1.

La présente méthode d’essai est équivalente à la ligne directrice 105 (1995) de l’OCDE pour les essais de produits chimiques. Cette méthode d’essai constitue une révision de la ligne directrice 105 adoptée en 1981. S’il n’y a pas eu de modification de fond, la présentation a été remaniée. La révision s’appuie sur la méthode d’essai “Hydrosolubilité” de l’Union européenne (1).

2.

La présence d’impuretés peut considérablement modifier la solubilité d’une substance dans l’eau. La présente méthode d’essai porte sur la mesure de la solubilité de substances essentiellement pures, stables dans l’eau et non volatiles. Avant de déterminer la solubilité dans l’eau, il est utile de disposer d’informations sur la substance telles que la formule développée, la pression de vapeur, la constante de dissociation et l’hydrolyse en fonction du pH.

3.

Les deux méthodes décrites dans cette méthode d’essai, la méthode par élution sur colonne et la méthode du flacon, couvrent respectivement les solubilités inférieures et supérieures à 10–2 g/l. Un essai préliminaire simple est également décrit. Il permet de déterminer approximativement la quantité de substance à utiliser dans l’essai proprement dit, ainsi que le temps nécessaire pour atteindre la saturation.

4.

La solubilité d’une substance dans l’eau est la concentration massique de saturation de cette substance dans l’eau à une température donnée.

5.

La solubilité dans l’eau est exprimée en masse de soluté par volume de solution. L’unité SI est le kg/m3, mais on utilise également le g/l.

6.

Il n’y a pas lieu d’employer des substances de référence lorsqu’on étudie une substance.

7.

L’essai est pratiqué de préférence à 20 °C ± 0,5 °C. La température choisie sera maintenue constante dans toutes les parties du dispositif expérimental où elle peut avoir une influence.

8.

Des volumes d’eau croissants sont ajoutés progressivement à environ 0,1 g d’échantillon (les solides doivent être pulvérisés), à température ambiante, dans un flacon gradué de 10 ml fermé par un bouchon en verre. Après chaque ajout d’eau, le mélange est agité pendant 10 minutes. On vérifie ensuite visuellement si l’échantillon est complètement dissous. Si des parties non dissoutes de l’échantillon subsistent après l’addition de 10 ml d’eau, l’essai se poursuit dans un flacon gradué de 100 ml. La solubilité approximative est indiquée dans le tableau 1, au-dessous du volume d’eau qui dissout complètement l’échantillon. Si la solubilité est faible, le temps requis pour dissoudre la substance peut être long et il faut attendre au moins 24 heures. Si après 24 heures la substance n’est toujours pas dissoute, il y a lieu d’attendre jusqu’à 96 heures ou de procéder à une dilution plus poussée, afin de déterminer s’il convient d’utiliser la méthode par élution sur colonne ou la méthode du flacon.

Tableau 1

9.

Il s’agit d’éluer la substance à étudier avec de l’eau d’une microcolonne remplie d’un support inerte et préalablement revêtu d’un excès de la substance à étudier (2). La solubilité correspond au plateau de la courbe de la concentration massique de l’éluat en fonction du temps.

10.

L’appareil se compose d’une microcolonne (figure 1) thermostatée, reliée soit à une pompe de recirculation (figure 2), soit à un réservoir de remise à niveau (figure 3). La microcolonne contient un support inerte maintenu en place par un petit tampon de laine de verre, qui sert aussi à filtrer les particules. Divers matériaux peuvent être employés comme support: billes de verre, terre de diatomées ou autres matériaux inertes.

11.

La microcolonne représentée à la figure 1 convient au montage comportant une pompe de recirculation. Elle a un volume tampon correspondant à cinq fois le volume de son lit (les premiers cinq volumes de lit sont rejetés au début de l’expérience) et au volume de cinq échantillons (prélevés pour analyse pendant l’expérience). On peut cependant réduire le volume tampon à condition de pouvoir ajouter de l’eau au système pendant l’expérience pour remplacer les premiers cinq volumes de lit éliminés avec les impuretés. La colonne est reliée, par un tuyau en matériau inerte, à une pompe de recirculation capable de pomper environ 25 ml/h. La pompe de recirculation peut être, par exemple, une pompe péristaltique ou une pompe à membrane. Il faut veiller à ce que le matériau du tuyau n’occasionne aucune contamination et/ou adsorption.

12.

Un montage comportant un réservoir de remise à niveau est schématisé à la figure 3. Dans ce montage, la microcolonne est munie d’un robinet d’arrêt à une voie. Elle est reliée au réservoir de remise à niveau par un tube en matériau inerte et un raccord en verre rodé. Le débit du réservoir de remise à niveau doit avoisiner 25 ml/h.

Figure 1

Dimensions en mm

Figure 2

Figure 3

13.

Verser environ 600 mg de matériau de support dans un flacon à fond rond de 50 ml. Dissoudre une quantité appropriée de substance à étudier dans un solvant volatil de qualité pour analyse et ajouter une quantité déterminée de cette solution au matériau support. Le solvant doit être complètement évaporé, par exemple à l’aide d’un évaporateur rotatif, sinon l’eau ne pourra pas saturer le support pendant l’élution à cause d’un effet de répartition à la surface. Faire tremper le support chargé pendant deux heures dans environ 5 ml d’eau et verser la suspension dans la microcolonne, ou bien verser le support sec dans la microcolonne déjà remplie d’eau et le laisser s’équilibrer pendant deux heures.

14.

Le chargement du support peut causer des problèmes conduisant à des résultats erronés, par exemple lorsque la substance à étudier est déposée sous forme d’huile. Ces problèmes doivent être examinés et détaillés dans le rapport.

15.

La circulation dans la colonne est amorcée. Il est recommandé d’appliquer un débit d’environ 25 ml/h, soit dix volumes de lit par heure pour la colonne décrite. Les premiers cinq volumes de lit au moins sont rejetés pour éliminer les impuretés hydrosolubles. Après quoi, on laisse fonctionner la pompe jusqu’à ce que l’équilibre soit atteint. L’équilibre est attesté lorsque l’analyse de cinq échantillons successifs donne des concentrations qui ne diffèrent pas de plus de ± 30 % de façon aléatoire. Ces prélèvements doivent être séparés entre eux par des intervalles de temps correspondant au passage d’au moins dix volumes de lit. Avec certaines méthodes analytiques, il peut être préférable de démontrer que l’équilibre est atteint à l’aide d’une courbe de la concentration en fonction du temps.

16.

Des fractions successives d’éluat sont recueillies et analysées suivant la méthode choisie. Les fractions du milieu de l’intervalle d’élution, là où la concentration demeure constante à ± 30 % près dans au moins cinq prélèvements consécutifs, servent à déterminer la solubilité.

17.

L’eau bidistillée est le meilleur éluant. On peut aussi utiliser de l’eau désionisée, caractérisée par une résistivité supérieure à 10 mégaohms/cm et une teneur totale en carbone organique inférieure à 0,01 %.

18.

Pour chaque méthode, l’opération est répétée en réduisant le débit de moitié. Si les résultats des deux opérations concordent, l’essai est satisfaisant. Si l’on mesure une solubilité plus élevée avec le débit inférieur, il y a lieu de continuer à diminuer le débit de moitié jusqu’à ce que deux essais successifs donnent la même solubilité.

19.

Pour chaque méthode, il faut vérifier la présence de matières colloïdales dans les fractions, par détection de l’effet Tyndall. La présence de particules fausse les résultats et l’essai doit être répété après avoir amélioré le pouvoir de filtration de la colonne.

20.

Le pH de chaque échantillon doit être mesuré, de préférence au moyen de bandelettes indicatrices spéciales.

21.

La substance est dissoute dans l’eau (les solides doivent être pulvérisés) à une température légèrement supérieure à celle de l’essai. Une fois la saturation obtenue, le mélange est refroidi et maintenu à la température de l’essai. Il est toutefois possible de réaliser la mesure directement, à la température de l’essai, si un échantillonnage pertinent prouve que l’équilibre de saturation a été atteint. Ensuite, la concentration de la substance est déterminée par une méthode analytique appropriée (3). La solution analysée ne doit contenir aucune particule non dissoute.

22.

Le matériel suivant est requis:

23.

Évaluer la quantité de substance nécessaire pour saturer le volume d’eau voulu, à la lumière de l’essai préliminaire. Introduire l’équivalent d’environ cinq fois cette quantité dans chacun des trois récipients en verre munis d’un bouchon en verre (tubes à centrifuger, flacons, par exemple). Ajouter un volume d’eau, choisi en fonction de la méthode analytique et de la gamme de solubilité, dans chaque récipient. Les récipients sont bouchés hermétiquement et ensuite agités à 30 °C. Il convient d’utiliser un système d’agitation ou mélangeur capable de fonctionner à température constante, par exemple un agitateur magnétique combiné à un bain-marie thermostaté. Après un jour, laisser l’un des récipients s’équilibrer pendant 24 heures à la température de l’essai en l’agitant de temps en temps. Centrifuger ensuite le contenu du récipient à la température de l’essai et déterminer, par une méthode analytique idoine, la concentration de la substance dans la phase aqueuse limpide. Les deux autres flacons sont traités de la même manière après avoir été équilibrés à 30 °C pendant deux et trois jours respectivement. Si les concentrations mesurées au moins dans les deux derniers flacons ne diffèrent pas de plus de 15 %, l’essai est satisfaisant. Si les résultats obtenus avec les flacons 1, 2 et 3 tendent à croître, il est nécessaire de refaire tout l’essai en appliquant des temps d’équilibrage plus longs.

24.

L’essai peut aussi être conduit sans préincubation à 30 °C. Afin d’estimer la rapidité avec laquelle s’établit l’équilibre de saturation, des échantillons sont prélevés jusqu’à ce que la durée de l’agitation n’influence plus les concentrations mesurées.

25.

Le pH de chaque échantillon doit être mesuré, de préférence au moyen de bandelettes indicatrices spéciales.

26.

Il est préférable d’employer une méthode d’analyse spécifique pour la substance, de petites quantités d’impuretés solubles pouvant fausser gravement la mesure de la solubilité. Parmi les méthodes possibles, citons la chromatographie en phase gazeuse ou liquide, le titrage, la photométrie, la voltamétrie.

27.

Pour chaque essai, il faut calculer la moyenne et l’écart-type sur au moins cinq échantillons consécutifs issus du plateau de saturation. Les moyennes établies à partir de deux essais pratiqués à des débits différents ne doivent pas s’écarter de plus de 30 %.

28.

On calcule la moyenne des résultats obtenus avec chacun des trois flacons. Ces résultats ne doivent pas différer de plus de 15 %.

29.

Le rapport d’essai doit comporter les informations suivantes:

30.

Le rapport d’essai doit comprendre les informations suivantes:

(1)

Directive 92/69/CEE de la Commission du 31 juillet 1992 portant dix-septième adaptation au progrès technique de la directive 67/548/CEE du Conseil concernant le rapprochement des dispositions législatives, réglementaires et administratives relatives à la classification, l’emballage et l’étiquetage des substances dangereuses (JO L 383 du 29.12.1992, p. 113).

(2)

NF T 20-045 (AFNOR) (septembre 1985). Produits chimiques à usage industriel — Détermination de la solubilité dans l’eau des solides et liquides à faible solubilité — Méthode de l’élution sur colonne

(3)

NF T 20-046 (AFNOR) (septembre 1985). Produits chimiques à usage industriel — Détermination de la solubilité dans l’eau des solides et liquides à forte solubilité — Méthode du flacon.»

1.

La présente méthode d’essai est équivalente à la ligne directrice 123 (2006) de l’OCDE pour les essais de produits chimiques. La méthode du brassage lent a permis de déterminer avec exactitude des valeurs logarithmiques du coefficient de partage 1-octanol/eau (POE) allant jusqu’à 8,2 (1). Aussi constitue-t-elle une approche expérimentale appropriée pour la détermination directe du POE de substances fortement hydrophobes.

2.

Les autres méthodes de détermination du coefficient de partage 1-octanol/eau (POE), sont la méthode par agitation en flacon (2) et la méthode par HPLC phase inverse (3). La méthode par agitation en flacon est sujette à des artéfacts dus au transfert de micro-gouttelettes d’octanol dans la phase aqueuse. Lorsque les valeurs du POE augmentent, la présence de ces gouttelettes dans la phase aqueuse engendre une surestimation croissante de la concentration de la substance d’essai dans l’eau. Aussi l’usage de cette méthode est-il limité aux substances dont le log POE est < 4. À partir de valeurs fiables du POE directement déterminées, la deuxième méthode étalonne la relation entre le temps de rétention sur la colonne HPLC et des valeurs mesurées du POE. Il existait un projet de ligne directrice de l’OCDE permettant de déterminer les coefficients de partage 1-octanol/eau de substances ionisables (4), mais il ne doit plus être utilisé.

3.

La présente méthode d’essai a été élaborée aux Pays-Bas. La précision des méthodes décrites dans ce pays a été validée et optimisée au cours d’un essai tournant de validation auquel ont participé 15 laboratoires (5).

4.

S’agissant des substances organiques inertes, une relation très significative a été mise en évidence entre leur coefficient de partage 1-octanol/eau (POE) et leur bioaccumulation dans les poissons. De plus, une corrélation entre le POE et, d’une part, la toxicité pour les poissons et, d’autre part, la sorption de produits chimiques sur des solides tels que les sols et les sédiments, a également été démontrée. La référence (6) livre un large aperçu de ces relations.

5.

Des relations très diverses entre le coefficient de partage 1-octanol/eau et d’autres propriétés des substances intéressant la chimie et la toxicologie environnementales ont été établies. Le coefficient de partage 1-octanol/eau est ainsi devenu un paramètre fondamental dans l’évaluation des risques des substances chimiques pour l’environnement et dans la prédiction du devenir de ces substances dans l’environnement.

6.

La méthode du brassage lent est censée réduire la formation de micro-gouttelettes de 1-octanol dans la phase aqueuse, ce qui écarte le problème de la surestimation de la concentration en phase aqueuse due à la présence de molécules de la substance d’essai dans ces gouttelettes. Par conséquent, la méthode du brassage lent convient particulièrement à la détermination du POE de substances dont le log POE est supposément supérieur ou égal à 5, gamme dans laquelle la méthode par agitation en flacon (2) tend à fournir des résultats fausséss.

7.

Le coefficient de partage d’une substance entre l’eau et un solvant lipophile (1-octanol) caractérise la répartition à l’équilibre de la substance chimique entre les deux phases. Le coefficient de partage entre l’eau et le 1-octanol (POE) est défini comme étant le rapport des concentrations à l’équilibre de la substance d’essai dans du 1-octanol saturé avec de l’eau (CO) et dans de l’eau saturée avec du 1-octanol (CE).

Le rapport de deux concentrations est une valeur adimensionnelle. Il est exprimé le plus souvent par son logarithme décimal (log POE). Le POE dépend de la température et les résultats rapportés doivent préciser la température de mesure.

8.

En vue de déterminer le coefficient de partage, on laisse le système formé par l’eau, le 1-octanol et la substance d’essai s’équilibrer à température constante. Ensuite, on mesure les concentrations de la substance d’essai dans les deux phases.

9.

La méthode du brassage lent, proposée ici, permet de réduire les difficultés expérimentales associées à la formation de micro-gouttelettes dans la méthode par agitation en flacon. Avec le brassage lent, l’eau, le 1-octanol et la substance d’essai s’équilibrent dans un réacteur thermostaté soumis à une agitation douce. Les échanges entre les phases sont accélérés par le brassage. Ce dernier produit une légère turbulence qui favorise les échanges entre le 1-octanol et l’eau sans provoquer la formation de gouttelettes (1).

10.

La présence de substances autres que la substance d’essai risquant d’influencer le coefficient d’activité de la substance d’essai, celle-ci doit être testée à l’état pur. Il convient d’employer une substance d’essai présentant le degré de pureté le plus élevé que l’on puisse trouver dans le commerce.

11.

Cette méthode s’applique aux substances pures qui ne se dissocient ni s’associent et qui ne manifestent aucune activité interfaciale sensible. Cette méthode convient également aux mélanges. Le cas échéant, les coefficients de partage 1-octanol/eau déterminés varient en fonction de la composition chimique du mélange testé et de la composition électrolytique employée comme phase aqueuse. À condition de prendre certaines mesures supplémentaires, cette méthode peut aussi s’appliquer à des substances qui se dissocient ou s’associent (paragraphe 12).

12.

Le partage des substances sujettes à la dissociation, telles que les acides organiques et les phénols, les bases organiques et les composés organométalliques, entre l’eau et le 1-octanol comportant de multiples équilibres dans ces phases, le POE est une constante conditionnelle qui dépend fortement de la composition électrolytique (7) (8). D’où la nécessité de contrôler le pH et la composition électrolytique lors de la détermination du POE et de rapporter les valeurs de ces deux paramètres. L’évaluation de ces coefficients de partage doit être confiée à un expert. Il convient de sélectionner des valeurs de pH appropriées d’après la valeur de la ou des constantes de dissociation, afin d’établir un coefficient de partage pour chaque état d’ionisation. Les composés organométalliques doivent être testés à l’aide de tampons non complexants (8). À la lumière des connaissances actuelles en matière de chimie en phase aqueuse (constantes de complexation et de dissociation), on choisira des conditions expérimentales permettant d’estimer la formation d’espèces par la substance d’essai en phase aqueuse. Il faut instaurer une force ionique identique dans toutes les expériences en employant un électrolyte de fond.

13.

Les substances peu solubles dans l’eau ou présentant un POE élevé peuvent engendrer des problèmes dus au fait que leurs concentrations dans l’eau sont si faibles qu’il devient difficile de les déterminer avec exactitude. La présente méthode d’essai livre des indications sur la manière de traiter ce problème.

14.

Le degré de pureté des réactifs chimiques doit au moins correspondre à celui de la qualité pour analyse. Il est recommandé d’utiliser des substances d’essai non marquées de composition chimique connue et d’une pureté d’au moins 99 % ou des substances d’essai radiomarquées de composition chimique et pureté radiochimique connues. S’il s’agit de traceurs à demi-vie courte, on appliquera des corrections pour tenir compte de la désintégration. Si la substance d’essai est radiomarquée, il y a lieu d’employer une méthode analytique spécifique à la substance de telle sorte que la radioactivité mesurée se rapporte directement à la substance d’essai.

15.

Il est possible d’estimer le log POE avec les logiciels vendus dans le commerce à cet effet, ou en s’appuyant sur le rapport des solubilités dans les deux solvants.

16.

Avant de déterminer le POE par la méthode du brassage lent, il faut disposer des informations suivantes sur la substance d’essai:

17.

Cette expérience nécessite du matériel courant de laboratoire, et en particulier:

18.

Les récipients doivent être composés d’un matériau inerte rendant négligeable l’adsorption à la surface des récipients.

19.

La détermination du POE requiert un 1-octanol de la qualité la plus pure qui puisse se trouver dans le commerce (au moins 99 %). Il est recommandé de purifier le 1-octanol par une extraction réalisée avec un acide, une base et de l’eau, suivie d’un séchage. Le 1-octanol peut, en plus, être purifié par distillation. Les solutions étalons des substances d’essai doivent être préparées avec du 1-octanol purifié. L’eau destinée à la détermination du POE doit être distillée à l’aide d’un dispositif en verre ou en quartz, ou traitée par un système de purification, ou encore être de qualité HPLC. Il convient de filtrer l’eau distillée à travers des mailles de 0,22 μm et d’inclure des blancs afin de s’assurer que les extraits concentrés ne renferment pas d’impuretés susceptibles d’interférer avec la substance d’essai. Si l’on emploie un filtre en fibres de verre, il faut le nettoyer en le laissant au moins trois heures dans un four à 400 °C.

20.

Afin de saturer chaque solvant par l’autre avant l’expérience, on les équilibre dans un récipient suffisamment grand. Pour ce faire, le système à deux phases est soumis à un brassage lent durant deux jours.

21.

Une concentration appropriée de la substance d’essai est choisie et dissoute dans du 1-octanol (saturé avec de l’eau). Il y a lieu de déterminer le coefficient de partage 1-octanol/eau dans des solutions diluées dans du 1-octanol et de l’eau. Aussi la concentration de la substance d’essai ne doit-elle pas excéder 70 % de sa solubilité avec une concentration maximale de 0,1 M dans chaque phase (1). Les solutions de 1-octanol utilisées pour l’expérience seront exemptes de substance d’essai en suspension à l’état solide.

22.

La quantité appropriée de substance d’essai est dissoute dans du 1-octanol (saturé avec de l’eau). Si l’estimation du log POE est supérieure à 5, il faut s’assurer que les solutions de 1-octanol utilisées pour l’expérience ne renferment pas de substance d’essai en suspension à l’état solide. À cette fin, la procédure suivante est appliquée pour les substances chimiques dont la valeur estimée de log POE > 5:

23.

Le dosage de la substance d’essai s’effectue par une méthode analytique validée. Les chercheurs doivent prouver que, durant l’essai, les concentrations dans le 1-octanol saturé avec de l’eau et dans la phase aqueuse saturée avec du 1-octanol sont supérieures au seuil de quantification du procédé analytique employé. Il y a lieu d’établir avant l’essai le taux de récupération par l’analyse de la substance d’essai en phase aqueuse et en phase 1-octanol, dans les cas où des méthodes d’extraction s’avèrent nécessaires. Le signal analytique doit être corrigé en fonction des blancs et l’on veillera à éviter tout transfert de la substance à analyser d’un échantillon à l’autre.

24.

Les concentrations des substances d’essai hydrophobes étant plutôt faibles en phase aqueuse, il faudra probablement extraire la substance de la phase aqueuse à l’aide d’un solvant organique et préconcentrer l’extrait avant analyse. Pour la même raison, il est nécessaire de réduire les éventuelles concentrations du blanc. À cette fin, on emploie des solvants très purs, de préférence des solvants pour l’analyse des résidus. En outre, un nettoyage soigneux (par exemple lavage au solvant ou cuisson à haute température) de la verrerie avant l’expérience peut diminuer le risque de contamination croisée.

25.

Il est possible d’estimer le log POE à l’aide d’un programme d’estimation ou en faisant appel à un expert. Si sa valeur est supérieure à six, d’une part il convient d’être très attentif aux corrections en fonction du blanc et à tout transfert de la substance à analyser d’un échantillon à l’autre et, d’autre part, il est impératif d’utiliser un étalon de substitution pour corriger le taux de récupération, de façon à pouvoir atteindre des facteurs de préconcentration élevés. Plusieurs logiciels d’estimation du log POE se trouvent dans le commerce (1), par exemple Clog P (16), KOWWIN (17), ProLogP (18) et ACD logP (19). Les références (20-22) décrivent les différents procédés d’estimation.

26.

Les seuils de quantification pour la détermination de la substance d’essai dans le 1-octanol et dans l’eau sont établis suivant des méthodes acceptées. Comme principe de base, le seuil de quantification de la méthode employée peut être considéré comme étant la concentration dans l’eau ou le 1-octanol qui produit un rapport signal/bruit de dix. Il convient de choisir des méthodes d’extraction et de préconcentration appropriées et de spécifier le taux de récupération de l’analyse. Le facteur de préconcentration doit être choisi de façon à produire un signal de l’intensité requise lors de la détermination analytique.

27.

En fonction des paramètres de la méthode analytique et des concentrations escomptées, on détermine le volume de l’échantillon qui permettra de déterminer avec exactitude la concentration de la substance d’essai. L’utilisation d’échantillons aqueux trop petits pour obtenir un signal analytique suffisant est à éviter. Les échantillons aqueux ne doivent pas non plus être trop grands, car le volume d’eau restant risquerait d’être insuffisant pour le nombre minimal d’analyses requises (n = 5). L’appendice 1 indique les volumes minimaux des échantillons en fonction du volume du récipient, du seuil de détection de la substance d’essai et de sa solubilité.

28.

La quantification des substances d’essai s’effectue par comparaison avec les courbes d’étalonnage des substances d’essai. Les concentrations des étalons doivent figurer entre parenthèses à côté des concentrations relevées dans les échantillons analysées.

29.

Pour les substances d’essai dont le log POE estimé est supérieur à six, on verse un étalon de substitution dans l’échantillon aqueux avant l’extraction afin de relever les pertes survenues durant l’extraction et la préconcentration des échantillons aqueux. Pour que la correction du taux de récupération soit correcte, les étalons de substitution doivent avoir des propriétés très semblables ou identiques à celles de la substance d’essai. À cette fin, on utilise de préférence des analogues isotopiques (stables) marqués de la substance d’essai (perdeutériés ou marqués au 13C, par exemple). Si l’utilisation d’un isotope marqué stable, c’est-à-dire marqué au 13C ou au 2H, est impossible, il faut démontrer, en s’appuyant sur des données fiables tirées de publications, que les propriétés physico-chimiques de l’étalon de substitution sont très proches de celles de la substance d’essai. Des émulsions peuvent se former au cours de l’extraction liquide-liquide de la phase aqueuse. Pour réduire ce phénomène, on peut ajouter du sel et laisser reposer l’émulsion toute une nuit. Les méthodes utilisées pour extraire et préconcentrer les échantillons doivent être mentionnées.

30.

Les échantillons prélevés dans la phase 1-octanol peuvent, si nécessaire, être dilués avec un solvant adéquat avant l’analyse. De plus, l’utilisation d’étalons de substitution pour corriger la récupération est recommandée pour les substances qui se sont avérées présenter un degré de variation élevé lors des essais de récupération (écart-type relatif supérieur à 10 %).

31.

Les détails de la méthode analytique devront figurer dans le rapport. Ceux-ci incluent la méthode d’extraction, les facteurs de préconcentration et de dilution, les paramètres des instruments, le processus d’étalonnage, la gamme d’étalonnage, la récupération de la substance d’essai présente dans l’eau par un procédé analytique, l’ajout d’étalons de substitution pour corriger le taux de récupération, les valeurs des blancs, les seuils de détection et les seuils de quantification.

32.

Les volumes d’eau et de 1-octanol sont choisis en fonction du seuil de quantification dans le 1-octanol et dans l’eau, des facteurs de préconcentration appliqués aux échantillons aqueux, des volumes prélevés dans le 1-octanol et dans l’eau et des concentrations prévues. Pour des raisons expérimentales, le volume de 1-octanol employé dans le système de brassage lent doit être choisi de telle sorte que la couche de 1-octanol soit suffisamment épaisse (> 0,5 cm) pour qu’un prélèvement puisse s’effectuer dans la phase 1-octanol sans la perturber.

33.

Les rapports volumiques utilisés couramment pour analyser des substances dont le log POE est supérieur ou égal à 4,5 sont de 20 à 50 ml de 1-octanol et de 950 à 980 ml d’eau dans un récipient d’un litre.

34.

Durant l’essai, le réacteur est thermostaté de manière à limiter la variation de température à moins de 1 °C. L’essai doit être conduit à 25 °C.

35.

On protège le système expérimental de la lumière du jour en effectuant l’essai dans une pièce obscure ou en recouvrant le réacteur d’une feuille d’aluminium.

36.

L’essai doit être mené dans un environnement aussi dépoussiéré que possible.

37.

Le système 1-octanol/eau est agité jusqu’à ce que l’équilibre soit atteint. Le temps requis pour atteindre l’équilibre est évalué au moyen d’un essai pilote de brassage lent au cours duquel on prélève de l’eau et de l’octanol périodiquement. Les temps de prélèvement doivent être espacés d’au moins cinq heures.

38.

Chaque détermination du POE doit s’effectuer sur la base d’au moins trois essais de brassage lent indépendants.

39.

On admet que l’équilibre est atteint lorsque la régression du rapport des concentrations dans le 1-octanol et dans l’eau en fonction du temps (la variable temps comprenant quatre point s) se traduit par une pente ne s’écartant pas de manière significative de zéro pour une valeur de p égale à 0,05. Le temps minimal requis pour atteindre l’équilibre avant de pouvoir commencer les prélèvements est d’un jour. En principe, le prélèvement des substances dont le log POE estimé est inférieur à cinq peut s’effectuer au cours des deuxième et troisième jours. Il est possible que le temps pour parvenir à l’équilibre soit plus long pour les substances plus hydrophobes. Pour une substance ayant un log POE égal à 8,23 (décachlorobiphényle), 144 heures ont été suffisantes pour atteindre l’équilibre. L’équilibre est évalué par une série de prélèvements effectués dans le même récipient.

40.

On commence par remplir le réacteur avec de l’eau saturée en 1-octanol. Ensuite, on attend que le système atteigne la température requise par le thermostat.

41.

La quantité voulue de substance d’essai (dissoute dans le volume requis de 1-octanol saturé en eau) est ajoutée soigneusement au réacteur. Il s’agit d’une étape critique de l’essai car il faut éviter le mélange turbulent des deux phases. À cette fin, la phase 1-octanol peut être versée doucement à l’aide d’une pipette sur la paroi du récipient d’essai, à proximité de la surface de l’eau. Elle ruissellera ainsi le long de la paroi et formera un film au dessus de la phase aqueuse. Il faut toujours éviter de décanter le 1-octanol directement dans la bouteille; on ne peut pas faire tomber des gouttes de 1-octanol directement dans l’eau.

42.

Une fois l’agitation lancée, on augmente lentement sa vitesse. Si les moteurs de l’agitateur ne peuvent être réglés correctement, on envisagera d’utiliser un transformateur. La vitesse d’agitation doit être réglée de manière à créer un vortex à l’interface entre l’eau et le 1-octanol d’une profondeur de 0,5 à 2,5 cm au maximum. Il faut diminuer la vitesse d’agitation si la profondeur du vortex dépasse 2,5 cm, sinon des micro-gouttelettes de 1-octanol peuvent se former dans la phase aqueuse et donner lieu à une surestimation de la concentration de la substance d’essai dans l’eau. D’après les résultats d’un essai tournant de validation (5), on recommande d’appliquer une vitesse maximale d’agitation de 2,5 cm. Elle représente un compromis permettant de parvenir rapidement à l’équilibre tout en limitant la formation de microgouttelettes de 1-octanol.

43.

Il convient d’arrêter l’agitateur avant d’effectuer les prélèvements et d’attendre que les liquides s’immobilisent. Lorsque le prélèvement est terminé, l’agitateur est remis en marche doucement, comme décrit plus haut; après quoi on augmente la vitesse d’agitation progressivement.

44.

La phase aqueuse est prélevée à un robinet situé à la base du réacteur. Il faut toujours éliminer le volume mort d’eau contenu dans les robinets (environ 5 ml pour le récipient illustré à l’appendice 2). L’eau retenue dans les robinets n’est pas agitée et donc pas en équilibre avec l’ensemble. On note le volume des échantillons aqueux et on vérifie que la quantité de substance d’essai présente dans l’eau éliminée est prise en compte dans l’établissement du bilan massique. Il y a lieu de réduire au minimum les pertes par évaporation en permettant à l’eau de s’écouler doucement dans l’entonnoir séparateur de façon à ne pas perturber la couche eau/1-octanol.

45.

On prélève les échantillons de 1-octanol en aspirant une petite aliquote (environ 100 μl) de la couche 1-octanol au moyen d’une seringue de 100 microlitres en verre et métal. Il faut veiller à ne pas perturber l’interface. Le volume de liquide prélevé est consigné. Une petite aliquote suffit, étant donné que l’échantillon de 1-octanol sera dilué.

46.

Les étapes inutiles de transfert d’échantillons sont à éviter. Aussi le volume des échantillons est-il déterminé par gravimétrie. Dans le cas des échantillons aqueux, cette détermination s’effectue par la collecte de l’échantillon aqueux dans un entonnoir séparateur contenant déjà le volume de solvant requis.

47.

La méthode d’essai prescrit de déterminer le POE en conduisant trois essais à brassage lent (trois unités expérimentales) dans des conditions expérimentales identiques. La régression utilisée pour démontrer que l’équilibre a été atteint doit s’appuyer sur les résultats d’au moins quatre déterminations du rapport CO/CE effectuées à quatre moments ponctuels successifs. La variance ainsi calculée correspond à une mesure de l’incertitude de la valeur moyenne obtenue pour chaque unité expérimentale.

48.

Le POE peut être caractérisé par la variance des données recueillies pour chaque unité expérimentale. Cette information est employée pour calculer le POE en considérant qu’il équivaut à la moyenne pondérée des résultats de chaque unité expérimentale. Pour ce faire, l’inverse de la variance des résultats des unités expérimentales est employé comme coefficient pondérateur. Ainsi, les données accusant une forte variation (exprimée par la variance), qui sont donc moins fiables, ont moins d’influence sur le résultat que les données offrant une variance faible.

49.

L’écart-type pondéré est calculé d’une manière analogue. Il caractérise la répétabilité de la mesure du POE. Un écart-type pondéré faible traduit une répétabilité élevée de la détermination du POE au sein d’un même laboratoire. Le traitement statistique formel des données est résumé ci-dessous.

50.

Le logarithme du rapport des concentrations de la substance d’essai dans le 1-octanol et dans l’eau (log CO/CE) est calculé pour chaque instant de prélèvement. On démontre que l’équilibre chimique est atteint en traçant une courbe de ce rapport en fonction du temps. L’apparition d’un plateau sur ce tracé, établi à partir d’au moins quatre points consécutifs sur l’axe du temps, indique que l’équilibre a été atteint et que le composé est complètement dissous dans le 1-octanol. Dans le cas contraire, il faut poursuivre l’essai jusqu’à ce que quatre points de temps successifs présentent une pente qui n’est pas significativement différente de zéro, pour une valeur de p = 0,05, montrant ainsi que le log CO/CE est indépendant du temps.

51.

La valeur du log POE de l’unité expérimentale correspond à la moyenne pondérée du log CO/CE pour la partie de la courbe du log CO/CE en fonction du temps, pour laquelle l’état d’équilibre a été démontré. On calcule la moyenne pondérée en pondérant les données avec l’inverse de la variance de telle sorte que l’influence des données sur le résultat final est inversement proportionnelle à l’incertitude des données.

52.

La valeur moyenne du log POE de différentes unités expérimentales correspond à la moyenne des résultats de chaque unité expérimentale pondérés avec leurs variances respectives.

Le calcul répond à la formule suivante:

où:

L’inverse de la variance de log POE,i est représentée par wi ().

53.

L’estimation de l’erreur de la moyenne de log POE correspond à la répétabilité des log CO/CE déterminés durant la phase d’équilibre dans chaque unité expérimentale. Elle se traduit par l’écart-type pondéré du log POE moy (σlog Poe moy) qui mesure l’erreur associée au log POE moy. L’écart-type pondéré peut être calculé à partir de la variance pondérée (varlog Poe moy) de la façon suivante:

où n représente le nombre d’unités expérimentales.

54.

Le rapport d’essai doit mentionner les informations suivantes:

(1)

De Bruijn J.H.M., Busser F., Seinen W., Hermens J. (1989). Determination of octanol/water partition coefficients with the ‘slow-stirring’ method. Environ. Toxicol. Chem. 8: 499-512.

(2)

Chapitre A.8 de la présente annexe, Coefficient de partition.

(3)

Chapter A.8 de la présente annexe, Coefficient de partition.

(4)

OCDE (2000). Ligne directrice de l’OCDE pour les essais de produits chimiques: 122 – Coefficient de partition (n-octanol/eau): méthode par pH-métrie pour les substances ionisables. Paris.

(5)

Tolls J. (2002). Partition Coefficient 1-Octanol/Water (Pow) Slow-Stirring Method for Highly Hydrophobic Chemicals, Validation Report. RIVM contract-Nrs 602730 M/602700/01.

(6)

Boethling R.S., Mackay D. (eds.) (2000). Handbook of property estimation methods for chemicals. Lewis Publishers Boca Raton, FL, USA.

(7)

Schwarzenbach R.P., Gschwend P.M., Imboden D.M. (1993). Environmental Organic Chemistry. Wiley, New York, NY.

(8)

Arnold C.G., Widenhaupt A., David M.M., Müller S.R., Haderlein S.B., Schwarzenbach R.P. (1997). Aqueous speciation and 1-octanol-water partitioning of tributyl- and triphenyltin: effect of pH and ion composition. Environ. Sci. Technol. 31: 2596-2602.

(9)

OCDE (1981) Ligne directrice de l’OCDE pour les essais de produits chimiques: 112 – Constantes de dissociation dans l’eau. Paris.

(10)

Chapitre A.6 de la présente annexe, Solubilité dans l’eau.

(11)

Chapitre C.7 de la présente annexe, Dégradation – Dégradation abiotique: hydrolyse en fonction du pH.

(12)

Chapitre C.4 – Parties II à VII (Méthode A à F) de la présente annexe, Détermination de la biodégradabilité immédiate.

(13)

Chapitre A.4 de la présente annexe, Pression de vapeur.

(14)

Pinsuwan S., Li A. and Yalkowsky S.H. (1995). Correlation of octanol/water solubility ratios and partition coefficients, J. Chem. Eng. Data. 40: 623-626.

(15)

Lyman W.J. (1990). Solubility in water. In: Handbook of Chemical Property Estimation Methods: Environmental Behavior of Organic Compounds, Lyman W.J., Reehl W.F., Rosenblatt D.H., Eds. American Chemical Society, Washington, DC, 2-1 to 2-52.

(16)

Leo A., Weininger D. (1989). Medchem Software Manual. Daylight Chemical Information Systems, Irvine, CA.

(17)

Meylan W. (1993). SRC-LOGKOW for Windows. SRC, Syracuse, N.Y.

(18)

Compudrug L (1992). ProLogP. Compudrug, Ltd, Budapest.

(19)

ACD. ACD logP; Advanced Chemistry Development: Toronto, Ontario M5H 3V9, Canada, 2001.

(20)

Lyman W.J. (1990). Octanol/water partition coefficient. In Lyman W.J., Reehl W.F., Rosenblatt D.H., eds, Handbook of chemical property estimation, American Chemical Society, Washington, DC.

(21)

Rekker R.F., de Kort H.M. (1979). The hydrophobic fragmental constant: An extension to a 1 000 data point set. Eur. J. Med. Chem. Chim. Ther. 14: 479-488.

(22)

Jübermann O. (1958). Houben-Weyl, ed, Methoden der Organischen Chemie: 386-390.

1.

La présente méthode d’essai est équivalente à la ligne directrice 403 (2009) de l’OCDE (1) pour les essais de produits chimiques. Une première ligne directrice 403 pour les essais de toxicité aiguë par inhalation a été adoptée en 1981. La présente méthode d’essai B.2 (équivalente à la ligne directrice 403 révisée a été conçue afin d’offrir une plus grande souplesse, de réduire l’utilisation d’animaux et de répondre aux exigences règlementaires. Elle décrit deux types d’études: un protocole traditionnel de détermination de la CL50 et un protocole “concentration × temps” (C × t). Les principales caractéristiques de cette ligne directrice tiennent au fait qu’elle permet d’obtenir une relation concentration-réponse pour les effets non létaux à létaux, afin d’en déduire une concentration létale médiane (CL50), une concentration seuil non létale (comme la CL01) et une pente, ainsi que de déterminer si un des sexes est plus sensible à la substance d’essai. Le protocole C × t est utilisé lorsque s’applique une réglementation particulière ou pour un besoin scientifique qui nécessite un essai sur des animaux pour plusieurs durées d’exposition différentes, par exemple à des fins d’aménagement du territoire ou de planification des interventions d’urgence: calcul des niveaux guides d’exposition aiguë, recommandations pour la planification des mesures d’urgence, niveaux seuil d’exposition aiguë, etc.

2.

On trouvera dans le document d’orientation no 39 sur les essais de toxicité aiguë par inhalation (document d’orientation 39) des indications sur la conduite et l’interprétation des études liées à la présente méthode d’essai (2).

3.

Le document d’orientation 39 (2) regroupe les définitions utilisées dans le contexte de la présente méthode d’essai.

4.

La présente méthode d’essai permet de caractériser les substances d’essai, de les soumettre à une évaluation quantitative des risques, et de classer conformément au règlement (CE) no 1272/2008 (3). Le document d’orientation 39 (2) fournit des indications sur le choix de la méthode d’essai appropriée pour les essais de toxicité aiguë. Lorsque seules sont requises des informations sur la classification et l’étiquetage, le chapitre B.52 de la présente annexe (4) est généralement recommandé [voir document d’orientation 39 (2)]. La méthode d’essai B.2 n’est pas spécifiquement destinée à tester des matériaux spéciaux comme les substances isométriques ou fibreuses faiblement solubles ou les nanomatériaux manufacturés.

5.

Avant d’entreprendre un essai conformément à la présente méthode d’essai, le laboratoire d’essai devra prendre en compte toutes les informations disponibles sur la substance d’essai, y compris les études existantes [par exemple, le chapitre B.52 de la présente annexe (4)] dont les résultats éviteraient des essais supplémentaires, afin de recourir le moins possible aux animaux. Parmi les informations utiles pour la détermination de l’espèce, de la souche, du sexe, du mode d’exposition et des concentrations d’essai appropriés, citons: l’identité, la structure chimique et les propriétés physico-chimiques de la substance d’essai, les résultats de tous les essais de toxicité in vitro ou in vivo auxquels elle a été soumise, son (ses) utilisation(s) escomptée(s) et les risques d’exposition humaine, les données (Q)SAR disponibles et les données toxicologiques sur les substances structurellement apparentées, voir document d’orientation 39 (2).

6.

Il convient d’éviter autant que possible de tester des substances corrosives et/ou irritantes à des concentrations susceptibles d’engendrer une souffrance sévère et/ou une détresse. Pour déterminer s’il est possible de renoncer à des essais complémentaires, le potentiel de corrosion/d’irritation fait l’objet d’une évaluation reposant sur un jugement d’expert basé sur les éléments suivants: données expérimentales sur l’homme et l’animal (provenant, par exemple, d’essais à doses répétées réalisés à des concentrations non corrosives ou irritantes), données in vitro existantes [par exemple chapitres B.40 (5), B.40 bis (6) de la présente annexe, ou ligne directrice 435 de l’OCDE (7)], valeurs du pH, informations concernant des substances analogues ou toute autre donnée pertinente. À des fins règlementaires spécifiques (par exemple pour l’établissement de plans d’urgence), la présente méthode d’essai peut être utilisée pour exposer des animaux à ces substances car elle donne au directeur de l’étude ou à l’investigateur principal la maîtrise du choix des concentrations cibles. Celles-ci ne doivent cependant pas induire d’effets corrosifs/irritants importants, mais elles sont suffisantes pour prolonger la courbe de concentration-réponse jusqu’à des niveaux correspondant à l’objectif scientifique et règlementaire de l’essai. Ces concentrations sont choisies au cas par cas et une justification du choix des concentrations est apportée, voir document d’orientation 39 (2).

7.

La présente méthode d’essai B.2 révisée doit en principe permettre d’obtenir des informations suffisantes sur la toxicité aiguë d’une substance d’essai pour procéder à son classement, et fournir les données sur sa létalité nécessaires aux évaluations quantitatives des risques (CL50, CL01 et pente, par exemple) pour l’un des sexes ou les deux. Cette méthode d’essai propose deux méthodes. La première suit un protocole traditionnel dans lequel des groupes d’animaux sont exposés à une concentration limite (essai limite) ou à une série de concentrations suivant un processus séquentiel pendant une durée prédéterminée de quatre heures en général. Des objectifs règlementaires spécifiques peuvent nécessiter de recourir à d’autres durées d’exposition. La seconde méthode suit un protocole “concentration x temps” (C × t) dans lequel des groupes d’animaux sont exposés à une concentration (concentration limite) ou à une série de concentrations différentes sur des durées différentes.

8.

Les animaux moribonds ou présentant des signes de souffrance manifeste ou de détresse sévère et persistante sont euthanasiés. Ils sont pris en compte dans l’interprétation des résultats de l’essai au même titre que ceux qui succombent au cours de l’essai. Le document d’orientation no 19 de l’OCDE sur les effets mesurés éthiquement acceptables détaille les critères orientant la décision d’euthanasier les animaux moribonds ou en grande souffrance, et aide à reconnaître une mort prévisible ou imminente (8).

9.

Le choix s’orientera vers de jeunes rongeurs en bonne santé, de souches communément utilisées en laboratoire. Le rat étant l’espèce la plus utilisée, il faudra justifier l’emploi d’autres espèces.

10.

Les femelles sont nullipares et non gravides. Le jour de leur exposition, les animaux sélectionnés sont de jeunes adultes âgés de 8 à 12 semaines. Leur poids corporel n’excède pas, pour chaque sexe, ± 20 % du poids moyen des animaux du même âge précédemment exposés. Sélectionnés au hasard, les animaux sont marqués pour être identifiés individuellement. En vue de leur acclimatation aux conditions de laboratoire, ils sont conservés dans leur cage pour une période d’au minimum 5 jours avant le début de l’essai. Les animaux sont également acclimatés aux appareils d’essai, pendant une courte période précédant l’essai, afin d’atténuer le stress causé par leur introduction dans un nouvel environnement.

11.

La température du local expérimental où les animaux sont conservés est de 22 ± 3 °C. Le taux d’humidité relative est idéalement maintenu entre 30 et 70 %, encore qu’il ne soit pas toujours possible de le faire si l’eau est utilisée comme véhicule. Avant et après exposition, les animaux sont généralement mis en cage en groupes par sexe et par concentration, mais le nombre d’animaux par cage ne doit pas faire obstacle à une observation précise de chaque animal, et ne doit engendrer qu’un minimum de pertes dues au cannibalisme et aux combats. Si les animaux sont exposés “nez seul”, il peut être nécessaire de les acclimater aux tubes de contention. Ceux-ci ne doivent pas provoquer chez les animaux de stress excessif, qu’il soit de nature physique, thermique ou dû à leur immobilisation. Les contraintes qu’ils subissent peuvent en effet modifier les paramètres physiologiques mesurés de l’animal, comme sa température corporelle (hyperthermie) et/ou son volume respiratoire par minute. Si l’on dispose de données génériques montrant que de telles modifications ne se produisent pas de façon appréciable, alors la période d’adaptation préalable aux tubes de contention n’est pas nécessaire. Les animaux exposés “corps entier” à un aérosol sont enfermés individuellement pendant l’exposition pour empêcher la filtration de l’aérosol d’essai par la fourrure des congénères. À l’exception des périodes d’exposition, le régime alimentaire des animaux est le régime classique et certifié de laboratoire, avec eau potable à satiété. L’éclairage est artificiel, la séquence d’éclairage étant de 12 heures de clarté et 12 heures d’obscurité.

12.

Le choix de la chambre d’inhalation prend en compte la nature de la substance d’essai et l’objet de l’essai. Le mode d’exposition “nez seul” (qui inclut les dispositifs “tête seule”, “nez seul” et “museau seul”) est privilégié. Le mode d’exposition “nez seul” est généralement choisi pour les études d’aérosols liquides ou solides et pour les vapeurs susceptibles de se condenser en aérosols. L’utilisation d’un mode d’exposition “corps entier” peut être préférable pour les besoins spécifiques de l’étude, mais cela est alors justifié dans le rapport d’étude. Pour assurer la stabilité de l’atmosphère d’une chambre d’exposition “corps entier”, on veille à ce que le volume total des animaux d’expérience ne dépasse pas 5 % du volume de la chambre. Le document d’orientation 39 (2) décrit les principes des techniques d’exposition “corps entier” ou “nez seul”, ainsi que leurs avantages et inconvénients spécifiques.

13.

Les expositions “nez seul” peuvent durer jusqu’à 6 heures pour les rats. Pour les souris, les expositions “nez seul” ne dépassent pas 4 heures en général. Si des essais d’une durée plus longue sont nécessaires, une justification est apportée, voir document d’orientation 39 (2). Les animaux exposés “corps entier” à des aérosols demeurent seuls dans la chambre afin d’éviter l’ingestion de la substance d’essai par le toilettage de leurs compagnons. Les animaux sont privés de nourriture pendant la période d’exposition. Dans une exposition “corps entier”, les animaux peuvent boire de l’eau.

14.

Les animaux sont exposés à la substance d’essai présentée sous forme de gaz, de vapeur, d’aérosol ou sous une forme mixte. L’état physique à tester dépend des propriétés physico-chimiques de la substance, de la concentration choisie, et/ou de la forme physique sous laquelle il est le plus probable qu’elle se présente lors de sa manipulation et de son utilisation. Les substances d’essai chimiquement réactives ou hygroscopiques sont testées sous air sec. On prendra soin d’éviter les concentrations susceptibles de provoquer une explosion.

15.

Une mesure de la taille des particules est réalisée pour tous les aérosols et les vapeurs susceptibles de se condenser pour former des aérosols. Pour que toutes les régions pertinentes de l’appareil respiratoire soient exposées, il est recommandé d’utiliser des aérosols dont le diamètre aérodynamique médian de masse (DAMM) se situe entre 1 et 4 μm, avec un écart type géométrique (σg) compris entre 1,5 et 3,0 (2) (9) (10). Un effort raisonnable est fourni pour remplir ces conditions, mais si tel n’est pas le cas, un jugement d’expert est nécessaire. Par exemple, les particules des fumées métalliques peuvent avoir une taille inférieure à cette norme, tandis que les particules chargées, les fibres et les substances hygroscopiques (dont la taille augmente dans l’environnement humide de l’appareil respiratoire) peuvent avoir une taille supérieure.

16.

Pour atteindre la concentration et la taille granulométrique appropriées de la substance d’essai, il est possible d’avoir recours à un véhicule; en règle générale, l’eau est choisie de préférence. Les substances particulaires peuvent être soumises à des procédés mécaniques afin d’atteindre la répartition granulométrique requise, mais un soin particulier devra être pris de ne pas décomposer ou altérer la substance d’essai. Lorsque les procédés mécaniques sont suspectés d’avoir altéré la composition de la substance d’essai (température extrême due aux frictions d’un broyage excessif, par exemple), la composition de la substance d’essai devra être vérifiée analytiquement. On prendra soin de ne pas contaminer la substance d’essai. Il n’est pas nécessaire de tester les substances granulaires non friables qui sont élaborées précisément pour ne pas être inhalables. Un test d’usure de surface est réalisé pour démontrer que la manipulation de la substance granulaire ne produit pas de particules respirables. Dans le cas contraire, un essai de toxicité par inhalation est réalisé.

17.

Un groupe témoin négatif (air) n’est pas nécessaire. Lorsqu’un véhicule autre que l’eau est utilisé pour produire l’atmosphère d’essai, un groupe témoin du véhicule est utilisé seulement quand on ne dispose pas de données historiques sur la toxicité. Si aucune toxicité n’a été détectée lors de l’étude d’une substance d’essai préparée dans un véhicule, ce dernier est considéré comme non toxique à la concentration testée; il n’y a donc pas lieu d’utiliser de témoin du véhicule.

18.

Le débit d’air dans la chambre est contrôlé avec soin, surveillé en continu et enregistré au moins toutes les heures pendant chaque exposition. Le suivi de la concentration de l’atmosphère d’essai (ou stabilité temporelle) constitue une mesure complète de tous les paramètres dynamiques et fournit un moyen indirect de contrôler tous les paramètres dynamiques pertinents de production de l’atmosphère d’essai. On prendra particulièrement soin d’éviter toute re-respiration dans les chambres d’exposition “nez seul” lorsque le débit d’air à travers le système d’exposition ne permet pas de produire une circulation dynamique de l’atmosphère contenant la substance d’essai. Des méthodologies sont prévues pour démontrer l’absence de re-respiration dans les conditions expérimentales choisies (2) (11). La concentration d’oxygène est d’au moins 19 % et celle de dioxyde de carbone ne dépasse pas 1 %. Si ces conditions ne peuvent être respectées, les concentrations d’oxygène et de dioxyde de carbone sont mesurées.

19.

La température de la chambre d’exposition est maintenue à 22 ± 3 °C. Dans les cas d’exposition “nez seul” et “corps entier” l’humidité relative dans la zone où respire l’animal est surveillée et enregistrée trois fois au minimum pour les durées allant jusqu’à 4 heures, et toutes les heures pour des durées plus courtes. L’humidité relative est de préférence comprise entre 30 et 70 %. Il est possible que ce taux ne puisse être atteint (par exemple lorsque la substance d’essai se présente sous forme de solution aqueuse), ou qu’il ne puisse être mesuré en raison d’interférences de la substance d’essai avec la méthode d’essai.

20.

Dans la mesure du possible, la concentration nominale dans la chambre d’exposition est calculée et enregistrée. La concentration nominale est la masse de la substance d’essai divisée par le volume d’air total qui passe dans le circuit de la chambre d’inhalation. La concentration nominale ne sert pas à caractériser l’exposition des animaux, mais une comparaison de la concentration nominale avec la concentration réelle donne une indication de la capacité de production du système d’essai, et peut donc permettre de mettre en évidence des problèmes de production.

21.

La concentration réelle est la concentration de la substance d’essai dans la zone de la chambre d’inhalation où les animaux respirent. Les concentrations réelles peuvent être obtenues par des méthodes spécifiques (par exemple, échantillonnage direct, méthodes d’adsorption ou de réaction chimique, et caractérisation analytique ultérieure) ou par des méthodes non spécifiques comme la gravimétrie sur filtre. Le recours à l’analyse gravimétrique n’est acceptable que pour des aérosols ne contenant qu’un seul composant en poudre ou pour des aérosols de liquides peu volatils, et des caractérisations spécifiques à la substance d’essai sont également effectuées par une préétude appropriée. Il est aussi possible d’avoir recours à la gravimétrie pour déterminer la concentration d’un aérosol contenant plusieurs composants en poudre, mais des données analytiques sont alors nécessaires, afin de démontrer que la composition du produit en suspension dans l’air est analogue à celle du produit de départ. Faute de cette information, il peut s’avérer nécessaire de soumettre la substance d’essai (idéalement en suspension dans l’air) à une nouvelle analyse à intervalles réguliers tout au long de l’étude. Pour des agents aérosolisés susceptibles de s’évaporer ou de se sublimer, il faut démontrer que toutes les phases ont été recueillies selon la méthode choisie. Les concentrations cibles, nominales et réelles sont fournies dans le rapport d’étude, mais seules les concentrations réelles sont utilisées dans les analyses statistiques pour calculer la valeur des concentrations létales.

22.

Un seul lot de la substance d’essai est utilisé, si possible, et l’échantillon est conservé dans des conditions préservant sa pureté, son homogénéité et sa stabilité. Avant le début de l’étude, il convient de réaliser une caractérisation de la substance d’essai afin de déterminer sa pureté et, si cela est techniquement possible, son identité et les quantités de contaminants et d’impuretés identifiés. Pour cela, on pourra recueillir les données suivantes: temps de rétention et surface relative du pic, poids moléculaire obtenu par spectroscopie de masse ou chromatographie en phase gazeuse, ou autres estimations. Bien que le laboratoire d’essai ne soit pas responsable de l’identification de la substance d’essai, il peut, par prudence, confirmer au moins une partie des caractéristiques fournies par le donneur d’ordre (couleur, nature physique, etc.).

23.

L’atmosphère d’exposition est maintenue aussi constante que possible et suivie soit en continu, soit de façon intermittente suivant la méthode d’analyse. Lorsque l’injection s’effectue de façon intermittente, les échantillons d’atmosphère de la chambre sont prélevés au moins deux fois sur une étude de quatre heures. En cas d’impossibilité en raison de débits d’air limités ou de faibles concentrations, le recueil d’un échantillon pour toute la période d’exposition est acceptable. Si des fluctuations nettes apparaissent d’un échantillon à un autre, on a recours à quatre échantillons par exposition pour les concentrations d’essai suivantes. Les écarts entre la concentration dans chaque chambre et la concentration moyenne n’excèdent pas ± 10 % pour les gaz et vapeurs ou ± 20 % pour les aérosols liquides ou solides. Il convient de calculer et de noter le temps d’équilibre dans la chambre d’exposition (t95). La durée d’une exposition couvre le temps de production de la substance d’essai, y compris le temps nécessaire pour l’égalisation des concentrations dans la chambre d’exposition t95. Des indications pour l’estimation de t95 sont fournies dans le document d’orientation 39 (2).

24.

Pour des systèmes très complexes constitués de gaz ou vapeurs et d’aérosols (atmosphères de combustion ou substances d’essai propulsées à partir de produits/dispositifs spécialisés, par exemple), chaque phase peut se comporter différemment dans la chambre d’inhalation. Pour chacune des phases (gaz ou vapeur et aérosol), on choisit donc au moins une substance indicatrice (analyte), en général la substance active principale dans le mélange. Quand la substance d’essai est un mélange, la concentration analytique devra être indiquée pour le mélange et pas uniquement pour la substance active ou le composant (analyte). Pour plus d’informations sur les concentrations réelles, se reporter au document d’orientation 39 (2).

25.

La répartition granulométrique des aérosols est déterminée au minimum deux fois pour chaque exposition de 4 heures à l’aide d’un impacteur en cascade ou d’un autre instrument, comme un spectromètre de mesure de la taille des particules aérodynamiques. Si les résultats obtenus avec l’impacteur en cascade et l’autre instrument se révèlent équivalents, ce dernier peut être utilisé tout au long de l’étude. Pour confirmer la capacité de recueil des particules de l’outil principal, un second instrument devra être utilisé en parallèle, par exemple un filtre gravimétrique ou un barboteur à gaz/impacteur. La concentration massique obtenue par l’analyse granulométrique se rapproche, dans des limites raisonnables, de celle obtenue par l’analyse sur filtre, voir document d’orientation 39 (2). Si cette équivalence est établie au début de la phase d’étude, il n’est pas nécessaire d’effectuer des mesures de confirmation dans la suite de l’étude. Pour le bien-être des animaux, il convient de réduire au minimum les données douteuses qui nécessiteraient de répéter une exposition. Une répartition granulométrique est effectuée dans le cas des vapeurs, s’il est possible qu’une condensation de la vapeur conduise à la formation d’un aérosol, ou si des particules sont détectées dans une atmosphère de vapeur susceptible de présenter des phases mixtes (voir paragraphe 15).

26.

Les deux types d’études décrits ci-dessous sont le protocole traditionnel et le protocole C × t. Tous deux peuvent comprendre une étude préliminaire, une étude principale et/ou un essai limite (protocole traditionnel) ou un essai à une concentration limite (C × t). Si l’un des sexes est connu pour être plus sensible à la substance d’essai, le directeur de l’étude peut choisir de réaliser ces essais avec seulement des animaux de ce sexe. Si des espèces de rongeurs autres que le rat sont exposées “nez seul”, il est possible d’ajuster la durée maximale d’exposition en fonction du stress propre à ces espèces. Avant le début de l’étude, toutes les données disponibles sont examinées afin de réduire l’usage des animaux. Par exemple, les données obtenues selon le chapitre B.52 de la présente annexe (4) peuvent supprimer la nécessité d’une étude préliminaire et aussi démontrer si l’un des sexes est plus sensible à la substance d’essai, voir document d’orientation 39 (2).

27.

Dans une étude traditionnelle, des groupes d’animaux sont exposés à une substance d’essai pendant une période de temps fixée (généralement 4 heures) dans une chambre d’exposition “nez seul” ou “corps entier”. Les animaux sont exposés soit à une concentration limite (essai limite), soit à trois concentrations au minimum selon une procédure séquentielle (étude principale). Une étude préliminaire peut précéder l’étude principale, sauf s’il existe déjà des informations concernant la substance d’essai, provenant par exemple d’une étude précédente effectuée selon l’étude B.52, voir document d’orientation 39 (2).

28.

Une étude préliminaire permet d’estimer l’activité de la substance d’essai, d’identifier des différences entre les sexes quant à la sensibilité à cette substance, et de choisir plus facilement les niveaux de concentration pour l’étude principale ou l’essai limite. Lors du choix des niveaux de concentration pour l’étude préliminaire, toutes les informations disponibles sont prises en compte, y compris les données (Q)SAR et les données correspondant à des produits chimiques analogues. Pour chaque concentration, on exposera au maximum trois mâles et trois femelles (il peut être nécessaire d’utiliser 3 animaux par sexe pour établir une différence de sensibilité entre les sexes). Une étude préliminaire peut être effectuée avec une seule concentration, ou plusieurs si nécessaire. Elle ne porte pas sur un nombre d’animaux ou de concentrations tel qu’elle ressemblerait à une étude principale. Il est possible d’utiliser les résultats d’une étude B.52 (4) précédente au lieu de réaliser une étude préliminaire, voir document d’orientation 39 (2).

29.

L’essai limite est utilisé si l’on sait ou si l’on prévoit que la substance d’essai sera virtuellement non toxique, c'est-à-dire qu’elle ne suscitera une réponse de toxicité qu’au-delà de la concentration limite réglementaire. Dans un essai limite, un seul groupe de trois mâles et trois femelles est exposé à la substance d’essai à une concentration limite. Des informations sur la toxicité de la substance d’essai peuvent être tirées d’essais déjà pratiqués sur des substances analogues, en tenant compte de l’identité et du pourcentage des composants dont la toxicité est avérée. Si l’on manque d’informations sur la toxicité de la substance d’essai, ou si l’on s’attend à ce qu’elle soit toxique, l’essai principal est réalisé.

30.

Le choix des concentrations limites dépend généralement des exigences règlementaires. Lorsqu’on applique le règlement (CE) no 1272/2008, les concentrations limites pour les gaz, les vapeurs et les aérosols sont respectivement de 20 000 ppm, 20 mg/l et 5 mg/l (ou, à défaut, la concentration maximale pouvant être atteinte) (3). Il peut s’avérer techniquement difficile d’atteindre les concentrations limites de certaines substances d’essai, en particulier pour les vapeurs et les aérosols. Pour les essais d’aérosols, le principal objectif est d’atteindre une taille de particule qui soit respirable (c’est-à-dire d’un DAMM de 1 à 4 μm), ce qui est possible avec la plupart des substances d’essai à des concentrations de 2 mg/l. Les essais sur des aérosols à des concentrations supérieures à 2 mg/l ne sont tentés que si l’on peut obtenir des particules de taille respirable, voir document d’orientation 39 (2). Selon le règlement (CE) no 1272/2008, il est déconseillé de réaliser des essais au-delà des concentrations limites pour des raisons de bien-être des animaux (3). Les essais aux concentrations limites ne sont envisagés que s’il est très probable que leurs résultats présenteront un intérêt direct pour la protection de la santé humaine (3), et une justification est fournie dans le rapport d’étude. En cas de substance potentiellement explosive, on prendra soin d’éviter les conditions susceptibles de provoquer une explosion. Afin d’éviter le recours inutile à des animaux, un essai sans animaux est effectué avant l’essai limite pour s’assurer qu’il est possible d’atteindre dans la chambre les conditions expérimentales d’un essai limite.

31.

Si une mortalité ou un état moribond sont observés à la concentration limite, les résultats de l’essai limite peuvent servir d’étude préliminaire pour les essais suivants à d’autres concentrations (voir étude principale). Si la concentration limite est impossible à atteindre du fait des propriétés physiques ou chimiques de la substance d’essai, c’est la concentration maximale pouvant être atteinte qui devra être testée. Si la létalité à cette concentration est inférieure à 50 %, il n’y a pas lieu de poursuivre l’essai. Si la concentration limite n’a pas pu être atteinte, une explication, étayée par des données, est fournie dans le rapport d’étude. Si la concentration maximale pouvant être atteinte pour une vapeur ne provoque pas de toxicité, il peut être nécessaire de produire la substance d’essai sous la forme d’un aérosol liquide.

32.

Une étude principale fait en général appel à cinq mâles et cinq femelles (ou cinq animaux du sexe le plus sensible, s’il est connu) par niveau de concentration, avec au minimum trois niveaux de concentration. Les niveaux de concentration sont suffisamment nombreux pour que l’on puisse obtenir une analyse statistique fiable. L’intervalle de temps entre l’exposition des différents groupes est déterminé par le moment d’apparition, la durée et la gravité des signes de toxicité observés. L’exposition au niveau de concentration supérieur est retardée jusqu’à ce que l’on soit raisonnablement sûr que les animaux précédemment soumis au traitement ont survécu. Le directeur de l’étude peut alors ajuster la concentration cible pour le groupe suivant. Pour les essais de toxicité par inhalation, qui nécessitent des technologies sophistiquées, il ne sera pas toujours possible de procéder ainsi, c’est pourquoi l’exposition des animaux à la concentration supérieure devra se baser sur l’expérience acquise et un jugement scientifique. Pour les essais portant sur des mélanges, il convient de se référer au document d’orientation 39 (2).

33.

Une étude séquentielle “concentration × temps” (C × t) peut constituer une alternative au protocole traditionnel lorsqu’il s’agit d’évaluer la toxicité par inhalation (12) (13) (14). Avec cette approche, les animaux sont exposés à la substance d’essai à plusieurs niveaux de concentration et pour des durées d’exposition variables. Tous les essais sont réalisés dans des chambres d’exposition “nez seul”, les chambres “corps entier” ne se prêtant pas à ce protocole. Un exemple de procédure séquentielle illustrant ce protocole est présenté à l’appendice 1. Une analyse de simulation a montré que le protocole traditionnel et le protocole C × t étaient tous les deux capables de donner des valeurs fiables de la CL50, mais que le protocole C × t permettait en général d’obtenir des valeurs plus sûres pour la CL01 et la CL10 (15).

34.

Une analyse de simulation a démontré qu’il convient généralement d’utiliser deux animaux par intervalle de C × t (un animal de chaque sexe ou deux animaux du sexe le plus sensible) pour tester 4 concentrations et 5 durées d’exposition lors de l’étude principale. Le directeur de l’étude peut choisir, dans certaines circonstances, d’utiliser deux rats de chaque sexe par intervalle de C × t (15), de manière à réduire le biais et la variabilité des estimations, augmenter le taux de succès de l’estimation et améliorer la couverture de l’intervalle de confiance. Cependant, en cas d’ajustement insuffisant aux données (en utilisant un animal par sexe ou deux animaux du sexe le plus sensible), une cinquième concentration d’exposition peut également suffire. Pour plus d’informations sur le nombre d’animaux et les concentrations à utiliser pour une étude C × t, se reporter au document d’orientation 39 (2).

35.

Une étude préliminaire permet d’estimer l’activité de la substance d’essai et facilite le choix des niveaux de concentration pour l’étude principale. Une étude préliminaire avec au maximum trois animaux par sexe et par concentration (pour plus de détails, voir l’appendice III du document d’orientation 39) (2) peut être utilisée afin de sélectionner une concentration de départ appropriée pour l’étude principale et de réduire le nombre d’animaux utilisés. Il peut en effet être nécessaire de recourir à trois animaux par sexe pour établir une différence selon le sexe. Ces animaux sont soumis à une exposition unique, d’une durée de 240 minutes en général. Pour évaluer la faisabilité de la production d’atmosphères d’essai appropriées, des essais techniques préliminaires sans animaux sont réalisés. Il n’est généralement pas nécessaire de procéder à une étude préliminaire si l’on dispose de données de mortalité provenant d’une étude effectuée suivant la méthode B.52 (4). Pour choisir la concentration cible initiale dans une étude B.2, le directeur de l’étude tient compte des profils de mortalité observés dans n’importe quelle étude B.52 (4) disponible, pour les deux sexes et pour toutes les concentrations testées, voir document d’orientation 39 (2).

36.

La concentration initiale (Session d’exposition I) (voir appendice 1) est soit une concentration limite, soit une concentration choisie par le directeur de l’étude sur la base d’une étude préliminaire. Des groupes constitués d’un animal de chaque sexe sont exposés à cette concentration pendant des périodes de durée variable (15, 30, 60, 120 ou 240 minutes, par exemple), soit un total de 10 animaux, pour ce qu’on appelle la Session d’exposition I (voir appendice 1).

37.

Le choix des concentrations limites dépend généralement des exigences règlementaires. Lorsqu’on applique le règlement (CE) no 1272/2008, les concentrations limites pour les gaz, les vapeurs et les aérosols sont respectivement de 20 000 ppm, 20 mg/l et 5 mg/l (ou, à défaut, la concentration maximale pouvant être atteinte) (3). Il peut s’avérer techniquement difficile d’atteindre les concentrations limites de certaines substances d’essai, en particulier pour les vapeurs et les aérosols. Pour les essais d’aérosols, l’objectif est d’atteindre une taille de particule qui soit respirable (c’est-à- dire un DAMM de 1 à 4 μm), ce qui est possible avec la plupart des substances d’essai à des concentrations de 2 mg/l. Les essais sur des aérosols à des concentrations supérieures à 2 mg/l ne sont tentés que si l’on peut obtenir des particules de taille respirable, voir document d’orientation 39 (2). Selon le règlement (CE) no 1272/2008, il est déconseillé de réaliser des essais au-delà des concentrations limites pour des raisons de bien-être des animaux (3). Les essais au-delà de la concentration limite ne sont envisagés que s’il est très probable que leurs résultats présenteront un intérêt direct pour la protection de la santé humaine (3), et une justification est alors fournie dans le rapport d’étude. En cas de substance potentiellement explosive, on prendra soin d’éviter les conditions susceptibles de provoquer une explosion. Afin d’éviter le recours inutile à des animaux, un essai sans animaux est effectué avant l’essai à la concentration initiale pour s’assurer qu’il est possible d’atteindre dans la chambre les conditions expérimentales d’un essai à cette concentration.

38.

Si une mortalité ou un état moribond sont observés à la concentration initiale, les résultats obtenus à cette concentration peuvent servir de point de départ pour les essais suivants à d’autres concentrations (voir étude principale). Si la concentration limite est impossible à atteindre du fait des propriétés physiques ou chimiques de la substance d’essai, c’est la concentration maximale pouvant être atteinte qui est testée. Si la létalité à cette concentration est inférieure à 50 %, il n’y a pas lieu de poursuivre l’essai. Si la concentration limite n’a pas pu être atteinte, une explication, étayée par des données, est fournie dans le rapport d’étude. Si la concentration maximale pouvant être atteinte pour une vapeur ne provoque pas de toxicité, il peut être nécessaire de produire la substance d’essai sous la forme d’un aérosol liquide.

39.

La concentration initiale (session d’exposition I) (voir appendice 1) testée dans l’étude principale est soit une concentration limite, soit une concentration choisie par le directeur de l’étude sur la base d’une étude préliminaire. Si une mortalité a été observée pendant ou après la session I, l’exposition minimale (C × t) qui a provoqué la mortalité sert de guide pour déterminer la concentration et les périodes d’exposition pour la session II. Chaque session d’exposition suivante dépendra de la session précédente (voir appendice 1).

40.

Pour de nombreuses substances d’essai, les résultats obtenus à la concentration initiale, plus ceux obtenus lors de trois sessions d’exposition supplémentaires sur une échelle de temps plus courte (la durée des périodes d’exposition successives suivant une progression géométrique de facteur √2), sont suffisants pour établir la relation de mortalité C × t (15). Nonobstant, il peut être utile de recourir à une cinquième concentration d’exposition [voir appendice 1 et document d’orientation 39 (2)]. Pour le traitement mathématique des résultats concernant le protocole C × t, voir appendice 1.

41.

Un examen clinique des animaux est pratiqué régulièrement pendant la période d’exposition. Après l’exposition, des examens cliniques sont réalisés au minimum deux fois le jour de l’exposition, ou plus fréquemment suivant la réponse des animaux au traitement, et au minimum une fois par jour par la suite pendant une période de 14 jours. La durée de la période d’observation n’est pas fixée, mais est déterminée par la nature et le moment d’apparition des signes cliniques, ainsi que par la durée de la période de récupération. Les moments d’apparition et de disparition des signes de toxicité sont importants, en particulier quand on constate un certain retard dans l’apparition de ces signes. Toutes les observations sont systématiquement enregistrées individuellement pour chaque animal. Les animaux moribonds ou présentant des signes de souffrance manifeste ou de détresse sévère et persistante sont euthanasiés pour des raisons de bien-être animal. Lors de l’examen clinique des signes de toxicité, il convient de veiller à ne pas confondre une piètre apparence initiale et des troubles respiratoires passagers, imputables à la procédure d’exposition, avec une toxicité de la substance d’essai qui impliquerait d’euthanasier les animaux plus tôt. Les principes et critères résumés dans le document d’orientation sur les effets mesurés éthiquement acceptables sont pris en considération, voir document d’orientation 19 (7). Quand des animaux sont retrouvés morts ou sont euthanasiés, l’heure de la mort est consignée le plus précisément possible.

42.

Les observations quotidiennes portent notamment sur les modifications de la peau et des poils, des yeux et des muqueuses, mais aussi sur les changements affectant l’appareil respiratoire, le système circulatoire, les systèmes nerveux autonome et central, ainsi que l’activité somatomotrice et le comportement. Toute différentiation entre les effets locaux et systémiques est consignée autant que possible. Les tremblements, les convulsions, la salivation, les diarrhées, la léthargie, le sommeil et le coma doivent retenir l’attention. La mesure de la température rectale peut aider à mettre en évidence une bradypnée réflexe ou une hypo/hyperthermie liée au traitement ou au confinement.

43.

Le poids corporel de chacun des animaux est enregistré une fois lors de la période d’acclimatation, le jour de l’exposition (jour 0) juste avant celle-ci et au moins les jours 1, 3, et 7 (puis de façon hebdomadaire par la suite), ainsi qu’au moment de la mort ou de l’euthanasie, s’il est postérieur au jour 1. Le poids corporel est un indicateur critique reconnu de la toxicité, on surveille donc attentivement les animaux, dont le poids reste constamment inférieur de 20 %, ou plus à celui précédant l’étude. Les animaux survivants sont pesés et euthanasiés à la fin de la période postexposition.

44.

Tous les animaux d’expérience, y compris ceux morts au cours de l’essai ou euthanasiés et écartés de l’étude pour des raisons de bien-être animal, subissent une autopsie macroscopique. Lorsqu’un animal est découvert mort et que son autopsie n’est pas réalisable immédiatement, l’animal est réfrigéré (mais non congelé) à une température suffisamment basse pour minimiser l’autolyse. Les autopsies sont réalisées le plus tôt possible, en général dans un délai d’un à deux jours. Tous les changements macropathologiques sont enregistrés pour chaque animal en prêtant particulièrement attention aux voies respiratoires.

45.

D’autres observations, ajoutées a priori à dessein, peuvent être envisagées afin d’élargir l’interprétation de l’étude, comme la mesure du poids pulmonaire des rats survivants et/ou la mise en évidence d’une irritation par examen de l’appareil respiratoire au microscope. Peuvent aussi être examinés les organes montrant une pathologie macroscopique chez les animaux survivant au moins 24 heures, et ceux pour lesquels une réaction au traitement est connue ou attendue. Un examen microscopique de l’intégralité de l’appareil respiratoire peut fournir des informations utiles pour les substances d’essai réactives à l’eau, comme les acides et les substances hygroscopiques.

46.

Pour chacun des animaux, le poids corporel et les conclusions de l’autopsie sont fournis. Les résultats des observations cliniques sont résumés sous la forme de tableaux et indiquer pour chaque groupe d’essai: le nombre d’animaux utilisés, le nombre d’animaux présentant des signes spécifiques de toxicité, le nombre d’animaux retrouvés morts au cours de l’essai ou euthanasiés, l’heure de la mort de chacun des animaux, la description et l’évolution dans le temps des effets toxiques ainsi que leur réversibilité, et les conclusions de l’autopsie.

47.

Le rapport d’essai contient, s’il y a lieu, les renseignements suivants:

(1)

OCDE (2009). Toxicité aiguë par inhalation. Ligne directrice de l’OCDE pour les essais de produits chimique no 403, OCDE Paris. Disponible sur l'internet (http://www.oecd.org/env/testguidelines).

(2)

OCDE (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing. Publications Hygiène et Sécurité de l’environnement – Série sur les essais et évaluations no 39, Paris. Disponible sur l'internet (http://www.oecd.org/env/testguidelines).

(3)

Règlement (CE) no 1272/2008 du Parlement européen et du Conseil du 16 décembre 2008 relatif à la classification, à l’étiquetage et à l’emballage des substances et des mélanges, modifiant et abrogeant les directives 67/548/CEE et 1999/45/CE et modifiant le règlement (CE) no 1907/2006 (JO L 353 du 31.12.2008, p. 1).

(4)

Chapitre B.52 de la présente annexe, Toxicité aiguë par inhalation – Méthode par classe de toxicité aiguë (ATC).

(5)

Chapitre B.40 de la présente annexe, Corrosion cutanée in vitro: Essai de résistance électrique transcutanée (RET).

(6)

Chapter B.40 bis de la présente annexe, Corrosion cutanée in vitro: Essai sur modèle de peau humaine.

(7)

OCDE (2005). Méthode d’essai in vitro sur membrane d’étanchéité pour la corrosion cutanée. Ligne directrice de l’OCDE pour les essais de produits chimiques no 435, OCDE, Paris. Disponible sur l'internet (http://www.oecd.org/env/testguidelines).

(8)

OCDE (2000), Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Évaluation. Publications Hygiène et Sécurité de l’environnement – Série sur les essais et évaluations no 19, OCDE, Paris. Disponible sur l'internet (http://www.oecd.org/env/testguidelines).

(9)

SOT (1992). Technical Committee of the Inhalation Specialty Section, Society of Toxicology (SOT). Recommendations for the Conduct of Acute Inhalation Limit Tests. Fund. Appl. Toxicol. 18: 321-327.

(10)

Phalen RF (2009). Inhalation Studies: Foundations and Techniques. (2nd Edition) Informa Healthcare, New York.

(11)

Pauluhn J. and Thiel A. (2007). A Simple Approach to Validation of Directed-Flow Nose-Only Inhalation Chambers. J. Appl. Toxicol. 27: 160-167.

(12)

Zwart J.H.E., Arts J.M., ten Berge W.F., Appelman L.M. (1992). Alternative Acute Inhalation Toxicity Testing by Determination of the Concentration-Time-Mortality Relationship: Experimental Comparison with Standard LC50 Testing. Reg. Toxicol. Pharmacol. 15: 278-290.

(13)

Zwart J.H.E., Arts J.M., Klokman-Houweling E.D., Schoen E.D. (1990). Determination of Concentration-Time-Mortality Relationships to Replace LC50 Values. Inhal. Toxicol. 2: 105-117.

(14)

Ten Berge W.F. and Zwart A. (1989). More Efficient Use of Animals in Acute Inhalation Toxicity Testing. J. Haz. Mat. 21: 65-71.

(15)

OCDE (2009), Performance Assessment: Comparison of 403 and C × t Protocols via Simulation and for Selected Real Data Sets. Publications Hygiène et Sécurité de l’environnement - Série sur les essais et évaluations no 104, OCDE, Paris. Disponible sur l'internet (http://www.oecd.org/env/testguidelines).

(16)

Finney D.J. (1977). Probit Analysis, 3rd ed. Cambridge University Press, London/New York.

1.

La présente méthode d’essai est équivalente à la ligne directrice 407 (2008) de l’OCDE pour les essais de produits chimiques. La ligne directrice 407 originale avait été adoptée en 1981. Des modifications y ont été apportées en 1995 afin de tirer davantage d’informations des animaux utilisés dans l’étude, en particulier en matière de neurotoxicité et d’immunotoxicité.

2.

L’OCDE a lancé en 1998 une activité prioritaire destinée à réviser les lignes directrices existantes et à en élaborer de nouvelles pour les essais et le dépistage des perturbateurs endocriniens (8). L’un des objectifs était de mettre à jour la ligne directrice de l’OCDE relative à l’“étude de toxicité orale à dose répétée pendant 28 jours sur les rongeurs” (407), en y introduisant des paramètres capables de détecter l’activité endocrinienne des substances d’essai. Le protocole a alors fait l’objet d’un programme international approfondi chargé d’évaluer la pertinence et la praticabilité de ces paramètres additionnels, leur performance pour des produits chimiques à activité (anti)œstrogénique, (anti)androgénique et (anti)thyroïdienne, leur reproductibilité intra- et inter-laboratoires et leur interférence avec les paramètres requis par la version antérieure de la ligne directrice. Les très nombreuses données ainsi recueillies ont été rassemblées et évaluées en détail dans un rapport très complet de l’OCDE (9). La présente mise à jour de la méthode B.7 est le fruit de l’expérience et des résultats accumulés durant le programme international d’essais. Elle permet de mettre certains effets à médiation endocrinienne en perspective avec d’autres effets toxicologiques.

3.

Lors de l’appréciation et de l’évaluation des caractéristiques toxiques d’un produit chimique, la détermination de la toxicité orale à doses répétées peut s’effectuer après avoir obtenu des informations préliminaires sur la toxicité à partir d’essais de toxicité aiguë. La présente méthode d’essai vise à étudier les effets toxiques des produits chimiques sur un large spectre de cibles de toxicité. Elle fournit des informations sur les risques pour la santé que peut entraîner une exposition répétée durant une période de temps relativement limitée, notamment pour le système nerveux, le système immunitaire et le système endocrinien. Concernant ces critères d’effet précis, elle devrait permettre d’identifier des produits chimiques potentiellement neurotoxiques, pouvant justifier des études plus approfondies de cet aspect, etdes produits chimiques qui interfèrent avec la physiologie de la thyroïde. Elle pourrait également fournir des données sur les produits chimiques qui affectent les organes reproducteurs mâles et/ou femelles des jeunes animaux adultes et donner des indications sur leurs effets immunologiques.

4.

Les résultats de la présente méthode d’essai B.7 devraient servir à l’identification des dangers et à l’évaluation des risques. Les résultats obtenus concernant les paramètres endocriniens devraient être interprétés à la lumière du “Cadre conceptuel de l’OCDE pour les essais et l’évaluation des produits chimiques perturbant le système endocrinien” (11). La méthode prévoit une étude basique de toxicité à dose répétée, pouvant être utilisée sur les produits chimiques pour lesquels une étude de 90 jours n’est pas justifiée (par exemple quand le volume de production ne dépasse pas certaines limites) ou préalablement à une étude à long terme. La durée d’exposition doit être de 28 jours.

5.

Le programme international mené afin de valider les paramètres susceptibles de détecter l’activité endocrinienne d’une substance d’essai a montré que la qualité des données obtenues grâce à cette méthode d’essai B.7 dépendra beaucoup de l’expérience du laboratoire pratiquant les essais. Ce constat concerne spécifiquement la détermination histopathologique de changements cycliques dans les organes reproducteurs femelles et la détermination du poids des petits organes hormono-dépendants, difficiles à disséquer. Un document d’orientation a été élaboré en matière d’histopathologie (19). Il est disponible sur le site de l’OCDE à la rubrique consacrée aux lignes directrices pour les essais de produits chimiques. Il vise à aider les pathologistes dans leurs investigations et à améliorer la sensibilité des essais. Un certain nombre de paramètres ont été identifiés comme indicateurs de toxicité endocrinienne et ont été ajoutés à la méthode d’essai. D’autres, dont l’utilité n’a pu être prouvée faute de données suffisantes ou dont la capacité à détecter les perturbateurs endocriniens a été insuffisamment démontrée par le programme de validation, sont proposés comme paramètres facultatifs (voir appendice 2).

6.

Sur la base des données produites par le processus de validation, il convient de souligner que la sensibilité de cet essai est insuffisante pour identifier toutes les substances présentant une action (anti)androgénique ou (anti)œstrogénique (9). La présente méhtode d’essai ne s’applique pas à un stade de vie très sensible aux perturbations endocriniennes. Elle a pourtant permis, pendant le processus de validation, d’identifier des substances affectant faiblement ou fortement la fonction thyroïdienne, ainsi que des substances agissant fortement ou modérément sur le système endocrinien par le biais des récepteurs aux œstrogènes et aux androgènes, mais dans la plupart des cas, n’est pas parvenue à identifier les substances agissant sur le système endocrinien en affectant faiblement ces récepteurs. Ainsi ne peut-elle être décrite comme un essai de dépistage de l’activité endocrinienne.

7.

Par conséquent, l’absence d’effet lié à ces modes d’action ne peut constituer une preuve de l’absence d’effet sur le système endocrinien. En ce qui concerne les effets à médiation endocrinienne, la caractérisation des substances ne doit donc pas s’appuyer uniquement sur les résultats de la présente méthode d’essai, mais doit être utilisée dans le cadre d’une démarche fondée sur le “poids de la preuve”, combinant toutes les données existant sur un produit chimique pour caractériser son action potentielle sur le système endocrinien. C’est pourquoi la prise de décision réglementaire sur l’activité endocrinienne des produits chimiques (caractérisation des substances) doit adopter une méthode large ne s’appuyant pas sur les résultats de cette seule méthode d’essai.

8.

Il est entendu que toutes les procédures d’essai utilisant des animaux obéiront aux normes locales en vigueur sur le traitement à leur réserver; la description des soins et traitements prodigués aux animaux utilisés dans le présent essai correspond donc à des normes de performance minimales qui seront le cas échéant adaptées à la législation locale si celle-ci est plus stricte. D’autres recommandations sur l’humanité du traitement à réserver aux animaux ont été formulées par l’OCDE (14).

9.

L’appendice 1 présente les définitions utilisées.

10.

La substance à tester est administrée quotidiennement par voie orale à différents niveaux de dose à plusieurs groupes d’animaux, à raison d’un niveau de dose par groupe, pendant une période de 28 jours. Chaque jour au cours de cette période, les animaux sont examinés soigneusement afin de déceler tout signe de toxicité. Les animaux qui meurent ou qui sont euthanasiés au cours de l’essai sont autopsiés et, au terme de l’essai, les animaux survivants sont également euthanasiés et autopsiés. Une étude de 28 jours fournit des informations sur les effets d’une exposition répétée par voix orale et peut indiquer la nécessité d’études ultérieures plus longues. Elle peut également apporter des informations sur la sélection des concentrations en vue d’études plus poussées. Les données tirées de l’application de la méthode d’essai devraient permettre de caractériser la toxicité de la substance d’essai, d’avoir une indication sur la relation dose réponse et de déterminer la concentration sans effet nocif observé (CSENO).

11.

L’espèce de rongeur préférée est le rat, bien que d’autres espèces de rongeurs puissent être utilisées. Si les paramètres spécifiés dans la méthode d’essai B.7 sont étudiés sur une autre espèce de rongeur, une justification détaillée devra être donnée. Bien qu’il soit biologiquement plausible que d’autres espèces répondent aux produits toxiques de manière similaire au rat, l’utilisation d’espèces plus petites peut provoquer une variabilité accrue compte tenu de la difficulté technique à disséquer des organes de plus petite taille. Le rat a été la seule espèce utilisée lors du programme international de validation des paramètres pour la détection des perturbateurs endocriniens. Il convient d’employer de jeunes animaux adultes sains issus de souches de laboratoire courantes. Les femelles doivent être nullipares et non gravides. L’administration doit commencer dès que possible après le sevrage et, dans tous les cas, avant l’âge de neuf semaines. Au début de l’étude, les différences de poids entre les animaux utilisés doivent être minimales et ne pas excéder ± 20 % de la moyenne du poids pour chaque sexe. Lorsque l’essai est conduit à titre d’étude préliminaire à une étude de toxicité à long terme, il est préférable d’utiliser des animaux issus de la même souche et de la même source dans les deux études.

12.

Toutes les procédures doivent respecter les normes locales en vigueur sur le traitement des animaux de laboratoire. La température dans le local d’expérimentation doit être de 22 °C (± 3 °C). L’humidité relative doit être d’au moins 30 % et si possible ne pas dépasser 70 %, excepté pendant le nettoyage de la pièce, l’idéal étant 50-60 %. Pour l’éclairage, on doit utiliser la lumière artificielle et respecter une séquence de 12 heures d’éclairement et 12 heures d’obscurité. Le régime alimentaire peut être un régime classique de laboratoire avec eau potable à satiété. Le choix du régime alimentaire peut être influencé par la nécessité d’assurer un mélange convenable de la substance d’essai, lorsqu’elle est administrée dans la nourriture. Les animaux doivent être encagés par petits groupes du même sexe; ils peuvent être encagés individuellement si une nécessité scientifique le justifie. Pour l’encagement de groupe, il convient de ne pas dépasser cinq animaux par cage.

13.

La nourriture doit être analysée régulièrement à la recherche de contaminants. Un échantillon en sera conservé jusqu’à la finalisation du rapport.

14.

De jeunes animaux adultes sains sont répartis au hasard entre le groupe témoin et les groupes traités. Les cages doivent être placées de façon à réduire au minimum l’influence éventuelle de leur disposition sur les résultats. Les animaux sont identifiés individuellement et placés dans les cages au moins cinq jours avant le début de l’étude, pour leur permettre de s’acclimater aux conditions du laboratoire.

15.

La substance d’essai est administrée par gavage ou dans la nourriture ou l’eau de boisson, la méthode étant choisie en fonction de l’objectif de l’étude et des propriétés physico-chimiques, toxiques et cinétiques de la substance d’essai.

16.

Lorsque cela s’avère nécessaire, la substance d’essai est dissoute ou mise en suspension dans un véhicule adéquat. On recommande, de privilégier, dans la mesure du possible, l’utilisation d’une solution ou d’une suspension aqueuse. À défaut, on peut utiliser une solution ou une suspension dans l’huile (par exemple l’huile de maïs) et finalement une solution dans d’autres véhicules. La toxicité des véhicules autres que l’eau doit être connue. La stabilité de la substance d’essai dans le véhicule doit être déterminée.

17.

Au moins 10 animaux (5 femelles et 5 mâles) doivent être utilisés pour chaque dose. Si on envisage d’euthanasier des animaux au cours de l’essai, il faut accroître le nombre d’animaux d’expérience du nombre d’animaux euthanasiés avant la fin de l’épreuve. On envisagera d’inclure un groupe satellite supplémentaire de 10 animaux (5 par sexe) dans le groupe témoin et dans le groupe traité à la plus forte dose, afin d’observer la réversibilité, la persistance, ou l’apparition tardive des effets toxiques, au moins 14 jours après le traitement.

18.

De manière générale, au moins trois groupes d’essai et un groupe témoin doivent être utilisés, mais si d’après l’évaluation des autres données aucun effet n’est attendu à la dose de 1 000 mg/kg de poids corporel/jour, un essai limite peut être réalisé. S’il n’existe aucune donnée préalable, une étude préliminaire (animaux de la même souche et de la même provenance) peut être menée pour faciliter la détermination des doses à utiliser. Exception faite de l’exposition avec la substance à tester, les animaux du groupe témoin doivent être traités d’une manière identique à ceux des groupes d’essai. Si un véhicule est employé pour administrer la substance d’essai, on administrera au groupe témoin le plus grand volume de véhicule utilisé.

19.

Les niveaux de dose doivent être déterminés en tenant compte de toutes les informations disponibles concernant les propriétés toxiques ou toxico-cinétiques de la substance d’essai ou de substances analogues. La dose la plus élevée doit provoquer des effets toxiques, sans être létale ou causer de sévères souffrances. Une séquence de doses décroissantes doit ensuite être sélectionnée en vue de mettre en évidence tout effet lié à la dose ainsi qu’une concentration sans effet nocif observé (CSENO) à la dose la plus faible. Des intervalles correspondant à un facteur 2 ou 4 sont souvent les plus appropriés entre les doses décroissantes et l’inclusion d’un quatrième groupe d’essai est souvent préférable à la fixation de très grands intervalles (par exemple un facteur supérieur à 10) entre les doses.

20.

En cas d’observation d’une toxicité générale (par exemple réduction du poids corporel, effets sur le foie, le cœur, les poumons ou les reins, etc.) ou d’autres modifications susceptibles de ne pas constituer une réponse toxique (par exemple diminution de la prise de nourriture, grossissement du foie), les effets observés sur les paramètres neurologiques, endocriniens ou liés au système immunitaire, devront être interprétés avec précaution.

21.

Si un essai pratiqué avec une seule dose d’au moins 1 000 mg/kg de poids corporel/jour, ou, pour une administration par le biais de la nourriture ou de l’eau, d’un pourcentage équivalent de cette nourriture ou de cette eau (en fonction de la détermination du poids corporel), en suivant le mode opératoire décrit pour cette étude, ne produit aucun effet toxique observable et s’il n’y a pas de raison de penser que la substance soit toxique compte tenu des données dont on dispose au sujet de substances ayant une structure analogue, on peut considérer qu’il n’est pas nécessaire de réaliser une étude complète avec trois niveaux de dose. L’essai limite s’applique, sauf lorsque les données d’exposition humaine indiquent la nécessité d’utiliser une dose plus élevée.

22.

La substance d’essai est administrée aux animaux quotidiennement, sept jours sur sept, sur une période de 28 jours. Lorsque la substance d’essai est administrée par gavage, les animaux doivent recevoir une dose unique, introduite au moyen d’une sonde gastrique ou d’une canule d’intubation appropriée. Le volume maximal de liquide pouvant être administré en une fois dépend de la taille de l’animal d’expérience. Ce volume ne doit pas dépasser 1 ml/100 g de poids corporel, sauf dans le cas des solutions aqueuses où il peut aller jusqu’à 2 ml/100 g de poids corporel. Exception faite des substances irritantes ou corrosives, qui provoqueront normalement des effets exacerbés aux concentrations plus élevées, il convient de réduire au minimum la variabilité du volume d’essai en ajustant la concentration pour obtenir un volume constant à toutes les doses.

23.

Si la substance d’essai est administrée dans les aliments ou l’eau de boisson, il importe de s’assurer que sa quantité n’interfère ni avec la nutrition normale ni avec l’équilibre hydrique. Lorsque la substance d’essai est incorporée aux aliments, deux possibilités sont offertes: soit le maintien d’une concentration constante dans les aliments (ppm), soit le maintien d’un niveau de dose constant par rapport au poids corporel des animaux; il y a lieu de préciser l’option choisie. Si la substance est administrée par gavage, la dose doit être administrée à la même heure chaque jour et ajustée si nécessaire pour rester constante par rapport au poids corporel de l’animal. Lorsqu’une étude à doses répétées sert de d’étude préliminaire à une étude de toxicité à long terme, il faut applique le même régime alimentaire dans les deux études.

24.

La période d’observation doit durer 28 jours. Les animaux d’un groupe satellite destinés à des observations ultérieures ne doivent recevoir aucun traitement pendant au moins 14 jours en vue de détecter d’éventuels effets toxiques différés ou persistants, ou de mettre en évidence le rétablissement des animaux traités.

25.

Les animaux doivent faire l’objet d’un examen clinique général au moins une fois par jour, de préférence aux mêmes heures, en prenant en considération la période où les effets prévus devraient être les plus marqués après l’administration. L’état de santé des animaux doit être consigné. Au moins deux fois par jour, l’ensemble des animaux fait l’objet d’un constat de morbidité et de mortalité.

26.

Tous les animaux doivent faire l’objet d’un examen clinique détaillé, une fois avant la première exposition (pour pouvoir effectuer des comparaisons sur un même individu), et ensuite au moins une fois par semaine. Ces observations doivent être effectuées hors de la cage habituelle, sur une aire standard, de préférence toujours au même moment de la journée. Elles doivent être soigneusement consignées, de préférence en utilisant un système de cotation, explicitement défini par le laboratoire qui réalise l’essai. Il faudrait s’efforcer de minimiser les variations des conditions d’essai et prendre les dispositions nécessaires pour que les examens soient effectués par des observateurs n’ayant pas connaissance du traitement. Les symptômes relevés devraient couvrir les observations suivantes (sans que cette liste soit exhaustive): modifications de l’état de la peau, de la fourrure, des yeux, des muqueuses, apparition de sécrétions et d’excrétions, et de réactions neuro-végétatives (par exemple, sécrétion de larmes, horripilation, dimension de la pupille, respiration anormale). Il convient également de consigner les changements dans la démarche, la posture et les réactions à la manipulation ainsi que la présence de mouvements cloniques ou toniques, des comportements stéréotypés (par exemple, toilettage excessif, parcours circulaires répétitifs) ou comportements bizarres (par exemple, automutilation, marche à reculons) (2).

27.

Lors de la quatrième semaine d’exposition, il faut vérifier la réactivité sensorielle à différents types de stimuli (2) (stimuli auditifs, visuels et proprioceptifs, par exemple) (3) (4) (5), et évaluer la force de préhension (6) et l’activité motrice (7). On trouvera dans les références bibliographiques susmentionnées une description plus détaillée des modes opératoires. Toutefois, on peut également utiliser d’autres modes opératoires que ceux qui figurent dans les références.

28.

Les observations fonctionnelles réalisées au cours de la quatrième semaine d’exposition peuvent être omises lorsque l’essai sert d’étude préliminaire à une étude subchronique ultérieure (90 jours). Dans ce cas, les observations fonctionnelles devront être menées au cours de la seconde étude. Cela étant, les données tirées des observations fonctionnelles de l’étude à doses répétées peuvent faciliter la sélection des doses retenues pour l’étude subchronique ultérieure.

29.

À titre exceptionnel, les observations fonctionnelles peuvent aussi être omises pour des groupes qui par ailleurs présentent des symptômes de toxicité à un degré tel qu’ils interféreraient sensiblement avec le déroulement de l’essai fonctionnel.

30.

Lors de l’autopsie, le cycle œstral de l’ensemble des femelles peut être déterminé (facultatif) par frottis vaginal. Ces observations fourniront des informations sur le stade du cycle œstral atteint au moment de l’euthanasie et faciliteront l’évaluation histologique des tissus sensibles aux œstrogènes [voir le guide d’orientations sur l’histopathologie (19)].

31.

Tous les animaux doivent être pesés au moins une fois par semaine. La consommation de nourriture doit également être mesurée au moins une fois par semaine. Si la substance d’essai est administrée dans l’eau de boisson, la consommation d’eau doit aussi être mesurée au moins une fois par semaine.

32.

À la fin de la période d’essai, il faut procéder aux examens hématologiques suivants: hématocrite, concentration d’hémoglobine, numération des érythrocytes, reticulocytes, numération et formule leucocytaire, numération des plaquettes et mesure du temps et potentiel de coagulation. D’autres analyses devant être menées si la substance d’essai ou ses métabolites supposés ont ou sont susceptibles d’avoir des propriétés oxydantes portent notamment sur la concentration de méthémoglobine et les corps de Heinz.

33.

Des échantillons de sang doivent être prélevés à un endroit spécifié juste avant ou pendant la procédure d’euthanasie des animaux, et stockés dans des conditions appropriées. Les animaux doivent avoir jeûné la nuit précédant l’euthanasie (7).

34.

Les analyses de biochimie clinique destinées à étudier les principaux effets toxiques sur les tissus, et en particulier sur le rein et le foie, devraient être pratiquées sur des échantillons de sang prélevés sur tous les animaux juste avant ou pendant leur euthanasie (à l’exception des animaux trouvés moribonds et/ou euthanasiés avant la fin de l’essai). Les analyses du plasma ou du sérum doivent porter sur le sodium, le potassium, le glucose, le cholestérol total, l’urée, la créatinine, la concentration totale de protéines et d’albumine, au moins deux enzymes indicatrices des effets hépatocellulaires (telles que l’alanine aminotransférase, l’aspartate aminotransférase, la phosphatase alcaline, la gamma glutamyle transpeptidase et la glutamate déshydrogénase), ainsi que sur les acides biliaires. Le dosage d’autres enzymes (d’origine hépatique ou autre) et de la bilirubine, peut fournir des informations utiles dans certaines circonstances.

35.

À titre facultatif, on peut effectuer les analyses d’urine suivantes au cours de la dernière semaine de l’étude sur des échantillons d’urine prélevés à des moments déterminés: apparence, volume, osmolalité ou poids spécifique, pH, protéines, glucose, sang et cellules sanguines.

36.

Il faudrait envisager par ailleurs de rechercher dans le plasma ou le sérum des marqueurs de lésions générales des tissus. Si les propriétés connues de la substance d’essai risquent ou sont soupçonnées d’affecter certaines voies métaboliques, on devrait procéder à d’autres analyses, notamment celles du calcium, du phosphate, des triglycérides, d’hormones spécifiques et de la cholinestérase. La nécessité de ces analyses doit être déterminée pour certaines classes de produits chimiques ou au cas par cas.

37.

Bien que l’évaluation internationale des paramètres liés au système endocrinien n’ait pas pu établir de façon claire l’intérêt de l’analyse des hormones thyroïdiennes (T3, T4) et de la TSH, il peut être utile de conserver des échantillons de plasma ou de sérum pour mesurer la T3, la T4 et la TSH (facultatif) s’il semble qu’un effet sur l’axe hypophyso-thyroïdien puisse exister. Ces échantillons pourront être congelés à - 20 °C pour être stockés. Les facteurs suivants peuvent influencer la variabilité et les concentrations absolues lors de l’analyse hormonale:

L’identification définitive des substances chimiques actives sur le système thyroïdien s’appuiera de manière plus fiable sur l’analyse histopathologique que sur les niveaux hormonaux.

38.

Les échantillons de plasma destinés spécifiquement à l’analyse hormonale doivent être prélevés aux mêmes heures de la journée. Il est recommandé de prendre en considération les taux de T3, T4 et TSH provoqués par des altérations de l’histopathologie de la thyroïde. Les valeurs numériques obtenues lors de l’analyse des concentrations hormonales diffèrent selon les kits d’essai du commerce utilisés. Il peut ainsi ne pas être possible de fournir des critères de performance fondés sur des données historiques homogènes. Pour pallier cet inconvénient, les laboratoires s’efforceront de maintenir les coefficients de variation en dessous de 25 pour la T3 et pour la T4 et de 35 pour la TSH. Toutes les concentrations doivent être exprimées en ng/ml.

39.

Si les données de référence historiques sont inappropriées, il conviendra de prendre en compte les variables d’hématologie et de biochimie clinique avant le début du dosage ou de préférence sur un groupe d’animaux distincts des groupes d’essai.

40.

Tous les animaux utilisés dans l’étude feront l’objet d’une autopsie générale, complète et détaillée, qui comporte un examen approfondi de la surface externe du corps, de tous les orifices ainsi que des cavités crânienne, thoracique et abdominale et de leur contenu. Le foie, les reins, les glandes surrénales, les testicules, les épididymes, l’ensemble formé par la prostate, les vésicules séminales et les glandes coagulantes, le thymus, la rate, le cerveau et le cœur de tous les animaux (à l’exception des animaux moribonds et/ou euthanasiés avant la fin de l’essai) doivent être débarrassés, le cas échéant, de tout tissu adhérent et pesés à l’état frais dès que possible après la dissection, afin d’éviter leur dessiccation. Il convient d’enlever très soigneusement les tissus adhérents de l’ensemble de la prostate, de façon à éviter toute ponction de la vésicule séminale remplies de liquide. Une alternative consistera à débarrasser la vésicule séminale et la prostate des tissus adhérents et de les peser après fixation.

41.

De manière facultative, deux autres organes peuvent aussi être pesés dès que possible après la dissection, afin d’éviter leur dessiccation: les deux ovaires (poids frais) et l’utérus, y compris le col de l’utérus [des orientations sur l’ablation et la préparation des tissus utérins pour leur pesée sont données par la ligne directrice 440 de l’OCDE (18)].

42.

Le poids de la thyroïde (facultatif) peut être déterminé après la fixation. L’élimination des tissus adhérents doit également s’opérer avec beaucoup de soin et seulement après la fixation pour éviter d’abîmer les tissus, et par là de compromettre l’analyse d’histopathologie.

43.

Les tissus suivants doivent être conservés dans le milieu de fixation le plus approprié compte tenu à la fois du type de tissu et des examens histopathologiques prévus (voir paragraphe 47): toutes les lésions macroscopiques, l’encéphale (les régions représentatives du cerveau comprenant les hémisphères cérébraux, le cervelet et la protubérance annulaire), la moelle épinière, les yeux, l’estomac, l’intestin grêle, le gros intestin (y compris les plaques de Peyer), le foie, les reins, les glandes surrénales, la rate, le cœur, le thymus, la thyroïde, la trachée et les poumons (préservés par injection de fixateur, puis immergés), les gonades (testicules et ovaires), les organes génitaux auxiliaires (utérus et col de l’utérus, épididymes, prostate + vésicules séminales et glandes coagulantes), le vagin, la vessie, les ganglions lymphatiques [le ganglion lymphatique le plus proximal et un autre, en fonction de l’expérience du laboratoire (15)], un nerf périphérique (sciatique ou poplité interne), de préférence tout près du muscle, un muscle squelettique et un os, avec la moelle osseuse (coupe ou à défaut une ponction examinée immédiatement). Il est recommandé de fixer les testicules par immersion dans un fixateur de Bouin ou de Davidson modifié (16) (17). L’albuginée du testicule doit être ponctionnée délicatement et superficiellement aux deux pôles de l’organe avec une aiguille pour permettre la pénétration rapide du fixateur. Les résultats des observations cliniques et autres peuvent conduire à l’examen de tissus supplémentaires. En outre, il y a lieu de conserver tout organe qui pourrait être considéré comme un organe cible possible, eu égard aux propriétés connues de la substance d’essai.

44.

Les tissus suivants peuvent apporter des informations utiles sur les effets endocriniens: gonades (ovaires et testicules), organes génitaux auxiliaires (utérus et col de l’utérus, épididymes, vésicules séminales et glande coagulante, prostate dorsolatérale et ventrale), vagin, hypophyse, glande mammaire mâle, glande thyroïdienne et glande surrénale. Les changements survenant dans les glandes mammaires mâles n’ont pas encore été insuffisamment documentés, mais ce paramètre peut s’avérer très sensible aux substances à action œstrogénique. L’observation des organes/tissus non cités au paragraphe 43 est facultative (voir appendice 2).

45.

Le document d’orientation sur l’histopathologie (19) fournit des informations supplémentaires sur la dissection, la fixation, le prélèvement et l’histopathologie des tissus endocriniens.

46.

Au cours du programme d’essais international, des éléments de preuve ont été apportés montrant que des effets subtils sur le système endocrinien de substances chimiques susceptibles de faiblement déséquilibrer l’homéostasie des hormones sexuelles peuvent être identifiés par leur capacité à perturber la synchronisation du cycle œstral dans différents tissus plutôt que par une nette altération histopathologique des organes sexuels femelles. Bien qu’aucune preuve définitive n’ait été apportée sur ces effets, il est recommandé que les preuves d’une asynchronie possible du cycle oestral soient prises en compte dans l’interprétation de l’examen histopathlogique des ovaires (cellules folliculaires, thécales et de la granulosa), de l’utérus, du col de l’utérus et du vagin. Si elle est évaluée (facultatif), la période du cycle déterminée par les frottis vaginaux peut également être incluse dans cette comparaison

47.

Un examen histopathologique complet doit être pratiqué sur les tissus et organes conservés de tous les animaux appartenant au groupe témoin et au groupe traité à la dose la plus élevée. Ces examens devront être étendus aux animaux de tous les autres groupes de dosage dès lors qu’on observe des modifications liées au traitement dans le groupe traité à la dose la plus élevée.

48.

Toutes les lésions macroscopiques seront examinées.

49.

Si un groupe satellite est inclus, les tissus et organes sur lesquels des effets ont été observés dans les groupes traités doivent faire l’objet d’un examen histopathologique.

50.

Il faut présenter les résultats correspondant à chaque animal. En outre, toutes les données doivent être résumés sous forme de tableaux faisant apparaître, pour chaque groupe d’essai, le nombre d’animaux au début de l’essai, le nombre d’animaux trouvés morts au cours de l’essai ou euthanasiés, le moment de la mort ou de l’euthanasie, le nombre d’animaux présentant des signes de toxicité, et une description des ces signes, notamment le moment de leur apparition, leur durée et leur gravité, le nombre d’animaux présentant des lésions, les types de lésions, leur gravité et le pourcentage d’animaux affecté par chaque type de lésion.

51.

Dans la mesure du possible, les résultats numériques devraient être évalués par une méthode statistique appropriée et largement reconnue. La comparaison des effets au sein d’une même fourchette de dosage devrait éviter d’avoir à recourir à des tests de t multiples. Les méthodes statistiques devront être sélectionnées au stade de la conception de l’étude.

52.

À des fins de contrôle de la qualité, il est suggéré de recueillir des données de contrôle historiques et de calculer les coefficients de variation pour les données numériques, en particulier pour les paramètres liés à la détection des perturbateurs endocriniens. Ces données peuvent être utilisées à des fins comparatives lorsque des études réelles sont évaluées.

53.

Le rapport d’essai doit inclure les informations suivantes:

(1)

OCDE (Paris, 1992). Rapport du président de la réunion du groupe de travail ad hoc d’experts sur la neurotoxicité systémique à court terme (et différée).

(2)

PISC (1986). Principes et méthodes de la neurotoxicité liée à l’exposition aux produits chimiques. Critères d’hygiène de l’environnement no 60.

(3)

Tupper D.E., Wallace R.B. (1980). Utility of the Neurologic Examination in Rats. Acta Neurobiol. Exp. 40: 999-1003.

(4)

Gad S.C. (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxicology. J. Toxicol Environ. Health 9: 691-704.

(5)

Moser V.C., McDaniel K.M., Phillips P.M. (1991). Rat Strain and Stock Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of Amitraz. Toxicol. Appl. Pharmacol. 108: 267-283.

(6)

Meyer O.A., Tilson H.A., Byrd W.C., Riley M.T. (1979). A Method for the Routine Assessment of Fore- and Hindlimb Grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxicol. 1: 233-236.

(7)

Crofton K.M., Howard J.L., Moser V.C., Gill M.W., Reiter L.W., Tilson H.A., MacPhail R.C. (1991). Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol. 13: 599-609.

(8)

OCDE (1998). Rapport de la première réunion du Groupe d’étude sur les essais et l’évaluation des perturbateurs endocriniens, 10 et 11 mars 1998, ENV/MC/CHEM/RA(98)5.

(9)

OCDE (2006). Report of the Validation of the Updated Test Guideline 407: Repeat Dose 28-day Oral Toxicity Study in Laboratory Rats. Series on Testing and Assessment No 59, ENV/JM/MONO(2006)26.

(10)

OCDE (2002). Detailed Review Paper on the Appraisal of Test Methods for Sex Hormone Disrupting Chemicals. Series on Testing and Assessment No 21, ENV/JM/MONO(2002)8.

(11)

OCDE (2012).Conceptual Framework for Testing and Assessment of Endocrine Disrupting Chemicals. http://www.oecd.org/document/58/0,3343,fr 2649 37407 2348794 1 1 1 37407,00.html

(12)

OCDE (2006). Compte rendu final de la réunion du Groupe de gestion de la validation pour les essais sur les mammifères. ENV/JM/TG/EDTA/M(2006)2.

(13)

OCDE. Projet de compte rendu du Groupe d’étude sur les essais et l’évaluation des perturbateurs endocriniens. ENV/JM/TG/EDTA/M(2006)3.

(14)

OCDE (2000) Guidance document on the recognition, assessment and use of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluation. Series on Testing and Assessment No 19. ENV/JM/MONO(2000)7.

(15)

Haley P., Perry R., Ennulat D., Frame S., Johnson C., Lapointe J.-M., Nyska A., Snyder P.W., Walker D. et Walter G. (2005). STP Position Paper: Best Practice Guideline for the Routine Pathology Evaluation of the Immune System. Toxicol Pathol 33: 404-407.

(16)

Hess R.A., Moore B.J. (1993) Histological Methods for the Evaluation of the Testis. In: Methods in Reproductive Toxicology, Chapin RE and Heindel JJ (eds). Academic Press: San Diego, CA, p. 52-85.

(17)

Latendresse J.R., Warbrittion A.R., Jonassen H., Creasy D.M. (2002). Fixation of testes and eyes using a modified Davidson’s fluid: comparison with Bouin’s fluid and conventional Davidson’s fluid. Toxicol. Pathol. 30, 524-533.

(18)

OCDE (2007). Ligne directrice pour les essais de produits chimiques de l’OCDE no 440: Bio-essai utérotrophique chez les rongeurs: Essai de dépistage à court terme des propriétés œstrogéniques.

(19)

OCDE. (2009). Guidance Document 106 on Histologic evaluation of Endocrine and Reproductive Tests in Rodents ENV/JM/Mono(2009)11.

1.

La présente méthode d’essai est équivalente à la ligne directrice 412 (2009) de l’OCDE pour les essais de produits chimiques. Le texte original de la ligne directrice 412 sur la toxicité subaiguë par inhalation avait été adopté en 1981 (1). La présente méthode d’essai B.8 (équivalente à la ligne directrice 412) a été révisée pour prendre en compte l’état de la science et répondre aux exigences règlementaires actuelles et futures.

2.

La présente méthode permet de caractériser les effets nocifs résultant d’une exposition quotidienne répétée, par inhalation, à une substance d’essai pendant 28 jours. Les données issues d’une étude sur la toxicité subaiguë par inhalation sur 28 jours peuvent être utilisées pour des estimations quantitatives de risques (si l’étude n’est pas suivie d’un essai de toxicité subchronique par inhalation sur une période de 90 jours, voir chapitre B.29 de la présente annexe). Ces données peuvent également fournir des informations permettant la détermination des concentrations pour des études à plus long terme comme l’essai de toxicité subchronique par inhalation sur une période de 90 jours. La présente méthode d’essai n’est pas spécifiquement destinée à tester les nanomatériaux. Le document d’orientation no 39 (2) regroupe les définitions utilisées dans le contexte de cette méthode d’essai.

3.

Avant toute étude, le laboratoire d’essai devra prendre en compte toutes les informations disponibles sur la substance d’essai afin d’améliorer la qualité de l’étude et de recourir le moins possible aux animaux. Parmi les informations utiles pour la détermination des concentrations d’essai appropriées, citons: l’identité, la structure chimique et les propriétés physico-chimiques de la substance d’essai; les résultats de tous les essais de toxicité in vitro ou in vivo auxquels elle a été soumise; son (ses) utilisation(s) escomptée(s) et les risques d’exposition humaine; les données (Q)SAR disponibles et les données toxicologiques sur les substances structurellement apparentées; ainsi que les données issues des essais de toxicité aiguë par inhalation. En cas de neurotoxicité, connue ou observée au cours de l’étude, le directeur de l’étude pourra décider d’inclure les évaluations jugées nécessaires, comme une batterie d’observations fonctionnelles (FOB) et des mesures de l’activité motrice. Bien que la durée des expositions par rapport à des examens spécifiques puisse être critique, l’exécution de ces activités supplémentaires n’interfère pas avec la conception de l’étude principale.

4.

Les dilutions de substances corrosives ou irritantes peuvent être testées à des concentrations qui permettront d’atteindre le degré de toxicité désiré, voir document d’orientation 39 (2). Lors de l’exposition des animaux à ces substances, les concentrations cibles sont assez faibles pour ne causer ni souffrance manifeste ni détresse, mais suffisantes pour prolonger la courbe concentration-réponse jusqu’à des niveaux correspondant à l’objectif scientifique et règlementaire de l’essai. Le choix de ces concentrations est fait au cas par cas, de préférence sur la base d’une étude préliminaire de détermination des concentrations, conçue de façon appropriée, et qui fournit des informations sur l’effet critique mesuré, un éventuel seuil d’irritation et le moment de son apparition (voir paragraphes 11-13). La justification du choix des concentrations est fournie.

5.

Les animaux moribonds ou présentant des signes de souffrance manifeste ou de détresse sévère et persistante sont euthanasiés. Les animaux moribonds sont pris en compte au même titre que ceux qui succombent au cours de l’essai. Le document d’orientation de l’OCDE sur les effets mesurés éthiquement acceptables (3) détaille les critères orientant la décision d’euthanasier les animaux moribonds ou en grande souffrance, et aide à reconnaître une mort prévisible ou imminente.

6.

Le choix s’orientera vers de jeunes rongeurs adultes en bonne santé, de souches communément utilisées en laboratoire. Le rat étant l’espèce la plus utilisée, il faudra justifier l’emploi d’autres espèces.

7.

Les femelles sont nullipares et non gravides. Le jour de la randomisation, les animaux sélectionnés sont de jeunes adultes âgés de 7 à 9 semaines. Leur poids corporel ne devra pas excéder ± 20 % du poids moyen pour chaque sexe. Sélectionnés au hasard, les animaux seront marqués pour être identifiés individuellement. En vue de leur acclimatation aux conditions de laboratoire, ils seront conservés dans leur cage pour une période d’au minimum 5 jours avant le début de l’essai.

8.

Les animaux sont identifiés de façon individuelle, de préférence à l’aide de dispositifs sous-cutanés, afin de faciliter leur observation et d’éviter toute confusion. La température du local expérimental où les animaux sont conservés est maintenue à 22 ± 3 °C. Le taux d’humidité relative est idéalement maintenu entre 30 et 70 %, encore qu’il ne soit pas toujours possible de le faire si l’eau est utilisée comme véhicule. Avant et après exposition, les animaux sont généralement mis en cage en groupes par sexe et par concentration, mais le nombre d’animaux par cage ne fait pas obstacle à une observation précise de chaque animal, et n’engendrer qu’un minimum de pertes dues au cannibalisme et aux combats. Si les animaux sont exposés “nez seul”, il peut être nécessaire de les acclimater aux tubes de contention. Ceux-ci ne provoquent pas chez les animaux de stress excessif, qu’il soit de nature physique, thermique ou dû à leur immobilisation. Les contraintes qu’ils subissent peuvent en effet modifier les paramètres physiologiques mesurés de l’animal, comme sa température corporelle (hyperthermie) et/ou son volume respiratoire par minute. Si l’on dispose de données génériques montrant que de telles modifications ne se produisent pas de façon appréciable, alors la période d’adaptation préalable aux tubes de contention n’est pas nécessaire. Les animaux exposés “corps entier” à un aérosol sont enfermés individuellement pendant l’exposition pour les empêcher de filtrer l’aérosol d’essai grâce à la fourrure de leurs congénères. À l’exception des périodes d’exposition, le régime alimentaire des animaux est le régime classique et certifié de laboratoire, avec eau potable à satiété. L’éclairage est artificiel, la séquence d’éclairage étant de 12 heures de clarté et 12 heures d’obscurité.

9.

Le choix de la chambre d’inhalation prend en compte la nature de la substance d’essai et l’objet de l’essai. Le mode d’exposition “nez seul” (qui inclut les dispositifs “tête seule”, “nez seul” et “museau seul”) est privilégié. Le mode d’exposition “nez seul” est généralement choisi pour les études d’aérosols liquides ou solides et pour les vapeurs susceptibles de se condenser en aérosols. L’utilisation d’un mode d’exposition “corps entier” peut être préférable pour les besoins spécifiques de l’étude, mais cela est justifié dans le rapport de l’étude. Pour assurer la stabilité de l’atmosphère d’une chambre d’exposition “corps entier”, on veillera à ce que le “volume” total des animaux d’expérience ne dépasse pas 5 % du volume de la chambre. Le document d’orientation 39 (2) décrit les principes des techniques d’exposition “corps entier” ou “nez seul”, ainsi que leurs avantages et inconvénients spécifiques.

10.

Contrairement aux études de toxicité aiguë, aucune concentration limite n’est définie pour les études de toxicité subaiguë par inhalation sur 28 jours. La concentration maximale testée prend en compte: 1) la concentration maximale pouvant être atteinte, 2) le niveau d’exposition humaine correspondant au “pire des cas”, 3) la nécessité de maintenir une alimentation adéquate en oxygène, et/ou 4) le bien-être des animaux. En l’absence de limites fondées sur des données, les valeurs limites pour la toxicité aiguë du règlement (CE) no 1272/2008 (13) peuvent être utilisées (c’est-à-dire jusqu’à une concentration maximale de 5 mg/l pour les aérosols, 20 mg/l pour les vapeurs et 20 000 ppm pour les gaz); voir document d’orientation 39 (2). S’il est nécessaire de dépasser ces limites lors d’essais de gaz ou de substances d’essai hautement volatiles (comme les réfrigérants), une justification est produite. La concentration limite permet d’obtenir une toxicité sans équivoque, sans causer de stress excessif chez les animaux ni affecter leur longévité (3).

11.

Avant le début de l’étude principale, une étude préliminaire de détermination des concentrations peut s’avérer nécessaire. Plus complète qu’une étude d’observation, elle n’est pas limitée au choix des concentrations. Les connaissances acquises grâce à une étude préliminaire de détermination des concentrations peuvent conduire à la réussite de l’étude principale. En effet, une telle étude peut fournir des informations techniques sur les méthodes d’analyse, la taille des particules, la découverte de mécanismes de toxicité, les données histopathologiques et de pathologie clinique, et les estimations de la concentration sans effet nocif observé (CSENO) et de la concentration maximale acceptable (CMA) dans une étude principale. Le directeur d’étude peut décider de s’appuyer sur une étude préliminaire de détermination des concentrations pour identifier: le seuil d’irritation de l’appareil respiratoire (par exemple avec une histopathologie de l’appareil respiratoire, des tests de la fonction pulmonaire ou des lavages bronchoalvéolaires), la concentration la plus élevée tolérée par les animaux sans provoquer de stress excessif, et les paramètres qui permettront de caractériser au mieux la toxicité de la substance d’essai.

12.

Une étude préliminaire de détermination des concentrations peut comporter un ou plusieurs niveaux de concentration. Pour chaque niveau de concentration, on exposera au maximum trois mâles et trois femelles. La durée d’une étude préliminaire de détermination des concentrations est d’au minimum 5 jours et ne pas excéder 14 jours en général. Il convient d’exposer dans le rapport d’étude les raisons du choix des concentrations retenues pour l’étude principale, dont l’objet est de démontrer une relation concentration-réponse basée sur l’effet mesuré le plus sensible auquel on s’attend. La concentration la plus faible n’engendre en principe aucune manifestation de toxicité, tandis que la concentration la plus élevée permet d’obtenir une toxicité sans équivoque, sans causer de stress excessif chez les animaux ni affecter leur longévité (3).

13.

Lors du choix des niveaux de concentration pour l’étude préliminaire de détermination des concentrations, toutes les informations disponibles sont prises en compte, y compris les relations structure-activité et les données correspondant à des produits chimiques analogues (voir paragraphe 3). Une étude préliminaire de détermination des concentrations peut confirmer ou réfuter le choix des effets mesurés les plus sensibles selon des critères mécanistiques, comme l’inhibition de la cholinestérase par des composés organophosphorés, la formation de méthémoglobine par des agents cytotoxiques d’isomérie érythro, les hormones thyroïdiennes (T3, T4) dans le cas de thyrotoxiques, les protéines, la LDH, ou les neutrophiles dans les lavages bronchoalvéolaires dans le cas de particules inoffensives faiblement solubles ou d’aérosols irritants pour les poumons.

14.

L’étude principale de toxicité subaiguë comporte en général trois niveaux de concentration ainsi qu’un témoin négatif (air) et/ou un témoin du véhicule, s’il y a lieu (voir paragraphe 17). L’ensemble des informations disponibles doit permettre de déterminer les niveaux d’exposition appropriés, y compris les résultats des études systémiques de toxicité, le métabolisme et la cinétique (on prendra garde d’éviter les niveaux de concentration élevée avec des processus cinétiques de saturation). Chaque groupe d’essai comprend au moins 10 rongeurs (5 mâles et 5 femelles) exposés à la substance d’essai 6 heures par jour, 5 jours par semaine pendant 4 semaines (soit une durée totale de l’étude de 28 jours). Les animaux peuvent aussi être exposés 7 jours par semaine (par exemple dans le cas d’essais sur des produits pharmaceutiques inhalés). S’il est connu qu’un des sexes est plus réactif à la substance d’essai, les niveaux de concentration peuvent différer selon le sexe afin d’optimiser la concentration-réponse telle que décrite au paragraphe 15. Si des espèces de rongeurs autres que le rat sont exposées “nez seul”, il est possible d’ajuster la durée maximale d’exposition en fonction du stress propre à ces espèces. Lorsque la durée d’exposition est inférieure à 6 heures par jour ou qu’il est nécessaire de mener une étude d’exposition “corps entier” de longue durée (par exemple de 22 heures par jour), des justifications sont fournies, voir document d’orientation 39 (2). Les animaux sont privés de nourriture pendant l’exposition sauf si sa durée dépasse 6 heures. Dans une exposition “corps entier”, les animaux peuvent boire de l’eau.

15.

Les concentrations cibles choisies permettent d’identifier le(s) organe(s) cible(s) et de mettre en évidence une concentration-réponse claire:

16.

Une étude de réversibilité peut être utilisée pour mettre en évidence le caractère réversible, persistant ou retardé de la toxicité, pour une période post-traitement d’une durée appropriée d’au minimum 14 jours. Les groupes satellites sont constitués de cinq mâles et de cinq femelles exposés en même temps que les animaux d’expérience de l’étude principale. Ils sont exposés à la concentration la plus élevée de la substance d’essai. Il convient également de faire appel à un témoin concurrent (air) et, le cas échéant, à un témoin du véhicule (voir paragraphe 17).

17.

Les animaux du groupe témoin négatif (air) sont traités d’une manière identique à ceux du groupe d’animaux d’essai, mais au lieu de la substance d’essai, ils sont exposés à de l’air filtré. Lorsque de l’eau ou une autre substance est utilisée pour produire l’atmosphère d’essai, un groupe témoin du véhicule est inclus dans l’étude, à la place du groupe témoin négatif exposé à l’air seulement. Autant que possible, l’eau est le véhicule utilisé. Dans ce cas, les animaux témoins sont exposés à un air dont le taux d’humidité relative est le même que pour les groupes exposés à la substance d’essai. Le choix du véhicule s’opère sur la base d’une étude préliminaire appropriée ou de données historiques. Si la toxicité d’un véhicule est mal connue, le directeur de l’étude peut choisir d’utiliser un témoin négatif (air) et un témoin du véhicule, mais cela est toutefois fortement déconseillé. Si les données historiques montrent qu’un véhicule n’est pas toxique, le groupe témoin à l’air n’est pas nécessaire et seul un témoin du véhicule est utilisé. Si aucune toxicité n’a été détectée lors de l’étude préliminaire d’une substance d’essai préparée dans un véhicule, ce véhicule est considéré comme non toxique à la concentration testée et ce véhicule témoin est utilisé.

18.

Les animaux sont exposés à la substance d’essai présenté sous forme de gaz, de vapeur, d’aérosol ou d’un mélange des deux. L’état physique à tester dépend des propriétés physico-chimiques de la substance, de la concentration choisie, et/ou de la forme physique sous laquelle il est le plus probable qu’elle se présente lors de sa manipulation et de son utilisation. Les substances d’essai chimiquement réactives ou hygroscopiques sont testées sous air sec. On prendra soin d’éviter les concentrations susceptibles de provoquer une explosion. Les substances particulaires peuvent être soumises à des procédés mécaniques afin de réduire la taille des particules. Pour plus d’informations, se reporter au document d’orientation 39 (2).

19.

Une mesure de la taille des particules est réalisée pour tous les aérosols et les vapeurs susceptibles se condenser pour former des aérosols. Pour que toutes les régions pertinentes de l’appareil respiratoire soient exposées, il est recommandé d’utiliser (4) des aérosols dont le diamètre aérodynamique médian de masse (DAMM) se situe entre 1 et 3 μm, avec un écart type géométrique (σg) compris entre 1,5 et 3,0. Un effort raisonnable est fourni pour remplir ces conditions, mais si tel n’est pas le cas, un jugement d’expert est nécessaire. Par exemple, les particules des fumées métalliques peuvent avoir une taille inférieure à cette norme, et les particules chargées ou les fibres une taille supérieure.

20.

La substance d’essai est idéalement testée sans véhicule. S’il est nécessaire d’avoir recours à un véhicule pour atteindre la concentration et la taille particulaire voulues de la substance d’essai, l’eau est choisie de préférence. Chaque fois qu’une substance d’essai est dissoute dans un véhicule, sa stabilité est démontrée.

21.

Le débit d’air dans la chambre d’exposition est contrôlé avec soin, surveillé en continu et enregistré au moins toutes les heures pendant chaque exposition. Le suivi en temps réel de la concentration de l’atmosphère d’essai (ou stabilité temporelle) constitue une mesure complète de tous les paramètres dynamiques et fournit un moyen indirect de contrôler tous les paramètres d’inhalation dynamiques pertinents. Si la concentration est suivie en temps réel, la fréquence peut être ramenée à une seule mesure du débit de l’air par exposition et par jour. Un soin particulier est apporté à éviter toute rerespiration dans les chambres d’exposition “nez seul”. La concentration d’oxygène est d’au moins 19 % et celle de dioxyde de carbone ne dépasser pas 1 %. Si ces conditions ne peuvent être respectées, les concentrations d’oxygène et de dioxyde de carbone sont mesurées. Si les mesures du premier jour d’exposition montrent que la concentration de ces gaz est appropriée, aucune mesure complémentaire ne devrait être nécessaire.

22.

La température de la chambre d’exposition est maintenue à 22 ± 3 °C. Dans les cas d’exposition “nez seul” et “corps entier”, l’humidité relative dans la zone où respire l’animal est autant que possible surveillée en continu et enregistrée toutes les heures pendant chaque exposition. L’humidité relative est de préférence comprise entre 30 et 70 %. Il est possible que ce taux ne puisse être atteint (par exemple lorsque la substance d’essai se présente sous forme de solution aqueuse), ou qu’il ne puisse être mesuré en raison d’interférences de la substance d’essai avec la méthode d’essai.

23.

Dans la mesure du possible, la concentration nominale dans la chambre d’exposition est calculée et enregistrée. La concentration nominale est la masse de la substance d’essai divisée par le volume d’air total qui passe dans le circuit de la chambre d’inhalation. La concentration nominale ne sert pas à caractériser l’exposition des animaux, mais une comparaison de la concentration nominale avec la concentration réelle donne une indication de la capacité de production du système d’essai, et peut donc permettre de mettre en évidence des problèmes de production.

24.

La concentration réelle est la concentration de la substance d’essai prélevée dans la zone de la chambre d’inhalation où les animaux respirent. Les concentrations réelles peuvent être obtenues par des méthodes spécifiques (par exemple, échantillonnage direct, méthodes d’adsorption ou de réaction chimique, et caractérisation analytique ultérieure) ou par des méthodes non spécifiques comme la gravimétrie sur filtre. Le recours à l’analyse gravimétrique n’est acceptable que pour des aérosols ne contenant qu’un seul composant en poudre ou pour des aérosols de liquides peu volatils, et des caractérisations spécifiques à la substance d’essai sont également effectuées par une pré-étude appropriée. Il est aussi possible d’avoir recours à la gravimétrie pour déterminer la concentration d’un aérosol contenant plusieurs composants en poudre, mais des données analytiques sont alors nécessaires, afin de démontrer que la composition du produit en suspension dans l’air est analogue à celle du produit de départ. Faute de cette information, il peut s’avérer nécessaire de soumettre le produit à tester (idéalement en suspension dans l’air) à une nouvelle analyse à intervalles réguliers tout au long de l’étude. Pour des agents aérosolisés susceptibles de s’évaporer ou de se sublimer, il faut démontrer que toutes les phases ont été recueillies selon la méthode choisie.

25.

Pendant toute la durée de l’étude, il est recommandé de n’employer si possible qu’un seul lot de la substance d’essai, et l’échantillon de la substance est conservé dans des conditions préservant sa pureté, son homogénéité et sa stabilité. Avant le début de l’étude, il conviendrait de réaliser une caractérisation de la substance d’essai afin de déterminer sa pureté et, si cela est techniquement possible, son identité et les quantités de contaminants et d’impuretés identifiés. Pour cela, on pourra recueillir les données suivantes: temps de rétention et surface relative du pic, poids moléculaire obtenu par spectroscopie de masse ou chromatographie en phase gazeuse, ou autres estimations. Bien que le laboratoire d’essai ne soit pas responsable de l’identification de la substance d’essai, il peut, par prudence, confirmer au moins une partie des caractéristiques fournies par le donneur d’ordre (couleur, nature physique, etc.).

26.

L’atmosphère d’exposition est maintenue constante autant que possible. Un dispositif de suivi en temps réel, tel qu’un photomètre à aérosol pour les aérosols ou un analyseur d’hydrocarbures totaux pour les vapeurs, peut être utilisé pour démontrer la stabilité des conditions d’exposition. La concentration réelle dans la chambre est mesurée au moins 3 fois chaque jour d’exposition et pour chaque niveau d’exposition. En cas d’impossibilité en raison de débits d’air limités ou de faibles concentrations, l’utilisation d’un échantillon par période d’exposition est acceptée. En principe, cet échantillon est alors recueilli pendant la totalité de la période d’exposition. Les écarts entre la concentration dans chaque chambre et la concentration moyenne n’excèdent pas ± 10 % pour les gaz et vapeurs et ± 20 % pour les aérosols liquides ou solides. Il convient de calculer et de noter le temps d’équilibre dans la chambre d’exposition (t95). La durée d’une exposition couvre le temps de production de la substance d’essai, y compris le temps nécessaire pour l’égalisation des concentrations dans la chambre d’exposition (t95) et leur déclin. Des indications pour l’estimation de t95 sont fournies dans le document d’orientation 39 (2).

27.

Pour des systèmes très complexes constitués de gaz ou de vapeurs et d’aérosols (atmosphères de combustion et substances d’essai propulsées à partir de produits/dispositifs spécialisés, par exemple), chaque phase peut se comporter différemment dans la chambre d’inhalation. Pour chacune des phases (gaz ou vapeur et aérosol), on choisira donc au moins une substance indicatrice (analyte), en général la principale substance active du mélange. Quand la substance d’essai est un mélange, la concentration analytique devra être indiquée pour le mélange global et pas uniquement pour le principe actif ou la substance indicatrice (analyte). Pour plus d’informations sur les concentrations réelles, se reporter au document d’orientation 39 (2).

28.

La répartition granulométrique des aérosols est déterminée au minimum chaque semaine pour chaque niveau de concentration, à l’aide d’un impacteur en cascade ou d’un autre instrument, comme un spectromètre de mesure de la taille des particules aérodynamiques (APS). Si les résultats obtenus avec l’impacteur en cascade et l’autre instrument se révèlent équivalents, ce dernier peut être utilisé tout au long de l’étude.

29.

Pour confirmer la capacité de recueil des particules de l’outil principal, un second instrument devra être utilisé en parallèle, par exemple un filtre gravimétrique ou un barboteur à gaz/impacteur. La concentration massique obtenue par l’analyse granulométrique se rapproche, dans des limites raisonnables, de celle obtenue par l’analyse sur filtre, voir document d’orientation 39 (2). Si pour toutes les concentrations testées, cette équivalence est établie au début de la phase d’étude, il n’est pas nécessaire d’effectuer des mesures de confirmation dans la suite de l’étude. Pour le bien-être des animaux, il convient de réduire au minimum les données douteuses qui nécessiteraient de répéter l’essai.

30.

Une répartition granulométrique est effectuée dans le cas des vapeurs, s’il est possible qu’une condensation de la vapeur conduise à la formation d’un aérosol, ou si des particules sont détectées dans une atmosphère de vapeur susceptible de présenter des phases mixtes.

31.

Un examen clinique attentif des animaux est pratiqué avant, pendant, et après la période d’exposition. Des observations plus fréquentes peuvent être réalisées en fonction de la réponse des animaux pendant l’exposition. Lorsque l’observation des animaux s’avère difficile en raison des tubes de contention, du mauvais éclairage des chambres d’exposition “corps entier” ou d’atmosphères opaques, les animaux seront observés attentivement après l’exposition. Les observations effectuées avant l’exposition du lendemain peuvent permettre d’estimer une éventuelle réversibilité ou exacerbation des effets toxiques.

32.

Toutes les observations sont enregistrées individuellement pour chaque animal. Quand des animaux sont retrouvés morts ou sont euthanasiés, l’heure de la mort est consignée le plus précisément possible.

33.

Les observations quotidiennes portent notamment sur les modifications de la peau et des poils, des yeux et des muqueuses, de l’appareil respiratoire, du système circulatoire, du système nerveux, ainsi que de l’activité somatomotrice et du comportement. Les tremblements, les convulsions, la salivation, les diarrhées, la léthargie, le sommeil et le coma retiennent l’attention. La mesure de la température rectale peut aider à mettre en évidence une bradypnée réflexe ou une hypo/hyperthermie liée au traitement ou au confinement. Il est possible d’enrichir le protocole d’étude par des estimations complémentaires telles que: cinétique, surveillance biologique, fonction pulmonaire, rétention de produits peu solubles qui s’accumulent dans les tissus pulmonaires et changements comportementaux.

34.

Le poids de chacun des animaux est enregistré individuellement: juste avant la première exposition (jour 0), deux fois par semaine par la suite (par exemple les vendredis et lundis, afin de mettre en évidence leur rétablissement après un week-end sans exposition, ou dans un délai permettant l’évaluation de la toxicité systémique), et au moment de leur mort ou de leur euthanasie. Si aucun effet n’est observé les 2 premières semaines, le poids corporel peut n’être mesuré qu’une fois par semaine pendant le reste de l’étude. Les animaux du groupe satellite (étude de réversibilité) sont toujours pesés de façon hebdomadaire tout au long de la période de récupération. Au terme de l’étude, tous les animaux sont pesés juste avant leur sacrifice pour ne pas fausser le calcul des rapports du poids des organes au poids du corps.

35.

La quantité de nourriture consommée est mesurée une fois par semaine. La consommation d’eau peut également l’être.

36.

Tous les animaux, y compris ceux des groupes témoins et satellites, quand ils sont sacrifiés, subissent des examens cliniques. Le délai entre la fin de l’exposition et la prise de sang est enregistré, en particulier quand la reconstitution de l’effet visé est rapide. À la fin de l’exposition, un échantillonnage est recommandé pour les paramètres ayant une courte demi-vie plasmatique (HbCO, ChE et MetHb, par exemple).

37.

Le tableau 1 énumère les paramètres de pathologie clinique généralement requis pour toutes les études toxicologiques. Une analyse d’urine n’est pas nécessaire en règle générale, mais peut être réalisée si on l’estime utile d’après la toxicité probable ou observée. Afin de mieux caractériser la toxicité de la substance d’essai, le directeur de l’étude peut faire appel à d’autres paramètres (cholinestérase, lipides, hormones, équilibre acido-basique, méthémoglobine ou corps de Heinz, créatine kinase, rapport myéloïde/érythroïde, troponines, gaz du sang, lactate déshydrogénase, sorbitol déshydrogénase, glutamate déshydrogénase, gamma glutamyl transpeptidase, etc.).

Tableau 1

Paramètres standards de pathologie clinique

38.

Quand il est prouvé que les voies respiratoires basses (c’est-à-dire les alvéoles pulmonaires) sont le principal site de dépôt et de rétention, le lavage broncho-alvéolaire (LBA) peut alors être la technique de choix pour effectuer une analyse quantitative les paramètres de la relation dose-effet basée sur les hypothèses, en se concentrant sur l’alvéolite, l’inflammation pulmonaire et la phospholipidose. Ceci permet d’étudier convenablement l’évolution de la relation dose-effet et du décours temporel d’une lésion alvéolaire. Le fluide du LBA peut être analysé en se basant sur le nombre total et différentiel de leucocytes, les protéines totales et la lactate déshydrogénase. D’autres paramètres peuvent également être considérés, comme ceux mettant en évidence une lésion lysosomale, une phospholipidose, une fibrose, une inflammation allergique ou irritante, laquelle peut inclure la détermination de cytokines ou de chimiokines pro-inflammatoires. Les mesures liées au LBA complètent souvent les résultats des examens histopathologiques sans toutefois s’y substituer. Des indications sur la manière de réaliser un lavage de poumon sont disponibles dans le document d’orientation 39 (2).

39.

Tous les animaux d’expérience, y compris ceux morts au cours de l’essai et ceux écartés de l’étude pour des raisons de bien-être animal, subissent une exsanguination complète (si cela est possible) et une autopsie macroscopique. Il convient d’enregistrer le délai entre la fin de la dernière exposition de chaque animal et leur sacrifice. Lorsqu’un animal est découvert mort et que son autopsie n’est pas réalisable immédiatement, l’animal est réfrigéré (mais non congelé) à une température suffisamment basse pour minimiser l’autolyse. Les autopsies sont réalisées le plus tôt possible, en général dans un délai d’un à deux jours. Tous les changements macropathologiques sont enregistrés pour chaque animal en prêtant particulièrement attention aux voies respiratoires.

40.

Le tableau 2 énumère les organes et tissus devant être conservés dans un milieu approprié lors de l’autopsie macroscopique en vue d’un examen histopathologique. La conservation des organes et tissus [entre crochets], et de tous les autres organes et tissus, est à la discrétion du directeur d’étude. Les organes indiqués en gras sont découpés et pesés à l’état humide, le plus tôt possible après la dissection, pour éviter leur dessiccation. La thyroïde et les épididymes ne sont pesés que si cela est nécessaire car leur découpe peut gêner l’évaluation histopathologique. Les organes et tissus sont fixés à l’aide de formol tamponné à 10 %, ou d’un autre fixateur approprié, dès que l’autopsie est effectuée, et pas moins de 24 à 48 heures avant le découpage, en fonction du fixateur utilisé.

Tableau 2

Organes et Tissus à Conserver Pendant L’autopsie Macroscopique

[Bulbe olfactif]

Capsules surrénales

Cerveau (y compris les tronçons du cortex cérébral et de la moelle/du pont)

Cœur