02009R0152 — BG — 26.04.2017 — 005.001

---

Този текст служи само за информационни цели и няма правно действие. Институциите на Съюза не носят отговорност за неговото съдържание. Автентичните версии на съответните актове, включително техните преамбюли, са версиите, публикувани в Официален вестник на Европейския съюз и налични в EUR-Lex. Тези официални текстове са пряко достъпни чрез връзките, публикувани в настоящия документ

►B	РЕГЛАМЕНТ (ЕО) № 152/2009 НА КОМИСИЯТА от 27 януари 2009 година за определяне на методите за вземане на проби и анализ за целите на официалния контрол на фуражите (текст от значение за ЕИП) (ОВ L 054, 26.2.2009 г., стp. 1)

Изменен с

		Официален вестник
		№	страница	дата
M1	РЕГЛАМЕНТ (ЕС) № 278/2012 НА КОМИСИЯТА от 28 март 2012 година	L 91	8	29.3.2012
►M2	РЕГЛАМЕНТ (ЕС) № 51/2013 НА КОМИСИЯТА от 16 януари 2013 година	L 20	33	23.1.2013
►M3	РЕГЛАМЕНТ (ЕС) № 691/2013 НА КОМИСИЯТА от 19 юли 2013 година	L 197	1	20.7.2013
►M4	РЕГЛАМЕНТ (ЕС) № 709/2014 НА КОМИСИЯТА от 20 юни 2014 година	L 188	1	27.6.2014
M5	РЕГЛАМЕНТ (ЕС) 2017/645 НА КОМИСИЯТА от 5 април 2017 година	L 92	35	6.4.2017

---

▼B

РЕГЛАМЕНТ (ЕО) № 152/2009 НА КОМИСИЯТА

от 27 януари 2009 година

за определяне на методите за вземане на проби и анализ за целите на официалния контрол на фуражите

(текст от значение за ЕИП)

▼M3

Член 1

Вземането на проби за целите на официалния контрол на фуражите, и по-специално с оглед определянето на съставките им, включително материали, които съдържат, състоят се или са произведени от генетично модифицирани организми (ГМО), фуражни добавки, определени в Регламент (ЕО) № 1831/2003 на Европейския парламент и на Съвета ( 1 ), и нежелани вещества, определени в Директива 2002/32/ЕО на Европейския парламент и на Съвета ( 2 ), се извършва в съответствие с методите, определени в приложение I.

Методът за вземане на проби, установен в приложение I, е приложим за контрола на фуражите по отношение на определянето на остатъчни вещества от пестициди, определени в Регламент (ЕО) № 396/2005 на Европейския парламент и на Съвета ( 3 ), и контрола на спазването на Регламент (ЕС) № 619/2011.

▼B

Член 2

Подготовката на проби за анализ и представянето на резултатите се извършва в съответствие с методите, посочени в приложение II.

Член 3

Анализът на фуражите за целите на официалния контрол се провежда, като се използват методите, посочени в приложение III (Методи за анализ с цел контролиране на състава на фуражните съставки и на комбинирания фураж), приложение IV (Методи за анализ с цел контролиране на равнището на позволени добавки във фуражите), приложение V (Методи за анализ с цел контролиране на нежеланите вещества във фуражите) и приложение VI (Методи за анализ за определяне на съставките от животински произход за целите на официалния контрол на фуражите).

Член 4

Енергийната стойност на комбинираните фуражи за домашни птици се изчислява в съответствие с приложение VII.

Член 5

Посочените в приложение VIII методи за анализ с цел контролиране на непозволено наличие на добавки, чието ползване във фуражи вече не е разрешено, се използват за потвърждение.

Член 6

Директиви 71/250/ЕИО, 71/393/ЕИО, 72/199/ЕИО, 73/46/ЕИО, 76/371/ЕИО, 76/372/ЕИО, 78/633/ЕИО, 81/715/ЕИО, 84/425/ЕИО, 86/174/ЕИО, 93/70/ЕИО, 93/117/ЕО, 98/64/ЕО, 1999/27/ЕО, 1999/76/ЕО, 2000/45/ЕО, 2002/70/ЕО и 2003/126/ЕО се отменят.

Позоваванията на отменените директиви се считат за позовавания на настоящия регламент и се четат съгласно таблиците на съответствието в приложение IX.

Член 7

Настоящият регламент влиза в сила на двадесетия ден след публикуването му в Официален вестник на Европейския съюз.

Той се прилага от 26 август 2009 г.

Настоящият регламент е задължителен в своята цялост и се прилага пряко във всички държави-членки.

▼M3

---

ПРИЛОЖЕНИЕ I

МЕТОДИ ЗА ВЗЕМАНЕ НА ПРОБИ

1.   ЦЕЛ И ОБХВАТ

Пробите, предназначени за официалния контрол на фуражите, се вземат по описаните по-долу методи. Така получените проби се смятат за представителни за изследваните партиди.

Целта на вземането на представителни проби е да се получи малка част от една партида по такъв начин, че определянето на която и да е конкретна характеристика на тази част да представлява средната стойност на характеристиката за цялата партида. Проба от партидата се взема, като многократно се вземат точкови проби на различни места в партидата. Тези точкови проби се смесват, така че да образуват съставна проба, от която чрез представително разделяне се подготвят представителни крайни проби.

Ако при визуална проверка части от фуража, подлежащ на вземане на проби, показват разлика в качеството в сравнение с останалата част на фуража от същата партида, тези части трябва да бъдат отделени от останалата част на фуража и третирани като отделна подпартида. Ако не е възможно фуражът да се раздели на подпартиди, от него се вземат проби като от една единична партида. В такива случаи това се посочва в протокола за вземане на проби.

Когато за даден фураж, от който се взети проби в съответствие с разпоредбите на настоящия регламент, се установи, че не отговаря на изискванията на ЕС, и той съставлява част от партида фуражи от една и съща категория или с едно и също описание, се приема, че констатациите се отнасят до всичкия фураж от тази партида, освен ако след щателна оценка не се окаже неоснователно да се счита, че останалата част от партидата не отговаря на изискванията на ЕС.

2.   ОПРЕДЕЛЕНИЯ

—

Партида : определено количество фураж, за което е установено, че има общи характеристики, като произход, разновидност, вид на опаковката, опаковчик, изпращач или етикетиране, и — в случай на производствен процес — представлява единица продукция от един завод, който използва еднакви производствени параметри, или няколко такива единици, когато са произведени в последователен ред и са складирани заедно.

—	Изследвана партида : партида или определена част от партидата или подпартидата.

—	Запечатана проба : проба, запечатана по такъв начин, че да се предотврати всякакъв достъп до нея, без да се счупи или премахне печатът или пломбата.

—	Точкова проба : количество, взето от едно място на изследваната партида.

—	Съставна проба : съвкупността от всички точкови проби, взети от една и съща изследвана партида.

—	Редуцирана проба : част от съставната проба, получена от нея чрез представително редуциране.

—	Крайна проба : част от редуцираната проба или от хомогенизираната съставна проба.

—	Лабораторна проба : проба, предназначена за лабораторията (както е получена в лабораторията), която може да бъде крайна, редуцирана или съставна проба.

3.   ОБЩИ РАЗПОРЕДБИ

4.   АПАРАТУРА

4.1.	Апаратурата за вземане на проби трябва да е изработена от материали, които не могат да замърсят взетите за проба продукти. Апаратурата, предназначена да бъде използвана многократно, трябва да се почиства лесно, за да се избегне кръстосаното замърсяване на пробите.

4.2.

Препоръчвана апаратура за вземане на проби от твърди фуражи 4.2.1.    Ръчно вземане на проби 4.2.1.1.   Плоска лопатка с вертикални страни 4.2.1.2. Сонда за вземане на проби с дълъг прорез или камери. Размерите на сондата за вземане на проби трябва да съответстват на характеристиките на изследваната партида (дълбочина на контейнера, размери на чувалите и т.н.) и на големината на частиците на фуража. Ако сондата за вземане на проби има няколко отвора, те трябва да водят до разделени камери или да са с последователно изместване по обиколката на напречното сечение на сондата, за да се гарантира, че пробата е взета от различни места по дължината на сондата. 4.2.2.    Механично вземане на проби Може да се използва подходяща механична апаратура за вземане на проби от фураж от конвейерна лента. Подходяща означава, че се вземат проби поне от цялото сечение на потока. Проби от фураж на конвейерна лента (при високи скорости на потока) може да се вземат с автоматичен пробовземач. 4.2.3.    Делителни устройства Ако е възможно и уместно, за подготовката на представителни редуцирани проби следва да се използват устройства, предназначени да разделят пробата на приблизително равни части.

5.   КОЛИЧЕСТВЕНИ ИЗИСКВАНИЯ ПО ОТНОШЕНИЕ НА БРОЯ НА ТОЧКОВИТЕ ПРОБИ

5.1.    Количествени изисквания по отношение на точковите проби във връзка с контрола на вещества или продукти, разпределени равномерно във фуража

5.1.1.    Насипни твърди фуражи

5.1.2.    Течни фуражи в насипно състояние

5.1.3.    Пакетирани фуражи

Фуражите (твърди и течни) могат да бъдат пакетирани в торби, чували, кутии, бидони и други, които в таблицата се обозначават като единици. Проби от големи единици (≥ 500 кг или литра) трябва да се вземат в съответствие с разпоредбите за насипни фуражи (вж. точки 5.1.1 и 5.1.2).

5.1.4.    Фуражни блокчета и минерални буци за близане

На една изследвана партида от 25 единици се взема за проба най-малко едно блокче или една буца, но не повече от четири блокчета или буци за близане.

За блокчета или буци за близане, които са с тегло до 1 kg, за точкова проба се приема съдържанието на едно блокче или една буца.

5.1.5.    Тревни и груби фуражи

5.2.    Количествени изисквания по отношение на точковите проби във връзка с контрола на съставки или вещества, които могат да са разпределени неравномерно във фуража

Тези количествени изисквания по отношение на точковите проби се използват в следните ситуации:

Ако надзорният орган има сериозни основания да подозира, че такова неравномерно разпределение съществува и в случай на кръстосано замърсяване от съставка или вещество в комбиниран фураж, може да се прилагат количествените изисквания, предвидени в таблицата по-долу.

5.3.    Количествени изисквания по отношение на точковите проби при много големи партиди

В случай на големи изследвани партиди (изследвани партиди > 500 тона) броят на точковите проби, които трябва да се вземат, е равен на 40 точкови проби + √ от тоновете по отношение на контрола на вещества или продукти, разпределени равномерно във фуража, или 100 точкови проби + √ от тоновете по отношение на контрола на съставки или вещества, които могат да са разпределени неравномерно във фуражните суровини.

6.   КОЛИЧЕСТВЕНИ ИЗИСКВАНИЯ ПО ОТНОШЕНИЕ НА СЪСТАВНИТЕ ПРОБИ

7.   КОЛИЧЕСТВЕНИ ИЗИСКВАНИЯ ПО ОТНОШЕНИЕ НА КРАЙНИТЕ ПРОБИ

Крайни проби

Изисква се анализ на поне една крайна проба. Масата на крайната проба за анализ не трябва да бъде по-малка от следното:

8.   МЕТОД ЗА ВЗЕМАНЕ НА ПРОБИ ОТ МНОГО ГОЛЕМИ ПАРТИДИ ИЛИ ПАРТИДИ, СЪХРАНЯВАНИ И ТРАНСПОРТИРАНИ ПО НАЧИН, ПРИ КОЙТО ВЗЕМАНЕТО НА ПРОБИ ОТ ЦЯЛАТА ПАРТИДА НЕ Е ОСЪЩЕСТВИМО

8.1.    Общи принципи

В случай че начинът на транспортиране или съхранение на дадена партида не позволява да се вземат точкови проби от цялата партида, за предпочитане е вземането на проби от такива партиди да се извърши, докато партидата е в движение.

При големи складови помещения, предназначени за съхраняване на фуражи, операторите следва да бъдат насърчавани да инсталират съответно оборудване в склада, което позволява (автоматично) вземане на проби от цялата складирана партида.

Когато се прилагат процедурите за вземане на проби, предвидени в настоящата точка 8, операторът във фуражния сектор или неговият представител биват осведомени за процедурата. Ако операторът във фуражния сектор или неговият представител оспорят тази процедура за вземане на проби, те трябва да дадат възможност на компетентния орган да вземе проби от цялата партида за сметка на оператора.

8.2.    Големи партиди, транспортирани с кораб

8.2.1.    Динамично вземане на проби от големи партиди, транспортирани с кораб

За предпочитане е вземането на проби от големи партиди на кораби да се извършва, докато продуктът е в движение (динамично вземане на проби).

Вземането на проби трябва да се извършва по трюмове (единици, които могат физически да бъдат отделени). Трюмовете обаче се изпразват частично един след друг, така че след прехвърлянето в съоръженията за съхранение първоначалното физическо разделяне вече не съществува. Поради това вземането на проби може да се извършва в зависимост от първоначалното физическо разделяне или в зависимост от разделянето след прехвърляне в съоръженията за съхранение.

Разтоварването на кораба може да продължи няколко дни. Обикновено вземането на проби се извършва на равномерни интервали по време на цялото разтоварване. Официалният инспектор обаче не винаги може или е целесъобразно да присъства на вземането на проби по време на цялото разтоварване. Поради това се разрешава да се вземат проби от част от цялата партида (изследвана партида). Броят на точковите проби се определя, като се вземе предвид размерът на изследваната партида.

Когато се вземат проби от част от партида фураж от една и съща категория или с едно и също описание и се установи, че тази част от партидата не отговаря на изискванията на ЕС, се приема, че констатациите се отнасят до всичкия фураж от тази партида, освен ако след щателна оценка не се окаже неоснователно да се счита, че останалата част от партидата не отговаря на изискванията на ЕС.

Дори когато официалната проба се взема автоматично, присъствието на инспектор е необходимо. Когато обаче автоматичното вземане на проби се извършва по предварително зададени параметри, които не могат да бъдат променяни по време на вземането на пробите, и точковите проби се събират в запечатан с пломба съд, което предотвратява всякакви потенциални измами, то присъствието на инспектор се изисква само в началото на вземането на проби, всеки път, когато съдът с пробите се сменя, и в края на вземането на пробите.

8.2.2.    Статично вземане на проби от партиди, транспортирани с кораб

Ако вземането на проби се извършва статично, трябва да се прилага същата процедура, както предвидената по отношение на съоръжения за съхранение (силози), достъпни отгоре (вж. точка 8.4.1).

Пробите се вземат от достъпната част (отгоре) на партидата/трюма. Броят на точковите проби се определя, като се вземе предвид размерът на изследваната партида. Когато се вземат проби от част от партида фураж от една и съща категория или с едно и също описание и се установи, че тази част от партидата не отговаря на изискванията на ЕС, се приема, че констатациите се отнасят до всичкия фураж от тази партида, освен ако след щателна оценка не се окаже неоснователно да се счита, че останалата част от партидата не отговаря на изискванията на ЕС.

8.3.    Вземане на проби от големи партиди, съхранявани в складове

Пробите се вземат от достъпната част на партидата. Броят на точковите проби се определя, като се вземе предвид размерът на изследваната партида. Когато се вземат проби от част от партида фураж от една и съща категория или с едно и също описание и се установи, че тази част от партидата не отговаря на изискванията на ЕС, се приема, че констатациите се отнасят до всичкия фураж от тази партида, освен ако след щателна оценка не се окаже неоснователно да се счита, че останалата част от партидата не отговаря на изискванията на ЕС.

8.4.    Вземане на проби от съоръжения за складиране (силози)

8.4.1.    Вземане на проби от силози, които са (лесно) достъпни отгоре

Пробите се вземат от достъпната част на партидата. Броят на точковите проби се определя, като се вземе предвид размерът на изследваната партида. Когато се вземат проби от част от партида фураж от една и съща категория или с едно и също описание и се установи, че тази част от партидата не отговаря на изискванията на ЕС, се приема, че констатациите се отнасят до всичкия фураж от тази партида, освен ако след щателна оценка не се окаже неоснователно да се счита, че останалата част от партидата не отговаря на изискванията на ЕС.

8.4.2.    Вземане на проби от силози, които не са достъпна отгоре (затворени силози)

8.4.2.1.    Силози, които не са достъпни отгоре (затворени силози), с размер > 100 тона

Пробите от фуражи, съхранявани в такива силози, не могат да се вземат статично. Поради това, ако от фуража в силоза трябва да бъдат взети проби, а пратката не може да бъде преместена, с оператора трябва да се постигне договореност той да информира инспектора кога силозът ще бъде разтоварен, с цел да се даде възможност за вземане на проби, когато фуражът е в движение.

8.4.2.2.    Силози, които не са достъпни отгоре (затворени силози), с размер < 100 тона

Процедурата за вземане на проби включва пускането на количество от 50—100 kg в съд и вземането на пробите от него. Размерът на съставната проба съответства на цялата партида, а броят на точковите проби се определя от количеството, пуснато от силоза в съда за вземане на проби. Когато се вземат проби от част от партида фураж от една и съща категория или с едно и също описание и се установи, че тази част от партидата не отговаря на изискванията на ЕС, се приема, че констатациите се отнасят до всичкия фураж от тази партида, освен ако след щателна оценка не се окаже неоснователно да се счита, че останалата част от партидата не отговаря на изискванията на ЕС.

8.5.    Вземане на проби от насипни фуражи в големи затворени контейнери

Често от такива партиди могат да се вземат проби само в момента на разтоварване. В някои случаи разтоварването е невъзможно на пункта за внос или контрол и поради това пробите следва да се вземат, когато контейнерите се разтоварват.

9.   ИНСТРУКЦИИ ОТНОСНО ВЗЕМАНЕТО, ПОДГОТОВКАТА И ОПАКОВАНЕТО НА ПРОБИТЕ

9.1.    Общи положения

Пробите се вземат и се подготвят без излишно забавяне, като се спазват изискваните предпазни мерки, за да се избегне подмяна или замърсяване на продукта. Инструментите, както и повърхностите и съдовете за поставяне на пробите трябва да са чисти и сухи.

9.2.    Точкови проби

Точковите проби трябва да се вземат произволно от цялата изследвана партида, а размерите им трябва да са приблизително еднакви.

Размерът на точковите проби е най-малко 100 грама или 25 грама при тревни или груби фуражи с ниска относителна плътност.

Ако в съответствие с правилата за процедурата за вземане на проби, установени в точка 8, трябва да бъдат взети по-малко от 40 точкови проби, размерът на точковите проби се определя в зависимост от изисквания размер на съставната проба, който трябва да бъде постигнат (вж. точка 6).

При вземането на проби от малки партиди пакетирани фуражи, когато в съответствие с количествените изисквания трябва да се вземе ограничен брой точкови проби, за точкова проба се приема съдържанието на една оригинална единица, която не надвишава 1 kg или един литър.

В случай на вземане на проби от пакетирани фуражи, съставени от малки единици (напр. < 250 g), размерът на точковата проба зависи от размера на единицата.

9.2.1.    Насипни фуражи

Когато е уместно, пробите могат да се вземат при преместване на изследваната партида (товарене или разтоварване).

9.2.2.    Пакетирани фуражи

След като се избере необходимият брой единици за вземане на проби, както е указано в точка 5, част от съдържанието на всяка единица се отделя с помощта на сонда или лопатка. Ако е необходимо, пробите се вземат, след като единиците се изсипят отделно една от друга.

9.2.3.    Хомогенни или поддаващи се на хомогенизация течни или полутечни фуражи

След като се избере необходимият брой единици за вземане на проби, както е указано в точка 5, съдържанието им се хомогенизира, ако е необходимо, и от всяка единица се взема определено количество.

Точковите проби могат да се вземат при източване на съдържанието.

9.2.4.    Неподдаващи се на хомогенизация течни или полутечни фуражи

След като се избере необходимият брой единици за вземане на проби, както е указано в точка 5, се вземат проби от различни нива.

Пробите могат да се вземат също така при източване на съдържанието, след отстраняване на първите количества.

И в двата случая общият обем на взетите проби не трябва да бъде под 10 литра.

9.2.5.    Фуражни блокчета и минерални буци за близане

След като бъде избран необходимият брой блокчета или буци за вземане на проби, както е указано в точка 5, може да се вземе част от всяко блокче или буца. В случай на съмнение, че блокчето или буцата е нехомогенно(а), като проба може да се вземе цялото блокче или цялата буца.

За блокчета или буци за близане с тегло до 1 kg за точкова проба се приема съдържанието на едно блокче или една буца.

9.3.    Подготовка на съставните проби

Точковите проби се смесват, за да се образува една-единствена съставна проба.

9.4.    Подготовка на крайните проби

Материалът в съставната проба се смесва грижливо ( 4 ).

9.5.    Опаковане на пробите

Контейнерите или опаковките се запечатват с пломба/печат и се етикетират по такъв начин, че да не могат да бъдат отваряни, без да се увреди пломбата/печата. Целият етикет трябва да е захванат от пломбата/печата.

9.6.    Изпращане на пробите до лабораторията

Пробата се изпраща без излишно забавяне на определената лаборатория за анализи, заедно с необходимите за анализа данни.

10.   ПРОТОКОЛ ЗА ВЗЕМАНЕ НА ПРОБИТЕ

За всяко вземане на проба се изготвя протокол, по който недвусмислено се идентифицират изследваната партида и нейният размер.

В протокола се посочват и евентуални отклонения от процедурата за вземане на проби, предвидена в настоящия регламент.

Протоколът се предоставя на разположение на официалната контролна лаборатория, както и на оператора във фуражния сектор и/или лабораторията, определена от него.

---

ПРИЛОЖЕНИЕ II

ОБЩИ РАЗПОРЕДБИ ОТНОСНО МЕТОДИТЕ ЗА АНАЛИЗ НА ФУРАЖИТЕ

А.   ПОДГОТОВКА НА ПРОБИТЕ ЗА АНАЛИЗ

1.    Цел

Описаните по-долу процедури се отнасят до подготовката за анализ на пробите, изпратени на лабораториите за контрол след вземане на проби, проведено в съответствие с разпоредбите в приложение I.

Лабораторните проби трябва да бъдат подготвени по такъв начин, че претеглените количества, предвидени в методите за анализ, да са хомогенни и представителни за крайните проби.

2.    Необходими предпазни мерки

Процедурата, която трябва да се следва за подготовка на пробите, зависи от използваните методи за анализ и от контролираните съставки или вещества. Поради това е от изключително значение да се гарантира, че следваната процедура за подготовка на пробите е подходяща за използвания метод за анализ и за контролираните съставки или вещества.

Всички необходими действия трябва да се извършват по такъв начин, че да се избегне, доколкото е възможно, замърсяване на пробата или промени в нейния състав.

Стриването, разбъркването и пресяването се извършват без забавяне с минимално излагане на пробата на въздух и светлина. Не се използва оборудване за смилане и стриване, което може да предизвика значително загряване на пробата.

За фуражите, които са особено чувствителни към загряване, се препоръчва ръчно смилане. Следи се също самият апарат да не бъде източник на замърсяване.

Ако подготовката не може да се проведе без значими промени в съдържанието на влага на пробата, се определя съдържанието на влага преди и след подготовката в съответствие с метода, описан в част А от приложение III.

3.    Процедура

3.1.    Обща процедура

Аликвотната част за изследване се взема от крайната проба. Методите на конуса и на четвъртинките не се препоръчват, защото при тях може да се получат аликвотни части с голяма грешка при разделяне.

3.1.1.    Фуражи, които могат да бъдат смлени във вида, в който са

3.1.2.    Фуражи, които могат да бъдат смлени след изсушаване

3.1.3.    Течни или полутечни фуражи

3.1.4.    Други фуражи

3.2.    Специална процедура в случай на изследване чрез визуална проверка или микроскопско изследване или когато цялата съставна проба се хомогенизира

4.    Съхранение на пробите

Пробите се съхраняват при температура, при която не се променя техният състав. Пробите, предназначени за анализ на витамини или вещества, които са особено чувствителни към светлина, се съхраняват при такива условия, че светлината да не оказва неблагоприятно въздействие върху тях.

Б.   РАЗПОРЕДБИ ОТНОСНО РЕАКТИВИТЕ И АПАРАТУРАТА, ИЗПОЛЗВАНИ ПРИ МЕТОДИТЕ ЗА АНАЛИЗ

В.   ПРИЛАГАНЕ НА МЕТОДИТЕ ЗА АНАЛИЗ И ИЗРАЗЯВАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ

1.    Процедура за екстракция

При няколко метода е необходима конкретна процедура за екстракция. По принцип могат да бъдат приложени други процедури за екстракция освен посочената в метода процедура, при условие че е доказано, че използваната процедура за екстракция има еквивалентна екстракционна ефективност за анализираната матрица, каквато има и упоменатата в метода процедура.

2.    Процедура за очистване

При няколко метода е необходима конкретна процедура за очистване. По принцип могат да бъдат приложени други процедури за очистване освен посочената в метода процедура, при условие че е доказано, че използваната процедура за очистване има еквивалентна очиствателна ефективност за анализираната матрица, каквато има и упоменатата в метода процедура.

3.    Брой на определянията

При анализ на нежелани вещества, ако резултатът от първото определяне е значително (> 50 %) по-нисък от стойността, която подлежи на контрол, не са необходими допълнителни определяния, при условие че се прилагат подходящите процедури за осигуряване на качеството. В други случаи е необходим повторен анализ (второ определяне), за да се изключи възможността за вътрешно кръстосано замърсяване на пробите или случайно объркване на пробите. За проверка на съответствието се използва средната стойност от двете определяния, като се отчита неопределеността на измерването.

При контрол на декларирано съдържание на вещество или съставка, ако резултатът от първото определяне потвърди декларираното съдържание, т.е. ако аналитичният резултат попада в интервала на допустимото отклонение за декларираното съдържание, не са необходими допълнителни определяния, при условие че се прилагат подходящи процедури за осигуряване на качеството. В други случаи е необходим повторен анализ (второ определяне), за да се изключи възможността за вътрешно кръстосано замърсяване на пробите или случайно объркване на пробите. За проверка на съответствието се използва средната стойност от двете определяния, като се отчита неопределеността на измерването.

В някои случаи интервалът на допустимото отклонение е определен от законодателството, например в Регламент (ЕО) № 767/2009 на Европейския парламент и на Съвета от 13 юли 2009 г. относно пускането на пазара и употребата на фуражи, за изменение на Регламент (ЕО) № 1831/2003 на Европейския парламент и на Съвета, за отмяна на Директива 79/373/ЕИО на Съвета, Директива 80/511/ЕИО на Комисията, директиви 82/471/ЕИО, 83/228/ЕИО, 93/74/ЕИО, 93/113/ЕО и 96/25/ЕО на Съвета, както и на Решение 2004/217/ЕО на Комисията ( 7 ).

4.    Протокол за използвания метод за анализ

В протокола за анализ се посочва използваният метод за анализ.

5.    Протокол за аналитичния резултат

Аналитичният резултат се изразява по начина, посочен в метода за анализ, със съответен брой значещи цифри и ако е необходимо, се коригира в зависимост от съдържанието на влага в крайната проба преди подготовката.

6.    Неопределеност на измерването и степен на възстановяване при анализ на нежелани вещества

По отношение на нежеланите вещества по смисъла на Директива 2002/32/ЕО продукти, предназначени за хранене на животни, се считат за неотговарящи на изискването за максимално съдържание, ако се прецени, че стойността на аналитичния резултат по отношение на фураж със съдържание на влага 12 % надвишава максималното съдържание, като се отчитат разширената неопределеност на измерването и корекцията за възстановяване. За да се оцени спазването на максималното съдържание, се използва анализираната концентрация, след като се коригира със стойността на възстановяването и след изваждане на разширената неопределеност на измерването. Тази процедура е приложима единствено в случаи, когато методът за анализ позволява оценка на неопределеността на измерването и корекция за възстановяване (тя не може да се прилага например при микроскопски изследвания).

Аналитичният резултат се отчита, както следва (доколкото използваният метод за анализ позволява да се оценят неопределеността на измерването и степента на възстановяване):

Ако обаче аналитичният резултат е значително (> 50 %) по-нисък от стойността, която подлежи на контрол, и при условие че се прилагат подходящите процедури за осигуряване на качеството и анализът се прави само за да се провери съответствието със законовите разпоредби, аналитичният резултат може да се отчете, без да се прави корекция за възстановяване и в тези случаи отчитането на степента на възстановяване и на неопределеността при измерване може да бъде пропуснато.

▼B

---

ПРИЛОЖЕНИЕ III

МЕТОДИ ЗА АНАЛИЗ С ЦЕЛ КОНТРОЛ НА СЪСТАВА НА ФУРАЖНИТЕ СУРОВИНИ И НА КОМБИНИРАНИТЕ ФУРАЖИ

А.   ОПРЕДЕЛЯНЕ НА СЪДЪРЖАНИЕТО НА ВЛАГА

1.   Цел и обхват

Настоящият метод дава възможност да се определи съдържанието на влага във фуражи. В случай, че фуражът съдържа летливи вещества, като например органични киселини, трябва да се отбележи, че заедно със съдържанието на влага се откриват и значителни количества от тези летливи вещества.

Методът не обхваща анализа на млечните продукти в качеството им на фуражни суровини, анализа на неорганичните вещества и смесите, съставени предимно от неорганични вещества, анализа на животинските и растителните мазнини и масла или анализа на маслодайните семена и плодове.

2.   Принцип

Пробата се изсушава при точно определени условия, които варират в зависимост от вида фураж. Загубата на тегло се определя посредством претегляне. При работа с твърди фуражи, които имат високо съдържание на влага, е необходимо да се извърши предварително сушене.

3.   Апаратура

4.   Процедура

N.B.:

Описаните в този раздел операции следва да се извършват незабавно след отварянето на опаковките с проби. Провежда се най-малко двукратен анализ.

4.1.   Подготовка

4.1.1.    Фуражи, различни от изброените в т. 4.1.2 и т. 4.1.3.

Вземат се най-малко 50 g от пробата. При необходимост това количество се раздробява или разделя така, че да се избегне промяна в съдържанието на влага (вж. т. 6).

4.1.2.    Зърнени култури и булгур

Вземат се най-малко 50 g от пробата. Смилат се на ситни частици, от които поне 50 % да могат да преминат през сито с големина на отворите 0,5  mm и от които най-много 10 % да не могат да преминат през сито с кръгли отвори с размер 1 mm.

4.1.3.    Фуражи в течно или пастообразно състояние и фуражи, състоящи се предимно от масла и мазнини.

Вземат се около 25 g от пробата, претеглят се с точност до 10 mg, добавя се съответното количество безводен пясък, претеглено с точност до 10 mg, и се разбърква до получаването на хомогенен продукт.

4.2.   Сушене

4.2.1.    Фуражи, различни от изброените в т. 4.2.2 и т. 4.2.3.

Съдът (т. 3.3) се претегля заедно с капака си с точност до 1 mg. В претегления съд се измерват с точност до 1 mg около 5 g от пробата и се разстилат равномерно. Съдът, без капака, се поставя в предварително загрятата до 103 oC пещ. За да се предотврати нежелателното спадане на температурата, съдът се поставя в пещта възможно най-бързо. Пробата се оставя да съхне четири часа, считано от времето на възстановяване на температурата от 103 oC. Капакът се поставя обратно върху съда, последният се изважда от пещта, оставя се да изстива 30—45 min в ексикатора (т. 3.6) и се претегля с точност до 1 mg.

За фуражи, състоящи се предимно от масла и мазнини, пробите се сушат 30 min по-дълго при температура 130 oC. Разликата между стойностите за съдържанието на влага, получени от двете претегляния, не трябва да надвишава 0,1  %.

4.2.2.    Зърнени култури, брашно, булгур и грис

Съдът (т. 3.3) се претегля заедно с капака с точност до 0,5  mg. В претегления съд се измерват с точност до 1 mg около 5 g от смляната проба и се разстилат равномерно. Съдът, без капака, се поставя в предварително загрятата до 130 oC пещ. За да се предотврати нежелателното спадане на температурата, съдът се поставя в пещта възможно най-бързо. Пробата се оставя да съхне четири часа, считано от времето на възстановяване на температурата от 130 oC. Капакът се поставя обратно върху съда, последният се изважда от пещта, оставя се да изстива 30—45 min в ексикатора (т. 3.6) и се претегля с точност до 1 mg.

Съдът (т. 3.3) се претегля заедно с капака с точност до 0,5 mg. В претегления съд се измерват с точност до 1 mg около 5 g от пробата и се разстилат равномерно. Съдът, без капака, се поставя в предварително загрятата от 80 oС до 85 oC вакуумна пещ (т. 3.5). За да се предотврати нежелателното спадане на температурата, съдът се поставя в пещта възможно най-бързо.

Налягането се увеличава до 100 Torr и пробата се оставя да се суши четири часа при това налягане на поток горещ сух въздух или посредством изсушаващ агент (около 300 g за 20 проби). Във втория случай вакуумната помпа се изключва, когато се достигне предписаното налягане. Времето на сушене се отчита от момента на възстановяване на температурата от 80 oС—85 oC в пещта. Налягането в пещта внимателно се понижава и изравнява с атмосферното. Пещта се отваря, капакът се поставя веднага върху съда, съдът се изважда от пещта, оставя се да се охлади за 30—45 min в ексикатора (т. 3.6) и се претегля с точност до 1 mg. Суши се още 30 min във вакумната пещ на 80 oC—85 oC и се претегля отново. Разликата между стойностите за съдържанието на влага, получени от двете претегляния, не трябва да надвишава 0,1  %.

4.3.   Предварително сушене

4.3.1.    Фуражи, различни от посочените в т. 4.3.2

Твърдите фуражи с високо съдържание на влага, което затруднява раздробяването, трябва да се подлагат на предварително сушене по следния начин:

Претеглят се 50 g от проба от нераздробен фураж се с точност до 10 mg (пресовани или слепени фуражи при необходимост могат да бъдат грубо разделени) в подходящ съд (напр. алуминиева плоча с размери 20 × 12 cm и височина на ръба 0,5  cm). Пробата се оставя да съхне в пещ при температура 60 oС—70 oC, докато съдържанието на влага спадне до 8 %—12 %. Пробата се изважда от пещта, оставя се да изстине без капак в лабораторията в продължение на един час и се претегля с точност до 10 mg. Незабавно се раздробява, както е указано в т. 4.1.1 и се суши, както е указано в т. 4.2.1 или т. 4.2.3 в зависимост от свойствата на фуража.

4.3.2.    Зърнени култури

Зърно със съдържание на влага над 17 % трябва да се подложи на предварително сушене по следния начин:

Претеглят се 50 g несмляно зърно с точност до 10 mg в подходящ съд (напр. алуминиева плоча с размери 20 × 12 cm и височина на ръба 0,5  cm). Оставя се да се суши за 5—7 min в пещ при температура 130 oC. Пробата се изважда от пещта, оставя се да изстине без капак в лабораторията в продължение на два часа и се претегля с точност до 10 mg. Незабавно се смила, както е указано в т. 4.1.2 и се суши, както е указано в т. 4.2.2.

5.   Изчисляване на резултатите

Съдържанието на влага (Х) като процент от пробата се изчислява по следните формули:

5.1.   Изсушаване без предварително сушене

където:

m

=

първоначално тегло в грамове на пробата за анализ,

m0

=

тегло в грамове на сухата проба за анализ.

5.2.   Изсушаване с предварително сушене

където:

m

=

първоначално тегло в грамове на пробата за анализ,

m1

=

тегло в грамове на пробата за анализ след предварителното сушене,

m2

=

тегло в грамове на пробата за анализ след раздробяване или смилане,

m0

=

тегло в грамове на сухата проба за анализ.

5.3.   Повторяемост

Разликата между резултатите от две паралелни определяния, проведени върху една и съща проба, не трябва да надвишава 0,2  % от абсолютната стойност на влагата.

6.   Забележки

В случай, че се наложи раздробяване, и ако това промени съдържанието на влага в продукта, резултатите от анализа на съставките на фуража трябва да бъдат коригирани въз основа на съдържанието на влага на пробата в първоначалното ѝ състояние.

Б.   ОПРЕДЕЛЯНЕ НА ВЛАГА В ЖИВОТИНСКИ И РАСТИТЕЛНИ МАЗНИНИ И МАСЛА

1.   Цел и обхват

Настоящият метод дава възможност да се определи съдържанието на вода и летливи вещества, съдържащи се в животински и растителни мазнини и масла.

2.   Принцип

Пробата се суши, докато теглото ѝ стане постоянно (намаляването на теглото при две последователни претегляния трябва да е по-малко или равно на 1 mg), при 103 oC. Загубата на тегло се определя посредством претегляне.

3.   Апаратура

4.   Процедура

В сухото претеглено блюдо (т. 3.1), в което е поставен термометърът (т. 3.2) се претеглят с точност до 1 mg около 20 g от хомогенизираната проба. Пробата се нагрява върху пясъчната баня или котлона (т. 3.3), като се разбърква непрекъснато с термометъра така, че да се достигне температура 90 oC за около 7 min.

Нагряването се намалява, като се наблюдава честотата, с която се появяват мехурчета от дъното на блюдото. Температурата не трябва да надвишава 105 oC. Разбъркването продължава, като се стърже дъното на блюдото, докато престанат да се образуват мехури.

За да се осигури напълно отстраняване на влагата, нагряването се повтаря няколко пъти до 103 oC ±2 oC с охлаждане до 93 oC между нагряванията. След това се оставя да се охлади до стайна температура в ексикатора (т. 3.4) и се претегля. Тази операция се повтаря, докато загубата на тегло между две последователни претегляния спре да надвишава 2 mg.

N.B.	Увеличаване на теглото на пробата след повторно нагряване е индикация за окисляване на мазнината. В този случай резултатът се пресмята, като за основа се взема претеглянето, проведено непосредствено преди теглото да започне да нараства.

5.   Изчисляване на резултатите

Съдържанието на влага (Х) като процент от пробата се пресмята по следната формула:

където:

m

=

теглото в грамове на пробата за анализ;

m1

=

теглото в грамове на блюдото със съдържанието му преди нагряване;

m2

=

теглото в грамове на блюдото със съдържанието му след нагряване;

Резултати по-ниски от 0,05  % трябва да бъдат записани като „по-ниски от 0,05  %“.

Повтаряемост

Разликата във влажността между резултатите в две паралелни определяния, проведени върху една и съща проба, не трябва да надвишава 0,05  % като абсолютна стойност.

В.   ОПРЕДЕЛЯНЕ НА СУРОВ ПРОТЕИН

1.   Цел и обхват

Настоящият метод дава възможност да се определи общото количество суров протеин в храните за животни на базата на съдържанието на азот, определяно по метода на Келдал.

2.   Принцип

Пробата се изварява със сярна киселина в присъствие на катализатор. Киселинният разтвор се алкализира с разтвор на натриев хидроксид. Амонякът се дестилира и събира в определено количество сярна киселина, излишъкът от която се титрува със стандартен разтвор на натриев хидроксид.

Като алтернатива, отделеният амоняк се дистилира в излишък от разтвор на борна киселина, след което се титрува с разтвор на солна или сярна киселина.

3.   Реагенти

Когато еквивалентният пункт се определя по колориметричен метод, индикаторните разтвори с метилово червено и бромокрезолно зелено се добавят към разтворите на борна киселина. Ако е приготвен 1 литър разтвор на борна киселина, преди коригирането на обема се добавят 7 ml индикаторен разтвор на метилово червено (т. 3.16) и 10 ml разтвор на бромокрезолно зелено (т. 3.17).

В зависимост от използваната вода, pH на разтвора на борна киселина може да се различава в различните партиди. Често е необходимо да направи корекция с малък обем алкално вещество, за да се получи надеждна празна проба

Забележка:

Добавянето на около 3 ml до 4 ml NaOH (т. 3.11) в 1 литър борна киселина с концентрация 10 g/l обикновено осигурява добра корекция. Разтворът се съхранява при стайна температура и се пази от светлина и източници на амонячни пари по време на съхранението.

Забележка:

Могат да се използват други концентрации с друго обемно съотношение (т. 3.5, т. 3.6, т. 3.7, т. 3.10, т. 3.11 и т. 3.19), ако се направи съответна корекция при изчисляването. Концентрациите се изписват винаги с четири знака след десетичната запетая.

4.   Апаратура

Апаратурата следва да бъде подходяща за изваряване, дестилация и титруване по процедурата на Келдал.

5.   Процедура

5.1.   Изваряване

Отмерва се 1 g от пробата с точност до 0,001  g и пробата се прехвърля в колбата на апарата за изваряване. Прибавят се 15 g калиев сулфат (т. 3.1), подходящо количество катализатор (т. 3.2) (от 0,3 до 0,4 меден (II) оксид или от 0,9 до 1,2  g меден (II) сулфат пентахидрат), 25 ml сярна киселина (т. 3.4) и ако е необходимо, няколко гранули пемза (т. 3.12) и се разбърква.

Колбата се нагрява първоначално бавно, като от време на време се завърта, докато съдържанието се овъгли и пяната изчезне; след това се нагрява по-интензивно, докато течността започне непрекъснато да кипи. Нагряването е подходящо, ако врящата киселина се кондензира по стените на колбата. Следи се стените да не прегреят и към тях да не прилепват органични частици.

Когато разтворът се избистри и стане бледозелен, продължава да се вари още два часа, след което се оставя да се охлади.

5.2.   Дестилация

Внимателно се добавя достатъчно вода, за да се осигури пълно разтваряне на сулфатите. Оставя се да се охлади и след това се прибавят няколко гранули цинк (т. 3.3), ако е необходимо. Действа се според т. 5.2.1 или т. 5.2.2.

5.2.1.    Дестилация в сярна киселина

В събирателната колба на апарата за дестилация се поставя точно измерено количество от 25 ml сярна киселина (т. 3.5) или (т. 3.7) в зависимост от предполагаемото съдържание на азот. Добавят се няколко капки индикатор метилово червено (т. 3.8).

Колбата, в която е проведено изваряването, се свързва към хладника на дестилационния апарат и изходът на хладника се потапя в течността в събирателната колба на дълбочина поне 1 cm (вж. забележка в т. 8.3). Бавно се изсипват 100 ml разтвор на натриев хидроксид (т. 3.9) в колбата за изваряване, без загуба на амоняк (вж. забележка в т. 8.1). Колбата се нагрява, докато амонякът се дестилира.

5.2.2.    Дистилация в борна киселина

Когато титруването на съдържанието на амоняк в дестилата се осъществява ръчно, се прилага описаната по-долу процедура. Когато дестилационният модул е напълно автоматизиран и включва титруването на съдържанието на амоняк в дестилата, се следват инструкциите на производителя за работата на дестилационния модул.

Поставя се събирателна колба, в която има 25 ml—30 ml разтвор на борна киселина (т. 3.18), под изхода на хладника по такъв начин, че изходната тръба да е под равнището на излишното количество разтвор на борна киселина. Настройва се дестилационният модул да подава 50 ml разтвор на натриев хидрооксид (т. 3.9). Дестилационният модул се пуска в действие в съответствие с инструкциите на производителя и се дестилира амонякът, отделен при добавянето на разтвора на натриев хидрооксид. Дестилатът се събира в приемащия разтвор на борна киселина. Количеството на дестилата (времето на дестилация на парите) зависи от количеството азот в пробата. Следват се инструкциите на производителя.

Забележка:

В полуавтоматичните дестилационни модули добавянето на излишъка от натриев хидрооксид и дестилацията на парите се извършват автоматично.

5.3.   Титруване

Действа се според т. 5.3.1 или т. 5.3.2.

5.3.1.    Сярна киселина

Излишното количество сярна киселина в събирателната колба се титрува с разтвор от натриев хидроксид (т. 3.10 или т. 3.11) в зависимост от концентрацията на използваната сярна киселина, докато се достигне еквивалентния пункт.

5.3.2.    Борна киселина.

Съдържанието на събирателната колба се титрува със стандартен обемен разтвор на солна киселина (т. 3.19) или със стандартен обемен разтвор на сярна киселина (т. 3.6), като се използва бюрета и се отчита количеството на използвания титрационен агент.

Когато се използва колориметричен метод за определяна на еквивалентния пункт, крайната точка е достигната, когато в съдържанието се появи първата розова следа. Показанията от бюретата се отчитат с точност до 0,05 ml. Може да се подпомогне визуализацията на еквивалентния пункт чрез използването на осветена магнитна бъркалка или фотометричен детектор.

Този процес може да се проведе автоматично, като се използва дестилатор на парите с автоматично титруване.

При работа с конкретен дестилатор или дестилатор/титратор се следват указанията на производителя.

Забележка:

Когато се използва автоматизирана система за титруване, титруването започва веднага след началото на дестилацията и се използва разтвор на борна киселина (т. 3.18) с концентрация 1 %. Когато се използва изцяло автоматизирана дестилация, автоматичното титруване на амоняка може да се осъществи също така чрез определяне на еквивалентния пункт като се използва система за потенциометрично определяне на pH. В този случай се използва автоматичен титратор с рН-метър. pH-метърът се калибрира правилно в обхвата от pH 4 до pH 7, като се следват обичайните лабораторни процедури за калибриране на pH. Еквивалентният пункт на титруването на pH е достигнат, когато pH достигне стойност 4,6 , като това е наи-високата точка на кривата на титруване (инфлексна точка).

5.4.   Тест с празна проба

За да се потвърди, че реагентите не съдържат азот, се извършва контролен тест с празна проба (изваряване, дестилация и титруване) с 1 g захароза (т. 3.14) вместо с пробата.

6.   Изчисляване на резултатите

Изчисляването се извършва в съответствие с т. 6.1 или т. 6.2.

6.1.   Пресмятане на титруването в съотвестствие с т. 5.3.1.

Съдържанието на суров протеин, изразено като процент от теглото на пробата, се пресмята по следната формула:

Където:

V0

=

е обемът (в ml) на NаОН (т. 3.10 или т. 3.11), използван в теста с празната проба.

V1

=

е обемът (в ml) на NаОН (т. 3.10 или т. 3.11), използван при титруването на пробата.

c

=

е концентрацията (в mol/l) на натриев хидроксид (т. 3.10 или т. 3.11).

m

=

е теглото (в g) на пробата.

6.2   Изчисляване на титруването в съответствие с т. 5.3.2.

6.2.1.    Титруване със солна киселина

Съдържанието на суров протеин, изразено като процент от теглото на пробата, се пресмята по следната формула:

където:

m

=

е теглото (в g) на частта от пробата за анализ;

c

=

е концентарацията (в mol/l) на стандартния обемен разтвор на солна киселина (точка 3.19);

V0

=

е обемът (в ml) на солната киселина, използвана при анализа на празната проба;

V1

=

е обемът (в ml) на солната киселина, използвана при анализа на частта от пробата за анализ.

6.2.2.    Титруване със сярна киселина

Съдържанието на суров протеин като процент от теглото на пробата се пресмята по следната формула:

където:

m

=

е теглото (в g) на частта от пробата за анализ;

c

=

е концентрацията (в mol/l) на стандартния разтвор на сярна киселина (т. 3.6);

V0

=

е обемът (в ml) на сярната киселина (т. 3.6), използвана при анализа на контролната проба;

V1

=

е обемът (в ml) на сярната киселина (т. 3.6), използвана при анализа на частта от пробата за анализ.

7.   Проверка на метода

7.1.   Повторяемост

Разликата между резултатите от две паралелни определяния, проведени върху една и съща проба не трябва да превишава:

7.2.   Точност

Анализът (изваряване, дестилация и титруване) се извършва с 1,5 до 2,0  g ацетанилид (т. 3.13) в присъствието на 1 g захароза (т. 3.14); 1 g ацеталинид консумира 14,80 ml сярна киселина (т. 3.5). Възстановяването трябва да бъде поне 99 %.

8.   Забележки

Г.   ОПРЕДЕЛЯНЕ НА КАРБАМИД

1.   Цел и обхват

Настоящият метод позволява определянето на съдържанието на карбамид във фуражите.

2.   Принцип

Пробата се суспендира във вода с избистрящ агент. Суспензията се филтрира. Съдържанието на карбамид във филтрата се определя след добавяне на 4-диметиламинобензалдехид (4-DMAB) чрез измерване на оптичната плътност при дължина на вълната 420 nm.

3.   Реагенти

4.   Апаратура

5.   Процедура

5.1.   Анализ на пробата

Претеглят се с точност до 1 mg 2 g от пробата и заедно с 1 g активен въглен (т. 3.4) се поставят в мерителна колба с вместимост 500 ml. Добавят се 400 ml вода и 5 ml разтвор на Карез I (т. 3.2), разбъркват се в продължение на около 30 секунди и след което се добавят 5 ml разтвор на Карез II (т. 3.3). Размесват се тридесет минути в барабанния смесител. Допълва се до марката с вода, разклаща се и се филтрира.

Взимат се 5 ml от прозрачните безцветни филтрати, поставят се в епруветки с шлифовани стъклени запушалки, добавя се 5 ml разтвор на 4-DMAB (т. 3.1) и се размесва. Поставят се епруветките във водна баня при 20 oС (+/– 4 oС). След петнадесет минути със спектрофотометър при 420 nm се измерва оптичната плътност на пробния разтвор. Сравнява се с контролния разтвор на реагентите.

5.2.   Калибрационна крива

Взимат се обеми от 1, 2, 4, 5 и 10 ml от карбамидния разтвор (т. 3.5), поставят се в мерителни колби с вместимост 100 ml и се допълват до марката с вода. Взимат се по 5 ml от всеки разтвор, добавят се 5 ml разтвор на 4-DМAB (т. 3.1) към всеки от тях, хомогенизират се и се измерва оптичната плътност, както е указано по-горе, като се сравняват с контролен разтвор, съдържащ 5 ml 4-DMAB и 5 ml вода, която не съдържа карбамид. Построява се калибрационната крива.

6.   Изчисляване на резултатите

Определя се количеството карбамид в пробата, като се използва калибрационната крива.

Резултатът се изразява като процент от пробата.

7.   Забележки

Д.   ОПРЕДЕЛЯНЕ СЪДЪРЖАНИЕТО НА ЛЕТЛИВИ АЗОТНИ ОСНОВИ

I.   ЧРЕЗ МИКРОДИФУЗИЯ

1.   Цел и обхват

Настоящият метод дава възможност да се определи съдържанието на летливи азотни основи, изразени като амоняк, във фуражите.

2.   Принцип

Пробата се извлича с вода и разтворът се избистря и филтрира. Летливите азотни основи се извличат чрез микродифузия, като се използва калиев карбонат, събират се в разтвор на борна киселина и се титруват със сярна киселина.

3.   Реагенти

4.   Апаратура

5.   Процедура

Претеглят се 10 g от пробата с точност до 1 mg и заедно със 100 ml вода се поставят в градуирана колба от 200 ml. Разбъркват се или се разклащат в смесителя в продължение на около 30 min. Добавят се 50 ml разтвор на трихлорооцетна киселина (т. 3.1), допълва се до пълния обем с вода, съдържанието силно се разклаща и се филтрира през нагънат филтър.

С помощта на пипета 1 ml разтвор на борна киселина (т. 3.3) се вкарва в централната част на клетката на Конуей, а 1 ml от филтрата на пробата се вкарва във венеца на клетката. Частично се покрива със смазания капак. Капва се бързо 1 ml от наситения разтвор на калиев карбонат (т. 3.4) във венеца и съдът се затваря херметически с капака. След това той се завърта върху хоризонтална плоскост така, че двата реагента да се смесят. Оставя се да инкубира най-малко четири часа при стайна температура или един час при температура 40 oC.

С помощта на микробюрета (т. 4.3) летливите основи в разтвора на борна киселина се титруват със сярна киселина (т. 3.5).

Провежда се контролен опит по същата процедура, но без проба за анализ.

6.   Изчисляване на резултатите

1 ml H2SO40,01 mol/l съответства на 0,34 mg амоняк.

Резултатът се изразява като процент от пробата.

Повторяемост

Разликата между резултатите от две паралелни определяния, проведени върху една и съща проба, не трябва да надвишава:

7.   Забележки

При условие че съдържанието на амоняк в пробата надвишава 0,6  %, първоначалният филтрат се разрежда.

CONWAY CELL

Scale 1/1

II.   ЧРЕЗ ДЕСТИЛАЦИЯ

1.   Цел и обхват

Настоящият метод дава възможност да се определи съдържанието на летливи азотни основи, изразени като амоняк, в рибено брашно, което на практика не съдържа карбамид. Той е приложим само тогава, когато съдържанието на амоняк е по-ниско от 0,25  %.

2.   Принцип

Пробата се извлича с вода и разтворът се избистря и филтрира. Летливите азотни основи се извличат в точката на кипене чрез добавяне на магнезиев оксид и се събират в точно определено количество сярна киселина, излишъкът от която се ретитрува с разтвор на натриев хидроксид.

3.   Реагенти

4.   Апаратура

5.   Процедура

Претеглят се 10 g от пробата с точност до 1 mg и заедно със 100 ml вода се поставят в градуирана колба от 200 ml. Разбъркват се или се разклащат в смесителя в продължение на 30 min. Добавят се 50 ml разтвор на трихлорооцетна киселина (т. 3.1), допълва се до пълния обем с вода, съдържанието силно се разклаща и се филтрира през нагънат филтър.

Взема се известно количество избистрен филтрат, подходящо за предполагаемото съдържание на летливи азотни основи (100 ml обикновено са достатъчни). Разрежда се до 200 ml и се добавят 2 g магнезиев оксид (т. 3.2) и няколко капки емулсия срещу образуване на пяна (т. 3.3). Разтворът трябва да бъде алкален при проба с лакмусова хартия; в противен случай се добавя още магнезиев оксид (т. 3.2). Процедира се в съответствие с т. 5.2 и т. 5.3 от метода за анализ за определяне на съдържанието на суров протеин (част В от настоящото приложение).

Провежда се контролен опит по същата процедура, но без проба за анализ.

6.   Изчисляване на резултатите

1 ml H2SO40,05 mol/l съответства на 1,7 mg амоняк.

Резултатът се изразява като процент от пробата.

Повторяемост

Разликата между резултатите от две паралелни определяния, проведени върху една и съща проба, не трябва да надвишава в относителна стойност 10 % амоняк.

Е.   ОПРЕДЕЛЯНЕ СЪДЪРЖАНИЕТО НА АМИНОКИСЕЛИНИ (БЕЗ ТРИПТОФАН)

1.   Цел и обхват

Настоящият метод служи за определяне с помощта на анализатор за аминокиселини на съдържанието на свободни (синтетични и естествени) аминокиселини и на общото съдържание на аминокиселини (участващи в пептидна връзка и свободни) във фуражите. Методът е приложим за следните аминокиселини: цист(е)ин, метионин, лизин, треонин, аланин, аргинин, аспарагинова киселина, глутаминова киселина, глицин, хистидин, изолевцин, левцин, фенилаланин, пролин, серин, тирозин и валин.

Методът не позволява да се разграничат солите на аминокиселините и да се различават D- и L-формите на аминокиселините. Той не важи за определяне на съдържанието на триптофан или на хидрокси аналози на аминокиселините.

2.   Принцип

2.1.   Свободни аминокиселини

Свободните аминокиселини се извличат с разредена солна киселина. Извлечените паралелно с тях азотисти макромолекули се утаяват със сяро-салицилова киселина и отстраняват посредством филтриране. Филтрираният разтвор се коригира до pH 2,20 . Аминокиселините се отделят посредством йонообменна хроматография и съдържанието им се определя посредством нинхидринова реакция с фотометрично отчитане при 570 nm.

2.2.   Общо съдържание на аминокиселини

Процедурата, която ще бъде избрана, зависи от вида на аминокиселините, които се изследват. Цист(е)инът и метионинът трябва да бъдат окислени съответно до цистеинова киселина и метионин сулфон преди хидролизата. Тирозинът трябва да се определя в продукти от хидролизата в неокислени проби. Всички останали аминокиселини, изброени в т. 1, могат да бъдат определени както в окислените, така и в неокислените проби.

Окислението се извършва при 0 oC със смес от пероксимравчена киселина и фенол. Излишъкът от окислителния реагент се разгражда с натриев дисулфит. Пробата, независимо дали е окислена или неокислена, се подлага на хидролиза със солна киселина (т. 3.20) в продължение на 23 часа. Продуктът на хидролизата се коригира до pH 2,20 . Аминокиселините се отделят посредством йонообменна хроматография и се определят посредством нинхидринова реакция с фотометрично отчитане при 570 nm (440 nm за пролина).

3.   Реагенти

Да се използва двойно дестилирана вода или вода с равностойно качество (проводимост < 10 μЅ)

Разтварят се 300 g NaOH (т. 3.5) във вода и се допълва с вода до 1 литър.

Разтварят се 40 g NaOH (т. 3.5) във вода и се допълва с вода до 1 литър.

Смесват се 889 g мравчена киселина (т. 3.2) със 111 g вода и се добавят 4,73  g фенол (т. 3.3).

Добавя се 1 g фенол (т. 3.3) към 492 ml HCl (т. 3.7) и се допълва с вода до 1 литър.

Разтварят се 60 g 5-сулфосалицилова киселина (т. 3.6) във вода и се допълва с вода до 1 литър

Смесват се 0,5 ml водороден прекис (т. 3.1) с 4,5 ml разтвор от мравчена киселина и фенол (т. 3.19) в малка бехерова чаша. Инкубира се при температура 20 oC—30 oC в продължение на 1 час, за да се образува пероксимравчена киселина, след което се охлажда в ледена водна баня (15 min) преди да се добави към пробата.

Внимание: Да се избягва контакт с кожата и да се носи защитно облекло.

Разтварят се 19,61  g натриев цитрат (т. 3.8), 5 ml тиодигликол (т. 3.9), 1 g фенол (т. 3.3) и 16,50 ml HCl в приблизително 800 ml вода. Стойността на рН се регулира на 2,20 . Допълва се до 1 литър с вода.

c = 2,5 μmol/ml от всяка в солна киселина.

Могат да бъдат купени в търговската мрежа.

Разтварят се 0,2115  g цистеинова киселина (т. 3.16.2) и 0,2265  g метионин сулфон (т. 3.16.3) в цитратния буферен разтвор (т. 3.24) в градуирана колба от 1 литър и се допълва до този обем с цитратен буферен разтвор. Да се съхранява под 5 oC не повече от 12 месеца. Този разтвор не се използва, ако базовият стандартен разтвор (т. 3.27.1) съдържа цистеинова киселина и метионин сулфон.

Разтварят се 0,6560  g норлевцин (т. 3.13) в цитратния буферен разтвор (3.24) в градуирана колба и се допълва до 250 ml с цитратен буферен разтвор. Да се съхранява под 5 oC не повече от 6 месеца.

Прехвърля се в градуирана колба от 50 ml, допълва се до марката с цитратен буферен разтвор (т. 3.24) и се разбърква.

Да се съхранява под 5 oC не повече от 3 месеца.

Вж. също забележка 9.1.

Да се съхранява под 5 oC не повече от 3 месеца.

4.   Апаратура

Колоната се запълва със сулфонирани полистиренови смоли, които могат да отделят аминокиселините една от друга и от други вещества, реагиращи положително на нинхидрин. Циркулацията на буферния разтвор и на нинхидриновия реагент се осигурява от помпи с устойчивост на потока от ±0,5  % за целия период, включващ както стандартното времетраене на калибрирането, така и извършване на анализа на пробата.

При някои уреди за анализ на аминокиселини може да се използва хидролизна процедура, при която хидролизатът е с концентрация на натрий с = 0,8 mol/l и съдържа цялата остатъчна мравчена киселина от етапа на окисляването. Други уреди не осигуряват задоволително отделяне на някои определени аминокиселини, ако хидролизатът съдържа излишък от мравчена киселина и/или високи концентрации на натриеви йони. В този случай количеството на киселината се намалява чрез изпарение до приблизително 5 ml след хидролизата и преди коригиране на киселинността. Изпарението се извършва във вакуумна среда при максимум 40 oС.

5.   Процедура

5.1.   Подготовка на пробата

Пробата се смила, така че да може да премине през сито с отвори 0,5  mm. Пробите с голяма влажност трябва да се изсушат на въздух при температура най-много 50 oС или чрез лиофилизация преди смилането. Пробите с високо съдържание на мастни вещества се екстрахират с петролен етер (т. 3.12) преди смилането.

5.2.   Определяне на свободни аминокиселини във фуражи и премикси

Претегля се с точност до 0,2 mg подходящо количество (1—5 g) от подготвената проба (т. 5.1) в конусовидна колба и се добавят 100,0 ml от сместа за екстракция (т. 3.21). Разбърква се или се размесва в продължение на 60 min с механична клатачна машина или с магнитна бъркалка (точка 4.8). Оставя се седиментът да се утаи и 10,0 ml от супернатанта се слага с пипета в бехерова чаша 100 ml.

Като се разбърква, се добавят 5,0 ml разтвор на сулфосалицилова киселина (т. 3.22), и с помощта на магнитната бъркалка разбъркването продължава още 5 min. Супернатантът се филтрира или центрофугира, така че да не остане никаква утайка. Поставят се 10,0 ml от получения разтвор в бехерова чаша 100 ml и с натриев хидроксид (т. 3.18) се коригира pH до 2,20 , прехвърля се в мерителна колба с подходящ обем, като се използва цитратен буферен разтвор (т. 3.24) и се допълва до пълния обем с буферния разтвор (т. 3.24).

Ако се използва вътрешен стандарт, се добавя 1,00 ml от вътрешния стандарт (т. 3.27.3) за всеки 100 ml от крайния разтвор и се допълва до пълния обем с буферния разтвор (т. 3.24).

Пристъпва се към етапа на хроматографията в съответствие с точка 5.4.

Ако екстрактите няма да се използват през същия ден, те трябва да се съхраняват при температура под 5 oC.

5.3.   Определяне на общото количество аминокиселини

5.3.1.    Окисляване

Претеглят се с точност до 0,2 mg между 0,1 и 1 g от подготвената проба (т. 5.1) във:

Претеглената част от пробата трябва да съдържа около 10 mg азот и не повече от 100 mg влага.

Колбата/шишето се слага в ледена водна баня и се охлажда до 0 oC, добавят се 5 ml от сместа за окисляване (т. 3.23) и се разбърква с помощта на стъклена шпатула със закривен връх. Колбата/шишето, в която/което се намира шпатулата, се запечатва херметично с филм, водната баня със запечатания съд се слага в хладилник при 0 oC и се оставя за 16 часа. След 16 часа се изважда от хладилника и излишният окислителен реагент се разлага чрез добавяне на 0,84  g натриев дисулфит (т. 3.4).

Пристъпва се към процедурата в т. 5.3.2.1

5.3.2.    Хидролиза

5.3.2.1.    Хидролиза на окислените проби

Към окислената проба, подготвена в съответствие с т. 5.3.1 се добавят 25 ml от сместа за хидролизиране (т. 3.20), като се измиват всякакви остатъци от пробата, полепнали по стените на съда и шпатулата.

Според използваната процедура за хидролиза се процедира в съответствие с процедурата в т. 5.3.2.3 или в т. 5.3.2.4.

5.3.2.2.    Хидролиза на неокислените проби

В облодънна колба с обем 100 ml или от 250 ml (т. 4.1) или в шише от 100 ml с винтова капачка (т. 4.2) се претеглят с точност до 0,2 mg между 0,1 и 1 g от подготвената проба (т. 5.1). Претеглената част от пробата трябва да съдържа около 10 mg азот. Внимателно се добавят 25 ml от сместа за хидролиза (т. 3.20) и се смесват с пробата. Процедира се в съответствие с процедурата в т. 5.3.2.3 или в т. 5.3.2.4.

5.3.2.3.    Открита хидролиза

Добавят се 3 стъклени топчета към сместа в колбата (приготвена в съответствие с процедурата в т. 5.3.2.1 или в т. 5.3.2.2) и се вари с обратех хладник и при постоянно отделяне на мехурчета в продължение на 23 часа. След приключване на хидролизата, хладникът се изплаква с 5 ml цитратен буферен разтвор (т. 3.24). Колбата се откача и се охлажда в ледена баня.

Процедира се в съответствие с т. 5.3.3.

5.3.2.4.    Затворена хидролиза

Шишето с приготвената съгласно т. 5.3.2.1 или т. 5.3.2.2 смес се поставя в сушилня (т. 4.3) при 110 oC. За да се избегне покачване на налягането (поради отделянето на газообразни вещества) и за да се предотврати избухване, през първия час винтовата капачка се поставя върху гърлото на съда без да се затваря. Да не се затваря съдът с капачката. След един час съдът се затваря с капачката и се оставя в сушилнята (т. 4.3) за 23 часа. След приключване на хидролизата, шишето се изважда от сушилнята, внимателно се отваря капачката на шишето и то се слага в ледена водна баня. Оставя се да се охлади.

В зависимост от процедурата за коригиране на pH (т. 5.3.3), съдържанието на шишето количествено се прехвърля в бехерова чаша от 250 ml или в облодънна колба от 250 ml, като се използва цитратен буферен разтвор (т. 3.24).

Процедира се в съответствие с т. 5.3.3.

5.3.3.    Коригиране на pH

В зависимост от толерантността на уреда за анализ на аминокиселини към натрий, коригирането на pH се извършва в съответствие с т. 5.3.31 или с т. 5.3.3.2.

5.3.3.1.    За хроматографски системи (т. 4.9), които изискват ниска концентрация на натрий.

Препоръчва се да се използва вътрешен основен стандартен разтвор (т. 3.27.3), когато се използват уреди за анализ на аминокиселини, изискващи ниски концентрации на натрий (когато трябва да се намали обемът на киселината).

В този случай преди изпарението към хидролизата се добавят 2,00 ml от вътрешния основен стандартен разтвор (т. 3.2.7.3).

Добавят се 2 капки 1-октанол (т. 3.15) към получения в съответствие с т. 5.3.2.3 или т. 5.3.2.4 хидролизат.

Като се използва ротационен изпарител (т. 4.7), обемът се намалява до 5—10 ml във вакуум при 40 oC. Ако случайно обемът е намален на по-малко от 5 ml, хидролизатът трябва да се изхвърли и анализът да се повтори.

Коригира се рН до 2,20 с разтвор на натриев хидроксид (т. 3.18) и се пристъпва към изпълнението на процедурата в т. 5.3.4.

5.3.3.2.    За всички други уреди за анализ на аминокиселини (т. 4.9)

Вземат се получените в съответствие с т. 5.3.2.3 или т. 5.3.2.4 хидролизати и частично се неутрализират, като внимателно се добавят при непрекъснато бъркане 17 ml разтвор на натриев хидроксид (т. 3.17), като се гарантира, че температурата не се покачва над 40 oС.

Коригира се рН до 2,20 при стайна температура, като се използва разтвор на натриев хидроксид (т. 3.17) и накрая разтвор на натриев хидроксид (т. 3.18). Пристъпва се към процедурата в т. 5.3.4

5.3.4.    Разтвор от пробата за хроматография

Хидролизатът с коригирано рН (т. 5.3.3.1 или т. 5.3.3.2) се прехвърля количествено с помощта на цитратен буферен разтвор (т. 3.24) в градуирана колба от 200 ml и се допълва до маркировката с буферен разтвор (т. 3.24).

Ако не е бил използван вътрешен стандарт, се добавят 2,00 ml от вътрешния стандарт (т. 3.27.3) и се допълва до пълния обем с цитратен буферен разтвор (т. 3.24). Старателно се размесва.

Пристъпва се към определяне чрез хроматография (т. 5.4).

Ако разтворите от пробата няма да се изследват през същия ден, те трябва да се съхраняват при температура под 5 oC.

5.4.   Хроматографско изследване

Преди започване на хроматографското изследване екстрактът (т. 5.2) или хидролизатът (т. 5.3.4) се затопля до стайна температура. Сместа се разклаща и подходящо количество от нея се филтрира през мембранен филтър с размер на отворите 0,22 μm (т. 4.5). Полученият бистър разтвор се подлага след това на йонообменна храматография, като се използва уред за анализ на аминокиселини (т. 4.9).

Впръскването може да се извърши ръчно или автоматично. Важно е в колоната за анализ да се поставя еднакво — с точност до ± 0,5  % — количество разтвор от стандарта и от пробата, освен когато се използва вътрешен стандарт, и съотношението между натрия и аминокиселини в разтворите на стандарта и на пробата да е толкова близко, колкото е възможно.

По принцип, честотата на калибровъчните операции зависи от стабилността на нинхидриновия реагент и от аналичната система. Стандартът или изследваната проба се разреждат с цитратен буферен разтвор (т. 3.24), така че пиковата повърхност на стандарта да бъде от 30 до 200 % от пиковата повърхност на аминокиселината на пробата.

Хроматографията на аминокиселините варира леко според типа на уреда за анализ и според използваната смола. Използваната система трябва да е в състояние да отдели аминокиселините една от друга и от вещества, реагиращи положително на нинхидрин. В работния диапазон на хроматографската система трябва да се наблюдава линейна зависимост спрямо промяната на количествата аминокиселини, които се въвеждат в колоната.

При хроматографския етап на анализа се прилагат съотношенията между най-ниските и най-високите стойности, споменати по-долу, при условие че се анализира еквимоларен разтвор (на определяните аминокиселини). Еквимоларният разтвор трябва да съдържа най-малко 30 % от максималното количество от всяка аминокиселина, която може да да бъде прецизно измерена със системата за анализ на аминокиселини (т. 4.9).

За разграничаването на треонин от серин съотношението между най-ниската и най-високата стойност върху хроматограмата за по-слабо представената от двете застъпващи се аминокиселини не трябва да надвишава 2:10. (ако се определят само цист(е)ин, метионин, треонин и лизин, недостатъчното разграничаване на придружаващите пикови стойности ще повлияе отрицателно върху определянето). За всички останали аминокиселини разграничаването трябва да бъде по-добро от 1:10.

Системата трябва да гарантира, че лизинът се разграничава от „лизиновите артефакти“ и от орнитин.

6.   Изчисляване на резултатите

Пиковата повърхност на пробата и на стандарта се измерва за всяка отделна аминокиселина и се пресмята количеството Х в грамове аминокиселина на килограм проба.

Ако се използва вътрешен стандарт, се умножава по:

A

=

пикова повърхност на хидролизат или екстракт

B

=

пикова площ на стандартния калибрационен разтвор

C

=

пикова повърхност на вътрешния стандарт в хидролизат или екстракт

D

=

пикова площ, вътрешен стандарт, калибрационен стандартен разтвор

M

=

моларно тегло на определяната амонокиселина

c

=

концентрация на стандарта в μmol/ml

m

=

тегло на пробата (g) (коригирано, за да се получи началното тегло, ако продуктът е изсушен или обезмаслен)

V

=

ml общ хидролизат (т. 5.3.4) или ml изчислен общ разтворен обем на екстракта (т. 6.1)

Цистинът и цистеинът се определят като цистеинова киселина в продукти на хидролизата на окислена проба, но се изчисляват като цистин (C6H12N2O4S2, M 240,30  g/mol), като се използва M 120,15  g/mol (= 0,5 × 240,30  g/mol).

Метионинът се определя като метионин сулфон в продуктите на хидролизата на окислената проба, но се изчислява като метионин, като се използва M на метионина: 149,21  g/mol.

Добавеният свободен метионин се определя след екстракция като метионин, като за изчисленията се използва същото M.

V

=

обем на крайния екстракт

7.   Оценка на метода

Методът е изпробван чрез взаимно сравнение, направено на международно ниво през 1990 година, като за целта са използвани четири различни вида фураж (фуражна смеска за свине, смеска за бройлери, протеинов концентрат, премикс). Резултатите за средните стойности и за стандартното отклонение след отстраняване на отклоняващите се стойности са дадени в таблицата в настоящата точка:

7.1.   Повторяемост

Повторяемостта на гореспоменатото сравнително изпитване, изразена като „стандартно лабораторно отклонение“, е дадена в таблиците по-долу:

7.2.   Възпроизводимост

В таблицата по-долу са дадени резултатите за стандартното отклонение между лабораториите при гореспоменатото сравнение:

8.   Използване на еталонни материали

Точното прилагане на метода се проверява с повтаряне на измерванията върху сертифицирани еталонни материали при наличие на такива. Препоръчва се калибриране със сертифициран калибрационен разтвор на аминокиселини.

9.   Забележки

Диапазонът на линейна чувствителност на апарата трябва да се провери за всички аминокиселини.

Стандартният разтвор се разрежда с цитратен буфер, за да може пиковите повърхности да съвпаднат със средата на диапазона.

Ж.   ОПРЕДЕЛЯНЕ НА ТРИПТОФАН

1.   Цел и обхват

Методът дава възможност да се определят общият и свободният триптофан във фуражите. Методът не прави разлика между D- и L-формите.

2.   Принцип

За да се определи общият триптофан, пробата се хидролизира в алкална среда с наситен разтвор на бариев хидроксид и се загрява до 110 oС в продължение на 20 часа. След хидролизата се прибавя вътрешен стандарт.

За да се определи свободният триптофан, пробата се подлага на екстракция в умерено кисела среда при наличие на вътрешен стандарт.

Триптофанът и вътрешният стандарт в хидролизата или в екстракта се определят чрез HPLC с флуоресцентен детектор.

3.   Реагенти

Разтварят се 40,0  g NaOH (т. 3.5) във вода и се долива вода (т. 3.1) до 1 литър.

Взимат се 492 ml НСl (т. 3.7) и се долива вода до 1 литър.

Взимат се 82 ml НСl (т. 3.7) и се долива вода до 1 литър.

Взимат се 8,2 ml НСl (т. 3.7) и се долива вода до 1 литър.

Взимат се 34 ml ортофосфорна киселина (т. 3.6) и се долива вода (т. 3.1) до 1 литър.

В мерителна колба от 500 ml се разтварят 0,2553  g триптофан (т. 3.2) в солна киселина (т. 3.13) и се допълва до пълния обем със солна киселина (т. 3.13). Разтворът се съхранява при –18 oС в продължение най-много на 4 седмици.

В мерителна колба от 500 ml се разтварят 0,2728  g α-метил-триптофан (т. 3.3) в солна киселина (т. 3.13) и се допълва до пълния обем със солна киселина (т. 3.13). Разтворът се съхранява при –18 oС в продължение най-много на 4 седмици.

Взимат се 2,00 ml концентриран разтвор на триптофан (т. 3.15) и 2,00 ml концентриран разтвор на вътрешния стандарт (α-метил-триптофан) (т. 3.16). Разреждат се с вода (т. 3.1) и метанол (т. 3.8) приблизително до същия обем и приблизително до същата концентрация на метанол (10—30 %) като тези на готовия хидролизат.

Разтворът трябва да бъде приготвен непосредствено преди употреба.

Да се осигури защита срещу пряка слънчева светлина по време на приготвянето на разтвора.

4.   Апаратура

5.   Процедура

5.1.   Подготовка на пробите

Пробата се смила, така че да може да премине през сито с отвори 0,5  mm. Пробите с голяма влажност трябва да се изсушат на въздух при температура най-много 50 oС или чрез лиофилизация преди смилането. Пробите с високо съдържание на мастни вещества се подлагат на екстракция с петролен етер (т. 3.9) преди смилането.

5.2.   Определяне на свободния триптофан (екстракт)

Претегля се с точност до 1 mg подходящо количество (1—5 g) от подготвената проба (т. 5.1) в конусовидна колба. Прибавят се 100,0 ml солна киселина (т. 3.13) и 5,00 ml концентриран разтвор на вътрешния стандарт (т. 3.16). Разбърква се или се размесва в продължение на 60 min с механична клатачна машина или или с магнитната бъркалка (т. 4.7). Оставя се седиментът да се утаи и с пипета се прехвърлят 10,0 ml от супернатанта в бехерова чаша. Прибавят се 5 ml ортофосфорна киселина (т. 3.14). Коригира се рН до 3, като се използва натриев хидроксид (т. 3.10). Прибавя се достатъчно количество метанол (т. 3.8), за да се постигне концентрация между 10 и 30 % метанол в крайния обем. Сместа се прехвърля в мерителна колба с подходящ обем и се разрежда с вода до достигане на необходимия за хроматографията обем (приблизително еднакъв с този на калибрационния стандартен разтвор (т. 3.17).

Няколко милилитра от разтвора се фитрират през мембранен филтър от 0,45 μm (т. 4.5), преди да бъдат впръскани в колоната за HPLC. Пристъпва се към етапа на хроматографията в съответствие с точка 5.4.

Стандартният разтвор и екстрактите следва да се пазят от пряка слънчева светлина. Ако не е възможно да се анализират в същия ден, екстрактите могат да се съхраняват при температура 5 oС за най-много 3 дни.

5.3.   Определяне на общия триптофан (хидролизат)

Претеглят се с точност до 0,2 mg между 0,1 и 1 g от подготвената проба (т. 5.1) в полипропиленова колба (т. 4.4). Претеглената част от пробата трябва да съдържа около 10 mg азот. Добавят се 8,4 g. бариев хидроксид октахидрат (т. 3,4 ) и 10 ml вода. Съставките се размесват с миксер Vortex (т. 4.8) или с магнитна бъркалка (т. 4.7). Покритият с тефлон магнит се оставя в сместа. Стените на съда се изплакват с 4 ml вода. Поставя се винтовата капачка и колбата се затваря, без да се затяга капачката. Прехвърля се в автоклав (т. 4.6) с вряща вода и пара за 30—60 min. Автоклавът се затваря и се включва на температура 110 oС (± 2) в продължение на 20 часа.

Преди отварянето на автоклава температурата се намалява до малко под 100 oC. За да се избегне кристализация на Ва(ОН)2 . 8Н2О, към загрятата смес се прибавят 30 ml вода със стайна температура. Леко се разклаща или разбърква. Прибавят се 2,00 ml от концентрирания разтвор на вътрешния стандарт (α-метил-триптофан) (т. 3.16). Съдовете се охлаждат във вода/ледена вана в продължение на 15 min.

След това се прибавят 5 ml ортофосфорна киселина (т. 3.14). Съдът се държи в охлаждащата вана и съдържанието се неутрализира със HCl (т. 3.11), като се бърка непркъснато и рН се коригира до 3,0 с помощта на HCl (т. 3.12). Прибавя се достатъчно количество метанол, за да се достигне концентрация между 10 и 30 % метанол в крайния обем. Прехвърля се в мерителна колба с подходящ обем и се разрежда с вода до достигане на обема, необходим за хроматографията (например 100 ml). Добавянето на метанол не трябва да предизвика утаяване.

Няколко милилитра от разтвора се фитрират през мембранен филтър от 0,45 μm (т. 4.5) преди да бъдат впръскани в колоната за HPLC. Пристъпва се към етапа на хроматографията в съответствие с точка 5.4.

Стандартният разтвор и хидролизатите трябва да се пазят от пряка слънчева светлина. Ако не е възможно да се анализират в същия ден, хидролизатите могат да се съхраняват при температура 5 oС в продължение най-много на 3 дни.

5.4.   Определяне с помощта на HPLC

За ориентиране се предлагат следните условия за изократно елуиране; може да се използват и други, при условие, че дават равностойни резултати (вж. също и забележките т. 9.1 и т. 9.2):

6.   Изчисляване на резултатите

Количеството триптофан (Х) се изчислява в g на 100 g проба.

A

=

пикова площ на вътрешния стандарт, разтвор на стандарта за калибриране (т. 3.17)

B

=

пикова площ на триптофана, ексракт (т. 5.2) или хидролизат (т. 5.3)

V1

=

обем в ml (2 ml) на концентрирания разтвор на триптофан (т. 3.15), прибавен към калибрационния разтвор (т. 3.17)

c

=

концентрация в μmol/ml (= 2,50 ) на концентрирания разтвор на триптофан (т. 3.15), прибавен към калибрационния разтвор (т. 3.17)

V2

=

обем в ml на разтвора на вътрешния стандарт (т. 3.16), прибавен към екстракта (т. 5.2) (= 5,00 ml) или към хидролизата (т. 5.3) (= 2,00 ml)

C

=

пикова повърхност на вътрешния стандарт, екстракт (т. 5.2) или хидролизат (т. 5.3)

D

=

пикова площ на триптофана, калибрационен стандартен разтвор (т. 3.17)

V3

=

обем в ml (= 2,00 ml) от концентрирания разтвор на вътрешния стандарт (т. 3.16), прибавен към калибрационния стандартен разтвор (т. 3.17)

m

=

тегло на пробата в g (коригирано, за да се получи началното тегло, ако продуктът е изсушен и/или обезмаслен)

M

=

молекулно тегло на триптофана (= 204,23  g/mol)

7.   Повторяемост

Разликата в резултатите от две паралелни определяния на една и съща проба не трябва да надхвърля 10 % по отношение на най-високия резултат.

8.   Резултати от съвместно изследване

Беше организирано съвместно изследване (4-то сравнение) в рамките на Общността, при което в 12 лаборатории бяха анализирани три проби, за да се сертифицира методът за изследване чрез хидролиза. Бяха направени 5 еднакви анализа на всяка проба. Резултатите са представени в таблицата по-долу:

L

=

брой на лабораториите, предали резултати

n

=

брой на запазените индивидуални резултати след елиминиране на отклоняващите се стойности (определни чрез тестовете на Cochran и Dixon)

sr

=

стандартно отклонение на повторяемостта

SR

=

стандартно отклонение на възпроизводимостта

r

=

повторяемост

R

=

възпроизводимост

CVr

=

коефициент на изменение на повторяемостта, %

CVR

=

коефициент на изменение на възпроизводимостта, %

Беше организирано друго съвместно изследване (3-то сравнение) в рамките на Общността, при което в 13 лаборатории бяха анализирани две проби, за да се сертифицира методът за екстракция на свободен триптофан. Бяха направени 5 еднакви анализа на всяка проба. Резултатите са представени в таблицата по-долу:

L

=

брой на лабораториите, предали резултати

n

=

брой на запазените индивидуални резултати след елиминиране на отклоняващите се стойности (определни чрез тестовете на Cochran и Dixon)

sr

=

стандартно отклонение на повторяемостта

SR

=

стандартно отклонение на възпроизводимостта

r

=

повторяемост

R

=

възпроизводимост

CVr

=

коефициент на изменение на повторяемостта, %

CVR

=

коефициент на изменение на възпроизводимостта, %

Беше организирано друго паралелно проучване в рамките на Общността, при което в 7 лаборатории бяха анализирани четири проби, за да се сертифицира методът за определяне на триптофан чрез хидролиза. Резултатите са представени по-долу. Бяха направени 5 еднакви анализа на всяка проба.

L

=

брой на лабораториите, предали резултати

n

=

брой на запазените индивидуални резултати след елиминиране на отклоняващите се стойности (определени чрез тестовете на Cochran и Dixon)

sr

=

стандартно отклонение на повторяемостта

SR

=

стандартно отклонение на възпроизводимостта

r

=

повторяемост

R

=

възпроизводимост

CVr

=

коефициент на изменение на повторяемостта, %

CVR

=

коефициент на изменение на възпроизводимостта, %

9.   Забележки

Изократно елуиране с последващо градиентно почистване на колоната:

В работния диапазон хроматографската система трябва да покаже линейна реакция. Линейната реакция се измерва при постоянна концентрация (т.е. нормална концентрация) на вътрешния стандарт и при различни концентрации на триптофана. Важно е височината на пиковете на триптофана и на вътрешния стандарт да се намира в линейния диапазон на системата HPLC/флуоресцентната система. Ако пикът или пиковете на триптофана и/или на вътрешния стандарт са прекалено ниски или прекалено високи, анализът се повтаря с проба с различна големина и/или изменен краен обем.

С течение на времето разтварянето на бариевият хидроксид става все по-трудно. Това води до мътен разтвор при определяне с HPLC, което може да доведе до слаби резултати за триптофана.

З.   ОПРЕДЕЛЯНЕ СЪДЪРЖАНИЕТО НА СУРОВИ МАСЛА И МАЗНИНИ

1.   Цел и обхват

Настоящият методът служи за определяне на съдържанието на сурови масла и мазнини във фуражите. Той не обхваща анализа на маслодайните семена и плодове.

Използването на двете разгледани по-долу процедури зависи от характера и състава на фуража и причината за извършване на анализа.

1.1.   Процедура А — Директно екстахируеми сурови масла и мазнини

Настоящият метод е приложим за фуражни суровини от растителен произход, с изключение на включените в обхвата на процедура Б.

1.2.   Процедура Б — Общо съдържание на сурови масла и мазнини

Настоящият метод е приложим за фуражни суровини от животински произход и за всички комбинирани фуражи. Той трябва да се използва за всички суровини, от които маслата и мазнините не могат да бъдат екстрахирани напълно, без преди това да се осъществи хидролиза (напр. глутени, мая, картофени протеини и продукти, подлежащи на преработка като екструдиране, сплескване и нагряване).

1.3.   Интерпретация на резултатите

Във всички случаи, когато резултатът, получен при използване на процедура Б, е по-висок от получения по процедура А, за действителен се приема резултатът от процедура Б.

2.   Принцип

2.1.   Процедура А

Пробата се подлага на екстракция с петролен етер. Разтворителят се дестилира, след което остатъкът се изсушава и претегля.

2.2.   Процедура Б

Пробата се обработва със солна киселина под действието на топлина. Сместа се охлажда и флитрира. Остатъкът се измива, изсушава и се подлага на определяне на съдържанието в съответствие с процедура А.

3.   Реагенти

4.   Апаратура

5.   Процедура

5.1.   Процедура А (вж. т. 8.1)

Претеглят се 5 g от пробата с точност до 1 mg, прехвърлят се в екстракционна гилза (т. 4.2), която се закрива с памучен тампон, по който не трябва да има мазнини.

Гилзата се поставя в екстрактора (т. 4.1) и се провежда екстракция в продължение на шест часа с петролен етер (т. 3.1). Екстрактът от петролния етер се събира в суха претеглена колба, в която са поставени парченца пемза ( 9 ).

Рзтворителят се отстранява чрез дестилация. Остатъкът се изсушава, като се остави колбата за час и половина в сушилнята (т. 4.3). Оставя се да се охлади в ексикатор и се претегля. Изсушава се отново в продължение на 30 min, за да се гарантира, че теглото на маслата и мазнините ще остане постоянно (загубата на тегло между две последователни претегляния трябва да бъде по-малка или равна на 1 mg).

5.2.   Процедура Б

Претеглят се 2,5  g от пробата с точност до 1 mg (вж. т. 8.2), поставят се в бехерова чаша от 400 ml или конусообразна колба от 300 ml и се добавят 100 ml солна киселина (т. 3.3) и парченца пемза. Бехеровата чаша се покрива със стъкло за наблюдение или на конусообразната колба се поставя обратен хладник. Сместа се оставя да заври леко над слаб пламък или котлон и се задръжа така един час. Не трябва да се позволява на продукта да полепва по стените на съда.

Съдържанието се охлажда, добавя се толкова филтратор (т. 3.4), колкото е достатъчно, за да се предотврати загубата на масло или мазнина по време на филтрирането. Сместа се филтрира през навлажнена, чиста от мазнини двойна филтърна хартия. Остатъкът се измива в студена вода до получаване на неутрален филтрат. Проверява се дали филтратът не съдържа масла или мазнини. Наличието им показва, че преди хидролизата пробата трябва да бъде екстрахирана с петролен етер, като се използва процедура А.

Двойната филтърна хартия с остатъка се поставя върху стъкло за наблюдение и се суши в продължение на час и половина в сушилня (т. 4.3) при 100 oС ± 3o С.

Двойната филтърна хартия със сухия остатък се поставя в екстракционна гилза (т. 4.2) и се покрива с чист от мазнини памучен тампон. Гилзата се поставя в екстрактора (т. 4.1) и се процедира, както е посочено във втори и трети параграф от точка 5.1.

6.   Изразяване на резултата

Теглото на остатъка се изразява като процент от теглото на пробата.

7.   Повторяемост

Разликата между резултатите от две паралелни определяния извършени на една и съща проба от един и същ аналитик, не трябва да бъдат повече от:

8.   Забележки

Претегелят се 20 g от пробата с точност до 1 mg и се смесват с 10 g или повече безводен натриев сулфат (т. 3.2). Провежда се екстрахиране с петролен етер (т. 3.1), както е указано в точка 5.1. Към получения екстракт се добавя петролен етер (т. 3.1) до 500 ml и се размесва. Вземат се 50 ml от разтвора и се поставят в малка суха претеглена колба, която съдържа парченцата пемза. Разтворителят се отстранява чрез дестилация, съдържанието на колбата се изсушава и се процедира, както е указано в последния параграф на точка 5.1.

От останалия в гилзата остатък от екстракцията се отстранява разтвотителят, остатъкът се натрошава до размер на чстиците от 1 mm, връща се в екстракционната гилза (да не се добавя натриев сулфат) и се процедира, както е указано във втория и третия параграф на точка 5.1.

Съдържанието на масла и мазнини се изчислява като процент от пробата, като се използва следната формула:

(10m1 + m2) × 5

където:

m1

=

тегло в грамове на остатъка след първата екстракция (аликвотна част на екстракта),

m2

=

тегло в грамове на остатъка след втората екстракция.

И.   ОПРЕДЕЛЯНЕ НА СУРОВИ ВЛАКНА

1.   Цел и обхват

Настоящият метод дава възможност за определяне във фуражите на неразтворими в кисели и в алкални среди органични вещества, които не съдържат мазнини, обикновено означавани като сурови влакна.

2.   Принцип

Пробата, обезмаслена, когато е необходимо, се обработва последователно с кипящи разтвори на сярна киселина и калиев хидроксид с определени концентрации. Остатъкът се отделя чрез филтриране с филтър от синтеровано стъкло, измива се, изсушава се, претегля се и се опепелява при температура от 475 до 500 oC. Загубата на тегло в резултат на опепеляването отговаря на суровите влакна, присъстващи в пробата за анализ.

3.   Реагенти

4.   Апаратура

5.   Процедура

Претегля се 1 g от пробата с точност до 1 mg и се слага в тигела (т. 4.2) (вж. забележки в т. 8.1, т. 8.2 и т. 8.3) и се добавя 1 g помощно средство за филтриране (т. 3.3).

Сглобяват се модулът за нагряване (т. 4.1) и филтрувалният тигел (т. 4.2), след което цилиндърът (т. 4.3) се свързва към тигела. Наливат се 150 ml вряща сярна киселина (т. 3.1) в сглобените цилиндър и тигел и ако е необходимо, се добавят няколко капки средство срещу образуване на пяна (т. 3.2).

Течността се нагрява до кипене за 5 ± 2 min и се оставя да ври при силно кипене точно 30 min.

Отваря се кранчето към отвеждащата тръба (т. 4.1) и под вакуум се филтрира сярната киселина през филтрувалния тигел, като остатъкът се измива три пъти с по 30 ml вряща вода, като се следи след всяко измиване остатъкът да е филтриран до сухо.

Затваря се изходното кранче и се наливат 150 ml врящ разтвор на калиев хидроксид (т. 3.7) в сглобените цилиндър и тигел и се добавят няколко капки средство срещу образуване на пяна (т. 3.2). Течността се нагрява до точката на кипене за 5 ± 2 min и се оставя да ври при силно кипене точно 30 min. Филтрира се и се повтаря процедурата на измиване, която е използвана при етапа на обработка със сярна киселина.

След последното измиване и изсушаване тигелът с неговото съдържание се отделя и се свързва с модула за студена екстракция (т. 4.6). Прилага се вакуумът и остатъкът във филтрувалния тигел се измива три пъти с по 25 ml ацетон (т. 3.4), като се следи след всяко измиване остатъкът да е фултруван до сухо.

Тигелът се изсушава, докато теглото му остане постоянно, в сушилня при температура 130 oC. След всяко сушене той се охлажда в ексикатор и бързо се претегля. Тигелът се поставя в муфелна пещ и се подлага на опепеляване, докато теглото му остане постоянно (загубата на тегло между две последователни претегляния трябва да бъде по-малка или равна на 2 mg) при 475 oC—500 oC в продължение най-малко на 30 min.

След всяко нагряване тигелът се охлажда първо в пещта, а после в ексикатора, преди да бъде претеглен.

Прави се празна проба. Загубата на тегло в резултат от опепеляването не трябва да надвишава 4 mg.

6.   Изчисляване на резултатите

Съдържанието на сурови влакна като процент от пробата се дава от израза:

където:

m

=

тегло в g на пробата;

m0

=

загуба на тегло в g след опепеляване по време на определянето;

m1

=

загуба на тегло в g след опепеляване при празната проба;

7.   Повторяемост

Разликата между резултатите от две определяния, проведени върху една и съща проба, не трябва да превишава:

8.   Забележки

Й.   ОПРЕДЕЛЯНЕ НА ЗАХАР

1.   Цел и обхват

Настоящият метод позволява определянето на съдържанието на редуциращи захари и общи захари след инверсия, изразени като глюкоза или, когато е целесъобразно, като захароза, при преобразуване с коефициент 0,95 . Той е приложим за комбинирани фуражи. За другите фуражи са предвидени специални методи. Когато е необходимо, лактозата се измерва отделно и се отчита при изчисляването на резултатите.

2.   Принцип

Захарите се екстрахират в разреден етанол; разтворът се избистря с разтвори на Карез I и II. След отстраняване на етанола количествата преди и след инверсията се определят по метода на Луф-Шорл.

3.   Реагенти

При внимателно разбъркване, разтворът на лимонена киселина (т. 3.8.2) се добавя към разтвора на натриев карбонат (т. 3.8.3). Добавя се разтворът на меден сулфат (т. 3.8.1) и се допълва до 1 литър с вода. Оставя се да престои една нощ и се филтрира.

Проверява се концентрацията на така получения реагент (Cu 0,05 mol/l; Na2 CO3 1 mol/l), вж. (т. 5.4), последния параграф. Стойността на рН на разтвора е приблизително 9,4 .

4.   Апаратура

Смесител (барабанен): приблизително 35 до 40 r.p.m.

5.   Процедура

5.1.   Екстрахиране на пробата

Претеглят се 2,5  g от пробата с точност до 1 mg и се изсипват в мерителна колба от 250 ml. Добавят се 200 ml етанол (т. 3.1) и пробата се размесва един час в барабанния смесител. Добавят се 5 ml разтвор на Карез I (т. 3.2) и се бърка около 30 секунди. Добавят се 5 ml разтвор на Карез II (т. 3.3) и се бърка още една минута. Допълва се до пълния обем с етанол (т. 3.1), хомогенизира се и се филтрира. Отделят се 200 ml от филтрата, който се сгъстява чрез изпаряване, докато обемът му намалее приблизително наполовина, за да се отстрани по-голямата част от етанола. Остатъкът след изпаряването се прибавя количествено в 200 ml мерителна колба с помощта на гореща вода, охлажда се, допълва се с вода до пълния обем, хомогенизира се и, ако е необходимо, се филтрира. Този разтвор се използва за определянето на количеството редуциращи захари и, след инверсия, на общите захари.

5.2.   Определяне на редуциращи захари

С помощта на пипета се взимат не повече от 25 ml от разтвора, съдържащ не повече от 60 mg редукторни захари, изразени като глюкоза. Ако е необходимо, обемът се коригира до 25 ml с дестилирана вода и се определя съдържанието на редуциращи захари по метода на Луф-Шорл. Резултатът се изразява като процентно съдържание на глюкоза в пробата.

5.3.   Определяне на общи захари след инверсия

С помощта на пипета се взимат 50 ml от разтвора и се прехвърлят в мерителна колба от 100 ml. Добавят се няколко капки разтвор на метилово оранжево (т. 3.4), след това внимателно и при непрекъснато разбъркване се добавя солна киселина (т. 3.5), докато течността придобие определено червен цвят. Добавят се 15 ml солна киселина (т. 3.6), колбата се потапя в силно кипяща вода и се оставя там в продължение на тридесет минути. Охлажда се бързо до около 20 oС и се добавят 15 ml разтвор на натриев хидроксид (т. 3.7). Допълва се до 100 ml с вода и се хомогенизира. Взимат се не повече от 25 ml, които съдържат не повече от 60 mg редуциращи захари, изразени като глюкоза. Ако е необходимо, обемът се коригира до 25 ml с дестилирана вода и се определя съдържанието на редуциращи захари по метода на Луф-Шорл. Резултатът се изразява като проценти глюкоза или, когато е целесъобразно, като захароза, чрез умножаване по коефициент 0,95 .

5.4.   Титруване по метода на Луф-Шорл

С помощта на пипета се вземат 25 ml от реагента на Луф-Шорл (т. 3.8) и се прехвърлят в ерленмайерова колба от 300 ml; добавят се точно 25 ml от избистрения захарен разтвор. Добавят се 2 гранули пемза (т. 3.13), нагряват се с бъркане на ръка на открит пламък със средна височина и течността се довежда до кипене за около две минути. Ерленмайеровата колба се поставя веднага върху покрита с азбест телена мрежа с отвор с диаметър около 6 cm, под която е запален пламък. Пламъкът следва да се регулира така, че само основата на ерленмайеровата колба да се нагрява. Ерленмайеровата колба се свързва към обратен хладник. Оставя се да кипи точно десет минути. Охлажда се веднага в студена вода и след около пет минути се титрува, както следва:

Добавя се 10 ml разтвор на калиев йодид (т. 3.12) и веднага след това (внимателно, тъй като има опасност от обилно образуване на пяна) се добавят 25 ml сярна киселина (т. 3.11). Титрува се с разтвор на натриев тиосулфат (т. 3.9) до появяване на матовожълт цвят, добавя се нишестеният индикатор (т. 3.10) и се завършва титруването.

Същото титруване се провежда с точно измерена смес от 25 ml реагент на Луф-Шорл (т. 3.8) и 25 ml вода след добавяне на 10 ml разтвор на калиев йодид (т. 3.12) и 25 ml сярна киселина (т. 3.11) без кипене.

6.   Изчисляване на резултатите

С помощта на таблицата се определя количеството глюкоза в mg, което съответства на разликата между стойностите на двете титрувания, изразена в mg натриев тиосулфат 0,1 mol/l. Резултатът се изразява като процент от теглото на пробата.

7.   Специални процедури

Хомогенизира се и се филтрира. Етанолът се отстранява, както е описано в т. 5.1. Ако няма декстринизирано нишесте, съдържанието на колбата се допълва до пълния обем с дестилирана вода.

8.   Забележки

И в двата случая количеството налична захар се определя по метода на Луф-Шорл и се изчислява в mg глюкоза. Едната от стойностите се изважда от другата и разликата се изразява като процент от теглото на пробата.

Пример

Двата обема, взети за всяко определение, отговарят на проба от 250 mg.

В първия случай се изразходват 17 ml разтвор на натриев тиосулфат от 0,1 mol/l, съответстващи на 44,2 mg глюкоза; във втория — 11 ml, съответстващи на 27,6 mg глюкоза.

Разликата е 16,6 mg глюкоза.

Съдържанието на редуциращи захари (с изключение на лактоза), изчислено като глюкоза, е съответно:

К.   ОПРЕДЕЛЯНЕ НА ЛАКТОЗА

1.   Цел и обхват

Настоящият метод позволява да се определи съдържанието на лактоза във фуражи, съдържащи повече от 0,5  % лактоза.

2.   Принцип

Захарите се разтварят във вода. Разтворът се подлага на ферментация под въздействие на дрождите Saccharomyces cerevisiae, които не засягат лактозата. След избистряне и филтриране съдържанието на лактоза във филтрата се определя по метода на Луф-Шорл.

3.   Реагенти

При внимателно разбъркване, разтворът на лимонена киселина (точка 3.4.2) се добавя към разтвора на натриев карбонат (3.4.3). Добавя се разтворът на меден сулфат (3.4.1) и се допълва до 1 литър с вода. Оставя се да престои една нощ и се филтрира. Проверява се концентрацията на така получения реактив (Cu 0,05 mol/l; Na2 CO3 1 mol/l). Стойността на рН на разтвора е приблизително 9,4 .

4.   Апаратура

Водна баня с термостат, настроен на 38—40 oС.

5.   Процедура

Претегля се 1 g от пробата с точност до 1 mg и тази част от пробата се поставя в мерителна колба от 100 ml. Добавят се 25—30 ml вода. Колбата се поставя в кипяща водна баня за тридесет минути и след това се охлажда до приблизително 35 oС. Добавят се 5 ml от дрождената суспензия (т. 3.1) и сместа се хомогенизира. Колбата се оставя да престои два часа на водна баня при температура 38—40 oС. Охлажда се до приблизително 20 oC.

Добавят се 2,5 ml разтвор на Карез I (т. 3.2), бърка се тридесет секунди, след това се добавят 2,5 ml разтвор на Карез II (т. 3.3) и отново се бърка тридесет секунди. Допълва се до 100 ml с вода, разбърква се и се филтрира. С помощта на пипета се взима част от филтрата — не повече от 25 ml, по възможност със съдържание на лактоза от 40 до 80 mg — и се прехвърля в ерленмайерова колба от 300 ml. Ако е необходимо, се допълва до 25 ml с вода.

Прави се празна проба по същия начин с 5 ml дрождена суспензия (3.1). Съдържанието на лактозата се определя по метода на Луф-Шорл, както следва: прибавят се точно 25 ml реагент на Луф-Шорл (3.4) и две гранули пемза (т. 3.5). Бърка се на ръка, като едновременно се нагрява на открит пламък със средна височина, и течността се довежда до кипене за около две минути. Ерленмайеровата колба се поставя веднага върху покрита с азбест телена мрежа с отвор с диаметър около 6 cm, под която е запален пламък. Пламъкът следва да се регулира така, че само основата на ерленмайеровата колба да се нагрява. Ерленмайеровата колба се свързва към обратен хладник. Оставя се да кипи точно десет минути. Охлажда се веднага в студена вода и след около пет минути се титрува, както следва:

Добавят се 10 ml разтвор на калиев йодид (т. 3.6) и веднага след това (внимателно, защото има опасност от обилно образуване на пяна) се добавят 25 ml сярна киселина (т. 3.7). Титрува се с разтвор на натриев тиосулфат (т. 3.8) до получаване на матово-жълт цвят, добавя се нишестеният индикатор (т. 3.9) и се завършва титруването.

Същото титруване се провежда върху точно измерена смес от 25 ml реагент на Луф-Шорл (т. 3.4) и 25 ml вода след добавяне на 10 ml разтвор на калиев йодид (т. 3.6) и 25 ml сярна киселина (т. 3.7) без кипене.

6.   Изчисляване на резултатите

Като се използва приложената таблица, се установява количеството лактоза в mg, което отговаря на разликата между резултатите от двете титрувания, изразено в ml натриев тиосулфат 0,1 mol/l.

Резултатът се изразява като процент безводна лактоза от пробата.

7.   Забележки

За продукти, съдържащи повече от 40 % ферментируема захар, се използват повече от 5 ml дрождена суспензия (т. 3.1).

Л.   ОПРЕДЕЛЯНЕ НА НИШЕСТЕ

ПОЛЯРИМЕТРИЧЕН МЕТОД

1.   Цел и обхват

Настоящият метод дава възможност да се определят нивата на нишесте и на продукти от разграждането на нишесте с високо молекулно тегло във фуражите, с цел проверка на съответствието с обявената енергийна стойност (разпоредби в приложение VII) и с Директива 96/25/ЕО на Съвета ( 10 ).

2.   Принцип

Методът включва две определяния. При първото пробата се третира с разредена солна киселина. След избистряне и филтриране се измерва въртенето на плоскостта на поляризацията на разтвора чрез поляриметрия.

При второто пробата се подлага на екстракция с 40 % етанол. След подкисляване на филтрата със солна киселина, избистряне и филтриране се измерва въртенето на плоскостта на поляризацията, както при първото определяне.

Като се умножи разликата между двете измервания с коефициент, който е известен, се получава съдържанието на нишесте в пробата.

3.   Реагенти

Концентрацията трябва да се провери чрез титруване, като се използва разтвор на натриев хидроксид 0,1 mol/l, в присъствие на 0,1  % (w/v) метилово червено в 94 % (v/v) етанол. За неутрализацията на 10 ml са необходими 30,94 ml NaOH 0,1 mol/l.

4.   Апаратура

5.   Процедура

5.1.   Подготовка на пробата

Пробата се разтрошава до получаване на достатъчно дребни частици, за да може цялата проба да премине през сито с кръгли отвори с големина 0,5  mm.

5.2.   Определяне на общото въртене на плоскостта на поляризацията (P или S) (вж. Забележка в т. 7.1)

Претеглят се точност до един mg 2,5  g от натрошената проба и се поставят в градуирана колба от 100 ml. Прибавят се 25 ml солна киселина (т. 3.2), разклаща се до получаване на равномерно разпределение на пробата, и се добавят още 25 ml солна киселина (т. 3.2). Колбата се потапя във водна баня с вряща вода, като енергично се разклаща през първите три минути, за да се предотврати образуването на агломерати. Количеството вода във водната баня трябва да е достатъчно, за да може при поставяне на колбата в нея кипенето на продължи. Колбата не трябва да се изважда от банята докато трае разклащането. Точно след 15 min колбата се изважда от водната баня, добавят се 30 ml студена вода и незабавно се охлажда до 20 oС.

Добавят се 5 ml разтвор на Карез I (т. 3.3) и се разбърква около 30 секунди. Добавят се 5 ml разтвор на Карез II (т. 3.4) и се разбърква още около 30 секунди. Допълва се с вода до запълване на обема, разбърква се и се филтрира. Ако филтратът не е идеално бистър (което рядко се случва), определянето се повтаря, като се използва по-голямо количество разтвор на Карез I и II, например 10 ml.

С поляриметър или захарометър се измерва въртенето на плоскостта на поляризацията на разтвора в епруветка от 200 mm.

5.3.   Определяне на въртенето на плоскостта на поляризацията (P' или S') на вещества, разтворими в 40 % етанол

Претеглят се 5 g от пробата с точност до един mg, поставят се в градуирана колба от 100 ml и се прибавят 80 ml етанол (т. 3.5) (вж. забележка 7.2). Колбата се оставя е в продължение на 1 час при стайна температура; през това време тя шесткратно се разклаща енергично, така че пробата за анализ напълно да се смеси с етанола. Допълва се с етанол (т. 3.5) до запълване на на обема, разбърква се и се филтрира.

Отмерват се с пипета 50 ml от филтрата (отговаря на 2,5  g от пробата) и се поставят в ерленмайерова колба от 250 ml, прибавят се 2,1 ml солна киселина (т. 3.1) и се разклаща енергично. Обратният хладник се монтира към ерленмайеровата колба и тя се потапя в баня с вряща вода. Точно след 15 минути ерленмайеровата колба се изважда от водната баня, съдържанието ѝ се прехвърля в градуирана колба от 100 ml, като колбата се изплаква с малко студена вода и се охлажда до 20 oС.

Съдържанието се избистря с разтвор на Карез I (т. 3.3) и II (т. 3.4), допълва се с вода до пълния обем, разбърква се, филтрира се и се измерва въртенето на плоскостта на поляризацията, както е посочено в параграфи 2 и 3 от точка 5.2.

6.   Изчисляване на резултатите

Съдържанието на нишесте (в %) се изчислява, както следва:

6.1.   Измерване с поляриметър

P

=

общо въртене на плоскостта на поляризацията в градуси

P'

=

въртене на плоскостта на поляризацията в градуси на веществата, разтворими в 40 % (v/v) етанол

=

Специфично въртене на плоскостта на поляризацията за чисто нишесте. Числовите стойности, които обикновено се приемат за този параметър, са следните: +185,9 o: оризово нишесте +185,7 o: картофено нишесте +184,6 o: царевично нишесте +182,7 o: пшенично нишесте +181,5 o: ечемичено нишесте +181,3 o: овесено нишесте +184,0 o: други видове нишесте и смеси от нишесте в комбинирани фуражи;

6.2.   Измерване със захарометър

S

=

Общо въртене на плоскостта на поляризацията в градуси на захарометъра

S'

=

Въртене на плоскостта на поляризацията в градуси на захарометъра на веществата, разтворими в 40 % (v/v) етанол

N

=

тегло (в g) на разтворена в 100 ml вода захароза, която предизвиква въртене на плоскостта на поляризацията от 100 градуса по скалата на захарометъра, измерени при използване на епруветка от 200 mm 16,29  g при френските захарометри 26,00  g при немските захарометри 20,00  g при смесени захарометри.

=

специфично въртене плоскостта на поляризацията на чистото нишесте (вж. т. 6.1)

6.3.   Повторяемост

Разликата в резултатите от две паралелни определяния, проведени върху една и съща проба, не трябва да превишава 0,4 като абсолютна стойност при съдържание на нишесте по-ниско от 40 %, и 1 % като относителна стойност при съдържание на нишесте от 40 % или повече.

7.   Забележки

М.   ОПРЕДЕЛЯНЕ НА СУРОВА ПЕПЕЛ

1.   Цел и обхват

Настоящият метод позволява определянето на съдържанието на сурова пепел във фуражите.

2.   Принцип

Пробата се опепелява при 550 oС; остатъкът се претегля.

3.   Реагенти

Разтвор на амониев нитрат, 20 % (w/v).

4.   Апаратура

5.   Процедура

Претеглят се с точност до един mg около 5 g от пробата (2,5  g при продукти, които имат свойството да набъбват) и се поставя в тигел за опепеляване, който е бил предварително нагрят до 550 oC, охладен и тариран. Тигелът се поставя върху нагревателната плоча и се нагрява постепенно, докато веществото се овъгли. Опепеляването се извършва в съответствие с процедурата в т. 5.1 или т. 5.2.

6.   Изчисляване на резултатите

Теглото на остатъка се изчислява, като се изважда тарираното тегло.

Резултатът се изразява като процент от пробата.

7.   Забележки

Н.   ОПРЕДЕЛЯНЕ НА НЕРАЗТВОРИМА В СОЛНА КИСЕЛИНА ПЕПЕЛ

1.   Цел и обхват

Настоящият метод позволява да се определи количеството на неразтворимите в солна киселина минерални вещества във фуражите. В зависимост от естеството на пробата могат да се приложат два метода.

2.   Принцип

3.   Реагенти

4.   Апаратура

5.   Процедура

5.1.   Метод А:

Пробата се опепелява по метода, описан за определянето на сурова пепел. Може да се използва и пепелта, получена при посочения анализ.

Пепелта се поставя в бехерова чаша с вместимост от 250—400 ml, като се използват 75 ml солна киселина (точка 3.1). Довежда се бавно до кипене и се оставя да кипи умерено в продължение на петнадесет минути. Горещият разтвор се филтрира през филтърна хартия, несъдържаща пепели, и остатъкът се промива с гореща вода до изчезване на киселинната реакция. Филтърът с остатъка се изсушава и се опепелява в тариран тигел при температура, не по-ниска от 550 oС и не по-висока от 700 oС. Охлажда се в ексикатор и се претегля.

5.2.   Метод Б:

Претеглят се 5 g от пробата с точност до един mg и се поставят в бехерова чаша с вместимост 250—400 ml. Добавят се последователно 25 ml вода и 25 ml солна киселина (т. 3.1), разбърква се и се изчаква да спре кипенето. Добавят се още 50 ml солна киселина (точка 3.1). Изчаква се да спре отделянето на газ, след което бехеровата чаша се поставя във вана с вряща вода и се държи там тридесет минути или повече, ако е необходимо, за да се хидролизира изцяло нишестето, което евентуално се съдържа в пробата. Докато е горещо, съдържанието се филтрира през филтър, несъдържащ пепел, и филтърът се промива с 50 ml топла вода (вж. забележка в т. 7). Филтърът се поставя с остатъка в тигел за опепеляване, изсушава се и се опепелява при температура, не по-ниска от 550 oС и не по-висока от 700 oС. Пепелта се поставя в бехерова чаша с вместимост 250—400 ml, като се добавят 75 ml солна киселина (точка 3.1); продължава се, както е описано във втория абзац на точка 5.1.

6.   Изчисляване на резултатите

Теглото на остатъка се изчислява, като се изважда теглото на тарата. Резултатът се изразява като процент от пробата.

7.   Забележки

Ако филтрирането се окаже трудно, анализът се повтаря, като се заместват 50-те ml солна киселина (точка 3.1) с 50 ml 20 % трихлороцетна киселина (точка 3.2) и се промива филтърът с топъл 1 % разтвор на трихлороцетна киселина (точка 3.3).

О.   ОПРЕДЕЛЯНЕ НА КАРБОНАТИ

1.   Цел и обхват

Настоящият метод позволява количественото определяне на съдържанието на карбонати, обикновено изразявани като калциев карбонат, в повечето фуражи.

В някои случаи обаче (напр. при железен карбонат) трябва да се използва специален метод.

2.   Принцип

Карбонатите се разлагат в солна киселина; освободеният въглероден диоксид се събира в градуирана епруветка и обемът му се сравнява с този, освободен при същите условия от известно количество калциев карбонат.

3.   Реагенти

4.   Апаратура

Апарат на Шайблер-Дитрих (вж. схемата) или еквивалентен на него апарат.

5.   Процедура

В зависимост от съдържанието на карбонати в пробата, претеглят се част от пробата, както е посочено по-долу:

Частта от пробата се поставя в специалната колба (4) на апарата, снабдена с малка тръбичка от нечуплив материал, съдържаща 10 ml солна киселина (т. 3.1), и колбата се свързва с апарата. Трипътният кран (5) се завърта така, че тръбата (1) да е свързана с външната среда. Като се използват подвижната тръба (2), напълнена с оцветена сярна киселина (точка 3.3) и свързана към градуираната тръба (1), се допълва течноста до нивото на нулевата марка. Завърта се кранът (5) така, че да се свързва тръби (1) и (3) и се проверява нивото да е на нула.

Солната киселина (точка 3.1) се прелива бавно върху частта от пробата, като колбата се накланя (4). Изравнява се налягането, като се сваля надолу тръбата (2). Разклаща се колбата (4) дотогава, докато спре напълно отделянето на въглероден диоксид.

Налягането се възстановява, като се изравнява наново течността до едно и също ниво в тръби (1) и (2). След няколко минути, когато обемът газ стане постоянен, се прави отчитането.

Прави се контролна проба при същите условия с 0,5  g калциев карбонат (точка 3.2).

6.   Изчисляване на резултатите

Съдържанието на карбонати, изразено като калциев карбонат, се изчислява по формулата:

където:

X

=

% (w/w) карбонати в пробата, изразено като калциев карбонат

V

=

обем на СО2 в ml, отделен от частта от пробата.

V1

=

обем CO2 в ml, отделен от 0,5  g CaCO3.

m

=

тегло в g на частта от пробата

7.   Забележки

П.   ОПРЕДЕЛЯНЕ НА ОБЩОТО КОЛИЧЕСТВО ФОСФОР

ФОТОМЕТРИЧЕН МЕТОД

1.   Цел и обхват

Настоящият метод дава възможност да се определи общото съдържание на фосфор във фуражите. Той е особено подходящ за анализ на продукти с ниско съдържание на фосфор. В някои случаи (при богати на фосфор продукти) може да се използва гравиметричен метод.

2.   Принцип

Пробата се минерализира чрез сухо изгаряне (за органични фуражи) или чрез киселинно изваряване (за минерални смеси и течни фуражи), след което се поставя в разтвор на киселина. Разтворът се обработва с молибдованадатен реагент. Оптичната плътност на така образувания жълт разтвор се измерва със спектрофотометър при 430 nm.

3.   Реагенти

4.   Апаратура

5.   Процедура

5.1.   Приготвяне на разтвора

Според вида на пробата разтворът се приготвя по начина, указан в точка 5.1.1 или в точка 5.1.2.

5.1.1.    Обичайна процедура

Претегля се 1 g или повече от пробата с точност до 1 mg. Пробата за анализ се поставя в колба тип Келдал, добавят се 20 ml сярна киселина (т. 3.5), колбата се разклаща с цел веществото напълно да се импрегнира с киселина и да се предотврати полепването му по стените ѝ, след което се нагрява и се поддържа в точката на кипене в продължение на 10 минути; Оставя се да изстине леко, добавят се 2 ml азотна киселина (точка 3.4), леко се нагрява, оставя се да изстине леко, добавя се още малко азотна киселина (точка 3.4) и отново се довежда до точката на кипене. Тази процедура се повтаря до получаване на безцветен разтвор. Последният се охлажда, добавя се малко вода, течността се прелива в градуирана колба с обем 500 ml, като колбата Келдал се изплаква с гореща вода. Оставя се да изстине, след което обемът се допълва с вода и течността се хомогенизира и филтрира.

5.1.2.    Проби, съдържащи органични вещества и несъдържащи калциеви и магнезиеви дихидроген фосфати.

Около 2,5  g от пробата се претеглят с точност до 1 mg в тигел за опепеляване. Пробата за анализ се разбърква до пълно смесване с 1 g калциев карбонат (т. 3.1). Сместа се опепелява в пещта при температура 550 oC до получаване на бяла или сива пепел (малко количество въглен не е от значение). Пепелта се пресипва в бехерова чаша с обем 250 ml. Добавят се 20 ml вода и солна киселина (т. 3.2), докато престане отделянето на газ. Добавят се още 10 ml солна киселина (т. 3.2). Бехеровата чаша се поставя на пясъчна баня и се оставя съдържанието ѝ да се сгъстява чрез изпарение, докато изсъхне, така че силициевият диоксид да стане неразтворим. Остатъкът се разтваря отново в 10 ml азотна киселина (т. 3.3) и се оставя да кипи на пясъчната баня или на нагревателна плоча 5 минути, без да се изпарява до изсъхване. Течността се прелива в градуирана колба с обем 500 ml, като бехеровата чаша се изплаква няколко пъти с гореща вода. Оставя се да изстине, след което обемът се допълва с вода и течността се хомогенизира и филтрира.

5.2.   Получаване на оцветяването и измерване на оптичната плътност

Аликвотна част от получения в съответствие с процедурата в т. 5.1.1 или т. 5.1.2 филтрат се разрежда до получаване на концентрация на фосфор не по-висока от 40 μg/ml. Поставят се 10 ml от този разтвор в епруветка (т. 4.6) и се добавят 10 ml от молибдованадатния реагент (т. 3.6). Сместа се хомогенизира и се оставя да престои най-малко 10 минути при температура 20 oC. Оптичната плътност се измерва в спектрофотометър при 430 nm спрямо разтвор, получен чрез добавяне на 10 ml от молибдованадатния реагент (т. 3.6) към 10 ml вода.

5.3.   Калибрационна крива

От стандартния разтвор (т. 3.7) се приготвят разтвори, със съдърание на фосфор съответно 5, 10, 20, 30 и 40 μg/ml. Вземат се по 10 ml от всеки от разтворите и към тях се прибавят по 10 ml от молибдованадатния реагент (т. 3.6) Смесите се хомогенизират и се оставят да престоят най-малко 10 минути при температура 20 oC. Измерва се оптичната плътност, както е указано в точка 5.2. Калибрационната крива се очертава, като различните стойности на оптичната плътност се нанасят спрямо съответните количества фосфор. За концентрации между 0 и 40 μg/ml графиката е линейна.

6.   Изчисляване на резултатите

Количеството фосфор в пробата за анализ се определя с помощта на калибрационната крива.

Резултатът се изразява като процент от пробата.

Повторяемост

Разликата между резултатите от две паралелни определяния, проведени върху една и съща проба, не трябва да надвишава:

Р.   ОПРЕДЕЛЯНЕ НА ХЛОР ОТ ХЛОРИДИ

1.   Цел и обхват

Настоящият метод позволява определянето на съдържанието на хлор в разтворими във вода хлориди, обикновено изразявани като натриев хлорид. Той е приложим за всички фуражи.

2.   Принцип

Хлоридите се разтварят във вода. Ако продуктът съдържа органични вещества, той се подлага на избистряне. Разтворът се подкислява леко с азотна киселина и хлоридите се утаяват под формата на сребърен хлорид с помощта на разтвор от сребърен нитрат. Излишният сребърен нитрат се титрува с разтвор на амониев тиоцианат по метода на Фолхард.

3.   Реагенти

4.   Апаратура

Смесител (барабанен): приблизително 35—40 r.p.m.

5.   Процедура

5.1.   Приготвяне на разтвора

Според естеството на пробата, се приготвя разтвор, както е посочено в т. 5.1.1, т. 5.1.2 или т. 5.1.3.

Същевременно се прави празна проба без подлежащото на анализ вещество.

5.1.1.    Проби, които не съдържат органични вещества

Претегля се с точност до един mg проба от не повече от 10 g, която съдържа не повече от 3 g хлор под формата на хлориди. Претегленото количество се слага заедно с 400 ml вода в мерителна колба от 500 ml при температура от около 20 oC. Сместа се размесва тридесет минути в барабанния смесител, допълва се до пълния обем, хомогенизира се и се филтрира.

5.1.2.    Проби, съдържащи органични вещества, без продуктите, описани в точка 5.1.3.

Претеглят се около 5 g от пробата с точност до един mg и това количество се поставя с 1 g активен въглен в мерителна колба от 500 ml. Добавят се 400 ml вода с температура около 20 oС и 5 ml разтвор на Карез I (т. 3.7), разбърква се 30 секунди и после се добавят 5 ml разтвор на Карез II (т. 3.8). Сместа се размесва тридесет минути в барабанния смесител, допълва се до пълния обем, хомогенизира се и се филтрира.

5.1.3.    Топлинно обработени фуражи, ленено кюспе и ленено брашно, продукти, богати на ленено брашно, и други продукти, богати на растителен клей или на колоидални субстанции (например декстринирано нишесте)

Разтворът се приготвя, както е описано в т. 5.1.2, но не се филтрира. Декантира се (ако се налага — се центрофугира), отливат се 100 ml от супернатанта, които се прехвърлят в мерителна колба от 200ml. Смесва се с ацетон (т. 3.6) и се допълва до пълния обем с този разтворител, хомогенизира се и се филтрира.

5.2.   Титруване

С помощта на пипета в ерленмайерова колба се прехвърлят 25 ml—100 ml от филтрата (в зависимост от предполагаемото хлорно съдържание), получен както е описано в т. 5.1.1, т. 5.1.2 или т. 5.1.3. Аликвотната част не трябва да съдържа повече от 150 mg хлор (Cl). Разрежда се, ако е необходимо, до не по-малко от 50 ml с вода, добавят се 5 ml азотна киселина (т. 3.4), 20 ml наситен разтвор на амониев ферисулфат (т. 3.3) и две капки разтвор на амониев тиоцианат (т. 3.1), прехвърлен с помощта на бюрета, допълнена до нулевото деление. Като се използва бюрета, разтворът на сребърен нитрат (т. 3.2) се прехвърля по такъв начин, че да се получи излишък от 5 ml. Добавят се 5 ml диетилов етер (т. 3.5) и се разклаща енергично, за да коагулира утайката. Излишният сребърен нитрат се титрува с разтвора на амониев тиоцианат (т. 3.1) дотогава, докато червено-кафеникавото оцветяване се задържи една минута.

6.   Изчисляване на резултатите

Съдържанието на хлор (Х), изразено като процентно съдържание на натриев хлорид, се изчислява по следната формула:

където:

V1

=

обем (в ml) на добавения разтвор на сребърен нитрат 0,1 mol/l

V2

=

обем (в ml) на разтвора на амониев тиоцианат 0,1 mol/l, използван за титруване

m

=

тегло на пробата.

В случай че празната проба покаже изразходване на разтвора на сребърен нитрат с концентрация 0,1 mol/l, тази стойност се изважда от обема (V1 – V2).

7.   Забележки

---

ПРИЛОЖЕНИЕ IV

МЕТОДИ ЗА АНАЛИЗ С ЦЕЛ КОНТРОЛ НА КОЛИЧЕСТВАТА РАЗРЕШЕНИ ДОБАВКИ ВЪВ ФУРАЖИТЕ

А.   ОПРЕДЕЛЯНЕ НА ВИТАМИН А

1.   Цел и обхват

Настоящият метод дава възможност за определяне на количеството на витамин А (ретинол) във фуражи и премикси. Витамин А включва изцяло транс ретинилов алкохол и неговите цис-изомери, които се определят по този метод. Съдържанието на виамин А се изразява в международни единици (IU) на kg. Една IU отговаря на активността на 0,300 μg изцяло транс-витамин А алкохол или на 0,344 μg изцяло транс-витамин А ацетат, или на 0,550 μg изцяло транс-витамин А палмитат.

Прагът на значимост е 2 000 UI витамин А/kg.

2.   Принцип

Пробата се хидролизира с етанолов разтвор на калиев хидроксид и витамин А се извлича в петролен етер. Разтворителят се елиминира чрез изпаряване; остатъкът се разтваря в метанол и, ако е необходимо, се разрежда до изискваната концентрация. Съдържанието на витамин А се определя чрез високоефективна течна хроматография с обратна фаза (RP-HPLC) с помощта на UV-детектор или флуоресцентен детектор. Параметрите на хроматографията се подбират така, че да не се разделя изцяло транс-витамин А алкохол от неговите цис-изомери.

3.   Реагенти

4.   Апаратура

5.   Процедура

Забележка:

Витамин А е чувствителен към (УВ) светлина и податлив на окисляване. Всички манипулации се извършват на тъмно (в стъклени съдове от тъмно стъкло или съдове, покрити с алуминиево фолио) и в отсъствие на кислород (елиминира се с азот). По време на екстракцията въздухът над течността се заменя с азот (за да се избягва прекалено голямото налягане, от време на време запушалката трябва да се отваря).

5.1.   Подготовка на пробата

Пробата се смила, така че да може да премине през сито с отвори 1 mm, като се избягва нагряване. Смилането трябва да стане непосредствено преди претеглянето и осапуняването, в противен случай съществува риск от загуби на витамин А.

5.2.   Осапуняване

Според тегловното съдържание на витамин А, в плоскодънна или конусовидна колба от 500 ml (т. 4.2.1.) се претеглят с точност до 1mg 2—25 g от пробата. Последователно се прибавят при постоянно разбъркване 130 ml етанол (т. 3.1), около 100 mg BHT (т. 3.13), 2 ml разтвор на натриев аскорбат (т. 3.5) и 2 ml разтвор на натриев сулфид (т. 3.6). Монтира се хладникът (т. 4.3) на колбата и последната се потапя във вана за водна баня с магнитна бъркалка (т. 4.7). Нагрява се до кипене и в продължение на 5 min се оставят парите да преминават през хладника. След това се прибавят 25 ml разтвор на калиев хидроксид (т. 3.4) през хладника (т. 4.3) и отново се оставят парите да преминават през хладника в продължение на 25 min, като се бърка при слаб приток на азот. След това хладникът се изплаква с приблизително 20 ml вода и се оставя съдържанието на колбата да изстине до достигане на стайна температура.

5.3.   Екстракция

Чрез декантация осапуняващият разтвор се прехвърля количествено, като колбата се изплаква с общо 250 ml вода, в делителна фуния от 1 000 ml (точка 4.2.3) или в екстрактора (точка 4.8). Колбата за осапуняване се изплаква последователно с 25 ml етанол (т. 3.1) и 100 ml петролен етер (т. 3.2) и течността от изплакването се прехвърля в делителната фуния или в екстрактора. Съотношението между водата и етанола при така комбинираните разтвори трябва да е около 2:1. Разклаща се енергично в продължение на 2 min и се оставя в покой за 2 min.

5.3.1.    Екстракция с делителна фуния (т. 4.2.3)

Когато слоевете се отделят (вж. забележката в т. 7.3), слоят от петролен етер се прехвърля в друга делителна фуния (т. 4.2.3). Екстракцията се повтаря два пъти със 100 ml петролен етер (т. 3.2), а след това два пъти с 50 ml петролен етер (т. 3.2).

Комбинираните екстракти се промиват два пъти в делителната фуния при леко разклащане (за да се избегне образуването на емулсия) с порции по 100 ml вода и след това с повторно разклащане с нови порции по 100 ml вода, докато последната остане безцветна след добавянето на разтвор на фенолфталеин (т. 3.7) (обикновено са достатъчни четири промивания). Промитият екстракт се филтрира със сух нагънат филтър за отделяне на фазите (т. 4.4), с цел да се отстрани всякаква суспендирана вода, и се прехвърля в градуирана колба от 500 ml (т. 4.2.2). Делителната фуния и филтърът се изплакват с 50 ml петролен етер (т. 3.2), допълва се до пълния обем с петролен етер (т. 3.2) и се разбърква добре.

5.3.2.    Екстракция с помощта на екстрактор (т. 4.8)

Когато слоевете се отделят (вж. забележката в т. 7.3), запушалката на стъкления цилиндър (т. 4.8.1) се заменя с шлифованата стъклена вложка (т. 4.8.2), като долният U-образен край на регулируемата тръба се поставя така, че да се окаже точно над нивото на граничната повърхност. Чрез подаване на азот през страничната тръбичка се прилага налягане и се прехвърля горният слой петролен етер в делителна фуния от 1 000 ml (т. 4.2.3). Прибавят се 100 ml петролен етер (т. 3.2) в стъкления цилиндър, поставя се запушалката и силно се разклаща. Оставят се слоевете да се отделят и горният слой се прехвърля в делителната фуния, както е посочено по-горе. Процедурата на екстракция се повтаря с нови 100 ml петролен етер (т. 3.2), след това още два пъти с по 50 ml петролен етер (т. 3.2) и слоевете петролен етер се добавят в делителната фуния.

Събраните екстракти от петролен етер се промиват съгласно процедурата, описана в точка 5.3.1, и се процедира съгласно указаното в посочената точка.

5.4.   Подготовка на разтвора на пробата за HPLC

Аликвотна част от разтвора на петролен етер (т. 5.3.1 или т. 5.3.2) се прехвърля с пипета в крушообразна колба от 250 ml (т. 4.2.4). Оставя се разтворителят да се изпари почти изцяло в ротационния изпарител (т. 4.1) при понижено налягане, при температура на ваната не по-висока от 40 oС. Възстановява се атмосферното налягане, като се вкара азот (точка 3.10), и колбата се изважда от ротационния изпарител. Останалото количество разтворител се отстранява в поток азот (т. 3.10) и остатъкът незабавно се разтваря в известен обем (10—100 ml) метанол (т. 3.3) (концентрацията на витамин А трябва да е в интервала от 5 IU/ml до 30 IU/ml).

5.5.   Определяне чрез HPLC

Витамин А се отделя в колона С18 с обратна фаза (т. 4.5.1) и концентрацията му се измерва с помощта на UV-детектор (325 nm) или флуоресцентен детектор (възбуждане: 325 nm, излъчване: 475 nm. (т. 4.5.2).

Впръсква се аликвотна част (например 20 μl) от получения метанолов разтвор (вж. т. 5.4) и се елуира с мобилната фаза (т. 3.9). Изчислява се средната височина на пика (площ) на няколко впръсквания със същия разтвор на пробата и средните височини на пиковете (площи) на няколко впръсквания с калибрационните разтвори (т. 5.6.2).

Условия на HPLC

Дават се следните указания за условията, като могат да се прилагат и други условия, стига те да дават еквивалентни резултати.

5.6.   Калибриране

5.6.1.    Приготвяне на работните стандартни разтвори

Отмерват се с пипета 20 ml от основния разтвор на витамин А ацетат (т. 3.11.1) или 20 ml от основния разтвор на витамин А палмитат (т. 3.12.1) в колба с плоско дъно или конусообразна колба с обем 500 ml (т. 4.2.1) и се хидролизира, както е описано в т. 5.2, но без да се прибавя BHT. След това се пристъпва към екстракция с петролен етер (т. 3.2) съгласно процедурата в т. 5.3 и се допълва до 500 ml с петролен етер (т. 3.2). В ротативния изпарител (вж. т. 5.4) 100 ml от този екстракт се подлагат на почти пълно изпаряване, отстранява се останалото количество разтворител в поток от азот (т. 3.10) и остатъкът отново се разтваря в 10,0  ml метанол (т. 3.3). Номиналната концентрация на този разтвор е 560 IU витамин А на ml. Точната концентрация следва да се определи в съответствие с т. 5.6.3.3. Работният стандартен разтвор се приготвя непосредствено преди употреба.

Отмерват се с пипета 2,0 ml от работния стандартен разтвор в градуирана колба от 20 ml, допълва се до пълния обем с метанол (т. 3.3) и се размесва. Номиналната концентрация на този разреден работен стандартен разтвор е 56 IU витамин А на ml.

5.6.2.    Приготвяне на калибрационните разтвори и построяване на калибрационната крива

Прехвърлят се 1,0 , 2,0 , 5,0 и 10,0 ml от разредения работен стандартен разтвор в градуирани колби от 20 ml, допълва се до пълния обем с метанол (т. 3.3) и се размесва. Номиналните концентрации на тези разтвори са 2,8 , 5,6 , 14,0 и 28,0 IU витамин А на ml.

Неколкократно се впръскват 20 μl от всеки калибрационен разтвор и се определят средните височини на пиковете (площите). Според средните височини на пиковете (площите) се начертава калибрационна крива, като се вземат предвид резултатите от UV-контрола (т. 5.6.3.3).

5.6.3.    Ултравиолетово калибриране на стандартните разтвори

5.6.3.1.    Основен разтвор на витамин А ацетат

Отмерват се с пипета 2,0 ml от основния разтвор на витамин А ацетат (т. 3.11.1) в градуирана колба от 50 ml (т. 4.2.2) и се допълва до пълния обем с 2-пропанол (т. 3.8). Номиналната концентрация на този разтвор е 56 IU витамин А на ml. Отмерват се пипета 3,0 ml от този разтвор в градуирана колба от 25 ml и се допълва до пълния обем с с 2-пропанол (т. 3.8). Номиналната концентрация на този разтвор е 6,72 IU витамин А на ml. Ултравиолетовият (UV) спектър на разтвора се сравнява с този на 2-пропанол (т. 3.8) в спектрофотометъра (т. 4.6) между 300 nm и 400 nm. Максимумът на екстинкция трябва да бъде между 325 nm и 327 nm.

Изчисляване на съдържанието на витамин А:

IU витамин A/ml = E326 × 19,0

(

за витамин А ацетат = 1 530 при 326 nm в 2-пропанол)

5.6.3.2.    Основен разтвор на витамин А палмитат

Отмерват се с пипета 2,0 ml от основния разтвор на витамин А палмитат (т. 3.12.1) в градуирана колба от 50 ml (т. 4.2.2) и се допълва до пълния обем с пропанол-2 (т. 3.8). Номиналната концентрация на този разтвор е 56 IU витамин А на ml. Отмерват се пипета 3,0 ml от този разреден разтвор наа витамин А в градуирана колба от 25 ml и се допълва до пълния обем с 2-пропанол (т. 3.8). Номиналната концентрация на този разтвор е 6,72 IU витамин А на ml. Ултравиолетовият (UV) спектър на разтвора се сравнява с този на 2-пропанол (т. 3.8) в спектрофотометърa (т. 4.6) между 300 nm и 400 nm. Максимумът на екстинкция трябва да бъде между 325 nm и 327 nm.

Изчисляване на съдържанието на витамин А:

IU витамин A/ml = E326 × 19,0

(

за витамин А палмитат = 957 при 326 nm в 2-пропанол)

5.6.3.3.    Работен стандартен разтвор на витамин А

Отмерват се с пипета 3,0 ml неразреден работен стандартен разтвор на витамин А, приготвен по процедурата в т. 5.6.1, в градуирана колба от 50 ml (т. 4.2.2) и се допълва до пълния обем с 2-пропанол (т. 3.8). Отмерват се пипета 5,0 ml от този разтвор в градуирана колба от 25 ml и се допълва до пълния обем с 2-пропанол (т. 3.8). Номиналната концентрация на този разтвор е 6,72 IU витамин А на ml. Ултравиолетовият (UV) спектър на разтвора се сравнява с този на 2-пропанол (т. 3.8) в спектрофотометъра (т. 4.6) между 300 nm и 400 nm. Максимумът на екстинкция трябва да бъде между 325 nm и 327 nm.

Изчисляване на съдържанието на витамин А:

IU витамин A/ml = E325 × 18,3

(

за витамин А алкохол = 1 821 при 325 nm в 2-пропанол)

6.   Изчисляване на резултатите

Като се изхожда от средната височина (площ) на пиковете на витамин А на разтвора на пробата, се определя концентрацията на този разтвор в IU/ml чрез сравняване с калибрационната крива (т. 5.6.2).

Съдържанието w на витамин А в пробата, изразено в IU/kg, се получава по следната формула:

[UI/kg]

където:

c

=

концентрация на витамин А в разтвора на пробата (т. 5.4) в IU/ml

V1

=

обем на разтвора на пробата (т. 5.4) в ml

V2

=

обем на взетата аликвотна част по т. 5.4 в ml

m

=

тегло на частта от пробата за анализ в g.

7.   Забележки

За да се провери дали прилаганият метод за анализ дава надеждни резултати за конкретната матрица (заместител на мляко), се провежда тест за възстановяване върху още една част от пробата. Ако степента на възстановяване е по-ниска от 80 %, аналитичният резултат следва да се коригира с оглед на възстановяването.

8.   Повторяемост

Разликата в резултатите от две паралелни определяния на една и съща проба не трябва да надхвърля 15 % по отношение на най-високия резултат.

9.   Резултати от съвместно изследване ( 11 )

L

=

брой на лабораториите

n

=

брой на единичните стойности

sr

=

стандартно отклонение на повторяемостта

sR

=

стандартно отклонение на възпроизводимостта

r

=

повторяемост

R

=

възпроизводимост

CVr

=

коефициент на вариация на повторяемостта

CVR

=

коефициент на вариация на възпроизводимостта

Б.   ОПРЕДЕЛЯНЕ НА ВИТАМИН Е

1.   Цел и обхват

Настоящият метод дава възможност за определяне на количеството на витамин Е във фуражи и премикси. Съдържанието на витамин Е се изразява в mg DL-α-токоферол ацетат на kg. 1 mg DL-α-токоферол ацетат отговаря на 0,91 mg DL-α-токоферол (витамин Е).

Прагът на количествено определяне е 2 mg витамин Е/kg. Достигането на този праг е възможно само с флуоресцентен детектор. При използване на UV-детектор прагът на количествено определяне е 10 mg/kg.

2.   Принцип

Пробата се хидролизира с етанолов разтвор на калиев хидроксид и витамин Е се извлича в петролен етер. Разтворителят се елиминира чрез изпаряване, остатъкът се разтваря в метанол и, ако е необходимо, се разрежда до изискваната концентрация. Съдържанието на витамин Е се определя чрез високоефективна течна хроматография с обратна фаза с помощта на флуоресцентен детектор или UV-детектор.

3.   Реагенти

4.   Апаратура

5.   Процедура

Забележка:

Витамин Е е чувствителен към (UV-) светлина и податлив на окисляване. Всички манипулации трябва да се извършват на тъмно (в съдове от тъмно или покрито с алуминиево фолио стъкло) и в отсъствие на кислород (елиминира се с азот). По време на екстракцията въздухът над течността се заменя с азот (за да се избягва прекалено голямото налягане, от време на време трябва да се отваря запушалката).

5.1.   Подготовка на пробата

Пробата се смила, така че да може да премине през сито с отвори 1 mm, като се избягва нагряване. Смилането трябва да стане непосредствено преди претеглянето и осапуняването, в противен случай съществува риск от загуби на витамин Е.

5.2.   Осапуняване

Според тегловното съдържание на витамин Е, от 2 до 25 g от пробата се претеглят с точност до 0,01  g в плоскодънна или конусовидна колба от 500 ml (т. 4.2.1.). Последователно се прибавят при постоянно разклащане 130 ml етанол (т. 3.1), около 100 mg BHT (т. 3.12), 2 ml разтвор на натриев аскорбат (т. 3.5) и 2 ml разтвор на натриев сулфид (точка 3.6). Монтира се хладникът (т. 4.3) на колбата и последната се потапя във вана за водна баня с магнитна бъркалка (т. 4.7). Нагрява се до кипене и в продължение на 5 min се оставят парите да преминават през хладника. След това се прибавят 25 ml разтвор на калиев хидроксид (т. 3.4) през хладника (т. 4.3) и отново се оставят парите да преминават през хладника в продължение на 25 min, като се бърка при слаб приток на азот. Изплаква се хладникът с около 20 ml вода и се оставя съдържанието на колбата да изстине до достигането на стайна температура.

5.3.   Екстракция

Чрез декантация осапуняващият разтвор се прехвърля количествено, като колбата се изплаква с общо 250 ml вода, в делителна фуния от 1 000 ml (т. 4.2.3) или в екстрактора (т. 4.8). Колбата за осапуняване се изплаква последователно с 25 ml етанол (т. 3.1) и 100 ml петролен етер (т. 3.2) и течността от изплакването се прехвърля в делителната фуния или в екстрактора. Съотношението между водата и етанола в комбинираните разтвори трябва да е около 2:1. Разклаща се енергично в продължение на 2 min и се оставя в покой за 2 min.

5.3.1.    Екстракция с делителна фуния (т. 4.2.3)

Когато слоевете се отделят (вж. забележката в т. 7.3), слоят от петролен етер се прехвърля в друга делителна фуния (т. 4.2.3). Екстракцията се повтаря два пъти с 100 ml петролен етер (т. 3.2), а след това два пъти с 50 ml петролен етер (т. 3.2).

Събраните екстракти се промиват два пъти в делителната фуния при леко разклащане (за да се избегне образуването на емулсия) с порции от по 100 ml вода и след това с повторно разклащане с нови порции от по 100 ml вода, докато последната остане безцветна след добавянето на разтвор на фенолфталеин (т. 3.7) (обикновено са достатъчни четири промивания). Промитият екстракт се филтрира със сух нагънат филтър за отделяне на фазите (т. 4.4), за да се отстрани всякаква суспендирана вода, и се прехвърля в градуирана колба от 500 ml (т. 4.2.2). Делителната фуния и филтърът се изплакват с 50 ml петролен етер (т. 3.2), долива се до пълния обем с петролен етер (т. 3.2) и се разбърква добре.

5.3.2.    Екстракция с помощта на екстрактор (т. 4.8)

Когато слоевете се отделят (вж. забележката в т. 7.3), запушалката на стъкления цилиндър (т. 4.8.1) се заменя с шлифованата стъклена вложка (т. 4.8.2), като долният U-образен край на регулиращата се тръба се поставя така, че да се окаже точно над нивото на разделителната повърхност. Чрез подаване на азот през страничната тръбичка се прилага налягане и се прехвърля горният слой петролен етер в делителна фуния от 1 000 ml (т. 4.2.3). Прибавят се 100 ml петролен етер (т. 3.2) в стъкления цилиндър, затваря се с запушалката и силно се разклаща. Оставят се слоевете да се отделят и горният слой се прехвърля в делителната фуния, както е посочено по-горе. Процедурата на екстракция се повтаря с нови 100 ml петролен етер (т. 3.2), след това още два пъти с по 50 ml петролен етер (т. 3.2) и слоевете петролен етер се добавят в делителната фуния.

Събраните екстракти от петролен етер се промиват съгласно процедурата, описана в т. 5.3.1, и се изпълняват процедурата, описана в посочената точка.

5.4.   Подготовка на разтвора на пробата за HPLC

Аликвотна част от разтвора на петролен етер (т. 5.3.1 или т. 5.3.2) се прехвърлят с пипета в крушообразна колба от 250 ml (т. 4.2.4). Оставя се разтворителят да се изпари почти изцяло в ротационния изпарител (т. 4.1) при понижено налягане, при температура на ваната не по-висока от 40 oС. Възстановява се атмосферното налягане, като се вкара азот (точка 3.9), и колбата се изважда от ротационния изпарител. Отстранява се останалото количество разтворител в поток азот (т. 3.9) и остатъкът незабавно се разтваря в известен обем (10—100 ml) метанол (т. 3.3) (концентрацията на DL-α-токоферол трябва да е в интервала от 5 μg/ml до 30 μg/ml).

5.5.   Определяне чрез HPLC

Витамин Е се отделя в обратнофазова колона С18 (т. 4.5.1) и концентрацията му се измерва с помощта на флуоресцентен детектор (възбуждане: 295 nm, излъчване: 330 nm) или с UV-детектор (292 nm) (т. 4.5.2).

Впръсква се аликвотна част (например 20 μl) от получения в съответствие с точка 5.4 метанолов разтвор и се елуира с подвижната фаза (т. 3.8). Изчисляват се средните височини на пиковете (площите) на няколко впръсквания със същия разтвор на пробата и средните височини на пиковете (площи) на няколко впръсквания с калибрационните разтвори (т. 5.6.2).

Условия на HPLC

Дават се следните указания за условията: могат да се прилагат и други условия, при условие че те дават еквивалентни резултати:

5.6.   Калибриране (DL-α-токоферол ацетат или DL-α-токоферол)

5.6.1.    Стандартен разтвор на DL-α-токоферол ацетат

5.6.1.1.    Приготвяне на работния стандартен разтвор

Прехвърлят се с пипета 25 ml от основния разтвор на DL-α-токоферол ацетат (т. 3.10.1) в плоскодъннаили конусообразна колба с обем 500 ml (т. 4.2.1) и се хидролизират, както е описано в точка 5.2. След това се пристъпва към екстракция с петролен етер (т. 3.2) в съответствие с процедурата в т. 5.3 и се допълва до 500 ml с петролен етер. Взимат се 25 ml от този екстракт и се подлагат на изпаряване в ротационния изпарител (т. 5.4) до почти пълно изпаряване на разтворителя, отстранява се останалото количество разтворител в поток от азот (т. 3.9) и остатъкът се разтваря отновов 25,0 ml метанол (т. 3.3). Номиналната концентрация на този разтвор е 45,5 μg DL-α-токоферол на ml, еквивалентен на 50 μg DL-α-токоферол ацетат на ml. Работният стандартен разтвор следва да е приготвен непосредствено преди употреба.

5.6.1.2.    Приготвяне на калибрационните разтвори и построяване на калибрационна крива

Прехвърлят се 1,0 , 2,0 , 4,0 и 10,0 ml от работния стандартен разтвор в няколко градуирани колби от 20 ml, допълват се до пълния обем с метанол (т. 3.3) и съдържанието се разбърква. Номиналните концентрации на тези разтвори са 2,5 , 5,0 , 10,0 и 25,0 μg/ml DL-α-токоферол ацетат, или 2,28 , 4,55 , 9,10 и 22,8 μg DL-α-токоферол.

Неколкократно се впръскват 20 μl от всеки калибрационен разтвор и се определят средните височини на пиковете (площите). Като се използват средните височини на пиковете (площите), се начертава калибрационната крива.

5.6.1.3.    UV-калибриране на основния разтвор на DL-α-токоферол ацетат (т. 3.10.1)

Разреждат се 5,0 ml от основния разтвор на DL-α-токоферол ацетат (т. 3.10.1) с етанол до 25,0 ml и ултравиолетовият спектър на този разтвор се сравнява със спектъра на етанол (т. 3.1) в спектрален фотометър (т. 4.6) при дължина на вълната между 250 nm и 320 nm.

Максималната абсорбция трябва да е при 284 nm:

= 43,6 при 284 nm в етанол

При това разреждане трябва да се получи стойност на екстинкция от 0,84 до 0,88 .

5.6.2.    Стандартен разтвор на DL-α-токоферол

5.6.2.1.    Приготвяне на работния стандартен разтвор

Прехвърлят се с пипета 2 ml от основния разтвор на DL-α-токоферол (т. 3.11.1) в градуирана колба от 50 ml, разтваря се в метанол (т. 3.3) и се допълва до пълния обем с метанол. Номиналната концентрация на този разтвор е 40 μg DL-α-токоферол на ml, еквивалентен на 44,0 μg DL-α-токоферол ацетат на ml. Работният стандартен разтвор следва да бъде приготвен непосредствено преди употреба.

5.6.2.2.    Приготвяне на калибрационните разтвори и построяване на калибрационната крива

Прехвърлят се 1,0 , 2,0 , 4,0 и 10,0 ml от работния стандартен разтвор в няколко градуирани колби от 20 ml, допълват се до пълния обем с метанол (т. 3.3) и съдържанието се разбърква. Номиналните концентрации на тези разтвори са 2,0 , 4,0 , 8,0 и 20,0 μg/ml DL-α-токоферол, или 2,20 , 4,40 , 8,79 и 22,0 μg/ml DL-α-токоферол ацетат.

Неколкократно се впръскват 20 μl от всеки калибрационен разтвор и се определят средните височини на пиковете (площите). Като се използват средните височини на пиковете (площите), се построява калибрационната крива.

5.6.2.3.    UV-калибриране на основния разтвор на DL-α-токоферол (т. 3.11.1)

Разреждат се 2,0 ml от основния разтвор на DL-α-токоферол (т. 3.11.1) с етанол до 25,0 ml и ултравиолетовият спектър на този разтвор се сравнява със спектъра на етанол (т. 3.1) в спектрофотометър (т. 4.6) при дължина на вълната между 250 nm и 320 nm. Максималното поглъщане се наблюдава при 292 nm:

= 75,8 при 292 nm в етанол

При това разреждане трябва да се получи стойност на екстинкция равна на 0,6 .

6.   Изчисляване на резултатите

Като се изхожда от средната височина (повърхността) на пиковете на витамин Е на разтвора на пробата, концентрацията на този разтвор в μg/ml (изчислена като α-токоферол ацетат) се определя чрез сравнение с калибрационната крива (т. 5.6.1.2 или т. 5.6.2.2.).

Съдържанието w на витамин Е в пробата, изразено в mg/kg, се пресмята по следната формула:

[mg/kg]

където:

c

=

концентрация на витамин Е (като α-токоферол ацетат) в разтвора на пробата (т. 5.4) в μg/ml

V1

=

обем на разтвора на пробата (т. 5.4) в ml

V2

=

обем на взетата аликвотната част (т. 5.4) в ml

m

=

тегло на частта от пробата за анализ в g.

7.   Забележки

8.   Повторяемост

Разликата в резултатите от две паралелни определяния, проведени върху една и съща проба, не трябва да надхвърля 15 % по отношение на по-високия резултат.

9.   Резултати от съвместно изследване ( 12 )

L

=

брой на лабораториите

n

=

брой на единичните стойности

sr

=

стандартно отклонение на повторяемостта

sR

=

стандартно отклонение на възпроизводимостта

r

=

повторяемост

R

=

възпроизводимост

CVr

=

коефициент на вариация на повторяемостта

CVR

=

коефициент на вариация на възпроизводимостта

В.   ОПРЕДЕЛЯНЕ НА СЛЕДИ ОТ МИКРОЕЛЕМЕНТИ — ЖЕЛЯЗО, МЕД, МАНГАН И ЦИНК

1.   Цел и обхват

Настоящият метод позволява да се определят микроелементите желязо, мед, манган и цинк в храните. Праговете за количествено определяне са следните:

2.   Принцип

Пробата се поставя в разтвор на солна киселина след разрушаване на органичните вещества, ако има такива. Елементите желязо, мед, манган и цинк се определят с атомноабсорбционна спектрометрия след подходящо разтваряне.

3.   Реагенти

Уводен коментар

За приготвянето на реагентите и аналитичните разтвори се използва вода, която не съдържа подлежащите на определяне катиони, получена чрез двойно дестилиране в боросиликатно или кварцово стъкло или чрез двойно третиране с йонообменна смола.

Реагентите трябва да бъдат поне с чистота за анализ. Отсъствието на елемента за определяне трябва да се проверява чрез експеримент с празна проба. Ако е необходимо, реагентите трябва допълнително да се пречистят.

Вместо описаните по-долу стандартни разтвори, могат да се използват търговски стандартни разтвори, при условие че те са с гарантирано качество и са проверени преди употреба.

4.   Апаратура

5.   Процедура ( 13 )

5.1.   Проби, съдържащи органични вещества

5.1.1.    Опепеляване и приготвяне на разтвор за анализ ( 14 )

Пепелта се навлажнява с вода и се прехвърля в бехерова чаша от 250 ml. Тигелът се измива с около 5 ml солна киселина (т. 3.1), след което последната бавно и внимателно се добавя към бехерова чаша (може да има бурна реакция поради образуването на СО2). Капка по капка се добавя солна киселина (т. 3.1) като се разбърква докато престане образуването на газови мехурчета. Изпарява се до сухо, като от време навреме се разбърква със стъклена пръчка.

Добавят се 15 ml солна киселина с концентрация 6 mol/l (т. 3.2) към остатъка, след което се добавят и 120 ml вода. Разбърква се със стъклена пръчка, която се оставя в бехеровата чаша, и последната се покрива с часовниково стъкло. Бавно се нагрява до кипене и се поддържа тази температура докато спре разтварянето на пепелта. Филтрира се през чиста от пепел филтърна хартия и филтратът се събира в мерителна колба от 250 ml. Бехеровата чаша и филтърът се измиват с 5 ml гореща солна киселина с концентрация 6 mol/l (т. 3.2) и два пъти с вряла вода. Напълва се мерителната колба до марката с вода (концентрация на солната киселина около 0,5 mol/l).

Забележки:

За намаляване на общия риск от замърсяване трябва да се работи в обезпрашена атмосфера с безупречно чисти прибори и внимателно измити стъклени съдове. Определянето на цинка е особено чувствително към много видове замърсяване, например от стъклените съдове, реагентите, прахта и др.

5.1.2.    Определяне чрез спектрофотометрия

5.1.2.1.    Приготвяне на калибрационни разтвори

За всеки от елементите, които ще се определят, от работните стандартни разтвори, посочени в точки 3.7.1, 3.8.1, 3.9.1 и 3.10.1, се приготвя серия от калибрационни разтвори, като всеки има концентрация на HCl около 0,5 mol/l (и (за желязото, мангана и цинка) концентрация на лантанов трихлорид, еквивалентна на 0,1  % Lа (w/v).

Подбраните концентрации на микроелементи трябва да бъдат в рамките на чувствителността на използвания спектрометър. Таблиците по-долу дават примери за състава на типични серии от калибрационни разтвори; в зависимост обаче от вида и чувствителността на използвания спектрофотометър, може да се наложи да се изберат други концентрации.

5.1.2.2.    Приготвяне на разтвора за анализ

За определянето на медта разтворът, приготвен както е указано в т. 5.1.1, може да се използва директно. Ако е необходимо концентрацията му да се сведе до рамките на калибрационните разтвори, може да се прехвърли аликвотна част от разтвора с пипета в мерителна колба от 100 ml и да се допълни до марката със солна киселина с концентрация 0,5 mol/l (т. 3.3).

За определянето на желязото, мангана и цинка се прехвърля с пипета аликвотна част от разтвора, приготвен, както е указано в т. 5.1.1, в мерителна колба от 100 ml, добавят се 10 ml разтвор от лантанов трихлорид (т. 3.11) и се допълва до марката със солна киселина с концентрация 0,5 mol/l (т. 3.3).

5.1.2.3.    Контролен експеримент

Контролният експеримент трябва да включва всички указани стъпки на процедурата, с изключение на това, че се пропуска добавянето на пробния материал. Калибрационен разтвор „0“ не трябва да се използва като контролен разтвор.

5.1.2.4.    Измерване на атомната абсорбция

Измерва се атомната абсорбция на калибрационните разтвори и на разтвора, който ще се анализира, чрез използване на окисляващ въздушноацетиленов пламък при следните дължини на вълната:

Всички измервания се извършат четири пъти.

5.2.   Минерални фуражи

Ако пробата не съдържа органични вещества, не е необходимо да се извършва предварително опепеляване. Процедира се, както е указано в точка 5.1.1.1, като се започне от втория параграф. Може да се пропусне изпаряването с флуороводородна киселина.

6.   Изчисляване на резултатите

С помощта на калибрационна крива се изчисляват концентрациите на микроелементите в разтвора за анализ и резултатът се изразява в милиграми микроелемент на килограм проба (ppm, части на милион).

7.   Повторяемост

Разликата между резултатите от две паралелни определяния, извършени с една и съща проба от един и същ аналитик, не трябва да бъдe повече от:

8.   Забележка

Наличието на големи количества фосфати може да окаже неблагоприятно влияние върху определянето на желязо, манган и цинк. Подобно влияние трябва да бъде коригирано с добавянето на разтвор на лантанов трихлорид (т. 3.11). Ако обаче тегловното съотношение Ca + Mg/P > 2, добавянето на разтвор на лантанов трихлорид (т. 3.11) към анализирания разтвор и към калибрационните разтвори може да се пропусне.

Г.   ОПРЕДЕЛЯНЕ НА ХАЛОФУГИНОН

DL-транс-7-бромо-6-хлоро-3-[3-(3-хидрокси-2-пиперидил)ацетонил]-хиназолин-4-(3Н)-он хидробромид.

1.   Цел и обхват

Методът позволява определянето на съдържанието на халофугинон във фуражите. Прагът на количествено определяне е 1 mg/kg.

2.   Принцип

След третиране с гореща вода, халофугинонът се екстрахира като свободна основа в етилов ацетат и след това се разделя като хидрохлорид във воден киселинен разтвор. Екстрактът се очиства посредством йоннообменна хроматография. Съдържанието на халофугинон се определя с помошта на високоефективна течна хроматография с обратна фаза (HPLC), като се използва UV-детектор.

3.   Реагенти

Претеглят се с точност до 0,1 mg 50 mg халофугинон (т. 3.6) в градуирана колба с вместимост 500 ml, разтварят се в буферен разтвор на амониев ацетат (т. 3.18), допълва се до пълния обем с буферен разтвор и се разбърква. Този разтвор остава стабилен в продължение на три седмици при температура 5 oС, ако се съхранява на тъмно.

В поредица от градуирани колби с вместимост 100 ml се прехвърлят 1,0 , 2,0 , 3,0 , 4,0 и 6,0 ml от основния стандартен разтвор на халофугинон (т. 3.6.1). Допълват се до пълния обем с подвижната фаза (т. 3.21) и се разбъркват. Разтворите ще имат съответно концентрации на халофугинон 1,0 , 2,0 , 3,0 , 4,0 и 6,0 μg/ml. Разтворите се приготвят непосредствено преди употреба.

Разтварят се 50 g натриев карбонат (т. 3.11) във вода, разрежда се до 1 литър и се добавя натриев хлорид (т. 3.12), докато се получи наситен разтвор.

Разтварят се 10 ml HCl (т. 3.7) във вода, докато се получи 1 l.

Разтварят се 19,3  g амониев ацетат (т. 3.3) и 30 ml оцетна киселина (т. 3.5) във вода (т. 3.14) и разтворът се разрежда до 1 l.

Подходящо количество амберлит (т. 3.2) се промива с вода, докато бъдат отстранени всички хлорни йони, като това се установява чрез тест със сребърен нитрат (т. 3.20), който се извършва върху промивната вода. След това смолата се промива с 50 ml метанол (3.8), отстранява се метанолът и се смолата се съхранява под чист метанол.

Разтварят се 0,17  g сребърен нитрат (т. 3.9) в 10 ml вода.

Смесват се 500 ml ацетонитрил (т. 3.1) с 300 ml буферен разтвор на амониев ацетат (т. 3.18) и 1 200 ml вода (т. 3.14). Киселинността се коригира до рН = 4,3 , като се използва оцетна киселина (т. 3.5). Разтворът се филтрира през филтър с размер на порите 0,22 μm (т. 4.8) и се обезгазява (напр.чрез подлагане на въздействието на ултразвук в продължение на 10 минути). Този разтвор остава стабилен в продължение на един месец, при условие че се съхранява на тъмно място в затворен съд.

4.   Апаратура

5.   Процедура

Забележка

:

Халофугинонът като свободна основа е нестабилен в алкални разтвори и в разтвор на етилов ацетат. Халофугинонът не трябва да остава в етилов ацетат повече от 30 min.

5.1.   Общи положения

Забележка

:

За целите на този метод фуражът без добавки трябва да е подобен по вид на този от пробата и при анализа да не се открие халофугинон.

5.2.   Екстракция

Претеглят се с точност до 0,1  g 10 g от подготвената проба в епруветка за центрофугиране с вместимост 200 ml, добавят се 0,5  g натриев аскорбат (т. 3.10), 0,5  g EDTA (т. 3.13) и 20 ml вода и се разбърква. Епруветката се поставя за 5 min във водна баня (80 oС). След охлаждане до стайна температура се добавят 20 ml разтвор на натриев карбонат (т. 3.15) и се разбърква. Незабавно се добавят 100 ml етилов ацетат (т. 3.4) и се разклаща силно с ръка в продължение на 15 секунди. След това епруветката се поставя за три минути в ултразвукова баня (т. 4.1) и се разхлабва запушалката. Центрофугира се в продължение на и се прелива фазата на етиловия ацетат през филтър от стъкловлакно (т. 4.6) в делителна фуния с вместимост 500 ml. Екстрахирането на пробата се повтаря с втора порция от 100 ml етилов ацетат. Събраните на едно място екстракти се промиват в продължение на с 50 ml наситен разтвор на натриев хлорид в разтвор на натриев карбонат (т. 3.16) и се отстранява водният слой.

Екстрахира се органичният слой в продължение на 1 min с 50 ml солна киселина (т. 3.17). Прехвърля се долният киселинен слой в делителна фуния с вместимост 250 ml. Повторно се екстрахира органичният слой в продължение на минута и половина с нови 50 ml разтвор на солна киселина и се прибавя към първия екстракт. Събраните заедно киселинни екстракти се промиват чрез въртене в продължение на приблизително 10 s с 10 ml етилов ацетат (т. 3.4).

Водният слой се прехвърля количествено в облодънна колба от 250 ml, като се отстранява органичната фаза. Изпарява се целият останал етилов ацетат от киселинния разтвор, като се използва ротационен тънкослоен изпарител (т. 4.2). Температурата на водата не трябва да надвишава 40 oC. Под вакуум от приблизително 25 mbar целият остатъчен етилов ацетат се отстранява в рамките на 5 min при температура 38 oС.

5.3.   Почистване

5.3.1.    Подготвяне на колоната с амберлит

За всеки екстракт на пробата се подготвя по една колона XAD-2. 10 g от подготвения амберлит (т. 3.19) се прехвърлят в стъклена колона (т. 4.5) с метанол (т. 3.8). Добавя се малка запушалка от стъклен памук в горната част на коритото от смола. Метанолът се източва от колоната и смолата се промива със 100 ml вода, като потокът се спира веднага, щом течността достигне горната част на коритото от смола. Оставя се колоната да се уравновеси за 10 min преди употреба. Не се допуска колоната да изсъхва.

5.3.2.    Почистване на пробата

Екстрактът (т. 5.2) се прехвърля количествено в горната част на подготвената колона от амберлит (т. 5.3.1) и се елуюира, като се изхвърля елуатът. Скоростта на потока за елуиране не трябва да надвишава 20 ml/min. Облодънната колба се изплаква с 20 ml солна киселина (т. 3.17), която се използва и за да се измие колоната със смола. Евентуално останалият киселинен разтвор се отстранява с въздушен поток. Промивните течности се отстраняват. Добавят се 100 ml метанол (т. 3.8) към колоната и се оставя процесът на елуиране да продължи от 5 до 10 min, като елуатът се събира в облодънна колба с вместимост 250 ml. Оставя се останалият метанол за 10 min, за да влезе в равновесие със смолата, и се продължава елуирането със скорост 20 ml/min, като елуатът се събира в същата облодънна колба. Изпарява се метанолът върху ротационния тънкослоен изпарител (т. 4.2), като температурата на водната баня не трябва да превишава 40 oС. Остатъкът се прехвърля количествено в мерителна колба от 10 ml, като се използва подвижната фаза (т. 3.21). Долива се до номиналния обем с подвижната фаза и се разбърква. Една аликвотна част се филтрира през мембранен филтър (т. 4.7). Този разтвор се запазва за определяне с помощта на HPLC (т. 5.4).

5.4.   Определяне с помощта на HPLC

5.4.1.    Параметри

Следните указания за параметрите са ориентировъчни, като могат да се използват и други параметри, при условие че с тях се получават еквивалентни резултати:

Колона за течна хроматография (т. 4.4.1);

Подвижна фаза за HPLC (т. 3.21);

Скорост на изтичане: 1,5 до 2 ml/min.

Дължина на вълната за откриване: 243 nm

Обем за впръскване: от 40 до 100 μl.

Проверява се стабилността на хроматографската система, като калибрационният разтвор (т. 3.6.2), съдържащ 3 μg/ml, се впръсква няколко пъти, докато височината на пиковете (или площите) и времето на задържане останат постоянни.

5.4.2.    Калибрационна крива

Всеки калибрационен разтвор (т. 3.6.2) се впръсква няколко пъти и се измерват височините на пиковете (площите) за всяка концентрация. Построява се калибрационна крива, като за ординати се използват средните височини на пиковете (площите) на калибрационните разтвори, а за абсциси — съответните концентрации в μg/ml.

5.4.3.    Разтвор на пробата

Екстрактът на пробата (т. 5.3.2) се впръсква няколко пъти, като се използва същият обем, който е взет за калибрационните разтвори, и се определя средната височина на пиковете (площи) за пиковете за халофугинона.

6.   Изчисляване на резултатите

Концентрацията на разтвора на пробата в μg/ml се определя от средната височина (площ) на пиковете за халофугинона от разтвора на пробата, като се сравнява с калибрационната крива (т. 5.4.2).

Съдържанието w (mg/kg) на халофугинон в пробата се получава със следната формула:

където:

c

:

концентрация на халофугинон в разтвора на пробата в μg/ml,

m

:

тегло на частта от пробата за анализ в грамове.

7.   Потвърждаване на резултатите

7.1.   Идентичност

Идентичността на аналита може да се потвърди с помощта на кохроматография или като се използва детектор с диодна матрица, с който се сравняват спектрите на екстракта на пробата и на калибрационния разтвор (т. 3.6.2), съдържащ 6,0 μg/ml.

7.1.1.    Кохроматография

Екстракт на пробата се обогатява като се добавя целесъобразно количество калибрационен разтвор (т. 3.6.2). Количеството добавен халофугинон трябва да е сходно с предполагаемото количество халофугинон, намерен в екстракта на пробата.

Увеличава се само височината на пика на халофугинона, след като се вземе под внимание както добавеното количество, така и разреждането на екстракта. Широчината на пика, на половината от неговата максимална височина, трябва да бъде в рамките на ± 10 % от първоначалната широчина.

7.1.2.    Детектиране с диодна матрица

Резултатите се оценяват според следните критерии:

Ако някой от критериите не е изпълнен, наличието на аналита не се потвърждава.

7.2.   Повторяемост

Разликата между резултатите от две паралелни определяния, проведени върху една и съща проба, не трябва да надвишава 0,5 mg/kg за съдържание на халофугинон до 3 mg/kg.

7.3.   Възстановяване

За обогатената празна проба възстановяването трябва да е минимум 80 %.

8.   Резултати от съвместно изследване

Беше проведено съвместно изследване ( 15 ), при което три проби са били подложени на анализ от осем лаборатории.

НО

=

не е открито

SR

=

стандартно отклонение на възпроизводимостта

CVR

=

коефициент на вариация на възпроизводимостта ( %)

Възст.

=

възстановяване ( %)

Д.   ОПРЕДЕЛЯНЕ НА РОБЕНИДИН

1,3-bis[(4-хлоробензилиден)амино]гванидин хидрохлорид

1.   Цел и обхват

Настоящият метод позволява определянето на съдържанието на робенидин във фуражите. Прагът на количествено определяне е 5 mg/kg.

2.   Принцип

Пробата се екстрахира с помощта на подкиселен метанол. Екстрактът се изсушава, след което аликвотна част от него се подлага на пречистване в колона с алуминиев оксид. Робенидинът се елуира от колоната с метанол, концентрира се и се разрежда до желания обем с подвижна фаза. Съдържанието на робенидин се определя с помощта на високоефективна течна хроматография с обратна фаза (HPLC), като се използва UV-детектор.

3.   Реагенти

Поставят се 4,0 ml солна киселина (ρ20 = 1,18  g/ml) в градуирана колба от 500 ml, допълва се с метанол до пълния обем (т. 3.1), и се разбърква. Разтворът се приготвя непосредствено преди употреба.

Тип 3А, частици с меш от 8 до 12 (частици от 1,6 —2,5  mm, кристален алуминосиликат, диаметър на порите 0,3  mm)

В подходящ съд се поставят 100 g алуминиев оксид и се прибавят 2,0 ml вода. Запушва се и се разклаща за приблизително 20 min. Така полученият разтвор се съхранява в добре запушен съд.

В градуирана колба от 1 000 ml се разтварят 3,40  g калиев дихидроген фосфат във вода (чиста за HPLC), допълва се до пълния обем и се разбърква.

В градуирана колба от 1 литър се Разтварят 3,55  g безводен динатриев хидроген фосфат (или 4,45  g дихидрат или 8,95  g додекахидрат) във вода (с чистота за HPLC), допълва се до пълния обем и се разбърква.

Смесват се следните реагенти:

Разтворът се филтрира през филтър с размер на порите 0,22 μm (т. 4.6) и се обезгазява (напр. чрез подлагане на въздействието на ултразвук в продължение на 10 минути).

Чист робенидин: 1,3 -bis[(4-хлоробензилиден)амино] гуанидин хидрохлорид.

С точност до 0,1 mg се отмерват 30 mg от стандартното вещество робенидин (т. 3.9). Това количество се разтваря в подкиселен метанол (т. 3.2) в градуирана колба от 100 ml, допълва се до пълния обем със същия разтворител и се разбърква. Колбата се увива с алуминиево фолио и се съхранява на тъмно място.

Прехвърлят се 10,0 ml от основния стандартен разтвор (т. 3.9.1) в градуирана колба от 250 ml, долива се с подвижната фаза (т. 3.8) до пълния обем и се разбърква. Колбата се увива с алуминиево фолио и се съхранява на тъмно място.

В мерителни колби от 50 ml се поставят съответно 5,0 , 10,0 , 15,0 , 20,0 и 25,0 ml от междинния стандартен разтвор (т. 3.9.2). Колбите се допълват до пълния им обем с подвижната фаза (т. 3.8) и се течността се разбърква. Разтворите отговарят съответно на 1,2 ; 2,4 ; 3,6 ; 4,8 и 6,0 μg/ml робенидин. Разтворите се приготвят непосредствено преди употреба.

4.   Апаратура

Направена от непрозрачно стъкло и снабдена със спирателно кранче, с резервоар с обем приблизително 150 ml, вътрешен диаметър от 10 до 15 mm и дължина 250 mm.

5.   Процедура

Забележка

:

Робенидинът е чувствителен към светлина. Трябва да се използват непрозрачни лабораторни съдове при всички операции.

5.1.   Общи положения

Забележка

:

За целите на метода пробата от фураж, който не съдържа робенидин, трябва да бъде сходна по вид с анализираната проба и при анализ в нея не трябва да се открие робенидин.

5.2.   Екстракция

Отмерват се с точност до 0,01  g приблизително 15 g от приготвената проба. Прехвърлят се в конична колба от 250 ml и се добавят 100,0 ml подкиселен метанол (т. 3.2), съдът се запушва добре и се разклаща в продължение на 1 h в клатачна машина (т. 4.2). Разтворът се филтрира през филтрова хартия от стъклени нишки (т. 4.5) и целият филтрат се събира в конична колба от 150 ml. Прибавят се 7,5  g молекулно сито (т. 3.4), съдът се запушва добре и се разклаща в продължение на 5 min. Незабавно се филтрира през филтрова хартия от стъклени нишки. Разтворът се запазва за етапа на пречистване (т. 5.3).

5.3.   Пречистване

5.3.1.    Подготовка на колоната с алуминиев оксид

Долният край на стъклената колона (т. 4.1) се запушвас тапа от стъклен памук, която се вкарва с помощта на стъклена пръчка. Отмерват се 11 g от приготвения алуминиев оксид (т. 3.5) и се прехвърлят в колоната. По време на тази манипулация излагането на въздействието на обкръжаващия въздух се свежда до минимум. Напълнената колона се почуква леко в долния край, за да улегне алуминиевият оксид.

5.3.2.    Пречистване на пробата

С пипета се прехвърлят в колоната 5 ml от екстракта на пробата, приготвен съгласно точка 5.2. Краят на пипетата се поставя близо до стената на колоната и се оставя разтворът да се абсорбира от алуминиевия оксид. Робенидинът от колоната се елуира, като се използват 100 ml метанол (т. 3.1) при скорост на изтичане 2—3 ml/min, а елуатът се събира в облодънна колба с вместимост 250 ml. Метаноловият разтвор се подлага на изпаряване до изсъхване при намалено налягане при температура 40 oC с помощта на ротационен тънкослоен изпарител (т. 4.3). Остатъкът се разтваря отново в 3—4 ml от подвижната фаза (т. 3.8) и се прехвърля количествено в градуирана колба от 10 ml. Колбата се изплаква на няколко пъти с порции от 1—2 ml от подвижната фаза и изплакнатите количества се прехвърлят в градуираната колба. Допълва се до пълния обем със същия разтворител и се разбърква. Една аликвотна част се филтрира през мембранен филтър от 0,45 μm (т. 4.7). Разтворът се запазва за определяне чрез HPLC (т. 5.4).

5.4.   Определяне с помощта на HPLC

5.4.1.    Параметри

Следните указания за параметрите са ориентировъчни, като могат да се използват и други параметри, при условие че с тях се получават еквивалентни резултати:

Колона за течна хроматография (т. 4.4.1),

подвижна фаза за HPLC (т. 3.8),

Скорост на изтичане: 1,5 до 2 ml/min,

Дължина на вълната, на която е настроен детекторът: 317 nm

обем за впръскване 20—50 μl.

Проверява се стабилността на хроматографската система, като на няколко пъти се впръсква калибрационен разтвор (т. 3.9.3), съдържащ 3,6 μg/ml, докато се постигнат постоянни височини на пика и постоянни времена на задържане.

5.4.2.    Калибрационна крива

Всеки от калибрационните разтвори (т. 3.9.3), се впръсква няколко пъти и се измерват височините (площите) за всяка концентрация. Построява се калибрационна крива, като за ординати се използват средните височини на пиковете или площите на калибрационните разтвори, а за абсциси — съответните концентрации в μg/ml.

5.4.3.    Разтвор на пробата

Разтворът на пробата (т. 5.3.2) се впръсква няколко пъти, като се използва същият обем, който е взет за калибрационните разтвори, и се определя средната височина на пиковете (площ) за пиковете на робенидина.

6.   Изчисляване на резултатите

Концентрацията на разтвора на пробата в μg/ml се определя от средната височина (площ) на пиковете за робенидина, като се сравнява с калибрационната крива (т. 5.4.2).

Съдържанието w (mg/kg) на робенидин в пробата се пресмята по следната формула:

където:

c

=

концентрация на робенидин в разтвора на пробата в μg/ml,

m

=

тегло на частта от пробата за анализ в грамове.

7.   Потвърждаване на резултатите

7.1.   Идентичност

Идентичността на аналита може да се потвърди с помощта на кохроматография или като се използва детектор с диодна матрица, с който се сравняват спектрите на екстракта на пробата и на калибрационния разтвор (т. 3.9.3), съдържащ 6 μg/ml.

7.1.1.    Кохроматография

Екстратът на пробата се обогатява, като към него се прибави подходящо количество от калибрационния разтвор (т. 3.9.3). Количеството добавен робенидин трябва да е сходно с предполагаемото количество робенидин, намерен в екстракта на пробата.

Увеличава се само височината на пика на робенидина, след като се вземе под внимание както добавеното количество, така и степента на разреждане на екстракта. Широчината на пика на половината от неговата максимална височина трябва да бъде в рамките на около 10 % от първоначалната широчина.

7.1.2.    Детектиране с диодна матрица

Резултатите се оценяват според следните критерии:

Ако някой от критериите не е изпълнен, наличието на аналита не се потвърждава.

7.2.   Повторяемост

Разликата между резултатите от две паралелни определяния, проведени върху една и съща проба, не трябва да надвишава 10 % от по-високия резултат при съдържание на робенидин по-високо от 15 mg/kg.

7.3.   Възстановяване

Възстановяването за обогатена проба от фураж без добавки трябва да бъде поне 85 %.

8.   Резултати от съвместно изследване

Беше организирано съвместно изследване в рамките на ЕО, при което четири проби от фураж за домашни птици и зайци под формата на брашно или пелети бе анализирано от 12 лаборатории. За всяка проба са проведени по два анализа. Резултатите от изследването са представени в следната таблица:

sr

=

стандартно отклонение на повторяемостта

CVr

=

коефициент на вариация на повторяемостта

SR

=

стандартно отклонение на възпроизводимостта

CVR

=

коефициент на вариация на възпроизводимостта, %

Е.   ОПРЕДЕЛЯНЕ НА ДИКЛАЗУРИЛ

(+)-4-хлорфенил [2,6-дихлоро-4-(2,3,4,5-тетрахидро-3,5-диоксо-1,2,4-триазин-2-ил)фенил]-ацетонитрил.

1.   Цели и обхват

Настоящият метод дава възможност за определяне на равнището на диклазурил във фуражи и премикси. Границата на откриване е 0,1 mg/kg, а границата на определяне е 0,5 mg/kg.

2.   Принцип

След прибавяне на вътрешен стандарт, пробата се екстрахира с подкислен метанол. При фуражите, една аликвотна част от екстракта се пречиства в патрон за екстракция на твърда фаза С18. Диклазурилът се елуира от патрона със смес от подкислен метанол и вода. След изпарение, остатъкът се разтваря в DMF/вода. При премиксите екстрактът се изпарява и остатъкът се разтваря в DMF/вода. Съдържанието на диклазурил се определя чрез високоефективна триградиентна течна хроматография (HPLC) с обратна фаза, с помощта на UV детектор.

3.   Реагенти

Претеглят се 25 mg стандартно вещество диклазурил (т. 3.8) с точност до 0,1 mg в градуирана колба от 50 ml. Разтварят се в DMF (т. 3.6), допълва се до пълния обем с DMF (3.6) и се разбърква. Колбата се обвива с алуминиево фолио или се използва колба от тъмно стъкло и се поставя за съхранение в хладилник. При температура ≤ 4 oС, разтворът е стабилен в продължение на 1 месец.

Прехвърлят се 5,00 ml от основния стандартен разтвор (т. 3.8.1) в градуирана колба от 50 ml, допълва се до пълния обем с DMF (т. 3.6) и се разбърква. Колбата се обвива с алуминиево фолио или се използва колба от тъмно стъкло и се поставя за съхранение в хладилник. При температура ≤ 4 oС, разтворът е стабилен в продължение на 1 месец.

Претеглят се 25 mg от веществото за вътрешен стандарт (т. 3.9) с точност до 0,1 mg в градуирана колба от 50 ml. Това количество се разтваря в DMF (т. 3.6), разтворът се допълва до пълния обем с DMF (3.6) и се разбърква. Колбата се обвива с алуминиево фолио или се използва колба от тъмно стъкло и се поставя за съхранение в хладилник. При температура ≤ 4 oС, разтворът е стабилен в продължение на 1 месец.

Прехвърлят се 5,00 ml от вътрешния основен стандартен разтвор (т. 3.9.1) в градуирана колба от 50 ml, допълва се до пълния обем с DMF (т. 3.6) и се разбърква. Колбата се обвива с алуминиево фолио или се използва колба от тъмно стъкло и се поставя за съхранение в хладилник. При температура ≤ 4 oС, разтворът е стабилен в продължение на 1 месец.

(р = номинално съдържание на диклазурил в mg/kg в премикса)

Отмерват се с точност до 0,1 mg p/10 mg от веществото, използвано за вътрешен стандарт, в градуирана колба от 100 ml, разтварят се в DMF (т. 3.6) в ултразвукова вана (т. 4.6), допълва се до пълния обем с DMF и се разбърква. Колбата се обвива с алуминиево фолио или се използва колба от тъмно стъкло и се поставя за съхранение в хладилник. При температура ≤ 4 oС, разтворът е стабилен в продължение на 1 месец.

Отмерват се с пипета 2,00 ml от стандартния разтвор на диклазурил (т. 3.8.2) и 2 ml от вътрешния стандартен разтвор в градуирана колба от 50 ml. Прибавят се 16 ml DMF (т. 3.6), допълва се до пълния обем с вода и се разбърква. Разтворът трябва да бъде приготвен непосредствено преди употреба.

Отмерват се с пипета 5,0 ml солна киселина (т. 3.7) и се смесват с 1 000 ml метанол (т. 3.5).

Разтварят се 5 g амониев ацетат (т. 3.2) и 3,4  g TBHS (т. 3.3) в 1 000 ml вода (т. 3.1) и се разбърква.

4.   Апаратура

5.   Процедура

5.1.   Общи положения

5.1.1.    Фураж без добавки

Анализира се фураж без добавки, за да се провери дали не той не е замърсен с диклазурил или други вещества. Фуражът без добавки трябва да е аналогичен по вид на този от пробата и при анализа да не се открие диклазурил или други нежелани вещества.

5.1.2.    Тест за възстановяване

Провежда се тест за възстановяване, като се анализира проба от фураж без добавки, обогатена чрез прибавяне на близко до наличното в пробата за изследване количество диклазурил. За да се обогати фуражът до равнище 1 mg/kg, се добавят 0,1 ml от основния стандартен разтвор (т. 3.8.1) към 50 g от фуража без добавки, смесва се и се изчаква 10 min, като се рамесва няколко пъти, преди да се премине към следващия етап (т. 5.2).

Като алтернатива, ако не е наличен фураж, подобен на този, от който е взета пробата (вж. 5.1.1), тестът за възстановяване може да се извърши чрез стандартия метод на добавяне. В този случай пробата, която ще се анализира, се обогатява с такова количество диклазурил, което е близко до вече съдържащото се в пробата. Тази проба се анализира заедно с необогатена проба, като степента на възстановяване се пресмята чрез изваждане.

5.2.   Екстракция

5.2.1.    Фураж

Претеглят се точност до 0,01  g около 50 g от пробата. Прехвърлят се в конична колба от 500 ml, прибавя се 1,00 ml разтвор на вътрешния стандарт (т. 3.9.2), 200 ml разтворител за екстракция (т. 3.12) и колбата се запушва. Сместа се поставя в клатачна машина (т. 4.1) и се оставя в нея до следващия ден. Сместа се оставя да се утаява в продължение на 10 минути. Прехвърлят се 20 ml аликвотна част от супернатанта в подходящ стъклен съд и се разрежда с 20 ml вода. Този разтвор се прехвърля в патрон за екстракция (т. 3.11) и се прекарва през последния чрез подаване на вакуум (т. 4.5). Патронът се промива с 25 ml смес от екстракционния разтворител (т. 3.12) и вода, 65 + 35 (V + V). Събраните фракции се отстраняват и съединенията се елуират с 25 ml смес от екстракционния разтворител (т. 3.12) и вода, 80 + 20 (V + V). Тази фракция се изпарява до сухо, като се използва ротационният изпарител (т. 4.3) при 60 oС. Остатъкът се разтваря в 1,0 ml DMF (т. 3.6), добавят се 1,5 ml вода (т. 3.1) и се разбърква. Филтрира се през мембранен филтър (т. 4.4). Пристъпва се към определяне чрез HPLC (т. 5.3).

5.2.2.    Премикси

Претегля се с точност до 0,001  g около 1 g от пробата. Претегленото количество се прехвърля в конична колба от 500 ml, прибавя се 1,00 ml от разтвора на вътрешния стандарт (т. 3.9.3), 200 ml екстракционен разтворител (т. 3.12) и колбата се запушва. Сместа се поставя в клатачна машина (т. 4.1) и се оставя в нея до следващия ден. Сместа се оставя да се утаява в продължение на 10 минути. Аликвотна част с обем 10,000 /р ml (р = номинално съдържание на диклазурил в премикса в mg/kg) от супернатанта се прехвърля в облодънна колба с подходящ размер. Течността се изпарява при понижено налягане и при 60 oC до сухо, като се използва ротационният изпарител (т. 4.3). Остатъкът се разтваря отново в 10,0 ml DMF (т. 3.6), прибавят се 15,0 ml вода (т. 3.1) и се разбърква. Пристъпва се към определяне чрез HPLC (т. 5.3).

5.3.   Определяне с помощта на HPLC

5.3.1.    Параметри

Следните условия са дадени като указание; може да се използват други, при условие, че дават равностойни резултати:

Стабилността на хроматографската система се проверява, като се впръска няколко пъти калибрационен разтвор (т. 3.10), съдържащ 2 μg/ml, докато се постигнат постоянни височини на пиковете и времена на задържане.

5.3.2.    Калибрационен разтвор

Впръскват се 20 μl от калибрационния разтвор (т. 3.10) няколко пъти и се определя средната височина (площ) на пика на диклазурила и на пиковете на вътрешния стандарт.

5.3.3.    Разтвор на пробата

Впръскват се 20 μl от разтвора на пробата (т. 5.2.1 или т. 5.2.2.) няколко пъти и се определя средната височина (площ) на пика на диклазурила и пиковете на вътрешния стандарт.

6.   Изчисляване на резултатите

6.1.   Фуражи

Съдържанието на диклазурил w (mg/kg) в пробата се пресмята по следната формула:

[mg/kg]

където:

hd, s

=

височина (площ) на пика на диклазурил в разтвора на пробата (т. 5.2.1)

hi, s

=

височина (площ) на пика на вътрешния стандарт в разтвора на пробата (т. 5.2.1)

hd, c

=

височина (площ) на пика на диклазурил в калибрационния разтвор (т. 3.10)

hi, c

=

височина (площ) на пика на вътрешния стандарт в калибрационния разтвор (т. 3.10)

cd, c

=

концентрация на диклазурил в калибрационния разтвор в μg/ml (т. 3.10)

m

=

тегло в g на частта от пробата за анализ.

V

=

обем на екстракта от пробата, съгласно т. 5.2.1 (т.е. 2,5 ml)

6.2.   Премикси

Съдържанието на диклазурил w (mg/kg) в пробата се пресмята по следната формула:

[mg/kg]

където:

hd,с

=

височина (площ) на пика на диклазурил в калибрационния разтвор (т. 3.10)

hi, c

=

височина (площ) на пика на вътрешния стандарт в калибрационния разтвор (т. 3.10)

hd, s

=

височина (площ) на пика на диклазурил в разтвора на пробата (т. 5.2.2)

hi, s

=

височина (площ) на пика на вътрешния стандарт в разтвора на пробата (т. 5.2.2)

cd, c

=

концентрация на диклазурил в калибрационния разтвор в μg/ml (т. 3.10)

m

=

тегло в g на частта от пробата за анализ.

V

=

обем на екстракта от пробата, съгласно т. 5.2.1 (т.е. 25 ml)

p

=

номинално съдържание на диклазурил в mg/kg в премикса

7.   Потвърждаване на резултатите

7.1.   Идентичност

Идентичността на аналита може да бъде потвърдена чрез кохроматография или като се използва детектор с диодна матрица, с помощта на който се сравняват спектрите на екстракта на пробата (т. 5.2.1 или т. 5.2.2) и на калибрационния разтвор (т. 3.10).

7.1.1.    Кохроматография

Обогатява се екстракт от пробата (т. 5.2.1 или т. 5.2.2), като се добави подходящо количество калибрационен разтвор (т. 3.10). Количеството добавен диклазурил трябва да бъде близко до откритото в екстракта от пробата.

След като се вземат под внимание както добавеното количество, така и разреждането на екстракта, увеличават се само височината на пика на диклазурила и тази на пика на вътрешния стандарт. Широчината на пика при половината от височината му трябва да бъде в границите на ± 10 % от оригиналната широчина на пика на диклазурила или на пика на вътрешния стандарт на необогатения екстракт от пробата.

7.1.2.    Детектиране с диодна матрица

Резултатите се оценяват според следните критерии:

Ако някой от критериите не е изпълнен, наличието на аналита не се потвърждава.

7.2.   Повторяемост

Разликата между резултатите от две паралелни определяния, проведени върху една и съща проба, не трябва да превишава:

7.3.   Възстановяване

При обогатена (празна) проба, извличането трябва да бъде най-малко 80 %.

8.   Резултати от съвместно изследване

Проведено беше съвместно изследване, при което 11 лаборатории анализираха 5 проби. Пробите се състояха от два премикса; единият беше смесен с органична матрица (О 100), а другият — с неорганична матрица (А 100). Теоретичното съдържание на диклазурил беше 100 mg/kg. Трите смесени фуража за домашни птици бяха произведени от три различни производителя (NL) (L1/Z1/K1). Теоретичното съдържание на диклазурил беше 1 mg/kg. Лабораториите бяха инструктирани да анализират всяка от пробите един или два пъти. (По-подробна информация за това съвместно изследване може да се открие в Journal of AOAC International, том 77, бр. 6, 1994 г., стр. 1359—1361). Резултатите са представени в следната таблица:

L

=

брой на лабораториите

n

=

брой на единичните стойности

Sr

=

стандартно отклонение на повторяемостта

CVr

=

коефициент на вариация на повторяемостта

SR

=

стандартно отклонение на възпроизводимостта

CVR

=

коефициент на вариация на възпроизводимостта

9.   Забележки

Необходимо е предваретелно да е доказано, че реакцията спрямо диклазурил е линейна в интервала на измерваните стойности.

Ж.   ОПРЕДЕЛЯНЕ НА ЛАЗАЛОЦИД-НАТРИЙ

Натриева сол на полиетерна монокарбонова киселина, получена от Streptomyces lasaliensis

1.   Цел и обхват

Настоящията метод дава възможност за определяне на равнището на лазалоцид-натрий във фуражи и премикси. Границата на откриване е 5 mg/kg, а границата на количествено определяне е 10 mg/kg.

2.   Принцип

Лазалоцид натрий се извлича от пробата в подкислен метанол и се определя чрез високоефективна течна хроматография (HPLC) с обратна фаза, с помощта на спектрофлуориметричен детектор.

3.   Реагенти

Разредждат се 23,5 ml ортофосфорна киселина (т. 3.2) до 100 ml с вода.

Разтварят се 1,36  g KH2PO4 (т. 3.1) в 500 ml вода (т. 3.11), добавят се 3,5 ml ортофосфорна киселина (т. 3.2) и 10,0 ml 6-метил-2-хептиламин (т. 3.4). Стойността на рН се коригира до 4,0 чрез прибавяне на разтвор на ортофосфорна киселина (т. 3.3) и разтворът се разрежда до 1 000 ml с вода (т. 3.11).

Прехвърлят се 5,0 ml солна киселина (т. 3.6) в градуирана колба от 1 000 ml, допълва се с метанол (т. 3.5) до пълния обем и се разбърква. Разтворът трябва да бъде приготвен непосредствено преди употреба.

Смесват се 5 ml от фосфатния буферен разтвор (т. 3.7) с 95 ml метанол (т. 3.5).

Претеглят се с точност до 0,1 mg 50 mg лазалоцид натрий (т. 3.10) и се поставят в градуирана колба от 100 ml, разтварят се в подкислен метанол (т. 3.8), допълва се със същия разтворител до пълния обем, и се разбърква. Разтворът трябва да бъде приготвен непосредствено преди употреба.

Отмерват се с пипета 10,0 ml от основния стандартен разтвор (т. 3.10.1) в градуирана колба от 100 ml, допълва се с подкислен метанол (т. 3.8) до пълния обем и се разбърква. Разтворът трябва да бъде приготвен непосредствено преди употреба.

В няколко колби от 50 ml се прехвърлят 1,0 , 2,0 , 4,0 , 5,0 и 10,0 ml от междинния стандартен разтвор (т. 3.10.2). Допълва се с подкислен метанол (т. 3.8) до пълния обем и се разбърква. Тези разтвори съдържат съответно 1,0 , 2,0 , 4,0 , 5,0 и 10,0 μg/ml лазалоцид натрий. Разтворите трябва да бъдат приготвени непосредствено преди употреба.

4.   Апаратура

5.   Процедура

5.1.   Общи положения

5.1.1.    Фураж без добавки

За провеждането на теста за възстановяване (т. 5.1.2), се анализира фураж без добавки, за да се провери дали не е замърсен с лазалоцид натрий или с други вещества. Фуражът без добавки трябва да е подобен по вид на този от изследваната проба и в него не трябва да се откриват лазалоцид натрий или нежелани вещества.

5.1.2.    Тест за възстановяване

Тестът за възстановяване се извършва, като се анализира пробата от фуража без добавки, обогатена чрез прибавяне на близко до наличното в пробата количество лазалоцид натрий. За да се обогати пробата до ниво до 100 mg/kg, 10,0 ml от стандартния разтвор (т. 3.10.1) се прехвърлят в конична колба от 250 ml и се подлагат на изпарение, докато количеството на разтвора намалее до около 0,5 ml. Добавят се 50 g от фуража без добавки, разбърква се старателно и се оставя за 10 min, като се разбърква неколкократно, преди да се премине към етапа на екстракция (т. 5.2).

Като алтернатива, ако не е наличен фураж без добавки, подобен на този, от който е взета пробата (вж. т. 5.1.1), тестът за възстановяване може да се извърши чрез стандартия метод на добавяне. В този случай пробата, която ще се анализира, се обогатява с такова количество лазалоцид натрий, което е близко до наличното в пробата. Тази проба се анализира заедно с необогатената проба, като извличането се пресмята чрез изваждане.

5.2.   Екстракция

5.2.1.    Фураж

Претеглят се 5 g до 10 g от пробата с точност до 0,01  g и се поставят в конична колба от 250 ml със запушалка. Прибавят се с пипета 100,0 ml подкислен метанол (т. 3.8). Запушва се хлабаво със запушалката и се разклаща, за да може съдържанието да се диспергира. Колбата се поставя в ултразвукова вана (т. 4.1) при температура приблизително 40 oС за 20 минути, след което се изважда и охлажда до стайна температура. Оставя се да престои около 1 час до утаяване на суспензията, след което през мембранен филтър от 0,45 μm (т. 4.2) се филтрира в подходящ съд една аликвотна част. Пристъпва се към определяне чрез HPLC (т. 5.3).

5.2.2.    Премикси

Около 2 g несмлян премикс се претеглят с точност до 0,001  g и се поставят в градуирана колба от 250 ml. Прибавят се 100,0 ml подкислен метанол (т. 3.8) и се разклаща, за да може съдържанието да се диспергира. Колбата със съдържанието си се поставя в ултразвукова вана (т. 4.1) при температура приблизително 40 oС за 20 минути, след което се изважда и охлажда до стайна температура. Разрежда се с подкислен метанол (т. 3.8) до пълния обем и се разбърква старателно. Оставя се да престои около 1 час до утаяване на суспензията, след което през мембранен филтър от 0,45 μm (т. 4.2) се филтрира една аликвотна част. Подходящ обем от чистия филтрат се разрежда с подкислен метанол (т. 3.8), за да се получи окончателен разтвор за анализ, който съдържа около 4 μg/ml лазалоцид натрий. Пристъпва се към определяне чрез HPLC (т. 5.3).

5.3.   Определяне с помощта на HPLC

5.3.1.    Параметри

За ориентиране се предлагат следните условия; може да се използват и други условия, ако дават равностойни резултати:

Стабилността на хроматографската система се проверява, като се впръсква няколко пъти калибрационен разтвор (т. 3.10.3), съдържащ 4,0 μg/ml, докато бъдат постигнати постоянни пикови височини (или площи) и времена на задържане.

5.3.2.    Калибрационна крива

Всеки калибрационен разтвор се впръсква (3.10.3) по няколко пъти и се определят средните пикови височини (площи) за всяка концентрация. Построява се калибрационна крива, като за ординати се използват средните височини на пиковете (площите), а за абсциси — съответните концентрации в μg/ml.

5.3.3.    Разтвор на пробата

Впръскват се няколко пъти получените в т. 5.2.1. или т. 5.2.2 екстракти от изследваната проба, като се взима същият обем като при калибрационния разтвор, и се определят средните пикови височини (площи) на пиковете на лазалоцид натрий.

6.   Изчисляване на резултатите

Като се използва средната пикова височина (площ), получена при впръскване на разтвора на пробата (т. 5.3.3), чрез сравняване с калибрационната крива се определя концентрацията на лазалоцид натрий (μg/ml).

6.1.   Фураж

Съдържанието на лазалоцид натрий w (mg/kg) в пробата се пресмята по следната формула:

[mg/kg]

където:

c

=

концентрация на лазалоцид натрий в разтвора на пробата (т. 5.2.1) в μg/ml

V1

=

обем на екстракта от пробата, съгласно т. 5.2.1 в ml (т.е. 100)

m

=

тегло в g на частта от пробата за анализ.

6.2.   Премикси

Съдържанието на лазалоцид натрий w (mg/kg) в пробата се пресмята по следната формула:

[mg/kg]

където:

c

=

концентрация на лазалоцид натрий в разтвора на пробата (т. 5.2.2) в μg/ml

V2

=

обем на екстракта от пробата, съгласно т. 5.2.2 в ml (т.е. 250)

f

=

фактор на разреждане, съгласно т. 5.2.2

m

=

тегло в g на частта от пробата за анализ.

7.   Потвърждаване на резултатите

7.1.   Идентичност

Методите, които се базират на спектрофлуориметрията, са по-малко податливи на смущения, отколкото тези, при които се използва UV детекция. Идентичността на аналита може да се потвърди чрез ко-хроматография.

7.1.1.    Ко-хроматография

Обогатява се екстракт от пробата (т. 5.2.1 или т. 5.2.2), като се добави подходящо количество калибрационен разтвор (т. 3.10.3). Количеството добавен лазалоцид натрий трябва да бъде близко до откритото в екстракта от пробата. Увеличава се само височината на пика на лазалоцид натрий, като се вземе предвид добавеното количество лазалоцид натрий и степента на разреждане на екстракта. Широчината на пика на половината от височината му трябва да бъде в рамките на ± 10 % от първоначалната широчина, получена за екстракта от необогатената проба.

7.2.   Повторяемост

Разликата между резултатите от две паралелни определяния, проведени върху една и съща проба, не трябва да превишава:

7.3.   Възстановяване

За обогатената проба от фуража, възстановяването трябва да бъде най-малко 80 %. При обогатените проби от премикси, възстановяването трябва да бъде най-малко 90 %.

8.   Резултати от съвместно изследване

Проведено беше съвместно изследване ( *1 ), при което бяха анализирани 2 премикса (проби 1 и 2) и 5 вида фураж (проби 3—7) от 12 лаборатории. За всяка проба са проведени по два анализа. Резултатите са представени в таблицата по-долу:

L

=

брой на лабораториите

n

=

брой на единичните резултати

sr

=

стандартно отклонение на повторяемостта

sR

=

стандартно отклонение на възпроизводимостта

CVr

=

коефициент на вариация на повторяемостта, %

CVR

=

коефициент на вариация на възпроизводимостта, %

---

ПРИЛОЖЕНИЕ V

МЕТОДИ ЗА АНАЛИЗ С ЦЕЛ КОНТРОЛ НА НЕЖЕЛАНИ ВЕЩЕСТВА ВЪВ ФУРАЖИТЕ

А.   ОПРЕДЕЛЯНЕ НА СВОБОДЕН И ОБЩ ГОСИПОЛ

1.   Цел и обхват

Настоящият метод дава възможност да се определи равнището на свободния госипол, общия госипол и химически сродни вещества в памучно семе, брашно от памучно семе, в кюспе от памучно семе и в комбинирани фуражи, съдържащи тези фуражни суровини, когато съдържанието на свободен госипол, общ госипол и химически сродни вещества надвишава 20 mg/kg.

2.   Принцип

Госиполът се екстрахира в присъствие на 3-аминопропан-1-ол — или със смес от пропан-2-ол и хексан — за определяне на свободния госипол, или с диметилформамид за определяне на общия госипол. Под въздействието на анилин госиполът се превръща в госипол-дианилин, чиято оптична плътност се измерва при 440 nm.

3.   Реагенти

Стандартните разтвори А и Б на госипол са стабилни в продължение на 24 часа, ако се съхраняват на тъмно.

4.   Апаратура

5.   Процедура

5.1.    Проба за изследване

Големината на пробата зависи от предполагаемото съдържание на госипол в нея. За предпочитане е да се работи с малка проба и относително голяма аликвотна част от филтрата, така че да се получи достатъчно количество госипол за прецизно спектрофотометрично измерване. При определяне на свободния госипол в памучно семе, брашно от памучно семе и в кюспе от памучно семе изследваната проба не трябва да надвишава 1 g; при комбиниран фураж, тя може да достигне и 5 g. За повечето случаи е подходящо да се използва аликвотна част от филтрата с обем 10 ml; тя трябва да съдържа от 50 до 100 μg госипол. При определяне на общия госипол пробата трябва да бъде от 0,5 до 5 g, така че в 2 ml от аликвотната част от филтрата да се съдържат от 40 до 200 μg госипол.

Анализът се провежда при стайна температура от около 20 oC.

5.2.    Определяне на свободен госипол.

Пробата се поставя в колба от 250 ml с шлифовано гърло, като дъното на колбата трябва да е покрито с натрошено стъкло. Добавят се с пипета 50 ml от разтворител А (т. 3.2), колбата се запушва и се разбърква в продължение на един час в смесителя. Филтрува се през сух филтър и филтратът се събира в малка колба с шлифовано гърло. По време на филтруването фунията се покрива с часовниково стъкло.

Равни аликвотни части от филтрата, съдържащ от 50 до 100 μg госипол, се прехвърлят с пипета в две градуирани колби (А и В) от по 25 ml. Ако е необходимо, обемът се допълва до 10 ml с разтворител А (т. 3.2). Съдържанието на колба А се допълва до пълния обем със сместа от пропан-2-ол и хексан (т. 3.1). Този разтвор се използва като еталонен разтвор и спрямо него се измерва разтворът на пробата.

В две други градуирани колби от 25 ml (В и Г) се прехвърлят с пипета по 10 ml от разтворител А (т. 3.2). Съдържанието на колба В се допълва до пълния обем със сместа от пропан-2-ол и хексан (т. 3.1). Този разтвор се използва като еталонен и спрямо него се измерват разтворите на празната проба.

Във всяка от колбите Г и Б се добавят по 2 ml анилин (т. 3.4). Колбите се нагряват в продължение на 30 минути над кипяща водна баня, за да се развие оцветяването. Охлаждат се до стайна температура, допълват се до пълния обем със сместа от пропан-2-ол и хексан (т. 3.1), хомогенизират се и се оставят да престоят един час.

Оптическата плътност на празната проба Г се определя чрез сравняване с еталонния разтвор В. Оптическата плътност на пробата Б се определя чрез сравняване със стандартния разтвор А. Измерването се провежда на спектрофотометър при 440 nm, като се използват стъклени кювети с дебелина 1 cm.

Оптическата плътност на празната проба се изважда от тази на изследваната проба (= коригирана оптична плътност). Като се вземе тази стойност, се изчислява количеството свободен госипол, както е описано в точка 6.

5.3.    Определяне на общ госипол

В градуирана колба от 50 ml се поставя проба, която съдържа от 1 до 5 mg госипол и се добавят 10 ml разтворител Б (т. 3.3). Едновременно с това се приготвя и празна проба, като 10 ml от разтворител Б (т. 3.3) се прехвърлят в друга градуирана колба от 50 ml. Двете колби се нагряват в продължение на 30 минути над кипяща водна баня. Охлаждат се до стайна температура и съдържанието на всяка колба се допълва до пълния обем със сместа от пропан-2-ол и хексан (т. 3.1). Съдържанието на колбите се хомогенизира и се оставя да се утаи в продължение на 10—15 минути, след което се филтрира и филтратите се събират в колби с шлифовани гърла.

С пипета се поставят по 2 ml от филтрата на пробата в две градуирани колби от 25 ml, а по 2 ml от филтрата на празната проба се слагат в други две градуирани колби от 25 ml. Съдържанието на колбите от всяка група се допълва до 25 ml със сместа от пропан-2-ол и хексан (т. 3.1). Тези разтвори се използват като еталонни разтвори.

Във всяка от другите две колби се добавят по 2 ml анилин (т. 3.4). Колбите се нагряват в продължение на 30 минути над кипяща водна баня, за да се развие оцветяването. Охлаждат се до стайна температура, допълват се до 25 ml със сместа от пропан-2-ол и хексан (т. 3.1), съдържанието им се хомогенизира се и се оставят да престоят един час.

Оптичната плътност се определя, както е указано в т. 5.2 за свободния госипол. Като се вземе тази стойност, се изчислява количеството на общия госипол, както е указано в точка 6.

6.   Изчисляване на резултатите

Резултатите могат да се изчислят както чрез специфичната оптична плътност (т. 6.1), така и чрез сравняване с калибрационната крива (т. 6.2).

6.1.    Определяне чрез специфичната оптична плътност

Очакваните стойности на специфичните оптични плътности при описаните условия са следните:

Съдържанието на свободен или общ госипол в пробата се изчислява по следната формула:

където:

Е

=

коригираната оптична плътност, определена както е указано в т 5.2.

p

=

масата в g на пробата;

a

=

аликвотна част от филтрата в ml.

6.2.    Чрез използване на калибрационната крива

6.2.1.    Свободен госипол

Подготвят се 2 серии от пет градуирани колби от 25 ml. Във всяка серия колби с пипета се прехвърлят по 2,0 , 4,0 , 6,0 , 8,0 и 10,0 ml аликвотни части от стандартния разтвор А на госипол (т. 3.5). Допълват се до 10 ml с разтворител А (т. 3.2). Към всяка серия се добавя градуирана колба от 25 ml, в която има само 10 ml разтворител А (т. 3.2) (празна проба).

Съдържанието на колбите от първата серия (включително колбата с празната проба) се допълва до 25 ml със сместа от пропан-2-ол и хексан (т. 3.1) (еталонна серия).

Във всяка от колбите от втората серия (включително в колбата с празната проба) се добавят по 2 ml анилин (т. 3.4). Колбите се нагряват в продължение на 30 минути над кипяща водна баня, за да се развие оцветяването. Охлаждат се до стайна температура, допълват се до пълния обем със сместа от пропан-2-ол и хексан (т. 3.1), хомогенизира се съдържанието им и се оставят да престоят един час (стандартна серия).

В съответствие с т. 5.2 се определя оптичната плътност на разтворите в стандартната серия, като се сравняват последните със съответните им разтвори от еталонната серия. Построява се калибрационната крива, като срещу количествата госипол (в μg) се нанася оптичната плътност.

6.2.2.    Общ госипол

Подготват се шест градуирани колби от 50 ml. В първата колба се поставят 10 ml от разтворител Б (т. 3.3), а в другите — съответно 2,0 , 4,0 , 6,0 , 8,0 и 10,0 ml от стандартния разтвор Б на госипол (т. 3.6) Всяка колба се допълва до 10 ml с разтворител Б (т. 3.3). Колбите се нагряват в продължение на 30 минути над кипяща водна баня. Охлаждат се до стайна температура, допълват се до пълния обем със сместа от пропан-2-ол и хексан (т. 3.1), и съдържанието им се хомогенизира.

Поставят се 2 ml от тези разтвори в две серии от шест градуирани колби от 25 ml. Съдържанието на колбите от първата серия се допълва до 25 ml със сместа от пропан-2-ол и хексан (т. 3.1) (еталонна серия).

Във всяка от колбите от втората серия се добавят по 2 ml анилин (т. 3.4). Колбите се нагряват в продължение на 30 минути над кипяща водна баня. Охлаждат се до стайна температура, допълват се до пълния обем със сместа от пропан-2-ол и хексан (т. 3.1), хомогенизира се съдържанието им и се оставят да престоят един час (стандартна серия).

В съответствие с т. 5.2 се определя оптичната плътност на разтворите в стандартната серия, като се сравняват последните със съответните им разтвори от еталонната серия. Построява се калибрационната крива, като срещу количествата госипол (в μg) се нанася оптичната плътност.

6.3.    Повторяемост

Разликата между резултатите от две паралелни определяния, проведени върху една и съща проба, не трябва да превишава:

▼M4

Б.   ОПРЕДЕЛЯНЕ НА НИВАТА НА ДИОКСИНИ (PCDD/PCDF) И PCB

ГЛАВА I

Методи за вземане на проби и тълкуване на резултатите от анализа

1.    Цел и обхват

Пробите, предназначени за официалния контрол на нивата на полихлорирани дибензо-р-диоксини (PCDD), полихлорирани дибензофурани (PCDF), диоксиноподобни полихлорирани бифенили (PCB) ( 16 ) и недиоксиноподобни PCB във фуражите, се вземат в съответствие с разпоредбите на приложение I. Прилагат се количествените изисквания във връзка с контрола на равномерно разпределени във фуражите вещества или продукти, посочени в точка 5.1 от приложение I. Така получените съставни проби се разглеждат като представителни за партидите или подпартидите, от които са взети. Съответствието с максимално допустимите количества, посочени в Директива 2002/32/ЕО, се определя въз основа на количествата, установени в лабораторните проби.

За целите на част Б се прилагат определенията от приложение I към Решение 2002/657/ЕО на Комисията ( 17 ).

Освен посочените определения за целите на настоящия регламент се прилагат следните определения:

2.    Съответствие на партидата или подпартидата с максимално допустимото количество

2.1.    По отношение на недиоксиноподобните PCB

Партидата съответства на максимално допустимото количество, ако резултатът от анализа не надвишава максимално допустимото количество на недиоксиноподобни PCB, установено с Директива 2002/32/ЕО, като се отчита неопределеността на измерването.

Партидата не съответства на максимално допустимото количество, ако горнограничният ( 18 ) резултат от анализа, потвърден с повторен анализ ( 19 ), надвишава максимално допустимото количество, установено с Директива 2002/32/ЕО, като се отчита неопределеността на измерването. За проверка на съответствието се използва средната стойност от две определяния, като се отчита неопределеността на измерването.

Неопределеността на измерването се взема предвид, като се приложи един от следните подходи:

Параграфи 1, 2 и 3 се прилагат по отношение на резултата, получен при анализа на пробата за целите на официалния контрол. При извършване на анализ с цел защита или за справка се прилагат националните правила.

2.2.    По отношение на PCDD/PCDF и диоксиноподобните PCB

Партидата съответства на максимално допустимите количества, ако резултатът от еднократен анализ:

При скрининг анализите трябва да се установят гранични стойности с оглед определянето на съответствието на пробата на максимално допустимите количества, установени за PCDD/PCDF или за сумата от PCDD/PCDF и диоксиноподобните PCB.

Партидата не съответства на максимално допустимото количество, ако горнограничният ( 20 ) резултат от анализа, получен чрез метод за потвърждение и потвърден с повторен анализ, надвишава максимално допустимото количество, установено с Директива 2002/32/ЕО, като се отчита неопределеността на измерването ( 21 ). За проверка на съответствието се използва средната стойност от две определяния, като се отчита неопределеността на измерването.

Неопределеността на измерването се взема предвид, като се приложи един от следните подходи:

Параграфи 1 — 4 се прилагат по отношение на резултата, получен при анализа на пробата за целите на официалния контрол. При извършване на анализ с цел защита или за справка се прилагат националните правила.

3.    Резултати, превишаващи праговете, определени в приложение II към Директива 2002/32/ЕО

Праговете са инструмент за отсяване на проби в случаите, в които е необходимо да се идентифицира източник на замърсяване и да се вземат мерки за неговото намаляване или отстраняване. Чрез скрининг методите трябва да се установят подходящи гранични стойности за отсяване на посочените проби. В случай че са необходими значителни усилия за идентифициране на източника или за намаляване или отстраняване на замърсяването, може да е целесъобразно надвишаването на праговете да се потвърди чрез повторен анализ при използване на метод за потвърждение и като се отчита неопределеността на измерването ( 22 ).

ГЛАВА II

Подготовка на пробите и изисквания към методите за анализ, използвани за целите на официалния контрол на съдържанието на диоксини (PCDD/PCDF) и на диоксиноподобни PCB във фуражите

1.    Приложно поле

Изискванията, изложени в настоящата глава, се прилагат при анализа на фуражи за целите на официалния контрол на съдържанието на заместените на 2,3,7,8 позиция полихлорирани дибензо-р-диоксини и полихлорирани дибензофурани (PCDD/PCDF) и диоксиноподобни полихлорирани бифенили (диоксиноподобни PCB), както и за други регулаторни цели.

Наблюдението за наличие на PCDD/PCDF и на диоксиноподобни PCB във фуражите може да се извършва чрез два различни вида аналитични методи:

Целта на скрининг методите е отсяване на пробите с нива на PCDD/PCDF и на диоксиноподобни PCB, които надвишават максимално допустимите количества или праговете. Тези методи позволяват икономически целесъобразна обработка на голям брой проби, като по този начин се увеличава вероятността за откриване на нови инциденти с висока степен на изложеност и рискове за здравето на потребителите. С прилагането им се цели избягване на фалшивите резултати за съответствие. Скрининг методите могат да включват биоаналитични методи и методи GC-MS.

Чрез тях се извършва сравнение на резултата от анализа с граничната стойност и се получава отговор от вида „да/не“ относно евентуалното надвишаване на максимално допустимото количество или прага. Концентрацията на PCDD/PCDF и сумата от PCDD/PCDF и диоксиноподобните PCB в пробите, за които има съмнение за несъответствие спрямо максимално допустимото количество, трябва да бъдат определени/потвърдени чрез метод за потвърждение.

Освен това скрининг методите може да дадат индикация за количествата на PCDD/PCDF и диоксиноподобните PCB, които се съдържат в пробата. При прилагане на биоаналитични скрининг методи резултатът се изразява като биоаналитични еквиваленти (BEQ), докато при прилагане на физикохимични GC-MS той се изразява като токсични еквиваленти (TEQ). Цифрово изразените резултати от скрининг методите са подходящи за доказване на съответствието или на съмненията за несъответствие или надвишаване на праговете и при проследяване чрез методи за потвърждение показват диапазона на нивата. Те не са подходящи за цели като извършване на оценка на фоновите нива, предварителна оценка на количеството, проследяване на тенденции във времето при нивата или повторна оценка на праговете и на максимално допустимите количества.

Методите за потвърждение позволяват еднозначното идентифициране и количествено определяне на съдържащите се в дадена проба PCDD/PCDF и диоксиноподобни PCB и предоставят пълна информация на ниво конгенери. Следователно тези методи позволяват извършването на контрол на максимално допустимите количества и праговете, в т.ч. потвърждаване на резултатите, получени чрез скрининг методите. Освен това резултатите могат да бъдат използвани за други цели, като например определяне на ниски фонови нива при мониторинг на фуражите, проследяване на тенденции във времето, извършване на оценка на експозицията и създаване на база данни за евентуална повторна оценка на праговете и на максимално допустимите количества. Те са важни също така за установяването на модели на конгенери с оглед идентифицирането на източника на евентуално замърсяване. При тези методи се използва GC-HRMS. За потвърждаване на съответствието или несъответствието спрямо максимално допустимите количества може да се използва и GC-MS/MS.

2.    Контекст

За да се изчислят концентрациите на токсичните еквиваленти (ТЕQ), концентрациите на отделните вещества в дадена проба се умножават по съответния им фактор за токсична еквивалентност (TEF) (вж. бележка под линия (16)  от глава I) и след това се сумират, за да се получи общата концентрация на диоксиноподобните съединения, изразени като ТЕQ.

„За целите на част Б приетата специфична граница за количествено определяне на отделен конгенер“ означава най-ниското съдържание на аналита, което може да бъде измерено при разумна степен на статистическа сигурност, при изпълнение на критериите за идентифициране, описани в международно признати стандарти, например в стандарт EN 16215:2012 (Фуражи. Определяне на диоксини, диоксин-подобни PCB и на индикаторни PCB чрез GC/HRMS и/или в последната редакция на методи EPA 1613 и 1668.

Границата за количествено определяне на отделен конгенер може да бъде определена като

Биоаналитичните скрининг методи не отчитат резултати на ниво конгенери, а само показват ( 23 ) нивото на токсичния еквивалент (ТЕQ), изразено в биоаналитични еквиваленти (BEQ), като потвърждават факта, че не всички съдържащи се в екстракта от проби съединения, които предизвикват отговор при изпитването, могат да се подчиняват на всички изисквания на принципа на ТЕQ.

Скрининг методите и методите за потвърждение могат да се използват за контрол на определена матрица само ако са достатъчно чувствителни с оглед надеждното откриване на количества на нивото на прага или максимално допустимото количество.

3.    Изисквания за осигуряване на качеството

3.1.	Вземат се мерки за избягване на кръстосано замърсяване на всеки етап от процедурата за вземане на проби и от анализа.

3.2.	Пробите се съхраняват и транспортират в контейнери от стъкло, алуминий, полипропилен или полиетилен, подходящи за съхранение без да се оказва никакво влияние върху нивата на PCDD/PCDF и диоксиноподобните PCB в пробите. От контейнера за съхранение на пробата се премахват следите от хартиен прах.

3.3.	Съхранението и транспортирането на пробите се извършват по начин, при който се запазва целостта на фуражната проба.

3.4.

Доколкото е уместно, всяка лабораторна проба се смила фино и се смесва оптимално чрез използване на процес, с който е доказано, че се постига пълно хомогенизиране (например смилане, което позволява преминаване през сито с размер на отворите 1 mm). Пробите се изсушават преди смилането, ако съдържанието на влага в тях е твърде високо.

3.5.	Осъществява се контрол на реагентите, лабораторната стъклария и оборудването от гледна точка на възможното им влияние върху резултатите на база ТЕQ или BEQ.

3.6.	Извършва се анализ на празна проба, като се изпълнява цялата аналитична процедура и се пропуска единствено пробата.

3.7.

При биоаналитичните методи цялата стъклария и разтворителите, използвани при анализа, преминават изпитвания за отсъствие на съединения, които интерферират при откриването на целевите съединения в работния обхват. Стъкларията се изплаква с разтворители или се загрява до температури, подходящи за отстраняване на следи от PCDD/PCDF, диоксиноподобни и интерфериращи съединения от нейната повърхност.

3.8.	Количеството на пробата, използвано за екстракцията, е достатъчно, за да отговаря на изискванията за достатъчно нисък работен обхват, включително концентрациите на максимално допустимото количество или на прага.

3.9.	Специфичните процедури за подготовка на пробите, използвани при разглежданите продукти, се основават на международно приетите насоки.

4.    Изисквания към лабораториите

4.1.

В съответствие с разпоредбите на Регламент (ЕО) № 882/2004 лабораториите трябва да бъдат акредитирани от признат орган, действащ в съответствие с Ръководство 58 на ISO, с цел да се гарантира осигуряване на качеството при анализите. Лабораториите трябва да бъдат акредитирани в съответствие със стандарт EN ISO/IEC 17025.

4.2.	Компетентността на лабораторията трябва да бъде доказана чрез постоянно успешно участие в междулабораторни изследвания за определяне на PCDD/PCDF и диоксиноподобни PCB в съответните матрици от фуражи и диапазони на концентрация.

4.3.

Лабораториите, които прилагат скрининг методи за целите на рутинния контрол на пробите, трябва да установяват тясно сътрудничество с лаборатории, прилагащи метода за потвърждение, както за целите на контрола на качеството, така и за потвърждаване на аналитичния резултат за проби, за които съществува съмнение за несъответствие.

5.    Основни изисквания, на които трябва да отговаря аналитичната процедура за диоксини (PCDD/PCDF) и диоксиноподобни PCB

5.1.    Нисък работен обхват и граници за количествено определяне

Подлежащите на откриване количества от PCDD/PCDF са в горната граница на фемтограма (10–15g) поради изключително високата токсичност на някои от тези съединения. За повечето конгенери на PCB е достатъчна граница за количествено определяне от порядъка на нанограма (10–9g). За измерването на по-токсичните диоксиноподобни конгенери на PCB (и по-специално не-ортозаместените) долната граница на работния обхват достига до ниските стойности от порядъка на пикограма (10–12g). За повечето от останалите конгенери на PCB граница на количествено определяне от порядъка на нанограмите (10–9g) е достатъчна.

5.2.    Висока избирателност (специфичност)

5.2.1.

Необходимо е разграничаване между PCDD/PCDF и диоксиноподобните PCB и множество други налични съвместно екстрахирани и вероятно интерфериращи съединения, чиито концентрации са до няколко степени по-високи от тези на аналитите от значение. При методите GC-MS се изисква разграничаване между отделните видове конгенери, например между токсичните конгенери (напр. седемнадесетте заместени на 2,3,7,8 позиция PCDD/PCDF и дванадесетте диоксиноподобни PCB) и други видове конгенери.

5.2.2.

Биоаналитичните методи трябва да позволяват откриването на целевите съединения като сумата на PCDD/PCDF и/или диоксиноподобните PCB. С пречистването на пробите се цели отстраняване на съединения, предизвикващи фалшиви резултати за несъответствие или на съединения, които могат да доведат до понижаване на отговора, като предизвикат фалшиви резултати за съответствие.

5.3.    Висока точност (истинност и прецизност, експериментално измерен аналитичен добив при биоанализ)

5.3.1.

При методите GC-MS определянето дава валидна оценка за истинската концентрация в дадена проба. Необходима е висока степен на точност, за да се избегне отхвърляне на резултата за дадена проба поради на ниска надеждност на определеното ниво на TEQ. Точността се изразява като истинност (разлика между средната стойност, измерена за даден аналит в сертифициран материал и неговата сертифицирана стойност, изразена като процент от тази стойност) и прецизност (RSDR, относително стандартно отклонение, което се изчислява на базата на резултатите, получени при възпроизводими условия).

5.3.2.

За биоаналитичните методи трябва да се определи експериментално измереният аналитичен добив при биоанализ. „Експериментално измерен аналитичен добив при биоанализ“ означава нивото на BEQ, изчислено от калибрационната крива на TCDD или на PCB 126, коригирано с резултатите от празната проба и след това разделено на нивото на ТЕQ, определено чрез метода за потвърждение. Целта му е коригирането на фактори като загубата на PCDD/PCDF и диоксиноподобни съединения по време на извличането и пречистването, успоредно извлечени съединения, които увеличават или намаляват силата на отговора (агонистичен и антагонистичен ефект), качеството на напасването на кривата или разликите между фактора за токсична еквивалентност (TEF) и стойностите на относителен потенциал (REP). Експериментално измереният аналитичен добив при биоанализ се изчислява от подходящи референтни проби с представителни модели на конгенерите около нивото от значение.

5.4.    Валидиране в диапазона на максимално допустимите количества и общи мерки за контрол на качеството

5.4.1.

По време на процедурата за валидиране и по време на рутинните анализи лабораториите трябва да докажат ефективността на даден метод в диапазона на максимално допустимото количество, например на нива 0,5, 1 и 2 пъти по-високи от максимално допустимото количество при приемлив коефициент на вариация за повтарящи се анализи.

5.4.2.

Като вътрешни мерки за контрол на качеството трябва да се извършват редовни изпитвания на празни проби и експерименти с добавка на референтен материал или анализи на контролни проби (за предпочитане е сертифициран референтен материал, ако е наличен). С цел да се гарантира, че анализите се извършват в съответствие с изискванията, диаграмите за контрола на качеството за изпитванията на празни проби, експериментите с добавка на референтен материал или анализа на контролните проби трябва да се регистрират и проверяват.

5.5.    Граница за количествено определяне

5.5.1.

За биоаналитичните скрининг методи установяването на граница за количествено определяне (LOQ) не е задължително изискване, но трябва да бъде доказано, че методът може да разграничи стойността при празна проба и граничната стойност. При представяне на нивото на BEQ трябва да се установи ниво на отчитане за обработването на проби, чийто отговор е под това ниво. Нивото на отчитане трябва доказано да се различава най-малко три пъти от нивото при процедурите с празни проби, като отговорът е под работния обхват. Следователно това ниво се изчислява от проби, в които целевите съединения се съдържат на равнище около изискваното минимално ниво, а не от съотношението S/N или от аналитична празна проба.

5.5.2.

При методите за потвърждение LOQ е около 1/5 от максимално допустимото количество.

5.6.    Аналитични критерии

За да се получат надеждни резултати чрез методите за потвърждение или скрининг методите, в диапазона на максимално допустимото количество или на прага трябва да бъдат изпълнени следните критерии по отношение на стойността съответно на ТЕQ или на BEQ, независимо дали е определена като общ ТЕQ (като сума от PCDD/PCDF и диоксиноподобните PCB), или поотделно за PCDD/PCDF и за диоксиноподобните PCB:

5.7.    Специфични изисквания относно скрининг методите

5.7.1.

За целите на скрининга могат да се използват както GC-MS, така и биоаналитични методи. По отношение на методите GC-MS трябва да бъдат изпълнени изискванията, посочени в точка 6. Специфичните изисквания по отношение на клетъчните биоаналитични методи са изложени в т. 7.

5.7.2.

Лабораториите, които прилагат скрининг методи за целите на рутинния контрол на пробите, трябва да установят тясно сътрудничество с лаборатории, които прилагат метода за потвърждение.

5.7.3.

По време на рутинните анализи се изисква проверка на ефективността на скрининг метода чрез аналитичен контрол на качеството и текущо валидиране на метода. Необходима е непрекъсната програма за контрол на резултатите, които отговарят на изискванията.

5.7.4.

Проверка за възможно потискане на клетъчния отговор и цитотоксичност: 20 % от екстрактите от проби трябва да бъдат измерени при рутинен скрининг без и със добавяне на 2,3,7,8-TCDD в съответствие с максимално допустимото количество или прага с цел да се провери възможността за евентуално потискане на отговора в резултат на интерфериращите вещества, намиращи се в екстракта от пробата. Измерената концентрация на пробата с добавен референтен материал се сравнява със сумата от концентрацията на екстракта без добавка плюс концентрацията на добавката. Ако тази измерена концентрация е по-ниска от изчислената (сумарната) концентрация с повече от 25 %, това е показател за потенциално потискане на сигнала и съответната проба трябва да бъде подложена на анализ за потвърждаване чрез GC-HRMS. Резултатите трябва да се наблюдават посредством диаграми за контрол на качеството.

5.7.5.

Контрол на качеството на проби, съответстващи на изискванията В зависимост от матричната проба и опита на лабораторията приблизително между 2 и 10 % от пробите, които съответстват на изискванията, трябва да бъдат потвърдени чрез GC-HRMS.

5.7.6.

Определяне на дела на грешните резултати за съответствие въз основа на данните от контрола на качеството: Определя се делът на фалшивите резултати за съответствие при скрининг на проби под и над максимално допустимото количество или прага. Действителният дял на фалшивите резултати за съответствие трябва да бъде под 5 %. Когато от контрола на качеството на съответстващите проби бъдат получени минимум 20 потвърдени резултата за всяка матрица/група матрици, въз основа на тази база данни се правят заключения относно дела на фалшивите резултати на съответствие. Резултатите от проби с диапазон на концентрацията например до 2 пъти максимално допустимото количество, анализирани при кръгови изследвания или при инциденти със замърсяване, също могат да бъдат включени в минимума от 20 резултата за оценка на дела на фалшивите резултати на съответствие. Пробите трябва да обхващат най-често срещаните модели на конгенери, които представляват различни източници. Въпреки че целта на скрининг анализите трябва да бъде преди всичко откриването на проби, в които е надвишен прагът, критерият за определяне на дела на фалшивите резултати за съответствие е максимално допустимото количество, като се отчита неопределеността на измерването на метода за потвърждение.

5.7.7.

Пробите със съмнение за несъответствие предвид резултатите, получени при скрининга, винаги се проверяват чрез пълен повторен анализ на оригиналната проба чрез метод за потвърждение. Тези проби могат да бъдат използвани също така за оценка на дела на фалшивите резултати за несъответствие. При скрининг методите делът на фалшивите резултати за несъответствие е частта от резултатите, потвърдени като съответстващи чрез потвърдителен анализ, като при предишен скрининг за пробата са били установени съмнения за несъответствие. Оценката на ползата от скрининг метода трябва да се основава на сравнение на пробите с фалшиво несъответствие с общия брой на проверените проби. Това съотношение трябва да бъде достатъчно ниско, за да може използването на скрининг метода да бъде от полза.

5.7.8.

Биоаналитичните методи трябва да предоставят валидна индикация за нивото на TEQ, изчислено и изразено като BEQ, поне при валидирането. Освен това при биоаналитичните методи, прилагани в условия на повторяемост, вътрешнолабораторното RSDr обикновено е по-малко от RSDR.в условия на възпроизводимост.

6.    Специфични изисквания към методите gc-ms, които трябва да бъдат изпълнени за целите на скрининга или потвърждаването

6.1.    Приемливи разлики между горнограничните и долнограничните резултати за WHO-TEQ

Разликата между горнограничното и долнограничното ниво не надвишава 20 % за потвърждение на надвишаването на максимално допустимото количество или при необходимост, на прага.

6.2.    Контрол на аналитичния добив

6.2.1.

За да се валидира аналитичната процедура, още в самото начало на аналитичния метод, например преди фазата на екстракция, се добавят вътрешни стандарти за PCDD/PCDF, маркирани с 13C и заместени с хлор на 2,3,7,8- позиции, както и вътрешни стандарти за диоксиноподобни РСВ, маркирани с 13C. Добавя се най-малко един конгенер за всяка от тетра- до октахлорираните хомоложни групи за PCDD/PCDF и най-малко един конгенер за всяка от хомоложните групи за диоксиноподобните РСВ (или най-малко един конгенер за всяка избрана йонозаписваща функция при масспектрометрията за наблюдение на PCDD/PCDF и диоксиноподобни РСВ). При методите за потвърждение се използват всички седемнадесет вътрешни стандарта за PCDD/PCDF, маркирани с 13C и заместени на 2,3,7,8- позиции, и всички дванадесет вътрешни стандарта за диоксиноподобни PCB, маркирани с 13C.

6.2.2.

За конгенерите, за които не се добавя маркиран с 13C аналог, също трябва да се определят относителните фактори на отговор чрез използване на подходящи калибриращи разтвори.

6.2.3.

За фуражи от растителен произход и фуражи от животински произход със съдържание на мазнини под 10 % добавянето на вътрешните стандарти трябва задължително да се извърши преди екстракцията. За фуражи от животински произход със съдържание на мазнини над 10 % вътрешните стандарти се добавят или преди, или след екстракцията на мазнините. Ефикасността на екстракцията трябва да бъде валидирана по подходящ начин в зависимост от етапа, на който са били добавени вътрешните стандарти, и от това дали резултатите са били отчетени за продукта или на база мазнини.

6.2.4.

Преди анализа с GC-MS се прибавят един или два стандарта за аналитичния добив (сурогат).

6.2.5.

Изисква се да се извършва контрол на аналитичния добив. При методите за потвърждение стойностите на аналитичния добив за отделните вътрешни стандарти трябва да бъдат в интервала от 60 % до 120 %. Допустими са по-ниски или по-високи проценти на аналитичен добив за отделни конгенери, по-специално определени хепта- и октахлорирани дибензо-р-диоксини и дибензофурани, при условие че участието им в стойността на TEQ не надхвърля 10 % от общата стойност на TEQ (на база сумата от PCDD/PCDF и диоксиноподобните PCB). За скрининг методите чрез GC-MS процентите за аналитичния добив следва да бъдат в интервала от 30 до 140 %.

6.3.    Отстраняване на интерфериращи вещества

6.4.    Калибриране чрез стандартна крива

Обхватът на калибрационната крива трябва да покрива съответния диапазон на максимално допустимите количества или праговете.

6.5.    Специфични критерии по отношение на методите за потвърждение

7.    Специфични изисквания по отношение на биоаналитичните методи

Биоаналитичните методи са методи, основани на използването на биологични принципи като клетъчни анализи, рецепторни анализи или имуноанализи. В настоящата точка 7 се установяват изискванията по отношение на биоаналитичните методи като цяло.

По принцип при скрининг метода дадена проба се класифицира като съответстваща проба или като проба, за която има съмнение за несъответствие. За тази цел изчисленото ниво на BEQ се сравнява с граничната стойност (вж. точка 7.3). Пробите със стойност под граничната се определят като съответстващи, а за пробите със стойност, равна на граничната или над нея, има съмнение за несъответствие и се налага анализ чрез метод за потвърждение. На практика ниво на BEQ, което отговаря на 2/3 от максимално допустимото количество, може да послужи като гранична стойност, при условие че е осигурен дял на фалшивите резултати за съответствие под 5 % и приемлив дял на резултатите за фалшиво несъответствие. При различни максимално допустими количества за PCDD/PCDF и за сумата от PCDD/PCDF и диоксиноподобните PCB проверката на съответствието на проби без разделяне на части изисква биоанализът да има подходящи гранични стойности за PCDD/PCDF. За гранична стойност при проверката на пробите, които надвишават праговете, може да послужи подходящ процент от съответния праг.

Освен това при някои биоаналитични методи може да се определи ориентировъчно ниво, изразено в BEQ, за проби в рамките на работния обхват, които превишават границата на отчитане (вж. точки 7.1.1 и 7.1.6).

7.1.    Оценка на отговора на изследването

7.1.1.   Общи изисквания

7.1.2.   Калибриране

7.1.2.1.   Калибриране чрез стандартна крива

7.1.2.2.   Калибриране с референтни проби

Като алтернатива може да се използва калибрационна крива, съставена въз основа на поне четири референтни проби (вж. точка 7.2.4: една празна проба от матрица плюс три референтни проби със стойност 0,5, 1 и 2 пъти нивото на максимално допустимото количество или прага), като така не се налага корекция за празна проба и за аналитичен добив. В този случай отговорът на изследването, съответстващ на 2/3 от максимално допустимото количество (вж. точка 7.3), може да бъде изчислен пряко от тези проби и да бъде използван като гранична стойност. За гранична стойност при проверката на пробите, които надвишават праговете, би могъл да се използва подходящ процент от тези прагове.

7.1.3.   Отделно определяне на PCDD/PCDF и диоксиноподобните PCB

Екстрактите могат да бъдат разделени на части, съдържащи PCDD/PCDF и диоксиноподобни PCB, което позволява отчитане на нивата на ТЕQ (изразени като BEQ) поотделно за PCDD/PCDF и за диоксиноподобните PCB. За предпочитане е да се използва калибрационна крива със стандарт PCB 126 при оценката на резултатите за частта, която съдържа диоксиноподобни PCB.

7.1.4.   Експериментално измерени аналитични добиви при биоанализ

„Експериментално измереният аналитичен добив при биоанализ“ се изчислява от подходящи референтни проби с представителни модели на конгенери около максимално допустимото количество или прага и се изразява като процент от нивото на BEQ спрямо нивото на ТЕQ. В зависимост от вида на анализа и на използваните TEF ( 24 ) разликите между факторите TEF и REP за диоксиноподобните PCB могат да доведат до ниски експериментално измерени аналитични добиви за диоксиноподобните PCB в сравнение с PCDD/PCDF. Следователно ако се извършва отделно определяне на PCDD/PCDF и на диоксиноподобните PCB, експериментално измереният аналитичен добив при биоанализ е: за диоксиноподобни PCB — от 20 до 60 %, за PCDD/PCDF — от 50 до 130 % (интервалите се прилагат за калибрационната крива за TCDD). Тъй като делът на диоксиноподобните PCB в сумата от PCDD/PCDF и диоксиноподобни PCB може да варира между различните матрици и проби, експериментално измереният аналитичен добив при биоанализ за сумата от PCDD/PCDF и диоксиноподобни PCB отразява тези разлики и трябва да бъде между 30 % и 130 %. Всяко отражение на преразгледаните в значителна степен стойности на TEF върху законодателството на Съюза, свързано с PCDD/PCDF и диоксиноподобните PCB, изисква преразглеждане на тези интервали.

7.1.5.   Контрол на аналитичния добив при пречистване

Загубата на съединения по време на пречистването трябва да бъде проверена при валидирането. Празна проба, към която е добавена смес от различните конгенери, се подлага на пречистване (най-малко n = 3), а аналитичният добив и вариациите се проверяват чрез метод за потвърждение. Аналитичният добив трябва да бъде между 60 % и 120 % особено за конгенери, чийто дял в нивото на ТЕQ в различни смеси е над 10 %.

7.1.6.   Граница на отчитане

При отчитане на равнищата на BEQ границата на отчитане се определя от съответните матрични проби, които включват типични модели на конгенери, а не от калибрационната крива на стандартите поради ниската прецизност в долната част на кривата. Взема се предвид въздействието на екстракцията и на пречистването. Границата на отчитане се установява поне три пъти над нивото при процедурите с празни проби.

7.2.    Използване на референтни проби

7.2.1.

Референтните проби представляват матрични проби, модели на конгенери и интервали на концентрация за PCDD/PCDF и диоксиноподобни PCB около максимално допустимото количество или прага.

7.2.2.

Във всяка серия от изпитвания се включва празна проба от матрица, а когато това не е възможно — процедура с празна проба, както и референтна проба с ниво, равно на максимално допустимото количество или на прага. Тези проби се подлагат на екстракция и се изследват по едно и също време при еднакви условия. Референтната проба следва да покаже много по-ясен отговор в сравнение с празната проба, като по този начин се гарантира пригодността на изпитването. Тези проби могат да се използват за корекция за празна проба и за аналитичен добив.

7.2.3.

Референтните проби, които са избрани за корекция за аналитичен добив, трябва да бъдат представителни по отношение на пробите за изпитване, което означава, че моделите на конгенерите не може да водят до подценяване на нивата.

7.2.4.

При контрола на максимално допустимото количество или прага могат да се включат допълнителни референтни проби със стойности например 0,5 и 2 пъти стойността на максимално допустимото количество или прага с цел установяване ефективността на изпитването в интервала от значение. Съчетани, тези проби могат да се използват за изчисляване на равнищата на BEQ в пробите за изпитване (вж. точка 7.1.2.2).

7.3.    Определяне на гранични стойности

Установява се връзката между биоаналитичните резултати, изразени в BEQ, и резултатите от методите за потвърждение, изразени в ТЕQ,например чрез калибрационни експерименти, при които се отчита влиянието на матрицата върху калибрационните прави и които включват референтни проби с добавка 0, 0,5, 1 и 2 пъти максимално допустимото количество с 6 повторения на всяко ниво (n = 24). Факторите за корекция (за празна проба и за аналитичен добив) могат да бъдат оценени въз основа на посочената връзка, но те трябва да бъдат проверявани в съответствие с точка 7.2.2.

Граничните стойности се установяват с оглед вземане на решение за съответствието на пробите спрямо максимално допустимите количества или за контрол на праговете, ако е от значение, като съответните максимално допустими количества или прагове се задават или поотделно за PCDD/PCDF и за диоксиноподобните PCB, или за сумата от PCDD/PCDF и диоксиноподобните PCB. Тези стойности са представени чрез долната крайна точка на разпределението на биоаналитичните резултати (коригирани за празна проба и за аналитичен добив), съответстваща на критичната граница при метода за потвърждение въз основа на 95-процентна доверителна вероятност, което предполага процент на фалшивите резултати за съответствие < 5 %, и при RSDR < 25 %. Критичната граница при метода за потвърждение е максимално допустимото количество, като се отчита неопределеността на измерването.

Граничната стойност (изразена в BEQ) може да бъде изчислена в съответствие с някой от подходите, изложени в точки 7.3.1, 7.3.2 и 7.3.3 (вж. графика 1).

7.3.1.

Използване на долната граница на 95-процентния интервал на предвиждане при критична граница при метода за потвърждение: където: BEQDL BEQ съответства на критичната граница при метода за потвърждение, която представлява максимално допустимото количество при отчитане на неопределеността на измерването sy,x остатъчно стандартно отклонение t α,f = m-2 коефициент на Стюдънт (α = 5 %, f = степени на свобода, едностранни) m общ брой калибрационни точки (индекс j) n брой повторения на всяко ниво xi Концентрация на пробата (изразена в TEQ) в калибрационна точка i, определена чрез метода за потвърждение средна стойност на концентрациите (изразена в TEQ) на всички калибрационни проби параметър за сумата на квадрат, i = индекс за калибрационна точка i

7.3.2.

Изчисляване въз основа на биоаналитични резултати (коригирани за празна проба и за аналитичен добив) от множество анализи на проби (n≥ 6), замърсени на нивото на критичната граница при метода за потвърждение, като долната крайна точка на разпределението на данните при съответната осреднена стойност на BEQ: Гранична стойност = BEQDL – 1.64 × SDR където: SDR стандартно отклонение на резултатите на биоанализа при BEQDL, измерено в условия на вътрешнолабораторна възпроизводимост

7.3.3.

Изчисляване като средна стойност на биоаналитични резултати (изразени в BEQ, коригирани за празна проба и за аналитичен добив) от множество анализи на проби (n≥ 6), замърсени на ниво 2/3 от максимално допустимото количество или прага, като се има предвид наблюдението, че това ниво ще бъде около граничната стойност, определена съгласно точка 7.3.1 или 7.3.2.: Графика 1. Изчисляване на гранични стойности въз основа на 95-процентна доверителна вероятност, при което делът на фалшивите резултати на съответствие е < 5 %, а RSDR е < 25 %: 1. от долната граница на 95-процентния интервал на предвиждане при критичната граница при метода за потвърждение 2. от множество анализи на проби (n≥ 6), замърсени на нивото на критичната граница при метода за потвърждение, като долната крайна точка на разпределението на данните (представен на графиката чрез камбановидна крива) при съответната осреднена стойност на BEQ.

7.3.4.

Ограничения за граничните стойности: Граничните стойности на база BEQ, които са изчислени от RSDR, постигнато по време на валидирането при използване на ограничен брой проби с различни модели на матриците/конгенерите, могат да бъдат по-високи от максимално допустимите количества или праговете на база ТЕQ поради по-голямата прецизност в сравнение с постиганата при рутинни условия, при които трябва да се контролира неизвестен спектър от възможни модели на конгенери. В такива случаи граничните стойности се изчисляват при RSDR = 25 % или, за предпочитане — на две трети от максимално допустимото количество или прага.

7.4.    Характеристики за ефективност

7.4.1.

Тъй като при биоаналитичните методи не могат да се използват вътрешни стандарти, за да се получат данни за стандартното отклонение в рамките на изпитванията и между различните серии изпитвания, се извършват изпитвания за повторяемост на биоаналитичните методи. Повторяемостта трябва да бъде под 20 %, а вътрешнолабораторната възпроизводимост — под 25 %. Това се базира на изчислените като BEQ нива след корекция за празна проба и за аналитичен добив.

7.4.2.

Като част от процеса на валидиране следва да се докаже, че чрез изследването се постига разграничаване между празна проба и ниво, равно на граничната стойност, което позволява да се идентифицират пробите над съответната гранична стойност (вж. точка 7.1.2).

7.4.3.

Определят се целевите съединения, възможните интерференции, както и максимално допустимите количества в празната проба.

7.4.4.

Процентното стандартно отклонение в отговора или в концентрацията, изчислена от отговора (възможно само в работния обхват) при трикратно определяне на екстракт от проба, не може да надхвърля 15 %.

7.4.5.

Некоригираните резултати от референтната/референтните проба/проби, изразени в BEQ (празна проба и на нивото на максимално допустимото количество или на прага), се използват за оценка на ефективността на биоаналитичния метод спрямо постоянен период от време.

7.4.6.

За да се гарантира, че анализите се провеждат в съответствие с изискванията, се регистрират и проверяват диаграми за контрол на качеството за процедурите с празни проби, както и за всеки вид референтна проба; за процедурите с празни проби по-специално това се извършва по отношение на изискваната минимална разлика спрямо ниската част на работния обхват, а за референтните проби — по отношение на вътрешнолабораторната възпроизводимост. Процедурите с празни проби се контролират стриктно, за да се избегнат фалшиви резултати за съответствие при приспадането.

7.4.7.

Получените чрез методите за потвърждение резултати на проби, за които има съмнение за несъответствие, както и 2 % — 10 % от съответстващите на изискванията проби (минимум 20 проби за матрица) се събират и се използват за оценка на ефективността на скрининг метода и на връзката между BEQ и ТЕQ. Тази база данни може да бъде използвана за повторната оценка на граничните стойности, които се прилагат при рутинните проби за валидираните матрици.

7.4.8.

Ефикасността на метода може да бъде доказана също и чрез участие в кръгови изпитвания. Резултатите от пробите с концентрация например до 2 пъти максимално допустимото количество, анализирани при кръговите изпитвания, също могат да бъдат включени при оценяването на дела на фалшивите резултати за съответствие, ако лабораторията докаже своята ефективност. Пробите трябва да обхващат най-често срещаните модели на конгенери, които представляват различни източници.

7.4.9.

При инциденти граничните стойности могат да бъдат подлагани на преоценка, която да отрази специфичната матрица и модела на конгенера при конкретния инцидент.

8.    Представяне на резултатите

8.1.    Методи за потвърждение

8.1.1.

Доколкото позволява аналитичната процедура, резултатите от анализа следва да включват количествата на отделните конгенери на PCDD/PCDF и диоксиноподобни PCB и да се отбелязват като долна граница, горна граница и средна граница с цел да се включи максимално възможната информация при изразяването на резултатите, позволяваща интерпретирането им в съответствие със специфичните изисквания.

8.1.2.

Отчетът включва информация за метода, използван при екстракцията на PCDD/PCDF и диоксиноподобните PCB.

8.1.3.

Данните за аналитичния добив за отделните вътрешни стандарти се представят в случаите, в които аналитичният добив е извън обхвата, посочен в точка 6.2.5, когато максимално допустимото количество е надвишено (в този случай — аналитичния добив за един от двата повторни анализа) или в други случаи при поискване.

8.1.4.

Тъй като при установяването на съответствието на пробата неопределеността на измерването трябва да бъде взета предвид, този параметър трябва да бъде представен. Така аналитичните резултати трябва да бъдат представени като х +/– U, където х е аналитичният резултат, а U — разширената неопределеност на измерването, като се използва фактор на покриване 2, който дава доверителна вероятност приблизително 95 %. В случай че PCDD/PCDF и диоксиноподобните PCB се определят поотделно, за разширената неопределеност на сумата от PCDD/PCDF и диоксиноподобните PCB се използва сумата от оценената разширена неопределеност на отделните резултати от анализа на PCDD/PCDF и на диоксиноподобните PCB.

8.1.5.

Ако неопределеността на измерването се взема предвид чрез прилагане на ССα (както е описано в настоящата част Б, глава I, точка 2.2), този параметър трябва да бъде представен.

8.1.6.

Резултатите трябва да бъдат изразени в същите единици и най-малко със същия брой значещи цифри като определените в Директива 2002/32/ЕО максимално допустими количества.

8.2.    Биоаналитични скрининг методи

8.2.1.

Резултатът от скрининга се представя като „съответства“ или „със съмнение за несъответствие“.

8.2.2.

В допълнение резултатът за PCDD/PCDF и/или за диоксиноподобните PCB може да се представи като изразен в BEQ, а не в ТЕQ.

8.2.3.

Пробите, чийто отговор е под границата на отчитане, се представят като „проби под границата на отчитане“.

8.2.4.

За всеки тип матрична проба в отчета се посочва максимално допустимото количество или прага, на което/който се базира оценката.

8.2.5.

В отчета се посочва видът на използваното изследване, принципът, на който той се базира, както и видът на калибрирането.

8.2.6.

Отчетът включва информация за метода, използван при екстракцията на PCDD/PCDF и диоксиноподобните PCB.

8.2.7.

При проби, за които има съмнение за несъответствие, отчетът трябва да включва бележка относно действията, които да бъдат предприети. Концентрацията на PCDD/PCDF и сумата от PCDD/PCDF и диоксиноподобните PCB в пробите с повишени количества трябва да бъдат определени/потвърдени чрез метод за потвърждение.

ГЛАВА III

Подготовка на пробите и изисквания към методите за анализ, използвани при официалния контрол на съдържанието на недиоксиноподобни PCB (PCB № 28, 52, 101, 138, 153, 180)

1.    Приложно поле

Посочените в настоящата глава изисквания се прилагат за анализа на фуражите за целите на официалния контрол на нивата на недиоксиноподобни полихлорирани бифенили (недиоксиноподобни PCB) и за други регулаторни цели.

2.    Приложими методи за откриване

Газова хроматография/Електроноулавяща детекция (GC/ECD), GC-LRMS, GC-MS/MS, GC/HRMS или еквивалентни методи.

3.    Идентифициране и потвърждаване на аналитите от значение

3.1.	Време на относително задържане спрямо вътрешните стандарти или референтните стандарти (допустимо отклонение от +/- 0,25 %).

3.2.

Отделяне посредством газова хроматография на всички шест индикаторни PCB (PCB 28, PCB 52, PCB 101, PCB 138, PCB 153 и PCB 180) от интерфериращите вещества, по-специално съвместно елуиращи PCB, особено ако количествата в пробите са в рамките на законово установените ограничения и несъответствието трябва да бъде потвърдено. [Конгенери, за които е установено, че често елуират съвместно, са например PCB 28/31, PCB 52/69 и PCB 138/163/164. При GC-MS трябва да се вземат предвид и възможните интерференции, причинени от фрагменти от конгенери с по-високо съдържание на хлор.]

3.3.

Изисквания към техниките GC-MS Наблюдение най-малко на: а) два специфични йона за HRMS; б) два специфични йона при m/z > 200 или три специфични йона при m/z > 100 за LRMS; в) 1 прекурсор и 2 производни йона за MS-MS. Максимално допустим толеранс за интензитетното съотношение за избраните масови фрагменти: Относително отклонение на интензитетното съотношение на избрани масови фрагменти от теоретичния интензитет или калибрационния стандарт за базовия йон (най-силно присъстващия наблюдаван йон) и за потвърдителния/потвърдителните йон/йони: Относителен интензитет на потвърдителния/ите йон/и в сравнение с базовия йон GC-EI-MS (относително отклонение) GC-CI-MS, GC-MSn (относително отклонение) > 50 % ± 10 % ± 20 % > 20 % до 50 % ± 15 % ± 25 % > 10 % до 20 % ± 20 % ± 30 % ≤ 10 % ± 50 % (1) ± 50 % (1) (1)   Налице е достатъчен брой масови фрагменти с относителен интензитет > 10 %, следователно не е препоръчително използването на потвърдителния/потвърдителните йон/йони с относителен интензитет, по-малък от 10 % в сравнение с целевия йон.

3.4.	Изисквания към техниките GC-ECD Резултатите, които надхвърлят толеранса, трябва да бъдат потвърдени с две GC колони с неподвижни фази с различна полярност.

4.    Доказване на ефективността на метода

Ефективността на метода се валидира в диапазона на максимално допустимото количество (от 0,5 до 2 пъти максимално допустимото количество) с приемлив коефициент на вариация за повтарящите се анализи (вж. изисквания за междинна прецизност в точка 9).

5.    Граница за количествено определяне

Стойностите от изпитвания на празни проби не трябва да бъдат над 30 % от нивото на замърсяване, съответстващо на максималната граница ( 25 ).

6.    Контрол на качеството

Редовни контролни изпитвания на празни проби, анализ на проби с добавка на референтен материал, проби за контрол на качеството, участие в междулабораторни изследвания за съответните матрици.

7.    Контрол на аналитичния добив

7.1.	Използват се подходящи вътрешни стандарти с физикохимични свойства, сравними с тези на аналитите от значение.

7.2.	Добавяне на вътрешни стандарти: Добавяне към продукти (преди екстракцията и пречистването).

7.3.

Изисквания към методите, при които се използват всички шест изотопно белязани конгенери на индикаторни PCB: а) резултатите се коригират за аналитичен добив при вътрешни стандарти; б) аналитичният добив при изотопно белязани вътрешни стандарти е между 50 и 120 %; в) допустима е по-ниска или по-висока степен на аналитичен добив за отделни конгенери, при които участието в сумата от шестте индикаторни PCB е под 10 %.

7.4.

Изисквания към методите, при които не всички шест изотопно белязани вътрешни стандарта се използват, или при които се използват други вътрешни стандарти: а) възстановяването при вътрешния/вътрешните стандарт/стандарти се контролира за всяка проба; б) възстановяването при вътрешния/вътрешните стандарт/стандарти е между 60 и 120 %; в) резултатите се коригират за аналитичен добив при вътрешни стандарти

7.5.	Аналитичният добив при небелязани конгенери се проверява чрез проби с добавен референтен материал или проби за контрол на качеството с концентрации в диапазона на максимално допустимото количество. Аналитичният добив за посочените конгенери се счита за приемлив, когато е между 70 и 120 %.

8.    Изисквания към лабораториите

В съответствие с разпоредбите на Регламент (ЕО) № 882/2004 лабораториите трябва да бъдат акредитирани от признат орган, действащ в съответствие с Ръководство 58 на ISO, с цел да се гарантира осигуряване на качеството при анализите. Лабораториите трябва да бъдат акредитирани в съответствие със стандарт EN ISO/IEC 17025.

9.    Характеристики за ефективност: критерии за сумата от шестте индикаторни PCB на нивото на максимално допустимото количество

10.    Представяне на резултатите

10.1.

Доколкото аналитичната процедура позволява, резултатите от анализа трябва да включват нивата на отделните конгенери на PCB и да бъдат представени като долна граница, горна граница и средна граница с цел при представянето им да бъде включена възможно най-много информация, което да позволи тълкуване в съответствие със специфични изисквания.

10.2.

Отчетът трябва да включва данни за метода, използван за екстракция на PCB и на мазнини.

10.3.

Данните за аналитичния добив за отделните вътрешни стандарти се представят в случаите, в които аналитичният добив е извън обхвата, посочен в точка 7, когато максимално допустимото количество е надвишено или в други случаи при поискване.

10.4.

Тъй като при установяването на съответствието на пробата неопределеността на измерването трябва да бъде взета предвид, този параметър трябва също да бъде представен. Така аналитичните резултати трябва да бъдат представени като х +/– U, където х е аналитичният резултат, а U — разширената неопределеност на измерването, като се използва фактор на покриване 2, който дава доверителна вероятност приблизително 95 %.

10.5.

Ако неопределеността на измерването се взема предвид чрез прилагане на ССα (както е описано в глава I, точка 2.1), този параметър трябва да бъде представен.

10.6.

Резултатите трябва да бъдат изразени в същите единици и най-малко със същия брой значещи цифри като определените в Директива 2002/32/ЕО максимално допустими количества.

▼M2

---

ПРИЛОЖЕНИЕ VI

МЕТОДИ ЗА АНАЛИЗ ЗА ОПРЕДЕЛЯНЕТО НА СЪСТАВКИ ОТ ЖИВОТИНСКИ ПРОИЗХОД ЗА ЦЕЛИТЕ НА ОФИЦИАЛНИЯ КОНТРОЛ НА ФУРАЖИТЕ

1.   ЦЕЛ И ОБХВАТ

Определянето на съставките от животински произход във фуражите се извършва, като се използва наблюдение със светлинен микроскоп или полимеразна верижна реакция (PCR) в съответствие с разпоредбите, предвидени в настоящото приложение.

Тези два метода дават възможност да се установи наличието на съставки от животински произход във фуражните суровини и комбинираните фуражи. Чрез тях обаче не може да се изчисли количеството на тези съставки във фуражните суровини и комбинираните фуражи. И при двата метода границата на откриване е под 0,1 % (w/w).

Методът чрез PCR позволява да бъде установена таксономичната група, към която принадлежат съставките от животински произход във фуражните суровини и комбинираните фуражи.

Тези методи се прилагат за контрол на прилагането на забраните, посочени в член 7, параграф 1 и приложение IV към Регламент (ЕО) № 999/2001 и в член 11, параграф 1 от Регламент (ЕО) № 1069/2009.

В зависимост от вида на изпитвания фураж тези методи могат да бъдат използвани в рамките на един и същ оперативен протокол както самостоятелно, така и заедно в съответствие със стандартните оперативни процедури (СОП), определени от референтната лаборатория на ЕС за животински протеини в хранителните смески (EURL-AP) и публикувани на нейната интернет страница ( 26 ).

2.   МЕТОДИ

2.1.    Светлинна микроскопия

2.1.1.    Принцип

Наличието на съставки от животински произход, които могат да бъдат открити в подложените на анализ фуражни суровини и комбинирани фуражи, се определя въз основа на типични характеристики, които се установяват чрез наблюдение под микроскоп, като например мускулни влакна и други месни частици, хрущяли, кости, рога, косми, четина, кръв, пера, черупки от яйца, рибешки кости и люспи.

2.1.2.    Реагенти и апаратура

2.1.2.1.   Реагенти

2.1.2.1.1.   Концентриращи средства

2.1.2.1.1.1.   Тетрахлоретилен (относителна плътност 1,62)

2.1.2.1.2.   Оцветяващи реагенти

2.1.2.1.2.1.

Разтвор на ализариново червено (в 100 ml вода се разтварят 2,5 ml солна киселина 1М и към този разтвор се прибавят 200 mg ализариново червено)

2.1.2.1.3.   Средства за фиксиране

2.1.2.1.3.1.   Основа (NaOH 2,5 % w/v или KOH 2,5 % w/v)

2.1.2.1.3.2.   Глицерол (неразреден, вискозитет: 1 490 cP)

2.1.2.1.3.3.   Norland ® Optical Adhesive 65 (вискозитет: 1 200 cP) или смола с равностойни свойства за подготовка на предметно стъкло за постоянна употреба

2.1.2.1.4.   Средства за фиксиране с оцветяващи свойства

2.1.2.1.4.1.

Разтвор на Лугол (2 g калиев йодид се разтварят в 100 ml вода и се прибавя 1 g йод, като се разклаща често)

2.1.2.1.4.2.

Цистинов реактив (2 g оловен ацетат, 10 g NaOH на 100 ml вода)

2.1.2.1.4.3.

Реактив на Фелинг (приготвен предварително от равни части (1/1) от два основни разтвора А и Б. Разтвор А: 6,9 g меден (II) сулфат пентахидрат се разтварят в 100 ml вода. Разтвор Б: 34,6 g натриев калиев тартарат тетрахидрат и 12 g NaOH се разтварят в 100 ml вода)

2.1.2.1.4.4.

тетраметилбензидин/водороден прекис 1 g 3,3’,5,5’ тетраметилбензидин (TMB) се разтварят в 100 ml безводна оцетна киселина и 150 ml вода. Преди употреба 4 части от така приготвения разтвор на TMB се смесват с 1 част трипроцентен водороден прекис.

2.1.2.1.5.   Промиващи средства

2.1.2.1.5.1.   Етанол ≥ 96 % (технически чист)

2.1.2.1.5.2.   Ацетон (технически чист)

2.1.2.1.6.   Избелващ реагент

2.1.2.1.6.1.   Готов разтвор на натриев хипохлорит (9—14 % активен хлор)

2.1.2.2.   Апаратура

2.1.2.2.1.   Аналитична везна с точност до 0,001 g

2.1.2.2.2.   Апаратура за смилане: мелничка или хаванче

2.1.2.2.3.   Сита с квадратни отвори с ширина на отвора 0,25 mm и 1 mm

2.1.2.2.4.

Конусовидна стъклена делителна фуния с вместимост 250 ml с тефлонов или стъклен спирателен кран в основата на конуса. Диаметърът на отваряне на крана следва да бъде ≥ 4 mm. Възможно е да се използва също така и бехерова чаша с конично дъно за утаяване, при условие че лабораторията е доказала, че нивата на откриване са еквивалентни на тези, получени при използване на конусовидна стъклена делителна фуния.

2.1.2.2.5.

Стереомикроскоп с обхват на общото увеличение най-малко 6,5× до 40×.

2.1.2.2.6.

Съставен микроскоп с обхват на общото увеличение най-малко 100× до 400× с преминаваща светлина и светло поле. В допълнение могат да бъдат използвани поляризирана светлина и диференциален интерферентен контраст.

2.1.2.2.7.

Стандартна лабораторна стъклария

2.1.2.2.8.

Апаратура за подготовка на предметно стъкло: класически микроскопски предметни стъкла, предметни стъкла с ямка, покривни стъкла (20×20 mm), щипци, фини шпатули

2.1.3.    Вземане на проби и подготовка на пробите

2.1.3.1.   Вземане на проби

Използват се представителни проби, взети в съответствие с разпоредбите в приложение I.

2.1.3.2.   Необходими предпазни мерки

С цел да се избегне кръстосано замърсяване в лабораториите апаратурата за многократно ползване се почиства внимателно преди употреба. Преди почистването частите на делителните фунии се демонтират. Частите на делителните фунии и лабораторната стъклария се измиват предварително на ръка, а след това и машинно. Ситата се почистват с помощта на четка с твърд синтетичен косъм. Препоръчва се след пресяването на мастни вещества, като рибно брашно например, ситата да бъдат почиствани окончателно с ацетон и сгъстен въздух.

2.1.3.3.   Подготовка на проби, различни от мазнини или масла

2.1.3.3.1.

Сушене на проба: пробите със съдържание на влага над 14 % се подлагат на предварително сушене.

2.1.3.3.2.

Предварително пресяване на проба: препоръчва се гранулираните фуражи и зърната да се пресяват предварително през сито с размер на отвора 1 mm, като двете получени в резултат фракции впоследствие се подготвят и анализират като отделни проби.

2.1.3.3.3.

Разделяне на пробата на части и смилане: най-малко 50 g от пробата се отделят като част от пробата за целите на анализа, като впоследствие тя се смила.

2.1.3.3.4.

Екстракция и подготовка на утайка: 10 g (с точност до 0,01 g) от смляната част от пробата се прехвърля в делителна фуния или бехерова чаша с конично дъно за утаяване и се добавят 50 ml тетрахлоретилен. Частта, която се прехвърля във фунията, е най-много 3 g за рибно брашно или други чисти животински продукти, минерални съставки или премикси, които образуват повече от 10 % утайка. Сместа се разклаща енергично в продължение на поне 30 секунди и внимателно се добавят още поне 50 ml тетрахлоретилен, като същевременно вътрешната повърхност на фунията внимателно се облива, за да бъдат отмити полепналите частици. Така получената смес се оставя да престои най-малко 5 минути, преди утайката да се отдели чрез отваряне на спирателния кран. Ако се използва бехерова чаша с конично дъно за утаяване, сместа се разбърква енергично в продължение на поне 15 секунди, като всички частици по стените на бехеровата чаша се отмиват внимателно от вътрешната повърхност с най-малко 10 ml чист тетрахлоретилен. Сместа се оставя да престои в продължение на 3 минути, след което се разбърква отново за 15 секунди, като всички частици по стените на бехеровата чаша се отмиват внимателно от вътрешната повърхност с най-малко 10 ml чист тетрахлоретилен. Така получената смес се оставя да престои в продължение на най-малко 5 минути, като след това течната фракция се отстранява и изхвърля чрез внимателно преливане, като се внимава да няма загуба на утайка. Утайката се изсушава и след това се претегля (с точност до 0,001 g). Ако над 5 % от утайката се състои от частици > 0,50 mm, тя се пресява през сито с големина на отвора 0,25 mm, като се изследват и двете получени по този начин фракции.

2.1.3.3.5.

Екстракция и подготовка на плаваща фракция: след възстановяването на утайката чрез описания по-горе метод в делителната фуния остават две фази: течна фаза, състояща се от тетрахлоретилен, и твърда фаза, състояща се от плаващ на повърхността слой. Тази твърда фаза представлява плаваща фракция и нейното възстановяване се извършва, като цялото количество тетрахлоретилен се излее от фунията с отварянето на спирателния кран. Чрез обръщане на делителната фуния плаващата фракция се прехвърля в голямо блюдо Петри и се изсушава чрез въздух във вентилационен шкаф. Ако над 5 % от плаващата фракция се състои от частици > 0,50 mm, тя се пресява през сито с големина на отвора 0,25 mm, като се изследват и двете получени по този начин фракции.

2.1.3.3.6.

Подготовка на суровина: извършва се подготовка на най-малко 5 g от отделената и смляна част от пробата. Ако над 5 % от веществото се състои от частици > 0,50 mm, то се пресява през сито с големина на отвора 0,25 mm, като се изследват и двете получени по този начин фракции.

2.1.3.4.   Подготовка на проби, които се състоят от мазнини или масла

Подготовката на проби, които се състоят от мазнини или масла, се извършва съгласно следния протокол:

2.1.3.5.   Използване на оцветяващи реагенти

С цел улесняване на правилното определяне на съставките от животински произход, при подготовката на пробите извършващият анализа може да използва оцветяващи реагенти в съответствие с насоките, определени от EURL-AP и публикувани на нейната интернет страница.

Когато за оцветяване на утайката се използва ализариново червено, се прилага следният протокол:

2.1.4.    Микроскопско изследване

2.1.4.1.   Подготовка на предметно стъкло

Микроскопските предметни стъкла се подготвят от утайката и, в зависимост от решението на извършващия анализа, от плаващата фракция или суровината. Ако при подготовката на пробите е използвано пресяване, подготовка се извършва и за двете получени фракции (ситна фракция и едра фракция). Пробите за анализ, отделени от нанесените върху предметни стъкла фракции, се считат за представителни по отношение на цялата фракция.

Необходимо е да бъдат подготвени достатъчен брой предметни стъкла, за да се осигури възможност за цялостен протокол на изследването съгласно точка 2.1.4.2.

Микроскопските предметни стъкла се фиксират с подходящи средства за фиксиране в съответствие със СОП, установени от EURL-AP и публикувани на нейната интернет страница. Предметните стъкла се покриват с покривни стъкла.

2.1.4.2.   Протоколи за наблюдение за откриване на частици от животински произход в комбинираните фуражи и фуражните суровини

Подготвените микроскопски предметни стъкла се наблюдават в съответствие с протоколите за наблюдение, илюстрирани на диаграма 1 за комбинираните фуражи и фуражните суровини, различни от чистото рибно брашно, или на диаграма 2 за чистото рибно брашно.

Микроскопските наблюдения се извършват, като се използва съставен микроскоп за утайката и, в зависимост от решението на извършващия анализа, за плаващата фракция или за суровината. В допълнение към съставния микроскоп за едрите фракции може да се използва и стереомикроскоп. Всяко предметно стъкло се изследва цялостно при различни степени на увеличение.

Минималният брой предметни стъкла, които трябва да бъдат наблюдавани при всеки от установените в протокола за наблюдение етапи, следва да се спазва стриктно, освен ако не е възможно необходимият брой предметни стъкла да бъде осигурен с помощта на веществото в цялата фракция. При всяко определяне се наблюдават максимум 6 предметни стъкла.

За да се улесни определянето на вида и произхода на частиците, извършващият анализа може да използва помощни средства, като например системи за подпомагане вземането на решения, бази данни с изображения и еталонни проби.

2.1.4.3.   Брой на определянията

Ако след първото определяне, проведено в съответствие с протоколите за наблюдение, изобразени на диаграма 1 или диаграма 2 в зависимост от случая, не е установено наличие на частици от животински произход от определен вид (т.е. сухоземни животни или риба), не е необходимо да се провежда допълнително определяне и резултатът от анализа се отчита, като се използва формулировката, посочена в точка 2.1.5.1.

Ако след първото определяне, проведено в съответствие с протоколите за наблюдение, изобразени на диаграма 1 или диаграма 2 в зависимост от случая, общият брой на установените частици от животински произход от определен вид (т.е. сухоземни животни или риба) е между 1 и 5, е необходимо да бъде извършено второ определяне за нова част от пробата (50 g). Ако след второто определяне броят на установените частици от животински произход от конкретния вид е между 0 и 5, резултатът от анализа се отчита, като се използва формулировката, посочена в точка 2.1.5.2; в противен случай се провежда трето определяне за нова част от пробата (50 g). Ако обаче след първото и второто определяне сумата от частиците от даден вид, установени при двете определяния, е над 15, не е необходимо допълнително определяне и резултатът от анализа се отчита, като се използва формулировката, посочена в точка 2.1.5.3. Ако след третото определяне сумата от частиците от животински произход от даден вид, установени при трите определяния, е над 15, резултатът от анализа се отчита, като се използва формулировката, посочена в точка 2.1.5.3. В противен случай резултатът от анализа се отчита, като се използва формулировката, посочена в точка 2.1.5.2.

Ако след първото определяне, проведено в съответствие с протоколите за наблюдение, изобразени на диаграма 1 или диаграма 2 в зависимост от случая, е установено наличие на повече от 5 частици от животински произход от определен вид (т.е. сухоземни животни или риба), резултатът от анализа се отчита, като се използва формулировката, посочена в точка 2.1.5.3.

2.1.5.    Отчитане на резултатите

При отчитането на резултатите лабораторията посочва вида на използвания при анализа материал (утайка, плаваща фракция или суровина), както и броя на извършените определяния.

Лабораторният доклад съдържа най-малко информация относно наличието на съставки, получени от сухоземни животни и риба.

Отделните случаи се представят по следния начин:

2.1.5.1.

Не е установено наличие на частици от животински произход от определен вид — доколкото може да се види под светлинен микроскоп, в разглежданата проба не се откриват частици, получени от сухоземни животни, — доколкото може да се види под светлинен микроскоп, в разглежданата проба не се откриват частици, получени от риба.

2.1.5.2.

Установено е наличие на средно 1 до 5 частици от животински произход от даден вид — доколкото може да се види под светлинен микроскоп, при всяко определяне на разглежданата проба се откриват средно не повече от 5 частици, получени от сухоземни животни. Установените частици са от … [кости, хрущяли, мускули, косми, рога …]. Тази ниска степен на наличие на частици е под границата на откриване на микроскопския метод, което означава, че не може да бъде изключен риск от грешен положителен резултат. Или, в зависимост от случая, — доколкото може да се види под светлинен микроскоп, при всяко определяне на разглежданата проба се откриват средно не повече от 5 частици, получени от риба. Установените частици са от … [рибешки кости, рибешки люспи, хрущяли, мускули, отолити, хриле …]. Тази ниска степен на наличие на частици е под границата на откриване на микроскопския метод, което означава, че не може да бъде изключен риск от грешен положителен резултат. Когато е използвано предварително пресяване на пробата, в лабораторния доклад се посочва в коя фракция (пресятата фракция, гранулираната фракция или зърната) са установени частиците от животински произход, доколкото откриването им само в пресятата фракция би могло да означава замърсяване на обкръжаващата среда.

2.1.5.3.

Установено е наличие на средно над 5 частици от животински произход от даден вид — доколкото може да се види под светлинен микроскоп, при всяко определяне на разглежданата проба се откриват средно над 5 частици, получени от сухоземни животни. Установените частици са от … [кости, хрущяли, мускули, косми, рога …]. Или, в зависимост от случая, — доколкото може да се види под светлинен микроскоп, при всяко определяне на разглежданата проба се откриват средно над 5 частици, получени от риба. Установените частици са от … [рибешки кости, рибешки люспи, хрущяли, мускули, отолити, хриле …]. Когато е използвано предварително пресяване на пробата, в лабораторния доклад се посочва в коя фракция (пресятата фракция, гранулираната фракция или зърната) са установени частиците от животински произход, доколкото откриването им само в пресятата фракция би могло да означава замърсяване на обкръжаващата среда.

2.2.    Полимеразна верижна реакция (РCR)

2.2.1.    Принцип

Фрагментите от дезоксирибонуклеинова киселина (ДНК) от животински произход, които е възможно да се намират във фуражните суровини и комбинираните фуражи, се откриват посредством техника за генетична амплификация чрез полимеразна верижна реакция (PCR), насочена към секвенции на ДНК, които са специфични за конкретен животински вид.

При метода чрез PCR е необходимо най-напред да бъде извършено извличане на ДНК. На следващия етап извлечената ДНК се подлага на амплификация с цел да бъдат установени животинските видове, предмет на анализа.

2.2.2.    Реагенти и апаратура

2.2.2.1.   Реагенти

2.2.2.1.1.   Реагенти при фазата на извличане на ДНК

Следва да бъдат използвани единствено реагенти, които са одобрени от EURL-AP и са публикувани на нейната интернет страница.

2.2.2.1.2.   Реагенти при фазата на генетична амплификация

2.2.2.1.2.1.   Праймери и сонди

Следва да се използват единствено праймери и сонди със секвенции на олигонуклеотиди, които са валидирани от EURL-AP ( 27 ).

2.2.2.1.2.2.   Реактивни смеси (Master Mix)

Следва да бъдат използвани само разтвори на реактивни смеси, в чийто състав липсват реагенти, които биха могли да доведат до грешни резултати поради присъствие на животинска ДНК ( 28 ).

2.2.2.1.2.3.   Реагенти за обеззаразяване

2.2.2.1.2.3.1.   Разтвор на солна киселина (0,1N)

2.2.2.1.2.3.2.   Избелване (разтвор на натриев хипохлорит при 0,15 % активен хлор)

2.2.2.1.2.3.3.   Некорозивни химични реагенти за обеззаразяване на скъпа апаратура, като аналитични везни (например DNA EraseTM на MP Biomedicals)

2.2.2.2.   Апаратура

2.2.2.2.1.   Аналитична везна с точност до 0,001 g

2.2.2.2.2.   Апаратура за смилане

2.2.2.2.3.   Термоциклично устройство, позволяващо извършване на PCR в реално време

2.2.2.2.4.   Микроцентрофуга за микроцентрофужни епруветки

2.2.2.2.5.   Набор от микропипети, позволяващи пипетиране от 1 μl до 1 000 μl

2.2.2.2.6.

Стандартни пластмасови консумативи за молекулярна биология: микроцентрофужни епруветки, пластмасови накрайници с филтър за микропипети, лабораторни плаки, подходящи за термоциклично устройство.

2.2.2.2.7.

Фризери за съхранение на проби и реагенти

2.2.3.    Вземане на проби и подготовка на пробите

2.2.3.1.   Вземане на проби

Използват се представителни проби, взети в съответствие с разпоредбите в приложение I.

2.2.3.2.   Подготовка на пробите

Подготовката на лабораторните проби до момента на извличането на ДНК се осъществява в съответствие с изискванията, посочени в приложение II. Най-малко 50 g от пробата се отделят като част от пробата за целите на анализа, като впоследствие тя се смила.

Подготовката на пробите се извършва в помещения, различни от предназначените за извличане на ДНК и за реакции за генетична амплификация съгласно стандарт ISO 24276.

Подготвят се две проби за анализ, като всяка от тях е поне 100 mg.

2.2.4.    Извличане на ДНК

Извличането на ДНК се извършва от всяка подготвена проба за анализ в съответствие със СОП, определени от EURL-AP и публикувани на нейната интернет страница.

За всяка серия по извличане се подготвят по две контролни проби на извличането съгласно стандарт ISO 24276.

2.2.5.    Генетична амплификация

Генетичната амплификация се извършва, като се използват валидираните методи за всеки от животинските видове, за които се изисква идентификация. Тези методи са установени в СОП, определени от EURL-AP и публикувани на нейната интернет страница. Всяка извлечена ДНК се анализира при най-малко две различни разреждания, за да се прецени наличието на инхибиране.

Подготвят се две контролни проби на амплификацията за всеки изследван животински вид съгласно стандарт ISO 24276.

2.2.6.    Тълкуване и отчитане на резултатите

При отчитането на резултатите лабораторията посочва информация най-малко относно теглото на използваните проби за анализ, използваната техника за извличане, броя на извършените определяния, както и относно границата на откриване на метода.

Резултатите не следва да се тълкуват и докладват, ако положителната контролна проба за извличане на ДНК и положителната контролна проба за ДНК от изследвания животински вид не дават положителни резултати по отношение на изследвания животински вид, а контролната проба на реагентите при амплификация е отрицателна.

В случай че е налице несъответствие между резултатите от двете проби за анализ, е необходимо повторно извършване най-малко на фазата на генетична амплификация. В случай на опасения от страна на лабораторията, че екстрактите на ДНК могат да са причина за несъответствието, преди да се пристъпи към тълкуване на резултатите, е необходимо да се извърши ново извличане на ДНК и последваща генетична амплификация.

Окончателното отчитане на резултатите следва да бъде извършено чрез обединяване и тълкуване на резултатите от двете проби за анализ в съответствие със СОП, определени от EURL-AP и публикувани на нейната интернет страница.

2.2.6.1.   Отрицателен резултат

Отрицателният резултат се отчита по следния начин:

В разглежданата проба не бе установено наличие на ДНК от X (X — животинските видове или групата от животински видове, предмет на анализа).

2.2.6.2.   Положителен резултат

Положителният резултат се отчита по следния начин:

В разглежданата проба бе установено наличие на ДНК от X (X — животинските видове или групата от животински видове, предмет на анализа).

▼B

---

ПРИЛОЖЕНИЕ VII

МЕТОД ЗА ИЗЧИСЛЯВАНЕ НА ЕНЕРГИЙНАТА СТОЙНОСТ НА ФУРАЖИТЕ ЗА ДОМАШНИ ПТИЦИ

1.   Метод за изчисляване и изразяване на енергийната стойност

Енергийната стойност на комбинираните фуражи за домашни птици трябва да бъде изчислявана в съответствие с посочената по-долу формула въз основа на процентното съдържание на определени аналитични компоненти във фуража. Тази стойност трябва да бъде изразена в мегаджаули (MJ) обменна енергия (ОЕ) с коригиран азот, на килограм от хранителната смес:

MJ/kg ОЕ = 0,1551 × % суров протеин + 0,3431 × % сурови мазнини + 0,1669 × % нишесте + 0,1301 × % общо захари (изразени като захароза)

2.   Допустими отклонения от декларираните стойности

Ако официалната проверка установи несъответствие (по-висока или по-ниска енергийна стойност на фуража), позволеното минимално отклонение между резултата от проверката и декларираната енергийна стойност е 0,4 MJ/kg ОЕ.

3.   Изразяване на резултата

След прилагането на горепосочената формула, полученият резултат трябва да бъде отчетен до първия знак след десетичната запетая.

4.   Методи за вземане на проби и анализ

Вземането на проби от комбинирания фураж и определянето на съдържанието на компонентите за анализ, посочени в метода за изчисление, трябва да бъде извършено в съответствие с общностните методи за вземане на проби и за анализ, използвани при официалния контрол на фуражите.

Трябва да се прилагат следните методи:

---

ПРИЛОЖЕНИЕ VIII

МЕТОДИ ЗА АНАЛИЗ С ЦЕЛ КОНТРОЛ НА НЕЗАКОННОТО НАЛИЧИЕ ВЪВ ФУРАЖИТЕ НА ДОБАВКИ, ЧИЕТО ПОЛЗВАНЕ ВЕЧЕ НЕ Е РАЗРЕШЕНО

А.   ОПРЕДЕЛЯНЕ НА METHYL BENZOQUATE

(7-бензокси-6-бутил-3-метоксикарбонил-4-хинолон)

1.   Цел и обхват

Настоящият метод позволява определянето на съдържанието на methyl benzoquate във фуражите. Прагът на количествено определяне е 1 mg/kg.

2.   Принцип

Methyl benzoquate се екстрахира от пробата с помощта на разтвор на метанол и метансулфонова киселина. Екстрактът се пречиства с дихлорметан чрез йоннообменна хроматография и след това отново с дихлорометан. Съдържанието на methyl benzoquate се определя чрез високоефективна течна хроматография (HPLC) с обратна фаза с помощта на UV-детектор.

3.   Реагенти

Смес от метанол (т. 3.2) и вода (с чистота за HPLC) 75 + 25 (v + v).

Разтворът се филтрира през филтър с размер на порите 0,22 μm (т. 4.5) и се обезгазява (напр. чрез подлагане на въздействието на ултразвук в продължение на 10 минути).

Разреждат се с метанолът 20,0 ml метансулфонова киселина до 1 000 ml (т. 3.2).

Разреждат се с вода 100 ml солна киселина (ρ201,18  g/ml) до 1 000 ml.

Смолата се подлага на предварителна подготовка: суспендират се 100 g от смолата в 500 ml разтвор на солна киселина (т. 3.5), сместа се нагрява на нагревателна плоча до завиране, като непрекъснато се разбърква. Оставя се да се охлади и киселината се източва. Прецежда се през филтърна хартия във вакуум. Смолата се промива два пъти с по 500 ml вода, а след това с 250 ml метанол (т. 3.2). Смолата се промива с още 250 ml метанол и се изсушава, като се пуска въздух през филтрата. Изсушената смола се съхранява в запушено шише.

Отмерерват се 50 mg от стандартното вещество (т. 3.7) с точност до 0,1 mg и се разтварят в разтвор на метаносулфонова киселина (т. 3.4) в градуирана колба от 100 ml, допълва се до пълния обем и се разбърква.

Прехвърлят се 5,0 ml от основния стандартен разтвор на methyl benzoquate (т. 3.7.1) в градуирана колба от 50 ml, допълва се до пълния обем с метанол (т. 3.2) и се разбърква.

Прехвърлят се 1,0 , 2,0 , 3,0 , 4,0 и 5,0 ml от междинния стандартен разтвор на methyl benzoquate (т. 3.7.2) в няколко градуирани колби от 25 ml. Допълва се до пълния обем с подвижната фаза (т. 3.3) и се разбърква. Концентрацията на methyl benzoquate в тези разтвори е съответно 2,0 , 4,0 , 6,0 , 8,0 и 10,0 μg/ml. Разтворите трябва да се приготвят непосредствено преди употреба.

4.   Апаратура

5.   Процедура

5.1.   Общи положения

Следва да се отбележи, че за целите на метода празната проба трябва да бъде сходна по вид с изследваната проба и при анализа ѝ не трябва да се открие наличие на methyl benzoquate.

5.2.   Екстракция

Отмерват се приблизително 20 g от приготвената проба с точност до 0,01  g и се прехвърлят в конична колба от 250 ml. Прибавят се 100 ml разтвор на метансулфонова киселина (т. 3.4) и се разклаща с механично приспособление (т. 4.1) в продължение на 30 min. Филтрира се през филтърна хартия и филтратът се запазва за етапа на разделяне течност-течност (т. 5.3).

5.3.   Разделяне течност-течност

В делителна фуния от 500 ml, съдъражаща 100 ml разтвор на солна киселина (т. 3.5), се прехвърлят 25,0 ml от филтрата, получен съгласно процедурата в т. 5.2. Прибавят се 100 ml дихлорметан (т. 3.1) във фунията и се разклаща в продължение на около една минута. Оставят се пластовете да се разделят и се източва долният (дихлорметанов) пласт в облодънна колба от 500 ml. Екстракцията на водната фаза се повтаря с още две дози от 40 ml дихлорметан и тези екстракти се смесват с първия екстракт в облодънната колба. Дихлорметановият екстракт се подлага на изпаряване до сухо в ротационния тънкослоен изпарител (т. 4.2) при понижено налягане и температура от 40 oC. Остатъкът се разтваря в 20—25 ml метанол (т. 3.2), колбата се запушва и се запазва целият екстракт за йоннообменната хроматография (т. 5.4).

5.4.   Йоннообменна хроматография

5.4.1.    Приготвяне на катионнообменната колона

Запушва се долният край на стъклената колона (т. 4.3) с тапа от стъклен памук. Приготвя се суспензия с 5,0  g от обработената катионнообменна смола (т. 3.6) и 50 ml солна киселина (т. 3.5), налива се в стъклената колона и се оставя да се утаи. Източва се излишното количество киселина до нивото на повърхността на смолата и колоната се промива с вода, докато източваната течност не покаже неутрална реакция спрямо лакмус. Прехвърлят се 50 ml метанол (т. 3.2) в колоната и се оставя да се отцеди до нивото на повърхността на смолата.

5.4.2.    Колонна хроматография

С помощта на пипета внимателно се прехвърля в колоната екстрактът, получен в съотвтствие с процедурата в т. 5.3. Облодънната колба се изплаква с две дози (5—10 ml) метанол (т. 3.2) и течността от изплакванията се прехвърля в колоната. Екстрактът се източва до нивото на смолата и колоната се промива с 50 ml метанол, като скоростта на изтичане е не по-голяма от 5 ml/min. Източеното количество се изхвърля. Като се използват 150 ml разтвор на метансулфонова киселина (т. 3.4), се елуира methyl benzoquate от колоната, а елуатът от колоната се поставя в конична колба от 250 ml.

5.5.   Разделяне течност-течност

Елуатът, получен с процедурата в т. 5.4.2, се прехвърля в делителна фуния от 1 l. Коничната колба се изплаква с 5—10 ml метанол (т. 3.2) и течността от изплакванията се смесва със съдържанието на делителната фуния. Прибавят се 300 ml разтвор на солна киселина (т. 3.5) и 130 ml дихлорметан (т. 3.1). Разклаща се за около 1 min и се оставя фазите да се разделят. Долният (дихлорметанов) слой се източва в облодънна колба от 500 ml. Екстракцията на водната фаза се повтаря с още две дози по 70 ml дихлорметан и новополучените екстракти се смесват с първия екстракт в облодънната колба.

Дихлорметановият екстракт се подлага на изпаряване до сухо в ротационния тънкослоен изпарител (т. 4.2) при понижено налягане и температура от 40 oC. Остатъкът в колбата се разтваря в 5 ml метанол (т. 3.2) и този разтвор се прехвърля количествено в градуирана колба от 10 ml. Облодънната колба се изплаква с още две дози метанол (1—2 ml) и съдържанието се прехвърля в градуираната колба. Допълва се с метанол до пълния обем и се разбърква. Една аликвотна част се филтрира през мембранен филтър (т. 4.6). Разтворът се запазва за определяне с HPLC (т. 5.6).

5.6.   Определяне с помощта на HPLC

5.6.1.    Параметри

Дават се следните указания за условията за провеждане на анализа. Могат да бъдат използвани и други условия, ако дават равностойни резултати:

Проверява се стабилността на хроматографичната система, като на няколко пъти се впръсква калибрационният разтвор (т. 3.7.3), съдържащ 4 μg/ml, докато се постигнат постоянни височини на пика и постоянни времена на задържане.

5.6.2.    Калибрационна крива

Всеки от калибрационните разтвори (3.7.3) се впръсква няколко пъти и се измерват височините (площите) на пика за всяка концентрация. Построява се калибрационна крива, като за ординати се използват средните височини на пиковете (площите) на калибрационните разтвори, а за абсциси — съответните концентрации в μg/ml.

5.6.3.    Разтвор на пробата

Разтворът на пробата (т. 5.5) се впръсква няколко пъти, като се използва същият обем като този за калибрационните разтвори и се определя средната височина (площ) на пиковете на methyl benzoquate.

6.   Изчисляване на резултатите

Чрез сравнение с калибрационната крива (т. 5.6.2) и като се използва средната височина (площ) на пиковете на methyl benzoquate за разтвора на пробата, се определя концентрацията на разтвора на пробата в μg/ml.

Съдържанието на methyl benzoquate w (mg/kg) в пробата се изчислява по следната формула:

където:

c

=

концентрация на methyl benzoquate в разтвора на пробата в μg/ml,

m

=

тегло на частта от пробата за анализ в грамове.

7.   Потвърждаване на резултатите

7.1.   Идентичност

Идентичността на аналита може да се потвърди чрез кохроматография или чрез използване на детектор с диодна матрица, с помощта на който могат да се сравнят спекрите на екстракта на пробата и на калибрационния разтвор (т. 3.7.3), съдържащ 10 μg/ml.

7.1.1.    Кохроматография

Екстрактът от пробата се обогатява, като към него се прибави подходящо количество от междинния стандартен разтвор (т. 3.7.2). Количеството добавен methyl benzoquate трябва да бъде сходно с количество methyl benzoquate, което се предполага, че се съдържа в екстракта от пробата.

Увеличава се само височината на пика на methyl benzoquate, след като се вземат предвид както добавеното количество, така и степента на разреждане на екстракта. Широчината на пика на половината от неговата максимална височина трябва да бъде в рамките на около 10 % от първоначалната широчина.

7.1.2.    Детектиране с диодна матрица

Резултатите се оценяват според следните критерии:

Ако някой от критериите не е изпълнен, наличието на аналита не се потвърждава.

7.2.   Повторяемост

Разликата между резултатите от две паралелни определяния, проведени върху една и съща проба, не трябва да превишава: 10 % спрямо по-високата стойност за съдържание на methyl benzoquate между 4 и 20 mg/kg.

7.3.   Възстановяване

Възстановяването за обогатена празна проба трябва да бъде най-малко 90 %.

8.   Резултати от съвместно изследване

Пет проби бяха подложени на анализ в 10 лаборатории. За всяка проба са проведени по два анализа.

НО

=

не е открито

sr

=

стандартно отклонение на повторяемостта

CVr

=

коефициент на вариация на повторяемостта, %

sR

=

стандартно отклонение на възпроизводимостта

CVR

=

коефициент на вариация на възпроизводимостта, %

Б.   ОПРЕДЕЛЯНЕ НА ОЛАКВИНДОКС

2-[N-2'-(хидроксиетил)карбамоил]-3-метилхиноксалин-N 1 ,N 4 -диоксид

1.   Цел и обхват

Настоящият метод позволява определянето на съдържанието на олавкиндокс във фуражите. Прагът на количествено определяне е 5 mg/kg.

2.   Принцип

Пробата се подлага на екстракция със смес от метанол и вода. Съдържанието на олквиндокс се определя с помощта на високоефективна течна хроматография с обратна фаза (HPLC), като се използва UV-детектор.

3.   Реагенти

Смес от вода (т. 3.3) и метанол (т. 3.2), 900 +100 (V + V).

Претеглят се с точност до 0,1 mg 50 mg олаквиндокс (т. 3.5) в градуирана колба от 200 ml и се добавят 190 ml вода. След това колбата се поставя за 20 min в ултразвукова вана (т. 4.1). След обработката с ултразвук, разтворът се охлажда до стайна температура, допълва се с вода до пълния обем и се разбърква. Колбата се завива в алуминиево фолио и се съхранява в хладилник. Този разтвор трябва да се приготвя ежемесечно.

Прехвърлят се 10,0 ml от основния стандартен разтвор (т. 3.5.1) в градуирана колба от 100 ml, долива се по пълния обем с подвижната фаза (т. 3.4) и се разбърква. Колбата се завива в алуминиево фолио и се съхранява в хладилник. Този разтвор трябва да се приготвя ежедневно.

В поредица градуирани колби от 50 ml се прехвърлят 1,0 , 2,0 , 5,0 , 10,0 , 15,0 и 20,0 ml от междинния стандартен разтвор (т. 3.5.2). Колбите се допълват до пълния обем с подвижната фаза (т. 3.4) и съдържанието им се разбърква. Колбите се завиват в алуминиево фолио. Тези разтвори отговарят съответно на 0,5 , 1,0 , 2,5 , 5,0 , 7,5 и 10,0 μg олаквиндокс на ml.

Тези разтвори трябва да се приготвят ежедневно.

4.   Апаратура

5.   Процедура

Забележка

:

Олаквиндоксът е чувствителен към светлина. Всички процедури се извършват при приглушена светлина или се използва лабораторна стъклария от тъмно стъкло.

5.1.   Общи положения

Забележка

:

За целите на този метод празната проба трябва да бъде сходна по вид с действителната проба и в нея не трябва да се отчита наличие на олаквиндокс.

5.2.   Екстракция

Претеглят се с точност 0,01  g приблизително 50 g от пробата. Прехвърлят се в коничнаа колба от 1 000 ml, добавят се 100 ml метанол (т. 3.1) и колбата се поставя в ултарзвукова баня (т. 4.1) за 5 минути. Добавят се 410 ml вода и се оставя в ултразвуковата вана за още 15 min. Колбата се изважда от ултразвуковата вана, разклаща се в продължение на 30 минути с клатачната машина (т. 4.2) и се филтрира през нагънат филтър. Прехвърлят се 10,0 ml от филтрата в градуирана колба от 20 ml, долива се вода до пълния обем и се разбърква. Една аликвотна част се филтрираа през мембранен филтър (т. 4.4). (вж. забележката в т. 9) Преминава се към определяне с помощта на HPLC (т. 5.3).

5.3.   Определяне с помощта на HPLC

5.3.1.    Параметри

Следните условия са дадени като указание; може да се използват и други, при условие, че дават равностойни резултати:

Проверява се стабилността на хроматографската система като няколко пъти се впръсква калибрационен разтвор (т. 3.5.3), в който се съдържат 2,5 μg/ml, докато се постигнат постоянни височини на пиковете и постоянни времена на задържане.

5.3.2.    Калибрационна крива

Впръсква се от всеки калибрационен разтвор (3.5.3) по няколко пъти и се определят средните пикови височини (площи) за всяка концентрация. Построява се калибрационна крива, като средните височини на пиковете (площите) на калибрационните разтвори се използват за ординати, а съответстващите им концентрации в μg/ml за абсциси.

5.3.3.    Разтвор на пробата

Екстрактът от пробата (т. 5.2) се впръсква няколко пъти, като се използва същият обем, както за калибриращите разтвори, и се определя средната височина (площта) на пиковете на олаквиндокс.

6.   Изчисляване на резултатите

От средната височина (площ) на пиковете на олаквиндокс в разтвора на пробата чрез сравняване с калибрационната крива (т. 5.3.2) се определя концентрацията на разтвора на пробата в μg/ml.

Съдържанието на олаквиндокс w в mg/kg в пробата се определя по формулата:

където:

c

=

концентрация на олаквиндокс в екстракта на пробата (т. 5.2) в μg/ml

m

=

тегло в g на частта от пробата за анализ (т. 5.2)

7.   Потвърждаване на резултатите

7.1.   Идентичност

Идентичността на аналита може да се потвърди с помощта на кохроматография или като се използва детектор с диодна матрица, с помощта на които се сравняват спектрите на екстракта на пробата (т. 5.2) и на калибрационния разтвор (т. 3.5.3), съдържащ 5,0 μg/ml.

7.1.1.    Кохроматография

Обогатява се екстракт от пробата (т. 5.2), като се добавя подходящо количество калибрационен разтвор (т. 3.5.3). Количество добавен олаквиндокс трябва да бъде сходно с количеството олаквиндокс в екстракта от пробата.

Увеличава се само височината на пика на олаквиндокс след като се вземат предвид както добавеното количество, така и степента на разреждане на екстракта от пробата. Широчината на пика на по средата на височината му трябва да бъде в рамките на ± 10 % от първоначалната широчина на пика на олаквиндокс в необогатения екстракт на пробата.

7.1.2.    Детектиране с диодна матрица

Резултатите се оценяват според следните критерии:

Ако някой от критериите не е изпълнен, наличието на аналита не се потвърждава.

7.2.   Повторяемост

Разликата между резултатите от две паралелни определяния, извършени върху една и съща проба, не трябва да надвишава 15 % спрямо по-високия резултат за съдържание на олаквиндокс между 10 и 200 mg/kg.

7.3.   Възстановяване

Възстановяването за обогатена празна проба трябва да бъде най-малко 90 %.

8.   Резултати от съвместно изследване

Организирано бе съвместно изследване в ЕО, при което 13 лаборатории анализираха четири проби от фураж за прасенца, включително една проба с необогатен фураж. Резултатите са представени по-долу:

L

=

брой на лабораториите

n

=

брой на единичните стойности

Sr

=

стандартно отклонение на повторяемостта

SR

=

стандартно отклонение на възпроизводимостта

CVr

=

коефициент на вариация на повторяемостта

CVR

=

коефициент на вариация на възпроизводимостта.

9.   Забележки

Въпреки че методът още не проверен за фуражи със съдържание на олаквиндокс над 100 mg/kg, възможно е да се постигнат задоволителни резултати, като се вземе проба с по-малко тегло и/или екстрактът (т. 5.2) се разтвори до постигане на концентрация в рамките на диапазона на калибрационната крива (т. 5.3.2).

В.   ОПРЕДЕЛЯНЕ НА АМПРОЛИУМ

1-[(4-амино-2-пропилпиримидин-5-ил)метил]-2-метил-пиридин хлорид хидрохлорид

1.   Цел и обхват

Настоящият метод дава възможност за определяне на съдържанието на ампролиум във фуражи и премикси. Границата на откриване е 1 mg/kg, а границата на количествено определяне е 5 mg/kg.

2.   Принцип

Пробата се подлага на екстракция със смес от метанол и вода. След разреждане с подвижната фаза и филтрация с мембранен филтър, съдържанието на ампролиум се определя чрез високоефективна течна хроматография (HPLC) с катионен обмен, с използване на UV детектор.

3.   Реагенти

Разтварят се във вода (т. 3.3) 13,80  g натриев дихидроген фосфат монохидрат в градуирана колба от 1 000 ml, допълва се до пълния обем с вода (т. 3.3) и се разбърква.

Разтварят се 224,74  g натриев перхлорат монохидрат във вода (т. 3.3) в градуирана колба от 1 000 ml, допълва се с вода (т. 3.3) до пълния обем и се разбърква.

Смес от ацетонитрил (т. 3.2), разтвор на натриев дихидроген фосфат (т. 3.4) и разтвор на натриев перхлорат (т. 3.5), 450 + 450 + 100 (v + v + v). Преди употреба, разтворът се филтрира през мембранен филтър от 0,22 μm (т. 4.3) и обезгазява (напр.в ултразвукова вана (т. 4.4) в продължение най-малко на 15 минути).

Претеглят се 50 mg ампролиум (т. 3.7) с точност до 0,1 mg в градуирана колба от 100 ml, това количество се разтваря в 80 ml метанол (т. 3.1) и колбата се поставя в ултразвукова вана (т. 4.4) за 10 минути. След обработката с ултразвук, разтворът се охлажда до стайна температура, допълва се с вода до пълния обем и се разбърква. При температура ≤ 4 oС разтворът е стабилен в продължение на 1 месец.

Отмерват се с пипета 5,0 ml от основния стандартен разтвор (т. 3.7.1) в градуирана колба от 50 ml, допълва се до пълния обем с екстракционен разтворител (т. 3.8) и се разбърква. При температура ≤ 4 oС разтворът е стабилен в продължение на 1 месец.

Прехвърлят се съответно 0,5 , 1,0 и 2,0 ml от междинния стандартен разтвор (т. 3.7.2) в поредица от градуирани колби от 50 ml. Колбите се допълват до пълния обем с подвижната фаза (т. 3.6) и съдържанието им се разбърква. Тези разтвори отговарят съответно на 0,5 , 1,0 и 2 μg ампролиум на ml. Разтворите трябва да бъдат приготвени непосредствено преди употреба.

Смес от метанол (т. 3.1) и вода, 2 + 1 (v + v).

4.   Апаратура

5.   Процедура

5.1.   Общи положения

5.1.1.    Фураж без добавки

За изпълнението на теста за възстановяване (т. 5.1.2), се анализира празна проба фураж, за да се провери за наличие на ампролиум и интерфериращи вещества. Фуражът от празната проба трябва да е подобен по вид на този от изследваната проба и в него не трябва да бъдат открити ампролиум или интерфериращи вещества.

5.1.2    Тест за възстановяване

Извършва се тест за възстановяване, като се анализира пробата от фураж без добавки, обогатена чрез прибавяне на известно количество ампролиум, сходно с наличното в изследваната проба. За да се обогати пробата до равнище 100 mg/kg, 10,0 ml от основния стандартен разтвор (т. 3.7.1) се прехвърлят в конична колба от 250 ml и се подлагат на изпарение, докато количеството на разтвора намалее до около 0,5 ml. Добавят се 50 g от фуража без добавки, разбърква се старателно и се оставя за 10 min, като се разбърква неколкократно, преди да се премине към етапа на екстракция (т. 5.2).

Като алтернатива, ако не е наличен фураж, подобен на този, от който е взета пробата (вж. т. 5.1.1), тестът за възстановяване може да се извърши чрез стандартия метод на добавяне. В този случай пробата, която ще се анализира, се обогатява с такова количество ампролиум, което е близко до вече съдържащото се в пробата. Тази проба се анализира заедно с необогатената проба, като възстановяването се пресмята чрез изваждане.

5.2.   Екстракция

5.2.1.    Премикси (съдържание < 1 % ампролиум) и фуражи

Претеглят се с точност до 0,01 mg от 5 g до 40 g от пробата, в зависимост от съдържанието на ампролиум, в конична колба от 500 ml, и се добавят 200 ml екстракционен разтворител (т. 3.8). Колбата се поставя в ултразвукова вана (т. 4.4) за 15 min. Колбата се изважда от ултразвуковата вана, разклаща се в продължение на 1 час с клатачна машина или се разбърква с магнитна бъркалка (т. 4.5). Една аликвотна част от екстракта се разрежда с подвижната фаза (т. 3.6) до получаване на съдържание на ампролиум от 0,5 до 2 μg/ml и се разбърква (вж. забележка 9.3). Филтрират се 5 до 10 ml от този разреден разтвор през мембранен филтър (т. 4.2). Пристъпва се към определяне чрез HPLC (т. 5.3).

5.2.2.    Премикси (съдържание ≥ 1 % ампролиум)

Претеглят се точност до 0,001  g от 1 до 4 g премикс, в зависимост от съдържанието на ампролиум, в конична колба от 500 ml, и се добавят 200 ml екстракционен разтворител (т. 3.8). Колбата се поставя в ултразвукова вана (т. 4.4) за 15 min. Колбата се изважда от ултразвуковата вана, разклаща се в продължение на 1 час с клатачна машина или се разбърква с магнитна бъркалка (т. 4.5). Една аликвотна част от екстракта се разрежда с подвижната фаза (т. 3.6) до получаване на съдържание на ампролиум от 0,5 до 2 μг/ml и се разбърква. Филтрират се 5 до 10 ml от този разреден разтвор през мембранен филтър (т. 4.2). Пристъпва се към определяне чрез HPLC (т. 5.3).

5.3.   Определяне с помощта на HPLC

5.3.1.    Параметри

Следните условия са дадени като указание; може да се използват и други, при условие, че дават равностойни резултати:

Проверява се стабилността на хроматографската система като няколко пъти се впръсква калибрационен разтвор (т. 3.7.3), в който се съдържат 1,0 μg/ml, докато се постигнат постоянни височини на пиковете и постоянни времена на задържане.

5.3.2.    Калибрационна крива

Впръсква се от всеки калибрационен разтвор (т. 3.7.3) по няколко пъти и се определят средните височини на пиковете (площите) за всяка концентрация. Построява се калибрационна крива, като средните височини на пиковете (площите) на калибрационните разтвори се използват за ординати, а съответстващите им концентрации в μg/ml — за абсциси.

5.3.3.    Разтвор на пробата

Екстрактът от пробата за изследване (5.2) се впръсква няколко пъти, като се използва същият обем като при калибрационните разтвори, и се определя средната височина (площ) на пиковете на ампролиум.

6.   Изчисляване на резултатите

От средната височина (площ) на пиковете на ампролиум в разтвора на пробата чрез сравняване с калибрационната крива (т. 5.3.2) се определя концентрацията на разтвора на пробата в μg/ml.

Съдържанието на ампролиум w в mg/kg в пробата се определя по формулата:

[mg/kg]

където:

V

=

обем на екстракционния разтворител (т. 3.8) в ml, съгласно т. 5.2 (т.е. 200 ml)

c

=

концентрация на ампролиум в екстракта на пробата (т. 5.2) в μg/ml

f

=

фактор на разреждане, съгласно т. 5.2.

m

=

тегло в g на частта от пробата за анализ.

7.   Потвърждаване на резултатите

7.1.   Идентичност

Идентичността на аналита може да се потвърди чрез ко-хроматография или чрез използване на детектор с диодна матрица, с помощта на които могат да се сравнят спекрите на екстракта на пробата и на калибрационния разтвор (т. 3.7.3), съдържащ 2,0 μg/ml.

7.1.1.    Кохроматография

Обогатява се екстракт от пробата (т. 5.2), като се добави подходящо количество калибрационен разтвор (т. 3.7.3). Количеството добавен ампролиум трябва да бъде близко до това, открито в екстракта на пробата.

Увеличава се само височината на пика на ампролиум, след като се вземат под внимание както добавеното количество, така и степента на разреждане на екстракта. Широчината на пика при половината от височината му трябва да бъде в границите на ± 10 % от първоначалната широчина на пика на ампролиум при необогатения екстракт от пробата.

7.1.2.    Детектиране с диодна матрица

Резултатите се оценяват според следните критерии:

Ако един от тези критерии не е спазен, наличието на аналита не е потвърдено.

7.2.   Повторяемост

Разликата между резултатите от две паралелни определяния, проведени върху същата проба, не трябва да превишава:

7.3.   Възстановяване

При обогатена (празна) проба, възстановяването трябва да бъде най-малко 90 %.

8.   Резултати от съвместно изследване

Проведено беше паралелно изследване, при което бяха анализирани три фуража за домашни птици (проби 1—3), един минерален фураж (проба 4) и един премикс (проба 5). Резултатите са представени в следната таблица:

L

=

брой на лабораториите

n

=

брой на единичните стойности

sr

=

стандартно отклонение на повторяемостта

CVr

=

коефициент на вариация на повторяемостта

sR

=

стандартно отклонение на възпроизводимостта

CVR

=

коефициент на вариация на възпроизводимостта

9.   Забележки

Г.   ОПРЕДЕЛЯНЕ НА КАРБАДОКС

Метил 3-(2-квиноксалинилметилен)карбазат N 1 ,N 4 -диоксид

1.   Цел и обхват

Настоящият метод дава възможност за определяне на съдържанието на карбадокс във фуражи, премикси и ветеринарномедицински препарати. Границата на откриване е 1 mg/kg, а границата на количествено определяне е 5 mg/kg.

2.   Принцип

Пробата се уравновесява с вода и се подлага на екстракция със смес метанол-ацетонитрил. При фуражите, една аликвотна част от филтрирания екстракт се подлага на очистване в колона с диалуминиев триоксид. При премиксите и ветеринарномедицинските препарати, една аликвотна част от филтрирания екстракт се разрежда с вода, метанол и ацетонитрил до получаване на подходяща концентрация. Съдържанието на карбадокс се определя чрез високоефективна течна хроматография (HPLC) с обратна фаза, с използване на UV детектор.

3.   Реагенти

Смесват се 500 ml метанол (т. 3.1) с 500 ml ацетонитрил (т. 3.2).

Разреждат се 10 ml оцетна киселина (т. 3.3) до 100 ml с вода.

Разтварят се 0,82  g натриев ацетат (т. 3.7) в 700 ml вода (т. 3.8), като с помощта на оцетна киселина (т. 3.6) се регулира стойността на рН до 6,0 . Прехвърля се в градуирана колба от 1 000 ml, допълва се до пълния обем с вода (т. 3.8) и се разбърква.

Смесват се 825 ml ацетатен буферен разтвор (т. 3.9) с 175 ml ацетонитрил (т. 3.2).

Разтворът се филтрира през филтър с размер на порите 0,22 μm (т. 4.5) и се обезгазява (напр. чрез подлагане на въздействието на ултразвук в продължение на 10 минути).

Чист карбадокс: Метил 3-(2-квиноксалинилметилен)карбазат N1,N4-диоксид, Е 850.

Претеглят се 25 mg стандартна вещество карбадокс (т. 3.11) с точност до 0,1 mg в градуирана колба от 250 ml. Разтварят се в смес метанол-ацетонитрил (т. 3.5) с помощта на ултразвук (т. 4.7). След ултразвуковата обработка, разтворът се оставя да достигне стайна температура, допълва се по пълния обемс с метанол-ацетонитрил (т. 3.5), и се разбърква. Колбата се обвива с алуминиево фолио или се използва съд от непрозрачно стъкло, и се съхранява в хладилник. При температура ≤ 4 oС, разтворът е стабилен в продължение на 1 месец.

Прехвърлят се съответно 2,0 , 5,0 , 10,0 и 20,0 ml от основния стандартен разтвор (т. 3.11.1) в поредица от градуирани колби от 100 ml. Прибавят се 30 ml вода, допълва се метанол-ацетонитрил (т. 3.5) до пълния обем и се разбърква. Колбите се завиват в алуминиево фолио. Разтворите отговарят съответно на 2,0 ; 5,0 ; 10,0 ; и 20,0 μg/ml карбадокс.

Калибрационните разтвори трябва да бъдат приготвени непосредствено преди употреба.

Забележка

:

За определянето на карбадокс във фуражи, съдържащи по-малко от 10 mg/kg, трябва да се приготвят калибрационни разтвори с концентрация под 2,0 μg/ml.

Смесват се 300 ml вода със 700 ml смес на метанол-ацетонитрил (т. 3.5).

4.   Апаратура

Забележка

:

също така може да се използва и стъклена колона със спирателен кран или стъклена колона със заострен край; в този случай, в долния край се поставя малка тапа от стъклена вата, която се вкарва с помощта на стъклена пръчка.

5.   Процедура

Забележка

:

Карбадоксът е чувствителен към светлина. Всички процедури се извършват на приглушена светлина или се използват стъклени съдове от тъмно стъкло или такива, обвити в алуминиево фолио.

5.1.   Общи положения

5.1.1.    Фураж без добавки

За изпълнението на теста за възстановяване (т. 5.1.2) се анализира празна проба фураж без добавки, за да се провери за наличието на карбадокс и интерфериращи субстанции. Фуражът от празната проба трябва да е подобен по вид на този от изследваната проба, и в него не трябва да бъдат открити карбадокс или интерфериращи вещества.

5.1.2.    Тест за възстановяване

Провежда се тест за възстановяване, като се анализира празната проба фураж (т. 5.1.1), обогатена чрез прибавяне на известно количество карбадокс, близко до наличното в изследваната проба. За да се обогати пробата до ниво 50 mg/kg, се пресипват 5,0 ml от основния стандартен разтвор (т. 3.11.1) в конична колба от 200 ml. Разтворът се подлага на изпаряване в струя азот, докато се обемът му се намали приблизително до 0,5 ml. Прибавят се 10 g от празната проба, смесва се добре и се изчакват 10 min, преди да се продължи с етапа на екстракция (т. 5.2).

Като алтернатива, ако не е наличен фураж, подобен на този, от който е взета пробата (вж. т. 5.1.1), тестът за възстановяване може да се извърши чрез стандартия метод на добавяне. В този случай пробата, която ще се анализира, се обогатява с такова количество карбадокс, което е близко до вече съдържащото се в пробата. Тази проба се анализира заедно с необогатената проба, като степента на възстановяване се пресмята чрез изваждане.

5.2.   Екстракция

5.2.1.    Фураж

Претеглят се 10 g от изследваната проба с точност до 0,01  g и се прехвърлят в конична колба от 200 ml. Прибавят се 15,0 ml вода, разбърква се и се уравновесява в продължение на 5 min. Добавят се 35,0 ml метанол-ацетонитрил (т. 3.5), колбата се запушва и се разклаща в продължение на 30 минути в клатачна машина или се разбърква с магнитната бъркалка (т. 4.1). Разтворът се филтрира през филтър от стъклени нишки (т. 4.2). Разтворът се запазва за етапа на пречистване (т. 5.3).

5.2.2.    Премикси (0,1 до 2,0  %)

Претегля се 1 g несмляна проба с точност до 0,001 mg и се прехвърля в конична колба от 200 ml. Прибавят се 15,0 ml вода, разбърква се и се уравновесява в продължение на 5 min. Добавят се 35,0 ml метанол-ацетонитрил (т. 3.5), колбата се запушва и се разклаща в продължение на 30 минути в клатачна машина или се разбърква с магнитната бъркалка (т. 4.1). Разтворът се филтрира през филтър от стъклени нишки (т. 4.2).

Отмерва се пипета една аликвотна част от филтрата в мерителна колба от 50 ml. Прибавят се 15,0 ml вода, допълва се с метанол-ацетонитрил (т. 3.5) до пълния обем и се разбърква. Концентрацията на карбадокс в крайния разтвор трябва да бъде приблизително 10 μg/ml. Една аликвотна част от разтвора се филтрира през филтър с размер на порите 0,45 μm (т. 4.6).

Пристъпва се към определяне чрез HPLC (т. 5.4).

5.2.3.    Ветеринарномедицински препарати (> 2 %)

Претеглят се 0,2  g несмляна проба с точност до 0,001 mg и се прехвърлят в конична колба от 250 ml. Прибавят се 45,0 ml вода, разбърква се и се уравновесява за 5 min. Добавят се 105,0 ml метанол-ацетонитрил (т. 3.5), колбата се запушва и съдържанието и се хомогенизира. Пробата се поставя в ултразвукова вана (т. 4.7) за 15 минути, след което се разклаща или разбърква в продължение на 15 минути (т. 4.1). Разтворът се филтрира през филтър от стъклени нишки (т. 4.2).

Една аликвотна част от филтрата се разрежда със сместа от вода, метанол и ацетонитрил (т. 3.12) до получаване на крайна концентрация на карбадокс от 10—15 μg/ml (за препарат с концентрация 10 %, факторът на разреждане е 10). Една аликвотна част се филтрира през филтър с размер на порите 0,45 μm (т. 4.6).

Пристъпва се към определяне чрез HPLC (т. 5.4).

5.3.   Пречистване

5.3.1.    Подготовка на колоната с диалуминиев триоксид

Претеглят се 4 g диалуминев триоксид (т. 3.4) и се прехвърлят в стъклената колона (т. 4.3).

5.3.2.    Пречистване на пробата

Прилагат се 15 ml от филтрирания екстракт (т. 5.2.1) към колоната с диалуминиевия оксид и първите 2 ml от елуат се отстраняват. Следващите 5 ml се събират и една аликтвотна част се филтрира през филтър с размер на порите 0,45 μm (т. 4.6).

Пристъпва се към определяне чрез HPLC (т. 5.4).

5.4.   Определяне с помощта на HPLC

5.4.1.    Параметри

Дават се следните указания за параметрите, могат да се използват и други параметри, при условие че с тях се получават еквивалентни резултати:

Проверява се стабилността на хроматографичната система, като на няколко пъти се впръсква калибрационният разтвор (т. 3.11.2), съдържащ 5,0 μg/ml, докато се постигнат постоянни височини на пика и постоянни времена на задържане.

5.4.2.    Калибрационна крива

Всеки калибрационен разтвор (3.11.2) се впръсква няколко пъти и се определят средните височини на пиковете (площите) за всяка концентрация. Построява се калибрационна крива, като се използват средните пикови височини или площи на калибрационните разтвори за ординати, а съответните им концентрации в μg/ml за абсциси.

5.4.3.    Разтвор на пробата

Екстрактът от пробата [(т. 5.3.2) за фуражи, (т. 5.2.2) за премикси и (т. 5.2.3) за ветеринарномедицинските препарати] се впръсква няколко пъти, и се определя средната пикова височина (площ) на пиковете на карбадокс.

6.   Изчисляване на резултатите

Концентрацията на карбадокс в разтвора на пробата в μg/ml се определя от средната височина (площ) на пиковете на карбадокс на разтвора на пробата, като се сравнява с калибрационната крива (т. 5.4.2).

6.1.   Фураж

Съдържанието w (mg/kg) на карбадокс в пробата се пресмята по следната формула:

[mg/kg]

където:

c

=

концентрация на карбадокс в екстракта на пробата (т. 5.3.2) в μg/ml

V1

=

обем на екстракта в ml (т.е. 50)

m

=

тегло в g на частта от пробата за анализ.

6.2.   Премикси и препарати

Съдържанието w (mg/kg) на карбадокс (mg/kg) в пробата се пресмята по следната формула:

[mg/kg]

където:

c

=

концентрация на карбадокс в екстракта на пробата (т. 5.2.2 или 5.2.3) в μg/ml

V2

=

обем на екстракта в ml (т.е. 50 за премикси; 150 за препарати)

f

=

фактор на разреждане съгласно т. 5.2.2 (премикси) или 5.2.3 (препарати)

m

=

тегло в g на частта от пробата за анализ.

7.   Потвърждаване на резултатите

7.1.   Идентичност

Идентичността на аналита може да се потвърди с помощта на кохроматография или като се използва детектор с диодна матрица, с които се сравняват спектрите на екстракта на пробата и на калибрационния разтвор (т. 3.11.2), съдържащ 10,0 μg/ml.

7.1.1.    Кохроматография

Обогатява се екстракт от пробата, като се прибави подходящо количество калибрационен разтвор (3.11.2). Количеството добавен карбадокс трябва да бъде близко до това, което се очаква да бъде открито в екстракта на пробата.

Увеличава се само височината на пика на карбадокс след като се вземат под внимание както добавеното количество, така и степента на разреждане на екстракта. Широчината на пика на половината от неговата максимална височина трябва да бъде в рамките на около 10 % от първоначалната широчина.

7.1.2.    Детектиране с диодна матрица

Резултатите се оценяват според следните критерии:

Ако някой от критериите не е изпълнен, наличието на аналита не се потвърждава.

7.2.   Повторяемост

При съдържание 10 mg/kg и по-високо, разликата между резултатите от две паралелни определяния, извършени върху същата проба, не трябва да превишава 15 % спрямо по-високия резултат.

7.3.   Възстановяване

При обогатена (празна) проба, възстановяването трябва да бъде най-малко 90 %.

8.   Резултати от съвместно изследване

Проведено беше съвместно изследване, при което бяха анализирани 6 фуража, 4 премикса и 3 препарата в 8 лаборатории. За всяка проба са проведени по два анализа. (По-подробна информация за това съвместно изследване може да се открие в Journal of AOAC International, том 71, 1988 г., стр. 484—490). Резултатите (с изключение на рязко отличаващите се стойности) са представени по-долу:

L

=

брой на лабораториите

n

=

брой на единичните стойности

Sr

=

стандартно отклонение на повторяемостта

CVr

=

коефициент на вариация на повторяемостта

SR

=

стандартно отклонение на възпроизводимостта

CVR

=

коефициент на вариация на възпроизводимостта

---

ПРИЛОЖЕНИЕ IX

ТАБЛИЦИ НА СЪОТВЕТСТВИЕТО, ПОСОЧЕНИ В ЧЛЕН 6

1.   Директива 71/250/ЕИО

2.   Директива 71/393/ЕИО

3.   Директива 72/199/ЕИО

4.   Директива 73/46/ЕИО

5.   Директива 76/371/ЕИО

6.   Директива 76/372/ЕИО

7.   Директива 78/633/ЕИО

8.   Директива 81/715/ЕИО

9.   Директива 84/425/ЕИО

10.   Директива 86/174/ЕИО

11.   Директива 93/70/ЕИО

12.   Директива 93/117/ЕО

13.   Директива 98/64/ЕО

14.   Директива 1999/27/ЕО

15.   Директива 1999/76/ЕО

16.   Директива 2000/45/ЕО

17.   Директива 2002/70/ЕО

18.   Директива 2003/126/ЕО

---

( 1 ) ОВ L 268, 18.10.2003 г., стр. 29.

( 2 ) ОВ L 140, 30.5.2002 г., стр. 10.

( 3 ) ОВ L 70, 16.3.2005 г., стр. 1.

( 4 ) Ако има бучки, те се смачкват (ако е необходимо, те се отделят от общата маса, а след това се връщат в пробата).

( 5 ) Освен в случай на груби и тревни фуражи с ниска относителна плътност.

( 6 ) Освен в случай на груби и тревни фураж с ниска относителна плътност.

( 7 ) ОВ L 229, 1.9.2009 г., стр. 1.

( 7 ) За изсушаването на зърнени култури, брашно, булгур и едросмляно брашно, фурната трябва да има такъв топлинен капацитет, че при предварително загряване до 131 oC, да достигне отново тази температура за по-малко от 45 минути след като в нея е било сложено максималното количество проби за едновременно сушене. Вентилацията трябва да е такава, че когато толкова проби от обикновено жито, колкото може да събере, се сушат в продължение на два часа, резултатите се различават от онези, които се получават след четиричасово сушене, с по-малко от 0,15  %.

( 7 ) Когато маслото или мазнината трябва след това да бъдат подложени на изпитания за качество, вместо парченца пемза се използват стъклени топчета.

( 7 ) ОВ L 125, 23.5.1996 г., стр. 35.

( 7 ) Проведено от Работната група по фуража на Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs- und Forschungsanstalten (VDLUFA)

( 7 ) Проведено от Работната група по фуража на Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs- und Forschungsanstalten (VDLUFA).

( 7 ) Могат да се използват и други методи за изваряване, при условие, че е доказано, че те дават сходни резултати (напр. изваряване под налягане с микровълни).

( 7 ) Зелените фуражи (пресни или изсушени) е възможно да съдържат значително количество силициев диоксид от растителен произход, който може да задържи микроелементите, и който трябва да да бъде отстранен. Поради това, за проби от тези фуражи трябва да се следват следните изменени процедури. Операция 5.1.1.1. се провежда едновременно с филтрирането. Филтърната хартия с неразтворимия остатък се измива два пъти с вряла вода и се поставя в кварцов или платинен тигел. В муфелната пещ (т. 4.1) филтърната хартия се изгаря при температура под 550 oC, докато всички саждени частици изчезнат напълно. Оставя се да изстине, добавят се няколко капки вода и 10—15 ml флуороводородна киселина (т. 3.4) и се подлага на изпаряване до сухо при около 150 oC. Ако има остатъци от силициев диоксид в остатъка, те се разтварят повторно в няколко милилитра флуороводородна киселина (3.4) и се подлагат на изпаряване до сухо. Добавят се няколко капки сярна киселина (т. 3.5) и се нагрява, докато престане да се образува бял дим. След като се добавят около 5 ml солна киселина с концентрация 6 mol/l (т. 3.2) и около 30 ml вода, разтворът се нагрява, филтрира се в мерителна колба от 250 ml и се допълва до пълния обем с вода (концентрация на HCl около 0,5 mol/l). След това се пристъпва към определянето в съответствие с точка 5.1.2.

( 7 ) The Analyst 108, 1983 г., стр. 1 252—1 256.

( *1 ) Analyst, 1995, 120, 2175—2180.

( 8 ) Таблица за TEF (= фактори за токсична еквивалентност) на диоксините, фураните и диоксиниподобните PCB:

TEF на СЗО за оценка на риска за хора, изготвени въз основа на заключенията на работния семинар на експертите в рамките на Международната програма за химическа безопасност (МПХБ) — на Световната здравна организация (СЗО), проведен в Женева през юни 2005 г. (Martin van den Berg et al., The 2005 World Health Organization Re-evaluation of Human and Mammalian Toxic Equivalency Factors for Dioxins and Dioxin-like Compounds. Toxicological Sciences 93(2), 223–241 (2006)).

Използвани съкращения: „T“ = тетра; „Pe“ = пента; „Hx“ = хекса; „Hp“ = хепта; „О“ = окта; „CDD“ = хлородибензодиоксин; „CDF“ = хлородибензофуран; „CB“ = хлоробифенил.

( 9 ) Решение 2002/657/ЕО на Комисията от 14 август 2002 г. за прилагане на Директива 96/23/ЕО на Съвета по отношение изпълнението на аналитични методи и тълкуването на резултати (ОВ L 221, 17.8.2002 г., стр. 8).

( 10 ) Принципът „горна граница“ изисква използването на границата за количествено определяне за изчисляване на участието на всеки конгенер, който не е количествено определен. Принципът „долна граничен“ изисква използването на стойност нула за изчисляване на участието на всеки конгенер, който не е количествено определен. Принципът „средна граница“ изисква използване на половината от границата за количествено определяне за изчисляване на участието на всеки конгенер, който не е количествено определен.

( 11 ) В общия случай се прилагат изискванията за повторен анализ, предвидени в приложение II, глава В, точка 3. За методите за потвърждение при използване на маркиран с 13C вътрешен стандарт за съответните аналити обаче повторният анализ е необходим само ако резултатът от първото определяне чрез прилагане на такива методи за потвърждение сочи несъответствие. Повторният анализ е необходим, за да се изключи възможността от вътрешно кръстосано замърсяване или от случайно смесване на пробите. В случай че анализът се провежда в контекста на инцидент, при който е налице замърсяване, потвърждението чрез повторен анализ може да не се извършва, ако избраните за анализ проби могат да бъдат проследени и свързани с инцидента, при който е получено замърсяването, и откритото количество е значително над максимално допустимото количество.

( 12 ) Принципът „горна граница“ изисква използването на границата за количествено определяне за изчисляване на участието на всеки конгенер, който не е количествено определен, към токсичния еквивалент (TEQ). Принципът „долна граничен“ изисква използването на стойност нула за изчисляване на участието на всеки конгенер, който не е количествено определен, към TEQ. Принципът „средна граница“ изисква използване на половината от границата за количествено определяне за изчисляване на участието на всеки конгенер, който не е количествено определен, към TEQ.

( 13 ) В общия случай се прилагат изискванията за повторен анализ, предвидени в приложение II, глава В, точка 3. За методите за потвърждение при използване на маркиран с 13C вътрешен стандарт за съответните аналити обаче повторният анализ е необходим само ако резултатът от първото определяне чрез прилагане на такива методи за потвърждение сочи несъответствие. Повторният анализ е необходим, за да се изключи възможността от вътрешно кръстосано замърсяване или от случайно смесване на пробите. В случай че анализът се провежда в контекста на инцидент, при който е налице замърсяване, потвърждението чрез повторен анализ може да не се извършва, ако избраните за анализ проби могат да бъдат проследени и свързани с инцидента, при който е получено замърсяването, и откритото количество е значително над максимално допустимото количество.

( 14 ) Обясненията и изискванията за повторен анализ за контрол на праговете са същите като тези в бележка под линия (20)  относно максимално допустимите количества.

( 15 ) Биоаналитичните методи не са характерни за конгенерите, които са включени в схемата за TEF. В екстракта от пробата е възможно наличието на други структурно свързани съединения с активен AhR, които допринасят за общата реакция. Следователно биоаналитичните резултати не могат да се разглеждат като оценка, а по-скоро като показател за стойността на ТЕQ в пробата.

( 16 ) Настоящите изисквания се базират на TEF, публикувани в: M. Van den Berg et al, Toxicol Sci 93 (2), 223–241 (2006).

( 17 ) Препоръчително е делът на нивото на реагента при празна проба в нивото на замърсителя в дадена проба да бъде по-нисък. Лабораторията е отговорна за контрола на вариацията в нивата при празни проби, и по-специално ако нивата при празна проба се приспадат.

( 18 ) http://eurl.craw.eu/

( 19 ) Списъкът с тези праймери и сонди за всеки от животинските видове, предмет на анализ, е на разположение на интернет страницата на EURL-AP.

( 20 ) Примери за използвани реактивни смеси са публикувани на интернет страницата на EURL-AP.