31984L0319

KOMISSION DIREKTIIVI,

annettu 7 päivänä kesäkuuta 1984,

kolmansista maista tuotavan siansukuisista kotieläimistä peräisin olevan tuoreen lihan trikiinitutkimuksesta annetun neuvoston direktiivin 77/96/ETY liitteiden muuttamisesta (84/319/ETY)

EUROOPAN YHTEISÖJEN KOMISSIO, joka

ottaa huomioon Euroopan talousyhteisön perustamissopimuksen,

ottaa huomioon kolmansista maista tuotavan siansukuisista kotieläimistä peräisin olevan tuoreen lihan trikiinitutkimuksesta 21 päivänä joulukuuta 1976 annetun neuvoston direktiivin 77/96/ETY (), sellaisena kuin se on viimeksi muutettuna direktiivillä 83/91/ETY (), ja erityisesti sen 8 artiklan,

sekä katsoo, että

uusimmat tutkimukset ovat tehneet mahdolliseksi kehittää tiettyjä menetelmiä trikiinien tutkimiseksi sianlihasta; näiden menetelmien terveydellinen luotettavuus vastaa nykyisiä menetelmiä; direktiivin 77/96/ETY liitteeseen I olisi siten tehtävä täydennyksiä,

trikiinitutkimusten helpottamiseksi on tärkeää, että kolmannet maat ja jäsenvaltiot voivat valita minkä tahansa säädetyistä tutkimusmenetelmistä,

nykyisin käytettäviin trikiinitutkimusmenetelmiin sekä edellytyksiin, jotka trikiinitutkimuksia tekevien laboratorioiden on täytettävä, on tehtävä joitakin teknisiä muutoksia, ja

tässä direktiivissä säädetyt toimenpiteet ovat pysyvän eläinlääkintäkomitean lausunnon mukaiset,

ON ANTANUT TÄMÄN DIREKTIIVIN:

1 artikla

Muutetaan direktiivi 77/96/ETY liitteessä esitetyllä tavalla.

2 artikla

Jäsenvaltioiden on saatettava tämän direktiivin noudattamisen edellyttämät lait, asetukset ja hallinnolliset määräykset voimaan viimeistään 1 päivänä tammikuuta 1985. Niiden on ilmoitettava tästä komissiolle viipymättä.

3 artikla

Tämä direktiivi on osoitettu kaikille jäsenvaltioille.

Tehty Brysselissä 7 päivänä kesäkuuta 1984.

Komission puolesta

Poul DALSAGER

Komission jäsen

() EYVL N:o L 26, 31.1.1977, s. 67

() EYVL N:o L 59, 5.3.1983, s. 34

LIITE

A. Muutetaan liite I seuraavasti:

1. II kohdan a alakohdassa:

- korvataan kymmenes luetelmakohta seuraavasti:

"- sopivalla valolähteellä varustettu stereomikroskooppi (15-40-kertainen suurennus),"

- korvataan viimeinen luetelmakohta seuraavasti:

"- ruuansulatusneste, joka koostuu seuraavista: 10 g pepsiiniä (80 y/g FIP: Fédération internationale de pharmacie), 5 ml HCl (vähintään 37 %) lisätään vesijohtovettä niin, että saadaan litra nestettä."

2. Korvataan III kohta seuraavasti:

"III YHDISTETTYJEN NÄYTTEIDEN DIGESTIOMENETELMÄ

a) Laitteisto ja reagenssit

- veitsi ja atulat näytteiden ottoa varten,

- lihamylly, jonka reikien läpimitta on 2-3 mm,

- 3 litran erlenmeyerpullo, jossa on kumi- tai vanutulppa,

- 2 000 ml:n kartiomainen erotussuppilo,

- tavallinen statiivi, jossa on noin 28 cm:n pituinen A-jalusta ja noin 80 cm:n varsi,

- rengas, jonka halkaisija on 10-11 cm ja joka voidaan kiinnittää statiiviin,

- tasaleukainen puristin (23 × 40 mm), joka voidaan kiinnittää statiiviin kaksoiskytkennällä,

- siivilä (silmäkoko 177 mikronia), ulkohalkaisija 11 cm, verkko messinkiä tai ruostumatonta terästä,

- suppilo, jonka sisähalkaisija on vähintään 12 cm,

- 100 ml:n mittalaseja,

- sopivalla valolähteellä varustettu stereomikroskooppi (15-40-kertainen suurennus), tai sopivalla valolähteellä varustettu trikinoskooppi, jossa on vaakatasopöytä puristuslasia varten,

- trikinoskooppia käytettäessä: toukkien laskukammio, joka voi olla seuraavanlainen:

toukkien laskukammio on valmistettu 3 mm paksuista akryylilevyistä seuraavasti:

i) kammion pohjan mitat ovat 180 × 40 mm, ja se on ruudutettu,

ii) sivulevyjen koko on 230 × 20 mm,

iii) päätylevyjen koko on 40 × 20 mm.

Pohja ja päädyt on sijoitettava sivujen väliin, jolloin kammion molempiin päihin jää pienet kädensijat. Pohjalevyn yläpinnan on oltava 7-9 mm sivujen ja päätyjen muodostaman kehyksen alareunan yläpuolella. Osat on kiinnitettävä materiaalille sopivalla liimalla,

- petrimaljoja, joiden halkaisija on 9 cm, ja joiden pohjaan on merkitty 10 × 10 mm:n tarkastusruudutus terävällä esineellä (stereomikroskooppia käytettäessä),

- useita 10 litran jäteastioita, joita käytetään positiivisten erien saastuttaman laitteiston käsittelemiseksi esimerkiksi formaliinilla ja saastuneen ruuansulatusnesteen keräämiseksi,

- väkevöityä (37 %) suolahappoa,

- pepsiiniä, jonka vahvuus on 1:10 000 NF (US National Formulary),

joka vastaa 1:12 500 BP (British Pharmacopoea),

joka vastaa 2 000 FIP (Fédération internationale de pharmacie),

- tarjottimia, joille mahtuu 50 noin 2 g:n painoista näytettä,

- vaaka, jonka tarkkuus on 0,1 g.

b) Näytteenotto

1. Kokonaisista ruhoista otetaan noin 2 g:n näyte palleapilareiden lihas- ja jänneosan yhtymäkohdasta; palleapilareiden puuttuessa otetaan samankokoinen näyte kyljen tai rintalastan puoleisesta pallean osasta taikka kieli-, purema- tai vatsalihaksista.

2. Lihapaloista otetaan noin 2 g:n vähärasvainen luurankolihasnäyte mahdollisuuksien mukaan läheltä luita tai jänteitä.

c) Menetelmä

1. i) Täydet erät (100 näytettä kerrallaan)

Sioista otetuista 100 yksittäisestä näytteestä otetaan jokaisesta noin 1 g näytettä. Yhdistetty näyte ajetaan kerran lihamyllyn läpi.

Jauhettu liha pannaan 3 l:n erlenmeyerpulloon samoin kuin 7 g pepsiiniä, noin 2 l vesijohtovettä, joka on lämmitetty noin 40-41 °C:n lämpötilaan, sekä 25 ml väkevöityä suolahappoa. Seosta on ravistettava, jotta pepsiini liukenee.

Liuoksen pH on noin 1,5-2.

- Sulatusta varten erlenmeyerpulloa on inkuboitava 40-41 °C:n lämmössä noin neljä tuntia. Pulloa on säännöllisesti ravisteltava inkuboinnin aikana vähintään kaksi kertaa tunnissa.

- Sulanut liuos siivilöidään 2 litran kartiomaiseen erotussuppiloon ja sen annetaan seistä statiivissa vähintään yksi tunti.

- Suppilosta lasketaan mittalasiin noin 45 ml näytettä, ja se jaetaan kolmeen petrimaljaan, joiden pohja on ruudutettu, 15 ml kuhunkin maljaan.

- Kutakin petrimaljaa tarkastellaan huolellisesti stereomikroskoopissa trikiinitoukkien havaitsemiseksi.

- Kun käytetään toukkien laskukammioita, 45 ml näytettä jaetaan tasaisesti kahteen toukkien laskukammioon, joita tarkastellaan trikinoskoopissa.

Toukat esiintyvät sakkautumissa tunnistettavina organismeina, ja kun vesi on haaleaa, voidaan usein havaita kierteen kiinni- ja aukikiertymisliikkeitä.

- Näytteet on tutkittava heti niiden valmistuttua. Tutkimusta ei missään tapauksessa saa jättää seuraavaan päivään.

Jos näyteliuos on sameaa tai jos sitä ei tutkita 30 minuutin kuluessa sen valmistumisesta, se on kirkastettava seuraavasti: Lopullinen 45 ml:n näyte kaadetaan mittalasiin ja sen annetaan seistä 10 minuuttia. Tämän jälkeen poistetaan 30 ml sakan yläpuolista nestettä varovasti imemällä ja 15 ml:n jäännökseen lisätään vesijohtovettä, kunnes tilavuus on 45 ml. Seoksen annetaan seistä vielä 10 minuuttia, minkä jälkeen 30 ml sakan yläpuolista nestettä poistetaan jälleen imemällä, ja loput 15 ml kaadetaan petrimaljaan tai toukkien laskukammioon tutkimusta varten. Mittalasi huuhdellaan 10 ml:lla vesijohtovettä, ja huuhde lisätään petrimaljassa tai laskukammiossa olevaan näytteeseen tutkimusta varten.

ii) Pienemmät kuin 100 näytteen erät

Täyteen 100 näytteen erään voidaan lisätä enintään 15 yksittäistä näytettä ja tutkia ne yhdessä täyden erän kanssa. Jos tutkitaan enemmän kuin 15 mutta vähemmän kuin 100 näytettä, ruuansulatusnesteen määrää on vähennettävä näytteiden määrän mukaan.

2. Jos yhdistetystä näytteestä saatu tulos on positiivinen tai epävarma, jokaisesta siasta on otettava 20 g:n lisänäyte b alakohdan mukaisesti. Viiden sian 20 g:n näytteet on yhdistettävä ja tutkittava edellä esitetyn menetelmän mukaisesti. Tällä tavoin tutkitaan 20 viiden sian ryhmän näytteet. Jos trikiinejä todetaan viiden sian ryhmän yhdistetyssä näytteessä, jokaisesta kyseisen ryhmän siasta on otettava erillinen 20 g:n näyte, ja kukin niistä on tutkittava erikseen edellä esitettyä menetelmää käyttäen."3. Lisätään IV, V ja VI kohta seuraavasti:

"IV MEKAANISESTI AVUSTETTU YHDISTETYN NÄYTTEEN DIGESTIOMENETELMÄ/LASKEUTUSMENETTELY

a) Laitteisto ja reagenssit

- veitsi tai sakset näytteiden leikkaamista varten,

- tarjottimia, joihin on merkitty 50 ruutua, joihin kuhunkin mahtuu noin 2 g:n lihanäyte,

- Stomacher Lab-blender -sekoitin 3 500 malli Thermo,

- Stomacher-sekoittimeen sopivia muovipusseja,

- 2 l:n kartiomainen erotussuppilo, jossa mieluiten teflonhanat,

- renkailla ja kiinnittimillä varustettuja statiiveja,

- siivilöitä, silmäkoko 177 mikronia, ulkohalkaisija 11 cm, verkko ruostumatonta terästä,

- suppiloita, joiden sisähalkaisija on vähintään 12 cm ja joihin siivilät sopivat,

- 100 ml:n mittalaseja,

- 25 ml:n pipetti,

- 3 litran lasimaljoja,

- lusikka tai lasisauva lasimaljoissa olevan ruuansulatusnesteen sekoittamista varten,

- muovinen injektioruisku ja imuputki,

- 6 g:n mittalusikka,

- lämpömittari, jonka tarkkuus on ± 0,5 °C ja mittausalue 1-100 °C,

- täristin, esim. sähköparranajokone, jonka pää on irrotettu,

- rele, joka avautuu ja sulkeutuu yhden minuutin välein,

- vaakatasopöydällä varustettu trikinoskooppi tai stereomikroskooppi, jossa on sopiva valolähde,

- toukkien laskukammio (trikinoskooppia käytettäessä). Toukkien laskukammio valmistetaan 3 mm paksuista akryylilevyistä seuraavasti:

i) kammion pohjan mitat ovat 180 × 40 mm, ja se on ruudutettu,

ii) sivulevyjen koko on 230 × 20 mm,

iii) päätylevyjen koko on 40 × 20 mm.

Pohja ja päädyt on sijoitettava sivujen väliin, jolloin kammion molempiin päihin jää pieni kädensija. Pohjalevyn yläpinnan on oltava 7-9 mm sivujen ja päätyjen muodostaman kehyksen alareunan yläpuolella. Osat on kiinnitettävä materiaalille sopivalla liimalla,

- petrimaljoja, joiden halkaisija on 9 cm, ja joiden pohjaan on merkitty 10 × 10 mm:n tarkastusruudutus terävällä esineellä (stereomikroskooppia käytettäessä),

- 17,5-prosenttista suolahappoa,

- pepsiiniä, jonka vahvuus on: 1:10 000 NF (US National Formulary),

joka vastaa 1:12 500 BP (British Pharmacopoea),

joka vastaa 2 000 FIP (Fédération internationale de pharmacie),

- useita 10 litran jäteastioita, joita käytetään positiivisten erien saastuttaman laitteiston käsittelemiseksi esimerkiksi formaliinilla ja saastuneen ruuansulatusnesteen keräämiseen,

- vaaka, jonka tarkkuus on 0,1 g.

b) Näytteenotto

1. Kokonaisista ruhoista otetaan noin 2 g:n näyte palleapilareiden lihas- ja jänneosan yhtymäkohdasta; palleapilareiden puuttuessa otetaan samankokoinen näyte kyljen tai rintalastan puoleisesta pallean osasta taikka purema- tai vatsalihaksista.

2. Lihapaloista otetaan noin 2 g:n vähärasvainen luurankolihasnäyte mahdollisuuksien mukaan läheltä luita tai jänteitä.

c) Menetelmä

1. Sulatus

i) Täydet erät (100 näytettä kerrallaan)

- Stomacher Lab-blender 3 500 -sekoittimeen asennetaan kaksinkertainen muovipussi, ja lämpötilavalitsin asetetaan 40-41 °C:seen.

- 1,5 litraa vettä, joka on lämmitetty 32-35 °C:n lämpötilaan, kaadetaan sisempään muovipussiin ja lämmitetään 40-41 °C:n lämpötilaan.

- Lisätään 25 ml 17,5-prosenttista suolahappoa muovipussissa olevaan veteen.

- Lisätään 100 jokaisesta b alakohdan mukaisesta yksittäisestä näytteestä otettua noin 1 g:n painoista näytettä (lämpötila 25-30 °C).

- Lopuksi lisätään 6 g pepsiiniä. Tätä lisäämisjärjestystä olisi noudatettava tarkasti, jotta pepsiini ei hajoa.

- Stomacherin annetaan hienontaa pussin sisältöä 25 minuuttia.

- Muovipussi poistetaan Stomacherista ja ruuansulatusneste suodatetaan siivilän läpi 3 litran lasimaljaan.

- Muovipussi huuhdellaan noin 100 ml:lla vettä, joka käytetään sitten siivilän huuhteluun ja lisätään lasimaljassa olevaan suodatettuun nesteeseen.

Täyteen 100 näytteen erään voidaan lisätä enintään 15 yksittäistä näytettä ja tutkia ne yhdessä täyden erän kanssa.

ii) Pienemmät kuin 100 näytteen erät

- Stomacher Lab-blender 3 500 -sekoittimeen asennetaan kaksinkertainen muovipussi, ja lämpötilavalitsin asetetaan 40-41 °C:een.

- Valmistetaan ruuansulatusneste sekoittamalla noin 1,5 litraa vettä ja 25 ml 17,5-prosenttista suolahappoa. Lisätään 6 g pepsiiniä ja lämmitetään neste 40-41 °C:seen. Tätä lisäämisjärjestystä on noudatettava tarkasti, jotta pepsiini ei hajoa.

- Ruuansulatusnestettä mitataan 15 ml/näytegramma (esim. 30:tä näytettä varten vaadittava määrä on 30 15 ml eli 450 ml), ja neste lisätään sisempään muovipussiin yhdessä jokaisesta yksittäisestä näytteestä b alakohdan mukaisesti otetun noin 1 g:n painoisen lihanäytteen (lämpötila 25-30 °C) kanssa.

- Kaadetaan ulompaan pussiin vettä, jonka lämpötila on noin 41 °C, kunnes kahden pussin kokonaisnestemäärä on 1,5 litraa.

- Stomacherin annetaan hienontaa pussin sisältöä 25 minuuttia.

- Muovipussi poistetaan Stomacherista ja ruuansulatusneste suodatetaan siivilän läpi 3 litran lasimaljaan.

- Muovipussi huuhdellaan noin 100 ml:lla vettä, joka käytetään sitten siivilän huuhteluun ja lisätään lasimaljassa olevaan suodatettuun nesteeseen.

2. Toukkien erottaminen sakkautuksen avulla

- Ruuansulatusnesteeseen lisätään 300-400 g jäälastuja tai -murskaa kunnes kokonaistilavuus on noin 2 litraa. Ruuansulatusnestettä sekoitetaan kunnes jää on sulanut. Kun on kyse pienemmistä eristä (ks. 1 alakohdan ii alakohta), jään määrää on vähennettävä vastaavasti.

- Jäähtynyt ruuansulatusneste kaadetaan 2 litran erotussuppiloon, joka on varustettu ylimääräisessä pitimessä olevalla täristimellä.

- Laskeuttamista varten sakkautussuppiloa täristetään jaksoittain 30 minuutin ajan niin, että yhden minuutin täristystä seuraa yhden minuutin tauko.

- Kun 30 minuuttia on kulunut, 60 ml sakkanäytettä lasketaan nopeasti 100 ml:n mittalasiin. (Suppilo huuhdellaan pesuliuoksella käytön jälkeen.)

- Annetaan 60 ml:n näytteen seistä vähintään 10 minuuttia, minkä jälkeen sakan yläpuolista nestettä poistetaan imemällä siten, että mittalasiin jää jäljelle 15 ml:n näyte, joka tutkitaan toukkien havaitsemiseksi.

- Imemiseen käytetään muoviletkulla varustettua kertakäyttöruiskua.

Letkun pituuden tulisi olla sellainen, että mittalasiin jää 15 ml, kun ruiskun pää lepää mittalasin reunalla.

- Loput 15 ml kaadetaan toukkien laskukammioon tai kahteen petrimaljaan ja tutkitaan trikinoskoopilla tai stereomikroskoopilla.

- Näytteet on tutkittava heti niiden valmistuttua. Tutkimusta ei missään tapauksessa saa jättää seuraavaan päivään.

Jos näyteliuos on sameaa, tai jos sitä ei tutkita 30 minuutin kuluessa sen valmistumisesta, se on kirkastettava seuraavasti: Lopullinen 60 ml:n näyte kaadetaan mittalasiin ja sen annetaan seistä 10 minuuttia. Tämän jälkeen poistetaan sakan yläpuolista nestettä 45 ml imemällä ja 15 ml:n jäännökseen lisätään vesijohtovettä, kunnes tilavuus on 45 ml. Seoksen annetaan seistä vielä 10 minuuttia, minkä jälkeen poistetaan sakan yläpuolista nestettä 30 ml imemällä, ja loput 15 ml kaadetaan petrimaljaan tai toukkien laskukammioon tutkimusta varten. Mittalasi huuhdellaan 10 ml:lla vesijohtovettä, ja huuhde lisätään petrimaljassa tai laskukammiossa olevaan näytteeseen tutkimusta varten.

3. Jos yhdistetystä näytteestä saatu tulos on positiivinen tai epävarma, jokaisesta siasta on otettava 20 g:n lisänäyte b alakohdan mukaisesti. Viiden sian 20 g:n näytteet on yhdistettävä ja tutkittava edellä esitetyn menetelmän mukaisesti. Tällä tavoin tutkitaan 20 viiden sian ryhmän näytteet. Jos trikiinejä todetaan viiden sian ryhmän yhdistetyssä näytteessä, jokaisesta kyseisen ryhmän siasta on otettava erillinen 20 g:n näyte, ja kukin niistä on tutkittava erikseen edellä esitettyä menetelmää käyttäen.

V MEKAANISESTI AVUSTETTU YHDISTETYN NÄYTTEEN DIGESTIOMENETELMÄ/SUODATINERISTYSMENETTELY

a) Laitteisto ja reagenssit

Samat kuin IV kohdan a alakohdassa; lisäksi tarvitaan:

- 1 litran Gelman-suppilo suodatinpidikkeineen (pidikkeen halkaisija 45 mm),

- suodatinlevyjä, jotka koostuvat seuraavista:

pyöreä, ruostumattomasta teräksestä valmistettu verkko, jonka silmäkoko on 35 mikronia (levyn halkaisija: 45 mm),

kaksi 1 mm:n paksuisesta kumista valmistettua rengasta (ulkohalkaisija: 45 mm, sisähalkaisija: 38 mm),

pyöreä verkko pannaan kahden kumirenkaan väliin ja kiinnitetään niihin näille kahdelle materiaalille sopivalla kaksikomponenttiliimalla,

- 3 l:n erlenmeyerpullo, jossa on sivuputki imemistä varten,

- suodatinpumppu,

- muovipusseja, joiden tilavuus on vähintään 80 ml,

- muovipussien saumausvälineet,

- "rennilaasi"-entsyymiä, vahvuus 1:150 000 Soxhlet-yksikköä grammaa kohti.

b) Näytteenotto

Katso IV kohdan b alakohdan menetelmä.

c) Menetelmä

1. Sulatus

i) Täydet erät (100 näytettä kerrallaan)

Katso IV kohdan c alakohdan 1 alakohdan i alakohdan menetelmä.

ii) Pienemmät kuin 100 näytteen erät

Katso IV kohdan c alakohdan 1 alakohdan ii alakohdan menetelmä.

2. Toukkien eristäminen suodatuksen avulla

- Ruuansulatusnesteeseen lisätään 300-400 g jäälastuja tai -murskaa), kunnes kokonaistilavuus on noin 2 litraa. Pienempiä eriä varten jään määrää on vähennettävä vastaavasti.

- Ruuansulatusnestettä sekoitetaan kunnes jää on sulanut. Jäähtyneen ruuansulatusnesteen annetaan seistä vähintään kolme minuuttia, jotta toukat ehtivät kiertyä.

- Suodatinpidikkeellä ja suodatinlevyllä varustettu Gelman-suppilo asennetaan suodatinpumppuun yhdistettyyn erlenmeyerpulloon.

- Ruuansulatusneste kaadetaan Gelman-suppiloon ja suodatetaan. Suodatuksen loppua kohti sulatusnesteen valumista suodattimen läpi voidaan avustaa suodatinpumpun imulla. Imu lopetetaan ennen suodattimen kuivumista, ts. kun suppilossa on jäljellä 2-5 ml nestettä.

- Kun kaikki ruuansulatusneste on suodatettu, suodatinlevy irrotetaan ja pannaan 80 ml:n muovipussiin, johon lisätään 15-20 ml rennilaasiliuosta. Liuos valmistetaan lisäämällä 2 g rennilaasia 100 ml:aan vesijohtovettä.

- Muovipussi saumataan kahdesti ja pannaan Stomacheriin sisä- ja ulkopussin väliin.

- Stomacherin annetaan käydä kolme minuuttia esim. käsiteltäessä täyttä tai vajaata erää.

- Kolmen minuutin kuluttua muovipussi suodattimineen ja rennilaasiliuoksineen poistetaan Stomacherista ja avataan saksilla. Nestesisältö kaadetaan toukkien laskukammioon tai petrimaljaan. Pussi huuhdellaan 5-10 ml:lla vettä, ja huuhde lisätään sitten toukkien laskukammioon trikinoskooppitutkimusta varten tai petrimaljaan stereomikroskooppitutkimusta varten.

- Näytteet on tutkittava heti niiden valmistuttua. Tutkimusta ei missään tapauksessa saa jättää seuraavaan päivään.

Huomautus

Ainoastaan täysin puhtaita suodatinlevyjä saa käyttää. Likaisten levyjen ei saa antaa kuivua.

Suodatinlevyt voidaan puhdistaa jättämällä ne rennilaasiliuokseen yöksi. Ennen käyttöä ne on pestävä puhtaalla rennilaasiliuoksella Stomacherin avulla.

3. Jos yhdistetystä näytteestä saatu tulos on positiivinen tai epävarma, jokaisesta siasta on otettava 20 g:n lisänäyte b alakohdan mukaisesti. Viiden sian 20 g:n näytteet on yhdistettävä ja tutkittava edellä esitetyn menetelmän mukaisesti. Tällä tavoin tutkitaan 20 viiden sian ryhmän näytteet. Jos trikiinejä todetaan viiden sian ryhmän yhdistetyssä näytteessä, jokaisesta kyseisen ryhmän siasta on otettava erillinen 20 g:n näyte, ja kukin niistä on tutkittava erikseen edellä esitettyä menetelmää käyttäen.

VI MAGNEETTISEKOITINMENETELMÄ YHDISTETTYJEN NÄYTTEIDEN DIGESTIOTA VARTEN

a) Laitteisto ja reagenssit

- veitsi ja atulat näytteiden leikkaamista varten,

- tarjottimia, joihin on merkitty 50 ruutua, joihin kuhunkin mahtuu noin 2 g:n lihanäyte,

- vihannesmylly ("moulinette"),

- magneettisekoitin, jossa on termostaattiohjattu lämpölevy ja teflonpäällysteinen, noin 5 cm:n pituinen magneettisauva,

- 2 l:n kartiomaisia erotussuppiloita,

- renkailla ja kiinnittimillä varustettuja statiiveja,

- siivilöitä, silmäkoko 177 mikronia, ulkohalkaisija 11 cm, verkko ruostumatonta terästä,

- suppiloita, joiden sisähalkaisija on vähintään 12 cm ja joihin siivilät sopivat,

- 3 litran lasimalja,

- noin 50 ml:n mittalaseja tai sentrifugiputkia,

- vaakatasopöydällä varustettu trikinoskooppi tai stereomikroskooppi, jossa sopiva valolähde,

- toukkien laskukammio (trikinoskooppia käytettäessä). Toukkien laskukammio valmistetaan 3 mm paksuista akryylilevyistä seuraavasti:

i) kammion pohjan mitat ovat 180 × 40 mm, ja se on ruudutettu,

ii) sivulevyjen koko on 230 × 20 mm,

iii) päätylevyjen koko on 40 × 20 mm.

Pohja ja päädyt on sijoitettava sivujen väliin, jolloin molempiin päihin jää pieni kädensija. Pohjalevyn yläpinnan on oltava 7-9 mm sivujen ja päätyjen muodostaman kehyksen alareunan yläpuolella.

Osat on kiinnitettävä materiaalille sopivalla liimalla,

- petrimaljoja, joiden halkaisija on 9 cm, ja joiden pohjaan on merkitty 10 × 10 mm:n tarkastusruudutus terävällä esineellä (stereomikroskooppia käytettäessä),

- alumiinifoliota,

- 25-prosenttista suolahappoa,

- pepsiiniä, jonka vahvuus on: 1:10 000 NF (US National Formulary),

joka vastaa 1:12 500 BP (British Pharmacopoea),

joka vastaa 2 000 FIP (Fédération internationale de pharmacie),

- vesijohtovettä, joka on lämmitetty 46-48 °C:n lämpötilaan,

- useita 10 litran jäteastioita, joita käytetään positiivisten erien saastuttaman laitteiston käsittelemiseksi esimerkiksi formaliinilla ja saastuneen ruuansulatusnesteen keräämiseen,

- vaaka, jonka tarkkuus on 0,1 g.

b) Näytteenotto

1. Kokonaisista ruhoista otetaan noin 2 g:n näyte palleapilareista lihas- ja jänneosan yhtymäkohdasta: palleapilareiden puuttuessa otetaan samankokoinen näyte kyljen tai rintalastan puoleisesta pallean osasta taikka purema- tai vatsalihaksista.

2. Lihapaloista otetaan noin 2 g:n vähärasvainen luurankolihasnäyte mahdollisuuksien mukaan läheltä luita tai jänteitä.

c) Menetelmä

1. i) Täydet erät (100 näytettä kerrallaan)

- Hienonnetaan 100 jokaisesta b alakohdan mukaisesti otetusta yksittäisestä näytteestä otettua noin 1 g:n painoista näytettä vihannesmyllyssä. Laitetta käytetään 3-4 kertaa noin sekunnin ajan kerrallaan.

- Hienonnettu liha pannaan 3 litran lasimaljaan ja sen päälle sirotellaan 10 g pepsiiniä. Lasimaljaan kaadetaan 2 litraa vesijohtovettä, joka on lämmitetty 46-48 °C:n lämpötilaan, sekä 16 ml suolahappoa.

- Vihannesmyllyn teräkappale upotetaan useita kertoja ruuansulatusnesteeseen, jotta siihen mahdollisesti tarttunut liha irtoaa.

- Magneettisauva pannaan lasimaljaan, joka peitetään alumiinifoliolla.

- Lasimalja pannaan magneettisekoittimen esilämmitetylle lämpölevylle, ja sekoitin käynnistetään. Ennen sekoittimen käynnistämistä magneettisekoitin olisi säädettävä siten, että se ylläpitää tasaisen 44-47 °C:n lämpötilan koko sekoituksen ajan. Sekoituksen aikana ruuansulatusnesteen olisi pyörittävä sellaisella nopeudella, että seoksen keskelle syntyy syvä pyörre nesteen kuitenkaan roiskumatta.

- Ruuansulatusnestettä sekoitetaan 30 minuuttia, minkä jälkeen sekoitin sammutetaan ja ruuansulatusneste kaadetaan suodattimen läpi laskeutussuppiloon.

- Ruuansulatusnesteen annetaan seistä suppilossa 30 minuuttia.

- Lasketaan 30 minuutin kuluttua 40 ml:n ruuansulatusnestenäyte nopeasti mittalasiin tai sentrifugiputkeen.

- Annetaan 40 ml:n näytteen seistä 10 minuuttia, minkä jälkeen poistetaan sakan yläpuolista nestettä 30 ml imemällä, jolloin jäljelle jää 10 ml.

- Jäljellä oleva 10 ml:n sakkanäyte kaadetaan toukkien laskukammioon tai petrimaljaan.

- Mittalasi tai sentrifugiputki huuhdellaan sitten noin 10 ml:lla vesijohtovettä, joka lisätään toukkien laskukammiossa tai petrimaljassa olevaan näytteeseen. Tämän jälkeen näyte tutkitaan trikinoskoopilla tai stereomikroskoopilla.

- Näytteet on tutkittava heti niiden valmistuttua. Tutkimusta ei missään tapauksessa saa jättää seuraavaan päivään.

Jos näytteitä ei tutkita 30 minuutin kuluessa niiden valmistumisesta, ne on kirkastettava seuraavasti: Lopullinen 40 ml:n näyte kaadetaan mittalasiin ja sen annetaan seistä 10 minuuttia. Tämän jälkeen sakan yläpuolista nestettä poistetaan 30 ml, jolloin jäljelle jää 10 ml. Tähän lisätään vesijohtovettä, kunnes tilavuus on 40 ml. Seoksen annetaan seistä vielä 10 minuuttia, minkä jälkeen sakan yläpuolista nestettä poistetaan 30 ml imemällä, jolloin jäljelle jää 10 ml petrimaljassa tai toukkien laskukammiossa tapahtuvaa tutkimusta varten. Mittalasi huuhdellaan 10 ml:lla vesijohtovettä, ja huuhde lisätään petrimaljassa tai laskukammiossa olevaan näytteeseen tutkimusta varten.

Jos näyte todetaan tutkimuksen yhteydessä sameaksi, näyte kaadetaan mittalasiin ja lisätään vesijohtovettä, kunnes tilavuus on 40 ml. Tämän jälkeen toistetaan edellä esitetty menettely.

ii) Pienemmät kuin 100 näytteen erät

Täyteen 100 näytteen kokonaiserään voidaan tarvittaessa lisätä enintään 15 kpl 1 g:n näytteitä, jotka voidaan tutkia yhdessä näiden näytteiden kanssa c alakohdan 1 alakohdan i alakohdan mukaisesti. Yli 15 näytteen erä on tutkittava omana eränään. Jos erässä on enintään 50 näytettä, ruuansulatusnesteen määrä voidaan vähentää 1 litraan.

2. Jos yhdistetystä näytteestä saatu tulos on positiivinen tai epävarma, jokaisesta siasta on otettava 20 g:n lisänäyte b alakohdan mukaisesti. Viiden sian 20 g:n näytteet on yhdistettävä ja tutkittava edellä esitetyn menetelmän mukaisesti. Tällä tavoin tutkitaan 20 viiden sian ryhmän näytteet. Jos trikiinejä todetaan viiden sian ryhmän yhdistetyssä näytteessä, jokaisesta kyseisen ryhmän siasta on otettava erillinen 20 g:n näyte, ja kukin niistä on tutkittava erikseen edellä esitettyä menetelmää käyttäen."B. Muutetaan liitteessä II olevan I luvun 1 kohta seuraavasti:

1. Korvataan b alakohdan teksti seuraavasti:

"b) riittävästi varustettu lukittava tutkimushuone, jonka on oltava pimennettävä, jos tutkimus tehdään trikinoskoopilla,"

2. Poistetaan f alakohta; g, h, i, j, k, l, m ja n alakohdasta tulee vastaavasti f, g, h, i, j, k, l ja m alakohta.

3. Korvataan uusi g kohta seuraavasti:

"g) tutkimusvälineiden (esim. näyteastiat, puristuslasit, veitset ja sakset) puhdistusta ja desinfiointia varten pesuhuone, jossa on:

- vedenpitävä lattiapinnoite, joka on lahoamaton sekä helppo puhdistaa ja desinfioida,

- sileät seinät, joilla on vähintään kahden metrin korkeuteen pestävä, vaalea pinnoite tai maali.

Tätä määräystä ei tarvitse soveltaa, kun käytetään liitteessä I olevassa II, III, IV, V tai VI kohdassa esitettyä menetelmää ja kun laboratoriot on varustettu suurella, sopivasti viemäröidyllä pesualtaalla."