„I“

:

територия, където наличието на BSE в местния добитък е било оценено като слабо вероятно за целите на износа в Европейската общност на животни, сертифицирани в съответствие с образци на сертификат BOV-X и BOV-Y.

„II“

:

територия, призната за официално свободна от туберкулоза за целите на износ в Европейската общност на животни, сертифицирани в съответствие с образец на сертификат BOV-X.

„III“

:

територия, призната за официално свободна от бруцелоза за целите на износ в Европейската общност на животни, които са сертифицирани в съответствие с образец на сертификат BOV-X.

„IVa“

:

територия, призната за официално свободна от ензоотична левкоза по говедата (EBL) за целите на износ в Европейската общност на животни в съответствие с образец на сертификат BOV-X.

„IVб“

:

територия с одобрени стопанства, призната за официално свободна от ензоотична левкоза по говедата (EBL) за целите на износа в Европейската общност на животни, които са сертифицирани в съответствие с Образец на сертификат BOV-X.

„V“

:

територия, призната за официално свободна от бруцелоза за целите на износ в Европейската общност в съответствие с образец на сертификат OVI-X.

„VI“

:

географски ограничения:

В случая на България, код на територия BG-1, животни, които са сертифицирани в съответствие с образци на ветеринарен сертификат BOV-X, BOV-Y, RUM, OVI-X и OVI-Y, могат да бъдат внасяни само в онези части на територията на държава-членка, която е посочена в приложение II към Решение 2001/138/ЕО от 9 февруари 2001 г., ако тази държава-членка разрешава така.

„VII“

:

територия, призната за официално свободна от туберкулоза за целите на износа в Европейската общност на животни, които са сертифицирани в съответствие с образец на сертификат RUM.

„VIII“

:

територия, призната за официално свободна от бруцелоза за целите на износ в Европейската общност на животни, които са сертифицирани в съответствие с образец на сертификат RUM.

„IX“

:

територия, призната за официално свободна от болестта на Ауески за целите на износ в Европейската общност на животни, които са сертифицирани в съответствие с Образец на сертификат POR-Х.

„BOV-X“

:

Образец на ветеринарен сертификат за домашни животни от рода на едрия рогат добитък (Bos taurus, Bison bison, Bubalus bubalis и техните кръстоски), които са предвидени за отглеждане и/или разплод след внос

„BOV-Y“

:

Образец на ветеринарен сертификат за домашни животни от рода на едрия рогат добитък (Bos taurus, Bison bison, Bubalus bubalis и техните кръстоски), които са предвидени за незабавно клане след внос

„OVI-X“

:

Образец на ветеринарен сертификат за домашни овце (Ovis aries) и кози (Capra hircus), които са предвидени за отглеждане и/или разплод след внос

„OVI-Y“

:

Образец на ветеринарен сертификат за домашни овце (Ovis aries) и кози (Capra hircus), които са предвидени за незабавно клане след внос

„POR-X“

:

Образец на ветеринарен сертификат за домашни свине (Sus scrofa), предвидени за отглеждане и/или разплод след внос

„POR-Y“

:

Образец на ветеринарен сертификат за домашни свине (Sus scrofa), които са предвидени за незабавно клане след внос

„RUM“

:

Образец на ветеринарен сертификат за недомашни животни, различни от свине

„SUI“

:

Образец на ветеринарен сертификат за недомашни свине(Suidae).

„A“

:

гаранции, които се отнасят до тестове за син език и епизоотична хеморагична болест на животни, които са сертифицирани в съответствие с образец на сертификат BOV-X (точка 10.8a), OVI-X (точка 10.6a) и RUM (точка 10.7a)

„B“

:

гаранции, които се отнасят до тестове за везикулозна болест по свинете и класическа чума по свинете върху животни, които са сертифицирани в съответствие с образец на сертификат POR-X (точка 10.4a) и SUI (точка 10.4a)

„C“

:

гаранции, които се отнасят до тест за бруцелоза върху животни, които са сертифицирани в съответствие с образец на сертификат POR-X (точка 10.4a) и SUI (точка 10. a)

а)

Ветеринарни сертификати се съставят от страната износителка въз основа на образците, посочени в приложение I, част 2, които съответстват на макета на образец, който отговаря на съответните животни. Те съдържат, по подреждането на номерата, което се показва в образеца, атестациите, които се изискват за всяка трета страна, и — според случая — онези допълнителни гаранции, които се изискват за страната износителка или част от нея.

Ако така се изисква от държавата-членка на ЕС по местоназначение за съответните животни, допълнителните сертификационни изисквания се инкорпорират също в оригиналния формуляр на ветеринарния сертификат.

б)

Отделен и уникален сертификат трябва да се осигури за животни, които се изнасят от една от териториите, посочени в приложение I, част 1, колони 2 и 3, които са отправени за същото местоназначение и транспортирани в същия железопътен вагон, камион, самолет или кораб.

в)

Оригиналът на всеки сертификат се състои от единичен лист, от двете страни, или когато се изисква повече текст той трябва да е в такава форма, че всички нужни страници да са част от интегрирано цяло и неделими.

г)

Той се съставя най-малко на един от официалните езици на държавата-членка на ЕС, в която се извършва инспекцията на граничния пункт, и на държавата-членка на ЕС по местоназначение. Въпреки това тези държави-членки могат да разрешат друг език на Общността вместо техния собствен, придружен, ако е необходимо, от официален превод.

д)

Ако по причини на идентификацията на артикулите на пратката (програма в точка 8.2 на образеца на сертификат), се прибавят допълнителни страници към сертификата, тези страници също се считат като част от оригинала на сертификата с полагането на подписа и печата на сертифициращия официален ветеринарен лекар върху всяка от страниците.

e)

Когато сертификатът, който включва допълнителни позиции, посочени в буква д), се състои от повече от един лист, всеки лист се номерира — (номер на страница) от (общ брой на страници) — в горната част и носи кодовия номер на сертификата, който е бил определен от компетентния орган в началото на документа.

ж)

Оригиналът на сертификата трябва да бъде попълнен и подписан от официален ветеринарен лекар в рамките на 24 часа преди натоварване на пратката за износ в Общността. Извършвайки това, компетентният орган на страната износителка гарантира, че са спазени принципи на сертифициране, еквивалентни на тези, които са установени в Директива 96/93/ЕО на Съвета.

Цветът на подписа е различен от цвета на написаното. Същото правило се прилага за печати, които са различни от тези с релеф или воден знак.

з)

Оригиналът на сертификата трябва да придружава пратката до достигане на граничния инспекционен пункт на ЕС.

и)

Сертификатът е валиден 10 дни от датата на издаване.

В случай на транспортиране с кораб срокът на валидност се продължава с времето на пътуването в кораба. За тази цел към ветеринарния сертификат се прилага декларация от капитана на кораба, която е съставена в съответствие с допълнението към част 3 от приложение I към настоящото решение, в нейната оригинална форма.

й)

Животните не се транспортират заедно с други животни, които не са с местоназначение в Европейската общност или са с по-нисък здравен статус.

к)

По време на транспортирането към Европейската общност животните не се разтоварват на територията на страна или част от нея, която не е одобрена за внос на тези животни в Общността.

I.

Те са под контрола на официален ветеринарен лекар.

II.

Всеки един от тях е разположен в центъра на район от 20 km в диаметър, в който, в съответствие с официално установяване, за най-малко 30 преди тяхното използуване като одобрени центровете, не е имало случай на шап.

III.

Преди всяко използуване те се почистват и дезинфекцират с дезинфектант, официално разрешен в страната износителка като ефективен за контрола на спомената болест в изискване II по-горе.

IV.

Те имат, вземайки предвид капацитета си за прием на животни: a) съоръжение, изключително предназначено за тази цел; б) подходящо съоръжение, лесно за почистване и дезинфекция, за натоварване, разтоварване и адекватно подслоняване от пригоден за животни стандарт, за тяхното поене и хранене, и за оказване на всяко нужно им третиране; в) подходящи съоръжения за инспекция и изолиране; г) подходящо оборудване за почистване и дезинфекция на помещения и камиони; д) подходяща складова площ за фураж, отпадъци и тор; е) подходящи системи за събиране и изнасяне на отпадни води; ж) офис за официалния ветеринарен лекар.

V.

Когато действат те имат достатъчно ветеринарни лекари за изпълнение на всички задължения.

VI.

Те приемат само животни, които са били индивидуално идентифицирани, така че да се гарантира проследимост. За тази цел, когато се приемат животни, собственикът или длъжностното лице от центъра осигурява, че животните са надлежно идентифицирани и придружени от здравни документи или сертификати за включените породи и категории. Нещо повече, това лице записва в регистър или база данни и съхранява най-малко три години името на собственика, произхода, датата на влизане и напускане, брой и идентификация на животните или регистрационен номер на стадото по произход и тяхното направление, и регистрационния номер на превозното средство или регистрационния номер на камиона, доставящ или взимащ животни от помещенията.

VII.

Всички животни, преминаващи през тях, отговарят на здравните условия, установени за внос на съответната категория животни в Европейската общност.

VIII.

Животни, които ще бъдат изнасяни към Европейската общност, които минават през събирателен център, трябва в рамките на шест дни от пристигането да бъдат натоварени и отправени директно към границата на страната износителка: a) без да влизат в контакт с чифтокопитни животни, различни от тези, които отговарят на здравните условия, установени за внос на съответни категории животни в Европейската общност; б) разделени на партидни пратки, така че никоя пратка да не съдържа едновременно животни за разплод или производство и животни за незабавно клане; в) в транспортни средства или контейнери, които са били първо почистени и дезинфектирани с дезинфектант, официално разрешен в страната износителка, който е ефективен в контрола на споменатата болест в изискване II по-горе, и които са така конструирани, чe фекалии, урина, отпадъци или фураж не могат да изтекат или паднат навън по време на транспортиране.

IX.

Където условията за износа в Общността изискват да бъде направен тест в специфично определено време преди натоварване, този период включва всеки период за събиране, до шест дни, след пристигането на животните в одобрения център.

X.

Страната износителка определя одобрени центрове, които са одобрени за животни за разплод и производство и одобрени центрове, които са одобрени за животни за клане и уведомява Комисията и компетентните централни органи на държавите-членки за имената и адресите на такива помещения, както и редовно за тяхното актуализиране.

XI.

Страната износителка определя процедурата за официален надзор на одобрени центрове и осигурява, че такъв надзор е осъществяван.

XII.

Те се инспектират редовно, за да се осигури, че изискванията за одобрение продължават да се изпълняват. В случай на оттегляне вследствие на неизпълнение на посочените изисквания, одобрението може да бъде възстановено само когато компетентният орган е удовлетворен от цялостно съответствие на центъра с всички разпоредби, посочени по-горе.

Конкурентният Елайза тест, използващ моноклонално антитяло 3-17-A3, е способен да идентифицира антитела на всички известни серумни типове на вирус на син език (BTV).

Принципът на теста е прекъсването на реакцията между BTV антиген и групово специфично моноклонално антитяло (3-17-A3) чрез добавка на тестов серум. Антителата на BTV, присъствуващи в тестовия серум, блокират реактивността на моноклоналното антитяло (Mab) и водят до намаляване на очакваното цветово развитие след добавяне на ензимно маркирано антимишо антитяло и на хромоген/субстрата. Серуми могат да бъдат тествани при 1:5 (точков тест — допълнение 1) или могат да бъдат титрувани (серум титруване — допълнение 2) за достигане крайна точка на разреждането. Стойности на забавяне по-високи от 50 % могат да се считат като позитивни.

1.

Подходящи Елайза микротитърни плаки.

2.

Антиген: доставен като клетъчно екстрактиран концентрат, приготвен, както е описано по-долу, и съхраняван или при – 20 °C, или при – 70 °C.

3.

Блокиращ буфер: фосфатно буферирана сол (PBS), съдържаща 0,3 % BTV отрицателен серум възрастни говеда, 0,1 % (v/v) Tween-20 (доставен като сироп на polyoxyethylene sorbiton monolaurate) в PBS.

4.

Моноклонално антитяло: 3-17-A3 (доставено като hybridoma тъканно-културов каймак) насочено срещу групово специфичен полипептид VP7, съхраняван при – 20 °C или изсушен замразително и разреден 1/100 с блокиращ буфер преди употреба.

5.

Съединете: заешки антимиши глобулин (адсорбиран и отмит), съединен с пероксидаза на хрян и държан на тъмно при 4 °C.

6.

Хромоген и субстрат: Orthophenylene diamine (OPD-chromogen) при крайна концентрация от 0,4 mg/ml в стерилна дестилирана вода. Водороден прекис (30 % w/v-субстрат) 0,05 % v/v, добавени непосредствено преди употреба (5μl H2O2 на 10 ml OPD). (боравете внимателно с OPD — носете гумени ръкавици — предположим мутаген).

7.

1 моларна сярна киселина: 26,6 ml киселина добавена към 473,4 ml дестилирана вода. (Помнете — винаги прибавяйте киселина към вода, никога вода към киселина).

8.

Орбитален шейкър.

9.

Елайза плаков четец (тестът може да бъде четен визуално).

Контрол на съединяване (Cс)

:

ямки 1A и 1Б са бланков контрол, състоящ се от BTV антиген и съединение. Това може да бъде използуване на бланков четец на Елайза.

Mab контрол (Cm)

:

Колони 1 и 2, редове Ж и З са контролни за моноклонално антитяло и съдържaт BTV антиген, моноклонално антитяло и съединение. Тези източници представляват максимален цвят. Средното на отчетената оптическа плътност от този контрол представлява 0 % стойност на инхибиране.

Позитивен контрол (C++, C–)

:

Колони 1 и 2, редове В-Г-Д-Е. Тези ямки съдържат BTV антиген, BTV силен и слаб позитивен антиген съответно, Mab и съединяване.

Отрицателен контрол (C–)

:

Ямки 2A и 2Б са негативните контроли, които съдържат BTV антиген, BTV негативен антисерум, Mab и съединяване.

Тестови серуми

:

За обширни изследвания и бърз скрининг, серуми биха могли да бъдат тествани при единствено разреждане от 1:5 (допълниние 1). Алтернативно, 10 серума могат да бъдат тествани в гама на разреждане от 1:5 до 1:640 (допълнение 2). Това ще даде определени индикации за титъра на тестваните серуми.

1.

Разредете BTV антиген към предварително титрувана концентрация на PBS, въздействайте ултразвуково за кратко, за да диспергирате агрегирания вирус (ако няма наличен ултразвуков апарат, пипетирайте енергично) и прибавете 50 ml към всички ямки на Елайза плаката. Потупайте страните на плаката за диспергиране на антиген.

2.

Инкубирайте при 37 °C за 60 минути в орбитален шейкър. Измийте плаките три пъти чрез наводняване и изпразване на ямките с нестерилна PBS и попийте с попивателна хартия.

3.

Контрол ямки: Прибавете 100 μl блокиращ буфер към Cc ямките. Прибавете 50 μl позитивни и негативни контролни серуми при разреждане от 1:5 (10 μl серуми + 40 μl блокиращ буфер), към съответните ямки C–, C + и C++. Прибавете 50 μl блокиращ буфер към Mab контролните ямки.

Метод точково титруване: Прибавете 1:5 разреждане от всеки тестов серум в блокиращ буфер, за да дублирате ямките на колони 3—12 (10 μl серум + 40 μl блокиращ буфер),

или

Метод за серумно титруване: Пригответе двукратни серии на всеки от тестовите образци (1:5 до 1:640) в блокиращ буфер върху осем ямки на единични колони 3—12.

4.

Веднага след прибавянето на тестовите серуми разредете Mab 1:100 в блокиращ буфер и добавете 50 μl към всички ямки на плаката, освен за празните контролни.

5.

Инкубирайте при 37 °C за 60 минути в орбитален шейкър. Измийте три пъти с PBS и попийте до сухо.

6.

Разредете заешки антимиши концентрат до 1/5000 в блокиращ буфер и добавете 50 μl към всички ямки на плаката.

7.

Инкубирайте при 37 °C за 60 минути в орбитален шейкър. Измийте три пъти с PBS и попийте до сухо.

8.

Размразете OPD и веднага преди употреба добавете 5 μl от 30 % въглероден прекис към всеки 10 ml на OPD. Добавете 50 μl към всички ямки на плаката. Оставете цвета да се развие за приблизително 10 минути и спрете реакцията с 1 M сярна киселина (50 μl на отвор). Цвят ще се развие в Mab контролните ямки и в тези ямки, съдържащи серуми без антитяло на BTV.

9.

Изследвайте и запишете плаките или визуално, или използвайки спектрофотометричен четец.

1.

Измийте 40-60 запръжки на сливащи се BHK-21 клетки три пъти с безсерумна тъканна среда и инфектирайте със син език вирусния серотип 1 в безсерумнна тъканна среда.

2.

Инкубирайте при 37 °C и изследвайте дневно за цитопатичен ефект (CPE).

3.

Когато CPE са завършени на 90 до 100 % на клетъчния лист на запръжка, съберете вируса чрез разклащане на все още залепнали клетки от стъклото.

4.

Центрофугирайте при 2 000 до 3 000 rpm, за да направите клетките на пелети.

5.

Отстранете повърхностно плуващото и суспендирайте отново клетките в приблизително 30 ml oт PBS, съдържащ 1 % „Sarkosyl“ и 2 ml phenylmethylsulphonyl fluoride (lysis буфер). Това може да доведе до това клетките да формират гел и за редуциране на този ефект може да бъде добавен повече lysis буфер. (NB phenylmethylsulphonyl fluoride е опасен — трябва да се борави с изключителна предпазливост.)

6.

Разрушавайте клетките за 60 секунди, използвайки ултразвукова сонда при амплитуда от 30 микрона.

7.

Центрофугирайте при 10 000 rpm за 10 минути.

8.

Съхранявайте повърхностно плаващото при + 4 °C и суспендирайте отново оставащата клетъчна пелета в 10 до 20 ml на lysis буфер.

9.

Въздействайте ултразвуково и прояснете, съхранявайки повърхностно плуващото при всеки етап, общо от три пъти.

10.

Съберете повърхностно плуващото и центрофугирайте при 24 000 rpm (100 000 g) за 120 минути при + 4 °C върху подложка от 5 ml 40 % захароза (w/v в PBS), използвайки 30 ml Becкмann центрофужни тръби и SW 28 ротор.

11.

Отстранете повърхностно плаващото, дренирайте тръбите цялостно и суспендирайте отново пелета в PBS чрез ултразвуково въздействие. Съхранете антигена в кратни обеми при – 20 °C.

1.

Титрувайте 1:20 разреждане на BTV антиген в PBS през микротитърната плака в двукратно разредителни серии (50 μl/ямка), използувайки многоканална пипета.

2.

Инкубирайте за един час при 37 °C върху орбитален шейкър.

3.

Измийте плаките три пъти с PBS.

4.

Добавете 50 μl моноклонално антитяло 3-17-A3 (разредено 1/100) към всеки отвор на микротитърната плака.

5.

Инкубирайте за един час при 37 °C върху орбитален шейкър.

6.

Измийте плаките три пъти с PBS.

7.

Добавете 50 μl от заешки антимиши глуболин, съединен към хрянова пероксидоза, разредена до предварително титрувана оптимална концентрация, към всяка ямка на микротитърна плака.

8.

Инкубирайте за един час при 37 °C върху орбитален шейкър.

9.

Добавете субстрат и хромоген, както е описано преди. Спрете реакцията след 10 минути чрез добавянето на 1 моларна сярна киселина (50 μl/ямка).

Процедура

:

1 % агароза, приготвена в боров или натриев барбитол буфер, pH 8,5—9,0,се изсипва в каменно легенче до минимална дълбочина от 3,0 mm. Тестов образец на седем безвлажностни ямки, всяка 5,0 mm в диаметър, се врязва в агара. Образецът се състои от една централна ямка и шест ямки, подредени около в кръг от радиус 3 cm. Централната ямка се пълни със стандартен антиген. Периферните ямки 2, 4 и 6 се пълнят с известен положителен серум, ямки 1, 3 и 5 се пълнят с тестови серуми. Системата се инкубира до 72 часа при стайна температура в затворена влажна камера.

Интерпретиране

:

Тестов серум е положителен, ако формира специфична линия на утайка с антигена и формира завършена линия на идентификация с контролния серум. Тестов серум е отрицателен, ако не формира специфична линия с антигена и не изкривява линията на контролния серум. Петри плаките би трябвало да се изследват срещу тъмен фон и използвайки индиректно осветление.

Процедура

:

1 % агароза, приготвена в боров или натриев барбитол буфер, pH 8,5—9,0, се изсипва в каменно легенче до минимална дълбочина от 3,0 mm. Тестов образец на седем безвлажностни ямки, всяка 5,0 mm в диаметър, се врязва в агара. Образецът се състои от един централна ямка и шест ямки, подредени около в кръг от радиус 3 cm. Централната ямка се пълни със стандартен антиген. Периферните ямки 2, 4 и 6 се пълнят с известен положителен серум, ямки 1, 3 и 5 се пълнят с тестови серуми. Системата се инкубира до 72 часа при стайна температура в затворена влажна камера.

Интерпретиране

:

Тестов серум е положителен, ако формира специфична отвесна линия с антигена и формира завършена линия с контролния серум. Тестов серум е отрицателен, ако не формира специфична линия с антигена и не изкривява линията на контролния серум. Петри плаки би следвало да се изследват срещу тъмен фон и използвайки индиректно осветление.

Серум

:

Всички серуми са топлинно дезактивирани при 56 °C за 30 минути преди употреба.

Процедура

:

Постоянно вирусновариращ серум неутрализиращ тест върху микротитърни плаки използува MDBK или други възприемащи клетки. Colorado, Oxford или всеки друг референтен товар на вирус се използува при 100 TCID50 на 0,025 ml; деактивирани неразредени серумни проби се смесват с равен обем (0,025 ml) на вирусна суспензия. Вирус/серум смесите се инкубират за 24 часа при 37 °C в микротитърни плаки, преди да се добавят MDBK клетките. Клетките се използуват при концентрация, която формира цялостен моно пласт след 24 часа.

Контроли

:

i) вирусна заразеност образец, ii) контроли на серумна токсичност, iii) незаразени клетъчно културни контроли, iv) референтни антисеруми.

Интерпретиране

:

Резултатите на неутрализиращия тест и титъра на вируса, използван в теста, се записват след три до шест дни инкубиране при 37 °C. Серумните титри се считат отрицателни, ако няма никаква неутрализация при разреждане от 1/2 (неразреден серум).

Реактиви

:

Преди вземане на проби се приготвя транспортиращо средство. Два ml обеми се разпределят в толкова контейнера, колкото са животните за вземане на проби. Използваните контейнери би трябвало да издържат замразяване върху твърд CO2 или течен азот. Пробите се получават чрез използуване на специално конструиран слюнков колектор или „пробатор“. За получаване на проба чашата на пробатора се прекарва през устата, над гърба на езика и надолу в горната част на хранопровода. Правят се опити да се изстърже повърхностния епител на горния хранопровод и фаринкса чрез движения, насочени странично и дорсално. Пробаторът се отдръпва тогава, за предпочитане след като животното е преглътнало. Чашата следва да е пълна и да съдържа смес от слуз, слюнка, хранопроводна течност и клетъчни остатъци. Би следвало да се внимава така че всеки екземпляр да съдържа някакъв видим клетъчен материал. Много грубо манипулиране, което причинява кървене, би следвало да се избягва. Пробите от някои животни могат да бъдат силно замърсени от преживно съдържание. Такива проби би следвало да се отстраняват и устата на животното да се изплакне с вода или за предпочитане с физиологична сол преди да се повтори вземането на проба.

Третиране на проби

:

Всяка събрана проба в пробаторната чаша се изследва за качество и 2 ml се добавят в равен обем транспортиращо средство в контейнер, който може да издържи замразяване. Контейнерите са здраво затворени, запечатани, дезинфекцирани и етикетирани. Пробите се държат охладени (+ 4 °C) и се изследват в рамките на три до четири часа или се поставят върху сух лед (– 69 °C) или течен азот и се държат замразени до изследване. Между две събирания на проба пробаторът се дезинфектира и измива в три смени чиста вода.

Тестване за вирус на FMD

:

Пробите се инкубират в култури на първични говежди клетки от щитовидна жлеза, използвайки най-малко три епруветки на проба. Други приемни клетки, напр. първични говежди или свински бъбречни клетки, могат да бъдат използувани, но трябва да се има предвид, че за някои товари на вирус на FMD те са по-малко чувствителни. Епруветките се инкубират при 37 °C на въртящ се апарат и изследват ежедневно за 48 часа за наличието на цитопатичен ефект (CPE). Ако са отрицателни, културите са покрито прехвърлени върху нови култури и изследвани отново 48 часа. Специфичността на всеки CPE трябва да бъде потвърдена.

1.

0,08M фосфатен буфер pH 7,2, съдържащ 0,01 % говежди серумен албумин, 0,002 % фенол червен и антибиотици.

2.

Средство на тъкана култура (напр. тъканна среда MEM), съдържаща 0,04M Hepes буфер, 0,01 % говежди серумен албумин и антибиотици, pH 7,2.

3.

Антибиотици (на ml финално) би следвало да бъдат добавяни към транспортиращото средство, пр. penicillin 1 000 IU, neomycin sulphate 100 IU, polymyxin B sulphate 50 IU, mycostatin 100 IU.

Реактиви

:

Запасен FMDV антиген се приготвя от клетъчни култури или върху говежди езици и се съхранява при температура – 70 °C или по-ниска или при – 20 °C след прибавяне на 50 % глицерол. Това е запасният антиген. FMDV е стабилен при тези условия и титри варират малко за период от месеци.

Процедура

:

Тестът се изпълнява в плоскодънна за тъканни култури градуирана плака, използваща приемащи клетки, такива като IB-RS-2, BHK-21 или клетки от телешки бъбрек. Серуми за теста се разреждат 1/4 в безсерерумни клетъчни културови средства с добавяне на 100 IU/ml neomycin или други подходящи антибиотици. Серуми се дезактивират при 56 °C за 30 минути и 0,05 ml количества се използуват за приготвяне на двукратни серии върху микротитърни плаки, използвайки 0,05 ml разреждащи вълни. Предварително титруван вирус, също разреден в безсерумна културова среда и съдържащ 100 TCID50/0,05 ml, се добавят към всяка ямка. След инкубирането при 37 °C за един час, позволяващо да се получи неутрализация, 0,05 ml клетъчни суспензии, съдържащи 0,5 до 1,0 × 106 клетки на 1 ml в клетъчно културова среда, съдържаща безсерумно FMD антитяло, се добавя към всяка ямка и плаките се запечатват. Плаките се инкубират при 37 °C. Монопластове са нормално съединяващи в рамките на 24 часа. CPE е обичайно достатъчно напреднал за 48 часа за микроскопско отчитане на теста. По това време може да бъде направено финално микроскопско отчитане или плаките могат да бъдат фиксирани и оцветени за микроскопско отчитане, например използвайки 10 % формолна сол и 0,05 % метилен син.

Контроли

:

Контролите при всеки тест включват хомологов антисерум на известен титър, клетъчен контрол, контрол на серумната токсичност, контрол на средата и вирусното титруване, от които се изчислява фактическото количество на вирус в теста.

Интерпретиране

:

Ямки с доказателство за CPE се считат за инфектирани и неутрализиращи титри се изразяват като реципрочни на финалното разреждане на наличния серум в серум/вирус смесите при 50 % крайна точка, пресметната в съответствие с метода на Спиърмен-Карбер. (Karber, G., 1931, Archiv fuer Experimentelle Pathologie und Pharmokologie, 162, 480). Тестовете се считат за валидни, когато действителното количество на вирус, използувано на ямка в теста, е между 101,5 и 102,5 TCID50 и когато титърът на референтния серум е в рамките на двукратното от неговия очакван титър, изчислен по начина на предишните титрувания. Когато контролите са извън тези граници, тестовете се повтарят. Крайна титърна точка от 1/11 или по-малко се приема за отрицателна.

Реактиви

:

Заешки антисеруми на 146S антиген от седем вида вирус на шап (FMDV), използувани като предварително определена оптимална концентрация в карбонатен/бикарбонатен буфер, pH 9,6. Антигени се приготвят от избрани товари на вирус, отгледани върху монопластове на BHK-21 клетки. Непречистените повърхностно плуващи флуиди се използуват и предварително се титруват, съгласно протокола, но без серум, за да дадат разреждане, което след добавяне на равен обем на PBST (фосфатно буферирана сол, съдържаща 0,05 % Tween-20 и фенол червен индикатор) биха дали оптическа плътност, отчитаща между 1,2 и 1,5. Вирусите могат да бъдат използувани неактивирани. PBST се използува като разредител. Антисеруми от морски свинчета се приготвят чрез заразяване на морски свинчета с 146S антиген на всеки серум тип. Предварително определена оптимална концентрация се приготвя в PBST, съдържащ 10 % нормален говежди серум и 5 % нормален заешки серум. Заешки антиморски свинчета имуноглуболин, съединен с хрянова пероксидоза, се използува при предварително определена оптимална концентрация в PBST, съдържаща 10 % нормален говежди серум и 5 % нормален заешки серум. Серумите се разреждат в PBST.

1.

Елайза плаки са покрити с пласт от 50 μl на заешки антивирусни серуми за през нощта във влажна камера при стайна температура.

2.

Петдесет микролитра от дубликат, двукратни серии на всеки тестов серум, започвайки от ¼, се приготвят в U-дънни мултиямкови плаки (пренасящи плаки). Петдесет микролитра от постоянна доза на антиген се добавят към всяка ямка и смесите се оставят една нощ при 4 °C. Добавянето на антиген редуцира стартовото разреждане на серума до 1/8.

3.

Елайза плаките се измиват пет пъти с PBST.

4.

Петдесет микролитра на серум/антиген смеси се преместват от пренасящите плаки към заешко серумно покритите Елайза плаки и инкубирани при 37 °C за един час върху ротационен шейкър.

5.

След измиване 50 μl от морски свинчета антисерум се добавят към използвания антиген в точка 4 към всяка ямка. Плаките се инкубират при 37 °C за един час върху ротационен шейкър.

6.

Плаките се измиват и 50 μl oт заешки антиморски свинчета имуноглуболин, свързан с хрянова пероксидоза, се добавя към всяка ямка. Плаките се инкубират при 37 °C за един час върху ротационен шейкър.

7.

Плаките се измиват и 50 μl oт ортофенилен диамин, съдържащ 0,05 % H2O2 (30 %) w/v, се добавя към всяка ямка.

8.

Реакцията се спира след 15 минути с 1,25M H2SO4.

Контроли

:

За всеки използван антиген 40 ямки не съдържат серум, но съдържат антиген, разреден в PBST. Дублирани двукратно разреждане серии от хомогенен говежди референтен антисерум. Дублирани двукратно разреждане серии на отрицателен говежди серум.

Интерпретиране

:

Титрите на антитяло се изразяват като крайното разреждане на тестови серуми, даващи 50 % от средните OD стойности, записани в вирусно контролните ямки, където отсъства тестов серум. Титрите в повече от 1/40 се считат положителни.

Позовавания

:

Hamblin C, Barnett ITR and Hedger RS (1986) „Нов ензимно свързан имунносорбентен образец (Елайза) за откриване на антитела против вирус на шап. I. Развитие и методи на Елайза.“Journal of Immunological Methods, 93, 115 до 121.11.

Серум

:

Всички серуми се инактивират топлинно при 56 °C за 30 минути преди използуване.

Процедура

:

Постоянният вирусно вариращ серумен неутрализационен тест върху микротитърни плаки използува Vero или други чувствителни клетъчни системи. Вирус на болестта на Ауески се използува при 100 TCID50 на 0,025 ml; неактивирани неразредени серумни проби се смесват с равен обем (0,025 ml) oт вирусна суспензия. Вирусно/серумните смеси се инкубират за два часа при 37 °C в микротитърни плаки преди да бъдат добавени подходящите клетки. Клетки се използуват при концентрация, която формира цялостен монопласт след 24 часа.

Контроли

:

i) вирус заразност образец, ii) серум токсичност контроли, iii) контроли на неинкубирана клетъчна култура, iv) референтни антисеруми.

Интерпретиране

:

Резултатите на неутрализиращия тест и титъра на вируса, използван в теста, се записват след три до седем дни инкубиране при 37 °C. Серумни титри по-малки от 1/2 (неразреден серум) се считат отрицателни.

Серум

:

Всички серуми са топлинно дезактивирани при 56 °C за минути преди употреба.

Процедура

:

Постоянният вирусно вариращ серумен неутрализационен тест върху микротитърни плаки използува A72 (кучешки тумор) клетки или други чувствителни клетъчни системи. TGE вирус се използува при 100 TCID50 на 0,025 ml; неактивирани неразредени серумни проби се сместват с равен обем (0,025 ml) oт вирусна суспензия. Вирусно/серумните смеси се инкубират за 30 до 60 минути при 37 °C в микротитърни плаки, преди да бъдат добавени подходящите клетки. Клетки се използуват при концентрация, която формира цялостен монопласт след 24 час. Всяка клетка получава 0,1 ml oт клетъчна суспензия.

Контроли

:

i) вирус заразност образец, ii) серум токсичност контроли, iii) контроли на неинкубирана клетъчна култура, iv) референтни антисеруми.

Интерпретиране

:

Резултатите на неутрализиращия тест и титърът на вируса, използван в теста, се записват след три до седем дни инкубиране при 37 °C. Серумни титри по-малки от 1/2 (неразреден серум) се считат отрицателни. Ако неразредени серумни проби са токсични към тъканите култури, тези серуми могат да бъдат разредени 1/2 преди да бъде използувани в теста. Това ще бъде еквивалентно на 1/4 финално разреждане на серум. Серумни титри по-малко от 1/4 (финално разреждане) се считат отрицателни в тези случаи.

„1“

:

Географски и времеви ограничения

„2“

:

Ограничения на категории

Карантия не е разрешена (с изключение на диафрагми и челюстни мускули от едър рогат добитък).

„BOV“

:

Образец на ветеринарен сертификат за прясно месо от домашен животни от рода на едрия рогат добитък (Bos taurus, Bison bison, Bubalus bubalis и техни кръстоски)

„POR“

:

Образец на ветеринарен сертификат за прясно месо от домашни свине (Sus scrofa)

„OVI“

:

Образец на ветеринарен сертификат за прясно месо oт домашни овце (Ovis aries) и кози (Capra hircus)

„EQU“

:

Образец на ветеринарен сертификат за прясно месо от домашни еднокопитни (Equus caballus, Equus asinus и техните кръстоски)

„RUF“

:

Образец на ветеринарен сертификат за прясно месо oт недомашни животни, отглеждани във ферми, различни от свине и еднокопитни

„RUW“

:

Образец на ветеринарен сертификат за прясно месо от диви недомашни животни, различни от свине и еднокопитни

„SUF“

:

Образец на ветеринарен сертификат за прясно месо от отглеждани във ферми недомашни свине

„SUW“

:

Образец на ветеринарен сертификат за прясно месо oт диви недомашни свине

„EQW“

:

Образец на ветеринарен сертификат за прясно месо от диви недомашни еднокопитни

„A“

:

гаранции, които се отнасят до зреенето, pH измерване и обезкостяване на прясно месо, изключвайки карантия, сертифицирани в съответствие с образците на сертификати BOV (точка 10.6), OVI (точка 10.6), RUF (точка 10.7) и RUW (точка 10.4)

„B“

:

гаранции, които се отнасят до узряла очистена карантия, както е описана в образеца на сертификат BOV (точка 10.6)

„C“

:

гаранции, които се отнасят до лабораторни тестове за класическа чума по свинете в кланични трупове, от които е било получено прясно месо, сертифицирано в съответствие с образеца на сертификат SUW (точка 10.3a)

„D“

:

гаранции, които се отнасят до хранене с помия в стопанство/а на животни, от които е било добито прясно месо, сертифицирано в съответствие с образци на сертификати POR (точка 10.3, буква г)

„E“

:

гаранции, които се отнасят до тестове за туберкулоза в животни, от които е било добито прясно месо, сертифицирано в съответствие с образец на сертификат BOV (точка 10.4, буква г)

„F“

:

гаранции, които се отнасят до зреенето и обезкостяването на прясно месо, изключвайки карантия, сертифицирана в съответствие с образците на сертификати BOV (точка 10.6), OVI (точка 10.6), RUF (точка 10.7) и RUW (точка 10.4)

a)

Ветеринарни сертификати се изготвят от страната износителка, основани на образците, посочени в приложение II, част 2, които съответстват на макета на образеца, който кореспондира на съответните меса. Те съдържат, в номерирана последователност, показана в образеца, атестиранията, които се изискват за всяка трета страна и, според случая, онези допълнителни гаранции, които се изискват за третата страна износителка или за част от нея.

б)

Отделен и единствен сертификат трябва да бъде осигурен за месо, което се изнася от единствена територия, появяваща се в приложение II, част 1, колони 2 и 3, което се изпраща за същото местоназначение и е транспортирано в същия железопътен вагон, камион, самолет или кораб.

в)

Оригиналът на всеки сертификат се състои от единствена страница, от двете страни или, където се изисква повече текст, в същата форма, в каквато трябва да бъдат всички страници като част от единно и неразделимо цяло.

г)

Той се съставя най-малко на един от официалните езици на държавата-членка на ЕС, в която ще се извърши инспекцията на граничния пункт, и на държавата-членка по местоназначение. Въпреки това тези държави-членки могат да разрешат и други езици, придружени — ако е необходимо — от официален превод.

д)

Ако за целите на идентификация на позициите в пратката (таблица в точка 8.3 на образеца на сертификат), към сертификата са прикачени допълнителни страници, тези страници също се считат като съставна част от оригинала чрез полагане на подписа и печата на сертифициращия официален ветеринарен лекар на всяка една от страниците.

е)

Когато сертификатът, включително допълнителните таблици, посочени в буква д), съдържа повече от една страница, всяка страница се номерира — (номер на страница) от (общ брой на страниците) — в долната част, а в горната част носи кодовия номер на сертификата, който е бил определен от компетентния орган.

ж)

Оригиналът на сертификата трябва да бъде попълнен и подписан от официален ветеринарен лекар. Изпълнявайки това, компетентните органи на изнасящите страни гарантират, че са следвани принципи на сертифициране, еквивалентни на установените в Директива 96/93/EО на Съвета.

Цветът на подписа е различен от този на напечатаното. Същото правило се прилага към печатите, с изключение на тези, които са релефни или с воден знак.

з)

Оригиналът на сертификата трябва да придружава пратката до граничния инспекционен пункт на ЕС.