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Document 32010R0175
Commission Regulation (EU) No 175/2010 of 2 March 2010 implementing Council Directive 2006/88/EC as regards measures to control increased mortality in oysters of the species Crassostrea gigas in connection with the detection of Ostreid herpesvirus 1 μvar (OsHV-1 μvar) (Text with EEA relevance)
Reglamento (UE) n o 175/2010 de la Comisión, de 2 de marzo de 2010 , por el que se aplica la Directiva 2006/88/CE del Consejo en lo referente a las medidas de lucha contra el aumento de la mortalidad de los ostiones de la especie Crassostrea gigas en relación con la detección del herpesvirus de los ostreidos tipo 1 μvar (OsHV-1 μvar) (Texto pertinente a efectos del EEE)
Reglamento (UE) n o 175/2010 de la Comisión, de 2 de marzo de 2010 , por el que se aplica la Directiva 2006/88/CE del Consejo en lo referente a las medidas de lucha contra el aumento de la mortalidad de los ostiones de la especie Crassostrea gigas en relación con la detección del herpesvirus de los ostreidos tipo 1 μvar (OsHV-1 μvar) (Texto pertinente a efectos del EEE)
DO L 52 de 3.3.2010, p. 1–13
(BG, ES, CS, DA, DE, ET, EL, EN, FR, IT, LV, LT, HU, MT, NL, PL, PT, RO, SK, SL, FI, SV)
No longer in force, Date of end of validity: 30/04/2011: This act has been changed. Current consolidated version: 12/12/2010
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3.3.2010 |
ES |
Diario Oficial de la Unión Europea |
L 52/1 |
REGLAMENTO (UE) No 175/2010 DE LA COMISIÓN
de 2 de marzo de 2010
por el que se aplica la Directiva 2006/88/CE del Consejo en lo referente a las medidas de lucha contra el aumento de la mortalidad de los ostiones de la especie Crassostrea gigas en relación con la detección del herpesvirus de los ostreidos tipo 1 μvar (OsHV-1 μvar)
(Texto pertinente a efectos del EEE)
LA COMISIÓN EUROPEA,
Visto el Tratado de Funcionamiento de la Unión Europea,
Vista la Directiva 2006/88/CE del Consejo, de 24 de octubre de 2006, relativa a los requisitos zoosanitarios de los animales y de los productos de la acuicultura, y a la prevención y el control de determinadas enfermedades de los animales acuáticos (1), y, en particular, su artículo 41, apartado 3, y su artículo 61, apartado 3,
Considerando lo siguiente:
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(1) |
La Directiva 2006/88/CE establece los requisitos zoosanitarios que deben aplicarse a la comercialización de animales y productos de la acuicultura. Además, establece medidas mínimas de prevención que deben aplicarse en caso de sospecha o de aparición de un foco de determinadas enfermedades en animales acuáticos. |
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(2) |
El artículo 41 de esta Directiva dispone que los Estados miembros deben adoptar las medidas adecuadas para controlar una situación de enfermedad emergente y evitar su propagación. Ante una situación de enfermedad emergente, el Estado miembro afectado ha de informar inmediatamente a los Estados miembros, a la Comisión y a los Estados miembros de la AELC en caso de obtenerse resultados de relevancia epidemiológica para otro Estado miembro. |
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(3) |
En varias zonas de Francia y de Irlanda se observó, a finales de la primavera y en el verano de 2008, un aumento de la mortalidad de los ostiones de la especie Crassostrea gigas (en lo sucesivo, «ostiones Crassostrea gigas»). Dicho aumento se atribuyó a una combinación de factores ambientales adversos, además de la presencia de bacterias del género Vibrio y del herpesvirus de los ostreidos tipo 1 (OsHV-1), incluido un genotipo recientemente descrito de ese virus llamado OsHV-1 μvar. |
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(4) |
En agosto de 2008, las autoridades francesas informaron de la situación y de las medidas adoptadas a los Estados miembros, a la Comisión y a los Estados miembros de la AELC, y el asunto se puso en conocimiento del Comité permanente de la cadena alimentaria y de sanidad animal en septiembre de 2008. |
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(5) |
En la primavera de 2009, un aumento de la mortalidad atribuido a la misma combinación de factores volvió a detectarse en Francia, Irlanda y las Islas Anglonormandas. Si bien las causas de las mortalidades siguen siendo inciertas, las investigaciones epidemiológicas emprendidas en Irlanda y el Reino Unido en 2009 sugieren que el OsHV-1 μvar tiene un papel importante. |
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(6) |
Las autoridades competentes de estos Estados miembros y de las Islas Anglonormandas informaron a la Comisión de la situación y de las medidas adoptadas, y el asunto se notificó en varias ocasiones al Comité permanente de la cadena alimentaria y de sanidad animal. |
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(7) |
Las medidas de confinamiento adoptadas por las autoridades competentes de esos Estados miembros y de las Islas Anglonormandas para controlar la situación de enfermedad emergente consistieron principalmente en restringir los desplazamientos de ostiones Crassostrea gigas a partir de las zonas afectadas por el aumento de la mortalidad. |
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(8) |
Ante la reaparición de esta situación de enfermedad emergente en 2009, la posibilidad de que se repita y el riesgo de propagación en primavera y verano de 2010, y sobre la base de la experiencia adquirida, es oportuno y necesario extender las medidas ya adoptadas por los Estados miembros afectados. |
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(9) |
Para aplicar en condiciones uniformes los requisitos de la Directiva 2006/88/CE en materia de enfermedades emergentes y velar por que las medidas adoptadas ofrezcan suficiente protección frente a la propagación, sin por ello imponer restricciones innecesarias a los desplazamientos de los ostiones Crassostrea gigas, es preciso coordinar a nivel de la Unión Europea las medidas relativas a esta situación de enfermedad emergente. |
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(10) |
Cuando se notifique a las autoridades competentes que se ha detectado un aumento de la mortalidad de los ostiones Crassostrea gigas, debe efectuarse un muestreo y han de realizarse ensayos para detectar o descartar la presencia del OsHV-1 μvar. |
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(11) |
Cuando se confirme la presencia del genotipo del virus OsHV-1 μvar, los Estados miembros deben aplicar medidas de control de la enfermedad y establecer una zona de confinamiento. Al definir la zona de confinamiento han de tenerse en cuenta varios factores que se establecen en el presente Reglamento. Las medidas de control de la enfermedad deben persistir hasta que las inspecciones muestren que la mortalidad excesiva ha cesado. |
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(12) |
Para limitar el riesgo de propagación de la enfermedad deben restringirse los desplazamientos de ostiones Crassostrea gigas a partir de las zonas de confinamiento. Sin embargo, conviene prever excepciones cuando el riesgo de propagación sea reducido. Estas excepciones son aplicables a los desplazamientos de ostiones Crassostrea gigas con destino a zonas de cría o de reinstalación situadas dentro de otra zona de confinamiento, o destinados al consumo humano. Para asegurar la rastreabilidad de las partidas de ostiones Crassostrea gigas destinadas a zonas de cría o de reinstalación, tales partidas deben ir acompañadas por un certificado zoosanitario. Al cumplimentar el certificado deben tenerse en cuenta las notas explicativas del anexo V del Reglamento (CE) no 1251/2008 de la Comisión, de 12 de diciembre de 2008, por el que se aplica la Directiva 2006/88/CE del Consejo en lo referente a las condiciones y los requisitos de certificación para la comercialización y la importación en la Comunidad de animales de la acuicultura y productos derivados y se establece una lista de especies portadoras (2). |
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(13) |
Para recabar más información sobre esta situación de enfermedad emergente en la Unión y, particularmente, en los Estados miembros y compartimentos aún no afectados, y garantizar la detección precoz de cualquier brote del OsHV-1 μvar, los Estados miembros pueden establecer programas de muestreo y ensayos específicos para la detección precoz del OsHV-1 μvar. Los ostiones Crassostrea gigas originarios de zonas que hayan estado sujetas a medidas de confinamiento en 2009, con arreglo a disposiciones nacionales, o en 2010, de conformidad con el presente Reglamento, deben estar sujetos a requisitos zoosanitarios adicionales si se introducen para la cría o la reinstalación en Estados miembros o compartimentos cubiertos por tales programas, siempre que no se haya detectado el OsHV-1 μvar en dichos Estados miembros o compartimentos. |
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(14) |
Para que los datos recogidos en diferentes Estados miembros con programas de muestreo y ensayos específicos para la detección precoz del OsHV-1 μvar sean comparables, conviene establecer determinados requisitos para el contenido de esos programas. |
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(15) |
A fin de controlar debidamente esta situación de enfermedad emergente es esencial disponer de información exacta y actualizada sobre la detección del OsHV-1 μvar en los Estados miembros. A tal efecto, los Estados miembros deben notificar a la Comisión y a los demás Estados miembros, sin demora injustificada, la primera presencia confirmada del virus OsHV-1 μvar en sus territorios en 2010. |
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(16) |
Además, conviene hacer uso de las páginas web de información creadas con arreglo al artículo 10 de la Decisión 2009/177/CE de la Comisión, de 31 de octubre de 2008, por la que se establecen disposiciones de aplicación de la Directiva 2006/88/CE del Consejo en lo que respecta a la vigilancia, los programas de erradicación y la calificación de libre de la enfermedad de Estados miembros, zonas y compartimentos (3). |
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(17) |
Para ofrecer transparencia y un acceso rápido a la información pertinente sobre la situación de enfermedad emergente, los Estados miembros han de poner a disposición de la Comisión Europea y de los demás Estados miembros información sobre las zonas de confinamiento, las zonas que antes eran de confinamiento pero donde se ha demostrado la ausencia del OsHV-1 μvar y los programas establecidos para la detección precoz del OsHV-1 μvar. |
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(18) |
Ante la incertidumbre que aún persiste sobre esta situación de enfermedad emergente, las medidas previstas en el presente Reglamento deberían aplicarse hasta que finalice diciembre de 2010. |
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(19) |
Las medidas previstas en el presente Reglamento se ajustan al dictamen del Comité permanente de la cadena alimentaria y de sanidad animal. |
HA ADOPTADO EL PRESENTE REGLAMENTO:
Artículo 1
Definición
A los efectos del presente Reglamento, «OsHV-1 μvar» designa un genotipo del herpesvirus de los ostreidos tipo 1 (OsHV-1) que se define en base a datos sobre la secuencia parcial que muestran una deleción sistemática de doce pares de bases en ORF 4 del genoma en comparación con el OsHV-1 (GenBank # AY509253).
Artículo 2
Muestreo, ensayos y establecimiento de zonas de confinamiento
1. Cuando se detecte un aumento de la mortalidad de los ostiones de la especie Crassostrea gigas (en lo sucesivo, «ostiones Crassostrea gigas»), la autoridad competente:
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a) |
tomará muestras con arreglo a la parte A del anexo I; |
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b) |
realizará ensayos para detectar la presencia del OsHV-1 μvar con los métodos de diagnóstico que se establecen en la parte B del anexo I. |
2. Cuando los resultados de los ensayos previstos en el apartado 1, letra b), revelen la presencia del OsHV-1 μvar, la autoridad competente establecerá una zona de confinamiento. Esta zona se definirá atendiendo a un análisis de cada caso particular que tenga en cuenta los factores que influyen en el riesgo de propagación de la enfermedad señalados en el anexo I, parte C.
3. Los Estados miembros notificarán a la Comisión y a los demás Estados miembros, sin demora injustificada, la primera zona de confinamiento que establezcan en su territorio en 2010.
Artículo 3
Requisitos de comercialización de los ostiones Crassostrea gigas originarios de una zona de confinamiento contemplada en el artículo 2
1. Los ostiones Crassostrea gigas originarios de una zona de confinamiento establecida con arreglo al artículo 2, apartado 2, no se sacarán de esa zona.
2. No obstante lo dispuesto en el apartado 1, las partidas de ostiones Crassostrea gigas podrán salir de la zona de confinamiento cuando:
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a) |
vayan destinadas a otra zona de confinamiento establecida con arreglo al artículo 2, apartado 2; |
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b) |
procedan de una parte de la zona de confinamiento, incluidos los criaderos, no afectada por el aumento de la mortalidad y hayan sido sometidas a:
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c) |
vayan destinadas a la transformación ulterior, antes del consumo humano, en centros de depuración, centros de expedición o establecimientos de transformación equipados con un sistema de tratamiento de efluentes validado por la autoridad competente que:
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d) |
vayan destinadas al consumo humano y estén embaladas y etiquetadas para ello con arreglo al Reglamento (CE) no 853/2004 del Parlamento Europeo y del Consejo (4), y:
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e) |
se destinen (las partidas o sus productos) al consumo humano sin transformación ulterior, siempre que estén embaladas para la venta al por menor en embalajes que se ajusten a lo dispuesto para ellos en el Reglamento (CE) no 853/2004. |
3. Las partidas contempladas en el apartado 2, letras a) y b), destinadas a zonas de cría o de reinstalación irán acompañadas de un certificado zoosanitario cumplimentado conforme al modelo del anexo II del presente Reglamento y a las notas explicativas del anexo V del Reglamento (CE) no 1251/2008.
Artículo 4
Levantamiento de las medidas previstas en los artículos 2 y 3
La autoridad competente podrá levantar las medidas de control de las zonas de confinamiento establecidas en virtud del artículo 2, apartado 2, y las restricciones a la comercialización previstas en el artículo 3 una vez que haya llevado a cabo dos inspecciones, con un intervalo de quince días, que muestren que ha cesado el aumento de la mortalidad.
Artículo 5
Requisitos de comercialización de los ostiones Crassostrea gigas originarios de un compartimento anteriormente sujeto a medidas de control por un aumento de la mortalidad de ostiones Crassostrea gigas relacionado con el OsHV-1 μvar
1. Para ser comercializados, los ostiones Crassostrea gigas que sean originarios de un compartimento que haya estado sujeto a medidas de confinamiento en 2009 o 2010 por un aumento de la mortalidad de los ostiones Crassostrea gigas relacionado con el OsHV-1 μvar deberán:
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a) |
ir acompañados de un certificado zoosanitario cumplimentado conforme al modelo del anexo II del presente Reglamento y a las notas explicativas del anexo V del Reglamento (CE) no 1251/2008, si:
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b) |
ser originarios de un compartimento en el que haya quedado demostrada la ausencia del OsHV-1 μvar mediante muestreo y ensayos efectuados de conformidad con la parte A del anexo I, y |
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c) |
cumplir los requisitos zoosanitarios establecidos en el modelo de certificado al que se hace referencia en la letra a). |
2. El programa de detección precoz del OsHV-1 μvar contemplado en el apartado 1, letra a), inciso i), cumplirá los siguientes requisitos:
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a) |
el programa deberá ser declarado al Comité permanente de la cadena alimentaria y de sanidad animal; |
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b) |
la declaración deberá ajustarse a los puntos 1, 5.1, 5.2, 5.3, 5.5 y 5.9, así como los puntos 6 y 7, del modelo de formulario establecido en el anexo II de la Decisión 2009/177/CE; |
|
c) |
el programa deberá incluir las siguientes medidas:
|
3. El apartado 1 se aplicará una semana después de la fecha de la reunión del Comité permanente de la cadena alimentaria y de sanidad animal en la que haya sido declarado el programa referido en el apartado 1, letra a), inciso i).
Artículo 6
Página web de información
1. Los Estados miembros pondrán a disposición de la Comisión y de los demás Estados miembros:
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a) |
una lista de las zonas de confinamiento y de los factores que se han tenido en cuenta para definirlas, con una descripción de sus límites geográficos, conforme a lo dispuesto en el artículo 2, apartado 2; |
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b) |
una lista, con descripción de límites geográficos, de los compartimentos:
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|
c) |
las declaraciones de los programas contemplados en el artículo 5, apartado 2, con descripción de los límites geográficos de la zona pertinente. |
2. La información prevista en el apartado 1 se mantendrá actualizada y se pondrá a disposición a través de las páginas web de información creadas conforme al artículo 10 de la Decisión 2009/177/CE.
Artículo 7
Elaboración de informes
A más tardar el 1 de octubre de 2010, los Estados miembros presentarán un informe a la Comisión sobre los programas declarados de conformidad con el artículo 5, apartado 2.
El informe se elaborará conforme al modelo establecido en el anexo VI de la Decisión 2009/177/CE.
Artículo 8
Entrada en vigor y aplicación
El presente Reglamento entrará en vigor el tercer día siguiente al de su publicación en el Diario Oficial de la Unión Europea.
Será aplicable del 15 de marzo al 31 de diciembre de 2010.
El presente Reglamento será obligatorio en todos sus elementos y directamente aplicable en cada Estado miembro.
Hecho en Bruselas, el 2 de marzo de 2010.
Por la Comisión
El Presidente
José Manuel BARROSO
(1) DO L 328 de 24.11.2006, p. 14.
(2) DO L 337 de 16.12.2008, p. 41.
(3) DO L 63 de 7.3.2009, p. 15.
(4) DO L 139 de 30.4.2004, p. 55.
ANEXO I
PARTE A
Muestreo
1. Muestreo a efectos de lo dispuesto en el artículo 2
Las muestras contempladas en el artículo 2 consistirán en al menos doce individuos de ostiones Crassostrea gigas. Para ello se seleccionarán y recogerán animales débiles, abiertos o que acaben de morir (no descompuestos) del compartimento donde se observe la mortalidad.
2. Muestreo a efectos de lo dispuesto en el artículo 3, apartado2, letra b), artículo 5, apartado 1, letra b), y artículo 5, apartado 2
|
a) |
el muestreo a efectos de lo dispuesto en el artículo 3, apartado 2, letra b), consistirá:
Al seleccionar a estos animales, todas las partes de la partida deberán quedar proporcionalmente representadas en la muestra. Si están presentes animales débiles, abiertos o que acaben de morir (no descompuestos), estos se seleccionarán de manera prioritaria; |
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b) |
el muestreo a efectos de lo dispuesto en el artículo 5, apartado 2, consistirá en al menos 150 individuos de Crassostrea gigas por cada punto de muestreo. Se muestrearán todas las explotaciones o zonas de cría de moluscos del Estado miembro o compartimento cubierto por el programa. El muestreo a efectos del artículo 5, apartado 1, letra b), consistirá en al menos 150 individuos de Crassostrea gigas por cada compartimento. Al seleccionar estos animales se tendrán en cuenta los siguientes criterios:
|
|
c) |
el muestreo previsto en el artículo 5, apartado 2, se hará en el período del año para el que se conozca la máxima prevalencia del OsHV-1 μvar en el Estado miembro o compartimento. Cuando no se disponga de estos datos, el muestreo se llevará a cabo inmediatamente después del período en el que la temperatura del agua supere los 16 °C o en el momento en que la temperatura suela alcanzar su máximo anual; |
|
d) |
el muestreo previsto en el artículo 5, apartado 1, letra b), se hará preferiblemente en el período del año descrito en la letra c). Si las muestras se recogen fuera de ese período, los ostiones muestreados deberán mantenerse, antes de los ensayos, en condiciones equivalentes a las descritas en la letra c) durante un período adecuado para la detección del OsHV-1 μvar. |
PARTE B
Métodos de diagnóstico para la detección del OsHV-1 μvar
1. Ámbito de aplicación
El presente procedimiento describe un método estándar de diagnóstico que ha de usarse para la detección e identificación del OsHV-1 μvar mediante reacción en cadena de la polimerasa (en lo sucesivo, «RCP»). Dicho método permite la distinción entre el OsHV-1 y el OsHV-1 μvar.
Los laboratorios pueden modificar los métodos descritos en el presente anexo cuando así convenga para optimizar las condiciones de reacción y adaptarse al equipo y las condiciones de que dispongan, siempre que pueda demostrarse que se obtienen idénticas sensibilidad y especificidad.
2. Definición
En el artículo 1 del presente Reglamento se define el OsHV-1 μvar.
3. Equipo y condiciones ambientales
La prueba de diagnóstico utilizada para la detección e identificación del OsHV-1 μvar mediante RCP exige el equipo y las condiciones ambientales habituales para las pruebas con RCP, a saber:
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— |
una campana cerrada equipada con un sistema de producción de rayos ultravioleta para eliminar posibles contaminaciones al preparar la mezcla de RCP, |
|
— |
dos juegos completos de pipetas (2 μl, 20 μl, 200 μl y 1 000 μl); el primero para la extracción del ADN y el segundo para la preparación de la mezcla de RCP, |
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— |
tres pipetas diferentes: una pipeta (2 μl) para distribuir las muestras en la mezcla de RCP, una pipeta (20 μl) para añadir el bromuro de etidio (BE) y otra pipeta (20 μl) para transferir los productos de RCP a los geles de azarosa, |
|
— |
puntas de pipeta con filtro (2 μl, 20 μl, 200 μl y 1 000 μl) para la extracción de ADN, la preparación de mezcla de RCP y la distribución de las muestras, |
|
— |
puntas de pipeta (20 μl) para recoger el BE y transferir los productos de amplificación al gel de azarosa, |
|
— |
un termociclador para efectuar amplificaciones, |
|
— |
un sistema de electroforesis horizontal para la electroforesis de los productos de RCP, |
|
— |
un dispositivo de UV para observar los productos de RCP después de la electroforesis en gel de azarosa, |
|
— |
un sistema para obtener imágenes de los geles. |
El manipulador debe llevar bata de laboratorio y guantes durante todas las fases que se describen a continuación. Preferiblemente, la bata y los guantes deben cambiarse tras cada paso principal: Extracción de ADN, preparación de la mezcla de RCP, distribución de las muestras, amplificación y transferencia al gel.
Se recomienda llevar a cabo estas fases en diferentes salas. En particular, la amplificación y la transferencia al gel/la electroforesis deberían efectuarse en una sala separada de la extracción del ADN, la preparación de la mezcla de RCP y la distribución del ADN.
4. Procedimiento
4.1. Preparación de las muestras
Se tratan para la extracción de ADN los ostiones vivos o que acaben de morir (no descompuestos), que pueden congelarse previamente.
Las muestras se tratan de modos diferentes según su tamaño:
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a) |
con las larvas se hacen grupos de 50 mg de animales enteros (con concha), que se completan con 200 μl de agua destilada, se trituran y se centrifugan a 1 000 G durante 1 minuto; |
|
b) |
con las semillas de tamaño inferior o igual a 6 mm se hacen grupos de 300 mg de animales enteros (con concha), que se completan con 1 200 μl de agua destilada, se trituran y se centrifugan a 1 000 G durante 1 minuto; |
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c) |
en el caso de las semillas de tamaño comprendido entre 6 y 15 mm, se trituran individualmente todos los tejidos blandos de cada animal; |
|
d) |
en el caso de los animales de más 15 mm, se aíslan pedazos de las branquias y del manto. |
La extracción del ADN se efectúa utilizando el kit QIAamp® DNA Mini Kit (QIAGEN) y siguiendo las instrucciones del protocolo de ensayo con tejidos.
La preparación ulterior de la muestra se lleva a cabo en el orden siguiente:
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1. |
Poner 100 μl del sobrenadante, en el caso de las muestras contempladas en las letras a) y b), o entre 10 y 50 mg de tejidos, en el caso de las muestras de las letras c) y d), en un tubo de microcentrifugación de 1,5 ml, y añadir 180 μl de tampón ATL. |
|
2. |
Añadir 20 μl de proteinasa K, mezclar con agitador vortex e incubar a 56 °C hasta que el tejido quede completamente lisado (hasta el día siguiente). Agitar con vortex ocasionalmente durante la incubación para dispersar la muestra. Centrifugar brevemente el tubo de microcentrifugación de 1,5 ml para retirar las gotas de la tapa. |
|
3. |
Añadir 200 μl de tampón AL a la muestra, mezclar con agitador vortex con sacudidas durante 15 s e incubar a 70 °C durante 10 minutos. Centrifugar brevemente el tubo de microcentrifugación de 1,5 ml para retirar las gotas de la tapa. |
|
4. |
Añadir 200 μl de etanol (96-100 %) a la muestra y mezclar con agitador vortex con sacudidas durante 15 s. Centrifugar brevemente el tubo de microcentrifugación de 1,5 ml para retirar las gotas de la tapa. |
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5. |
Aplicar cuidadosamente la mezcla del paso 4 a la columna QIAamp (en un tubo de recogida de 2 ml) sin mojar el borde. Cerrar el tapón y centrifugar a 10 000 rpm durante 1 min. Poner la columna de centrifugación QIAamp en un tubo de recogida limpio de 2 ml (suministrado en el kit) y desechar el tubo que contiene el filtrado. |
|
6. |
Abrir con cuidado la columna de centrifugación QIAamp y añadir 500 μl de tampón AW1 sin mojar el borde. Cerrar el tapón y centrifugar a 10 000 rpm durante 1 min. Poner la columna de centrifugación QIAamp en un tubo de recogida limpio de 2 ml (suministrado en el kit) y desechar el tubo de recogida que contiene el filtrado. |
|
7. |
Abrir con cuidado la columna de centrifugación QIAamp y añadir 500 μl de tampón AW2 sin mojar el borde. Cerrar el tapón y centrifugar a toda velocidad (14 000 rpm) durante 3 min. |
|
8. |
(Optativo) Poner la columna de centrifugación QIAamp en un tubo de recogida nuevo de 2 ml (no suministrado en el kit) y desechar el tubo de recogida que contiene el filtrado. Centrifugar a toda velocidad (14 000 rpm) durante 1 min. |
|
9. |
Poner la columna de centrifugación QIAamp en un tubo de microcentrifugación limpio de 1,5 ml (no suministrado en el kit) y desechar el tubo de recogida que contiene el filtrado. Abrir con cuidado la columna de centrifugación QIAamp y añadir 100 μl de agua destilada. Incubar 5 minutos a temperatura ambiente y centrifugar a 10 000 rpm durante 1 min. |
|
10. |
Controlar la calidad y la eficacia de la extracción [por ejemplo, midiendo la DO (260 nm) bajo el espectrofotómetro o tras la electroforesis en gel de agarosa]. |
|
11. |
Preparar la dilución de las muestras para tener una concentración final de ADN de 50-100 ng/μl. |
|
12. |
Las soluciones de ADN se guardan a 4 °C hasta que se efectúen los análisis por RCP. |
Para las extracciones del ADN pueden usarse otros kits comerciales, siempre que se haya demostrado que dan resultados similares.
4.2. Reacción en cadena de la polimerasa (RCP)
4.2.1. Reactivos
|
— |
Tampón 10 X (suministrado con la Taq ADN polimerasa) |
|
— |
MgCl2 (suministrado con la Taq ADN polimerasa) (25 mM) |
|
— |
Taq ADN polimerasa (Goldstar, Eurogentec) 5 U/μl |
|
— |
dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTT) Master Mix (20 mM), diluido diez veces (a 2 mM) antes de su uso |
|
— |
dH2O (H2O destilada libre de ADN y ARN) |
4.2.2. Cebadores
Deberán utilizarse los siguientes cebadores (1):
|
|
CF (10 μM) |
|
|
CR (10 μM) |
4.2.3. Mezcla de RCP
La mezcla de RCP para cada tubo será:
|
|
Volumen por tubo |
Concentración final |
|
Tampón (10 X) |
5 μl |
1X |
|
MgCl2 (25 mM) |
5 μl |
2,5 mM |
|
dNTP (2 mM) |
5 μl |
0,2 mM |
|
CF (10 μM) |
1 μl |
0,2 μM |
|
CR (10 μM) |
1 μl |
0,2 μM |
|
Taq polimerasa (5 U/μl) |
0,5 μl |
2,5 U |
|
dH2O |
31,5 μl |
|
|
— |
En cada tubo de RCP se ponen 49 μl de esta mezcla de RCP. |
|
— |
A cada tubo se añade 1 μl de ADN extraído (50-100 ng/μl). |
4.2.4. Controles
Se utilizan dos tipos de control:
|
— |
Los controles negativos consisten en dH2O (1 μl por 49 μl de mezcla de RCP). Tienen por objeto detectar una posible contaminación reactiva del entorno de trabajo. Debería incluirse un control negativo por cada diez muestras o después de cada lote de muestras. |
|
— |
Los controles positivos consisten en ADN plasmídico que contiene la región objetivo del genoma CF-CR del OsHV-1. Su objetivo es comprobar la eficacia de la reacción de la RCP. Debería incluirse un control positivo por cada análisis por RCP. El Laboratorio Comunitario de Referencia puede facilitar los controles positivos. |
4.2.5. Amplificación
Los ciclos de amplificación se llevan a cabo en el termociclador.
|
— |
Desnaturalización inicial: 2 min a 94 °C. |
|
— |
Amplificación: 35 ciclos (1 min a 94 °C, 1 min a 50 °C y 1 min a 72 °C). |
|
— |
Elongación final: 5 min a 72 °C. |
4.3. Electroforesis
4.3.1. Reactivos
|
— |
50 X TAE (puede comprarse listo para usar):
|
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Gel de agarosa 2,5 % en 1X TAE Bromuro de etidio (0,5 μg/ml) añadido después de enfriar el gel. |
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Colorante azul para carga:
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Marcador de peso molecular: SmartLadder SF (Eurogentec): un marcador de peso molecular listo para usar, con nueve bandas a intervalos regulares de 100 a 1 000 pb. |
4.3.2. Preparación del gel de agarosa
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1. |
Pesar 2,5 g de agarosa, añadir 100 ml de 1X TAE y calentar hasta que se funda la mezcla. |
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2. |
Tras enfriar la solución, añadir bromuro de etidio (5 μl para 100 ml de gel de agarosa) y poner la solución en un molde específico equipado con peines (para formar ranuras). |
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3. |
Cuando el gel se polimeriza, se retiran los peines y el gel se dispone en un sistema de electroforesis horizontal que contiene 1X TAE suficiente para cubrir el gel de agarosa. |
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4. |
Mezclar 10 μl de productos de RCP con 2 μl de colorante azul (6X) y disponer en las ranuras. |
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5. |
Reservar una ranura para el marcador de peso molecular (5 μl). |
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6. |
Aplicar un voltaje de 50 a 150 voltios durante entre 30 min y 1 hora, dependiendo del tamaño y grosor del gel. |
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7. |
Observar el gel con UV. |
4.4. Interpretación
La presencia del OsHV-1 μvar en una muestra queda indicada por la presencia de una banda del tamaño apropiado (157 pb en lugar de 173 pb para el OsHV-1) en un gel de agarosa al 2,5 % con resultado negativo de todos los controles negativos y resultado positivo de todos los controles positivos.
PARTE C
Definición de la zona de confinamiento
A la hora de definir la zona de confinamiento con arreglo al artículo 2, apartado 2, se tendrán en cuenta los siguientes factores que influyen en el riesgo de propagación de la enfermedad:
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a) |
número, porcentaje y distribución de los moluscos en la explotación o zona de cría de moluscos infectada; |
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b) |
distancia y densidad de las explotaciones o zonas de cría vecinas; |
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c) |
proximidad a centros de transformación; contacto con otras explotaciones o zonas de cría de moluscos; |
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d) |
especies presentes en las explotaciones o zonas de crías de moluscos; |
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e) |
prácticas de cría aplicadas en las explotaciones o zonas de cría de moluscos afectadas y vecinas, y |
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f) |
condiciones hidrodinámicas y otros factores de importancia epizootiológica. |
(1) Estos cebadores o sus descripciones pueden obtenerse del Laboratorio Comunitario de Referencia para las enfermedades de los moluscos (LGP-Ifremer, av. de Mus de Loup, 17390 La Tremblade, Francia).
ANEXO II
Modelo de certificado zoosanitario para la comercialización de ostiones Crassostrea gigas destinados a zonas de cría y de reinstalación
