izvješće je potrebno uključiti metodu koja se koristi za ekstrakciju PCDD/PCDF-ova i dioksinima sličnih PCB-ova.

8.1.3.

Iskorištenja pojedinih internih standarda moraju biti navedena ako su izvan raspona navedenog u točki 6.2.5., u slučaju da je dobiveni rezultat veći od najveće dopuštene količine (u tom slučaju iskorištenja za jednu ili dvije dvostruke analize) te u drugim slučajevima na zahtjev.

8.1.4.

S obzirom na to da proširenu mjernu nesigurnost treba uzeti u obzir pri odluci o sukladnosti uzorka, potrebno je navesti taj parametar. Stoga se analitički rezultati prikazuju kao x +/– U, pri čemu je x analitički rezultat, a U je proširena mjerna nesigurnost uz faktor pokrivanja 2, čime se dobiva razina pouzdanosti od približno 95 %. U slučaju kada se PCDD/PCDF-ovi i dioksinima slični PCB-ovi određuju odvojeno, tada se zbroj procijenjene proširene nesigurnosti za pojedinačne analitičke rezultate PCDD/PCDF-ova i dioksinima sličnih PCB-ova koristi za zbroj PCDD/PCDF-ova i dioksinima sličnih PCB-ova.

8.1.5.

Rezultati se izražavaju u istim jedinicama i zaokružuju se barem na isti broj bitnih decimalnih mjesta kao najveće dopuštene količine utvrđene u Direktivi 2002/32/EZ.

8.2.    Bioanalitičke orijentacijske metode

8.2.1.

Rezultat orijentacijske metode izražava se kao „sukladan” ili se za njega „sumnja da je nesukladan” („sumnjiv”).

8.2.2.

Osim toga, okvirni rezultat za PCDD/PCDF-ove i/ili dioksinima slične PCB-ove može se izraziti u BEQ, a ne TEQ.

8.2.3.

Za uzorke s odgovorom ispod granice izvještavanja navodi se da su „ispod granice izvještavanja”. Za uzorke s odgovorom iznad radnog raspona navodi se da „prelaze radni raspon” i odgovarajuća količina do gornjeg dijela radnog raspona navodi se u BEQ.

8.2.4.

Za svaku vrstu uzorka matrice u izvješću se mora navesti najveća dopuštena količina ili prag za pokretanje postupka na kojima se procjena temelji.

8.2.5.

U izvješću se mora navesti vrsta ispitivanja koje se koristi, osnovno načelo ispitivanja i vrsta kalibracije.

8.2.6.

U izvješće je potrebno uključiti metodu koja se koristi za ekstrakciju PCDD/PCDF-ova i dioksinima sličnih PCB-ova.

8.2.7.

U slučaju uzoraka za koje se sumnja da nisu sukladni, izvješće treba uključivati napomenu o postupku koji treba poduzeti. Koncentracija PCDD/PCDF-ova i zbroj PCDD/PCDF-ova i dioksinima sličnih PCB-ova u tim uzorcima s povišenim razinama mora se odrediti/potvrditi potvrdnom metodom.

8.2.8.

Nesukladni rezultati navode se samo iz potvrdne analize.

8.3.    Fizikalno-kemijske orijentacijske metode

8.3.1.

Rezultat orijentacijske metode izražava se kao „sukladan” ili se za njega „sumnja da je nesukladan” („sumnjiv”).

8.3.2.

Za svaku vrstu uzorka matrice u izvješću se mora navesti najveća dopuštena količina ili prag za pokretanje postupka na kojima se procjena temelji.

8.3.3.

Osim toga mogu se navesti količine za pojedine PCDD/PCDF-ove i/ili dioksinima slične PCB kongenere te TEQ vrijednosti izražene kao donje, gornje i srednje. Rezultati se izražavaju u istim jedinicama i zaokružuju se barem na isti broj bitnih decimalnih mjesta kao najveće dopuštene količine utvrđene u Direktivi 2002/32/EZ.

8.3.4.

Iskorištenja pojedinih internih standarda moraju biti navedena ako su izvan raspona navedenog u točki 6.2.5., u slučaju da je dobiveni rezultat veći od najveće dopuštene količine (u tom slučaju iskorištenja za jednu ili dvije dvostruke analize) te u drugim slučajevima na zahtjev.

8.3.5.

U izvješću se navodi primijenjena GC-MS metoda.

8.3.6.

U izvješće je potrebno uključiti metodu koja se koristi za ekstrakciju PCDD/PCDF-ova i dioksinima sličnih PCB-ova.

8.3.7.

U slučaju uzoraka za koje se sumnja da nisu sukladni, izvješće treba uključivati napomenu o postupku koji treba poduzeti. Koncentracija PCDD/PCDF-ova i zbroj PCDD/PCDF-ova i dioksinima sličnih PCB-ova u tim uzorcima s povišenim razinama mora se odrediti/potvrditi potvrdnom metodom.

8.3.8.

O nesukladnosti se može odlučiti samo nakon potvrdne analize.

POGLAVLJE III.

Priprema uzorka i zahtjevi za metode analize koje se koriste za službenu kontrolu količina PCB-ova koji nisu slični dioksinima u hrani za životinje

1.    Područje primjene

Zahtjevi iz ovog poglavlja primjenjuju se kad se hrana za životinje analizira za službenu kontrolu količina PCB-ova koji nisu slični dioksinima i u pogledu pripreme uzoraka i analitičkih zahtjeva za druge regulatorne svrhe, uključujući kontrole koje provodi subjekt u poslovanju s hranom za životinje za osiguranje sukladnosti s odredbama Uredbe (EZ) br. 183/2005.

2.    Metode detekcije koje se koriste

Plinska kromatografija/detektor hvatanja elektrona (GC-ECD), GC-LRMS, GC-MS/MS, GC-HRMS ili istovjetne metode.

3.    Identifikacija i potvrđivanje predmetnih analita

3.1.	Relativno retencijsko vrijeme u odnosu na interne standarde ili referentne standarde (prihvaćena devijacija od +/– 0,25 %).

3.2.	Plinsko kromatografsko odvajanje PCB-ova koji nisu slični dioksinima od interferirajućih tvari, posebno ko-eluiranih PCB-ova, a posebno ako su uzorci u rasponu zakonski dozvoljenih granica i nesukladnost se mora potvrditi ( 28 ).

3.3.

Zahtjevi za tehnike GC-MS Praćenje najmanje sljedećeg broja molekularnih iona ili karakterističnih iona iz molekularnog klastera: (a)  dva specifična iona za HRMS; (b)  tri specifična iona za LRMS; (c)  dva specifična prekursor iona, svakog s jednim posebnim odgovarajućim prijelaznim ionom produkta za MS-MS. Najveća dozvoljena odstupanja za omjere brojnosti odabranih masenih fragmenata: Relativna devijacija intenziteta omjera brojnosti odabranih masenih fragmenata u odnosu na teoretsku brojnost ili kalibracijski standard za ciljni ion (praćeni ion s najvećom brojnosti) i kvalifikacijskih iona: ± 15 %

3.4.	Zahtjevi za tehnike GC-ECD Potvrda rezultata koji prelaze najveću dopuštenu količinu s dva stupca GC sa stacionarnim fazama različitog polariteta.

4.    Prikazivanje izvođenja metode

Izvođenje metode validira se u rasponu najveće dopuštene količine (0,5 do 2 puta više od najveće dopuštene količine) s prihvatljivim koeficijentom varijacije za ponovljene analize (vidjeti zahtjeve za srednju preciznost u točki 9.).

5.    Granica kvantifikacije

Zbroj LOQ-ova ( 29 ) PCB-ova koji nisu slični dioksinima ne smije biti veći od jedne trećine najveće dopuštene količine ( 30 ).

6.    Kontrola kvalitete

Redovite slijepe probe, analize uzoraka s dodatkom, analize uzoraka za kontrolu kvalitete, sudjelovanje u međulaboratorijskim studijama relevantnih matrica.

7.    Kontrola iskorištenja

7.1.	Korištenje primjerenih internih standarda s fizikalno-kemijskim svojstvima koji odgovaraju predmetnim analitima.

7.2.	Dodavanje internih standarda: Dodavanje proizvodima (prije ekstrakcije i postupka čišćenja).

7.3.

Zahtjevi za metode u kojima se koristi svih šest izotopski označenih kongenera PCB-ova koji nisu slični dioksinima (a)  korekcija rezultata za iskorištenje unutarnjih standarda; (b)  iskorištenje izotopski označenih unutarnjih standarda je između 60 i 120 %; (c)  prihvatljivo je manje ili veće iskorištenje za pojedinačne kongenere s doprinosom manjim od 10 % zbroju PCB-ova koji nisu slični dioksinima.

7.4.

Zahtjevi za metode u kojima se ne koristi svih šest izotopski označenih internih standarda ili se koriste drugi interni standardi: (a)  kontrola iskorištenja unutarnjih standarda za svaki uzorak; (b)  iskorištenje unutarnjih standarda između 60 i 120 %; (c)  korekcija rezultata u pogledu iskorištenja unutarnjih standarda.

7.5.	Iskorištenje neoznačenih kongenera provjerava se analizom uzoraka s dodatkom ili kontrolnih uzoraka s koncentracijama u rasponu najveće dopuštene količine. Prihvatljivo iskorištenje za te je kongenere između 60 i 120 %.

8.    Zahtjevi za laboratorije

U skladu s odredbama Uredbe (EZ) br. 882/2004, laboratorije akreditiraju priznata tijela koja rade u skladu sa smjernicom ISO 58 kako bi se osiguralo da primjenjuju analitičko osiguranje kvalitete. Laboratoriji se akreditiraju prema normi EN ISO/IEC 17025. Osim toga, načela opisana u tehničkim smjernicama za procjenu mjerne nesigurnosti i granica kvantifikacije za analizu PCB-ova poštuju se ako su primjenjiva ( 31 ).

9.    Karakteristike izvedivosti: kriteriji za zbroj PCB-ova koji nisu slični dioksinima pri najvećoj dopuštenoj količini

10.    Izvještavanje o rezultatima

10.1.

Analitički rezultati sadržavaju količine pojedinačnih PCB-ova koji nisu slični dioksinima i zbroj kongenera PCB-ova koji se navode kao donji, gornji ili srednji kako bi se u izvješće uključilo što više informacija o rezultatima i na taj način omogućilo tumačenje rezultata u skladu s posebnim zahtjevima.

10.2.

Izvješće obuhvaća metodu koja se koristi za ekstrakciju PCB-ova.

10.3.

Iskorištenja pojedinih internih standarda navode se u slučaju da su izvan raspona navedenog u točki 7., u slučaju da je dobiveni rezultat veći od najvećih dopuštenih količina te u drugim slučajevima na zahtjev.

10.4.

S obzirom na to da proširenu mjernu nesigurnost treba uzeti u obzir pri odlučivanju o sukladnosti uzorka, potrebno je navesti i taj parametar. Stoga se analitički rezultati prikazuju kao x +/– U, pri čemu je x analitički rezultat, a U je proširena mjerna nesigurnost uz faktor pokrivanja 2, čime se dobiva razina pouzdanosti od približno 95 %.

10.5.

Rezultati se izražavaju u istim jedinicama i zaokružuju se barem na isti broj bitnih decimalnih mjesta kao najveće dopuštene količine utvrđene u Direktivi 2002/32/EZ.

▼M2

---

PRILOG VI.

METODE ANALIZE ZA ODREĐIVANJE SASTOJAKA ŽIVOTINJSKOG PODRIJETLA ZA SLUŽBENU KONTROLU HRANE ZA ŽIVOTINJE

1.   CILJ I PODRUČJE PRIMJENE

Određivanje sastojaka životinjskog podrijetla u hrani za životinje provodi se svjetlosnom mikroskopijom ili lančanom reakcijom polimerazom (PCR) u skladu s odredbama iz ovog Priloga.

Ove dvije metode omogućuju otkrivanje prisutnosti sastojaka životinjskog podrijetla u krmivima i krmnim smjesama. Međutim, one ne omogućavaju izračun količine takvih sastojaka u krmivima i krmnim smjesama. Obje metode imaju granicu detekcije ispod 0,1 % (m/m).

PCR metoda omogućuje određivanje taksonomske skupine sastojaka životinjskog podrijetla prisutnih u krmivima i krmnim smjesama.

Ove metode primjenjuju se pri kontroli provedbe zabrana iz članka 7. stavka 1. i Priloga IV. Uredbi (EZ) br. 999/2001 i iz članka 11. stavka 1. Uredbe (EZ) br. 1069/2009.

Ovisno o vrsti hrane za životinje koja se ispituje, ove metode mogu se koristiti u okviru jednog jedinstvenog operativnog protokola bilo samostalno ili zajedno u skladu sa standardiziranim operativnim postupcima (SOP) koje je uspostavio referentni laboratorij EU-a za životinjske bjelančevine u hrani za životinje (EURL-AP) i objavio na svojim internetskim stranicama ( 32 ).

2.   METODE

2.1.    Svjetlosna mikroskopija

2.1.1.    ►M7  Načelo

Sastojci životinjskog podrijetla koji mogu biti prisutni u krmivima i krmnim smjesama poslanima na analizu identificiraju se na temelju tipičnih i mikroskopski prepoznatljivih karakteristika kao što su mišićna vlakna i ostale čestice mesa, hrskavica, kosti, rogovi, dlaka, čekinje, krv, kapljice mlijeka, kristali laktoze, perje, ljuske jaja, riblje kosti i krljušt. ◄

2.1.2.    Reagensi i oprema

2.1.2.1.   Reagensi

2.1.2.1.1.   Sredstvo za koncentriranje

2.1.2.1.1.1.   Tetrakloretilen (gustoća 1,62)

2.1.2.1.2.   Reagens za bojenje

2.1.2.1.2.1.

Alizarin crvenilo (otopi se 2,5 ml 1M kloridne kiseline u 100 ml vode i toj se otopini doda 200 mg alizarin crvenila)

2.1.2.1.3.   Sredstva za pripremu preparata

2.1.2.1.3.1.   Lužina (NaOH 2,5 % w/v ili KOH 2,5 % w/v)

2.1.2.1.3.2.    ►M7  Glicerol (nerazrijeđen, viskoznost: 1 490 cP) ili sredstvo za pripremu preparata s ekvivalentnim svojstvima za pripremu privremenih preparata ◄

2.1.2.1.3.3.   Norland ® Optical Adhesive 65 (viskoznost: 1 200 cP) ili smola s istovjetnim svojstvima za pripremu trajnih preparata

2.1.2.1.4.   Sredstva za pripremu preparata s osobinama bojenja

2.1.2.1.4.1.

Lugolova otopina (otopi se 2 g kalijevog jodida u 100 ml vode, zatim se uz često mućkanje doda 1 g joda)

2.1.2.1.4.2.

Cistinski reagens (2 g olovnog acetata, 10 g NaOH/100 ml vode)

2.1.2.1.4.3.

Fehlingov reagens (pripravi se prije uporabe od jednakih dijelova (1/1) osnovnih otopina A i B. Otopina A: 6,9 g bakrova (II) sulfata pentahidrata otopi se u 100 ml vode. Otopina B: 34,6 g kalij-natrijevog tartarata tetrahidrata i 12 g NaOH otopi se u 100 ml vode)

2.1.2.1.4.4.

Tetrametilbenzidin/vodikov peroksid (otopi se 1 g 3,3’,5,5’-tetrametilbenzidina (TMB) u 100 ml ledene octene kiseline i 150 ml vode. Prije uporabe izmiješaju se 4 dijela te TMB otopine s jednim dijelom 3 % vodikovoga peroksida)

2.1.2.1.5.   Sredstva za ispiranje

2.1.2.1.5.1.   Etanol ≥ 96 % (tehnički čist)

2.1.2.1.5.2.   Aceton (tehnički čist)

2.1.2.1.6.   Reagens za izbjeljivanje

2.1.2.1.6.1.   Komercijalna otopina natrijevog hipoklorita (9 – 14 % aktivnog klora)

2.1.2.2.   Oprema

2.1.2.2.1.   Analitička vaga s preciznošću od 0,001 g

2.1.2.2.2.    ►M7  Pribor za mljevenje: nož ili mlin s rotorom. Ako se koristi mlin s rotorom zabranjena je upotreba mlinskih sitâ ≤ 0,5 mm ◄

2.1.2.2.3.    ►M7  Sita s mrežicom kvadratnih očica širine 0,25 mm i 1 mm. Osim kod prethodnog prosijavanja uzorka, promjer sita ne smije biti veći od 10 cm kako bi se izbjegao gubitak materijala. Kalibracija sita nije potrebna ◄

2.1.2.2.4.

Konusni stakleni lijevak za odjeljivanje zapremine 250 ml s teflonskim čepom ili čepom od brušenog stakla na dnu konusa. Promjer otvora čepa mora biti ≥ 4 mm. Umjesto toga se može upotrijebiti čaša s konusnim dnom za taloženje pod uvjetom da je laboratorij dokazao da su granice detekcije istovjetne onima kada se koristi konusni stakleni lijevak za odjeljivanje. Lijevak za odjeljivanje

2.1.2.2.5.

Stereomikroskop koji obuhvaća barem konačni opseg povećanja od 6,5 × do 40 ×

2.1.2.2.6.

Sastavljeni mikroskop koji obuhvaća barem konačni opseg povećanja od 100× do 400× s poljem za propušteno svjetlo. Mogu se dodatno koristiti polarizirano svjetlo i diferencijalni interferentni kontrast

2.1.2.2.7.

Standardno laboratorijsko posuđe od stakla

2.1.2.2.8.

Oprema za pripremu preparata: klasična mikroskopska stakalca, stakalca s udubinom, pokrovna stakalca (20 × 20 mm), pinceta, fina lopatica

▼M7

2.1.2.2.9.

Laboratorijska peć

2.1.2.2.10.

Centrifuga

2.1.2.2.11.

Filtar papir: kvalitativni celulozni filtar (veličine pora 4–11 μm)

▼M2

2.1.3.    Uzorkovanje i priprema uzorka

2.1.3.1.    ►M7  Uzorkovanje

Koristi se reprezentativni uzorak uzet u skladu s odredbama iz Priloga I. ovoj Uredbi. ◄

2.1.3.2.   Mjere predostrožnosti

Kako bi se spriječila križna kontaminacija u laboratoriju, svu laboratorijsku opremu za višekratnu uporabu potrebno je pažljivo očistiti prije uporabe. Dijelove lijevka za odjeljivanje potrebno je prije čišćenja rastaviti. Dijelove lijevka za odjeljivanje i posuđe od stakla potrebno je prethodno oprati ručno, a zatim oprati u perilici posuđa. Sita se moraju očistiti četkom s tvrdim sintetičkim dlačicama. Preporuča se završno čišćenje sita acetonom i komprimiranim zrakom nakon prosijavanja masnog materijala, kao što je riblje brašno.

2.1.3.3.   Priprema uzoraka osim masti i ulja

2.1.3.3.1.

►M7  Sušenje uzorka: uzorci sa sadržajem vlage > 14 % suše se prije rukovanja u skladu s Prilogom III. ovoj Uredbi. ◄

2.1.3.3.2.

►M7  Prethodno prosijavanje uzorka: kako bi se prikupile informacije o mogućem okolišnom zagađenju hrane za životinje, preporučuje se da se hrana u peletima i zrnu prethodno prosije na 1 mm i da se dvije dobivene frakcije, koje se moraju smatrati različitim uzorcima, zatim odvojeno pripreme i analiziraju te da se o njima odvojeno izvijesti. ◄

2.1.3.3.3.

Razdioba uzorka u poduzroke i mljevenje: barem 50 g uzorka se razdijeli na poduzorke za analizu koji se zatim melju.

2.1.3.3.4.

Ekstrakcija i priprema taloga: prenese se dio od 10 g (s preciznošću od 0,01 g) samljevenog poduzorka u lijevak za odjeljivanje ili čašu s konusnim dnom za taloženje i doda se 50 ml tetrakloretilena. Dio koji je prenesen u lijevak mora se ograničiti na 3 g u slučaju ribljeg brašna ili drugih čistih proizvoda životinjskog podrijetla, mineralnih sastojaka ili premiksa koji proizvode više od 10 % taloga. Mješavinu je potrebno snažno protresti tijekom najmanje 30 s i mora se oprezno dodati najmanje još 50 ml tetrakloretilena kako bi se isprale unutarnje stijenke lijevka i uklonile sve prianjajuće čestice. Tako dobivena mješavina se ostavi stajati najmanje 5 minuta prije odvajanja taloga otvaranjem čepa. Ako se koristi čaša s konusnim dnom za taloženje, mješavinu je potrebno snažno miješati najmanje 15 s, a sve prianjajuće čestice uz stijenke čaše potrebno je pažljivo isprati niz unutarnju površinu s najmanje 10 ml čistog tetrakloretilena. Mješavinu je potrebno ostaviti stajati tijekom 3 minute i zatim ponovo promiješati tijekom 15 sekundi, a sve čestice koje prianjaju uz stijenke čaše potrebno je pažljivo isprati niz unutarnju površinu s najmanje 10 ml čistog tetrakloretilena. Tako dobivena mješavina se ostavi stajati najmanje 5 minuta, zatim se tekuća frakcija odstrani i ukloni pažljivim dekantiranjem, vodeći računa da se niti malo taloga ne izgubi. ▼M7 Talog se prikuplja na filtar papiru koji se stavlja u lijevak kako bi se omogućilo odvajanje preostalog trikloretilena (TCE) i pritom izbjeglo nakupljanje masti u talogu. Talog se zatim suši. Preporučuje se da se talog zatim izvaže (s preciznošću od 0,001 g) u svrhu kontrole faze sedimentacija. Konačno, osim ako se prosijavanje smatra nepotrebnim, talog se prosijava na 0,25 mm te se dvije dobivene frakcije ispituju. ▼M2

2.1.3.3.5.

Ekstrakcija i priprema flotata: nakon dobivanja taloga gore opisanom metodom, u lijevku za odvajanje moraju ostati dvije faze: tekuća koja se sastoji od tetrakloretilena i kruta koja se sastoji od plivajućeg materijala. Ta kruta faza je flotat koji se izolira tako da se tetrakloretilen u cijelosti odlije iz lijevka otvaranjem čepa. Okretanjem lijevka za odvajanje, flotat se prenese u veliku Petrijevu zdjelicu i posuši na zraku u digestoru. Ako se više od 5 % flotata sastoji od čestica > 0,50 mm, mora se prosijati kroz sito 0,25 mm i dvije dobivene frakcije se ispituju.

2.1.3.3.6.

Priprema sirovine: pripremi se dio od najmanje 5 g samljevenog poduzorka. Ako se više od 5 % sirovine sastoji od čestica > 0,50 mm, mora se prosijati kroz sito 0,25 mm i dvije dobivene frakcije se ispituju.

2.1.3.4.   Priprema uzoraka koji se sastoje od masti ili ulja

Potrebno je slijediti sljedeći protokol za pripremu uzoraka koji se sastoje od masti ili ulja:

2.1.3.5.   Uporaba reagensa za bojanje

Kako bi se olakšala pravilna identifikacija sastojaka životinjskog podrijetla, subjekt može koristiti reagense za bojanje tijekom pripreme uzorka u skladu sa smjernicama koje je izdao EURL-AP i objavio na svojoj internetskoj stranici.

Ako se koristi otopina Alizarin crvenila za bojanje taloga primjenjuje se sljedeći protokol:

2.1.4.    Mikroskopski pregled

2.1.4.1.

Priprema preparata ▼M7 Mikroskopski preparati pripremaju se od taloga i, po izboru laboranta, od flotata ili sirovine. ▼M2 Mikroskopski preparati se pripremaju s odgovarajućim sredstvom za pripremu preparata u skladu sa SOP-om koji je odredio EURL-AP i objavio na svojoj internetskoj stranici. Preparate je potrebno pokriti pokrovnim stakalcima.

▼M7

2.1.4.2.

Dijagram toka pregleda za određivanje životinjskih čestica u krmnim smjesama i krmivima Pripremljeni mikroskopski preparati promatraju se u skladu s dijagramima toka pregleda propisanima u dijagramima 1. i 2. Mikroskopski pregledi provode se koristeći sastavljeni mikroskop na talogu i, po izboru laboranta, na flotatu ili na sirovini. Uz sastavljeni mikroskop može se koristiti i stereomikroskop za grube frakcije. Svaki preparat pregledava se u cijelosti i pod različitim povećanjima. Precizna objašnjenja o korištenju dijagrama toka pregleda detaljno su navedena u standardiziranim operativnim postupcima (SOP) koje je utvrdio referentni laboratorij EU-a za životinjske bjelančevine u hrani za životinje (EURL-AP) i objavio na svojim internetskim stranicama. Najmanji broj preparata koji se mora promotriti u svakoj fazi dijagramâ toka pregleda mora se strogo poštovati, osim u slučajevima kada cijeli materijal frakcije ne omogućuje postizanje utvrđenog broja preparata, primjerice u slučaju nedobivanja taloga. Pri svakom određivanju upotrebljava se najviše 6 preparata za bilježenje broja čestica. Ako se na flotatu ili sirovini pripremaju dodatni preparati primjenom posebnog sredstva za pripremu preparata s osobinama bojenja, kako je utvrđeno u točki 2.1.2.1.4., za potrebe daljnjeg utvrđivanja struktura (npr. perja, dlaka, mišića ili čestica krvi) otkrivenih na preparatima pripremljenima drugim sredstvom za pripremu preparata, kako je utvrđeno u točki 2.1.2.1.3., broj čestica računa se na temelju broja preparata po određivanju koji nije veći od 6, uključujući dodatne preparate s posebnim sredstvom za pripremu preparata. Za lakšu identifikaciju vrste i podrijetla čestica laborant može koristiti pomoćne alate kao što su sustavi za potporu pri odlučivanju, zbirke slika i referentni uzorci. Dijagram 1. Dijagram toka pregleda za određivanje životinjskih čestica u krmnim smjesama i krmivima za prvo određivanje (D1 i D2 odnose se na prvo i drugo određivanje; *: kopneni kralježnjaci, ribe) Dijagram 2. Dijagram toka pregleda za određivanje životinjskih čestica u krmnim smjesama i krmivima za drugo određivanje (D1 i D2 odnose se na prvo i drugo određivanje; *: kopneni kralježnjaci, ribe)

▼M2

2.1.4.3.

►M7  Broj određivanja Određivanja se provode na različitim poduzorcima od po 50 g. Ako se nakon prvog određivanja provedenog u skladu s dijagramom toka pregleda propisanim u dijagramu 1. ne otkriju životinjske čestice, nije potrebno provesti dodatno određivanje, a o rezultatima analize potrebno je izvijestiti korištenjem terminologije iz točke 2.1.5.1. Ako se nakon prvog određivanja provedenog u skladu s dijagramom toka pregleda propisanim u dijagramu 1. otkrije jedna ili više životinjskih čestica danog podrijetla (tj. od kopnenih kralježnjaka ili ribe), a podrijetlo pronađenih čestica potvrđuje prijavljeni sadržaj uzorka, nije potrebno provesti drugo određivanje. Ako je broj životinjskih čestica danog podrijetla otkrivenih tijekom tog prvog određivanja veći od 5, o rezultatima analize potrebno je izvijestiti po životinjskom podrijetlu korištenjem terminologije iz točke 2.1.5.3. Inače je o rezultatima analize potrebno izvijestiti po životinjskom podrijetlu korištenjem terminologije iz točke 2.1.5.2. U drugim slučajevima, ako laboratoriju nije dostavljena deklaracija sadržaja, provodi se drugo određivanje na temelju novog poduzorka. Ako je, nakon drugog određivanja provedenog u skladu s dijagramom toka pregleda propisanim u dijagramu 2., zbroj životinjskih čestica danog podrijetla otkrivenih u dva određivanja veći od 10, o rezultatima analize potrebno je izvijestiti po životinjskom podrijetlu korištenjem terminologije iz točke 2.1.5.3. Inače je o rezultatima analize potrebno izvijestiti po životinjskom podrijetlu korištenjem terminologije iz točke 2.1.5.2. ◄

2.1.5.    ►M7  Prikaz rezultata

Pri izvješćivanju o rezultatima, laboratorij mora navesti na kojoj vrsti materijala je provedena analiza (talog, flotat ili sirovina). U izvješću se jasno navodi koliko je određivanja provedeno i je li prije pripreme preparata provedeno prosijavanje frakcija u skladu sa zadnjim stavkom točke 2.1.3.3.4.

Laboratorijsko izvješće mora sadržavati barem informacije o prisutnosti sastojaka podrijetlom od kopnenih kralježnjaka ili ribe.

O različitim slučajevima izvješćuje se na sljedeće načine.

2.2.    PCR

2.2.1.    Načelo

Fragmenti deoksiribonukleinske kiseline (DNK) životinjskog podrijetla koji mogu biti prisutni u krmivima i krmnim smjesama otkrivaju se tehnikom genskog umnožavanja putem PCR-a koja cilja DNK sekvence značajne za vrstu.

PCR metoda zahtijeva najprije ekstrakciju DNK-a. Umnožavanje se vrši kasnije na tako dobivenom DNK ekstraktu kako bi se otkrila ciljana životinjska vrsta.

2.2.2.    Reagensi i oprema

2.2.2.1   Reagensi

2.2.2.1.1.   Reagensi za ekstrakciju DNK-a

Upotrebljavaju se samo reagensi koje je odobrio EURL-AP i objavio na svojoj internetskoj stranici.

2.2.2.1.2.   Reagensi za umnožavanje genskog materijala

2.2.2.1.2.1.   Početnice i sonde

Upotrebljavaju se samo početnice i sonde sa sekvencama oligonukleotida koje je validirao EURL-AP i objavio na svojoj internetskoj stranici ( 34 ).

2.2.2.1.2.2.   Glavna mješavina (Master mix)

Upotrebljavaju se samo otopine glavne mješavine koje ne sadrže reagense koji bi mogli prouzročiti lažne rezultate zbog prisutnosti životinjskog DNK-a ( 35 ).

2.2.2.1.2.3.   Reagensi za dekontaminaciju

2.2.2.1.2.3.1.   Otopina kloridne kiseline (0,1 N)

2.2.2.1.2.3.2.   Izbjeljivač (otopina natrijevog hipoklorita s 0,15 % aktivnog klora)

2.2.2.1.2.3.3.   Nehrđajući reagensi za dekontaminaciju skupih uređaja kao što su analitičke vage (npr. DNA EraseTM proizvođača MP Biomedicals)

2.2.2.2.   Oprema

2.2.2.2.1.   Analitička vaga s preciznošću od 0,001 g

2.2.2.2.2.   Pribor za mljevenje

2.2.2.2.3.   Uređaj za PCR (Thermocycler) koji omogućava PCR u stvarnom vremenu

2.2.2.2.4.   Mikrocentrifuga za mikroepruvete

2.2.2.2.5.   Komplet mikropipeta koje omogućavaju pipetiranje od 1 μl do 1 000 μl

2.2.2.2.6.   Standardna plastična oprema za mikrobiologiju: mikroepruvete za mikrocentrifugu, plastični nastavci s filtrima za mikropipete, odgovarajuće pločice za uređaj za PCR (thermocycler).

2.2.2.2.7.   Hladnjaci za skladištenje uzoraka i reagensa

2.2.3.    Uzorkovanje i priprema uzorka

2.2.3.1.   Uzorkovanje

Koristi se reprezentativan uzorak uzet u skladu s odredbama iz Priloga I.

2.2.3.2.   Priprema uzorka

Pri pripremi laboratorijskih uzoraka do ekstrakcije DNK-a potrebno je poštovati zahtjeve iz Priloga II. Od najmanje 50 g uzorka se napravi poduzorak za analizu, koji se zatim samelje.

Priprema uzorka mora se provesti u drugom prostoru od onih koji se koriste za ekstrakciju DNK-a i umnožavanje genskog materijala u skladu sa standardom ISO 24276.

Pripreme se dva testna uzorka od najmanje 100 mg svaki.

2.2.4.    Ekstrakcija DNK-a

Ekstrakcija DNK-a provodi se na svakom pripremljenom testnom uzorku koristeći SOP koji je uspostavio EURL-AP i objavio na svojoj internetskoj stranici.

Za svaku seriju ekstrakcije DNK-a pripremaju se dva kontrolna uzorka kako je opisano u ISO standardu 24276:

2.2.5.    Umnožavanje genskog materijala

Genski materijal se umnožava koristeći metode validirane za svaku vrstu koja zahtijeva identifikaciju. Te metode su propisane u SOP koji je uspostavio EURL-AP i objavio na svojoj internetskoj stranici. Svaki ekstrakt DNK-a se analizira u najmanje dva različita razrjeđenja kako bi se ocijenila inhibicija.

Za svaku ciljanu vrstu pripremaju se dva kontrolna uzorka koja se umnažaju kako je opisano u ISO standardu 24276:

2.2.6.    Tumačenje i prikaz rezultata

U izvješću o rezultatima laboratorij mora navesti najmanje masu upotrijebljenog testnog uzorka, korištene tehnike za ekstrakciju, broj provedenih određivanja i granicu detekcije metode.

Rezultati se ne smiju tumačiti i priopćavati ako pozitivni kontrolni uzorak ekstrakcije DNK-a i pozitivni kontrolni uzorak s ciljanim DNK-om ne omogućavaju određivanje ciljane vrste pri analizi, dok je rezultat kontrolnog uzorka reagensa za umnožavanje negativan.

U slučaju da rezultati dvaju testnih uzoraka nisu dosljedni, potrebno je ponoviti barem korak genskog umnožavanja. Ako laboratorij sumnja da razlog za nesukladnost mogu biti ekstrakti DNK-a, provodi se nova ekstrakcija DNK-a i umnažanje genskog materijala prije tumačenja rezultata.

Konačni prikaz rezultata mora se temeljiti na integraciji i tumačenju rezultata dvaju testnih uzoraka u skladu sa SOP-om koji je uspostavio EURL-AP i objavio na svojoj internetskoj stranici.

2.2.6.1.   Negativni rezultat

O negativnom rezultatu se izvještava na sljedeći način:

U dostavljenom uzorku nije bio otkriven ni jedan DNK iz X (X je životinjska vrsta ili skupina životinjskih vrsta koja je predmet ispitivanja).

2.2.6.2.   Pozitivni rezultat

O pozitivnom rezultatu se izvještava na sljedeći način:

DNK iz X je otkriven u dostavljenom uzorku (X je životinjska vrsta ili skupina životinjskih vrsta koja je predmet ispitivanja).

▼B

---

PRILOG VII.

METODA IZRAČUNA ENERGETSKE VRIJEDNOSTI HRANE ZA PERAD

1.    Metoda izračuna i prikaza energetske vrijednosti

Energetska vrijednost hrane za perad mora se izračunani prema formuli navedenoj dalje u tekstu na temelju postotka nekih analitičkih sastojaka hrane za životinje. Ta se vrijednost iskazuje u megadžulima (MJ) metaboličke energije (ME), s korekcijama za dušik, na kilogram krmne smjese:

MJ/kg ME = 0,1551 × % sirovih bjelančevina + 0,3431 × % sirovih masti + 0,1669 × % škroba + 0,1301 × % ukupnog šećera (iskazanog kao saharoza).

2.    Odstupanja primjenjiva za navedene vrijednosti

Ako se službenom inspekcijom otkrije razlika (povećana ili smanjena energetska vrijednost hrane za životinje) između rezultata pregleda i navedene energetske vrijednosti, dopušteno je najmanje odstupanje od 0,4 MJ/kg ME.

3.    Prikaz rezultata

Nakon primjene gore navedene formule dobiveni rezultat treba iskazati s jednim decimalnim mjestom.

4.    Metode uzorkovanja i metode analize

Uzorkovanje krmnih smjesa i određivanje udjela analitičkih sastojaka navedenih u metodi izračuna moraju biti u skladu s metodama Zajednice za uzorkovanje ili analitičkim metodama Zajednice za službeni pregled hrane za životinje.

Primjenjuje se sljedeće:

---

PRILOG VIII.

ANALITIČKE METODE ZA KONTROLU NEPROPISNE PRISUTNOSTI KRMNIH DODATAKA KOJI VIŠE NISU DOPUŠTENI U HRANI ZA ŽIVOTINJE

A.   ODREĐIVANJE METIL BENZOKVATA

7-benziloksi-6-butil-3-metoksikarbonil-4-kinolon

1.    Svrha i područje primjene

Ovom se metodom omogućuje određivanje razine metil benzokvata u hrani za životinje. Granica kvantifikacije je 1 mg/kg.

2.    Načelo

Metil benzokvat se iz uzorka ekstrahira otopinom metanol metansulfonske kiseline. Ekstrakt se pročisti diklormetanom ionsko-izmjenjivačkom kromatografijom i zatim ponovo diklormetanom. Udio metil benzokvata određuje se tekućinskom kromatografijom visoke učinkovitosti (HPLC) s reverznom fazom uz upotrebu UV detektora.

3.    Reagensi.

Smjesa metanola (točka 3.2.) i vode (za HPLC) 75 + 25 (v + v).

Filtrira se kroz filtar 0,22 μm (točka 4.5.) a otopina se otplini (npr. 10 minuta u ultrazvučnoj kupelji).

Metanolom se razrijedi 20,0 ml metansulfonske kiseline do 1 000 ml (točka 3.2.).

Vodom se razrijedi 100 ml klorovodične kiseline (ρ20 1,18 g/ml) do 1 000 ml.

Smola se prije uporabe obradi. Suspendira se 100 g smole u 500 ml otopine klorovodične kiseline (točka 3.5.) i uz stalno miješanje zagrijava na grijaćoj ploči do ključanja. Ohladi se i kiselina odlije. Filtrira se kroz papirni filtar pod vakuumom. Smola se dvaput ispere s 500 ml vode, zatim s 250 ml metanola (točka 3.2.). Ispere se još jednom s 250 ml metanola i osuši propuhivanjem zraka kroz filtriranu pogaču. Suha se smola pohrani u zatvorenoj boci.

Odvagne se 50 mg standardne tvari (točka 3.7.) s preciznošću od 0,1 mg, otopi u otopini metansulfonske kiseline (točka 3.4.) u odmjernoj tikvici obujma 100 ml, dopuni do oznake i promiješa.

Prenese se 5,0 ml osnovne standardne otopine metil benzokvata (točka 3.7.1.) u graduiranu tikvicu obujma 50 ml, dopuni do oznake metanolom (točka 3.2.) i promiješa.

U seriju graduiranih tikvica obujma 25 ml prenese se 1,0, 2,0, 3,0, 4,0 i 5,0 ml intermedijarne standardne otopine metil benzokvata (točka 3.7.2). Dopuni se do oznake mobilnom fazom (točka 3.3.) i promiješa. Koncentracija metil benzokvata u tim otopinama iznosi 2,0, 4,0, 6,0, 8,0 i 10,0 μg/ml. Prije uporabe ove se otopine moraju svježe pripremiti.

4.    Oprema

5.    Postupak

5.1.    Općenito

Napomena

:

Kod ove metode slijepa proba hrane za životinje mora biti slične vrste kao i uzorak, a analizom se u njoj ne smije pronaći metil benzokvat.

5.2.    Ekstrakcija

Odvagne se približno 20 g pripravljenog uzorka s preciznošću od 0,01 g i prenese u konusnu tikvicu obujma 250 ml. Doda se 100,0 ml otopine metansulfonske kiseline (točka 3.4.) i mehanički protresa (točka 4.1.) 30 minuta. Otopina se filtrira kroz papirni filtar, a filtrat se spremi za postupak razdvajanja tekućina-tekućina (točka 5.3.).

5.3.    Razdvajanje tekuće-tekuće

U lijevak za odjeljivanje obujma 500 ml u kojem se nalazi 100 ml otopine klorovodične kiseline (točka 3.5.) prenese se 25,0 ml filtrata dobivenog u postupku iz točke 5.2. U lijevak se doda 100 ml diklormetana (točka 3.1.) i trese jednu minutu. Pričeka se da se slojevi razdvoje te se donji (diklormetanski) sloj odlije u tikvicu s okruglim dnom obujma 500 ml. Ponovi se ekstrakcija vodene faze s 40 ml diklormetana, a dobiveni se ekstrakti pomiješaju s prvim ekstraktom u tikvici s okruglim dnom. Ekstrakt diklormetana se otpari do suhog u rotacijskom otparivaču (točka 4.2.) pri sniženom tlaku, na 40 °C. Ostatak se otopi u 20 – 25 ml metanola (točka 3.2.), tikvica se začepi i sav ekstrakt spremi za ionsko-izmjenjivačku kromatografiju (točka 5.4.).

5.4.    Ionsko-izmjenjivačka kromatografija

5.4.1.    Priprema kationske izmjenjivačke kolone

U donji dio staklene kolone postavi se mali čep od staklene vune (točka 4.3.). Pripremi se suspenzija s 5,0 g obrađene kationske izmjenjivačke smole (točka 3.6.) i 50 ml klorovodične kiseline (točka 3.5.), ulije u staklenu kolonu i pričeka da se umiri. Ukloni se višak kiseline do visine neposredno iznad površine smole, zatim se kolona ispire vodom do neutralne reakcije eluata na lakmusov papir. U kolonu se prenese 50 ml metanola (točka 3.2.) i ostavi da istekne do površine smole.

5.4.2.    Kolonska kromatografija

Dobiveni se ekstrakt (točka 5.3.) pipetom pažljivo prenese u kolonu. Tikvica s okruglim dnom se dvaput ispere s 5 – 10 ml metanola (točka 3.2.), a isprane tekućine prenesu u kolonu. Ekstrakt se ulije do površine smole i kolona ispere s 50 ml metanola, pri čemu brzina protoka ne smije prijeći 5 ml na minutu. Eluat se odbaci. Metil benzokvat se iz kolone eluira sa 150 ml otopine metansulfonske kiseline (točka 3.4.), a eluat iz kolone prikupi u konusnu tikvicu obujma 250 ml.

5.5.    Razdvajanje tekuće-tekuće

Dobiveni eluat (točka 5.4.2.) prenese se u lijevak za odjeljivanje obujma 1 l. Konusna tikvica se ispere s 5 – 10 ml metanola (točka 3.2.), a isprana tekućina pomiješa sa sadržajem u lijevku za odjeljivanje. Doda se 300 ml otopine klorovodične kiseline (točka 3.5.) i 130 ml diklormetana (točka 3.1.). Trese se 1 minutu i ostavi da se faze razdvoje. Donji (diklormetanski) sloj se odlije u tikvicu s okruglim dnom obujma 500 ml. Ekstrakcija vodene faze se ponovi dvaput sa 70 ml diklormetana, a oba se ekstrakta pomiješaju s prvim u tikvici s okruglim dnom.

Ekstrakt diklormetana se otpari do suhog u rotacijskom otparivaču (točka 4.2.) pod sniženim tlakom na 40 °C. Ostatak u tikvici se otopi u približno 5 ml metanola (točka 3.2.), a otopina prenese u graduiranu tikvicu obujma 10 ml. Tikvica s okruglim dnom se dvaput ispere s 1 – 2 ml metanola, a isprane tekućine prenesu u graduiranu tikvicu. Dopuni se metanolom do oznake i promiješa. Alikvotni dio se filtrira kroz membranski filtar (točka 4.6.). Ta se otopina pohrani za određivanje putem HPLC-a (točka 5.6.).

5.6.    Određivanje putem HPLC-a

5.6.1.    Parametri

Sljedeći uvjeti predlažu se kao smjernice; mogu se koristiti i drugi uvjeti ako se njima jamče jednakovrijedni rezultati:

Stabilnost kromatografskog sustava se provjerava višekratnim ubrizgavanjem kalibracijske otopine koncentracije 4,0 μg/ml (točka 3.7.3.) sve dok se ne dobiju konstantne visine ili površine vršaka i konstantna vremena retencije.

5.6.2.    Kalibracijska krivulja

Više puta se ubrizga svaka kalibracijska otopina (točka 3.7.3.) i za svaku koncentraciju izmjere vrijednosti visina (površina) vršaka. Kalibracijska krivulja se pripremi tako da se na ordinatu nanose srednje vrijednosti visina ili površina vršaka kalibracijskih otopina, a na apscisu odgovarajuće koncentracije u μg/ml.

5.6.3.    Otopina uzorka

Više puta se ubrizga ekstrakt uzorka (točka 5.5.), pri čemu se koriste jednaki volumeni kao za kalibracijske otopine, zatim se odredi srednja vrijednost visina (površina) vršaka metil benzokvata.

6.    Izračun rezultata

Koncentracija otopine uzorka u μg/ml određuje se iz srednjih vrijednosti vršaka (površina) metil benzokvata iz kalibracijske krivulje (točka 5.6.2.).

Udio metil benzokvata (w) (mg/kg) u uzorku izračunava se sljedećom formulom:

pri čemu je:

c

=

koncentracija metil benzokvata u otopini uzorka u μg/ml.

m

=

masa pokusnog uzorka u gramima.

7.    Vrednovanje rezultata

7.1.    Identifikacija

Identifikacija analita može se potvrditi ko-kromatografijom ili detektorom s nizom dioda kojima se uspoređuje spektar ekstrakta uzorka i spektar kalibracijske otopine (točka 3.7.3.) koncentracije 10 μg/ml.

7.1.1.    Ko-kromatografija

Ekstraktu uzorka se doda odgovarajuća količina intermedijarne standardne otopine (točka 3.7.2.). Količina dodanog metil benzokvata mora biti slična procijenjenoj količini metil benzokvata u ekstraktu uzorka.

Može se povećati samo visina vrška metil benzokvata, uzimajući u obzir dodane količine i razrjeđenje ekstrakta. Širina vrha na polovici njegove najviše visine mora biti unutar 10 % vrijednosti prvotne širine.

7.1.2.    Detekcija s nizom dioda

Rezultati se ocjenjuju u skladu sa sljedećim mjerilima:

Ako nije ispunjeno jedno od navedenih mjerila, prisutnost analita nije potvrđena.

7.2.    Ponovljivost

Razlika između rezultata dvaju usporednih postupaka određivanja, izvedenih na istom uzorku, ne smije prijeći: 10 % najvišeg rezultata za udio metil benzokvata između 4 i 20 mg/kg.

7.3.    Iskorištenje

Za obogaćeni slijepi uzorak hrane za životinje iskorištenje mora iznositi najmanje 90 %.

8.    Rezultati međulaboratorijske studije

Provedena je analiza 5 uzoraka u 10 laboratorija. Svaki se uzorak analizirao dvaput.

ND

=

nije određeno

sr

=

standardna devijacija ponovljivosti

CVr

=

koeficijent varijacije ponovljivosti u %

sR

=

standardna devijacija obnovljivosti

CVR

=

koeficijent varijacije obnovljivosti u %.

B.   ODREĐIVANJE OLAKVINDOKSA

2-[N-2’-(hidroksietil)karbamoil]-3-metilkinoksalin-N1,N4-dioksid

1.    Svrha i područje primjene

Ovom se metodom omogućuje određivanje razine olakvindoksa u hrani za životinje. Granica kvantifikacije je 5 mg/kg.

2.    Načelo

Uzorak se ekstrahira smjesom vode i metanola. Udio olakvindoksa određuje se tekućinskom kromatografijom visoke učinkovitosti (HPLC) s reverznom fazom uz upotrebu UV detektora.

3.    Reagensi

Smjesa vode (točka 3.3) i metanola (točka 3.2), 900 + 100 (V + V).

Odvagne se 50 mg olakvindoksa (točka 3.5.) s preciznošću od 0,1 mg i prenese u graduiranu tikvicu obujma 200 ml, zatim se doda približno 190 ml vode. Tikvica se zatim drži 20 minuta u ultrazvučnoj kupelji (točka 4.1.). Nakon obrade ultrazvukom, otopina se zagrije do sobne temperature, dopuni vodom do oznake i promiješa. Tikvica se omota aluminijskom folijom i pohrani u hladnjaku. Ova se otopina mora svježe pripremiti svaki mjesec.

Prenese se 10,0 ml osnovne standardne otopine (točka 3.5.1.) u graduiranu tikvicu obujma 100 ml, dopuni mobilnom fazom (točka 3.4.) do oznake i promiješa. Tikvica se omota aluminijskom folijom i pohrani u hladnjaku. Ova se otopina mora svježe pripremiti svaki dan.

U seriju graduiranih tikvica obujma 50 ml prenese se 1,0, 2,0, 5,0, 10,0, 15,0 i 20,0 ml intermedijarne standardne otopine (točka 3.5.2.). Dopuni se mobilnom fazom (točka 3.4.) do oznake i promiješa. Tikvice se omotaju aluminijskom folijom. Ove otopine odgovaraju količini od 0,5, 1,0, 2,5, 5,0, 7,5 i 10,0 μg olakvindoksa na ml.

Ove se otopine moraju svježe pripremiti svaki dan.

4.    Oprema

5.    Postupak

Napomena

:

Olakvindoks je osjetljiv na svjetlo. Svi se postupci izvode pod prigušenim svjetlom ili u laboratorijskom posuđu od smeđeg stakla.

5.1.    Općenito

Napomena

:

U provedbi ove metode slijepa proba hrane za životinje mora biti slična uzorku, a analizom se mora potvrditi odsutnost olakvindoksa.

5.2.    Ekstrakcija

Odvagne se približno 50 g uzorka s preciznošću od 0,01 g. Prenese se u konusnu tikvicu obujma 1 000 ml, doda 100 ml metanola (točka 3.1.) i tikvica 5 minuta drži u ultrazvučnoj kupelji (točka 4.1.). Doda se 410 ml vode i ostavi daljnjih 15 minuta u ultrazvučnoj kupelji. Tikvica se izvadi iz ultrazvučne kupelji, 30 minuta protresa u tresilici (točka 4.2.) i zatim filtrira kroz nabrani filtar. Prenese se 10,0 ml filtrata u graduiranu tikvicu obujma 20 ml, dopuni vodom do oznake i promiješa. Alikvot se filtrira kroz membranski filtar (točka 4.4.) (vidjeti točku 9. Napomena). Prelazi se na postupak određivanja putem HPLC-a (točka 5.3.).

5.3.    Određivanje putem HPLC-a

5.3.1.    Parametri:

Sljedeći se uvjeti predlažu kao smjernice; mogu se koristiti i drugi uvjeti ako se njima jamče jednakovrijedni rezultati.

Stabilnost kromatografskog sustava se provjerava višekratnim ubrizgavanjem kalibracijske otopine (točka 3.5.3.) koncentracije 2,5 μg/ml sve dok se ne dobiju konstantne visine vršaka i konstantna vremena retencije.

5.3.2.    Kalibracijska krivulja

Više puta se ubrizga svaka kalibracijska otopina (točka 3.5.3.) i za svaku koncentraciju izmjere srednje vrijednosti visina (površina) vršaka. Kalibracijska krivulja se pripremi tako da se na ordinatu nanose srednje vrijednosti visina (površina) vršaka kalibracijskih otopina, a na apscisu odgovarajuće koncentracije u μg/ml.

5.3.3.    Otopina uzorka

Više puta se ubrizga ekstrakt uzorka (točka 5. 2.), pri čemu se koriste jednaki volumeni kao za kalibracijsku otopinu, zatim se odredi srednja vrijednost visina (površina) vršaka olakvindoksa.

6.    Izračun rezultata

Koncentracija otopine uzorka u μg/ml određuje se iz srednjih vrijednosti visina (površina) vršaka olakvindoksa u otopini uzorka iz kalibracijske krivulje (točka 5.3.2.).

Udio olakvindoksa (w) (mg/kg) u uzorku izračunava se sljedećom formulom:

pri čemu je:

c

=

koncentracija olakvindoksa u ekstraktu uzorka (točka 5.2.) u μg/ml

m

=

masa pokusnog uzorka u g (točka 5.2.).

7.    Vrednovanje rezultata

7.1.    Identifikacija

Identifikacija analita može se potvrditi ko-kromatografijom ili detektorom s nizom dioda kojim se uspoređuje spektar ekstrakta uzorka (točka 5.2.) i spektar kalibracijske otopine (točka 3.5.3.) koncentracije 5,0 μg/ml.

7.1.1.    Ko-kromatografija

U ekstrakt uzorka (točka 5.2.) doda se primjerena količina kalibracijske otopine (točka 3.5.3.). Količina dodanog olakvindoksa mora biti slična procijenjenoj količini olakvindoksa u ekstraktu uzorka.

Dopušteno je povećanje samo visine vrška olakvindoksa uzimajući u obzir dodane količine i razrjeđenje ekstrakta. Širina vrška, na polovici maksimalne visine, mora biti unutar ± 10 % početne širine vrška olakvindoksa u ekstraktu uzorka bez dodanog olakvindoksa.

7.1.2.    Detekcija s nizom dioda

Rezultati se ocjenjuju u skladu sa sljedećim mjerilima:

Ako nije ispunjeno jedno od navedenih mjerila, prisutnost analita nije potvrđena.

7.2.    Ponovljivost

Razlika između rezultata dvaju usporednih postupaka određivanja, izvedenih na istom uzorku, ne smije prijeći 15 % najvišeg rezultata za udio olakvindoksa između 10 i 200 mg/kg.

7.3.    Iskorištenje

Za obogaćeni slijepi uzorak hrane za životinje iskorištenje mora iznositi najmanje 90 %.

8.    Rezultati međulaboratorijske studije

Provedena je međulaboratorijska studija na razini EZ-a u kojoj se u najviše 13 laboratorija analiziralo četiri uzorka hrane za prasad, uključujući jednu slijepu probu. Rezultati su prikazani u donjoj tablici:

L

=

broj laboratorija

n

=

broj pojedinačnih vrijednosti

Sr

=

standardna devijacija ponovljivosti

SR

=

standardna devijacija obnovljivosti

CVr

=

koeficijent varijacije ponovljivosti

CVR

=

koeficijent varijacije obnovljivosti.

9.    Napomena

Iako ova metoda nije vrednovana za hranu za životinje koja sadrži više od 100 mg/kg olakvindoksa, mogu se dobiti zadovoljavajući rezultati uporabom manje mase uzorka i/ili razrjeđivanjem ekstrakta (točka 5.2.) tako da se dobije koncentracija u području kalibracijske krivulje (točka 5.3.2.).

C.   ODREĐIVANJE AMPROLIUMA

1-[(4-amino-2-propilpirimidin-5-il)metil]-2-metil-piridinijum klorid hidroklorid

1.    Svrha i područje primjene

Ovom se metodom omogućuje određivanje razine amproliuma u hrani za životinje i premiksima. Granica detekcije je 1 mg/kg, a granica kvantifikacije 5 mg/kg.

2.    Načelo

Uzorak se ekstrahira smjesom metanola i vode. Nakon razrjeđivanja mobilnom fazom i membranske filtracije, udio amproliuma određuje se tekućinskom kromatografijom visoke učinkovitosti (HPLC) s izmjenom kationa uz upotrebu UV detektora.

3.    Reagensi

U graduiranoj tikvici obujma 1 000 ml otopi se u vodi (točka 3.3.) 13,80 g natrijevog dihidrogen fosfat monohidrata, dopuni vodom (točka 3.3.) do oznake i promiješa.

U odmjernoj tikvici obujma 1 000 ml otopi se u vodi (točka 3.3.) 224,74 g natrijevog perklorat monohidrata, dopuni vodom (točka 3.3.) do oznake i promiješa.

Smjesa acetonitrila (točka 3.2.), otopine natrijevog dihidrogen fosfata (točka 3.4.) i otopine natrijevog perklorata (točka 3.5.), 450 + 450 + 100 (v + v + v). Prije uporabe filtrira se membranskim filtrom 0,22 μm (točka 4.3.), a otopina se otplini (npr. najmanje 15 minuta u ultrazvučnoj kupelji (točka 4.4.)).

Odvagne se 50 mg amproliuma (točka 3.7.) s preciznošću od 0,1 mg i prenese u graduiranu tikvicu obujma 100 ml, otopi u 80 ml metanola (točka 3.1) i tikvicu 10 minuta drži u ultrazvučnoj kupelji (točka 4.4.). Nakon obrade ultrazvukom otopina se zagrije do sobne temperature, dopuni vodom do oznake i promiješa. Na temperaturi ≤ 4 °C otopina je stabilna 1 mjesec.

Pipetom se prenese 5,0 ml osnovne standardne otopine (točka 3.7.1.) u graduiranu tikvicu obujma 50 ml, dopuni do oznake ekstrakcijskim otapalom (točka 3.8.) i promiješa. Na temperaturi ≤ 4 °C otopina je stabilna 1 mjesec.

U seriju graduiranih tikvica obujma 50 ml prenese se 0,5, 1,0, i 2,0 ml intermedijarne standardne otopine (točka 3.7.2.). Dopuni se do oznake mobilnom fazom (točka 3.6.) i promiješa. Ove otopine odgovaraju koncentraciji od 0,5, 1,0 i 2,0 μg amproliuma na ml. Ove se otopine moraju pripremiti svježe prije uporabe.

Smjesa metanola (točka 3.1.) i vode 2 + 1 (v + v)

4.    Oprema

5.    Postupak

5.1.    Općenito

5.1.1.    Slijepa proba hrane za životinje

Kod primjene testa iskorištenja (točka 5.1.2.) analizom slijepe probe hrane za životinje utvrđuje se da nisu prisutni niti amprolium niti interferentne tvari. Slijepa proba hrane za životinje mora biti slične vrste kao i uzorak, a analizom se u njoj ne smiju pronaći amprolium niti interferentne tvari.

5.1.2.    Test iskorištenja

Test iskorištenja provodi se analizom slijepe probe hrane za životinje u koju se doda količina amproliuma slična količini u uzorku. Kako bi se dobila koncentracija od 100 mg/kg, prenese se 10,0 ml osnovne standardne otopine (točka 3.7.1.) u konusnu tikvicu obujma 250 ml i otopina otpari do približno 0,5 ml. Doda se 50 g slijepe probe hrane za životinje, dobro promiješa i ostavi 10 minuta te ponovo promiješa nekoliko puta prije prelaska na postupak ekstrakcije (točka 5.2.).

Ako nije dostupna slijepa probe hrane za životinje slična uzorku (vidjeti točku 5.1.1.), test iskorištenja može se umjesto toga provesti metodom dodavanja standarda. U tom se slučaju uzorku za analizu doda količina amproliuma slična onoj u uzorku. Taj se uzorak analizira zajedno s uzorkom bez dodanog amproliuma, a iskorištenje se izračuna oduzimanjem.

5.2.    Ekstrakcija

5.2.1.    Premiksi (udio amproliuma < 1 %) i hrana za životinje

Odvagne se 5 – 40 g uzorka, ovisno o udjelu amproliuma, s preciznošću od 0,01 g, prenese u konusnu tikvicu obujma 500 ml, te se doda 200 ml ekstrakcijskog otapala (točka 3.8.). Tikvica se stavi u ultrazvučnu kupelj (točka 4.4.) i ostavi 15 minuta. Izvadi se iz ultrazvučne kupelji i 1 sat protresa u tresilici ili miješa magnetskom mješalicom (točka 4.5.). Alikvot ekstrakta se razrijedi mobilnom fazom (točka 3.6.) do udjela amproliuma od 0,5 – 2 μg/ml i promiješa (vidjeti napomenu pod točkom 9.3.). 5 – 10 ml tako razrijeđene otopine filtrira se kroz membranski filtar (točka 4.2.). Prelazi se na postupak određivanja putem HPLC-a (točka 5.3.).

5.2.2.    Premiksi (udio amproliuma ≥ 1 %)

Odvagne se 1 – 4 g uzorka, ovisno o udjelu amproliuma, s preciznošću od 0,001 g, prenese u konusnu tikvicu obujma 500 ml te se doda 200 ml ekstrakcijskog otapala (točka 3.8.). Tikvica se stavi u ultrazvučnu kupelj (točka 4.4.) i ostavi 15 minuta. Izvadi se iz ultrazvučne kupelji i 1 sat protresa u tresilici ili miješa magnetskom mješalicom (točka 4.5.). Alikvot ekstrakta se razrijedi mobilnom fazom (točka 3.6.) do udjela amproliuma od 0,5 – 2 μg/ml i promiješa. 5 – 10 ml tako razrijeđene otopine filtrira se kroz membranski filtar (točka 4.2.). Prelazi se na postupak određivanja putem HPLC-a (točka 5.3.).

5.3.    Određivanje putem HPLC

5.3.1.    Parametri:

Sljedeći se uvjeti predlažu kao smjernice; mogu se koristiti i drugi uvjeti ako se njima jamče jednakovrijedni rezultati.

Stabilnost kromatografskog sustava se provjerava višekratnim ubrizgavanjem kalibracijske otopine (točka 3.7.3.) koncentracije 1,0 μg/ml sve dok se ne dobiju konstantne visine vršaka i konstantna vremena retencije.

5.3.2.    Kalibracijska krivulja

Više puta se ubrizga svaka kalibracijska otopina (točka 3.7.3.) te se za svaku koncentraciju izmjere srednje vrijednosti visina (površina) vršaka. Kalibracijska krivulja se pripremi tako da se na ordinatu nanose srednje vrijednosti visina (površina) vršaka kalibracijskih otopina, a na apscisu odgovarajuće koncentracije u μg/ml.

5.3.3.    Otopina uzorka

Više puta se ubrizga ekstrakt uzorka (točka 5.2.), pri čemu se koriste jednaki volumeni kao za kalibracijsku otopinu, zatim se odredi srednja vrijednost visina (površina) vršaka amproliuma.

6.    Izračun rezultata

Koncentracija otopine uzorka u μg/ml određuje se iz srednjih vrijednosti visina (površina) vršaka amproliuma u otopini uzorka iz kalibracijske krivulje (točka 5.3.2.).

Udio amproliuma (w) (mg/kg) u uzorku izračunava se sljedećom formulom:

pri čemu je:

V

=

volumen ekstrakcijskog otapala (točka 3.8.) u ml u skladu s točkom 5.2. (tj. 200 ml)

c

=

koncentracija amproliuma u ekstraktu uzorka (točka 5.2.) u μg/ml

f

=

faktor razrjeđenja u skladu s točkom 5.2.

m

=

masa pokusnog uzorka u gramima.

7.    Vrednovanje rezultata

7.1.    Identifikacija

Identifikacija analita može se potvrditi ko-kromatografijom ili detektorom s nizom dioda kojim se uspoređuje spektar ekstrakta uzorka (točka 5.2.) i spektar kalibracijske otopine (točka 3.7.3.) koncentracije 2,0 μg/ml.

7.1.1.    Ko-kromatografija

U ekstrakt uzorka (točka 5.2.) doda se primjerena količina kalibracijske otopine (točka 3.7.3.). Količina dodanog amproliuma mora biti slična procijenjenoj količini amproliuma u ekstraktu uzorka.

Dopušteno je povećanje samo visine vrška amproliuma uzimajući u obzir dodane količine i razrjeđenje ekstrakta. Širina vrška, na polovici maksimalne visine, mora biti unutar ± 10 % početne širine amproliuma u ekstraktu uzorka bez dodanog amproliuma.

7.1.2.    Detektor s nizom dioda

Rezultati se ocjenjuju u skladu sa sljedećim mjerilima:

Ako nije ispunjeno jedno od navedenih mjerila, prisutnost analita nije potvrđena.

7.2.    Ponovljivost

Razlika između rezultata dvaju usporednih postupaka određivanja, izvedenih na istom uzorku, ne smije prijeći:

7.3.    Iskorištenje

Kod obogaćenog (slijepog) uzorka iskorištenje iznosi najmanje 90 %.

8.    Rezultati međulaboratorijske studije

Provedena je međulaboratorijska studija u kojoj se analiziralo tri uzorka hrane za perad (uzorci 1 – 3), jedan uzorak mineralne hrane za životinje (uzorak 4) i jedan uzorak premiksa (uzorak 5). Rezultati su navedeni u donjoj tablici:

L

=

broj laboratorija

n

=

broj pojedinačnih vrijednosti

sr

=

standardna devijacija ponovljivosti

CVr

=

koeficijent varijacije ponovljivosti

sR

=

standardna devijacija obnovljivosti

CVR

=

koeficijent varijacije obnovljivosti.

9.    Napomene

D.   ODREĐIVANJE KARBADOKSA

Metil 3-(2-kinoksalinilmetilen)karbazat N1,N4-dioksid

1.    Svrha i područje primjene

Ovom se metodom omogućuje određivanje razine karbadoksa u hrani za životinje, premiksima i pripravcima. Granica detekcije iznosi 1 mg/kg. Granica kvantifikacije je 5 mg/kg.

2.    Načelo

Uzorak se uravnoteži vodom i ekstrahira metanol-acetonitrilom. Kod hrane za životinje pročisti se alikvotni dio filtriranog ekstrakta na koloni iz aluminijevog oksida. Kod premiksa i pripravaka alikvotni se dio filtriranog ekstrakta razrijedi do primjerene koncentracije vodom, metanolom i acetonitrilom. Udio karbadoksa određuje se tekućinskom kromatografijom visoke učinkovitosti (HPLC) s reverznom fazom uz upotrebu UV detektora.

3.    Reagensi

Pomiješa se 500 ml metanola (točka 3.1.) s 500 ml acetonitrila (točka 3.2.).

Vodom se razrijedi 10 ml octene kiseline (točka 3.3.) do 100 ml.

Otopi se 0,82 g natrijevog acetata (točka 3.7.) u 700 ml vode (točka 3.8.), vrijednost pH se octenom kiselinom (točka 3.6.) podesi na 6,0. Prenese se u graduiranu tikvicu obujma 1 000 ml, dopuni vodom (točka 3.8.) do oznake i promiješa.

Pomiješa se 825 ml otopine acetatnog pufera (točka 3.9.) sa 175 ml acetonitrila (točka 3.2.).

Filtrira se kroz filtar 0,22 μm (točka 4.5.), a otopina otplini (npr. 10 minuta u ultrazvučnoj kupelji).

Čisti karbadoks: metil 3-(2-kinoksalinilmetilen)karbazat N1,N4-dioksid, E 850

Odvagne se 25 mg standardne tvari karbadoksa (točka 3.11.) s preciznošću od 0,1 mg i prenese u graduiranu tikvicu obujma 250 ml. Otopi se u metanol-acetonitrilu (točka 3.5.) obradom u ultrazvučnoj kupelji (točka 4.7.). Nakon obrade ultrazvukom, otopina se zagrije do sobne temperature, dopuni do oznake metanol-acetonitrilom (točka 3.5.) i promiješa. Tikvica se omota aluminijskom folijom ili se koristi tikvica od smeđeg stakla i pohrani u hladnjaku. Na temperaturi ≤ 4 °C otopina je stabilna 1 mjesec.

U seriju graduiranih tikvica obujma 100 ml prenese se 2,0, 5,0, 10,0 i 20,0 ml osnovne standardne otopine (točka 3.11.1.). Doda se 30 ml vode, dopuni do oznake metanol-acetonitrilom (točka 3.5.) i promiješa. Tikvice se omotaju aluminijskom folijom. Ove otopine odgovaraju koncentracijama karbadoksa od 2,0, 5,0, 10,0, i 20,0 μg/ml.

Kalibracijske otopine treba pripremiti svježe prije uporabe.

Napomena

:

Za određivanje karbadoksa u hrani za životinje koja sadrži manje od 10 mg/kg karbadoksa, moraju se pripremiti kalibracijske otopine čija je koncentracija manja od 2,0 μg/ml.

Pomiješa se 300 ml vode sa 700 ml smjese metanola i acetonitrila (točka 3.5.).

4.    Oprema

Napomena

:

Može se koristiti i staklena kolona s pipcem ili staklena kolona s konusnim završetkom; u tom se slučaju u donji kraj umetne mali jastučić od staklene vune i staklenim štapićem potisne na dno.

5.    Postupak

Napomena

:

Karbadoks je osjetljiv na svjetlo. Svi se postupci izvode pod prigušenim svjetlom ili u laboratorijskom posuđu od smeđeg stakla ili u posuđu omotanom aluminijskom folijom.

5.1.    Općenito

5.1.1.    Slijepa proba hrane za životinje

Kod primjene testa iskorištenja (točka 5.1.2.) analizom slijepe probe hrane za životinje utvrđuje se da nisu prisutni ni karbadoks niti interferentne tvari. Slijepa proba hrane za životinje mora biti slične vrste kao i uzorak, a analizom se u njoj ne smiju pronaći karbadoks niti interferentne tvari.

5.1.2.    Test iskorištenja

Test iskorištenja provodi se analizom slijepe probe hrane za životinje (točka 5.1.1.) u koju se doda količina karbadoksa slična količini u uzorku. Kako bi se dobila koncentracija od 50 mg/kg, prenese se 5,0 ml osnovne standardne otopine (točka 3.11.1.) u konusnu tikvicu obujma 200 ml. Otopina se otpari do približno 0,5 ml pod strujom dušika. Doda se 10 g slijepe probe hrane za životinje, promiješa i ostavi 10 minuta prije prelaska na postupak ekstrakcije (točka 5.2.).

Ako nije dostupna slijepa proba hrane za životinje slična uzorku (vidjeti točku 5.1.1.), test iskorištenja može se umjesto toga provesti metodom dodavanja standarda. U tom se slučaju uzorku za analizu doda količina karbadoksa slična onoj u uzorku. Taj se uzorak analizira zajedno s uzorkom bez dodanog karbadoksa, a iskorištenje se izračuna oduzimanjem.

5.2.    Ekstrakcija

5.2.1.    Hrana za životinje

Odvagne se 10 g uzorka s preciznošću od 0,01 g i prenese u konusnu tikvicu obujma 200 ml. Doda se 15,0 ml vode, promiješa i ostavi 5 minuta da se uravnoteži. Doda se 35,0 ml metanol-acetonitrila (točka 3.5), začepi i trese 30 minuta u tresilici ili miješa magnetnom mješalicom (točka 4.1.). Otopina se filtrira kroz filtar papir od staklenih vlakana (točka 4.2.). Ova se otopina pohrani za fazu pročišćivanja (točka 5.3.).

5.2.2.    Premiksi (0,1 – 2,0 %)

Odvagne se 1 g neusitnjenog uzorka s preciznošću od 0,001 g i prenese u konusnu tikvicu obujma 200 ml. Doda se 15,0 ml vode, promiješa i ostavi 5 minuta da se uravnoteži. Doda se 35,0 ml metanol-acetonitrila (točka 3.5.), začepi i trese 30 minuta na tresilici ili miješa magnetnom mješalicom (točka 4.1.). Otopina se filtrira kroz filtar papir od staklenih vlakana (točka 4.2.).

Alikvot filtrata se pipetom prenese u graduiranu tikvicu obujma 50 ml. Doda se 15,0 ml vode, dopuni do oznake metanol-acetonitrilom (točka 3.5.) i promiješa. Koncentracija karbadoksa u konačnoj otopini iznosi približno 10 μg/ml. Alikvot se filtrira kroz filtar 0,45 μm (točka 4.6.).

Prelazi se na postupak određivanja putem HPLC-a (točka 5.4.).

5.2.3.    Pripravci (> 2 %)

Odvagne se 0,2 g neusitnjenog uzorka s preciznošću od 0,001 g i prenese u konusnu tikvicu obujma 250 ml. Doda se 45,0 ml vode, promiješa i ostavi 5 minuta da se uravnoteži. Doda se 105,0 ml metanol-acetonitrila (točka 3.5), začepi i homogenizira. Uzorak se drži 15 minuta u ultrazvučnoj kupelji (točka 4.7.), zatim se 15 minuta protresa ili miješa (točka 4.1). Otopina se filtrira kroz filtar papir od staklenih vlakana (točka 4.2.).

Alikvot filtrata razrijedi se smjesom vode, metanola i acetonitrila (točka 3.12.) tako da konačna koncentracija karbadoksa iznosi 10 – 15 μg/ml (za 10 %-tni preparat faktor razrjeđenja je 10). Alikvot se filtrira kroz filtar 0,45 μm (točka 4.6.).

Prelazi se na postupak određivanja putem HPLC-a (točka 5.4.).

5.3.    Pročišćivanje

5.3.1.    Priprema kolone aluminijevog oksida

Odvagne se 4 g aluminijevog oksida (točka 3.4.) i prenese u staklenu kolonu (točka 4.3.).

5.3.2.    Pročišćivanje uzorka

Kroz kolonu od aluminijevog oksida propusti se 15 ml filtriranoga ekstrakta (točka 5.2.1.), a prva 2 ml eluata se odbace. Prikupi se sljedećih 5 ml, alikvot se filtrira kroz filtar 0,45 μm (točka 4.6.).

Prelazi se na postupak određivanja putem HPLC-a (točka 5.4.).

5.4.    Određivanje putem HPLC-a

5.4.1.    Parametri

Sljedeći se uvjeti predlažu kao smjernice; mogu se koristiti i drugi uvjeti ako se njima jamče jednakovrijedni rezultati:

Stabilnost kromatografskog sustava provjerava se višekratnim ubrizgavanjem kalibracijske otopine (točka 3.11.2.) koncentracije 5,0 μg/ml, sve dok se ne dobiju konstantne visine (površine) vršaka i konstantna vremena retencije.

5.4.2.    Kalibracijska krivulja

Više puta se ubrizga svaka kalibracijska otopina (točka 3.11.2.) i za svaku koncentraciju izmjere vrijednosti visina (površina) vršaka. Kalibracijska krivulja se pripremi tako da se na ordinatu nanose srednje vrijednosti visina ili površina vršaka kalibracijskih otopina, a na apscisu odgovarajuće koncentracije u μg/ml.

5.4.3.    Otopina uzorka

Više puta se ubrizga ekstrakt uzorka ((točka 5.3.2.) za hranu za životinje, (točka 5.2.2.) za premikse i (točka 5.2.3.) za pripravke) i odredi srednja vrijednost visina (površina) vršaka karbadoksa.

6.    Izračun rezultata

Koncentracija karbadoksa u otopini uzorka u μg/ml određuje se iz srednjih vrijednosti visina (površina) vršaka karbadoksa u otopini uzorka iz kalibracijske krivulje (točka 5.4.2.).

6.1.    Hrana za životinje

Udio karbadoksa (w) (mg/kg) u uzorku izračunava se sljedećom formulom:

pri čemu je:

c

=

koncentracija karbadoksa u ekstraktu uzorka (točka 5.3.2.) u μg/ml

V1

=

volumen ekstrakta u ml (tj. 50)

m

=

masa pokusnog uzorka u gramima.

6.2.    Premiksi i pripravci

Udio karbadoksa (w) (mg/kg) u uzorku izračunava se sljedećom formulom:

pri čemu je:

c

=

koncentracija karbadoksa u ekstraktu uzorka (točka 5.2.2. ili 5.2.3.) u μg/ml

V2

=

volumen ekstrakta u ml (tj. 50 za premikse; 150 za pripravke)

f

=

faktor razrjeđenja u skladu s točkom 5.2.2. (premiksi) ili 5.2.3. (pripravci)

m

=

masa pokusnog uzorka u gramima.

7.    Vrednovanje rezultata

7.1.    Identifikacija

Identifikacija analita može se potvrditi ko-kromatografijom ili detektorom s nizom dioda kojim se uspoređuje spektar ekstrakta uzorka i spektar kalibracijske otopine (točka 3.11.2.) koncentracije 10,0 μg/ml.

7.1.1.    Ko-kromatografija

U ekstrakt uzorka doda se primjerena količina kalibracijske otopine (točka 3.11.2.). Količina dodanog karbadoksa mora biti slična procijenjenoj količini karbadoksa u ekstraktu uzorka.

Dopušteno je povećanje samo visine vrška karbadoksa uzimajući u obzir dodane količine i razrjeđenje ekstrakta. Širina vrška, na polovici maksimalne visine, mora biti unutar ± 10 % početne širine.

7.1.2.    Detektor s nizom dioda

Rezultati se ocjenjuju u skladu sa sljedećim mjerilima:

Ako nije ispunjeno jedno od navedenih mjerila, prisutnost analita nije potvrđena.

7.2.    Ponovljivost

Razlika između rezultata dvaju usporednih postupaka određivanja, izvedenih na istom uzorku, za udio od 10 mg/kg i više ne smije prijeći 15 % vrijednosti višega rezultata.

7.3.    Iskorištenje

Kod obogaćenog (slijepog) uzorka iskorištenje iznosi najmanje 90 %.

8.    Rezultati međulaboratorijske studije

Provedena je međulaboratorijska studija u kojoj se u 8 laboratorija analiziralo 6 uzoraka hrane za životinje, 4 uzorka premiksa i 3 uzorka pripravaka. Svaki je uzorak analiziran dvaput. (Podrobnije informacije o navedenoj međulaboratorijskoj studiji mogu se pronaći u Journal of AOAC, svezak 71, 1988., str. 484. – 490.) Rezultati (bez ekstremnih vrijednosti) prikazani su u donjim tablicama:

L

=

broj laboratorija

n

=

broj pojedinačnih vrijednosti

Sr

=

standardna devijacija ponovljivosti

CVr

=

koeficijent varijacije ponovljivosti

SR

=

standardna devijacija obnovljivosti

CVR

=

koeficijent varijacije obnovljivosti.

---

PRILOG IX.

KORELACIJSKE TABLICE IZ ČLANKA 6.

1.    Direktiva 71/250/EEZ

2.    Direktiva 71/393/EEZ

3.    Direktiva 72/199/EEZ

4.    Direktiva 73/46/EEZ

5.    Direktiva 76/371/EEZ

6.    Direktiva 76/372/EEZ

7.    Direktiva 78/633/EEZ

8.    Direktiva 81/715/EEZ

9.    Direktiva 84/425/EEZ

10.    Direktiva 86/174/EEZ

11.    Direktiva 93/70/EEZ

12.    Direktiva 93/117/EZ

13.    Direktiva 98/64/EZ

14.    Direktiva 1999/27/EZ

15.    Direktiva 1999/76/EZ

16.    Direktiva 2000/45/EZ

17.    Direktiva 2002/70/EZ

18.    Direktiva 2003/126/EZ

---

( 1 ) SL L 268, 18.10.2003., str. 29.

( 2 ) SL L 140, 30.05.2002., str. 10.

( 3 ) SL L 70, 16.3.2005., str. 1.

( 4 ) Sve grude se razbiju (prema potrebi, tako da se odvoje i zatim vrate u uzorak).

( 5 ) Osim kod vlaknaste krme ili krmiva niske specifične težine.

( 6 ) Osim kod vlaknaste krme ili krmiva niske specifične težine.

( 7 ) SL L 229, 1.9.2009., str. 1.

( 7 ) Za sušenje žitarica, brašna, grube krupice i sitne krupice sušilo mora imati takav toplinski kapacitet da se nakon postavljanja temperature na 131 °C vraća na tu temperaturu za manje od 45 minuta nakon što se u sušilo postavi maksimalan broj testnih uzoraka za istodobno sušenje. Ventilacija mora biti takva da se, u slučaju kada se u sušilu dva sata suši najveći mogući broj uzoraka pšenice, rezultati razlikuju za manje od 0,15 % od uzoraka koji su sušeni 4 sata.

( 7 ) Kada se ulje ili mast podvrgavaju naknadnim testovima kakvoće, krhotine plovućca zamjenjuju se staklenim kuglicama.

( 7 ) SL L 125, 23.5.1996., str. 35.

( 7 ) Studiju je provela radna skupina za stočnu hranu pri Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs- und Forschungsanstalten (VDLUFA).

( 7 ) Studiju je provela radna skupina za stočnu hranu pri Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs- und Forschungsanstalten (VDLUFA).

( 7 ) Mogu se koristiti i druge metode za mineralizaciju ako dokazano jamče usporedive rezultate (poput, primjerice, mikrovalne mineralizacije pod tlakom).

( 7 ) U zelenoj se krmi (svježoj ili osušenoj) mogu naći velike količine kvarca biljnog podrijetla koji može sadržavati elemente u tragovima koje treba ukloniti. Kod uzoraka takve stočne hrane treba provesti sljedeći izmijenjeni postupak. Provode se postupci iz točke 5.1.1.1. sve do filtracije. Filtarski se papir koji sadrži netopljiv ostatak dvaput ispere vrelom vodom i prenese u lončić za spaljivanje od kvarcnog stakla ili platine. Spali se u mufolnoj peći (točka 4.1.) na temperaturi nižoj od 550 °C do potpunog nestanka svih ugljičnih tvari. Ostavi se da se ohladi, doda se nekoliko kapi vode i 10 – 15 ml fluoridne kiseline (točka 3.4.), zatim se otpari do suhog na otprilike 150 °C. Ako se u ostatku i dalje nalazi kvarcni pijesak, ponovno se otopi u nekoliko mililitara fluoridne kiseline (točka 3.4.) i otpari do suhog. Doda se pet kapljica sumporne kiseline (točka 3.5.) i grije dok ne prestane izlaziti bijeli dim. Nakon dodavanja 5 ml klorovodične kiseline 6 mol/l (točka 3.2.) i oko 30 ml vode, zagrije se i otopina filtrira u graduiranu tikvicu obujma 250 ml te dopuni vodom do oznake (koncentracija HCl oko 0,5 mol/l). Nastavi se s utvrđivanjem u skladu s točkom 5.1.2.

( 7 ) The Analyst 108, 1983., str. 1 252 . - 1 256 .

( *1 ) Analyst, 1995., 120, 2 175 . - 2 180 .

( 8 ) Tablica faktora ekvivalentne toksičnosti (TEF) za PCDD-ove, PCDF-ove i PCB-ove slične dioksinima: WHO-TEF-ovi za procjenu rizika za zdravlje ljudi na temelju zaključaka sa stručnog zasjedanja Svjetske zdravstvene organizacije (WHO) – Međunarodni program za sigurnost kemikalija (IPCS) održanog u Ženevi u lipnju 2005. (Martin van den Berg et al., The 2005 World Health Organization Re-evaluation of Human and Mammalian Toxic Equivalency Factors for Dioxins and Dioxin-like Compounds. Toxicological Sciences 93(2), 223–241. (2006.)).

Upotrijebljene kratice: „T” = tetra; „Pe” = penta; „Hx” = heksa; „Hp” = hepta; „O” = okta; „CDD” = klordibenzodioksin; „CDF” = klordibenzofuran; „CB” = klorbifenil.

( 9 ) Odluka Komisije 2002/657/EZ od 14. kolovoza 2002. o primjeni Direktive Vijeća 96/23/EZ o provođenju analitičkih metoda i tumačenju rezultata (SL L 221, 17.8.2002., str. 8.).

( 10 ) Načela opisana u smjernicama „Guidance Document on Measurement Uncertainty for Laboratories performing PCDD/F and PCB Analysis using Isotope Dilution Mass Spectrometry” (http://ec.europa.eu/food/safety/animal-feed_en) poštuju se ako su primjenjiva.

( 11 ) Pojam „gornji” zahtijeva primjenu granice kvantifikacije za izračun doprinosa svakog pojedinačnog nekvantificiranog kongenera. Pojam „donji” zahtijeva primjenu nule za izračun doprinosa svakog pojedinačnog nekvantificiranog kongenera. Pojam „srednji” zahtijeva primjenu polovine granice kvantifikacije za izračun doprinosa svakog pojedinačnog nekvantificiranog kongenera.

( 12 ) Dvostruka analiza: odvojena analiza predmetnih analita upotrebom drugog alikvota istog homogeniziranog uzorka. Općenito, primjenjuju se zahtjevi za dvostruku analizu iz Priloga II. poglavlja C točke 3. Međutim, za metode u kojima se upotrebljava 13C-obilježeni unutarnji standard za odgovarajuće analite dvostruka analiza potrebna je samo ako rezultat prvog određivanja nije sukladan. Dvostruka analiza potrebna je kako bi se isključila mogućnost unutarnje uzajamne kontaminacije ili slučajne zamjene uzoraka. Ako se analiza izvodi tijekom incidenta kontaminacije, potvrđivanje dvostrukom analizom može se izostaviti u slučaju da su uzorci koji su odabrani za analizu sljedivošću povezani s incidentom kontaminacije i otkrivena je količina znatno veća od najveće dopuštene količine.

( 13 ) Pojam „gornji” zahtijeva primjenu granice kvantifikacije za izračun doprinosa svakog pojedinačnog nekvantificiranog kongenera ekvivalentu toksičnosti (TEQ). Pojam „donji” zahtijeva primjenu nule za izračun doprinosa svakog pojedinačnog nekvantificiranog kongenera ekvivalentu toksičnosti (TEQ). Pojam „srednji” zahtijeva primjenu polovine granice kvantifikacije za izračun doprinosa svakog pojedinačnog nekvantificiranog kongenera ekvivalentu toksičnosti (TEQ).

( 14 ) Općenito, primjenjuju se zahtjevi za dvostruku analizu iz Priloga II. poglavlja C točke 2. Međutim, za potvrdne metode u kojima se upotrebljava 13C-obilježeni unutarnji standard za odgovarajuće analite dvostruka analiza potrebna je samo ako rezultat prvog određivanja nije sukladan. Dvostruka analiza potrebna je kako bi se isključila mogućnost unutarnje uzajamne kontaminacije ili slučajne zamjene uzoraka. Ako se analiza izvodi tijekom incidenta kontaminacije, potvrđivanje dvostrukom analizom može se izostaviti u slučaju da su uzorci koji su odabrani za analizu sljedivošću povezani s incidentom kontaminacije i otkrivena je količina znatno veća od najveće dopuštene količine.

( 15 ) Jednako obrazloženje i zahtjevi za dvostruku analizu za kontrolu pragova za pokretanje postupka kao u bilješci 2. za najveće dopuštene količine.

( 16 ) Uredba (EZ) br. 183/2005 Europskog parlamenta i Vijeća od 12. siječnja 2005. o utvrđivanju zahtjeva u pogledu higijene hrane za životinje (SL L 35, 8.2.2005., str. 1.).

( 17 ) Bioanalitičke metode nisu specifične za te kongenere koji su uključeni u sustav TEF. U izolatu uzorka mogu biti prisutni i drugi strukturno povezani spojevi koji se vežu na receptor aromatskih ugljikovodika (AhR), što pridonosi općem odgovoru. Stoga bioanalitički rezultati nisu procjena, već više pokazatelj vrijednosti TEQ u uzorku.

( 18 ) „Guidance Document on Measurement Uncertainty for Laboratories performing PCDD/F and PCB Analysis using Isotope Dilution Mass Spectrometry” (http://ec.europa.eu/food/safety/animal-feed_en), „Guidance Document on the Estimation of LOD and LOQ for Measurements in the Field of Contaminants in Feed and Food” (http://ec.europa.eu/food/safety/animal-feed_en).

( 19 ) Trenutačni zahtjevi temelje se na TEF-ovima objavljenima u: M. Van den Berg et al., Toxicol Sci 93 (2), 223–241. (2006.).

( 20 ) Kongeneri za koje je često ustanovljeno da ko-eluiraju su npr. PCB 28/31, PCB 52/69 i PCB 138/163/164. Za GC-MS uzimaju se u obzir i moguće interferencije fragmenata viših kloriranih kongenera.

( 21 ) Načela opisana u smjernicama „Guidance Document on the Estimation of LOD and LOQ for Measurements in the Field of Contaminants in Feed and Food” (http://ec.europa.eu/food/safety/animal-feed_en) poštuju se ako su primjenjiva.

( 22 ) Izrazito se preporučuje niži doprinos razine reagensa u slijepoj probi od razine kontaminanta u uzorku. Laboratorij je odgovoran kontrolirati varijaciju razina vrijednosti slijepih proba, posebno ako su te vrijednosti oduzete.

( 23 ) Trenutačni zahtjevi temelje se na TEF-ovima objavljenima u: M. Van den Berg et al., Toxicol Sci 93 (2), 223–241. (2006.).

( 24 ) http://eurl.craw.eu/

( 25 ) http://eurl.craw.eu/

( 26 ) Popis ovih početica i sondi za svaku ciljanu životinjsku vrstu dostupan je na internetskoj stranici EURL-AP-a.

( 27 ) Primjeri glavnih mješavina koje su funkcionalne dostupni su na internetskoj stranici EURL-AP-a.