32001R0213

tšehhikeelne eriväljaanne: Peatükk 03 Köide 031 Lk 240 - 338
eestikeelne eriväljaanne: Peatükk 03 Köide 031 Lk 240 - 338
lätikeelne eriväljaanne: Peatükk 03 Köide 031 Lk 240 - 338
leedukeelne eriväljaanne: Peatükk 03 Köide 031 Lk 240 - 338
ungarikeelne eriväljaanne Peatükk 03 Köide 031 Lk 240 - 338
maltakeelne eriväljaanne: Peatükk 03 Köide 031 Lk 240 - 338
poolakeelne eriväljaanne: Peatükk 03 Köide 031 Lk 240 - 338
slovakikeelne eriväljaanne: Peatükk 03 Köide 031 Lk 240 - 338
sloveenikeelne eriväljaanne: Peatükk 03 Köide 031 Lk 240 - 338
bulgaariakeelne eriväljaanne: Peatükk 03 Köide 036 Lk 43 - 141
rumeeniakeelne eriväljaanne: Peatükk 03 Köide 036 Lk 43 - 141

32001R0213

Komisjoni määrus (EÜ) nr 213/2001, 9. jaanuar 2001, milles sätestatakse nõukogu määruse (EÜ) nr 1255/1999 üksikasjalikud rakenduseeskirjad seoses piima ja piimatoodete analüüsimise ning kvaliteedi hindamise meetoditega ning millega muudetakse määrusi (EÜ) nr 2771/1999 ja (EÜ) nr 2799/1999

Euroopa Liidu Teataja L 037 , 07/02/2001 Lk 0001 - 0099
CS.ES Peatükk 3 Köide 31 Lk 240 - 338
ET.ES Peatükk 3 Köide 31 Lk 240 - 338
HU.ES Peatükk 3 Köide 31 Lk 240 - 338
LT.ES Peatükk 3 Köide 31 Lk 240 - 338
LV.ES Peatükk 3 Köide 31 Lk 240 - 338
MT.ES Peatükk 3 Köide 31 Lk 240 - 338
PL.ES Peatükk 3 Köide 31 Lk 240 - 338
SK.ES Peatükk 3 Köide 31 Lk 240 - 338
SL.ES Peatükk 3 Köide 31 Lk 240 - 338

Komisjoni määrus (EÜ) nr 213/2001,

9. jaanuar 2001,

milles sätestatakse nõukogu määruse (EÜ) nr 1255/1999 üksikasjalikud rakenduseeskirjad seoses piima ja piimatoodete analüüsimise ning kvaliteedi hindamise meetoditega ning millega muudetakse määrusi (EÜ) nr 2771/1999 ja (EÜ) nr 2799/1999

EUROOPA ÜHENDUSTE KOMISJON,

võttes arvesse Euroopa Ühenduse asutamislepingut,

võttes arvesse nõukogu 17. mai 1999. aasta määrust (EÜ) nr 1255/1999 piima- ja piimatooteturu ühise korralduse kohta, [1] eriti selle artikleid 10 ja 15 ning artikli 26 lõiget 3, artikli 29 lõiget 1 ja artikli 31 lõiget 14,

ning arvestades järgmist:

(1) Komisjoni määrustes (EMÜ) nr 1216/68, (EMÜ) nr 3942/92, (EÜ) nr 86/94, (EÜ) nr 2721/95, (EÜ) nr 1080/96, (EÜ) nr 1081/96, (EÜ) nr 1082/96, (EÜ) nr 1854/96, (EÜ) nr 880/98 ja (EÜ) nr 1459/98, millele on täielikult viidatud käesoleva määruse XXVI lisas, sätestatakse piima ja piimatoodete analüüsi ja kvaliteedi hindamise standardmeetodid ja tavapärased meetodid ning kehtestatakse nimetatud meetodite kohaldamise ulatus ja eeskirjad. Selguse huvides tuleks eespool nimetatud määrused uuesti sõnastada ning koondada ühte teksti, et sektori ettevõtjatel oleks võimalik kasutada ühtset hulka meetodeid ja nende rakenduseeskirju. Samal põhjusel tuleks muuta komisjoni 16. detsembri 1999. aasta määrust (EÜ) nr 2771/1999, millega sätestataske nõukogu määruse (EMÜ) nr 1255/1999 üksikasjalikud rakenduseeskirjad või- ja kooreturul sekkumise osas, [2] ja 17. detsembri 1999. aasta määrust (EÜ) nr 2799/1999, millega sätestatakse määruse (EÜ) nr 1255/1999 üksikasjalikud rakenduseeskirjad loomatoiduks mõeldud lõssi ja lõssipulbri jaoks toetuse andmise osas ja kõnealuse lõssipulbri müügi osas, [3] nii et kõnealuste määruste lisad analüüsimeetodite kohta oleksid võetud käesolevasse määrusesse.

(2) Määrusega (EÜ) nr 1255/1999 sätestatud korras ette nähtud piima ja piimatoodete koostist ja kvaliteedinõudeid tuleb nende täpse täitmise tagamiseks kontrollida.

(3) Sageli on niisuguste vastavustõendamiste puhul standardmeetoditeks meetodid, mis on avaldatud selliste rahvusvaheliste organisatsioonide poolt nagu Euroopa Standardikomitee, Rahvusvaheline Piimandusföderatsioon, Rahvusvahelise Standardiorganisatsiooni ja Analüütilise Keemia Laboratooriumides Töötavate Pädevate Keemikute Rahvusvaheline Assotsiatsioon. Mõnel juhul on ühenduse standardmeetod kehtestatud, kuid mõnel juhul ei ole ühenduse eeskirjadega standardmeetodit määratletud. Standardmeetodite ühtse kohaldamise tagamiseks tuleks igal aastal koostada standardmeetodite loetelu ning lubada kasutada üksnes loetelus nimetatud meetodeid.

(4) Tavapäraste meetodite kasutamist ei peaks eeskirjadega keelama. Seetõttu tuleks nende kasutamise tingimused määratleda.

(5) Samuti tuleks kehtestada ühised meetodid, et tagada analüüsitulemuste ühetaoline hindamine, asjaomaste toodete organoleptiline hindamine ning vaidlustatud tulemuste uuesti läbivaatamine.

(6) Mõnede analüüside jaoks ei ole praegu kehtivat rahvusvaheliselt tunnustatud standardmeetodit ning seetõttu ei ole teave eri laboratooriumites tehtud analüüsitulemuste erinevustest kättesaadav. Seepärast tuleks kehtestada ühenduse meetodid, mis oleks kinnitatud vastavalt rahvusvaheliselt kehtestatud eeskirjadele ning mida kasutataks standardmeetoditena.

(7) Komisjoni 15. detsembri 1997. aasta määrusega (EÜ) nr 2571/97 või müügi kohta alandatud hindadega ning toetuse andmise kohta koore, või ja kontsentreeritud või kasutamise korral pagaritoodete, jäätise ja teiste toiduainete valmistamiseks, [4] viimati muudetud määrusega (EÜ) nr 635/2000, [5] nähakse teatavatel asjaoludel ette koore, või ja kontsentreeritud või jälgimine, et tagada nende toodete sihipärane lõppkasutus. Märgistusainete lisamine on kava nõuetekohaseks toimimiseks oluline ning selles osalevate ettevõtjate võrdse kohtlemise tagamiseks tuleks kehtestada ühised meetodid mõne kõnealuse märgistusaine kindlaksmääramiseks.

(8) Komisjoni 11. novembri 1985. aasta määruse (EMÜ) nr 3143/85 (kontsentreeritud võina otsetarbimiseks ettenähtud sekkumisvõi müügi kohta alandatud hindadega, [6] viimati muudetud määrusega (EÜ) nr 101/1999 [7]), komisjoni 20. veebruari 1990. aasta määruse (EMÜ) nr 429/90 (ühenduses otsetarbimiseks ettenähtud kontsentreeritud võile pakkumismenetluse teel toetuse andmise kohta, [8] viimati muudetud määrusega (EÜ) nr 124/1999 [9]) ja määruse (EÜ) nr 2571/97 alusel tuleb märgistusained kontsentreeritud võile lisada järelevalve all. Kontsentreeritud või märgistamise nõuetest tuleb rangelt kinni pidada, et vältida toodete teisiti kasutamine. Seetõttu tuleks sätestada kõnealuste märgistusainete kindlakstegemise ühine meetod.

(9) Määruse (EÜ) nr 1255/1999 artikli 9 alusel võib eraladustusabi anda lambapiimast valmistatud juustu puhul. Nendele toodetele võib anda eritoetust käesoleva määruse artikli 31 alusel. Lamba-, kitse- või pühvlipiimast või lamba-, kitse- ja pühvlipiima segust valmistatud juustu võib teatavatest kolmandatest riikidest importida ühendusse sooduskorra alusel. Eelnevaid sätteid silmas pidades on tarvis asjakohaseid kontrolle kindlustamaks, et asjaomaste toodete koostisesse ei oleks lisatud lehmapiima. Seetõttu tuleks sätestada ühenduse standardmeetod lehmapiima kindlakstegemiseks, ilma et see piiraks tavapäraste meetodite kasutamist, kui need vastavad teatavatele kriteeriumitele.

(10) Komisjoni 10. oktoobri 1990. aasta määruse (EMÜ) nr 2921/90, lõssist kaseiini ja kaseinaatide tootmiseks antava abi kohta, [10] viimati muudetud määrusega (EÜ) nr 2654/1999, [11] alusel peab olema kindlaks tehtud kolibakterite puudumine. Rahvusvaheliselt aktsepteeritud standardmeetod kolibakterite kindlakstegemiseks piimas ja piimatoodetes on rahvusvaheline IDFi standard 73 A:1985. Siiski on see standard ainult mugandatud kujul kohaldatav kolibakterite avastamiseks konkreetses tootekoguses. Seetõttu tuleks eespool nimetatud standardi alusel kehtestada kolibakterite kindlakstegemiseks ühenduse standardmeetod.

(11) Nõukogu 23. juuli 1987. aasta määruses (EMÜ) nr 2658/87 tariifi- ja statistikanomenklatuuri ning ühise tollitariifistiku kohta, [12] viimati muudetud määrusega (EÜ) nr 254/2000, [13] nähakse ette erinevad tollimaksumäärad tariifirubriiki nr 2309 kuuluvate segasöötade jaoks, sõltuvalt nende piimatoodete sisaldusest. Kõnealuste eeskirjade ühtse kohaldamise tagamiseks tuleks sätestada igas liikmesriigis kohustuslikuks kasutamiseks üldiselt tunnustatud analüüsimeetod laktoosisisalduse kindlakstegemiseks.

(12) Määruse (EÜ) nr 1255/1999 alusel peavad sekkumiseks ettenähtud või ja lõssipulber ning loomatoiduks ettenähtud lõssipulber vastama teatavatele kvaliteedinõuetele. Nende nõuete täitmise kontrollimiseks tuleks kehtestada standardmeetodid.

(13) Mõne käesolevas määruses esmakordselt esitatud meetodi rakendamine nõuab kohanemisperioodi. Seetõttu tuleks nende meetodite kohaldamist edasi lükata.

(14) Piima- ja piimatooteturu korralduskomitee ei ole oma eesistuja määratud tähtaja jooksul arvamust esitanud,

ON VASTU VÕTNUD KÄESOLEVA MÄÄRUSE:

I PEATÜKK

ÜLDSÄTTED

Artikkel 1

Rakendatavus ja rakendusala

Käesolevas määruses sätestatakse määrusega (EÜ) nr 1255/1999 kehtestatud korras piima- ja piimatooteturu ühise korralduse jaoks ettenähtud korras kasutatavad piima ja piimatoodete keemilise, füüsilise ja mikrobioloogilise analüüsi ning organoleptilise hindamise meetodite rakenduseeskirjad. Samuti sätestatakse mõned kõnealused meetodid.

Artikkel 2

Meetodite loetelu

1. Käesoleva määruse I lisa sisaldab nende standardmeetodite loetelu, mida kohaldatakse artiklis 1 osutatud analüüside suhtes.

2. Komisjon ajakohastab loetelu vähemalt kord aastas määruse (EÜ) nr 1255/1999 artiklis 42 sätestatud korras.

Artikkel 3

Tavapärased meetodid

Ühenduse eeskirjadega nõutavaid analüüse võib teha seni kasutatud meetoditega juhul, kui kalibreerimise tingimused on õiged ja standardmeetodiga korrapäraselt kontrollitud.

II lisas kirjeldatud menetlusi võib kohaldada selliste tavapäraste meetoditega saadud tulemuste kontrollimiseks, mis on lähedal asjaomastes määrustes määratletud piirväärtustele.

Vaidluse korral on otsustavad standardmeetodi abil saadud tulemused.

Artikkel 4

Standardmeetodite valideerimine

1. Standardmeetodid on valideeritud, kui need vastavad korratavuse ja reprodutseeritavuse piirnorme käsitlevatele varem kindlaks määratud täpsuskriteeriumidele.

2. Kui asjaomastes määrustes sätestatud standardmeetod ei ole valideeritud, kehtestab liikmesriik reprodutseeritavuse ajutise piirnormi.

See piirnorm määratakse kindlaks III lisa punktis b kirjeldatud korras. Siiski võivad liikmesriigid 18 kuu jooksul pärast käesoleva määruse jõustumist kasutada samaväärset korda.

Piirnormide järgimist kontrollitakse vähemalt kord aastas.

3. Kui valideeritud standardmeetodi või ajutiste täpsusnäitajatega meetodi tulemused näitavad piirnormide ületamist, võib analüütiliste tulemuste hindamisel kasutada IV lisas kirjeldatud meetodit, et määrata kindlaks kriitiline erinevus asjaomasest piirnormist.

Artikkel 5

Analüüsitulemuste vastuvõetavus

1. Analüüsid tehakse laborites, mis tegutsevad vastavalt V lisa punktis a kirjeldatud sisemise kvaliteedikontrolli korrale või samaväärsete normide põhjal kehtestatud korrale.

Laboris peab olema võimalik tutvuda kohaldatava korra üksikasjalise kirjeldusega.

2. Laborid kehtestavad oma sisemised piirnormid kõikide kasutatavate meetodite puhul, järgides:

a) V lisa punktis b kirjeldatud korda; või

b) trükis avaldatud valideeritud korda, mille puhul korratavus on määratletud.

Vastavust reprodutseeritavuse piirnormile tuleb kontrollida vähemalt kord aastas III lisa punktis a kirjeldatud korras.

Teist lõiku ei kohaldata laborite puhul, mis on aasta jooksul osalenud tasemekatsete kavas.

3. Laboratoorse analüüsi tulemuste aruanne peab sisaldama piisavalt teavet tulemuste hindamiseks vastavalt IV ja VIII lisale.

4. Analüüsitulemused loetakse vastuvõetavateks, kui need on saadud vastavalt lõikes 1 osutatud sisemise kvaliteedikontrolli menetluse vastuvõetavuskriteeriumidele ja lõikes 2 osutatud sisemistele täpsuskriteeriumidele.

Artikkel 6

Organoleptiline hindamine

1. Või puhul kohaldatakse hindajate töö ning tulemuste usaldusväärsuse kontrollimiseks VI lisas kirjeldatud menetlust. Organoleptilise hindamise standardmeetodina kohaldatakse VII lisas kirjeldatud menetlust.

2. Piima ja piimatoodete (v.a või) puhul kasutatakse liikmesriikides organoleptilise hindamise standardmeetodina Rahvusvahelise Piimandusföderatsiooni standardit 99C/1997 või muid võrreldavaid meetodeid, millest teatatakse komisjonile.

Hindajate töö ning tulemuste usaldusväärsuse kontrollimiseks võib kasutada VI lisas kirjeldatud menetlust.

Artikkel 7

Proovi võtmine ja analüüsitulemuste vaidlustamine

1. Ühenduse eeskirjadega ettenähtud analüüside jaoks tuleb võtta kordusproov.

2. VIII lisas kirjeldatud menetlust kasutatakse juhul, kui analüüsitulemused ei ole ettevõtjale vastuvõetavad.

II PEATÜKK

ANALÜÜSIMEETODID

Artikkel 8

Või vee-, rasvavaba kuivaine, ja rasvasisaldus

1. Või veesisalduse kindlaksmääramise standardmeetodina kasutatakse IX lisas kirjeldatud analüüsimeetodit.

2. Või rasvavaba kuivaine sisalduse kindlaksmääramise standardmeetodina kasutatakse X lisas kirjeldatud analüüsimeetodit.

3. Või rasvasisalduse kindlaksmääramise standardmeetodina kasutatakse XI lisas kirjeldatud analüüsimeetodit.

Artikkel 9

Märgistusained

1. Kontsentreeritud või, või ja koore vanilliinisisalduse kindlaksmääramise standardmeetodina kasutatakse XII lisas kirjeldatud analüüsimeetodit.

2. Kontsentreeritud või ja või ß-apo-8’-karoteenhappe etüülestri sisalduse kindlaksmääramise standardmeetodina kasutatakse XIII lisas kirjeldatud meetodit.

3. Või ja kontsentreeritud või ß-sitosterooli- ja stigmasteroolisisalduse kindlaksmääramise standardmeetodina kasutatakse XIV lisas kirjeldatud analüüsimeetodit.

4. Kontsentreeritud või, või ja koor on märgistatud vastavalt kehtivatele ühenduse eeskirjadele, kui saadud tulemused vastavad artikli 8 lõigetes 1, 2 ja 3 osutatud lisade lõike 8 spetsifikatsioonidele.

Artikkel 10

Lehmapiima kaseiini avastamine

1. XV lisas kirjeldatud standardmeetodit tuleb kasutada selle tagamiseks, et juust, mis peaks olema valmistatud ainult lamba-, kitse- või pühvlipiimast või lamba-, kitse- ja pühvlipiima segust, ka tegelikult ei sisalda lehmapiima kaseiini.

Lehmapiima kaseiini olemasolu peetakse tõestatuks, kui analüüsitavas proovis on lehmapiima kaseiini sama palju või rohkem kui XV lisas kirjeldatud standardproovis, mis sisaldab 1 % lehmapiima.

2. Tavapäraseid meetodeid lehmapiima kaseiini avastamiseks lõikes 1 osutatud juustus võib kasutada tingimusel, et:

a) avastamispiir on 0,5 % või väiksem;

b) valepositiivseid tulemusi ei esine;

c) lehmapiima kaseiin on nõutava tundlikkusega avastatav isegi pärast pikka laagerdusaega, mis võib esineda tavalistes kaubandustingimustes.

Kui punktis b esitatud nõue ei ole täidetud, tuleb kõiki positiivsete tulemustega proove analüüsida standardmeetodit kasutades.

Kui punktis c esitatud nõue ei ole täidetud ühe lõikes 1 osutatud juustusordi suhtes, tuleb seda juustusorti analüüsida standardmeetodit kasutades.

Artikkel 11

Kolibakterite avastamine

1. XVI lisas kirjeldatud analüüsimeetodit kohaldatakse kolibakterite avastamiseks võis, lõssipulbris, kaseiinis ja kaseinaatides.

2. Tavapäraseid kolibakterite avastamise meetodeid võib kasutada tingimusel, et saadud tulemused on võrreldavad nimetatud lisas kirjeldatud standardmeetodi abil saadud tulemustega. Eelkõige peab tavapärastel meetoditel olema piisav avastamiskünnis. Valenegatiivseid tulemusi ei tohi esineda. Kui valepositiivseid tulemusi pole võimalik välistada, tuleb kõikide positiivsete tulemuste kohta kinnitust saada standardmeetodit kasutades.

Artikkel 12

Laktoosisisaldus

CN-koodi 2309 alla kuuluvate toodete laktoosisisalduse kindlaksmääramiseks kasutatavat meetodit on kirjeldatud XVII lisas.

Artikkel 13

Laabivadaku avastamine

1. Meetodit vadaku avastamiseks riiklikuks ladustamiseks ettenähtud lõssipulbris on kirjeldatud XVIII lisas.

2. Meetodit vadaku avastamiseks loomasöödana kasutamiseks ettenähtud lõssipulbris ja selle segudes on kirjeldatud XIX lisas.

Artikkel 14

Petipiima avastamine

Meetodit petipiima avastamiseks lõssipulbris on kirjeldatud XX lisas.

Artikkel 15

Mikroobivastaste ainete jäägid

Meetodit antibiootikumide ja sulfoonamiidi/dapsoni jääkide avastamiseks lõssipulbris on kirjeldatud XXI lisas.

Artikkel 16

Lõssipulbrisisaldus

Segasöötade lõssipulbrisisalduse kindlaksmääramise meetodit on kirjeldatud XXII lisas.

Artikkel 17

Tärklise tuvastamine

Meetodit tärklise avastamiseks lõssipulbris, denatureeritud piimapulbris ja segasöötades on kirjeldatud XXIII lisas.

Artikkel 18

Hapukoorepeti pulbri niiskusesisaldus

Meetodit segasöötades kasutamiseks ettenähtud hapukoorepeti pulbri niiskusesisalduse kindlaksmääramiseks on kirjeldatud XXIV lisas.

Artikkel 19

Võõraste rasvade avastamine

Meetodit võõraste rasvade kindlaksmääramiseks piimarasvas on kirjeldatud XXV lisas.

III PEATÜKK

LÕPPSÄTTED

Artikkel 20

Määruse (EÜ) nr 2771/1999 muutmine

Määrust (EÜ) nr 2771/1999 muudetakse järgmiselt.

1. Artikli 4 lõike 1 esimene lause asendatakse järgmisega: "Pädevad asutused kontrollivad või kvaliteeti I lisas sätestatud meetodeid kasutades ning IV lisas sätestatud eeskirjade kohaselt võetud proovide alusel."

2. I lisa joonealune märkus 2 asendatakse järgmisega: "Vt määruse (EÜ) nr 213/2001 I lisa".

3. II ja III lisa jäetakse välja.

4. IV lisa 2. osa eelviimases lauses asendatakse sõnad "III lisaga" sõnadega "määruse (EÜ) nr 213/2001 VII lisaga".

Artikkel 21

Määruse (EÜ) nr 2799/1999 muutmine

Määrust (EÜ) nr 2799/1999 muudetakse järgmiselt.

1. Artikli 20 lõiked 1, 2, 3 ja 4 asendatakse järgmisega:

"1. Segude ja segasööda lõssipulbrisisaldus määratakse kindlaks, testides iga proovi vähemalt kaks korda, kasutades määruse (EÜ) nr 213/2001 XXII lisas kirjeldatud analüüsimeetodit, mida täiendatakse käesoleva määruse artikli 17 lõikes 3 sätestatud kontrollidega. Kui kõnealuste kontrollide tulemuste vahel on lahknevusi, on otsustav kohapealse kontrolli tulemus.

2. Laabivadaku puudumine tõendatakse määruse (EÜ) nr 213/2001 XIX lisas kirjeldatud meetodit kasutades.

3. Segasöötade tärklisesisaldus määratakse kindlaks käesoleva määruse artikli 17 lõikes 3 ette nähtud kontrollidega, mida tuleb täiendada määruse (EÜ) nr 213/2001 XXIII lisas kirjeldatud analüüsimeetodiga.

4. Hapukoorepeti pulbri niiskusesisaldus määratakse kindlaks määruse (EÜ) nr 213/2001 XXIV lisas kirjeldatud analüüsimeetodit kasutades."

2. III, IV, V ja VI lisa jäetakse välja.

Artikkel 22

Kehtetukstunnistamised

Määrused (EMÜ) nr 1216/68, (EMÜ) nr 3942/92, (EÜ) nr 86/94, (EÜ) nr 2721/95, (EÜ) nr 1854/96, (EÜ) nr 1080/96, (EÜ) nr 1081/96, (EÜ) nr 1082/96, (EÜ) nr 880/98 ja (EÜ) nr 1459/98 tunnistatakse kehtetuks.

Viiteid kehtetuks tunnistatud määrustele käsitatakse viidetena käesolevale määrusele.

Artikkel 23

Jõustumine

Käesolev määrus jõustub seitsmendal päeval pärast selle avaldamist Euroopa Ühenduste Teatajas.

III lisas, IV lisa 4. osas, V, VI ja VIII lisas kirjeldatud meetodeid hakatakse siiski kohaldama 18 kuu pärast peale käesoleva määruse jõustumist.

Käesolev määrus on tervikuna siduv ja vahetult kohaldatav kõikides liikmesriikides.

Brüssel, 9. jaanuar 2001

Komisjoni nimel

komisjoni liige

Franz Fischler

[1] EÜT L 160, 26.6.1999, lk 48.

[2] EÜT L 333, 24.12.1999, lk 11.

[3] EÜT L 340, 31.12.1999, lk 3.

[4] EÜT L 350, 20.12.1997, lk 3.

[5] EÜT L 76, 25.3.2000, lk 9.

[6] EÜT L 298, 12.11.1985, lk 9.

[7] EÜT L 11, 16.1.1999, lk 14.

[8] EÜT L 45, 21.2.1990, lk 8.

[9] EÜT L 16, 21.1.1999, lk 19.

[10] EÜT L 279, 11.10.1990, lk 22.

[11] EÜT L 325, 17.12.1999, lk 10.

[12] EÜT L 256, 7.9.1987, lk 1.

[13] EÜT L 28, 3.2.2000, lk 16.

--------------------------------------------------

I LISA

(Artikkel 2)

STANDARDMEETODITE LOETELU

Indeks

Min = miinimum,

Maks = maksimum,

Lisa = osutatud määruse lisa,

SNF = rasvavaba kuivaine,

FFA = vabad rasvhapped,

PV = peroksiidarv,

A = esinemine,

F = lõhn ja maitse,

K = konsistents,

TBC = bakterite üldarv,

Term = termofiilsete bakterite arv,

MS = liikmesriik,

IDF = Rahvusvaheline Piimandusföderatsioon,

ISO = Rahvusvaheline Standardiorganisatsioon,

IUPAC = Rahvusvaheline Puhta Keemia ja Rakenduskeemia Liit,

ADPI = Ameerika Piimatoodete Instituut,

SCM = suhkruga kondenspiim,

EMC = suhkruta kondenspiim või koor,

MSNF = rasvata piimakuivaine

Märkus 1 : Piimarasv eraldatakse IDFi standardi 6B:1989 kohaselt (töökohta tuleb kaitsta valguse eest).

Märkus 2 : Standardmeetodit ei ole kindlaks määratud.

Märkus 3 : Proovid tuleb ette valmistada IDFi standardi 122C:1996 või IDFi standardi 73A:1985 kohaselt.

Märkus 4 : Inkubeeritakse 55 °C juures 48 tundi, tuleks hoolikalt jälgida, et sööde ära ei kuivaks.

Märkus 5 : SNF-% = tahkete ainete protsent – rasvaprotsent.

Märkus 6 : Või peab vastama komisjoni määruse (EÜ) nr 2771/1999 V lisas osutatud tootmisliikmesriigi riiklikule kvaliteediklassile.

Märkus 7 : Komisjoni direktiiv 84/8/EMÜ.

Märkus 8 : Komisjoni määrus (EÜ) nr 1758/94 (EÜT L 183, 19.7.1994, lk 14).

Märkus 9 : Komisjoni direktiiv 78/633/EMÜ.

A OSA

Vesi | Kuni 16 % | IX lisa | |

SNF | Kuni 2 % | X lisa | |

FFA (maks) | 1,2 mmoli 100 g rasva kohta | IDFi standard 6B:1989 | |

PV (maks) | 0,3 meq hapnikku 1000 g rasva kohta | IDFi standard 74A:1991 | Märkus 1 |

Kolibakterid | 1 grammis ei ole avastatavad | XVII lisa | Märkus 3 |

Mittepiimarasv | Triglütseriidi analüüsiga ei ole avastatavad | XXVI lisa | |

Steroolmärgised | Ei ole avastatavad | XIV lisa | |

Muud märgistusained: | | | |

—vanilliin | Ei ole avastatav | XII lisa | |

—karoteenhappe etüülester | Ei ole avastatav | XIII lisa | |

—enanthappe triglütseriidid | Ei ole avastatav | IUPAC 2.301 sub 5 | |

Organoleptilised omadused | A, G ja C puhul vähemalt 4 punkti 5st | VII lisa | |

Eraldunud vesi | Vähemalt 4 punkti | IDFi standard 112A:1989 | |

Vesi | Kuni 16 % | IX lisa | |

Vesi | Kuni 16 % | IX lisa | |

Sool | Kuni 2 % | IDFi standard 12B:1988 | |

Vesi | Kuni 16 % | IX lisa | |

Märgistusained: | | | |

—steroolid | | XIV lisa | |

—vanilliin | | XII lisa | |

—karoteenhappe etüülester | | XIII lisa | |

—enanthappe triglütseriidid | | IUPAC 2.301 sub 5 | |

Vesi | Kuni 16 % | IX lisa | |

Sool | Kuni 2 % | IDFi standard 12B:1988 | |

Märgistusained: | | | |

– steroolid | | XIV lisa | |

– vanilliin | | XII lisa | |

– karoteenhappe etüülester | | XIII lisa | |

– enanthappe triglütseriidid | | IUPAC 2.301 sub 5 | |

Niiskus ja MSNF | Kuni 0,2 % | IDFi standard 23A:1988 (niiskus) IDFi standard 24:1964 (MSNF) | |

FFA | Kuni 0,35 % (oleiinhappena) | IDFi standard 6B:1989 | |

PV (maks) | 0,5 meq hapnikku 1000 g rasva kohta | IDFi standard 74A:1991 | Märkus 1 |

Mittepiimarasv | Puudub | XXV lisa | |

Maitse | Puhas | | |

Lõhn | Võõras lõhn puudub | | |

Muu | Neutraliseerimisvedelik, antioksüdandid ja säilitusained puuduvad | | |

Märgistusained: | | | |

—steroolid | | XIV lisa | |

—vanilliin | | XII lisa | |

—karoteenhappe etüülester | | XIII lisa | |

—enanthappe triglütseriidid | | IUPAC 2.301 sub 5 | |

Märgistusained: | | | |

—steroolid | | Pädeva asutuse poolt heaks kiidetud meetodid | Märkus 2 |

—vanilliin | | XII lisa | |

—karoteenhappe etüülester | | Pädeva asutuse poolt heaks kiidetud meetodid | Märkus 2 |

—enanthappe triglütseriidid | | IUPAC 2.301 sub 5 | |

SNF | Kuni 2 % | Pädeva asutuse poolt heaks kiidetud meetodid | Märkus 2 |

Märgistusained: | | | |

—stigmasterool (95 %) | 15 g 100 kg kontsentreeritud või kohta | XIV lisa | |

—stigmasterool (85 %) | 17 g 100 kg kontsentreeritud või kohta | XIV lisa | |

—enanthappe triglütseriidid | 1,1 kg 100 kg kontsentreeritud või kohta | IUPAC 2.301 sub 5 | |

—võihappe etüülester ja stigmasterool | Vt lisa punkti 1c | XIV lisa | Märkus 2 |

—letsitiin (E322) | Kuni 0,5 % | Pädeva asutuse poolt heaks kiidetud meetodid | Märkus 2 |

NaCl | Kuni 0,75 % | IDFi standard 12B:1988 | |

FFA | Kuni 0,35 % (oleiinhappena) | IDFi standard 6B:1989 | |

PV (maks) | Kuni 0,5 meq hapnikku 1000 g rasva kohta | IDFi standard 74A:1991 | Märkus 1 |

Maitse | Puhas | | |

Lõhn | Võõras lõhn puudub | | |

Muu | Neutraliseerimisvedelik, antioksüdandid ja säilitusained puuduvad | | |

Vesi | Kuni 16 % | IX lisa | |

Vesi | Kuni 16 % | IX lisa | |

Sool | Kuni 2 % | IDFi standard 12B:1988 | |

Rasv | Kuni 1,75 % | IDFi standard 127A:1988 | |

Vabad rasvhapped | Kuni 0,30 % (piimhappeid) | IDFi standard 91:1979 | |

Rasv | Kuni 1,00 % | IDFi standard 127A:1988 | |

Tuhk | Min. 7,50 % | IDFi standard 90:1979 | |

Piimavalk | Min 88,00 % | IDFi standard 92:1979 | |

Rasv ja tuhk | Kuni 6,00 % | IDFi standard 127A:1988 IDFi standard 89:1979 või IDFi standard 90:1979 | |

Rasv | Kuni 1,50 % | IDFi standard 127A:1988 | |

Vabad rasvhapped | Kuni 0,20 % (piimhappeid) | IDFi standard 91:1979 | |

TBC (maks) | 30000 l/g | IDFi standard 100B:1991 | Märkus 3 |

Kolibakterid | 0,1 grammis puuduvad | XVI lisa | Märkus 3 |

Term (maks) | 5000 l/g | IDFi standard 100B:1991 | Märkused 3 ja 4 |

Rasv | Kuni 1,00 % | IDFi standard 127A:1988 | |

Tuhk | Min. 7,50 % | IDFi standard 90:1979 | |

TBC (maks) | 30000 l/g | IDFi standard 100B:1991 | Märkus 3 |

Kolibakterid | 0,1 grammis puuduvad | XVI lisa | Märkus 3 |

Term (maks) | 5000 l/g | IDFi standard 100B:1991 | Märkused 3 ja 4 |

Piimavalk | Min 88,00 % | IDFi standard 92:1979 | |

Rasv ja tuhk | Kuni 6,00 % | IDFi standard 127A:1988 IDFi standard 89:1979 või 90:1979 | |

TBC (maks) | 30000 l/g | IDFi standard 100B:1991 | Märkus 3 |

Kolibakterid | 0,1 grammis puuduvad | XVI lisa | Märkus 3 |

Term (maks) | 5000 l/g | IDFi standard 100B:1991 | Märkused 3 ja 4 |

Piimavalk | Min 85,00 % | IDFi standard 92:1979 | |

Rasv | Kuni 1,50 % | IDFi standard 127A:1988 | |

Laktoos | Kuni 1,00 % | IDFi standard 106:1982 | |

Tuhk | Kuni 6,50 % | IDFi standard 89:1979 või 90:1979 | |

TBC (maks) | 30000 l/g | IDFi standard 100B:1991 | Märkus 3 |

Kolibakterid | 0,1 g puuduvad | XVI lisa | Märkus 3 |

Term (maks) | 5000 l/g | IDFi standard 100B:1991 | Märkused 3 ja 4 |

Valk | 31,4 % (min) rasvata kuivainest | IDFi standard 20B:1993 | |

Vesi (LP) | Kuni 5 % | IDFi standard 26A:1993 | |

Rasv (LP) | Kuni 11 % | IDFi standard 9C:1987 | |

Laabivadak (LP) | Puudub | XIX lisa | Märkus 7 |

Tärklis (LP) | Puudub | XXIII lisa | |

Vesi (segudes) | Kuni 5 % rasvata kuivainest | IDFi standard 26A:1993 | |

Rasv (segudes) | – | Komisjoni direktiiv 84/4/EMÜ (EÜT L 15, 18.1.1984, lk 28) | |

Laabivadak (segudes) | Puudub | XIX lisa | |

LP sisaldus (lõpptootes) | Min 50 % | XXII lisa | Märkus 7 |

Rasv (lõpptootes) | Min 2,5 % või 5 % | Komisjoni direktiiv 84/4/EMÜ | Märkus 8 |

Tärklis (lõpptootes) | Min 2 % | XXIII lisa | Märkus 9 |

Vask (lõpptootes) | 25 ppm | Komisjoni direktiiv 78/633/EMÜ (EÜT L 206 29.7.1978, lk 43) | |

Valk | 31,4 % (min) rasvata kuivainest | IDFi standard 20B:1993 | |

Vesi | Kuni 3,5 % | IDFi standard 26A:1993 | |

Happesus (N/10 NaOH) | Kuni 19,5 ml | IDFi standard 86:1981 | |

Laktaadid | Kuni 150 mg/100 g | IDFi standard 69B:1987 | |

Fosfaadid | Negatiivne | IDFi standard 3356:1975 | |

Lahustuvus | Kuni 0,5 ml 24 °C juures | IDFi standard 129A:1988 | |

Kõrbenud osakesed | Ketas B min (15,0 mg) | ADPI:1990 | |

TBC | 40000/1 g | IDFi standard 100B:1991 | Märkus 3 |

Kolibakterid | Negatiivne/0,1 g | XVI lisa | Märkus 3 |

Petipiim | Negatiivne | XX lisa | |

Laabivadak | Negatiivne | XVIII lisa | |

Happevadak | Negatiivne tulemus | Pädeva asutuse poolt heaks kiidetud meetodid | Märkus 2 |

Mikroobivastased ained | | XXI lisa | |

B OSA

B osas loetletud standardmeetodeid võib kasutada kõikide 1. veerus nimetatud määrustega hõlmatud toodete analüüsimisel.

Määrus (EMÜ) nr 2658/87 (EÜT L 256, 7.9.1987, lk 1) Määrus (EÜ) nr 2414/98 (EÜT L 299, 10.11.1998, lk 7) Määrus (EÜ) nr 1374/98 (EÜT L 185, 30.6.1998, lk 21) Määrus (EÜ) nr 2508/97 (EÜT L 345, 16.12.1997, lk 31) Määrus (EÜ) nr 174/1999 (EÜT L 20, 27.1.1999, lk 8) | Piim ja koor, kontsentreerimata, suhkru- või muu magusaine-lisandita | 0401 | Rasv (≤ 6 %) | Piirnormid on samad, mis on määratletud vastava CN-koodi alla kuuluva toote kirjelduses ning vajaduse korral täpsustatud komisjoni määruse (EMÜ) nr 3846/87 (EÜT L 366, 24.12.1987, lk 1) 9. osas ekspordinomenklatuuri kohta või määruses (EÜ) nr 1374/98 (EÜT L 185, 30.6.1998, lk 21) | IDFi standard 1D:1996 | |

Rasv (> 6 %) | IDFi standard 16C:1987 | |

Rasv (tahkel kujul) | IDFi standard 9C:1987 | |

Valk | IDFi standard 20B:1993 | |

Sahharoos (tavaline sisaldus) | IDFi standard 35A: 1992 | |

Sahharoos (madal sisaldus) | Pädeva asutuse poolt heaks kiidetud meetodid | Märkus 2 |

Tahked ained (SCM) | IDFi standard 15B:1991 | |

Tahked ained (EMC) | IDFi standard 21B:1987 | |

Vesi (piima- ja koorepulber) | IDFi standard 26A:1993 | |

Petipiim, fermenteeritud või hapendatud piim ja koor, kontsentreeritud või mitte, suhkru- või muu magusainelisandiga | 0403 | Rasv | IDFi standardid 1D:1996, 9C:1987, 16C:1987, 22B:1987, 126A:1988 | |

Valk | IDFi standard 20B:1993 | |

Sahharoos (tavaline sisaldus) | IDFi standard 35 A:1992 | |

Sahharoos (madal sisaldus) | Pädeva asutuse poolt heaks kiidetud meetodid | Märkus 2 |

Vesi (hapukoorepeti pulber) | XXIV lisa | |

Vesi (rõõsakoorepeti pulber) | IDFi standard 26A:1993 | |

Tahked ained (muud tooted) | Pädeva asutuse poolt heaks kiidetud meetodid | |

Vadak, kontsentreeritud või mitte, suhkru- või muu magusainelisandiga või ilma, tooted naturaalpiima komponentidest IDFi standardid 9C:1987, 16C:1987, 22B:1987 | 0404 | Rasv | IDFi standardid 9C:1987, 16C:1987, 22B:1987 | |

Valk | IDFi standard 20B:1993 | |

Sahharoos (tavaline sisaldus) | IDFi standard 35A:1992 | |

Sahharoos (madal sisaldus) | Pädeva asutuse poolt heaks kiidetud meetodid | Märkus 2 |

040490 | Valk | IDFi standard 20B:1993 | |

Vesi | IDFi standard 26A:1993 | |

Tahked ained | IDFi standard 15B:1991 | |

(Kontsentreeritud tooted) | IDFi standard 21B:1987 | |

Vesi | IX lisa | |

Või | SNF | X lisa | |

NaCl | IDFi standard 12B:1998 | |

Võiõli | Rasv (kui rasvasisaldus on > 99 %) | IDFi standard 24:1964 | |

Vesi (kui rasvasisaldus on < 99 %) | IDFi standard 23A:1988 | |

Tahked ained | IDFi standard 4A:1982 | |

Tahked ained (Ricotta) | IDFi standard 58:1970 | |

NaCl | IDFi standard 88A:1988 | |

Laktoos | IDFi standard 79B:1991 | |

--------------------------------------------------

II LISA

(Artikkel 3)

TAVAPÄRASTE MEETODITEGA SAADUD SELLISTE TULEMUSTE KONTROLLIMINE, MIS ON LÄHEDAL KOOSTIST JA KVALITEEDINÕUDEID KÄSITLEVATES MÄÄRUSTES MÄÄRATLETUD PIIRVÄÄRTUSTELE

Kui mo on määruses määratletud koostise ja kvaliteedinõude piirnorm, on määramispiir (L)

L = m

kus RRout/RRef ≤ 1

RRout : reprodutseeritavuse piirnorm tavapärase meetodi puhul

RRef : reprodutseeritavuse piirnorm standardmeetodi puhul

Kui mo on ülempiir ja RRout/RRef > 1, siis saadakse määramispiir valemiga

L = m

· CrD

Kui mo on samadel tingimustel alampiir, saadakse määramispiir valemiga

L = m

· CrD

95,

kus CrD95 on standardmeetodi kriitiline diferents (vt IV lisa).

Kui mo on ülempiir, tuleb tavapärase meetodiga saadud ja määramispiiri ületav lõpptulemus asendada standardmeetodiga saadud lõpptulemusega. See lõpptulemus peab põhinema vähemalt samal arvul analüüsidel/proovidel kui tavapärase meetodiga saadud lõpptulemus.

Kui mo on alampiir, tuleb sama menetlust järgida tavapärase meetodiga saadud ja määramispiirist allapoole jääva lõpptulemuse puhul.

Märkus:

Eespool kirjeldatud menetlust saab järgida juhul, kui maatriksefekt ei ole avastatav.

Maatriksefekt on avastatav järgmiselt: iga kalibreerimiseks kasutatud proovi puhul määratakse kindlaks tavapärase meetodiga ja standardmeetodiga saadud tulemuste erinevus (wi).

Standardhälve arvutatakse valemiga

s =

∑ w

i2/2m

m : kalibreerimiseks kasutatud proovide arv,

mida võrreldakse tavapärase ja standardmeetodi standardhälbe korratavuse aritmeetilise keskmisega

+ s

rrout2/2

Maatriksefekti ei saa välistada, kui

+++++ TIFF +++++

kus

f = m (f: vabadusastmete arv)

α = vea tõenäosus; α = 0,05.

Sellisel juhul on enne määramispiiri kinnitamist vajalikud lisauuringud.

--------------------------------------------------

III LISA

(Artiklid 4 ja 5)

a) Menetlus kehtestatud reprodutseeritavuse piirnormile vastavuse määramiseks (keemiline analüüs)

Tulemuste vastavust kehtestatud reprodutseeritavuse piirnormile kontrollitakse, võrreldes labori analüüsitulemusi mõne vilunud labori [1] tulemustega, mis on saadud identseid proove kasutades. Mõlemas laboris tehakse kaks määramist ning nende tulemusi hinnatakse, kasutades järgmist valemit:

CrD

kus

CrD

95 : kriitiline diferents (P = 0,95)

—1 : esimese labori kahe tulemuse aritmeetiline keskmine

—2 : teise labori kahe tulemuse aritmeetiline keskmine

R : reprodutseeritavuse piirnorm, määratakse interpolatsiooniga

r : korratavuse piirnorm, kui täpsus on eri tasemetel erinev

Kui kriitiline diferents on ületatud, tuleb kahe kuu jooksul teha teine katse. Kui teise katse tulemused ei vasta reprodutseeritavuse piirnormile, peavad pädevad asutused võtma vajalikud meetmed.

b) Reprodutseeritavuse ajutise piirnormi määramise menetlus (keemiline analüüs)

Reprodutseeritavuse ajutine piirnorm (Rprov) saadakse järgmise võrrandiga:

r22

kus

—1 : esimese labori kahe tulemuse keskmine

—2 : teise labori kahe tulemuse keskmine (vt III lisa punkti a)

r : korratavuse piirnorm või korratavuse ajutine piirnorm.

Märkused:

1. Rprov on kasutatav kriitiliste erinevuste arvutamiseks (vt VI lisa).

2. Rprov on 2r, kui Rprov arvestuslik väärtus on väiksem kui 2r.

3. RSDR c [2] tuletatud R-väärtus, on Rprov liiga suur ja seda ei saa kasutada kriitiliste diferentside arvutamiseks.

4. Rprov tuleks kindlaks määrata vähemalt kord aastas kahes laboris saadud tulemuste põhjal (vt IV lisa).

5. Kriitiliste diferentside arvutamisel tuleb kasutada Rprov keskväärtust. Punktides 2 ja 3 esitatud reegleid kohaldatakse Rprov keskväärtuse suhtes.

Reprodutseeritavuse piirnorm (R-väärtus) saadakse arvestuslikust RSDR väärtusest järgmiselt:

R = 0,0283

RSD

- : saadud tulemuse aritmeetiline keskmine

Mõned arvestuslikud RSDR väärtused (näited):

Kontsentratsioon | RSDR (%) |

1 g/100 g | 4 |

0,01 g/100 g | 8 |

1 mg/1000 g | 16 |

Analüüdi kontsentratsioon 1 g/100 g arvutatakse järgmiselt:

R = 0,0283 * 1 * 4 = 0,11 g/100 g.

[1] Vilunud labor on üldiselt niisugune labor, mis on edukalt osalenud kas analüüsimeetodivalideerimises või tasemekatses.

[2] kümnendmurdudes väljendatud kontsentratsioon (näiteks: 10 g/100 g = 0,1).Viide:Peeler J. T., Horwitz, W. ja Albert, R.J.Ass. ff. Anal. Chem.72(5), 784-806 (1989).

--------------------------------------------------

IV LISA

(Artikkel 4)

KINNITATUD MEETODITEGA SAADUD ANALÜÜSITULEMUSTE HINDAMINE

Kui analüüsitulemused näitavad, et piirnormi on ületatud, arvutatakse kahe või enama tulemuse aritmeetiline keskmine. Menetluskord on järgmine.

1. Kui analüüsitulemus on saadud ühe analüüsi põhjal, tuleb teine analüüs teha korratavuse tingimustele vastavalt. Kui kahte analüüsi ei ole võimalik korratavuse tingimuste alusel läbi viia, tehakse korratavuse tingimustes täiendav kordusanalüüs, mille tulemusi kasutatakse kriitilisele diferentsile vastavuse hindamiseks.

2. Määratakse kindlaks vastavalt korratavuse tingimustele saadud aritmeetilise keskmise ja piirnormide erinevuse absoluutväärtus. Kriitilisest diferentsist suurema erinevuse absoluutväärtus tähendab, et analüüsitud proov ei vasta nõuetele.

Kriitiline diferents määratakse järgmise valemiga:

CrD

- m

kus:

— : saadud tulemuste aritmeetiline keskmine

m0 : piirnorm

n : analüüside/proovide arv

Kui täpsus on eri tasemetel erinev, võib osutuda vajalikuks määrata r ja R kindlaks interpolatsiooni teel.

Üldjuhul peavad proovi kohta esitatud lõpptulemused näitama, et piirnormidest on kinni peetud.

Seetõttu võivad üksnes erandkorras esineda lõpptulemused, mis jäävad vahemikku:

- m

ja m

+ CrD

maksimaalse piirnormi puhul;

- vahemikku m

ja m

+ CrD

95y— - m 0| minimaalse piirnormi puhul.

Nimetatud vahemikesse jäävaid lõpptulemusi aktsepteeritakse üksnes juhul, kui need ilmnevad analüüsitavas partiis mitte sagedamini kui kord iga viie proovi kohta. Kui partiist analüüsitakse alla viie proovi, võib kõnealusesse vahemikku jääda üks tulemus. Siiski tuleb eeskirjast, et viie analüüsitud proovi kohta tohib esineda ainult üks nimetatud vahemikesse jääv tulemus, pidada kinni, kui tootja tarnib partiisid korduvalt.

3. Kui lõpptulemus x arvutatakse valemiga x = y1 ± y2 (näiteks: vesi + või rasvavaba kuivaine sisaldus rasvasisalduse arvutamiseks), kus y1 ja y2 on üht liiki analüüside lõpptulemused, arvutatakse lõpptulemuse x korratavuse ja reprodutseeritavuse piirnormid rx ja Rx järgmiselt:

2r12+ r22

2R12+ R22

kus r1 ja r2 on vastavalt y1 ja y2 korratavuse piirnormid ning R1 ja R2 reprodutseeritavuse piirnormid.

Lõpptulemust x võrreldakse piirnormiga m0 vastavalt punktides 1 ja 2 määratletud eeskirjadele. Kriitiline diferents määratakse järgmise valemiga:

CrD

x - m

kus x on saadud tulemuste x1 aritmeetiline keskmine.

4. Kui lõpptulemus arvutatakse, kasutades valemit:

x =

(näiteks: rasv juustu kuivainesisalduses)

kus y1 ja y2 on üht tüüpi analüüside lõpptulemused, arvutatakse korratavuse ja reprodutseeritavuse piirnormid rx ja Rx järgmiselt:

= μ

x2r*12+ r*22

= μ

x2R*12+ R*22

= μ

| μ

μ1 : y1 piirnorm või sihtväärtus (näiteks rasva puhul)

μ2 : y2 piirnorm või sihtväärtus (näiteks kuivaine puhul)

≤ 0,15

kus

r1 : y1 korratavuse piirnorm

r2 : y2 korratavuse piirnorm

≤ 0,15

kus

R1 : y1 reprodutseeritavuse piirnorm

R2 : y2 reprodutseeritavuse piirnorm

Menetlust rx ja Rx arvutamiseks kohaldatakse üksnes siis, kui suhtelised korratavuse ja reprodutseeritavuse piirnormid (r*1, r*2; R*1, R*2) on väiksemad kui 0,15 või sellega võrdsed.

Lõpptulemust x võrreldakse piirnormiga m0 vastavalt punktides 1 ja 2 määratletud eeskirjadele. Kriitiline diferents määratakse järgmise valemiga:

CrD

- μ

kus

on kronoloogilises järjekorras saadud lõpptulemuste x aritmeetiline keskmine. [1]

[1] Märkus:Kui näiteks on saadud tulemused y11, y12, y21 ja y22, tuleb arvutada y11/y21 ja y12/y22 aritmeetiline keskmine.

--------------------------------------------------

V LISA

SISEKONTROLL

(Artikkel 5)

a) Sisemise kvaliteedikontrolli kord (IQC) (keemiline analüüs)

Kontrollaine mõiste

Sisemiseks kvaliteedikontrolliks kasutatavat materjali käideldakse samas või osaliselt samas korras kui analüüsitavaid materjale.

Kontrollaine võib olla:

- sertifitseeritud võrdlusaine,

- laborisisene võrdlusaine,

- laboritevaheliste katsetega valideeritud materjal,

- kunstlikult koostatud materjal.

Sisekontrolli korra kehtestamine

Labor peaks kehtestama sisemise kvaliteedikontrolli korra vastavalt IUPACi dokumendis "Ühtlustatud suunised analüüsilaborite sisemiseks kvaliteedikontrolliks" [1] kirjeldatud menetlusele.

Sisemine kvaliteedikontroll hõlmab kontrollaine kaasamist analüütilises järjestuses või uuritava proovi kordusanalüüse. Kontrollained peavad olema sarnase keemilise koostisega kui uuritavad proovid ja piisavalt stabiilsed kogu uurimisaja vältel. Tuleb tõendada, et neid saab jagada analüüside jaoks ühesugusteks osadeks ning et analüüdi kontsentratsioon on kohane kõnealuseks uurimiseks.

Kontrollainet tuleb kasutada vähemalt üks kord analüüsi käigus ning saadud väärtus märkida pikaajalise vea mõõtmiseks kontrollkaardile. Lisaks peaks labor analüüside tegemise jooksul korrapäraselt tõendama vastavust korratavuse tingimustele. Seda peab olema võimalik saavutada kontrolli- ja/või katsematerjali kordusanalüüsiga. Selliste analüüside tulemusi tuleks võrrelda mis tahes avaldatud korratavuse piirnormidega ja andmetega laborisisese täpsuspiiride kohta.

Kui kasutatakse kontrollainet, tuleb kontrollaine analüüsisarja välistel analüüsidel saadud väärtused koos asjakohaste piirmääradega märkida Shewharti kaardile (ISO 8258 (1991)). Tegevuspiirid tuleb kehtestada tasemel

x ± 3s

kus st on kogu standardhälve,

hoiatuspiirid tasemel

x ± 2s

Kogu standardhälve:

2sb2+sw2/n

kus:

sb : analüüsisarja väline standardhälve

sw : katsesisene standardhälve

n : määramiste arv

Kui kontrollainet ei kasutata (nt kui aine ei ole stabiilne), tuleb igas sarjas vähemalt üht analüüsitavat materjali analüüsida kaks korda.

Sama analüüsisarja kordusanalüüside absoluutsed erinevused (vt III lisa) tuleb registreerida. Keskjoon on 1,128 sw, alampiir 0, ülempiir (tegevuspiir) 3,686 sw, kus sw on katsesisene standardhälve.

Kui kontsentratsioonivahemik on suur, peaks kontrollimenetlus hõlmama nii madala kui kõrge kontsentratsiooniga materjale.

Kui kontrollaine analüüdi kontsentratsioonierinevused on suured, peaks labor kehtestama suhte katse täpsuse ja katse mahu vahel. Kui täpsus on mahuga võrdeline, peaks järelkontroll põhinema suhtelisel täpsusel (nt absoluutne erinevus protsentides keskväärtusest).

Analüüsisüsteem ei ole usaldusväärne, kui esineb üks järgmistest:

A. jooksev väärtus jääb tegevuspiiridest väljapoole,

B. jooksev väärtus ja eelnev väärtus jäävad hoiatuspiiridest väljapoole, kuid on tegevuspiiride sees,

C. kui kontrollaine kasutamise korral jäävad üheksa järjestikust väärtust keskjoonest samale poole.

Labor peaks kõnealustele olukordadele reageerima järgmiselt:

A. lõpetama analüüsid ning ootama diagnostiliste testide tegemist ja heastavaid meetmeid ning

B. jätma analüüsisarja tulemused vastu võtmata ning analüüsima katsematerjale uuesti.

b) Laborisisese kontrollaine valimise kord ning laborisiseste piirmäärade määramiseks (keemiline analüüs)

Andmed laborisisese täpsuse kohta võivad olla saadud kontrollainete ja/või uuritavate proovide kordusanalüüsidest.

Laborid peaksid järgmist menetluskorda kasutama sarjasiseste ja sarjaväliste erinevuste täpsusparameetrite kehtestamiseks, mida kasutatakse kontrollkaartide koostamisel. Laborid võivad kasutada alternatiivseid meetodeid, tingimusel et nad suudavad adekvaatselt tõestada, et andmed täpsuse kohta on usaldusväärsed.

1. Kontrollainete valimine

Kui labor kasutab kontrollainet, tuleb piiride määramiseks kõigepealt andmeid koguda. Võimaluse korral tuleks kasutada sertifitseeritud etalonaineid. Võimalikke kontrollaineid tuleks analüüsida korratavuse tingimustel samas sarjas, koos asjakohaste sertifitseeritud etalonainete kasutamisega; kasutatakse korduvanalüüsi ja juhuslikku valimit. Kui selline lähenemine ei ole võimalik, peaksid laborid osalema tasemekatsel ja määrama kokkuleppelise väärtusega keskarvu, mida võib pidada tegelikuks keskarvuks ja millele võib liita märgatavad ebatäpsused. Muud menetlused hõlmavad tegelike väärtuste määramist, valmistades või kasutades kontrollaineid, millele on lisatud analüüsitavat ainet.

Kui labor teeb seda tüüpi analüüse regulaarselt ja on võtnud juba kasutusele statistilise kontrolli, tuleb hankida kõik uued kontrollained (mida vajatakse näiteks varude lõppemise korral), pidades silmas analüüse, mille jaoks on juba olemas varem kasutatud ainetel põhinev kontrollimenetlus.

2. Piirnormide määramine

Pärast kontrollaine valimist peaks labor seda kasutama analüüsisarja siseste ja väliste täpsuspiirnormide määramiseks.

Sarjasisese täpsuse määramise miinimumnõudeks on kontrollainega korduskatsete tegemine 12 korral. Kordusanalüüs tuleb läbi viia korratavuse tingimustel (sama operaator, samad reaktiivid jne). Kontrollainega tehtavad korduskatsed tuleks analüüsisarja käigus teha juhusliku valimiga. Kõik kordusanalüüsid tuleks teha eraldi päevadel teatava ajavahemiku tagant, et oleks arvestatud mõistlikud erinevused analüüsisarjade vahel, võttes arvesse tavapäraseid erinevusi (nt reaktiive, vahendite uuesti kalibreerimist ja vajaduse korral analüüsija vahetumist).

Märkus:

Kui kasutatakse andmeid, mis analüüsisarjade väliste erinevuste osas ei ole täiesti usaldusväärsed, võib see liiga kitsaste piiride sätestamise tõttu viia analüüside tarbetu kordamiseni. Vastupidi, kui labor esitab liiga ebatäpseid andmeid, võib standardmeetodites ettenähtud piiride järgimine osutuda labori jaoks võimatuks; seetõttu on tulemus partnerlaborite omast halvem ning ei anna kavatsetud eesmärgiks kõlbavat teavet.

2.1. Analüüsisarja sisese täpsuse määramine

2.1.1. Analüüsisarja sisene täpsus, kui kontrollaine on kättesaadav

Kordusandmete puhul (vähemalt 12 duplikaadipaari) tuleks kõigepealt teha Cochrani suurima dispersiooni test. Selleks võrreldakse suurima dubleeriva vahemiku ruutu vahemike ruutude summaga.

c =

max

∑

kus

di = duplikaatide vaheline erinevus.

Cochrani kriteeriumi väärtust C võrreldakse tabelis esitatud väärtustega (ISO 5725 (1994)). Kui see väärtus on kaheldav või võõrväärtus, tuleks tulemust seletuse (nt tehniline viga, arvutusviga, viga katse läbiviimisel, vale proovi analüüs) leidmiseks uurida. Kui tehniline viga teeb kahtlase tulemuse asendamise võimatuks, tuleks see välja praakida nagu tegelik võõrväärtus. Kui on jäänud veel mingeid kaheldavaid näitajaid või võõrväärtusi, mida pole võimalik seletada, loetakse kaheldavad näitajad õigeteks ning statistilised võõrväärtused praagitakse välja. Labor peaks üritama leida uued väärtused.

Kui labor on saanud võõrväärtused välja praakida, arvutatakse analüüsisarja sisene standardhälve sw järgmiselt: leitakse iga kordustepaari xi1, xi2 summa,

= x

+ x

ja duplikaatide erinevus,

= x

- x

need liidetakse kokku ja saadakse

A = ∑

B = ∑

C = ∑

Analüüsisarja sisene hinnanguline standardhälve on

2B2p

Laborisisene täpsuspiir on 2,8 sw.

Kui kasutatakse standardmeetodit, tuleks laborisisest täpsuspiiri võrrelda avaldatud korratavuse piirnormiga. Labor peaks vastama standardmeetodi puhul esitatavatele nõuetele. Selle nõude täitmise rikkumist tuleb uurida.

Kehtestatud piirnorme tuleks pidada ajutisteks ja hiljem uuesti üle vaadata.

2.1.2. Analüüsisarja sisene täpsus, kui kontrollaine ei ole kättesaadav

Labor võib määrata analüüsisarja sisese täpsuse ka representatiivsete proovide kordusanalüüsidega (vähemalt 12 duplikaadipaari). Kui kontrollaineid pole võimalik kasutada, nt ebastabiilsuse tõttu, tuleb dubleeriv teave koguda käesoleval viisil.

Märkus:

Eeldatakse, et analüüsid hõlmavad suhteliselt kitsast väärtuste vahemikku ning seetõttu võib kõikide proovide suhtes kohaldada ühte väärtust. Kui väärtuste vahemik on laiem, nt rohkem kui suurusjärgu võrra, ning täpsus sõltub sisaldusest, peaksid laborid kasutama suhtelist standardhälvet.

Andmete suhtes tuleks kohaldada Cochrani testi vastavalt lõigule 2.1.1. Kui labor on saanud võõrväärtused välja praakida, arvutatakse analüüsisarja sisene standardhälve ja laborisisene täpsuspiir vastavalt lõigule 2.1.1.

Analüüsisarja sisest standardhälvet sw võib kasutada kontrollkaartide koostamiseks (vt II lisa). Kehtestatud piirnorme tuleks pidada ajutisteks ja hiljem uuesti üle vaadata.

2.2. Analüüsisarja välise täpsuse määramine

Arvutada iga paari keskmine väärtus (s1/2) ja teha neile Grubbsi test (ISO 5725 (1994)). Võõrväärtuste või kaheldavate väärtuste tagasilükkamise/vastuvõtmise kriteeriumid on kirjeldatud lõigus 2.1.1. Labor peaks üritama leida uued väärtused väljapraagitute asemele. Kui labor on saanud võõrväärtused välja praakida, arvutatakse analüüsisarja väline standardhälve sb.

C -

Β -

või 0, kui ruutjuure alune avaldis on negatiivne.

Kogu standardhälvet st kasutatakse n määramise keskmise kontrollkaartide koostamiseks (vt II lisa). Sätestatud täpsusmäära tuleks pidada ajutiseks ja hiljem täpsustada.

3. Esialgsete piirmäärade läbivaatamine

Eespool kirjeldatud korras sätestatud piirmäärasid käsitatakse esialgsetena.

Vastuvõetava analüüsisarja sisese täpsuse (lõik 2.1.2) alusel sätestatud piirmäärade ajakohastamiseks tuleks koguda täiendavat teavet korduskatsete kohta. Läbivaatamisele eelnev ajavahemik sõltub analüüside sagedusest. Põhimõtteliselt võiks teabe läbi vaadata pärast 10 uue duplikaadi saamist. Seetõttu tuleb kogu teabe suhtes kohaldada Cochrani testi ning sätestada standardhälbe uue väärtuse põhjal uued piirmäärad. Hilisemad otsused piirmäärade kehtivuse kohta tuleb teha lisateabe põhjal.

Analüüsisarja välise täpsuse määramiseks saadud esialgse teabe läbivaatamine sõltub samuti analüüside sagedusest. Kui kontrollaine analüüsimisel (sagedusega üks katse partii kohta) on saadud kümme uut teabepunkti, on üldjuhul soovitatav esialgsed standardhälbed ja keskväärtus üle vaadata.

Kogu teabe suhtes tuleks kohaldada Grubbsi võõrväärtuste test. Keskväärtus ja standardhälve tuleks uute andmete põhjal uuesti arvutada.

Lisaks peaks labor selles etapis kasutama CUSUM-kaarti (BS S700: (1984) ja muudatust 5480 (1987)), näiteks reaktiivide aegumisega seotud probleemide uurimiseks.Tuleb uurida kõiki tulemusi, mis CUSUM V-maski piiridest välja jäävad.

Uusi piirmäärasid (keskväärtus ja standardhälve) tuleb korrapäraselt kontrollida, kasutades CUSUM-meetodit. Kõiki viiteid kontrollaine kehtivuse küsitavusele tuleb põhjalikult uurida.

4. Täpsusandmetest teavitamine

Laborid peavad pädevale riigiasutusele saatma järgmise teabe:

- kasutatud meetod,

- analüüsisarja sisene standardhälve sw ja laborisisene täpsusmäär,

- analüüsisarja väline standardhälve sb,

- kogu standardhälve sl,

- täpsust käsitleva teabe saamiseks tehtud analüüside arv.

[1] M. Thompson and R. Wood: "Pure and Applied Chemistry" 67 (4), 649–666 (1995).

--------------------------------------------------

VI LISA

(Artikkel 6)

HINDAJATE HINDAMINE JA ORGANOLEPTILISTE ANALÜÜSIDE TULEMUSTE USALDUSVÄÄRSUS

Järgmisi menetlusi kohaldatakse hindamisviiside kasutamise puhul (IDFi standard 99C/1997).

a) Korratavusindeksi määramine

Hindaja analüüsib 12 kuu jooksul vähemalt kümmet pimedat kordusproovi. Tavaliselt toimub see mitme eri hindamisvooru ajal. Üksiktoodete omadustega seotud tulemusi hinnatakse järgmise valemi abil:

∑

kus

1 : korratavusindeks

i1 : proovi xi esimese hindamise tulemused

i2 : proovi xi teise hindamise tulemused

n : proovide arv

Hinnatavad proovid peaksid olema küllalt erineva kvaliteediga. wI ei tohiks olla suurem kui 1,5 (viiepallisüsteemis).

b) Hälbeindeksi määramine

Seda indeksit tuleks kasutada, et kontrollida, kas hindaja kasutab kvaliteedi hindamiseks sama skaalat kui rühm kogenud hindajaid. Hindaja antud punkte võrreldakse hindajate rühma antud keskmiste punktidega.

Tulemuste hindamiseks kasutatakse järgmist valemit:

= 1 +

∑

- x

—i222n

kus

xi1; xi2 : vt jaotist a

; x

—i2 : hindajate rühma keskmised tulemused vastavalt proovi xi esimesel ja teisel hindamisel

n : proovide arv (vähemalt kümme 12 kuu jooksul).

Hinnatavad proovid peaksid olema küllalt erineva kvaliteediga. DI ei tohiks olla suurem kui 1,5 (viiepallisüsteemis).

Liikmesriigid peavad teatama kõigist selle menetluse kohaldamisel ilmnenud raskustest.

c) Liikmesriigi eri piirkondades ja eri liikmesriikides saadud tulemuste võrdlemine

Vajaduse korral tuleb vähemalt kord aastas teha test eri piirkondade hindajate poolt saadud tulemuste võrdlemiseks. Märkimisväärsete erinevuste ilmnemisel tuleks võtta vajalikke meetmeid põhjuste kindlakstegemiseks ning võrreldavate tulemuste saamiseks.

Liikmesriigid võivad korraldada teste oma hindajate ja naaberliikmesriikide hindajate poolt saadud tulemuste võrdlemiseks. Märkimisväärsete erinevuste korral peaks läbi viima põhjaliku uurimise, mille eesmärgiks on võrreldavate tulemuste saamine.

Liikmesriik peaks komisjonile teatama nende võrdlemiste tulemused.

--------------------------------------------------

VII LISA

(Artikkel 6)

VÕI ORGANOLEPTILINE HINDAMINE

1. Reguleerimismisala

Käesolev või organoleptilise hindamise menetlus kujutab endast ühtset meetodit, mis on rakendatav kõikides liikmesriikides.

2. Mõisted

Organoleptiline hindamine – toote omaduste hindamine meeleorganitega.

Hindamiskomisjon – valikrühm hindajaid, kes hindamise ajal omavahel ei suhtle ja üksteist ei mõjuta.

Hinde panemine – organoleptiline hindamine, mille puhul hindamiskomisjon rakendab arvskaalat. Seejuures kasutatakse puuduste nomenklatuuri.

Kvaliteediastme määramine – liigitamine kvaliteedi järgi hinnete alusel.

Hindelehed – vormid, millele märgitakse igale tootele üksikomaduste eest antud hinded ja kvaliteediaste. (Sellele hindelehele võib märkida ka toote keemilise koostise.)

3. Tööruum

3.1. Tuleb võtta tarvitusele abinõud, et välised tegurid tööruumis ei mõjutaks hindajaid.

3.2. Tööruumis ei tohi olla kõrvalisi lõhnu ja seda peab olema kerge hoida puhtana. Seinad peavad olema heledad.

3.3. Tööruum ja selle valgustus ei tohi mõjutada toote omaduste hindamist. Ruumis peavad olema vajalikud temperatuuri reguleerimisseadmed.

4. Hindajate valimine

Hindaja peab tundma võitooteid ja olema organoleptilise hindamise alal pädev. Pädev asutus peaks hindaja pädevust korrapäraselt (vähemalt kord aastas) kontrollima.

5. Hindamiskomisjonile esitatavad nõuded

Hindamiskomisjonis peab olema paaritu arv, mitte vähem kui kolm hindajat. Enamiku peavad moodustama pädeva asutuse töötajad või volitatud isikud, kes ei tööta piimatööstuses.

Enne hindamist tuleb arvesse võtta mitmeid tegureid, et hindajate tegevus oleks optimaalne:

- hindajad ei tohi põdeda haigusi, mis võiksid nende tegevust mõjutada; sellisel juhul asendatakse hindaja komisjonis kellegi teisega,

- hindajad peavad õigeks ajaks kohale tulema ja tagama, et neil on hindamise läbiviimiseks piisavalt aega,

- hindajad ei tohi kasutada tugevalõhnalisi aineid (näiteks lõhnaõli, pärast habemeajamist kasutatavat vedelikku, desodeerivaid aineid jne) ja võiksid vältida tugevasti maitsestatud (nt väga vürtsist) toitu jne,

- hindajad ei tohi pool tundi enne hindamist suitsetada ega süüa või juua midagi peale vee.

6. Üksikomaduste hindamine

6.1. Organoleptiliselt hinnatakse kolme järgmist omadust: välimus, konsistents ning maitse.

Välimuse all mõistetakse järgmisi tunnusjooni: värvus, nähtav puhtusemäär, hallituse olemasolu ja eraldunud vesi. Eraldunud vee olemasolu teimitakse IDFi standardi 112 A/1989 kohaselt.

Konsistentsi all mõistetakse järgmisi tunnusjooni: kõvadus ja võietavus.

Või konsistentsi hindamiseks võib kasutada füüsikalisi meetodeid. Komisjon näeb ette nende meetodite edasise ühtlustamise.

Maitse ja lõhna all mõistetakse järgmisi tunnusjooni: maitse ja lõhn.

Oluline kõrvalekaldumine ettenähtud temperatuurist raskendab konsistentsi ning maitse ja lõhna usaldusväärset hindamist. On väga tähtis, et temperatuur oleks õige.

6.2. Iga omadust hinnatakse organoleptiliselt eraldi. Hinded pannakse tabeli 1 kohaselt.

6.3. Ühtluse saavutamiseks on soovitav, et enne hindamise alustamist paneksid hindajad üheskoos hinded välimuse, konsistentsi ning maitse ja lõhna eest ühele või mitmele standardproovile.

6.4. Hinded, millega või vastu võetakse, on järgmised:

| Maksimaalsed | Nõutavad |

Välimus | 5 | 4 |

Konsistents | 5 | 4 |

Maitse ja lõhn | 5 | 4 |

Kui pannakse nõutavast madalam hinne, tuleb esitada puuduse kirjeldus. Iga hindaja hinne iga omaduse eest tuleb märkida hindelehele. Toode võetakse vastu või jäetakse vastu võtmata enamuse otsuse alusel. Juhtumid, mil üksikhindajate hinded iga omaduse eest erinevad enam kui ühe punkti võrra, ei tohi esineda sageli (mitte sagedamini kui üks kord 20 proovi kohta). Vastasel korral tuleb komisjoni esimehel kontrollida komisjoni pädevust.

7. Järelevalve

Hindamiskomisjoni esimees, kes peab olema pädeva asutuse ametnik ja võib olla komisjoni liige, vastutab kogu menetluse eest tervikuna. Ta märgib hindelehele iga hindaja hinde iga omaduse eest ja tõendab toote vastuvõtmist või tagasilükkamist.

8. Proovi võtmine ja ettevalmistamine

8.1. - Selleks et vältida võimalikku erapoolikust, on soovitav proovide päritolu hindamise kestel salajas hoida.

- Abinõud päritolu salajasuse tagamiseks rakendab komisjoni esimees teiste komisjoniliikmete juuresolekuta enne hindamist.

8.2. Kui organoleptiline hindamine toimub külmhoones, võetakse proov võipuuriga. Kui organoleptiline hindamine toimub mujal, tuleb võtta vähemalt 500 g suurune proov.

8.3. Hindamisel peab või temperatuur olema 10–12 °C. Suuri kõrvalekaldumisi peab igal juhul vältima.

9. Nimetused

Vt tabel 2.

Tabel 1: Või hindamine

Välimus | Konsistents | Maitse ja lõhn |

5 | | Väga hea ideaalne tüüp kõrgeim kvaliteet (ühtlaselt kuiv) | 5 | | Väga hea ideaalne tüüp kõrgeim kvaliteet (hästi võietav) | 5 | | Väga hea ideaalne tüüp kõrgeim kvaliteet (täiesti puhas õrn aroom) |

4 | | Hea [2] | 4 | | Hea [2] | 4 | | Hea [2] |

| | 18 | Pehme | | |

3 | | Rahuldav (nõrgad vead) | 3 | | Rahuldav (nõrgad vead) | 3 | | Rahuldav (nõrgad vead) |

1 | Lahtine vesi, niiskus | 14 | Rabe, purunev | 21 | Ebapuhas |

2 | Ebaühtlane | 15 | Taignane, määrduv | 22 | Võõrmaitse |

3 | Vöödiline | 16 | Kleepuv | 25 | Hapu |

4 | Kirju, marmorjas | 17 | Kõva | 27 | Keedumaitse, |

5 | Täpiline | 18 | Pehme | 33 | kõrbemaitse |

6 | Eraldunud rasv | | | 34 | Söödamaitse |

7 | Liialt värvitud | | | 35 | Mõrkjas, kibe |

8 | Nõrgalt pressitud | | | | |

2 | | Halb (märgatavad vead) | 2 | | Halb (märgatavad vead) | 2 | | Halb (märgatavad vead) |

1 | Lahtine vesi, niiskus | 14 | Rabe, purunev | 21 | Ebapuhas |

3 | Vöödiline | 15 | Taignane, määrduv | 22 | Võõrmaitse |

4 | Kirju, marmorjas | 16 | Kleepuv | 23 | Vanamaitse |

5 | Täpiline | 17 | Kõva | 25 | Hapu |

6 | Eraldunud rasv | 18 | Pehme | 32 | Oksüdeerunud, |

10 | Võõrlisandid | | | 33 | metallimaitse |

11 | Hallitanud | | | 34 | Mõrkjas, kibe |

12 | Lahustamata sool | | | 35 | Ülesoolatud |

| | | | 36 | Läppunud, roisumaitse |

| | | | 38 | Kemikaalide maitse |

1 | | Väga halb (tugevad vead) | 1 | | Väga halb (tugevad vead) | 1 | | Väga halb (tugevad vead) |

1 | Lahtine vesi, niiskus | 14 | Rabe, purunev | 22 | Võõrmaitse |

3 | Vöödiline | 15 | Taignane, määrduv | 24 | Juustumaitse |

4 | Kirju, marmorjas | 16 | Kleepuv | 25 | Hapu |

5 | Täpiline | 17 | Kõva | 26 | Pärmimaitse |

6 | Eraldunud rasv | 18 | Pehme | 28 | Hallitusmaitse |

7 | Liialt värvitud | | | 29 | Rääsunud |

9 | Teraline | | | 30 | Õli-, kalamaitse |

10 | Võõrlisandid | | | 31 | Rasvamaitse |

11 | Hallitanud | | | 32 | Oksüdeerunud metallimaitse, |

12 | Lahustamata sool | | | 34 | Mõrkjas, kibe |

| | | | 36 | Läppunud, roisumaitse |

| | | | 37 | Linnasemaitse |

| | | | 38 | Kemikaalide maitse |

Tabel 2: Või vead

I. Välimus

1. lahtine vesi, niiskus

2. ebaühtlane, kahevärviline

3. vöödiline

4. kirju, marmorjas

5. täpiline

6. eraldunud rasv

7. liialt värvitud

8. nõrgalt pressitud

9. teraline

10. võõrlisandid

11. hallitanud

12. lahustumata sool

II. Konsistents

14. rabe, purunev

15. taignane, määrduv

16. kleepuv

17. kõva

18. pehme

III. Maitse ja lõhn

20. lõhnata

21. ebapuhas [3]

22. võõrmaitse

23. vanamaitse

24. juustumaitse, piimane juustulõhn

25. hapu

26. pärmimaitse

27. a) keedumaitse

b) kõrbemaitse

28. hallitusmaitse

29. rääsunud

30. õli-, kalamaitse

31. rasvamaitse

32. a) oksüdeerunud maitse

b) metallimaitse

33. söödamaitse

34. mõrkjas, kibe

35. ülesoolatud

36. läppunud, roisumaitse

37. linnasemaitse

38. kemikaalide maitse

[1] Tabel 2.

[2] Kategoorias "Hea" märgitud vead on väga väikesed kõrvalekalded ideaalsest tüübist.

[3] Seda määratlust tuleks kasutada nii harva kui võimalik ja üksnes siis, kui viga ei saa täpsemalt kirjeldada.

--------------------------------------------------

VIII LISA

(Artikkel 7)

VAIELDAVATE ANALÜÜSITULEMUSTE PUHUL KASUTATAV MENETLUS (keemiline analüüs)

1. Seitsme päeva jooksul alates esimese analüüsi tulemuste teatamisest võib käitleja nõudmisel teha lisaanalüüsi, tingimusel et toote pitseeritud kordusproovid on kättesaadavad ning need on pädevate asutuste poolt asjakohaselt ladustatud.

2. Pädev asutus saadab need proovid käitleja taotlusel ja kulul teise laborisse. Nimetatud labor peab olema ametlike analüüside tegemiseks heaks kiidetud ning nende pädevus kõnealuste analüüside tegemiseks peab olema tõestatud. Seda pädevust tuleks dokumentaalselt tõendada eduka osavõtuga ühisuuringutest, tasemekatsetest või laboritevahelisest võrdlemisest. Kõnealune teine labor peab kasutama standardmeetodit. Kahe labori saadud tulemusi võrreldakse järgmiselt:

a) Kui mõlemad laborid vastavad korratavuse ja reprodutseeritavuse nõuetele

Lõpptulemusena teatatakse mõlema labori analüüside keskmine. Võttes arvesse kriitilist diferentsi, hinnatakse seda lõpptulemust järgmise valemi abil:

CrD

- m

1 -

kus

- : mõlema labori kõikide tulemuste aritmeetiline keskmine

mo : piirmäär

R : reprodutseeritavus

r : korratavus

n1 : esimese labori tulemuste arv

n2 : teise labori tulemuste arv.

Märkus:

Kui lõpptulemus saadakse järgmise valemi abil:

x = y

± y

või

x = y

tuleks valemisse R2 ja r 2asemel panna R2x ja r2x (vaata vastavalt IV lisa lõiget 3 või 4).

b) Kui mõlemad laborid vastavad korratavuse nõuetele, kuid ei vasta reprodutseeritavuse nõuetele

Kui teise analüüsi tulemused kinnitavad esimese analüüsi tulemusi, tuleks analüüsitud kogus lükata tagasi kui nõetele mitte vastav. Muul juhul tuleks kogus heaks kiita.

c) Kui ainult üks labor vastab korratavuse nõuetele

Korratavuse nõuetele vastava labori lõpptulemuse põhjal otsustatakse, kas analüüstud kogus heaks kiita või mitte.

d) Kui kumbki labor ei vasta korratavuse nõuetele, kuid reprodutseeritavuse nõuded on täidetud

Kohaldatakse punkti a.

e) Kui kumbki labor ei vasta korratavuse ega reprodutseeritavuse nõuetele

Analüüsitav kogus kiidetakse heaks, kui ühes laboris saadud tulemuste põhjal niisugusele järeldusele jõutakse.

f) Kui tulemused on saadud kinnitamata meetoditega

Analüüsitav kogus kiidetakse heaks, kui ühes laboris saadud tulemuste põhjal niisugusele järeldusele jõutakse.

3. Pädev asutus peab teise analüüsi tulemused teatama ettevõtjale võimalikult kiiresti. Ettevõtja kannab teise analüüsi kulud juhul, kui analüüsitavat kogust heaks ei kiidetud.

4. Kui ettevõtja suudab viie tööpäeva jooksul pärast proovi võtmist tõestada, et proovi ei võetud õigesti, tuleb võimaluse korral võtta kordusproov. Kui kordusproovi ei ole võimalik võtta, tuleb analüüsitud kogus heaks kiita.

--------------------------------------------------

IX LISA

(Artikkel 8)

VÕI VEESISALDUSE MÄÄRAMINE

1. Rakendatavus ja rakendusala

Käesoleva standardmeetodiga täpsustatakse või veesisalduse määramise meetod.

2. Viited

IDFi standard 50C: 1995 – Piim ja piimatooted – Proovivõtumeetodid

3. Mõiste

Või veesisaldus: massi kadu pärast käesolevas standardis kirjeldatud kuumutamist. Seda väljendatakse grammides 100 grammi kohta.

4. Põhimõte

Vee aurumine katsekogusest kuivatuskapis pimsskivi juuresolekul temperatuuril 102 °C.

5. Seadmed ja materjalid

Tavalised, eelkõige järgmised laboratooriumiseadmed:

5.1. Analüütilised kaalud täpsusega 1 mg.

5.2. Tõhusa kuivatusainega (nt hiljuti kuivatatud silikageel, millel on hügroskoopsuse indikaator) varustatud eksikaator.

5.3. Ventileeritav kuivatuskapp, mida saab seada temperatuurile 102 ± 2 °C.

5.4. Klaasist, portselanist või roostevabast metallist nõud kõrgusega umbes 20 mm ja läbimõõduga 60–80 mm.

5.5. Granuleeritud ja pestud pimsskivi läbimõõduga 0,8–10 mm.

6. Proovi võtmine

Vt IDF 50 C: 1995

7. Analüüsi käik

7.1. Uuritava proovi ettevalmistamine

Laboriproovi kuumutatakse poole kuni kahe kolmandikuni täidetud klaasist või nõuetekohasest plastist valmistatud suletud mahutis temperatuurini, mille juures proov on piisavalt pehme, et seda saaks mehhaanilise loksuti abil või käsitsi hõlpsasti segada ühtlaseks massiks. Üldjuhul ei tohiks segamistemperatuur ületada 35 °C. Proov jahutatakse ümbritseva õhu temperatuurini. Mahuti avatakse pärast proovi jahtumist nii kiiresti kui võimalik ja proovi segatakse enne kaalumist lühiajaliselt (mitte üle 10 sekundi) sobiva vahendiga, nt lusika või spaatliga.

7.2. Veesisalduse määramine

7.2.1. Nõusse pannakse umbes 10 grammi pimsskivi (5.4).

7.2.2. Nõu koos pimsskiviga kuivatatakse kuivatuskapis (5.3) 102 ± 2 °C juures vähemalt üks tund.

Märkus:

Punktides 7.2.2, 7.2.5 ja 7.2.7 nimetatud kuivatusaeg algab siis, kui temperatuur kuivatuskapis jõuab 102 ± 2 °C.

7.2.3. Nõu jahutatakse eksikaatoris (5.2) kaalumisruumi temperatuurini ja kaalutakse täpsusega 1 mg.

7.2.4. Nõusse pannakse 5 g uuritava proovi 1 mg täpsusega kaalutud kaalutis.

7.2.5. Seejärel asetatakse nõu kolmeks tunniks kuivatuskappi 102 ± 2 °C juures.

7.2.6. Nõu jahutatakse eksikaatoris kaalumisruumi temperatuurini ja kaalutakse täpsusega 1 mg.

7.2.7. Üks tund kestvat kuivatusprotsessi korratakse, jahutades ja kaaludes nagu kirjeldatud punktis 7.2.6 kuni konstantse massini (massi muutus ei ületa 1 mg).

Kui mass suureneb, võetakse arvutuste aluseks väikseim saadud mass.

8. Tulemuste esitamine

8.1. Arvutamismeetod ja valem

Veesisaldus W massiprotsendina arvutatakse järgneva valemi abil:

W =

-- m

× 100

kus:

m0 on nõu mass grammides koos pimsskiviga (7.2.3)

m1 on katsekoguse, nõu ja pimsskivi mass grammides enne kuivatamist (7.2.4)

m2 on katsekoguse, nõu ja pimsskivi mass grammides pärast kuivatamist (7.2.7)

Tulemus esitatakse ühe kümnendkoha täpsusega.

8.2. Korratavus

Ühel ja samal ajal või kohe teineteise järel samade seadmetega ühe ja sama analüüsija poolt identse materjaliga läbiviidud kahe määramise tulemuste vaheline erinevus ei tohi olla suurem kui 0,2 %.

8.3. Reprodutseeritavus

Absoluutne erinevus kahe üksiktulemuse vahel, mis on saadud kahe eri analüüsija poolt eri laboratooriumites sama katsematerjaliga, ei tohi olla suurem kui 0,3 %.

9. Katsearuanne

Analüüsiprotokollis täpsustakse kasutatud meetod ja saadud tulemused. Selles märgitakse samuti kõik üksikasjad, mida ei ole nimetatud käesolevas rahvusvahelises standardis või mis on valikulised, samuti üksikasjad tulemust mõjutada võinud vahejuhtumite kohta. Analüüsiprotokoll sisaldab kõiki proovi täielikuks tuvastamiseks vajalikke andmeid.

--------------------------------------------------

X LISA

(Artikkel 8)

VÕI: RASVAVABA KUIVAINE SISALDUSE MÄÄRAMINE

1. Rakendatavus ja rakendusala

Käesolev standard täpsustab võis rasvavaba kuivaine määramise meetodi.

2. Viited

IDFi standard 50C: 1995 – Piim ja piimatooted – Proovivõtumeetodid

3. Mõisted

Rasvavaba kuivaine sisaldus võis: kindlaksmääratud meetodil määratud ainete massiprotsent. Seda väljendatakse grammides 100 grammi kohta.

4. Põhimõte

Vee aurumine konkreetsest või massist, rasva ekstraheerimine lakibensiiniga ja jääkprodukti kaalumine.

5. Reaktiiv

Lakibensiin keemistemperatuuriga 30–60 °C. Reaktiiv ei tohi jätta 100 ml aurustumisel rohkem kui 1 mg jääkprodukte.

6. Seadmed ja materjalid

6.1. Analüütilised kaalud täpsusega 1 mg.

6.2. Tõhusa kuivatusainega (nt hiljuti kuivatatud silikageel, millel on hügroskoopsuse indikaator) varustatud eksikaator.

6.3. Ventileeritav kuivatuskapp, mida saab seada temperatuurile 102 ± 2 °C.

6.4. Klaasist, portselanist või roostevabast metallist nõud kõrgusega umbes 20 mm ja läbimõõduga 60–80 mm ja klaasist segamispulk.

6.5. Klaasist filtertiigel, mille membraanfiltri pooride läbimõõt on 16–40 μm koos imikolviga.

7. Proovi võtmine

Vt IDFi standard 50C: 1995

8. Analüüsi käik

8.1. Uuritava proovi ettevalmistamine

8.2. Määramine

8.2.1. Nõu, segamispulka (6.4) ja tiiglit (6.5) kuivatatakse kuivatuskapis (6.3) üks tund. Nimetatud esemed jahutatakse eksikaatoris ja kaalutakse koos (nõu, segamispulk ja tiigel) 1 mg täpsusega (m0).

Märkused:

- üldjuhul on 45 minutiline jahutusaeg piisav,

- kui analüüsitakse rohkem kui ühte katsekogust, on oluline, et iga katsekoguse puhul kasutakse sama nõud, segamispulka ja tiiglit.

8.2.2. Tiigel võetakse ära ja segamispulga ja nõu kaal registreeritakse 1 mg täpsusega (m1).

8.2.3. Nõusse pannakse 5 g uuritava proovi (8.1) 1 mg täpsusega kaalutud kaalutis (m2).

8.2.4. Seejärel asetatakse nõu (koos segamispulga ja võiga) kuivatuskappi 102 ± 2 °C juures ja jäetakse ööks seisma.

8.2.5. Nõul (8.2.3) lastakse jahtuda toatemperatuurini.

8.2.6. Nõusse lisatakse 15 ml sooja (umbes 25 °C) lakibensiini ja eemaldatakse klaaspulgaga niipalju kui võimalik nõu külge jäänud sadet. Tiiglisse viiakse lahustit ja lastakse sel filtreeruda imikolbi.

8.2.7. Toimingut 8.2.6 korratakse neli korda. Kui nõu pinnal ei ole enam rasva, kantakse neljanda pesemise ajal kvantitatiivselt võimalikult palju setet tiiglisse. Vastasel juhul korratakse toimingut 8.2.6, kuni rasva enam ei ole.

8.2.8. Tiiglis pestakse setet 25 ml sooja lakibensiiniga.

8.2.9. Nõu, segamispulka ja tiiglit kuivatatakse kuivatuskapis 102 ± 2 °C juures 30 minutit.

8.2.10. Tiigel jahutatakse eksikaatoris toatemperatuurini ja kaalutakse täpsusega 1 mg.

8.2.11. Toiminguid 8.2.9 ja 8.2.10 korratakse, kuni nõu, segamispulga ja tiigli ühine mass (m3) ei muutu (massi muutus ei ületa 1 mg).

9. Tulemuste esitamine

9.1. Rasvavaba kuivaine sisalduse arvutamine

Rasvavabade kuivainete sisaldus SNF massiprotsendina arvutatakse järgmise valemi abil:

SNF =

-- m

× 100

kus:

m0 on tühja nõu, klaasist segamispulga ja tiigli mass grammides (8.2.1)

m1 on tühja nõu ja klaasist segamispulga mass grammides (8.2.2)

m2 on katsekoguse, nõu ja klaasist segamispulga mass grammides (8.2.3)

m3 on nõu, klaasist segamispulga ja settega tiigli lõplik mass grammides (8.2.11)

Tulemus esitatakse ühe kümnendkoha täpsusega.

9.2. Korratavus

9.3. Reprodutseeritavus

Absoluutne erinevus kahe üksiktulemuse vahel, mis on saadud kahe eri analüüsija poolt eri laboratooriumites sama katsematerjaliga, ei tohi olla suurem kui 0,2 %.

10. Katsearuanne

Märkus:

Soolatud või analüüsil määratletakse lisatud sool rasvavaba kuivainena. Piima rasvavaba kuivaine määramiseks tuleb rasvavaba kuivaine sisaldusest lahutada lisatud soola sisaldus. Piima rasvavaba kuivaine määramiseks arvutatud täpsuse näitajad on:

Korratavus : r = 0,104 %

Reprodutseeritavus : R = 0,206 %.

Võib nentida, et rasvavaba kuivaine määramiseks kasutavad täpsuse näitajad on kehtivad ka piima rasvavaba kuivaine määramisel.

--------------------------------------------------

XI LISA

(Artikkel 8)

VÕI RASVASISALDUSE MÄÄRAMINE

Rasvasisaldus leitakse kaudselt vee ja rasvavaba kuivaine sisalduse määramise teel vastavalt IX ja X lisale. Rasva massiprotsent on:

100 -

W + SNF

kus

W on vee massiprotsent

SNF on rasvavaba kuivaine massiprotsent

Rasvasisalduse määramiseks arvutatud täpsuse näitajad on:

korratavus: | r = 0,22 % |

reprodutseeritavus: | R = 0,36 %. |

--------------------------------------------------

XII LISA

(Artikkel 9)

KONTSENTREERITUD VÕI, VÕI JA RÕÕSA KOORE VANILLIINISISALDUSE MÄÄRAMINE KÕRGSURVEVEDELIKKROMATOGRAAFIA ABIL

1. Rakendatavus ja rakendusala

Käesolev meetod kirjeldab vanilliini kvantitatiivse määramise protseduuri kontsentreeritud võis, võis ja rõõsas koores.

2. Põhimõte

Teatav kogus proovi ekstraheeritakse isopropanooli/etanooli/atsetonitriili seguga (1 : 1 : 2). Suurem osa rasvast sadestatakse, jahutades proovi temperatuurile –15 °C kuni –20 °C, ja proov tsentrifuugitakse.

Pärast veega lahjendamist määratakse kõrgsurvevedelikkromatograafia (HPLC) abil vanilliinisisaldus.

3. Seadmed

Tavalised, eelkõige järgmised laboratooriumiseadmed:

3.1. sügavkülmik temperatuuril –15 °C kuni –20 °C;

3.2. 2milliliitrised ühekordsed süstlad;

3.3. mikro-membraanfiltrid, poori suurusega 0,45 m, mis peavad vastu 5 % ekstraheerimislahusele (4.4);

3.4. vedelikkromatograafiaseade, mis koosneb pumbast (läbivool 1,0 ml/min), injektorist (injektsioon 20 μl, automaatne või manuaalne), UV detektorist (lainepikkus 306 nm, AU täielik skaala), meerikust või integraatorist ja 25 °C juures töötavast termostaadiga kolonnist;

3.5. analüütiline kolonn (250 mm × 4,6 mm ID), mis on pakitud LiChrospher RP 18ga (Merck, 5 m) või samaväärse materjaliga;

3.6. kaitsekolonn (ca 20 mm × 3 mm ID), mis on pakitud kuivalt Perisorb RP 18-ga (30–40 m) või samaväärse materjaliga.

4. Reaktiivid

Kõik reaktiivid peavad olema analüütiliselt puhtad.

4.1. Isopropanool

4.2. 96mahuprotsendiline etanool

4.3. Atsetonitriil

4.4. Ekstraheerimislahus

Segada isopropanool (4.1), etanool (4.2) ja atsetonitriil (4.3) vahekorras 1 : 1 : 2 (v/v).

4.5. Vanilliin (4-hüdroksü-3-metoksübensaldehüüd)

4.5.1. Vanilliini põhilahus (= 500 μg/ml)

Panna 100milliliitrisesse mõõtekolbi 0,1 mg täpsusega kaalutud umbes 50 mg (CM mg) vanilliini kaalutis (4.5), lisada 25 ml ekstraheerimislahust (4.4) ja täita kolb veega.

4.5.2. Vanilliini standardlahus (= 10 g/ml)

Pipettida 250milliliitrisesse mõõtekolbi 5 ml vanilliini põhilahust (4.5.1) ja täita see veega.

4.6. Metanool, HPLC-puhas

4.7. Jää-äädikhape

4.8. Vesi, HPLC-puhas

4.9. HPLC liikuv faas

Segada 1000milliliitrises mõõtekolvis 300 ml metanooli (4.6), umbes 500 ml vett (4.8) ja 20 ml äädikhapet (4.7) ja täita mõõtekolb veega (4.8). Filtreerida läbi 0,45 μm filtri (3.3).

5. Analüüsi käik

5.1. Uuritava proovi ettevalmistamine

5.1.1. Või

Kuumutada proovi sulamiseni. Vältida temperatuuri tõusmist üle 40 °C. Kui proov muutub piisavalt vedelaks, homogeenida raputades. Segada võid enne proovi võtmist 15 sekundit. Panna 1 mg täpsusega kaalutud umbes 5 g (SM g) või kaalutis 100milliliitrisesse mõõtekolbi.

5.1.2. Kontsentreeritud või

Vahetult enne proovi võtmist asetada kontsentreeritud võid sisaldav anum kuivatuskappi, mille temperatuur on 40–50 °C, ja hoida seal kuni või täieliku sulamiseni. Segada proovi loksutades või segades, vältides liiga tugeva segamise tulemusel õhumullide tekkimist. Panna 1 mg täpsusega kaalutud umbes 4 g (SM g) kontsentreeritud või kaalutis 100milliliitrisesse mõõtekolbi.

5.1.3. Rõõsk koor

Kuumutada proovi veevannis või inkubaatoris temperatuuril 35–40 °C. Jaotada rasv ühtlaselt loksutades või vajaduse korral segades. Jahutada proov kiiresti temperatuurile 20 ± 2 °C. Proovi välimus peaks olema ühtlane, vastasel korral tööd korrata. Panna 1 mg täpsusega kaalutud umbes 10 g (SM g) rõõsa koore kaalutis 100milliliitrisesse mõõtekolbi.

5.2. Uuritava lahuse ettevalmistamine

Lisada proovile (5.1.1, 5.1.2 või 5.1.3) umbes 75 ml ekstraheerimislahust (4.4), loksutada või raputada tugevalt umbes 15 minutit ja täita ekstraheerimislahusega (4.4). Eraldada sellest ekstraktist umbes 10 ml korgiga katseklaasi. Asetada katseklaas sügavkülmikusse (3.1) ja hoida seal umbes 30 minutit. Tsentrifuugida külma ekstrakti umbes 5 minutit kiirusel umbes 2000 pööret minutis ja dekanteerida viivitamatult. Lasta dekanteeritud lahusel jahtuda toatemperatuurini. Pipettida 100milliliitrisesse mõõtekolbi 5 ml dekanteeritud lahust ja täita kolb veega. Filtreerida alikvoot läbi mikro-membraanfiltri (3.3). Filtraat on HPLC määramiseks valmis.

5.3. Kalibreerimine

Pipettida 100milliliitrisesse mõõtekolbi 5 ml vanilliini standardlahust (4.5.2). Lisada 5 ml ekstraheerimislahust (4.4) ja täiendada kuni märgini veega. See lahus sisaldab 0,5 g/ml vanilliini.

5.4. Määramine kõrgsurvevedelikkromatograafia abil

Lasta kromatograafiaseadmel umbes 30 minutit stabiliseeruda. Süstida standardlahus (5.3). Korrata seda kuni kahe järjestikuse süstimise vaheline piigipindala või piigi kõrgus on väiksem kui 2 %. Kirjeldatud tingimustes on vanilliini peetumisaeg umbes 9 minutit. Analüüsida standardlahust (5.3) kaks korda, süstides 20 μl. Süstida 20 μl uuritavat lahust (5.2). Määrata saadud vanilliinipiigi pindala või kõrgus. Analüüsida standardlahust (5.3) uuesti pärast seda, kui uuritavat proovi (5.2) on süstitud 10 korda.

6. Tulemuste arvutamine

Arvutada kahekordse süstimise käigus iga uuritava proovi partii vanilliinipiikide keskmine piigipindala (või -kõrgus) (AC) (kokku neli pindala).

Arvutada kalibreerimistegur (R):

R = AC/CM

kus CM on vanilliini mass milligrammides (4.5.1).

Uuritava proovi vanilliinisisaldus (C, mg/kg) saadakse järgmise valemi abil:

AS × 20 × 0,96SM × R

kus

AS = uuritava proovi vanilliinipiigi piigipindala.

SM =

uuritava proovi mass grammides (5.1.1, 5.1.2 või 5.1.3).

Kui vanilliini määramiseks analüüsitakse rõõska koort, tuleb märgistusaine kontsentratsioon väljendada milligrammides piimarasva kilogrammi kohta. Selleks korrutatakse C teguriga 100/f, kus f on koore rasvasisaldus protsentides (m/m).

20 = tegur, millega võetakse arvesse standardproovi ja uuritava proovi lahjendamist.

0,96 = paranduskoefitsient uuritava proovi esimese lahjendamise rasvasisalduse jaoks.

Märkus:

Piigipindala asemel võib kasutada piigi kõrguseid (vt 8.3).

7. Meetodi täpsus

7.1. Korratavus (r)

Ühe sooritaja poolt samade seadmete ja katsematerjaliga läbiviidud kahe teineteisele vahetult järgneva analüüsi tulemused ei tohi erineda rohkem kui 16 mg/kg.

7.2. Reprodutseeritavus (R)

Kaks üksiktulemust, mis on saadud kahes eri laboratooriumis eri seadmetega, kuid sama katsematerjaliga, ei tohi erineda rohkem kui 27 mg/kg.

8. Lubatud hälbed

8.1. Selleks et kindlaks teha, kas märgistusaine on jaotunud ühtlaselt, tuleb märgistatud tootest võtta kolm proovi.

8.2. Vanilliinist või sünteetilisest vanilliinist saadud märgistusaine:

8.2.1. 4-hüdroksü-3-metoksübensaldehüüdi lisatakse 250 g kontsentreeritud või ja või tonni kohta. Kui märgistatakse koort, lisatakse seda 250 g piimarasva tonni kohta.

8.2.2. Tooteanalüüsi kolme proovi tulemuste abil kontrollitakse märgistusaine sisalduse määra ja ühtlust. Kõige väiksemat neist tulemustest võrreldakse järgmiste piirmääradega (võttes arvesse kriitilist diferentsi 95 %lise tõenäosuse juures (DCr95):

- 221,0 mg/kg (95 % lisatavast miinimummäärast),

- 159,0 mg/kg (70 % lisatavast miinimummäärast).

Arvestatakse märgistusaine kontsentratsiooni kõige väiksema tulemuse andnud proovis ja kasutatakse näitajate 221,0 mg ja 159,0 mg/kg vahelist interpoleerimist.

8.3. Vanillikupardest või nende täisekstraktidest saadud märgistusained:

8.3.1. 4-hüdroksü-3-metoksübensaldehüüdi lisatakse 100 g kontsentreeritud või ja või tonni kohta. Kui märgistatakse koort, lisatakse seda 100 g piimarasva tonni kohta.

8.3.2. Tooteanalüüsi kolme proovi tulemuste abil kontrollitakse märgistusaine sisalduse määra ja ühtlust. Kõige väiksemat neist tulemustest võrreldakse järgmiste piirmääradega (võttes arvesse kriitilist erinevust 95 %lise tõenäosuse juures (DCr95):

- 79,0 mg/kg (95 % lisatavast miinimummäärast),

- 54,0 mg/kg (70 % lisatavast miinimummäärast).

Arvestatakse märgistusaine kontsentratsiooni kõige väiksema tulemuse andnud proovis ja kasutatakse näitajate 79,0 mg ja 54,0 mg/kg vahelist interpoleerimist.

9. Märkused

9.1. Korratavus r on näitaja, millest allpool samal meetodil, sama katsematerjaliga, samadel tingimustel (samad seadmed, sama laboratoorium, sama aeg) läbi viidud kahe üksikkatse tulemuste absoluutne erinevus jääb teatava tõenäosuse piiresse; kui ei ole märgitud teisiti, on tõenäosus 95 %.

9.2. Reprodutseeritavus R on näitaja, millest allpool samal meetodil, sama katsematerjaliga, eri tingimustel (eri sooritaja, eri seadmed, ja/või eri aeg) läbi viidud kahe teineteisele vahetult järgneva üksikkatse tulemuste absoluutne erinevus jääb teatava tõenäosuse piiresse; kui ei ole märgitud teisiti, on tõenäosus 95 %.

9.3. Lisatud vanilliini tagasisaamine tasemel 250 mg/kg võiõli on vahemikus 97,0–103,8. Tuvastatud keskmine sisaldus oli 99,9 % ja selle standardhälve 2,7 %.

9.4. Standardlahus sisaldab 5 % ekstraheerimislahust, mis hüvitab uuritavas proovis sisalduva 5 % ekstraheerimislahustest tuleneva piigi laienemise. See võimaldab kvantitatiivset määramist piigi kõrguse põhjal.

9.5. Analüüs põhineb katkematul lineaarsel kalibreerimisjoonel.

Lineaarsust tuleks kontrollida standardlahuse asjakohaste lahjenduste abil esimesel analüüsimisel ja seejärel korrapäraste ajavahemike järel ning pärast HPLC seadmete muutmist või parandamist.

--------------------------------------------------

XIII LISA

(Artikkel 9)

BEETA-APO-8’-KAROTEENHAPPE ETÜÜLESTRI SPEKTROFOTOMEETRILINE MÄÄRAMINE VÕIS JA KONTSENTREERITUD VÕIS

1. Rakendatavus ja rakendusala

Käesolev meetod kirjeldab beeta-apo-8’-karoteenhappe etüülestri (apokaroteenestri) kvantitatiivse määramise protseduuri võis ja kontsentreeritud võis. Apokaroteenestriks peetakse kõiki neid aineid kokku, mis esinevad käesolevas meetodis kirjeldatud tingimuste kohaselt eraldatud proovide ekstraktis ja neelavad valgust 440 nm juures.

2. Põhimõte

Piimarasv lahustatakse petrooleetris ja lahuses mõõdetakse valguse neeldumine 440 nm juures. Apokaroteenestri sisaldus määratakse välise etaloni alusel.

3. Seadmed

3.1. Pipetid – gradueeritud, 0,25, 0,50, 0,75 ja 1,0 ml

3.2. Spektrofotomeeter – võimaldab töötada 440 (ja 447–449) nm juures; varustatud küvettidega, mille optilise tee pikkus on 1 cm

3.3. Mõõtekolvid, 20 ja 100 ml

3.4. Analüütilised kaalud täpsusega 0,1 mg.

4. Reaktiivid

Kõik reaktiivid peavad olema analüütiliselt puhtad.

4.1. Apokaroteenestri suspensioon (ligikaudu 20 %-line)

4.1.1. Suspensiooni kontsentratsioon määratakse järgmiselt:

Mõõtekolbi (100 ml) pannakse umbes 400 mg aine kaalutis, lahustatakse 20 ml kloroformiga (4.4) ja täiendatakse tsükloheksaaniga (4.5) mahumärgini. 5 ml saadud lahust lahjendatakse tsükloheksaaniga 100 milliliitrini (lahus A). 5 ml lahust A lahjendatakse tsükloheksaaniga 100 milliliitrini. Mõõdetakse neeldumine 447–449 nm juures (1 cm küvetid, võrdlusküvetis tsükloheksaan, mõõdetakse lainepikkusel, mille puhul neeldumine on suurim).

Apokaroteeni estri sisaldus

· 40000

A · 2550

A max = mõõtelahuse suurim neeldumine

A = proovi mass (grammides)

2550 = lahuse A (1 %, 1 cm) väärtus

Suspensiooni puhtuse määra tähistab edaspidi P (%).

Märkus:

Õhu, soojuse ja valguse käes on apokaroteenestri suspensioon ebastabiilne. Avamata originaalkonteineris (kui see on suletud lämmastiku atmosfääris) ja jahedas võib seda säilitada ligikaudu 12 kuud. Pärast avamist tuleb sisu lühikese aja jooksul ära tarvitada.

4.1.2. Apokaroteenestri standardlahus kontsentratsiooniga ligikaudu 0,2 mg/ml

Kaalutakse täpsusega 0,1 mg ligikaudu 0,100 g apokaroteenestri suspensiooni (4.1.1) (W grammi), lahustatakse see petrooleetris (4.2), kantakse kvantitatiivselt üle 100 ml mõõtkolbi ja täiendatakse petrooleetriga märgini.

Saadud lahuse ühes milliliitris on (W.P)/10 mg apokaroteenestrit.

Märkus:

Lahust tuleb säilitada jahedas ja pimedas; säilimisaeg 1 kuu.

4.2. Lakibensiin (keemisvahemik 40–60 °C)

4.3. Naatriumsulfaat, veevaba, teraline, enne kasutamist kuivatatud 102 °C juures kaks tundi

4.4. Kloroform

4.5. Tsükloheksaan

5. Analüüsi käik

5.1. Uuritava proovi ettevalmistamine

5.1.1. Kontsentreeritud või

Proov sulatatakse ahjus ligikaudu 45 °C juures.

5.1.2. Või

Proov sulatatakse ahjus ligikaudu 45 °C juures ja representatiivne osa sellest filtreeritakse 45 °C juures läbi filtri, mis sisaldab ligikaudu 10 g veevaba naatriumsulfaati (4.3); töökohta varjatakse tugeva päeva- ja tehisvalguse eest. Kogutakse sobiv kogus piimarasva.

5.2. Määramine

Kaalutakse (täpsusega 1 mg) ligikaudu 1 g kontsentreeritud võid (või (5.1.2) kohaselt eraldatud piimarasva) (mg). See kantakse petrooleetri (4.2) abil kvantitatiivselt üle 20 ml mõõtekolbi (V ml), täiendatakse märgini ja segatakse hoolikalt.

1 cm küvetti pannakse alikvoot ja mõõdetakse valguse neeldumine puhta petrooleetri suhtes 440 nm juures. Apokaroteenestri kontsentratsioon uuritavas lahuses (C/ml) leitakse kalibreerimisgraafiku abil.

5.3. Kalibreerimisgraafik

Viide 100 ml mõõtkolbi pipetitakse 0, 0,25, 0,5, 0,75 ja 1,0 ml apokaroteenestri standardlahust (4.1.2), täiendatakse petrooleetriga (4.2) märgini ja segatakse.

Saadud lahuste kontsentratsioonid on vahemikus 0–2 g/ml; need arvutatakse täpselt välja, lähtudes standardlahuse (4.1.2) kontsentratsioonist, (W.P)/10 mg/ml. Mõõdetakse valguse neeldumine nendes lahustes puhta petrooleetri (4.2) suhtes.

Koostatakse kalibreerimisgraafik, mille y-teljel on neeldumise ja x-teljel apokaroteenestri kontsentratsiooni väärtused.

6. Tulemuste arvutamine

6.1. Apokaroteenestri sisaldus (milligrammides ühe kilogrammi toote kohta) leitakse järgmiselt:

kontsentreeritud või puhul: (C.V)/M

või puhul: 0,82 (C.V)M

kus

C = kalibreerimisgraafiku (5.3) abil leitud apokaroteenestri sisaldus (g/ml),

V = uuritava lahuse (5.2) maht (ml)

M = uuritava proovi mass grammides (5.2)

0,82 = parandustegur, mis võtab arvesse piimarasva sisaldust võis.

7. Meetodi täpsus

7.1. Korratavus

7.1.1. Või analüüs

Ühe sooritaja poolt samade seadmete ja katsematerjaliga läbiviidud kahe teineteisele vahetult järgneva analüüsi tulemused ei tohi erineda rohkem kui 1,4 mg/kg.

7.1.2. Kontsentreeritud või analüüs

Ühe sooritaja poolt samade seadmete ja katsematerjaliga läbiviidud kahe teineteisele vahetult järgneva analüüsi tulemused ei tohi erineda rohkem kui 1,6 mg/kg.

7.2. Reprodutseeritavus

7.2.1. Või analüüs

Kaks üksiktulemust, mis on saadud kahes eri laboratooriumis eri seadmetega, kuid sama katsematerjaliga, ei tohi erineda rohkem kui 4,7 mg/kg.

7.2.2. Kontsentreeritud või analüüs

Kaks üksiktulemust, mis on saadud kahes eri laboratooriumis eri seadmetega, kuid sama katsematerjaliga, ei tohi erineda rohkem kui 5,3 mg/kg.

7.3. Täpsust iseloomustavate andmete päritolu

Täpsust iseoomustavad andmed on saadud katsetes, mis tehti 1995. aastal üheteistkümnes laboratooriumis kaheteistkümne märgistatud võiprooviga (kuus pimekatset) ja kaheteistkümne märgistatud kontsentreeritud või prooviga (kuus pimekatset).

8. Lubatud hälbed

8.1. Selleks et kindlaks teha, kas toode on korralikult märgistatud, tuleb märgistatud tootest võtta kolm proovi.

8.2. Või

8.2.1. Apokaroteenestri lisamise määr (arvestades taustneeldumist) on 22 mg/kg.

- 18,0 mg/kg (95 % lisatavast miinimummäärast),

- 13,0 mg/kg (70 % lisatavast miinimummäärast).

Arvestatakse märgistusaine kontsentratsiooni kõige väiksema tulemuse andnud proovis ja kasutatakse näitajate 18,0 mg ja 13,0 mg/kg vahelist interpoleerimist.

8.3. Kontsentreeritud või

8.3.1. Apokaroteenestri lisamise määr (arvestades taustneeldumist) on 24 mg/kg.

- 20,0 mg/kg (95 % lisatavast miinimummäärast),

- 14,0 mg/kg (70 % lisatavast miinimummäärast).

Arvestatakse märgistusaine kontsentratsiooni kõige väiksema tulemuse andnud proovis ja kasutatakse näitajate 20,0 mg ja 14,0 mg/kg vahelist interpoleerimist.

--------------------------------------------------

XIV LISA

(Artikkel 9)

SITOSTEROOLI VÕI STIGMASTEROOLI MÄÄRAMINE VÕIS VÕI KONTSENTREERITUD VÕIS KAPILLAARKOLONN-GAASIKROMATOGRAAFIA ABIL

1. RAKENDUSALA JA -ULATUS

Käesolev meetod kirjeldab võis ja kontsentreeritud võis sitosterooli või stigmasterooli kvantitatiivse määramise protseduuri. Sitosterooli sisalduse all mõeldakse -sitosterooli ja 22-dihüdro-sitosterooli sisalduse summat võis; muude sitosteroolide sisaldust peetakse tähtsusetuks.

2. PÕHIMÕTE

Või või kontsentreeritud või seebistatakse etanoolilahuses kaaliumhüdroksüüdiga ja mitteseebistuvad komponendid ekstraheeritakse dietüüleetriga.

Steroolid muundatakse trimetüülsilüüleetriteks ja neid analüüsitakse kapillaarkolonn-gaasikromatograafiliselt, kasutades sisestandardina betuliini.

3. SEADMED

3.1. Püstjahutiga varustatud lihvühendustega 150 ml seebistamiskolb.

3.2. 500 ml jaotuslehtrid.

3.3. 250 ml kolvid.

3.4. Rõhku võrdsustavad ligikaudu 250 ml lehtrid dietüüleetri jääkide kogumiseks.

3.5. 350 mm × 20 mm klaasfilterkorgiga klaaskolonn.

3.6. Veevann või isomantel.

3.7. 2 ml reaktsioonipudelid.

3.8. Gaasikromatograaf, mis võimaldab kasutada kapillaarkolonni ja on varustatud järgmistest seadistest koostatud jaotussüsteemiga:

3.8.1. termostateeritav kolonnikamber, mis hoiab nõutavat temperatuuri täpsusega ±1 °C;

3.8.2. reguleeritava temperatuuriga aurustamisseadis;

3.8.3. leekionisatsioonidetektor ja muundurvõimendi;

3.8.4. integraatormeerik, mida saab kasutada koos muundurvõimendiga (3.8.3).

3.9. Sulatatud ränidioksiidist kapillaarkolonn, mis on üleni kaetud BP1 või samaväärse materjali ühtlase 0,25 μm paksuse kihiga; kolonn peab võimaldama lahutada lanosterooli ja sitosterooli trimetüülsilüülderivaate, selleks sobib 12 m pikkune 0,2 mm sisediameetriga BP-1 kapillaar.

3.10. l l karastatud nõelaga gaasikromatograafias kasutatav mikrosüstal.

4. REAKTIIVID

Kõik reaktiivid peavad olema analüütiliselt puhtad. Kasutada tuleb destilleeritud või vähemalt samaväärse puhtusastmega vett.

4.1. Etanool, vähemalt 95 % puhtusastmega.

4.2. Kaaliumhüdroksiid, 60 % lahus: lahustada vees 600 g kaaliumhüdroksiidi (vähemalt 85 %list) ja täiendada veega ühe liitrini.

4.3. Betuliin, vähemalt 99 % puhtusastmega.

4.3.1. betuliini lahused dietüüleetris (4.4).

4.3.1.1. Sitosterooli määramisel peab betuliinilahuse kontsentratsioon olema 1,0 mg/ml.

4.3.1.2. Stigmasterooli määramisel peab betuliinilahuse kontsentratsioon olema 0,4 mg/ml.

4.4. Dietüüleeter, analüütiliselt puhas (ei sisalda peroksiidi ega peroksiidijääke).

4.5. Naatriumsulfaat, veevaba, teraline, enne kasutamist kuivatatud 102 °C juures kaks tundi.

4.6. Silüüliv reaktiiv, näiteks TRI-SIL (Pierce Chemical Co, Cat No 49001) või sellega samaväärne reaktiiv. (Hoiatus: TRI-SIL on tuleohtlik, mürgine, söövitav ja tõenäoliselt kantserogeen. Laboratooriumi personal peab tundma TRI-SILi ohutuse tingimusi ja võtma vajalikke meetmeid.)

4.7. Lanosterool.

4.8. Sitosterool, vähemalt 90 % puhtusastmega (P).

Märkus 1:

Kalibreerimiseks vajalike standardainete puhtuse määramisel kasutatakse normimismeetodit. Eeldatakse, et kromatogrammil ilmnevad kõik proovis olemasolevad steroolid, piikide kogupindala vastab 100 % steroolkomponentidele ja detektor reageerib igale steroolile ühtemoodi. Kontsentratsioonide määramisvahemikus tuleb kontrollida süsteemi lineaarsust.

4.8.1. Sitosterooli standardlahus: sitosterooli (4.8) lahus dietüüleetris (4.4) kontsentratsiooniga ligikaudu 0,5 mg/ml (W1) valmistatakse 0,001 mg/ml täpsusega.

4.9. Stigmasterool, vähemalt 90 % puhtusastmega (P).

4.9.1. Stigmasterooli standardlahus: stigmasterooli (4.9) lahus dietüüleetris (4.4) kontsentratsiooniga ligikaudu 0,2 mg/ml (W1) valmistatakse täpsusega 0,001 mg/ml.

4.10. Lahutusvõime testimise segu: valmistatakse lahus, mis sisaldab 0,05 mg/ml lanosterooli (4.7) ja 0,5 mg/ml sitosterooli (4.8) dietüüleetris (4.4).

5. MEETOD

5.1. Kromatograafiliste standardlahuste valmistamine. Uuritava sterooli standardlahusele lisatakse sisestandardi lahus (4.3.1) samal ajal, kui see lisatakse seebistatud proovile (vt 5.2.2).

5.1.1. Sitosterooli kromatograafiline standardlahus. Kummassegi reaktsioonipudelisse (3.7) kantakse 1 ml sitosterooli standardlahust (4.8.1) ja kõrvaldatakse sellest dietüüleeter lämmastikuvoolu abil. Lisatakse 1 ml sisestandardi lahust (4.3.1.1) ja kõrvaldatakse uuesti dietüüleeter lämmastikuvoolu abil.

5.1.2. Stigmasterooli kromatograafiline standardlahus. Kummassegi reaktsioonipudelisse (3.7) kantakse 1 ml stigmasterooli standardlahust (4.9.1) ja kõrvaldatakse sellest dietüüleeter lämmastikuvoolu abil. Lisatakse 1 ml sisestandardi lahust (4.3.1.2) ja kõrvaldatakse uuesti dietüüleeter lämmastikuvoolu abil.

5.2. Mitteseebistuvate komponentide ettevalmistamine.

5.2.1. Võiproov sulatatakse temperatuuril kuni 35 °C ja segatakse põhjalikult läbi.

150 ml kolbi (3.1) pannakse 1 mg täpsusega kaalutud ligikaudu 1 g või kaalutis (W2) või kontsentreeritud või kaalutis (W2). Lisatakse 50 ml etanooli (4.1) ja 10 ml kaaliumhüdroksiidi lahust (4.2). Kolb ühendatakse püstjahutiga ja soojendatakse 30 minutit 75 °C juures. Püstjahuti eemaldatakse ja kolb jahutatakse ligikaudu toatemperatuurini.

5.2.2. Kolbi lisatakse 1,0 ml standardlahust (4.3.1.1 või 4.3.1.2) vastavalt sellele, kas määratakse sitosterooli või stigmasterooli. Segatakse hoolikalt. Kolvi sisu kantakse kvantitatiivselt 500 ml jaotuslehtrisse (3.2), pestes kolbi kõigepealt 50 ml veega ja siis 250 ml dietüüleetriga (4.4). Jaotuslehtrit loksutatakse energiliselt kaks minutit ja lastakse faasidel eralduda. Seejärel lastakse alumine veekiht välja ja pestakse eetrikiht läbi, loksutades seda järjestikku nelja 100 ml vee alikvoodiga.

Märkus 2:

Selleks et vältida emulsiooni tekkimist, tuleb esimesel kahel korral veega pesta ettevaatlikult, pöörates jaotuslehtrit ümber sujuvalt 10 korda. Kolmandal pesemisel raputatakse jaotuslehtrit energiliselt 30 sekundit. Juhul kui tekib emulsioon, võib selle lõhkuda 5–10 ml etanooli lisamisega. Pärast etanooli lisamist tuleb kindlasti teha veel kaks energilist lisapesemist veega.

5.2.3. Selge seebivaba eeterkiht lastakse läbi 30 g veevaba naatriumsulfaadiga (4.5) täidetud klaaskolonni (3.5). Eeter kogutakse 250 ml kolbi (3.3). Lisatakse üks keemistsenter ja aurustatakse veevannil või isomantlil peaaegu kuivaks, kogudes lenduvad lahustijäägid.

Märkus 3:

Kui proovi ekstrakt aurustada liiga kõrgel temperatuuril täiesti kuivaks, võib esineda steroolide kadusid.

5.3. Trimetüülsilüüleetrite valmistamine

5.3.1. Kolbi jäänud eetrilahus kantakse 2 ml dietüüleetri abil kvantitatiivselt 2 ml reaktsioonipudelisse (3.7) ja kõrvaldatakse eeter lämmastikuvoolu abil. Kolbi pestakse veel kaks korda 2 ml dietüüleetri alikvoodiga, iga kord kogudes pesusolvendi reaktsioonipudelisse ja kõrvaldades eetri lämmastikuvooluga.

5.3.2. Proov silüülitakse 1 ml TRI-SILi (4.6) lisamise abil. Pudel suletakse ja lahustamiseks loksutatakse proovi energiliselt. Kui lahustumine ei ole täielik, soojendatakse seda temperatuurini 65–70 °C. Enne süstimist gaasikromatograafi lastakse seista vähemalt viis minutit. Standardid silüülitakse samuti nagu proovid. Lahutusvõime testimise segu (4.10) silüülitakse samuti nagu proovid.

Märkus 4:

Silüülimine peab toimuma veevabas keskkonnas. Betuliini ebatäieliku silüülimise tunnuseks on teise piigi ilmumine betuliini piigi ligidal.

Silüülimist segab etanooli olemasolu keskkonnas. See võib olla põhjustatud ebatäielikust pesemisest ekstraheerimisel. Sel juhul võib ekstraheerimisel kasutada veel lisaks viiendat pesemist, loksutades energiliselt 30 sekundit.

5.4. Gaasikromatograafiline analüüs

5.4.1. Töötingimuste valik

Gaasikromatograaf seatakse töökorda tootja juhendite kohaselt.

Töö põhitingimused on järgmised:

- kolonni temperatuur: 265 °C

- injektori temperatuur: 265 °C

- detektori temperatuur: 300 °C

- kandegaasi voolu kiirus: 0,6 ml/min

- vesiniku rõhk: 84 kPa

- õhusurve: 155 kPa

- proovi jaotussuhe: 10 : 1 – 50 : 1; jaotussuhe optimeeritakse tootja juhendite kohaselt ja seejärel kontrollitakse kontsentratsioonide määramisvahemikus detektori näitude lineaarsust.

Märkus 5:

On eriti oluline korrapäraselt puhastada aurustamiskambrit.

- süstitava aine kogus: 1 μl TMSE lahust.

Enne analüüside alustamist lastakse süsteemil tasakaalustuda, kuni saavutatakse rahuldavad püsivad näidud.

Olenevalt kolonni ja gaasikromatograafi karakteristikutest võib neid tingimusi muuta, nii et kromatogrammid vastaksid järgmistele nõuetele:

- sitosterooli piik peab olema küllaldaselt eraldunud lanosterooli piigist. Joonisel 1 on esitatud näidiskromatogramm, mille peab andma silüülitud lahutusvõime testimise segu (4.10) analüüs;

- steroolide suhtelised peetumisajad peavad olema järgmised:

kolesterool: 1,0

stigmasterool: 1,3

sitosterool: 1,5

betuliin: 2,5

- betuliini peetumisaeg peaks olema ligikaudu 24 minutit.

5.4.2. Analüüsi käik

Süstitakse 1 l stigmasterooli või sitosterooli silüülitud standardlahust ja reguleeritakse välja integraatori kalibreerimisparameetrid.

Süstitakse veel kord 1 l silüülitud standardlahust, et määrata peetumisajad betuliini suhtes.

Süstitakse 1 l silüülitud proovi lahust ja mõõdetakse piikide pindalad. Iga kromatograafilise analüüsi eel ja järel tuleb süstida standardid.

Tavaliselt tehakse kahe standardisüsti vahel kuus proovi süsti.

Märkus 6:

Stigmasterooli piigi integreerimisel tuleb arvesse võtta joonisel 2b punktidega 1, 2 ja 3 piiritletud pindasid.

Kui hinnatakse kogu sitosterooli sisaldust, tuleb sitosterooli piigi integreerimisel arvesse võtta ka 22-dihüdro-beeta-sitosterooli (stigmastanooli) piiki, mis elueerub vahetult pärast sitosterooli (vt joonist 3b).

6. TULEMUSTE ARVUTAMINE

6.1. Määratakse kummaski enne ja pärast proove süstitud standardis sisalduva sterooli piigi ja betuliini piigi pindala ning arvutatakse R1:

standardis sisalduva sterooli piigi keskmine pindalastandardis sisalduva betuliini piigi keskmine pindala

Määratakse proovis sisalduva sterooli (stigmasterooli ja sitosterooli) piigi ja betuliini piigi pindala ning arvutatakse R2:

proovis sisalduva sterooli piigi pindalaproovis sisalduva betuliini piigi pindala

W1 = sterooli sisaldus milligrammides 1 milliliitris standardlahuses (4.8.1 või 4.9.1)

W2 = proovi mass grammides (5.2.1)

P = standardsterooli puhtus (4.8 või 4.9)

Proovi steroolisisaldus

× P × 10

7. MEETODI TÄPSUS

7.1. Või

7.1.1. Korratavus

7.1.1.1. Stigmasterool

Ühe sooritaja poolt samade seadmete ja katsematerjaliga läbiviidud kahe teineteisele vahetult järgneva analüüsi tulemused ei tohi erineda rohkem kui 19,3 mg/kg.

7.1.1.2. Sitosterool

Ühe sooritaja poolt samade seadmete ja katsematerjaliga läbiviidud kahe teineteisele vahetult järgneva analüüsi tulemused ei tohi erineda rohkem kui 23,0 mg/kg.

7.1.2. Reprodutseeritavus

7.1.2.1. Stigmasterool

Kaks üksiktulemust, mis on saadud kahes eri laboratooriumis eri seadmetega, kuid sama katsematerjaliga, ei tohi erineda rohkem kui 31,9 mg/kg.

7.1.2.2. Sitosterool

Kaks üksiktulemust, mis on saadud kahes eri laboratooriumis eri seadmetega, kuid sama katsematerjaliga, ei tohi määramise keskmisest erineda rohkem kui 8,7 %.

7.1.3. Täpsustiseloomustavate andmete päritolu

Täpsust iseloomustavad andmed on saadud katsetes, mis tehti 1992. aastal kaheksas laboratooriumis kuue stigmasterooli prooviga (kolm pimekatset) ja kuue sitosterooli prooviga (kolm pimekatset).

7.2. Kontsentreeritud või

7.2.1. Korratavus

7.2.1.1. Stigmasterool

Ühe sooritaja poolt samade seadmete ja katsematerjaliga läbiviidud kahe teineteisele vahetult järgneva analüüsi tulemused ei tohi erineda rohkem kui 10,2 mg/kg.

7.2.1.2. Sitosterool

Ühe sooritaja poolt samade seadmete ja katsematerjaliga läbiviidud kahe teineteisele vahetult järgneva analüüsi tulemuste erinevus ei tohi olla suurem kui 3,6 % keskmisest tulemusest.

7.2.2. Reprodutseeritavus

7.2.2.1. Stigmasterool

Kaks üksiktulemust, mis on saadud kahes eri laboratooriumis eri seadmetega, kuid sama katsematerjaliga, ei tohi erineda rohkem kui 25,3 mg/kg.

7.2.2.2. Sitosterool

Kaks üksiktulemust, mis on saadud kahes eri laboratooriumis eri seadmetega, kuid sama katsematerjaliga, ei tohi määramiste keskmisest erineda rohkem kui kui 8,9 %.

7.2.3. Täpsust iseloomustavate andmete päritolu

Täpsust iseloomustavad andmed on saadud katsetes, mis tehti 1991. aastal üheksas laboratooriumis kuue stigmasterooli prooviga (kolm pimekatset) ja kuue sitosterooli prooviga (kolm pimekatset).

8. LUBATUD HÄLBED

8.1. Selleks et kindlaks teha, kas märgistusaine on jaotunud ühtlaselt, tuleb märgistatud tootest võtta kolm proovi.

8.2. Või

8.2.1. Stigmasterool

8.2.1.1. Stigmasterooli lisamise määr on 150 grammi vähemalt 95 % puhtusastmega stigmasterooli ühe tonni või kohta (142,5 mg/kg) või 170 grammi vähemalt 85 % puhtusastmega stigmasterooli ühe tonni või kohta (144,5 mg/kg).

8.2.1.2. Tooteanalüüsi kolme proovi tulemuste abil kontrollitakse märgistusaine sisalduse määra ja ühtlust. Kõige väiksemat neist tulemustest võrreldakse järgmiste piirmääradega (võttes arvesse kriitilist diferentsi 95 %lise tõenäosuse juures (DCr95)):

- 116,0 mg/kg (95 % lisatavast miinimummäärast 95 % puhtusastmega stigmasterooli puhul),

- 118,0 mg/kg (95 % lisatavast miinimummäärast 85 % puhtusastmega stigmasterooli puhul),

- 81,0 mg/kg (70 % lisatavast miinimummäärast 95 % puhtusastmega stigmasterooli puhul),

- 82,0 mg/kg (70 % lisatavast miinimummäärast 85 % puhtusastmega stigmasterooli puhul).

Arvestatakse märgistusaine kontsentratsiooni proovis, mis andis kõige väiksema tulemuse, ning kasutatakse näitajate 116,0 mg/kg ja 81,0 mg/kg või 118,0 mg/kg ja 82,0 mg/kg vahelist interpoleerimist.

8.2.2. Sitosterool

8.2.2.1. Sitosterooli lisamise määr on 600 grammi vähemalt 90 % puhtusastmega sitosterooli ühe tonni või kohta (540 mg/kg).

8.2.2.2. Tooteanalüüsi kolme proovi tulemuste abil kontrollitakse märgistusaine sisalduse määra ja ühtlust. Kõige väiksemat neist tulemustest võrreldakse järgmiste piirmääradega (võttes arvesse kriitilist diferentsi 95 %lise tõenäosuse juures (DCr95)):

- 486,0 mg/kg (95 % lisatavast miinimummäärast 90 % puhtusastmega sitosterooli puhul),

- 358,0 mg/kg (70 % lisatavast miinimummäärast 90 % puhtusastmega sitosterooli puhul).

Arvestatakse märgistusaine kontsentratsiooni kõige väiksema tulemuse andnud proovis ja kasutatakse näitajate 486,0 mg/kg ja 358,0 mg/kg vahelist interpoleerimist.

8.3. Kontsentreeritud või

8.3.1. Stigmasterool

8.3.1.1. Stigmasterooli lisamise määr on 150 grammi vähemalt 95 % puhtusastmega stigmasterooli ühe tonni kontsentreeritud või kohta (142,5 mg/kg); või 170 grammi vähemalt 85 % puhtusastmega stigmasterooli ühe tonni kontsentreeritud või kohta (144,5 mg/kg).

8.3.1.2. Tooteanalüüsi kolme proovi tulemuste abil kontrollitakse märgistusaine sisalduse määra ja ühtlust. Kõige väiksemat neist tulemustest võrreldakse järgmiste piirmääradega (võttes arvesse kriitilist diferentsi 95 % tõenäosuse juures (DCr95)):

- 120,0 mg/kg (95 % lisatavast miinimummäärast 95 % puhtusastmega stigmasterooli puhul),

- 122,0 mg/kg (95 % lisatavast miinimummäärast 85 % puhtusastmega stigmasterooli puhul),

- 84,0 mg/kg (70 % lisatavast miinimummäärast 95 % puhtusastmega stigmasterooli puhul),

- 86,0 mg/kg (70 % lisatavast miinimummäärast 85 % puhtusastmega stigmasterooli puhul).

Arvestatakse märgistusaine kontsentratsiooni proovis, mis andis kõige väiksema tulemuse, ning kasutatakse näitajate 120,0 mg/kg ja 84,0 mg/kg või 122,0 mg/kg ja 86,0 mg/kg vahelist interpoleerimist.

8.3.2 Sitosterool

8.3.2.1. Sitosterooli lisamise määr on 600 grammi vähemalt 90 % puhtusastmega sitosterooli ühe tonni kontsentreeritud või kohta (540 mg/kg).

8.3.2.2. Tooteanalüüsi kolme proovi tulemuste abil kontrollitakse märgistusaine sisalduse määra ja ühtlust. Kõige väiksemat neist tulemustest võrreldakse järgmiste piirmääradega (võttes arvesse kriitilist diferentsi 95 % tõenäosuse juures (DCr95)):

- 486,0 mg/kg (95 % lisatavast miinimummäärast 90 % puhtusastmega sitosterooli puhul),

- 358,0 mg/kg (70 % lisatavast miinimummäärast 90 % puhtusastmega sitosterooli puhul).

Arvestatakse märgistusaine kontsentratsiooni kõige väiksema tulemuse andnud proovis ja kasutatakse näitajate 486,0 mg/kg ja 358,0 mg/kg vahelist interpoleerimist.

+++++ TIFF +++++

--------------------------------------------------

XV LISA

(Artikkel 10)

STANDARDMEETOD LEHMAPIIMA JA LEHMAPIIMA KASEIINI MÄÄRAMISEKS JUUSTUS, MIS ON VALMISTATUD LAMBA-, KITSE- VÕI PÜHVLIPIIMAST VÕI LAMBA-, KITSE- JA PÜHVLIPIIMA SEGUST

1. Reguleerimismisala

Lehmapiima ja lehmapiima kaseiini määramine lamba-, kitse- või pühvlipiimast või lamba-, kitse- ja pühvlipiima segust valmistatud juustus -kaseiinide isoelektrilise fookustamise abil pärast lüüsimist plasmiiniga.

2. Kohaldamisala

Käesolev meetod sobib töötlemata ja kuumtöödeldud lehmapiima ning lehmapiima kaseiini avastamiseks laagerdumata ja laagerdunud juustus, mis on valmistatud lamba-, kitse- või pühvlipiimast või lamba-, kitse- ja pühvlipiima segust. See meetod ei sobi võltsimise avastamiseks, kui piima või juustu on võltsitud lehmapiimast eraldatud kuumtöödeldud vadakuvalgu kontsentraadiga.

3. Meetodi põhimõte

3.1. Kaseiinide eraldamine juustust ja etalonist

3.2. Eraldatud kaseiinide lahustamine ja lõhustamine plasmiiniga (EC.3.4.21.7)

3.3. Plasmiiniga töödeldud kaseiinide isoelektriline fookustamine uurea juuresolekul ja valkude värvimine

3.4. Värviga töödeldud 3- ja 2-kaseiini mustrite (tõend lehmapiima olemasolust) võrdlemine mustritega, mis on saadud katsetes 0 ja 1 % lehmapiimalõssi sisaldavate etalonidega samas geelis.

4. Reaktiivid

Kui ei ole märgitud teisiti, tuleb kasutada analüütiliselt puhtaid kemikaale. Vesi peab olema kahekordselt destilleeritud või samaväärse puhtusastmega.

Märkus:

Edaspidi esitatud üksikasjad on rakendatavad nendes laboratooriumides, kus kasutatakse uureat sisaldavaid polüakrüülamiidgeele mõõtmetega 265 × 125 × 0,25 mm. Kui kasutatakse teistsuguste mõõtmetega või muud tüüpi geele, tuleb lahutamistingimusi sellele vastavalt kohandada.

Isoelektriline fookustamine

4.1. Reaktiivid uureat sisaldavate polüakrüülamiidgeelide valmistamiseks

4.1.1. Geeli põhilahus

Lahustada vees:

4,85 g akrüülamiidi,

0,15 g N,N’-metüleenbisakrüülamiidi (BIS)

48,05 g uureat

15,00 g 87massiprotsendilist glütserooli

ja täiendada maht 100 milliliitrini. Säilitada külmikus tumedas klaaspudelis.

Märkus:

Neurotoksilise akrüülamiidi määratletud kaalutiste asemel on parem kasutada müügil olevat akrüülamiidi ja BISi eelvalmistatud lahust. Kui eelvalmistatud lahus sisaldab 30 (massi/mahu)protsenti akrüülamiidi ja 0,8 (massi/mahu)protsenti BISi, tuleb eespool märgitud segu valmistamiseks võtta määratletud kaalutiste asemel 16,2 ml eelvalmistatud lahust. põhilahuse säilimisaeg on 10 päeva; kui põhilahuse juhtivus on suurem kui 5 μS, tuleb see deioniseerida, segades seda 2 g ioonvahetajaga Amberlite MB-3 kolmekümne minuti jooksul ja filtreerides seejärel läbi 0,45 μm membraani.

4.1.2. Geeli lahus

Segada geeli põhilahus (4.1.1) lisandite ja amfolüütidega:

9,0 ml põhilahust

24 mg -alaniini

500 l amfolüüti, pH 3,5–9,5 [1]

250 l amfolüüti, pH 5–7 [2]

250 l amfolüüti, pH 6–8 [3]

Segada geeli lahus ning degaseerida ultrahelivannis või vaakumis kahe kuni kolme minuti jooksul.

Märkus:

Geeli lahus valmistatakse vahetult enne selle valamist kattekilele (vt 6.2).

4.1.3. Katalüsaatori lahused

4.1.3.1. N,N,N’,N’-tetrametüületüleendiamiin (TEMED)

4.1.3.2. 40-(massi/mahu)protsendiline ammooniumpersulfaadi lahus (PER):

Lahustada 800 mg PERi vees ja täiendada maht 2 milliliitrini.

Märkus:

Alati tuleb kasutada värskelt valmistatud PERi lahust.

4.2. Kontaktvedelik

Petrool või vedel parafiin

4.3. Anoodlahus

Lahustada 5,77 g 85massiprotsendilist fosforhapet vees ja täiendada maht 100 milliliitrini.

4.4. Katoodlahus

Lahustada 2,00 g naatriumhüdroksiidi vees ja täiendada maht veega 100 milliliitrini.

Proovi ettevalmistamine

4.5. Reaktiivid valgu eraldamiseks

4.5.1. Lahjendatud äädikhape (täiendada 25,0 ml jää-äädikhappe maht veega 100 milliliitrini)

4.5.2. Diklorometaan

4.5.3. Atsetoon

4.6. Valgu solventpuhver

Lahustada vees:

5,75 g 87massiprotsendilist glütserooli,

24,03 g uureat,

250 mg ditiotreitoolija täiendada maht 50 milliliitrini.

Märkus:

Säilitada külmikus; säilimisaeg üks nädal.

4.7. Reaktiivid kaseiinide lõhustamiseks plasmiiniga

4.7.1. Ammooniumkarbonaatpuhver

Tiitrida ammooniumvesinikkarbonaadi lahus (kontsentratsioon 0,2 mol/l ehk 1,58 g/100 ml H2O, sisaldab 0,05 mol/l ehk 1,46 g/100 ml etüleendiamiintetraatsetaati (EDTAd)) ammooniumkarbonaadi lahusega (kontsentratsioon 0,2 mol/l ehk 1,92 g/100 ml H2O, sisaldab 0,05 mol/l EDTAd) kuni pH-ni 8.

4.7.2. Veise plasmiin (EC. 3.4.21.7) aktiivsusega vähemalt 5 U/ml

4.7.3. ε-aminokaproonhappe lahus ensüümi inhibeerimiseks

Lahustada 2,624 g ε-aminokaproonhapet (6-amino-n-heksaanhapet) 100 milliliitris 40mahuprotsendilises etanoolis.

4.8. Standardid

4.8.1. Laabiga kalgendatud lamba- ja kitsepiimalõssist saadud sertifitseeritud etalonsegusid (tugietalone), mis sisaldavad 0 % ja 1 % lehmapiima, on võimalik hankida Komisjoni Etalonainete ja Mõõtmiste Instituudist, B-2440 Geel, Belgia.

4.8.2. 0 % ja 1 % lehmapiima sisaldavate laboratoorsete vaheetalonide valmistamine laabiga kalgendatud pühvlipiimalõssist.

Lõssi saamiseks tsentrifuugitakse kas pühvli või veise toorpiimapartii proovi 37 °C ja 2500 g juures 20 minutit. Pärast tsentrifuugitopsi ja selle sisu kiiret jahutamist temperatuurini 6–8 °C kõrvaldatakse ülemine rasvakiht täielikult. 1 %-lise etalonsegu valmistamiseks pannakse 1 l keeduklaasi 495 ml pühvlipiimalõssi, lisatakse 5,00 ml lehmapiimalõssi ja reguleeritakse 10-(massi/mahu)protsendilise piimhappe lisamise abil pH-le 6,4. Temperatuur reguleeritakse väärtusele 35 °C, lisatakse 100 l vasika laapi (aktiivsus 1 : 10000, ligikaudu 3000 U/ml), segatakse üks minut ja jäetakse keeduklaas alumiiniumfooliumiga kaetuna 35 °C juures üheks tunniks seisma, et lõss kalgenduks. Kui kalgend on moodustunud, külmkuivatatakse kogu kalgendunud mass, seda eelnevalt homogeenimata ja vadakut eraldamata. Külmkuivatatud mass jahvatatakse peeneks ühtlaseks pulbriks. 0 %line etalon valmistatakse sama protseduuri abil puhtast pühvlipiimalõssist. Etalone tuleb säilitada –20 °C juures.

Märkus:

Enne etalonide valmistamist on soovitatav pühvlipiimalõssi puhtust kontrollida plasmiiniga töödeldud kaseiinide isoelektrilise fookustamise abil.

Reaktiivid valkude värvimiseks

4.9. Kinnisti

Lahustada 150 g trikloroäädikhapet vees ja täiendada maht 1000 milliliitrini.

4.10. Värvi väljapesemise lahus

Täiendada 500 ml metanooli ja 200 ml jää-äädikhappe segu maht destilleeritud veega 2000 milliliitrini.

Märkus:

Iga päev tuleb valmistada värske värvi väljapesemise lahus. Seda saab valmistada, segades 50mahuprotsendilise metanooli ja 20mahuprotsendilise jää-äädikhappe põhilahuseid võrdsetes mahtudes.

4.11. Värvilahused

4.11.1. Värvi põhilahus 1

Lahustada magnetsegaja abil 3,0 g Coomassie-briljantsinist G-250 (C.I. 42655) 1000 ml 90mahuprotsendilises metanoolis umbes 45 minuti jooksul ja filtreerida läbi kahe keskmise kiirusega toimiva kurdfiltri.

4.11.2. Värvi põhilahus 2

Lahustada 5,0 g vasksulfaatpentahüdraati 1000 ml 20mahuprotsendilises äädikhappes.

4.11.3. Värvimislahus (kasutusvalmis)

Segada kokku 125 ml kumbagi värvi põhilahust (4.11.1 ja 4.11.2) vahetult enne värvimist.

Märkus:

Värvimislahus tuleb valmistada kasutamise päeval.

5. Vahendid

5.1. Klaasplaadid (265 × 125 × 4 mm); kummirull (laius 15 cm); nivelleerimislaud

5.2. Geeli kandekile (265 × 125 mm)

5.3. Kattekile (280 × 125 mm), mille kummassegi pikemasse serva kinnitatakse 280 × 6 × 0,25 mm kleepriba (vt joonis 1)

5.4. Elektrofookustamiskamber jahutusplaadiga (nt 265 × 125 mm) ja sobiva pingeallikaga (= 2,5 kV) või automaatne elektroforeesiseade

5.5. Tsirkulatsioonkrüostaat, mis võimaldab hoida temperatuuri 12 ± 0,5 °C.

5.6. Tsentrifuug, mis võimaldab töötada 3000 g juures

5.7. Elektroodribad (≥ 265 mm pikkused).

5.8. Plastikust pudelid anood- ja katoodlahustele.

5.9. Proovi aplikaatorid (10 × 5 mm, viskoosist või valkusid väheadsorbeerivast filterpaberist)

5.10. Roostevabast terasest käärid, skalpellid, pintsetid

5.11. Roostevabast terasest või klaasist anumad värvimiseks ja värvi väljapesemiseks (nt 280 × 150 mm küvetid)

5.12. Reguleeritav varrashomogenaator (varda diameeter 10 mm, 8000–20000 pööret minutis)

5.13. Magnetsegur

5.14. Ultrahelivann.

5.15. Kilekeevitusaparaat

5.16. 25 l mikropipetid

5.17. Vaakumtsentrifuug või külmkuivati

5.18. Termostateeritav vesivann, reguleeritav temperatuuridele 35 ja 40 ± 1 °C, loksutajaga

5.19. Densitomeeter, mis võimaldab töötada lainepikkusel λ = 634 nm

6. Analüüsi käik

6.1. Proovi ettevalmistamine

6.1.1. Kaseiinide eraldamine

100 ml tsentrifuugitopsi pannakse juustu või etaloni kaalutis, mis on ekvivalentne 5 g kuivmassiga, lisatakse 60 ml destilleeritud vett ja homogeenitakse varrashomogenaatori abil (8000–10000 pööret minutis). pH reguleeritakse lahjendatud äädikhappega (4.5.1) väärtusele 4,6 ja tsentrifuugitakse (5 minutit, 3000 g). Rasv ja vadak dekanteeritakse, jääk suspendeeritakse 40 ml destilleeritud vees, reguleeritakse lahjendatud äädikhappega (4.5.1) pH-le 4,5 ja homogeenitakse (20000 pööret minutis); lisatakse 20 ml diklorometaani (4.5.2), homogeenitakse veel kord ja tsentrifuugitakse (5 minutit, 3000 g). Kaseiinikiht, mis jääb vee- ja orgaanilise faasi vahele (vt joonis 2), eraldatakse spaatliga ning mõlemad faasid kõrvaldatakse dekanteerimise abil. Kaseiin homogeenitakse uuesti 40 ml destilleeritud vees (vt eespool) ja 20 ml diklorometaanis (4.5.2) ning tsentrifuugitakse. Seda protseduuri korratakse seni (kaks või kolm korda), kuni mõlemad ekstraheerimisfaasid jäävad värvusetuks. Valgujääk homogeenitakse 50 ml atsetoonis (4.53) ja filtreeritakse läbi keskmise kiirusega toimiva kurdpaberfiltri. Filtrile kogutud jääki pestakse kahe eraldi 25 ml atsetooniportsjoniga, kuivatatakse õhu käes või lämmastikuvoolus ja hõõrutakse uhmris peeneks.

Märkus:

Kuivi kaseiinipreparaate tuleb säilitada –20 °C juures.

6.1.2. β-kaseiinide lõhustamine plasmiini abil γ-kaseiinide intensiivistamiseks

25 mg kaseiinipreparaati (6.1.1) hajutatakse 0,5 ml ammooniumkarbonaatpuhvris (4.7.1) ja homogeenitakse 20 minutit näiteks ultraheliga töötlemise abil. Soojendatakse temperatuurini 40 °C, lisatakse 10 l plasmiini (4.7.2), segatakse ja inkubeeritakse 40 °C juures ühe tunni jooksul pidevalt loksutades. Ensüümi inhibeerimiseks lisatakse 20 μl ε-aminokaproonhappe lahust (4.7.3), seejarel lisatakse 200 mg tahket uureat ja 2 mg ditiotreitooli.

Märkus:

Selleks et fookustatud kaseiiniribad tuleksid sümmeetrilisemad, on soovitatav pärast ε-aminokaproonhappe lisamist lahus külmkuivatada ja kuivjääk lahustada 0,5 ml valgu solventpuhvris (4.6).

6.2. Uureat sisaldavate polüakrüülamiidgeelide valmistamine

Geeli kandekilet (5.2) niisutatakse mõne tilga veega ja rullitakse see klaasplaadile (5.1), kõrvaldades eralduva vee pabersalvrätiku või lapiga. Kleepribadega (0,25 mm) kattekile (5.3) rullitakse teisele klaasplaadile samal viisil ja plaat asetatakse nivelleerimislauale horisontaalasendisse.

Ettevalmistatud deaereeritud geelilahusele (4.1.2) lisatakse 10 l TEMEDit (4.1.3.1), segatakse, lisatakse 10 l PERi lahust (4.1.3.2), segatakse hoolikalt ja valatakse kohe kattekile keskele ühtlaselt laiali. Geeli kandeplaadi üks serv asetatakse, kilepind allpool, kattekilega plaadile ja kandeplaat lastakse aeglaselt alla, nii et kahe kile vahel moodustub ühtlane mullideta geeli kelme (joonis 3). Õhukese spaatli abil lastakse geeli kandeplaat ettevaatlikult lõpuni alla ja asetatakse selle peale raskuseks veel kolm klaasplaati. Umbes 60 minuti pärast, kui polümerisatsioon on lõppenud, eemaldatakse kergelt klaasplaate koputades kandekilele polümeriseerunud geel koos kattekilega. Kandekile väline pind puhastatakse hoolikalt geelijääkidest ja uureast. Kande- ja kattekile vahel olev geel keevitatakse kilerulli ja säilitatakse külmikus (säilimisaeg 6 nädalat).

Märkus:

Kleepribadega kattekilet võib kasutada korduvalt. Kui proove on vähe või kasutatakse automaatset elektroforeesiseadet, võib polüakrüülamiidgeeli lõigata väiksemateks tükkideks (kaks geeli, 4,5 × 5 cm).

6.3. Isoelektriline fookustamine

Jahutustermostaat reguleeritakse temperatuurile 12 °C. Geeli kandekile väline pind puhastatakse petrooliga, lastakse jahutusbloki keskele mõned tilgad petrooli (4.2) ja rullitakse geel selle peal lahti nii, et kandekile jääks allapoole ega tekiks mulle. Pühitakse ära liigne petrool ja kõrvaldatakse kattekile. Elektroodribad niisutatakse elektroodlahustega (4.3, 4.4), lõigatakse geeliga ühepikkuseks ja asetatakse kohale (elektroodide vahemaa 9,5 cm).

Isoelektrilise fookustamise tingimused:

6.3.1. Geeli mõõtmed 265 × 125 × 0,25 mm

Märkus:

Kui geeli paksust või laiust on muudetud, reguleeritakse voolutugevust ja võimsust sellele vastavalt (nt 265 × 125 × 0,5 mm geeli puhul tuleb voolutugevust ja võimsust kahekordistada).

6.3.2. Automaatse elektroforeesiseadme pingeprogrammi näide (kaks 5,0 × 4,5 cm geeli; elektroodid on geelile asetatud vahetult, ilma elektroodribadeta):

1. Eelfookustamine | 1000 V | 15 mA | 3,5 W | 8 °C | 85 Vh |

2. Proovi fookustamine | 250 V | 15 mA | 2,5 W | 8 °C | 30 Vh |

3. Fookustamine | 1200 V | 5 mA | 3,5 W | 8 °C | 80 Vh |

4. Fookustamine | 1500 V | 6 mA | 7,0 W | 8 °C | 570 Vh |

Proovi aplikaator asetatakse kohale 2. etapil 0ndal volttunnil.

Proovi aplikaator eemaldatakse 2. etapil, kui protsess on kestnud 30 volttundi.

6.4. Valkude värvimine

6.4.1. Valkude kinnistamine

Pärast pinge väljalülitamist eemaldatakse viivitamatult elektroodribad ja geel asetatakse kohe värvimise/pesemise küvetti, millesse on valatud 200 ml kinnistit (4.9). Geeli hoitakse kinnistis 15 minutit, loksutades pidevalt.

6.4.2. Geeli pesemine ja värvimine

Kogu kinnisti nõrutatakse välja ja geeli pestakse kaks korda 100 ml värvi väljapesemise lahusega (4.10), iga kord 30 sekundit. Värvi väljapesemise lahus valatakse ära ja asendatakse 250 ml värvimislahusega (4.11.3). Geelil lastakse värvuda 45 minutit, lahust ettevaatlikult loksutades.

6.4.3. Värvi väljapesemine geelist

Värvimislahus valatakse välja, geeli pestakse kaks korda 100 ml värvi väljapesemise lahusega (4.10), seejärel loksutatakse 200 ml värvi väljapesemise lahusega 15 minutit. Värvi väljapesemisetappi korratakse vähemalt 2–3 korda, kuni saadakse selge värvitu foon. Seejärel loputatakse geeli destilleeritud vees (2 × 2 minutit) ja lastakse sellel õhu käes kuivada (2–3 tundi) või kuivatatakse fööniga (10–15 minutit).

Märkus 1:

Kinnistada, pesta, värvida ja värvi välja pesta tuleb 20 °C juures; mitte kasutada kõrgemat temperatuuri.

Märkus 2:

Juhul kui eelistatakse värvimist tundlikuma hõbedaga (nt Silver Staining Kit, Protein, Pharmacia Biotech, Code N0 17-1150-01), tuleb plasmiiniga töödeldud kaseiiniproove lahjendada kuni kontsentratsioonini 5 mg/ml.

7. Tulemuste hindamine

Hindamiseks võrreldakse uuritava proovi valgumustrit etalonide mustritega samal geelil. Lehmapiima olemasolu juustus, mis on valmistatud lamba-, kitse- või pühvlipiimast või lamba-, kitse- ja pühvlipiima segust, tehakse kindlaks γ2- ja γ3-kaseiini järgi, mille isoelektrilised punktid on pH 6,5 ja pH 7,5 vahel (joonised 4a, 4b ja 5). Avastamiskünnis on madalam kui 0,5 %.

7.1. Visuaalne hindamine

Lehmapiima koguse visuaalseks hindamiseks on soovitav reguleerida proovide ja etalonide kontsentratsioonid selliseks, et lamba, kitse ja/või pühvli γ2- ja γ3-kaseiini mustrijoonte intensiivsus oleks ühesugune (vt γ2 E,G,B ja γ3 E,G,B joonistel 4a, 4b ja 5). Sellisel juhtumil saab uuritava proovi lehmapiima sisaldust (mis võib olla suurem või väiksem kui 1 % või võrdne 1 %ga) hinnata otse, võrreldes lehma γ2 ja γ3-kaseiini mustrijoonte intensiivsusi (joonised 4a, 4b ja 5, ribad γ3 C ja γ2 C) 0 %lise ja 1 %lise tugietaloni (lammas, kits) või laboratoorse vaheetaloni (pühvel) vastavate intensiivsustega.

7.2. Densitomeetriline hindamine

Kui see on võimalik, tuleb densitomeetriliselt (5.19) määrata lehma γ2- ja γ3-kaseiinile vastavate piikide pindalade suhted lamba, kitse ja pühvli γ2- ja γ3-kaseiinile vastavate piikide pindaladesse (joonis 5). Neid suhteid võrreldakse γ2- ja γ3-kaseiinile vastavate piikide pindalade suhetega samal geelil analüüsitud 1 %lise tugietaloni (lammas, kits) või laboratoorse vaheetaloni (pühvel) puhul.

Märkus:

Meetodi kasutamine on rahuldav, kui 1 %lise etaloni puhul saadakse nii lehma γ2 kui ka γ3-kaseiini olemasolu kohta selge kinnitus, kuid 0 %lise etaloni puhul seda ei saada. Kui selliseid tulemusi ei ilmne, tuleb määramisprotseduuri optimeerida, pidades täpselt kinni meetodi tingimustest kõigis üksikasjades.

Proov loetakse positiivseks, kui nii lehma γ2 kui ka γ3-kaseiini ribade intensiivsused või piikide pindalad on samaväärsed või suuremad kui 1 %-lise etaloni vastavad tasemed.

8. Viited

1. Addeo F., Moio L., Chianese L., Stingo C., Resmini P., Berner I, Krause I., Di Luccia A., Bocca A.: Use of plasmin to increase the sensitivity of the detection of bovine milk in ovine and/or caprine cheese by gel isoelectric focusing of 2-caseins. Milchwissenschaft 45, 708–711 (1990).

2. Addeo F., Nicolai M. A., Chianese L., Moio L., Spagna Musso S., Bocca A., Del Giovine L.: A control method to detect bovine milk in ewe and water buffalo cheese using immunoblotting. Milchwissenschaft 50, 83–85 (1995).

3. Krause I., Berner I, Klostermeyer H.: Sensitive detection of cow milk in ewe and goat milk and cheese by carrier ampholyte - and carrier ampholyte/immobilized pH gradient - isoelectric focusing of -caseins using plasmin as signal amplifier. in: Electrophoresis-Forum 89 (B. J. Radola, ed.) pp 389–393, Bode-Verlag, München (1989).

4. Krause, I., Belitz H.-D., Kaiser K.-P.: Nachweis von Kuhmilch in Schaf and Ziegenmilch bzw. -käse durch isoelektrische Fokussierung in harnstoffhaltigen Polyacrylamidgelen. Z. Lebensm. Unters. Forsch. 174, 195–199 (1982).

5. Radola B. J.: Ultrathin-layer isoelectric focusing in 50–100 m polyacrylamide gels on silanised glass plates or polyester films. Electrophoresis 1, 43–56 (1980).

+++++ TIFF +++++

[1] Valmistised Ampholine® pH 3,5–9,5 (Pharmacia) ning Resolyte® pH 5–7 ja pH 6–8 (BDH, Merck) on osutunud eriti sobivaks kaseiinide nõutava eraldamise saavutamiseks.

[2] Valmistised Ampholine® pH 3,5–9,5 (Pharmacia) ning Resolyte® pH 5–7 ja pH 6–8 (BDH, Merck) on osutunud eriti sobivaks kaseiinide nõutava eraldamise saavutamiseks.

[3] Valmistised Ampholine® pH 3,5–9,5 (Pharmacia) ning Resolyte® pH 5–7 ja pH 6–8 (BDH, Merck) on osutunud eriti sobivaks kaseiinide nõutava eraldamise saavutamiseks.

[4] Proovi pealekandmine: Pärast eelfookustamist (aste 1) pipetitakse 18 l proovi ja standardlahust proovi aplikaatoritesse (10 × 5 mm), neile kantakse geeli, jättes igaühe vahele 1 mm vahe ja anoodi servast pikisuunas 5 mm vahe ning vajutatakse õrnalt. Fokuseeritakse, kasutades eespool toodud tingimusi, eemaldades ettevaatlikult proovi aplikaatorid pärast 60 minuti pikkust proovi fokuseerimist.

--------------------------------------------------

XVI LISA

(Artikkel 11)

STANDARDMEETOD KOLIBAKTERITE AVASTAMISEKS VÕIS, LÕSSIPULBRIS NING KASEIINIS JA KASEINAATIDES

Kui kontrollitakse kolibakterite leidumist võis, nakatatakse kasvukeskkond 1grammiste võiproovidega.

Kui kontrollitakse kolibakterite leidumist lõssipulbris või kaseiinis/kaseinaatides, nakatatakse kasvukeskkond 0,1grammiste proovidega.

IDFi standardi 73 A:1985 meetodit B kohaldatakse järgmiste modifikatsioonidega.

1) Proovid valmistatakse ette vastavalt IDFi standardile 122B:1992. Happega kalgendamise teel saadud kaseiini korral võib alternatiivselt kasutada IDFi standardis 73A:1985 kirjeldatud proovide ettevalmistamise meetodit.

2) Katseklaase, mis on nakatatud vastavalt 1grammiste proovidega (või) või 0,1grammiste proovidega (lõssipulber, kaseiin/kaseinaadid), inkubeeritakse ja tulemusi hinnatakse. Kümnekordseid lahjendusi ei tehta.

Tulemuste hindamine

Kolm negatiivset tulemust: | Vastab nõuetele |

Kaks või kolm positiivset tulemust: | Ei vasta nõuetele |

Kaks negatiivset tulemust: | Analüüsitakse veel kahte proovi, kaaludes 1 g (või) ja 0,1 g (lõssipulber, kaseiin/kaseinaat). Kui viimased kaks tulemust on negatiivsed, siis vastab nõuetele; muul juhul ei vasta nõuetele. |

Märkus

Kolibakterite sisaldus: 1/10 g või puhul; 1/g lõssipulbri, kaseiini/kaseinaatide puhul, keskmiselt.

Täidetud nõuet näitav tulemus saadakse tõenäosusega 93 %.

Kolibakterite sisaldus: 1/g või puhul; 1/0,1 g lõssipulbri, kaseiini/kaseinaatide puhul, keskmiselt.

Täitmata nõuet näitav tulemus saadakse tõenäosusega 91 %.

(Hinnang: Poissoni jaotus)

--------------------------------------------------

XVII LISA

(Artikkel 12)

MEETOD LAKTOOSISISALDUSE MÄÄRAMISEKS CN-KOODI 2309 ALLA KUULUVATES TOODETES [1]

I OSA

1. Kohaldamisala

Meetodit tuleks kohaldada juhtudel, kui laktoosisisaldus ületab 0,5 %.

2. Põhimõte

Suhkrud lahustatakse vees. Pärmil (Saccharomyces cerevisiae) lastakse mõjuda; see jätab laktoosi esialgsele kujule. Pärast selitamist ja filtreerimist määratakse lahuse laktoosisisaldus Luff-Schoorli meetodil.

3. Reaktiivid

Naatriumtiosulfaat 0,1 N

Indikaator: tärkliselahus. 1 liitrile keevale veele lisatakse 5 g lahustatud tärklist (säilitusaineks võib lisada 10 mg elavhõbejodiidi) ja 30 ml vett; segul lastakse kolm minutit keeda ja jäetakse jahtuma.

30 % kaaliumjodiidi lahus AR (m/v).

6 N väävelhape.

Luff-Schoorli reaktiiv:

a) 25 g rauavaba vask-2-sulfaatpentahüdraati (CuSO45H2O) lahustatakse 100 ml vees.

b) 50 g sidrunhappe monohüdraati (C6H8O7H2O) lahustatakse 50 ml vees.

c) 143,8 g veevaba naatriumkarbonaati (Na2CO2) lahustatakse umbes 300 ml soojas vees ja lastakse jahtuda.

Lahus b lisatakse lahusele c, loksutatakse kergelt ja lisatakse lahus a. Täiendatakse veega 1 liitrini, jäetakse ööseks seisma ja filtreeritakse. Kontrollitakse sel viisil saadud reaktiivi normaalsust (Cu 0,1 N, Na2CO3 2 N). pH peab olema ligikaudu 9,4.

Carrez’ lahus I: 23,8 g Zn (C2H3O2)2.2H2O ja 3 g jää-äädikat lahustatakse vees ja täiendatakse 100 ml märgini.

Carrez’ lahus II: 10,6 g K4F2(CN)6.3H2O lahustatakse vees ja täiendatakse 100 ml märgini.

Pimsskiviterad, soolhappes läbi keedetud, veega pestud ja kuivatatud. Saccharomyces cerevisiae suspensioon: 25 g värsket pärmi 100 ml vees (mitte hoida külmikus üle nädala).

4. Analüüsi käik

Võetakse ligikaudu 1 g proovi kaalutis 1 mg täpsusega, pannakse 100 ml mõõtekolbi. Lisatakse 25–30 ml vett. Kolb asetatakse 30 minutiks keeva vee vanni, seejärel jahutatakse umbes 35 °Cni.

Lisatakse 5 ml pärmisuspensiooni [2] ja loksutatakse. Mõõtkolb koos selle sisuga jäetakse kaheks tunniks 38–40 °C temperatuuriga veevanni.

Pärast kääritamist jahutatakse temperatuurini ligikaudu 20 °C. Lisatakse 2,5 ml Carrez’ lahust I ja loksutatakse kolmkümmend sekundit; siis lisatakse 2,5 ml Carrez’ lahust II ja loksutatakse veel kolmkümmend sekundit. Täiendatakse veega 100 ml märgini, segatakse ja filtreeritakse. Pipetitakse kuni 25 ml filtraati, mille laktoosisisaldus on 40–80 mg; vajaduse korral täiendatakse veega 25 ml märgini ja määratakse veevaba laktoosi sisaldus Luff-Schoorli meetodi abil.

Tehakse täielik pimekatse ainult pärmiga.

II OSA

1. Laktoosisisalduse määramine Luff-Schoorli meetodiga

Pipetitakse 25 ml Luff-Schoorli reaktiivi ja pannakse 300 ml Erlenmeyeri kolbi; lisatakse täpselt 25 ml selitatud lahust.

Lisatakse 2 pimsskivitera, kuumutatakse, loksutades käsitsi keskmise kõrgusega lahtise leegi kohal ja kuumutatakse keemiseni umbes kahe minuti jooksul. Erlenmeyeri kolb asetatakse viivitamata asbestkattega traatvõrgule, mille all on eelnevalt süüdatud leek. See on reguleeritud nii, et Erlenmeyeri kolbi kuumutatakse üksnes põhja alt; siis ühendatakse püstjahuti. Sellest hetkest alates keedetakse täpselt kümme minutit. Jahutatakse kohe külmas vees ja umbes 5 minuti möödudes tehakse järgmine katse.

Vedelikule lisatakse 10 ml kaaliumjodiidi ja kohe seejärel ettevaatlikult (kuna võib tekkida märkimisväärne vahutamine) 25 ml väävelhapet 6 N.

Testitakse naatriumtiosulfaadiga kuni kahvatukollase värvuse tekkimiseni, testimise lõpul lisatakse tärkliseindikaator.

Sama test, seekord ilma keetmata, tehakse seguga, milles on täpselt 25 ml Luff-Schrooli reaktiivi ja 25 ml vett ning millele on eelnevalt lisatud 10 ml kaaliumjodiidi lahust ja 25 ml väävelhapet 6 N.

Järgmise tabeli abil määratakse laktoosisisaldus milligrammides, mis vastab kahe testimise tulemuste vahele (väljendatud 0,1 N naatriumtiosulfaadi milliliitrites).

TABEL

Tabel 25 ml Luff-Schoorli reaktiivi

(vt tekstis esitatud tingimusi)

1. Naatriumtiosulfaat 0,1 N

2. Laktoos C12H22O11

1 | 2 |

ml | mg | vahe |

1 | 3,6 | |

| | 3,7 |

2 | 7,3 | |

| | 3,7 |

3 | 11,0 | |

| | 3,7 |

4 | 14,7 | |

| | 3,7 |

5 | 18,4 | |

| | 3,7 |

6 | 22,1 | |

| | 3,7 |

7 | 25,8 | |

| | 3,7 |

8 | 29,5 | |

| | 3,7 |

9 | 33,2 | |

| | 3,8 |

10 | 37,0 | |

| | 3,8 |

11 | 40,8 | |

| | 3,8 |

12 | 44,6 | |

| | 3,8 |

13 | 48,4 | |

| | 3,8 |

14 | 52,2 | |

| | 3,8 |

15 | 56,0 | |

| | 3,9 |

16 | 59,9 | |

| | 3,9 |

17 | 63,8 | |

| | 3,9 |

18 | 67,7 | |

| | 4,0 |

19 | 71,7 | |

| | 4,0 |

20 | 75,7 | |

| | 4,1 |

21 | 79,8 | |

| | 4,1 |

22 | 83,9 | |

| | 4,1 |

23 | 88,0 | |

[1] Määrus (EMÜ) nr 222/88.

[2] Toodete puhul, mis sisaldavad üle 40 % fermenteeritavat suhkrut, suurendatakse suspensiooni kogust.

--------------------------------------------------

XVIII LISA

(Artikkel 13)

RIIKLIKUKS LADUSTAMISEKS ETTENÄHTUD LÕSSIPULBRIS ESINEVA LAABIVADAKU KINDLAKSTEGEMINE GLÜKOMAKROPEPTIIDIDE MÄÄRAMISE TEEL KÕRGSURVEVEDELIKKROMATOGRAAFIA (HPLC) ABIL

1. Rakendatavus ja rakendusala

Käesolev meetod võimaldab tuvastada laabivadakut riiklikuks ladustamiseks ettenähtud lõssipulbris glükomakropeptiidide määramise teel.

2. Viited

Lähtutakse rahvusvahelise standard ISO 707 – Piim ja piimatooted – Proovivõtu meetodid, mis vastavad I lisa lõike 2 punkti c viimase lõigu juhistele.

3. Mõiste

Glükomakropeptiidide sisaldus lõssipulbris: käesolevas lisas ettenähtud meetodil määratud ainete sisaldus massiprotsentides.

4. Põhimõte

- Pulbrist regenereeritakse lõss, trikloroäädikhappe lisamise abil eraldatakse rasv ja valgud ning seejärel tsentrifuugitakse;

- supernatandis määratakse kõrgsurvevedelikkromatograafia (HPLC) abil glükomakropeptiidide (GMPde) kogus;

- proovide tulemusi võrreldakse lõssipulbri standardproovidega, millele kas on või ei ole lisatud teadaolev protsent vadakupulbrit.

5. Reaktiivid

Kõik reaktiivid peavad olema analüütiliselt puhtad. Kasutada tuleb destilleeritud või vähemalt samaväärse puhtusastmega vett.

5.1. Trikloroäädikhappe lahus

Lahustada 240 g trikloroäädikhapet (Cl3CCOOH) vees ja täiendada 1000 ml märgini.

5.2. Eluentlahus, pH 6,0

Lahustada 1,74 g dikaaliumvesinikfosfaati (K2HPO4), 12,37 g kaaliumdivesinikfosfaati (KH2PO4) ja 21,41 g naatriumsulfaati (Na2SO4) umbes 700 ml vees. Vajaduse korral reguleerida pH 6,0-le, kasutades fosforhappe või naatriumhüdroksiidi lahust.

Täiendatakse veega 1000 ml märgini ja homogeenitakse.

Enne kasutamist filtreerida eluentlahus lbi membraanfiltri, mille pooride läbimõõt on 0,45 μm.

5.3. Loputuslahus

Segada üks mahuosa atsetonitriili (CH3CN) üheksa mahuosa veega. Enne kasutamist filtreerida segu läbi membraanfiltri, mille pooride läbimõõt on 0,45 μm.

Märkus:

Võib kasutada mõnda muud baktereid tapva toimega lahustit, mis ei vähenda kolonnide lahutusvõimet.

5.4. Standardproovid

5.4.1. Käesoleva määruse nõuetele vastav lõssipulber (s.o [0]).

5.4.2. Sama lõssipulber, millele on lisatud 5 massiprotsenti standardkoostisega laabivadakupulbrit (s.o [5]).

6. Seadmed

6.1. Analüütilised kaalud.

6.2. Tsentrifuug, mis võimaldab saavutada tsentrifugaaljõu välja 2200 g ja on varustatud suletavate umbes 25 ml küvettidega.

6.3. Mehaaniline loksuti.

6.4. Magnetsegur

6.5. Umbes 7 cm läbimõõduga klaaslehtrid.

6.6. Umbes 12,5 cm läbimõõduga keskmise tihedusega paberfiltrid.

6.7. Klaasist filtreerimisseade, mille membraanfiltri pooride läbimõõt on 0,45 μm.

6.8. Gradueeritud 10 ml pipetid (ISO 648, A klass, või ISO/R 835).

6.9. Termostateeritav vesivann, reguleeritud temperatuurile 25 ± 0,5 °C.

6.10. HPLC-seade, mille komplekti kuulub:

6.10.1. Pump.

6.10.2. Käsi- või automaatinjektor, 15 kuni 30 μl.

6.10.3. Kaks järjestikku ühendatud TSK 2000-SW või sellega võrdväärset kolonni (pikkus 30 cm, siseläbimõõt 0,75 cm) ja eelkolonn (3 cm × 0,3 cm), täidetud I 125-ga või muu sama efektiivse materjaliga.

6.10.4. Termostateeritav kolonnahi, reguleeritud temperatuurile 35 ± 1 °C.

6.10.5. Muudetava lainepikkusega 0,008 A tundlikkusega UV-detektor, mis võimaldab teha mõõtmisi 205 nm juures.

6.10.6. Integraator, mis võimaldab integreerida miinimumist miinimumini.

Märkus:

Võib töötada ka toatemperatuuril hoitavate kolonnidega, kuid siis on nende lahutusvõime pisut madalam. Sellisel juhtumil ei tohi temperatuur ühe analüüsi jooksul muutuda rohkem kui ±5 °C.

7. Proovi võtmine

7.1. Proovide võtmisel lähtutakse juhistest, mis sisalduvad rahvusvahelise standardi ISO 707 – Piim ja piimatooted – Proovivõtu meetodid – I lisa lõike 2 punkti c viimases lõigus.

7.2. Proovi hoitakse tingimustes, mis välistavad selle riknemise või koostise muutumise.

8. Analüüsi käik

8.1. Uuritava proovi ettevalmistamine

Lõssipulber pannakse õhukindla kaanega anumasse, mille maht on lõssipulbri mahust umbes kaks korda suurem. Anum suletakse kohe. Lõssipulber segatakse hästi läbi, anumat korduvalt ümber pöörates.

8.2. Katsekogus

Panna 2,000 ± 0,001 g teimitava proovi kaalutis tsentrifuugiküvetti (6.2).

8.3. Rasva ja valkude eemaldamine

8.3.1. Analüüsitavale kogusele lisatakse 20 g kuuma vett (50 °C). Lahustada pulber, loksutades segu mehaanilisel loksutil (6.3) viis minutit. Jahutada tops 25 °C-ni.

8.3.2. Magnetsegajal segades (6.4) lisada kahe minuti jooksul 10,0 ml trikloroäädikhapet. Seejärel asetatakse küvett 60 minutiks vesivanni (6.9).

8.3.3. Tsentrifuugitakse (6.2) 10 minutit 2200 g juures või filtreeritakse läbi paberi (6.6), visates filtraadist ära esimesed 5 ml.

8.4. Kromatograafiline määramine

8.4.1. Süstida HPLC seadmesse (6.10) 15–30 μl täpselt mõõdetud supernatanti või filtraati (8.3.3) voolukiirusel 1,0 ml eluentlahust (5.2) minutis.

Märkused:

1. Selleks et säilitada eluenti gaasivabana ja ära hoida bakterite kasvu, tuleb kromatograafilise analüüsi vältel hoida eluentlahust (5.2) temperatuuril 85 °C. Võib kasutada ka muid samalaadse toimega ettevaatusabinõusid.

2. Igal analüüsi vaheajal tuleb kolonnid pesta veega. Kolonnidesse ei tohi jätta eluentlahust (5.2).

Enne töö katkestamist enam kui 24 tunniks tuleb kolonnid läbi pesta veega ja seejärel vähemalt kolme tunni vältel pesta lahusega (5.3) voolukiirusel 0,2 ml minutis.

8.4.2. Teimitava proovi ([E]) kromatograafilise analüüsi tulemused saadakse kromatogrammina, millel iga piik identifitseeritakse selle peetumisaja (RT) järgi järgmiselt:

Piik II: | kromatogrammi teine piik, mille RT on umbes 12,5 minutit |

Piik III: | kromatogrammi kolmas piik, mis vastab GMPle ja mille RT on 15,5 ± 1,0 minutit |

Piik IV: | kromatogrammi neljas piik, mille RT on umbes 17,5 minutit. |

Kolonnide kvaliteet võib mõjutada piikide peetumisaega.

Integraator (6.10.6) arvutab automaatselt iga piigi pindala A:

AII: | piigi pindala II |

AIII: | piigi pindala III |

AIV: | piigi pindala IV. |

Enne kvantitatiivset interpreteerimist tuleb kontrollida iga kromatogrammi kuju, et avastada võimalikud kõrvalekalded, mis on tingitud seadme või kolonnide puudulikust tööst või analüüsitava proovi päritolust ja iseloomust.

Kahtluse korral tuleb analüüsi korrata.

8.5. Kalibreerimine

8.5.1. Rakendatakse täpselt sama menetlust, mis on kirjeldatud standardproovide (5.4) puhul punktides 8.2–8.4.2.

Tuleb kasutada värskelt valmistatud lahuseid, sest GMPd lagunevad 8 % trikloroäädikhappe keskkonnas. Hinnangu kohaselt on kadu 30 °C juures 0,2 % tunnis.

8.5.2. Enne proovide kromatograafilist määramist tuleb kolonnid tasakaalustada, süstides korduvalt standardproovi (5.4.2) lahust (8.5.1), kuni GMPdele vastava piigi pindala ja peetumisaeg jääb konstantseks.

8.5.3. Määratakse kalibreerimistegurid R, süstides samapalju filtraate (8.5.1) nagu teimitavate proovide puhul.

9. Tulemuste esitamine

9.1. Arvutamismeetod ja valemid

9.1.1. Kalibreerimisteguri R arvutamine:

Piik II: | RII=100AII0 |

Piik IV: | RIV=100AIV0 |

kus:

RII ja RIV = vastavalt piikide II ja IV kalibreerimistegurid,

AII [0] ja AIV [0] = punktis 8.5.3 saadud standardproovi piikide II ja IV pindalad.

Piik III: | RIII=WAIII5- AIII0 |

kus:

RIII = piigi III kalibreerimistegur,

AIII [0] ja AIII [5] = punktis 8.5.3 saadud standardproovide [0] ja [5] piigi III pindalad,

W = standardproovi [5] vadakusisaldus, s.o 5.

9.1.2. Proovi [E] piikide suhtelise pindala arvutamine

= R

× A

IIE

= R

× A

IIIE

= R

× A

IVE

kus:

SII [E], SIII [E], SIV [E] = vastavalt proovi [E] piikide II, III ja IV suhtelised pindalad,

AII [E], AIII [E], AIV [E] = punktis 8.4.2 saadud proovi [E] piikide II, III ja IV pindalad,

RII, RIII, RIV = punktis 9.1.1 arvutatud kalibreerimistegurid.

9.1.3. Proovi [E] piigi III suhtelise peetumisaja arvutamine

RRT

III5

kus:

RRTIII [E] = proovi [E] piigi III suhtelise peetumisaja arvutamine,

RTIII [E] = punktis 8.4.2 saadud proovi [E] piigi III peetumisaja arvutamine,

RTIII [5] = punktis 8.5.3 saadud kontrollproovi [5] piigi III peetumisaja arvutamine.

9.1.4. Katsed on näidanud, et piigi III suhtelise peetumisaja (s.o RRTIII [E]) ja kuni 10 %-ni lisatud vadakupulbri protsendimäära vahel on lineaarne sõltuvus.

- RRTIII [E] < 1, 000, kui vadakusisaldus > 5 %;

- RRTIII [E] ≥1, 000, kui vadakusisaldus ≤ 5 %.

Lubatud kõikumine RRTIII väärtuste puhul on ±0,002.

Tavaliselt erineb RRTIII [0] väärtus veidi 1,034st. Sõltuvalt kolonnide olukorrast võib väärtus läheneda väärtusele 1, 000, kuid peab alati olema sellest suurem.

9.2. Proovis sisalduva laabivadakupulbri protsendi arvutamine:

W = S

- 0,9)]

kus:

W = proovis [E] sisalduva laabivadaku massiprotsent;

SIII [E] = punktis 9.1.2 saadud proovi [E] piigi III suhteline pindala;

1,3 = näitab piigi III suhtelist keskmist pindala, mis on väljendatud grammides 100 g laabivadaku kohta, mis on määratud eri päritoluga muutmata koostisega lõssipulbri puhul. See arv on saadud katseliselt;

SIII [0] = piigi III suhteline pindala, mis on võrdne RIII × AIII [0]. Need arvud on saadud vastavalt punktides 9.1.1 ja 8.5.3;

(SIII [0] – 0,9) = suhtelisse keskmisse pindalasse 1,3 tehtav parandus, kui SIII [0] erineb 0,9st. Katseliselt on kontrollproovi [0] piigi III suhteline keskmine pindala 0,9.

9.3. Meetodi täpsus

9.3.1. Korratavus

Ühel ja samal ajal või kohe üksteise järel samade seadmetega ühe ja sama analüüsija poolt identse materjaliga läbiviidud kahe määramise tulemuste vaheline erinevus ei tohi olla suurem kui 0,2 massiprotsenti.

9.3.2. Reprodutseeritavus

Erinevus kahe üksiktulemuse vahel, mis on saadud kahes eri laboris sama katsematerjaliga, ei tohi olla suurem kui 0,4 % massiprotsenti.

9.4. Tõlgendamine

9.4.1. Vadak puudub, kui piigi III suhteline pindala (SIII [E]) on, väljendatuna laabivadaku grammides 100 g toote kohta ≤

2,0 +

kus:

2,0 = piigi III suhtelise pindala puhul lubatud maksimaalne väärtu, võttes arvesse piigi III suhtelist pindala (s.t 1,3), määramatus on tingitud lõssipulbri koostise muutumisest ja meetodi reprodutseeritavusest (9.3.2),

(SIII [0] – 0,9) = parandus, mis tehakse juhul, kui SIII [0] on erinev kui 0,9 (vt punkt 9.2)

9.4.2. Kui piigi III suhteline pindala on

on > 2,0 +

ja piigi II suhteline pindala SII [E] ≤ 160, määratakse laabivadaku sisaldus vastavalt punktis 9.2 osutatule.

9.4.3. Kui piigi III suhteline pindala on SIII [E] on SIII[E] > 2,0 + (SIII[0] – 0,9) ja piigi II suhteline pindala SII [E] ≤ 160, määratakse üldine valgusisaldus (P %); seejärel uuritakse jooniseid 1 ja 2.

9.4.3.1. Kogu kõrge valgusisaldusega muutmata koostisega lõssipulbri proovide analüüsimisel saadud teave on rühmitatud joonistel 1 ja 2.

Pidev joon kujutab lineaarset regressiooni, mille koefitsiendid arvutatakse vähimruutude meetodil.

Sirge katkendjoon fikseerib piigi III suhtelise pindala ülemmäära, kusjuures on tõenäoline, et 90 % juhtudest seda ei ületata.

Jooniste 1 ja 2 katkendjoonte võrrand:

. | . |

SIII= 0,376 P % - 10,7 | (joonis 1) |

SIII= 0,0123 SIIE+ 0,93 | (joonis 2) |

kus vastavalt:

SIII on piigi III suhteline pindala, arvutatud vastavalt kas kogu valgusisaldusele võipiigi SII [E] suhtelisele pindalale,

P % on kogu valgusisaldus massiprotsendina,

SII [E] on punktis 9.1.2 arvutatud proovi suhteline pindala

Need võrrandid on võrdsed punktis 9.2 nimetatud arvuga 1,3.

Lahknevused (T1 ja T2) leitud suhtelise pindala SIII [E] ja suhtelise pindala SIII vahel saadakse järgmiselt:

= S

- 0,9

= S

0,0123 S

+ 0,93)

- 0,9

9.4.3.2. Kui T1 ja/või T2 on null või väiksem, ei saa laabivadaku olemasolu tuvastada

Kui T1 ja T2 on suurem kui null, esineb laabivadakut

Laabivadaku sisaldus arvutatakse vastavalt järgmisele võrrandile:

W = T

+ 0,91

kus:

0,91 on pidevjoone ja katkendjoone vaheline kaugus vertikaalteljel.

+++++ TIFF +++++

--------------------------------------------------

XIX LISA

(Artikkel 13)

KUIVLAABIVADAKU SISALDUSE MÄÄRAMINE LÕSSIPULBRIS JA MÄÄRUSES (EÜ) nr 2799/1999 OSUTATUD SEGUDES

1. Eesmärk: Lisatud kuivlaabivadaku kindlakstegemine:

a) määruse (EÜ) nr 2799/1999 artiklis 2 määratletud lõssipulbris,

b) määruse (EÜ) nr 2799/1999 artiklis 4 määratletud segudes.

2. Viited: rahvusvaheline standard ISO 707

3. Mõiste

Kuivlaabivadaku sisaldus leitakse massiprotsentides järgnevalt kirjeldatud meetodil.

4. Põhimõte

Glükomakropeptiidi A sisaldus määratakse vastavalt XVIII lisale. Positiivseid proove analüüsitakse glükomakropeptiidi A tuvastamiseks pöördfaasilise kõrgsurvevedelikkromatograafia (HPLC) abil. Saadud tulemusi võrreldakse lõssipulbrit sisaldavate standardproovidega, millest osale on lisatud teatav kogus vadakupulbrit. Kui tulemus on suurem kui 1 massiprotsent, näitab see, et proov sisaldab kuivlaabivadakut.

5. Reaktiivid

Kõik reaktiivid peavad olema analüütiliselt puhtad. Kasutada tuleb destilleeritud või vähemalt samaväärse puhtusastmega vett. Atsetonitriili kvaliteet peab vastama spektroskoopia või HPLC nõuetele.

Menetluseks vajalikud reaktiivid on kirjeldatud käesoleva määruse XVIII lisas.

Pöördfaasilise HPLC puhul kasutatavad reaktiivid.

5.1. Trikloroäädikhappe lahus

Lahustada vees 240 g trikloroäädikhapet (CCI3CCOOH) ja täiendada 1000 ml märgini.

5.2. Eluendid A ja B

Eluent A: 150 ml atsetonitriili (CH3CN), 20 ml isopropanooli (CH3CHOHCH3) ja 1,00 ml trifluoroäädikhapet (TFA, CF3CHOOH) pannakse 1000 ml mõõtekolbi. Täiendatakse veega kuni 1000 ml lahuse saamiseni. Eluent B: 550 ml atsetonitriili, 20 ml isopropanooli ja 1,00 ml TFAd pannakse 1000 ml mõõtekolbi. Täiendatakse veega kuni 1000 ml lahuse saamiseni. Enne kasutamist filtreeritakse eluentlahus läbi membraanfiltri, mille pooride läbimõõt on 0,45 μm.

5.3. Kolonni konserveerimine

Pärast analüüse voolutatakse kolonnist läbi eluendi B gradienti ja seejärel 30 minuti jooksul atsetonitriili gradienti. Kolonn jäetakse seisma atsetonitriiliga.

5.4. Standardproovid

5.4.1. Riikliku ladustamise nõuetele vastav lõssipulber (0).

5.4.2. Sama lõssipulber, millele on lisatud 5 massiprotsenti standardkoostisega laabivadakupulbrit (s.o (5)).

5.4.3. Sama lõssipulber, millele on lisatud 50 massiprotsenti standardkoostisega laabivadakupulbrit (s.o (50)). [1]

6. Seadmed

Menetluseks vajalikud seadmed on kirjeldatud käesoleva määruse XVIII lisas.

6.1. Analüütilised kaalud.

6.2. Tsentrifuug, mis võimaldab saavutada tsentrifugaaljõu välja 2200 g ja on varustatud suletavate umbes 50 ml küvettidega.

6.3. Mehhaaniline loksuti, mis töötab temperatuuril 50 °C.

6.4. Magnetsegur

6.5. Umbes 7 cm läbimõõduga klaaslehtrid.

6.6. Umbes 12,5 cm läbimõõduga keskmise tihedusega paberfiltrid.

6.7. Klaasist filtreerimisseade, mille membraanfiltri pooride läbimõõt on 0,45 μm.

6.8. Mõõtepipetid (ISO 648, klass A või ISO/R 835) või doseerimisseade, mis võimaldavad mõõta 10,0 ml kahe minuti jooksul.

6.9. Termostateeritav vesivann, reguleeritud temperatuurile 25 ± 0,5 °C.

6.10. HPLC seade, mille komplekti kuulub:

6.10.1. Pumbasüsteem, mis võimaldab saada kahekomponendilist gradienti.

6.10.2. 100 μl automaatne või mitteautomaatne injektor.

6.10.3. Kolonn Dupont Protein Plus (sisemõõtudega 25 cm ja 0,46 cm) või sellele vastav suurepooriline silikageeliga täidetud pöördfaasiline kolonn.

6.10.4. Termostateeritav kolonnahi, reguleeritud temperatuurile 35 ± 1 °C.

6.10.5. Muudetava lainepikkusega 0,02 Å tundlikkusega UV-detektor, mis võimaldab teha mõõtmisi 210 nm juures (vajaduse korral võib kasutada kuni 220 nm lainepikkust).

6.10.6. Integraator, mis võimaldab integreerida miinimumist miinimumini.

Märkus:

Kolonniga saab töötada toatemperatuuril, kui see ei kõigu rohkem kui 1 °C, vastasel korral varieerub GMPÅ peetumisaeg liiga palju.

7. Proovi võtmine

7.1. Proove võetakse vastavalt rahvusvahelise standardiga ISO 707 sätestatud korrale. Liikmesriigid võivad kasutada muud proovide võtmise meetodit, kui see on kooskõlas eespool nimetatud standardi põhimõtetega.

7.2. Proovi hoitakse tingimustes, mis välistavad selle riknemise või koostise muutumise.

8. Analüüsi käik

8.1. Uuritava proovi ettevalmistamine

8.2. Katsekogus

Tsentrifuugiküvetti (6.2) või sobivasse suletavasse anumasse (50 ml) pannakse 2,00 ± 0,001 g analüüsitava proovi kaalutis.

8.3. Rasva ja valkude eemaldamine

8.3.1. Analüüsitavale kogusele lisatakse 20,0 g kuuma vett (50 °C). Pulber lahustatakse, loksutades mehhaanilisel loksutil (6.3) viis minutit, hapukoorepeti korral 30 minutit. Küvett asetatakse vesivanni (6.9) ja tasakaalustatakse 25 °C juures.

8.3.2. Magnetsegajal (6.4) tugevasti segades lisatakse pidevalt kahe minuti jooksul 10,0 ml 25 °C trikloroäädikhapet (5.1). Seejärel asetatakse küvett 60 minutiks vesivanni (6.9).

8.3.3. Tsentrifuugitakse (6.2) 10 minutit 2200 g juures või filtreeritakse läbi paberi (6.6), visates filtraadist ära esimesed 5 ml.

8.4. Kromatograafiline määramine

8.4.1. Tehakse XVIII lisas kirjeldatud HPLC-analüüs. Kui tulemus on negatiivne, ei sisalda analüüsitud proov märkimisväärses koguses kuivlaabivadakut. Kui tulemus on positiivne, tuleb kasutada järgnevalt kirjeldatud pöördfaasilist HPLC-meetodit. Hapukoorepeti pulbri sisaldus võib põhjustada ekslikult positiivse tulemuse. Pöördfaasilise HPLC-meetodi puhul on see aga välistatud.

8.4.2. Enne pöördfaasilise HPLC-analüüsi läbiviimist tuleb optimeerida gradiendi tingimused. 6 ml tühimahuga gradientsüsteemide puhul (maht lahuste ühinemispunktist kuni injektori silmuseni, viimane kaasa arvatud) on optimaalne GMPA peetumisaeg 26 ± 2 minutit. Väiksema tühimahuga (näiteks 2 ml) gradientsüsteemide puhul on optimaalne peetumisaeg 22 minutit.

Analüüsitakse standardproovide (5.4) lahuseid, millest osa sisaldab 50 % laabivadakut.

HPLC-seadmesse süstitakse 100 μl supernatanti voi filtraati (8.3.3) tabelis 1 esitatud proovigradiendi tingimustel.

Tabel 1

Proovigradiendi tingimused kromatograafilise analüüsi optimeerimiseks

| Voolukiirus (ml/min) | % A | % B | Kõver |

Init | 1,0 | 90 | 10 | * |

27 | 1,0 | 60 | 40 | lin |

32 | 1,0 | 10 | 90 | lin |

37 | 1,0 | 10 | 90 | lin |

42 | 1,0 | 90 | 10 | lin |

Kahe kromatogrammi võrdlus peaks andma GMPÅ piigi asukoha.

Normaalgradiendi (8.4.3) tekitamiseks kasutatava lähtelahuse kontsentratsioon arvutatakse järgmiste valemite abil:

% B = 10 - 2,5 +

30/27

% B = 7,5 +

1,11

kus:

RTgmpA : GMPA peetumisaeg proovigradiendi puhul

10 : % B proovigradiendi alguses

2,5 : % B normaalgradiendi keskel, millest lahutatakse % B normaalgradiendi alguses

13,5 : proovigradiendi keskpunkti saavutamise aeg

26 : GMPÅ nõutav peetumisaeg

6 : proovi- ja normaalgradiendi tõusude suhe

30 : % B proovigradiendi alguses, millest lahutatakse % B 27 minuti pärast

27 : proovigradiendi läbijooksuaeg.

8.4.3. Võetakse analüüsitavate proovide lahused

HPLC-seadmesse süstitakse 100 μl täpselt mõõdetud kogus supernatanti või filtraati (8.3.3) voolukiirusel 1,0 ml eluentlahust (5.2) minutis.

Eluendi koostis analüüsi alguses saadakse punkti 8.4.2 kohaselt. Harilikult on see ligikaudu A : B = 76 : 24 (5.2). Kohe pärast süstimist alustatakse lineaargradienti, mille tulemuseks on 5 % võrra suurem B kogus 27 minuti pärast. Seejärel alustatakse lineaargradienti, mille tulemusel on eluendis viie minuti pärast 90 % B. Seda kontsentratsiooni hoitakse viis minutit ja pärast seda taastatakse lineaargradiendi abil viie minuti jooksul esialgne kontsentratsioon. Sõltuvalt pumbasüsteemi mahutavusest võib järgmist analüüsi alustada 15 minutit pärast algtingimuste saavutamist.

Märkused:

1. Glükomakropeptiidi peetumisaeg on 26 ± 2 minutit. Seda on võimalik saavutada, muutes esimese gradiendi alg- ja lõpptingimusi. % B erinevus esimese gradiendi lõpus ja alguses peab siiski olema 5.

2. Eluentidest tuleb õhk piisavalt hästi eemaldada ja need peavad sellisena püsima. See on oluline gradiendi pumbasüsteemi tõrgeteta toimimiseks. GMP-piigi peetumisaja standardhälve peab olema väiksem kui 0,1 minutit (n = 10).

3. Iga viienda proovi järel tuleb süstida standardproov (5) ja arvutada selle alusel uus kalibreerimistegur R (9.1.1).

8.4.4. Analüüsitava proovi (E) kromatograafilise analüüsi tulemused saadakse kromatogrammina, millel GMP piik tehakse kindlaks 26minutilise peetumisaja alusel.

Integraator (6.40.6) arvutab automaatselt GMP piigi kõrguse H. Kontrollida tuleb iga kromatogrammi nulljoone asukohta. Kui nulljoone asukoht on vale, tuleb analüüsi või integreerimist korrata.

Enne kvantitatiivset interpreteerimist tuleb kontrollida iga kromatogrammi kuju, et avastada võimalikud kõrvalekalded, mis on tingitud seadme või kolonni puudulikust tööst või analüüsitava proovi päritolust ja iseloomust. Kahtluse korral tuleb analüüsi korrata.

8.5. Kalibreerimine

8.5.1. Rakendatakse täpselt sama menetlust, nagu on kirjeldatud standardproovide (5.4.1–5.4.2) puhul punktides 8.2–8.4.4. Kasutatakse värskelt valmistatud lahuseid, sest GMP laguneb toatemperatuuril 8 % trikloroäädikhappe keskkonnas. Temperatuuril 4 °C püsib lahus stabiilsena 24 tundi. Pikkade analüüsiseeriate korral on automaatinjektori puhul soovitatav kasutada jahutatud proovialust.

Märkus:

Punkti 8.4.2 võib ära jätta, kui eelmistest analüüsidest on teada % B algtingimuste puhul.

Standardproovi (5) kromatogramm peab vastama joonisele 1. Sellel joonisel eelneb GMPA piigile kaks väikest piiki. Piigid peavad lahknema samal määral.

8.5.2. Enne proovide kromatograafilist määramist süstitakse 100 μl standardproovi, mis ei sisalda laabivadakut (0) (5.4.1).

Kromatogrammil ei tohi olla GMPA peetumisajale vastavat piiki.

8.5.3. Määratakse kalibreerimistegurid R, süstides samas mahus filtraati (8.5.1) nagu analüüsitavate proovide puhul.

9. Tulemuste esitamine

9.1. Arvutamismeetod ja valemid

9.1.1. Kalibreerimisteguri R arvutamine:

GMP piik: R = W/H

kus:

R = GMP piigi kaliibrimistegur

H = GMP piigi kõrgus

W = standardproovi (5) vadakusisaldus.

9.2. Proovis sisalduva laabivadakupulbri protsendi arvutamine

W(E) = R × H(E)

kus:

W(E) = proovis (E) sisalduva laabivadaku massiprotsent

R = GMP piigi kalibreerimistegur (9.1.1)

H(E) = proovi (E) GMP piigi kõrgus.

Kui W(E) on suurem kui 1 % ning kui peetumisaegade erinevus proovi ja standardproovi (5) puhul on väiksem kui 0,2 minutit, näitab see, et proov sisaldab laabivadakut.

9.3. Meetodi täpsus

9.3.1. Korratavus

9.3.2. Reprodutseeritavus

Veel kindlaks määramata.

9.3.3. Lineaarsus

Laabivadaku kontsentratsioonide vahemikus 0–16 % peavad tulemused olema lineaarses seoses korrelatsioonikoefitsiendiga > 0,99.

9.4. Tõlgendamine

9.4.1. Loetakse, et proov sisaldab vadakut, kui punkti 9.2 kohaselt saadud tulemus on suurem kui 1 massiprotsent ja GMP piigi peetumisaja erinevus proovi ja standardproovi (5) puhul on väiksem kui 0,2 minutit. See 1 %line piirang on ette nähtud vastavalt määruse (EMÜ) nr 625/78 V lisa punktide 9.2 ja 9.4.1 sätetele.

+++++ TIFF +++++

[1] Standardkoostisega laabivadakupulber on saadaval NIZOst, Kernhemseweg 2, PO Box 20 – NL-6710 BA Ede. Kasutada võib siiski ka NIZO pulbritega samaväärseid tulemusi andvaid pulbreid.

--------------------------------------------------

XX LISA

(Artikkel 14)

LÕSSIPULBER: FOSFATIDÜÜLSERIINI JA FOSFATIDÜÜLETANOOLAMIINI KVANTITATIIVNE MÄÄRAMINE

Meetod: pöördfaasiline kõrgsurvevedelikkromatograafia

1. Eesmärk ja rakendusala

Käesolev meetod kirjeldab fosfatidüülseriini (PS) ja fosfatidüületanoolamiini (PE) määramismenetlust lõssipulbris (SMP) ja see sobib kuivpetipiima kindlaksmääramiseks SMPs.

2. Mõiste

PS + PE sisaldus: kõnealuse aine massiosa, mis on kindlaks tehtud käesolevas lisas määratletud menetlust kasutades. Tulemus väljendatakse dipalmitüülfosfatidüületanoolamiini (PEDP) milligrammides 100 g pulbri kohta.

3. Põhimõte

Pulbrilõssist ekstraheeritakse metanooliga aminofosfolipiidid. PS ja PE määratakse o-ftaaldialdehüüdderivaatidena (OPA) pöördfaasilise HPLC ja fluorestsentsi avastamise menetluse abil. PS ja PE sisaldus teimitavas proovis väljendatakse kvantitatiivselt standardproovi suhtes, mis sisaldab teadaolevat kogust PEDPd.

4. Reaktiivid

Kõik reaktiivid peavad olema analüütiliselt puhtad. Kasutada tuleb destilleeritud või vähemalt samaväärse puhtusastmega vett.

4.1. Etalonmaterjal: PEDP, vähemalt 99 % puhtusastmega.

Märkus:

Etalonmaterjali tuleb säilitada –18 °C juures.

4.2. Reaktiivid standardproovide ja uuritavate proovide valmistamiseks

4.2.1. HPLC-puhas metanool

4.2.2. HPLC-puhas kloroform

4.2.3. Trüptamiinmonohüdrokloriid

4.3. Reaktiivid o-ftaaldialdehüüdi derivaatide valmistamiseks

4.3.1. Naatriumhüdroksiidi vesilahus 12 M

4.3.2. Boorhappe vesilahus 0,4 M, pH kohandatud 10,0-ni naatriumhüdroksiidiga (4.3.1)

4.3.3. 2-merkaptoetanool

4.3.4. o-ftaaldialdehüüd (OPA)

4.4. HPLC-elueerimislahustid

Elueerimislahustid peavad olema valmistatud HPLC-puhaste reaktiividega.

4.4.1. HPLC-puhas vesi

4.4.2. Metanool, puhtus fluoromeetriliselt kontrollitud

4.4.3. Tetrahüdrofuraan

4.4.4. Naatriumdivesinikfosfaat

4.4.5. Naatriumatsetaat

4.4.6. Äädikhape

5. Seadmed

5.1. Analüütilised kaalud

5.2. Keeduklaasid, 25 ja 100 ml mahuga

5.3. Pipetid, millega saab annustada 1 ja 10 ml

5.4. Magnetsegaja

5.5. Mõõtepipetid, millega saab annustada 0,2, 0,5 ja 5 ml

5.6. Mõõtekolvid, 10, 50 ja 100 ml mahuga

5.7. Süstlad, 20 ja 100 μl mahuga

5.8. Ultrahelivann.

5.9. Tsentrifuug, 27000 × g

5.10. Väikesed klaaspudelid, ligikaudu 5 ml mahuga

5.11. Mõõtesilinder, 25 ml mahuga

5.12. pH-meeter

5.13. HPLC-seadmed

5.13.1. Gradiendi pumbasüsteem, töökiirus 1,0 ml/min 200 baarise rõhu juures

5.13.2. Automaatproovivõtja, mille abil saab valmistada derivaate

5.13.3. Kolonni soojendaja, reguleeritud 30 °C-le

5.13.4. Fluorestsentsidetektor, reguleeritud kiirguslainepikkusele 330 nm ja ergastuslainepikkusele 440 nm

5.13.5. Integraator või automaatse andmetöötluse arvutiprogramm, millega on võimalik mõõta piikide pindala

5.13.6. Lichrosphere-100 kolonn (250 × 4,6 mm) või samaväärne kolonn, mis on pakitud oktadetsüülsilaaniga (C 18), osakeste suurusega 5 μm

6. Proovi võtmine

Proovid tuleb võtta vastavalt IDFi standardile 50B:1985.

7. Analüüsi käik

7.1. Sisestandardlahuse ettevalmistamine

100 ml mõõtekolbi pannakse 30,0 ± 0,1 mg trüptamiinmonohüdrokloriidi (4.2.3) kaalutis ning täidetakse kolb metanooliga (4.2.1) kuni märgini. 10 ml mõõtekolbi pipetitakse 1 ml (5.3) lahust ning täidetakse kolb metanooliga (4.2.1) kuni märgini, et saavutada trüptamiini kontsentratsioon 0,15 mM.

7.2. Uuritava proovilahuse ettevalmistamine

25 ml keeduklaasi pannakse 1,000 ± 0,001 g SMP proovi (5.2) kaalutis. Lisatakse pipetiga (5.3) 10 ml 40 °C destilleeritud vett ja segatakse magnetsegajaga (5.4) 30 minutit, kuni kõik tükid on lahustunud. 10 ml mõõtekolbi (5.6) pipetitakse 0,2 ml (5.5) taastatud piima, lisatakse süstlaga (5.7) 100 μl 0,15 mM trüptamiini lahust (7.1) ja täiendatakse metanooliga (4.2.1). Segatakse kolbi korduvalt ümber pöörates ja ultrahelitöötlusega (5.8) hoolikalt 15 min. Tsentrifuugitakse (5.9) 27000 × g 10 minutit ja kogutakse supernatant klaaspudelisse (5.10).

Märkus:

Testitavat proovilahust tuleks säilitada 4 °C juures, kuni HPLC-analüüs on lõpetatud.

7.3. Välisstandardlahuse ettevalmistamine

50 ml mõõtekolbi (5.6) pannakse 55,4 mg PEDPi (4.1) kaalutis ning lisatakse mõõtesilindriga (5.11) ligikaudu 25 ml kloroformi (4.2.2). Kinnikorgitud kolb kuumutatakse 50 °C-ni ja segatakse hoolikalt kuni PEDP on lahustunud. Kolb jahutatakse 20 °C-ni, täiendatakse metanooliga (4.2.1) ja segatakse kolbi ümber pöörates. Pipetitakse 1 ml (5.3) seda lahust 100 ml mõõtekolbi (5.6) ning täiendatakse metanooliga (4.2.1). Pipetitakse 1 ml (5.3) seda lahust 10 ml mõõtekolbi (5.6), lisatakse 100 μl (5.7) 0,15 mM trüptamiini lahust (7.1) ja täidetakse metanooliga (4.2.1). Segatakse kolbi korduvalt ümber pöörates.

Märkus:

Standardproovi lahust tuleks säilitada 4 °C juures, kuni HPLC-analüüs on lõpetatud.

7.4. Derivatiseerimisreaktiivi valmistamine

10 ml mõõtekolbi pannakse 25,0 ± 0,1 mg OPA (4.3.4) kaalutis, lisatakse 0,5 ml (5.5) metanooli (4.2.1) ja segatakse hoolikalt, et OPA lahustuks. Täiendatakse märgini boorhappe lahusega (4.3.2) ning lisatakse süstlaga (5.7) 20 μl 2-merkaptoetanooli (4.3.3).

Märkus:

Derivatiseerimisreaktiivi tuleks säilitada tumedas pudelis 4 °C juures ning see säilib üks nädal.

7.5. Määramine kõrgsurvevedelikkromatograafia abil

7.5.1. Elueerimislahustid (4.4)

Lahusti A:

0,3 mM naatriumdivesinikfosfaadi ja 3 mM naatriumatsetaadi lahus (pH reguleeritud äädikhappega tasemeni 6,5): metanool: tetrahüdrofuraan = 558 : 440 : 2 (v/v/v)

Lahusti B:

metanool

7.5.2. Soovitatav elueerimisgradient:

Aeg (min) | Lahusti A (%) | Lahusti B (%) | Voolukiirus (ml/min) |

Initial | 40 | 60 | 0 |

0,1 | 40 | 60 | 0,1 |

5,0 | 40 | 60 | 01 |

6,0 | 40 | 60 | 0,1 |

6,5 | 40 | 60 | 1,0 |

9,0 | 36 | 64 | 1,0 |

10,0 | 20 | 80 | 1,0 |

11,5 | 16 | 84 | 1,0 |

12,0 | 16 | 84 | 1,0 |

16,0 | 10 | 90 | 1,0 |

19,0 | 0 | 100 | 1,0 |

20,0 | 0 | 100 | 1,0 |

21,0 | 40 | 60 | 1,0 |

29,0 | 40 | 60 | 1,0 |

30,0 | 40 | 60 | 0 |

Märkus:

Joonisel 1 näidatud resolutsiooni saamiseks võib olla vaja elueerimisgradienti natuke muuta.

Kolonni temperatuur: 30 °C.

7.5.3. Süstitav maht: 50 l derivatiseerimisreaktiivi ja 50 l proovilahust.

7.5.4. Kolonni tasakaalustamine

Kui süsteemi käivitatakse iga päev, loputatakse kolonni 15 minutit 100 % lahustiga B, seejärel segatakse A : B 40 : 60 ja tasakaalustatakse 1 ml/min juures 15 minutit. Tehakse pimekatse, süstides metanooli (4.2.1).

Märkus:

Enne pikaajalist hoiustamist loputatakse kolonni metanooli ja kloroformi seguga (80 : 20 (v/v)) 30 minutit.

7.5.5. PS + PE sisalduse määramine uuritavas proovis

7.5.6. Tehakse järjestikused kromatograafilised analüüsid, hoides nende läbiviimise vahelise aja konstantsena, et saada konstantseid peetumisaegu. Kalibreerimisteguri hindamiseks lisatakse proovilahusele iga 5–10 proovi tagant välisstandardlahust (7.3).

Märkus:

Pärast iga 20–25 käitamist tuleb kolonni puhastada, loputades vähemalt 30 minutit 100 %lise lahustiga B (7.5.1).

7.6. Integratsioonimeetod

7.6.1. PEDP piik

PEDPi elueeritakse ühe piigina. Piigi pindala määratakse miinimumist miinimumini integreerides.

7.6.2. Trüptamiinipiik

Trüptamiini elueeritakse ühe piigina (joonis 1). Piigi pindala määratakse miinimumist miinimumini integreerides.

7.6.3. PS ja PE piigirühmad

Kirjeldatud tingimustel (joonis 1) elueeritakse PSi kahe peamise osaliselt lahknemata piigina, millele eelneb väikseim piik. PEd elueeritakse kolme peamise osaliselt lahknemata piigina. Määratakse kindlaks iga piigirühma kogupindala, asetades lähtejoone joonisel 1 esitatud viisil.

8. Tulemuste arvutamine ja esitamine

PS ja PE sisaldus uuritavas proovis arvutatakse järgmiselt:

C = 55,36 1×

T1T2

kus

C = PS või PE sisaldus uuritavas proovis (mg/100 g pulbri kohta)

1 = standardproovi lahuse (7.3) PEDP piigipindala

2 = uuritava proovi lahuse (7.2) PS või PE piigipindala

1 = standardproovi lahuse (7.3) trüptamiini piigipindala

2 = uuritava proovi lahuse (7.2) trüptamiini piigipindala.

9. Täpsus

Märkus:

Korratavuse väärtused on arvutatud IDFi rahvusvahelise standardi [1] kohaselt. Reprodutseeritavuse esialgne piir on arvutatud käesoleva määruse III lisa punktis b määratletud menetluse kohaselt.

9.1. Korratavus

Suhteline standardhälve ehk korratavus, mis väljendab sõltumatute analüüsitulemuste varieeruvust ning mis on lühikese aja jooksul saadud ühe ja sama analüüsija poolt samades tingimustes samade seadme ja prooviga, ei tohi ületada 2 %. Kui nendes tingimustes on saadud kaks tulemust, ei tohi kahe tulemuse suhteline erinevus olla suurem kui 6 % tulemuste aritmeetilisest keskmisest.

9.2. Reprodutseeritavus

Kui eri laboratooriumide analüüsijad on ühe ja sama proovi analüüsimisel saanud kaks erinevat tulemust, kasutades eri seadmeid erinevates tingimustes, ei tohi kahe tulemuse suhteline erinevus olla suurem kui 11 % nende tulemuste aritmeetilisest keskmisest.

10. Viited

10.1. Resmini P., Pellegrino L., Hogenboom J. A., Sadini V., Rampilli M., "Detection of buttermilk solids in skimmilk powder by HPLC quantification of aminophospholipids." Sci. Tecn. Latt.-Cas., 39,395 (1988).

+++++ TIFF +++++

[1] Rahvusvaheline IDFi standard 135B/1991. Piim ja piimasaadused. Analüüsimeetodite täpsusomadused. Ühisuuringute menetluse lühiiseloomustus.

--------------------------------------------------

XXI LISA

(Artikkel 15)

MIKROOBIVASTASTE AINETE JA SULFOONAMIID/DAPSONI JÄÄKIDE KINDLAKSMÄÄRAMINE LÕSSIPULBRIS

Kasutatakse mikroobiinhibiitorite lausteimimist mikroorganismil Bacillus stearothermophilus var. calidolactis C953, mis on piisavalt tundlik selleks, et määrata 4 μg bensüülpenitsilliini ja 100 μg sulfadimidiini olemasolu ühes liitris lõssis. On olemas kaubanduslikul eesmärgil toodetavad teimimiskomplektid, mida võib kasutada, kui nende tundlikkus bensüülpenitsilliini ja sulfadimidiini suhtes vastab nõuetele. [1]

Testimisel kasutatakse pulbrilõssi (1 g pulbrit + 9 ml destilleeritud vett). Testitakse IDF-bülletääni nr 258/1991 1. jao 2. peatüki või teimimiskomplekti tootja juhendi kohaselt.

Positiivseid tulemusi interpreteeritakse järgmiselt.

1. Testi korratakse teimisüsteemil, millele on lisatud penitsillinaasi:

Positiivne tulemus: käesoleva menetlusega ei ole võimalik inhibeerivat ainet kindlaks teha.

Negatiivne tulemus: inhibeeriv aine on -laktaamantibiootikum.

2. Testi korratakse teimisüsteemil, millele on lisatud p-aminobensoehapet:

Positiivne tulemus: käesoleva menetlusega ei ole võimalik inhibeerivat ainet kindlaks teha;

Negatiivne tulemus: inhibeeriv aine on sulfoonamiid/dapson.

3. Testi korratakse teimisüsteemil, millele on lisatud penitsillinaasi ja p-aminobensoehapet:

Positiivne tulemus: käesoleva menetlusega ei ole võimalik inhibeerivat ainet kindlaks teha.

Negatiivne tulemus: inhibeerivad ained on -laktaamantibiootikum ja sulfoonamiid/dapson.

[1] Oluline märkus:Lõssipulbri analüüsil võivad esineda ekslikud positiivsed tulemused. Seetõttu on oluline kontrollida, et kasutatud teimisüsteem ei annaks ekslikke positiivseid tulemusi.

--------------------------------------------------

XXII LISA

(Artikkel 16)

SEGASÖÖDA LÕSSIPULBRISISALDUSE KVANTITATIIVNE MÄÄRAMINE PARAKASEIINI ENSÜMAATILISE KOAGULATSIOONI ABIL

1. Eesmärk

Segasööda lõssipulbrisisalduse kvantitatiivne määramine parakaseiini ensümaatilise koagulatsiooni abil.

2. Reguleerimismisala

Kõnealust meetodid kohaldatakse segasööda suhtes, mis sisaldab vähemalt 10 % lõssipulbrit; petipiima ja/või teatavate mittepiimavalkude suured kogused võivad määramisel põhjustada häireid.

3. Meetodi põhimõte

3.1. Segasöödas sisalduva kaseiini ekstraheerimine naatriumtsitraadilahuse abil.

3.2. Kaltsiumioonide sisalduse reguleerimine parakaseiini sadestamiseks nõutavale tasemele; laabi lisamisel saadakse kaseiinist parakaseiin.

3.3. Parakaseiini sademe lämmastikusisaldus määratakse IDFi standardis 20 A 1986 kirjeldatud Kjeldahli meetodiga; lõssipulbri kogus arvutatakse kaseiini minimaalselt 27,5 % suuruse sisalduse põhjal (vaata punkt 9.1).

4. Reaktiivid

Kasutatavad reaktiivid peavad olema analüütiliselt puhtad. Kasutada tuleb destilleeritud või samaväärse puhtusastmega vett. Reaktiivid ja lahused ei tohi sisaldada lämmastikuühendeid, välja arvatud laap (4.5).

4.1. Trinaatriumtsitraat, dihüdraat (ühe (massi/mahu)protsendiline lahus).

4.2. Kaltsiumkloriid (2M lahus). Kaalutakse sobiva suurusega (150–200 ml) portselanalusele või keeduklaasi 20,018 g (analüütiliselt puhast) CaCO3. Valatakse peale destilleeritud vesi ja asetatakse keeva vee vanni. Lisatakse aeglaselt 50–60 ml HCl lahust (vahekorras HCl : vesi = 1 : 1) karbonaadi täielikuks lahustamiseks. Hoitakse keeva vee vannis, kuni CaCl2 on kuivanud, et kõrvaldada reageerimata HCl. Kantakse destilleeritud veega 100 ml mõõtekolbi ning see täiendatakse märgini. Mõõdetakse pH väärtus, mis ei tohi olla madalam kui 4,0. Lahust säilitatakse külmikus.

4.3. 0,1 N naatriumhüdroksiid.

4.4. 0,1 N soolhape.

4.5. Vasikamaolaap (standarditud laabilahus 1 : 10000). Säilitada külmikus temperatuuril 4–6 °C

4.6. Reaktiivid, mida on vaja lämmastikusisalduse kvantitatiivseks määramiseks Kjeldahli meetodil vastavalt IDFi standardile 20A 1986.

5. Seadmed

Tavalised laboratooriumiseadmed, sealhulgas:

5.1. Uhmer või homogenisaator

5.2. Analüütilised kaalud

5.3. 50 ml küvettidega lauatsentrifuug (2000–3000 pööret minutis)

5.4. 10–15 mm pikkuste segajatega magnetsegur

5.5. 150–200 ml keeduklaasid

5.6. 250–500 ml kolvid

5.7. 60–80 mm läbimõõduga klaaslehtrid

5.8. 150 mm läbimõõduga tuhavabad kiirfiltrid (S.S. 5892, S.S. 595 ½)

5.9. Mitmesuguse nimimahuga pipetid

5.10. Termostateeritav vesivann, seatud temperatuurile 37 °C

5.11. pH-meeter

5.12. Kjeldahli kolvid, mineraliseerimiseks ja destilleerimiseks, ning lisaseadmed

5.13. 25 ml mõõtebürett

5.14. Plastikpihusti destilleeritud vee jaoks

5.15. Roostevabast terasest spaatlid

5.16. Kraadiklaasid

5.17. Reguleeritava temperatuuriga kuivatuskapp.

6. Analüüsi käik

6.1. Proovi ettevalmistamine

Homogeense segu saamiseks jahvatatakse uhmris või homogeenitakse veskis 10–20 g proovi.

6.2. Lõssipulbri lahustamine ja lahustumatu jäägi eraldamine.

6.2.1. 1,000 ± 0,002 g hästi homogeenitud segasööda (6.1) kaalutis pannakse otse 50 ml tsentrifuugiküvetti. Lisatakse 30 ml eelnevalt 45 °C kuumutatud trinaatriumtsitraadi lahust (4.1). Segatakse magnetseguriga vähemalt viis minutit.

6.2.2. Tsentrifuugitakse 500 g juures (2000–3000 pööret minutis) 10 minutit ja kallatakse läbipaistev supernatant 150–200 ml keeduklaasi, jälgides, et põhjast ei tuleks kaasa sadet.

6.2.3. Jääki ekstraheeritakse veel kaks korda samal viisil ja saadud ekstraktid ühendatakse esimesega.

6.2.4. Kui pinnale moodustub õlikiht, jahutatakse külmikus, kuni rasv on tahkunud ning eemaldatakse see spaatliga.

6.3. Kaseiini koaguleerimine laapensüümide abil.

6.3.1. Saadud vesilahusele (umbes 100 ml) lisatakse pidevalt segades tilkhaaval 3,4 ml küllastunud kaltsiumkloriidi lahust (4.2). Reguleeritakse NaOH (4.3) ja HCL (4.4) lahustega pH-tase vahemikku 6,4–6,5. Lahus asetatakse 15–20 minutiks 37 °C juures termostateeritud vesivannile soolade tasakaalu saabumiseni. Sellest annab märku lahuse kerge hägustumine.

6.3.2. Vedelik kantakse ühte (või kahte) tsentrifuugiküvetti ja tsentrifuugitakse 2000 g juures 10 minutit, et eemaldada sadestunud materjal. Supernatant viiakse ühte (või kahte) tsentrifuugiküvetti ilma sadet pesemata.

6.3.3. Supernatandi temperatuur reguleeritakse 37 °C-le. Ekstrakti segades lisatakse tilkhaaval 0,5 ml vedelat laapi (4.5). Koagulatsioon toimub 1–2 minuti pärast.

6.3.4. Proov asetatakse uuesti vesivannile ja jäetakse 15 minutiks seisma temperatuuril 37 °C. Proov võetakse vannilt ära ning koagulaat segatakse läbi. Tsentrifuugitakse 10 minutit 2000 g juures. Supernatant filtreeritakse läbi sobiva filterpaberi [1] (Whatman nr 541 või samaväärne paber) ning filterpaber säilitatakse. Sadet pestakse, segades seda tsentrifuugiküvetis 50 ml veega temperatuuril umbes 35 °C.

Tsentrifuugitakse uuesti 2000 g juures 10 minutit. Supernatant filtreeritakse läbi varem kasutatud filterpaberi.

6.4. Kaseiinis sisalduva lämmastiku määramine.

6.4.1. Pärast pesemist kantakse sade destilleeritud veega kvantitatiivselt varem kasutatud (punkt 6.3.4) filterpaberile. Filterpaber pannakse Kjeldahli kolbi. Lämmastikusisaldus määratakse IDFi standardis 20 A 1986 kirjeldatud Kjeldahli meetodiga.

7. Pimekatse

7.1. Pimekatse tegemisel kasutatakse alati tuhavaba filterpaberit (5.8), mida on niisutatud 90 ml-st naatriumtsitraadilahusest (4.1), 1 ml-st küllastunud kaltsiumkloriidi lahusest (4.2) ja 0,5 ml-st vedelast laabist (4.5) koosneva seguga ning pestakse 3 × 15 ml destilleeritud veega enne mineraliseerimist IDFi standardis 20 A 1986 kirjeldatud Kjeldahli meetodiga.

7.2. Pimekatsel kulunud happe maht lahutatakse proovi tiitrimisel kulunud happe (4.4) mahust.

8. Kontrollkatse

8.1. Eespool nimetatud menetluse ja reaktiivide kontrollimiseks määratakse standardsegasööt, mille lõssipulbrisisaldus on kindlaks määratud ühisuuringute käigus. Kahe määramise keskmine tulemus ei tohi ühisuuringu tulemusest erineda rohkem kui 1 %.

9. Tulemuste esitamine

9.1. Segasöödas sisalduva lõssipulbri protsent arvutatakse järgmise valemi abil:

% MMP =

27,5

-- 2,81

0,908

kus N on lämmastiku protsent parakaseiinis; 27,5 on konstant, mille abil kindlaksmääratud kaseiini sisaldus arvutatakse ümber lõssipulbri protsendiks; 2,81 ja 0,908 on regressioonanalüüsiga saadud parandusfaktorid.

10. Meetodi täpsus

10.1. Korratavus

Vähemalt 95 % uuritud juhtudest ei tohi ühe ja sama töötleja poolt ühes ja samas laboratooriumis ühe ja sama proovi analüüsitulemuste erinevus olla suurem kui 2,3 grammi lõssipulbrit 100 grammi segasööda kohta.

10.2. Reprodutseeritavus

Vähemalt 95 % uuritud juhtudest ei tohi kahes laboratooriumis ühe ja sama proovi analüüsitulemuste erinevus olla suurem kui 6,5 grammi lõssipulbrit 100 grammi segasööda kohta.

11. Lubatud hälve

CrD95-väärtus (kriitiline diferents; 95 %line usalduspiir) arvutatakse järgmise valemi abil (ISO 5725):

CrD

(R: reprodutseeritavus; r: korratavus)

Kaks määramist: CrD95 = 4,5 g

Kui keemilise analüüsi tulemus erineb deklareeritud lõssipulbrisisaldusest rohkem kui 4,5 g (kahe määramise põhjal), loetakse segasööda saadetis vastavaks määruse käesolevale sättele.

12. Märkused

12.1. Teatavate mittepiimavalkude, eriti sojajahuvalkude suure koguse lisamine lõssipulbrile kuumutamise ajal võib anda liiga kõrge protsendi, mis on tingitud piimas sisalduva parakaseiini kaasasadestumisest.

12.2. Petipiima lisamine võib anda mõnevõrra madalama protsendi, mis on tingitud sellest, et määratakse ainult rasvavaba osa. Teatava hapukoorepeti lisamine võib anda suhteliselt madala protsendi, kuna lahustumine tsitraadilahuses ei ole täielik.

12.3. 0,5 % või suurema koguse letsitiini lisamine võib samuti anda madalama protsendi.

12.4. Kõrgkuumutatud lõssipulbri lisamine võib anda liiga kõrge protsendi, mis on tingitud teatavate vadakuvalkude sadestumisest koos piimas sisalduva parakaseiiniga.

[1] Kasutatakse tuhavaba kiirfilterpaberit.

--------------------------------------------------

XXIII LISA

(Artikkel 17)

TÄRKLISE KVALITATIIVNE MÄÄRAMINE LÕSSIPULBRIS, DENATUREERITUD PIIMAPULBRIS JA SEGASÖÖDAS

1. Reguleerimismisala

Kõnealust meetodit kasutatakse sellise tärklise määramiseks, mida kasutatakse märgistusainena denatureeritud piimapulbris.

Meetodi avastamispiir on ligikaudu 0,05 g tärklist 100 grammi proovi kohta.

2. Põhimõte

Reaktsioon põhineb jodomeetrias kasutataval reaktsioonil:

- vaba joodi kolloidide määramine vesilahuses,

- imendumine tärklise mitsellidega ning värvuse tekkimisega.

3. Reaktiivid

3.1. Joodilahus

- jood: 1 g,

- kaaliumjodiid: 2 g,

- destilleeritud vesi: 100 ml.

4. Seadmed

4.1. Analüütilised kaalud

4.2. Vesivann

4.3. Katseklaasid 25 mm × 200 mm

5. Analüüsi käik

Kaalutakse 1 gramm proovi ning valatakse see katseklaasi (4.3).

Lisatakse 20 ml destilleeritud vett ja loksutatakse, et proov jaotuks.

Seejärel asetatakse 5 minutiks keeva veega vesivanni (4.2).

Eemaldatakse vannilt ning jahutatakse toatemperatuurini.

Lisatakse 0,5 ml joodilahust (3.1), loksutatakse ning jälgitakse tekkivat värvust.

6. Tulemuste esitamine

Siniseks värvumine näitab loodusliku tärklise esinemist proovis.

Kui proov sisaldab modifitseeritud tärklist, ei ole värvus sinine.

7. Märkused

Värvus, selle intensiivsus ning tärklise mikroskoopiline kujutis erinevad olenevalt loodusliku tärklise päritolust (nt mais või kartul) ning proovis esineva modifitseeritud tärklise liigist.

Modifitseeritud tärklise esinemisel muutub tekkiv värvus violetseks, punaseks või pruuniks vastavalt loodusliku tärklise kristallistruktuuri muutumise astmele.

--------------------------------------------------

XXIV LISA

(Artikkel 18)

HAPUKOOREPETI PULBRI NIISKUSESISALDUSE MÄÄRAMINE

1. Reguleerimismisala

Loomasöödaks mõeldud hapukoorepeti pulbri niiskusesisalduse määramine.

2. Põhimõte

Proov kuivatatakse vaakumis. Massi kadu määratakse kaalumise abil.

3. Seadmed

3.1. Analüütilised kaalud

3.2. Õhukindlalt suletavad roostevabast metallist või klaasist kuivad anumad; põhjaga, millele saab analüüsitavat proovi laotada tihedusega 0,3 g/cm2.

3.3. Reguleeritava temperatuuriga elektriline vaakumkuivatuskapp, mis on varustatud õlipumbaga ning kuhu saab juhtida kuuma ja kuiva õhku või kuhu pannakse kuivatusaine (nt kaltsiumoksiid).

3.4. Tõhusat kuivatusainet sisaldav eksikaator.

3.5. Ventileeritav ja termostateeritav kuivatuskapp, seatud temperatuurile 102 ± 2 °C.

4. Analüüsi käik

Kaanega anumat (3.2) kuumutatakse kuivatuskapis (3.5) vähemalt üks tund. Kaas asetatakse anumale, anum pannakse kohe eksikaatorisse (3.4), lastakse jahtuda toatemperatuurini ja kaalutakse täpsusega 0,5 mg.

Kaanega anum (3.2) kaalutakse täpsusega 0,5 mg. Teadaoleva kaaluga anumasse pannakse umbes 5 g täpsusega 1 mg kaalutud proovi kaalutis ja laotatakse see ühtlaselt laiali. Kaaneta anum pannakse eelnevalt temperatuurini 83 °C kuumutatud vaakumkuivatuskappi (3.3). Anum asetatakse ahju võimalikult kiiresti, et vältida kuivatuskapi jahtumist.

Rõhk tõstetakse 100 torrini (13,3 kPa) ja proov jäetakse sellise rõhu all umbes neljaks tunniks kuivama kas kuuma kuiva õhu voolus või kuivatusaine juuresolekul (umbes 300 g 20 proovi kohta). Kui kasutatakse kuivatusainet, ühendatakse vaakumpump lahti pärast ettenähtud rõhu saavutamist. Kuivamisaega arvestatakse alates hetkest, kui kuivatuskapi temperatuur on jälle 83 °C. Ettevaatlikult taastatakse kuivatuskapis atmosfäärirõhk. Avatakse kuivatuskapp, asetatakse kaas kohe anumale, võetakse anum ahjust välja, lastakse jahtuda 30–45 minutit eksikaatoris (3.4) ja kaalutakse milligrammi täpsusega. Kuivatatakse veel 30 minutit vaakumkuivatuskapis (3.3) temperatuuril 83 °C ning kaalutakse uuesti. Kahe kaalumistulemuse erinevus ei tohi olla suurem kui 0,1 % niiskuse kaalust.

5. Arvutamine

100E

kus

E = analüüsitava proovi algmass grammides,

m = kuiva analüüsitava proovi mass grammides.

6. Täpsus

6.1. Korratavus

Võimalikult lühikese ajavahemiku järel samade seadmetega ühe ja sama analüüsija poolt identse materjaliga läbiviidud kahe määramise tulemuste vaheline erinevus ei tohi olla suurem kui 0,4 g vett 100 g hapukoorepeti pulbri kohta.

6.2. Reprodutseeritavus

Eri laboratooriumide analüüsijate poolt eri seadmetega identse materjaliga läbiviidud kahe määramise tulemuste vaheline erinevus ei tohi olla suurem kui 0,6 g vett 100 g hapukoorepeti pulbri kohta.

6.3. Täpsust iseloomustavate andmete päritolu

Täpsusandmed on kindlaks määratud 1995. aastal kaheksas laboratooriumis 12 prooviga läbiviidud katsete põhjal (6 kahekordset pimekatset).

--------------------------------------------------

XXV LISA

(Artikkel 19)

STANDARDMEETOD VÕÕRASTE RASVADE MÄÄRAMISEKS PIIMARASVAS TRIGLÜTSERIIDIDE GAASIKROMATOGRAAFILISE ANALÜÜSIGA — UUESTI LÄBI VAADATUD VERSIOON 1

1. Rakendatavus ja rakendusala

Käesoleva standardiga kehtestatakse meetod nii taimset kui ka loomset päritolu võõraste rasvade, nagu näiteks looma- ja searasv, määramiseks piimasaaduste piimarasvas triglütseriidide gaasikromatograafilise analüüsiga.

Puhtas piimarasvas tehakse söötmis- ja laktatsioonitingimustest olenemata taimsed ja loomsed rasvad nii kvalitatiivselt kui ka kvantitatiivselt kindlaks teatavaid triglütseriidvalemeid kasutades.

Märkus 1:

Kuigi taimsetes rasvades on väikesi ja keskmisi piimarasva koguseid võimalik määrata ainult piimarasvas esineva võihappe (C4) järgi, ei saa selle järgi C4 sisalduse suure varieeruvuse tõttu 3,5 ja 4,5 massiprotsendi vahemikus kvalitatiivselt ja kvantitatiivselt kindlaks teha kuni 20 massiprotsendi sisaldusega võõraid rasvu puhtas piimarasvas.

Märkus 2:

Et sõltuvalt tootmis- ja töötlemistingimustest steroolide sisaldus taimsetes rasvades muutub, on kvantitatiivseid tulemusi tegelikult võimalik saada ainult triglütseriidide analüüsiga.

2. Mõiste

Piimarasvas sisalduvad võõrad rasvad: standardi kohaselt on võõrad rasvad kõik taimsed ja loomsed rasvad, välja arvatud piimarasv.

3. Meetodi põhimõte

Pärast piimarasva eraldamist valmistatakse põhilahus. Põhilahuses määratakse kolonngaasikromatograafiliselt triglütseriidide (erineva süsinikuaatomite üldarvuga molekulide) sisaldus. Asendades vastavas triglütseriidvalemis eri suurusega molekulide (C24 – C54, ainult paarisarvud) kaaluprotsendid, määratakse võõrad rasvad kas kvalitatiivselt või kvantitatiivselt.

Märkus:

Kui on tagatud tulemuste samaväärsus, võib käesoleva analüüsimeetodi rakendamisel kasutada ka kapillaargaasikromatograafiat. [1]

4. Reaktiivid

Tuleb kasutada analüütilise puhtusastmega kemikaale.

4.1. Kandegaas: ≥ 99,996 % puhtusastmega lämmastik.

4.2. Standardsed küllastatud triglütseriidid [2] ja kolesterool standardse piimarasva standardimiseks vastavalt jaotisele 6.5.4.

4.3. Metanool, veevaba.

4.4. n-heksaan.

4.5. n-heptaan.

4.6. Tolueen

4.7. Dimetüüldiklorosilaani lahus: 50 ml dimetüüldiklorosilaani lahustatakse 283 ml tolueenis.

4.8. Põletusgaasid: Vesinik ja sünteetiline õhk.

4.9. Statsionaarne faas: 125/150 μm (100/120 mesh) Gas ChromQ, millele on kantud 3 % OV-1. [3]

4.10. 10 % kakaovõi lahus.

5. Seadmed

Tavalised, eeskätt järgmised laboratooriumiseadmed.

5.1. Kõrgtemperatuurigaasikromatograaf, mis on kohandatud tööks vähemalt 400–450 °C juures ning varustatud leekionisatsioonidetektoriga (FID) ja kandegaasi massi pidevvoolu kontrolleriga. Põletusgaaside voolukiirus: 30 ml/min (H2), 270 ml/min (sünteetiline õhk).

Kuna kandegaasi voolukiirus on kõrge, peaks põleti suue olema eriti suur.

Märkus:

Kõrge temperatuuri tõttu triglütseriidide analüüsil tuleb FIDi ja injektsioonisüsteemi klaasdetaile sageli puhastada.

Gaasikromatograaf tuleb varustada kõrget temperatuuri taluvate lekkimiskindlate vaheseinadega, mis peavad vastu sagedasele kasutamisele.

Märkus:

Sobivad Chromblue (tm) vaheseinad (Chrompack).

Vaheseinu tuleb vahetada korrapäraselt, näiteks 100 injektsiooni järel, või siis, kui lahutusvõime väheneb (vt joonis 4).

5.2. Kromatograafiakolonn

U-kujuline klaaskolonn (siseläbimõõt 2 mm, pikkus 500 mm), klaasi pinna desaktiveerimiseks silaanitud dimetüüldiklorosilaaniga vastavalt jaotisele 6.1.

Märkus:

Sobivad ka pikemad (80–2000 mm) kolonnid. Nende abil võib saavutada tulemuste mõnevõrra parema reprodutseeritavuse. Teisest küljest, nende kolonnide puhul võivad pärast tööd statsionaarsesse faasi tekkida lõhed, mis omakorda võivad anda vähem täpseid kvantitatiivseid tulemusi. Lisaks sellele võib FIDi leek kandegaasi nõutava ülisuure voolukiiruse tõttu (75–85 ml/min) kergesti kustuda.

5.3. Kolonni täitmise seade (vt joonis 1)

+++++ TIFF +++++

5.3.1. Pealekeeratavate otsikutega plastkolonn, millel on statsionaarse faasi nõutavat taset näitav märk.

5.3.2. Keermelise otsikuga peen sõel (avad ligikaudu 100 μm) klaaskolonni sulgemiseks, nagu on näidatud joonisel 1.

5.3.3. Desaktiveeritud (silaanitud) klaasvill.

5.3.4. Vibraator statsionaarse faasi ühtlaseks jaotamiseks kolonni täitmisel.

5.4. Silikageeliga täidetud 1–3 ml Extrelut-kolonn. [4] Seda kolonni võib kasutada teise võimalusena piimarasva eraldamiseks.

5.5. 6 mm avaga 6,4 mm (1/4″) grafiittihend.

5.6. Seadmed kolonni klaaspinna silaanimiseks vastavalt jaotisele 6.1.

5.6.1. Woulffi pudel.

5.6.2. Veejugapump.

5.7. Vesivann, reguleeritav temperatuurile 50 ± 2 °C.

5.8. Kuivatuskapp, reguleeritav temperatuuridele 50 ± 2 °C ja 100 ± 2 °C.

5.9. Mikropipett.

5.10. 5 ml gradueeritud pipett 1,5 ml metanooli doseerimiseks.

5.11. 50 ml ümarkolb.

5.12. 50 ml Erlenmeyeri kolb.

5.13. Lehter.

5.14. Peenepooriline filter.

5.15. Pöördauruti.

5.16. 1 ml nominaalmahutavusega alumiiniumkapsliga suletavad ampullid, mille sees on vahesein.

5.17. Injektsioonisüstal, mille kolb ei ulatu nõela tipuni.

Märkus:

Sellised süstlad võimaldavad saavutada tulemuste paremat reprodutseeritavust.

Selleks et vältida vaheseina kahjustamist, tuleb nõela otsa korrapäraselt kontrollida (näiteks stereomikroskoobi abil).

6. Analüüsi käik

6.1. Kolonni ettevalmistamine (silaanimine)

Pärast seda, kui Woulffi pudel on joonise 2 kohaselt ühendatud veejugapumbaga, pannakse vooliku 2 ots lahusesse (4.7). Korkkraani sulgemisel kolonn täitub; nüüd eemaldatakse mõlemad voolikud.

+++++ TIFF +++++

Kolonn kinnitatakse statiivile ja täiendatakse pipeti abil dimetüüldiklorosilaani lahusega ääreni.

20–30 minuti pärast asendatakse Woulffi pudel Bunseni kolviga ja kolonn tühjendatakse sellega ühendatud veejugapumba abil (vt joonis 3).

6.2. Kolonni täitmine

Seejärel kolonn pestakse, voolutades sellest läbi 75 ml tolueeni ja 25 ml metanooli; tühjendatud kolonni kuivatatakse kuivatuskapis 100 °C juures umbes 30 minutit.

+++++ TIFF +++++

Kolonni täitmiseks kasutatakse joonisel 1 kujutatud seadet. Plastkolonn täidetakse statsionaarse faasiga (4.9) märgini. Täidetava klaaskolonni alumisse otsa lükatakse terasvarda abil umbes 1 cm pikkune eelnevalt silaanitud klaasvillatropp. Seejärel suletakse kolonni ots sõelaga (5.3.2).

Kolonn täidetakse rõhu all (3 baari, N2 atmosfäär) statsionaarse faasiga. Selleks et täitumine oleks ühtlane, katkestusteta ja stabiilne, liigutatakse täitmise ajal piki kolonni edasi-tagasi vibraatorit.

Pärast täitmist pistetakse tihe silaanitud klaasvillatropp ka kolonni teise otsa, väljaulatuvad otsad lõigatakse maha ja tropp surutakse spaatliga mõne millimeetri võrra sissepoole.

6.3. Proovide valmistamine

Proovi valmistamiseks võib valida ühe järgmisest kolmest meetodist.

6.3.1. Piimarasva eraldamine võist

5 kuni 10 g võid sulatatakse sobivas anumas vesivannil (5.7) 50 °C juures.

50 ml Erlenmeyeri kolb ja filtriga (5.14) lehter soojendatakse kuivatuskapis 50 °Cni. Sulatatud võiproovi rasvakiht filtreeritakse eelsoojendatud seadme abil.

Nii saadud piimarasv on peaaegu fosfolipiidivaba.

6.3.2. Rasvafraktsiooni eraldamine Röse-Gottliebi meetodil.

Rasv eraldatakse vastavalt IDFi standardile I C: 1987, 16C: 1987, 116 A: 1987 või 22B: 1987.

Sellisel meetodil saadud piimarasvas sisalduvad fosfolipiidid suurendavad kolesteroolipiiki ligikaudu 0,1 %.

See mõjutab koos kolesterooliga 100-le normitud triglütseriidide spektrit vaid tähtsusetul määral.

6.3.3. Piimast eraldamine silikageelkolonnide abil

1–3 ml Extrelut-kolonnile kantakse mikropipetiga (5.4) 0,7 ml 20 °C temperatuuriga piimaproovi ja lastakse sellel silikageelis ligikaudu 5 minuti jooksul ühtlaselt jaotuda.

Valkude ja lipiidide komplekside denatureerimiseks lisatakse pipeti abil 1,5 ml metanooli. Seejärel ekstraheeritakse proov 20 ml n-heksaaniga. N-heksaani lisatakse aeglaselt väikeste portsjonite haaval ja väljavoolav eluaat kogutakse eelnevalt konstantse kaaluni kuivatatud 50 ml ümarkolbi.

Pärast ekstraheerimist lastakse kolonn tühjaks.

Solvendid destilleeritakse eluaadist välja pöördkuivati abil vesivannil 40–50 °C temperatuuri juures.

Kolb kuivatatakse ja rasva saagis määratakse kaalumise teel.

Märkus:

Rasva eraldamine Gerberi, Weibull-Berntropi või Schmid-Bondzynski-Ratzlaffi meetodil või detergentide abil (BDI-meetod) ei sobi triglütseriidide analüüsi puhul, sest nende meetodite kasutamisel võivad rasvafaasi sattuda suuremad kogused mittetäielikult esterdunud glütseriide ja fosfolipiide.

6.4. Proovilahuse valmistamine

Gaasikromatograafiliseks analüüsiks kasutatakse jaotise 6.3 kohaselt saadud 5 % rasvalahust n-heptaanis. Selle proovilahuse valmistamiseks kaalutakse vajalik kogus jaotiste 6.3.1 või 6.3.2 kohaselt saadud proovimaterjali ja lahustatakse see nõutavas koguses n-heptaanis.

Juhul kui proovimaterjal on saadud jaotise 6.3.3 kohaselt, arvutatakse kolvis olevale proovimaterjalile lisatav n-heptaani kogus kaalumistulemuste alusel ning selles lahustatakse kogu kolvis olev jääk.

Ligikaudu 1 ml proovilahust suletakse ampulli (jagu 5.16).

6.5. Triglütseriidide kromatograafiline määramine

Kõrgel temperatuuril (kuni 350 °C), mida kasutatakse pikaahelaliste triglütseriidide (C52–C56) elueerimiseks, tõuseb nulljoon kiiresti, eriti siis, kui kolonn ei ole enne piisavalt tasakaalustatud. Nulljoone tõusu saab täielikult kompenseerida kas kahe kolonni ühendamise või nulljoone lahutamise abil.

Kompensatsioonikolonni puhul või töötamisel ühe kolonniga, samuti injektori ja detektori klaasvahepitside puhul tuleb kasutada grafiittihendeid (5.5).

6.5.1. Nulljoone korrigeerimine

Nulljoone tõusu kompenseerimiseks võib kasutada ühte järgmisest neljast meetodist.

6.5.1.1. Kolonnide ühendamine

Kahte täidetud kolonni kasutatakse kompenseerival viisil.

6.5.1.2. Nulljoone korrigeerimine gaasikromatograafi abil

Nulljoone tõusu saab kompenseerida, kui rasvalahust süstimata teha gaasikromatograafiga üks voolutuskatse ja saadud nulltase edaspidi tulemustest lahutada.

6.5.1.3. Nulljoone korrigeerimine integreeriva tarkvara abil

Nulljoone tõusu saab kompenseerida, kui rasvalahust süstimata teha voolutuskatse integreeriva süsteemiga ja saadud nulltase edaspidi tulemustest lahutada.

6.5.1.4. Nulljoone korrigeerimine hea tasakaalustamise abil

Kui kolonn eelnevalt hästi tasakaalustada ja teha 20 piimarasvalahuse injektsiooni, tõuseb nulljoon kõrgel temperatuuril sageli nii vähe, et seda ei ole vaja korrigeerida.

6.5.2. Injektsioonimeetod

Et ära hoida diskriminatsiooniefekti ja saavutada kõrge keemistemperatuuriga triglütseriidkomponentide lahutamisel paremaid kvantitatiivseid tulemusi, rakendatakse kuuminjektsiooni meetodit. Rasvalahus tõmmatakse süstlasse ja külma süstlanõela soojendatakse enne süstimist injektsioonipesas ligikaudu 3 sekundit. Seejärel süstitakse kiiresti süstla sisu.

Märkus:

Sellise injektsioonimeetodi puhul väheneb fraktsioneerumise oht süstla sees, samuti injektsioonibloki oht. Otsest pealtsüstimist kolonni kuuma pikendatud ülaosasse ei kasutata, sest kui vahetada korrapäraselt injektori vahepitsi, võimaldab käesolev meetod kolonni lahti monteerimata sinna kogunenud vaheseinaosakesi ja saastet hõlpsasti vältida.

Et mitte kahjustada vaheseina, tuleb kindlasti hoida ära nõelaotsa deformeerimist, vältides selle puutumist vastu proovianuma põhja (defektid ei pruugi silmaga märgatavad olla).

+++++ TIFF +++++

6.5.3. Täidetud kolonni tasakaalustamine

Et hoida ära saastumist, ei ühendata kolonni ülemist otsa detektoriga allpool loetletud etappidel a–c.

Jaotise 6.2 kohaselt täidetud kolonn tasakaalustatakse järgmiselt:

a) N2 läbivoolutamine, 40 ml/min, 50 °C, 15 min;

b) temperatuuri tõstmine 355 °C-ni, 1 K/min, 10 ml N2/min;

c) hoidmine temperatuuril 335 °C 12–15 tundi;

d) kaks ühe mikroliitrilist kakaovõi lahuse (jagu 4.10) süsti ja vastav temperatuurirežiim;

e) kakskümmend 0,5mikroliitrilist piimarasva lahuse (jagu 6.4) süsti kahe kuni kolme päeva jooksul.

Märkus:

Kakaovõi koosneb peaaegu eranditult triglütseriididest C50–C56, mille keemistemperatuur on kõrge. Kakaovõi süstimise eesmärgiks ongi kolonni spetsiaalne tasakaalustamine pikaahelaliste molekulide juhtumil. Kõrge keemistemperatuuriga triglütseriidide C50–C54 puhul võib kalibreerimistegur olla mõnikord kuni 1,20. Piimarasvalahuse korduval süstimisel võib C50–C54 puhul tavaliselt oodata algselt suure kalibreerimisteguri vähenemist. Väikese atsüül-C arvuga triglütseriidide puhul läheneb kalibreerimisteguri väärtus 1-le. Valmistatakse ette kolm paari jaotise 6.2 kohaselt täidetud kolonni. Tasakaalustatud paare kontrollitakse tavalise piimarasva analüüsi abil.

Kasutamiseks valitakse kolonnipaar, mis annab kõige paremad kvantitatiivsed tulemused (kalibreerimisteguri väärtus on lähedane 1-le). Kolonne, mille puhul kaliibrimistegur on suurem kui 1,20, ei kasutata.

6.5.4. Kalibreerimine

Kalibreerimise puhul määratakse triglütseriidide ja piimarasva (standarditud rasva) kolesterooli kalibreerimistegurid, kasutades standarditud triglütseriide (triglütseriidide C24, C30, C36, C42, C48 ja C54 kasutamine on kohustuslik; peale selle on soovitav kasutada ka C50 ja C52). Vahepealsed kalibreerimistegurid on leitavad matemaatilise interpolatsiooni abil.

Standarditud rasvaga tehakse iga päev kaks või kolm kalibreerimist. Kui tulemused ligilähedaselt kattuvad, näitab see, et proovide triglütseriidide analüüsi tulemused on kvantitatiivselt hästi reprodutseeritavad.

Standarditud piimarasv säilib –18 °C või madalama temperatuuri juures mitu kuud ja järelikult sobib kasutamiseks standardina.

Märkus:

Iga koostisosa kalibreerimistegurit võib ka määrata, kasutades ühtse triglütseriidide sisaldusega rasva, näiteks CRM 519 (veevaba piimarasva), mida võib saada Komisjoni Etalonainete ja Mõõtmiste Instituudist, Geelist, Belgiast.

6.5.5. Temperatuurirežiim, kandegaas ja muud triglütseriidide analüüsi tingimused

Temperatuurirežiim: kolonni hoitakse 1 minut algtemperatuuril 210 °C, siis tõstetakse temperatuur 350 °C-ni kiirusega 6 °C/min ja kolonni hoitakse sellel temperatuuril 5 minutit.

Detektori ja injektori temperatuur: kumbki 370 °C.

Märkus:

Detektori, injektori ja ahju temperatuur (algtemperatuur) tuleb hoida püsivana (ka öösel, nädalavahetustel ja pikematel töövaheaegadel).

Kandegaas: lämmastik, voolukiirus 40 ml/min.

Märkus:

Juhul kui kasutatakse 80 cm kolonne, peab N2 voolu kiirus olema vähemalt 75 ml/min. Kandegaasi tuleb läbi voolutada katkestamatult (ka öösel, nädalavahetustel ja pikematel töövaheaegadel). Kandegaasi voolu tegelik kiirus tuleb välja reguleerida selliselt, et C54 elueeruks kolonni pikkusest olenemata 341 °C juures.

Analüüsi kestus: 29,3 minutit.

Süstitav maht: 0,5 μl

Märkus:

Pärast iga süstimist tuleb süstalt mõned korrad puhta heptaaniga loputada.

FID-tingimused: vastavalt jaotisele 5.1.

Märkus:

Leekionisatsioonidetektor süüdatakse iga tööpäeva alguses.

7. Integreerimine, määramine ja määramistingimuste kontrollimine

Paaritu atsüül-C arvuga (2n + 1) triglütseriidid liidetakse eelneva paaris atsüül-C arvuga (2n) triglütseriididega. Halvasti reprodutseeritavat väikest C56 sisaldust ei võeta arvesse. Kromatogrammi ülejäänud triglütseriidid (piikide ala), sealhulgas kolesterool (C24 läheduses asetsev piik), korrutatakse standarditud rasva vastavate kalibreerimisteguritega (viimasest kalibreerimisest) ja kõik koos normitakse ühele. Nõnda määratakse vaba kolesterool ning triglütseriidid C24, C26, C28, C30, C32, C34, C36, C38, C40, C42, C44, C46, C48, C50, C52 ja C54. Tulemused väljendatakse massiprotsentides (g/100 g).

Kromatogrammi piikide pindalad tuleb määrata nulljoont tõmbava integraatori abil. Pärast integreerimisparameetrite optimeerimist peab olema võimalik uuesti integreerida.

Joonistel 5 ja 6 on kaks triglütseriidide kromatogrammi näidet. Joonisel 5 kujutatud kromatogramm on hästi analüüsitav, joonisel 6 esineb aga juhuslik viga piirkonnas C50–C54, võrreldes joonisega 5 kulgeb nulljoon valesti. Selliseid tüüpilisi vigu saab suure tõenäosusega avastada ja vältida ainult nulljoont tõmbava integraatori abil.

+++++ TIFF +++++

Mõõtmistingimuste kontrollimiseks võib kasutada eri triglütseriidide jaoks tabelis 1 esitatud suhtelisi standardhälbeid (RSD: variatsioonikordaja × 100). Need on arvutatud sama piimarasva 19 järjestikuse analüüsi põhjal.

Tabel 1

Triglütseriidide sisalduse suhteline standardhälve (n = 19)

Triglütseriid | Suhteline standardhälve |

C24 | 10,00 |

C26 | 2,69 |

C28 | 3,03 |

C30 | 1,76 |

C32 | 1,03 |

C34 | 0,79 |

C36 | 0,25 |

C38 | 0,42 |

C40 | 0,20 |

C42 | 0,26 |

C44 | 0,34 |

C46 | 0,37 |

C48 | 0,53 |

C50 | 0,38 |

C52 | 0,54 |

C54 | 0,60 |

Kui RSDd on tabeli 1 väärtustest märkimisväärselt kõrgemad, ei ole kromatograafilised tingimused vastuvõetavad ning vaheseinu või kandegaasi voolukiirust tuleb muuta. Samuti võivad klaasvillale kolonni sisendis olla sadestunud väikesed septumioskesed või kolonn võib olla muutunud kasutamiskõlbmatuks vananemise, temperatuurimõjude jms tõttu (vt joonis 3).

Märkus:

Tabelis 1 esitatud väärtused ei ole kohustuslikud, kuid on kvaliteedi kontrolli otstarbel soovitatavad. Kui kõrgemad RSD väärtused on siiski vastuvõetavad, tuleb sellest hoolimata järgida punktis 11 esitatud korratavuse ja reprodutseeritavuse piirmäärasid.

8. Võõraste rasvade kvalitatiivne määramine

Võõraste rasvade kindlakstegemiseks on tuletatud triglütseriidvalemid (tabel 2) ja S-le esitatavad piirnormid (tabel 3), mille vahemikus puhta piimarasva S väärtused võivad kõikuda. Kui need piirnormid ületatakse, peetakse võõrast rasva olemasolevaks.

Näiteks searasva lisandi kindlakstegemiseks on kõige tundlikum järgmine valem:

6,5125 · C26 + 1,2052 · C32 + 1,7336 · C34 + 1,7557 · C36 + 2,2325 · C42 + 2,8006 · C46 + 2,5432 · C52 + 0,9892 · C54 = S

Märkus:

755 piimaproovi kasutades määrati usaldusnivool 99 % puhta piimarasva S vahemikuks 97,96–102,04, kusjuures iga S standardhälve oli 0,39897.

Lähtudes triglütseriidide sisaldusest tundmatus rasvaproovis, võimaldab selline valem arvutit kasutamata lihtsal teel kindlaks teha, kas koos vastavate kordajatega siin esitatud triglütseriidide sisalduste summa jääb väljapoole vahemikku 97,96–102,04 ja kas antud juhul võõra rasva lisandi olemasolu on tõenäoline.

Mitmesuguste võõraste rasvade kindlakstegemiseks on tabelis 2 esitatud erinevad triglütseriidvalemid. Ühist grupivalemit võib kasutada järgmiste võõraste rasvade gruppide puhul: soja-, päevalille-, oliivi-, rapsi- lina-, nisu-, maisi- ja puuvillaõli ning hüdrogeenitud kalarasv; taimsed rasvad nagu kookosrasv ja palmisäsiõli; palmiõli ja loomarasv.

Et triglütseriidide sisaldus võõrastes rasvades samuti kõigub, kasutati sama liiki rasva puhul kuni nelja erineva eksperimentaalse määramise tulemusel saadud andmeid võõra rasva triglütseriidide sisalduse kohta. (Iga võõra rasva liigi puhul arvestati vastavaid kõige rangemaid piirnorme (vt tabel 4)).

Kõikide võõraste rasvade puhul võib saada ühtmoodi häid tulemusi järgmise universaalvalemi abil:

-2,7575 · C26 + 6,4077 · C28 + 5,5437 · C30 - 15,3247 · C32 + 6,2600 · C34 + 8,0108 · C40 - 5,0336 · C42 + 0,6356 · C44 + 6,0171 · C46 = S

Arvutused võõraste segarasvade määramiseks piimarasvas on näidanud, et kui näiteks searasva jaoks tabelis 2 esitatud valemi puhul on selle võõra rasva alumine avastamispiir piisavalt madal, nimelt 2,7 %, siis muid rasvu, nagu kookosrasv, palmiõli ja palmisäsiõli, mille avastamispiir on vastavalt 26,8, 12,5 ja 19,3 %, saab selle valemi abil kindlaks teha ainult juhul, kui neid on lisatud piimarasvale väga suurtes kogustes. Sama kehtib ka teiste tabeli 2 valemite kohta.

Tabel 2

Triglütseriidvalemid mitmesuguste võõraste rasvade kindlakstegemiseks piimarasvas ja S-i standardhälbed SD

Valem soja-, päevalille-, oliivi-, rapsi-, lina-, nisu-, maisi- ja puuvillaõli ning kalarasva kindlakstegemiseks

2,0983 · C30 + 0,7288 · C34 + 0,6927 · C36 + 0,6353 · C38 + 3,7452 · C40 - 1,2929 · C42 + 1,3544 · C44 + 1,7013 · C46 + 2,5283 · C50 = S; SD = 0,38157

Valem kookosrasva ja palmisäsiõli kindlakstegemiseks

3,7433 · C32 + 1,1134 · C36 + 1,3648 · C38 + 2,1544 ·C42 + 0,4273 · C44 + 0,5809 · C46 + 1,1226 · C48 + 1,0306 · C50 + 0,9953 · C52 + 1,2396 · C54 = S; SD = 0,11323

Valem palmiõli ja loomarasva kindlakstegemiseks

3,6644 · C28 + 5,2297 · C30 + 12,5073 · C32 + 4,4285 · C34 - 2,2010 · C36 + 1,2791 · C38 + 6,7433 · C40 - 4,2714 · C42 + 6,3739 · C46 = S; SD = 0,81094

Valem searasva kindlakstegemiseks

6,5125 · C26 + 1,2052 · C32 + 1,7336 · C34 + 1,7557 · C36 + 2,2325 · C42 + 2,8006 · C46 + 2,5432 · C52 + 0,9892 · C54 = S; SD = 0,39897

Kui on arvata, et tundmatu proov on piimarasva ja ühe või mitme rasva segu 14 eri võõra rasva hulgast, tuleb selle kontrollimiseks kasutada kõiki tabeli 2 valemeid ja universaalvalemit (2). Kui uuritava proovi triglütseriidide sisalduste asendamisel mainitud valemitesse vähemalt ühe valemi puhul saadakse S väärtus, mis jääb väljapoole tabelis 3 esitatud vahemikke, on proov suure tõenäosusega modifitseeritud piimarasv. Kui võõra rasva olemasolu piimarasvas on nelja tabeli 2 valemi hulgast ühe abil kindlaks tehtud, ei saa sellest siiski teha järeldusi lisatud võõra rasva liigi kohta.

Tabel 3

S piirnormid piimarasvades

Avastamise valem | S-vahemik |

Soja-, päevalille-, oliivi-, rapsiseemne-, linaseemne-, nisuidu-, maisiidu-, puuvilla-, kalaõli | 98,05–101,95 |

Kookosrasv ja palmisäsiõli | 99,42–100,58 |

Palmiõli ja loomarasv | 95,90–104,10 |

Seapekk | 97,96–102,04 |

Universaalvalem | 95,68–104,32 |

Tabelis 4 on esitatud eri võõraste rasvade avastamispiir 99 % usaldusnivool. Teises veerus on alumine avastamispiir, mis vastab tabelis 2 esitatud optimaalsetele piimarasva valemitele. Teises veerus on universaalvalemile vastav avastamispiir. Kuigi viimati mainitud piirid on mõnevõrra kõrgemad, piisab nendest pisut suuremate võõra rasva koguste kindlakstegemiseks ainult sellest valemist. Kõik need valemid võimaldavad kindlaks teha ka mitme võõra rasva samaaegset olemasolu. Ühte ja sama liiki võõra rasva triglütseriidide sisalduse kõikumise ulatus ei mõjuta arvestamisväärselt selle avastamispiiri.

Tabel 4

Avastamispiir 99 % usaldusnivool, väljendatuna piimarasvale lisatud võõra rasva protsentides

| Erivalem | Universaalvalem |

Sojaõli | 2,1 | 4,4 |

Päevalilleõli | 2,3 | 4,8 |

Oliiviõli | 2,4 | 4,7 |

Kookosrasv | 3,5 | 4,3 |

Palmiõli | 4,4 | 4,7 |

Palmisäsiõli | 4,6 | 5,9 |

Rapsiseemneõli | 2,0 | 4,0 |

Linaseemneõli | 2,0 | 4,4 |

Nisuiduõli | 2,7 | 6,4 |

Maisiiduõli | 2,2 | 4,5 |

Puuvillaseemneõli | 3,3 | 4,4 |

Seapekk | 2,7 | 4,7 |

Loomarasv | 5,2 | 5,4 |

Hüdrogeenitud kalaõli | 5,4 | 6,1 |

Märkus:

S-piirnormid on arvutatud selliselt, et võõrast rasva saab pidada olemasolevaks ainult sellisel juhul, kui on ületatud erivalemile vastav piir (vt tabel 4).

9. Võõraste rasvade kvantitatiivne määramine

Informatsiooni saamiseks võõraste rasvade kvantitatiivse sisalduse kohta piimarasva proovis kasutatakse järgmist valemit:

= 100 ·

100 - S

kus X on uuritava võõra rasva või võõraste rasvade segu sisaldus uuritavas piimarasva proovis. S oleneb uuritava võõra rasva lisandist ning saadakse võõra ja piimarasva segu triglütseriidide sisalduste asendamise teel eespool esitatud triglütseriidide universaalvalemisse. Kui piimarasvale on lisatud uuritavat võõrast rasva, loetakse universaalvalemi puhul eri võõraste rasvade keskmine S-väärtus võrdseks SF-ga; see keskmine S-väärtus saadakse puhaste võõraste rasvade triglütseriidiandmete panemisel kõnesolevasse valemisse ja keskmise arvutamise teel (SF = 7,46). Häid kvantitatiivseid tulemusi mis tahes võõraste rasvade lisandi kohta on samuti saadud palmiõli ja loomarasva valemi (tabel 2) ja keskmise SF-väärtuse 10, 57 kasutamisel.

Kui võõra rasva liik on teada, tuleb eespool esitatud valemis ja vastavas võõra rasva kindlakstegemise valemis (tabel 2) kasutada järgmisi SF väärtusi:

Tabel 5

Eri võõraste rasvade SF väärtused

Võõras rasv | SF |

Sojaõli | 8,18 |

Päevalilleõli | 9,43 |

Oliiviõli | 12,75 |

Kookosrasv | 118,13 |

Palmiõli | 7,55 |

Palmisäsiõli | 112,32 |

Rapsiseemneõli | 3,30 |

Linaseemneõli | 4,44 |

Nisuiduõli | 27,45 |

Maisiiduõli | 9,29 |

Puuvillaseemneõli | 41,18 |

Seapekk | 177,55 |

Loomarasv | 17,56 |

Kalaõli | 64,12 |

10. Määramismeetodi kasutusala

Kirjeldatud meetod on rakendatav suurte piimakoguste puhul ja see põhineb piimarasva proovide representatiivsusel.

Kui representatiivse arvu piimarasva proovide alusel tuletada eespool kirjeldatutele sarnased valemid iga riigi jaoks eraldi, oleks võimalik teha kõrge spetsiifilisusega määramisi.

Eriti sobivad määramisvõimalused avaneksid juhul, kui representatiivse arvu piimarasva proovide alusel tuletada siin kirjeldatutega sarnased valemid iga riigi jaoks eraldi. Juhul kui rakendada tabelis 2 kasutatud triglütseriidide kombinatsioone ja määrata uuesti vähimruutude meetodil kordajad, ei ole vaja kasutada keerulisi arvutiprogramme.

Kui kasutada tabelis 3 esitatud S vahemikke, võib neid valemeid üldiselt rakendada ka erandlike söötmistingimuste puhul, nagu näiteks lehmade alatoitmise või söötmise korral söödapärmi või kaltsiumseebiga. Need valemid näitavad osaliselt modifitseeritud piimarasva olemasolu ainult äärmuslike söötmistingimuste korral (näiteks puhta söödaõli rohke omastamine, rohke toitmine samaaegselt kaltsiumiseebi ja söödarasvaga jne).

Märkus:

Et piimarasva modifitseerimiseks peetakse üksnes selliseid juhtumeid, mil piirnormid ületatakse, loetakse fraktsioneeritud piimarasvu üldiselt modifitseerimata piimarasvadeks. Ainult selliste ebatavalise koostisega fraktsioneeritud piimarasvade puhul nagu kõva fraktsioon, mida mõneprotsendilise saagisega saadakse fraktsioneerimisel kõrgendatud temperatuuril (ligikaudu 30 °C) füüsikaliste meetoditega või ülekriitilise CO2-ga, näitavad need valemid, et tegemist on modifitseerimisega.

Piimarasvade fraktsioneerimist on võimalik kindlaks teha muude meetoditega, näiteks diferentsiaalse skaneeriva kalorimeetria abil.

11. Meetodi täpsus

Andmed on saadud tabeli 2 valemite ja tabeli 3 S vahemike alusel ning kasutatud on piimarasva.

11.1. Korratavus

Väljendatakse kahel järjestikusel määramisel saadud S väärtuste vahena, kusjuures määramised on toimunud võimalikult väikese vahega ja need on teinud üks ja seesama katsetaja, kasutades sama meetodit, proovimaterjali ja tingimusi (sama katsetaja, samad seadmed, sama laboratoorium).

Tabel 6

Erinevate valemite puhul rakendatavad korratavuse piirnormid (r)

Avastamise valem | r |

Soja-, päevalille-, oliivi-, rapsiseemne-, linaseemne-, nisuidu-, maisiidu-, puuvilla-, kalaõli | 0,67 |

Kookosrasv ja palmisäsiõli | 0,12 |

Palmiõli ja loomarasv | 1,20 |

Seapekk | 0,58 |

Universaalvalem | 1,49 |

11.2. Reprodutseeritavus

Väljendatakse kahel määramisel saadud S väärtuste vahena, kusjuures määramised on teinud katsetajad eri laboratooriumides, kasutades sama meetodit ja proovimaterjali, kuid töötades erinevates tingimustes ja eri aegadel (eri katsetajad, erinevad seadmed).

Tabel 7

Erinevate valemite puhul rakendatavad reprodutseeritavuse piirnormid (R)

Avastamise valem | R |

Soja-, päevalille-, oliivi-, rapsiseemne-, linaseemne-, nisuidu-, maisiidu-, puuvilla-, kalaõli | 1,08 |

Kookosrasv ja palmisäsiõli | 0,40 |

Palmiõli ja loomarasv | 1,81 |

Seapekk | 0,60 |

Universaalvalem | 2,07 |

11.3. Kriitilised diferentsid

Võttes arvesse korratavuse (r) ja reprodutseeritavuse (R) piirnorme, saab arvutada kriitilised diferentsid kõigi tabelis 3 esitatud S vahemike puhul (kahekordsed analüüsid). Vastavad väärtused on esitatud tabelis 8.

Tabel 8

Kriitilised diferentsid erinevate triglütseriidvalemite puhul

Avastamise valem | Vahemik |

Soja-, päevalille-, oliivi-, rapsiseemne-, linaseemne-, nisuidu-, maisiidu-, puuvilla-, kalaõli | 97,43–102,57 |

Kookosrasv ja palmisäsiõli | 99,14–100,86 |

Palmiõli ja loomarasv | 94,91–105,09 |

Seapekk | 97,65–102,35 |

Universaalvalem | 94,58–105,42 |

11.4. Tulemuste vastuvõetavus

Kõik triglütseriidide C24, C26, C28–C54 ja kolesterooli kahe kümnendkohani ümardatud kalibreeritud sisaldused tuleb normida täpselt 100-le.

Korratavuse kontrollimiseks kasutatakse kahekordse analüüsi tulemusi. Kui kõigi viie valemi puhul S kahe määramistulemuse absoluutne erinevus ei ületa tabelis 6 esitatud korratavuse piirnorme r, vastab tulemus korratavuse nõuetele.

Selleks et optimeerida gaasikromatograafilise analüüsi tingimusi, eeskätt kolonni kvaliteeti, tuleb tagada, et kõigi viie triglütseriidvalemi puhul 10 korduskatses saadud suurima ja väikseima S väärtuse erinevus ei ületaks taset x · r, kus x = 1,58 (10 katse puhul; vt kirjanduse viidet 16) ja korratavuse piirnormid r erinevate valemite puhul on esitatud tabelis 6.

12. Viidatud standardid

DIN 10 336:1994 | Nachweis und bestimmung von Fremdfetten in Milchfett anhand einer gaschromatographischen Triglyceridanalyse |

IDF Standard 1C:1987 | Milk. Determination of Fat Content – Röse-Gottlieb Gravimetric Method |

IDF Standard 16C: 1987 | Cream. Determination of Fat Content – Röse-Gottlieb Gravimetric Method |

IDF Standard 116A:1987 | Milk-Based Edible Ices and Ice Mixes. Determination of Fat Content – Röse-Gottlieb Gravimetric Method |

IDF Standard 22B:1987 | Skimmed Milk, Whey & Buttermilk. Determination of Fat Content – Röse-Gottlieb Gravimetric Method |

13. Viited

1. Euroopa Ühenduste Komisjon: Detection of foreign fats in milk fat by means of gas chromatographic triglyceride analysis; dok nr VI/5202/90-EN, VI/2645/91.

2. Euroopa Ühenduste Komisjon: Control of butter fat purity of 100 different samples of different feeding periods from 11 EEC countries; dok nr VI/4577/93.

3. Euroopa Ühenduste Komisjon: Consideration of results from the first, second, third, fourth, fifth and sixth EEC collaborative trial: Determination of triglycerides in milk fat; dok nr VI/2644/91, VI/8.11.91, VI/1919/92, VI/3842/92, VI/5317/92, VI/4604/93.

4. Timms, R.E.: Detection and quantification of non-milk fat in mixtures of milk and non-milk fats. Dairy Research 47295–303 (1980).

5. Precht, D., Heine, K.: Nachweis von modifiziertem Milchfett mit der Triglyceridanalyse. 2. Fremdfettnachweis im Milchfett mit Hilfe von Triglyceridkombinationen, 41406–410 (1986).

6. Luf, W., Stock, A., Brandl, E.: Zum Nachweis von Fremdfett in Milchfett über die triglyceridanalyse, Österr. Milchwirtsch. Wissensch. Beilage 5, 42 29–35 (1987).

7. Precht, D.: Bestimmung von pflanzlichen Fetten oder tierischen Depotfetten in Milchfett. Kieler Milchwirtsch. Forschungber. 42143–157 (1989).

8. Precht, D.: Schnelle Extraktion von Milchfett., Kieler Milchwirtsch. Forschungber. 42119–128 (1990).

9. Precht, D.: Schnelle gaschromatographische Triglyceridanalyse von Milchfett. Kieler Milchwirtsch. Forschungber. 42139–154 (1900).

10. Precht, D.: Control of milk fat purity by gas chromatographic triglyceride analysis. Kieler Milchwirtsch. Forschungber. 43 (3) 219 –242 (1991).

11. Precht, D.: Detection of adulterated milk fat by fatty acid and triglyceride analysis. Fat Sci. Technol. 93538–544 (1991).

12. Precht, D: Detection for foreign fat in milk fat. I. Qualitative detection by triacylglycerol formulae. II Quantitative evaluation of foreign fat mixtures. Z. Lebensm. Unters. Forsch. 194 1–8, 107–114 (1992).

13. Precht D.: Gas chromatography of triacylglycerols and other lipids on packed columns in CRC Handbook of Chromatography: Analysis of lipids, p. 123–138, Ed. K.D. Mukherjee, N. Weber, J. Sherma, CRC Press, Boca Raton (1993).

14. Precht, D., Molkentin, J.: Quantitative triglyceride analysis using short capillary columns. Chrompack News 4 16–17 (1993).

15. Molkentin, J., Precht, D.: Comparison of packed and capillary columns for quantitative gas chromatography of triglycerides in milk fat. Chromatographia 39 (5/6) 265–270 (1994).

16. Stange, K.: Angewandte Statistik, Erster Teil, Eindimensionale Probleme. Springer Verlag, Berlin, P. 378 (1970).

[1] Nõuetekohaseid meetodeid on juba kirjeldatud – D. Precht ja J. Molkentin: Quantitative triglyceride analysis using short capillary columns, Chrompack News 4, 16–17 (1993).

[2] Nõuetekohased tooted on müügil.

[3] Erikaubanduses kättesaadavate sobivate toodete puhul on eeskujuks niisugused kaubanimetused nagu näiteks Extrelut, Gas ChromQ, Chrompack. Seda teavet kasutatakse standardi kasutajapoolse hõlpsa käsitsemise otstarbel, mitte nõudluse suurendamiseks nimetatud toote järele. Teravilja nimetamiselt on üle mindud SI-ühikule vastavalt BS 410:1988 "British Standard Specification for test sieves".

[4] Vt lk 86 joonealust märkust nr 3.

--------------------------------------------------

XXVI LISA

ESIMESES PÕHJENDUSES OSUTATUD MÄÄRUSTE LOETELU

- komisjoni 9. augusti 1968. aasta määrus (EMÜ) nr 1216/68, millega sätestatakse kolmandast riikidest imporditud segasöötade laktoosisisalduse kindlaksmääramise meetod, [1] viimati muudetud komisjoni 22. detsembri 1987. aasta määrusega (EMÜ) nr 222/88, millega muudetakse teatavaid piima- ja piimatooteturu ühise korralduse meetmeid seoses koondnomenklatuuri kehtestamisega [2];

- komisjoni 22. detsemberi 1992. aasta määrus (EMÜ) nr 3942/92, millega kehtestatakse standardmeetmed sitosterooli ja stigmasterooli määramiseks võiõlis, [3] viimati muudetud komisjoni määrusega (EÜ) nr 175/1999, millega muudetakse määrusi (EMÜ) nr 3942/92, (EÜ) nr 86/94, (EÜ) nr 1082/96 ja (EÜ) nr 1459/98, millega kehtestatakse standardmeetodid teatavate märgistusainete määramiseks võis, võiõlis ja koores [4];

- komisjoni 19. jaanuari 1994. aasta määrus (EÜ) nr 86/94, millega kehtestatakse standardmeetod sitosterooli ja stigmasterooli määramiseks võis, [5] viimati muudetud määrusega (EÜ) nr 175/1999;

- komisjoni 24. novembri 1995. aasta määrus (EÜ) nr 2721/95, mis kehtestab ühise turukorralduse raames eeskirjad piima ja piimatoodete analüüsi ja kvaliteedi hindamise standardmeetodite ja seni kasutatud meetodite kohaldamiseks [6];

- komisjoni 14. juuni 1996. aasta määrus (EÜ) nr 1080/96, millega kehtestatakse standardmeetod kolibakterite leidmiseks võis, lõssipulbris ja kaseiinis/kaseinaatides [7];

- komisjoni 14. juuni 1996. aasta määrus (EÜ) nr 1081/96, millega kehtestatakse standardmeetod lehmapiima ja lehmapiima kaseiini määramiseks juustus, mis on valmistatud lamba-, kitse- või pühvlipiimast või lamba-, kitse- ja pühvlipiima segust, ning tunnistatakse kehtetuks määrus (EMÜ) nr 690/92 [8];

- komisjoni 14. juuni 1996. aasta määrus (EÜ) nr 1082/96, millega kehtestatakse standardmeetod ß-apo-8’-karoteenhappe etüülestri määramiseks võis ja kontsentreeritud võis, [9] muudetud määrusega (EÜ) nr 175/1999;

- komisjoni 26. septembri 1996. aasta määrus (EÜ) nr 1854/96 piima ja piimatoodete analüüsimisel ning kvaliteedi hindamisel ühises turukorralduses rakendatavate standardmeetodite nimekirja kehtestamise kohta, [10] muudetud määrusega (EÜ) nr 881/1999 [11];

- komisjoni 24. aprilli 1998. aasta määrus (EÜ) nr 880/98, millega kehtestatakse standardmeetodid vee, rasvavaba kuivaine, ja rasva sisalduse määramiseks võis [12];

- komisjoni 8. juuli 1998. aasta määrus (EÜ) nr 1459/98, millega kehtestatakse standardmeetod vanilliini määramiseks kontsentreeritud võis, võis ja rõõsas koores, [13] muudetud määrusega (EÜ) nr 175/1999.

[1] EÜT L 198, 10.8.1968, lk 13.

[2] EÜT L 28, 1.2.1988, lk 1.

[3] EÜT L 399, 31.12.1992, lk 29.

[4] EÜT L 20, 27.1.1999, lk 22.

[5] EÜT L 17, 20.1.1994, lk 7.

[6] EÜT L 283, 25.11.1995, lk 7.

[7] EÜT L 142, 15.6.1996, lk 13.

[8] EÜT L 142, 15.6.1996, lk 15.

[9] EÜT L 142, 15.6.1996, lk 26.

[10] EÜT L 246, 27.9.1996, lk 5.

[11] EÜT L 111, 29.4.1999, lk 24.

[12] EÜT L 124, 25.4.1998, lk 16.

[13] EÜT L 193, 9.7.1998, lk 16.

--------------------------------------------------