02009R0152 — CS — 16.11.2020 — 007.001

---

Tento dokument slouží výhradně k informačním účelům a nemá žádný právní účinek. Orgány a instituce Evropské unie nenesou za jeho obsah žádnou odpovědnost. Závazná znění příslušných právních předpisů, včetně jejich právních východisek a odůvodnění, jsou zveřejněna v Úředním věstníku Evropské unie a jsou k dispozici v databázi EUR-Lex. Tato úřední znění jsou přímo dostupná přes odkazy uvedené v tomto dokumentu

►B	NAŘÍZENÍ KOMISE (ES) č. 152/2009 ze dne 27. ledna 2009, kterým se stanoví metody odběru vzorků a laboratorního zkoušení pro úřední kontrolu krmiv (Text s významem pro EHP) (Úř. věst. L 054 26.2.2009, s. 1)

Ve znění:

		Úřední věstník
		Č.	Strana	Datum
M1	NAŘÍZENÍ KOMISE (EU) č. 278/2012 ze dne 28. března 2012,	L 91	8	29.3.2012
►M2	NAŘÍZENÍ KOMISE (EU) č. 51/2013 ze dne 16. ledna 2013,	L 20	33	23.1.2013
►M3	NAŘÍZENÍ KOMISE (EU) č. 691/2013 ze dne 19. července 2013,	L 197	1	20.7.2013
M4	NAŘÍZENÍ KOMISE (EU) č. 709/2014 ze dne 20. června 2014,	L 188	1	27.6.2014
M5	NAŘÍZENÍ KOMISE (EU) 2017/645 ze dne 5. dubna 2017,	L 92	35	6.4.2017
►M6	NAŘÍZENÍ KOMISE (EU) 2017/771 ze dne 3. května 2017,	L 115	22	4.5.2017
►M7	PROVÁDĚCÍ NAŘÍZENÍ KOMISE (EU) 2020/1560 ze dne 26. října 2020,	L 357	17	27.10.2020

---

▼B

NAŘÍZENÍ KOMISE (ES) č. 152/2009

ze dne 27. ledna 2009,

kterým se stanoví metody odběru vzorků a laboratorního zkoušení pro úřední kontrolu krmiv

(Text s významem pro EHP)

▼M3

Článek 1

Odběr vzorků pro úřední kontrolu krmiv, zejména pokud jde o stanovení jejich složek, včetně materiálů, které obsahují geneticky modifikované organismy (GMO), sestávají z nich nebo jsou z nich vyrobeny, doplňkových látek v krmivech, jak jsou definovány nařízením Evropského parlamentu a Rady (ES) č. 1831/2003 ( 1 ), a nežádoucích látek, jak jsou definovány směrnicí Evropského parlamentu a Rady 2002/32/ES ( 2 ), se provádí podle metod stanovených v příloze I.

Metoda odběru vzorků stanovená v příloze I je použitelná pro kontrolu krmiv, pokud jde o stanovení reziduí pesticidů, jak je definováno v nařízení Evropského parlamentu a Rady (ES) č. 396/2005 ( 3 ), a pro kontrolu souladu s nařízením (EU) č. 619/2011.

▼B

Článek 2

Příprava vzorků ke zkoušení a vyjádření výsledků se provádí podle metod stanovených v příloze II.

Článek 3

Zkoušení pro úřední kontrolu krmiv se provádí za použití metod stanovených v příloze III (Metody zkoušení pro kontrolu složení krmných surovin a krmných směsí), v příloze IV (Metody zkoušení pro kontrolu obsahu povolených doplňkových látek v krmivech), v příloze V (Metody zkoušení pro kontrolu nežádoucích látek v krmivech) a v příloze VI (Metody zkoušení pro stanovení složek živočišného původu pro úřední kontrolu krmiv).

Článek 4

Obsah energie u krmných směsí pro drůbež se vypočítá na základě přílohy VII.

Článek 5

Metody zkoušení pro kontrolu nepřípustné přítomnosti již nepovolených doplňkových látek v krmivech, které jsou stanoveny v příloze VIII, se použijí pro účely potvrzování.

Článek 6

Směrnice 71/250/EHS, 71/393/EHS, 72/199/EHS, 73/46/EHS, 76/371/EHS, 76/372/EHS, 78/633/EHS, 81/715/EHS, 84/425/EHS, 86/174/EHS, 93/70/EHS, 93/117/ES, 98/64/ES, 1999/27/ES, 1999/76/ES, 2000/45/ES, 2002/70/ES a 2003/126/ES se zrušují.

Odkazy na zrušené směrnice se považují za odkazy na toto nařízení v souladu se srovnávacími tabulkami v příloze IX.

Článek 7

Toto nařízení vstupuje v platnost dvacátým dnem po vyhlášení v Úředním věstníku Evropské unie.

Použije se od 26. srpna 2009.

Toto nařízení je závazné v celém rozsahu a přímo použitelné ve všech členských státech.

▼M3

---

PŘÍLOHA I

METODY ODBĚRU VZORKŮ

1.   ÚČEL A ROZSAH

Vzorky určené pro úřední kontrolu krmiv se odebírají podle níže popsaných metod. Takto získané vzorky jsou považovány za reprezentativní vzorky ze vzorkované partie.

Účelem odběru reprezentativních vzorků je získat malou frakci z šarže takovým způsobem, aby stanovení jakékoli konkrétní vlastnosti této frakce odpovídalo střední hodnotě vlastnosti šarže. Šarže se vzorkuje opakovaným odběrem dílčích vzorků v různých místech šarže. Tyto dílčí vzorky se spojí mícháním s cílem získat jeden souhrnný vzorek, z něhož se reprezentativním dělením připraví konečné reprezentativní vzorky.

Pokud na základě vizuální kontroly vykazují partie krmiva, které mají být vzorkovány, odlišnost v kvalitě od krmiva z téže šarže, oddělí se tyto partie od zbytku krmiva a zachází se s nimi jako se samostatnou dílčí šarží. Pokud není možné rozdělit krmivo do samostatných dílčích šarží, vzorkuje se krmivo jako jedna šarže. V takových případech se tato skutečnost uvede do protokolu o odběru vzorku.

Je-li krmivo vzorkované v souladu s ustanoveními tohoto nařízení označeno jako krmivo, které nesplňuje požadavky EU, a je-li částí šarže krmiva téže třídy nebo popisu, má se za to, že všechno krmivo dané šarže vykazuje stejné vlastnosti, pokud z podrobného posouzení nevyplyne existence důkazů o tom, že zbytek šarže nesplňuje požadavky EU.

2.   DEFINICE

—

Šarže (nebo partie) : identifikovatelné množství krmiva, které má vykazovat jednotné vlastnosti, jako je původ, druh, typ balení, balírna, dodavatel nebo označení; a v případě výrobního procesu jednotka vyrobeného množství z jednoho výrobního zařízení za použití jednotných výrobních parametrů nebo řada takových jednotek, pokud jsou vyráběny kontinuálně a skladovány společně.

—	Vzorkovaná partie : šarže nebo identifikovaná část šarže nebo dílčí šarže.

—	Zapečetěný vzorek : vzorek zapečetěný tak, aby nebyl možný přístup ke vzorku bez porušení nebo odstranění pečeti.

—	Dílčí vzorek : množství odebrané v jednom bodě vzorkované partie.

—	Souhrnný vzorek : souhrn dílčích vzorků odebraných ze stejné vzorkované partie.

—	Redukovaný vzorek : reprezentativní část souhrnného vzorku, která se získá redukcí jeho množství.

—	Konečný vzorek : část redukovaného vzorku nebo homogenizovaného souhrnného vzorku.

—	Laboratorní vzorek : vzorek určený pro laboratoř (v podobě přijímané laboratoří) a může jít o vzorek konečný, redukovaný nebo souhrnný.

3.   OBECNÁ USTANOVENÍ

4.   PŘÍSTROJE

4.1	Přístroje určené k odběru vzorků musí být vyrobeny z materiálů, které nemohou kontaminovat produkty, u nichž má být odběr vzorků proveden. Přístroje a pomůcky, které jsou určeny k opakovanému použití, musí být snadno čistitelné, aby se zamezilo křížové kontaminaci.

4.2

Přístroje doporučené pro odběr vzorků tuhých krmiv 4.2.1    Ruční odběr vzorků 4.2.1.1   Lopatka s rovným dnem a vertikálními okraji. 4.2.1.2 Vzorkovač s dlouhým žlábkem nebo vzorkovací krabice. Rozměry vzorkovače musí být přiměřené vlastnostem vzorkované partie (hloubce nádoby, rozměrům pytle apod.) a velikosti částic krmiva. V případě, že má vzorkovač několik otvorů, měly by být pro zajištění odběru na různých místech podél vzorkovače otvory prostorově odděleny nebo pravidelně rozloženy. 4.2.2    Mechanický odběr vzorků Pro odběr vzorků krmiva v pohybu lze použít vhodná mechanická zařízení. Výrazem „vhodná“ se rozumí to, že by měla umožňovat odběr vzorku alespoň z celé sekce pohybu krmiva. Odběr vzorků z krmiva v pohybu (při silném průtoku) lze provádět automatickými vzorkovači. 4.2.3    Dělič Pokud je to možné a vhodné, měl by se při přípravě reprezentativních redukovaných vzorků používat přístroj určený k dělení vzorků do přibližně stejných částí.

5.   KVANTITATIVNÍ POŽADAVKY NA POČET DÍLČÍCH VZORKŮ

5    Kvantitativní požadavky na dílčí vzorky v souvislosti s kontrolami látek nebo produktů obsažených rovnoměrně v krmivech

5.1.1    Volně ložené tuhé krmivo

5.1.2    Volně ložené tekuté krmivo

5.1.3    Balené krmivo

Krmivo (tuhé i tekuté) může být baleno v pytlích, plechovkách, barelech atd., které se v tabulce označují jako balení. Odběr vzorků z velkých balení (≥ 500 kg nebo litrů) musí být prováděn v souladu s ustanoveními platnými pro volně ložené krmivo (viz body 5.1.1 a 5.1.2).

5.1.4    Krmiva v blocích a minerální lizy

Nejméně jeden blok nebo liz ke vzorkování na jednu vzorkovanou partii obsahující 25 jednotek, maximálně čtyři bloky nebo lizy.

V případě bloků nebo lizů o hmotnosti vyšší než 1 kg se za dílčí vzorek považuje obsah jednoho bloku nebo jednoho lizu.

5.1.5    Objemná krmiva/pícniny

5.2    Kvantitativní požadavky na dílčí vzorky ke kontrole složek nebo látek, které jsou v krmivech pravděpodobně obsaženy nerovnoměrně

Tyto kvantitativní požadavky týkající se dílčích vzorků se použijí v těchto situacích:

V případě, že má kontrolní orgán silné podezření, že k tomuto nerovnoměrnému rozložení dochází také v případě křížové kontaminace některou ze složek nebo látkou v krmných směsích, mohou být uplatňovány kvantitativní požadavky stanovené v níže uvedené tabulce.

5.3    Kvantitativní požadavky na dílčí vzorky v případě velmi velkých šarží

V případě velkých vzorkovaných partií (vzorkované partie > 500 tun) se počet dílčích vzorků, které mají být odebrány, rovná součtu 40 dílčích vzorků + √ tun ve vztahu ke kontrole látek nebo produktů obsažených rovnoměrně v krmivu nebo 100 dílčích vzorků + √ tun ve vztahu ke kontrole složek nebo látek, které jsou v krmivech pravděpodobně obsaženy nerovnoměrně.

6.   KVANTITATIVNÍ POŽADAVKY NA SOUHRNNÝ VZOREK

7.   KVANTITATIVNÍ POŽADAVKY NA KONEČNÉ VZORKY

Konečné vzorky

Požaduje se provedení laboratorního zkoušení alespoň u jednoho konečného vzorku. Množství v konečném vzorku pro laboratorní zkoušení nesmí být nižší než:

8.   METODA ODBĚRU VZORKŮ PRO VELMI VELKÉ ŠARŽE NEBO ŠARŽE SKLADOVANÉ NEBO PŘEPRAVOVANÉ TAK, ŽE ODBĚR VZORKŮ V CELÉ ŠARŽI NENÍ PROVEDITELNÝ

8.1    Obecné zásady

V případě, že způsob přepravy nebo skladování šarže neumožňuje odběr dílčích vzorků z celé šarže, měl by se odběr z těchto šarží pokud možno provádět, když je šarže v pohybu.

V případě velkých skladů určených ke skladování krmiv by měli být provozovatelé nabádáni, aby do skladu instalovali zařízení, které umožní (automatický) odběr vzorků z celé skladované šarže.

V případě uplatňování stejných postupů odběru vzorků, jak jsou stanoveny v této kapitole 8, se o postupu odběru vzorků informuje provozovatel krmivářského podniku nebo jeho zástupce. V případě, že provozovatel krmivářského podniku nebo jeho zástupce postup odběru vzorků zpochybní, umožní provozovatel krmivářského podniku nebo jeho zástupce příslušnému orgánu odběr vzorků z celé šarže na své náklady.

8.2    Velké šarže přepravované lodí

8.2.1    Dynamický odběr vzorků z velkých šarží přepravovaných lodí

Odběr vzorků z velkých šarží na lodích se přednostně provádí, když je produkt v pohybu (dynamický odběr vzorků).

Odběr vzorků se provádí po nákladových prostorech (jednotka, kterou lze fyzicky oddělit). Nákladové prostory se však částečně jeden po druhém vyprazdňují, takže počáteční fyzické oddělení po přesunu do skladovacího zařízení již neexistuje. Odběr vzorků lze proto provádět při počátečním fyzickém oddělování nebo při oddělování po přesunu do skladovacího zařízení.

Vykládka lodi může trvat několik dní. Odběr vzorků musí být za běžných okolností prováděn v pravidelných intervalech po celou dobu trvání vykládky. Přítomnost inspektora za účelem odběru vzorků po celou dobu vykládky však není vždy možná nebo vhodná. Je proto možné provést odběr vzorků u části (vzorkovaná partie) celé šarže. Počet dílčích vzorků se stanoví s přihlédnutím k velikosti vzorkované partie.

V případě, že se vzorky odebírají z části šarže krmiva stejné třídy nebo popisu a že bylo zjištěno, že tato část šarže nesplňuje požadavky EU, předpokládá se, že všechna krmiva v dané šarži vykazují stejné vlastnosti, pokud důkladné šetření neprokáže, že neexistují důkazy o tom, že zbytek šarže nesplňuje požadavky EU.

Přítomnost inspektora je nezbytná, i když se oficiální vzorek odebírá automaticky. V případě, že za účelem předejití podvodu automatický odběr probíhá s předem stanovenými parametry, které není možné změnit během odběru, a že jsou dílčí vzorky odebírány do zapečetěné nádoby, je přítomnost inspektora nutná pouze na počátku odběru vzorků, dále pokaždé, kdy je nutno vyměnit nádobu se vzorky, a na konci odběru vzorků.

8.2.2    Statický odběr vzorků z šarží přepravovaných lodí

V případě, že je odběr vzorků prováděn statickým způsobem, musí se použít stejný postup jako pro shora přístupná skladovací zařízení (sila) (viz bod 8.4.1)

Odběr vzorků se musí provádět na (shora) přístupné části šarže/partie. Počet dílčích vzorků se stanoví s přihlédnutím k velikosti vzorkované partie. V případě, že se vzorky odebírají z části šarže krmiva stejné třídy nebo popisu a že bylo zjištěno, že tato část šarže nesplňuje požadavky EU, předpokládá se, že všechna krmiva v dané šarži vykazují stejné vlastnosti, pokud důkladné šetření neprokáže, že neexistují důkazy o tom, že zbytek šarže nesplňuje požadavky EU.

8.3    Odběr vzorků z velkých šarží uložených ve skladech

Odběr vzorků se musí provádět na přístupné části šarže. Počet dílčích vzorků se stanoví s přihlédnutím k velikosti vzorkované partie. V případě, že se vzorky odebírají z části šarže krmiva stejné třídy nebo popisu a že bylo zjištěno, že tato část šarže nesplňuje požadavky EU, předpokládá se, že všechna krmiva v dané šarži vykazují stejné vlastnosti, pokud důkladné šetření neprokáže, že neexistují důkazy o tom, že zbytek šarže nesplňuje požadavky EU.

8.4    Odběr vzorků ze skladovacích zařízení (sila)

8.4.1    Odběr vzorků ze (snadno) shora přístupných sil

Odběr vzorků se musí provádět na přístupné části šarže. Počet dílčích vzorků se stanoví s přihlédnutím k velikosti vzorkované partie. V případě, že se vzorky odebírají z části šarže krmiva stejné třídy nebo popisu a že bylo zjištěno, že tato část šarže nesplňuje požadavky EU, předpokládá se, že všechna krmiva v dané šarži vykazují stejné vlastnosti, pokud důkladné šetření neprokáže, že neexistují důkazy o tom, že zbytek šarže nesplňuje požadavky EU.

8.4.2    Odběr vzorků ze shora nepřístupných sil (uzavřená sila)

8.4.2.1    Shora nepřístupná sila (uzavřená sila) o velikosti > 100 tun

Odběr vzorků krmiv skladovaných v těchto silech nelze provádět statickým způsobem. V případě, že je třeba odebrat vzorky krmiva v takovém silu a není možné jeho obsah přemístit, je třeba se dohodnout s provozovatelem, že je povinen informovat inspektora o tom, kdy bude silo vykládáno, a umožnit mu odběr vzorků, až bude krmivo v pohybu.

8.4.2.2    Shora nepřístupná sila (uzavřená sila) o velikost < 100 tun

Při odběru se postupuje tak, že se 50 až 100 kg krmiva upustí do nádoby a z ní se odebere vzorek. Velkost souhrnného vzorku odpovídá celé šarži a počet dílčích vzorků se řídí množstvím krmiva upuštěného ze sila do nádoby pro účely odběru vzorků. V případě, že se vzorky odebírají z části šarže krmiva stejné třídy nebo popisu a že bylo zjištěno, že tato část šarže nesplňuje požadavky EU, předpokládá se, že všechna krmiva v dané šarži vykazují stejné vlastnosti, pokud důkladné šetření neprokáže, že neexistují důkazy o tom, že zbytek šarže nesplňuje požadavky EU.

8.5    Odběr vzorků krmiva volně loženého ve velkých uzavřených kontejnerech

Vzorky z těchto šarží lze často odebírat pouze při vykládce. V některých případech není vyložení v místě dovozu nebo kontroly možné, a odběr vzorků by proto měl proběhnout ve chvíli, kdy se tyto kontejnery vykládají.

9.   POKYNY TÝKAJÍCÍ SE ODBĚRU, PŘÍPRAVY A BALENÍ VZORKŮ

9.1    Obecně

Vzorky musí být odebrány a upraveny bez zbytečného prodlení a musí být dodržena nezbytná opatření pro zajištění toho, aby produkt nebyl narušen či kontaminován. Nástroje, plochy i nádoby na vzorky musí být čisté a suché.

9.2    Dílčí vzorky

Odběry dílčích vzorků se provádějí náhodně v celé vzorkované partii a hmotnost nebo objem dílčích vzorků musí být přibližně stejné.

Velikost dílčího vzorku v případě objemných krmiv je alespoň 100 g a u pícnin s nízkou hustotou činí alespoň 25 g.

V případě, že musí být v souladu s pravidly pro postup odběru vzorků stanovených v bodě 8 odebráno méně než 40 dílčích vzorků, stanoví se velikost dílčích vzorků podle požadované velikost souhrnného vzorku (viz bod 6).

V případě odběru vzorků z malých šarží baleného krmiva, kde je podle kvantitativních požadavků třeba odebrat omezený počet dílčích prvků, považuje se za dílčí vzorek obsah původního balení, jehož obsah nepřesahuje 1 kg nebo 1 litr.

V případě odběru vzorků z baleného krmiva sestávajícího z malých balení (např. < 250 g) závisí velikost dílčího vzorku na velikosti balení.

9.2.1    Volně ložené krmivo

Případně lze odebrat vzorky v průběhu manipulace se vzorkovanou partií (nakládka či vykládka).

9.2.2    Balené krmivo

Poté, co byl vybrán požadovaný počet balení k odebrání vzorků, který je stanoven v kapitole 5, odebere se část obsahu každého balení pomocí vzorkovače nebo lopatky. V případě potřeby se vzorky odeberou po vyprázdnění každého balení zvlášť.

9.2.3    Homogenní nebo homogenizovaná tekutá nebo polotekutá krmiva

Poté, co byl vybrán požadovaný počet balení k odebrání vzorků, jak je uvedeno v kapitole 5, jejich obsah se v případě potřeby homogenizuje a z každého balení se odebere určité množství.

Dílčí vzorky mohou být odebrány během stáčení obsahu.

9.2.4    Nehomogenizovaná tekutá nebo polotekutá krmiva

Poté, co byl vybrán požadovaný počet balení k odebrání vzorků, který je stanoven v kapitole 5, provede se odběr v různých vrstvách.

Vzorky mohou být odebrány rovněž během stáčení obsahu, avšak až po odstranění prvních frakcí.

V obou případech nesmí být celkový objem odebraných vzorků nižší než 10 litrů.

9.2.5    Krmiva v blocích a minerální lizy

Poté, co byl vybrán požadovaný počet bloků nebo lizů k odebrání vzorků, který je stanoven v kapitole 5, z každého bloku nebo lizu se odebere část. V případě podezření na nehomogenní blok nebo liz, lze jako vzorek odebrat celý blok nebo celý liz.

V případě bloků nebo lizů o hmotnosti vyšší než 1 kg se za dílčí vzorek považuje obsah jednoho bloku nebo jednoho lizu.

9.3    Příprava souhrnných vzorků

Dílčí vzorky se smíchají, aby tvořily jeden souhrnný vzorek.

9.4    Příprava konečných vzorků

Materiál v souhrnném vzorku se pečlivě promísí ( 4 ).

9.5    Balení vzorků

Nádoby nebo balení se zapečetí a opatří štítkem tak, aby je nebylo možno bez poškození pečeti otevřít. Celý štítek musí být součástí pečeti.

9.6    Zaslání vzorků do laboratoře

Vzorek se společně s údaji nutnými pro laboratorní zkoušení bez zbytečného prodlení zašle do určené zkušební laboratoře.

10.   PROTOKOL O ODBĚRU VZORKU

U každého vzorku musí být veden protokol, který umožňuje jednoznačně identifikovat každou vzorkovanou partii a její velikost.

Do protokolu se uvedou veškeré odchylky od postupu odběru vzorků podle tohoto nařízení.

Protokol se kromě úřední kontrolní laboratoře dá k dispozici provozovateli krmivářského podniku a/nebo laboratoři určené provozovatelem krmivářského podniku.

---

PŘÍLOHA II

OBECNÁ USTANOVENÍ O METODÁCH LABORATORNÍHO ZKOUŠENÍ KRMIV

A.   PŘÍPRAVA VZORKŮ PRO ZKOUŠENÍ

1.    Účel

Postupy popsané níže se týkají přípravy pro laboratorní zkoušení vzorků, které byly zaslány do kontrolních laboratoří po odběru podle ustanovení v příloze I.

Tyto laboratorní vzorky musí být připraveny tak, aby byly navážky stanovené v metodách laboratorního zkoušení homogenní a reprezentativní pro konečné vzorky.

2.    Předběžná opatření

Postup přípravy vzorku, podle něhož se má postupovat, závisí na tom, které metody laboratorního zkoušení se mají použít a které složky nebo látky se mají kontrolovat. Proto je velmi důležité zajistit, aby postup úpravy vzorku odpovídal použité metodě zkoušení a kontrolovaným složkám nebo látkám.

Veškeré nezbytné úkony musí být prováděny tak, aby se pokud možno zabránilo kontaminaci vzorku a změnám jeho složení.

Rozmělňování, míchání a prosévání se provádí okamžitě s minimálním vystavením vzorku vlivům vzduchu a světla. Nepoužívají se mlýnky a drtiče, jež by mohly vzorek znatelně zahřát.

Ruční rozmělňování se doporučuje v případě krmiv, která jsou obzvláště citlivá na teplo. Rovněž je třeba zajistit, aby zdrojem kontaminace nebyl samotný přístroj.

Pokud nelze úpravu provést bez zásadních změn obsahu vlhkosti ve vzorku, stanoví se obsah vlhkosti před úpravou a po úpravě na základě metody uvedené v části A přílohy III.

3.    Postup

3.1    Obecný postup

Testovaná část se odebírá z konečného vzorku. Dělení vzorku kvartací se nedoporučuje, protože testované části vzniklé tímto dělením mohou být zatíženy velkou chybou.

3.1.1    Krmiva, která mohou být rozmělněna ihned

3.1.2    Krmiva, která mohou být rozmělněna až po usušení

3.1.3    Tekutá nebo polotekutá krmiva

3.1.4    Ostatní krmiva

3.2    Zvláštní postup v případě vizuální prohlídky nebo zkoumání mikroskopem nebo v případě, že je celý souhrnný vzorek homogenizovaný

4.    Skladování vzorků

Vzorky musí být skladovány při takové teplotě, která nezmění jejich složení. Vzorky určené k laboratornímu zkoušení na obsah vitaminů nebo látek, které jsou obzvláště citlivé na světlo, se skladují tak, aby nedošlo k nepříznivému ovlivnění vzorku působením světla.

B.   USTANOVENÍ O CHEMIKÁLIÍCH A PŘÍSTROJÍCH POUŽÍVANÝCH PŘI METODÁCH LABORATORNÍHO ZKOUŠENÍ

C.   UPLATŇOVÁNÍ METOD LABORATORNÍHO ZKOUŠENÍ A VYJADŘOVÁNÍ VÝSLEDKŮ

1.    Extrakční postup

Některé metody vyžadují zvláštní extrakční postup. Obecně platí, že jiné extrakční postupy, než jsou postupy uvedené v příslušných metodách, mohou být použity jen pod podmínkou, že se prokáže, že použitý extrakční postup má rovnocennou extrakční účinnost na zkoušenou matrici jako postup uvedený v příslušné metodě.

2.    Postup čištění

Některé metody vyžadují zvláštní postup čištění. Obecně platí, že jiné postupy čištění, než jsou postupy uvedené v příslušných metodách, mohou být použity jen pod podmínkou, že se prokáže, že použitý postup čištění vykazuje rovnocenné výsledky zkoušky pro zkoušenou matrici jako postup uvedený v příslušné metodě.

3.    Počet stanovení

Pokud je v případě laboratorního zkoušení na nežádoucí látky výsledek prvního stanovení výrazně (> 50 %) nižší než specifikace, jež má být zkontrolována, není zapotřebí žádných dalších stanovení, jestliže byly dodrženy vhodné postupy kontroly kvality. V ostatních případech je opakované laboratorní zkoušení (druhé stanovení) nutná k vyloučení možnosti vnitřní křížové kontaminace nebo náhodného promíchání vzorků. K ověření souladu se použije střední hodnota těchto dvou stanovení se zohledněním nejistoty měření.

Pokud v případě kontroly deklarovaného obsahu látky nebo složky výsledek prvního stanovení potvrdí deklarovaný obsah, tj. jestliže výsledek zkoušky spadá do přijatelného rozsahu odchylky od deklarovaného obsahu, není zapotřebí žádných dalších stanovení, jestliže byly dodrženy vhodné postupy kontroly kvality. V ostatních případech je opakované laboratorní zkoušení (druhé stanovení) nutná k vyloučení možnosti vnitřní křížové kontaminace nebo náhodného promíchání vzorků. K ověření souladu se použije střední hodnota těchto dvou stanovení se zohledněním nejistoty měření.

V některých případech je tento přijatelný rozsah odchylky stanoven v právních předpisech: např. v nařízení Evropského parlamentu a Rady (ES) č. 767/2009 ze dne 13. července 2009 o uvádění na trh a používání krmiv, o změně nařízení (ES) č. 1831/2003 a o zrušení směrnice Rady 79/373/EHS, směrnice Komise 80/511/EHS, směrnic Rady 82/471/EHS, 83/228/EHS, 93/74/EHS, 93/113/ES a 96/25/ES a rozhodnutí Komise 2004/217/ES ( 7 ).

4.    Zpráva o použité metodě laboratorního zkoušení

Použitá metoda laboratorního zkoušení se uvede do protokolu o laboratorním zkoušení.

5.    Zpráva o výsledku laboratorního zkoušení

Výsledek laboratorního zkoušení se vyjadřuje způsobem, který je stanoven v metodě laboratorního zkoušení, příslušným počtem platných číslic a v případě potřeby se opraví v závislosti na obsahu vlhkosti v konečném vzorku před úpravou.

6.    Nejistota měření a výtěžnost v případě zkoušky na nežádoucí látky

Pokud jde o nežádoucí látky ve smyslu směrnice 2002/32/ES, považuje se produkt určený ke krmení za nevyhovující stanovenému maximálnímu obsahu, pokud se na základě výsledku laboratorního zkoušení krmiva s obsahem vlhkosti 12 % pokládá maximální obsah za překročený, přičemž se zohlední rozšířená nejistota měření a korekce na výtěžnost. K posouzení shody se použije zkoušená koncentrace poté, co byla korigovaná na výtěžnost, a poté, co byla odečtena rozšířená nejistota měření. Tento postup se použije pouze v případě, že metoda laboratorního zkoušení umožňuje odhad nejistoty měření a korekci na výtěžnost (nelze jej použít např. v případě mikroskopického zkoušení).

Výsledek laboratorního zkoušení (pokud použitá metoda laboratorního zkoušení umožňuje odhad nejistoty měření a výtěžnosti) se uvede v této podobě:

Pokud je však výsledek laboratorního zkoušení výrazně (> 50 %) nižší než specifikace, jež má být zkontrolována, a pokud byly dodrženy vhodné postupy kontroly kvality a pokud zkouška slouží jen pro účely kontroly dodržení ustanovení právních předpisů, může být podána zpráva o výsledku zkoušky bez korekce na výtěžnost a v těchto případech lze vynechat údaje o výtěžnosti a o nejistotě měření.

▼B

---

PŘÍLOHA III

METODY ZKOUŠENÍ PRO KONTROLU SLOŽENÍ KRMNÝCH SUROVIN A KRMNÝCH SMĚSÍ

A.   STANOVENÍ OBSAHU VLHKOSTI

1.   Účel a rozsah

Tato metoda umožňuje stanovení obsahu vlhkosti v krmivech. V případě, že krmivo obsahuje těkavé látky, např. organické kyseliny, je třeba si uvědomit, že spolu s obsahem vlhkosti se stanoví i značné množství těkavých látek.

Nevztahuje se na zkoušení mléčných výrobků jako krmných surovin, zkoušení minerálních látek a směsí, které jsou tvořeny převážně minerálními látkami, zkoušení živočišných a rostlinných tuků a olejů ani na zkoušení olejnatých semen a plodů.

2.   Princip

Vzorek se suší za předepsaných podmínek, které závisejí na druhu krmiva. Úbytek hmotnosti se stanoví vážkově. U pevných krmiv s vysokým obsahem vlhkosti je nutné provést předsoušení.

3.   Přístroje a pomůcky

4.   Postup

Poznámka

:

Postupy uvedené v tomto bodě musí být provedeny ihned po otevření obalů vzorků. Zkouška musí být provedena nejméně dvakrát.

4.1   Příprava

4.1.1    Krmiva mimo krmiva uvedená v bodech 4.1.2 a 4.1.3

Odebere se minimálně 50 g vzorku. Pokud je to nutné, vzorek se rozemele takovým způsobem, aby nedošlo ke změně obsahu vlhkosti (viz bod 6).

4.1.2    Obiloviny a krupky

Odebere se minimálně 50 g vzorku. Toto množství se rozemele tak, aby alespoň 50 % částic prošlo sítem s oky o velikosti 0,5 mm a zbytek na sítě s kulatými oky velikosti 1 mm byl maximálně 10 %.

4.1.3    Tekutá nebo pastovitá krmiva a krmiva, která jsou složena převážně z tuků

Odebere se 25 g vzorku s přesností na 10 mg, smíchá se s odpovídajícím množstvím předem vysušeného písku zváženého s přesností na 10 mg, až vznikne homogenní hmota.

4.2   Sušení

4.2.1    Krmiva mimo krmiva uvedená v bodech 4.2.2 a 4.2.3

Vysoušečka s víčkem (3.3) se zváží s přesností na 1 mg. Do předem zvážené vysoušečky se naváží asi 5 g vzorku s přesností na 1 mg a rovnoměrně se rozprostře. Vysoušečka se po sejmutí víčka umístí do laboratorní sušárny předehřáté na 103 oC. Aby se zabránilo příliš rychlému poklesu teploty, je třeba vložit vysoušečku do sušárny co nejrychleji. Sušení probíhá 4 hodiny, přičemž doba sušení se počítá od okamžiku, kdy teplota v laboratorní sušárně opět dosáhla 103 oC. Potom se vysoušečka uzavře víčkem, vyjme ze sušárny, nechá vychladnout 30–45 minut v exsikátoru (3.6) a nakonec se zváží s přesností na 1 mg.

U krmiv, která se skládají převážně z olejů a tuků, se suší ještě dalších 30 minut při teplotě 130 oC a znovu se zváží. Rozdíl mezi těmito dvěma váženími nesmí být větší než 0,1 % vlhkosti.

4.2.2    Obiloviny, mouka, kroupy a krupice

Vysoušečka s víčkem (3.3) se zváží s přesností na 0,5 mg. Do předem zvážené vysoušečky se naváží asi 5 g rozemletého vzorku s přesností na 1 mg a rovnoměrně se rozprostře. Vysoušečka se po sejmutí víčka umístí do laboratorní sušárny předehřáté na 130 oC. Aby se zabránilo příliš rychlému poklesu teploty, je třeba vložit vysoušečku do sušárny co nejrychleji. Sušení probíhá 2 hodiny, přičemž doba sušení se počítá od okamžiku, kdy teplota v laboratorní sušárně opět dosáhla 130 oC. Potom se vysoušečka uzavře víčkem, vyjme ze sušárny, nechá vychladnout 30–45 minut v exsikátoru (3.6) a nakonec se zváží s přesností na 1 mg.

Vysoušečka s víčkem (3.3) se zváží s přesností na 0,5 mg. Do předem zvážené vysoušečky se naváží asi 5 g vzorku s přesností na 1 mg a rovnoměrně se rozprostře. Vysoušečka se po sejmutí víčka umístí do laboratorní vakuové sušárny (3.5) předehřáté na 80–85 oC. Aby se zabránilo příliš rychlému poklesu teploty, je třeba vložit vysoušečku do sušárny co nejrychleji.

Tlak se upraví na 100 torrů a vzorek se suší při tomto tlaku 4 hodiny buď pomocí přívodu horkého a suchého vzduchu, nebo pomocí vysoušecího prostředku (přibližně 300 g na 20 vzorků). V tomto druhém případě se přeruší spojení s vakuovou pumpou, jakmile bylo dosaženo předepsaného tlaku. Doba sušení se počítá od okamžiku, kdy bylo v laboratorní sušárně opět dosaženo teploty 80–85 oC. Potom se tlak v sušárně opatrně upraví zpět na atmosférický tlak. Po otevření vakuové laboratorní sušárny se vysoušečka ihned uzavře víčkem, vyjme ze sušárny, nechá vychladnout 30–45 minut v exsikátoru (3.6) a nakonec se zváží s přesností na 1 mg. Vysoušečka se suší dalších 30 minut ve vakuové laboratorní sušárně při teplotě 80–85 oC a znovu se zváží. Rozdíl mezi těmito dvěma váženími nesmí být větší než 0,1 % vlhkosti.

4.3   Předsoušení

4.3.1    Krmiva mimo krmiva uvedená v bodě 4.3.2

Pevná krmiva s vysokým obsahem vlhkosti, která způsobuje obtíže při mletí, se musí předsoušet takto:

Naváží se 50 g nerozemletého vzorku s přesností na 10 mg (v případě potřeby se provede hrubé rozemletí u lisovaných krmiv nebo u krmiv v kusech) do vhodné nádoby (např. do hliníkové misky 20 × 12 cm s okrajem 0,5 cm). Suší se v laboratorní sušárně při teplotě 60–70 oC až do snížení obsahu vlhkosti na hodnotu 8–12 %. Vysoušečka se vyjme ze sušárny, nechá se 1 hodinu volně chladit a pak se zváží s přesností na 10 mg. Podle druhu krmiva se pak rozemele způsobem uvedeným v bodě 4.1.1 a suší způsobem uvedeným v bodě 4.2.1 nebo 4.2.3.

4.3.2    Obiloviny

Zrna, jejichž obsah vlhkosti je vyšší než 17 %, se musí předsoušet takto:

Do vhodné nádoby (např. do hliníkové misky 20 × 12 cm s okrajem 0,5 cm) se naváží 50 g nerozemletých zrn s přesností na 10 mg. Suší se v laboratorní sušárně po dobu 5–7 minut při teplotě 130 oC. Vyjme se ze sušárny, nechá se 2 hodiny volně chladit a pak se zváží s přesností na 10 mg. Pak se ihned rozemele způsobem uvedeným v bodě 4.1.2 a suší způsobem uvedeným v bodě 4.2.2.

5.   Výpočet a vyjádření výsledků

Obsah vlhkosti (X) jako procento vzorku se vypočte podle následujícího vzorce:

5.1   Sušení bez předsoušení

kde:

m

=

počáteční hmotnost zkoušeného vzorku v gramech

m0

=

hmotnost sušeného zkoušeného vzorku v gramech.

5.2   Sušení s předsoušením

kde:

m

=

počáteční hmotnost zkoušeného vzorku v gramech

m1

=

hmotnost zkoušeného vzorku po předsoušení v gramech

m2

=

hmotnost zkoušeného vzorku po rozemletí nebo rozmělnění v gramech

m0

=

hmotnost sušeného zkoušeného vzorku v gramech.

5.3   Opakovatelnost

Rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení obsahu vlhkosti provedených na stejném vzorku nesmí překročit absolutní hodnotu vlhkosti 0,2 %.

6.   Poznámka

Pokud je nutné provést rozemletí vzorku a pokud se na základě toho musí počítat se změnou obsahu vlhkosti materiálu, je nutno korigovat výsledky zkoušky jednotlivých složek krmiva podle obsahu vlhkosti vzorku v jeho původním stavu.

B.   STANOVENÍ OBSAHU VLHKOSTI V ŽIVOČIŠNÝCH A ROSTLINNÝCH TUCÍCH A OLEJÍCH

1.   Účel a rozsah

Tato metoda umožňuje stanovení obsahu vody a těkavých látek v živočišných a rostlinných tucích a olejích.

2.   Princip

Vzorek se vysuší do konstantní hmotnosti při 103 oC (úbytek hmotnosti mezi dvěma po sobě následujícími váženími musí být maximálně 1 mg). Úbytek hmotnosti se stanoví vážkově.

3.   Přístroje a pomůcky

4.   Postup

Do misky (3.1), předem vysušené a zvážené, opatřené teploměrem (3.2) se naváží asi 20 g homogenizovaného vzorku s přesností na 1 mg. Zahřívá se na pískové lázni nebo na topné desce (3.3) za stálého promíchávání teploměrem tak, aby teplota během asi 7 minut dosáhla 90 oC.

Zahřívání se sníží a sleduje se intenzita tvorby bublinek, které stoupají ode dna misky. Teplota nesmí přesáhnout 105 oC. V důkladném míchání ode dna misky se pokračuje, dokud se nepřestanou tvořit bubliny.

Během zahřívání se vzorek několikrát zahřeje na 103 ± 2 oC a ochladí na 93 oC, aby se zajistilo úplné odstranění vlhkosti. Poté se nechá vychladnout na laboratorní teplotu v exsikátoru (3.4) a zváží se. Tato operace se opakuje, dokud není dosaženo úbytku hmotnosti mezi dvěma následujícími váženími nižšího než 2 mg.

Poznámka

:

Zvýšení hmotnosti vzorku po opakovaném zahřívání je způsobeno oxidací tuku. V tomto případě se výsledek počítá z vážení provedeného bezprostředně před tím, než se hmotnost začala zvyšovat.

5.   Výpočet a vyjádření výsledků

Obsah vlhkosti (X) jako procento vzorku se vypočte podle následujícího vzorce:

kde:

m

=

hmotnost zkoušeného vzorku v gramech

m1

=

hmotnost misky s obsahem před ohřevem v gramech

m2

=

hmotnost misky s obsahem po ohřevu v gramech

Výsledky nižší než 0,05 % musí být uváděny jako „nižší než 0,05 %“.

Opakovatelnost

Rozdíl ve vlhkosti mezi výsledky dvou paralelních stanovení provedených na stejném vzorku nesmí překročit 0,05 % v absolutní hodnotě.

C.   STANOVENÍ OBSAHU DUSÍKATÝCH LÁTEK

1.   Účel a rozsah

Tato metoda umožňuje stanovení obsahu dusíkatých látek v krmivech na základě stanovení obsahu dusíku metodou podle Kjeldahla.

2.   Princip

Vzorek se mineralizuje horkou kyselinou sírovou za přítomnosti katalyzátoru. Kyselý roztok se alkalizuje roztokem hydroxidu sodného. Amoniak se vydestiluje a jímá se do odměřeného množství kyseliny sírové a přebytek se titruje standardním roztokem hydroxidu sodného.

Uvolněný amoniak se případně vydestiluje do přebytku roztoku kyseliny borité a následně se titruje roztokem kyseliny chlorovodíkové nebo kyseliny sírové.

3.   Chemikálie

Pokud se použije kolorimetrická detekce bodu ekvivalence, do roztoků kyseliny borité se musí přidat methylčerveň a bromokresol. Pokud se připravuje 1 litr roztoku kyseliny borité, před úpravou objemu se přidá 7 ml roztoku methylčerveně (3.16) a 10 ml roztoku bromokresolové zeleně (3.17).

V závislosti na použité vodě se může pH jednotlivých roztoků kyseliny borité lišit. Často je nezbytná úprava pomocí malého množství zásadité látky, aby se získalo vhodné pH.

Poznámka

:

Přidání 3–4 ml NaOH (3.11) do 1 litru 10 g/l kyseliny borité obvykle představuje vhodnou úpravu. Roztok se skladuje při laboratorní teplotě a během skladování musí být chráněn před světlem a zdrojem amoniakových výparů.

Poznámka

:

Lze použít i jiné koncentrace odměrných roztoků (3.5, 3.6, 3.7, 3.10, 3.11 a 3.19), pokud je tato skutečnost korigována ve výpočtech. koncentrace se vždy vyjadřují s přesností na čtyři desetinná místa.

4.   Přístroje a pomůcky

Přístroje vhodné pro provedení mineralizace, destilace a titrace podle Kjeldahlovy metody.

5.   Postup

5.1   Mineralizace

Do mineralizační baňky se naváží 1 g vzorku s přesností na 0,001 g. Přidá se 15 g síranu draselného (3.1) a vhodné množství katalyzátoru (3.2) (0,3 –0,4 g oxidu měďnatého nebo 0,9 –1,2 g pentahydrátu síranu měďnatého, 25 ml kyseliny sírové (3.4) a několik granulí pemzy (3.12) a zamíchá se.

Baňka se zahřívá nejprve mírně a podle potřeby se občas zamíchá, dokud nedojde ke zuhelnatění hmoty a neustane pěnění; potom se intenzita zahřívání zvyšuje, dokud se kapalina ustáleně nevaří. Zahřívání je odpovídající, pokud vroucí kyselina kondenzuje na stěnách baňky. Nesmí docházet k přehřívání stěn baňky a k ulpívání organických částic na stěnách baňky.

Jakmile se roztok stane čirým a získá světle zelené zabarvení, pokračuje se v ohřevu ještě 2 hodiny a potom se ponechá vychladnout.

5.2   Destilace

Opatrně se přidá tolik vody, aby došlo k úplnému rozpuštění sulfátů. Nechá se vychladnout a potom se přidá několik granulí zinku (3.3), pokud je třeba. Dále se postupuje podle bodu 5.2.1 nebo 5.2.2.

5.2.1    Destilace do kyseliny sírové

Do předlohy destilačního zařízení se odměří přesně 25 ml kyseliny sírové (3.5) nebo (3.7) podle předpokládaného obsahu dusíku. Přidá se několik kapek methylčerveně (3.8).

Mineralizační baňka se připojí ke kondenzátoru destilačního přístroje a konec kondenzátoru se ponoří do kapaliny v předloze do hloubky nejméně 1 cm (viz poznámka 8.3). Do mineralizační baňky se zvolna přilije 100 ml hydroxidu sodného (3.9) tak, aby nedošlo ke ztrátám amoniaku (viz poznámka 8.1). Baňka se zahřívá, dokud se nepředestiluje veškerý amoniak.

5.2.2    Destilace do kyseliny borité

V případě manuální titrace amoniakového obsahu destilátu se použije níže popsaný postup. Pokud je destilační jednotka plně automatická a zahrnuje titraci amoniakového obsahu destilátu, dodrží se pokyny výrobce pro provoz destilační jednotky.

Předloha s obsahem 25–30 ml roztoku kyseliny borité (3.18) se umístí pod otvor kondenzátoru tak, že jeho vývod je ponořen pod hladinu přebytku roztoku kyseliny borité. Destilační jednotka se upraví na dávkování 50 ml roztoku hydroxidu sodného (3.9). S destilační jednotkou se pracuje podle pokynů výrobce a oddestiluje se amoniak uvolněný přidáním roztoku hydroxidu sodného. Destilát se jímá do roztoku kyseliny borité. Množství destilátu (doba destilace párou) závisí na množství dusíku ve vzorku. Je třeba dodržet pokyny výrobce.

Poznámka

:

V poloautomatické destilační jednotce se doplnění přebytku hydroxidu sodného a destilace párou provádí automaticky.

5.3   Titrace

Postupuje se podle bodu 5.3.1 nebo 5.3.2.

5.3.1    Kyselina sírová

Přebytek kyseliny sírové v předloze se titruje roztokem hydroxidu sodného (3.10 nebo 3.11) podle použité koncentrace kyseliny sírové do dosažení bodu ekvivalence.

5.3.2    Kyselina boritá

Obsah předlohy se titruje se standardním odměrným roztokem kyseliny chlorovodíkové (3.19) nebo se standardním odměrným roztokem kyseliny sírové (3.6) s použitím byrety a odečte se množství použitého titračního činidla.

Pokud se použije kolorimetrická detekce bodu ekvivalence, je bodu ekvivalence dosaženo při prvním zbarvení obsahu do růžova. Odečte se objem byretou s přesností na 0,05 ml. Bod ekvivalence bude zřetelnější při použití osvětlené magnetické míchačky nebo fotometrického detektoru.

Lze provést automaticky s použitím parního destilátoru s automatickou titrací.

Je třeba dodržet pokyny výrobce pro provoz konkrétního destilačního přístroje nebo destilačního/titračního přístroje.

Poznámka

:

Při použití automatického titračního systému začíná titrace ihned po zahájení destilace a použije se 1 % roztok kyseliny borité (3.18). Při použití plně automatické destilační jednotky lze automatickou titraci amoniaku provést rovněž pomocí detekce bodu ekvivalence s použitím potenciometrického systému pH. V tomto případě se použije automatický titrační přístroj s pH metrem. pH metr je správně kalibrován v rozsahu pH 4–7 podle běžných laboratorních postupů pro kalibraci pH. Takto bude pH bodu ekvivalence titrace dosaženo při hodnotě pH 4,6 , přičemž se jedná o nejstrmější skok na titrační křivce (inflexní bod).

5.4   Slepá zkouška

Pro potvrzení, že všechny použité chemikálie jsou prosté dusíku, se provede slepá zkouška (mineralizace, destilace a titrace) s 1 g sacharózy (3.14) místo vzorku.

6.   Výpočet a vyjádření výsledků

Výpočet se provede podle bodu 6.1 nebo 6.2.

6.1   Výpočet pro titraci podle bodu 5.3.1

Obsah dusíkatých látek vyjádřený v procentech hmotnosti se vypočítá podle následujícího vzorce:

kde:

V0

=

spotřeba NaOH (3.10 nebo 3.11) na slepou zkoušku v ml

V1

=

spotřeba NaOH (3.10 nebo 3.11) na titraci vzorku v ml

c

=

koncentrace hydroxidu sodného (3.10 nebo 3.11) v mol/l

m

=

hmotnost vzorku v g.

6.2   Výpočet pro titraci podle bodu 5.3.2

6.2.1    Titrace kyselinou chlorovodíkovou

Obsah dusíkatých látek vyjádřený v procentech hmotnosti se vypočítá podle následujícího vzorce:

kde:

m

=

hmotnost zkoušeného vzorku v g

c

=

koncentrace standardního odměrného roztoku hydroxidu sodného (3.19) v mol/l

V0

=

spotřeba kyseliny chlorovodíkové na slepou zkoušku v ml

V1

=

spotřeba kyseliny chlorovodíkové na zkušební vzorek v ml.

6.2.2    Titrace kyselinou sírovou

Obsah dusíkatých látek vyjádřený v procentech hmotnosti se vypočítá podle následujícího vzorce:

kde:

m

=

hmotnost zkušebního vzorku v g

c

=

koncentrace standardního odměrného roztoku kyseliny sírové (3.6) v mol/l

V0

=

spotřeba kyseliny sírové (3.6) na slepou zkoušku v ml

V1

=

spotřeba kyseliny sírové (3.6) na zkušební vzorek v ml.

7.   Verifikace metody

7.1   Opakovatelnost

Rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení provedených u stejného vzorku nesmí překročit:

7.2   Přesnost

Provede se zkouška (mineralizace, destilace a titrace) s 1,5 –2,0 g acetanilidu (3.13) a 1 g sacharózy (3.14); spotřeba kyseliny sírové (3.5) na 1 g acetanilidu je 14,80 ml. Výtěžnost musí být nejméně 99 %.

8.   Poznámky

D.   STANOVENÍ OBSAHU MOČOVINY

1.   Účel a rozsah

Tato metoda umožňuje stanovení obsahu močoviny v krmivech.

2.   Princip

Vzorek s čeřicím činidlem se rozmíchá ve vodě. Suspenze se přefiltruje. Obsah močoviny ve filtrátu se stanoví po přidání 4-dimethylaminobenzaldehydu (4-DMAB) spektrofotometricky při vlnové délce 420 nm.

3.   Chemikálie

4.   Přístroje a pomůcky

5.   Postup

5.1   Analýza vzorku

Do 500ml odměrné baňky se naváží 2 g vzorku ± 1 mg a přidá se 1 g aktivního uhlí (3.4). Přidá se 400 ml vody a 5 ml Carrezova činidla I (3.2), míchá se po dobu 30 sekund a přidá se 5 ml Carrezova činidla II (3.3). Míchá se po dobu třiceti minut na míchacím zařízení. Doplní se vodou po značku, promíchá a přefiltruje.

Do zkumavek se zabroušenými skleněnými zátkami se odpipetuje 5 ml čirého, bezbarvého filtrátu, přidá se 5 ml roztoku 4-DMAB (3.1) a promíchá. Zkumavky se vloží do vodní lázně nastavené na teplotu 20 oC (+/– 4 oC). Po patnácti minutách se změří absorbance roztoku na spektrofotometru při vlnové délce 420 nm. Porovná se slepou zkouškou roztoku činidel.

5.2   Kalibrační křivka

Do odměrných baněk na 100 ml se napipetuje 1, 2, 4, 5 a 10 ml roztoku močoviny (3.5) a doplní se po značku vodou. Z těchto roztoků se odpipetuje 5 ml, ke každému se přidá 5 ml roztoku 4-DMAB (3.1), homogenizuje se a změří se absorbance, jak je uvedeno výše, a porovná s kontrolním roztokem obsahujícím 5 ml 4-DMAB a 5 ml vody bez močoviny. Sestaví se kalibrační křivka.

6.   Výpočet a vyjádření výsledků

Stanoví se množství močoviny ve vzorku s použitím kalibrační křivky.

Výsledek se vyjádří jako procento vzorku.

7.   Poznámky

E.   STANOVENÍ OBSAHU TĚKAVÝCH DUSÍKATÝCH BÁZÍ

I.   MIKRODIFUZE

1.   Účel a rozsah

Tato metoda umožňuje stanovení obsahu těkavých dusíkatých látek vyjádřených jako amoniak v krmivech.

2.   Princip

Vzorek se extrahuje vodou, roztok se vyčeří a přefiltruje. Těkavé dusíkaté báze se po přidání roztoku uhličitanu draselného vytěsní a mikrodifuzí se zachycují v roztoku kyseliny borité a titrují se kyselinou sírovou.

3.   Chemikálie

4.   Přístroje a pomůcky

5.   Postup

Do 200 ml odměrné baňky se naváží 10 g vzorku s přesností na 1 mg, přidá se 100 ml vody a míchá se 30 minut v míchacím zařízení. Pak se přidá 50 ml kyseliny trichloroctové (3.1), doplní vodou po značku, důkladně se protřepe a přefiltruje přes skládaný filtr.

Na střed Conwayovy misky se napipetuje 1 ml roztoku kyseliny borité (3.3), okolo ní po obvodu misky se napipetuje 1 ml přefiltrovaného vzorku. Miska se částečné zakryje víkem, potřeným tukem, pak se rychle přidá 1 ml nasyceného roztoku uhličitanu draselného (3.4) na obvod misky a miska se vzduchotěsně uzavře. Aby s jistotou došlo ke smíchání reagenčních činidel, je nutno miskou opatrně otáčet ve vodorovné poloze. Pak se nechá směs stát minimálně 4 hodiny při laboratorní teplotě nebo 1 hodinu při teplotě 40 oC.

Těkavé dusíkaté báze v roztoku kyseliny borité se pak titrují kyselinou sírovou (3.5) pomocí mikrobyrety (4.3).

Stejným způsobem se provede slepá zkouška bez zkoušeného vzorku.

6.   Výpočet a vyjádření výsledků

1 ml 0,01 mol/l H2SO4 odpovídá 0,34 mg amoniaku.

Výsledek se vyjádří jako procento vzorku.

Opakovatelnost

Rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení provedených na stejném vzorku nesmí přesáhnout:

7.   Poznámka

Obsahuje-li vzorek více než 0,6 % amoniaku, je nutno původní filtrát zředit.

CONWAYOVA MISKA

Poměr 1/1

II.   DESTILACE

1.   Účel a rozsah

Tato metoda umožňuje stanovení obsahu těkavých dusíkatých bází, vyjádřených jako amoniak, v rybích moučkách, které neobsahují prakticky žádnou močovinu. Metoda je použitelná pouze u obsahu amoniaku nižšího než 0,25 %.

2.   Princip

Vzorek se extrahuje vodou, roztok se vyčeří a přefiltruje. Těkavé dusíkaté báze se vytěsní za varu po přidání oxidu hořečnatého a zachycují se v předepsaném množství kyseliny sírové. Přebytek kyseliny sírové se titruje roztokem hydroxidu sodného.

3.   Chemikálie

4.   Přístroje a pomůcky

5.   Postup

Do 200 ml odměrné baňky se naváží 10 g vzorku s přesností na 1 mg, přidá se 100 ml vody a míchá se 30 minut v míchacím zařízení. Pak se přidá 50 ml roztoku kyseliny trichloroctové (3.1), doplní se vodou po značku, důkladně se protřepe a přefiltruje přes skládaný filtr.

Podle předpokládaného obsahu těkavých dusíkatých bází se odpipetuje odpovídající množství čirého filtrátu (obvykle 100 ml), zředí se na 200 ml a přidají se 2 g oxidu hořečnatého (3.2) a několik kapek odpěňovací emulze (3.3). Roztok musí na lakmusový papírek reagovat alkalicky; v opačném případě je nutno ještě přidat oxid hořečnatý (3.2). Dále se postupuje podle bodů 5.2 a 5.3 metody laboratorního zkoušení pro stanovení obsahu dusíkatých látek (část C této přílohy).

Stejným způsobem se provede slepá zkouška, ale bez zkoušeného vzorku.

6.   Výpočet a vyjádření výsledků

1 ml 0,05 mol/l H2SO4 odpovídá 1,7 mg amoniaku.

Výsledek se vyjádří jako procento vzorku.

Opakovatelnost

Rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení provedených na stejném vzorku nesmí překročit hodnotu 10 % amoniaku v relativní hodnotě.

F.   STANOVENÍ OBSAHU AMINOKYSELIN (KROMĚ TRYPTOFANU)

1.   Účel a rozsah

Tato metoda umožňuje stanovení obsahu volných (syntetických a přírodních) a celkových (peptidy vázané a volné) aminokyselin v krmivech za použití analyzátoru aminokyselin. Metoda je použitelná pro tyto aminokyseliny: cyst(e)in, methionin, lysin, threonin, alanin, arginin, kyselinu asparagovou, kyselinu glutamovou, glycin, histidin, isoleucin, leucin, fenylalanin, prolin, serin, tyrosin a valin.

Tato metoda nerozlišuje mezi solemi aminokyselin a nemůže také u aminokyselin rozlišovat mezi formami D a L. Není použitelná pro stanovení tryptofanu nebo hydroxyanalogů aminokyselin.

2.   Princip

2.1   Volné aminokyseliny

Volné aminokyseliny se extrahují zředěnou kyselinou chlorovodíkovou. Současně extrahované dusíkaté makromolekuly se vysráží kyselinou sulfosalicylovou a odstraní se filtrací. Přefiltrovaný roztok se upraví na pH 2,20 . Aminokyseliny se separují katexovou chromatografií a stanoví se po reakci s ninhydrinem fotometrickou detekcí při 570 nm.

2.2   Celkové aminokyseliny

Zvolený proces závisí na zkoumaných aminokyselinách. Cyst(e)in a methionin musí být před hydrolýzou oxidovány na kyselinu cysteovou a na methioninsulfon. Tyrosin se musí stanovovat v hydrolyzátech neoxidovaných vzorků. Ostatní aminokyseliny uvedené v bodě 1 mohou být stanovovány buď v oxidovaném, nebo v neoxidovaném vzorku.

Oxidace se provádí při 0 oC směsí kyseliny permravenčí a fenolu. Nadbytečné oxidační činidlo se rozloží dvojsíranem sodným. Oxidovaný nebo neoxidovaný vzorek se hydrolyzuje kyselinou chlorovodíkovou (3.20) po 23 hodin. Hydrolyzát se upraví na pH 2,20 . Aminokyseliny se separují katexovou chromatografií a stanovují se po reakci s ninhydrinem fotometrickou detekcí při 570 nm (440 nm pro prolin).

3.   Chemikálie

Musí být použita dvakrát destilovaná voda nebo voda obdobné jakosti (vodivost < 10 μS).

300 g NaOH (3.5) se rozpustí ve vodě a doplní na 1 litr.

40 g NaOH (3.5) se rozpustí ve vodě a doplní na 1 litr.

smíchá se 889 g kyseliny mravenčí (3.2) se 111 g vody a přidá se 4,73 g fenolu (3.3).

do 492 ml HCl (3.7) se přidá 1 g fenolu (3.3) a doplní se vodou na 1 litr.

60 g kyseliny 5-sulfosalicylové (3.6) se rozpustí ve vodě a doplní se vodou na 1 litr.

v malé kádince se smíchá 0,5 ml peroxidu vodíku (3.1) s 4,5 ml roztoku kyseliny mravenčí a fenolu (3.19). Ponechá se v klidu jednu hodinu při 20–30 oC, aby se utvořila kyselina permravenčí, před přidáním ke vzorku se směs ochladí v lázni s ledovou vodou (15 minut).

Pozor: je nutno zamezit kontaktu s kůží a používat ochranný oděv.

v přibližně 800 ml vody se rozpustí 19,61 g citronanu sodného (3.8), 5 ml thiodiglykolu (3.9), 1 g fenolu (3.3) a 16,50 ml HCl (3.7). pH se upraví na 2,20 . Doplní se vodou na 1 litr.

c = 2,5 μmol/ml pro každou aminokyselinu v kyselině chlorovodíkové.

Tento roztok lze obdržet i komerčně připravený.

Do 1 000 ml odměrné baňky se naváží 0,2115 g kyseliny cysteové (3.16.2) a 0,2265 g methioninsulfonu (3.16.3), rozpustí se v citrátovém tlumivém roztoku (3.24) a doplní se jím po značku. Skladuje se při teplotě pod 5 oC nejdéle 12 měsíců. Tento roztok se nepoužívá, pokud zásobní standardní roztok (3.27.1) obsahuje kyselinu cysteovou a methioninsulfon.

Do 250 ml odměrné baňky se naváží 0,6560 g norleucinu (3.13), rozpustí se v citrátovém tlumivém roztoku (3.24) a doplní se jím po značku. Skladuje se při teplotě pod 5 oC nejdéle 6 měsíců.

Roztok se kvantitativně převede do 50ml odměrné baňky, doplní se po značku citrátovým tlumivým roztokem (3.24) a zamíchá.

Skladuje se při teplotě pod 5 oC nejdéle 3 měsíce.

Viz také poznámka 9.1.

Skladuje se při teplotě pod 5 oC nejdéle 3 měsíce.

4.   Přístroje a pomůcky

Kolona se naplní sulfonovanou polystyrenovou pryskyřicí, která umožňuje vzájemné oddělení aminokyselin a oddělení od jiných ninhydrin-pozitivních látek. Průtok tlumivého roztoku a ninhydrinu zajišťují čerpadla se stálostí průtoku ±0,5 % po dobu zahrnující standardní kalibraci i zkoušku vzorku.

Některé analyzátory aminokyselin je možno použít také v případě, že hydrolyzát vykazuje koncentraci sodíkových iontů c = 0,8 mol/l a obsahuje zbytkovou kyselinu mravenčí z oxidačního kroku. Jiné analyzátory nezaručují uspokojivé oddělení určitých aminokyselin, obsahuje-li hydrolyzát nadbytečnou kyselinu mravenčí a/nebo vysoké koncentrace sodíkových iontů. V takovém případě se sníží objem kyseliny před úpravou pH odpařením hydrolyzátu na objem asi 5 ml. Odpaření se provádí ve vakuu při teplotě nejvýše 40 oC.

5.   Postup

5.1   Příprava vzorku

Vzorek se upraví mletím tak, aby prošel sítem s oky 0,5 mm. Vzorky s vysokou vlhkostí se musí před mletím vysušit na vzduchu při teplotě nepřesahující 50 oC nebo při zmrazení. Vzorky s vysokým obsahem tuku se před mletím extrahují petroletherem (3.12).

5.2   Stanovení volných aminokyselin v krmivech a v premixech

Do kónické baňky se naváží příslušné množství (1–5 g) upraveného vzorku (5.1) s přesností na 0,2 mg a přidá se 100,0 ml extrakční směsi (3.21). Směs se třepe 60 minut na mechanické třepačce nebo míchá na magnetickém míchacím zařízení (4.8). Po usazení sedimentu se odpipetuje 10,0 ml supernatantu do 100 ml kádinky.

Za stálého míchání se přidá 5,0 ml roztoku sulfosalicylové kyseliny (3.22) a pokračuje se v míchání na magnetickém míchacím zařízení dalších 5 minut. Supernantant se přefiltruje nebo odstředí tak, aby se odstranila veškerá sraženina. 10,0 ml odstředěného roztoku se přenese do 100 ml kádinky, pH se upraví na 2,20 pomocí roztoku hydroxidu sodného (3.18), potom se roztok převede pomocí citrátového tlumivého roztoku (3.24) do odměrné baňky přiměřené velikosti a doplní po značku tlumivým roztokem (3.24).

Použije-li se vnitřní standard, přidá se 1,00 ml roztoku vnitřního standardu (3.27.3) na každých 100 ml odstředěného roztoku a potom se doplní po značku tlumivým roztokem (3.24).

Dále se pokračuje podle bodu 5.4 – chromatografie.

Nejsou-li extrakty zkoušeny týž den, uchovávají se při teplotě pod 5 oC.

5.3   Stanovení celkových aminokyselin

5.3.1    Oxidace

0,1 –1 g upraveného vzorku (5.1) se odváží s přesností na 0,2 mg:

Navážka vzorku musí mít obsah dusíku asi 10 mg a obsah vlhkosti nepřesahující 100 mg.

Baňka/nádoba se umístí do lázně s ledovou vodou a ochladí se na 0 oC, potom se přidá 5 ml oxidační směsi (3.23) a promíchá se skleněnou lžící se zahnutou špičkou. Baňka/nádoba se uzavře i se lžící vzduchotěsnou fólií a vloží se i s lázní s ledovou vodou do chladničky a ponechá se v ní 16 hodin při 0 oC. Po 16 hodinách se vyjme z chladničky a přebytečné oxidační činidlo se rozloží přidáním 0,84 g disiřičitanu sodného (3.4).

Dále se postupuje podle bodu 5.3.2.1.

5.3.2    Hydrolýza

5.3.2.1    Hydrolýza oxidovaných vzorků

K oxidovanému vzorku připravenému podle bodu 5.3.1 se přidá 25 ml hydrolyzační směsi (3.20) tak, aby neulpěl žádný vzorek na stěnách nádoby ani na lžíci.

Podle zvoleného postupu hydrolýzy se pokračuje podle bodu 5.3.2.3 nebo 5.3.2.4.

5.3.2.2    Hydrolýza neoxidovaných vzorků

Do baňky s kulatým dnem o obsahu 100 ml nebo 250 ml (4.1) nebo do láhve o obsahu 100 ml se šroubovacím uzávěrem (4.2) se naváží 0,1 –1 g upraveného vzorku (5.1) s přesností na 0,2 mg. Navážka vzorku musí mít obsah dusíku asi 10 mg. Opatrně se přidá 25 ml hydrolyzační směsi (3.20) a smíchá se vzorkem. Dále se postupuje podle bodu 5.3.2.3 nebo 5.3.2.4.

5.3.2.3    Otevřená hydrolýza

Ke směsi v baňce (připravené podle bodu 5.3.2.1 nebo 5.3.2.2) se přidají 3 skleněné kuličky a směs se uvede do mírného varu pod zpětným chladičem na dobu 23 hodin. Po skončení hydrolýzy se zpětný chladič promyje 5 ml citrátového tlumivého roztoku (3.24). Baňka se odpojí a ochladí se v ledové lázni.

Dále se postupuje podle bodu 5.3.3.

5.3.2.4    Uzavřená hydrolýza

Baňka se směsí připravenou podle bodu 5.3.2.1 nebo 5.3.2.2 se umístí do sušárny (4.3) při 110 oC. Aby se během první hodiny zabránilo narůstání tlaku (v důsledku vyvíjení plynných látek) a aby nedošlo k výbuchu, položí se šroubovací uzávěr volně na baňku. Nádoba se neuzavírá. Po uplynutí jedné hodiny se uzávěr zašroubuje a uzavřená baňka se ponechá v sušárně (4.3) 23 hodin. Po skončení hydrolýzy se baňka vyjme ze sušárny, opatrně se odšroubuje uzávěr a baňka se postaví do lázně s ledovou vodou. Nechá se vychladnout.

Podle zvoleného postupu pro úpravu pH (5.3.3) se obsah baňky kvantitativně převede pomocí citrátového tlumivého roztoku (3.24) do 250ml kádinky nebo do 250ml baňky s kulatým dnem.

Dále se postupuje podle bodu 5.3.3.

5.3.3    Úprava pH

Podle toho, jakou toleranci k sodíku má analyzátor aminokyselin (4.9), postupuje se při úpravě pH podle bodu 5.3.3.1 nebo 5.3.3.2.

5.3.3.1    Pro chromatografické systémy (4.9) vyžadující nízkou koncentraci sodíku

Pokud analyzátor aminokyselin vyžaduje nízkou koncentraci sodíku (má-li se snížit obsah kyselin), doporučuje se použít vnitřní zásobní standardní roztok (3.27.3).

V takovém případě se před odpařováním přidají do hydrolyzátu 2,00 ml vnitřního zásobního standardního roztoku (3.27.3).

Do hydrolyzátu připraveného podle bodu 5.3.2.3 nebo 5.3.2.4 se přidají 2 kapky 1-oktanolu (3.15).

Na rotační odparce (4.7) se sníží objem na 5–10 ml za vakua při 40 oC. Pokud by se objem při odpařování snížil pod 5 ml, hydrolyzát je třeba odstranit a zkoušku zahájit znovu.

pH se upraví na 2,20 roztokem hydroxidu sodného (3.18) a dále se postupuje podle bodu 5.3.4.

5.3.3.2    Pro všechny ostatní analyzátory aminokyselin (4.9)

Hydrolyzáty připravené podle bodu 5.3.2.3 nebo 5.3.2.4 se částečně zneutralizují opatrným přidáním 17 ml roztoku hydroxidu sodného (3.17) za stálého míchání a při zaručené teplotě pod 40 oC.

pH se upraví na 2,20 roztokem hydroxidu sodného (3.17) a nakonec roztokem hydroxidu sodného (3.18) při laboratorní teplotě. Dále se postupuje podle bodu 5.3.4.

5.3.4    Roztok vzorku pro chromatografii

Hydrolyzát (5.3.3.1 nebo 5.3.3.2) s upraveným pH se kvantitativně převede pomocí citrátového tlumivého roztoku (3.24) do 200 ml odměrné baňky a doplní se po značku tlumivým roztokem (3.24).

Nebyl-li dosud použit vnitřní standard, přidají se 2,00 ml vnitřního standardu (3.27.3) a potom se doplní po značku citrátovým tlumivým roztokem (3.24). Důkladně se promíchá.

Dále se pokračuje v chromatografii (5.4).

Nejsou-li roztoky vzorků zkoušeny týž den, uchovávají se při teplotě pod 5 oC.

5.4   Chromatografie

Před chromatografií musí mít extrakt (5.2) nebo hydrolyzát (5.3.4) laboratorní teplotu. Směs se protřepe a potřebné množství se přefiltruje membránovým filtrem 0,22 μm (4.5). Výsledný čirý roztok se podrobí katexové chromatografii s použitím analyzátoru aminokyselin (4.9).

Nástřik lze provést ručně nebo automaticky. Přitom je důležité, aby se do kolony přidávalo stejné množství roztoku ± 0,5 % pro zkoušení standardů a vzorků s výjimkou případu, kdy je použit vnitřní standard. Rovněž poměr sodíku a aminokyselin by měl být v standardních roztocích a v roztocích vzorků co možná nejpodobnější.

Frekvence kalibrace závisí hlavně na stabilitě ninhydrinového činidla a analytického systému. Standard nebo vzorek se ředí citrátovým tlumivým roztokem (3.24) tak, aby plocha píku standardu tvořila 30–200 % plochy píku roztoku vzorků pro jednotlivé aminokyseliny.

Chromatografie aminokyselin se mírně liší v závislosti na typu použitého analyzátoru a použitého ionexu. Zvolený systém musí být schopen oddělit jednotlivé aminokyseliny od sebe navzájem i od ostatních ninhydrin-pozitivních materiálů. V rozsahu svého působení musí chromatografický systém lineárně reagovat na změny objemů aminokyselin přidaných do kolony.

Při zkoušení equimolárního roztoku (zkoušených aminokyselin) by mělo být při chromatografii dosaženo níže uvedených poměrů sedla k vrcholu píku. Tento equimolární roztok musí obsahovat nejméně 30 % maximálního obsahu jednotlivých aminokyselin, což může být přesně měřeno na použitém analyzátoru aminokyselin (4.9).

Při separaci threoninu a serinu nesmí poměr výšek sedla a vrcholu nižšího z píku překrývajících se aminokyselin na chromatogramu přesahovat 2 : 10 (pokud se stanovuje pouze cyst(e)in, methionin, threonin a lysin, je stanovení nepříznivě ovlivněno nedostatečnou separací od přilehlých píků). Pro všechny ostatní aminokyseliny musí být separace lepší než 1 : 10.

Systém musí zaručit, že lysin bude separován od „lysinových náhražek“ a ornithinu.

6.   Výpočet a vyjádření výsledků

Plocha píků vzorku a standardu se měří pro každou jednotlivou aminokyselinu a vypočítává se množství (X) aminokyseliny v g na kg vzorku.

Je-li použit vnitřní standard, násobí se výsledek:

A

=

plocha píku hydrolyzátu nebo extraktu

B

=

plocha píku kalibračního standardního roztoku

C

=

plocha píku vnitřního standardu v hydrolyzátu nebo v extraktu

D

=

plocha píku vnitřního standardu v kalibračním standardním roztoku

M

=

molekulární hmotnost stanovované aminokyseliny

c

=

koncentrace standardu v μmol/ml

m

=

hmotnost navážky vzorku v g (korigovaná na původní hmotnost, pokud je vzorek vysušen nebo odtučněn)

V

=

celkový objem hydrolyzátu (5.3.4) v ml nebo celkový objem zředěného extraktu (6.1)

Cystin a cystein se v hydrolyzátech oxidovaného vzorku stanovují jako kyselina cysteová, ale vypočítávají se jako cystin (C6H12N2O4S2, MV 240,30 g/mol) s použitím MV 120,15 g/mol (= 0,5 × 240,30 g/mol).

Methionin se v hydrolyzátech oxidovaného vzorku stanovuje jako methioninsulfon, ale vypočítává se jako methionin s použitím MV methioninu: 149,21 g/mol.

Přidaný volný methionin se stanovuje po extrakci jako methionin, pro výpočet se použije stejná MV.

V

=

objem výsledného extraktu.

7.   Ověření metody

Tato metoda byla vyzkoušena porovnáním na mezinárodní úrovni v roce 1990 při použití čtyř různých krmiv (krmná směs pro prasata, kombinované krmivo pro brojlery, proteinový koncentrát, premix). Po vyloučení odlehlých hodnot jsou výsledky středních a standardních odchylek uvedeny v následujících tabulkách:

7.1   Opakovatelnost

Opakovatelnost vyjádřená jako „vnitrolaboratorní standardní odchylka“ je uvedena v následujících tabulkách:

7.2   Reprodukovatelnost

Výsledky pro mezilaboratorní standardní odchylku vyplývající z výše uvedeného srovnání jsou uvedeny v následující tabulce:

8.   Použití referenčních materiálů

Správné použití uvedené metody se ověřuje opakovaným měřením certifikovaných referenčních materiálů, jsou-li k dispozici. Doporučuje se kalibrace certifikovanými kalibračními roztoky aminokyselin.

9.   Poznámky

Lineární rozsah přístroje je nutno zkontrolovat pro všechny aminokyseliny.

Standardní roztok se ředí citrátovým tlumivým roztokem tak, aby se dosáhlo ploch píků uprostřed tohoto rozsahu.

G.   STANOVENÍ OBSAHU TRYPTOFANU

1.   Účel a rozsah

Tato metoda umožňuje stanovení obsahu celkového a volného tryptofanu v krmivech. Nerozlišuje mezi D- a L- formou.

2.   Princip

Pro stanovení celkového tryptofanu se vzorek hydrolyzuje za alkalických podmínek nasyceným roztokem hydroxidu barnatého při 110 oC po dobu 20 hodin. Po hydrolýze se přidává vnitřní standard.

Pro stanovení volného tryptofanu se vzorek extrahuje za mírně kyselých podmínek v přítomnosti vnitřního standardu.

Tryptofan a vnitřní standard se stanoví v hydrolyzátu nebo extraktu metodou HPLC s fluorescenční detekcí.

3.   Chemikálie

40,0 g NaOH (3.5) se rozpustí ve vodě a vodou (3.1) se doplní na 1 litr.

492 ml HCl (3.7) se doplní vodou na 1 litr.

82 ml HCl (3.7) se doplní vodou na 1 litr.

8,2 ml HCl (3.7) se doplní vodou na 1 litr.

34 ml kyseliny fosforečné (3.6) se doplní vodou (3.1) na 1 litr.

v 500 ml odměrné baňce se rozpustí 0,2553 g tryptofanu (3.2) v kyselině chlorovodíkové (3.13) a doplní se jí po značku. Skladuje se při –18 oC nejdéle 4 týdny.

v 500 ml odměrné baňce se rozpustí 0,2728 g α-methyl-tryptofanu (3.3) v kyselině chlorovodíkové (3.13) a doplní se jí po značku. Skladuje se při –18 oC nejdéle 4 týdny.

2,00 ml koncentrovaného roztoku tryptofanu (3.15) a 2,00 ml koncentrovaného roztoku vnitřního standardu α-methyl-tryptofanu (3.16) se zředí vodou (3.1) a methanolem (3.8) přibližně na stejný objem a stejnou koncentraci methanolu (10–30 %) jako v konečném hydrolyzátu.

Roztok musí být připravován čerstvý před použitím.

Během přípravy musí být roztok chráněn před slunečním světlem.

4.   Přístroje a pomůcky

5.   Postup

5.1   Příprava vzorků

Vzorek se upraví mletím tak, aby prošel sítem s oky 0,5 mm. Vzorky s vysokým obsahem vlhkosti musí být před mletím předsušeny buď na vzduchu při teplotě do 50 oC, nebo při zmrazení. Vzorky s vysokým obsahem tuku se před mletím extrahují petroletherem (3.9).

5.2   Stanovení volného tryptofanu (extrakt)

Vhodné množství (1–5 g) upraveného vzorku (5.1) se naváží s přesností na 1 mg do kónické baňky. Přidá se 100,0 ml roztoku kyseliny chlorovodíkové (3.13) a 5,00 ml koncentrovaného roztoku vnitřního standardu (3.16). Směs se třepe nebo míchá 60 minut na mechanické třepačce nebo magnetickém míchacím zařízení (4.7). Sediment se nechá usadit a odpipetuje se 10,0 ml supernatantu do kádinky. Přidá se 5 ml roztoku kyseliny fosforečné (3.14). pH se upraví roztokem hydroxidu sodného (3.10) na 3,0 . Přidá se tolik methanolu (3.8), aby jeho konečná koncentrace v roztoku byla 10–30 %. Roztok se převede do odměrné baňky vhodného objemu a zředí se vodou na objem potřebný pro chromatografické stanovení (přibližně stejný objem, jako mají kalibrační standardní roztoky (3.17)).

Před nástřikem na kolonu HPLC se přefiltruje několik ml roztoku přes 0,45 μm membránový filtr (4.5). Dále se postupuje podle bodu 5.4 – chromatografie.

Standardní roztok a extrakty je nutno chránit před přímým slunečním světlem. Pokud není možné provést zkoušku tentýž den, extrakty lze skladovat při 5 oC nejvýše tři dny.

5.3   Stanovení celkového tryptofanu (hydrolyzát)

Do polypropylenové nádoby (4.4) se naváží 0,1 –1 g upraveného vzorku (5.1) s přesností na 0,2 mg. Obsah dusíku v navážce vzorku je asi 10 mg. Přidá se 8,4 g oktahydrátu hydroxidu barnatého (3.4) a 10 ml vody. Promíchá se ponorným mixerem (4.8) nebo na magnetickém míchacím zařízení (4.7). Magnet s teflonovým povrchem se ponechá ve směsi. Stěny nádoby se opláchnou 4 ml vody. Nádoba se uzavře a víčko se volně dotáhne. Uzavřená nádoba se umístí na 30–60 minut do autoklávu (4.6) s vroucí vodou a párou. Potom se autokláv uzavře a směs se hydrolyzuje 20 hodin při teplotě 110 (± 2) oC.

Před otevřením autoklávu se sníží teplota pod 100 oC. Aby se zabránilo krystalizaci Ba(OH)2 . 8 H2O, přidá se k horké směsi 30 ml vody o laboratorní teplotě. Mírně se zamíchá nebo protřepe. Přidají se 2,00 ml roztoku koncentrovaného vnitřního standardu α-methyl-tryptofanu (3.16). Nádoba se vychladí 15 minut ve vodní lázni s ledem.

Dále se přidá 5 ml roztoku kyseliny fosforečné (3.14). Nádoba se ponechá v ledové lázni a za stálého míchání se neutralizuje roztokem kyseliny chlorovodíkové (3.11) a potom se pH upraví roztokem kyseliny chlorovodíkové (3.12) na hodnotu 3,0 . Přidá se tolik methanolu, aby jeho výsledná koncentrace v konečném objemu byla 10–30 %. Roztok se převede do odměrné baňky vhodného objemu a zředí se vodou na stanovený objem, který je nutný pro chromatografické stanovení (např. 100 ml). Přídavek methanolu nesmí způsobit tvorbu sraženiny.

Před nástřikem na kolonu HPLC se přefiltruje několik ml roztoku přes 0,45 μm membránový filtr (4.5). Dále se postupuje podle bodu 5.4 – chromatografie.

Standardní roztok a hydrolyzáty je nutno chránit před přímým slunečním světlem. Pokud není možné provést zkoušku tentýž den, hydrolyzáty lze skladovat při 5 oC nejvýše tři dny.

5.4   Stanovení HPLC

Následující podmínky izokratické eluce jsou pouze doporučené; mohou být použity jiné podmínky za předpokladu, že poskytují rovnocenné výsledky (viz poznámky 9.1 a 9.2):

6.   Výpočet a vyjádření výsledků

Obsah tryptofanu (X) v g na 100 g vzorku se vypočte podle následujícího vzorce:

A

=

plocha píku vnitřního standardu v kalibračním standardním roztoku (3.17)

B

=

plocha píku tryptofanu v extraktu (5.2) nebo hydrolyzátu (5.3)

V1

=

objem koncentrovaného roztoku tryptofanu (3.15) přidaného do kalibračního roztoku (3.17) v ml (2 ml)

c

=

koncentrace tryptofanu v koncentrovaném roztoku tryptofanu (3.15) přidaném do kalibračního roztoku (3.17) v μmol/ml (= 2,50 )

V2

=

objem koncentrovaného roztoku vnitřního standardu (3.16) přidaný při extrakci (5.2) (= 5,00 ml) nebo do hydrolyzátu (5.3) v ml (= 2,00 ml)

C

=

plocha píku vnitřního standardu v extraktu (5.2) nebo hydrolyzátu (5.3)

D

=

plocha píku tryptofanu v kalibračním standardním roztoku (3.17)

V3

=

objem koncentrovaného roztoku vnitřního standardu (3.16) přidaného do kalibračního standardního roztoku (3.17) v ml (= 2,00 ml)

m

=

hmotnost navážky vzorku v g (korigovaná na původní hmotnost, pokud byl vzorek vysušen a/nebo odtučněn)

M

=

molekulární hmotnost tryptofanu (= 204,23 g/mol).

7.   Opakovatelnost

Rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení provedených na stejném vzorku nesmí překročit 10 % relat. z hodnoty nejvyššího výsledku.

8.   Výsledky kruhových testů

ES uspořádala kruhové testy (4. porovnání) pro tři vzorky, které byly zkoušeny ve 12 laboratořích, aby byl ověřen postup stanovení celkového tryptofanu (hydrolýza). Každý vzorek byl zkoušen pětkrát. Výsledky jsou uvedeny v následující tabulce:

L

=

počet laboratoří, které poskytly výsledky

n

=

počet jednotlivých výsledků po vyloučení odlehlých hodnot (určených Cochranovým a Dixonovým testem)

sr

=

standardní odchylka opakovatelnosti

SR

=

standardní odchylka reprodukovatelnosti

r

=

opakovatelnost

R

=

reprodukovatelnost

CVr

=

variační koeficient opakovatelnosti v %

CVR

=

variační koeficient reprodukovatelnosti v %

Další kruhový test ES (3. porovnání) byl proveden na dvou vzorcích ve 13 laboratořích pro ověření postupu extrakce volného tryptofanu. Každý vzorek byl zkoušen pětkrát. Výsledky jsou uvedeny v následující tabulce:

L

=

počet laboratoří, které poskytly výsledky

n

=

počet jednotlivých výsledků po vyloučení odlehlých hodnot (určených Cochranovým a Dixonovým testem)

sr

=

standardní odchylka opakovatelnosti

SR

=

standardní odchylka reprodukovatelnosti

r

=

opakovatelnost

R

=

reprodukovatelnost

CVr

=

variační koeficient opakovatelnosti v %

CVR

=

variační koeficient reprodukovatelnosti v %

Další kruhový test ES byla proveden na na čtyřech vzorcích v 7 laboratořích pro ověření hydrolýzy tryptofanu. Každý vzorek byl zkoušen pětkrát. Výsledky jsou uvedeny níže.

L

=

počet laboratoří, které poskytly výsledky

n

=

počet jednotlivých výsledků po vyloučení odlehlých hodnot (určených Cochranovým a Dixonovým testem)

sr

=

standardní odchylka opakovatelnosti

SR

=

standardní odchylka reprodukovatelnosti

r

=

opakovatelnost

R

=

reprodukovatelnost

CVr

=

variační koeficient opakovatelnosti v %

CVR

=

variační koeficient reprodukovatelnosti v %.

9.   Poznámky

Po izokratické eluci následuje gradientové čištění kolony:

Chromatografický systém musí v rozsahu měření poskytovat lineární odezvu. Lineární odezva se měří s konstantní (normální) koncentrací vnitřního standardu a různými koncentracemi tryptofanu. Je důležité, aby velikost píků tryptofanu i vnitřního standardu byla v lineárním rozsahu HPLC/fluorescenčního systému. Pokud jsou píky tryptofanu a/nebo vnitřního standardu příliš velké nebo příliš malé, zkouška se zopakuje s jinou navážkou vzorku a/nebo s jiným konečným objemem.

Stárnutím hydroxidu barnatého se zhoršuje jeho rozpustnost, což způsobuje, že roztok pro stanovení HPLC není čirý a výsledky obsahu tryptofanu mohou být nízké.

H.   STANOVENÍ OBSAHU TUKU

1.   Účel a rozsah

Touto metodou se stanoví obsah tuku v krmivech. Metoda se nevztahuje na zkoušení olejnatých semen a plodin.

Podle druhu a složení krmiva a podle účelu, pro který se zkouška provádí, se použije jeden ze dvou níže uvedených postupů.

1.1   Postup A – přímo extrahovatelné tuky

Tato metoda je použitelná pro krmiva rostlinného původu s výjimkou těch, která jsou uvedena v postupu B.

1.2   Postup B – celkové tuky

Tato metoda je použitelná pro krmiva živočišného původu a pro všechny krmné směsi. Používá se pro všechny materiály, z nichž není možné tuk zcela extrahovat bez předchozí hydrolýzy (např. lepky, kvasnice, bramborové proteiny a výrobky, které byly podrobeny zpracování, jako je vytlačování, vločkování a zahřívání).

1.3   Interpretace výsledků

Ve všech případech, kdy se dosáhlo postupem B vyššího výsledku než postupem A, je třeba považovat za platnou hodnotu výsledek dosažený postupem B.

2.   Princip

2.1   Postup A

Vzorek se extrahuje petroletherem. Rozpouštědlo se oddestiluje, zbytek se vysuší a zváží.

2.2   Postup B

Vzorek se hydrolyzuje za horka s kyselinou chlorovodíkovou. Směs se ochladí a přefiltruje. Zbytek na filtru se promyje a vysuší a dále se pokračuje ve stanovení podle postupu A.

3.   Chemikálie

4.   Přístroje a pomůcky

5.   Postup

5.1   Postup A (viz bod 8.1)

Do extrakční patrony (4.2) se naváží 5 g vzorku s přesností na 1 mg a patrona se uzavře tukuprostou vatou.

Patrona se umístí do extrakčního přístroje (4.1) a extrahuje se šest hodin petroletherem (3.1). Petroletherový extrakt se jímá do suché, předem zvážené baňky s varnými kamínky ( 9 ).

Rozpouštědlo se oddestiluje, zbytek v baňce se vysuší 1,5 hodiny v sušárně (4.3). Nechá se vychladnout v exsikátoru a zváží se. Suší se dalších 30 minut, aby se zajistila konstantní hmotnost tuku (rozdíl mezi dvěma následujícími váženími musí být maximálně 1 mg).

5.2   Postup B

Do 400 ml kádinky nebo do 300ml kónické baňky se naváží 2,5 g vzorku s přesností na 1 mg (viz bod 8.2) a přidá se 100 ml kyseliny chlorovodíkové (3.3) a varné kamínky. Kádinka se přikryje hodinovým sklem nebo se kónická baňka napojí na refluxní chladič. Směs se zahřívá k varu na kahanu nebo na topné desce a potom se udržuje v mírném varu jednu hodinu. Během varu se nesmí částečky vzorku usazovat na stěnách nádoby.

Směs se vychladí a přidá se dostatečné množství filtračního prostředku (3.4), aby se zabránilo ztrátám tuku během filtrace. Filtruje se přes zvlhčený dvojitý filtr, který neobsahuje žádný tuk. Zbytek na filtru se promývá studenou vodou, dokud není filtrát neutrální. Provede se kontrola, zda filtrát neobsahuje žádný tuk, jinak je nutné před hydrolýzou provést extrakci petroletherem podle postupu A.

Dvojitý filtr se zbytkem po hydrolýze se umístí na hodinové sklo a suší se 1,5 hodiny v sušárně (4.3) při 100 ± 3 oC.

Dvojitý filtr s vysušeným zbytkem se vloží do extrakční patrony (4.2) a utěsní se tukuprostou vatou. Patrona se umístí do extrakčního přístroje (4.1) a dále se postupuje podle druhého a třetího odstavce bodu 5.1.

6.   Vyjádření výsledku

Hmotnost zbytku po extrakci se vyjádří jako % tuku ve vzorku.

7.   Opakovatelnost

Rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení provedených na stejném vzorku týmž laborantem nesmí překročit:

8.   Poznámky

Naváží se 20 g vzorku s přesností na 1 mg, promíchá se s 10 nebo více gramy bezvodého síranu sodného (3.2). Extrahuje se petroletherem (3.1) podle bodu 5.1. Získaný extrakt se doplní petroletherem (3.1) na objem 500 ml a promíchá. Do malé, suché, předem zvážené baňky s varnými kamínky se odměří 50 ml tohoto roztoku. Rozpouštědlo se oddestiluje a po vysušení se postupuje podle posledního odstavce bodu 5.1.

Ze zbytku po extrakci v patroně se odstraní veškeré rozpouštědlo a zbytek se umele tak, aby prošel sítem s oky 1 mm. Potom se vrátí do extrakční patrony (síran sodný se již nepřidává) a postupuje se podle druhého a třetího odstavce bodu 5.1.

Obsah tuku se vypočítá jako procento ze vzorku podle následujícího vzorce:

(10m1 + m2) × 5

kde:

m1

=

hmotnost zbytku po první extrakci v gramech (alikvotní části extraktu)

m2

=

hmotnost zbytku po druhé extrakci v gramech.

I.   STANOVENÍ OBSAHU VLÁKNINY

1.   Účel a rozsah

Tato metoda umožňuje stanovit v krmivu organické látky, které neobsahují tuk, jsou nerozpustné v roztoku kyseliny a louhu a jsou běžně nazývány vláknina.

2.   Princip

Vzorek se v případě potřeby odtuční a působí se na něj postupně vroucím roztokem kyseliny sírové a hydroxidu draselného o přesně stanovené koncentraci. Zbytek se oddělí filtrací přes skleněný filtrační kelímek, promyje, vysuší, zváží a spálí při teplotě 475–500 oC. Úbytek váhy po spálení odpovídá obsahu vlákniny ve zkoušeném vzorku.

3.   Chemikálie

4.   Přístroje a pomůcky

5.   Postup

Do filtračního kelímku (4.2) se naváží 1 g upraveného vzorku s přesností na 1 mg (viz poznámky 8.1, 8.2 a 8.3) a přidá se 1 g filtrační pomůcky (3.3).

Filtrační kelímek (4.2) se připojí k zahřívací jednotce (4.1) a poté k hydrolyzační nádobce (4.3). Do spojené hydrolyzační nádobky a filtračního kelímku se nalije 150 ml vroucího roztoku kyseliny sírové (3.1) a v případě potřeby se přidá několik kapek odpěňovacího činidla (3.2).

Zahřeje se během 5 (±2) minut k varu a intenzivně se vaří přesně 30 minut.

Otevře se vypouštěcí ventil (4.1) a kyselina sírová se odsaje za použití vakua přes filtrační kelímek a zbytek se promyje asi třikrát 30 ml horké vody, vždy po úplném odsátí kapaliny z kelímku.

Vypouštěcí ventil se uzavře, přidá se 150 ml vroucího roztoku hydroxidu draselného (3.7) do spojené hydrolyzační nádobky a filtračního kelímku a přidá se několik kapek odpěňovacího činidla (3.2). Kapalina se přivede během 5 (±2) minut k varu a intenzivně se vaří přesně 30 minut. Potom se zopakuje filtrace a promývání jako po varu s kyselinou sírovou.

Po skončení promývání a odsávání se odpojí filtrační kelímek se svým obsahem a připojí se ke studené extrakční jednotce (4.6). Za použití vakua se promyje zbytek ve filtračním kelímku třikrát 25 ml acetonu (3.4), promývá se vždy do úplného odsátí acetonu.

Filtrační kelímek se vysuší do konstantní hmotnosti v sušárně při teplotě 130 oC. Po každém vysušení a ochlazení v exsikátoru se vždy rychle zváží. Filtrační kelímek se vloží do muflové pece a spaluje při 475–500 oC nejméně 30 minut do konstantní hmotnosti (úbytek hmotnosti mezi dvěma váženími nesmí být větší než 2 mg).

Po každém spalování a ochlazení nejprve v peci a potom v exsikátoru se zváží.

Provede se slepá zkouška bez zkoušeného vzorku. Úbytek hmotnosti po spalování nesmí být větší než 4 mg.

6.   Výpočet a vyjádření výsledků

Obsah vlákniny jako procento vzorku se vypočítá podle následujícho vzorce:

kde:

m

=

hmotnost vzorku v g

m0

=

úbytek hmotnosti po spálení při vlastním stanovení v g

m1

=

úbytek hmotnosti po spálení při slepé zkoušce v g.

7.   Opakovatelnost

Rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení provedených na stejném vzorku nesmí překročit:

8.   Poznámky

J.   STANOVENÍ OBSAHU CUKRŮ

1.   Účel a rozsah

Tato metoda umožňuje stanovení obsahu redukujících cukrů a veškerých cukrů po inverzi vyjádřených jako glukóza nebo sacharóza s použitím faktoru 0,95 . Je použitelná pro krmné směsi. Pro ostatní krmiva jsou používány zvláštní metody. Je-li to nutné, může být obsah laktózy zjištěn zvlášť a potom zahrnut do celkového výsledku.

2.   Princip

Cukry se vyextrahují zředěným ethanolem. Extrakt se vyčeří Carrezovými činidly I a II. Ethanol se odstraní a množství cukru před a po inverzi se stanoví metodou podle Luff-Schorla.

3.   Chemikálie

Za opatrného míchání se nalije roztok kyseliny citrónové (3.8.2) do roztoku uhličitanu sodného (3.8.3). Přidá se roztok síranu měďnatého (3.8.1) a doplní se vodou na 1 litr. Nechá se přes noc usadit a pak se přefiltruje.

Zkontroluje se koncentrace takto získaného činidla (Cu – 0,05 mol/l; Na2CO3 – 1 mol/l), viz poslední odstavec bodu 5.4. pH tohoto roztoku je přibližně 9,4 .

4.   Přístroje a pomůcky

Míchací zařízení: přibližně 35–40 otáček/min.

5.   Postup

5.1   Extrakce vzorku

Do 250 ml odměrné baňky se naváží 2,5 g vzorku s přesností na 1 mg. Přidá se 200 ml ethanolu (3.1) a míchá se po dobu jedné hodiny na míchacím zařízení. Přidá se 5 ml Carrezova činidla I (3.2) a asi 30 sekund se míchá. Přidá se 5 ml Carrezova činidla II (3.2) a znovu se míchá jednu minutu. Doplní se po značku ethanolem (3.1), homogenizuje a přefiltruje. Odpipetuje se 200 ml filtrátu a odpaří se na polovinu objemu, aby se odstranila většina ethanolu. Zbytek po odpařování se kvantitativně převede do 200 ml odměrné baňky pomocí horké vody. Zchladí se, doplní se vodou po značku, homogenizuje a v případě potřeby přefiltruje. Tento roztok se použije pro stanovení obsahu redukujících cukrů a, po inverzi, pro stanovení obsahu veškerých cukrů.

5.2   Stanovení redukujících cukrů

Odpipetuje se maximálně 25 ml roztoku, který obsahuje nejvýše 60 mg redukujících cukrů vyjádřených jako glukóza. V případě potřeby se odpipetovaný objem doplní destilovanou vodou na 25 ml. Obsah redukujících cukrů se stanoví metodou podle Luff-Schorla. Výsledek se vyjádří jako procentní obsah glukózy ve vzorku.

5.3   Stanovení obsahu veškerých cukrů po inverzi

Do 100 ml odměrné baňky se odpipetuje 50 ml roztoku. Přidá se několik kapek roztoku methyloranže (3.4) a potom se za stálého, opatrného míchání přidá kyselina chlorovodíková (3.5), až se kapalina trvale zbarví do červena. Poté se přidá 15 ml kyseliny chlorovodíkové (3.6) a baňka se rychle ponoří do vařící vodní lázně, kde se ponechá třicet minut. Rychle se vychladí na 20 oC a přidá se 15 ml roztoku hydroxidu sodného (3.7). Doplní se vodou do 100 ml a homogenizuje. Odpipetuje se maximálně 25 ml roztoku, který obsahuje nejvýše 60 mg redukujících cukrů vyjádřených jako glukóza. V případě potřeby se odpipetovaný objem doplní destilovanou vodou na 25 ml. Obsah redukujících cukrů se stanoví metodou podle Luff-Schorla. Výsledek se vyjádří jako procento glukózy nebo, kde je to vhodné, jako sacharózy po vynásobení faktorem 0,95 .

5.4   Titrace (metoda podle Luff-Schoorla)

Do 300 ml Erlenmeyerovy baňky se odpipetuje 25 ml Luff-Schoorlova činidla (3.8); přidá se přesně 25 ml vyčeřeného cukerného roztoku. Přidají se dvě granule pemzy (3.13) a při ručním míchání se zahřívá nad otevřeným plamenem střední délky tak, aby se kapalina uvedla do varu přibližně za dvě minuty. Pak se Erlenmeyerova baňka neprodleně umístí na azbestem potaženou drátěnou síťku s otvorem o průměru přibližně 6 cm, pod kterou je zapálen plamen. Tento plamen musí být regulován tak, aby se zahřívalo pouze dno Erlenmeyerovy baňky. K Erlenmeyerově baňce se připojí zpětný chladič a vaří se přesně deset minut. Potom se baňka ihned vychladí ve studené vodě a přibližně po pěti minutách se titruje takto:

Do baňky se přidá 10 ml roztoku jodidu draselného (3.12) a ihned poté (opatrně a pomalu, vzhledem k riziku nadměrného pěnění) se přidá 25 ml kyseliny sírové (3.11). Titruje se roztokem thiosíranu sodného (3.9), až se objeví kalně žlutá barva. Pak se přidá škrobový indikátor (3.10) a dokončí se titrace.

Stejná titrace se provede s přesně odměřenou směsí 25 ml Luff-Schoorlova činidla (3.8) a 25 ml vody, 10 ml roztoku jodidu draselného (3.12) a 25 ml kyseliny sírové (3.11) bez vaření.

6.   Výpočet a vyjádření výsledků

S použitím tabulky se stanoví obsah glukózy v mg, který odpovídá rozdílu mezi hodnotami obou titrací vyjádřených v mg thiosíranu sodného 0,1 mol/l. Výsledek se vyjádří jako procento vzorku.

7.   Zvláštní postupy

Homogenizuje se a přefiltruje. Ethanol se odstraní postupem uvedeným v odstavci 5.1. Pokud ve směsi není žádný dextrinovaný škrob, doplní se po značku destilovanou vodou.

8.   Poznámky

V obou případech se obsah přítomného cukru stanoví metodou podle Luff-Schoorla a vyjádří v mg glukózy. Jeden údaj se odečte od druhého a rozdíl se vyjádří jako procento ve vzorku.

Příklad:

Oba objemy odpovídají pro každé stanovení hmotnosti navážky vzorku 250 mg.

V prvním případě je spotřebováno 17 ml roztoku thiosíranu sodného 0,1 mol/l, což odpovídá 44,2 mg glukózy. V druhém případě je spotřebováno 11 ml téhož roztoku, což odpovídá 27,6 mg glukózy.

Rozdíl činí 16,6 mg glukózy.

Obsah redukujících cukrů (s výjimkou laktózy) vyjádřených jako glukóza je tedy:

K.   STANOVENÍ OBSAHU LAKTÓZY

1.   Účel a rozsah

Tato metoda umožňuje stanovení množství laktózy v krmivech obsahujících více než 0,5 % laktózy.

2.   Princip

Cukry se vyextrahují ze vzorku vodou. Extrakt se vystaví fermentačnímu účinku kvasinek Saccharomyces cerevisiae, které ponechají laktózu v nezměněném stavu. Po vyčeření a filtraci se obsah laktózy ve filtrátu stanoví metodou podle Luff-Schoorla.

3.   Chemikálie

Za opatrného míchání se nalije roztok kyseliny citrónové (3.4.2) do roztoku uhličitanu sodného (3.4.3). Přidá se roztok síranu měďnatého (3.4.1) a doplní se vodou na 1 litr. Nechá se přes noc usadit a potom se přefiltruje. Zkontroluje se koncentrace takto získaného činidla (Cu 0,05 mol/l; Na2 CO3 1 mol/l). pH tohoto roztoku je přibližně 9,4 .

4.   Přístroje a pomůcky

Vodní lázeň s termostatem nastaveným na 38–40 oC.

5.   Postup

Do 100 ml odměrné baňky se naváží 1 g vzorku s přesností na 1 mg. Přidá se 25–30 ml vody. Baňka se umístí do vroucí vodní lázně na třicet minut a pak se ochladí přibližně na 35 oC. Přidá se 5 ml suspenze kvasinek (3.1) a homogenizuje. Obsah baňky se nechá stát po dobu dvou hodin ve vodní lázni o teplotě 38–40 oC a potom se vychladí se na teplotu přibližně 20 oC.

Přidá se 2,5 ml Carrezova činidla I (3.2) a třicet vteřin se míchá. Potom se přidá 2,5 ml Carrezova činidla II (3.3) a znovu se míchá třicet vteřin. Doplní se vodou na 100 ml, zamíchá se a přefiltruje. Do 300 ml Erlenmeyerovy baňky se odpipetuje část filtrátu, nejvýše 25 ml, která obsahuje asi 40–80 mg laktózy. Pokud je třeba, doplní se vodou na 25 ml.

Stejným způsobem se provede slepá zkouška s 5 ml suspenze kvasinek (3.1). Stanoví se obsah laktózy metodou podle Luff-Schoorla tímto způsobem: přidá se přesně 25 ml Luff-Schoorlova činidla (3.4) a dvě granule pemzy (3.5). Ručně se zamíchá při zahřívání na volném plameni střední výšky a kapalina se přivede do varu přibližně během dvou minut. Pak se Erlenmeyerova baňka neprodleně umístí na azbestem potaženou drátěnou síťku s otvorem o průměru přibližně 6 cm, pod kterou byl zapálen plamen. Tento plamen musí být regulován tak, aby se zahřívalo pouze dno Erlenmeyerovy baňky. K Erlenmeyerově baňce se připevní zpětný chladič. Vaří se přesně deset minut. Potom se baňka ihned ochladí ve studené vodě a přibližně po pěti minutách se titruje takto:

Přidá se 10 ml roztoku jodidu sodného (3.6) a ihned poté (opatrně a pomalu, vzhledem k riziku nadměrného pěnění) se přidá 25 ml kyseliny sírové (3.7). Titruje se roztokem thiosíranu sodného (3.8), až se objeví kalně žlutá barva. Pak se přidá škrobový indikátor (3.9) a dokončí se titrace.

Stejná titrace se provede s přesně odměřenou směsí 25 ml Luff-Schoorlova činidla (3.4) a 25 ml vody, po přidání 10 ml roztoku jodidu sodného (3.6) a 25 ml kyseliny sírové (3.7) bez vaření.

6.   Výpočet a vyjádření výsledků

S použitím přiložené tabulky se stanoví množství laktózy v mg, které odpovídá rozdílu mezi výsledky dvou titrací, vyjádřených v ml roztoku thiosíranu sodného 0,1 mol/l.

Výsledek se vyjádří jako bezvodá laktóza vyjádřená jako procento ve vzorku.

7.   Poznámka

U látek obsahujících více než 40% zkvasitelného cukru se použije více než 5 ml kvasinkové suspenze (3.1).

L.   STANOVENÍ OBSAHU ŠKROBU

– POLARIMETRICKÁ METODA –

1.   Účel a rozsah

Tato metoda umožňuje stanovení obsahu škrobu a degradačních produktů škrobu s vysokou molekulární hmotností v krmivech za účelem kontroly shody s obsahem metabolizovatelné energie (ustanovení v příloze VII) a se směrnicí Rady 96/25/ES ( 10 ).

2.   Princip

Metoda zahrnuje dvě stanovení. Nejprve je vzorek podroben působení zředěné kyseliny chlorovodíkové. Po vyčeření a filtraci je optická otáčivost roztoku měřena polarimetricky.

Potom je vzorek extrahován 40% ethanolem. Po okyselení filtrátu kyselinou chlorovodíkovou, vyčeření a filtraci je optická otáčivost roztoku měřena stejně jako u prvního stanovení.

Rozdíl mezi těmito dvěma měřeními násobený známým faktorem udává obsah škrobu ve vzorku.

3.   Chemikálie

Koncentrace se musí zkontrolovat titrací za použití roztoku 0,1 mol/l hydroxidu sodného a přítomnosti 0,1 % (w/v) methylčerveně v 94% (v/v) ethanolu. Pro neutralizaci 10 ml je zapotřebí 30,94 ml NaOH 0,1 mol/l.

4.   Přístroje a pomůcky

5.   Postup

5.1   Příprava vzorku

Vzorek se upraví mletím tak, aby prošel sítem s kruhovými otvory o velikosti 0,5 mm.

5.2   Stanovení celkové optické otáčivosti (P nebo S) (viz poznámka 7.1)

Do 100 ml odměrné baňky se naváží 2,5 g umletého vzorku s přesností na 1 mg. Přidá se 25 ml kyseliny chlorovodíkové (3.2), protřepe se, aby se vzorek rovnoměrně rozprostřel, a potom se přidá dalších 25 ml kyseliny chlorovodíkové (3.2). Baňka se ponoří do vroucí vodní lázně a první tři minuty se s ní intenzivně třepe, aby nedošlo k tvorbě shluků. Množství vody ve vodní lázni musí být takové, aby při ponoření baňky do lázně nedošlo k přerušení varu. Během protřepávání nesmí být baňka vyjmuta z lázně. Přesně po 15 minutách se baňka vyjme z lázně, přidá se 30 ml studené vody a ihned se ochladí na 20 oC.

Přidá se 5 ml Carrezova činidla I (3.3) a asi 30 sekund se protřepává. Přidá se 5 ml Carrezova činidla II (3.4) a opět se protřepává asi 30 sekund. Baňka se doplní po značku vodou, promíchá a přefiltruje. Pokud není filtrát zcela čirý (k tomu dochází pouze výjimečně), stanovení se zopakuje s použitím většího množství Carrezových činidel I a II, například 10 ml.

Optická otáčivost roztoku se měří na polarimetru nebo sacharimetru v 200 mm trubici.

5.3   Stanovení optické otáčivosti (P' nebo S') látek rozpustných ve 40% ethanolu

Do 100 ml odměrné baňky se naváží 5 g vzorku s přesností na 1 mg a přidá se asi 80 ml ethanolu (3.5) (viz poznámka 7.2). Baňka se nechá stát 1 hodinu při laboratorní teplotě; během této doby se šestkrát důkladně protřepe, aby se zkoušený vzorek zcela promísil s ethanolem. Doplní se ethanolem (3.5) po značku, promíchá a přefitruje.

Odpipetuje se 50 ml filtrátu (= 2,5 g vzorku) do 250 ml Erlenmeyerovy baňky, přidá se 2,1 ml kyseliny chlorovodíkové (3.1) a důkladně se protřepe. Na Erlenmeyerovu baňku se připojí zpětný chladič a baňka se ponoří do vroucí vodní lázně. Přesně po 15 minutách se baňka vyjme z lázně, její obsah se převede do 100 ml odměrné baňky, varná baňka se vypláchne malým množstvím studené vody a ochladí se na 20 oC.

Potom se vyčeří Carrezovými činidly I a II (3.3 a 3.4), doplní se vodou po značku, promíchá a přefiltruje. Při měření optické otáčivosti se postupuje podle druhého a třetího odstavce bodu 5.2.

6.   Výpočet a vyjádření výsledků

Obsah škrobu (v %) se vypočte podle následujících vzorců:

6.1   Měření na polarimetru

P

=

celková optická otáčivost v úhlových stupních

P'

=

optická otáčivost v úhlových stupních látek rozpustných ve 40% (v/v) ethanolu

=

specifická optická otáčivost čistého škrobu. Konvenční hodnoty D přijaté pro tento faktor jsou následující: +185,9 o: rýžový škrob, +185,7 o: bramborový škrob, +184,6 o: kukuřičný škrob, +182,7 o: pšeničný škrob, +181,5 o: ječný škrob, +181,3 o: ovesný škrob, +184,0 o: ostatní typy škrobu a škrobových směsí v krmných směsích.

6.2   Měření na sacharimetru

S

=

celková optická otáčivost ve stupních sacharizace

S'

=

optická otáčivost ve stupních sacharizace látek rozpustných ve 40% (v/v) ethanolu

N

=

navážka sacharózy v g ve 100 ml vody, která poskytne ve 200mm trubici optickou otáčivost rovnou 100o sacharizace 16,29 g pro francouzské sacharimetry 26,00 g pro německé sacharimetry 20,00 g pro směsné sacharimetry

=

specifická optická otáčivost čistého škrobu (viz 6.1).

6.3   Opakovatelnost

Rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení provedených na stejném vzorku nesmí překročit 0,4 % v absolutní hodnotě u obsahu škrobu do 40 % a 1 % relat. u obsahu škrobu 40 % a více.

7.   Poznámky

M.   STANOVENÍ OBSAHU POPELA

1.   Účel a rozsah

Tato metoda umožňuje stanovení obsahu popela v krmivech.

2.   Princip

Vzorek se zpopelní při 550 oC; zbytek se zváží.

3.   Chemikálie

Dusičnan amonný, roztok 20 % (w/v).

4.   Přístroje a pomůcky

5.   Postup

Do spalovacího kelímku, který byl předem zahřát na teplotu 550 oC, ochlazen a zvážen, se s přesností na 1 mg naváží 5 g vzorku (2,5 g v případě látek, které mají během spalování tendenci zvětšovat svůj objem). Potom se kelímek vloží na topnou desku a postupně se zahřívá, až látka zuhelnatí. Spaluje se podle bodu 5.1 nebo 5.2.

6.   Výpočet a vyjádření výsledků

Vypočítá se hmotnost zbytku po odečtení hmotnosti kelímku (táry).

Výsledek se vyjádří jako procento vzorku.

7.   Poznámky

N.   STANOVENÍ OBSAHU POPELA NEROZPUSTNÉHO V KYSELINĚ CHLOROVODÍKOVÉ

1.   Účel a rozsah

Tato metoda umožňuje stanovení obsahu minerálních látek nerozpustných v kyselině chlorovodíkové v krmivech. Podle druhu vzorku mohou být použity dvě různé metody.

2.   Princip

3.   Chemikálie

4.   Přístroje a pomůcky

5.   Postup

5.1   Metoda A

Vzorek se zpopelní podle postupu uvedeného v metodě pro stanovení obsahu popela. Může se použít rovněž popel získaný při uvedeném stanovení.

Popel se pomocí 75 ml kyseliny chlorovodíkové (3.1) převede do 250–400 ml kádinky. Uvede se pomalu do varu a mírně se vaří patnáct minut. Teplý roztok se přefiltruje přes bezpopelný papírový filtr a zbytek na filtru se promyje teplou vodou do vymizení kyselé reakce. Filtr s promytým zbytkem se vysuší a potom zpopelní v předem zváženém kelímku při teplotě minimálně 550 oC a maximálně 700 oC. Nechá se vychladnout v exsikátoru a zváží se.

5.2   Metoda B

Do 250–400 ml kádinky se naváží 5 g vzorku s přesností na 1 mg. Přidá se postupně 25 ml vody a 25 ml kyseliny chlorovodíkové (3.1), promíchá se a nechá se stát, dokud neustane pěnění. Přidá se dalších 50 ml kyseliny chlorovodíkové (3.1). Po ukončení vývoje plynu se kádinka umístí na vroucí vodní lázeň, kde se ponechá 30 minut nebo v případě potřeby déle, aby mohlo dojít k hydrolýze veškerého přítomného škrobu. Přefiltruje se za horka přes bezpopelný papírový filtr a filtr se promyje 50 ml horké vody (viz poznámka 7). Filtr se zbytkem se vloží do spalovacího kelímku, vysuší se a potom zpopelní při teplotě minimálně 550 oC a maximálně 700 oC. Po spálení se popel převede pomocí 75 ml kyseliny chlorovodíkové (3.1) do 250–400 ml kádinky; pokračuje se podle druhého odstavce bodu 5.1.

6.   Výpočet a vyjádření výsledků

Vypočítá se hmotnost zbytku po odečtení hmotnosti kelímku (táry). Výsledek se vyjádří jako procento vzorku.

7.   Poznámka

Jestliže je filtrace obtížná, je možno nahradit 50 ml kyseliny chlorovodíkové (3.1) 50 ml 20% kyseliny trichloroctové (3.2) a zbytek na filtru promývat teplým roztokem 1% kyseliny trichloroctové (3.3).

O.   STANOVENÍ OBSAHU UHLIČITANŮ

1.   Účel a rozsah

Tato metoda umožňuje stanovení obsahu uhličitanů vyjádřených obvykle jako uhličitan vápenatý ve většině krmiv.

Nicméně v některých případech (např. u uhličitanu železnatého) musí být použita zvláštní metoda.

2.   Princip

Uhličitany se rozloží v kyselině chlorovodíkové; vzniklý oxid uhličitý se změří v kalibrované trubici a jeho objem se porovná s objemem plynu uvolněného za stejných podmínek ze známého množství uhličitanu vápenatého.

3.   Chemikálie

4.   Přístroje a pomůcky

Scheibler-Dietrichův přístroj (viz obrázek) nebo obdobný přístroj.

5.   Postup

Podle obsahu uhličitanů ve vzorku se naváží:

Navážka vzorku se umístí do zvláštní nádobky (4) přístroje, vybavené malou trubicí z nerozbitného materiálu, která obsahuje 10 ml kyseliny chlorovodíkové (3.1), a nádobka se připojí k přístroji. Trojcestný kohout (5) se otočí tak, aby trubice (1) byla spojena s vnějším prostorem. Pomocí mobilní trubice (2), která je naplněna obarvenou kyselinou sírovou (3.3) a spojena s kalibrovanou trubicí (1), se vyrovnají hladiny na nulu. Kohout (5) se otočí tak, aby byly spojeny trubice (1) a (3), a zkontroluje se, zda je hladina na nule.

Pomalým nakláněním nádobky (4) se kyselina chlorovodíková (3.1) nalije na navážku vzorku. Tlak se vyrovná snížením trubice (2). Nádobkou (4) se třepe tak dlouho, dokud zcela neustane uvolňování oxidu uhličitého.

Tlak se obnoví vyrovnáním kapalin v trubicích (1) a (2) na stejnou hladinu. Po několika minutách, až se ustálí tlak plynu, se odečte jeho hodnota.

Provede se kontrolní zkouška za stejných podmínek s navážkou 0,5 g uhličitanu vápenatého (3.2).

6.   Výpočet a vyjádření výsledků

Obsah uhličitanů vyjádřených jako uhličitan vápenatý se vypočítá podle následujícho vzorce:

kde:

X

=

% (w/w) uhličitanů vyjádřených jako uhličitan vápenatý ve vzorku

V

=

ml CO2 uvolněné z navážky vzorku

V1

=

ml CO2 uvolněné z 0,5 g CaCO3

m

=

hmotnost navážky vzorku v gramech.

7.   Poznámky

P.   STANOVENÍ OBSAHU CELKOVÉHO FOSFORU

FOTOMETRICKÁ METODA

1.   Účel a rozsah

Tato metoda umožňuje stanovení obsahu celkového fosforu v krmivech. Je vhodná především pro zkoušení krmiv s nízkým obsahem fosforu. V určitých případech (u produktů s vysokým obsahem fosforu) je možno použít gravimetrickou metodu.

2.   Princip

Vzorek se mineralizuje buď suchou cestou (zejména u organických krmiv), nebo mokrou cestou (zejména u minerálních sloučenin a tekutých krmiv), a převede se do kyselého roztoku. K tomuto roztoku se přidá molybdátovanadátové činidlo. Absorbance žlutě zbarveného roztoku se měří při 430 nm pomocí spektrofotometru.

3.   Chemikálie

4.   Přístroje a pomůcky

5.   Postup

5.1   Příprava roztoku

Podle druhu vzorku se připraví roztok způsobem, který je uveden v bodě 5.1.1 nebo 5.1.2.

5.1.1    Obvyklý postup

Do Kjeldahlovy baňky se naváží 1 g nebo větší množství vzorku s přesností na 1 mg. Přidá se 20 ml kyseliny sírové (3.5), baňka se důkladně protřepe, aby se vzorek a kyselina dobře spojily a aby se zabránilo usazování vzorku na stěnách baňky; pak se roztok zahřeje a 10 minut vaří. Po mírném ochlazení se přidají 2 ml kyseliny dusičné (3.4); slabě se zahřeje a opět mírně ochladí. Pak se opět přidá trochu kyseliny dusičné (3.4) a uvede se opět do varu. Postup se opakuje tolikrát, až se získá čirý roztok. Potom se ochladí, přidá se trochu vody, kapalina se převede do 500 ml odměrné baňky a Kjeldahlova baňka se vypláchne horkou vodou. Po ochlazení se baňka doplní vodou po značku, homogenizuje a přefiltruje.

5.1.2    Postup pro vzorky, které obsahují organické látky, ale neobsahují dihydrogenfosforečnan vápenatý a hořečnatý

Do spalovacího kelímku se naváží přibližně 2,5 g vzorku s přesností na 1 mg a dokonale se promíchá s 1 g uhličitanu vápenatého (3.1). V muflové peci se spaluje při teplotě 550 oC tak dlouho, dokud se nezíská popel bílé nebo šedé barvy (malé množství uhlíkatých částic není na závadu). Popel se převede do 250 ml kádinky, přidá se 20 ml vody a potom se přidává kyselina chlorovodíková (3.2), dokud neustane pěnění; nakonec se přidá dalších 10 ml kyseliny chlorovodíkové (3.2). Kádinka se postaví na pískovou lázeň a odpaří se do sucha, aby se vyloučily křemičitany. Zbytek se rozpustí v 10 ml kyseliny dusičné (3.3) a 5 minut vaří na pískové lázni nebo na topné desce tak, aby nedošlo k úplnému vysušení. Kapalina se převede do 500 ml odměrné baňky a kádinka se několikrát vymyje horkou vodou. Po ochlazení se doplní vodou po značku, homogenizuje a přefiltruje.

5.2   Vývoj zbarvení a měření absorbance

Alikvotní množství filtrátu připraveného podle bodu 5.1.1 nebo 5.1.2 se zředí tak, aby koncentrace fosforu byla maximálně 40 μg/ml. 10 ml tohoto roztoku se odpipetuje do zkumavky (4.6) a přidá se 10 ml molybdátovanadátového činidla (3.6). Homogenizuje se a nechá se stát minimálně po dobu 10 minut při teplotě 20 oC. Pak se měří absorbance ve spektrofotometru při 430 nm proti roztoku připravenému z 10 ml vody a 10 ml molybdátovanadátového činidla (3.6).

5.3   Kalibrační křivka

Ze standardního roztoku (3.7) se připraví roztoky, které obsahují 5, 10, 20, 30 a 40 μg fosforu na jeden ml. Ke každým 10 ml těchto roztoků se přidá 10 ml molybdátovanadátového činidla (3.6). Homogenizuje se a nechá se stát minimálně po dobu 10 minut při teplotě 20 oC. Pak se měří absorbance, jak je uvedeno v bodě 5.2. Kalibrační křivka se vytvoří vynesením hodnot absorbancí proti odpovídajícím množstvím fosforu. Křivka je lineární při koncentraci fosforu 0–40 μg/ml.

6.   Výpočet a vyjádření výsledků

Obsah fosforu ve zkoušeném vzorku se stanoví pomocí kalibrační křivky.

Výsledek se vyjádří jako procento vzorku.

Opakovatelnost

Rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení provedených na stejném vzorku nesmí přesáhnout:

Q.   STANOVENÍ OBSAHU VE VODĚ ROZPUSTNÝCH CHLORIDŮ

1.   Účel a rozsah

Tato metoda umožňuje stanovení obsahu ve vodě rozpustných chloridů obvykle vyjadřovaných jako chlorid sodný. Tato metoda je vhodná pro všechna krmiva.

2.   Princip

Chloridy se rozpustí ve vodě. Jestliže produkt obsahuje organickou hmotu, roztok se vyčeří. Roztok se mírně okyselí kyselinou dusičnou a chloridy se vysrážejí pomocí roztoku dusičnanu stříbrného jako chlorid stříbrný. Přebytek dusičnanu stříbrného se titruje roztokem thiokyanatanu amonného podle Volhardovy metody.

3.   Chemikálie

4.   Přístroje a pomůcky

Míchací zařízení: přibližně 35–40 otáček/min.

5.   Postup

5.1   Příprava roztoku

Příprava vzorku závisí na druhu vzorku a roztok se připraví podle odstavce 5.1.1, 5.1.2 nebo 5.1.3.

Současně se provede slepá zkouška bez zkoušeného vzorku.

5.1.1    Vzorky bez organické hmoty

Do 500 ml odměrné baňky se naváží maximálně 10 g vzorku s přesností na 1 mg tak, aby navážka obsahovala nejvýše 3 g ve vodě rozpustných chloridů, přidá se asi 400 ml vody a třicet minut se míchá na míchacím zařízení při teplotě asi 20 oC. Potom se doplní po značku, homogenizuje a přefiltruje.

5.1.2    Vzorky obsahující organickou hmotu, kromě produktů uvedených v bodě 5.1.3

Do 500 ml odměrné baňky se naváží asi 5 g vzorku s přesností na 1 mg a 1 g aktivního uhlí. Přidá se 400 ml vody o teplotě přibližně 20 oC a 5 ml Carrezova činidla I (3.7), asi 30 sekund se míchá, pak se přidá 5 ml Carrezova činidla II (3.8). Třicet minut se míchá na míchacím zařízení, potom se doplní po značku, homogenizuje a přefiltruje.

5.1.3    Tepelně opracovaná krmiva, lněné pokrutiny, lněná moučka, směsi s jejich převážným obsahem a jiné produkty bohaté na rostlinný sliz nebo koloidní látky (např. dextrinovaný škrob)

Roztok se připraví podle bodu 5.1.2, ale nefiltruje se. Místo toho se dekantuje nebo v případě potřeby odstředí. Do 200 ml odměrné baňky se odpipetuje 100 ml supernatantu, smíchá se s acetonem (3.6) a doplní se tímto rozpouštědlem po značku. Homogenizuje se a přefiltruje.

5.2   Titrace

Do Erlenmayerovy baňky se odpipetuje 25–100 ml filtrátu (podle předpokládaného obsahu chlóru) získaného podle bodu 5.1.1, 5.1.2 nebo 5.1.3. Alikvotní část nesmí obsahovat více než 150 ml chlóru (Cl). V případě potřeby se doplní vodou na minimálně 50 ml, přidá se 5 ml kyseliny dusičné (3.4), 20 ml nasyceného roztoku síranu železitoamonného (3.3) a dvě kapky roztoku thiokyanatanu amonného (3.1) z byrety naplněné ke značce nula. Jinou byretou se přidá roztok dusičnanu stříbrného (3.2) tak, aby se získal přebytek 5 ml. Dále se přidá 5 ml diethyletheru (3.5) a silně se protřepe, aby sraženina dobře koagulovala. Přebytek dusičnanu stříbrného se titruje s roztokem thiokyanatanu amonného (3.1), dokud není dosaženo červenohnědého zabarvení, které vydrží jednu minutu.

6.   Výpočet a vyjádření výsledků

Obsah ve vodě rozpustných chloridů (X) vyjádřených jako procento chloridu sodného se vypočítá podle následujícího vzorce:

kde:

V1

=

přidaný roztok dusičnanu stříbrného 0,1 mol/l v ml

V2

=

roztok thiokyanatanu amonného 0,1 mol/l použitý pro titraci v ml

m

=

hmotnost vzorku

Jestliže byl při slepé zkoušce roztok dusičnanu stříbrného 0,1 mol/l spotřebován, odečte se tato hodnota z objemu (V1 – V2).

7.   Poznámky

---

PŘÍLOHA IV

METODY ZKOUŠENÍ PRO KONTROLU OBSAHU POVOLENÝCH DOPLŇKOVÝCH LÁTEK V KRMIVECH

A.   STANOVENÍ OBSAHU VITAMINU A

1.   Účel a rozsah

Tato metoda umožňuje stanovení obsahu vitaminu A (retinolu) v krmivech a premixech. Vitamin A zahrnuje all-trans-retinyl alkohol a jeho cis izomery, které se stanovují touto metodou. Obsah vitaminu A se vyjadřuje v mezinárodních jednotkách (m. j.) na kilogram. Jedna mezinárodní jednotka odpovídá aktivitě 0,300 μg all-trans vitaminu A (alkohol) nebo 0,344 μg all-trans vitaminu A (acetát) nebo 0,550 μg all-trans vitaminu A (palmitát).

Mez kvantifikace je 2 000 m. j. vitaminu A/kg.

2.   Princip

Vzorek se hydrolyzuje ethanolickým roztokem hydroxidu draselného a vitamin A se extrahuje petroletherem. Rozpouštědlo se odpaří a zbytek se rozpustí v methanolu a, pokud je to nutné, naředí se na vhodnou koncentraci. Obsah vitaminu A se stanoví metodou vysokoúčinné kapalinové chromatografie na reverzní fázi (RP-HPLC) s UV nebo fluorescenční detekcí. Chromatografické parametry jsou vybrány tak, aby nedocházelo k separaci all-trans vitaminu A (alkohol) a jeho cis izomerů.

3.   Chemikálie

4.   Přístroje a pomůcky

5.   Postup

Poznámka

:

Vitamin A je citlivý na (UV) světlo a oxidaci. Všechny operace se provádí bez přístupu světla (používá se tmavé sklo nebo se chrání před světlem hliníkovou fólií) a kyslíku (pod dusíkem). Vzduch nad kapalinou se během extrakce vytěsní dusíkem (aby nedošlo k přetlakování, je nutno občas uvolnit zátku).

5.1   Příprava vzorku

Vzorek se rozmělní tak, aby prošel sítem o velikosti oka 1 mm a aby během úpravy nedošlo k jeho zahřátí. Vzorek se musí rozmělňovat bezprostředně před vážením a saponifikací, jinak může docházet ke ztrátám vitaminu A.

5.2   Saponifikace

Podle obsahu vitaminu A ve vzorku se s přesností na 1 mg naváží 2–25 g vzorku do 500 ml baňky s plochým dnem nebo kónické baňky (4.2.1). Za intenzivního míchání se přidá 130 ml ethanolu (3.1), asi 100 mg BHT (3.13), 2 ml roztoku askorbátu sodného (3.5) a 2 ml roztoku sulfidu sodného (3.6). Baňka se připojí k chladiči (4.3) a ponoří se do vodní lázně s magnetickým mícháním (4.7). Zahřeje se k varu a vaří se pod refluxem 5 minut. Potom se přes chladič (4.3) přidá 25 ml roztoku hydroxidu draselného (3.4) a vaří se pod refluxem za míchání pod pomalým proudem dusíku dalších 25 minut. Potom se chladič opláchne asi 20 ml vody a obsah baňky se nechá vychladnout na laboratorní teplotu.

5.3   Extrakce

Saponifikovaný roztok se dekantací a propláchnutím celkem 250 ml vody převede kvantitativně do 1 000 ml dělicí nálevky (4.2.3) nebo do extrakčního zařízení (4.8). Saponifikační baňka se opláchne 25 ml ethanolu (3.1) a poté 100 ml petroletheru (3.2) a oba oplachy se převedou do dělicí nálevky nebo do extrakčního zařízení. Konečný poměr vody a ethanolu v kombinovaných roztocích musí být asi 2 : 1. Roztok se 2 minuty intenzivně třepe a potom se nechá 2 minuty stát.

5.3.1    Extrakce v dělicí nálevce (4.2.3)

Po rozdělení vrstev (poznámka 7.3) se petroletherová vrstva převede do další dělicí nálevky (4.2.3). Extrakce se opakuje ještě dvakrát se 100 ml petroletheru (3.2) a dvakrát s 50 ml petroletheru (3.2).

Spojené extrakty v dělicí nálevce se dvakrát promyjí mírným kroužením (aby nevznikala emulze) 100 ml vody a potom se opakovaně protřepávají se 100 ml vody, dokud voda nezůstane po přidání roztoku fenolftaleinu (3.7) bezbarvá (obvykle stačí 4 promytí). Promytý extrakt se přefiltruje do 500 ml odměrné baňky (4.2.2) přes suchý skládaný filtr pro oddělování fází (4.4), aby se odstranila suspendovaná voda. Dělicí nálevka se opláchne 50 ml petroletheru (3.2) a ten se přidá přes filtr do téže odměrné baňky. Baňka se petroletherem (3.2) doplní po značku a dobře promíchá.

5.3.2    Extrakce v extrakčním zařízení (4.8)

Po rozdělení vrstev (poznámka 7.3) se odstraní zátka z válce (4.8.1) a místo ní se vloží vnitřní zařízení (4.8.2). Spodní strana U-trubice se umístí tak, aby byla právě nad rozhraním. Za použití tlaku dusíku (přiváděného postranním raménkem) se převede horní petroletherová vrstva do 1 000 ml dělicí nálevky (4.2.3). Přidá se 100 ml petroletheru (3.2), válec se zazátkuje a důkladně protřepe. Po oddělení vrstev se horní vrstva opět převede stejným způsobem do dělicí nálevky. Extrakce se opakuje s dalšími 100 ml petroletheru (3.2) a pak ještě dvakrát s 50 ml petroletheru (3.2). Po rozdělení fází se vždy horní petroletherová vrstva přidá k předchozí do dělicí nálevky.

Spojené extrakty petroletheru v dělicí nálevce se promyjí, jak je popsáno v bodě 5.3.1, a postupuje se dále podle bodu 5.3.1.

5.4   Příprava roztoku vzorku pro stanovení HPLC

Alikvotní část roztoku petroletheru (podle bodu 5.3.1 nebo 5.3.2) se odpipetuje do 250 ml hruškovité baňky (4.2.4). Rozpouštědlo se na vakuové rotační odparce (4.1) odpaří za sníženého tlaku při teplotě do 40 oC téměř do sucha. Atmosférický tlak se obnoví zavedením dusíku (3.10) do baňky a ta se odpojí od rotační odparky. Zbytek rozpouštědla se odpaří pod proudem dusíku (3.10) a odparek se ihned rozpustí ve známém objemu (10–100 ml) methanolu (3.3) (výsledná koncentrace vitaminu A musí být v rozsahu 5–30 m. j./ml).

5.5   Stanovení HPLC

Vitamin A se separuje na koloně C18 s reverzní fází (4.5.1) a jeho koncentrace se měří UV detektorem (325 nm) nebo fluorescenčním detektorem (excitace: 325 nm, emise: 475 nm) (4.5.2).

Do přístroje se nastřikuje alikvotní část (např. 20 μl) methanolického roztoku získaného podle bodu 5.4 a eluuje se mobilní fází (3.9). Průměrná hodnota výšek (ploch) píků se vypočte z několika opakovaných nástřiků téhož vzorku nebo kalibračních roztoků (5.6.2).

Podmínky HPLC

Následující podmínky jsou doporučené; mohou být použity jiné podmínky za předpokladu, že poskytují rovnocenné výsledky.

5.6   Kalibrace

5.6.1    Příprava pracovních standardních roztoků

Do 500 ml baňky s plochým dnem nebo kónické baňky (4.2.1) se odpipetuje 20 ml zásobního roztoku vitaminu A (acetát) (3.11.1) nebo 20 ml zásobního roztoku vitaminu A (palmitát) (3.12.1) a hydrolyzuje se podle bodu 5.2, ale bez přidání BHT. Potom se provede extrakce petroletherem (3.2) podle bodu 5.3 a doplní se na 500 ml petroletherem (3.2). 100 ml tohoto extraktu se odpaří na rotační odparce téměř do sucha (viz 5.4), zbylé rozpouštědlo se odpaří pod proudem dusíku (3.10) a odparek se rozpustí v 10,0 ml methanolu (3.3). Nominální koncentrace vitaminu A v tomto roztoku je 560 m. j./ml. Přesný obsah se stanoví podle bodu 5.6.3.3. Pracovní standardní roztok musí být připraven čerstvý před použitím.

Do 20 ml odměrné baňky se odpipetují 2,0 ml tohoto pracovního standardního roztoku, baňka se doplní po značku methanolem (3.3) a promíchá. Nominální koncentrace vitaminu A v tomto zředěném pracovním standardním roztoku je 56 m. j./ml.

5.6.2    Příprava kalibračních roztoků a kalibrační křivky

Do 20 ml odměrných baněk se odpipetuje postupně 1,0 , 2,0 , 5,0 a 10,0 ml zředěných pracovních standardních roztoků, doplní se methanolem (3.3) po značku a promíchá. Nominální koncentrace vitaminu A v těchto roztocích jsou 2,8 , 5,6 , 14,0 a 28,0 m. j./ml.

Do přístroje se opakovaně nastřikuje 20 μl jednotlivých kalibračních roztoků a stanoví se průměrné hodnoty výšek (ploch) píků. Z průměrných hodnot výšek (ploch) píků se sestrojí kalibrační křivka, přičemž se použijí výsledky UV kontroly (5.6.3.3).

5.6.3    UV standardizace standardních roztoků

5.6.3.1    Zásobní roztok vitaminu A (acetát)

Do 50 ml odměrné baňky (4.2.2) se odpipetují 2,0 ml zásobního roztoku vitaminu A (acetát) (3.11.1) a doplní se po značku 2-propanolem (3.8). Nominální koncentrace vitaminu A v tomto roztoku je 56 m. j./ml. Do 25 ml odměrné baňky se odpipetuje 3,0 ml tohoto zředěného roztoku vitaminu A (acetát) a doplní se po značku 2-propanolem (3.8). Nominální koncentrace vitaminu A v tomto roztoku je 6,72 m. j./ml. Na spektrofotometru (4.6) se proměří UV spektrum tohoto roztoku proti 2-propanolu (3.8) v rozmezí 300–400 nm. Extinkční maximum musí ležet mezi 325 a 327 nm.

Výpočet obsahu vitaminu A:

m. j. vitaminu A / ml = E326 × 19,0

(

pro vitamin A acetát = 1 530 při 326 nm v 2-propanolu).

5.6.3.2    Zásobní roztok vitaminu A (palmitát)

Do 50 ml odměrné baňky (4.2.2) se odpipetují 2,0 ml zásobního roztoku vitaminu A (palmitát) (3.12.1) a doplní se po značku 2-propanolem (3.8). Nominální koncentrace vitaminu A v tomto roztoku je 56 m. j./ml. Do 25 ml odměrné baňky se odpipetuje 3,0 ml tohoto zředěného roztoku vitaminu A (palmitát) a doplní se po značku 2-propanolem (3.8). Nominální koncentrace vitaminu A v tomto roztoku je 6,72 m. j./ml. Na spektrofotometru (4.6) se proměří UV spektrum tohoto roztoku proti 2-propanolu (3.8) v rozmezí 300–400 nm. Extinkční maximum musí ležet mezi 325 a 327 nm.

Výpočet obsahu vitaminu A:

m. j. vitaminu A / ml = E326 × 19,0

(

pro vitamin A palmitát = 957 při 326 nm v 2-propanolu).

5.6.3.3    Pracovní standardní roztok vitaminu A

Do 50 ml odměrné baňky (4.2.2) se odpipetují 3,0 ml nezředěného pracovního standardního roztoku vitaminu A připraveného podle bodu 5.6.1 a doplní se po značku 2-propanolem (3.8). Do 25 ml odměrné baňky se odpipetuje 5,0 ml tohoto roztoku a doplní se po značku 2-propanolem (3.8). Nominální koncentrace vitaminu A v tomto roztoku je 6,72 m. j./ml. Na spektrofotometru (4.6) se proměří UV spektrum tohoto roztoku proti 2-propanolu (3.8) v rozmezí 300–400 nm. Extinkční maximum musí ležet mezi 325 a 327 nm.

Výpočet obsahu vitaminu A:

m. j. vitaminu A / ml = E325 × 18,3

(

pro vitamin A alkohol = 1 821 při 325 nm v 2-propanolu).

6.   Výpočet a vyjádření výsledků

Koncentrace vitaminu A v extraktu vzorku v m. j./ml se stanoví porovnáním s kalibrační křivkou podle průměrných hodnot výšek (ploch) píků (5.6.2).

Obsah vitaminu A (w) v m. j./kg ve vzorku se vypočte podle následujícího vzorce:

(m. j./kg)

kde:

c

=

koncentrace vitaminu A v extraktu vzorku (5.4) v m. j./ml

V1

=

objem extraktu vzorku (5.4) v ml

V2

=

objem alikvotní části podle bodu 5.4 v ml

m

=

hmotnost zkušebního vzorku v gramech.

7.   Poznámky

Pro kontrolu toho, zda použitá metoda zkoušení poskytuje spolehlivé výsledky, pokud jde o tuto specifickou matrici (mléčné krmné směsi), se provede zkouška na výtěžnost u dodatečné navážky vzorku. Pokud je výtěžnost nižší než 80 %, výsledek zkoušky je třeba korigovat na výtěžnost.

8.   Opakovatelnost

Rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení provedených na stejném vzorku nesmí překročit 15 % relat. z hodnoty vyššího výsledku.

9.   Výsledky kruhových testů ( 11 )

L

=

počet laboratoří

n

=

počet jednotlivých hodnot

sr

=

standardní odchylka opakovatelnosti

sR

=

standardní odchylka reprodukovatelnosti

r

=

opakovatelnost

R

=

reprodukovatelnost

CVr

=

variační koeficient opakovatelnosti

CVR

=

variační koeficient reprodukovatelnosti

B.   STANOVENÍ OBSAHU VITAMINU E

1.   Účel a rozsah

Tato metoda umožňuje stanovení obsahu vitaminu E v krmivech a premixech. Obsah vitaminu E se vyjadřuje jako mg DL-α-tokoferol acetátu na kilogram. 1 mg DL-α-tokoferol acetátu odpovídá 0,91 mg DL-α-tokoferolu (vitamin E).

Mez kvantifikace je 2 mg vitaminu E/kg. Tato mez kvantifikace je dosažitelná pouze s fluorescenčním detektorem. Při použití UV detektoru je mez kvantifikace 10 mg/kg.

2.   Princip

Vzorek se hydrolyzuje ethanolickým roztokem hydroxidu draselného a vitamin E se extrahuje petroletherem. Rozpouštědlo se odpaří a zbytek se rozpustí v methanolu a, pokud je to nutné, naředí se na vhodnou koncentraci. Obsah vitaminu E se stanoví metodou vysokoúčinné kapalinové chromatografie na reverzní fázi (RP-HPLC) s fluorescenční nebo UV detekcí.

3.   Chemikálie

4.   Přístroje a pomůcky

5.   Postup

Poznámka

:

Vitamin E je citlivý na (UV) světlo a oxidaci. Všechny operace se provádí bez přístupu světla (používá se tmavé sklo nebo se chrání před světlem hliníkovou fólií) a kyslíku (pod dusíkem). Vzduch nad kapalinou se během extrakce vytěsní dusíkem (aby nedošlo k přetlakování, je nutno občas uvolnit zátku).

5.1   Příprava vzorku

Vzorek se rozmělní tak, aby prošel sítem o velikosti oka 1 mm a aby během úpravy nedošlo k jeho zahřátí. Rozmělnění musí být provedeno bezprostředně před vážením a saponifikací, jinak dochází ke ztrátám vitaminu E.

5.2   Saponifikace

Podle obsahu vitaminu E ve vzorku se s přesností na 0,01 g naváží 2–25 g vzorku do 500 ml baňky s plochým dnem nebo kónické baňky (4.2.1). Za intenzivního míchání se postupně přidá 130 ml ethanolu (3.1), asi 100 mg BHT (3.12), 2 ml roztoku askorbátu sodného (3.5) a 2 ml roztoku sulfidu sodného (3.6). Baňka se připojí k chladiči (4.3) a ponoří se do vodní lázně s magnetickým mícháním (4.7). Zahřeje se k varu a vaří se pod refluxem 5 minut. Potom se přes chladič (4.3) přidá 25 ml roztoku hydroxidu draselného (3.4) a vaří se pod refluxem za míchání pod pomalým proudem dusíku dalších 25 minut. Potom se chladič opláchne asi 20 ml vody a obsah baňky se nechá vychladnout na laboratorní teplotu.

5.3   Extrakce

Saponifikovaný roztok se dekantací a propláchnutím celkem 250 ml vody převede kvantitativně do 1 000 ml dělicí nálevky (4.2.3) nebo do extrakčního zařízení (4.8). Saponifikační baňka se postupně opláchne 25 ml ethanolu (3.1) a 100 ml petroletheru (3.2) a oba oplachy se převedou do dělicí nálevky nebo do extrakčního zařízení. Konečný poměr vody a ethanolu v kombinovaných roztocích musí být asi 2 : 1. Roztok se 2 minuty intenzivně třepe a potom se nechá 2 minuty stát.

5.3.1    Extrakce v dělicí nálevce (4.2.3)

Po rozdělení vrstev (viz poznámka 7.3) se petroletherová vrstva převede do další dělicí nálevky (4.2.3). Extrakce se opakuje dvakrát se 100 ml petroletheru (3.2) a dvakrát s 50 ml petroletheru (3.2).

Spojené extrakty v dělicí nálevce se dvakrát promyjí mírným kroužením (aby nevznikala emulze) 100 ml vody a potom se opakovaně protřepávají se 100 ml vody, dokud voda nezůstane po přidání roztoku fenolftaleinu (3.7) bezbarvá (obvykle stačí 4 promytí). Promytý extrakt se přefiltruje do 500 ml odměrné baňky (4.2.2) přes suchý skládaný filtr pro oddělování fází (4.4), aby se odstranila suspendovaná voda. Dělicí nálevka se opláchne 50 ml petroletheru (3.2) a ten se přidá přes filtr do téže odměrné baňky. Baňka se petroletherem (3.2) doplní po značku a důkladně promíchá.

5.3.2    Extrakce v extrakčním zařízení (4.8)

Po rozdělení vrstev (poznámka 7.3) se odstraní zátka z válce (4.8.1) a místo ní se vloží vnitřní zařízení (4.8.2). Spodní strana U-trubice se umístí tak, aby byla právě nad rozhraním. Za použití tlaku dusíku (přiváděného postranním raménkem) se převede horní petroletherová vrstva do 1 000 ml dělicí nálevky (4.2.3). Přidá se 100 ml petroletheru (3.2), válec se zazátkuje a důkladně protřepe. Po oddělení vrstev se horní vrstva opět převede stejným způsobem do dělicí nálevky. Extrakce se opakuje s dalšími 100 ml petroletheru (3.2) a pak ještě dvakrát s 50 ml petroletheru (3.2). Po rozdělení fází se vždy horní petroletherová vrstva přidá k předchozí do dělicí nálevky.

Spojené extrakty petroletheru v dělicí nálevce se promyjí, jak je popsáno v bodě 5.3.1, a postupuje se dále podle bodu 5.3.1.

5.4   Příprava roztoku vzorku pro stanovení HPLC

Alikvotní část roztoku petroletheru (podle bodu 5.3.1 nebo 5.3.2) se odpipetuje do 250 ml hruškovité baňky (4.2.4). Roztok se na vakuové rotační odparce (4.1) odpaří za sníženého tlaku při teplotě do 40 oC téměř do sucha. Atmosférický tlak se obnoví zavedením dusíku (3.9) do baňky a ta se odpojí od rotační odparky. Zbytek rozpouštědla se odpaří pod proudem dusíku (3.9) a odparek se ihned rozpustí ve známém objemu (10–100 ml) methanolu. (3.3). Výsledná koncentrace DL-α-tokoferolu musí být 5–30 μg/ml.

5.5   Stanovení HPLC

Vitamin E se separuje na koloně C18 s reverzní fází (4.5.1) a jeho koncentrace se měří fluorescenčním detektorem (excitace: 295 nm, emise: 330 nm) nebo UV detektorem (292 nm) (4.5.2).

Do přístroje se nastřikuje alikvotní část (např. 20 μl) methanolického roztoku získaného podle bodu 5.4 a eluuje se mobilní fází (3.8). Průměrná hodnota výšek (ploch) píků se vypočte z několika opakovaných nástřiků téhož vzorku nebo kalibračních roztoků (5.6.2).

Podmínky HPLC

Následující podmínky jsou doporučené; mohou být použity jiné podmínky za předpokladu, že poskytují rovnocenné výsledky.

5.6   Kalibrace (DL-α-tokoferol acetát nebo DL-α-tokoferol)

5.6.1    Standardní DL-α-tokoferol acetát

5.6.1.1    Příprava pracovního standardního roztoku

Do 500 ml baňky s plochým dnem nebo kónické baňky (4.2.1) se odpipetuje 25 ml zásobního roztoku DL-α-tokoferol acetátu (3.10.1) a hydrolyzuje se podle bodu 5.2. Potom se provede extrakce petroletherem (3.2) podle bodu 5.3 a doplní se na 500 ml petroletherem. 25 ml tohoto extraktu se odpaří na rotační odparce (viz. 5.4) téměř do sucha, zbylé rozpouštědlo se odpaří pod proudem dusíku (3.9) a odparek se rozpustí v 25,0 ml methanolu (3.3). Nominální koncentrace tohoto roztoku je 45,5 μg DL-α-tokoferolu/ml, což odpovídá 50 μg DL-α-tokoferol acetátu/ml. Pracovní standardní roztok se připravuje čerstvý před použitím.

5.6.1.2    Příprava kalibračních roztoků a kalibrační křivky

Do odměrných baněk na 20 ml se odpipetuje postupně 1,0 , 2,0 , 4,0 a 10,0 ml pracovních standardních roztoků, doplní se methanolem (3.3) po značku a promíchá. Nominální koncentrace těchto roztoků jsou 2,5 , 5,0 , 10,0 a 25,0 μg/ml DL-α-tokoferol acetátu, tj. 2,28 , 4,55 , 9,10 a 22,8 μg/ml DL-α-tokoferolu.

Do přístroje se opakovaně nastřikuje 20 μl jednotlivých kalibračních roztoků a stanoví se průměrné hodnoty výšek (ploch) píků. Z průměrných hodnot výšek (ploch) píků se sestrojí kalibrační křivka.

5.6.1.3    UV standardizace zásobního roztoku DL-α-tokoferol acetátu (3.10.1)

Do 25 ml odměrné baňky se odpipetuje 5,0 ml zásobního roztoku DL-α-tokoferol acetátu (3.10.1) a doplní se po značku ethanolem. Na spektrofotometru (4.6) se proměří UV spektrum tohoto roztoku proti ethanolu (3.1) v rozmezí 250–320 nm.

Absorpční maximum je při 284 nm:

= 43,6 při 284 nm v ethanolu

Při tomto ředění musí být získaná hodnota extinkce 0,84 –0,88 .

5.6.2    Standardní DL-α-tokoferol

5.6.2.1    Příprava pracovního standardního roztoku

Do 50 ml odměrné baňky se odpipetují 2 ml zásobního roztoku DL-α-tokoferolu (3.11.1), zředí se methanolem (3.3) a doplní se jím po značku. Nominální koncentrace tohoto roztoku je 40 μg/ml DL-α-tokoferolu, což odpovídá 44,0 μg/ml DL-α-tokoferol acetátu. Pracovní standardní roztok se připravuje čerstvý před použitím.

5.6.2.2    Příprava kalibračních roztoků a kalibrační křivky

Do odměrných baněk na 20 ml se odpipetuje postupně 1,0 , 2,0 , 4,0 a 10,0 ml pracovních standardních roztoků, doplní se methanolem (3.3) po značku a promíchá. Nominální koncentrace těchto roztoků jsou 2,0 , 4,0 , 8,0 a 20,0 μg/ml DL-α-tokoferolu, tj. 2,20 , 4,40 , 8,79 a 22,0 μg/ml DL-α-tokoferol acetátu.

Do přístroje se opakovaně nastřikuje 20 μl jednotlivých kalibračních roztoků a stanoví se průměrné hodnoty výšek (ploch) píků. Z průměrných hodnot výšek (ploch) píků se sestrojí kalibrační křivka.

5.6.2.3    UV standardizace zásobního roztoku DL-α-tokoferolu (3.11.1)

Do 25 ml odměrné baňky se odpipetuje 2,0 ml zásobního roztoku DL-α-tokoferolu (3.11.1) a doplní se po značku ethanolem. Na spektrofotometru (4.6) se proměří UV spektrum tohoto roztoku proti ethanolu (3.1) v rozmezí 250–320 nm. Absorpční maximum je při 292 nm:

= 75,8 při 292 nm v ethanolu

Při tomto ředění musí být získána hodnota extinkce 0,6 .

6.   Výpočet a vyjádření výsledků

Ze průměrné výšky (plochy) píků vitaminu E pro roztok vzorku se stanoví koncentrace roztoku vzorku v μg/ml (počítáno jako α-tokoferol acetát) porovnáním s kalibrační křivkou (5.6.1.2 nebo 5.6.2.2).

Obsah vitaminu E (w) v mg/kg ve vzorku se vypočte podle následujícího vzorce:

(mg/kg)

kde:

c

=

koncentrace vitaminu E (jako α-tokoferol acetátu) v extraktu vzorku (5.4) v μg/ml

V1

=

objem extraktu vzorku (5.4) v ml

V2

=

objem alikvotní části (5.4) v ml

m

=

navážka zkušebního vzorku v g.

7.   Poznámky

8.   Opakovatelnost

Rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení provedených na stejném vzorku nesmí překročit 15 % relat. z hodnoty vyššího výsledku.

9.   Výsledky kruhových testů ( 12 )

L

=

počet laboratoří

n

=

počet jednotlivých hodnot

sr

=

standardní odchylka opakovatelnosti

sR

=

standardní odchylka reprodukovatelnosti

r

=

opakovatelnost

R

=

reprodukovatelnost

CVr

=

variační koeficient opakovatelnosti

CVR

=

variační koeficient reprodukovatelnosti

C.   STANOVENÍ OBSAHU STOPOVÝCH PRVKŮ ŽELEZA, MĚDI, MANGANU A ZINKU

1.   Účel a rozsah

Tato metoda umožňuje stanovení stopových prvků železa, mědi, manganu a zinku v krmivech. Meze stanovitelnosti jsou:

2.   Princip

Vzorek se převede po destrukci organické hmoty (pokud je obsažena) do roztoku kyselinou chlorovodíkovou. Prvky železo, měď, mangan a zinek se stanovují po příslušném zředění atomovou absorpční spektrofotometrií.

3.   Chemikálie

Úvodní poznámky

Pro přípravu chemikálií a analytických roztoků se používá voda, dvakrát destilovaná ve skleněném destilačním přístroji (borosilikátové nebo křemičité sklo) nebo po dvojím průchodu přes ionex, která prokazatelně neobsahuje kationty.

Chemikálie musí být nejméně analytické čistoty. Nepřítomnost prvků, které mají být stanoveny, musí být kontrolována slepou zkouškou. Pokud je to nutné, musí být chemikálie přečištěny.

Místo standardních roztoků popsaných níže mohou být použity komerční standardní roztoky za předpokladu, že mají deklarovaný obsah a před použitím byly překontrolovány.

4.   Přístroje a pomůcky

5.   Postup ( 13 )

5.1   Vzorky obsahující organickou hmotu

5.1.1    Spalování a příprava roztoku pro zkoušku ( 14 )

Popel se zvlhčí vodou a přenese se do 250 ml kádinky. Kelímek se vypláchne celkem asi 5 ml kyseliny chlorovodíkové (3.1) a další kyselina se přidává pomalu a opatrně do kádinky (může proběhnout prudká reakce v důsledku tvorby CO2). Kyselina chlorovodíková (3.1) se přidává po kapkách a za míchání, dokud neustane šumění. Odpaří se do sucha za občasného zamíchání skleněnou tyčinkou.

K odparku se přidá 15 ml kyseliny chlorovodíkové 6 mol/l (3.2) a poté asi 120 ml vody. Promíchá se skleněnou tyčinkou, která se ponechá v kádince, a poté se kádinka zakryje hodinovým sklem. Obsah kádinky se uvede do mírného varu a udržuje se na bodu varu, dokud se popel nerozpustí. Roztok se přefiltruje přes bezpopelný papírový filtr a filtrát se jímá do 250 ml odměrné baňky. Kádinka a filtr se promyjí 5 ml horké kyseliny chlorovodíkové 6 mol/l (3.2) a dvakrát vroucí vodou. Odměrná baňka se doplní po značku vodou (koncentrace HCl je asi 0,5 mol/l).

Poznámky:

5.1.2    Spektrofotometrické stanovení

5.1.2.1    Příprava kalibračních roztoků

Pro každý stanovovaný prvek se připraví z pracovních standardních roztoků (3.7.1, 3.8.1, 3.9.1 a 3.10.1) řada kalibračních roztoků. Kalibrační roztoky mají koncentraci HCl asi 0,5 mol/l a (v případě železa, manganu a zinku) koncentraci chloridu lanthanitého asi 0,1 % La (w/v).

Koncentrace vybraných stopových prvků musí ležet v rozsahu citlivosti použitého spektrofotometru. Níže uvedené tabulky ukazují příklad složení typických řad kalibračních roztoků; v závislosti na typu a citlivosti použitého spektrofotometru však může být nutno zvolit jiné koncentrace.

Železo

Měď

Mangan

Zinek

5.1.2.2    Příprava roztoku pro zkoušku

Při stanovení mědi lze použít přímo roztok připravený podle bodu 5.1.1. Pokud je nutné jeho koncentraci naředit na úroveň kalibračních roztoků, odpipetuje se alikvotní část roztoku do 100 ml odměrné baňky a doplní se po značku kyselinou chlorovodíkovou 0,5 mol/l (3.3).

Při stanovení železa, manganu a zinku se odpipetujte alikvotní část roztoku připraveného podle bodu 5.1.1 do 100 ml odměrné baňky, přidá se 10 ml roztoku chloridu lanthanitého (3.11) a doplní se po značku kyselinou chlorovodíkovou 0,5 mol/l (3.3) (viz rovněž bod 8 Poznámka).

5.1.2.3    Slepá zkouška

Slepá zkouška musí zahrnovat všechny předepsané kroky postupu, ale vlastní vzorek se nepoužije. „0“ kalibrační roztok nemůže být použit jako slepá zkouška.

5.1.2.4    Měření atomové absorpce

Atomová absorpce kalibračních roztoků a zkoušeného roztoku se změří s použitím oxidačního plamene vzduch-acetylen při následujících vlnových délkách:

Každé měření se provede čtyřikrát.

5.2   Minerální krmiva

Pokud vzorek neobsahuje organickou hmotu, nemusí se spalovat. Příprava se provádí podle druhého odstavce bodu 5.1.1.1. Nemusí se provádět ani odpařování s kyselinou fluorovodíkovou.

6.   Výpočet a vyjádření výsledků

Koncentrace příslušného stopového prvku v roztoku se vypočte z kalibrační křivky a výsledek se vyjádří v miligramech stopového prvku na kilogram vzorku (ppm).

7.   Opakovatelnost

Rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení provedených na stejném vzorku týmž laborantem nesmí překročit:

8.   Poznámka

Přítomnost velkého množství fosfátů může ovlivňovat stanovení železa, manganu a zinku. Proto musí být přidáván roztoku chloridu lanthanitého (3.11). Pokud je váhový poměr (Ca + Mg)/P ve vzorku > 2, nemusí se do roztoku pro zkoušku ani do kalibračních roztoků přidávat roztok chloridu lanthanitého (3.11).

D.   STANOVENÍ OBSAHU HALOFUGINONU

DL-trans-7-brom-6-chlor-3-[3-(3-hydroxy-2-piperidyl)acetonyl]-quinazolin-4-(3H)-1-hydrobromid

1.   Účel a rozsah

Tato metoda umožňuje stanovení obsahu halofuginonu v krmivech. Mez kvantifikace je 1 mg/kg.

2.   Princip

Obsah halofuginonu se stanoví jako volná báze po extrakci horkou vodou do ethylacetátu a následně se rozdělí jako hydrochlorid do vodného kyselého roztoku. Extrakt se přečistí na ionexové chromatografické koloně. Obsah halofuginonu se stanoví metodou vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC) na reverzní fázi s UV detekcí.

3.   Chemikálie

Do 500 ml odměrné baňky se naváží 50 mg halofuginonu (3.6) s přesností na 0,1 mg, rozpustí se v tlumivém roztoku octanu amonného (3.18), doplní po značku tlumivým roztokem a promíchá. Tento roztok je stálý tři týdny při teplotě 5 oC, je-li skladován ve tmě.

Do řady 100 ml odměrných baněk se odpipetuje 1,0 , 2,0 , 3,0 , 4,0 a 6,0 ml standardního zásobního roztoku (3.6.1). Doplní se po značku mobilní fází (3.21) a promíchá. Roztoky mají koncentrace halofuginonu 1,0 , 2,0 , 3,0 , 4,0 a 6,0 μg/ml. Tyto roztoky se musí připravovat čerstvé před použitím.

50 g uhličitanu sodného (3.11) se rozpustí ve vodě, doplní se na 1 000 ml a přidává se chlorid sodný (3.12), až k nasycení roztoku.

10 ml HCl (3.7) se zředí vodou na 1 000 ml.

19,3 g octanu amonného (3.3) a 30 ml kyseliny octové (3.5) se rozpustí ve vodě (3.14) a zředí se na 1 000 ml.

Přiměřené množství amberlitu (3.2) se promývá ve vodě, až se odstraní všechny chloridové ionty, což se prokáže zkouškou pomocí dusičnanu stříbrného (3.20) na odstraňované vodní fázi. Pak se pryskyřice promyje 50 ml methanolu (3.8), který se odstraní, a pryskyřice se uloží pod čerstvý methanol.

0,17 g dusičnanu stříbrného (3.9) se rozpustí v 10 ml vody.

Smíchá se 500 ml acetonitrilu (3.1), 300 ml tlumivého roztoku octanu amonného (3.18) a 1 200 ml vody (3.14). pH se upraví na 4,3 za použití kyseliny octové (3.5). Přefiltruje se filtrem 0,22 μm (4.8) a roztok se odplyní (např. tím, že se vystaví ultrazvuku po dobu 10 minut). Tento roztok je stálý jeden měsíc, je-li skladován ve tmě a v uzavřené nádobě.

4.   Přístroje a pomůcky

5.   Postup

Poznámka

:

Halofuginon jako volná báze je nestálý v alkalických roztocích a v roztocích ethylacetátu. Nesmí zůstat v roztoku ethylacetátu déle než 30 minut.

5.1   Obecné pokyny

Poznámka

:

Pro účely této metody je slepý vzorek krmiva podobného druhu jako vzorek a při zkoušce není zjištěn halofuginon.

5.2   Extrakce

Do odstředivkové zkumavky o obsahu 200 ml se naváží 10 g upraveného vzorku s přesností na 0,1 g, přidá se 0,5 g askorbátu sodného (3.10), 0,5 g EDTA (3.13) a 20 ml vody a promíchá se. Zkumavka se umístí na 5 minut do vodní lázně (80 oC). Po vychladnutí na laboratorní teplotu se přidá 20 ml roztoku uhličitanu sodného (3.15) a promíchá se. Ihned se přidá 100 ml ethylacetátu (3.4) a ručně se 15 sekund intenzivně třepe. Pak se zkumavka s uvolněnou zátkou umístí na tři minuty do ultrazvukové lázně (4.1). Odstředí se dvě minuty a ethylacetátová fáze se odlije přes filtr ze skleněných vláken (4.6) do 500 ml separační nálevky. Extrakce vzorku se opakuje s dalšími 100 ml ethylacetátu. Kombinované extrakty se promývají jednu minutu 50 ml roztoku uhličitanu sodného saturovaného chloridem sodným (3.16) a poté se vodná vrstva odstraní.

Organická vrstva se extrahuje po dobu jedné minuty 50 ml kyseliny chlorovodíkové (3.17). Spodní kyselinová vrstva se vypustí do 250 ml separační nálevky. Organická vrstva se znovu extrahuje 1,5 minuty s dalšími 50 ml kyseliny chlorovodíkové a kyselinová vrstva se spojí s prvním extraktem. Spojené kyselinové extrakty se třepou přibližně 10 sekund s 10 ml ethylacetátu (3.4).

Vodná vrstva se kvantitativně převede do 250 ml baňky s kulatým dnem a organická fáze se odstraní. Pomocí rotační odparky (4.2) se z kyselého roztoku odpaří všechen zbývající ethylacetát. Teplota vodní lázně nesmí přesáhnout 40 oC. Ve vakuu přibližně 25 mbar se všechen zbývající ethylacetát odstraní během 5 minut při teplotě 38 oC.

5.3   Přečištění

5.3.1    Příprava amberlitové kolony

Pro každý extrakt vzorku se připraví kolona s XAD-2. Do skleněné kolony (4.5) se přenese 10 g připraveného amberlitu (3.19) spolu s methanolem (3.8). Na horní konec pryskyřicové kolony se vloží malá zátka ze skelné vaty. Methanol z kolony se odstraní a kolona se promyje 100 ml vody. Přívod vody se zastaví, jakmile tekutina dosáhne horního konce pryskyřicové kolony. Před použitím se kolona nechá 10 minut ekvilibrovat. Kolona nesmí nikdy vyschnout.

5.3.2    Přečištění vzorku

Extrakt (5.2) se kvantitativně převede na horní část připravené amberlitové kolony (5.3.1) a eluuje se, přičemž se eluát odstraňuje. Rychlost promývání nesmí přesáhnout 20 ml/min. Baňka s kulatým dnem se vypláchne 20 ml kyseliny chlorovodíkové (3.17) a tato tekutina se použije k promytí pryskyřicové kolony. Zbytek kyselého roztoku se z kolony odstraní proudem vzduchu. Promývací roztok se také odstraní. Na kolonu se přidá 100 ml methanolu (3.8) a vypustí se asi 5–10 ml eluátu do 250 ml baňky s kulatým dnem. Zbývající methanol se nechá 10 minut ustát na koloně a potom se pokračuje v promývání rychlostí, která nepřesáhne 20 ml/min. Eluát se shromažďuje v téže baňce s kulatým dnem. Methanol se odpaří na rotační odparce (4.2), teplota vodní lázně nesmí přesáhnout 40 oC. Odparek se pomocí mobilní fáze (3.21) kvantitativně převede do 10 ml odměrné baňky. Doplní se mobilní fází po značku a promíchá. Alikvotní část se filtruje membránovým filtrem (4.7). Tento roztok se uschová pro stanovení HPLC (5.4).

5.4   Stanovení HPLC

5.4.1    Parametry

Následující podmínky jsou doporučené, lze použít i jiné podmínky, pokud zajišťují srovnatelné výsledky:

Kolona pro kapalinovou chromatografii (4.4.1).

HPLC mobilní fáze (3.21).

Průtok: 1,5 –2 ml/min.

Detekční vlnová délka: 243 nm.

Objem nástřiku: 40–100 μl.

Stálost chromatografického systému se kontroluje opakovaným nástřikem kalibračního roztoku (3.6.2), který obsahuje 3,0 μg/ml halofuginonu. Opakuje se několikrát, až se dosáhne konstantní výšky (plochy) píků a konstantních retenčních časů.

5.4.2    Kalibrační křivka

Provede se několikrát nástřik každého kalibračního roztoku (3.6.2) a změří se výšky (plochy) píků pro každou koncentraci. Kalibrační křivka se vytvoří vynesením průměrných hodnot výšek nebo ploch píků kalibračních roztoků proti příslušným koncentracím v μg/ml.

5.4.3    Roztok vzorku

Provede se několikrát nástřik roztoku vzorku (5.3.2), přičemž se použije stejný objem jako pro kalibrační roztoky a zjistí se průměrná hodnota výšky (plochy) halofuginonových píků.

6.   Výpočet a vyjádření výsledků

Koncentrace halofunginonu v roztoku vzorku v μg/ml se stanoví podle průměrné hodnoty výšky (plochy) halofuginonových píků v roztoku vzorku porovnáním s kalibrační křivkou (5.4.2).

Obsah halofuginonu (w) v mg/kg ve vzorku se vypočítá podle následujícího vzorce:

kde:

c

:

koncentrace halofuginonu v roztoku vzorku v μg/ml

m

:

hmotnost navážky vzorku v gramech.

7.   Ověření výsledků

7.1   Identita

Identita analytu může být potvrzena opakovaným stanovením s přídavkem (co-chromatography) nebo využitím detektoru diodového pole, přičemž se porovnávají spektra extraktu vzorku a kalibračního roztoku (3.6.2) obsahujícího 6,0 μg/ml halofuginonu.

7.1.1    Opakované stanovení s přídavkem (co-chromatography)

K extraktu vzorku se přidá vhodné množství kalibračního roztoku (3.6.2). Množství přidaného halofuginonu musí odpovídat odhadovanému obsahu halofuginonu v extraktu vzorku.

Přídavek se projeví pouze zvýšením píku halofuginonu, a to úměrně k přidanému množství a ředění extraktu. Šířka píku v polovině maximální výšky se může odchylovat od šířky původního píku nejvýše o ±10 %.

7.1.2    Detektor diodového pole

Výsledky jsou posuzovány podle následujících kritérií:

Jestliže některé z těchto kritérií není splněno, přítomnost analytu není potvrzena.

7.2   Opakovatelnost

Rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení provedených na stejném vzorku nesmí překročit 0,5 mg/kg při obsahu halofuginonu do 3 mg/kg.

7.3   Výtěžnost

Výtěžnost pro obohacený slepý vzorek krmiva musí být nejméně 80 %.

8.   Výsledky kruhových testů

Při kruhových testech ( 15 ) byly osmi laboratořemi zkoušeny tři vzorky.

ND

=

nezjištěno

SR

=

standardní odchylka reprodukovatelnosti

CVR

=

variační koeficient reprodukovatelnosti (%)

Rec.

=

výtěžnost (%).

E.   STANOVENÍ OBSAHU ROBENIDINU

1,3 -bis[(4-chlorobenzyliden) amino]guanidin hydrochlorid

1.   Účel a rozsah

Tato metoda umožňuje stanovení obsahu robenidinu v krmivech. Mez kvantifikace je 5 mg/kg.

2.   Princip

Vzorek se extrahuje okyseleným methanolem. Extrakt se vysuší a jeho alikvotní část se přečistí na koloně s oxidem hlinitým. Robenidin se eluuje z kolony methanolem, koncentruje se a na vhodný objem se upraví pomocí mobilní fáze. Obsah robenidinu se stanoví vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC) na reverzní fázi pomocí UV detektoru.

3.   Chemikálie

Do 500 ml odměrné baňky se odměří 4,0 ml kyseliny chlorovodíkové (ρ20 = 1,18 g/ml), doplní se po značku methanolem (3.1) a promíchá. Tento roztok se připravuje čerstvý před použitím.

Typ 3A, 8–12 mesh (1,6 –2,5 mm perličky krystalického hlinitokřemičitanu, průměr pórů 0,3 mm).

100 g oxidu hlinitého se naváží do vhodné nádoby a přidají se 2,0 ml vody. Zazátkuje se a protřepává přibližně 20 minut. Skladuje se v dobře zazátkované nádobě.

3,4 g dihydrogenfosforečnanu draselného se rozpustí ve vodě (pro HPLC) v 1 000 ml odměrné baňce, doplní se po značku a promíchá.

3,55 g bezvodého (nebo 4,45 g dihydrátu, nebo 8,95 g dodekahydrátu) hydrogenfosforečnanu sodného se rozpustí ve vodě (pro HPLC) v 1 000 ml odměrné baňce, doplní se po značku a promíchá.

Smíchá se:

Přefiltruje se filtrem 0,22 μm (4.6) a roztok se odplyní (např. ultrazvukem po dobu 10 minut).

Čistý robenidin: 1,3 -bis[(4-chlorobenzyliden) amino]guanidin hydrochlorid.

Naváží se 30 mg standardní látky robenidinu (3.9) s přesností na 0,1 mg. Rozpustí se v okyseleném methanolu (3.2) ve 100 ml odměrné baňce, doplní se po značku týmž rozpouštědlem a promíchá se. Baňka se obalí aluminiovou fólií a uloží ve tmě.

Odměří se 10,0 ml základního standardního roztoku (3.9.1) do 250 ml odměrné baňky, doplní se po značku mobilní fází (3.8) a promíchá. Baňka se obalí aluminiovou fólií a uloží ve tmě.

Do sady 50 ml odměrných baněk se odměří 5,0 , 10,0 , 15,0 , 20,0 a 25,0 ml pracovního standardního roztoku (3.9.2). Doplní se po značku mobilní fází (3.8) a promíchá. Tyto roztoky odpovídají 1,2 , 2,4 , 3,6 , 4,8 a 6,0 μg/ml robenidinu. Tyto roztoky se připravují čerstvé před použitím.

4.   Přístroje a pomůcky

Vyrobená z tmavého skla, vybavená uzavíracím kohoutem a nádržkou o obsahu přibližně 150 ml. Vnitřní průměr 10–15 mm, délka 250 mm.

5.   Postup

Poznámka

:

Robenidin je citlivý na světlo. Proto se při všech operacích použije vždy tmavé sklo.

5.1   Obecné pokyny

Poznámka

:

Pro účely této metody je slepý vzorek krmiva podobného druhu jako vzorek a při zkoušce není zjištěn robenidin.

5.2   Extrakce

Do 250 ml kónické baňky se naváží přibližně 15 g upraveného vzorku s přesností na 0,01 g, přidá se 100,0 ml okyseleného methanolu (3.2), zazátkuje a hodinu třepe na třepačce (4.2). Roztok se přefiltruje přes filtr ze skleněných vláken (4.5) a celý objem filtrátu se jímá do 150 ml kónické baňky. Přidá se 7,5 g molekulárního síta (3.4), zazátkuje a pět minut se třepe. Potom se ihned přefiltruje přes filtr ze skleněných vláken. Tento roztok se použije k čištění (5.3).

5.3   Čištění

5.3.1    Příprava kolony s oxidem hlinitým

Do spodního konce skleněné kolony (4.1) se vloží malá zátka ze skelné vaty a utěsní se skleněnou tyčinkou. Naváží se 11,0 g připraveného kysličníku hlinitého (3.5) a nasype se do kolony, pokud možno s minimální časovou prodlevou v okolním prostředí. Oxid hlinitý se v naplněné koloně setřese lehkým poklepem na dolní konec kolony.

5.3.2    Čištění vzorku

Na kolonu se napipetuje 5,0 ml upraveného extraktu vzorku (5.2). Špička pipety se opře o stěnu kolony a roztok se nechá absorbovat oxidem hlinitým. Robenidin se z kolony eluuje pomocí 100 ml methanolu (3.1) při rychlosti průtoku 2–3 ml za minutu a eluát se jímá do 250 ml baňky s kulatým dnem. Methanolový roztok se za redukovaného tlaku a při teplotě 40 oC odpaří do sucha v rotační odparce (4.3). Odparek se znovu rozpustí ve 3–4 ml mobilní fáze (3.8) a kvantitativně se převede do 10 ml odměrné baňky. Baňka se několikrát vypláchne 1–2 ml mobilní fáze a tyto roztoky se přidají do odměrné baňky. Baňka se doplní po značku týmž rozpouštědlem a promíchá. Alikvotní část se přefiltruje přes 0,45 μm membránový filtr (4.7). Tento roztok se použije pro stanovení HPLC (5.4).

5.4   Stanovení HPLC

5.4.1    Parametry

Následující podmínky jsou doporučené, mohou být použity jiné podmínky za předpokladu, že poskytují rovnocenné výsledky.

Kolona pro kapalinovou chromatografii (4.4.1)

Mobilní fáze HPLC (3.8)

Průtok: 1,5 –2 ml/min

Vlnová délka detektoru: 317 nm

Objem nástřiku: 20–50 μl

Stabilita chromatografického systému se kontroluje opakovaným nástřikem kalibračního roztoku (3.9.3), který obsahuje 3,6 μg/ml, dokud se nedosáhne konstantních výšek píků a konstantních retenčních časů.

5.4.2    Kalibrační křivka

Pro každý kalibrační roztok (3.9.3) se provede několik nástřiků a změří se výšky (plochy) píků pro každou koncentraci. Kalibrační křivka se vytvoří vynesením průměrných hodnot výšek nebo ploch píků kalibračních roztoků proti příslušným koncentracím v μg/ml.

5.4.3    Roztok vzorku

Opakovaně se nastříkne stejný objem extraktu vzorku (5.3.2) jako při kalibraci a určí se průměrná hodnota výšky (plochy) píků robenidinu.

6.   Výpočet a vyjádření výsledků

Z průměrných hodnot výšky (plochy) robenidinových píků v roztoku vzorku se určí koncentrace robenidinu v roztoku vzorku v μg/ml porovnáním s kalibrační křivkou (5.4.2).

Obsah robenidinu (w) v mg/kg ve vzorku se vypočítá podle následujícího vzorce:

kde:

c

=

koncentrace robenidinu v roztoku vzorku v μg/ml

m

=

hmotnost navážky vzorku v gramech.

7.   Ověření výsledků

7.1   Identita

Identitu analytů lze potvrdit opakovaným stanovením s přídavkem anebo využitím detektoru diodového pole, který umožňuje porovnání spektra extraktu vzorku a kalibračního roztoku (3.9.3) obsahujícího 6 μg/ml robenidinu.

7.1.1    Opakované stanovení s přídavkem (co-chromatography)

K extraktu vzorku se přidá vhodné množství kalibračního roztoku (3.9.3). Množství přidaného robenidinu musí odpovídat předpokládanému obsahu robenidinu v extraktu vzorku.

Přídavek se projeví pouze zvýšením píku robenidinu, a to úměrně k přidanému množství a ředění. Šířka píku v polovině jeho maximální výšky se může odchylovat od šířky původního píku nejvýše o ±10 %.

7.1.2    Detektor diodového pole

Výsledky jsou posuzovány podle následujících kritérií:

Jestliže některé z těchto kritérií není splněno, přítomnost analytu není potvrzena.

7.2   Opakovatelnost

Rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení provedených na stejném vzorku nesmí přesáhnout 10 % z hodnoty nejvyššího výsledku při obsahu robenidinu nad 15 mg/kg.

7.3   Výtěžnost

Výtěžnost pro obohacený slepý vzorek krmiva musí být nejméně 85 %.

8.   Výsledky kruhových testů

Byl proveden kruhový test ES, ve kterém dvanáct laboratoří analyzovalo čtyři vzorky krmiv pro drůbež a králíky, sypkých nebo peletovaných. U každého vzorku byly provedeny dvě zkoušky. Výsledky jsou uvedeny v následující tabulce:

sr

=

standardní odchylka opakovatelnosti

CVr

=

variační koeficient opakovatelnosti v %

SR

=

standardní odchylka reprodukovatelnosti

CVR

=

variační koeficient reprodukovatelnosti v %.

F.   STANOVENÍ DICLAZURILU

2,6-dichlor-alfa-(4-chlorofenyl)-4-(4,5-dihydro-3,5-dioxo-1,2,4-triazin-2-(3-H)yl)benzenacetonitril

1.   Účel a rozsah

Tato metoda umožňuje stanovení obsahu diclazurilu v krmivech a premixech. Mez detekce je 0,1 mg/kg, mez kvantifikace 0,5 mg/kg.

2.   Princip

Po přidání interního standardu se vzorek extrahuje okyseleným methanolem. U krmiv se alikvotní část extraktu přečistí na SPE patroně C18. Diclazuril se z patrony eluuje směsí okyseleného methanolu a vody. Po odpaření se zbytek rozpustí v roztoku DMF/voda. U premixů se extrakt odpaří a zbytek se rozpustí v roztoku DMF/voda. Obsah diclazurilu se stanoví vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC) na reverzní fázi s ternárním gradientem s UV detekcí.

3.   Chemikálie

Do 50 ml odměrné baňky se naváží 25 mg diclazurilu (3.8) s přesností na 0,1 mg, rozpustí se v DMF (3.6), doplní se DMF (3.6) po značku a promíchá. Odměrná baňka se obalí hliníkovou fólií nebo se použije odměrná baňka z tmavého skla a uchovává se v chladničce. Roztok je při teplotě ≤ 4 oC stálý jeden měsíc.

Do 50 ml odměrné baňky se převede 5,00 ml základního standardního roztoku (3.8.1), doplní se DMF (3.6) po značku a promíchá. Odměrná baňka se obalí hliníkovou fólií nebo se použije odměrná baňka z tmavého skla a uchovává se v chladničce. Roztok je při teplotě ≤ 4 oC stálý jeden měsíc.

Do 50 ml odměrné baňky se naváží 25 mg interní standardní substance (3.9) s přesností na 0,1 mg, rozpustí se v DMF (3.6), doplní se DMF (3.6) po značku a promíchá. Odměrná baňka se obalí hliníkovou fólií nebo se použije odměrná baňka z tmavého skla a uchovává se v chladničce. Roztok je při teplotě ≤ 4 oC stálý jeden měsíc.

Do 50 ml odměrné baňky se převede 5,00 ml interního základního standardního roztoku (3.9.1), doplní se DMF (3.6) po značku a promíchá. Odměrná baňka se obalí hliníkovou fólií nebo se použije odměrná baňka z tmavého skla a uchovává se v chladničce. Roztok je při teplotě ≤ 4 oC stálý jeden měsíc.

(p = deklarovaný obsah diclazurilu v premixu v mg/kg)

Do 100 ml odměrné baňky se naváží p/10 mg interní standardní substance s přesností na 0,1 mg, rozpustí se v DMF (3.6) v ultrazvukové lázni (4.6), doplní DMF po značku a promíchá. Odměrná baňka se obalí hliníkovou fólií nebo se použije odměrná baňka z tmavého skla a uchovává se v chladničce. Roztok je při teplotě ≤ 4 oC stálý jeden měsíc.

Do 50 ml odměrné baňky se odpipetuje 2,00 ml standardního roztoku diclazurilu (3.8.2) a 2,00 ml interního standardního roztoku (3.9.2). Přidá se 16 ml DMF (3.6), doplní se vodou po značku a promíchá. Tento roztok se připravuje čerstvý před použitím.

Do 1 000 ml methanolu (3.5) se napipetuje 5,0 ml kyseliny chlorovodíkové (3.7) a promíchá.

5 g octanu amonného (3.2) a 3,4 g TBHS (3.3) se rozpustí v 1 000 ml vody a promíchá se.

4.   Přístroje a pomůcky

5.   Postup

5.1   Obecné pokyny

5.1.1    Slepý vzorek krmiva

Za účelem kontroly toho, že slepý vzorek krmiva neobsahuje ani diclazuril, ani jiné rušivé látky, se provede slepá zkouška. Slepý vzorek krmiva má podobné složení jako zkoušený vzorek a není zjištěn diclazuril ani jiné rušivé látky.

5.1.2    Zkouška na výtěžnost

Zkouška na výtěžnost se provede na slepém vzorku krmiva, ke kterému bylo přidáno takové množství diclazurilu, které odpovídá množství diclazurilu ve zkoušeném vzorku. Pro obohacení na obsah 1 mg/kg se k 50 g slepého vzorku krmiva přidá 0,1 ml základního standardního roztoku (3.8.1). Důkladně se promíchá, nechá se 10 minut stát a před zahájením extrakce (5.2) se znovu několikrát promíchá.

Není-li k dispozici slepý vzorek krmiva podobného složení jako zkoušený vzorek (viz 5.1.1), lze provést zkoušku na výtěžnost metodou standardního přídavku. V tom případě se ke zkoušenému vzorku přidá přibližně stejné množství diclazurilu, jaké je ve vzorku již obsaženo. Obohacený vzorek se potom zkouší společně se vzorkem neobohaceným a výtěžnost se vypočte odečtením.

5.2   Extrakce

5.2.1    Krmiva

Do 500 ml kónické baňky se naváží 50 g vzorku s přesností na 0,01 g. Přidá se 1,00 ml interního standardního roztoku (3.9.2) a 200 ml extrakční směsi (3.12) a baňka se uzavře. Směs se přes noc třepe na míchacím zařízení (4.1). Poté se nechá 10 minut usadit. 20 ml supernatantu se převede do vhodné skleněné nádoby a zředí se 20 ml vody. Tento roztok se nanese na extrakční patronu (3.11) a prosaje se pomocí vakua (4.5). Patrona se promyje 25 ml směsi složené z extrakční směsi (3.12) a vody, 65 + 35 (V + V). Spojené frakce se odstraní, účinná látka a interní standard se eluují 25 ml směsi složené z extrakční směsi (3.12) a vody, 80 + 20 (V + V). Tato frakce se v rotační odparce (4.3) odpaří při 60 oC do sucha. Odparek se rozpustí v 1,0 ml DMF (3.6), přidá se 1,5 ml vody (3.1) a promíchá. Roztok se přefiltruje přes membránový filtr (4.4). Dále se pokračuje se stanovením HPLC (5.3).

5.2.2    Premixy

Do 500 ml kónické baňky se naváží 1 g vzorku s přesností na 0,001 g. Přidá se 1,00 ml interního standardního roztoku (3.9.3) a 200 ml extrakční směsi (3.12) a baňka se uzavře. Směs se přes noc třepe na třepačce (4.1). Poté se nechá 10 minut usadit. 10 000 /p ml (p = deklarovaný obsah diclazurilu v premixu v mg/kg) supernatantu se převede do baňky s kulatým dnem vhodné velikosti. V rotační odparce (4.3) se odpaří za sníženého tlaku při 60 oC do sucha. Odparek se rozpustí v 10,0 ml DMF (3.6), přidá se 15,0 ml vody (3.1) a promíchá. Dále se pokračuje se stanovením HPLC (5.3).

5.3   Stanovení HPLC

5.3.1    Parametry

Níže uvedené podmínky jsou doporučené, lze použít jiné podmínky, pokud poskytují rovnocenné výsledky.

Stabilita chromatografického systému se kontroluje opakovaným nástřikem kalibračního roztoku (3.10), který obsahuje 2 μg/ml, dokud se nedosáhne konstantních výšek píků a konstantních retenčních časů.

5.3.2    Kalibrační roztok

Několikrát se nastřikuje 20 μl kalibračního roztoku (3.10) a stanoví se průměrná hodnota výšky (plochy) píku diclazurilu a interního standardu.

5.3.3    Roztok vzorku

Několikrát se nastřikuje 20 μl roztoku vzorku (5.2.1 nebo 5.2.2) a stanoví se průměrná hodnota výšky (plochy) píku diclazurilu a interního standardu.

6.   Výpočet výsledků

6.1   Krmiva

Obsah diclazurilu (w) v mg/kg ve vzorku se vypočte podle následujícího vzorce:

(mg/kg)

kde:

hd,s

=

výška (plocha) píku diclazurilu v roztoku vzorku (5.2.1)

hi,s

=

výška (plocha) píku interního standardu v roztoku vzorku (5.2.1)

hd,c

=

výška (plocha) píku diclazurilu v kalibračním roztoku (3.10)

hi,c

=

výška (plocha) píku interního standardu v kalibračním roztoku (3.10)

cd,c

=

koncentrace diclazurilu v kalibračním roztoku v μg/ml (3.10)

m

=

hmotnost navážky vzorku v g

V

=

objem extrakční směsi podle 5.2.1 (tj. 2,5 ml).

6.2   Premixy

Obsah diclazurilu (w) v mg/kg ve vzorku se vypočte podle následujícího vzorce:

(mg/kg)

kde:

hd,c

=

výška (plocha) píku diclazurilu v kalibračním roztoku (3.10)

hi,c

=

výška (plocha) píku interního standardu v kalibračním roztoku (3.10)

hd,s

=

výška (plocha) píku diclazurilu v roztoku vzorku (5.2.2)

hi,s

=

výška (plocha) píku interního standardu v roztoku vzorku (5.2.2)

cd,c

=

koncentrace diclazurilu v kalibračním roztoku v μg/ml (3.10)

m

=

hmotnost navážky vzorku v g

V

=

objem extrakční směsi podle 5.2.2 (tj. 25 ml)

p

=

deklarovaný obsah diclazurilu v premixu v mg/kg.

7.   Ověření výsledků

7.1   Identita

Identitu analytů lze potvrdit opakovaným stanovením s přídavkem (co-chromatography) nebo využitím detektoru diodového pole, přičemž se srovnávají spektra extraktu vzorku (5.2.1 nebo 5.2.2) a kalibračního roztoku (3.10).

7.1.1    Opakované stanovení s přídavkem (co-chromatography)

K extraktu vzorku (5.2.1 nebo 5.2.2) se přidá vhodné množství kalibračního roztoku (3.10). Přidané množství diclazurilu musí odpovídat obsahu diclazurilu v extraktu vzorku.

Přídavek se projeví pouze zvýšením píku diclazurilu a píku interního standardu, a to úměrně přidanému množství a ředění. Šířka píku v polovině maximální výšky se může odchylovat od šířky původního píku diclazurilu nebo píku interního standardu v neobohaceném extraktu vzorku nejvýše o ± 10 %.

7.1.2    Detektor diodového pole

Výsledky jsou posuzovány podle následujících kritérií:

Jestliže některé z těchto kritérií není splněno, přítomnost analytu není potvrzena.

7.2   Opakovatelnost

Rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení provedených u stejného vzorku nesmí překročit:

7.3   Výtěžnost

Pro obohacený (slepý) vzorek musí být výtěžnost nejméně 80 %.

8.   Výsledky kruhových testů

Při mezilaboratorních zkouškách bylo zkoušeno 5 vzorků 11 laboratořemi. Tyto vzorky sestávaly ze dvou premixů, z nichž jeden byl smísen s organickou (O 100) a druhý s anorganickou matricí (A 100). Teoretický obsah diclazurilu je 100 mg/kg. Tři krmné směsi pro drůbež pocházely od 3 různých výrobců (NL) (L1/Z1/K1). Teoretický obsah diclazurilu je 1 mg/kg. Laboratoře byly pověřeny, aby každý ze vzorků podrobily jedné nebo dvěma zkouškám. (Přesnější údaje o těchto kruhových testech viz Journal of AOAC International, Volume 77, No6, 1994, s. 1 359–1 361). Výsledky jsou shrnuty v níže uvedené tabulce.

L

=

počet laboratoří

n

=

počet jednotlivých hodnot

Sr

=

standardní odchylka opakovatelnosti

CVr

=

variační koeficient opakovatelnosti

SR

=

standardní odchylka reprodukovatelnosti

CVR

=

variační koeficient reprodukovatelnosti.

9.   Poznámky

Musí být předem prokázáno, že odezva diclazurilu je měřena v lineární oblasti koncentrace.

G.   STANOVENÍ OBSAHU LASALOCIDU

Sodná sůl polyetherové karboxylové kyseliny produkované Streptomyces lasaliensis

1.   Účel a rozsah

Tato metoda umožňuje stanovení obsahu lasalocidu v krmivech a premixech. Mez detekce je 5 mg/kg, mez kvantifikace 10 mg/kg.

2.   Princip

Lasalocid se extrahuje ze vzorku okyseleným methanolem a stanoví se vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC) na reverzní fázi s použitím spektrofluorimetru.

3.   Chemikálie

23,5 ml kyseliny fosforečné (3.2) se doplní vodou na 100 ml.

V 500 ml vody (3.11) se rozpustí 1,36 g KH2PO4 (3.1), přidá se 3,5 ml kyseliny fosforečné (3.2) a 10,0 ml 6-methyl-2-heptylaminu (3.4). Hodnota pH se upraví roztokem kyseliny fosforečné (3.3) na 4,0 a doplní se vodou (3.11) na 1 000 ml.

Do 1 000 ml odměrné baňky se odměří 5,0 ml kyseliny chlorovodíkové (3.6), doplní se methanolem (3.5) po značku a promíchá. Tento roztok se připravuje čerstvý před použitím.

Smíchá se 5 ml fosfátového tlumivého roztoku (3.7) a 95 ml methanolu (3.5).

Do 100 ml odměrné baňky se naváží 50 mg lasalocidu (3.10) s přesností na 0,1 mg a rozpustí se v okyseleném methanolu (3.8), doplní se jím po značku a promíchá. Tento roztok se musí připravovat čerstvý před použitím.

10,0 ml základního standardního roztoku (3.10.1) se odpipetuje do 100 ml odměrné baňky, doplní se po značku okyseleným methanolem (3.8) a promíchá. Tento roztok se musí připravovat čerstvý před použitím.

Do řady 50 ml odměrných baněk se odpipetuje 1,0 , 2,0 , 4,0 , 5,0 a 10,0 ml pracovního standardního roztoku (3.10.2). Doplní se po značku okyseleným methanolem (3.8) a promíchá. Tyto roztoky odpovídají 1,0 , 2,0 , 4,0 , 5,0 a 10,0 μg lasalocidu na ml. Tyto roztoky se musí připravovat čerstvé před použitím.

4.   Přístroje a pomůcky

5.   Postup

5.1   Obecné pokyny

5.1.1    Slepý vzorek krmiva

Pro provedení zkoušky na výtěžnost (5.1.2) se provede zkouška slepého vzorku krmiva pro kontrolu, že není přítomen ani lasalocid ani jiné rušivé látky. Slepý vzorek krmiva má podobné složení jako zkoušený vzorek a není zjištěn lasalocid ani jiné rušivé látky.

5.1.2    Zkouška na výtěžnost

Zkouška na výtěžnost se provede na slepém vzorku krmiva, ke kterému bylo přidáno takové množství lasalocidu, které odpovídá množství lasalocidu ve zkoušeném vzorku. Pro obohacení na obsah 100 mg/kg se přidá 10,0 ml základního standardního roztoku (3.10.1) do 250 ml kónické baňky a roztok se odpaří na objem asi 0,5 ml. Potom se přidá 50 g slepého vzorku krmiva. Důkladně se promíchá, nechá se 10 minut stát a před zahájením extrakce (5.2) se znovu několikrát promíchá.

Není-li k dispozici slepý vzorek krmiva podobného složení jako zkoušený vzorek (viz 5.1.1), lze provést zkoušku na výtěžnost metodou standardního přídavku. V tom případě se ke zkoušenému vzorku přidá přibližně stejné množství lasalocidu, jaké je ve vzorku již obsaženo. Obohacený vzorek se potom zkouší společně se vzorkem neobohaceným a výtěžnost se vypočte odečtením.

5.2   Extrakce

5.2.1    Krmiva

Do 250 ml kónické baňky se zátkou se naváží 5–10 g vzorku s přesností na 0,01 g. Pipetou se přidá 100,0 ml okyseleného methanolu (3.8). Baňka se volně uzavře zátkou a promíchá kroužením. Potom se vloží na 20 minut do ultrazvukové lázně (4.1) při teplotě asi 40 oC. Pak se baňka vyjme a ochladí na laboratorní teplotu. Nechá se stát asi hodinu, aby se usadily suspedované částice, a potom se alikvotní část přefiltruje přes membránový filtr 0,45 μm (4.2) do vhodné nádoby. Dále se pokračuje se stanovením HPLC (5.3).

5.2.2    Premixy

Do 250 ml odměrné baňky se naváží asi 2 g nemletého vzorku premixu s přesností na 0,001 g. Přidá se 100,0 ml okyseleného methanolu (3.8) a promíchá kroužením. Potom se vloží na 20 minut do ultrazvukové lázně (4.1) při teplotě asi 40 oC. Pak se baňka vyjme a ochladí na laboratorní teplotu. Doplní se po značku okyseleným methanolem (3.8) a důkladně promíchá. Nechá se stát asi hodinu, aby se usadily suspendované částice, a potom se alikvotní část přefiltruje přes membránový filtr 0,45 μm (4.2). Vhodný objem čirého filtrátu se naředí okyseleným methanolem (3.8) na konečnou koncentraci asi 4 μg/ml lasalocidu. Dále se pokračuje se stanovením HPLC (5.3).

5.3   Stanovení HPLC

5.3.1    Parametry

Následující podmínky jsou doporučené; mohou být použity jiné podmínky za předpokladu, že poskytují rovnocenné výsledky:

Stabilita chromatografického systému se kontroluje opakovaným nástřikem kalibračního roztoku (3.10.3), který obsahuje 4,0 μg/ml, dokud se nedosáhne konstantních výšek (nebo ploch) píků a konstantních retenčních časů.

5.3.2    Kalibrační křivka

Každý kalibrační roztok (3.10.3) se nastřikuje několikrát a změří se výšky (plochy) píků pro každou koncentraci. Kalibrační křivka se vytvoří vynesením průměrných hodnot výšek nebo ploch píků kalibračních roztoků proti příslušným koncentracím v μg/ml.

5.3.3    Roztok vzorku

Extrakt ze vzorku 5.2.1 nebo 5.2.2 se nastřikuje několikrát za použití stejného objemu jako v případě kalibračního roztoku a zjišťuje se průměrná hodnota výšek (ploch) píků lasalocidu.

6.   Výpočet a vyjádření výsledků

Z průměrné hodnoty výšky (plochy) píku v roztoku vzorku (5.3.3) se porovnáním s kalibrační křivkou stanoví koncentrace lasalocidu v μg/ml.

6.1   Krmiva

Obsah lasalocidu (w) v mg/kg ve vzorku se vypočítá podle následujícího vzorce:

(mg/kg)

kde:

c

=

koncentrace lasalocidu v roztoku vzorku (5.2.1) v μg/ml

V1

=

objem extraktu vzorku podle 5.2.1 v ml (tj. 100 ml)

m

=

hmotnost navážky vzorku v g.

6.2   Premixy

Obsah lasalocidu (w) v mg/kg ve vzorku se vypočítá podle následujícího vzorce:

(mg/kg)

kde:

c

=

koncentrace lasalocidu v roztoku vzorku (5.2.2) v μg/ml

V2

=

objem extraktu vzorku podle 5.2.2 v ml (tj. 250 ml)

f

=

faktor ředění podle 5.2.2

m

=

hmotnost navážky vzorku v g.

7.   Ověření výsledků

7.1   Identita

Metody založené na spektrofluorimetrické detekci jsou méně náchylné na interference než metody s UV detekcí. Identita analytu může být potvrzena opakovaným stanovením s přídavkem (co-chromatography).

7.1.1    Opakované stanovení s přídavkem (co-chromatography)

K extraktu vzorku (5.2.1 nebo 5.2.2) se přidá vhodné množství kalibračního roztoku (3.10.3). Přidané množství lasalocidu musí odpovídat obsahu lasalocidu v extraktu vzorku. Přídavek se projeví pouze zvýšením píku lasalocidu, a to úměrně k přidanému množství lasalocidu a ředění extraktu. Šířka píku v polovině maximální výšky se může odchylovat od šířky původního píku v neobohaceném extraktu vzorku nejvýše o ±10 %.

7.2   Opakovatelnost

Rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení provedených u stejného vzorku nesmí překročit:

7.3   Výtěžnost

Pro obohacený (slepý) vzorek krmiva je výtěžnost nejméně 80 %. Pro obohacené vzorky premixů je výtěžnost nejméně 90 %.

8.   Výsledky kruhových testů

Kruhové testy ( *1 ) byly provedeny se 2 vzorky premixů (vzorky 1 a 2) a 5 vzorky krmiva (vzorky 3–7) ve 12 laboratořích. U každého vzorku byly provedeny dvě zkoušky. Výsledky jsou uvedeny v následující tabulce:

L

=

počet laboratoří

n

=

počet jednotlivých hodnot

sr

=

standardní odchylka opakovatelnosti

sR

=

standardní odchylka reprodukovatelnosti

CVr

=

variační koeficient opakovatelnosti v %

CVR

=

variační koeficient reprodukovatelnosti v %.

---

PŘÍLOHA V

METODY ZKOUŠENÍ PRO KONTROLU NEŽÁDOUCÍCH LÁTEK V KRMIVECH

A.   STANOVENÍ VOLNÉHO A CELKOVÉHO GOSSYPOLU

1.   Účel a rozsah

Tato metoda umožňuje stanovení obsahu volného a celkového gossypolu a chemicky příbuzných látek v bavlníkových semenech, bavlníkové mouce a bavlníkových pokrutinách a v krmných směsích, které obsahují krmné suroviny, v nichž je obsažen volný a celkový gossypol a chemicky příbuzné látky v koncentraci nad 20 mg/kg.

2.   Princip

Gossypol se extrahuje buď za přítomnosti aminopropanolu (3-aminopropan-1-ol) směsí 2-propanolu a hexanu při stanovení volného gossypolu, nebo dimethylformamidem při stanovení celkového gossypolu. Gossypol je reakcí s anilinem převeden na gossypol-dianilin a absorbance roztoku je měřena při 440 nm.

3.   Chemikálie

Standardní roztoky gossypolu A a B jsou stálé 24 hodin, pokud jsou chráněny před světlem.

4.   Přístroje a pomůcky

5.   Postup

5.1    Zkoušený vzorek

Množství zkoušeného vzorku závisí na předpokládaném obsahu gossypolu ve vzorku. Je vhodnější pracovat s malým množstvím zkoušeného vzorku a relativně velkou alikvotní částí filtrátu, aby obsah gossypolu byl dostatečný pro přesné spektrofotometrické měření. Pro stanovení volného gossypolu v bavlníku, bavlníkové mouce a bavlníkových pokrutinách navážka vzorku nepřesáhne 1 g; v krmných směsích může být 5 g. Ve většině případů je vhodný alikvotní podíl filtrátu 10 ml; obsahuje 50–100 μg gossypolu. Pro stanovení celkového gossypolu je navážka 0,5 –5 g, tedy 2 ml alikvotní části filtrátu budou obsahovat 40–200 μg gossypolu.

Stanovení se provádí při laboratorní teplotě asi 20 oC.

5.2    Stanovení volného gossypolu

Do širokohrdlé 250 ml baňky, na jejíž dno bylo přidáno drcené sklo, se naváží zkušební vzorek. Do baňky se odpipetuje 50 ml rozpouštědla A (3.2), baňka se uzavře a mixuje po dobu jedné hodiny v míchacím zařízení. Pak se obsah baňky filtruje suchým filtrem do malé širokohrdlé baňky. Během filtrace se filtrační nálevka přikryje hodinovým krycím sklem.

Do dvou 25 ml odměrných baněk (označí se A a B) se odpipetuje stejná alikvotní část filtrátu obsahující 50–100 μg gossypolu. Pokud je třeba, doplní se rozpouštědlem A (3.2) na objem 10 ml. Roztok v baňce A se pak doplní po značku směsí 2-propanolu a hexanu (3.1). Tento roztok se použije jako referenční roztok, proti kterému se měří roztok vzorku.

Do dalších dvou 25 ml odměrných baněk (označí se C a D) se odpipetuje 10 ml rozpouštědla A (3.2). Baňka C se doplní po značku směsí 2-propanolu a hexanu (3.1). Tento roztok se použije jako referenční roztok, proti kterému se měří roztok slepé zkoušky.

Do odměrných baněk B a D se odpipetuje po 2 ml anilinu (3.4). Baňky se zahřívají po dobu 30 minut na vroucí vodní lázni, aby došlo k vybarvení roztoků. Potom se ochladí na laboratorní teplotu, doplní směsí 2-propanolu a hexanu (3.1) po značku a homogenizují. Nechají se asi jednu hodinu stát.

Na spektrofotometru se měří absorbance roztoku slepé zkoušky (D) proti referenčnímu roztoku (C) a absorbance roztoku vzorku (B) proti referenčnímu roztoku (A) v kyvetách optické délky 10 mm při vlnové délce 440 nm.

Od absorbance vzorku se odečte absorbance slepé zkoušky a rozdíl absorbancí (korigovaná absorbance) je základem výpočtu obsahu volného gossypolu podle odstavce 6.

5.3    Stanovení celkového gossypolu

Do 50 ml odměrné baňky se naváží zkoušený vzorek, který obsahuje 1–5 mg gossypolu a přidá se 10 ml rozpouštědla B (3.3). Do další 50 ml odměrné baňky se přidá přesně 10 ml rozpouštědla B (3.3) pro slepou zkoušku. Obě baňky se zahřívají na vroucí vodní lázni po dobu 30 minut. Potom se ochladí na laboratorní teplotu a obě baňky se doplní po značku směsí 2-propanolu a hexanu (3.1). Homogenizují se a nechají 10–15 minut usadit, poté se obsah filtruje do širokohrdlých baněk.

Do obou 25 ml odměrných baněk se z filtrátu vzorku odpipetuje po 2 ml a z filtrátu slepé zkoušky do obou 25 ml odměrných baněk rovněž po 2 ml. Jedna baňka se vzorkem a jedna se slepou zkouškou se doplní směsí 2-propanolu a hexanu (3.1) po značku. Tyto roztoky se použijí jako referenční roztoky.

Do druhých dvou baněk se přidají 2 ml anilinu (3.4). Baňky se zahřívají po dobu 30 minut na vroucí vodní lázni, aby došlo k vybarvení roztoků. Potom se ochladí na laboratorní teplotu, doplní směsí 2-propanolu a hexanu (3.1) po značku a homogenizují. Nechají se jednu hodinu stát.

Absorbance se stanoví podle bodu 5.2 pro volný gossypol. Z těchto hodnot se vypočítá obsah celkového gossypolu podle odstavce 6.

6.   Výpočet a vyjádření výsledků

Výsledky mohou být vypočítány ze specifických absorbančních koeficientů (6.1) nebo podle kalibrační křivky (6.2).

6.1    Ze specifických absorbančních koeficientů

Specifické absorbanční koeficienty jsou na základě uvedených podmínek tyto:

Obsah volného nebo celkového gossypolu ve vzorku se vypočítá podle následujícího vzorce:

kde:

E

=

korigovaná absorbance stanovená podle 5.2

p

=

navážka zkušebního vzorku v g

a

=

alikvotní podíl filtrátu v ml.

6.2    Z kalibrační křivky

6.2.1    Volný gossypol

Připraví se 2 sady pěti 25 ml odměrných baněk. Do každé sady baněk se odpipetuje 2,0 , 4,0 , 6,0 , 8,0 a 10,0 ml standardního roztoku gossypolu A (3.5). Doplní se na 10 ml rozpouštědlem A (3.2). Každá sada se doplní o 25 ml odměrnou baňku obsahující pouze 10 ml rozpouštědla A (3.2) (slepá zkouška).

Obsah baněk první sady (včetně baňky pro slepou zkoušku) se doplní na 25 ml směsí 2-propanolu a hexanu (3.1) (referenční sada).

Do každé baňky druhé sady (včetně baňky pro slepou zkoušku) se přidají 2 ml anilinu (3.4). Baňky se zahřívají po dobu 30 minut na vroucí vodní lázni, aby došlo k vybarvení roztoků. Potom se ochladí na laboratorní teplotu, doplní směsí 2-propanolu a hexanu (3.1) po značku a homogenizují. Nechají se asi jednu hodinu stát (standardní sada).

Absorbance roztoků standardní sady se stanoví podle bodu 5.2 porovnáním s odpovídajícími roztoky v referenční sadě. Kalibrační křivka se vytvoří vynesením hodnot absorbancí proti odpovídajícím množstvím gossypolu (v μg).

6.2.2    Celkový gossypol

Připraví se šest 50 ml odměrných baněk. Do první baňky se napipetuje 10 ml rozpouštědla B (3.3) a do ostatních 2,0 , 4,0 , 6,0 , 8,0 a 10,0 ml standardního roztoku gossypolu B (3.6). Obsah každé baňky se doplní na 10 ml rozpouštědlem B (3.3). Baňky se zahřívají na vroucí vodní lázni po dobu 30 minut. Potom se ochladí na laboratorní teplotu, doplní směsí 2-propanolu a hexanu (3.1) po značku a homogenizují.

2,0 ml těchto roztoků se přenese do každé ze dvou sad šesti 25 ml odměrných baněk. Baňky první sady se doplní směsí 2-propanolu a hexanu (3.1) na 25 ml (referenční sada).

Do každé baňky druhé sady se přidají 2 ml anilinu (3.4). Baňky se zahřívají na vroucí vodní lázni po dobu 30 minut. Potom se ochladí na laboratorní teplotu, doplní se směsí 2-propanolu a hexanu (3.1) po značku a homogenizují. Nechají se asi jednu hodinu stát (standardní sada).

Absorbance roztoků standardní sady se stanoví podle bodu 5.2 porovnáním s odpovídajícími roztoky v referenční sadě. Kalibrační křivka se vytvoří vynesením hodnot absorbancí proti odpovídajícím množstvím gossypolu (v μg).

6.3    Opakovatelnost

Rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení provedených u stejného vzorku nesmí překročit:

▼M6

B.   STANOVENÍ OBSAHU DIOXINŮ (PCDD/PCDF) A PCB

KAPITOLA I

Metody odběru vzorků a interpretace výsledků analýz

1.    Oblast působnosti a definice

Vzorky určené pro úřední kontrolu obsahu polychlorovaných dibenzo-p-dioxinů (PCDD), polychlorovaných dibenzofuranů (PCDF), polychlorovaných bifenylů (PCB) s dioxinovým efektem ( 16 ) a PCB bez dioxinového efektu v krmivech se odebírají v souladu s ustanoveními přílohy I. Musí být použity kvantitativní požadavky týkající se kontroly látek nebo produktů obsažených rovnoměrně v krmivech, jak je stanoveno v bodě 5.1 přílohy I. Takto získané souhrnné vzorky se považují za reprezentativní pro šarže nebo části šarže. Dodržení maximálních limitů stanovených ve směrnici 2002/32/ES se posuzuje na základě obsahů zjištěných v laboratorních vzorcích.

Pro účely této části B se použijí definice stanovené v příloze I rozhodnutí Komise 2002/657/ES ( 17 ).

Kromě zmíněných definic se pro účely této části B použijí tyto definice:

2.    Dodržení maximálního limitu v šarži nebo části šarže

2.1.    Pokud jde o PCB bez dioxinového efektu

Šarže nebo část šarže vyhovuje maximálnímu limitu, pokud výsledek analýzy pro sumu PCB 28, PCB 52, PCB 101, PCB 138, PCB 153 a PCB 180 (dále jen „PCB bez dioxinového efektu“) nepřekračuje maximální limit stanovený ve směrnici 2002/32/ES, s přihlédnutím k rozšířené nejistotě měření ( 18 ). Šarže nebo část šarže nevyhovuje maximálnímu limitu stanovenému ve směrnici 2002/32/ES, pokud střední hodnota dvou horních odhadů ( 19 ) výsledků analýzy získaná opakovanou analýzou ( 20 ) při zohlednění rozšířené nejistoty měření takřka nepochybně překračuje maximální limit, tj. k posouzení shody se použije zkoušená koncentrace poté, co byla odečtena rozšířená nejistota měření.

Rozšířená nejistota měření se vypočítá za použití faktoru pokrytí 2, který odpovídá míře spolehlivosti přibližně 95 %. Šarže nebo část šarže nevyhovuje, pokud je střední hodnota naměřených hodnot minus rozšířená nejistota měření střední hodnoty vyšší než maximální limit.

Pravidla zmíněná ve výše uvedených odstavcích tohoto bodu se použijí na výsledky analýzy získané u vzorku pro úřední kontrolu. V případě analýzy za účelem obhajoby nebo rozhodčího řízení se použijí vnitrostátní předpisy.

2.2.    Pokud jde o PCDD/PCDF a PCB s dioxinovým efektem

Šarže nebo část šarže je v souladu s maximálním limitem, pokud výsledek jedné zkoušky

U screeningových zkoušek se pro rozhodnutí o souladu vzorku s příslušnými maximálními limity stanovenými buď pro PCDD/PCDF, nebo pro sumu PCDD/PCDF a PCB s dioxinovým efektem stanoví mezní hodnota.

Šarže nebo část šarže nevyhovuje maximálnímu limitu stanovenému směrnicí 2002/32/ES, pokud střední hodnota dvou horních odhadů ( 21 ) výsledků zkoušky získaná opakovanou analýzou ( 22 ) s použitím konfirmační metody při zohlednění rozšířené nejistoty měření takřka nepochybně překračuje maximální limit, tj. k posouzení shody se použije zkoušená koncentrace poté, co byla odečtena rozšířená nejistota měření.

Rozšířená nejistota měření se vypočítá za použití faktoru pokrytí 2, který odpovídá míře spolehlivosti přibližně 95 %. Šarže nebo část šarže nevyhovuje, pokud je střední hodnota naměřených hodnot minus rozšířená nejistota měření střední hodnoty vyšší než maximální limit.

Pro sumu PCDD/PCDF a PCB s dioxinovým efektem se použije součet odhadované rozšířené nejistoty měření samostatných výsledků analýz u PCDD/PCDF a PCB s dioxinovým efektem.

Pravidla zmíněná ve výše uvedených odstavcích tohoto bodu se použijí na výsledky analýz získané u vzorku pro úřední kontrolu. V případě analýzy za účelem obhajoby nebo rozhodčího řízení se použijí vnitrostátní předpisy.

3.    Výsledky překračující akční prahy stanovené v příloze II směrnice 2002/32/ES

Akční prahy slouží jako nástroj pro výběr vzorků v případech, kdy je nezbytné zjistit zdroj kontaminace a přijmout opatření pro jeho omezení nebo odstranění. Screeningové metody stanoví vhodné mezní hodnoty pro výběr těchto vzorků. V případě, kdy je zjištění zdroje a omezení nebo odstranění kontaminace velmi náročné, je účelné potvrdit překročení akčního prahu opakovanou analýzou s použitím konfirmační metody s přihlédnutím k rozšířené nejistotě měření ( 23 ).

KAPITOLA II

Příprava vzorků a požadavky na metody zkoušení použité při úřední kontrole obsahu dioxinů (PCDD/PCDF) a PCB s dioxinovým efektem v krmivech

1.    Oblast působnosti

Požadavky stanovené v této kapitole se použijí tam, kde jsou zkoušena krmiva pro úřední kontrolu obsahu PCDD/PCDF substituovaných v polohách 2,3,7,8 a PCB s dioxinovým efektem a pro přípravu vzorků a analytické požadavky k jiným regulačním účelům, včetně kontrol prováděných provozovatelem krmivářského podniku k zajištění dodržování ustanovení nařízení Evropského parlamentu a Rady (ES) č. 183/2005 ( 24 ).

Sledování přítomnosti PCDD/PCDF a PCB s dioxinovým efektem v krmivech může být provedeno dvěma různými druhy analytických metod:

2.    Souvislosti

Pro výpočet koncentrací TEQ se koncentrace jednotlivých látek v daném vzorku vynásobí jejich příslušnými faktory toxické ekvivalence (TEF) (viz poznámka 1 v kapitole I), sečtou se a výsledná suma je celkovou koncentrací sloučenin s dioxinovým efektem vyjádřenou v TEQ.

Pro účely této části B se schválenou specifickou mezí kvantifikace jednotlivého kongeneru rozumí nejnižší obsah analytu, který lze měřit s rozumnou mírou statistické jistoty, splňující kritéria pro identifikaci, jež jsou popsána v mezinárodně uznávaných normách, například v normě EN 16215:2012 (Krmiva – stanovení dioxinů a PCB s dioxinovým efektem pomocí plynové chromatografie/hmotnostní spektrometrie s vysokým rozlišením (GC-HRMS) a indikátorových PCB pomocí GC-HRMS) a/nebo v metodách EPA 1613 a 1668 ve znění pozdějších revizí.

Mez kvantifikace jednotlivého kongeneru může být identifikována jako:

Bioanalytické screeningové metody neposkytnou výsledky na úrovni kongeneru, ale pouze orientační ( 25 ) hodnoty úrovně TEQ, vyjádřené v BEQ, aby byla zohledněna skutečnost, že ne všechny sloučeniny přítomné v extraktu vzorku, který při zkoušce dává odezvu, nutně splňují všechny požadavky principu TEQ.

Screeningové a konfirmační metody mohou být použity pouze pro kontrolu určité matrice, pokud jsou tyto metody dostatečně citlivé, aby spolehlivě zjistily hladiny na úrovni akčního prahu nebo maximálního limitu.

3.    Požadavky na zabezpečení kvality

3.1.	Na každém stupni odběru vzorků a zkoušky se přijmou opatření k zamezení křížové kontaminace.

3.2.	Vzorky musí být uchovávány a přepravovány ve skleněných, hliníkových, polypropylenových nebo polyethylenových nádobách vhodných pro skladování bez jakéhokoli vlivu na úrovně PCDD/PCDF a PCB s dioxinovým efektem ve vzorcích. Z nádoby na vzorky se odstraní stopy papírového prachu.

3.3.	Vzorky se uchovávají a přepravují tak, aby byla zachována integrita vzorku krmiv.

3.4.	Pokud je to relevantní, jednotlivé laboratorní vzorky se jemně rozemelou a důkladně promísí postupem, u něhož je prokázáno, že se jím dosáhne úplné homogenizace (např. rozemletím a proséváním přes síto s průměrem oček 1 mm). Je-li vlhkost vzorků příliš vysoká, musí se vzorky před rozemletím sušit.

3.5.	Je vždy důležité zkontrolovat činidla, pomůcky ze skla a vybavení z hlediska možného vlivu na výsledky založené na TEQ nebo BEQ.

3.6.	Provede se slepý pokus, při němž se provede celý analytický postup bez vzorku.

3.7.

U bioanalytických metod se u veškerých při zkoušce použitých pomůcek ze skla a rozpouštědel potvrdí, že jsou prosty sloučenin, které mohou bránit zjištění cílových sloučenin v pracovním rozsahu. Skleněné pomůcky se vypláchnou rozpouštědly nebo zahřejí na teploty vhodné pro odstranění stop PCDD/PCDF, sloučenin s dioxinovým efektem a interferujících sloučenin z jejich povrchu.

3.8.	Množství vzorku použité pro extrakci musí být dostatečné, aby byly splněny požadavky s ohledem na dostatečně nízký pracovní rozsah včetně koncentrací maximálních limitů nebo akčního prahu.

3.9.	Specifické postupy přípravy vzorku použité pro zkoumané produkty musí splňovat mezinárodně uznávané metodiky.

4.    Požadavky na laboratoře

4.1.

V souladu s nařízením (ES) č. 882/2004 musí být laboratoře akreditovány uznaným subjektem působícím v souladu s pokyny ISO Guide 58, aby bylo zaručeno, že uplatňují postupy zajištění analytické kvality. Laboratoře musí být akreditovány podle normy EN ISO/IEC 17025. V příslušném případě je třeba se řídit zásadami popsanými v technických pokynech pro odhad nejistoty měření a meze kvantifikace pro analýzu PCDD/PCDF a PCB ( 26 ).

4.2.	Odbornost laboratoře prokazuje soustavná úspěšná účast v mezilaboratorních studiích týkajících se stanovení PCDD/PCDF a PCB s dioxinovým efektem v příslušných matricích krmiv a koncentračních rozpětích.

4.3.	Laboratoře, které pro rutinní kontrolu vzorků používají screeningové metody, musí úzce spolupracovat s laboratořemi používajícími konfirmační metodu, za účelem jak kontroly kvality, tak konfirmace výsledku analýzy podezřelých vzorků.

5.    Základní požadavky, které musí splňovat analytický postup u dioxinů (PCDD/PCDF) a PCB s dioxinovým efektem

5.1.    Nízký pracovní rozsah a meze kvantifikace

V případě PCDD/PCDF musí být zjistitelná množství z důvodu extrémní toxicity některých těchto sloučenin na horní úrovni femtogramů (10– 15 g). V případě většiny kongenerů PCB je dostatečná již mez kvantifikace na úrovni nanogramů (10– 9 g). Pro měření toxičtějších kongenerů PCB s dioxinovým efektem (zejména non-ortho substituovaných kongenerů) musí nejspodnější část pracovního rozsahu dosahovat nízkých úrovní pikogramů (10– 12 g). U všech ostatních kongenerů PCB je dostatečná již mez kvantifikace na úrovni nanogramů (10– 9 g).

5.2.    Vysoká selektivita (specifičnost)

5.2.1.

Je třeba rozlišit PCDD/PCDF a PCB s dioxinovým efektem a řadu jiných sloučenin, které se extrahují společně s těmito látkami, mohou rušit při jejich stanovování a jsou přítomny v koncentracích až o několik řádů vyšších než koncentrace sledovaných analytů. Pro metody GC-MS je třeba rozlišení mezi různými kongenery, např. mezi toxickými kongenery (např. sedmnácti PCDD/PCDF substituovanými v polohách 2,3,7,8 a dvanácti PCB s dioxinovým efektem) a ostatními kongenery.

5.2.2.

Bioanalytické metody musí být schopny detekovat cílové sloučeniny jako sumu PCDD/PCDF a/nebo PCB s dioxinovým efektem. Přečištění vzorku se zaměří na odstranění sloučenin způsobujících falešně nevyhovující výsledky nebo sloučenin, které mohou způsobovat snížení odezvy vedoucí k falešně vyhovujícím výsledkům.

5.3.    Vysoká správnost (pravdivost a přesnost, zjevná výtěžnost biologické zkoušky)

5.3.1.

U metod GC-MS musí stanovení poskytovat správný odhad skutečné koncentrace ve vzorku. Vysoká správnost je nezbytná k tomu, aby nedošlo k zamítnutí výsledku analýzy vzorku na základě malé spolehlivosti stanovené úrovně TEQ. Správnost je vyjádřena pravdivostí (rozdílem mezi střední naměřenou hodnotou analytu v certifikovaném materiálu a jeho certifikovanou hodnotou, vyjádřeným v procentech této hodnoty) a přesností (RSDR je relativní směrodatná odchylka vypočtená z výsledků získaných za podmínek reprodukovatelnosti).

5.3.2.

Pro bioanalytické metody se určí zjevná výtěžnost biologické zkoušky. Zjevnou výtěžností biologické zkoušky se rozumí úroveň BEQ vypočtená z kalibrační křivky TCDD nebo PCB 126 upravená o hodnoty slepého stanovení a poté vydělená hodnotou TEQ určenou konfirmační metodou. Jejím účelem je korekce činitelů, jako je ztráta PCDD/PCDF a sloučenin s dioxinovým efektem během extrakce a čištění, současně extrahované sloučeniny zesilující nebo tlumící odezvu (agonistické a antagonistické účinky), kvalita kalibrace nebo rozdíly mezi hodnotami TEF a relativní účinnosti (REP). Zjevná výtěžnost biologické zkoušky se vypočte z vhodných referenčních vzorků s reprezentativním zastoupením kongenerů kolem sledované úrovně.

5.4.    Validace v rozsahu maximálního limitu a obecná opatření pro kontrolu kvality

5.4.1.

Laboratoře musí prokázat spolehlivost metody v rozsahu kolem maximálního limitu, např. v polovině, jednonásobku nebo dvojnásobku maximálního limitu, a to s přijatelným variačním koeficientem pro opakovanou analýzu, a sice během validace a během rutinní analýzy.

5.4.2.

Jako opatření v rámci vnitřní kontroly kvality se provádějí pravidelná slepá kontrolní stanovení, stanovení s obohacenými vzorky nebo analýzy kontrolních vzorků (nejlépe certifikovaného referenčního materiálu, je-li k dispozici). Ze slepých kontrolních stanovení, stanovení s obohacenými vzorky nebo analýz kontrolních vzorků se vyhotoví a ověří grafy kontroly kvality, aby bylo zajištěno, že analytická výkonnost je v souladu s požadavky.

5.5.    Mez kvantifikace

5.5.1.

Pro bioanalytické screeningové metody není stanovení meze kvantifikace (LOQ) nezbytné, příslušná metoda však musí prokázat, že umožňuje rozlišení mezi hodnotou slepého stanovení a mezní hodnotou. Při poskytování úrovně BEQ se stanoví oznamovací mez pro vzorky s odezvou nižší než tato úroveň. Musí být prokázáno, že se oznamovací mez významně (nejméně trojnásobně) liší od slepých vzorků odrážejících celý pracovní postup s odezvou nižší než pracovní rozsah. Vypočte se proto ze vzorků obsahujících cílové sloučeniny přibližně v požadované minimální úrovni, a nikoli z poměru signál–šum nebo ze slepé zkoušky.

5.5.2.

Mez kvantifikace u konfirmační metody činí přibližně jednu pětinu maximálního limitu.

5.6.    Analytická kritéria

Pro spolehlivé výsledky konfirmačních nebo screeningových metod musí být v rozsahu maximálního limitu splněna následující kritéria pro hodnotu TEQ nebo BEQ, ať už je určena jako celkový TEQ nebo celkový BEQ (jako suma PCDD/PCDF a PCB s dioxinovým efektem), nebo samostatně pro PCDD/PCDF a PCB s dioxinovým efektem.

5.7.    Zvláštní požadavky na screeningové metody

5.7.1.

Pro screening mohou být použity jak metody GC-MS, tak bioanalytické metody. Metody GC/MS musí splňovat požadavky stanovené v bodě 6. Pro buněčné bioanalytické metody jsou zvláštní požadavky stanoveny v bodě 7.

5.7.2.

Laboratoře, které pro rutinní kontrolu vzorků používají screeningové metody, musí úzce spolupracovat s laboratořemi používajícími konfirmační metodu.

5.7.3.

Během rutinní analýzy je nutné ověřovat výkonnost příslušné screeningové metody, a to kontrolou kvality při analýzách a průběžnou validací metody. Zavede se stálý program kontroly vyhovujících výsledků.

5.7.4.

Kontrola možného potlačení buněčné odezvy a cytotoxicity: 20 % extraktů vzorků se změří při rutinním screeningu bez přidání a s přidáním 2,3,7,8-TCDD v množství odpovídajícím maximálnímu limitu nebo akčnímu prahu, aby se zjistilo, zda odezva není potlačována interferujícími látkami přítomnými v extraktu vzorku. Naměřená koncentrace u obohaceného vzorku se porovná se sumou koncentrace neobohaceného extraktu a koncentrace obohacující látky. Pokud je tato naměřená koncentrace o více než 25 % nižší než vypočtená (souhrnná) koncentrace, svědčí to o tom, že možná dochází k potlačení odezvy, a dotčený vzorek musí být podroben konfirmační analýze pomocí GC-HRMS. Výsledky musí být zaznamenány v grafech kontroly kvality.

5.7.5.

Kontrola kvality u vyhovujících vzorků Přibližně 2 až 10 % vyhovujících vzorků, v závislosti na matrici vzorků a zkušenostech laboratoře, musí být potvrzeno pomocí GC/HRMS.

5.7.6.

Určení míry falešně vyhovujících vzorků na základě údajů z kontroly kvality: Určí se míra falešně vyhovujících výsledků na základě screeningu vzorků nižších a vyšších než maximální limit nebo akční práh. Skutečný podíl falešně vyhovujících výsledků musí být nižší než 5 %. Je-li k dispozici nejméně 20 potvrzených výsledků z kontroly kvality vyhovujících vzorků na matrici/matricovou skupinu, vyvodí se z těchto výsledků závěry ohledně míry falešně vyhovujících výsledků. Do minimálního počtu 20 výsledků pro hodnocení míry falešně vyhovujících výsledků se mohou zahrnout i výsledky ze vzorků analyzovaných pomocí kruhových testů nebo při kontaminačních aférách, které pokrývají rozpětí koncentrace až např. do dvojnásobku maximálního limitu. Vzorky musí zahrnovat nejčastější zastoupení kongenerů, které představují různé zdroje. Ačkoli se mají screeningové testy přednostně zaměřit na zjištění vzorků přesahujících akční práh, je kritériem pro stanovení míry falešně vyhovujících vzorků maximální limit, s přihlédnutím k rozšířené nejistotě měření konfirmační metody.

5.7.7.

Případné nevyhovující vzorky ze screeningu musí být vždy ověřeny úplnou opakovanou analýzou původního vzorku pomocí konfirmační metody analýzy. Tyto vzorky mohou být také použity pro vyhodnocení podílu falešně nevyhovujících výsledků. U screeningových metod je mírou falešně nevyhovujících výsledků podíl výsledků, které konfirmační analýza potvrdí jako vyhovující, zatímco při předchozím screeningu byl vzorek prohlášen za potenciálně nevyhovující. Hodnocení výhodnosti použití screeningové metody musí vycházet z porovnání falešně nevyhovujících výsledků a celkového počtu kontrolovaných vzorků. Tento poměr musí být dostatečně nízký, aby bylo možné považovat používání příslušného screeningového nástroje za výhodné.

5.7.8.

Bioanalytické metody musí při validačních podmínkách poskytovat platné údaje o úrovni TEQ, vypočtené a vyjádřené jako BEQ. Pro bioanalytické metody prováděné za podmínek opakovatelnosti je vnitrolaboratorní RSDr obvykle menší než za podmínek reprodukovatelnosti RSDR.

6.    Zvláštní požadavky, které musí splňovat metody GC-MS, aby vyhovovaly pro účely screeningu nebo konfirmace

6.1.    Přijatelné rozdíly mezi horním a dolním odhadem výsledků WHO-TEQ

Rozdíl mezi horním odhadem a dolním odhadem nesmí překročit 20 % pro konfirmaci překročení maximálního limitu nebo, v případě potřeby, akčních prahů.

6.2.    Kontrola výtěžnosti

6.2.1.

Vnitřní standardy 2,3,7,8-chlor-substituovaných PCDD/PCDF značené izotopem 13C a standardy PCB s dioxinovým efektem značené izotopem13C musí být přidány na samém začátku analýzy, např. před extrakcí, aby bylo možné validovat analytický postup. Alespoň jeden kongener musí být přidán pro každou z tetra- až okta-chlorovaných homologických skupin PCDD/PCDF a alespoň jeden kongener pro každou z homologických skupin PCB s dioxinovým efektem (nebo alespoň jeden kongener pro každou skupinu vybraných iontů při použití hmotnostní spektrometrie v režimu registrace vybraných iontů použitou pro sledování PCDD/PCDF a PCB s dioxinovým efektem). V případě konfirmačních metod se použije všech 17 vnitřních standardů 2,3,7,8-substituovaných PCDD/PCDF značených izotopem 13C a všech 12 vnitřních standardů PCB s dioxinovým efektem značených izotopem 13C.

6.2.2.

Relativní faktory odezvy se s pomocí vhodných kalibračních roztoků stanoví také pro kongenery, pro něž nebyly přidány sloučeniny značené izotopem 13C.

6.2.3.

U krmiv rostlinného původu a krmiv živočišného původu s obsahem tuku nižším než 10 % je přidání vnitřních standardů před extrakcí povinné. U krmiv živočišného původu s obsahem tuku vyšším než 10 % lze vnitřní standardy přidat buď před extrakcí, nebo po extrakci tuku. Vhodným způsobem se validuje účinnost extrakce, a to v závislosti na fázi, ve které se přidávají vnitřní standardy.

6.2.4.

Před analýzou metodou GC-MS musí být přidány 1 nebo 2 obohacené standardy (recovery standardy) pro stanovení výtěžnosti.

6.2.5.

Kontrola výtěžnosti je nezbytná. U konfirmačních metod se výtěžnost jednotlivých vnitřních standardů musí pohybovat v rozmezí 60 až 120 %. Nižší nebo vyšší hodnota výtěžnosti u jednotlivých kongenerů, zejména některých hepta- a okta-chlorovaných dibenzo-p-dioxinů a dibenzofuranů, je přípustná pod podmínkou, že jejich příspěvek k hodnotě TEQ nepřesáhne 10 % celkové hodnoty TEQ (na základě sumy PCDD/PCDF a PCB s dioxinovým efektem). Hodnota výtěžnosti u screeningových metod GC-MS se musí pohybovat mezi 30 a 140 %.

6.3.    Odstranění interferujících látek

6.4.    Kalibrace pomocí standardní křivky

Rozsah kalibrační křivky musí pokrývat odpovídající rozpětí maximálních limitů nebo akčních prahů.

6.5.    Zvláštní kritéria pro konfirmační metody

7.    Zvláštní požadavky na bioanalytické metody

Bioanalytické metody jsou metody založené na využití biologických principů, jako jsou buněčné testy, receptorové testy nebo imunologické testy. V tomto bodě 7 se stanoví obecné požadavky na bioanalytické metody.

Screeningové metody v zásadě klasifikují vzorky jako vyhovující nebo vzorky podezřelé jako nevyhovující. Za tímto účelem se vypočtená úroveň BEQ porovnává s mezní hodnotou (viz bod 7.3). Vzorky nižší než mezní hodnota se považují za vyhovující, vzorky rovnající se mezní hodnotě nebo vyšší se považují za podezřelé jako nevyhovující a je nutné provést jejich analýzu pomocí konfirmační metody. Prakticky může jako mezní hodnota sloužit úroveň BEQ odpovídající 2/3 maximálního limitu, pokud je zajištěna míra falešně vyhovujících vzorků nižší než 5 % a přijatelná míra falešně nevyhovujících vzorků. Při různém maximálním limitu pro PCDD/PCDF a pro sumu PCDD/PCDF a PCB s dioxinovým efektem vyžaduje kontrola souladu vzorků bez frakcionace vhodné mezní hodnoty pro biologickou zkoušku pro PCDD/PCDF. Pro kontrolu vzorků překračujících akční prahy je vhodnou mezní hodnotou přiměřené procento příslušného akčního prahu.

Je-li orientační úroveň vyjádřena v BEQ, musí být výsledky vzorku vyjádřeny v pracovním rozsahu a přesahovat oznamovací mez (viz body 7.1.1 a 7.1.6).

7.1.    Hodnocení odezvy zkoušky

7.1.1.    Obecné požadavky

7.1.2.    Kalibrace

7.1.2.1.   Kalibrace pomocí standardní křivky

7.1.2.2.   Kalibrace pomocí referenčních vzorků

Případně lze použít kalibrační křivku zhotovenou alespoň ze čtyř referenčních vzorků (viz bod 7.2.4): jednoho matričního slepého vzorku plus tří referenčních vzorků na polovině, jednonásobku a dvojnásobku maximálního limitu nebo akčního prahu, čímž odpadne nutnost odečtu hodnoty slepého stanovení a korekce na výtěžnost, pokud se vlastnosti matrice referenčních vzorků kryjí s vlastnostmi neznámých vzorků. V tomto případě lze odezvu odpovídající 2/3 maximálního limitu (viz bod 7.3) vypočítat přímo z těchto vzorků a použít ji jako mezní hodnotu. Pro kontrolu vzorků překračujících akční prahy je vhodnou mezní hodnotou přiměřené procento těchto akčních prahů.

7.1.3.    Samostatné stanovení PCDD/PCDF a PCB s dioxinovým efektem

Extrakty lze rozdělit do frakcí obsahujících PCDD/PCDF a PCB s dioxinovým efektem, což umožňuje získání oddělených údajů o úrovni TEQ pro PCDD/PCDF a PCB s dioxinovým efektem (v BEQ). Pro hodnocení výsledků pro frakci obsahující PCB s dioxinovým efektem se přednostně použije kalibrační křivka standardu PCB 126.

7.1.4.    Zjevná výtěžnost biologické zkoušky

„Zjevná výtěžnost biologické zkoušky“ se vypočte z vhodných referenčních vzorků s reprezentativním zastoupením kongenerů kolem maximálního limitu nebo akčního prahu a vyjádří se jako procento úrovně BEQ v porovnání s úrovní TEQ. V závislosti na použitém typu zkoušky a použitých TEF ( 27 ) mohou rozdíly mezi faktory TEF a REP pro PCB s dioxinovým efektem způsobit nízkou zjevnou výtěžnost u PCB s dioxinovým efektem v porovnání s PCDD/PCDF. Proto při samostatném stanovení PCDD/PCDF a PCB s dioxinovým efektem musí být zjevná výtěžnost biologických zkoušek následující: u PCB s dioxinovým efektem 20 % až 60 %, u PCDD/PCDF 50 % až 130 % (rozmezí platná pro kalibrační křivku TCDD). Jelikož podíl PCB s dioxinovým efektem na sumě PCDD/PCDF a PCB s dioxinovým efektem se může u různých matric a vzorků lišit, odráží se tyto rozdíly i ve zjevné výtěžnosti biologických zkoušek pro sumu PCDD/PCDF a PCB s dioxinovým efektem, která se má pohybovat v rozmezí 30 % až 130 %. Důsledky případné podstatné revize hodnot TEF pro právní předpisy Unie týkající se PCDD/PCDF a PCB s dioxinovým efektem budou vyžadovat revizi těchto rozmezí.

7.1.5.    Kontrola výtěžnosti pro účely čištění

Při validaci je nutné zkontrolovat ztrátu sloučenin během čištění. Slepý vzorek obohacený směsí různých kongenerů se podrobí čištění (alespoň n = 3) a výtěžnost a variabilita se ověří konfirmační metodou. Výtěžnost musí být v rozmezí 60 % až 120 %, zejména u kongenerů s podílem na množství TEQ v různých směsích, který je vyšší než 10 %.

7.1.6.    Oznamovací mez

Při vydávání úrovní BEQ musí být stanovena oznamovací mez z příslušných matričních vzorků zahrnujících typická zastoupení kongenerů, avšak vzhledem k nízké přesnosti v dolním rozsahu křivky nikoli z kalibrační křivky standardů. Je třeba vzít v úvahu účinky extrakce a čištění. Oznamovací mez musí být stanovena nejméně trojnásobně vyšší než hodnoty slepých vzorků odrážejících celý pracovní postup.

7.2.    Použití referenčních vzorků

7.2.1.

Referenční vzorky musí představovat matrice vzorku, zastoupení kongenerů a rozpětí koncentrací pro PCDD/PCDF a PCB s dioxinovým efektem kolem maximálního limitu nebo akčního prahu.

7.2.2.

Každá série zkoušek musí zahrnovat slepý vzorek odrážející celý pracovní postup, či nejlépe slepý matriční vzorek, a referenční vzorek na maximálním limitu nebo akčním prahu. Tyto vzorky musí být extrahovány a zkoušeny současně a za stejných podmínek. Referenční vzorek musí vykázat jasně vyšší odezvu v porovnání s odezvou slepého vzorku, čímž je zajištěna vhodnost zkoušky. Tyto vzorky mohou být použity pro korekci o hodnoty slepého stanovení a korekci na výtěžnost.

7.2.3.

Referenční vzorky vybrané pro provedení korekce na výtěžnost musí být reprezentativní pro zkušební vzorky, což znamená, že zastoupení kongenerů nesmí vést k podhodnocení úrovní.

7.2.4.

Pro prokázání odpovídající výkonnosti zkoušky ve sledovaném rozsahu pro kontrolu maximálního limitu nebo akčního prahu lze kromě toho zahrnout ještě referenční vzorky o např. poloviční a dvojnásobné koncentraci, než je maximální limit nebo akční práh. Dohromady mohou být tyto vzorky použity pro výpočet úrovní BEQ ve zkušebních vzorcích (viz bod 7.1.2.2).

7.3.    Stanovení mezních hodnot

Je nutné určit vztah mezi výsledky biologické zkoušky v BEQ a výsledky konfirmační metody v TEQ (např. pomocí kalibračních pokusů, které zohledňují vliv matrice, s referenčními vzorky obohacenými na nule, polovině, jednonásobku a dvojnásobku maximálního limitu s šesti opakováními na každé úrovni (n = 24)). Na základě tohoto vztahu lze odhadnout korekční faktory (odečtení hodnoty slepého stanovení a korekce na výtěžnost), je však nutno je ověřit v souladu s bodem 7.2.2.

Je nutné stanovit mezní hodnoty pro účely rozhodnutí ohledně souladu vzorku s maximálními limity nebo pro kontrolu akčních prahů, jsou-li sledovanou hodnotou, a rovněž s příslušnými maximálními limity nebo akčními prahy, stanovenými buď zvlášť pro PCDD/PCDF a PCB s dioxinovým efektem, nebo pro sumu PCDD/PCDF a PCB s dioxinovým efektem. Tyto hodnoty jsou zastoupeny nižším cílovým bodem distribuce výsledků biologické zkoušky (upravených o hodnoty slepého stanovení a korigovaných na výtěžnost) odpovídajícím rozhodovací mezi u příslušné konfirmační metody na základě 95 % spolehlivosti, z čehož vyplývá míra falešně vyhovujících výsledků < 5 %, a na základě RSDR < 25 %. Rozhodovací mezí u konfirmační metody je maximální limit při zohlednění rozšířené nejistoty měření.

Mezní hodnotu (v BEQ) lze vypočítat v souladu s jedním z postupů uvedených v bodech 7.3.1, 7.3.2 a 7.3.3 (viz graf 1).

7.3.1.

S použitím nižší části 95 % predikčního intervalu ve výši rozhodovací meze konfirmační metody: kde: BEQDL je BEQ odpovídající rozhodovací mezi u konfirmační metody, což je maximální limit včetně rozšířené nejistoty měření sy,x je reziduální směrodatná odchylka tα,f = m-2 je kvantil Studentova t-rozdělení (α = 5 %, f = stupně volnosti, jednostranný) m je celkový počet kalibračních bodů (index j) n je počet opakování na každé úrovni xi je koncentrace vzorku (v TEQ) v kalibračním bodě i stanovená konfirmační metodou je průměr koncentrací (v TEQ) všech kalibračních vzorků je parametr sumy čtverců, i = index pro kalibrační bod i

7.3.2.

Z výsledků biologické zkoušky (upravených o hodnoty slepého stanovení a korigovaných na výtěžnost) získaných z vícenásobných analýz vzorků (n ≥ 6) kontaminovaných na úrovni rozhodovací meze konfirmační metody, jakožto nižší část rozdělení výsledků na odpovídající průměrné hodnotě BEQ: Mezní hodnota = BEQDL – 1,64 × SDR kde: SDR je směrodatná odchylka výsledků biologické zkoušky na BEQDL, měřeno za podmínek vnitrolaboratorní reprodukovatelnosti.

7.3.3.

Výpočet jako střední hodnota výsledků bioanalýzy (v BEQ, upravených o hodnoty slepého stanovení a korigovaných na výtěžnost) z vícenásobné analýzy vzorků (n ≥ 6) kontaminovaných na 2/3 maximálního limitu nebo akčního prahu, na základě poznatku, že tato úroveň se bude pohybovat kolem mezní hodnoty určené v bodech 7.3.1 nebo 7.3.2: Výpočet mezních hodnot vycházející z 95 % míry spolehlivosti, z níž vyplývá míra falešně vyhovujících výsledků < 5 %, a z RSDR < 25 %: 1.  z nižší části 95 % predikčního intervalu na úrovni rozhodovací meze konfirmační metody; 2.  z vícenásobné analýzy vzorků (n ≥ 6) kontaminovaných na úrovni rozhodovací meze konfirmační metody jakožto nižší část distribuce údajů (v grafu je znázorňuje křivka ve tvaru zvonu) na odpovídající průměrné hodnotě BEQ. Graf 1

7.3.4.

Omezení mezních hodnot Mezní hodnoty vycházející z BEQ a vypočtené z RSDR dosažené při validaci s použitím omezeného počtu vzorků s různým zastoupením matrice/kongenerů mohou být vyšší než maximální limity nebo akční prahy vycházející z TEQ, vzhledem k větší přesnosti, než je přesnost, jíž lze běžně dosáhnout s neznámým spektrem zastoupení kongenerů. V takových případech se mezní hodnoty vypočtou z RSDR = 25 % nebo se dá přednost dvěma třetinám maximálního limitu nebo akčního prahu.

7.4.    Kritéria výkonnosti

7.4.1.

Vzhledem k tomu, že při bioanalytických metodách nelze použít žádné vnitřní standardy, provedou se zkoušky opakovatelnosti bioanalytických metod pro získání informací o směrodatné odchylce v rámci zkoušek a mezi sériemi zkoušek. Opakovatelnost musí být nižší než 20 %, vnitrolaboratorní reprodukovatelnost pak nižší než 25 %. To musí vycházet z vypočtených úrovní v BEQ po odečtení hodnot slepého stanovení a korekci na výtěžnost.

7.4.2.

Jako součást postupu validace musí být prokázáno, že zkouška umožňuje rozlišit slepý vzorek a úroveň ve výši mezní hodnoty, a umožňuje tak identifikovat vzorky nad příslušnou mezní hodnotou (viz bod 7.1.2).

7.4.3.

Je třeba určit cílové sloučeniny, možné interference a nejvyšší přípustný obsah ve slepém vzorku.

7.4.4.

Procentní směrodatná odchylka odezvy nebo koncentrace vypočtená z odezvy (možné pouze v pracovním rozsahu) trojnásobného stanovení extraktu vzorku nesmí být vyšší než 15 %.

7.4.5.

Pro hodnocení výkonnosti bioanalytické metody v konstantním časovém období se použijí nekorigované výsledky referenčního vzorku (referenčních vzorků) vyjádřené v BEQ (pro slepý vzorek a maximální limit nebo akční práh).

7.4.6.

Pro slepé vzorky odrážející celý pracovní postup a pro každý typ referenčního vzorku se zaznamenávají a ověřují grafy kontroly kvality, aby bylo zajištěno, že analytická výkonnost je v souladu s příslušnými požadavky, u slepých vzorků odrážejících celý pracovní postup zejména s ohledem na požadovanou minimální odlišnost v nejspodnější části pracovního rozsahu a u referenčních vzorků zejména s ohledem na vnitrolaboratorní reprodukovatelnost. Slepé vzorky odrážející celý pracovní postup musí být důkladně kontrolovány, aby se zamezilo falešně vyhovujícím výsledkům po jejich odečtení.

7.4.7.

Výsledky konfirmačních metod u podezřelých vzorků a 2 až 10 % vyhovujících vzorků (minimálně 20 vzorků na jednu matrici) se zaznamenají a použijí se pro hodnocení výkonnosti screeningové metody a vztahu mezi BEQ a TEQ. Tuto databázi lze použít pro přehodnocení mezních hodnot platných pro běžné vzorky pro validované matrice.

7.4.8.

Dobrou výkonnost metody lze rovněž prokázat v kruhových testech. Výsledky vzorků analyzovaných v kruhových testech, které pokrývají rozsah koncentrací až do např. dvojnásobku maximálního limitu, se rovněž mohou zahrnout do hodnocení podílu falešně vyhovujících výsledků, je-li laboratoř schopna prokázat dobrou výkonnost. Vzorky musí zahrnovat nejčastější zastoupení kongenerů, které představují různé zdroje.

7.4.9.

Při incidentech lze mezní hodnoty přehodnotit, aby odrážely konkrétní matrici a zastoupení kongenerů tohoto konkrétního incidentu.

8.    Vydávání výsledků

8.1.    Konfirmační metody

8.1.1.

Analytické výsledky musí obsahovat hodnoty jednotlivých kongenerů PCDD/PCDF a PCB s dioxinovým efektem a hodnoty TEQ se vydávají jako dolní, horní a střední odhad, aby se do vydávání výsledků zahrnulo co nejvíce informací, a umožnil se tak výklad výsledků podle příslušných zvláštních požadavků.

8.1.2.

Protokol musí také zahrnovat metodu použitou pro extrakci PCDD/PCDF a PCB s dioxinovým efektem.

8.1.3.

Pokud výtěžnost leží mimo rozpětí uvedené v bodě 6.2.5, je-li překročen maximální limit (v tomto případě výtěžnosti pro jednu ze dvou opakovaných analýz), nebo v ostatních případech na žádost, musí být dány k dispozici hodnoty výtěžnosti pro jednotlivé vnitřní standardy.

8.1.4.

Protože se má při rozhodování o souladu vzorku přihlédnout také k rozšířené nejistotě měření, je třeba poskytnout tento parametr. Analytické výsledky se proto vydají ve tvaru „x +/– U“, kde x je výsledek analýzy a U je rozšířená nejistota měření, přičemž se použije faktor pokrytí 2, který odpovídá míře spolehlivosti přibližně 95 %. V případě samostatného stanovení PCDD/PCDF a PCB s dioxinovým efektem se pro sumu PCDD/PCDF a PCB s dioxinovým efektem musí použít suma odhadované rozšířené nejistoty měření samostatných výsledků analýzy pro PCDD/PCDF a PCB s dioxinovým efektem.

8.1.5.

Výsledky se vyjádří ve stejných jednotkách a (alespoň) se stejným počtem platných číslic jako maximální limity stanovené ve směrnici 2002/32/ES.

8.2.    Bioanalytické screeningové metody

8.2.1.

Výsledek screeningu se vyjádří jako „vyhovující“ nebo „podezřelý jako nevyhovující“ („podezřelý“).

8.2.2.

Kromě toho je možné vydat orientační výsledek pro PCDD/PCDF a/nebo PCB s dioxinovým efektem vyjádřený v BEQ, nikoli TEQ.

8.2.3.

Vzorky s odezvou nižší než oznamovací mez musí být vyjádřeny jako „nižší než oznamovací mez“. Vzorky s odezvou vyšší než pracovní rozsah se vydávají jako „vzorky překračující pracovní rozsah“ a úroveň odpovídající horní části pracovního rozsahu se uvede v BEQ.

8.2.4.

Pro každý typ matrice vzorku musí protokol uvádět maximální limit nebo akční práh, z něhož hodnocení vychází.

8.2.5.

Protokol musí uvádět použitý typ zkoušky, základní principy zkoušky a druh kalibrace.

8.2.6.

Protokol musí také zahrnovat metodu použitou pro extrakci PCDD/PCDF a PCB s dioxinovým efektem.

8.2.7.

V případě vzorků podezřelých jako nevyhovující musí protokol obsahovat poznámku o tom, jaká opatření mají být učiněna. Koncentraci PCDD/PCDF a sumu PCDD/PCDF a PCB s dioxinovým efektem v těchto vzorcích se zvýšeným obsahem je třeba stanovit/potvrdit konfirmační metodou.

8.2.8.

Nevyhovující výsledky se vydávají pouze tehdy, pokud byly zjištěny konfirmační analýzou.

8.3.    Fyzikálně-chemické screeningové metody

8.3.1.

Výsledek screeningu se vyjádří jako „vyhovující“ nebo „podezřelý jako nevyhovující“ („podezřelý“).

8.3.2.

Pro každý typ matrice vzorku musí protokol uvádět maximální limit nebo akční práh, z něhož hodnocení vychází.

8.3.3.

Kromě toho mohou být hodnoty jednotlivých kongenerů PCDD/PCDF a/nebo PCB s dioxinovým efektem a hodnoty TEQ udávány jako dolní, horní a střední odhad. Výsledky se vyjádří ve stejných jednotkách a (alespoň) se stejným počtem platných číslic jako maximální limity stanovené ve směrnici 2002/32/ES.

8.3.4.

Pokud výtěžnost leží mimo rozpětí uvedené v bodě 6.2.5, je-li překročen maximální limit (v tomto případě výtěžnosti pro jednu ze dvou opakovaných analýz), nebo v ostatních případech na žádost, musí být dány k dispozici hodnoty výtěžnosti pro jednotlivé vnitřní standardy.

8.3.5.

V protokolu musí být uvedeno, která metoda GC-MS byla použita.

8.3.6.

Protokol musí také zahrnovat metodu použitou pro extrakci PCDD/PCDF a PCB s dioxinovým efektem.

8.3.7.

V případě vzorků podezřelých jako nevyhovující musí protokol obsahovat poznámku o tom, jaká opatření mají být učiněna. Koncentraci PCDD/PCDF a sumu PCDD/PCDF a PCB s dioxinovým efektem v těchto vzorcích se zvýšeným obsahem je třeba stanovit/potvrdit konfirmační metodou.

8.3.8.

O tom, zda hodnota nebyla dodržena, může být rozhodnuto pouze konfirmační analýzou.

KAPITOLA III

Příprava vzorků a požadavky na analytické metody používané při úřední kontrole obsahu PCB bez dioxinového efektu v krmivech

1.    Oblast působnosti

Požadavky stanovené v této kapitole se vztahují na analýzu krmiv pro úřední kontrolu obsahu PCB bez dioxinového efektu a pro přípravu vzorků a analytické požadavky k jiným regulačním účelům, včetně kontrol prováděných provozovatelem krmivářského podniku k zajištění dodržování ustanovení nařízení (ES) č. 183/2005.

2.    Použitelné metody detekce

Plynová chromatografie v tandemu s detektorem elektronového záchytu (GC-ECD), GC-LRMS, GC-MS/MS, GC-HRMS nebo rovnocenné metody.

3.    Identifikace a konfirmace sledovaných analytů

3.1.	Relativní retenční čas ve vztahu k vnitřním standardům nebo referenčním standardům (s přijatelnou odchylkou ± 0,25 %).

3.2.	Separace PCB bez dioxinového efektu plynovou chromatografií od interferujících látek, zejména současně se eluujících PCB, zvláště jsou-li úrovně vzorků v rozmezí limitů stanovených právními předpisy a případný nesoulad má být teprve potvrzen ( 28 ).

3.3.

Požadavky na techniky GC-MS: Sledování alespoň následujícího počtu molekulárních iontů nebo charakteristických iontů z molekulárních klastrů: a)  dvou specifických iontů u HRMS; b)  tří specifických iontů u LRMS; c)  dvou specifických prekurzorových iontů, každý s jedním odpovídajícím specifickým přechodovým produktovým iontem pro MS-MS. Nejvyšší přípustné tolerance intenzity vybraných hmotnostních fragmentů: Relativní odchylka intenzity vybraných hmotnostních fragmentů od teoretické intenzity nebo kalibračního standardu pro cílový iont (nejintenzivnější sledovaný iont) a identifikační iont (ionty): ± 15 %

3.4.	Požadavky na techniky GC-ECD Konfirmace výsledků překračujících maximální limit s dvěma kolonami GC se stacionární fází jiné polarity.

4.    Prokazování výkonnosti metody

Výkonnost metody se prokáže v rozsahu maximálního limitu (polovina až dvojnásobek maximálního limitu) s přijatelným variačním koeficientem pro opakovanou analýzu (viz požadavky na mezilehlou preciznost uvedené v bodě 9).

5.    Mez kvantifikace

Suma mezí kvantifikace ( 29 ) PCB bez dioxinového efektu nesmí překročit jednu třetinu maximálního limitu ( 30 ).

6.    Kontrola kvality

Pravidelné slepé kontrolní vzorky, analýzy obohacených vzorků, vzorky pro kontrolu kvality, účast v mezilaboratorních studiích o příslušných matricích.

7.    Kontrola výtěžnosti

7.1.	Použijí se vhodné vnitřní standardy s fyzikálně-chemickými vlastnostmi porovnatelnými se sledovanými analyty.

7.2.	Přidání vnitřních standardů: přidání k produktům (před extrakcí a čištěním).

7.3.

Požadavky na metody s využitím všech šesti izotopicky značených kongenerů PCB bez dioxinového efektu a)  korekce výsledků na výtěžnost vnitřních standardů; b)  výtěžnosti izotopicky značených vnitřních standardů mají být mezi 60 a 120 %; c)  nižší nebo vyšší výtěžnosti jednotlivých kongenerů, které se na sumě PCB bez dioxinového efektu podílejí méně než 10 %, jsou přijatelné.

7.4.

Požadavky na metody, které nevyužívají všech šesti izotopicky značených vnitřních standardů nebo jiných vnitřních standardů: a)  kontrola výtěžnosti vnitřního standardu (vnitřních standardů) pro každý vzorek; b)  výtěžnost vnitřních standardů má být mezi 60 a 120 %; c)  výsledky se opraví na výtěžnost vnitřních standardů.

7.5.	Výtěžnosti neoznačených kongenerů se ověří pomocí obohacených vzorků nebo vzorků pro kontrolu kvality s koncentracemi v rozsahu maximálního limitu. Výtěžnost těchto kongenerů se považuje za přijatelnou, pokud je mezi 60 a 120 %.

8.    Požadavky na laboratoře

V souladu s nařízením (ES) č. 882/2004 musí být laboratoře akreditovány uznaným subjektem působícím v souladu s pokyny ISO Guide 58, aby bylo zaručeno, že uplatňují postupy zajištění analytické kvality. Laboratoře musí být akreditovány podle normy EN ISO/IEC 17025. Kromě toho je v příslušném případě třeba řídit se zásadami popsanými v technických pokynech pro odhad nejistoty měření a meze kvantifikace pro analýzu PCB ( 31 ).

9.    Kritéria výkonnosti: kritéria pro sumu PCB bez dioxionového efektu při maximálním limitu

10.    Vydávání výsledků

10.1.

Analytické výsledky musí obsahovat hodnoty jednotlivých PCB bez dioxinového efektu a sumu těch kongenerů PCB vydávaných jako dolní, horní a střední odhad, aby se do vydávání výsledků zahrnulo co nejvíce informací, a umožnil se tak výklad výsledků podle příslušných zvláštních požadavků.

10.2.

Protokol musí také zahrnovat metodu použitou pro extrakci PCB.

10.3.

Pokud výtěžnost leží mimo rozpětí uvedené v bodě 7, je-li překročen maximální limit nebo v ostatních případech na žádost musí být dány k dispozici hodnoty výtěžnosti pro jednotlivé vnitřní standardy.

10.4.

Protože se má při rozhodování o souladu vzorku přihlédnout také k rozšířené nejistotě měření, je třeba poskytnout také tento parametr. Analytické výsledky se proto vydají ve tvaru „x +/– U“, kde x je výsledek analýzy a U je rozšířená nejistota měření, přičemž se použije faktor pokrytí 2, který odpovídá míře spolehlivosti přibližně 95 %.

10.5.

Výsledky se vyjádří ve stejných jednotkách a (alespoň) se stejným počtem platných číslic jako maximální limity stanovené ve směrnici 2002/32/ES.

▼M2

---

PŘÍLOHA VI

METODY ZKOUŠENÍ PRO STANOVENÍ SLOŽEK ŽIVOČIŠNÉHO PŮVODU PRO ÚŘEDNÍ KONTROLU KRMIV

1.   ÚČEL A ROZSAH

Identifikace složek živočišného původu v krmivech se provádí pomocí světelné mikroskopie nebo polymerázové řetězové reakce podle ustanovení uvedených v této příloze.

Tyto dvě metody umožňují zjistit přítomnost složek živočišného původu v krmných surovinách a krmných směsích. Neumožňují však výpočet množství takových složek v krmných surovinách a krmných směsích. Obě metody mají mezní hodnotu detekce nižší než 0,1 % (hmot.).

Metoda polymerázové řetězové reakce umožňuje identifikaci systematické skupiny složek živočišného původu, jež jsou přítomny v krmných surovinách a krmných směsích.

Tyto metody se použijí ke kontrole uplatňování zákazů, jež jsou stanoveny v čl. 7 odst. 1 a příloze IV nařízení (ES) č. 999/2001 a v čl. 11 odst. 1 nařízení (ES) č. 1069/2009.

V závislosti na druhu zkoušeného krmiva lze tyto metody použít v rámci jednoho operačního protokolu, a to buď jednotlivě, či ve vzájemné kombinaci v souladu se standardními operačními postupy, jež stanovila a na svých internetových stránkách zveřejnila Referenční laboratoř EU pro živočišné proteiny v krmivech (EURL-AP) ( 32 ).

2.   METODY

2.1    Světelná mikroskopie

2.1.1    ►M7  Princip

Složky živočišného původu, jež mohou být přítomny v krmných surovinách a krmných směsích zaslaných k analýze, jsou identifikovány na základě charakteristických, mikroskopicky rozeznatelných znaků, jako jsou např. svalová vlákna a jiné masité částice, chrupavky, kosti, rohy, chlupy, štětiny, krev, kapky mléka, krystaly laktózy, peří, vaječné skořápky, rybí kosti a šupiny. ◄

2.1.2    Činidla a vybavení

2.1.2.1   Činidla

2.1.2.1.1   Koncentrační přípravek

2.1.2.1.1.1   Tetrachlorethylen (hustota 1,62)

2.1.2.1.2   Činidlo k barvení

2.1.2.1.2.1

Roztok alizarinové červeně (2,5 ml 1M kyseliny chlorovodíkové se rozpustí ve 100 ml vody a do tohoto roztoku se přidá 200 mg alizarinové červeně).

2.1.2.1.3   Zalévací přípravky

2.1.2.1.3.1   Louh (NaOH 2,5 % hm./obj. nebo KOH 2,5 % hm./obj.)

2.1.2.1.3.2    ►M7  Glycerol (neředěný, viskozita: 1 490 cP) nebo zalévací přípravek s rovnocennými vlastnostmi pro přípravu neustálených podložních mikroskopických sklíček ◄

2.1.2.1.3.3   Norland ® Optical Adhesive 65 (viskozita: 1 200 cP) nebo pryskyřice s obdobnými vlastnostmi za účelem přípravy ustáleného podložního sklíčka

2.1.2.1.4   Barvící zalévací přípravky

2.1.2.1.4.1

Lugolův roztok (2 g jodidu draselného se rozpustí ve 100 ml vody a přidá se 1 g jódu za častého protřepávání).

2.1.2.1.4.2

Činidlo na cystin (2 g octanu olovnatého, 10 g NaOH/100 ml vody)

2.1.2.1.4.3

Fehlingovo činidlo (připravuje se těsně před použitím ze dvou stejně velkých částí (1/1) ze dvou roztoků A a B. Roztok A: 6,9 g modré skalice se rozpustí ve 100 ml destilované vody. Roztok B: 34,6 g vinanu sodnodraselného tetrahydrátu a 12 g NaOH se rozpustí ve 100 ml destilované vody)

2.1.2.1.4.4

Tetramethylbenzidin/peroxid vodíku (1 g 3,3‘,5,5’ tetramethylbenzidinu se rozpustí ve 100 ml ledové kyseliny octové a 150 ml destilované vody. Před použitím je nutno promíchat 4 díly roztoku tetramethylbenzidinu s 1 dílem 3 % peroxidu vodíku)

2.1.2.1.5   Oplachovací činidla

2.1.2.1.5.1   Ethanol ≥ 96 % (technický)

2.1.2.1.5.2   Aceton (technický)

2.1.2.1.6   Bělicí činidlo

2.1.2.1.6.1   Komerční roztok hypochloritu sodného (9 až 14 % aktivního chlóru)

2.1.2.2   Vybavení

2.1.2.2.1   Analytické váhy s přesností 0,001 g

2.1.2.2.2    ►M7  Rozmělňovací zařízení: nůž nebo rotorový mlýn. Jestliže se používá rotorový mlýn, jsou zakázána mlýnská síta ≤ 0,5 mm ◄

2.1.2.2.3    ►M7  Síta se čtvercovými oky v šíři o rozměrech 0,25 mm a 1 mm. S výjimkou předběžného prosévání vzorku by průměr síta neměl překročit 10 cm, aby se zabránilo ztrátě materiálů. Kalibrace síta se nevyžaduje ◄

2.1.2.2.4

Skleněná kuželovitá dělicí nálevka o objemu 250 ml s teflonovým nebo skleněným zabroušeným kohoutem na spodku kužele. Průřez kohoutu v otevřené poloze je ≥ 4 mm. Namísto skleněné kuželovité dělicí nálevky může být použita usazovací kádinka s kónickým dnem, prokázala-li laboratoř, že hodnoty mezní detekce odpovídají hodnotám získaným za použití skleněné kuželovité dělicí nálevky. Dělicí nálevka

2.1.2.2.5

Stereoskopický mikroskop umožňující minimálně konečný rozsah zvětšení 6,5× až 40×.

2.1.2.2.6

Kombinovaný mikroskop umožňující minimálně konečný rozsah zvětšení 100× až 400× v jasném poli procházejícího světla. Dále lze použít i polarizační zařízení a diferenciální interferenční kontrast.

2.1.2.2.7

Běžné laboratorní sklo

2.1.2.2.8

Vybavení pro přípravu podložního sklíčka: běžná mikroskopická sklíčka, děrovaná sklíčka, krycí sklíčka (20×20 mm), pinzety, laboratorní stěrka

▼M7

2.1.2.2.9

Laboratorní pec

2.1.2.2.10

Odstředivka

2.1.2.2.11

Filtrační papír: filtr z kvalitní buničiny (o rozměru pórů 4–11 μm)

▼M2

2.1.3    Odběr a příprava vzorků

2.1.3.1    ►M7  Odběr vzorků

Používá se reprezentativní vzorek odebraný podle postupů stanovených v příloze I tohoto nařízení. ◄

2.1.3.2   Předběžná opatření

Veškeré vybavení k vícenásobnému použití se před použitím důkladně vyčistí, čímž se zabrání křížové kontaminaci v laboratoři. Před čištěním se rozebere dělicí nálevka na jednotlivé části. Jednotlivé části dělicí nálevky a skleněné vybavení se předem omývají ručně a následně se vloží do mycího zařízení. Síta se čistí kartáčem s tuhými syntetickými štětinami. Po prosívání materiálu s obsahem tuků, jako je např. rybí moučka, se na závěr doporučuje očistit síta acetonem a tlakovým vzduchem.

2.1.3.3   Příprava jiných vzorků, než jsou tuky či oleje

2.1.3.3.1

►M7  Vysoušení vzorku: Vzorky s obsahem vody > 14 % se před zpracováním vysuší podle přílohy III tohoto nařízení. ◄

2.1.3.3.2

►M7  Předběžné prosévání vzorku: Za účelem shromáždění informací o možné kontaminaci krmiva z okolního prostředí se doporučuje předběžně prosít granulované a jádrové krmivo sítem o velikosti 1 mm, a následně připravit, analyzovat a zvlášť vykazovat dvě vzniklé frakce, jež je třeba považovat za samostatné vzorky. ◄

2.1.3.3.3

Dílčí vzorkování a mletí: Z alespoň 50 g vzorku se připraví dílčí vzorky za účelem provedení analýzy a následně se rozemelou.

2.1.3.3.4

Extrakce a příprava sedimentu: Do dělicí nálevky nebo do usazovací kádinky s kónickým dnem se naváží nejméně 10 g (s přesností na 0,01 g) dílčího rozemletého vzorku a přidá se nejméně 50 ml tetrachlorethylenu. V případě rybí moučky nebo jiných výrobků čistě živočišného původu, minerálních složek či premixů, jež vytvářejí více než 10 % sedimentu, se navážka do dělicí nálevky sníží na 3 g. Směs se důkladně protřepává po dobu alespoň 30 s a v průběhu oplachování vnitřního povrchu dělicí nálevky za účelem odstranění jakýchkoli přilnutých pevných částic se opatrně přidává minimálně dalších 50 ml tetrachlorethylenu. Vzniklá směs se ponechá ustát po dobu alespoň pěti minut, než je otevřením kohoutu oddělen sediment. Je-li použita usazovací kádinka s kónickým dnem, musí být směs důkladně promíchávána alespoň po dobu 15 s a veškeré pevné částice, jež přilnou na stěně usazovací kádinky, je nutné z vnitřního povrchu opatrně opláchnout alespoň 10 ml tetrachlorethylenu. Směs se ponechá ustát alespoň po dobu tří minut a následně se opět promíchá po dobu 15 s a veškeré pevné částice, jež přilnou na stěny usazovací kádinky, je nutné z vnitřního povrchu opatrně opláchnout alespoň 10 ml tetrachlorethylenu. Vzniklá směs se ponechá ustát minimálně po dobu pěti minut a následně se pomocí dekantace tekutá frakce opatrně odstraní a vylije, přičemž se dbá na to, aby nedošlo k vylití sedimentu. ▼M7 Sediment se zachytí na filtrační papír umístěný do nálevky, aby bylo možné oddělit zbývající TCE a zároveň se vyhnout ukládání tuku do sedimentu. Sediment se vysuší. Pro kontrolu sedimentace se doporučuje sediment následně zvážit (s přesností na 0,001 g). Nakonec se sediment proseje sítem o velikosti 0,25 mm, přičemž budou analyzovány tyto dvě vzniklé frakce, ledaže by prosévání nebylo považováno za nutné. ▼M2

2.1.3.3.5

Extrakce a příprava flotátu: po odebrání sedimentu podle výše popsané metody by v dělicí nálevce měly zůstat dvě fáze: tekutá, kterou tvoří tetrachlorethylen, a pevná z vrstvy plovoucího materiálu. Pevnou složkou je flotát, který je nutno odebrat tak, že se z nálevky otevřením výpustního kohoutu zcela vypustí tetrachlorethylen. Obrácením dělicí nálevky se flotát přemístí na velkou Petriho misku a vysuší vzduchem v laboratorní digestoři. Tvoří-li více než 5 % flotátu pevné částice > 0,50 mm, je třeba jej prosít sítem o velikosti 0,25 mm, přičemž budou analyzovány tyto dvě vzniklé frakce.

2.1.3.3.6

Příprava suroviny: Připraví se navážka nejméně 5 g rozemletého dílčího vzorku. Tvoří-li více než 5 % materiálu pevné částice > 0,50 mm, je třeba jej prosít sítem o velikosti 0,25 mm, přičemž budou analyzovány tyto dvě vzniklé frakce.

2.1.3.4   Příprava vzorků obsahujících tuky či oleje

Pro přípravu vzorků obsahujících tuky či oleje se použije tento protokol:

2.1.3.5   Použití činidel k barvení

Osoba provádějící analýzu může pro usnadnění správné identifikace složek živočišného původu použít při přípravě vzorků činidla k barvení v souladu s pokyny, jež stanovila a na svých internetových stránkách zveřejnila Referenční laboratoř EU pro živočišné proteiny v krmivech (EURL-AP).

Je-li k obarvení sedimentu použit roztok alizarinové červeně, použije se tento protokol:

2.1.4    Mikroskopické zkoumání

2.1.4.1   Příprava podložních mikroskopických sklíček

▼M7

Podložní mikroskopická sklíčka se připraví ze sedimentu a dle úvahy osoby provádějící analýzu rovněž buď z flotátu, nebo suroviny.

▼M2

Za účelem provedení úplného zkušebního protokolu stanoveného v bodě 2.1.4.2 je třeba připravit dostatečný počet podložních sklíček.

Mikroskopická podložní sklíčka se zalijí přiměřeným zalévacím přípravkem v souladu se standardním operačním postupem, jejž stanovila a na svých internetových stránkách zveřejnila Referenční laboratoř EU pro živočišné proteiny v krmivech (EURL-AP). Podložní sklíčka se zakryjí krycími sklíčky.

▼M7

2.1.4.2   Vývojový diagram pozorování za účelem zjišťování živočišných částic v krmných směsích a krmných surovinách

Připravená mikroskopická podložní sklíčka se pozorují v souladu s vývojovými diagramy pozorování, jež jsou stanoveny v diagramech č. 1 a 2.

Mikroskopická pozorování se provádí pomocí kombinovaného mikroskopu, přičemž je pozorován sediment a dle úvahy osoby provádějící analýzu rovněž buď flotát, nebo surovina. Pro hrubší frakce lze kromě kombinovaného mikroskopu použít i stereoskopický mikroskop. Celá plocha mikroskopického podložního sklíčka se prozkoumá při různém zvětšení. Přesné vysvětlení, jak používat vývojové diagramy pozorování, podrobně popisuje standardní operační postup, jejž stanovila a na svých internetových stránkách zveřejnila Referenční laboratoř EU pro živočišné proteiny v krmivech (EURL-AP).

Minimální počet mikroskopických podložních sklíček, jež mají být zkoumána, je třeba důsledně dodržet u každého z kroků vývojových diagramů pozorování s výjimkou případů, kdy celý materiál frakce neumožňuje dosažení stanoveného počtu podložních sklíček, například pokud není získán žádný sediment. Pro záznam počtu částic se provádí pozorování na jednotlivé stanovení s nejvýše 6 podložními sklíčky.

Jsou-li na flotátu nebo na surovině připravována další mikroskopická podložní sklíčka pomocí specifičtějšího barvícího zalévacího přípravku stanoveného v bodě 2.1.2.1.4 pro další charakterizaci struktur (např. peří, chlupů, svalových nebo krevních částic), které byly zjištěny na podložních sklíčkách připravených jinými zalévacími přípravky, jak je stanoveno v bodě 2.1.2.1.3, počet částic se vypočítá na základě počtu podložních sklíček na jednotlivé stanovení s nejvýše 6 podložními sklíčky, včetně dalších podložních sklíček se specifičtějším zalévacím přípravkem.

Osoba provádějící pozorování může za účelem usnadnění identifikace povahy a původu částic využít podpůrných nástrojů, jako jsou např. podpůrné systémy pro rozhodování, knihovny snímků a referenční vzorky.

Diagram 1
Vývojový diagram pozorování za účelem zjišťování živočišných částic v krmných směsích a krmných surovinách pro první stanovení
(D1 a D2 se vztahují k prvnímu a druhému určení; *: suchozemští obratlovci, ryby)

Diagram 2
Vývojový diagram pozorování za účelem zjišťování živočišných částic v krmných směsích a krmných surovinách pro druhé stanovení
(D1 a D2 se vztahují k prvnímu a druhému stanovení; *: suchozemští obratlovci, ryby)

▼M2

2.1.4.3    ►M7  Počet stanovení

Stanovení se provádějí na různých dílčích vzorcích o hmotnosti 50 g.

Nejsou-li po prvním stanovení, jež bylo provedeno v souladu s vývojovým diagramem pozorování uvedeným v diagramu 1, zjištěny žádné živočišné částice, není další stanovení nutné a výsledky analýzy se nahlašují s využitím pojmů stanovených níže v bodě 2.1.5.1.

Je-li po prvním stanovení, jež bylo provedeno v souladu s vývojovým diagramem pozorování uvedeným v diagramu 1, zjištěna jedna nebo více živočišných částic dané povahy (tj. ze suchozemského obratlovce či ryby) a povaha zjištěných částic potvrdí deklarovaný obsah vzorku, není nutné druhé stanovení. Je-li počet živočišných částic dané povahy zjištěný během tohoto prvního stanovení vyšší než 5, podá se o výsledku analýzy zpráva podle druhu zvířete s využitím pojmů stanovených v bodě 2.1.5.3. Jinak se o výsledku analýzy podává zpráva podle živočišné povahy s využitím pojmů stanovených v bodě 2.1.5.2.

V ostatních případech, včetně případů, kdy nebylo laboratoři poskytnuto prohlášení o obsahu, se provede druhé stanovení s novou navážkou dílčího vzorku.

Je-li po druhém stanovení provedeném v souladu s vývojovým diagramem pozorování stanoveným v diagramu 2 celkový počet živočišných částic dané povahy zjištěný během dvou stanovení vyšší než 10, podá se o výsledku analýzy zpráva podle živočišné povahy s využitím pojmů stanovených v bodě 2.1.5.3. Jinak se o výsledku analýzy podává zpráva podle živočišné povahy s využitím pojmů stanovených v bodě 2.1.5.2. ◄

2.1.5    ►M7  Vyjádření výsledků

Při nahlašování výsledků uvede laboratoř druh materiálu, na kterém byla analýza provedena (sediment, flotát, surovina). Při nahlašování musí být jasně uveden počet stanovení, jež byla vykonána, a zda nebylo před přípravou podložního sklíčka provedeno prosévání frakcí v souladu s posledním odstavcem bodu 2.1.3.3.4.

Laboratorní zpráva musí obsahovat přinejmenším informace o přítomnosti složek ze suchozemských obratlovců a z ryb.

Různé nálezy se nahlašují následovně:

2.2    Polymerázová řetězová reakce

2.2.1    Princip

Fragmenty deoxyribonukleové kyseliny (DNA) živočišného původu, jež mohou být přítomny v krmných surovinách a krmných směsích, jsou zjišťovány prostřednictvím polymerázové řetězové reakce pomocí genetické amplifikace, jež se zaměřuje na příslušné sekvence DNA jednotlivých živočišných druhů.

Metoda polymerázové řetězové reakce vyžaduje fázi extrakce DNA. Fáze amplifikace se používá na takto získaný extrakt DNA s cílem zjistit živočišné druhy, na něž je zkouška zaměřena.

2.2.2    Činidla a vybavení

2.2.2.1   Činidla

2.2.2.1.1   Činidla pro fázi extrakce DNA

Používají se pouze činidla, která schválila a na svých internetových stránkách zveřejnila Referenční laboratoř EU pro živočišné proteiny v krmivech (EURL-AP).

2.2.2.1.2   Činidla pro fázi genetické amplifikace

2.2.2.1.2.1   Primery a sondy

Použijí se pouze primery a sondy validované Referenční laboratoří EU pro živočišné proteiny v krmivech ( 34 ).

2.2.2.1.2.2   Master Mix

Použijí se pouze roztoky Master Mix, jež neobsahují činidla, která by mohla vést k nesprávným výsledkům z důvodu přítomnosti živočišné DNA ( 35 ).

2.2.2.1.2.3   Činidla pro dekontaminaci

2.2.2.1.2.3.1   Roztok kyseliny chlorovodíkové (0,1 mol/l).

2.2.2.1.2.3.2   Bělidlo (roztok hypochloritu sodného s 0,15 % aktivního chlóru)

2.2.2.1.2.3.3   Činidla bez žíravých účinků pro dekontaminaci nákladných přístrojů, jako jsou např. analytické váhy (např. DNA EraseTM od společnosti MP Biomedicals)

2.2.2.2   Vybavení

2.2.2.2.1   Analytické váhy s přesností 0,001 g

2.2.2.2.2   Rozmělňovací zařízení

2.2.2.2.3   Termocykler umožňující polymerázovou řetězovou reakci v reálném čase

2.2.2.2.4   Mikroodstředivka pro zkumavky do mikroodstředivky

2.2.2.2.5   Sada mikropipet umožňujících pipetování od 1 μl do 1 000 μl

2.2.2.2.6

Běžné plastové vybavení pro molekulární biologii: zkumavky pro mikroodstředivky, plastové špičky mikropipet s filtrem, vhodné misky pro termocykler

2.2.2.2.7

Mrazící boxy k uchovávání vzorků a činidel

2.2.3    Odběr a příprava vzorků

2.2.3.1   Odběr vzorků

Používá se reprezentativní vzorek odebraný podle postupů stanovených v příloze I.

2.2.3.2   Příprava vzorků

Příprava laboratorních vzorků pro extrakci DNA musí splňovat požadavky stanovené v příloze II. Alespoň 50 g vzorku by mělo být rozděleno na dílčí vzorky pro účely analýzy a následně rozemleto.

Příprava vzorku probíhá v jiné místnosti, než je místnost určená k extrakci DNA a k reakcím genetické amplifikace, jak je stanoveno v normě ISO 24276.

Připraví se dvě navážky vzorku, každá minimálně o hmotnosti 100 mg.

2.2.4    Extrakce DNA

Extrakce DNA se provede u každé navážky vzorku připravené podle standardního operačního postupu, jejž stanovila a na svých internetových stránkách zveřejnila Referenční laboratoř EU pro živočišné proteiny v krmivech (EURL-AP).

Pro každou ze sérií navážek k extrakci se připraví dvě extrakční kontroly, jak je stanoveno v normě ISO 24276:

2.2.5    Genetická amplifikace

Genetická amplifikace se provádí s využitím metod validovaných pro každý druh, který vyžaduje identifikaci. Tyto metody jsou stanoveny ve standardním operačním postupu, jejž stanovila a na svých internetových stránkách zveřejnila Referenční laboratoř EU pro živočišné proteiny v krmivech (EURL-AP). Každý extrakt DNA se analyzuje alespoň ve dvou rozdílných ředěních, aby bylo možné vyhodnotit inhibici.

Pro každý cílový druh se připraví dvě kontroly amplifikace, jak je stanoveno v normě ISO 24276:

2.2.6    Interpretace a vyjadřování výsledků

Při nahlašování výsledků uvádí laboratoř minimálně hmotnost použitých navážek vzorku, použitý způsob extrakce, počet provedených stanovení a mezní hodnotu detekce dané metody.

Výsledky se neinterpretují a neohlašují, pokud extrakční kontrola pozitivní DNA a kontroly pozitivní cílové DNA nejsou pro zkoumaný cíl pozitivní a zároveň je kontrola amplifikačních činidel negativní.

V případě neslučitelných výsledků ze dvou navážek vzorku se zopakuje alespoň fáze genetické amplifikace. Domnívá-li se laboratoř, že neslučitelnosti by mohly být zapříčiněny extrakty DNA, provede se před vypočtením výsledků nová extrakce DNA a následná genetická amplifikace.

Konečné vyjádření výsledků vychází z integrace a interpretace výsledků dvou navážek vzorku v souladu se standardním operačním postupem, jejž stanovila a na svých internetových stránkách zveřejnila Referenční laboratoř EU pro živočišné proteiny v krmivech (EURL-AP).

2.2.6.1   Negativní výsledek

Negativní výsledek se oznamuje takto:

V předloženém vzorku nebyla zjištěna žádná DNA z X (přičemž X označuje živočišný druh či skupinu živočišných druhů, na který či na kterou byla zkouška zaměřena).

2.2.6.2   Pozitivní výsledek

Pozitivní výsledek se oznamuje takto:

V předloženém vzorku byla zjištěna DNA z X (přičemž X označuje živočišný druh či skupinu živočišných druhů, na který či na kterou byla zkouška zaměřena).

▼B

---

PŘÍLOHA VII

METODA VÝPOČTU OBSAHU ENERGIE U KRMNÝCH SMĚSÍ PRO DRŮBEŽ

1.   Metoda výpočtu a vyjádření obsahu energie

Obsah energie krmných směsí pro drůbež se vypočítá podle níže uvedeného vzorce na základě procentního podílu určitých analytických složek krmiva. Tato hodnota se vyjadřuje v megajoulech (MJ) metabolizovatelné energie (ME) s korekcí na dusík na jeden kilogram krmné směsi:

MJ/kg ME = 0,1551 × % hrubého proteinu + 0,3431 × % tuku + 0,1669 × % škrobu + 0,1301 × % veškerého cukru (vyjádřeného jako sacharóza).

2.   Tolerance pro deklarované obsahy

Jestliže úřední kontroly zjistí odchylku mezi výsledkem kontroly a deklarovaným obsahem energie znamenající zvýšení nebo snížení obsahu energie krmiva, povoluje se minimální přípustná odchylka 0,4 MJ/kg metabolizovatelné energie.

3.   Vyjádření výsledku

Výsledek vypočítaný podle výše uvedeného vzorce se uvádí s přesností na jedno desetinné místo.

4.   Metody odběru vzorků a metody laboratorního zkoušení

Odběr vzorku krmné směsi a stanovení obsahu analytických složek uvedených ve výpočetní metodě se provádí podle metod odběru vzorků a metod laboratorního zkoušení Společenství pro úřední kontrolu krmiv.

Použije se:

---

PŘÍLOHA VIII

METODY ZKOUŠENÍ PRO KONTROLU NEPŘÍPUSTNÉ PŘÍTOMNOSTI JIŽ NEPOVOLENÝCH DOPLŇKOVÝCH LÁTEK V KRMIVECH

A.   STANOVENÍ OBSAHU METHYLBENZOCHÁTU

2-methyl-7-benzyl-oxy-6-butyl-1,4-dihydro-4-oxychinolin-3-karboxylát

1.   Účel a rozsah

Tato metoda umožňuje stanovení obsahu methylbenzochátu v krmivech. Mez kvantifikace je 1 mg/kg.

2.   Princip

Methylbenzochát se extrahuje ze vzorku pomocí methanolového roztoku kyseliny methansulfonové. Extrakt se přečistí dichlormethanem, ionexovou chromatografií, a následně pak znovu dichlormethanem. Obsah methylbenzochátu se stanoví metodou vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC) na reverzní fázi s UV detekcí.

3.   Chemikálie

Směs methanolu (3.2) a vody (pro HPLC) 75 + 25 (v + v).

Přefiltruje se filtrem 0,22 μm (4.5) a roztok se odplyní (např. vystaví se ultrazvuku po dobu 10 minut).

20 ml kyseliny methansulfonové se zředí v 1 000 ml methanolu (3.2).

100 ml kyseliny chlorovodíkové (ρ201,18 g/ml) se zředí v 1 000 ml vody.

100 g ionexu se rozmíchá v 500 ml roztoku kyseliny chlorovodíkové (3.5) a za stálého míchání se zahřeje na topné desce k varu. Po ochlazení se kyselina dekantuje. Filtruje se přes papírový filtr za vakua. Ionex se propláchne dvakrát 500 ml vody a potom 250 ml methanolu (3.2). Potom se ionex propláchne dalšími 250 ml methanolu a vysuší se prosáváním vzduchu přes filtrační koláč. Vysušený ionex se uchovává v uzavřené láhvi.

Naváží se 50 mg standardní látky (3.7) s přesností na 0,1 mg, rozpustí se ve 100 ml odměrné baňce v roztoku kyseliny methansulfonové (3.4), doplní se jí po značku a promíchá.

Do 50 ml odměrné baňky se odpipetuje 5,0 ml základního standardního roztoku methylbenzochátu (3.7.1), doplní se methanolem (3.2) po značku a promíchá.

Do sady 25 ml odměrných baněk se odpipetuje 1,0 , 2,0 , 3,0 , 4,0 a 5,0 ml pracovního standardního roztoku methylbenzochátu (3.7.2). Doplní se po značku mobilní fází (3.3) a promíchá. Tyto roztoky mají koncentrace 2,0 , 4,0 , 6,0 , 8,0 a 10,0 μg/ml methylbenzochátu. Tyto roztoky se připravují čerstvé před použitím.

4.   Přístroje a pomůcky

5.   Postup

5.1   Obecné pokyny

Poznámka: slepý vzorek krmiva pro účel této metody je podobného typu jako vzorek a při jeho zkoušce nesmí být zjištěn methylbenzochát.

5.2   Extrakce

Do 250 ml kónické baňky se naváží s přesností na 0,01 g asi 20 g upraveného vzorku. Přidá se 100 ml roztoku kyseliny methansulfonové (3.4) a mechanicky se třepe (4.1) po dobu 30 minut. Roztok se přefiltruje přes papírový filtr a filtrát se použije na extrakci kapalina-kapalina (5.3).

5.3   Extrakce kapalina-kapalina

Do 500 ml dělicí nálevky obsahující 100 ml roztoku kyseliny chlorovodíkové (3.5) se přidá 25,0 ml filtrátu, který byl získán postupem uvedeným v bodě 5.2. Dále se do nálevky přidá 100 ml dichlormethanu (3.1) a třepe po dobu jedné minuty. Potom se nechají vrstvy separovat a spodní vrstva (dichlormethanu) se odpustí do 500 ml baňky s kulatým dnem. Extrakce vodné fáze se opakuje se dvěma dalšími 40 ml dávkami dichlormethanu a ty se spojí s prvním extraktem v baňce s kulatým dnem. Extrakt dichlormethanu se odpaří do sucha na rotační odparce (4.2) při sníženém tlaku a teplotě 40 oC. Odparek se rozpustí v 20–25 ml methanolu (3.2), baňka se zazátkuje a celý extrakt se použije pro chromatografii s iontovou výměnou (5.4).

5.4   Chromatografie s iontovou výměnou

5.4.1    Příprava ionexové kolony

Do dolního konce skleněné kolony (4.3) se vloží tampon ze skelné vaty. Připraví se suspenze z 5,0 g upraveného ionexu (3.6) a z 50 ml kyseliny chlorovodíkové (3.5). Tato směs se nalije do skleněné kolony a nechá se usadit. Přebytečná kyselina se odpustí až těsně nad hladinu ionexu a kolona se promývá vodou, dokud proteklý eluát není neutrální na lakmusový papír. Potom se do kolony se nalije 50 ml methanolu (3.2) a nechá se stéci až k povrchu ionexu.

5.4.2    Kolonová chromatografie

Na kolonu se opatrně napipetuje získaný extrakt (5.3). Baňka s kulatým dnem se vypláchne dvěma dávkami 5–10 ml methanolu (3.2) a výplachy se také převedou na kolonu. Kolona se promyje 50 ml methanolu tak, aby průtok nepřesahoval 5 ml za minutu. Proteklá kapalina se odstraní. Methylbenzochát se eluuje z kolony 150 ml roztoku kyseliny methansulfonové (3.4) a eluát se jímá do 250 ml kónické baňky.

5.5   Extrakce kapalina-kapalina

Získaný eluát (5.4.2) se převede do 1 000 ml dělicí nálevky. Kónická baňka se propláchne 5–10 ml methanolu (3.2) a výplach se přidá do dělicí nálevky. Dále se do dělicí nálevky přidá 300 ml roztoku kyseliny chlorovodíkové (3.5) a 130 ml dichlormethanu (3.1). Třepe se po dobu jedné minuty a potom se nechají fáze separovat. Spodní vrstva (dichlormethanu) se odpustí do 500 ml baňky s kulatým dnem. Extrakce vodné fáze se opakuje se dvěma dalšími 70 ml dávkami dichlormethanu a tyto extrakty se smísí s prvním extraktem v baňce s kulatým dnem.

Extrakt dichlormethanu se odpaří do sucha v rotační odparce (4.2) při sníženém tlaku a teplotě 40 oC. Odparek v baňce se rozpustí v přibližně 5 ml methanolu (3.2) a tento roztok se kvantitativně převede do 10 ml odměrné baňky. Baňka s kulatým dnem se vypláchne dvěma dalšími dávkami 1–2 ml methanolu a opět se převede do odměrné baňky. Baňka se doplní po značku methanolem a promíchá. Alikvotní část se přefiltruje přes membránový filtr (4.6). Tento roztok se použije pro stanovení HPLC (5.6).

5.6   Stanovení HPLC

5.6.1    Parametry

Následující podmínky jsou doporučené, mohou být použity jiné podmínky za předpokladu, že poskytují rovnocenné výsledky:

Stabilita chromatografického systému se kontroluje opakovaným nástřikem kalibračního roztoku (3.7.3) obsahujícího 4 μg/ml, dokud se nedosáhne konstantních výšek nebo ploch píků a konstantních retenčních časů.

5.6.2    Kalibrační křivka

Provede se několikrát nástřik každého kalibračního roztoku (3.7.3) a změří výšky (plochy) píků pro každou koncentraci. Kalibrační křivka se vytvoří vynesením průměrných hodnot výšek nebo ploch píků kalibračních roztoků proti příslušným koncentracím v μg/ml.

5.6.3    Roztok vzorku

Opakovaně se nastřikuje extrakt vzorku (5.5) s použitím stejného objemu, jaký byl použit pro kalibrační roztoky, a určí se průměrná hodnota výšky (plochy) píků methylbenzochátu.

6.   Výpočet a vyjádření výsledků

Z průměrných hodnot výšek (ploch) píků methylbenzochátu v roztoku vzorku se stanoví koncentrace v roztoku vzorku v μg/ml porovnáním s kalibrační křivkou (5.6.2).

Obsah methylbenzochátu (w) ve vzorku v mg/kg se vypočítá podle následujícího vzorce:

kde:

c

=

koncentrace methylbenzochátu v roztoku vzorku v g/ml

m

=

hmotnost navážky vzorku v gramech.

7.   Ověření výsledků

7.1   Identita

Identita analytu může být potvrzena opakovaným stanovením s přídavkem nebo pomocí detektoru diodového pole, který umožňuje porovnání spektra extraktu vzorku se spektrem kalibračního roztoku (3.7.3) obsahujícího 10 μg/ml methylbenzochátu.

7.1.1    Opakované stanovení s přídavkem (co-chromatography)

Extrakt vzorku se obohatí přidáním vhodného množství pracovního standardního roztoku (3.7.2). Množství přidaného methylbenzochátu musí být podobné jako odhadovaný obsah methylbenzochátu v extraktu vzorku.

Přídavek se projeví pouze zvýšením píku methylbenzochátu, a to úměrně k přidanému množství a ředění extraktu. Šířka píku v polovině maximální výšky se může odchylovat od šířky původního píku nejvýše o ±10 %.

7.1.2    Detektor diodového pole

Výsledky jsou posuzovány podle následujících kritérií:

Jestliže některé z těchto kritérií není splněno, přítomnost analytu není potvrzena.

7.2   Opakovatelnost

Rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení provedených u stejného vzorku nesmí překročit: 10 % relat. z hodnoty vyššího výsledku při obsahu methylbenzochátu od 4,0 do 20 mg/kg.

7.3   Výtěžnost

Výtěžnost pro obohacený vzorek musí být nejméně 90 %.

8.   Výsledky kruhových testů

V deseti laboratořích bylo zkoušeno pět vzorků. U každého vzorku byly provedeny dvě zkoušky.

ND

=

nezjištěno

sr

=

standardní odchylka opakovatelnosti

CVr

=

variační koeficient opakovatelnosti v %

sR

=

standardní odchylka reprodukovatelnosti

CVR

=

variační koeficient reprodukovatelnosti v %.

B.   STANOVENÍ OLACHINDOXU

2-[N-2'-(hydroxyethyl)karbamoyl]-3-methylchinoxalin-N1,N4-dioxid

1.   Účel a rozsah

Tato metoda umožňuje stanovení obsahu olachindoxu v krmivech. Mez kvantifikace je 5 mg/kg.

2.   Princip

Vzorek se extrahuje směsí vody a methanolu. Obsah olachindoxu se stanoví vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC) na reverzní fázi za použití UV detektoru.

3.   Chemikálie

Směs vody (3.3) a methanolu (3.2), 900 + 100 (V + V).

Do 200 ml odměrné baňky se naváží 50 mg olachindoxu (3.5) s přesností na 0,1 mg a přidá se asi 190 ml vody. Baňka se postaví na 20 minut do ultrazvukové lázně (4.1). Po vyjmutí z ultrazvukové lázně se roztok ochladí na laboratorní teplotu, doplní vodou po značku a promíchá. Baňka se obalí hliníkovou fólií a uschová v chladničce. Tento roztok se musí připravovat čerstvý každý měsíc.

10,0 ml základního standardního roztoku (3.5.1) se převede do 100 ml odměrné baňky, doplní se po značku mobilní fází (3.4) a promíchá. Baňka se obalí hliníkovou fólií a uschová v chladničce. Tento roztok se musí připravovat denně čerstvý.

Do sady 50 ml odměrných baněk se odpipetuje 1,0 , 2,0 , 5,0 , 10,0 , 15,0 a 20,0 ml pracovního standardního roztoku (3.5.2). Doplní se po značku mobilní fází (3.4) a promíchá. Baňky se obalí hliníkovou fólií. Tyto roztoky odpovídají 0,5 , 1,0 , 2,5 , 5,0 , 7,5 a 10,0 μg/ml olachindoxu.

Tyto roztoky se musí připravovat denně čerstvé.

4.   Přístroje a pomůcky

5.   Postup

Poznámka

:

Olachindox je citlivý na světlo. Všechny postupy se musí provádět při tlumeném světle nebo v nádobách z tmavého skla.

5.1   Obecné pokyny

Poznámka

:

Pro účely této metody je slepý vzorek krmiva podobného typu jako zkoušený vzorek a nesmí být zjištěn olachindox.

5.2   Extrakce

Naváží se přibližně 50 g vzorku s přesností na 0,01 g. Přenese se do kónické baňky o obsahu 1 000 ml, přidá se 100 ml methanolu (3.1) a baňka se umístí na pět minut do ultrazvukové lázně (4.1). Přidá se 410 ml vody a ponechá se v ultrazvukové lázni dalších 15 minut. Baňka se vyjme z ultrazvukové lázně, dále se třepe 30 minut na míchacím zařízení (4.2) a potom se přefiltruje složeným filtrem. 10,0 ml filtrátu se přenese do 20 ml odměrné baňky, doplní se vodou po značku a promíchá. Poměrná část se přefiltruje membránovým filtrem (4.4). (viz bod 9 Poznámka). Dále se pokračuje se stanovením HPLC (5.3).

5.3   Stanovení HPLC

5.3.1    Parametry:

Následující podmínky jsou doporučené, mohou být použity jiné podmínky za předpokladu, že poskytují rovnocenné výsledky:

Stabilita chromatografického systému se kontroluje opakovaným nástřikem kalibračního roztoku (3.5.3), který obsahuje 2,5 μg/ml, dokud se nedosáhne konstantních výšek píků a konstantních retenčních časů.

5.3.2    Kalibrační křivka

Provede se několikrát nástřik každého kalibračního roztoku (3.5.3) a změří se průměrná hodnota výšky (plochy) píků pro každou koncentraci. Kalibrační křivka se vytvoří vynesením průměrných hodnot výšek (ploch) píků kalibračních roztoků proti příslušným koncentracím v μg/ml.

5.3.3    Roztok vzorku

Provede se několik nástřiků extraktu vzorku (5.2) při použití stejného objemu jako u kalibračních roztoků a změří se průměrná hodnota výšky (plochy) píků olachindoxu.

6.   Výpočet a vyjádření výsledků

Z průměrné hodnoty výšky (plochy) píků olachindoxu v roztoku vzorku se stanoví koncentrace v roztoku vzorku v μg/ml porovnáním s kalibrační křivkou (5.3.2).

Obsah olachindoxu ve vzorku (w) v mg/kg se vypočítá podle následujícího vzorce:

kde:

c

=

koncentrace olachindoxu v extraktu vzorku (5.2) v μg/ml

m

=

hmotnost navážky vzorku v g (5.2).

7.   Ověření výsledků

7.1   Identita

Identita analytu může být potvrzena opakovaným stanovením s přídavkem (co-chromatography) nebo využitím detektoru diodového pole, přičemž se porovnávají spektra extraktu vzorku (5.2) a kalibračního roztoku (3.5.3), obsahujícího 5,0 μg/ml.

7.1.1    Opakované stanovení s přídavkem (co-chromatography)

Extrakt vzorku (5.2) se obohatí přídavkem přiměřeného množství kalibračního roztoku (3.5.3). Množství přidaného olachindoxu musí odpovídat množství olachindoxu nalezeného v extraktu vzorku.

Přídavek se projeví pouze zvýšením píku olachindoxu, a to úměrně k přidanému množství a ředění extraktu. Šířka píku v polovině jeho výšky musí být v rozmezí ±10 % původní šířky píku olachindoxu v neobohaceném extraktu vzorku.

7.1.2    Detektor diodového pole

Výsledky jsou posuzovány podle následujících kritérií:

Jestliže některé z těchto kritérií není splněno, přítomnost analytu není potvrzena.

7.2   Opakovatelnost

Rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení provedených na stejném vzorku nesmí přesáhnout 15 % relat. z vyššího výsledku při obsahu olachindoxu mezi 10 a 200 mg/kg.

7.3   Výtěžnost

Výtěžnost pro obohacený slepý vzorek krmiva musí být nejméně 90 %.

8.   Výsledky kruhových testů

V rámci ES byly provedeny kruhové testy, při nichž až 13 laboratoří zkoušelo čtyři vzorky krmiva pro selata, včetně jednoho slepého vzorku. Výsledky jsou uvedeny v následující tabulce:

L

=

počet laboratoří

n

=

počet jednotlivých hodnot

Sr

=

standardní odchylka opakovatelnosti

SR

=

standardní odchylka reprodukovatelnosti

CVr

=

variační koeficient opakovatelnosti

CVR

=

variační koeficient reprodukovatelnosti.

9.   Poznámka

Ačkoliv tato metoda nebyla ověřena pro krmiva obsahující více než 100 mg/kg olachindoxu, je možné obdržet uspokojivé výsledky menší navážkou vzorku a/nebo zředěním extraktu (5.2) tak, aby se dosáhlo koncentrace v rozsahu kalibrační křivky (5.3.2).

C.   STANOVENÍ OBSAHU AMPROLIA

1-[(4-amino-2-propyl-pyrimidinyl)-metyl]-2-picoliniumchlorid hydrochlorid

1.   Účel a rozsah

Tato metoda umožňuje stanovení obsahu amprolia v krmivech a premixech. Mez detekce je 1 mg/kg, mez kvantifikace je 5 mg/kg.

2.   Princip

Vzorek se extrahuje směsí methanolu a vody. Po zředění mobilní fází a membránové filtraci se obsah amprolia stanoví vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC) s výměnou kationtů a UV detekcí.

3.   Chemikálie

13,80 g dihydrogenfosforečnanu sodného se rozpustí ve vodě (3.3) v odměrné baňce o objemu 1 000 ml, doplní se vodou (3.3) po značku a promíchá.

224,74 g chloristanu sodného se rozpustí ve vodě (3.3) v odměrné baňce o objemu 1 000 ml, doplní se vodou (3.3) po značku a promíchá.

Směs acetonitrilu (3.2), roztoku dihydrogenfosforečnanu sodného (3.4) a roztoku chloristanu sodného (3.5), 450 + 450 + 100 (v + v + v). Roztok se před použitím přefiltruje přes membránový filtr 0,22 μm (4.3) a odplyní (např. v ultrazvukové lázni (4.4) po dobu nejméně 15 minut).

Do 100 ml odměrné baňky se s přesností na 0,1 mg naváží 50 mg amprolia (3.7), rozpustí se v 80 ml methanolu (3.1) a vloží se na 10 minut do ultrazvukové lázně (4.4). Po vyjmutí z ultrazvukové lázně se roztok ochladí na laboratorní teplotu, doplní vodou po značku a promíchá. Roztok je při teplotě ≤ 4 oC stálý jeden měsíc.

Do 50 ml odměrné baňky se napipetuje 5,0 ml základního standardního roztoku (3.7.1), doplní se po značku extrakční směsí (3.8) a promíchá. Roztok je při teplotě ≤ 4 oC stálý jeden měsíc.

Do sady 50 ml odměrných baněk se napipetuje 0,5 , 1,0 a 2,0 ml pracovního standardního roztoku (3.7.2). Doplní se po značku mobilní fází (3.6) a promíchá. Tyto roztoky obsahují 0,5 , 1,0 a 2,0 μg amprolia v 1 ml. Tyto roztoky se musí připravovat čerstvé před použitím.

Směs methanolu (3.1) a vody, 2 + 1 (v + v).

4.   Přístroje a pomůcky

5.   Postup

5.1   Obecné pokyny

5.1.1    Slepý vzorek krmiva

Pro provedení zkoušky na výtěžnost (5.1.2) se provede zkouška slepého vzorku krmiva za účelem kontroly, že ve vzorku není přítomno amprolium ani jiné rušivé látky. Slepý vzorek krmiva je podobného složení jako zkoušený vzorek a nesmí být zjištěno amprolium ani rušivé látky.

5.1.2    Zkouška na výtěžnost

Zkouška na výtěžnost se provede na slepém vzorku krmiva, ke kterému bylo přidáno takové množství amprolia, které odpovídá množství amprolia ve zkoušeném vzorku. Pro obohacení na obsah 100 mg/kg se převede 10,0 ml základního standardního roztoku (3.7.1) do 250 ml kónické baňky a roztok se odpaří na přibližně 0,5 ml. Poté se přidá 50 g slepého vzorku krmiva. Důkladně se promíchá, nechá se 10 minut stát a před zahájením extrakce (5.2) se znovu několikrát promíchá.

Není-li k dispozici slepý vzorek krmiva podobného složení jako zkoušený vzorek (viz 5.1.1), lze provést zkoušku na výtěžnost metodou standardního přídavku. V tom případě se ke zkoušenému vzorku přidá přibližně stejné množství amprolia, jaké je ve vzorku již obsaženo. Obohacený vzorek se potom zkouší společně se vzorkem neobohaceným a výtěžnost se vypočte odečtením.

5.2   Extrakce

5.2.1    Krmiva a premixy (obsah amprolia < 1 %)

Podle obsahu amprolia se do 500 ml kónické baňky naváží 5–40 g vzorku s přesností na 0,01 g a přidá se 200 ml extrakční směsi (3.8). Baňka se vloží na 15 minut do ultrazvukové lázně (4.4). Poté se vyjme a 1 hodinu třepe nebo míchá na magnetickém míchacím zařízení (4.5). Alikvotní část extraktu se zředí mobilní fází (3.6) na obsah amprolia 0,5 –2 μg/ml a promíchá se (viz poznámka 9.3). 5–10 ml tohoto naředěného roztoku se přefiltruje přes membránový filtr (4.2). Dále se pokračuje se stanovením HPLC (5.3).

5.2.2    Premixy (obsah amprolia ≥ 1 %)

Podle obsahu amprolia se do 500 ml kónické baňky naváží 1–4 g premixu s přesností na 0,001 g a přidá se 200 ml extrakční směsi (3.8). Baňka se vloží na 15 minut do ultrazvukové lázně (4.4). Poté se vyjme a 1 hodinu třepe nebo míchá na magnetickém míchacím zařízení (4.5). Alikvotní část extraktu se zředí mobilní fází (3.6) na obsah amprolia mezi 0,5 –2 μg/ml a promíchá se. 5–10 ml tohoto zředěného roztoku se přefiltruje přes membránový filtr (4.2). Dále se pokračuje se stanovením HPLC (5.3).

5.3   Stanovení HPLC

5.3.1    Parametry:

Následující podmínky jsou doporučené, mohou být použity jiné podmínky za předpokladu, že poskytují rovnocenné výsledky.

Stabilita chromatografického systému se kontroluje opakovaným nástřikem kalibračního roztoku (3.7.3), který obsahuje 1,0 μg/ml, dokud se nedosáhne konstantních výšek píků a konstantních retenčních časů.

5.3.2    Kalibrační křivka

Provede se několikrát nástřik každého kalibračního roztoku (3.7.3) a změří se průměrná hodnota výšek (ploch) píků pro každou koncentraci. Kalibrační křivka se vytvoří vynesením průměrných hodnot výšek nebo ploch píků kalibračních roztoků proti příslušným koncentracím v μg/ml.

5.3.3    Roztok vzorku

Provede se několik nástřiků extraktu vzorku (5.2) při použití stejného objemu jako u kalibračních roztoků a zjistí se průměrná hodnota výšek (ploch) píků amprolia.

6.   Výpočet a vyjádření výsledků

Z průměrné hodnoty výšky (plochy) píků amprolia u roztoku vzorku se podle kalibrační křivky (5.3.2) stanoví koncentrace roztoku vzorku v μg/ml.

Obsah amprolia (w) v mg/kg ve vzorku se vypočte podle následujícího vzorce:

(mg/kg)

kde:

V

=

objem extrakční směsi (3.8) v ml podle 5.2 (tj. 200 ml)

c

=

koncentrace amprolia v extraktu vzorku (5.2) v μg/ml

f

=

faktor ředění podle 5.2

m

=

hmotnost navážky vzorku v g.

7.   Ověření výsledků

7.1   Identita

Identitu analytů lze potvrdit opakovaným stanovením s přídavkem (co-chromatography) nebo pomocí detektoru diodového pole, přičemž se porovnávají spektra roztoku vzorku (5.2) a kalibračního roztoku (3.7.3) obsahujícího 2,0 μg/ml.

7.1.1    Opakované stanovení s přídavkem (co-chromatography)

K roztoku vzorku (5.2) se přidá vhodné množství kalibračního roztoku (3.7.3). Přidané množství amprolia musí odpovídat obsahu amprolia v extraktu vzorku.

Přídavek se projeví pouze zvýšením píku amprolia, a to úměrně k přidanému množství a ředění extraktu. Šířka píku v polovině maximální výšky se může odchylovat od šířky původního píku amprolia v neobohaceném extraktu vzorku nejvýše o ±10 %.

7.1.2    Detektor diodového pole

Výsledky jsou posuzovány podle následujících kritérií:

Není-li některé z těchto kritérií splněno, přítomnost analytu není potvrzena.

7.2   Opakovatelnost

Rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení provedených u téhož vzorku nesmí překročit

7.3   Výtěžnost

Pro obohacený (slepý) vzorek musí být výtěžnost nejméně 90 %.

8.   Výsledky kruhových testů

Při kruhových testech byla zkoušena tři krmiva pro drůbež (vzorky 1–3), minerální krmivo (vzorek 4) a premix (vzorek 5). Výsledky jsou shrnuty v níže uvedené tabulce.

L

=

počet laboratoří

n

=

počet jednotlivých hodnot

sr

=

standardní odchylka opakovatelnosti

CVr

=

variační koeficient opakovatelnosti

sR

=

standardní odchylka reprodukovatelnosti

CVR

=

variační koeficient reprodukovatelnosti.

9.   Poznámky

D.   STANOVENÍ OBSAHU CARBADOXU

Methyl-3-(2-chinoxalinylmethylen)-carbazat- N 1 ,N 4 -dioxid

1.   Účel a rozsah

Tato metoda umožňuje stanovení obsahu carbadoxu v krmivech, premixech a přípravcích. Mez detekce je 1 mg/kg, mez kvantifikace je 5 mg/kg.

2.   Princip

Vzorek se zvlhčí vodou a poté se extrahuje směsí methanolu a acetonitrilu. U krmiv se alikvotní část extraktu po filtraci přečistí na koloně s oxidem hlinitým. Extrakt z premixů a přípravků se přímo ředí na vhodnou koncentraci směsí vody, methanolu a acetonitrilu. Obsah carbadoxu se stanoví vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC) na reverzní fázi s UV detekcí.

3.   Chemikálie

500 ml methanolu (3.1) se smíchá s 500 ml acetonitrilu (3.2).

10 ml kyseliny octové (3.3) se smíchá se 100 ml vody.

0,82 g octanu sodného (3.7) se rozpustí v 700 ml vody (3.8) a kyselinou octovou (3.6) se upraví pH na 6,0 . Roztok se převede do odměrné baňky o objemu 1 000 ml, doplní se vodou (3.8) po značku a promíchá.

825 ml octanového tlumivého roztoku (3.9) se smíchá se 175 ml acetonitrilu (3.2).

Roztok se přefiltruje přes membránový filtr 0,22 μm (4.5) a odplyní se (např. v ultrazvukové lázni po dobu 10 minut).

Čistý carbadox: Methyl-3-(2-chinoxalinylmethylen)-carbazat-N1,N4-dioxid, E 850.

Do 250 ml odměrné baňky se naváží 25 mg carbadoxu (3.11) s přesností na 0,1 mg. Rozpustí se ve směsi methanolu a acetonitrilu (3.5) v ultrazvukové lázni (4.7). Po působení ultrazvuku se roztok ochladí na laboratorní teplotu, doplní se směsí methanolu a acetonitrilu (3.5) po značku a promíchá. Baňka se obalí hliníkovou fólií (nebo se použije odměrná baňka z tmavého skla) a uchovává se v chladničce. Roztok je při teplotě ≤ 4 oC stálý jeden měsíc.

Do sady 100 ml odměrných baněk se přenese 2,0 , 5,0 , 10,0 a 20,0 ml základního standardního roztoku (3.11.1). Přidá se po 30 ml vody, doplní se po značku směsí methanolu a acetonitrilu (3.5) a promíchá. Baňky se obalí hliníkovou fólií. Tyto roztoky obsahují 2,0 , 5,0 , 10,0 a 20,0 μg carbadoxu v 1 ml.

Kalibrační roztoky se připravují čerstvé před použitím.

Poznámka

:

Pro stanovení carbadoxu v krmivech obsahujících méně než 10 mg/kg se musí připravovat kalibrační roztoky s koncentrací nižší než 2,0 μg/ml.

300 ml vody se smíchá se 700 ml směsi methanolu a acetonitrilu (3.5).

4.   Přístroje a pomůcky

Poznámka

:

Lze použít i skleněnou kolonu s kohoutem a kónicky zúženou skleněnou kolonu; v tom případě se do spodní části kolony vloží malá zátka ze skelné vaty a utěsní se pomocí skleněné tyčinky.

5.   Postup

Poznámka

:

Carbadox je citlivý na světlo. Celý postup se musí provádět při tlumeném světle nebo je třeba použít nádobí z tmavého skla nebo sklo obalit hliníkovou fólií.

5.1   Obecné pokyny

5.1.1    Slepý vzorek krmiva

Pro provedení zkoušky na výtěžnost (5.1.2) se provede zkouška slepého vzorku krmiva za účelem kontroly, že není přítomen ani carbadox, ani rušivé látky. Slepý vzorek krmiva má podobné složení jako zkoumaný vzorek a nesmí být zjištěn carbadox ani rušivé látky.

5.1.2    Zkouška na výtěžnost

Zkouška na výtěžnost se provede na slepém vzorku krmiva (5.1.1), ke kterému bylo přidáno takové množství carbadoxu, které odpovídá množství carbadoxu ve zkoušeném vzorku. Pro obohacení na obsah 50 mg/kg se 5,0 ml základního standardního roztoku (3.11.1) převede do 200 ml kónické baňky. Roztok se v proudu dusíku odpaří na přibližně 0,5 ml. Přidá se 10 g slepého vzorku krmiva, promíchá se a po deseti minutách se může začít s extrakcí (5.2).

Není-li k dispozici slepý vzorek krmiva podobného složení jako zkoušený vzorek (viz 5.1.1), lze provést zkoušku na výtěžnost metodou standardního přídavku. V tom případě se ke zkoušenému vzorku přidá přibližně stejné množství carbadoxu, jaké je ve vzorku již obsaženo. Obohacený vzorek se potom zkouší společně se vzorkem neobohaceným a výtěžnost se vypočte odečtením.

5.2   Extrakce

5.2.1    Krmiva

Do 200 ml kónické baňky se naváží 10 g vzorku s přesností na 0,01 g. Přidá se 15,0 ml vody, promíchá se a nechá se 5 minut stát. Poté se přidá 35,0 ml směsi methanolu a acetonitrilu (3.5), baňka se uzavře a 30 minut se protřepává nebo míchá na magnetickém míchacím zařízení (4.1). Roztok se přefiltruje přes filtr ze skleněných vláken (4.2). Tento roztok se použije k čištění (5.3).

5.2.2    Premixy (0,1 –2,0 %)

Do 200 ml kónické baňky se naváží 1 g nemletého vzorku s přesností na 0,001 g. Přidá se 15,0 ml vody, promíchá se a nechá se 5 minut stát. Poté se přidá 35,0 ml směsi methanolu a acetonitrilu (3.5), baňka se uzavře a 30 minut se protřepává nebo míchá na magnetickém míchacím zařízení (4.1). Roztok se přefiltruje přes filtr ze skleněných vláken (4.2).

Alikvotní část filtrátu se odpipetuje do 50 ml odměrné baňky. Přidá se 15,0 ml vody, doplní se po značku směsí methanolu a acetonitrilu (3.5) a promíchá. Koncentrace carbadoxu v konečném roztoku je přibližně 10 μg/ml. Alikvotní část se přefiltruje přes filtr 0,45 μm (4.6).

Dále se pokračuje se stanovením HPLC (5.4).

5.2.3    Přípravky (> 2 %)

Do 250 ml kónické baňky se naváží 0,2 g nemletého vzorku s přesností na 0,001 g. Přidá se 45,0 ml vody, promíchá se a nechá se 5 minut stát. Poté se přidá 105,0 ml směsi methanolu a acetonitrilu (3.5), baňka se uzavře a homogenizuje. Baňka se vloží na 15 minut do ultrazvukové lázně (4.7) a poté se 15 minut třepe nebo míchá na magnetickém míchacím zařízení (4.1). Roztok se přefiltruje přes filtr ze skleněných vláken (4.2).

Alikvotní část filtrátu se zředí směsí vody, methanolu a acetonitrilu (3.12) tak, aby se získala koncentrace carbadoxu 10–15 μg/ml (pro 10 % přípravek je faktor ředění 10). Alikvotní část se přefiltruje přes filtr 0,45 μm (4.6).

Dále se pokračuje se stanovením HPLC (5.4).

5.3   Čištění

5.3.1    Příprava kolony s oxidem hlinitým

Do skleněně kolony (4.3) se naváží 4 g oxidu hlinitého (3.4).

5.3.2    Čištění vzorku

Na kolonu s oxidem hlinitým se nanese 15 ml přefiltrovaného extraktu (5.2.1) a první 2 ml eluátu se odstraní. Následujících 5 ml se zachycuje, alikvotní část se přefiltruje přes filtr 0,45 μm (4.6).

Dále se pokračuje se stanovením HPLC (5.4).

5.4   Stanovení HPLC

5.4.1    Parametry

Následující podmínky jsou doporučené, mohou být použity jiné podmínky za předpokladu, že poskytují rovnocenné výsledky:

Stabilita chromatografického systému se kontroluje opakovaným nástřikem kalibračního roztoku (3.11.2), který obsahuje 5,0 μg/ml, dokud se nedosáhne konstantních výšek (ploch) píků a konstantních retenčních časů.

5.4.2    Kalibrační křivka

Provede se několikrát nástřik každého kalibračního roztoku (3.11.2) a změří se výšky (plochy) píků pro každou koncentraci. Kalibrační křivka se vytvoří vynesením průměrných hodnot výšek (ploch) píků proti příslušným koncentracím v μg/ml.

5.4.3    Roztok vzorku

Extrakt ze vzorku ((5.3.2) pro krmiva, (5.2.2) pro premixy a (5.2.3) pro přípravky) se opakovaně nastřikuje a stanoví se průměrná hodnota výšky (plochy) píku carbadoxu.

6.   Výpočet a vyjádření výsledků

Z průměrné hodnoty výšky (plochy) píků carbadoxu v roztoku vzorku se porovnáním s kalibrační křivkou (5.4.2) stanoví koncentrace carbadoxu v roztoku vzorku v μg/ml.

6.1   Krmiva

Obsah carbadoxu (w) v mg/kg ve vzorku se vypočítá podle následujícího vzorce:

[mg/kg]

kde:

c

=

koncentrace carbadoxu v extraktu vzorku (5.3.2) v μg/ml

V1

=

objem extrakční směsi (tj. 50 ml)

m

=

hmotnost navážky vzorku v g.

6.2   Premixy a přípravky

Obsah carbadoxu (w) v mg/kg ve vzorku se vypočítá podle následujícího vzorce:

[mg/kg]

kde:

c

=

koncentrace carbadoxu v extraktu vzorku (5.2.2 nebo 5.2.3) v μg/ml

V2

=

objem extrakční směsi (tj. 50 ml pro premixy; 150 ml pro přípravky)

f

=

faktor ředění podle 5.2.2 (premixy) nebo 5.2.3 (přípravky)

m

=

hmotnost navážky vzorku v g.

7.   Ověření výsledků

7.1   Identita

Identitu analytu lze potvrdit opakovaným stanovením s přídavkem (co-chromatography) nebo pomocí detektoru diodového pole, přičemž se srovnávají spektra extraktu vzorku a kalibračního roztoku (3.11.2) obsahujícího 10,0 μg/ml carbadoxu.

7.1.1    Opakované stanovení s přídavkem (co-chromatography)

K extraktu vzorku se přidá vhodné množství kalibračního roztoku (3.11.2). Přidané množství carbadoxu musí odpovídat obsahu carbadoxu v extraktu vzorku.

Přídavek se projeví pouze zvýšením píku carbadoxu, a to úměrně k přidanému množství a ředění extraktu. Šířka píku v polovině maximální výšky se může odchylovat od šířky původního píku carbadoxu nejvýše o ±10 %.

7.1.2    Detektor diodového pole

Výsledky jsou posuzovány podle následujících kritérií:

Jestliže některé z těchto kritérií není splněno, přítomnost analytu není potvrzena.

7.2   Opakovatelnost

Rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení provedených u téhož vzorku nesmí při obsahu carbadoxu 10 mg/kg překračovat 15 % relat. z hodnoty vyššího výsledku.

7.3   Výtěžnost

Pro obohacený (slepý) vzorek musí být výtěžnost nejméně 90 %.

8.   Výsledky kruhových testů

Při kruhových testech bylo 8 laboratořemi zkoušeno 6 krmiv, 4 premixy a 3 přípravky. U každého vzorku byly provedeny dvě zkoušky. (Přesnější údaje o těchto kruhových testech viz Journal of the AOAC, Volume 71, 1998, s. 484–490.) Výsledky (s výjimkou odlehlých hodnot) jsou shrnuty v níže uvedené tabulce:

L

=

počet laboratoří

n

=

počet jednotlivých hodnot

Sr

=

standardní odchylka opakovatelnosti

CVr

=

variační koeficient opakovatelnosti

SR

=

standardní odchylka reprodukovatelnosti

CVR

=

variační koeficient reprodukovatelnosti.

---

PŘÍLOHA IX

SROVNÁVACÍ TABULKY PODLE ČLÁNKU 6

1.   Směrnice 71/250/EHS

2.   Směrnice 71/393/EHS

3.   Směrnice 72/199/EHS

4.   Směrnice 73/46/EHS

5.   Směrnice 76/371/EHS

6.   Směrnice 76/372/EHS

7.   Směrnice 78/633/EHS

8.   Směrnice 81/715/EHS

9.   Směrnice 84/425/EHS

10.   Směrnice 86/174/EHS

11.   Směrnice 93/70/EHS

12.   Směrnice 93/117/ES

13.   Směrnice 98/64/ES

14.   Směrnice 1999/27/ES

15.   Směrnice 1999/76/ES

16.   Směrnice 2000/45/ES

17.   Směrnice 2002/70/ES

18.   Směrnice 2003/126/ES

---

( 1 ) Úř. věst. L 268, 18.10.2003, s. 29.

( 2 ) Úř. věst. L 140, 30.5.2002, s. 10.

( 3 ) Úř. věst. L 70, 16.3.2005, s. 1.

( 4 ) Hrudky se rozdrtí (v případě potřeby se nejprve oddělí a po rozdrcení se vrátí do vzorku).

( 5 ) S výjimkou objemných krmiv nebo pícnin s nízkou hustotou.

( 6 ) S výjimkou objemných krmiv nebo pícnin s nízkou hustotou.

( 7 ) Úř. věst. L 229, 1.9.2009, s. 1.

( 7 ) Laboratorní sušárna určená pro sušení obilí, mouky, krup a krupice musí mít takovou tepelnou kapacitu, aby, pokud je nastavena na teplotu 131 oC, této teploty opět dosáhla v době kratší než 45 minut poté, co byl do sušárny umístěn maximální počet zkoušených vzorků, které se mají sušit současně. Větrání musí být takové, že když se všechny vzorky pšenice obecné, které může sušárna pojmout, současně suší po dobu dvou hodin, vykazují s ohledem na výsledky čtyřhodinového sušení rozdíl, který je nižší než 0,15 %.

( 7 ) Pokud má být vyextrahovaný tuk použit pro další zkoušky kvality, nahradí se varné kamínky skleněnými kuličkami.

( 7 ) Úř. věst. L 125, 23.5.1996, s. 35.

( 7 ) Provedla pracovní skupina pro krmiva Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs- und Forschungsanstalten (VDLUFA).

( 7 ) Provedla pracovní skupina pro krmiva Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs- und Forschungsanstalten (VDLUFA).

( 7 ) Lze použít i jiné metody mineralizace, pokud prokazatelně poskytují podobné výsledky (např. mikrovlnný tlakový rozklad).

( 7 ) Zelené pícniny (čerstvé nebo suché) často obsahují velké množství rostlinného křemíku, který může zadržovat stopové prvky, a proto musí být odstraněn. U vzorků těchto krmiv musí být proto dodržen následující modifikovaný postup. Postupuje se podle bodu 5.1.1.1 až k filtraci. Filtrační papír obsahující nerozpustný zbytek se promyje dvakrát vroucí vodou a vloží se zpět do křemíkového nebo platinového kelímku. Spaluje se v muflové peci (4.1) při teplotě pod 550 oC, dokud všechny uhlíkaté částice zcela nezmizí. Nechá se vychladnout, přidá se několik kapek vody a poté 10–15 ml kyseliny fluorovodíkové (3.4) a odpaří se do sucha při asi 150 oC. Pokud zůstane nějaký křemičitý zbytek, rozpustí se znovu v několika mililitrech kyseliny fluorovodíkové (3.4) a odpaří se do sucha. Přidá se pět kapek kyseliny sírové (3.5) a zahřívá se, dokud se nepřestane uvolňovat bílý kouř. Po přidání 5 ml kyseliny chlorovodíkové 6 mol/l (3.2) a asi 30 ml vody se roztok zahřeje, přefiltruje do 250 ml odměrné baňky a doplní se po značku vodou (koncentrace HCl je asi 0,5 mol/l). Pak se pokračuje podle bodu 5.1.2.

( 7 ) The Analyst 108, 1983, s. 1 252–1 256.

( *1 ) Analyst, 1995, 120, s. 2 175–2 180.

( 8 ) Tabulka faktorů toxické ekvivalence (TEF) pro PCDD, PCDF a PCB s dioxinovým efektem: WHO-TEF (faktory toxické ekvivalence Světové zdravotnické organizace) pro hodnocení nebezpečnosti pro člověka vycházející ze závěrů zasedání odborníků Světové zdravotnické organizace (WHO) Mezinárodní program chemické bezpečnosti (IPCS), které se konalo v Ženevě v červnu 2005 (Martin Van den Berg et al., The 2005 World Health Organization Re-evaluation of Human and Mammalian Toxic Equivalency Factors for Dioxins and Dioxin-like Compounds. Toxicological Sciences 93(2), 223–241 (2006)).

Použité zkratky: „T“ = tetra; „Pe“ = penta; „Hx“ = hexa; „Hp“ = hepta; „O“ = okta; „CDD“ = chlordibenzo-p-dioxin; „CDF“ = chlordibenzofuran; „CB“ = chlorbifenyl.

( 9 ) Rozhodnutí Komise 2002/657/ES ze dne 14. srpna 2002, kterým se provádí směrnice Rady 96/23/ES, pokud jde o provádění analytických metod a interpretaci výsledků (Úř. věst. L 221, 17.8.2002, s. 8).

( 10 ) V příslušném případě je třeba se řídit zásadami popsanými v dokumentu Guidance Document on Measurement Uncertainty for Laboratories performing PCDD/F and PCB Analysis using Isotope Dilution Mass Spectrometry (http://ec.europa.eu/food/safety/animal-feed_en).

( 11 ) Koncept „horního odhadu“ vyžaduje pro příspěvek každého nekvantifikovaného kongeneru použití hodnoty meze kvantifikace. Koncept „dolního odhadu“ vyžaduje pro příspěvek každého nekvantifikovaného kongeneru použití nulové hodnoty. Koncept „středního odhadu“ vyžaduje pro výpočet příspěvku každého nekvantifikovaného kongeneru použití poloviny hodnoty meze kvantifikace.

( 12 ) Opakovanou analýzou se rozumí samostatná analýza sledovaných analytů na základě druhého alikvotu téhož homogenizovaného vzorku. Obecně se použijí požadavky na opakovanou analýzu stanovené v příloze II kapitole C bodu 3. Avšak u metod s použitím vnitřního standardu značeného izotopem 13C pro příslušné analyty je opakovaná analýza nezbytná pouze tehdy, pokud výsledek prvního stanovení není vyhovující. Opakovaná analýza je nezbytná k vyloučení možnosti vnitřní křížové kontaminace nebo náhodného promíchání vzorků. Je-li analýza prováděna v rámci kontaminační aféry, lze od potvrzení opakovanou analýzou upustit, pokud lze zpětně vysledovat spojitost vzorků vybraných pro analýzu s danou kontaminační aférou a zjištěný obsah je výrazně vyšší než maximální limit.

( 13 ) Koncept „horního odhadu“ vyžaduje pro příspěvek každého nekvantifikovaného kongeneru k hodnotě toxického ekvivalentu (TEQ) použití hodnoty meze kvantifikace. Koncept „dolního odhadu“ vyžaduje pro příspěvek každého nekvantifikovaného kongeneru k hodnotě TEQ použití nulové hodnoty. Koncept „středního odhadu“ vyžaduje pro výpočet příspěvku každého nekvantifikovaného kongeneru k hodnotě TEQ použití poloviny hodnoty meze kvantifikace.

( 14 ) Obecně se použijí požadavky na opakovanou analýzu stanovené v příloze II kapitole C bodu 2. Avšak u konfirmačních metod s použitím vnitřního standardu značeného izotopem 13C pro příslušné analyty je opakovaná analýza nezbytná pouze tehdy, pokud výsledek prvního stanovení za použití takové konfirmační metody není vyhovující. Opakovaná analýza je nezbytná k vyloučení možnosti vnitřní křížové kontaminace nebo náhodného promíchání vzorků. Je-li analýza prováděna v rámci kontaminační aféry, lze od potvrzení opakovanou analýzou upustit, pokud lze zpětně vysledovat spojitost vzorků vybraných pro analýzu s danou kontaminační aférou a zjištěný obsah je výrazně vyšší než maximální limit.

( 15 ) Totožné vysvětlení a požadavky na provedení opakované analýzy pro kontrolu akčních prahů jako v poznámce 2 výše pro maximální limity.

( 16 ) Nařízení Evropského parlamentu a Rady (ES) č. 183/2005 ze dne 12. ledna 2005, kterým se stanoví požadavky na hygienu krmiv (Úř. věst. L 35, 8.2.2005, s. 1).

( 17 ) Bioanalytické metody nejsou specifické pro kongenery zahrnuté v systému TEF. V extraktu vzorku mohou být přítomny jiné strukturně příbuzné AhR-aktivní sloučeniny, které přispívají k celkové reakci. Proto bioanalytické výsledky nelze považovat za odhad, ale spíše za orientační úroveň TEQ ve vzorku.

( 18 ) Guidance Document on Measurement Uncertainty for Laboratories performing PCDD/F and PCB Analysis using Isotope Dilution Mass Spectrometry (http://ec.europa.eu/food/safety/animal-feed_en), Guidance Document on the Estimation of LOD and LOQ for Measurements in the Field of Contaminants in Feed and Food (http://ec.europa.eu/food/safety/animal-feed_en).

( 19 ) Současné požadavky vycházejí z TEF vydaných v: M. Van den Berg et al, Toxicol Sci 93 (2), 223–241 (2006).

( 20 ) Mezi kongenery, u nichž je často zjištěno, že se eluují zároveň, patří např. PCB 28/31, PCB 52/69 a PCB 138/163/164. U GC-MS je rovněž nutné vzít v úvahu možné interference z fragmentů vyšších chlorovaných kongenerů.

( 21 ) V příslušném případě je třeba se řídit zásadami popsanými v dokumentu Guidance Document on the Estimation of LOD and LOQ for Measurements in the Field of Contaminants in Feed and Food (http://ec.europa.eu/food/safety/animal-feed_en).

( 22 ) Velmi se doporučuje, aby hodnoty slepého stanovení činidla byly nižší, než je obsah kontaminující látky ve vzorku. Je povinností laboratoře kontrolovat rozptyl hodnot slepých stanovení, zejména v případě, kdy se hodnoty slepého stanovení odečítají.

( 23 ) Současné požadavky vycházejí z TEF vydaných v: M. Van den Berg et al, Toxicol Sci 93 (2), 223–241 (2006).

( 24 ) http://eurl.craw.eu/

( 25 ) http://eurl.craw.eu/

( 26 ) Seznam těchto primerů a sond je pro jednotlivé druhy živočichů k dispozici na internetových stránkách Referenční laboratoře EU pro živočišné proteiny v krmivech.

( 27 ) Příklady Master Mixů, jež lze použít, jsou k dispozici na internetové stránce Referenční laboratoře EU pro živočišné proteiny v krmivech.