32000L0032

Language
- My EUR-Lex
- Sign in
- Register
- My recent searches (0)

This document is an excerpt from the EUR-Lex website

Search tips

Need more search options? Use the Advanced search

EUROPA
EUR-Lex home
Директива - 2000/32 - EN - EUR-Lex

Document 32000L0032

Help

Директива 2000/32/EO на Комисията от 19 май 2000 година относно двадесет и шесто адаптиране към техническия прогрес на Директива 67/548/ЕИО на Съвета за сближаване на законовите, подзаконовите и административните разпоредби на държавите-членки относно класификацията, опаковането и етикетирането на опасни вещества и препаратитекст от значение за ЕИП.

OB L 136, 8.6.2000, p. 1–89 (ES, DA, DE, EL, EN, FR, IT, NL, PT, FI, SV)

(CS, ET, LV, LT, HU, MT, PL, SK, SL, BG, RO, HR)
⏵Този документ е публикуван в специално издание (CS, ET, LV, LT, HU, MT, PL, SK, SL, BG, RO, HR)
специално чешко издание: глава 13 том 025 стр. 155 - 241
специално естонско издание глава 13 том 025 стр. 155 - 241
специално латвийско издание: глава 13 том 025 стр. 155 - 241
специално литовско издание: глава 13 том 025 стр. 155 - 241
специално унгарско издание глава 13 том 025 стр. 155 - 241
специално малтийско издание: глава 13 том 025 стр. 155 - 241
специално полско издание: глава 13 том 025 стр. 155 - 241
специално словашко издание: глава 13 том 025 стр. 155 - 241
специално словенско издание: глава 13 том 025 стр. 155 - 241
специално българско издание: глава 13 том 029 стр. 38 - 124
специално румънско издание: глава 13 том 029 стр. 38 - 124
специално хърватско издание: глава 13 том 018 стр. 47 - 50

Legal status of the document No longer in force, Date of end of validity: 31/05/2015; заключение отменено от 32008R1272

ELI: http://data.europa.eu/eli/dir/2000/32/oj

Date of document:: 19/05/2000
Date of effect:: 11/06/2000; влизане в сила дата на публикуване + 3 виж член 3
Date of transposition:: 01/06/2001; най - късно виж чл. 2.1
Date of end of validity:: 31/05/2015; заключение отменено от 32008R1272

Author:: Европейска комисия
Form:: Директива
Addressee:: Петнадесетте държави-членки: Белгия, Дания, Германия, Ирландия, Гърция, Испания, Франция, Италия, Люксембург, Нидерландия, Австрия, Португалия, Финландия, Швеция, Обединеното кралство
Additional information:: разширяване на ЕИП от 22004D0059, изменяща директива, отнася се за ЕИП
Authentic language:: испански, датски, немски, гръцки, английски, френски, италиански, нидерландски, португалски, фински, шведски, исландски, норвежки

Treaty:

Договор за създаване на Европейската общност

Legal basis:

31967L0548 - A28

Link

Select all documents mentioning this document

Modifies:

Relation	Act	Comment	Subdivision concerned	From
Modifies	31967L0548	поправка	приложение 1	11/06/2000
Modifies	31967L0548	поправка	приложение 2	11/06/2000
Modifies	31967L0548	поправка	приложение 4	11/06/2000
Modifies	31967L0548	поправка	приложение 6	11/06/2000
Modifies	31967L0548	изпълнение	приложение 5	11/06/2000
Modifies	31967L0548	поправка	приложение 9	11/06/2000

Modified by:

Relation	Act	Comment	Subdivision concerned	From	To
Implicitly repealed by	32008R1272			01/06/2015

Link

EUROVOC descriptor:

Subject matter:

Directory code:

13.30.18.00 Индустриална политика и вътрешен пазар / Вътрешен пазар: сближаване на законодателството / Опасни вещества

HTML

PDF

Official Journal

13/ 29

Официален вестник на Европейския съюз

32000L0032

L 136/1

ОФИЦИАЛЕН ВЕСТНИК НА ЕВРОПЕЙСКИЯ СЪЮЗ

ДИРЕКТИВА 2000/32/EO НА КОМИСИЯТА

от 19 май 2000 година

относно двадесет и шесто адаптиране към техническия прогрес на Директива 67/548/ЕИО на Съвета за сближаване на законовите, подзаконовите и административните разпоредби на държавите-членки относно класификацията, опаковането и етикетирането на опасни вещества и препарати (1)

(текст от значение за ЕИП)

КОМИСИЯТА НА ЕВРОПЕЙСКИТЕ ОБЩНОСТИ

като взе предвид Договора за създаване на Европейската общност,

като взе предвид Директива 67/548/ЕИО на Съвета от 27 юни 1967 г. за сближаване на законовите, подзаконовите и административни разпоредби относно класификацията, опаковането и етикетирането на опасни вещества (2), последно изменена с Директива 1999/33/ЕО на Европейския парламент и на Съвета (3), и по-специално член 28 от нея,

като има предвид, че:

(1)

Приложение I към Директива 67/548/ЕИО съдържа списък на опасни вещества, заедно с подробности за класификацията и етикетирането на всяко вещество. Съвременните научни и технически познания са показали, че списъкът с опасни вещества в това приложение следва да се адаптира. Някои езикови варианти на директивата изискват поправки в конкретни части на предговора и на таблица А към приложение I.

(2)

Приложение III към Директива 67/548/ЕИО съдържа списък на фразите, посочващи естеството на особените рискове, свързани с опасни вещества и препарати. Приложение IV към Директива 67/548/ ЕИО съдържа списък на фрази, посочващи съвети за безопасност относно опасни вещества и препарати. Приложение VI към Директива 67/548/ ЕИО съдържа ръководство за класификацията и етикетирането на опасни вещества и препарати. Някои езикови варианти на директивата изискват поправки в конкретни раздели на приложения III, IV и VI.

(3)	В приложение V към Директива 67/548/ЕИО са посочени методите за определяне на физикохимичните свойства, токсичността и екотоксичността на веществата и препаратите. Необходимо е това приложение да се адаптира към техническия прогрес.

(4)	Приложение IX към Директива 67/548/ЕИО съдържа разпоредбите относно закрепващи устройства за предпазване от деца. Тези разпоредби следва да се преработят и актуализират. Необходимо е да се разшири обхватът на употреба на закрепващите устройства за предпазване от деца.

(5)	Предвидените в настоящата директива мерки са в съответствие със становището на Комитета по адаптиране към техническия прогрес на директиви относно премахването на техническите пречки пред търговията с опасни вещества и препарати,

ПРИЕ НАСТОЯЩАТА ДИРЕКТИВА:

Член 1

Директива 67/548/ЕИО се изменя, както следва:

Приложение I се изменя, както следва:

а)	Забележка Р в приложение 1A към настоящата директива заменя съответната забележка в предговора.

б)	Редовете в приложение 1Б към настоящата директива заменят съответните редове в таблица A.

в)	Вписванията в приложение 1В към настоящата директива заменят съответните текстове.

г)	Добавят се вписванията в приложение 1Г към настоящата директива.

2.	Рисковата фраза в приложение 2 към настоящата директива заменя съответната фраза в приложение III.

Приложение IV се изменя, както следва:

а)	фразите за безопасност в приложение 3A към настоящата директива заменят съответните фрази в приложение IV.

б)	комбинираните фрази за безопасност в приложение 3Б към настоящата директива заменят съответните фрази в приложение IV.

Част Б от приложение V се изменя, както следва:

а)	Текстът в приложение 4А към настоящата директива заменя глава Б10,

б)	Текстът в приложение 4Б към настоящата директива заменя глава Б11,

в)	Текстът в приложение 4В към настоящата директива заменя глава Б12,

г)	Текстът в приложение 4Г към настоящата директива заменя глава Б13 и глава Б14.

д)	Текстът в приложение 4Д към настоящата директива заменя глава Б17.

е)	Текстът в приложение 4E към настоящата директива заменя глава Б23. Изменя се съответно заглавието на глава Б23 в обяснителната бележка.

ж)	Добавя се текста в приложение 4Ж към настоящата директива.

5.	Четвъртото тире на общото въведение към част В на приложение V се заличава.

6.	Текстовете в приложение 5 към настоящата директива заменят съответните текстове в приложение VI.

7.	Приложение IX се изменя, както е посочено в приложение 6 към настоящата директива.

Член 2

1. Държавите-членки въвеждат в сила законовите, подзаконовите и административните разпоредби, необходими, за да се съобразят с настоящата директива не по-късно от 1 юни 2001 г. Те незабавно информират Комисията за това.

Когато държавите-членки приемат тези разпоредби, в тях се съдържа позоваване на настоящата директива или то се извършва при официалното им публикуване. Условията и редът на позоваване се определят от държавите-членки.

2. Държавите-членки съобщават на Комисията текста на основните разпоредби от националното законодателство в областта, уредена с настоящата директива, както и таблица на съответствието между разпоредбите на настоящата директива и приетите национални разпоредби.

Член 3

Настоящата Директива влиза в сила на третия ден от датата на публикуването ѝ в Официален вестник на Европейските общности.

Член 4

Адресати на настоящата директива са държавите-членки.

Съставено в Брюксел на 19 май 2000 година.

За Комисията

Margot WALLSTRÖM

Член на Комисията

(1) Приета след 27-то адаптиране.

(2) ОВ 196, 16.8.1967 г., стр. 1.

(3) ОВ L 199, 30.7.1999 г., стр. 57.

ПРИЛОЖЕНИЕ 1A

ПРЕДГОВОР КЪМ ПРИЛОЖЕНИЕ I

Виж Директива 2001/59/ЕО на Комисията (ОВ L 225, 21.8.2001 г., стр. 1).

ПРИЛОЖЕНИЕ 1Б

„ТАБЛИЦА A

Знак

Argón

Argon

Αργό

Argon

Árgon

Argon

Gadolinio

Gadolinium

Γαδολίνιο

Gadolinium

Gadolinio

Gadolinium

Gadolínio

Gadolinium“

ПРИЛОЖЕНИЕ 1В

Индекс №	Химическо наименование	Бележки към веществата	ЕО №	CAS №	Класификация	Етикиране	Граници на концентрация	Бележки към препаратите
006-011-00-7	карбарил (ISO) 1-нафтил метилкарбамат		200-555-0	63-25-2	Carc. Cat. 3; R40 Xn; R22 N; R50	Xn; N R: 22-40-50 S: (2-)22-24-36/37-46-61
006-013-00-8	метам-натрий (ISO) натриев метилдитиокарбамат		205-293-0	137-42-8	Xn; R22 R31 C; R34 R43 N; R50-53	C; N R: 22-31-34-43-50/53 S: (1/2-)26-36/37/39-45-60-61
006-015-00-9	диурон (ISO) 3-(3,4-дихлорфенил)-1,1-диметилкарбамид		206-354-4	330-54-1	Carc. Cat. 3; R40 Muta. Cat. 3; R40 Xn; R22-48/22 N; R50-53	Xn; N R: 22-40-48/22-50/53 S: (2-)13-22-23-37-46-60-61
006-016-00-4	пропоксур (ISO) 2-изопропоксифенил N-метилкарбамат2- изопропоксифенил метилкарбамат		204-043-8	114-26-1	T; R25 N; R50-53	T; N R: 25-50/53 S: (1/2-)37-45-60-61
006-017-00-X	алдикарб (ISO) 2-метил-2-(метилтио)пропанал-O-(N- метилкабамоил)оксим		204-123-2	116-06-3	T+; R26/28 T; R24 N; R50-53	T+; N R: 24-26/28-50/53 S: (1/2-)22-36/37-45-60-61
006-018-00-5	аминокарб (ISO) 4-(диметиламино)-3-толил метилкарбамат		217-990-7	2032-59-9	T; R24/25 N; R50-53	T; N R: 24/25-50/53 S: (1/2-)28-36/37-45-60-61
006-019-00-0	ди-алат (ISO) S-(2,3-дихлоралил)-N,N-ди- изопропилтиокарбамат		218-961-1	2303-16-4	Carc. Cat. 3; R40 Xn; R22 N; R50-53	Xn; N R: 22-40-50/53 S: (2-)25-36/37-60-61
006-020-00-6	барбан (ISO) 4-хлорбут-2-инил N-(3-хлорфенил)карбамат		202-930-4	101-27-9	Xn; R22 R43 N; R50-53	Xn; N R: 22-43-50/53 S: (2-)24-36/37-60-61
006-023-00-2	меркаптодиметур (ISO) метиокарб 3,5-диметил-4-метилтиофенил N-метилкарбамат		217-991-2	2032-65-7	T; R25 N; R50-53	T; N R: 25-50/53 S: (1/2-)22-37-45-60-61
006-024-00-8	проксан-натрий (ISO) натриев O-изопропилдитиокарбамат		205-443-5	140-93-2	Xn; R22 Xi; R38 N; R51-53	Xn; N R: 22-38-51/53 S: (2-)13-61
006-026-00-9	карбофуран (ISO) 2,3-дихидро-2,2-диметилбензофуран-7-ил N-метилкарбамат		216-353-0	1563-66-2	T+; R26/28 N; R50-53	T+; N R: 26/28-50/53 S: (1/2-)36/37-45-60-61
006-028-00-X	динобутон (ISO) 2-(1-метилпропил)-4,6-динитрофенил- изопропил карбонат		213-546-1	973-21-7	T; R25 N; R50-53	T; N R: 25-50/53 S: (1/2-)37-45-60-61
006-029-00-5	диоксакарб (ISO) 2-(1,3-диоксолан-2-ил)фенил N-метилкарбамат		230-253-4	6988-21-2	T; R25 N; R51-53	T; N R: 25-51/53 S: (1/2-)37-45-61
006-033-00-7	метоксурон (ISO) 3-(3-хлор-4-метоксифенил)-1,1- диметилкарбамид		243-433-2	19937-59-8	N; R50-53	N R: 50/53 S: 60-61
006-034-00-2	пебулат (ISO) N-бутил-N-етил-S-пропилтиокарбамат		214-215-4	1114-71-2	Xn; R22 N; R51-53	Xn; N R: 22-51/53 S: (2-)23-61
006-035-00-8	пиримикарб (ISO) 5,6-диметил 2-(диметиламино)-пиримидин-4- ил-N,N-диметилкарбамат		245-430-1	23103-98-2	T; R25 N; R50-53	T; N R: 25-50/53 S: (1/2)22-37-45-60-61
006-037-00-9	промекарб (ISO) 3-изопропил-5-метилфенил N-метилкарбамат		220-113-0	2631-37-0	T; R25 N; R50-53	T; N R: 25-50/53 S: (1/2-)24-37-45-60-61
006-038-00-4	сулфалат (ISO) 2-хлоралил N,N-диметилдитиокарбамат	E	202-388-9	95-06-7	Carc. Cat. 2; R45 Xn; R22 N; R50-53	T; N R: 45-22-50/53 S: 53-45-60-61
006-039-00-X	три-алат (ISO) S-2,3,3-трихлоралил-диизопропилтиокарбамат		218-962-7	2303-17-5	Xn; R22-48/22 R43 N; R50-53	Xn; N R: 22-43-48/22-50/53 S: (2-)24-37-60-61
006-042-00-6	монурон (ISO) 3-(4-хлорфенил)-1,1-диметилкарбамид		205-766-1	150-68-5	Carc. Cat. 3; R40 Xn; R22 N; R50-53	Xn; N R: 22-40-50/53 S: (2-)36/37-60-61
006-043-00-1	монурон-TCA 3-(4-хлорфенил)-1,1-диметилурон трихлорацетат		—	140-41-0	Xi; R36/38 Carc. Cat. 3; R40 N; R50-53	Xn; N R: 36/38-40-50/53 S: (2-)36/37-60-61
006-045-00-2	метомил (ISO) 1-(метилтио)етилиденамино N-метилкарбамат		240-815-0	16752-77-5	T+; R28 N; R50-53	T+; N R: 28-50/53 S: (1/2-)22-36/37-45-60-61
006-046-00-8	бендиoкарб (ISO) 2,2-диметил-1,3-бензодиоксол-4-ил N-метилкарбамат		245-216-8	22781-23-3	T; R23/25 Xn; R21 N; R50-53	T; N R: 21-23/25-50/53 S: (1/2-)22-36/37-45-60-61
006-047-00-3	буфенкарб (ISO) Смес: 3-(1-метилбутил)фенил N-метилкарбамат и 3-(1-етилпропил)фенил N-метилкарбамат		—	8065-36-9	T; R24/25 N; R50-53	T; N R: 24/25-50/53 S: (1/2-)28-36/37-45-60-61
006-048-00-9	етиофенкарб (ISO) 2-(етилтиометил)фенил N-метилкарбамат		249-981-9	29973-13-5	Xn; R22 N; R50-53	Xn; N R: 22-50/53 S: (2-)60-61
006-050-00-X	фенурон-TCA 1,1-диметил-3-фенилурон трихлорацетат		—	4482-55-7	Xi; R38 N; R50-53	Xi; N R: 38-50/53 S: (2-)60-61
006-053-00-6	изопрокарб (ISO) 2-изопропилфенил N-метилкарбамат		220-114-6	2631-40-5	Xn; R22 N; R50-53	Xn; N R: 22-50/53 S: (2-)60-61
006-054-00-1	мексакарбат (ISO) 3,5-диметил-4-(диметиламинофенил) N-метилкарбамат		206-249-3	315-18-4	T+; R28 Xn; R21 N; R50-53	T+; N R: 21-28-50/53 S: (1/2-)36/37-45-60-61
006-057-00-8	нитрапирин (ISO) 2-хлор-6-трихлорметилпиридин		217-682-2	1929-82-4	Xn; R22 N; R51-53	Xn; N R: 22-51/53 S: (2-)24-61
006-060-00-4	оксикарбоксин (ISO) 2,3 дихидро 6-метил-5-(N-фенилкарбамоил)- 1,4-оксотиин 4,4 диоксид		226-066-2	5259-88-1	Xn; R22 R52-53	Xn R: 22-52/53 S: (2-)61
006-069-00-3	тиофанат-метил (ISO) 1,2-ди(3-(метоксикарбонил-2- тиоуреидо)бензен		245-740-7	23564-05-8	Muta. Cat. 3; R40 N; R50-53	Xn; N R: 40-50/53 S: (2-)36/37-60-61
006-070-00-9	фурмециклокс N-циклохексил-N-метокси-2,5-диметил-3- фурамид		262-302-0	60568-05-0	Carc. Cat. 3; R40 N; R50-53	Xn; N R: 40-50/53 S: (2-)36/37-60-61
006-088-00-7	ненфуракарб (ISO) етил-N-[(2,3-дихидро-2,2- диметилбензофуран-7- илоксикарбонил(метил)аминотио]-N- изопропил-β-аланинат		—	82560-54-1	T; R23/25 N; R50-53	T; N R: 23/25-50/53 S: (1/2-)36/37-45-60-61
007-012-00-5	N,N-диметилхидразин 1,1-диметилхидразин	E	200-316-0	57-14-7	F; R11 Carc. Cat. 2; R45 T; R23/25 C; R34 N; R51-53	F; T; N R: 45-11-23/25-34-51/53 S: 53-45-61
007-013-00-0	N,N′-диметилхидразин 1,2-диметилхидразин	E	—	540-73-8	Carc. Cat. 2; R45 T; R23/24/25 N; R51-53	T; N R: 45-23/24/25-51/53 S: 53-45-61	C ≥ 25 %: T; R45-23/24/25 3 % ≤ C < 25 %: T; R45-20/21/22 0,01 % ≤ C < 3 %: T; R45
009-003-00-1	Флуороводородна киселина… %	B	231-634-8	7664-39-3	T+; R26/27/28 C; R35	T+; C R: 26/27/28-35 S: (1/2-)7/9-26-36/37-45	C ≥ 7 %: T+; C; R26/27/28-35 1 % ≤ C < 7 %: T; R23/24/25-34 0,1 % ≤ C < 1 %: Xn; R20/21/22-36/37/38
015-039-00-9	азинфос-метил (ISO) O,O-диметил-4-оксобензотриазин 3-илметил фосфородитиоат		201-676-1	86-50-0	T+; R26/28 T; R24 R43 N; R50-53	T+; N R: 24-26/28-43-50/53 S: (1/2-)28-36/37-45-60-61
015-048-00-8	фентион (ISO) O,O-диметил-O (4- метилтио –m-толил) фосфоротиоат		200-231-9	55-38-9	Muta. Cat. 3; R40 T; R23-48/25 Xn; R21/22 N; R50-53	T; N R: 21/22-23-40-48/25-50/53 S: (1/2-)36/37-45-60-61
015-056-00-1	азинофос-етил (ISO) O,O-диетил 4oxoбензотриазин-3- илметилфосфородитиоат		220-147-6	2642-71-9	T+; R28 T; R24 N; R50-53	T+; N R: 24-28-50/53 S: (1/2-)28-36/37-45-60-61
015-140-00-8	триазофос (ISO) O,O-диетил-O-1-фенил-1H-1,2,4-триaзол-3- илфосфоротиоат		245-986-5	24017-47-8	T; R23/25 Xn; R21 N; R50-53	T; N R: 21-23/25-50/53 S: (1/2-)36/37-45-60-61
016-013-00-X	серен дихлорид		234-129-0	10545-99-0	R14 C; R34 N; R50	C; N R: 14-34-50 S: (1/2-)26-36/37/39-45-61	C ≥ 10 %: C; R34 5 % ≤ C < 10 %: Xi; R36/37/38
016-014-00-5	серен тетрахлорид		—	13451-08-6	R14 C; R34 N; R50	C; N R: 14-34-50 S: (1/2-)26-36/37/39-45-61	C ≥ 10 %: C; R34 5 % ≤ C < 10 %: Xi; R36/37/38
016-023-00-4	диметил сулфат	E	201-058-1	77-78-1	Carc. Cat. 2; R45 Muta. Cat. 3; R40 T+; R26 T; R25 C; R34 R43	T+ R: 45-25-26-34-43 S: 53-45	C ≥ 25 %: T+; R45-25-26-34-43 10 % ≤ C < 25 %: T+; R45-22-26-34-43 7 % ≤ C < 10 %: T+; R45-22-26-36/37/38-43 5 % ≤ C < 7 %: T; R45-22-23-36/37/38-43 3 % ≤ C < 5 %: T; R45-22-23-43 1 % ≤ C < 3 %: T; R45-23-43 0,1 % ≤ C < 1 %: T; R45-20 0,01 % ≤ C < 0,1 %: T; R45
016-024-00-X	димексано (ISO) бис (метокситиокарбонил)дисулфид		215-993-8	1468-37-7	Xn; R22 N; R50-53	Xn; N R: 22-50/53 S: (2-)60-61
016-071-00-6	тринатриев 3-амино-6,13-дихлор-10-[(3-((4-хлор-6-(2-сулфофениламино)-1,3,5-триазин-2-ил)амино}пропил)амино]-4,11-трифеноксидиоксазин дисулфонат		410-130-3	136248-03-8	R43	Xi R: 43 S: (2-)22-24-37
022-001-00-5	титаниев тетрахлорид		231-441-9	7550-45-0	R14 C; R34	C R: 14-34 S: (1/2-)7/8-26-36/37/39-45	C ≥ 10 %: C; R34 5 % ≤ C < 10 %: Xi; R36/37/38
030-004-00-8	диметил цинк [1] диетил цинк [2]		208-884-1 [1] 209-161-3 [2]	544-97-8 [1] 557-20-0 [2]	R14 F; R17 C; R34 N; R50-53	F; C; N R: 14-17-34-50/53 S: (1/2-)16-43-45-60-61
050-002-00-0	циклохексатин (ISO) трициклохексилстанан трициклохексилкалаен хидроксид		236-049-1	13121-70-5	Xn; R20/21/22 N; R50-53	Xn; N R: 20/21/22-50/53 S: (2-)13-60-61
050-012-00-5	тетрациклохексилстанан [1] хлор(трициклохексил)станан [2] бутил(трициклохексил)станан [3]		215-910-5 [1] 221-437-5 [2] 230-358-5 [3]	1449-55-4 [1] 3091-32-5 [2] 7067-44-9 [3]	Xn; R20/21/22 N; R50-53	Xn; N R: 20/21/22-50/53 S: (2-)26-28-60-61	C ≥ 1 %: Xn; R20/21/22	1
050-017-00-2	фенбутатиноксид (ISO) бис(трис (2-метил–2-фенилпропил)-калаен оксид		236-407-7	13356-08-6	T+; R26 Xi; R36/38 N; R50/53	T+; N R: 26-36/38-50/53 S: (1/2-)28-36/37-45-60-61
082-009-00-X	Жълто – оловен сулфохромат CI Пигмент Жълто 34 (Това вещество се идентифицира в Цветовия Индекс № с Конституционен номер CI 77603)		215-693-7	1344-37-2	Carc. Cat. 3; R40 Repr. Cat. 1; R61 Repr. Cat. 3; R62 R33 N; R50-53	T; N R: 61-33-40-50/53-62 S: 53-45-60-61		1
082-010-00-5	Червено - оловно-хроматен молибдатен сулфат CI Пигмент Черевено104 (Това вещество се идентифицира в Цветовия Индекс № с Конституционен номер CI 77605)		235-759-9	12656-85-8	Carc. Cat. 3; R40 Repr. Cat. 1; R61 Repr. Cat. 3; R62 R33 N; R50-53	T; N R: 61-33-40-50/53-62 S: 53-45-60-61		1
601-024-00-X	кумол [1] пропилбензен [2]		202-704-5 [1] 203-132-9 [2]	98-82-8 [1] 103-65-1 [2]	R10 Xn; R65 Xi; R37 N; R51-53	Xn; N R: 10-37-51/53-65 S: (2-)24-37-61-62		4
601-032-00-3	бензо[a]пирен бензо[def]хризен		200-028-5	50-32-8	Carc. Cat.2; R45 Muta. Cat. 2; R46 Repr. Cat. 2; R60-61 N; R50-53	T; N R: 45-46-60-61-50/53 S: 53-45-60-61
601-034-00-4	бензо[e]ацефенантрилен		205-911-9	205-99-2	Carc. Cat.2; R45 N; R50-53	T; N R: 45-50/53 S: 53-45-60-61
602-035-00-2	1,4-дихлорбензен p-дихлорбензен		203-400-5	106-46-7	Xi; R36 N; R50-53	Xi; N R: 36-50/53 S: (2-)24/25-46-60-61
602-054-00-6	3-йодопропен алил йодид		209-130-4	556-56-9	R10 C; R34	C R: 10-34 S: (1/2-)7-26-45
603-076-00-9	бут-2-ин-1,4-диол 2-бутин-1,4-диол		203-788-6	110-65-6	T; R23/25 Xn; R21-48/22 C; R34	T R: 21-23/25-34-48/22 S: (1/2-)26-36/37/39-45	C ≥ 50 %: T; R21-23/25-34-48/22 25 % ≤ C < 50 %: T; R21-23/25-36/38-48/22 10 % ≤ C < 25 %: Xn; R20/22-48/22 3 % ≤ C < 10 %: Xn; R20/22
603-091-00-0	екзо-1-метил-4-(1-метилетил)-7-оксабицикло[2.2.1]хептан-2-ол		402-470-6	87172-89-2	O; R8 Xn; R22 Xi; R36	O; Xn R: 8-22-36 S: (2-)26
603-093-00-1	екзо-(±)-1-метил-4-(1-метилетил)-2-[(2-метилфенил)метокси]-7- оксабицикло[2.2.1]хептан		402-410-9	87818-31-3	Xn; R20 N; R51-53	Xn; N R: 20-51/53 S: (2-)23-61
603-097-00-3	1,1′, 1″-нитрилотрипропан-2-ол триизопропаноламин		204-528-4	122-20-3	Xi; R36 R52-53	Xi R: 36-52/53 S: (2-)26-61
603-117-00-0	пропан-2-ол изопропилалкохол изопропанол		200-661-7	67-63-0	F; R11 Xi; R36 R67	F; Xi R: 11-36-67 S: (2-)7-16-24/25-26		6
604-020-00-6	бифенил-2-ол 2-хидроксибифенил 2-фенилфенол (ISO)		201-993-5	90-43-7	Xi; R36/37/38 N; R50	Xi; N R: 36/37/38-50 S: (2-)22-61
604-021-00-1	2-фенилфенол, натриева сол натриев 2-фенилфенолат		205-055-6	132-27-4	Xn; R22 Xi; R37/38-41 N; R50	Xn; N R: 37/38-41-50 S: (2-)22-26-61
604-024-00-8	4,4'-изобутилетилидендифенол или 2,2-бис(4-хидроксфенил)-4-метилпентан		401-720-1	6807-17-6	Repr. Cat. 2; R60 Xi; R36 N; R50-53	T; N R: 60-36-50/53 S: 53-45-60-61
604-041-00-0	ацифлуорфен [1] ацифлуорфен -натрий [2] 5-[2-хлор-4-(трифлоурметил)фенокси]-2- нитробензоена киселина [1] натрий-5-[2-хлор-4-(трифлоурметил)фенокси]- 2-нитробензоат [2]		256-634-5 [1] 263-560-7 [2]	50594-66-6 [1] 62476-59-9 [2]	Xn; R22 Xi; R38-41 N; R50-53	Xn; N R: 22-38-41-50/53 S: (2-)24-39-60-61
604-043-00-1	монобензон 4-хидроксифенил бензил етер хидрохинон монобензил етер		203-083-3	103-16-2	Xi; R36 R43	Xi R: 36-43 S: (2-)24/25-26-37
604-044-00-7	мехинол 4-метоксифенол хидрохинон монометил етер		205-769-8	150-76-5	Xn; R22 Xi; R36 R43	Xn R: 22-36-43 S: (2-)24/25-26-37/39-46
605-016-00-7	глиокзал … % етандиал … %	B	203-474-9	107-22-2	Muta. Cat. 3; R40 Xn; R20 Xi; R36/38 R43	Xn R: 20-36/38-40-43 S: (2-)36/37	C ≥ 10 %: Xn; R20-36/38-40-43 1 % ≤ C < 10 %: Xn; R40-43
606-016-00-X	пиндон(ISO) 2-пивалоилиндан-1,3-дион		201-462-8	83-26-1	T; R25-48/25 N; R50-53	T; N R: 25-48/25-50/53 S: (1/2-)37-45-60-61
606-018-00-0	дихлон (ISO) 2,3-дихлор-1,4-нафтохинон		204-210-5	117-80-6	Xn; R22 Xi; R36/38 N; R50-53	Xn; N R: 22-36/38-50/53 S: (2-)26-60-61
606-019-00-6	хлордекон (ISO) перхлорпентацикло[5.3.0.02,6.03,9.04,8] декан-5-он декахлорпентацикло[5.2.1.02,6.03,9.05,8] декан-4- он		205-601-3	143-50-0	Carc. Cat. 3; R40 T; R24/25 N; R50-53	T; N R: 24/25-40-50/53 S: (1/2-)22-36/37-45-60-61
606-034-00-8	метрибузин (ISO) амино-6-трет-бутил-3-(метилтио)-1,2,4- триазин-5(4H)-он 4-амино-4,5-дихидро-6-(1,1 диметилетил)-3- метилтио-1,2,4-триазин-5-он		244-209-7	21087-64-9	Xn; R22 N; R50-53	Xn; N R: 22-50/53 S: (2-)60-61
606-035-00-3	хлоридазон (ISO) 5-амино-4-хлор-2-фенилпиридазин-3(2H)-он пиразон		216-920-2	1698-60-8	R43 N; R50-53	Xi; N R: 43-50/53 S: (2-)24-37-60-61
606-036-00-9	кинометионат хинометионат (ISO) 6-метил-1,3-дитиоло(4,5-b)-хиноксалин-2-он		219-455-3	2439-01-2	Repr. Cat. 3; R62 Xn; R20/21/22- 48/22 Xi; R36 R43 N; R50-53	Xn; N R: 20/21/22-36-43-48/22-50/53-62 S: (2-)24-37-60-61
606-037-00-4	триадимефон (ISO) 1-(4-хлорфенокси)-3,3-диметил-1-(1,2,4-триазол-1-ил)бутан-2-он		256-103-8	43121-43-3	Xn; R22 N; R51-53	Xn; N R: 22-51/53 S: (2-)61
606-044-00-2	2,4,6-триметилбензофенон		403-150-9	954-16-5	Xn; R22 Xi; R36 N; R50-53	Xn; N R: 22-36-50/53 S: (2-)26-60-61
607-043-00-X	дикамба (ISO) 2,5- дихлор-6-метоксибензоена киселина 3,6-дихлор-2- метоксибензоена киселина		217-635-6	1918-00-9	Xn; R22 Xi; R41 R52-53	Xn; N R: 22-41-52/53 S: (2-)26-61
607-057-00-6	кумахлор (ISO) 3-[1-(4-хлорфенил)-3-оксобутил]-4- хидроксикумарин		201-378-1	81-82-3	Xn; R48/22 R52-53	Xn R: 48/22-52/53 S: (2-)37-61
607-058-00-1	кумафурил (ISO) фумарин (RS)-3-[1-(2-фурил)-3-оксобутил)]-4- хидроксикумарин 4-хидрокси-3-[3-оксо-1-(2-фурил)бутил] кумарин		204-195-5	117-52-2	T; R25-48/25 R52-53	T R: 25-48/25-52/53 S: (1/2-)37-45-61
607-079-00-6	келеван (ISO) етил-5-(перхлор-5- хидроксипентацикло[5.3.0.02,6.03,9.04,8]декан- 5-ил)-4 оксопентаноат етил-5-(1,2,3,5,6,7,8,9,10,10-декахлор-4- хидроксипентацикло [5.2.1.02,6.03,9.05,8]декан-4-ил)-4-оксовалерат		—	4234-79-1	T; R24 Xn; R22 N; R51-53	T; N R: 22-24-51/53 S: (1/2-)36/37-45-61
607-097-00-4	тримелитов анхидрид на бензен-1,2,4- трикарбоксилна киселина 1,2-анхидрид		209-008-0	552-30-7	Xi; R37-41 R42/43	Xn R: 37-41-42/43 S: (2-)22-26-36/37/39
607-143-00-3	валерианова киселина		203-677-2	109-52-4	C; R34 R52-53	C R: 34-52/53 S: (1/2-)26-36-45-61
607-152-00-2	2,3,6-TBA (ISO) 2,3,6-трихлорбензоатна киселина беназолин		200-026-4	50-31-7	Xn; R22 N; R51-53	Xn; N R: 22-51/53 S: (2-)61
607-153-00-8	беназолин (ISO) (4-хлор-2,3-дихидро-2-оксо 1,3-бензотиазол- 3-ил)оцетна киселина		223-297-0	3813-05-6	Xi; R36/38 R52-53	Xi R: 36/38-52/53 S: (2-)22-61
607-156-00-4	хлорфенсон (ISO) 4-хлорфенил-4-хлорбензенсулфонат		201-270-4	80-33-1	Xn; R22 Xi; R38 N; R50-53	Xn; N R: 22-38-50/53 S: (2-)37-60-61
607-158-00-5	натриева сол на хлороцетна киселина натриев хлорацетат		223-498-3	3926-62-3	T; R25 Xi; R38 N; R50	T; N R: 25-38-50 S: (1/2-)22-37-45-61
607-159-00-0	хлорбензилат(ISO) етил-2,2-ди(4-хлорфенил)-2-хидроксиацетат етил-4,4'-дихлорбензилат		208-110-2	510-15-6	Xn; R22 N; R50-53	Xn; N R: 22-50/53 S: (2-)60-61
607-176-00-3	Смес от: α-(3-(3-(2H-бензотриазол-2-ил)-5- трет-бутил-4-хидроксифенил)пропионил}-ω- хидроксиполи(oксиетилен); α-(3-(3-(2H- бензотриазол-2-ил)-5-трет-бутил-4- хидроксифенил) пропионил )-ω-3-(3-(2H- бензотриазол-2-ил)-5-трет-бутил-4- хидроксифенил) пропионилoксиполи (oксиетилен)		400-830-7	—	R43 N; R51-53	Xi; N R: 43-51/53 S: (2-)36/37-61
607-188-00-9	хидроген натрий-N-карбоксилатоетил-N- октадец-9-енилмалеамат		402-970-4	—	R43 N; R51-53	Xi; N R: 43-51/53 S: (2-)24/37-61
607-209-00-1	Смес от: O,Ó-ди(1-метилетил)тритио-бис- тиоформат; O,Ó-ди(1-метилетил)тетратио-бис- тиоформат; O,Ó-ди(1-метилетил)пентатио-бис- тиоформат		403-030-6	—	Xn; R22 R43 N; R50-53	Xn; N R: 22-43-50/53 S: (2-)36/37-60-61
607-213-00-3	етил-3,3-бис [1,1-диметилпропил)перокси] бутират		403-320-2	67567-23-1	E; R2 O; R7 R10 N; R51-53	E; N R: 2-7-10-51/53 S: (2-)3/7-14-33-36/37/39-61
607-217-00-5	2-етоксиетил-2-[4-(2,6-дихидро-2,6-диоксо-7-фенил-1,5-диоксаиндацен-3-ил)фенoкси]ацетат		403-960-2	—	R43 R53	Xi R: 43-53 S: (2-)24-37-61
607-243-00-7	натриев 3,6-дихлоро-о-анизат [1] 3,6-дихлоро-о-анизова киселина, съединение с 2,2′-иминодиетанол (1:1) [2] 3,6-дихлоро-о-анизова киселина, съединение с 2-аминоетанол (1:1) [3]		217-846-3 [1] 246-590-5 [2] 258-527-9 [3]	1982-69-0 [1] 25059-78-3 [2] 53404-28-7 [3]	R52-53	R: 52/53 S: 61
607-248-00-4	нафталам -натрий натриев N-нафт-1-илфталамат		205-073-4	132-67-2	Xn; R22	Xn R: 22 S: (2)
607-249-00-X	(1-метил-1,2-етандиил)бис[oкси(метил-2,1- етандиил)диакрилат трипропиленглико диакрилат TPGDA		256-032-2	42978-66-5	Xi; R36/37/38 R43 N; R51-53	Xi; N R: 36/37/38-43-51/53 S: (2-)24-37-61	C ≥ 10 %: Xi; R36/37/38-43 1 % ≤ C < 10 %: Xi; R43
607-252-00-6	ламбда-цихалотрин(ISO) Смес (1:1) от: (S)-алфа-циано-3- феноксибензил(Z)-(1R)-цис-3-(2-хлор-3,3,3- трифлуоропропенил)-2,2- диметилциклопропанкарбоксилат и (R)-алфа- циано-3-феноксибензил(Z)-(1S)-cis-3-(2-хлор- 3,3,3- трифлуоропропенил)-2,2- диметилциклопропанкарбоксилат		415-130-7	91465-08-6	T+; R26 T; R25 Xn; R21 N; R50-53	T+; N R: 21-25-26-50/53 S: (1/2-) 28-36/37/39-38-45-60-61
607-255-00-2	флуроксипир (ISO) 4-амино-3,5-дихлор-6-флуоро-2- пиридилoксиоцетна киселина		—	69377-81-7	R52-53	R: 52/53 S: 61
608-003-00-4	акрилонитрил	D E	203-466-5	107-13-1	F; R11 Carc. Cat. 2; R45 T; R23/24/25 Xi; R37/38-41 R43 N; R51-53	F; T; N R: 45-11-23-/ 24/25-37/38-41-43-51/53 S: 9-16-53-45-61	C ≥ 20 %: T; R45-23/24/25-37/38-41-43 10 % ≤ C < 20 %: T; R45-23/24/25-41-43 5 % ≤ C < 10 %: T; R45-23/24/25-36-43 1 % ≤ C < 5 %: T; R45-23/24/25-43 0,2 % ≤ C < 1 %: T; R45-20/21/22 0,1 % ≤ C < 0,2 %: T; R45
608-016-00-5	1,4 дициано-2,3,5,6-тетрахлорбензен		401-550-8	1897-41-2	R43 N; R50-53	Xi; N R: 43-50/53 S: (2-)24-37-60-61
609-030-00-4	динотерб (ISO) 2-трет-бутил-4,6-динитрофенол	E	215-813-8	1420-07-1	Repr. Cat. 2; R61 T+; R28 T; R24 R44 N; R50-53	T+; N R: 61-24-28-44-50/53 S: 53-45-60-61
609-040-00-9	нитрофен (ISO) 2,4-дихлорфенил 4-нитрофенил етер	E	217-406-0	1836-75-5	Carc. Cat. 2; R45 Repr. Cat. 2; R61 Xn; R22 N; R50-53	T; N R: 45-61-22-50/53 S: 53-45-60-61
609-044-00-0	текнацен (ISO) 1,2,4,5-тетрахлор-3-нитробензен		204-178-2	117-18-0	Xn; R22 R43 N; R50-53	Xn; N R: 22-43-50/53 S: (2-)24-37-60-61
611-008-00-4	4-аминоазобензен 4-(фенилазо)анилин		200-453-6	60-09-3	Carc. Cat. 2; R45 N; R50-53	T; N R: 45-50/53 S: 53-45-60-61
611-013-00-1	трилитиев 1-хидрокси-7-(3-сулфонатоанилино)-2-(3-метил-4(2-метокси-4-(3-сулфонатофенилазо)фенилазо)фенилазо) нафтален-3-сулфонат		403-650-7	117409-78-6	E; R2 N; R51-53	E; N R: 2-51/53 S: (2-)35-61
611-031-00-X	4,4'-(4-иминциклохекса-2,5-диенилиденметилен)дианилин хидрохлорид CI Базово червено 9		209-321-2	569-61-9	Carc. Cat. 2; R45	T R: 45 S: 53-45
612-035-00-4	2-метоксианилин o-анизидин	E	201-963-1	90-04-0	Carc. Cat. 2; R45 Muta. Cat. 3; R40 T; R23/24/25	T R: 45-23/24/25 S: 53-45
612-042-00-2	бензидин 1,1'-бифенил-4,4'-диамин 4,4'-диаминобифенил бифенил-4,4'-илендиамин	E	202-199-1	92-87-5	Carc. Cat. 1; R45 Xn; R22 N; R50-53	T; N R: 45-22-50/53 S: 53-45-60-61	C ≥ 25 %: T; R45-22 0,01 % ≤ C < 25 %: T; R45
612-051-00-1	4,4'-диаминодифенилметан 4,4'-метилендианилин	E	202-974-4	101-77-9	Carc. Cat. 2; R45 Muta. Cat. 3; R40 T; R39/23/24/25 Xn; R48/20/21/22 R43 N; R51-53	T; N R: 45-39/23/24/25-43-48/20/21/22-51/53 S: 53-45-61
612-081-00-5	Соли на 4,4'-би-о-толуидин Соли на 3,3'-диметилбензидин Соли на o-толидин	A E	210-322-5 265-294-7 277-985-0	612-82-8 64969-36-4 74753-18-7	Carc. Cat. 2; R45 Xn; R22 N; R51-53	T; N R: 45-22-51/53 S: 53-45-61
612-099-00-3	4-метил-m-фенилenдиамин 2,4-толуендиамин	E	202-453-1	95-80-7	Carc. Cat. 2; R45 T; R25 Xn; R21 Xi; R36 R43 N; R51-53	T; N R: 45-21-25-36-43-51/53 S: 53-45-61
612-105-00-4	2-пиперазин-1-илетиламин		205-411-0	140-31-8	Xn, R21/22 C; R34 R43 R52-53	C R: 21/22-34-43-52/53 S: (1/2-)26-36/37/39-45-61
612-111-00-7	2-метил-m-фенилендиамин 2,6-толуендиамин		212-513-9	823-40-5	Muta. Cat. 3; R40 Xn; R21/22 R43 N; R51-53	Xn; N R: 21/22-40-43-51/53 S: (2-)24-36/37-61
612-125-00-3	2-метил-p-фенилендиамин 2,5- толуендиамин		202-442-1	95-70-5	T; R25 Xn; R20/21 R43 N; R51-53	T; N R: 20/21-25-43-51/53 S: (1/2-)24-37-45-61
612-144-00-7	флуметралин (ISO) N-(2-хлор-6-флуорбензил)-N-етил-алфа, алфа, алфа-трифлуоро-2,6 динитро-p-толуидин		—	62924-70-3	Xi; R36/38 R43 N; R50-53	Xi; N R: 36/38-43-50/53 S: (2-)36/37-60-61
612-151-00-5	диаминотолуен	E	246-910-3	25376-45-8	Carc. Cat. 2; R45 T; R25 Xn; R20/21 Xi; R36 R43 N; R51-53	T; N R: 45-20/21-25-36-43-51/53 S: 53-45-61
613-018-00-4	морфамкват (ISO) 1,1'-бис(3,5-диметилморфолинкарбонил-метил)-4,4'-бипиридилиев йон		—	7411-47-4	Xn; R22 Xi; R36/37/38 R52-53	Xn R: 22-36/37/38-52/53 S: (2-)22-36-61
613-031-00-5	симклозен трихлоризоцианурова киселина трихлор-1,3,5-триазинтрион		201-782-8	87-90-1	O; R8 Xn; R22 R31 Xi; R36/37 N; R50-53	O; Xn; N R: 8-22-31-36/37-50/53 S: (2-)8-26-41-60-61
613-038-00-3	6-фенил-1,3,5-триазин-2,4-диилдиамин 6-фенил-1,3,5-триазин-2,4-диамин бензогуанамин		202-095-6	91-76-9	Xn; R22 R52-53	Xn R: 22-52/53 S: (2-)61
613-042-00-5	имазалил (ISO) 1-[2-(алилoкси)-2-(2,4-дихлорфенил)етил]-1H-имидазол		252-615-0	35554-44-0	Xn; R20/22 N; R41 N; R50-53	Xn; N R: 20/22-41-50/53 S: (2-)26-39-60-61
613-043-00-0	имазалил сулфат (ISO) 1-[2-(алилoкси)етил-2-(2,4-дихлорфенил)]-1H-имидазол-хидроген сулфат [1] (±)-1-[2-(алилoкси)етил-2-(2,4-дихлорфенил)]-1H- имидазол-хидроген сулфат[2 ]		261-351-5 [1] 281-291-3 [2]	58594-72-2 [1] 83918-57-4 [2]	Xn; R20/22 Xi; R41 N; R50-53	Xn; N R: 20/22-41-50/53 S: (2-)26-39-60-61
613-066-00-6	тербуметон (ISO) 2-трет-бутиламино-4-етиламино-6-метокси-1,3,5-триaзин		251-637-8	33693-04-8	Xn; R22 N; R50-53	Xn; N R: 22-50/53 S: (2-)60-61
613-091-00-2	марфамкват дихлорид [1] марфамкват сулфат [2]		225-062-8 [1]	4636-83-3 [1] 29873-36-7 [2]	Xn; R22 Xi; R36/37/38 R52-53	Xn; R: 22-36/37/38-52/53 S: (2-)22-36-61
613-098-00-0	N-(n-октил)-2-пиролидинон		403-700-8	2687-94-7	C; R34 N; R51-53	C; N R: 34-51/53 S: (1/2-)23-26-36/37/39-45-61
613-130-00-3	хексаконазол (ISO) (RS)-2-(2,4-дихлорфенил)-1-(1H-1,2,4-триазол-1-ил)хексан-2-ол		—	79983-71-4	R43 N; R51-53	Xi; N R: 43-51/53 S: (2-)24-37-61
613-131-00-9	пирохиолон (ISO) 1,2,5,6-тетрахидро[3,2,1-ij]хинолин-4-он		—	57369-32-1	Xn; R22 R52-53	Xn R: 22-52/53 S: (2-)61
613-134-00-5	миколбутанил (ISO) 2-(4-хлорфенил)-2-[(1H-1,2,4-триазол-1-илметил)хексаннитрил		—	88671-89-0	Repr. Cat. 3; R63 Xn; R22 Xi; R36 N; R51-53	Xn; N R: 22-36-51/53-63 S: (2-)36/37-46-61
613-137-00-1	метабензтиазурон (ISO) 1-(1,3-бензотиазол-2-ил)1,3-диметилкарбамид		242-505-0	18691-97-9	N; R50-53	N R: 50/53 S: 60-61
613-139-00-2	метсулфорон-метил метил 2-(4-метокси-6-метил-1,3,5-триaзин-2-илкарбамоилсулфамоил) бензоат		—	74223-64-6	N; R50-53	N R: 50/53 S: 60-61
614-001-00-4	никотин (ISO) 3-(N-метил-2-пиролидинил)пиридин		200-193-3	54-11-5	T+; R27 T; R25 N; R51-53	T+; N R: 25-27-51/53 S: (1/2-)36/37-45-61
614-006-00-1	бруцин 2,3-диметоксистрихнин		206-614-7	357-57-3	T+; R26/28 R52-53	T+ R: 26/28-52/53 S: (1/2-)13-45-61
614-007-00-7	бруцин сулфат [1] бруцин нитрат [2] Стрихнидин-10-он, 2,3-диметокси-моно[(R)-1-метилхептил 1,2-бензендикарбоксилат] [3] Стрихнидин-10-он, 2,3-диметокси- съединение с (S)-моно(1-метилхептил-1,2-бензен-дикарбоксилат (1:1) [4]		225-432-9 [1] 227-317-9 [2] 269-439-5 [3] 269-710-8 [4]	4845-99-2 [1] 5786-97-0 [2] 68239-26-9 [3] 68310-42-9 [4]	T+; R26/28 R52-53	T+ R: 26/28-52/53 S: (1/2-)13-45-61
615-006-00-4	2-метил-m-фенилен диизоцианат [1] 4-метил-m- фенилен диизоцианат [2] m-толилиден диизоцианат [3] толуен-2,6-диизоцианат [1] толуен-2,4-диизоцианат [2] толуен-диизоцианат [3]	C	202-039-0 [1] 209-544-5 [2] 247-722-4 [3]	91-08-7 [1] 584-84-9 [2] 26471-62-5 [3]	Carc. Cat. 3; R40 T+; R26 Xi; R36/37/38 R42/43 R52-53	T+ R: 26-36/37/38-40-42/43-52/53 S: (1/2-)23-36/37-45-61	C ≥ 20 %: T+; R26-36/37/38-40-42/43 7 % ≤ C < 20 %: T+; R26-40-42/43 1 % ≤ C < 7 %: T; R23-40-42/43 0,1 % ≤ C < 1 %: Xn; R20-42	2
616-010-00-9	тозилхлорамид натрий		204-854-7	127-65-1	Xn; R22 R31 C; R34 R42	C R: 22-31-34-42 S: (1/2-)7-22-26-36/37/39-45
616-034-00-X	пиракарболид (ISO) 3,4-дихидро-6-метил-2H-пиран-5-карбоканилид		246-419-4	24691-76-7	R52-53	R: 52/53 S: 61
616-035-00-5	цимоксанил 2-циано-N-[(етиламино)карбонил]-2-(метоксиимино)ацетамид		261-043-0	57966-95-7	Xn; R22 R43 N; R50-53	Xn; N R: 22-43-50/53 S: (2-)36/37-60-61
617-004-00-9	1,2,3,4-тетрахидро-1-нафтил хидропероксид		212-230-0	771-29-9	O; R7 Xn; R22 C; R34 N; R50-53	O; C; N R: 7-22-34-50/53 S: (1/2-)3/7-14-26-36/37/39-45-60-61	C ≥ 25 %: C; R22-34 10 % ≤ C < 25 %: C; R34 5 % ≤ C < 10 %: Xi; R36/37/38
617-006-00-X	бис(α,α-диметилбензил) пероксид		201-279-3	80-43-3	O; R7 Xi; R36/38 N; R51-53	O; Xi; N R: 7-36/38-51/53 S: (2-)3/7-14-36/37/39-61
617-008-00-0	дибензоил пероксид бензоил пероксид		202-327-6	94-36-0	E; R2 Xi; R36 R43	E; Xi; R: 2-36-43 S: (2-)3/7-14-36/37/39
650-007-00-3	хлордимеформ (ISO) N 2-(4-хлор-о-толил)-N 1,N 1-диметилформамидин		228-200-5	6164-98-3	Carc. Cat. 3; R40 Xn; R21/22 N; R50-53	Xn; N R: 21/22-40-50/53 S: (2-)22-36/37-60-61
650-008-00-9	дразоксолон (ISO) 4-(2-хлорфенилхидразон]-3-метил-5-изоксазонол		227-197-8	5707-69-7	T; R25 N; R50-53	T; N R: 25-50/53 S: (1/2-)22-24-36/37-45-60-61
650-009-00-4	хлордимеформ хидрохлорид N′-(4-хлор-o-толил)-N,N-диметилформамидинхидрохлорид N 2-(4-хлор-o- толил)-N 1,N 1- диметилформамидинхидрохлорид		243-269-1	19750-95-9	Carc. Cat. 3; R40 Xn; R22 N; R50-53	Xn; N R: 22-40-50/53 S: (2-)22-36/37-60-61
650-033-00-5	есфенвалерат(ISO) (S)-α-циано-3-феноксибензил-(S)-2-(4-хлорфенил)-3-метилбутират		—	66230-04-4	T; R23/25 R43 N; R50-53	T; N R: 23/25-43-50/53 S: (1/2-)24-36/37/39-45-60-61
650-041-00-9	триасулфурон (ISO) 1-[2-(2-хлоретокси)фенилсулфонил]-3-(4-метокси-6-метил-1,3,5-триазин-2-ил)карбамид		—	82097-50-5	N; R50-53	N R: 50/53 S: 60-61

ПРИЛОЖЕНИЕ 1Г

Индекс №	Химическо наименование	Бележки към веществата	ЕО №	CAS №	Класификация	Етикиране	Граници на концентрация	Бележки към препаратите
006-090-00-8	2-(3-йодопроп-2-ин-1-илoкси)етил фенилкарбамат		408-010-0	88558-41-2	Xn; R20 Xi; R41 R52-53	Xn R: 20-41-52/53 S: (2-)22-26-39-61
014-016-00-0	Смес от: 1,3-дихекс-5-ен-1-ил-1,1,3,3-тетраметилдисилоксан и 1,3-дихекс-n-ен-1-ил-1,1,3,3-тетраметилдисилоксан		406-490-6	—	N; R51-53	N R: 51/53 S: 61
015-164-00-9	калциев-P,P'-(1-хидроксиетилен) бис(дихидрогенфосфонат)дихидрат		400-480-5	36669-85-9	R52-53	R: 52/53 S: 61
015-165-00-4	Смес от:тиобис(4,1-фенилен)-S, S, S′, S'-тетрафенилдисулфониумбисхексафлуорофосфат;дифенил(4-фенилтиофеил)сулфониум хексафлуорофосфат		404-986-7	—	Xi; R41 N; R50-53	Xi; N R: 41-50/53 S: (2-)15-26-39-60-61
015-166-00-X	3,9-бис(2,6-ди-трет-бутил-4-метилфенoкси)-2,4,8,10-тетраокса-3,9-дифосфаспиро[5.5] ундекан		410-290-4	80693-00-1	R53	R: 53 S: 61
015-167-00-5	3-(хидроксифенилфосфинил)пропанова киселина		411-200-6	14657-64-8	Xi; R41	Xi R: 41 S: (2-)26-39
601-050-00-1	бензен C10-13-алкилни деривати		267-051-0	67774-74-7	N; R50	N R: 50 S: 61
601-051-00-7	4-фенилбут-1-ен		405-980-7	768-56-9	Xi; R38 N; R51-53	Xi; N R: 38-51/53 S: (2-)37-61
602-083-00-4	дифенил етер пентапентабромо дериват пентабромодеифенил етер		251-084-2	32534-81-9	Xn; R48/21/22 R64 N; R50-53	Xn; N R: 48/21/22-50/53-64 S: (1/2-)36/37-45-60-61
602-084-00-X	1,1-дихлор-1-флуоретан		404-080-1	1717-00-6	N; R52-53-59	N R: 52/53-59 S: 59-61
603-128-00-0	2-(фенилметокси)нафтален		405-490-3	613-62-7	R53	R: 53 S: 61
603-129-00-6	1-трет-бутoксипропан-2-ол		406-180-0	57018-52-7	R10 Xi; R41	Xi R: 10-41 S: (2-)26-39
603-130-00-1	Смес от изомери на:α-(диметил)бифенилил)-ω-хидроксиполи (oксиетилен)		406-325-8	—	Xn; R22 R52-53	Xn R: 22-52/53 S: (2-)39-61
603-131-00-7	Смес (3:1):1-деoкси-1-[метил(1-оксододецил)амино]-D-глуцитол; 1-деoкси-1-[метил(1-оксотетрадецил)амино]-D- глуцитол		407-290-1	—	Xi; R41	Xi R: 41 S: (2-)26-39
603-132-00-2	2-(хидроксиметил)-9-метил-6-(1-метилетил)-1,4-диоксаспиро[4.5]декан		408-200-3	63187-91-7	Xi; R38-41 R52-53	Xi R: 38-41-52/53 S: (2-)26-37/39-61
603-133-00-8	Смес от:3-[(4-амино-2-хлор-5-нитрофенил)амино]пропан-1,2-диол и 3,3'-(2-хлор-5-нитро-1,4-фенилендиимино)бис(пропан-1,2-диол)		408-240-1	—	Xn; R22 R52-53	Xn R: 22-52/53 S: (2-)22-36-61
603-134-00-3	Смес от: заместени додецил и/или тетрадецил, дифенил етери. Веществото е получено чрез реакцията на Фридел Ктафтс. Катализаторът се отстранява от продукта на реакцията. Дифенил етер се замества от C1-C10 алкилни групи. Алкилните групи са свързани произволно между C1 и C6. Използват се 50/50 линейни С12 и С14.		410-450-3	—	R53	R: 53 S: 61
603-135-00-9	бис[[2,2',2''нитрилотрис[етанолато]]-1-N,О]бис[2-(2-метоксиетокси)етокси]-титан		410-500-4	—	Xi; R41 N; R51-53	Xi; N R: 41-51/53 S: (2-)26-39-61
603-136-00-4	3-((4-(бис(2-хидроксиетил)амино]-2-нитрофенил)амино)-1-пропанол		410-910-3	104226-19-9	R43 R52-53	Xi R: 43-52/53 S: (2-)24-37-61
603-137-00-X	Смес от: 1-деoкси-1-[метил-(1-оксохексадецил[амино]-D-глуцитол и 1-деoкси-1-[метил-(1-оксооктадецил)амино]-D- глуцитол		411-130-6	—	Xi; R41	Xi R: 41 S: (2-)26-39
603-138-00-5	3-(2,2-диметил-3-хидроксипропил)толуен или): 2,2-диметил-3-(3-метилфенил)пропанол		403-140-4	103694-68-4	R52-53	R: 52/53 S: 61
604-050-00-X	4-хлор-о-крезол 4-хлор-2-метил фенол		216-381-3	1570-64-5	T; R23 C; R35 N; R50	T; C; N R: 23-35-50 S: (1/2-)26-36/37/39-45-61	C ≥ 25 %: T; C; R23-35 10 % ≤ C < 25 %: C; R20-35 5 % ≤ C < 10 %: C; R20-34 3 % ≤ C < 5 %: Xn; R20-36/37/38 1 % ≤ C < 3 %:Xi; R36/37/38
604-051-00-5	3,5-бис(3,5-ди-трет-бутил-4-хидрокси)бензил)-2,4,6-триметилфенол		401-110-5	87113-78-8	R52-53	R: 52/53 S: 61
604-052-00-0	2,2'-метиленбис(6-(2H-бензотриазол-2-ил)-4-(1,1,3,3-тетраметилбутил)фенол)		403-800-1	103597-45-1	R53	R: 53 S: 61
604-053-00-6	2-метил-4-(1,1-диметилетил)-6-1-метилпентадецил)-фенол		410-760-9	157661-93-3	Xi; R38 R43 N; R50-53	Xi; N R: 38-43-50/53 S: (2-)24-37-60-61
604-054-00-1	Смес от: 2-метокси-4-(тетрахидро-4-метилен-2Н-пиран-2-ил)-фенол и 4-(3,6-дихидро-4-метил-3,6-дихидро-2Н-пиран-2-ил)-2-метоксифенол		412-020-0	—	R43 R52-53	Xi R: 43-52/53 S: (2-)24-37-61
604-055-00-7	2,2'-((3,5, 5,5'-тетраметил-(1,1'-бифенил)-4,4'-диил)-бис(оксиметилен))-бис-оксиран		413-900-7	85954-11-6	Muta. Cat.3; R40	Xn R: 40 S: (2-)22-36-37
605-027-00-7	Смес от: 3a,4,5,6,7,7a-хексахидро-4,7-метано-1H-инден-6-карбоксалдехид и 3a,4,5,6,7,7a-хексахидро-4,7-метано-1H-инден-5-карбоксалдехид		410-480-7	—	R43 N; R51-53	Xi; N R: 43-51/53 S: (2-)24-37-61
606-051-00-0	4-пентилциклохексанон		406-670-4	61203-83-6	N; R51-53	N R: 51/53 S: 61
606-052-00-6	4-(N,N-дибутиламино)-2-хидрокси-2'-карбоксибензофенон		410-410-5	54574-82-2	R52-53	R: 52/53 S: 61
607-272-00-5	флуороксипир-мептил (ISO) [1] флуроксипир-бутометил (ISO) [2] метилхептил, О-((4-амино-3,5-дихлор-6-флуоро-2-пиридилoкси) ацетат [1] (2-бутoкси-1-метилетил), О-((4-амино-3,5-дихлоро-6-флуоро-2- пиридилoкси) ацетат [2]		279-752-9 [1] —	81406-37-3 [1] 154486-27-8 [2]	N; R50-53	N R: 50/53 S: 60-61
607-273-00-0	амониум-7-(2,6-диметил-8-(2,2-диметилбутирилокси)-1,2,6,7,8,8a-хексахидро-1-нафтил)-3,5-дихидроксихептаноат		404-520-2	—	R52-53	R: 52/53 S: 61
607-274-00-6	2-(N-бензил-N-метиламино)етил-3-амино-2-бутеноат		405-350-1	54527-73-0	R43 N; R51-53	Xi; N R: 43-51/53 S: (2-)24-37-61
607-275-00-1	натриeв (бензоилoкси)бензен-4-сулфонат		405-450-5	66531-87-1	R43	Xi R: 43 S: (2-)24-37
607-276-00-7	бис[(1-метилимидазол)-2-етил-хексаноат)], цинков комплеск		405-635-0	—	Xi; R38-41 N; R50-53	Xi; N R: 38-41-50/53 S: (2-)26-37/39-60-61
607-277-00-2	Смес от: 2-(хексилтио)етиламин хидрохлорид и натриев пропионат		405-720-2	—	Xn; R22 Xi; R41 R43 N; R51-53	Xn; N R: 22-41-43-51/53 S: (2-)24-26-37/39-61
607-278-00-8	Смес от: изомери на натриев фенетилнафталенсулфонат и натриев нафтилетилбензенсулфонат		405-760-0	—	Xi; R41 R43 R52-53	Xi R: 41-43-52/53 S: (2-)24-26-37/39-61
607-279-00-3	Смес от n-октадециламинодиетил-бис(хидрогенмалеат) и n-октадециламинодиетил хидроген-малеат хидрогенфталат		405-960-8	—	R43 N; R51-53	Xi; N R: 43-51/53 S: (2-)24-37-61
607-280-00-9	натриев 4-хлор-1-хидроксибутан-1-сулфонат		406-190-5	54322-20-2	Xn; R22 Xi; R36 R43	Xn R: 22-36-43 S: (2-)22-26-36/37
607-281-00-4	Смес от разклонени и линейни:C7-C9 алкил-3-[3-(2H-бензотриазол-2-ил)-5-(1,1-диметил-етил)-4-хидроксифенил]пропионати		407-000-3	127519-17-9	N; R51-53	N R: 51/53 S: 61
607-282-00-X	2-(ацетoксиметил)-4-бензилoксибутил-1ил ацетат		407-140-5	131266-10-9	R52-53	R: 52/53 S: 61
607-283-00-5	(E) етил-4-оксо-4-фенилкротонат		408-040-4	15121-89-8	Xn; R21/22 Xi; R38-41 R43 N; R50-53	Xn; N R: 21/22-38-41-43-50/53 S: (2-)26-36/37/39-60-61
607-284-00-0	Смес 9:1 от: натрий-3,3'-(1,4-фениленбис(карбонилимино-3,1-пропандиилимино))бис(10-амино-6,13-дихлор)4,11-трифенодиоксазиндисулфонат и литиев 3,3'-(1,4-фениленбис-(карбонилимино-3,1-пропанедил-имино))бис(10-амино-6,13-дихлор-4,11-трифенодиоксазиндисулфонат		410-040-4	136213-76-8	N; R51-53	N R: 51/53 S: 61
607-285-00-6	Смес от: 7-(((3-аминофенил)сулфонил)амино)-нафтален-1,3-дисулфонова киселина, натриев 7-(((3 аминофенил)сулфонил)амино) нафтален 3-1,3-дисулфонат и клаиев 7-(((3 аминофенил)сулфонил)амино) нафтален 3-1,3-дисулфонат		410-065-0	—	R43	Xi R: 43 S: (2-)22-24-37
607-286-00-1	Смес от: натриев/калиев 7-[[[3-[[4-((2-хидрокси-нафтил)азо)фенил]азо)фенил]сулфонил]амино]-нафтален-1,3-дисулфонат		410-070-8	141880-36-6	R43 R52-53	Xi R: 43-52/53 S: (2-)22-24-37-61
607-287-00-7	О'-метил О-(1-метил-2-(метакрилoилoкси)етил]-1,2,3,6-тетрахидрофталат		410-140-8	—	R52-53	R: 52/53 S: 61
607-288-00-2	Тетранатриев [c-(3-(1-(3-(е(6-дихлор-5-цианопиримидин-f-ил(метил)амино)пропил-1,6-дихидро-2-хидрокси-4-метил-6-оксо-3-пиридилазо)-4-сулфонатофенилсулфамои)фталоцианин-a,b,d-трисулфонато(6-))никелато(II), където а е 1 или 2, или 3 или 4; b е 8 или 9, или 10, или 11; c e 15 или16, или 17, или 18; d е 22 или 23, или 24, или 25 и където e и f заедно са съответно 2 и 4 или 4 и 2.		410-160-7	148732-74-5	Xi; R36 R43 R52-53	Xi R: 36-43-52/53 S: (2-)22-26-36/37-61
607-288-00-8	3-(3-(4-(2,4-бис(1,1диметилпропил)фенокси)бутиламинокарбонил-4-хидрокси-1-нафталенил)тио)пропанова киселина		410-370-9	105488-33-3	R53	R: 53 S: 61
607-290-00-3	Смес (съотношение неизвестно)от:1-C14-C18 алкилоксикарбонил-2-(3-алилoкси-2-хидроксипропоксикарбонил)етан-1-сулфонат и ;амониев 2-C14-C18-алкилoксикарбонил-1-(3-алилокси-2-хидроксипропоксикарбонил)етан-1-сулфонат		410-540-2	—	Xi; R38 R43 N; R50-53	Xi; N R: 38-43-50/53 S: (2-)24-37-60-61
607-291-00-9	додецил-ω-(C5/C6-циклоалкил)алкил карбоксилат		410-630-1	104051-92-5	R53	R: 53 S: 61
607-292-00-4	Смес от: [1-(метоксиметил)-2-(C12 алкокси)-етокси]оцетна киселина и [1-(метоксиметил)-2-(C14 алкокси)-етокси]оцетна киселина		410-640-6	—	Xi; R38-41 N; R50-53	Xi; N R: 38-41-50/53 S: (2-)26-37/39-60-61
607-293-00-X	Смес от: N-аминоетилпиперазониум моно-2,4,6-триметилнонилдифенил етер ди-сулфонат и; N-аминоетилпиперазониум-ди-2,4,6-триметилнонилдифенил етер ди-сулфонат		410-650-0	—	Xi; R41 R43 N; R51-53	Xi; N R: 41-43-51/53 S: (2-)26-36/37/39-61
607-294-00-5	натриев 2-(бензоилoкси)-1-хидроксиетан-сулфонат		410-680-4	—	R43	Xi R: 43 S: (2-)24-37
607-295-00-0	Смес от: тетранатриев фосфоноетан-1,2-дикарбоксилат и хексанатриев фосфонобутан-1,2,3,4-тетракарбоксилат		410-800-5	—	R43 N; R51-53	Xi; N R: 43-51/53 S: (2-)24-37-61
607-296-00-6	Смес от: тетраестери на пентаеритрол с хептанова киселина и 2-етилхексанова киселина		410-830-9	—	R53	R: 53 S: 61
607-297-00-1	(E-E)-3,3'-(1,4-фенилендиметил)бис(2-оксоборнан-10-сулфонова киселина		410-960-6	92761-26-7	Xi; R41	Xi R: 41 S: (2-)26-39
607-298-00-7	2-(триметиламонио)етоксикарбоксибензен-4-сулфонат		411-010-3	—	R43	Xi R: 43 S: (2-)22-36/37
607-299-00-2	метил-3-(ацетилтио)-2-метил-пропаноат		411-040-7	97101-46-7	Xn; R22 R43 N; R50-53	Xn; N R: 22-43-50/53 S: (2-)24-37-60-61
607-300-00-6	тринатриев [2-(5-хлор-2,6-дифлуоропиримидин-4-иламино)-5-(b-сулфамоил-c,d-сулфонатофтало-цианин-а-ил-K4, N29,N30,N31,N32-сулфони-ламино)бензоато(5-)]купрат(II), където a = 1, 2, 3, 4, b = 8, 9, 10, 11, c = 15, 16, 17, 18, d = 22, 23, 24, 25		411-430-7	—	R43	Xi R: 43 S: (2-)22-24-37
607-301-00-1	Смес от: додеканова киселина и поли(1-7)лактатни естери на додеканова киселина		411-860-5	—	Xi; R38-41 R43 N; R51-53	Xi; N R: 38-41-43-51/53 S: (2-)24-26-37/39-61
607-302-00-7	Смес от: тетрадеканова киселина и поли(1-7)лактатни естери на тетрадеканова киселина		411-910-6	—	Xi; R38-41 R43 N; R51-53	Xi; N R: 38-41-43-51/53 S: (2-)24-26-37/39-61
607-303-00-2	1-циклопропил-6,7-дифлуор-1,4-дихидро-4-оксо-хинолин-3-карбоксилна киселина		413-760-7	93107-30-3	Repr. Cat.3; R62 R52-53	Xn R: 62-52/53 S: (2-)22-36/37-61
608-023-00-3	4-(4-хлорфенил)-2-фенил-2-[(1H-1,2,4-триазол-1-ил)метил]бутаннитрил		406-140-2	114369-43-6	N; R50-53	N R: 50/53 S: 60-61
608-024-00-9	2-(4-(N-бутил-N-фенетиламино)фенил)етилен-1,1,2-трикарбонитрил		407-650-8	97460-76-9	R53	R: 53 S: 61
608-025-00-4	2-нитро-4,5-бис(бензилoкси)фенилацетонитрил		410-970-0	117568-27-1	R53	R: 53 S: 61
609-053-00-X	хидразин-три-нитрометан		414-850-9	—	E; R3 O; R8 Carc. Cat. 2; R45 T; R23/25 R43	E; T R: 45-3-8-23/25-43 S: 53-45
610-010-00-2	2-бромо-1-(2-фурил)-2-нитроетилен		406-110-9	35950-52-8	Xn; R22-48/22 C; R34 R43 N; R50-53	C; N R: 22-34-43-48/22-50/53 S: (1/2-)22-26-36/37/39-45-60-61
611-043-00-5	Смес (2:1:1) от: тринатриев N(1')-N(2):N(1''')-N(2'')-η-6-[2-амино-4-(или 6)-хидрокси-(или4-амино-2-хидрокси)фенилазо]-6''-(1-карбанилоил-2-хидроксипроп-1-енилазо)-5',5'''-дисулфамоил-3,3''-дисулфонатобис(нафтален-2,1'-азобензен-1,2'-диолато-О(1),O(2'))-хромат, тринатриев N(1')-N(2):N(1''')-N(2'')-η-6,6''-бис(1-карбанилоил-2- хидроксипроп-1-енилазо)-5',5'''-дисулфамоил-3,3''-дисулфонатобис(нафтален-2,1'-азобензен-1,2'-диолато-О(1),O(2'))-хромат и тринатриев N(1')-N(2):N(1'')-N(2'')-η-6,6''-бис[(2-амино-4-(или 6)-хидрокси-(или 4-амино-2 хидрокс)фенилазо]-5',5'''-дисулфамоил-3,3''-дисулфонатобис(нафтален-2,1'-азобензен-1,2'-диолато-О(1),O(2'))-хромат		402-850-1		Xi; R41 52-53	Xi R: 41-52/53 S: (2-)26-39-61
611-044-00-0	Смес от:трет-алкил(C12-C14)амоний бис[1-[(2-хидрокси-5-нитрофенил)азо]-2-нафталенолато(2-)]-хромат(1-);трет-алкил(C12-C14)амоний бис[1-[(2-хидрокси-4-нитрофенил)азо]-2-нафталенолато(2-)]-хромат(1-); трет-алкил(C12-C14)амоний бис[1-[[5-(1,1-диметилпропил)-2-хидрокси-3-нитрофенил]азо]-2-нафталенолато(2-)]-хромат(1-); трет-алкил(C12-C14)амоний-[[1-[(2- хидрокси-5-нитрофенил)азо]-2-нафталенолато(2-)]-[1-[(2- хидрокси-5-нитрофенил)азо]-2- нафталенолато(2-)]]-хромат(1-); трет-алкил(C12-C14)амоний-[[1-[[5-1,1-диметилпропил)-2-хидрокси-3-нитрофернил]азо]-2- нафталенолато(2-)]-[1-[(2- хидрокси-5- нитрофернил)азо]-2- нафталенолато(2-)]]- хромат(1-); трет-алкил(C12-C14)амоний((1-(4(или5)-нитро-2-оксидофенилазо)-2-нафтолато) (1-(3-нитро-2-оксидо-5-пентилфенилазо)-2-нафтолато))хромат(1-)		403-720-7	117527-94-3	N; R51-53	N R: 51/53 S: 61
611-045-00-6	2-[4-[N-4-ацетоксибутил)-N-етил]амино-2-метилфенилазо]-3-ацетил-5-нитротиофен		404-830-8	—	R53	R: 53 S: 61
611-046-00-1	4,4'-диамино-2-метилазобензен		407-590-2	43151-99-1	T; R25 Xn; R48/22 R43 N; R50-53	T; N R: 25-43-48/22-50/53 S: (1/2-)22-28-36/37-45-60-61
611-047-00-7	Смес (1:1) от: 2-[[4-[N-етил-N-(2-ацетоксиетил)амино]фенил]азо]-5,6-дихлорбензотиазол и [[4-[N-етил-N-(2-ацетоксиетил)амино]фенил]азо]-6,7-дихлорбензотиазол		407-890-3	111381-11-4	R53	R: 53 S: 61
611-048-00-2	Смес (1:1) от: 2-[[4-[бис(2-ацетоксиетил)амино]фенил]азо]-5,6-дихлорбензотиазол и 2-[[4-[бис(2-ацетoксиетил)амино]фенил]азо]-6,7-дихлорбензотиазол		407-900-6	111381-12-5	R53	R: 53 S: 61
611-049-00-8	7-[4-(3-(диетиламинопропиламино)-6-(3-(диетиламониопропиламино)-1,3,5-триaзин-2-иламино]-4-хидрокси-3-(4-фенилазофенилазо)-нафтален-2-сулфонат,оцетна киселина и млечна киселина (2:1:1)		408-000-6	118658-98-3	Xn; R48/22 R43 R52-53	Xn R: 43-48/22-52/53 S: (2-(22-36/37-61
611-051-00-9	2-(4-(N-етил-N-(2-хидрокси)етил)амино-2-метилфенил)азо-6-метокси-3-метилбензотиазолиум хлорид		411-110-7	136213-74-6	N; R50-53	N R: 50/53 S: 60-61
611-052-00-4	мононатриум аква-[5-[[2,4-дихидрокси-5-[(2-хидрокси-3,5-динитрофенил)азо]-фенил]азо]-2-нафталенсулфонат], железен комплекс		400-720-9	—	R52-53	R: 52/53 S: 61
612-156-00-2	Смес от: трихексадецилметиламониев хлорид и дихексадецилдиметил)амониев хлорид		405-620-9	—	Xi; R41 N; R50-53	Xi; N R: 41-50/53 S: (2-)26-39-60-61
612-157-00-8	(Z)-1-(1-бензо[b]тиен-2-илeтанон оксим хидрохлорид		410-780-8	—	Xn; R22-48/22 Xi; R41 R43 N; R51-53	Xn; N R: 22-41-43-48/22-51/53 S: (2-)22-26-36/37/39-61
612-158-00-3	Смес от: бис(5-додецил-2-хидроксибензалдоксимат)мед(II) C12- алкилна група е разклонена и 4- додецил салицилалдоксим		410-820-4	—	R53	R: 53 S: 61
612-159-00-9	Реакционни продукти от: триметилхексаметилен диамин (смес от 2,2,4-триметил-1-6-хександиамин и 2,4,4-триметил-1-6-хександиамин (в списъка на EINECS), Епоксид 8 (деривати на моно[(C10-C16)-алкилoкси)метил]оксиран) и p-толуен-сулфонова киселина		410-880-1	—	Xn; R22 C; R34 N; R50-53	C; N R: 22-34-50/53 S: (1/2-)23-26-36/37/39-45-60-61
613-149-00-7	2-трет-бутил-5-[(4-трет-бутилбензилтио)-4-хлор-пиридазин-3(2H)-он		405-700-3	96489-71-3	T; R23/25 N; R50-53	T; N R: 23/25-50/53 S: (1/2-)36/37-45-60-61
613-150-00-2	2,2'-[3,3'-(пиперазин-1,4-диил)дипропил]бис(1H-бензимидазо[[2,1-b]бензо[l,m,n][3,8]фенантролин-1,3,6-трион		406-295-6	—	R53	R: 53 S: 61
613-151-00-8	1-(3-мезилoкси-5-тритилоксиметил-2-D-треофурил)тимин		406-360-9	104218-44-2	R53	R: 53 S: 61
613-152-00-3	фенил-N-(4,6-диметоксипиримидин-2-ил)карбамат		406-600-2	89392-03-0	R43 N; R51-53	Xi; N R: 43-51/53 S: (2-)24-37-61
613-153-00-9	2,3,5-трихлорпиридин		407-270-2	16063-70-0	R52-53	R: 52/53 S: 61
613-154-00-4	2-амино-4-хлор-6-метоксипиримидин		410-050-9	5734-64-5	Xn; R22	Xn R: 22 S: (2-)22
613-155-00-X	5-хлор-2,3-дифлуорпиридин		410-090-7	89402-43-7	R10 Xn; R22 R52-53	Xn R: 10-22-52/53 S: (2-)23-36-61
613-156-00-5	2-бутил-4-хлор-5-формилимидазол		410-260-0	83857-96-9	R43 N; R51-53	Xi; N R: 43-51/53 S: (2-)24-37-61
613-157-00-0	2,4-диамино-5-метоксиметилпиримидин		410-330-0	54236-98-5	Xn; R22-48/22 Xi; R36	Xn R: 22-36-48/22 S: (2-)22-26-36
613-158-00-6	2,3-дихлор-5-трифлуорметил-пиридин		410-340-5	69045-84-7	Xn; R20/22 Xi; R41 R43 N; R51-53	Xn; N R: 20/22-41-43-51/53 S: (2-)24-26-37/39-61
613-159-00-1	4-[2-[4-(1,1-диметилетилфенил]-етокси]хиназолин		410-580-0	120928-09-8	T; R25 Xn; R20 N; R50-53	T; N R: 20-25-50/53 S: (1/2-)37-45-60-61
613-160-00-7	(1S)-2-метил-2,5-диaзобицикло[2.2.1]хептан дихидробромид		411-000-9	125224-62-6	R43	Xi R: 43 S: (2-)24-37
615-022-00-1	метил-3-изоцианатосулфонил-2-тиофен-карбоксилат		410-550-7	79277-18-2	E; R2 R14 Xn; R48/22 R42/43	E; Xn R: 2-14-42/43-48/22 S: (2-)22-30-35-36/37
615-023-00-7	метил естер на 2-(изоцианатосулфонилметил)бензоена киселина или: метил-2-(изоцианатосулфонилметил)бензоат		410-900-9	83056-32-0	R10 R14 Muta. Cat.3; R40 Xn; R20-48/22 Xi; R41 R42	Xn R: 10-14-20-40-41-42-48/22 S: (2-)23-26-36/37/39
616-044-00-4	N-(3,5-дихлор-4-етил-2-хидроксифенил)-2-(3-пентадецилфенокси)-бутанамид		402-510-2	—	N; R51-53	N R: 51/53 S: 61
616-045-00-X	2'-(4-хлор-3-циано-5-формил-2-тиенилазо)-5'-(диетиламино)-2-метоксиацетанилид		405-190-2	122371-93-1	R43 R53	Xi R: 43-53 S: (2-)22-24-37-61
616-046-00-5	N-[2-(6-хлор-7-метилпиразолo(1,5-b)1,2,4-триазол-4-ил)пропил]-2-(2,4-ди-трет-пентилфенокси)октанамид		406-390-2	—	N; R50-53	N R: 50/53 S: 60-61
616-047-00-0	Смес от: 2,2',2'',2'''-(етилендинитрилотетракис-N,N-ди(C16)алкилацетамид; 2,2',2'',2''''-(етилenдинитрилотетракис- N,N-ди(C18)алкилацетамид		406-640-0	—	R43	Xi R: 43 S: (2-)24-37
616-048-00-6	3'-трифлуорметилизобутиранилид		406-740-4	1939-27-1	Xn; R48/22 N; R51-53	Xn; N R: 48/22-51/53 S: (2-)22-36-61
616-049-00-1	2-(2,4-бис(1,1-диметилетил)фенокси) N-(3,5-дихлор-4-етил-2-хидроксифенил)-хексанамид		408-150-2	99141-89-6	R53	R: 53 S: 61
616-050-00-7	N-[2,5-дихлор-4-(1,1,2,3,3,3-хексафлуорпропокси)-фенил)-аминокарбонил]-(2,6-дифлуоробензамид		410-690-9	103055-07-8	R43 N; R50-53	Xi; N R: 43-50/53 S: (2-)24-37-60-61
616-051-00-2	Смес от: 2,4-бис(N'-(4-метилфенил)-уреидо)- толуен и 2,6-бис(N'-(4-метилфенил)-уреидо)- толуен		411-070-0	—	R53	R: 53 S: 61
617-015-00-9	бис(4-метилбензоил)пероксид		407-950-9	895-85-2	E; R2 O; R7 N; R50-53	E; N R: 2-7- 50/53 S: (2-)7-14-36/37/39-47-60-61
650-032-00-X	ципроконазол (ISO) (2RS, 3RS; 2RS, 3SR)-2-(4-хлорфенил)-3-циклопропил-1-(1H-1,2,4-триазол-1-ил)бутан-2-ол		—	94361-06-5	Repr. Cat. 3; R63 Xn; R22 N; R50-53	Xn; N R: 22-50/53-63 S: (2-)36/37-60-61

ПРИЛОЖЕНИЕ 2

Виж Акта за присъединяване от 2003 г. (ОВ L 236, 23.9.2003 г., стр. 96).

ПРИЛОЖЕНИЕ 3A

Виж Акта за присъединяване от 2003 г. (ОВ L 236, 23.9.2003 г., стр. 96).

ПРИЛОЖЕНИЕ 3Б

Виж Акта за присъединяване от 2003 г. (ОВ L 236, 23.9.2003 г., стр. 96).

ПРИЛОЖЕНИЕ 4А

„Б.10. МУТАГЕННОСТ — ТЕСТ ИН ВИТРО ЗА ХРОМОЗОМНИ АБЕРАЦИИ ПРИ БОЗАЙНИЦИ

1. МЕТОД

Настоящият метод е изцяло подобен на теста ин витро за хромозомни аберации при бозайници на ОИСР TG 473 от 1997 г.

1.1 ВЪВЕДЕНИЕ

Целта на теста ин витро за хромозомни аберации е да се идентифицират агентите, причиняващи структурни хромозомни аберации в култивирани клетки от бозайници (1) (2) (3). Структурните аберации могат да бъдат два типа: хромозомни и хроматидни. При повечето химични мутагени индуцираните аберации са от хроматиден тип, но се срещат също и аберации от хоромозомен тип. Увеличение в полиплоидията може да е показателно за това, че един химикал има потенциал да предизвиква геномни аберации. Все пак, настоящият метод не е предназначен да измерва геномни аберации и не се използва рутинно за тази цел. Хромозомните мутации и свързаните с тях събития са причината за много генетични болести при човека, а има реални доказателства, че хромозомните мутации и свързаните с тях събития, които водят до промени в онкогените и тумороподтискащите гени на соматични клетки, участват в причиняването на рак при хора и опитни животни.

За ин витро теста за хромозомни аберации могат да се използват култури на доказани клетъчни линии, клетъчни щамове или първични клетъчни култури. Клетките се избират въз основа на способността на растеж в културата, стабилността на кариотипа, броя на хромозомите, хромозомното разнообразие и спонтанната честота на хромозомни аберации.

Тестове, провеждани ин витро, по принцип изискват използването на екзогенен източник на метаболична активация. Тази система на метаболична активация не може изцяло да възпроизведе ин виво условията при бозайници. Следва внимателно да се избягват условия, които биха довели до положителни резултати, неотразяващи свойствена мутагенност, и които биха могли да възникнат от промени на pH, осмотично налягане или високи нива на цитотоксичност (4) (5).

Настоящият тест се използва за откриване на евентуални мутагени и канцерогени при бозайници. Много съединения, които са положителни в настоящия тест, са канцерогени за бозайници; все пак, няма идеална съответствие между настоящия тест и канцерогенността. Съответсвието зависи от химичния клас, а се появяват все повече доказателства, че съществуват канцерогени, които не се откриват с настоящия тест, тъй като очевидно те действат чрез други механизми, различни от прякото увреждане на ДНК.

Вижте също „Общо въведение“, Част Б.

1.2. ДЕФИНИЦИИ

Хроматиден тип аберация: структурно увреждане на хромозомата, изразяващо се в разкъсване на единични хроматиди или разкъсване и повторно съединяване между хроматиди.

Хромозомен тип аберация: структурно увреждане на хромозомата, изразяващо се в разкъсване, или разкъсване и повторно съединяване на двата хроматида от една и съща страна.

Ендоредупликация: процес, при които след период S на ДНК репликация ядрото не навлиза в митоза, а започва друг S период. Резултатът е хромозоми с 4, 8, 16… хроматиди.

Празнина: ахроматично увреждане, по-малко от ширината на един хроматид с минимална несъосност на хроматидите.

Митотичен индекс: съотношението на клетки в метафаза, разделени на броя клетки, наблюдавани в клетъчна популация; показател за степента на пролиферация на тази популация.

Геномна аберация: промяна в броя на хромозомите в сравнение с нормалния брой, характерен за използваните клетки.

Полиплоидия: множимо на хаплоидния брой хромозоми (n), различно от диплоидния брой (т.е. 3n, 4n, и т.н.).

Структурна аберация: промяна в хромозомната структура, която се открива при микроскопско изследване на етапа на метафаза на клетъчното деление, наблюдавана във вид на заличавания и фрагменти, вътрешнохромозомни или междухромозомни изменения

1.3. ПРИНЦИП НА МЕТОДА НА ТЕСТА

Клетъчни култури се подлагат на въздействието на тестваното вещество с и без метаболична активизация. На предварително определени интервали след експозицията на клетъчните култури към тестваното вещество те се третират с блокиращо метафазата вещество (например Колцемид® или колхицин), събират се, оцветяват се и метафазните клетки се анализират под микроскоп за наличието на хромозомни аберации.

1.4. ОПИСАНИЕ НА МЕТОДА НА ТЕСТА

1.4.1. Подготовка

1.4.1.1. Клетки

Могат да се използват разнообразни клетъчни линии, щамове или първични клетъчни култури, включително и човешки клетки (например фибробласти от китайски хамстер, лимфоцити от периферна кръв на хора или други бозайници).

1.4.1.2. Хранителни среди и условия за отглеждане на културата

При отглеждането на културата следва да се използват подходящи хранителни среди и инкубационни условия (носители на културата, концентрация на CO2, температура и влажност). Доказаните клетъчни линии и щамове следва да се проверяват редовно за стабилност на модалния хромозомен брой и отсъствие на микоплазмено замърсяване, а ако са замърсени, не следва да се използват. Следва да се знае нормалното време на клетъчен цикъл при клетките и използваните условия за отглеждане на културата.

1.4.1.3. Приготвяне на културите

Установени клетъчни линии и щамове: от изходни култури се размножават клетки, посяват се в хранителна среда с такава гъстота, че културите да не достигат точката на сливане преди времето на обиране, и се инкубират при 37 °C.

Лимфоцити: цялостна кръв, третирана с антикоагулант (например хепарин), или сепарирани лимфоцити, получени от здрави субекти, се добавят към хранителната среда, съдържаща митоген (например фитохемаглутинин), и се инкубират при 37 °C.

1.4.1.4. Метаболична активация

Клетките следва да се излагат на тестваното вещество, както в присъствието, така и в отсъствието на подходяща система за метаболична активация. Най-често използваната система е постмитохондрична фракция (S9) с добавка на ко-фактор, приготвена от черните дробове на гризачи, третирани с ензимно-индуциращи реактиви като Ароклор 1254 (6) (7) (8) (9) или смес от фенобарбитон и β-нафтофлавон (10) (11) (12).

Постмитохондричната фракция обичайно се използва в концентрации с обхват от 1 до 10 % v/v в последната тестова среда. Състоянието на система за метаболична активация може да зависи от изпитвания химикал. В някои случаи може да е подходящо да се прилага повече от една концентрация на постмитохондрична фракция.

Редица разработки, включително изграждането клетъчни линии чрез генно инженерство, изразяващи специфични активизиращи ензими, могат да осигурят възможности за ендогенна активация. Изборът на използваните клетъчни линии следва да е научно обоснован (напр. чрез приложимостта на изоензим Цитохром P450 за метаболизма на тестваното вещество).

1.4.1.5. Тествано вещество/подготовка

Твърдите вещества за теста следва да се разтворят или суспендират в подходящи разтворители или носители, и, ако е необходимо, да се разредят преди третирането на клетките. Течните тествани вещества могат да се добавят директно към тестовите системи и/или да се разредят преди третирането. Следва да се използват пресни препарати на тестваното вещество, освен ако данните за устойчивостта му не показват, че може да се съхранява.

1.4.2. Условия за провеждане на теста

1.4.2.1. Разтворител/носител

Не следва да има съмнения за химическа реакция на разтворителя/носителя с тестваното вещество и той следва да е съвместим с оцеляването на клетките и активността на S9. Ако се използват други освен добре познатите разтворители/носители, включването им в теста следва да се подкрепи от данни за съвместимостта им. Препоръчва се, винаги когато е възможно, първо да се разглежда възможността за прилагането на воден разтворител/носител. При тестването на вещества, нестабилни във вода, използваните органични разтворители не следва да съдържат вода. Водата може да се отстрани чрез добавянето на молекулно сито.

1.4.2.2. Концентрации на експозицията

Измежду критериите, които следва да се имат предвид при определянето на най-високите концентрации, са цитoтоксичността, разтворимостта в тестовата система и промените в pH или осмотичното налягане.

Цитотоксичността следва да се определи със и без метаболична активация в главния експеримент, като се използва подходяща индикация на клетъчната цялост и растеж като степен на сливане, количества жизнеспособни клетки, или митотичен индекс. Може да бъде полезно, ако се определи цитотоксичността и разтворимостта в предварителен експеримент.

Следва да се използват най-малко три концентрации, които могат да бъдат подложени на анализ. Там, където се среща цитотоксичност, тези три концентрации следва да покриват обхват от максимална до слаба или липса на токсичност; това обикновено означава, че концентрациите следва да се различават с коефициент не повече от 2 до √10. В момента на събиране на реколтата най-високата концентрация следва да показва значително намаляване на степента на сливане, клетъчния брой или митотичен индекс (всички са повече от 50 %). Митотичният индекс е само едно косвено мерило за цитотоксичните/цитостатични ефекти и зависи от времето след третирането. Все пак, митотичният индекс е приложим за суспензиони култури, при които други начини на измерване на токсичността могат да се окажат неудобни и непрактични. Информацията за клетъчната кинетика като средно генерационно време (СГВ), може да се използва като допълваща информация. СГВ, обаче, е едно общо средно число, което не винаги е показателно за съществуването на забавени субпопулации, а дори съвсем малко увеличение на средното генерационно време може да се свърже с особено голямо забавяне на времето на оптимален добив на аберации.

За относително нецитотоксични вещества максималната тестова концентрация следва да е 5μl/ml, 5 mg/ml или 0,01 M, в зависимост от това коя е най-ниска.

За относително неразтворими вещества, които не са токсични в концентрации, по-ниски от неразтворимата концентрация, най-високата използвана доза следва да е в концентрация над границата на разтворимост в последната хранителна среда в края на периода на третиране. В някои случаи (напр. когато токсичността се получава само с концентрация, по-висока от най-ниската неразтворимата концентрация), препоръчително е тестът да се провежда при повече от една концентрация с видимо утаяване. Полезно би било разтворимостта да се прецени в началото и края на обработването, тъй като разтворимостта може да се измени по време на курса на експозиция в тестовата система поради наличието на клетки, серум S9 и др. Неразтворимостта може да се установи и с просто око. Преципитатът не следва да пречи на отчитането.

1.4.2.3. Отрицателни и положителни контроли

Във всеки експеримент следва да се включат паралелни положителни и отрицателни (разтворител или носител) контроли, с и без метаболична активация. Когато се прилага метаболична активация, химикалът за положителен контрол, следва да е такъв, че да изисква активация, за да произведе мутагенна реакция.

За извършване на положителни контроли следва да се използва известен еластоген при нива на експозиция, при които се очаква да се достигне репродуцируемо и забележимо увеличение спрямо фон, показващ нагледно чувствителността на тестовата система.

Концентрациите на положителен контрол следва да са така избрани, че ефектите да са ясни, но да не разкриват непосредствено на четящото устройство идентичността на кодираните предметни стъкла. Примерите за положителни контролни вещества включват:

Метаболична активация	Вещество	CAS №	Einecs №
Отсъствие на екзогенна метаболична активация	метил метансулфонат	66-27-3	200-625-0
	етил метансулфонат	62-50-0	200-536-7
	етил нитрозокарбамид	759-73-9	212-072-2
	митомицин C	50-07-7	200-008-6
	4-нитрохинолин-N-оксид	56-57-5	200-281-1
Наличие на екзогенна метаболична активация	бензо[a]пирен	50-32-8	200-028-5
	циклофосфамид	50-18-0	200-015-4
	циклофосфамид монохидрат	6055-19-2

Могат да се използват други подходящи положителни контролни вещества. За положителна контрола следва да се взема предвид използването на химикали, принадлежащи към химичен клас, когато такива са налични.

Отрицателните контроли, състоящи се само от разтворител или носител в средата, в която се извършва обработването, и третирани по същия начин като културите, които се обработват, следва да се включат за всяко прибиране на клетъчна реколтата. В допълнение към това следва също да се използват нетретирани контроли, освен ако няма контролни данни от предишни изследвания, показващи че от избрания разтворител не се предизвикват делеционни или мутагенни ефекти.

1.4.3. Процедура

1.4.3.1. Третиране с тестваното вещество

Пролифериращите клетки се обработват с тестваното вещество при наличието и при отсъствието на метаболична активационна система. Третирането на лимфоцити следва да започне около 48 часа след митогенната стимулация.

1.4.3.2. Нормално за всяка концентрация следва да е използването на дубликатни култури, а те са силно препоръчителни и за отрицателни/разтворителни контролни култури. Когато на базата на данни от предишни изследвания може да се демонстрира минимално вариране между дубликатни култури (13) (14), би могло да се приеме използването на една култура за всяка концентрация.

Газообразни или летливи вещества следва да се тестват чрез подходящи методи, като например в запечатани носители на културата (15) (16).

1.4.3.3. Време за събиране на реколтата от културата

В първия експеримент клетките следва да се експонират на въздействието на тестваното вещество, както със, така и без метаболична активация, в продължение на 3 до 6 часа и да се вземе проба след време, равно на около 1,5 пъти от нормалната продължителност на клетъчния цикъл след началото на третирането (12). Ако тази процедура дава отрицателни резултати както със, така и без активация, следва да се извърши допълнителен експеримент без активация, с непрекъснато третиране до вземането на проба след време, равно на около 1,5 пъти от нормалната продължителност на клетъчния цикъл. Някои химични вещества могат по-лесно да се различат при периоди на обработване/вземане на проба, по-дълги от 1,5 пъти от продължителността на клетъчния цикъл. Отрицателните резултати с метаболична активация следва да се потвърдят за всеки случай поотделно. В случаите, когато се счита, че не е необходимо потвърждаването на отрицателни резултати, това следва да е обосновано.

1.4.3.4. Подготовка на хромозомите

Клетъчните култури се третират с Колцемид® или колхицин обикновено в продължение на 1 до 3 часа преди събирането на реколтата. Всяка клетъчна култура се обира и обработва отделно за подготовката на хромозомите. Подготовка на хромозомите включва хипотонично третиране на клетките, фиксиране и оцветяване

1.4.3.5. Анализ

Всички предметни стъкла, включително и тези на положителните и отрицателни контроли, следва да се кодират независимо едно от друго преди микроскопския анализ. Тъй като процедурите на фиксиране водят често до разкъсване на част от метафазните клетки със загуба на хромозоми, отчетените клетки следва да съдържат известен брой центромери, равен на модалния брой ≠ 2 за всички клетъчни типове. Следва да се отчетат най-малко 200 добре разнесени метафази за всяка концентрация и контрола, разделени поравно между дубликатите, ако това е приложимо. Този брой може да се намали, когато се наблюдава голям брой аберации.

Въпреки че целта на теста е да се открият структурни хромозомни аберации, от значение е да се регистрира полиплоидия и ендоредупликация, когато тези събития се наблюдават.

2. ДАННИ

2.1. ОБРАБОТКА НА РЕЗУЛТАТИТЕ

Експерименталната единица е клетката и по тази причина следва да се оценява процентът на клетки със структурна хромозомна аберация(и). Следва да се изготвят списъци на различни типове структурни хромозомни аберации с техния брой и честоти при експерименталните и контролни култури. Празнините се отбелязват отделно и се протоколират, но по принцип не се включват в общата честота на аберациите.

Следва също да се документират съпътстващите измервания на цитотоксичността за всички третирани и отрицателни контролни култури в главните опити за аберации.

Следва да се осигурят данни за отделните култури. Освен това всички данни следва да се резюмират в табличен вид.

Няма изискване за потвърждаване на ясна положителна реакция. Двузначните резултати следва да се изяснят чрез допълнително тестване, като за предпочитане е условията на опита да се модифицират. Необходимостта от потвърждаване на отрицателни резултати е разгледана в т. 1.4.3.3. Изменението на параметрите на изследването с цел разширяване на обхвата на изследваните условия следва да се има предвид при последващите експерименти. Параметрите на изследването, които могат да се изменят, включват границите на концентрацията и условията на метаболична активация.

2.2. ОЦЕНКА И ТЪЛКУВАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ

Има няколко критерия за определяне на положителен резултат като например увеличение, свързано с концентрацията, или репродуцируемо увеличение в броя на клетки с хромозомни аберации. Първо, следва да се вземе предвид биологичната значимост на резултатите. При оценката на резултатите от теста биха могли да се използват статистически методи (3) (13). Статистическата значимост не следва да е единственият решаващ фактор за положителна реакция.

Едно увеличение в броя на полиплоидни клетки може да показва, че тестваното вещество е способно да инхибира митотични процеси и да индуцира многобройни хромозомни аберации. Увеличение в броя на клетки с ендоредуплицирани хромозоми може да е показателно за способността на тестваното вещество да инхибира прогресията на клетъчния цикъл (17) (18).

Тествано вещество, за което резултатите не удовлетворяват горните критерии се счита немутагенно в настоящата система.

Въпреки че повечето опити дават ясно положителни или отрицателни резултати, в редки случаи получените данни изключват възможността да се направи категорична преценка за активността на тестваното вещество. Резултатите могат да останат неясни или под въпрос, независимо от това колко пъти е повторен опитът.

Положителните резултати от теста ин витро за хромозомни аберации показват, че тестваното вещество индуцира структурни хромозомни аберации в култивирани соматични клетки на бозайници. Отрицателните резултати показват, че при условията на теста изследваното вещество не предизвиква хромозомни аберации в култивирани соматични клетки на бозайници.

3. ДОКЛАДВАНЕ

ДОКЛАД ЗА ТЕСТА

Докладът за теста трябва да съдържа следната информация:

Разтворител/носител:

—	обосновка за избора на носител,

—	разтворимост и стабилност на тестваното вещество в разтворител/носител, ако са известни.

Клетки:

—	тип и източник на клетки,

—	кариотипни особености и дали използваният тип клетки е подходящ,

—	отсъствие на микоплазма, ако е приложимо,

—	информация за продължителността на клетъчния цикъл,

—	пол на кръвните донори, цялостна кръв или изолирани лимфоцити, използван митоген,

—	брой на пасажи, ако е приложим,

—	методи за поддържане на клетъчна култура, ако са приложими,

—	модален брой на хромозомите.

Условия за провеждане на теста:

—	идентичност на веществото, блокиращо метафазата, концентрация и времетраене на експозицията на клетките,

—	основна причина за избора на концентрации и брой култури, в т.ч., например цитотоксичнни данни и ограничения за разтворимостта, ако са налични,

—	състав на средите, CO2 концентрация, ако са приложими,

—	концентрация на тестваното вещество,

—	общ обем на носителя и тествано вещество,

—	температура на инкубация,

—	време на инкубация,

—	времетраене на третирането,

—	гъстота на клетките при посяване, ако е необходимо,

—	тип и състав на система за метаболична активация, в.т.ч. критериите за приемливост,

—	положителни и отрицателни контроли,

—	методи на подготовка на предметно стъкло,

—	критерии за отчитане на аберации,

—	брой на анализираните метафази,

—	методи за измерване на токсичността,

—	критерии за считане на проучванията положителни, отрицателни или двузначни,

Резултати:

—	признаци на токсичност, напр. степен на сливане, данни за клетъчния цикъл, клетъчно броене, митотичен индекс,

—	признаци на утаяване,

—	данни за pH и осмотичното налягане на средата за тестване, ако са определени,

—	дефиниция за аберации, в т.ч. празнини,

—	брой на клетки с хромозомни аберации и тип на хромозомните аберации, дадени отделно за всяка третирана и контролна култура,

—	изменения в полиплоидията, ако се наблюдават,

—	взаимоотношение доза-реакция, при възможност,

—	статистически анализ, ако има такъв,

—	данни от паралелни отрицателни (разтворител/носител) и положителни контроли,

—	данни от предишни изследвания от отрицателни (разтворител/носител) и положителни контроли, с обхвати, средни стойности и стандартни отклонения.

Обсъждане на резултатите.

Заключения.

4. ПОЗОВАВАНИЯ

(1)	Evans, H. J. (1976), Cytological Methods for Detecting Chemical Mutagens, in: Chemical mutagens, Principles and Methods for their Detection, Vol. 4, Hollaender, A. (ed) Plenum Press, New York and London, pp. 1-29.

(2)	Ishidate, M. Jr. and Sofumi, T. (1985), The In Vitro Chromosomal Aberration Test Using Chinese Hamster Lung (CHL) Fibroblast Cells in Culture, in: Progress in Mutation Research, Vol. 5, Ashby, J. et al., (eds) Elsevier Science Publishers, Amsterdam-New York-Oxford, pp. 427-432.

(3)

Galloway, S. M., Armstrong, M. J., Reuben, C., Colman, S., Brown, B., Cannon, C., Bloom, A. D., Nakamura, F., Ahmed, M., Duk, S., Rimpo, J., Margolin, G. H., Resnick, M. A., Anderson, G. and Zeiger E. (1978), Chromosome aberration and sister chromatic exchanges in Chinese hamster ovary cells: Evaluation of 108 chemicals, Environs, Molec. Mutagen 10 (suppl.10), pp. 1-175.

(4)	Scott, D., Galloway, S. M., Marshall, R. R., Ishidate, M. Jr., Brusick, D., Ashby, J. and Myhr, B. C. (1991), Genotoxicity under Extreme Culture Conditions. A report from ICPEMC Task Group 9, Mutation Res., 257, pp. 147-204.

(5)	Morita, T., Nagaki, T., Fukuda, I. and Okumura, K., (1992), Clastogenicity of low pH to Various Cultured Mammalian Cells, Mutation Res., 268, pp. 297-305.

(6)	Ames, B. N., McCann, J. and Yamasaki, E. (1975), Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian Microsome Mutagenicity Test, Mutation Res., 31, pp. 347-364.

(7)	Maron, D. M. and Ames, B. N. (1983), Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test, Mutation Res., 113, pp. 173-215.

(8)

Natarajan, A. T., Tates, A. D., van Buul, P. P. W., Meijers, M. and de Vogel, N. (1976), Cytogenetic Effects of Mutagen/Carcinogens after Activation in a Mircrosomal System In Vitro, I. Induction of Chromosome Aberrations and Sister Chromatid Exchange by Diethylnitrosamine (DEN) and Dimethylnitrosamine (DMN) in CHO Cells in the Presence of Rat-Liver Microsomes, Mutation Res., 37, pp. 83-90.

(9)	Matsuoka, A., Hayashi, M. and Ishidate, M. Jr. (1979), Chromosomal Aberration Tests on 29 Chemicals Combined with S9 Mix In Vitro, Mutation Res., 66, pp. 277-290.

(10)	Elliot, B. M., Combes, R. D., Elcombe, C. R., Gatehouse, D. G., Gibson, G. G., Mackay, J. M. and Wolf, R. C. (1992), Report of UK Environmental Mutagen Society Working Party. Alternative to Aroclor 1254-induced S9 in In Vitro Genotoxicity Assays, Mutagenesis, 7, pp. 175-177.

(11)

Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. (1976), A. Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems, in: de Serres, F. J. Fouts, J. R. Bend, J. R. and Philpot, R. M. (eds), In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, Elsevier, North-Holland, pp. 85-88.

(12)	Galloway, S. M., Aardema, M. J., Ishidate, M. Jr., Ivett, J. L., Kirkland, D. J. Morita, T., Mosesso, P., Sofumi, T. (1994), Report from Working Group on in In Vitro Tests for Chromosomal Aberrations, Mutation Res., 312, pp. 241-261.

(13)	Richardson, C., Williams, D. A., Allen, J. A., Amphlett, G., Chanter, D. O. and Phillips, B. (1989), Analysis of Data from In Vitro Cytogenetic Assays, in: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Kirkland, D. J., (cd) Cambridge University Press, Cambridge, pp. 141-154.

(14)	Soper, K. A. and Galloway, S. M. (1994), Replicate Flasks are not Necessary for In Vitro Chromosome Aberration Assays in CHO Cells, Mutation Res., 312, pp. 139-149.

(15)	Krahn, D. F., Barsky, F. C. and McCooey, K. T. (1982), CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids, in: Tice, R. R., Costa, D. L., Schaich, K. M. (eds), Genotoxic Effects of Airborne Agents, New York, Plenum, pp. 91-103.

(16)	Zamora, P. O., Benson, J. M., Li, A. P. and Brooks, A. L. (1983), Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown on Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in the CHO/HGPRT Mutation Assay, Environmental Mutagenesis, 5, pp. 795-801.

(17)	Locke-Huhle, C. (1983), Endoreduplication in Chinese hamster cells during alpha-radiation induced G2 arrest, Mutation Res., 119, pp. 403-413.

(18)	Huang, Y., Change, C. and Trosko, J. E. (1983), Aphidicolin-induced endoreduplication in Chinese hamster cells, Cancer Res., 43, pp. 1362-1364.“

ПРИЛОЖЕНИЕ 4Б

„Б.11. МУТАГЕННОСТ — ТЕСТ ИН ВИВО ЗА ХРОМОЗОМНИ АБЕРАЦИИ В КОСТНИЯ МОЗЪК НА БОЗАЙНИЦИ

1. МЕТОД

Настоящият метод e изцяло подобен на теста за хромозомни аберации в костния мозък на бозайници на ОИСР TG 475 от 1997 г.

1.1 ВЪВЕДЕНИЕ

Тестът ин виво в микроядрата на клетки от бозайници се използва за откриване на структурни хромозомни аберации, индуцирани от тествано вещество в клетки от костен мозък на животни, обикновено гризачи (1) (2) (3) (4). Структурните хромозомни аберации могат да бъдат два вида: хромозомни или хроматидни. Едно увеличение в полиплоидията би могло да показва, че дадено химично вещество има потенциал да предизвиква геномни аберации. С повечето химични мутагени се предизвикват аберации от хроматиден тип, но хромозомният тип аберации също се срещат. Хромозомните аберации и свързаните с тях събития са причината за генетични болести у човека, а има реални доказателства, че хромозомните мутации и свързаните с тях събития, причиняващи промени в онкогените и тумороподтискащите гени, участват в причиняването на рак на хора и експериментални системи.

В настоящия тест обикновено се използват гризачи. Обект на настоящия тест е тъканта на костният мозък, тъй като последния представлява високо васкуларизирана тъкан и съдържа популация от бързо циклиращи клетки, които могат лесно да се изолират и обработят. Друг видове и тъкани не са обекти на настоящия метод.

Настоящият тест за хромозомни аберации е от специално значение за оценка на мутагеннната опасност поради това, че позволява разглеждане на фактори на ин виво метаболизма, фармакокинетиката и процесите на ДНК репарация, въпреки че те варират при различните видове и тъкани. Тест ин виво е също полезен за по-нататъшното изследване на мутагенния ефект, установен чрез тест ин витро.

Ако има доказателства, че тестваното вещество или реактивен метаболит няма да достигнат до тъканта, която е обект на изследване, не е подходящо да се използва в настоящият тест.

Вижте също „Общо въведение“, част Б.

1.2. ДЕФИНИЦИИ

Хромозомен тип аберация: структурно увреждане на хромозомата, изразяващо се в разкъсване, или разкъсване и повторно съединяване на двата хроматида на същата страна.

Ендоредупликация: процес, при който след период S на ДНК репликация ядрото не навлиза в митоза, а започва друг S период. Резултатът е хромозоми с 4, 8, 16,… хроматиди.

Празнина: ахроматично увреждане, по-малко от ширината на един хроматид с минимална несъосност на хроматида-(ите).

Полиплоидия: кратно число на хаплоидния брой хромозоми (n), различно от диплоидния брой (т.е. 3n, 4n, и т.н.).

Структурна аберация: промяна в хромозомната структура, която се открива чрез микроскопско изследване на етапа на метафаза на клетъчното деление, наблюдавана във вид на заличавания и фрагменти, вътрешнохромозомни или междухромозомни изменения.

1.3. ПРИНЦИП НА МЕТОДА НА ТЕСТА

Животни се излагат на тестваното вещество по подходящ начин и се убиват в подходящи моменти след обработването. Преди убиването, животните се третират с блокиращ метафазата агент (например колхицин или Колцемид®). След това се приготвя хромозомен препарат от клетки на костния мозък, оцветява се и клетките в метафаза се анализират за хромозомни аберации.

1.4. ОПИСАНИЕ НА МЕТОДА НА ТЕСТА

1.4.1. Подготовка

1.4.1.1. Подбор на животински вид

Обичайно използваните животни са плъхове, мишки и китайски хамстери, въпреки че всеки подходящ вид бозайник би могъл да се използва. Следва да се вземат общо използваните лабораторни щамове на млади, здрави, пораснали животни. В началото на изследването вариациите в теглото на животните следва да е минимално и да не превишават ± 20 % от средното тегло на всеки пол.

1.4.1.2. Условия на отглеждане и хранене

Прилагат се общите условия в Общото въведение към част Б, въпреки че следва да се цели влажността на въздуха да е 50—60 %.

1.4.1.3. Подготовка на животните

Здрави, млади, пораснали животни се определят произволно за контролните и опитни групи. Клетките следва да се подредят така че да се намалят до минимум евентуалните ефекти от разполагането им. На животните се дава уникална идентифакация. Животните са аклиматизират към лабораторните условия поне пет дена.

1.4.1.4. Приготвяне на дози

Твърдите вещества за теста следва да се разтворят или суспендират в подходящи разтворители или носители, и, при необходимост, да се разредят преди даване на дозата на животните. Течните вещества за теста могат да се дават директно или да разредят преди дозиране. Следва да се използват пресни препарати на тестваното вещество, освен ако данните за устойчивостта му не показват, че може да се съхранява.

1.4.2. Условия за провеждане на теста

1.4.2.1 Разтворител/носител

Разтворителят/носителят не следва да предизвиква токсично въздействие с използваните нива на дозиране, а също така не следва да има съмнения за химическа реакция между него и тестваното вещество. Ако се използват други, освен добре познатите разтворители/носители, включването им в теста следва да се подкрепи от данни за съвместимостта им. Препоръчва се, винаги когато е възможно, първо да се разглежда възможността за прилагането на воден разтворител/носител.

1.4.2.2. Контроли

Във всеки тест следва да се включват паралелни положителни и отрицателни (разтворител/носител) контроли за всеки пол. Като се изключи третирането с тестваното вещество, с животните в контролните групи следва да борави по един и същи начин, както с животните от опитните групи.

Положителните контроли следва да произвеждат структурни аберации ин виво при нива на експозиция, при които се очаква да се постигне забележимо увеличение спрямо дадения фон. Положителните контролни дози следва да са така избрани, че ефектите да са ясни, но да не разкриват непосредствено на четеца идентичността на кодираните предметни стъкла. Приемливо е положителните контроли, да се прилагат по различен начин от тестваното вещество и да им се взема проба само еднократно. За положителна контрола може да се разглежда използването на химикали, принадлежащи към химичен клас, когато такива са налични. Примерите за положителни контролни вещества включват:

Вещество	CAS No	Einecs No
етил метасулфонат	62-50-0	200-536-7
етил нитрозокарбамид	759-73-9	212-072-2
митомицин C	50-07-7	200-008-6
циклофосфамид	50-18-0	200-015-4
циклофосфамид монохидрат	6055-19-2
триетиленмеламин	51-18-3	200-083-5

За всяко вземане на проби следва да се включват отрицателните контроли, третирани само с разтворител или носител, а за всички останали неща третирани както опитните групи, освен ако няма приемлива изменчивост между животните и честотите на клетки с хромозомни аберации са доказани с контролни данни от предшестващи изследвания. Ако за отрицателни контроли се прилага еднократно вземане на проби, най-подходящият момент е първото вземане на проба. Освен това, следва също да се използват нетретирани контроли, освен ако няма данни от предшестващи изследвания или публикувани контролни данни, показващи, че няма никакви вредни или мутагенни ефекти, предизвикани от избрания разтворител/носител.

1.5. ПРОЦЕДУРА

1.5.1. Брой и пол на животните

Всяка група от животни, с които се извършват опити и всяка контролна група включва поне пет животни за анализ от един и същ пол. Ако по времето на изследването има налични данни от изследвания на същия вид и по същия начин на експозиция, които показват, че няма значителни разлики между половете по отношение на токсичността, то тестването на един пол ще бъде достатъчно. Когато експозицията на хора спрямо химически вещества може да е в специфична зависимост от пола, като например към някои фармацевтични агенти, тестът следва да се проведе с животни от подходящия пол.

1.5.2 График на обработване

За предпочитане е тестваните вещества да се въвеждат чрез еднократно третиране. Тестваните вещества могат също да се въвеждат като доза на отделни части, т.е. две обработвания в един и същи ден, разделени от не повече от няколко часа, за да се улесни прилагането на голям обем материал. Други режими на дозиране следва да са научно обосновани.

Пробите следва да се вземат в два отделни момента след третирането в един ден. За гризачи първият интервал на вземане на проба е 1,5 пъти от продължителността на нормалния клетъчен цикъл (който нормално е 12—18 часа) след третирането. Тъй като времето за поемането и метаболизма на тестваното вещество, както и ефекта му върху кинетиката на клетъчния цикъл, могат да повлияят на оптималното време за откриване на хромозомни аберации, препоръчва се и вземане на по-късна проба 24 часа след първата проба. Ако се използват режими на дози за повече от един ден, следва да се взема една проба 1,5 пъти продължителността на нормалните клетъчни цикли след последното третиране.

Преди убиването животните се инжектират интраперитонеално с подходяща доза на блокиращ метафазата агент (например Колцемид® или колхицин). След това, след подходящ интервал от време от животните се взема проба. За мишки този интервал е приблизително 3—5 часа; за китайски хамстери - около 4—5 часа. Клетките се събират от костния мозък и се анализират за хромозомни аберации.

1.5.3. Нива на дозиране

Ако се извършва изследване за обхват поради това, че няма подходящи данни в наличност, то следва да е в същата лаборатория, като се използва същия вид, щам, пол и режим на третиране, както в главното изследване (5). Ако има токсичност, за първото вземане на проба се използват три нива на дозиране. Тези нива на дозиране следва да включват обхват от максимална до слаба токсичност или липса на токсичност. При вземане на проба на по-късен етап следва да се прилага само най-високата доза. Най-високата доза се дефинира като доза, създаваща признаци на такава токсичност, че от по-високи нива на дозиране, базирани на същия режим, би могло да се очаква да доведат до леталност. Вещества със специфични биологични активности при ниски, нетоксични дози (като хормони и митогени) могат да бъдат изключения от критериите за опрeделяне на дозата и трябва да се оценяват за всеки конкретен случай. Най-високата доза може също да се дефинира като доза, която показва известни признаци на токсичност в костния мозък (например намаляване на митотичния индекс с повече от 50 %).

1.5.4. Граничен тест

Ако тест с едно ниво на дозиране от минимум 2 000 mg/kg телесно тегло при еднократно третиране или две третирания в един и същи ден, не дава забележими токсични ефекти, а не би могло да се очаква генотоксичност на базата на данни от структурно свързани вещества, то тогава пълно изследване с три нива на дозиране може да не се счита за необходимо. За по-дълготрайни изследвания граничната доза е 2 000 mg/kg/телесно тегло/ден за период на третиране до 14 дни и 1 000 mg/kg/телесно тегло/ден за период на третиране, по-дълъг от 14 дни. Очакваната експозиция при хора може да покаже необходимост в граничния тест да се използва по-високо ниво на дозиране.

1.5.5. Администриране на дозите

Тестваното вещество обикновено се дава със стомашна сонда като се използва тръба или подходяща интубационна канюла, или чрез интраперитонеална инжекция. Други начини на експозиция биха били приемливи, ако могат да се обосноват. Максималният обем течност, който може да се вкара еднократно със стомашна сонда или инжекция зависи от големината на опитното животно. Обемът не трябва да превишава 2ml/100g телесно тегло. Обеми, по-високите от тези, трябва да се обосноват. С изключение на дразнещи или корозивни вещества, които нормално дават изострящи ефекти при по-високи концентрации, варируемостта на тестовия обем следва да се сведе до минимум чрез регулиране на концентрацията с цел осигуряване на постоянен обем на всички нива на дозиране.

1.5.6. Подготовка на хромозомите

Непосредствено след убиването на животните костният мозък се извлича, експонира се в хипотоничен разтвор и се фиксира. След това клетките се рaзнасят върху предметни стъкла и се оцветяват.

1.5.7. Анализ

Митотичният индекс следва да се определи като мярка на цитотоксичност в най-малко 1 000 клетки на едно животно за всички опитни животни (включително и положителните контроли) и животни, които не са подлагани на опити, с отрицателни контроли.

За всяко животно следва да се анализират най-малко 100 клетки. Този брой би могъл да се намали, когато се наблюдава висок брой аберации. Всички предметни стъкла, включително и тези на положителните и отрицателните контроли, следва да се кодират поотделно преди анализа под микроскоп. Тъй като процедурите по подготовка на предметно стъкло често водят до разкъсване на част от метафазите със загуба на хромозоми, отчетените клетки следва да съдържат известен брой центромери, равни на броя 2n ± 2.

2. ДАННИ

2.1. ОБРАБОТКА НА РЕЗУЛТАТИТЕ

Данните за всяко от животните следва да се представят в таблица.. Експерименталната единица е животното. За всяко изследвано животно отделно се оценява броя на отчетените клетки, броя на аберации на клетка и процента на клетки със структурна хромозомна аберация(и). Следва да се попоказват различните типове структурни хромозомни аберации с броя и честотота им за групите, при които се извършват опити, и за контролните групи. Празнини се регистрират отделно и докладват, но принципно не се включват в общата честота на аберациите. Ако няма факти за разлика в реакцията между половете, данните от двата пола могат да се комбинират за статистическия анализ.

2.2. ОЦЕНКА И ТЪЛКУВАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ

Има няколко критерия за определяне на положителен резултат, като например свързано с дозата увеличение в относителния брой на клетки с хромозомни аберации, или явно увеличение в броя на клетки с аберации в групата с еднократна доза и еднократно вземане на проба. Първо следва да се вземе предвид биологичната значимост на резултатите. Статистически методи може да се използват като помощно средство за оценката на резултатите от теста (6). Статистическата значимост не следва да е единственият решаващ фактор за положителна реакция. Двузначните резултати следва да се изяснят чрез още тестове, като за предпочитане е да се изменят условията на експеримента.

Увеличение в полоплоидията може да е показателно за това, че тестваното вещество има потенциала да индуцира геномни хромозомни аберации. Увеличение в ендоредупликацията може да показва, че тестваното вещество е в състояние да инхибира прогресията на клетъчния цикъл (7) (8).

Тествано вещество, за което резултатите не отговарят на горните критерии, се счита за немутагенно при настоящия тест.

Въпреки че повечето опити дават ясно положителни или отрицателни резултати, в редки случаи наборът данни изключва възможността да се направи категорична преценка за активността на тестваното вещество. Резултатите могат да останат неясни или под въпрос, независимо от това колко пъти е извършен опитът.

Положителните резултати от теста ин виво за хромозомни аберации показват, че тестваното вещество предизвиква структурни хромозомни аберации в костния мозък на тествания вид. Отрицателните резултати показват, че при условията за провеждане на теста, тестваното вещество не предизвиква хромозомни аберации в костния мозък на тествания вид.

Следва да се обсъди вероятността тестваното вещество или метаболитите му да достигнат общото кръвообращение или по-конкретно тъканта, която е обект на тестването (например системна токсичност).

3. ДОКЛАДВАНЕ

ДОКЛАД ЗА ТЕСТА

Докладът за теста трябва да включва следната информация:

Разтворител/носител:

—	обосновка за избора на носител,

—	разтворимост и стабилност на тестваното вещество в разтворител/носител, ако са известни.

Опитни животни:

—

вид/щам,

—	брой, възраст и пол на животните,

—	източник, условия на отглеждане, начин на хранене и др.

—	индивидуално тегло на животните в началото на теста, в т.ч. обхват на телесното тегло, средни стойности и стандартно отклонение за всяка група.

Условия за провеждане на теста:

—	положителни и отрицателни (носител/разтворител) контролни данни,

—	данни от изследването за установяване на обхват, ако е проведено,

—	основна причина за избора на нивото на дозата,

—	подробности за приготвянето на тестваното вещество,

—	подробности за администрирането на тестваното вещество,

—	основна причина за начина на администриране,

—	методи за проверка на достигането на тестваното вещество до общото кръвообращение или тъкан, която е обект на тестването, ако са приложими,

—	преминаване от концентрация (ppm) на тестваното вещество в храната/питейната вода към действителната доза (mg/kg телесно тегло), ако е приложимо,

—	подробности за качеството на храната и водата,

—	подробно описание на графиците на третиране и вземане на проби,

—	методи на измерване на токсичността,

—	идентичност на блокиращото метафазата вещество, концентрация и времетраене на третирането

—	методи на приготвяне на предметно стъкло,

—	критерии за отчитане на аберации,

—	брой на анализирани клетки (животно,

—	критерии за определяне на изследванията като положителни, отрицателни или двузначни.

Резултати:

—	признаци на токсичност,

—	митотичен индекс,

—	тип и брой на аберациите, дадени отделно за всяко животно,

—	общ брой на аберациите на група със средни стойности и стандартни отклонения,

—	изменения в полиплоидията, ако се наблюдават,

—	брой клетки с аберации на група със средни стойности и стандартни отклонения,

—	взаимоотношение доза-реакция, където е възможно,

—	статистически анализи, ако има такива,

—	паралелни отрицателни контролни данни,

—	исторически отрицателни данни от предишни изследвания с обхвати, средни стойности и стандартни отклонения

—	паралелни положителни контролни данни.

Обсъждане на резултатите.

Заключения.

4. ПОЗОВАВАНИЯ

(1)	Adler, I. D. (1984), Cytogenetic Tests in Mammals, in: Mutagenicity Testing: a Practical Approach, S. Venitt and J. M. Parry (eds), IRL Press, Oxford, Washington D. C., pp. 275-306.

(2)	Preston, R. J., Dean, B. J., Galloway, S., Holden, H., McFee, A. F. and Shelby, M. (1987), Mammalian In Vivo Cytogenetic Assays: Analysis of Chromosome Aberrations in Bone Marrow Cells, Mutation Res., 189, pp. 157-165.

(3)

Richold, M., Chandley, A., Ashby, J., Gatehouse, D. G., Bootman, J. and Henderson, L. (1990), In vivo Cytogenetic Assays, in: D. J. Kirkland (ed.), Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report, Part I revised, Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 115-141.

(4)

Tice, R. R., Hayashi, M., MacGregaro, J. T., Anderson, D., Blakey, D. H., Holden, H. E., Kirsch-Volders, M., Oleson Jr., F. B., Pacchierotti, F., Preston, R. J., Romagna, F., Shimada, H., Sutou, S. and Vannier, B. (1994), Report from the Working Group on the in Vivo Mammalian Bone Marrow Chromosomal Aberration Test, Mutation Res., 312, pp. 305-312.

(5)

Fielder, R. J., Allen, J. A., Boobis, A. R., Botham, P. A., Doe, J., Esdaile, D. J., Gatehouse, D. G., Hodson-Walker, G., Morton, D. B., Kirkland, D. J. and Richold, M. (1992), Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group: Dose setting in In Vivo Mutagenicity Assays, Mutagenesis, 7, pp. 313-319.

(6)

Lovell, D. P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G. E., Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D. G. and Savage, J. R. K. (1989), Statistical Analysis of In Vivo Cytogenetic Assays, in: UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing, Report Part III. Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, D. J. Kirkland (ed.) Cambridge University Press, Cambridge, pp. 184-232.

(7)	Locke-Huhle, C. (1983), Endoreduplication in Chinese hamster cells during alpha-radiation-induced G2 arrest, Mutation Res., 119, pp. 403-413.

(8)	Huang, Y., Change, C. and Trosko, J. E. (1983), Aphidicolin-induced endoreduplication in Chinese hamster cells, Cancer Res., 43, pp. 1362-1364.“

ПРИЛОЖЕНИЕ 4В

„Б.12. МУТАГЕННОСТ — ИН ВИВО МИКРОЯДРЕН ТЕСТ НА ЕРИТРОЦИТИ ОТ БОЗАЙНИЦИ

1. МЕТОД

Настоящият метод e изцяло подобен на микроядрен тест на еритроцити от бозайници на ОИСР TG 474 от 1997 г.

1.1. ВЪВЕДЕНИЕ

Микроядрен тест ин виво на еритроцити от бозайници се използва за откриване на увреждания, предизвиквани от тестваното вещество, на хромозомите или митотичния апарат на еритробласти чрез анализ на еритроцити, така както са взети като проби от клетки в костния мозък и/или периферната кръв на животни, обичайно гризачи.

Целта на микроядрения тест е да се идентифицират вещества, причиняващи цитогенно увреждане, което води до образуването на микроядра, съдържащи изоставащи хромозомни фрагменти или цели хромозоми.

Когато еритробласт на костен мозък се развие в полихроматичен еритроцит, главното ядро се екструдира, а всяко образувано вече микроядро може да изостане в иначе обезядрената цитоплазма. Онагледяването на микроядрата се улеснява в тези клетки, тъй като на тях им липсва главното ядро. Увеличаването на честотата на полихроматични еритроцити с микроядра в третираните животни е показател за индуцирано хромозомно увреждане.

В настоящия тест обикновено се използва костния мозък на гризачи, тъй като в тази тъкан се произвеждат полихроматични еритроцити. Измерването на незрели (полихроматични) еритроцити с микроядра в периферна кръв е еднакво приемливо във всеки вид, при който неспособността на далака да отстранява еритроцити с микроядра е изявена, или който е показал адекватна чувствителност да открива агенти, причиняващи структурни или геномни хромозомни аберации. Микроядрата могат да бъдат разграничени чрез редица критерии. Те включват идентификация на наличието или отсъствието на кинетохорна или центромерна ДНК в микроядрата. Честотата на незрели (полихроматични) еритроцити с микроядра е главнита крайна точка. Броят на зрели (нормохроматични) еритроцити в периферната кръв, съдържащи микроядра измежду даден брой зрели еритроцити може също да се използва като крайна точка за анализа на опита, когато животните се третират в продължение на четири или повече седмици.

Настоящият микроядрен тест ин виво на еритроцити от бозайници е особено важен за оценка на мутагенната опасност поради това, че дава възможност за разглеждане на фактори на процесите ин виво на метаболизма, фармакокинетиката и възстановителните процеси в ДНК, въпреки че те могат да варират според вида, тъканта и генетичните крайни точки. Анализ чрез тест ин виво е полезен и за по-нататъшното изследване на мутагенния ефект, установен чрез система ин витро.

Ако има доказателства, че тестваното вещество или реактивен метаболит няма да достигнат до тъкан, която е обект на анализ, не е подходящо да се използва настоящият тест.

Вижте също „Общо въведение“, част Б.

1.2. ДЕФИНИЦИИ

Центромера (Кинетохора): област(и) на хромозомата, с която вретеновидни фибри се свързват по време на клетъчното деление, като така позволяват методично придвижване на дъщерните хромозоми към полюсите на дъщерните клетки.

Микроядра: малки ядра, отделни от и в допълнение към главното ядро на клетките, произведени по време на телофазата на митоза (мейоза) чрез изоставащи хромозомни фрагменти или цели хромозоми.

Нормохроматичен еритроцит: зрял еритроцит, на който му липсват рибозоми и може да бъде отличен от незрели, полихроматични еритроцити чрез оцветявания, селективни за рибозоми.

Полихроматичен еритроцит: незрял еритроцит в междинен етап на развитие, който все още съдържа рибозоми и следователно може да бъде отличен от зрели нормохроматични еритроцити чрез оцветявания, селективни за рибозоми.

1.3 ПРИНЦИП НА МЕТОДА НА ТЕСТА

Животните се експонират на въздействието на тестваното вещество по подходящ начин. Ако се използва костен мозък, животните се убиват в подходящи моменти след третирането, костният мозък се извлича, а препаратите се изготвят и оцветяват (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7). Когато се използва периферна кръв, кръвта се взема в подходящи моменти след третирането, а препаратите за намазка се изготвят и оцветяват (4) (8) (9) (10). За опити с периферна кръв следва да мине възможно най-малко време между експозицията и обирането на реколтата от клетки. Препаратите се анализират за наличие на микроядра.

1.4 ОПИСАНИЕ НА МЕТОДА НА ТЕСТА

1.4.1 Подготовка

1.4.1.1. Подбор на животинския вид

Ако се използва костен мозък, препоръчват се мишки или плъхове, въпреки че всеки подходящ вид от бозайници би могъл да се използва. Когато се използва периферна кръв, препоръчват се мишки. Все пак, всеки подходящ вид от бозайници би могъл да се използва, при условие че това е вид, в който далакът не отстранява еритроцити с микроядра или вид, показал адекватна чувствителност за откриване на агенти, които причиняват структурни или геномни хромозомни аберации. За теста трябва да се вземат общо използваните лабораторни щамове на млади, здрави животни. В началото на изследването, вариациите в теглото на животните следва да са минимални и да не превишават ± 20 % от средното тегло на всеки пол.

1.4.1.2. Условия на отглеждане и хранене

Прилагат се общите условия в Общото въведение към част Б, въпреки че целта е влажността на въздуха да е 50—60 %.

1.4.1.3. Подготовка на животните

Здрави млади животни се отделят на произволен принцип за контролните и опитни групи. На животните се дава уникална идентифакация. Животните са аклиматизират към лабораторните условия поне пет дена. Клетките следва да се подредят така че да се намалят до минимум евентуалните ефекти от разполагането им.

1.4.1.4. Приготвяне на дози

Твърдите вещества за теста следва да се разтворят или суспендират в подходящи разтворители или носители, и, при необходимост, да се разредят преди даване на дозата на животните. Течните вещества за теста могат да се дозират директно или да разредят преди дозиране. Следва да се използват пресни препарати на тестваното вещество, освен ако данните за устойчивостта му не показват, че може да се съхранява.

1.4.2. Условия за провеждане на теста

1.4.2.1. Разтворител/носител

Разтворителят/носителят не следва да има токсично въздействие при използваните нива на дозиране, а също така не следва да предизвиква съмнения за химическа реакция между него и тестваното вещество. Ако се използват други, освен добре познатите разтворители/носители, включването им в теста следва да се подкрепи от данни за съвместимостта им. Препоръчва се, винаги когато е възможно, първо да се разглежда възможността за прилагането на воден разтворител/носител.

1.4.2.2. Контроли

Във всеки тест следва да се включват паралелни положителни и отрицателни (разтворител/носител) контроли за всеки пол. Като се изключи третирането с тестваното вещество, с животните в контролните групи следва да борави по един и същи начин както с животните от групите, с които се извършват опити.

Положителните контроли следва да произвеждат микроядра ин виво при нива на експозиция, при които се очаква да се постигне забележимо увеличение спрямо съответния фон. Положителните контролни дози следва да са така избрани, че ефектите да са ясни, но да не разкриват непосредствено на четеца идентичността на кодираните предметни стъкла.Приемливо е положителните контроли, да се администрират по различен начин от тестваното вещество и да им се взема проба само еднократно. Освен това, за положителна контрола следва да се смята използването на химикали, принадлежащи към химичен клас, когато такива са налични. Примерите за положителни контролни вещества включват:

Вещество	CAS №	Einecs №
етил метансулфонат	62-50-0	200-536-7
N- етил -N-нитрозокарбамид	759-73-9	212-072-2
митомицин C	50-07-7	200-008-6
циклофосфамид	50-18-0	200-015-4
циклофосфамид монохидрат	6055-19-2
триетиленмеламин	51-18-3	200-083-5

За всяко вземане на проби следва да се включват отрицателните контроли, третирани само с разтворител или носител, а за всички останали неща третирани както опитните групи, освен ако няма приемлива изменчивост между животните и честотите на клетки с микроядра са доказани с контролни данни от предишни изследвания. Ако за отрицателни контроли се прилага еднократно вземане на проби, най-подходящият момент е първият. Освен това, следва също да се използват необработени контроли, освен ако няма контролни данни от предишни изследвания или публикувани контролни данни, които показват, че няма никакви вредни или мутагенни ефекти, предизвикани от избрания разтворител/носител.

Ако се използва периферна кръв, проба преди третирането може да е приемлива в качеството на паралелна отрицателна контрола, но само при кратките изследвания на периферна кръв (напрример 1—3 третирания), когато резултантните данни са в очаквания обхват за контрола от предишни изследвания.

1.5. ПРОЦЕДУРА

1.5.1. Брой и пол на животните

Всяка група за опити и всяка контролна група трябва да включват поне пет анализируеми животни от един пол (11). Ако по времето на изследването има налични данни от изследвания на същия вид и чрез същия начин на експозиция, които показват, че няма значителни разлики между половете по отношение на токсичността, то тестването на един пол ще бъде достатъчно. Когато експозицията на хора спрямо химически вещества може да е в специфична зависимост от пола, като например с някои фармацевтични агенти, тестът следва да се проведе с животни от подходящия пол.

1.5.2. График на обработване

Не може да се препоръча стандартен график на обработване (т.е. едно, две или повече третирания на 24-часови интервали). Пробите от обширни режими на дози са приемливи дотолкова, доколкото е демонстриран положителен ефект за настоящето изследване, или за изследване с отрицателен ефект дотолкова, доколкото е демонстрирана токсичността или е използване граничната доза и дозирането е продължило до времето на вземане на проба. Тестваните вещества могат също да се администрират като разделена доза, т.е. две третирания в един и същи ден, разделени от не повече от няколко часа, за да се улесни даването на голям обем материал.

Тестът може да се извърши по два начина:

животните се третират веднъж с тестваното вещество. Проби от костен мозък се вземат най-малко два пъти, като се започне не по-рано от 24 часа след третирането, но не повече от 48 часа след третирането на подходящи интервали между пробите. Вземането на проби по-рано от 24 часа след третирането следва да бъде обосновано. Проби от периферна кръв се вземат най-малко два пъти, като се започне не по-рано от 36 часа след третирането на подходящи интервали след първато, но не повече от 72 часа. Когато се разпознае положителна реакция след едно вземане на проба, не се изисква допълнително вземане на проба;

б)	Ако се прилагат две или повече обработвания на ден (например две или повече третирания на 24-часови интервали), следва да се вземат проби веднъж между 18-ия и 24-ия час след последното третиране за костния мозък и веднъж между 36-ия и 48-ия час след последното третиране за периферната кръв (12).

Когато е уместно, може да се използва друг график на вземане на проби.

1.5.3. Нива на дозиране

Ако се извършва изследване за обхват поради това, че няма в наличност подходящи данни, то следва да се извърши в същата лаборатория, като се използва същия вид, щам, пол и режим на третиране, който се използва и в главното изследване (13). Ако има токсичност, за първото вземане на проба се използват три нива на дозиране. Тези нива на дозиране следва да включват обхват от максимална до слаба токсичност или липса на токсичност. При вземане на проба на по-късен етап е необходимо да се прилага само най-високата доза. Най-високата доза се дефинира като доза, създаваща признаци на такава токсичност, че от по-високи нива на дозиране, базирани на същия режим, би могло да се очаква да доведат до леталност. Вещества със специфични биологични активности при ниски, нетоксични дози (като хормони и митогени) могат да бъдат изключения по отношение на критериите за опрeделяне на дозата и следва да се оценяват за всеки конкретен случай. Най-високата доза може също да се дефинира като доза, която показва известни признаци на токсичност в костния мозък (напр. нaмаляване на съответната част от незрели еритроцити спрямо общия брой еритроцити в костния мозък или периферната кръв).

1.5.4. Граничен тест

Ако тест с едно ниво на дозиране от минимум 2 000 mg/kg телесно тегло при еднократно третиране или две третирания в един и същи ден, не дава забележими токсични ефекти, а генотоксичност не би могла да се очаква на базата на данни от структурно свързани вещества, то тогава пълно изследване с три нива на дозиране може да не се счита за необходимо. За по-дълготрайни изследвания граничната доза е 2 000 mg/kg/телесно тегло/ден за период на третиране до 14 дни и 1 000 mg/kg/телесно тегло/ден за период на третиране, по-дълъг от 14 дни. Очакваната експозиция към хора може да покаже, че е необходимо в граничния тест да се използва по-високо ниво на дозиране.

1.5.5. Администриране на дозите

Тестваното вещество обикновено се дава със стомашна сонда като се използва тръба или подходяща интубационна канюла, или чрез интраперитонеална инжекция. Други начни на експозиция биха били приемливи, ако могат да се обосноват. Максималният обем течност, който може да се вкара еднократно със стомашна сонда или инжекция зависи от големината на опитното животно. Обемът не следва да превишава 2 ml/100 g телесно тегло. Използването на обеми, по-големи от тези, трябва да бъде обосновано. С изключение на дразнещи или корозивни вещества, които нормално дават изострящи ефекти при по-високи концентрации променливостта на тестовия обем следва да се сведе до минимум чрез регулиране на концентрацията с цел осигуряване на постоянен обем на всички нива на дозиране.

1.5.6. Подготовка на костния мозък/кръвта

Клетките на костния мозък обичайно се вземат от бедрените кости или от тибиите (големите пищяли), непосредствено след убиването на животното. Според общоприетата практика клетките се изваждат от бедрените кости или от тибиите, подготвят се и се оцветяват по установените методи. Периферната кръв се взема от опашната вена или друг подходящ кръвоносен съд и незабавно се оцветява суправитално (8) (9) (10), или се приготвят препарати за намазка, след което се оцветяват. Използването на специфични оцветители за ДНК (напр. акридин оранжево (14) или Хьохст 33258 плюс пиронин-Y (15)) може да елиминира някои от аретафктите, свързани с използването на оцветител, което не е специфично за ДНК. Това предимство не изключва използването на конвенционални багрила (например Гиемса). Могат също да се използват допълнителни системи (например целулозни колони за отстраняване на клетки с ядра (16)), при условие че е доказано, че тези системи работят адекватно в лабораторното приготвяне на микроядра.

1.5.7. Анализ

Пропорцията на незрелите от общо (незрели + зрели) еритроцити се определя за всяко животно като се отброяват общо най-малко 200 еритроцити за костен мозък и 1 000 еритроцити за периферна кръв (17). Всички предметни стъкла, включително и тези за положителни и отрицателни контроли, следва да се кодират поотделно преди анализа под микроскоп. Най-малко 2 000 незрели еритроцити на животно се изследват за разпространението на незрели еритроцити с микроядра. Допълнителна информация може да се получи чрез изследване на зрели еритроцити за микроядра. Когато се анализират предметни стъкла, пропорцията незрели от общия брой еритроцити не следва да е по-малко от 20 % от контролната стойност. Когато животните се третират непрекъснато в течение на четири или повече седмици, най-малко 2 000 зрели еритроцити на животно могат също да се изследват за разпространението на микроядра. Приемливи алтернативи на ръчния анализ са системите за автоматизиран анализ (анализ на изображението и поточен цитометричен анализ на клетъчни суспензии), ако са подходящо обосновани и валидирани.

2. ДАННИ

2.1. ОБРАБОТКА НА РЕЗУЛТАТИТЕ

Индивидуалните данни за животните следва да се представят в таблица. Експерименталната единица е животното. За всяко изследвано животно следва да се дава отделно броят на отчетените незрели еритроцити, броят на незрелите еритроцити с микроядра и броят на незрелите спрямо общото количество на еритроцитите. Когато животните се третират непрекъснато в течение на четири или повече седмици, данни за зрелите еритроцити следва също да се дадат, ако са събрани. Пропорцията на незрелите спрямо общия брой на еритроцитите, и ако се счита за приложимо, процентът на еритроцитите с микроядра, се посочва за всяко животно. Ако няма факти за разлика в реакцията между половете, данните от двата пола могат да се комбинират за статистическия анализ.

2.2. ОЦЕНКА И ТЪЛКУВАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ

Има няколко критерия за определяне на положителен резултат, като свързано с дозата увеличение на броя клетки с микроядра или явно увеличение на броя клетки с микроядра в група с еднократна доза и еднократно вземане на проба. Първо следва да се разгледа биологичната значимост на резултатите. При оценката на резултатите от теста като помощно средство може да се използват статистически методи (18) (19). Статистическата значимост не следва да е единственият решаващ фактор за положителна реакция. Двузначните резултати следва да се изяснят чрез допълнително тестване, като за предпочитане е да се изменят условията на експеримента.

Въпреки че повечето експерименти дават ясно положителни или отрицателни резултати, в редки случаи наборът данни изключва възможността да се направи категорична преценка за активността на тестваното вещество. Резултатите могат да останат двузначни или под въпрос, независимо от това колко пъти е повторен опитът.

Положителните резултати в микронуклеарния тест показват, че веществото индуцира микроядра, които са резултат от хромозомно увреждане или увреждане на митотичния апарат в еритробластите на опитния вид. Отрицателните резултати показват, че при условията за провеждане на теста, тестваното вещество не създава микроядра в незрелите еритроцити на тествания вид.

Следва да се обсъди вероятността тестваното вещество или метаболитите му да достигнат общото кръвообращение или конкретно тъканта, която е обект на изследване (напр. системна токсичност).

3. ДОКЛАДВАНЕ

ДОКЛАД ЗА ТЕСТА

Докладът за теста следва да включва следната информация:

Разтворител/носител:

—	обосновка за избора на носител,

—	разтворимост и стабилност на тестваното вещество в разтворител/носител, ако са известни.

Опитни животни:

—

вид/щам,

—	брой, възраст и пол на животните,

—	източник, условия на отглеждане, начин на хранене и др.,

—	индивидуално тегло на животните в началото на теста, в т.ч. обхват на телесното тегло, средни стойности и стандартно отклонение за всяка група.

Условия за провеждане на теста:

—	положителни и отрицателни (носител/разтворител) контролни данни,

—	данни от изследването за установяване на обхват, ако е проведено,

—	основна причина за избора на нивото на дозата,

—	подробности за приготвянето на тестваното вещество,

—	подробности за администрирането на тестваното вещество,

—	основна причина за начина на администриране,

—	методи за проверка на достигането на тестваното вещество до общото кръвообращение или прицелната тъкан, ако са приложими,

—	преминаване от концентрация (ppm) на тестваното вещество в храната/питейната вода към действителната доза (mg/kg телесно тегло), ако е приложимо,

—	подробности за качеството на храната и водата,

—	подробно описание на графиците на третиране и вземане на проби,

—	методи на приготвяне на предметно стъкло,

—	методи на измерване на токсичността,

—	критерии за отчитане на незрели еритроцити,

—	брой на анализирани клетки (животно,

—	критерии за считане на изследванията положителни, отрицателни или двузначни.

Резултати:

—	признаци на токсичност,

—	пропорция на незрелите еритроцити от общия брой еритроцити,

—	брой на незрелите еритроцити с микроядра, посочен отделно за всяко животно,

—	средна стойност ± стандартно отклонение на незрелите еритроцити с микроядра на група,

—	взаимоотношение доза-реакция, където е възможно,

—	статистически анализи, ако има такива,

—	паралелни отрицателни данни и отрицателни данни от предишни изследвания,

—	паралелни положителни контролни данни.

Обсъждане на резултатите.

Заключения.

4. ПОЗОВАВАНИЯ

(1)	Heddle, J. A. (1973), A Rapid In Vivo Test for Chromosomal Damage, Mutation Res., 18, pp. 187-190.

(2)	Schmid, W. (1975), The Micronucleus Test, Mutation Res., 31, pp. 9-15.

(3)	Heddle, J. A., Salamone, M. F., Hite, M., Kirkhart, B., Mavournin, K., MacGregor, J. G. and Newell, G. W. (1983), The Induction of Micronuclei as a Measure of Genotoxicity, Mutation Res. 123, pp. 61-118.

(4)	Mavournin, K. H., Blakey, D. H., Cimino, M. C., Salamone, M. F. and Heddle, J. A. (1990), The In Vivo Micronucleus Assay in Mammalian Bone Marrow and Peripheral Blood. A report of the U. S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program, Mutation Res., 239, pp. 29-80.

(5)

MacGregor, J. T., Schlegel, R., Choy, W. N. and Wehr, C. M. (1983), Micronuclei in Circulating Erythrocytes: A Rapid Screen for Chromosomal Damage During Routine Toxicity Testing in Mice, in: Developments in Science and Practice of Toxicology, ed. A. W. Hayes, R. C. Schnell and T. S. Miya. Elsevier, Amsterdam, pp. 555-558.

(6)	MacGregor, J. T., Heddle, J. A. Hite, M., Margolin, G. H., Ramel, C., Salamone, M. F., Tice, R. R., and Wild, D. (1987), Guidelines for the Conduct of Micronucleus Assays in Mammalian Bone Marrow Erythrocytes, Mutation Res., 189, pp. 103-112.

(7)	MacGregor, J. T., Wehr, C. M., Henika, P. R. and Shelby, M. E. (1990), The in vivo Erythrocyte Micronucleus Test: Measurement at Steady State Increases Assay Efficiency and Permits Integration with Toxicity Studies, Fund. Appl. Toxicol. 14, pp. 513-522.

(8)	Hayashi, M., Morita, T., Kodama, Y., Sofumi, T. and Ishidate, M. Jr. (1990), The Micronucleus Assay with Mouse Peripheral Blood Reticulocytes Using Acridine Orange-Coated Slides, Mutation Res., 245, pp. 245-249.

(9)	The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test (1992). Micronucleus Test with Mouse Peripheral Blood Erythrocytes by Acridime Orange Supravital Staining: The Summary Report of the 5th Collaborative Study by CSGMT/JEMMS, MMS, Mutation Res., 278, pp. 83-98.

(10)	The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test (CSGMT/JEMMS, MMS: The Mammalian Mutagenesis Study Group of the Environmental Mutagen Society of Japan) (1995), Protocol recommended for the short-term mouse peripheral blood micronucleus test, Mutagenesis, 10, pp. 53-159.

(11)	Hayashi, M., Tice, R. R., MacGregor, J. T., Anderson, D., Blackey, D. H., Kirsch-Volders, M., Oleson, Jr. F. B., Pacchicrotti, F., Romagna, F., Shimada, H. Sutou, S. and Vannier, B. (1994), in Vivo Rodent Erythrocyte Micronucleus Assay, Mutation Res., 312, pp. 293-304.

(12)	Higashikuni, N. and Sutou, S. (1995), An optimal, generalised sampling time of 30 ± 6 h after double dosing in the mouse peripheral micronucleus test, Mutagenesis, 10, pp. 313-319.

(13)

Fielder, R. J., Allen, J. A., Boobis, A. R., Botham, P. A., Doe, J., Esdaile, D. J., Gatehouse, D. G., Hodson-Walker, G., Morton, D. B., Kirkland, D. J. and Rochold, M. (1992), Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group: Dose Setting in In Vivo Mutagenicity Assays, Mutagenesis, 7, pp. 313-319.

(14)	Hayashi, M., Sofumi, T. and Ishidate, M. Jr. (1983), An Application of Acridine Orange Fluorescent Staining to the Micronucleus Test, Mutation Res., 120, pp. 241-247.

(15)	MacGregor, J. T., Wehr, C. M. and Langlois, R. G. (1983), A Simple Fluorescent Staining Procedure for Micronuclei and RNA in Erythrocytes Using Hoechst 33258 and Pyromin Y, Mutation Res., 120, pp. 269-275.

(16)	Romagna, F. and Staniforth, C. D. (1989), The automated bone marrow micronucleus test, Mutation Res., 213, pp. 91-104.

(17)	Gollapudi, B. and McFadden, L. G. (1995), Sample size for the estimation of polychromatic to normochromatic erythrocyte ratio in the bone marrow micronucleus test, Mutation Res., 347, pp. 97-99.

(18)

Richold, M., Ashby, J., Bootman, J., Chandley, A., Gatehouse, D. G. and Henderson, L. (1990), In Vivo Cytogenetics Assay, in: D. J. Kirkland (ed.), Basic Mutagenicity tests, UKEMS Recommended Procedures, UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report, Part 1, revised, Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 115-141.

(19)

Lovell, D. P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G. E., Clare, G., Ferguson R., Richold, M., Papworth, D. G. and Savage, J. R. K. (1989), Staticical Analysis of In Vivo Cytogenetic Assays, in: D. J. Kirkland (ed.), Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report, Part III, Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 184-232.“

ПРИЛОЖЕНИЕ 4 Г

„Б.13/14. МУТАГЕННОСТ — БАКТЕРИИ ЗА ТЕСТВАНЕ НА ОБРАТНИ МУТАЦИИ

1. МЕТОД

Настоящият метод е изцяло подобен на бактериалния тест за обратни мутации на ОИСР TG 471 от 1997 г.

1.1. ВЪВЕДЕНИЕ

Бактериалният тест за обратни мутации използва изискващи аминокиселина щамове на Salmonella typhimurium и на Escherichia coli, за да се открият точкови мутации, състоящи се в заместване, добавяне или делеция на една или няколко ДНК базови двойки (1) (2) (3). Принципът на настоящия бактериален тест за обратни мутации се състои в това, че той открива мутации, които обръщат мутациите, налични в тестваните щамове и възстановяват функционалните способности на бактериите да синтезират основна аминокиселина. Ревертантните бактерии се откриват по способността им да растат при отсъствието на аминокиселина, изисквана от родителския тестван щам.

Точковите мутации са причината за много човешки генетични заболявания и има фактически доказателства, че точковите мутации в онкогени и тумороподтискащи гени на соматични клетки участват в образуването на тумори у хора и експериментални животни. Бактериалният тест за обратни мутации е бърз, евтин и относително лесен за провеждане. Много от тестваните щамове имат няколко характеристики, които ги правят по-чувствителни за откриване на мутации, включително реагиращи секвенции на ДНК в положение на реверсия, повишена клетъчна пропускливост към големи молекули и елиминиране на системи за репарация на ДНК или увеличаването на репарационните процеси на ДНК, при които са възможни грешки. Специфичността на тестваните щамове може да даде полезна информация за типовете мутации, които се индуцират от генотоксични агенти. За бактериалните тестове за обратни мутации съществува огромна база данни с резултати за голямо разнообразие от структури, а също така са разработени и добре установени методологии за тестване на химикали с различни физико-химични свойства, в т.ч. летливи съединения.

Вижте също „Общо въведение“, част Б.

1.2. ДЕФИНИЦИИ

Тест за обратни мутации в Salmonella typhimurium или Escherichia coli открива мутация в нуждаещия се от аминокиселина щам (съответно хистидин или триптофан), за да се получи независим от външна доставка на аминокиселина щам.

Мутагени заместители на основна двойка са агенти, причиняващи основна промяна в ДНК. В реверсивен тест тази промяна може да възникне от страната на първоначалната мутация или от втора страна в бактериалния геном.

Фреймшифт мутагени са агенти, предизвикващи добавянето или делецията на една или повече основни двойки в ДНК, като по този начин се променя четящата рамка в РНК.

1.3. НАЧАЛНИ СЪОБРАЖЕНИЯ

Бактериалният тест за обратни мутации използва прокариотни клетки, които се различават от клетките на бозайниците по фактори като поглъщане, метаболизъм, хромозомна структура и ДНК репарационни процеси. Провежданите тесотве ин витро по принцип изискват използването на екзогенен източник на метаболична активация. Системите ин витро за метаболична активация не могат изцяло да имитират условията ин виво на бозайниците. Следователно тестът не осигурява пряка информация за мутагенната и канцерогенна сила на дадено вещество при бозайници.

Бактериалният тест за обратни мутации обикновено се използва като първоначално откриване на генотоксична дейност, и в частност, на дейност, индуцираща точкова мутация. Обширна база данни е показала, че много химикали, които са положителни при настоящия тест, също проявяват мутагенна активност при други тестове. Има примери за мутагенни агенти, които не се откриват с настоящия тест; причините за тези недостатъци могат да се припишат на специфичното естество на установената крайна точка, разлики в метаболичната активация или разлики в бионаличността. От друга страна, факторите, които подобряват чувствителността на бактериалния тест за обратни мутации могат да доведат до надценяване на мутагенна активност.

Бактериалният тест за обратни мутации може да не е подходящ за оценката на някои класове химични вещества, например някои съединения с високо бактерицидно съдържание (например някои антибиотици) и тези, за които се счита (или се знае), че си взаимодействат конкретно със системата на клетъчна репликация у бозайниците напр. някои инхибитори на топоизомеразата и някои нуклеозидни аналози). В подобни случаи може би по-подходящи са тестовете за мутации при бозайници.

Въпреки че много съединения, които са положителни в настоящия тест, са канцерогени за бозайниците, съответсвието не е абсолютно. То зависи от химичния клас, а има канцерогени, които не се откриват с настоящия тест, тъй като те действат чрез други, негенотоксични механизми или механизми, които не се срещат в бактериалните клетки.

1.4. ПРИНЦИП НА МЕТОДА НА ТЕСТА

Суспензии на бактериални клетки се експонират на въздействието на тестваното вещество с наличие и отсъствие на система за екзогенна метаболична активация. При метода с посяване на блюдо тези суспензии се смесват с пласт от агар и незабавно се посяват в блюдо върху минимална среда. При метода с предварително инкубиране сместа за обработване се инкубира и след това се смесва с пласт от агар преди да се посее в блюдо върху минимална среда. При двата метода след два или три дни инкубация се преброяват ревертантните колонии и се сравняват с броя на спонтанни ревертантни колонии в контролни плочки с разтворител.

Описани са няколко процедури за провеждането на бактериалния тест за обратни мутации. Измежду най-често използваните са методът с посяване в блюдо (1) (2) (3) (4), прединкубационният метод (2) (3) (5) (6) (7) (8), флуктуационният метод (9) (10) и суспензионният метод (11). Описани са и модификации за тестване на газове или пари (12).

Описаните в метода процедури се отнасят главно за метода с посяване в блюдо и прединкубационния метод. Който и да е от тях е приемлив за провеждане на опити, както със, така и без метаболична активация. Някои вещества могат да се открият по-ефикасно като се използва прединкубационния метод. Тези вещества принадлежат към химични класове, включващи алифатни нитрозамини с къси вериги, двувалентни метали, алдехиди, азо багрила и диазо съединения, пиролизидинови алкалоиди, алилни съединения и нитро съединения (3). Признава се също, че някои класове мутагени не винаги се откриват със стандартните процедури като методът на посяване в блюдо или прединкубационния метод. Те трябва да се считат за „специални случаи“ и силно се препоръчва за откриването им да се използват други процедури. Следните „специални случаи“ биха могли да бъдат идентифицирани (заедно с примери за процедурите, които биха могли да се използват за откриването им): азо багрила и диазо съединения (3) (5) (6) (13), газове и летливи химикали (12) (14) (15) (16) и гликозиди (17) (18). Отклонение от стандартната процедура следва да бъде научно обосновано.

1.5. ОПИСАНИЕ НА МЕТОДА НА ТЕСТА

1.5.1. Подготовка

1.5.1.1. Бактерии

Свежи бактериални култури следва да се отглеждат до късната експоненциална или ранна стационарна фаза на растеж (приблизително 109 клетки на ml). Не следва да се използват култури в късна стационарна фаза. От първостепенна важност е културите, използвани в опита, да съдържат висок титър жизнеспособни бактерии. Титърът може да се илюстрира с контролни данни от предишни изследвания за кривите на растежа или във всеки анализ на опита чрез определяне количествата на жизнеспособни клетки чрез експеримент с посев в блюдо.

Препоръчителната температура на инкубация е 37 °C.

Следва да се използват се най-малко пет бактериални щама. Те включват четири щама на Salmonella typhimurium (TA 1535; TA 1537 или TA97a или TA97; TA98; и TA100), които са показали, че са надеждни и репродуктивно реагиращи между лабораториите. Тези четири щама на Salmonella typhimurium имат GC основни двойки на главната реверсивна страна и е известно, че те не биха могли да открият някои оксидиращи мутагени, напречно свързващи се агенти и хидразини. Подобни вещества могат да се открият с щамове на Escherichia coli WP2 или Salmonella typhimurium TA102 (19), които имат AT основна двойка на главната реверсивна страна. Следователно препоръчителната комбинация от щамове е:

—	Salmonella typhimurium TA1535, и

—	Salmonella typhimurium TA1537 или TA97 или TA97a, и

—	Salmonella typhimurium TA98, и

—	Salmonella typhimurium TA100, и

—	Escherichia coli WP2 uvrA, или Escherichia coli WP2 uvrA (pKMl0l), или Salmonella typhimurium TA102.

За да се открият напречно свързващи се мутагени, може би е за предпочитане да се включи TA102 или да се добави щам of Escherichia coli с изобилие от ДНК репарации (напр. Escherichia coli WP2 или Escherichia coli WP2 (pKMl0l)).

Следва да се използват установените процедури за приготвяне на изходна култура, проверка на маркера и съхранение. Следва да се посочи необходимата за растеж аминокиселината за приготвянето на всяка замразена изходна култура (хистидин за щамове на Salmonella typhimurium, и триптофан за щамове на Escherichia coli). По аналогичен начин следва да се проверят други фенотипни характеристики, а именно: наличието или отсъствието на плазмиди на R-фактор, при необходимост (т.е. устойчивост на ампицилин в щамовете TA98, TA100 и TA97a или TA97, WP2 uvrA и WP2 uvrA (pKMlOl), и устойчивост на ампицилин + тетрациклин в щам TA 102); наличието на характерни мутации (т.е. rfa мутация в Salmonella typhimurium чрез чувствителност към кристално виолетово, и uvrA мутация в Escherichia coli или uvrB мутация в Salmonella typhimurium, чрез чувствителност към ултравиолетова светлина) (2) (3). Щамовете следва също така да произвеждат спонтанни ревертантни колонии в блюдо в рамките на честотните обхвати, които се очакват от контролните данни, получени от предишни изследвания в лабораторията и, за предпочитане, в обхвата, описан в литературата.

1.5.1.2. Среда

Използва се подходящ минимален агар (например съдържащ минимална среда Е на Фьогел-Бонер и глюкоза), и пласт от агар, съдържащ хистидин и биотин или триптофан, за да се получат няколко клетъчни деления (1) (2) (9).

1.5.1.3. Метаболична активация

Бактериите трябва да се ескпонират на тестваното вещество, както при наличие, така и при липса на подходяща система за метаболична активация. Най-често използваната система е постмитохондрична фракция (S9) с добавка на ко-фактор, приготвена от черните дробове на гризачи, третирани с ензимно-индуциращи реактиви като Ароклор 1254 (1) (2) или смес от фенобарбитон и β-нафтофлавон (18) (20) (21). Постмитохондричната фракция обичайно се използва с концентрации в обхвата от 5 до 30 % v/v в сместа S9. Изборът и състоянието на системата за метаболична активация може да зависи от класа на тествания химикал. В някои случаи е подходящо да се използва повече от една концентрация на постмитохондрична фракция. За азо багрила и диазо съединения може да е по-подходяща редуцираща система за метаболична активация (6) (13).

1.5.1.4. Тествано вещество/приготвяне

Твърдите вещества за теста следва да се разтворят или суспендират в подходящи разтворители или носители, и, при необходимост, да се разредят преди третиране на клетките. Течните вещества за теста могат да се добавят директно към системите за тестване и/или да разредят преди третиране. Следва да се използват пресни препарати на тестваното вещество, освен ако данните за устойчивостта му не показват, че може да се съхранява.

Не следва да има съмнения за химическа реакция на разтворителя/носителя с тестваното вещество и той следва да е съвместим с оцеляването на бактериите и активността на S9 (22). Ако се използват други освен добре познатите разтворители/носители, включването им в теста следва да се подкрепи от данни за съвместимостта им. Препоръчва се, винаги когато е възможно, първо да се разглежда възможността за прилагането на воден разтворител/носител. При тестването на вещества, нестабилни във вода, използваните органични разтворители не следва да съдържат вода.

1.5.2. Условия за провеждане на теста

1.5.2.1. Тествани щамове (Виж. 1.5.1.1)

1.5.2.2. Концентрация на експозиция

Измежду критериите, които следва да се вземат предвид при определянето на най-високото количество на тестваното вещество са цитотоксичността и разтворимостта в окончателната смес за третиране.

Полезно би било да се определи токсичността и неразтворимостта в предварителен опит. Цитотоксичността може да се открие чрез намаляване на броя на ревертантните колонии, почистване или намаляване на фона, или степента на оцеляване на третираните култури. Цитотоксичността на едно вещество може да се промени в присъствието на системи за метаболична активация. Неразтворимостта следва да се оценява като утаяване в крайната смес при реални условия за провеждане на теста и е видима с просто око.

Препоръчителната максимална тестова концентрация за разтворими нецитотоксични вещества е 5 mg/блюдо или 5μl/блюдо. За нецитотоксични вещества, които не са разтворими при 5 mg/блюдо или 5μl/блюдо, една или повече тествани концентрации следва да са неразтворими в крайната смес за третиране. Тествани вещества, които вече са цитотоксични под 5 mg/блюдо или 5μl/блюдо, следва да се тестват до границата на цитотоксична концентрация. Преципитатът не следва да влияе на отчитането.

Използват се най-малко пет различни, даващи възможност за анализ концентрации на тестваното вещество на приблизително полулогаритмични (i.e. √10) интервали между тестваните точки за начален опит. Могат да бъдат подходящи и по-малки интервали, когато се изследва реакция на концентрация. Тестване над концентрацията от 5 mg/блюдо или 5μl/блюдо може евентуално да се извършва, когато се изследват вещества, съдържащи значителни количества потенциално мутагенни примеси.

1.5.2.3. Отрицателни и положителни контроли

Във връзка с анализа на всеки отделен опит следва да се включват паралелни положителни и отрицателни (разтворител или носител) контроли със специфичен щам, както със, така и без метаболична активация. Следва да се избират положителните контролни концентрации, показващи ефективно провеждане на всеки опит.

За тестове със система за метаболична активация, референтното вещество(а) за положителни контроли се избира въз основа на вида на използваните бактериални щамове.

Следните вещества са примери за подходящи положителни контроли за тестове с метаболична активация:

Вещество	CAS №	Einecs №
9,10-диметилантрацен	781-43-1	212-308-4
7,12-диметилбенз[a]антрацен	57-97-6	200-359-5
бензо[a]пирен	50-32-8	200-028-5
2-аминоантрацен	613-13-8	210-330-9
циклофосфамид	50-18-0	200-015-4
циклофосфамид монохидрат	6055-19-2

Следното вещество е подходяща положителна контрола за метода с редуцираща метаболична активация:

Вещество	CAS №	Einecs №
Конгочервено	573-58-0	209-358-4

Не следва да се използва 2-аминоантрацен като единствен показател за ефикасността на сместа S9. Ако се използва 2-аминоантрацен, всяка партида от S9 следва също да се характеризира с мутаген, изискващ метаболична активация от микрозомни ензими, например, бензо[a]пирен, диметилбензантрацен.

Следните вещества са примери на специфични по щам положителни контроли за тестове без система за екзогенна метаболична активация:

Вещество	CAS №	Einecs №	Щам
натриев азид	26628-22-8	247-852-1	TA 1535 и TA 100
2-нитрофлуорен	607-57-8	210-138-5	TA 98
9-амноакридин	90-45-9	201-995-6	TA 1537, TA 97 и TA 97a
ICR 191	17070-45-0	241-129-4	TA 1537, TA 97 и TA 97a
кумол хидроперокисид	80-15-9	201-254-7	TA 102
митомицин C	50-07-7	200-008-6	WP2 uvrA и TA 102
N-етил-N-нитро-N-нитрозогуанидин	70-25-7	200-730-1	WP2, WP2uvrA и WP2uvrA(pKM101)
4-нитрохинолин-1-оксид	56-57-5	200-281-1	WP2, WP2uvrA и WP2uvrA(pKM101)
фурилфурамид (AF2)	3688-53-7		Щамове, съдържащи плазмид

Могат да се използват други референтни вещества за положителни контроли. За положителна контрола следва да се разглежда използването на химикали, принадлежащи към химичен клас, когато такива са налични.

Следва да бъдат включени отрицателните контроли, състоящи се само от разтворител или носител в средата за третиране, и третирани по същия начин както опитните групи. В допълнение към това следва също да се използват нетретирани контроли, освен ако няма исторически контролни данни от предишни изследвания, показващи, че избраният разтворител не причинява вредни или мутагенни ефекти.

1.5.3. Процедура

При метода на посяване в блюдо (1) (2) (3) (4) без метаболична активация се смесват обичайно 0,05ml или 0,1ml тестовите разтвори, 0,1ml свежа бактериална култура (съдържаща около 10s жизнеспособни клетки) и 0,5ml стерилен буфер с 2,0ml слой от агар. За тест с метаболична активация се смесват обикновено 0,5ml от сместа за метаболична активация, съдържаща адекватно количество постмитохондрична фракция (в границите от 5 до 30 % v/v в сместа за метаболична активация), със слой от агар (2,0ml) заедно а бактериите и тестваното вещество/тестван разтвор. Съдържанието на всяка епруветка се смесва и изсипва върху повърхността на блюдо с минимален агар. Слоят от агар се оставя да се втвърди преди инкубацията.

При прединкубационния метод (2) (3) (5) (6), тестваното вещество/тестван разтвор се инкубира предварително с тествания щам (съдържащ около 108 жизнеспособни клетки) и стерилен буфер или система за метаболична активация (0,5 ml) обичайно за 20 или повече минути при 30—37 °C преди смесването със слоя от агар и изливането върху повърхността на блюдо с минимален агар. Обикновено 0,05 или 0,1ml от тестваното вещество/тестван разтвор, 0,1 ml бактерии и 0,5 ml от S9 или стерилен буфер се смесват с 2,0 ml слой от агар. Епруветките се аерират по време на предварителната инкубация с шейкър.

За адекватна оценка на променливостта при всяко ниво на дозиране се използват по три блюда. Използването на две блюда е приемливо, когато е научно обосновано. Загубата по невнимание на блюдо, не обезсилва опита по необходимост.

Газообразни или летливи вещества се изпитват чрез подходящи методи, като например в запечатани съдовеs (12) (14) (15) (16).

1.5.4. Инкубация

Всички блюда на даден тест се инкубират при 37 °C за 48—72 часа. След инкубационния период се преброяват ревертантните колонии на блюдо.

2. ДАННИ

2.1. ОБРАБОТКА НА РЕЗУЛТАТИТЕ

Данните се представят като брой ревертантни колонии на блюдо. Също се дава броят ревертантни колонии както върху блюдата за отрицателни (контрола на разтворител и нетретирана контрола, ако се използва), така и за положителните контроли. Представят се броя на отделните блюда, средният брой ревертантни колонии на блюдо и стандартното отклонение за тестваното вещество и положителните и отрицателни (третирани и/или разтворител) контроли.

Няма изискване за потвърждаване на явно положителна реакция. Резултатите, които не са категорични, следва да се изяснят с още тестове, като за предпочитане е да се изменят условията на експеримента. Отрицателните резултати следва да се потвърдят за всеки случай поотделно. В случаите, когато не се счита необходимо потвърждаването на отрицателни резултати, следва да се даде обосновка. Изменението на параметрите на изследването с цел разширяване на обхвата на оценяваните условия следва да се вземе под внимание при следващите експерименти. Параметрите на изследването, които биха могли да се променят, включват границите на концентрацията, метода на третиране (посев върху блюдо или течна прединкубация) и условията на метаболична активация.

2.2. ОЦЕНКА И ТЪЛКУВАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ

Има няколко критерия за определяне на положителен резултат, като например увеличение на концентрацията спрямо тествания обхват и/или репродуцируемо увеличение при една или повече концентрации на броя на ревертантни колонии на блюдо в поне един щам с или без система за метаболична активация (23). Първо следва да се разгледа биологичната значимост на резултатите. При оценката на резултатите от теста биха могли да се използват статистически методи (24). Статистическата значимост не следва да е единственият решаващ фактор за положителна реакция.

Тествано вещество, за което резултатите не отговарят на горните критерии, се счита за немутагенно в настоящия тест.

Въпреки че повечето експерименти дават ясно положителни или отрицателни резултати, в редки случаи наборът данни изключва изключва възможността да се направи категорична преценка за активността на тестваното вещество. Резултатите могат да останат двусмислени или под въпрос, независимо от това колко пъти е повторен опитът.

Положителните резултати от бактериалния тест за обратни мутации показват, че веществото индуцира точкови мутации чрез заместване на бази или фреймшифтове в генома на Salmonella typhimurium и/или Escherichia coli. Отрицателните резултати показват, че при условията за провеждане на теста, тестванто вещество не е мутагенно в тествания вид.

3. ДОКЛАДВАНЕ

ДОКЛАД ЗА ТЕСТА

Докладът за теста трябва да включва следната информация:

Разтворител/носител:

—	обосновка за избора на носител,

—	разтворимост и стабилност на тестваното вещество в разтворител/носител, ако са известни.

Щамове:

—	използвани щамове,

—	брой на клетки на култура,

—	характеристики на щама,

Условия за провеждане на теста:

—	количество тествано вещество на блюдо (mg) блюдо или μl/plate) с основна причина за избора на доза и брой на блюдата на концентрация,

—	използвани среди,

—	тип и състав на системата за метаболична активация, в т.ч. критерии за приемливост,

—	процедури на третиране.

Резултати:

—	признаци на токсичност,

—	признаци на утаяване,

—	брой отделни блюда,

—	средният брой на ревертантните колонии на блюдо и стандартно отклонение,

—	взаимоотношение доза-реакция, където е възможно,

—	статистическа оценка, ако има такава,

—	паралелни отрицателни (разтворител/носител) и положителни контролни данни с обхват, средни стойности и стандартни отклонения,

—	отрицателни (разтворител/носител) и положителни контролни данни от предишни изследвания с обхват, средни стойности и стандартни отклонения,

Обсъждане на резултатите.

Заключения.

4. ПОЗОВАВАНИЯ

(1)	Ames, B. N., McCann, J. and Yamasaki E. (1975), Methods of Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian-Microsome Mutagenicity Test, Mutation Res., 31, pp. 347-364.

(2)	Maron, D. M. and Ames, B. N. (1983), Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test, Mutation Res., 113, pp. 173-215.

(3)	Gatehouse, D., Haworth, S., Cebula, T., Gocke, E., Kier, L., Matsushima, T., Melcion, C., Nohmi, T., Venitt, S. and Zeiger, E. (1994), Recommendations for the Performance of Bacterial Mutation Assays, Mutation Res., 312, pp. 217-233.

(4)

Kier, L. D., Brusick D. J., Auletta, A. E., Von Halle, E. S., Brown, M. M., Simmon, V. F., Dunkel, V., McCann, J., Mortelmans, K., Prival, M., Rao, T. K. and Ray V. (1986), The Salmonella typhimurium/Mammalian Microsomal Assay: A Report of the U. S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program, Mutation Res., 168, pp. 69-240.

(5)	Yahagi, T., Degawa, M., Seino, Y. Y., Matsushima, T., Nagao, M., Sugimura, T. and Hashimoto, Y. (1975), Mutagenicity of Carcinogen Azo Dyes and their Derivatives, Cancer Letters 1, pp. 91-96.

(6)	Matsushima, M., Sugimura, T., Nagao, M., Yahagi, T., Shirai, A. and Sawamura, M. (1980), Factors Modulating Mutagenicity Microbial Tests, in: Short-term Test Systems for Detecting Carcinogens, ed. Norpoth K. H. and Garner, R. C., Springer, Berlin-Heidelberg-New York, pp. 273-285.

(7)	Gatehouse, D. G., Rowland, I. R., Wilcox, P., Callender, R. D. and Foster, R. (1980), Bacterial Mutation Assays, in: Basic Mutagenicity Tests: UKEMS Part 1 Revised, ed. D. J. Kirkland, Cambridge University Press, pp. 13-61.

(8)	Aeschacher, H. U., Wolleb, U. and Porchet, L. (1987), Liquid Preincubation Mutagenicity Test for Foods, J. Food Safety, 8, pp. 167-177.

(9)	Green, M. H. L., Muriel, W. J. and Bridges, B. A. (1976), Use of a simplified fluctuation test to detect low levels of mutagens, Mutation Res., 38, pp. 33-42.

(10)	Hubbard, S. A., Green, M. H. L., Gatehouse, D. and Bridges, J. W. (1984), The Fluctuation Test in Bacteria, in: Handbook of Mutagenicity Test Procedures, 2nd Edition, ed. Kilbey, B. J., Legator, M., Nichols, W. and Ramel, C., Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, pp. 141-161.

(11)	Thompson, E. D. and Melampy, P. J. (1981), An Examination of the Quantitative Suspension Assay for Mutagenesis with Strains of Salmonella typhimurium, Environmental Mutagenesis, 3, pp. 453-465.

(12)	Araki, A., Noguchi, T., Kato, F. and Matsushima, T. (1994), Improved Method for Mutagenicity Testing of Gaseous Compounds by Using a Gas Sampling Bag, Mutation Res., 307, pp. 335-344.

(13)	Prival, M. J., Bell, S. J., Mitchell, V. D., Reipert, M. D. and Vaughan, V. L. (1984), Mutagenicity of Benzidine and Benzidine-Congener Dyes and Selected Monoazo Dyes in a Modified Salmonella Assay, Mutation Res., 136, pp. 33-47.

(14)	Zeiger, E., Anderson, B. E., Haworth, S., Lawlor, T. and Mortelmans, K. (1992), Salmonella Mutagenicity Tests. V. Results from the Testing of 311 Chemicals, Environ. Mol. Mutagen., 19, pp. 2-141.

(15)	Simmon, V., Kauhanen, K. and Tardiff, R. G. (1977), Mutagenic Activity of Chemicals Identified in Drinking Water, in Progress in Genetic Toxicology, D. Scott, B. Bridges and F., Sobels (eds.) Elsevier, Amsterdam, pp. 249-258.

(16)	Hughes, T. J., Simmons, D. M., Monteith, I. G. and Claxton, L. D. (1987), Vaporisation Technique to Measure Mutagenic Activity of Volatile Organic Chemicals in the Ames /Salmonella Assay, Environmental Mutagenesis, 9, pp. 421-441.

(17)	Matsushima, T., Matsumoto, A., Shirai, M., Sawamura, M., and Sugimura, T. (1979), Mutagenicity of the Naturally Occurring Carcinogen Cycasin and Synthetic Methylazoxy Methane Conjugates in Salmonella typhimurium, Cancer Res., 39, pp. 3780-3782.

(18)	Tamura, G., Gold, C., Ferro-Luzzi, A. and Ames, B. N. (1980), Fecalase: A Model for Activation of Dietary Glycosides to Mutagens by Intestinal Flora, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, pp. 4961-4965.

(19)	Wilcox, P., Naidoo, A., Wedd, D. J. and Gatehouse, D. G. (1990), Comparison of Salmonella typhimurium TA 102 with Escherichia coli WP2 Tester strains, Mutagenesis, 5, pp. 285-291.

(20)	Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. (1976), A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer or Metabolic Activation Systems, in: In vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, eds. F. J. de Serres et al. Elsevier, North Holland, pp. 85-88.

(21)	Elliot, B. M., Combes, R. D., Elcombe, C. R., Gatehouse, D. G., Gibson, G. G., Mackay, J. M. and Wolf, R. C. (1992), Alternatives to Aroclor 1254-induced S9 in in vitro Genotoxicity Assays, Mutagenesis, 7, pp. 175-177.

(22)	Maron, D., Katzenellenbogen, J. and Ames, B. N. (1981), Compatibility of Organic Solvents with the Salmonella/Microsome Test, Mutation Res., 88, pp. 343-350.

(23)	Claxton, L. D., Allen, J., Auletta, A., Mortelmans, K., Nestmann, E. and Zeiger, E. (1987), Guide for the Salmonella typhimurium/Mammalian Microsome Tests for Bacterial Mutagenicity, Mutation Res., 189, pp. 83-91.

(24)

Mahon, G. A. T., Green, M. H. L., Middleton, B., Mitchel, I., Robinson, W. D. and Tweats, D. J. (1989), Analysis of Data from Microbial Colony Assays, in: UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing, Part II. Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, ed. Kirkland, D. J., Cambridge University Press, pp. 28-65.“

ПРИЛОЖЕНИЕ 4 Д

„Б.17. МУТАГЕННОСТ — ИН ВИТРО ТЕСТ ЗА КЛЕТЪЧНИ ГЕННИ МУТАЦИИ ПРИ БОЗАЙНИЦИ

1. МЕТОД

Настоящият метод е изцяло подобен теста ин витро за клетъчни генни мутации при бозайници на ОИСР TG 476 от 1997 г.

1.1. ВЪВЕДЕНИЕ

Тестът ин витро за клетъчни генни мутации при бозайници може да се използва за откриване на генни мутации, индуцирани от химични вещества. Подходящи клетъчни линии са L5178Y на миши лимфомни клетки, линиите CHO, CHO-AS52 и V79 на клетките на китайски хамстер и TK6 на човешки лимфобластоидни клетки (1). В тези клетъчни линии най-често използваните генетични крайни точки измерват мутацията на киназата на тимидина (TK) и трансферазата на хипокснатин-гуанин фосфорибозил (HPRT), както и трансген от трансферазата на ксантин-гуанин фосфорибозил (XPRT). Тестовете за мутации на TK, HPRT и XPRT откриват различни спектри на генетични събития. Автозомното разполагне на TK и XPRT може да даде възможност за откриването на генетични събития (напр. големи делеции), които не се забелязват на локуса на HPRT върху X хромозоми (2)(3)(4)(5)(6).

В теста ин витро за клетъчни генни мутации при бозайници могат да се използват култури на установени клетъчни линии или клетъчни щамове. Клетките се избират въз основа на способността за растеж в дадена култура и устойчивостта в честотата на спонтанните мутации.

Тестовете ин витро по принцип изискват екзогенен източник на метаболична активация. Тази система за метаболична активация не може изцяло да имитира условията ин виво при бозайниците. Следва да се избягват условия, които биха довели до резултати, неотразяващи присъща мутагенност. Положителни резултати, които не отразяват присъща мутагенност, могат да възникнат от промени в pH, осмотично налягане или високи нива на цитотоксичност (7).

Настоящият тест се използва за откриване на евентуални мутагени и канцерогени. Много съединения, които са положителни в настоящия тест, са канцерогени за бозайници; все пак, няма идеално съответсвие между настоящия тест и канцерогенността. Съответсвието зависи от химичния клас, а има все повече доказателства за това, че съществуват канцерогени, които не се откриват чрез настоящия тест, защото вероятно те действат чрез други, негенотоксични механизми или механизми, отсъстващи в бактериалните клетки(6).

Вижте също „Общо въведение“, част Б.

1.2. ДЕФИНИЦИИ

Мутация в поколението напред: генна мутация от родителския тип на мутанта, от който възниква изменение или загуба на ензимна активност на функцията на кодирания протеин.

Мутагени-заместители на основна двойка: вещества, които причиняват заместване на една или няколко основни двойки в ДНК.

Фреймшифт мутагени: Вещества, които причиняват добавяне или делеция на една или много основни двойки в ДНК молекула.

Време на фенотипно изразяване: период, през който непроменените генни продукти са изчерпани от новомутиралите клетки.

Мутантна честота: броят на наблюдаваните мутантни клетки, разделен на броя на жизнеспособните клетки.

Относителен общ растеж: увеличение в броя на клетките за период време в сравнение контролна популация клетки; изчислен като продукта от суспензионния растеж спрямо в отрицателната контрола, умножен по ефективността (к.п.д.) на клониране спрямо отрицателна контрола.

Относителен суспензионен растеж: увеличение в броя клетките за период на изразяване спрямо отрицателната контрола.

Жизнеспособност: ефективността на клониране на третираните клетки по време на посяването в блюдо в селективни условия след периода на изразяване.

Оцеляване: ефективността на клониране на третираните клетки, когато са посети в блюдо в края на периода на третиране; оцеляването обикновено се изразява по отношение на оцеляването в контролната клетъчна популация.

1.3. ПРИНЦИП НА МЕТОДА НА ТЕСТА

Клетките с дефицит от тимидин киназа (TK) поради мутацията TK+/– —> TK –/– са устойчиви на цитотоскичните ефекти на пиримидиновия аналог трифлуороитимидин (TFT). Клетките с изобилие от тимидин киназа са чувствителни към TFT, което причинява инхибиране на клетъчния метаболизъм и спира по-нататъшното клетъчно деление. Така мутантните клетки са способни да пролиферират в присъствието на TFT, докато нормални клетки, съдържащи тимидин киназа, не са. Аналогично, клетките с дефицит от HPRT или XPRT се избират според устойчивостта им към 6-тиогуанин (TG) или 8-азагуанин (AG). Следва внимателно да се подходи към свойствата на тестваното вещество, ако базов аналог или съединение се тестуват в някой от тестовете за клетъчни генни мутации при бозайници. Например, следва всяка съмнителна селективна токсичност, предизвикана от тестваното вещество за мутантни или немутантни клетки да бъде проучена. Следователно, характеристиките на селекционната система/агент трябва да се потвърдят, когато се тестват химикали, структурно свързани със селективния агент (8).

Клетки в суспензия или еднослойна култура се излагат на тестваното вещество, с и без метаболична активация, за подходящ период от време и се субкултивират, за да се определи цитотоксичността и да се даде възможност за фенотипно изразяване преди селекцията на мутанти (9) (10) (11) (12) (13). Цитотоксичността обикновено се определя чрез измерване на относителната ефективност на клониране (оцеляване) или относителен общ растеж на културите след периода на третиране. Третираните култури се поддържат в среда на растеж за достатъчен период от време, характерен за всеки избран локус и клетъчен тип, за да се осигури почти оптимално фенотипно изразяване на индицираните мутации. Мутантната честота се определя чрез посяване на известни количества клетки в среда, съдържаща селективния агент, за да се открият мутантни клетки, и в среда без селективен агент, за да се определи ефективността на клониране (оцеляване). След подходящ инкубацинен период колониите се преброяват. Мутантната честота се получава от броя на мутантни колонии в селективна среда и броя на колониите в неселективна среда.

1.4. ОПИСАНИЕ НА МЕТОДА НА ТЕСТА

1.4.1 Подготовка

1.4.1.1. Клетки

За настоящия тест има в наличност разнообразни клетъчни типове включително и субклони на L5171Y, CHO, CHO-AS52, V79 или TK6 клетки. Типовете клетки, използвани в настоящия тест, следва да са показали чувствителност към химични мутагени, висока ефективност на клониране и стабилна честота на спонтанни мутации. Клетките следва да се проверят за замърсяване на микоплазмата, и ако са замърсени, не следва да се използват.

Тестът следва да се провежда с предварително определена чувствителност и енергия. Броят клетки, култури и концентрации на тестваното вещество следва да отразяват тези дефинирани параметри (14). Минималният брой жизнеспособни клетки, оцеляващи от третирането и използвани на всеки етап на теста, следва да се базира на честотата на спонтанни мутации. Една принципна насока е да се използва брой клетки, който е равен най-малко на 10 пъти реципрочната стойност на честотата на спонтанни мутации. Все пак, препоръчително е да се използват поне 106 клетки. Следва да има съответстващи данни от предишни изследвания за използваната клетъчна система, които да свидетелстват за последователност при провеждането на теста.

1.4.1.2. Среда и условия за отглеждане на културите

Следва да се използват подходящя хранителна среда и инкубационни условия (носители на културата, температура, концентрация на CO2 и влажност на въздуха). Видовете хранителна среда следва да се подберат в съответствие със селективните системи и типа клетки на теста. Особено важно е условията за отглеждане на културите да се подберат така че да осигуряват оптимален растеж на клетките по време на периода на изразяване и способност за образуване на колонии както за мутантни, така и за немутантни клетки.

1.4.1.3. Приготвяне на културите

Размножават се клетки от изходни култури, посяват се в хранителна среда и се инкубират при 37 °C. Преди употребата им в настоящия тест може да се окаже необходимо културите да се почистят от съществуващи преди това мутантни клетки.

1.4.1.4. Метаболична активация

Клетките следва да се ескпонират на тестваното вещество както в наличието, така и в отсъствието на подходяща система за метаболична активация. Най-често използваната система е постмитохондрична фракция (S9) с добавка на ко-фактор, приготвена от черните дробове на гризачи, третирани с ензимно-индуциращи реактиви като Ароклор 1254 (15) (16) (17) (18) или смес от фенобарбитон и β-нафтофлавон (19) (20).

Постмитохондричната фракция обикновено се използва с концентрации в обхвата от 1—10 % v/v в последната среда на теста. Изборът и състоянието на системата за метаболична активация може да зависи от класа на тествания химикал. В някои случаи би било подходящо да се използва повече от една концентрация на постмитохондрична фракция.

Редица разработки, включително и създаването на генно конструирани клетъчни линии, изразяващи специфични активизиращи ензими, могат да осигурят потенциал за ендогенна активация. Изборът на клетъчни линии за теста следва да е научно обоснован (напр. чрез значението на изоензим цитохром P450 за метаболизма на тестваното вещество).

1.4.1.5. Подготовка на тестваното вещество

Твърдите вещества за теста следва да се разтворят или суспендират в подходящи разтворители или носители, и, ако трябва, да се разредят преди третиране на клетките. Течните вещества за теста могат да се добавят директно или да разредят преди третиране. Следва да се използват пресни препарати на тестваното вещество, освен ако данните за стабилността му не показват, че може да се съхранява.

1.4.2. Условия за провеждане на теста

1.4.2.1. Разтворител/носител

Не следва да съществуват съмнения за химическа реакция на разтворителя/носителя с тестваното вещество и той следва да е съвместим с оцеляването на клетките и активността на S9. Ако се използват други освен добре познатите разтворители/носители, включването им в теста трябва да се подкрепи от данни за съвместимостта им. Препоръчва се, винаги когато е възможно, първо да се разглежда възможността за прилагането на воден разтворител/носител. При тестването на вещества, нестабилни във вода, използваните органични разтворители не следва да съдържат вода. Водата може да се отстрани чрез добавянето на молекулно сито.

1.4.2.2. Концентрации на експозиция

Цитотоксичността следва да се определи със и без метаболична активация в главния експеримент, като се използва подходяща индикация на клетъчната цялост и растеж като относителна ефективност на клониране (оцеляване) или относителен общ растеж. Може би ще е полезно да се определи цитотоксичността и разтворимостта в предварителен експеримент.

Следва да се използват най-малко четири анализируеми концентрации. Там, където се среща цитотоксичност, тези концентрации следва да покриват обхват от максимална до слаба токсичност или липса на токсичност; това обикновено означава, че концентрациите следва да се различават с коефициент не повече от 2 до √10. Ако максималната концентрация е базирана на цитотоксичност, то резултатът следва да е приблизително 10—20 % (но не по-малко от 10 %) относително оцеляване (относителна ефективност на клониране) или относителен общ растеж. За относително нецитотоксични вещества, максималната тестова концентрация следва да е 5 mg/ml, 5 μl/ml, или 1,01 M, в зависимост от това коя е най-ниска.

Относително неразтворимите вещества следва да се тестват до или над границата им на разтворимост при условията на отглеждане на културата. Доказателствата за неразтворимост следва се определят в последната среда на третиране, на която са експонирани клетките. може да бъде да се определи разтворимостта в началото и края на третирането, тъй като тя може да се промени в течение на експонирането в тестваната система поради присъствието на клетки, S9, серум и др. Неразтворимостта може да се установи с просто око. Утайката не следва да пречи на отчитането.

1.4.2.3. Контроли

Паралелни положителни и отрицателни (разтворител или носител) контроли, както със, така и без метаболична активация, следва да се включат във всеки експеримент. Когато се използва метаболична активация, химикалът за положителните контроли следва да е от такъв вид, че да изисква активация, за да произведе мутагенна реакция.

Примерите за положителни контролни вещества включват:

Състояние на метаболична активация	Локус	Вещество	CAS №	Einecs №
Отсъствие на екзогенна метаболична активация	HPRT	етил метансулфонат	62-50-0	200-536-7
	HPRT	етил нитрозокарбамид	759-73-9	212-072-2
	TK (малки и големи колонии)	метил метансулфонат	66-27-3	200-625-0
	XPRT	етил метансулфонат	62-50-0	200-536-7
	XPRT	етил нитрозокарбамид	759-73-9	212-072-2
Наличие на екзогенна метаболична активация	HPRT	3-метилхолантрен	56-49-5	200-276-4
		N-нитрозодиметиламин	62-75-9	200-549-8
		7,12-диметилбензантрацен	57-97-6	200-359-5
	TK (малки и големи колонии)	циклофосфамид	50-18-0	200-015-4
		циклофосфамид монохидрат	6055-19-2
		бензо[a]пирен	50-32-8	200-028-5
		3-метилхолантрен	56-49-5	200-276-5
	XPRT	N-нитрозодиметиламин (за високи нива на S-9)	62-75-9	200-549-8
	XPRT	бензо[a]пирен	50-32-8	200-028-5

Могат да се използват други подходящи референтни вещества за положителни контроли, напр. ако една лаборатория има база данни от предишни изследвания за 5-бромо 2′-деоксиуридин (CAS № 59-14-3, Einecs № 200-415-9), това рефрентно вещество би могло също да се използва. Следва да се има предвид използването на химикали за положителна контрола, принадлежащи към химичен клас, когато такива са налични.

Следва да се включат отрицателните контроли, състоящи се само от разтворител или носител в средата за третиране, и третирани по същия начин както опитните групи. В допълнение към това, следва също да се използват нетретирани контроли, освен ако няма контролни данни от предишни изследвания, показващи, че избраният разтворител не причинява делеционни или мутагенни ефекти.

1.4.3. Процедура

1.4.3.1. Третиране с тестваното вещество

Пролифериращи клетки се експонират на въздействието на тестваното вещество, както със, така и без метаболична активация. Експозицията следва да е за подходящ период от време (обикновено 3—6 часа е ефективен период). Времето на експозиция може да обхване един или повече клетъчни цикли.

За всека тествана концентрация може да се използват две или една третирани култури. Когато се използва по една култура, броят на концентрациите следва да се увеличи, за да се осигури адекватен брой култури за анализ (напр. най-малко осем анализируеми концентрации). Отрицателните (разтворител) контролни култури следва да са две.

Газообразните или летливи вещества следва да се тестват чрез подходящи методи, като например в запечатани носители на културата (21) (22).

1.4.3.2. Измерване на оцеляването, жизнеспособността и честотата на мутантите

В края на периода на експозиция, клетките се промиват и култивират, за да се определи оцеляването и да се даде възможност за изразяване на мутантния фенотип. Измерването на цитотоксичността чрез определяне на относителната ефективност на клониране (оцеляване) или относителния общ растеж на културите обикновено започва след периода на третиране.

Всеки локус изисква точно определено минимално време за почти оптимално изразяване на фенотипа на новоиндуцираните мутанти (HPRT и XPRT изискват поне 6—8 дена, а TK поне два дена). Клетките се отглеждат в среда с и без селективен агент(и) за определяне на бройките мутанти и съответно на ефективността на клониране. Измерването на жизнеспособността (използвано за изчисляване на честотата на мутантите) започва в края на времето на изразяване чрез култивиране в блюдо в неселективна среда.

Ако тестваното вещество е положително в L5178Y TK+/–теста, сортирането на колониите следва да се извърши поне на една от тестваните култури (най-високата положителна концентрация) и на отрицателните и положителни контроли. Ако тестваното вещество е отрицателно в L5178Y TK+/–теста, сортирането на колониите трябва да се извърши на отрицателните и положителни контроли. В изследвания, използващи TK6TK+/– може също да се направи сортиране на колониите.

2. ДАННИ

2.1. ОБРАБОТКА НА РЕЗУЛТАТИТЕ

Данните следва да обхващат цитотоксичността и жизнеспособността, броя на колониите и честотите на мутантите за третираните и контролни култури. В случай на положителна реакция в L5178Y TK+/–теста, колониите се отчитат като се използват критериите за малки и големи колонии при поне една концентрация на тестваното вещество (най-високата положителна концентрация) и на отрицателните и положителни контроли. Молекулното и цитогенетично естество на мутантите, както от големите, така и от малките колонии е изследвано в детайли (23) (24). В TK+/– теста колониите се отчитат с помощта на критериите за колонии с нормален растеж (големи) и бавен растеж (малки) (25). Мутантните клетки, претърпели най-обширното генетично увреждане имат удължен времена за удвояване и поради това образуват малки колонии. Това увреждане типично варира по мащаб от загубите на целия ген до кариотипно видими хромозомни аберации. Индуцирането на мутанти на малки колонии се свързва с химикали, индуциращи едри хромозомни аберации (26). По-малко засегнатите мутантни клетки растат с темпове, подобни на тези на родителските клетки и формират големи колонии.

Следва да се посочи оцеляването (относителни ефективности на клониране) или относителен общ растеж. Честотата на мутантите следва да се изрази като брой на мутиралите клетки спрямо броя на оцеляващите клетки.

Посочват се данните за отделните култури. Освен това, всички данни се резюмират в таблица.

Няма изискване за потвърждаване на ясна положителна реакция. Двузначните резултати следва да се изяснят чрез допълнително тестване, като за предпочитане е да бъдат изменени условията на извършване на опита. Отрицателните резултати следва да се потвърдят за всеки случай поотделно. В случаите, когато не се счита необходимо потвърждаването на отрицателни резултати, трябва да се даде обосновка. Няма изискване за потвърждаване на ясна положителна реакция. Следва да се предвиди изменение в параметрите на изследване, за да се разширят условията, при които се прави оценка, при последващи опити или двузначните или отрицателните резултати. Параметрите на изследването, които биха могли да се изменят, обхващат границите на концентрацията и условията на метаболична активация.

2.2. ОЦЕНКА И ТЪЛКУВАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ

Има няколко критерия за определяне на положителен резултат като например увеличение, свързано с концентрацията, или репродуцируемо увеличение на честотата на мутантите. Първо трябва да се разгледа биологичната значимост на резултатите. При оценката на резултатите от теста биха могли да се използват статистически методи. Статистическата значимост не следва да е единственият решаващ фактор за положителна реакция.

Тествано вещество, за което резултатите не удовлетворяват горните критерии, се счита немутагенно в настоящата система.

Въпреки че повечето опити дават ясно положителни или отрицателни резултати, в редки случаи наборът данни изключва правенето на категорична преценка за активността на тестваното вещество. Резултатите могат да останат двузначни или под въпрос, независимо от това колко пъти е повторен опитът.

Положителните резултати от теста ин витро за клетъчни генни мутации при бозайници показват, че тестваното вещество индуцира генни мутации в използваните в теста култивирани клетки на бозайници. Най-значима е положителната реакция на концентрация, която е репродуцируема. Отрицателните резултати показват, че при условията на теста тестваното вещество не предизвиква генни мутации в използваните в теста култивирани клетки на бозайници.

3. ДОКЛАДВАНЕ

ДОКЛАД ЗА ТЕСТА

Докладът за теста трябва да включва следната информация:

Разтворител/носител:

—	обосновка за избора на носител,

—	разтворимост и стабилност на тестваното вещество в разтворител/носител, ако са известни.

Клетки:

—	тип и източник на клетки,

—	брой клетъчни култури,

—	брой клетъчни пасажи, ако е приложим,

—	методи за поддържане на клетъчна култура, ако е приложим,

—	отсъствие на микоплазма.

Условия за провеждане на теста:

—	основна причина за избора на концентрации и броя на култури, в т.ч. напр. данни за цитотоксичността и граници на разтворимост, ако са налични,

—	състав на средите, CO2 концентрация,

—	концентрация на тестваното вещество,

—	обем на носителя и тестваното вещество сумарно,

—	температура на инкубация,

—	време на инкубация,

—	времетраене на третирането,

—	гъстота на клетките по време на третиране,

—	тип и състав на системата за метаболична активация, в т.ч. критерии за приемливост,

—	положителни и отрицателни контроли,

—	продължителност на периода на изразяване (в т.ч. брой на посетите клетки и субкултури и графици на подхранване, ако са уместни),

—	селективни агенти,

—	критерии за считане на тестовете положителни, отрицателни или двузначни,

—	използвани методи за преброяване на жизнеспособните и мутирали клетки,

—	кои дефиниции за размера и типа на колониите са взети предвид (в т.ч. критерии за „малки“ и „големи“ колонии, както е уместно).

Резултати:

—	признаци на токсичност,

—	признаци на утаяване,

—	данни за pH и осмотичното налягане по време на експозицията към тестваното вещество, ако са определени,

—	размер на колониите, ако са отчетени поне за отрицателни и положителни контроли,

—	адекватност на лабораторията за откриване на мутанти от малки колонии със системата L5178Y TK+/–, когато е уместно,

—	взаимоотношение доза-реакция, където е възможно,

—	статистически анализи, ако има такива,

—	паралелни отрицателни (разтворител/носител) и положителни контролни данни,

—	отрицателни (разтворител/носител) и положителни контролни данни от предишни изследвания с обхвати, средни стойности и стандартни отклонения,

—	честота на мутантите.

Обсъждане на резултатите.

Заключения.

4. ПОЗОВАВАНИЯ

(1)	Moore, M. M., DeMarini, D. M., DeSerres, F. J. and Tindal, K. R. (eds.) (1987), Banbury Report 28; Mammalian Cell Mutagenesis, Cold Spring Harbor Laboratory, New York.

(2)	Chu, E. H. Y. and Malling H. V. (1968), Mammalian Cell Genetics. II. Chemical Induction of Specific Locus Mutations in Chinese Hamster Cells In Vitro, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 61, pp. 1306-1312.

(3)	Liber, H. L. and Thilly, W. G. (1982), Mutation Assay at the Thymidine Kinase Locus in Diploid Human Lymphoblasts, Mutation Res. 94, pp. 467-485.

(4)	Moore, M. M., Harington-Brock, K., Doerr, C. L. and Dearfield, K. L. (1989), Differential Mutant Quantitation at the Mouse Lymphoma TK and CHO HGPRT Loci, Mutagenesis, 4, pp. 394-403.

(5)	Aaron, C. S., and Stankowski, Jr. L. F., (1989), Comparison of the AS52/XPRT and the CHO/HPRT Assays: Evaluation of Six Drug Candidates, Mutation Res. 223, pp. 121-128.

(6)

Aaron, C. S., Bolcsfoldi, G., Glatt, H. R., Moore, M., Nishi, Y., Stankowski, Jr. L. F., Theiss, J. and Thompson, E. (1994), Mammalian Cell Gene Mutation Assays Working Group Report. Report of the International Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Procedures. Mutation Res. 312, pp. 235-239.

(7)	Scott, D., Galloway, S. M., Marshall, R. R., Ishidate, M., Brusick, D., Ashby, J. and Myhr, B. C. (1991), Genotoxicity Under Extreme Culture Conditions. A report from ICPEMC Task Group 9, Mutation Res. 257, pp. 147-204.

(8)	Clive, D., McCuen, R., Spector, J. F. S., Piper, C. and Mavournin, K. H. (1983), Specific Gene Mutations in L5178Y Cells in Culture. A Report of the U. S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program, Mutation Res., 115, pp. 225-251.

(9)

Li, A. P., Gupta, R. S., Heflich, R. H. and Wasson, J. S. (1988), A Review and Analysis of the Chinese Hamster Ovary/Hypoxanthine Guanine Phosphoribosyl Transferase System to Determine the Mutagenicity of Chemical Agents: A Report of Phase III of the U. S. Environmental Protections Agency Gene-Tox Program, Mutation Res., 196, pp. 17-36.

(10)

Li, A. P., Carver, J. H., Choy, W. N., Hsie, A. W., Gupta, R. S., Loveday, K. S., ÓNeill, J. P., Riddle, J. C., Stankowski, L. F. Jr. and Yang, L. L. (1987), A Guide for the Performance of the Chinese Hamster Ovary Cell/Hypoxanthine-Guanine Phosphoribosyl Transferase Gene Mutation Assay, Mutation Res., 189, pp. 135-141.

(11)	Liber, H. L., Yandell, D. W. and Little, J. B. (1989), A Comparison of Mutation Induction at the TK and HPRT Loci in Human Lymphoblastoid Cells: Quantitative Differences are Due to an Additional Class of Mutations at the Autosomal TK Locus, Mutation Res., 216, pp. 9-17.

(12)	Stankowski, L. F. Jr., Tindal,, K. R., and Hsie, A. W. (1986), Quantitative and Molecular Analyses of Ethyl Methanosulphonate — and ICR 191-Induced Molecular Analyses of Ethyl Methanosulphonate — and ICR 191 Induced Mutation in AS52 Cells, Mutation Res., 160, pp. 133-147.

(13)	Turner, N. T., Batson, A. G. and Clive, D. (1984), Procedure for the L5178Y/TK+/– — TK+/– Mouse Lymphoma Cell Mutagenicity Assay, in: Kilbey, B. J. et al (eds.) Handbook of Mutagenicity Test Procedures, Elsevier Science Publishers, New York, pp. 239-268.

(14)	Arlett, C. F., Smith, D. M., Clarke, G. M., Green, M. H. L., Cole, J., McGregor, D. B. and Asquith S. C. (1989), Mammalian Cell Gene Mutation Assays Based upon Colony Formation, in: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Kirkland, D. J., ed., Cambirdge University Press, pp. 66-101.

(15)	Abbondandolo, A., Bonatti, S., Corti, G., Fiorio, R., Loprieno, N. and Mazzaccoro, A. (1977), Induction of 6-Thioguanine-Resistant Mutants in V79 Chinese Hamster Cells by Mouse-Liver Microsome- Activated Dimethylnitrosamine, Mutation Res. 46, pp. 365-373.

(16)	Ames, B. N., McCann, J. and Yamasaki, E. (1975), Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian-Microsome Mutagenicity Test, Mutation Res. 31, pp. 347-364.

(17)	Clive, D., Johnson, K. O., Spector, J. F. S., Batson A. G. and Brown M. M. M. (1979), Validation and Characterisation of the L5178Y/TK+/– — Mouse Lymphoma Mutagen Assay System, Mutat. Res. 59, pp. 61-108.

(18)	Maron, D. M. and Ames, B. N. (1983), Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test, Mutation Res. 113, pp. 173-215.

(19)	Elliott, B. M., Combes, R. D., Elcombe, C. R., Gatehouse, D. G., Gibson, G. G., Mackay, J. M. and Wolf, R. C. (1992), Alternatives to Aroclor 1254-Induced S9 in: In Vitro Genotoxicity Assays, Mutagenesis 7, pp. 175-177.

(20)

Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. (1976), A Safe Substitute for Polycholrinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems, in: In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, de Serres, F. J., Fouts, J. R., Bend, J. R. and Philpot, R. M. (eds), Elsevier, North-Holland, pp. 85-88.

(21)	Krahn, D. F., Barsky, F. C. and McCooey, K. T. (1982), CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids, in: Ticc, R. R., Costa, D. L., Schaich, K. M. (eds), Genotoxic Effects of Airborne Agents, New York, Plenum, pp. 91-103.

(22)	Zamora, P. O., Benson, J. M., Li, A. P. and Brooks, A. L. (1983), Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown on Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in the CHO/HGPRT Mutation Assay, Environmental Mutagenesis, 5, pp. 795-801.

(23)	Applegate, M. L., Moore, M. M., Broder, C. B., Burrell, A. and Hozier, J. C. (1990), Molecular Dissection of Mutations at the Heterozygous Thymidine Kinase Locus in Mouse Lymphoma Cells, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, pp. 51-55.

(24)	Moore, M. M., Clive, D. Hozier, J. C., Howard, B. E., Batson, A. G., Turner, N. T. and Sawyer, J. (1985), Analysis of Trifluoronthymidine, Resistant (TFT+) Mutants of L5178Y/TK+/– — Mouse Lymphoma Cells, Mutation Res. 151, pp. 161-174.

(25)	Yandell, D. W., Dryja, T. P. and Little, J. B. (1990), Molecular Genetic Analysis of Recessive Mutations at a Heterozygous Autosomal Locus in Human Cells, Mutation Res. 229, pp. 89-102.

(26)	Moore, M. M. and Doerr, C. L. (1990), Comparison of Chromosome Aberration Frequency and Small Colony TK-Deficient Mutant Frequency in L5178Y/TK+/– — 3.7.2C Mouse Lymphoma Cells, Mutagenesis, 5, pp. 609-614.“

ПРИЛОЖЕНИЕ 4Е

„Б.23. ТЕСТ ЗА СПЕРМАТОГОНИАЛНИ ХРОМОЗОМНИ АБЕРАЦИИ ПРИ БОЗАЙНИЦИ

1. МЕТОД

Настоящият метод е изцяло подобен на теста за сперматогониални хромозомни аберации при бозайници на ОИСР TG 483 от 1997 г.

1.1. ВЪВЕДЕНИЕ

Целта на теста ин виво за сперматогониални хромозомни аберации при бозайници е да се идентифицират веществата, причиняващи структурни хромозомни аберации в сперматогониалните клетки на бозайници (1) (2) (3) (4) (5). Структурните аберации могат да бъдат два типа: хромозомни и хроматидни. При повечето химични мутагени индуцираните аберации са от хроматиден тип, но се срещат също и аберации от хоромозомен тип. Настоящият метод не е предназначен да измерва геномни аберации и не се използва обикновено за тази цел. Хромозомните мутации и свързаните с тях събития са причината за много генетични болести при човека

Настоящият тест измерва хромозомните събития в сперматогониалните зародишни клетки и следователно от него се очаква да предсказва индуцирането на унаследяеми мутации в зародишни клетки.

В настоящия тест се използват обикновено гризачи. Този цитогенетичен тест ин виво открива хромозомни аберации в сперматогониални митози. Други прицелни клетки на са обект на настоящия метод.

За да се открият аберации от хроматиден тип в сперматогониални клетки, следва да се изследва първото митотично клетъчно деление след третиране преди тези увреждания да се загубят в следващите клетъчни деления. Допълнителна информация от третирани сперматогониални стволови клетки може да се получи чрез мейотичен хромозомен анализ за аберации от хромозомен тип на диакинезисна метафаза I, когато третираните клетки стават сперматоцити.

Настоящият тест ин виво е предназначен да изследва дали мутагените на соматични клетки са също така активни в зародишни клетки. Освен това сперматогониалният тест е от значение за оценката на опасността от с това, че позволява разглеждането на фактори като ин виво метаболизма, фармакокинетиката и процесите на ДНК репарация.

В тестиса съществува редица генерации сперматогони със спектър на чувствителност към химично третиране. Следователно, откритите аберации представляват съвкупна реакция на третираните популации сперматогониални клетки, като преобладаващи са по-многобройните диференцирани сперматогониални клетки. В зависимост от положението им в границите на тестиса, различните генерации сперматогони биха могли или не да бъдат експонирани на общото кръвообращение поради физическата и физиологична клетъчна бариера на Сертоли и бариерата кръв-тестис.

Ако има доказателства, че тестваното вещество или реактивен метаболит няма да достигнат до прицелната тъкан, не е подходящо да се използва настоящият тест.

Вижте също „Общо въведение“, част Б.

1.2. ДЕФИНИЦИИ

Хроматиден тип аберация: структурно увреждане на хромозомата, изразяващо се в скъсване на единични хроматиди или скъсване и повторно съединяване между хроматиди.

Хромозомен тип аберация: структурно увреждане на хромозомата, изразяващо се в скъсване, или скъсване и повторно съединяване на двата хроматида на една и съща страна.

Ендоредупликация: процес, при които след период S на ДНК репликация ядрото не навлиза в митоза, а започва друг S период. Резултатът е хромозоми с 4, 8, 16,… хроматиди.: Празнина: ахроматично увреждане, по-малко от ширината на един хроматид с минимално отклонение в реда на хроматида-(ите).

Геномна аберация: промяна в броя на хромозоми в сравнение с нормалния брой, характерен за използваните животни.

Полиплоидия: множимо на хаплоидния брой хромозоми (n), различно от диплоидния брой (т.е. 3n, 4n, и т.н.).

Структурна аберация: промяна в хромозомната структура, откриваема чрез наблюдение с микроскоп на етапа на метафаза на клетъчното деление, наблюдавана като делеции и фрагменти, вътрешнохромозомни или междухромозомни промени.

1.3. ПРИНЦИП НА МЕТОДА НА ТЕСТА

Животни се експонират на тестваното вещество по подходящ начин и се убиват в подходящи моменти след третирането. Преди убиването, животните се третират с блокиращ метафазата агент (например колхицин или Колцемид®). След това се приготвя хромозомен препарат от клетки на зародиш, оцветява се и клетките в метафаза се анализират за хромозомни аберации.

1.4. ОПИСАНИЕ НА МЕТОДА НА ТЕСТА

1.4.1. Подготовка

1.4.1.1. Подбор на животинския вид

Мъжките китайски хамстери и мишки са общо използваните. Обаче, мъжки индивиди от и друг подходящ вид бозайници биха могли да се използват. За теста следва да се вземат общо използваните лабораторни щамове на млади, здрави, пораснали животни. В началото на изследването, вариациите в теглото на животните следва да са минимални и да не превишават ± 20 % от средното тегло.

1.4.1.2. Условия на отглеждане и хранене

Прилагат се общите условия в Общото въведение към част Б, въпреки че целта е влажността на въздуха да е 50—60 %.

1.4.1.3. Подготовка на животните

Здрави, млади, пораснали животни от мъжки пол се отделят на произволен принцип за контролните и опитни групи. Клетките трябва да се подредят така че да се намалят до минимум евентуалните ефекти от разполагането им. На животните се дава уникална идентифакация. Животните се аклиматизират към лабораторните условия поне пет дена преди началото на изследването.

1.4.1.4. Приготвяне на дози

Твърдите вещества за теста следва да се разтворят или суспендират в подходящи разтворители или носители, и, ако трябва, да се разредят преди даване на дозата на животните. Течните вещества за теста могат да се дават директно или да разредят преди дозиране. Следва да се използват пресни препарати на тестваното вещество, освен ако данните за стабилността му не показват, че може да се съхранява.

1.4.2. Условия за провеждане на теста

1.4.2.1 Разтворител/носител

Разтворителят/носителят не следва да има токсично въздействие с използваните нива на дозиране, а също така не следва да има съмнения за химическа реакция между него и тестваното вещество. Ако се използват други, освен добре познатите разтворители/носители, включването им в теста следва да се подкрепи от данни за съвместимостта им. Препоръчва се, винаги когато е възможно, първо да се разглежда възможността за прилагането на воден разтворител/носител.

1.4.2.2. Контроли

Във всеки тест следва да се включват паралелни положителни и отрицателни (разтворител/носител) контроли. Като се изключи третирането с тестваното вещество, с животните в контролните групи следва да се борави по един и същи начин, както с животните от опитните групи.

Положителните контроли следва да произвеждат структурни хромозомни аберации ин виво в сперматогониални клетки, когато се администрират при нива на експозиция, при които се очаква да се постигне забележимо увеличение спрямо фона.

Положителните контролни дози следва да са така избрани, че ефектите да са ясни, но да не разкриват непосредствено на четеца идентичността на кодираните предметни стъкла. Приемливо е положителните контроли, да се администрират по различен начин от тестваното вещество и да им се взема проба само еднократно. Освен това, за положителна контрола трябва да се разглежда използването на химикали, принадлежащи към химичен клас, когато такива са налични. Примерите за положителни контролни вещества включват:

Вещество	CAS №	Einecs №
циклофосфамид	50-18-0	200-015-4
циклофосфамид монохидрат	6055-19-2
циклохексамин	108-91-8	203-629-0
митомицин C	50-07-7	200-008-6
акриламид мономер	79-06-1	201-173-7
триетиленмеламин	51-18-3	200-083-5

За всяко вземане на проби следва да се включват отрицателните контроли, третирани само с разтворител или носител, а за всички останали неща третирани както опитните групи, освен ако няма приемлива изменчивост между животните и честотите на клетки хромозомни аберации са доказани с исторически контролни данни от предишни изследвания. Освен това, следва също да се използват нетретирани контроли, освен ако няма данни от предишни контролни изследвания или публикувани контролни данни, пказващи, че няма никакви делеционни или мутагенни ефекти, индуцирани от избрания разтворител/носител.

1.5. ПРОЦЕДУРА

1.5.1 Брой на животните

Всяка опитана и контролна група трябва да включва най-малко пет анализируеми мъжки животни.

1.5.2. График на третиране

За предпочитане е тестваните вещества да се администрират веднъж или два пъти (т.е. като еднократно или две третирания). Тестваните вещества могат също да администрират като разделена доза, т.е. две третирания в един и същи ден, разделени от не повече от няколко часа, за да се улесни даването на голям обем материал. Други режими на дозиране следва да се обосноват научно.

В групата с най-висока доза проби се вземат два пъти след третирането. Тъй като кинетиката на клетъчния цикъл може да се повлияе от тестваното вещество, практикува се едно ранно и едно късно вземане на проба около 24 и 48 часа след третирането. За дози, различни от най-високата, проба се взема на 24 часа или 1,5 пъти продължителността на клетъчния цикъл, освен ако не е известно друго време за вземане на проба, по-подходящо за откриване на ефектите (6).

Осен това, могат да се използват други времена на вземане на проби. Например, когато се използват химикали, които могат да индуцират хромозомно изоставане или могат да предизвикат S-независими ефекти, по-ранните периоди на вземане проби могат да бъдат по-подходящи (1).

Доколко е уместно използването на повторен график на третиране следва да се идентифицира за всеки случай поотделно. След повторен график на третиране животните следва да бъдат убити след 24 часа (1,5 пъти от продължителността на клетъчния цикъл) след последното третиране.При необходимост, могат да се прилагат допълнителни периоди на вземане нa проби.

Преди убиването животните се инжектират интраперитонеално с подходящо блокиращо метафазата вещество (например Колцемид® или колхицин). След това, след подходящ интервал от животните се взема проба. За мишки този интервал е приблизително 3—5 часа, за китайски хамстери той е около 4—5 часа.

1.5.3. Нива на дозиране

Вещества със специфични биологични активности при ниски, нетоксични дози (като хормони и митогени) могат да бъдат изключения за критериите за опрeделяне на дозата и трябва да се оценяват за всеки конкретен случай. Най-високата доза може също да се дефинира като доза, която показва известни признаци на токсичност в сперматогониалните клетки (напр. намаляване на съотношението на сперматогониални митози спрямо първата и втора метафаза на клетъчното деление, това намаляване не следва да надвишава 50 %).

1.5.4. Граничен тест

Ако тест с едно ниво на дозиране от минимум 2 000 mg/kg телесно тегло/ден при еднократно третиране или две третирания в един и същи ден, не дава забележими токсични ефекти, а генотоксичност не би могла да се очаква на базата на данни от структурно свързани вещества, то тогава пълно изследване с три нива на дозиране може да не се счита за необходимо. Очакваната експозиция на хора може да покаже, че е необходимо в граничния тест да се използва по-високо ниво на дозиране.

1.5.5. Администриране на дозите

Тестваното вещество обикновено се дава със стомашна сонда като се използва тръба или подходяща интубационна канюла, или чрез интраперитонална инжекция. Други начини на експозиция са приемливи, ако могат да бъдат обосновани. Максималният обем течност, който може да се вкара еднократно със стомашна сонда или инжекция зависи от големината на опитното животно. Обемът не следва да превишава 2ml/100g телесно тегло. Обеми, по-високите от тези, трябва да се обосноват. С изключение на дразнещи или корозивни вещества, които нормално дават изострящи ефекти при по-високи концентрации, променливостта на тестовия обем следва да се сведе до минимум чрез регулиране на концентрацията с цел осигуряване на постоянен обем на всички нива на дозиране.

1.5.6. Подготовка на хромозомите

Незабавно след убиване на животните от един или двата тестиса се приготвят клетъчни суспензии, експонират се на хипотоночен разтвор и се фиксират. Клетките се разнасят по предметни стъкла и се оцветяват.

1.5.7. Анализ

За всяко животно следва да се анализират най-малко 100 добре разнесени метафази (т.е. минимум 500 метафази на група). Този брой може да се намали, когато се наблюдават голям брой аберации. Всички предметни стъкла, включително и тези на положителни и отрицателни контроли, следва да се кодират независимо едно от друго преди микроскопския анализ. Тъй като процедурите по фиксиране водят до разкъсване на част от метафазите със загуба на хромозоми, отчетените клетки следва да съдържат известен брой центромери, равни на броя 2n ± 2.

2. ДАННИ

2.1. ОБРАБОТКА НА РЕЗУЛТАТИТЕ

Индивидуалните данни за животните следва да се представят в таблица. Експерименталната единица е животното. За всяко изследвано животно отделно се оценява броя клетки със структурни хромозомни аберации и хромозомни аберации на клетка. Следва да се попоказват различните типове структурни хромозомни аберации с броя и честотота им за опитните и контролните групи. Празнините се записват отделно и докладват, но принципно не се включват в общата честота на аберациите.

Ако се наблюдава митоза, както и мейоза, следва да се определи съотношението на сперматогониалните митози спрямо първата и втора мейотични метафази като мярка за цитотоксичността за всички опитни животни и тези от отрицателните контроли в обща проба от 100 делящи клетки на животно, за да се установи евентуален цитотоксичен ефект. Ако се наблюдава само митоза, митозният индекс следва да се определи в минимум 1 000 клетки за всяко животно.

2.2. ОЦЕНКА И ТЪЛКУВАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ

Има няколко критерия за определяне на положителен резултат, като свързано с дозата увеличение в броя клетки хромозомни аберации илиявно увеличение в броя на клетки с аберации при еднократна доза и еднократно вземане на проба. Първо следва да се вземе предвид биологичната значимост на резултатите. При оценката на резултатите от теста като помощно средство е възможно използването на статистически методи (8). Статистическата значимост не следва да е единственият решаващ фактор за положителна реакция. Двузначните резултати следва да се изяснят чрез допълнителни тестове, като за предпочитане е да се изменят условията на експеримента.

Тествано вещество, за което резултатите не удовлетворяват горните критерии, се счита немутагенно в настоящия тест.

Положителните резултати от теста ин виво за сперматогониални хромозомни аберации показват, че тестваното вещество индуцира структурни хромозомни аберации в зародишните клетки на тествания вид. Отрицателните резултати показват, че при условията за провеждане на теста, че тестваното вещество не индуцира хромозомни аберации в зародишните клетки на тествания вид.

Следва да се обсъди вероятността тестваното вещество или метаболитите му да достигнат тъканта, която е обект на изследването.

3. ДОКЛАДВАНЕ

ДОКЛАД ЗА ТЕСТА

Докладът за теста трябва да включва следната информация:

Разтворител/носител:

—	обосновка за избора на носител,

—	разтворимост и стабилност на тестваното вещество в разтворител/носител, ако са известни.

Опитни животни:

—

вид/щам,

—	брой и възраст на животните,

—	източник, условия на отглеждане, начин на хранене и др.

—	индивидуално тегло на животните в началото на теста, в т.ч. обхват на телесното тегло, средни стойности и стандартно отклонение за всяка група.

Условия за провеждане на теста:

—	основна причина за определяне времето на убиване на животните,

—	данни от изследването за установяване на обхват, ако е проведено,

—	основна причина за избора на нивото на дозата,

—	подробности за приготвянето на тестваното вещество,

—	подробности за администрирането тестваното вещество,

—	основна причина за определяне на момента на убиване на животните

—	преминаване от концентрация (ppm) на тестваното вещество в храната/питейната вода към действителната доза (mg/kg телесно тегло), ако е приложимо,

—	подробности за качеството на храната и водата,

—	подробно описание на графиците на третиране и вземане на проби,

—	методи на измерване на токсичността,

—	идентичност на блокиращото метафазата вещество, концентрация и времетраене на третирането,

—	методи на приготвяне на предметно стъкло,

—	критерии за отчитане на аберации,

—	брой анализирани клетки/животно,

—	критерии за считане н изследванията положителни, отрицателни или двусмислени.

Резултати:

—	признаци на токсичност,

—	митотичен индекс,

—	съотношение на сперматогониалните митозни клетки към първата и втора мейотична метафаза,

—	тип и брой на аберациите, дадени отделно за всяко животно,

—	общ брой аберации на група,

—	брой на клетки с аберации на група,

—	взаимоотношение доза-реакция, където е възможно,

—	статистически анализи, ако има такива,

—	паралелни отрицателни контролни данни,

—	отрицателни контролни данни от предишни изследвания с обхвати, средни стойности и стандартни отклонения,

—	паралелни положителни контролни данни,

—	промени в плоидията, ако се забелязват.

Обсъждане на резултатите.

Заключения.

4. ПОЗОВАВАНИЯ

(1)

Adler, I. D., (1986), Clastogenic Potential in Mouse Spermatogonia of Chemical Mutagens Related to their Cell-Cycle Specifications, in: Genetic Toxicology of Environmental Chemicals, Part B: Genetic Effects and Applied Mutagenesis, Ramel, C., Lambert, B. and Magnusson, J. (eds) Liss, New York, pp. 477-484.

(2)	Adler, I. D., (1984), Cytogenetic tests in Mammals, in: Mutagenicity Testing: a Practical Approach, (ed.) S. Venitt and J. M. Parry, IRL Press, Oxford, Washington DC, pp. 275-306.

(3)	Evans, E. P., Breckon, G. and Ford, C. E. (1964), An Air-drying Method for Meiotic Preparations from Mammalian Testes, Cytogenetics and Cell Genetics, 3, pp. 289-294.

(4)

Richold, M., Ashby, J., Chandley, A., Gatehouse, D. G. and Henderson, L. (1990), In Vivo Cytogenetic Assays, in: D. J. Kirkland (ed.), Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Subcommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report. Part I revised, Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 115-141.

(5)	Yamamoto, K. and Kikuchi, Y. (1978), A New Method for Preparation of Mammalian Spermatogonial Chromosomes, Mutation Res., 52, pp. 207-209.

(6)	Adler, I. D., Shelby M. D., Bootman, J., Favor, J., Generoso, W., Pacchierotti, F., Shibuya, T. and Tanaka N. (1994), International Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Procedures. Summary Report of the Working Group on Mammalian Germ Cell Tests, Mutation Res., 312, pp. 313-318.

(7)

(8)

Lovell, D. P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G. E., Clarc, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D. G. and Savage J. R. K. (1989), Statistical Analysis of In Vivo Cytogenetic Assays, in: D. J. Kirkland (ed.), Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. UKEMS Subcommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing, report, Part III. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 184-232.“

ПРИЛОЖЕНИЕ 4Ж

„Б.39. ТЕСТ ЗА НЕРЕПАРАТИВЕН СИНТЕЗ НА ДНК (НСД) С ЧЕРНОДРОБНИ КЛЕТКИ ОТ БОЗАЙНИЦИ ИН ВИВО

1. МЕТОД

Настоящият метод е изцяло подобен на теста за нерепаративен синтез на ДНК (НСД) с чернодробни клетки от бозайници ин виво на ОИСР TG 486 от 1997 г.

1.1 ВЪВЕДЕНИЕ

Целта на теста за нерепаративен синтез на ДНК (НСД) с чернодробни клетки от бозайници ин виво е да се идентифицират тествани вещества, които индуцират репарация на ДНК в чернодробните клетки на третираните животни (1) (2) (3) (4).

Настоящият ин виво тест осигурява метод за изследване на генотоксичните ефекти на химикали в черния дроб. Измерената крайна точка показва увреждане на ДНК и последваща репарация в чернодробни клетки. По принцип черният дроб е главната площадка на метаболизма на абсорбираните съединения. Ето защо той е подходящото място за измерване на увреждане на ДНК ин виво.

Ако има доказателства, че тестваното вещество няма да достигне тъкан, която е обект на изследването, не е уместно да се използва настоящия тест.

Крайната точка на нерепаративния синтез на ДНК (НСД) се измерва чрез определяне на поглъщането на радиоактивно маркирани нуклеозиди в клетки, които не претърпяват репаративен синтез на ДНК (S-фаза). Най-широко използваният способ е определянето на поглъщането на маркирания с тритий тимидин (3H-TdR) чрез авторадиография. За НСД тестове ин виво се предпочита черен дроб на плъхове. Освен черен дроб могат да се използват други тъкани, но те не са обект на настоящия метод.

Откриването на НСД реакция зависи от ДНК базите, изрязани и заместени от страната на увреждането. Следователно тест НСД е особено ценен за откриване на „репарация с дълги парчета“ (20 до 30 бази), индуцирана от вещество. И обратното, „репарация с къси парчета“ (една до три бази) се открива с много по-ниска чувствителност. Освен това, мутагенните събития могат да се случат поради липса на репарация, погрешна репарация или погрешна репликация на ДНК поражения.Степента на НСД реакция изобщо не показва надеждността на процеса на репарация. В допълнение на това възможно е мутаген да реагира с ДНК, но увреждането на ДНК не се коригира чрез процеса на ексцизионна репарация. Липсата на конкретна информация за мутагенната акивност от НСД теста се компенсира от потенциалната чувствителност на тази крайна точка, тъй като се измерва в целия геном.

Вижте също „Общо въведение“, част Б.

1.2. ДЕФИНИЦИИ

Клетки в репарация: нето ядрено зрънце (НЯЗ), по-голямо от предварително определена стойност, която се доказва в лабораторията, провеждаща теста.

Нето ядрени зрънца (НЯЗ): количествена мярка за НСД активност на клетки авторадиографни НСД тестове, изчислявана чрез изваждане на средния брой of цитоплазмени зрънца на цитоплазмени зони, еквивалентни на ядрото (ЦЗ), от броя на ядрени зрънца (ЯЗ): НЯЗ = ЯЗ - ЦЗ. НЯЗ количества се изчисляват за отделните клетки и след това се групират за клетките в култура, паралелни култури и др.

Нерепаративен синтез на ДНК (НСД): ДНК репаративен синтез след ексцизията и отстраняването на участък от ДНК, съдържащ област на увреждане, индуцирано от химични вещества или физически агенти.

1.3. ПРИНЦИП НА МЕТОДА НА ТЕСТА

НСД тестът ин виво с чернодробни клетки от бозайници показва ДНК репаративен синтез след ексцизията и отстраняването на участък от ДНК, съдържащ област на увреждане, индуцирано от химични вещества или физически агенти. Обикновено тестът се базира на включването на 3H-TdR в ДНК на чернодробни клетки, които имат ниска честота на клетки в S-фазата на клетъчния цикъл. Поглъщането на 3H-TdR обикновено се определя чрез авторадиография, тъй като този способ не е чувствителен към интерференция от страна на клетки в S-фаза, както например течното сцинтилационно броене.

1.4. ОПИСАНИЕ НА МЕТОДА

1.4.1. Подготовка

1.4.1.1. Избор на животински вид

Най-често се използват плъхове, въпреки че всеки подходящ вид от бозайници може да се използва. Следва да се вземат общо използваните лабораторни щамове на млади, здрави, пораснали животни. В началото на изследването вариациите в теглото на животните следва да е минимално и да не превишават ± 20 % от средното тегло на всеки пол.

1.4.1.2. Условия на отглеждане и хранене

Прилагат се общите условия в Общото въведение към Част Б, въпреки че целта е влажността на въздуха да е 50 до 60 %.

1.4.1.3. Подготовка на животните

Здрави, млади, пораснали животни се определят на произволен принцип за контролните и опитни групи. Клетките следва да се подредят така че да се намалят до минимум евентуалните ефекти от разполагането им. На животните се дава уникална идентифакация и се държат в клетките поне пет дни преди началото на изследването, за да се аклиматизират към лабораторните условия.

1.4.1.3. Тествано вещество/приготвяне

Твърдите вещества за теста следва да се разтворят или суспендират в подходящи разтворители или носители, и, ако е необходимо, да се разредят преди даване на дозата на животните. Течните вещества за теста могат да се дават директно или да разредят преди дозиране. Следва да се използват пресни препарати на тестваното вещество, освен ако данните за стабилността му не показват, че може да се съхранява.

1.4.2. Условия за провеждане на теста

1.4.2.1. Разтворител/носител

Разтворителят/носителят не трябва да има токсично въздействие с използваните нива на дозиране, а също така не трябва да има съмнения за химическа реакция между него и тестваното вещество. Ако се използват други, освен добре познатите разтворители/носители, включването им в теста следва да се подкрепи от данни за съвместимостта им. Препоръчва се, винаги когато е възможно, първо да се разглежда възможността за прилагането на воден разтворител/носител.

1.4.2.2. Контроли

Паралелни положителни и отрицателни контроли (разтворител/носител) следва да се включат във всяка отделно провеждана част от експеримента. С изключение на третирането с тестваното вещество, с животните в контролните групи следва да борави по същия начин, както с животните от опитните групи.

Положителните контроли следва да са вещества, за които се знае, че генерират НСД, когато се администрират на нива на експозиция, от които се очаква да се получи забележимо увеличение спрямо общия фон. Положителните контроли, които имат нужда от метаболична активация, следва да се използват с дози, предизвикващи умерена реакция (4). Дозите могат да са така избрани, че ефектите да са ясни, но да не разкриват непосредствено на четеца идентичността на кодираните предметни стъкла. Примерите за положителни контролни вещества включват:

Времетраене на вземането на проби	Вещество	CAS №	Einecs №
Ранни (2—4 часа)	N-нитрозодиметиламин	62-75-9	200-249-8
Късни (12—16 часа)	N-2-флуоренилацетамид (2-AAF)	53-96-3	200-188-6

Могат да се използват други подходящи положителни контролни вещества. Приемливо е положителните контроли да се администрират по начин, различен от тестваното вещество.

1.5. ПРОЦЕДУРА

1.5.1. Брой и пол на животните

Следва да се използва адекватен брой животни, за да се вземе предвид естественото биологично вариране на реакцията към теста. Броят на животните следва да е минимум три анализируеми животни на група. Когато има натрупана значителна база данни от предишни изследвания, за паралелните отрицателни и положителни контролни групи се изисква само едно или две животни.

Ако в момента на изследването има налични данни от изследвания, поведени със същия вид и със същия начин на експозиция, показващи, че няма съществени разлики по отношение токсичността между половете, тогава тестването на един пол, за предпочитане мъжки, е достатъчно. Когато експозицията на хора към химикали може да е специфична в зависимост от пола, като например към някои фармацевтични агенти, тестът следва да се проведе с животни от подходящия пол.

1.5.2 График на третиране

Тестваните вещества по принцип се администрират като едноктартно третиране.

1.5.3. Нива на дозиране

Нормално се използват две нива на дозиране. Най-високата доза се дефинира като доза, създаваща признаци на такава токсичност, че от по-високи нива на дозиране, базирани на същия режим, би могло да се очаква да доведат до леталност. По принцип по-ниската доза трябва да бъде от 50 % до 25 % от високата доза.

Вещества със специфични биологични активности при ниски, нетоксични дози (като хормони и митогени) могат да бъдат изключения от критериите за опрeделяне на дозата и следва да се оценяват за всеки конкретен случай. Ако се извършва изследване за обхват поради това, че няма подходящи данни в наличност, то трябва да е в същата лаборатория, като се използва същия вид, щам, пол и режим на третиране, както в главното изследване.

Най-високата доза може също да се дефинира като доза, показваща известни признаци на токсичност в черния дроб (напр. пикнотични ядра).

1.5.4. Граничен тест

Ако тест с едно ниво на дозиране от минимум 2 000 mg/kg телесно тегло при еднократно третиране или две третирания в един и същи ден, не дава забележими токсични ефекти, а не би могла да се очаква генотоксичност на базата на данни от структурно свързани вещества, то тогава пълно изследване може да не се счита за необходимо. Очакваната експозиция на хора може да покаже нобходимост в граничния тест да се използва по-високо ниво на дозиране.

1.5.5. Администриране на дозите

Тестваното вещество обикновено се дава със стомашна сонда като се използва тръба или подходяща интубационна канюла. Други начини на експозиция са приемливи, ако могат да бъдат обосновани. Все пак, интраперитонеалният път не се препоръчва, тъй като той би изложил черния дроб директно на въздействието на тестваното вещество, а не през системата на кръвообращението. Максималният обем течност, който може да се вкара еднократно със стомашна сонда или инжекция зависи от големината на опитното животно. Обемът не трябва да превишава 2ml/100g телесно тегло. Обеми, по-високите от тези, трябва да се обосноват. С изключение на дразнещи или корозивни вещества, които нормално дават изострящи ефекти при по-високи концентрации, променливостта на тестовия обем следва да се сведе до минимум чрез регулиране на концентрацията с цел осигуряване на постоянен обем на всички нива на дозиране.

1.5.6. Подготовка на чернодробните клетки

Чернодробните клетки се подготвят от третирани животни нормално от 12 до 16 часа след дозиране. По принцип необходимо е по-ранно вземане на проба (нормално от два до четири часа след третиране), освен ако няма ясна положителна реакция на 12 до 16 часа. Все пак, може да се практикува вземане на проби и по друго време, когато това е обосновано на базата на токсикокинетични данни.

Краткосрочни култури на чернодробни клетки от бозайници обикновено се създават чрез обливане на черния дроб in situ с колагеназа, като прясно дисоциираните клетки се оставят да се прикрепят към подходяща повърхност. Чернодробните клетки от отрицателни контролни животни следва да имат жизнеспособност (5) минимум 50 %.

1.5.7. Определяне на НСД

Прясно изолираните чернодробни клетки от бозайници се инкубират обикновено със среда, съдържаща 3H-TdR за подходящ период от време, напр. от три до осем часа. В края на инкубационното време средата следва да се отстрани от клетките, които след това се инкубират със среда, съдържаща голямо количество немаркиран тимидин, за да се намали неабсорбираната радиоактивност („студено отстраняване“). След това клетките се изплакват, фиксират и изсушават. При по-продължително инкубационно време студеното отстраняване може и да не необходимо. Предметните стъкла се потопяват в авторадиографична емулсия, експонират се на тъмно (напр. държат се в хладилник от 7 до 14 дни, проявяват се, оцветяват се и експонираните сребърни зрънца се преброяват. Две до три предметни стъкла се подготвят от всяко животно.

1.5.8. Анализ

Препаратът на предметното стъкло следва да съдържа достатъчно клетки с нормална морфология, за да може да се направи пълноценна оценка на НСД. Препаратите се изследват под микроскоп за признаци на явно изразена цитотоксичност (напр. пикноза, намалени нива на радиоактивно маркиране).

Предметните стъкла се кодират преди преброяването на зрънцата. Нормално 100 клетки се изследват от всяко животно от най-малко две предметни стъкла; база за отчитане на резултатите от по-малко 100 клетки/животно следва да бъде обоснована. Не се отчитат количествата зрънца за ядра в S-фаза, но пропорцията клетки в S-phase клетки може да регистрира.

Количеството на 3H-TdR, въведено в ядрата и цитоплазмата на морфологично нормални клетки, по начина, по който се проявява чрез отлагането на сребърни зрънца, следва да се определи чрез подходящи методи.

2. ДАННИ

2.1. ОБРАБОТКА НА РЕЗУЛТАТИ

Следва да се представят индивидуални данни за всяко предметно стъкло и животно. В допълнение на това, всички данни следва да се резюмират в таблица. Следва да се изчислят количествата на нето ядрените зрънца (НЯЗ) за всяка клетка, за всяко животно и всяка доза и време чрез изваждане на ЦЗ бройки от ЯЗ бройки. Ако се броят „клетки в репарация“, критериите за дефиниране на „клетки в репарация“ следва да се обосноват и да се базират на паралелни отрицателни контролни данни или на такива от предишни изследвания. Цифровите резултати могат да с оценяват чрез статистически методи. Ако се използват, статистическите тестове следва да се подберат и обосноват преди провежедане на изследването.

2.2. ОЦЕНКА И ТЪЛКУВАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ

Примерите на критерии за положителни/отрицателни реакции включват:

положителни	i)	НЯЗ стойности над зададен праг, обоснован на базата на лабораторни данни от предишни изследвания;
или	ii)	НЯЗ стойности, значително по-високи от паралелни контроли;
отрицателни	i)	НЯЗ стойности в границите на/под контролен праг от предишни изследвания;
или	ii)	НЯЗ стойности, незначително по-високи от паралелни контроли.

Следва да се разгледа биологическата значимост на данните: т.е. параметри като изменчивост между животните, взаимодействие между дозата-реакцията и цитотоксичността следва да вземат под внимание. При оценката на резултатите от теста като помощно средство биха могли да се използват статистически методи. Статистическата значимост не следва да е единственият решаващ фактор за положителна реакция.

Въпреки че повечето експерименти дават ясно положителни или отрицателни резултати, в редки случаи наборът данни изключва правенето на категорична преценка за активността на тестваното вещество. Резултатите могат да останат двузначни или под въпрос, независимо от това колко пъти е повторен опитът.

Положителен резултат от теста за нерепаративен синтез на ДНК (НСД) с чернодробни клетки от бозайници ин виво показва, че увреждането на ДНК с чернодробни клетки от бозайници ин виво може да се репарира чрез нерепаративен синтез на ДНК ин виво. Отрицателният резултат показва,че при условията за провеждане на теста, тестваното вещество не индуцира ДНК увреждане, което се открива с настоящия тест.

Следва да се обсъди вероятността тестувното вещество да достигне общото кръвообращение или конкретно прицелната тъкан (напр.системна токсичност).

3. ДОКЛАДВАНЕ

ДОКЛАД ЗА ТЕСТА

Докладът за теста трябва да включва следната информация:

Разтворител/носител:

—	обосновка за избора на носител,

—	разтворимост и стабилност на тестваното вещество в разтворител/носител, ако са известни.

Опитни животни:

—

вид/щам,

—	брой, възраст и пол на животните,

—	източник, условия на отглеждане, начин на хранене и др.,

—	индивидуално тегло на животните в началото на теста, в т.ч. обхват на телесното тегло, средно и стандартно отклонение за всяка група.

Условия за провеждане на теста:

—	положителни и отрицателни носител/разтворител контроли,

—	данни от изследването за установяване на обхват, ако е проведено,

—	основна причина за избора на нивото на дозата,

—	подробности за приготвянето на тестваното вещество,

—	подробности за администрирането тестваното вещество,

—	основна причина за начина на администриране,

—	методи за проверка дали тестваният агент е достигнал общото кръвообращение или тъканта, която е обект на изследването,ако са приложими,

—	преминаване от концентрация (ppm) на тестваното вещество в храната/питейната вода към действителната доза (mg/kg телесно тегло), ако е приложимо,

—	подробности за качеството на храната и водата,

—	подробно описание на графиците на третиране и вземане на проби,

—	методи на измерване на токсичността,

—	метод на подготовка на чренодробни клетки и култура,

—	използван авторадиографичен способ,

—	брой на подготвените предметни стъкла и брой на отчетените клетки,

—	критерии за оценка,

—	критерии за считане на изследванията положителни, отрицателни или двузначни.

Резултати:

—	средни стойности на индивиудално предметно стъкло, животно и група за ядрени зрънца, цитоплазмени зрънца и нето ядрени зрънца,

—	взаимоотношение доза-реакция, където е възможно,

—	статистическа оценка, ако има такава,

—	признаци на токсичност,

—	паралелни отрицателни (разтворител/носител) и положителни контролни данни,

—	отрицателни (разтворител/носител) от предишни изследвания и положителни контролни данни с обхват, средни стойности и стандартни отклонения,

—	брой на „клетки в репарация“, ако е определен,

—	брой клетки в S-фаза, ако е определен,

—	жизнеспособност на клетките.

Обсъждане на резултатите.

Заключения.

4. ПОЗОВАВАНИЯ

(1)	Ashby, J. Lefevre, P. A., Burlinson, B. and Penman, M. G. (1985), An Assessment of the In Vivo Rat. Hepatocyte DNA Repair Assay, Mutation Res., 156, pp. 1-18.

(2)	Butterworth, B. E., Ashby, J., Bermudez, E., Casciano, D., Mirsalis, J., Probst, G. and Williams, G. (1987), A Protocol and Guide for the In Vivo Rat Hepatocyte DNA Repair Assay, Mutation Res., 189, pp. 123-133.

(3)

Kennelly, J. C., Waters, R., Ashby, J., Lefevre, P. A., Burlinson, B., Benford, D. J., Dean, S. W. and Mitchell, I. de G. (1993), In Vivo Rat Liver UDS Assay, in: Kirkland D. J. and Fox M., (eds), Supplementary Mutagenicity Tests: UKEM Recommended Procedures. UKEMS Subcommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report. Part II revised, Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 52-77.

(4)	Madle, S., Dean, S. W., Andrac, U., Brambilla. G., Burlinson, B., Doolittle, D. J., Furihata, C., Hertner, T., McQueen, C. A. and Mori, H. (1993), Recommendations for the Performance of UDS Tests In Vitro and In Vivo, Mutation Res., 312, pp. 263-285.

(5)	Fautz, R., Hussain, B., Efstathiou, E. and Hechenberger-Freudl. C. (1993), Assessment of the Relation Between the Initial Viability and the Attachment of Freshly Isolated Rat Hepatocytes Used for the In Vivo/In Vitro DNA Repair Assay (UDS), Mutation Res., 291, pp. 21-27.

(6)	Mirsalis, J. C., Tyson, C. K. and Butterworth, B. E. (1982), Detection of Genotoxic Carcinogens in the In Vivo/In Vitro Hepalocyte DNA Repair Assay, Environ. Mutagen, 4, pp. 553-562.“

ПРИЛОЖЕНИЕ 5

Виж Директива 2001/59/ЕО на Комисията (ОВ L 225, 21.8.2001 г., стр. 1)

ПРИЛОЖЕНИЕ 6

„ПРИЛОЖЕНИЕ IX

ЧАСТ A

Разпоредби относно закрепващи устройства за предпазване от деца

В допълнение към разпоредбите в член 22, параграф 1, буква д) от настоящата директива, контейнери с всякакъв обем, които съдържат вещества, представляващи опасност при вдишване (Xn; R65) и са класифицирани и етикетирани съгласно параграф 3.2.3 от приложение VI към настоящата директива, с изключение на веществата, пуснати на пазара под формата на аерозоли или в контейнер, оборудван със запечатано приспособление за пръскане, следва да бъде снабдено със закрепващи устройства за предпазване от деца.

1. Опаковки за многократно използване

Закрепващи устройства за предпазване от деца при опаковки за многократно използване съответстват на стандарта ISO 8317 (издание от 1 юли 1989 г.) относно „Опаковки за предпазване от деца – Изисквания и методи на изследване на опаковки за многократно използване“, приети от Международния комитет по стандартизация (ISO).

2. Опаковки, които не се използват многократно

Закрепващи устройства за предпазване от деца при опаковки, които не се използват многократно отговарят на стандарта CEN EN 862 (издание от март 1997 г.) относно „Опаковки- Опаковки за предпазване от деца - Изисквания и процедури на изследване при опаковки, които не се използват многократно за не-фармацевтични продукти, приет от Европейската комисия по стандартизация (CEN).“

3. Забележка

1.	Свидетелство за съответствие с посочените по-горе стандарти може да бъде издадено от лабораториите, които отговарят на Европейските стандарти серия EN 45 000.

Особени случаи

Ако е очевидно, че опаковката е безопасна за деца, защото те не могат да мат достъп до нейното съдържание без помощта на някакъв инструмент, не е необходимо да се извършва изследване.

Във всички други случаи, когато има достатъчно основания за съмнение във връзка със сигурността на запечатването по отношение на децата, националните власти могат да поискат от лицето отговорно за пускането на продукта на пазара да представи сертификат от лаборатория, както се посочва в 3.1, който декларира:

—	или че видът на затварянето е такъв, че не е необходимо да се изследват спрямо стандартите ISO и CEN, посочени по-горе, или

—	че затварянето е било изследвано и се приема, че отговаря на посочените по-горе стандарти.

ЧАСТ Б

Разпоредби относно осезаемите средства за предупреждение

Техническите спецификации при осезаемите средства за предупреждение съответстват на стандарта ISO EN 11683 (издание от 1997 г.) относно „Опаковки — Осезаеми средства за предупреждение — Изисквания“.“

Top

All