This document is an excerpt from the EUR-Lex website
Document 01991R2568-20191020
Commission Regulation (EEC) No 2568/91 of 11 July 1991 on the characteristics of olive oil and olive-residue oil and on the relevant methods of analysis
Consolidated text: Komission asetus (ETY) N:o 2568/91, annettu 11 päivänä heinäkuuta 1991, oliiviöljyn ja uutetun oliiviöljyn ominaisuuksista sekä niiden määritysmenetelmistä
Komission asetus (ETY) N:o 2568/91, annettu 11 päivänä heinäkuuta 1991, oliiviöljyn ja uutetun oliiviöljyn ominaisuuksista sekä niiden määritysmenetelmistä
No longer in force
- Date of document:
- 20/10/2019
- Date of effect:
- 20/10/2019
- Author:
- Not available
- Form:
- Konsolidoitu teksti
- Link
- Link
- Link
- Select all documents mentioning this document
- Consolidation: basic act:
- 31991R2568
01991R2568 — FI — 20.10.2019 — 032.001
Tämä asiakirja on ainoastaan dokumentoinnin apuväline eikä sillä ole oikeudellista vaikutusta. Unionin toimielimet eivät vastaa sen sisällöstä. Säädösten todistusvoimaiset versiot on johdanto-osineen julkaistu Euroopan unionin virallisessa lehdessä ja ne ovat saatavana EUR-Lexissä. Näihin virallisiin teksteihin pääsee suoraan tästä asiakirjasta siihen upotettujen linkkien kautta.
|
KOMISSION ASETUS (ETY) N:o 2568/91, annettu 11 päivänä heinäkuuta 1991, oliiviöljyn ja uutetun oliiviöljyn ominaisuuksista sekä niiden määritysmenetelmistä (EUVL L 248 5.9.1991, s. 1) |
Muutettu:
Oikaistu:
|
(*) |
Tätä asiakirjaa ei ole julkaistu suomenkielisenä. |
KOMISSION ASETUS (ETY) N:o 2568/91,
annettu 11 päivänä heinäkuuta 1991,
oliiviöljyn ja uutetun oliiviöljyn ominaisuuksista sekä niiden määritysmenetelmistä
1 artikla
1. Öljyjä, joiden ominaisuudet ovat tämän asetuksen liitteessä I olevassa 1 ja 2 kohdassa määritettyjen ominaisuuksien mukaiset, pidetään asetuksen N:o 136/66/ETY liitteessä olevan 1 kohdan a ja b alakohdassa tarkoitettuina neitsytoliiviöljyinä.
2. Öljyä, jonka ominaisuudet ovat tämän asetuksen liitteessä I olevassa 3 kohdassa määritettyjen ominaisuuksien mukaiset, pidetään asetuksen N:o 136/66/ETY liitteessä olevassa 1 c kohdassa tarkoitettuna oliivilamppuöljynä.
3. Öljyä, jonka ominaisuudet ovat tämän asetuksen liitteessä I olevassa 4 kohdassa määritettyjen ominaisuuksien mukaiset, pidetään asetuksen N:o 136/66/ETY liitteessä olevassa 2 kohdassa tarkoitettuna jalostettuna oliiviöljynä.
4. Öljyä, jonka ominaisuudet ovat tämän asetuksen liitteessä I olevassa 5 kohdassa määritettyjen ominaisuuksien mukaiset, pidetään asetuksen N:o 136/66/ETY liitteessä olevassa 3 kohdassa tarkoitettuna jalostetusta oliiviöljystä ja neitsytoliiviöljystä valmistettuna oliiviöljynä.
5. Öljyä, jonka ominaisuudet ovat tämän asetuksen liitteessä I olevassa 6 kohdassa määritettyjen ominaisuuksien mukaiset, pidetään asetuksen N:o 136/66/ETY liitteessä olevassa 4 kohdassa tarkoitettuna raakana oliivin puristemassaöljynä.
6. Öljyä, jonka ominaisuudet ovat tämän asetuksen liitteessä I olevassa 7 kohdassa määritettyjen ominaisuuksien mukaiset, pidetään asetuksen N:o 136/66/ETY liitteessä olevassa 5 kohdassa tarkoitettuna jalostettuna oliivin puristemassaöljynä.
7. Öljyä, jonka ominaisuudet ovat tämän asetuksen liitteessä I olevassa 8 kohdassa määritettyjen ominaisuuksien mukaiset, pidetään asetuksen N:o 136/66/ETY liitteessä olevassa 6 kohdassa tarkoitettuna oliivin puristemassaöljynä.
2 artikla
1. Liitteessä I säädettyjen öljyjen ominaisuudet määritetään seuraavilla määritysmenetelmillä:
a) oleiinihappoprosentteina ilmaistavat vapaat rasvahapot määritetään liitteessä II esitetyllä menetelmällä;
b) peroksidiluku määritetään liitteessä III esitetyllä menetelmällä;
c) vahapitoisuus määritetään liitteessä IV esitetyllä menetelmällä;
d) sterolien ja triterpeenidialkoholien koostumus ja pitoisuus määritetään kapillaarikaasukromatografialla liitteessä V esitetyllä menetelmällä;
e) 2-glyseryylimonopalmitaatin prosenttiosuus määritetään liitteessä VII esitetyllä menetelmällä;
f) spektrofotometrinen määritys tehdään liitteessä IX esitetyllä menetelmällä;
g) rasvahappokoostumus määritetään liitteessä X esitetyllä menetelmällä;
h) haihtuvat halogeeniliuottimet määritetään liitteessä XI esitetyllä menetelmällä;
i) neitsytoliiviöljyn aistinvaraiset ominaisuudet arvioidaan liitteessä XII esitetyllä menetelmällä;
j) stigmastadieenit määritetään liitteessä XVII esitetyllä menetelmällä;
k) C42:ta sisältävien triglyseridien koostumus määritetään liitteessä XVIII esitetyllä menetelmällä;
l) sterolien rakenne ja pitoisuus sekä alkoholiyhdisteet määritetään kapillaarikaasukromatografisella menetelmällä, joka kuvataan liitteessä XIX;
m) vahojen, rasvahappojen metyyliestereiden ja rasvahappojen etyyliestereiden pitoisuudet määritetään liitteessä XX esitetyllä menetelmällä.
▼M28 —————
2. Kansallisilta viranomaisilta tai näiden edustajilta edellytettävistä neitsytoliiviöljyjen aistinvaraisten ominaisuuksien tarkistuksesta vastaavat jäsenvaltioiden hyväksymät maistajaraadit.
Ensimmäisessä kohdassa tarkoitetun oliiviöljyn aistinvaraisten ominaisuuksien katsotaan olevan yhdenmukaisia ilmoitetun oliiviöljyluokan kanssa, jos asianomaisen jäsenvaltion hyväksymä raati vahvistaa kyseisen luokituksen.
Jos raati ei vahvista ilmoitusta ilmoitetun oliiviöljyluokan aistinvaraisten ominaisuuksien osalta, kansalliset viranomaiset tai niiden edustajat teettävät asianomaisen pyynnöstä viipymättä muilla hyväksytyillä raadeilla kaksi seurantamääritystä. Ainakin toisen raadin on oltava asianomaisen tuottajajäsenvaltion hyväksymä raati. Kyseisten ominaisuuksien katsotaan olevan yhdenmukaisia ilmoitettujen ominaisuuksien kanssa, jos ilmoitettu luokitus vahvistetaan molemmissa seurantamäärityksissä. Päinvastaisessa tapauksessa, riippumatta siitä, minkätyyppisiä virheitä seurantamäärityksissä todetaan, luokitus on ilmoitettava ominaisuuksia vastaamattomaksi ja seurantamääritysten kustannuksista vastaa asianomainen.
3. Kun on kyse kansallisten viranomaisten tai niiden edustajien tekemästä 1 kohdan mukaisesta öljyn ominaisuuksien toteamisesta, näytteenotto tehdään koenäytteen valmistelua ja näytteenottoa koskevia kansainvälisiä standardeja EN ISO 661 ja EN ISO 5555 noudattaen. Poiketen siitä, mitä standardissa EN ISO 5555 olevassa 6.8 kohdassa määrätään, silloin kun kyseessä ovat tällaiset pakkaukseen suorassa kosketuksessa olevat öljyt, näytteenotto tehdään kuitenkin tämän asetuksen liitteen I a mukaisesti. Kun kyseessä on pakkaamaton öljy, josta ei voida ottaa näytettä standardin EN ISO 5555 mukaisesti, näytteenotto tehdään jäsenvaltion toimivaltaisen viranomaisten ohjeiden mukaisesti.
Rajoittamatta standardin EN ISO 5555 ja standardissa EN ISO 661 olevan 6 luvun määräysten soveltamista näytteet on sijoitettava viipymättä valolta ja lämmöltä suojattuun paikkaan ja lähetettävä laboratorioon määritettäviksi viimeistään näytteenottoa seuraavana viidentenä työpäivänä; muussa tapauksessa näytteet on säilytettävä niin, että ne eivät heikenny tai vahingoitu kuljetuksen tai varastoinnin aikana ennen laboratorioon lähettämistä.
4. Edellä 3 kohdassa tarkoitettua todentamista varten liitteissä II, III, IX, XII ja XX tarkoitetut määritykset ja tapauksen mukaan kansallisessa lainsäädännössä säädetyt vastamääritykset on tehtävä ennen vähimmäissäilymisajan päättymistä, kun kyseessä ovat pakatut tuotteet. Kun kyseessä ovat pakkaamattomat öljyt, määritykset on tehtävä kuuden kuukauden kuluessa näytteenottokuukaudesta.
Muihin tässä asetuksessa säädettyihin määrityksiin ei sovelleta määräaikoja.
Jos määritysten tulokset eivät vastaa oliiviöljyn tai oliivin puristemassaöljyn ilmoitetun luokan ominaisuuksia, asianomaisen on ilmoitettava asiasta kuukauden kuluessa ensimmäisessä alakohdassa tarkoitetun määräajan päättymisestä, paitsi jos näyte on otettu vähimmäissäilymisajan päättymistä edeltävien kahden kuukauden kuluessa.
5. Määritystuloksia verrataan suoraan tässä asetuksessa säädettyihin rajoihin oliiviöljyjen ominaisuuksien määrittelemiseksi 1 kohdan ensimmäisessä alakohdassa säädettyjä menetelmiä noudattaen.
2 a artikla
1. Tämän artiklan soveltamiseksi ’kaupan pidetyllä oliiviöljyllä’ tarkoitetaan jäsenvaltion oliiviöljyn ja oliivin puristemassaöljyn kokonaismäärää, joka kulutetaan kyseisessä jäsenvaltiossa tai viedään sieltä.
2. Jäsenvaltioiden on sen varmistamiseksi, että kaupan pidetty oliiviöljy on ilmoitetun luokan mukaista, huolehdittava, että vaatimustenmukaisuustarkastukset tehdään valikoivasti riskianalyysin perusteella ja asianmukaisin aikavälein.
3. Riskien arviointiperusteisiin voi kuulua myös
a) öljyn luokka, tuotantokausi, öljyjen hinta suhteessa muihin kasviöljyihin, sekoitus- ja kauppakunnostustoimet, varastointitilat ja -olosuhteet, alkuperämaa, määränpäämaa, kuljetustapa tai erän suuruus;
b) toimijoiden asema kaupan pitämisen ketjussa, toimijoiden kaupan pitämä määrä ja/tai arvo, toimijoiden kaupan pitämät öljyluokat, kaupallisen toiminnan tyyppi, kuten puristus, varastointi, jalostus, sekoittaminen, pakkaaminen tai vähittäismyynti;
c) aiemmissa tarkastuksissa tehdyt havainnot mukaan lukien puutteiden lukumäärä ja tyyppi, kaupan pidettyjen öljyjen tavanomainen laatu tai käytettävien teknisten laitteiden suorituskyky;
d) toimijoiden laadunvarmistusjärjestelmien tai omavalvonnan luotettavuus kaupan pitämisen vaatimusten mukaisuuden osalta;
e) tarkastuksentehopaikka, erityisesti jos se on unioniin saapumispaikka, unionista lähtöpaikka tai paikka, jossa öljyt tuotetaan, kauppakunnostetaan, lastataan tai myydään loppukuluttajalle;
f) muut tiedot, jotka voivat osoittaa vaatimustenvastaisuusriskin.
4. Jäsenvaltioiden on vahvistettava etukäteen
a) erien vaatimustenvastaisuusriskin arviointiperusteet;
b) kunkin riskiluokan riskianalyysin perusteella toimijoiden tai erien ja/tai määrien vähimmäismäärät, joille on tehtävä vaatimustenmukaisuustarkastus.
Tuhatta jäsenvaltiossa kaupan pidettyä oliiviöljytonnia kohden on tehtävä vuosittain vähintään yksi vaatimustenmukaisuustarkastus.
5. Jäsenvaltioiden on varmistettava vaatimustenmukaisuus
a) tekemällä liitteessä I säädetyt määritykset missä tahansa järjestyksessä; tai
b) seuraamalla vuokaaviota koskevassa liitteessä I b säädettyä järjestystä, kunnes päästään johonkin kyseisessä kaaviossa mainittuun päätökseen.
▼M19 —————
3 artikla
Jos havaitaan, ettei öljy vastaa luokan kuvausta, asianomaisen jäsenvaltion on sovellettava tehokkaita, oikeasuhteisia ja varoittavia seuraamuksia, jotka vahvistetaan havaitun poikkeaman vakavuuden mukaisesti, sanotun kuitenkaan rajoittamatta muiden mahdollisten seuraamusten soveltamista.
Jos tarkastuksissa havaitaan merkittäviä poikkeamia, jäsenvaltion on lisättävä kaupanpitämisen vaiheen, öljyluokan, alkuperän tai muiden seikkojen tarkastuksia.
4 artikla
1. Jäsenvaltiot voivat hyväksyä maistajaraateja, jotta kansalliset viranomaiset tai niiden edustajat voivat arvioida ja valvoa aistinvaraisia ominaisuuksia.
Jäsenvaltioiden on vahvistettava hyväksymistä koskevat edellytykset etenkin siten, että:
— liitteessä XII olevan 4 kohdan edellytykset täyttyvät,
— raadin puheenjohtajan koulutuksesta vastaa laitos jäsenvaltion tässä tarkoituksessa hyväksymin edellytyksin,
— hyväksynnän pätevyys ratkaistaan jäsenvaltion käyttöönottamassa vuotuisessa valvontajärjestelmässä saatujen tulosten perusteella.
Kunkin jäsenvaltion on toimitettava komissiolle luettelo hyväksytyistä raadeista ja tämän kohdan mukaisesti toteutetuista toimenpiteistä.
2. Jos jäsenvaltiolla on vaikeuksia maistajien raadin perustamisessa omalle alueelleen, se voi käyttää toisen jäsenvaltion hyväksyttyä maistajien raatia.
3. Kunkin jäsenvaltion on laadittava luettelo ammattijärjestöjen tai ammattien välisten järjestöjen 1 kohdan edellytysten mukaisesti perustamista maistajien raadeista ja niiden on valvottava näiden edellytysten noudattamista.
▼M19 —————
6 artikla
1. Oliiviöljyn erottamisesta syntyneen öljykakun ja muiden yhdistetyn nimikkeistön CN-koodeihin 2306 90 11 ja 2306 90 19 kuuluvien jätteiden öljypitoisuus määritetään liitteen XV menetelmän mukaisesti.
2. Edellä 1 kohdassa tarkoitettu öljypitoisuus ilmaistaan öljyn painoprosenttina kuiva-aineesta.
7 artikla
Haitallisten aineiden osalta sovelletaan niiden esiintymistä koskevia yhteisön säännöksiä.
Halogeeniliuottimien pitoisuuden osalta raja-arvot ovat kaikkien oliiviöljyluokkien osalta seuraavat:
— Kunkin havaitun halogeeniliuottimen enimmäispitoisuus 0,1 mg/kg
— Havaittujen halogeeniliuottimien summan enimmäispitoisuus 0,2 mg/kg
7 a artikla
Luonnollisten henkilöiden, oikeushenkilöiden tai henkilöryhmittymien, joilla on hallussaan oliiviöljyä tai oliivin puristemassaöljyä jossakin vaiheessa puristamosta pullotusvaiheeseen mihin tahansa ammatillisiin tai kaupallisiin tarkoituksiin, on pidettävä jokaisen öljyluokan osalta kirjaa varastoonvienneistä ja varastostapoistoista.
Jäsenvaltion on varmistettava, että ensimmäisessä kohdassa säädettyä velvollisuutta noudatetaan asianmukaisesti.
8 artikla
1. Jäsenvaltioiden on annettava tämän asetuksen täytäntöönpanotoimenpiteet komissiolle tiedoksi. Niiden on ilmoitettava komissiolle kaikista myöhemmistä muutoksista.
2. Jäsenvaltioiden on vuosittain viimeistään 31 päivänä toukokuuta annettava komissiolle kertomus tämän asetuksen täytäntöönpanosta edellisenä kalenterivuonna. Kertomuksessa on oltava vähintään oliiviöljyille tehtyjen vaatimustenmukaisuustarkastusten tulokset, jotka on ilmoitettava liitteessä XXI esitetyn mallin mukaisesti.
3. Tässä asetuksessa tarkoitetut ilmoitukset on tehtävä komission asetuksen (EY) N:o 792/2009 ( 1 ) mukaisesti.
9 artikla
Kumotaan asetus (ETY) N:o 1058/77.
10 artikla
1. Tämä asetus tulee voimaan seuraavana päivänä sen jälkeen, kun se on julkaistu Euroopan yhteisöjen virallisessa lehdessä. Liitteen XII menetelmä on kuitenkin otettava käyttöön ►M1 1 päivästä marraskuuta 1992 ◄ , interventioon liittyviä toimia lukuun ottamatta.
Tämä menetelmä ei koske ennen 1 päivää marraskuuta 1992 pakattuja neitsytoliiviöljyjä.
2. Tämä asetus ei koske ennen tämän asetuksen voimaantuloa pakattua ja 31 päivään lokakuuta 1992 asti kaupan pidettyä oliiviöljyä tai uutettua oliiviöljyä.
Tämä asetus on kaikilta osiltaan velvoittava, ja sitä sovelletaan sellaisenaan kaikissa jäsenvaltioissa.
LIITTEET
YHTEENVETO
|
Liite I |
Oliiviöljyjen ominaisuudet |
|
Liite I a |
Näytteenotto oliiviöljyistä tai oliivin puristemassaöljyistä, jotka toimitetaan tuotteeseen suorassa kosketuksessa olevissa pakkauksissa |
|
Liite I b |
Vuokaavio sen todentamiseksi, onko oliiviöljynäyte ilmoitetun luokan mukainen |
|
Liite II |
Vapaiden rasvahappojen määrittäminen kylmämenetelmällä |
|
Liite III |
Peroksidiluvun määrittäminen |
|
Liite IV |
Vahapitoisuuden määrittäminen kapillaarikaasukromatografisella menetelmällä |
|
Liite VII |
2-glyseryylimonopalmitaatin prosenttiosuuden määrittäminen |
|
Liite IX |
Spektrofotometrinen määritys ultraviolettivalossa |
|
Liite X |
Rasvahappojen metyyliesterien määrittäminen kaasukromatografisella menetelmällä |
|
Liite XI |
Haihtuvien halogeeniliuottimien pitoisuuden määrittäminen oliiviöljystä |
|
Liite XII |
Kansainvälisen oliivineuvoston menetelmä neitsytoliiviöljyn aistinvaraista arviointia varten |
|
Liite XV |
Oliivijätteen öljypitoisuus |
|
Liite XVI |
Jodiluvun määrittäminen |
|
Liite XVII |
Menetelmä stigmastadieenien määrittämiseksi kasviöljyistä |
|
Liite XVIII |
ECN42-Triasyyliglyserolien teoreettisen koostumuksen ja todellisen koostumuksen välisen eron määritys |
|
Liite XIX |
Sterolien rakenteen ja pitoisuuden sekä alkoholiyhdisteiden määrittäminen kapillaarikaasukromatografisella menetelmällä |
|
Liite XX |
Vahojen, rasvahappojen metyyliestereiden ja rasvahappojen etyyliestereiden pitoisuuksien määrittäminen kapillaarikaasukromatografisella menetelmällä |
|
Liite XXI |
8 artiklan 2 kohdassa tarkoitetut oliiviöljyille tehtyjen vaatimustenmukaisuustarkastusten tulokset |
LIITE I
OLIIVIÖLJYJEN OMINAISUUDET
Laatuominaisuudet
|
Ryhmä |
Happamuus (%) (*) |
Peroksidiluku (mEq O2/kg) |
K232 |
K268 tai K270 |
Delta-K |
Aistinvarainen arvio |
Rasva-happojen etyyliesterit (mg/kg) |
|
|
Virheen mediaani (Md) (*) |
Hedelmäi-syyden mediaani (Mf) |
|||||||
|
1. Ekstra-neitsytoliiviöljy |
≤ 0,80 |
≤ 20,0 |
≤ 2,50 |
≤ 0,22 |
≤ 0,01 |
Md = 0,0 |
Mf > 0,0 |
≤ 35 |
|
2. Neitsytoliiviöljy |
≤ 2,0 |
≤ 20,0 |
≤ 2,60 |
≤ 0,25 |
≤ 0,01 |
Md ≤ 3,5 |
Mf > 0,0 |
— |
|
3. Lamppuoliiviöljy |
> 2,0 |
— |
— |
— |
— |
Md > 3,5 (1) |
— |
— |
|
4. Jalostettu oliiviöljy |
≤ 0,30 |
≤ 5,0 |
— |
≤ 1,25 |
≤ 0,16 |
|
— |
— |
|
5. Jalostetusta oliiviöljystä ja neitsytoliiviöljystä valmistettu oliiviöljy |
≤ 1,00 |
≤ 15,0 |
— |
≤ 1,15 |
≤ 0,15 |
|
— |
— |
|
6. Raaka oliivin puristemassaöljy |
— |
— |
— |
— |
— |
|
— |
— |
|
7. Jalostettu oliivin puristemassaöljy |
≤ 0,30 |
≤ 5,0 |
— |
≤ 2,00 |
≤ 0,20 |
|
— |
— |
|
8. Oliivin puristemassaöljy |
≤ 1,00 |
≤ 15,0 |
— |
≤ 1,70 |
≤ 0,18 |
|
— |
— |
|
(1) Virheen mediaani voi olla enintään 3,5, kun hedelmäisyyden mediaani on 0,0. |
||||||||
Puhtausominaisuudet
|
Ryhmä |
Rasvahappokoostumus (1) |
Transoleiini-isomeerien summa (%) |
Translinoli-isomeerien ja translinoleeni-isomeerien summa (%) |
Stigmastadieenit (mg/kg) (2) |
HPLC:llä määritetyn ja teoreettisesti lasketun ECN42:n välinen ero |
2-glyseryylimonopalmitaatti (%) |
|||||
|
Myristiini-happo (%) |
Linoleeni-happo (%) |
Arakidoni-happo (%) |
Eikoseeni-happo (%) |
Beheeni-happo (%) |
nihappo (%) |
||||||
|
1. Ekstra-neitsytoliiviöljy |
≤ 0,03 |
≤ 1,00 |
≤ 0,60 |
≤ 0,50 |
≤ 0,20 |
≤ 0,20 |
≤ 0,05 |
≤ 0,05 |
≤ 0,05 |
≤ |0,20| |
≤ 0,9 jos palmitiinihapon kokonaisprosenttiosuus ≤ 14,00 % |
|
≤ 1,0 jos palmitiinihapon kokonaisprosenttiosuus > 14,00 % |
|||||||||||
|
2. Neitsytoliiviöljy |
≤ 0,03 |
≤ 1,00 |
≤ 0,60 |
≤ 0,50 |
≤ 0,20 |
≤ 0,20 |
≤ 0,05 |
≤ 0,05 |
≤ 0,05 |
≤ |0,20| |
≤ 0,9 jos palmitiinihapon kokonaisprosenttiosuus ≤ 14,00 % |
|
≤ 1,0 jos palmitiinihapon kokonaisprosenttiosuus > 14,00 % |
|||||||||||
|
3. Lamppuoliiviöljy |
≤ 0,03 |
≤ 1,00 |
≤ 0,60 |
≤ 0,50 |
≤ 0,20 |
≤ 0,20 |
≤ 0,10 |
≤ 0,10 |
≤ 0,50 |
≤ |0,30| |
≤ 0,9 jos palmitiinihapon kokonaisprosenttiosuus ≤ 14,00 % |
|
≤ 1,1 jos palmitiinihapon kokonaisprosenttiosuus > 14,00 % |
|||||||||||
|
4. Jalostettu oliiviöljy |
≤ 0,03 |
≤ 1,00 |
≤ 0,60 |
≤ 0,50 |
≤ 0,20 |
≤ 0,20 |
≤ 0,20 |
≤ 0,30 |
— |
≤|0,30| |
≤ 0,9 jos palmitiinihapon kokonaisprosenttiosuus ≤ 14,00 % |
|
≤ 1,1 jos palmitiinihapon kokonaisprosenttiosuus > 14,00 % |
|||||||||||
|
5. Jalostetusta oliiviöljystä ja neitsytoliiviöljystä valmistettu oliiviöljy |
≤ 0,03 |
≤ 1,00 |
≤ 0,60 |
≤ 0,50 |
≤ 0,20 |
≤ 0,20 |
≤ 0,20 |
≤ 0,30 |
— |
≤ |0,30| |
≤ 0,9 jos palmitiinihapon kokonaisprosenttiosuus ≤ 14,00 % |
|
≤ 1,0 jos palmitiinihapon kokonaisprosenttiosuus > 14,00 % |
|||||||||||
|
6. Raaka oliivin puristemassaöljy |
≤ 0,03 |
≤ 1,00 |
≤ 0,60 |
≤ 0,50 |
≤ 0,30 |
≤ 0,20 |
≤ 0,20 |
≤ 0,10 |
— |
≤ |0,60| |
≤ 1,4 |
|
7. Jalostettu oliivin puristemassaöljy |
≤ 0,03 |
≤ 1,00 |
≤ 0,60 |
≤ 0,50 |
≤ 0,30 |
≤ 0,20 |
≤ 0,40 |
≤ 0,35 |
— |
≤ |0,50| |
≤ 1,4 |
|
8. Oliivin puristemassaöljy |
≤ 0,03 |
≤ 1,00 |
≤ 0,60 |
≤ 0,50 |
≤ 0,30 |
≤ 0,20 |
≤ 0,40 |
≤ 0,35 |
— |
≤ |0,50| |
≤ 1,2 |
|
(1) Muiden rasvahappojen pitoisuus (%): palmitiinihappo: 7,50–20,00; palmitoleiinihappo: 0,30–3,50; heptadekaanihappo: ≤ 0,40; heptadekeenihappo: ≤ 0,60; steariinihappo: 0,50–5,00; oleiinihappo: 55,00–83,00; linolihappo: 2,50–21,00. (2) Isomeerien kokonaismäärä, joka voidaan (tai jota ei voida) erottaa kapillaarikolonnin avulla. |
|||||||||||
|
Ryhmä |
Sterolikoostumus |
Kokonaissterolit (mg/kg) |
Erytrodioli ja uvaoli (%) (**) |
Vahat (mg/kg) (**) |
|||||
|
Kolesteroli (%) |
Brassicasteroli (%) |
Kampesteroli (1) (%) |
Stigmasteroli (%) |
Näenn. ß-sitosterolipit. (2) (%) |
δ-7- Stigmastenoli (1) (%) |
||||
|
1. Ekstra-neitsytoliiviöljy |
≤ 0,5 |
≤ 0,1 |
≤ 4,0 |
< kamp. |
≥ 93,0 |
≤ 0,5 |
≥ 1 000 |
≤ 4,5 |
C42 + C44 + C46 ≤ 150 |
|
2. Neitsytoliiviöljy |
≤ 0,5 |
≤ 0,1 |
≤ 4,0 |
< kamp. |
≥ 93,0 |
≤ 0,5 |
≥ 1 000 |
≤ 4,5 |
C42 + C44 + C46 ≤ 150 |
|
3. Lamppuoliiviöljy |
≤ 0,5 |
≤ 0,1 |
≤ 4,0 |
— |
≥ 93,0 |
≤ 0,5 |
≥ 1 000 |
≤ 4,5 (3) |
C40 + C42 + C44 + C46 ≤ 300 (3) |
|
4. Jalostettu oliiviöljy |
≤ 0,5 |
≤ 0,1 |
≤ 4,0 |
< kamp. |
≥ 93,0 |
≤ 0,5 |
≥ 1 000 |
≤ 4,5 |
C40 + C42 + C44 + C46 ≤ 350 |
|
5. Jalostetusta oliiviöljystä ja neitsytoliiviöljystä valmistettu oliiviöljy |
≤ 0,5 |
≤ 0,1 |
≤ 4,0 |
< kamp. |
≥ 93,0 |
≤ 0,5 |
≥ 1 000 |
≤ 4,5 |
C40 + C42 + C44 + C46 ≤ 350 |
|
6. Raaka oliivin puristemassaöljy |
≤ 0,5 |
≤ 0,2 |
≤ 4,0 |
— |
≥ 93,0 |
≤ 0,5 |
≥ 2 500 |
> 4,5 (4) |
C40 + C42 + C44 + C46 > 350 (4) |
|
7. Jalostettu oliivin puristemassaöljy |
≤ 0,5 |
≤ 0,2 |
≤ 4,0 |
< kamp. |
≥ 93,0 |
≤ 0,5 |
≥ 1 800 |
> 4,5 |
C40 + C42 + C44 + C46 > 350 |
|
8. Oliivin puristemassaöljy |
≤ 0,5 |
≤ 0,2 |
≤ 4,0 |
< kamp. |
≥ 93,0 |
≤ 0,5 |
≥ 1 600 |
> 4,5 |
C40 + C42 + C44 + C46 > 350 |
|
(1) Ks. tämän liitteen lisäys. (2) Näennäinen β-sitosterolipitoisuus: δ-5,23-stigmastadienoli + klerosteroli + β-sitosteroli + sitostanoli + δ-5-avenasteroli + δ-5,24-stigmastadienoli. (3) Kun öljyn vahapitoisuus on 300–350 mg/kg, öljyä pidetään lamppuöljynä, jos alifaattisten alkoholien kokonaispitoisuus on enintään 350 mg/kg tai jos erytrodioli- ja uvaolipitoisuus on enintään 3,5 prosenttia. (4) Kun öljyn vahapitoisuus on 300–350 mg/kg, öljyä pidetään raakana oliivin puristemassaöljynä, jos alifaattisten alkoholien kokonaispitoisuus on yli 350 mg/kg ja jos erytrodioli- ja uvaolipitoisuus on yli 3,5 prosenttia. |
|||||||||
Huomautukset:
a) Analyysitulokset on ilmaistava yhtä monen desimaalin tarkkuudella kuin kunkin ominaisuuden osalta esitetään. Viimeinen luku on pyöristettävä yhdellä yksiköllä ylöspäin, jos sitä seuraava luku on suurempi kuin 4.
b) Jos öljyn yksikin ominaisuus poikkeaa annetuista arvoista, öljyn luokka muutetaan tai todetaan, ettei öljy täytä tässä asetuksessa säädettyjä puhtausvaatimuksia.
c) Lamppuöljyllä molemmat tähdellä (*) merkityt ominaisuudet saavat poiketa samanaikaisesti kyseiselle luokalle vahvistetuista raja-arvoista.
d) Kaksi tähteä (**) laatuominaisuuden kohdalla tarkoittaa, että raa'an oliivin puristemassaöljyn ei tarvitse täyttää kaikkia raja-arvoja koskevia vaatimuksia samanaikaisesti. Oliivin puristemassaöljyn ja jalostetun oliivin puristemassaöljyn osalta yksi asianomaisista arvoista saa poiketa todetuista arvoista.
Lisäys
Päätöksentekojärjestelmä
Kampesterolia koskeva päätöksentekokaavio neitsytoliiviöljyä ja ekstra-neitsytoliiviöljyä varten:
Muiden parametrien on vastattava asetuksen mukaisia rajoja.
δ-7-stigmastenolia koskeva päätöksentekojärjestelmä:
— Ekstra-neitsytoliiviöljy ja neitsytoliiviöljy
—
Muiden parametrien on vastattava asetuksen mukaisia rajoja.
— Oliivin puristemassaöljy (raaka ja jalostettu)
—
Muiden parametrien on vastattava asetuksen mukaisia rajoja.
LIITE I a
NÄYTTEENOTTO OLIIVIÖLJYISTÄ TAI OLIIVIN PURISTEMASSAÖLJYISTÄ, JOTKA TOIMITETAAN TUOTTEESEEN SUORASSA KOSKETUKSESSA OLEVISSA PAKKAUKSISSA
Tätä näytteenottomenetelmää sovelletaan oliiviöljy- tai oliivin puristemassaöljyeriin, jotka toimitetaan suorassa kosketuksessa tuotteeseen olevissa pakkauksissa. Näytteenottomenetelmä vaihtelee sen mukaan, onko suorassa kosketuksessa tuotteeseen olevan pakkauksen vetoisuus yli viisi litraa vai ei.
Ilmaisulla ’erä’ tarkoitetaan kaikkia myyntiyksiköitä, jotka on tuotettu, valmistettu ja pakattu sellaisissa olosuhteissa, että kunkin tällaisen myyntiyksikön sisältämää öljyä pidetään yhdenmukaisena kaikkien analyyttisten ominaisuuksien osalta. Erä on yksilöitävä Euroopan parlamentin ja neuvoston direktiivin 2011/91/EU ( 2 ) mukaisesti.
’Näyteyksiköllä’ tarkoitetaan tuotteeseen kosketuksessa olevaan pakkaukseen sisältyvää öljymäärää, joka otetaan erästä satunnaisotannalla.
1. PERUSNÄYTTEEN SISÄLTÖ
1.1. Tuotteeseen kosketuksessa olevat, vetoisuudeltaan enintään viiden litran pakkaukset
Tuotteeseen kosketuksessa olevista, vetoisuudeltaan enintään viiden litran pakkauksista otetulla ’perusnäytteellä’ tarkoitetaan erästä taulukon 1 mukaisesti otettujen näyteyksiköiden lukumäärää.
Taulukko 1
Perusnäytteen vähimmäiskoko muodostetaan seuraavasti
|
Jos tuotteeseen kosketuksessa olevien pakkausten vetoisuus on |
Perusnäytteeksi valitaan |
|
a) vähintään 1 litra |
a) yhden tuotteeseen kosketuksessa olevan pakkauksen öljy |
|
b) alle 1 litra. |
b) pienin mahdollinen määrä pakkauksia, joiden vetoisuus yhteensä on vähintään 1,0 litraa. |
Jokainen jäsenvaltio voi lisätä perusnäytteen muodostavien taulukossa 1 tarkoitettujen pakkausten määrää omien tarpeidensa mukaan (esimerkiksi, jotta aistinvaraisen arvioinnin voi tehdä eri laboratorio kuin kemialliset analyysit, vastamäärityksiä varten jne.).
1.2. Tuotteeseen kosketuksessa olevat, vetoisuudeltaan yli viiden litran pakkaukset
Tuotteeseen kosketuksessa olevista, vetoisuudeltaan yli viiden litran pakkauksista otetulla ’perusnäytteellä’ tarkoitetaan edustavaa otosta kaikista näyteyksiköistä, jotka on saatu jakomenettelyn avulla ja taulukon 2 mukaisesti. Perusnäyte on muodostettava useista kappaleista.
Perusnäytteen ’kappaleella’ tarkoitetaan kutakin perusnäytteeseen kuuluvaa pakkausta.
Taulukko 2
Valittavien näyteyksiköiden vähimmäismäärä
|
Erään kuuluvien pakkausten lukumäärä |
Valittavien näyteyksiköiden vähimmäismäärä |
|
Enintään 10 |
1 |
|
11–150 |
2 |
|
151–500 |
3 |
|
501–1 500 |
4 |
|
1 501 –2 500 |
5 |
|
> 2 500 , tuhatta pakkausta kohden |
1 ylimääräinen näyteyksikkö |
Jotta tuotteeseen kosketuksessa olevien pakkausten näytteenoton määrää voidaan pienentää, näyteyksiköiden sisältö homogenisoidaan perusnäytteen valmistamiseksi. Eri näyteyksiköiden annokset kaadetaan yhteen säiliöön ja homogenisoidaan sekoittamalla siten, että näyte suojataan ilmalta mahdollisimman hyvin.
Perusnäytteen sisältö kaadetaan useisiin, vetoisuudeltaan vähintään 1,0 litran pakkauksiin, joista jokainen muodostaa perusnäytteen kappaleen.
Jokainen jäsenvaltio voi lisätä perusnäytteiden lukumäärää omien tarpeidensa mukaan (esimerkiksi, jotta aistinvaraisen arvioinnin voi tehdä eri laboratorio kuin kemialliset analyysit, vastamäärityksiä varten jne.).
Jokainen pakkaus on täytettävä siten, että pintaan jäävä ilmakerros on mahdollisimman pieni, ja pakkaus on suljettava asianmukaisesti ja sinetöitävä sen varmistamiseksi, että tuotetta ei voida muuttaa.
Kappaleet on merkittävä siten, että ne voidaan tunnistaa virheettömästi.
2. MÄÄRITYKSET JA TULOKSET
2.1. Kukin perusnäyte jaetaan standardissa EN ISO 5555 olevan 2.5 kohdan mukaisesti laboratorionäytteiksi, ja perusnäytteet määritetään liitteessä I b annetun vuokaavion mukaisessa järjestyksessä tai muussa satunnaisessa järjestyksessä.
2.2. Jos määritysten kaikki tulokset vastaavat ilmoitetun öljyluokan ominaisuuksia, koko kyseinen erä on todettava vaatimusten mukaiseksi.
Jos määritysten yksikin tulos ei vastaa ilmoitetun öljyluokan ominaisuuksia, koko kyseinen erä on todettava vaatimusten vastaiseksi.
3. ERÄN LUOKAN TARKISTAMINEN
3.1. Toimivaltainen viranomainen voi lisätä erän eri kohdista otettujen perusnäytteiden lukumäärää erän luokan tarkistamiseksi seuraavan taulukon mukaisesti:
Taulukko 3
Erän koon mukaan määritettävä perusnäytteiden lukumäärä
|
Erän koko (litroina) |
Perusnäytteiden lukumäärä |
|
Alle 7 500 |
2 |
|
7 500 :sta alle 25 000 :een |
3 |
|
25 500 :sta alle 75 000 :een |
4 |
|
75 000 :sta alle 125 000 :een |
5 |
|
125 000 ja sitä enemmän |
6 + 1 kutakin 50 000 :ta litraa kohden |
Jokainen perusnäytteen muodostava näyteyksikkö on otettava samasta kohdasta erää; jokaisen perusnäytteen sijainti on merkittävä muistiin, ja siihen on laitettava selkeät tunnisteet.
Jokainen perusnäyte muodostetaan 1.1 ja 1.2 kohdassa tarkoitettujen menettelyjen mukaisesti.
Sen jälkeen jokaiselle perusnäytteelle tehdään 2 artiklan 1 kohdassa tarkoitetut määritykset.
3.2. Jos 2 artiklan 1 kohdassa tarkoitettujen määritysten tulokset eivät vähintään yhden perusnäytteen osalta vastaa ilmoitetun öljyluokan ominaisuuksia, koko kyseinen erä on todettava vaatimusten vastaiseksi.
LIITE I b
VUOKAAVIO SEN TODENTAMISEKSI, ONKO OLIIVIÖLJYNÄYTE ILMOITETUN LUOKAN MUKAINEN
Yleistaulukko
Taulukko 1 – Ekstra-neitsytoliiviöljy – laatukriteerit
Taulukko 2 – Neitsytoliiviöljy – laatukriteerit
Taulukko 3 – Ekstra-neitsytoliiviöljy ja neitsytoliiviöljy – puhtauskriteerit
Taulukko 4 – Lamppuoliiviöljy – puhtauskriteerit
Taulukko 5 – Jalostettu oliiviöljy – laatukriteerit
Taulukko 6 – Oliiviöljy (jalostetusta oliiviöljystä ja neitsytoliiviöljystä valmistettu oliiviöljy) – puhtauskriteerit
Taulukko 7 – Jalostettu oliiviöljy ja jalostetusta oliiviöljystä ja neitsytoliiviöljystä valmistettu oliiviöljy – puhtauskriteerit
Taulukko 8 – Raaka oliivin puristemassaöljy – puhtauskriteerit
Taulukko 9 – Jalostettu oliivin puristemassaöljy – laatukriteerit
Taulukko 10 – Oliivin puristemassaöljy – laatukriteerit
Taulukko 11 – Jalostettu oliivin puristemassaöljy ja oliivin puristemassaöljy – puhtauskriteerit
LIITE II
VAPAIDEN RASVAHAPPOJEN MÄÄRITTÄMINEN KYLMÄMENETELMÄLLÄ
1. TARKOITUS JA SOVELTAMISALA
Tässä menetelmässä selostetaan vapaiden rasvahappojen määrittäminen oliiviöljyissä ja oliivin puristemassaöljyissä. Vapaiden rasvahappojen pitoisuus ilmaistaan öljyhappoprosentteina laskettuna happamuutena.
2. PERIAATE
Näyte liuotetaan liuotinseokseen ja vapaat rasvahapot titrataan kaliumhydroksidi- tai natriumhydroksidiliuoksella.
3. REAGENSSIT
Kaikkien reagenssien on oltava määritykseen hyväksyttyä analyysilaatua ja veden on oltava joko tislattua tai vastaavaa puhtausastetta.
|
3.1 |
Dietyylieetteri; 95-prosenttinen etanoli (v/v), yhtä suuret tilavuusosat kumpaakin. Seos, johon on lisätty 0,3 ml fenoliftaleiiniliuosta (3.3) 100 ml:aan, neutraloidaan juuri ennen käyttöä kaliumhydroksidiliuoksella (3.2). Huomautus 1: Dietyylieetteri on helposti syttyvää ja voi muodostaa räjähtäviä peroksideja. Sen käytössä on oltava erittäin varovainen. Huomautus 2: Jos ei voida käyttää dietyylieetteriä, voidaan käyttää etanolin ja tolueenin seosta. Etanoli voidaan tarvittaessa korvata 2-propanolilla. |
|
3.2 |
Kalium- tai natriumhydroksidi titrattuna etanoli- tai vesiliuoksena, c(KOH) [tai c(NaOH9] noin 0,1 mol/l tai tarvittaessa c(KOH) [tai c(NaOH)] noin 0,5 mol/l. Kaupallisia liuoksia on saatavilla. Kaliumhydroksidiliuoksen (tai natriumhydroksidiliuksen) tarkka väkevyys on tunnettava ja tarkistettava juuri ennen käyttöä. Käytetään liuosta, joka on valmistettu vähintään viisi vuorokautta ennen käyttöä ja dekantoitu ruskeaan lasipulloon, jossa on kumitulppa. Liuoksen on oltava väritöntä tai oljenkeltaista. Jos kaliumhydroksidin (tai natriumhydroksidin) vesiliuosta käytettäessä havaitaan faasien erottumista, vesiliuos on korvattava etanoliliuoksella. Huomautus 3: Väritön, stabiili kaliumhydroksidiliuos (tai natriumhydroksidiliuos) voidaan valmistaa seuraavasti: Kuumennetaan kiehuvaksi 1 000 ml etanolia tai vettä, johon on lisätty 8 g kaliumhydroksidia (tai natriumhydroksidia) ja 0,5 g alumiinilastuja, ja keitetään seosta yksi tunti palautusjäähdyttimen kanssa. Tislataan välittömästi. Tisleeseen liuotetaan tarvittava määrä kaliumhydroksidia (tai natriumhydroksidia). Annetaan seistä useita vuorokausia ja dekantoidaan kirkas neste, joka on kaliumkarbonaattisakan (tai natriumkarbonaattisakan) yläpuolella. Liuos voidaan myös valmistaa ilman tislausta seuraavasti: lisätään 4 ml alumiinibutylaattia 1 000 ml:aan etanolia (tai vettä) ja seoksen annetaan seistä joitakin vuorokausia. Dekantoidaan seoksen yläpuolella oleva neste ja liuotetaan tarvittava määrä kaliumhydroksidia (tai natriumhydroksidia). Liuos on käyttövalmis. |
|
3.3 |
Fenoliftaleiiniliuos 10 mg fenoliftaleiiniä litrassa 95–96-prosenttista etanolia (v/v) tai 20 g alkalisinistä 6B tai tymolftaleiiniä litrassa 95–96-prosenttista etanolia (v/v). Kun on kyse voimakkaan värisistä öljyistä, on käytettävä alkalisinistä tai tymolftaleiiniä. |
4. VÄLINEISTÖ
Tavanomainen laboratoriovälineistö ja erityisesti:
4.1 Analyysivaaka
4.2 Erlenmeyerpullo, 250 ml
4.3 Byretti, 10 ml, A luokka, mitta-asteikon jakoväli 0,05 ml, tai vastaavanlainen automaattibyretti.
5. MENETTELY
5.1 Testinäytteen esikäsittely
Jos liuos on sameaa, se on suodatettava.
5.2 Näyte
Näyte otetaan oletetun happamuuden perusteella seuraavan taulukon mukaan:
|
Oletettu happamuus (öljyhappo g/100 g) |
Näytemäärä (g) |
Näytteen punnitustarkkuus (g) |
|
0–2 |
10 |
0,02 |
|
> 2–7,5 |
2,5 |
0,01 |
|
> 7,5 |
0,5 |
0,001 |
Näyte punnitaan erlenmeyerpullossa (4.2).
5.3 Määritys
Näyte (5.2) liuotetaan 50–150 ml:aan ennalta neutraloitua dietyylieetteri/etanoli-seosta (3.1).
Titrataan, koko ajan sekoittaen, 0,1 mol/l kaliumhydroksidiliuoksella (tai natriumhydroksidiliuoksella (3.2) (ks. Huom. 4), kunnes indikaattorin väri muuttuu (värjäytyneen indikaattorin väri säilyy vähintään 10 sekunnin ajan).
Huomautus 4: Jos tarvittavan 0,1 mol/l -kaliumhydroksidiliuoksen (tai natriumhydroksidiliuoksen) määrä on yli 10 ml, on käytettävä 0,5 mol/l -liuosta tai muutettava näytemäärää oletetun vapaiden happojen pitoisuuden ja ehdotetun taulukon mukaisesti.
Huomautus 5: Jos liuos samenee titrattaessa, liuotinseosta (3.1) lisätään tarpeen mukaan, kunnes liuos on kirkasta.
Toinen määritys tehdään ainoastaan siinä tapauksessa, että ensimmäinen tulos on korkeampi kuin kyseiselle öljyn luokalle asetettu raja.
6. TULOSTEN ILMOITTAMINEN
Happamuus öljyhapon painoprosentteina ilmaistuna on:
jossa
|
V |
= |
käytetyn titratun kaliumhydroksidiliuoksen (tai natriumhydroksidiliuoksen) määrä millilitroina; |
|
c |
= |
käytetyn titratun kaliumhydroksidiliuoksen (tai natriumhydroksidiliuoksen) tarkka pitoisuus moolia/litra; |
|
M |
= |
282 g/mol, öljyhapon moolimassa g/mol; |
|
m |
= |
näytteen massa grammoina. |
Öljyhappopitoisuus ilmoitetaan seuraavasti:
a) kahden desimaalin tarkkuudella, kun arvo on 0–1;
b) yhden desimaalin tarkkuudella, kun arvo on 1–100.
LIITE III
PEROKSIDILUVUN MÄÄRITTÄMINEN
1. Soveltamisala
Tässä liitteessä kuvataan eläin- ja kasviöljyjen ja -rasvojen peroksidiluvun määritysmenetelmä.
2. Määritelmä
Peroksidiluku ilmaisee näytteessä olevien kaliumjodidia hapettavien aineiden määrän (ilmaistuna aktiivisen hapen milliekvivalentteina kilogrammaa kohti) tässä kuvatuissa koeolosuhteissa.
3. Periaate
Näyte liuotetaan etikkahapon ja kloroformin seokseen ja käsitellään kaliumjodidilla. Vapautuva jodi titrataan normalisoidulla natriumtiosulfaattiliuoksella.
4. Välineistö
Käytettävien laitteiden on oltava puhtaita siten, että niissä ei ole mitään hapettavia tai pelkistäviä aineita.
Huom. 1: Hiottuja lasipintoja ei saa rasvata.
4.1 Punnituslasi, 3 ml
4.2 Lasipulloja, vetoisuus noin 250 ml, hiotut suut ja tulpat, etukäteen kuivattu ja täytetty puhtaalla, kuivalla inerttikaasulla (typellä tai mieluummin hiilidioksidilla).
4.3 Byretti, vetoisuus 5 ml, 10 ml tai 25 ml, mitta-asteikon jakoväli vähintään 0,05 ml, mieluiten automaattinen nollatason säätö, tai vastaavanlainen automaattibyretti.
4.4 Analyysivaaka.
5. Reagenssit
5.1 Analyysilaatuinen kloroformi, josta happi on poistettu puhtaalla, kuivalla inerttikaasuvirralla tapahtuvalla kaasuhuuhtelulla.
5.2 Analyysilaatuinen jääetikka, josta happi on poistettu puhtaalla, kuivalla inerttikaasuvirralla tapahtuvalla kaasuhuuhtelulla.
5.3 Kaliumjodidin tuore, kyllästetty vesiliuos, joka ei sisällä jodia eikä jodaatteja. Liuotetaan noin 14 g kaliumjodidia noin 10 millilitraan vettä huoneenlämmössä.
5.4 Natriumtiosulfaatin vesiliuos 0,01 mol/l (vastaa 0,01 N), normalisoitu huolellisesti juuri ennen käyttöä.
Valmistetaan päivittäin 0,01 mol/l natriumtiosulfaattiliuos 0,1 mol/l natriumtiosulfaatin standardiliuoksesta ennen käyttöä, tai määritetään tarkka normaalisuus. Kuten kokemus osoittaa, stabiilisuus on rajallinen ja riippuu pH-arvosta ja vapaan hiilidioksidin pitoisuudesta. Laimennukseen käytetään vain juuri keitettyä vettä, joka on mahdollisesti puhdistettu typen avulla.
Jäljempänä kuvattavaa menetelmää suositellaan natriumtiosulfaattiliuoksen tarkan normaalisuuden määrittämiseksi:
Punnitaan 0,001 g:n tarkkuudella 0,27–0,33 g kaliumjodaattia (mKIO3) mittapulloon (250 ml tai 500 ml) ja täytetään pullo vastakeitetyllä, huoneenlämpöiseksi jäähdytetyllä vedellä (V2). Pipetoidaan 5 ml tai 10 ml tätä kaliumjodaattiliuosta (V1) 250 ml:n erlenmeyerpulloon. Lisätään 60 ml vastakeitettyä vettä, 5 ml 4-molaarista suolahappoa ja 25–50 mg kaliumjodidia tai 0,5 ml kyllästettyä kaliumjodidiliuosta. Tämä liuos titrataan natriumtiosulfaattiliuoksella (V3) natriumtiosulfaattiliuoksen tarkan normaalisuuden määrittämiseksi.
jossa
mKIO3 on kaliumjodaatin massa grammoina
V1 on kaliumjodaattiliuoksen tilavuus millilitroina (5 ml tai 10 ml)
V2 on kaliumjodaattiliuoksen kokonaistilavuus millilitroina (250 ml tai 500 ml)
V3 on natriumtiosulfaattiliuoksen tilavuus millilitroina
wKIO3 on kaliumjodaatin puhtaus g/100 g
mKIO3 on kaliumjodaatin molekyylimassa (214 g/mol)
T on natriumtiosulfaattiliuoksen tarkka normaalisuus (mol/l).
5.5 Tärkkelysliuos, 10 g/l vesidispersio, liukoisesta luonnon tärkkelyksestä valmistettu tuore liuos. Voidaan käyttää myös vastaavia reagensseja.
6. Näyte
Huolehditaan siitä, että näyte otetaan ja säilytetään pimeässä ja kylmässä, ja että sen lasisissa säilytysastioissa ei ole tyhjää tilaa. Astiat on suljettava ilmatiiviisti joko hiotuilla lasitulpilla tai korkilla.
7. Menettely
Määritys tehdään hajapäivänvalossa tai keinovalossa. Näyte punnitaan 0,001 g:n tarkkuudella punnituslasissa (4.1) tai, ellei sellaista ole, pullossa (4.2). Tarvittava näytemäärä riippuu oletetusta peroksidiluvusta seuraavan taulukon mukaan:
|
Oletettu peroksidiluku (meq) |
Näytemäärä (g) |
|
0–12 |
5,0–2,0 |
|
12–20 |
2,0–1,2 |
|
20–30 |
1,2–0,8 |
|
30–50 |
0,8–0,5 |
|
50–90 |
0,5–0,3 |
Avataan pullo (4.2) ja asetetaan sisään punnituslasi, jossa on näyte. Lisätään 10 ml kloroformia (5.1). Liuotetaan näyte nopeasti sekoittaen. Lisätään 15 ml etikkahappoa (5.2), sitten 1 ml kaliumjodidiliuosta (5.3). Suljetaan pullo nopeasti, ravistetaan yksi minuutti ja annetaan seistä tasan viisi minuuttia pimeässä 15–25 °C:n lämpötilassa.
Lisätään noin 75 ml tislattua vettä. Vapautunut jodi titrataan natriumtiosulfaattiliuoksella (5.4) voimakkaasti sekoittaen ja käytetään tärkkelysliuosta (5.5) indikaattorina.
Samasta näytteestä tehdään kaksi määritystä.
Sokeakoe tehdään samanaikaisesti. Jos sen tulos on suurempi kuin 0,05 ml 0,01 N natriumtiosulfaattiliuosta (5.4), ovat reagenssit olleet epäpuhtaita ja ne on vaihdettava.
8. Tulosten ilmoittaminen
Peroksidiluku (PV), ilmaistuna aktiivisen hapen milliekvivalentteina kilogrammaa kohti, saadaan kaavasta:
jossa
|
V |
= |
määritykseen käytetyn normalisoidun natriumtiosulfaattiliuoksen (5.4) määrä millilitroina, korjattuna sokeakokeen tuloksilla; |
|
T |
= |
määritykseen käytetyn natriumtiosulfaattiliuoksen (5.4) tarkka normaalisuus (mol/l); |
|
m |
= |
näytteen massa grammoina. |
Tulos on kahden määrityksen tulosten aritmeettinen keskiarvo.
Määrityksen tulos ilmoitetaan yhden desimaalin tarkkuudella.
LIITE IV
VAHAPITOISUUDEN MÄÄRITTÄMINEN KAPILLAARIKAASUKROMATOGRAFISELLA MENETELMÄLLÄ
1. TARKOITUS
Tällä menetelmällä määritetään oliiviöljyjen vahapitoisuus. Vahat eroavat toisistaan hiiliatomien lukumäärän suhteen. Tätä menetelmää voidaan käyttää erityisesti tekemään ero puristamalla saadun oliiviöljyn ja puristemassasta saadun öljyn välillä.
2. PERIAATE
Rasva, johon on lisätty soveltuva sisäinen standardi, fraktioidaan kromatografisesti hydratoitua silikageeliä sisältävässä kolonnissa; koeolosuhteissa ensimmäisenä eluoitunut jae (jonka polaarisuus on triglyseridien polaarisuutta heikompi) otetaan talteen ja määritetään suoraan kapillaarikaasukromatografian avulla.
3. VÄLINEISTÖ
|
3.1 |
Erlenmeyer-pullo, 25 ml. |
|
3.2 |
Lasikolonni kaasukromatografiaa varten, sisähalkaisija 15,0 mm ja pituus 30–40 cm, varustettu hanalla. |
|
3.3 |
Soveltuva kaasukromatografialaitteisto, joka toimii kapillaarikolonnin kanssa ja jossa on suoraan kolonniin johtava näytteensyöttöjärjestelmä. Laitteiston osat ovat:
|
|
3.4 |
Mikroruisku, kolonniin suoraan syöttämiseksi, 10 μl, jossa on kiinteä neula. |
|
3.5 |
Sähkökäyttöinen sekoittaja. |
|
3.6 |
Pyöröhaihduttaja. |
|
3.7 |
Muhveliuuni. |
|
3.8 |
Analyysivaaka, jonka tarkkuus ± 0,1 mg. |
|
3.9 |
Laboratorion tavanomaiset lasivälineet. |
4. REAGENSSIT
|
4.1 |
Silikageeliä, jonka hiukkaskoko 60–200 μm. Silikageeli laitetaan uuniin 500 °C:n lämpötilaan vähintään 4 tunniksi. Jäähdytetään ja lisätään vettä 2 % silikageelin määrästä. Sekoitetaan massan homogenoimiseksi. Säilytetään pimeässä vähintään 12 tuntia ennen käyttöä. |
|
4.2 |
N-heksaani, kromatografialaatua. |
|
4.3 |
Etyylieetteriä, kromatografialaatua. |
|
4.4 |
N-heptaani, kromatografialaatua. |
|
4.5 |
Lauryyliarakidaatin standardiliuos, 0,1 % (m/V) liuos heksaanissa (sisäinen standardi). (On myös mahdollista käyttää palmityylipalmitaattia tai myristyylistearaattia.)
|
|
4.6 |
Kantajakaasut: vety tai helium, kaasukromatografista laatua. |
|
4.7 |
Apukaasut: — puhdas vety, kaasukromatografialaatua, — puhdas ilma, kaasukromatografialaatua. |
5. SUORITUS
5.1 Kromatografiakolonnin esikäsittely
Suspendoidaan 15 g silikageeliä (4.1) n-heksaaniin (4.2) ja laitetaan kolonniin (3.2). Annetaan laskeutua itsestään ja autetaan laskeutumista sähkökäyttöisellä sekoittajalla (3.5), jotta saadaan homogeenisempi kromatografiakerros. Suodatetaan läpi 30 ml n-heksaania mahdollisten epäpuhtauksien poistamiseksi. Punnitaan vaa’alla (3.8) tarkasti 500 mg näytettä 25 ml:n erlenmeyerpulloon (3.1), lisätään sopiva määrä sisäistä standardia (4.5) oletetun vahapitoisuuden mukaan. Esimerkiksi: lauryyliarakidaattia lisätään 0,1 mg, jos on kyse oliiviöljystä, ja 0,25–0,5 mg, jos kyse on puristemassaöljystä. Siirretään näin valmistettu näyte kahden 2 ml:n n-heksaaniannoksen avulla kromatografiakolonniin (4.2).
Liuottimen annetaan valua, kunnes se on 1 mm absorboimisaineen pinnan yläpuolella, minkä jälkeen suodatetaan läpi 70 ml n-heksaania luonnostaan esiintyvien n-alkaanien poistamiseksi. Aloitetaan kromatografinen eluointi keräämällä 180 ml n-heksaani/etyylieetteriseosta, suhde 99:1, valumisnopeuden ollessa noin 15 tippaa 10 sekunnissa. Näyte eluoidaan lämpötilassa 22 °C ± 4.
Huom.
— N-heksaani/etyylieetteriseos, suhde 99:1, on valmistettava uudelleen joka päivä.
— Vahojen eluoitumisen tarkkailemiseksi silmämääräisesti liuosnäytteeseen on mahdollista lisätä 100 μl 1-prosenttista sudania eluutioliuoksessa. Koska sudanin retentioaika sijoittuu vahojen ja triglyseridien välille, eluointi keskeytetään, kun väri saavuttaa kromatografiakolonnin pohjan, sillä tällöin kaikki vahat ovat eluoituneet.
Tällä tavoin saatu jae kuivataan pyöröhaihduttimessa (3.6), kunnes lähes kaikki liuotin on saatu poistettua. Viimeiset 2 ml liuotinta poistetaan heikon typpivirtauksen avulla, minkä jälkeen lisätään 2–4 ml n-heptaania.
5.2 Kaasukromatografinen määritys
5.2.1 Esivalmistelut
Kolonni asennetaan kaasukromatografiin (3.3) siten, että alkupää yhdistetään on-column -järjestelmään ja loppupää detektoriin. Tarkistetaan kaasukromatografialaitteiden toimivuus (kaasuliitäntöjen kunto, detektorin ja piirturijärjestelmän suoritusteho jne.).
Jos kolonnia ei ole aikaisemmin käytetty, se on ensin valmisteltava käyttöön. Kevyt kaasuvirtaus johdetaan kolonnin läpi ja kaasukromatografi käynnistetään. Lämmitetään asteittain siten, että lämpötila on noin neljän tunnin kuluttua kohonnut 350 °C:een. Tätä lämpötilaa pidetään yllä vähintään kaksi tuntia, jonka jälkeen laitteisto säädetään käyttöolosuhteisiin (kaasuvirtojen säätö, liekin sytytys, kytkeminen elektroniseen piirturiin (3.3.4), uunin lämpötilan säätö kolonnia varten, detektorin lämpötilasäätö jne.) ja signaali säädetään niin, että sen herkkyys on vähintään kaksi kertaa niin suuri kuin on arvioitu määrityksessä tarvittavan. Saadun pohjaviivan on oltava suora, siinä ei saa olla minkäänlaisia piikkejä eikä ryömintää mihinkään suuntaan.
Jos ilmenee negatiivista suoraviivaista ryömintää, se on merkki kolonnin liitäntöjen vuotamisesta; positiivinen ryömintä johtuu kolonnin riittämättömästä valmistelusta.
5.2.2 Toimintaolosuhteiden valinta
Yleisesti kromatografia tehdään seuraavissa käyttöolosuhteissa:
— kolonnin lämpötila:
—
|
|
20 °C minuutissa |
|
5 °C minuutissa |
|
20 °C minuutissa |
|
|
aluksi 80 °C (1′) |
→ |
240 °C |
→ |
325 °C (6′) |
→ |
340 °C (10′) |
— detektorin lämpötila: 350 °C,
— injektoidun aineen määrä: 1 μl n-heptaaniliuosta (2–4 ml),
— kantajakaasut: helium tai vety valitun kaasun optimaalisella lineaarinopeudella (ks. lisäys),
— laitteen herkkyys siten että seuraavat edellytykset täyttyvät:
Näitä olosuhteita voidaan muuttaa kolonnin ja kaasukromatografin ominaisuuksien perusteella, jotta kaikki vahat saadaan erotettua, jotta piikkien erotuskyky on riittävä (ks. kuva) ja jotta sisäisen standardin C32 retentioaika on 18 ± 3 minuuttia. Edustavimpien vahojen piikin on oltava vähintään 60 % asteikon pohjasta.
Piikkien integrointiparametrit asetetaan niin, että huomioon otettavien piikkien pinta-alat voidaan arvioida oikein.
Huom.Koska lopullinen lämpötila on korkea, sallitaan positiivinen siirtymä, joka saa kuitenkin olla enintään 10 % asteikon alarajasta.
5.3 Määritys
Imetään 10 μl:n mikroruiskuun 1 μl liuosta; vedetään männällä neula tyhjäksi. Työnnetään neula injektiolaitteeseen ja 1–2 sekunnin kuluttua injektoidaan nopeasti; noin 5 sekunnin kuluttua vedetään neula hitaasti pois.
Piirturi pidetään käynnissä, kunnes vahat ovat eluoituneet täydellisesti.
Pohjaviivan on koko ajan oltava vaatimusten mukainen.
5.4 Piikkien tunnistaminen
Eri piikkien tunnistaminen suoritetaan retentioaikojen perusteella ja vertaamalla samoissa olosuhteissa määritettyihin vahojen seoksiin, joiden retentioajat tunnetaan.
Kuva 1 esittää neitsytoliiviöljyn vahojen kromatogrammia.
5.5 Kvantitatiivinen arviointi
Sisäisen standardin ja C40–C46 -alifaattisten esterien piikkien pinta-alat lasketaan integraattorilla.
Lasketaan kunkin esterin vahapitoisuus, ilmoitettuna mg/kg rasvaa, seuraavasti:
jossa:
|
Ax |
= |
kunkin esterin piikin pinta-ala neliömillimetreinä |
|
As |
= |
kunkin sisäisen standardin piikin pinta-ala neliömillimetreinä |
|
ms |
= |
lisätyn sisäisen standardin massa milligrammoina |
|
m |
= |
määritystä varten otetun näytteen massa grammoina. |
6. TULOSTEN ILMOITTAMINEN
C40–C46:n eri vahojen pitoisuuksien summa ilmoitetaan mg/kg rasvaa (ppm).
Huom.Määritetään piikkien pinta-aloista niiden komponenttien määrät, joissa on parillinen määrä C-atomeja välillä C40–C46, jäljempänä olevassa kuvassa esitetyn oliiviöljyn vahojen kromatogrammin mukaisesti. Jos C46-esteri esiintyy kahtena piikkinä, sen tunnistamiseksi on syytä analysoida oliivinpuristemassaöljyn vahojen jae, jossa C46:n piikki on helppo tunnistaa, koska se on selvästi hallitsevin.
Tulokset ilmoitetaan yhden desimaalin tarkkuudella.
KUVA
Oliiviöljyn vahojen kromatogrammi ( 3 )
Merkkien selitykset::
|
I.S. |
= |
lauryyliarakidaatti |
|
1 |
= |
diterpeeniesterit |
|
2 + 2′ |
= |
C40-esterit |
|
3 + 3′ |
= |
C42-esterit |
|
4 + 4′ |
= |
esterit C44 |
|
5 |
= |
C46-esterit |
|
6 |
= |
steroliesterit ja triterpeenialkoholi. |
Lisäys
Kaasun lineaarinopeuden määrittäminen
Injektoidaan 1–3 μl metaania (tai propaania) tavanomaisiin käyttöolosuhteisiin säädettyyn kaasukromatografialaitteistoon. Mitataan aika, jonka kaasu kulkee kolonnin läpi, alkaen injektiohetkestä piikin muodostumiseen (tM).
Lineaarinopeus, cm/s, saadaan kaavasta L/tM, jossa L on kolonnin pituus senttimetreinä ja tM on aika sekunteina sekuntikellolla mitattuna.
▼M32 —————
▼M26 —————
LIITE VII
2-GLYSERYYLIMONOPALMITAATIN PROSENTTIOSUUDEN MÄÄRITTÄMINEN
1. TARKOITUS JA SOVELTAMISALA
Tällä menetelmällä määritetään triglyseridin 2-asemassa olevan palmitiinihapon prosenttiosuus 2-glyseryylimonopalmitaatin määrityksen avulla.
Menetelmää sovelletaan kasviöljyihin, jotka ovat nestemäisiä huoneenlämmössä (20 °C).
2. PERIAATE
Öljynäyte valmistellaan ja käsitellään haimalipaasin avulla: kun triglyseridimolekyyli hydrolysoidaan osittain ja spesifisesti 1- ja 3-asemassa, jäävät jäljelle 2-asemassa olevat monoglyseridit. 2-glyseryylimonopalmitaatin prosenttiosuus monoglyseridijakeessa määritetään silyloinnin jälkeen käyttäen kapillaarikaasukromatografista määritystä.
3. VÄLINEISTÖ
|
3.1 |
Erlenmeyer-pullo, 25 ml. |
|
3.2 |
Dekantterilaseja, 100, 250 ja 300 ml. |
|
3.3 |
Lasikolonni kromatografiaa varten (sisähalkaisija 21–23 mm, pituus 400 mm), varustettuna sintterilasilevyllä ja hanalla. |
|
3.4 |
Koeputkia, 10, 50, 100 ja 200 ml. |
|
3.5 |
Kolveja, 100 ja 250 ml. |
|
3.6 |
Pyöröhaihduttaja. |
|
3.7 |
Kartiopohjaisia sentrifugiputkia, 10 ml, hiottu tulppa. |
|
3.8 |
Sentrifugi 10 ja 100 ml:n putkia varten. |
|
3.9 |
Termostaatti, joka ylläpitää lämpötilaa 40 °C ± 0,5 °C. |
|
3.10 |
Mittapipettejä, 1 ja 2 ml. |
|
3.11 |
Injektioruisku, 1 ml. |
|
3.12 |
Mikroruisku, 100 μl. |
|
3.13 |
Suppilo, 1 000 ml |
|
3.14 |
Kapillaarikolonnilla varustettu kaasukromatografi, jossa on kolonniin liitetty kylmäinjektori, jonka avulla näyte voidaan syöttää suoraan koloniin, sekä uuni, joka pysyy valitussa lämpötilassa yhden celsiusasteen tarkkuudella. |
|
3.15 |
Kolonniin liitetty kylmäinjektori, näytteen syöttämiseksi suoraan kolonniin. |
|
3.16 |
Liekki-ionisaatiodetektori ja analysaattori. |
|
3.17. |
Integroiva piirturi, joka toimii analysaattorin kanssa ja jonka vastenopeus on enintään 1 sekunti ja jonka paperin nopeutta voidaan säätää. |
|
3.18 |
Lasinen tai kvartsilasinen kapillaarikolonni, jonka pituus on 8–12 m ja sisähalkaisija 0,25–0,32 mm ja jonka sisäpinta on päällystetty 5-prosenttisella metyylipolysiloksaanilla tai fenyylimetyylipolysiloksaanilla siten, että nestekerroksen paksuus on 0,10–0,30 μm, ja jota voidaan käyttää 370 °C:n lämpötilassa. |
|
3.19 |
Mikroruisku, 10 μl, jossa on vähintään 7,5 cm:n kiinteä neula, jonka avulla näyte voidaan syöttää suoraan kolonniin. |
4. REAGENSSIT
|
4.1 |
Silikageeli, jonka hiukkaskoko 0,063–0,200 mm (70/280 mesh) ja joka valmistetaan seuraavasti: Silikageeli pannaan posliiniastiaan, kuivataan lämpökaapissa 160 °C:n lämpötilassa neljän tunnin ajan, minkä jälkeen jäädytetään eksikkaattorissa huoneenlämmössä. Lisätään vettä 5 % silikageelin painosta seuraavasti: punnitaan 500 ml:n erlenmeyer-pulloon 152 g silikageeliä, lisätään 8 g tislattua vettä, suljetaan pullo ja ravistetaan varovasti siten, että vesi jakautuu tasaisesti. Säilytetään vähintään 12 tuntia ennen käyttöä. |
|
4.2 |
n-heksaani (kromatografialaatua). Heksaani voidaan korvata iso-oktaanilla (2,2,4-trimetyylpentaani, kromatografialaatua) edellyttäen, että vastaavat toistotarkkuusarvot saavutetaan. |
|
4.3 |
Isopropanoli |
|
4.4 |
Isopropanoli, vesiliuos 1/1 (V/V) |
|
4.5 |
Haimalipaasi. Käytettävän lipaasiaktiivisuuden on oltava 2,0–10 lipaasiyksikköä/mg. (Haimalipaasia, jonka aktiivisuus on 2–10 yksikköä/mg, on saatavilla valmiina.) |
|
4.6 |
Tri-hydroksimetyyliaminometaani-puskuriliuos: lisätään vesiliuokseen suolahappoa 1 M, kunnes pH on 8 (tarkistetaan potentiometrillä) (1/1 V/V) |
|
4.7 |
Natriumkolaatti (entsyymilaatua), 0,1 % vesiliuos (käytettävä 15 päivän kuluessa valmistamisesta). |
|
4.8 |
Kalsiumkloridi, vesiliuos 22 %. |
|
4.9 |
Dietyylieetteri, kromatografialaatua. |
|
4.10 |
Kehitysliuos: n-heksaani/etyylieetteriseos (87/13) (V/V) |
|
4.11 |
Natriumhydroksidi, 12-painoprosenttinen liuos. |
|
4.12 |
1-prosenttinen fenoliftaleiiniliuos etanolissa. |
|
4.13 |
Kantajakaasut: vety tai helium, kaasukromatografista laatua. |
|
4.14 |
Apukaasut: vety, vähintään 99-prosenttinen, kuiva ja ilman orgaanisia aineita, ja vesi kaasukromatografista laatua, sama puhtausaste. |
|
4.15 |
Silylointireagenssi: Pyridiinin, heksametyylidisilatsaanin ja trimetyylikloorisilaanin seos 9/3/1 (V/V/V). (Käyttövalmiita liuoksia on kaupallisesti saatavana. Voidaan käyttää myös muita silylointireagensseja, kuten esim. bis-trimetyylisilyylitrifluoriasetamidi + 1 % trimetyylikloorisilaania; reagenssi laimennetaan samalla määrällä vedetöntä pyridiiniä.) |
|
4.16 |
Standardit: puhtaat monoglyseridit tai monoglyseridien seokset, joiden prosenttiosuuksien mukainen tunnettu koostumus on samanlainen kuin näytteen. |
5. MENETTELY
5.1 Näytteen valmistelu
|
5.1.1 |
Öljyjä, joiden vapaiden happojen pitoisuus on alle 3 %, ei tarvitse neutraloida ennen silikageelikolonnikromatografiaa. Öljyt, joiden vapaiden happojen pitoisuus on yli 3 %, on neutraloitava 5.1.1.1 kohdan mukaisesti.
|
|
5.1.2 |
Kaadetaan 1,0 g edellä kuvatulla tavalla käsiteltyä öljyä 25 ml:n erlenmeyer-pulloon (3.1) ja liuotetaan se 10 ml:aan kehitysliuosta (4.10). Liuoksen annetaan seistä vähintään 15 minuuttia ennen silikageelikolonnikromatografiaa. Jos liuos on sameaa, se sentrifugoidaan optimaalisten edellytysten varmistamiseksi kromatografiaa varten. (Voidaan käyttää käyttövalmiita 500 mg:n SPE-silikageelipatruunoita.) |
|
5.1.3 |
Kromatografiakolonnin esikäsittely Kolonniin (3.3) kaadetaan noin 30 ml kehitysliuosta (4.10) ja kolonnin alaosaan työnnetään lasisauvalla pumpulituppo; painetaan tuppoa ilman poistamiseksi. Valmistetaan dekantterilasissa suspensio, jossa on 25 g silikageeliä (4.1) ja noin 80 ml kehitysliuosta, ja kaadetaan se suppilon avulla kolonniin. Varmistetaan, että kaikki silikageeli on syötetty kolonniin; pestään kehitysliuoksella (4.10), avataan hana ja annetaan nesteen tulla pylväästä, kunnes sen pinta on noin 2 mm piihappogeelin yläpinnan yläpuolella. |
|
5.1.4 |
Kolonnikromatografia Punnitaan 25 ml:n erlenmeyer-pulloon (3.1) tarkasti 1,0 g 5.1 kohdan mukaisesti valmistettua näytettä. Liuotetaan näyte 10 ml:aan kehitysliuosta (4.10). Kaadetaan liuos 5.1.3 kohdan mukaisesti valmisteltuun kromatografikolonniin. Vältetään koskemasta kolonnin pintaa. Hana avataan ja liuottimen annetaan tulla pylväästä, kunnes sen pinta on silikageelin pinnan tasolla. Annetaan kehittyä 150 ml:ssa kehitysliuosta. Säädetään virtaukseksi 2 ml/minuutissa (siten että 150 ml valuu 60–70 minuutissa). Eluaatti kerätään 250 ml:n taarattuun kolviin. Liuotin haihdutetaan tyhjiössä ja sen jäänteet poistetaan typpivirtauksen avulla. Punnitaan pullo ja lasketaan kerätty uute. (Jos käytetään käyttövalmiita SPE-silikageelipatruunoita, toimitaan seuraavasti: Lisätään 1 ml liuosta (5.1.2) patruunoihin, jotka on etukäteen käsitelty 3 ml:lla n-heksaania. Kun liuos on suodattunut, annetaan kehittyä 4 ml:ssa n-heksaania/dietyylietteriä 9/1 (V/V). Eluaatti kerätään 10 ml:n putkeen ja haihdutetaan kuiviin typpivirtauksen alla. Kuiva jäännös käsitellään haimalipaasin (5.2) avulla. Rasvahappokoostumus on ehdottomasti tarkistettava sekä ennen SPE-patruunan käyttöä että sen jälkeen. |
5.2 Hydrolyysi haimalipaasin avulla
|
5.2.1 |
Mitataan sentrifugin putkeen 0,1 g 5.1 kohdan mukaisesti valmisteltua öljyä. Lisätään 2 ml puskuriliuosta (4.6), 0,5 ml natriumkolaattiliuosta (4.7) ja 0,2 ml kalsiumkloridiliuosta sekoittaen hyvin jokaisen lisäyksen jälkeen. Putki suljetaan hiotulla tulpalla ja asetetaan heti termostoituun hauteeseen, jonka lämpötila on 40 °C ± 0,5. |
|
5.2.2 |
Putkeen lisätään 20 mg lipaasia, ravistetaan varovasti (niin että tulppa ei pääse kastumaan), asetetaan putki termostoituun hauteeseen tasan 2 minuutiksi ja poistetaan, minkä jälkeen ravistetaan voimakkaasti tasan 1 minuutti ja annetaan jäähtyä. |
|
5.2.3 |
Lisätään 1 ml dietyylieetteriä, suljetaan pullo ja ravistetaan voimakkaasti, sentrifugoidaan ja siirretään eetteriliuos mikroruiskulla puhtaaseen ja kuivaan putkeen. |
5.3 Silanoitujen johdannaisten ja kaasukromatografian valmistelu
|
5.3.1 |
Lisätään mikroruiskulla 10 ml:n kartiopohjaiseen putkeen 100 μl liuosta (5.2.3). |
|
5.3.2 |
Liuotin haihdutetaan heikossa typpivirrassa, lisätään 20 μl silylointireagenssia (4.15), suljetaan putki tulpalla ja annetaan seistä 20 minuuttia. |
|
5.3.3 |
Lisätään 1–5 ml n-heksaania (kromatografiaolosuhteiden mukaisesti). Tuloksena on liuos kaasukromatografiaa varten. |
5.4 Kaasukromatografia
Käyttöolosuhteet ovat seuraavat:
— Injektorin (kolonniin liitetty kylmäinjektori) lämpötila matalampi kuin liuoksen kiehumislämpötila (68 °C),
— Detektorin lämpötila: 350 °C,
— Kolonnin lämpötila: uunin lämpötila ohjelmoidaan seuraavasti: 60 °C yhden minuutin ajan, lisätään 15 °C minuutissa kunnes lämpötila on 180 °C, minkä jälkeen lisätään 5 °C minuutissa kunnes lämpötila on 340 °C, minkä jälkeen lämpötila pidetään 340 °C:ssa 13 minuutin ajan,
— Kantajakaasut: vety tai helium sopivalla lineaarinopeudella kuvassa 1 esitetyn resoluution saavuttamiseksi. C54-triglyseridin retentioajan on oltava 40 ± 5 minuuttia (ks. kuva 2). (Jäljempänä esitetyt käyttöolosuhteet ovat ohjeellisia. Käyttäjän on optimoitava ne halutun resoluution saavuttamiseksi. 2-glyseryylimonopalmitaatin piikin korkeuden on oltava vähintään 10 % piirturin asteikosta.),
— Injektoidun aineen määrä: 0,5–1 μl n-heksaaniliuosta (5 ml) (5.3.3.).
5.4.1 Piikkien tunnistaminen
Yksittäiset monoglyseridit tunnistetaan retentioaikojen perusteella ja suhteessa niihin, jotka on saatu samoissa olosuhteissa määritetyillä monoglyseridien standardiseoksilla.
5.4.2 Kvantitatiivinen arviointi
Jokaisen piikin pinta-ala lasketaan elektronisen integraattorin avulla.
6. TULOSTEN ESITTÄMINEN
Glyseryylimonopalmitaatin prosenttiosuus lasketaan sitä vastaavan piikin suhteellisena osuutena kaikkien monoglyseridien piikkien yhteenlasketusta pinta-alasta (ks. kuva 2) seuraavan kaavan mukaisesti:
Glycéril monopalmitate (%):
NdT: Glycéril monopalmitate = glyseryylimonopalmitaatti jossa:
|
Ax |
= |
glyseryylimonopalmitaatin piikin pinta-ala |
|
ΣA |
= |
kaikkien monoglyseridien piikkien pinta-alojen summa. |
Tulos ilmoitetaan yhden desimaalin tarkkuudella.
7. MÄÄRITYSSELOSTE
Määritysselosteessa on oltava:
— viittaus tähän menetelmään,
— näytteen tunnistamiseksi tarvittavat tiedot,
— määrityksen tulos,
— poikkeamiset tästä menetelmästä riippumatta siitä, johtuvatko ne asianomaisten päätöksestä vai jostain muusta syystä,
— laboratorion tunnistetiedot, määrityspäivä ja määrityksestä vastaavien allekirjoitukset.
Kuva 1
Kromatogrammi silylointireaktion tuotteista, saatu lipaasikäsittelyllä jalostetusta oliiviöljystä, johon lisätty 20 % esteröityä öljyä (100 %).
Selityksiä:: Acides gras libres = vapaat rasvahapot Huile d’olive raffinée = jalostettu oliiviöljy + 20 % huile estérifiée = + 20 % esteröityä öljyä 1–2 monopalmitine = 1–2-monopalmitiini 1–2 mono C18 insat. = tyydyttymätön C18, 1–2-mono- Squalene = skvaleeni
Kuva 2
Kromatogrammi:
|
A) |
esteröimätön oliiviöljy, lipaasikäsittelyn jälkeen; silyloinnin jälkeen; näissä olosuhteissa (kapillaarikolonni 8–12 m) vahajae eluoituu samassa ajassa kuin diglyseridijae tai hieman sen jälkeen. Triglyseridipitoisuus saa lipaasikäsittelyn jälkeen olla enintään 15 %. 
Merkkien selitykset::
|
Kromatogrammi:
|
B) |
esteröity öljy lipaasikäsittelyn jälkeen; silyloinnin jälkeen; näissä olosuhteissa (kapillaarikolonni 8–12 m) vahajae eluoituu samassa ajassa kuin diglyseridijae tai hieman sen jälkeen. Triglyseridipitoisuus saa lipaasikäsittelyn jälkeen olla enintään 15 % 
Merkkien selitykset:
|
8. SELITYKSIÄ
LIPAASIN VALMISTUS
Myynnissä on lipaaseja, joiden aktiivisuus on tyydyttävä. On myös mahdollista valmistaa niitä laboratoriossa seuraavasti:
Jäähdytetään 5 kg tuoretta sian haimaa 0 °C:seen. Poistetaan ympäröivä kiintorasva ja kalvot ja jauhetaan sekoittimessa niin, että syntyy tahnamainen neste. Tahnaan lisätään 2,5 l vedetöntä asetonia ja sekoitetaan 4–6 tuntia, minkä jälkeen liuos sentrifugoidaan. Jäännöstä uutetaan vielä kolme kertaa samalla tilavuusmäärällä vedetöntä asetonia, sitten kaksi kertaa asetonin ja dietyylieetterin seoksella 1:1 (V/V) ja kaksi kertaa dietyylieetterillä.
Jäännös kuivataan tyhjiössä 48 tuntia, jotta saadaan stabiili jauhe, joka säilyy kauan jääkaapissa ja kuivissa olosuhteissa.
LIPAASIAKTIIVISUUDEN TARKISTAMINEN
Valmistetaan oliiviöljyemulsio seuraavasti:
Sekoitetaan 165 ml arabikumiliuosta (100 g/l), 15 g jäämurskaa ja 20 ml neutraloitua öljyä sekoittimella.
Lisätään 50 ml:n dekantterilasiin 10 ml tätä emulsiota, sitten 0,3 ml natriumkolaattiliuosta (0,2 g/ml) ja sitten 20 ml tislattua vettä.
Dekantterilasi asetetaan termostoituun hauteeseen, jonka lämpötila on 37 °C. Upotetaan pH-mittarin elektrodit nesteeseen ja asetetaan spiraalisekoitin paikoilleen.
Lisätään natriumhydroksidiliuosta (0,1 N) tipoittain byretin avulla, kunnes pH on 8,3.
Lisätään sama tilavuusmäärä lipaasijauheen vesisuspensiota (0,1 g/ml lipaasia). Heti kun pH on 8,3, käynnistetään sekuntikello ja aloitetaan natriumhydroksidiliuoksen tiputtaminen sellaisella nopeudella, että pH pysyy koko ajan 8,3:ssa. Liuoksen kulutus luetaan joka minuutti.
Tiedot kirjataan koordinaatistoon, jossa x-akselilla on aika ja y-akselilla on pH:n säilyttämiseen tarvittavan emäsliuoksen määrä millilitroina. Tuloksena on oltava lineaarinen kuvaaja.
Lipaasiaktiviteetti, joka mitataan lipaasiyksikköinä mg:aa kohden, saadaan seuraavasti:
jossa:
|
A |
aktiviteetti lipaasiyksikköä/mg |
|
V |
natriumhydroksidiliuoksen (0,1 N) määrä millilitroina minuutissa (kuvaajasta laskettuna) |
|
N |
natriumhydroksidiliuoksen normaalisuus |
|
m |
lipaasinäytteen paino mg:oina. |
Lipaasiyksikkö on se määrä entsyymiä, joka tarvitaan vapauttamaan 10 mikroekvivalenttia happoa minuutissa.
▼M20 —————
LIITE IX
SPEKTROFOTOMETRINEN MÄÄRITYS ULTRAVIOLETTIVALOSSA
JOHDANTO
Spektrofotometrinen määritys ultraviolettivalossa antaa tietoa rasvan laadusta ja säilymisestä sekä muutoksista, joita käsittelyt ovat siinä aiheuttaneet. Tässä menetelmässä käytetyillä aallonpituuksilla tapahtuva absorptio johtuu konjugoiduista dieeni- ja trieenijärjestelmistä, jotka ovat peräisin hapetusprosesseista ja/tai puhdistusmenetelmistä. Nämä absorptiot ilmaistaan ominaisekstinktiona
(ekstinktio, joka tapahtuu tiettyyn liuottimeen valmistetun 1-prosenttisen w/v-rasvaliuoksen 10 mm:n paksuisessa kerroksessa), josta tavallisesti käytetään merkkiä K (kutsutaan myös ekstinktiokertoimeksi).
1. SOVELTAMISALA
Tässä liitteessä kuvataan menetelmä, jolla oliiviöljylle tehdään spektrofotometrinen määritys ultraviolettivalossa.
2. MENETELMÄN PERIAATE
Näyte liuotetaan määrättyyn liuottimeen ja liuoksen absorbanssi mitataan tietyllä aallonpituudella käyttäen vertailuliuoksena puhdasta liuotinta.
Lasketaan spesifinen ekstinktio iso-oktaanissa aallonpituuksilla 232 nm ja 268 nm tai sykloheksaanissa aallonpituuksilla 232 nm ja 270 nm, kun pitoisuus on 1 % w/v 10 mm:n kyvetissä.
3. VÄLINEISTÖ
|
3.1 |
Spektrometri, jolla voidaan mitata ultraviolettivalon aallonpituuksia (220–360 nm) yhden nanometrin tarkkuudella. Spektrometrin aallonpituus- ja absorbanssiasteikkojen tarkkuuden ja uusittavuuden sekä hajavalon osalta suositellaan säännöllisiä tarkastuksia.
|
|
3.2 |
Suorakaiteen muotoisia kvartsikyvettejä kansineen, optinen väli 10 mm, joilla voidaan mitata ultraviolettivalon aallonpituuksia (220–360 nm). Vedellä tai muulla sopivalla liuottimella täytettynä kyvettien antamien lukemien ero saa olla enintään 0,01 ekstinktioyksikköä. |
|
3.3 |
A-luokan mittapulloja, 25 ml. |
|
3.4 |
Analyysivaaka, jonka tarkkuus 0,0001 g. |
4. REAGENSSIT
Kaikkien määrityksessä käytettävien reagenssien on oltava hyväksyttyä analyysilaatua, jollei toisin mainita, ja veden on oltava joko tislattua tai demineralisoitua tai vastaavaa puhtausastetta.
Liuotin: Iso-oktaani (2,2,4-trimetyylipentaani) mitattavaksi aallonpituudella 232 nm ja 268 nm ja sykloheksaani mitattavaksi aallonpituudella 232 nm ja 270 nm; liuottimen absorbanssin on oltava alle 0,12 aallonpituudella 232 nm ja alle 0,05 aallonpituudella 270 nm suhteessa tislattuun veteen, mitattuna 10 mm:n kyvettiin.
5. MENETTELY
|
5.1 |
Näytteen on oltava täysin homogeenista eikä siinä saa olla suspendoituneita epäpuhtauksia. Jos näin ei ole, näyte suodatetaan paperin läpi noin 30 °C:ssa. |
|
5.2 |
Punnitaan noin 0,25 g näytettä (1 mg:n tarkkuudella), joka on esikäsitelty edellä kuvatulla tavalla, 25 ml:n mittapulloon, joka täytetään merkkiin liuottimella ja homogenoidaan. Syntyvän liuoksen on oltava täysin kirkasta. Jos ilmenee sameutta tai sakkaa, liuos suodatetaan nopeasti paperin läpi. HUOM. Yleensä 0,25–0,30 g:n massa on riittävä neitsyt- ja ekstraneitsytoliiviöljyjen absorbanssimittauksiin aallonpituuksilla 268 ja 270 nm. Aallonpituudella 232 nm tehtäviin mittauksiin näytettä tarvitaan yleensä 0,05 g, joten tavallisesti valmistetaan kaksi erillistä liuosta. Oliivin puristemassaöljyjen, jalostettujen oliiviöljyjen ja väärennettyjen oliiviöljyjen absorbanssimittauksiin tarvitaan niiden suuremman absorbanssin vuoksi yleensä pienempi näyte, esim. 0,1 g. |
|
5.3 |
Tarvittaessa korjataan perusviiva (220–290 nm) molemmissa kvartsikyveteissä (näyte ja vertailuliuos), täytetään näytteen sisältävä kvartsikyvetti testiliuoksella ja mitataan ekstinktiot aallonpituuksilla 232, 268 ja 270 nm vertailuliuoksena käytettyä liuotinta vastaan. Saatujen ekstinktioarvojen on oltava 0,1–0,8 tai spektrofotometrin lineaarisuusalueella, joka on tarkistettava. Jollei tällaisia tuloksia saada, koe on uusittava käyttäen vahvempia tai laimeampia liuoksia tarpeen mukaan. |
|
5.4 |
Kun absorbanssi on mitattu aallonpituudella 268 tai 270 nm, mitataan aallonpituudet λmax, λmax + 4 ja λmax – 4. Näitä absorbanssiarvoja käytetään ominaisekstinktion variaation (ΔΚ) määrittämiseksi. HUOM. Aallonpituutena λmax pidetään liottimena käytetyn isotaanin osalta 268 nm ja sykloheksaanin osalta 270 nm. |
6 TULOSTEN ESITTÄMINEN
|
6.1 |
Lasketaan ominaisekstinktiot (ekstinktiokertoimet) eri aallonpituuksilla seuraavasta kaavasta:
jossa
ilmaistuna kahden desimaalin tarkkuudella. |
|
6.2 |
Ominaisekstinktion variaatio (ΔΚ) Ominaisekstinktion absoluuttisen arvon variaatio (ΔΚ) saadaan seuraavalla kaavalla:
jossa Km on ominaisekstinktio maksimiabsorbtion aallopituuden ollessa 270 ja 268 nm käytetystä liuottimesta riippuen. Tulokset ilmaistaan kahden desimaalin tarkkuudella. |
LIITE X
RASVAHAPPOJEN METYYLIESTERIEN MÄÄRITTÄMINEN KAASUKROMATOGRAFISELLA MENETELMÄLLÄ
1. SOVELTAMISALA
Tässä liitteessä esitetään ohjeet kasvirasvoissa ja -öljyissä esiintyvien vapaiden ja sidottujen rasvahappojen määrittämiseksi kaasukromatografisella menetelmällä sen jälkeen kun ne on muunnettu rasvahappojen metyyliestereiksi.
Triasyyliglyseridien sidotut rasvahapot ja esteröintimenetelmästä riippuen vapaat rasvahapot muunnetaan rasvahappojen metyyliestereiksi, jotka määritetään kaasukromatografisella menetelmällä.
Tässä liitteessä kuvatun menetelmän avulla voidaan määrittää rasvahappojen metyyliesterit C12–C24, mukaan lukien tyydyttyneet, cis-kertatyydyttymättömät ja trans-kertatyydyttymättömät sekä cis-monityydyttymättömät ja trans-monityydyttymättömät rasvahappojen metyyliesterit.
2. PERIAATE
Rasvahappojen metyyliesterien kvantitatiiviseen määritykseen käytetään kaasukromatografista menetelmää. Rasvahappojen metyyliesterit valmistellaan A osan mukaisesti. Ne syötetään injektoriin ja höyrystetään. Rasvahappojen metyyliesterit erotetaan analyyttisissä kolonneissa, joilla on tietty polariteetti ja pituus. Rasvahappojen metyyliesterien havaitsemiseksi käytetään liekki-ionisaatiodetektoria. Määritysedellytykset esitetään B osassa.
Kun rasvahappojen metyyliestereitä määritetään liekki-ionisaatiodetektorin avulla, kantajakaasuna (liikkuva faasi) voidaan käyttää vetyä tai heliumia. Vety nopeuttaa erottumista ja antaa terävämmät piikit. Stationäärifaasi on mikroskooppisen ohut nestekerros kvartsilasista tehdyn inertin kiinteän pinnan päällä.
Kun analysoitavat haihtuvat yhdisteet kulkevat kapillaarikolonnissa, ne joutuvat vuorovaikutukseen kolonnin sisäpintaa verhoavan stationäärifaasin kanssa. Koska eri yhdisteiden vuorovaikutus on erilainen, ne eluoituvat eri aikaan. Tätä kutsutaan yhdisteen retentioajaksi tietyn määritysparametriyhdistelmän osalta. Eri yhdisteet tunnistetaan retentioaikoja vertaamalla.
A OSA
OLIIVIÖLJYN JA OLIIVIN PURISTEMASSAÖLJYN RASVAHAPPOJEN METYYLIESTERIEN VALMISTAMINEN
1. SOVELTAMISALA
Tässä osassa kuvataan rasvahappojen metyyliesterien valmistamista. Siihen sisältyy menetelmät oliiviöljyn ja oliivin puristemassaöljyn rasvahappojen metyyliesterien valmistamiseksi.
2. SOVELTAMISALA
Oliiviöljyn ja oliivin puristemassaöljyn rasvahappojen metyyliesterit valmistetaan transesteröimällä kaliumhydroksidin metanoliliuoksella huoneenlämmössä. Näytteen puhdistustarve ennen transesteröintiä riippuu näytteen vapaiden rasvahappojen pitoisuudesta ja määriteltävästä analyyttisestä parametrista, ja menetelmä voidaan valita seuraavan taulukon mukaisesti:
|
Öljyluokka |
Menetelmä |
|
Neitsytoliiviöljy, jonka happamuus ≤ 2,0 % |
1. Rasvahapot 2. Transrasvahapot 3. ΔECN42 (sen jälkeen kun puhdistettu silikageelillä SPE) |
|
Jalostettu oliiviöljy |
|
|
Jalostetusta oliiviöljystä ja neitsytoliiviöljystä koostuva oliiviöljy |
|
|
Jalostettu oliivin puristemassaöljy |
|
|
Oliivin puristemassaöljy |
|
|
Neitsytoliiviöljy, jonka happamuus > 2,0 % Raaka oliivin puristemassaöljy |
1. Rasvahapot (sen jälkeen kun puhdistettu silikageelillä SPE) 2. Transrasvahapot (sen jälkeen kun puhdistettu silikageelillä SPE) 3. ΔECN42 (sen jälkeen kun puhdistettu silikageelillä SPE) |
3. MENETELMÄ
3.1 Transesteröinti kaliumhydroksidin metanoliliuoksella huoneenlämmössä
3.1.1 Periaate
Metyyliesterit muodostuvat transesteröitymällä kaliumhydroksidin metanoliliuoksessa välivaiheessa ennen saippuointia.
3.1.2 Reagenssit
|
3.1.2.1 |
Metanolia, jossa enintään 0,5 % (m/m) vettä. |
|
3.1.2.2 |
Heksaania kromatografiaa varten |
|
3.1.2.3 |
Heptaania kromatografiaa varten. |
|
3.1.2.4 |
Dietyylieetteri, stabiloitu analyysia varten. |
|
3.1.2.5 |
Asetonia kromatografiaa varten. |
|
3.1.2.6 |
Eluutioliuotin öljyn puhdistamiseksi kolonni-/SPE-kromatografialla: heksaanin ja dietyylieetterin seos 87/13 (v/v). |
|
3.1.2.7 |
Kaliumhydroksidi, noin 2 M metanoliliuos: Liuotetaan 11,2 g kaliumhydroksidia 100 ml:aan metanolia. |
|
3.1.2.8 |
Piihappopatruunoita, 1 g (6 ml) kiinteäfaasiuuttoa varten. |
3.1.3 Välineistö
|
3.1.3.1 |
Kierrekorkkisia koeputkia (tilavuus 5 ml), joiden korkissa PTFE-liitos. |
|
3.1.3.2 |
Mitta- tai automaattipipetit, 2 ml ja 0,2 ml. |
3.1.4 Öljynäytteiden puhdistaminen
Näytteet on tarvittaessa puhdistettava ajamalla öljy piihappopatruunan läpi kiinteäfaasiuuttona. Piihappopatruuna (3.1.2.8) pannaan tyhjiöeluutiolaitteeseen ja pestään 6 ml:lla heksaania (3.1.2.2) ilman tyhjiötä. Kolonniin pannaan öljyliuos (noin 0,12 g) 0,5 ml:ssa heksaania (3.1.2.2). Imeytetään liuos piihappoon ja eluoidaan 10 ml:lla heksaania/dietyylioksidia (87:13 v/v) (3.1.2.6). Homogenoidaan eluaatti kokonaan ja jaetaan se kahdeksi yhtä suureksi näytteeksi. Toinen näyte haihdutetaan kuiviin alipaineessa pyöröhaihduttajassa huoneenlämmössä. Jäännös liotetaan 1 ml:aan heptaania. Saadusta liuoksesta voidaan määrittää rasvahapot kaasukromatografialla. Toinen näyte haihdutetaan ja liuotetaan jäännös 1 ml:aan asetonia triglyseridien määrittämiseksi tarvittaessa HPCL-menetelmällä.
3.1.5 Menettely
Mitataan 5 ml:n kierrekorkilliseen koeputkeen (3.1.3.1) noin 0,1 grammaa näyteöljyä. Lisätään 2 ml heptaania (3.1.2.2) ja ravistetaan. Lisätään 0,2 ml kaliumhydroksidin metanoliliuosta (3.1.2.7), suljetaan tiiviisti PTFE-liitoksella varustetulla korkilla, ravistetaan voimakkaasti 30 sekuntia. Putken annetaan seistä kunnes liuoksen pintakerros kirkastuu. Erotetaan pintakerros, jossa metyyliesterit ovat. Heptaaniliuos voidaan injektoida kromatografiin. Liuos on syytä säilyttää jääkaapissa kunnes se määritetään kromatografilla. Liuosta ei suositella säilytettäväksi yli 12:ta tuntia.
B OSA
RASVAHAPPOJEN METYYLIESTERIEN ANALYSOINTI KAASUKROMATOGRAFISELLA MENETELMÄLLÄ
1. SOVELTAMISALA
Tässä osassa annetaan yleisohjeita kapillaarikaasukromatografian käyttöön, kun tarkoituksena on määrittää A osassa kuvatulla menetelmällä saadun rasvahappojen metyyliesterien seoksen koostumus kvalitatiivisesti ja kvantitatiivisesti.
Tätä osaa ei sovelleta polymeroitujen rasvahappojen tutkimiseen.
2. REAGENSSIT
2.1 Kantajakaasu
Inertti kaasu (helium tai vety), huolellisesti kuivattu; ei saa sisältää happea yli 10 mg/kg.
Huomautus 1: Vety kaksinkertaistaa määritysnopeuden, mutta sen käyttö on vaarallista. Turvalaitteita on kuitenkin saatavana.
2.2 Apukaasut
|
2.2.1 |
Vety (puhtaus ≥ 99,9 %), ei saa sisältää orgaanisia epäpuhtauksia. |
|
2.2.2 |
Ilmaa tai happea, ei saa sisältää orgaanisia epäpuhtauksia. |
|
2.2.3 |
Typpi (puhtaus > 99 %). |
2.3 Vertailustandardi
Rasvahappojen puhtaiden metyyliestereiden seos tai sellaisen tunnetun rasvan metyyliesterit, jotka ovat mahdollisimman samanlaisia kuin tutkittava rasva. Oktadekeeni-, oktadekadieeni- ja oktadekatrieenihappojen metyyliesterien cis- ja trans-isomeerit ovat hyödyllisiä tyydyttymättömien happojen trans-isomeerien havaitsemiseksi.
Monityydyttymättömien rasvahappojen hapettumista on vältettävä.
3. VÄLINEISTÖ
Nämä ohjeet koskevat tavallista kapillaarikolonnilla varustettua kaasukromatografista laitteistoa sekä liekki-ionisaatiodetektoria.
3.1 Kaasukromatografi
Kaasukromatografissa on oltava seuraavat osat.
3.1.1 Injektiojärjestelmä
On käytettävä injektiojärjestelmää, jossa on kapillaarikolonnit, jolloin injektiojärjestelmän on oltava erityisesti suunniteltu tällaisten kolonnien kanssa käytettäväksi. Järjestelmä voi olla jakajatyyppiä tai jakajaton, kolonniin liitetty (on-column) injektori.
3.1.2 Uuni
Uunin tulee pystyä lämmittämään kolonni vähintään 260 °C:n lämpötilaan ja pitämään se valitussa lämpötilassa 0,1 °C:n tarkkuudella. Viimeksi mainittu vaatimus on erittäin tärkeä, jos käytetään kvartsilasiputkea.
Lämpötilaohjelmoidun laitteen käyttöä suositellaan kaikissa tapauksissa ja erityisesti rasvahapoille, joissa on alle 16 hiiliatomia.
3.1.3 Kapillaarikolonni
|
3.1.3.1 |
Putki, joka on valmistettu analysoitaville aineille inertistä aineesta (tavallisesti lasista tai kvartsilasista). Sisähalkaisijan on oltava 0,20–0,32 mm. Sisäpinta on käsiteltävä sopivalla menetelmällä (esim. pintakäsittely, inaktivointi) ennen kuin se päällystetään stationäärifaasikerroksella. Riittävä pituus rasvahapoille ja rasvahappojen cis- ja trans-isomeereille on 60 m. |
|
3.1.3.2 |
Stationäärifaasi, polaarista polysiloksaanityyppiä (syanosilikonit) olevat kytketyt kolonnit (kolonniverkot) ovat sopivia. Huomautus 2: On olemassa vaara, että polaariset polysiloksaanit vaikeuttavat linoleenihapon ja C20-happojen erottumista ja tunnistamista. Päällysteen on oltava ohut, 0,1–0,2 μm. |
|
3.1.3.3 |
Kolonnin kokoaminen ja esivalmistelut Tavanomaisia varotoimenpiteitä on noudatettava kapillaarikolonnien kokoamisessa, ts. kolonnin sijoittelu uuniin (tukirakenteet), liitosten valinta ja asennus (tiiviys), kolonnin päiden liittäminen injektiojärjestelmään ja detektoriin (mahdollisimman vähän kuollutta tilaa). Kantajakaasuvirta johdetaan kolonnin läpi (esimerkiksi 0,3 baaria, 30 kPa, 25 m pitkään kolonniin, jonka sisähalkaisija on 0,3 mm). Kolonni esilämmitetään ohjelmoimalla uuni niin, että lämpötila nousee 3 °C minuutissa huoneenlämmöstä sellaiseen lämpötilaan, joka on 10 °C alhaisempi kuin stationäärifaasin hajoamislämpötila. Uuni pidetään tässä lämpötilassa yhden tunnin ajan, kunnes perusviiva on tasoittunut. Lämpötila palautetaan 180 °C:seen ja työskentelyä jatketaan vakiolämpötilassa. Huomautus 3: Esivalmisteltuja kolonneja voi myös ostaa. |
3.1.4 Liekki-ionisaatiodetektori ja muuntaja-vahvistin
3.2 Ruisku
Ruiskun enimmäistilavuuden on oltava 10 μl ja jakovälin 0,1 μl.
3.3 Tiedonkeruujärjestelmä
Verkkoon yhdistettävä tiedonkeruujärjestelmä detektoreineen sekä ohjelmisto piikkien integroimiseksi ja standardoimiseksi.
4. MENETTELY
Toimenpiteet kohdissa 4.1–4.3 koskevat liekki-ionisaatiodetektorin käyttöä.
4.1 Testiolosuhteet
4.1.1 Optimaalisten koeolosuhteiden valinta kapillaarikolonneille
Kapillaarikolonnien tehokkuus- ja permeabiliteettiominaisuuksien vuoksi aineosien erottuminen ja määrityksen kesto riippuvat voimakkaasti kantajakaasun virtausnopeudesta kolonnissa. Sen vuoksi koeolosuhteet on optimoitava muuttamalla tätä parametria (eli kolonnin täytehäviötä) sen mukaan, halutaanko parantaa erotuskykyä vai saada tulos nopeasti.
Seuraavat olosuhteet ovat osoittautuneet sopiviksi rasvahappojen metyyliesterien (C4–C26) erottamiseen. Esimerkkejä kromatogrammeista esitetään lisäyksessä B:
|
Injektorin lämpötila: |
250 °C |
|
Detektorin lämpötila: |
250 °C |
|
Uunin lämpötila: |
165 °C:sta (8 min) 210 °C:seen nostaen lämpötilaa 2 °C/min |
|
Kantajakaasuna vety |
kolonnin pään paine: 179 kPa |
|
Kokonaisvirtaus: |
154,0 ml/min |
|
Jakosuhde: |
1:100 |
|
Injektiotilavuus: |
1 μl |
4.1.2 Resoluution määrittäminen (ks. lisäys A)
Viereisten piikkien I ja II resoluutio (R) lasketaan seuraavalla kaavalla:
R = 2 × ((dr(II) – d r(I))/(ω(I) + ω(II))) tai R = 2 × ((tr(II) – t r(I))/(ω(I) + ω(II))) (USP) (United States Pharmacopeia),
tai
R = 1,18 × ((tr(II) – tr(I))/(ω0,5(I) + ω0,5(II))) (EP, BP, JP, DAB), (JP (Japanese Pharmacopeia), EP (Pharmacopée Européenne), BP (British Pharmacopeia))
jossa
d r(I) on piikin I retentioetäisyys;
d r(II) on piikin II retentioetäisyys;
t r(I) on piikin I retentioaika;
t r(II) on piikin II retentioaika;
ω(I) on piikin I kannan leveys;
ω(II) on piikin II kannan leveys;
ω0,5 on piikin leveys tietyssä yhdisteessä piikin keskivälissä.
Jos ω(I) ≈ ω(II), R lasketaan seuraavilla kaavoilla:
R = (dr(II) – d r(I))/ω = (dr(II) – d r(I))/4σ
jossa
σ on keskihajonta (ks. lisäys A, kuvio 1).
Jos piikkien d r(II) – d r(I) välinen etäisyys dr on yhtä suuri kuin 4σ, resoluutiotekijä R = 1.
Jos piikit eivät ole erottuneet toisistaan kokonaan, piikkien käännepisteisiin piirretyt tangentit leikkaavat kohdan C. Jotta piikit saadaan erottumaan täysin, niiden välisen etäisyyden on oltava
d r(II) – d r(I) = 6 σ josta R = 1,5 (ks. lisäys A, kuvio 3).
5. TULOSTEN ILMOITTAMINEN
5.1 Kvalitatiivinen analyysi
Näytteen metyyliesteripiikit tunnistetaan lisäyksessä B, kuva 1, esitetyn kromatogrammin avulla, tarvittaessa interpoloimalla tai vertaamalla vertailuseosten vastaaviin metyyliesteripiikkeihin (kuten 2.3 kohdassa esitetään).
5.2 Kvantitatiivinen analyysi
5.2.1 Koostumuksen määrittäminen
Lasketaan yksittäisten rasvahappojen metyyliesterien massaosuus wi ilmaistuna prosenttiosuutena metyyliesterien massasta seuraavasti:
5.2.2 Laskentamenetelmä
5.2.2.1 Yleinen tapaus
Lasketaan tietyssä aineosassa i olevien metyyliesterien pitoisuus massaprosentteina määrittämällä piikin pinta-alan suhteellinen osuus kaikkien piikkien yhteenlasketusta pinta-alasta seuraavan kaavan avulla:
wi = (Ai/ΣA) × 100
jossa
Ai on pinta-ala yksittäisen rasvahappojen metyyliesterin i piikin alla;
ΣA on kaikkien yksittäisten rasvahappojen metyyliesterien kaikkien piikkien alla olevien pinta-alojen summa.
Tulokset ilmoitetaan kahden desimaalin tarkkuudella.
Huomautus 4: Rasvoissa ja öljyissä rasvahappojen metyyliesterien massaosuus on yhtä suuri kuin triasyyliglyseridien massaosuus grammoina 100 grammassa. Tapauksissa, joissa näin ei voida olettaa, menetellään 5.2.2.2 alakohdan mukaan.
5.2.2.2 Korjauskertoimien käyttö
Joissakin tapauksissa, esimerkiksi silloin kun rasvahapossa on vähemmän kuin 8 hiiliatomia tai hapossa on sekundaarisia ryhmiä, pinta-alat on korjattava soveltamalla erityisiä korjauskertoimia (Fci). Nämä tekijät on määriteltävä jokaisen yksittäisen välineen osalta. Tähän on käytettävä sopivia vertailumateriaaleja, joiden rasvahappokoostumus on sertifioitu vastaavilla vertailuväleillä.
Huomautus 5: Korjauskertoimet eivät ole identtiset lisäyksessä A esitettyjen teoreettisten liekki-ionisaatiodetektorin korjauskerrointen kanssa, koska niihin sisältyy muun muassa injektiojärjestelmän suorituskyky. Jos erot ovat suurempia, koko järjestelmän suorituskyky olisi tarkistettava.
Vertailuseoksen rasvahappojen metyyliesterien i prosentuaalinen massaosuus saadaan kaavasta:
wi = (mi /Σm) × 100
jossa
mi on rasvahappojen metyyliesterien i massa vertailuseoksessa;
Σm on eri aineosien massojen kokonaismäärä vertailuseoksen rasvahappojen metyyliestereinä
Lasketaan vertailuseoksen kromatogrammista rasvahappojen metyyliesterien i prosentuaalinen pinta-ala:
wi = (Ai/ΣA) × 100
jossa
Ai on rasvahappojen metyyliesterien i pinta-ala vertailuseoksessa;
ΣA on vertailuseoksen kaikkien rasvahappojen metyyliesterien pinta-alojen summa.
Näin ollen korjauskerroin Fc on
Fc = (mi × ΣA)/(Ai/Σm)
Näytteen jokaisen rasvahappojen metyyliesterin i prosentuaalinen massaosuus on:
wi = (Fi × Ai)/Σ (Fi × Ai)
Tulokset ilmoitetaan kahden desimaalin tarkkuudella.
Huomautus 6: Laskettu arvo vastaa triasyyliglyserideinä laskettua yksittäisten rasvahappojen prosentuaalista massaosuutta 100 rasvagrammaa kohden.
5.2.2.3 Sisäisen standardin käyttö
Tietyissä määrityksissä (esimerkiksi jos kaikkien rasvahappojen määriä ei tunneta, kuten silloin kun 16 ja 18 hiiliatomia sisältävien rasvahappojen ohella esiintyy neljä ja kuusi hiiliatomia sisältäviä happoja tai kun on tarpeen määrittää näytteessä olevien rasvahappojen absoluuttinen määrä) on tarpeen käyttää sisäistä standardia. Usein käytetään rasvahappoja, joissa on 5, 15 tai 17 hiiliatomia. Sisäisen standardin korjauskerroin on määritettävä tarvittaessa.
Aineen i prosentuaalinen massaosuus metyyliestereinä ilmaistuna saadaan kaavasta:
wi = (mIS × Fi × Ai)/(m × FIS × AIS)
jossa
A i on rasvahappojen metyyliesterien i pinta-ala;
A IS on sisäisen standardin pinta-ala;
F i on rasvahapon i korjauskerroin rasvahapon metyyliestereinä ilmaistuna;
F IS on sisäisen standardin korjauskerroin;
m on näytteen massa milligrammoina;
m IS on sisäisen standardin massa milligrammoina.
Tulokset ilmoitetaan kahden desimaalin tarkkuudella.
6. KOESELOSTE
Koeselosteessa on ilmoitettava metyyliestereiden valmistusmenetelmät ja käytetty kaasukromatografinen menetelmä. Siinä on myös mainittava kaikki menettelylliset yksityiskohdat, joista ei määrätä tässä standardimenetelmässä, tai joita pidetään valinnaisina, sekä kaikki tapahtumat, jotka ovat voineet vaikuttaa tuloksiin.
Koeselosteessa on oltava kaikki tarpeelliset tiedot, jotka tarvitaan näytteen täydelliseen tunnistamiseen.
7. TARKKUUS
7.1 Monilaboratoriotestin tulokset
Yksityiskohtaiset tiedot menetelmän tarkkuutta koskevasta monilaboratoriotestistä esitetään standardin IOC/T.20/Asiak. nro 33 liitteessä C. Tästä monilaboratoriotestistä saatuja arvoja ei välttämättä voi soveltaa muihin kuin esitettyihin pitoisuusalueisiin ja matriiseihin.
7.2 Toistettavuus
Kahden riippumattoman yksittäisen testituloksen, jotka sama henkilö on saanut samassa laboratoriossa samalla menetelmällä ja samalla välineistöllä täysin samanlaiselle testimateriaalille lyhyen ajan kuluessa, absoluuttinen ero saa korkeintaan 5 prosentissa tapauksista olla suurempi kuin standardin IOC/T.20/Asiak. nro 33 liitteessä C olevissa taulukoissa 1–14 esitetty r.
7.3 Uusittavuus
Kahden yksittäisen testituloksen, jotka eri henkilöt ovat saaneet eri laboratorioissa samalla menetelmällä mutta eri välineistöllä täysin samanlaiselle testimateriaalille, absoluuttinen ero saa korkeintaan 5 prosentissa tapauksista olla suurempi kuin standardin IOC/T.20/Asiak. nro 33 liitteessä C olevissa taulukoissa 1–14 esitetty R.
Lisäys A
Kuvio 1
Leveys ω0,5 kolmion (ABC) puolen välin korkeudella ja leveys b kolmion (NPM) puolen välin korkeudella.
|
Kuvio 2 |
Kuvio 3 |
|
|
|
Lisäys B
Kuvio 1
Metylaatiomenetelmällä kylmässä saatu oliivin puristemassaöljyn kromatogrammi
Kromatogrammin piikit vastaavat metyyliestereitä, ellei toisin mainita.
LIITE XI
HAIHTUVIEN HALOGEENILIUOTTIMIEN PITOISUUDEN MÄÄRITTÄMINEN OLIIVIÖLJYSTÄ
1 PERIAATE
Kaasukromatografinen määritys kaasutilatekniikalla (head space).
2 VÄLINEISTÖ
|
2.1 |
Kaasukromatografialaitteisto, johon kuuluu elektroninkaappausdetektori (ECD). |
|
2.2 |
Kaasutilalaitteisto (head space). |
|
2.3 |
Kaasukromatografiakolonni, lasinen, pituus 2 m, halkaisija 2 mm, stationäärifaasi. OV101 10 % tai vastaava, kalsinoituun, happopestyyn ja silanoituun piimaahan imeytettynä, hiukkaskoko 80—100 mesh. |
|
2.4 |
Kantaja- ja apukaasu: kaasukromatografiaan tarkoitettua typpeä, joka soveltuu elektroninkaappausdetektorille. |
|
2.5 |
Teflonpinnoitteisia lasipulloja, 10—15 ml, varustettu alumiinitulpalla, jossa on sovitus näytteenottoruiskua varten. |
|
2.6 |
Ilmatiiviisti sulkevat puristimet |
|
2.7 |
Kaasuruisku, 0,5—2 ml. |
3 REAGENSSIT
Standardi: kaasukromatografista laatua olevia haihtuvia halogeeniliuottimia.
4 SUORITUS
|
4.1 |
Punnitaan tarkasti noin 3 g öljyä lasipulloon, jota ei enää käytetä uudestaan; suljetaan se ilmatiiviisti. Pullo asetetaan termostaattiin 70 °C:seen yhdeksi tunniksi. Imetään ruiskulla varovasti 0,2—0,5 ml kaasutilaa. Injektoidaan tämä näyte kaasukromatografialaitteiston kolonniin, joka on säädetty seuraavasti: — injektorin lämpötila: 150 °C, — kolonnin lämpötila: 70—80 °C, — detektorin lämpötila: 200—250 °C. |
|
4.2 |
Vertailuliuokset. Valmistetaan standardiliuoksia puhdistetusta oliiviöljystä, jossa ei ole lainkaan liuottimia, pitoisuudeltaan 0,05 — 1 ppm (mg/kg), jotka vastaavat näytteen oletettua pitoisuutta. Halogeeniliuottimia voidaan tarvittaessa laimentaa pentaanilla. |
|
4.3 |
Kvantitatiivinen määritys. Verrataan toisiinsa näytteen piikkien korkeuksia tai pinta-aloja sekä sen standardiliuoksen piikkien korkeuksia ja pinta-aloja, jonka pitoisuuden oletetaan olevan lähinnä näytteen pitoisuutta. Jos suhteellinen poikkeama on suurempi kuin 10 %, määritys on tehtävä uudestaan käyttämällä eri standardiliuosta, kunnes suhteellinen poikkeama on alle 10 %. Määrä lasketaan yksittäisten injektioiden keskiarvon perusteella. |
|
4.4 |
Tulosten esittäminen: ppm (mg/kg). Toteamisraja tässä menetelmässä on 0,01 mg/kg. |
LIITE XII
KANSAINVÄLISEN OLIIVINEUVOSTON MENETELMÄ NEITSYTOLIIVIÖLJYJEN AISTINVARAISTA ARVIOINTIA VARTEN
1. TARKOITUS JA SOVELTAMISALA
Tässä liitteessä kuvatulla kansainvälisellä menetelmällä on tarkoitus määrittää menettely, jota käytetään Euroopan unionin ja neuvoston asetuksen (EU) N:o 1308/2013 ( 4 ) liitteessä VII olevan VIII osan 1 kohdassa tarkoitettujen neitsytoliiviöljyjen aistinvaraisten ominaisuuksien arvioinnissa, ja vahvistaa menetelmä neitsytoliiviöljyjen luokittelemiseksi kyseisten ominaisuuksien perusteella. Siinä annetaan myös valinnaisia pakkausmerkintöjä koskevia ohjeita.
Kuvattua menetelmää sovelletaan ainoastaan neitsytoliiviöljyihin ja niiden luokitteluun tai niiden pakkausmerkintöihin raadissa havaittujen virheiden ja hedelmäisyyden voimakkuuden perusteella. Raadin muodostaa ryhmä valikoituja, koulutettuja ja valvottuja maistajia.
Tässä liitteessä mainituista kansainvälisen oliivineuvoston standardeista käytetään niiden viimeisintä saatavilla olevaa versiota.
2. YLEINEN PERUSSANASTO AISTINVARAISTA ARVIOINTIA VARTEN
Viitataan standardiin IOC/T.20 / Asiak. nro 4 Sensory Analysis: General Basic Vocabulary (Aistinvarainen arviointi: yleinen perussanasto).
3. ERITYISSANASTO
3.1. Negatiiviset ominaisuudet
Tunkkainen, sakkainen Maku on ominainen öljylle, joka on saatu kasoina tai muutoin sellaisissa olosuhteissa varastoiduista oliiveista, että anaerobinen käyminen on päässyt pitkälle, tai öljylle, joka on ollut kosketuksissa niin ikään anaerobiseen käymisprosessiin joutuneen tynnyrien ja sammioiden pohjasakan kanssa.
Homeinen, kostea, maa Maku on ominainen sellaisista oliiveista saadulle öljylle, joita on säilytetty useita päiviä kosteissa olosuhteissa siten, että niihin on päässyt kasvamaan sienirihmastoa ja hometta, tai pesemättömistä maahan pudonneista tai mutaisista oliiveista saadulle öljylle.
Viinimäinen, etikkainen, happoinen, hapan Öljylle ominainen viiniä tai etikkaa muistuttava maku johtuu pääasiassa oliivien tai huonosti pestyissä puristusmatoissa olevien oliivimassajäännösten aerobisesta käymisestä, joka johtaa etikkahapon, etyyliasetaatin ja etanolin muodostumiseen.
Eltaantunut Maku on ominainen vahvasti hapettuneelle öljylle.
Jäätyneet oliivit (puumainen, kostea) Maku on ominainen puussa jäätyneistä oliiveista saadulle öljylle.
3.1.1 Muut negatiiviset ominaisuudet
|
Paistunut tai palanut |
Maku on ominainen öljylle, jota on kuumennettu valmistuksen aikana liikaa ja/tai liian pitkään, varsinkin kun tahnaa sekoitetaan ja kuumennetaan samanaikaisesti ja se tehdään sopimattomissa lämpöolosuhteissa. |
|
Heinämäinen, puumainen |
Maku on ominainen kuivuneista oliiveista tuotetulle öljylle. |
|
Karkea |
Toisinaan vanha öljy aiheuttaa paksun, tahmean suutuntuman. |
|
Rasvainen |
Öljyn maku muistuttaa petrolia, rasvaa tai mineraaliöljyä. |
|
Kasvisvesi |
Maku, joka syntyy, kun öljy on ollut kauan kosketuksissa käymisprosessiin joutuneen kasvisveden kanssa. |
|
Suolavesi |
Maku johtuu siitä, että öljy on saatu suolaliemessä säilötyistä oliiveista. |
|
Metallinen |
Metallia muistuttava maku on ominainen öljylle, joka on ollut pitkäaikaisessa kosketuksessa metallipintojen kanssa murskauksen, sekoituksen, puristuksen tai varastoinnin aikana. |
|
Espartoheinä |
Maku on ominainen öljylle, joka on puristettu uusien espartomattojen läpi. Se voi olla erilainen sen mukaan, oliko mattojen esparto vihreää vai kuivaa. |
|
Toukkainen |
Maku on ominainen öljylle, joka on saatu oliivikärpäsen (Bactrocera oleae) toukkien pilaamista oliiveista. |
|
Kurkku |
Maku syntyy, kun öljyä on säilytetty ilmatiiviissä peltiastioissa liian kauan, ja se johtuu 2,6-nonadienaalin muodostumisesta. |
3.2 Positiiviset ominaisuudet
|
Hedelmäinen |
Oliivien lajikkeesta riippuvat hajuaistimukset ovat ominaisia hyvänlaatuisista ja tuoreista, raaoista tai kypsistä oliiveista saadulle öljylle. Ne havaitaan suoraan ja/tai nenän takaosan kautta. |
|
Karvas |
Maku on raaoista tai vielä kypsyvistä oliiveista saadun öljyn perusominaismaku, joka havaitaan kielen takaosan V:n muodostavilla vallinystyillä. |
|
Pistävä |
Pistelevä suutuntuma on ominainen satokauden alussa pääasiassa vielä raaoista oliiveista tuotetuille öljyille, ja se voidaan havaita koko suuontelossa, erityisesti kurkussa. |
3.3 Valinnaiset termit pakkausmerkintöjä varten
Raadin puheenjohtaja voi pyynnöstä todistaa, että arvioidut öljyt ovat ominaisuuksien voimakkuuden ja havaitsemisen osalta seuraavia ilmaisuja vastaavien määritelmien ja vertailuvälien mukaisia.
Positiiviset ominaisuudet (hedelmäinen, karvas ja pistävä): Aistimuksen voimakkuuden mukaan:
— Voimakas, jos asianomaisen ominaisuuden mediaani on yli 6,0,
— Keskivoimakas, jos asianomaisen ominaisuuden mediaani on yli 3,0 ja enintään 6,0,
— Mieto, jos asianomaisen ominaisuuden mediaani on enintään 3,0.
|
Hedelmäisyys |
Oliivien lajikkeesta riippuvat hajuaistimukset ovat ominaisia hyvänlaatuisista ja tuoreista oliiveista saadulle öljylle, jossa raakoja ja kypsiä oliiveja on samassa suhteessa. Ne havaitaan suoraan ja/tai nenän takaosan kautta. |
|
Vihreä hedelmäisyys |
Oliivien lajikkeesta riippuvat hajuaistimukset tuovat mieleen vihreät hedelmät. Ne ovat ominaisia raaoista, hyvänlaatuisista ja tuoreista oliiveista saadulle öljylle. Ne havaitaan suoraan ja/tai nenän takaosan kautta. |
|
Kypsä hedelmäisyys |
Oliivien lajikkeesta riippuvat hajuaistimukset tuovat mieleen kypsät hedelmät. Ne ovat ominaisia hyvänlaatuisista ja tuoreista oliiveista saadulle öljylle. Ne havaitaan suoraan ja/tai nenän takaosan kautta. |
|
Tasapainoinen öljy |
Öljy ei ole epätasapainossa; epätasapainolla tarkoitetaan sellaisen öljyn haju- ja makuaistimusta sekä suutuntumaa, jossa karvauden ja pistävyyden mediaanit ovat enintään 2,0 yksikköä korkeampia kuin hedelmäisyyden mediaani. |
|
Mieto öljy |
Karvauden mediaani ja pistävyyden mediaani ovat öljyssä 2,0 tai vähemmän. |
Ilmaisujen luettelo aistimuksen voimakkuuden mukaan:
|
Aistinvaraisessa arviointitodistuksessa käytettävät ilmaisut |
Ominaisuuden mediaani |
|
Hedelmäisyys |
— |
|
Kypsä hedelmäisyys |
— |
|
Vihreä hedelmäisyys |
— |
|
Mieto hedelmäisyys |
≤ 3,0 |
|
Keskivoimakas hedelmäisyys |
3,0 < Me ≤ 6,0 |
|
Voimakas hedelmäisyys |
> 6,0 |
|
Mieto kypsä hedelmäisyys |
≤ 3,0 |
|
Keskivoimakas kypsä hedelmäisyys |
3,0 < Me ≤ 6,0 |
|
Voimakas kypsä hedelmäisyys |
> 6,0 |
|
Mieto vihreä hedelmäisyys |
≤ 3,0 |
|
Keskivoimakas vihreä hedelmäisyys |
3,0 < Me ≤ 6,0 |
|
Voimakas vihreä hedelmäisyys |
> 6,0 |
|
Mieto karvaus |
≤ 3,0 |
|
Keskivoimakas karvaus |
3,0 < Me ≤ 6,0 |
|
Voimakas karvaus |
> 6,0 |
|
Mieto pistävyys |
≤ 3,0 |
|
Keskivoimakas pistävyys |
3,0 < Me ≤ 6,0 |
|
Voimakas pistävyys |
> 6,0 |
|
Tasapainoinen öljy |
Karvauden ja pistävyyden mediaanit ovat enintään 2,0 yksikköä korkeampia kuin hedelmäisyyden mediaani. |
|
Mieto öljy |
Karvauden ja pistävyyden mediaanit ovat enintään 2,0. |
4. LASI ÖLJYN MAISTAMISTA VARTEN
Viitataan standardiin IOC/T.20 / Asiak. nro 5, Glass for Oil Tasting (Öljynmaistamislasi).
5. MAISTAMISHUONE
Viitataan standardiin IOC/T.20 / Asiak. nro 6, Guide for the Installation of a Test Room (Maistamishuoneen suunnittelu).
6. TARVIKKEET
Seuraavien tarvikkeiden, joita maistaja tarvitsee voidakseen suoriutua tehtävästään, on oltava jokaisessa arvostelukopissa käden ulottuvilla:
— laseja (standardoituja), joissa tunnuksella merkityt näytteet peitetään kellolasilla ja säilytetään 28 °C ± 2 °C:n lämpötilassa,
— profiililomake (ks. kuva 1) paperitulosteena tai tiedostona edellyttäen, että profiililomakkeen käyttöä koskevat ehdot täyttyvät; tarvittaessa lomakkeen käyttöohjeet,
— kuulakärkikynä tai pysyvä muste,
— tarjottimia, joilla omenalohkoja ja/tai vettä, hiilihapotettua vettä ja/tai korppuja,
— lasillinen huoneenlämpöistä vettä,
— 8.4 ja 9.11 kohdassa luetellut yleiset säännöt,
— sylkykuppeja.
7. RAADIN PUHEENJOHTAJA JA MAISTAJAT
7.1. Raadin puheenjohtaja
Raadin puheenjohtajalla on oltava asianmukainen koulutus ja asiantuntemusta niistä öljyistä, joita työn kuluessa tulee käsiteltäväksi. Puheenjohtaja on raadin avainhenkilö ja vastaa sen organisaatiosta ja toiminnasta.
Raadin puheenjohtajan työ edellyttää peruskoulutusta aistinvaraisen arvioinnin välineisiin, aistinvaraisia taitoja, huolellisuutta kokeiden valmistelussa, järjestämisessä ja toteuttamisessa sekä taitoa ja kärsivällisyyttä suunnitella ja toteuttaa kokeet tieteellisellä tavalla.
Puheenjohtaja on yksin vastuussa maistajien valinnasta, koulutuksesta ja valvonnasta, jotta näiden soveltuvuus tehtäväänsä säilyy riittävän hyvänä. Puheenjohtaja vastaa siten myös maistajien arvioinnista, jonka on aina oltava objektiivista ja jota varten puheenjohtajien on kehitettävä erityiset kokeisiin perustuvat menettelyt ja hyvin perustellut hyväksyntä- ja hylkäämisperusteet. Viitataan standardiin IOC/T.20 / Asiak. nro 14, Guide for the selection, training and monitoring of skilled virgin olive oil tasters (Neitsytoliiviöljyn pätevien maistajien valinta-, koulutus- ja valvontaopas).
Raadin puheenjohtaja on vastuussa raadin toiminnasta ja siten sen suorittamasta arvioinnista, josta puheenjohtajan on esitettävä luotettavaa ja objektiivista näyttöä. Puheenjohtajan on kaikissa tapauksissa aina voitava osoittaa, että menetelmä ja maistajat ovat hänen hallinnassaan. Suositellaan, että raati kalibroidaan määräajoin (IOC/T.20 / Asiak. nro 14, 5 §).
Puheenjohtaja on viime kädessä vastuussa raadin asiakirjojen säilyttämisestä. Asiakirjojen on aina oltava jäljitettävissä. Hänen on noudatettava aistinvaraisen arvioinnin varmistamista ja laatua koskevien kansainvälisten standardien vaatimuksia ja varmistettava aina näytteiden nimettömyys.
Puheenjohtaja vastaa välineistön ja tarvittavien laitteiden inventoinnista ja siitä, että ne ovat tämän menetelmän edellyttämien eritelmien mukaisia sekä asianmukaisesti puhdistettuja ja huollettuja. Hänen on varmistettava, että siitä säilytetään kirjalliset todisteet, samoin kuin koeolosuhteiden vaatimustenmukaisuudesta.
Puheenjohtaja vastaa näytteiden vastaanotosta ja säilyttämisestä sen jälkeen, kun ne saapuvat laboratorioon, samoin kuin niiden varastoinnista kokeiden jälkeen. Puheenjohtajan on edellä mainituissa toimissa aina varmistettava, että näytteet pysyvät nimettöminä ja että niitä säilytetään asianmukaisesti. Hänen on laadittava sitä varten kirjalliset menettelyt, joilla varmistetaan koko prosessin jäljitettävyys ja takeet vaatimustenmukaisuudesta.
Lisäksi puheenjohtaja vastaa näytteiden valmistelusta, merkinnästä ja esittelystä maistajille noudattamalla ennalta vahvistettujen protokollien mukaista asiaankuuluvaa koesuunnitelmaa sekä maistajilta saatavien tietojen kokoamisesta ja tilastollisesta käsittelystä.
Puheenjohtaja vastaa myös kaikkien muiden sellaisten menettelyjen kehittelystä ja laatimisesta, joita saatetaan tarvita täydentämään tätä standardia ja varmistamaan, että raati toimii asianmukaisesti.
Hänen on pohdittava keinoja, joilla raadin tuloksia voidaan verrata muiden neitsytoliiviöljyä arvioivien raatien tuloksiin sen varmistamiseksi, että raati toimii asianmukaisesti.
Raadin puheenjohtajan velvollisuus on motivoida raadin jäseniä luomalla heidän keskuudessaan innostunut, utelias ja kilpaileva henki. Tätä varten suositellaan voimakkaasti, että sujuva vuorovaikutus raadin jäsenten kanssa varmistetaan pitämällä jäsenet ajan tasalla kaikista tehtävistä, joita he suorittavat, sekä saaduista tuloksista. Lisäksi puheenjohtajan on varmistettava, että hänen oma mielipiteensä ei ole tiedossa, jotta hän ei siirrä omia perusteitaan muille maistajille.
Puheenjohtaja kutsuu maistajat koolle riittävän ajoissa ja vastaa mahdollisiin kysymyksiin kokeiden suorittamisesta, mutta hän ei saa esittää näytettä koskevia näkemyksiä.
7.1.1 Raadin varapuheenjohtaja
Raadin puheenjohtajan voi perustellusta syystä korvata varapuheenjohtaja, joka hoitaa testauksen suorittamiseen liittyvät tehtävät. Tällä varahenkilöllä on oltava kaikki puheenjohtajana toimimiseksi tarvittavat taidot.
7.2. Maistajat
Oliiviöljyjä koskevissa aistinvaraisissa kokeissa maistajina toimivien henkilöiden on oltava vapaaehtoisia. Tästä syystä on suositeltavaa, että ehdokkaat tekevät kirjallisen hakemuksen. Raadin puheenjohtaja valitsee ja kouluttaa maistajaehdokkaat ja valvoo heidän taitoaan erottaa samanlaisia näytteitä. On muistettava, että koulutus lisää maistajien tarkkuutta.
Maistajan on toimittava todellisen aistinvaraisen havainnoitsijan tavoin, jätettävä syrjään oma henkilökohtainen makunsa ja raportoitava pelkästään havaitsemistaan aistimuksista. Tätä varten työ on aina tehtävä hiljaisuudessa, rennosti ja kiirehtimättä, jotta aistit voidaan kokonaan suunnata maistettavaan näytteeseen.
Jokaiseen kokeeseen tarvitaan 8–12 maistajaa, vaikka on aina hyvä pitää varalla muutama ylimääräinen maistaja, jotta mahdollisesti poisjääneet voidaan korvata.
8. KOEOLOSUHTEET
8.1. Näytteen esittely
Arvioitava öljynäyte esitellään standardin IOC/T.20 / Asiak. nro 5, Glass for Oil Tasting mukaisessa maistamislasissa.
Lasissa on 14–16 ml öljyä tai 12,8–14,6 g, jos näytteet punnitaan. Ne on peitetty kellolasilla.
Jokainen lasi on merkitty tunnuksella, joka koostuu kahdesta satunnaisesta numerosta tai numeroista ja kirjaimista. Merkinnät on tehtävä hajuttomalla tavalla.
8.2. Kokeen ja näytteen lämpötila
Maistettavaksi tarkoitetut öljynäytteet on koko kokeen ajan säilytettävä laseissa 28 ± 2 °C:n lämpötilassa. Tämä lämpötila on valittu siksi, että siinä on helpompi havaita aistinvaraisia eroja kuin huonelämpötilassa. Toinen syy tämän lämpötilan valintaan on, että kylmemmässä öljyn aromaattiset aineet tuskin pääsevät haihtumaan ja korkeammassa lämpötilassa haihtuu aineita, jotka ovat ominaisia kuumennetulle öljylle. Näytteen lämmittämiseen lasissa käytettävä menetelmä on esitetty standardissa IOC/T.20 / Asiak. nro 5, Glass for Oil Tasting.
Maistamishuoneen lämpötilan on oltava 20–25 °C (ks. IOC/T.20 / Asiak. nro 6).
8.3. Kokeen ajankohta
Aamupäivä on parasta aikaa maistaa öljyjä: on todettu, että päivän aikana on jaksoja, jolloin maku- ja hajuaistimukset havaitaan parhaiten. Maku- ja hajuherkkyys kohoavat ennen aterioita ja vähenevät aterioiden jälkeen.
Tätä seikkaa ei saa kuitenkaan korostaa liikaa niin, että maistajat kärsivät nälän tunteesta, joka häiritsee heitä ja vaikuttaa erottelukykyyn. Siitä syystä maistamistilaisuudet suositellaan järjestettäviksi klo 10–12 aamupäivällä.
8.4. Maistajat: yleiset käyttäytymissäännöt
Maistajien työskentelyyn sovelletaan seuraavia käyttäytymissuosituksia.
Kun raadin puheenjohtaja kutsuu osallistumaan aistinvaraiseen arviointiin, maistajan olisi voitava osallistua etukäteen sovittuna ajankohtana ja noudattaa seuraavia ohjeita:
— Ennen kokeen alkamista maistaja ei tupakoi eikä juo kahvia ainakaan 30 minuuttiin.
— Maistaja ei saa käyttää hajusteita, kosmetiikkaa tai saippuaa, jonka tuoksu voi säilyä koeajankohtaan asti. Kädet pestään tuoksuttomalla saippualla, ja kädet huuhdellaan ja kuivataan pesun jälkeen niin monta kertaa kuin on tarpeen mahdollisen tuoksun poistamiseksi.
— Ennen maistamista ollaan syömättä ainakin yhden tunnin ajan.
— Jos maistaja tuntee olonsa fyysisesti sairaaksi ja varsinkin jos tämä vaikuttaa haju- tai makuaistiin tai jos maistajaan kohdistuva psyykkinen paine estää häntä keskittymästä työhönsä, maistaja pidättyy maistamisesta ja ilmoittaa asiasta raadin puheenjohtajalle.
— Noudatettuaan edellä annettuja ohjeita maistaja asettuu hänelle osoitettuun maistamiskoppiin hillitysti ja rauhallisesti.
— Maistaja tutustuu huolellisesti profiililomakkeessa annettuihin ohjeisiin. Hän ei ala tutkia näytettä, ennen kuin on täysin valmistautunut tehtävään (rento ja kiireetön). Jos maistajalla on jotain kysymyksiä, hän kysyy yksityisesti neuvoa raadin puheenjohtajalta.
— Tehtävä suoritetaan hiljaisuudessa.
— Matkapuhelin kytketään aina pois päältä, jotta kollegojen keskittyminen ja työskentely ei häiriydy.
9. AISTINVARAINEN ARVIOINTIMENETTELY JA NEITSYTOLIIVIÖLJYN LUOKITTELU
9.1. Maistamistekniikka
9.1.1 Maistaja ottaa lasin käteensä, kun kansi on vielä paikoillaan, ja kallistaa sitä varovaisesti ja kiertää sitä niin, että öljy kastelee lasin sisäpintaa mahdollisimman paljon. Tämän vaiheen jälkeen hän ottaa kannen pois ja haistaa näytettä vetämällä henkeä tasaisesti, syvään ja hitaasti öljyn arvioimiseksi. Haistaminen ei saa kestää yli 30:tä sekuntia. Ellei maistaja ole tässä ajassa ehtinyt päätyä mihinkään tulokseen, hänen on odotettava hetki ennen kuin hän yrittää uudestaan.
Kun haistamiskoe on suoritettu, voidaan siirtyä maun arviointiin (sisältää haju-, maku- ja tuntoaistimuksen). Tätä varten maistaja ottaa suuhunsa noin 3 ml öljyä. On tärkeätä, että öljy leviää kaikkialle suuhun, suun etuosasta ja kielen kärjestä sivuja pitkin suun takaosaan ja kitapurjeeseen, sillä makuaistin ja suutuntuman herkkyys vaihtelevat tunnetusti kielen, kitalaen ja nielun eri osissa.
On hyvin tärkeää antaa riittävän määrän öljyä levitä hyvin hitaasti kielen yli kitapurjeeseen ja nieluun saakka, samalla kun maistaja keskittyy siihen, missä järjestyksessä karvas ja pistävä aistimus tuntuvat. Jos näin ei tehdä, molemmat aistimukset saattavat jäädä huomaamatta joissakin öljyissä ja toisaalta karvas maku saattaa jäädä pistävän maun peittämäksi.
Lyhyiden, peräkkäisten, suun kautta tapahtuvien sisäänhenkäisyjen avulla maistaja saa näytteen leviämään kaikkialle suuhun ja pakottaa haihtuvat, aromaattiset yhdisteet nenän takaosaan aistittaviksi.
Huom. Jos maistaja ei havaitse näytteessä hedelmäisyyttä ja luokiteltavan negatiivisen ominaisuuden voimakkuus on enintään 3,5, raadin puheenjohtaja voi päättää järjestää maistajille tilaisuuden analysoida näyte uudelleen huoneenlämmössä (COI/T.20/Doc. No 6/Rev. 1, September 2007, section – General specifications for installation of a test room); hänen on myös täsmennettävä tilanteen asiayhteys ja huoneenlämpötilan käsite. Kun näyte on huoneenlämpöinen, maistajan on arvioitava se uudelleen yksinomaan todetakseen, onko aistittavissa hedelmäisyyttä. Jos näin on, maistajan on merkittävä sen voimakkuus asteikolla.
Myös pistävä suutuntuma otetaan huomioon. Tätä tarkoitusta varten öljy on suositeltavaa niellä.
9.1.2. Kun neitsytoliiviöljyä arvioidaan aistinvaraisesti, yhdellä maistamiskerralla on suositeltavaa arvioida enintään NELJÄÄ NÄYTETTÄ siten, että päivässä järjestetään enintään kolme maistamistilaisuutta, sillä muiden näytteiden välitön arviointi saattaisi aiheuttaa kontrastivaikutuksen.
Koska peräkkäiset maistamiset aiheuttavat väsymistä ja aistiherkkyys vähenee, on tärkeää käyttää jotakin tuotetta, joka poistaa öljyn suusta ennen seuraavaa maistamista.
On suositeltavaa käyttää pientä omenapalaa, jota pureskellaan ja joka syljetään sitten sylkykuppiin. Sen jälkeen suu huuhdellaan pienellä määrällä huoneenlämpöistä vettä. Maistamisten välillä pidetään vähintään 15 minuutin tauko.
9.2. Miten maistaja käyttää profiililomaketta
Maistajan käyttämä profiililomake on esitetty yksityiskohtaisesti tämän liitteen kuvassa 1.
Jokainen raatiin kuuluva maistaja haistaa ja maistaa ( 5 ) tarkasteltavaa öljyä. Sen jälkeen hänen on merkittävä profiililomakkeessa oleviin 10 cm:n asteikkoihin kunkin havaitsemansa negatiivisen ja positiivisen ominaisuuden voimakkuus.
Jos maistaja havaitsee negatiivisia ominaisuuksia, joita ei ole lueteltu 4 kohdassa, ne merkitään kohtaan ”muut” käyttämällä ilmauksia, jotka täsmällisimmin kuvaavat kyseisiä ominaisuuksia.
9.3. Miten raadin puheenjohtaja käyttää tietoja
Raadin puheenjohtaja kerää kunkin maistajan täyttämät profiililomakkeet ja tarkastaa eri ominaisuuksille osoitetut voimakkuusasteet. Jos havaitaan poikkeavuuksia, puheenjohtaja pyytää maistajaa tarkistamaan profiililomakkeensa ja tarvittaessa toistamaan kokeen.
Raadin puheenjohtaja vie raadin jäsenten arviointitiedot (standardin IOC/T.20/Asiak. nro 15 mukaiseen) tietokonesovellukseen, jotta arvioinnin tulokset voidaan laskea tilastollisesti niiden mediaanin perusteella. Ks. tämän liitteen 9.4 kohta ja lisäys. Tiettyä näytettä koskevat tiedot kirjataan yhdeksän saraketta käsittävän matriisin avulla. Sarakkeet edustavat yhdeksää aistimusominaisuutta. Matriisissa on n riviä, jotka edustavat käytettyjen raadin jäsenten lukumäärää n.
Jos vähintään 50 prosenttia raadin jäsenistä on merkinnyt havaitsemansa virheen kohtaan ”muut”, kyseisen virheen mediaani lasketaan ja öljy luokitellaan vastaavasti.
Robusti variaatiokerroin (voimakkuudeltaan voimakkain virhe ja hedelmäinen ominaisuus), joka määrittää luokituksen, saa olla enintään 20 prosenttia.
Jos näin ei ole, raadin puheenjohtajan on toistettava kyseisen näytteen arviointi toisessa maistamistilaisuudessa.
Jos tällainen tilanne toistuu usein, raadin puheenjohtajan on suositeltavaa antaa maistajille erityistä lisäkoulutusta (IOC/T.20/Asiak. nro 14, 5 §) ja käyttää toistettavuusindeksiä ja poikkeamaindeksiä maistajan suorituksen tarkastamiseen (IOC/T.20/Asiak. nro 14, 6 §).
9.4. Öljyn luokittelu
Öljy luokitellaan jäljempänä esitettyihin luokkiin virheen mediaanin ja hedelmäisyyden mediaanin mukaan. Virheen mediaanilla tarkoitetaan voimakkaimmin havaitun virheen mediaania. Virheen mediaani ja hedelmäisyyden mediaani ilmaistaan yhden desimaalin tarkkuudella.
Öljy luokitellaan vertaamalla virheen mediaanin ja hedelmäisyyden mediaanin arvoa jäljempänä annettuihin vertailuväleihin. Koska vertailuvälien rajoja määriteltäessä on otettu huomioon menetelmän virhe, niitä on pidettävä absoluuttisina. Luokittelu voidaan esittää tietokonesovellusten avulla visuaalisesti tilastotiedoista koottuna taulukkona tai kaaviona.
a) Ekstra-neitsytoliiviöljy: virheen mediaani on 0,0 ja hedelmäisyyden mediaani yli 0,0;
b) Neitsytoliiviöljy: virheen mediaani on yli 0,0 mutta enintään 3,5 ja hedelmäisyyden mediaani on yli 0,0;
c) Lamppuneitsytoliiviöljy: virheen mediaani on yli 3,5 tai virheen mediaani on enintään 3,5 ja hedelmäisyyden mediaani on 0,0.
Huomautus 1: Jos karvaan ja/tai pistävän ominaisuuden mediaani on yli 5,0, raadin puheenjohtaja tekee siitä merkinnän öljyn arviointitodistukseen.
Jos kyse on vaatimustenmukaisuustarkastuksina tehdyistä analyyseistä, on tehtävä koe. Jos kyse on vasta-analyyseistä, on tehtävä toistomääritys eri tilaisuudessa. Toistomäärityksen tulosten on oltava tilastollisesti yhdenmukaisia (ks. 9.5 kohta). Jollei näin ole, näytteelle on jälleen tehtävä kaksi uutta määritystä. Luokitteluominaisuuksien mediaanin lopullinen arvo lasketaan käyttäen molempien mediaanien keskiarvoa.
9.5. Toistomääritysten hyväksymis- ja hylkäämisperusteet
Jäljempänä määriteltyä normalisoitua virhettä käytetään sen määrittämiseen, ovatko toistomäärityksen kaksi tulosta yhdenmukaisia tai tilastollisesti hyväksyttäviä:
jossa Me1 ja Me2 ovat kahden rinnakkaisnäytteen (ensimmäisessä ja toisessa määrityksessä saadut) mediaanit ja U1 ja U2 vastaavat kahden arvon osalta saatua laajennettua epävarmuutta laskettuna jäljempänä esitetyllä kaavalla lisäyksen mukaisesti:
U
1 = c × s* ja
Laajennettu epävarmuus, c = 1,96; siten
U1 = 0,0196 × CVr × Me1
jossa CVr on robusti variaatiokerroin.
Sen toteamiseksi, etteivät saaduilla kahdella arvolla ole tilastollista eroa, En saa olla enintään 0,1.
Kuvio 1
NEITSYTOLIIVIÖLJYN PROFIILILOMAKE
|
Havaittujen virheiden voimakkuus |
||||
|
Tunkkainen/sakkainen |
|
|
||
|
Homeinen/kostea/maa |
|
|
||
|
Viinimäinen/etikkainen happoinen/hapan |
|
|
||
|
Jäätyneet oliivit (puumainen, kostea) |
|
|
||
|
Eltaantunut |
|
|
||
|
Muut negatiiviset ominaisuudet: |
|
|
||
|
Laatusana: |
Metallinen □ Heinämäinen □ Toukkainen □ Karkea□ Suolavesi □ Paistunut tai palanut □ Kasvisvesi□ Espartoheinä □ Kurkku □ Rasvainen□ |
|||
|
Havaittujen positiivisten ominaisuuksien voimakkuus |
||||
|
Hedelmäinen |
|
|
||
|
|
Vihreä□ |
Kypsä□ |
||
|
Karvas |
|
|
||
|
Pistävä |
|
|
||
|
|
|
|
||
|
Maistajan nimi: |
|
Maistajan tunnus: |
||
|
Näytteen tunnus: |
Allekirjoitus: |
|||
|
Päiväys: |
||||
|
Huomautukset: |
||||
Lisäys
Mediaanin ja luottamusvälin laskutapa
Mediaani
Mediaanilla tarkoitetaan reaalilukua Xm, joka osoittaa, että todennäköisyys (p) siihen, että jakauman arvot (X) ovat pienempiä kuin Xm, on enintään 0,5 ja että samanaikaisesti todennäköisyys (p) siihen, että jakauman arvot (X) ovat enintään Xm, on vähintään 0,5. Käytännönläheisemmän määritelmän mukaan mediaani on 50. prosenttipiste suuruusjärjestykseen asetetuista luvuista. Yksinkertaisemmin sanottuna mediaani on keskimmäinen suuruusjärjestykseen asetetuista luvuista, jos niitä on pariton määrä, tai kahden keskimmäisen luvun keskiarvo, jos suuruusjärjestykseen asetettuja lukuja on parillinen määrä.
Robusti keskihajonta
Jotta mediaanin variaatiosta saataisiin luotettava arvio, on käytettävä Stuartin ja Kendallin (4) arviointimenetelmää robustin keskihajonnan määrittämiseksi. Seuraavalla kaavalla saadaan asymptoottinen keskihajonta eli kyseessä olevien tietojen variaation robusti arvio, jossa N on havaintojen lukumäärä ja IQR kvartiilivälin pituus, joka sisältää täsmälleen 50 prosenttia tietyn todennäköisyysjakauman havainnoista.
Kvartiiliväli lasketaan laskemalla 75. ja 25. prosenttipisteen ero.
Prosenttipiste on arvo Xpc, joka osoittaa, että todennäköisyys (p) siihen, että jakauman arvot ovat pienempiä kuin Xpc, on enintään tietty prosentti, ja että samanaikaisesti todennäköisyys (p) siihen, että jakauman arvot ovat enintään Xpc, on vähintään kyseinen prosentti. Prosentti ilmoittaa tietyn jakauman fraktiilin. Kun kyseessä on mediaani, se on 50/100.
Käytännössä prosenttipiste on jakauman arvo, joka vastaa tiettyä jakauman tai tiheyden kaarelta rajattua aluetta. Esimerkiksi 25. prosenttipiste edustaa jakauman arvoa, joka vastaa aluetta 0,25 tai 25/100.
Tässä menetelmässä prosenttipisteet lasketaan tietomatriisissa olevien todellisten arvojen perusteella (prosenttipisteiden laskentamenettely).
Robusti variaatiokerroin (%)
Robusti variaatiokerroin CVr% on puhdas luku, joka osoittaa analysoitavan lukujoukon variaation prosenttiosuuden. Tämän vuoksi se on erittäin hyödyllinen raadin jäsenten luotettavuuden tarkistamiseksi.
95 prosentin luottamusväli suhteessa mediaaniin
95 prosentin luottamusväli (ensimmäisen lajin virheen arvo on 0,05 tai 5 prosenttia) kuvaa väliä, jolla mediaanin arvo voi vaihdella, jos koe olisi mahdollista toistaa lukemattomia kertoja. Käytännössä luottamusväli osoittaa kokeen vaihteluväliä valituissa toimintaolosuhteissa, jos oletetaan, että koe voitaisiin toistaa useita kertoja. Luottamusvälin kuten robustin variaatiokertoimenkin avulla voidaan arvioida kokeen luotettavuus.
jossa c = 1,96, kun luottamusväli on 95 prosentin tasolla.
Standardin IOC/T 20 / Asiak. nro 15 liitteessä I on esitetty esimerkkilaskelma.
Kirjallisuus
(1) Wilkinson, L. (1990). Systat: The system for statistics. SYSTAT Inc., Evanston, IL.
(2) Cicchitelli, G. (1984). Probabilità e Statistica. Maggioli Editore, Rimini.
(3) Massart, D. L., Vandeginste, B. G. M., Deming, Y., Michotte, L. (1988). Chemometrics. A textbook. Elsevier, Amsterdam.
(4) Kendall, M. G., Stuart, A. (1967). The advanced theory of statistics. Vol. 1. Hafner Publishing Co., New York.
(5) McGill, R., Tukey, J. W., Larsen, W. A. (1978). Variation of Box Plots. The American Statistician, 32: 2, 12–16.
(6) IOC/T.28 / Asiakirja nro 1 (syyskuu 2007), Guidelines for the accreditation of sensory testing laboratories with particular reference to virgin olive oil according to standard ISO/IEC 17025:2005.
(7) IOC/T.20 / Asiakirja nro 14.
(8) IOC/T.20 / Asiakirja nro 15.
(9) ISO/IEC 17025:05.
▼M20 —————
▼M19 —————
LIITE XV
1 OLIIVIJÄTTEEN ÖLJYPITOISUUS
1.1 Välineistö
— sopiva uuttolaitteisto, johon voidaan liittää pyöreäpohjainen pullo, 200—250 ml,
— sähköllä lämmitettävä vesihaude, hiekkahaude tai levy,
— analyysivaaka,
— lämpökaappi, jonka voi säätää enintään 80 °C:seen,
— sähköuuni jossa termostaatti, jonka voi säätää 103 ± 2 °C:seen ja johon voi puhaltaa ilmaa tai jossa voi käyttää alipainetta,
— mekaaninen jauhin, joka on helppo puhdistaa ja jossa oliivijäännös voidaan jauhaa ilman lämpötilan nousua tai mainittavaa vesi- tai öljypitoisuuden alenemista,
— uuttohylsy ja hydrofiilistä pumpulia tai suodatinpaperia, josta on poistettu heksaaniin uuttuvat aineet,
— eksikkaattori,
— seula, jonka reikien halkaisija on 1 mm,
— kuivattuja hohkakiven palasia.
1.2 Reagenssi
Teknistä n-heksaania, josta jää täydellisesti haihdutettuna alle 0,002 g jäännöstä/100 ml.
2 SUORITUS
2.1 Näytteen esikäsittely
Käytetään tarvittaessa mekaanista jauhinta näytteen jauhamiseksi niin hienoksi, että se menee kokonaan seulan läpi; jauhin on ensin hyvin puhdistettava.
Näytteestä käytetään noin 1/20 jauhatuslaitteen puhdistamiseen, heitetään pois syntynyt jauhos, jauhetaan loput näytteestä ja kerätään se, sekoitetaan huolellisesti ja määritetään viipymättä.
2.2 Näytteenotto
Heti kun jauhaminen on päättynyt, punnitaan noin 10 g näytettä 0,01 g:n tarkkuudella koetta varten.
2.3 Uuttohylsyn esikäsittely
Näyte pannaan uuttohylsyyn, joka suljetaan hydrofiilisellä pumpulitupolla. Jos käytetään suodatinpaperia, jauhettu näyte kääritään siihen.
2.4 Esikuivaus
Jos oliivijäännös on hyvin kosteata (ts. kosteutta ja haihtuvia aineita on yli 10 %), näyte kuivataan asettamalla täytetty uuttohylsy (tai paperiin kääritty näyte) lämpökaappiin sopivaksi ajaksi korkeintaan 80 °C:seen, jotta kosteus ja haihtuvat aineet vähenisivät alle 10 %:iin.
2.5 Pyöreäpohjaisen pullon esikäsittely
Punnitaan 1 mg:n tarkkuudella pullo, jossa on pari hohkakivikappaletta. Hohkakivi kuivataan ensin uunissa 103 ± 2 °C:ssa ja jäähdytetään eksikkaattorissa vähintään tunnin ajan.
2.6 Ensimmäinen uutto
Uuttohylsy näytteineen (tai paperiin kääritty näyte) sijoitetaan uuttolaitteistoon. Pulloon kaadetaan tarpeellinen määrä heksaania. Pullo liitetään uuttolaitteistoon ja asetetaan kokonaisuus sähkökäyttöiseen lämpöhauteeseen. Lämpö säädetään niin, että refluksointinopeus on vähintään kolme tippaa sekunnissa (kohtalainen, ei kova kiehuminen).
Neljän tunnin uuton jälkeen annetaan jäähtyä. Hylsy irrotetaan uuttolaitteistosta ja pannaan ilmavirtaan, jotta suurin osa imeytyneestä liuottimesta haihtuisi.
2.7 Toinen uutto
Hylsyn sisältö siirretään mikrojauhatuslaitteeseen ja jauhetaan niin hienoksi kuin mahdollista. Jauhettu näyte kootaan tarkoin ja pannaan takaisin hylsyyn, joka liitetään taas uuttolaitteistoon.
Jatketaan uuttoa vielä kaksi tuntia käyttäen samaa pyöreäpohjaista pulloa, jossa on ensimmäinen uute.
Uuttopulloon kertyvän liuoksen on oltava kirkasta. Ellei näin ole, se suodatetaan paperin läpi ja pullo ja suodatinpaperi pestään useaan kertaan heksaanilla. Suodos ja pesuliuotin kerätään toiseen kuivattuun 1 mg:n tarkkuudella taarattuun pulloon.
2.8 Liuottimen poistaminen ja uutteen punnitseminen
Tislataan pois enin osa liuottimesta haihduttamalla sähkökäyttöisessä hauteessa. Liuottimen jäänteet poistetaan kuumentamalla pulloa 20 minuuttia uunissa 103 ± 2 °C:ssa. Liuottimen haihtumista voidaan edistää puhaltamalla ajoittain uuniin ilmaa tai mieluummin inerttiä kaasua tai käyttämällä alipainetta.
Pullo asetetaan eksikkaattoriin jäähtymään vähintään tunniksi ja punnitaan 1 mg:n tarkkuudella.
Kuumennetaan uudestaan samoissa olosuhteissa 10 minuuttia, jäähdytetään eksikkaattorissa ja punnitaan uudelleen.
Näiden kahden punnitustuloksen ero saa olla enintään 10 mg. Ellei tähän päästä, kuumennetaan jälleen 10 minuuttia, jäähdytetään ja punnitaan, kunnes massan ero edelliseen on enintään 10 mg. Viimeisen punnituksen tulos merkitään muistiin.
Samasta näytteestä tehdään kaksi eri määritystä.
3 TULOSTEN ESITTÄMINEN
3.1 Laskutapa ja kaava
a) Uutteen määrä ilmaistuna painoprosentteina saadusta tuotteesta on:
jossa:
S = saadun tuotteen uutteen painoprosentti,
mo = näytteen paino grammoina,
m1 = kuivatun uutteen paino grammoina.
Tulos on kahden rinnakkaiskokeen aritmeettinen keskiarvo, jos kokeen toistettavuusehdot täyttyvät.
Tulos ilmoitetaan yhden desimaalin tarkkuudella.
b) Uute ilmaistaan kuiva-aineena seuraavalla kaavalla:
jossa:
S = saadun tuotteen uutteen painoprosenttiosuus [ks. a)],
U = kosteus ja haihtuvat aineet näytteessä.
3.2 Toistettavuus
Saman kokeen tekijän peräkkäisten tai samanaikaisten rinnakkaiskokeiden tulosten välinen ero ei saa olla yli 0,2 g heksaaniuutetta/100 g näytettä.
Jos tämä ehto ei täyty, koe toistetaan kahdella uudella näytteellä. Jos ero on yhä suurempi kuin 0,2 g, tulos on tehdyn neljän määrityksen aritmeettinen keskiarvo.
LIITE XVI
JODILUVUN MÄÄRITTÄMINEN
1 TARKOITUS
Tämä kansainvälinen standardi kuvaa menetelmän jodiluvun määrittämiseksi eläin-ja kasvirasvoista sekä -öljyistä, joihin tästedes viitataan sanalla rasva.
2 MÄÄRITELMÄ
Tätä kansainvälistä standardia varten määritellään seuraavat käsitteet:
|
2.1 |
Jodiluku. u:näytteen absorboiman jodin massa tässä kansainvälisessä standardissa määrätyissä olosuhteissa. Jodiluku ilmoitetaan grammoina jodia/100 g näytettä. |
3 PERIAATE
Näyte liuotetaan liuottimeen ja lisätään Wijsin reagenssia. Tietyn ajan kuluttua lisätään kaliumjodidin vesiliuosta ja vapautunut jodi titrataan natriumtiosulfaattiliuoksella.
4 REAGENSSIT
Kaikkien reagenssien on oltava hyväksyttyä analyysilaatua.
|
4.1 |
Kaliumjodidiliuos, 100 g/l, ei saa sisältää jodaatteja eikä vapaata jodia. |
|
4.2 |
Tärkkelysliuos. Lisätään 5 g liukoista tärkkelystä 30 ml:aan vettä, lisätään tämä seos 1 000 ml:aan kiehuvaa vettä; annetaan kiehua kolme minuuttia ja jäähdytetään. |
|
4.3 |
Natriumtiosulfaatti, standardi titrausliuos c(Na2S2O3 . 5H2O) = 0,1 mol/l, standardoitu enintään seitsemän päivää ennen käyttöä. |
|
4.4 |
Liuotin, valmistettu sekoittamalla yhtä suuret tilavuudet sykloheksaania ja etikkahappoa. |
|
4.5 |
Wijsin reagenssi, joka sisältää jodimonokloridia etikkahapossa. On käytettävä valmiina saatavaa Wijsin reagenssia. Huom: Reagenssi sisältää 9 g ICI3:a ja 9 g I:a etikkahapossa. |
5 VÄLINEISTÖ
Tavallinen laboratoriovälineistö ja erityisesti seuraavat:
|
5.1 |
Punnituslaseja, jotka sopivat näytemäärän punnitsemiseen ja pulloon (5.2) siirtämiseen. |
|
5.2 |
Erlenmeyerpulloja, 500 ml, hiotut lasitulpat, täysin kuivia. |
6 NÄYTTEEN VALMISTAMINEN
Homogenoitu näyte kuivatetaan natriumsulfaatilla ja suodatetaan.
7 SUORITUS
|
7.1 |
Näytteenotto Näytemäärä määräytyy oletetun jodiluvun perusteella taulukon 1 mukaisesti.
Taulukko 1
Näytemäärä punnitaan 0,1 mg:n tarkkuudella punnituslasissa (5.1). |
|
7.2 |
Määritys Näyte pannaan 500 ml:n pulloon (5.2). Lisätään 20 ml liuotinta (4.5) rasvan liuottamiseksi. Lisätään tasan 25 ml Wijsin reagenssia (4.6), suljetaan tulpalla, ravistetaan ja jätetään pullo pimeään. Wijsin reagenssin kanssa ei saa käyttää suupipettiä. Sokeakoe valmistellaan samalla tavalla käyttäen liuotinta ja reagenssia ilman näytettä. Pullot jätetään pimeään tunniksi, jos näytteen oletettu jodiluku on alle 150; jos oletettu jodiluku on yli 150 tai tuote on polymeroitunut tai hyvin hapettunut, pullot jätetään pimeään kahdeksi tunniksi. Ajan päätyttyä lisätään 20 ml kaliumjodidiliuosta (4.2) ja 150 ml vettä (4.1) kuhunkin pulloon. Titrataan standardilla natriumtiosulfaatin titrausliuoksella (4.4), kunnes jodin aiheuttama keltainen väri on melkein hävinnyt. Lisätään pari tippaa tärkkelysliuosta (4.3) ja jatketaan titraamista, kunnes sininen väri juuri katoaa liuosta voimakkaasti ravistettaessa. Huom. Myös potentiometrinen titrauksen loppupisteen määrittäminen on sallittua. |
|
7.3 |
Määritysten lukumäärä Samasta näytteestä tehdään kaksi määritystä. |
8 TULOSTEN ESITTÄMINEN
Jodiluku saadaan kaavasta
jossa:
c = käytetyn natriumtiosulfaattiliuoksen (4.4) tarkka pitoisuus, moolia/litra;
V1 = sokeakokeeseen käytetyn natriumtiosulfaattiliuoksen (4.4) tilavuus millilitroina;
V2 = määritykseen käytetyn natriumtiosulfaattiliuoksen (4.4) tilavuus millilitroina;
m = näytemäärä (7.1) grammoina.
Tulos on kahden määrityksen tulosten aritmeettinen keskiarvo sillä ehdolla, että toistettavuusehto täyttyy.
LIITE XVII
MENETELMÄ STIGMASTADIEENIEN MÄÄRITTÄMISEKSI KASVIÖLJYISTÄ
1. TARKOITUS
Stigmastadieenien määritys kasviöljyistä, joissa näiden hiilivetyjen pitoisuudet ovat pieniä, kuten neitsytoliiviöljystä ja oliivin puristusjätteestä saadusta raakaöljystä.
2. SOVELTAMISALA
Tätä standardia voidaan soveltaa kaikkiin kasviöljyihin; mittaustulokset ovat kuitenkin luotettavia ainoastaan, jos näiden hiilivetyjen pitoisuus on 0,01—4,0 mg/kg. Menetelmä soveltuu erityisesti puhdistettujen kasviöljyjen (oliivi, oliivin puristusjäte, auringonkukka, palmu tms.) toteamiseen neitsytoliiviöljystä, sillä puhdistetut öljyt sisältävät stigmastadieeneja, mutta neitsytöljyt eivät sisällä niitä.
3. PERIAATE
Saippuoitumattoman aineksen erottaminen. Steroidihiilivetyfraktion erottaminen pylväskromatografian avulla käyttäen silikageeliä ja kapillaarikaasukromatografista määritystä.
4. LAITTEISTO
|
4.1 |
250 ml:n pulloja, joita voi käyttää palautusjäähdyttimen kanssa. |
|
4.2 |
Erotussuppiloita, joiden vetoisuus on 500 ml. |
|
4.3 |
Pyöreäpohjaisia 100 ml:n pulloja. |
|
4.4 |
Pyöröhaihdutin (”rotavapori”). |
|
4.5 |
Lasinen kromatografiakolonni (sisähalkaisija 1,5—2,0 cm, pituus 50 cm), jossa on teflonhana ja jonka pohjalla on lasivillatulppa tai lasisintterievy. Silikageelikolonni valmistellaan kaatamalla kromatografiakolonniin n. 5 cm kerros heksaania ja täyttämällä sen jälkeen kolonni silikageelin heksaanilietteellä (15 g en 40 ml:ssa) käyttäen apuna heksaaniannoksia. Annetaan seistä ja viimeistellään asettuminen kevyellä tärytyksellä. Lisätään vedetöntä natriumsulfaattia noin 0,5 cm:n kerros ja eluoidaan lopuksi liika heksaani. |
|
4.6 |
Kaasukromatografi, jossa on liekki-ionisaatiodetektori, jakajatyyppinen tai kylmä kolonniin liittyvä (on-column) injektori sekä uuni, joka on ohjelmoitavissa ± 1 celsiusasteen tarkkuudella. |
|
4.7 |
Kaasukromatografinen kvartsilasikapillaarikolonni (sisähalkaisija 0,25 tai 0,32 mm, pituus 25 m), joka on pinnoitettu 5-prosenttisella fenyylimetyylisilikonifaasilla, jonka kerrospaksuus on 0,25 μm. Huomautus 1: Voidaan käyttää myös muita kolonneja, joiden polaarisuus on sama tai pienempi. |
|
4.8 |
Tallentava integraattori, jolla voidaan integroida pohjasta pohjaan. |
|
4.9 |
Liimatulla neulalla varustettu 5—10 μl:n mikroruisku kaasukromatografiaa varten. |
|
4.10 |
Sähköinen kuumennusvaippa tai lämpölevy. |
5. REAGENSSIT
Kaikkien reagenssien tulee olla analyysilaatua, ellei toisin määrätä. Käytettävän veden tulee olla tislattua vettä tai puhtaudeltaan vähintään vastaavaa.
|
5.1 |
Heksaani tai alkaaniseos, jonka aineosien kiehumispisteet ovat 65–70 °C ja joka on tislattu rektifioimiskolonnilla. Heksaani voidaan korvata iso-oktaanilla (2,2,4-trimetyylipentaani, kromatografialaatua) edellyttäen, että sillä saadaan vertailukelpoiset toistotarkkuusarvot. Jäännös, kun 100 ml liuotinta on haihtunut, voidaan tarkastaa. Liuottimien, joilla on n-heksaania korkeampi kiehumispiste, haihtuminen kestää pidempään. Ne ovat kuitenkin suositeltavampia heksaanin myrkyllisyyden vuoksi. |
|
5.2 |
96-prosenttista (v/v) etanolia. |
|
5.3 |
Vedetöntä natriumsulfaattia. |
|
5.4 |
Kaliumhydroksidin 10-prosenttista alkoholiliuosta. Lisätään 10 ml vettä 50 g:aan kaliumhydroksidia, sekoitetaan ja liuotetaan seos 500 ml:aan etanolia. Huomautus 3: Kalilipeän alkoholiliuos muuttuu seistessään ruskeaksi. Liuos on valmistettava uudelleen joka päivä ja pidettävä hyvin suljetuissa ruskeissa lasipulloissa. |
|
5.5 |
Silikageeliä 60 kaasukromatografiaa varten, 70—230 mesh (Merck ref. 7734 tai samanlainen). Huomautus 4: Silikageeli voidaan yleensä ottaa käyttöön suoraan pakkauksesta ilman mitään käsittelyä. Joissakin valmistuserissä esiintyy kuitenkin alhaista aktiivisuutta, joka johtaa huonoon kromatografiseen erottumiseen. Tällöin silikageeli on käsiteltävä seuraavasti: Silikageeli aktivoidaan kuumentamalla sitä vähintään neljä tuntia 550° C:n lämpötilassa. Kuumentamisen jälkeen silikageelin annetaan jäähtyä eksikkaattorissa ja pannaan sitten tulpalla suljettuun pulloon. Lisätään 2 % vettä ja ravistetaan, kunnes paakkuja ei näy ja jauhe virtaa vapaasti. Jos silikageelin valmistuserä on sellainen, että se aiheuttaa kromatogrammiin toisiaan häiritseviä huipuja, silikageeli on käsiteltävä edellä esitetyllä tavalla. Vaihtoehtoinen tapa on käyttää erikoispuhdasta silikageeliä 60 (Merck, ref. 7754). |
|
5.6 |
Kolesta-3,5-dieenin (Sigma, 99-prosenttinen puhtaus) varastoliuos (200 ppm) heksaanissa (10 mg 50 ml:ssa). |
|
5.7 |
Kolesta-3,5-dieenin standardiliuos heksaanissa, pitoisuus 20 ppm, saadaan laimentamalla edellä mainitusta liuoksesta. Huomautus 5: 5.6 ja 5.7 kohdassa tarkoitetut liuokset säilyvät huononematta vähintään neljä kuukautta, jos niitä säilytetään alle 4° C:n lämpötilassa. |
|
5.8 |
n-nonakosaanin heksaaniliuos, pitoisuus n. 100 ppm. |
|
5.9 |
Kantajakaasu kromatografiaa varten: helium tai vety, puhtaus 99,9990 %. |
|
5.10 |
Apukaasut liekki-ionisaatiodetektoria varten: vety, jonka puhtaus on 99,9990 %, ja puhdistettu ilma. |
6. MENETTELY
6.1 Saippuoitumattoman aineksen valmistelu:
|
6.1.1 |
Punnitaan 20 ± 0,1 g öljyä 250 ml:n pulloon (4.1), lisätään 1 ml kolesta-3,5-dieenin (20 μg) standardiliuosta ja 75 ml kalilipeän 10-prosenttista alkoholiliuosta, kiinnitetään palautusjäähdytin ja keitetään hiljalleen 30 minuuttia. Otetaan näytteen sisältävä pullo pois lämpölähteestä ja annetaan liuoksen jäähtyä hieman (liuos ei saa jäähtyä kokonaan, sillä tällöin näyte erottuu). Lisätään 100 ml vettä ja siirretään lios erotussuppiloon (4.2) 100 ml:lla heksaania. Seosta ravistetaan voimakkaasti 30 sekuntia, minkä jälkeen sen annetaan erottua kerroksiksi. huomautus 6: Jos muodostuu emulsio, joka ei häviä nopeasti, lisätään hieman etanolia. |
|
6.1.2 |
Pohjalle jäävä vesifaasi siirretään toiseen erotussuppiloon ja uutetaan uudelleen 100 ml:lla heksaania. Pohjalle jäävä osa juoksutetaan taas pois ja heksaaniuute (yhdistettynä toisen erotussuppilon ainekseen) pestään kolme kertaa 100 ml:lla etanoli-vesiseoksella (1:1), kunnes pH on neutraali. |
|
6.1.3 |
Heksaaniliuos johdetaan vedettömän natriumsulfaatin (50 g) läpi, pestään 20 ml:lla heksaania ja haihdutetaan kuivaksi pyöröhaihduttimessa 30° C:n lämpötilassa matalassa paineessa. |
6.2 Steroidihiilivetyjakeen erottaminen:
|
6.2.1 |
Jäännös siirretään fraktiointikolonniin käyttäen kahta yhden millilitran heksaaniannosta, näyte johdetaan kolonniin antaen liuoksen pinnan vajota natriumsulfaattikerroksen pinnan tasalle ja aloitetaan kromatografinen eluointi heksaanilla käyttäen virtausnopeutta, joka on n. 1 ml/min. Eluaatin ensimmäiset 20—30 ml heitetään pois ja seuraava 40 ml:n jae otetaan talteen. Talteen otettu jae siirretään 100 ml:n pyöreäpohjaiseen pulloon (4.3). Huomautus 7: Ensimmäinen jae sisältää tyydyttyneitä hiilivetyjä (kuva 1a) ja toinen jae steroidihiilivetyjä. Lisäeluointi tuottaa skvaleenia ja vastaavia yhdisteitä. Jotta saavutetaan tyydyttyneiden ja steroidihiilivetyjen tarkka erottuminen, jakeiden tilavuudet on määritettävä ihanteellisiksi. Tätä varten ensimmäisen jakeen tilavuus on valittava siten, että toista jaetta määritettäessä tyydyttyneiden hiilivetyjen huippu on matala (ks. kuva 1c); jos niitä ei ilmene ja standardihuippu on heikko, tilavuutta on pienennettävä. Joka tapauksessa on tarpeetonta erottaa täysin ensimmäisen ja toisen jakeen osia, sillä kaasukromatografisessa määrityksessä ei esiinny päällekkäisiä huippuja, jos kaasukromatografiaolosuhteet säädetään 6.3.1 kohdan mukaisesti. Toisen jakeen ihannetilavuutta ei yleensä tarvitse etsiä, sillä myöhemmät osat erottuvat hyvin. Jos kutenkin esiintyy suuri huippu, jonka retentioaika on n. 1,5 minuuttia lyhyempi kuin standardin, tämä johtuu skvaleenista ja osoittaa huonoa erotuskykyä. |
|
6.2.2 |
Toinen jae haihdutetaan kuivaksi haihduttimessa 30° C lämpötilassa matalassa paineessa, ja jäännös liuotetaan välittömästi 0,2 ml:aan heksaania. Liuos säilytetään jääkaapissa määritykseen asti. Huomautus 8: 6.1.3 ja 6.2.2 kohdassa tarkoitettuja jakeita ei pidä säilyttää kuivana eikä huoneenlämpötilassa. Liuotin on lisättävä heti kun jäännös on saatu, ja liuoksia on tämän jälkeen säilytettävä jääkaapissa. |
6.3 Kaasukromatografia
|
6.3.1 |
Työskentelyolosuhteet jakajakatyyppistä injektoria varten: — Injektorin lämpötila: 300° C. — Detektorin lämpötila: 320° C. — Tallentava intergraattori: integrointiparametrit on valittava siten, että pinta-alat arvioidaan oikein. Integrointi pohjasta pohjaan on suositeltavaa. — Herkkyys: noin 16 kertaa vähimmäisvaimennus. — Injektoitava liuosmäärä: 1μl. — Uunin lämpötilaohjelma: alussa 235° C 6 minuutin ajan, sen jälkeen lämpötilaa kohotetaan 2° C/min, kunnes lämpötila on 285° C. — Injektori, jossa on virtauksenjakaja 1:15. — Kantajakaasu: helium tai vety, paine n. 120 kPa. Näitä olosuhteita voidaan muuttaa kromatografin ja kolonnin ominaisuuksien mukaan, jotta saavutetaan seuraavien vaatimusten mukainen kromatogrammi: sisäisen standardin huippu n. 5 minuutin tarkkuudella 6.3.2 kohdassa tarkoitetussa ajassa; sisäisen standardin huipun on oltava vähintään 80 prosenttia täydestä asteikosta. Kaasukromatografijärjestelmä on tarkistettava ruiskuttamalla kolestadieenin (5.6) varastoliuoksen ja n-nonakosaaniliuoksen (5.8) seosta. Kolesta-3,5-dieenin huippu tulee esiintyä ennen n-notakosaanin huipua (kuva1c); jos näin ei käy, voidaan menetellä kahdella tavalla: alentaa uunin lämpötilaa ja/tai käyttää polaarisuudeltaan pienempää kolonnia. |
|
6.3.2 |
Huipun tunnistaminen Sisäisen standardin huippu esiintyy n. 19 minuutin kuluttua ja stigmasta-3,5-dieenin huippu suhteellisella retentioajalla, joka on n. 1,29 (ks. kuva 1b). Stigmasta-3,5-dieenin mukana kulkee pieni määrä isomeeria, ja yleensä molemmat sisältyvät samaan huippuun. Jos kolonni on kuitenkin liian polaarinen tai sen erotuskyky on suuri, isomeerin huippu saattaa näkyä erillisenä pinenä stigmasta-3,5-dieenihuippua välittömästi edeltävänä huippuna (kuva 2). Jotta voidaan varmistaa, että eluoituvat stigmastadieenit muodostavat vain yhden huipun, on suotavaa vaihtaa kolonnin tilalle vähemmän polaarinen tai sisähalkaisijaltaan suurempi kolonni. Huomautus 9: Stigmastadieeneja voidaan saada kromatografista vertailua varten määrittämällä puhdistettua kasviöljyä ja käyttämällä pinempää näytettä (1—2 g). Stigmastadieenit tuottavat voimakkaan ja helposti tunnistettava huipun. |
|
6.3.3 |
Kvantitatiivinen märitys Stigmastadieenipitoisuus määritetään seuraavan kaavan avulla: stigmastadieenipitoisuus mg/kg =
Toteamisraja: noin 0,01 mg/kg. Huomautus 10: Kun stigmastadieeneja esiintyy pitoisuuksina yli 4 mg/kg ja jos kvantifioimista edellytetään, on käytettävä stereenien määrittämiseen jalostetusta öljystä tarkoitettua kansainvälisen oliivineuvoston menetelmää. |
Kuva 1
Kaasukromatogrammi, joka on saatu oliiviöljynäytteistä, jotka on määritetty kvartsilasikapillaarikolonnissa (sisähalkaisija 0,25, pituus 25 m); kolonni on pinnoitettu 5-prosenttisella fenyylimetyylisilikonillaa, kerrospaksuus 0,25 μm.
a) Neitsytöljyn ensimmäinen jae (30 ml), jossa näkyy standardin huippu.
b) Oliiviöljyn toinen jae (40 ml); öljy sisältää 0,10 mg/kg stigmastadieeneja.
c) Toinen jae (40 ml), joka sisältää pienen osuuden ensimmäistä jaetta.
Kuva 2
Kaasukromatogrammi, joka on saatu DB-5-kolonnilla määritetystä puhdistetun oliiviöljyn näytteestä; kromatogrammissa näkyy stigmasta-3,5-dieenin isomeeri.
LIITE XVIII
ECN42-TRIASYYLIGLYSEROLIEN TEOREETTISEN KOOSTUMUKSEN JA TODELLISEN KOOSTUMUKSEN VÄLISEN ERON MÄÄRITYS
1. SOVELTAMISALA
Seuraavien arvojen välisen absoluuttisen eron määrittäminen: triasyyliglyserolien (TAG), joiden ekvivalenttihiililuku on 42 (ECN42HPLC), kokeelliset arvot, jotka saadaan määrittämällä ne öljyssä suuren erotuskyvyn käänteisfaasinestekromatografialla, ja triasyyliglyserolien, joiden ekvivalenttihiililuku on 42 (ECN 42theoretical), teoreettinen arvo, joka saadaan laskemalla rasvahappokoostumuksesta.
2. SOVELTAMISALA
Standardia sovelletaan oliiviöljyihin. Menetelmä soveltuu pienten siemenöljymäärien (joissa on paljon linolihappoa) osoittamiseen kaikissa oliiviöljyissä.
3. PERIAATE
Aitojen oliiviöljyjen ECN42-triasyyliglyserolien HPLC-analyysillä määritetty ja ECN42-triasyyliglyserolien teoreettinen koostumus (joka lasketaan rasvahappokoostumuksen GLC-määrityksen perusteella) vastaavat tietyissä rajoissa toisiaan. Jos erotus on suurempi kuin öljytyypille vahvistettu arvo, on öljyssä todennäköisesti siemenöljyjä.
4. MENETELMÄ
Menetelmä ECN42-triasyyliglyserolien teoreettisen pitoisuuden ja HPLC-määrityksen tulosten välisen erotuksen laskemiseksi perustuu pääasiallisesti muilla menetelmillä saatujen analyyttisten tietojen koordinointiin. Tässä voidaan erottaa kolme vaihetta: rasvahappokoostumuksen määritys kapillaarikaasukromatografialla, ECN42-triasyyliglyserolien teoreettisen koostumuksen laskeminen ja ECN42-triasyyliglyserolien HPLC-määritys.
4.1 Välineistö
|
4.1.1 |
Pyörökolveja, 250 ml ja 500 ml |
|
4.1.2 |
Dekanttilaseja, 100 ml |
|
4.1.3 |
Lasinen kromatografiapylväs, sisähalkaisija 21 mm, pituus 450 mm, jossa on tulppa ja standardoitu naaraspuolinen hios yläpäässä |
|
4.1.4 |
Erotussuppiloita, 250 ml, joissa on standardoitu koiraspuolinen hios alapäässä ja joka voidaan liittää pylvään yläpäähän |
|
4.1.5 |
Lasisauva, pituus 600 mm |
|
4.1.6 |
Lasisuppilo, halkaisija 80 mm |
|
4.1.7 |
Mittapulloja, 50 ml |
|
4.1.8 |
Mittapulloja, 20 ml |
|
4.1.9 |
Pyöröhaihdutin |
|
4.1.10 |
Korkean suorituskyvyn nestekromatografi, jonka pylväs voidaan termostoida |
|
4.1.11 |
Injektiolaite, jolla voidaan injisoida 10 μl |
|
4.1.12 |
Detektori: differentiaalirefraktometri. Koko asteikon herkkyyden pitäisi olla vähintään 10–4 taitekerroinyksikköä. |
|
4.1.13 |
Pylväs: ruostumatonta terästä, pituus 250 mm ja sisähalkaisija 4,5 mm, johon pakattu 5 μm:n piihappopartikkeleja, jotka sisältävät 22–23 % hiiltä oktadekyylisilaanin muodossa. |
|
4.1.14 |
Tietokoneohjelma tulosten käsittelyyn |
|
4.1.15 |
Suppiloita, noin 2 ml, joissa teflon-septumit ja kierrekorkit. |
4.2 Reagenssit
Reagenssien on oltava analyysipuhtausluokkaa. Eluointiliuottimista on poistettava kaasut, ja niitä voi käyttää useaan kertaan ilman että se vaikuttaa erotuksiin.
|
4.2.1 |
Petrolieetteri 40–60 °C, kromatografialaatua, tai heksaani. Heksaani voidaan korvata iso-oktaanilla (2,2,4-trimetyylipentaani, kromatografialaatua) edellyttäen, että sillä saadaan vertailukelpoiset toistotarkkuusarvot. Liuottimien, joilla on n-heksaania korkeampi kiehumispiste, haihtuminen kestää pidempään. Ne ovat kuitenkin suositeltavampia heksaanin myrkyllisyyden vuoksi. |
|
4.2.2 |
Etyylieetteri, peroksidivapaa, tislattu juuri ennen käyttöä |
|
4.2.3 |
Eluutioliuotin öljyn puhdistamiseksi kolonnikromatografialla: petrolieetterin ja etyylieetterin seos 87/13 (v/v) |
|
4.2.4 |
Piihappogeeli, 70–230 mesh, tyyppiä Merck 7734, jonka vesipitoisuus on standardoitu 5 prosenttiin (w/w) |
|
4.2.5 |
Lasivilla |
|
4.2.6 |
Asetoni HPLC-määritystä varten |
|
4.2.7 |
Asetonitriili tai propionitriili HPLC-määritystä varten |
|
4.2.8 |
HPLC-eluutioliuotin: asetonitriili + asetoni (osuudet säädetään siten että saadaan haluttu erotus; aloitetaan 50:50-seoksella) tai propionitriili |
|
4.2.9 |
Liuottamisliuotin: asetoni |
|
4.2.10 |
Vertailutriglyseridit: joko käytetään kaupallisia triglyseridejä (tripalmitiini, trioleiini jne.) ja kuvataan retentioajat ekvivalenttihiililuvun funktiona tai tehdään vertailukromatogrammit soijaöljy-oliiviöljyseoksella suhteessa 30:70 ja puhtaalla oliiviöljyllä (ks. huomautukset 1 ja 2 sekä kuvat 1–4). |
|
4.2.11 |
Kiinteäfaasiuuttopylväs, jossa on piihappofaasi 1 g, 6 ml |
|
4.2.12 |
Heptaani, kromatografialaatua. Heptaani voidaan korvata iso-oktaanilla (2,2,4-trimetyylipentaani, kromatografialaatua). |
4.3 Näytteen valmistus
Koska monet aineet voivat antaa vääriä positiivisia tuloksia, näyte on aina puhdistettava paistorasvoissa esiintyvien polaaristen yhdisteiden määrittämiseen tarkoitetulla IUPAC-menetelmällä 2.507.
4.3.1 Kromatografiapylvään valmistelu
Pylväs (4.1.3) täytetään noin 30 ml:lla eluutioliuosta (4.2.3), siihen pannaan hiukan lasivillaa (4.2.5), joka työnnetään pylvään pohjaan lasisauvalla (4.1.5).
Suspendoidaan 100 ml:n dekanterilasiin 25 g piihappogeeliä (4.2.4) 80 ml:ssa eluutioliuosseosta (4.2.3), joka lisätään pylvääseen lasisuppilon (4.1.6) avulla.
Jotta piihappogeeli saadaan kokonaan siirretyksi pylvääseen, dekanterilasia pestään eluutioliuoksella ja pesunesteet lisätään pylvääseen.
Tulppa avataan ja liuottimen annetaan valua pylväästä, kunnes sen pinta on noin 1 cm piihappogeelin pinnan yläpuolella.
4.3.2 Pylväskromatografia
Punnitaan 0,001 g:n tarkkuudella 2,5 ± 0,1 g öljyä, joka on etukäteen suodatettu ja homogenoitu ja josta on tarvittaessa poistettu vesi, 50 ml:n mittapulloon (4.1.7).
Öljy liuotetaan noin 20 ml:aan eluutioliuotinta (4.2.3). Lämmitetään tarvittaessa liuottamisen helpottamiseksi. Annetaan jäähtyä huoneenlämpötilaan, ja tilavuus säädetään merkkiin eluutioliuottimella.
20 ml tätä liuosta siirretään volymetrisellä pipetillä kohdan 4.3.1 mukaisesti valmisteltuun pylvääseen. Tulppa aukaistaan ja liuottimen annetaan valua piihappogeelin pinnan tasolle.
Eluoidaan 150 ml:lla eluutioliuotinta (4.2.3). Eluutionopeus noin 2 ml/min (150 ml menee pylvään läpi noin 60–70 minuutissa).
Eluaatti kerätään 250 ml:n pyörökolviin (4.1.1), joka on taarattu uunissa ja punnittu tarkasti. Liuotin haihdutetaan alipaineessa pyöröhaihduttimessa ja jäännös punnitaan. Siitä tehdään HPLC-analyysiin ja metyyliesterin valmistukseen käytettävä liuos.
Pylväästä on saatava talteen vähintään 90 % näytteestä, kun kyseessä ovat ekstraneitsytoliiviöljyn, neitsytoliiviöljyn, puhdistetun oliiviöljyn ja oliiviöljyn luokat, ja vähintään 80 %, kun kyseessä ovat lamppuöljyt ja oliivin puristemassaöljyt.
4.3.3 Puhdistus kiinteäfaasiuuttona
Kiinteäfaasiuuttopiihappopylväs aktivoidaan 6 ml heksaanilla (4.2.3) tyhjiössä kuivumista välttäen.
Punnitaan 0,001 g:n tarkkuudella 0,12 g 2 ml:n pulloon (4.1.15) ja liuotetaan 0,5 ml:lla heksaania (4.2.3).
Täytetään kiinteäfaasiuuttopylväs liuoksella ja eluoidaan tyhjiössä 10 ml:lla heksaania/dietyylioksidia (87:13 v/v) (4.2.3).
Kerätty jae haihdutetaan kuiviin alipaineessa pyöröhaihduttajassa (4.1.9) huoneenlämmössä. Haihdutusjäännös liuotetaan 2 ml:aan asetonia (4.2.6) triasyyliglyserolien määritystä varten.
4.4 HPLC-määritys
4.4.1 Näytteiden valmistus kromatografiaan
Analysoitavasta näytteestä valmistetaan 5-prosenttinen liuos punnitsemalla 0,5 ± 0,001 g näytettä 10 ml:n asteikolliseen pulloon ja täyttämällä 10 ml:ksi liuottamisliuottimella (4.2.9).
4.4.2 Menettely
Kootaan kromatografialaitteisto. Eluutioliuotinta (4.2.8) pumpataan nopeudella 1,5 ml/min laitteiston puhdistamiseksi. Odotetaan, kunnes perusviiva on tasainen.
Injisoidaan 10 μl näytettä, joka on valmistettu kuten kohdassa 4.3 selostetaan.
4.4.3 Tulosten laskeminen ja ilmoittaminen
Käytetään sisäisen standardin menetelmää, ts. oletetaan, että TAGien (ECN42-triglyserideistä ECN52-triglyserideihin) piikkien yhteenlasketut pinta-alat ovat 100 %.
Kunkin triglyseridin suhteellinen prosenttiosuus lasketaan kaavalla:
.
Tulokset on ilmoitettava vähintään kahden desimaalin tarkkuudella.
Ks. alaviitteet 1–4.
4.5 Triasyyliglyseridien koostumuksen laskeminen (mooli-%) rasvahappokoostumusta koskevista tiedoista (pinta-ala-%)
4.5.1 Rasvahappokoostumuksen määritys
Rasvahappokoostumus määritetään ISO 5508 -standardia noudattaen kapillaarikolonnilla. Metyyliesterit valmistetaan asiakirjan COI/T.20/Doc. No 24 mukaisesti.
4.5.2 Laskemisessa huomioon otettavat rasvahapot
Glyseridit ryhmitellään niiden ekvivalenttihiililuvun (ECN) mukaan ottaen huomioon seuraavat vastaavuudet ECN:n ja rasvahappojen välillä. Huomioon otetaan ainoastaan 16 ja 18 hiiliatomia sisältävät rasvahapot, koska niillä on merkitystä oliiviöljylle. Rasvahapot olisi standardoitava 100 %:iin.
|
Rasvahappo (FA) |
Lyhenne |
Molekyylipaino (MW) |
ECN |
|
Palmitiinihappo |
P |
256,4 |
16 |
|
Palmito-oleiinihappo |
Po |
254,4 |
14 |
|
Steariinihappo |
S |
284,5 |
18 |
|
Öljyhappo |
O |
282,5 |
16 |
|
Linolihappo |
L |
280,4 |
14 |
|
Linoleenihappo |
Ln |
278,4 |
12 |
4.5.3 Pinta-alaprosenttien muuntaminen mooleiksi, kaikki rasvahapot (1)
|
|
|
|
|
|
|
|
4.5.4 Rasvahappomoolien standardoiminen 100 %:iin (2)
Tulos ilmoittaa kunkin rasvahapon prosenttiosuuden mooliprosentteina TAGien 1,2,3-asemassa.
Sitten lasketaan tyydyttyneiden rasvahappojen P ja S (SFA) ja tyydyttymättömien rasvahappojen Po, O, L ja Ln (UFA) summa (3):
4.5.5 Rasvahappokoostumuksen laskeminen TAGien 2- sekä 1- ja 3-asemassa
Rasvahapot jakautuvat kolmeen ryhmään seuraavasti: yksi 2-asemalle ja kaksi samanlaista 1- ja 3-asemille siten, että tyydyttyneillä (P ja S) ja tyydyttymättömillä hapoilla (Po, O, L ja Ln) on eri kertoimet.
4.5.5.1 Tyydyttyneet rasvahapot 2-asemassa [P(2) ja S(2)] (4)
4.5.5.2 Tyydyttymättömät rasvahapot 2-asemassa [Po(2), O(2), L(2) ja Ln(2)] (5):
4.5.5.3 Rasvahapot 1,3-asemassa [P(1,3), S(1,3), Po(1,3), O(1,3), L(1,3) ja Ln(1,3)] (6):
4.5.6 Triasyyliglyserolien laskeminen
4.5.6.1 TAGit, joissa on yksi rasvahappo (AAA, tässä LLL, PoPoPo) (7)
4.5.6.2 TAGit, joissa on kaksi rasvahappoa (AAB, tässä PoPoL, PoLL) (8)
4.5.6.3 TAGit, joissa on kolme eri rasvahappoa (ABC, tässä OLLn, PLLn, PoOLn, PPoLn) (9)
4.5.6.4 ECN42-triasyyliglyserolit
ECN42-triasyyliglyserolit lasketaan yhtälöistä 7, 8 ja 9, ja tulokset annetaan HPLC:n odotetussa eluutiojärjestyksessä (tavallisesti vain kolme piikkiä).
LLL
PoLL ja LPoL:n paikkaisomeeri
OLLn ja OLnL:n sekä LnOL:n paikkaisomeerit
PoPoL ja PoLPo:n paikkaisomeeri
PoOLn ja OPoLn:n sekä OLnPo:n paikkaisomeerit
PLLn ja LLnP:n sekä LnPL:n paikkaisomeerit
PoPoPo
SLnLn ja LnSLn:n paikkaisomeeri
PPoLn ja PLnPo:n sekä PoPLn:n paikkaisomeerit
ECN42-triasyyliglyseridit saadaan näiden yhdeksän triasyyliglyserolin ja niiden paikkaisomeerien summana. Tulokset on ilmoitettava vähintään kahden desimaalin tarkkuudella.
5. TULOSTEN ARVIOINTI
Verrataan laskemalla saatua teoreettista koostumusta ja HPLC:llä määritettyä koostumusta. Jos absoluuttisten HPLC-tulosten ja teoreettisten tulosten välinen erotus on suurempi kuin kyseiselle öljyluokalle kaupan pitämisen vaatimuksissa vahvistetut arvot, näyte sisältää siemenöljyä.
Tulokset ilmoitetaan kahden desimaalin tarkkuudella.
6. ESIMERKKI (NUMEROT VIITTAAVAT MENETELMÄÄ SELOSTAVAN TEKSTIN KOHTIIN)
— 4.5.1 Rasvahappojen mooliprosenttien laskeminen GLC-tuloksista (standardisoitu pinta-ala-%)
GLC:llä saadaan rasvahappokoostumukselle seuraavat tulokset:
|
FA |
P |
S |
Po |
O |
L |
Ln |
|
MW |
256,4 |
284,5 |
254,4 |
282,5 |
280,4 |
278,4 |
|
Pinta-ala-% |
10,0 |
3,0 |
1,0 |
75,0 |
10,0 |
1,0 |
— 4.5.3 Pinta-ala-prosenttien muuntaminen mooleiksi kaikille rasvahapoille (ks. kaava 1)
|
moolia P |
= |
|
|
moolia S |
= |
|
|
moolia Po |
= |
|
|
moolia O |
= |
|
|
moolia L |
= |
|
|
moolia Ln |
= |
|
|
Yhteensä |
= |
0,35821 moolia TAG |
— 4.5.4 Rasvahappomoolien standardoiminen 100 %:iin (ks. kaava 2)
|
mooli-% P(1,2,3) |
= |
|
|
mooli-% S(1,2,3) |
= |
|
|
mooli-% Po(1,2,3) |
= |
|
|
mooli-% O(1,2,3) |
= |
|
|
mooli-% L(1,2,3) |
= |
|
|
mooli-% Ln(1,2,3) |
= |
|
|
Yhteensä mooli-% |
= |
100 % |
Tyydyttyneiden ja tyydyttymättömien rasvahappojen summa TAGien 1,2,3-asemassa (ks. kaava 3):
— 4.5.5 Rasvahappokoostumuksen laskeminen TAGien 2- ja 1,3-asemassa
— 4.5.5.1 Tyydyttyneet rasvahapot 2-asemassa [P(2) ja S(2)] (ks. kaava 4):
— 4.5.5.2 Tyydyttymättömät rasvahapot 2-asemassa [Po(1,3), O(1,3), L(1,3) ja Ln(1,3)] (ks. kaava 5)
— 4.5.5.3 Rasvahapot 1,3-asemassa [P(1,3), S(1,3), Po(1,3), O(1,3), L(1,3) ja Ln(1,3)] (ks. kaava 6)
— 4.5.6 Triasyyliglyserolien laskeminen
Lasketusta rasvahappokoostumuksesta sn-2 ja sn-1,3-asemassa:
|
FA seuraavissa: |
1,3-as. |
2-as. |
|
P |
16,004 % |
0,653 % |
|
S |
4,325 % |
0,177 % |
|
Po |
1,015 % |
1,262 % |
|
O |
68,526 % |
85,296 % |
|
L |
9,204 % |
11,457 % |
|
Ln |
0,927 % |
1,153 % |
|
Sum |
100,0 % |
100,0 % |
lasketaan seuraavat triasyyliglyserolit:
LLL
PoPoPo
PoLL ja 1 paikkaisomeeri
SLnLn ja 1 paikkaisomeeri
PoPoL ja 1 paikkaisomeeri
PPoLn ja 2 paikkaisomeeriä
OLLn ja 2 paikkaisomeeriä
PLLn ja 2 paikkaisomeeriä
PoOLn ja 2 paikkaisomeeriä
— 4.5.6.1 TAGit, joissa on yksi rasvahappo (LLL, PoPoPo) (ks. kaava 7)
, = 0,09706 moolia LLL
— 4.5.6.2 TAGit, joissa on kaksi rasvahappoa (PoLL, SLnLn, PoPoL) (ks. kaava 8)
0,03210 moolia PoLL
0,00094 moolia SLnLn
0,00354 moolia PoPoL
— 4.5.6.3 TAGit, joissa on kolme eri rasvahappoa (PoPLn, OLLn, PLLn, PoOLn) (ks. kaava 9)
0,00761 moolia PPoLn
0,43655 moolia OLLn
0,06907 moolia PLLn
0,04812 moolia PoOLn
ECN42 = 0,69512 moolia TAGs
Huomautus 1: Eluutiojärjestys voidaan määrittää laskemalla ekvivalenttihiililuvut, jotka määräytyvät usein yhtälön
perusteella, jossa CN on hiililuku ja n on kaksoissidosten määrä; se voidaan laskea tarkemmin ottamalla huomioon kaksoissidoksen alkuperä. Jos no, nl ja nln ovat öljyhapon, linolihapon ja linoleenihapon kaksoissidokset, ekvivalenttilihiililuku voidaan laskea yhtälöstä
jossa kertoimet do, dl ja dln voidaan laskea vertailutriglyseridien avulla. Tässä menetelmässä eritellyissä oloissa suhde on lähellä seuraavaa:
Huomautus 2: Usean triglyseridin avulla voi myös laskea erotuskyvyn trioleiinin suhteen:
trioleinkäyttämällä redusoitua retentioaikaa
.
Log α:aa f:n funktiona (jossa f on kaksoissidosten määrä) esittävän kuvaajan avulla voidaan määrittää retentioarvot kaikille vertailutriglyserideihin sisältyvien rasvahappojen triglyserideille; katso kuvio 1.
Huomautus 3: Pylvään pitäisi olla niin tehokas, että trilinoleiinipiikki erottuu selvästi niiden triglyseridien piikeistä, joiden retentioajat ovat sitä lähellä. Eluutiota jatketaan aina ECN52:een asti.
Huomautus 4: Jotta saataisiin sellainen kromatogrammi, että kaikkien tärkeiden piikkien pinta-alat voidaan mitata luotettavasti, on ECN50-triglyseridiä vastaavan toisen piikin korkeuden oltava 50 % koko asteikosta.
Kuvio 1
Log α:aa f:n funktiona (jossa f on kaksoissidosten määrä) esittävä kuvaaja
Kaksoissidosten määrä
La: lauriinihappo; My: myristiinihappo; P: palmitiinihappo; S: steariinihappo; O: öljyhappo; L: linolihappo; Ln: linoleenihappo.
Kuvio 2
Vähän linolihappoa sisältävä oliiviöljy
a
Liuottimena asetoni/asetonitriili
PROFIILI a: Kromatogrammin piikkien tärkeimmät komponentit: ECN42: (1) LLL + PoLL; (2) OLLn + PoOLn; (3) PLLn; ECN44: (4) OLL + PoOL; (5) OOLn + PLL; (6) POLn + PPoPo; (7) OOL + PoOO; ECN46: (8) OOL + LnPP; (9) PoOO; (10) SLL + PLO; (11) PoOP + SPoL + SOLn + SPoPo; (12) PLP; ECN48: (13) OOO + PoPP; (14 + 15) SOL + POO; (16) POP; ECN50: (17) SOO; (18) POS + SLS.
b
Liuottimena propionitriili
PROFIILI b: Kromatogrammin piikkien tärkeimmät komponentit: ECN42: (1) LLL; (2) OLLn + PoLL; (3) PLLn; ECN44: (4) OLL; (5) OOLn + PoOL; (6) PLL + PoPoO; (7) POLn + PPoPo + PPoL; ECN46: (8) OOL + LnPP; (9) PoOO; (10) SLL + PLO; (11) PoOP + SPoL + SOLn + SPoPo; (12) PLP; ECN48: (13) OOO + PoPP; (14) SOL; (15) POO; (16) POP; ECN50: (17) SOO; (18) POS + SLS
Kuvio 3
Paljon linolihappoa sisältävä oliiviöljy
a
Liuottimena asetoni/asetonitriili (50:50)
Profiili a: Kromatogrammin piikkien tärkeimmät komponentit: ECN42: (1’) LLL + PoLL; (2’) OLLn + PoOLn; (3’) PLLn; ECN44: (4’) OLL + PoOL; (5’) OOLn + PLL; (6’) POLn + PPoPo; ECN46: (7’) OOL + PoOO; (8’) PLO + SLL + PoOP; (9’) PLP + PoPP; ECN48: (10’) OOO; (11’) POO + SLL + PPoO; (12’) POP + PLS; ECN50: (13’) SOO; (14’) POS + SLS
b
Liuottimena propionitriili
Profiili b: Kromatogrammin piikkien tärkeimmät komponentit: ECN42: (1) LLL; (2 + 2’) OLLn + PoLL; (3) PLLn; ECN44: (4) OLL; (5) OOLn + PoOL; (6) PLL + PoPoO; (7) POLn + PPoPo + PPoL; ECN46: (8) OOL + LnPP; (9) PoOO; (10) SLL + PLO; (11) PoOP + SPoL + SOLn + SPoPo; ECN48: (12) PLP; (13) OOO + PoPP; (14) SOL; (15) POO; (16) POP; ECN50: (17) SOO; (18) POS + SLS; ECN52: (19) AOO.
LIITE XIX
STEROLIEN RAKENTEEN JA PITOISUUDEN SEKÄ ALKOHOLIYHDISTEIDEN MÄÄRITTÄMINEN KAPILLAARIKAASUKROMATOGRAFISELLA MENETELMÄLLÄ
1. SOVELTAMISALA
Menetelmässä kuvataan menettely oliiviöljyjen ja oliivin puristemassaöljyjen yksittäisten alkoholiyhdisteiden pitoisuuden ja alkoholiyhdisteiden kokonaispitoisuuden määrittämiseksi.
Oliiviöljyjen ja oliivin puristemassaöljyjen sisältämiin alkoholiyhdisteisiin kuuluvat alifaattiset alkoholit, sterolit ja triterpeenidialkoholit.
2. PERIAATE
Öljyt, joihin on lisätty α-kolestanolia ja 1-eikosanolia sisäiseksi standardiksi, saippuoidaan kaliumhydroksidin etanoliliuoksella ja saippuoitumaton aines uutetaan etyylieetterillä.
Eri alkoholiyhdisteiden fraktiot erotetaan saippuoitumattomasta uutteesta joko ohutkerroskromatografian avulla emäksisellä silikageelilevyllä (vertailumenetelmä) tai HPLC:llä silikageelikolonnissa. Silikageelierotuksella saatu fraktio muutetaan trimetyylisilyylieettereiksi ja määritetään kapillaarikaasukromatografialla.
1 OSA
SAIPPUOITUMATTOMAN AINEKSEN ESIKÄSITTELY
1. SOVELTAMISALA
Tässä osassa kuvataan saippuoitumattoman aineksen valmistelu ja uuttaminen. Se kattaa myös oliiviöljystä ja oliivin puristemassaöljystä saadun saippuoitumattoman aineksen valmistelun ja uuttamisen.
2. PERIAATE
Näyte saippuoidaan keittämällä sitä palautusjäähdytintä käyttäen kaliumhydroksidin etanoliliuoksessa. Saippuoitumaton aines uutetaan dietyylieetterillä.
3. VÄLINEISTÖ
Tavallinen laboratoriovälineistö ja erityisesti seuraavat:
3.1 Pullo, 250 ml, jossa on hiotut lasiliitännät sekä palautusjäähdytin.
3.2 Erotussuppilo, 500 ml.
3.3 Pulloja, 250 ml.
3.4 Mikroruiskuja, 100 μl ja 500 μl.
3.5 Lasisintterisuodatinsuppilo, jonka huokoskoko on G 3 (15–40 μm), halkaisija noin 2 cm ja korkeus 5 cm ja jossa on liitäntä tyhjiösuodatusta varten sekä koirashios.
3.6 Erlenmeyerpullo, 50 ml, jossa on naarashios ja joka sopii suodatinsuppiloon (3.5).
3.7 Koeputki, 10 ml, jossa on kartiomainen pohja ja ilmatiivis lasitulppa.
3.8 Kalsiumkloridia sisältävä eksikaattori.
4. REAGENSSIT
4.1 Kaliumhydroksidi (vähintään 85 %).
4.2 Kaliumhydroksidin etanoliliuos, noin 2 M.
130 g kaliumhydroksidia (4.1) liuotetaan 200 ml:aan tislattua vettä samalla jäähdyttäen ja lisätään etanolia (4.7) niin, että liuosta on yksi litra. Liuosta säilytetään tiiviisti suljetuissa, tummissa lasipulloissa enintään kahden päivän ajan.
4.3 Etyylieetteri, analyysilaatua.
4.4 Vedetön natriumsulfaatti, analyysilaatua.
4.5 Asetoni, kromatografialaatua.
4.6 Etyylieetteri, kromatografialaatua.
4.7 Etanoli, analyysilaatua.
4.8 Etyyliasetaatti, analyysilaatua.
4.9 Sisäinen standardi, α-kolestanoli, puhtausaste yli 99 prosenttia (puhtausaste on tarkastettava kaasukromatografisella määrityksellä).
4.10 α-Kolestanoli, sisäisen standardin mukainen liuos, 0,2-prosenttisena (m/V) etyyliasetaattiluoksena (4.8).
4.11 Fenolftaleiini, 10 g liuotettuna litraan etanolia (4.7).
4.12 0,1-prosenttinen (m/V) 1-eikosanolin etyyliasetaattiliuos (sisäinen standardi).
5. SUORITUS
250 μl:n pulloon (3.1) lisätään 500 μl:n mikroruiskulla (3.4) sellainen tilavuusmäärä α-kolestanolin sisäisen standardin mukaista liuosta (4.10) ja 1-eikosanolia (4.12), jonka sisältämä kolestanolin ja eikosanolin määrä on noin 10 prosenttia sterolin ja alkoholin määrästä näytteessä. Esimerkiksi 5 gramman oliiviöljynäytteeseen lisätään 500 μl α-kolestanoliliuosta (4.10) ja 250 μl 1-eikosanoliliuosta (4.12). Oliivin puristemassaöljyä koskevaan näytteeseen lisätään 1 500 μl α-kolestanoliliuosta (4.10) ja 1 500 μl 1-eikosanoliliuosta (4.12). Haihdutetaan kuiviin kevyessä typpivirrassa lämpimässä vesihauteessa. Pullon jäähdyttyä punnitaan 5,00 ± 0,01 g kuivattua, suodatettua näytettä samaan pulloon.
Huomautus 1: Eläin- tai kasvirasvat ja -öljyt, jotka sisältävät paljon kolesterolia, voivat tuottaa piikin, jonka retentioaika on sama kuin kolestanolin. Jos käy näin, sterolifraktio on määritettävä kahdesti niin, että toisella kertaa käytetään sisäistä standardia ja toisella ei.
Lisätään 50 ml 2 M kaliumhydroksidin etanoliliuosta (4.2) ja hieman hohkakiveä, käynnistetään palautusjäähdytin ja kuumennetaan vesihauteessa hiljalleen kiehuvaksi koko ajan voimakkaasti sekoittaen, kunnes saippuoituminen on tapahtunut (liuos kirkastuu). Kuumentamista jatketaan vielä 20 minuuttia, sitten lisätään 50 ml tislattua vettä jäähdyttimen yläpäästä, irrotetaan jäähdytin ja jäähdytetään pullo noin 30 °C:n lämpötilaan.
Pullon sisältämä seos siirretään kvantitatiivisesti 500 ml:n erotussuppiloon (3.2) käyttämällä useita annoksia tislattua vettä (50 ml). Lisätään noin 80 ml etyylieetteriä (4.6), ravistetaan voimakkaasti noin 60 sekunnin ajan siten, että paine poistetaan ajoittain kääntämällä erotussuppilo ylösalaisin ja avaamalla tulppa. Annetaan seistä, kunnes kaksi faasia ovat täysin erottuneet (huomautus 2). Sen jälkeen saippualiuos otetaan mahdollisimman tarkoin toiseen erotussuppiloon. Vesi-alkoholifaasi uutetaan vielä kaksi kertaa samalla tavoin käyttämällä 60–70 ml etyylieetteriä (4.6).
Huomautus 2: Mahdollinen emulsio voidaan hajottaa lisäämällä pieniä määriä etanolia (4.7).
Yhdistetään saadut kolme eetteriuutetta yhteen erotussuppiloon, joka sisältää 50 ml vettä. Pestään vedellä (50 ml kerralla), kunnes pesuvesi ei enää saa vaaleanpunaista väriä, kun siihen lisätään tippa fenolftaleiiniliuosta (4.11). Kun pesuvesi on poistettu, suodatetaan vedettömän natriumsulfaatin (4.4) läpi etukäteen punnittuun 250 ml:n pulloon ja pestään suppilo ja suodatin pienillä määrillä etyylieetteriä (4.6).
Liuotin haihdutetaan haihduttimessa 30 °C:n lämpötilassa tyhjiössä. Lisätään 5 ml asetonia (4.5), ja haihtuva liuotin poistetaan kokonaan kevyessä typpivirrassa. Jäännöstä kuivatetaan lämpökaapissa 103 ± 2 °C:n lämpötilassa 15 minuutin ajan. Jäähdytetään eksikaattoreissa ja punnitaan 0,1 mg:n tarkkuudella.
2 OSA
ALKOHOLIYHDISTEIDEN FRAKTIOIDEN EROTTAMINEN
1. SOVELTAMISALA
Edellä olevan 1 osan mukaisesti valmisteltu saippuoitumaton aines fraktioidaan erilaisiksi alkoholiyhdisteiksi, alifaattisiksi alkoholeiksi, steroleiksi ja triterpeenidialkoholeiksi (erytrodioliksi ja uvaoliksi).
2. PERIAATE
Saippuoitumaton aines voidaan fraktioida emäksisten levyjen avulla ohutkerroskromatografialla (vertailumenetelmä) ja tehdä näkyväksi ja sitä vastaavat vyöhykkeet voidaan raaputtaa ja erottaa uuttamalla. Vaihtoehtoisena erotusmenetelmänä voidaan käyttää HPLC:tä silikageelikolonnissa ja UV-detektoria ja kerätä erilaiset fraktiot. Alifaattiset ja terpeenialkoholit sekä sterolit ja triterpeenidialkoholit eristetään yhdessä.
3. VÄLINEISTÖ
Tavallinen laboratoriovälineistö ja erityisesti seuraavat:
3.1 Ohutkerroskromatografialaitteisto, jonka lasilevyjen koko on 20 × 20 cm.
3.2 Ultraviolettivalo, jonka aallonpituus on 366 tai 254 nm.
3.3 Mikroruiskuja, 100 μl ja 500 μl.
3.4 Lasisintterisuodatinsuppilo, jonka huokoskoko on G 3 (15–40 μm), halkaisija noin 2 cm ja korkeus 5 cm ja jossa on liitäntä tyhjiösuodatusta varten sekä koirashios.
3.5 Erlenmeyerpullo, 50 ml, jossa on naarashios ja joka sopii suodatinsuppiloon (3.4).
3.6 Koeputki, 10 ml, jossa on kartiomainen pohja ja ilmatiivis lasitulppa.
3.7 Kalsiumkloridia sisältävä eksikaattori.
3.8 HPLC-järjestelmä, joka koostuu seuraavista osista:
3.8.1 Binääripumppu.
3.8.2 Manuaalinen tai automaattinen injektori, jossa on 200 μl:n injektiosilmukka.
3.8.3 Integroitu kaasunpoistaja.
3.8.4 UV/VIS- tai infrapunadetektori.
3.9 HPLC-laitteiston kolonni, (25 cm × 4 mm sisähalkaisija), silikageeli 60 (hiukkaskoko 5 μm).
3.10 Ruiskusuodatin, 0,45 μm.
3.11 Erlenmeyerpullo, 25 mL.
4. REAGENSSIT
4.1 Kaliumhydroksidi (vähintään 85 %).
4.2 Kaliumhydroksidin etanoliliuos, noin 2 M.
130 g kaliumhydroksidia (4.1) liuotetaan 200 ml:aan tislattua vettä samalla jäähdyttäen ja lisätään etanolia (4.9) niin, että liuosta on yksi litra. Liuosta säilytetään tiiviisti suljetuissa, tummissa lasipulloissa enintään kahden päivän ajan.
4.3 Etyylieetteri, analyysilaatua.
4.4 Kaliumhydroksidin etanoliliuos, noin 0,2 M.
Liuotetaan 13 g kaliumhydroksidia (4.1) 20 ml:aan tislattua vettä ja lisätään etanolia (4.9) niin, että liuosta on yksi litra.
4.5 Silikageelillä päällystetyt lasilevyt (20 × 20 mm), paksuudeltaan 0,25 mm, ilman fluoresenssi-indikaattoria (voidaan ostaa käyttövalmiina).
4.6 Asetoni, kromatografialaatua.
4.7 n-Heksaani, kromatografialaatua.
4.8 Etyylieetteri, kromatografialaatua.
4.9 Etanoli, analyysilaatua.
4.10 Etyyliasetaatti, analyysilaatua.
4.11 Ohutkerroskromatografian vertailuliuos: kolesteroli, fytosterolit, alkoholit ja erytrodiolin 5-prosenttinen liuos etyyliasetaatissa (4.10).
4.12 2,7-Dikloorifluoreseiini, 0,2-prosenttinen etanoliliuos. Liuos tehdään lievästi emäksiseksi lisäämällä muutama tippa kaliumhydroksidin 2 M alkoholiliuosta (4.2).
4.13 n-Heksaani (4.7)/etyylieetteri (4.8)-seos, 65:35 (V/V).
4.14 HPLC:n liikkuva faasi, n-heksaani (4.7)/etyylieetteri (4.8)-seos, 1:1 (V/V).
5. VERTAILUMENETELMÄ: ALKOHOLIYHDISTEIDEN EROTTAMINEN EMÄKSISELLÄ OHUTKERROSKROMATOGRAFIAN LEVYLLÄ
Emäksisten ohutkerroskromatografian levyjen valmistaminen. Upotetaan tai kastetaan silikageelilevyt (4.5) kokonaan kaliumhydroksidin 0,2 M etanoliliuokseen (4.4) kymmeneksi sekunniksi, minkä jälkeen niiden annetaan kuivua kaksi tuntia vetokaapissa ja lopuksi yksi tunti 100 °C:ssa lämpökaapissa.
Kun levyt on otettu lämpökaapista, niitä säilytetään kalsiumkloridia sisältävässä eksikaattorissa käyttöhetkeen saakka (näin käsitellyt levyt on käytettävä 15 päivän kuluessa).
Heksaani-etyylieetteriseos (4.13) (huomautus 3) kaadetaan kehitysastiaan siten, että sitä on noin 1 cm. Kehitysastia suljetaan sopivalla kannella ja annetaan seistä avaamatta viileässä paikassa vähintään puoli tuntia, jotta syntyy neste-höyrytasapaino. Astian sisäseinille voidaan kiinnittää suodatinpaperisuikaleita, jotka ulottuvat eluointiaineeseen. Tämä lyhentää kehitysaikaa lähes kolmanneksella ja aineosat eluoituvat tasaisemmin.
Huomautus 3: Kehitysliuos on vaihdettava uuteen ennen jokaista koetta, jotta eluointiolosuhteet olisivat täysin toistettavissa. Vaihtoehtoisesti liuottimena voidaan käyttää n-heksaani-etyylieetteriseosta (50:50, V/V).
Edellä olevan 1 osan mukaisesti valmistetusta saippuoitumattomasta aineksesta valmistetaan noin 5-prosenttinen liuos etyyliasetaattiin (4.10), jota levitetään 0,3 ml ohuena ja tasaisena nauhana 100 μl:n mikroruiskulla (3.3) kromatografialevyn (4.5) alareunaan (2 cm). Asetetaan 2–3 μl aineen vertailuliuosta (4.11) lähtöviivan tasalle niin, että sterolin, triterpeenidialkoholien ja alkoholien vyöhykkeet voidaan tunnistaa kehityksen jälkeen.
Levy asetetaan kehitysastiaan (3.1). Ympäristön lämpötilan on oltava 15–20 °C (huomautus 4). Astian kansi suljetaan heti ja levyn annetaan eluoitua, kunnes liuotinrintama on siirtynyt noin 1 cm:n päähän levyn yläreunasta. Levy otetaan kehitysastiasta ja liuotin haihdutetaan kuumassa ilmavirrassa tai panemalla levy joksikin aikaa vetokaappiin.
Huomautus 4: Korkeampi lämpötila voi haitata erotusta.
Levylle suihkutetaan ohuelti ja tasaisesti 2,7-dikloorifluoreseiiniliuosta (4.12), ja se jätetään kuivumaan. Sterolien, triterpeenidialkoholien ja alkoholien vyöhykkeet voidaan tunnistaa ultraviolettivalossa kohdistamalla ne vertailuliuoksesta (4.11) syntyneisiin pisteisiin. Vyöhykkeiden ääriviivat merkitään mustalla kynällä fluoresenssin rajoja seuraten (ks. kuvio 1, TLC-levy).
Silikageeli raaputetaan levystä irti metallilastalla merkityn alueen kohdalta. Saatu aines hienonnetaan ja siirretään suodatinsuppiloon (3.4). Lisätään 10 ml kuumaa etyyliasetaattia (4.10), sekoitetaan huolellisesti metallilastalla ja suodatetaan (tarvittaessa tyhjiössä). Suodos kerätään suodatinsuppiloon liitettyyn erlenmeyerpulloon (3.5).
Pulloon jäänyt aines pestään kolme kertaa noin 10 ml:lla etyylieetteriä (4.3), ja suodos kerätään samaan, suodatinsuppiloon liitettyyn pulloon. Suodosta haihdutetaan, kunnes sen tilavuus on noin 4–5 ml, ja jäännösliuos kaadetaan etukäteen punnittuun 10 ml:n koeputkeen (3.6). Liuosta kuivataan alhaisella lämmöllä kevyessä typpivirrassa; jäännös liuotetaan muutamaan tippaan asetonia (4.6) ja kuivataan jälleen. Koeputkessa olevan jäännös on steroli- ja triterpeenidialkoholifraktio tai alkoholi- ja triterpeenialkoholifraktio.
6. ALKOHOLIFRAKTION EROTUS HPLC:LLÄ
Saippuoitumaton aines, joka saatiin 1 osasta, liuotetaan 3 ml:aan liikkuvaa faasia (4.14), liuos suodatetaan ruiskusuodattimella (3.10) ja otetaan talteen.
200 μl suodatettua saippuoitumatonta liuosta injektoidaan HPLC-laitteistoon (3.8).
HPLC-erotus ajetaan virtauksella 0,8 ml/min, ensimmäiset 5 minuuttia jätetään huomiotta ja aikavälillä 5–10 minuuttia kerätään alifaattiset ja triterpeenialkoholit ja aikavälillä 11–25 minuuttia sterolit sekä erytrodioli ja uvaoli 25 ml:n erlenmeyerpulloihin (huomautus 5).
Erotusta voidaan seurata UV-detektorilla 210 nm:n aallonpituudella tai refraktioindeksidetektorilla (ks. kuva 6).
Fraktiot kuivataan haihduttamalla ja valmistellaan kromatografiamääritystä varten.
Huomautus 5: Valvokaa tarkoin HPLC-pumpun painetta, sillä etyylieetteri voi lisätä painetta, ja säätäkää virtausta paineen pitämiseksi valvonnassa.
3 OSA
ALKOHOLIYHDISTEIDEN FRAKTIOIDEN KAASUKROMATOGRAFINEN MÄÄRITYS
1. SOVELTAMISALA
Tässä osassa annetaan yleisohjeita kapillaarikaasukromatografian käyttöön, kun tarkoituksena on määrittää tämän menetelmän 2 osan mukaisesti eristettyjen alkoholiyhdisteiden koostumus kvalitatiivisesti ja kvantitatiivisesti.
2. PERIAATE
Saippuoitumattomasta aineksesta TLC:tä tai HPLC:tä käyttäen kerätyt fraktiot johdetaan trimetyylisilyylieettereihin ja määritetään sen jälkeen kapillaarikaasukromatografialla, jossa käytetään jakoinjektiota ja liekki-ionisaatiodetektoria.
3. VÄLINEISTÖ
Tavallinen laboratoriovälineistö ja erityisesti seuraavat:
3.1 Koeputki, 10 ml, jossa on kartiomainen pohja ja ilmatiivis lasitulppa.
3.2 Kaasukromatografi, jota käytetään kapillaarikolonnin ja jakoinjektiojärjestelmän kanssa ja jonka osat ovat
3.2.1 termostaattisäätöinen kolonniuuni, joka säilyttää halutun lämpötilan noin ± 1 °C:n tarkkuudella;
3.2.2 injektoriyksikkö, jonka lämpötilaa voi säätää ja jonka höyrystämisosa on persilanoitua lasia ja jossa on virtauksenjakojärjestelmä;
3.2.3 liekki-ionisaatiodetektori (FID);
3.2.4 tiedonkeruujärjestelmä, joka sopii käytettäväksi FID-detektorin kanssa (3.10.3) ja jonka voi integroida manuaalisesti.
3.3 Kvartsilasinen kapillaarikolonni, jonka pituus on 20–30 m ja sisähalkaisija 0,25–0,32 mm ja jonka sisäpinta on päällystetty yhdisteellä, jossa on 5 prosenttia bifenyyliä ja 95 prosenttia dimetyylipolysiloksaania (SE-52 tai SE-54, stationäärifaasi tai vastaava) siten, että päällysteen paksuus on kauttaaltaan 0,10–0,30 μm.
3.4 Jakoinjektioon sopiva kiinteäneulainen mikroruisku, 10 μl, kaasukromatografiaa varten.
4. REAGENSSIT
4.1 Vedetön pyridiini, kromatografialaatua.
4.2 Heksametyylidisilatsaani, analyysilaatua.
4.3 Trimetyylikloorisilaani, analyysilaatua.
4.4 Sterolien trimetyylisilyylieettereiden (TMSE) näyteliuokset. Ne valmistetaan vasta käyttöhetkellä steroleista ja erytrodiolista, jotka saadaan niitä sisältävistä öljyistä.
4.5 Alifaattisten C20–C28-alkoholien trimetyylisilyylieettereiden standardiliuokset. Ne valmistetaan puhtaiden alkoholien seoksista juuri ennen käyttöä.
4.6 Kantajakaasut: vety tai helium, kaasukromatografista laatua.
4.7 Apukaasut: vety, helium, typpi ja ilma, kaasukromatografista laatua.
4.8 Silylointireagenssi, jossa on pyridiiniä, heksametyylidisilatsaania ja trimetyylikloorisilaania tilavuussuhteessa 9:3:1 (V/V/V).
4.9 n-Heksaani, kromatografialaatua.
5. TRIMETYYLISILYYLIEETTEREIDEN VALMISTUS
Koeputkessa (3.1) olevaan alkoholiyhdisteen fraktioon lisätään 50 μl silylointireagenssia (4.8) (huomautus 6) jokaista koeputkessa olevaa alkoholiyhdisteen milligrammaa kohti niin, että kosteutta ei pääse mukaan (huomautus 7).
Huomautus 6: Käyttövalmiita liuoksia on kaupan. Saatavana on myös muita silylointireagensseja, kuten esim. bistrimetyylisilyylitrifluoriasetamidi + 1 % trimetyylikloorisilaani; reagenssi laimennetaan samalla määrällä vedetöntä pyridiiniä. Pyridiini voidaan korvata samalla määrällä asetonitriiliä.
Huomautus 7: Lievä sameus on tavallista eikä ole haitaksi. Valkoiset hiutaleet tai vaaleanpunaiseksi värjäytyminen ovat merkkejä kosteudesta tai reagenssien muuttumisesta. Jos näitä ilmenee, koe on uusittava (ainoastaan käytettäessä heksametyylidisilatsaania tai trimetyylikloorisilaania).
Koeputki (3.1) suljetaan tulpalla, ravistetaan varovasti (ei ylösalaisin), kunnes yhdisteet ovat täysin liuenneet. Annetaan seistä vähintään 15 minuuttia huoneenlämmössä ja sentrifugoidaan sitten muutaman minuutin ajan. Kirkas liuos on nyt valmis kaasukromatografista määritystä varten.
6. KAASUKROMATOGRAFINEN MÄÄRITYS
6.1 Esivalmistelut ja kapillaarikolonnin valmistelu
Kolonni (3.3) asennetaan kaasukromatografialaitteistoon kiinnittämällä kolonnin alkupää jakoinjektoriin ja kolonnin loppupää detektoriin.
Tarkistetaan kaasukromatografisten laitteiden toiminta (kaasuliitännän tiiviys, detektorin, virtauksenjakojärjestelmän ja piirturin toimivuus jne.).
Jos kapillaarikolonnia ei ole aikaisemmin käytetty, se on ensin valmisteltava käyttöön. Pieni määrä kaasua johdetaan kolonnin läpi, käynnistetään kaasukromatografi ja aloitetaan asteittainen lämmittäminen, jota jatketaan, kunnes lämpötila on kohonnut vähintään 20 °C korkeammaksi kuin käyttölämpötila (huomautus 8). Korkeaa lämpötilaa pidetään yllä vähintään kaksi tuntia, minkä jälkeen kromatografialaitteisto saatetaan käyttövalmiiksi (kaasuvirtojen ja jaon säätö, liekinsytytys, tietojärjestelmään kytkeminen, kolonnin, detektorin ja injektorin lämpötilan säätö jne.) ja signaalia rekisteröidään herkkyydellä, joka on vähintään kaksi kertaa niin suuri kuin määrityksessä käytettävä. Saadun perusviivan on oltava suora, eikä siinä saa olla minkäänlaisia piikkejä eikä siirtymää mihinkään suuntaan. Jos ilmenee negatiivista suoraviivaista siirtymää, se on merkki kolonnin liitäntöjen vuodosta, ja jos ilmenee positiivista siirtymää, se johtuu kolonnin riittämättömästä valmistelusta.
Huomautus 8: Esivalmistelulämpötilan on aina oltava vähintään 20 °C alempi kuin käytettävä stationäärifaasin korkein lämpötila.
6.2 Käyttöolosuhteet
Optimoidaan lämpötilaohjelma ja kantajakaasun virtaus siten, että saadaan kuvien 3–6 kaltaiset kromatogrammit.
Seuraavat parametrit testattiin ja todettiin käyttökelpoisiksi:
6.2.1 Alifaattiset alkoholit
|
Uunin lämpötilaohjelma |
180 °C (8 min) → 260 °C (5 °C/min) → 260 °C (15 min) |
|
Injektorin lämpötila |
280 °C |
|
Detektorin lämpötila |
290 °C |
|
Kantajakaasun lineaarinopeus |
helium (20–30 cm/s); vety (30–50 cm/s) |
|
Jakosuhde |
1:50–1:100 |
|
Injektiotilavuus |
0,5–1 μl trimetyylisilyylieetteriliuosta (TMSE) |
6.2.2 Sterolit ja triterpeenidialkoholit
|
Uunin lämpötilaohjelma |
260 ± 5 °C isoterminen |
|
Injektorin lämpötila |
280–300 °C |
|
Detektorin lämpötila |
280–300 °C |
|
Kantajakaasun lineaarinopeus |
helium (20–30 cm/s); vety (30–50 cm/s) |
|
Jakosuhde |
1:50–1:100 |
|
Injektiotilavuus |
0,5–1 μl trimetyylisilyylieetteriliuosta (TMSE) |
Näitä olosuhteita voidaan muuttaa kolonnin ja kaasukromatografin ominaisuuksien mukaan siten, että saadaan seuraavat vaatimukset täyttävät kromatogrammit:
— C26-alkoholin retentioaika on 18 ± 5 minuuttia.
— C22-alkoholin piikki on 80 ± 20 % täydestä asteikosta oliiviöljylle ja 40 ± 20 % täydestä asteikosta oliivin puristemassaöljylle.
— β-sitosterolin piikin retentioaika on 20 ± 5 minuuttia.
— kampesterolin piikki: oliiviöljylle (pitoisuus keskimäärin 3 %) 20 ± 5 % täydestä asteikosta.
— kaikki mukana olevat sterolit on erotettava. Lisäksi kunkin piikin jälkeen piirturin tulee palata perusviivalle ennen uuden piikin alkua. Tämä ei ole kuitenkaan tarpeen, jos suhteellisen retentioajan (RRT) 1,02 piikki (sitostanoli) pystytään mittaamaan kohtisuoraan.
6.3 Määritys
Imetään 10 μl:n mikroruiskuun (3.4) 1 μl heksaania, sitten 0,5 μl ilmaa ja tämän jälkeen 0,5–1 μl näyteliuosta; lopuksi männällä vedetään vielä neula tyhjäksi. Neula työnnetään septumin läpi injektoriin ja 1–2 sekunnin kuluttua seos injektoidaan nopeasti, odotetaan noin viisi sekuntia, minkä jälkeen neula vedetään pois hitaasti. Myös automaattista injektoria voidaan käyttää.
Rekisteröintiä jatketaan, kunnes näytteessä olevien vastaavien alkoholiyhdisteiden TMSE on kokonaan eluoitunut. Perusviivan on koko ajan oltava vastaavien käyttöolosuhteiden vaatimusten mukainen (6.2.1 tai 6.2.2).
6.4 Piikkien tunnistaminen
Yksittäiset piikit tunnistetaan retentioaikojen perusteella sekä vertaamalla samoissa olosuhteissa määritettyyn alifaattisten ja triterpeenialkoholien tai sterolien ja triterpeenidialkoholien TMSE-seokseen. Alifaattisten ja triterpeenialkoholien fraktion kromatogrammi esitetään kuviossa 3, ja vastaavat kromatogrammit sterolien ja triterpeenidialkoholien osalta esitetään kuviossa 2.
Alifaattiset alkoholit eluoituvat seuraavassa järjestyksessä: C20-oli (I.S.), C22-oli, C23-oli, C24-oli, C25-oli, C26-oli, C27-oli ja C28-oli.
Sterolit ja triterpeenidialkoholit eluoituvat seuraavassa järjestyksessä: kolesteroli, brassikasteroli, ergosteroli, 24-metyleenikolesteroli, kampesteroli, kampestanoli, stigmasteroli, δ-7-kampesteroli, δ-5,23-stigmastadienoli, klerosteroli, β-sitosteroli, sitostanoli, δ-5-avenasteroli, δ-5,24-stigmastadienoli, δ-7-sigmastenoli, δ-7-avenasteroli, erytrodioli ja uvaoli.
6.5 Kvantitatiivinen arviointi
1-eikosanolin ja C22, C24, C26 ja C28 alifaattisten alkoholien piikkien pinta-alat lasketaan tiedonkeruujärjestelmän avulla. 1-eikosanolin vastekerroin on 1.
Lasketaan α-kolestanolin sekä sterolien ja triterpeenidialkoholien piikkien pinta-alat tietojärjestelmän avulla. Sellaisten aineiden piikit jätetään huomiotta, jotka eivät esiinny taulukossa 1 (ergosterolin piikkiä ei lasketa). α-Kolestanolin vastekerroin on 1.
Lasketaan kunkin yksittäisen alkoholiyhdisteen pitoisuus mg/kg:ssa rasvaa tai öljyä seuraavalla kaavalla:
jossa:
|
Ax |
= |
alkoholiyhdisteen x piikin pinta-ala, tietojärjestelmällä laskettuna; |
|
As |
= |
1-eikosanolin/α-kolestanolin piikin pinta-ala, tietojärjestelmällä laskettuna; |
|
ms |
= |
lisätyn 1-eikosanolin/α-kolestanolin massa milligrammoina; |
|
m |
= |
määritykseen käytetyn näytteen massa grammoina. |
7. TULOSTEN ESITTÄMINEN
Ilmoitetaan yksittäisten alifaattisten ja triterpeenialkoholien pitoisuudet mg/kg:ssa rasvaa tai öljyä ja niiden pitoisuuksien yhteismäärä, ”alifaattisen alkoholin kokonaismäärä”. Kokonaismäärä on C22, C24, C26 ja C28 alifaattisten alkoholien yhteenlaskettu määrä.
Kunkin yksittäisen alkoholiyhdisteen pitoisuus ilmaistaan yhden desimaalin tarkkuudella.
Kokonaissterolipitoisuus ilmaistaan kokonaislukuna.
Lasketaan yksittäisen sterolin prosenttiosuus sitä vastaavan piikin suhteellisena osuutena kaikkien sterolipiikkien yhteenlasketusta pinta-alasta:
jossa:
|
Ax |
= |
sterolin x piikin pinta-ala; |
|
ΣA |
= |
kaikkien sterolien piikkien yhteenlaskettu pinta-ala. |
Näennäinen β-sitosterolipitoisuus: δ-5-23-stigmastadienoli + klerosteroli + β-sitosteroli + sitostanoli + δ-5-avenasteroli + δ-5-24-stigmastadienoli.
Lasketaan erytrodiolin ja uvaolin prosenttiosuus:
jossa:
|
AEr |
= |
erytrodiolin pinta-ala, tietojärjestelmällä laskettuna; |
|
AUv |
= |
uvaolin pinta-ala, tietojärjestelmällä laskettuna; |
|
Σ AT |
= |
sterolin + erytrodiolin + uvaolin kokonaispinta-ala, tietojärjestelmällä laskettuna. |
Yksittäisten sterolien ja triterpeenidialkoholien suhteellisen prosenttiosuuden sekä sterolien kokonaispitoisuuden lisäksi on laskettava erytrodiolin ja uvaolin pitoisuudet sekä niiden summa mg/kg:ssa rasvaa tai öljyä seuraavasti:
jossa:
|
AEr |
= |
erytrodiolin piikin pinta-ala, tietojärjestelmällä laskettuna; |
|
AUv |
= |
uvaolin pinta-ala, tietojärjestelmällä laskettuna; |
|
As |
= |
α-kolestanolin piikin pinta-ala, tietojärjestelmällä laskettuna; |
|
ms |
= |
lisätyn α-kolestanolin massa milligrammoina; |
|
m |
= |
määritykseen käytetyn näytteen massa grammoina. |
Lisäys
|
|
1 Hiilivedyt 2 α-Tokoferoli 3 Prenolit 4 Triterpeenialkoholit 5 Alifaattiset alkoholit 6 Metyylisterolit 7 Sterolit 8 Triterpeenidialkoholit |
Kuvio 1 – TLC oliivin puristemassaöljyn saippuoitumattomasta osasta; eluoitu kahdesti heksaani-dietyylieetteriseoksella (65:35), kehitetty SO4H2:lla (50 %) ja kuumennettu. Raaputettavat vyöhykkeet näkyvät kuviossa suorakulmioina, 1 on alifaattisten alkoholien vyöhykkeet ja 2 sterolien ja triterpeenidialkoholien vyöhykkeet.
Taulukko I – Sterolien suhteelliset retentioajat
|
Piikki |
Nimi |
Suhteellinen retentioaika |
||
|
Kolonni SE 54 |
Kolonni SE 52 |
|||
|
1 |
kolesteroli |
δ-5-kolesteeni-3-β-oli |
0,67 |
0,63 |
|
2 |
kolestanoli |
5-α-kolestaani-3-ß-oli |
0,68 |
0,64 |
|
3 |
brassicasteroli |
[24S]-24-metyyli-δ-5,22-kolestadieeni-3-ß-oli |
0,73 |
0,71 |
|
* |
ergosteroli |
[24S]-24-metyyli-δ-5,7,22-kolestatrieeni-3-ß-oli |
0,78 |
0,76 |
|
4 |
24-metyleenikolesteroli |
24-metyleeni-δ-5,24-kolestadieeni-3-ß-oli |
0,82 |
0,80 |
|
5 |
kampesteroli |
(24R)-24-metyyli-δ-5-kolesteeni-3-ß-oli |
0,83 |
0,81 |
|
6 |
kampestanoli |
(24R)-24-metyyli-δ-5-kolestaani-3-ß-oli |
0,85 |
0,82 |
|
7 |
stigmasteroli |
(24S)-24-etyyli-δ-5,22-kolestadieeni-3-ß-oli |
0,88 |
0,87 |
|
8 |
δ-7-kampesteroli |
(24R)-24-metyyli-δ-7-kolesteeni-3-ß-oli |
0,93 |
0,92 |
|
9 |
δ-5,23-stigmastadienoli |
(24R,S)-24-etyyli-δ-5,23-kolestadieeni-3-ß-oli |
0,95 |
0,95 |
|
10 |
klerosteroli |
(24S)-24-etyyli-δ-5,25-kolestadieeni-3-ß-oli |
0,96 |
0,96 |
|
11 |
ß-sitosteroli |
(24R)-24-etyyli-δ-5-kolesteeni-3-ß-oli |
1,00 |
1,00 |
|
12 |
sitostanoli |
24-etyyli-kolestaani-3-ß-oli |
1,02 |
1,02 |
|
13 |
δ-5-avenasteroli |
(24Z)-24-etylideeni-δ-5-kolesteeni-3-ß-oli |
1,03 |
1,03 |
|
14 |
δ-5,24-stigmastadienoli |
(24R,S)-24-etyyli-δ-5,24-kolestadieeni-3-ß-oli |
1,08 |
1,08 |
|
15 |
δ-7-stigmastenoli |
(24R,S)-24-etyyli-δ-7-kolesteeni-3-ß-oli |
1,12 |
1,12 |
|
16 |
δ-7-avenasteroli |
(24Z)-24-etylideeni-δ-5-kolesteeni-3-ß-oli |
1,16 |
1,16 |
|
17 |
erytrodioli |
5-α-oleaani-12-eeni-3-β-28-dioli |
1,41 |
1,41 |
|
18 |
uvaoli |
δ-12-urseeni-3-β-28-dioli |
1,52 |
1,52 |
Kuvio 2. GC–FID-kromatografinen profiili jalostetusta oliiviöljystä saaduista sterolista ja triterpeenidialkoholeista. 1) kolesteroli, 2) α-kolestanoli (I.S.), 3) 24-metyleenikolesteroli, 4) kampesteroli, 5) kampestanoli, 6) stigmasteroli, 7) δ-5,23-stigmastadienoli, 8) klerosteroli, 9) β-sitosteroli, 10) sitostanoli, 11) δ-5-avenasteroli, 12) δ-5,24-stigmastadienoli, 13) δ-7-stigmastenoli, 14) δ-7-avenasteroli, 15) erytrodioli, 16) uvaoli.
Kuvio 3. GC–FID-kromatografinen profiili lamppuoliiviöljystä saaduista sterolista ja triterpeenidialkoholeista. 1) kolesteroli, 2) α-kolestanoli, 3) brassicasteroli, 4) 24-metyleenikolesteroli, 5) kampesteroli, 6) kampestanoli, 7) stigmasteroli, 8) δ-7-kampesteroli, 9) δ-5,23-stigmastadienoli, 10) klerosteroli, 11) β-sitosteroli, 12) sitostanoli, 13) δ-5-avenasteroli, 14) δ-5,24-stigmastadienoli, 15) δ-7-stigmastenoli, 16) δ-7-avenasteroli, 17) erytrodioli, 18) uvaoli.
Kuvio 4. GC–FID-kromatografinen profiili oliiviöljystä saaduista alifaattisista alkoholeista ja triterpeenialkoholeista. (I.S.) C20-oli, 1) C22-oli, 2) C24-oli, 3) C26-oli, 4) C28-oli, 5) triterpeenialkoholit.
Kuvio 5. GC–FID-kromatografinen profiili jalostetusta oliiviöljystä ja toisen sentrifugoinnin oliiviöljystä saaduista alifaattisista alkoholeista ja triterpeenialkoholeista. (I.S.) C20-oli, 1) C22-oli, 2) C24-oli, 3) C26-oli, 4) C28-oli, 5) triterpeenialkoholit.
Kuvio 6. HPLC-kromatogrammi oliiviöljystä, erotettu saippuoitumatta HLPC:llä UV-detektoria käyttäen. 1) Alifaattiset ja triterpeenialkoholit 2) Sterolit ja triterpeenidialkoholit.
LIITE XX
Menetelmä vahojen, rasvahappojen etyyliestereiden ja rasvahappojen metyyliestereiden pitoisuuksien määrittämiseksi kapillaarikaasukromatografian avulla
1. TARKOITUS
Tällä menetelmällä määritetään vahojen, rasvahappojen metyyliestereiden ja rasvahappojen etyyliestereiden pitoisuudet oliiviöljyissä. Vahat ja alkyyliesterit eroavat toisistaan hiiliatomien lukumäärän perusteella. Menetelmää suositellaan käytettävän välineenä oliiviöljyn ja oliivin puristemassaöljyn erottamiseksi toisistaan sekä ekstra-neitsytoliiviöljyn laatuparametrina, jonka avulla voidaan havaita, onko ekstra-neitsytoliiviöljyyn vilpillisesti sekoitettu heikompilaatuisia öljyjä (neitsyt- tai lamppuöljyjä tai eräitä hajuttomiksi tehtyjä öljyjä).
2. PERIAATE
Öljy, johon on lisätty soveltuva sisäinen standardi, fraktioidaan kromatografisesti hydratoitua silikageeliä sisältävässä kolonnissa. Koeolosuhteissa eluoitunut jae (jonka polaarisuus on triasyyliglyserolien polaarisuutta heikompi) otetaan talteen ja määritetään suoraan kapillaarikaasukromatografian avulla.
3. LAITTEISTO
|
3.1. |
Erlenmeyer-pullo, 25 ml. |
|
3.2. |
Lasikolonni nestekromatografiaa varten, sisähalkaisija 15 mm ja pituus 30–40 cm, varustettu hanalla. |
|
3.3. |
Kaasukromatografi, jota voidaan käyttää kapillaarikolonnin kanssa ja johon kuuluu kolonniin suoraan injektointia varten sellainen järjestelmä, jonka osat ovat:
|
|
3.4. |
Mikroruisku, 10 μl, jossa on karkaistu neula, jonka avulla näyte voidaan injektoida suoraan kolonniin. |
|
3.5. |
Sähkökäyttöinen ravistelija. |
|
3.6. |
Pyöröhaihdutin |
|
3.7. |
Muhveliuuni |
|
3.8. |
Analyysivaaka, jonka tarkkuus ± 0,1 mg |
|
3.9. |
Tavanomaiset laboratorion lasivälineet. |
4. REAGENSSIT
|
4.1. |
Silikageeli, 60–200 μm mesh. Silikageeli pannaan muhveliuuniin 500 °C:n lämpötilaan vähintään 4 tunniksi. Jäähdytetään ja lisätään vettä 2 % silikageelin määrästä. Sekoitetaan massan homogenisoimiseksi ja säilytetään eksikkaattorissa vähintään 12 tunnin ajan ennen käyttöä. |
|
4.2. |
n-heksaani, kromatografialaatua tai jäämien määritykseen soveltuvaa laatua. Heksaani voidaan korvata iso-oktaanilla (2,2,4-trimetyylpentaani, kromatografialaatua) edellyttäen, että vastaavat toistotarkkuusarvot saavutetaan. Liuottimien, joiden kiehumispiste on korkeampi kuin n-heksaanilla, haihtuminen kestää pidempään. Ne ovat kuitenkin suositeltavampia heksaanin myrkyllisyyden vuoksi. Puhtausaste on tarkistettava; voidaan esimerkiksi tarkastaa jäännös, kun 100 ml liuotinta on haihtunut. VAROITUS: Höyryt ovat herkästi syttyviä. Eristettävä lämmönlähteistä, kipinöistä ja avoliekeistä. Pullot on pidettävä aina asianmukaisesti suljettuina. Riittävästä ilmanvaihdosta käytön aikana on huolehdittava. Varottava höyryjen syntymistä. Poistettava tulipaloriskin mahdollisesti aiheuttavat laitteet, kuten lämmittimet tai sähkölaitteet, joita ei ole valmistettu syttymättömästä materiaalista. Haitallista hengitettynä, koska voi vahingoittaa hermosoluja. Vältettävä höyryjen hengittämistä. Tarvittaessa on käytettävä asianmukaisia hengityssuojaimia. Varottava aineen joutumista silmiin tai iholle. Iso-oktaani on syttyvä neste, joka aiheuttaa palovaaran. Räjähdysrajat ilmassa ovat 1,1 % ja 6,0 % (tilavuusosuus). Se on myrkyllistä nieltynä ja hengitettynä. Työskentele tämän liuotteen kanssa vetokaapissa hyvissä toimintaolosuhteissa. |
|
4.3. |
Etyylieetteri, kromatografialaatua.
VAROITUS: Erittäin helposti syttyvä ja kohtalaisen myrkyllinen. Ärsyttää ihoa. Haitallista hengitettynä. Saattaa aiheuttaa silmävaurioita. Vaikutukset voivat ilmaantua viipeellä. Saattaa muodostua räjähtäviä peroksideja. Höyryt voivat syttyä. Eristettävä lämmönlähteistä, kipinöistä ja avoliekeistä. Pullot on pidettävä aina asianmukaisesti suljettuina. Riittävästä ilmanvaihdosta käytön aikana on huolehdittava. Varottava höyryjen syntymistä. Poistettava tulipaloriskin mahdollisesti aiheuttavat laitteet, kuten lämmittimet tai sähkölaitteet, joita ei ole valmistettu syttymättömästä materiaalista. Ei saa haihduttaa kuivaksi tai lähes kuivaksi. Veden tai muun sopivan aineen lisäys vähentää peroksidien muodostumista. Ei saa niellä. Vältettävä höyryjen hengittämistä. Varottava pitkäaikaista tai toistuvaa ihokosketusta. |
|
4.4. |
n-heptaani, kromatografialaatua, tai iso-oktaani. VAROITUS: Syttyvää. Haitallista hengitettynä. Eristettävä lämmönlähteistä, kipinöistä ja avoliekeistä. Pullot on pidettävä aina asianmukaisesti suljettuina. Riittävästä ilmanvaihdosta käytön aikana on huolehdittava. Vältettävä höyryjen hengittämistä. Varottava pitkäaikaista tai toistuvaa ihokosketusta. |
|
4.5. |
Lauryyliarakidaatin standardiliuos (Huomautus 3), 0,05 % (m/V) liuos heksaanissa (sisäinen standardi vahoille). Huomautus 3: Voidaan käyttää myös palmityylipalmitaattia, myristyylistearaattia tai lauryyliarakidaattia. |
|
4.6. |
Metyyliheptadekanoaatin standardiliuos, 0,02 % (m/V) heksaanissa (sisäinen standardi metyyli- ja etyyliestereille). |
|
4.7. |
Sudan 1 (1-fenyyliatso)-2-naftoli). |
|
4.8. |
Kantajakaasut: vety tai helium, puhdasta kaasukromatografista laatua. VAROITUS Vety. Erittäin helposti syttyvä puristettuna. Eristettävä lämmönlähteistä, kipinöistä ja avoliekeistä tai sähkölaitteista, joita ei ole valmistettu syttymättömistä materiaaleista. On varmistettava, että pullon venttiili on kiinni aina, kun se ei ole käytössä. Paineenalenninta on aina käytettävä. Jousen paine päästetään pois ennen pullon venttiilin avaamista. Älä seiso pullon edessä venttiiliä avatessasi. Riittävästä ilmanvaihdosta käytön aikana on huolehdittava. Vetyä ei saa siirtää pullosta toiseen. Kaasua ei saa sekoittaa pullossa. Pullot on kiinnitettävä kaatumisen estämiseksi. Säilytettävä auringonvalolta ja lämmönlähteiltä suojattuna. Varastointipaikan on oltava sellainen, ettei siellä voi tapahtua syöpymistä. Vaurioituneita tai merkitsemättömiä pulloja ei saa käyttää. Helium. Korkeassa paineessa puristettu kaasu. Se pienentää hengitettävän hapen määrää. Pullo on pidettävä suljettuna. Riittävästä ilmanvaihdosta käytön aikana on huolehdittava. Varastointitiloihin, jotka eivät ole asianmukaisesti tuuletettuja, ei pidä mennä. Paineenalenninta on aina käytettävä. Jousen paine päästetään pois ennen pullon venttiilin avaamista. Kaasua ei saa siirtää pullosta toiseen. Pullot on kiinnitettävä kaatumisen estämiseksi. Älä seiso pullon edessä venttiiliä avatessasi. Säilytettävä auringonvalolta ja lämmönlähteiltä suojattuna. Varastointipaikan on oltava sellainen, ettei siellä voi tapahtua syöpymistä. Vaurioituneita tai merkitsemättömiä pulloja ei saa käyttää. Ei saa hengittää. Käytetään yksinomaan teknisiin tarkoituksiin. |
|
4.9. |
Apukaasut: — Vety, puhdasta kaasukromatografista laatua. — Paineilma, puhdasta kaasukromatografista laatua. VAROITUS Paineilma. Korkeassa paineessa puristettu kaasu. Käytettävä varoen syttyvien aineiden lähistöllä, sillä useimpien paineilman sisältämien orgaanisten yhdisteiden itsesyttymislämpötila on suuressa paineessa huomattavasti alhaisempi. On varmistettava, että pullon venttiili on kiinni, kun se ei ole käytössä. Paineenalenninta on aina käytettävä. Jousen paine päästetään pois ennen pullon venttiilin avaamista. Älä seiso pullon edessä venttiiliä avatessasi. Kaasua ei saa siirtää pullosta toiseen. Älä sekoita kaasua pullossa. Pullot on kiinnitettävä kaatumisen estämiseksi. Säilytettävä auringonvalolta ja lämmönlähteiltä suojattuna. Varastointipaikan on oltava sellainen, ettei siellä voi tapahtua syöpymistä. Vaurioituneita tai merkitsemättömiä pulloja ei saa käyttää. Teknisiin tarkoituksiin tarkoitettua paineilmaa ei saa käyttää hengittämiseen tai hengityslaitteissa. |
5. MENETTELY
5.1. Kromatografiakolonnin esikäsittely
Suspendoidaan 15 g silikageeliä (kohta 4.1) n-heksaaniin (kohta 4.2) ja lisätään kolonniin (kohta 3.2). Annetaan laskeutua itsestään. Autetaan laskeutumista sähkökäyttöisellä sekoittajalla, jotta saadaan homogeenisempi kromatografiakerros. Valutetaan läpi 30 ml n-heksaania mahdollisten epäpuhtauksien poistamiseksi. Punnitaan analyysivaa’alla (kohta 3.8) tarkasti noin 500 mg näytettä 25 ml:n erlenmeyer-pulloon (kohta 3.1) ja lisätään sopiva määrä sisäistä standardia (kohta 4.5) oletetun vahapitoisuuden mukaan. Esimerkki: oliiviöljyyn lisätään lauryyliarakidaattia 0,1 mg ja oliivin puristemassaöljyyn 0,25–0,50 mg, tai oliiviöljyihin (kohta 4.6) 0,05 mg metyyliheptadekanoaattia.
Siirretään näin valmistettu näyte kahden 2 ml:n n-heksaaniannoksen avulla kromatografiakolonniin.
Liuottimen annetaan valua, kunnes se on 1 mm absorbentin pinnan yläpuolella. Valutetaan vielä n-heksaani/etyylieetteriseosta (suhde 99:1) ja kerätään 220 ml valumisnopeuden ollessa noin 15 pisaraa 10 sekunnissa. (Tämä jae sisältää metyyli- ja etyyliestereitä ja vahoja). (Huomautus 4) (Huomautus 5).
Huomautus 4: N-heksaani/etyylieetteriseos, suhde 99:1, on valmistettava uudelleen joka päivä.
Huomautus 5: Vahojen eluoitumisen tarkkailemiseksi silmämääräisesti voidaan näyteliuokseen lisätä 100 μl 1-prosenttista Sudan 1 -väriainetta eluutioliuoksessa.
Väriaineen retentioaika on vahojen ja triasyyliglyserolien retentioaikojen välissä. Eluointi on keskeytettävä, kun väri saavuttaa kromatografiakolonnin pohjan, sillä tällöin kaikki vahat ovat eluoituneet.
Tällä tavoin saatu jae kuivataan pyöröhaihduttimessa, kunnes lähes kaikki liuotin on saatu poistettua. Viimeiset 2 ml poistetaan heikon typpivirtauksen avulla. Kerätään metyyli- ja etyyliestereitä sisältävä jae 2–4 ml:lla n-heptaania tai iso-oktaania.
5.2. Kaasukromatografinen analyysi
5.2.1. Esivalmistelut
Kolonni liitetään kaasukromatografiin (kohta 3.3) siten, että injektioportti yhdistetään on-column -järjestelmään ja ulostulo detektoriin. Tarkistetaan kaasukromatografisten laitteiden toimivuus (kaasusilmukoiden kunto, detektorin ja piirturijärjestelmän tehokkuus jne.).
Jos kolonnia ei ole aikaisemmin käytetty, se on ensin esikäsiteltävä. Kolonnin läpi johdetaan kevyt kaasuvirtaus ja kaasukromatografi käynnistetään. Lämmitetään asteittain, kunnes lämpötila on noin neljän tunnin kuluttua kohonnut 350 °C:een.
Tätä lämpötilaa pidetään yllä vähintään 2 tunnin ajan. Sen jälkeen laitteisto säädetään käyttöolosuhteisiin (kaasuvirtojen säätö, liekin sytytys, kytkeminen elektroniseen piirturiin (kohta 3.3.4), uunin lämpötilan säätö kolonnia varten, detektorin säätö jne.). Signaali säädetään niin, että sen herkkyys on vähintään kaksi kertaa niin suuri kuin määrityksessä tarvitaan. Saadun pohjaviivan on oltava suora, siinä ei saa olla minkäänlaisia piikkejä eikä ryömintää mihinkään suuntaan.
Jos ilmenee negatiivista suoraviivaista ryömintää, se on merkki kolonnin liitäntöjen viasta. Positiivinen ryömintä johtuu kolonnin riittämättömästä esikäsittelystä.
5.2.2. Toimintaolosuhteiden valinta vahoille sekä metyyli- ja etyyliestereille (Huomautus 6)
Kromatografia tehdään yleensä seuraavissa käyttöolosuhteissa:
|
— |
Kolonnin lämpötila : 20 °C minuutissa 5 °C minuutissa aluksi 80 °C (1′) |
140 °C 
335 °C (20)|
— |
Detektorin lämpötila : 350 °C |
|
— |
Injektoidun aineen määrä : 1 μl n-heptaaniliuosta (2–4 ml) |
|
— |
Kantajakaasu : helium tai vety valitun kaasun optimaalisella lineaarisella nopeudella (ks. lisäys A) |
|
— |
Laitteen herkkyys : siten, että edellä mainitut edellytykset täyttyvät. |
Huomautus 6: Koska loppulämpötila on korkea, positiivinen ryömintä sallitaan, mutta se saa olla enintään 10 % huippuarvosta.
Kyseisiä käyttöolosuhteita voidaan muuttaa kolonnin ja kaasukromatografin ominaisuuksien perusteella, jotta kaikki vahat ja rasvahappojen metyyli- ja etyyliesterit saadaan erotettua ja piikkien erotus on riittävä (ks. kuvat 2, 3 ja 4) ja jotta sisäisen lauryyliarakidaattistandardin retentioaika on 18 ± 3 minuuttia. Vahojen edustavimman piikin on oltava yli 60 % huippuarvosta; metyyli- ja etyyliestereiden osalta käytettävän sisäisen metyyliheptadekanoaattistandardin on saavutettava huippuarvo.
Piikkien integrointiparametrit asetetaan niin, että haluttujen piikkien pinta-alat voidaan arvioida oikein.
5.3. Määritys
10 μl:n mikroruiskuun vedetään 10 μl liuosta; vedetään männällä neula tyhjäksi. Työnnetään neula injektiolaitteeseen ja 1–2 sekunnin kuluttua injektoidaan nopeasti. Noin 5 sekunnin kuluttua vedetään neula hitaasti pois.
Piirturi pidetään käynnissä, kunnes vahat tai stigmastadieenit (riippuen analysoitavasta jakeesta) ovat eluoituneet täydellisesti.
Pohjaviivan on koko ajan oltava vaatimusten mukainen.
5.4. Piikkien tunnistus
Piikit tunnistetaan retentioaikojen perusteella vertaamalla samoissa olosuhteissa määritettyihin vahojen, joiden retentioajat tunnetaan, seoksiin. Alkyyliesterit tunnistetaan oliiviöljyjen tärkeimpien rasvahappojen (palmitiini- ja oleiinihappo) metyyli- ja etyyliesterien perusteella.
Kuva 1 esittää neitsytoliiviöljyn vahojen kromatogrammia. Kuvissa 2 ja 3 on kahden vähittäismyytävän ekstra-neitsytoliiviöljyn kromatogrammit; ensimmäinen metyyli- ja etyyliesterien kanssa ja toinen ilman niitä. Kuvassa 4 on kromatogrammit huippulaatuisesta ekstra-neitsytoliiviöljystä ja samasta öljystä, johon on sekoitettu 20 % hajuttomaksi tehtyä öljyä.
5.5. Vahojen kvantitatiivinen määritys
Sisäisen lauryyliarakidaattistandardin ja C 40 – C 46 -alifaattisten esterien piikkien pinta-alat lasketaan integraattorilla.
Kokonaisvahapitoisuus (mg/kg rasvaa) lasketaan muodostamalla yksittäisten vahojen summa seuraavasti:
jossa:
|
Ax |
= |
kunkin esterin piikin pinta-ala tietokoneella laskettuna |
|
As |
= |
sisäisen lauryyliarakidaattistandardin piikin pinta-ala tietokoneella laskettuna |
|
ms |
= |
lisätyn sisäisen lauryyliarakidaattistandardin massa milligrammoina |
|
m |
= |
määritettävän näytteen massa grammoina. |
5.5.1. Metyyli- ja etyyliesterien kvantitatiivinen määritys
Sisäisen metyyliheptadekanoaattistandardin, C16- ja C18-rasvahappojen metyyliesterien ja C16- ja C18-rasvahappojen etyyliesterien piikkien pinta-alat määritetään integraattorin avulla.
Lasketaan kunkin alkyyliesterin pitoisuus (mg/kg rasvaa) seuraavasti:
jossa:
|
Ax |
= |
kunkin C16- ja C18-esterin piikin pinta-ala tietokoneella laskettuna |
|
As |
= |
sisäisen metyyliheptadekanoaattistandardin piikin pinta-ala tietokoneella laskettuna |
|
ms |
= |
lisätyn sisäisen metyyliheptadekanoaattistandardin massa milligrammoina |
|
m |
= |
määritettävän näytteen massa grammoina. |
6. TULOSTEN ILMOITTAMINEN
C40–C46:n (Huomautus 7) eri vahojen pitoisuuksien summa ilmoitetaan mg/kg rasvaa.
Ilmoitetaan C16–C18-rasvahappojen metyyli- ja etyyliesterien pitoisuuksien summa ja molempien yhteismäärä.
Tulokset ilmoitetaan mg/kg:n tarkkuudella.
Huomautus 7: Piikkien pinta-aloista määritetään niiden komponenttien määrät, joissa on parillinen määrä C-atomeja välillä C40–C46, liitteenä olevassa kuvassa esitetyn oliiviöljyn vahojen kromatogrammin mukaisesti. Jos C46-esteri esiintyy kahtena piikkinä, sen tunnistamiseksi on syytä analysoida oliivin puristemassaöljyn vahojen jae, jossa C46:n piikki on helppo tunnistaa, koska se on selvästi hallitsevin.
Ilmoitetaan etyyli- ja metyyliesterien välinen suhde.
Kuva 1
Esimerkki oliiviöljyn vahajakeen kaasukromatogrammista ( 6 )
Niiden rasvahappojen metyyli- ja etyyliesterien piikit, joiden retentioajat ovat välillä 5–8 minuuttia
Merkkien selitykset:
|
I.S. |
= |
lauryyliarakidaatti |
|
1 |
= |
diterpeeniesterit |
|
2+2′ |
= |
C40-esterit |
|
3+3′ |
= |
C42-esterit |
|
4+4′ |
= |
C44-esterit |
|
5 |
= |
C46-esterit |
|
6 |
= |
steroliesterit ja triterpeenialkoholit. |
Kuva 2
Metyyliesterit, etyyliesterit ja vahat neitsytoliiviöljyssä
Merkkien selitykset:
|
1 |
– |
C16-metyyli |
|
2 |
– |
C16-etyyli |
|
3 |
– |
metyyliheptadekanoaatti I.S. |
|
4 |
– |
C18-metyyli |
|
5 |
– |
C18-etyyli |
|
6 |
– |
skvaleeni |
|
7 |
– |
lauryyliarakidaatti I.S |
|
A |
– |
diterpeeniesterit |
|
B |
– |
vahat |
|
C |
– |
steroliesterit ja triterpeeniesterit |
Kuva 3
Metyyliesterit, etyyliesterit ja vahat ekstra-neitsytoliiviöljyssä
Merkkien selitykset:
|
1 |
– |
metyyliheptadekanoaatti I.S |
|
2 |
– |
C18-metyyli |
|
3 |
– |
C18-etyyli |
|
4 |
– |
skvaleeni |
|
5 |
– |
lauryyliarakidaatti I.S. |
|
A |
– |
diterpeeniesterit |
|
B |
– |
vahat |
|
C |
– |
steroliesterit ja triterpeeniesterit |
Kuva 4
Kromatogrammit ekstra-neitsytoliiviöljystä ja samasta öljystä, johon on sekoitettu 20 % hajuttomaksi tehtyä öljyä
Merkkien selitykset:
|
1 |
– |
metyylimyristaatti I.S. |
|
2 |
– |
metyylipalmitaatti |
|
3 |
– |
etyylipalmitaatti |
|
4 |
– |
metyyliheptadekanoaatti I.S. |
|
5 |
– |
metyylilinoleaatti |
|
6 |
– |
metyylioleaatti |
|
7 |
– |
metyylistearaatti |
|
8 |
– |
etyylilinoleaatti |
|
9 |
– |
etyylioleaatti |
|
10 |
– |
etyylistearaatti |
Lisäys A
Lineaarisen kaasuvirtausnopeuden määritys
Injektoidaan 1:3 μl metaania (tai propaania) tavanomaisiin käyttöolosuhteisiin säädettyyn kaasukromatografialaitteistoon. Otetaan tarkka aika siitä, miten kauan kaasu kulkee kolonnin läpi, alkaen injektiohetkestä piikin muodostumiseen (tM).
Lineaarinen nopeus (cm/s) saadaan kaavasta L/tM, jossa L on kolonnin pituus senttimetreinä ja tM on sekunteina mitattu aika.
▼M28 —————
LIITE XXI
8 artiklan 2 kohdassa tarkoitetut oliiviöljyille tehtyjen vaatimustenmukaisuustarkastusten tulokset
|
|
Merkinnät |
Kemialliset parametrit |
Aistinvaraiset ominaisuudet (4) |
Lopullinen päätelmä |
|||||||||||||
|
Otos |
Luokka |
Alkuperämaa |
Tarkastuspaikka (1) |
Virallinen nimi |
Alkuperänimitys |
Varastointiedellytykset |
Virheelliset tiedot |
Luettavuus |
C/NC (3) |
Parametrejä yli rajojen Kyllä/Ei |
Jos kyllä, mikä/mitkä (2) |
C/NC (3) |
Virheen mediaani |
Hedelmäisyyden mediaani |
C/NC (3) |
Vaadittu toimi |
Seuraamus |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
(1) Sisämarkkinat (puristamo, pullottajat, vähittäismyyntivaihe), vienti, tuonti (2) Jokaisella liitteessä I esitetyllä oliiviöljyn ominaisuudella on oltava koodi. (3) Vaatimusten mukainen / Vaatimusten vastainen (4) Ei vaadita oliiviöljyltä ja oliivin puristemassaöljyltä. |
|||||||||||||||||
( 1 ) EUVL L 228, 1.9.2009, s. 3.
( 2 ) Euroopan parlamentin ja neuvoston direktiivi 2011/91/EU, annettu 13 päivänä joulukuuta 2011, elintarvike-erän tunnistamismerkinnöistä (EUVL L 334, 16.12.2011, s. 1).
( 3 ) Kun steroliesterit ovat eluoituneet, kromatogrammissa ei saa olla merkittäviä piikkejä (triglyseridit).
( 4 ) Euroopan parlamentin ja neuvoston asetus (EU) N:o 1308/2013, annettu 17 päivänä joulukuuta 2013, maataloustuotteiden yhteisestä markkinajärjestelystä ja neuvoston asetusten (ETY) N:o 922/72, (ETY) N:o 234/79, (EY) N:o 1037/2001 ja (EY) N:o 1234/2007 kumoamisesta (EUVL L 347, 20.12.2013, s. 671).
( 5 ) 1 Maistaja voi kieltäytyä maistamasta öljyä, jos hän havaitsee suoraan hajuaistimuksen perusteella jonkin äärimmäisen voimakkaan negatiivisen ominaisuuden. Hänen on merkittävä tällainen poikkeuksellinen TILANNE profiililomakkeeseen.
( 6 ) Kun steroliesterit ovat eluoituneet, kromatogrammissa ei pitäisi olla merkittäviä piikkejä (triasyyliglyseroleja).
