32001R0213

РЕГЛАМЕНТ (ЕО) № 213/2001 НА КОМИСИЯТА

от 9 януари 2001 година

относно определяне на подробни правила за прилагането на Регламент (ЕО) № 1255/1999 на Съвета по отношение на методи за анализ и оценка на качеството на млякото и млечните продукти и за изменение на Регламенти (ЕО) № 2771/1999 и (ЕО) № 2799/1999

КОМИСИЯТА НА ЕВРОПЕЙСКИТЕ ОБЩНОСТИ,

като взе предвид Договора за създаване на Европейската общност,

като взе предвид Регламент (ЕО) № 1255/1999 на Съвета от 17 май 1999 г. относно общата организация на пазара на мляко и млечни продукти (1), и по-специално членове 10 и 15 и член 26, параграф 3, член 29, параграф 1 и член 31, параграф 14 от него,

като има предвид, че:

ПРИЕ НАСТОЯЩИЯ РЕГЛАМЕНТ:

ГЛАВА I

ОБЩИ РАЗПОРЕДБИ

Член 1

Предмет и приложно поле

Настоящият регламент определя правилата за прилагане на методите за химичен, физичен и микробиологичен анализ и сензорна оценка на мляко и млечни продукти, които следва да се използват в рамките на режимите, предвидени в общата организация на пазара на мляко и млечни продукти, създадена с Регламент (ЕО) № 1255/1999. Също така, той определя някои от тези методи.

Член 2

Списък от методи

1.   В приложение I към настоящия регламент се съдържа списък от референтните методи, които са приложими към анализите, посочени в член 1.

2.   Комисията актуализира този списък поне веднъж годишно в съответствие с процедурата, установена в член 42 от Регламент (ЕО) № 1255/1999.

Член 3

Рутинни методи

За анализите, които се изискват съгласно правилата на Общността, могат да бъдат използвани рутинни методи, при условие че те са надлежно приведени в съответствие с референтните методи и се проверяват регулярно за наличието на това съответствие.

Процедурата, описана в приложение II, може да се прилага за проверка на резултатите, получени чрез рутинните методи, които са близо до границите, определени в съответните регламенти.

В случай на спор, решаващи са получените чрез референтния метод резултати.

Член 4

Потвърждаване на референтните методи

1.   Референтните методи се потвърждават, ако отговарят на предварително определените критерии за прецизност по отношение на границата за повторяемост и възпроизвеждане.

2.   Ако установеният в съответните регламенти референтен метод не е потвърден, държавите-членки определят граница за временно възпроизвеждане.

Тази граница се получава съгласно процедурата, описана в приложение III, буква б). За първите 18 месеца, обаче, след влизането в сила на настоящия регламент, държавите-членки могат да използват еквивалентна процедура.

Съобразността с границата се проверява поне веднъж годишно.

3.   Когато резултатите от прилагането на приети референтни методи или методи с временни данни за прецизност показват, че границата е превишена, аналитичните резултати могат да бъдат оценявани, като се използва методът, описан в приложение IV, за определяне на критичната разлика спрямо съответната граница.

Член 5

Приемливост на резултатите от анализа

1.   Анализите се извършват в лаборатории при спазване на вътрешната процедура за контрол на качеството в съответствие с тази, описана в приложение V, буква a), или еквивалентна процедура.

Подробно описание на прилаганата процедура трябва да бъде на разположение в лабораторията за извършването на справки.

2.   Лабораториите създават вътрешни правила за прецизност при използването на всички методи, включително:

Съблюдаването на границата на възпроизвеждане трябва да бъде проверявано поне веднъж годишно, като се използва процедурата, описана в приложение III, буква a).

Втора алинея не се прилага за лаборатории, които са участвали в система за професионално тестване в рамките на последната година.

3.   Лабораторните отчети на резултатите от анализа трябва да съдържат достатъчно информация за оценката на резултатите, която следва да се направи в съответствие с приложение IV и приложение VIII.

4.   Резултатите от анализа се считат за приемливи, ако са получени в съответствие с критериите за приемливост, описани във вътрешната процедура за контрол на качеството, посочена в параграф 1 и правилата за вътрешната прецизност, посочени в параграф 2.

Член 6

Сензорна оценка

1.   За масло се прилагат процедурите, описани в приложение VI, за проверка на работата на оценителите и надеждността на резултатите. Процедурата, описана в приложение VII, се прилага като референтен метод за сензорна оценка.

2.   За мляко и млечни продукти, които са различни от масло, като референтен метод за сензорна оценка от държавите-членки се използва IDF стандарт 99C/1997 или други сравними методи, за което се уведомява Комисията.

Процедурите, описани в приложение VI, могат да бъдат използвани за проверка на работата на оценителите и надеждността на резултатите.

Член 7

Вземане на проби и оспорвания на резултатите от анализите

1.   За анализи, които се изискват съгласно правилата на Общността, трябва да бъдат вземани двойни проби.

2.   Процедурата, описана в приложение VIII, се използва в случаите, когато резултатите от анализа не се приемат от оператора.

ГЛАВА II

MЕТОДИ ЗА АНАЛИЗ

Член 8

Съдържание на вода/сухо вещество без мазнини/мазнини в масло

1.   Методът за анализ, описан в приложение IX, се използва като референтен метод за определяне на водното съдържание в масло.

2.   Методът за анализ, описан в приложение X, се използва като референтен метод за определяне на съдържанието на сухо вещество без мазнини в масло.

3.   Методът за анализ, описан в приложение XI, се използва като референтен метод за определяне на маслеността на маслото.

Член 9

Маркери за проследяване

1.   Методът за анализ, описан в приложение XII, се използва като референтен метод за определяне на ванилин в концентрирано масло, масло и сметана.

2.   Методът за анализ, описан в приложение XIII, се използва като референтен метод за определяне на етилов естер с бета-aпо-8' съдържание на каротинна киселина в концентрирано масло и масло.

3.   Методът за анализ, описан в приложение XIV, се използва като референтен метод за определяне на съдържание на β-ситостерин или сигмастерол в масло и концентрирано масло.

4.   Концентрираното масло, маслото и сметаната са проследени съобразно съответните правила на Общността, ако получените резултати са в съответствие със спецификациите в параграф 8 от приложенията, посочени в параграфи 1, 2 и 3.

Член 10

Откриване на казеин в краве мляко

1.   Референтният метод за анализ, описан в приложение XV, се използва, за да се гарантира, че сирене, което трябва да е произведено изключително от овче мляко, козе мляко или биволско мляко или смес от овче, козе и биволско мляко, на практика не съдържа казеин от краве мляко.

Счита се, че е налице казеин от краве мляко, ако видимото съдържание на казеин от краве мляко в анализираната пробата е равно или е по-голямо от съдържанието в референтната проба, съдържаща 1 % краве мляко, както е описано в приложение XV.

2.   Рутинните методи за откриване на казеин от краве мляко в сирената, посочени в параграф 1, могат да бъдат използвани, при условие че:

Ако предвиденото в буква б) изискване не е спазено, всяка проба, която дава положителен резултат при използване на референтния метод, трябва да бъде анализирана.

Ако предвиденото в буква в) изискване не е спазено за един от видовете сирене, посочени в параграф 1, сиренето трябва да бъде анализирано при използване на референтния метод.

Член 11

Откриване на форми на коли бактерии

1.   Референтният метод за анализ, описан в приложение XVI, се използва за откриване на форми на коли бактерии в масло, обезмаслено масло, казеин и казеинати.

2.   Рутинните методи за откриване на форми на коли бактерии могат да се използват, при условие че получените резултати са сравними с резултатите, получени чрез референтния метод, описан в посоченото приложение. Рутинните методи трябва да имат, по-конкретно, адекватна граница за откриване. Не трябва да се получават фалшиви положителни резултати. Ако не може да бъде изключено получаването на фалшиви положителни резултати, всеки положителен резултат трябва да бъде потвърден чрез използване на референтния метод.

Член 12

Съдържание на лактоза

Методът за определяне на съдържанието на лактоза в продукти, попадащи в код по КН 2309, е описан в приложение XVII.

Член 13

Откриване на сирищна суроватка

1.   Методът за определяне на сирищна суроватка в обезмаслено мляко на прах, предназначено за публично складиране, е описан в приложение XVIII.

2.   Методът за определяне на сирищна суроватка в обезмаслено мляко на прах и смеси, предназначени за използване като храна за животни, е описан в приложение XIX.

Член 14

Откриване на мътеница

Методът за откриване на мътеница в обезмаслено мляко на прах е описан в приложение XX.

Член 15

Антибиотични утайки

Методът за откриване на антибиотични и сулфонамидни/дапсонови утайки в обезмаслено мляко на прах е описан в приложение XXI.

Член 16

Съдържание на обезмаслено мляко на прах

Методът за определяне на съдържанието на обезмаслено мляко на прах в смеси от комбинирани фуражи е описан в приложение XXII.

Член 17

Откриване на скорбяла

Методът за откриване на скорбяла в обезмаслено мляко на прах, денатурирано мляко на прах и смеси от комбинирани фуражи е описан в приложение XXIII.

Член 18

Съдържание на влага в кисела мътеница на прах

Методът за определяне на съдържанието на влага в кисела мътеница на прах, предназначена за използване в храни за животни, е описан в приложение XXIV.

Член 19

Откриване на чужди мазнини

Методът за откриване на чужди мазнини в мазнини на мляко е описан в приложение XXV.

ГЛАВА III

ЗАКЛЮЧИТЕЛНИ РАЗПОРЕДБИ

Член 20

Изменения на Регламент (ЕО) № 2771/1999

Регламент (ЕО) № 2771/1999 се изменя, както следва:

Член 21

Изменения на Регламент (ЕО) № 2799/1999

Регламент (ЕО) № 2799/1999 се изменя, както следва:

Член 22

Отмяна

Регламенти (ЕИО) № 1216/68, 3942/92, (ЕО) № 86/94, (ЕО) № 2721/95, (ЕО) № 1854/96, (ЕО) № 1080/96, (ЕО) № 1081/96, (ЕО) № 1082/96, (ЕО) № 880/98 и (ЕО) № 1459/98 се отменят.

Позоваванията на отменените регламенти се тълкуват като позовавания на настоящия регламент.

Член 23

Влизане в сила

Настоящия регламент влиза в сила на седмия ден след публикуването му в Официален вестник на Европейските общности.

Въпреки това, методите, които са описани в приложения III, IV. 4, V, VI и VIII, се прилагат от осемнадесетия месец от влизането в сила на настоящия регламент.

(1)  ОВ L 160, 26.6.1999 г., стр. 48.

(2)  ОВ L 333, 24.12.1999 г., стр. 11.

(3)  ОВ L 340, 31.12.1999 г., стр. 3.

(4)  ОВ L 350, 20.12.1997 г., стр. 3.

(5)  ОВ L 76, 25.3.2000 г., стр. 9.

(6)  ОВ L 298, 12.11.1985 г., стр. 9.

(7)  ОВ L 11, 16.1.1999 г., стр. 14.

(8)  ОВ L 45, 21.2.1990 г., стр. 8.

(9)  ОВ L 16, 21.1.1999 г., стр. 19.

(10)  ОВ L 279, 11.10.1990 г., стр. 22.

(11)  ОВ L 325, 17.12.1999 г., стр. 10.

(12)  ОВ L 256, 7.9.1987 г., стр. 1.

(13)  ОВ L 28, 3.2.2000 г., стр. 16.

ПРИЛОЖЕНИЕ I

(член 2)

СПИСЪК НА РЕФЕРЕНТНИТЕ МЕТОДИ

Индекс

Мин. = минимум, Макс. = максимум, Приложение = Приложение към цитирания регламент, SNF = сухо вещество без мазнини, FFA = свободни мастни киселини, PV = пероксидно число, A = форма, F = вкус, C = консистенция, TBC = общо бактериално число, Therm = термофилно бактериално число, MS = държава-членка, IDF = Международна федерация по млякото, ISO = Международна организация по стандартите, IUPAC = Международен съюз за теоретична и приложна химия, ADPI = Американски институт по млечните продукти, SCM = подсладено кондензирано мляко, EMC = сгъстено мляко или сметана, MSNF = млечно сухо вещество без мазнини.

ЧАСТ A

ЧАСТ Б

Референтните методи, изброени в част Б, могат да бъдат използвани за продуктите, обхванати от някой от регламентите, изброени в колона 1.

ПРИЛОЖЕНИЕ II

(член 3)

ПРОВЕРКА НА ПОЛУЧЕНИТЕ ЧРЕЗ РУТИННИТЕ МЕТОДИ РЕЗУЛТАТИ, КОИТО СА БЛИЗКИ ДО ГРАНИЦИТЕ, ОПРЕДЕЛЕНИ В РЕГЛАМЕНТИТЕ ЗА ИЗИСКВАНИЯТА ЗА СЪСТАВ И КАЧЕСТВО

Ако mо е граница за изискванията за състав и качество, определена в регламент, то решението за границата (L) е:

ако RRout/RRef ≤ 1

RRout: граница на възпроизвеждане на рутинния метод

RRef: граница на възпроизвеждане на референтния метод

Ако m0 е горна граница и RRout/RRef > 1, решението за границата се получава като се използва формулата:

Ако при същите условия mo е долна граница, решението за границата се получа като се използва формулата:

където CrD95 е критичната разлика на референтния метод (виж приложение IV).

Когато m0 е горна граница, окончателният резултат за решението на границата, получен чрез използване на рутинен метод, трябва да бъде заменен с окончателен резултат, получен чрез използване на референтен метод. Този окончателен резултат трябва да се базира поне на същия брой анализи/проби, както окончателният резултат, получен чрез използване на рутинния метод.

Когато mо е долна граница, същата процедура трябва да бъде следвана за окончателен резултат, който се намира под решението за граница, получен чрез използване на рутинен метод.

Забележка:

Гореописаната процедура може да бъде следвана, ако няма налице откриваеми матрични ефекти.

Матричните ефекти могат да бъдат откривани по следния начин: за всяка проба, използвана за калибриране, се определя разликата (wi) между резултатите, получени с референтния и рутинния метод.

Стандартното отклонение се изчислява чрез използване на формулата:

m: брой проби, използвани за калибриране

То се сравнява с аритметичното значение на повтарящото се стандартно отклонение на референтния и рутинния метод:

Матричен ефект може да бъде изключен, ако:

където,

f= m (f: брой на степените на свобода)

α= вероятност за грешка; α = 0,05.

В този случай, преди да се определи решението за граница, са необходими по-нататъшни изследвания.

ПРИЛОЖЕНИЕ III

(членове 4 и 5)

a)   Процедура за определяне съблюдаването на установена граница на възпроизвеждане (химически анализ)

Съблюдаването на границата на възпроизвеждане се проверя чрез сравняване на лабораторните резултати с резултатите от лаборатория с опит (1), получени чрез използване на идентична проба. В двете лаборатории се извършва двойно определяне и резултатите се оценяват чрез използване на формулата:

където:

Ако критичната разлика е превишена, то тогава в рамките на следващите два месеца трябва да бъде извършен друг експеримент. Ако резултатите от втория експеримент не отговарят на сравнителната граница, компетентните органи трябва да предприемат необходимите стъпки.

(б)   Процедура за получаване на временна граница на възпроизвеждане (химически анализ)

Временна граница на възпроизвеждане(Rprov) се получава чрез използване на следното уравнение:

където:

Забележки:

Границата на възпроизвеждане (R-стойност) е получена от изчислената RSDR-стойност, както следва:

: средна аритметична стойност на получените резултати)

Някои изчислени RSDR — стойности (примери)

При концентрация на аналит от 1 g/100 g, се получава следната стойност:

(1)  Лаборатория с опит би следвало да бъде по принцип лаборатория, която е участвала успешно или в утвърждаване на тестовия метод или в тест за професионалност.

(2)  Уравнение на Хорвитц:

където:

Позовавания:

Peeler, J.T., Horwitz, W. and Albert, R.

J.Ass. Off. Anal. Chem.

72(5), 784-806 (1989).

ПРИЛОЖЕНИЕ IV

(член 4)

ОЦЕНКА НА АНАЛИТИЧНИТЕ РЕЗУЛТАТИ, ПОЛУЧЕНИ ЧРЕЗ ИЗПОЛЗВАНЕТО НА УТВЪРДЕНИ МЕТОДИ

Средно аритметичната стойност на два или повече резултата се изчислява, ако аналитичният резултат показва, че е превишена граница. Следната процедура следва да бъде спазвана:

2.

Абсолютната стойност на разликата между средната стойност на резултатите, получени при сравнителни условия, и границата е определена. Абсолютна стойност на разликата, която е по-голяма от критичната разлика, показва, че анализираната проба не изпълнява изискванията. Критичната разлика се определя чрез използване на следната формула: където: : средна стойност на получените резултати mo: граница n: брой анализи/проби Ако прецизността се променя от нивото, може да е необходимо да се определи r и R чрез интерполация. Обикновено, окончателният резултат, отчитан за пробата, трябва да показва, че границата се съблюдава. Поради това, окончателните резултати: — в обхвата наи, ако границата е максимум, — в обхвата наи, ако границата е минимум би следвало да се получат само като изключение. Окончателните резултати в рамките на упоменатите обхвати са приемливи, само ако се получават не повече от веднъж на всеки пет проби, анализирани за пратка. Ако за пратка се анализират по-малко от пет проби, се приема един резултат в рамките на упоменатия обхват. Правилото, че в рамките на упоменатия обхват за пет анализирани проби се получава само един резултат, трябва да се спазва, ако производителят представя едни и същи пратки.

3.

Ако окончателният резултат x се изчислява чрез използване на формула като x = y1 ± y2 (пример: вода + съдържание сухо вещество без мазнини в масло за изчисляване на съдържанието на мазнини), където y1 и y2 са окончателните резултати на единичен тип анализ, то тогава общите граници на повторяемост и границите на възпроизвеждане r и R на окончателните резултати се изчисляват, като: където r1 и r2 са границите за повторяемост, а R1 and R2 са границите на възпроизвеждане на y1 и y2,, съответно. x се сравнява с границата m0, като се спазват определените в 1 и 2 правила. Критичната разлика се определя чрез използването на формула: където x е средната стойност на получените резултати x1.

4.

Ако окончателният резултат се изчислява чрез използване на формулата: (пример: мазнина в съдържание сухо вещество на сирене) където y1 и y2 са окончателните резултати на единичен тип анализ, то тогава общите граници на повторяемост и границите на възпроизвеждане r и R на окончателните резултати могат да бъдат изчислени, като: µ1: граница или целева стойност за y1 (пример: мазнина) µ2: граница или целева стойност за y2 (пример: сухо вещество) където: r1: граница на повторяемост y1 r2: граница на повторяемост y2 където R1: граница на възпроизвеждане y1 R 2: граница на възпроизвеждане y2 Процедурите за изчисляване на r× и R са приложими, само ако относителните граници на повторяемост и границите на възпроизвеждане r *1;r *2;R *1;R *2 са по-малки или равни на 0,15. x се сравнява с границата µx, като се спазват определените в 1 и 2 правила. Критичната разлика се определя чрез използване на формулата: където x– е средно аритметичната стойност на резултатите x, получени по хронологичен ред (1).

(1)  

Бележка: Ако например, резултатите y11, и y22,са получени, трябва да бъде изчислена средно аритметичната стойност на y11/y21 и y12/y22.

ПРИЛОЖЕНИЕ V

ВЪТРЕШЕН КОНТРОЛ

(член 5)

a)   Процедура за вътрешен контрол на качеството (ВКК) (химически анализ)

Дефиниция на контролния материал

Материалът, който се използва за целта на ВКК, е предмет на същата или част от същата процедура за тестване на материали.

Контролен материал може да бъде:

Процедура за създаване на ВКК

Лабораторията би следвало да въведе ВКК като спазва процедурата, описана в документа на IUPAC „Хармонизирани указания за вътрешен контрол на качеството в аналитични лаборатории“ (1).

ВКК се извършва чрез включването на контролните материали в аналитичната им последователност или чрез възпроизвеждането на анализа върху същата тестова проба. Контролните материали трябва да са еднакви по химически състав с тестовите проби и да бъдат адекватно стабилни през наблюдавания период. Трябва да се демонстрира, че те могат да бъдат разделени по подходящ начин на равни части за анализ и имат концентрация на аналити, подходяща за сферата на наблюдение.

Контролният материал трябва да бъде включен поне веднъж при всяка аналитична серия и получената стойност трябва да бъде вписвана в контролна диаграма, за да се измерват дългосрочните грешки. В допълнение, лабораторията би следвало периодично да демонстрира изпълнение на границите за повторяемост в рамките на серията. Това може да бъде постигнато чрез двойни анализи на контролните и/или тестовите материали. Резултатите от тези анализи би следвало да бъдат сравнени с всички публикувани граници за повторяемост и съществуващите данни за вътрешната прецизност.

Когато се използват контролни материали, получените стойности между аналитичните серии на контролния материал, трябва да бъдат вписвани в диаграма-Shewhart (ISO 8258 (1991)) с подходящи контролни граници. Границите за действие трябва да бъдат установени:

Общото стандартно отклонение:

в което:

В случаите, в които контролните материали не се използват (напр. поради липса на стабилност), във всяка серия трябва да бъде анализиран двойно поне един от тестовите материали.

Абсолютната разлика, получена от двойния анализ в рамките на серия (виж приложение III), трябва да бъде вписана. Централната линия е 1.128 sw, долната граница е 0, горната граница (граница на действие) е 3.686 s, където sw е стандартното отклонение в рамките на серията.

Контролната процедура би следвало да включва материали с ниско и високо ниво, когато степента на концентрация е голяма.

Ако тестовите материали обхващат голяма област на концентрация на аналити, лабораторията би следвало да установи връзката между прецизността и нивото. Ако прецизността е пропорционална на нивото, последващият контрол би следвало да се базира на относителна прецизност (т.e. абсолютната разлика като процент от средната стойност).

Когато е налице условие, което е извън контрол в аналитичната система, то се идентифицира при възникване на следното:

Лабораторията би следвало да отговори на условие, което е извън контрол, чрез:

б)   Процедура за избор на вътрешен контролен материал и определяне на „вътрешни“ граници за прецизност (химически анализ)

Данните за лабораторна прецизност могат да бъдат получени чрез възпроизвеждане на анализ на контролни материали и/или чрез възпроизвеждане на анализ на тестови проби.

Лабораториите би следвало да използват при съставянето на контролни диаграми следната процедура за установяване на параметри на прецизността за варирането в рамките на серията и между сериите. Лабораториите могат да приемат алтернативни процедури, при условие че могат да демонстрират по адекватен начин, че са получени надеждни данни за прецизност.

1.   Избор на контролни материали

Когато за лабораторията е уместно да използва контролен материал, първо трябва да бъдат получени данните, с оглед определянето на граници. Когато е възможно, би следвало да бъдат използвани сертифицирани референтни материали (СРМ). Бъдещите контролни материали би следвало да бъдат анализирани при условия на повторяемост в рамките на серията, включително подходящи СРМ, с възпроизвеждане и хаотизиране. Когато този подход не е подходящ, лабораториите би следвало да се стремят да участват в професионално тестване и да установяват съгласувани средни стойности (определени стойности), които могат да бъдат считани като приета реална средна стойност, съдържаща фактор на несигурност. Други подобни процедури включват определянето на реална стойност чрез изчисляването на формулата или използването на контролни материали, заместени с аналити.

В допълнение, когато лабораторията извършва регулярно този тип анализ и вече е създала статистически контрол, всички нови контролни материали (напр. изисквани поради изчерпване на количествата) трябва да бъдат получавани по отношение на анализите, които се контролират при използване на съществуващите материали.

2.   Определяне на граници

След като е избран контролен материал, лабораторията би следвало да го използва, за да определи данните на прецизността в рамките на серията и между сериите.

Като минимално изискване за установяването на прецизност в рамките на серията, контролният материал би следвало да се анализира двойно 12 пъти. Двойният анализ би следвало да бъде извършван при условия за повторяемост, т.e. същият оператор, същите реагенти и т.н. Двойният анализ на контролния материал би следвало да бъде хаотизиран в рамките на аналитичната серия. Всеки двоен анализ би следвало да бъде предприеман в отделен ден за период от време, така че да се отчете варирането от серия до серия, като се вземат предвид нормалните вариации, напр. реагенти, инструменти, ново калибриране и, ако е уместно, различни анализатори.

Бележка: Използването на данните, които не са напълно представителни за вариацията между сериите, може да резултира в ненужно възпроизвеждане на анализ поради определянето на изключително тесни граници. От друга страна, лаборатория с прекалено неточни данни на прецизността може да не достигне предписаните в референтните методи граници и би следвало да очаква да покаже слаб резултат в сравнение с други лаборатории, както и да представи данни, които не са подходящи за целта.

2.1.   Определяне на прецизност в рамките на серията

2.1.1.   Прецизност в рамките на серията, когато е наличен контролен материал

Двойните данни (минимум 12 дублирания) би следвало първо да бъдат предмет на Cochran-тест за максималните вариации. Това включва сравняване на максималния обхват на дублиране на квадрат със сумата на обхватите на квадрат.

където:

Стойността на критерия С на Cochran се сравнява с табулираните стойности (ISO 5725 (1994)). Когато стойността може да се класифицира като изоставаща или отдалечаваща се, резултатът би следвало да бъде проучен за обяснение, напр. техническа грешка, изчислителна грешка, грешка при провеждането на теста, анализ на грешна проба. Ако обяснението на техническата грешка е такова, че замяната на съмнителния резултат се оказва невъзможна, то този резултат би следвало да се отстрани като реална отдалечаваща се стойност. Ако останат каквито и да е изоставащи или отдалечаващи се стойности, които не могат да бъдат обяснени, изоставащите стойности се запазват като коректни, а статистически отдалечаващите се стойности се отстраняват. Лабораторията би следвало да се стреми да получава заместващи стойности.

Когато лабораторията се увери, че в данните няма изоставащи стойности, стандартното отклонение в рамките на серията sw се получава, както следва:

За всяка двойка xi1,xi2 на данните на дублиранията, сумата на дублиранията,

и разликата между дублиранията,

се сравняват и сумират до:

Оценката на стандартното отклонение в рамките на серията е:

Границата на вътрешната прецизност е: 2.8. sw.

Ако се използва референтен метод, границата на вътрешната прецизност би следвало да бъде сравнявана с публикуваната граница на повторяемост. Лабораторията би следвало да изпълнява изискването на референтния метод. Неспазването на това изискване би следвало да бъде проучвано.

Определените граници би следвало да бъдат считани като временни и предмет на преглед.

2.1.2.   Прецизност в рамките на серията, когато не е наличен контролен материал

Лабораторията може да избере да определи прецизност в рамките на серията чрез двоен анализ на представителни тестови проби (минимум 12 дублиращи анализа). В случаите, в които не е възможно да се използват контролни материали, напр. поради нестабилност, дублиращите данни трябва да бъдат събрани с този метод.

Бележка: Предполага се, че анализите покриват относително близък обхват на стойностите и поради това за всички проби може да бъде прилагана единична стойност. В случаите, в които обхватът на резултатите е по-широк, напр. по реда на величините, и прецизността зависи от нивото, лабораториите би следвало да проучват използването на относителните стандартни отклонения.

Данните би следвало да се подложат на Cochran-тест, както в 2.1.1. Когато лабораторията е уверена, че в данните няма изоставащи стойности, стандартното отклонение в рамките на серията и границата на вътрешната прецизност могат да бъдат получени, както в раздел 2.1.1.

Стандартното отклонение sw в рамките на серията може да бъде използвано за съставянето на контролни диаграми (виж приложение II). Определените граници би следвало да бъдат считани като временни и предмет на преглед.

2.2.   Определяне на прецизността между сериите

За всяка двойка се изчислява средно аритметичната стойност (s1/2) и тези стойности се подлагат на Grubbs-тест (ISO 5725 (1994)). Критериите за отказ/приемане на отдалечаващите се стойности или на изоставащите стойности са както описаните в 2.1.1. Лабораторията би следвало да се стреми да получава заместваща стойност за всеки отстранен резултат. Когато лабораторията е уверена, че в данните няма отдалечаващи се стойности, стандартното отклонение между сериите sb се изчислява:

или 0, ако изразът под знака за корен квадратен е отрицателен.

Общото стандартно отклонение s се използва за съставянето на контролни диаграми за средната стойност на n определяния (виж прилож ение II). Определените граници би следвало да бъдат считани като временни и предмет на преглед.

3.   Преглед на първоначалните граници

Контролните граници, определени както е описано по-горе, трябва да бъдат считани като първоначални оценки.

С оглед да се актуализират определените граници на базата на приемлива оценка в рамките на сериите (раздел 2.1.2), за тестовите проби би следвало да бъдат събрани допълнителни дублиращи данни. Периодът преди прегледа ще зависи от последователността на анализа. Като указание, данните би следвало да бъдат преглеждани след получаването на 10 допълнителни дублирания. След това, всички данни би следвало да бъдат подложени на Cochran-тест, както и отново да бъдат определени границите на базата на новото стандартно отклонение. В светлината на допълнителните данни, трябва да бъдат взети последващи решения за валидността на контролните граници.

Прегледът на първоначалните данни, получени при оценката между сериите, зависи също и от последователността на анализа. Като указание, след като са получени допълнително десет точки данни от анализа на контролния материал при последователност от един анализ за партида, направените първоначални предполагания за стандартното отклонение и средната стойност би следвало да бъдат преразгледани.

Всички данни би следвало да бъдат подложени на Grubbs-тест за отдалечаващите се резултати. Средната стойност и стандартното отклонение би следвало да бъдат преизчислени на базата на новите данни.

В допълнение, на този етап лабораторията би следвало да прилага Cusum-диаграма (BS S700: (1984) с изменение и допълнение 5480 (1987)), за да проучва всички проблеми, които могат да бъдат свързвани, напр. с остаряването на реагенти. Всеки единичен резултат, който попада извън границата на Cusum-„V-маска“, трябва да бъде проучен.

Новите граници (средна стойност и стандартно отклонение) трябва да са предмет на регулярна проверка чрез използването на Cusum-техниката. Всяка индикация, че валидността на контролния материал се поставя под въпрос, трябва подробно да бъде проучена.

4.   Отчитане на данните на прецизността

Лабораториите трябва да изпращат следната информация на компетентния национален орган:

(1)  M. Thompson и R. Wood: „Теоретична и приложна химия“ 67 (4), 649-666 (1995).

ПРИЛОЖЕНИЕ VI

(член 6)

ОЦЕНЯВАНЕ НА ОЦЕНИТЕЛИТЕ И НАДЕЖНОСТТА НА РЕЗУЛТАТИТЕ ПРИ ЧУВСТВИТЕЛНИ АНАЛИЗИ

Ако се използват методи със скала (IDF стандарт 99C/1997), се прилагат следните процедури:

a)   Определяне на „индекса на повторяемост“

В рамките на 12 месеца оценителят анализира най-малко десет проби като дублирания на празни проби. Обичайно, това се извършва на няколко етапа. Резултатите за отделните характеристики на продукта се оценяват чрез използване на следната формула:

където:

wI: индекс на повторяемост

xi1: резултат за първата оценка на проба xi

xi2: резултат за втората оценка на проба xi

n: брой проби

Пробите, които се оценяват, би следвало да покриват широк обхват от качество. wI не би следвало да превишава 5 (5-точкови скали).

б)   Определяне на „индекса на отклонение“

Този индекс би следвало да служи за проверка дали оценителят използва същата скала за оценка на качеството, както използваната от група оценители с опит. Получените от оценителя резултати са сравними със средната стойност на резултатите, получени от групата оценители.

Следната формула се използва за оценка на резултатите:

където:

xi1; xi2: виж буква а)

: среден резултат на групата оценители, съответно за първата и втората оценка на пробата x

n: брой проби (най-малко десет за 12 месеца)

Пробите, които се оценяват, би следвало да покриват широк обхват от качество. DI не би следвало да превишава 1.5 (5-точкови скали).

Държавите-членки трябва да съобщават за всички трудности, които са срещнати при прилагането на тази процедура.

в)   Сравнение на резултатите, получени в различни региони на държава-членка и в различни държави-членки

Когато е приложимо, поне веднъж годишно трябва да бъде организиран тест за сравняване на резултатите, които са получени от оценители от различни региони. Ако се наблюдават значителни разлики, би следвало да бъдат предприети необходимите стъпки за идентифицирането на причините и получаването на сравними резултати.

Държавите-членки могат да организират тестове, за да сравняват резултатите, получени от техните оценители и от оценители от съседни държави-членки. Значителните разлики би следвало да бъдат предмет на задълбочено проучване с цел получаването на сравними резултати.

Държавите-членки би следвало да уведомяват Комисията за резултатите от тези сравнения.

ПРИЛОЖЕНИЕ VII

(член 6)

СЕНЗОРНА ОЦЕНКА НА МАСЛО

1.   Обхват

Целта на тази процедура за сензорна оценка на масло е да осигури унифициран метод, приложим във всички държави-членки.

2.   Дефиниции

3.   Стая за тестове

4.   Избор на оценители

Оценителят трябва да е запознат с масла и да е компетентен да извършва чувствително степенуване. Неговата компетентност би следвало да бъде оценявана на регулярна основа (поне веднъж годишно) от компетентния орган.

5.   Изисквания за панела

Броят на оценителите в панела не би следвало да е четен, като минималният брой следва да е три. Мнозинството оценители трябва да бъдат служители на компетентния орган или упълномощени лица, които не работят в млечната промишленост.

С оглед извършването на оптимална работа от лицата, преди оценката трябва да бъдат взети предвид определен брой фактори:

6.   Оценка на стойността на всеки белег

6.1.   Сензорната оценка следва да се извършва по отношение на следните три белега: външност, консистенция и аромат.

Външността включва следните характеристики: цвят, видима степен на хомогенност, растеж на плесени и водна дисперсия. Водната дисперсия се тества съгласно IDF-стандарт 112A/1989.

Консистенцията включва следните характеристики: твърдост и способност за намазване.

За оценката на консистенцията на масло могат да бъдат прилагани физически методи. Комисията планира бъдещото хармонизиране на тези методи.

Ароматът включва следните характеристики: вкус и миризма.

При значително отклонение на препоръчваната температура не е възможна надеждна оценка на консистенцията и аромата. Температурата е от изключително значение.

6.2.   Всеки белег се оценява чувствително поотделно. Оценяването на резултата трябва да бъде направено съгласно таблица 1.

6.3.   С оглед постигането на унифициране, би могло да е уместно оценителите да оценяват резултатите заедно преди началото на оценката на една или две референтни проби за външност, консистенция и аромат.

6.4.   Приемането на оценката на резултатите е, както следва:

Когато необходимият резултат не е получен, следва да бъде дадено описание на грешката. Резултатът, даден от всеки оценител за всеки белег, трябва да бъде записан в контролния документ. Продуктът е приет или отхвърлен на базата на решението, прието с мнозинствоо. Случаите, в които разликите между индивидуалните резултати за всеки белег са по-големи от съответстващите точки, не би следвало да възникват регулярно (не повече от веднъж на 20 проби). В противен случай, ръководителят на панела би следвало да провери компетентността на последния.

7.   Надзор

По принцип, за цялата процедура отговаря ръководителят на панела, който трябва да бъде служител на компетентния орган и може да бъде член на панела. Той трябва да записва индивидуалните резултати за всеки белег в контролния документ и да удостоверява дали продуктът е приет или отхвърлен.

8.   Вземане на проба и подготовка на пробата

9.   Номенклатура

Виж приложената таблица 2.

Таблица 1:   оценяване на резултатите на масло

Таблица 2:   таблица на дефектите на масло

I.   Външност

II.   Консистенция

III.   Аромат

(1)  Таблица 2.

(2)  Дефектите, упоменати под „добре“ представляват само малки отклонения от идеалния тип.

(3)  Това обозначаване би следвало да се използва възможно най-рядко и само когато дефектът не може да бъде описан по-точно.

ПРИЛОЖЕНИЕ VIII

(член 7)

ПРИЛОЖИМА ПРОЦЕДУРА ПРИ ОСПОРВАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ ОТ АНАЛИЗА (химически анализ)

1.   По искане на оператора може да бъде извършен допълнителен анализ в рамките на седем работни дни от съобщаването на резултатите от първия анализ, при условие че са налични запечатани дублиращи проби от продукта, които се съхраняват по подходящ начин от компетентните органи.

По искане и за сметка на оператора, компетентният орган изпраща тези проби на втора лаборатория. Тази лаборатория трябва да е оторизирана да извършва официални анализи и трябва да има доказана компетентност за въпросните анализи. Компетентността би следвало да е документирана от успешно участие в съвместни изследвания, професионални тестове или сравнения между лаборатории. Втората лаборатория трябва да използва реферетния метод. Получените от двете лаборатории резултати трябва да бъдат оценени, както следва:

a)   Когато двете лаборатории изпълняват изискването за повторяемост и изискването за възпроизвеждане

Средно аритметичната стойност на тестовите резултати, получени от двете лаборатории, се използва при окончателния резултат. Този окончателен резултат се оценява, като се взема предвид критичната разлика, при използване на следната формула:

където

Бележка: Ако окончателният резултат се изчислява при използване на формулата:

or

(виж приложение IV(3) и (4), съответно), R2 x и r2 x би следвало да бъдат внесени във формулата вместо R2 и r2.

б)   Когато двете лаборатории изпълняват изискването за повторяемост, но не изпълняват изискването за възпроизвеждане

Ако вторият анализ потвърждава първия, анализираното количество би следвало да бъде отхвърлено. В противен случай, количеството би следвало да се приеме.

в)   Когато само една лаборатория изпълнява изискването за повторяемост

Окончателният резултат на лабораторията, която изпълнява изискването за повторяемост, следва да се използва, за да се реши дали да се приеме анализираното количество.

г)   Когато никоя лаборатория не изпълнява изискването за повторяемост, но изискването за възпроизвеждане е изпълнено

Прилага се a).

д)   Когато никоя лаборатория не изпълнява нито изискването за повторяемост, нито изискването за възпроизвеждане

Анализираното количество би следвало да бъде прието, ако получените от една лаборатория резултати водят до това заключение.

е)   Когато резултатите са получени чрез използването на невалидни методи

Анализираното количество би следвало да бъде прието, ако получените от една лаборатория резултати водят до това заключение.

3.   Резултатите от втория анализ трябва да бъдат съобщени на оператора от компетентния орган възможно най-бързо. Разходите за втория анализ следва да бъдат поети от оператора, ако анализираното количество се отхвърли.

4.   Ако операторът може да докаже в рамките на пет работни дни от вземането на пробата, че процедурата по вземането на пробата не е извършена коректно, вземането на пробата трябва да бъде повторено, когато това е възможно. Ако вземането на пробата не може да бъде повторено, анализираното количество трябва да бъде прието.

ПРИЛОЖЕНИЕ IX

(член 8)

ОПРЕДЕЛЯНЕ НА ВОДНОТО СЪДЪРЖАНИЕ НА МАСЛО

1.   Обхват и приложно поле

Този референтен метод установява методика за определяне на водното съдържание на масло.

2.   Позовавания

IDF стандарт 50 °C: 1995 — Мляко и млечни продукти — методи за вземане на проби

3.   Дефиниция

Водно съдържание на масло: загубата на маса след завършване на подгряващия процес, определен в упоменатия стандарт. Изразява се в грамове на 100 грама.

4.   Принцип

Изпаряване на вода от тестова доза в сушилня, в присъствието на пемза и при температура от 102 °C.

5.   Апаратура и материали

Обичайна лабораторна апаратура, и по-специално:

6.   Вземане на проби

Виж IDF 50 C: 1995

7.   Процедура

7.1.   Подготовка на тестовата проба

Лабораторната проба се затопля в затворен стъклен или подходящ пластмасов съд, който би следвало да е пълен от една втора до две-трети, до температура, при която пробата ще стане достатъчно мека, за да се улесни смесването до постигане на хомогенно състояние (или с механичен шейкър или с ръка). Обичайно, температурата на смесване не би следвало да надвишава 35 °C. Пробата се охлажда до стайна температура. Съдът се отваря възможно най-бързо след охлаждането на пробата и се разклаща бързо (не повече от 10 секунди) с подходящ предмет, например лъжица или шпатула, преди да се претегли.

7.2.   Определяне на водното съдържание

В случай на увеличаване на масата, за изчисление се взема отчетената най-малка маса.

8.   Изразяване на резултати

8.1.   Метод на изчисляване и формула

Водното съдържание W се изчислява като процент от масата чрез използване на следната формула:

където:

Резултатите се отчитат до първия десетичен знак.

8.2.   Повторяемост

Абсолютната разлика между резултатите от две отделни определяния, извършени едновременно или едно след друго от същия оператор и при същите условия върху идентичен тестов материал, не надвишава 0,2 %.

8.3.   Възпроизвеждане

Абсолютната разлика между два отделни и независими резултата, получени от двама оператори, които работят в различни лаборатории върху идентичен тестов материал, не надвишава 0,3 %.

9.   Отчитане на теста

При отчитането на теста се посочват използваният метод и получените резултати. Също така, се упоменават всички оперативни детайли, които не са определени в този международен стандарт или които се считат като опция, заедно с детайлите за всички случайности, които може да са повлияли на резултатите. При отчитането на теста се дава всяка необходима информация за пълното идентифициране на пробата.

ПРИЛОЖЕНИЕ X

(член 8)

МАСЛО: ОПРЕДЕЛЯНЕ НА СЪДЪРЖАНИЕТО НА СУХО ВЕЩЕСТВО БЕЗ МАЗНИНИ

1.   Обхват и приложно поле

Този стандарт установява метод за определяне на съдържанието на сухо вещество без мазнини в масло.

2.   Позовавания

IDF стандарт 50 C: 1995 — Мляко и млечни продукти — методи за вземане на проби

3.   Дефиниции

Съдържание на сухо вещество без мазнини в масло: процент от масата, установен при определената процедура. Изразява се в грама на 100 грама.

4.   Принцип

Изпаряване на вода от известна маса масло, екстракция на мазнината с петролен етер и измерване на утайката.

5.   Реагент

Петролен етер с амплитуда на кипене от 30 до 60 °C. След изпаряването на 100 ml, реагентът не оставя повече от 1 mg утайка.

6.   Апаратура и материали.

7.   Вземане на проби.

Виж IDF стандарт 50 C: 1995

8.   Процедура

8.1.   Подготовка на тестовата проба

Лабораторната проба се затопля в затворен стъклен или подходящ пластмасов съд, който би следвало да е пълен от една втора до две-трети, до температура, при която пробата ще стане достатъчно мека, за да се улесни смесването до постигане на хомогенно състояние (или с механичен шейкър или с ръка). Обичайно, температурата на смесване не би следвало да надвишава 35 °C. Пробата се охлажда до стайна температура. Съдът се отваря възможно най-бързо след охлаждането на пробата и се разклаща бързо (не повече от 10 секунди) с подходящ предмет, например лъжица или шпатула, преди претеглянето.

8.2.   Определяне

8.2.1.   Съдът с бъркалката (6.4) и тегела (6.5) се изсушава в пещта (6.3) за 1 час. Тези предмети се оставят да се охладят в ексикатора и се претеглят заедно (напр. съд, бъркалка и тегел) с точност до 1 mg (m0).

Бележки:

8.2.2.   Тегелът се отстранява, отчита се общото тегло на съда и бъркалката с точност до 1 mg (m1).

8.2.3.   В съда се измерва с точност до 1 mg тестова доза от приблизително 5 mg на тестовата проба (8.1) (m2).

8.2.4.   Съдът (заедно с бъркалката и маслото) се поставя в пещта при 102 ± 2 °C и се оставя да престои през нощта.

8.2.5.   Съдът (8.2.3) се оставя да се охлади на стайна температура.

8.2.6.   15 ml топъл (приблизително 25 °C) петролен етер се добавя към съда и се отделя колкото е възможно повече от седимента, залепнал за съда, чрез използването на стъклената бъркалка. Разтворителят се прехвърля в тегела и се оставя да се филтрира в колбата за просмукване.

8.2.7.   Операция 8.2.6 се извършва допълнително четири пъти. Ако върху повърхността на чашата няма следи от мазнина, по време на четвъртото измиване в тегела се прехвърля възможно най-много количество от седимента. В противен случай, операция 8.2.6 се повтаря до цялостното елиминиране на всички следи от мазнина.

8.2.8.   Седиментът в тегела се измива с 25 ml топъл петролен естер.

8.2.9.   Съдът и бъркалката се изсушават заедно с тегела в пещта при 102 ± 2 °C за 30 минути.

8.2.10.   Съдът се оставя да се охлади в ексикатора на стайна температура и се измерва с точност до 1 mg.

8.2.11.   Операции 8.2.9 и 8.2.10 се повтарят, докато не се получи обща константна маса (промяната на масата не трябва да надвишава 1 mg) за съда, бъркалката и тегела (m3).

9.   Изразяване на резултати

9.1.   Изчисляване на съдържанието на сухо вещество без мазнини

Съдържанието на сухо вещество без мазнини SNF се изчислява като процент от масата чрез използване на следната формула:

където:

Резултатите се отчитат до първия десетичен знак.

9.2.   Повторяемост

Абсолютната разлика между резултатите на две отделни определяния, извършени едновременно или едно след друго от същия оператор и при същите условия върху идентичен тестов материал, не надвишава 0,2 %.

9.3.   Възпроизвеждане

Абсолютната разлика между два отделни и независими резултата, получени от двама оператори, които работят в различни лаборатории върху идентичен тестов материал, не надвишава 0,2 %.

10.   Отчитане на теста

При отчитането на теста се посочват използваният метод и получените резултати. Също така, се упоменават всички оперативни детайли, които не са определени в този международен стандарт или които се считат като опция, заедно с детайлите за всички случайности, които може да са повлияли на резултатите. При отчитането на теста се дава всяка необходима информация за пълното идентифициране на пробата.

Бележка:

Ако се анализира осолено масло, прибавената сол се определя като сухо вещество без мазнини. За определянето на съдържанието на сухо вещество без мазнини в мляко, съдържанието на прибавената сол трябва да се извлече от съдържанието на сухото вещество без мазнини. Изчисляването на данните на прецизността за определянето на съдържанието на сухо вещество без мазнини в мляко е:

Може да се направи заключение, че данните на прецизността, получени за определянето на съдържанието на сухо вещество без мазнини, са валидни за определянето на съдържанието на сухо вещество без мазнини в мляко.

ПРИЛОЖЕНИЕ XI

(член 8)

ОПРЕДЕЛЯНЕ НА МАСЛЕНОСТТА НА МАСЛОТО

Маслеността на маслото се получава директно чрез определяне на водното съдържание и съдържанието на сухото вещество без мазнини, съответно съгласно прилож ение IX и прилож ение X. Процентът на маслеността от масата е равен на:

където:

Изчислените данни на прецизността за определянето на маслеността са:

ПРИЛОЖЕНИЕ XII

(член 9)

ОПРЕДЕЛЯНЕ НА СЪДЪРЖАНИЕТО НА ВАНИЛИН В КОНЦЕНТРИРАНО МАСЛО, МАСЛО ИЛИ СМЕТАНА ЧРЕЗ ВИСОКООПТИМАЛНА TЕЧНА ХРОМАТОГРАФИЯ

1.   Обхват и приложно поле

Методът описва процедура за количествено определяне на ванилин в концентрирано масло, масло или сметана.

2.   Принцип

Извличане на известно количество проба със смес на изопропанол/етанол/ацетонитрил (1:1:2). Утаяване на по-голямата част от мазнините чрез охлаждане между –15 °C и –20 °C, последвано от центрофугиране.

След разреждане с вода, определяне на съдържанието на ванилин чрез високооптимална течна хроматография (HPLC).

3.   Апаратура

Обичайна лабораторна апаратура, и по-специално следното:

4.   Реагенти

Всички използвани реагенти трябва да са с признато аналитично качество.

5.   Процедура

5.1.   Подготовка на тестовата проба

5.1.1.   Масло

Пробата се загрява докато започне топенето. Избягва се прегряването над 40 °C. Когато пробата стане достатъчно гъвкава, тя се хомогенизира чрез разклащане. Маслото се разбърква за 15 секунди преди вземането на пробата. Около 5 g (SМ g) масло се претеглят се с точност до 1 mg в 100 ml измерителна колба.

5.1.2.   Концентрирано масло

Непосредствено преди вземането на пробата, съдът с концентрираното масло се поставя в пещ при 40 до 50 °C, докато маслото се разтопи напълно. Пробата се смесва чрез разклащане или бъркане, като се избягва образуването на мехурчета въздух от прекалено силното бъркане. Около 4 g (SМ g) концентрирано масло се претегля с точност до 1 mg в 100 ml измерителна колба.

5.1.3.   Сметана

Пробата се загрява във водна баня или инкубатор при температура от 35 до 40 °C. Мазнината се разпределя хомогенно чрез разклащане, и ако е необходимо- чрез бъркане. Пробата се охлажда бързо до 20 ± 2 °C. Пробата трябва да изглежда хомогенна, в противен случай процедурата би следвало да бъде повторена. Около 10 g (SМ g) сметана се претегля с точност до 1 mg в 100 ml измерителна колба.

5.2.   Подготовка на тестовия разтвор

Добавя се около 75 ml екстрактен разтвор (4.4) към тестовата доза (5.1.1, 5.1.2 или 5.1.3), разбърква се или се разклаща силно за около 15 минути и се допълва с екстрактен разтвор (4.4). Около 10 ml от този екстракт се поставя в реагентна стъклена чаша със запушалка. Реагентната стъклена чаша се поставя в хладилник (3.1 ) и се оставя да престои около 30 минути. Студеният екстракт се центрофугира за около 5 минути при приблизително 2 000 rpm и веднага се прелива. Прелетият разтвор се оставя да се охлади до стайна температура. 5 ml от прелетия разтвор се капва в 100 ml измерителна колба и се долива вода. Една аликвотна част се филтрира чрез мембранен филтър (3.3). Филтратът е готов за определяне от HPLC.

5.3.   Калибриране

5 ml стандартен разтвор ванилин (4.5.2) се капват в 100 ml измерителна колба. Добавят се около 5 ml екстрактен разтвор (4.4) и се долива до маркировката с вода. Този разтвор съдържа 0,5 µg/ml ванилин.

5.4.   Определяне чрез HPLC

Хроматографската система се оставя да се стабилизира за 30 минути. Инжектира се стандартният разтвор (5.3). Това се повтаря докато разликата в пиковата повърхност или пиковата височина между две последователни инжектирания е по-малка от 2 %. При описаните условия, времето за запазване на ванилина е около 9 минути. Стандартният разтвор (5.3) се анализира двойно чрез инжектиране на 20 µl. Инжектира се 20 µl от тестовите разтвори (5.2). Определя се пиковата повърхност или височина за ванилина, който е получен. Двойното инжектиране на стандартния разтвор (5.3) се повтаря след 10 инжектирания на тестови проби (5.2).

6.   Изчисляване на резултатите

Изчислява се средната пикова повърхност (или височина) (AC) на ванилина, свързвана с двойните инжектирания за всяка партида на тестовите разтвори (общо четири повърхности или височини).

Изчислява се коефициентът на влияние (R):

където: СМ. е масата ванилин в mg (4.5.1).

Съдържанието (mg/kg) ванилин (C) в тестовата проба е дадено от:

където:

Когато се анализира сметана за съдържание на ванилин, концентрацията на индикаторите трябва да бъде изразена като mg индикатор/kg млечни мазнини. Това се извършва чрез умножаване на C с 100/f. f е съдържанието на мазнини в сметана, изразено в проценти (m/m).

Бележка: Вместо пикова повърхност могат да бъдат използвали пикови височини (виж 8.3).

7.   Точност на метода

7.1.   Повторяемост (r)

Разликата между резултатите от две определяния, извършени в най-краткия възможен срок от един и същ оператор и при използване на същата апаратура върху идентичен тестов материал, не могат да надвишават 16 mg/kg.

7.2.   Възпроизвеждане (R)

Разликата между резултатите от две определяния, извършени от оператори в различни лаборатории и при използване на същата апаратура върху идентичен тестов материал, не могат да надвишават 27 mg/kg.

8.   Граници на толерантност

8.1.   От обозначения продукт трябва да бъдат взети три проби за проверка на хомогенността.

Индикаторите се получават или от ванилин или от синтетичен ванилин.

8.2.1.   Размерът за смесване за 4-хидрокси-3-метоксибензалдехид е 250 g за тон концентрирано масло или масло. Когато се индикира сметана, размерът за смесване е 250 g за тон млечни мазнини.

8.2.2.   Получените от анализа на продукта резултати за трите проби се използват за проверка на размера и хомогенността на смесването на индикатора, като най-ниският от резултатите се сравнява със следните граници (критична граница за вероятност от 95 % (DCr95) е взета предвид):

Използва се концентрацията на индикатора на пробата с най-ниския резултат, който се получава чрез изпаряване между 221,0 mg/kg и 159,0 mg/kg

Индикатор, получен изключително от ванилови зърна или интегрални екстракти от тях

8.3.1.   Размерът за смесване за 4-хидрокси-3-метоксибензалдехид е 100 g за тон концентрирано масло или масло. Когато се индикира сметана, размерът за смесване е 100 g за тон млечни мазнини.

8.3.2.   Получените от анализа на продукта резултати за трите проби се използват за проверка на размера и хомогенността на смесването на индикатора, като най-ниският от тези резултати се сравнява със следните граници (критична граница за вероятност от 95 % (DCr95) е взета предвид):

Използва се концентрацията на индикатора на пробата с най-ниския резултат, който се получава чрез изпаряване между 79,0 mg/kg и 54,0 mg/kg

9.   Бележки

9.1.   Повторяемостта r е стойността, под която абсолютната разлика между два отдели тестови резултата, получени чрез един и същ метод върху идентичен тестови материал и при същите условия (същата апаратура, същата лаборатория и за кратък период от време), може да бъде очаквана с определена вероятност; при отсъствието на други индикации, вероятността е 95 %.

9.2.   Възпроизвеждането R е стойността, под която абсолютната разлика между два отделни тестови резултата, получени чрез един и същ метод върху идентичен тестови материал и при различни условия (различна апаратура, различни лаборатории, и/или в различен период от време), може да бъде очаквана с определена вероятност; при отсъствието на други индикации, вероятността е 95 %.

9.3.   Откриването на прибавен ванилин при количество от 250 mg/kg масло варира от 97,0 до 103,8. Откритото средно съдържание бе 99,9 % със стандартно отклонение от 2,7 %.

9.4.   Стандартният разтвор съдържа 5 % екстрактен разтвор, за да се компенсира пиковото разширяване, причинено от присъствието на 5 % екстрактен разтвор на тестовите проби. Това позволява определянето на количеството чрез пиковите височини.

9.5.   Анализът се базира на нормална линия на калибриране с нулева отсечка.

Чрез използването на подходящи разреждания на стандартния разтвор (4.5.2), линеарността би следвало да бъде проверявана първия път, когато се извършва анализът, а след това- на регулярни интервали от време и при промени или ремонтиране на оборудването за HPLC.

ПРИЛОЖЕНИЕ XIII

(член 9)

ОПРЕДЕЛЯНЕ НА ЕТИЛОВ ЕСТЕР НА БЕТА-АПО-8'-КАРОТИННА КИСЕЛИНА В КОНЦЕНТРИРАНО МАСЛО И МАСЛО ЧРЕЗ СПЕКТРОМЕТРИЯ

1.   Обхват и приложно поле

Методът описва процедура за количествено определяне на етилов естер на бета-апо-8'-каротинна киселина (апо-каротинен естер) в концентрирано масло и масло. Апо-каротинният естер е сумата от всички субстанции, намиращи с е в екстракт от проби, получени при описаните в метода условия, които абсорбират светлината при 440 nm.

2.   Принцип

Мазнините на маслото се разтварят в петролен естер, като абсорбцията се измерва при 440 nm. Съдържанието на апо-каротинен естер се определя чрез външен стандарт.

3.   Апаратура

4.   Реагенти

Всички реагенти трябва да са с признато аналитично качество.

5.   Процедура

5.1.   Подготовка на тестовата проба

5.1.1.   Концентрирано масло

Пробата се стопява в пещта при приблизително 45 °C.

5.1.2.   Масло

Пробата се стопява в пещта при приблизително 45 °C и представителна доза от нея се филтрира през филтър, който съдържа около 10 g дехидратиран натриев сулфат (4.3), в среда, защитена от естествена и изкуствена светлина и поддържаща температура от 45 °C. От маслото се отнема подходящо количество мазнини.

5.2.   Определяне

1 g концентрирано масло (или екстракт на мазнини от масло (5.1.2)), (Mg) се измерва с приблизителна точност от 1 mg Количеството се прехвърля в 20 ml (Vml) измерителна колба при използване на лаков бензин (4.2), допълва се до маркировката и внимателно се смесва.

Аликвотна част се прехвърля в кювета от 1 cm и се измерва абсорбцията при 440 nm, като се сравнява с празната проба на лаков бензин. Концентрацията на апо-каротинен естер се получава в разтвора чрез графиката на калибриране (C µ/ml).

5.3.   Графика на калибриране

0, 0,25, 0,5, 0,75 и 0 1,0 ml стандартен разтвор на апо-каротинен естер (4.1.2) се капват в пет 100 ml измерителни колби. Обемът се разрежда с лаков бензин (4.2) и се смесва.

Подходящите концентрации на разтворите са в обхвата от 0 до 2 µg/ml и се изчисляват точно чрез концентрацията на стандартния разтвор (4.1.2) (W.P)/10 mg/ml. Абсорбциите се измерват при 440 nm, като се сравняват с празната проба на лаков бензин (4.2).

Стойностите на абсорбцията се записват в y-координата срещу концентрацията на апо-каротинен естер в х-координатата.

6.   Изчисляване на резултатите

7.   Точност на метода

7.1.   Повторяемост

7.1.1.   Анализ на масло

Разликата между резултатите от две определяния, извършени в рамките на възможно най-краткия срок от един оператор и чрез използване на същата апаратура върху идентичен тестови материал, не трябва да надвишават 1.4 mg/kg

7.1.2.   Анализ на концентрирано масло

Разликата между резултатите от две определяния, извършени в рамките на възможно най-краткия срок от един оператор и чрез използване на същата апаратура върху идентичен тестови материал, не трябва да надвишават 1.6 mg/kg

7.2.   Възпроизвеждане

7.2.1.   Анализ на масло

Разликата между резултатите от две определяния, извършени от оператори в различни лаборатории и чрез използване на различни апаратури върху идентичен тестови материал, не трябва да надвишават 4.7 mg/kg

7.2.2.   Анализ на концентрирано масло

Разликата между резултатите от две определяния, извършени от оператори в различни лаборатории и чрез използване на различни апаратури върху идентичен тестови материал, не трябва да надвишават 5.3 mg/kg

7.3.   Източник на данните на прецизността

Данните на прецизността бяха определени от експеримент, проведен през 1995 г. и включващ 11 лаборатории и 12 индикаторни проби (шест празни дублирания) за масло и 12 индикаторни проби (шест празни дублирания) за концентрирано масло.

8.   Граници на толерантност

8.1.   От индикаторния продукт трябва да бъдат взети проби за проверка на коректността на индикирането на продукта.

8.2.   Масло

8.2.1.   Размерът за смесване за масло, като се вземе предвид основната абсорбция, е 22 mg/kg

8.2.2.   Получените от анализа на продукта резултати за трите проби се използват за проверка на размера и хомогенността на смесването на индикатора, като най-ниският от тези резултати се сравнява със следните граници (критична граница за вероятност от 95 % (DCr95) е взета предвид):

Използва се концентрацията на индикатора на пробата с най-ниския резултат, който се получава чрез изпаряване между 18.0 mg/kg и 13.0 mg/kg

8.3.   Концентрирано масло

8.3.1.   Размерът за смесване за концентрирано масло, като се вземе предвид основната абсорбция, е 24 mg/kg.

8.3.2.   Получените от анализа на продукта резултати за трите проби се използват за проверка на размера и хомогенността на смесването на индикатора, като най-ниският от тези резултати се сравнява със следните граници (критична граница на вероятност от 95 % (DCr95) е взета предвид):

Използва се концентрацията на индикатора на пробата с най-ниския резултат, който се получава чрез изпаряване между 20,0 mg/kg и 14,0 mg/kg

ПРИЛОЖЕНИЕ XIV

(член 9)

ОПРЕДЕЛЯНЕ НА СИТОСТЕРИН ИЛИ СТИГМАСТЕРОЛ В МАСЛО ИЛИ КОНЦЕНТРИРАНО МАСЛО ЧРЕЗ ГАЗОВА ХРОМАТОГРАФИЯ С КАПИЛЯРНА КОЛОНА

1.   ОБХВАТ И ПРИЛОЖНО ПОЛЕ

Методът описва процедура за количествено определяне на ситостерин или стигмастерол в масло и концентрирано масло. Ситостеринът се взема като сума от β-ситостерин и 22 дихидро-β-ситостерин; други ситостерини се вземат като незначителни.

2.   ПРИНЦИП

Маслото или концентрираното масло се хидролизира с разтвор на калиев хидроксид и нехидрализираните съставки се извличат с диетилов етер.

Стеролите се прехвърлят върху триметил-силил етери и се анализират чрез газова хроматография с капилярна колона, с бетулин като външен стандарт.

3.   АПАРАТУРА

4.   РЕАГЕНТИ

Всички реагенти трябва да са с доказано аналитично качество. Използваната вода трябва да е дестилирана или да се използва вода с най-малко еквивалентна степен на чистота.

4.1.   Етанол, поне 95 % чисто съдържание.

4.2.   Калиев хидроксид, 60 % разтвор (600 g калиев хидроксид (минимум 85 %) се разтваря във вода и се долива до един литър с вода.

Бетулин, поне 99 % чисто съдържание.

Разтвори на бетулин в диетилов етер (4.4).

4.4.   Диетилов етер с аналитична степен на чистота (без прекиси и утайки).

4.5.   Натриев сулфат, дехидратиран, гранулиран и предварително изсушен при 102 °C за два часа.

4.6.   Силилов реагент, например TRI-SIL (наличен от Pierce Chemical Co, кат. № 49001) или подобен (важно: TRI-SIL е възпламеним, токсичен, корозивен и е възможно да бъде канцерогенен. Лабораторният персонал трябва да е запознат с данните за безопасност на TRI-SIL и да вземе необходимите предварителни мерки.)

4.7.   Ланостерин.

Ситостерин известна степен на чистота, с не по-малко от 90 % чисто съдържание (P).

Бележка 1: Степента на чистота на използваните стандартни материали за калибриране трябва да бъде определена чрез използването на метода на нормализиране. Прима се, че всички стероли, присъстващи в пробата, са представени върху хроматограмата, като общата пикова повърхност представлява 100 % от стеролните съставки, и че стеролите дават същия детекторен отговор. Линеарността на системата трябва да бъде валидирана за областите на концентрация, които са от интерес.

4.8.1.   Ситостеринен стандартен разтвор — приготвя се разтвор, съдържащ с точност до 0,001 mg/ml приблизително 0,5 mg/ml (W1) ситостерин (4.8) в диетилов етер (4.4).

Стигмастерол с известна степен на хомогенност, не по-малко от 90 % чисто съдържание (P).

4.9.1.   Стигмастеролен стандартен разтвор — приготвя се разтвор, съдържащ с точност до 0,001 mg/ml приблизително 0,2 mg/ml (W1) стигмастерол (4.9) в диетилов етер 4.4).

4.10.   Тестов разтвор за проверка на разтварянето. Приготвя се разтвор, съдържащ 0,05 mg/ml ланостерин (4.7) и 0,5 mg/ml ситостерин (4.8) в диетилов етер (4.4).

5.   МЕТОД

Приготвяне на стандартни разтвори за хроматография. Вътрешният стандартен разтвор (4.3.1) трябва да се добави към подходящ стеролов разтвор в същото време, когато се добавя към хидролизираната проба (виж 5.2.2).

5.1.1.   Ситостеринов стандартен хроматографски разтвор: 1 ml ситостеринов стандартен разтвор (4.8.1) се поставя във всеки от двата реактивни флакона (3.7) и диетиловият етер се отстранява чрез струя азот. Добавя се 1 ml вътрешен разтвор (4.3.1.1) и диетиловият етер се отстранява чрез струя азот.

5.1.2.   Сигмастеролен стандартен хроматографски разтвор: 1 ml сигмастеролен стандартен разтвор (4.9.1) се поставя във всеки от двата реактивни флакона (3.7) и диетиловият етер се отстранява чрез струя азот. Добавя се 1 ml вътрешен разтвор (4.3.1.2) и диетиловият етер се отстранява чрез струя азот.

5.2.   Подготовка на нехидрализираните съставки

5.2.1.   Пробата масло се стопява при температура, която не надвишава 35 °C; пробата се смесва внимателно чрез бъркане.

В 150 ml колба (3.1) се измерва с точност до 1 mg приблизително 1 g масло (W2) или концентрирано масло (W2). Добавя се 50 ml етанол (4.1) и 10 ml разтвор на калиев хидроксид (4.2). Поставя се конверторният увеличител и се загрява приблизително при 75 °C за 30 минути. Конверторният увеличител се отваря и колбата се охлажда на близка до стайната температура.

5.2.2.   В колбата се добавя 1,0 ml вътрешен стандартен разтвор (4.3.1.1), ако ситостеринът трябва да се определи, или (4.3.1.2), ако стигмастеролът трябва да се определи. Смесва се внимателно. Съдържанието на колбата се поставя в 500 ml отделителна фуния (3.2), като колбата последователно се измива с 50 ml вода и 250 ml диетилов етер (4.4). Отделителната фуния се разклаща силно за две минути и се оставя за отделяне на фазите. Долният воден слой се отстранява и етеровият слой се измива чрез разклащане с четири последователни части вода от 100 ml.

Бележка 2: За да се избегне образуването на емулсия, е съществено първите две измивания с вода да се извършват леко (10 превъртания). При третото измиване може да се разклаща силно за 30 секунди. Ако е образувана емулсия, тя може да бъде унищожена с добавянето на 5—10 ml етанол. Око се добавя етанол, е важно да се извършат две допълнителни енергични измивания с вода.

5.2.3.   Чистият нехидрализиран етеров слой се оставя да изтече през стъклена колона (3.5), съдържаща 30 g дихидратиран натриев сулфат (4.5). Етерът се събира в 250 ml колба (3.3). Добавя се гранула против кипене с енергично отделяне на пара и се изпарява близо до изсушаване във водна баня или кожух, като се събират остатъците от разтвора.

Бележка 3: Ако екстрактите от пробата са отнети, за да се завърши сушенето при прекалено висока температура, може да възникне загуба на стерол.

5.3.   Приготвяне на триметил силил етери

5.3.1.   Етеровият разтвор, оставащ в колбата се поставя в 2 ml реактивен флакон (3.7) заедно с 2 ml диетилов етер и етерът се отстранява чрез използване на струя азот. Колбата се измива с две допълнителни части от 2 ml диетилов етер, който се поставя във флакона, и етерът се отстранява всеки път с азот.

5.3.2.   Пробата се силилира чрез добавянето на 1 ml TRI-SIL (4.6). Флаконът се затваря и се разклаща силно, за да се разтвори. Ако разтварянето не е завършило, се подгрява при 65—70 °C. Оставя се да престои най-малко пет минути преди инжектирането в газовата хроматография. Стандартите се силилират по същия начин като пробите. Тестовият разтвор за проверка на разтварянето (4.10) се силилира по същия начин като пробите.

Бележка 4: Силилирането трябва да се извършва в безводна среда. Непълното силилиране на бетулин се индикира с втори пик, близък до този на бетулина.

Присъствието на етанол на етапа на силилиране влияе на силилирането. Това може да е резултат от неадекватното измиване на етапа на извличането. Ако този проблем продължава, на етапа на екстракцията може да бъде въведено пето измиване, като се разклаща силно за 30 секунди.

5.4.   Газов хроматографски анализ

5.4.1.   Избор на оперативни условия

Газовият хромотограф се настройва съобразно инструкциите на производителя.

Указанията за условията на работа са, както следва:

Бележка 5: Изключително важно е тръбичката за инжектиране да се почиства регулярно.

Преди започването на какъвто и да е анализ, системата се оставя да се уравновеси и да даде удовлетворителен постоянен сигнал-отговор.

Тези условия трябва да варират в светлината на характеристиките на колоната и газовия хроматограф, така че да се получат хроматограми, които изпълняват следните условия:

5.4.2.   Аналитична процедура

6.   ИЗЧИСЛЯВАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ

6.1.   Пиковата повърхност на стерол и бетулин се определя в двата стандарта за партида и се изчислява R1:

Определя се пиковата повърхност на стерол (стигмастерол и ситостерин) и на бетулин в пробата и се изчислява R2:

7.   ТОЧНОСТ НА МЕТОДА

7.1.   Масло

7.1.1.   Повторяемост

7.1.1.1.   Стигмастерол

Разликата между резултатите от две определяния, извършени в рамките на възможно най-краткия срок от един оператор и чрез използване на същата апаратура върху идентичен тестови материал, не трябва да надвишава 19,3 mg/kg.

7.1.1.2.   Ситостерин

Разликата между резултатите от две определяния, извършени в рамките на възможно най-краткия срок от един оператор и чрез използване на същата апаратура върху идентичен тестови материал, не трябва да надвишава 23,0 mg/kg.

7.1.2.   Възпроизвеждане

7.1.2.1.   Стигмастерол

Разликата между резултатите от две определяния, извършени от оператори в различни лаборатории и чрез използване на различни апаратури върху идентичен тестови материал, не трябва да надвишава 31,9 mg/kg.

7.1.2.2.   Ситостерин

Разликата между резултатите от две определяния, извършени от оператори в различни лаборатории и чрез използване на различни апаратури върху идентичен тестови материал, не трябва да надвишава 8,7 % от средната стойност на определянето.

7.1.3.   Източник на данните на прецизността

Данните на прецизността бяха определени от експеримент, проведен през 1992 г. и включващ осем лаборатории и шест проби (три празни дублирания) за стигмастерол в масло и шест проби (три празни дублирания) за ситостерин.

7.2.   Концентрирано масло

7.2.1.   Повторяемост

7.2.1.1.   Стигмастерол

Разликата между резултатите от две определяния, извършени в рамките на възможно най-краткия срок от един оператор и чрез използване на същата апаратура върху идентичен тестови материал, не трябва да надвишава 10,2 mg/kg

7.2.1.2.   Ситостерин

Разликата между резултатите от две определяния, извършени в рамките на възможно най-краткия срок от един оператор и чрез използване на същата апаратура върху идентичен тестови материал, не трябва да надвишава 3,6 % от средната стойност на определянето.

7.2.2.   Възпроизвеждане

7.2.2.1.   Стигмастерол

Разликата между резултатите от две определяния, извършени от оператори в различни лаборатории и чрез използване на различни апаратури върху идентичен тестови материал, не трябва да надвишават 25,3 mg/kg

7.2.2.2.   Ситостерин

Разликата между резултатите от две определяния, извършени от оператори в различни лаборатории и чрез използване на различни апаратури върху идентичен тестови материал, не трябва да надвишава 8,9 % от средната стойност на определянето.

7.2.3.   Източник на данните на прецизността

Данните на прецизността бяха определени от експеримент, проведен през 1991 г. и включващ девет лаборатории и шест проби (три празни дублирания) за стигмастерол в масло и шест проби (три празни дублирания) за ситостерин.

8.   ГРАНИЦИ НА ТОЛЕРАНТНОСТ

8.1.   От индикаторния продукт трябва да бъдат взети проби за проверка на коректността на индикирането на продукта.

8.2.   Масло

8.2.1.   Стигмастерол

8.2.1.1.   Количеството за смесване за стигмастерол е 150 g от най-малко 95 % чист стигмастерол за тон масло, т.е. 142,5 mg/kg или 170 g от най-малко 85 % чист стигмастерол за тон масло, т.e. 144,5 mg/kg.

8.2.1.2.   Получените от анализа на продукта резултати за трите проби се използват за проверка на размера и хомогенността на смесването на индикатора, като най-ниският от тези резултати се сравнява със следните граници (критична граница на вероятност от 95 % (DCr95) е взета предвид):

Използва се концентрацията на индикатора на пробата с най-ниския резултат, който се получава чрез изпаряване между 116,0 mg/kg и 81,0 mg/kg или 118,0 mg/kg и 82,0 mg/kg.

8.2.2.   Ситостерин

8.2.2.1.   Количеството за смесване за ситостерин е 600 g от най-малко 90 % хомогенен ситостерин за тон масло, т.e. 540 mg/kg.

8.2.2.2.   Получените от анализа на продукта резултати за трите проби се използват за проверка на размера и хомогенността на смесването на индикатора, като най-ниският от тези резултати се сравнява със следните граници (критична граница на вероятност от 95 % (DCr95) е взета предвид):

Използва се концентрацията на индикатора на пробата с най-ниския резултат, който се получава чрез изпаряване между 486,0 mg/kg и 358,0 mg/kg.

8.3.   Концентрирано масло

8.3.1.   Стигмастерол

8.3.1.1.   Количеството за смесване за стигмастерол е 150 g от най-малко 95 % чист стигмастерол за тон концентрирано масло, т.e. 142,5 mg/kg или 170 g от най-малко 85 % чист стигмастерол за тон концентрирано масло, т.e. 144,5 mg/kg.

8.3.1.2.   Получените от анализа на продукта резултати за трите проби се използват за проверка на размера и хомогенността на смесването на индикатора, като най-ниският от тези резултати се сравнява със следните граници (критична граница на вероятност от 95 % (DCr95) е взета предвид):

Използва се концентрацията на индикатора на пробата с най-ниския резултат, който се получава чрез изпаряване между 120,0 mg/kg и 84,0 mg/kg или 122,0 mg/kg и 86,0 mg/kg.

8.3.2.   Ситостерин

8.3.2.1.   Количеството за смесване за ситостерин е 600 g от най-малко 90 % чист ситостерин за тон концентрирано масло, т.e. 540 mg/kg.

8.3.2.2.   Получените от анализа на продукта резултати за трите проби се използват за проверка на размера и хомогенността на смесването на индикатора, като най-ниският от тези резултати се сравнява със следните граници (критична граница на вероятност от 95 % (DCr95) е взета предвид):

Използва се концентрацията на индикатора на пробата с най-ниския резултат, който се получава чрез изпаряване между между 486,0 mg/kg и 358,0 mg/kg.

ПРИЛОЖЕНИЕ XV

(член 10)

РЕФЕРЕНТЕН МЕТОД ЗА ОТКРИВАНЕ НА КРАВЕ МЛЯКО И КАЗЕИНАТИ В СИРЕНА ОТ ОВЧЕ МЛЯКО, КОЗЕ МЛЯКО ИЛИ БИВОЛСКО МЛЯКО ИЛИ СМЕСИ ОТ ОВЧЕ, КОЗЕ И БИВОЛСКО МЛЯКО

1.   Обхват

Откриване на краве мляко и казеинати в сирена, произведени от овче мляко, козе мляко, биволско мляко или смеси от овче, козе и биволско мляко чрез изоелектрическо фокусиране на γ-казеини след плазминолиза.

2.   Приложно поле

Методът е подходящ за чувствително и специфично откриване на натурално и топлинно обработвано краве мляко и казеинати в пресни и узрели сирена, произведени от овче мляко, козе мляко, биволско мляко или смеси от овче, козе и биволско мляко. Той не е подходящ за откриването на подправяне на мляко и сирене чрез топлинно обработени концентрати на протеин в краве суроватка.

3.   Принцип на метода

4.   Реагенти

Ако не е посочено друго, трябва да бъдат използвани химикали с аналитично качество. Водата трябва да е двойно дестилирана или да е с еквивалента степен на чистота.

Бележка: Следните данни се прилагат за лаборатория, която е подготвила полиакриламидни гелове, съдържащи урея, с размери 265 × 125 × 0,25 mm. Когато се използват други размери и типове гел, би могло да е необходимо адаптирането на условията за отделяне.

Изоелектрическо фокусиране

4.1.   Реагенти за добиването на уреята, съдържащи полиакриламидни гелове

4.1.1.   Разтваряне на основен гел

Разтваряне на:

във вода, като се допълва до 100 ml и се съхранява в бутилка от кафяво стъкло в хладилник.

Бележка: Вместо цитираните определени дози невротоксични акриламиди може да се използва обичайният готов разтвор акриламид/BIS. Когато такъв разтвор съдържа 30 % w/v акриламид и 0,8 % w/v BIS, вместо определените дози за сместа трябва да бъде използван обем от 16,2 ml. Годността на основния разтвор е максимум 10 дни; ако неговата проводимост е повече от 5 µS, той се дейонизира чрез разклащане с 2 g Амберлит MB-3 за 30 минути, след това се филтрира през мембрана от 0,45 µm.

4.1.2.   Разтвор на гел.

Приготвя се разтвор на гел чрез смесването на добавки и амфолити с основния разтвор на гел (виж 4.1.l).

Разтворът на гел се смесва и се подлага на суха дестилация за две до три минути в ултразвукова баня или във вакуум.

Бележка: Разтворът на гел се приготвя непосредствено преди изливането му (виж 6.2).

4.1.3.   Катализаторни разтвори

4.1.3.1.   N, N, N′ N′ — тетраметилетиленедиамин (Temed).

4.1.3.2.   40 % w/v амониев персулфат (PER):

800 mg PER се разтварят във вода и се долива до 2 ml

Бележка: Винаги се използва прясно приготвен разтвор PER.

4.2.   Контактна течност

Керосин или течен парафин

4.3.   Aноден разтвор

5,77 g фосфорна киселина (85 % w/w) се разтваря във вода и се разрежда до 100 ml.

4.4.   Катоден разтвор

2,00 g натриев хидроксид се разтваря във вода и се разрежда до 100 ml с вода.

Подготовка на проби

4.5.   Реагенти за изолиране на протеин

4.5.1.   Разредена оцетна киселина (25,0 ml кристализирала оцетна киселина с добавена вода до 100 ml)

4.5.2.   Дихлорметан

4.5.3.   Ацетон

4.6.   Неутрализатор за разтваряне на протеин

Разтварят се:

във вода и се добавя до 50 ml

Бележка: Съхранява се в хладилник; максимална годност- една седмица.

4.7.   Реагенти за плазмено отделяне на казеини

4.7.1.   Неутрализатор- амониев карбонат

0,2 mol/l разтвор на амониев бикарбонат (1,58 g/100 ml вода), съдържащ 0,05 mol/l етилен-диамин-тетраацетна киселина (EDTA, 1,46 g/100 ml), се титрува с 0,2 mol/l разтвор на амониев кaрбонат (1,92 g/100 ml вода), съдържащ 0,05 mol/l EDTA, до ph 8.

4.7.2.   Плазма на краве мляко (EC. 3.4.21.7), с дейност най-малко 5 U/ml.

4.7.3.   ε-разтвор на амино-капронна киселина за активиране на ензими

2,624 g ε-амино-капронна киселина (6 амино-n-циклохексанонова киселина) се разтварят в 100 ml 40 % (v/v) етанол.

4.8.   Стандартни проби

4.8.1.   Сертифицирани референтни стандартни проби на смес от засирени овче и козе обезмаслено мляко, съдържащи 0 % и 1 % краве мляко, са налични в Института на Комисията за референтни материали и метрология, B-2440 Geel, Белгия.

4.8.2.   Подготовка на вътрешнолабораторни стандартни проби на биволско засирено мляко, съдържащо 0 % и 1 % краве мляко:

Обезмасленото мляко се приготвя чрез центрофугиране на биволско или краве сурово непакетирано мляко при 37 °C за 2 500 g за 20 минути. След бързо охлаждане на съда със съдържанието от 6 до 8 °C, горният слой се отстранява напълно. За подготовката на 1 % -на стандартна проба, към 495 ml биволско обезмаслено мляко се добавя 5,00 ml краве обезмаслено мляко в 1 л. бехерова чаша, адаптира се pH до 6,4 чрез прибавяне на разредена млечна киселина (10 % w/v). Температурата се регулира на 35 °C и се прибавя 100 µl телно сирище (сирищна дейност 1: 10 000, c. 3 000 U/ml), разклаща се за 1 минута и бехеровата чаша се оставя покрита с алуминиево фолио при 35 °C за един час, за да може да се образува съсирване. След образуването на съсирването, цялото сирищно мляко се суши чрез сублимиране без предварително хомогенизиране или отцеждане на суроватката. След сушенето чрез сублимиране, то е основа за добиването на хомогенен прах. За подготовката на 0 %-на стандартна проба се извършва същата процедура чрез използване на натурално биволско обезмаслено мляко. Стандартните проби трябва да бъдат съхранявани при –20 °C.

Бележка: Препоръчително е да се проверява чистотата на биволското мляко чрез изоелектрическо фокусиране на третираните с плазма казеини, преди подготовката на стандартните проби.

Реагенти за оцветяване на протеин

4.8.   Фиксатори

150 g трихлор оцетна киселина се разтварят във вода и се добавя до 1 000 ml.

4.9.   Обезцветяващ разтвор

500 ml метанол и 200 ml кристализирала оцетна киселина се разреждат до 2 000 ml с дестилирана вода.

Бележка: Всеки ден се приготвя пресен обезцветяващ разтвор; той може да бъде приготвен чрез смесване на равни обеми основни разтвори на 50 % (v/v) метанол и 20 % (v/v) кристализирала оцетна киселина.

4.11.   Оцветяващи разтвори

4.11.1.   Оцветяващ разтвор (основен разтвор 1)

3,0 g Coomassie Brilliant Blue G-250 (C.I. 42655) се разтваря в 1 000 ml 90 % (v/v) метанол чрез използване на магнитна бъркалка (приблизително 45 минути), филтрира се чрез два прегънати филтъра със средна скорост.

4.11.2.   Оцветяващ разтвор (основен разтвор 2)

5,0 g меден сулфатен пентахидрат се разтваря в 1 000 ml 20 % (v/v) оцетна киселина.

4.11.3.   Оцветяващ разтвор (работен разтвор)

Смесват се заедно 125 ml от всеки от основните разтвори (4.11.1, 4.11.2) непосредствено преди оцветяването.

Бележка: Оцветяващият разтвор би следвало да бъде приготвен в деня, в който се използва.

5.   Оборудване

5.1.   Огледални стъкла (265 ×125 × 4 mm); гумена ролка (ширина 15 cm); нивелирана маса.

5.2.   Носещо фолио на гел (265 × 125 mm).

5.3.   Покривно фолио (280 × 125 mm). Двете дължини се залепват с импрегнирана ивица (280 × 6 × 0,25 mm) (виж фигура 1).

5.4.   Камера за електрофокусиране с охлаждаща плоча (напр. 265 × 125 mm.) и подходящо електрическо захранване (≥ 2,5 kV) или автоматично устройство за електрофореза.

5.5.   Криостат за циркулация, термостатно контролиран при 12 ± 0,5 °C.

5.6.   Центрофуга, приспособена за 3 000 g.

5.7.   Електродни ленти (≥ 265 mm. дълги).

5.8.   Пластмасови флакони за капене на анодните и катодните разтвори.

5.9.   Апликатори за проби (10 × 5 mm., вискозна филтърна хартия или филтърна хартия с ниска абсорбция на протеин).

5.10.   Ножове от неръждаема стомана, скалпели и пинсети.

5.11.   Чаши от неръждаема стомана или от стъкло за оцветяване и обезцветяване (напр. 280 ×150 mm. корита за инструменти).

5.12.   Приспособим хомогенизатор с мотовилка (с диаметър на ос от 10 mm.), при обхват от 8 000 до 20 000.

5.13.   Магнитна бъркалка.

5.14.   Ултразвукова баня.

5.15.   Фолиен оксижен.

5.16.   25 µl микро-капкомери.

5.17.   Вакуумен концентратор или сушилня чрез сублимиране.

5.18.   Термостатично контролирана водна баня, регулируема за 35 и 40 ± 1 °C с шейкър.

5.19.   Денсиметър, четящ при λ = 634 nm.

6.   Процедура

6.1.   Подготовка на проби

6.1.1.   Изолиране на казеини

Масата, еквивалентна на 5 g сухо вещество сирене, или референтните стандартни проби се претеглят в 100 ml цетрофужен съд, прибавя се 60 g дестилирана вода и се хомогенизира с хомогенизатор с мотовилка (от 8 000 до 10 000 rpm). Регулира се до pH 4,6 с разредена оцетна киселина (4.5.1) и се центрофугира (5 минути, 3 000 г.). Мазнината и суроватката се отделят, утайката се хомогенизира при 20 000 rpm в 40 ml дестилирана вода, регулирана до pH 4,5 с разредена оцетна киселина (4.5.1), добавя се 20 ml дихлорметан (4.5.2), отново се хомогенизира и се центрофугира (5 минути, 3 000 g). Казеиновият слой, който се намира между водната и органичната фаза (виж фигура 2) се отстранява със шпатула и двете фази се отделят. Казеинът се хомогенизира отново в 40 ml дестилирана вода (виж по-горе) и 20 ml дихлорметан (4.5.2) и се центрофугира. Тази процедура се повтаря, докато двете фази на екстракцията останат безцветни (от два до три пъти). Утайката от протеин се хомогенизира с 50 ml ацетон (4.5.3) и се филтрира чрез прегъната филтърна хартия със средна скорост. Утайката върху филтъра се измива с две отделни части от 25 ml ацетон и се оставя да се изсуши на въздух или чрез струя азот, след което фино се стрива на прах в хаван.

Бележка: Сухият изолиран казеин би следвало да бъде съхраняван при –20 °C.

6.1.2.   Плазмено отделяне на β-казеини за интензифициране на γ-казеини

25 mg изолирани казеини (6.1.1) се разпръскват в 0,5 ml неутрализатор на амониев карбонат (4.7.1) и се хомогенизират за 20 минути чрез напр. използване на ултразвуково третиране. Подгрява се до 40 °C и се добавя 10 µl плазма (4.7.2), смесва се и се инкубира за един час при 40 °C, с непрекъснато разклащане. За да се активизира ензимът, се добавя 20 µl разтвор от ε-амино-капронна киселина (4.7.3), след това се добавя 200 mg твърда урея и 2 mg дитиотрейтол.

Бележка: За да се получи по-голяма симетрия на фокусираните казеинови ивици, е препоръчително разтворът да се изсуши чрез сублимиране след добавянето на ε-аминокапронна киселина, като след това утайките се разредят в 0,5 ml неутрализатор за обезцветяване на протеин (4.6).

6.2.   Приготвяне на урея, съдържаща полиакриламидни гелове

С помощта на няколко капки вода, носещото фолио на гела (5.2) се навива на огледално стъкло (5.1), като излизащата навън вода се отстранява с хартиена кърпа или памук. По същия начин, покривното фолио (5.3) се навива с ограничителите (0,25 mm) върху друго огледално стъкло. Стъклото се поставя хоризонтално върху нивелирана маса.

Към приготвения и с отстранен въздух разтвор от гел (4.1.2) се добавя 10 µl Temed (4.1.3.1 ), разклаща се и се добавя 10 µl PER-разтвор (4.1.3.2), внимателно се смесва и веднага се излива равномерно върху центъра на покривното фолио. Единият край на носещото фолио на гела (с фолиото надолу) се поставя върху стъклото с покривното фолио и се смъква бавно, така че филмът от гел да се разпредели между фолията, без да се образуват мехурчета (фигура 3). Носещото стъкло на гела се смъква внимателно чрез използването на тънка шпатула и върху върха му се поставят още три огледални стъкла за тежест. След завършването на полимеризацията (около 60 минути), полимеризираният гел върху носещото фолио на гела се отстранява заедно с покривното фолио чрез наклоняване на огледалните стъкла. Обратната страна на носещото фолио се почиства внимателно, за да се отстрани утайката и уреята. „Гел-сандвичът“ се затваря във фолиев съд и се съхранява в хладилник (максимум шест седмици).

Бележка: Покривното фолио с ограничителите не може да бъде използвано повторно. Полиакриламидният гел може да бъде разпределен на по-малки части, което е препоръчително, когато има няколко проби или ако се използва автоматично устройство за електрофореза (два гела, с размер 4,5 × 5 см).

6.3.   Изоелектрическо фокусиране

Охлаждащият термостат се настройва на 12 °C. Обратната страна на фолиото на съда с гел се избърсва с керосин, след това в центъра на охлаждащия блок се капват няколко капки керосин (4.2). След това „гел-сандвичът“ се притиска надолу към страната на съда, като се внимава да не се образуват мехурчета. Излишният керосин се избърсва и покривното фолио се отстранява. Електродните ивици се напояват с електродните разтвори (4.3, 4.4), изрязват се по дължината на гела и се поставят на предвидените места (разстояние на електродите от 9,5 cm).

Условия за изоелектрическо фокусиране:

6.3.1.   Размер на гел — 265 × 125 × 0,25 mm.

Бележка: Ако се промени плътността и ширината на геловете, стойностите за електрически ток и мощност следва да се адаптират по подходящ начин (напр. удвояване на стойностите за електрически ток и за мощност, ако се използва гел с размери 265 × 125 × 0,5 mm).

6.3.2.   Примери за програма за волтаж за автоматично устройство за електрофореза (2 гела с размери 5,0 × 4,5 cm); електродите без ивици се прилагат директно върху гела.

При стъпка 2, апликаторът на пробата се поставя на 0 Vh.

При стъпка 2, апликаторът на пробата се отстранява на 30 Vh.

6.4.   Оцветяване на протеин

6.4.1.   Фиксиране на протеин

Електродните ивици се отстраняват непосредствено след изключване на захранването и гелът веднага се поставя в съд за оцветяване/премахване на цвета, пълен с 200 ml фиксатор (4.9); оставя се за 15 минути, като непрекъснато се разклаща.

6.4.2.   Измиване и оцветяване на съда с гел

Фиксаторът се отцежда внимателно и съдът с гел се измива два пъти за 30 секунди, всеки път със 100 ml обезцветяващ разтвор (4.10). Обезцветяващият разтвор се излива и съдът се пълни с 250 ml оцветяващ разтвор (4.11.3); оставя се да се оцвети за 45 минути с леко разклащане.

6.4.3.   Обезцветяване на съда с гел

Оцветяващият разтвор се излива, съдът с гел се измива два пъти, като всеки път се използва 100 ml обезцветяващ разтвор (4.10), след това се разклаща с 200 ml обезцветяващ разтвор за 15 минути и стъпката за обезцветяване се повтаря най-малко два или три пъти, докато основата стане чиста и безцветна. След това съдът с гел се изплаква с дестилирана вода (2 × 2 минути) и се изсушава на въздуха (от 2 до 3 часа) или със сешоар (от 10 до 15 минути).

Бележка 1: Фиксирането, измиването, оцветяването и обезцветяването се извършва при 20 °C. Не се използват високи температури.

Бележка 2: Ако се предпочита по-изразено сребърно оцветяване (напр. кит за сребърно оцветяване, протеин, Pharmacia Biotech, код № 17-1150-01), пробите от казеин, третирани с плазма, следва да бъдат разредени до 5 mg/ml.

7.   Оценка

Оценката се извършва чрез сравняване на ивиците протеин на непозната проба с референтни проби върху същия гел. Откриването на краве мляко в сирена от овче мляко, козе мляко и биволско мляко и смеси от овче, козе и биволско мляко се извършва чрез γ3-and γ2-казеини, чийто обхват на изоелектрически точки е между pH 6,5 и pH 7,5 (фигури 4 a, б, фигура 5). Границата на откриване е по-ниска от 0,5 %.

7.1.   Визуална оценка

За визуална оценка на количеството краве мляко се препоръчва да се адаптират концентрациите на пробите и стандартите за получаване на същото ниво на интензивност на овчи, кози и/или биволски γ2-и γ3-казеини (виж „γ2 E,G,B“ и „γ3 E,G,B“ във фигури 4 a, б и фигура 5). След това, количеството на кравето мляко (по-малко от, равно или по-голямо от 1 %) в непознатата проба може да бъде оценявано директно чрез сравняване интензитета на краве γ3-и γ2-казеини (виж „γ3 C“ и „γ2 C“ във фигури 4 a, б и фигура 5) с тези на 0 % и 1 % референтни стандарти (овца, коза) или вътрешнолабораторни стандарти (бивол).

7.2.   Денсиметрична оценка

Ако е налице, за определянето на съотношението на най-високите повърхности на краве спрямо овчи, кози и/или биволски γ2-и γ3-казеини (виж фигура 5) се използва денсиметър (5.19). Тази стойност се сравнява със съотношението на най-високите повърхности на γ2-и γ3-казеини от 1 % референтен стандарт (овца, коза) или вътрешнолабораторен стандарт (бивол), анализирани върху същия гел.

Бележка: Методът функционира задоволително, ако има ясен положителен сигнал за двата краве γ2-и γ3-казеина в 1 % референтен стандарт, но не и в 0 % референтен стандарт. Ако няма, процедурата се оптимизира, като прецизно се съблюдават детайлите на метода.

Пробата се оценява като положителна, ако двата краве γ2-и γ3-казеина или съотношенията на най-високите повърхности са равни или по-големи от нивото на 1 % референтен стандарт.

8.   Позовавания

(1)  Продуктите Ampholine® pH 3,5—9,5 (Pharmacia), както и Resolyte® pH 5—7, съответно pH 6—8 (BDH, Merck), се оказват особено подходящи за получаване на исканото отделяне на γ-казеини.

(2)  Прилагане на проби: След пред-фокусирането (стъпка 1), 18 µl от всеки от разтворите от пробата се дозират с капкомер върху апликаторите на пробата (10 × 5 mm.), поставят се върху гела на разстояние 1 mm. един от друг и на разстояние 5 mm. от анода и се притискат леко. Фокусирането се извършва, като се използват горните условия и след 60 минути фокусиране на пробата апликаторите внимателно се отстранят.

ПРИЛОЖЕНИЕ XVI

(член 11)

РЕФЕРЕНТЕН МЕТОД ЗА ОТКРИВАНЕ НА ФОРМИ НА КОЛИ БАКТЕРИИ В МАСЛО, ОБЕЗМАСЛЕНО МЛЯКО НА ПРАХ, КАЗЕИН И КАЗЕИНАТИ

За тестване наличието на форми на коли бактерии в масло, в средата на пробата се инокулират проби от 1 g масло.

Когато за наличието на форми на коли бактерии се тества обезмаслено мляко на прах или казеин/казеинати, в средата на пробата се инокулират 0,1 g проби.

IDF стандарт 73A: 1985. Метод B се прилага със следните модификации:

Оценка на резултатите

Бележка:

Съдържание на форми на коли бактерии: 1/10 g за масло; 1/g за обезмаслено мляко на прах, казеин/казеинати.

Резултатите, които показват, че изискването е изпълнено, са получени с вероятност от 93 %.

Съдържание на форми на коли бактерии: 1/g за масло; 1/0,1 g за обезмаслено мляко на прах или казеин/казеинати средно.

Резултатите, които показват, че изискването не е изпълнено, са получени с вероятност от 91 %.

(Предположение: разпространение на инфекция)

ПРИЛОЖЕНИЕ XVII

(член 12)

МЕТОД ЗА ОПРЕДЕЛЯНЕ НА СЪДЪРЖАНИЕТО НА ЛАКТОЗА В ПРОДУКТИ, КОИТО ПОПАДАТ В КОД ПО КН 2309 (1)

ЧАСТ I

1.   Приложно поле

Методът би следвало да се прилага в случаите, в които съдържанието на лактоза надвишава 0,5 %.

2.   Принцип

Захарта се разтваря във вода. Дрождите (Saccharomyces cerevisiae) се оставят да подействат; това ще запази лактозата. Чрез Luff-Schoorl-метода се определя съдържанието на лактоза в този разтвор, след избистрянето и филтрирането.

3.   Реагенти

Натриев тиосулфат 0,1 N

Индикатор: разтвор на скорбяла. Добавя се смес от 5 g разтворима скорбяла (10 mg живачен йодид може да бъде добавен като консервиращ агент) и 30 ml вода към 1 литър кипяща вода; сместа се оставя да кипи три минути; оставя се да се охлади.

Разтвор на калиев йодид AR при 30 % (w/v)

Разтвор на сярна киселина 6 N

Luff-Schoorl-реагент:

б) се добавя към в), като се разклаща леко, след това се добавя (a). Допълва се до 1 литър, оставя се да престои през нощта и след това се филтрира. Проверява се нормалността на така получения реагент (Cu 0.1 N, Na2CO32 N). pH трябва да бъде приблизително 9,4.

Carrez I-разтвор: 23,8 g Zn (C2H3O2).2H2O и 3 g кристализирала оцетна киселина се разтварят във вода е се долива до 100 ml.

Carrez II-разтвор: 10,6 g de K4F2(CN)6.3H2O се разтваря във вода и се долива до 100 ml.

Зрънца от пемза, третирани при кипенето със солна киселина, измити с вода и изсушени. Суспензия на Saccharomyces cerevisae: 25 g пресни дрожди в 100 ml вода (не се съхранява повече от една седмица в хладилник).

4.   Процедура

1 g от пробата за анализ се претегля с точност до 1 mg; поставя се в измерителна колба от 100 ml. Добавя се от 25 до 30 ml вода. Колбата се поставя в кипяща водна баня за три минути, след което се охлажда приблизително при 35 °C.

Добавят се 5 ml от суспензията на дрождите (2) и се разклаща. Измерителната колба със съдържанието се оставя във водна баня при температура от 38 до 40 °C за два часа.

След ферментирането, колбата се охлажда до температура от приблизително 20 °C. Добавят се 2,5 ml Carrez I-разтвор и се разклаща за тридесет секунди; след това се добавят 2,5 ml Carrez II-разтвор и отново се разклаща за тридесет секунди. Допълва се до 100 ml с вода, смесва се и се филтрира. Капва се количество от филтрата, което е не повече от 25 ml и при възможност съдържа от 40 до 80 mg лактоза; ако е необходимо, се допълва до 25 ml с вода и Luff-Schoorl-метода се определя съдържанието на безводната лактоза.

Само с дрожди се извършва пълен празен тест.

ЧАСТ II

1.   Определяне на съдържанието на лактоза с Luff-Schoorl-метода

Капват се 25 ml Luff-Schoorl-реагент и се поставят в Erlenmeyer-колба от 300 ml; добавя се 25 ml избистрен разтвор, претеглен с точност.

Добавят се две зрънца пемза и се подгрява, като се разклаща с ръка над непокрит пламък от средна височина; течността се оставя да заври за приблизително две минути. Erlenmeyer-колбата се поставя веднага на метална цедка с азбестово сито, под която предварително е запален пламък. Регулира се така, че Erlenmeyer-колбата да се нагрява единствено в долната част; след това се свързва с кондензатор за отлив. От този момент се оставя да кипи точно за десет минути. Веднага се охлажда в студена вода и се тества приблизително за пет минути, както следва:

Към течността се добавят 10 ml калиев йодид и веднага след това, но внимателно (тъй като може да възникне значително пенене), 25 ml сярна киселина 6 N.

Тестът с натриев тиосулфат се извършва до появяването на матов жълт цвят, като в края на теста се добавя индикатор за скорбяла.

Същият тест се извършва със смес от точно 25 ml реагент Luff-Schoorl и 25 ml вода, след добавянето на 10 ml калиев йодид и 25 ml сярна киселина 6 N, този път без кипене.

Със следната таблица се определя количеството лактоза в mg, отговарящо на разликата между резултатите от двата теста (изразено в ml натриев тиосулфат 0,1 N):

ТАБЛИЦА

Таблица за 25 ml Luff-Schoorl-реагент

(виж описанието в текста)

(1)  Регламент (ЕИО) № 222/88.

(2)  За продуктите, които съдържат повече от 40 % ферментационна захар, количеството на суспензията се увеличава.

ПРИЛОЖЕНИЕ XVIII

(член 13)

ОТКРИВАНЕ НА СИРИЩНА СУРОВАТКА В ОБЕЗМАСЛЕНО МЛЯКО НА ПРАХ ЗА ОБЩЕСТВЕНО СКЛАДИРАНЕ ЧРЕЗ ОПРЕДЕЛЯНЕТО НА ГЛИКОМАКРОПЕПТИДИ ЧРЕЗ ВИСОКООПТИМАЛНА ТЕЧНА ХРОМАТОГРАФИЯ (HPLC)

1.   Обхват и приложно поле

Този метод позволява откриването на сирищна суроватка в обезмаслено мляко на прах, предназначено за обществено складиране, чрез определянето на гликомакропептиди.

2.   Позоваване

Международен стандарт ISO 707 — Мляко и млечни продукти — методи за вземане на проби в съответствие с указанията, съдържащи се в приложение I(2)(в), последен параграф.

3.   Дефиниция

Съдържание на гликомакропептиди в обезмаслено мляко напрах: съдържание на субстанции, определено от метода, изложен по-долу, и изразено като процент от масата.

4.   Принцип

5.   Реагенти

Всички реагенти трябва да са с доказано аналитично качество. Използваната вода трябва да е дестилирана или с най-малко същата чистота.

5.1.   Разтвор на трихлор-оцетна киселина

240 g трихлор-оцетна киселина (Cl3CCOOH) се разтварят във вода и се долива до 1 000 ml

5.2.   Елюентен разтвор, pH 6,0

1,74 g Di-калиев фосфат (K2HPO4), 12,37 g Mono-калиев фосфат (KH2PO4) и 21,41 g натриев сулфат (Na2SO4) се разтварят в около 700 ml вода. Регулира се, ако е необходимо, до pH 6,0, като се използва разтвор на фосфорна киселина или калиев хидроксид.

Долива се до 1 000 ml с вода и се хомогенизира.

Елюентният разтвор се филтрира, преди да се използва, чрез мембранен филтър с 0,45 µm диаметър на пората.

5.3.   Промиващ разтворител

Един обем ацетонитрил (CH3CN) се смесва с девет обема вода. Преди да се използва, сместа се филтрира чрез мембранен филтър с 0,45 µm диаметър на пората.

Бележка: Може да бъде използван всеки друг промиващ разтворител с бактерициден ефект, който не уврежда ефективността на разтварянето в колоната.

5.4.   Стандартни проби

6.   Апаратура

Бележка: Възможно е да се работи с колони, които се държат на стайна температура, но тяхната ефективност на разтваряне е малко по-ниска. В този случай, при една и съща аналитична серия температурата би следвало да варира с по-малко от ± 5 °C.

7.   Вземане на проби

8.   Процедура

8.1.   Подготовка на тестовата проба

Млякото на прах се прехвърля в съд, снабден с уплътнен капак.и имащ вместимост, която е около два пъти обема на праха. Съдът се затваря веднага. Млякото на прах се смесва добре чрез многократна инверсия на съда.

8.2.   Тестова доза

2 000 + 0,001 g от тестовата проба се измерват в центрофужна туба (6.2).

8.3.   Отстраняване на протеини