31992D0532

KOMISSION PÄÄTÖS,

tehty 19 päivänä marraskuuta 1992,

näytteenottosuunnitelmista ja taudinmääritysmenetelmistä tiettyjen kalatautien esiintymisen havaitsemiseksi ja vahvistamiseksi (92/532/ETY)

EUROOPAN YHTEISÖJEN KOMISSIO, joka

ottaa huomioon Euroopan yhteisön perustamissopimuksen,

ottaa huomioon eläinten terveyttä koskevista edellytyksistä saatettaessa vesiviljeltyjä eläimiä ja tuotteita markkinoille 28 päivänä tammikuuta 1991 annetun neuvoston direktiivin 91/67/ETY () ja erityisesti sen 15 artiklan,

sekä katsoo, että

olisi vahvistettava mainitun direktiivin 15 artiklaa noudattaen kalatautien esiintymisen havaitsemisessa ja vahvistamisessa käytettävät näytteenottosuunnitelmat ja taudinmääritysmenetelmät,

komission päätöksellä 81/651/ETY () perustettua eläinlääkintäalan tiedekomiteaa on kuultu, ja

tässä päätöksessä määrätyt toimenpiteet ovat pysyvän eläinlääkintäkomitean lausunnon mukaiset,

ON TEHNYT TÄMÄN PÄÄTÖKSEN:

1 artikla

Näytteenottosuunnitelmat ja taudinmääritysmenetelmät tarttuvan verta muodostavan kudoksen kuolion (IHN) ja virusperäisen verenvuotoseptikemian (VHS) esiintymisen havaitsemiseksi ja vahvistamiseksi vahvistetaan liitteessä.

2 artikla

Tämä päätös on osoitettu kaikille jäsenvaltioille.

Tehty Brysselissä 19 päivänä marraskuuta 1992.

Komission puolesta

Ray MAC SHARRY

Komission jäsen

()()

() EYVL N:o L 46, 19.2.1991, s. 1

() EYVL N:o L 233, 19.8.1981, s. 32

LIITE

I OSA

VHS- JA IHN-VALVONNAN NÄYTTEENOTTO- JA TAUDINMÄÄRITYSMENETELMÄT

I. Näytteenotto

1. Näytteenottoajankohta

Viljelylaitoksissa on suoritettava kliininen tarkastus vähintään kaksi kertaa vuodessa loka-kesäkuun aikana tai muuna ajankohtana, jolloin veden lämpötila on alle 14 °C. Tarkastusten välillä on oltava vähintään neljä kuukautta. Kaikki tuotantoyksiköt (lammikot, altaat, akvaariot, verkkoaltaat jne.) on tarkastettava kuolleiden, heikkojen tai poikkeavasti käyttäytyvien kalojen havaitsemiseksi. Erityistä huomiota on kiinnitettävä poistovesipisteeseen (jos mahdollista), jonne heikoilla kaloilla on taipumus kerääntyä veden virtauksen vuoksi.

2. Näytteiden valinta ja kerääminen

Tutkimusta varten kerätään taulukossa 1 A tarkoitettujen tarkastusten yhteydessä näytteitä, jotka koostuvat 30 P150 kalasta ja/tai ovarinesteistä. Jos viljelyssä on kirjolohia, näytteen olisi sisällettävä tämän lajin kaloja. Muussa tapauksessa näytteen on sisällettävä kaikkien muiden viljelyssä olevien lajien kaloja siltä osin, kuin nämä lajit ovat alttiita VHS- ja/tai IHN-taudille (siten kuin ne on määritelty eläinten terveyttä koskevista edellytyksistä saatettaessa vesiviljeltyjä eläimiä ja tuotteita markkinoille annetun direktiivin 91/67/ETY liitteessä A). Lajien on oltava tasapuolisesti edustettuna näytteessä. Hyväksyntää edeltävän ensimmäisen neljän vuoden valvontajakson aikana näytteen on koostuttava 150 yksiköstä jolloin saavutetaan 95 prosentin luotettavuusaste levinneisyydeltään 2 prosenttia olevan viruksen havaitsemisessa. Seuraavina vuosina (hyväksynnän säilyttäminen) näytekokoa voidaan pienentää 30 yksikköön, jolloin saavutetaan 95 prosentin luotettavuusaste levinneisyydeltään 10 prosenttia olevan viruksen havaitsemisessa (taulukko 1 B).

Viljelylaitoksissa, jotka ovat todistettavasti olleet jo pitkään VHS- ja IHN-vapaita (säännöllisen virallisen terveystarkastusohjelman perusteella), voidaan käyttää pienempää näytekokoa myös ensimmäisen neljän vuoden pituisen valvontajakson aikana.

Jos kalantuotannossa käytetään useampaa kuin yhtä vedensaantilähdettä, 150 tai 30 kalaa sisältävässä näytteessä on oltava kaikkia vedensaantilähteitä edustavia kaloja. Jos joukossa on heikkokuntoisia, poikkeavasti käyttäytyviä tai äskettäin kuolleita (mutta ei vielä hajoamistilassa olevia) kaloja, nämä on ensisijaisesti sisällytettävä näytteeseen. Jos joukossa ei ole tällaisia kaloja, näytteen on koostuttava terveistä, ulkonäöltään tavanomaisista kaloista, jotka on kerätty siten, että kaikki viljelylaitoksen osat ja kaikki vuosiluokat ovat edustettuna.

3. Kalanäytteiden valmistaminen ja lähettäminen

Ennen lähettämistä tai siirtämistä laboratorioon tutkittavat elinten kappaleet on irrotettava kalasta saksien tai muiden steriilien välineiden avulla ja asetettava muoviputkiin, jotka sisältävät kuljetuselatusainetta eli 10 prosenttia vasikan seerumia ja antibiootteja sisältävää soluviljelyyn käytettävää elatusainetta. Suositeltava on yhdiste, joka sisältää 200 KY penisilliiniä, 200 ìg streptomysiiniä ja 200 ìg kanamysiiniä millilitrassa, mutta voidaan myös käyttää muita teholtaan tutkittuja antibiootteja. Tutkittavat kudokset ovat perna, etummainen munuainen, aivot ja joissain tapauksissa ovarineste (taulukot 1 A ja 1 B).

Lukumäärältään 5 P10 kalan (taulukot 1 A ja 1 B) elinten kappaleet voidaan kerätä yhteen putkeen yhteisnäytteeksi. Kussakin näytteessä olevan kudoksen painon on oltava vähintään 1 gramma siten, että lopullinen laimennos on noin 1:10.

Putket ja riittävä määrä jäitä tai "kylmävaraajia" asetetaan eristettyihin säiliöihin (esimerkiksi paksuseinäisiin polystyreenilaatikoihin) sen varmistamiseksi, että näytteiden lämpötila on 0 P5 °C laboratorioon kuljettamisen aikana. Näytteitä on varjeltava jäätymiseltä.

Virologinen tutkimus on aloitettava mahdollisimman pian ja viimeistään 48 tuntia näytteiden keräämisen jälkeen. Jos tutkittavat kalat ovat pituudeltaan alle 6 cm, ne voidaan lähettää laboratorioon kokonaisina edellä kuvatulla tavalla jäähdytetyissä muovipusseissa.

4. Taudinmäärityksen lisäaineiston kerääminen

Muitakin kalojen kudoksia voidaan asianomaisen taudinmäärityslaboratorion kanssa tehdyn sopimuksen mukaisesti kerätä ja valmistaa lisätutkimuksia varten.

II. Näytteiden valmistaminen virologista tutkimusta varten

1. Elinten homogenointi

Putkissa olevat kudokset on laboratoriossa täydellisesti homogenoitava (joko stomacher-homogenisaattorin, sekoittimen tai huhmaren ja morttelin avulla) ja sen jälkeen suspendoitava alkuperäiseen kuljetuselatusaineeseen. Jos näyte koostuu kokonaisista kaloista eli kaloista, joiden pituus on alle 6 cm, nämä leikataan steriileillä saksilla pieniksi palasiksi sen jälkeen, kun suolen aukon takana oleva osa ruumiista on poistettu, homogenoidaan edellä kuvatun menetelmän mukaisesti ja suspendoidaan elatusaineeseen suhteessa 1:10.

2. Homogenaatin sentrifugointi

Homogenaatti sentrifugoidaan sentrifugissa, joka on jäähdytetty 2 P5 °C:seen, 2 000 P4 000 g, 15 minuutin ajan, ja kelluva neste kerätään talteen tutkimustarkoituksiin.

Jos näyte lähetetään elatusaineessa (eli antibiooteille altistuneena), kelluvaa nestettä ei saa enää käsitellä antibiooteilla.

Jos näyte on lähetetty kokonaisina kaloina, sentrifugoinnin jälkeen saatu homogenaatti on käsiteltävä antibiooteilla sen uudelleen suspendointiin käytetyssä kuljetuselatusaineessa joko neljän tunnin ajan huoneenlämpötilassa tai yön yli 4 °C:ssa.

Antibioottikäsittelyllä pyritään pitämään näytteiden bakteerikontaminaatio hallinnassa ja tekemään suodatus kalvosuodattimilla tarpeettomaksi.

Kelluvaa osaa sekoitetaan välittömästi sentrifugoinnin jälkeen tilavuudeltaan yhtä suureen määrään kahdenarvoista IPN-viruksen antiseerumia (vertailukannat Sp ja Ab), jota on laimennettu asianmukaisella tavalla, ja inkuboidaan tällaisena vähintään tunti 15 °C:ssa tai enintään 18 tuntia 4 °C:ssa. Antiseerumin pitoisuuden on oltava vähintään 1/2 000 50-prosenttisessa plakkineutralisaatiokokeessa.

Käsittelemällä kaikki inokulaatit IPN-viruksen antiseerumilla (tietyillä alueilla Euroopassa tämä virus esiintyy 50 prosentissa kalanäytteistä) pyritään estämään IPN-viruksesta aiheutuvan CPE:n kehittyminen inokuloiduissa soluviljelmissä. Tämä lyhentää virologisten tutkimusten kestoa sekä vähentää sellaisten tapausten lukumäärää, joissa CPE:n ilmeneminen olisi katsottava VHS:n tai IHN:n mahdolliseksi indikaatioksi.

Jos näytteet ovat lähtöisin IPN-vapaiksi katsotuista tuotantoyksiköistä, inokulaatteja ei tarvitse käsitellä IPN-viruksen antiseerumilla.

III. Virologinen tutkimus

1. Soluviljelmät ja elatusaineet

BF-2 ja joko EPC- tai FHM-solut kasvatetaan 20 P25 °C:n lämpötilassa Eagle's MEM-elatusaineessa (tai sen muunnelmissa), johon on lisätty 10 prosenttia naudan sikiön seerumia ja antibiootteja standardipitoisuuksina.

Viljeltäessä soluja suljetuissa pulloissa elatusaine puskuroidaan bikarbonaatilla. Avoimissa yksiköissä kasvatettavissa soluviljelmissä käytettävä elatusaine on puskuroitava Tris-HCl:lla (23 mM) ja natriumbikarbonaatilla (6 mM) siten, että pH on mahdollisimman tarkasti 7,6, joka on ihanteellinen virusten lisääntymiselle.

Kudosaineen inokulaatiossa käytettävien soluviljelmien tulisi olla nuoria (4 P48 tunnin ikäisiä) ja aktiivisessa kasvuvaiheessa (ei yhtyviä) inokulaatiohetkellä.

2. Soluviljelmien inokulaatio

Soluviljelmiin inokuloidaan antibioottikäsiteltyä elinsuspensiota kahtena laimennoksena eli itse primäärilaimennoksen lisäksi sen 1:100 laimennoksena (homologisen interferenssin estämiseksi). Vähintään kaksi solulinjaa on inokuloitava (katso III.1. jakso). Inokulaatin koon ja soluviljelyelatusaineen tilavuuden suhteen tulisi olla noin 1:10.

Kutakin laimennosta ja solulinjaa kohti käytettävän solualueen tulisi olla vähintään noin 2 cm2 vastaten yhtä kuoppaa 24-kuoppaisessa soluviljelyastiassa. Soluviljelyastioiden käyttö on suositeltavaa, mutta myös muut, samanlaisen tai suuremman kasvupinnan tarjoavat alustat soveltuvat tähän tarkoitukseen.

3. Soluviljelmien inkubointi

Inokuloituja soluviljelmiä inkuboidaan 15 °C:ssa seitsemän päivää. Jos soluviljelmän elatusaineen väri muuttuu punaisesta keltaiseksi osoittaen elatusaineen happamoitumista, on pH-arvoa säädettävä steriilin bikarbonaattiliuoksen tai vastaavien aineiden avulla solun virusinfektioherkkyyden varmistamiseksi.

Jäädytetyt VHS- ja IHN-viruskannat on titrattava kuuden kuukauden välein soluviljelmien infektioherkkyyden tarkistamiseksi.

4. Mikroskopointi

Inokuloidut soluviljelmät tarkastetaan päivittäin CPE:n muodostumisen havaitsemiseksi noin 40-kertaisella suurennuksella. Jos havaitaan selvä CPE-esiintymä, viruksen tunnistamismenetelmät on aloitettava välittömästi IV jakson mukaisesti.

Samanaikaisesti on toteutettava asianmukaiset toimenpiteet sen tuotantoyksikön, josta positiivinen virusnäyte on lähtöisin, ja kaikkien muidenkin siitä alavirtaan sijaitsevien tuotantoyksiköiden hyväksynnän keskeyttämiseksi.

Hyväksynnän keskeyttäminen on pidettävä voimassa, kunnes laboratoriokokeet osoittavat, että kyseessä ei ole VHS- tai IHN-virus. Viruksen tunnistamiseksi sallitaan enintään neljän viikon määräaika mukaan lukien määrityksiin kuluva aika vertailulaboratorioissa.

5. Jatkoviljelmät

Jos CPE:tä ei ole kehittynyt seitsemän päivän inkubaation jälkeen, suoritetaan jatkoviljely tuoreille soluviljelmille käyttäen samanlaista solualuetta kuin primääriviljelmässä.

Kaikista primääriviljelmän muodostavista viljelmistä/kuopista lähtöisin olevat elatusaineen määräosat ryhmitellään solukannan mukaan viljelmien yhden jäädytys- ja sulatuskierroksen jälkeen, ja 0,5 ml elatusainetta sekoitetaan yhtä suureen määrään IPN-viruksen antiseerumia II jakson 2 kohdassa kuvatulla tavalla, ja seos inkuboidaan 15 °C:ssa 60 minuutin ajan. Seos inokuloidaan tämän jälkeen homologisiin soluviljelmiin laimennoksina 1:1 ja 1:100 III jakson 2 kohdan mukaisesti. Inokulointia voi edeltää kaikkien laimennosten esi-inkubointi kahdenarvoisen IPN-viruksen antiseerumin kanssa sopivana laimennoksena.

Tämän jälkeen inokuloituja viljelmiä inkuboidaan seitsemän päivän ajan 15 °C:ssa ottaen huomioon III.4. jakson 4 määräykset.

IV. Viruksen tunnistaminen

1. Neutralisaatio

Jos soluviljelmässä on todettu CPE:n muodostuminen, elatusaine kerätään talteen, solut poistetaan hidasnopeuksisella sentrifugoinnilla tai suodattamalla kalvosuodattimella (0,45 ìm), minkä jälkeen elatusaine laimennetaan suhteeseen 1:100 ja 1:10 000 soluviljelmän elatusaineessa.

Laimennosten määräosat sekoitetaan ja niitä inkuboidaan erikseen 60 minuutin ajan 15 °C:ssa yhdessä seuraavien reagenssien samansuuruisten osien kanssa:

P VHS-viruksen (Egtved-virus) ryhmäspesifinen vasta-aine 1:50*

P tarttuvan verta muodostavan kudoksen kuolion (IHN) aiheuttavan viruksenryhmäspesifinen

vasta-aine 1:50* P tarttuvan haimakuoliotaudin (IPN) aiheuttavan viruksen kahdenarvoinen antiseerumi

(vertailukannat Sp ja Ab) 1:50* P elatusaine 1:1* * tai vertailulaboratorion määräämällä tavalla antiseerumien mahdollisen sytotoksisuuden osalta.

Käytettyjen reagenssien on oltava pitoisuuden ja spesifisyyden osalta vertailulaatua.

Vähintään kaksi soluviljelmää inokuloidaan kukin 50 ìl:lla viruksen ja seerumin seosta ja inkuboidaan 15 °C:ssa. CPE:n kehittymistä valvotaan III jakson 4 kohdan mukaisesti.

Jos virusta ei ole kokeen avulla varmuudella tunnistettu viikon kuluessa, on suoritettava jokin seuraavista toimista:

a) virus siirretään kansalliseen kalaviruksiin erikoistuneeseen vertailulaboratorioon viruksen välitöntä tunnistamista varten;

b) sovelletaan IFAT- (IV.2. jakso) tai ELISA-tekniikkaa (IV.3. jakso) tai muita virusten tunnistamistekniikoita vertailulaatuisten reagenssien avulla.

2. Immunofluoresenssi (IFAT)

Kutakin tunnistettavaa eristettyä virusta kohti istutetaan vähintään kahdeksalle peitinlasille tai vastaavalle alustalle CPE-soluja sellaisella tiheydellä, että se johtaa noin 60 P90 prosentin peittoon 24 tunnin viljelyn jälkeen. CPE-solut valitaan tähän tarkoitukseen, koska ne kiinnittyvät voimakkaasti lasipintoihin.

Kun solut ovat asettuneet lasipinnalle (noin tunti istuttamisesta) tai kun viljelmiä on inkuboitu enintään 24 tunnin ajan, tunnistettava virus inokuloidaan. Neljä viljelmää inokuloidaan tilavuussuhtein 1:10 ja neljä viljelmää suhtein 1:100.

Sen jälkeen, kun inokulaatiosta on kulunut 20-30 tuntia, viljelmät huuhdotaan kahteen kertaan Eagle's MEM P tuotteella, joka ei sisällä seerumia, kiinnitetään asetonilla ja värjätään kaksikerros-IFAT:lla. Ensimmäinen reagenssikerros koostuu hyväksytystä antiseerumista (kuten IV.1. jaksossa). Toinen reagenssikerros on ensimmäisessä kerroksessa käytetyn immunoglobuliinin FITC-konjugoitu antiseerumi. Kutakin kokeessa käytettyä antiseerumia kohti värjätään vähintään yksi suurella annoksella inokuloitu ja yksi pienellä annoksella inokuloitu viljelmä. Kokeen on sisällettävä asianmukaiset negatiiviset ja positiiviset kontrollit.

Värjätyt viljelmät irrotetaan glyserolisuolaliuoksella. Ne tutkitaan tulevan ultraviolettivalon alla. Käytetään 10 tai 12 -okulaaria ja 25 tai 40 -objektiivilinssejä, joiden vastaavat numeeriset aukot ovat >0,7 ja >1,3. Primääriantiseerumin ja FITC-konjugoidun immunoglobuliinin laimennokset riippuvat valitusta tai käytettävissä olevasta mikroskopialaitteistosta.

Tietyt Egtved-viruskannat reagoivat voimakkaasti IFAT:n F 1 -vertailukantojen antiseerumin kanssa, vaikka ne eivät reagoisi neutralisaatiokokeissa.

3. ELISA-testi (enzyme linked immunosorbent assay)

Mikrotiitterilevyjen (esimerkiksi Nunc-immunolevyt, Maxisorp, Nunc, Tanska) kuopat peitetään yöksi IV.1. jaksossa mainittujen antiseerumien proteiini A:lla puhdistettujen immunoglobuliinijakeiden suositelluilla laimennoksilla.

Sen jälkeen, kun kuopat on huuhdeltu PBS-Tween-20 -puskurilla, tunnistettava virus viedään kuoppiin kaksin- tai nelinkertaisina laimennossarjoina ja annetaan reagoida peittävän vasta-aineen kanssa 60 minuutin ajan 37 °C:ssa. PBS-Tween-20 -puskurilla tapahtuvan huuhtelun jälkeen lisätään spesifisyydeltään peittäviä vasta-aineita vastaavia biotinyylillä käsiteltyjä vasta-aineita ja annetaan reagoida 60 minuutin ajan 20 °C:ssa. Sen jälkeen, kun edellä kuvattu huuhtelu on toistettu, lisätään HRP-konjugoitu streptavidiini ja annetaan reagoida tunnin ajan 20 °C:ssa. Viimeisen huuhtelun jälkeen sidottu entsyymi saadaan näkyviin sopivien ELISA-substraattien (OPD, TMB tai muu) avulla.

Edellä esitetty biotiini- ja avidiini-pohjainen ELISA-versio on annettu vain esimerkkinä. Sen asemesta voidaan käyttää myös muita teholtaan tutkittuja ELISA-versioita.

>TAULUKON PAIKKA>

>TAULUKON PAIKKA>

II OSA

TAUDINMÄÄRITYSMENETTELYT IHN:N TAI VHS:N VAHVISTAMISEKSI

TAUTIEPÄILYTAPAUKSISSA

IHN:n ja VHS:n taudinmääritys voidaan suorittaa käyttäen jotakin seuraavista tekniikoista:

P A. Tavanomainen viruseristys ja sitä seuraava viruksen serologinen tunnistaminen,

P B. Viruseristys samanaikaisesti viruksen serologisen tunnistamisen kanssa,

P C. Nopeat taudinmääritystekniikat (IFAT, ELISA).

IHN:n ja VHS:n ensimmäinen taudinmääritys hyväksytyillä vyöhykkeillä sijaitsevissa viljelylaitoksissa ei saa perustua pelkästään menetelmään C. Lisäksi on käytettävä joko menetelmää A tai B.

Virologiseen tutkimukseen tarkoitetun kudoksen mukana voi jossain tapauksissa olla myös lisäaineistoa bakteriologista, parasitologista, histologista tai muuta tutkimusta varten erotusdiagnoosin mahdollistamiseksi. Kyseinen aineisto olisi kerättävä OIE:n määrittelemien menettelyjen mukaisesti.

A. Viruksen tavanomainen eristäminen ja sitä seuraava viruksen serologinen tunnistaminen

A.I.1 Näytteiden valinta

Tutkimuskäyttöön on syytä valita vähintään 10 kalaa, joissa ilmenee tyypillisiä IHN:n tai SHV:n merkkejä.

A.I.2 Kalanäytteiden valmistaminen ja lähettäminen

Ennen lähettämistä tai siirtämistä laboratorioon tutkittavat elinten kappaleet on irrotettava kalasta saksien tai muiden steriilien välineiden avulla ja asetettava muoviputkiin, jotka sisältävät kuljetuselatusainetta eli 10 prosenttia vasikan seerumia ja antibiootteja sisältävää soluviljelyyn käytettävää elatusainetta. Suositeltava on yhdiste, joka sisältää 200 KY penisilliiniä, 200 ìg streptomysiiniä ja 200 ìg kanamysiiniä millilitrassa, mutta voidaan myös käyttää muita teholtaan tutkittuja antibiootteja. Tutkittavat kudokset ovat perna, etummainen munuainen ja aivot.

Lukumäärältään 5 P10 kalan elinten kappaleet voidaan kerätä yhteen putkeen yhteisnäytteeksi. Kussakin näytteessä olevan kudoksen painon on oltava vähintään 1 g siten, että lopullinen laimennos on noin 1:10.

Putket ja riittävä määrä jäitä tai "kylmävaraajia" asetetaan eristettyihin säiliöihin (esimerkiksi paksuseinäisiin polystyreenilaatikoihin) sen varmistamiseksi, että näytteiden lämpötila on 0 P5 °C laboratorioon kuljettamisen aikana. Näytteitä on varjeltava jäätymiseltä.

Virologinen tutkimus on aloitettava mahdollisimman pian ja viimeistään 48 tuntia näytteiden keräämisen jälkeen. Jos tutkittavat kalat ovat pituudeltaan alle 6 cm, ne voidaan lähettää laboratorioon kokonaisina edellä kuvatulla tavalla jäähdytetyissä muovipusseissa.

A.I.3 Taudinmäärityksen lisäaineiston kerääminen

Muitakin kalojen kudoksia voidaan asianomaisen taudinmäärityslaboratorion kanssa tehdyn sopimuksen mukaisesti kerätä ja valmistaa lisätutkimuksia varten.

A.II.1 Elinten homogenointi

Putkissa olevat kudokset on laboratoriossa täydellisesti homogenoitava (joko stomacher-homogenisaattorin, sekoittimen tai huhmaren ja morttelin avulla) ja sen jälkeen suspendoitava alkuperäiseen kuljetuselatusaineeseen. Jos näyte koostuu kokonaisista kaloista eli kaloista, joiden pituus on alle 6 cm, nämä leikataan steriileillä saksilla pieniksi palasiksi sen jälkeen, kun suolen aukon takana oleva osa ruumiista on poistettu, homogenoidaan edellä kuvatun menetelmän mukaisesti ja suspendoidaan elatusaineeseen suhteessa 1:10.

A.II.2 Homogenaatin sentrifugointi

Homogenaatti sentrifugoidaan sentrifugissa, joka on jäähdytetty 2 P5 °C:seen, 2 000 P4 000 g, 15 minuutin ajan, ja kelluva neste kerätään talteen tutkimustarkoituksiin.

Jos näyte lähetetään elatusaineessa (eli antibiooteille altistuneena), kelluvaa nestettä ei saa enää käsitellä antibiooteilla.

Jos näyte on lähetetty kokonaisina kaloina, sentrifugoinnin jälkeen saatu homogenaatti on käsiteltävä antibiooteilla sen uudelleen suspendointiin käytetyssä kuljetuselatusaineessa joko neljän tunnin ajan huoneenlämpötilassa tai yön yli 4 °C:ssa.

Antibioottikäsittelyllä pyritään pitämään näytteiden bakteerikontaminaatio hallinnassa ja tekemään suodatus kalvosuodattimilla tarpeettomaksi.

Kelluvaa nestettä sekoitetaan välittömästi sentrifugoinnin jälkeen tilavuudeltaan yhtä suureen määrään kahdenarvoista IPN-viruksen antiseerumia (vertailukannat Sp ja Ab), jota on laimennettu asianmukaisella tavalla, ja inkuboidaan tällaisena vähintään tunti 15 °C:ssa tai enintään 18 tuntia 4 °C:ssa. Antiseerumin pitoisuuden on oltava vähintään 1/2 000 50-prosenttisessa plakkineutralisaatiokokeessa.

Käsittelemällä kaikki inokulaatit IPN-viruksen antiseerumilla (tietyillä alueilla Euroopassa tämä virus esiintyy 50 prosentissa kalanäytteistä) pyritään estämään IPN-viruksesta aiheutuvan CPE:n kehittyminen inokuloiduissa soluviljelmissä. Tämä lyhentää virologisten tutkimusten kestoa sekä vähentää sellaisten tapausten lukumäärää, joissa CPE:n ilmeneminen olisi katsottava VHS:n tai IHN:n mahdolliseksi indikaatioksi.

Jos näytteet ovat lähtöisin IPN-vapaiksi katsotuista tuotantoyksiköistä, inokulaatteja ei tarvitse käsitellä IPN-viruksen antiseerumilla.

A.III.1 Soluviljelmät ja elatusaineet

BF-2 ja joko EPC- tai FHM-solut kasvatetaan 20 P25 °C:n lämpötilassa Eagle's MEM-elatusaineessa (tai sen muunnelmissa), johon on lisätty 10 prosenttia naudan sikiön seerumia ja antibiootteja standardipitoisuuksina.

Viljeltäessä soluja suljetuissa pulloissa elatusaine puskuroidaan bikarbonaatilla. Avoimissa yksiköissä kasvatettavissa soluviljelmissä käytettävä elatusaine on puskuroitava Tris-HCl:lla (23 mM) ja natriumbikarbonaatilla (6 mM) siten, että pH on mahdollisimman tarkasti 7,6, joka on ihanteellinen virusten lisääntymiselle.

Kudosaineen inokulaatiossa käytettävien soluviljelmien tulisi olla nuoria (4 P48 tunnin ikäisiä) ja aktiivisessa kasvuvaiheessa (ei yhtyviä) inokulaatiohetkellä.

A.III.2 Soluviljelmien inokulaatio

Soluviljelmiin inokuloidaan antibioottikäsiteltyä elinsuspensiota kahtena laimennoksena eli itse primäärilaimennoksen lisäksi sen 1:100 laimennoksena (homologisen interferenssin estämiseksi). Vähintään kaksi solulinjaa on inokuloitava (katso A.III.1.).

Inokulaatin koon ja soluviljelyelatusaineen tilavuuden suhteen tulisi olla noin 1:10.

Kutakin laimennosta ja solulinjaa kohti käytettävän solualueen tulisi olla vähintään noin 2 cm2 vastaten yhtä kuoppaa 24-kuoppaisessa soluviljelyastiassa. Soluviljelyastioiden käyttö on suositeltavaa, mutta myös muut, samanlaisen tai suuremman kasvupinnan tarjoavat alustat soveltuvat tähän tarkoitukseen.

A.III.3 Soluviljelmien inkubointi

Inokuloituja soluviljelmiä inkuboidaan 15 °C:ssa seitsemän päivää. Jos soluviljelmän elatusaineen väri muuttuu punaisesta keltaiseksi osoittaen elatusaineen happamoitumista, on pH-arvoa säädettävä steriilin bikarbonaattiliuoksen tai vastaavien aineiden avulla solun virusinfektioherkkyyden varmistamiseksi.

Jäädytetyt VHS- ja IHN-viruskannat on titrattava kuuden kuukauden välein soluviljelmien infektioherkkyyden tarkistamiseksi.

A.III.4 Mikroskopointi

Inokuloidut soluviljelmät tarkastetaan päivittäin CPE:n muodostumisen havaitsemiseksi noin 40-kertaisella suurennuksella. Jos havaitaan selvä CPE-esiintymä, viruksen tunnistamismenetelmät on aloitettava välittömästi A.IV. jakson mukaisesti.

Samanaikaisesti on toteutettava asianmukaiset toimenpiteet sen tuotantoyksikön, josta positiivinen virusnäyte on lähtöisin, ja kaikkien muidenkin siitä alavirtaan sijaitsevien tuotantoyksiköiden hyväksynnän keskeyttämiseksi.

Hyväksynnän keskeyttäminen on pidettävä voimassa, kunnes laboratoriokokeet osoittavat, että kyseessä ei ole VHS- tai IHN-virus. Viruksen tunnistamiseksi sallitaan enintään neljän viikon määräaika mukaan lukien määrityksiin kuluva aika vertailulaboratorioissa.

A.III.5 Jatkoviljelmät

Jos CPE:tä ei ole kehittynyt seitsemän päivän inkubaation jälkeen, suoritetaan jatkoviljely tuoreille soluviljelmille käyttäen samanlaista solualuetta kuin primääriviljelmässä.

Kaikista primääriviljelmän muodostavista viljelmistä/kuopista lähtöisin olevat elatusaineen määräosat ryhmitellään solukannan mukaan viljelmien yhden jäädytys- ja sulatuskierroksen jälkeen, ja 0,5 ml elatusainetta sekoitetaan yhtä suureen määrään IPN-viruksen antiseerumia A.II.2. jaksossa kuvatulla tavalla, ja seos inkuboidaan 15 °C:ssa 60 minuutin ajan. Seos inokuloidaan tämän jälkeen soluviljelmiin laimennoksina 1:1 ja 1:100 A.III.2. jakson mukaisesti. Inokulointia voi edeltää kaikkien laimennosten esi-inkubointi divalentin kahdenarvoisen IPN-viruksen antiseerumin kanssa sopivana laimennoksena.

Tämän jälkeen inokuloituja viljelmiä inkuboidaan seitsemän päivän ajan 15 °C:ssa ottaen huomioon A.III.4. jakson määräykset.

A.IV.1 Neutralisaatio

Jos soluviljelmässä on todettu CPE:n muodostuminen, elatusaine kerätään talteen, solut poistetaan hidasnopeuksisella sentrifugoinnilla tai suodattamalla kalvosuodattimella (0,45 ìm), minkä jälkeen elatusaine laimennetaan suhteeseen 1:100 ja 1:10 000 soluviljelmän elatusaineessa.

Laimennosten määräosat sekoitetaan ja inkuboidaan erikseen 60 minuutin ajan 15 °C:ssa yhdessä seuraavien reagenssien samansuuruisten osien kanssa:

P VHS-viruksen (Egtved-virus) ryhmäspesifinen vasta-aine 1:50*

P tarttuvan verta muodostavan kudoksen kuolion (IHN) aiheuttavan

viruksen ryhmäspesifinen vasta-aine 1:50* P tarttuvan haimakuoliotaudin (IPN) aiheuttavan viruksen kahdenarvoinen

antiseerumi (vertailukannat Sp ja Ab) 1:50* P elatusaine 1:1* * tai vertailulaboratorion määräämällä tavalla antiseerumien mahdollisen sytotoksisuuden osalta.

Käytettyjen reagenssien on oltava pitoisuuden ja spesifisyyden osalta vertailulaatua.

Vähintään kaksi soluviljelmää inokuloidaan kukin 50 ìl:lla viruksen ja seerumin seoksella ja inkuboidaan 15 °C:ssa. CPE:n kehittymistä valvotaan A.III.4. jakson mukaisesti.

Jos virusta ei ole kokeen avulla varmuudella tunnistettu viikon kuluessa, on suoritettava jokin seuraavista toimista:

a) virus siirretään kansalliseen kalaviruksiin erikoistuneeseen vertailulaboratorioon viruksen välitöntä tunnistamista varten;

b) sovelletaan IFAT- (A.IV.2. jakso) tai ELISA-tekniikkaa (A.IV.3. jakso) tai muita virusten tunnistamistekniikoita vertailulaatuisten reagenssien avulla.

A.IV.2 Immunofluoresenssi (IFAT)

Kutakin tunnistettavaa eristettyä virusta kohti istutetaan vähintään kahdeksalle peitinlasille tai vastaavalle alustalle CPE-soluja tiheydellä, että se johtaa noin 60 P90 prosentin peittoon 24 tunnin viljelyn jälkeen. CPE-solut valitaan tähän tarkoitukseen, koska ne kiinnittyvät voimakkaasti lasipintoihin.

Kun solut ovat asettuneet lasipinnalle (noin tunti istuttamisesta) tai kun viljelmiä on inkuboitu enintään 24 tunnin ajan, tunnistettava virus inokuloidaan. Neljä viljelmää inokuloidaan tilavuussuhtein 1:10 ja neljä viljelmää suhtein 1:100.

Sen jälkeen, kun inokulaatiosta on kulunut 20 P30 tuntia, viljelmät huuhdotaan kahteen kertaan Eagle's MEM -tuotteella, joka ei sisällä seerumia, kiinnitetään asetonilla ja värjätään kaksikerros-IFAT:lla. Ensimmäinen reagenssikerros koostuu hyväksytystä antiseerumista (kuten IV.1. jaksossa). Toinen reagenssikerros on ensimmäisessä kerroksessa käytetyn immunoglobuliinin FITC-konjugoitu antiseerumi. Kutakin kokeessa käytettyä antiseerumia kohti värjätään vähintään yksi suurella annoksella inokuloitu ja yksi pienellä annoksella inokuloitu viljelmä. Kokeen on sisällettävä asianmukaiset negatiiviset ja positiiviset kontrollit.

Värjätyt viljelmät irrotetaan glyserolisuolaliuoksella. Ne tutkitaan tulevan ultraviolettivalon alla. Käytetään 10 tai 12 -okulaaria ja 25 tai 40 -objektiivilinssejä, joiden vastaavat numeeriset aukot ovat >0,7 ja >1,3. Primääriantiseerumin ja FITC-konjugoidun immunoglobuliinin laimennokset riippuvat valitusta tai käytettävissä olevasta mikroskopialaitteistosta.

Tietyt Egtved-viruskannat reagoivat voimakkaasti IFAT:n F 1 -vertailukantojen antiseerumin kanssa, vaikka ne eivät reagoisi neutralisaatiokokeissa.

A.IV.3 ELISA-testi (enzyme linked immunosorbent assay)

Mikrotiitterilevyjen (esimerkiksi Nunc-immunolevyt, Maxisorp, Nunc, Tanska) kuopat peitetään yöksi A jakson IV kohdan 1 alakohdassa mainittujen antiseerumien proteiini A:lla puhdistettujen immunoglobuliinijakeiden suositelluilla laimennoksilla.

Sen jälkeen, kun kuopat on huuhdeltu PBS-Tween-20 -puskurilla, tunnistettava virus viedään kuoppiin kaksin- tai nelinkertaisina laimennossarjoina ja annetaan reagoida peittävän vasta-aineen kanssa 60 minuutin ajan 37 °C:ssa. PBS-Tween-20 -puskurilla tapahtuvan huuhtelun jälkeen lisätään spesifisyydeltään peittäviä vasta-aineita vastaavia biotinyylillä käsiteltyjä vasta-aineita ja annetaan reagoida 60 minuutin ajan 20 °C:ssa. Sen jälkeen, kun edellä kuvattu huuhtelu on toistettu, lisätään HRP-konjugoitu streptavidiini ja annetaan reagoida tunnin ajan 20 °C:ssa. Viimeisen huuhtelun jälkeen sidottu entsyymi saadaan näkyviin sopivien ELISA-substraattien (OPD, TMB tai muu) avulla.

Edellä esitetty biotiini- ja avidiini-pohjainen ELISA-versio on annettu vain esimerkkinä. Sen asemesta voidaan käyttää myös muita teholtaan tutkittuja ELISA-versioita.

B. Viruksen eristäminen samanaikaisesti viruksen serologisen tunnistamisen kanssa

B.I.1 Näytteiden valinta

Katso A.I.1.

B.I.2 Kalanäytteiden valmistaminen ja lähettäminen

Katso A.I.2.

B.II.1 Elinten homogenointi

Katso A.II.1.

B.II.2 Homogenaatin sentrifugointi

Katso A.II.2.

B.II.3 Kelluvan liuoksen käsittely diagnostisten antiseerumien avulla

Antibiootilla ja anti-IPN:llä käsitelty elinsuspensio laimennetaan suhteeseen 1:10 ja 1:10 000 soluviljelyelatusaineessa, ja määräosat sekoitetaan ja inkuboidaan 60 minuutin ajan 15 °C:ssa A.IV.1. jaksossa lueteltujen reagenssien samansuuruisten osien kanssa.

B.III.1 Soluviljelmät ja elatusaineet

Katso A.III.1.

B.III.2 Soluviljelmien inokulaatio

Kustakin (B.II.3. jakson mukaisesti valmistetusta) virus/seerumiseoksesta inokuloidaan 50 ìl vähintään kahteen kunkin solulinjan soluviljelmään.

B.III.3 Soluviljelmien inkubaatio

Katso A.III.3.

B.III.4 Mikroskopointi

Inokuloidut soluviljelmät tarkastetaan päivittäin CPE:n muodostumisen havaitsemiseksi noin 40-kertaisella suurennuksella. Jos jokin käytetyistä antiseerumeista estää CPE:n muodostumisen, virus voidaan katsoa tunnistetuksi.

Jos kyseiset antiseerumit eivät estä CPE:n muodostumista, on syytä toimeenpanna viruksen tunnistamismenettelyt A.IV. jakson mukaisesti.

B.III.5 Jatkoviljelmät

Jos CPE:tä ei ole muodostunut seitsemän päivän kuluessa, on suoritettava jatkoviljely kelluvalla liuoksella inokuloiduista viljelmistä ja elatusaineesta (B.II.3.).

C. Nopeat taudinmääritystekniikat (IFAT, ELISA)

Supernatantti, joka on valmistettu A.II.2. jaksossa kuvatulla tavalla, käsitellään IFAT:lla tai ELISA:lla A.IV.2. tai A.IV.3. jakson mukaisesti. Näitä nopeita tekniikoita on täydennettävä virologisella tutkimuksella A:n tai B:n mukaisesti alle 48 tunnin kuluessa näytteenotosta, jos:

a) on saatu negatiivinen tulos

tai

b) on saatu positiivinen tulos ensimmäistä IHN- tai VHS-tapausta edustavista näytteistä hyväksytyllä vyöhykkeellä.