31975L0084

ΕΚΤΗ ΟΔΗΓΙΑ ΤΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗΣ της 20ής Δεκεμβρίου 1974 περί καθορισμού των κοινοτικών μεθόδων αναλύσεων για τον επίσημο έλεγχο των ζωοτροφών

Η ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΤΩΝ ΕΥΡΩΠΑΪΚΩΝ ΚΟΙΝΟΤΗΤΩΝ,

Έχοντας υπόψη:

τη συνθήκη περί ιδρύσεως της Ευρωπαϊκής Οικονομικής Κοινότητος,

την οδηγία του Συμβουλίου της 20ής Ιουλίου 1970 περί εισαγωγής μεθόδων λήψεως δειγμάτων και κοινοτικών μεθόδων αναλύσεως για τον επίσημο έλεγχο των ζωοτροφών(1), όπως τροποποιήθηκε τελευταία από την πράξη(2) τη συνημμένη στη συνθήκη προσχωρήσεως νέων Κρατών Μελών στην Ευρωπαϊκή Οικονομική Κοινότητα και στην Ευρωπαϊκή Κοινότητα Ατομικής Ενεργείας(3), που υπεγράφη στις Βρυξέλλες, την 22αΙανουαρίου 1972, και ιδίως το άρθρο 2,

Εκτιμώντας:

ότι η ανωτέρω οδηγία προβλέπει, ότι ο επίσημος έλεγχος των ζωοτροφών, για να διαπιστωθεί εάν οι προδιαγεγγραμμένοι όροι, δυνάμει νομοθετικών, κανονιστικών ή διοικητικών διατάξεων που αφορούν την ποιότητα και τη σύνθεση των ζωοτροφών τηρούνται, διεξάγεται σύμφωνα με τις μεθόδους λήψεως δειγμάτων και τις κοινοτικές μεθόδους αναλύσεως-

ότι οι οδηγίες αριθ. 71/250/ΕΟΚ, αριθ. 71/393/ΕΟΚ, αριθ. 72/199/ΕΟΚ, αριθ. 73/46/ΕΟΚ, αριθ. 74/203/ΕΟΚ της Επιτροπής της 15ης Ιουνίου 1971(4), της 18ης Νοεμβρίου 1971(5), της 27ης Απριλίου 1972(6), της 5ης Δεκεμβρίου 1972(7) και της 25ης Μαρτίου 1974(8), έχουν ήδη καθορίσει έναν ορισμένο αριθμό κοινοτικών μεθόδων αναλύσεως- ότι, λαμβανομένης υπόψη της προόδου των εργασιών που μέχρι τότε έχουν πραγματοποιηθεί, αρμόζει να εκδοθεί έκτη σειρά μεθόδων-

ότι τα μέτρα που προβλέπονται στην παρούσα οδηγία είναι σύμφωνα με τη γνώμη της Μονίμου Επιτροπής Ζωοτροφών,

ΕΞΕΔΩΣΕ ΤΗΝ ΠΑΡΟΥΣΑ ΟΔΗΓΙΑ:

Άρθρο 1

Τα Κράτη Μέλη ορίζουν να γίνονται οι αναλύσεις για τον επίσημο έλεγχο των ζωοτροφών, όσον αφορά την περιεκτικότητά τους σε βουκινολαϊκό, σουλφακινοξαλίνη και φουραζολιδόνη, σύμφωνα με τις μεθόδους που περιγράφονται στο παράρτημα της παρούσας οδηγίας.

Οι γενικές διατάξεις που αναγράφονται στο μέρος 1 (εισαγωγή) του παραρτήματος της πρώτης οδηγίας αριθ. 71/250/ΕΟΚ της Επιτροπής της 15ης Ιουνίου 1971, εκτός του μέρους που αφορά την προπαρασκευή του δείγματος για ανάλυση, εφαρμόζονται στις μεθόδους που περιγράφονται στο παράρτημα της παρούσας οδηγίας.

Άρθρο 2

Τα Κράτη Μέλη θέτουν σε ισχύ, το αργότερο μέχρι την 1η Νοεμβρίου 1975, τις αναγκαίες νομοθετικές, κανονιστικές ή διοικητικές διατάξεις για τη συμμόρφωσή τους με τις διατάξεις της παρούσας οδηγίας. Ενημερώνουν γι' αυτό αμέσως την Επιτροπή.

Άρθρο 3

Η παρούσα οδηγία απευθύνεται στα Κράτη Μέλη.

Έγινε στις Βρυξέλλες, στις 20 Δεκεμβρίου 1974.

Για την Επιτροπή

Ο Πρόεδρος

Francois-Xavier ORTOLI

(1) ΕΕ αριθ. Ν 170 της 3.8.1970, σ. 2.

(2) ΕΕ αριθ. Ν 73 της 27.3.1972, σ. 14.

(3) ΕΕ αριθ. Ν 73 της 27.3.1972, σ. 5.

(4) ΕΕ αριθ. Ν 155 της 12.7.1971, σ. 13.

(5) ΕΕ αριθ. Ν 279 της 20.12.1971, σ. 7.

(6) ΕΕ αριθ. Ν 123 της 29.5.1972, σ. 6.

(7) ΕΕ αριθ. Ν 83 της 30.3.1973, σ. 21.

(8) ΕΕ αριθ. Ν 108 της 22.4.1974, σ. 7.

ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ

I. ΠΟΣΟΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΟΥ ΒΟΥΚΙΝΟΛΑΪΚΟΥ (BUQUINOLATE) (καρβοξυλική αιθυλο-4-υδροξυ-6,7-δισοβουτοξυ-3-κινολεΐνη) 1. Αντικείμενο και τομέας εφαρμογής

Η μέθοδος επιτρέπει τον ποσοτικό προσδιορισμό του βουκινολαϊκού στις ζωοτροφές, στις συμπεκυκνωμένες ζωοτροφές και στα προμείγματα. Το κατώτερο όριο της ποσοτικής αναλύσεως είναι της τάξεως των 10 ppm. Το δεκοκιναϊκό (decoquinate) υπεισέρχεται στη μέθοδο αναλύσεως.

2. Αρχή

Το δείγμα εκχυλίζεται με χλωροφόρμιο. Το εκχύλισμα εξατμίζεται χωρίς να μείνει μέρος υγρού, το υπόλειμμα παραλαμβάνεται με χλωροφόρμιο και το διάλυμα χρησιμοποιείται σε χρωματογραφία λεπτής στιβάδος. Το βουκινολαϊκό παραλαμβάνεται με αιθανόλη και ανιχνεύεται με φασματοφωτομετρική μέθοδο φθορισμού, συγκριτικά με διαλύματα γνωστής περιεκτικότητος (πρότυπα).

3. Αντιδραστήρια

3.1. Χλωροφόρμιο για χημικές αναλύσεις (pro analysi).

3.2. Αιθανόλη 96% (0/0) για χημικές αναλύσεις (pro analysi).

3.3. Μείγμα χλωροφορμίου και αιθανόλης: αναμιγνύουμε 10 μέρη όγκου χλωροφορμίου (3.1) και 1 μέρος όγκου αιθανόλης (3.2).

3.4. Αιθανόλη 80% (0/0) για χημικές αναλύσεις (pro analysi).

3.5. Sillica gel G, για χρωματογραφία σε λεπτή στιβάδα.

3.6. Ουσία γνωστής περιεκτικότητος: καθαρό βουκινολαϊκό.

3.7. Διαλύματα γνωστής περιεκτικότητας (πρότυπα):

3.7.1. Διάλυμα γνωστής περιεκτικότητος βουκινολαϊκού 0,2 mg/ml: Ζυγίζουμε 50 mg με ακρίβεια 0,1 mg της ουσίας γνωστής περιεκτικότητας (3.6). Διαλύουμε σε χλωροφόρμιο (3.1) εντός ογκομετρικής φιάλης των 250 ml θερμαίνοντας εντός υδρολούτρου εις 50oC. Το διάλυμα αφίεται να κρυώσει σε θερμοκρασία δωματίου, συμπληρώνεται σε όγκο με χλωροφόρμιο (3.1) και αναμειγνύεται καλώς.

3.7.2. Πρότυπα διαλύματα εργασίας: Παραλαμβάνουμε όγκους αντίστοιχα 5, 10, 15, 20, και 25 ml του διαλύματος (3.7.1) και τοποθετούμε αυτούς εντός ογκομετρικών φιαλών των 25 ml. Ο όγκος συμπληρούται, μέχρι χαραγής, με χλωροφόρμιο (3.1) και αναμειγνύεται καλώς. Τα διαλύματα αυτά παρασκευάζονται αμέσως πριν από τη χρήση τους. Περιέχουν αντίστοιχα 0,04, 0,08, 0,12, 0,16 και 0,20 mg βουκινολαϊκού ανά ml.

4. Εργαστηριακός εξοπλισμός

4.1. Κωνικές φιάλες των 50 και 250 ml με εσμυρισμένα πώματα.

4.2. Ανακινητής.

4.3. Φυγόκεντρος με δοκιμαστικούς σωλήνες των 15 ml εφοδιασμένους με εσμυρισμένα πώματα.

4.4. Υδρόλουτρο εις 50oC.

4.5. Εξοπλισμός για χρωματογραφία λεπτής στιβάδος.

4.6. Υάλινες πλάκες για χρωματογραφία λεπτής στιβάδος, 200x200 mm, οι οποίες προετοιμάζονται ως ακολούθως: Στις πλάκες απλώνεται ομοιόμορφα ένα στρώμα 0,5 mm πάχους, από silica gel G (3.5) και κατόπιν αφήνεται να στεγνώσει επί 15 λεπτά, στον αέρα. Εν συνεχεία, τοποθετούνται επί δίωρο εντός πυριατηρίου ξηράνσεως (4.11) και κατόπιν μεταφέρονται εντός ξηραντήρος, εφοδιασμένου μετά αφυδατωμένης ποσότητος silica gel. Έτοιμες πλάκες δύνανται να χρησιμοποιηθούν, εφ' όσον δίδουν αποτελέσματα παρόμοια εκείνων των πλακών, οι οποίες έχουν υποστεί την ως άνω διαδικασία.

4.7. Μικροσιφώνια των 0,50 ml.

4.8. Συλλέκτης ζωνών για χρωματογραφία λεπτής στιβάδος.

4.9. Λαμπτήρ υπεριωδών ακτίνων, μικρού μήκους κύματος.

4.10. Φασματοφωτόμετρο φθορισμού, εφοδιασμένο με λαμπτήρα xenon και με δύο μονοχρωματιστές (monochromators).

4.11. Πυριατήριο ξηράνσεως μετ εξαεριστήρος και ρυθμισμένο στους 100oC.

4.12. Περιστρεφόμενος εξατμιστής-συμπυκνωτής, για την εξάτμιση υπό κενό, μετά φιάλης των 250 ml.

5. Τρόπος εργασίας

5.1. Προετοιμασία δείγματος

Το δείγμα αλέθεται σε βαθμό ώστε να δύναται εξ ολοκλήρου να περνά από κόσκινο, διαμέτρου οπών 1 mm (σύμφωνα με τις προδιαγραφές του ISO R 565).

5.2. Εκχύλιση

Ζυγίζουμε με ακρίβεια 1 mg, μία ποσότητα δείγματος που έχει λεπτοαλεσθεί και ομοιογενοποιηθεί περιέχουσα 1,25 mg περίπου βουκινολαϊκού. Εισάγουμε το ληφθέν δείγμα σε κωνική φιάλη των 250 ml (4.1) και προσθέτουμε 100 ml χλωροφόρμιο (3.1). Αναμειγνύουμε, πωματίζουμε την φιάλη και ανακινούμε επί 1 περίπου ώρα με τη βοήθεια ανακινητήρος (4.2). Αφήνουμε για καθίζηση, διηθούμε και απορρίπτουμε τα πρώτα ml του διηθήματος.

Μεταφέρουμε 80 ml του καθαρού διηθήματος σε ποτήρι ζέσεως των 150 ml ή σε φιάλη του περιστρεφόμενου εξατμιστού-συμπυκνωτού (4.12). Εξατμίζουμε σχεδόν μέχρι ξηρού σε υδρόλουτρο (4.4), και το ελαιώδες ίζημα διαλύεται με επανειλημμένες χρήσεις μερικών millilitres χλωροφορμίου (3.1). Ακολουθεί ποσοτική μεταφορά των υγρών σε ογκομετρική φιάλη των 10 ml χρησιμοποιώντας χωνί με λεπτό αυχένα. Συμπληρώνουμε σε όγκο με χλωροφόρμιο (3.1) και αναμειγνύουμε. Αν το διάλυμα δεν είναι διαφανές, φυγοκεντρούμε επί 3 λεπτά σε 3 000 στροφές/λεπτό σε πωματισμένο σωλήνα.

5.3 Χρωματογραφία λεπτής στιβάδος

Τοποθετούμε με ακρίβεια, σε πλάκα κατάλληλη για χρωματογραφία λεπτής στιβάδας (4.6) με τη βοήθεια μικροσιφωνίου (4.7) και σε απόσταση 2 cm σταγόνες των 0,25 ml του εκχυλίσματος του ληφθέντος στο 5.2 και από τα πέντε πρότυπα διαλύματα εργασίας (3.7.2).

Ακολουθεί εμφάνιση του χρωματογραφήματος με χλωροφόρμιο (3.1) μέχρις ότου το μέτωπο του διαλύτου φθάσει πρακτικά το ανώτερο άκρο της πλακός, εν συνεχεία δε ξηραίνουμε με τη βοήθεια ρεύματος αέρος. Εμφανίζεται εν συνεχεία με μείγμα χλωροφορμίου/αιθανόλης (3.3), μέχρις ότου το μέτωπο του διαλύτου έχει διανύσει περί τα 12 εκατοστά. Αφήνουμε να εξατμισθούν οι διαλύτες. Ακτινοβολούμε το χρωματογράφημα με υπεριώδες φως (4.9) και καθορίζουμε τα όρια των κηλίδων του βουκινολαϊκού (τιμή Rf: 0,4-0,6), με τη βοήθεια βελόνας.

5.4. Παραλαβή

Παραλαμβάνουμε το silica gel από κάθε σημειωμένη ζώνη με τη βοήθεια ενός συλλέκτη ζωνών (4.8) και την τοποθετούμε σε σωλήνες φυγοκεντρήσεως (4.3). Προσθέτουμε, σε κάθε σωλήνα 10,0 ml αιθανόλης (3.4) ανακινούμε επί 20 λεπτά και φυγοκεντρούμε επί 5 λεπτά σε 3 000 στροφές/λεπτό. Μεταγγίζουμε το καθαρό διάλυμα σε κωνικές φιάλες των 50 ml (4.1).

5.5. Μέτρηση φθορισμού

Ρυθμίζουμε στα 100 την κλίμακα του φασματοφωτομέτρου φθορισμού (4.10) με τη βοήθεια των υγρών εκπλύσεως (5.4), των προερχομένων από το πρότυπο διάλυμα με τη μεγαλύτερη συγκέντρωση, χρησιμοποιούντες, για τη διέγερση, το μήκος κύματος μεταξύ 200 και 280 mm που δίδει τον πλέον έντονο φθορισμό και, για την εκπομπή, το μήκος κύματος των 375 mm.

Μετράμε, με αυτές τις συνθήκες, την ένταση φθορισμού των υγρών εκπλύσεως των άλλων δειγμάτων (5.4). Προσδιορίζουμε, από τις ανευρεθείσες τιμές, την ποσότητα (Α) του βουκινολαϊκού σε mg την αντιστοιχούσα σε 10 ml του παρεληφθέντος δείγματος του προερχομένου από το αρχικό δείγμα.

6. Υπολογισμός των αποτελεσμάτων

Το περιεχόμενο βουκινολαϊκού σε mg/kg δείγματος, δίδεται με τον τύπο:

- 50 000

όπου:

A= ποσότητα βουκινολαϊκού σε mg προσδιορισθείσα με τη φασματομετρική μέθοδο φθορισμού.

P= βάρος σε g του παραληφθέντος δείγματος.

7. Επαναληψιμότητα

Η διαφορά μεταξύ των αποτελεσμάτων δύο παραλλήλων προσδιορισμών που πραγματοποιούνται στο ίδιο δείγμα δέον να μην υπερβαίνει:

το 50% σε σχέση με το μεγαλύτερο αποτέλεσμα, για περιεκτικότητες σε βουκινολαϊκό που κυμαίνονται μεταξύ 10 και 20 ppm-

10 ppm σε απόλυτο τιμή για περιεκτικότητες που κυμαίνονται μεταξύ 20 και 100 ppm-

το 10% σε σχέση με το μεγαλύτερο αποτέλεσμα, για περιεκτικότητες που κυμαίνονται μεταξύ 100 και 5 000 ppm-

500 ppm σε απόλυτο τιμή για περιεκτικότητες που κυμαίνονται μεταξύ 5 000 και 10 000 ppm-

το 5% σε σχέση με το μεγαλύτερο αποτέλεσμα, για περιεκτικότητες ανώτερες των 10 000 ppm.

2. ΠΟΣΟΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΗΣ ΣΟΥΛΦΟΚΙΝΟΞΑΛΙΝΗΣ (SHLPHAQUINOXALINE) (2-σουλφανιλοαμιδοκινοξαλίνη) 1. Αντικείμενο και τομέας εφαρμογής

Η μέθοδος επιτρέπει τον ποσοτικό προσδιορισμό της σουλφοκινοξαλίνης στις ζωοτροφές στις συμπεπυκνωμένες ζωοτροφές και στα προμίγματα. Το κατώτερο όριο της ποσοτικής αναλύσεως είναι της τάξεως των 20 ppm. Άλλα σουλφοναμίδια, όπως και το αρσανιλικό οξύ, υπεισέρχονται στη μέθοδο αναλύσεως.

2. Αρχή

Το δείγμα υποβάλλεται σε εκχύλιση με διμεθυλοφορμαμίδη και χλωροφόρμιο. Η σουλφακινοξαλίνη υδρολύεται σε αλκαλικό διάλυμα. Κατόπιν εξουδετερώσεως, το σχηματιζόμενο αμινοπαραγωγό είναι διαζωτούχο και συνδυάζεται με την Ν-(1-ναφθυλο)αιθυλενοδιαμίνη. Η οπτική πυκνότης του διαλύματος μετράται στα 545 nm.

3. Αντιδραστήρια

3.1. Ν, Ν-διμεθυλοφορμαμίδη, για χημικές αναλύσεις (P.A.).

3.2. Χλωροφόρμιο, για χημικές αναλύσεις (P.A.).

3.3. Απόλυτος αιθανόλη.

3.4. Αλκαλικό διάλυμα: Διαλύουμε σε ύδωρ 10 γρ. υδροξειδίου του νατρίου (P.A.) και 25 γρ. χλωριούχου νατρίου (P.A.). Συμπληρώνουμε έως 500 ml με ύδωρ και αναμειγνύουμε.

3.5. Υδροχλωρικό οξύ πυκνό (P.A.) (πυκνότης d = 1,18).

3.6. Διάλυμα 0,1% (B/O) νιτρώδους νατρίου: Διαλύουμε στο ύδωρ 100 mg νιτρώδους νατρίου (P.A.), συμπληρώνουμε έως τα 100 ml με ύδωρ και αναμειγνύουμε. Παρασκευάζεται αμέσως πριν από τη χρήση.

3.7. Διάλυμα σουλφαμιδικού αμμωνίου 0,5% (B/O): Διαλύουμε σε ύδωρ 500 mg σουλφαμιδικού αμμωνίου (P.A.), συμπληρώνουμε έως τα 100 ml με ύδωρ και αναμειγνύουμε. Παρασκευάζεται αμέσως πριν από τη χρήση.

3.8. Διάλυμα διυδροχλωρικού άλατος της Ν-(1-ναφθυλο)αιθυλενοδιαμίνης 0,1% (B/O): Διαλύουμε εντός υδροχλωρικού οξέος (P.A.) 0,1%(O/O) 100mg του διυδροχλωρικού άλατος της Ν-(1-ναφθυλο)αιθυλενοδιαμίνης (P.A.), συμπληρούμε έως τα 100 ml με το αυτό οξύ και αναμειγνύουμε. Παρασκευάζεται αμέσως πριν από τη χρήση.

3.9. Ουσία γνωστής περιεκτικότητος- καθαρή σουλφακινοξαλίνη.

3.10. Διάλυμα γνωστής περιεκτικότητος: Ζυγίζουμε, με ακρίβεια 0,1 mg, 250 mg της ουσίας γνωστής περιεκτικότητος (3.9). Διαλύουμε σε 50 ml διάλυμα υδροξειδίου του νατρίου (διάλυμα 25 ml υδροξειδίου του νατρίου P.A.-25 ml ύδωρ), συμπληρούμε έως 500 ml με ύδωρ και αναμειγνύουμε. Λαμβάνουμε 5,0 ml από το διάλυμα τούτο και αραιώνουμε στα 100 ml με ύδωρ. 1 ml αυτού του διαλύματος περιέχει 25 μικρογραμμάρια σουλφακινοξαλίνης.

4. Εργαστηριακός εξοπλισμός

4.1. Κωνικές φιάλες των 250 ml (με εσμυρισμένα πώματα).

4.2. Ανακινητής.

4.3. Χοάνη διηθήσεως, πορώδους 3, διάμετρος: 80 mm, με φιάλη κενού.

4.4. Διαχωριστικές φιάλες των 250 ml.

4.5. Ογκομετρικές φιάλες των 50, 100, 250 και 500 ml.

4.6. Δοκιμαστικοί σωλήνες, 150 mmx25 mm.

4.7. Υδρόλουτρο με ζέον ύδωρ.

4.8. Φασματοφωτόμετρο με κυψελίδες πάχους 20 mm.

5. Τρόπος εργασίας

5.1. Προετοιμασία του δείγματος

Το δείγμα αλέθεται σε βαθμό ώστε να δύναται εξ ολοκλήρου να περνά από κόσκινο διαμέτρου οπών 1 mm (σύμφωνα με τις προδιαγραφές του ISO R 565).

5.2. Εκχύλιση

Ζυγίζουμε με ακρίβεια 1 mg μία ποσότητα από το λεπτοαλεσμένο και ομογενοποιημένο δείγμα περιέχουσα 0,25 έως 1,25 mg σουλφακινοξαλίνης. Τοποθετούμε το δείγμα σε κωνική φιάλη των 250 ml (4.1) και προσθέτουμε 20 ml N, Ν-διμεθυλοφορμαμίδης (3.1). Αναμειγνύουμε και θερμαίνουμε 20 λεπτά σε υδρόλουτρο (4.7). Αφήνουμε να κρυώσει σε ψυχρό ρεύμα αέρος. Προσθέτουμε 60 ml χλωροφορμίου (3.2), πωματίζουμε τη φιάλη και ανακινούμε 30 λεπτά με τη βοήθεια ανακινητήρος (4.2).

Διηθούμε το υγρό στη χοάνη διηθήσεως (4.3), σε συνθήκες ηπίας αναρροφήσεως. Ξεπλένουμε τη φιάλη με τέσσερις όγκους των 5 ml χλωροφορμίου (3.2) και κάθε φορά μεταφέρουμε τα υγρά καθαρισμού εντός της χοάνης διηθήσεως. Μεταφέρουμε στη συνέχεια το διήθημα σε διαχωριστική φιάλη (4.4), ξεπλένουμε τη φιάλη 15 ml περίπου χλωροφορμίου (3.2) και μεταφέρουμε το υγρό στη διαχωριστική φιάλη.

5.3. Υδρόλυση

Προσθέτουμε στη διαχωριστική φιάλη 50 ml αλκαλικού διαλύματος (3.4) και 5 ml αιθανόλης (3.3). Αναμειγνύουμε καλώς, αποφεύγοντες τη δημιουργία γαλακτώματος, είτε αναστρέφοντες τη φιάλη είκοσι περίπου φορές, είτε περιστρέφοντες τη φιάλη περί τον άξονά της. Αφήνουμε στη συνέχεια το υγρό να ηρεμήσει, μέχρι τον πλήρη διαχωρισμό των δύο φάσεων (ο διαχωρισμός έχει γίνει πλήρως μετά από 15 λεπτά περίπου).

Μεταφέρουμε την ανώτερη φάση (υδάτινο στρώμα) εντός ογκομετρικής φιάλης των 250 ml (4.5). Εκχυλίζουμε εκ νέου τη χλωροφορμική φάση με τρεις ακόμη όγκους αλκαλικού διαλύματος, των 50 ml κάθε φορά (3.4) και μεταφέρουμε μετά από κάθε εκχύλιση το υδατικό εκχύλισμα στην ογκομετρική φιάλη. Συμπληρώνουμε σε όγκο έως της χαραγής, με ύδωρ και αναμειγνύουμε.

Μεταφέρουμε 25 ml του διαλύματος αυτού εντός ογκομετρικής φιάλης των 50 ml (4.5), προσθέτουμε 5 ml υδροχλωρικού οξέος (3.5), συμπληρώνουμε σε όγκο με ύδωρ έως της χαραγής, και αναμειγνύουμε. Διηθούμε, αν παραστεί ανάγκη, και απομακρύνουμε τα 15 πρώτα ml του διηθήματος. Τοποθετούμε από 10 ml του διαλύματος σε δύο δοκιμαστικούς σωλήνες (4.6), Α και Β.

5.4. Ανάπτυξη χρώματος και μέτρηση της οπτικής πυκνότητος

Προσθέτουμε σε κάθε δοκιμαστικό σωλήνα 2 ml διαλύματος νιτρώδους νατρίου (3.6), ανακινούμε και αφήνουμε να ηρεμήσουν για 3 λεπτά. Προσθέτουμε 2 ml διαλύματος σουλφαμιδικού αμμωνίου (3.7), αφήνουμε να ηρεμήσει για 2 λεπτά. Προσθέτουμε στη συνέχεια 1 ml διαλύματος του υδροχλωρικού άλατος της Ν-(1-ναφθυλο)αιθυλενοδιαμίνης (3.8) στο σωλήνα Α και 1 ml ύδωρ στο σωλήνα Β. Αναμειγνύουμε πολύ καλά το περιεχόμενο κάθε σωλήνα. Συνδέουμε τους σωλήνες με αντλία ύδατος, με τη βοήθεια αρμών από καουτσούκ, και εφαρμόζουμε ένα ελαφρό κενό για να απομακρύνουμε το διαλελυμένο άζωτο.

Μετράμε 10 λεπτά αργότερα τις οπτικές πυκνότητες Ε Α και Ε Β των διαλυμάτων στο φασματοφωτόμετρο (4.8), σε μήκος κύματος 545 nm χρησιμοποιώντας σαν "λευκό" ύδωρ. Βάσει των τιμών Ε Α και Ε Β καθορίζουμε την ποσότητα (Α) της σουλφακινοξαλίνης, η οποία ευρίσκεται στο διάλυμα του δείγματος, λαμβάνοντες υπόψη την καμπύλη βαθμολογήσεως (5.5) που έχει εκ των προτέρων καθορισθεί.

5.5. Καθορισμός καμπύλης βαθμολογήσεως

Τοποθετούμε σε ογκομετρικές φιάλες των 100 ml (4.5) ποσότητες αντιστοίχως 2, 4, 6, 8 και 10 ml του γνωστού διαλύματος (3.10), οι οποίες αντιστοιχούν σε 50, 100, 150, 200 και 250 μικρογραμμάρια σουλφακινοξαλίνης. Προσθέτουμε 8 ml υδροχλωρικού οξέος (3.5) σε εκάστη φιάλη, συμπληρούμε κατόγκο με ύδωρ και ανακινούμε.

Λαμβάνουμε 10 ml από κάθε φιάλη (τούτο αντιστιχεί σε 5,10,15,20 και 25 μικρογραμμάρια σουλφακινοξαλίνης) και τα τοποθετούμε σε δοκιμαστικούς σωλήνες (4.6). Αναπτύσουμε το χρώμα όπως αναφέρεται στο 5.4, πρώτη παράγραφος. Μετράμε στη συνέχεια τις οπτικές πυκνότητες, σε 545 nm χρησιμοποιώντας σαν "λευκό" ύδωρ. Σχηματίζουμε την καμπύλη βαθμολογήσεως, θέτοντες στον άξονα των συντεταγμένων τις τιμές της οπτικής πυκνότητος και στον άξονα των συντετμημένων τις αντιστοιχούσες ποσότητες σουλφακινοξαλίνης σε μικρογραμμάρια.

6. Υπολογισμός των αποτελεσμάτων

Η περιεκτικότητα της σουλφακινοξαλίνης σε mg/kg του δείγματος, δίδεται από τον τύπο:

-50

όπου:

A = ποσότης σε μικρογραμμάρια της σουλφακινοξαλίνης, καθορισθείσα με τη φωτομετρική μέθοδο.

P = βάρος σε γραμμάρια του ληφθέντος δείγματος.

7. Επαναληπτικότης

Η διαφορά στα αποτελέσματα δύο παραλλήλων προσδιορισμών, γενομένων στο αυτό δείγμα, δεν πρέπει να υπερβαίνει:

10 ppm σε απόλυτο τιμή για περιεκτικότητες σουλφακινοξαλίνης περιλαμβανόμενες μεταξύ 20 και 100 ppm-

το 10%, σε σχέση με το μεγαλύτερο αποτέλεσμα για περιεκτικότητες μεταξύ 100 και 5 000 ppm-

500 ppm σε απόλυτο τιμή για περιεκτικότητες μεταξύ 5 000 και 10 000 ppm-

το 5%, σε σχέση με το αποτέλεσμα, για περιεκτικότητες ανώτερες των 10 000 ppm.

3. ΠΟΣΟΤΙΚΟΣ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΦΟΥΡΑΖΟΛΙΔΟΝΗΣ [Ν-(5-νιτρο-2-φουρφουριλιδενο)-3-αμινο-2-οξαζολιδόνη] 1. Αντικείμενο και τομέας εφαρμογής

Η μέθοδος επιτρέπει τον ποσοτικό προσδιορισμό της φουραζολιδόνης στις ζωοτροφές, στις συμπεπυκνωμένες ζωοτροφές και στα προμείγματα. Το κατώτερο όριο της ποσοτικής αναλύσεως είναι της τάξεως των 10 ppm.

2. Αρχή

Η φουραζολιδόνη εκχυλίζεται με ακετόνη μετά από προηγούμενη αφαίρεση των λιπαρών ουσιών του δείγματος με πετρελαϊκό αιθέρα. Το εκχύλισμα κλασματοποιείται με χρωματογραφία κολώνας (στήλης) από οξείδιο του αργιλίου και η φουραζολιδόνη απομακρύνεται με ακετόνη. Το διάλυμα εξατμίζεται μέχρι ξηρού και λαμβάνεται με αμυλική αλκοόλη. Η φουραζολιδόνη εκχυλίζεται με ένα διάλυμα ουρίας και η οπτική πυκνότητα του εκχυλίσματος μετράται σε μήκος κύματος 375 nm.

3. Αντιδραστήρια

3.1. Ακετόνη για χημικές ενώσεις (P.A.).

3.2. Οξείδιο του αργιλίου για χρωματογραφία, ουδέτερο, μεγέθους σωματιδίων, 100 έως 240 mesh, παρασκευαζόμενο ως εξής: αναμειγνύουμε 500 γρ. οξειδίου του αργιλίου σε 11 ύδατος θερμού απεσταγμένου, αφήνουμε να καθιζήσει και μεταγγίζεται το υπερκείμενο υγρό. Επαναλαμβάνουμε δύο φορές την εργασία αυτή και διηθούμε στη συνέχεια σε χοάνη Buchner. Ξηραίνουμε το οξείδιο του αργιλίου στους 105oC μέχρι σταθερού βάρους.

3.3. Οξικό άμυλο για χημικές αναλύσεις (P.A.).

3.4. Αμυλική αλκοόλη P.A. (συνιστώνται τα μείγματα ισομερών).

3.5. Πετρελαϊκός αιθήρ (σημείο βρασμού 40-60oC).

3.6. Διάλυμα ουρίας. Αναμειγνύουμε 90 g ουρίας P.A. σε 100 ml ύδατος, θερμαίνουμε ελαφρώς μέχρι πλήρους διαλύσεως.

3.7. Ουσία γνωστής περιεκτικότητος: φουραζολιδόνη καθαρή.

3.8. Διάλυμα γνωστής περιεκτικότητος: ζυγίζουμε, με ακρίβεια 0,1 mg, 25 mg της γνωστής ουσίας (3.7), διαλύουμε σε ακετόνη (3.1), σε ογκομετρική φιάλη των 250 ml (4.1), συμπληρώνουμε σε όγκο με ακετόνη (3.1) και αναμειγνύουμε. Ένα (1) ml του διαλύματος αυτού περιέχει 100 μικρογραμμάρια φουραζολιδόνης.

4. Εργαστηριακός εξοπλισμός

4.1. Ογκομετρικές φιάλες σκοτεινού χρώματος 100 και 250 ml.

4.2. Διαχωριστικές χοάνες σκοτεινού χρώματος, 100 ml.

4.3. Συσκευή εκχυλίσεως π.χ. Soxhlet ή Twisselmann.

4.4. Φύσιγγες εκχυλίσεως 25x80 mm ή 25x100 mm.

4.5. Στήλες χρωματογραφίας, από ύαλο, εσωτερικής διαμέτρου 10 mm και μήκους 300 mm.

4.6. Υδρόλουτρο με ζέον ύδωρ.

4.7. Φασματοφωτόμετρο με κυψελίδες πάχους 10 mm.

5. Τρόπος εργασίας

Σημείωση: Όλες οι εργασίες πρέπει να διεξάγονται σε χώρους, που προστατεύονται από το απ ευθείας προσπίπτον φως.

5.1. Προετοιμασία του δείγματος

Το δείγμα αλέθεται σε βαθμό ώστε να δύναται εξ ολοκλήρου να περνά από κόσκινο διαμέτρου οπών 1 mm (σύμφωνα με τις προδιαγραφές του ISO R 565).

5.2. Εκχύλιση

Ζυγίζουμε, με ακρίβεια 1 mg, 5 έως 20 g από το λεπτοαλεσμένο και ομογενοποημένο δείγμα (περιέχοντος κατά το μέγιστον 1 mg φουραζολιδόνης), εντός φυσίγγων εκχυλίσεως (4.4). Τοποθετούμε αυτά σε συσκευή εκχυλίσεως και εκχυλίζουμε με πετρελαϊκό αιθέρα (3.5). Για τη συσκευή Soxhlet, 13 έως 17 ανακυκλώσεις του διαλύτου είναι απαραίτητοι. Για τις άλλες συσκευές η διάρκεια της εκχυλίσεως δεν δύναται να είναι κατώτερη των 30 λεπτών. Αποσύρουμε στη συνέχεια τη φύσιγγα εκχυλίσεως από τη συσκευή, απομακρύνουμε το υπόλοιπο του διαλύτου και ξηραίνουμε το δοχείο και το περιεχόμενό του με τη βοήθεια ρεύματος θερμού αέρος.

Τοποθετούμε στη συνέχεια τη φύσιγγα εκχυλίσεως και το περιεχόμενό της σε καθαρή συσκευή εκχυλίσεως και εκχυλίζουμε με ακετόνη (3.1). Για τη συσκευή Soxhlet, 25 ανακυκλώσεις του διαλύτου τουλάχιστον είναι απαραίτητοι. Για τις άλλες συσκευές, οι απαραίτητες συνθήκες για την επίτευξη πλήρους εκχυλίσεως θα πρέπει να τύχουν προηγουμένου προσδιορισμού. Εξατμίζουμε το εκχύλισμα της ακετόνης σε υδρόλουτρο (4.6) μέχρις όγκου 5-10 ml και αφήνουμε να ψυχθεί στη θερμοκρασία του περιβάλλοντος.

5.3. Χρωματογραφία

Θέτουμε πώμα από υαλοβάμβακα στο κατώτερο άκρο μιας στήλης χρωματογραφίας (4.5) και συσσωρεύουμε πιέζοντας με κατάλληλη ράβδο ώστε να επιτύχουμε πάχος 2-3 mm. Παρασκευάζουμε στη συνέχεια αιώρημα οξειδίου του αργιλίου (3.2) με ακετόνη (3.1), τοποθετούμε το αιώρημα στη στήλη και αφήνουμε να καθιζήσει. Η κατά τέτοιο τρόπο παρασκευαζομένη στήλη πρέπει να έχει ύψος 200 mm περίπου. Αφήνουμε να φτάσει η ακετόνη έως την ανώτερη επιφάνεια της στήλης.

Μεταφέρουμε το εκχύλισμα της ακετόνης το παρασκευασθέν σε 5.2 στη στήλη, εκπλύνουμε τη φιάλη με ακετόνη πολλές φορές (3.1) και τοποθετούμε επίσης τα υγρά εκπλύσεως στη στήλη. Τοποθετούμε κατάλληλη φιάλη κάτω από τη στήλη και παραλαμβάνουμε τη φουραζολιδόνη με ακετόνη ((3.1). Ο συνολικός όγκος της χρησιμοποιουμένης ακετόνης, περιλαμβανόμενης και αυτής η οποία χρησιμοποιήθηκε για εκπλύσεις, πρέπει να είναι 150 ml περίπου.

5.4. Εκχύλιση και μέτρηση της οπτικής πυκνότητος

Εξατμίζουμε το εκχύλισμα το ληφθέν σε 5.3 έως ξηρού σε υδρόλουτρο (4.6).(Αναλόγως της περιπτώσεως είναι δυνατό να παραλάβουμε μικρή ποσότητα διακετόνης-αλκοόλης, προϊόν συμπυκνώσεως της ακετόνης στα οξείδια του αργιλίου, η οποία δεν παρεμποδίζει τις περαιτέρω εκχυλίσεις). Διαλύουμε το υπόλειμμα σε 10 ml αμυλικής αλκοόλης (3.4) και μεταφέρουμε το διάλυμα σε διαχωριστική χοάνη (4.2). Εκπλύνουμε τη φιάλη κατ' επανάληψη με 10 ml οξικό άμυλο (3.3) και 10 ml διάλυμα ουρίας (3.6), μεταγγίζουμε τα διαλύματα στη διαχωριστική χοάνη και ανακινούμε ισχυρά επί δύο λεπτά.

Αφήνουμε να ηρεμήσει 3-4 λεπτά και παραλαμβάνουμε στη συνέχεια την υδατική φάση σε ογκομετρική φιάλη των 100 ml (4.1). Επαναλαμβάνουμε την έκπλυση και την εκχύλιση τέσσερις φορές, με 10 ml κάθε φορά, από διάλυμα ουρίας (3.6) και συλλέγουμε κάθε φορά την υδατική φάση στην ογκομετρική φιάλη. Συμπληρώνουμε το περιεχόμενο της φιάλης έως τα 100 ml με διάλυμα ουρίας (3.6) και αναμειγνύουμε. Μετράμε την οπτική πυκνότητα σε φασματοφωτόμετρο (4.7) σε μήκος κύματος 375 nm συγκριτικά με διάλυμα ουρίας (3.6). Προσδιορίζουμε την ποσότητα της φουραζολιδόνης κάνοντας αναφορά στην καμπύλη βαθμολογήσεως (5.5).

5.5. Καθορισμός καμπύλης βαθμολογήσεως

Ετοιμάζουμε τέσσερις στήλες χρωματογραφίας σύμφωνα με τον τρόπο παρασκευής που περιεγράφει στην 5.3 πρώτη παράγραφος. Τοποθετούμε με τη βοήθεια σιφωνίου στις στήλες όγκους αντιστοίχως 2,5, 5, 7,5 και 10 ml του διαλύματος γνωστής περιεκτικότητος (3.8). Εκχυλίζουμε κάθε στήλη με 150 ml ακετόνη (3.1) και συνεχίζουμε κατά τρόπο που περιγράφεται στην 5.4. Σχηματίζουμε την καμπύλη βαθμολογήσεως, θέτοντες στον άξονα των συντεταγμένων τις τιμές της οπτικής πυκνότητος και στον άξονα των συντετμημένων τις αντιστοιχούσες ποσότητες φουραζολιδόνης σε μικρογραμμάρια.

6. Υπολογισμός αποτελεσμάτων

Η περιεκτικότητα της φουραζολιδόνης σε mg/kg του δείγματος, δίδεται από τον τύπο

όπου:

A =ποσότης σε μικρογραμμάρια της φουραζολιδόνης, προσδιορισθείσης με τη φωτομετρική μέθοδο.

P =βάρος σε g του ληφθέντος δείγματος.

7. Επαναληπτικότης

Η διαφορά μεταξύ αποτελεσμάτων δύό παραλλήλων προσδιορισμών, γενομένων επί του αυτού δείγματος, δεν πρέπει να υπερβαίνει:

το 50%, σε σχέση με το μεγαλύτερο αποτέλεσμα, για περιεκτικότητες σε φουραζολιδόνη που κυμαίνονται μεταξύ 10 και 20 ppm-

10 ppm σε απόλυτο τιμή για περιεκτικότητες μεταξύ 20 και 100 ppm-

το 10%, σε σχέση με το μεγαλύτερο αποτέλεσμα, για περιεκτικότητες μεταξύ 100 και 5 000 ppm-

500 ppm σε απόλυτο τιμή για περιεκτικότητες μεταξύ 5 000 και 10 000 ppm-

το 5%, σε σχέση με το μεγαλύτερο αποτέλεσμα, για περιεκτικότητες ανώτερες των 10 000 ppm.