31975L0084

++++

KOMMISSIONENS SJETTE DIREKTIV

af 20 . december 1974

om fastsaettelse af faellesskabsanalysemetoder til den officielle kontrol af foderstoffer

( 75/84/EOEF )

KOMMISSIONEN FOR DE EUROPAEISKE FAELLESSKABER HAR -

under henvisning til traktaten om oprettelse af Det europaeiske oekonomiske Faellesskab ,

under henvisning til Raadets direktiv af 20 . juli 1970 om indfoerelse af faellesskabsproeveudtagningsmaader og -analysemetoder for saa vidt angaar den officielle kontrol med foderstoffer ( 1 ) , senest aendret ved akten ( 2 ) , der er knyttet til traktaten vedroerende nye medlemsstaters tiltraedelse af Det europaeiske oekonomiske Faellesskab og Det europaeiske Atomenergifaellesskab ( 3 ) , undertegnet i Bruxelles den 2 . januar 1972 , saerlig artikel 2 , og

ud fra foelgende betragtninger :

Ovennaevnte direktiv bestemmer , at den officielle kontrol med foderstoffer til konstatering af , om de betingelser , der er fastsat paa grundlag af administrativt eller ved lov fastsatte bestemmelser om foderstoffernes beskaffenhed og sammensaetning , er opfyldt , skal foretages efter faellesskabsproeveudtagningsmaader og -analysemetoder ;

Kommissionens direktiver nr . 71/250/EOEF af 15 . juni 1971 ( 4 ) , nr . 71/393/EOEF af 18 . november 1971 ( 5 ) , nr . 72/199/EOEF af 27 . april 1972 ( 6 ) nr . 73/46/EOEF af 5 . december 1972 ( 7 ) og nr . 74/203/EOEF af 25 . marts 1974 ( 8 ) har allerede fastlagt en raekke faellesskabsanalysemetoder ; i betragtning af den hastighed , hvormed arbejdet siden da er skredet frem , er det hensigtsmaessigt at fastlaegge en sjette raekke metoder ;

de i dette direktiv fastsatte foranstaltninger er i overensstemmelse med udtalelse fra Den staaende Foderstofkomité -

UDSTEDT FOELGENDE DIREKTIV :

Artikel 1

Medlemsstaterne foreskriver , at analyserne i forbindelse med den officielle kontrol af foderstoffer for saa vidt angaar deres indhold af buquinolat , sulfaquinoxalin og furazolidon skal foretages efter de metoder , der er beskrevet i bilaget til dette direktiv .

De almindelige bestemmelser i foerste del ( indledning ) af bilaget til Kommissionens foerste direktiv nr . 71/250/EOEF af 15 . juni 1971 , finder med undtagelse af den del der vedroerer tilberedelsen af analyseproeven , anvendelse paa de metoder , der er beskrevet i bilaget til dette direktiv .

Artikel 2

Medlemsstaterne saetter de noedvendige administrativt eller ved lov fastsatte bestemmelser i kraft for senest den 1 . november 1975 at efterkomme bestemmelserne i dette direktiv . De underretter omgaaende Kommissionen herom .

Artikel 3

Dette direktiv er rettet til medlemsstaterne .

Udfaerdiget i Bruxelles , den 20 . december 1974 .

Paa Kommissionens vegne

François-Xavier ORTOLI

Formand

( 1 ) EFT nr . L 170 af 3 . 8 . 1970 , s . 2 .

( 2 ) EFT nr . L 73 af 27 . 3 . 1972 , s . 14 .

( 3 ) EFT nr . L 73 af 27 . 3 . 1972 , s . 5 .

( 4 ) EFT nr . L 155 af 12 . 7 . 1971 , s . 13 .

( 5 ) EFT nr . L 279 af 20 . 12 . 1971 , s . 7 .

( 6 ) EFT nr . L 123 af 29 . 5 . 1972 , s . 6 .

( 7 ) EFT nr . L 83 af 30 . 3 . 1973 , s . 21 .

( 8 ) EFT nr . L 108 af 22 . 4 . 1974 , s . 7 .

BILAG

1 . Bestemmelse af buquinolat

( ethyl-4-hydroxy-6,7-diisobutoxy-3-quinolincarboxylat )

1 . Formaal og anvendelsesomraade

Metoden goer det multigt at bestemme buquinolatindholdet i foderstoffer , koncentrater og for-blandinger . Den mindste maengde , der kan bestemmes , er 10 ppm . Decoquinat paavirker analyseresultaterne .

2 . Princip

Proeven ekstraheres med chloroform , hvorpaa ekstrakten inddampes til toerhed , og remanensen oploeses i chloroform , hvorefter oploesningen tyndtlagschromatograferes . Buquinolatindholdet elueres derpaa med ethanol og bestemmes med spektrofotofluoerimetri ved sammenligning med standardoploesninger .

3 . Reagenser

3.1 . Chloroform p.a .

3.2 . 96 % ( v/v ) ethanol p.a .

3.3 . Blanding af chloroform og ethanol : 10 dele chloroform ( 3.1 ) blandes med 1 del ethanol ( 3.2 ) .

3.4 . 80 % ( v/v ) ethanol p.a .

3.5 . Kiselgel-G til tyndtlagschromatografi .

3.6 . Standardsubstans : rent buquinolat .

3.7 . Standardoploesninger :

3.7.1 . buquinolatoploesning : 0,2 mg pr . ml

50 mg standardsubstans ( 3.6 ) afvejes med en noejagtighed paa 0,1 mg , oploeses derefter i chloroform ( 3.1 ) i en 250 ml maalekolbe ved opvarmning paa vandbad ved 50 * C . Henstilles til afkoeling til stuetemperatur , og der fyldes op til maerket med chloroform ( 3.1 ) og blandes grundigt .

3.7.2 . Arbejdsstandardoploesninger : maengder paa henholdsvis 5,0 - 10,0 - 15,0 - 20,0 og 25,0 ml af oploesningen ( 3.7.1 ) overfoeres til 25 ml maalekolber , hvorefter der fyldes op til maerket med chloroform ( 3.1 ) og blandes grundigt . Oploesningerne tilberedes umiddelbart foer anvendelsen , 1 ml af disse oploesninger indeholder henholdsvis 0,04 - 0,08 - 0,12 - 0,6 og 0,20 mg buquinolat .

4 . Apparatur

4.1 . 50 ml og 250 ml koniske kolber med sleben glasprop .

4.2 . Rysteapparat .

4.3 . Centrifuge med 15 ml centrifugeglas med sleben prop .

4.4 . Vandbad ved 50 * C .

4.5 . Apparatur til tyndtlagschromatografi .

4.6 . 200 mm gange 200 mm glasplader til tyndtlagschromatografi , der tilberedes paa foelgende maade : ensartet fordelt spredes et 0,5 mm tykt lag Kiselgel-G-suspension ( 3.5 ) paa pladerne , hvorpaa man lader disse henstaa til lufttoerring i 15 minutter . Derefter anbringes pladerne i 2 timer i varmeskab ( 4.11 ) og flyttes derpaa til en ekssikkator , der som toerremiddel indeholder silicagel . Fabriksfremstillede faerdig-plader et egnede i den udstraekning , de giver lignende resultater , som de plader , der er behandlet paa den ovenfor beskrevne maade .

4.7 . 0,50 ml micropipetter .

4.8 . Zonekollektor til tyndtlagschromatografi .

4.9 . Kortboelgelampe .

4.10 . Spektrofotofluorimeter forsynet med en xenonlampe og to monochromatorer .

4.11 . Varmeskab forsynet med en ventilator og indstillet paa 100 * C .

4.12 . Vakuum-rotations-fordamper med 250 ml kolbe .

5 . Fremgangsmaade

5.1 . Tilberedning af proeven

Proeven findeles i en saadan grad , at den i sin helhed kan gaa igennem en sigte med en maskevidde paa 1 mm ( som anbefalet af ISO R 565 ) .

5.2 . Ekstraktion

Med en noejagtighed paa 1 mg afvejes en findelt og homogen proevemaengde , der indeholder ca . 1,25 mg buquinolat . Proevematerialet haeldes i en 250 ml konisk kolbe ( 4.1 ) , og der tilsaettes 100,0 ml chloroform ( 3.1 ) , hvorefter der blandes , kolben tilproppers , og der omrystes i 1 time paa rysteapparatet ( 4.2 ) . Efter bundfaeldning dekanteres , filtreres , og de foerste ml af filtratet kasseres .

80,0 ml af det klare filtrat haeldes derpaa i et 150 ml beagerglas eller i rotationsfordamperens kolbe ( 4.12 ) . Derefter inddampes naesten til toerhed paa vandbad ( 4.4 ) , den olieagtige remanens oploeses ved gentagne tilsaetninger af nogle faa ml chloroform ( 3.1 ) , og oploesningerne overfoeres kvantitativt til en 10 ml maalekolbe ved hjaelp af en tyndhalset tragt . Derpaa fyldes op til maerket med chloroform ( 3.1 ) og blandes grundigt . Saafremt oploesningen ikke er klar , centrifugeres i tre minutter med 3 000 o./min . i tilproppet glas .

5.3 . Tyndtlagschromatografi

Paa en plade til tyndtlagschromatografi ( 4.6 ) , anbringes som pletter ved hjaelp af en micropipette ( 4.7 ) , og med en indbyrdes afstand af 2 cm maengder paa 0,25 ml , dels af den under 5.2 opnaaede ekstrakt dels af de fem arbejdsstandardoploesninger ( 3.7.2 ) .

Derpaa udvikles chromatogrammet med chloroform ( 3.1 ) , indtil oploesningsmidlets front helt naar pladens oevre kant , hvorefter der toerres ved luftstroem . Derpaa udvikles chromatogrammet med chloroform/ethanolblandingen ( 3.3 ) , indtil oploesningsmidlets front er vandret ca . 12 cm , hvorefter pladerne henlaegges til afdampning af oploesningsmidlerne . Derefter bestraales chromatogrammet med * y * fra UV-lampen ( 4.9 ) , og buquinolatpletterne afgraenses ( Rf-vaerdi : 0,4 - 0,6 ) ved hjaelp af en naal .

5.4 . Eluering

Kiselgelen fra hver afgraenset plet opsamles med en zonekollektor ( 4.8 ) i et centrifugeglas ( 4.3 ) . Der tilsaettes 10,0 ml ethanol ( 3.4 ) i hvert glas , som omrystes i 20 minutter , hvorpaa der centrifugeres i 5 minutter med 3 000 o./min . , og derefter dekanteres de klare oploesninger * 50 ml koniske kolber ( 4.1 ) .

5.5 . Maaling af fluorescens

Skalaen paa spectrofotofluorimetret ( 4.10 ) , indstilles paa 100 ved hjaelp af det eluat ( 5.4 ) , der fremkommer fra den mest koncentrerede standardoploesning , idet der til exitation anvendes den boelgelaengde i omraadet mellem 200 og 280 mm , der fremkalder den kraftigste fluorescens . Emissionen maales ved en boelgelaengde paa 375 mm .

Derefter maales de andre eluaters ( 5.4 ) fluorescensintensitet . Paa grundlag af de fundne vaerdier bestemmes den buquinolatmaengde ( A ) i mg , der indeholdes i de 10 ml eluat , som hidroerer fra proeven .

6 . Beregning

Buquinolatindholdet i proevematerialet i mg/kg beregnes efter formlen :

A/P * 50 000

hvor :

A = buquinolatmaengden i mg , bestemt ved den spectrofluorimetriske maaling

P = proevens vaegt i gram .

7 . Reproducerbarhed

Forskellen mellem resultaterne af dobbeltbestemmelser maa ikke overstige :

50 % i forhold til hoejeste resultat for et buquinolatindhold paa mellem 10 og 20 ppm ;

10 ppm i absolut vaerdi for et indhold paa mellem 20 og 100 ppm ;

10 % i forhold til hoejeste resultat for et indhold paa mellem 100 og 5 000 ppm ;

500 ppm i absolut vaerdi for et indhold paa mellem 5 000 og 10 000 ppm ;

5 % i forhold til hoejeste resultat for et indhold paa over 10 000 ppm .

2 . BESTEMMELSE AF SULFAQUINOXALIN

( 2-sulfamylamidoquinoxalin )

1 . Formaal og anvendelsesomraade

Metoden goer det muligt at bestemme sulfaquinoxalinindholdet i foderstoffer , koncentrater og for-blandinger . Den mindste maengde , der kan bestemmes , er 20 ppm . Baade andre sulfonamider og arsanilsyre paavirker analyseresultaterne .

2 . Princip

Proeven ekstraheres med dimethylformamid og chloroform . Sulfaquinoxalinet hydrolyseres derefter i alkalisk mijoe . Efter neutralisering diasoteres det fremkomne aminoderivat og sammenkobles med N-2-aminoethyl-1-naphtylaminet . Oploesningens lysabsorption maales ved 545 mm .

3 . Reagenser

3.1 . N,N-dimethylformamid p.a .

3.2 . Chloroform p.a .

3.3 . Absolut ethanol .

3.4 . Alkalisk saltoploesning : 10 g natriumhydroxyd p.a . og 25 g natriumchlorid p.a . oploeses i vand , hvorpaa der fyldes op med vand til 500 ml og blandes grundigt .

3.5 . Koncentreret saltsyre p.a . ( mf = 1,18 ) .

3.6 . 0,1 % ( w/v ) natriumnitritoploesning : 100 mg natriumnitrit p.a . oploeses i vand , hvorpaa der fyldes op med vand til 100 ml og blandes grundigt . Tilberedes umiddelbart foer anvendelsen .

3.7 . 0,5 % ( w/v ) ammoniumamidesulfonatoploesning : 500 mg ammoniumamidesulfonat p.a . oploeses i vand , hvorpaa der fyldes op med vand til 100 ml og blandes grundigt . Tilberedes umiddelbart foer anvendelsen .

3.8 . 0,1 % ( w/v ) N-2-aminoethyl-1 -naphtylamindihydrochloridoploesning :

100 mg N-2-aminoethyl-1-naphtylamindihydrochlorid p.a . oploeses i 0,1 % ( v/v ) saltsyre p.a . , hvorpaa der fyldes op med samme syre til 100 ml og blandes grundigt . Tilberedes umiddelbart foer anvendelsen .

3.9 . Standardsubstans : rent sulfaquinoxalin .

3.10 . Standardoploesning : 250 mg standardsubstans ( 3.9 ) afvejes med en noejagtighed paa 0,1 mg og oploeses i en 50 ml natriumhydroxydoploesning ( 25 ml natriumhydroxydoploesning p.a . 0,1 N + 25 ml vand ) , hvorefter der fyldes op med vand til 500 ml og blandes grundigt . 5,0 ml af denne oploesning fortyndes til 100 ml vand , 1 ml af denne oploesning indeholder 25 mg sulfaquinoxalin .

4 . Apparatur

4.1 . 250 ml koniske kolber med normalslib .

4.2 . Rysteapparat .

4.3 . Glasfilterdigel , type G 3 , diameter : 80 mm med filterkolbe .

4.4 . 250 ml skilletragte .

4.5 . 50 ml , 100 ml , 250 ml og 500 ml maalekolber .

4.6 . 150 mm gange 25 mm reagensglas .

4.7 . Kogende vandbad .

4.8 . Spektrofotometer med 20 mm kuvetter .

5 . Fremgangsmaade

5.1 . Tilberedning af proeven

Proeven findeles i en saadan grad , at den i sin helheld kan gaa igennem en sigte med en maskevidde paa 1 mm ( som anbefalet af ISO R 565 ) .

5.2 . Ekstraktion

Med en noejagtighed paa 1 mg afvejes en findelt og homogen proevemaengde , der indeholder 0,25 - 1,25 mg sulfaquinoxalin . Proevematerialet haeldes i en 250 ml konisk kolbe ( 4.1 ) og tilsaettes 20 ml N,N-dimethylformamid ( 3.1 ) . Der blandes og opvarmes i 20 minutter paa vandbad ( 4.7 ) . Derefter afkoeles kolben under koldt rindende vand . Der tilsaettes 60 ml chloroform ( 3.2 ) , hvorefter kolben tilproppes og omrystes i 30 minutter paa rysteapparatet ( 4.2 ) . Vaesken filtreres fra med en filterdigel ( 4.3 ) under let sugning . Kolben renses med fire dele chloroform à 5 ml ( 3.2 ) , som overfoeres til filterdiglen Derefter overfoeres filtratet til en skilletragt ( 4.4 ) , filterkolben renses med ca . 15 ml chloroform ( 3.2 ) , som overfoeres til skilletragten .

5.3 . Hydrolyse

50 ml alkalisk saltoploesning ( 3.4 ) , og 5 ml ethanol ( 3.3 ) , tilsaettes i skilletragten , og indholdet blandes fuldstaendigt , idet emulsionsdannelse undgaas , ved at tragten vend * langsomt en snes gange , eller drejes omkring vandret akse mellem fod og prop . Blandingen henstar derefter , indtil faserne er adskilt ( adskillelsen er almindeligvis fuldstaendig efter ca . 15 minutters forloeb ) .

Den oeverste fase ( vandfasen ) overfoeres derpaa til en 250 ml maalekolbe ( 4.5 ) . Chloroformfasen ekstraheres derefter igen med tre 50 ml portioner alkalisk saltoploesning ( 3.4 ) , og vandfasen overfoeres efter hver enkelt ekstraktion til maalekolben . Derefter fyldes der op med vand til maerket og blandes grundigt .

25,0 ml af oploesningen overfoeres til en 50 ml maalekolbe ( 4.5 ) , og der tilsaettes 5 ml salt syre ( 3.5 ) , hvorpaa der fyldes op med vand og blandes grundigt . Der filtreres om noedvendigt , og de foerste 15 ml af filtratet kasseres . Derefter overfoeres 10 ml af oploesningen til hvert af de to reagensglas ( 4.6 ) , A og B .

5.4 . Farveudvikling og maaling af lysabsorptionen

Man tilsaetter i hvert reagensglas 2,0 ml natriumnitritoploesning ( 3.6 ) , omryster og lader henstaa i tre minutter . Derpaa tilsaetter man 2,0 ml ammoniumamidesulfonatoploesning ( 3.7 ) , omryster og lader henstaa i to minutter . Derefter tilsaettes 1,0 ml 2-aminoethyl-1 -naphtylamindihydrochloridoploesning ( 3.8 ) i reagensglas A og 1,0 ml vand i reagensglas B . Hvert reagensglas' indhold blandes kraftigt , hvorpaa reagensglassene forbindes til en vandstraalepumpe ved hjaelp af gummislanger , og let vakuum anvendes til bortskaffelse af oploest kvaelstof .

Efter 10 minutters forloeb maales oploesningernes lysabsorptioner E A og E B med et spektrofotometer ( 4.8 ) ved 545 nm , idet der maales over for vand . Ud fra vaerdien af E A - E B bestemmes proeveoploesningens sulfaquinoxalinindhold ( A ) paa grundlag af kalibreringskurve ( 5.5 ) , der er udarbejdet i forvejen .

5.5 . Kalibreringskurve

Til fem 100 ml maalekolber ( 4.5 ) , overfoeres 2,0 - 4,0 - 6,0 - 8,0 og 10,0 ml standardoploesning ( 3.10 ) svarende til henholdsvis 50 , 100 , 150 , 200 og 250 microgram sulfaquinoxalin . Der tilsaettes derpaa 8 ml saltsyre ( 3.5 ) i hver enkelt kolbe , som fyldes op til maerket med vand , og der blandes grundigt . 10,0 ml af hver enkelt oploesning ( hvilket svarer til et sulfaquinoxalinindhold paa henholdsvis 5 , 10 , 15 , 20 og 25 microgram ) afpipetteres i reagensglas ( 4.6 ) , hvorefter farveudviklingen foretages som beskrevet under 5.4 , foerste afsnit . Derefter maales lysabsorptionerne ved 545 nm over for vand . Kalibreringskurven optegnes nu , ved at lysabsorptionsvaerdierne afsaettes som ordinat og de tilsvarende sulfaquinoxalinmaengder i microgram som abscisse .

6 . Beregning

Sulfaquinoxalinindholdet i proevematerialet i mg/kg beregnes efter formlen :

A/P * 50

hvor :

A = sulfaquinoxalinmaengden i microgram , bestemt ved den fotometriske maaling ;

P = proevens vaegt i gram .

7 . Reproducerbarhed

Forskellen mellem resultaterne af dobbeltbestemmelser maa ikke overstige :

10 ppm i absolut vaerdi for et sulfaquinoxalinindhold mellem 20 og 100 ppm ;

10 % i forhold til hoejeste resultat for et indhold paa mellem 100 og 5 000 ppm ;

500 ppm i absolut vaerdi for et indhold paa mellem 5 000 og 10 000 ppm ;

5 % i forhold til hoejeste resultat for et indhold paa over 10 000 ppm .

3 . BESTEMMELSE AF FURAZOLIDON

( N-(5-nitro-2-furfuryliden)-3-aamino-2-oxazolidon )

1 . Formaal og anvendelsesomraade

Metoden goer det muligt at bestemme furazolidonindholdet i foderstoffer , koncentrater og for-blandinger . Den mindste maengde , der kan bestemmes , er 10 ppm .

2 . Princip

Efter affedtning af proeven med petroleumsether ekstraheres furazolidonet med acetone . Derpaa renses ekstrakten ved chromatografi paa en aluminiumoxydsoejle , og furazolidonet elueres med acetone , hvorpaa eluatet inddampes til toerhed , og remanensen oploeses i amylalkohol . Furazolidonet ekstraheres derefter heraf med en urinstofoploesning , hvorpaa lysabsorptionen maales ved 375 nm .

3 . Reagenser

3.1 . Acetone p.a .

3.2 . Aluminiumoxyd til chromatografi , neutral , 100 - 240 mesh , der er forbehandlet paa foelgende maade :

500 g aluminiumoxyd blandes med 1 liter varmt destilleret vand , hvorefter den oeverste fase dekanteres . Efter at dette er gentaget to gange , filtreres der paa en Buchner-tragt . Derefter toerres aluminiumoxydet ved 105 * C , indtil vaegten er konstant .

3.3 . Amylacetat p.a .

3.4 . Amylalkohol p.a . ( isomére blandinger kan anvendes ) .

3.5 . Petroleumsether , kogepunkt-interval 40 - 60 * C .

3.6 . Urinstofoploesning : 90 g urinstof p.a . blandes med 100 ml vand , og der opvarmes let for at opnaa fuldstaendig oploesning .

3.7 . Standardsubstans : rent furazolidon .

3.8 . Standardoploesning : 25 g standardsubstans ( 3.7 ) afvejes med en noejagtighed paa 0,1 mg og oploeses i acetone ( 3.1 ) i en 250 ml maalekolbe ( 4.1 ) , som fyldes op til maerket med acetone ( 3.1 ) og der blandes grundigt . 1 ml af denne oploesning indeholder 100 mg furazolidon .

4 . Apparatur

4.1 . 100 ml og 250 ml maalekolber af brunt glas .

4.2 . 100 ml skilletragte af brunt glas .

4.3 . Ekstraktionsapparat , f.eks . Soxhlet eller Twisselmann .

4.4 . Ekstraktionshylser , enten 25 mm gange 80 mm eller 28 mm gange 100 mm .

4.5 . Chromatografiror af glas , indvendig diameter : 10 mm , laengde 300 mm .

4.6 . Kogende vandbad .

4.7 . Spektrofotometer med 10 mm kuvetter .

5 . Fremgangsmaade

NB : Alle arbejdsoperationer maa foregaa i daempet belysning .

5.1 . Tilberedning af proeven

Proeven findeles i en saadan grad , at den i sin helhed kan gaa igennem en sigte med en maskevidde paa 1 mm ( som anbefalet af ISO R 565 ) .

5.2 . Ekstraktion

5 - 20 g findelt og homogent proevemateriale afvejes med en noejagtighed paa 1 mg ( med et furazolidonindhold paa hoejst 1 mg ) i en ekstraktionshylse ( 4.4 ) , hvorpaa denne anbringes i et ekstraktionsapparat ( 4.3 ) , og der ekstraheres med petroleumsether ( 3.5 ) . Ved anvendelse af et Soxhletapparat kraeves 13 - 17 cirkulationer af oploesningsmidlet , anvendes andre apparattyper , boer ekstraktionsperioden ikke vaere under 30 minutter . Derefter fjernes hylsen fra ekstraktionsapparatet , resterende oploesningsmiddel afdraenes , og ekstraktionshylsen med indhold toerres ved hjaelp af en varm luftstroem .

Hylsen med indhold anbringes derpaa i et rent ekstraktionsapparat , og der ekstraheres med acetone ( 3.1 ) . Ved anvendelse af et Soxhletapparat kraeves mindst 25 cirkulationer af oploesingsmidlet ; anvendes andre apparattyper , boer de noedvendige betingelser af at opnaa fuldstaendig ekstraktion bestemmes forud . Acetoneekstrakten inddampes derefter paa vandbadet ( 4.6 ) indtil en maengde paa 5 - 10 ml og afkoeles derpaa til stuetemperatur .

5.3 . Chromatografi

En glasuldsprop indsaettes i bunden af et chromatografiroer ( 4.5 ) og presses godt sammen med en tilpasset pind , saa der kan opnaas en tykkelse paa 2 - 3 mm . Derpaa tilberedes en opslemning af aluminiumoxyd ( 3.2 ) , i acetone ( 3.1 ) ; denne opslemning haeldes i roeret , og man lader den bundfaelde sig . Den saaledes opnaaede soejle boer have en hoejde af ca . 200 mm , og man lader acetonens vaeskeniveau synke helt ned til soejlens oevre overflade .

Den under 5.2 opnaaede acetoneekstrakt overfoeres til soejlen , og flasken renses gentagne gange med acetone ( 3.1 ) , som overfoeres til soejlen . Derefter anbringes en egnet kolbe under soejlen , og furazolidonet elueres med acetone ( 3.1 ) . Den samlede maengde acetone , der skal anvendes , herunder den maengde , som anvendes til rensningen , boer vaere paa ca . 150 ml .

5.4 . Ekstraktion og maaling af lysabsorption

Det under 5.3 opnaaede eluat inddampes til toerhed paa et vandbad ( 4.6 ) . ( Der fremkommer undertiden en ubetydelig maengde diacetonealkohol , idet acetonen kondenseres og gaar i forbindelse med aluminiumoxydet ; dette generer dog ikke de foelgende ekstraktioner ) . Derpaa oploeses remanensen i 10 ml amylalkohol ( 3.4 ) , og oploesningen overfoeres til en skilletragt ( 4.2 ) , hvorefter kolben renses , foerst med 10 ml amylacetat ( 3.3 ) , og dernaest med 10 ml urinstofoploesning ( 3.6 ) , og disse oploesninger overfoeres efterhaanden til skilletragten , som omrystes kraftigt i to minutter .

Man lader derpaa indholdet henstaa i 3 - 4 minutter , hvorefter vandfasen opsamles i en 100 ml maalekolbe ( 4.1 ) . Rensningen og ekstraktionen gentages ved hjaelp af fire 10 ml portioner urinstofoploesning ( 3.6 ) , idet vandfasen hver gang opsamles i maalekolben . Maalekolbens indhold fortyndes til 100 ml med urinstofoploesningen ( 3.6 ) , og der blandes grundigt . Oploesningens lysabsorption maales derpaa med spektrofotometret ( 4.7 ) ved 37 * nm over for urinstofoploesningen ( 3.6 ) , og furazolidonindholdet bestemmes derefter paa grundlag af kalibreringskurven ( 5.5 ) .

5.5 . Kalibreringskurve

Fire chromatografisoejler tilberedes efter den fremgangsmaade , som er beskrevet under 5.3 , foerste afsnit . Der afpipetteres derpaa i 4 soejler fire standardoploesningsmaengder paa henholdsvis 2,5 - 5,0 - 7,5 og 10,0 ml ( 3.8 ) , hvorefter hver soejle elueres med 150 ml acetone ( 3.1 ) , og der viderebehandles som beskrevet under 5.4 . Kalibreringskurven optegnes nu , ved at lysabsorptionsvaerdierne afsaettes som ordinat og de tilsvarende furazolidonmaengder i microgram som abscisse .

6 . Beregning

Furazolidonindholdet i proevematerialet i mg/kg beregnes efter formlen :

A/P

hvor :

A = furazolidonmaengden i microgram , bestemt ved den fotometriske maaling ;

P = proevens vaegt i gram .

7 . Reproducerbarhed

Forskellen mellem resultaterne af dobbeltbestemmelser paa ikke overstige :

50 % i forhold til hoejeste resultat for et furazolidonindhold paa mellem 10 og 20 ppm ;

10 ppm i absolut vaerdi for et indhold paa mellem 20 og 100 ppm ;

10 % i forhold til hoejeste resultat for et indhold paa mellem 100 og 5 000 ppm ;

500 ppm i absolut vaerdi for et indhold paa mellem 5 000 og 10 000 ppm ;

5 % i forhold til hoejeste resultat for et indhold paa over 10 000 ppm .