10)
|
les chapitres C.27, C.28, C.29 et C.30 sont ajoutés:
«C.27 ESSAI DE TOXICITÉ SUR LES CHIRONOMES DANS UN SYSTÉME EAU-SÉDIMENT DOPÉ
INTRODUCTION
1.
|
La présente méthode d’essai est équivalente à la ligne directrice 218 (2004) de l’OCDE pour les essais de produits chimiques. Cette méthode d’essai est conçue pour évaluer les effets d’une exposition prolongée à des substances chimiques sur des larves de Chironomus sp., un diptère vivant dans les sédiments d’eau douce. Elle s’appuie sur des protocoles d’essais de toxicité sur Chironomus riparius et Chironomus tentans, mis au point en Europe (1) (2) (3) et en Amérique du Nord (4) (5) (6) (7) (8), et soumis à des essais circulaires (1) (6) (9). D’autres espèces de chironomes bien documentées peuvent aussi être employées, par exemple Chironomus yoshimatsui (10) (11).
|
2.
|
Le scénario d’exposition appliqué dans cette méthode d’essai consiste à introduire la substance d’essai dans le sédiment. La sélection du mode d’exposition dépend de la finalité de l’essai. Le dopage du sédiment vise à simuler l’accumulation de produits chimiques persistants dans le sédiment. Ce chargement s’effectue dans un système expérimental eau-sédiment.
|
3.
|
En général, les substances à tester sur des organismes vivant dans les sédiments subsistent longtemps dans ce compartiment. Ces organismes peuvent être exposés par diverses voies. L’importance relative de chaque voie d’exposition et le temps pris par chacune d’entre elles pour contribuer à l’effet toxique global dépendent des propriétés physico-chimiques de chaque substance chimique. Dans le cas des substances fortement adsorbantes (par exemple avec un log Koe> 5) ou des substances liées de façon covalente au sédiment, l’ingestion d’aliments contaminés peut constituer une voie d’exposition non négligeable. Afin de ne pas sous-estimer la toxicité des substances fortement lipophiles, on envisagera d’ajouter de la nourriture au sédiment avant l’application de la substance d’essai. La présente méthode d’essai est axée sur l’exposition à long terme, de façon à couvrir toutes les voies d’exposition potentielles. L’essai dure de 20 à 28 jours pour C. riparius et C. yoshimatsui et de 28 à 65 jours pour C. tentans. Si l’on a besoin de données à court terme pour un motif précis, par exemple pour étudier les effets d’une substance chimique instable, des récipients supplémentaires, ajoutés au dispositif expérimental, peuvent être retirés après 10 jours d’essai.
|
4.
|
Les effets observés sont le nombre total d’adultes émergés et temps écoulé jusqu’à l’émergence. Si l’on a besoin de données à court terme, il est recommandé de ne mesurer la survie et la croissance des larves qu’après 10 jours, en ajoutant le nombre nécessaire de récipients supplémentaires.
|
5.
|
L’utilisation d’un sédiment reconstitué est recommandée en raison de ses avantages par rapport aux sédiments naturels:
—
|
la variabilité expérimentale est réduite parce que le sédiment reconstitué forme une “matrice normalisée” reproductible; en outre, il n’est plus nécessaire de trouver des sources de sédiments non contaminés et non pollués,
|
—
|
les essais peuvent être effectués à n’importe quel moment de l’année, la variabilité saisonnière n’intervenant plus, et il n’est pas nécessaire de traiter préalablement le sédiment afin d’éliminer la faune indigène; l’utilisation de sédiments reconstitués diminue aussi le coût associé à la collecte sur le terrain d’une quantité suffisante de sédiments pour les essais systématiques,
|
—
|
les sédiments reconstitués permettent de comparer la toxicité des substances et de les classer en conséquence.
|
|
6.
|
L’appendice 1 contient les définitions employées dans la présente méthode d’essai.
|
PRINCIPE DE L’ESSAI
7.
|
Des chironomes au premier stade larvaire sont exposés à une gamme de concentrations de la substance d’essai dans un système sédiment-eau. Une fois la substance d’essai incorporée au sédiment, des larves au premier stade sont introduites dans des béchers où les concentrations d’eau et de sédiment ont été stabilisées. L’émergence des chironomes et leur vitesse de développement sont mesurées à la fin de l’essai. La survie des larves et leur poids peuvent aussi être mesurés après 10 jours si nécessaire (en ajoutant le nombre d’expériences identiques requis). Ces données sont analysées, soit à l’aide d’un modèle de régression pour estimer la concentration qui entraînerait une réduction de x % de l’émergence ou de la survie des larves ou de leur croissance (par exemple CE15, CE50, etc.), soit par la vérification d’une hypothèse statistique afin de déterminer une CSEO/CMEO. Cette dernière nécessite une comparaison entre les valeurs efficaces et les valeurs des témoins à l’aide de tests statistiques.
|
INFORMATIONS SUR LA SUBSTANCE D’ESSAI
8.
|
Il faudrait connaître l’hydrosolubilité de la substance d’essai, sa pression de vapeur, son coefficient de partage mesuré ou calculé dans le sédiment et sa stabilité dans l’eau et le sédiment. Il convient de disposer d’une méthode d’analyse fiable pour quantifier la substance d’essai dans l’eau sus-jacente, dans l’eau des pores et dans le sédiment, et pour laquelle la précision et le seuil de détection sont connus. Il est également utile de connaître la formule structurale et la pureté de la substance d’essai ainsi que son devenir chimique (par exemple sa dissipation, sa dégradation abiotique et biotique, etc.). Des indications complémentaires pour tester les substances se prêtant difficilement à l’essai en raison de leurs propriétés physico-chimiques sont fournies à la référence (12).
|
SUBSTANCES CHIMIQUES DE RÉFÉRENCE
9.
|
Des substances de référence pourront être testées régulièrement afin de démontrer, la fiabilité du protocole et des conditions de l’essai. Voici quelques exemples de toxiques de référence ayant fait leurs preuves dans des essais circulaires et des études de validation: lindane, trifluraline, pentachlorophénol, chlorure de cadmium et chlorure de potassium (1) (2) (5) (6) (13).
|
VALIDITÉ DE L’ESSAI
10.
|
Pour que l’essai soit valide, les conditions suivantes doivent être remplies:
—
|
l’émergence chez les témoins doit atteindre au moins 70 % à la fin de l’essai (1) (6),
|
—
|
s’agissant de C. riparius et C. yoshimatsui, l’émergence au stade adulte dans les récipients témoins doit avoir lieu entre 12 et 23 jours après leur introduction dans les récipients expérimentaux; C. tentans nécessite une période de 20 à 65 jours,
|
—
|
à la fin de l’essai, le pH et la concentration d’oxygène dissous seront mesurés dans chaque récipient. La concentration d’oxygène devrait atteindre au moins 60 % de la valeur de saturation en air (VSA) à la température appliquée et le pH de l’eau sus-jacente devrait être compris entre 6 et 9 dans tous les récipients expérimentaux,
|
—
|
la température de l’eau ne devrait pas varier de plus de ± 1,0 °C et pourrait être contrôlée grâce à une chambre isotherme, auquel cas la température de la chambre devra être confirmée à intervalles appropriés.
|
|
DESCRIPTION DE LA MÉTHODE
Récipients expérimentaux
11.
|
L’essai se déroule dans des béchers en verre de 600 ml, mesurant 8 cm de diamètre. D’autres récipients peuvent être utilisés à condition qu’ils permettent de garantir une profondeur adéquate d’eau et de sédiment. Le sédiment doit offrir une superficie de 2 à 3 cm2 par larve. Le quotient de la profondeur de la couche de sédiment par la profondeur de la couche d’eau sus-jacente doit être égal à 1/4. Les récipients et les autres appareils qui entreront en contact avec le système d’essai doivent être composés uniquement de verre ou d’un autre matériau chimiquement inerte (par exemple du Téflon).
|
Sélection des espèces
12.
|
Chironomus riparius est l’espèce qui convient le mieux. Chironomus tentans peut aussi être utilisé, mais il est plus difficile à manipuler et nécessite une période d’essai plus longue. Chironomus yoshimatsui convient également. La méthode de culture de Chironomus riparius est détaillée à l’appendice 2. D’autres documents décrivent les conditions de culture des autres espèces: Chironomus tentans (4) et Chironomus yoshimatsui (11). L’identification de l’espèce est à confirmer avant l’essai, mais n’est pas requise avant chaque essai si les organismes proviennent d’un élevage interne.
|
Sédiment
13.
|
Il est préférable d’employer un sédiment reconstitué (également dénommé sédiment artificiel ou synthétique). Néanmoins, si l’on opte pour un sédiment naturel, il faudrait le caractériser, au moins quant au pH et à la teneur en carbone organique, (la détermination d’autres paramètres, tels que le rapport C/N et la granulométrie est aussi recommandée) et s’assurer qu’il n’est pas contaminé et n’abrite pas d’autres organismes qui pourraient entrer en compétition avec les chironomes ou les consommer. Avant d’utiliser un sédiment naturel dans un essai de toxicité sur les chironomes, il est également recommandé de le maintenir durant sept jours dans des conditions identiques à celles qui seront appliquées durant l’essai (conditionnement). Le sédiment reconstitué décrit ci-dessous, basé sur le sol artificiel utilisé dans la méthode d’essai C.8, est recommandé (14) (1) (15) (16):
a)
|
4-5 % (poids sec) de tourbe, avec un pH aussi proche que possible de 5,5 à 6,0; il est important d’utiliser une tourbe sous forme de poudre, finement broyée (dimension des particules ≤ 1 mm) et séchée uniquement à l’air;
|
b)
|
20 % (poids sec) d’argile kaolinique (teneur en kaolinite de préférence supérieure à 30 %);
|
c)
|
75-76 % (poids sec) de sable quartzique (composé en majorité de sable fin, plus de 50 % des particules mesurant entre 50 et 200 μm);
|
d)
|
ajouter de l’eau désionisée jusqu’à ce que la teneur en humidité du mélange final atteigne 30 à 50 %;
|
e)
|
ajouter du carbonate de calcium de qualité chimiquement pure (CaCO3) pour ajuster le pH du mélange final composant le sédiment à 7,0 ± 0,5. Il convient d’obtenir 2 % (± 0,5 %) de carbone organique dans le mélange final en y ajoutant les quantités appropriées de tourbe et de sable, comme indiqué en a) et en c).
|
|
14.
|
Les sources de tourbe, de kaolin et de sable doivent être connues. On vérifiera que les composants du sédiment ne sont pas contaminés par des substances chimiques (par exemple des métaux lourds, des composés organochlorés, des composés organophosphorés, etc.). Un exemple de préparation de sédiment reconstitué est décrit à l’appendice 3. Les composants peuvent aussi être mélangés à l’état sec, à condition de démontrer qu’après l’ajout de l’eau sus-jacente, les composants du sédiment ne se séparent pas (flottement de particules de tourbe, par exemple) et que la tourbe ou le sédiment sont suffisamment conditionnés.
|
Eau
15.
|
Toute eau conforme aux caractéristiques chimiques d’une eau de dilution acceptable selon les critères spécifiés aux appendices 2 et 4 peut servir à l’essai. Toute eau appropriée, naturelle (eau superficielle ou souterraine), reconstituée (voir appendice 2) ou eau du robinet déchlorée, est acceptable comme eau pour l’élevage et les essais si les chironomes y survivent sur toute la durée de l’élevage et de l’essai sans manifester de signes de stress. Au début de l’essai, le pH de l’eau d’essai se situera entre 6 et 9 et sa dureté totale ne dépassera pas 400 mg/l en CaCO3. Néanmoins, si l’on suspecte une interaction entre les ions qui provoquent la dureté et la substance d’essai, il faudra utiliser une eau moins dure (et ne pas employer le milieu Elendt M4 dans ce cas). Le même type d’eau doit être utilisé tout au long de l’étude. Les caractéristiques de la qualité de l’eau énumérées à l’appendice 4 sont à mesurer au moins deux fois par an ou chaque fois que ses caractéristiques sont susceptibles d’avoir été significativement modifiées.
|
Solutions mères – sédiments dopés
16.
|
Les sédiments dopés sont généralement préparés à la concentration souhaitée en ajoutant directement une solution de la substance d’essai au sédiment. Une solution mère de la substance d’essai dissoute dans de l’eau désionisée est mélangée au sédiment reconstitué à l’aide d’un agitateur à rouleaux, d’un mélangeur pour aliments ou mélangée à la main. Si la substance d’essai est peu soluble dans l’eau, elle peut être dissoute dans un volume aussi petit que possible d’un solvant organique adéquat (hexane, acétone ou chloroforme, par exemple). Cette solution est ensuite mélangée à 10 g de sable quartzique fin par récipient d’essai. Il faut attendre que le solvant s’évapore jusqu’à ce qu’il soit totalement éliminé du sable; le sable est ensuite mélangé avec la quantité appropriée de sédiment par bécher. Seuls des agents très volatils peuvent être utilisés pour solubiliser, disperser ou émulsifier la substance d’essai. On n’oubliera pas de tenir compte de la quantité de sable apportée avec le mélange de la substance d’essai et du sable lors de la préparation du sédiment (ce dernier sera préparé avec moins de sable). Il faudra veiller à mélanger complètement la substance d’essai au sédiment et à l’y répartir uniformément. Si nécessaire, on analysera des sous-échantillons afin de déterminer le degré d’homogénéité.
|
CONCEPTION DE L’ESSAI
17.
|
La conception de l’essai définit le nombre et l’espacement des concentrations expérimentales, le nombre de récipients à chaque concentration et le nombre de larves par récipient. La marche à suivre pour estimer une valeur de CE, la CSEO et mener un essai limite est décrite.
|
Conduite d’une analyse de régression
18.
|
La concentration efficace (par exemple, CE15, CE50) et la gamme de concentrations dans laquelle l’effet produit par la substance d’essai est d’intérêt doivent être couvertes par les concentrations incluses dans l’essai. Généralement, l’exactitude, et plus particulièrement la validité, de l’estimation des concentrations efficaces (CEx) s’accroissent lorsque la concentration efficace se situe dans la gamme des concentrations testées. Il faut éviter d’extrapoler des résultats très en dessous de la concentration efficace la plus faible ou au-dessus de la concentration maximale. Il est utile de conduire un essai préliminaire pour déterminer la gamme des concentrations à utiliser (voir paragraphe 27).
|
19.
|
S’il faut estimer la CEx, au moins cinq concentrations et trois répétitions par concentration doivent être mises à l’essai. En tout état de cause, il est recommandé de tester suffisamment de concentrations pour obtenir une bonne estimation du modèle. Le facteur séparant les concentrations ne doit pas excéder deux (sauf dans les cas où la courbe dose-effet présente une pente faible). Le nombre de répétitions par traitement peut être diminué si le nombre de concentrations expérimentales entraînant différents effets est augmenté. L’augmentation du nombre de répétitions ou la contraction des intervalles entre les concentrations expérimentales tend à réduire les intervalles de confiance pour l’essai. Le nombre de répétitions sera augmenté s’il y a lieu d’estimer le taux de survie et la croissance des larves après dix jours.
|
Procédure d’estimation d’une CSEO/CMEO
20.
|
S’il faut estimer la CMEO ou la CSEO, il convient de tester cinq concentrations expérimentales et au moins quatre répétitions par concentration, le facteur séparant les concentrations n’excédant pas deux. Le nombre d’expériences identiques doit être tel qu’il fournit une puissance statistique permettant de détecter une différence de 20 % avec le témoin, au seuil de signification statistique de 5 % (p = 0,05). S’agissant de la vitesse de développement, une analyse de la variance (ANOVA) convient généralement, telle que le test de Dunnett ou le test de Williams (17) (18) (19) (20). S’agissant du taux d’émergence, le test de Cochran-Armitage, le test exact de Fisher (avec correction selon Bonferroni) ou le test de Mantel-Haenszel peuvent être utilisés.
|
Essai limite
21.
|
Si l’essai préliminaire de détermination de l’ordre de grandeur des concentrations n’a engendré aucun effet, un essai limite peut être conduit (une concentration expérimentale et un témoin). L’essai limite se pratique avec une concentration suffisamment élevée pour permettre aux décideurs d’exclure tout effet toxique possible de la substance d’essai et la limite est fixée à une concentration censée ne jamais être atteinte dans les conditions réelles. Une concentration de 1 000 mg/kg (poids sec) est recommandée. Il est généralement nécessaire de mener au moins six répétitions pour les organismes traités et les témoins. Il y a lieu de démontrer que la puissance statistique est suffisante pour détecter une différence de 20 % avec les témoins, au seuil de signification statistique de 5 % (p = 0,05). En ce qui concerne l’effet sur la vitesse de développement et sur le poids, le test t constitue une méthode statistique appropriée, si les données respectent les conditions exigées par ce test (normalité, variances homogènes). On pourra recourir au test t à variance inégale ou à un test non paramétrique, tel que le test de Wilcoxon-Mann-Whitney si ces conditions ne sont pas remplies. S’agissant du taux d’émergence, le test exact de Fisher convient.
|
MODE OPÉRATOIRE
Conditions d’exposition
Préparation du système sédiment dopé – eau
22.
|
La procédure de mélange de la substance d’essai au sédiment décrite dans la méthode d’essai C.8, Toxicité pour les vers de terre, est recommandée pour cet essai (14). Les sédiments dopés sont placés au fond des récipients avant d’y verser l’eau, de façon à obtenir un ratio volumique sédiment-eau de 1/4 (voir paragraphes 11 et 15). La profondeur de la couche de sédiment doit être comprise entre 1,5 et 3 cm. Afin d’éviter la séparation des constituants du sédiment et la resuspension des particules fines pendant le remplissage de la colonne d’eau, on peut recouvrir le sédiment d’un disque en plastique durant cette opération et retirer le disque juste après. D’autres dispositifs conviennent également.
|
23.
|
Les récipients expérimentaux doivent être couverts (par des plaques de verre, par exemple). On prendra soin de remplacer les volumes d’eau évaporée durant l’étude, le cas échéant, et ce avec de l’eau distillée ou désionisée afin d’empêcher l’accumulation de sels.
|
Stabilisation
24.
|
Une fois que le sédiment dopé surmonté d’une couche d’eau a été préparé, il est souhaitable de laisser la substance d’essai se répartir entre la phase aqueuse et le sédiment (3) (4) (6) (13), et ce, de préférence, dans les mêmes conditions de température et d’aération que durant l’essai. L’équilibre met de quelques heures à quelques jours à s’établir, voire 4-5 semaines dans de rares cas, selon le sédiment et la substance chimique. Il ne faut pas attendre que l’équilibre soit atteint, car beaucoup de substances risquent de se dégrader durant cette période, mais un temps d’attente de 48 heures est recommandé. Au terme de cette période d’équilibrage, on mesure la concentration de la substance d’essai dans l’eau sus-jacente, les pores et le sédiment, au moins pour la concentration la plus élevée et la plus faible (voir paragraphe 38). Ces déterminations analytiques de la substance d’essai permettent de calculer le bilan massique et d’exprimer les résultats en fonction des concentrations mesurées.
|
Introduction des organismes d’essai
25.
|
Quatre à cinq jours avant d’introduire les organismes d’essai dans les récipients, des amas d’œufs sont prélevés dans les cultures et déposés dans de petits flacons contenant du milieu de culture. Un milieu plus ancien issu de la culture mère tout comme un milieu fraîchement préparé peuvent être utilisés. Si ce dernier est utilisé, on ajoutera une petite quantité de nourriture, par exemple des algues vertes et/ou quelques gouttes du filtrat d’une suspension de paillettes pour poissons finement broyées, au milieu de culture (voir appendice 2). Seuls des amas d’œufs fraîchement pondus peuvent être utilisés. Normalement, les larves commencent à éclore quelques jours après la ponte (2 à 3 jours pour Chironomus riparius à 20 °C et 1 à 4 jours pour Chironomus tentans à 23 °C et Chironomus yoshimatsui à 25 °C) et le développement des larves se déroule en quatre stades, dont chacun dure 4 à 8 jours. Cet essai se pratique au premier stade larvaire (2-3 ou 1-4 jours après l’éclosion). Il est possible de vérifier le stade de développement des moucherons d’après la largeur de la capsule céphalique (6).
|
26.
|
Vingt larves au premier stade, choisies au hasard, sont déposées dans chaque récipient contenant le sédiment dopé et l’eau, à l’aide d’une pipette émoussée. L’aération de l’eau doit être interrompue dès qu’on introduit les larves dans les récipients expérimentaux, et ce durant 24 heures après l’ajout des larves (voir paragraphes 25 et 32). Selon le protocole expérimental suivi (voir paragraphes 19 et 20), le nombre de larves utilisées par concentration s’élève au moins à 60 pour l’estimation d’une valeur de concentration efficace (CE) et à 80 pour la détermination de la CSEO.
|
Concentrations d’essai
27.
|
Il peut être utile de conduire un essai de détermination de l’ordre de grandeur pour délimiter la gamme de concentrations à appliquer dans l’essai proprement dit. À cet effet, on utilise une série de concentrations largement espacées de la substance d’essai. Afin de reproduire la même densité de surface par chironome que dans l’essai proprement dit, les chironomes sont exposés à chaque concentration de la substance d’essai durant une période permettant d’estimer les concentrations expérimentales appropriées et aucune expérience identique n’est nécessaire.
|
28.
|
Les concentrations pour l’essai définitif sont choisies en fonction des résultats de l’essai de détermination de l’ordre de grandeur. Au moins cinq concentrations doivent être appliquées et sélectionnées comme décrit aux paragraphes 18 à 20.
|
Témoins
29.
|
L’essai inclura le nombre nécessaire de récipients témoins pourvus du sédiment mais exempts de toute substance d’essai (voir paragraphes 19-20). Si la substance d’essai a été appliquée à l’aide d’un solvant (voir paragraphe 16), il convient d’ajouter un témoin dont le sédiment contient également le solvant.
|
Système expérimental
30.
|
Des systèmes statiques sont utilisés. Des systèmes semi-statiques ou à écoulement continu avec renouvellement intermittent ou continu de l’eau sus-jacente peuvent être utilisés dans des cas exceptionnels, par exemple si les spécifications de la qualité de l’eau deviennent inappropriées pour l’organisme d’expérience ou affectent l’équilibre chimique (si, par exemple, la concentration d’oxygène dissous devient trop basse, la concentration des excréta augmente de façon trop importante ou si des minéraux lessivés à partir du sédiment affectent le pH et/ou la dureté de l’eau). Néanmoins, d’autres méthodes d’amélioration de la qualité de l’eau sus-jacente, telles que l’aération, seront normalement suffisantes et préférables.
|
Alimentation
31.
|
Les larves ont besoin d’être nourries, de préférence quotidiennement TetraPhyll; ou au moins trois fois par semaine. Durant les dix premiers jours, chaque jeune larve recevra quotidiennement 0,25 à 0,5 mg (0,35-0,5 mg pour C. yoshimatsui) de nourriture pour poissons (suspendue dans l’eau ou finement moulue, par exemple TetraMin ou TetraPhyll; voir les détails à l’appendice 2). Il peut être nécessaire d’augmenter légèrement cette quantité pour les larves plus âgées: 0,5-1 mg par larve et par jour devrait suffire pour le reste de l’essai. On diminuera la ration alimentaire de tous les organismes traités et témoins si des champignons se développent ou si des organismes témoins meurent. Si la croissance fongique s’avère impossible à enrayer, l’essai doit être renouvelé. Si l’essai porte sur des substances fortement adsorbantes (par exemple avec un log Koe > 5) ou des substances liées de façon covalente au sédiment, la quantité de nourriture nécessaire à la survie et à la croissance naturelle des organismes peut être ajoutée au sédiment reconstitué avant la période de stabilisation. Dans ce cas, la nourriture pour poissons est remplacée par une ration végétale, par exemple 0,5 % (poids sec) de feuilles finement broyées d’ortie (Urtica dioica), de mûrier (Morus alba), de trèfle blanc ou rampant (Trifolium repens), d’épinard (Spinacia oleracea), par exemple, ou d’un autre matériau végétal (Cerophyl ou alpha-cellulose).
|
Conditions d’incubation
32.
|
L’eau sus-jacente est soumise à une légère aération, mise en route de préférence 24 heures après l’introduction des larves et maintenue jusqu’à la fin de l’essai (il faut veiller à ce que la concentration d’oxygène dissous ne tombe pas en dessous de 60 % de la valeur de saturation en air). L’air est insufflé à travers une pipette Pasteur en verre fixée 2 à 3 cm au-dessus de la couche de sédiment (une ou quelques bulles par seconde). Si la substance d’essai est volatile, il faudra éventuellement supprimer l’aération.
|
33.
|
L’essai est mené à température constante (20 °C ± 2 °C). Pour C. tentans et C. yoshimatsui, les températures recommandées s’élèvent respectivement à 23 °C et 25 °C (± 2 °C). La photopériode est de 16 heures et l’éclairement compris entre 500 et 1 000 lux.
|
Durée de l’exposition
34.
|
L’exposition débute avec l’introduction des larves dans les récipients traités et témoins. La durée maximale de l’exposition s’élève à 28 jours pour C. riparius et C. yoshimatsui et à 65 jours pour C. tentans. Si les moucherons émergent plus tôt, l’essai peut s’achever au moins cinq jours après l’émergence du dernier adulte témoin.
|
Observations
Émergence
35.
|
La durée du développement et le nombre total de moucherons mâles et femelles adultes totalement émergés sont à déterminer. Les mâles sont faciles à identifier grâce à leurs antennes plumeuses.
|
36.
|
Au moins trois fois par semaine, on vérifiera que les organismes des récipients expérimentaux ne manifestent aucun comportement anormal (sortie du sédiment, nage inhabituelle par exemple) par rapport aux témoins. Chaque jour, durant la période supposée de l’émergence, on comptera le nombre de moucherons émergés et on consignera le sexe et le nombre de moucherons complètement émergés. Après identification, les moucherons sont retirés des récipients. Tout amas d’œufs déposé avant la fin de l’essai doit être recensé puis enlevé afin d’empêcher la réintroduction de larves dans le sédiment. Le nombre de pupes visibles n’ayant pas réussi à émerger est aussi enregistré. Des indications sur la façon de mesurer l’émergence sont données à l’appendice 5.
|
Croissance et survie
37.
|
S’il faut fournir des données sur la survie et la croissance des larves après 10 jours, des récipients d’essai supplémentaires seront ajoutés dès le début de l’essai, pour pouvoir être utilisés ultérieurement. Le sédiment de ces récipients supplémentaires sera tamisé à travers des mailles de 250 μm pour retenir les larves. La mort est déterminée par deux critères: l’immobilité et l’absence de réaction à un stimulus mécanique. Les larves non récupérées doivent aussi être comptabilisées parmi les mortes (les larves qui sont mortes au début de l’essai ont pu être dégradées par des microbes). Après avoir déterminé le poids sec (sans cendres) des larves survivantes par récipient expérimental, on calcule le poids sec individuel moyen par récipient. Il est utile d’établir à quel stade se trouvent les larves survivantes, et ce d’après la largeur de la capsule céphalique de chaque individu.
|
Mesures analytiques
Concentration de la substance d’essai
38.
|
Avant le début de l’essai (c’est-à-dire avant l’introduction des larves), on prélève des échantillons du sédiment d’au moins un récipient par traitement, afin de déterminer analytiquement la concentration de la substance d’essai dans le sédiment. Il est recommandé d’analyser, au minimum, des échantillons de l’eau sus-jacente, de l’eau des pores, et du sédiment, au début (voir paragraphe 24) et à la fin de l’essai, et ce de la concentration la plus élevée et d’une concentration plus basse. Les concentrations de la substance d’essai nous renseignent sur le comportement et la répartition de la substance d’essai dans le système eau-sédiment.
|
39.
|
Lorsqu’on effectue des mesures intermédiaires (par exemple au septième jour) et si l’analyse requiert des échantillons volumineux qui ne peuvent être prélevés des récipients sans influencer le système expérimental, les analyses seront pratiquées sur des échantillons provenant de récipients expérimentaux supplémentaires traités de la même façon (y compris par la présence des organismes d’essai), mais non utilisés pour des observations biologiques.
|
40.
|
Pour isoler l’eau interstitielle, on recommande de centrifuger les échantillons à 10 000 g et à 4 °C durant 30 minutes. Cependant, s’il est démontré que la substance d’essai ne s’adsorbe pas sur les filtres, la filtration est également acceptable. Avec des échantillons trop petits, il arrive que les concentrations dans l’eau des pores soient impossibles à analyser.
|
Paramètres physico-chimiques
41.
|
Le pH de l’eau et la température des récipients d’essai doivent être mesurés de façon appropriée (voir paragraphe 10). La dureté de l’eau et la teneur en ammoniac sont mesurées dans les récipients témoins et dans un récipient traité à la concentration la plus élevée, au début et à la fin de l’essai.
|
RÉSULTATS ET RAPPORT
Traitement des résultats
42.
|
Cet essai vise à déterminer l’effet de la substance d’essai sur la vitesse de développement et le nombre total de moucherons mâles et femelles totalement émergés ou, dans le cas de l’essai de 10 jours, les effets sur la survie et le poids des larves. Si rien n’indique que les deux sexes présentent des différences statistiques de sensibilité, les résultats obtenus sur les mâles et les femelles peuvent être regroupés pour l’analyse statistique. Les différences de sensibilité entre les sexes peuvent être jugées statistiquement par un test (de tableau) χ2 - r × 2, par exemple. La survie des larves et le poids sec individuel moyen par récipient doivent être déterminés après dix jours, le cas échéant.
|
43.
|
Il est préférable de calculer les concentrations efficaces, exprimées en fonction du poids sec, à partir des concentrations mesurées dans le sédiment au début de l’essai (voir paragraphe 38).
|
44.
|
Pour estimer ponctuellement la CE50 ou une quelconque CEx, les statistiques par récipient peuvent être utilisées comme des expériences identiques proprement dites. Lorsqu’on calcule un intervalle de confiance pour une quelconque CEx, il faut tenir compte de la variabilité entre les récipients ou montrer que celle-ci est négligeable. Si le modèle est ajusté par la méthode des moindres carrés, il convient d’appliquer une transformation des données pour les statistiques par récipient afin d’accroître l’homogénéité de la variance. Toutefois, les valeurs de la CEx sont à calculer après que les résultats ont été “retransformés” de façon à recouvrer leur valeur originale.
|
45.
|
Si l’analyse statistique vise à déterminer la CSEO/CMEO par la vérification d’une hypothèse, la variabilité entre les récipients doit être prise en compte, par exemple à l’aide d’une analyse de la variance (ANOVA) “emboîtée”. Par contre, des tests plus robustes (21) peuvent être utilisés au cas où les hypothèses habituelles de l’analyse de la variance ne se vérifient pas.
|
Taux d’émergence
46.
|
Le taux d’émergence donne une réponse par tout ou rien et peut être analysé par le test de Cochran-Armitage appliqué de façon régressive si la relation dose-effet est supposée être monotone et si les taux d’émergence corroborent cette hypothèse. Dans le cas contraire, un test exact de Fisher ou un test de Mantel-Haenszel avec des valeurs de p corrigées selon Bonferroni-Holm peuvent être employés. S’il s’avère que la variabilité entre expériences identiques à la même concentration est supérieure à ce qu’une distribution binomiale indiquerait (variation souvent qualifiée d’“extra-binomiale”), on appliquera un test plus robuste (Cochran-Armitage ou test exact de Fisher) comme proposé à la référence (21).
La somme des moucherons émergés par récipient, ne, est déterminée et divisée par le nombre de larves introduites, na:
où:
TE
|
=
|
taux d’émergence
|
ne
|
=
|
nombre de moucherons émergés par récipient
|
na
|
=
|
nombre de larves introduites par récipient
|
|
47.
|
Une variante plus appropriée aux échantillons de grande taille, lorsque la variance est extra-binomiale, consiste à traiter le taux d’émergence comme une réponse continue et à appliquer une méthode telle que le test de William si la relation dose-effet est supposée être monotone et si les taux d’émergence corroborent cette hypothèse. Le test de Dunnett convient dans le cas où la relation ne s’avère pas monotone. Ici, on considère qu’un échantillon est de grande taille lorsque le nombre de moucherons émergés et le nombre de chironomes non émergés dépassent chacun cinq, par récipient expérimental.
|
48.
|
Pour réaliser l’analyse de la variance (ANOVA), il convient d’appliquer aux valeurs de TE une transformation “arcsinus-racine carrée” ou “Freeman-Tukey” afin d’obtenir une distribution proche de la normale et d’égaliser les variances. Le test de Cochran-Armitage, le test exact de Fisher (avec correction de Bonferroni) ou le test de Mantel-Haenszel peuvent être employés lorsqu’on utilise des fréquences absolues. La transformation arcsinus-racine carrée consiste à calculer l’inverse du sinus (sinus-1) de la racine carrée du TE.
|
49.
|
Pour les taux d’émergence, les valeurs de la CEx sont calculées par une analyse de régression [ou par probit (22), logit, Weibull, des logiciels commerciaux appropriés, etc.]. Si l’analyse de la régression échoue (par exemple, lorsqu’il y a moins de deux réponses partielles), on fait appel à d’autres méthodes non paramétriques telles que la moyenne mobile ou une simple interpolation.
|
Vitesse de développement
50.
|
La période de développement moyenne représente le temps moyen écoulé entre l’introduction des larves (jour 0 de l’essai) et l’émergence de la cohorte expérimentale de moucherons (pour calculer la période de développement réelle, il faut tenir compte de l’âge des larves au moment de l’introduction). La vitesse de développement est l’inverse de la période de développement (unité: 1/jour) et représente la partie du développement larvaire qui s’effectue par jour. Pour évaluer la toxicité dans les sédiments, il est préférable de choisir la vitesse de développement, car sa variance est plus faible et ses valeurs sont plus homogènes et plus proches d’une distribution normale, en comparaison avec la période de développement. C’est pourquoi les tests paramétriques puissants conviennent mieux à la vitesse de développement qu’à la période de développement. Si la vitesse de développement est traitée comme une réponse continue, les valeurs de la CEx peuvent être estimées par l’analyse de la régression, par exemple (23), (24).
|
51.
|
Pour les tests statistiques suivants, le nombre de moucherons observés le jour × sont considérés comme ayant émergé au milieu de l’intervalle de temps compris entre le jour x et le jour x - 1 (1 = longueur de l’intervalle d’observation, habituellement 1 jour). La vitesse de développement moyenne par récipient (x) est calculée comme suit:
où:
|
:
|
vitesse de développement moyenne par récipient
|
i
|
:
|
indice de l’intervalle d’observation
|
m
|
:
|
nombre maximal d’intervalles d’observation
|
|
:
|
nombre de moucherons émergés durant l’intervalle d’observation i
|
ne
|
:
|
nombre total de moucherons émergés à la fin de l’expérience (= )
|
xi
|
:
|
vitesse de développement des moucherons émergés durant l’intervalle i
|
où:
jouri
|
:
|
jour d’observation (compté depuis l’application)
|
li
|
:
|
durée de l’intervalle d’observation I (exprimé en jours, habituellement 1 jour)
|
|
Rapport d’essai
52.
|
Le rapport d’essai doit fournir au moins les informations suivantes:
|
Substance d’essai:
—
|
état physique et, s’il y a lieu, propriétés physico-chimiques (hydrosolubilité, pression de vapeur, coefficient de partage dans le sol (ou dans le sédiment s’il est connu), stabilité dans l’eau, etc.),
|
—
|
identification chimique (nom courant, nom chimique, formule structurale, numéro CAS, etc.), pureté et méthode d’analyse pour la quantification de la substance d’essai.
|
|
|
Espèce d’essai:
—
|
animal d’essai utilisé: espèce, nom scientifique, source et conditions d’élevage,
|
—
|
informations sur la manipulation des amas d’œufs et des larves,
|
—
|
âge des animaux d’expérience au moment où ils ont été déposés dans les récipients expérimentaux.
|
|
|
Conditions expérimentales:
—
|
sédiment utilisé, c’est-à-dire naturel ou reconstitué,
|
—
|
pour les sédiments naturels: localisation et description du site de prélèvement et notamment, si possible, son histoire en matière de contamination; caractéristiques: pH, teneur en carbone organique, quotient C/N et granulométrie, le cas échéant,
|
—
|
préparation du sédiment reconstitué: ingrédients et caractéristiques (teneur en carbone organique, pH, humidité, etc. au début de l’essai),
|
—
|
préparation de l’eau d’essai (si l’eau est reconstituée) et caractéristiques (concentration d’oxygène, pH, conductivité, dureté, etc. au début de l’essai),
|
—
|
profondeur du sédiment et de l’eau sus-jacente,
|
—
|
volume de l’eau sus-jacente et de l’eau des pores; poids du sédiment humide avec et sans eau des pores,
|
—
|
récipients expérimentaux (matériau et dimension),
|
—
|
méthode de chargement du sédiment: concentrations expérimentales appliquées, nombre d’expériences identiques et utilisation d’un solvant, le cas échéant,
|
—
|
phase de stabilisation du système sédiment dopé-eau: durée et conditions,
|
—
|
conditions d’incubation: température, cycle et intensité de lumière, aération (fréquence et intensité),
|
—
|
informations détaillées sur la nourriture: type, préparation, quantité et régime d’administration.
|
|
|
Résultats:
—
|
concentrations d’essai nominales, concentrations d’essai mesurées et résultats de toutes les analyses conduites pour déterminer la concentration de la substance d’essai dans le récipient expérimental,
|
—
|
qualité de l’eau dans les récipients expérimentaux: pH, température, oxygène dissous, dureté et teneur en ammoniac,
|
—
|
remplacement de l’eau d’essai évaporée, le cas échéant,
|
—
|
nombre de moucherons mâles et femelles émergés par récipient et par jour,
|
—
|
nombre de larves non émergées sous la forme de moucherons par récipient,
|
—
|
poids sec individuel moyen des larves par récipient, et par stade larvaire, s’il y a lieu,
|
—
|
pourcentage d’émergence par expérience identique et concentration d’essai (regroupement des résultats pour les moucherons mâles et femelles),
|
—
|
vitesse de développement moyenne des moucherons totalement émergés par expérience identique et concentration d’essai (regroupement des résultats pour les moucherons mâles et femelles),
|
—
|
estimation des effets toxiques observés, par exemple CEx (et intervalles de confiance associés), CSEO et/ou CMEO, et méthodes statistiques employées pour les déterminer,
|
—
|
analyse des résultats, y compris les répercussions sur les résultats d’un écart éventuel à la présente méthode d’essai.
|
|
|
BIBLIOGRAPHIE:
(1)
|
BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H. Köpp. Berlin 1995.
|
(2)
|
Fleming R. et al. (1994). Sediment Toxicity Tests for Poorly Water-Soluble Substances. Final Report to the European Commission. Report No: EC 3738. August 1994. WRc, UK.
|
(3)
|
SETAC (1993). Guidance Document on Sediment toxicity Tests and Bioassays for Freshwater and Marine Environments. From the WOSTA Workshop held in the Netherlands.
|
(4)
|
ASTM International/E1706-00 (2002). Test Method for Measuring the Toxicity of Sediment-Associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. pp 1125-1241. In ASTM International 2002 Annual Book of Standards. Volume 11.05. Biological Effects and Environmental Fate; Biotechnology; Pesticides. ASTM. International, West Conshohocken, PA.
|
(5)
|
Environment Canada (1997). Test for Growth and Survival in Sediment using Larvae of Freshwater Midges (Chironomus tentans or Chironomus riparius). Biological Test Method. Report SPE 1/RM/32. December 1997.
|
(6)
|
US-EPA (2000). Methods for Measuring the Toxicity and Bioaccumulation of Sediment-associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. Second edition. EPA 600/R-99/064. March 2000. Revision to the first edition dated June 1994.
|
(7)
|
US-EPA/OPPTS 850.1735. (1996): Whole Sediment Acute Toxicity Invertebrates.
|
(8)
|
US-EPA/OPPTS 850.1790. (1996): Chironomid Sediment toxicity Test.
|
(9)
|
Milani D., Day K.E., McLeay D.J., and Kirby R.S. (1996). Recent intra- and inter-laboratory studies related to the development and standardisation of Environment Canada’s biological test methods for measuring sediment toxicity using freshwater amphipods (Hyalella azteca) and midge larvae (Chironomus riparius). Technical Report. Environment Canada. National Water Research Institute. Burlington, Ontario, Canada.
|
(10)
|
Sugaya Y. (1997). Intra-specific variations of the susceptibility of insecticides in Chironomus yoshimatsui. Jp. J. Sanit. Zool. 48 (4): 345-350.
|
(11)
|
Kawai K. (1986). Fundamental studies on Chironomid allergy. I. Culture methods of some Japanese Chironomids (Chironomidae, Diptera). Jp. J. Sanit. Zool. 37(1): 47-57.
|
(12)
|
OCDE (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. Publications Hygiène et Sécurité de l’environnement – Série sur les essais et évaluations, no 23.
|
(13)
|
Environment Canada (1995). Guidance Document on Measurement of Toxicity Test Precision Using Control Sediments Spiked with a Reference Toxicant. Report EPS 1/RM/30. September 1995.
|
(14)
|
Méthode d’essai C.8 de la présente annexe, Toxicité pour les vers de terre.
|
(15)
|
Suedel B.C. and J.H. Rodgers (1994). Development of formulated reference sediments for freshwater and estuarine sediment testing. Environ. Toxicol. Chem. 13: 1163-1175.
|
(16)
|
Naylor C. and C. Rodrigues (1995). Development of a test method for Chironomus riparius using a formulated sediment. Chemosphere 31: 3291-3303.
|
(17)
|
Dunnett C.W. (1964). A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Amer. Statis. Assoc., 50: 1096-1121.
|
(18)
|
Dunnett C.W. (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics, 20: 482-491.
|
(19)
|
Williams D.A. (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics, 27: 103-117.
|
(20)
|
Williams D.A. (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics, 28: 510-531.
|
(21)
|
Rao J.N.K. and Scott A.J. (1992). A simple method for the analysis of clustered binary data. Biometrics 48: 577-585.
|
(22)
|
Christensen E.R. (1984). Dose-response functions in aquatic toxicity testing and the Weibull model. Water Research 18: 213-221.
|
(23)
|
Bruce and Versteeg (1992). A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry 11: 1485-1494.
|
(24)
|
Slob W. (2002). Dose-response modelling of continuous endpoints. Toxicol. Sci. 66: 298-312.
|
Appendice 1
DÉFINITIONS
Les définitions suivantes s’appliquent aux fins de la présente méthode d’essai:
|
Le sédiment reconstitué, ou artificiel ou synthétique, désigne le mélange de matériaux utilisés pour reproduire au mieux les composants physiques d’un sédiment naturel.
|
|
L’eau sus-jacente est l’eau surmontant le sédiment dans le récipient expérimental.
|
|
L’eau interstitielle, ou l’eau des pores, se réfère à l’eau qui occupe les vides laissés entre le sédiment et les particules de sol.
|
|
Le sédiment dopé est un sédiment auquel on a ajouté la substance d’essai.
|
|
Une substance d’essai est toute substance ou tout mélange soumis à un essai réalisé suivant la présente méthode d’essai.
|
Appendice 2
Recommandations pour la culture de Chironomus riparius
1.
|
Les larves de Chironomus peuvent être élevées dans des cristallisoirs ou de grands récipients. Du sable quartzique fin est déposé en couche mince (environ 5 à 10 mm d’épaisseur) sur le fond du récipient. Le Kieselguhr (par exemple l’art. 8117 de Merck) convient aussi comme substrat (une couche encore plus mince de quelques millimètres à peine suffit). Une eau de qualité appropriée, profonde de plusieurs centimètres, vient ensuite recouvrir le substrat. En cas d’évaporation, le niveau d’eau doit toujours être ramené à sa hauteur initiale, afin de prévenir toute dessiccation. L’eau peut être remplacée, si nécessaire. Une légère aération est fournie. Les récipients d’élevage des larves doivent être placés dans des cages appropriées, afin d’empêcher la fuite des adultes émergeant. La cage sera suffisamment grande pour permettre aux adultes émergés d’essaimer, sans quoi la copulation risque de ne pas avoir lieu (dimensions minimales: 30 × 30 × 30 cm).
|
2.
|
Les cages doivent être gardées à température ambiante, ou à 20 ± 2 °C si elles sont installées dans une chambre à ambiance constante, avec une photopériode de 16 heures de lumière (intensité: environ 1 000 lux) et 8 heures d’obscurité. Une humidité relative de l’air inférieure à 60 % serait susceptible d’empêcher la reproduction.
|
Eau de dilution
3.
|
Toute eau naturelle ou reconstituée appropriée peut être utilisée. L’eau d’un puits, de l’eau du robinet déchlorée et un milieu artificiel (Elendt “M4” ou “M7”, voir ci-après) sont souvent utilisés. L’eau doit être aérée avant emploi. Si nécessaire, on peut renouveler l’eau de culture en versant ou en siphonnant soigneusement l’eau usée des récipients expérimentaux, sans détruire les tubes des larves.
|
Alimentation des larves
4.
|
Les larves de Chironomus reçoivent des paillettes pour poissons (TetraMin®, TetraPhyll® ou une autre marque déposée équivalente), à raison d’environ 250 mg par récipient et par jour. Cette nourriture peut être administrée sous la forme d’une poudre moulue à sec ou d’une suspension dans l’eau: 1,0 g de paillettes ajoutées à 20 ml d’eau de dilution et agitées de façon à obtenir un mélange homogène. Cette préparation peut être administrée à raison d’environ 5 ml par récipient et par jour (agiter avant emploi). Les larves plus âgées peuvent en recevoir plus.
|
5.
|
La nourriture est ajustée en fonction de la qualité de l’eau. Si le milieu de culture devient trouble, il convient de réduire la ration. Les quantités de nourriture données sont soigneusement notées. Un manque de nourriture fera émigrer les larves vers la colonne d’eau, tandis qu’un excès de nourriture intensifiera l’activité microbienne et abaissera la concentration d’oxygène. Ces deux conditions sont susceptibles de ralentir la croissance des organismes.
|
6.
|
Certaines cellules d’algues vertes (Scenedesmus subspicatus, Chlorella vulgaris) peuvent aussi être ajoutées lors de la préparation de nouveaux récipients de culture.
|
Alimentation des adultes émergents
7.
|
Certains expérimentateurs ont suggéré de nourrir les adultes émergés au moyen d’un tampon d’ouate imbibé d’une solution de sucrose saturée.
|
Émergence
8.
|
À 20 ± 2 °C, les adultes commencent à émerger des récipients d’élevage des larves après environ 13 à 15 jours. Il est facile de distinguer les mâles d’après leurs antennes plumeuses.
|
Amas d’œufs
9.
|
Dès que des adultes sont présents dans la cage d’élevage, il faut vérifier trois fois par semaine, dans tous les récipients d’élevage de larves, si des amas d’œufs gélatineux n’ont pas été déposés. Le cas échéant, les amas d’œufs doivent être soigneusement enlevés et transférés dans un petit récipient contenant un échantillon de l’eau d’élevage. Les amas d’œufs servent à préparer un nouveau récipient de culture (2 à 4 amas d’œufs par récipient, par exemple) ou à pratiquer des essais de toxicité.
|
10.
|
Les larves au premier stade devraient éclore après 2-3 jours.
|
Préparation de nouveaux récipients de culture
11.
|
Une fois que les cultures ont été lancées, il devrait être possible de préparer un nouveau récipient de culture de larves, une fois par semaine ou moins souvent, suivant les besoins de l’essai, et de retirer les récipients plus anciens après que les moucherons adultes ont émergé. Ce système permet d’obtenir régulièrement un contingent d’adultes, avec une organisation minimale.
|
Préparation des solutions d’essai “M4” et “M7”
12.
|
Elendt (1990) a décrit le milieu “M4”. Le milieu “M7” est préparé comme le milieu “M4”, sauf pour les substances reprises au tableau 1, dont les concentrations sont quatre fois plus faibles dans le milieu “M7” que dans le milieu “M4”. Une publication sur le milieu “M7” est en préparation (Elendt, communication personnelle). La solution d’essai ne doit pas être préparée selon les instructions d’Elendt et Bias (1990), car les concentrations de NaSiO35H2O, NaNO3, KH2PO4 et K2HPO4 indiquées pour la préparation des solutions mères ne conviennent pas.
|
Préparation du milieu “M7”
13.
|
Chaque solution mère (I) est préparée séparément et une solution mère combinée (II) est préparée à partir de ces solutions mères (I) (voir tableau 1). Cinquante millilitres de la solution mère combinée (II) additionnés de la quantité de chaque solution mère de macronutriments indiquée au tableau 2 sont amenés à 1 litre avec de l’eau désionisée pour préparer le milieu “M7”. On prépare une solution mère de vitamines en ajoutant trois vitamines à de l’eau désionisée, comme indiqué au tableau 3 et on verse 0,1 ml de la solution mère combinée de vitamines au milieu “M7” final, peu avant l’emploi (la solution mère de vitamines est stockée congelée par petites aliquotes). Le milieu est aéré et stabilisé.
|
BIBLIOGRAPHIE:
BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H. Köpp. Berlin 1995.
Tableau 1
Solutions mères d’éléments en traces pour les milieux M4 et M7
Solutions mères (I)
|
Quantité (mg) pour former une solution d’1 litre avec de l’eau désionisée
|
Pour préparer la solution mère combinée (II): mélanger les quantités suivantes (ml) de solutions mères (I) et compléter à 1 litre avec de l’eau désionisée
|
Concentrations finales dans les solutions expérimentales (mg/l)
|
M4
|
M7
|
M4
|
M7
|
H3BO3
(15)
|
57 190
|
1,0
|
0,25
|
2,86
|
0,715
|
MnCl2 · 4 H2O (15)
|
7 210
|
1,0
|
0,25
|
0,361
|
0,090
|
LiCl (15)
|
6 120
|
1,0
|
0,25
|
0,306
|
0,077
|
RbCl (15)
|
1 420
|
1,0
|
0,25
|
0,071
|
0,018
|
SrCl2 · 6 H2O (15)
|
3 040
|
1,0
|
0,25
|
0,152
|
0,038
|
NaBr (15)
|
320
|
1,0
|
0,25
|
0,016
|
0,004
|
Na2MoO4 · 2 H2O (15)
|
1 260
|
1,0
|
0,25
|
0,063
|
0,016
|
CuCl2 · 2 H2O (15)
|
335
|
1,0
|
0,25
|
0,017
|
0,004
|
ZnCl2
|
260
|
1,0
|
1,0
|
0,013
|
0,013
|
CaCl2 · 6 H2O
|
200
|
1,0
|
1,0
|
0,010
|
0,010
|
KI
|
65
|
1,0
|
1,0
|
0,0033
|
0,0033
|
Na2SeO3
|
43,8
|
1,0
|
1,0
|
0,0022
|
0,0022
|
NH4VO3
|
11,5
|
1,0
|
1,0
|
0,00058
|
0,00058
|
Na2EDTA · 2 H2O (15)
(16)
|
5 000
|
20,0
|
5,0
|
2,5
|
0,625
|
FeSO4 · 7 H2O (15)
(16)
|
1 991
|
20,0
|
5,0
|
1,0
|
0,249
|
Tableau 2
Solutions mères de macronutriments pour les milieux M4 et M7
|
Quantité (mg) pour former une solution d’1 litre avec de l’eau désionisée
|
Quantités de solutions mères de macronutriments ajoutées pour préparer les milieux M4 et M7
(ml/l)
|
Concentrations finales dans les solutions expérimentales M4 et M7
(mg/l)
|
CaCl2 · 2 H2O
|
293 800
|
1,0
|
293,8
|
MgSO4 · 7 H2O
|
246 600
|
0,5
|
123,3
|
KCl
|
58 000
|
0,1
|
5,8
|
NaHCO3
|
64 800
|
1,0
|
64,8
|
NaSiO3 · 9 H2O
|
50 000
|
0,2
|
10,0
|
NaNO3
|
2 740
|
0,1
|
0,274
|
KH2PO4
|
1 430
|
0,1
|
0,143
|
K2HPO4
|
1 840
|
0,1
|
0,184
|
Tableau 3
Solution mère de vitamines pour les milieux M4 et M7. Les trois solutions de vitamines seront mélangées de façon à ne former qu’une solution mère de vitamines
|
Quantité pour former une solution d’un litre avec de l’eau désionisée
(mg)
|
Quantité de solution mère de vitamines ajoutée pour préparer les milieux M4 et M7
(ml/l)
|
Concentrations finales dans les solutions d’essai M4 et M7
(mg/l)
|
Hydrochlorure de thiamine
|
750
|
0,1
|
0,075
|
Cyanocobalamine (B12)
|
10
|
0,1
|
0,0010
|
Biotine
|
7,5
|
0,1
|
0,00075
|
BIBLIOGRAPHIE:
Elendt, B.P. (1990). Selenium Deficiency in Crustacean. Protoplasma 154: 25-33.
Elendt, B.P. & W.-R. Bias (1990). Trace Nutrient Deficiency in Daphnia magna Cultured in Standard Medium for Toxicity Testing. Effects on the Optimization of Culture Conditions on Life History Parameters of D. magna. Water Research 24 (9): 1157-1167.
Appendice 3
PRÉPARATION DU SÉDIMENT RECONSTITUÉ
Composition du sédiment
Le sédiment sera reconstitué comme suit:
Ingrédient
|
Caractéristiques
|
% du sédiment
poids sec
|
Tourbe
|
Tourbe de sphaigne, pH aussi proche que possible de 5,5-6,0, pas de résidus de plantes visibles, finement broyée, particules (≤ 1 mm) et séchée à l’air
|
4 - 5
|
Sable quartzique
|
Dimension des particules: > 50 % des particules doivent mesurer entre 50 et 200 μm
|
75 - 76
|
Argile kaolinique
|
Taux de kaolinite ≥ 30 %
|
20
|
Carbone organique
|
Ajusté par l’addition de tourbe et de sable
|
2 (± 0,5)
|
Carbonate de calcium
|
CaCO3, pulvérisé, chimiquement pur
|
0,05 - 0,1
|
Eau
|
Conductivité ≤ 10 μS/cm
|
30 - 50
|
Préparation
La tourbe est séchée à l’air et broyée en poudre fine. Une suspension de la quantité requise de poudre de tourbe dans de l’eau désionisée est préparée à l’aide d’un homogénéisateur à haute performance. Le pH de cette suspension est ajusté à 5,5 ± 0,5 avec du CaCO3. La suspension est conditionnée durant au moins deux jours en l’agitant doucement à 20 ± 2 °C, afin de stabiliser le pH et d’établir une flore microbienne stable. Le pH est vérifié à nouveau; il devrait atteindre 6,0 ± 0,5. Ensuite la suspension de tourbe est mélangée avec les autres ingrédients (sable et argile kaolinique) et de l’eau désionisée pour former un sédiment homogène avec une teneur en eau de 30 à 50 % du poids sec du sédiment. Le pH du mélange final est encore mesuré et ajusté à 6,5-7,5 avec du CaCO3, si nécessaire. On prélève des échantillons de sédiment afin de déterminer le poids sec et la teneur en carbone organique. Ensuite, avant d’utiliser le sédiment reconstitué dans l’essai de toxicité sur les chironomes, il est recommandé de le conditionner durant sept jours dans des conditions identiques à celles qui seront appliquées durant l’essai subséquent.
Stockage
Les ingrédients secs destinés à la préparation du sédiment artificiel peuvent être entreposés dans un endroit sec et frais, à température ambiante. Le sédiment reconstitué (humide) ne doit pas être stocké avant son utilisation dans l’essai. Il doit être utilisé immédiatement après la période de conditionnement de sept jours qui achève sa préparation.
BIBLIOGRAPHIE:
Chapitre C.8 de la présente annexe: Toxicité pour les vers de terre.
Meller M., Egeler P., Rombke J., Schallnass H., Nagel R., Streit B. (1998). Short-term Toxicity of Lindane, Hexachlorobenzene and Copper Sulfate on Tubificid Sludgeworms (Oligochaeta) in Artificial MEDIA. Ecotox. and Environ. Safety 39: 10-20.
Appendice 4
Caractéristiques chimiques d’une eau de dilution acceptable
Substance
|
Concentrations
|
Matières particulaires
|
< 20 mg/l
|
Carbone organique total
|
< 2 mg/l
|
Ammoniac non ionisé
|
< 1 μg/l
|
Dureté en CaCO3
|
< 400 mg/l (17)
|
Chlore résiduel
|
< 10 μg/l
|
Totalité des pesticides organophosphorés
|
< 50 ng/l
|
Totalité des pesticides organochlorés et des biphényles polychlorés
|
< 50 ng/l
|
Chlore organique total
|
< 25 ng/l
|
Appendice 5
Conseils pour suivre l’émergence des larves de chironomes
Les béchers expérimentaux sont coiffés par des pièges à émergence, du 20e jour jusqu’à la fin de l’essai. Le schéma ci-dessous illustre un exemple de piège:
A: toile de nylon.
B: coupelles en plastique renversées.
C: bécher expérimental sans bec.
D: ouvertures recouvertes de toile par où s’effectuent les échanges.
E: eau.
F: sédiment.
C. 28. ESSAI DE TOXICITÉ SUR LES CHIRONOMES DANS UN SYSTÈME EAU CHARGÉE-SÉDIMENT
INTRODUCTION
1.
|
La présente méthode d’essai est équivalente à la ligne directrice 219 de l’OCDE (2004) pour les essais de produits chimiques. Elles est conçue pour évaluer les effets d’une exposition prolongée à des substances chimiques sur des larves de Chironomus sp., un diptère vivant dans les sédiments d’eau douce. Elle s’inspire principalement de la ligne directrice du BBA, dans laquelle l’exposition s’effectue à l’aide d’un système expérimental sédiment-eau, composé de sol artificiel et d’une colonne d’eau (1). Elle tient compte également des protocoles d’essais de toxicité sur Chironomus riparius et Chironomus tentans, mis au point en Europe et en Amérique du Nord (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) et soumis à des essais circulaires (1) (6) (9). D’autres espèces de chironomes bien documentées peuvent aussi être employées, par exemple Chironomus yoshimatsui (10) (11).
|
2.
|
Le scénario d’exposition appliqué dans la présente méthode d’essai consiste à introduire la substance d’essai dans l’eau. La sélection du scénario d’exposition dépend de la finalité de l’essai. Le scénario d’exposition qui consiste à doper la colonne d’eau, vise à simuler des pertes par dispersion lors de l’épandage de pesticides et couvre le pic de concentrations initial dans l’eau interstitielle. Il s’applique également à d’autres types d’exposition (notamment des fuites de produits chimiques), à l’exclusion des processus d’accumulation d’une durée supérieure à celle de l’essai.
|
3.
|
En général, les substances à tester sur des organismes vivant dans les sédiments subsistent longtemps dans ce compartiment. Ces organismes peuvent être exposés par diverses voies. L’importance relative de chaque voie d’exposition et le temps pris par chacune d’entre elles pour contribuer à l’effet toxique global dépendent des propriétés physico-chimiques de chaque substance chimique. Dans le cas des substances fortement adsorbantes (par exemple avec un log Koe > 5) ou des substances liées de façon covalente au sédiment, l’ingestion d’aliments contaminés peut constituer une voie d’exposition non négligeable. Afin de ne pas sous-estimer la toxicité des substances fortement lipophiles, on envisagera d’ajouter de la nourriture au sédiment avant l’application de la substance d’essai. La présente méthode d’essai est axée sur l’exposition à long terme, de façon à couvrir toutes les voies d’exposition potentielles. L’essai dure de 20 à 28 jours pour C. riparius et C. yoshimatsui et de 28 à 65 jours pour C. tentans. Si l’on a besoin de données à court terme pour un motif précis, par exemple pour étudier les effets de substances chimiques instables, des récipients supplémentaires, ajoutés au dispositif expérimental, peuvent être retirés après 10 jours d’essai.
|
4.
|
Les effets mesurés sont le nombre total d’adultes émergés et temps écoulé jusqu’à l’émergence. Si l’on a besoin de données à court terme, il est recommandé de ne mesurer la survie et la croissance des larves qu’après 10 jours, en ajoutant le nombre nécessaire de récipients supplémentaires.
|
5.
|
L’utilisation d’un sédiment reconstitué est recommandée en raison de ses avantages par rapport aux sédiments naturels:
—
|
la variabilité expérimentale est réduite parce que le sédiment reconstitué forme une “matrice normalisée” reproductible; en outre, il n’est plus nécessaire de trouver des sources de sédiments non contaminés et non pollués,
|
—
|
les essais peuvent être effectués à n’importe quel moment de l’année, la variabilité saisonnière n’intervenant plus et il n’est pas nécessaire de traiter préalablement le sédiment afin d’éliminer la faune indigène; l’utilisation de sédiments reconstitués diminue aussi le coût associé à la collecte sur le terrain d’une quantité suffisante de sédiments pour les essais systématiques,
|
—
|
les sédiments reconstitués permettent de comparer la toxicité des substances et de les classer en conséquence; les essais pratiqués sur des sédiments naturels et artificiels ont fourni des données de toxicité comparables pour plusieurs substances chimiques (2).
|
|
6.
|
L’appendice 1 contient les définitions applicables à la présente méthode d’essai.
|
PRINCIPE DE L’ESSAI
7.
|
Des chironomes au premier stade larvaire sont exposés à une gamme de concentrations de la substance d’essai dans un système sédiment-eau. L’essai débute par l’introduction de larves au premier stade dans les béchers expérimentaux contenant le système sédiment-eau et l’ajout de la substance d’essai à l’eau. L’émergence des chironomes et leur vitesse de développement sont mesurées à la fin de l’essai. La survie des larves et leur poids peuvent aussi être mesurés après 10 jours si nécessaire (en ajoutant le nombre d’expériences identiques requis). Ces données sont analysées, soit à l’aide d’un modèle de régression pour estimer la concentration qui entraînerait une réduction de x % de l’émergence ou de la survie des larves ou de leur croissance (par exemple CE15, CE50, etc.), soit par la vérification d’une hypothèse statistique afin de déterminer une CSEO/CMEO. Cette dernière requiert une comparaison entre les valeurs efficaces et les valeurs des témoins à l’aide de tests statistiques.
|
INFORMATIONS SUR LA SUBSTANCE D’ESSAI
8.
|
Il faudrait connaître l’hydrosolubilité de la substance d’essai, sa pression de vapeur, son coefficient de partage mesuré ou calculé dans le sédiment et sa stabilité dans l’eau et le sédiment. Il convient de disposer d’une méthode d’analyse fiable pour quantifier la substance d’essai dans l’eau sus-jacente, l’eau interstitielle et le sédiment, et pour laquelle la précision et le seuil de détection sont connus. Il est également utile de connaître la formule structurale et la pureté de la substance d’essai ainsi que son devenir chimique (par exemple dissipation, dégradation abiotique et biotique, etc.). Des indications complémentaires pour tester les substances se prêtant difficilement à l’essai en raison de leurs propriétés physico-chimiques sont fournies à la référence (12).
|
SUBSTANCES DE RÉFÉRENCE
9.
|
Des substances de référence pourront être testées régulièrement pour démontrer la fiabilité du protocole et des conditions de l’essai. Voici quelques exemples de toxiques de référence ayant fait leurs preuves dans des essais circulaires et des études de validation: lindane, trifluraline, pentachlorophénol, chlorure de cadmium et chlorure de potassium (1) (2) (5) (6) (13).
|
VALIDITÉ DE L’ESSAI
10.
|
Pour que l’essai soit valide, les conditions suivantes doivent être remplies:
—
|
l’émergence chez les témoins doit atteindre au moins 70 % à la fin de l’essai (1) (6),
|
—
|
s’agissant de C. riparius et C. yoshimatsui, l’émergence au stade adulte dans les récipients témoins doit avoir lieu entre 12 et 23 jours après leur introduction dans les récipients expérimentaux; C. tentans nécessite une période de 20 à 65 jours,
|
—
|
à la fin de l’essai, le pH et la concentration d’oxygène dissous seront mesurés dans chaque récipient. La concentration d’oxygène devrait atteindre au moins 60 % de la valeur de saturation en air (VSA) à la température appliquée et le pH de l’eau sus-jacente devrait être compris entre 6 et 9 dans tous les récipients expérimentaux,
|
—
|
la température de l’eau ne devrait pas varier de plus de ± 1,0 °C et pourrait être contrôlée grâce à une chambre isotherme, auquel cas la température de la chambre devra être confirmée à intervalles appropriés.
|
|
DESCRIPTION DE LA MÉTHODE
Récipients expérimentaux
11.
|
L’essai se déroule dans des béchers en verre de 600 ml, mesurant 8 cm de diamètre. D’autres récipients peuvent être utilisés à condition qu’ils permettent de garantir une profondeur adéquate d’eau et de sédiment. Le sédiment doit offrir une superficie de 2 à 3 cm2 par larve. Le quotient de la profondeur de la couche de sédiment par la profondeur de la couche d’eau sus-jacente doit être égal à 1/4. Les récipients et les autres appareils qui entreront en contact avec le système d’essai doivent être composés uniquement de verre ou d’un autre matériau chimiquement inerte (par exemple du Téflon).
|
Sélection des espèces
12.
|
Chironomus riparius est l’espèce qui convient le mieux. Chironomus tentans peut aussi être utilisé, mais il est plus difficile à manipuler et nécessite une période d’essai plus longue. Chironomus yoshimatsui convient également. La méthode de culture de Chironomus riparius est détaillée à l’appendice 2. D’autres documents décrivent les conditions de culture des autres espèces: Chironomus tentans (4) et Chironomus yoshimatsui (11). L’identification des espèces est à confirmer avant l’essai, mais n’est pas requise avant chaque essai si les organismes proviennent d’un élevage interne.
|
Sédiment
13.
|
Il est préférable d’employer un sédiment reconstitué (également dénommé sédiment artificiel ou synthétique). Néanmoins, si l’on opte pour un sédiment naturel, il faudrait le caractériser, au moins quant au pH et à la teneur en carbone organique (la détermination d’autres paramètres, tels que le rapport C/N et la granulométrie est aussi recommandée), et s’assurer qu’il n’est pas contaminé et n’abrite pas d’autres organismes qui pourraient entrer en compétition avec les chironomes ou les consommer. Avant d’utiliser un sédiment naturel dans un essai de toxicité sur les chironomes, il est également recommandé de le maintenir durant sept jours dans des conditions identiques à celles qui seront appliquées durant l’essai (conditionnement). Le sédiment reconstitué décrit ci-dessous, basé sur le sol artificiel utilisé dans la méthode d’essai C.8 est recommandé (14) (1) (15) (16):
a)
|
4-5 % (poids sec) de tourbe, avec un pH aussi proche que possible de 5,5 à 6,0; il est important d’utiliser une tourbe sous forme de poudre, finement broyée (dimension des particules ≤ 1 mm) et séchée uniquement à l’air;
|
b)
|
20 % (poids sec) d’argile kaolinique (teneur en kaolinite de préférence supérieure à 30 %);
|
c)
|
75-76 % (poids sec) de sable quartzique (composé en majorité de sable fin, plus de 50 % des particules mesurant entre 50 et 200 μm);
|
d)
|
ajouter de l’eau désionisée jusqu’à ce que la teneur en humidité du mélange final atteigne 30 à 50 %;
|
e)
|
ajouter du carbonate de calcium de qualité chimiquement pure (CaCO3) pour ajuster le pH du mélange final de sédiments à 7,0 ± 0,5;
|
f)
|
il convient d’obtenir 2 % (± 0,5 %) de carbone organique dans le mélange final en y ajoutant les quantités appropriées de tourbe et de sable, comme indiqué en a) et en c).
|
|
14.
|
Les sources de tourbe, d’argile kaolinique et de sable doivent être connues. On vérifiera que les composants du sédiment ne sont pas contaminés par des substances chimiques (par exemple des métaux lourds, des composés organochlorés, organophosphorés, etc.). Un exemple de préparation de sédiment reconstitué est décrit à l’appendice 3. Les composants peuvent aussi être mélangés à l’état sec, à condition de démontrer qu’après l’ajout de l’eau sus-jacente, les composants du sédiment ne se séparent pas (flottement de particules de tourbe, par exemple) et que la tourbe ou le sédiment sont suffisamment conditionnés.
|
Eau
15.
|
Toute eau conforme aux caractéristiques chimiques d’une eau de dilution acceptable selon les critères spécifiés aux appendices 2 et 4 convient à l’essai. Toute eau appropriée, naturelle (eau superficielle ou souterraine), reconstituée (voir appendice 2) ou eau du robinet déchlorée, est acceptable comme eau pour l’élevage et les essais si les chironomes y survivent sur toute la durée de l’élevage et de l’essai sans manifester de signes de stress. Au début de l’essai, le pH de l’eau d’essai se situera entre 6 et 9 et sa dureté totale ne dépassera pas 400 mg/l en CaCO3. Néanmoins, si l’on suspecte une interaction entre les ions qui provoquent la dureté et la substance d’essai, il faudra utiliser une eau moins dure (et ne pas employer le milieu Elendt M4 dans ce cas). Le même type d’eau doit être utilisé tout au long de l’étude. Les caractéristiques de la qualité de l’eau énumérées à l’appendice 4 sont à mesurer au moins deux fois par an ou chaque fois que ses caractéristiques sont susceptibles d’avoir été significativement modifiées.
|
Solutions mères – eau chargée
16.
|
Les concentrations expérimentales sont calculées en fonction des concentrations dans la colonne d’eau recouvrant le sédiment. Les solutions d’essai sont généralement préparées aux concentrations choisies par dilution d’une solution mère. Il est préférable de préparer les solutions mères en dissolvant la substance d’essai dans le milieu d’essai. Dans certains cas, il sera nécessaire d’utiliser des solvants ou des dispersants pour obtenir une solution mère à la concentration voulue. Voici quelques exemples de solvants appropriés: acétone, éthanol, méthanol, éthylèneglycol, monoéthyléther, diméthyléther d’éthylèneglycol, diméthylformamide et triéthylèneglycol. Les dispersants qui peuvent être utilisés sont le Cremophor RH40, le Tween 80, la méthylcellulose à 0,01 % et l’HCO-40. La concentration de l’agent solubilisant dans le milieu d’essai final doit être minimale (≤ 0,1 ml/l) et identique dans tous les traitements. L’agent solubilisant, s’il est utilisé, ne doit pas avoir d’effets significatifs sur la survie, ni d’effet nocif visible sur les larves de chironomes, et ce d’après l’observation des organismes du récipient témoin traité uniquement au solvant. Néanmoins, l’utilisation de ces substances est à éviter dans la mesure du possible.
|
CONCEPTION DE L’ESSAI
17.
|
La conception de l’essai définit le nombre et l’espacement des concentrations expérimentales, le nombre de récipients à chaque concentration et le nombre de larves par récipient. La marche à suivre pour estimer une valeur de CE, la CSEO et effectuer un essai limite est décrite. L’analyse de régression est préférable à une approche par vérification d’hypothèses.
|
Conduite d’une analyse de régression
18.
|
La concentration efficace (par exemple, CE15, CE50) et la gamme de concentrations dans laquelle l’effet de la substance d’essai est d’intérêt doivent être couvertes par les concentrations incluses dans l’essai. Généralement, l’exactitude, et plus particulièrement la validité, de l’estimation des concentrations efficaces (CEx) s’accroissent lorsque la concentration efficace se situe dans la gamme des concentrations testées. Il faut éviter d’extrapoler des résultats très en dessous de la concentration efficace la plus faible ou au-dessus de la concentration maximale. Il est utile de conduire un essai préliminaire de détermination de l’ordre de grandeur afin de délimiter la gamme des concentrations à appliquer (voir paragraphe 27).
|
19.
|
S’il faut estimer la CEx, au moins cinq concentrations et trois répétitions par concentration doivent être testées. En tout état de cause, il est recommandé de tester suffisamment de concentrations pour obtenir une bonne estimation du modèle. Le facteur séparant les concentrations ne doit pas excéder deux (sauf dans les cas où la courbe dose-effet présente une pente faible). Le nombre de répétitions par traitement peut être diminué si le nombre de concentrations expérimentales entraînant différents effets est augmenté. L’augmentation du nombre de répétitions ou la contraction des intervalles entre les concentrations expérimentales tend à réduire les intervalles de confiance pour l’essai. Le nombre de répétitions sera augmenté s’il y a lieu d’estimer le taux de survie et la croissance des larves après dix jours.
|
Procédure d’estimation d’une CSEO/CMEO
20.
|
S’il faut estimer la CMEO ou la CSEO, il convient de tester cinq concentrations expérimentales et au moins quatre répétitions par concentration, le facteur séparant les concentrations n’excédant pas deux. Le nombre d’expériences identiques doit être tel qu’il fournit une puissance statistique permettant de détecter une différence de 20 % avec le témoin, au seuil de signification statistique de 5 % (p = 0,05). S’agissant de la vitesse de développement, une analyse de la variance (ANOVA) convient généralement, telle que le test de Dunnett ou le test de Williams (17) (18) (19) (20). S’agissant du taux d’émergence, le test de Cochran-Armitage, le test exact de Fisher (avec correction selon Bonferroni) ou le test de Mantel-Haenszel peuvent être utilisés.
|
Essai limite
21.
|
Si l’essai préliminaire de détermination de l’ordre de grandeur des concentrations n’a engendré aucun effet, un essai limite peut être conduit (une concentration expérimentale et un témoin). L’essai limite vise à montrer que la concentration toxique de la substance d’essai est supérieure à la concentration limite testée. Aucune concentration ne peut être recommandée pour cette méthode d’essai; cela est laissé à l’appréciation des instances réglementaires. Généralement, il est nécessaire de mener au moins six répétitions pour les organismes traités et les témoins. Il y a lieu de démontrer que la puissance statistique est suffisante pour révéler une différence de 20 % avec les témoins, au seuil de signification statistique de 5 % (p = 0,05). En ce qui concerne l’effet sur la vitesse de développement et sur le poids, le test t constitue une méthode statistique appropriée, si les données respectent les conditions exigées par ce test (normalité, variances homogènes). On pourra recourir au test t à variance inégale ou à un test non paramétrique, tel que le test de Wilcoxon-Mann-Whitney si ces conditions ne sont pas remplies. S’agissant du taux d’émergence, le test exact de Fisher est approprié.
|
MODE OPÉRATOIRE
Conditions d’exposition
Préparation du système eau chargée-sédiment
22.
|
Une quantité appropriée de sédiment reconstitué (voir paragraphes 13-14 et appendice 3) est déposée dans les récipients expérimentaux, de façon à former une couche d’au moins 1,5 cm. La profondeur de l’eau versée sur ce sédiment atteindra 6 cm (voir paragraphe 15). Le ratio entre la profondeur du sédiment et la profondeur de l’eau n’excédera pas 1/4 et la couche de sédiment ne dépassera pas 3 cm. Le système sédiment-eau sera laissé sous aération légère pendant 7 jours avant l’ajout des organismes d’essai (voir paragraphe 14 et appendice 3). Afin d’éviter la séparation des constituants du sédiment et la resuspension des particules fines durant le remplissage de la colonne d’eau, on peut recouvrir le sédiment d’un disque en plastique et retirer le disque juste après le remplissage. D’autres dispositifs conviennent également.
|
23.
|
Les récipients expérimentaux doivent être couverts (par des plaques de verre, par exemple). On prendra soin de remplacer les volumes d’eau évaporée durant l’étude, le cas échéant, et ce avec de l’eau distillée ou désionisée afin d’empêcher l’accumulation de sels.
|
Introduction des organismes d’essai
24.
|
Quatre à cinq jours avant d’introduire les organismes d’essai dans les récipients, des amas d’œufs sont prélevés dans les cultures et déposés dans de petits flacons contenant du milieu de culture. Un milieu plus ancien issu de la culture mère tout comme un milieu fraîchement préparé peuvent être utilisés. Si ce dernier est utilisé, on ajoutera une petite quantité de nourriture, par exemple des algues vertes et/ou quelques gouttes du filtrat d’une suspension de paillettes pour poissons finement broyées, au milieu de culture (voir appendice 2). Seuls des amas d’œufs fraîchement pondus peuvent être utilisés. Normalement, les larves commencent à éclore quelques jours après la ponte (2 à 3 jours pour Chironomus riparius à 20 °C et 1 à 4 jours pour Chironomus tentans à 23 °C et Chironomus yoshimatsui à 25 °C) et le développement des larves se déroule en quatre stades, dont chacun dure 4 à 8 jours. Cet essai se pratique au premier stade larvaire (2-3 ou 1-4 jours après l’éclosion). Il est possible de vérifier le stade de développement des moucherons d’après la largeur de la capsule céphalique (6).
|
25.
|
Vingt larves au premier stade, choisies au hasard, sont déposées dans chaque récipient contenant le sédiment chargé et l’eau, à l’aide d’une pipette émoussée. L’aération de l’eau doit être interrompue dès qu’on introduit les larves dans les récipients expérimentaux, et ce durant 24 heures après l’ajout des larves (voir paragraphes 24 et 32). Selon le protocole expérimental suivi (voir paragraphes 19 et 20), le nombre de larves utilisées par concentration s’élève au moins à 60 pour l’estimation d’une valeur de concentration efficace (CE) et à 80 pour la détermination de la CSEO.
|
26.
|
Vingt-quatre heures après l’introduction des larves dans les récipients expérimentaux, la substance d’essai est ajoutée à la colonne d’eau sus-jacente et une légère aération est à nouveau dispensée. De petits volumes de la solution contenant la substance d’essai sont injectés en dessous de la surface de la colonne d’eau à l’aide d’une pipette. Ensuite, il convient de mélanger l’eau sus-jacente en prenant soin de ne pas remuer le sédiment.
|
Concentrations d’essai
27.
|
Il peut être utile de conduire un essai de détermination de l’ordre de grandeur pour délimiter la gamme de concentrations à appliquer dans l’essai proprement dit. À cet effet, on utilise une série de concentrations largement espacées de la substance d’essai. Afin de reproduire la même densité de surface par chironome que dans l’essai proprement dit, les chironomes sont exposés à chaque concentration de la substance d’essai durant une période permettant d’estimer les concentrations expérimentales appropriées et aucune expérience identique n’est nécessaire.
|
28.
|
Les concentrations expérimentales pour l’essai définitif sont choisies en fonction des résultats de l’essai de détermination de l’ordre de grandeur. Au moins cinq concentrations doivent être appliquées et sélectionnées comme indiqué aux paragraphes 18 à 20.
|
Témoins
29.
|
L’essai comportera le nombre nécessaire de récipients témoins pourvus du sédiment mais exempts de toute substance d’essai (voir paragraphes 19-20). Si la substance d’essai a été appliquée à l’aide d’un solvant (voir paragraphe 16), il convient d’ajouter un témoin dont le sédiment contient également le solvant.
|
Système expérimental
30.
|
Des systèmes statiques sont utilisés. Des systèmes semi-statiques ou à écoulement continu avec renouvellement intermittent ou continu de l’eau sus-jacente peuvent être utilisés dans des cas exceptionnels, par exemple si les spécifications de la qualité de l’eau deviennent inappropriées pour l’organisme d’expérience ou affectent l’équilibre chimique (si, par exemple, la concentration d’oxygène dissous devient trop basse, la concentration des excréta augmente de façon trop importante ou si des minéraux lessivés à partir du sédiment affectent le pH et/ou la dureté de l’eau). Néanmoins, d’autres méthodes d’amélioration de la qualité de l’eau sus-jacente, telles que l’aération, seront normalement suffisantes et préférables.
|
Alimentation
31.
|
Les larves ont besoin d’être nourries, de préférence quotidiennement ou au moins trois fois par semaine. Durant les dix premiers jours, chaque jeune larve recevra quotidiennement 0,25 à 0,5 mg (0,35-0,5 mg pour C. yoshimatsui) de nourriture pour poissons (suspendue dans l’eau ou finement broyée, par exemple TetraMin ou TetraPhyll; voir les détails à l’appendice 2). Il peut être nécessaire d’augmenter légèrement cette quantité pour les larves plus âgées: 0,5-1 mg par larve et par jour devrait suffire pour le reste de l’essai. On diminuera la ration alimentaire de tous les organismes traités et témoins si des champignons se développent ou si des organismes témoins meurent. Si la croissance fongique s’avère impossible à enrayer, l’essai doit être renouvelé. Si l’essai porte sur des substances fortement adsorbantes (par exemple avec un log Koe > 5) ou des substances liées de façon covalente au sédiment, la quantité de nourriture nécessaire à la survie et à la croissance naturelle des organismes peut être incorporée au sédiment reconstitué avant la période de stabilisation. Dans ce cas, la nourriture pour poissons est remplacée par une ration végétale, par exemple 0,5 % (poids sec) de feuilles finement broyées d’ortie (Urtica dioica), de mûrier (Morus alba), de trèfle blanc ou rampant (Trifolium repens), d’épinard (Spinacia oleracea) ou d’un autre matériau végétal (Cerophyl ou alpha-cellulose).
|
Conditions d’incubation
32.
|
L’eau sus-jacente est soumise à une légère aération, mise en œuvre de préférence 24 heures après l’introduction des larves et maintenue jusqu’à la fin de l’essai (il faut veiller à ce que la concentration d’oxygène dissous ne tombe pas en dessous de 60 % de la valeur de saturation en air). L’air est insufflé à travers une pipette Pasteur en verre fixée 2 à 3 cm au-dessus de la couche de sédiment (une ou quelques bulles par seconde). Si la substance d’essai est volatile, il faudra éventuellement supprimer l’aération.
|
33.
|
L’essai est mené à température constante (20 °C ± 2 °C). Pour C. tentans et C. yoshimatsui, les températures recommandées s’élèvent respectivement à 23 °C et 25 °C (± 2 °C). La photopériode est de 16 heures et l’éclairement compris entre 500 et 1 000 lux.
|
Durée de l’exposition
34.
|
L’exposition débute avec l’introduction des larves dans les récipients traités et témoins. La durée maximale d’exposition atteint 28 jours pour C. riparius et C. yoshimatsui et 65 jours pour C. tentans. Si les moucherons émergent plus tôt, l’essai peut s’achever au moins cinq jours après l’émergence du dernier adulte témoin.
|
OBSERVATIONS
Émergence
35.
|
La durée du développement et le nombre total de moucherons mâles et femelles adultes totalement émergés sont à déterminer. Les mâles sont faciles à identifier grâce à leurs antennes plumeuses.
|
36.
|
Au moins trois fois par semaine, on vérifiera que les organismes des récipients d’essai ne manifestent aucun comportement anormal (sortie du sédiment, nage inhabituelle, par exemple) par rapport aux témoins. Chaque jour, durant la période supposée de l’émergence, il faut compter le nombre de moucherons émergés et consigner le sexe et le nombre de moucherons complètement émergés. Une fois identifiés, les moucherons sont retirés des récipients. Tout amas d’œufs déposé avant la fin de l’essai doit être recensé puis enlevé afin d’empêcher la réintroduction de larves dans le sédiment. Le nombre de pupes visibles n’ayant pas réussi à émerger est aussi enregistré. Des indications sur la façon de mesurer l’émergence sont données à l’appendice 5.
|
Croissance et survie
37.
|
S’il faut fournir des données sur la survie et la croissance des larves après 10 jours, des récipients expérimentaux supplémentaires seront inclus dès le début de l’essai, pour pouvoir être utilisés ultérieurement. Le sédiment de ces récipients supplémentaires est tamisé à travers des mailles de 250 μm pour retenir les larves. La mort est déterminée par deux critères: l’immobilité et l’absence de réaction à un stimulus mécanique. Les larves non récupérées doivent aussi être comptabilisées parmi les mortes (les larves qui sont mortes au début de l’essai ont pu être dégradées par des microbes). Après avoir déterminé le poids sec (sans cendres) des larves survivantes par récipient expérimental, on calcule le poids sec individuel moyen par récipient. Il est utile d’établir à quel stade se trouvent les larves survivantes, et ce d’après la largeur de la capsule céphalique de chaque individu.
|
Mesures analytiques
Concentration de la substance d’essai
38.
|
Il est recommandé d’analyser, au minimum, des échantillons de l’eau sus-jacente, de l’eau interstitielle, et du sédiment, au début (de préférence une heure après l’application de la substance d’essai) et à la fin de l’essai, et ce pour la concentration la plus élevée et pour une concentration plus faible. La concentration de la substance d’essai nous renseigne sur le comportement et la répartition de la substance d’essai dans le système eau-sédiment. Le prélèvement d’échantillons de sédiment au début de l’essai risque de perturber le système d’essai (enlèvement de larves, par exemple), il faut donc inclure des récipients expérimentaux supplémentaires pour effectuer des déterminations analytiques au début de l’essai et, s’il y a lieu, au cours de l’essai (voir paragraphe 39). Il n’est pas forcément nécessaire d’analyser le sédiment si la répartition de la substance d’essai entre l’eau et le sédiment a été clairement déterminée par une étude eau/sédiment menée dans des conditions comparables (par exemple, quotient sédiment/eau, type d’application, teneur en carbone organique du sédiment).
|
39.
|
Lorsqu’on effectue des mesures intermédiaires (par exemple au septième jour) et si l’analyse requiert des échantillons volumineux qui ne peuvent être prélevés des récipients sans influencer le système expérimental, les analyses seront pratiquées sur des échantillons provenant de récipients expérimentaux supplémentaires traités de la même façon (y compris par la présence des organismes d’essai), mais non utilisés pour les observations biologiques.
|
40.
|
Pour isoler l’eau interstitielle, on recommande de centrifuger des échantillons à 10 000 g et à 4 °C durant 30 minutes. Cependant, s’il est démontré que la substance d’essai ne s’adsorbe pas sur les filtres, la filtration est également acceptable. Avec des échantillons trop petits, il arrive que les concentrations dans l’eau interstitielle soient impossibles à analyser.
|
Paramètres physico-chimiques
41.
|
Le pH, l’oxygène dissous dans l’eau d’essai et la température des récipients expérimentaux doivent être mesurés de façon appropriée (voir paragraphe 10). La dureté de l’eau et la teneur en ammoniac sont mesurées dans les récipients témoins et dans un récipient traité à la concentration la plus élevée, au début et à la fin de l’essai.
|
RÉSULTATS ET RAPPORT
Traitement des résultats
42.
|
Cet essai vise à déterminer l’effet de la substance d’essai sur la vitesse de développement et le nombre total de moucherons mâles et femelles totalement émergés ou, dans le cas de l’essai de 10 jours, les effets sur la survie et le poids des larves. Si rien n’indique que les deux sexes présentent des différences statistiques de sensibilité, les résultats obtenus sur les mâles et les femelles peuvent être regroupés pour l’analyse statistique. Les différences de sensibilité entre les sexes peuvent être appréciées statistiquement par un test (de tableau) a χ2 - r x 2, par exemple. La survie des larves et le poids sec individuel moyen par récipient doivent être déterminés après dix jours, le cas échéant.
|
43.
|
Il est préférable de calculer les concentrations efficaces, exprimées en concentrations dans l’eau sus-jacente, en fonction des concentrations mesurées au début de l’essai (voir paragraphe 38).
|
44.
|
Pour estimer ponctuellement la CE50 ou une quelconque CEx, les statistiques par récipient peuvent être utilisées comme des expériences identiques proprement dites. Lorsqu’on calcule un intervalle de confiance pour une quelconque CEx, il faut tenir compte de la variabilité entre les récipients ou montrer que celle-ci est négligeable. Si le modèle est ajusté par la méthode des moindres carrés, il convient d’appliquer une transformation des données pour les statistiques par récipient afin d’accroître l’homogénéité de la variance. Toutefois, les valeurs de la CEx sont à calculer après que les résultats ont été “retransformés” de façon à recouvrer leur valeur originale.
|
45.
|
Si l’analyse statistique vise à déterminer la CSEO/CMEO par la vérification d’hypothèses, la variabilité entre les récipients doit être prise en compte, par exemple à l’aide d’une analyse de la variance (ANOVA) “emboîtée”. Par contre, des tests plus robustes (21) peuvent être utilisés au cas où les hypothèses habituelles de l’analyse de la variance ne se vérifient pas.
|
Taux d’émergence
46.
|
Le taux d’émergence donne une réponse par tout ou rien et peut être analysé par le test de Cochran-Armitage appliqué de façon régressive si la relation dose-effet est supposée être monotone et si les taux d’émergence corroborent cette hypothèse. Dans le cas contraire, un test exact de Fisher ou un test de Mantel-Haenszel avec des valeurs de p corrigées selon Bonferroni-Holm peuvent être employés. S’il s’avère que la variabilité entre expériences identiques à la même concentration est supérieure à ce qu’une distribution binomiale indiquerait (variation souvent qualifiée d’“extra-binomiale”), on appliquera un test plus robuste (Cochran-Armitage ou test exact de Fisher) comme proposé à la référence (21).
|
47.
|
La somme des moucherons émergés par récipient, ne, est déterminée et divisée par le nombre de larves introduites, na:
où:
TE
|
=
|
taux d’émergence
|
ne
|
=
|
nombre de moucherons émergés par récipient
|
ne
|
=
|
nombre de larves introduites par récipient
|
|
48.
|
Une variante plus appropriée aux échantillons de grande taille, lorsque la variance est extra-binomiale, consiste à traiter le taux d’émergence comme une réponse continue et à appliquer une méthode telle que le test de Williams, si la relation dose-effet est supposée être monotone et si les résultats du taux d’émergence corroborent cette hypothèse. Le test de Dunnett convient dans le cas où la relation ne s’avère pas monotone. Ici, on considère qu’un échantillon est de grande taille lorsque le nombre de moucherons émergés et le nombre de chironomes non émergés dépassent chacun cinq, par récipient d’essai.
|
49.
|
Pour appliquer l’analyse de la variance (ANOVA), il convient d’appliquer aux valeurs de TE une transformation “arcsinus-racine carrée” ou “Freeman-Tukey” afin d’obtenir une distribution proche de la normale et d’égaliser les variances. Le test de Cochran-Armitage, le test exact de Fisher (avec correction de Bonferroni) ou le test de Mantel-Haenszel peuvent être employés lorsqu’on utilise des fréquences absolues. La transformation arcsinus-racine carrée consiste à calculer l’inverse du sinus (sinus-1) de la racine carrée du TE.
|
50.
|
Pour les taux d’émergence, les valeurs de la CEx sont calculées par une analyse de régression [ou par probit (22), logit, Weibull, des logiciels commerciaux appropriés, etc.]. Si l’analyse de la régression échoue (par exemple, lorsqu’il y a moins de deux réponses partielles), on fait appel à d’autres méthodes non paramétriques telles que la moyenne mobile ou une simple interpolation.
|
Vitesse de développement
51.
|
La période moyenne de développement représente le temps moyen écoulé entre l’introduction des larves (jour 0 de l’essai) et l’émergence de la cohorte expérimentale de moucherons (pour calculer la période réelle de développement, il faut tenir compte de l’âge des larves au moment de l’introduction). La vitesse de développement est l’inverse de la période de développement (unité: 1/jour) et représente la partie du développement larvaire qui s’effectue par jour. Pour évaluer la toxicité dans les sédiments, il est préférable de choisir la vitesse de développement car sa variance est plus faible et ses valeurs sont plus homogènes et plus proches d’une distribution normale, en comparaison avec la période de développement. C’est pourquoi les tests paramétriques puissants conviennent mieux à la vitesse de développement qu’à la période de développement. Si la vitesse de développement est traitée comme une réponse continue, les valeurs de la CEx peuvent être estimées par l’analyse de la régression, par exemple (23), (24).
|
52.
|
Pour les tests statistiques suivants, le nombre de moucherons observés le jour x sont considérés comme ayant émergé au milieu de l’intervalle de temps compris entre le jour x et le jour x - 1 (1 = longueur de l’intervalle d’observation, habituellement 1 jour). La vitesse de développement moyenne par récipient (x) est calculée comme suit:
où:
|
:
|
vitesse de développement moyenne par récipient
|
i
|
:
|
indice de l’intervalle d’observation
|
m
|
:
|
nombre maximal d’intervalles d’observation
|
|
:
|
nombre de moucherons émergés durant l’intervalle d’observation i
|
ne
|
:
|
nombre total de moucherons émergés à la fin de l’expérience (= )
|
xi
|
:
|
vitesse de développement des moucherons émergés durant l’intervalle i
|
où:
jouri
|
:
|
jour d’observation (compté à partir de l’application)
|
li
|
:
|
durée de l’intervalle d’observation i (exprimée en jours, habituellement 1 jour)
|
|
Rapport d’essai
53.
|
Le rapport d’essai doit fournir au moins les informations suivantes:
|
Substance d’essai:
—
|
état physique et, s’il y a lieu, propriétés physico-chimiques (hydrosolubilité, pression de vapeur, coefficient de partage dans le sol (ou dans le sédiment s’il est connu), stabilité dans l’eau, etc.),
|
—
|
identification chimique (nom courant, nom chimique, formule structurale, numéro CAS, etc.), pureté et méthode d’analyse pour la quantification de la substance d’essai.
|
|
|
Espèce d’essai:
—
|
animal d’essai utilisé: espèce, nom scientifique, source et conditions d’élevage,
|
—
|
informations sur la manipulation des amas d’œufs et des larves,
|
—
|
âge des animaux d’expérience au moment où ils ont été déposés dans les récipients d’essai.
|
|
|
Conditions expérimentales:
—
|
sédiment utilisé, c’est-à-dire naturel ou reconstitué,
|
—
|
pour les sédiments naturels: localisation et description du site de prélèvement et notamment, si possible, son histoire en matière de contamination; caractéristiques: pH, teneur en carbone organique, quotient C/N et granulométrie, le cas échéant,
|
—
|
préparation du sédiment reconstitué: ingrédients et caractéristiques (teneur en carbone organique, pH, humidité, etc. au début de l’essai),
|
—
|
préparation de l’eau d’essai (si l’eau est reconstituée) et caractéristiques (concentration d’oxygène, pH, conductivité, dureté, etc. au début de l’essai),
|
—
|
profondeur du sédiment et de l’eau sus-jacente,
|
—
|
volume de l’eau sus-jacente et de l’eau interstitielle; poids du sédiment humide avec et sans eau interstitielle,
|
—
|
récipients expérimentaux (matériau et dimension),
|
—
|
méthode de préparation des solutions mères et des concentrations expérimentales,
|
—
|
application de la substance d’essai: concentrations expérimentales utilisées, nombre d’expériences identiques et utilisation d’un solvant, le cas échéant,
|
—
|
conditions d’incubation: température, cycle et intensité de lumière, aération (fréquence et intensité),
|
—
|
informations détaillées sur la nourriture: type de nourriture, préparation, quantité et régime d’administration.
|
|
|
Résultats:
—
|
concentrations d’essai nominales, concentrations d’essai mesurées et résultats de toutes les analyses conduites pour déterminer la concentration de la substance d’essai dans le récipient expérimental,
|
—
|
qualité de l’eau dans les récipients expérimentaux: pH, température, oxygène dissous, dureté et teneur en ammoniac,
|
—
|
remplacement de l’eau d’essai évaporée, le cas échéant,
|
—
|
nombre de moucherons mâles et femelles émergés par récipient et par jour,
|
—
|
nombre de larves non émergées sous la forme de moucherons par récipient,
|
—
|
poids sec individuel moyen des larves par récipient, et par stade larvaire, s’il y a lieu,
|
—
|
pourcentage d’émergence par expérience identique et par concentration d’essai (regroupement des résultats pour les moucherons mâles et femelles),
|
—
|
vitesse de développement moyenne des moucherons totalement émergés par expérience identique et par concentration d’essai (regroupement des résultats pour les moucherons mâles et femelles),
|
—
|
estimation des effets toxiques observés, par exemple CEx (et intervalles de confiance associés), CSEO et/ou CMEO, et méthodes statistiques employées pour les déterminer,
|
—
|
analyse des résultats, y compris les répercussions sur les résultats d’un écart éventuel à la présente méthode d’essai.
|
|
|
BIBLIOGRAPHIE:
(1)
|
BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H. Köpp. Berlin 1995.
|
(2)
|
Fleming R. et al. (1994). Sediment Toxicity Tests for Poorly Water-Soluble Substances. Final Report to the European Commission. Report No: EC 3738. August 1994. WRc, UK.
|
(3)
|
SETAC (1993). Guidance Document on Sediment toxicity Tests and Bioassays for Freshwater and Marine Environments. From the WOSTA Workshop held in the Netherlands.
|
(4)
|
ASTM International/E1706-00 (2002). Test Method for Measuring the Toxicity of Sediment-Associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. pp 1125-1241. In ASTM International 2002 Annual Book of Standards. Volume 11.05. Biological Effects and Environmental Fate; Biotechnology; Pesticides. ASTM International, West Conshohocken, PA.
|
(5)
|
Environnement Canada (1997). Essai de croissance et de survie de larves de moucherons d’eau douce (Chironomus tentans ou Chironomus riparius). Méthode d’essai biologique. Rapport SPE 1/RM/32. Décembre 1997.
|
(6)
|
US-EPA (2000). Methods for Measuring the Toxicity and Bioaccumulation of Sediment-associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. Second edition. EPA 600/R-99/064. March 2000. Revision to the first edition dated June 1994.
|
(7)
|
US-EPA/OPPTS 850.1735. (1996): Whole Sediment Acute Toxicity Invertebrates.
|
(8)
|
US-EPA/OPPTS 850.1790. (1996): Chironomid Sediment toxicity Test.
|
(9)
|
Milani D., Day K.E., McLeay D.J., Kirby R.S. (1996). Recent intra- and inter-laboratory studies related to the development and standardisation of Environment Canada’s biological test methods for measuring sediment toxicity using freshwater amphipods (Hyalella azteca) and midge larvae (Chironomus riparius). Technical Report. Environment Canada. National Water Research Institute. Burlington, Ontario, Canada.
|
(10)
|
Sugaya Y. (1997). Intra-specific variations of the susceptibility of insecticides in Chironomus yoshimatsui. Jp. J. Sanit. Zool. 48 (4): 345-350.
|
(11)
|
Kawai K. (1986). Fundamental studies on Chironomid allergy. I. Culture methods of some Japanese Chironomids (Chironomidae, Diptera). Jp. J. Sanit. Zool. 37(1): 47-57.
|
(12)
|
OCDE (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. OCDE Publications Hygiène et sécurité de l’environnement – Série sur les essais et évaluations, no 23.
|
(13)
|
Environnement Canada (1995). Document d’orientation sur la mesure de la précision des essais de toxicité au moyen de sédiments de contrôle dopés avec un produit toxique de référence. Rapport SPE 1/RM/30. Septembre 1995.
|
(14)
|
Chapitre C.8 de la présente annexe, Toxicité pour les vers de terre.
|
(15)
|
Suedel B.C. and Rodgers J.H. (1994). Development of formulated reference sediments for freshwater and estuarine sediment testing. Environ. Toxicol. Chem. 13: 1163-1175.
|
(16)
|
Naylor C. and Rodrigues C. (1995). Development of a test method for Chironomus riparius using a formulated sediment. Chemosphere 31: 3291-3303.
|
(17)
|
Dunnett C.W. (1964). A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Amer. Statis. Assoc. 50: 1096-1121.
|
(18)
|
Dunnett C.W. (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics 20: 482-491.
|
(19)
|
Williams D.A. (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27: 103-117.
|
(20)
|
Williams D.A. (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics 28: 510-531.
|
(21)
|
Rao J.N.K. and Scott A.J. (1992). A simple method for the analysis of clustered binary data. Biometrics 48: 577-585.
|
(22)
|
Christensen E.R. (1984). Dose-response functions in aquatic toxicity testing and the Weibull model. Water Research 18: 213-221.
|
(23)
|
Bruce and Versteeg (1992). A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry 11: 1485-1494.
|
(24)
|
Slob W. (2002). Dose-response modelling of continuous endpoints. Toxicol. Sci. 66: 298-312.
|
Appendice 1
DÉFINITIONS
Les définitions suivantes s’appliquent aux fins de la présente méthode d’essai:
|
Le sédiment reconstitué, ou artificiel ou synthétique, désigne le mélange de matériaux utilisés pour reproduire au mieux les composants physiques d’un sédiment naturel.
|
|
L’eau sus-jacente est l’eau recouvrant le sédiment dans le récipient d’essai.
|
|
L’eau interstitielle, ou l’eau des pores, se réfère à l’eau qui occupe les vides laissés entre le sédiment et les particules de sol.
|
|
L’eau chargée est l’eau d’essai à laquelle on a ajouté la substance d’essai.
|
|
Une substance d’essai est toute substance ou tout mélange soumis à un essai réalisé suivant la présente méthode d’essai.
|
Appendice 2
Recommandations pour la culture de Chironomus riparius
1.
|
Les larves de Chironomus peuvent être élevées dans des cristallisoirs ou de grands récipients. Du sable quartzique fin est déposé en couche mince (environ 5 à 10 mm d’épaisseur) sur le fond du récipient. Le Kieselguhr (par exemple l’art. 8117 de Merck) convient aussi comme substrat (une couche encore plus mince de quelques millimètres à peine suffit). Une eau de qualité appropriée, profonde de plusieurs centimètres, vient ensuite recouvrir le substrat. En cas d’évaporation, le niveau d’eau doit toujours être ramené à sa hauteur initiale, afin de prévenir toute dessiccation. L’eau peut être remplacée, si nécessaire. Une légère aération est fournie. Les récipients d’élevage des larves doivent être placés dans des cages appropriées, afin d’empêcher la fuite des adultes émergeant. La cage sera suffisamment grande pour permettre aux adultes émergés d’essaimer, sans quoi la copulation risque de ne pas avoir lieu (dimensions minimales: 30 × 30 × 30 cm).
|
2.
|
Les cages doivent être gardées à température ambiante, ou à 20 ± 2 °C si elles sont placées dans une chambre à ambiance constante, avec une photopériode de 16 heures de lumière (intensité: environ 1 000 lux) et 8 heures d’obscurité. Une humidité relative de l’air inférieure à 60 % pourrait empêcher la reproduction.
|
Eau de dilution
3.
|
Toute eau naturelle ou reconstituée appropriée peut être utilisée. L’eau d’un puits, de l’eau du robinet déchlorée et un milieu artificiel (Elendt “M4” ou “M7”, voir ci-après) sont souvent utilisés. L’eau doit être aérée avant l’emploi. Si nécessaire, on peut renouveler l’eau de culture en versant ou en siphonnant soigneusement l’eau usée des récipients expérimentaux, sans détruire les tubes des larves.
|
Alimentation des larves
4.
|
Les larves de Chironomus reçoivent des paillettes pour poissons (Tetra Min®, Tetra Phyll® ou une autre marque déposée équivalente), à raison d’environ 250 mg par récipient et par jour. Cette nourriture peut être administrée sous la forme d’une poudre moulue à sec ou d’une suspension dans l’eau: 1,0 g de paillettes ajoutées à 20 ml d’eau de dilution et agitées de façon à obtenir un mélange homogène. Cette préparation peut être administrée à raison d’environ 5 ml par récipient et par jour (agiter avant emploi). Les larves plus âgées peuvent en recevoir plus.
|
5.
|
La nourriture est ajustée en fonction de la qualité de l’eau. Si le milieu de culture devient trouble, il convient de réduire la ration. Les quantités de nourriture données sont soigneusement notées. Un manque de nourriture fera émigrer les larves vers la colonne d’eau, tandis qu’un excès de nourriture intensifiera l’activité microbienne et abaissera la concentration d’oxygène. Ces deux conditions sont susceptibles de ralentir la croissance des organismes.
|
6.
|
Certaines cellules d’algues vertes (Scenedesmus subspicatus, Chlorella vulgaris) peuvent aussi être ajoutées lors de la préparation de nouveaux récipients de culture.
|
Alimentation des adultes émergeant
7.
|
Certains expérimentateurs ont suggéré de nourrir les adultes émergés au moyen d’un tampon d’ouate imbibé d’une solution de sucrose saturée.
|
Émergence
8.
|
À 20 ± 2 °C, les adultes commencent à émerger des récipients d’élevage des larves après environ 13 à 15 jours. Il est facile de distinguer les mâles d’après leurs antennes plumeuses.
|
Amas d’œufs
9.
|
Dès que des adultes sont présents dans la cage d’élevage, il faut vérifier trois fois par semaine, dans tous les récipients d’élevage de larves, si des amas d’œufs gélatineux n’ont pas été déposés. Le cas échéant, les amas d’œufs doivent être soigneusement enlevés et transférés dans un petit récipient contenant un échantillon de l’eau d’élevage. Les amas d’œufs sont utilisés pour préparer un nouveau récipient de culture (2 à 4 amas d’œufs par récipient, par exemple) ou pratiquer des essais de toxicité.
|
10.
|
Les larves au premier stade devraient éclore après 2-3 jours.
|
Préparation de nouveaux récipients de culture
11.
|
Une fois que les cultures ont été lancées, il devrait être possible de préparer un nouveau récipient de culture de larves, une fois par semaine ou moins souvent, suivant les besoins de l’essai, et de retirer les récipients plus anciens après que les moucherons adultes ont émergé. Ce système permet d’obtenir régulièrement un contingent d’adultes, avec une organisation minimale.
|
Préparation des solutions d’essai “M4” et “M7”
12.
|
Elendt (1990) a décrit le milieu “M4”. Le milieu “M7” est préparé comme le milieu “M4”, sauf pour les substances reprises au tableau 1, dont les concentrations sont quatre fois plus faibles dans le milieu “M7” que dans le milieu “M4”. Une publication sur le milieu “M7” est en préparation (Elendt, communication personnelle). La solution d’essai ne doit pas être préparée selon les instructions d’Elendt et Bias (1990), car les concentrations de NaSiO3 5 H2O, NaNO3, KH2PO4 et K2HPO4 indiquées pour la préparation des solutions mères ne conviennent pas.
|
Préparation du milieu “M7”
13.
|
Chaque solution mère (I) est préparée séparément et une solution mère combinée (II) est préparée à partir de ces solutions mères (I) (voir tableau 1). 50 ml de la solution mère combinée (II) additionnés de la quantité de chaque solution mère de macronutriments indiquée au tableau 2 sont amenés à 1 l avec de l’eau désionisée pour composer le milieu “M7”. On prépare une solution mère de vitamines en ajoutant trois vitamines à de l’eau désionisée, comme indiqué au tableau 3 et on verse 0,1 ml de la solution mère combinée de vitamines au milieu “M7” final, peu avant l’emploi (la solution mère de vitamines est stockée congelée par petites aliquotes). Le milieu est aéré et stabilisé
Tableau 1
Solutions mères d’éléments en traces pour les milieux M4 et M7
Solutions mères (I)
|
Quantité (mg) pour former une solution d'un litre avec de l’eau désionisée
|
Pour préparer la solution mère combinée (II): mélanger les quantités suivantes (ml) de solutions mères (I) et compléter à un litre avec de l’eau désionisée
|
Concentrations finales dans les solutions expérimentales (mg/l)
|
M4
|
M7
|
M4
|
M7
|
H3BO3
(18)
|
57 190
|
1,0
|
0,25
|
2,86
|
0,715
|
MnCl2 • 4 H2O (18)
|
7 210
|
1,0
|
0,25
|
0,361
|
0,090
|
LiCl (18)
|
6 120
|
1,0
|
0,25
|
0,306
|
0,077
|
RbCl (18)
|
1 420
|
1,0
|
0,25
|
0,071
|
0,018
|
SrCl2 • 6 H2O (18)
|
3 040
|
1,0
|
0,25
|
0,152
|
0,038
|
NaBr (18)
|
320
|
1,0
|
0,25
|
0,016
|
0,004
|
Na2MoO4 • 2 H2O (18)
|
1 260
|
1,0
|
0,25
|
0,063
|
0,016
|
CuCl2 • 2 H2O (18)
|
335
|
1,0
|
0,25
|
0,017
|
0,004
|
ZnCl2
|
260
|
1,0
|
1,0
|
0,013
|
0,013
|
CaCl2 • 6 H2O
|
200
|
1,0
|
1,0
|
0,010
|
0,010
|
KI
|
65
|
1,0
|
1,0
|
0,0033
|
0,0033
|
Na2SeO3
|
43,8
|
1,0
|
1,0
|
0,0022
|
0,0022
|
NH4VO3
|
11,5
|
1,0
|
1,0
|
0,00058
|
0,00058
|
Na2EDTA • 2 H2O (18)
(19)
|
5 000
|
20,0
|
5,0
|
2,5
|
0,625
|
FeSO4 • 7 H2O (18)
(19)
|
1 991
|
20,0
|
5,0
|
1,0
|
0,249
|
Tableau 2
Solutions mères de macronutriments pour les milieux M4 et M7
|
Quantité pour former une solution d’un litre avec de l’eau désionisée
(mg)
|
Quantités de solutions mères de macronutriments ajoutées pour préparer les milieux M4 et M7
(ml/l)
|
Concentrations finales dans les solutions expérimentales M4 et M7
(mg/l)
|
CaCl2 • 2 H2O
|
293 800
|
1,0
|
293,8
|
MgSO4 • 7 H2O
|
246 600
|
0,5
|
123,3
|
KCl
|
58 000
|
0,1
|
5,8
|
NaHCO3
|
64 800
|
1,0
|
64,8
|
NaSiO3 • 9 H2O
|
50 000
|
0,2
|
10,0
|
NaNO3
|
2 740
|
0,1
|
0,274
|
KH2PO4
|
1 430
|
0,1
|
0,143
|
K2HPO4
|
1 840
|
0,1
|
0,184
|
Tableau 3
Solution mère de vitamines pour les milieux M4 et M7
Les trois solutions de vitamines sont mélangées de façon à ne former qu’une solution mère de vitamines.
|
Quantité pour former une solution d’un litre avec de l’eau désionisée
(mg)
|
Quantités de solutions mères de vitamines ajoutées pour préparer les milieux M4 et M7
(ml/l)
|
Concentrations finales dans les solutions d’essai M4 et M7
(mg/l)
|
Hydrochlorure de thiamine
|
750
|
0,1
|
0,075
|
Cyanocobalamine (B12)
|
10
|
0,1
|
0,0010
|
Biotine
|
7,5
|
0,1
|
0,00075
|
|
BIBLIOGRAPHIE:
BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H. Köpp. Berlin 1995.
Elendt B.P. (1990). Selenium Deficiency in Crustacean. Protoplasma 154: 25-33.
Elendt B.P. and Bias W.-R. (1990). Trace Nutrient Deficiency in Daphnia magna Cultured in Standard Medium for Toxicity Testing. Effects on the Optimization of Culture Conditions on Life History Parameters of D. magna. Water Research 24 (9): 1157-1167.
Appendice 3
PRÉPARATION DU SÉDIMENT RECONSTITUÉ
Composition du sédiment
Le sédiment sera reconstitué comme suit:
Ingrédient
|
Caractéristiques
|
% du sédiment
poids sec
|
Tourbe
|
Tourbe de sphaigne, pH aussi proche que possible de 5,5-6,0, pas de résidus de plantes visibles, finement broyée, particules (≤ 1 mm) et séchée à l’air
|
4-5
|
Sable quartzique
|
Dimension des particules: > 50 % des particules doivent mesurer entre 50 et 200 μm
|
75-76
|
Argile kaolinique
|
Taux de kaolinite ≥ 30 %
|
20
|
Carbone organique
|
Ajusté par l’addition de tourbe et de sable
|
2 (± 0,5)
|
Carbonate de calcium
|
CaCO3, pulvérisé, chimiquement pur
|
0,05 - 0,1
|
Eau
|
Conductivité ≤ 10 μS/cm
|
30 - 50
|
Préparation
La tourbe est séchée à l’air et broyée en poudre fine. Une suspension de la quantité requise de poudre de tourbe dans de l’eau désionisée est préparée à l’aide d’un homogénéisateur à haute performance. Le pH de cette suspension est ajusté à 5,5 ± 0,5 avec du CaCO3. La suspension est conditionnée durant au moins deux jours en l’agitant doucement à 20 ± 2 °C, afin de stabiliser le pH et d’établir une flore microbienne stable. Le pH est vérifié à nouveau; il devrait atteindre 6,0 ± 0,5. Ensuite la suspension de tourbe est mélangée avec les autres ingrédients (sable et argile kaolinique) et de l’eau désionisée pour former un sédiment homogène avec une teneur en eau de 30 à 50 % du poids sec du sédiment. Le pH du mélange final est encore mesuré et ajusté à 6,5-7,5 avec du CaCO3, si nécessaire. On prélève des échantillons de sédiment afin de déterminer le poids sec et la teneur en carbone organique. Ensuite, avant d’utiliser le sédiment reconstitué dans l’essai de toxicité sur les chironomes, il est recommandé de le conditionner durant sept jours dans des conditions identiques à celles qui seront appliquées durant l’essai subséquent.
Stockage
Les ingrédients secs destinés à la préparation du sédiment artificiel peuvent être entreposés dans un endroit sec et frais, à température ambiante. Le sédiment reconstitué (humide) ne doit pas être stocké avant son utilisation dans l’essai. Il doit être utilisé immédiatement après la période de conditionnement de sept jours qui achève sa préparation.
BIBLIOGRAPHIE:
Chapitre C.8 de la présente annexe: Toxicité pour les vers de terre.
Meller M., Egeler P., Rombke J., Schallnass H., Nagel R., Streit B. (1998). Short-term Toxicity of Lindane, Hexachlorobenzene and Copper Sulfate on Tubificid Sludgeworms (Oligochaeta) in Artificial MEDIA. Ecotox. and Environ. Safety 39: 10-20.
Appendice 4
Caractéristiques chimiques d’une eau de dilution acceptable
Substance
|
Concentrations
|
Matières particulaires
|
< 20 mg/l
|
Carbone organique total
|
< 2 mg/l
|
Ammoniac non ionisé
|
< 1 μg/l
|
Dureté en CaCO3
|
< 400 mg/l (20)
|
Chlore résiduel
|
< 10 μg/l
|
Totalité des pesticides organophosphorés
|
< 50 ng/l
|
Totalité des pesticides organochlorés et des biphényles polychlorés
|
< 50 ng/l
|
Chlore organique total
|
< 25 ng/l
|
Appendice 5
Conseils pour suivre l’émergence des larves de chironomes
Les béchers expérimentaux sont coiffés par des pièges à émergence, du 20e jour jusqu’à la fin de l’essai. Le schéma ci-dessous illustre un exemple de piège:
A
|
:
|
toile de nylon.
|
B
|
:
|
coupelles en plastique renversées.
|
C
|
:
|
bécher expérimental sans bec.
|
D
|
:
|
ouvertures recouvertes de toile par où s’effectuent les échanges d’eau.
|
E
|
:
|
eau.
|
F
|
:
|
sédiment.
|
C.29. BIODÉGRADABILITÉ FACILE – DÉGAGEMENT DE CO2 DANS DES FLACONS HERMÉTIQUEMENT CLOS (ESSAI DE L’ESPACE DE TÊTE AU-DESSUS DU LIQUIDE)
INTRODUCTION
1.
|
La présente méthode d’essai est équivalente à la ligne directrice 310 (2006) de l’OCDE pour les essais de produits chimiques. Cette méthode de criblage permet de classer les substances chimiques en fonction de leur biodégradabilité facile et fournit des informations semblables à celles exposées dans les six méthodes d’essai (A à F) décrites au chapitre C.4 de la présente annexe. Par conséquent, une substance chimique livrant un résultat positif pour cet essai de l’espace de tête peut être considérée comme facilement biodégradable et donc rapidement dégradable dans l’environnement.
|
2.
|
L’essai, désormais bien mis au point, de dégagement de CO2 (1), basé sur l’essai original de Sturm (2), qui permet d’évaluer la biodégradabilité des produits chimiques organiques d’après la mesure du dioxyde de carbone produit par l’activité microbiologique, est normalement celui qui se prête le mieux à l’essai des substances chimiques peu solubles et celles fortement adsorbantes. Il est également choisi pour les substances solubles (mais non volatiles) puisque beaucoup considèrent que le dégagement de dioxyde de carbone constitue la seule preuve irréfutable de l’activité microbiologique. La disparition du carbone organique dissous peut faire intervenir des processus physico-chimiques (adsorption, volatilisation, précipitation, hydrolyse) ainsi que l’action microbiologique et de nombreuses réactions non-biologiques consommant de l’oxygène; il est rare que le CO2 soit produit à partir de produits chimiques organiques par un processus abiotique. Dans les essais original et modifié de Sturm (1) (2), le CO2 est extrait de la phase liquide et envoyé dans des récipients absorbants par barbotage (passage bulle à bulle d’air traité à travers le milieu liquide pour éliminer le CO2), alors que dans la version de Larson (3) (4), lors de son transfert du réacteur vers l’absorbeur, le CO2 traverse un espace de tête contenant de l’air exempt de CO2, tandis que le réacteur est agité en continu. Le réacteur n’est agité que dans la version de Larson modifiée; l’agitation n’est prescrite que pour les substances insolubles dans la norme ISO 9439 (5) et dans la version originale des États-Unis (6), qui prescrivent toutes deux le barbotage plutôt que le remplacement de l’espace de tête. Dans une autre méthode officielle (7) de l’Agence des États-Unis pour la protection de l’environnement (US EPA), basée sur la méthode de Gledhill (8), le réacteur agité est fermé à l’atmosphère et le CO2 produit est directement recueilli de la phase gazeuse dans un piège alcalin interne, comme dans les respiromètres classiques de Warburg/Barcroft.
|
3.
|
Il a toutefois été démontré que le carbone inorganique s’accumule dans le milieu durant l’application de l’essai standard modifié de Sturm à plusieurs substances chimiques (9). La dégradation de l’aniline à 20 mg C/l a produit une concentration assez élevée de carbone inorganique, à savoir 8 mg/l. Autrement dit, la collecte de CO2 dans les pièges alcalins n’a pas reflété la quantité réelle de CO2 produite par des processus microbiologiques à des moments intermédiaires au cours de la dégradation. Par conséquent, la prescription selon laquelle une production de CO2 supérieure à 60 % de la production maximale théorique (ThCO2) doit être atteinte dans un intervalle de 10 jours (les dix jours suivant immédiatement le franchissement du seuil de 10 % de biodégradation) pour une substance d’essai à classer comme facilement biodégradable, ne pourra être respectée pour certaines substances qui rentreraient dans cette classification d’après la disparition du carbone organique dissous.
|
4.
|
Lorsque le pourcentage de dégradation est inférieur au niveau attendu, il est probable que du carbone inorganique se soit accumulé dans la solution expérimentale. À ce moment-là, la dégradabilité peut être évaluée avec les autres essais de biodégradabilité facile.
|
5.
|
D’autres inconvénients de la méthode de Sturm (laborieuse, longue, davantage sujette à des erreurs expérimentales et non applicable aux substances volatiles) avaient déjà incité les chercheurs à s’orienter vers une technique en flacon hermétiquement clos, autre que celle de Gledhill, plutôt que d’utiliser un écoulement gazeux continu (10) (11). Boatman et al. (12) ont réexaminé les méthodes précédentes et adopté un système d’espace de tête fermé dans lequel le CO2 est libéré dans l’espace de tête à la fin de l’incubation moyennant une acidification du milieu. Le CO2 était mesuré par chromatographie gazeuse (carbone inorganique) dans des échantillons prélevés automatiquement de l’espace de tête, mais le carbone inorganique dissous dans la phase liquide n’était pas pris en compte. En outre, les récipients utilisés étaient très petits (20 ml) et ne contenaient que 10 ml de milieu, ce qui engendrait des problèmes, par exemple lorsqu’on ajoutait des quantités forcément très petites de substances d’essai insolubles, et/ou du fait que le milieu inoculé risquait de ne pas renfermer (suffisamment) de micro-organismes capables de dégrader les substances d’essai.
|
6.
|
Ces problèmes ont été résolus par les études indépendantes de Struijs et Stoltenkamp (13) et de Birch et Fletcher (14), ces derniers s’étant inspirés de leur expérience avec les appareils utilisés dans l’essai de biodégradation anaérobie (15). Dans la première méthode (13), le CO2 est mesuré dans l’espace de tête après acidification et équilibrage, tandis que dans la seconde (14), le carbone inorganique dissous est mesuré dans les phases gazeuse et liquide, sans traitement; plus de 90 % du carbone inorganique formé était présent dans la phase liquide. Ces deux méthodes présentent des avantages sur l’essai de Sturm du fait que le système expérimental est plus compact et maniable, qu’elles s’appliquent aussi aux substances volatiles et que le risque de retard dans la mesure du CO2 produit est écarté.
|
7.
|
Ces deux approches ont été combinées dans la norme ISO (essai au CO2 – espace de tête) (16) qui a fait l’objet d’un essai circulaire (17) et qui forme la base de la présente méthode d’essai. Ces deux approches ont également été appliquées dans la méthode de l’US EPA (18). Deux méthodes de mesure du CO2 ont été recommandées, à savoir le CO2 dans l’espace de tête après acidification (13) et le carbone inorganique dans la phase liquide après l’ajout d’un excès de base. Cette dernière méthode a été introduite par Peterson au cours de l’essai circulaire, conduit par le CONCAWE (19), de cette méthode de l’espace de tête modifiée pour mesurer la biodégradabilité intrinsèque. Les changements apportés par la révision effectuée en 1992 (20) des méthodes contenues dans le chapitre C.4 de la présente annexe pour les essais de biodégradabilité facile ont été incorporés dans la présente méthode d’essai, si bien que les conditions (milieu, durée, etc.) sont par ailleurs identiques à celles de l’essai modifié de Sturm (20). Birch et Fletcher (14) ont montré que, sur les mêmes substances, l’essai de l’espace de tête livrait des résultats très proches de ceux de l’essai circulaire organisé par l’OCDE des méthodes d’essai révisées (21).
|
PRINCIPE DE L’ESSAI
8.
|
Une population mixte de micro-organismes est ensemencée dans un milieu tampon composé de sels minéraux, où la substance d’essai, généralement à une concentration de 20 mg C/l, représente la seule source de carbone et d’énergie. L’essai est conduit dans des flacons hermétiquement clos comportant un espace de tête d’air, qui sert de réserve d’oxygène pour la biodégradation aérobie. On détermine le CO2 dégagé par la biodégradation aérobie finale de la substance d’essai en mesurant l’excédent de carbone inorganique produit dans les flacons d’essai par rapport au carbone inorganique produit dans les flacons témoins à blanc ne renfermant que le milieu ensemencé. Le degré de biodégradation est exprimé en pourcentage de la production maximale théorique de carbone inorganique (ThCI), d’après la quantité de substance d’essai (en carbone organique) ajoutée au départ.
|
9.
|
La disparition de carbone organique dissous et/ou le niveau de la biodégradation primaire de la substance d’essai peuvent aussi être mesurés (20).
|
INFORMATIONS SUR LA SUBSTANCE D’ESSAI
10.
|
Il faut connaître la teneur (% poids) en carbone organique de la substance d’essai, d’après sa structure chimique ou par une mesure, de façon à pouvoir calculer le pourcentage de dégradation. Dans le cas des substances d’essai volatiles, il est utile de mesurer ou de calculer la constante de Henry afin de déterminer un rapport volumique espace de tête/liquide approprié. Les informations sur la toxicité de la substance d’essai à l’égard des micro-organismes permettent de choisir une concentration d’essai appropriée et facilitent l’interprétation des résultats lorsque la biodégradabilité est faible: on recommande d’inclure un témoin d’inhibition, sauf si l’on sait que la substance d’essai n’inhibe pas l’activité des micro-organismes (voir paragraphe 24).
|
CHAMP D’APPLICATION DE LA MÉTHODE
11.
|
Cet essai convient aux substances insolubles et solubles dans l’eau, cependant la substance d’essai doit être bien dispersée. Si l’on applique le rapport volumique espace de tête/liquide recommandé de 1/2, les substances volatiles dont la constante de Henry ne dépasse pas 50 Pa.m3.mol-1 peuvent être testées puisque la proportion de la substance d’essai dans l’espace de tête n’excèdera pas 1 % (13). Un volume plus petit d’espace de tête peut être utilisé pour tester des substances plus volatiles, mais dont la biodisponibilité risque d’être limitante, surtout si elles sont peu solubles dans l’eau. Toutefois, les expérimentateurs doivent s’assurer que le rapport volumique espace de tête/liquide et la concentration de la substance d’essai laissent suffisamment d’oxygène disponible pour permettre à la biodégradation aérobie d’être complète (en évitant, par exemple, d’utiliser un substrat très concentré et un petit espace de tête). Des orientations sur ce point figurent dans les références (13) et (23).
|
SUBSTANCES DE RÉFÉRENCE
12.
|
Il faut vérifier le procédé expérimental en testant en parallèle une substance de référence de biodégradabilité connue. À cet effet, l’aniline, le benzoate de sodium ou l’éthylèneglycol peuvent être utilisés pour les substances d’essai solubles dans l’eau et le 1-octanol pour les substances d’essai peu solubles (13). La biodégradation de ces substances doit être supérieure à 60 % de la ThCI au bout de 14 jours.
|
REPRODUCTIBILITÉ
13.
|
L’essai circulaire réalisé par l’ISO de la méthode (17) a produit les résultats suivants, pour les conditions recommandées, notamment une concentration de la substance d’essai de 20 mg C/l:
Substance d’essai
|
Pourcentage moyen de biodégradation
(28 jours)
|
Coefficient de variation
(%)
|
Nombre de laboratoires
|
Aniline
|
90
|
16
|
17
|
1-octanol
|
85
|
12
|
14
|
Avec l’aniline, la variabilité interne de l’essai était faible, les coefficients de variabilité ne dépassant pas 5 % dans presque tous les essais. Dans les deux cas où la répétabilité a été moins bonne, la plus grande variabilité a probablement été due à une production élevée de carbone inorganique dans les témoins à blanc. Le 1-octanol a donné lieu à une moins bonne répétabilité, mais avec une variabilité néanmoins inférieure à 10 % dans 79 % des essais. Cette plus grande variabilité interne de l’essai pourrait résulter d’erreurs de dosage, le volume de 1-octanol à injecter dans les flacons expérimentaux hermétiquement clos étant faible (3 à 4 μl). Des concentrations plus faibles de la substance d’essai engendreraient des coefficients de variation plus élevés, en particulier aux concentrations inférieures à 10 mg C/l. Ce problème pourrait être en partie résolu par la diminution de la concentration du carbone inorganique total dans l’inoculum.
|
14.
|
Un essai circulaire de cinq agents tensioactifs à 10 mg C/L, organisé par l’Union européenne (24), a livré les résultats suivants:
Substance d’essai
|
Pourcentage moyen de biodégradation
(28 jours)
|
Coefficient de variation
(%)
|
Nombre de laboratoires
|
Benzènesulfonate de tétrapropylène
|
17
|
45
|
10
|
Diisooctylsulfosuccinate
(anionique)
|
72
|
22
|
9
|
Chlorure d’ammonium hexadécyl-triméthyique (21)
(cationique)
|
75
|
13
|
10
|
(éthoxylate d’)9 isononylphénol
(non ionique)
|
41
|
32
|
10
|
Cocoamidepropyl- diméthylhydroxy- sulfobétaïne
(amphotère)
|
60
|
23
|
11
|
Les résultats montrent qu’en général, les agents tensioactifs les moins bien dégradés présentent une plus grande variabilité. La variabilité interne de l’essai, qui était inférieure à 15 % dans plus de 90 % des cas, n’a pas dépassé 30-40 %.
Note:
|
la plupart des agents tensioactifs ne se composent pas d’une seule espèce moléculaire, mais sont des mélanges d’isomères, d’homologues, etc. qui se dégradent à l’issue de différentes périodes de latence et à différentes vitesses, et qui génèrent des courbes “brouillées”, atténuées, de sorte que le seuil de 60 % risque de n’être pas atteint dans la fenêtre de dix jours, même si chaque espèce moléculaire atteindrait plus de 60 % en l’espace de dix jours si elle avait été testée isolément. Ce phénomène peut aussi s’observer avec d’autres mélanges complexes.
|
|
DESCRIPTION DE LA MÉTHODE
Appareillage
15.
|
Appareils courants de laboratoire et:
a)
|
flacons à sérum en verre fermés avec des bouchons en caoutchouc butylique sertis de surcapsules en aluminium. La capacité recommandée est de 125 ml, soit un volume total d’environ 160 ml (dans ce cas, le volume de chaque flacon doit atteindre 160 ml avec une précision de 1 ml). Des flacons plus petits peuvent être utilisés si les résultats remplissent les conditions décrites aux paragraphes 66 et 67;
|
b)
|
analyseur de carbone ou autre instrument (chromatographe en phase gazeuse, par exemple) pour mesurer le carbone inorganique;
|
c)
|
seringues à haute précision pour les échantillons gazeux et liquides;
|
d)
|
agitateur orbital dans un environnement thermostaté;
|
e)
|
source d’air exempt de CO2 – on peut la préparer en faisant passer l’air à travers des granules de chaux sodée ou en utilisant un mélange gazeux à 80 % de N2 et 20 % d’O2 (facultatif) (voir paragraphe 28);
|
f)
|
appareil à membrane filtrante à pores de 0,20 à 0,45 μm (facultatif);
|
g)
|
analyseur de carbone organique (facultatif).
|
|
Réactifs
16.
|
Tous les réactifs doivent être de qualité pour analyse.
|
Eau
17.
|
On utilise de l’eau distillée ou désionisée dont la teneur en carbone organique total est ≤ 1 mg/l. Cela représente une quantité ≤ 5 % de la teneur initiale en carbone organique introduite par la dose recommandée de substance d’essai.
|
Solutions mères pour le milieu composé de sels minéraux
18.
|
Les solutions mères et le milieu minéral sont similaires à ceux de la norme ISO 14593 (16) et des essais de “biodégradabilité facile” du chapitre C.4 (20). L’utilisation d’une concentration plus élevée de chlorure d’ammonium (2,0 g/l au lieu de 0,5 g/l) ne devrait être nécessaire que dans des cas très exceptionnels, par exemple lorsque la concentration de la substance d’essai est > 40 mg C/l. Les solutions mères doivent être gardées au froid et éliminées après six mois, ou avant si l’on remarque une précipitation ou une prolifération bactérienne. Préparer les solutions mères suivantes:
a)
|
Dihydrogénophosphate de potassium (KH2PO4) 8,50 g
Hydrogénophosphate de potassium (K2HPO4) 21,75 g
Hydrogénophosphate de sodium dihydraté (Na2HPO4.2H20) 33,40 g
Chlorure d’ammonium (NH4Cl) 0,50 g
Dissoudre dans l’eau et porter le volume à 1 litre. Le pH de la solution doit être égal à 7,4 (± 0,2). Si ce n’est pas le cas, préparer une autre solution;
|
b)
|
Chlorure de calcium dihydraté (CaCl2.2H2O) 36,40 g
Dissoudre dans l’eau et porter le volume à 1 litre;
|
c)
|
Sulfate de magnésium heptahydraté (MgSO4.7H2O) 22,50 g
Dissoudre dans l’eau et porter le volume à 1 litre;
|
d)
|
Chlorure de fer (III) hexahydraté (FeCl3.6H20) 0,25 g
Dissoudre dans l’eau, porter le volume à 1 litre et ajouter une goutte de HCl concentré.
|
|
Préparation du milieu minéral
19.
|
Mélanger 10 ml de la solution a) avec environ 800 ml d’eau (paragraphe 17), puis ajouter 1 ml des solutions b), c) et d) et compléter le volume à 1 litre avec de l’eau (paragraphe 17).
|
Autres réactifs
20.
|
Acide phosphorique concentré (H3PO4) (> 85 % masse par volume).
|
Solution d’hydroxyde de sodium 7M
21.
|
Dissoudre 280 g d’hydroxyde de sodium (NaOH) dans 1 litre d’eau (paragraphe 17). Déterminer la teneur en carbone inorganique dissous de cette solution et tenir compte de cette valeur dans le calcul du résultat de l’essai (voir paragraphes 55 et 61), notamment en fonction du critère de validité mentionné au paragraphe 66 b). Préparer une nouvelle solution si la concentration en carbone inorganique dissous est trop élevée.
|
Substance d’essai
22.
|
Préparer une solution mère d’une substance d’essai suffisamment hydrosoluble, dans l’eau (paragraphe 17) ou dans le milieu d’essai (paragraphe 19), à une concentration de préférence 100 fois supérieure à la concentration finale à utiliser dans l’essai; il peut être nécessaire d’ajuster le pH de la solution mère. La solution mère doit être ajoutée au milieu minéral de telle sorte que la concentration finale de carbone organique atteigne entre 2 et 40 mg C/l, de préférence 20 mg C/l. Des concentrations plus faibles que celles mentionnées ci-dessus risquent de diminuer la précision. Les substances liquides solubles et insolubles peuvent être introduites directement dans les récipients à l’aide de seringues à haute précision. Les substances d’essai peu solubles et insolubles peuvent requérir un traitement spécial (25), à choisir parmi les suivants:
a)
|
ajout direct de quantités de poids connu;
|
b)
|
dispersion aux ultrasons avant l’ajout;
|
c)
|
dispersion à l’aide d’agents émulsifiants dont il y a lieu d’établir, avant d’ajouter la substance d’essai, s’ils exercent une action inhibitrice ou stimulante sur l’activité microbiologique;
|
d)
|
adsorption des substances d’essai liquides, ou d’une solution de la substance d’essai dans un solvant volatil approprié, sur un milieu ou un support inerte (par exemple un filtre en fibres de verre), suivie par l’évaporation du solvant, le cas échéant, et ajout direct de quantités connues;
|
e)
|
ajout d’un volume connu d’une solution de la substance d’essai dans un solvant suffisamment volatil pour qu’il s’évapore complètement du récipient, suivi par l’évaporation du solvant.
|
Il faut vérifier par un essai si les agents ou les solvants utilisés aux points c), d) et e) ont un effet stimulant ou inhibiteur sur l’activité microbiologique [voir paragraphe 42 b)].
|
Substance de référence
23.
|
Préparer une solution mère de la substance de référence (soluble) dans l’eau (paragraphe 17) à une concentration de préférence 100 fois supérieure à la concentration finale (20 mg C/l) à utiliser dans l’essai.
|
Vérification de l’inhibition
24.
|
Il arrive souvent que les substances d’essai ne se dégradent pas de façon significative dans les conditions appliquées aux évaluations de la biodégradation immédiate. Cela peut résulter du fait que la substance d’essai exerce un effet inhibiteur sur l’inoculum à la concentration à laquelle elle est testée. Une vérification de l’effet inhibiteur peut être incluse dans la conception de l’essai pour faciliter l’identification (rétrospective) de l’inhibition comme l’une des causes possibles ou l’un des facteurs contributifs, soit, au contraire, pour éliminer cette possibilité d’interférences, ce qui démontrerait que la dégradation faible ou nulle n’est imputable qu’au fait que les micro-organismes n’attaquent pas la substance dans les conditions de l’essai. Afin d’obtenir des informations sur la toxicité de la substance d’essai à l’égard des micro-organismes (aérobies), on prépare une solution contenant la substance d’essai et la substance de référence dans le milieu d’essai (paragraphe 19), chacune à la même concentration que celle à laquelle elles ont été ajoutées dans le milieu d’essai lors de l’essai (voir paragraphes 22 et 23).
|
Inoculum
25.
|
L’inoculum peut provenir de différentes sources: boues activées, effluents d’eaux usées (non chlorés); eaux de surface et sols; ou d’un mélange de ces milieux (20). Il convient de vérifier l’activité biodégradante de la source à l’aide d’une substance de référence. Quelle que soit la source, il ne faut pas utiliser de micro-organismes ayant déjà été exposés à la substance d’essai pour l’essai de biodégradabilité facile.
Attention:
|
les boues activées, les eaux usées et les effluents d’eaux usées renferment des organismes pathogènes et doivent être manipulés avec précaution.
|
|
26.
|
On sait empiriquement que le volume optimal de l’inoculum est celui qui:
—
|
suffit pour fournir une activité biodégradante adéquate,
|
—
|
dégrade la substance de référence dans le pourcentage stipulé (voir paragraphe 66),
|
—
|
fournit 102 à 105 unités formant colonie par millilitre dans le mélange final,
|
—
|
donne normalement une concentration de 4 mg/l de solides en suspension dans le mélange final lorsqu’on utilise de la boue activée; des concentrations allant jusqu’à 30 mg/l peuvent être utilisées, mais elles risquent d’augmenter sensiblement la production de CO2 dans les témoins à blanc (26),
|
—
|
représente moins de 10 % de la concentration initiale de carbone organique introduite par la substance d’essai,
|
—
|
équivaut généralement à 1 à 10 ml d’inoculum par litre de solution expérimentale.
|
|
Boues activées
27.
|
Prélever un échantillon de boue activée dans le bassin d’aération d’une station d’épuration ou d’une installation à l’échelle du laboratoire traitant principalement des eaux usées domestiques. Éliminer, si nécessaire, les grosses particules à l’aide d’un tamis (possédant des orifices de 1 mm2, par exemple) et conserver ensuite la boue en aérobiose jusqu’à son utilisation.
|
28.
|
Une autre possibilité consiste, après avoir éliminé toutes les grosses particules, à laisser décanter la boue ou à la centrifuger (par exemple à 1 100 g pendant 10 minutes). Éliminer le surnageant. La boue peut être lavée dans la solution minérale. Suspendre la boue concentrée dans le milieu minéral de façon à obtenir une concentration de 3 à 5 g/l de matières en suspension. Aérer ensuite la suspension jusqu’à son utilisation.
|
29.
|
La boue doit provenir d’une station d’épuration ordinaire en bon état de fonctionnement. Les boues issues d’une station d’épuration dont le débit est important, ainsi que les boues susceptibles de contenir des inhibiteurs, doivent être lavées. Décanter ou centrifuger la boue remise en suspension après agitation vigoureuse, éliminer le liquide surnageant et resuspendre la boue lavée dans un volume de milieu minéral frais. Répéter cette opération jusqu’à ce que la boue puisse être considérée comme exempte de substrat en excès ou d’inhibiteur.
|
30.
|
Prélever un échantillon de boue remise en suspension (lorsque la resuspension est complète) ou de boue non traitée juste avant le moment de son utilisation afin de déterminer le poids sec des matières en suspension.
|
31.
|
Une autre possibilité consiste à homogénéiser la boue activée (entre 3 et 5 g/l de solides en suspension). Passer la boue dans un mélangeur mécanique réglé sur une vitesse moyenne pendant 2 minutes. Laisser reposer la boue homogénéisée pendant 30 minutes, ou plus longtemps si nécessaire, et prélever la phase liquide, qui sera utilisée comme inoculum à raison d’environ 10 ml par litre de milieu minéral.
|
32.
|
Il est possible d’obtenir une réduction plus importante du dégagement de CO2 dans le témoin à blanc en aérant la boue toute une nuit avec de l’air exempt de CO2. Dans cet essai, la concentration de l’inoculum doit s’élever à 4 mg/l de solides de boue activée (13).
|
Effluent secondaire d’eaux usées
33.
|
L’inoculum peut également provenir de l’effluent secondaire d’une station d’épuration ou d’une installation à l’échelle du laboratoire recevant principalement des eaux usées domestiques. Conservé en aérobiose, l’échantillon sera utilisé le jour de son prélèvement ou préconditionné si nécessaire. L’effluent doit être filtré à travers un filtre grossier et son pH est mesuré.
|
34.
|
Pour réduire la teneur en carbone inorganique du filtrat, on fait barboter dans celui-ci de l’air exempt de CO2 [paragraphe 15 e)] durant 1 heure tout en maintenant le pH à 6,5 avec de l’acide phosphorique (paragraphe 20). La valeur du pH est ramenée à sa valeur de départ avec de l’hydroxyde de sodium (paragraphe 21) et on laisse reposer le filtrat pendant environ 1 heure, avant d’y prélever un volume approprié de surnageant pour l’inoculation. Ce processus de barbotage diminue la teneur de l’inoculum en carbone inorganique. Par exemple, si on utilise le volume maximal recommandé d’effluent filtré et barboté (100 ml) par litre comme inoculum, la quantité de carbone inorganique présente dans les flacons témoins à blanc est comprise entre 0,4 et 1,3 mg/l (14), ce qui représente 2 à 6,5 % du carbone de la substance d’essai à 20 mg C/l et 4 à 13 % à 10 mg C/l.
|
Eaux de surface
35.
|
Dans une eau de surface adéquate, on prélève un échantillon qui sera conservé en aérobiose et utilisé le jour même. Si nécessaire, l’échantillon est concentré par filtration ou centrifugation. Le volume d’inoculum à utiliser dans chaque récipient expérimental doit satisfaire aux critères énoncés au paragraphe 26.
|
Sols
36.
|
Prélever un échantillon dans un sol approprié à une profondeur allant jusqu’à 20 cm en dessous de la surface du sol. Il convient d’enlever les pierres, les débris végétaux et les invertébrés de l’échantillon de sol avant de le passer au travers d’un tamis pourvu d’orifices de 2 mm (si l’échantillon est trop mouillé pour pouvoir être tamisé immédiatement, on le sèche partiellement à l’air). Il faut le garder en aérobiose et l’utiliser le jour même (si l’échantillon est transporté dans un sac noir de polythène fermé de manière non hermétique, il peut être conservé à 2 à 4 °C dans ce sac jusqu’à un mois).
|
Préconditionnement de l’inoculum
37.
|
L’inoculum peut être préconditionné aux conditions expérimentales, mais non préadapté à la substance d’essai. Le préconditionnement peut diminuer le dégagement de CO2 dans le témoin à blanc. Le préconditionnement consiste à aérer la boue activée, après l’avoir diluée dans le milieu expérimental à 30 mg/l, avec de l’air humide exempt de CO2 durant 5 à 7 jours à la température de l’essai.
|
MODE OPÉRATOIRE
Nombre de flacons
38.
|
Le nombre de flacons [paragraphe 15 a)] requis pour un essai dépendra de la fréquence des analyses et de la durée de l’essai.
|
39.
|
On recommande d’analyser les flacons en trois exemplaires, après un nombre suffisant d’intervalles de temps pour pouvoir identifier la fenêtre des dix jours. On analyse également au moins cinq flacons expérimentaux [paragraphe 15 a)] des séries a), b) et c) (voir paragraphe 42) à la fin de l’essai, afin de pouvoir calculer les intervalles de confiance à 95 % pour le pourcentage moyen de biodégradation.
|
Milieu ensemencé
40.
|
L’inoculum est utilisé à une concentration de 4 mg/l en solides secs de boue activée. Juste avant l’utilisation, préparer une quantité suffisante de milieu ensemencé en ajoutant, par exemple, 2 ml de boue activée traitée comme il convient (paragraphes 27 à 32) à une concentration de 2 000 mg/l à 1 litre de milieu minéral (paragraphe 19). Si l’on utilise un effluent secondaire d’eaux usées, ajouter jusqu’à 100 ml d’effluent (paragraphe 33) à 900 ml de milieu minéral (paragraphe 19) et porter à 1 litre avec du milieu.
|
Préparation des flacons
41.
|
Verser des aliquotes de milieu ensemencé dans des flacons identiques en plusieurs exemplaires, de telle sorte que le rapport espace de tête/liquide soit de 1/2 (introduire, par exemple 107 ml dans des flacons de 160 ml de capacité). D’autres rapports peuvent être appliqués, mais il faut tenir compte de l’avertissement donné au paragraphe 11. Quel que soit le type d’inoculum utilisé, on veillera à mélanger correctement le milieu ensemencé pour qu’il se répartisse uniformément dans les flacons d’essai.
|
42.
|
Préparer des séries de flacons [paragraphe 15 a)] destinés aux usages suivants:
a)
|
flacons d’essai (FT) contenant la substance d’essai;
|
b)
|
flacons témoins à blanc (FB) ne contenant que le milieu expérimental et l’inoculum; tous les produits chimiques, solvants, agents ou filtres en fibres de verre utilisés pour introduire la substance d’essai dans les récipients expérimentaux doivent aussi y être ajoutés;
|
c)
|
flacons contenant la substance de référence (FC) pour vérifier le procédé;
|
d)
|
si nécessaire, flacons (FI) pour vérifier un éventuel effet inhibiteur de la substance d’essai contenant à la fois la substance d’essai et la substance de référence aux mêmes concentrations (paragraphe 24) que dans les flacons FT et FC respectivement;
|
e)
|
flacons (FS) pour vérifier une éventuelle dégradation abiotique; il s’agit des flacons (FT) auxquels on a ajouté 50 mg/l de HgCl2 ou qu’on a stérilisés d’une autre manière (à l’autoclave, par exemple).
|
|
43.
|
Les substances d’essai et de référence solubles dans l’eau sont ajoutées aux flacons sous la forme de leurs solutions mères aqueuses (paragraphes 22, 23 et 24), de manière à fournir une concentration de 10 à 20 mg C/l.
|
44.
|
Les substances d’essai et de référence insolubles sont ajoutées aux flacons de différentes façons [voir paragraphe 22 a) à e)] en fonction de la nature de la substance, avant ou après l’ajout du milieu ensemencé, selon la méthode de traitement de la substance. Si l’on utilise l’une des procédures exposées au paragraphe 22 a) à e), les flacons témoins à blanc (FB) [paragraphe 42 b)] doivent être traités de manière identique, si ce n’est qu’ils ne contiendront ni la substance d’essai ni la substance de référence.
|
45.
|
Les substances d’essai volatiles doivent être introduites dans des flacons hermétiquement clos (paragraphe 47) au moyen d’une microseringue. La dose est calculée en fonction du volume injecté et de la densité de la substance.
|
46.
|
Si nécessaire, on ajoutera de l’eau aux flacons, afin que le volume de liquide soit identique dans tous les flacons. On s’assurera que le rapport espace de tête/liquide (généralement de 1/2) et la concentration de la substance d’essai sont tels que l’espace de tête renferme suffisamment d’oxygène pour permettre une biodégradation totale.
|
47.
|
Tous les flacons sont ensuite fermés hermétiquement, par exemple au moyen de bouchons en caoutchouc butylique et de surcapsules en aluminium. Les substances d’essai volatiles doivent être ajoutées à ce stade (paragraphe 45). S’il y a lieu de mesurer la baisse de concentration du carbone organique dissous dans la solution expérimentale et d’analyser au temps zéro la concentration initiale de carbone inorganique ou d’autres paramètres [témoins stériles, paragraphe 42 e)], on prélève un échantillon approprié du flacon d’essai. Le flacon d’essai et son contenu sont ensuite éliminés.
|
48.
|
Les flacons hermétiquement clos sont placés sur un agitateur rotatif [paragraphe 15 d)], réglé sur une vitesse d’agitation suffisante pour que le contenu du flacon reste bien mélangé et en suspension (par exemple 150 à 200 tpm), et mis à incuber dans l’obscurité à température constante (20 °C ± 1 °C).
|
Prélèvement
49.
|
Le programme de prélèvement dépendra de la période de latence et de la vitesse de biodégradation de la substance d’essai. Des flacons sont retirés définitivement du dispositif expérimental afin d’être analysés le jour du prélèvement, lequel intervient au moins une fois par semaine ou plus fréquemment (par exemple deux fois par semaine), si une courbe de dégradation complète est requise. On retire le nombre nécessaire de flacons identiques de l’agitateur dans chaque catégorie: FT, FB et FC et, le cas échéant FI et FS (voir paragraphe 42). L’essai dure normalement 28 jours. Si la courbe de biodégradation atteint un plateau avant 28 jours, l’essai peut s’arrêter avant 28 jours. Prélever des échantillons dans les cinq flacons réservés aux analyses à effectuer le 28e jour et utiliser les résultats pour calculer les limites de confiance ou le coefficient de variation du pourcentage de biodégradation. Les flacons destinés à vérifier l’inhibition et la dégradation abiotique ne doivent pas faire l’objet de prélèvements aussi fréquents que les autres flacons; il suffira de deux prélèvements effectués respectivement le 1er jour et le 28e jour.
|
Analyse du carbone inorganique
50.
|
On détermine la production de CO2 dans les flacons en mesurant l’augmentation de la concentration de carbone inorganique durant l’incubation. Deux méthodes, décrites ci-après, sont recommandées pour mesurer la quantité de carbone inorganique produite durant l’essai. Au cours d’un même essai, il ne faudra utiliser qu’une seule méthode, car ces méthodes risquent de donner des résultats légèrement différents.
|
51.
|
On recommande la méthode (a) si le milieu est susceptible de contenir des résidus, par exemple de papier filtre en verre et/ou d’une substance d’essai insoluble. Cette analyse peut être pratiquée au moyen d’un chromatographe en phase gazeuse, à défaut d’un analyseur de carbone. Il est important de maintenir les flacons à une température assez proche de la température de l’essai durant l’analyse du gaz de l’espace de tête. La méthode (b) peut s’avérer plus facile à appliquer par les laboratoires qui mesurent le carbone inorganique à l’aide d’un analyseur de carbone. Il importe que la solution d’hydroxyde de sodium (paragraphe 21) utilisée pour convertir le CO2 en carbonate soit fraîchement préparée ou que sa teneur en carbone inorganique soit connue, de telle sorte que ce paramètre puisse être pris en compte lors du calcul des résultats de l’essai [voir paragraphe 66 b)].
|
Méthode (a): acidification à pH < 3
52.
|
Avant chaque lot d’analyses, l’analyseur de carbone inorganique est étalonné au moyen d’un étalon de carbone inorganique approprié (par exemple une dilution 1 % poids/poids de CO2 dans du N2). Injecter de l’acide phosphorique concentré (paragraphe 20) à travers le bouchon de chaque flacon destiné à un prélèvement, afin d’abaisser le pH du milieu à une valeur < 3 (ajouter, par exemple, 1 ml à 107 ml de milieu expérimental). Remettre les flacons sur l’agitateur. Après avoir subi une agitation d’une heure à la température expérimentale, les flacons sont retirés de l’agitateur. On prélève des aliquotes de gaz (1 ml, par exemple) dans l’espace de tête de chaque flacon et on les injecte dans l’analyseur de carbone inorganique. Les concentrations de carbone inorganique mesurées sont notées en mg C/l.
|
53.
|
Cette méthode repose sur le principe suivant lequel après l’acidification à pH < 3 et l’équilibrage à 20 °C, la constante d’équilibre de la répartition du CO2 entre les phases liquide et gazeuse des flacons d’essai est égale à 1,0 lorsqu’elle est mesurée sous forme de concentration (13). Cette relation doit être démontrée au moins une fois pour le système expérimental, de la façon suivante:
Préparer des flacons contenant 5 et 10 mg/l de carbone inorganique à l’aide d’une solution de carbonate de sodium anhydre (Na2CO3) dans de l’eau exempte de CO2 [préparer cette eau en l’acidifiant à pH 6,5 avec de l’acide phosphorique concentré (paragraphe 20), en y faisant barboter de l’air exempt de CO2 toute une nuit et en ramenant le pH à une valeur neutre avec un produit alcalin]. S’assurer que le rapport volumique espace de tête/liquide est le même que dans les essais (1/2, par exemple). Acidifier et équilibrer comme indiqué au paragraphe 52 et mesurer les concentrations de carbone inorganique dans l’espace de tête et dans la phase liquide. Vérifier que les deux concentrations sont identiques, à l’erreur expérimentale près. Si elles ne le sont pas, l’expérimentateur devra réexaminer les procédures. Il n’est pas nécessaire de vérifier la répartition du carbone inorganique entre les phases liquide et gazeuse à chaque essai; cette vérification pourrait être effectuée au cours de l’étalonnage
|
54.
|
S’il y a lieu de mesurer la disparition de carbone organique dissous (substances d’essai hydrosolubles uniquement), des échantillons sont prélevés dans la phase liquide de flacons séparés (non acidifiés), filtrés sur une membrane et injectés dans l’analyseur de carbone organique dissous. Ces flacons peuvent servir à d’autres analyses, si nécessaire, permettant de mesurer la biodégradation primaire.
|
Méthode (b): conversion du CO2 en carbonate
55.
|
Avant chaque lot d’analyses, l’analyseur de carbone inorganique est étalonné au moyen d’un étalon adéquat, par exemple une solution de bicarbonate de sodium (NaHCO3) dans de l’eau exempte de CO2 (voir paragraphe 53), à une concentration de 0 à 20 mg de carbone inorganique/litre. Injecter une solution d’hydroxyde de sodium (7M, paragraphe 21) (par exemple à raison d’1 ml pour 107 ml de milieu) à travers le bouchon de chaque flacon destiné à un prélèvement et agiter les flacons durant une heure à la température de l’essai. On utilise la même solution de NaOH dans tous les flacons retirés définitivement un jour donné, mais pas nécessairement pour tous les prélèvements effectués tout au long de l’essai. Si les valeurs absolues de la teneur en carbone inorganique des témoins à blanc sont requises à chaque prélèvement, il faudra déterminer la teneur en carbone inorganique de la solution de NaOH chaque fois qu’elle est utilisée. Enlever les flacons de l’agitateur et laisser reposer. Extraire un volume approprié (50 à 1 000 μl, par exemple) de la phase liquide de chaque flacon à l’aide d’une seringue. Injecter les échantillons dans l’analyseur de carbone inorganique et enregistrer les concentrations de carbone inorganique. On s’assurera que l’analyseur employé se prête au traitement des échantillons alcalins obtenus par cette méthode.
|
56.
|
Cette méthode repose sur le principe selon lequel après l’ajout d’une solution alcaline et agitation, la concentration de carbone inorganique dans l’espace de tête est négligeable. Cela doit être vérifié au moins une fois pour le système expérimental. Il faut, pour ce faire, utiliser des étalons de carbone inorganique, ajouter une solution basique et équilibrer, et mesurer la concentration de carbone inorganique dans l’espace de tête et dans la phase liquide (voir paragraphe 53). La concentration dans l’espace de tête devrait avoisiner zéro. Il n’est pas nécessaire de vérifier cette absorption pratiquement complète de CO2 à chaque essai.
|
57.
|
Si la disparition de carbone organique dissous (substances d’essai hydrosolubles uniquement) est à mesurer, des échantillons sont prélevés dans la phase liquide de flacons séparés (ne contenant pas de produit alcalin ajouté), filtrés sur une membrane et injectés dans l’analyseur de carbone organique dissous. Ces flacons peuvent servir à d’autres analyses, si nécessaire, pour mesurer la biodégradation primaire.
|
RÉSULTATS ET RAPPORT
Calcul des résultats
58.
|
En supposant que la substance d’essai a été minéralisée à 100 % en CO2, la production maximale théorique de carbone inorganique (ThCI) des flacons d’essai excédant celle des témoins à blanc est égale au carbone organique total (COT) ajouté dans chaque flacon d’essai au début de l’essai, autrement dit:
La masse totale (mg) de carbone inorganique (CIT) dans chaque flacon est:
|
Équation [1]
|
où:
VL
|
=
|
volume de liquide dans le flacon (litre);
|
CL
|
=
|
concentration de carbone inorganique dans le liquide (carbone en mg/l);
|
VH
|
=
|
volume de l’espace de tête (litre);
|
CH
|
=
|
concentration de carbone inorganique dans l’espace de tête (carbone en mg/l).
|
Les calculs du CIT pour les deux méthodes analytiques utilisées pour mesurer le carbone inorganique dans cet essai sont décrits ci-dessous aux paragraphes 60 et 61. Le pourcentage de biodégradation (% D) dans chaque cas est donné par l’équation suivante:
|
Équation [2]
|
où:
CITt
|
=
|
mg de CIT dans le flacon d’essai au temps t;
|
CITb
|
=
|
la moyenne des mg de CIT dans les flacons témoins à blanc au temps t;
|
COT
|
=
|
mg de COT ajoutés initialement au flacon d’essai.
|
Le pourcentage de biodégradation (% D) est calculé pour les flacons d’essai (FT) et de référence (FC) et, le cas échéant, les flacons (FI) destinés à la vérification d’un éventuel effet inhibiteur, à partir des quantités respectives de carbone inorganique total produites jusqu’à chaque temps de prélèvement.
|
59.
|
Une augmentation significative de la teneur en CIT dans les témoins stériles (FS) durant l’essai permet de conclure à une dégradation abiotique de la substance d’essai et il faut en tenir compte dans le calcul de D dans l’équation [2].
|
Acidification à pH < 3
60.
|
L’acidification à pH < 3 et l’équilibrage entraînant l’égalisation de la concentration de CIT entre les phases liquide et gazeuse, seule la concentration de carbone inorganique dans la phase gazeuse doit être mesurée. Aussi, d’après l’équation [1],
, où VB = est le volume du flacon de sérum. |
Conversion du CO2 en carbonate
61.
|
Dans cette méthode, les calculs sont effectués conformément à l’équation [1], mais la quantité négligeable de carbone inorganique dans la phase gazeuse est ignorée, de sorte que
, et
. |
Expression des résultats
62.
|
On trace une courbe de biodégradation en reportant le pourcentage de biodégradation, D, en fonction du temps d’incubation, courbe qui indiquera, si possible, la phase de latence, la phase de biodégradation, la fenêtre des dix jours et la phase plateau, c’est-à-dire la phase durant laquelle la dégradation a atteint son maximum et où la courbe de biodégradation marque un palier. Si des résultats comparables sont obtenus pour les flacons d’essai (FT) testés en parallèle (< 20 % de différence), on trace une courbe moyenne (voir appendice 2, figure 1); dans le cas contraire, on trace une courbe pour chaque flacon d’essai. On détermine la valeur moyenne du pourcentage de biodégradation dans la phase plateau ou on évalue sa valeur maximale (par exemple si la courbe fléchit dans la phase plateau), mais il est important d’estimer si, dans ce dernier cas, la valeur n’est pas nettement divergente. Ce niveau maximal de biodégradation doit être mentionné en tant que “degré de biodégradation de la substance d’essai” dans le rapport d’essai. Si le nombre de flacons d’essai s’est avéré insuffisant pour préciser une phase plateau, on utilise les données mesurées du dernier jour de l’essai pour calculer une valeur moyenne. Cette dernière valeur, la moyenne de cinq essais identiques, sert à indiquer la précision avec laquelle le pourcentage de biodégradation a été déterminé. La valeur obtenue au terme de la fenêtre des dix jours doit également figurer dans le rapport.
|
63.
|
Tracer, de la même manière, une courbe pour la substance de référence, FC, et, le cas échéant, pour la vérification de la dégradation abiotique FS et pour le contrôle de l’inhibition, FI.
|
64.
|
Les quantités de CIT présentes dans les témoins à blanc (FB) sont consignées, de même que celles présentes dans les flacons FS, si ces flacons sont inclus dans le système expérimental.
|
65.
|
Calculer D pour les flacons FI, d’après le rendement théorique escompté en carbone inorganique provenant uniquement de la substance de référence du mélange. Si, au 28e jour, ([DFC ( (22)) – DFI ( (23))]/DFC) × 100 > 25 %, il est permis de supposer que la substance d’essai a inhibé l’activité de l’inoculum, ce qui peut expliquer les faibles valeurs de DFT obtenues dans les conditions de l’essai. Dans ce cas, l’essai pourrait être répété avec une concentration d’essai plus faible, et en réduisant de préférence le carbone inorganique dissous (CID) dans l’inoculum et le CIT formé dans les témoins à blanc, car une diminution de la concentration de la substance d’essai amoindrit la précision de la méthode. Un autre inoculum peut également être utilisé. Si la quantité de CIT dans le flacon FS (dégradation abiotique) montre une augmentation significative (> 10 %), il se peut qu’une dégradation abiotique ait eu lieu.
|
Validité des résultats
66.
|
Un essai est considéré comme valable si:
a)
|
le pourcentage moyen de dégradation dans les flacons FC contenant la substance de référence est > 60 % au 14e jour de l’incubation; et
|
b)
|
la quantité moyenne de CIT présente dans les témoins à blancs FB à la fin de l’essai est > 3 mg C/l.
|
Si ces limites ne sont pas atteintes, on répétera l’essai avec un inoculum provenant d’une autre source et/ou on révisera les procédures appliquées. Par exemple, si une production élevée de carbone inorganique dans le témoin à blanc pose un problème, il convient de suivre la procédure exposée aux paragraphes 27 à 32.
|
67.
|
Si la substance d’essai ne fournit pas 60 % de la production maximale théorique de carbone inorganique (ThCI) et qu’il a été démontré qu’elle n’exerce aucun effet inhibiteur (paragraphe 65), l’essai peut être répété avec une concentration accrue d’inoculum (jusqu’à 30 mg/l de boue activée et 100 ml d’effluent/l) ou avec un inoculum provenant d’autres sources, en particulier si la dégradation a atteint une valeur comprise entre 20 et 60 %.
|
Interprétation des résultats
68.
|
Si une substance d’essai atteint une biodégradation > 60 % de la ThCI dans la fenêtre des dix jours au cours de cet essai, cela démontre qu’elle est facilement biodégradable en aérobiose.
|
69.
|
Si la valeur de seuil de 60 % de la ThCI n’a pas été atteinte, on mesure le pH du milieu des flacons qui n’ont pas été acidifiés ou alcalinisés; une valeur inférieure à 6,5 pourrait indiquer qu’une nitrification a eu lieu. Dans ce cas, on répète l’essai avec une solution tampon plus concentrée.
|
Rapport d’essai
70.
|
Dresser un tableau du pourcentage de dégradation (% D) relevé dans chaque flacon d’essai (FT), de référence (FC) et, le cas échéant, de vérification de l’inhibition (FI) pour chaque jour de prélèvement. Si les flacons identiques livrent des résultats comparables, tracer une courbe du % D moyen en fonction du temps. Noter la quantité de carbone inorganique total dans les témoins à blanc (FB) et dans les témoins stériles (FS), de même que le carbone organique dissous et/ou d’autres paramètres, ainsi que leur pourcentage de disparition.
|
71.
|
Déterminer la valeur moyenne du % D dans la phase plateau ou utiliser la valeur maximale si la courbe de biodégradation fléchit dans la phase plateau et rapporter cette valeur en tant que “degré de biodégradation de la substance d’essai”. Il importe de vérifier que dans ce dernier cas, la valeur la plus élevée n’est pas nettement divergente.
|
72.
|
Le rapport d’essai doit mentionner les informations suivantes:
|
Substance d’essai:
—
|
nom courant, nom chimique, numéro CAS, formule structurale et propriétés physico-chimiques pertinentes,
|
—
|
pureté (impuretés) de la substance d’essai.
|
|
|
Conditions expérimentales:
—
|
référence à la présente méthode d’essai,
|
—
|
description du système expérimental utilisé (par exemple, volume du flacon, rapport espace de tête/liquide, méthode d’agitation, etc.),
|
—
|
ajout de la substance d’essai et de la substance de référence dans le système expérimental: concentration appliquée et quantité de carbone mesurée dans chaque flacon d’essai, et, le cas échéant, solvants utilisés,
|
—
|
détails sur l’inoculum utilisé, traitement préalable et préconditionnement éventuels,
|
—
|
température d’incubation,
|
—
|
validation du principe de l’analyse du carbone inorganique,
|
—
|
principales caractéristiques de l’analyseur de carbone inorganique employé (et de toute autre méthode d’analyse utilisée),
|
|
|
Résultats:
—
|
données brutes et valeurs calculées de la biodégradabilité présentées dans un tableau,
|
—
|
graphique du pourcentage de dégradation en fonction du temps pour les substances d’essai et de référence, phase de latence, phase de dégradation, fenêtre des dix jours et pente,
|
—
|
pourcentage de disparition au niveau du plateau, à la fin de cet essai et après la fenêtre des dix jours,
|
—
|
justification en cas de rejet des résultats expérimentaux,
|
—
|
tout autre fait se rapportant à la procédure utilisée,
|
|
|
BIBLIOGRAPHIE:
(1)
|
Chapitre C.4 de la présente annexe Détermination de la biodégradabilité “facile” - Essai de dégagement de CO2 (Méthode C.4-C).
|
(2)
|
Sturm R.N. (1973). Biodegradability of Nonionic surfactants: screening test for predicting rate and ultimate biodegradation. J.A., Oil Chem Soc. 50: 159-167.
|
(3)
|
Larson R.J. (1979). Estimation of biodegradation potential of xenobiotic organic chemicals. Appl Env. Microbiol. 38: 1153-1161.
|
(4)
|
Larson R.J., Hansmann M.A. and Bookland E.A. (1996). Carbon dioxide recovery in ready biodegradability tests: mass transfer and kinetic constants, Chemosphere 33: 1195-1210.
|
(5)
|
ISO 9439 (1990; révisée en 1999). Qualité de l’eau – Évaluation de la biodégradabilité aérobie ultime en milieu aqueux des composés organiques – Essai de dégagement de dioxyde de carbone (Sturm).
|
(6)
|
US EPA (1996). Fate, Transport and Transformation Test Guideline. 835. 3110 Carbon dioxide evolution test. Office, Prevention Pesticides and Toxic Substances Washington, DC.
|
(7)
|
US EPA (1996). Fate, Transport and Transformation Test Guideline. 835. 3100. Aerobic aquatic biodegradation. Office, Prevention Pesticides and Toxic Substances Washington, DC.
|
(8)
|
Gledhill W.E. (1975). Screening test for assessment of biodegradability: Linear alkyl benzene sulfonate. Appl Microbiol. 30: 922-929.
|
(9)
|
Weytjens D., Van Ginneken I. and Painter H.A. (1994). The recovery of carbon dioxide in the Sturm test for ready biodegradability. Chemosphere 28: 801-812.
|
(10)
|
Ennis D.M. and Kramer A. (1975). A rapid microtechnique for testing biodegradability of nylons and polyamides. J. Food Sci. 40: 181-185.
|
(11)
|
Ennis D.M., Kramer A., Jameson C.W., Mazzoccki P.H. and Bailey P.H. (1978). Appl. Env. Microbiol. 35: 51-53.
|
(12)
|
Boatman R.J., Cunningham S.L. and Ziegler D.A. (1986). A method for measuring the biodegradation of organic chemicals, Env. Toxicol. Chem. 5: 233-243.
|
(13)
|
Struijs J. and Stoltenkamp J. (1990). Head space determination of evolved carbon dioxide in a biodegradability screening test. Ecotox. Env. Safety 19: 204-211.
|
(14)
|
Birch R.R. and Fletcher R.J. (1991). The application of dissolved inorganic carbon measurements to the study of aerobic biodegradability. Chemosphere 23: 507-524.
|
(15)
|
Birch R.R., Biver C., Campagna R., Gledhill W.E., Pagga U., Steber J., Reust H., and Bontinck W.J. (1989). Screening of chemicals for anaerobic biodegradation. Chemosphere 19: 1527-1550.
|
(16)
|
ISO 14593, (1999) Qualité de l’eau – Évaluation en milieu aqueux de la biodégradabilité aérobie ultime des composés organiques – Méthode par analyse du carbone inorganique dans des récipients hermétiquement clos (essai au CO2 – espace de tête).
|
(17)
|
Battersby N.S. (1997). The ISO headspace C02 biodegradation test, Chemosphere 34: 1813-1822.
|
(18)
|
US EPA (1996). Fate, Transport and Transportation. 835.3120. Sealed vessel carbon dioxide production test. Office, Prevention Pesticides and Toxic Substance, Washington, DC.
|
(19)
|
Battersby N.S., Ciccognani D., Evans M.R., King D., Painter H.A., Peterson D.R. and Starkey M. (1999). An “inherent” biodegradability test for oil products: description and results of an international ring test. Chemosphere 38: 3219-3235.
|
(20)
|
Chapitre C.4 de la présente annexe, Détermination de la biodégradabilité “facile”.
|
(21)
|
OCDE (1988). OECD Ring-test of methods for determining ready biodegradability: Chairman’s report (M. Hashimoto; MITI) and final report (M. Kitano and M. Takatsuki; CITI). Paris.
|
(22)
|
Chapitre C.11 de la présente annexe, Boues activées: essai d’inhibition de la respiration.
|
(23)
|
Struijs J., Stoltenkamp-Wouterse M.J. and Dekkers A.L.M. (1995). A rationale for the appropriate amount of inoculum in ready biodegradability tests. Biodegradation 6: 319-327.
|
(24)
|
EU (1999). Ring-test of the ISO Headspace CO2 method: application to surfactants: Surfactant Ring Test-1, Report EU4697, Water Research Centre, May 1999, Medmenham, SL7 2HD, UK.
|
(25)
|
ISO 10634 (1996) Qualité de l’eau – Lignes directrices pour la préparation et le traitement des composés organiques peu solubles dans l’eau en vue de l’évaluation de leur biodégradabilité en milieu aqueux.
|
Appendice 1
ABRÉVIATIONS ET DÉFINITIONS
CI: carbone inorganique.
ThCO2: production théorique de CO2 (mg); correspond à la quantité de dioxyde de carbone calculée à partir de la teneur en carbone connue ou mesurée de la substance d’essai, qui doit se dégager lors de la minéralisation complète de celle-ci; également exprimée en mg de dioxyde de carbone dégagé par mg de substance d’essai.
COD: le carbone organique dissous est le carbone organique présent en solution ou qui traverse un filtre à pores de 0,45 micron ou encore qui reste dans le surnageant après une centrifugation de 15 minutes à environ 4 000 g (40 000 m sec-2).
CID: carbone inorganique dissous.
ThCI: production théorique de carbone inorganique.
CIT: carbone inorganique total.
Facilement biodégradable: classification arbitraire des produits chimiques qui ont répondu positivement à certains essais de dépistage spécifiques portant sur la biodégradabilité ultime; du fait de la rigueur de ces essais, on admet que de tels composés se dégraderont rapidement et complètement en milieu aquatique dans des conditions aérobies.
Fenêtre des dix jours: les dix jours qui suivent immédiatement le moment où le taux de biodégradation atteint 10 %.
Biodégradabilité intrinsèque: classification des produits chimiques pour lesquels une biodégradation (primaire ou finale) se manifeste sans ambiguïté au cours d’un quelconque essai de biodégradabilité.
Biodégradation ultime en aérobiose: niveau de dégradation atteint lorsque la totalité de la substance d’essai a été utilisée par des micro-organismes pour produire du dioxyde de carbone, de l’eau, des sels minéraux et de nouveaux constituants cellulaires microbiologiques (biomasse).
Minéralisation: dégradation complète d’un composé organique en CO2 et en H2O dans des conditions aérobies, et en CH4, CO2 et H2O dans des conditions anaérobies.
Phase de latence: correspond à la période qui commence au début de l’essai et s’achève au moment où les micro-organismes dégradants se sont acclimatés et/ou adaptés et où le degré de biodégradation d’une substance chimique ou d’une matière organique a atteint un niveau détectable (par exemple 10 % de la biodégradation maximale théorique, ou moins, suivant la précision de la technique de mesure).
Phase de dégradation: correspond à la période qui commence à la fin de la phase de latence et se termine au moment où on atteint 90 % du taux maximal de dégradation.
Phase plateau: phase au cours de laquelle la dégradation atteint sa valeur maximale et où la courbe de biodégradation marque un palier.
Substance d’essai: toute substance ou tout mélange soumis à un essai réalisé suivant la présente méthode d’essai.
Appendice 2
Exemple de courbe de biodégradation
Figure 1
Biodégradation du 1-octanol au cours de l’essai de l’espace de tête (dégagement de CO2)
Glossaire
biodégradation.
phase de dégradation.
niveau maximal de biodégradation.
phase plateau.
fenêtre de dix jours.
durée de l’essai (jours).
C. 30. BIOACCUMULATION CHEZ LES OLIGOCHÈTES TERRESTRES
INTRODUCTION
1.
|
La présente méthode d’essai est équivalente à la ligne directrice 317 (2010) de l’OCDE pour les essais de produits chimiques. Parmi les méthodes d’essai relatives au devenir environnemental, celles intitulées “Bioconcentration: essai avec renouvellement continu sur les poissons” [chapitre C.13 de la présente annexe (49)] et “Bioaccumulation chez les oligochètes benthiques fouisseurs” (53) ont été publiées, respectivement, en 1996 et en 2008. Il est difficile voire impossible d’extrapoler aux organismes terrestres comme les vers de terre les données sur la bioaccumulation en milieu aquatique. Des calculs de modèles fondés sur la lipophilie d’une substance d’essai, voir par exemple (14) ou (37), sont actuellement utilisés pour évaluer la bioaccumulation des substances chimiques dans le sol, notamment dans le document d’orientation technique de l’Union européenne (19). La nécessité d’appliquer une méthode d’essai comportant des compartiments spécifiques a déjà été exposée (55). Une telle méthode est particulièrement importante pour évaluer l’empoisonnement secondaire dans les chaînes alimentaires terrestres (4). Plusieurs méthodes d’essai nationales portent sur la bioaccumulation chez les organismes autres que les poissons, par exemple (2) et (72). Une méthode d’évaluation de la bioaccumulation chez les vers de terre (Eisenia fetida, Savigny) et les enchytrées dans des sols contaminés a été élaborée par l’American Society for Testing and Materials (ASTM) (3). Une méthode internationalement reconnue visant à déterminer la bioaccumulation dans un sol chargé permettra de mieux évaluer les risques des produits chimiques pour les écosystèmes terrestres, notamment (25) et (29).
|
2.
|
Les invertébrés géophages sont exposés aux substances chimiques présentes dans le sol. Au nombre de ces animaux, les oligochètes terrestres jouent un rôle important dans la structure et la fonction des sols (15) (20). Les oligochètes terrestres vivent dans le sol et, partiellement, à sa surface (notamment sur la litière); ils représentent fréquemment l’espèce la plus abondante en termes de biomasse (54). Leur rôle dans la bioturbation du sol et leur fonction de proies confèrent à ces animaux une influence considérable sur la biodisponibilité des substances chimiques pour d’autres organismes comme les prédateurs invertébrés [dont les acariens et les coléoptères; voir notamment (64)] ou vertébrés [dont les renards et les mouettes (18) (62)]. Certaines espèces d’oligochètes terrestres actuellement utilisées dans les essais écotoxicologiques sont décrites à l’appendice 5.
|
3.
|
Le guide de l’ASTM sur les essais en laboratoire consacrés à la toxicité du sol ou à la bioaccumulation chez les vers de terre Eisenia fetida et les enchytrées Enchytraeus albidus (3) fournit nombre d’informations essentielles qui ont servi à mettre en œuvre la méthode d’essai exposée ici sur la bioaccumulation dans le sol. Parmi les autres références citées dans la présente méthode d’essai figurent le chapitre C.13 de la présente annexe, intitulé “Bioconcentration: essai avec renouvellement continu sur les poissons” (49) et la ligne directrice 315 de l’OCDE intitulée “Bioaccumulation chez les oligochètes benthiques fouisseurs” (53). Des expériences pratiques tirées d’études et de diverses publications sur la bioaccumulation dans le sol, dont (1) (5) (11) (12) (28) (40) (43) (45) (57) (59) (76) (78) (79), ont également largement inspiré la présente méthode d’essai.
|
4.
|
Cette méthode d’essai s’applique essentiellement aux substances chimiques organiques neutres, stables, qui ont tendance à être adsorbées dans le sol. Elle permet également d’évaluer la bioaccumulation de composés organométalliques stables, associés au sol. Cette méthode s’applique aussi aux métaux et autres éléments présents à l’état de traces.
|
PRÉREQUIS
5.
|
Les essais visant à mesurer la bioaccumulation d’une substance dans les oligochètes terrestres ont été réalisés avec des métaux lourds [voir notamment (63)] et des substances organiques persistantes dont le log Kow (Koe) se situe entre 3,0 et 6,0 (40). Ces essais s’appliquent également aux:
—
|
substances dont le log Kow est supérieur à 6,0 (substances super-hydrophobes),
|
—
|
substances appartenant à la classe des substances organiques connues pour leur potentiel de bioaccumulation dans les organismes vivants, par exemple les substances fortement adsorbantes ou tensio-actives,
|
—
|
substances qui présentent un potentiel de bioaccumulation de par leurs caractéristiques structurelles (analogues des substances dont le potentiel de bioaccumulation est connu),
|
|
6.
|
Avant de débuter toute étude, il convient de disposer de certaines informations sur la substance d’essai, comme le nom courant, le nom chimique (de préférence le nom IUPAC), la formule structurale, le numéro CAS, la pureté, les mesures de sécurité, les conditions de stockage appropriées et les méthodes d’analyse. Il faut aussi connaître les propriétés suivantes de la substance:
a)
|
solubilité dans l’eau;
|
b)
|
coefficient de partage octanol-eau, Kow;
|
c)
|
coefficient de partage sol-eau, exprimé par Koc;
|
e)
|
dégradabilité (dans le sol ou l’eau notamment);
|
|
7.
|
Il est possible d’utiliser des substances d’essai radiomarquées ou non. Cependant, l’utilisation de substances radiomarquées est recommandée car elle facilite l’analyse. La décision d’y recourir dépendra des limites de détection ou de la nécessité de mesurer le composé parent et les métabolites. Dans le cas où une substance radiomarquée est utilisée et où le total des résidus radioactifs est mesuré, il est important que les résidus radiomarqués tant dans le sol que dans les organismes d’essai soient définis en pourcentages de la substance d’essai parente et de la substance marquée non-parente, par exemple dans des échantillons prélevés à un état stationnaire ou à la fin de la phase d’absorption, pour permettre de calculer le facteur de bioaccumulation (FBA) pour la substance d’essai parente et les métabolites du sol pertinents (voir paragraphe 50). Il peut s’avérer nécessaire de modifier la méthode décrite ici, en particulier en vue de disposer d’une biomasse suffisante pour mesurer les substances d’essai organiques non-radiomarquées ou les métaux. Lorsque le total des résidus radioactifs est mesuré (par comptage en scintillation liquide après extraction, combustion ou solubilisation des tissus), le facteur de bioaccumulation est basé sur la susbtance d’essai parente et sur les métabolites. Il est préférable que le FBA soit calculé sur la base de la concentration de la substance d’essai parente dans les organismes et du total des résidus radioactifs. Ensuite, le facteur d’accumulation biota-sol (BSAF) (biota-soil accumulation factor), normalisé par rapport à la teneur en lipides des vers et à la teneur en carbone organique (CO) du sol, est calculé à partir du FBA pour garantir la comparabilité des résultats de différents essais de bioaccumulation.
|
8.
|
Il convient que la toxicité de la substance d’essai envers les espèces utilisées dans l’essai soit connue, notamment la concentration d’effet (CEx) ou la concentration létale (CLx) pour la durée de la phase d’absorption [(19) par exemple]. La concentration de la substance d’essai représente de préférence environ 1 % de sa CL50 aiguë asymptotique, et elle est au moins dix fois supérieure à sa limite de détection dans le sol par la méthode d’analyse utilisée. La préférence est donnée, lorsqu’elles sont disponibles, aux valeurs de toxicité issues d’études à long terme sur les effets sublétaux observés (51) et (52). Si ces données ne sont pas disponibles, un essai de toxicité aiguë apportera des informations utiles [voir notamment (23)].
|
9.
|
Il est nécessaire de disposer d’une méthode d’analyse appropriée, dont on connaît l’exactitude, la précision et la sensibilité pour quantifier la substance dans les solutions d’essai, dans le sol et dans le matériel biologique; il est aussi nécessaire de disposer des détails de la préparation et du stockage des échantillons, et des fiches de données de sécurité des substances. Il convient également de connaître les limites de détection analytiques de la substance d’essai dans le sol et les tissus du ver. Si une substance d’essai marquée au 14C est utilisée, il est nécessaire de connaître aussi la radioactivité spécifique (c’est-à- dire en Bq.mol-1) et le pourcentage de radioactivité associé aux impuretés. La radioactivité spécifique de la substance d’essai sera suffisamment élevée pour faciliter l’analyse et les concentrations d’essai utilisées ne provoqueront pas d’effets toxiques.
|
10.
|
L’essai peut être réalisé sur sol naturel ou artificiel. Avant le début de l’essai, il convient de connaître les caractéristiques du sol naturel utilisé, par exemple son origine ou ses constituants, son pH, sa teneur en carbone organique, sa distribution granulométrique (pourcentages de sable, de limon et d’argile), et sa capacité de rétention d’eau (CRE) (3) (48).
|
PRINCIPE DE L’ESSAI
11.
|
Les paramètres qui caractérisent la bioaccumulation d’une substance d’essai se composent du facteur de bioaccumulation (FBA), de la constante de vitesse d’absorption (ks) et de la constante de vitesse d’élimination (ke). L’appendice 1 donne des définitions détaillées de ces paramètres.
|
12.
|
L’essai consiste en deux phases, la phase d’absorption (exposition) et la phase d’élimination (postexposition). Durant la phase d’absorption, des groupes répliqués de vers sont exposés au sol chargé avec la substance d’essai. En plus des animaux d’essai, des groupes témoins de vers sont conservés dans des conditions identiques, sans la substance d’essai. Le poids sec et la teneur en lipides des organismes d’essai sont mesurés. Pour ce faire, on peut utiliser des vers du groupe témoin. Les valeurs de fond analytiques (essai à blanc) peuvent être obtenues en analysant des échantillons des vers et du sol témoins. Pour la phase d’élimination, les vers sont transférés dans un sol dépourvu de la substance d’essai. Une phase d’élimination est toujours nécessaire sauf si l’absorption de la substance d’essai au cours de la phase d’exposition s’avère être non significative. Elle permet de recueillir des informations sur la vitesse à laquelle la substance d’essai est excrétée par l’organisme d’essai (27). Si un état stationnaire n’a pas été atteint durant la phase d’absorption, il est préférable de déterminer les paramètres cinétiques – constantes de vitesse d’absorption et d’élimination, facteur de bioaccumulation cinétique FBAk – en s’appuyant sur l’ajustement simultané des résultats des phases d’absorption et d’élimination. La concentration de la substance d’essai dans ou sur les vers est contrôlée pendant toute la durée des deux phases de l’essai.
|
13.
|
Durant la phase d’absorption, des mesures sont effectuées pendant des temps de prélèvement pouvant durer jusqu’à 14 jours (enchytrées) ou 21 jours (vers de terre) jusqu’à ce que l’état stationnaire soit atteint (11) (12) (67). On identifie un état stationnaire lorsque le tracé de la concentration dans les vers en fonction du temps est parallèle à l’axe du temps, et lorsque trois analyses successives de la concentration réalisées sur des échantillons prélevés à des intervalles d’au moins deux jours ne diffèrent pas de plus de ± 20 % l’une par rapport à l’autre sur la base de comparaisons statistiques (par exemple, analyse de la variance, analyse de la régression).
|
14.
|
La phase d’élimination consiste à transférer les organismes d’essai dans des récipients qui contiennent un substrat identique, mais sans la substance d’essai. Durant la phase d’élimination, les mesures sont réalisées pendant des durées pouvant aller jusqu’à 14 jours (enchytrées) ou 21 jours (vers de terre), à moins qu’une détermination analytique antérieure n’ait mis en évidence une diminution de 90 % des résidus de substance d’essai dans les vers. La concentration de la substance d’essai dans les vers à la fin de la phase d’élimination est consignée comme résidus non éliminés. Le facteur de bioaccumulation à l’état stationnaire (steady state) (FBAss) est calculé de préférence à la fois comme le rapport de la concentration dans les vers (Ca) à celle dans le sol (Cs) à un état stationnaire apparent, et comme un facteur de bioaccumulation cinétique (FBAK), c’est-à-dire comme le rapport de la constante de vitesse d’absorption à partir du sol (ks) à la constante de vitesse d’élimination (ke) (voir l’appendice 1 pour les définitions) en supposant une cinétique du premier ordre (voir l’appendice 2 pour les calculs). Si la cinétique du premier ordre n’est manifestement pas applicable, il convient d’employer d’autres modèles.
|
15.
|
La constante de vitesse d’absorption, la constante de vitesse d’élimination (ou les constantes, si d’autres modèles ont été utilisés), le facteur de bioaccumulation cinétique (FBAK), et lorsque cela est possible, les limites de confiance de chacun de ces paramètres, sont calculés à partir d’équations de modèles à l’aide de programmes informatiques (voir l’appendice 2). La qualité de l’ajustement d’un modèle peut être déterminée à partir du coefficient de corrélation ou du coefficient de détermination (des coefficients proches de 1 indiquent une bonne qualité d’ajustement) ou de la loi du chi-deux. De plus la grandeur de l’écart-type ou de l’intervalle de confiance autour des paramètres estimés peut donner une bonne indication de la qualité de l’ajustement du modèle.
|
16.
|
Pour réduire la variabilité des résultats pour les substances de lipophilie élevée, les facteurs de bioaccumulation sont exprimés par rapport à la teneur en lipides et à la teneur en carbone organique [teneur en kg de carbone organique (CO) du sol par teneur en kg de lipides des vers]. Cette approche s’appuie sur le fait que, pour certaines classes chimiques, il existe une relation claire entre le potentiel de bioaccumulation et la lipophilie; cette relation a été clairement établie pour le poisson (47). Il existe une relation entre la teneur en lipides du poisson et la bioaccumulation de ces substances. Pour les organismes benthiques, des corrélations similaires ont été trouvées [voir notamment (30) (44)]. Cette corrélation a également été démontrée pour les oligochètes terrestres (5) (6) (7) (14). Si on dispose de suffisamment de tissu de vers, il est possible de déterminer la teneur en lipides des animaux d’essai sur le même matériel biologique que celui utilisé pour déterminer la concentration de la substance d’essai. Il est également possible de mesurer la teneur en lipides en utilisant des animaux témoins.
|
VALIDITÉ DE L’ESSAI
17.
|
Pour qu’un essai soit valable, les critères suivants seront remplis tant concernant les animaux témoins que les animaux traités:
—
|
à l’issue de l’essai, la mortalité totale au cours des phases d’absorption et d’élimination ne dépasse pas 10 % (vers de terre) ou 20 % (enchytrées) du nombre total de vers introduits,
|
—
|
avec Eisenia fetida et Eisenia andrei, la perte de poids moyenne mesurée à la fin des phases d’absorption et d’élimination ne dépasse pas 20 % du poids frais initial au début de chaque phase.
|
|
DESCRIPTION DE LA MÉTHODE
Espèces d’essai
18.
|
Différentes espèces d’oligochètes terrestres sont recommandées pour les essais sur la bioaccumulation. Les espèces les plus couramment employées, Eisenia fetida ou Eisenia andrei (vers de terre) ou encore Enchytraeus albidus, Enchytraeus crypticus ou Enchytraeus luxuriosus (enchytrées), sont décrites à l’appendice 5.
|
Appareillage
19.
|
Il convient d’éviter avec soin d’utiliser pour l’appareillage des matériaux susceptibles de dissoudre ou d’adsorber la substance d’essai ou de laisser s’échapper des substances ayant un effet délétère sur les animaux d’essai. Il est possible d’utiliser des récipients rectangulaires ou cylindriques standard, faits dans un matériau chimiquement inerte et d’une capacité adaptée, conforme au taux de charge, c’est-à- dire au nombre de vers d’essai. De l’acier inoxydable, du plastique ou du verre peut être utilisé pour tout équipement entrant en contact avec le milieu d’essai. Les récipients d’essai devront être fermés de manière appropriée, pour éviter que les vers ne s’échappent, tout en assurant un apport d’air suffisant. Du verre silanisé peut s’avérer nécessaire pour des substances de coefficient d’adsorption élevé comme les pyréthroïdes synthétiques. Dans ces cas de figure, l’équipement devra être jeté après usage (49). Il conviendra d’éviter l’évaporation des substances radiomarquées et des substances chimiques volatiles. On utilisera des pièges (par exemple des flacons de lavage des gaz) contenant un absorbant permettant de capter d’éventuels résidus susceptibles de s’évaporer des récipients d’essai.
|
Sol
20.
|
Il convient que le sol d’essai soit être d’une qualité permettant la survie et de préférence la reproduction des organismes d’essai durant les périodes d’acclimatation et d’essai, sans qu’ils ne présentent un aspect ou un comportement anormal. Les vers devront pouvoir s’enfouir dans le sol.
|
21.
|
Il est recommandé d’utiliser comme substrat lors des essais le sol artificiel décrit au chapitre C.8 de la présente annexe (48). La préparation du sol artificiel en vue d’essais sur la bioaccumulation est décrite à l’appendice 4, où figurent également des recommandations relatives au stockage de ce sol artificiel. Tout sol artificiel séché à l’air peut être stocké à température ambiante jusqu’à son utilisation.
|
22.
|
Toutefois, il est possible d’utiliser des sols naturels provenant de sites non pollués comme sol d’essai et/ou d’élevage. Les sols naturels sont caractérisés au moins par leur origine (site de prélèvement), leur pH, leur teneur en carbone organique, leur distribution granulométrique (pourcentage de sable, de limon et d’argile), leur capacité maximale de rétention d’eau (CREmax), et leur teneur en eau (3). La recherche de micropolluants dans le sol ou dans ses constituants, préalablement à son utilisation, devrait fournir des informations utiles. En cas d’utilisation d’un sol naturel prélevé sur des terres agricoles, il convient que ce dernier n’ait pas été traité avec des produits phytopharmaceutiques ou n’ait pas fait l’objet d’un épandage de fumier d’animaux traités pendant au moins un an avant l’échantillonnage, ou d’un épandage d’engrais organiques pendant au moins six mois avant l’échantillonnage (50). Les procédures de manipulation des sols naturels avant utilisation dans le cadre d’essais écotoxicologiques sur des oligochètes en laboratoire sont décrites dans le document de l’ASTM (3). La durée de stockage des sols naturels au laboratoire est aussi courte que possible.
|
Application de la substance d’essai
23.
|
La substance d’essai est incorporée dans le sol. Il convient de prendre en compte les propriétés physico-chimiques de cette substance. Une substance d’essai soluble dans l’eau est entièrement dissoute dans l’eau avant d’être mélangée au sol. La procédure de chargement recommandée pour les substances d’essai peu solubles dans l’eau consiste à enrober un ou plusieurs des constituants du sol (artificiel) avec la substance d’essai. Par exemple, le sable de quartz, ou une portion de celui-ci, peut être trempé dans une solution de la substance d’essai dans un solvant organique adapté, lequel est ensuite lentement évaporé jusqu’à dessiccation. La fraction enrobée peut ensuite être mélangée avec le sol mouillé. Cette procédure a pour principal avantage de n’introduire aucun solvant dans le sol. En cas d’utilisation d’un sol naturel, la substance d’essai peut être ajoutée soit par chargement d’une portion du sol séchée à l’air comme décrit précédemment pour le sol artificiel, soit par mélange avec le sol mouillé, puis évaporation si un agent de solubilisation est utilisé. En règle générale, il conviendra d’éviter autant que possible tout contact du sol mouillé avec les solvants. Les éléments suivants sont à prendre en considération (3):
—
|
si un solvant autre que l’eau est utilisé, il convient qu’il soit miscible à l’eau et/ou puisse être éliminé (par évaporation notamment) pour ne laisser que la substance chimique d’essai sur le sol,
|
—
|
si un témoin solvant est utilisé, aucun témoin négatif n’est nécessaire. Le témoin solvant présentera la plus forte concentration de solvant ajouté au sol et le solvant en question sera issu du même lot que celui utilisé pour la solution mère. La toxicité et la volatilité du solvant ainsi que la solubilité de la substance d’essai dans le solvant sélectionné constituent les principaux critères de choix pour l’agent de solubilisation.
|
|
24.
|
Pour les substances peu solubles dans l’eau et les solvants organiques, 2,0 à 2,5 g de sable quartzique finement broyé par récipient d’essai peuvent être mélangés, au moyen d’un mortier et d’un pilon par exemple, à la quantité nécessaire de la substance d’essai pour obtenir la concentration expérimentale voulue. Ce mélange de sable quartzique et de la substance d’essai est ajouté au sol préhumidifié, auquel il est mélangé complètement après l’ajout de la quantité nécessaire d’eau désionisée pour atteindre l’humidité requise. Le mélange final est réparti entre les récipients d’essai. On répète la procédure pour chaque concentration expérimentale et on prépare un témoin approprié de 2,0 à 2,5 g de sable quartzique finement broyé par récipient d’essai.
|
25.
|
La concentration de la substance d’essai dans le sol est déterminée après chargement. La répartition homogène de la substance d’essai dans le sol est contrôlée avant l’introduction des organismes d’essai. La méthode de chargement choisie et les raisons de ce choix sont notées (24).
|
26.
|
Idéalement, il convient d’établir un équilibre entre le sol et l’eau interstitielle avant l’ajout des organismes; une période de quatre jours à 20 °C est recommandée. Pour un grand nombre de substances chimiques organiques faiblement solubles dans l’eau, le laps de temps nécessaire pour qu’un véritable équilibre soit atteint entre les parties adsorbées et dissoutes peut s’étendre sur plusieurs jours ou plusieurs mois. Selon l’objectif de l’étude, par exemple lorsqu’il s’agit de simuler des conditions environnementales, il peut être nécessaire de “vieillir” plus longtemps le sol chargé [trois semaines à 20 °C pour les métaux notamment (22)].
|
Élevage des animaux d’essai
27.
|
Il est préférable de conserver les vers en élevage de laboratoire permanent. Des conseils sur les méthodes d’élevage en laboratoire concernant Eisenia fetida et Eisenia andrei, et les espèces enchytrées figurent à l’appendice 5 [voir aussi (48), (51) et (52)].
|
28.
|
Il convient que les vers utilisés dans les essais ne présentent pas de maladies, anomalies ou parasites observables.
|
DÉROULEMENT DE L’ESSAI
29.
|
Les organismes d’essai sont exposés à la substance d’essai durant la phase d’absorption. La phase d’absorption dure 14 jours (enchytrées) ou 21 jours (vers de terre) sauf s’il est prouvé que l’état stationnaire a été atteint.
|
30.
|
Pour la phase d’élimination, les vers sont transférés sur un sol dépourvu de la substance d’essai. Le premier échantillon est prélevé de 4 à 24 h après le début de la phase d’élimination. L’appendice 3 donne des exemples de programme d’échantillonnage pour une phase d’absorption de 21 jours et une phase d’élimination de 21 jours.
|
Organismes d’essai
31.
|
Chez de nombreuses espèces d’oligochètes terrestres, le poids individuel est très faible (5 à 10 mg de poids humide par individu pour Enchytraeus albidus et moins pour Enchytraeus crypticus ou Enchytraeus luxuriosus); la pesée et l’analyse chimique peuvent nécessiter de réunir les vers des récipients de réplicats (tous les vers d’un récipient de réplicat sont utilisés afin d’obtenir un seul résultat pour les tissus analysés). Vingt enchytrées sont ajoutés à chaque réplicat, et au moins trois réplicats sont utilisés. Si la limite de détection analytique de la substance d’essai est élevée, il peut être nécessaire d’utiliser un plus grand nombre de vers. Pour les espèces d’essai de poids individuel supérieur (Eisenia fetida et Eisenia andrei), il est possible de recourir à des récipients de réplicats contenant un seul individu.
|
32.
|
Il convient que les vers de terre utilisés lors d’un essai soient de poids similaire (Eisenia fetida et Eisenia andrei ont par exemple un poids individuel de 250 à 600 mg). Les enchytrées (Enchytraeus albidus notamment) mesurent environ 1 cm de long. Tous les vers utilisés pour un même essai proviennent de la même source et sont adultes (avec un clitellum) (appendice 5). Le poids et l’âge d’un animal pouvant influer sur les valeurs de FBA (par exemple, du fait d’une teneur en lipides variable et/ou de la présence d’œufs), ces paramètres sont consignés avec précision, et pris en compte dans l’interprétation des résultats. De plus, des cocons sont susceptibles d’apparaître pendant la période d’exposition, ce qui a également des répercussions sur les valeurs de FBA. Il est recommandé de peser un sous-échantillon des vers avant l’essai afin d’estimer les poids humides et secs moyens.
|
33.
|
Un rapport sol/vers élevé est utilisé afin de minimiser la baisse de la concentration de la substance d’essai dans le sol durant la phase d’absorption. Il est recommandé que ce rapport s’élève au minimum, pour Eisenia fetida et Eisenia andrei, à 50 g de poids sec de sol par ver et, pour les enchytrées, à 10-20 g de poids sec de sol par récipient d’essai. La couche de sol contenu dans les récipients a une épaisseur de 2 à 3 cm (enchytrées) ou de 4 à 5 cm (vers de terre).
|
34.
|
Les vers utilisés lors d’un essai sont extraits du milieu d’élevage (les enchytrées par exemple à l’aide de pinces de joaillier). Les animaux adultes sont transférés pour acclimatation sur un sol d’essai non traité, puis nourris (voir le paragraphe 36). Si les conditions d’essai diffèrent des conditions d’élevage, une phase d’acclimatation de 24 à 72 h devrait suffire à l’adaptation des vers aux conditions d’essai. Une fois acclimatés, les vers de terre sont transférés dans des récipients en verre (des boîtes de Petri par exemple) contenant une eau propre pour y être rincés, puis ils sont pesés avant d’être déposés sur le sol d’essai. Avant la pesée, tout excès d’eau est enlevé en tapotant délicatement les vers contre le bord du récipient ou en les séchant précautionneusement à l’aide d’une serviette en papier légèrement humidifiée.
|
35.
|
Le comportement d’enfouissement des organismes d’essai est observé et consigné. Dans les essais menés avec des vers de terre, les animaux (témoins et traités) s’enfouissent dans le sol normalement en quelques heures; ceci est vérifié 24 h maximum après l’ajout des vers dans le récipient d’essai. Si ce n’est pas le cas (par exemple, plus de 10 % ne s’enfouissent pas pendant plus de la moitié de la phase d’absorption), soit les conditions d’essai ne sont pas appropriées, soit les organismes d’essai ne sont pas en bonne santé. Il conviendra alors d’arrêter l’essai et de le répéter. Les enchytrées vivant essentiellement dans les pores interstitiels du sol, il arrive souvent que leur tégument soit seulement partiellement en contact avec le substrat environnant. On suppose que l’exposition des enchytrées enfouis et non enfouis est équivalente, et le non-enfouissement des enchytrées n’exige pas nécessairement de répéter l’essai.
|
Alimentation
36.
|
L’alimentation des organismes d’essai est envisagée si le sol utilisé présente une faible teneur en carbone organique total. Avec un sol artificiel, il est recommandé d’alimenter les vers suivant une fréquence hebdomadaire (une fois par semaine) à raison de 7 mg de fumier séché par gramme de masse sèche du sol pour les vers de terre, et de 2 à 2,5 mg de flocons d’avoine moulus par gramme de masse sèche du sol pour les enchytrées (11). La première ration est mélangée au sol immédiatement avant l’ajout des organismes d’essai. Il convient d’employer, de préférence, le même type d’alimentation que pour l’élevage (appendice 5).
|
Régime d’éclairage et température
37.
|
Les essais sont menés suivant un cycle contrôlé de 16/8 heures de lumière/obscurité, avec une intensité lumineuse comprise de préférence entre 400 et 800 lx au niveau des récipients d’essai (3). La température est maintenue à 20 ± 2 °C tout au long de l’essai.
|
Concentrations d’essai
38.
|
Une seule concentration est utilisée. Les cas où une ou plusieurs concentrations seraient requises font l’objet d’une justification. Si la toxicité (CEx) de la substance d’essai est voisine de la limite de détection analytique, on recommande l’utilisation d’une substance d’essai radiomarquée, de radioactivité spécifique élevée. Pour les métaux, la concentration devra être supérieure à la concentration de fond dans les tissus et le sol.
|
Réplicats
39.
|
Concernant les mesures de cinétique (phase d’absorption et d’élimination), le nombre minimum de récipients de réplicats traités devra être de trois par point d’échantillonnage. Le nombre total de réplicats préparés suffira à couvrir tous les temps de prélèvement prévus au cours des phases d’absorption et d’élimination.
|
40.
|
Pour les observations et les mesures biologiques (rapport poids sec/poids humide, teneur en lipides) et pour l’analyse des concentrations de fond dans les vers et le sol, au moins 12 récipients de réplicats d’un témoin négatif (quatre échantillons prélevés au démarrage, quatre à la fin de la phase d’absorption et quatre à la fin de la phase d’élimination) sont fournis, si aucun solvant autre que l’eau n’a été utilisé. Si un agent de solubilisation est utilisé pour l’application de la substance d’essai, il convient de prévoir, en plus des réplicats traités, des témoins solvant (quatre récipients de réplicats devront faire l’objet d’un prélèvement au démarrage, quatre à la fin de la phase d’absorption et quatre à la fin de la phase d’élimination) contenant tous les constituants, à l’exception de la substance d’essai. Dans ce cas, quatre récipients supplémentaires de réplicats d’un témoin négatif (sans solvant) pourront également être fournis pour procéder à un nouvel échantillonnage à la fin de la phase d’absorption. Ces réplicats pourront être comparés biologiquement avec le témoin solvant afin d’obtenir des informations sur une éventuelle influence du solvant sur les organismes d’essai. Il est recommandé de prévoir un nombre suffisant de récipients supplémentaires de réplicats de réserve (huit, par exemple) pour les vers traités et les vers témoins.
|
Fréquence des mesures de la qualité du sol
41.
|
Le pH et le taux d’humidité du sol sont mesurés au début et à la fin des phases d’absorption et d’élimination. La température de la chambre d’essai est relevée en continu. Il convient de contrôler l’humidité du sol une fois par semaine en pesant les récipients d’essai et en comparant leur poids au moment des contrôles avec leur poids en début d’essai. Les pertes d’humidité sont compensées par l’ajout d’eau désionisée.
|
Échantillonnage et analyse des vers et du sol
42.
|
L’appendice 3 donne un exemple de programme d’échantillonnage pour les phases d’absorption et d’élimination des essais de bioaccumulation sur les vers de terre et les enchytrées.
|
43.
|
Un échantillon du sol est prélevé dans les récipients d’essai pour déterminer la concentration de la substance d’essai avant l’introduction des vers, puis durant les phases d’absorption et d’élimination. Pendant l’essai, les concentrations de la substance d’essai sont déterminées dans les vers et dans le sol. En règle générale, on mesure les concentrations totales dans le sol. On peut également mesurer les concentrations dans l’eau interstitielle; dans ce cas, il convient de justifier ce choix et de décrire les méthodes appropriées prévues avant le début de l’étude, puis de consigner ces informations dans le rapport.
|
44.
|
Les vers et le sol sont échantillonnés au moins à six reprises durant les phases d’absorption et d’élimination. Si la stabilité d’une substance d’essai est démontrée, le nombre d’analyses du sol peut être réduit. Il est recommandé d’analyser au moins trois réplicats au début et à la fin de la phase d’absorption. Si la concentration mesurée dans le sol à la fin de la phase d’absorption s’écarte de la concentration initiale de plus de 30 %, les échantillons de sol prélevés à d’autres dates sont également analysés.
|
45.
|
Enlever du sol les vers d’un réplicat donné à chaque temps de prélèvement (par exemple, après avoir étalé le sol du réplicat sur un plateau peu profond et prélevé les vers à l’aide d’une pince de joaillier), les rincer rapidement à l’eau dans un récipient peu profond en verre ou en acier. Enlever l’eau en excès (voir le paragraphe 34). Transférer délicatement les vers dans un récipient préalablement taré, et les peser immédiatement, en incluant le contenu de l’intestin.
|
46.
|
Les vers de terre (Eisenia sp.) doivent pouvoir purger leur intestin pendant la nuit, par exemple sur un papier filtre humide dans une boîte de Petri fermée (voir paragraphe 34). Après la purge, il convient de déterminer le poids des vers afin d’évaluer la perte éventuelle de biomasse pendant l’essai (voir les critères de validité au paragraphe 17). La pesée et l’analyse des tissus des enchytrées sont effectuées sans purge, ceci étant techniquement difficile en raison de la petite taille de ces vers. Une fois le poids final déterminé, les vers sont tués immédiatement, en utilisant la méthode la plus appropriée (par exemple avec de l’azote liquide, ou en congelant les vers à une température inférieure à - 18 °C).
|
47.
|
Durant la phase d’élimination, les vers remplacent le contenu contaminé de leur intestin par des éléments du sol propre. Autrement dit, les mesures réalisées sur un échantillon de vers qui ne se sont pas purgés (les enchytrées en l’occurrence) immédiatement avant la phase d’élimination incluent le sol contaminé présent dans l’intestin. S’agissant des oligochètes aquatiques, on suppose qu’après les 4 à 24 h initiales de la phase d’élimination, l’essentiel du contenu intestinal contaminé a été remplacé par du sédiment propre [voir notamment (46)]. Des observations similaires ont été rapportées pour les vers de terre lors d’études sur l’accumulation de cadmium et de zinc radiomarqués (78). Chez les enchytrées ne s’étant pas purgés, la concentration de ce premier échantillon de la phase d’élimination peut être considérée comme la concentration dans les tissus après la purge de l’intestin. Pour tenir compte de la dilution de la concentration de la substance d’essai par du sol non contaminé durant la phase d’élimination, il est possible d’estimer le poids du contenu de l’intestin à partir des rapports poids des vers humides/poids des cendres de vers ou poids des vers secs/poids des cendres de vers.
|
48.
|
Il est préférable d’analyser les échantillons de sol et de vers immédiatement après extraction (c’est-à-dire dans les 1 à 2 jours suivants) afin d’éviter des dégradations ou d’autres pertes, et il est recommandé de calculer les vitesses approximatives d’absorption et d’élimination pendant le déroulement de l’essai. Si l’analyse est retardée, les échantillons devront être stockés suivant une méthode appropriée, par exemple, en procédant à leur congélation (≤ - 18 °C).
|
49.
|
Il conviendra de vérifier que la précision et la reproductibilité de l’analyse chimique, ainsi que la récupération de la substance d’essai dans les échantillons de sol et de vers sont satisfaisantes pour la méthode donnée; l’efficacité d’extraction, la limite de détection et la limite de quantification devront être consignées. De même, il faudra s’assurer que la substance d’essai n’est pas détectable dans les récipients témoins à des concentrations supérieures à la concentration de fond. Si la concentration de la substance d’essai dans l’organisme d’essai Ca est > 0 pour les vers témoins, il faudra l’inclure au calcul des paramètres cinétiques (appendice 2). Pendant toute la durée de l’essai, tous les échantillons sont manipulés de façon à réduire au minimum les contaminations et les pertes (résultant, par exemple, de l’adsorption de la substance d’essai sur le dispositif d’échantillonnage).
|
50.
|
En cas d’utilisation de substances d’essai radiomarquées, il est possible d’analyser le produit parent et les métabolites. Une quantification de la substance d’essai parente et des métabolites à l’état stationnaire ou à la fin de la phase d’absorption fournit des informations importantes. Les échantillons sont alors nettoyés de façon à pouvoir quantifier séparément la substance d’essai parente. Si des métabolites simples excèdent 10 % de la radioactivité totale du ou des échantillons analysés, l’identification de ces métabolites est recommandée.
|
51.
|
La récupération globale et la récupération de la substance d’essai dans les vers, le sol, et le cas échéant, dans les pièges contenant des absorbants permettant de retenir la substance d’essai évaporée, sont consignées et rapportées.
|
52.
|
Le regroupement d’individus échantillonnés à partir d’un récipient d’essai donné est acceptable pour les enchytrées, plus petits que les vers de terre. Si ce regroupement implique de réduire le nombre de réplicats, cela restreint les procédures statistiques pouvant s’appliquer aux données. Si une procédure et une puissance statistiques spécifiques sont requises, alors l’essai comprend un nombre adéquat de récipients de réplicats, adapté aux quantités, à la procédure et à la puissance voulues.
|
53.
|
Il est recommandé d’exprimer le FBA à la fois comme une fonction du poids sec total et, si nécessaire (à savoir pour des substances fortement hydrophobes), comme une fonction de la teneur en lipides. La teneur en lipides est déterminée par des méthodes appropriées [certaines méthodes existantes, voir par exemple (31) ou (58), ont besoin d’être adaptées à cette fin]. Ces méthodes s’appuient sur une technique d’extraction au chloroforme/méthanol. Toutefois, afin d’éviter l’utilisation de solvants chlorés, il convient d’utiliser une version modifiée de la méthode de Bligh et Dyer (9) qui est décrite dans (17). Comme les diverses méthodes ne conduisent pas forcément à des valeurs identiques, il est important de détailler la méthode employée. Lorsque cela est possible, c’est-à-dire si on dispose de suffisamment de tissu de vers, la teneur en lipides est, idéalement, analysée à partir du même échantillon ou extrait que la substance d’essai, l’extrait devant souvent être débarrassé de ses lipides avant d’être analysé par chromatographie (49). Une autre possibilité consiste à mesurer la teneur en lipides sur des animaux témoins et à utiliser la valeur obtenue pour normaliser les valeurs de FBA. Cette dernière approche réduit la contamination de l’équipement par la substance d’essai.
|
RÉSULTATS ET RAPPORT
Traitement des résultats
54.
|
On obtient la courbe d’absorption de la substance d’essai en portant la concentration de la substance d’essai dans/sur les vers durant la phase d’absorption en fonction du temps, en échelle arithmétique. Lorsque la courbe atteint un plateau ou état stationnaire (voir les définitions à l’appendice 1), le facteur de bioaccumulation à l’état stationnaire (FBAss) est calculé à l’aide de la formule suivante:
Ca représente la concentration de la substance d’essai dans l’organisme d’essai, et
Cs la concentration de la substance d’essai dans le sol.
|
55.
|
Si la courbe n’atteint pas de plateau, le FBAK, fondé sur les constantes de vitesse, devra être déterminé à la place du BAFss comme suit:
—
|
déterminer le facteur d’accumulation (FBAK) comme le rapport ks/ke,
|
—
|
les vitesses d’absorption et d’élimination sont calculées de préférence simultanément (voir l’équation 11 à l’appendice 2),
|
—
|
La constante de vitesse d’élimination (ke) est généralement déterminée à partir de la courbe d’élimination (c’est-à-dire du tracé de la concentration de la substance d’essai dans les vers durant la phase d’élimination). La constante de vitesse d’absorption ks est ensuite calculée en fonction de ke et d’une valeur de Ca qui est dérivée de la courbe d’absorption – voir la description de ces méthodes à l’appendice 2. La méthode préférée pour l’obtention du FBAK et des constantes de vitesse, ks et ke, consiste à utiliser des méthodes informatisées non linéaires d’estimation des paramètres. Si la courbe d’élimination n’obéit manifestement pas à une cinétique du premier ordre, des modèles plus complexes devront alors être utilisés.
|
|
Rapport d’essai
56.
|
Le rapport d’essai comporte les informations suivantes:
|
Substance d’essai:
—
|
toute information disponible sur la toxicité aiguë ou à long terme (par exemple CEx, CLx, CSEO) de la substance d’essai vis-à-vis des oligochètes fouisseurs,
|
—
|
pureté, état physique et propriétés physico-chimiques, par exemple log Kow, solubilité dans l’eau,
|
—
|
données d’identification de la substance; provenance de la substance d’essai, identité et concentration des solvants éventuellement utilisés,
|
—
|
en cas d’utilisation d’une substance d’essai radiomarquée, position précise des atomes marqués, radioactivité spécifique et pureté radiochimique.
|
|
|
Espèces d’essai:
—
|
nom scientifique, souche, source, traitement préalable éventuel, acclimatation, âge, taille, etc.
|
|
|
Conditions d’essai:
—
|
procédure d’essai utilisée,
|
—
|
type et caractéristiques de l’éclairage utilisé et photopériode(s),
|
—
|
protocole d’essai (par exemple, nombre et dimension des récipients d’essai, masse du sol et épaisseur de la couche de sol, nombre de réplicats, nombre de vers par réplicat, nombre de concentrations d’essai, durée des phases d’absorption et d’élimination, fréquence d’échantillonnage),
|
—
|
justification du matériau choisi pour les récipients d’essai,
|
—
|
méthode de préparation et d’application de la substance d’essai, ainsi que raisons du choix de la méthode,
|
—
|
concentrations d’essai nominales, moyennes et écarts-types des valeurs mesurées dans les récipients d’essai, et méthode d’obtention de ces valeurs,
|
—
|
source des constituants du sol artificiel ou – si un milieu naturel est utilisé – origine du sol, description d’un éventuel traitement préalable, résultats des contrôles (survie, augmentation de la biomasse, reproduction), caractéristiques du sol [pH, teneur totale en carbone organique, distribution granulométrique (pourcentage de sable, de limon et d’argile), capacité maximale de rétention d’eau (CREmax), teneur en eau au début et à la fin de l’essai, et toutes autres mesures réalisées],
|
—
|
informations détaillées sur le traitement des échantillons de sol et de vers, y compris les détails concernant la préparation, le stockage, les procédures de chargement en substance d’essai, l’extraction et les procédures analytiques (et leur précision) pour la substance d’essai dans les vers et le sol, la teneur en lipides (si mesurée), et les méthodes de récupération de la substance d’essai.
|
|
|
Résultats:
—
|
mortalité des vers témoins et des vers dans chaque récipient d’essai et éventuel comportement anormal observé (par exemple, évitement du sol, absence de reproduction lors d’un essai de bioaccumulation chez les enchytrées),
|
—
|
rapport poids sec/poids humide du sol et des organismes d’essai (utiles pour la normalisation),
|
—
|
poids humides des vers à chaque temps de prélèvement; pour les vers de terre, poids humides au début de l’essai, et à chaque temps de prélèvement avant et après la purge de l’intestin,
|
—
|
teneur en lipides des organismes d’essai (si déterminée),
|
—
|
courbes montrant les constantes cinétiques d’absorption et d’élimination de la substance d’essai chez les vers, et la durée pour atteindre l’état stationnaire,
|
—
|
Ca et Cs (avec écart-type et fourchette, si nécessaire) pour tous les temps de prélèvement (Ca exprimé en g.kg-1 de poids humide et sec du corps entier, Cs exprimé en g.kg-1 du poids humide et sec). Si un facteur d’accumulation biote-sol (BSAF) est nécessaire (par exemple, pour une comparaison des résultats entre deux essais ou plus réalisés avec des animaux de teneurs en lipides différentes), Ca est en plus être exprimé en g.kg-1 de teneur en lipides de l’organisme et Cs est exprimé en g.kg-1 de carbone organique (CO) du sol,
|
—
|
FBA (exprimé en kg de sol kg-1 de ver), constante de vitesse d’absorption du sol ks (exprimée en g de sol kg-1 de vers j-1), et constante de vitesse d’élimination ke (exprimée en j-1); éventuellement, BSAF (exprimé en kg de CO du sol kg-1 de teneur en lipides des vers),
|
—
|
le cas échéant: pourcentages de substance parente, de métabolites et de résidus liés (c’est-à-dire le pourcentage de substance d’essai ne pouvant être extraite par les méthodes d’extraction courantes) détectés dans le sol et les animaux d’essai,
|
—
|
méthodes utilisées pour les analyses statistiques des données.
|
|
|
Évaluation des résultats:
—
|
conformité des résultats avec les critères de validité tels qu’énoncés au paragraphe 17,
|
—
|
résultats inattendus ou inhabituels, par exemple élimination incomplète de la substance d’essai des animaux d’essai.
|
|
|
BIBLIOGRAPHIE:
(1)
|
Amorim M. (2000). Chronic and toxicokinetic behavior of Lindane (γ-HCH) in the Enchytraeid Enchytraeus albidus. Master thesis, University Coimbra.
|
(2)
|
ASTM (2000). Standard guide for the determination of the bioaccumulation of sediment-associated contaminants by benthic invertebrates. American Society for Testing and Materials, E 1688-00a.
|
(3)
|
ASTM International (2004). Standard guide for conducting laboratory soil toxicity or bioaccumulation tests with the Lumbricid earthworm Eisenia fetida and the Enchytraeid potworm Enchytraeus albidus. ASTM International, E1676-04: 26 pp.
|
(4)
|
Beek B., Boehling S., Bruckmann U., Franke C., Joehncke U., Studinger G. (2000). The assessment of bioaccumulation. In Hutzinger, O. (editor), The Handbook of Environmental Chemistry, Vol. 2 Part J (Vol. editor: B. Beek): Bioaccumulation – New Aspects and Developments. Springer-Verlag Berlin Heidelberg: 235-276.
|
(5)
|
Belfroid A., Sikkenk M., Seinen W., Van Gestel C., Hermens J. (1994). The toxicokinetic behavior of chlorobenzenes in earthworms (Eisenia andrei): Experiments in soil. Environ. Toxicol. Chem. 13: 93-99.
|
(6)
|
Belfroid A., Van Wezel A., Sikkenk M., Van Gestel C., Seinen W. & Hermens J. (1993). The toxicokinetic behavior of chlorobenzenes in earthworms (Eisenia andrei): Experiments in water. Ecotox. Environ. Safety 25: 154-165.
|
(7)
|
Belfroid A., Meiling J., Drenth H., Hermens J., Seinen W., Van Gestel C. (1995). Dietary uptake of superlipophilic compounds by earthworms (Eisenia andrei). Ecotox. Environ. Safety 31: 185-191.
|
(8)
|
Bell A.W. (1958). The anatomy of Enchytraeus albidus, with a key to the species of the genus Enchytraeus. Ann. Mus. Novitat. 1902: 1-13.
|
(9)
|
Bligh E.G. and Dyer W.J. (1959). A rapid method of total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Physiol. 37: 911-917.
|
(10)
|
Bouché M. (1972). Lombriciens de France. Écologie et systématique. INRA, Annales de zoologie-écologie animale, Paris, 671 p.
|
(11)
|
Bruns E., Egeler Ph., Moser T., Römbke J., Scheffczyk A., Spörlein P. (2001a). Standardisierung und Validierung eines Bioakkumulationstests mit terrestrischen Oligochaeten. Report to the German Federal Environmental Agency (Umweltbundesamt Berlin), R&D No.: 298 64 416.
|
(12)
|
Bruns E., Egeler Ph., Römbke J., Scheffczyk A., Spörlein P. (2001b). Bioaccumulation of lindane and hexachlorobenzene by the oligochaetes Enchytraeus luxuriosus and Enchytraeus albidus (Enchytraeidae, Oligochaeta, Annelida). Hydrobiologia 463: 185-196.
|
(13)
|
Conder J.M. and Lanno R.P. (2003). Lethal critical body residues as measures of Cd, Pb, and Zn bioavailability and toxicity in the earthworm Eisenia fetida. J. Soils Sediments 3: 13-20.
|
(14)
|
Connell D.W. and Markwell R.D. (1990). Bioaccumulation in the Soil to Earthworm System. Chemosphere 20: 91-100.
|
(15)
|
Didden W.A.M. (1993). Ecology of Terrestrial Enchytraeidae. Pedobiologia 37: 2-29.
|
(16)
|
Didden W. (2003). Oligochaeta, In: Bioindicators and biomonitors. Markert, B.A., Breure, A.M. & Zechmeister, H.G. (eds). Elsevier Science Ltd., The Netherlands, p. 555-576.
|
(17)
|
De Boer J., Smedes F., Wells D., Allan A. (1999). Report on the QUASH interlaboratory study on the determination of total-lipid in fish and shellfish. Round 1 SBT-2, Exercise 1000, EU, Standards, Measurement and Testing Programme.
|
(18)
|
Dietrich D.R., Schmid P., Zweifel U., Schlatter C., Jenni-Eiermann S., Bachmann H., Bühler U., Zbinden N. (1995). Mortality of birds of prey following field application of granular carbofuran: A Case Study. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 29: 140-145.
|
(19)
|
Règlement (CE) no 1907/2006 du Parlement européen et du Conseil du 18 décembre 2006 concernant l’enregistrement, l’évaluation et l’autorisation des substances chimiques, ainsi que les restrictions applicables à ces substances (REACH), instituant une agence européenne des produits chimiques, modifiant la directive 1999/45/CE et abrogeant le règlement (CEE) no 793/93 du Conseil et le règlement (CE) no 1488/94 de la Commission ainsi que la directive 76/769/CEE du Conseil et les directives 91/155/CEE, 93/67/CEE, 93/105/CE et 2000/21/CE de la Commission (JO L 396 du 30.12.2006, p. 1).
|
(20)
|
Edwards C.A. and Bohlen P.J. (1996). Biology and ecology of earthworms. Third Edition, Chapman & Hall, London, 426 pp.
|
(21)
|
OCDE (2008). Bioaccumulation chez les oligochètes benthiques fouisseurs, ligne directrice 315 de l’OCDE pour les essais de produits chimiques, OCDE, Paris.
|
(22)
|
Egeler Ph., Gilberg D., Scheffczyk A., Moser Th. and Römbke J. (2009). Validation of a Soil Bioaccumulation Test with Terrestrial Oligochaetes by an International Ring Test (Validierung einer Methode zur standardisierten Messung der Bioakkumulation mit terrestrischen Oligochaeten). Report to the Federal Environmental Agency (Umweltbundesamt Dessau-Rosslau), R&D No: 204 67 458: 149 pp. Le document peut être téléchargé à l’adresse suivante: http://www.oecd.org/dataoecd/12/20/42552727.pdf.
|
(23)
|
Elmegaard N. and Jagers op Akkerhuis G.A.J.M. (2000). Safety factors in pesticide risk assessment, Differences in species sensitivity and acute-chronic relations. National Environmental Research Institute, NERI Technical Report 325: 57 pp.
|
(24)
|
Environnement Canada (1995). Document d’orientation sur la mesure de la précision des essais de toxicité sur sédiments de contrôle dopé avec un produit toxique de référence, Série de la protection de l’environnement, Rapport SPE 1/RM/30.
|
(25)
|
EPPO (2003). Environmental Risk Assessment scheme for plant protection products. Soil organisms and functions, EPPO (European Plant Protection Organization) Standards, Bull, OEPP/EPPO 33: 195-208.
|
(26)
|
Franke C. (1996). How meaningful is the bioconcentration factor for risk assessment? Chemosphere 32: 1897-1905.
|
(27)
|
Franke C., Studinger G., Berger G., Böhling S., Bruckmann U., Cohors-Fresenborg D., Jöhncke U. (1994). The assessment of bioaccumulation. Chemosphere 29: 1501-1514.
|
(28)
|
Füll C. (1996). Bioakkumulation und Metabolismus von -1,2,3,4,5,6-Hexachlorcyclohexan (Lindan) und 2-(2,4-Dichlorphenoxy)-propionsäure (Dichlorprop) beim Regenwurm Lumbricus rubellus (Oligochaeta, Lumbricidae). Dissertation University Mainz, 156 pp.
|
(29)
|
Füll C., Schulte C., Kula C. (2003). Bewertung der Auswirkungen von Pflanzenschutzmitteln auf Regenwürmer. UWSF - Z. Umweltchem, Ökotox. 15: 78-84.
|
(30)
|
Gabric A.J., Connell D.W., Bell P.R.F. (1990). A kinetic model for bioconcentration of lipophilic compounds by oligochaetes. Wat. Res. 24: 1225-1231.
|
(31)
|
Gardner W.S., Frez W.A., Cichocki E.A., Parrish C.C. (1985). Micromethods for lipids in aquatic invertebrates. Limnology and Oceanography 30: 1099-1105.
|
(32)
|
Hawker D.W. and Connell D.W. (1988). Influence of partition coefficient of lipophilic compounds on bioconcentration kinetics with fish. Wat. Res. 22: 701-707.
|
(33)
|
Hund-Rinke K. and Wiechering H. (2000). Earthworm avoidance test for soil assessments: An alternative for acute and reproduction tests. J. Soils Sediments 1: 15-20.
|
(34)
|
Hund-Rinke K., Römbke J., Riepert F., Achazi R. (2000). Beurteilung der Lebensraumfunktion von Böden mit Hilfe von Regenwurmtests. In: Toxikologische Beurteilung von Böden. Heiden, S., Erb, R., Dott, W. & Eisentraeger, A. (eds), Spektrum Verl., Heidelberg, 59-81.
|
(35)
|
ISO 11268-2 (1998), Qualité du sol – Effets des polluants vis- à-vis des vers de terre (Eisenia fetida), Partie 2: Détermination des effets sur la reproduction.
|
(36)
|
Jaenike J. (1982). “Eisenia foetida” is two biological species. Megadrilogica 4: 6-8.
|
(37)
|
Jager T. (1998). Mechanistic approach for estimating bioconcentration of organic chemicals in earthworms (Oligochaeta). Environ. Toxicol. Chem. 17: 2080-2090.
|
(38)
|
Jager T., Sanchez P.A., Muijs B., van der Welde E., Posthuma L. (2000). Toxicokinetics of polycyclic aromatic hydrocarbons in Eisenia andrei (Oligochaeta) using spiked soil. Environ. Toxicol. Chem. 19: 953-961.
|
(39)
|
Jager T., Baerselman R., Dijkman E., De Groot A.C., Hogendoorn E.A., DeJong A., Kruitbosch J.A.W., Peijnenburg W.J.G.M. (2003a). Availability of polycyclic aromatic hydrocarbons to earthworms (Eisenia andrei, Oligochaeta) in field-polluted soils and soil-sediment mixtures. Environ. Toxicol. Chem. 22: 767-775.
|
(40)
|
Jager T., Fleuren R.L.J., Hoogendoorn E., de Korte G. (2003b). Elucidating the routes of exposure for organic chemicals in the earthworm, Eisenia andrei (Oligochaeta). Environ. Sci. Technol. 37: 3399-3404.
|
(41)
|
Janssen M.P.M., Bruins A., De Vries T.H., Van Straalen N.M. (1991). Comparison of cadmium kinetics in four soil arthropod species. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 20: 305-312.
|
(42)
|
Kasprzak K. (1982). Review of enchytraeid community structure and function in agricultural ecosystems. Pedobiologia 23: 217-232.
|
(43)
|
Khalil A.M. (1990). Aufnahme und Metabolismus von 14C-Hexachlorbenzol und 14C-Pentachlornitrobenzol in Regenwürmern. Dissertation University München, 137 pp.
|
(44)
|
Landrum P.F. (1989). Bioavailability and toxicokinetics of polycyclic aromatic hydrocarbons sorbed to sediments for the amphipod Pontoporeia hoyi. Environ. Sci. Toxicol. 23: 588-595.
|
(45)
|
Marinussen M.P.J.C., Van der Zee S.E.A.T.M., De Haan F.A. (1997). Cu accumulation in Lumbricus rubellus under laboratory conditions compared with accumulation under field conditions. Ecotox. Environ. Safety 36: 17-26.
|
(46)
|
Mount D.R., Dawson T.D., Burkhard L.P. (1999). Implications of gut purging for tissue residues determined in bioaccumulation testing of sediment with Lumbriculus variegates. Environ. Toxicol. Chem. 18: 1244-1249.
|
(47)
|
Nendza M. (1991). QSARs of bioaccumulation: Validity assessment of log Kow/log BCF correlations, In: R. Nagel and R. Loskill (eds.): Bioaccumulation in aquatic systems, Contributions to the assessment, Proceedings of an international workshop, Berlin 1990, VCH, Weinheim.
|
(48)
|
Chapitre C.8 de la présente annexe, Toxicité pour les vers de terre.
|
(49)
|
Chapitre C.13 de la présente annexe, Bioconcentration: essai avec renouvellement continu sur les poissons.
|
(50)
|
Chapitre C.21 de la présente annexe, Microorganismes du sol: essai de transformation de l’azote.
|
(51)
|
OCDE (2004ba) Essai de reproduction chez l’enchytrée. Ligne directrice 220 de l’OCDE pour les essais de produits chimiques; OCDE, Paris.
|
(52)
|
OCDE (2004b) Essai de reproduction chez le lombric (Eisenia fetida/Eisenia andrei). Ligne directrice 222 de l’OCDE pour les essais de produits chimiques; OCDE, Paris.
|
(53)
|
OCDE (2008) Bioaccumulation chez les oligochètes benthiques fouisseurs. Ligne directrice 315 de l’OCDE pour les essais de produits chimiques; OCDE, Paris.
|
(54)
|
Petersen H. and Luxton M. (1982). A comparative analysis of soil fauna populations and their role in decomposition processes. Oikos 39: 287-388.
|
(55)
|
Phillips D.J.H. (1993). Bioaccumulation. In: Handbook of Ecotoxicology Vol. 1. Calow P. (ed.). Blackwell Scientific Publ., Oxford. 378-396.
|
(56)
|
Pflugmacher J. (1992). Struktur-Aktivitätsbestimmungen (QSAR) zwischen der Konzentration von Pflanzenschutzmitteln und dem Octanol-Wasser-Koeffzienten UWSF- Z. Umweltchem. Ökotox. 4: 77-81.
|
(57)
|
Posthuma L., Weltje L., Anton-Sanchez F.A. (1996). Joint toxic effects of cadmium and pyrene on reproduction and growth of the earthworm Eisenia fetida. RIVM Report No. 607506001, Bilthoven.
|
(58)
|
Randall R.C., Lee II H., Ozretich R.J., Lake J.L., Pruell R.J. (1991). Evaluation of selected lipid methods for normalising pollutant bioaccumulation. Environ.Toxicol. Chem. 10: 1431-1436.
|
(59)
|
Römbke J., Egele P., Füll C. (1998). Literaturstudie über Bioakkumulationstests mit Oligochaeten im terrestrischen Medium. UBA-Texte 28/98, 84 S.
|
(60)
|
Römbke J. and Moser Th. (1999). Organisation and performance of an international ring-test for the validation of the Enchytraeid reproduction test. UBA-Texte 4/1999: 373 pp.
|
(61)
|
Römbke J., Riepert F., Achazi R. (2000). Enchytraeen als Testorganismen, In: Toxikologische Beurteilung von Böden. Heiden, S., Erb, R., Dott, W. & Eisentraeger, A. (eds.). Spektrum Verl., Heidelberg. 105-129.
|
(62)
|
Romijn C.A.F.M., Luttik R., Van De Meent D., Slooff W.,Canton J.H. (1993). Presentation of a General Algorithm to Include Effect Assessment on Secondary Poisoning in the Derivation of Environmental Quality Criteria, Part 2: Terrestrial food chains. Ecotox. Envir. Safety 27: 107-127.
|
(63)
|
Sample B.E., Suter D.W., Beauchamp J.J., Efroymson R.A. (1999). Literature-derived bioaccumulation models for earthworms: Development and validation. Environ. Toxicol. Chem. 18: 2110-2120.
|
(64)
|
Schlosser H.-J. and Riepert F. (1992). Entwicklung eines Prüfverfahrens für Chemikalien an Bodenraubmilben (Gamasina), Teil 2: Erste Ergebnisse mit Lindan und Kaliumdichromat in subletaler Dosierung. Zool. Beitr. NF 34: 413-433.
|
(65)
|
Schmelz R. and Collado R. (1999). Enchytraeus luxuriosus sp. novembre, a new terrestrial oligochaete species (Enchytraeide, Clitellata, Annelida). Carolinea 57: 93–100.
|
(66)
|
Sims R.W. and Gerard B.M. (1985). Earthworms, In: Kermack, D. M. & Barnes, R. S. K. (Hrsg.): Synopses of the British Fauna (New Series) No. 31. 171 S. London: E. J. Brill/Dr. W. Backhuys.
|
(67)
|
Sousa J.P., Loureiro S., Pieper S., Frost M., Kratz W., Nogueira A.J.A., Soares A.M.V.M. (2000). Soil and plant diet exposure routes and toxicokinetics of lindane in a terrestrial isopod. Environ. Toxicol. Chem. 19: 2557–2563.
|
(68)
|
Spacie A. and Hamelink J.L. (1982). Alternative models for describing the bioconcentration of organics in fish. Environ. Toxicol. Chem. 1, 309-320.
|
(69)
|
Stephenson G.L., Kaushik A., Kaushik N.K., Solomon K.R., Steele T., Scroggins R.P. (1998). Use of an avoidance-response test to assess the toxicity of contaminated soils to earthworms. In: Advances in earthworm ecotoxicology. S. Sheppard, J. Bembridge, M. Holmstrup, L. Posthuma (eds). Setac Press, Pensacola, 67-81.
|
(70)
|
Sterenborg I., Vork N.A., Verkade S.K., Van Gestel C.A.M., Van Straalen N.M. (2003). Dietary zinc reduces uptake but not metallothionein binding and elimination of cadmium in the springtail Orchesella cincta. Environ. Toxicol. Chemistry 22: 1167-1171.
|
(71)
|
UBA (Umweltbundesamt) (1991). Bioakkumulation – Bewertungskonzept und Strategien im Gesetzesvollzug. UBA-Texte 42/91. Berlin.
|
(72)
|
US EPA (2000). Methods for measuring the toxicity and bioaccumulation of sediment-associated contaminants with freshwater invertebrates. Second Edition, EPA 600/R-99/064, US, Environmental Protection Agency, Duluth, MN, March 2000.
|
(73)
|
Van Brummelen T.C. and Van Straalen N.M. (1996). Uptake and elimination of benzo(a)pyrene in the terrestrial isopod Porcellio scaber. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 31: 277-285.
|
(74)
|
Van Gestel C.A.M. (1992). The influence of soil characteristics on the toxicity of chemicals for earthworms; a review, In: Ecotoxicology of Earthworms (Ed. Becker, H., Edwards, P.J., Greig-Smith, P.W. & Heimbach, F.). Intercept Press, Andover (GB).
|
(75)
|
Van Gestel C.A. and Ma W.-C. (1990). An approach to quantitative structure-activity relationships (QSARs) in earthworm toxicity studies. Chemosphere 21: 1023-1033.
|
(76)
|
Van Straalen N.M., Donker M.H., Vijver M.G., van Gestel C.A.M. (2005). Bioavailability of contaminants estimated from uptake rates into soil invertebrates. Environmental Pollution 136: 409-417.
|
(77)
|
Venter J.M. and Reinecke A.J. (1988). The life-cycle of the compost-worm Eisenia fetida (Oligochaeta). South African J. Zool. 23: 161-165.
|
(78)
|
Vijver M.G., Vink J.P.M., Jager T., Wolterbeek H.T., van Straalen N.M., van Gestel C.A.M. (2005). Biphasic elimination and uptake kinetics of Zn and Cd in the earthworm Lumbricus rubellus exposed to contaminated floodplain soil. Soil Biol, Biochem. 37: 1843-1851.
|
(79)
|
Widianarko B. and Van Straalen N.M. (1996). Toxicokinetics-based survival analysis in bioassays using nonpersistent chemicals, Environ. Toxicol. Chem. 15: 402–406.
|
Appendice 1
DÉFINITIONS
|
La bioaccumulation est l’augmentation de concentration de la substance d’essai dans ou sur un organisme, par rapport à la concentration de la substance d’essai dans le milieu environnant. La bioaccumulation est le résultat combiné des processus de bioconcentration et de bioamplification (voir ci-dessous).
|
|
La bioconcentration est l’augmentation de concentration de la substance d’essai dans ou sur un organisme, résultant de l’absorption de la substance exclusivement depuis le milieu environnant (à savoir via la surface du corps et le sol ingéré), par rapport à la concentration de la substance d’essai dans le milieu environnant.
|
|
La bioamplification est l’augmentation de concentration de la substance d’essai dans ou sur un organisme, résultant principalement de l’absorption d’aliments ou de proies contaminés, par rapport à la concentration de la substance d’essai dans l’alimentation ou la proie. La bioamplification peut conduire à un transfert ou à une accumulation de la substance d’essai dans les réseaux trophiques.
|
|
L’élimination d’une substance est la perte de cette substance par les tissus de l’organisme d’essai selon des processus actifs ou passifs survenant indépendamment de la présence ou de l’absence de la substance d’essai dans le milieu environnant.
|
|
Le facteur de bioaccumulation (FBA) à n’importe quel instant de la phase d’absorption de l’essai de bioaccumulation, est la concentration de la substance d’essai dans ou sur l’organisme d’essai (Ca en g.kg-1 de poids humide ou sec de ver) divisée par la concentration de la substance dans le milieu environnant (Cs en g.kg-1 de poids de sol humide ou sec). Le FBA est exprimé en kg de sol kg-1 de ver.
|
|
Le facteur de bioaccumulation à l’état stationnaire (FBAss), qui est le FBA à l’état stationnaire, ne varie pas de façon significative pendant une longue période, la concentration de la substance d’essai dans le milieu environnant (Cs en g kg-1 de poids de sol sec) étant constante pendant cette période.
|
|
Les facteurs de bioaccumulation calculés directement à partir du rapport de la constante de vitesse d’absorption du sol divisée par la constante de vitesse d’élimination (ks et ke, voir ci-dessous), sont appelés facteurs de bioaccumulation cinétiques (FBAK).
|
|
Le facteur d’accumulation biote-sol (BSAF) est la concentration de la substance d’essai normalisée par rapport aux lipides dans/sur l’organisme d’essai, divisée par la concentration de la substance d’essai normalisée par rapport au carbone organique, dans le sol à l’état stationnaire. Ca est alors exprimée en g.kg-1 de teneur en lipides de l’organisme, et Cs en g.kg-1 de teneur en carbone organique du sol; le BSAF est exprimé en kg de CO.kg-1 de lipides.
|
|
Un plateau ou état stationnaire est défini comme l’équilibre entre les processus d’absorption et d’élimination survenant simultanément durant la phase d’exposition. L’état stationnaire est atteint, dans le tracé du FBA en fonction du temps, lorsque la courbe devient parallèle à l’axe des temps et que trois analyses successives de FBA réalisées sur des échantillons pris à intervalles d’au moins deux jours ne diffèrent pas de plus de 20 % les uns des autres et qu’il n’y a pas de différence statistique significative entre les trois périodes d’échantillonnage. Pour les substances d’essai absorbées lentement, des intervalles plus appropriés seraient de sept jours (49).
|
|
Le coefficient de partage carbone organique-eau (Kco) est le rapport de la concentration d’une substance dans/sur la fraction de carbone organique d’un sol et de la concentration de substance dans l’eau à l’équilibre.
|
|
Le coefficient de partage octanol-eau (Kow) est le rapport des solubilités de la substance dans le n-octanol et dans l’eau à l’équilibre; il est parfois exprimé par Pow. Le logarithme de Kow (log Kow) est utilisé comme indicateur du potentiel de bioaccumulation de la substance par les organismes aquatiques.
|
|
La phase d’absorption ou d’exposition est la durée pendant laquelle les organismes d’essai sont exposés à la substance d’essai.
|
|
La constante de vitesse d’absorption du sol (ks) est la valeur numérique définissant la vitesse d’augmentation de la concentration de la substance d’essai dans/sur l’organisme d’essai résultant de l’absorption de la phase du sol. ks est exprimé en g de sol kg-1 de ver j-1.
|
|
La phase d’élimination est la durée, suite au transfert des organismes d’essai depuis un milieu contaminé dans un milieu dépourvu de la substance d’essai, durant laquelle est étudiée l’élimination (ou la perte nette) de la substance par les organismes d’essai.
|
|
La constante de vitesse d’élimination (ke) est la valeur numérique définissant la vitesse de réduction de la concentration de la substance d’essai dans/sur l’organisme d’essai, suite au transfert des organismes d’essai depuis un milieu contenant l’élément d’essai vers un milieu dépourvu de cette substance. ke est exprimé en j-1.
|
|
Une substance d’essai est toute substance ou tout mélange soumis à un essai réalisé suivant la présente méthode d’essai.
|
Appendice 2
Calcul des paramètres d’absorption et d’élimination
Le principal effet observé d’un essai de bioaccumulation est le facteur de bioaccumulation, FBA. Il est possible de calculer le FBA en divisant la concentration dans l’organisme d’essai, Ca, par la concentration dans le sol, Cs, à l’état stationnaire. Si l’état stationnaire n’est pas atteint durant la phase d’absorption, le FBAK est calculé à partir des constantes de vitesse et non du FBAss. Il convient d’indiquer si le FBA est basé, ou non, sur des concentrations à l’état stationnaire.
La procédure habituelle pour obtenir le facteur de bioaccumulation cinétique (FBAK), la constante de vitesse d’absorption du sol (ks) et la constante de vitesse d’élimination (ke) consiste à faire à appel à des méthodes informatisées non linéaires d’estimation des paramètres, par exemple à partir des modèles décrits dans (68). D’après un ensemble de valeurs séquentielles de la concentration en fonction du temps et les équations de modèles:
|
0 < t < tc
|
[équation 1]
|
ou
|
t > tc
|
[équation 2]
|
où:
Ca
|
=
|
concentration de la substance dans les vers [g.kg-1 de poids humide ou sec]
|
ks
|
=
|
constante de vitesse d’absorption dans les tissus [g de sol kg-1 de ver j - 1]
|
Cs
|
=
|
concentration de la substance dans le sol [g.kg-1 de poids humide ou sec]
|
ke
|
=
|
constante de vitesse d’élimination [j - 1]
|
tc
|
=
|
temps à la fin de la phase d’absorption,
|
ces programmes informatiques calculent les valeurs de FBAK, ks et ke.
Lorsque la concentration de fond dans les vers non exposés, par exemple au jour 0, diffère sensiblement de zéro (cela peut être le cas pour les métaux notamment), cette concentration (Ca,0) est incluse dans ces équations comme suit:
|
0 < t < tc
|
[équation 3]
|
et
|
t > tc
|
[équation 4]
|
Dans les cas où l’on observe une forte baisse de la concentration de la substance d’essai dans le sol durant la phase d’absorption, il est possible de recourir aux modèles suivants (par exemple, (67) et (79):
|
[équation 5]
|
où:
Cs
|
=
|
concentration de la substance dans le sol [g.kg-1 de poids humide ou sec]
|
k0
|
=
|
constante de vitesse de dégradation dans le sol [d-1]
|
C0
|
=
|
concentration initiale de la substance dans le sol [g.kg-1 de poids humide ou sec]
|
|
0 < t < tc
|
[équation 6]
|
|
t > tc
|
[équation 7]
|
où:
Ca
|
=
|
concentration de la substance dans les vers [g.kg-1 de poids humide ou sec]
|
ks
|
=
|
constante de vitesse d’absorption dans les tissus [g de sol kg-1 de vers j-1]
|
k0
|
=
|
constante de vitesse de dégradation dans le sol [j - 1]
|
ke
|
=
|
constante de vitesse d’élimination [j - 1]
|
tc
|
=
|
temps à la fin de la phase d’absorption.
|
Lorsqu’on a atteint un état stationnaire durant la phase d’absorption (c’est-à-dire t = ∞), il est possible de réduire l’équation 1
|
0 < t < tc
|
[équation 1]
|
à:
ou à
|
[équation 8]
|
Ensuite ks/ke × Cs donne une valeur approchée de la concentration de la substance d’essai dans le tissu du ver à l’état stationnaire (Ca,ss).
Le facteur d’accumulation biote-sol (BSAF) peut se calculer comme suit:
|
[équation 9]
|
où foc est la fraction de carbone organique dans le sol, et flip est la fraction de lipides dans le ver, toutes deux étant déterminées, de préférence, sur des échantillons prélevés de l’essai, et basées respectivement soit sur le poids sec, soit sur le poids humide.
Il est possible de modéliser les constantes cinétiques d’élimination en utilisant les données issues de la phase d’élimination et en appliquant l’équation de modèle suivante et une méthode informatisée non linéaire d’estimation des paramètres. Si le tracé des données en fonction du temps indique une décroissance exponentielle constante de la concentration de la substance d’essai dans les animaux, le déroulement temporel de l’élimination peut être décrit par un modèle à un compartiment (équation 9).
|
[équation 10]
|
Les processus d’élimination semblent parfois se dérouler en deux étapes, montrant une décroissance rapide de Ca au cours des premières étapes, qui évolue vers une perte plus lente des éléments d’essai dans les étapes ultérieures de l’élimination [par exemple (27), (68)]. Les deux étapes peuvent être interprétées en faisant l’hypothèse de l’existence de deux compartiments dans l’organisme, compartiments à partir desquels la substance d’essai est éliminée à différentes vitesses. Dans ces cas particuliers, il convient d’étudier la littérature pertinente, par exemple (38), (39), (40), (78).
À l’aide des équations de modèles ci-dessus, on peut également calculer les paramètres cinétiques (ks et ke) en une seule fois, en appliquant un modèle de cinétique du premier ordre à toutes les données des phases d’absorption et d’élimination simultanément. Pour une description d’une méthode pouvant permettre un tel calcul combiné des constantes de vitesse d’absorption et d’élimination, consulter (41), (73) et (70).
|
[équation 11]
|
Note:
|
quand les paramètres d’absorption et d’élimination sont estimés simultanément à partir des données combinées d’absorption et d’élimination, “m” tel que mentionné dans l’équation 11 est un descripteur qui permet au programme informatique d’attribuer les sous-termes de l’équation aux ensembles de données de la phase correspondante et de faire une évaluation correcte (m = 1 pour la phase d’absorption; m = 2 pour la phase d’élimination).
|
Quoi qu’il en soit, ces équations de modèles seront utilisées avec précaution, en particulier lorsque des modifications de la biodisponibilité de la substance d’essai, ou (bio)dégradation, surviennent durant l’essai [voir notamment (79)].
Appendice 3
EXEMPLES DE PROGRAMMES D’ÉCHANTILLONNAGE POUR DES ESSAIS DE BIOACCUMULATION DANS LE SOL
Essai sur des vers de terre
a)
|
Phase d’absorption avec 8 dates d’échantillonnage pour le calcul des paramètres cinétiques
Jour
|
Activité
|
- 6
|
Conditionnement du sol préparé durant 48 h.
|
- 4
|
Chargement d’une fraction du sol avec la solution de la substance d’essai; évaporation de tout solvant; mélange des constituants du sol; répartition du sol dans les récipients d’essai; équilibration dans les conditions d’essai durant 4 jours (3 semaines pour les sols chargés en métaux).
|
- 3 à - 1
|
Séparation des organismes d’essai du milieu d’élevage pour acclimatation; préparation et humidification des constituants du sol.
|
0
|
Mesure de la température et du pH du sol; retrait d’échantillons de sol des récipients traités et des témoins au solvant pour la détermination de la concentration de la substance d’essai; ajout d’une ration alimentaire; pesée et distribution aléatoire des vers dans les récipients d’essai; conservation d’un nombre suffisant de sous-échantillons de vers pour la détermination des valeurs de fond analytiques, des poids humide et sec, ainsi que de la teneur en lipides; pesée de tous les récipients d’essai pour le contrôle de l’humidité du sol; contrôle de l’alimentation en air, en cas de système en circuit fermé.
|
1
|
Contrôle de l’alimentation en air, consignation du comportement des vers et de la température; prélèvement d’échantillons de sol et de vers pour la détermination de la concentration de la substance d’essai.
|
2
|
Comme le 1er jour.
|
3
|
Contrôle de l’alimentation en air, du comportement des vers et de la température.
|
4
|
Comme le 1er jour.
|
5 – 6
|
Comme le 3e jour.
|
7
|
Comme le 1er jour; ajout d’une ration alimentaire; contrôle de l’humidité du sol en pesant de nouveau les récipients d’essai et en compensant l’eau évaporée.
|
8 – 9
|
Comme le 3e jour.
|
10
|
Comme le 1er jour.
|
11 – 13
|
Comme le 3e jour.
|
14
|
Comme le 1er jour; ajout d’une ration alimentaire; contrôle de l’humidité du sol en pesant de nouveau les récipients d’essai et en compensant l’eau évaporée.
|
15 – 16
|
Comme le 3e jour.
|
17
|
Comme le 1er jour.
|
18 – 20
|
Comme le 3e jour.
|
21
|
Comme le 1er jour; mesure de la température et du pH du sol; contrôle de l’humidité du sol en pesant de nouveau les récipients d’essai; fin de la phase d’absorption; transfert des vers des réplicats exposés restants vers des récipients contenant du sol propre pour la phase d’élimination (sans purge de l’intestin); échantillonnage du sol et des vers des témoins au solvant.
|
|
Les activités préalables à l’exposition (phase d’équilibration) sont programmées en tenant compte des propriétés de la substance d’essai.
|
|
Les activités décrites pour le 3e jour sont réalisées quotidiennement (au moins les jours ouvrés).
|
|
b)
|
Phase d’élimination
Jour
|
Activité
|
- 6
|
Préparation et humidification des constituants du sol; conditionnement du sol préparé durant 48 h.
|
- 4
|
Mélange des constituants du sol; répartition du sol dans les récipients d’essai; incubation dans les conditions d’essai durant 4 jours.
|
0 (fin de la phase d’absorption)
|
Mesure de la température et du pH du sol; pesée et distribution aléatoire des vers dans les récipients d’essai; ajout d’une ration alimentaire; transfert des vers des réplicats exposés restants vers des récipients contenant du sol propre; prélèvement d’échantillons de sol et de vers après 4 à 6 h pour la détermination de la concentration de la substance d’essai.
|
1
|
Contrôle de l’alimentation en air, consignation du comportement des vers et de la température; prélèvement d’échantillons de sol et de vers pour la détermination de la concentration de la substance d’essai.
|
2
|
Comme le 1er jour.
|
3
|
Contrôle de l’alimentation en air, du comportement des vers et de la température.
|
4
|
Comme le 1er jour.
|
5 – 6
|
Comme le 3e jour.
|
7
|
Comme le 1er jour; ajout d’une ration alimentaire; contrôle de l’humidité du sol en pesant de nouveau les récipients d’essai et en compensant l’eau évaporée.
|
8 – 9
|
Comme le 3e jour.
|
10
|
Comme le 1er jour.
|
11 – 13
|
Comme le 3e jour.
|
14
|
Comme le 1er jour; ajout d’une ration alimentaire; contrôle de l’humidité du sol en pesant de nouveau les récipients d’essai et en compensant l’eau évaporée.
|
15 – 16
|
Comme le 3e jour.
|
17
|
Comme le 1er jour.
|
18 – 20
|
Comme le 3e jour.
|
21
|
Comme le 1er jour; mesure de la température et du pH du sol; contrôle de l’humidité du sol en pesant de nouveau les récipients d’essai; échantillonnage du sol et des vers des témoins au solvant.
|
|
La préparation du sol avant le début de la phase d’élimination intervient de la même manière qu’avant la phase d’absorption.
|
|
Les activités décrites pour le 3e jour sont réalisées quotidiennement (au moins les jours ouvrés).
|
|
Essai sur des enchytrées
a)
|
Phase d’absorption avec 8 dates d’échantillonnage pour le calcul des paramètres cinétiques
Jour
|
Activité
|
- 6
|
Conditionnement du sol préparé durant 48 h.
|
- 4
|
Chargement d’une fraction du sol avec la solution de la substance d’essai; évaporation de tout solvant; mélange des constituants du sol; répartition du sol dans les récipients d’essai; équilibration dans les conditions d’essai durant 4 jours (3 semaines pour les sols chargés en métaux).
|
- 3 à - 1
|
Séparation des organismes d’essai du milieu d’élevage pour acclimatation; préparation et humidification des constituants du sol.
|
0
|
Mesure de la température et du pH du sol; retrait d’échantillons de sol des récipients traités et des témoins au solvant pour la détermination de la concentration de la substance d’essai; ajout d’une ration alimentaire dans le sol; pesée et distribution aléatoire des vers dans les récipients d’essai; conservation de suffisamment de sous-échantillons de vers pour la détermination des valeurs de fond analytiques, du poids sec et humide et de la teneur en lipides; pesée de tous les récipients d’essai pour le contrôle de l’humidité du sol; contrôle de l’alimentation en air, en cas de système en circuit fermé.
|
1
|
Contrôle de l’alimentation en air, consignation du comportement des vers et de la température; prélèvement d’échantillons de sol et de vers pour la détermination de la concentration de la substance d’essai.
|
2
|
Comme le 1er jour.
|
3
|
Contrôle de l’alimentation en air, du comportement des vers et de la température.
|
4
|
Comme le 1er jour.
|
5 – 6
|
Comme le 3e jour.
|
7
|
Comme le 1er jour; ajout d’une ration alimentaire dans le sol; contrôle de l’humidité du sol en pesant de nouveau les récipients d’essai et en compensant l’eau évaporée.
|
9
|
Comme le 1er jour.
|
10
|
Comme le 3e jour.
|
11
|
Comme le 1er jour.
|
12 – 13
|
Comme le 3e jour.
|
14
|
Comme le 1er jour; ajout d’une ration alimentaire dans le sol; mesure de la température et du pH du sol; contrôle de l’humidité du sol en pesant de nouveau les récipients d’essai; fin de la phase d’absorption; transfert des vers des réplicats exposés restants vers des récipients contenant du sol propre pour la phase d’élimination (sans purge de l’intestin); échantillonnage du sol et des vers des témoins au solvant.
|
|
Les activités préalables à l’exposition (phase d’équilibration) sont programmées en tenant compte des propriétés de la substance d’essai.
|
|
Les activités décrites pour le 3e jour sont réalisées quotidiennement (au moins les jours ouvrés)
|
|
Appendice 4
Sol artificiel – recommandations pour la préparation et le stockage
Les sols naturels provenant d’une source particulière ne sont pas toujours disponibles tout au long de l’année, et des organismes indigènes ainsi que la présence de micropolluants peuvent influer sur l’essai; il est donc recommandé d’utiliser un substrat artificiel, le sol artificiel décrit au chapitre C.8 de la présente annexe, Toxicité pour les vers de terre (48). Plusieurs espèces d’essai peuvent survivre, se développer et se reproduire dans ce sol, et une normalisation maximum doublée d’une comparabilité intra- et interlaboratoire des conditions d’essai et d’élevage est proposée.
Constituants du sol:
Tourbe:
|
10 %
|
Tourbe de sphaigne, conformément à la ligne directrice 207 de l’OCDE (48).
|
Sable quartzique:
|
70 %
|
Sable quartzique industriel (séché à l’air); taille des grains: plus de 50 % des particules seront dans une fourchette comprise entre 50 et 200 μm, mais toutes seront ≤ 2 mm.
|
Argile kaolinique:
|
20 %
|
Teneur en kaolinite ≥ 30 %.
|
Carbonate de calcium:
|
≤ 1 %
|
CaCO3, pulvérisé, chimiquement pur.
|
Il est également possible de réduire la teneur en carbone organique du sol artificiel, notamment en abaissant la teneur en tourbe à 4-5 % de sol sec et en augmentant la teneur en sable en conséquence. Cette réduction de la teneur en carbone organique est susceptible de diminuer les possibilités d’adsorption de la substance d’essai sur le sol (carbone organique) et d’augmenter la disponibilité de la substance d’essai pour les vers (74). Il a été démontré que Enchytraeus albidus et Eisenia fetida peuvent satisfaire aux critères de validité concernant la reproduction lorsqu’ils sont testés sur des sols naturels dont la teneur en carbone organique est inférieure (2,7 %, par exemple) (33) et (61), et on a constaté expérimentalement qu’il pouvait en aller de même sur un sol artificiel renfermant 5 % de tourbe.
Préparation
Les constituants secs du sol sont soigneusement mélangés (par exemple, dans un grand mélangeur de laboratoire). Ce mélange est réalisé environ une semaine avant le début de l’essai. Le mélange sec de constituants du sol est humidifié avec de l’eau désionisée au moins 48 h avant l’application de la substance d’essai de manière à équilibrer/stabiliser l’acidité. Pour déterminer le pH, on utilisera un mélange de sol et d’une solution de 1 M KCl suivant un rapport de 1/5. Si le pH ne se trouve pas dans la plage requise (6,0 ± 0,5), soit on ajoute au sol une quantité suffisante de CaCO3, soit on prépare un nouveau lot de sol.
La capacité maximale de rétention d’eau (CRE) du sol artificiel est déterminée conformément à la norme ISO 11268-2 (35). Au moins deux jours avant de démarrer l’essai, on humidifie le sol artificiel sec en ajoutant suffisamment d’eau désionisée ou reconstituée pour obtenir approximativement la moitié de la teneur finale en eau. Cette teneur finale en eau devrait représenter 40 % à 60 % de la CRE maximale. Au début de l’essai, on divise le sol préalablement humidifié en lots d’un nombre égal à celui des concentrations d’essai et des témoins utilisés pour l’essai, et, en employant la solution de la substance d’essai et/ou en ajoutant de l’eau désionisée ou reconstituée, on ajuste le taux d’humidité pour qu’il se trouve entre 40 et 60 % de la CREmax. Le taux d’humidité est déterminé au début et à la fin de l’essai (à 105 °C). Il sera optimal pour satisfaire les exigences des espèces (le taux d’humidité peut aussi être contrôlé comme suit: le sol légèrement pressé dans la main doit laisser apparaître de petites gouttes d’eau entre les doigts).
Stockage
Les constituants secs du sol artificiel peuvent être stockés à température ambiante jusqu’à leur utilisation. Le sol préparé, préhumidifié peut être stocké dans un endroit frais pendant maximum trois jours avant d’être chargé; il convient de veiller à minimiser l’évaporation de l’eau. Un sol chargé avec la substance d’essai sera utilisé immédiatement, sauf si des informations spécifient qu’il est possible de stocker ce sol sans affecter la toxicité et la biodisponibilité de la substance d’essai. Des échantillons de sol chargé peuvent alors être stockés dans les conditions recommandées pour la substance d’essai donnée jusqu’à l’analyse.
Appendice 5
Espèces d’oligochètes terrestres recommandées pour les essais de bioaccumulation dans le sol
Vers de terre
L’espèce d’essai recommandée est Eisenia fetida (Savigny, 1826), qui appartient à la famille des Lumbricidae. Depuis 1972, on la divise en deux sous-espèces [Eisenia fetida et Eisenia andrei (10)]. Selon Jaenike (36), il s’agit là de deux espèces à part entière. Eisenia fetida est facilement reconnaissable à ses larges bandes jaunes entre les segments alors qu’Eisenia andrei présente une couleur rouge foncé uniforme. Probablement originaires de la région de la mer Noire, elles sont aujourd’hui présentes partout dans le monde, surtout dans les habitats modifiés par les activités anthropiques comme les tas de compost. Toutes deux se prêtent à la réalisation d’essais écotoxicologiques et d’essais de bioaccumulation.
Eisenia fetida et Eisenia andrei sont disponibles dans le commerce, notamment comme appât pour la pêche. Par rapport à d’autres vers de terre de la même famille, ces deux espèces ont un cycle de vie court et atteignent leur maturité en 2 à 3 mois (à température ambiante). Leur température optimale oscille entre 20 et 24 °C. Elles préfèrent les substrats relativement humides, d’un pH presque neutre et à forte teneur en matière organique. Ces espèces étant largement utilisées dans les essais écotoxicologiques normalisés depuis environ 25 ans, leur élevage est bien établi (48) (77).
Ces deux espèces peuvent être élevées dans des déjections animales très diverses. Le milieu d’élevage recommandé par l’ISO (35) est un mélange 50/50 de crottin de cheval ou de bouse de vache et de tourbe. Le milieu aura un pH d’environ 6 à 7 (ajusté avec du carbonate de calcium), une faible conductivité ionique (une concentration de sels inférieure à 0,5 % ou à 6 mS/cm) et ne sera pas trop contaminé par de l’ammoniac ou des urines animales. Il est également possible d’utiliser de la terre de jardin, vendue dans le commerce, qui soit sans additifs, un sol artificiel tel que défini par l’OCDE (48), ou encore un mélange des deux, à parts égales (50/50). Le substrat sera humide, mais pas mouillé. Des boîtes d’élevage d’une capacité de 10 à 50 litres conviennent.
Pour obtenir une population de vers homogène quant à l’âge et à la masse, il vaut mieux commencer l’élevage avec des cocons. À cet effet, des vers adultes sont ajoutés à une boîte d’élevage qui contient du substrat frais pour produire des cocons. L’expérience a montré qu’une densité démographique d’environ 100 vers adultes par kg de substrat (poids humide) donne de bons taux de reproduction. Après 28 jours, les vers adultes sont retirés. Les vers de terre éclos sont utilisés pour les essais une fois adultes, soit 2 mois plus tard au moins mais pas au-delà de 12 mois.
Les vers des espèces décrites précédemment peuvent être considérés comme sains s’ils se déplacent dans le substrat, ne tentent pas de s’en échapper et se reproduisent continuellement. Une extrémité postérieure qui bouge très lentement ou qui est jaune (s’agissant d’E. fetida) indique un épuisement du substrat. Il est alors recommandé d’utiliser du substrat frais et/ou de réduire le nombre d’animaux par boîte.
Références bibliographiques complémentaires
Gerard B.M. (1964). Synopsis of the British fauna. No. 6 Lumbricidae. Linnean Soc. London, 6: 1-58.
Graff O. (1953). Die Regenwürmer Deutschlands. Schr. Forsch. Anst. Landwirtsch. 7: 1-81.
Römbke J., Egeler P., Füll C. (1997). Literaturstudie über Bioakkumulationstests mit Oligochaeten im terrestrischen Medium. Bericht für das UBA F + E 206 03 909, 86 S.
Rundgren S. (1977). Seasonality of emergence in lumbricids in southern Sweden. Oikos 28: 49-55.
Satchell J.E. (1955). Some aspects of earthworm ecology. Soil Zoology (Kevan): 180-201.
Sims R.W. and Gerard B.M. (1985). A synopsis of the earthworms. Linnean Soc. London 31: 1-171.
Tomlin A.D. (1984). The earthworm bait market in North America. In: Earthworm Ecology - from Darwin to vermiculture. Satchell, J.E. (ed.), Chapman & Hall, London. 331-338 pp.
Enchytrées
L’espèce d’essai recommandée est Enchytraeus albidus, Henle 1837 (ver blanc). Enchytraeus albidus est l’une des plus grosses espèces (jusqu’à 15 mm) de la famille des annélides oligochètes (Enchytraeidae) et c’est la plus répandue dans le monde (8). Enchytraeus albidus colonise des habitats marins, dulcicoles et terrestres, constitués la plupart du temps de matière organique en décomposition (algues, compost), et fréquente rarement les prairies (42). Le fait qu’il tolère une gamme étendue de conditions écologiques et certaines variations morphologiques indiquent qu’il pourrait exister différentes races.
Enchytraeus albidus est disponible dans le commerce, plus particulièrement sous forme de nourriture pour les poissons. Il convient de vérifier si l’élevage est contaminé par d’autres espèces, généralement plus petites (60). Dans l’affirmative, tous les vers sont lavés à l’eau dans une boîte de Petri. De grands spécimens adultes d’Enchytraeus albidus sont ensuite sélectionnés (à l’aide d’un stéréomicroscope) pour commencer un nouvel élevage. Tous les autres vers sont éliminés. Le cycle de vie de ces vers est court puisqu’ils arrivent à maturité entre 33 jours (à 18 °C) et 74 jours (à 12 °C). Seuls les vers ayant été conservés en laboratoire pendant au moins 5 semaines (une génération) sans problème devront être utilisés pour des essais.
D’autres espèces du genre Enchytraeus conviennent également, notamment Enchytraeus luxuriosus. L’univers de vie de cette espèce est le sol, comme récemment décrit dans (65). Si on utilise d’autres espèces d’Enchytraeus, il faut les identifier clairement et justifier ce choix dans le rapport.
L’espèce Enchytraeus crypticus (Westheide et Graefe, 1992) appartient au même groupe qu’E. luxuriosus. L’existence ďEnchytraeus crypticus dans la nature n’est pas certaine, cette espèce n’ayant été décrite que dans les élevages de lombrics et les tas de compost (Römbke, 2003). Par conséquent, on ne connaît pas ses besoins écologiques d’origine. Cependant, des études récemment menées en laboratoire avec différents sols naturels ont confirmé la grande tolérance de cette espèce vis-à-vis de propriétés du sol telles que le pH et la texture (Jänsch et al., 2005). Ces dernières années, cette espèce a souvent été utilisée dans des études écotoxicologiques en raison de sa facilité d’élevage et de mise à l’essai (Kuperman et al., 2003). Néanmoins, elle est petite (3-12 mm; 7 mm en moyenne) (Westheide et Müller, 1996), ce qui la rend plus difficile à manipuler qu’Enchytraeus albidus. Si on utilise cette espèce et non Enchytraeus albidus, les récipients d’essai peuvent être de plus petite taille, mais cela n’est pas nécessaire. En outre, il convient de considérer que cette espèce se reproduit très rapidement, son temps de génération étant inférieur à 20 jours à 20 ± 2 °C (Achazi et al., 1999), voire encore plus court à des températures supérieures.
Les Enchytraeidae de l’espèce Enchytraeus albidus (comme d’autres espèces d’enchytrées) peuvent être élevés dans de grandes boîtes en plastique (par exemple: 30 × 60 × 10 cm ou 20 × 12 × 8 cm, ce qui convient à la culture de vers de petite taille) remplies d’un mélange de sol artificiel et d’une terre de jardin, vendue dans le commerce, non contaminée et sans additifs. L’emploi de compost, qui risque de contenir des substances toxiques, telles que des métaux lourds, est à éviter. La faune est retirée du sol d’élevage avant usage par triple congélation. Un sol entièrement artificiel est également envisageable, mais le taux de reproduction pourrait être moindre par rapport à celui obtenu avec des substrats mixtes. Il convient que le substrat présente un pH de 6,0 ± 0,5. Les vers sont conservés dans un incubateur à une température de 15 ± 2 °C sans lumière. Dans tous les cas, il convient d’éviter une température supérieure à 23 °C. Ce sol artificiel/naturel sera humide, mais pas mouillé. Légèrement pressé dans la main, il laissera apparaître de petites gouttes d’eau. Dans tous les cas, on évite de créer des conditions anoxiques (si on utilise un couvercle, ce dernier devra comporter un nombre de trous suffisamment élevé pour assurer un échange d’air approprié). Il convient d’aérer le sol d’élevage en le remuant délicatement une fois par semaine.
Les vers sont nourris au moins une fois par semaine ad libitum avec des flocons d’avoine placés dans une cavité à la surface du sol et recouverte de sol. Si de la nourriture reste de la fois précédente, il convient d’ajuster la ration alimentaire à ajouter. Si la nourriture restante est infestée de champignons, elle est remplacée par une nouvelle ration de flocons d’avoine. Pour favoriser la reproduction, les flocons d’avoine peuvent être remplacés toutes les deux semaines par une poudre protéique du commerce, enrichie en vitamines. Après trois mois, les animaux sont transférés vers un substrat d’élevage fraîchement préparé. Les flocons d’avoine, qui sont conservés dans des récipients hermétiquement fermés, sont passés à l’autoclave ou chauffés avant l’emploi afin de prévenir toute infection par des acariens de stockage (Glycyphagus sp., Astigmata, Acarina, par exemple) ou des acariens prédateurs [Hypoaspis (Cosmolaelaps) miles, Gamasida, Acarina, par exemple]. Une fois désinfectée, la nourriture est moulue de façon à pouvoir être facilement parsemée à la surface du sol. Il est également possible de nourrir les vers avec de la levure de boulanger ou de la nourriture pour poissons TetraMin®.
En règle générale, les conditions d’élevage sont satisfaisantes si les vers ne tentent pas de quitter le substrat, se déplacent rapidement dans le sol, présentent une surface brillante sur laquelle les particules de sol n’adhèrent pas, ont une couleur plus ou moins blanchâtre, et représentent diverses tranches d’âge. On peut considérer que les vers sont sains s’ils se reproduisent continuellement.
Références bibliographiques complémentaires
Achazi R.K., Fröhlich E., Henneken M., Pilz C. (1999). The effect of soil from former irrigation fields and of sewage sludge on dispersal activity and colonizing success of the annelid Enchytraeus crypticus (Enchytraeidae, Oligochaeta). Newsletter on Enchytraeidae 6: 117-126.
Jänsch S., Amorim M.J.B., Römbke J. (2005). Identification of the ecological requirements of important terrestrial ecotoxicological test species. Environ. Reviews 13: 51-83.
Kuperman R.G., Checkai R.T., Simini M., Phillips C.T., Kolakowski J.E., Kurnas C.W., Sunahara G.I. (2003). Survival and reproduction of Enchytraeus crypticus (Oligochaeta, Enchytraeidae) in a natural sandy loam soil amended with the nitro-heterocyclic explosives RDX and HMX. Pedobiologia 47: 651-656.
Römbke J. (2003). Ecotoxicological laboratory tests with enchytraeids: A review. Pedobiologia 47: 607-616.
Westheide W. and Graefe U. (1992). Two new terrestrial Enchytraeus species (Oligochaeta, Annelida). J. Nat. Hist. 26: 479 – 488.
Westheide W. and Müller M.C. (1996). Cinematographic documentation of enchytraeid morphology and reproductive biology. Hydrobiologia 334: 263-267.
» |