31975L0084

SEXTA DIRECTIVA DE LA COMISIÓN

de 20 de diciembre de 1974

sobre determinación de métodos de análisis comunitarios para el control oficial de la alimentación animal

( 75/84/CEE )

LA COMISIÓN DE LAS COMUNIDADES EUROPEAS ,

Visto el Tratado constitutivo de la Comunidad Económica Europea ,

Vista la Directiva del Consejo , de 20 de julio de 1970 , referente a la introducción de modos de toma de muestras y de métodos de análisis comunitarios para el control oficial de la alimentación animal (1) , modificada en último lugar , por el Acta (2) adjunta al Tratado relativo a la adhesión de nuevos Estados miembros a la Comunidad Económica Europea y a la Comunidad Europea de la Energía Atómica (3) firmado en Bruselas el 22 de enero de 1972 y , en particular , su artículo 2 ,

Considerando que la Directiva arriba mencionada prevé que los controles oficiales de la alimentación animal que comprueban el cumplimiento de las condiciones establecidas en virtud de las disposiciones legales , reglamentarias y administrativas referentes a la calidad y la composición de los alimentos para animales , se realicen de acuerdo con los modos de toma de muestras y los métodos de análisis comunitarios ;

Considerando que las Directivas n º 71/250/CEE , n º 71/393/CEE , n º 72/199/CEE , n º 73/46/CEE y n º 74/203/CEE de la Comisión , de los días 15 de junio de 1971 (4) , 18 de noviembre de 1971 (5) , 27 de abril de 1972 (6) , 5 de diciembre de 1972 (7) y 25 de marzo de 1974 (8) , ya han establecido determinado número de métodos de análisis comunitarios ; que , teniendo en cuenta el estado de avance de los trabajos realizados desde entonces , conviene adoptar una sexta serie de métodos ;

Considerando que las medidas previstas en la presente Directiva concuerdan con el dictamen del Comité permanente de la alimentación animal ,

HA ADOPTADO LA PRESENTE DIRECTIVA :

Artículo 1

Los Estados miembros dispondrán que los análisis para los controles oficiales de la alimentación animal , relativos a sus contenidos en buquinolato sulfaquinoxalina y furazolidona , sean realizados de acuerdo con los métodos descritos en el Anexo de la presente Directiva .

Las disposiciones generales que figuran en la primera parte ( introducción ) del Anexo de la presente Directiva n º 71/250/CEE de la Comisión , de 15 de junio de 1971 , excepto la parte referente a la preparación de la muestra por analizar , serán aplicables a los métodos descritos en el Anexo de la presente Directiva .

Artículo 2

Los Estados miembros aplicarán , a más tardar , el 1 de noviembre de 1975 , las disposiciones legales , reglamentarias y administrativas necesarias para cumplir la presente Directiva e informarán de ello inmediatamente a la Comisión .

Artículo 3

Los destinatarios de la presente Directiva serán los Estados miembros .

Hecho en Bruselas , el 20 de diciembre de 1974 .

Por la Comisión

El Presidente

François-Xavier ORTOLI

(1) DO n º L 170 de 3 . 8 . 1970 , p. 2 .

(2) DO n º L 73 de 27 . 3 . 1972 , p. 14 .

(3) DO n º L 73 de 27 . 3 . 1972 , p. 5 .

(4) DO n º L 155 de 12 . 7 . 1971 , p. 13 .

(5) DO n º L 279 de 20 . 12 . 1971 , p. 7 .

(6) DO n º L 123 de 29 . 5 . 1972 , p. 6 .

(7) DO n º L 83 de 30 . 3 . 1973 , p. 21 .

(8) DO n º L 108 de 22 . 4 . 1974 , p. 7 .

ANEXO

1 . DOSIFICACÓN DEL BUQUINOLATO

( etil-4-hidroxi-6,7-diisobutoxi-3-quinoleina carboxilato )

1 . Objeto y ámbito de aplicación

El método permite dosificar el buquinolato en los alimentos , los concentrados y las premezclas . El límite inferior de la dosificación es de 10 ppm . El decoquinato interfiere en la dosificación .

2 . Principio

La muestra se somete a la extracción mediante cloroformo . El extracto se evapora en seco , el residuo se recoge mediante cloroformo y luego se somete la solución a una cromatografía en capa fina . El buquinalato es eluído con etanol y se determina mediante espectrofotofluorimetría por comparación con soluciones patrón .

3 . Reactivos

3.1 . Cloroformo p.a.

3.2 . Etanol de 96 grados ( v/v ) p.a.

3.3 . Mezcla de cloroformo y de etanol : mezclar 10 volúmenes de cloroformo ( 3.1 ) y 1 volumen de etanol ( 3.2 ) .

3.4 . Etanol de 80 grados ( v/v ) p.a.

3.5 . Gel de sílice G para cromatografía en capa fina .

3.6 . Sustancia patrón : buquinolato puro .

3.7 . Soluciones patrón :

3.7.1 . Solución patrón de 0,2 mg de buquinolato por ml : Pesar , con un margen de error máximo de 0,1 mg , 50 mg de sustancia patrón ( 3.6 ) . Disolver con cloroformo ( 3.1 ) en un matraz graduado de 250 ml calentando en baño de agua a 50 ° C . Dejar enfriar hasta temperatura ambiente , completar el volumen con cloroformo ( 3.1 ) y homogeneizar .

3.7.2 . Soluciones patrón de trabajo : tomar , respectivamente , unos volúmenes de 5,0-10,0-15,0-20,0 y 25,0 ml de la solución ( 3.7.1 ) e introducirlos en matraces graduados de 25 ml . Completar el volumen con cloroformo ( 3.1 ) y homogeneizar . Preparar en el momento de su utilización . Dichas soluciones contienen , respectivamente 0,04-0,08-0,12-0,16 y 0,20 mg de buquinolato por ml .

4 . Equipo

4.1 . Frascos cónicos de 50 y 250 ml , con tapón esmerilado .

4.2 . Agitador

4.3 . Centrifugadora , con tubos de 15 ml , con tapón esmerilado .

4.4 . Baño de agua a 50 ° C .

4.5 . Equipo para cromatografía en capa fina .

4.6 . Placas de vidrio para cromatografía en capa fina , 200 por 200 mm , preparadas de la siguiente manera : extender uniformemente sobre las placas una capa de 0,5 mm de espesor de gel de sílice G ( 3.5 ) y dejar secar al aire durante 15 minutos . Luego , mantener las placas durante 2 horas en la estufa ( 4.11 ) , después trasladarlas a un desecador provisto del gel de sílice deshidratante . Las placas preparadas para su utilización son convenientes en la medida en que dan resultados similares a los de las placas tratadas como arriba se indica .

4.7 . Micropipetas de 0,50 ml .

4.8 . Colector de zonas para cromatografía en capa fina .

4.9 . Lámpara UV de onda corta .

4.10 . Espectrofotofluorímetro dotado de una lámpara Xenon y de dos monocromadores .

4.11 . Estufa dotada de un ventilador y regulada a 100 ° C .

4.12 . Aparato rotativo de evaporación en vacío con matraz de 250 ml .

5 . Modo de operar

5.1 . Preparación de la muestra

Triturar la muestra de manera que pase en su totalidad a través de un tamiz de malla de 1 mm ( conforme a la recomendación ISO R 565 ) .

5.2 . Extracción

Pesar , con un margen de error máximo de 1 mg , una cantidad de muestra dividida y homogeneizada que contenga alrededor de 1,25 mg de buquinolato . Introducir la zona de muestra en un frasco cónico de 250 ml ( 4.1 ) y agregar 100,0 ml de cloroformo ( 3.1 ) . Mezclar , tapar el frasco y agitar con el agitador ( 4.2 ) durante una hora . Dejar decantar , filtrar y eliminar los primeros ml de líquido filtrado .

Introducir 80,0 ml de líquido filtrado limpio en una copa de vidrio de 150 ml o en el matraz del aparato rotativo ( 4.12 ) . Evaporar casi hasta secar en baño de agua ( 4.4 ) , volver a poner el residuo aceitoso , repetidas veces , en unos ml de cloroformo ( 3.1 ) y trasvasar cuantitativamente los líquidos a un matraz graduado de 10 ml , por medio de un embudo de conducto fino . Completar el volumen con cloroformo ( 3.1 ) y homogeneizar . Si la solución no está limpia , centrifugar durante 3 minutos a 3 000 t/m tubo tapado .

5.3 . Cromatografía en capa fina

Depositar puntualmente sobre una placa para cromatografía en capa fina ( 4.6 ) , mediante una micropipetea ( 4.7 ) y a unas distancias respectivas de 2 cm , unos volúmenes de 0,25 ml del extracto obtenido en 5.2 y cinco soluciones patrón de trabajo ( 3.7.2 ) .

Revelar el cromatograma con cloroformo ( 3.1 ) hasta que el frente del disolvente alcance prácticamente el borde superior de la placa , luego secar mediante una corriente de aire . Luego , revelar con la mezcla cloroformo/etanol ( 3.3 ) hasta que el frente del disolvente se haya desplazado alrededor de 12 cm . Dejar evaporar los disolventes . Irradiar el comatograma con la luz UV ( 4.9 ) y delimitar las manchas de buquinolato ( valor Rf : 0,4 a 0,6 ) por medio de una aguja .

5.4 . Elución

Recoger la sílice de cada zona delimitada , por medio de un colector de zonas ( 4.8 ) , en un tubo de centrifugación ( 4.3 ) . Agregar en cada tubo 10,0 ml de etanol ( 3.4 ) , agitar durante 20 minutos , luego , centrifugar durante 5 minutos a 3 000 t/m . Decantar las soluciones limpias en unos frascos cónicos de 50 ml ( 4.1 ) .

5.5 . Medida de la fluorescencia

Regular en 100 la escala del espectrofotofluorímetro ( 4.10 ) por medio del eluido ( 5.4 ) procedente de la solución patrón más concentrada , utilizando para la estimulación la extensión de onda comprendida entre 200 y 280 mm que dan la fluorescencia más intensa y , para la emisión , la extensión de onda de 375 mm .

Medir , en estas condiciones , la intensidad de la fluorescencia de los otros eluidos ( 5.4 ) . Determinar , a partir de los valores encontrados , la cantidad ( A ) de buquinolato en mg contenido en los 10 ml del eluido procedente de la muestra .

6 . Cálculo de resultados

El contenido en mg de buquinolato por kg de muestra se expresa con la fórmula

A/P · 50 000

en la cual :

A - cantidad en mg de buqinolato determinada por la medida espectrofluorimétrica .

P - peso en g de la toma de muestra .

7 . Repetibilidad

La diferencia entre los resultados de dos determinaciones paralelas realizadas sobre la misma muestra no debe sobrepasar :

el 50 % del resultado más elevado para los contenidos en buquinolato comprendidos entre 10 y 20 ppm ;

10 ppm , en valor absoluto , para los contenidos entre 20 y 100 ppm ;

el 10 % del resultado más elevado para los contenidos comprendidos entre 100 y 5 000 ppm ;

500 ppm , en valor absoluto , para los contenidos comprendidos entre 5 000 y 10 000 ppm ;

el 5 % del resultado más elevado para los contenidos superiores a 10 000 ppm .

2 . DOSIFICACIÓN DE LA SULFAQUINOXALINA

( 2-sulfanilamidoquinoxalina )

1 . Objeto y ámbito de aplicación

El método permite dosificar la sulfaquinoxalina en los alimentos , los concentrados y las premezclas . El límite inferior de la dosificación es de 20 ppm . Otras sulfonamidas , así como el ácido arsanílico interfieren en la dosificación .

2 . Principio

La muestra se somete a la extracción mediante la dimetilformamida y el cloroformo . La sulfaquinoxalina se hidroliza en medio alcalino . Después de la neutralización , el derivado aminado que se ha formado , se diazota y acopla a la N-1 naftil ) etilenodiamina . La densidad óptica de la solución se mide en 545 mm .

3 . Reactivos

3.1 . N,N-dimetilformamida p.a.

3.2 . Cloroformo p.a.

3.3 . Etanol absoluto .

3.4 . Lejía alcalina : disolver en agua 10 mg de hidróxido de sodio p.a. y 25 de cloruro de sodio p.a.

Completar los 500 ml con agua y homogeneizar .

3.5 . Acido clorídrico concentrado p.a. ( d = 1,18 ) .

3.6 . Solución de 0,1 % ( p/v ) de nitrito de sodio : disolver en agua 100 mg de nitrito de sodio p.a. , completar los 100 ml con agua y homogeneizar . Preparar inmediatamente antes de su utilización .

3.7 . Solución de 0,5 % ( p/v ) de sulfamato de amonio : disolver en el agua 500 mg de sulfamato de amonio p.a. , completar los 100 ml con agua y homogeneizar . Preparar inmediatamente antes de su utilización .

3.8 . Solución de 0,1 por ciento ( p/v ) de diclorhidrato de N-(1-naftil) etilenodiamina : disolver en ácido clorídrico p.a. de 0,1 % ( v/v ) 100 mg de diclorhidrato de N-(1-naftil) etilenodiamina p.a. , completar los 100 ml con el mismo ácido y homogeneizar . Preparar inmediatamente antes de su utilización .

3.9 . Sustancia patrón : sulfaquinoxalina pura .

3.10 . Solución patrón : pesar , con un margen de error máximo de 0,1 mg , 250 mg de sustancia patrón ( 3.9 ) . Disolver en 50 ml de una solución de hidróxido de sodio ( 25 ml de solución de hidróxido de sodio p.a. 0,1 N + 25 ml de agua ) , completar los 500 ml con agua y homogeneizar . Tomar 5,0 ml de dicha solución y diluir con agua hasta los 100 ml . Un ml de dicha solución contiene 25 microgramos de sulfaquinoxalina .

4 . Equipo

4.1 . Frascos cónicos de 250 ml , de esmerilado normal .

4.2 . Agitador

4.3 . Crisol filtrante , porosidad 3 , diámetro : 80 mm , con frasco en vacío .

4.4 . Ampollas de decantación de 250 ml .

4.5 . Matraces graduados de 50 , 100 , 250 y 500 ml .

4.6 . Tubos de ensayo , 150 mm por 25 mm .

4.7 . Baño de agua hirviendo .

4.8 . Espectrofotómetro , con cubeta de 20 mm de espesor .

5 . Modo de operar

5.1 . Preparación de la muestra

Triturar la muestra de forma que pase en su totalidad por un tamiz de malla de 1 mm ( conforme a la recomendación ISO R 565 ) .

5.2 . Extracción

Pesar , con un margen de error máximo de 1 mg , una cantidad de muestra dividida y homogeneizada que contenga de 0,25 a 1,25 mg de sulfaquinoxalina . Introducir la toma de muestra en un frasco cónico de 250 ml ( 4.1 ) y agregar 20 ml de N,N-dimetilfromamida ( 3.1 ) . Mezclar y calentar durante 20 minutos en baño de agua ( 4.7 ) . Dejar enfriar bajo una corriente de agua fría . Agregar 60 ml de cloroformo ( 3.2 ) , tapar el frasco y agitar durante 30 minutos con el agitador ( 4.2 ) .

Filtrar el líquido en un crisol filtrante ( 4.3 ) aspirando levemente . Enjugar el frasco con cuatro porciones de 5 ml de cloroformo ( 3.2 ) y trasvasar los líquidos al crisol filtrante . Luego , trasvasar el líquido a una ampolla de decantación ( 4.4 ) , enjuagar el frasco con 15 ml de cloroformo ( 3.2 ) aproximadamente , y trasvasar el líquido a la ampolla .

5.3 . Hidrólisis

Agregar en la ampolla 50 ml de lejía alcalina ( 3.4 ) y 5 ml de etanol ( 3.3 ) . Mezclar completamente evitando la formación de emulsión , bien invirtiendo la ampolla unas veinte veces , bien haciéndola girar alrededor del eje horizontal que pasa del cuello al tapón .

Luego dejar reposar hasta la separación de las fases ( generalmente la separación culmina después de 15 minutos aproximadamente ) .

Trasvasar la fase superior ( fase acuosa ) a un matraz graduado de 250 ml ( 4.5 ) . Extraer nuevamente la fase clorofórmica mediante tres porciones de 50 ml de lejía alcalina ( 3.4 ) y trasvasar después de cada extracción el extracto acuoso al matraz graduado . Completar el volumen con agua y homogeneizar .

Introducir 25,0 ml de la solución en un matraz graduado de 50 ml ( 4.5 ) , agregar 5,0 ml de ácido clorídrico ( 3.5 ) , completar el volumen con agua y homogeneizar . Filtrar , si es necesario , y eliminar los 15 primeros ml del líquido filtrado . Introducir 10,0 ml de la solución en dos tubos de ensayo ( 4.6 ) A y B , respectivamente .

5.4 . Revelado de la coloración y medida de la densidad óptica

Agregar en cada tubo , 2,0 ml de solución de nitrito de sodio ( 3.6 ) , agitar y dejar reposar 3 minutos . Agregar 2,0 ml de solución de sulfamato de amonio ( 3.7 ) , agitar y dejar reposar 2 minutos . Luego , agregar 1,0 ml de solución de diclorhidrato de N-(1-naftil) etilenodiamina ( 3.8 ) en el tubo B . Mezclar intensamente el contenido de cada tubo . Unir los tubos a una trompa de agua mediante junturas de caucho y aplicar un pequeño vacío para eliminar el nitrógeno disuelto .

Pasados 10 minutos , medir las densidades ópticas E A y E B de las soluciones en el espectrofotómetro ( 4.8 ) a 545 nm por comparación con el agua . Determinar a partir del valor E A - E B la cantidad ( A ) de sulfaquinoxalina presente en la solución de la muestra con referencia a la curva de contraste ( 5.5 ) establecida previamente .

5.5 . Curva de contraste

Introducir en los matraces graduados de 100 ml ( 4.5 ) , respectivamente , los volúmenes 2,0 - 4,0 - 6,0 - 8,0 y 10,0 ml de la solución patrón ( 3.10 ) correspondientes a 50 , 100 , 150 , 200 y 250 microgramos de sulfaquinoxalina . Agregar 8 ml de ácido clorídrico ( 3.5 ) en cada matraz , completar el volumen con agua y homogeneizar .

Tomar 10,0 ml de cada solución ( 10 que corresponde respectivamente a 5 , 10 , 15 , 20 y 25 microgramos de sulfaquinoxalina ) e introducirlos en tubos de ensayo ( 4.6 ) . Revelar la coloración como se indica en el apartado primero 5.4 . Luego , medir las densidades ópticas a 545 nm por comparación con el agua . Trazar la curva de contraste situando en ordenada los valores de la densidad óptica y en abscisa las correspondientes cantidades de sulfaquinoxalina , en microgramos .

6 . Cálculo de resultados

El contenido en mg de sulfaquinoxalina por kg de muestra se expresa con la fórmula

A/P · 50

en la cual

A = cantidad en microgramos de sulfaquinoxalina , determinada por la medida fotométrica ;

P = peso en gramos de la toma de muestra .

7 . Repetibilidad

La diferencia entre los resultados de dos determinaciones paralelas realizadas sobre la misma muestra no debe sobrepasar :

10 ppm , en valor absoluto , para los contenidos en sulfaquinoxalina comprendidos entre 20 y 100 ppm ;

el 10 % del resultado más elevado para los contenidos comprendidos entre 100 y 5 000 ppm ;

500 ppm , en valor absoluto , para los contenidos comprendidos entre 5 000 y 10 000 ppm ;

el 5 por ciento del resultado más elevado para los contenidos superiores a 10 000 ppm .

3 . DOSIFICACIÓN DE LA FURAZOLIDONA

[ N-(5-nitro-2-furfurilideno)-3-amino-2-oxazolidona ]

1 . Objeto y ámbito de aplicación

El método permite dosificar la furazolidona en los alimentos , los concentrados y las premezclas . El límite inferior de la dosificación es de 10 ppm .

2 . Principio

La furazolidona se extrae por medio de la acetona , una vez realizado el previo desengrasado de la muestra mediante éter de petróleo . El extracto se purifica por cromatografía sobre columna de óxido de aluminio y la furazolidona se eluye con acetona . El eluido se evapora en seco y el residuo se recoge mediante alcohol amílico . La furazolidona se extrae mediante una solución de urea y la densidad óptica del extracto se mide en 375 nm .

3 . Reactivos

3.1 . Acetona p.a.

3.2 . Óxido de aluminio para cromatografía , neutro ,

granulometría : 100 a 240 mallas que se preparan de la siguiente manera : mezclar 500 g de óxido de aluminio con un l de agua destilada caliente y luego decantar el líquido que queda en la superficie . Repetir dos veces dicha operación y luego filtrar por un embudo Buchner . Secar el óxido de aluminio a 105 % ° C hasta el peso constante .

3.3 . Acetato de amilo p.a.

3.4 . Alcohol amílico p.a. ( son convenientes las mezclas de isómeros ) .

3.5 . Eter de petróleo , eb. 40 - 60 ° C .

3.6 . Solución de urea : mezclar 90 g de urea p.a. con 100 ml de agua , calentar suavemente para que se disuelva por completo .

3.7 . Sustancia patrón : furazolidona pura .

3.8 . Solución patrón : pesar , con un margen de error máximo de 0,1 mg , 25 mg de sustancia patrón ( 3.7 ) . Disolver con la acetona ( 3.1 ) en un matraz graduado de 250 ml ( 4.1 ) , completar el volumen con acetona ( 3.1 ) y homogeneizar . Un ml de dicha solución contiene 100 microgramos de furazolidona .

4 . Equipo

4.1 . Matraces graduados de vidrio pardo , 100 y 250 ml .

4.2 . Ampollas de decantación de vidrio pardo , 100 ml .

4.3 . Aparatos de extracción , por ej. : Soxhlet o Twisselmann .

4.4 . Cartuchos de extracción , 25 por 80 mm ó 28 por 100 mm .

4.5 . Tubos de vidrio para cromatografía , diámetro interior : 10 mm ; longitud : 300 mm .

4.6 . Baño de agua hirviendo .

4.7 . Espectrofotómetro con cubetas de 10 mm de espesor .

5 . Modo de operar

NB Todas las operaciones se deben realizar fuera del alcance de la luz directa .

5.1 . Preparación de la muestra

Triturar la muestra de forma que pase en su totalidad por un tamiz de malla de 1 mm ( conforme a la recomendación ISO R 565 ) .

5.2 . Extracción

Pesar , con un margen de error máximo de 1 mg , 5 a 20 g de la muestra dividida y homogeneizada ( que contenga un máximo de 1 mg de furazolidona ) en un cartucho de extracción ( 4.4 ) , colocarla en un aparato de extracción ( 4.3 ) y extraer mediante éter de petróleo ( 3.5 ) . Para el aparato de Soxhlet , se necesitan de 13 a 17 ciclos de disolvente ; para otros aparatos , la duración de la extracción no debe ser inferior a 30 minutos . Luego , retirar el cartucho del aparato , eliminar el residuo de disolvente y secar el cartucho y su contenido mediante una corriente de aire caliente .

Luego , colocar el cartucho y su contenido en un aparato de extracción limpio y extraer con acetona ( 3.1 ) . Para el aparato de Soxhlet , se necesitan , por lo menos , 25 ciclos de disolvente ; para otros aparatos , las condiciones necesarias para la obtención de una extracción completa se deben determinar previamente . Evaporar el extracto acetónico en el baño de agua ( 4.6 ) hasta un volumen de 5 a 10 ml y luego dejar enfriar hasta temperatura ambiente .

5.3 . Cromatografía

Introducir un tapón de lana de vidrio en la extremidad inferior de un tubo para cromatografía ( 4.5 ) y comprimir el tapón mediante una varilla adecuada para obtener un espesor de 2 a 3 mm . Luego preparar una suspensión de óxido de aluminio ( 3.2 ) en la acetona ( 3.1 ) , introducir la suspensión en el tubo y dejar que se deposite . La columna así obtenida debe tener una altura de 200 mm aproximadamente . Dejar que descienda la acetona hasta la superficie superior de la columna .

Trasvasar el extracto acetónico obtenido en 5.2 sobre la columna , enjuagar el frasco varias veces con acetona ( 3.1 ) y trasvasar los líquidos sobre la columna , colocar un frasco adecuado debajo de la columna y eluir la furazolidona con acetona ( 3.1 ) . El volumen total de acetona que se debe utilizar , incluido el volumen que se haya empleado para el enjuague , debe ser de 150 ml aproximadamente .

5.4 . Extracción y medida de la densidad óptica

Evaporar en baño de agua ( 4.6 ) el eluido obtenido en 5.3 hasta que quede seco . ( Ocasionalmente se obtiene una pequeña cantidad de diacetona-alcohol , producida por condensación de la acetona en el óxido de aluminio , que no obstaculiza las extracciones posteriores ) . Disolver el residuo en 10 ml de alcohol amílico ( 3.4 ) y trasvasar la solución a una ampolla de decantación ( 4.2 ) . Enjuagar el frasco sucesivamente , con 10 ml de acetato de amilo ( 3.3 ) y 10 ml de solución de urea ( 3.6 ) , trasvasar dichas soluciones a la ampolla de decantación y agitar enérgicamente durante 2 minutos .

Dejar reposar durante 3 ó 4 minutos y luego recoger la fase acuosa en un matraz graduado de 100 ml ( 4.1 ) . Repetir el enjuague y la extracción mediante cuatro porciones de 10 ml de solución de urea ( 3.6 ) y , cada vez , recoger la fase acuosa en el matraz graduado . Completar 100 ml del contenido del matraz con la solución de urea ( 3.6 ) y homogeneizar . Medir la densidad óptica de la solución en el espectrofotómetro ( 4.7 ) en 375 nm por comparación con la solución de urea ( 3.6 ) . Determinar la cantidad de furazolidona con referencia a la curva de contraste ( 5.5 ) .

5.5 . Curva de contraste

Preparar cuatro columnas cromatográficas de acuerdo con el modo de operar indicado en el primer apartado de 5.3 . Introducir con la pipeta , en las columnas , respectivamente , unos volúmenes de 2,5 - 5,0 - 7,5 - y 10,00 ml de la solución patrón ( 3.8 ) . Eluír cada columna con 150 ml de acetona ( 3.1 ) y proseguir el modo de operar como se indica en 5.4 . Trazar la curva de contraste situando en ordenada los valores de la densidad óptica y en abscisa las correspondientes cantidades de furazolidona en microgramos .

6 . Cálculo de resultados

El contenido en mg de furazolidona por kg de muestra se expresa con la fórmula

A/P

en la cual :

A = cantidad en microgramos de furazolidano determinada por la medida fotométrica ,

P = peso en gramos de la toma de muestra .

7 . Repetibilidad

La diferencia entre los resultados de dos determinaciones paralelas realizadas sobre la misma muestra no debe sobrepasar :

el 50 % del resultado más elevado para los contenidos en furazolidona comprendidos entre 10 y 20 ppm ;

10 ppm , en valor absoluto , para los contenidos comprendidos entre 20 y 100 ppm ;

el 10 % del resultado más elevado para los contenidos comprendidos entre 100 y 5 000 ppm ;

500 ppm , en valor absoluto , para los contenidos comprendidos entre 5 000 y 10 000 ppm ;

el 5 % del resultado más elevado para los contenidos superiores a 10 000 ppm .