20.   ОПРЕДЕЛЯНЕ НА D-ЯБЪЛЧЕНА КИСЕЛИНА

(ензимен метод)

1.   ПРИНЦИП

В присъствието на D-малатдехидрогеназа (D-MDH) D-ябълчената киселина (D-малатът) се окислява от никотинамидадениндинуклеотид (NAD) до оксалацетат. Полученият оксалацетат се разпада на пируват и въглероден диоксид.

Количеството получен NADH е пропорционално на концентрацията на D-ябълчена киселина и се измерва при дължина на вълната 334, 340 или 265 nm.

2.   РЕАГЕНТИ

Опитна комбинация за приблизително 30 изчисления:

Приготвяне на разтворите

Стабилност на разтворите

Съдържанието на бутилка № 1 е стабилно в продължение на поне една година при съхранение на + 4 °С; разтвор № 2 е стабилен в продължение на три седмици при съхранение на + 4 °С и на два месеца при съхранение на – 20 °С; разтвор № 3 е стабилен в продължение на пет дни при съхранение на + 4 °С.

3.   АПАРАТУРА

4.   ПРИГОТВЯНЕ НА ПРОБАТА

Анализът на D-малат обикновено се провежда направо върху виното, без предварително обезцветяване.

Количеството D-малат в кюветата следва да бъде между 2 и 50 μg. Следователно виното трябва да бъде разредено, така че да даде концентрация на D-малат съответно между 0,02 и 0,5 g/l или 0,02 и 0,3 g/l (в зависимост от използваната апаратура).

Таблица на разреждането:

5.   ПРОЦЕДУРА

Със спектрофотометъра, нагласен на дължина на вълната 340 nm, се определя абсорбцията, като се използват кюветите от 1 cm, или чрез използване на въздух, за да се определи абсорбция „нула“ (без кювета в оптичния път), или на вода.

В кюветите се отпипетира:

Смесва се и след около шест минути се измерва абсорбцията на референтните разтвори на пробите (A1).

Прибавя се:

Смесва се; изчаква се до приключване на реакцията (около 20 минути) и се измерва абсорбцията на разтворите за справка и на опитните разтвори (A2).

Изчислява се абсорбционната разлика (A2 – A1) за референтните разтвори (ΔΑT) и за опитните разтвори (ΔΑE). Накрая се изчислява разликата между тези разлики: .

Забележка: Времето, необходимо за приключване на ензимната активност, може да варира между различните поредици. Даденото по-горе време служи само за насока, така че е препоръчително то да се определя поотделно за всяка поредица.

D-ябълчената киселина реагира бързо. Ензимът преобразува и L-тартаровата киселина, но много по-бавно. Това обяснява леката странична реакция, която може да бъде коригирана чрез екстраполация (виж допълнение А).

6.   ИЗРАЗЯВАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ

Общата формула за изчисляване концентрацията в mg/l е:

където:

Ако пробата е била разредена по време на приготвянето ѝ, резултатът се умножава по фактора на разреждане.

Концентрацията на D-ябълчената киселина е дадена в милиграми на литър (mg/l), без знаци след десетичната запетая.

7.   ТОЧНОСТ

В допълнение Б са обобщени някои подробности за междулабораторното изпробване на точността на метода. Стойностите, получени при междулабораторното изпробване, могат да не бъдат приложими към аналитични концентрации и субстрати, различни от дадените в допълнение Б.

7.1.   Повторяемост

Абсолютната разлика между два отделни резултата, получени при използването на еднакъв материал, подложен на опит от оператор, използващ същата апаратура, за най-краткия времеви интервал, не трябва да надхвърля стойността на повторяемост r в повече от 5 % от случаите.

r= 11 mg/l.

7.2.   Възпроизводимост

Абсолютната разлика между два отделни резултата, получени при използването на еднакъв материал, подложен на опит в две различни лаборатории, не трябва да надхвърля стойността на възпроизводимост R в повече от 5 % от случаите.

R= 20 mg/l.

8.   КОМЕНТАР

С оглед на степента на точност на описания метод стойности на D-ябълчна киселина под 50 mg/l следва при необходимост да бъдат потвърдени чрез друг аналитичен метод, с използване на друг принцип на измерване, като например този на Пшиборски et al. (Mitteilungen Klosterneuburg 43, 1993; 215—218. 1993).

Винената проба в кюветата не бива да надхвърля 0,1 ml, за да се избегне евентуално инхибиране на ензимната активност от полифеноли.

„38.   ОПРЕДЕЛЕНИЕ НА ЦИАНИДНИ ПРОИЗВОДНИ

(Внимание: да се спазват мерките за безопасност при работа с химикалите хлорамин-Т, пиридин, калиев цианид, солна киселина и фосфорна киселина. Отстраняването на използваните продукти да става в съответствие с действащото законодателство по опазване на околната среда. Да се внимава с циановодородната киселина, отделяща се при дестилацията на подкислено вино.)

1.   ПРИНЦИП

Общото количество свободна циановодородна киселина във виното се освобождава чрез киселинна хидролиза и се отделя чрез дестилация. След протичане на реакция с хлорамин-Т и пиридин, образувалият се глутакониев диалдехид се доказва чрез колориметрия на базата на синьото оцветяване, което той дава с 1,3-диметилбарбитурова киселина.

2.   АПАРАТУРА

2.1.   Дестилационна апаратура

Използва се описаната дестилационна апаратура за определяне на алкохолното съдържание на виното.

2.2.   500-милилитрова колба с кръгло дъно със стандартизирани шлифовани съединения.

2.3.   Водна баня, термостатично поддържана на 20 °C.

2.4.   Спектрофотометър, позволяващ абсорбцията да бъде измервана на дължина на вълната 590 nm.

2.5.   Стъклени клетки или клетки за еднократна употреба с дължина на оптичния път 20 mm.

3.   РЕАГЕНТИ

3.1.   Фосфорна киселина (H3PO4) при 25 % (m/v).

3.2.   Разтвор на хлорамин-Т (C7H7CINNa O2S, 3H2O) 3 % (m/v).

3.3.   Разтвор на 1,3-диметилбарбитурова киселина: разтварят се 3,658 g 1,3-диметилбарбитурова киселина (C6H8N2O3) в 15 ml пиридин и 3 ml солна киселина (ρ20 = 1,19 g/ml) и се добавят 50 ml дестилирана вода.

3.4.   Калиев цианид (KCN).

3.5.   Разтвор на калиев йодид (KI) 10 % (m/v).

3.6.   Разтвор на сребърен нитрат (AgNO3), 0,1 M.

4.   ПРОЦЕДУРА

4.1.   Дестилация

Сипват се 25 ml вино, 50 ml дестилирана вода, 1 ml солна киселина (3.1) и се добавят няколко стъклени маниста в 500-милилитровата колба (2.2). Колбата се слага веднага на дестилационната апаратура. С помощта на изтънена тръба дестилатът се отвежда в 50-милилитрова градуирана колба, съдържаща 10 ml вода. Градуираната колба се потапя в ледена вода. Събират се 30—35 ml от дестилата (или общо около 45 ml течност) в градуираната колба.

Промива се изтънената тръба на хладника с няколко милилитра дестилирана вода, дестилатът се загрява до 20 °C и се допълва с дестилирана вода до марката.

4.2.   Измерване

Сипват се 25 ml от дестилата в 50-милилитрова конична колба с шлифована стъклена тапа, добавя се 1 ml разтвор на хлорамин-T (3.2) и се запушва с тапата. Точно след 60 секунди се добавят 3 ml разтвор на 1,3-диметилбарбитурова киселина (3.3), запушва се с тапата и се оставя да престои 10 минути. След това се измерва абсорбцията, като се сравнява с контролен разтвор (25 ml дестилирана вода вместо 25 ml дестилат) при дължина на вълната 590 nm в кювети с дължина на оптичния път 20 mm.

5.   ОПРЕДЕЛЯНЕ НА КАЛИБРОВЪЧНАТА КРИВА

5.1.   Аргентометрично титруване на калиевия цианид

Разтварят се около 0,2 g KCN (3.4), внимателно премерен, в 100 ml дестилирана вода в 300-милилитрова градуирана колба. Добавят се 0,2 ml разтвор на калиев йодид (3.5) и се титрува с 0,1 М разтвор на сребърен нитрат (3.6) до получаване на устойчиво жълтеникаво оцветяване.

Изчислява се концентрацията на пробата KCN, като се приема, че 1 ml 0,1 M разтвор на сребърен нитрат отговаря на 13,2 mg KCN.

5.2.   Стандартна крива

5.2.1.   Приготвяне на стандартни разтвори

След определянето на концентрацията на KCN съгласно процедурата, описана в 5.1, се приготвя стандартен разтвор, съдържащ 30 mg/l циановодородна киселина (30 mg HCN ≅ 72,3 mg KCN). Разтворът се разрежда до 1/10.

Отсипват се по 1,0 ml, 2,0 ml, 3,0 ml, 4,0 ml и 5,0 ml от разредения пробен разтвор в 100-милилитрови градуирани колби и се допълват с дестилирана вода до марката. Така приготвените разтвори съдържат съответно 30 μg, 60 μg, 90 μg, 120 μg и 150 μg циановодородна киселина на литър.

5.2.2.   Титруване

Вземат се 25-милилитрови проби от така получените разтвори и се продължава съгласно инструкциите, дадени в 4.1 и 4.2 по-горе.

Стойностите, получени за абсорбцията, взети спрямо стандартните разтвори като функция на съответното съдържание на циановодородна киселина, следва да дават права, преминаваща през началото.

6.   ИЗРАЗЯВАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ

Циановодородната киселина се изразява в микрограмове на литър (μg/l), без знаци след десетичната запетая.

6.1.   Метод на изчисление

Съдържанието на циановодородната киселина се отчита по калибровъчната крива. Ако пробата е била разредена, резултатът се умножава по фактора на разреждане.

Повторяемост (r) и възпроизводимост (R)