PRILOGA I

(Člen 1)

SEZNAM REFERENČNIH METOD

Seznam okrajšav Min. = najmanj, Maks. = največ, Priloga = priloga k navedeni uredbi, SNF = suha snov brez maščobe, PV = peroksidno število, A = videz, F = aroma, C = konsistenca, TBC = skupno število bakterij, Term. = število termofilnih bakterij, MS = država članica, IDF = International Dairy Federation (Mednarodno združenje za mlekarstvo), ISO = International Standards Organisation (Mednarodna organizacija za standardizacijo), IUPAC = International Union of Pure and Applied Chemistry (Mednarodna zveza za čisto in uporabno kemijo), ADPI = American Dairy Products Institute (Ameriški inštitut za mlečne proizvode), SCM = sladkano zgoščeno mleko, EMC = evaporirano mleko ali smetana.

DEL A:

Uredba Komisije	Proizvod	Parameter	Meja (1)	Referenčna metoda	Pripomba
Uredba (ES) št. 2771/1999 – Javno skladiščenje	Nesoljeno maslo	Maščoba	Min. 82 % m/m	ISO 17189:2003|IDF 194:2003
		Voda	Do 16 % m/m	ISO 3727–1:2001|IDF 80–1:2001
		SNF	Do 2 % m/m	ISO 3727–2:2001|IDF 80–2:2001
		Kislost maščobe	1,2 mmol/100 g maščobe	ISO 1740:2004|IDF 6:2004
		PV (maks.)	0,3 mekv. kisika/1 000 g maščobe	ISO 3976:2006|IDF 74:2006	Opomba 1
		Koliformne bakterije	Pod mejo zaznavnosti v 1 g	Priloga X	Opomba 3
		Nemlečna maščoba	Pod mejo zaznavnosti za analizo trigliceridov	Priloga XX
		Sterolni sledilci	Pod mejo zaznavnosti, β-sitosterol ≤ 40 mg/kg	Priloga VIII
		Drugi sledilci
		— vanilin	Pod mejo zaznavnosti	Priloga VI
		— etil ester karotenske kisline	≤ 6 mg/kg	Priloga VII
		— trigliceridi heptanojske kisline	Pod mejo zaznavnosti	Priloga V
		Senzorične lastnosti	Najmanj 4 od 5 točk za A, F in C	Priloga IV
		Disperzija vode	Najmanj 4 točke	ISO 7586:1985|IDF 112A:1989
Uredba (ES) št. 2771/1999 – Zasebno skladiščenje	Nesoljeno maslo	Maščoba	Min. 82 % m/m	ISO 17189:2003|IDF 194:2003
		Voda	Do 16 % m/m	ISO 3727–1:2001|IDF 80–1:2001
		SNF	Do 2 % m/m	ISO 3727–2:2001|IDF 80–2:2001
Uredba (ES) št. 2771/1999 – Zasebno skladiščenje	Soljeno maslo	Maščoba	Min. 80 % m/m	ISO 17189:2003|IDF 194:2003
		Voda	Do 16 % m/m	ISO 3727–1:2001|IDF 80–1:2001
		SNF (razen soli)	Do 2 % m/m	ISO 3727–2:2001|IDF 80–2:2001
		Sol	Do 2 % m/m	ISO 15648:2004|IDF 179:2004
Uredba (ES) št. 1898/2005, poglavje II	Nesoljeno maslo	Maščoba	Min. 82 % m/m	ISO 17189:2003|IDF 194:2003
		Nemlečna maščoba		Priloga XX
		Voda	Do 16 % m/m	ISO 3727–1:2001|IDF 80–1:2001
		SNF	Do 2 % m/m	ISO 3727–2:2001|IDF 80–2:2001
		Sledilci:
		— steroli	Glej Prilogo VIII	Priloga VIII
		— vanilin	Glej Prilogo VI	Priloga VI
		— etil ester karotenske kisline	Glej Prilogo VII	Priloga VII
		— trigliceridi heptanojske kisline	Glej Prilogo V	Priloga V
Uredba (ES) št. 1898/2005, poglavje II	Soljeno maslo	Maščoba	Min. 80 % m/m	ISO 17189:2003|IDF 194:2003
		Nemlečna maščoba		Priloga XX
		Voda	Do 16 % m/m	ISO 3727–1:2001|IDF 80–1:2001
		SNF (razen soli)	Do 2 % m/m	ISO 3727–2:2001|IDF 80–2:2001
		Sol	Do 2 % m/m	ISO 15648:2004|IDF 179:2004
		Sledilci:
		— steroli	Glej Prilogo VIII	Priloga VIII
		— vanilin	Glej Prilogo VI	Priloga VI
		— etil ester karotenske kisline	Glej Prilogo VII	Priloga VII
		— trigliceridi heptanojske kisline	Glej Prilogo V	Priloga V
Uredba (ES) št. 1898/2005, poglavje II	Zgoščeno maslo	Maščoba	Min. 99,8 % m/m	IDF 24:1964
		Voda in SNF	Do 0,2 % m/m	ISO 5536:2002|IDF 23:2002 (vlaga) IDF 24:1964 (SNF)
		Kislost maščobe	1,2 mmol/100 g maščobe	ISO 1740:2004|IDF 6:2004
		PV (maks.)	0,5 mekv. kisika/1 000 g maščobe	ISO 3976:2006|IDF 74:2006	Opomba 1
		Nemlečna maščoba	Ni prisotna	Priloga XX
		Aroma	Čista
		Vonj	Odsotnost tujih vonjav
		Drugo	Odsotnost nevtralizacijskih sredstev, antioksidantov in konzervansov
		Sledilci:
		— steroli	Glej Prilogo VIII	Priloga VIII
		— vanilin	Glej Prilogo VI	Priloga VI
		— etil ester karotenske kisline	Glej Prilogo VII	Priloga VII
		— trigliceridi heptanojske kisline	Glej Prilogo V	Priloga V
Uredba (ES) št. 1898/2005, poglavje II	Smetana	Maščoba	Min. 35 % m/m	ISO 2450:1999|IDF 16C:1987
		Nemlečna maščoba		Priloga XX
		Sledilci:
		— steroli	Glej Prilogo VIII		Opomba 2
		— vanilin	Glej Prilogo VI	Priloga VI
		— etil ester karotenske kisline	Glej Prilogo VII		Opomba 2
		— trigliceridi heptanojske kisline	Glej Prilogo V	Priloga V
Uredba (ES) št. 1898/2005, poglavje III	Zgoščeno maslo	Maščoba	Min. 96 % m/m		Opomba 2
		Nemlečna maščoba		Priloga XX
		SNF	Do 2 % m/m		Opomba 2
		Sledilci:
		— stigmasterol (95 % m/m)	15 g/100 kg zgoščenega masla	Priloga VIII
		— stigmasterol (85 % m/m)	17 g/100 kg zgoščenega masla	Priloga VIII
		— trigliceridi heptanojske kisline	10,34 kg/100 kg zgoščenega masla	Priloga V
		— etil ester maslene kisline in stigmasterol		— etil ester maslene kisline — stigmasterol: Priloga VIII	Opomba 2
		— etil ester maslene kisline in trigliceridi heptanojske kisline		— etil ester maslene kisline — trigliceridi heptanojske kisline: Priloga V	Opomba 2
		lecitin (E 322)	Do 0,5 % m/m		Opomba 2
		NaCl	Do 0,75 % m/m	ISO 15648:2004|IDF 179:2004
		Kislost maščobe	1,2 mmol/100 g maščobe	ISO 1740:2004|IDF 6:2004
		PV (maks.)	Do 0,5 mekv. kisika/1 000 g maščobe	ISO 3976:2006|IDF 74:2006	Opomba 1
		Aroma	Čista
		Vonj	Odsotnost tujih vonjav
		Drugo	Odsotnost nevtralizacijskih sredstev, antioksidantov in konzervansov
Uredba (ES) št. 1898/2005, poglavje IV	Nesoljeno maslo	Maščoba	Min. 82 % m/m	ISO 17189:2003|IDF 194:2003
		Voda	Do 16 % m/m	ISO 3727–1:2001|IDF 80–1:2001
		SNF	Do 2 % m/m	ISO 3727–2:2001|IDF 80–2:2001
Uredba (ES) št. 1898/2005, poglavje IV	Soljeno maslo	Maščoba	Min. 80 % m/m	ISO 17189:2003|IDF 194:2003
		Voda	Do 16 % m/m	ISO 3727–1:2001|IDF 80–1:2001
		SNF (razen soli)	Do 2 % m/m	ISO 3727–2:2001|IDF 80–2:2001
		Sol	Do 2 % m/m	ISO 15648:2004|IDF 179:2004
Člen 9 in naslov II Uredbe (ES) št. 1255/1999	Sir iz ovčjega in/ali kozjega mleka	Kravje mleko	< 1 % m/m	Priloga IX
Uredba (EGS) št. 2921/90	Priloga I – kisli kazein	Voda	Do 12,00 % m/m	ISO 5550:2006|IDF 78:2006
		Maščoba	Do 1,75 % m/m	ISO 5543:2004|IDF 127:2004
		Prosta kislost	Do 0,30 ml 0,1 N raztopine NaOH/g	ISO 5547:1978|IDF 91:1979
Uredba (EGS) št. 2921/90	Priloga I – siriščni kazein	Voda	Do 12,00 % m/m	ISO 5550:2006|IDF 78:2006
		Maščoba	Do 1,00 % m/m	ISO 5543:2004|IDF 127:2004
		Pepel	Min. 7,50 % m/m	ISO 5545:1978|IDF 90:1979
Uredba (EGS) št. 2921/90	Priloga I – kazeinati	Voda	Do 6,00 % m/m	ISO 5550:2006|IDF 78:2006
		Mlečne beljakovine	Min. 88,00 % m/m	ISO 5549:1978|IDF 92:1979
		Maščoba in pepel	Do 6,00 % m/m	ISO 5543:2004|IDF 127:2004
		Določen pepel		ISO 5544:1978|IDF 89:1979
		Pepel		ISO 5545:1978|IDF 90:1979
Uredba (EGS) št. 2921/90	Priloga II – kisli kazein	Voda	Do 10,00 % m/m	ISO 5550:2006|IDF 78:2006
		Maščoba	Do 1,50 % m/m	ISO 5543:2004|IDF 127:2004
		Proste kisline	Do 0,20 ml 0,1 N raztopine NaOH/g	ISO 5547:1978|IDF 91:1979
		TBC (maks.)	30 000/g	ISO 4833:2003	Opomba 3
		Koliformne bakterije	Pod mejo zaznavnosti v 0,1 g	Priloga X	Opomba 3
		Term. (maks.)	5 000/g	ISO 4833:2003	Opombi 3 in 4
Uredba (EGS) št. 2921/90	Priloga II – siriščni kazein	Voda	Do 8,00 % m/m	ISO 5550:2006|IDF 78:2006
		Maščoba	Do 1,00 % m/m	ISO 5543:2004|IDF 127:2004
		Pepel	Min. 7,50 % m/m	ISO 5545:1978|IDF 90:1979
		TBC (maks.)	30 000/g	ISO 4833:2003	Opomba 3
		Koliformne bakterije	Pod mejo zaznavnosti v 0,1 g	Priloga X	Opomba 3
		Term. (maks.)	5 000/g	ISO 4833:2003	Opombi 3 in 4
Uredba (EGS) št. 2921/90	Priloga II – kazeinati	Voda	Do 6,00 % m/m	ISO 5550:2006|IDF 78:2006
		Mlečne beljakovine	Min. 88,00 % m/m	ISO 5549:1978|IDF 92:1979
		Maščoba in pepel	Do 6,00 % m/m	ISO 5543:2004|IDF 127:2004 ISO 5544:1978|IDF 89:1979 ali ISO 5545:1978|IDF 90:1979
		TBC (maks.)	30 000/g	ISO 4833:2003	Opomba 3
		Koliformne bakterije	Pod mejo zaznavnosti v 0,1 g	Priloga X	Opomba 3
		Term. (maks.)	5 000/g	ISO 4833:2003	Opombi 3 in 4
Uredba (EGS) št. 2921/90	Priloga III – kazeinati	Voda	Do 6,00 % m/m	ISO 5550:2006|IDF 78:2006
		Mlečne beljakovine	Min. 85,00 % m/m	ISO 5549:1978|IDF 92:1979
		Maščoba	Do 1,50 % m/m	ISO 5543:2004|IDF 127:2004
		Laktoza	Do 1,00 % m/m	ISO 5548:2004|IDF 106:2004
		Pepel	Do 6,50 % m/m	ISO 5544:1978|IDF 89:1979 ali ISO 5545:1978|IDF 90:1979
		TBC (maks.)	30 000/g	ISO 4833:2003	Opomba 3
		Koliformne bakterije	Pod mejo zaznavnosti v 0,1 g	Priloga X	Opomba 3
		Term. (maks.)	5 000/g	ISO 4833:2003	Opombi 3 in 4
Uredba (ES) št. 2799/1999	Krmne mešanice in posneto mleko v prahu (SMP) (kadar se uporablja kot krma)	Voda (kisli pinjenec v prahu)	Do 5 % m/m	Priloga XIX
		Beljakovine	31,4 % m/m (min.) na suho snov brez maščobe	ISO 8968–1|2|3:2001|IDF 20–1|2|3:2001
		Voda (SMP)	Do 5 % m/m	ISO 5537:2004|IDF 26:2004
		Maščobe (SMP)	Do 11 % m/m	ISO 1736:2000|IDF 9C:1987
		Siriščna sirotka (SMP)	Ni prisotna	Priloga XIII	Opomba 6
		Škrob (SMP)	Ni prisoten	Priloga XVII
		Voda (mešanice)	Do 5 % suhe snovi brez maščobe	ISO 5537:2004|IDF 26:2004
		Maščobe (mešanice)		Direktiva Komisije 84/4/EGS (UL L 15, 18.1.1984, str. 29)
		Siriščna sirotka (mešanice)	Ni prisotna	Priloga XIII
		Vsebina SMP (v končnem proizvodu)	Min. 50 % m/m	Priloga XVI
		Maščobe (v končnem proizvodu)	Min. 2,5 % m/m ali 5 % m/m	Direktiva Komisije 84/4/EGS (UL L 15, 18.1.1984, str. 29)	Opomba 7
		Škrob (v končnem proizvodu)	Min. 2 % m/m	Priloga XVII	Opomba 8
		Baker (v končnem proizvodu)	25 ppm	Direktiva Komisije 78/633/EGS (UL L 206, 26.7.1987, str. 43)
Uredba (ES) št. 214/2001	SMP (sprej metoda)	Maščoba	Do 1,0 % m/m	ISO 1736:2000|IDF 9C:1987
		Beljakovine	31,4 % (2)m/m (min.) na suho snov brez maščobe	ISO 8968–1/2:2001|IDF 20–1/2:2001
		Voda	Do 3,5 % m/m	ISO 5537:2004|IDF 26:2004
		Kislost	Do 19,5 ml 0,1 N NaOH, 10 g suhe snovi brez maščobe	ISO 6091:1980|IDF 86:1981
		Laktati	Do 150 mg/100 g suhe snovi brez maščobe	ISO 8069:2005|IDF 69:2005
		Fosfataza	Negativna	ISO 11816–1:2006|IDF 155–1:2006
		Indeks netopnosti	Do 0,5 ml pri 24 °C	ISO 8156:2005|IDF 129:2005
		Sežgani delci	Plošča A ali B (15,0 mg)	ADPI (1990)
		TBC	40 000/g	ISO 4833:2003	Opomba 3
		Koliformne bakterije	Negativno/0,1 g	Priloga X	Opomba 3
		Pinjenec	Negativno	Priloga XIV
		Siriščna sirotka	Negativno	Priloga XII
		Kisla sirotka	Negativno		Opomba 2
		Protimikrobna sredstva		Priloga XV

DEL B

Referenčne metode, naštete v delu B, se lahko uporabijo za analizo proizvodov, zajetih v kateri koli od uredb iz stolpca 1.

Uredba Komisije	Proizvod	Oznaka KN	Parameter	Meja	Referenčna metoda	Pripomba
Uredba (EGS) št. 2658/87 Uredba (ES) št. 2535/2001 Uredba (ES) št. 1282/2006	Mleko in smetana, nezgoščena in brez dodanega sladkorja ali drugih sladil	0401	Maščoba (≤ 6 % m/m)	Veljajo omejitve, določene v opisu oznake KN za določeni proizvod, ki so podrobneje določene, kadar je primerno, v Uredbi Komisije (EGS) št. 3846/87 (UL L 366, 24.12.1987, str. 1), delu 9 izvozne nomenklature ali Uredbi (ES) št. 2535/2001 (UL L 341, 22.12.2001, str. 29).	ISO 1211:2001|IDF 1D:1996
			Maščoba (> 6 % m/m)		ISO 2450:1999|IDF 16C:1987
	Mleko in smetana, zgoščena ali z dodanim sladkorjem ali drugim sladilom	0402	Maščoba (v tekoči obliki)		ISO 1737:1999|IDF 13C:1987
			Maščoba (v trdni obliki)		ISO 1736:2000|IDF 9C:1987
			Beljakovina		ISO 8968–1|2|3:2001|IDF 20–1|2|3:2001
			Saharoza (običajna vsebnost)		ISO 2911:2004|IDF 35:2004
			Saharoza (nizka vsebnost)			Opomba 2
			Trdne snovi (SCM)		ISO 6734:1989|IDF 15B:1991
			Trdne snovi (EMC)		ISO 6731:1989|IDF 21B:1987
			Voda (mleko v prahu)		ISO 5537:2004/IDF 26:2004
			Voda (smetana v prahu)		Priloga XVIII
	Pinjenec, fermentirano ali kislo mleko in smetana, zgoščena ali nezgoščena, z dodanim sladkorjem ali drugim sladilom	0403	Maščoba		ISO 1211:2001|IDF 1D:1996 ISO 1736:2000|IDF 9C:1987 ISO 2450:1999|IDF 16C:1987 ISO 7208:1999|IDF 22B:1987 ISO 8262–3:2005|IDF 124–3:2005
			Beljakovine		ISO 8968–1|2|3:2001|IDF 20–1|2|3:2001
			Saharoza (običajna vsebnost)		ISO 2911:2004|IDF 35:2004
			Saharoza (nizka vsebnost)			Opomba 2
			Voda (kisli pinjenec v prahu)		Priloga XIX:
			Voda (sladki pinjenec v prahu)		ISO 5537:2004|IDF 26:2004
			Trdne snovi (drugi proizvodi)		Metode, ki jih odobri pristojni organ
	Sirotka, koncentrirana ali nekoncentrirana, ali sirotka, ki vsebuje dodan sladkor ali druga sladila; proizvodi iz naravnih mlečnih sestavin	0404	Maščoba		ISO 1736:2000|IDF 9C:1987 ISO 2450:1999|IDF 16C:1987 ISO 7208:1999|IDF 22B:1987
			Beljakovina		ISO 8968–1|2|3:2001|IDF 20–1|2|3:2001
			Saharoza (običajna vsebnost)		ISO 2911:2004|IDF 35:2004
			Saharoza (nizka vsebnost)			Opomba 2
		0404 90	Beljakovina		ISO 8968 1/2 2001|IDF 20–1/2:2001
			Voda		IDF 21B:1987
			Trdne snovi		ISO 6734:1989|IDF 15B:1991
			(koncentrirani proizvodi)		ISO 6731:1989|IDF 21B:1987
	Maslo in druge maščobe, pridobljene iz mleka; mlečni namazi	0405	Maščoba (če je ≤ 85 % m/m)		ISO 17189:2003|IDF 194:2003
		Maslo	Voda		ISO 3727–1:2001|IDF 80–1:2001
			SNF		ISO 3727–2:2001|IDF 80–2:2001
			NaCl		ISO 15648:2004|IDF 179:2004
			Maščoba (če je > 99 % m/m)		IDF 24:1964
	Masleno-mlečna maščoba		Voda (če je maščoba < 99 % m/m)		ISO 5536:2002|IDF 23:2002
	Sir in skuta	0406	Maščoba		ISO 1735:2004|IDF 5:2004
			Trdne snovi		ISO 5534:2004|IDF 4:2004
			Trdne snovi (ricotta)		ISO 2920:2004|IDF 58:2004
			NaCl		ISO 5943:2006|IDF 88:2006
			Laktoza		ISO 5765–1/2:2002|IDF 79–1/2:2002
Uredba (EGS) št. 2658/87	Krmne mešanice	2309	Laktoza		Priloga XI

Opombe k seznamu referenčnih metod Evropske unije

Opomba 1: Izolacija mlečne maščobe, kakor je opisana v standardu ISO 1740:1991 (zavarovano pred svetlobo).

Opomba 2: Uvedena ni bila nobena referenčna metoda. Metode, ki jih odobri pristojni organ.

Opomba 3: Vzorec je treba pripraviti v skladu s standardom ISO 8261:2001|IDF 122:2001.

Opomba 4: Inkubacija 48 ur pri temperaturi 55 °C, preprečiti je treba izsušitev umetnega gojišča.

Opomba 5: % m/m SNF = % m/m suhe snovi – % m/m maščobe.

Opomba 6: Direktiva Komisije 84/4/EGS.

Opomba 7: Uredba Komisije (ES) št. 2799/1999 (UL L 340, 31.12.1999, str. 3–27).

Opomba 8: Direktiva Komisije 78/633/EGS.

---

(1)  Ne glede na zahteve določene uredbe.

(2)  1. septembra 2009 bi bila najmanjša vsebnost beljakovin 34 %.

PRILOGA II

(Člen 3)

OCENA SKLADNOSTI POŠILJKE S PRAVNO OMEJITVIJO

1.   POSTOPEK

Če zadevna zakonodaja podrobno določa postopke vzorčenja, se uporabljajo ti postopki. V vseh drugih primerih se uporabi vzorec vsaj treh vzorčnih enot, naključno izbranih iz pošiljke, ki se predloži v pregled. Pripravi se lahko sestavljen vzorec. Pridobljeni rezultat se primerja s pravnimi omejitvami z izračunom 95-odstotne stopnje natančnosti kot dvakratnega standardnega odmika, pri čemer je ustrezni standardni odmik odvisen od tega, (1) ali se metoda potrdi z mednarodnim sodelovanjem z vrednostmi za σr in σR ali (2) se v primeru znotrajlaboratorijske validacije izračuna interna obnovljivost. Ta stopnja natančnosti bo nato enaka merilni negotovosti rezultata.

2.   METODA JE VALIDIRANA Z MEDNARODNIM SODELOVANJEM

V tem primeru se določita standardni odmik ponovljivosti σr in standardni odmik obnovljivosti σR, medtem ko lahko laboratorij dokaže skladnost z učinkovitostjo validirane metode.

Izračunajte aritmetično sredino za n ponovljenih meritev.

Izračunajte razširjeno negotovost (k = 2) kot

Če se končni rezultat x merjenja izračuna s formulo v obliki x = y 1 + y 2, x = y 1 – y 2, x = y 1. y 2 ali x = y 1 / y 2 je treba uporabiti običajne postopke za združevanje standardnih odmikov v takšnih primerih.

Obravnava se, da pošiljka ni v skladu z zgornjo pravno omejitvijo UL, če je

;

sicer se obravnava, da je v skladu z UL.

Obravnava se, da pošiljka ni v skladu s spodnjo pravno omejitvijo LL, če je

;

sicer se obravnava, da je v skladu z LL.

3.   ZNOTRAJLABORATORIJSKA VALIDACIJA Z IZRAČUNOM STANDARDNEGA ODMIKA INTERNE OBNOVLJIVOSTI

Če se uporabljajo metode, ki niso določene v tej uredbi, in niso določeni ukrepi za natančnost, je treba izvesti znotrajlaboratorijsko validacijo. V formulah za izračun razširjene negotovosti U je treba ustrezno uporabiti standardni odmik interne ponovljivosti sir in standardni odmik interne obnovljivosti siR namesto σr in σ R .

Veljajo pravila za odločanje iz točke 1. Če se pošiljka obravnava kot neskladna s pravno omejitvijo, je treba meritve ponoviti na podlagi metode iz te uredbe ter sprejeti odločitev v skladu s točko 1.

PRILOGA III

(Člen 4)

OCENA OCENJEVALCEV IN ZANESLJIVOST REZULTATOV PRI SENZORIČNIH ANALIZAH

Pri uporabi točkovalnih postopkov se uporabljajo naslednji postopki (standard IDF 99C:1997).

A.   DOLOČEVANJE „INDEKSA PONOVLJIVOSTI“

Ocenjevalec analizira najmanj deset slepih vzorcev v vzporednih izvajanjih v roku 12 mesecev. To se navadno dogaja v več stopnjah. Rezultati za značilnosti posameznih proizvodov se ovrednotijo po naslednji enačbi:

kjer je:

w1	:	:indeks ponovljivosti
xi1	:	:točke prve ocenitve vzorca xi
xi2	:	:točke druge ocenitve vzorca xi
n	:	:število vzorcev

Ocenjevani vzorci morajo kazati visoko kakovost; wI ne sme presegati 1,5 točke (na lestvici s petimi točkami).

B.   DOLOČEVANJE „INDEKSA ODKLONA“

Ta indeks je treba uporabiti za preverjanje, ali ocenjevalec uporablja enako lestvico za kakovostno ocenjevanje kot izkušena skupina za ocenjevanje. Točke, ki jih dobi ocenjevalec, se primerjajo s povprečjem točk, ki jih dobi skupina za ocenjevanje.

Za ovrednotenje rezultatov se uporablja naslednja enačba:

kjer je:

xi1; xi2	:	glej oddelek A
;	:	povprečno število točk ocenjevalne skupine za prvo in drugo ocenjevanje vzorca xi
n	:	število vzorcev (najmanj deset na 12 mesecev).

Vzorci, ki se ocenjujejo, morajo kazati visoko kakovost. DI ne sme presegati 1,5 točke (na lestvici s petimi točkami).

Države članice morajo javiti vsakršne težave, na katere naletijo pri uporabi tega postopka.

Če se ugotovi, da so posamezni ocenjevalci presegli mejo 1,5 točke za indeks odklona ali ponovljivosti, mora(-jo) strokovnjak(-i) uradnega organa izvesti enega ali več naključnih ponovnih pregledov uspešnosti na vzorcih, ki se bodo ocenjevali v naslednjih nekaj tednih, ali skupaj s temi ocenjevalci izvesti enega ali več „spremljevalnih“ pregledov. Natančno spremljanje je nujno za odločitev, ali naj se te storitve ohranijo. Ugotovitve je treba dokumentirati in shraniti kot dokazila o nadaljnjih ukrepih.

C.   PRIMERJAVA REZULTATOV, PRIDOBLJENIH V RAZLIČNIH REGIJAH DRŽAVE ČLANICE IN V RAZLIČNIH DRŽAVAH ČLANICAH

Preskus je treba, kadar je to primerno, organizirati najmanj enkrat na leto zaradi primerjave rezultatov, ki jih dobijo ocenjevalci iz različnih regij. Če se opazijo pomembne razlike, je treba sprejeti potrebne ukrepe, da se ugotovijo vzroki zanje in dosežejo primerljivi rezultati.

Države članice lahko organizirajo preskuse za primerjavo rezultatov, ki jih dobijo njihovi lastni ocenjevalci, z rezultati ocenjevalcev iz sosednjih držav članic. Večje razlike morajo sprožiti poglobljeno preiskavo za dosego primerljivih rezultatov.

Države članice morajo o rezultatih teh primerjav obvestiti Komisijo.

PRILOGA IV

(Člen 4)

SENZORIČNO OCENJEVANJE MASLA

1.   PODROČJE UPORABE

Namen tega postopka za senzorično ocenjevanje masla je zagotoviti enoten postopek, ki bi se uporabljal v vseh državah članicah.

Za nadaljnje informacije glej sedanji mednarodni standard IDF za mleko in mlečne proizvode, IDF 99 – deli 1, 2 in 3 o senzoričnem ocenjevanju.

2.   OPREDELITEV POJMOV

„Senzorično ocenjevanje“ (ovrednotenje) pomeni preverjanje lastnosti proizvoda s čutili.

„Skupina ocenjevalcev“ pomeni skupino izbranih ocenjevalcev, ki ocenjujejo brez medsebojne komunikacije in zunanjega vpliva.

„Ocenjevalec“ je opredeljen kot oseba, izbrana zaradi sposobnosti izvajanja senzoričnega preskusa. Izkušnje tega tipa ocenjevalca so lahko omejene.

„Strokovni ocenjevalec“ je opredeljen kot oseba z visoko stopnjo senzorične občutljivosti in izkušnjami na področju senzorične metodologije, ki je sposoben doslednega in zanesljivega ocenjevanja različnih proizvodov. Ta tip ocenjevalca ima dober dolgoročni senzorični spomin.

„Določanje indeksa odklona“ pomeni senzorično ocenjevanje skupine ocenjevalcev, ki uporablja številčno lestvico. Uporabljati je treba nomenklaturo pomanjkljivosti.

„Točkovanje“ pomeni razvrščanje po kakovosti, ki poteka na podlagi doseženih točk.

„Ocenjevalne listine“: listine, ki se uporabljajo za beleženje posameznih točk za vsako lastnost in končno razvrstitev proizvoda. (Ta listina se lahko uporabi tudi za zapis kemične sestave.)

3.   PROSTOR ZA OCENJEVANJE

Za nadaljnje informacije glej standarda ISO 8589 in ISO/DIS 22935–2|IDF 99–2, odstavek 7.

Poskrbeti je treba, da na ocenjevalce v prostoru za ocenjevanje ne vplivajo zunanji dejavniki.

V prostoru za ocenjevanje ne sme biti tujih vonjev in mora biti enostaven za čiščenje. Stene morajo biti svetle barve in od njih se svetloba ne sme odbijati.

Prostor za ocenjevanje in njegova osvetlitev morata biti takšna, da ne vplivata na lastnosti ocenjevanih proizvodov.

Prostor mora biti opremljen z ustrezno napravo za uravnavanje temperature za ohranjanje stalne temperature masla. Temperatura masla med ocenjevanjem mora biti 12 °C (±2 °C).

4.   IZBOR OCENJEVALCEV

Ocenjevalec mora poznati proizvode iz masla in biti usposobljen za razvrščanje teh proizvodov v kakovostne razrede na podlagi senzoričnega ocenjevanja. Njegovo/njeno usposobljenost mora redno (najmanj enkrat na leto) oceniti pristojni organ.

4.1   Za podrobnosti o splošnih zahtevah in izločilnih preskusih, ki se lahko uporabijo pred uradno zaposlitvijo novega ocenjevalca, glej ISO/DIS 22935–1|IDF 99–1, odstavek 4 (zaposlovanje) in odstavek 5.1.

Bistveno je, da usposabljanje poteka stalno in da splošna srečanja potekajo redno. Za informacije o usposabljanju skupine ocenjevalcev glej ISO 8586–1.

4.2   Začetno usposabljanje mora vključevati:

—	splošno teorijo in praktičen pomen senzoričnega ocenjevanja,

—	metode, lestvice in opis senzoričnih vtisov,

—	odkrivanje in prepoznavanje senzoričnih lastnosti in posebnih senzoričnih izrazov,

—	osnovno usposabljanje o proizvodnji masla,

—	potrjene reference in primerke, ki lahko ocenjevalcu pomagajo pri opredelitvi posebnih okusov in intenzivnosti okusa v proizvodu.

5.   ZAHTEVE ZA SKUPINO OCENJEVALCEV

Število ocenjevalcev v skupini mora biti neparno, najmanjše število članov je tri. Večina od njih mora biti zaposlena pri pristojnem organu ali pa morajo biti to pristojne osebe, ki niso zaposlene v mlekarski industriji.

Vodja skupine za ocenjevanje je odgovoren za celoten postopek in lahko sodeluje v skupini za ocenjevanje.

Pred ocenjevanjem je treba upoštevati številne dejavnike, da se doseže optimalna uspešnost članov skupine:

—	član ne sme imeti bolezni, ki bi lahko vplivala na njegovo uspešnost; če jo ima, mora zadevnega ocenjevalca v skupini zamenjati nekdo drug,

—	člani morajo z ocenjevanjem začeti pravočasno in poskrbeti, da imajo za ocenjevanje dovolj časa,

—	člani ne smejo uporabljati intenzivno dišečih sredstev, kot so parfum, losjoni po britju, dezodoranti itd., ter ne smejo uživati močno aromatične (npr. zelo začinjene) hrane itd.,

—	člani pol ure pred začetkom ocenjevanja ne smejo kaditi in jesti. Pijejo lahko le vodo.

6.   USPEŠNOST

Vsi ocenjevalci morajo redno sodelovati v skupinah za senzorično ocenjevanje za ohranjanje svoje usposobljenosti. Pogostost bo odvisna od mase in količine masla na enoto časa in je, kadar je to mogoče, vsaj ena skupina za ocenjevanje na mesec.

Višji ocenjevalci morajo vsako leto sodelovati v več skupinah za ocenjevanje in, kadar je to mogoče, vsaj enkrat na tri mesece.

7.   VZORČENJE IN PRIPRAVA VZORCA

Bistveno je, da je identiteta vzorcev med ocenjevanjem prikrita, da se tako prepreči kakršna koli pristranskost. Vzorcem je treba dodeliti šifre.

To je treba organizirati pred ocenjevanjem. Določiti je treba zahtevano temperaturo masla med prevozom v prostor za ocenjevanje (6 °C ± 2 °C).

Kadar se senzorično ocenjevanje izvaja v hladilnicah, se vzorci odvzamejo s pripomočkom za vzorčenje masla. Če pa se ocenjuje maslo iz drugih skladišč, je treba odvzeti najmanj 500 g vzorca. Med ocenjevanjem mora biti temperatura masla 12 °C (±2 °C) (vir: v ISO/DIS 22935–2|IDF 99–2 je temperatura za ocenjevanje masla 14 °C ±2 °C). Velikemu odstopanju se je treba na vsak način izogniti.

8.   OCENJEVANJE VREDNOSTI POSAMEZNIH LASTNOSTI

8.1   Senzorično ocenjevanje se izvaja za naslednje lastnosti: zunanji videz, konsistenca in aroma.

„Zunanji videz“ obsega naslednje značilnosti: barvo, vidno čistost, odsotnost fizičnega onesnaženja in nastajanja plesni ter enotna razporeditev vode. Razporeditev vode se ugotavlja po standardu IDF 112A/1989.

„Konsistenca“ zajema naslednje značilnosti: gostoto, teksturo in čvrstost. Mazavost se lahko spremlja s fizičnimi sredstvi, če to želi posamezna država članica, da bi izpolnila zahteve stranke. Komisija se lahko odloči, da bo v prihodnje uskladila metodologijo.

„Gostota“ je izraz, ki se uporablja za konsistenco proizvoda, ko se zaužije. Ponavadi se povezuje s trdnostjo in mazavostjo ter mora biti enaka v celotnem proizvodu. Tesno je povezana s teksturo in pomeni lastnost proizvoda, da se ne sesede pod lastno težo. Dokazuje jo upor pri rezanju in se lahko meri mehansko ali preveri z jezikom ali prstom.

„Okus“ je lastnost, ki se zazna v ustih, zlasti z okušalnimi brbončicami na jeziku.

„Aroma“ je lastnost, ki se zazna z nosom in vohom.

Znatno odstopanje od priporočene temperature onemogoča zanesljivo ocenjevanje konsistence in okusa. Temperatura je odločilnega pomena.

Če je temperatura zunaj priporočenega območja, je treba ocenjevanje masla preložiti.

8.2   Vsako lastnost je treba senzorično oceniti ločeno. Točke se določijo v skladu s tabelo 1.

8.3   Zaželeno je lahko, da ocenjevalci pred začetkom ocenjevanja skupaj določijo točke enemu ali več referenčnim vzorcem za zunanji videz, konsistenco in okus, da se tako zagotovi enotnost.

8.4   Točkovanje za sprejemljivost proizvoda je naslednje:

Glej del 7 – Nomenklatura in opis meril za točkovanje

	Največje število	Zahtevano število
Zunanji videz	5	4
Konsistenca	5	4
Okus/aroma	5	4

—	Kadar proizvod ne doseže zahtevanega števila točk, je treba pripraviti opis pomanjkljivosti.

—	Število točk, ki so jih posamezni ocenjevalci dali za posamezno lastnost, je treba zabeležiti v ocenjevalni list.

—	Proizvod se sprejme ali zavrne na podlagi odločitve večine.

—	Primeri, ko so razlike med določitvami točk posameznikov za posamezno lastnost večje od ene točke navzgor ali navzdol, se ne smejo pojavljati pogosto (najpogosteje enkrat na 20 vzorcev). Sicer mora usposobljenost skupine ocenjevalcev preveriti njihov vodja.

9.   NADZOR

Vodja skupine ocenjevalcev, ki mora biti uradno zaposlen pri pristojnem organu in je lahko član skupine, mora biti na splošno odgovoren za celoten postopek. V ocenjevalni list mora zapisovati posamezne točke za vsako lastnost in potrditi sprejem ali zavrnitev proizvoda.

10.   NOMENKLATURA

Glej priloženo tabelo 2.

11.   VIRI

FIL-IDF 99C:1997 Senzorično ocenjevanje mlečnih proizvodov z določanjem točk – referenčna metoda.

ISO/DIS 22935|IDF 99 Mednarodni standard za mleko in mlečne proizvode – Senzorična analiza – deli 1–3.

ISO 8586–1 Senzorična analiza – Splošne smernice za izbor, usposabljanje in nadzor ocenjevalcev – del 1.

ISO 8589 Senzorična analiza – Splošne smernice za zasnovo prostorov za ocenjevanje.

FIL-IDF 112A:1989 Maslo – Določitev vrednosti za razporeditev vode.

Tabela 1

Določanje točk maslu

Zunanji videz			Konsistenca			Okus + aroma
Točke	Št. (1)	Opombe	Točke (kakovostni razred)	Št. (1)	Opombe	Točke (kakovostni razred)	Št. (1)	Opombe
5		Zelo dober odličen vzorec najvišja kakovost (enakomerno suho)	5		Zelo dobra odličen vzorec najvišja kakovost (dobro mazavo)	5		Zelo dobra odličen vzorec najvišja kakovost (popolnoma čista fina aroma)
4		Dober  (2) brez očitnih pomanjkljivosti	4	17 18	Dobra  (2) trdo mehko	4		Dobra  (2) brez očitnih pomanjkljivosti
3	1 2 3 4 5 6 7 8	Primeren (manjše pomanjkljivosti) izločena voda neenotno, dvobarvno progasto pisano, marmorirano lisasto izločena maščoba preizrazita barva premalo čvrsto	3	14 15 16 17 18	Primerna (manjše pomanjkljivosti) prhko, krhko, drobljivo testeno, oljnato lepljivo trdo mehko	3	21 22 25 27 33 34 35	Primerna (manjše pomanjkljivosti) nečisto tuja aroma kislo okus po kuhanem, okus po zažganem okus po krmi grenko, trpko preslano
2	1 3 4 5 6 10 11 12	Slab (očitne pomanjkljivosti) izločena voda progasto pisano, marmorirano lisasto izločena maščoba tuji delčki plesnivo neraztopljena sol	2	14 15 16 17 18	Slaba (očitne pomanjkljivosti) prhko, krhko, drobljivo testeno, oljnato lepljivo trdo mehko	2	21 22 23 25 32 33 34 35 36 38	Slaba (očitne pomanjkljivosti) nečisto tuja aroma plesnivo kislo oksidiran okus, kovinski okus okus po krmi grenko, trpko preslano zatohel, gniloben okus okus po kemikalijah
1	1 3 4 5 6 7 9 10 11 12	Zelo slab (velike pomanjkljivosti) izločena voda progasto pisano, marmorirano lisasto izločena maščoba preizrazita barva zrnasto tuji delčki plesnivo neraztopljena sol	1	14 15 16 17 18	Zelo slaba (velike pomanjkljivosti) prhko, krhko, drobljivo testeno, oljnato lepljivo trdo mehko	1	22 24 25 26 28 29 30 31 32 34 35 36 37 38	Zelo slaba (velike pomanjkljivosti) tuja aroma sirasto, sirasto kislo kislo kvasasto okus po plesni žarek okus okus po olju, ribah okus po loju oksidiran okus, kovinski okus grenko, trpko preslano zatohel, gniloben okus okus po sladu okus po kemikalijah

Tabela 2

Tabela pomanjkljivosti masla

I. Zunanji videz

1. izločena voda

2. neenotno, dvobarvno

3. progasto

4. pisano, marmorirano

5. lisasto

6. izločena maščoba

7. preizrazita barva

8. premalo čvrsto

9. zrnasto

10. tuji delčki

11. plesnivo

12. neraztopljena sol

II. Konsistenca

14. prhko, krhko, drobljivo

15. testeno, oljnato

16. lepljivo

17. trdo

18. mehko

III. Aroma in vonj

20. brez arome

21. nečisto (3)

22. tuja aroma

23. plesnivo

24. sirast, mlečno sirasto

25. kislo

26. kvasasto

27. (a) okus po kuhanem

(b) okus po zažganem

28. okus po plesni

29. žarek okus

30. okus po olju, ribah

31. okus po loju

32. (a) oksidiran okus

(b) kovinski okus

33. okus po krmi

34. grenko, trpko

35. preslano

36. zatohel, gniloben okus

37. okus po sladu

38. okus po kemikalijah

---

(1)  Tabela 2.

(2)  Pomanjkljivosti pri oceni „dober“ pomenijo le zelo majhno odstopanje od odličnega vzorca.

(3)  Ta oznaka naj se uporablja čim redkeje in samo v primerih, ko pomanjkljivosti ni mogoče opisati natančneje.

PRILOGA V

(Člen 5)

DOLOČANJE VSEBNOSTI TRIGLICERIDOV ENANTIČNE KISLINE V MASLU, MASLENO-MLEČNI MAŠČOBI IN SMETANI S PLINSKO KROMATOGRAFSKO ANALIZO TRIGLICERIDOV

1.   PODROČJE UPORABE

Ta metoda določa metodo za določanje vsebnosti trigliceridov enantične kisline v maslenem olju, maslu in smetani.

2.   IZRAZI IN OPREDELITEV POJMOV

Vsebnost enantične kisline: vsebnost trigliceridov enantične kisline, ki se ugotavlja s postopkom iz te metode.

Opomba: Vsebnost enantične kisline je za masleno olje in maslo izražena v kilogramih na tono proizvoda, za smetano pa v kilogramih na tono mlečne maščobe.

3.   POSTOPEK

Mlečna maščoba se iz različnih proizvodov ekstrahira v skladu s standardom ISO 14156|IDF 172:2001. Količinsko določanje vsebnosti trigliceridov enantične kisline v ekstrahirani maščobi se določi s kapilarno plinsko kromatografijo. Rezultat, pridobljen za vzorec, se oceni glede na trigliceride kaprojske kisline kot interni standard.

Opomba: Kot ustrezen interni standard se je izkazal tudi tributirin.

4.   REAGENTI

Uporabijo se le reagenti priznane analitske čistosti.

4.1   N-heksan

4.2   Standardni trigliceridi kaprojske kisline z vsaj 99-odstotno čistostjo

4.3   Standardni trigliceridi enantične kisline z vsaj 99-odstotno čistostjo

4.4   Brezvodni natrijev sulfat (Na2SO4)

5.   OPREMA

Običajna laboratorijska oprema in zlasti naslednje:

5.1   Analitska tehtnica s točnostjo 1 mg

5.2   Merilne bučke s prostornino 10 in 20 ml

5.3   Epruvete za centrifugiranje s prostornino 30 ml

5.4   Rotacijski izparilnik

5.5   Sušilnik, ki lahko ohranja temperaturo 50 °C ± 5 °C

5.6   Filtrirni papir, srednje porozen, s premerom približno 15 cm

Oprema za plinsko kromatografijo

5.7.1   Plinski kromatograf z injektorjem z deljenjem vzorca ali brez deljenja vzorca v koloni ali injektorjem za vbrizgavanje v kolono in s plamenskim ionizacijskim detektorjem.

Kolona plinskega kromatografa s stacionarno fazo, ki se je uspešno uporabila za ločevanje trigliceridov (100 % dimetilpolisiloksan ali 5 % fenil- in 95 % metilpolisiloksan). Izberite stacionarno fazo, dolžino kolone (4–15 m), notranji premer (0,22–0,50 mm) in debelino nanosa (0,12 μm ali več) ob upoštevanju laboratorijskih izkušenj in uporabljenega sistema za vbrizgavanje. V vsakem primeru mora izbrana kolona zagotoviti popolno ločevanje vrha topila in trigliceridov kaprojske kisline ter osnovno ločbo med vrhovi trigliceridov kaprojske in enantične kisline. Primeri veljavnih pogojev so navedeni spodaj.

5.7.2.1   Primer veljavnih pogojev pri uporabi injektorja z deljenjem vzorca

—	nosilni plin: helij

—	tlak v glavi kolone: 100 KPa

—	kolona: dolžina 12 m, notranji premer 0,5 mm, debelina nanosa 0,1 μm, kolona iz zlitega silicijevega dioksida

—	stacionarna faza: 100 % dimetilpolisiloksan ali 5 % fenil–95 % dimetilpolisiloksan (za prejšnji HT5)

—	temperatura kolone: začetna temperatura 130 °C se ohranja eno minuto, nato se povečuje po stopnji 20 °C/min do 260 °C ter nato po stopnji 30 °C/min do 360 °C; temperatura 360 °C se ohrani 10 minut

—	temperatura detektorja: 370 °C

—	temperatura injektorja: 350 °C

—	cepitveno razmerje: 1:30

—	količina vbrizganega vzorca: 1 μl.

5.7.2.2   Primer veljavnih pogojev pri uporabi injektorja za vbrizgavanje v kolono

—	nosilni plin: vodik (sistem stalnega pretoka)

—	tlak v glavi kolone: 89 kPa

—	kolona: dolžina 4 m, notranji premer 0,32 mm, debelina nanosa 0,25 μm, kolona iz zlitega silicijevega dioksida

—	stacionarna faza: 5 % fenil, 95 % dimetilpolisiloksan

—	temperatura kolone: začetna temperatura 60 °C se ohranja 2 minuti, nato pa se povečuje po stopnji 35 °C/minuto do 340 °C ter se pri tej temperaturi ohrani 5 minut

—	temperatura detektorja: 350 °C

—	količina vbrizganega vzorca: 1 μl.

5.8   Brizgalka s prostornino 5 μl.

6.   VZORČENJE

Laboratorij mora prejeti vzorec, ki je resnično reprezentativen in ni bil poškodovan ali spremenjen med prevozom ali skladiščenjem.

Vzorčenje ni del metode, ki je opredeljena v tem mednarodnem standardu. Priporočena metoda vzorčenja je navedena v IDF: standard 50C:1995 ali ISO 707–1997 – mleko in mlečni proizvodi – metode vzorčenja

7.   POSTOPEK

7.1   Priprava vzorca in deleža za analizo

V skladu s standardom ISO 14156|IDF 172:2001.

7.1.1   Masleno olje, maslo

7.1.1.1   V pečici raztopite 50–100 g preskusnega vzorca (5.5).

7.1.1.2   Na prepognjen filtrirni papir dodajte 0,5–1,0 g brezvodnega natrijevega sulfata (5.4).

7.1.1.3   Maščobo prefiltrirajte skozi filtrirni papir z brezvodnim natrijevim sulfatom, pri čemer se filtrat zbira v čaši v sušilniku (5.5). Pri dekantiranju stopljenega masla na filtrirni papir bodite pozorni, da se ne prenese serum.

7.1.2   Smetana

7.1.2.1   Preskusni vzorec segrejte na temperaturo 20 °C ± 2 °C.

7.1.2.2   Vzorec temeljito premešajte ali pretresite.

7.1.2.3   Raztopite ustrezno količino preskusnega vzorca, da pridobite 100 ml preskusnega deleža s približno 4-odstotnim masnim deležem maščobe.

7.1.2.4   Kot pri surovem in homogeniziranem mleku (glej standard ISO 14156|IDF 172:2001, odstavek 8.3) ekstrahirajte maščobo iz smetane.

7.1.2.5   V 10-mililitrski merilni bučki (5.2) na 1 mg natančno odmerite 1 g ekstrahirane maščobe. Dodajte 1 ml raztopine 7.2.2. Do oznake 10 ml dolijte n-heksan (4.1) in premešajte.

7.1.2.6   V 10-mililitrsko merilno bučko (5.2) vlijte 1 ml raztopine 7.1.1.2 in razredčite z 10 ml n-heksana (4.1).

7.2   Priprava kalibracijskih standardov

7.2.1   Raztopite 100 mg trigliceridov enantične kisline (4.3) v 10 ml n-heksana (4.1).

7.2.2   Raztopite 100 mg trigliceridov kaprojske kisline (4.2) v 10 ml n-heksana (4.1).

7.2.3   V 10-mililitrsko merilno bučko (5.2) vlijte 1 ml raztopine 7.2.2. Do oznake 10 ml dolijte n-heksan (4.1).

7.2.4   V 10-mililitrsko merilno bučko (5.2) vlijte 1 ml raztopine 7.2.1 in 1 ml raztopine 7.2.2. Do oznake 10 ml dolijte n-heksan (4.1).

7.2.5   V 10-mililitrsko merilno bučko (5.2) vlijte 1 ml raztopine 7.2.4 in dolijte 10 ml n-heksana (4.1).

7.3   Kromatografsko določanje

7.3.1   Dvakrat vbrizgajte 1 μl standardne raztopine 7.2.5.

7.3.2   Vbrizgajte 1 μl vsake preskusne raztopine.

Opomba: Če se uporablja sistem injektorja za vbrizgavanje v kolono, je treba standardno in preskusno raztopino bolj razredčiti.

7.3.3   Postopek 7.3.1 ponovite na vsake 3 vzorce, tako da zajamete vzorce med dve vbrizganji standarda. Rezultati temeljijo na povprečnih odzivnih faktorjih iz standardnih kromatogramov.

8.   IZRAČUN REZULTATOV

Za vsak kromatogram povežite površino vrhov, povezanih s trigliceridi enantične in kaprojske kisline.

Upoštevajte navodila za vsak zajet niz, tj. serijo zajetih vzorcev; standard, ki se vbrizga dvakrat takoj pred njimi, je STD1, standard, ki se vbrizga dvakrat tako po njih, je STD2.

8.1   Kalibracija

8.1.1   Izračunajte odzivni faktor za vsak dvojni STD1, Rf1(a) in Rf1(b)

Rf1 (a) ali (b) = (površina vrha za trigliceride kaprojske kisline/površina vrha za trigliceride enantične kisline) × 100

Izračunajte povprečni odzivni faktor, Rf1

Rf1 = (Rf1 (a) + Rf1 (b)) / 2

8.1.2   Podobno izračunajte povprečni odzivni faktor za STD2, Rf2.

8.1.3   Izračunajte povprečni odzivni faktor, Rf.

Rf = (Rf1 + Rf2) / 2

8.2   Preskusni vzorci

Za vsak kromatogram vzorcev med STD1 in STD2 izračunajte vsebnost enantične kisline, C (kg/t):

C = (površina vrha za trigliceride enantične kisline × Rf × 100)/(površina vrha za trigliceride kaprojske kisline × Wt × 1 000)

kjer je:

—	Wt = masa odvzete maščobe (g),

—	100 = volumen razredčitve za vzorec,

—	1 000 = pretvorbeni faktor (z μg/g v kg/t).

Za vzorce masla upoštevajte vsebnost maščobe v maslu in izračunajte popravljeno vrednost koncentracije, Cmaslo (kg/t masla)

Cmaslo = Cmaščoba × F

kjer je F vsebnost maščobe v maslu.

9.   NATANČNOST

V točki 12 so navedene podrobnosti medlaboratorijskega preskusa masla na podlagi standardov ISO 5725–1 in ISO 5725–2 glede natančnosti metode.

Vrednosti za mejo ponovljivosti in obnovljivosti sta izraženi pri 95-odstotni stopnji verjetnosti ter mogoče ne bosta ustrezali razponom koncentracij in matricam, ki se od danih razlikujejo.

9.1   Ponovljivost

Absolutne razlike med rezultatoma dveh posameznih preskusov, ki sta bila pridobljena po enaki metodi na enakem preskusnem materialu v istem laboratoriju pri istem izvajalcu, ki je uporabljal enako opremo, v kratkem časovnem obdobju, bodo le v največ 5 % primerov večje od 0,35 kg/t.

9.2   Obnovljivost

Absolutne razlike med rezultatoma dveh posameznih preskusov, ki sta bila pridobljena po enaki metodi na enakem preskusnem materialu v različnih laboratorijih pri različnih izvajalcih, ki so uporabljali različno opremo, bodo le v največ 5 % primerov večje od 0,66 kg/t.

10.   DOVOLJENO ODSTOPANJE: SPODNJE MEJE (PRIMER NEZADOSTNIH KOLIČIN)

10.1   Od sledenega proizvoda je treba vzeti tri vzorce, da se preveri pravilno sledenje proizvoda.

10.2   Maslo in zgoščeno maslo

10.2.1   Stopnja vključitve je 11 kg trigliceridov enantične kisline s čistostjo najmanj 95 % na tono masla, tj. 10,45 kg/t.

10.2.2   Rezultati za vse tri vzorce, dobljeni z analizo proizvoda, se uporabijo za preverjanje stopnje in homogenosti vključitve sledila, najnižji od teh rezultatov pa se primerja z naslednjimi mejami:

—	9,51 kg/t (95 % najmanjše stopnje vključitve trigliceridov enantične kisline s 95-odstotno čistostjo, posamezna določitev),

—	6,89 kg/t (70 % najmanjše stopnje vključitve trigliceridov enantične kisline s 95-odstotno čistostjo, posamezna določitev),

—	koncentracija sledila v vzorcu, s katero se doseže najnižji rezultat, se uporabi v zvezi z interpolacijo med 9,51 kg/t in 6,89 kg/t.

10.3   Smetana

10.3.1   Vključitev je 10 kg trigliceridov enantične kisline s čistostjo najmanj 95 % na tono mlečne maščobe, tj. 9,50 kg/t sledene mlečne maščobe.

10.3.2   Rezultati za vse tri vzorce, dobljeni z analizo proizvoda, se uporabijo za preverjanje stopnje homogenosti vključenosti sledila, najnižji od treh rezultatov pa se primerja z naslednjimi mejami:

—	8,60 kg/t (95 % najmanjše stopnje vključitve trigliceridov enantične kisline s 95-odstotno čistostjo, posamezna določitev),

—	6,23 kg/t (70 % najmanjše stopnje vključitve trigliceridov enantične kisline s 95-odstotno čistostjo, posamezna določitev),

—	koncentracija sledila v vzorcu, s katero se doseže najnižji rezultat, se uporabi v zvezi z interpolacijo med 8,60 kg/t in 6,23 kg/t.

11.   DOVOLJENO ODSTOPANJE: ZGORNJE MEJE (V PRIMERU PRESEŽENE KOLIČINE ZA VEČ KOT 20 %)

11.1   Od sledenega proizvoda je treba vzeti tri vzorce, da se preveri pravilno sledenje proizvoda.

11.2   Maslo in zgoščeno maslo

11.2.1   Rezultati treh vzorcev, dobljeni z analizo proizvoda, se uporabijo za preverjanje stopnje in homogenosti vključitve sledila, povprečje teh rezultatov pa se primerja z naslednjimi mejami:

—	zgornja meja je 12,96 kg/t.

11.3   Smetana

11.3.1   Rezultati treh vzorcev, dobljeni z analizo proizvoda, se uporabijo za preverjanje stopnje in homogenosti vključitve sledila, povprečje teh rezultatov pa se primerja z naslednjimi mejami:

—	zgornja meja je 11,82 kg/t.

12.   DODATNI PODATKI: STATISTIČNA ANALIZA REZULTATOV DOLOČITVE TRIENANTOATA V MASLENI MAŠČOBI Z ANALIZO TRIGLICERIDOV.

Za določitev vsebnosti trienantoata v sledenem maslu so bila izvedena štiri medlaboratorijska preskušanja.

Pri prvem testu primerljivosti je sodelovalo devet laboratorijev in specifikacije o analitski metodi niso bile predložene.

Pri drugem testu primerljivosti je sodelovalo deset laboratorijev in uporabljene so bile štiri različne metode:

—	količinska opredelitev metilheptanoata z n-nonanom ali metilnonanoatom kot internim standardom,

—	količinska opredelitev trienantoata s trikaproatom kot internim standardom,

—	količinska opredelitev metileheptanoata s kalibracijskim vzorcem/mešanico,

—	količinska opredelitev metilheptanoata s kalibracijsko mešanico.

Poleg tega sta bila za analizo metilestrov maščobnih kislin (FAME) uporabljena dva različna postopka metiliranja (De Francesco ter Christopherson in Glass).

Glede na dobljene rezultate sta bili za izvajanje tretjega testa primerljivosti izbrani dve metodi:

—	količinska opredelitev metilheptanoata z n-nonanom ali metilnonanoatom kot internim standardom,

—	količinska opredelitev trienantoata s trikaproatom kot internim standardom.

Rezultati sedmih laboratorijev so pokazali, da je metoda FAME povzročila večjo spremenljivost, zato so sklenili, da se uporabi le določitev trienantoata kot triglicerida po postopku količinske opredelitve q za trienantoat z uporabo trikaproata kot internega standarda. Poleg tega je treba analizo trigliceridov izvajati s kapilarno kolono.

Pri četrtem testu primerljivosti so bili obravnavani štirje vzorci (A, B, C, D) in devet laboratorijev je predložilo rezultate (tabele 1–2).

Dva laboratorija (DE in UE) sta analizirala vzorce z metodo FAME.

Zaradi manj laboratorijev je bil statistični izračun narejen za celoten sklop (sliki 1 in 2) podatkov, vključno z rezultati FAME, in za podatke, dobljene z analizo TG.

Preskusi za ubežnike:

—	Vzorec A. Dixonov, Cochranov in Grubbsov preskus na ravni 1 in 5 % so pokazali enega laboratorijskega ubežnika.

—	Vzorec B. Grubbsov preskus na ravni 5 % je pokazal enega laboratorijskega ubežnika.

—	Vzorec C. Dixonov in Grubbsov preskus na ravni 1 in 5 % sta pokazala enega laboratorijskega ubežnika.

—	Vzorec D. Dixonov in Grubbsov preskus na ravni 1 in 5 % sta pokazala enega laboratorijskega ubežnika.

Ubežnik je bil izključen iz izračuna.

Pomembno je opozoriti, da rezultati, pridobljeni z metodo FAME, pri opravljenih preskusih nikoli niso veljali za ubežnike.

Parametri natančnosti

Tabeli 1 in 2 prikazujeta rezultate vseh laboratorijev in parametrov natančnosti, izračunanih ob sprejemljivem številu (8) laboratorijev, vendar ti žal niso pridobljeni z enako analitsko metodo.

Tabeli 3 in 4 prikazujeta rezultate, ki so nastali le z metodo TG in ustreznimi parametri natančnosti. Sprejemljivost teh parametrov je pogojena s sprejemljivostjo majhnega števila laboratorijev (6).

Sliki 2 in 3 prikazujeta trend Sr in SR, izračunan za štiri vzorce dveh navedenih sklopov podatkov.

Tabela 5 prikazuje vrednosti Sr in SR z ustreznimi združenimi vrednostmi ter celotnima parametroma r in R.

Izračunana je bila tudi kritična razlika za 95-odstotno verjetnostno stopnjo.

Tabela 1

Statistični rezultati metod TG in FAME*

Vzorec A		R1	R2	Povprečje	Št. laboratorijev po izločitvi ubežnikov	8
RENNES	FR1	11,0	11,1	11,1	Št. ubežnikov	1
RIKILT	NL	11,2	11,2	11,2	Ubežniki	DК
ZPLA	DE*	11,6	11,8	11,7	Povprečna vrednost	11,3
ADAS	GB	11,4	11,2	11,3	Dejanska vrednost	11,0
CNEVA	FR2	11,4	11,4	11,4	Standardni odmik ponovljivosti (Sr)	0,09
LODI	IT	11,1	11,3	11,2	Relativni stand. odmik ponovljivosti (RSDr %)	0,80
EELA	FI	11,3	11,2	11,3	Ponovljivost r (95 %)	0,26
ISPRA	UE*	11,0	11,0	11,0	Relativna ponovljivost r %	2,24
D.V.F.A.	DK	13,3	11,8	12,6	Standardni odmik obnovljivosti (SR)	0,23
					Relativni stand. odmik obnovljivosti (RSDR %)	2,04
					Obnovljivost R (95 %)	0,84
					Relativna obnovljivost R %	5,71
Vzorec B		R1	R2	Povprečje	Št. laboratorijev po izločitvi ubežnikov	8
RENNES	FR1	12,7	12,8	12,8	Št. ubežnikov	1
RIKILT	NL	13,5	13,3	13,4	Ubežniki	DK
ZPLA	DE*	14,0	13,8	13,9	Povprečna vrednost	13,4
ADAS	GB	13,4	13,5	13,5	Dejanska vrednost	13,5
CNEVA	FR2	13,3	13,4	13,4	Standardni odmik ponovljivosti (Sr)	0,14
LODI	IT	13,9	13,5	13,7	Relativni stand. odmik ponovljivosti (RSDr %)	1,04
EELA	FI	13,4	13,2	13,3	Ponovljivost r (95 %)	0,40
ISPRA	UE*	13,2	13,3	13,3	Relativna ponovljivost r %	2,91
D.V.F.A.	DK	14,1	14,8	14,5	Standardni odmik obnovljivosti (SR)	0,35
					Relativni stand. odmik obnovljivosti (RSDR %)	2,61
					Obnovljivost R (95 %)	0,99
					Relativna obnovljivost R %	7,31

Tabela 2

Statistični rezultati metod TG in FAME*

Vzorec C		R1	R2	Povprečje	Št. laboratorijev po izločitvi ubežnikov	8
RENNES	FR1	8,9	9,2	9,1	Št. ubežnikov	1
RIKILT	NL	9,2	9,3	9,3	Ubežniki	DK
ZPLA	DE*	9,2	9,4	9,3	Povprečna vrednost	9,3
ADAS	GB	9,5	9,3	9,4	Dejanska vrednost	9,3
CNEVA	FR2	9,4	9,4	9,4	Standardni odmik ponovljivosti (Sr)	0,14
LODI	IT	9,2	9,5	9,4	Relativni stand. odmik ponovljivosti (RSDr %)	1,50
EELA	FI	9,4	9,6	9,5	Ponovljivost r (95 %)	0,40
ISPRA	UE*	9,4	9,3	9,4	Relativna ponovljivost r %	4,20
D.V.F.A.	DK	10,7	10,9	10,8	Standardni odmik obnovljivosti (SR)	0,17
					Relativni stand. odmik obnovljivosti (RSDR %)	1,82
					Obnovljivost R (95 %)	0,47
					Relativna obnovljivost R %	5,10
Vzorec D		R1	R2	Povprečje	Št. laboratorijev po izločitvi ubežnikov	8
RENNES	R1	1,6	1,6	1,6	Št. ubežnikov	1
RIKILT	NL	2,1	2,1	2,1	Ubežniki	DK
ZPLA	DE*	2,3	2,3	2,3	Povprečna vrednost	2,1
ADAS	GB	2,1	2,2	2,2	Dejanska vrednost	2,1
CNEVA	FR2	2,1	2,1	2,1	Standardni odmik ponovljivosti (Sr)	0,08
LODI	IT	2,2	1,9	2,1	Relativni stand. odmik ponovljivosti (RSDr %)	3,81
EELA	FI	2,3	2,3	2,3	Ponovljivost r (95 %)	0,22
ISPRA	UE*	2,3	2,3	2,3	Relativna ponovljivost r %	10,67
D.V.F.A.	DK	3,4	2,9	3,2	Standardni odmik obnovljivosti (SR)	0,24
					Relativni stand. odmik obnovljivosti (RSDR %)	11,43
					Obnovljivost R (95 %)	0,67
					Relativna obnovljivost R %	32,00

Tabela 3

Statistični rezultati metod TG in FAME*

Vzorec A		R1	R2	Povprečje	Št. laboratorijev po izločitvi ubežnikov	6
RENNES	FR1	11,0	11,1	11,1	Št. ubežnikov	1
RIKILT	NL	11,2	11,2	11,2	Ubežniki	DК
ADAS	GB	11,4	11,2	11,3	Povprečna vrednost	11,2
CNEVA	FR2	11,4	11,4	11,4	Dejanska vrednost	11,0
LODI	IT	11,1	11,3	11,2	Standardni odmik ponovljivosti (Sr)	0,09
EELA	FI	11,3	11,2	11,3	Relativni stand. odmik ponovljivosti (RSDr %)	0,80
D.V.F.A.	DK	13,3	11,8	12,6	Ponovljivost r (95 %)	0,25
					Relativna ponovljivost r %	2,24
					Standardni odmik obnovljivosti (SR)	0,13
					Relativni stand. odmik obnovljivosti (RSDR %)	1,16
					Obnovljivost R (95 %)	0,36
					Relativna obnovljivost R %	3,25
Vzorec B		R1	R2	Povprečje	Št. laboratorijev po izločitvi ubežnikov	6
RENNES	FR1	12,7	12,8	12,8	Št. ubežnikov	1
RIKILT	NL	13,5	13,3	13,4	Ubežniki	DК
ADAS	GB	13,4	13,5	13,5	Povprečna vrednost	13,3
CNEVA	FR2	13,3	13,4	13,4	Dejanska vrednost	13,5
LODI	IT	13,9	13,5	13,7	Standardni odmik ponovljivosti (Sr)	0,15
EELA	FI	13,4	13,2	13,3	Relativni stand. odmik ponovljivosti (RSDr %)	1,13
D.V.F.A.	DK	14,1	14,8	14,5	Ponovljivost r (95 %)	0,42
					Relativna ponovljivost r %	3,16
					Standardni odmik obnovljivosti (SR)	0,33
					Relativni stand. odmik obnovljivosti (RSDR %)	2,48
					Obnovljivost R (95 %)	0,93
					Relativna obnovljivost R %	6,94

Tabela 4

Statistični rezultati metode TG

Vzorec C		R1	R2	Povprečje	Št. laboratorijev po izločitvi ubežnikov	6
RENNES	FR1	8,9	9,2	9,1	Št. ubežnikov	1
RIKILT	NL	9,2	9,3	9,3	Ubežniki	DК
ADAS	GB	9,5	9,3	9,4	Povprečna vrednost	9,3
CNEVA	FR2	9,4	9,4	9,4	Dejanska vrednost	9,3
LODI	IT	9,2	9,5	9,4	Standardni odmik ponovljivosti (Sr)	0,15
EELA	FI	9,4	9,6	9,5	Relativni stand. odmik ponovljivosti (RSDr %)	1,61
D.V.F.A.	DK	10,7	10,9	10,8	Ponovljivost r (95 %)	0,42
					Relativna ponovljivost r %	4,51
					Standardni odmik obnovljivosti (SR)	0,19
					Relativni stand. odmik obnovljivosti (RSDR %)	2,04
					Obnovljivost R (95 %)	0,53
					Relativna obnovljivost R %	5,71
Vzorec D		R1	R2	Povprečje	Št. laboratorijev po izločitvi ubežnikov	6
RENNES	FR1	1,6	1,6	1,6	Št. ubežnikov	1
RIKILT	NL	2,1	2,1	2,1	Ubežniki	DK
					Povprečna vrednost	2,1
ADAS	GB	2,1	2,2	2,2	Dejanska vrednost	2,1
CNEVA	FR2	2,1	2,1	2,1	Standardni odmik ponovljivosti (Sr)	0,09
LODI	IT	2,2	1,9	2,1	Relativni stand. odmik ponovljivosti (RSDr %)	4,29
EELA	FI	2,3	2,3	2,3	Ponovljivost r (95 %)	0,26
D.V.F.A.	DK	3,4	2,9	3,2	Relativna ponovljivost r %	12,01
					Standardni odmik obnovljivosti (SR)	0,25
					Relativni stand. odmik obnovljivosti (RSDR %)	11,90
					Obnovljivost R (95 %)	0,69
					Relativna obnovljivost R %	33,32

Tabela 5

Ponovljivost in obnovljivost (s FAME)

	Št. laboratorijev	Ubežnik	Ponovljivost Sr (95 %)	Obnovljivost SR (95 %)
Vzorec A	8	1	0,09	0,23
Vzorec B	8	1	0,14	0,35
Vzorec C	8	1	0,14	0,17
Vzorec D	8	1	0,08	0,24
Združena vrednost			0,116	0,256
			R	R
Združena vrednost* 2,8			0,324	0,716
CrD95 = 0,40 Najmanjša čistost, določena za trienantoat = 95 % Najmanjša mejna vrednost, določena za trienantoat v masleni maščobi = 11 kg/t Ob upoštevanju kritične razlike za 95-odstotno verjetnostno stopnjo povprečje dveh rezultatov ni manjše kot:   v primeru vključitve 95-odstotno čistega trienantoata 10,05 kg/t.

Ponovljivost in obnovljivost (brez FAME)

	Št. laboratorijev	Ubežnik	Ponovljivost Sr (95 %)	Obnovljivost SR (95 %)
Vzorec A	6	1	0,09	0,13
Vzorec B	6	1	0,15	0,33
Vzorec C	6	1	0,15	0,19
Vzorec D	6	1	0,09	0,25
Združena vrednost			0,124	0,237
			r	R
Združena vrednost* 2,8			0,347	0,663
CrD95 = 0,36 Najmanjša čistost, določena za trienantoat = 95 %. Najmanjša mejna vrednost, določena za trienantoat v masleni maščobi = 11 kg/t. Ob upoštevanju kritične razlike za 95-odstotno verjetnostno stopnjo povprečje dveh rezultatov ni manjše kot:   v primeru vključitve 95-odstotno čistega trienantoata 10,09 kg/t.

Slika 1 (1)

Rezultati preskusa: Vzorec A

Rezultati preskusa: Vzorec B

Rezultati preskusa: Vzorec C

Rezultati preskusa: Vzorec D

Slika 2

Standardni odmik ponovljivosti in obnovljivosti na različnih stopnjah (TG+FAME)

Slika 3

Standardni odmik ponovljivosti in obnovljivosti na različnih stopnjah (TG)

Slika 4

Primer z injektorjem za vbrizgavanje v kolon

---

(1)  = Metoda FAME.

PRILOGA VI

(Člen 5)

DOLOČITEV VSEBNOSTI VANILINA V ZGOŠČENEM MASLU, MASLU ALI SMETANI S TEKOČINSKO KROMATOGRAFIJO VISOKE LOČLJIVOSTI

1.   NAMEN IN PODROČJE UPORABE

Metoda opisuje postopek za količinsko določanje vanilina v zgoščenem maslu, maslu ali smetani.

2.   POSTOPEK

Ekstrakcija znane količine vzorca z mešanico izopropanola/etanola/acetonitrila (1:1:2). Sedimentacija večine maščobe z ohladitvijo med –15 °C in –20 °C, ki ji sledi centrifugiranje.

Po razredčenju z vodo sledi določitev vsebnosti vanilina s tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti (HPLC).

3.   OPREMA

Običajna laboratorijska oprema, zlasti naslednja:

3.1   Zamrzovalnik, ki deluje pri temperaturnem razponu –15 °C do –20 °C

3.2   Brizgalke z razpoložljivo prostornino 2 ml

3.3   Membranski mikrofiltri z velikostjo luknjic 0,45 μm, odporni na raztopino, ki vsebuje 5 % ekstrakcijske raztopine (4.4)

3.4   Sistem za tekočinsko kromatografijo, ki vsebuje črpalko (pretok 1,0 ml/min), injektor (z injekcijsko prostornino 20 μl, samodejni ali ročni), UV-detektor (ki deluje pri 306 nm, 0,01 AU celotne lestvice), zapisovalnik ali integrator in grelnik kolone, ki deluje pri 25 °C

3.5   Analitska kolona (250 mm × 4,6 mm ID), napolnjena z LiChrospherjem RP 18 (Merck, 5 μm) ali enakovrednim polnilom

3.6   Varovalna kolona (pribl. 20 mm × 3 mm ID), suho polnjena z LiChrospherjem RP 18 (5 do 10 μm) ali enakovrednim polnilom

3.7   Centrifuga, ki deluje pri 2 000 rpm.

4.   REAGENTI

Vsi uporabljeni reagenti morajo biti priznane analitske kakovosti.

4.1   Izopropanol

4.2   Etanol 96 % (v/v)

4.3   Acetonitril

4.4   Ekstrakcijska raztopina

Pripravite zmes izopropanola (4.1), etanola (4.2) in acetonitrila (4.3) v razmerju 1:1:2 (v/v).

Vanilin (4-hidroksi-3-metoksibenzaldehid) ≥ 98 %

4.5.1   Osnovna raztopina vanilina (= 500 μg/ml)

V 100-mililitrsko merilno bučko natehtajte približno 50 mg (CM mg) vanilina (4.5) na 0,1 mg natančno, dodajte 25 ml ekstrakcijske raztopine (4.4) in dopolnite z vodo.

4.5.2   Standardna raztopina vanilina (= 10 μg/ml)

V 250-mililitrsko merilno bučko odpipetirajte 5 ml osnovne raztopine vanilina (4.5.1) in dopolnite z vodo.

4.5.3   Metanol, HPLC-čistosti

4.5.4   Ledocetna kislina

4.5.5   Voda, HPLC-čistosti

4.5.6   Mobilna faza HPLC

V 1 000-mililitrski merilni bučki zmešajte 300 ml metanola (4.5.3) s približno 500 ml vode (4.5.5) in 20 ml ocetne kisline (4.5.4) ter dopolnite z vodo (4.5.5). Zmes prefiltrirajte skozi filter 0,45 μm (3.3).

5.   POSTOPEK

5.1   Priprava preskusnega vzorca

5.1.1   Maslo

Maslo segrevajte toliko časa, da se začne taliti. Maslo se na posameznih mestih ne sme pregreti prek 30 °C. V nobenem primeru se ne sme ločiti v dve fazi. Ko vzorec postane dovolj plastičen, ga homogenizirajte z mešanjem. Maslo mešajte 15 s, preden vzamete vzorec. V 100-mililitrsko merilno bučko natehtajte približno 5 g (SM g) masla na 1 mg natančno.

5.1.2   Zgoščeno maslo

Tik pred vzorčenjem postavite posodo z zgoščenim maslom v sušilnik, segret na 40 do 50 °C, dokler se maslo popolnoma ne stali. Vzorec premešajte z vrtenjem ali mešanjem, preprečite nastajanje zračnih mehurčkov zaradi premočnega mešanja. V 100-mililitrsko merilno bučko natehtajte na 1 mg natančno približno 4 g (SM g) zgoščenega masla.

5.1.3   Smetana

Vzorec segrejte v vodni kopeli ali inkubatorju pri temperaturi 35 °C do 40 °C. Maščobo enakomerno razporedite z vrtenjem ali, če je treba, z mešanjem. Vzorec na hitro ohladite na 20 ± 2 °C. Vzorec mora biti videti homogen; sicer je treba postopek ponoviti. V 100-mililitrsko merilno bučko natehtajte približno 10 g (SM g) smetane na 1 mg natančno.

5.2   Priprava preskusne raztopine

Preskusnemu deležu vzorca (5.1.1, 5.1.2 ali 5.1.3) dodajte približno 75 ml ekstrakcijske raztopine (4.4), približno 15 minut dobro mešajte ali stresajte, nato dolijte ekstrakcijsko raztopino (4.4). Približno 10 ml tega ekstrakta prenesite v epruveto z zamaškom. Postavite epruveto v zamrzovalnik (3.1) in jo pustite v njem približno 30 minut. Centrifugirajte hladni ekstrakt pet minut pri približno 2 000 vrtljajih na minuto in ga takoj oddekantirajte. Pustite, da se odcejena raztopina ohladi na temperaturo okolice. Odpipetirajte 5 ml oddekantirane raztopine v 100-mililitrsko merilno bučko in dopolnite vodo. Prefiltrirajte alikvot skozi membranski mikrofilter (3.3) z brizgalko (3.2). Filtrat je pripravljen za HPLC-določitev.

5.3   Kalibracija

Odpipetirajte 5 ml standardne raztopine vanilina (4.5.2) v 100-mililitrsko merilno bučko. Dodajte 5 ml ekstrakcijske raztopine (4.4) in dopolnite z vodo do oznake. Ta raztopina vsebuje 0,5 μg/ml vanilina.

5.4   HPLC-določitev

Pustite kromografski sistem približno 30 minut, da se umiri. Vbrizgajte standardno raztopino (5.3). To ponavljate, dokler razlika na površini vrha ali višini vrha med dvema zaporednima vbrizganjema ne znaša manj kot 2 %. Pri opisanih pogojih znaša retenzijski čas vanilina približno 9 minut. Opravite dve vzporedni analizi standardne raztopine (5.3) z vbrizganjem 20 μl. Vbrizgajte 20 μl preskusne raztopine (5.2). Določite površino ali višino dobljenega vrha vanilina. Ponovite vzporedno vbrizganje standardne raztopine (5.3) po 10 vbrizganjih preskusnih vzorcev (5.2).

6.   IZRAČUN REZULTATOV

Izračunajte povprečno površino vrha (ali višino) (AC) vrhov za vanilin v povezavi z določenim številom vzporednih vbrizganj za vsako serijo preskusne raztopine (skupaj štiri površine ali višine).

Izračunajte odzivni faktor (R):

kjer je CM masa vanilina v mg (4.5.1).

Vsebnost (mg/kg) vanilina (C) v preskusnem vzorcu se izračuna:

kjer je:

AS	=	površina ali višina vrha vanilina pri preskusnem vzorcu
SM	=	masa preskusnega vzorca v g (5.1.1, 5.1.2 ali 5.1.3)

Opomba: Pri analizi vanilina v smetani mora biti koncentracija sledila izražena v mg sledila/kg mlečne maščobe. To se naredi tako, da se C pomnoži s 100/f, kjer je f vsebnost maščobe v smetani, izražena v odstotkih (m/m).

20	=	faktor, ki upošteva redčenje standardnega in preskusnega vzorca
0,96	=	korekcijski faktor za vsebnost maščobe pri prvem redčenju preskusnega vzorca

Opomba: Opomba: Namesto površine vrha se lahko uporabi višina vrha (glej 8.3).

7.   TOČNOST METODE

7.1   Ponovljivost (r)

Razlika med rezultatoma dveh določitev, ki ju isti izvajalec izvede v najkrajšem možnem časovnem presledku z isto opremo na enakem preskusnem materialu, ne sme presegati 16 mg/kg.

7.2   Obnovljivost (R)

Razlika med rezultatoma dveh določitev izvajalcev v različnih laboratorijih z različno opremo na enakem preskusnem materialu ne sme presegati 27 mg/kg.

8.   DOVOLJENO ODSTOPANJE

8.1   Od sledenega proizvoda je treba vzeti tri vzorce, da se preveri homogenost.

Sledilo, pridobljeno iz vanilina ali sintetičnega vanilina

8.2.1   Stopnja vključitve za 4-hidroksi-3-metoksibenzaldehid je 250 g na tono zgoščenega masla ali masla. Pri sledenju smetane znaša stopnja vključitve 250 g na tono mlečne maščobe.

8.2.2   Rezultati za vse tri vzorce, dobljeni z analizo proizvoda, se uporabijo za preverjanje stopnje in homogenosti vključitve sledila, najnižji od teh rezultatov pa se primerja z naslednjimi mejami:

—	220,8 mg/kg (95 % od najmanjše stopnje vključitve),

—	158,3 mg/kg (70 % od najmanjše stopnje vključitve).

Koncentracija sledila v vzorcu, s katero se doseže najnižji rezultat, se uporabi v zvezi z interpolacijo med 220,8 mg/kg in 158,3 mg/kg.

Sledila, dobljena izključno iz vanilijevih zrn ali njihovih integralnih ekstraktov:

8.3.1   Stopnja vključitve za 4-hidroksi-3-metoksibenzaldehid je 100 g na tono zgoščenega masla ali masla. Pri sledenju smetane znaša stopnja vključitve 100 g na tono mlečne maščobe.

8.3.2   Rezultati za vse tri vzorce, dobljeni z analizo proizvoda, se uporabijo za preverjanje stopnje in homogenosti vključitve sledila, najnižji od teh rezultatov pa se primerja z naslednjimi mejami:

—	78,3 mg/kg (95 % od najmanjše stopnje vključitve),

—	53,3 mg/kg (70 % od najmanjše stopnje vključitve).

Koncentracija sledila v vzorcu, s katero se doseže najnižji rezultat, se uporabi v zvezi z interpolacijo med 78,3 mg/kg in 53,3 mg/kg.

9.   OPOMBE

9.1   Izkoristek dodanega vanilina pri stopnji 250 mg/kg maslenega olja se giblje med 97,0 in 103,8. Povprečna ugotovljena vsebnost je znašala 99,9 % s standardnim odmikom 2,7 %.

9.2   Standardna raztopina vsebuje 5 % ekstrakcijske raztopine, ki uravnava širjenje vrha, ki ga povzroči 5-odstotna ekstrakcijska raztopina preskusnih vzorcev. To omogoča količinsko opredelitev z višino vrha.

9.3   Analiza temelji na linearni kalibracijski krivulji s presečiščem 0.

9.4   Pri ustreznih redčenjih standardne raztopine (4.5.2) je treba preveriti linearnost pri prvem izvajanju analize in nato v rednih časovnih presledkih ali po spremembah ali popravilu HPLC-opreme. Vanilin se lahko razgradi v vanilinsko kislino, divanilin in druge spojine z delovanjem lastnih encimov v nepasterizirani smetani ali proizvodih iz nje.

PRILOGA VII

(Člen 5)

DOLOČITEV ETIL ESTRA BETA-APO-8’-KAROTENSKE KISLINE V ZGOŠČENEM MASLU IN MASLU S SPEKTROFOTOMETRIJO

1.   Namen in področje uporabe

Metoda opisuje postopek za količinsko določanje etil estra beta-apo-8'-karotenske kisline (apo-karotenski ester) v zgoščenem maslu in maslu. Apo-karotenski ester je vsota vseh snovi, prisotnih v dekstraktu vzorcev, dobljenih pri pogojih, opisanih v postopku, ki absorbirajo svetlobo pri 440 nm.

2.   Postopek

Maslena maščoba se raztopi v petroletru, absorbanca pa se meri pri 440 nm. Vsebnost apo-karotenskega estra se določi s sklicevanjem na eksterni standard.

3.   Oprema

3.1   Pipete – polnilne, s prostornino 0,25, 0,50, 0,75 in 1,0 ml

3.2   Spektrofotometer – primeren za uporabo pri 440 nm (in 447–449 nm) in opremljen s kiveto, dolgo 1 cm

3.3   Merilni bučki, 20 ml in 100 ml

3.4   Analitska tehtnica z občutljivostjo 0,1 mg, ki lahko tehta na 1 mg natančno, s čitljivostjo 0,1 mg

3.5   Sušilnik, 45 °C ± 1 °C

3.6   Filtri za hitro filtriranje brez pepela

4.   Reagenti

Uporabljeni reagenti morajo biti priznane analitske kakovosti.

Suspenzija apo-karotenskega estra (približno 20 %)

4.1.1   Ugotovite vsebnost suspenzije na naslednji način:

Segrejte suspenzijo na temperaturi med 45 °C in 50 °C ter homogenizirajte v neodprti prvotni posodi. V merilno bučko (100 ml) natehtajte približno 400 mg, raztopite jo v 20 ml kloroforma (4.4) in prostornino dopolnite s cikloheksanom (4.5). Razredčite 5 ml te raztopine na 100 ml s cikloheksanom (raztopina A). Razredčite 5 ml raztopine A na 100 ml s cikloheksanom. Merite absorbanco pri 447–449 nm (izmeri se največja vrednost proti cikloheksanu kot slepemu vzorcu v 1-centimetrski kiveti).

Vsebnost apo-karotenskega estra P (%) = (Absmaks × 40 000) / (Msusp × 2 550) ali: (Absmaks / 2 550) × (100 / 5) × (100 / 5) × (100 / Msusp)

Absmaks	=	največja absorbanca merjene raztopine
Msusp	=	masa suspenzije (g)
2 550	=	referenčna vrednost Abs (1 %, 1 cm)
P	=	čistost (vsebnost) suspenzije (%)

Opomba: Suspenzija apo-karotenskega estra je občutljiva na zrak, toploto in svetlobo. V zaprti prvotni posodi (zaprta pod dušikom) in na hladnem mestu se lahko hrani približno eno leto. Po odprtju je treba vsebino čim prej porabiti.

4.1.2   Standardna raztopina apo-karotenskega estra, pribl. 0,2 mg/ml

Natehtajte na 1 mg natančno približno 0,100 g suspenzije apo-karotenskega estra (4.1.1) (W), raztopite jo v petroletru (4.2), količinsko jo prenesite v merilno bučko s prostornino 100 ml in jo dopolnite s petroletrom do oznake.

Ta raztopina vsebuje (W x P)/10 mg/ml apo-karotenskega estra.

Opomba: Raztopino je treba hraniti v hladnem in temnem prostoru. Neporabljeno raztopino po enem mesecu zavrzite.

4.2   Petroleter (40–60 °C)

4.3   Natrijev sulfat, brezvodni, v zrnih, predhodno sušen dve uri pri 102 °C

4.4   Kloroform

4.5   Cikloheksan

5.   Postopek

5.1   Priprava preskusnega vzorca

5.1.1   Zgoščeno maslo

Vzorec raztalite v sušilniku pri temperaturi približno 45 °C.

5.1.2   Maslo

Vzorec raztalite v sušilniku pri približno 45 °C in prefiltrirajte reprezentativno količino skozi filter, ki vsebuje približno 10 g brezvodnega natrijevega sulfata (4.3), v okolici, zaščiteni pred močno naravno in umetno svetlobo, in ga hranite pri temperaturi 45 °C. Zberite primerno količino maslene maščobe.

5.2   Določitev

Natehtajte na 1 mg natančno približno 1 g zgoščenega masla (ali izločene maslene maščobe (5.1.2)), (M). Količinsko ga prenesite v 20-mililitrsko (V) merilno bučko s petroletrom (4.2), dopolnite do oznake in temeljito premešajte.

Prenesite alikvot v 1-centimetrsko kiveto in izmerite absorbanco pri 440 nm proti petroletru kot slepemu vzorcu. Določite koncentracijo apo-karotenskega estra v raztopini glede na umeritveno krivuljo (C μ/ml).

5.3   Kalibracija

Odpipetirajte 0, 0,25, 0,5, 0,75 in 1,0 ml standardne raztopine apo-karotenskega estra (4.1.2) v pet 100-mililitrskih merilnih bučk. Dopolnite celotno prostornino s petroletrom (4.2) in zmešajte.

Približne koncentracije raztopin segajo od 0 do 2 μg/ml, točno pa se izračunajo glede na koncentracijo standardne raztopine (4.1.2) (W × P)/10 mg/ml. Izmerite absorbance pri 440 nm proti slepemu vzorcu petroletra (4.2).

Nanesite vrednosti absorbance na os y, koncentracijo apo-karotenskega estra pa na os x. Izračunajte enačbo umeritvene krivulje.

6.   Izračun rezultatov

6.1   Vsebnost apo-karotenskega estra, izražena v mg/kg, je podana z:

Zgoščeno maslo: (C × V)/M

maslo: 0,82 (C × V)M

kjer je:

C	=	vsebnost apo-karotenskega estra, μg/ml, odčitana na umeritveni krivulji (5.3)
V	=	prostornina (ml) preskusne raztopine (5.2)
M	=	masa (g) preskusnega deleža (5.2)
0,82	=	korekcijski faktor za vsebnost maslene maščobe v maslu

7.   Točnost metode

7.1   Ponovljivost

7.1.1   Analiza masla

Razlika med rezultatoma dveh določitev, ki ju isti izvajalec izvede v najkrajšem možnem časovnem presledku z isto opremo na enakem preskusnem materialu, ne sme presegati 1,4 mg/kg.

7.1.2   Analiza zgoščenega masla

Razlika med rezultatoma dveh določitev, ki ju isti izvajalec izvede v najkrajšem možnem časovnem presledku z isto opremo na enakem preskusnem materialu, ne sme presegati 1,6 mg/kg.

7.2   Obnovljivost

7.2.1   Analiza masla

Razlika med rezultatoma dveh določitev izvajalcev v različnih laboratorijih z različno opremo na enakem preskusnem materialu ne sme presegati 4,7 mg/kg.

7.2.   2 Analiza zgoščenega masla

Razlika med rezultatoma dveh določitev izvajalcev v različnih laboratorijih z različno opremo na enakem preskusnem materialu ne sme presegati 5,3 mg/kg.

7.3   Vir podatkov natančnosti

Podatki natančnosti so bili določeni s preskusom leta 1995, pri katerem je sodelovalo 11 laboratorijev in 12 sledenih vzorcev (šest slepih vzporednih izvajanj) za maslo in 12 sledenih (šest slepih vzporednih analiz) za zgoščeno maslo.

8.   Dovoljeno odstopanje

8.1   Od sledenega proizvoda je treba vzeti tri vzorce, da se preveri pravilno sledenje proizvoda.

8.2   Maslo

8.2.1   Stopnja vključitve za maslo znaša ob upoštevanju absorbance ozadja 22 mg/kg.

8.2.2   Rezultati za vse tri vzorce, dobljeni z analizo proizvoda, se uporabijo za preverjanje stopnje in homogenosti vključitve sledila, najnižji od teh rezultatov pa se primerja z naslednjimi mejami:

—	17,7 mg/kg (95 % od najmanjše stopnje vključitve),

—	12,2 mg/kg (70 % od najmanjše stopnje vključitve).

Koncentracija sledila v vzorcu, s katero se doseže najnižji rezultat, se uporabi v zvezi z interpolacijo med 17,7 mg/kg in 12,2 mg/kg.

8.3   Zgoščeno maslo

8.3.1   Stopnja vključitve za zgoščeno maslo ob upoštevanju absorbance ozadja znaša 24 mg/kg

Rezultati za vse tri vzorce, dobljeni z analizo proizvoda, se uporabijo za preverjanje stopnje in homogenosti vključitve sledila, najnižji od teh rezultatov pa se primerja z naslednjimi mejami:

—	19,2 mg/kg (95 % od najmanjše stopnje vključitve),

—	13,2 mg/kg (70 % od najmanjše stopnje vključitve).

Koncentracija sledila vzorca, ki pokaže najnižji rezultat, se uporabi v zvezi z interpolacijo med 19,2 mg/kg in 13,2 mg/kg.

PRILOGA VIII

(Člen 5)

DOLOČITEV SITOSTEROLA ALI STIGMASTEROLA V MASLU ALI ZGOŠČENEM MASLU S KAPILARNO-PLINSKO KROMATOGRAFIJO

1.   NAMEN IN PODROČJE UPORABE

Metoda opisuje postopek za količinsko določanje sitosterola ali sigmasterola v maslu in zgoščenem maslu. Za sitosterol se vzame vsota β-sitosterola in 22-dihidro-β-sitosterola, za druge sitosterole se predpostavlja, da so nepomembni.

2.   POSTOPEK

Maslo ali zgoščeno maslo se umili v etanolski raztopini kalijevega hidroksida, snovi, ki jih ni mogoče umiliti, se ekstrahirajo z dietiletrom.

Steroli se preoblikujejo v trimetil-silil etre in se analizirajo s kapilarno-kolonsko plinsko kromatografijo glede na interni standard/betulin.

3.   OPREMA

3.1   150-mililitrska bučka za umiljenje s povratnim hladilnikom z obrusi

3.2   500-mililitrski liji ločniki

3.3   250-mililitrske bučke

3.4   Lijaki za izenačenje tlaka, 250 ml ali podobni, za zbiranje odpadnega dietiletra

3.5   Steklena kolona, 350 mm × 20 mm z zamaškom iz sintranega stekla

3.6   Vodna kopel ali grelna obloga

3.7   Reakcijske stekleničke, 2 ml

Plinski kromatograf, primeren za uporabo s kapilarno nosilno kolono z razcepitvenim sistemom, ki ga sestavljajo:

3.8.1   termostatski grelnik za kolone, ki lahko ohranja želeno temperaturo do ±1 °C natančno;

3.8.2   izparjevalnik z možnostjo nastavitve temperature;

3.8.3   detektor plamenske ionizacije (FID) in pretvornik-ojačevalnik;

3.8.4   integrator-zapisovalnik, primeren za uporabo s pretvornikom-ojačevalnikom (3.8.3);

3.9   Kapilarne kolone iz taljenega kremenovega stekla, v celoti prevlečene z BP1 ali enakovrednim materialom (ali katere koli druge kolone z najmanj enako ločljivostjo) z enakomerno debelino 0,25 μm; v koloni mora biti mogoče ločiti trimetil-silil derivate lanosterola in sitosterola. Primerna je kolona z dolžino 12 m in notranjim premerom 0,2 mm;

3.10   1 μl mikrobrizgalka z iglo s trdo konico za plinsko kromatografijo.

4.   REAGENTI

Uporabljeni reagenti morajo biti priznane analitske kakovosti. Uporabljena voda mora biti destilirana voda ali voda vsaj enakovredne čistosti.

4.1   Etanol, najmanj 95-odstotno čist

4.2   Kalijev hidroksid, 60-odstotna raztopina, raztopite 600 g kalijevega hidroksida (najmanj 85 %) v vodi in dopolnite do enega litra z vodo

Betulin, najmanj 99-odstotno čist

Raztopine betulina v dietiletru (4.4)

4.3.1.1   Koncentracija raztopine betulina, ki se uporabi pri določitvi sitosterola, mora biti 1,0 mg/ml.

4.3.1.2   Koncentracija raztopine betulina, ki se uporabi pri določitvi stigmasterola, mora biti 0,4 mg/ml.

4.4   Dietileter, analitsko čist (brez peroksidov ali ostankov)

4.5   Natrijev sulfat, brezvodni, v zrnih, predhodno sušen dve uri pri 102 °C

4.6   Sililacijski reagent, na primer TRI–SIL (na voljo pri Pierce Chemical Co, kat. št. 49001) ali enakovreden (pomembno: TRI–SIL je vnetljiv, strupen, koroziven in morebiti rakotvoren. Laboratorijsko osebje se mora seznaniti z varnostnimi podatki o TRI-SILU in sprejeti ustrezne varnostne ukrepe).

4.7   Lanosterol

Sitosterol, znane čistosti, ki mora biti najmanj 90 % (P)

Opomba 1: Čistost standardnih materialov, ki se uporabijo za kalibracijo, je treba določiti po postopku normalizacije. Predpostavite, da so vsi steroli, prisotni v vzorcu, prikazani na kromatogramu, celotna površina vrhov pa pomeni 100 % sestavin sterola, in da steroli dajejo enak detektorski odziv. Linearnost sistema je treba potrditi za celotni razpon koncentracij, ki se proučujejo.

4.8.1   Standardna raztopina sitosterola – pripravite raztopino, ki na 0,001 mg/ml natančno vsebuje približno 0,5 mg/ml (W1) sitosterola (4.8) v dietiletru (4.4).

Stigmasterol, znane čistosti, ki mora biti najmanj 90 % (P).

4.9.1   Standardna raztopina stigmasterola – pripravite raztopino, ki na 0,001 mg/ml natančno vsebuje približno 0,2 mg/ml (W1) stigmasterola (4.9) v dietiletru (4.4).

4.10   Zmes za preverjanje ločbe. Pripravite raztopino, ki vsebuje 0,05 mg/ml lanosterola (4.7) in 0,5 mg/ml sitosterola (4.8) v dietiletru (4.4).

5.   POSTOPEK

5.1   Priprava standardne raztopine za kromatografijo.

Raztopino internega standarda (4.3.1) je treba dodati ustrezni standardni raztopini sterola hkrati z njenim dodajanjem umiljenemu vzorcu (glej 5.2.2).

5.1.1   Standardna kromatografska raztopina sitosterola: 1 ml standardne raztopine sitosterola (4.8.1) prenesite v vsako od dveh reakcijskih stekleničk (3.7) in odstranite dietileter s tokom dušika. Dodajte 1 ml raztopine internega standarda (4.3.1.1) in odstranite dietileter s tokom dušika.

5.1.2   Standardna kromatografska raztopina stigmasterola: 1 ml standardne raztopine stigmasterola (4.9.1) prenesite v vsako od dveh reakcijskih stekleničk (3.7) in odstranite dietileter s tokom dušika. Dodajte 1 ml raztopine internega standarda (4.3.1.2) in odstranite dietileter s tokom dušika.

5.2   Priprava neumiljivih snovi

5.2.1   Raztalite vzorec masla pri temperaturi, ki ne presega 35 °C, in vzorec temeljito premešajte.

V 150-mililitrsko bučko (3.1) na 1 mg natančno natehtajte približno 1 g masla (W2) ali zgoščenega masla (W2). Dodajte 50 ml etanola (4.1) in 10 ml raztopine kalijevega hidroksida (4.2). Namestite povratni hladilnik in segrevajte 30 minut pri približno 75 °C. Odstranite kondenzator in bučko ohladite približno na temperaturo okolice.

5.2.2   Pri ugotavljanju sitosterola dodajte v bučko 1,0 ml raztopine internega standarda (4.3.1.1), pri ugotavljanju stigmasterola pa 0,4 mg/ml (4.3.1.2). Temeljito premešajte. Vsebino bučke količinsko prenesite v 500-mililitrski lij ločnik (3.2), nato bučko zaporedoma sperite s 50 ml vode in 250 ml dietiletra (4.4). Dve minuti močno stresajte lij ločnik in nato pustite, da se faze ločijo. Odstranite spodnji vodni sloj in s stresanjem sperite sloj etra s štirimi zaporednimi 100 ml alikvoti vode.

Opomba 2: Da se prepreči nastanek emulzije, je bistveno, da se prvi dve izpiranji z vodo opravita počasi (10 vrtljajev). Pri tretjem spiranju se lahko 30 sekund močno pretresa. Če nastane emulzija, se ta odstrani z dodajanjem 5–10 ml etanola. Če se doda etanol, je zelo pomembno, da se opravita še dve dodatni močni spiranji z vodo.

5.2.3   Čisti sloj etra brez mila spustite skozi stekleno kolono (3.5), ki vsebuje 30 g brezvodnega natrijevega sulfata (4.5). Zberite eter v 250-mililitrsko bučko (3.3). Dodajte vrelni kamenček in izparevajte skoraj do suhega v vodni kopeli ali grelni oblogi, pri tem pa poskrbite, da zberete odpadna topila.

Opomba 3: Če se ekstrakti vzorca popolnoma posušijo pri previsoki temperaturi, se sterol lahko izgubi.

5.3   Priprava trimetil silil etrov

5.3.1   Prenesite raztopino etra, ki je ostala v bučki, v 2-mililitrsko reakcijsko stekleničko (3.7) skupaj z 2 ml dietiletra in eter odstranite s tokom dušika. Sperite bučko z dvema dodatnima 2 ml alikvotoma dietiletra, prenesite v stekleničko in vsakič odstranite eter z dušikom.

5.3.2   Sililirajte vzorec z dodatkom 1 ml TRI-SIL-a (4.6). Zaprite stekleničko in močno stresajte, da se vsebina raztopi. Če se ne raztopi popolnoma, stekleničko segrejte na 65–70 °C. Pred vbrizganjem raztopine v plinski kromatograf jo pustite stati najmanj pet minut. Enako kot vzorce sililirajte tudi standardne raztopine. Enako kot vzorce sililirajte tudi zmes za preverjanje ločbe (4.10).

Opomba 4: Sililacija mora potekati v suhem okolju. Nepopolna sililacija betulina se pokaže kot drugi vrh poleg vrha betulina.

Prisotnost etanola v fazi sililacije moti sililacijo. To je lahko posledica nezadostnega spiranja v fazi ekstrakcije. Če se ta težava pojavlja, se v fazi ekstrakcije lahko uvede peto spiranje s 30-sekundnim močnim stresanjem.

5.4   Analiza s plinskim kromatografom

5.4.1   Izbira pogojev za izvajanje

Namestite plinski kromatograf po navodilih proizvajalca.

Smernice glede pogojev izvajanja so naslednje:

—	temperatura kolone: 265 °C

—	temperatura injektorja: 265 °C

—	temperatura detektorja: 300 °C

—	stopnja pretoka nosilnega plina: 0,6 ml/min

—	tlak vodika: 84 kPa

—	zračni tlak: 155 kPa

—	cepitev vzorca: 10:1 do 50:1; cepitveno razmerje mora biti optimizirano glede na navodila proizvajalca in linearnost odziva detektorja, nato ga je treba potrditi za celotno koncentracijsko območja proučevanja. Opomba 5: Zlasti pomembno je redno čiščenje vložka injektorja.

—	količina vbrizgane snovi: 1 μl raztopine TMSE.

Preden začnete kakršno koli analizo, počakajte, da se sistem uravnovesi in odziva dovolj stabilno.

Te pogoje je treba spreminjati glede na značilnosti kolone in plinskega kromatografa, da se dobijo kromatogrami, ki izpolnjujejo naslednje zahteve:

—	vrh sitosterola se mora ustrezno ločiti od lanosterola; na sliki 1 je predstavljen značilni kromatogram, ki ga je treba dobiti za sililizirano zmes za preverjanje ločbe (4.10),

—	relativni retenzijski časi naslednjih sterolov morajo znašati približno: — holesterol: 1,0 — stigmasterol: 1,3 — sitosterol: 1,5 — betulin: 2,5,

—	retenzijski čas za betulin mora znašati približno 24 minut.

5.4.2   Analitski postopek

Vbrizgajte 1 μl sililizirane standardne raztopine (stigmasterola ali sitosterola) in prilagodite kalibracijske parametre integratorja.

Vbrizgajte dodatni 1 μl sililizirane standardne raztopine, da določite odzivne faktorje glede na betulin.

Vbrizgajte 1 μl raztopine sililiziranega vzorca in izmerite površino vrhov. Vsaka kromatografska serija mora biti omejena z vbrizganjem standardov.

Kot smernico je mogoče navesti, da naj bo v vsako serijo vključenih šest vbrizganj vzorca.

Opomba 6: V integracijo vrha stigmasterola je treba zajeti vsak rep, kakor je določeno v točkah 1, 2 in 3 slike 2b.

Pri oceni celotnega sitosterola je treba v integracijo vrha sitosterola zajeti površino vrha za 22-dihidro-β-sitosterol (stigmastanol), ki se eluira takoj za sitosterolom (glej sliko 3b).

6.   IZRAČUN REZULTATOV

6.1   Določite površino vrhov sterola in vrhov betulina v obeh standardih, ki omejujeta serijo vzorcev, ter izračunajte R1:

R1 = (povprečna površina vrha sterola v standardu)/(povprečna površina vrha betulina v standardu)

Določite površino vrha sterola (stigmasterola in sitosterola) in vrha betulina v vzorcu ter izračunajte R2:

R2 = (površina vrha sterola v vzorcu)/(površina vrha betulina v vzorcu)

W1	=	vsebnost sterola v standardu (mg), ki ga vsebuje 1 ml standardne raztopine (4.8.1 ali 4.9.1)
W2	=	masa vzorca (g) (5.2.1)
P	=	čistost standarda sterola (4.8 ali 4.9)

Vsebnost sterola v vzorcu (mg/kg) = ((R 2)/(R 1)) × ((W 1)/(W 2)) × P × 10

7.   TOČNOST METODE

7.1   Maslo

7.1.1   Ponovljivost

7.1.1.1   Stigmasterol

Razlika med rezultatoma dveh določitev, ki ju isti izvajalec izvede v najkrajšem možnem časovnem presledku z isto opremo na enakem preskusnem materialu, ne sme presegati 19,3 mg/kg.

7.1.1.2   Sitosterol

Razlika med rezultatoma dveh določitev, ki ju isti izvajalec izvede v najkrajšem možnem časovnem presledku z isto opremo na enakem preskusnem materialu, ne sme presegati 23,0 mg/kg.

7.1.2   Obnovljivost

7.1.2.1   Stigmasterol

Razlika med rezultatoma dveh določitev izvajalcev v različnih laboratorijih z različno opremo na enakem preskusnem materialu ne sme presegati 31,9 mg/kg.

7.1.2.2   Sitosterol

Razlika med rezultatoma dveh določitev, ki ju opravijo izvajalci v različnih laboratorijih z različno opremo na enakem preskusnem materialu, ne sme presegati 8,7 % glede na srednjo vrednost določitve.

7.1.3   Vir natančnih podatkov

Podatki natančnosti so bili določeni s preskusom leta 1992, pri katerem je sodelovalo osem laboratorijev in šest vzorcev (tri slepa vzporedna izvajanja) za stigmasterol in šest vzorcev (tri slepa vzporedna izvajanja) za sitosterol.

7.2   Zgoščeno maslo

7.2.1   Ponovljivost

7.2.1.1   Stigmasterol

Razlika med rezultatoma dveh določitev, ki ju isti izvajalec izvede v najkrajšem možnem časovnem presledku z isto opremo na enakem preskusnem materialu, ne sme presegati 10,2 mg/kg.

7.2.1.2   Sitosterol

Razlika med rezultatoma dveh določitev, ki ju isti izvajalec opravi v najkrajšem možnem časovnem presledku z isto opremo na enakem preskusnem materialu, ne sme presegati 3,6 % glede na srednjo vrednost določitev.

7.2.2   Obnovljivost

7.2.2.1   Stigmasterol

Razlika med rezultatoma dveh določitev izvajalcev v različnih laboratorijih z različno opremo na enakem preskusnem materialu ne sme presegati 25,3 mg/kg.

7.2.2.2   Sitosterol

Razlika med rezultatoma dveh določitev, ki ju opravijo izvajalci v različnih laboratorijih z različno opremo na enakem preskusnem materialu, ne sme presegati 8,9 % glede na srednjo vrednost določitev.

7.2.3   Vir natančnih podatkov

Podatki natančnosti so bili določeni s preskusom leta 1991, pri katerem je sodelovalo devet laboratorijev in šest vzorcev (tri slepa vzporedna izvajanja) za stigmasterol in šest vzorcev (tri slepa vzporedna izvajanja) za sitosterol.

8.   DOVOLJENO ODSTOPANJE

8.1   Od sledenega proizvoda je treba vzeti tri vzorce, da se preveri pravilno sledenje proizvoda.

8.2   Maslo

8.2.1   Stigmasterol

8.2.1.1   Stopnja vključitve za stigmasterol je 150 g najmanj 95-odstotno čistega stigmasterola na tono masla, tj. 142,5 mg/kg, ali 170 g najmanj 85-odstotno čistega stigmasterola na tono masla, tj. 144,5 mg/kg.

8.2.1.2   Rezultati za vse tri vzorce, dobljeni z analizo proizvoda, se uporabijo za preverjanje stopnje in homogenosti vključitve sledila, najnižji od teh rezultatov pa se primerja z naslednjimi mejami:

—	115,8 mg/kg (95 % od najmanjše stopnje vključitve za 95-odstotno čist stigmasterol),

—	117,7 mg/kg (95 % od najmanjše stopnje vključitve za 85-odstotno čist stigmasterol),

—	80,1 mg/kg (70 % od najmanjše stopnje vključitve za 95-odstotno čist stigmasterol),

—	81,5 mg/kg (70 % od najmanjše stopnje vključitve za 85-odstotno čist stigmasterol).

Koncentracija sledila v vzorcu, s katero se doseže najnižji rezultat, se uporabi v zvezi z interpolacijo med 115,8 mg/kg in 80,1 mg/kg ali 117,7 mg/kg in 81,5 mg/kg.

8.2.2   Sitosterol

8.2.2.1   Stopnja vključitve za sitosterol je 600 g najmanj 90-odstotno čistega sitosterola na tono masla, tj. 540 mg/kg.

8.2.2.2   Rezultati za vse tri vzorce, dobljeni z analizo proizvoda, se uporabijo za preverjanje stopnje in homogenosti vključitve sledila, najnižji od teh rezultatov pa se primerja z naslednjimi mejami:

—	482,6 mg/kg (95 % od najmanjše stopnje vključitve za 90-odstotno čist sitosterol),

—	347,6 mg/kg (70 % od najmanjše stopnje vključitve za 90-odstotno čist sitosterol).

Koncentracija sledila v vzorcu, s katero se doseže najnižji rezultat, se uporabi v zvezi z interpolacijo med 482,6 mg/kg in 347,6 mg/kg.

8.3   Zgoščeno maslo

8.3.1   Stigmasterol

8.3.1.1   Stopnja vključitve za stigmasterol je 150 g najmanj 95-odstotno čistega stigmasterola na tono zgoščenega masla, tj. 142,5 mg/kg; ali 170 g najmanj 85-odstotno čistega stigmasterola na tono zgoščenega masla, tj. 144,5 mg/kg.

8.3.1.2   Rezultati za vse tri vzorce, dobljeni z analizo proizvoda, se uporabijo za preverjanje stopnje in homogenosti vključitve sledila, najnižji od teh rezultatov pa se primerja z naslednjimi mejami:

—	118,5 mg/kg (95 % od najmanjše stopnje vključitve za 95-odstotno čist stigmasterol),

—	120,4 mg/kg (95 % od najmanjše stopnje vključitve za 85-odstotno čist stigmasterol),

—	82,9 mg/kg (70 % od najmanjše stopnje vključitve za 95-odstotno čist stigmasterol),

—	84,3 mg/kg (70 % od najmanjše stopnje vključitve za 85-odstotno čist stigmasterol).

Koncentracija sledila v vzorcu, s katero se doseže najnižji rezultat, se uporabi v zvezi z interpolacijo med 118,5 mg/kg in 82,9 mg/kg ali 120,4 mg/kg in 84,3 mg/kg.

8.3.2.   Sitosterol

8.3.2.1   Stopnja vključitve za sitosterol je 600 g najmanj 90-odstotno čistega sitosterola na tono zgoščenega masla, tj. 540 mg/kg.

8.3.2.2   Rezultati za vse tri vzorce, dobljeni z analizo proizvoda, se uporabijo za preverjanje stopnje in homogenosti vključitve sledila, najnižji od teh rezultatov pa se primerja z naslednjimi mejami:

—	480,9 mg/kg (95 % od najmanjše stopnje vključitve za 90-odstotno čist sitosterol),

—	345,9 mg/kg (70 % od najmanjše stopnje vključitve za 90-odstotno čist sitosterol).

Koncentracija sledila v vzorcu, s katero se doseže najnižji rezultat, se uporabi v zvezi z interpolacijo med 480,9 mg/kg in 345,9 mg/kg.

Slika 1

Kromatogram zmesi za preverjanje ločbe.

Zaželena je popolna ločba, tj. vrh krivulje za lanosterol se mora vrniti v izhodišče, preden se dvigne na vrh sitosterola, čeprav je nepopolna ločba dopustna.

Slika 2a	Slika 2b
Standard stigmasterola	Vzorec masla, denaturiran s stigmasterolom
Hinweis: Die Integration des Stigmasterin-Peaks muss etwaige Tailings gemäß den Ziffern 1, 2 und 3 beinhalten.

Slika 3a	Slika 3b
Standard sitosterola	Vzorec masla, denaturiran z β-sitosterolom
Opomba: β-sitosterol pogosto vsebuje nečistočo (opredeljeno kot stigmastanol), ki se eluira takoj za β-sitosterolom. Če se ocenjuje skupen β-sitosterol, ki je prisoten, je treba sešteti površine teh dveh vrhov.