31984L0425

ДЕСЕТА ДИРЕКТИВА НА КОМИСИЯТА

от 25 юли 1984 година

относно установяване на общностни методи за анализ за целите на официалния контрол на храните за животни

(84/425/ЕИО)

КОМИСИЯТА НА ЕВРОПЕЙСКИТЕ ОБЩНОСТИ,

като взе предвид Договора за създаване на Европейката икономическа общност,

като взе предвид Директива 70/373/ЕИО на Съвета от 20 юли 1970 г. относно въвеждането на общностни методи за вземане на проби и анализ за целите на официалния контрол на храните за животни (1), последно изменена с Акта за присъединяване на Гърция, и по-специално член 2 от нея,

като има предвид, че посочената директива изисква официалният контрол на храните за животни с цел проверка на съответствието с изискванията, предвидени със законов, подзаконов или административен акт, по отношение на качеството им и състава да се извършва въз основа на общностни методи за вземане на проби и анализ;

като има предвид, че Директиви 71/250/ЕИО (2), 73/46/ЕИО (3), 74/203/ЕИО (4), 75/84/ЕИО (5), 76/372/ЕИО (6) на Комисията, последно изменени с Директива 81/680/ЕИО (7), и Директиви 71/393/ЕИО (8), 72/199/ЕИО (9), 78/633/ЕИО (10), последно изменени с Директива 84/4/ЕИО (11), и Директива 81/715/ЕИО (12), вече са предвидили редица общностни методи за анализ; като има предвид, че с оглед напредъка в работата е препоръчително да се приеме нов метод;

като има предвид, че мерките, предвидени в настоящата директива, са в съответствие със становището на Постоянния комитет по храните за животни,

ПРИЕ НАСТОЯЩАТА ДИРЕКТИВА:

Член 1

Държавите-членки изискват анализът за целите на официалния контрол на храните за животни по отношение съдържанието на спирамицин в тях да се извършва съгласно описания в приложението метод.

Член 2

Държавите-членки въвеждат в сила законовите, подзаконовите и административните разпоредби, необходими за да се съобразят с настоящата директива, най-късно до 30 юни 1985 г. и незабавно уведомяват Комисията за това.

Член 3

Адресати на настоящата директива са държавите-членки.

(1)  ОВ L 170, 3.8.1970 г., стр. 2.

(2)  ОВ L 155, 12 7.1971 г., стр. 13.

(3)  ОВ L 83, 30.3.1973 г., стр. 21.

(4)  ОВ L 108, 22.4.1974 г., стр. 7.

(5)  ОВ L 32, 5.2.1975 г., стр. 26.

(6)  ОВ L 102, 15.4.1976 г., стр. 8.

(7)  ОВ L 246, 29.8.1981 г., стр. 32.

(8)  ОВ L 279, 20.12.1971 г., стр. 7.

(9)  ОВ L 123, 29.5 1972 г., стр. 6.

(10)  ОВ L 206, 29.7.1978 г., стр. 43.

(11)  ОВ L 15, 18.1.1984 г., стр. 28.

(12)  ОВ L 257, 10.9.1981 г., стр. 38.

ПРИЛОЖЕНИЕ

ОПРЕДЕЛЯНЕ СЪДЪРЖАНИЕТО НА СПИРАМИЦИН ЧРЕЗ ДИФУЗИЯ В ХРАНИТЕЛНА СРЕДА АГАР-АГАР

1.   Цел и обхват

Методът се използва за определяне съдържанието на спирамицин в храните за животни и предварително приготвените смеси. Долната граница на определяне е 1 mg/kg (1ррm) (1).

2.   Принцип

Пробата се извлича със смес на метанол/фосфат-бикарбонатен буфер при рН 8. Извлекът се декантира или центрофугира и разрежда. Неговата антибиотична активност се определя чрез измерване на дифузията на спирамицин в агар-агар среда, изкуствено заразена в Micrococcus luteus. Дифузията се показва чрез формиране на зони на инхибиране на микроорганизмите. Приема се, че диаметърът на тези зони е правопропорционален на логаритъма на антибиотичната концентрация в обхвата на използваните антибиотични концентрации.

3.   Микроорганизъм: Microсоccus luteus АТСС 9341 (NCTC 834, NCIB 8553)

3.1.   Поддържане на изходна култура

В тръби, съдържащи културална хранителна среда (4.1), се посява Micrococcus luteus и се слага в инкубатор за 24 часа при 30 °С. Културата се съхранява в хладилник при около 4 °С. Слага се отново в инкубатор на всеки 2 седмици.

3.2.   Приготвяне на бактериалната суспензия (2)

Взема се продуктът на свежа хранителна среда агар-агар (3.1) с 2 до 3 ml разтвор на натриев хлорид (4.3). Тази суспензия се използва, за да се посее в 250 ml културална среда (4.1), съдържаща се в Roux колба и се поставя в инкубатор за 18—20 часа при 30 °С Полученото се слага в 25 ml разтвор на натриев хлорид (4.3) и се разбърква. Суспензията се разрежда до 1/10 с разтвор на натриев хлорид (4.3). Прозрачността на суспензията трябва да бъде около 75 %, измерена при 650 nm в клетка 1 cm, спрямо разтвор на натриев хлорид (4.3). Тази суспензия може да се съхранява една седмица при около 4 °С.

4.   Културална среда и реактиви

4.1.   Културална среда (3)

4.2.   Културална среда за извършване на анализа (3)

4.3.   Разтвор на натриев хлорид 0,8 % (w/v).

Разтварят се 8 g натриев хлорид във вода и се разрежда до 1 000 ml; стерилизира се.

4.4.   Фосфатно-бикарбонатен буфер рН 8,0

4.5.   Смес на метанолов фосфатно-бикарбонатен буфер (4.4)

50/50 (v/v).

4.6.   Стандартна субстанция

Спирамицин с известна активност (в IU).

5.   Стандартни разтвори

Разтваря се точно претеглено количество стандартна субстанция (4.6) в сместа (4.5) и се разтваря със същата смес, за да се получи изходен разтвор, съдържащ 1 000 IU спирамицин на 1 ml. Съхраняван в запушена колба при 4 °С, този разтвор е стабилен до 5 дни.

От този изходен разтвор се приготвят чрез последователно разреждане със сместа (4.5) следните разтвори:

6.   Приготвяне на екстракта и разтворите за извършване на анализ

6.1.   Извличане

Претегля се проба от 20 g при храни за животни и от 1 до 20 g при предварително приготвени смеси. Добавят се 100 ml от сместа (4.5) и се разтръсква в продължение на 30 min. Центрофугира се или се декантира и плаващият по повърхността слой се разрежда с разтвора (4.5), за да се получи очаквано съдържание на спирамицин от 1 IU/ml (= U8).

За очаквани нива на спирамицин, по-ниски от 2,5 mg/kg храна за животни, извличането се извършва, както следва: претеглят се 20 g проба; добавят се 100 ml от сместа (4.5) и се разтръсква в продължение на 30 min; центрофугира се в продължение на няколко min, вземат се 50 ml от плаващия на повърхността разтвор и се изпаряват до около 4 ml при намалено налягане в ротационен изпарител при температура, непревишаваща 40 °С. Остатъкът се разрежда със сместа (4.5), за да се получи очаквано съдържание на спирамицин от 1 IU/ml (= U8).

6.2.   Разтвори за извършване на анализ

От разтвор U8 се приготвят разтвори U4 (очаквано съдържание: 0,5 IU/ml), U2 (очаквано съдържание: 0,25 IU/ml) и U1 (очаквано съдържание: 0,125 IU/ml) чрез последователно разреждане (1 + 1) със сместа (4.5).

7.   Процедура на извършване на анализа

7.1.   Посяване на средата за изпитване

В средата за изпитване (4.2) се посява бактериалната суспензия (3.2) при около 50 °С. Чрез предварителни опити в петрита със среда за изпитване (4.2) се определя количеството на бактериалната суспензия, необходимо за да се получат най-големите и най-ясни зони на инхибиране с различна концентрация на спирамицин.

7.2.   Подготовка на петритата

Дифузията през агар-агар се извършва в петрита с четирите концентрации на стандартния разтвор (S8, S4, S2 и S1) и четирите концентрации на анализирания разтвор (U8, U4, U2 и U1). Тези четири концентрации на екстракта и стандарта трябва задължително да се поставят във всяко петри. В тази връзка се избират петрита, достатъчно големи, за да позволят в средата агар-агар да се направят поне 8 отвора с диаметър от 10 до 13 mm и не по-малко от 30 mm между центровете. Тестът трябва да се извърши в петрита, състоящи се от лист стъкло, покрит с алуминиев или пластмасов пръстен, поставен отгоре, с вътрешен диаметър 200 mm и височина 20 mm.

В петритата се излива част от средата (4.2), посята както в 7.1, за да се получи слой, дебел около 2 mm (60 ml за петри с диаметър 200 mm). Оставя се да се изравни, пробиват се дупките и в тях се обозначават точно премерени обеми от разтворите за анализиране и стандартните разтвори (между 0,10 и 0,15 ml на дупка в зависимост от диаметъра). Всяка концентрация се полага поне 4 пъти, така че на всяко определяне да подлежат на оценка 32 зони на инхибиране.

7.3.   Поставяне в инкубатор

Петритата се поставят в инкубатор за 16—18 часа при температура 30 ± 2 °С.

8.   Оценяване

Измерва се диаметърът на зоните на инхибиране с точност до 0,1 mm. Отбелязват се средноаритметичните стойности на измерванията за всяка концентрация върху милиметрова хартия, показваща логаритъма на концентрациите във връзка с диаметрите на зоните на инхибиране. Начертават се линиите на най-добро съответствие на стандартния разтвор и екстракта.

Определя се „най-точно съответстващата“ точка за стандартното най-ниско ниво (SL), като се използва формулата:

Определя се „най-точно съответстващата“ точка за стандартното най-високо ниво (SH), като се използва формулата:

По подобен начин се изчисляват и „най-точно съответстващите“ точки за най-ниските нива на екстракта (UL) и най-високите нива на екстракта (UH), като във формулите се заменят S1, S2, S4 и S8 с U1, U2, U4 и U8  (4).

Изчислените стойности на SL и SH се нанасят на същата милиметрова хартия и се свързват, за да се получи линията на „най-точно съответствие“ за стандартния разтвор. По подобен начин се нанасят UL и UH и се свързват, за да се получи линията на „най-точно съответствие“ за екстракта.

При отсъствие на интерференции линиите трябва да са паралелни. За практически цели линиите могат да се считат паралелни, ако стойностите (SH – SL) и (UH – UL) не се различават с повече от 10 % от тяхната средна аритметична стойност.

Ако се окаже, че линиите не са паралелни, u1 и s1 или u8 и s8 могат да се изключат и SL, SH, UL и UH да се изчислят, като се използват алтернативните формули, за да се получат линиите на „най-точно съответствие“:

и по-подобен начин за UL и UH. Трябва да бъде удовлетворен същият критерий за успоредност. Фактът, че резултатът е изчислен от три нива, трябва да бъде отбелязан в крайния отчет.

Когато линиите се считат за успоредни, се изчислява логаритъмът на относителна активност (log A) посредством една от следните формули в зависимост от това, дали са използвани три или четири нива за оценка на успоредността.

За четири нива

За три нива

или

Активността на пробвания екстракт е равна на активността на релевантния стандарт умножена по А:

Ако относителната активност се окаже извън обхвата от 0,5 до 2, анализът се повтаря, като се правят подходящи корекции на концентрациите на екстракта или ако това не е възможно — на стандартните разтвори. Когато относителната активност не може да се доведе в изисквания обхват, всеки получен резултат се счита за приблизителен и това се отбелязва в крайния отчет.

Когато линиите не могат да се считат за успоредни, определянето се повтaря. Ако пак не може да се получи успоредност, определянето се счита за незадоволително.

Резултатите се изразяват в mg спирамицинова база на kg храна за животни.

9.   Повторяемост

Разликата между резултатите на две успоредни определяния, направени на същата проба от същия лаборант, не трябва да превишава:

(1)  1 mg спирамицинова основа е еквивалентен на 3 200 международни единици (UI)

(2)  Могат да бъдат използвани други методи, в случай че се установи, че при тях се получават сходни бактериални суспензии.

(3)  Може да се използва културална среда от търговски характер със сходен състав, даваща същите резултати

(4)  Малките букви s и u указват диаметрите на зоните на инхибиране.