1991R2568 — BG — 04.08.2016 — 029.001

---

Този текст служи само за информационни цели и няма правно действие. Институциите на Съюза не носят отговорност за неговото съдържание. Автентичните версии на съответните актове, включително техните преамбюли, са версиите, публикувани в Официален вестник на Европейския съюз и налични в EUR-Lex. Тези официални текстове са пряко достъпни чрез връзките, публикувани в настоящия документ

►B	РЕГЛАМЕНТ (ЕИО) № 2568/91 НА КОМИСИЯТА от 11 юли 1991 година относно характеристиките на маслиновото масло и маслиновото масло от остатъчен материал и съответните методи за анализ (ОВ L 248, 5.9.1991 г., стp. 1)

Изменен с

		Официален вестник
		№	страница	дата
►M1	РЕГЛАМЕНТ (ЕИО) № 3682/91 НА КОМИСИЯТА от 17 декември 1991 година	L 349	36	18.12.1991
M2	РЕГЛАМЕНТ (ЕИО) № 1429/92 НА КОМИСИЯТА от 26 май 1992 година	L 150	17	2.6.1992
M3	COMMISSION REGULATION (EEC) No 1683/92 of 29 June 1992 (*)	L 176	27	30.6.1992
M4	COMMISSION REGULATION (EEC) No 1996/92 of 15 July 1992 (*)	L 199	18	18.7.1992
►M5	РЕГЛАМЕНТ (ЕИО) № 3288/92 НА КОМИСИЯТА от 12 ноември 1992 година	L 327	28	13.11.1992
M6	РЕГЛАМЕНТ (ЕИО) № 183/93 НА КОМИСИЯТА от 29 януари 1993 година	L 22	58	30.1.1993
M7	Изменен с РЕГЛАМЕНТ (ЕИО) № 826/93 НА КОМИСИЯТА от 6 април 1993 година	L 87	6	7.4.1993
M8	COMMISSION REGULATION (EEC) No 620/93 of 17 March 1993 (*)	L 66	29	18.3.1993
M9	РЕГЛАМЕНТ (ЕО) № 177/94 НА КОМИСИЯТА от 28 януари 1994 година	L 24	33	29.1.1994
M10	COMMISSION REGULATION (EC) No 2632/94 of 28 October 1994 (*)	L 280	43	29.10.1994
►M11	РЕГЛАМЕНТ (ЕО) № 656/95 НА КОМИСИЯТА от 28 март 1995 година	L 69	1	29.3.1995
M12	COMMISSION REGULATION (EC) No 2527/95 of 27 October 1995 (*)	L 258	49	28.10.1995
M13	COMMISSION REGULATION (EC) No 2472/97 of 11 December 1997 (*)	L 341	25	12.12.1997
M14	РЕГЛАМЕНТ (ЕО) № 282/98 НА КОМИСИЯТА от 3 февруари 1998 година	L 28	5	4.2.1998
M15	COMMISSION REGULATION (EC) No 2248/98 of 19 October 1998 (*)	L 282	55	20.10.1998
M16	РЕГЛАМЕНТ (ЕО) № 379/1999 НА КОМИСИЯТА от 19 февруари 1999 година	L 46	15	20.2.1999
M17	COMMISSION REGULATION (EC) No 455/2001 of 6 March 2001 (*)	L 65	9	7.3.2001
M18	COMMISSION REGULATION (EC) No 2042/2001 of 18 October 2001 (*)	L 276	8	19.10.2001
►M19	COMMISSION REGULATION (EC) No 796/2002 of 6 May 2002 (*)	L 128	8	15.5.2002
►M20	РЕГЛАМЕНТ (ЕО) № 1989/2003 НА КОМИСИЯТА от 6 ноември 2003 година	L 295	57	13.11.2003
►M21	РЕГЛАМЕНТ (ЕО) № 702/2007 НА КОМИСИЯТА от 21 юни 2007 година	L 161	11	22.6.2007
M22	РЕГЛАМЕНТ (ЕО) № 640/2008 НА КОМИСИЯТА от 4 юли 2008 година	L 178	11	5.7.2008
►M23	РЕГЛАМЕНТ (ЕС) № 61/2011 НА КОМИСИЯТА от 24 януари 2011 година	L 23	1	27.1.2011
M24	РЕГЛАМЕНТ ЗА ИЗПЪЛНЕНИЕ (ЕС) № 661/2012 НА КОМИСИЯТА от 19 юли 2012 година	L 192	3	20.7.2012
►M25	РЕГЛАМЕНТ ЗА ИЗПЪЛНЕНИЕ (ЕС) № 299/2013 НА КОМИСИЯТА от 26 март 2013 година	L 90	52	28.3.2013
►M26	РЕГЛАМЕНТ ЗА ИЗПЪЛНЕНИЕ (ЕС) № 1348/2013 НА КОМИСИЯТА от 16 декември 2013 година	L 338	31	17.12.2013
►M27	ДЕЛЕГИРАН РЕГЛАМЕНТ (ЕС) 2015/1830 НА КОМИСИЯТА от 8 юли 2015 година	L 266	9	13.10.2015
►M28	РЕГЛАМЕНТ ЗА ИЗПЪЛНЕНИЕ (ЕС) 2015/1833 НА КОМИСИЯТА от 12 октомври 2015 година	L 266	29	13.10.2015
►M29	РЕГЛАМЕНТ ЗА ИЗПЪЛНЕНИЕ (ЕС) 2016/1227 НА КОМИСИЯТА от 27 юли 2016 година	L 202	7	28.7.2016

поправен от

C1	Поправка, ОВ L 078, 24.3.2011, стp.  69 (61/2011)

(*)	Настоящият акт никога не е публикуван на български език.

---

▼B

РЕГЛАМЕНТ (ЕИО) № 2568/91 НА КОМИСИЯТА

от 11 юли 1991 година

относно характеристиките на маслиновото масло и маслиновото масло от остатъчен материал и съответните методи за анализ

▼M20

Член 1

1.  Масло, чиито характеристики отговарят на посочените в точки 1 и 2 от приложение I към настоящия регламент, се считат за необработено маслиново масло virgin по смисъла на точка 1, а) и б) от приложението към Регламент № 136/66/ЕИО.

2.  Масло, чиито характеристики отговарят на посочените в точка 3 от приложение I към настоящия регламент се счита за маслиново масло за осветление по смисъла на точка 1, в) от приложението към Регламент № 136/66/ЕИО.

3.  Масло, чиито характеристики отговарят на посочените в точка 4 от приложение I към настоящия регламент се счита за рафинирано маслиново масло по смисъла на точка 2 от приложението към Регламент № 136/66/ЕИО.

4.  Масло, чиито характеристики отговарят на посочените в точка 5 от приложение I към настоящия регламент се счита за маслиново масло съставено от рафинирани маслинови масла и необработени маслинови масла virgin по смисъла на точка 3 от приложението към Регламент № 136/66/ЕИО.

5.  Масло, чиито характеристики отговарят на посочените в точка 6 от приложение I към настоящия регламент се счита за сурово маслиново масло от остатъчен материал по смисъла на точка 4 от приложението към Регламент № 136/66/ЕИО.

6.  Масло, чиито характеристики отговарят на посочените в точка 7 от приложение I към настоящия регламент се счита за рафинирано маслиново масло от остатъчен материал по смисъла на точка 5 от приложението към Регламент № 136/66/ЕИО.

7.  Масло, чиито характеристики отговарят на посочените в точка 8 от приложение I към настоящия регламент се счита за маслиново масло от остатъчен материал по смисъла на точка 6 от приложението към Регламент № 136/66/ЕИО.

▼M26

Член 2

1.  Характеристиките на маслата, установени в приложение I, се определят в съответствие със следните методи за анализ:

▼M28

▼M26

▼M28

▼M26

▼M28 —————

▼M26

2.  Проверката на органолептичните характеристики на необработените масла от страна на националните органи или техни представители се извършва посредством групи от дегустатори, одобрени от държавите членки.

Ако такава група потвърди класифицирането на дадено масло, органолептичните характеристики на маслото, посочени в първа алинея, се приемат за отговарящи на категорията.

Ако групата не потвърди декларираната категория по отношение на органолептичните характеристики, при поискване от заинтересованата страна националните органи или техни представители своевременно организират две насрещни оценки, които се извършват от други одобрени групи дегустатори, като поне една от тези оценки се извършва от одобрена от засегнатата държава членка производител група дегустатори. Ако декларираната категория бъде потвърдена при най-малко две от насрещните оценки, съответните характеристики се приемат за отговарящи на декларираните. При липса на такова потвърждение разходите за насрещните оценки се поемат от заинтересованата страна.

3.  Когато националните органи или техни представители извършват проверка на характеристиките на маслото съгласно посоченото в параграф 1, вземането на проби се извършва в съответствие с международните стандарти EN ISO 661 относно подготовката на пробата за изпитване и EN ISO 5555 относно вземането на проби. Независимо от разпоредбите на точка 6.8 от стандарт EN ISO 5555 обаче в случай на партиди от такива масла в директни опаковки пробите се вземат съгласно приложение Ia към настоящия регламент. При наличието на наливни масла, при които вземането на проби не може да се извърши в съответствие със стандарт EN ISO 5555, пробите се вземат в съответствие с инструкциите, предоставени от компетентния орган на държавата членка.

Без да се засягат разпоредбите на стандарт EN ISO 5555 и глава 6 от стандарт EN ISO 661, взетите проби се пренасят възможно най-бързо на тъмно и хладно място и се изпращат за лабораторен анализ не по-късно от петия работен ден след вземането им; в противен случай пробите се съхраняват така, че да се избегне тяхното повреждане или влошаването на състоянието им по време на транспортирането или съхранението, преди да бъдат изпратени в лабораторията.

4.  За целите на предвидената в параграф 3 проверка анализите, посочени в приложения II, III, IX, XII и XX, и — когато е приложимо — всички необходими насрещни анализи, изисквани съгласно националното законодателство, се провеждат преди изтичането на срока на минималната трайност, ако тази проверка засяга пакетирани продукти. При вземане на проби от наливни масла анализите се извършват не по-късно от шестия месец след месеца, през който са били взети пробите.

По отношение на другите анализи, предвидени в настоящия регламент, срок не е предвиден.

Освен в случаите, когато пробата е била взета по-малко от два месеца преди изтичането на срока на минималната трайност, ако резултатите от анализите не отговарят на характеристиките на декларираната категория маслиново масло или маслиново масло от остатъчен материал, засегнатата страна бива уведомена не по-късно от един месец преди изтичането на срока, посочен в първа алинея.

5.  С оглед определянето на характеристиките на маслиновото масло по методите, предвидени в параграф 1, първа алинея, резултатите от анализа се подлагат на пряко сравнение с пределните стойности, посочени в настоящия регламент.

▼M25

Член 2а

1.  За целите на настоящия член „търгувано маслиново масло“ означава общото количество маслиново масло и масло от маслинено кюспе на дадена държава членка, което се консумира в тази държава членка или се изнася от същата държава членка.

2.  Държавите членки гарантират, че проверките за съответствие се извършват селективно, въз основа на анализ на риска и с подходяща честота, така че да се гарантира, че търгуваното маслиново масло съответства на декларираната категория.

3.  Критериите за оценка на риска могат да включват:

4.  Държавите членки определят предварително:

Годишно се провежда най-малко една проверка за съответствие на всеки хиляда тона маслиново масло, търгувано в държавата членка.

5.  Държавите членки проверят съответствието като:

▼M19 —————

▼M25

Член 3

Когато се установи, че дадено масло не отговаря на описанието за категорията си, съответната държава членка налага, без да се засягат другите санкции, ефективни, пропорционални и възпиращи санкции, които се определят в зависимост от сериозността на установената нередност.

Когато при проверките се откриват значителни нередности, държавите членки увеличават честотата на проверките по отношение на етапа на предлагане на пазара, категорията на маслата, произхода или други критерии.

▼M5

Член 4

▼M19

1.  The Member States may approve assessment panels so that national authorities or their representatives can assess and verify organoleptic characteristics.

The terms of approval shall be set by Member States and ensure that:

Member States shall notify to the Commission a list of approved panels and the action taken under this paragraph.

▼M5

2.  Когато държавите-членки изпитват затруднения при създаването на групи от дегустатори на тяхната територия, те могат да се обърнат към група от дегустатори, одобрени в друга държава-членка.

3.  Всяка държава-членка съставя списък на групите от дегустатори, създадени от професионални или междубраншови организации в съответствие с условията, установени в параграф 1 и гарантира, че тези условия се спазват.

▼M19 —————

▼B

Член 6

1.  Масленото съдържание на кюспето и другите остатъчни материали от добиването на маслиново масло (кодове по КН 2306 90 11 и 2306 90 19 ) се определя чрез използване на метода, изложен в приложение XV.

2.  Масленото съдържание, посочено в параграф 1, се изразява като процентно съотношение от теглото на маслото към теглото на сухото вещество.

▼M20

Член 7

Разпоредбите на Общността, отнасящи се до наличието на примеси се прилагат:

По отношение на халогенираните разтворители, ограниченията за всички категории маслиново масло са, както следва:

▼M25

Член 7а

Физическите или юридическите лица и групите от такива лица, които държат маслиново масло и масло от маслинено кюспе за каквито и да било професионални или търговски цели, от етапа на екстракция във фабриката за производство на маслиново масло до етапа на бутилиране включително, са длъжни да водят входящи и изходящи регистри за всяка категория от тези масла.

Държавата членка гарантира, че задължението, установено в първа алинея, надлежно се изпълнява.

▼M25

Член 8

1.  Държавите членки уведомяват Комисията за мерките за прилагане на настоящия регламент. Те уведомяват Комисията за всички последващи изменения.

2.  Най-късно до 31 май всяка година държавите членки предават на Комисията доклад относно прилагането на настоящия регламент през предходната календарна година. Докладът съдържа най-малко резултатите от проверките за съответствие, извършени по отношение на маслиновите масла съгласно образците, съдържащи се в приложение XXI.

3.  Уведомленията, посочени в настоящия регламент, се извършват в съответствие с Регламент (ЕО) № 792/2009 на Комисията ( 1 ).

▼B

Член 9

Регламент (ЕИО) № 1058/77 се отменя.

Член 10

1.  Настоящият регламент влиза в сила на третия ден след публикуването му в Официален вестник на Европейските общности.

Въпреки това методът, описан в приложение XII, се прилага от ►M1  1 ноември 1992 г. ◄ , освен за действия, свързани с режима на интервенция.

▼M5

Този метод не се прилага за необработено маслиново масло, подготвено за предлагане на пазара преди 1 ноември 1992 г.

▼B

2.  Настоящият регламент не се прилага спрямо маслиновото масло и маслиновото масло от остатъчен материал, опаковани преди неговото влизане в сила и пуснати на пазара до 31 октомври 1992.

Настоящият регламент е задължителен в своята цялост и се прилага пряко във всички държави-членки.

---

ПРИЛОЖЕНИЯ

Съдържание

Приложение I:	Характеристики на категориите маслиново масло
Приложение Iа:	Вземане на проби от маслиново масло или маслиново масло от остатъчен материал, доставяни в директни опаковки
Приложение Iб:	Схема на решенията за проверка на съвместимостта на пробата от маслиново масло с декларираната категория
Приложение II:	Определяне на свободните мастни киселини, студен метод
Приложение III:	Определяне на перокисното число
Приложение IV:	Определяне на съдържанието на парафини чрез капилярна газова хроматография
Приложение V:	Определяне на компонентния състав и съдържанието на стероли и на тритерпенови диалкохоли чрез капилярна газова хроматография
Приложение VII:	►M21  Определяне на процентното съдържание на 2-глицерил монопалмитат ◄
▼M20 —————
▼B
Приложение IX:	Спектрофотометрично изследване в ултравиолетовия спектър
▼M28
Приложение Х:	Определяне на метилови естери на мастни киселини чрез газова хроматография
▼B
Приложение XI:	Определяне на халоген-съдържащите разтворители на маслиновото масло
Приложение XII:	Метод за органолептична оценка на необработено маслиново масло на международния съвет за маслиновите продукти (ioc)
▼M20 —————
▼M19 —————
▼B
Приложение XV:	Маслено съдържание на остатъчния материал
Приложение XVI:	Определяне стойността на йодното число
Приложение ХVII:	Метод за определяне на стигмастадиени в растителни масла
Приложение XVIII:	Определяне на разликата между действителното и теоретичното съдържание на триацилглицерини с ecn 42
Annex XIX:	►M28  Определяне на съдържанието на алифатни и тритерпенови алкохоли чрез капилярна газова хроматография ◄
▼M23
Приложение ХХ:	Метод за установяване на съдържанието на восъци, етилови естери на мастни киселини и метилови естери на мастни киселини посредством капилярна газова хроматография
▼M28 —————
▼M25
Приложение ХХI:	Резултати от проверките за съответствие, извършени по отношение на маслиновите масла, посочени в член 8, параграф 2

▼M27

---

ПРИЛОЖЕНИЕ I

ХАРАКТЕРИСТИКИ НА КАТЕГОРИИТЕ МАСЛИНОВО МАСЛО

Забележки:

---

Допълнение

СХЕМА НА РЕШЕНИЯТА

Схема на решенията по отношение на кампестерола за необработено маслиново масло „Virgin“ и необработено маслиново масло „Extra virgin“:

Другите параметри трябва да са в границите, определени в настоящия регламент.

Схема на решенията по отношение на делта-7-стигмастенола за:

Другите параметри трябва да са в границите, определени в настоящия регламент.

▼M26

---

ПРИЛОЖЕНИЕ Iа

ВЗЕМАНЕ НА ПРОБИ ОТ МАСЛИНОВО МАСЛО ИЛИ МАСЛИНОВО МАСЛО ОТ ОСТАТЪЧЕН МАТЕРИАЛ, ДОСТАВЯНИ В ДИРЕКТНИ ОПАКОВКИ

Методът за вземане на проби се прилага за партиди маслиново масло или маслиново масло от остатъчен материал в директни опаковки. В зависимост от това, дали директната опаковка надвишава 5 литра или не, се прилагат различни методи за вземане на проби.

„Партида“ означава набор продажни единици, които са произведени, изработени и опаковани в условия, позволяващи маслото, съдържащо се във всяка продажна единица, да бъде считано за хомогенно по отношение на всички аналитични характеристики. Идентифицирането на дадена партида трябва да се извършва в съответствие с Директива 2011/91/ЕС на Европейския парламент и на Съвета ( 2 ).

„Единична проба“ означава количеството масло, съдържащо се в директна опаковка и взето произволно от партидата.

1.   СЪДЪРЖАНИЕ НА ПЪРВИЧНАТА ПРОБА

1.1.    Директна опаковка, която не надвишава 5 литра

„Първична проба“ за директна опаковка, която не надвишава 5 литра, означава броят на единичните проби, взети от дадена партида и отговарящи на изискванията по таблица 1.

В зависимост от потребностите си (например органолептична оценка, извършена от лаборатория, различна от тази, която е провела химичните анализи, насрещен анализ и др.) всяка държава членка може да увеличи посочения в таблица 1 брой опаковки, който представлява първична проба.

1.2.    Директна опаковка, която надвишава 5 литра

„Първична проба“ за директна опаковка, която надвишава 5 литра, означава представителна част от общия брой единични проби, взети от дадена партида и отговарящи на изискванията по таблица 2. Първичната проба трябва да се състои от различни извадки.

„Извадка“ от първична проба означава всяка една от опаковките, съставляващи първичната проба.

С цел да се намали обемът на директните опаковки, използвани при пробите, съдържанието на единичните проби се хомогенизира за приготвяне на първичната проба. Различните единични проби се изсипват в общ контейнер за хомогенизиране чрез разбъркване, така че да се осигури възможно най-добра защита от въздуха.

Съдържанието на първичната проба трябва да се излее в поредица от опаковки с минимален капацитет 1,0 литър, всяка от които представлява извадка от първичната проба.

В зависимост от потребностите си (например органолептична оценка, извършена от лаборатория, различна от тази, която е провела химичните анализи, насрещен анализ и др.) всяка държава членка може да увеличи броя първични проби.

Всяка опаковка трябва да се напълни така, че горният въздушен слой да бъде ограничен до минимум, след което да се затвори и запечата по подходящ начин, гарантиращ, че продуктът е защитен от външна намеса.

Извадките трябва да бъдат етикетирани, за да се гарантира правилното им идентифициране.

2.   АНАЛИЗИ И РЕЗУЛТАТИ

3.   ПРОВЕРКА НА КАТЕГОРИЯТА НА ПАРТИДАТА

---

ПРИЛОЖЕНИЕ Iб

СХЕМА НА РЕШЕНИЯТА ЗА ПРОВЕРКА НА СЪВМЕСТИМОСТТА НА ПРОБАТА ОТ МАСЛИНОВО МАСЛО С ДЕКЛАРИРАНАТА КАТЕГОРИЯ

Таблица 1

Таблица 2

Таблица 3

---

Допълнение 1

▼M29

---

ПРИЛОЖЕНИЕ II

ОПРЕДЕЛЯНЕ НА СВОБОДНИТЕ МАСТНИ КИСЕЛИНИ, СТУДЕН МЕТОД

1.   ОБХВАТ И ПРИЛОЖНО ПОЛЕ

Този метод описва определянето на свободните мастни киселини в маслиновите масла и маслиновите масла от остатъчен материал. Съдържанието на свободни мастни киселини се изразява като киселинност, изчислена като процент олеинова киселина.

2.   ПРИНЦИП

Проба се разтваря в смес от разтворители и наличните свободни мастни киселини се титруват, като се използва разтвор на калиев хидроксид или на натриев хидроксид.

3.   РЕАКТИВИ

Всички реактиви трябва да са с квалификация „чист за анализ“, а водата, която се използва, трябва да е или дестилирана, или с еквивалентна чистота.

3.1

Диетилов етер; 95 % етанол (v/v), смес от равни обемни части. Неутрализира се точно в момента на употреба с разтвора на калиев хидроксид (3.2), с добавяне на 0,3 ml от разтвора на фенолфталеин (3.3) на 100 ml от сместа. Забележка 1:  диетиловият етер е лесно запалим и може да образува експлозивни пероксиди. Трябва да се работи със специално внимание при употребата му. Забележка 2:  ако не е възможно да се използва диетилов етер, може да се използва смес от разтворители, съдържаща етанол и толуен. Ако е необходимо, етанолът може да се замести с пропан-2-ол.

3.2

Калиев хидроксид или натриев хидроксид, титруван етанолов или воден разтвор, c(KOH) [или c(NaOH)] около 0,1 mol/l или, ако е необходимо, c(KOH) [или c(NaOH)] около 0,5 mol/l. Разтвори могат да се доставят от търговската мрежа. Точната концентрация на разтвора на калиев хидроксид (или на разтвора на натриев хидроксид) трябва да е известна и да се провери преди употреба. Използва се разтвор, приготвен поне пет дни преди употреба и декантиран в бутилка от кафяво стъкло с гумена запушалка. Разтворът трябва да е безцветен или със сламен цвят. Ако при използването на воден разтвор на калиев хидроксид (или на натриев хидроксид) се наблюдава разделяне на фази, водният разтвор се заменя с етанолов разтвор. Забележка 3:  стабилизиран безцветен разтвор на калиев хидроксид (или на натриев хидроксид) може да се приготви по следния начин. Довеждат се до кипене 1 000 ml етанол или вода с 8 g калиев хидроксид (или натриев хидроксид) и 0,5 g алуминиеви стружки и кипенето се поддържа с обратен хладник в продължение на един час. Дестилира се незабавно. Изискваното количество калиев хидроксид (или натриев хидроксид) се разтваря в дестилата. Оставя се за няколко дни и бистрата супернатантна течност се декантира от утайката от калиев карбонат (или натриев карбонат). Разтворът може също така да се приготви и без дестилация по следния начин: към 1 000 ml етанол (или вода) се добавят 4 ml алуминиев бутилат и сместа се оставя за няколко дни. Декантира се супернатантната течност и се разтваря нужното количество калиев хидроксид (или натриев хидроксид). Разтворът е готов за употреба.

3.3	Фенолфталеин, разтвор от 10 g/l в 95 до 96 % етанол (v/v) или алкалиблау 6B, или тимолфталеин, разтвор от 20 g/l в 95 до 96 % етанол (v/v). В случай на силно оцветени масла следва да се използва алкалиблау или тимолфталеин.

4.   АПАРАТУРА

Обикновено лабораторно оборудване, включващо:

5.   ПРОЦЕДУРА

5.1    Подготовка на пробата за изпитване

Ако пробата е мътна, тя следва да се филтрува.

5.2    Маса на пробата

Пробата се взема в зависимост от очакваната киселинност, в съответствие със следната таблица:

Пробата се претегля в конусовидната колба (4.2).

5.3    Определяне

Пробата (5.2) се разтваря в 50 до 100 ml от предварително неутрализираната смес от диетилов етер и етанол (3.1).

Титрува се, като се разклаща, с 0,1 mol/l разтвор на калиев хидроксид (или на натриев хидроксид) (3.2) (вж. забележка 4) до промяна в индикатора (цветът на оцветения индикатор се задържа в продължение на най-малко 10 секунди).

Второ определяне се извършва само ако първият резултат е по-висок от определената граница за категорията на маслото.

6.   ИЗРАЗЯВАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ

Киселинността в тегловни проценти олеинова киселина е равна на:

където:

V

=

обемът на използвания титруван разтвор на калиев хидроксид (или на натриев хидроксид), в милилитри;

c

=

точната концентрация на използвания титруван разтвор на калиев хидроксид (или на натриев хидроксид), в mol/l;

M

=

282 g/mol, моларната маса на олеиновата киселина, в g/mol;

m

=

масата на пробата, в грамове.

Киселинността, изразена като олеинова киселина, се протоколира, както следва:

▼B

---

ПРИЛОЖЕНИЕ III

ОПРЕДЕЛЯНЕ НА ПЕРОКИСНОТО ЧИСЛО

1.   ОБХВАТ

Стандартът описва метод за определянето на перокисното число на маслата и мазнините.

2.   ПРИЛОЖНО ПОЛЕ

Стандартът е приложим за животински и растителни масла и мазнини.

3.   ОПРЕДЕЛЕНИЕ

Перокисното число е количеството на тези вещества в пробата, изразени в милиеквиваленти активен кислород на килограм, които окисляват калиевия йодид, съгласно описаната опитна постановка.

4.   ПРИНЦИП

Обработка на част от пробата в разтвор на оцетна киселина и хлороформ с разтвор на калиев йодид.

5.   АПАРАТУРА

Цялото оборудване трябва да е свободно от редуциращи или оксидиращи вещества.

Бележка: Не бива да се омазняват стените.

5.1.	3-милилитрова стъклена лопатка.

5.2.	Колби с шлифовани гърла и запушалки с вместимост от около 250 ml, предварително изсушени и запълнени с чист сух инертен газ (азот или за предпочитане въглероден диоксид).

5.3.	25- или 30-милилитрова бюрета, градуирана през 0,1 ml.

6.   РЕАКТИВИ

6.1.	Хлороформ, с качество за аналитични цели, освободен от кислород чрез прокарване на поток от чист сух инертен газ през него.

6.2.	Ледена оцетна киселина, с качество за аналитични цели, освободена от кислород чрез прокарване на поток от чист сух инертен газ през нея.

6.3.	Калиев йодид, наситен воден разтвор, прясно приготвен, свободен от йод и йодати.

6.4.	Натриев тиосулфат, 0,01 или 0,002 Mol/L, прецизно стандартизиран воден разтвор, стандартизиран точно преди употребата.

6.5.	Разтвор на скорбяла, 10 g/l водна дисперсия, прясно приготвена от естествено разтворима скорбяла.

7.   ПРОБА

Пробата следва да се вземе и съхранява без достъп на светлина, на студено и да се съхранява в изцяло запълнени стъклени контейнери, херметично запечатани със запушалки от шлифовано стъкло или корк.

8.   ХОД НА ОПИТА

Опитът се провежда при разсеяна светлина или при изкуствено осветление. Измерва се в стъклена лопатка (5.1.) или, ако това е невъзможно, в колба (5.2.), с точност до 0,001 g, маса от пробата в съответствие със следната таблица, съгласно очакваното перокисно число:

Отпушва се колбата (5.2.) и се поставя стъклената лъжичка, съдържаща частта от пробата. Прибавят се 10 ml хлороформ (6.1.). Разтваря се частта от пробата чрез бързо разбъркване. Добавят се 15 ml оцетна киселина (6.2.) и след това — 1 ml разтвор на калиев йодид (6.3.). Поставя се бързо запушалката, разклаща се в продължение на една минута и се оставя в покой за точно пет минути, без достъп на светлина, при температура от 15 до 25 °C.

Прибавя се около 75 ml дестилирана вода. Титрира се освободеният йод с разтвор на натриев тиосулфат (6.4.) (0,002 Mol/L разтвор за очаквани стойности по-малки от 12 и 0,01 Mol/L разтвор за очаквани стойности над 12), като се разклаща енергично при използването на разтвор на скорбяла като индикатор.

Провеждат се две определяния на същата опитна проба.

Провежда се едновременно контролен опит. Ако резултатът от контролния опит превишава 0,05 ml от 0,01 Mol/L разтвор на натриев тиосулфат (6.4.) нечистите реактиви се подменят.

9.   ИЗРАЗЯВАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ

Перокисното число (ПЧ), изразено в милиеквиваленти активен кислород на килограм, е представено чрез формулата:

,

където:

V

=

броят милилитри от стандартизирания разтвор на натриев тиосулфат (6.4.), използван за опита, коригиран, след като се вземат предвид резултатите от контролния опит;

T

=

точната молярност на използвания разтвор на натриев тиосулфат (6.4.);

m

=

масата на частта от пробата, в грамове.

За резултат се приема средната аритметична стойност от две проведени определяния.

▼M21

---

ПРИЛОЖЕНИЕ IV

ОПРЕДЕЛЯНЕ НА СЪДЪРЖАНИЕТО НА ПАРАФИНИ ЧРЕЗ КАПИЛЯРНА ГАЗОВА ХРОМАТОГРАФИЯ

1.   ПРЕДМЕТ

Този метод описва способ за определяне на съдържанието на парафини в маслиново масло. Парафините се анализират съобразно броя въглеродни атоми. Методът може да се използва по-специално за диференциране на маслиновото масло, получено чрез пресоване, от това, което е получено чрез екстракция (маслиново масло от остатъчен материал).

2.   ПРИНЦИП

Мастното вещество, към което е добавен подходящ вътрешен стандарт, се фракционира чрез хроматография върху колонка от хидратиран силикагел; снема се фракцията, която първа се елуира в опитните условия (при полярност, по-ниска от тази на триглицеридите), след което се анализира директно чрез капилярна газова хроматография.

3.   ОБОРУДВАНЕ

3.1.	Ерленмайерова колба от 25 ml.

3.2.	Стъклена колонка за газова хроматография с вътрешен диаметър 15 mm, височина 30 до 40 cm, оборудвана с кранче.

3.3.

Апарат за газова хроматография, приспособен за функциониране с капилярна колонка, оборудван със система за директно въвеждане в колонката, състояща се от: 3.3.1. Термостатна камера за колонките, оборудвана с температурен програматор. 3.3.2. Инжектор за студено пускане — за директно вкарване в колонката. 3.3.3. Пламъчно-йонизационен детектор и усилвателен преобразувател. 3.3.4. Записващ интегратор, пригоден за работа с усилвателен преобразувател (3.3.3), с време на отговор под 1 секунда и променлива скорост на подаване на хартията. (Възможно е да се използват и информационни системи, които позволяват компютризирано събиране на данните от газовата хроматография.) 3.3.5. Капилярна колонка от стъкло или кварц, с дължина от 8 до 12 m, вътрешен диаметър от 0,25 до 0,32 mm, покрита отвътре със стационарна фаза, с еднородна дебелина между 0,10 и 0,30 μm. (Стационарни фази от тип SE-52 или SE-54, годни за употреба, се намират в търговската мрежа.)

3.4.	Микроспринцовка с вместимост 10 μl, за директно подаване в колонката, снабдена със закалена игла.

3.5.	Електровибратор.

3.6.	Ротационен изпарител.

3.7.	Муфелна пещ.

3.8.	Аналитични везни, гарантиращи точност на измерване до ± 0,1 mg.

3.9.	Обикновена лабораторна стъклария.

4.   РЕАКТИВИ

4.1.

Силикагел с гранулометричен състав между 60 и 200 μm. Силикагелът трябва да престои в пещ при 500 °C в продължение на минимум 4 часа. След охлаждане добавете към него вода, равна на 2 % от снетото количество силикагел. Разбъркайте добре, за да хомогенизирате сместа. Оставете я на тъмно в продължение на минимум 12 часа преди употреба.

4.2.	n-хексан за хроматография.

4.3.	Етилов етер за хроматография.

4.4.	n-хептан за хроматография.

4.5.	Стандартен разтвор на лауринов арахидат — 0,1 % (m/v) в хексан (вътрешен стандарт). (Възможно е да се използва и цетилов палмитат или миристилов стеарат.) 4.5.1. Судан 1 (1-фенил-азо-2-нафтол).

4.6.	Газ носител: чист водород или хелий, за газова хроматография.

4.7.	Спомагателни газове: — чист водород за газова хроматография; — чист въздух за газова хроматография.

5.   РАБОТЕН РЕЖИМ

5.1.   Подготовка на хроматографската колонка

Потопете 15 g силикагел (4.1) в n-хексан (4.2) и го поставете в колонката (3.2). Компенсирайте бързата седиментация с помощта на електрическа бъркалка (3.5), за да направите хроматографския пласт по-хомогенен. Перколирайте 30 ml n-хексан, за да отстраните евентуалните примеси. Претеглете с помощта на везните (3.8) точно 500 mg от пробата в ерленмайеровата колба с вместимост 25 ml (3.1), добавете нужното количество вътрешен стандарт (4.5), в зависимост от предполагаемото съдържание на парафини. Например, когато се касае за маслиново масло, добавете 0,1 mg лауринов арахидат, а когато става въпрос за маслиново масло от остатъчен материал — 0,25 до 0,5 mg. Прехвърлете така приготвената проба в хроматографската колонка с помощта на две дози n-хексан, всяка по 2 ml (4.2).

Оставете разтворителя да изтече, така че да достигне на 1 mm от горното ниво на абсорбента, след което перколирайте допълнително 70 ml n-хексан, за да отстраните естествено наличните n-алкани. После започнете хроматографското елуиране, събирайки 180 ml от сместа n-хексан/етилов етер, в съотношение 99:1, като поддържате дебит от около 15 капки на 10 секунди. Елуирането на пробата трябва да се извърши при стайна температура 22 ± 4 °C.

Бележки:

Изсушете така получената фракция в ротационен изпарител (3.6) до практически пълното отстраняване на разтворителя. Последните 2 ml от разтворителя се отстраняват с помощта на слаб азотен поток; след това добавете 2-4 ml n-хептан.

5.2.   Анализ чрез газова хроматография

5.2.1.   Предварителни операции

Поставете колонката в газовия хроматограф (3.3), свързвайки входния извод към системата on-column, а изходния — към детектора. Извършете основните проверки на апаратурата за газова хроматография (здравина на газовите контури, ефективност на детектора и на записващата система и т. н.).

Ако колонката се използва за първи път, се препоръчва да пристъпите към кондиционирането ѝ. Прокарайте през колонката малко газ, след което включете апаратурата за газова хроматография. Нагрейте постепенно до достигане, след около 4 часа, на температура 350 °C. Поддържайте тази температура в продължение на минимум 2 часа, след което пристъпете към настройката на апаратурата към условията на работа (настройка на газовия поток, запалване на пламъка, включване към електронното записващо устройство (3.3.4), настройка на температурата на камерата за колонката, на детектора и т. н.) и настройте сигнала на чувствителност поне 2 пъти по-висока от предвидената за провеждане на анализа. Ходът на основната линия трябва да бъде линеен, без пикове от каквото и да е естество, и не трябва да показва отклонения.

Отрицателното праволинейно отклонение е показател за неизправни връзки на колонката; положителното отклонение е показател за недостатъчно кондициониране на колонката.

5.2.2.   Избор на работните условия

Общо взето, работните условия, които следва да се спазват, са следните:

Тези условия могат да варират в зависимост от характеристиките на колонката и на газовия хроматограф по такъв начин, че да се постигне анализиране на всички парафини, задоволителна разделителна способност на пиковете (виж фигурата); времето на задържане на вътрешния стандарт C32 следва да бъде 18 ± 3 минути. Най-изразеният пик на парафините следва да се намира на минимум 60 % височина от основата на скалата.

Параметрите на интегриране на пиковете следва да се определят по начин, който позволява правилно изчисление на лицата на пиковете, взети под внимание.

Бележка. Като се има предвид високата крайна температура, се допуска положително отклонение, което не бива да надвишава 10 % височина от основата на скалата.

5.3.   Провеждане на анализа

С помощта на микроспринцовка с вместимост 10 μl вземете 1 μl от разтвора; издърпайте буталото на спринцовката, така че иглата да остане празна. Вкарайте иглата в инжекционния прибор и след 1—2 секунди бързо инжектирайте разтвора; след около 5 секунди бавно извадете иглата.

Проведете запис на анализа до пълното елуиране на парафините.

Основната линия следва винаги да отговаря на необходимите условия.

5.4.   Идентифициране на пиковете

Идентифицирането на различните пикове следва да се извършва въз основа на времената на задържане и в сравнение със смеси от парафини с познати времена на задържане, анализирани при същите условия.

Фигурата представя хроматограма на парафините в необработено маслиново масло.

5.5.   Количествено изчисление

С помощта на интегратора пристъпете към изчислението на лицата на пиковете на вътрешния стандарт и на алифатните естери от C40 до C46.

Изчислете съдържанието на парафин във всеки един от естерите, в mg/kg мастно вещество, по формулата:

където:

Ax

=

лице на пика на всеки естер, в квадратни милиметри;

As

=

лице на пика на вътрешния стандарт, в квадратни милиметри;

ms

=

добавена маса на вътрешния стандарт, в милиграми;

m

=

маса на пробата, взета за анализ, в грамове.

6.   ИЗРАЗЯВАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ

Отбележете сумата на съдържанията на отделните парафини от C40 до C46, в mg/kg мастно вещество (ppm).

Забележка. Компонентите, които трябва да се определят, се отнасят до пиковете с четно въглеродно число между естерите C40 и C46, съгласно примера на хроматограмата на парафините в маслиновото масло, посочена на фигурата по-долу. Ако естерът C46 се появи двойно, се препоръчва за идентифицирането му да се анализира фракцията на парафините в маслиново масло от остатъчен материал, където пикът C46 се идентифицира лесно, тъй като е най-изразеният.

Резултатите се дават с точност до една десета.

Фигура

Хроматограма на парафините в маслиново масло ( 3 )

Легенда:

I.S.

=

лауринов арахидат;

1

=

дитерпенови естери;

2 + 2′

=

естери C40;

3 + 3′

=

естери C42;

4 + 4′

=

естери C44;

5

=

естери C46;

6

=

стеролови естери и тритерпенови алкохоли.

---

Допълнение

Определяне на линейната скорост на газа

Инжектирайте от 1 до 3 μl метан (или пропан) в газовия хроматограф след настройката му към нормални условия на работа. Засечете с хронометър времето, необходимо на газа да премине през колонката, от момента на инжектирането му до момента, в който пикът се очертае (tM).

Линейната скорост, в cm/s, се изчислява по формулата L/tM, където L е дължината на колонката в сантиметри, а tM е засеченото време в секунди.

▼M26

---

ПРИЛОЖЕНИЕ V

ОПРЕДЕЛЯНЕ НА КОМПОНЕНТНИЯ СЪСТАВ И СЪДЪРЖАНИЕТО НА СТЕРОЛИ И НА ТРИТЕРПЕНОВИ ДИАЛКОХОЛИ ЧРЕЗ КАПИЛЯРНА ГАЗОВА ХРОМАТОГРАФИЯ

1.   ОБХВАТ

Методът описва процедура за определяне на отделното и общото съдържание на стероли и тритерпенови диалкохоли в маслиновите масла и маслиновите масла от остатъчен материал.

2.   ПРИНЦИП

Маслото, към което е добавен α-холестанол като вътрешен стандарт, се осапунява с етанолов разтвор на калиев хидроксид, след което неосапуняемите съставки се екстрахират с помощта на етилов етер.

Фракцията на стеролите и на тритерпеновите диалкохоли се отделя от неосапуняемите съставки чрез тънкослойна хроматография на основна плака със силикагел. Фракциите, възстановени от силикагела, се преобразуват в триметилсилилови етери, след което се анализират чрез капилярна газова хроматография.

3.   ОБОРУДВАНЕ

Стандартно лабораторно оборудване, включващо по-конкретно следното:

4.   РЕАГЕНТИ

5.   ПРОЦЕДУРА

5.1.

Приготвяне на неосапуняемите съставки. 5.1.1. С помощта на микроспринцовка с вместимост 500 μl (точка 3.6) в колба с вместимост 250 ml (точка 3.1) се въвежда обем вътрешен стандартен разтвор на α-холестанол (точка 4.20), чието съдържание на холестанол съответства на приблизително 10 % от съдържанието на стероли в пробата. Така например за мостра маслиново масло с маса 5 g се прибавят 500 μl разтвор на α-холестанол (точка 4.20) и 1 500 μl, ако маслиновото масло е от остатъчен материал. Мострата се подлага на изпарение до изсъхване на топла водна баня със слаба струя азот; след охлаждане на колбата в нея се претеглят 5 ± 0,01 g от сухата филтрувана проба. Бележка 1: Животинските или растителните масла, съдържащи значителни количества холестерол, могат да отбележат пик с време на задържане, подобно на това при холестанола. В този случай стероловата фракция се подлага на двукратен анализ — с вътрешен стандарт и без него. 5.1.2. Добавят се 50 ml 2 N етанолов разтвор на калиев хидроксид (точка 4.2) и малко пемза, поставя се обратният хладник и се нагрява до слабо кипене, докато се извърши осапуняването (разтворът се избистря). Нагряването продължава още 20 минути, след което през върха на хладника се прибавят 50 ml дестилирана вода, хладникът се отделя и колбата се охлажда до приблизително 30 °C. 5.1.3. Съдържанието на колбата се прехвърля количествено в делителна фуния с вместимост 500 ml (точка 3.2), като се използват няколко части дестилирана вода (50 ml). Добавят се приблизително 80 ml етилов етер (точка 4.10) и делителната фуния се разклаща енергично в продължение на около 60 секунди, като налягането се освобождава периодично чрез нейното обръщане и отваряне на спирателния кран. Изчаква се до получаването на пълно разделяне на две фази (бележка 2). След това сапуненият разтвор се отлива възможно най-изчерпателно в отделна делителна фуния. По същия начин се извършват още две екстракции на фазата на водно-алкохолна смес, като всеки път се използват 60 до 70 ml етилов етер (точка 4.10). Бележка 2: Всяка емулсия може да бъде разрушена с прибавяне на малки количества етанол (точка 4.11). 5.1.4. Трите етерни екстракта се смесват в делителна фуния, съдържаща 50 ml вода. Промиването с вода (50 ml) продължава, докато промивната вода престане да се оцветява в розово при добавянето на капка разтвор на фенолфталеин (точка 4.21). След отстраняване на промивната вода се филтрува безводен натриев сулфат (точка 4.5) в предварително претеглена колба с вместимост 250 ml, като фунията и филтърът се промиват с малки количества етилов етер (точка 4.10). 5.1.5. Разтворителят се изпарява под вакуум чрез дестилация в ротационен изпарител при температура 30 °C. Добавят се 5 ml ацетон и летливият разтворител се отстранява напълно посредством лека въздушна струя. Остатъкът се изсушава в пещ при температура 103 ± 2 °C в продължение на 15 минути. След това се охлажда в десикатори и се претегля с точност до 0,1 mg.

5.2.

Отделяне на фракцията на стеролите и тритерпеновите диалкохоли (еритродиол + уваол) 5.2.1. Подготовка на основните плаки за тънкослойна хроматография. Плаките със силикагел (точка 4.6) се потапят на 4 cm в 0,2 N етанолов разтвор на калиев хидроксид (точка 4.5) за 10 секунди, след което се оставят да изсъхнат в лабораторна камина за два часа и накрая се поставят в пещ при 100 °C за един час. Изваждат се от пещта и се съхраняват в десикатор за калциев хлорид (точка 3.13) до момента на употреба (така обработените плаки трябва да се използват в рамките на 15 дни). Бележка 3: Когато за отделяне на стероловата фракция се използват основни плаки със силикагел, не е необходимо неосапуняемата фракция да се обработва с диалуминиев триоксид. По този начин всички съединения с киселинни свойства (мастни киселини и други) се задържат в точката на накапване и ивицата на стеролите се отделя ясно от ивицата на алифатните и тритерпеновите алкохоли. 5.2.2. В проявителната камера се налива до дълбочина около 1 cm смес от хексан и етилов етер (точка 4.24) (бележка 4). Камерата се затваря с подходящ капак и се оставя най-малко за половин час на хладно, така че да се установи равновесие между течността и парите. Към вътрешните повърхности на камерата могат да се прикрепят ивици от филтърна хартия, потопени в елуента. Това намалява времето за проявяване с приблизително една трета и осигурява по-равномерно и правилно елуиране на съставките. Бележка 4: Необходимо е проявителната смес да се подменя за всяко изпитване, за да се получат напълно възпроизводими условия за елуиране; допуска се употребата на алтернативен разтворител 50:50 (V/V) n-хексан/етилов етер. 5.2.3. Приготвя се приблизително 5 % разтвор на неосапуняемите съставки (точка 5.1.5) в етилацетат (точка 4.12) и с помощта на микроспринцовка с вместимост 100 μl 0,3 ml от разтвора се нанасят на тънка и равномерна ивица върху долния край (2 cm) на хроматографската плака (точка 5.2.1). На същото равнище като ивицата се накапват 2 до 3 μl от референтния разтвор (точка 4.13.), така че ивицата на стеролите и тритерпеновите диалкохоли да може да бъде разпозната след проявяването. 5.2.4. Плаката се поставя в проявителната камера, приготвена съгласно изискванията в точка 5.2.2. Околната температура се поддържа между 15 и 20 °C (бележка 5). Камерата се затваря веднага с капака и се оставя за елуиране, докато фронтът на разтворителя достигне приблизително 1 cm от горния ръб на плаката. След това плаката се изважда от проявителната камера и разтворителят се изпарява под струя горещ въздух или като плаката се остави за кратко време под камина. Бележка 5: По-високата температура може да влоши разделянето. 5.2.5. Плаката се напръсква леко и равномерно с разтвора на 2,7-дихлорофлуоресцеин (точка 4.14), след което се оставя да изсъхне. Когато плаката се наблюдава под ултравиолетова светлина, ивиците на стеролите и тритерпеновите диалкохоли могат да се разпознаят, като се изравнят с петната, получени от референтния разтвор (точка 4.13). Границите на ивиците се очертават с черен молив по краищата на флуоресценцията (вж. фигура 3 относно плаките за тънкослойна хроматография). 5.2.6. Силикагелът в очертаните участъци се изтърква с помощта на метална шпатула. Отделеният надробен материал от силикагел се поставя във фунията за филтруване (точка 3.7). Прибавят се 10 ml горещ етилов ацетат (точка 4.12), разбърква се добре с металната шпатула и се филтрува под вакуум, като филтратът се събира в конусовидната колба (точка 3.8.), свързана с фунията за филтруване. Утайката от фунията се промива три пъти с етилов етер (точка 4.3) (приблизително 10 ml всеки път) и филтратът се събира в същата колба, свързана с фунията; филтратът се изпарява до обем 4—5 ml и остатъчният разтвор се прехвърля в епруветка с вместимост 10 ml (точка 3.9.), която е била претеглена предварително; изпарява се до изсъхване чрез слабо подгряване под слаба струя азот; утайката се разтваря отново с няколко капки ацетон (точка 4.8), след което отново се изпарява до изсъхване. Остатъкът в епруветката трябва да се състои от фракциите на стеролите и на тритерпеновите диалкохоли.

5.3.

Приготвяне на триметилсилиловите етери. 5.3.1. В епруветката, съдържаща фракцията на стеролите и тритерпена, се добавя реагентът за силилиране (точка 4.25) (бележка 6) в съотношение 50 μl за всеки милиграм стероли и тритерпенови диалкохоли, като се избягва проникването на влага (бележка 7). Бележка 6: Готови за употреба разтвори могат да се доставят от търговската мрежа. Могат да се доставят и други реагенти за силилиране, като например бистриметилсилилтрифлуороацетамид + 1 % триметилхлоросилан, който трябва да се разреди със същия обем безводен пиридин. Пиридинът може да се замени със същото количество ацетонитрил. 5.3.2. Епруветката се затваря и внимателно се разклаща (без да се преобръща) до пълно разтваряне на съставките. Оставя се за да престои най-малко 15 минути при стайна температура, след което се центрофугира в продължение на няколко минути. Бистрият разтвор е готов за анализ чрез газова хроматография. Бележка 7: Слабата опалесценция, която може да се получи, е нормална и не причинява аномалии. Формирането на бял флокулат или появата на розово оцветяване е знак за наличието на влага или за увреждането на реагента. Ако това се случи, анализът трябва да бъде повторен (само ако се използва хексаметилдисилазан/ триметилхлоросилан).

5.4.

Анализ чрез газова хроматография 5.4.1. Предварителни операции, кондициониране на капилярната колона. 5.4.1.1. Колоната (точка 3.11) се монтира в газовия хроматограф чрез свързване на входния край с инжектора с разделяне и на изходния край — с детектора. Извършва се обща проверка на газовохроматографския агрегат (течове от газовите вериги, ефикасност на детектора, ефикасност на разделителната система и на записващата система и т.н.). 5.4.1.2. Ако колоната се използва за първи път, се препоръчва тя да бъде кондиционирана: през нея се прокарва слаба струя газ, след което се включва газовохроматографският агрегат и се започва постепенно нагряване до достигането на температура от поне 20 °C над температурата за експлоатация (бележка 8). Тази температура се поддържа в продължение на най-малко два часа, след което целият агрегат се привежда в работен режим (настройка на газовата струя и разделяне, възпламеняване на пламъка, свързване с изчислителната система, настройване на температурата на колоната, детектора и инжектора и т.н.) и след това се записва сигналът с поне два пъти по-висока чувствителност от тази, която ще се използва при анализа. Ходът на базовата линия трябва да е прав, без пикове от какъвто и да било вид и без измествания. Отрицателното праволинейно изместване е показател за изтичане от свръзките на колоната, а положителното изместване — за нейното неподходящо кондициониране. Бележка 8: Температурата на кондициониране трябва винаги да е поне с 20 °C по-ниска от максималната температура, определена за използваната неподвижна фаза. 5.4.2. Избор на условия за работа 5.4.2.1. Условията за работа са следните: — температура на колоната: 260 ± 5 °C, — температура на инжектора: 280—300 °C, — температура на детектора: 280—300 °C, — линейна скорост на газа носител: хелий — 20 до 30 cm/s, водород — 30 до 50 cm/s, — коефициент на разделяне: 1:50 до 1:100, — чувствителност на инструмента: 4 до 16 пъти минималното намаляване, — чувствителност на записване: 1 до 2 mV от пълната скала, — количество на инжектираното вещество: 0,5 до 1 μl от разтвора на триметилсилилови етери. Тези условия могат да се изменят в зависимост от характеристиките на колоната и на газовия хроматограф с цел да се получат хроматограми, отговарящи на следните изисквания: — времето на задържане на β-ситостерола трябва да е 20 ± 5 минути, — пикът на кампестерола трябва да е, както следва: за маслиновото масло (средно съдържание 3 %) — 20 ± 5 % от пълната скала, за соевото масло (средно съдържание 20 %) — 80 ± 10 % от пълната скала, — всички налични стероли трябва да са разделени. В добавка към изискването за разделяне на пиковете те трябва да бъдат напълно отделени един от друг, т.е. следата на всеки пик трябва да се върне напълно до основата, преди да се издигне за следващия пик. Допуска се обаче непълно отделяне, при условие че пикът при RRT 1,02 (ситостанол) може да се изрази количествено чрез използването на перпендикуляр. 5.4.3. Провеждане на анализа 5.4.3.1. С помощта на микроспринцовката с вместимост 10 μl се изтегля 1 μl хексан, въвежда се 0,5 μl въздух и впоследствие — 0,5 до 1 μl от разтвора на пробата. Буталото на спринцовката се изтегля, за да се изпразни иглата. Иглата се въвежда през мембраната на инжектора и след една до две секунди разтворът се инжектира бързо, като иглата се изважда бавно след приблизително пет секунди. Също така може да се използва автоматичен инжектор. 5.4.3.2. Записването продължава до пълното елуиране на триметилсилиловите етери на наличните тритерпенови диалкохоли. Базовата линия трябва да продължи да отговаря на изискванията (точка 5.4.1.2). 5.4.4. Идентифициране на пиковете Идентифицирането на отделните пикове се извършва съгласно времената на задържане и чрез сравнение със сместа от стероли и триметилсилилови етери на тритерпеновите диалкохоли, анализирани при същите условия (вж. допълнението). Стеролите и тритерпеновите диалкохоли се елуират в следния ред: холестерол, брасикастерол, ергостерол, 24-метиленхолестерол, кампестерол, кампестанол, стигмастерол, Δ7-кампестерол, Δ5,23-стигмастадиенол, клеростерол, β-ситостерол, ситостанол, Δ5-авенастерол, Δ5,24-стигмастадиенол, Δ7-стигмастенол, Δ7-авенастерол, еритродиол и уваол. Времената на задържане за ß-ситостерол за колони SE-52 и SE-54 са посочени в таблица 1. Типичните хроматограми за някои масла са показани на фигури 1 и 2. 5.4.5. Количествена оценка. 5.4.5.1. С помощта на изчислителната система се намира площта на пиковете на α-холестанола и на стеролите и тритерпеновите диалкохоли. Пиковете за всички съединения, които не са включени (ергостеролът не трябва да се изчислява) в таблица 1, не се вземат под внимание. Корекционният фактор за α-холестанола се приема за равен на 1. 5.4.5.2. Концентрацията на всеки отделен стерол, изразена в mg/kg мастно вещество, се изчислява по следния начин: където: Ax = площта на пика на стерол x в единиците, използвани от изчислителната система, As = площта на пика на α-холестанола в единиците, използвани от изчислителната система, ms = масата на добавения α-холестанол в милиграми, m = масата на използваната за определянето проба в грамове.

6.   ИЗРАЗЯВАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ

▼M28

▼M26

---

Допълнение

Определяне на линейната скорост на газа

В газовия хроматограф, настроен на нормални условия за работа, се инжектират 1 до 3 μl метан (или пропан) и се измерва времето, необходимо за преминаване на метана (или пропана) през колоната от момента на инжектиране до появата на пика (tM).

Линейната скорост на газа в cm/s е представена чрез L/tM, където L е дължината на колоната в сантиметри, а tM е измереното време в секунди.

Фигура 1

Газова хроматограма на фракцията на стеролите и тритерпеновите диалкохоли на маслиново масло за осветление (с добавен вътрешен стандарт)

Фигура 2

Газова хроматограма на фракцията на стеролите и тритерпеновите диалкохоли на рафинирано маслиново масло (с добавен вътрешен стандарт)

Фигура 3

Плака за тънкослойна хроматография на маслиново масло от остатъчен материал с участъка, който трябва да бъде изтъркан с оглед определянето на стеролите и тритерпеновите диалкохоли

▼M26 —————

▼M21

---

ПРИЛОЖЕНИЕ VII

ОПРЕДЕЛЯНЕ НА ПРОЦЕНТНОТО СЪДЪРЖАНИЕ НА 2-ГЛИЦЕРИЛ МОНОПАЛМИТАТ

1.   ПРЕДМЕТ И СФЕРА НА ПРИЛОЖЕНИЕ

Този метод описва аналитичната процедура за определяне на процентното съдържание на палмитинова киселина в позиция 2 на триглицеридите посредством анализа на 2-глицерил монопалмитат.

Методът е приложим за течни растителни масла при стайна температура (20 °C).

2.   ПРИНЦИП

След подготовката ѝ маслената проба се подлага на въздействието на панкреатична липаза: частична хидролиза, специфична за позиции 1 и 3 на молекулата на триглицерида, води до появата на моноглицериди в позиция 2. Процентното съдържание на 2-глицерил монопалмитат в моноглицеридната фракция се определя, след силилация, посредством капилярна газова хроматография.

3.   АПАРАТУРА И ЛАБОРАТОРНО ОБОРУДВАНЕ

3.1.	Ерленмайерова колба от 25 ml.

3.2.	Бехерови чаши от 100, 250 и 300 ml.

3.3.	Стъклена колонка за хроматография, с вътрешен диаметър 21—23 mm, дължина 400 mm, оборудвана с диск с поресто дъно и кранче.

3.4.	Градуирани епруветки от 10, 50, 100 и 200 ml.

3.5.	Колби с вместимост 100 и 250 ml.

3.6.	Ротационен изпарител.

3.7.	Центрофужни епруветки с конично дъно, с вместимост 10 ml, с шлифована запушалка.

3.8.	Центрофуга за епруветки от 10 и 100 ml.

3.9.	Термостат, който позволява поддържане на постоянна температура от 40 °C ± 0,5 °C.

3.10.

Калибровани пипети от 1 и 2 ml.

3.11.

Хиподермична спринцовка от 1 ml.

3.12.

Микроспринцовка от 100 μl.

3.13.

Фуния от 1 000 ml.

3.14.

Газов хроматограф за капилярни колонки, оборудван със система за студено инжектиране „on column“, за директно вкарване на пробата в колонката и с пещ, която е в състояние да поддържа желаната температура с точност до 1 °C.

3.15.

Инжектор за студено пускане „on column“ за директно вкарване на пробата в колонката.

3.16.

Пламъчно-йонизационен детектор и електрометър.

3.17.

Записващ интегратор, адаптиран към електрометъра, с време на отговор под 1 секунда и променлива скорост на подаване на хартията.

3.18.

Капилярна колонка от стъкло или кварц, с дължина 8—12 метра, с вътрешен диаметър от 0,25 до 0,32 mm, с покритие от метилполисилоксан или фенил метилполисилоксан 5 %, с дебелина 0,10—0,30 μm, която може да се използва при 370 °C.

3.19.

Микроспринцовка с вместимост 10 μl, снабдена със закалена игла, с минимална дължина 7,5 cm, за директно инжектиране върху колонката.

4.   РЕАКТИВИ

4.1.

Силикагел с гранулометричен състав между 0,063 и 0,200 mm (70/280 mesh), приготвен по следния начин: поставете силикагела в порцеланова капсула, изсушете в пещ при 160 °C в продължение на 4 часа, след което оставете да се охлади на стайна температура в ексикатор. Добавете обем вода, равен на 5 % от теглото на силикагела, като процедирате по следния начин: в ерленмайерова колба от 500 ml претеглете 152 g силикагел и добавете 8 g дестилирана вода, запушете с тапа и разклатете внимателно до равномерно разпределяне на водата. Оставете да престои минимум 12 часа преди употреба.

4.2.	n-хексан (за хроматография).

4.3.	Изопропанол.

4.4.	Воден разтвор на изопропанол, в обемно съотношение 1/1.

4.5.	Панкреатична липаза. Използваната липаза трябва да има активност между 2,0 и 10 липазни единици/mg. (В търговската мрежа се предлагат панкреатични липази с активност между 2 и 10 единици на милиграм ензим.)

4.6.	Буферен разтвор: 1 M воден разтвор на трисхидрокси-метиламинометан, доведен до pH 8 (проверява се с потенциометър), чрез добавяне на концентрирана солна киселина (1/1 v/v).

4.7.	Натриев холат с ензимно качество — воден разтвор 0,1 % (разтворът трябва да се използва до 15 дни след приготвянето му).

4.8.	Калциев хлорид, воден разтвор 22 %.

4.9.	Диетилов етер за хроматография.

4.10.

Проявяващ разтворител: смес n-хексан/диетилов етер (87/13) (v/v).

4.11.

Натриев хидроокис, разтвор 12 тегловни процента.

4.12.

Разтвор в етилов алкохол на 1 % фенолфталеин.

4.13.

Газ носител: водород или хелий, за газова хроматография.

4.14.

Спомагателни газове: водород, минимум 99 %, свободен от влага и органични примеси, и въздух, за газова хроматография, със същата чистота.

4.15.

Реактив за силанизация: смес пиридин(хексаметилдисилазан) триметилхлоросилан 9/3/1 (v/v/v). (В търговската мрежа се предлагат готови за употреба разтвори. Могат да се използват други реактиви за силилация като бис-триметилсилил трифлуорацетамид + 1 % триметилхлоросилан, разреден със същия обем безводен пиридин.)

4.16.

Сравнителни проби: чисти моноглицериди или смеси от моноглицериди с известен състав на процентното съдържание, подобен на този на пробата.

5.   ПРОЦЕДУРА

5.1.   Подготовка на пробата

5.1.1.

Маслото със свободна киселинност под 3 % не се нуждае от неутрализация преди хроматографията върху колонката със силикагел. Маслото със свободна киселинност над 3 % трябва да се подложи на неутрализация, както е описано в точка 5.1.1.1. 5.1.1.1. Във фунията с вместимост 1 000 ml (3.13) налейте 50 g масло и 200 ml n-хексан. Добавете 100 ml изопропанол и такова количество от разтвора на натриевия хидроокис 12 % (4.11), което съответства на свободната киселинност на маслото плюс добавка от 5 %. Разклатете енергично в продължение на една минута. Добавете 100 ml дестилирана вода, разбъркайте отново и оставете в покой. След декантирането отстранете долния слой от сапуни. Отстранете евентуалните междинни слоеве (клей и неразтворими вещества). Промийте хексановия разтвор от неутрализираната киселина с последователни дози от по 50—60 ml от разтвора изопропанол/вода 1/1 (v/v) (4.4) до изчезване на розовото оцветяване на фенолфталеина. Отстранете по-голямата част от хексана чрез дестилация под вакуум (използвайте например ротационен изпарител) и прехвърлете маслото в колба от 100 ml (3.5). Изсушете маслото под вакуум до пълното отстраняване на разтворителя. В края на тази операция киселинността на маслото трябва да бъде под 0,5 %.

5.1.2.

Поставете 1,0 g масло, приготвено по горепосочения начин, в ерленмайерова колба от 25 ml (3.1) и разтворете в 10 ml проявяваща смес (4.10). Оставете разтвора да престои в продължение на минимум 15 минути преди хроматографията върху колонка със силикагел. Ако разтворът е мътен, го центрофугирайте, за да гарантирате оптимални условия за хроматография. (Могат да се използват готови за употреба патрони силикагел SPE от 500 mg.)

5.1.3.

Подготовка на хроматографската колонка Сипете в колонката (3.3) около 30 ml от проявяващия разтвор (4.10), поставете парче памук в долната част на колонката с помощта на стъклена пръчица; натиснете, за да отстраните въздуха. В бехерова чаша пригответе суспензия от 25 g силикагел (4.1) в около 80 ml проявяващ разтвор и я сипете в колонката с помощта на фуния. Проверете дали цялото количество силикагел е постъпило в колонката; промийте с проявяващия разтвор (4.10), отворете кранчето и оставете нивото на течността да стигне до около 2 mm над горното ниво на силикагела.

5.1.4.

Хроматография върху колонка В ерленмайерова колба от 25 ml (3.1) претеглете точно 1,0 g от пробата, приготвена по описания в точка 5.1 начин. Разтворете пробата в 10 ml проявяващ разтвор (4.10). Сипете разтвора, приготвен по указанията в точка 5.1.3, в хроматографската колонка. Избягвайте движението на повърхността на колонката. Отворете кранчето и оставете разтвора на пробата да изтече, докато достигне нивото на силикагела. Проявете със 150 ml проявяващ разтвор. Регулирайте дебита на 2 ml/min (така че 150 ml да изтекат в колонката за около 60—70 минути). Съберете елуата в предварително претеглена колба с вместимост 250 ml. Изпарете разтворителя под вакуум и отстранете последните следи от него под азотен поток. Претеглете колбата и изчислете събрания екстракт. (В случай че използвате готови за употреба SPE патрони от силикагел, процедирайте по следния начин: поставете 1 ml разтвор (5.1.2) в предварително приготвените с 3 ml n-хексан патрони.) След перколация на разтвора проявете с 4 ml n-хексан/диетилов етер 9/1 (v/v). Съберете елуата в епруветка от 10 ml и го подложете на изпарение под азотен поток до изсъхване. Подложете сухия остатък на въздействие на панкреатична липаза (5.2). От основно значение е да проверите съдържанието на мастни киселини преди и след преминаването върху SPE патрона).

5.2.   Хидролиза с панкреатична липаза

5.2.1.

В центрофужна епруветка претеглете 0,1 g масло, приготвено съгласно точка 5.1. Добавете 2 ml буферен разтвор (4.6), 0,5 ml разтвор на натриев холат (4.7) и 0,2 ml разтвор на калциев хлорид, като разклащате добре след всяко добавяне. Затворете епруветката с шлифованата запушалка и я поставете в термостата при 40 ± 0,5 °C.

5.2.2.

Добавете 20 mg липаза, разклатете старателно (като внимавате да не намокрите запушалката) и поставете епруветката в термостата за точно 2 минути, след което я извадете, разклатете енергично в продължение точно на 1 минута и оставете да се охлади.

5.2.3.

Добавете 1 ml диетилов етер, запушете с тапата и разклатете енергично, след което центрофугирайте и прехвърлете етеровия разтвор в чиста и суха епруветка с помощта на микроспринцовка.

5.3.   Подготовка на силанизираните деривати и на газовата хроматография

5.3.1.

С помощта на микроспринцовка поставете 100 μl разтвор (5.2.3) в епруветка с конично дъно от 10 ml.

5.3.2.

Отстранете разтворителя под слаб азотен поток, добавете 200 μl реактив за силанизация (4.15), запушете епруветката и оставете да престои 20 минути.

5.3.3.

След 20 минути добавете от 1 до 5 ml n-хексан (в зависимост от хроматографските условия): полученият разтвор е готов за газова хроматография.

5.4.   Газова хроматография

Условията на работа са следните:

5.4.1.   Идентифициране на пиковете

Идентифицирането на индивидуалните моноглицериди се извършва в съответствие с получените времена на задържане и в сравнение със стандартните смеси моноглицериди, анализирани при същите условия.

5.4.2.   Количествена преценка

Лицето на всеки пик се изчислява с помощта на електронен интегратор.

6.   ИЗРАЗЯВАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ

Процентното съдържание на глицерил монопалмитат се изчислява от съотношението между лицето на съответния пик и сбора от лицата на пиковете на всички моноглицериди (виж фигура 2) по формулата:

Глицерил монопалмитат (%):

където:

Ax

=

лицето на пика, съответстващ на глицерил монопалмитат;

ΣА

=

сборът от лицата на всички пикове на моноглицеридите.

Резултатът се дава с точност до една десета.

7.   ПРОТОКОЛ ОТ АНАЛИЗА

Протоколът от анализа следва да посочва:

Фигура 1

Хроматограма на продуктите от реакцията на силанизация, получени чрез действието на липазата върху рафинирано маслиново масло, към което е добавено 20 % естерифицирано масло (100 %)

Легенда: „acides gras libres“ = свободни мастни киселини; „Huile d’olive raffinée + 20 % huile estérifiée“ = рафинирано маслиново масло + 20 % естерифицирано масло; „1-2 monopalmitoléine“ = 1-2 монопалмитолеин; „1-2 mono C18 insat.“ = 1-2 моно C18 ненаситени; „squalene“ = скуален

Фигура 2

Хроматограма на:

A)

неестерифицирано маслиново масло, след липаза; след силанизация; в тези условия (капилярна колонка 8—12 m) парафиновата фракция се елуира едновременно с диглицеридната фракция или малко след това. След липаза съдържанието на триглицериди не би следвало да надвишава 15 %. Легенда: 1 = Свободни мастни киселини 2 = Моноглицериди 3 = Диглицериди 4 = Триглицериди * = 2-монопалмитин ** = Триглицерид C54

Хроматограма на:

Б)

естерифицирано масло след липаза; след силанизация; в тези условия (капилярна колонка 8—12 m), парафиновата фракция се елуира едновременно с диглицеридната фракция или малко след това. След липаза съдържанието на триглицериди не би следвало да надвишава 15 %. Легенда: 1 = Свободни мастни киселини 2 = Моноглицериди 3 = Диглицериди 4 = Триглицериди * = 2-монопалмитин ** = Триглицерид C54

8.   БЕЛЕЖКИ

ПРИГОТВЯНЕ НА ЛИПАЗАТА

В търговската мрежа се предлагат липази със задоволителна липазна активност. Възможно е и да бъдат приготвени лабораторно по следния начин:

Охладете до 0 °C 5 kg пресен свински панкреас. Отстранете околните твърда мазнина и съединителна тъкан и раздробете добре в ножова мелница до получаване на гладка кремообразна смес. Разбъркайте в продължение на 4 до 6 часа с 2,5 литра безводен ацетон, след което центрофугирайте. Екстрахирайте утайката още три пъти със същото количество безводен ацетон, след това два пъти със смес от равни части ацетон и диетилов етер и два пъти с диетилов етер.

Изсушете остатъка под вакуум за 48 часа до получаването на устойчив прах, който трябва да се съхранява в хладилник и на сухо.

ПРОВЕРЯВАНЕ НА АКТИВНОСТТА НА ЛИПАЗАТА

Пригответе емулсия от маслиново масло, както следва:

Разбъркайте в смесител в продължение на 10 минути смес от 165 ml от разтвор на гуми арабика при 100 g/l, 15 g натрошен лед и 20 ml предварително неутрализирано маслиново масло.

Сипете последователно в бехерова чаша с вместимост 50 ml 10 ml от тази емулсия, а след това 0,3 ml разтвор на натриев холат при 0,2 g/ml и 20 ml дестилирана вода.

Поставете бехеровата чаша в термостат, настроен на 37 °C; потопете електродите на pH метъра и спиралната бъркалка.

Прибавете, капка по капка, с помощта на бюрета, разтвор на натриев хидроокис (0,1 N), докато pH достигне 8,3.

Добавете един обем водна суспензия на липазен прах (0,1 g/ml липаза). Веднага щом pH метърът покаже pH 8,3, включете хронометъра и добавете разтвора на натриевия хидроокис, капка по капка, така че да се поддържа pH от 8,3. Отчитайте всяка минута обема на консумирания разтвор.

Нанесете данните в координатна система, чиято абсциса съответства на времето, а ординатата ѝ — на милилитрите алкален разтвор (0,1 N), нужни за поддържането на постоянно pH. Трябва да се получи линейна графика.

Активността на липазата, измерена в липазни единици/mg, се изчислява по следната формула:

където:

A

—

е активността в липазни единици/mg;

V

—

използваният обем на разтвор на натриев хидроокис — 0,1 N за минута, в милилитри (изчислен по графиката);

N

—

нормалността на разтвора на натриев хидроокис;

m

—

масата в mg на опитната липаза.

Единица липаза се дефинира като количеството ензим, което отделя 10 микроеквивалента киселина в минута.

▼M20 —————

▼M28

---

ПРИЛОЖЕНИЕ IХ

СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧНО ИЗСЛЕДВАНЕ В УЛТРАВИОЛЕТОВИЯ СПЕКТЪР

ПРЕДИСЛОВИЕ

Спектрофотометричното изследване в ултравиолетовия спектър може да осигури информация за качеството на дадена мазнина, състоянието ѝ на запазеност и промените, настъпили в нея при технологичните процеси. Абсорбцията при дължините на вълните, упоменати в метода, е вследствие на системи от конюгирани диени и триени, проявяващи се в резултат на процеси на окисляване и/или практики на рафиниране. Тези абсорбции са изразени като специфични екстинкции

(екстинкцията на 1 % разтвор (w/v) на мазнината в упоменатия разтворител, в кювета 10 mm), обикновено обозначавани като К (наричан още „коефициент на екстинкция“).

1.   ОБХВАТ

Настоящото приложение описва процедурата за извършване на спектрофотометрично изследване на маслиново масло в ултравиолетовия спектър.

2.   ПРИНЦИП НА МЕТОДА

Проба се разтваря в нужния разтворител и абсорбцията на разтвора се определя при определени дължини на вълната срещу чистия разтворител.

Изчисляват се специфичните екстинкции при 232 nm и 268 nm в изооктан или при 232 nm и 270 nm в циклохексан за концентрация от 1 % w/v в кювета 10 mm.

3.   ОБОРУДВАНЕ

3.1.

Спектрофотометър, подходящ за извършване на измервания при ултравиолетови дължини на вълната (от 220 nm до 360 nm), с възможност за отчитане на отделните нанометрични единици. Препоръчва се редовна проверка на точността и възпроизводимостта на абсорбцията и скалите за дължина на вълната, както и за разсеяна светлина. 3.1.1. Скала за дължина на вълната: Тя може да се провери с помощта на референтен материал, състоящ се от филтър от оптично стъкло, съдържащ холмиев оксид или разтвор на холмиев оксид (запечатан или не), който има ясно разграничени абсорбционни ивици. Референтните материали са предназначени за проверка и калибриране на скалите за дължина на вълната на спектрофотометри във видимата и ултравиолетовата област с номинални ширини на спектралната ивица 5 nm или по-малко. Измерванията се извършват спрямо празна проба въздух в диапазона от дължини на вълната от 640 до 240 nm, според указанията, приложени към референтните материали. Извършва се корекция на базисната линия с празна траектория на лъча при всяка промяна на ширината на процепа. Дължините на вълната на стандарта са изброени в сертификата на референтния материал. 3.1.2. Скала за абсорбция: Тя може да се провери, като се използват налични в търговската мрежа запечатани референтни материали, състоящи се от подкислени разтвори на калиев дихромат, при някои концентрации и сертифицирани стойности на абсорбция при неговото λmax (от 4 разтвора на калиев дихромат в перхлорна киселина, запечатани в четири ултравиолетови кварцови кювети за измерване на линейността и референтната фотометрична точност в ултравиолетовата област). Разтворите на калиев дихромат се измерват спрямо празна проба на използваната киселина, след корекция на базисната линия, съгласно указанията, приложени към референтния материал. Стойностите на абсорбция са изброени в сертификата на референтния материал. С оглед на проверката на отклика на фотоклетката и фотоумножителя може да се постъпи и по следния начин: претеглят се 0,2000 g чист калиев хромат за спектрофотометрия и се разтварят в 0,05 N разтвор на калиев хидроксид в 1 000 ml градуирана колба като се долива до резката. Вземат се точно 25 ml от получения разтвор, пренасят се в 500 ml градуирана колба и се разреждат до резката като се използва същият разтвор на калиев хидроксид. Измерва се екстинкцията на така получения разтвор при 275 nm, като се използва разтворът на калиев хидроксид като референтен. Измерената екстинкция при използването на 1 cm кювета трябва да е 0,200 ± 0,005.

3.2.

Кварцови кювети с правоъгълно сечение, с капачки, подходящи за измервания на дължини на вълната в ултравиолетовия спектър (220 до 360 nm), с оптичен път от 10 mm. Когато се напълнят с вода или друг подходящ разтворител, кюветите не трябва да показват помежду си разлики по-големи от 0,01 екстинкционни единици.

3.3.	Мерителни колби с резка с обем 25 ml, клас А.

3.4.	Аналитична везна, която позволява отчитане с точност до 0,0001 g.

4.   РЕАКТИВИ

По време на анализа, освен ако е посочено друго, се използват само реактиви, признати като „чисти за анализ“, и дестилирана или деминерализирана вода, или вода с еквивалентна степен на чистота.

Разтворител: изооктан (2,2,4-триметилпентан) за измерването при 232 nm и 268 nm и циклохексан за измерването при 232 nm и 270 nm, с абсорбция по-малка от 0,12 при 232 nm и по-малка от 0,05 при 270 nm спрямо дестилирана вода, измерена в кювета 10 mm.

5.   ПРОЦЕДУРА

5.1.	Пробата трябва да е напълно хомогенна и без суспендирани онечиствания. В противен случай тя трябва да се филтрува през хартия при температура приблизително 30 °С.

5.2.

Измерват се прецизно приблизително 0,25 g (с точност до 1 mg) от така подготвената проба в 25-милилитрова градуирана колба, долива се от определения разтворител до резката и се хомогенизира. Полученият разтвор трябва да е напълно бистър. Ако има наличност на опалесценция или мътност, бързо се филтрува през хартия. БЕЛЕЖКА: По принцип маса от 0,25—0,30 g е достатъчна за измерване на абсорбция на необработено маслиново масло и необработено маслиново масло екстра качество при 268 nm и 270 nm. За измерване при 232 nm, обикновено се изисква проба от 0,05 g, поради което обикновено се приготвят два отделни разтвора. За измервания на абсорбция на маслинови масла от остатъчен материал, рафинирани маслинови масла и маслинови масла с примеси обикновено е необходима по-малка проба, напр. 0,1 g, поради тяхната по-висока абсорбция.

5.3.

Ако е необходимо, се коригира базисната линия (220—290 nm) с разтворител в двете кварцови кювети (с проба и референтна), след това кварцовата кювета с пробата се напълва с изпитвания разтвор и се измерва екстинкцията при 232, 268 или 270 nm спрямо референтния разтворител. Записаните стойности на екстинкцията трябва да са в рамките от 0,1 до 0,8 или в рамките на интервала на линейност на спектрофотометъра, който следва да бъде проверен. В противен случай измерванията трябва да се повторят, като според нуждата се използват по-концентрирани или по-разредени разтвори.

5.4.

След измерване на абсорбцията при 268 или 270 nm се измерва абсорбцията при λmax, λmax + 4 и λmax – 4. Тези стойности на абсорбцията се използват за определяне на вариацията на специфичната екстинкция (ΔΚ). БЕЛЕЖКА: λmax се приема за 268 nm за изооктан, използван като разтворител, и 270 nm за циклохексан.

6.   ИЗРАЗЯВАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ

6.1.

Записват се специфичните екстинкции (коефициенти на екстинкция) при различните дължини на вълната, изчислени по следния начин: където: Kλ = специфичната екстинкция при дължина на вълната λ; Eλ = екстинкцията, измерена при дължина на вълната λ; c = концентрация на разтвора в g/100 ml; s = дължина на пътя на кварцовата кювета, в cm; с точност до два знака след десетичната запетая.

6.2.

Вариация на специфичната екстинкция (ΔΚ) Вариацията на абсолютната стойност на екстинкцията (ΔΚ) се изчислява по следния начин: където Km е специфичната екстинкция при дължина на вълната за максимална абсорбция при 270 nm и 268 nm в зависимост от използвания разтворител. Резултатите се изразяват с точност до два знака след десетичната запетая.

---

ПРИЛОЖЕНИЕ Х

ОПРЕДЕЛЯНЕ НА МЕТИЛОВИ ЕСТЕРИ НА МАСТНИ КИСЕЛИНИ ЧРЕЗ ГАЗОВА ХРОМАТОГРАФИЯ

1.   ОБХВАТ

В настоящото приложение са дадени указания за определяне чрез газова хроматография на свободни и свързани мастни киселини в растителни мазнини и масла след тяхното превръщане в метилови естери на мастни киселини (МЕМК).

Свързаните мастни киселини на триацилглицеролите (TAG) и, в зависимост от метода на естерификация, свободните мастни киселини (FFA) се превръщат в метилови естери на мастни киселини (МЕМК)), които се определят чрез капилярна газова хроматография.

Методът, описан в настоящото приложение, позволява определянето на метиловите естери на мастни киселини от C12 до C24, включително метилови естери на наситени, цис- и транс-мононенаситени и цис- и транс-полиненаситени мастни киселини.

2.   ПРИНЦИП

Газовата хроматография се използва за количествен анализ на метилови естери на мастни киселини. Метиловите естери на мастни киселини се подготвят в съответствие с част A. След това те се инжектират в инжектора и се изпаряват в него. Разделянето на метиловите естери на мастни киселини се извършва в аналитични колони със специфична полярност и дължина. Пламъчно-йонизационен детектор (FID) се използва за откриване на метилови естери на мастни киселини. Условията на анализ са представени в част Б.

Може да се използва водород или хелий като газ носител (подвижна фаза) в газовата хроматография на метиловите естери на мастни киселини с пламъчно-йонизационен детектор. Водородът ускорява разделянето и дава по-резки пикове. Неподвижната фаза е микроскопичен слой на тънко течно покритие върху инертна твърда повърхност от кварц.

При преминаването си през капилярната колонка анализираните изпарени съединения взаимодействат с неподвижната фаза, която покрива вътрешната повърхност на колоната. Поради това различно взаимодействие на различни съединения, те елуират по различно време, което се нарича време на задържане на съединението за даден набор от параметри на анализа. Сравнението на времената на задържане се използва за идентификация на отделните съединения.

ЧАСТ A

ПРИГОТВЯНЕ НА МЕТИЛОВИТЕ ЕСТЕРИ НА МАСТНИТЕ КИСЕЛИНИ ОТ МАСЛИНОВО МАСЛО И МАСЛИНОВО МАСЛО ОТ ОСТАТЪЧЕН МАТЕРИАЛ

1.   ОБХВАТ

В настоящата част се определя приготвянето на метиловите естери на мастните киселини. Тя включва методи за приготвянето на метилови естери на мастните киселини от маслиново масло и маслиново масло от остатъчен материал.

2.   ПРИЛОЖНО ПОЛЕ

Приготвянето на метилови естери на мастни киселини от маслинови масла и маслинови масла от остатъчен материал се извършва чрез транс-естерификация с метанолов разтвор на калиев хидроксид при стайна температура. Необходимостта от пречистване на пробата преди транс-естерификацията зависи от съдържанието на свободни мастни киселини в пробата и аналитичния параметър, който следва да бъде определен, той може да се избира в съответствие със следната таблица:

3.   МЕТОДОЛОГИЯ

3.1.    Транс-естерификация с метанолов разтвор на калиев хидроксид при стайна температура

3.1.1.    Принцип

Метиловите естери се образуват чрез транс-естерификация с метанолов разтвор на калиев хидроксид като междинен етап преди да се извърши осапуняването.

3.1.2.    Реактиви

3.1.2.1.

Метанол със съдържание на не повече от 0,5 % (m/m) вода.

3.1.2.2.

Хексан с качество за хроматография.

3.1.2.3.

Хептан с качество за хроматография.

3.1.2.4.

Диетилов етер, стабилизиран за анализ.

3.1.2.5.

Ацетон с качество за хроматография.

3.1.2.6.

Разтворител за елуиране, за пречистване на маслото чрез колонна хроматография/ТФЕ, смес от хексан/диетилов етер в съотношение 87/13 (v/v).

3.1.2.7.

Калиев хидроксид, приблизително 2М метанолов разтвор: разтварят се 11,2 g калиев хидроксид в 100 ml метанол.

3.1.2.8.

Патрони силикагел — 1 g (6 ml) за твърдофазна екстракция.

3.1.3.    Апаратура

3.1.3.1.

Епруветки с отвор на винт (с вместимост 5 ml ) с капачка със снадка от политетрафлуороетилен.

3.1.3.2.

Градуирани или автоматични пипети, 2 ml и 0,2 ml.

3.1.4.    Пречистване на пробите масло

При необходимост пробите се пречистват чрез преминаване на маслото през патрон силикагел за твърдофазна екстракция. Патрон силикагел (3.1.2.8) се поставя в апарат за вакуумно елуиране и се промива с 6 ml хексан (3.1.2.2); промиването се извършва без вакуум. След това разтвор на маслото (приблизително 0,12 g) в 0,5 ml хексан (3.1.2.2) се зарежда в колоната. Разтворът се прекарва през колоната и след това се елуира с 10 ml хексан/диетилов етер (87:13 v/v) (3.1.2.6). Комбинираните елуати се хомогенизират и се разделят на две еднакви по обем части. Една аликвотна част се изпарява до изсъхване в ротационен изпарител при понижено налягане при стайна температура. Остатъкът се разтваря в 1 ml хептан и разтворът е готов за анализ на мастни киселини чрез газова хроматография. Втората аликвотна част се изпарява и остатъкът се разтваря в 1 ml ацетон за анализ на триглицеридите чрез ВЕТХ при необходимост.

3.1.5.    Процедура

В епруветка с отвор на винт с вместимост 5 ml (3.1.3.1) се претегля приблизително 0,1 g от пробата от маслото. Добавят се 2 ml (3.1.2.2) хептан и се разклаща. Добавят се 0,2 ml метанолов разтвор на калиев хидроксид (3.1.2.7), поставя се капачката със снадка от политетрафлуороетилен, затяга се и се разклаща енергично в продължение на 30 секунди. Оставя се да се разслои до избистряне на горния слой от разтвора. Декантира се горният слой, който съдържа метиловите естери. Хептановият разтвор е готов за инжектиране в газовия хроматограф. Препоръчва се разтворът да се запази в хладилника до анализа чрез газова хроматография. Не се препоръчва съхраняване на разтвора в продължение на повече от 12 часа.

ЧАСТ Б

АНАЛИЗ НА МЕТИЛОВИ ЕСТЕРИ НА МАСТНИ КИСЕЛИНИ ЧРЕЗ ГАЗОВА ХРОМАТОГРАФИЯ

1.   ОБХВАТ

В настоящата част се дават общи насоки за прилагането на капилярна газова хроматография за определяне на качествения и количествен състав на сместа от метилови естери на мастните киселини, получени в съответствие с метода, указан в част А.

Частта не е приложима за полимеризирани мастни киселини.

2.   РЕАКТИВИ

2.1.    Газ носител

Инертен газ (хелий или водород), щателно подсушен и с кислородно съдържание по-малко от 10 mg/kg.

2.2.    Спомагателни газове

2.2.1.

Водород (чистота ≥ 99,9 %), свободен от органични онечиствания.

2.2.2.

Въздух или кислород, свободен от органични онечиствания.

2.2.3.

Азот (чистота > 99 %).

2.3.    Референтен еталон

Смес от метилови естери на чисти мастни киселини или метиловите естери на мазнина с известен състав, за предпочитане сходен с този на мастното вещество, което ще се анализира. Цис- и транс- изомерите на метилови естери на октадеценова, октадекадиенова и октадекатриенова киселина са полезни за идентифициране на транс-изомери на ненаситени киселини.

Трябва да се вземат мерки за предотвратяване на окисляването на полиненаситените мастни киселини.

3.   АПАРАТУРА

Дадените инструкции се отнасят до обикновеното оборудване, използвано за газова хроматография, включващо капилярни колонки и пламъчно-йонизационен детектор.

3.1.    Газов хроматограф

Газовият хроматограф се състои от следните елементи.

3.1.1.    Система за инжектиране

Използва се инжекционна система с капилярни колонки, като в този случай системата за инжектиране следва да е специално проектирана за използване с такива колонки. Тя може да е с колонен инжектор от тип със или без разделяне на пробата.

3.1.2.    Пещ

Пещта трябва да е в състояние да нагрява капилярната колонка до температура от поне 260 °С и да поддържа желаната температура с точност до 0,1°С. Последното изискване е особено важно, когато се използва епруветка от кварц.

Използването на програмирано температурно нагряване се препоръчва във всички случаи и в частност за мастни киселини с по-малко от 16 въглеродни атома.

3.1.3.    Капилярна колона

3.1.3.1.

Тръба, изготвена от материал, инертен към веществата, които ще се анализират (обикновено от стъкло или кварц). Вътрешният диаметър трябва да е между 0,20 и 0,32 mm. Вътрешната повърхност следва да се обработи по подходящ начин (напр. подготовка на повърхността, инактивация), преди да се запълни с покритието от неподвижната фаза. Дължина 60 m е достатъчна за мастни киселини и цис- и транс- изомери на мастните киселини.

3.1.3.2.

Подходящи са колонки с неподвижна фаза полярен полисилоксан (цианопропилсиликон) омрежен (напречно свързан). Бележка 2:  Съществува риск полярните полисилоксани да създадат трудности при разпознаването и разделянето на линоленовата киселина и киселините с С20. Покритието трябва да е тънко, т.е. 0,1 до 0,2 μm.

3.1.3.3.

Сглобяване и кондициониране на колонката Спазват се нормалните мерки за безопасност при сглобяване на капилярните колонки, т.е. подреждането на колонката в пещта (носител), избор и сглобяване на свръзките (плътност за недопускане на изтичане), поставяне на краищата на колонката в инжектора и детектора (намаляване на мъртвите обеми). Поставя се колонката под поток от газ носител (напр. 0,3 bar (30 kPa) за колонка с дължина 25 m и вътрешен диаметър 0,3 mm). Колонката се кондиционира чрез програмиране на пещта за повишаване на температурата в сравнение с околната с 3 °С/min до температура с 10 °С по-ниска от границата за разграждане на неподвижната фаза. Поддържа се температурата на пещта в продължение на един час до стабилизиране на базисната линия. Понижава се до 180 °C за работа при изотермални условия. Бележка 3:  Предварително кондиционирани по подходящ начин колонки се предлагат в търговската мрежа.

3.1.4.    Пламъчно-йонизационен детектор и усилвателен преобразувател.

3.2.    Спринцовка

Спринцовката трябва да има максимална вместимост 10 μl и да е градуирана на деления от 0,1 μl.

3.3.    Система за събиране на данни

Система за събиране на данни, свързана онлайн с детекторите и използвана със софтуерна програма, подходяща за интегриране на пиковете и нормализиране.

4.   ПРОЦЕДУРА

Дейностите, описани в точки 4.1.—4.3, се отнасят до използването на пламъчно-йонизационен детектор.

4.1.    Условия на изпитване

4.1.1.    Избор на оптимални условия на работа за капилярни колони

Предвид ефикасността и пропускливостта на капилярните колонки разделянето на различните съставки и времетраенето на анализа в голяма степен зависят от скоростта на потока на газа носител в колонката. Следователно ще е необходимо да се оптимизират условията на работа чрез коригиране на този параметър (или просто — към намаляване на налягането на колонката) в зависимост от това дали се цели подобряването на разделянето или извършването на по-бърз анализ.

Следните условия се оказаха подходящи за разделяне на метилови естери на мастни киселини (C4—C26). Примери на хроматограми са показани в допълнение Б:

4.1.2.    Определяне на разделителната способност (вж. допълнение А)

Изчисляване на разделителната способност R, на два съседни пика I и II, използвайки формулата:

R = 2 × ((dr(II) – dr(I) )/(ω(I) ω(II))) или R = 2 × ((tr(II) – tr(I) )/(ω(I) ω(II))) (USP) (Фармакопея на САЩ),

или

R = 1,18 × ((tr(II) – tr(I))/(ω0,5(I) + ω0,5(II))) (EP, BP, JP, DAB), (JP (Фармакопея на Япония), EP (Европейска фармакопея), (BP (Фармакопея на Великобритания)

където:

Ако ω(I) ≈ ω(II), да се изчисли R, като се използват следните формули:

R = (dr(II) – d r(I))/ω = (dr(II) – d r(I))/4σ

където:

σ е стандартното отклонение (вж. допълнение А, фигура 1).

Ако разстоянието dr между двата пика d r(II) – d r(I) е равно на 4σ, разделителната способност R = 1.

Ако два пика не са напълно разделени, допирателните към инфлексните точки на двата пика се пресичат в точка C. За да бъдат напълно разделени двата пика, разстоянието между тях трябва да бъде равно на:

d r(II) – d r(I) = 6 σ откъдето R = 1,5 (вж. допълнение A, фигура 3).

5.   ИЗРАЗЯВАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ

5.1.    Качествен анализ

Разпознават се пиковете на метиловите естери за пробата от хроматограмата в допълнение Б, фигура 1, ако е необходимо чрез интерполация или чрез сравнение с тези на референтните смеси на метиловите естери (както е посочено в точка 2.3).

5.2.    Количествен анализ

5.2.1.    Определяне на състава

Изчислява се масовата част w i на отделните метилови естери на мастни киселини, изразена в проценти от масата на метиловите естери, както следва:

5.2.2.    Метод на изчисляване

5.2.2.1.   Общ случай

Изчислява се съдържанието на даден компонент i, изразено в проценти от масата на метиловите естери, чрез определянето на процента, представляващ площта на съответния пик, отнесена към сбора от площите на всички пикове, при използване на следната формула:

wi = (Αi/ΣΑ) × 100

където:

Резултатите се изразяват с точност до две цифри след десетичната запетая.

5.2.2.2.   Използване на корекционни коефициенти

В определени случаи, например при наличието на мастни киселини с по-малко от осем въглеродни атома или на киселини с вторични групи, площите се коригират със специфични корекционни коефициенти (Fci). Тези коефициенти се определят за всеки един инструмент. За тази цел трябва да се използват подходящи референтни материали със сертифициран състав на мастни киселини в съответния обхват.

За тази референтна смес, процентното съотношение на метилов естер на мастни киселини i е представено от формулата:

wi = (mi /Σm) × 100

където:

От хроматограмата на референтната смес се изчислява процентът на площта за метилов естер на мастни киселини i както следва:

wi = (Αi/ΣΑ) × 100

където:

Съответно корекционният коефициент Fc е

Fc = (mi × ΣΑ)/(Αi/Σm)

За извадката, процентът от масата на всеки метилов естер на мастни киселини i е:

wi = (Fi × Αi)/Σ (Fi × Αi)

Резултатите се изразяват до две цифри след десетичната запетая.

5.2.2.3.   Използване на вътрешен стандарт

При определени анализи (например, когато не са определени количествено всички мастни киселини, например когато има наличие на киселини с четири и шест въглеродни атома, наред с киселини с 16 и 18 въглеродни атома, или когато е необходимо да се определи абсолютното количество на някоя мастна киселина в дадена проба) е необходимо да се използва вътрешен стандарт. Често се използват мастни киселини с 5, 15 или 17 въглеродни атома. Трябва да се определи корекционният коефициент (ако има такъв) за вътрешния стандарт.

Процентното съотношение по маса на компонента i, изразено като метилови естери, тогава се дава чрез формулата:

wi = (mIS × Fi × Ai)/(m × FIS × AIS)

където:

Резултатите се изразяват с точност до две цифри след десетичната запетая.

6.   ПРОТОКОЛ ОТ ИЗПИТВАНЕТО

Протоколът от изпитването следва да описва методите, използвани за приготвянето на метиловите естери и за анализа чрез газова хроматография. Също така той трябва да включва всички подробности около извършването, които не са упоменати в настоящия стандартен метод, или разгледани като незадължителни, както и подробности относно всички инциденти, които може да са повлияли на резултатите.

Протоколът от изпитването трябва да съдържа всички необходими данни за пълната идентификация на пробата.

7.   ТОЧНОСТ

7.1.    Резултати от междулабораторно изпитване

Подробности за междулабораторно изпитване относно прецизността на метода са дадени в приложение В към стандарт IOC/T.20/Doc. № 33. Стойностите, получени от това междулабораторно изпитване може да не са приложими към концентрационни обхвати и матрици, различни от посочените.

7.2.    Повторяемост

Абсолютната разлика между два независими единични резултата от изпитване, получени чрез използването на един и същ метод върху идентичен изпитван материал, в една и съща лаборатория, от един и същ оператор, чрез използването на едно и също оборудване, в кратък интервал от време, не трябва да надвишава в повече от 5 % от случаите r от таблиците 1—14 в приложение В към стандарт IOC/T.20/Doc. № 33.

7.3.    Възпроизводимост

Абсолютната разлика между два независими единични резултата от изпитване, получени чрез използването на един и същ метод върху идентичен изпитван материал, в различни лаборатории, от различни оператори, чрез използването на различно оборудване, не трябва да надвишава в повече от 5 % от случаите R от таблиците 1—14 в приложение В към стандарт IOC/T.20/Doc. № 33.

---

Допълнение A

Фигура 1

ω0.5 е широчината при средата на височината на триъгълника (ABC) и b е широчината при средата на височината на триъгълника (NPM).

---

Допълнение Б

Фигура 1

Газово-хроматографски профил, получен по метода на метилиране на студено от маслиново масло от остатъчен материал.

Хроматографските пикове съответстват на метиловите и етиловите естери, освен ако е посочено друго.

▼B

---

ПРИЛОЖЕНИЕ XI

ОПРЕДЕЛЯНЕ СЪДЪРЖАНИЕТО НА ЛЕТЛИВИТЕ ХАЛОГЕНИРАНИ РАЗТВОРИТЕЛИ В МАСЛИНОВОТО МАСЛО

1.   МЕТОД

Газов хроматографски анализ по способа на височинния газов обем.

2.   ОБОРУДВАНЕ

2.1.	Апарат за газова хроматография с детектор за улавяне на електрони (ДУЕ).

2.2.	Апарат за височинен газов обем.

2.3.	Газовохроматографска колонка, стъклена, с дължина 2 m и диаметър 2 mm, неподвижна фаза. OV101 10 % или еквивалентен за импрегниране на калцирана инфузорна почва, промита с киселина и силанизирана, с размер на частиците между 80 и 100 mesh.

2.4.	Пренасящи и спомагателни газове: азот за газова хроматография, подходящ за разпознаване чрез електронно улавяне.

2.5.	Стъклени колби, от 10 до 15 ml, с тефлоново покритие и алуминиеви тапи, и приспособление за вкарване на спринцовка.

2.6.	Щипки за херметично затваряне.

2.7.	Газова спринцовка, от 0,5 до 2 ml.

3.   РЕАКТИВИ

Стандартни: халогенирани разтворители със степен на чистота, подходящи за газова хроматография.

4.   ХОД НА ОПИТА

4.1.

Претеглят се точно 3 g масло в стъклена колба (която няма да се използва повече); затваря се херметично. Поставя се в термостат при 70 °C за един час. Като се използва спринцовка, внимателно се отнемат 0,2 до 0,5 ml от височинния обем. Инжектира се в колонката на газовия хроматографски апарат, настроен както следва: — температура на инжектора: 150 °C; — температура на колонката: 70 до 80 °C; — температура на детектора: 200 до 250 °C. Могат да се използват и други температурни стойности, стига резултатът да остане еквивалентен.

4.2.	Референтни разтвори: подготвят се стандартни разтвори като се използва рафинирано маслиново масло без следи от разтворители с концентрации от 0,05 до 1 ppm (mg/kg), които да съответстват на предполагаемото съдържание на пробата. Халогенираните разтворители могат да се разреждат с пентан.

4.3.

Количествено измерване: изчислява се съотношението между повърхностите или покачванията на пиковете на пробата и стандартния разтвор с предполагаема най-близка концентрация. Ако отклонението е по-голямо от 10 %, анализът трябва да се повтори, като се проведе сравнение с друг стандартен разтвор, докато отклонението се сведе в рамките на 10 %. Съдържанието се определя въз основа на средната стойност от отделните инжектирания.

4.4.	Изразяване на резултатите: в ppm (mg/kg). Границата на разпознаване по този метод е 0,01 mg/kg.

▼M26

---

ПРИЛОЖЕНИЕ XII

МЕТОД ЗА ОРГАНОЛЕПТИЧНА ОЦЕНКА НА НЕОБРАБОТЕНО МАСЛИНОВО МАСЛО НА МЕЖДУНАРОДНИЯ СЪВЕТ ЗА МАСЛИНОВИТЕ ПРОДУКТИ (IOC)

▼M28

1.   ЦЕЛ И ОБХВАТ

Целта на описания в настоящото приложение международно използван метод е да се установи процедурата за оценка на органолептичните характеристики на необработеното маслиново масло по смисъла на част VIII, точка 1 от приложение VII към Регламент (ЕС) № 1308/2013 на Европейския парламент и на Съвета ( 4 ) и да се определи методът за неговото класифициране въз основа на посочените характеристики. Методът съдържа също така указания за незадължително етикетиране.

Описаният метод се прилага само за необработеното маслиново масло и за неговото класифициране или етикетиране в зависимост от интензитета на разграничените недостатъци и на плодовия аромат, определени от група подбрани, обучени и проверени дегустатори, които работят в група.

Посочените в настоящото приложение стандарти на IOC се използват в тяхната последна налична редакция.

▼M26

2.   ОСНОВНИ ОБЩИ ПОНЯТИЯ, ИЗПОЛЗВАНИ ПРИ СЕТИВНИЯ АНАЛИЗ

Вж. стандарт IOC/T.20/Doc. № 4 — „Сетивен анализ — основни общи понятия“

3.   СПЕЦИФИЧНИ ПОНЯТИЯ

3.1.    Отрицателни признаци

▼M28

3.1.1.    Други отрицателни признаци

3.2.    Положителни признаци

▼M29

3.3.    Незадължителни понятия за целите на етикетирането

При поискване ръководителят на групата дегустатори може да удостовери, че оценените масла съответстват на определенията и скалите, които отговарят единствено на посочените по-долу термини в зависимост от интензитета и възприятието на признаците.

Положителни признаци (плодов аромат, горчивина и стипчивост): в зависимост от интензитета на възприемане:

Плодов аромат

Съвкупност от характерни за маслото обонятелни възприятия, която зависи от сорта маслини, произхожда от здрави и пресни маслини и в която не преобладава вкусът нито на зелените, нито на зрелите маслини. Тя се възприема пряко и/или ретроназално.

Вкус на зелени маслини

Съвкупност от характерни за маслото обонятелни възприятия, която напомня зелени плодове, зависи от сорта маслини и произхожда от здрави и пресни зелени маслини. Тя се възприема пряко и/или ретроназално.

Вкус на зрели маслини

Съвкупност от характерни за маслото обонятелни възприятия, която напомня зрели плодове, зависи от сорта маслини и произхожда от здрави и пресни маслини. Тя се възприема пряко и/или ретроназално.

Добре балансирано

Масло, което не показва липса на баланс, т.е. обонятелно–вкусово и допирно усещане, при което медианата на признака „горчивина“ и тази на признака „стипчивост“ са с не повече от 2 пункта по-високи от медианата на признака „плодов аромат“.

Масло с мек вкус

Масло, за което медианата на признаците „горчивина“ и „стипчивост“ е равна на 2 или е по-ниска.

Списък на термините в зависимост от интензитета на възприемане:

▼M26

4.   ЧАША ЗА ДЕГУСТАЦИЯ НА МАСЛИНОВО МАСЛО

Вж. стандарт IOC/T.20/Doc. № 5 — „Чаша за дегустация на маслиново масло“

5.   ИЗПИТВАТЕЛНО ПОМЕЩЕНИЕ

Вж. стандарт IOC/T.20/Doc. № 6 — „Ръководство за оборудване на изпитвателното помещение“

6.   ПОМОЩНИ СРЕДСТВА

Описаните по-долу помощни средства, необходими за правилното изпълнение на поставените на дегустаторите задачи, трябва да са налице във всяка от кабините и до тях да е осигурен лесен достъп:

7.   ГРУПА ДЕГУСТАТОРИ — РЪКОВОДИТЕЛ И УЧАСТНИЦИ

7.1.    Ръководител на групата

Ръководителят на групата трябва да е преминал подходящо обучение и да разполага с експертни знания за видовете масла, на които ще попада по време на работата си. Той е основната фигура в групата и отговаря за нейната организация и функциониране.

За работата на ръководителя на групата дегустатори е необходимо основно обучение в инструментите за сетивен анализ, сетивни умения, щателен подход към подготовката, организацията и провеждането на изпитванията, както и умения и търпение за планирането и научното провеждане на изпитванията.

Ръководителят единствен носи отговорност за подбора, обучението и наблюдението на дегустаторите с оглед установяване на тяхното ниво на компетентност. Поради това негова отговорност е да поставя оценка на дегустаторите, която трябва винаги да е обективна; за целта той разработва специфични процедури, основани на изпитвания и солидни критерии за приемане и отхвърляне. Вж стандарт IOC/T.20/Doc. № 14 — „Ръководство за подбор, обучение и наблюдение на квалифицирани дегустатори на необработено маслиново масло“.

Ръководителят на групата отговаря за качеството на нейната работа, а оттам — и за оценката на нейните членове, във връзка с която трябва да предостави надеждни и обективни доказателства. При всички случаи той трябва да е в състояние да докаже във всеки един момент своя контрол върху прилагания метод и върху дегустаторите. Препоръчва се групата дегустатори да се подлага на периодично калибриране (IOC/T.20/Doc. № 14 § 5).

Ръководителят е изцяло отговорен за воденето на отчетността на групата. Отчетността трябва да е винаги проследима. Ръководителят трябва да осигури спазването на изискванията за гаранции и качество, определени в международните стандарти за сетивен анализ, както и анонимността на пробите по всяко време.

Ръководителят отговаря за инвентаризацията и гарантира, че апаратурата и оборудването, които са необходими за спазването на спецификациите на този метод, са добре почистени и поддържани, и съхранява писмени доказателства за това, както и за спазването на условията за провеждане на изпитването.

Ръководителят отговаря за приемането и съхраняването на пробите при пристигането им в лабораторията, както и за тяхното съхраняване след провеждане на изпитването. Във връзка с това той гарантира във всеки един момент, че пробите остават анонимни и са надлежно съхранени, като за тази цел трябва да разработи писмени процедури, гарантиращи проследимостта и надеждността на целия процес.

Наред с това ръководителят отговаря за изготвянето, кодирането и представянето на пробите на дегустаторите съгласно подходящ план на изследването в съответствие с предварително установени протоколи, както и за събирането и статистическата обработка на получените от дегустаторите данни.

Ръководителят отговаря за разработването и изготвянето на всички други процедури, които могат да се окажат необходими за допълване на този стандарт и за осигуряване на правилното функциониране на групата.

Ръководителят трябва да потърси начини за сравнение на получените от групата резултати с резултатите, получени от други групи за анализ на необработено маслиново масло, за да установи дали групата функционира правилно.

Ръководителят на групата дегустатори е длъжен да мотивира нейните членове, като насърчава интереса, любознателността и духа на състезателност сред тях. С оглед на това настоятелно се препоръчва да се осигури безпрепятствен двупосочен поток на информация с членовете на групата, като им се предоставя информация за всички възложени задачи и за получените резултати. Наред с това ръководителят взема мерки становището му да не става известно и се грижи по-активните членове на групата да не налагат своите критерии над останалите дегустатори.

Ръководителят свиква дегустаторите достатъчно рано и отговаря на запитвания относно провеждането на изпитванията, но се въздържа от каквото и да било становище относно пробите.

▼M28

7.1.1.    Заместник ръководител на групата

Ръководителят на групата може, по обосновани съображения, да бъде заменен от заместник ръководител на групата, който може да поеме задълженията относно провеждането на изпитванията. Този заместник трябва да разполага с всички необходими умения, които се изискват от ръководител на група.

▼M28

7.2.    Дегустатори

Лицата, работещи като дегустатори при органолептични изпитвания на маслинови масла, трябва да го правят на доброволна основа. Поради това се препоръчва кандидатите да подадат заявление в писмена форма. Те се подбират, обучават и наблюдават от ръководителя на групата в съответствие с уменията им да разграничават сходни проби; трябва да се има предвид, че точността им се подобрява чрез обучение.

Дегустаторите трябва да действат като обективни наблюдатели на органолептичните качества, като се абстрахират от личните си вкусове и отчитат единствено своите възприятия. За тази цел те трябва винаги да работят в мълчание, на спокойствие и без да бързат, като обръщат възможно най-голямо внимание на органолептичните качества на дегустираната проба.

За всяко изпитване са необходими между 8 и 12 дегустатори, но е разумно да има няколко резервни, които да заместят евентуалните отсъстващи.

▼M26

8.   УСЛОВИЯ ЗА ПРОВЕЖДАНЕ НА АНАЛИЗА

8.1.    Представяне на пробата

Пробата маслиново масло за анализ се представя в стандартни чаши за дегустация, отговарящи на стандарт IOC/T.20/Doc. № 5 — „Чаша за дегустация на маслиново масло“.

Чашата трябва да съдържа 14—16 ml масло (или 12,8—14,6 g, ако пробите се претеглят) и да е покрита с часовниково стъкло.

Всяка чаша е обозначена с код, съставен от цифри или комбинация от букви и цифри, избрани на случаен принцип. Кодът се поставя посредством безмирисна технология.

8.2.    Температура на изпитвателното помещение и на пробите

По време на цялото изпитване предназначените за дегустация проби маслиново масло се съхраняват в чашите при температура 28 °C ± 2 °C. Тази температура е избрана, тъй като при нея наблюдението на органолептичните различия се извършва по-лесно, отколкото при стайна температура, и защото при по-ниски температури характерните за тези масла ароматни съединения се изпаряват слабо, докато по-високите температури благоприятстват образуването на летливи съединения, специфични за нагретите масла. Вж. стандарт IOC/T.20/Doc. № 5 — „Чаша за дегустация на маслиново масло“ относно метода, който трябва да се използва за нагряването на поставените в чашата проби.

Температурата на изпитвателното помещение трябва да е между 20 °C и 25 °C (вж. IOC/T.20/Doc. № 6).

8.3.    Време за провеждане на анализите

Най-подходящото време за дегустация на масла е сутрин. Доказано е, че през деня има периоди на оптимална сетивност по отношение на вкуса и обонянието. В периода преди хранене обонятелно-вкусовата възприемчивост нараства, докато след хранене тя намалява.

С този критерий обаче не бива да се злоупотребява, тъй като е възможно чувството за глад да отклони дегустаторите от задачата им и да намали способността им да разграничават отделните проби; поради това се препоръчва дегустациите да се извършват между 10 часа сутринта и 12 по пладне.

8.4.    Общи правила за поведение на дегустаторите

Изброените по-долу препоръки се отнасят за поведението на дегустаторите по време на работата им.

Когато дегустаторите получат покана от ръководителя на групата да участват в органолептично изпитване, те трябва да са в състояние да се явят в уговореното време и да спазват следните изисквания:

9.   ПРОЦЕДУРА ОТНОСНО ОРГАНОЛЕПТИЧНАТА ОЦЕНКА И КЛАСИФИКАЦИЯТА НА НЕОБРАБОТЕНОТО МАСЛИНОВО МАСЛО

9.1.    Начин на дегустация

▼M29

▼M26

9.2.    Попълване на профилиращия лист от страна на дегустаторите

Профилиращият лист, попълван от дегустаторите, е посочен във фигура 1 от настоящото приложение.

Всеки дегустатор от групата помирисва и вкусва ( 5 ) изследваното масло. След това отбелязва интензитета, с който възприема всеки от отрицателните и положителните признаци, по 10-сантиметровата скала, фигурираща върху предоставения профилиращ лист.

Ако дегустаторът установи наличието на отрицателни признаци, които не са изброени в раздел 4, той ги записва в графата „други“, като използва понятието или понятията, описващи най-точно тези признаци.

▼M28

9.3.    Използване на данните от страна на ръководителя на групата

Ръководителят на групата събира профилиращите листове, попълнени от всеки дегустатор, и преглежда вписаните данни за интензитета по отношение на различните признаци. Ако установи аномалия, той приканва съответния дегустатор да преразгледа своя профилиращ лист и при необходимост да повтори изпитването.

Ръководителят на групата въвежда записаните от всеки дегустатор данни относно оценката в компютърна програма като предвидената в стандарт IOC/T.20/Doc. № 15, с цел статистическо изчисление на резултатите от анализа чрез изчисляване на тяхната медианна стойност. Вж. точка 9.4 и допълнението към настоящото приложение. Данните за дадена проба се вписват с помощта на матрица, която включва 9 колони, представляващи 9-те сетивни признака, и n на брой редове, представляващи участвалите n на брой дегустатори.

Когато най-малко 50 % от дегустаторите установят и запишат даден недостатък в графата „други“, ръководителят на групата изчислява медианата на този недостатък и изготвя съответната класификация.

Стойността на устойчивия коефициент на вариация, който определя класификацията (недостатък с най-силен интензитет и признак „плодов аромат“), не трябва да надвишава 20 %.

В противен случай ръководителят на групата трябва да повтори оценката на конкретната проба в рамките на друга дегустация.

При често възникване на такива случаи се препоръчва ръководителят на групата да организира специализирано допълнително обучение за дегустаторите (IOC/T.20/Doc. № 14, параграф 5) и да използва показателите за повторяемост и отклонение, за да провери работата на дегустатора (IOC/T.20/Doc. № 14, параграф 6).

▼M29

9.4.    Класификация на маслото

Маслото се класифицира в зависимост от медианата на недостатъците и медианата на признака „плодов аромат“. Медианата на недостатъците се определя като медианата на недостатъка, който се възприема с най-висок интензитет. Медианата на недостатъците и медианата на признака „плодов аромат“ се посочват с точност до един знак след десетичната запетая.

Класифицирането на маслото се осъществява, като се съпоставят стойностите на медианата на недостатъците и на медианата на признака „плодов аромат“ с референтните скали, посочени по-долу. Тъй като грешката на метода е взета предвид при определянето на границите на тези скали, те се считат за абсолютни. Използваните компютърни програми онагледяват класифицирането във вид на таблица със статистически данни или на графика.

▼M29

9.5    Критерии за приемане и отхвърляне на повторения

Нормализираната грешка, определена по-долу, се използва, за да се определи дали двата резултата от анализа с две повторения са хомогенни или статистически приемливи:

където Me1 и Me2 са медианите на двете повторения (съответно първи и втори анализ), а U1 и U2 са разширените неопределености, получени за двете стойности, изчислени както е посочено в допълнението, както следва:

U 1 = c × s* и

За разширената неопределеност c = 1,96; откъдето:

U1 = 0,0196 × CVr × Me1

където CVr е устойчивият коефициент на вариация.

За да бъде посочено, че двете получени стойности не са със статистически значими различия, En трябва да е по-малка или равна на 1,0.

▼M26

---

Допълнение

Метод за изчисляване на медианата и на доверителните интервали

Медиана

Медианата се определя като реално число Xm, което се характеризира от факта, че вероятността (p) стойностите на разпределение (X) да са по-ниски от въпросното число (Xm) е равна на 0,5 или по-малка, като същевременно вероятността (p) стойностите на разпределение (X) да са равни на Xm или по-ниски, е равна на 0,5 или по-голяма. Съгласно по-практично определение медианата представлява 50-ият процентил на разпределението на числа, подредени по възходящ ред. С други думи, тя е средната точка на последователна съвкупност от нечетен брой числа или средната стойност на двете средни точки на последователна съвкупност от четен брой числа.

Устойчиво стандартно отклонение

С оглед да се постигне надеждна приблизителна оценка на отклоненията от средната стойност е необходимо да се прибегне до метода на устойчивото стандартно отклонение на Stuart и Kendall (4). Формулата се отнася за асимптотичното устойчиво стандартно отклонение, т.е. устойчивата приблизителна оценка на отклонението на разглежданите данни, където N е броят наблюдения, а IQR — интерквартилният размах, който обхваща точно 50 % от случаите при разпределение с дадена вероятност:

Интерквартилният размах се получава, като се изчисли разликата между 75-ия и 25-ия процентил.

където процентилът е стойността Xpc, която се характеризира от факта, че вероятността (p) разпределените стойности да са по-ниски от Xpc е равна на специфична процентна стойност или по-малка, като същевременно вероятността (p) разпределените стойности да са равни на Xpc или по-малки е по-голяма или равна на тази на специфичната процентна стойност. Тази процентна стойност указва използваната част от разпределението. Конкретно за медианата тя е равна на 50/100.

За практически цели процентилът е стойността на разпределение, отговаряща на определена площ, очертана от кривата на разпределение или на плътност. Например 25-ият процентил представлява стойността на разпределение, отговаряща на област, равна на 0,25 или 25/100.

При този метод процентилите се изчисляват въз основа на реалните стойности, използвани в матрицата на данните (метод за изчисляване на процентилите).

Устойчив коефициент на вариация (%)

Устойчивият коефициент на вариация (CVr%) представлява безразмерно число, което указва процента на отклонение на съвкупността от анализирани числа. Ето защо той е много полезен за проверката на надеждността на оценителите в групата.

Доверителни интервали на медианата при 95 %

Доверителните интервали при 95 % (стойност на грешката от първи род, равна на 0,05 или 5 %) са интервалите, в които стойността на медианата може да се променя при хипотезата, че е възможно опитът да бъде повторен неограничен брой пъти. В практиката те указват интервала на отклонение при изпитването в приетите условия на работа и при хипотезата, че то може да бъде повторено неограничен брой пъти. Както при случая със CVr% интервалът помага да се оцени надеждността на изпитването.

където C = 1,96 за доверителен интервал при равнище 95 %.

Пример за изчислителна таблица е представен в приложение I към стандарт IOC/T 20/Doc. № 15.

Литература

▼M20 —————

▼M19 —————

▼B

---

ПРИЛОЖЕНИЕ XV

1.   МАСЛЕНО СЪДЪРЖАНИЕ НА ОСТАТЪЧНИЯ МАТЕРИАЛ

1.1.   Апаратура

1.2.   Реактив

Нормален хексан за технически цели, който след пълно изпаряване трябва да има остатък от по-малко от 0,002 g на 100 ml.

2.   ХОД НА ОПИТА

2.1.   Подготовка на опитната проба

Ако е необходимо се използва механичната мелница, която е била добре почистена предварително, за смилане на лабораторната проба с оглед на раздробяването ѝ до частици, които да могат напълно да преминават през ситото.

Използва се една двадесета от пробата за завършване на процеса по почистване на мелницата, раздробеният материал се отстранява, остатъкът се смила и събира, смесва се внимателно и се анализира незабавно.

2.2.   Размер на пробата

Веднага след извършването на операцията по смилане, се измерват около 10 g от пробата с точност до 0,01 g за извършване на опита.

2.3.   Подготовка на екстракционната гилза

Поставя се частта от пробата в гилзата и се запушва с памук. Ако се използва филтърна хартия, частта от пробата се обвива в нея.

2.4.   Предварително изсушаване

Ако остатъците от преработката на маслини са много влажни (т.е. съдържанието на влага и летливи вещества е повече от 10 %), се извършва предварително изсушаване чрез поставяне на заредената гилза (или филтърна хартия) в нагрятата пещ за подходящо време при не повече от 80 °С с оглед на намаляването на съдържанието на влага и летливи вещества до по-малко от 10 %.

2.5.   Подготовка на колбата с кръгло дъно

Претегля се с точност до 1 mg колбата, съдържаща една или две частици пемза, предварително изсушена в пещта при 103 ± 2 °С и след това охладена в десикатор за не по-малко от един час.

2.6.   Първоначална екстракция

В апарата за екстракция се поставя гилзата (или филтърната хартия), съдържаща частта от пробата. Налива се в колбата необходимото количество хексан. Свързва се колбата с апарата за екстракция и цялата система се поставя в банята с електрическо подгряване. Настройва се скоростта на подгряване по такъв начин, че скоростта на оросяване да не е по-малка от три капки за секунда (средно, не силно кипене). След екстракция в продължение на четири часа, се оставя да се охлади. Гилзата се отстранява от апарата за екстракция и се поставя под въздушна струя с оглед на издухване на влагата от импрегниращия разтворител.

2.7.   Повторна екстракция

Изтърсва се съдържанието на гилзата в миксер и се смила възможно най-фино. Връща се смляната смес в гилзата без загуби и тя се поставя отново в апарата за екстракция.

Екстракцията се продължава за още два часа, като се използва същата колба с кръгло дъно, която съдържа първоначалния екстракт.

Полученият разтвор в екстракционната колба трябва да е бистър. Ако не е, се филтрира през филтърна хартия, а колбата, в която е бил, и филтърната хартия се промиват няколко пъти с хексан. Филтратът и промивният разтворител се събират в друга колба с кръгло дъно, която е била изсушена и тарирана с точност до 1 mg.

2.8.   Премахване на разтворителя и претегляне на екстракта

По-голямата част от разтворителя се премахва чрез дестилация в баня с електрическо подгряване. Последните следи от разтворителя се премахват чрез нагряване на колбата в пещта при 103 ± 2 °С за 20 минути. Процесът на елиминация се подпомага или чрез продухване с въздух, или за предпочитане с инертен газ, през определени периоди от време, или чрез използването на ниско налягане.

Колбата се поставя в десикатор за охлаждане за поне един час и се претегля с точност до 1 mg.

Нагрява се отново в продължение на 10 минути при същите условия, охлажда се в десикатор и се претегля.

Разликата между двете измервания не трябва да превишава 10 mg. Ако превишава, се нагрява отново за периоди от 10 минути, последвани от охлаждане и претегляне докато разликата в теглата стане 10 mg или по-малко. Отбелязва се последното тегло на колбата.

Провеждат се дублиращи определяния на опитната проба.

3.   ИЗРАЗЯВАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ

3.1.   Метод за изчисляване и формула

3.2.   Повторяемост

Разликата между едновременно или бързо едно след друго проведените от същия аналитик дублиращи определяния не трябва да превишава 0,2 g хексанов екстракт на 100 g от пробата.

Ако това условие не е удовлетворено, анализът се повтаря с други две опитни части. Ако и в този случай разликата превишава 0,2 g, за резултат се приема средното аритметично от четирите определяния.

---

ПРИЛОЖЕНИЕ XVI

ОПРЕДЕЛЯНЕ НА ЙОДНОТО ЧИСЛО

1.   ОБХВАТ

Настоящият Международен стандарт определя метод за определянето на йодното число на животинските и растителни мазнини и масла, наричани по-долу мазнини.

2.   ОПРЕДЕЛЕНИЕ

За целите на Международния стандарт се прилага следното определение:

2.1.	йодно число. Масата на абсорбирания от пробата йод при условията на работа, определени в настоящия Международен стандарт. Йодното число се изразява в грамове йод на 100 g от пробата.

3.   ПРИНЦИП

Разтварянето на част от пробата в разтворител и добавяне на реактива на Вийс. След определено време, добавяне на разтвор на калиев йодид и вода и титруване с разтвор на натриев тиосулфат.

4.   РЕАКТИВИ

Всички реактиви трябва да са с признато за аналитични цели качество:

4.1.	вода, в съответствие с изискванията на ISO 3696, Качество 3.

4.2.	калиев йодид, разтвор от 100 g/l, който не съдържа йодат или свободен йод.

4.3.	скорбяла, разтвор. Смесват се 5 g разтворима скорбяла с 30 ml вода, тази смес се прибавя към 1 000 ml кипяща вода, вари се в продължение на три минути и се оставя да се охлади.

4.4.	натриев тиосулфат, стандартен волуметричен разтвор c(Na2S2O3.5H2O) = 0,1 mol/l, стандартизиран не повече от седем дни преди употреба.

4.5.	разтворител, приготвен чрез смесването на равни обеми циклохексан и оцетна киселина.

4.6.	реактив на Вийс, съдържащ йоден монохлорид в оцетна киселина. Следва да се използва реактив на Вийс от търговската мрежа.

5.   АПАРАТУРА

Обикновена лабораторна апаратура и, по-специално, следното:

5.1.	стъклени мерителни лъжички, подходящи за частта от пробата и за поставяне в колбите (5.2.).

5.2.	ерленмайерови колби, с вместимост 500 ml, снабдени със запушалки от шлифовано стъкло и напълно сухи.

6.   ПОДГОТОВКА НА ПРОБАТА

Хомогенизираната проба се подсушава върху натриев сулфат и се филтрира.

7.   ХОД НА ОПИТА

7.1.

Част от пробата Масата на частта от пробата варира в зависимост от очакваното йодно число, както е показано в таблица 1. Таблица 1 Очаквано йодно число Маса на пробата (g) по-малко от 5 3,00 5 до 20 1,00 21 до 50 0,40 51 до 100 0,20 101 до 150 0,13 151 до 200 0,10 Тегло на пробата с точност до 0,1 mg в стъклена мерителна чашка (5.1)

7.2

Определяне Пробата се поставя в колба от 500 ml (6.2.). Добавя се 20 ml Разтвор (4.5), за да се разтворят мазнините. Добавят се точно 25 ml от реактива на Вийс (4.6.), слага се запушалка, разклаща се съдържанието и колбата се поставя на тъмно. Не се използва пипета за устно подаване за реактива на Вийс. По същия начин се приготвя празна проба с разтворител и реактив, без изпитна проба. Проби, които имат йоден клапан под 150, колбите се оставят на тъмно за един час; за тези с йоден клапан над 150 и за полимеризирани продукти или продукти, окислени в значителна степен, се оставят за два часа. Към края се добавя 20 ml калиево-йоден разтвор (4.2.) и 150 ml вода (4.1.) към всяка колба. Титрува се с стандартен обемен разтвор от содиев триофосфат (4.4.), докато жълтият цвят дължащ се на йода почти изчезне. Добавят се няколко капки от разтвор на скорбяла (4.3.) и титруването продължава, докато синият цвят изчезне след енергично разклащане. Бележка: Допуска се потенциометрично определяне в крайната точка.

7.3.	Брой на определянията Правят се две определяния на същата проба.

8.   ИЗРАЗЯВАНЕ НА РЕЗУЛТАТА

Йодният клапан се изразява чрез израза

където:

c = е цифровата стойност на точната концентрация, в мол на литър, на използвания стандартен обемен содиев триофосфатен разтвор (4.4.).

V1 = е цифровата стойност на обема, в милилитри, на стандартния обемен содиев триофосфатен разтвор (4.4.), използван за празната проба.

V2 = е цифровата стойност на обема в милилитри, на стандартния обемен содиев триофосфатен разтвор (4.4.), използван при определянето

m = е цифровата стойност на масата, в грамове от пробата (7.1.).

Като резултат се отчита средно аритметично от двете определяния, при условие че изискването за повторяемост (9.2.) е спазено.

▼M11

---

ПРИЛОЖЕНИЕ ХVII

МЕТОД ЗА ОПРЕДЕЛЯНЕ НА СТИГМАСТАДИЕНИ В РАСТИТЕЛНИ МАСЛА

1.   ЦЕЛ

Определяне на стигмастадиени в растителни масла, съдържащи ниски концентрации на тези въглеводороди и по-специално в необработеното маслиново масло (virgin) и в суровото маслиново масло от остатъчен материал.

2.   ОБХВАТ

Стандартът може да се прилага за всички растителни масла, въпреки че измерванията са надеждни само когато съдържанието на тези въглеводороди е между 0,01 и 4,0 мг/кг. Методът е особено подходящ за откриване на наличие на рафинирани растителни масла (от маслини, остатъчен материал, слънчоглед, палмови ядки и т.н.) в необработеното маслиново масло (virgin), тъй като рафинираните масла съдържат стигмастадиени, а необработеното маслиново масло не съдържа такива вещества.

3.   ПРИНЦИП

Изолиране на неосапунващи се съединения. Отделяне на стероидна въглеводородна фракция посредством колбена хроматография върху силициев гел и анализ посредством капилярна газова хроматография.

4.   АПАРАТУРА

4.1.	Епруветки 250 мл, подходящи за употреба с кондензатор с обратно оттичане.

4.2.	Отделителни фунии с капацитет 500 мл.

4.3.	Шишета с кръгло дъно и вместимост 100 мл.

4.4.	Ротационен изпарител.

4.5.

Стъклена хроматографска колба (с вътрешен диаметър от 1,5 до 2,0 см и височина 50 см) с тефлоново разклонение и запушалка от стъклена влакнеста вата или диск от синтеровано стъкло на дъното. За да се подготви колбата от силициев гел, се налива хексан в хроматографската колба до дълбочина приблизително 5 см и след това се напълва с каша от силициев гел в хексан (15 грама в 40 мл), с помощта на части от хексан. Изчаква се да се утаи и се довършва утаяването с прилагане на лека вибрация. Добавя се анхидриден натриев сулфат до височина приблизително 0,5 см и накрая се отмива излишният хексан.

4.6.	Газов хроматограф с детектор на пламъкова йонизация, монтиран на колоната разделен или студен инжектор и пещ с възможност за програмиране в рамките на ± 1 °С.

4.7.	Капилярна колба от разтопен силиций за газова хроматография (с вътрешен диаметър от 0,25 до 0,32 мм на дължина 25 м), покрита с 5-процентна фаза от фенилметилсиликон, с дебелина на слоя 0,25 мм. Забележка 1: Могат да се използват други колби с аналогична или по-ниска полярност.

4.8.	Интегриращо и регистриращо устройство с възможност за интегриране на базова линия-базова линия.

4.9.	Микроспринцовка от 5 до 10 мл за газова хроматография с циментирана игла.

4.10.

Електрическа пещ или котлон.

5.   РЕАГЕНТИ

Всички реагенти са с качество на анализи, освен ако не е посочено друго. Използва се дестилирана вода или вода с поне еквивалентна чистота.

5.1.	Хексан или смес от алкани с интервал на точката на завиране от 65 до 70 °С, дестилирани с изправителна колона. Забележка 2: Разтворителят се дестилира, за да се отстранят страничните примеси.

5.2.	96 v/v (обемни части) етанол.

5.3.	Обезводнен натриев сулфат

5.4.	Алкохолен разтвор на калиев хидроокис на 10 %. Добавете 10 мл вода към 50 г калиев хидроокис, разбъркайте и след това разтворете сместа в етанол до 500 мл. Забележка 3: Алкохолният поташ става кафяв при престояване. Той се приготвя ежедневно и се пази в добре запушени шишета от тъмно стъкло.

5.5.

Силициев гел 60 за колонна хроматография, от 70 до 230 отвори на ситото (Мерк, референция № 7734 или сходна). Забележка 4: Обикновено силициевият гел може да се използва директно от контейнера, без каквато и да било обработка. Някои партиди силициев гел могат обаче да покажат ниска активност в резултат на лошо хроматографско сепариране. При това обстоятелство силициевият гел се обработва по следния начин: Активира се силициевият гел посредством загряване в продължение на минимум четири часа при температура 550 °С. След загряването силициевият гел се поставя в сушилен шкаф, докато се охлади и след това се прехвърля в епруветка със запушалка. Добавят се 2 % вода и се разклаща, докато вече не се виждат бучки и прахът се движи свободно. Ако партидите силициев гел доведат до хроматограми с неправилни пикове, силициевият гел се обработва така, както е указано по-горе. Като алтернатива може да се използва изключително чист силициев гел (Мерк, референция № 7754).

5.6.	Изходен разтвор (200 ppm) на холеста-3,5-диен (Сигма, 99 % чистота) в хексан (10 мг в 50 мл).

5.7.	Стандартен разтвор на холеста-3,5-диен хексан с концентрация 20 ppm, получен с разреждане на горния разтвор. Забележка 5: Разтворите 5.6 и 5.7 са стабилни за период от минимум четири месеци, ако се пазят при температура под 4 °С.

5.8.	Разтвор на n-нонакозан в хексан с концентрация приблизително 100 ppm.

5.9.	Газ-носител за хроматографията: хелий или водород с чистота 99,9990 %.

5.10.

Помощни газове за детектора на пламъчна йонизация: водород с чистота 99,9990 % и пречистен въздух.

6.   ПРОЦЕДУРА

6.1.   Подготовка на неосапунващи се материи

6.1.1.

Претеглете 20 ± 0,1 г масло в шише с вместимост 250 мл (4.1), добавете 1 мл стандартен разтвор на холеста-3,5-диен (20 микрограма) и 75 мл 10-процентен алкохолен поташ (калиев карбонат), поставете обратния хладник и нагрейте до леко кипене в продължение на 30 минути. Отстранете шишето, съдържащо мострата, от нагревателя и оставете разтвора леко да се охлади (не оставяйте да се охлади напълно, тъй като мострата ще се утаи). Добавете 100 мл вода и прехвърлете разтвора в сепарираща фуния (4.2) с помощта на 100 мл хексан. Разклащайте силно сместа в продължение на 30 секунди и оставете да се сепарира. Забележка 6: Ако се получи емулсия, която не изчезва бързо, се добавят малки количества етанол.

6.1.2.

Прехвърлете водната фаза отдолу във втора сепарираща фуния и извлечете отново със 100 мл хексан. Оставя се долната фаза да изтече още веднъж и се промиват три пъти екстрактите от хексан (комбинирано в друга отделяща фуния), като всеки път се използват 100 мл смес от етанол и вода (1:1), докато бъде достигната фаза с неутрално рН.

6.1.3.

Прокарва се хексановият разтвор през анхидриден натриев сулфат (50 г), промива се с 20 мл хексан и се изпарява в ротационен изпарител при температура 30 °С при намалено налягане, докато изсъхне.

6.2.   Отделяне на фракция от стероиден въглеводород

6.2.1.

Взема се остатъкът в колбата за фракциониране с помощта на две части по 1 мл хексан, прокарва се пробата по колбата, като се оставя нивото на разтвора да падне до максимума на натриевия сулфат и се започва хроматографското елюиране с хексан с приблизителна скорост на потока 1 мл/мин. Изхвърлят се първите 25 до 30 мл елюат и след това се взема следващата фракция от 40 мл. След това взетата фракция се слага в епруветка с кръгло дъно и вместимост 100 мл (4.3). Забележка 7: Първата фракция съдържа наситените въглеводороди (фигура 1а), а втората фракция – стероидните. По-нататъшното елюиране дава сквален и свързани с него съставки. За да се постигне добро сепариране между наситените и стероидните въглеводороди, е необходимо да се оптимизират обемите на фракциите. За целта обемът на първата фракция се регулира така, че когато се анализира втората фракция максимумите, представляващи наситените въглеводороди, да са ниски (виж фигура 1в); ако те не се появят, а интензитетът на стандартния максимум е нисък, трябва да се намали обемът. Във всеки случай, пълното сепариране между компонентите на първата и втората фракция е излишно; тъй като не се получава припокриване на максимумите през време на анализа на GC, ако условията на GC се регулират по начина, посочен в 6.3.1. Оптимизацията на обема на втората фракция, ако втората фракция по принцип не е необходима като добра сепарация, става със следващите компоненти. Въпреки това обаче, присъствието на голям максимум при време на задържане по-малко с около 1,5 минути спрямо стандартното се дължи на сквалена и е показател за лоша сепарация.

6.2.2.

Изпарете втората фракция в ротационен изпарител при температура 30 °С при намалено налягане, докато изсъхне и незабавно разтворете остатъка в 0,2 мл хексан. Запазете разтвора в хладилник до анализа. Забележка 8: Остатъци 6.1.3 и 6.2.2 не трябва да се държат в сухо състояние и при стайна температура. Веднага щом бъдат получени, се добавя разтворът и разтворите се пазят в хладилник.

6.3.   Газова хроматография

6.3.1.

Работни условия за разделено инжектиране: — температура на инжектора: 300 °С, — температура на детектора: 320 °С, — интегратор-регистратор: параметрите за интегриране се определят по такъв начин, че да дадат правилна оценка на зоните. Препоръчваме метод на интегриране „базова линия-базова линия“, — чувствителност: приблизително 16 пъти от минималната чувствителност, — количество инжектиран разтвор: 1 микролитър, — пещ с възможност за програмиране на температурите: първоначално 235 °С в продължение на шест минути и след това увеличение с 2 °С/минута, докато се достигнат 285 °С, — инжектор с делител на потока 1:15, — носител: хелий или водород с налягане около 120 кРа. Тези условия могат да се регулират според характеристиката на хроматографа и колоната, така че да се получат хроматограми, отговарящи на следните изисквания: вътрешен стандартен максимум в рамките на около пет минути от времето, посочено в 6.3.2; вътрешният стандартен максимум трябва да е минимум 80 % от пълния мащаб. Системата за газова хроматография се проверява, като се инжектира смес от изходен разтвор на холестадиен (5.6) и разтвор на n-нонакозан (5.8). Максимумът на холеста-3,5-диена трябва да се появи преди n-нонакозана (фигура 1в); ако това не стане, могат да се предприемат две действия: да се намали температурата на пещта и/или да се използва по-малко полярна колона.

6.3.2.

Идентификация на максимума Вътрешният стандартен максимум се появява след около 19 минути, а 3,5-стигмастадиенът – след относително време на задържане от около 1,29 минути (виж фигура 1б). 3,5-стигмастадиенът се получава с малки количества изомер и обикновено двете вещества се елюират заедно като един-единствен хроматографен максимум. Въпреки това обаче, ако колоната е твърде полярна или има висока разделителна способност, изомерът може да се появи като малък максимум преди и близко до този на стигмаста-3,5-диена (фигура 2). За да се гарантира, че стигмастадиените се елюират като един максимум, бихме препоръчали да замените колоната или с такава, която е по-малко полярна, или има по-голям вътрешен диаметър. Забележка 9: Сравнителни стигмастадиени можете да получите от анализа на рафинирано зеленчуково масло, като използвате по-малко количество мостра (1 до 2 грама). Стигмастадиените дават очебиен и лесно определяем максимум.

6.3.3.

Количествен анализ Съдържанието на стигмастадиени се определя по следната формула: мг/кг стигмастадиени = , където: As = зона на максимума на стигмастадиените (ако максимумът е решен в два изомера, сумирайте зоните на двата максимума), Ac = зона на вътрешния стандарт (холестадиен), Mc = маса на добавения стандарт, в микрограмове, Mo = маса на взетото масло, в грамове. Граница на откриване: около 0,01 мг/кг.

Фигура 1

Газови хроматограми, получени от мостри на маслиново масло, анализирани на капилярна колона от стопен силиций (вътрешен диаметър 0,25 мм на 25 м), покрити с фенилметилсиликон 5 %, дебелина на слоя 0,25 микрометра.

Фигура 2

Газова хроматограма, получена от мостра на рафинирано маслиново масло, анализирана на колона DB-5, показваща изомера на 3,5-стигмастадиена.

▼M25

---

ПРИЛОЖЕНИЕ XVIII

ОПРЕДЕЛЯНЕ НА РАЗЛИКАТА МЕЖДУ ДЕЙСТВИТЕЛНОТО И ТЕОРЕТИЧНОТО СЪДЪРЖАНИЕ НА ТРИАЦИЛГЛИЦЕРИНИ С ECN 42

1.   ОБХВАТ

Определяне на абсолютната разлика между експерименталните стойности на триацилглицерините (TAG) с еквивалентно въглеродно число 42 (ECN42HPLC), получени чрез определяне в маслото посредством високоефективна течна хроматография (HPLC), и теоретичната стойност на TAG с еквивалентно въглеродно число 42 (ECN 42теоретично), изчислена въз основа на състава на мастните киселини.

2.   ПРИЛОЖНО ПОЛЕ

Стандартът се прилага за маслинови масла. Целта на метода е да се установи наличието на малки количества масла от семена (богати на линолова киселина) във всяка категория маслиново масло.

3.   ПРИНЦИП

Съдържанието на триацилглицерини с ECN 42, определено чрез анализ с HPLC, и теоретичното съдържание на триацилглицерини с ECN 42 (изчислено въз основа на определянето на състава на мастните киселини чрез газово-течна хроматография (GLC)) до известна степен си съответстват при чистите масла. Разлика, която превишава стойностите, приети за всяка категория масло, е показател за наличието на масла от семена в това масло.

4.   МЕТОД

Методът за изчисляване на теоретичното съдържание на триацилглицерини с ECN 42 и на разликата с данните от HPLC се състои основно в координацията на аналитичните данни, получени посредством други методи. Могат да се различат три фази: определяне на състава на мастните киселини чрез капилярна газова хроматография, изчисляване на теоретичния състав на триацилглицерините с ECN 42, определяне с HPLC на триацилглицерините с ECN 42.

4.1.    Апаратура

4.1.1.

Колби с обло дъно, с вместимост 250 и 500 ml.

4.1.2.

Бехерови чаши с вместимост 100 ml.

4.1.3.

Стъклена хроматографска колона, вътрешен диаметър 21 mm, дължина 450 mm, оборудвана с кранче и стандартен конус (женски) на върха.

4.1.4.

Делителни фунии, с капацитет 250 ml, със стандартен конус (мъжки) в основата, която може да се прикачи към върха на колоната.

4.1.5.

Стъклена пръчка с дължина 600 mm.

4.1.6.

Стъклена фуния с диаметър 80 mm.

4.1.7.

Мерителни колби с вместимост 50 ml.

4.1.8.

Мерителни колби с вместимост 20 ml.

4.1.9.

Ротационен изпарител.

4.1.10.

Високоефективен течен хроматограф, позволяващ термостатичен контрол на температурата на колоната.

4.1.11.

Инжектори за 10 μl.

4.1.12

Детектор: диференциален рефрактометър. Чувствителността в пълния обхват на скалата трябва да бъде поне 10–4 единици от рефракционния индекс.

4.1.13

Колона: тръба от неръждаема стомана с дължина 250 mm и вътрешен диаметър 4,5 mm, пълна с частици силициев диоксид с диаметър 5 μm с 22—23 % въглерод под формата на октадецилсилан.

4.1.14

Софтуер за обработка на данни.

4.1.15

Стъкленици с вместимост около 2 ml, с тефлонови прегради и капачки на винт.

4.2.    Реактиви

Реактивите трябва да са „чисти за анализ“ (ч.з.а.). Отмиващите разтворители трябва да бъдат дегазирани и могат да се рециклират няколкократно, без да това да оказва ефект върху фракциониранията.

4.2.1.

Петролен етер, загрят до температура между 40 и 60 °C, за хроматография, или хексан.

4.2.2.

Прясно дестилиран етилов етер без пероксид.

4.2.3.

Отмиващ разтворител за пречистване на маслото чрез колонна хроматография: смес от петролен етер/етилов етер в съотношение 87/13 (v/v).

4.2.4.

Силикагел с размер на частиците 70—230, от вида Merck 7734, с водно съдържание, стандартизирано на 5 % (w/w).

4.2.5.

Стъклена вата.

4.2.6.

Ацетон за HPLC.

4.2.7.

Ацетонитрил или пропионитрил за HPLC.

4.2.8.

Отмиващ разтворител за HPLC: ацетонитрил + ацетон (пропорциите се нагласят за получаването на желаното фракциониране; започва се със смес в съотношение 50:50) или пропионитрил.

4.2.9.

Солубилизиращ разтворител: ацетон.

4.2.10.

Стандартни триглицериди: могат да се използват или триглицериди, които се намират в търговската мрежа (трипалмитин, триолеин и т.н.), и оттам времената за задържане да се нанесат на графика, в съответствие с еквивалентното въглеродно число, или стандартни хроматограми на соево масло, на смес от соево и маслиново масло 30:70 и на чисто маслиново масло (вж. бележки 1 и 2 и фигури от 1 до 4).

4.2.11.

Колона за екстракция на твърдата фаза с 1 g фаза силициев диоксид, 6 ml.

4.3.    Подготовка на пробите

Като се има предвид, че редица интерферентни субстанции могат да предизвикат фалшиви положителни резултати, пробата трябва винаги да се пречиства съгласно метода IUPAC 2.507, използван за определяне на полярните съединения в мазнините за пържене.

4.3.1.    Подготовка на хроматографската колона

Колоната (4.1.3) се напълва с около 30 ml отмиващ разтворител (4.2.3), след което в нея се вкарва известно количество стъклена вата (4.2.5) и се натиска до дъното на колоната с помощта на стъклената пръчка (4.1.5).

В бехерова чаша с вместимост 100 ml се приготвя суспензия от 25 g силикагел (4.2.4) в 80 ml отмиваща смес (4.2.3), която след това се прехвърля в колоната с помощта на стъклена фуния (4.1.6).

За да е сигурно, че целият силикагел е прехвърлен в колоната, бехеровата чаша се измива с отмиващата смес, като отмиващата течност също се прехвърля в колоната.

Кранчето се отваря и разтворителят се оставя да изтече от колоната, докато нивото му достигне около 1 cm над силикагела.

4.3.2    Колонна хроматография

В мерителна колба с вместимост 50 ml (4.1.7) се претегля, с точност до 0,001 g, 2,5 ± 0,1 g предварително филтрирано, хомогенизирано и, ако е необходимо, дехидратирано масло.

То се разтваря в около 20 ml отмиващ разтворител (4.2.3.). Ако е необходимо, леко се загрява, за да се улесни разтварянето. Охлажда се до стайна температура и се допълва с отмиващ разтворител.

С помощта на мерителна пипета се вкарват 20 ml от разтвора в колоната, подготвена съгласно точка 4.3.1, кранчето се отваря и разтворителят се оставя да изтече до нивото на слоя от силикагел.

След това се измива със 150 ml отмиващ разтворител (4.2.3), като дебитът на разтворителя се регулира на около 2 ml в минута (така че 150 ml преминават през колоната за около 60—70 минути).

Отмивката се събира в колба с обло дъно с вместимост 250 ml (4.1.1), предварително тарирана в пещ и точно претеглена. Разтворителят се отстранява под намалено налягане в ротационен изпарител (4.1.9) и се претегля остатъкът, който ще се използва за приготвяне на разтвора за HPLC анализ и за приготвянето на метилови естери.

След преминаване през колоната пробата трябва да се събере поне на 90 % за категориите необработено маслиново масло „extra virgin“, необработено маслиново масло „virgin“, обикновено маслиново масло, рафинирано маслиново масло и маслиново масло, а за маслиновото масло за осветление и маслата от маслинено кюспе — поне на 80 %.

4.3.3    Пречистване чрез екстракция на твърдата фаза (SPE)

Колоната за SPE, напълнена със силициев диоксид, се активира чрез пропускането на 6 ml хексан (4.2.3) под вакуум, като се избягва изсъхването.

В стъкленица с вместимост 2 ml (4.1.15) се претеглят 0,12 g с точност до 0,001 g и се разтварят в 0,5 ml хексан (4.2.3).

Колоната за SPE се напълва с разтвора и се отмива с 10 ml смес от хексан и диетилов етер (87:13 v/v) (4.2.3) във вакуум.

Събраната част се изпарява до изсъхване в ротационен изпарител (4.1.9) под намалено налягане и при стайна температура. Остатъкът се разтваря в 2 ml ацетон (4.2.6) за анализ на триацилглицерините (TAG).

4.4.    HPLC анализ

4.4.1    Подготовка на пробите за хроматографски анализ

Приготвя се 5 % разтвор от пробата за анализ, като се претеглят 0,5 ± 0,001 g от пробата в градуирана колба с вместимост 10 ml и се допълват до 10 ml със солубилизиращия разтворител (4.2.9.).

4.4.2    Процедура

Включва се хроматографската система. Изпомпва се отмиващият разтворител (4.2.8) с дебит 1,5 ml/min, за да се прочисти цялата система. Изчаква се до получаването на стабилна основна линия.

Инжектират се 10 μl от пробата, приготвена в съответствие с точка 4.3.

4.4.3    Изчисляване и изразяване на резултатите

Използва се методът за нормализация на лицата на пиковете, т.е. приема се, че сумата на лицата на пиковете, съответстващи на TAG от ECN 42 до ECN 52, се равнява на 100 %.

Относителният процентен дял на всеки триглицерид се изчислява по формулата:

.

Резултатите трябва да се представят поне до два знака след десетичната запетая.

Вж. бележки от 1 до 4.

4.5.    Изчисляване на състава на триацилглицерините (% мол.) въз основа на данните за състава на мастните киселини (% от лицето)

4.5.1    Определяне на състава на мастните киселини

Съставът на мастните киселини се определя по ISO 5508 с помощта на капилярна колона. Метиловите естери се приготвят съгласно COI/T.20/Док. № 24.

4.5.2.    Мастни киселини, които участват в изчисленията

Глицеридите се групират съгласно еквивалентното въглеродно число (ECN), като се вземат предвид следните съответствия между ECN и мастните киселини. Разглеждат се единствено тези мастни киселини, които имат 16 и 18 въглеродни атома, тъй като само те са от значение за маслиновото масло. Мастните киселини трябва да са нормализирани на 100 %.

4.5.3    Преобразуване в молове на % от лицето за всички мастни киселини (1)

4.5.4    Нормализиране на моловете на мастните киселини на 100 % (2)

Резултатът показва процентното съдържание на всяка мастна киселина, изразено в % моларни, във всички (1,2,3-) позиции на TAG.

След това се изчисляват сумите на наситените мастни киселини P и S (SFA) и ненаситените мастни киселини Po, O, L и Ln (UFA):

4.5.5    Изчисляване на състава на мастните киселини в позиции 2 и 1, 3 на TAG

Мастните киселини се разпределят на три групи по следния начин: една група за позиция 2 и две идентични групи за позиции 1 и 3, с различни коефициенти за наситените (P и S) и ненаситените киселини (Po, O, L и Ln).

4.5.5.1   Наситени мастни киселини в позиция 2 [P(2) и S(2)]

4.5.5.2   Ненаситени мастни киселини в позиция 2 [Po(2), O(2), L(2) и Ln(2)] (5):

4.5.5.3   Мастни киселини в позиции 1,3 [P(1,3), S(1,3), Po(1,3), O(1,3), L(1,3) и Ln(1,3)] (6):

4.5.6    Изчисляване на триацилглицерините

4.5.6.1   TAG с една мастна киселина (AAA, тук LLL, PoPoPo) (7)

4.5.6.2   TAG с две мастни киселини (AAB, тук PoPoL, PoLL) (8)

4.5.6.3   TAG с три различни мастни киселини (ABC, тук OLLn, PLLn, PoOLn, PPoLn) (9)

4.5.6.4   Триацилглицерини с ECN42

Триацилглицерините с ECN42 се изчисляват съгласно уравненията 7, 8 и 9, след което се дават по реда на очакваното отмиване в HPLC (обикновено само три пика).

Триацилглицерините с ECN42 се получават от сумата на деветте триацилглицерина, включително позиционните им изомери. Резултатите трябва да се представят поне до два знака след десетичната запетая.

5.   ОЦЕНКА НА РЕЗУЛТАТИТЕ

Сравняват се изчисленото теоретично съдържание и съдържанието, определено чрез HPLC анализ. Ако разликата в абсолютната стойност на данните от HPLC минус теоретичните данни е по-голяма от стойностите, посочени в стандарта за съответната категория масло, то пробата съдържа масло от семена.

Резултатите се представят до два знака след десетичната запетая.

6.   ПРИМЕР (НОМЕРАЦИЯТА ОТГОВАРЯ НА СЪОТВЕТНИТЕ РАЗДЕЛИ В ТЕКСТА НА МЕТОДА)

— 4.5.1.    Изчисляване на мастните киселини в % моларни въз основа на данните от GLC (нормализиран % от лицето)

Чрез GLC се получават следните данни за състава на мастните киселини:

— 4.5.3    Преобразуване, в молове, на % от лицето за всички мастни киселини (вж. формула (1)

молове P

=

молове S

=

молове Po

=

молове O

=

молове L

=

молове Ln

=

Общо

=

0,35821 мола TAG

— 4.5.4    Нормализиране на моловете на мастните киселини на 100 % (вж. формула (2)

% мол. P(1,2,3)

=

% мол. S(1,2,3)

=

% мол. Po(1,2,3)

=

% мол. O(1,2,3)

=

% мол. L(1,2,3)

=

% мол. Ln(1,2,3)

=

Общо % моларни

=

100 %

Сума на наситените и ненаситените мастни киселини в позиции 1, 2 и 3 на TAG (вж. формула (3):

— 4.5.5    Изчисляване на състава на мастните киселини в позиции 2 и 1,3 на TAG

— 4.5.5.1   Наситени мастни киселини в позиция 2 [P(2) и S(2)] (вж. формула (4)

— 4.5.5.2   Ненаситени мастни киселини в позиция 2 [Po(1,3), O(1,3), L(1,3) и Ln(1,3)] (вж. формула (5)

— 4.5.5.3   Мастни киселини в позиции 1,3 [P(1,3), S(1,3), Po(1,3), O(1,3), L(1,3) и Ln(1,3)] (вж. формула (6)

— 4.5.6.    Изчисляване на триацилглицерините

От изчисления състав на мастни киселини в позиции sn-2 и sn-1,3 (вж. по-горе):

се изчисляват следните триацилглицерини:

— 4.5.6.1   TAG с една мастна киселина (LLL, PoPoPo) (вж. формула (7)

, = 0,09706 мол. LLL

— 4.5.6.2   TAG с две мастни киселини (PoLL, SLnLn, PoPoL) (вж. формула (8)

0,03210 мол. PoLL

0,00094 мол. SLnLn

0,00354 мол. PoPoL

— 4.5.6.3   TAG с три различни мастни киселини (PoPLn, OLLn, PLLn, PoOLn) Вж. формула (9)

0,00761 мол. PPoLn

0,43655 мол. OLLn

0,06907 мол. PLLn

0,04812 мол. PoOLn

ECN42 = 0,69512 мол. TAG

Бележка 1: Редът на отмиване може да се определи чрез изчисляването на еквивалентните въглеродни числа, често определяни като зависимостта , където CN е въглеродното число, а „n“ е броят на двойните връзки; той може да се изчисли по-прецизно, като се вземе предвид произходът на двойната връзка. Ако no, nl и nln представляват броя на двойните връзки, характерни съответно за олеиновата, линоловата и линоленовата киселина, еквивалентното въглеродно число може да се изчисли чрез зависимостта във формулата:

където коефициентите do, dl и dln могат да се изчислят чрез референтните триглицериди. При условията, посочени в настоящия метод, получената зависимост ще е близка до:

Бележка 2: При няколко стандартни триглицериди е възможно да се изчисли и равенството по отношение на триолеина:

триолеинкато се използва намаленото време за задържане

.

Графиката на log α при основа f (брой на двойните връзки) позволява определянето на времената за задържане за всички триглицериди на мастните киселини, съдържащи се в референтните триглицериди — вж. фигура 1.

Бележка 3: Ефикасността на колоната трябва да позволява ясното отделяне на пика на трилинолеина от пиковете на триглицеридите с близко RT. Отмиването се осъществява до пика ECN 52.

Бележка 4: Точността на измерване на лицата на всички пикове, които са от значение за настоящото определяне, е спазена, ако вторият пик, съответстващ на ECN 50, е равен на 50 % от пълния обхват на скалата на записващото устройство.

Фигура 1

Графика на log α към f (брой на двойните връзки)

Брой на двойните връзки

La: лауринова киселина; My: миристинова киселина; P: палмитинова киселина; S: стеаринова киселина; O: олеинова киселина; L: линолова киселина; Ln: линоленова киселина

Фигура 2

Маслиново масло с ниско съдържание на линолова киселина

а

С разтворител: ацетон/ацетонитрил.

ПРОФИЛ a: Основни компоненти на хроматографските пикове: ECN42: (1) LLL+PoLL; (2) OLLn+PoOLn; (3) PLLn; ECN44: (4) OLL+PoOL; (5) OOLn +PLL; (6) POLn+PPoPo; (7) OOL+PoOO; ECN46: (8) OOL+LnPP; (9) PoOO; (10) SLL+PLO; (11) PoOP+SPoL+SOLn+SPoPo; (12) PLP; ECN48: (13) OOO+PoPP; (14+15) SOL+POO; (16) POP; ECN50: (17) SOO; (18) POS+SLS.

б

С разтворител: пропионитрил

ПРОФИЛ б: Основни компоненти на хроматографските пикове: ECN42: (1) LLL; (2) OLLn+PoLL; (3) PLLn; ECN44: (4) OLL; (5) OOLn+PoOL; (6) PLL+PoPoO; (7) POLn+PPoPo+PPoL; ECN46: (8) OOL+LnPP; (9) PoOO; (10) SLL+PLO; (11) PoOP+SPoL+SOLn+SPoPo; (12) PLP; ECN48: (13) OOO+PoPP; (14) SOL; (15) POO; (16) POP; ECN50: (17) SOO; (18) POS+SLS

Figure 3

Маслиново масло с високо съдържание на линолова киселина

а

При разтворител: ацетон/ацетонитрил (50:50).

Профил a: Основни компоненти на хроматографските пикове: ECN42: (1’) LLL+PoLL; (2’) OLLn+PoOLn; (3’) PLLn; ECN44: (4’) OLL+PoOL; (5’) OOLn +PLL; (6’) POLn+PPoPo; ECN46: (7’) OOL+PoOO; (8’) PLO+SLL+ PoOP; (9’) PLP+PoPP; ECN48: (10’) OOO; (11’) POO+SLL+PPoO; (12’) POP+PLS; ECN50: (13’) SOO; (14’) POS+SLS

б

С разтворител: пропионитрил.

Профил б: Основни компоненти на хроматографските пикове: ECN42: (1) LLL; (2+2’) OLLn+PoLL; (3) PLLn; ECN44: (4) OLL; (5) OOLn+PoOL; (6) PLL+PoPoO; (7) POLn+PPoPo+PPoL; ECN46: (8) OOL+LnPP; (9) PoOO; (10) SLL+PLO; (11) PoOP+SPoL+SOLn+SPoPo; ECN48: (12) PLP; (13) OOO+PoPP; (14) SOL; (15) POO; (16) POP; ECN50: (17) SOO; (18) POS+SLS; ECN52: (19) AOO.

▼M19

---

ANNEX XIX

▼M28

ОПРЕДЕЛЯНЕ НА СЪДЪРЖАНИЕТО НА АЛИФАТНИ И ТРИТЕРПЕНОВИ АЛКОХОЛИ ЧРЕЗ КАПИЛЯРНА ГАЗОВА ХРОМАТОГРАФИЯ

1.   ПРЕДМЕТ

В настоящото приложение се описва метод за определяне на съдържанието на алифатни и тритерпенови алкохоли в масла и мазнини.

▼M19

2.   PRINCIPLE OF THE METHOD

The fatty substance, with 1-eicosanol added as internal standard, is saponified with ethanolic potassium hydroxide and then the unsaponifiable matter extracted with ethyl ether. The alcoholic fraction is separated from the unsaponifiable matter by chromatography on a basic silica gel plate; the alcohols recovered from the silica gel are transformed into trimethylsilyl ethers and analysed by capillary gas chromatography.

3.   EQUIPMENT

4.   REAGENTS

▼M28

▼M19

5.   PROCEDURE

5.1.   Preparation of the unsaponifiables

5.1.1.

Using a 500 μl microsyringe place, into a 250 ml round-bottom flask, a volume of 0,1 % 1-eicosanol solution in chloroform (4.17) containing a quantity of 1-eicosanol approximately equal to 10 % of the aliphatic alcohols content in that portion of sample to be taken for analysis. For example, to 5 g of sample add 250 μl of the 0,1 % 1-eicosanol solution if olive oil and 1 500 μl if olive pomace oil. Evaporate to dryness in current of nitrogen and then weigh accurately 5 g of the dry filtered sample into the same flask.

5.1.2.

Add 50 ml of 2 N potassium hydroxide ethanolic solution, fit the reflux condenser and heat the apparatus to slight boiling on a steam bath, stirring continuously throughout the heating process until saponification has taken place (the solution becomes clear). Continue heating for a further 20 minutes and then add 50 ml of distilled water through the condenser. The condenser is then disconnected and the flask cooled to approximately 30 °C.

5.1.3.

The contents of the flask are quantitatively transferred to a separating funnel of 500 ml capacity by adding distilled water several times, using a total of around 50 ml distilled water. Add approximately 80 ml of ethyl ether, shake vigorously for approximately 30 seconds and allow to settle (Note 1). Separate off the lower aqueous phase collecting it in a second separating funnel. Two further extractions are effected on the aqueous phase, in the same manner, using each time 60 to 70 ml ethyl ether. Note 1: Emulsions may be eliminated by adding, using as a spray, small quantities of ethyl alcohol or methyl alcohol.

5.1.4.

The ethyl ether extracts are combined in a separating funnel and washed with distilled water (50 ml at a time) until the washing water gives a neutral reaction. Discard the washing water, dry with anhydrous sodium sulphate and filter, into a flask of 250 ml capacity which has been weighed beforehand, the funnel and filter being washed with small quantities of ethyl ether which are added to the total.

5.1.5.

Distil the ether down to a few ml, then bring to dryness under a slight vacuum or in a current of nitrogen, completing drying in an oven at 100 °C for approximately a quarter of an hour, and then weigh after cooling in a desiccator.

5.2.   Separation of alcoholic fractions

5.2.1.

Preparation of basic TLC plates: the silica gel plates (4.4) are immersed completely, in 0,2 N potassium hydroxide solution (4.5) for 10 seconds, and then left to dry for two hours under an extractor hood and finally placed in an oven at 100 °C for one hour. Remove from the oven and keep in a calcium chloride desiccator until required for use (plates treated in this way must be used within 15 days). Note 2: When basic silica gel plates are used to separate the alcoholic fraction there is no need to treat the unsaponifiables with alumina. It follows that all acid compounds (fatty acids and others) are retained at the origin thereby obtaining both aliphatic alcohol and terpenic alcohol bands which are both separated distinctly from the sterol band.

5.2.2.

Place a 65/35 by volume hexane/ethyl ether mixture in the plate-developing chamber to a depth of approximately 1 cm ( 6 ). Close the chamber using an appropriate cover and leave for half an hour to allow equilibration between vapour and liquid. Strips of filter paper dipping into the eluent may be affixed to the inside surfaces of the tank to reduce the development time by approximately one third and obtain more uniform, regular elution of the components. Note 3: The developing solution must be replaced for each analysis in order to obtain reproducible developing conditions.

5.2.3.

An approximately 5 % solution of unsaponifiable matter (5.1.5) in chloroform is prepared and 0,3 ml of the solution is streaked as a uniform strip of minimum thickness, using the 100 μl microsyringe, on a TLC plate at approximately 2 cm from the bottom of the TLC plate. Aligned with the origin, 2 to 3 μl of the aliphatic alcohols reference solution (4.11) are spotted for the identification of the aliphatic alcohols band after development has been completed.

5.2.4.

Place the plate inside the development tank as stated in 5.2.2. The ambient temperature should be maintained between 15 and 20 °C. Immediately close the chamber with the cover and allow to elute until the solvent front reaches approximately 1 cm from the upper edge of the plate. The plate is then removed from the development chamber and the solvent evaporated under a hot air current or the plate is left for a while under the extractor hood.

▼M28

5.2.5.

Плаката се напръсква леко и равномерно с разтвора на 2′,7′-дихлорофлуоресцин когато се наблюдава под ултравиолетова светлина. Ивицата от алифатни алкохоли може да се разпознае чрез сравняване с петното, получено от референтния разтвор: границите на ивицата се отбелязват с черен молив, като се очертават заедно ивицата от алифатни алкохоли и ивицата непосредствено над нея, която е ивицата от терпеновите алкохоли (Бележка 4). Бележка 4: Изискването за съвместното групиране на ивицата от алифатни алкохоли и ивицата от терпенови алкохоли се определя от възможната миграция на някои алифатни алкохоли към ивицата на тритерпеновите алкохоли. Пример на разделяне посредством газова хроматография е даден на фигура 1 от допълнението.

5.2.6.

Силикагелът в очертаните участъци се изтърква с помощта на метална шпатула. Отделеният стрит на фин прах материал от силикагел се поставя във фунията за филтруване (точка 3.7). Добавят се 10 ml горещ хлороформ, разбърква се добре с металната шпатула и се филтрува под вакуум, като филтратът се събира в конусовидната колба (точка 3.8.), свързана с фунията за филтруване. Силикагелът от фунията се промива три пъти с етилов етер (с около 10 ml всеки път), като филтратът се събира в същата колба, свързана с фунията. Филтратът се изпарява до обем 4—5 ml и остатъчният разтвор се прехвърля в епруветка с вместимост 10 ml (точка 3.9.), която е била претеглена предварително; изпарява се до изсъхване чрез слабо подгряване под слаба струя азот; утайката се разтваря отново с няколко капки ацетон, след което отново се изпарява до изсъхване, поставя се в пещ при температура 105 °C за около 10 минути, след което се оставя да се охлади в десикатор и се претегля. Остатъкът в епруветката се състои от алкохолната фракция.

▼M19

5.3.   Preparation of the trimethylsilyl ethers

5.3.1.

The reagent for silylation, consisting of a mixture of 9:3:1 by volume (Note 5) of pyridine-hexamethyldisilazane-trimethylchlorosilane in the proportion of 50 μl for each milligram of aliphatic alcohols, is added to the test tube containing the alcoholic fraction, avoiding all absorption of moisture (Note 6). Note 5: Solutions which are ready for use are available commercially. Other silanising reagents such as, for example, bis-trimethylsilyl, trifluor acetamide + 1 % trimethyl chlorosilane, which has to be diluted with an equal volume of anhydrous pyridine, are also available. Note 6: The slight opalescence which may form is normal and does not cause any interference. The formation of a white floc or the appearance of a pink colour are indicative of the presence of moisture or deterioration of the reagent. If these occur the test must be repeated.

5.3.2.

Stopper the test tube, shake carefully (without overturning) until the aliphatic alcohols are completely dissolved. Stand for at least 15 minutes at ambient temperature and then centrifuge for a few minutes. The clear solution is ready for gas chromatographic analysis.

5.4.   Gas chromatography analysis

5.4.1.   Preliminary operations, column packing

5.4.1.1.

Fit the column in the gas chromatograph, attaching the inlet end to the injector connected to the splitting system and the outlet end to the detector. Carry out a general check of the gas chromatography assembly (tightness of gas fittings, efficiency of the detector, efficiency of the splitting system and of the recording system, etc.).

5.4.1.2.

If the column is being used for the first time it is recommended that it should be subjected to conditioning. A little carrier gas is passed through the capillary column and then the gas chromatography assembly is switched on and gradually heated until a temperature not less than 20 °C above the operating temperature (see Note 7) is attained. That temperature is held for not less than two hours and then the assembly is brought to the operating conditions (regulation of gas flow, split flame ignition, connection to the electronic recorder, adjustment of the temperature of the capillary column oven, the detector and the injector, etc.) and the signal is adjusted to a sensitivity not less than twice the highest level contemplated for the execution of the analysis. The course of the base line must be linear, without peaks of any kind, and must not drift. A negative straight-line drift indicates leakage from the column connections; a positive drift indicates inadequate conditioning of the column. Note 7: The conditioning temperature shall be at least 20 °C less than the maximum temperature contemplated for the liquid phase employed.

5.4.2.   Choice of operating conditions

5.4.3.   Analytical procedure

▼M28

5.4.4.    Идентифициране на пиковете.

Идентифицирането на индивидуалните пикове се извършва съгласно времената за задържане и в сравнение със стандартната смес от триметилсилилови етери, анализирана при същите условия.

Примери на хроматограма на алкохолната фракция на рафинирано маслиново масло са показани на фигури 2 и 3 от допълнението.

▼M19

5.4.5.   Quantitative evaluation

6.   EXPRESSION OF THE RESULTS

The contents of the individual aliphatic alcohols in mg/1 000 g of fatty substance and the sum of the „total aliphatic alcohols“ are reported.

▼M28

---

Допълнение

Пример на разделяне посредством тънкослойна хроматография и примери на хроматограми

Фигура 1

Плака за тънкослойна хроматография от неосапуняемата фракция от маслиново масло, елуирано с хексан/етилов етер (65/35)

Фигура 2

Хроматограма на алкохолната фракция на рафинирано маслиново масло

Фигура 3

Алифатни и тритерпенови алкохоли от рафинирано маслиново масло и маслиново масло от второ центрофугиране

▼M23

---

ПРИЛОЖЕНИЕ ХХ

Метод за определяне на съдържанието на парафини, метилови естери на мастни киселини и етилови естери на мастни киселини чрез капилярна газова хроматография

1.   ЦЕЛ

Този метод се използва за определяне съдържанието на восъци, метилови и етилови естери на мастни киселини в маслиновите масла. Отделните восъци и алкилови естери се разделят според броя на въглеродните атоми. Методът се препоръчва като средство за разграничаване на маслиновото масло от маслиновото масло от кюспе и като качествен параметър за необработените маслинови масла с екстра качество, правещ възможно откриването на фалшифицирани смеси на необработени маслинови масла с екстра качество с по-нискокачествени, независимо дали са необработени масла, масла за осветление или обезмирисени масла.

2.   ПРИНЦИП

Добавяне на подходящи вътрешни стандарти към маслото и разделяне чрез хроматография върху колонка от хидратиран силикагел. Добиване на елюираната при опитните условия фракция (при полярност, по-ниска от тази за триацилглицерините) и директен анализ чрез капилярна газова хроматография.

3.   АПАРАТУРА

3.1.	Ерленмайерова колба, 25 ml.

3.2.	Стъклена колона за течна хроматография, с вътрешен диаметър 15 mm, дължина 30—40 cm, оборудвана с кранче.

3.3.

Газов хроматограф, подходящ за използване с капилярна колона, снабдена със система за директно подаване в колоната, състоящ се от: 3.3.1. Термостатирана пещ с програмиране на температурата. 3.3.2. Инжектор за студено пускане за директно подаване в колоната. 3.3.3. Пламъчно-йонизационен детектор и усилвателен преобразувател. 3.3.4. Записващ интегратор (забележка 1) за използване с усилвателния преобразувател (точка 3.3.3), с инертност не по-голяма от 1 s и с променлива скорост на подаване на хартията. Забележка 1:  Когато данните от газовата хроматография се въвеждат с персонален компютър може да се използват компютъризирани системи. 3.3.5. Капилярна колона, аморфен кварц (за анализиране на восъците и метиловите и етиловите естери), дължина от 8—15 m, вътрешен диаметър 0,25—0,32 mm, с вътрешно покритие в течна фаза (забележка 2) до равномерна дебелина на слоя 0,10—0,30 μm. Забележка 2:  За целта се продават подходящи готови течни фази като SE52, SE54 и др.

3.4.	Микроспринцовка, 10 μl, със закалена игла, за директно подаване в колоната.

3.5.	Електрически уред за разклащане.

3.6.	Ротационен изпарител.

3.7.	Муфелна пещ.

3.8.	Аналитична везна за претегляне с точност до 0,1 mg.

3.9.	Стандартно лабораторно оборудване.

4.   РЕАГЕНТИ

4.1.

Силикагел, размер на частиците — mesh 60—200 μm. Силикагелът се поставя в муфелната пещ при 500 °C в продължение на най-малко 4 часа. Оставя се да се охлади и след това се добавя 2 % вода, отнесено към използваното количество силикагел. Разклаща се добре, за да се хомогенизира суспензията и се държи в сушилнята поне 12 часа преди да се използва.

4.2.

n-хексан с хроматографска чистота или чистота за остатък (чистотата трябва да бъде проверена). ВНИМАНИЕ — пàрите за запалими. Да се държи настрани от източници на топлина, искри или открит пламък. Да се гарантира, че бутилките са винаги добре затворени. При употреба да се осигури подходяща вентилация. Да се избягва натрупването на пàри и да се отстранят всички възможни причинители на пожар, като нагреватели или електрически уреди, които не са произведени от незапалим материал. Опасен е при вдишване, тъй като може да причини увреждане на нервните клетки. Да се избягва вдишването им. Ако е необходимо да се използва подходящ апарат за дишане. Да се избягва контакт с очите и кожата.

4.3.

Етилов етер, хроматографска чистота. ВНИМАНИЕ — силно запалим и леко токсичен. Предизвиква дразнене на кожата. Вреден при вдишване. Може да причини увреждане на очите. Ефектите може да се проявят със закъснение. Може да образува взривоопасни прекиси. Пàрите за запалими. Да се държи настрани от източници на топлина, искри или открит пламък. Да се гарантира, че шишетата са винаги добре затворени. При употреба да се осигурява подходяща вентилация. Да се избягва натрупването на пàри и да се отстранят всички възможни причинители на пожар, като нагреватели или електрически уреди, които не са произведени от незапалим материал. Да не се изпарява до сухо или почти сухо. Добавянето на вода или друг подходящ редуктор може да намали образуването на прекис. Да не се пие. Да се избягва вдишване на пàрите. Да се избягва продължителен или многократен контакт с кожата.

4.4.

n-хептан, хроматографска чистота, или изооктан. ВНИМАНИЕ — лесно запалим. Вреден при вдишване. Да се държи настрани от източници на топлина, искри или открит пламък. Да се гарантира, че бутилките са винаги добре затворени. При употреба да се осигурява подходяща вентилация. Да се избягва вдишване на пàрите. Да се избягва продължителен или многократен контакт с кожата.

4.5.	Стандартен разтвор на лаурилов арахидат (забележка 3) — 0,05% (m/V) в хептан (вътрешен стандарт за восъци). Забележка 3:  Може да се използват и палмитилов палмитат, миристилов стеарат или арахидилов лауреат.

4.6.	Стандартен разтвор на метилов хептадеканоат — 0,02 % (m/V) в хептан (вътрешен стандарт за метилови и етилови естери).

4.7.	Судан 1 (1-фенилазо-2-нафтол).

4.8.

Газ носител: водород или хелий, пречистен, чистота за газова хроматография. ВНИМАНИЕ Водород. Леснозапалим, намира се под налягане. Да се държи настрани от източници на топлина, искри, открит пламък или електрически уреди, които не са произведени от незапалим материал. Да се гарантира, че клапата на бутилката е затворена, когато тя не се използва. Да се използва винаги с редуцирвентил. Да се освободи пружината на редуцирвентила преди отваряне на клапата на бутилката. Да не се застава пред изходния отвор на бутилката при отваряне на клапата. При употребата да се осигурява подходяща вентилация. Да не се прехвърля водород от една бутилка в друга. Да не се смесват газове в бутилката. Да се гарантира, че бутилките не могат да бъдат преобърнати. Да се пазят от слънчева светлина и настрани от източници на топлина. Да се съхраняват в корозионноустойчива среда. Да не се използват повредени или неетикетирани бутилки. Хелий. Газ, сгъстен под високо налягане. Намалява количеството на кислорода за дишане. Бутилката да се съхранява затворена. При употреба да се осигурява подходяща вентилация. Да не се влиза в складови площи, освен ако не са с подходяща вентилация. Да се използва винаги с редуцирвентил. Да се освободи пружината на редуцирвентила преди отваряне на клапата на бутилката. Да не се прехвърля газ от една бутилка в друга. Да се гарантира, че бутилките не могат да бъдат преобърнати. Да не се застава пред изходния отвор на бутилката при отваряне на клапата. Да се пазят от слънчева светлина и настрани от източници на топлина. Да се съхраняват в корозионноустойчива среда. Да не се използват повредени или неетикетирани бутилки. Да не се вдишва. Да се използва само за технически цели.

4.9.

Спомагателни газове: — водород, пречистен, с чистота за газова хроматография. — въздух, пречистен, с чистота за газова хроматография. ВНИМАНИЕ Въздух. Газ, сгъстен под високо налягане. Да се използва с повишено внимание при наличие на горими вещества, тъй като температурата на самозапалване на повечето органични съединения във въздуха е значително по-ниска при високо налягане. Да се гарантира, че клапата на шишето е затворена, когато то не се използва. Да се използва винаги редуцирвентил. Да се освободи пружината на редуцирвентила преди отваряне на клапата на бутилката. Да не се застава пред изходния отвор на бутилката при отваряне на клапата. Да не се прехвърля газ от една бутилка в друга. Да не се смесват газове в бутилката. Да се гарантира, че бутилките не могат да бъдат преобърнати. Да се пазят от слънчева светлина и настрани от източници на топлина. Да се съхраняват в корозионноустойчива среда. Да не се използват повредени или неетикетирани бутилки. Въздухът, предназначен за технически цели, не трябва да се вдишва или да се използва за уреди за дишане.

5.   ПРОЦЕДУРА

5.1.    Подготовка на хроматографската колона

Суспендират се 15 g силикагел (точка 4.1) в n-хексан (точка 4.2) и се подават в колоната (точка 3.2). Оставя се да се утаи самостоятелно. Утаяването се завършва с помощта на електрически уред за разклащане, за да се осигури по-голяма еднородност на хроматографския слой. Перколират се 30 ml n-хексан, за да бъдат отстранени евентуални онечиствания. С помощта на аналитична везна (точка 3.8) се претеглят точно 500 mg от пробата в 25-милилитрова колба (точка 3.1) и се добавя подходящо количество вътрешен стандарт (точка 4.5) в зависимост от предполагаемото съдържание на восъци, например се добавя 0,1 mg лаурилов арахидат в случай на маслиново масло, 0,25 - 0,50 mg в случай на масло от маслинено кюспе и 0,05 mg метилов хептадеканоат за маслинови масла (точка 4.6).

Подготвената проба се прехвърля в хроматографската колона с помощта на две части от по 2 ml n-хексан (точка 4.2).

Оставя се разтворителят да стигне до 1 mm над горното ниво на абсорбента. Перколират се допълнително n-хексан/етилов етер (99:1) и се събират 220 ml при дебит от около 15 капки на всеки 10 секунди. (Тази фракция съдържа метиловите и етиловите естери и восъците). (Забележка 4) (Забележка 5).

Получените фракции се изпаряват в ротационен изпарител до почти пълно отстраняване на разтворителя. Последните 2 ml се отстраняват при слаба струя азот. Събира се фракцията, съдържаща метиловите и етиловите естери, като се разрежда с 2-4 ml n-хептан или изооктан.

5.2.    Анализ чрез газова хроматография

5.2.1.    Предварителна процедура

Поставя се колоната в газовия хроматограф (точка 3.3), свързвайки входния отвор към системата на колоната, а изходния отвор към детектора. Проверява се апаратът за газова хроматография (работа на газовите контури, ефективност на детектора и записващата система и т.н.).

Ако колоната се използва за първи път, препоръчително е да бъде приведена към желаните условия. Подава се слаб поток от газ през колоната, след което се включва апаратът за газова хроматография. Нагрява се постепенно до достигане след около 4 часа на температура 350 °C.

Тази температура се поддържа в продължение на поне два часа, след което апаратът се регулира за работни условия (регулира се притокът на газ, запалва се пламъкът, свързва се към електронното записващо устройство (точка 3.3.4), регулира се температурата на пещта за колоната, регулира се детекторът и др.). Записва се сигналът при чувствителност поне два пъти по-висока от изискваната за анализа. Основната графика трябва да бъде линейна, без каквито и да било пикове, и да не бъде изместена.

Отрицателно линейно изместване показва, че свръзките на колоната не са правилни, а положително изместване показва, че колоната не е приведена правилно към работни условия.

5.2.2.    Избор на работните условия за восъци и метилови и етилови естери (забележка 6).

В общия случай работните условия са следните:

—	Температура на колоната : 20 °C/min 5 °C/min първо 80 °C (1′) 140 °C 335 °C (20)

—	Температура на детектора : 350 °C.

—	Инжектирано количество : 1 μl от разтвора в n-хептан (2-4 ml).

—	Газ носител : хелий или водород с оптимална линейна скорост за съответния газ (виж допълнениe А).

—	Чувствителност на измервателния уред : подходяща, за да бъдат изпълнени горните условия.

Тези условия могат да бъдат променяни според характеристиките на колоната и на газовия хроматограф, за да се отделят всички восъци и метилови и етилови естери на мастни киселини и да бъде постигнато задоволително максимално разделяне (виж фигури 2, 3 и 4) и време на задържане от 18 ± 3 минути за вътрешния стандарт от лаурилов арахидат. Най-представителният пик за восъците трябва да бъде над 60% от обхвата на скалата, а вътрешният стандарт от метил хептадеканоат за метилови и етилови естери трябва да достига обхвата на скалата.

Параметрите за интегриране на пиковете се определят по такъв начин, че да се извърши правилна оценка на съответните площи на пиковете.

5.3.    Извършване на анализа

Вземат се 10 μl от разтвора с помощта на микроспринцовка от 10 μl като буталото се изтегля докато иглата се изпразни. Иглата се вкарва в системата за инжектиране и се извършва инжектиране бързо след 1-2 секунди. След около 5 секунди иглата внимателно се изтегля.

Записването продължава до пълното елюиране на восъците или стигмастадиените, в зависимост от анализираната фракция.

Основната крива следва винаги да отговаря на поставените условия.

5.4.    Определяне на пиковете

Пиковете се определят по времената на задържане, като се сравняват с тези на смеси на восъци, чиито времена на задържане са известни и са анализирани при същите условия. Алкиловите естери се разпознават в смеси на метилови и етилови естери по главните мастни киселини в маслиновите масла (палмитинова и олеинова).

На фигура 1 е представена хроматограма на восъците в необработено маслиново масло. На фигури 2 и 3 са показани хроматограмите на две продавани на дребно необработени маслинови масла с екстра качество, едното с метилови и етилови естери, а другото без. На фигура 4 са показани хроматограмите за най-висококачествено необработено маслиново масло с екстра качество и същото масло с пикове, дължащи се на 20 % обезмирисено масло

5.5.    Количествен анализ на восъците

С помощта на интегратора се определят площите на пиковете, съответстващи на вътрешния стандарт от лаурилов арахидат и алифатните естери от С40 до С46.

Определя се общото съдържание на восъци, като се добавя всеки отделен восък в mg/kg мастно вещество както следва:

където:

Ax

=

е площта, съответстваща на пика за отделния естер, в отброяванията на компютъра.

As

=

е площта, съответстваща на пика за вътрешния стандарт от лаурилов арахидат, в отброяванията на компютъра

ms

=

е масата на вътрешния стандарт от лаурилов арахидат, в милиграми;

m

=

e масата на взетата за определяне проба, в грамове.

5.5.1.    Количествен анализ на метиловите и етиловите естери

С помощта на интегратора се определят площите на пиковете, съответстващи на вътрешния стандарт от метил хептадеканоат, на метиловите естери на мастните киселини C16 и C18 и на етиловите естери на мастните киселини С16 и С18.

Определя се общото съдържание на всеки алкилов естер в mg/kg мастно вещество, както следва:

където:

Ax

=

е площта, съответстваща на пика за отделния естер C16 и C18, в отброяванията на компютъра

As

=

е площта, съответстваща на пика за вътрешния стандарт от метилов хептадеканоат, в отброяванията на компютъра

ms

=

е масата на добавения вътрешен стандарт от метилов хептадеканоат, в милиграми;

m

=

e масата на взетата за определяне проба, в грамове.

6.   ИЗРАЗЯВАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ

Записва се сумата от съдържанията на отделните восъци от C40 до C46 (забележка 7) в милиграми на килограм мастно вещество.

Записват се сумите от съдържанията на метиловите и етиловите естери от C16 до C18 и сумарната стойност от двете суми.

Резултатите следва да бъдат изразени чрез закръгляне до най-близкия mg/kg.

Записва се съотношението на етиловите естери към метиловите естери

Фигура 1

Примерна газова хроматограма на фракцията на восъците в маслиново масло ( 7 )

Пикове с време на задържане на метиловите и етиловите естери на мастни киселини от 5 до 8 минути

Условни знаци:

I.S. —

Лаурилов арахидат

1 —	дитерпенови естери

2+2′ —

естери C40

3+3′ —

естери C42

4+4′ —

естери C44

5 —	естери C46

6 =	стеролови естери и тритерпенови алкохоли

Фигура 2

Метилови естери, етилови естери и восъци в необработено маслиново масло

Условни знаци:

1

–

метил C16

2

–

етил C16

3

–

метилов хептадеканоат I.S.

4

–

метил C18

5

–

етил C18

6

–

сквален

7

–

лаурилов арахидат I.S.

A

–

дитерпенови естери

B

–

восъци

C

–

стеролови естери и тритерпенови естери

Фигура 3

Метилови естери, етилови естери и восъци в необработено маслиново масло с екстра качество

Условни знаци:

1

–

метилов хептадеканоат I.S.

2

–

метил C18

3

–

етил C18

4

–

сквален

5

–

лаурилов арахидат I.S.

A

–

дитерпенови естери

B

–

восъци

C

–

стеролови естери и тритерпенови естери

Фигура 4

Част от хроматограма за необработено маслиново масло с екстра качество и същото масло с пикове от обезмирисено масло

Условни знаци:

1

–

метилов миристат I.S.

2

–

метилов палмитат

3

–

етилов палмитат

4

–

метилов хептадеканоат I.S.

5

–

метилов линолеат

6

–

метилов олеат

7

–

метилов стеарат

8

–

етилов линолеат

9

–

етилов олеат

10

–

етилов стеарат

---

Приложение A

Определяне на линейната скорост на газа

Инжектират се от 1 до 3 μl метан (или пропан) в газовия хроматограф след настройването му към нормалните работни условия. Измерва се времето, за което газът преминава през колоната от момента на инжектирането му до появяването на пика (tM).

Линейната скорост в cm/s се пресмята по формулата L/tM, където L е дължината на колоната в сантиметри, а tM е измереното време в секунди.

▼M28 —————

▼M25

---

ПРИЛОЖЕНИЕ ХХI

---

( 1 ) ОВ L 228, 1.9.2009 г., стр. 3.

( 2 ) Директива 2011/91/ЕС на Европейския парламент и на Съвета от 13 декември 2011 г. относно означенията или маркировките, идентифициращи партидата, към която принадлежи дадена храна (ОВ L 334, 16.12.2011 г., стр. 1).

( 3 ) След елуирането на стероловите естери хроматографският ход не бива да съдържа изразени пикове (триглицериди).

( 4 ) Регламент (ЕС) № 1308/2013 на Европейския парламент и на Съвета от 17 декември 2013 г. за установяване на обща организация на пазарите на селскостопански продукти и за отмяна на регламенти (ЕИО) № 922/72, (ЕИО) № 234/79, (ЕО) № 1037/2001 и (ЕО) № 1234/2007 на Съвета (ОВ L 347, 20.12.2013 г., стр. 671).

( 5 ) Дегустаторът може да реши да не вкусва масло, когато при непосредствено помирисване забележи изключително интензивен отрицателен признак — в този случай той отбелязва това извънредно обстоятелство върху профилиращия лист.

( 6 ) In these cases in particular, a 95/5 by volume benzene/acetone eluent mixture must be used to obtain distinct band separation.

( 7 ) След елюирането на стероловите естери, хроматограмата не трябва да съдържа изразени пикове (триацилглицерини).