1)

A osasse lisatakse järgmine peatükk:

„A.25.   DISSOTSIATSIOONIKONSTANDID VEES (TIITRIMISMEETOD, SPEKTROFOTOMEETRILINE MEETOD, KONDUKTOMEETRILINE MEETOD)

SISSEJUHATUS

Käesolev katsemeetod on samaväärne OECD katsejuhendiga nr 112 (1981).

Eeltingimused

Juhendteave

Erinõuded

Alusdokumendid

Käesolev katsemeetod põhineb meetoditel, mis on esitatud osas „Kirjandus“ loetletud dokumentides, samuti 18. augusti 1978. a EPA tootmiseelse teatise suuniste esialgsel kavandil (Preliminary Draft Guidance for Premanufacture Notification EPA).

MEETOD: SISSEJUHATUS, EESMÄRK, KASUTUSALA, ASJAKOHASUS, KASUTAMINE JA KATSEMEETODI PIIRANGUD

Aine keskkonnamõju hindamisel on oluline teada tema dissotsieerumist vees. Dissotsieerumisest oleneb, millisel kujul aine esineb; see omakorda määrab aine käitumise ja edasikandumise. See võib mõjutada kemikaali adsorptsiooni pinnasel ja setetes, samuti neeldumist rakkudes.

Mõisted ja mõõtühikud

Dissotsieerumine on pöörduv jagunemine kaheks või enamaks keemiliseks üksuseks, mis võivad olla ioonsed. Seda protsessi kirjeldatakse üldiselt võrrandiga

RX ⇌ R ++ X –

ning kontsentratsioonide kaudu väljendatud reaktsiooni tasakaaluolekut kirjeldab tasakaalukonstant

Näiteks erijuhul, kui R on vesinik (aine on hape), kirjeldab konstanti võrrand

või

Võrdlusained

Järgmisi võrdlusaineid ei ole uue aine uurimisel alati vaja kasutada. Need on esitatud peamiselt selleks, et kaliibrida aeg-ajalt meetodit ja võimaldada tulemuste võrdlemist muu meetodi abil saadud tulemusega.

Kasulik oleks kasutada ainet, millel on mitu pK-d, nagu on näidatud allpool meetodi põhimõtte selgitamisel. Selline aine saaks olla:

Katsemeetodi põhimõte

Kirjeldatav keemiline protsess sõltub keskkonnatemperatuurile vastavas vahemikus üldiselt vaid vähe temperatuurist. Dissotsiatsioonikonstandi määramiseks on vaja mõõta kemikaali dissotsieerunud ja dissotsieerumata vormi kontsentratsioonid. Teades eespool mõistete ja mõõtühikute osas kirjeldatud stöhhiomeetriat, saab määrata asjakohase konstandi. Käesolevas katsemeetodis kirjeldatud erijuhtumi korral käitub aine happe või alusena ja määramist on kõige parem teha aine ioniseeritud ja ioniseerimata vormi suhteliste kontsentratsioonide ja lahuse pH määramisega. Nende terminite vaheline seos on esitatud pKa valemiga, vt eespool osa „Mõisted ja mõõtühikud“. Mõnel ainel on rohkem kui üks dissotsiatsioonikonstant ja nende jaoks saab tuletada sarnased valemid. Mõned kirjeldatud meetoditest sobivad kasutamiseks ka muu kui happe-aluse dissotsiatsiooni puhul.

Kvaliteedinõuded

Korduvus

Dissotsiatsioonikonstandi väärtused (vähemalt kolmest paralleelmääramisest) peavad olema vahemikus ± 0,1 logaritmilist ühikut.

KATSEMEETODI KIRJELDUS

pKa määramisele on kaks peamist lähenemisviisi. Ühe meetodi puhul tiitritakse aine teadaolevat kogust vastavalt vajadusele happe või aluse standardlahusega; teise meetodi puhul määratakse ioniseeritud ja ioniseerimata vormide suhteline kontsentratsioon ja selle pH-sõltuvus.

Ettevalmistused

Neile põhimõtetele tuginevad meetodid võib jaotada tiitrimiseks, spektrofotomeetriliseks ja konduktomeetriliseks määramiseks.

Katselahused

Tiitrimismeetodi ja konduktomeetrilise meetodi kasutamiseks tuleb kemikaal lahustada destilleeritud vees. Spektrofotomeetrilise meetodi ja muude meetodite puhul kasutatakse puhverlahuseid. Uuritava aine kontsentratsioon ei tohi ületada väiksemat järgmistest – 0,01 M või pool küllastuskontsentratsiooni – ning lahuste valmistamiseks tuleks kasutada aine kõige puhtamat kättesaadavat vormi. Kui aine on vees halvasti lahustuv, võib selle lahustada väheses koguses veega segunevas lahustis enne eespool osutatud kontsentratsioonide saavutamiseks vajaliku koguse lisamist.

Lahuseid tuleb kontrollida emulsiooni esinemise suhtes; selleks kasutatakse Tyndalli efekti; see on eriti oluline siis, kui lahustuvuse suurendamiseks lisati kaaslahustit. Puhverlahuse kasutamise korral ei tohi puhvri kontsentratsioon ületada 0,05 M.

Katsetingimused

Temperatuur

Temperatuuri tuleb reguleerida täpsusega vähemalt ± 1 °C. Mõõtmised tuleks eelistatult teha 20 °C juures.

Kui kahtlustatakse tugevat sõltuvust temperatuurist, tuleb määramised teha veel vähemalt kahel temperatuuril. Sellisel juhul peaksid temperatuuri intervallid olema 10 °C ja temperatuuri reguleerimise täpsus ± 0,1 °C.

Analüüsid

Meetodi valimine sõltub uuritava aine omadustest. Meetod peab olema piisavalt tundlik, et võimaldada aine eri vormide määramist igal uuritava lahuse kontsentratsioonil.

Katse käik

Tiitrimismeetod

Uuritavat lahust tiitritakse, vastavalt vajadusele kas aluse või happe standardlahusega, ning pH määratakse pärast iga titrandikoguse lisamist. Enne ekvivalentsuspunkti saavutamist tuleb lisada vähemalt 10 titrandikogust. Kui tasakaal saavutatakse piisavalt kiiresti, võib kasutada registreerivat potentsiomeetrit. Selle meetodi puhul peavad nii aine üldkogus kui ka kontsentratsioon olema täpselt teada. Tuleb kasutada ettevaatusabinõusid, et välistada süsinikdioksiidi juurdepääs. Katse läbiviimise üksikasjad, ettevaatusabinõud ja arvutused on esitatud standardkatsete kirjeldustes (vt näiteks viited 1–4).

Spektrofotomeetriline meetod

Määratakse lainepikkus, mille juures ioniseeritud ja ioniseerimata vormi ekstinktsioonikoefitsiendid on märgatavalt erinevad. Määratakse muutumatu kontsentratsiooniga lahuste UV- või nähtava valguse neeldumisspekter pH eri väärtustel, millel aine on peamiselt ioniseerimata, on täielikult ioniseeritud, ning veel mitmel vahepealsel pH väärtusel. Seda võib teha kas kontsentreeritud happe (aluse) väikeste ruumalaliste koguste lisamisega uuritava aine lahuse suhteliselt suurele ruumalalisele kogusele paljukomponendilises puhvris, mis on algul väikese (suure) pH-ga (viide 5), või uuritava aine põhilahuse (nt vees, metanoolis) võrdses ruumalas lisamisega muutumatu ruumalaga eri puhverlahustele, mille pH väärtused katavad kogu soovitud pH-vahemiku. pH väärtustest ja neeldumise väärtustest valitud lainepikkusel arvutatakse piisav arv pKa väärtusi, kasutades andmeid, mis on saadud vähemalt viiel pH väärtusel, millel aine on vähemalt 10 % ja vähem kui 90 % ioniseeritud. Katse täiendavad üksikasjad ja arvutamismeetod on esitatud viites 1.

Konduktomeetriline meetod

Kasutades väikese ja teadaoleva konstandiga juhtivusandurit, mõõdetakse konduktomeetriaks sobivas vees lahustatud uuritava aine ligikaudu 0,1 M lahuse juhtivus. Mõõdetakse ka rea sellest lahusest täpselt valmistatud lahjenduste juhtivuse väärtused. Iga lahjendusega vähendatakse kontsentratsiooni poole võrra ja seeria peaks hõlmama vähemalt üht kontsentratsiooni suurusjärku. Määratakse ka juhtivuse piirväärtus lõpmatul lahjendusel; selleks tehakse samasugune katse naatriumisoolaga ja ekstrapoleeritakse. Seejärel võib iga lahuse juhtivusest arvutada Onsageri võrrandi abil dissotsiatsiooniastme ja selle alusel arvutada Ostwaldi lahjendusseaduse abil dissotsiatsioonikonstandi K = α2C/(1 – α), kus C on molaarne kontsentratsioon (mol/l) ja α on aine dissotsieerunud fraktsioon. Tuleb kasutada ettevaatusabinõusid, et välistada CO2 juurdepääs. Täiendavad katse üksikasjad ja arvutamismeetod on esitatud alustekstides ning viidetes 1, 6 ja 7.

ANDMED JA KATSEPROTOKOLLI KOOSTAMINE

Tulemuste töötlemine

Tiitrimismeetod

pKa arvutatakse tiitrimiskõvera 10 mõõdetud punkti järgi. Arvutatakse selliste pKa-de keskväärtus ja standardhälve. Andmed esitatakse tabelina ja koostatakse graafik pH sõltuvuse kohta aluse või happe standardlahuse lisatud ruumalast.

Spektrofotomeetrilised meetodid

Iga spektri kohta esitatakse tabelis neelduvus ja pH. Arvutatakse vähemalt viis väärtust pKa jaoks vahepealsetest spektriandmepunktidest; nendest väärtustest arvutatakse veel keskväärtus ja standardhälve.

Konduktomeetriline meetod

Arvutatakse ekvivalentjuhtivus Λ happe iga kontsentratsiooni jaoks ja sellise segu iga kontsentratsiooni jaoks, mille saamiseks segatakse üks ekvivalent hapet ja 0,98 ekvivalenti karbonaadivaba naatriumhüdroksiidi. Hape on liias, et vältida hüdrolüüsi tõttu tekkivat OH– liiga. Tehakse graafik teljestikus 1/Λ ja Ö_C ning soola Λo saab sellest leida ekstrapoleerimisega kontsentratsioonile 0.

Happe Λo saab arvutada kirjanduses esitatud H+ and Na+ väärtustest. pKa saab arvutada tulemustest α = Λi/Λo ja iga kontsentratsiooni Ka = α2C/(1 – α). Ka täpsemad väärtused saadakse siis, kui viiakse sisse ka liikuvust ja aktiivsust arvestavad parandid. Tuleb arvutada ka pKa väärtuste keskväärtus ja standardhälve.

Katseprotokoll

Kõik saadud töötlemata andmed ja arvutatud pKa väärtused tuleb esitada koos arvutamismeetodiga eelistatult tabelina, nagu on soovitatud viites 1, samuti tuleb esitada eespool kirjeldatud statistilised parameetrid. Tiitrimismeetodite puhul tuleb esitada titrantide standardimise üksikasjad.

Spektrofotomeetrilise meetodi puhul tuleb esitada kõik spektrid. Konduktomeetrilise meetodi puhul tuleb esitada konduktomeetri konstandi määramise üksikasjalik kirjeldus. Esitada tuleb ka kasutatud meetodit, analüüsimeetodeid ja kõiki kasutatud puhvreid käsitlev teave.

Tuleb esitada katse temperatuur(id).

KIRJANDUS

2)

B osas asendatakse peatükk B.5 järgmisega:

„B.5.   SILMADE ÄGE ÄRRITUS/SÖÖVITUS

SISSEJUHATUS

Käesolev katsemeetod on samaväärne OECD katsejuhendiga nr 405 (2012). Kemikaalidega katsete tegemise OECD katsejuhendeid vaadatakse perioodiliselt läbi tagamaks, et need kajastaksid parimaid olemasolevaid teadusandmeid. Käesoleva meetodi eelnevates läbivaatamistes on pööratud erilist tähelepanu meetodi võimalikule täiustamisele kogu uuritavast kemikaalist olemasoleva teabe hindamise kaudu, et vältida tarbetuid loomkatseid, võttes seega arvesse loomade heaolu probleeme. Katsejuhendis nr 405 (vastu võetud 1981 ning ajakohastatud 1987, 2002 ja 2012) on soovitatud, et enne silmade ägeda ärrituse/söövituse jaoks kirjeldatud in vivo katse tegemist tuleb olemasolevate asjakohaste andmete alusel analüüsida tõendite kaalukust (1). Kui olemasolevad andmed on puudulikud, soovitatakse nende täiendamiseks kohaldada järjestikuste katsete tegemist (2, 3). See katsestrateegia hõlmab käesoleva katsemeetodi täiendmaterjalis esitatud valideeritud ja heakskiidetud in vitro katsete tegemist. Määruse (EÜ) nr 1907/2006 (mis käsitleb kemikaalide registreerimist, hindamist, autoriseerimist ja piiramist (REACH) (2)) kohaldamiseks lisatakse integreeritud katsestrateegia ka asjakohastesse Euroopa Kemikaaliameti (ECHA, edaspidi – „kemikaaliamet“) juhenditesse (21). Loomkatseid võib teha ainult juhul, kui pärast olemasolevate alternatiivsete meetodite kaalumist on kindlaks tehtud selliste katsete vajalikkus, ning teha võib ainult neid katseid, mille kohta on kindlaks tehtud, et need on asjakohased. Käesoleva ajakohastatud katsemeetodi koostamise ajal on siiski veel olukordi, kui selle meetodi kasutamine on vajalik või nõutav teatavates õigusraamistikes.

Viimane ajakohastamine oli peamiselt keskendatud analgeetikumide ja anesteetikumide kasutamisele, ilma et see oleks mõjutanud katsejuhendi üldpõhimõtet ja ülesehitust. Alternatiivmeetodite valideerimise ametitevaheline koordineerimiskomitee (ICCVAM) (3) ja rahvusvaheline sõltumatu teaduslik eksperthindamise komisjon vaatasid läbi pinnaanesteetikumide, süsteemsete valuvaigistite ja humaansete näitajate rutiinse kasutamise kasulikkuse ja piirangud silma ärrituse in vivo ohutuskatsetes (12). Läbivaatamise alusel järeldati, et pinnaanesteetikumide ja süsteemsete valuvaigistite kasutamisega välditaks suurt osa valust ja kannatusest või välditaks neid täielikult, ilma et see mõjutaks katse tulemust, ning soovitati, et neid aineid tuleks alati kasutada. Käesolevas katsemeetodis võetakse seda läbivaatamist arvesse. Silmade ägeda ärrituse ja söövituse in vivo katsete tegemisel tuleb tavapraktika korras kasutada pinnaanesteetikume, süsteemseid valuvaigisteid ja humaanseid näitajaid. Erandeid nende kasutamise suhtes tuleb põhjendada. Käesolevas meetodis kirjeldatud täiustamine vähendab oluliselt või aitab vältida loomade valu ja kannatusi enamikus katseolukordades, kui in vivo katsetamine on siiski vajalik, et teha kindlaks kemikaali ohutus silmadele.

Tasakaalustatud ennetav valuravi peab hõlmama: i) tavapärast premedikatsiooni pinnaanesteetikumiga (nt proparakaiin või tetrakaiin) ja süsteemse valuvaigistiga (nt buprenorfiin), ii) tavapärast käitlusjärgset süsteemse analgeesia skeemi (nt buprenorfiin ja meloksikaam), iii) loomade valu ja kannatuse kliiniliste sümptomite vaatluse, seire ja registreerimise ajakava ning iv) kõigi silmakahjustuste iseloomulike avalduste, raskusastme ja kulu vaatlust, seiret ja registreerimist. Täiendavad üksikasjad on esitatud allpool kirjeldatud ajakohastatud katsejuhendites. Pärast uuritava kemikaali manustamist ei tohiks täiendavat pinnaanesteetikumi või valuvaigistit kasutada, et vältida uuringut segavat mõju. Põletikuvastase toimega valuvaigisteid (nt meloksikaam) ei tohi kasutada pindmiselt ning süsteemse toime annused ei tohi moonutada toimet silmadele.

Mõisted on esitatud käesoleva katsemeetodi liites.

LÄHTEKAALUTLUSED

Nii teadusandmete õigsuse kui ka loomade heaolu huvides ei nähta in vivo katsete tegemist ette enne, kui tõendite kaalukuse analüüsi alusel on hinnatud kõiki olemasolevaid asjakohaseid andmeid uuritava kemikaali puhul silmi söövitava/ärritava toime võimalikkuse kohta. Sellised andmed hõlmavad tõendeid varem inimeste ja/või katseloomadega tehtud uuringutest, tõendeid ühe või mitme struktuuriliselt samalaadse aine või selliste ainete segude põhjustatud söövituse/ärrituse kohta, andmeid aine tugevast happelisusest või aluselisusest (4, 5) ning valideeritud ja heakskiidetud in vitro või ex vivo katsete tulemusi silmade söövituse/ärrituse kohta (6, 13–17). Uuringud võivad olla tehtud enne tõendite kaalukuse analüüsi või selle tulemusena.

Teatavate kemikaalide puhul võib selline analüüs viidata vajadusele uurida kemikaali silmi söövitava/ärritava toime võimalikkust in vivo. Kõigil sellistel juhtudel tuleb enne in vivo silmakatsete tegemise kaalumist teha sellise kemikaali suhtes kõigepealt nahka söövitava toime in vitro ja/või in vivo uuring ning hinnata seda vastavalt katsemeetodi B.4 (7) järjestikuste katsete tegemise strateegiale või kemikaaliameti juhendis kirjeldatud integreeritud katsestrateegiale (21).

Järjestikuste katsete tegemise strateegia, mis hõlmab silmade söövituse/ärrituse valideeritud in vitro või ex vivo katsete tegemist, on esitatud käesoleva katsemeetodi täiendmaterjalis ning lisatud kemikaaliameti juhenditesse kemikaalide registreerimise, hindamise ja autoriseerimise (REACH) (21) eesmärgil. Seda katsestrateegiat soovitatakse järgida enne in vivo katsete tegemist. Uute kemikaalide puhul soovitatakse kemikaali söövitava/ärritava toime kohta teaduspõhiste andmete saamiseks etapiti katsetamist. Olemasolevate kemikaalide jaoks, mille puhul andmed nahka ja silmi söövitava/ärritava toime kohta ei ole piisavad, saab seda strateegiat kasutada puuduvate andmete hankimiseks. Muu katsestrateegia või -korra kasutamist või otsust loobuda etapiviisi katsetamisest tuleb põhjendada.

IN VIVO KATSE PÕHIMÕTE

Pärast premedikatsiooni süsteemse valuvaigistiga ja sobiva pinnaanesteesia esile kutsumist pannakse uuritav kemikaal ühekordse annusena katselooma ühte silma; kemikaaliga töötlemata silma kasutatakse kontrollina. Silma ärrituse/söövituse astet hinnatakse sidekesta, sarvkesta ja vikerkesta kahjustuste punktiskaala alusel teatud ajavahemike tagant. Kirjeldatakse ka muid toimeid silmale ning kahjulikke süsteemseid toimeid, et hinnata kogu toimet täielikult. Katse kestus peab olema piisav, et saaks hinnata vaadeldud toimete pöörduvust või pöördumatust.

Loomad, kellel mis tahes katseetapis avalduvad raske kannatuse ja/või valu sümptomid, mis vastavad selles katsemeetodis kirjeldatud humaansetele näitajatele (vt punkt 26), tuleb humaanselt hukata ning hinnata kemikaali sellele vastavalt. Otsustamiskriteeriumid surmaeelses seisundis või raskelt kannatavate loomade humaanseks hukkamiseks on esitatud OECD juhendis (8).

IN VIVO KATSE ETTEVALMISTAMINE

Loomaliigi valik

Eelistatud katseloom on albiinoküülik, kasutatakse terveid noori täiskasvanud loomi. Muu liigi või liini kasutamist tuleb põhjendada.

Loomade ettevalmistamine

Iga esialgu katseks valitud katselooma mõlemat silma tuleb uurida 24 tunni sees enne katse algust. Loomi, kellel esineb silmade ärritust, silmadefekte või juba olemasolevaid sarvkesta vigastusi, ei kasutata.

Pidamis- ja söötmistingimused

Loomi peetakse ühekaupa. Küülikute jaoks peab katseloomade ruumi temperatuur olema 20 °C (± 3 °C). Kuigi suhteline niiskus peab olema vähemalt 30 % ja eelistatavalt mitte üle 70 %, v.a ruumi koristamise ajal, on sobivaim vahemik 50–60 %. Kasutatakse tehisvalgustust, valgusrežiimiga 12 tundi valgust ja 12 tundi pimedust. Liiga eredat valgust tuleb vältida. Söötmiseks võib kasutada labori tavapärast söödavalikut koos piiramatus koguses joogiveega.

KATSE KÄIK

Pinnaanesteetikumide ja süsteemsete valuvaigistite kasutamine

Silmadele ohutuse hindamisel soovitatakse katsete tegemisel kasutada valu ja kannatuste vältimiseks ja minimeerimiseks järgmisi meetodeid. Nende asemel võib kasutada ka muid meetodeid, mis tõendatult ning samaväärselt või paremini aitavad vältida või leevendada valu ja kannatusi.

Uuritava kemikaali silma panemine

Uuritav kemikaal tuleb panna iga looma ühe silma sidekestakotti, milleks tuleb alumist laugu õrnalt silmamunast eemale tõmmata. Seejärel pigistatakse laud umbes üheks sekundiks õrnalt kinni, et vältida aine silmast väljavalgumist. Teine silm, kuhu uuritavat kemikaali ei kanta, toimib kontrollina.

Silmade loputus

Katseloomade silmi ei tohi loputada enne, kui on möödunud vähemalt 24 tundi uuritava kemikaali manustamisest, välja arvatud tahkiste kasutamise puhul (vt punkt 18) ning viivitamatult avaldunud söövitava või ärritava toime korral. 24 tunni pärast võib silmi loputada, kui see on vajalik.

Täiendava loomade rühma (nn satelliitrühma) kasutamine loputamise mõju uurimiseks ei ole soovitatav, välja arvatud juhul, kui see on teaduslikult põhjendatud. Kui satelliitrühma on vaja, kasutatakse kahte küülikut. Loputustingimused tuleb üksikasjalikult dokumenteerida, nt selleks kulunud aeg; loputuslahuse koostis ja temperatuur; loputuse kestus, vedeliku kogus ja voolukiirus.

Annustamine

1)   Vedelike uurimine

Vedelike uurimiseks kasutatakse annust 0,1 ml. Pumppihustit ei tohi kemikaali otse silmale kandmiseks kasutada. 0,1 ml silma tilgutamiseks tuleb pihustatav vedelik enne väljutada ja koguda proovinõusse.

2)   Tahkiste uurimine

Tahkiste, pastade ja peenosakestest koosnevate kemikaalide uurimisel kasutatav kogus on ruumalaga 0,1 ml või massiga kuni 100 mg. Uuritav kemikaal peab olema jahvatatud peentolmuks. Tahke materjali kogust tuleb mõõta pärast selle ettevaatlikku tihendamist, nt mõõteanuma raputamisega. Kui esimese vaatluse ajal (üks tund pärast kemikaali silma panemist) ei ole tahke kemikaal katselooma silmast füsioloogiliste mehhanismide abil eemaldatud, võib silma loputada füsioloogilise lahuse või destilleeritud veega.

3)   Aerosoolide uurimine

Iga pumppihustis olev kemikaal (pihus või aerosool) on soovitatav silma tilgutamiseks eelnevalt koguda. Üks erand on aerosoolmahutites rõhu all olevad kemikaalid, mida ei saa koguda aurustumise tõttu. Sellisel juhul tuleks hoida looma silm lahti ja pihustada uuritav kemikaal otse sellesse 10 cm kauguselt silma eest ligikaudu üks sekund kestva purskega. Kaugus silmast võib varieeruda sõltuvalt kemikaalist pihustis ja selle rõhust. Tuleb olla ettevaatlik, et pihusejoa rõhk ei kahjustaks silma. Vajaduse korral tuleb hinnata võimalust, kas pihustatava kemikaali avaldatav rõhk ei tekita mehaanilist silmakahjustust.

Aerosooli annust võib hinnata järgmise mudelkatsega. Kemikaali pihustatakse kaalupaberile läbi otse selle ees oleva avause, mis on küüliku silma suurune. Paberi kaalu suurenemise järgi hinnatakse ligikaudne silma pihustatav kogus. Lenduvate kemikaalide puhul võib annust hinnata, kui kaaluda kogumisnõu enne ja pärast uuritava kemikaali eemaldamist.

Eelkatse (silma ärrituse/söövituse in vivo katse ühe loomaga)

In vivo eelkatses on väga soovitatav kasutada vaid üht looma (vt käesoleva katsemeetodi täiendmaterjali: „Järjestikuste katsete tegemise strateegia silmade ärrituse ja söövituse uurimiseks“). Vaatlused peavad võimaldama määrata silmakahjustuse raskusastet ja pöörduvust enne kinnitava katse tegemist teisel katseloomal.

Kui selle katse tulemustest nähtub, et kemikaal on kirjeldatud meetodi järgi tehtud katse põhjal silma söövitav või tugevalt ärritav, ei ole vaja täiendavaid silma ärrituse katseid teha.

Kinnitav katse (silma ärrituse in vivo katse täiendavate katseloomadega)

Kui söövitavat või tugevalt ärritavat toimet ei ole eelkatses täheldatud, tuleb ärritava või negatiivse reaktsiooni kinnitamiseks teha lisakatse veel kahe katseloomaga. Kui ärritav toime sedastatakse eelkatses, siis on soovitatav, et kinnitav katse tehtaks katsete järjestikuse tegemise põhimõtte kohaselt, s.o kasutada katse kohta korraga pigem üht looma kui teha katse samaaegselt mõlema lisaloomaga. Kui teisel loomal avaldub söövitavaid või tugevalt ärritavaid toimeid, siis katset enam ei jätkata. Kui teise loomaga tehtud katse tulemused on piisavad ohuklassifikatsiooni määramiseks, siis täiendavaid katseid ei tehta.

Vaatlusperiood

Vaatlusperioodi kestus peab olema piisav, et hinnata täielikult vaadeldava toime ulatust ja pöörduvust. Katse tuleb siiski lõpetada kohe, kui loomal avalduvad tugeva valu või kannatuse sümptomid (8). Toime pöörduvuse üle otsustamiseks tuleb loomi üldjuhul pärast uuritava kemikaali manustamist jälgida 21 päeva jooksul. Kui toime pöörduvus ilmneb enne 21 päeva möödumist, tuleb katse lõpetada sel ajal.

Kliiniline vaatlus ja silma reaktsioonide raskusastme hindamine

Silmi tuleb silmakahjustuse esinemise või puudumise suhtes üks tund pärast uuritava kemikaali silma panemist põhjalikult hinnata, pärast seda tuleb nende seisundit hinnata vähemalt kord päevas. Loomade seisundit tuleb esimese kolme päeva jooksul hinnata mitu korda päevas, et õigeaegselt otsustada katse lõpetamise üle. Katseloomi tuleb tavapraktika korras hinnata kogu uuringu jooksul vähemalt kaks korda päevas valu ja/või kannatuse kliiniliste sümptomite esinemise suhtes (nt silma korduv kraapimine või hõõrumine, liigne pilgutamine, liigne pisaravool) (9–11), vaatlustevaheline ajavahemik on vähemalt 6 tundi (vajaduse korral hinnatakse sagedamini). See on vajalik, et i) hinnata katseloomadel valu ja kannatuse avaldumise tõendeid piisavalt, otsustamaks tõenduspõhiselt valuvaigistite annuse suurendamise vajaduse üle, ja ii) hinnata katseloomi kindlaksmääratud humaansete näitajate alusel, et otsustada tõenduspõhiselt, kas loomade humaanne eutanaasia on asjakohane, ning et tagada selliste otsuste õigeaegsus. Selleks et hinnata ja mõõta silmakahjustust ning otsustada kehtestatud humaansete näitajate alusel humaanse eutanaasia vajaduse üle, kasutatakse rutiinse abivahendina fluorestseiiniga värvimist ja vajaduse korral biomikroskoopi (nt sarvkesta haavandumise korral kahjustuse sügavuse hindamiseks). Sedastatud silmakahjustuste digifotod võib koguda tõendusmaterjaliks ja silmakahjustuse ulatuse dünaamika pidevaks dokumenteerimiseks. Loomi tohib pidada katses vaid nii kaua, kuni lõplikud andmed on saadud. Loomad, kel avalduvad tugeva valu või kannatuse nähud, tuleb viivitamata humaanselt hukata, ning kemikaali tuleb hinnata vastavalt sellele.

Loomad, kel on pärast kemikaali silma tilgutamist tekkinud järgmised silmakahjustused, tuleb humaanselt hukata (kahjustuste raskusastme kirjeldus on esitatud tabelis 1): sarvkesta perforatsioon või sarvkesta oluline haavand, sealhulgas stafüloom; veri silma eeskambris; sarvkesta 4. astme hägustumine; valgusrefleksi puudumine (2. astme pupillireaktsioon), mis püsib 72 tunni jooksul; sidekesta haavandumine; sidekesta või pilkkile nekroos; või niiske kärbus. Seda seetõttu, et sellised kahjustused üldiselt on pöördumatud. Peale selle soovitatakse selleks, et lõpetada katse enne 21päevase vaatlusperioodi lõppu, kasutada humaansete näitajatena järgmisi silmakahjustusi. Neid kahjustusi peetakse prognostilisteks silma tugeva ärrituse või selliste söövitusvigastuste puhul, mis on 21päevase vaatlusperioodi jooksul pöördumatud: väga sügav vigastus (nt sarvkesta haavand, mis ulatub pealmistest strooma kihtidest sügavamale), limbuse lagunemine > 50 % (mida tõendab sidekesta koe kahvatuks ja värvusetuks muutumine) ning raske silmainfektsioon (mädane eritis). Koos esinevaid sarvkesta pinna vaskularisatsiooni (st pannus), fluorestseiiniga värvunud pindala suuruse muutumatust (st igapäevase hindamise alusel see ei vähene) ja/või viie päeva möödumisel pärast kemikaali silma panekut reepiteliseerumise puudumist võib samuti pidada võimalikeks kasulikeks kriteeriumideks, mis võivad mõjutada kliinilist otsust uuringu varasema lõpetamise suhtes. Eraldi esinevatena ei ole need leiud siiski piisavad, et põhjendada uuringu varasemat lõpetamist. Kui on tuvastatud raske toime silmale, tuleb kliinilise läbivaatuse jaoks konsulteerida raviva veterinaararsti või katseloomadele spetsialiseerunud veterinaararstiga või kliiniliste kahjustuste diagnostika valdkonnas koolitatud töötajaga, et otsustada, kas nende nähtude koosesinemine on aluseks uuringu varasemale lõpetamisele. Silma (side-, sarv- ja vikerkesta) reaktsiooni astet tuleb hinnata ja dokumenteerida 1, 24, 48 ja 72 tunni möödumisel uuritava kemikaali silma panekust. Loomad, kellel ei teki silmakahjustusi, võib hukata mitte varem kui kolm päeva pärast kemikaali silma tilgutamist. Loomi, kelle silmakahjustused ei ole rasked, tuleb jälgida seni, kuni kahjustused paranevad või 21 päeva, misjärel katse lõpetatakse. Selleks et määrata kahjustuste seisund ja otsustada nende pöörduvuse või pöördumatuse üle tuleb vaatlusi teha ja nähtu dokumenteerida vähemalt 1 tunni, 24 tunni, 48 tunni, 72 tunni, 7 päeva, 14 päeva ja 21 päeva järel. Vaatluste sagedust tuleb vajaduse korral suurendada, et otsustada, kas katseloom tuleb humaansetest kaalutlustest lähtudes hukata või eemaldada uuringust negatiivsete tulemuste tõttu.

Silmakahjustuste astmed (tabel 1) tuleb registreerida iga läbivaatuse ajal. Kõigist muudest silmakahjustustest (nt pannus, värvumine, eeskambri muutused) või kahjulikust süsteemsest toimest tuleb samuti teatada.

Reaktsioonide uurimist lihtsustab binokulaarluubi, käsi-pilulambi, biomikroskoobi või muu sobiva seadme kasutamine. Pärast 24 tunni vaatluste registreerimist võib silmi edasi uurida fluorestseiini abil.

Silma reaktsioonide hindamine on vältimatult subjektiivne. Silma reaktsiooni hindamise ühtlustamiseks ning selleks, et aidata katselaboreid ja neid, kes vaatlusi läbi viivad või tõlgendavad, tuleb personali, kes vaatlusi teeb ja tõlgendab, kasutatava hindamissüsteemi mõistmiseks piisavalt koolitada.

ANDMED JA KATSEPROTOKOLLI KOOSTAMINE

Tulemuste hindamine

Silma ärrituse punktisummasid tuleks hinnata vastavalt kahjustuste iseloomulikele omadustele ja raskusastmele ning nende pöörduvusele või pöördumatusele. Üksikud punktisummad ei ole kemikaali hindamisel silmi ärritavate omaduste absoluutne standard, sest hinnatakse ka uuritava kemikaali muid toimeid. Selle asemel tuleks üksikuid punktisummasid käsitada võrdlusväärtustena ja need on tähenduslikud üksnes siis, kui neid täiendavad kõigi vaatlusandmete täielik kirjeldamine ja hindamine.

Katseprotokoll

Katseprotokoll peab sisaldama järgmist teavet.

Tulemuste tõlgendamine

Silma ärrituse uuringute loomkatsetest saadud tulemuste ekstrapolatsioon inimesele kehtib üksnes piiratud ulatuses. Paljudel juhtudel on albiinoküülikud silma ärritavate või söövitavate ainete suhtes tundlikumad kui inimesed.

Andmete tõlgendamisel tuleb olla hoolikas, et välistada sekundaarsest infektsioonist tingitud ärritus.

KIRJANDUS

Tabel 1

Silmakahjustuste hindamise skaala

KATSEMEETODI B.5 TÄIENDMATERJAL  (4)

JÄRJESTIKUSTE KATSETE TEGEMISE STRATEEGIA SILMA ÄRRITUSE JA SÖÖVITUSE UURIMISEKS

Üldkaalutlused

Teadusandmete õigsuse ja loomade heaolu huvides on oluline vältida loomade tarbetut kasutamist ja minimeerida selliste katsete tegemist, mis tõenäoliselt tekitavad loomadel raskeid reaktsioone. Kogu teavet kemikaali võimaliku silmi ärritava/söövitava toime kohta tuleb hinnata enne in vivo katsete tegemise kaalumist. Piisav tõendusmaterjal uuritava kemikaali klassifitseerimiseks selle võimaliku silmi ärritava või söövitava toime suhtes võib juba olemas olla, ilma et oleks vaja teha loomkatseid. Seega minimeerivad tõendite kaalukuse analüüs ja järjestikuste katsete tegemise strateegia in vivo katsetamise vajadust, eriti juhul, kui kemikaal põhjustab tõenäoliselt raskeid reaktsioone.

Tõendite kaalukuse analüüsi on soovitatav kasutada kemikaali silmi ärritava ja söövitava toime kohta olemas oleva teabe hindamiseks, et otsustada, kas selle toime iseloomustamiseks saaks täiendavalt teha muid kui in vivo silmauuringuid. Kui on vaja teha täiendavaid uuringuid, on soovitatav asjakohaste katseandmete saamiseks kasutada järjestikuste katsete tegemise strateegiat. Kui aine kohta ei ole katseandmeid, tuleb kasutada järjestikuste katsete strateegiat, et saada andmeid, mida on vaja silmi ärritava/söövitava toime hindamiseks. Käesolevas täiendmaterjalis kirjeldatud eelkatsete tegemise strateegia on välja töötatud OECD töörühma poolt (1). Strateegia kinnitati ja seda laiendati hiljem keemiliste ainete mõju inimeste tervisele ja keskkonnale käsitleva ohtude integreeritud ja harmoneeritud klassifitseerimise süsteemis, mis kiideti heaks kemikaalikomitee ja kemikaalitöörühma 28. ühisistungil 1998. aasta novembris (2) ja ajakohastati OECD eksperdirühma poolt 2011. aastal.

Kuigi see strateegia ei ole B.5 katsemeetodi lahutamatu osa, väljendab see soovitatavat lähenemisviisi silmi ärritavate/söövitavate omaduste kindlaks tegemiseks. See lähenemisviis esindab nii hea tava kui ka eetikapõhist võrdlusalust silmi ärritava/söövitava toime in vivo katsete tegemisel. Selles katsemeetodis on esitatud in vivo katse tegemise juhised ning kokkuvõte teguritest, mida tuleb käsitleda enne sellise katse kaalumist. Järjestikuste katsete tegemise strateegiaga nähakse ette tõendite kaalukusel põhinev lähenemisviis uuritava kemikaali silmi ärritavate/söövitavate omaduste hindamiseks ja astmelisel katsete tegemise strateegial põhinev lähenemisviis asjakohaste andmete saamiseks kemikaali kohta, mille suhtes on vaja teha täiendavaid uuringuid või millega ei ole veel katseid tehtud. Strateegia hõlmab kõigepealt valideeritud ja heakskiidetud in vitro või ex vivo katsete tegemist ning seejärel erandlikel asjaoludel katsemeetodi B.4 uuringute tegemist (3, 4).

Etapiviisi katsetamise strateegia kirjeldus

Enne katsete tegemist tuleb järjestikuste katsete tegemise strateegia (joonis) osana hinnata kogu olemasolevat teavet in vivo silmakatsete vajaduse määramiseks. Kuigi üksikute parameetrite hindamisel võib saada olulist teavet (nt äärmuslik pH-väärtus), tuleb olemasolevat teavet hinnata terviklikult. Tõendite kaalukuse alusel otsustamiseks tuleb hinnata kõiki asjakohaseid andmeid uuritava kemikaali ja selle struktuurianaloogide toime kohta ja tehtud otsuse kohta tuleb esitada põhjendus. Peamine rõhuasetus tuleks teha inimeste või loomade kohta seoses kemikaaliga juba olemas olevatele andmetele ning seejärel kemikaali in vitro või ex vivo uurimise tulemustele. Kui vähegi võimalik, tuleb söövitavate kemikaalide puhul in vivo uuringuid vältida. Katsete tegemise strateegias võetakse arvesse järgmisi tegureid.

KATSETE TEGEMISE JA HINDAMISE STRATEEGIA SILMA ÄRRITUSE/SÖÖVITUSE JAOKS

KIRJANDUS

3)

B osas asendatakse peatükk B.10 järgmisega:

„B.10.    In vitro kromosoomaberratsioonkatse imetajarakkudega

SISSEJUHATUS

Käesolev katsemeetod on samaväärne OECD katsejuhendiga nr 473 (2016). See kuulub geneetilise toksikoloogia katsemeetodite seeriasse. Välja on töötatud OECD dokument, milles on esitatud kokkuvõtlik teave geneetilise toksikoloogia katsetest ning ülevaade nende katsejuhendites tehtud viimastest muudatustest (1).

In vitro kromosoomaberratsioonkatse eesmärk on teha kindlaks kemikaalid, mis põhjustavad struktuurseid kromosoomaberratsioone kultiveeritud imetajarakkudes (2–4). Struktuursed aberratsioonid võivad olla kahte tüüpi: kromosoom- või kromatiidaberratsioonid. In vitro kromosoomaberratsioonkatsetes võib esineda polüploidsust (sealhulgas endoreduplikatsiooni). Kuigi aneugeenid võivad põhjustada polüploidsust, ei tõenda polüploidsus üksi aneugeenset potentsiaali ja võib lihtsalt viidata rakutsükli häirumisele või tsütotoksilisusele (5). Käesolev katse ei ole ette nähtud aneuploidsuse mõõtmiseks. Aneuploidsuse määramiseks on soovitatav kasutada mikrotuumade tekke in vitro katset (6).

In vitro kromosoomaberratsioonkatses võib kasutada inimrakkude või näriliste rakkude püsirakuliine või primaarseid rakukultuure. Kasutatavad rakud valitakse rakukultuuris kasvamise võime, karüotüübi (sh kromosoomiarvu) stabiilsuse ja spontaansete kromosoomaberratsioonide sageduse alusel (7). Praegu olemasolevad andmed ei võimalda anda kindlaid soovitusi, kuid nende alusel võib eeldada, et keemiliste ohutegurite hindamisel on oluline võtta arvesse katseks valitud rakkude p53 staatust, geneetilist (karüotüübi) stabiilsust, DNA reparatsiooni võimet ja päritolu (näriliste või inimpäritolu rakud). Seega soovitatakse käesoleva katsemeetodi kasutajatel indutseeritud kromosoomaberratsioonide tekke määramiseks võtta arvesse neid ja – valdkonna teadmiste lisandumisel – muid rakuliini toimimist mõjutavaid rakulisi näitajaid.

Kasutatud mõisted on esitatud 1. liites.

LÄHTEKAALUTLUSED JA PIIRANGUD

In vitro katsete puhul tuleb üldjuhul kasutada eksogeenset metaboolse aktivatsiooni allikat, välja arvatud juhul, kui rakud metaboliseerivad uuritavaid kemikaale. Eksogeenne metaboolse aktivatsiooni süsteem ei ole täielikult samastatav in vivo tingimustega. Hoolikalt tuleb vältida tingimusi, mis võivad põhjustada valepositiivseid tulemusi, st neid kromosoomikahjustusi, mida ei põhjusta uuritavate kemikaalide ja kromosoomide vaheline vahetu interaktsioon; sellised tingimused hõlmavad pH või osmolaalsuse muutusi (8–10), söötme koostisosadega reageerimist (11, 12) või liiga suurt tsütotoksilisust (13–16).

Käesolevat katsemeetodit kasutatakse selliste kromosoomaberratsioonide määramiseks, mida võivad põhjustada klastogeensed protsessid. Kromosoomaberratsioonide teket tuleb analüüsida metafaasi rakkudes. Seega on oluline, et nii kemikaaliga töödeldud kui ka töötlemata rakkude puhul oleksid rakud jõudnud mitoosi. Käesoleva katsemeetodi kohandamiseks tehislike nanomaterjalide uurimiseks võib vaja minna erimeetmeid, kuid neid ei ole käesolevas katsemeetodis kirjeldatud.

Enne kui kasutada seda meetodit segu korral, et saada andmeid kavandatud regulatiivse eesmärgi jaoks, tuleb kaaluda, kas see katse annab selle eesmärgi jaoks piisavaid tulemusi ja kui annab, siis miks. Sellist kaalumist ei ole vaja, kui regulatiivne nõue eeldabki segu katsetamist.

KATSE PÕHIMÕTE

Inimrakkude või muud päritolu imetajarakkude kultuurid lastakse uuritava kemikaaliga kokku puutuda nii metaboolse aktivatsiooni eksogeense allika juuresolekul kui ka ilma selleta, välja arvatud juhul, kui kasutatakse piisava metaboliseerimisvõimega rakke (vt punkt 13). Asjakohaste ettenähtud ajavahemike järel pärast rakkude kokkupuudet uuritava kemikaaliga töödeldakse neid rakutsüklit metafaasis peatava kemikaaliga (nt koltsemiid või kolhitsiin), rakud kogutakse, värvitakse ning metafaasis rakke analüüsitakse mikroskoopiliselt kromatiid- või kromosoomaberratsioonide esinemise suhtes.

MEETODI KIRJELDUS

Ettevalmistus

Rakud

On võimalik kasutada mitmeid rakuliine (nt hiina hamstri munasarjarakuliin (CHO), hiina hamstri kopsurakuliin V79, hiina hamstri kopsurakuliin (CHL/IU), rakuliin TK6) või primaarkultuuri, sh inimese või teiste imetajate perifeerse vere lümfotsüüte (7). Rakuliinide valikut tuleb teaduslikult põhjendada. Kui kasutatakse primaarseid rakke, tuleb loomade heaolu huvides kaaluda inimpäritolu rakukultuuride kasutamist kõigil juhtudel, kui rakkude kättesaadavus on probleemitu ja proovivõtt on kooskõlas inimuuringute eetika põhimõtete ja nõuetega. Inimese perifeerse vere lümfotsüüte tuleks võtta noortelt (umbes 18–35aastastelt) mittesuitsetavatelt isikutelt, kellel ei ole teadaolevaid haigusi ning kes ei ole hiljuti kokku puutunud genotoksiliste teguritega (nt kemikaalid, ioniseeriv kiirgus) koguses, mis võiks suurendada kromosoomaberratsioonide esinemist katse foonis. See tagaks, et kromosoomaberratsioonide esinemissagedus foonis on väike ja püsiv. Kromosoomaberratsioonide esinemissageduse lähtetase suureneb vanusega ja see trend on rohkem väljendunud naistel kui meestel (17, 18). Kui eri doonoritelt kogutud rakud ühendatakse üheks prooviks, tuleb esitada doonorite arv. On vaja tõendada, et rakud on pärast uuritava kemikaaliga töötlemise alustamist kuni proovi võtmiseni jagunenud. Rakukultuure hoitakse eksponentsiaalse kasvu faasis (rakuliinid) või stimuleeritakse rakkude jagunemist (lümfotsüütide primaarkultuurid), et saada rakke rakutsükli eri faasidest, sest eri faasides olevate rakkude tundlikkus uuritava kemikaali suhtes võib olla teadmata. Primaarsed rakud, mida tuleb jagunemiseks stimuleerida mitogeenidega, ei ole uuritava kemikaaliga kokkupuute ajal tavaliselt enam sünkroniseeritud (nt inimese lümfotsüüdid pärast 48tunnist stimulatsiooni mitogeeniga). Kemikaaliga töötluse ajal ei soovitata sünkroniseeritud rakkude kasutamist, kuid see võib olla aktsepteeritav, kui see on põhjendatud.

Söötmed ja kultiveerimistingimused

Rakukultuuride jaoks tuleb kasutada asjakohast söödet ja asjakohaseid inkubeerimistingimusi (kasvunõud, sobiva õhuniiskuse juures 5 % CO2 atmosfääris (kui asjakohane), inkubeerimistemperatuur 37 °C). Rakuliine tuleb tavapraktika korras kontrollida modaalse kromosoomiarvu stabiilsuse ning mükoplasmaga saastumise puudumise suhtes (7, 19); saastunud rakke või rakke, mille modaalne kromosoomiarv on muutunud, ei kasutata. Katselaboris kasutatavate rakuliinide ja primaarkultuuride puhul tuleb teha kindlaks normaalne rakutsükliks kuluv aeg ja see peab vastama rakkude kohta avaldatud iseloomulikele näitajatele (20).

Rakukultuuride ettevalmistamine

Rakuliinid: rakke kasvatatakse tüvikultuurist, külvates neid söötmesse sellise tihedusega, et rakud jätkaksid nii suspensioonis kui ka monokihina eksponentsiaalset kasvamist kuni nende kogumiseni (nt monokihina kasvavate rakkude puhul tuleb konfluentsust vältida).

Lümfotsüüdid: antikoagulandiga (nt hepariin) töödeldud täisverest eraldatud lümfotsüüte kasvatatakse (nt 48 tundi inimese lümfotsüütide puhul) mitogeeni juuresolekul (nt fütohemaglutiniin (PHA) inimese lümfotsüütide puhul)), et indutseerida rakkude jagunemist enne nende töötlemist uuritava kemikaaliga.

Metaboolne aktivatsioon

Eksogeenseid metaboliseerivaid süsteeme tuleb kasutada juhul, kui kasutatavate rakkude endogeenne metaboliseerimisvõime on ebapiisav. Kui ei ole teisiti põhjendatud, soovitatakse vaikevalikuna kõige sagedamini kasutatavat süsteemi, milleks on näriliste (tavaliselt roti) maksast valmistatud postmitokondriline fraktsioon S9, millele on lisatud kofaktor ning mida on töödeldud ensüümide induktoritega, nagu Aroclor 1254 (21–23) või fenobarbitaali ja β-naftoflavooni kombinatsiooniga (24–29). Viimane ei ole vastuolus püsivate orgaaniliste saasteainete Stockholmi konventsiooniga (Stockholm Convention on Persistent Organic Pollutants) (30) ning on mitme funktsiooniga oksüdaaside induktorina osutunud sama tõhusaks kui Aroclor 1254 (24–28). S9-fraktsiooni kasutatakse tavaliselt kontsentratsioonivahemikus 1–2 % (mahuprotsent), kuid kontsentratsiooni võib suurendada 10 %-ni (mahuprotsent) katse lõplikus söötmes. Tooteid, mis vähendavad mitoosiindeksit, eriti kaltsiumiga komplekse moodustavaid tooteid (31) tuleb vältida töötlemise ajal. Uuritavate kemikaalide klass võib mõjutada kasutatava eksogeense metaboolse aktivatsiooni süsteemi või ensüümi induktori tüübi ja kontsentratsiooni valikut.

Uuritava kemikaali preparaadi valmistamine

Enne rakkude töötlemist tuleb tahke uuritav kemikaal lahustada sobivas lahustis ja vajaduse korral lahjendada (vt punkt 23). Uuritavat kemikaali, mis on vedelik, võib lisada katsesüsteemile vahetult ja/või lahjendada enne katsesüsteemile lisamist. Gaasi või lenduva kemikaali kasutamiseks katsetes tuleb katse-eeskirja asjakohaselt muuta, näiteks teha kemikaaliga töötlemine suletud anumas (32–34). Uuritava kemikaali preparaadid tuleb valmistada vahetult enne kasutamist, välja arvatud juhul, kui nende stabiilsuse andmetest nähtub, et neid võib säilitada.

Katsetingimused

Lahustid

Lahusti tuleb valida nii, et uuritavate kemikaalide lahustuvust saaks parandada, ilma et see moonutaks katse käiku (nt muudaks rakkude kasvukiirust, muudaks uuritavat kemikaali, reageeriks rakkude kasvunõuga, kahjustaks metaboolse aktivatsiooni süsteemi). Kui see on vähegi võimalik, on esimese võimalusena soovitatav kaaluda vesilahustuva lahusti (või söötme) kasutamist. Tavalised lahustid on näiteks vesi või dimetüülsulfoksiid. Üldjuhul ei tohiks töötlusetapis kasutatavas lõppsöötmes orgaanilise lahusti sisaldus ületada 1 % (mahuprotsent) ja vesilahustuva lahusti (füsioloogiline lahus või vesi) sisaldus ei tohiks ületada 10 % (mahuprotsent). Kui kasutatakse muid kui tavaliselt kasutatavaid lahusteid (nt etanooli või atsetooni), tuleb esitada andmed, millest nähtuks nende kokkusobivus uuritava kemikaali ja katsesüsteemiga ning genotoksilise toime puudumine kasutatud kontsentratsioonis. Nende tugiandmete puudumisel on oluline lisada lahustiga töötlemata kontrollid (vt 1. liide), et tõendada valitud lahustil kahjuliku või klastogeense toime puudumist.

Rakkude paljunemise ja tsütotoksilisuse mõõtmine ning uuritava kemikaali kontsentratsioonide valimine

Uuritava kemikaali suurimat kontsentratsiooni määrates tuleb vältida kontsentratsioone, mis võivad põhjustada valepositiivseid tulemusi, nagu kontsentratsioonid, millel avaldub liiga suur tsütotoksilisus (vt punkt 22), söötmes sadestumine (vt punkt 23) või oluline pH või osmolaalsuse muutus (vt punkt 5). Kui kemikaal muudab lisamise hetkel oluliselt söötme pH-d, võib pH-d reguleerida töötlusetapis kasutatavat lõppsöödet puhverdades, et vältida valepositiivseid tulemusi ja säilitada asjakohased rakkude kasvutingimused.

Mõõdetakse rakkude paljunemist, et veenduda selles, et piisav arv töödeldud rakke on katse ajal jõudnud mitoosi ja et töötlused tehakse asjakohasel tsütotoksilisuse tasemel (vt punktid 18 ja 22). Tsütotoksilisust tuleb põhikatses määrata nii metaboolse aktivatsiooni süsteemi juuresolekul kui ka ilma selleta, kasutades asjakohaseid meetodeid raku surma ja kasvu tuvastamiseks. Kuigi tsütotoksilisuse hindamine eelkatses võib osutuda kasulikuks, et paremini määrata põhikatses kasutatavad kontsentratsioonid, ei ole eelkatse tegemine kohustuslik. Kui tsütotoksilisust hinnatakse eelkatses, ei asenda need tulemused tsütotoksilisuse mõõtmist põhikatses.

Asjakohased meetodid tsütotoksilisuse hindamiseks tsütogeneetilistes katsetes on rakupopulatsiooni suhteline kahekordistumine (relative population doubling, RPD) või rakkude arvu suhteline suurenemine (relative increase in cell count, RICC) (13, 15, 35, 36, 55) (vt arvutusvalemid, 2. liide). Pikaajalise töötluse korral ja juhul, kui proovide võtmise aeg pärast kemikaaliga töötlemise algust ületab 1,5 korda rakutsükli kestust (st on pikem kui 3 rakutsüklit kokku), võib RPD kaudu tsütotoksilisust alahinnata (37). Neil tingimustel võib RICC olla parem mõõtmisvahend; RPD abil saaks tsütotoksilisuse kasuliku hinnang pärast 1,5 normaalse rakutsükli pikkusele vastava aja möödumist.

Lümfotsüütide primaarkultuuri puhul on tsütotoksilise/tsütostaatilise toime mõõduks mitoosiindeks (MI), kuigi seda mõjutavad kemikaaliga töötluse järel möödunud aeg, kasutatud mitogeen ja rakutsükli võimalik katkestus. Mitoosiindeks on sellele vaatamata aktsepteeritav, sest muud tsütotoksilisuse mõõtmised võivad osutuda töömahukateks ja ebapraktiliseks ning neid ei saa kohaldada PHA-stimulatsiooni tagajärjel kasvavale lümfotsüütide populatsioonile.

Kuigi rakuliinide puhul on RICC ning RPD ja primaarse rakukultuuri puhul mitoosiindeks soovitatavad tsütotoksilisuse näitajad, võib kasulikku lisateavet saada ka muude näitajate (nt rakkude terviklikkus, apoptoos, nekroos, rakutsükkel) põhjal.

Lahusti kontrolli ja positiivset kontrolli kaasa arvamata tuleb hinnata vähemalt kolme katsekontsentratsiooni, mis vastavad nõuetekohasuse kriteeriumidele (asjakohane tsütotoksilisus, rakkude arv jne). Sõltumata rakuliigist (rakuliinid või lümfotsüütide primaarkultuur) võib iga kontsentratsiooniga töödelda kas paralleelselt mitut või ainult ühte rakukultuuri. Kuigi soovitatav on kasutada paralleelkultuure, võib ka üksikkultuuride kasutamist aktsepteerida eeldusel, et nii ühe kui ka paralleelkultuuride puhul hinnatakse kokku ühesugune arv rakke. Üksikkultuuride kasutamine on eriti asjakohane, kui hinnatakse rohkem kui 3 kontsentratsiooni (vt punkt 31). Konkreetse kontsentratsiooniga sõltumatutest paralleelkultuuridest saadud tulemused võib andmeanalüüsiks kokku arvestada (38). Uuritavate kemikaalide puhul, mille tsütotoksilisus on väike või millel see puudub, on tavaliselt sobivad kahe- kuni kolmekordsed kontsentratsiooniintervallid. Tsütotoksilisuse avaldumise korral peavad katseks valitud kontsentratsioonid katma vahemiku alates kontsentratsioonist, millel avaldub tsütotoksilisus (nagu on kirjeldatud punktis 22), ja hõlmama kontsentratsioonid, millel esineb mõõdukas ja väike (või olematu) tsütotoksilisus. Paljudel uuritavatel kemikaalidel on kontsentratsiooni-toime sõltuvuse kõver järsu tõusuga ja selleks, et saada andmeid vähese või mõõduka tsütotoksilisuse kohta või et uurida doosi-toime seost üksikasjalikult, tuleb kasutada väiksema intervalliga kontsentratsioone ja/või enam kui kolme kontsentratsiooni (üks kultuur või mitu paralleelkultuuri), eriti olukorras, kui vajatakse korduskatset (vt punkt 47).

Kui maksimumkontsentratsioon põhineb tsütotoksilisusel, on suurima kontsentratsiooni puhul eesmärk saavutada 55 ± 5 % tsütotoksilisust, soovitatavate tsütotoksilisuse näitajate (st RICC ja RPD vähenemine rakuliinide puhul ning mitoosiindeksi vähenemine lümfotsüütide primaarkultuurides kuni 45 ± 5 % võrreldes samaaegse negatiivse kontrolliga) põhjal. Hoolikas tuleb olla nende positiivsete tulemuste tõlgendamisel, mis esinevad ainult selle 55 ± 5 % tsütotoksilisuse vahemiku ülemises osas (13).

Halvasti lahustuva uuritava kemikaali puhul, mis ei ole tsütotoksiline kontsentratsioonidel, mis on väiksemad kui kõige väiksem kontsentratsioon, millel kemikaal ei lahustu, peab suurim analüüsitav kontsentratsioon kemikaaliga töötluse lõpus alati tekitama hägususe või silma või invertmikroskoobiga nähtava sademe. Isegi kui tsütotoksilisus avaldub suuremal kontsentratsioonil kui vähim kontsentratsioon, millel kemikaal ei lahustu, on soovitatav teha katse ainult ühe sellise kontsentratsiooniga, millel tekib hägusus või nähtav sade, sest sade võib toimet moonutada. Sademe moodustumise kontsentratsioonil tuleb hoolikalt veenduda, et sade ei mõjuta katse tegemist (nt värvimist või hindamist). Kasulikuks võib osutuda kemikaali lahustuvuse määramine söötmes enne katsega alustamist.

Kui ei sadet ega piiravat tsütotoksilisust ei täheldata, peab suurim kontsentratsioon katses vastama vähimale kontsentratsioonile järgmistest: 10 mM, 2 mg/ml või 2 μl/ml (39-41). Kui uuritava kemikaali koostis ei ole määratav, nt tundmatu või muutuva koostisega aine, komplekssed reaktsioonisaadused või bioloogiline materjal (UVCB) (42), keskkonnast saadud ekstrakt vms, võib iga koostisosa kontsentratsiooni suurendamiseks olla vajalik kasutada suuremat maksimaalset kontsentratsiooni (nt 5 mg/ml), kui sellega ei kaasne olulist tsütotoksilisust. Tuleb siiski märkida, et inimravimite suhtes võivad need nõuded olla teistsugused (43).

Kontrollid

Iga kogumise kohta tuleb ette näha ka samaaegsed negatiivsed kontrollid (vt punkt 15), milles kemikaaliga töötluseks kasutatavale söötmele lisatakse vaid lahusti ja mille rakke käideldakse muus osas samamoodi kui uuritava kemikaaliga töödeldud kultuure.

Samaaegseid positiivseid kontrolle on vaja, et tõendada labori pädevust kasutatud katsemetoodika tingimustel tuvastada klastogeene ning (vajaduse korral) eksogeense metaboolse aktivatsiooni süsteemi tõhusust. Positiivsete kontrollide näited on esitatud allpool tabelis 1. Kui see on põhjendatud, võib kasutada alternatiivseid positiivse kontrolli kemikaale. Kuna in vitro genotoksilisuse katsed imetajarakkudega on piisavalt standarditud, võib positiivsete kontrollide osas piirduda metaboolset aktivatsiooni vajava klastogeeni kasutamisega. Eeldusel, et kontroll tehakse samaaegselt aktiveerimata katsega, kasutades töötluseks sama kestust, nähtub sellest ainsast reaktsioonist positiivsele kontrollile nii metaboolse aktivatsiooni süsteemi aktiivsus kui ka katsesüsteemi tundlikkus. Pikaajalise töötluse jaoks (ilma S9-fraktsioonita) peab siiski olema oma positiivne kontroll, sest töötluse kestus erineb sellest, mida kasutatakse metaboolse aktivatsiooniga katses. Iga positiivse kontrolli kemikaali tuleb kasutada ühel või enamal kontsentratsioonil, mis eelduse kohaselt põhjustab fooniga võrreldes korratava ja määratava suurenemise, et näidata katsesüsteemi tundlikkust (st toime on selge, kuid ei paljasta hindajale kohe, millise proovi või kontrolliga on kodeeritud kromosoomipreparaatide puhul tegemist), ning vastusreaktsiooni ei tohi moonutada tsütotoksilisus, mis ületab selles katsemeetodis ettenähtud piire.

Tabel 1.

Labori pädevuse hindamiseks ja positiivsete kontrollide valikuks soovitatavad võrdluskemikaalid

KATSE KÄIK

Uuritava kemikaaliga töötlemine

Paljunevaid rakke töödeldakse uuritava kemikaaliga nii metaboolse aktivatsiooni süsteemi juuresolekul kui ka ilma selleta.

Rakkude kogumise aeg

Negatiivse tulemuse kohta järelduse tegemiseks võib vaja minna põhjalikku hindamist, milleks tuleb katsed läbi viia, kasutades kõiki kolme eri katsetingimustega olukorda: lühiajaline töötlemine kemikaaliga koos metaboolse aktivatsiooniga ja ilma selleta ning pikaajaline töötlemine kemikaaliga ilma metaboolse aktivatsioonita (vt punktid 43–45).

Juhul kui üks eespool esitatud katsetingimustest andis positiivse tulemuse, võib muude katsetingimuste kasutamine osutuda ebavajalikuks.

Kromosoomipreparaatide valmistamine

Rakukultuure töödeldakse koltsemiidi või kolhitsiiniga tavaliselt 1–3 tunni jooksul enne kogumist. Iga rakukultuur kogutakse ja töödeldakse kromosoomipreparaatide tegemiseks eraldi. Kromosoomipreparaatide valmistamiseks töödeldakse rakud hüpotoonilise lahusega, fikseeritakse ja värvitakse. Monokihtides võib 3–6 tundi kestnud töötlemise lõpus olla mitootilisi rakke (tuvastatavad selle järgi, et on ümmargused ja irduvad kasvunõu pinnalt). Kuna mitootilised rakud irduvad kergesti, võib neid uuritavat kemikaali sisaldava söötme eemaldamisel kaotsi minna. Kui on tõendeid, et mitootiliste rakkude arv on kontrolliga võrreldes oluliselt suurem, mis viitab rakutsükli tõenäolisele peatumisele mitoosifaasis, tuleb rakud koguda tsentrifuugimisega ja külvata tagasi rakukultuuri, et vältida kogumise ajal kromosoomaberratsiooni tekke riskiga mitoosis olevate rakkude kaotamist.

Analüüs

Kõik mikroskoobipreparaadid, sealhulgas need, millel on positiivsed ja negatiivsed kontrollid, tuleb sõltumatult kodeerida enne kromosoomaberratsioonide esinemise mikroskoopilist analüüsi. Fikseerimine põhjustab sageli osal metafaasis rakkudest kromosoomide kadu, seetõttu tuleb hinnata vaid rakke, milles olevate tsentromeeride arv vastab modaalsele kromosoomiarvule ± 2.

Iga kontsentratsiooni ja kontrolli kohta tuleb hinnata vähemalt 300 hästi eristuvat metafaasi, et käsitada uuritavat kemikaali selgelt negatiivsena (vt punkt 45). Kui kasutatakse paralleelkultuure, peavad 300 rakku olema paralleelide vahel võrdselt jagatud. Kui kontsentratsiooni kohta kasutatakse üht rakukultuuri (vt punkt 21), tuleb selles ühes kultuuris loendada vähemalt 300 hästi eristuvat metafaasi. 300 raku loendamise eelis on, et see lisab katsele statistilist võimsust ja lisaks on tulemuseks harva nullväärtus (eeldatavasti vaid 5 %) (44). Hinnatavate metafaaside arvu vähendatakse, kui tuvastatakse suur arv kromosoomaberratsioonidega rakke ja uuritavat kemikaali käsitatakse selgelt positiivsena.

Tuleb hinnata struktuursete kromosoomaberratsioonidega, sh tühikutega ja ilma, rakke. Kromosoomikatked ja tühikud määratletakse 1. liites kooskõlas kirjandusviidetega (45, 46). Kromatiid- ja kromosoomaberratsioonid tuleb eraldi dokumenteerida ja klassifitseerida alatüüpide alusel (katked, vahetused). Labori eeskirjadega peab olema tagatud, et kromosoomaberratsioonianalüüsi teevad selleks koolitatud hindajad ning vajaduse korral kasutatakse vastastikust hindamist.

Kuigi katse eesmärk on tuvastada struktuursed kromosoomaberratsioonid, on tähtis registreerida ka polüploidsuse ja endoreduplikatsiooni sagedus juhul, kui neid täheldatakse. (Vt punkt 2.)

Labori pädevus

Katsemeetodiga piisava kogemuse saamiseks enne selle rutiinset kasutamist peab labor olema teinud katsesarju positiivse kontrolli kemikaalidega, mis toimivad teistsuguste mehhanismide kaudu, ja mitmesuguste negatiivse kontrolli kemikaalidega (kasutades erinevaid lahusteid/vehiikuleid). Nende positiivse ja negatiivse kontrolli kemikaalidega saadud reaktsioonid peavad olema kooskõlas teaduskirjanduse andmetega. Seda nõuet ei kohaldata asjakohase kogemusega laborite puhul, kui on olemas varasemate katsete põhine andmebaas, nagu on määratletud punktis 37.

Positiivseks kontrolliks valitud kemikaale (vt tabel 1, punkt 26) tuleb uurida lühi- ja pikaajalise töötlusega ilma metaboolse aktivatsioonita ning ka lühiajalise töötlusega metaboolse aktivatsiooni juuresolekul, et tõendada klastogeensete kemikaalide tuvastamiseks ja metaboolse aktivatsiooni süsteemi tõhususe määramiseks vajalikku pädevust. Valitud kemikaalide puhul tuleb katsesüsteemi tundlikkuse ja dünaamilise vahemiku tõendamiseks valida kontsentratsioonivahemikud nii, et oleks võimalik saada foonist suuremaid ning korratavaid ja kontsentratsioonist sõltuvaid väärtusi.

Varasemad kontrolli andmed

Labor peab määrama:

Kui esmakordselt hangitakse andmeid varasemate negatiivse kontrolli tulemuste jaotuse määramiseks, peavad paralleelsed negatiivse kontrolli andmed olema kooskõlas kontrolli kohta avaldatud andmetega (kui need on olemas). Kui kontrolli väärtuste jaotusele lisatakse uusi katseandmeid, peaksid negatiivse kontrolli paralleelid ideaaljuhul olema selle jaotuse usaldusvahemikus usaldatavustasemel 95 % (44, 47). Labori varasemate negatiivsete kontrollide andmebaasi koostamisel tuleb alguses kasutada vähemalt 10 katse andmeid, kuid eelistatavalt peaks andmebaas sisaldama vähemalt 20 võrreldavatel tingimustel tehtud katse andmeid. Laboritel tuleb kasutada kvaliteedikontrolli meetodeid, selliseid nagu kontrollkaardid (nt vastavuse kontrollkaardid või X-tüüpi kontrollkaardid (48)), et määrata, kui suures ulatuses positiivse ja negatiivse kontrolli andmed varieeruvad, ja tõendada, et metoodika on laboris „kontrolli all“ (44). Täiendavaid soovitusi selle kohta, kuidas koguda ja kasutada varasemate katsete andmeid (st tulemuste varasemate andmete andmebaasi võtmise või sellest väljajätmise kriteeriumid ja konkreetse katse nõuetekohasuse kriteeriumid), võib leida kirjandusest (47).

Katse-eeskirja muudatuste puhul tuleb arvestada, kas need mõjutavad andmete vastavust neile andmetele, mis on labori varem tehtud kontrollide andmebaasis olemas. Oluliste mittevastavuste korral tuleb koostada uus varasemate kontrolli andmete andmebaas.

Negatiivse kontrolli andmed peaksid hõlmama kromosoomaberratsioonidega rakkude esinemust ühes rakukultuuris või nende summat paralleelkultuuridest, nagu on kirjeldatud punktis 21. Negatiivse kontrolli paralleelide tulemused peaksid ideaaljuhul olema labori varasemate kontrolli andmete jaotuse usaldusvahemikus usaldatavustasemel 95 % (44, 47). Kui negatiivse kontrolli paralleelide tulemused jäävad väljapoole usaldusvahemikku usaldatavustasemel 95 %, võivad need olla varasemate kontrolli andmete jaotuses arvessevõtmiseks vastuvõetavad juhul, kui tegemist ei ole äärmusliku võõrväärtusega ning on tõendatud, et katsesüsteem on „kontrolli all“ (vt punkt 37) ja ei ole tõendeid, et tegemist on tehnilise vea või inimliku eksitusega.

ANDMED JA KATSEPROTOKOLLI KOOSTAMINE

TULEMUSTE ESITAMINE

Struktuurse(te) kromosoomaberratsiooni(de)ga rakkude osakaalu hinnatakse protsentides. Alatüüpideks klassifitseeritud kromatiid- ja kromosoomaberratsioonid (murrud, vahetused) loetletakse eraldi, esitades nende arvu ja sageduse uuritava kemikaali ja kontrolli kultuuride puhul. Tühikud registreeritakse ja nende andmed esitatakse eraldi, kuid neid ei võeta arvesse aberratsioonide üldsageduses. Polüploidsete ja/või endoreduplikatsiooniga rakkude (kui neid täheldatakse) osakaal esitatakse protsentides.

Aberratsiooni põhikatses/-katsetes tuleb registreerida kõikide uuritava kemikaaliga töödeldud, negatiivse ja positiivse kontrolli kultuuride tsütotoksilisuse paralleelmõõtmiste tulemused.

Andmed tuleb esitada iga kultuuri kohta eraldi. Lisaks tuleb tabelina esitada kõikide andmete kokkuvõte.

Katse nõuetekohasuse kriteeriumid

Katse nõuetekohasus põhineb järgmistel kriteeriumidel:

Tulemuste hindamine ja tõlgendamine

Tingimusel, et kõik katse nõuetekohasuse kriteeriumid on täidetud, käsitatakse uuritavat kemikaali selgelt positiivsena, kui mis tahes uuritud katsetingimustes (vt punkt 28):

Kui kõik need kriteeriumid on täidetud, järeldatakse, et kemikaal põhjustab selles katsesüsteemis kromosoomaberratsioone kultiveeritud imetajarakkudes. Soovitusi kõige asjakohasemate statistiliste meetodite kohta leiab kirjandusest (49–51).

Tingimusel, et kõik katse nõuetekohasuse kriteeriumid on täidetud, käsitatakse uuritavat kemikaali selgelt negatiivsena, kui kõikides uuritud katsetingimustes (vt punkt 28):

Sel juhul järeldatakse, et kemikaal ei saa selles katsesüsteemis põhjustada kromosoomaberratsioone kultiveeritud imetajarakkudes.

Selget positiivset või selget negatiivset reaktsiooni ei ole vaja kinnitada.

Juhul, kui reaktsioon ei ole selgelt negatiivne ega selgelt positiivne, nagu eespool kirjeldatud, või selleks, et teha kindlaks tulemuse bioloogiline olulisus, hinnatakse andmeid eksperdihinnangu ja/või täiendavate uuringute abil. Kasulikuks võib osutuda lisarakkude hindamine (kui see on asjakohane) või korduskatse tegemine, võimaluse korral muudetud tingimustes (nt kontsentratsioonivahemik, teistsugused metaboolse aktivatsiooni tingimused (nt S9-fraktsiooni kontsentratsioon või S9 päritolu).

Harvadel juhtudel võivad andmed isegi pärast täiendavaid uuringuid olla positiivse või negatiivse tulemuse suhtes järelduse tegemist välistavad ning seetõttu järeldatakse, et uuritava kemikaali toime on ebaselge.

Polüploidsete rakkude arvu suurenemine võib viidata sellele, et uuritav kemikaal võib inhibeerida mitoosi protsesse ja põhjustada kromosoomide arvu muutusi (52). Endoreduplitseeritud kromosoomidega rakkude arvu suurenemine võib viidata sellele, et uuritav kemikaal võib inhibeerida rakutsükli edenemist (53, 54) (vt punkt 2). Seepärast tuleb polüploidsed rakud ja endoreduplitseeritud kromosoomidega rakud eraldi registreerida.

Katseprotokoll

Katseprotokoll peab sisaldama järgmist teavet.

KIRJANDUS

4)

B osas asendatakse peatükk B.11 järgmisega:

„B.11.   Kromosoomaberratsioonkatse imetajate luuüdiga

SISSEJUHATUS

Käesolev katsemeetod on samaväärne OECD katsejuhendiga nr 475 (2014). See kuulub geneetilise toksikoloogia katsemeetodite seeriasse. Välja on töötatud OECD dokument, milles on esitatud kokkuvõtlik teave geneetilise toksikoloogia katsetest ning ülevaade nende katsejuhendites tehtud viimastest muudatustest (1).

In vivo kromosoomaberratsioonkatse imetajate luuüdiga on genotoksilisuse hindamiseks eriti oluline, sest kuigi metabolismi, farmakokineetika ja DNA reparatsiooniprotsesside in vivo tegurid võivad liigiti erineda, on need aktiivsed ja annavad oma panuse organismi reageerimisse. Samuti võib in vivo katse olla kasulik in vitro süsteemis kindlaks tehtud genotoksilisuse täiendavaks uurimiseks.

In vivo kromosoomaberratsioonkatset imetajarakkudega kasutatakse uuritava kemikaali põhjustatud struktuursete kromosoomaberratsioonide tuvastamiseks imetajate (tavaliselt näriliste) luuüdirakkudes (2–5). Struktuursed kromosoomaberratsioonid võivad olla kahte tüüpi: kromosoom- või kromatiidaberratsioonid. Kuigi enamik genotoksiliste kemikaalide põhjustatud aberratsioone on kromatiidaberratsioonid, esineb ka kromosoomaberratsioone. Kromosoomikahjustused ja nende tagajärjed põhjustavad mitmeid inimeste geneetilisi haigusi ning on olulisi tõendeid selle kohta, et need kahjustused ja nende tagajärjed põhjustavad muutusi onkogeenides ja tuumorsupressorgeenides ning on seotud vähktõve tekkega inimestel ja katsesüsteemides. Kromosoomaberratsiooni katsetes in vivo võib esineda polüploidsust (sealhulgas endoreduplikatsiooni). Polüploidsuse suurenemine ei viita siiski iseenesest aneugeensele potentsiaalile ja võib lihtsalt viidata rakutsükli häirumisele või tsütotoksilisusele. Käesolev katsemeetod ei ole ette nähtud aneuploidsuse mõõtmiseks. Mikrotuumade tekke in vivo katse imetajate erütrotsüütidega (käesoleva lisa peatükk B.12) või mikrotuumade tekke in vitro katse imetajarakkudega (käesoleva lisa peatükk B.49) oleksid vastavalt in vivo ja in vitro katsed, mis on soovitatavad aneuploidsuse määramiseks.

Kasutatud terminitega seotud mõisted on esitatud 1. liites.

LÄHTEKAALUTLUSED

Kõnealuses katses kasutatakse tavaliselt närilisi, kuid mõnel juhul võib asjakohane olla teiste liikide kasutamine, kui see on põhjendatud. Selle katse sihtkude on luuüdi, sest see on väga veresoonterikas kude, milles on populatsioon kiire rakutsükliga rakke, mida on kerge eraldada ja käidelda. Katseprotokollis tuleb esitada teaduslik põhjendus, miks kasutatakse muud loomaliiki kui rott või hiir. Kui kasutatakse muud loomaliiki kui närilisi, on soovitatav, et luuüdi kromosoomaberratsioonide mõõtmine oleks integreeritud muusse asjakohasesse toksilisuse katsesse.

Kui on tõendeid selle kohta, et uuritav kemikaal või selle metaboliit/metaboliidid ei jõua sihtkoeni, võib käesoleva katse kasutamine olla asjakohatu.

Enne kui kasutada seda meetodit segu korral, et saada andmeid kavandatud regulatiivse eesmärgi jaoks, tuleb kaaluda, kas see katse annab selle eesmärgi jaoks piisavaid tulemusi ja kui annab, siis miks. Sellist kaalumist ei ole vaja, kui regulatiivne nõue eeldabki segu katsetamist.

KATSEMEETODI PÕHIMÕTE

Loomade viiakse kokkupuutesse uuritava kemikaaliga, kasutades asjakohast kokkupuuteviisi, ning loomad hukatakse pärast kemikaaliga töötlemist humaanselt ja õigel ajal. Enne hukkamist manustatakse loomadele mitoosi metafaasis peatavat ainet (nt kolhitsiini või koltsemiidi). Seejärel tehakse luuüdirakkudest kromosoomipreparaadid, need värvitakse ja analüüsitakse metafaasis olevate rakkude kromosoomaberratsioone.

LABORI PÄDEVUSE TÕENDAMINE

Pädevuse tõendamise katsed

Kinnitamaks, et laboril on enne katse rutiinset kasutamist katse tegemise piisav kogemus, peab labor olema tõendanud, et ta suudab korrata avaldatud tööde (nt (6)) põhjal eeldatavaid tulemusi kromosoomaberratsioonide sageduse määramisel vähemalt kahe positiivse kontrolli kemikaaliga (kaasa arvatud positiivse kontrolli kemikaalide väikeste annustega põhjustatud nõrgad reaktsioonid), vt tabel 1, ja vastava vehiikuli/lahusti kontrolliga (vt punkt 22). Nendes katsetes tuleks kasutada annuseid, mis põhjustavad reprodutseeritavaid ja annusest sõltuvaid suurenemisi ning tõendavad katsesüsteemi tundlikkust huvipakkuva koe (luuüdi) puhul, mõõtmispiirkonna ja laboris kasutatava hindamismeetodi sobivust. Seda nõuet ei kohaldata kogemusega labori puhul, see tähendab, kui laboril on varasemate katsete põhine andmebaas, nagu on määratletud punktides 10–14.

Varasemad kontrolli andmed

Pädevuse tõendamise ajal peab labor kindlaks tegema:

Kui esmakordselt hangitakse andmeid varasemate negatiivse kontrolli tulemuste jaotuse määramiseks, peavad paralleelsed negatiivse kontrolli andmed olema kooskõlas kontrolli kohta avaldatud andmetega (kui need on olemas). Kui kontrolli väärtuste jaotusele lisatakse uusi katseandmeid, peaksid negatiivse kontrolli paralleelid ideaaljuhul olema selle jaotuse usaldusvahemikus usaldatavustasemel 95 %. Labori varasemate negatiivse kontrolli katsete andmebaas peaks olema statistiliselt usaldusväärne, et laboril oleks võimalik hinnata oma negatiivse kontrolli andmete jaotust. Kirjanduse põhjal läheb vaja vähemalt kümmet katset, kuid parem oleks, kui andmebaasis oleksid vähemalt 20 võrreldavates tingimustes tehtud katse tulemused. Laboritel tuleb kasutada kvaliteedikontrolli meetodeid, selliseid nagu kontrollkaardid (nt vastavuse kontrollkaardid või X-tüüpi kontrollkaardid (7)), et määrata, kui suures ulatuses andmed varieeruvad, ja tõendada, et metoodika on laboris „kontrolli all“. Täiendavaid soovitusi selle kohta, kuidas koguda ja kasutada varasemate katsete andmeid (st varasemate andmete andmebaasi võtmise või sellest väljajätmise kriteeriumid ja konkreetse katse vastuvõetavuse kriteeriumid), võib leida kirjandusest (8).

Kui labor ei tee piisavat arvu katseid, et saada statistiliselt usaldusväärne negatiivse kontrolli jaotus (vt punkt 11) pädevuskontrolli katsete käigus (kirjeldatud punktis 9), siis on lubatud selle jaotuse kindlakstegemine esimeste rutiinsete katsetega. Sellise lähenemisviisi kasutamisel tuleks järgida kirjanduses (8) esitatud soovitusi ja nendes katsetes saadud negatiivse kontrolli tulemused peaksid olema kooskõlas negatiivse kontrolli kohta avaldatud andmetega.

Katse-eeskirja kõigi muudatuste puhul tuleb arvestada, kas need mõjutavad saadavate andmete kooskõla andmetega, mis on labori varem tehtud kontrollide andmebaasis olemas. Ainult väga vastuoluliste andmete puhul tuleks koostada uus varasemate kontrolli tulemuste andmebaas, kui eksperdihinnangu alusel tuvastatakse, et uus jaotus erineb varasemast jaotusest (vt punkt 11). Uue andmebaasi koostamise ajal ei ole konkreetse katse tegemise lubamiseks negatiivsete kontrollide täielikku andmebaasi vaja, kui labor suudab tõendada, et nende paralleelse negatiivse kontrolli väärtused on kooskõlas nende varasema andmebaasiga või vastavate avaldatud andmetega.

Negatiivse kontrolli andmetes peab iga looma kohta esitama kromosoomaberratsioonide (välja arvatud tühikute) esinemissageduse. Negatiivse kontrolli paralleelide tulemused peaksid ideaaljuhul olema labori varasemate kontrolli tulemuste jaotuse usaldusvahemikus usaldatavustasemel 95 %. Kui negatiivse kontrolli paralleelide tulemused jäävad väljapoole usaldusvahemikku usaldatavustasemel 95 %, võivad need olla varasemate kontrolli tulemuste jaotuses arvessevõtmiseks vastuvõetavad juhul, kui tegemist ei ole äärmusliku võõrväärtusega ning on tõendatud, et katsesüsteem on „kontrolli all“ (vt punkt 11) ja ei ole tõendeid, et tegemist on tehnilise vea või inimliku eksitusega.

MEETODI KIRJELDUS

Ettevalmistused

Loomaliigi valimine

Kasutada tuleb tavapärastest laboriliinidest pärit terveid noori täiskasvanud isendeid. Tavaliselt kasutatakse rotte, kuigi ka hiired võivad katseks sobida. Ka mis tahes muid katseks sobivaid loomaliike võib kasutada, kui selle kohta esitatakse katseprotokollis teaduslik põhjendus.

Loomade pidamis- ja söötmistingimused

Näriliste puhul peab loomade pidamisruumi temperatuur olema 22 °C (± 3 °C). Kuigi suhteline niiskus peaks ideaaltingimustes olema 50–60 %, peab see olema vähemalt 40 % ja eelistatavalt mitte üle 70 %, välja arvatud ruumi koristamise ajal. Kasutatakse tehisvalgustust, valgusrežiimiga 12 tundi valgust ja 12 tundi pimedust. Söötmiseks võib kasutada labori tavapärast söödavalikut koos piiramatus koguses joogiveega. Söödavalikut võib mõjutada vajadus tagada uuritava kemikaali sobiv lisamine söödasse, kui kemikaali manustatakse sellisel viisil. Närilisi tuleb pidada väikestes rühmades (kuni viis looma puuris), igas puuris on samast soost ja sama katserühma loomad, kui ei eeldata agressiivset käitumist; eelistatud on kõva põrandaga ja asjakohaselt mitmekesistatud keskkonnaga puurid. Loomi võib ühekaupa pidada ainult siis, kui see on teaduslikult põhjendatud.

Loomade ettevalmistamine

Tavaliselt kasutatakse terveid noori täiskasvanud loomi (näriliste puhul ideaaljuhul katse alguses 6–10nädalased loomad, kuigi lubatud on ka veidi vanemad loomad), kes jagatakse juhuvaliku alusel katse- ja kontrollirühmadesse. Iga loom saab kordumatu identimismärgistuse, mille tegemiseks kasutatakse humaanset võimalikult vähe invasiivset meetodit (nt rõngastamine, märgistamine, mikrokiipimine või biomeetriline tuvastamine, kuid mitte kõrva sälkamine või varba köndistamine) ning loomadel lastakse vähemalt viis päeva laboritingimustega kohaneda. Puurid paigutatakse nii, et puuri asukohast tingitud mõju on võimalikult väike. Tuleb vältida ristsaastumist positiivse kontrolli ja uuritava kemikaaliga. Katse alguses peavad loomade kehamassi erinevused olema minimaalsed ning mitte erinema üle ±20 % kummagi soo keskmisest massist.

Annuste valmistamine

Tahke uuritav kemikaal tuleb lahustada või suspendeerida sobivas lahustis või vehiikulis ja segada sööda sisse või joogivette enne loomadele andmist. Vedelat uuritavat kemikaali võib manustada vahetult või lahjendada enne manustamist. Sissehingamise kaudu toimuva kokkupuute korral manustatakse uuritavat kemikaali gaasi, auru või tahke/vedela dispersse faasiga aerosoolina, sõltuvalt kemikaali füüsikalis-keemilistest omadustest. Kasutada tuleks uuritava kemikaali värskeid preparaate, välja arvatud juhul, kui püsivuse andmetest nähtub, et säilitamine on aktsepteeritav ja on määratletud asjakohased säilitamistingimused.

Lahusti/vehiikul

Kasutatavates annustes ei tohi lahusti/vehiikul avaldada toksilist toimet ega keemiliselt reageerida uuritava kemikaaliga. Kui kasutatakse muid kui kirjeldatud omadustega lahusteid/vehiikuleid, peab võrdlusandmetest nähtuma nende sobivus. Kui vähegi võimalik, on kõigepealt soovitatav kaaluda vesilahustuva lahusti/vehiikuli kasutamist. Tavaliselt kasutatavad lahustid/vehiikulid on näiteks vesi, füsioloogiline keedusoolalahus, metüültselluloosi lahus, karboksümetüültselluloosi naatriumsoola lahus, oliiviõli ja maisiõli. Kui puuduvad varasemad või avaldatud kontrolli andmed, millest nähtub, et valitud ebatüüpiline lahusti/vehiikul ei põhjusta kromosoomaberratsioonide teket ega muid kahjulikke tagajärgi, tuleb kõigepealt teha eelkatse, et tõendada lahusti/vehiikuli kontrolliks kasutamise sobivust.

Kontrollid

Positiivsed kontrollid

Igasse katsesse peab tavaliselt kavandama positiivse kontrolli kemikaaliga kokku puutuva loomade rühma. Sellest võib loobuda juhul, kui katselabor on tõendanud kõnealuse katse läbiviimise pädevust ja on kindlaks teinud varasemate katsete positiivse kontrolli vahemiku. Kui paralleelset positiivse kontrolli rühma ei kasutata, tuleb igas katses teha hindamise kontrolle (fikseeritud ja värvimata mikropreparaadid). Neid saadakse, kui katse hindamisel lisatakse asjakohased võrdlusstandardid, mis on saadud ja säilitatud eraldi tehtud positiivse kontrolli katsest, mida tehakse uuringukatset läbiviivas laboris korrapäraselt (nt iga 6–18 kuu tagant), näiteks tasemekatsete käigus ja seejärel korrapäraselt vastavalt vajadusele.

Positiivse kontrolli kemikaalid peavad usaldusväärselt põhjustama struktuursete kromosoomaberratsioonidega rakkude esinemissageduse määratava suurenemise, võrreldes spontaanse esinemissagedusega. Positiivse kontrolli annused valitakse nii, et nende toime on selge, kuid see ei paljasta hindajale kohe kodeeritud proovide identiteeti. Positiivse kontrolli kemikaali manustamiseks võib kasutada ka muud manustamisteed kui uuritava kemikaali puhul, muu manustamisskeemi kasutamine ja proovide võtmine võib toimuda ka ainult ühel ajahetkel. Kui see on asjakohane, võib lisaks kaaluda selliste positiivse kontrolli kemikaalide kasutamist, mis kuuluvad uuritava kemikaaliga samasse kemikaalide rühma. Tabelis 1 on esitatud mõned positiivse kontrolli kemikaalide näited.

Tabel 1

Positiivse kontrolli kemikaalide näited

Negatiivsed kontrollid

Igal proovivõtukorral tuleb võtta proovid ka negatiivse kontrolli rühma loomadelt, keda muidu tuleb käidelda samamoodi nagu katserühma loomi, selle erinevusega, et neile ei manustata uuritavat kemikaali. Kui uuritava kemikaali manustamisel kasutatakse lahustit/vehiikulit, tuleb kontrollrühmale manustada sedasama lahustit/vehiikulit. Kui igal proovivõtu korral on saadud negatiivse kontrolli andmed kromosoomaberratsioonidega rakkude esinemissageduse kohta olnud kooskõlas katselabori varasemates katsetes saadud negatiivse kontrolli andmetega, arvestades loomadevahelist varieeruvust, võib negatiivse kontrolli jaoks vaja minna ainult ühte proovivõttu. Kui negatiivse kontrolli puhul kasutatakse ainult ühte proovivõttu, tuleb see teha uuringu esimese proovivõtu ajal.

KATSE KÄIK

Loomade arv ja sugu

Üldjuhul on mikrotuumade tekke reaktsioon isas- ja emasloomadel ühesugune (9) ning eeldatakse, et see kehtib ka kromosoomaberratsioonide kohta; seepärast võib enamiku katseid teha ükskõik kummast soost loomadega. Andmed, millest nähtuks isas- ja emasloomade vaheline erinevus (nt süsteemse toksilisuse, metabolismi, biosaadavuse, luuüdi suhtes avalduva toksilisuse jne erinevus, sealhulgas nt annusevahemiku uuringu sellekohased andmed), toetaksid kummastki soost loomade kasutamist. Sel juhul võib olla asjakohane teha uuring kummastki soost loomadega, näiteks osana korduvannuse toksilisuse uuringust. Kui kasutatakse kummastki soost loomi, võib olla asjakohane kasutada mitme faktori määramist võimaldavat katseplaani. Üksikasjad, kuidas sellise katseplaani puhul andmeid analüüsida, on esitatud 2. liites.

Uuringu alguses tuleb määrata rühmade suurused, nii et rühmas oleks vähemalt viis analüüsitavat samast või kummastki soost looma (kui kasutatakse mõlemast soost loomi). Kui inimese kokkupuude kemikaalidega võib olla soospetsiifiline, nagu näiteks mõnede ravimite puhul, tehakse katse vastavast soost loomadega. Kahe proovivõtuajaga luuüdiuuringuks, milles on kolm eri annusega katserühma, paralleelne negatiivse kontrolli rühm ning positiivse kontrolli rühm (igas rühmas on viis samasoolist looma), on vastavalt maksimaalsele tüüpvajadusele vaja 45 looma.

Annused

Kui tehakse annusevahemiku eeluuring, sest puuduvad sobivad andmed annusevahemiku valimiseks, tuleb see teha samas laboris ning kasutada sama loomaliiki, -liini, sugu ja manustamiskava, mida kasutatakse põhiuuringus (10). Uuringu eesmärk on kindlaks määrata maksimaalne talutav doos (maximum tolerated dose, MTD), mis on suurim annus, mida loomad uuringuperioodil taluvad, ilma et neil avalduks uuringut piirava toksilisuse nähte (näiteks väheneb neil kehamass või avaldub tsütotoksilisus vereloomesüsteemi suhtes, kuid see ei kutsu esile surmajuhte ega sellist valu, piinlemist või kannatusi, mis nõuaksid loomade humaanset hukkamist (11)).

Suurimat annust võib määratleda ka doosina, mille korral esineb teatavaid luuüdi suhtes avalduva toksilisusega seotud nähte.

Kemikaalid, mille toksiko-kineetilistes omadustes esineb küllastumine või mis põhjustavad selliseid detoksifitseerimisprotsesse, mille tõttu kokkupuude võib väheneda pärast nende pikaajalist manustamist, võivad olla doosi määramise kriteeriumide seisukohast erandlikud ning iga üksikjuhtumit tuleks hinnata eraldi.

Teabe saamiseks annuse ja toime seose kohta peab täielikus uuringus olema negatiivne kontrollrühm ja vähemalt kolm eri annust, mis tavaliselt erinevad üksteisest kaks korda, kuid mitte enam kui neli korda. Kui kemikaal ei ole doosivahemiku eelkatse või olemasolevate andmete põhjal toksiline, on suurim ühekordselt manustatav annus 2 000 mg kehamassi kg kohta. Kui uuritav kemikaal siiski on toksiline, peab suurim manustatav annus olema maksimaalne talutav doos (MTD) ning muud kasutatavad annused peaksid eelistatavalt olema vahemikus sellest maksimaalselt talutavast doosist kuni vähetoksilise või üldse mitte toksilise annuseni. Kui toksilisust sihtkoe (luuüdi) suhtes täheldatakse kõigi katses kasutatud annuste puhul, on soovitatav teha katse ka mittetoksilise annusega. Uuringutes, milles tahetakse täielikult iseloomustada kvantitatiivset annuse ja toime seost, võib vaja minna täiendavaid annuserühmi. Teatavat tüüpi uuritavate kemikaalide (näiteks inimravimite) puhul, millele kohaldatakse erinõudeid, võivad need piirmäärad olla teistsugused.

Piirsisalduskatse

Kui annusevahemiku leidmise katsetest või lähedasi loomaliine käsitlevatest andmetest on saadud tõendeid, et piirannuse manustamise katses (kirjeldatud allpool) ei ole uuritaval kemikaalil sedastatavat toksilist toimet (sealhulgas luuüdirakkude paljunemise vähenemist ega muid tõendeid tsütotoksilisusest sihtkoes), ja kui genotoksilisust ei ole alust eeldada in vitro genotoksilisuse uuringute või sarnase struktuuriga kemikaalide andmete põhjal, võib täielikku kolme annusetasemega uuringut käsitada ebavajalikuna, kui on tõendatud, et uuritav kemikaal jõuab / uuritavad kemikaalid jõuavad sihtkoeni (luuüdisse). Sellistel juhtudel võib olla piisav teha katse ühe annusega, mis on piirannus. Kui manustamisperiood on rohkem kui 14 päeva, on piirannus 1 000 mg kehamassi kg kohta päevas. Kui manustamisperiood on 14 päeva või vähem, on piirannus 2 000 mg kehamassi kg kohta päevas.

Annuste manustamine

Katse kavandamisel tuleks silmas pidada inimese võimalikku kokkupuuteviisi. Seega võib valida selliste kokkupuuteviiside seast, nagu manustamine sööda või joogiveega, paikselt naha alla, veenisiseselt, suu kaudu (toitmissondiga), inhalatsiooniga, intratrahheaalselt või implantatsiooniga, kui see on põhjendatud. Igal juhul tuleb kokkupuuteviisi valikuga tagada kemikaali adekvaatne kokkupuude sihtkoega/-kudedega. Tavaliselt ei soovitata intraperitoneaalset süstimist, sest see ei ole inimese puhul ette nähtud kokkupuuteviis, ning seda võib kasutada ainult konkreetse teadusliku põhjenduse alusel. Kui uuritav kemikaal segatakse sööda sisse või joogivette, eriti ühekordse annuse manustamise korral, tuleb jälgida, et ajavahemik sööda ja vee tarbimise ning proovide võtmise vahel oleks piisav, et võimaldada toime tuvastamist (vt punktid 33–34). Vedeliku suurim kogus, mida saab toitmissondi kaudu või süstimisel ühe korraga manustada, sõltub katselooma suurusest. Tavaliselt ei tohi kogus ületada 1 ml 100 g kehamassi kohta, välja arvatud vesilahuste puhul, kus võib kasutada kogust 2 ml 100 g kehamassi kohta. Suurema koguse kasutamise korral tuleb seda põhjendada. Kui jätta välja ärritavad või söövitavad kemikaalid, mille toime on suurema kontsentratsiooni korral tavaliselt tugevam, tuleb katses vedelikukoguse varieeruvust minimeerida ja reguleerida kontsentratsioone nii, et kõiki annuseid manustataks kehamassi suhtes ühesuguse lahusekogusega.

Manustamiskava

Tavaliselt manustatakse uuritavaid kemikaale ühekordse annusena, kuid neid võib manustada ka jagatud annustena (näiteks kaks manustamist ühel päeval mitte rohkem kui 2–3tunnise vahega), et kergendada suure lahusekoguse manustamist. Selles olukorras või kui uuritavat kemikaali manustatakse inhalatsiooniga, tuleb proovide võtmise aeg kavandada viimase manustamise või kokkupuute lõppemise aja põhjal.

Korduvannuse eeskirja kasutamise kohta seoses käesoleva katsega on vähe andmeid. Olukorras, kui on siiski soovitatav ühendada see katse korduvannuse toksilisuse katsega, tuleb jälgida, et välditaks kromosoomikahjustustega mitoosirakkude kadu, mis võib tekkida toksiliste annuste juures. Selline katsete ühendamine on vastuvõetav ainult siis, kui suurim annus on suurem piirannusest (vt punkt 29) või sellega võrdne ja annuserühmale manustatakse piirannust kogu töötlemise perioodi ajal. Mikrotuumade tekke katset (katsemeetod B.12) tuleb käsitada valikmeetodina kromosoomaberratsioonkatseks in vivo, kui seda soovitakse ühendada teiste uuringutega.

Luuüdiproovid tuleb võtta kahel korral pärast ühekordset manustamist. Näriliste puhul peab esimene proovivõtuvahemik võrduma ajaliselt 1,5 normaalse rakustükli läbimiseks kuluva ajaga (tavaliselt 12–18 tundi pärast manustamist). Kuna uuritava kemikaali / uuritavate kemikaalide omastamiseks ja metabolismiks vajalik aeg ja ka kemikaali toime rakutsükli kineetikale võivad mõjutada optimaalset aega kromosoomaberratsioonide tuvastamiseks, on soovitatav võtta teine proov 24 tundi pärast esimese proovi võtmist. Esimese proovivõtu ajal peab uuritav kemikaal olema manustatud kõigile annuserühmadele ning kõigilt rühmadelt kogutakse proovid analüüsimiseks; järgmistel proovivõtukordadel tuleb manustada üksnes suurimat annust. Kui teadusliku põhjenduse alusel kasutatakse üle ühe päeva pikkust annustusskeemi, kasutatakse pärast lõppannuse manustamist ligikaudu 1,5 normaalse rakutsükli kestuse möödumise järel tavaliselt ühte proovivõtu korda.

Pärast manustamist ja enne proovi võtmist süstitakse loomadele intraperitoneaalselt asjakohases annuses rakke metafaasis peatavat ainet (nt koltsemiidi või kolhitsiini) ning proovid võetakse pärast asjakohase ajavahemiku möödumist. Hiirte puhul on see ajavahemik ligikaudu 3–5 tundi enne proovi võtmist ja rottide puhul 2–5 tundi. Luuüdi rakud kogutakse, töödeldakse nende pundumiseks, fikseeritakse ja värvitakse ning neis analüüsitakse kromosoomaberratsioonid (12).

Vaatlus

Vähemalt üks kord päevas, eelistatult igal päeval samal ajal ning võttes arvesse ajavahemikku, kui eeldatav toime avaldub pärast annuse manustamist kõige intensiivsemalt, tuleb teha katseloomade üldine kliiniline vaatlus ja registreerida kõik kliinilised sümptomid. Haigestumise ja surmajuhtude tuvastamiseks tuleb kemikaali manustamise perioodil kõik loomad vähemalt kaks korda päevas üle vaadata. Kõik loomad tuleb kaaluda uuringu alguses, korduvannuse uuringute ajal vähemalt kord nädalas ja pärast eutanaasiat. Kui uuring kestab vähemalt ühe nädala, tuleb vähemalt kord nädalas mõõta tarbitud sööda kogust. Kui uuritavat kemikaali manustatakse joogiveega, tuleb vee tarbimist mõõta pärast iga veevahetust ja vähemalt üks kord nädalas. Loomad, kellel avalduvad äärmusliku, kuigi mitte letaalse toksilisuse rasked nähud, tuleb enne katse lõppu humaanselt hukata (11).

Sihtkoe kokkupuude

Kui muid andmeid uuritava kemikaali ja luuüdi kokkupuute tõendamiseks ei ole, tuleb asjakohasel ajal (asjakohastel aegadel) võtta vereproov(id) ja analüüsida neist kemikaali sisaldust plasmas, et selle kaudu tõendada luuüdi ja kemikaali kokkupuute toimumist (vt punkt 44).

Luuüdi- ja kromosoomipreparaadid

Kohe pärast humaanset eutanaasiat eraldatakse luuüdi rakud loomade reie- või sääreluust, pannakse hüpotoonilisse lahusesse ja fikseeritakse. Seejärel tehakse metafaasis olevatest rakkudest äigepreparaat ning värvitakse see kindlaks määratud meetoditel (vt 3, 12).

Analüüs

Kõik mikroskoobipreparaadid, sh positiivse ja negatiivse kontrolliga, tuleb enne analüüsi sõltumatult kodeerida ja randomiseerida, nii et hindaja ei teaks, millise rühma loomalt proov on saadud.

Kõikide katseloomade (sh positiivse kontrolli loomade) ning kemikaaliga mitte kokku puutunud või vehiikuli/lahustiga kokku puutunud negatiivse kontrolli rühma loomade puhul tuleb tsütotoksilisuse mõõtmiseks määrata mitoosiindeks, kasutades vähemalt 1 000 rakku iga looma kohta.

Iga looma kohta tuleb analüüsida 200 metafaasis rakku struktuursete kromosoomaberratsioonide (nii koos tühikutega kui ka ilma tühikuid arvestamata) esinemise suhtes (6). Kui varasemate katsete negatiivse kontrolli andmebaasi alusel nähtub, et struktuursete kromosoomaberratsioonide keskmine esinemissagedus katselaboris on < 1 %, tuleb kaaluda täiendavate rakkude hindamist. Kromatiid- ja kromosoomaberratsioonid tuleb eraldi registreerida ja klassifitseerida alatüüpide alusel (murrud, vahetused). Labori eeskirjad peavad tagama, et kromosoomaberratsioonianalüüsi teevad pädevad hindajad ning vajaduse korral kasutatakse vastastikust hindamist. Arvestades, et mikroskoobipreparaadi valmistamise meetodid põhjustavad sageli osa metafaasis olevate rakkude purunemise, mille tõttu kaotatakse kromosoome, peab hinnatavates rakkudes tsentromeeride arv olema mitte väiksem kui 2n ± 2, kus n on liigiomane haploidne kromosoomiarv.

ANDMED JA KATSEPROTOKOLLI KOOSTAMINE

Andmete töötlemine

Iga looma andmed esitatakse tabelina. Iga looma kohta tuleb esitada mitoosiindeks, hinnatud metafaasirakkude arv, kromosoomaberratsioonide arv metafaasis raku kohta ja kromosoomaberratsioonidega rakkude osakaal (protsent). Eri tüüpi struktuursed kromosoomaberratsioonid tuleb esitada koos nende esinemise absoluutarvu ja sagedusega katse- ja kontrollirühmades. Tühikud, nagu ka polüploidsed rakud ja endoreduplitseeritud kromosoomid registreeritakse eraldi. Tühikute sagedus esitatakse, kuid üldjuhul ei arvestada seda struktuursete aberratsioonide üldsageduse analüüsis. Kui reaktsiooni puhul puudub tõendus sugudevahelise erinevuse kohta, võib andmed statistilise analüüsi jaoks ühendada. Samuti tuleb esitada andmed loomadel avaldunud toksilisuse kohta ja kliinilised sümptomid.

Katse nõuetekohasuse kriteeriumid

Katse nõuetekohasuse kriteeriumid on järgmised:

Tulemuste hindamine ja tõlgendamine

Tingimusel, et kõik katse nõuetekohasuse kriteeriumid on täidetud, käsitatakse uuritavat kemikaali selgelt positiivsena, kui:

Kui teataval proovivõtu ajal uuritakse üksnes suurimat annust, käsitatakse uuritavat kemikaali selgelt positiivsena, kui võrreldes paralleelse negatiivse kontrolliga tuvastatakse statistiliselt oluline suurenemine ja tulemused on väljaspool labori varasemate negatiivse kontrolli andmete jaotust (nt Poissoni jaotuse usaldusvahemikku usaldatavustasemel 95 %). Soovitusi asjakohaste statistiliste meetodite kohta leiab kirjandusest (13). Annuse-reaktsiooni analüüsi korral tuleb analüüsida vähemalt kolme annuse katserühma. Statistiliste testide puhul tuleb ühte looma lugeda katseühikuks. Kromosoomaberratsioonikatses saadud positiivsed tulemused tähendavad, et uuritav kemikaal põhjustab kromosoomaberratsioone katses kasutatud loomaliigi luuüdis.

Tingimusel, et kõik katse nõuetekohasuse kriteeriumid on täidetud, käsitatakse uuritavat kemikaali selgelt negatiivsena, kui kõikides uuritud katsetingimustes:

Soovitusi kõige asjakohasemate statistiliste meetodite kohta leiab kirjandusest (13). Uuritava kemikaali luuüdiga kokkupuute tõendus võib olla mitoosiindeksi vähenemine või uuritava kemikaali / uuritavate kemikaalide kontsentratsiooni mõõtmine plasmas või täisveres. Intravenoosse manustamise puhul ei ole kokkupuudet vaja tõendada. Teise võimalusena võib luuüdi kokkupuute tõendamiseks kasutada uuritava kemikaali imendumise, jaotumise, metabolismi ja eritumise (ADME) andmeid, mis on saadud sõltumatu uuringuga, milles on kasutatud sama manustamisviisi ja loomaliiki. Negatiivsed tulemused viitavad sellele, et kemikaal ei põhjusta nendel katsetingimustel kromosoomaberratsioone kasutatud loomaliigi luuüdis.

Selget positiivset või selget negatiivset vastust ei ole vaja kinnitada.

Juhul kui vastus ei ole selgelt negatiivne ega positiivne ning selleks, et aidata mõista tulemuse (nt väikse või piiripealse suurenemise) bioloogilist olulisust, tuleb andmetele anda eksperdihinnang ja/või täiendavalt uurida olemasolevaid lõpetatud katseid. Mõnel juhul võib kasulikuks osutatud suurema arvu rakkude analüüsimine või muudetud katsetingimustega korduskatse.

Harvadel juhtudel ei võimalda isegi täiendavate uuringute tulemused teha järeldust, kas uuritava kemikaaliga saadud tulemus on positiivne või negatiivne; sel juhul loetakse uuringu tulemus ebaselgeks.

Polüploidsuse ja endoreduplikatsiooniga metafaaside arv tuleb registreerida eraldi metafaaside koguarvust. Polüploidsete/endoreduplikatsiooniga rakkude arvu suurenemine võib viidata sellele, et uuritaval kemikaalil on võime inhibeerida mitoosi protsesse või rakutsükli edenemist (vt punkt 3).

Katseprotokoll

Katseprotokoll peab sisaldama järgmist teavet.

Kokkuvõte

KIRJANDUS

5)

B osas asendatakse peatükk B.12 järgmisega:

„B.12.   Mikrotuumade tekke katse imetajate erütrotsüütidega

SISSEJUHATUS

Käesolev katsemeetod on samaväärne OECD katsejuhendiga nr 474 (2014). See kuulub geneetilise toksikoloogia katsemeetodite seeriasse. Välja on töötatud OECD dokument, milles on esitatud kokkuvõtlik teave geneetilise toksikoloogia katsetest ning ülevaade nende katsejuhendites tehtud viimastest muudatustest (1).

Mikrotuumade tekke in vivo katse imetajarakkudega on genotoksilisuse hindamiseks eriti oluline, sest kuigi in vivo metabolismi, farmakokineetika ja DNA reparatsiooni protsessid võivad erineda liigiti, on need aktiivsed ja annavad oma panuse reaktsioonidesse. In vivo katse on kasulik ka täiendavateks uuringuteks, kui genotoksilisus on tuvastatud in vitro süsteemiga.

Mikrotuumade tekke in vivo katset imetajarakkudega kasutatakse, et teha kindlaks erütroblastide kromosoomide või mitoosiaparaadi kahjustus, mille on põhjustanud uuritav kemikaal. Katsega hinnatakse mikrotuumade moodustumist erütrotsüütides, mis saadakse loomadelt, tavaliselt närilistelt, võetud luuüdi või perifeerse vere rakkude proovidest.

Mikrotuumade tekke katse eesmärk on teha kindlaks kemikaalid, mis põhjustavad tsütogeneetilist kahjustust, mille tulemus on kas kromosoomiloivest mahajäänud fragmente või terveid kromosoome sisaldava mikrotuumade moodustumine.

Kui luuüdi erütroblast areneb ebaküpseks erütrotsüüdiks (mõnikord nimetatakse seda ka polükroomseks erütrotsüüdiks või retikulotsüüdiks), siis põhituum lükatakse välja; moodustunud mikrotuumad võivad jääda tsütoplasmasse. Põhituuma puudumine hõlbustab mikrotuumade visualiseerimist või määramist nendes rakkudes. Mikrotuumsete ebaküpsete erütrotsüütide esinemissageduse suurenemine kemikaaliga kokkupuutunud loomades näitab, et kemikaal on tekitanud struktuurseid kromosoomaberratsioone või kromosoomiarvu muutusi.

Uudismoodustisena tekkinud mikrotuumadega erütrotsüüte määratakse ja loendatakse värvimise abil, millele järgneb kas visuaalne hindamine mikroskoobiga või automaatanalüüs. Piisava arvu ebaküpsete erütrotsüütide loendamist täiskasvanud loomade perifeerses veres või luuüdis hõlbustab oluliselt automaatse hindamisplatvormi kasutamine. Sellised platvormid on vastuvõetav alternatiiv käsitsi hindamisele (2). Võrdlevate uuringutega on näidatud, et selliste meetoditega, milles kasutatakse asjakohaseid kaliibrimisstandardeid, saab tagada parema laborisisese ja laboritevahelise korratavuse ja tundlikkuse kui mikroskoobi abil käsitsi hindamisega (3, 4). Automatiseeritud süsteemid, millega saab mõõta mikrotuumadega erütrotsüütide sagedust, on läbivoolutsütomeetrid (5), kujutiste analüüsi platvormid (6, 7) ja laserskaneerimisega tsütomeetrid (8), kuid neid on veel muidki.

Kuigi seda kõnealuse katse raames tavaliselt ei tehta, saab kromosoomifragmente eristada terviklikest kromosoomidest rea kriteeriumide alusel. Need hõlmavad kinetohoori või tsentromeerse DNA olemasolu või puudumise kindlakstegemist; mõlemad on iseloomulikud terviklikele kromosoomidele. Kinetohoori või tsentromeerse DNA puudumine näitab, et mikrotuum sisaldab üksnes kromosoomifragmente; kui need on olemas, näitab see kromosoomide kaotsiminekut.

Kasutatud terminite määratlused on esitatud 1. liites.

LÄHTEKAALUTLUSED

Selle katse puhul on geneetilise kahjustuse sihtkoeks noorte täiskasvanud näriliste luuüdi, kuna erütrotsüüdid tekivad selles koes. Mikrotuumade määramiseks perifeerse vere ebaküpsetes erütrotsüütides võib kasutada ka muid imetajaliike, kui nende puhul on tõendatud piisav tundlikkus, mis võimaldab kindlaks teha kemikaale, mis põhjustavad struktuurseid kromosoomaberratsioone või kromosoomiarvu muutusi nendes rakkudes (tekitades mikrotuumasid ebaküpsetes erütrotsüütides), ja esitatakse teaduslik põhjendus. Mikrotuumadega ebaküpsete erütrotsüütide sagedus on peamine uuritav näitaja. Uuritava näitajana võib kasutada ka mikrotuumi sisaldavate perifeerse vere küpsete erütrotsüütide sagedust liigis, mille põrnas ei esine tugevat selektsiooni mikrotuumadega erütrotsüütide vastu ja kui loomadel on pidev kokkupuude kemikaaliga ajavahemiku jooksul, mis on pikem kui erütrotsüüdi eluiga asjaomases liigis (hiirte puhul näiteks neli nädalat või rohkem).

Kui on tõendeid selle kohta, et uuritav(ad) kemikaal(id) või metaboliit(metaboliidid) ei jõua sihtkoeni, ei pruugi käesoleva katse kasutamine olla asjakohane.

Enne kui meetodit hakatakse kasutama segu korral, et saada andmeid kavandatud regulatiivse eesmärgi saavutamiseks, tuleb kaaluda, kas sel viisil üldse saadakse sobivaid tulemusi selle eesmärgi jaoks, ja kui, siis miks. Sellist kaalumist ei ole vaja, kui regulatiivne nõue eeldabki segu katsetamist.

KATSEMEETODI PÕHIMÕTE

Loomadele manustatakse uuritavat kemikaali sobiva manustamistee kaudu. Luuüdi kasutamise korral hukatakse loomad humaanselt sobival ajal pärast kemikaali manustamist; eraldatakse luuüdi, valmistatakse preparaadid ning värvitakse need (9–15). Kui kasutatakse perifeerset verd, võetakse veri sobival ajal pärast manustamist, valmistatakse preparaadid ja värvitakse need (12, 16–18). Kui kemikaal manustatakse lühikese aja jooksul, on oluline valida luuüdi või perifeerse vere proovide võtmiseks selline aeg, kus kemikaali toimel tekkinud mikrotuumsete ebaküpsete erütrotsüütide määramine on võimalik. Proovide võtmisel perifeersest verest peab olema möödunud piisavalt aega, et sellised ebaküpsed erütrotsüüdid oleksid jõudnud vereringesse. Preparaate analüüsitakse mikrotuumade esinemise määramiseks kas mikroskopeerides, läbivoolutsütomeetriaga või laserskaneeriva tsütomeetriaga.

LABORI PÄDEVUSE KONTROLLIMINE

Pädevuse tõendamise katsed

Enne katsete rutiinset tegemist peab labor tõendama, et tal on piisavalt kogemusi selle katse tegemiseks; selleks peab ta näitama, et suudab korrata mikrotuumade sageduse määramise kohta avaldatud töödes (17, 19–22) saadud tulemusi vähemalt kahe positiivse kontrolli kemikaaliga (kaasa arvatud positiivse kontrolli kemikaalide väikeste doosidega saadud nõrk toime), vt tabel 1, ja vastava vehiikuli/lahusti kontrolli katsega (vt punkt 26). Nendes katsetes tuleks kasutada doose, mis annavad reprodutseeritavaid ja doosist sõltuvaid suurenemisi ning tõendavad labori kasutatava hindamismeetodi puhul katsesüsteemi tundlikkust ja dünaamilist ulatust huvipakkuvas koes (luuüdi või perifeerne veri). Seda nõuet ei kohaldata kogemusega laborite puhul, see tähendab, kui on olemas varasemate katsete andmebaas, mis on määratletud punktides 14–18.

Varasemad kontrolli andmed

Pädevuse tõendamise katsete käigus peab labor kindlaks tegema:

Kui hakatakse saama tulemusi varasemate negatiivse kontrolli andmete jaotuse kohta, peaksid negatiivse kontrolli paralleelide väärtused olema kooskõlas kontrolli katsete avaldatud andmetega (kus need on avaldatud). Kui varasemate kontrolli katsete jaotusele lisatakse uusi eksperimendiandmeid, peaksid paralleelsete negatiivse kontrolli katsete tulemused ideaaljuhul olema selle jaotuse usaldusvahemikus usaldatavustasemel 95 %. Labori varasemate negatiivse kontrolli katsete andmebaas peaks olema statistiliselt usaldusväärne, et laboril oleks võimalik hinnata oma negatiivse kontrolli andmete jaotust. Kirjanduse põhjal läheb vaja vähemalt kümmet katset, kuid parem oleks, kui andmebaasis oleksid vähemalt 20 võrreldavates tingimustes tehtud katse tulemused. Laboritel tuleb kasutada kvaliteedikontrolli meetodeid, selliseid nagu kontrollkaardid (nt vastavuse kontrollkaardid või X-tüüpi kontrollkaardid (23)), et määrata, kui suures ulatuses nende andmed varieeruvad, ja tõendada, et metoodika on laboris „kontrolli all“. Täiendavaid soovitusi selle kohta, kuidas koguda ja kasutada varasemaid andmeid (st varasemate andmete andmebaasi võtmise või sellest väljajätmise kriteeriumid ja konkreetse katse vastuvõetavuse kriteeriumid), võib leida kirjandusest (24).

Kui labor ei tee piisavat arvu katseid, et saada statistiliselt usaldusväärne negatiivse kontrolli jaotus (vt punkt 15) pädevuskontrolli katsete käigus (kirjeldatud punktis 13), siis on lubatud selle jaotuse kindlakstegemine esimeste rutiinsete katsetega. Sellise lähenemisviisi kasutamisel tuleks järgida kirjanduses (24) esitatud soovitusi ja negatiivse kontrolli katsetes saadud tulemused peaksid olema kooskõlas avaldatud negatiivse kontrolli andmetega.

Katse-eeskirja igasuguse muutmise puhul tuleks arvestada, kuidas see võib mõjutada saadavate andmete kooskõla labori varasemate kontrolli katsete tulemuste andmebaasiga. Ainult suurte vastuolude tekkimise puhul tuleks koostada uus varasemate kontrolli katsete tulemuste andmebaas, kui ekspertteadmiste alusel tehakse kindlaks, et uus jaotus erineb varasemast jaotusest (vt punkt 15). Uue andmebaasi koostamise ajal ei ole ühe konkreetse katse tegemiseks täielikku negatiivsete kontrolli katsete tulemuste andmebaasi vaja siis, kui labor suudab tõendada, et nende negatiivse kontrolli paralleelkatsete väärtused on kooskõlas kas nende varasema andmebaasiga või vastavate avaldatud andmetega.

Negatiivse kontrolli andmed peaksid sisaldama mikrotuumsete ebaküpsete erütrotsüütide esinemise sagedust iga looma puhul. Negatiivse kontrolli paralleelide tulemused peaksid ideaaljuhul olema labori varasemate kontrolli katsete jaotuse usaldusvahemikus usaldatavustasemel 95 %. Kui negatiivse kontrolli paralleelkatsete tulemused jäävad väljapoole usaldusvahemikku usaldatavustasemel 95 %, võivad need olla varasemate kontrolli katsete jaotuses arvessevõtmiseks vastuvõetavad juhul, kui tegemist ei ole äärmusliku võõrväärtusega ning on tõendatud, et katsesüsteem on „kontrolli all“ (vt punkt 15), ja ei ole tõendeid, et tegemist on tehnilise vea või inimliku eksitusega.

MEETODI KIRJELDUS

Ettevalmistus

Loomaliigi valimine

Kasutada tuleks tavapärastest laboriliinidest pärit terveid noori loomi. Kasutada võib hiiri, rotte või muid sobivaid imetajaliike. Kui kasutatakse perifeerset verd, tuleb kindlaks teha, et valitud loomaliigi puhul ei takista mikrotuumsete rakkude vereringest eemaldamine põrna poolt tekkinud mikrotuumsete rakkude kindlakstegemist. See on kindlalt tõendatud roti ja hiire perifeerse vere puhul (2). Katseprotokollis tuleb esitada teaduslik põhjendus, miks kasutati muud liiki kui rott või hiir. Kui kasutatakse muud loomaliiki kui närilisi, on soovitatav, et kemikaali põhjustatud mikrotuumade mõõtmine oleks integreeritud muusse sobivasse toksilisuskatsesse.

Loomade pidamis- ja söötmistingimused

Näriliste puhul peaks pidamisruumi temperatuur olema 22 °C (± 3 °C). Kuigi suhteline niiskus peaks ideaaljuhul olema 50–60 %, peaks see olema vähemalt 40 % ja eelistatavalt mitte üle 70 %, v.a ruumi koristamise ajal. Kasutatakse tehisvalgustust, valgusrežiimiga 12 tundi valgust ja 12 tundi pimedust. Söötmisel võib kasutada tavapärast labori söödavalikut; joogivee kogust ei piirata. Söödavalikut võib mõjutada vajadus tagada uuritava kemikaali sobiv lisamine söödasse, kui kemikaali manustatakse sellisel viisil. Närilisi tuleb pidada väikestes rühmades (kuni viis looma puuris), igas puuris on samast soost ja sama katserühma loomad, kui ei eeldata agressiivset käitumist; eelistatavalt peaksid puurid olema kõva põrandaga, sobivalt mitmekesistatud keskkonnaga. Loomi võib üksikult pidada ainult siis, kui see on teaduslikult põhjendatud.

Loomade ettevalmistamine

Tavaliselt kasutatakse terveid noori täiskasvanud loomi (näriliste puhul ideaaljuhul soovitatavalt 6–10nädalased, kuigi lubatud on ka veidi vanemad loomad), kes jagatakse juhuvaliku alusel kontrolli- ja katserühmadesse. Iga loom saab kordumatu identimismärgistuse, mille tegemiseks kasutatakse humaanset võimalikult vähe invasiivset meetodit (nt rõngastamine, märgistamine, mikrokiipimine või biomeetriline tuvastamine, kuid mitte kõrva sälkamine või varba köndistamine) ning loomadel lastakse vähemalt viis päeva laboritingimustega kohaneda. Puurid paigutatakse nii, et puuri asukohast tingitud mõju on võimalikult väike. Positiivse kontrolli ja uuritava kemikaali omavahelist ristsaastumist tuleks vältida. Katse alguses peavad loomade kehamassi erinevused olema minimaalsed ning mitte erinema üle ± 20 % kummagi soo keskmisest massist.

Dooside valmistamine

Tahke uuritav kemikaal tuleb lahustada või suspendeerida sobivas lahustis või vehiikulis või segada sööda sisse või joogivette enne loomadele andmist. Vedelat uuritavat kemikaali võib manustada vahetult või lahjendada enne manustamist. Sissehingamise kaudu toimuva kokkupuute korral manustatakse uuritavat kemikaali gaasi, auru või tahke/vedela disperse faasiga aerosoolina, sõltuvalt kemikaali füüsikalis-keemilistest omadustest. Kasutada tuleks uuritava kemikaali värskeid valmistisi, välja arvatud juhul, kui andmed püsivuse kohta näitavad, et säilitamine on aktsepteeritav ja on määratletud sobivad säilitamistingimused.

Katsetingimused

Lahusti/vehiikul

Lahusti/vehiikul avaldada toksilist toimet korral kasutatavate dooside korral ega keemiliselt reageerida uuritava kemikaaliga. Kui kasutatakse tuntud lahustist/vehiikulist erinevat lahustit või ainet, peab olema võrdlusandmetega näidatud, et see on sobiv. Kui vähegi võimalik, on kõigepealt soovitatav kaaluda vesilahustuva lahusti/vehiikuli kasutamist. Tavaliselt kasutatavad lahustid/kandeained on näiteks vesi, füsioloogiline keedusoolalahus, metüültselluloosi lahus, karboksümetüültselluloosi naatriumsoola lahus, oliiviõli ja maisiõli. Kui ei ole varasemaid või kirjanduses avaldatud kontrolli andmeid, mis näitaksid, et valitud ebatüüpiline lahusti/vehiikul ei põhjusta mikrotuumade moodustumist ega muid kahjulikke tagajärgi, tuleks kõigepealt teha esialgne katse, et näidata lahusti/vehiikuli sobivust lahusti/vehiikuli kontrolli katses.

Kontrollid

Positiivsed kontrollid

Igasse katsesse peab tavaliselt lisama positiivse kontrolli kemikaaliga kokku puutuva loomade rühma. Sellest võib loobuda juhul, kui katselabor on tõendanud kõnealuse katse läbiviimise pädevust ja on kindlaks teinud varasemate katsete positiivse kontrolli väärtuste vahemiku. Kui paralleelset positiivse kontrolli rühma ei kasutata, tuleb igas katses teha hindamise kontrolli katseid (fikseeritud ja värvimata mikroskoobipreparaadid või rakususpensioonide proovid, sõltuvalt sellest, mis on hindamismeetodi asjakohane). Neid võib saada sobivate võrdlusstandardite hindamise lisamisega uuringu hindamistesse; selliseid võrdlusstandardeid saadakse eraldi positiivse kontrolli katsega, mida tehakse korrapäraselt (nt iga 6–18 kuu tagant) ja millega saadud materjale selleks alles hoitakse; näiteks kasutatakse tasemekatsete materjale ja seejärel tehakse selleks katseid korrapäraselt vastavalt vajadusele.

Positiivse kontrolli kemikaalid peavad usaldusväärselt põhjustama mikrotuumade sageduse määratava suurenemise, võrreldes mikrotuumade spontaanse esinemissagedusega. Mikroskoobiga hindamise korral tuleks positiivse kontrolli doosid valida nii, et nende toime oleks selge, kuid hindaja ei tohiks kodeeritud preparaatide hulgas kontrolli katset siiski kohe ära tunda. Positiivse kontrolli kemikaali manustamiseks on lubatud kasutada ka muud manustamisteed kui uuritava kemikaali puhul, muu manustamisskeemi kasutamine ja proovide võtmine võib toimuda ka ainult ühel ajahetkel. Võimaluse korral tuleks kaaluda selliste positiivse kontrolli kemikaalide kasutamist, mis kuuluvad samasse kemikaalide rühma kui uuritav kemikaal. Tabelis 1 on esitatud mõned positiivse kontrolli kemikaalide näited.

Tabel 1

Positiivse kontrolli kemikaalide näited.

Kemikaal ja CASi nr

Etüülmetaansulfonaat [CASi nr 62-50-0]

Metüülmetaansulfonaat [CASi nr 66-27-3]

Etüülnitrosokarbamiid [CASi nr 759-73-9]

Mitomütsiin C [CASi nr 50-07-7]

Tsüklofosfamiid (monohüdraat) [CASi nr 50-18-0 (CASi nr 6055-19-2)]

Trietüleenmelamiin [CASi nr 51-18-3]

Kolhitsiin [CASi nr 64-86-8] või vinblastiin [CASi nr 865-21-4] kui aneugeenid

Negatiivsed kontrollid

Igal proovivõtukorral tuleks võtta proovid ka negatiivse kontrolli rühma loomadelt, keda muidu tuleks käidelda kui katserühma kuuluvaid loomi, selle erinevusega, et neile ei manustata uuritavat kemikaali. Kui uuritava kemikaali manustamisel kasutatakse lahustit/vehiikulit, tuleb kontrollrühmale manustada sedasama lahustit/vehiikulit. Kui igal proovivõtu korral on loomadevahelise varieeruvuse ja mikrotuumadega rakkude esinemissagedus andmed siiski olnud tõendatult kooskõlas katselabori varasemates katsetes saadud negatiivse kontrolli andmetega, võib negatiivse kontrolli jaoks vaja minna ainult ühte proovivõttu. Kui negatiivse kontrolli puhul kasutatakse ainult ühte proovivõttu, peab see toimuma katse esimese proovivõtu ajal.

Kui kasutatakse perifeerset verd, võib lühiajalise uuringu korral enne kemikaali manustamist võetud proovi kasutada paralleelse negatiivse kontrollina, kui saadud tulemused on kooskõlas sama labori varasemate kontrollikatsete tulemuste andmebaasiga. Rottide puhul on näidatud, et väikese ruumalaga proovide (nt alla 100 μl päevas) võtmisel on minimaalne mõju mikrotuumade taustsagedusele (25).

KATSE KÄIK

Loomade arv ja sugu

Üldiselt on mikrotuumade tekke reaktsioon isas- ja emasloomadel sarnane ja seepärast võib enamiku uuringuid teha ükskõik kummast soost loomadega (26). Andmed, millest nähtuks isas- ja emasloomade vaheline erinevus (nt süsteemse toksilisuse, metabolismi, biosaadavuse, luuüdi suhtes avalduva toksilisuse jne erinevus, sealhulgas nt annusevahemiku uuringu andmed), toetaksid kummastki soost loomade kasutamist. Sellisel juhul võib olla asjakohane teha uuring kummastki soost loomadega, näiteks osana korduvdoosi toksilisuse uuringust. Kui kasutatakse mõlemast soost loomi, võib olla asjakohane kasutada mitme faktori määramist võimaldavat katseplaani. Üksikasjad selle kohta, kuidas sellise katseplaani puhul andmeid analüüsida, on esitatud 2. liites.

Uuringu alguses tuleks moodustada nii suured rühmad, et igas rühmas oleks viis analüüsitavat looma ühest soost või kummastki soost, kui kasutatakse mõlemast soost loomi. Kui inimese kokkupuude kemikaalidega võib olla soospetsiifiline, nagu näiteks mõnede ravimite puhul, tehakse katse vastavast soost loomadega. Luuüdi uuringuks, mis viiakse läbi punktis 37 sätestatud näitajate määramiseks kolme doosirühma ning paralleelsete negatiivse ja positiivse kontrolli rühmadega (millest igaühesse kuuluvad viis samast soost looma), kulub loomadega seotud kõige tüüpilisemate nõuete kohaselt 25–35 looma.

Doosid

Kui tehakse vahemiku leidmise eeluuring, sest sobivaid andmeid doosi valimiseks ei ole, tuleb see teha samas laboris, kasutades sama loomaliiki, -liini, sugu ja manustamiskava, mida kasutatakse põhiuuringus (27). Uuringu eesmärk on kindlaks määrata maksimaalne talutav doos (maximum tolerated dose, MTD), mis on suurim doos, mida loomad suudavad taluda uuringu ajavahemiku jooksul ilma, et neil avalduks uuringut piirava toksilisuse nähte (näiteks väheneb neil kehamass või avaldub tsütotoksiline mõju vereloomesüsteemi suhtes, kuid see ei kutsu veel esile surma ega selliseid valu, piinlemist või kannatusi, mis nõuaksid loomade humaanset hukkamist (28)).

Suurima doosi võib samuti määratleda kui doosi, mis avaldab toksilist toimet luuüdile (näiteks vähendab ebaküpsete erütrotsüütide osakaalu luuüdis või perifeerses veres rohkem kui 50 % erütrotsüütide üldarvust, kuid mitte väiksema väärtuseni kui 20 % kontrolli väärtusest). Kui analüüsitakse CD71-positiivseidrakke perifeerses vereringes (läbivoolutsütomeetria abil), reageerib see väga noorte ebaküpsete erütrotsüütide fraktsioon toksilise kemikaaliga mõjutamisele siiski kiiremini kui ebaküpsete erütrotsüütide RNA-positiivne suurem fraktsioon. Seetõttu võib akuutset kokkupuudet hõlmava katsekorralduse korral avalduda suurem näiline toksilisus, kui mõõdetakse CD71-positiivsete ebaküpsete erütrotsüütide fraktsiooni, võrreldes sellise katsekorraldusega, kus ebaküpseid erütrotsüüte määratakse RNA-sisalduse järgi. Kui katses kasutatakse sellist kokkupuudet kemikaaliga, mis kestab viis päeva või vähem, võib toksilise toimega uuritavate kemikaalide suurima doosi määratleda kui doosi, mis põhjustab CD71-positiivsete ebaküpsete erütrotsüütide osakaalu statistiliselt olulise vähenemise erütrotsüütide üldarvus, kuid mitte väiksema väärtuseni kui 5 % kontrolli väärtusest (29).

Kemikaalid, mille toksiko-kineetilistes omadustes esineb küllastumine, või mis põhjustavad selliseid detoksifitseerimisprotsesse, mille tõttu kokkupuude võib väheneda pärast pikaajalist manustamist, võivad olla doosi määramise kriteeriumide seisukohast erandlikud ning neid tuleks hinnata iga üksikjuhtumi puhul eraldi.

Selleks et saada teavet doosi ja toime seose kohta, peaks täielik uuring hõlmama negatiivse kontrolli rühma ja vähemalt kolme doositaset, mis tavaliselt erinevad üksteisest kaks korda, kuid mitte rohkem kui neli korda. Kui doosivahemiku leidmise uuringus või olemasolevate andmete põhjal ei põhjusta uuritav kemikaal toksilisust, tuleks 14-päevase või pikema manustamisperioodi puhul kasutada suurimat doosi 1 000 mg kehamassi kg kohta päevas, 14 päevast lühema manustamisperioodi puhul aga 2 000 mg kehamassi kg kohta päevas. Kui uuritava kemikaali puhul avaldub toksiline toime, peaks suurim manustatav doos olema MTD ning muud kasutatavad doositasemed peaksid eelistatult hõlmama vahemikku MTD-st kuni vähese toksilisusega või ilma toksilise toimeta doosini. Kui toksilisust sihtkoe (luuüdi) suhtes täheldatakse kõikide katses kasutatud dooside korral, on soovitatav teha katse ka mittetoksilise doosiga. Uuringute puhul, millega tahetakse täielikult iseloomustada kvantitatiivset doosi-toime sõltuvust, võib vaja minna täiendavaid doosirühmasid. Teatavat tüüpi uuritavate kemikaalide (näiteks inimtervishoius kasutatavate ravimite) puhul, millele kohaldatakse erinõudeid, võivad need piirmäärad olla teistsugused.

Piirsisalduskatse

Kui doosipiirkonna leidmise katsetega või lähedasi loomaliine käsitlevatest andmetest on saadud tõendeid, et piirdoosi manustamise katses (kirjeldatud allpool) ei ole uuritaval kemikaalil sedastatavat toksilist toimet (sealhulgas luuüdirakkude paljunemise vähenemist ega muid tõendeid sihtkoe suhtes avalduva tsütotoksilisuse suhtes), ja kui genotoksilisust ei ole alust eeldada in vitro genotoksilisuse uuringute või sarnase struktuuriga kemikaalide andmete põhjal, võib täielikku kolme doositasemega uuringut pidada ebavajalikuks, kui on tõendatud, et uuritav kemikaal jõuab (uuritavad kemikaalid jõuavad) sihtkoesse (luuüdisse). Sellistel juhtudel võib olla piisav ühe doosiga nn piirsisalduskatse. Kui manustamine kestab 14 päeva või rohkem, on piirdoos 1 000 mg kehakaalu kg kohta päevas. Kui manustamisperiood on vähem kui 14 päeva, on piirdoos 2 000 mg kehakaalu kg kohta päevas.

Dooside manustamine

Katse kavandamisel tuleks silmas pidada inimese võimalikku kokkupuuteviisi. Seepärast võib vastavalt põhjendatusele kasutada selliseid manustamisviise nagu manustamine söödaga, joogiveega, paikselt naha alla, veenisiseselt, suu kaudu (toitmissondiga), inhalatsiooniga, intratrahheaalselt või implantatsiooniga. Igal juhul tuleb manustamistee valikuga tagada kemikaali adekvaatne kokkupuude sihtkoega (-kudedega). Tavaliselt ei soovitata intraperitoneaalset süstimist, kuna see ei ole inimese puhul ette nähtud kokkupuute viis, ning seda tuleks kasutada ainult konkreetse teadusliku põhjendatuse korral. Kui uuritav kemikaal segatakse sööda sisse või joogivette, eriti üheainsa doosi manustamise korral, tuleks jälgida, et sööda ja vee tarbimise ning proovide võtmise vahel oleks ajavahemik, mis oleks piisav, et võimaldada toime tuvastamist (vt punkt 37). Vedeliku suurim kogus, mida saab toitmissondi kaudu või süstides ühel korral manustada, sõltub katselooma suurusest. Tavaliselt ei tohiks kogus ületada 1 ml 100 g kehamassi kohta, välja arvatud vesilahuste puhul, kus võib kasutada kogust 2 ml 100 g kehamassi kohta. Suurema koguse kasutamise korral tuleb seda põhjendada. Kui jätta kõrvale ärritavad või söövitavad kemikaalid, mille toime on suurema kontsentratsiooni korral tavaliselt tugevam, tuleks katses vedeliku ruumala varieeruvust minimeerida ja reguleerida kontsentratsioone nii, et kõiki doose manustataks kehamassi suhtes ühesuguse lahusekogusega.

Manustamiskava

Eelistatavalt tuleks kemikaali manustada kaks või rohkem korda, 24-tunniste vahedega, eriti kui katse ühendatakse muude toksilisuse uuringutega. Alternatiivina võib kemikaali manustada ühe korraga, kui see on teaduslikult põhjendatud (nt kui uuritav kemikaal teadaolevalt blokeerib rakutsükli). Uuritavaid kemikaale võib manustada ka jagatud doosina, näiteks kaks manustamist ühel päeval mitte rohkem kui 2–3-tunnise vahega, et hõlbustada lahuse suure ruumala manustamist. Sellistel asjaoludel, või kui uuritavat kemikaali manustatakse sissehingamisega, tuleks proovide võtmise aeg kavandada selle põhjal, millal toimus viimane manustamine või lõpetati kokkupuude.

Katse võib teha hiirte või rottidega ühel viisil järgmistest kolmest:

Võib kasutada ka muid dooside manustamise ja proovide võtmise ajakavasid, kui need on asjakohased ja teaduslikult põhjendatud ning hõlbustavad katsete ühendamist muude toksilisuse määramise katsetega.

Vaatlus

Vähemalt üks kord päevas, eelistatult igal päeval samal ajal ning võttes arvesse ajavahemikku, kui eeldatav toime avaldub pärast manustamist kõige intensiivsemalt, tuleb teha katseloomade üldisi kliiniline vaatlus ja registreerida kõik kliinilised sümptomid. Haigestumise ja surmajuhtude tuvastamiseks tuleb kemikaali manustamise perioodil kõik loomad vähemalt kaks korda päevas üle vaadata. Kõik loomad tuleb kaaluda uuringu alguses, vähemalt kord nädalas korduvdoosi uuringute ajal ja pärast eutanaasiat. Kui uuring kestab vähemalt ühe nädala, tuleb vähemalt kord nädalas mõõta sööda tarbimist. Kui uuritavat kemikaali manustatakse joogiveega, tuleb vee tarbimist mõõta pärast iga veevahetust ja vähemalt üks kord nädalas. Loomad, kellel avalduvad surmavaga mitte lõppeva raske toksilisuse nähud, tuleb humaanselt hukata enne katse lõppu (28). Teatavate asjaolude puhul võiks jälgida loomade kehatemperatuuri, kuna kemikaali manustamisest tingitud hüper- või hüpotermiat on seostatud ekslike tulemuste põhjustamisega (32–34).

Sihtkoe kokkupuude

Sobival ajal (sobivatel aegadel) tuleb võtta vereproov, et mõõta uuritava kemikaali sisaldust vereplasmas, selleks et tõendada, et luuüdi kokkupuude on tõesti toimunud, kui muid andmeid kokkupuute kohta ei ole olemas (vt punkt 48).

Luuüdi-/verepreparaat

Luuüdirakud eraldatakse tavaliselt loomade reie- või sääreluudest vahetult pärast humaanset eutanaasiat. Rakud eraldatakse, prepareeritakse ja värvitakse enamasti kindlakskujunenud meetoditega. Loomade heaolu standarditega kooskõlas võib perifeerse vere väikse ruumalaga proove võtta, kas meetodiga, mis võimaldab katselooma ellu jätta, näiteks vere võtmine sabaveenist või muust sobivast veresoonest, või südamepunktsiooniga või proovi võtmisega suurest veresoonest looma eutanaasia ajal. Luuüdist või perifeersest verest saadud erütrotsüütide puhul võib, olenevalt analüüsimeetodist, rakud kohe värvida supravitaalvärvide abil (16–18), teha äigepreparaadid ja seejärel värvida mikroskoopia jaoks või fikseerida ja värvida rakud sobivalt läbivoolutsütomeetria analüüsi jaoks. DNA-spetsiifilise värvaine kasutamisega (nt akridiinoranž (35) või Hoechst 33258 pluss püroniin-Y (36)) võib vältida mõne muu kui DNA-spetsiifilise värvaine kasutamisega seotud artefakte. See eelis ei välista aga tavaliste värvainete kasutamist (nt Giemsa mikroskoopiliseks analüüsiks). Täiendavaid süsteeme (nt tsellulooskolonne tuumaga rakkude eemaldamiseks (37, 38)) saab samuti kasutada tingimusel, et laboris on tõendatud kõnealuste süsteemide ühildatavus preparaatide valmistamisega.

Kui kõnealused meetodid on kohaldatavad, võib kinetohoorivastaseid antikehi (39), in situ fluorestsentshübriidimist pantsentromeersete DNA proovidega (40) või praimerite põhist in situ märgistamist pantsentromeersete praimeritega koos DNA asjakohase kontrastvärvimisega (41) kasutada, et määrata, mida mikrotuumad sisaldavad (kromosoom/kromosoomifragment), et teha kindlaks, kas mikrotuumade tekke põhjus on klastogeenne või aneugeenne protsess. Klastogeenide ja aneugeenide eristamiseks võib kasutada muid meetodeid, mille kohta on tõendatud, et need on tõhusad.

Analüüs (manuaalne ja automaatne)

Kõik analüüsitavad mikroskoobipreparaadid või proovid, sh positiivsete ja negatiivsete kontrollide omad, kodeeritakse sõltumatult enne analüüsi ja need tuleb randomiseerida, et käsitsi hindaja ei teaks, millise kokkupuutetasemega on proovi puhul tegemist; selline kodeerimine ei ole vajalik, kui kasutatakse automaatsüsteeme, mis ei põhine visuaalsel vaatlusel ja mida hindaja kallutatus ei saa mõjutada. Iga looma kohta määratakse ebaküpsete erütrotsüütide osakaal erütrotsüütide koguhulgast (ebaküpsed + küpsed), loendades kokku vähemalt 500 erütrotsüüti luuüdist ja 2 000 erütrotsüüti perifeersest verest (42). Ebaküpsete mikrotuumsete erütrotsüütide esinemissageduse määramiseks hinnatakse looma kohta vähemalt 4 000 ebaküpset erütrotsüüti (43). Kui varasemad negatiivse kontrolli andmed andmebaasis näitavad, et mikrotuumsete erütrotsüütide esinemise keskmine taustsagedus asjaomases laboris on < 0,1 %, tuleks kaaluda täiendavate rakkude hindamist. Proovide analüüsimisel ei tohiks ebaküpsete erütrotsüütide osakaal erütrotsüütide üldarvust olla väiksem kui 20 % vastavast osakaalust lahusti/vehiikuli kontrolli katsetes mikroskoobi abil hindamise puhul ja mitte väiksem kui ligikaudu 5 % vastavast osakaalust lahusti/vehiikuli kontrolli katsetes, kui näitajat CD 71+ ebaküpsed erütrotsüüdid hinnatakse tsütomeetriliste meetoditega (vt punkt 31) (29). Näiteks kui luuüdi katset hinnatakse mikroskoobi abil ja kui kontrolli katses on ebaküpsete erütrotsüütide osakaal luuüdis 50 %, oleks toksilisuse ülempiir 10 % ebaküpseid erütrotsüüte.

Kuna roti põrn peab kinni ja hävitab mikrotuumseid erütrotsüüte, oleks analüüsi suure tundlikkuse säilitamiseks roti perifeerse vere analüüsimise puhul soovitatav piirduda mikrotuumsete ebaküpsete erütrotsüütide kõige noorema fraktsiooni analüüsimisega. Automatiseeritud analüüsimeetodite kasutamise korral võib neid kõige ebaküpsemaid erütrotsüüte teha kindlaks nende suure RNA-sisalduse järgi või nende pinnal ekspresseeritud transferriiniretseptorite (CD71+) suure arvu järgi (31). Erinevate värvimismeetodite otsene võrdlus on siiski näidanud, et häid tulemusi on võimalik saada mitmesuguste meetoditega, sealhulgas tavapärase akridiinoranžiga värvimise abil (3, 4).

ANDMED JA KATSEPROTOKOLLI KOOSTAMINE

Andmete töötlemine

Andmed üksikute loomade kohta esitatakse tabelina. Iga analüüsitava looma kohta tuleb eraldi esitada ebaküpsete erütrotsüütide arv, mikrotuumadega ebaküpsete erütrotsüütide arv ja ebaküpsete erütrotsüütide osakaal erütrotsüütide üldarvust. Kui uuritavat kemikaali manustatakse hiirtele järjest neli nädalat või rohkem, tuleb esitada andmed ka mikrotuumsete küpsete erütrotsüütide arvu ja osakaalu kohta, kui neid on kogutud. Samuti tuleb esitada andmed toksilisuse kohta ja kliinilised sümptomid.

Katse nõuetekohasuse kriteeriumid

Katse nõuetekohasuse kriteeriumid on järgmised:

Tulemuste hindamine ja tõlgendamine

Tingimusel, et kõik katse nõuetekohasuse kriteeriumid on täidetud, loetakse uuritav kemikaal selgelt positiivseks, kui:

Kui teataval proovivõtuajal uuritakse üksnes suurimat doosi, loetakse konkreetne uuritav kemikaal selgelt positiivseks, kui tuvastatakse statistiliselt oluline suurenemine, võrreldes paralleelse negatiivse kontrolliga, ja tulemused on väljaspool labori varasemate negatiivse kontrolli andmete jaotust (nt Poissoni jaotuse usaldusvahemikku usaldatavustasemel 95 %). Soovitusi kõige asjakohasemate statistiliste meetodite kohta võib leida kirjandusest (44–47). Doosi-toime analüüsi tegemise korral tuleks analüüsida vähemalt kolme doosirühma. Statistiliste testide puhul tuleb ühte looma lugeda katseühikuks. Mikrotuumade tekke katse positiivsed tulemused viitavad sellele, et uuritav kemikaal indutseerib mikrotuumade teket; mikrotuumad tekivad katsealuse loomaliigi erütroblastide kromosoomide või mitoosiaparaadi kahjustuse tagajärjel. Kui tehakse katse, et kindlaks teha tsentromeeride olemasolu mikrotuumades, on uuritav kemikaal, mis tekitab tsentromeeri sisaldavaid mikrotuumasid (tsentromeerne DNA või kinetohoor, mis viitab terve kromosoomi kaotusele), tõendiks, et uuritav kemikaal on aneugeen.

Tingimusel, et kõik katse nõuetekohasuse kriteeriumid on täidetud, loetakse uuritav kemikaal selgelt negatiivseks, kui kõikides uuritud katsetingimustes:

Soovitusi kõige asjakohasemate statistiliste meetodite kohta võib leida kirjandusest (44–47). Tõend luuüdi kokkupuutest uuritava kemikaaliga võib olla ebaküpsete ja küpsete erütrotsüütide proportsiooni vähenemine või uuritava kemikaali kontsentratsiooni mõõtmine vereplasmas või veres. Intravenoosse manustamise puhul ei ole tõendeid kokkupuute kohta vaja esitada. Teise võimalusena võib luuüdi kokkupuute tõendamiseks kasutada uuritava kemikaali imendumise, jaotumise, metabolismi ja eritumise (ADME) andmeid, mis on saadud sõltumatu uuringuga, milles on kasutatud sama manustamisviisi ja loomaliiki. Negatiivsed tulemused viitavad sellele, et antud katsetingimustes ei põhjusta kemikaal katsealuse loomaliigi ebaküpsetes erütrotsüütides mikrotuumade teket.

Selget positiivset või selget negatiivset vastust ei ole vaja kinnitada.

Juhul kui vastus ei ole negatiivne ega positiivne ning selleks, et aidata mõista tulemuse (nt vähese või piiripealse suurenemise) bioloogilist olulisust, tuleb andmetele anda eksperdihinnang ja/või uurida lõpetatud katsest saadud tulemusi edasi. Mõnel juhul võib olla kasulik analüüsida rohkem rakke või teha korduskatse, kasutades muudetud katsetingimusi.

Harvadel juhtudel ei võimalda isegi edasiste uuringutega saadud andmed teha järeldust, kas uuritava kemikaaliga saadi positiivne või negatiivne tulemus, sel juhul loetakse, et tulemus on ebaselge.

Katseprotokoll

Katseprotokoll peab sisaldama järgmist teavet:

KIRJANDUS

6)

B osast jäetakse peatükk B.15 välja.

7)

B osast jäetakse peatükk B.16 välja.

8)

B osast jäetakse peatükk B.18 välja.

9)

B osast jäetakse peatükk B.19 välja.

10)

B osast jäetakse peatükk B.20 välja.

11)

B osast jäetakse peatükk B.24 välja.

12)

B osas asendatakse peatükk B.47 järgmisega:

„B.47.   Veise sarvkesta hägususe ja läbilaskvuse katsemeetod selliste kemikaalide kindlakstegemiseks, i) mis tekitavad raskeid silmakahjustusi, ja ii) mida ei ole vaja klassifitseerida seoses silmade ärrituse või raske silmakahjustusega

SISSEJUHATUS

Käesolev katsemeetod on samaväärne OECD katsejuhendiga nr 437 (2013). Veise sarvkesta hägususe ja läbilaskvuse (Bovine Corneal Opacity and Permeability, BCOP) katsemeetodit hinnati alternatiivmeetodite valideerimise ametitevahelise koordineerimiskomitee (Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods, ICCVAM) poolt koostöös alternatiivmeetodite valideerimise Euroopa keskuse (ECVAM) ja alternatiivmeetodite valideerimise Jaapani keskusega (JaCVAM) 2006. ja 2010. aastal (1, 2). Esimesel hindamisel hinnati BCOP-katsemeetodi kasulikkust selliste kemikaalide (ainete ja segude) kindlakstegemisel, mis tekitavad rasket silmakahjustust (1). Teisel hindamisel hinnati BCOP-katsemeetodi kasulikkust selliste kemikaalide (ainete ja segude) kindlakstegemisel, mida ei klassifitseerita seoses silmade ärrituse või raske silmakahjustusega (2). BCOP-katsemeetodi valideerimise andmebaas sisaldas 113 ainet ja 100 segu (2, 3). Nendest hindamistest ja eksperdiarvamustest tehti järeldus, et kõnealuse katsemeetodiga on võimalik õigesti kindlaks teha kemikaale (nii aineid kui ka segusid), mis tekitavad rasket silmakahjustust (1. kategooria), ja ka kemikaale, mida ei ole vaja klassifitseerida seoses silmade ärrituse või raske silmakahjustusega, nagu need on määratletud Ühinenud Rahvaste Organisatsiooni ühtses ülemaailmses kemikaalide klassifitseerimise ja märgistamise süsteemis (GHS) (4) ja määruses (EÜ) nr 1272/2008, mis käsitleb ainete ja segude klassifitseerimist, märgistamist ja pakendamist (CLP) (7); sellepärast on kõnealune meetod tunnistatud teaduslikult põhjendatuks mõlemaks eesmärgiks. Raske silmakahjustus on koekahjustuse tekkimine silmas või tugev füüsiline nägemise langus pärast uuritava kemikaali silma eespinnale manustamist, kui kahjustus ei ole 21 päeva jooksul pärast uuritava kemikaali manustamist täielikult taandunud. Uuritav kemikaal, mis põhjustab rasket silmakahjustust, klassifitseeritakse vastavalt ÜRO GHSile 1. kategooriasse. Kemikaal, mida ei klassifitseerita seoses silmade ärrituse või raske silmakahjustusega, on määratletud kui kemikaal, mis ei vasta ÜRO GHSi 1. või 2. (2A või 2B) kategooriasse klassifitseerimise nõuetele, see tähendab, et sellele viidatakse kui ÜRO GHSi kategooriata kemikaalile. Käesolevas katsemeetodis on esitatud BCOP-katse soovitatav kasutusala ja piirangud, mis põhinevad hindamistel. Peamised erinevused OECD katsejuhendi 2009. aasta originaalversiooni ja ajakohastatud 2013. aasta versiooniga on järgmised, kuid ei piirdu nendega: BCOP-katsemeetodit kasutatakse selliste kemikaalide tuvastamiseks, mis ei vaja klassifitseerimist vastavalt ÜRO GHSile (punktid 2 ja 7); selgitatud on BCOP-katsemeetodi kohaldatavust alkoholide, ketoonide ja tahkete kemikaalide (punktid 6 ja 7) ning ainete ja segude (punkt 8) uurimiseks; selgitatud on pindaktiivsete ainete või selliseid aineid sisaldavate segude uurimist (punkt 28); selgitatud ja ajakohastatud on positiivse kontrolli küsimusi (punktid 39 ja 40); ajakohastatud on BCOP-katsemeetodi alusel otsuse tegemise kriteeriume (punkt 47); ajakohastatud on katse nõuetekohasuse kriteeriume (punkt 48); ajakohastatud on katseprotokollis esitatavaid andmeelemente (punkt 49); ajakohastatud on 1. liidet mõistete kohta; lisatud on 2. liide BCOP-katsemeetodi prognoosivõime kohta eri klassifitseerimissüsteemide kasutamisel; ajakohastatud on 3. liites esitatud pädevuse tõendamise kemikaalide loetelu; ning ajakohastatud on 4. liidet BCOP-katses kasutatava sarvkestahoidiku (punkt 1) ja hägususmõõtja kohta (punktid 2 ja 3).

Praegu ollakse üldiselt arvamusel, et lähitulevikus ei ole võimalik ärritava toime kogu ulatuse prognoosimisel eri kemikaaliklasside puhul ühegi in vitro silmaärrituse katsega asendada Draize'i in vivo silmakatset. Kuid mitme alternatiivse testi strateegilise (astmelise) kombineerimisega võib siiski olla võimalik asendada Draize'i silmakatset (5). Ülalt-alla lähenemisviisi (5) tuleks kasutada siis, kui olemasoleva teabe põhjal võib eeldada, et kemikaal võib silma tugevasti ärritada; alt-üles lähenemisviisi (5) tuleks kasutada siis, kui olemasoleva teabe põhjal ei eeldata, et kemikaal põhjustab piisavat silma ärritust, mis nõuaks klassifitseerimist. BCOP-meetod on in vitro katsemeetod, mida võib kasutada teatavatel asjaoludel ja teatavate konkreetsete piirangutega, et klassifitseerida ja märgistada silmade jaoks ohtlike kemikaale. Seda ei peeta katsemeetodiks, mis üksinda võiks asendada küüliku in vivo silma katset, kuid BCOP-katsemeetodit soovitatakse kasutada lähtepunktina ülalt-alla katsetamisstrateegias, mida soovitasid Scott jt (5) sellise kemikaali kindlakstegemiseks, mis tekitab rasket silmakahjustust, st mis tuleb ÜRO ühtse ülemaailmse süsteemi kohaselt klassifitseerida 1. kategooriasse ilma edasiste uuringuteta (4). BCOP-meetodit soovitatakse kasutada ka selliste kemikaalide kindlakstegemiseks, mis ei vaja klassifitseerimist seoses silmade ärrituse või raske silmakahjustusega, nagu on määratletud ÜRO ühtses ülemaailmses süsteemis (ÜRO GHSi kategooriata kemikaal) (4) katsestrateegias, milles kasutatakse alt-üles lähenemisviisi (5). Kemikaal, mille puhul BCOP-katsega ei prognoosita raske silmakahjustuse tekitamist või kuulumist silmaärrituse või raske silmakahjustuse seisukohast klassifitseerimist vajavaks kemikaaliks, vajab siiski täiendavat (in vitro ja/või in vivo) uurimist, mille alusel saaks määrata lõpliku klassifikatsiooni.

Käesoleva katsemeetodi eesmärk on kirjeldada protseduure, millega hinnatakse uuritava kemikaali võimalikku ohtlikkust silmale selle võime kaudu põhjustada veiselt isoleeritud sarvkesta hägustumist või suurenenud läbilaskvust. Toksilist toimet sarvkestale mõõdetakse: i) valgusläbilaskvuse vähenemise (hägususe tekke) ja ii) naatriumfluorestseiini läbilaskvuse suurenemise järgi. Sarvkesta hägususe ja läbilaskvuse hinnangud, mis on tehtud pärast sarvkesta kokkupuudet uuritava kemikaaliga, kombineeritakse, et saada in vitro ärritava toime punktisumma (In Vitro Irritancy Score, IVIS), mida kasutatakse kemikaali ärritava toime taseme hindamiseks.

Mõisted on esitatud 1. liites.

LÄHTEKAALUTLUSED JA PIIRANGUD

Käesolev katsemeetod põhineb ICCVAMi BCOP-katsemeetodi eeskirjal (6, 7), mis töötati algselt välja teabe alusel, mis saadi In Vitro Teaduste Instituudi (IIVS) ja INVITTOXi metoodikatest124 (8). Viimast kasutati Euroopa Ühenduse rahastatud eelvalideerimisuuringus aastatel 1997–1998. Mõlemad eeskirjad põhinevad BCOP-katse metoodikal, mille esimesena avaldasid Gautheron ja kaasautorid (9).

BCOP-katsemeetodit saab kasutada selliste kemikaalide kindlakstegemiseks, mis tekitavad rasket silmakahjustust, nagu on määratletud ÜRO GHSis, ja mis tuleb klassifitseerida ÜRO GHSi 1. kategooriasse (4). Kui BCOP-katsemeetodit kasutatakse sellel eesmärgil, on katse kogutäpsus 79 % (150/191), valepositiivsete tulemuste määr on 25 % (32/126) ja valenegatiivsete tulemuste määr 14 % (9/65), võrreldes küüliku silma in vivo katsemeetodi andmetega, mis on klassifitseeritud ÜRO GHSi klassifitseerimise süsteemi järgi (3) (vt 2. liide, tabel 1). Kui andmebaasist jäetakse välja teatavad uuritavate kemikaalide klassid (st alkoholid, ketoonid) või füüsikalised klassid (st tahked kemikaalid), on katse kogutäpsus 85 % (111/131), valepositiivsete tulemuste määr on 20 % (16/81) ja valenegatiivsete tulemuste määr 8 % (4/50) ÜRO GHSi klassifikatsiooni süsteemi korral (3). BCOP-katsemeetodi võimalikud puudused rasket silmakahjustust põhjustavate (st ÜRO GHSi 1. kategooria) kemikaalide kindlakstegemisel on seotud valideerimise andmebaasis täheldatud rohkete valepositiivsete tulemustega alkoholide ja ketoonide määramisel ning rohkete valenegatiivsete tulemustega tahkete kemikaalide määramisel (1–3). Kuna BCOP-katsemeetodiga ei määratud siiski mitte kõiki alkohole ja ketoone asjatult positiivseks ja mõned neist määrati õigesti ÜRO GHSi 1. kategooriasse, ei peeta neid kahte orgaaniliste kemikaalide funktsionaalset rühma olevaks väljaspool kõnealuse katsemeetodi kasutusala. Katsemeetodi kasutaja peab ise otsustama, kas ta võib lubada mõne alkoholi või ketooni liigset määramist positiivseks või tuleks tõendite kaalukuse lähenemisviisi alusel teha edasisi katseid. Valenegatiivsete tulemuste kohta tahkete kemikaalide puhul tuleks märkida, et tahke kemikaal võib põhjustada erinevaid ja äärmuslikke kokkupuutetingimusi Draize'i in vivo silmaärrituskatses, mis võib segada tegeliku ärritava toime õigesti hindamist (10). Samuti tuleks märkida, et ükski valenegatiivne kemikaal ICCVAMi valideerimise andmebaasis (2, 3) ei andnud rasket silmakahjustust põhjustavate kemikaalide (ÜRO GHSi 1. kategooria) kindlakstegemisel tulemuseks väärtust IVIS ≤ 3; see on kriteerium, mille alusel tuleks kemikaal määrata ÜRO GHSi kategooriata kemikaaliks. Peale selle, BCOP-katse valenegatiivsed tulemused ei ole kriitilise tähtsusega, kuna kõiki uuritavaid kemikaale, mille puhul 3 < IVIS ≥ 55, uuritakse hiljem muude asjakohaselt valideeritud in vitro testidega või viimase võimalusena, sõltuvalt regulatiivsetest nõuetest, katsetes küülikutega, kasutades järjestikuste katsete tegemise strateegiat ja tõendite kaalukuse lähenemisviisi. Võttes arvesse asjaolu, et mõned tahked kemikaalid on BCOP-katsemeetodiga õigesti määratud ÜRO GHSi 1. kategooriasse, ei ole ka see füüsikaline olek väljaspool kõnealuse meetodi kasutusala. Teadlased võiksid kaaluda kõnealuse meetodi kasutamist iga tüüpi kemikaalide puhul, kusjuures IVIS > 55 tuleks lugeda tõendiks, et kemikaal põhjustab rasket silmakahjustust ja tuleks liigitada ÜRO GHSi 1. kategooriasse ilma edasise katsete tegemiseta. Nagu juba märgitud, tuleb alkoholide või ketoonidega saadud positiivsetesse tulemustesse suhtuda ettevaatusega, kuna nende puhul on oht toimet üle hinnata.

BCOP-katsemeetodit saab kasutada ka selleks, et teha kindlaks kemikaale, mida ÜRO GHSi järgi ei ole vaja klassifitseerida silmade ärrituse või raske silmakahjustuse tekitajatena (4). Kui BCOP-katsemeetodit kasutatakse sellel eesmärgil, on katse kogutäpsus 69 % (135/196), valepositiivsete tulemuste määr on 69 % (61/89) ja valenegatiivsete tulemuste määr 0 % (0/107), võrreldes küüliku silma in vivo katsemeetodi andmetaga ÜRO GHSis klassifitseerimise süsteemi järgi (3) (vt 2. liide, tabel 2). Saadud valepositiivsete tulemuste määr (ÜRO GHSi kategooriata kemikaalide puhul, mille IVIS > 3, vt punkt 47) on küllaltki suur, kuid kõnealuses kontekstis mitte kriitiline, kuna kõiki uuritavaid kemikaale, mille puhul 3 < IVIS ≤ 55, uuritakse hiljem muude asjakohaselt valideeritud in vitro testidega või viimase võimalusena, sõltuvalt regulatiivsetest nõuetest, katsetes küülikutega, kasutades järjestikuste katsete tegemise strateegiat ja tõendite kaalukuse lähenemisviisi. BCOP-katsemeetodil ei ole spetsiifilisi vajakajäämisi alkoholide, ketoonide ja tahkete ainete uurimisel, kui eesmärk on teha kindlaks kemikaalid, mis ei vaja klassifitseerimist seoses silmade ärrituse või raske silmakahjustusega (ÜRO GHSi kategooriata kemikaal) (3). Teadlased võiksid kaaluda kõnealuse meetodi kasutamist iga tüüpi kemikaalide puhul, kusjuures negatiivne tulemus (IVIS ≤ 3) tuleks lugeda tõendiks, et kemikaal ei vaja klassifitseerimist (ÜRO GHSi kategooriata kemikaal). Kuna BCOP-katsemeetodiga saab õigesti määrata vaid 31 % kemikaalidest, mis ei vaja klassifitseerimist silmi ärritava või rasket silmakahjustust tekitavana, ei tohiks seda meetodit kasutada esimese valikuna nn alt-üles lähenemisviisi (5) puhul, kui on olemas muid valideeritud ja heakskiidetud in vitro meetodeid, millel on sarnane suur tundlikkus, aga suurem spetsiifilisus.

BCOP-katsemeetodi valideerimise andmebaas sisaldas 113 ainet ja 100 segu (2, 3). BCOP-katsemeetodit peetakse seepärast kohaldatavaks nii ainete kui ka segude uurimiseks.

BCOP-katsemeetodit ei soovitata kasutada sellise uuritava kemikaali kindlakstegemiseks, mis tuleks klassifitseerida silmi ärritavaks (ÜRO GHSi 2. või 2A kategooria) või silmi nõrgalt ärritavaks (ÜRO GHSi 2B kategooria), kuna sellega on palju ÜRO GHSi 1. kategooria kemikaale klassifitseeritud liiga madalasse kategooriasse, nagu ÜRO GHSi 2., 2A või 2B kategooria; samuti on ÜRO GHSi kategooriata kemikaale klassifitseeritud liiga kõrgesse kategooriasse, nagu ÜRO GHSi 2., 2A või 2B kategooria (2, 3). Selleks võib vaja minna täiendavaid uuringuid muu sobiva meetodiga.

Veiste silmade ja sarvkestadega tehtavate kõigi toimingute puhul tuleb järgida katselaboris kohaldatavaid loomsete materjalide, kaasa arvatud (kuid mitte ainult) kudede ja koevedelike käsitsemise eeskirju ja korda. Soovitatakse järgida üldisi laboratoorseid ohutusnõudeid (11).

BCOP-katsemeetodiga ei uurita sidekesta ega vikerkesta vigastusi; sellega uuritakse toimet sarvkestale, mis on põhiline alus in vivo klassifitseerimisel, kui kaalutakse klassifitseerimist vastavalt ÜRO GHSile. Iseenesest ei saa BCOP-katsemeetodiga hinnata sarvkestakahjustuste pöörduvust. Küüliku silma uuringute põhjal on tehtud ettepanek, et sarvkestavigastuse algsügavuse hindamist võib kasutada pöördumatu toime mõne tüübi kindlaks tegemiseks (12). Siiski on vaja rohkem teaduslikult põhjendatud teadmisi, et mõista, kuidas tekib pöördumatu mõju, mis ei ole seotud esialgse raske vigastusega. Lõpuks ei võimalda BCOP-katsemeetod hinnata silma kokkupuutega kaasneva süsteemse toksilisuse võimalikkust.

Kõnealust meetodit ajakohastatakse korrapäraselt uue teabe ja andmete põhjal. Näiteks võib olla kasulik histopatoloogiline uuring, kui sarvkesta kahjustust on vaja täielikumalt kirjeldada. Nagu on selgitatud OECD juhenddokumendis nr 160 (13), innustatakse meetodi kasutajaid sarvkesti säilitama ja valmistama histopatoloogilisi preparaate, mida saab kasutada andmebaasi ja otsustamiskriteeriumide väljatöötamiseks, mille abil võib selle meetodi täpsust veelgi parandada.

Igal laboril, kes alustab käesoleva katsemeetodi kasutamist, tuleks oma pädevuse kontrollimiseks kasutada 3. liites esitatud pädevuse kontrolli kemikaale. Labor võib osutatud kemikaale kasutada selleks, et tõendada oma tehnilist pädevust BCOP-katse läbiviimisel, enne kui ta esitab BCOP-katsemeetodiga saadud andmed regulatiivseks ohu klassifitseerimiseks.

KATSE PÕHIMÕTE

BCOP-katsemeetod on organotüüpne mudel, mille abil on lühiajaliselt võimalik säilitada veise sarvkesta normaalset füsioloogilist ja biokeemilist talitlust in vitro. Katsemeetodis hinnatakse uuritava kemikaali põhjustatud kahjustust sarvkesta hägususe ja läbilaskvuse muutuste mõõtmisega hägususmõõtja ja nähtava valguse spektrofotomeetri abil. Mõlema suuruse alusel arvutatakse IVIS, mille alusel uuritavale kemikaalile määratakse in vitro ärritava toime klassifikatsiooni kategooria, et prognoosida uuritava kemikaali silmi ärritava toime potentsiaali in vivo (vt otsustuskriteeriumid, punkt 48).

BCOP-katsemeetodi puhul kasutatakse värskelt tapetud veise silmast eraldatud sarvkesta. Sarvkesta hägusust mõõdetakse kvantitatiivselt sarvkesta läbinud valgushulga alusel. Läbilaskvust mõõdetakse kvantitatiivselt värvaine naatriumfluorestseiini kogusena, mis on läbinud kogu sarvkesta paksuse ja jõudnud tagumises kambris olevasse söötmesse. Uuritavad kemikaalid kantakse sarvkesta epiteliaalsele pinnale sel teel, et need lisatakse sarvkestahoidiku eesmisesse kambrisse. 4. liites on esitatud BCOP-katsemeetodi sarvkestahoidiku kirjeldus ja skeem. Sarvkestahoidikuid võib osta mitmelt firmalt või ehitada ise.

Veisesilmade hankimine, loomade vanus ja valimine

Tapamajja saadetavad veised tapetakse harilikult kas inimtoiduks või muul kaubanduslikul eesmärgil. BCOP-katseks sobib üksnes sarvkest, mis on võetud tervelt loomalt, keda peetakse sobivaks inimtoidus kasutamiseks. Kuna veised on tõust, vanusest ja soost olenevalt väga erineva kaaluga, ei ole looma soovitatavat kaalu tapmise ajal määratletud.

Eri vanuses loomade silmade kasutamise korral võivad sarvkesta mõõtmed olla erinevad. Sarvkestad, mille horisontaalläbimõõt on üle 30,5 mm ja paksus keskosas vähemalt 1 100 μm, on tavaliselt pärit üle kaheksa aasta vanustelt veistelt, samas kui sarvkestad horisontaalläbimõõduga alla 28,5 mm ja paksusega keskosas alla 900 μm on tavaliselt veistelt, kelle vanus on alla viie aasta (14). Seepärast ei kasutata tavaliselt üle 60 kuu vanuste veiste silmi. Alla 12 kuu vanuste veiste silmi ei ole tavaliselt kasutatud, sest nende silmad alles arenevad ning sarvkesta paksus ja läbimõõt on oluliselt väiksemad kui täiskasvanud veistel. Noorloomade (vanus 6–12 kuud) sarvkestade kasutamine on siiski lubatav, sest on ka teatavaid eeliseid, nagu suurem kättesaadavus, kitsas vanusevahemik ja väiksem oht, et töötajad võivad kokku puutuda veiste spongiformse entsefalopaatiaga (15). Kuna oleks kasulik hinnata söövitavate või ärritavate kemikaalide suhtes avalduva sarvkesta tundlikkuse sõltuvust sarvkesta suurusest või paksusest, palutakse kasutajatel teatada, mis vanuses ja/või millise kaaluga loomadelt pärinesid uuringus kasutatud sarvkestad.

Silmade eemaldamine ja transport laborisse

Silmad eemaldatakse tapamaja töötajate poolt. Selleks et viia miinimumini silmade mehaanilised ja muud tüüpi vigastused, tuleb silmad eemaldada võimalikult kiiresti pärast looma surma, jahutada kohe pärast eemaldamist ning hoida jahutatult transpordi ajal. Et vältida silmade kokkupuudet ärritust põhjustada võivate kemikaalidega, ei tohi tapamaja töötajad looma pea loputamisel kasutada detergente.

Silmad tuleks paigutada sobiva suurusega anumasse nii, et need oleksid üleni kaetud Hanki tasakaalustatud soolalahusega (Hank's Balanced Salt Solution, HBSS), ja transportida laborisse nii, et nende kahjustumise või bakteriaalse saastumise oht oleks minimaalne. Kuna silmad võetakse tapmisprotsessi ajal, võivad need kokku puutuda vere ja muude bioloogiliste materjalidega, sealhulgas bakterite ja muude mikroorganismidega. Seepärast on oluline tagada, et silmade saastumise risk viidaks miinimumini (näiteks silmi sisaldava anuma hoidmisega jääl silmade võtmise ja transportimise ajal ning antibiootikumide lisamisega HBSS-le, milles silmi säilitatakse transportimise ajal [näiteks penitsilliin kontsentratsioonis 100 IU/ml ja streptomütsiin kontsentratsioonis 100 μg/ml]).

Ajavahemik silmade eemaldamise ja sarvkestade BCOP-katses kasutamise vahel peaks olema võimalikult lühike (tavaliselt eemaldatakse ja kasutatakse samal päeval), kusjuures tuleks tõendada, et see ei mõjuta katsetulemusi. Nende tulemuste aluseks on silmade valimise kriteeriumid ning positiivse ja negatiivse kontrolliga saadud tulemused. Kõik katses kasutatud silmad peavad olema ühest ja samast silmade rühmast, mis on võetud ühel konkreetsel päeval.

Silmade valimise kriteeriumid BCOP-katsemeetodi puhul

Silmi uuritakse pärast laborisse saabumist hoolikalt, et neil ei esineks defekte, sealhulgas suurenenud hägusust, kriimustusi ega neovaskularisatsiooni. Kasutatakse ainult sellistest silmadest pärit sarvkesti, milles selliseid defekte ei ole.

Iga sarvkesta kvaliteeti hinnatakse ka katse hilisematel etappidel. Sarvkestad, mille hägusus on suurem kui seitse hägususe ühikut või selle ekvivalenti katses kasutatud hägususmõõtja ja sarvkestahoidikute puhul pärast esialgset ühe tunni pikkust tasakaalustumisperioodi, visatakse ära (MÄRKUS: hägususmõõtja tuleks kaliibrida hägususe standardiga, mida kasutatakse hägususe ühikute kindlaks tegemiseks, vt 4. liide).

Igas katserühmas (uuritav kemikaal, sellega paralleelselt läbiviidavad positiivse ja negatiivse kontrolli katsed) kasutatakse vähemalt kolme silma. BCOP-katsemeetodi puhul kasutatakse negatiivse kontrolli katses kolme sarvkesta. Kuna kõik sarvkestad eemaldatakse kogu silmamunalt ja paigutatakse sarvkestakambrisse, võivad üksiku sarvkesta, sealhulgas negatiivse kontrolli katses kasutatud sarvkesta hägususe ja läbilaskvuse väärtusi mõjutada käsitsemisest tekkinud artefaktid. Lisaks kasutatakse negatiivse kontrolliga töödeldud sarvkestadega saadud väärtusi, et korrigeerida uuritava kemikaali ja positiivse kontrolliga töödeldud sarvkestade hägususe ja läbilaskvuse väärtusi IVIS-tulemuste arvutustes.

KATSE KÄIK

Silmade ettevalmistamine

Defektitud sarvkestad eemaldatakse koos 2–3 mm laiuse kõvakestaäärega, mis hõlbustab edasist käsitsemist, kusjuures tuleb vältida sarvkesta epiteeli ja endoteeli kahjustamist. Eraldatud sarvkestad kinnitatakse spetsiaalsesse sarvkestahoidikusse, millel on eesmine kamber – selle poole on sarvkesta epiteliaalne külg –, ja tagumine kamber, mille poole on endoteliaalne külg. Mõlemad kambrid täidetakse kuni ülevoolamiseni eelsoojendatud EMEM-söötmega (Eagle's Minimum Essential Medium), mis ei sisalda fenoolpunast, alustades tagumisest kambrist ja jälgides, et ei tekiks mulle. Seadet tasakaalustatakse seejärel temperatuuril 32 ± 1 °C vähemalt üks tund, et sarvkestad tasakaalustuksid söötmega ja saavutaksid võimalikus ulatuses normaalse metaboolse aktiivsuse (sarvkesta pinna ligikaudne temperatuur in vivo on 32 °C).

Pärast tasakaalustumisperioodi lisatakse mõlemasse kambrisse värsket eelsoojendatud EMEMi, mis ei sisalda fenoolpunast, ja registreeritakse iga sarvkesta hägususe lähteväärtus. Katsest jäetakse välja kõik sarvkestad, millel esineb makroskoopilisi koekahjustusi (näiteks kriimustusi, pigmentatsiooni, neovaskularisatsiooni) või mille hägusus on suurem kui seitse hägususe ühikut või selle ekvivalenti katses kasutatud hägususmõõtja ja sarvkestahoidikute puhul. Negatiivse (või lahusti) kontrolli rühma valitakse vähemalt kolm sarvkesta. Ülejäänud sarvkestad jagatakse seejärel kahte rühma: uuritava kemikaali töödeldavad ja positiivse kontrolli katse sarvkestad.

Kuna vee soojusmahtuvus on suurem kui õhul, on inkubeerimise ajal võimalik veega saavutada püsivamaid temperatuuritingimusi. Seepärast soovitatakse sarvkestahoidikute ja nende sisu säilitamiseks temperatuuril 32 ± 1 °C kasutada vesivanni. Kuid kasutada võib ka õhktermostaate, võttes vajalikud meetmed temperatuuri stabiilsuse säilitamiseks (näiteks sarvkestahoidikute ja söötmete eelsoojendamine).

Uuritava kemikaaliga töötlemine

Kasutatakse kaht töötlemismeetodit, millest üks on vedelike ja (tahkete või vedelate) pindaktiivsete ainete jaoks ning teine on selliste tahkete kemikaalide jaoks, mis ei ole pindaktiivsed.

Vedelikke katsetatakse ilma lahjendamata. Pooltahkeid kemikaale, kreeme ja vahasid uuritakse tavaliselt nagu vedelikke. Puhtaid pindaktiivseid aineid katsetatakse kontsentratsioonis 10 % (w/v) 0,9 % naatriumkloriidi lahuses, destilleeritud vees või muus lahustis, mille kohta on tõendatud, et sel ei ole kahjulikku toimet katsesüsteemile. Muude lahjenduskontsentratsioonide kasutamist tuleb asjakohaselt põhjendada. Pindaktiivseid aineid sisaldavaid segusid võib katsetada kas lahjendamata või sobiva kontsentratsioonini lahjendatult, olenevalt vastavast kokkupuutestsenaariumist in vivo. Muu uuritud lahjenduskontsentratsiooni kasutamist tuleb asjakohaselt põhjendada. Sarvkestadel lastakse vedelike ja pindaktiivsete ainetega kokku puutuda 10 minutit. Muu kokkupuuteaja kasutamise korral tuleb esitada piisav teaduslik põhjendus. Pindaktiivse aine ja sellist ainet sisaldava segu mõisted on esitatud 1. liites.

Tahkeid kemikaale, mis ei ole pindaktiivsed, katsetatakse lahuste või suspensioonidena kontsentratsioonis 20 % (w/v) 0,9 % naatriumkloriidi lahuses, destilleeritud vees või muus lahustis, mille kohta on tõendatud, et sel ei ole kahjulikku toimet katsesüsteemile. Teatavatel puhkudel ja asjakohase teadusliku põhjendusega võib tahkeid kemikaale katsetada ka puhtal kujul, kui uuritav kemikaal kantakse otse sarvkesta pinnale, kasutades lahtise kambri meetodit (vt punkt 32). Sarvkestad jäetakse tahke kemikaaliga kokkupuutesse neljaks tunniks, kuid nagu ka vedelike ja pindaktiivsete ainete puhul võib asjakohase teadusliku põhjendusega kasutada ka muid kokkupuuteaegu.

Pealekandmiseks võib kasutada mitmesuguseid meetodeid, olenevalt uuritava kemikaali füüsikalisest olekust ja keemilistest omadustest (näiteks tahke kemikaal, vedelik, viskoosne või mitteviskoosne vedelik). Oluline on tagada, et uuritav kemikaal kataks korralikult epiteliaalse pinna ja eemaldataks täielikult loputamistega. Mitteviskoosse või väheviskoosse uuritava vedela kemikaali puhul kasutatakse tavaliselt suletud kambri meetodit, samas kui poolviskoosse ja viskoosse vedela uuritava kemikaali või tahke puhta kemikaali uurimiseks kasutatakse tavaliselt lahtise kambri meetodit.

Suletud kambri meetodis viiakse eesmisesse kambrisse kambri ülaosas asuvate annustamisavade kaudu piisav kogus uuritavat kemikaali (750 μl), et see kataks sarvkesta epiteliaalse külje; seejärel suletakse avad kokkupuute ajaks korgiga. Oluline on tagada, et iga sarvkest oleks uuritava kemikaaliga kokkupuutes vajaliku ajavahemiku jooksul.

Lahtise kambri meetodis võetakse eesmise kambri akna kinnitusrõngas ja klaasaken enne pealekandmist ära. Kontrolli kemikaal või uuritav kemikaal (750 μl või sarvkesta täielikuks katmiseks piisav kogus) kantakse mikropipetiga otse sarvkesta epiteliaalsele pinnale. Kui uuritavat kemikaali on raske pipeteerida, võib kemikaali doseerimise hõlbustamiseks viia rõhu all kolbpipetti. Kolbpipeti otsik sisestatakse süstla dosaatorotsikusse, nii et materjali saab rõhu all viia kolbpipeti otsikusse. Samaaegselt pipetikolvi tagasitõmbamisega lastakse süstla kolb vabaks. Kui pipetiotsikusse ilmuvad õhumullid, surutakse uuritav kemikaal välja ja võtet korratakse, kuni otsik on täidetud ja selles ei ole õhumulle. Vajaduse korral võib kasutada tavalist (ilma nõelata) süstalt, kuna sellega saab uuritava kemikaali ruumala täpselt mõõta, samuti on sellega võimalik kemikaali hõlpsamini kanda sarvkesta epiteliaalsele pinnale. Pärast uuritava kemikaali pealekandmist pannakse eesmise kambri klaasaken tagasi, et taas tekiks suletud süsteem.

Kokkupuutejärgne inkubeerimine

Pärast kokkupuuteaja lõppu eemaldatakse uuritav kemikaal, negatiivne kontroll või positiivse kontrolli kemikaal eesmisest kambrist ja epiteeli pestakse vähemalt kolm korda (või nii kaua, kuni kemikaali jääke ei ole enam võimalik näha) EMEMiga (millesse on lisatud fenoolpunast). Loputamiseks kasutatakse fenoolpunast sisaldavat lahust, kuna fenoolpunase värvuse muutust võib kasutada happelise või aluselise uuritava kemikaali väljapesemise täielikkuse hindamiseks. Sarvkesti pestakse rohkem kui kolm korda, kui fenoolpunane muudab veel oma värvi (kollane või punakaslilla) või kuni uuritavat kemikaali on veel näha. Kui söötmes ei ole enam uuritavat kemikaali, loputatakse sarvkesti viimast korda (fenoolpunast mittesisaldava) EMEMiga. Fenoolpunast mittesisaldavat EMEMi kasutatakse viimaseks loputuseks, et tagada fenoolpunase eemaldamine eesmisest kambrist enne hägususe mõõtmist. Seejärel täidetakse eesmine kamber värske (fenoolpunast mittesisaldava) EMEMiga.

Vedelike ja pindaktiivsete kemikaalide puhul inkubeeritakse sarvkesti pärast loputamist veel kaks tundi temperatuuril 32 ± 1 °C. Mõnes olukorras on pikem kokkupuutejärgne ajavahemik kasulik ja seda tuleks juhupõhiselt kaaluda. Tahke kemikaaliga töödeldud sarvkesti loputatakse põhjalikult pärast neljatunnilist kokkupuuteaega, kuid täiendavat inkubeerimist ei ole nende puhul vaja.

Vedeliku ja pindaktiivse kemikaali puhul kokkupuutejärgse inkubatsiooniaja lõpus ning tahke kemikaali puhul, mis ei ole pindaktiivne, registreeritakse neljatunnise kokkupuuteaja lõpus iga sarvkesta hägusus ja läbilaskvus. Samuti vaadeldakse iga sarvkesta visuaalselt ja dokumenteeritakse kõik asjakohased tähelepanekud (näiteks koe irdumine, uuritava kemikaali jäägid, ebaühtlaselt jaotunud hägususe mustrid). Sellised tähelepanekud võivad olla olulised, kuna need erisused võivad mõjutada hägususmõõt näitu.

Kontrolli kemikaalid

Igas katses kasutatakse ka paralleelseid negatiivset või lahusti/vehiikuli kontrolli ja positiivseid kontrolle.

BCOP-katse läbiviimisel 100-protsendilise vedela ainega tehakse paralleelselt negatiivse kontrolli katse (näiteks 0,9 % naatriumkloriidi lahuse või destilleeritud veega), et kindlaks teha mittespetsiifiliste muutuste esinemine testsüsteemis ja saada katse näitajate lähteväärtused. Sellega tõendatakse ka, et katsetingimused ise ei põhjusta muutusi, mida ekslikult võiks ärrituseks pidada.

Lahjendatud vedeliku, pindaktiivse aine või tahkise testimisel lisatakse BCOP-katsesse paralleelne lahusti/vehiikuli kontrolli rühm, nii et oleks võimalik tuvastada testsüsteemi ebaspetsiifilisi muutusi ning saada katse näitajate lähteväärtused. Katses võib kasutada ainult sellist lahustit/vehiikulit, mille kohta on tõendatud, et sel ei ole kahjulikku toimet katsesüsteemile.

Igasse katsesse lisatakse positiivse kontrollina teadaolevalt positiivset reaktsiooni põhjustav kemikaal, veendumaks, et katsesüsteem on teviklik ja toimib õigesti. Kuid selleks, et oleks võimalik hinnata ka positiivse kontrolli kemikaali mõju sõltuvust ajast, ei tohiks ärritusreaktsioon olla ülemäära suur.

Vedelate positiivse kontrolli kemikaalide näited on 100-protsendiline etanool või 100-protsendiline dimetüülformamiid. Tahke positiivse kontrolli kemikaali näide on 20 % (w/v) imidasooli suspensioon 0,9 % naatriumkloriidi lahuses.

Võrdluskemikaalid võimaldavad hinnata teatavasse kemikaali- või tooteklassi kuuluva tundmatu kemikaali omadust põhjustada silmade ärritust või hinnata teatava silmi ärritava kemikaali toime võimalikkust ärritusreaktsiooni teatavas vahemikus.

Mõõdetavad näitajad

Hägusus määratakse sarvkesta läbinud valgushulga mõõtmisega. Sarvkesta hägusust mõõdetakse hägususmõõtja abil, millega saadakse hägususe väärtused pidevas skaalas.

Läbilaskvust määratakse värvaine naatriumfluorestseiini koguse järgi, mis tungib läbi kõigi sarvkesta kihtide (st sarvkesta välispinnal asuvast epiteelist kuni sisepinnal asuva endoteelini). Sarvkestahoidiku eesmisesse kambrisse, mille poole on sarvkesta epiteliaalne külg, lisatakse 1 ml naatriumfluorestseiini lahust (4 mg/ml, kui uuritav kemikaal on vedelik või pindaktiivne aine, ja 5 mg/ml, kui see on pindaktiivsete omadusteta tahkis), samas kui tagumine kamber, mille poole on endoteliaalne külg, täidetakse värske EMEMiga. Seejärel inkubeeritakse sarvkestahoidikut horisontaalasendis 90 ± 5 minutit temperatuuril 32 ± 1 °C. UV/VIS-spektrofotomeetriaga mõõdetakse tagumisse kambrisse tunginud naatriumfluorestseiini kogus. Lainepikkusel 490 nm läbiviidavate spektrofotomeetriliste mõõtmiste tulemused registreeritakse optilise tiheduse (OD490) või valguse neeldumise ühikutes pidevas skaalas. Fluorestseiini läbilaskvuse väärtused määratakse OD490 väärtustest, mis määratakse nähtava valguse spektrofotomeetriga, kasutades standardset optilise tee pikkust 1 cm.

Selle asemel võib kasutada 96-kannulise mikrotiiterplaadi lugejat, kui: i) on võimalik näidata, et fluorestseiini määramisel on OD490 väärtused plaadilugeja lineaarses piirkonnas, ja ii) 96-kannulisel mikrotiiterplaadil kasutatakse õiget fluorestseiiniproovi ruumala, nii et saadakse samad OD490 väärtused kui tavalise 1 cm optilise tee pikkusega mõõtmisel (selleks võib olla vaja täita kann täielikult (tavaliselt 360 μl)).

ANDMED JA KATSEPROTOKOLLI KOOSTAMINE

Andmete hindamine

Kui hägususe ja keskmise läbilaskvuse (OD490) väärtused on korrigeeritud tausthägususe ja negatiivse kontrolli läbilaskvuse OD490 väärtuste suhtes, tuleb iga katserühma keskmised hägususe ja läbilaskvuse OD490 väärtused asendada empiiriliselt tuletatud valemisse, et arvutada in vitro-ärritava toime hinne (IVIS) iga katserühma jaoks:

IVIS = keskmine hägususe väärtus + (15 × keskmine läbilaskvuse OD490 väärtus)

Sina jt (16) avaldasid, et see valem tuletati laborisiseste ja laboritevaheliste uuringutega. 36 ühendiga läbiviidud laboritevahelise uuringu andmeid analüüsiti mitmese korrelatsioonanalüüsiga, et leida in vivo ja in vitro saadud tulemuste seost kõige paremini kirjeldav võrrand. Kahe eri firma teadlased tegid selle analüüsi ja said peaaegu ühesugused võrrandid.

Hägususe ja läbilaskvuse väärtusi tuleks ka sõltumatult hinnata, et teha kindlaks, kas uuritav kemikaal põhjustas söövitust või tugevat ärritust ainult ühe kaudu kahest näitajast (vt Otsustamiskriteeriumid).

Otsustamiskriteeriumid

Selleks, et teha kindlaks IVISe läviväärtused, mille järgi uuritavaid kemikaale, mis põhjustavad rasket silmakahjustust (ÜRO GHSi 1. kategooria), eristatakse uuritavatest kemikaalidest, mida ei ole vaja klassifitseerida seoses silmade ärrituse või raske silmakahjustusega (ÜRO GHSi kategooriata kemikaal), on järgmised:

Uuringu nõuetekohasuse kriteeriumid

Katse loetakse nõuetekohaseks, kui positiivne kontroll annab IVISe väärtuse, mis erineb kuni kahe standardhälbe võrra varasemate uuringute jooksvast keskväärtusest, mida ajakohastatakse vähemalt iga kolme kuu järel või iga nõuetekohase katse läbiviimise järel laboris, kus katseid tehakse harva (harvem kui kord kuus). Negatiivse kontrolli või lahusti/vehiikuli kontrolli katses saadud hägususe ja läbilaskvuse väärtused peavad olema väiksemad kui tausthägususe ja -läbilaskvuse väärtuse ülempiirid, mis on varem kindlaks tehtud veise sarvkestadega, mida on töödeldud negatiivse kontrolli või lahusti/vehiikuli kontrolli kemikaalidega. Üksainus uuring vähemalt kolme sarvkestaga peaks olema piisav uuritava kemikaali kohta, kui klassifitseerimise tulemus on ühene. Kuid kui esimene uuring annab piiripealsed tulemused, tuleb kaaluda teise uuringu tegemist (mis ei ole tingimata nõutav), samuti kolmanda uuringu tegemist, kui esimese kahe uuringu IVISe keskmised väärtused ei ole kooskõlas. Selles kontekstis loetakse esimese uuringu tulemus piiripealseks, kui kolme sarvkestaga saadud tulemused ei ole kooskõlas, näiteks:

Katseprotokoll

Katseprotokollis tuleb esitada järgmine teave, kui see on uuringu läbiviimise seisukohast asjakohane: