LIITE I

(1 artikla)

VERTAILUMENETELMIEN LUETTELO

Lyhenneluettelo: Min. = minimi, Max. = maksimi, Liite = mainitun asetuksen liite, IDF = kansainvälinen meijeriliitto, ISO = kansainvälinen standardisoimisjärjestö, IUPAC = International Union of Pure and Applied Chemistry, ADPI = American Dairy Products Institute.

A OSA

Komission asetus	Tuote	Parametri	Raja-arvo (1)	Vertailumenetelmä	Huomautus
Asetus (EY) N:o 2771/1999 – Julkinen varastointi	Suolaton voi	Rasva	Min. 82 % m/m	ISO 17189:2003|IDF 194:2003
		Vesi	Enintään 16 % m/m	ISO 3727-1:2001|IDF 80-1:2001
		Rasvaton kuiva-aine	Enintään 2 % m/m	ISO 3727-2:2001|IDF 80-2:2001
		Rasvan happamuus	1,2 mmol/100g rasvaa	ISO 1740:2004|IDF 6:2004
		Peroksidiluku (Max.)	0,3 mekv. happea/1 000g rasvaa	ISO 3976:2006|IDF 74:2006	Huomautus 1
		Koliformit	Ei havaittavissa 1g:ssa	Liite X	Huomautus 3
		Muu kuin maitorasva	Ei havaittavissa triglyseridianalyysissä	Liite XX
		Merkkiaineet: sterolit	Ei havaittavissa, β-sitosteroli ≤ 40 mg/kg	Liite VIII
		Muut merkkiaineet
		— vanilliini	Ei havaittavissa	Liite VI
		— karoteenihappoetyyliesteri	≤ 6 mg/kg	Liite VII
		— enanttihappotriglyseridit	Ei havaittavissa	Liite V
		Aistinvaraiset ominaisuudet	Vähintään 4 5:stä pisteestä ulkonäön, maun ja koostumuksen osalta	Liite IV
		Irrallinen vesi	Vähintään 4 pistettä	ISO 7586:1985|IDF 112A:1989
Asetus (EY) N:o 2771/1999 – Yksityinen varastointi	Suolaton voi	Rasva	Min. 82 % m/m	ISO 17189:2003|IDF 194:2003
		Vesi	Enintään 16 % m/m	ISO 3727-1:2001|IDF 80-1:2001
		Rasvaton kuiva-aine	Enintään 2 % m/m	ISO 3727-2:2001|IDF 80-2:2001
Asetus (EY) N:o 2771/1999 – Yksityinen varastointi	Suolattu voi	Rasva	Min. 80 % m/m	ISO 17189:2003|IDF 194:2003
		Vesi	Enintään 16 % m/m	ISO 3727-1:2001|IDF 80-1:2001
		Rasvaton kuiva-aine (suola pois luettuna)	Enintään 2 % m/m	ISO 3727-2:2001|IDF 80-2:2001
		Suola	Enintään 2 % m/m	ISO 15648:2004|IDF 179:2004
Asetus (EY) N:o 1898/2005, II luku	Suolaton voi	Rasva	Min. 82 % m/m	ISO 17189:2003|IDF 194:2003
		Muu kuin maitorasva		Liite XX
		Vesi	Enintään 16 % m/m	ISO 3727-1 2001|IDF 80-1:2001
		Rasvaton kuiva-aine	Enintään 2 % m/m	ISO 3727-2:2001|IDF 80-2:2001
		Merkkiaineet:
		— sterolit	Ks. liite VIII	Liite VIII
		— vanilliini	Ks. liite VI	Liite VI
		— karoteenihappoetyyliesteri	Ks. liite VII	Liite VII
		— enanttihappotriglyseridit	Ks. liite V	Liite V
Asetus (EY) N:o 1898/2005, II luku	Suolattu voi	Rasva	Min. 80 % m/m	ISO 17189:2003|IDF 194:2003
		Muu kuin maitorasva		Liite XX
		Vesi	Enintään 16 % m/m	ISO 3727-1:2001|IDF 80-1:2001
		Rasvaton kuiva-aine (suola pois luettuna)	Enintään 2 % m/m	ISO 3727-2:2001|IDF 80-2:2001
		Suola	Enintään 2 % m/m	ISO 15648:2004|IDF 179:2004
		Merkkiaineet:
		— sterolit	Ks. liite VIII	Liite VIII
		— vanilliini	Ks. liite VI	Liite VI
		— karoteenihappoetyyliesteri	Ks. liite VII	Liite VII
		— enanttihappotriglyseridit	Ks. liite V	Liite V
Asetus (EY) N:o 1898/2005, II luku	Voiöljy	Rasva	Min. 99,8 % m/m	IDF 24:1964
		Vesi ja rasvaton kuiva-aine	Enintään 0,2 % m/m	ISO 5536:2002|IDF 23:2002 (kosteus) IDF 24:1964 (SNF)
		Rasvan happamuus	1,2 mmol/100 g rasvaa	ISO 1740:2004|IDF 6:2004
		Peroksidiluku (Max.)	0,5 mekv. happea/1 000g rasvaa	ISO 3976:2006|IDF 74:2006	Huomautus 1
		Muu kuin maitorasva	Ei esiinny	Liite XX
		Maku	Tuore
		Haju	Ei vieraita hajuja
		Muut	Ei neutraloivia aineita, antioksidantteja tai säilöntäaineita
		Merkkiaineet:
		— sterolit	Ks. liite VIII	Liite VIII
		— vanilliini	Ks. liite VI	Liite VI
		— karoteenihappoetyyliesteri	Ks. liite VII	Liite VII
		— enanttihappotriglyseridit	Ks. liite V	Liite V
Asetus (EY) N:o 1898/2005, II luku	Kerma	Rasva	Vähintään 35 % m/m	ISO 2450:1999|IDF 16 C:1987
		Muu kuin maitorasva		Liite XX
		Merkkiaineet:
		— sterolit	Ks. liite VIII		Huomautus 2
		— vanilliini	Ks. liite VI	Liite VI
		— karoteenihappoetyyliesteri	Ks. liite VII		Huomautus 2
		— enanttihappotriglyseridit	Katso liite V	Liite V
Asetus (EY) N:o 1898/2005, III luku	Voiöljy	Rasva	Min. 96 % m/m		Huomautus 2
		Muu kuin maitorasva		Liite XX
		Rasvaton kuiva-aine	Enintään 2 % m/m		Huomautus 2
		Merkkiaineet:
		— stigmasteroli (95 % m/m)	15 g/100 kg voiöljyä	Liite VIII
		— stigmasteroli (85 % m/m)	17 g/100 kg voiöljyä	Liite VIII
		— enanttihappotriglyseridit	10,34 kg/t voiöljyä	Liite V
		— voihappoetyyliesteri ja stigmasteroli		— voihappoetyyliesteri — stigmasteroli: liite VIII	Huomautus 2
		— voihappoetyyliesteri ja enanttihappotriglyseridit		— voihappoetyyliesteri — enanttihappotriglyseridit: liite V	Huomautus 2
		Lesitiini (E 322)	Enintään 0,5 % m/m		Huomautus 2
		NaC1	Enintään 0,75 % m/m	ISO 15648:2004|IDF 179:2004
		Rasvan happamuus	1,2 mmol/100 g rasvaa	ISO 1740:2004|IDF 6:2004
		Peroksidiluku (Max.)	Enintään 0,5 mekv. happea/1 000g rasvaa	ISO 3976:2006|IDF 74:2006	Huomautus 1
		Maku	Tuore
		Haju	Ei vieraita hajuja
		Muut	Ei neutraloivia aineita, antioksidantteja tai säilöntäaineita
Asetus (EY) N:o 1898/2005, IV luku	Suolaton voi	Rasva	Min. 82 % m/m	ISO 17189:2003|IDF 194:2003
		Vesi	Enintään 16 % m/m	ISO 3727-1:2001|IDF 80-1:2001
		Rasvaton kuiva-aine	Enintään 2 % m/m	ISO 3727-2:2001|IDF 80-2:2001
Asetus (EY) N:o 1898/2005, IV luku	Suolattu voi	Rasva	Min. 80 % m/m	ISO 17189:2003|IDF 194:2003
		Vesi	Enintään 16 % m/m	ISO 3727-1:2001|IDF 80-1:2001
		Rasvaton kuiva-aine (suola pois luettuna)	Enintään 2 % m/m	ISO 3727-2:2001|IDF 80-2:2001
		Suola	Enintään 2 % m/m	ISO 15648:2004|IDF 179:2004
Asetuksen (EY) N:o 1255/1999 9 artikla ja II osasto	Uuhen ja/tai vuohen maidosta valmistettu juusto	Lehmänmaito	< 1 % m/m	Liite IX
Asetus (ETY) N:o 2921/90	Liite I – Happokaseiini	Vesi	Enintään 12,00 % m/m	ISO 5550:2006|IDF 78:2006
		Rasva	Enintään 1,75 % m/m	ISO 5543:2004|IDF127:2004
		Vapaa happo	Enintään 0,30 ml 0,1N NaOH -liuosta/g	ISO 5547:1978|IDF 91:1979
Asetus (ETY) N:o 2921/90	Liite I – Juoksetekaseiini	Vesi	Enintään 12,00 % m/m	ISO 5550:2006|IDF 78:2006
		Rasva	Enintään 1,00 % m/m	ISO 5543:2004|IDF 127:2004
		Tuhka	Min. 7,50 % m/m	ISO 5545:1978|IDF 90:1979
Asetus (ETY) N:o 2921/90	Liite I – Kaseinaatti	Vesi	Enintään 6,00 % m/m	ISO 5550:2006|IDF 78:2006
		Maitoproteiini	Min. 88,00 % m/m	ISO 5549:1978|IDF 92:1979
		Rasva ja tuhka	Enintään 6,00 % m/m	ISO 5543:2004|IDF 127:2004
		Kiinnittynyt tuhka		ISO 5544:1978|IDF 89:1979
		Tuhka		ISO 5545:1978 – IDF 90:1979
Asetus (ETY) N:o 2921/90	Liite II – Happokaseiini	Vesi	Enintään 10,00 % m/m	ISO 5550:2006|IDF 78:2006
		Rasva	Enintään 1,50 % m/m	ISO 5543:2004|IDF 127:2004
		Vapaa happo	Enintään 0,20 ml 0,1 N NaOH -liuosta/g	ISO 5547:1978|IDF 91:1979
		Bakteerien kokonaismäärä (Max.)	30 000/g	ISO 4833:2003	Huomautus 3
		Koliformit	Ei esiinny 0,1g:ssa	Liite X	Huomautus 3
		Termofiilisten bakteerien määrä (Max.)	5 000/g	ISO 4833:2003	Huomautukset 3 ja 4
Asetus (ETY) N:o 2921/90	Liite II – Juoksetekaseiini	Vesi	Enintään 8,00 % m/m	ISO 5550:2006|IDF 78:2006
		Rasva	Enintään 1,00 % m/m	ISO 5543:2004|IDF 127:2004
		Tuhka	Min. 7,50 % m/m	ISO 5545:1978|IDF 90:1979
		Bakteerien kokonaismäärä (Max.)	30 000/g	ISO 4833:2003	Huomautus 3
		Koliformit	Ei esiinny 0,1g:ssa	Liite X	Huomautus 3
		Termofiilisten bakteerien määrä (Max.)	5 000/g	ISO 4833:2003	Huomautukset 3 ja 4
Asetus (ETY) N:o 2921/90	Liite II – Kaseinaatit	Vesi	Enintään 6,00 % m/m	ISO 5550:2006|IDF 78:2006
		Maitoproteiini	Min. 88,00 % m/m	ISO 5549:1978|IDF 92:1979
		Rasva ja tuhka	Enintään 6,00 % m/m	ISO 5543:2004|IDF 127:2004 ISO 5544:1978|IDF 89:1979 tai ISO 5545:1978|IDF 90:1979
		Bakteerien kokonaismäärä (Max.)	30 000/g	ISO 4833:2003	Huomautus 3
		Koliformit	Ei esiinny 0,1g:ssa	Liite X	Huomautus 3
		Termofiilisten bakteerien määrä (Max.)	5 000/g	ISO 4833:2003	Huomautukset 3 ja 4
Asetus (ETY) N:o 2921/90	Liite III – Kaseinaatit	Vesi	Enintään 6,00 % m/m	ISO 5550:2006|IDF 78:2006
		Maitoproteiini	Min. 85,00 % m/m	ISO 5549:1978|IDF 92:1979
		Rasva	Enintään 1,50 % m/m	ISO 5543:2004|IDF 127:2004
		Laktoosi	Enintään 1,00 % m/m	ISO 5548:2004|IDF 106:2004
		Tuhka	Enintään 6,50 % m/m	ISO 5544:1978|IDF 89:1979 tai ISO 5545:1978|IDF 90:1979
		Bakteerien kokonaismäärä (Max.)	30 000/g	ISO 4833:2003	Huomautus 3
		Koliformit	Ei esiinny 0,1g:ssa	Liite X	Huomautus 3
		Termofiilisten bakteerien määrä (Max.)	5 000/g	ISO 4833:2003	Huomautukset 3 ja 4
Asetus (EY) N:o 2799/1999	Rehuseokset ja rasvaton maitojauhe (rehulaatu)	Vesi (hapan kirnupiimäjauhe)	Enintään 5 % m/m	Liite XIX
		Proteiinit	Min. 31,4 % (rasvattomasta kuiva-aineesta)	ISO 8968-1|2|3:2001|IDF 20-1|2|3:2001
		Vesi (rasvaton maitojauhe)	Enintään 5 % m/m	ISO 5537:2004|IDF 26:2004
		Rasva (rasvaton maitojauhe)	Enintään 11 % m/m	ISO 1736:2000|IDF 9C:1987
		Herajuoksete (rasvaton maitojauhe)	Ei esiinny	Liite XIII	Huomautus 6
		Tärkkelys (rasvaton maitojauhe)	Ei esiinny	Liite XVII
		Vesi (esiseos)	Enintään 5 % m/m rasvattomasta kuiva-aineesta	ISO 5537:2004|IDF 26:2004
		Rasva (esiseos)		Komission direktiivi 84/4/ETY (EYVL L 15, 18.1.1984, s. 29)
		Herajuoksete (esiseos)	Ei esiinny	Liite XIII
		Rasvattoman maitojauheen pitoisuus (lopputuotteessa)	Min. 50 % m/m	Liite XVI
		Rasva (lopputuotteessa)	Min. 2,5 % m/m tai 5 % m/m	Komission direktiivi 84/4/ETY (EYVL L 15, 18.1.1984, s. 29)	Huomautus 7
		Tärkkelys (lopputuotteessa)	Min. 2 % m/m	Liite XVII	Huomautus 8
		Kupari (lopputuotteessa)	25 ppm	Komission direktiivi 78/633/ETY (EYVL L 206, 26.7.1987, s. 43)
Asetus (EY) N:o 214/2001	Rasvaton spraymaitojauhe	Rasva	Enintään 1,0 % m/m	ISO 1736:2000|IDF 9C:1987
		Proteiinit	Min. 31,4 % (2)m/m (min.) rasvattomasta kuiva-aineesta	ISO 8968-1/2:2001|IDF 20-1/2:2001
		Vesi	Enintään 3,5 % m/m	ISO 5537:2004|IDF 26:2004
		Happamuus	Enintään 19,5 ml, 0,1 N NaOH, 10g rasvaton kuiva-aine	ISO 6091:1980|IDF 86:1981
		Laktaatit	Enintään 150 mg/100 g rasvatonta kuiva-ainetta	ISO 8069:2005|IDF 69:2005
		Fosfataasi	Negatiivinen	ISO 11816-1:2006|IDF 155-1:2006
		Liukenemattomuusindeksi	Enintään 0,5 ml 24 °C:ssa	ISO 8156:2005|IDF 129:2005
		Palaneet hiukkaset	A- tai B-levy (15,0 mg)	ADPI (1990)
		Bakteerien kokonaismäärä	40 000/g	ISO 4833:2003	Huomautus 3
		Koliformit	Negatiivinen/0,1g	Liite X	Huomautus 3
		Kirnupiimä	Negatiivinen	Liite XIV
		Herajuoksete	Negatiivinen	Liite XII
		Hapanhera	Negatiivinen		Huomautus 2
		Antimikrobiaineet		Liite XV

B OSA

B osassa olevia vertailumenetelmiä voidaan soveltaa kaikkien ensimmäisessä sarakkeessa mainitun asetuksen soveltamisalaan kuuluvien tuotteiden analysointiin.

Komission asetus	Tuote	CN-koodi	Parametri	Raja-arvo	Vertailumenetelmä	Huomautus
Asetus (ETY) N:o 2658/87 Asetus (EY) N:o 2535/2001 Asetus (EY) N:o 1282/2006	Maito ja kerma, tiivistämätön ja lisättyä sokeria tai muuta makeutusainetta sisältämätön	0401	Rasva (≤ 6 % m/m)	Sovellettavat raja-arvot täsmennetään kyseisen tuotteen CN-koodin kuvauksessa ja tarvittaessa komission asetuksen (ETY) N:o 3846/87 (EYVL L 366, 24.12.1987, s. 1) vientitukinimikkeistön 9 osassa tai asetuksessa (EY) N:o 2535/2001 (EYVL L 341, 22.12.2001, s. 29)	ISO 1211:2001|IDF 1D:1996
			Rasva (> 6 % m/m)		ISO 2450:1999|IDF 16C:1987
	Maito ja kerma, tiivistetty tai lisättyä sokeria tai muuta makeutusainetta sisältävä	0402	Rasva (nestemäisenä)		ISO 1737:1999|IDF 13C:1987
			Rasva (kiinteänä)		ISO 1736:2000|IDF 9C:1987
			Proteiinit		ISO 8968-1|2|3:2001|IDF 20-1|2|3:2001
			Sakkaroosi (tavanomainen pitoisuus)		ISO 2911:2004|IDF 35:2004
			Sakkaroosi (vähäinen pitoisuus)			Huomautus 2
			Kuiva-aine (makeutettu maitotiiviste)		ISO 6734:1989|IDF 15B:1991
			Kuiva-aine (maito- tai kermatiiviste)		ISO 6731:1989|IDF 21B:1987
			Vesi (maitojauhe)		ISO 5537:2004/IDF 26:2004
			Vesi (kermajauhe)		Liite XVIII
	Kirnupiimä, käynyt tai hapatettu maito ja kerma, myös tiivistetty, lisättyä sokeria tai muuta makeutusainetta sisältävä	0403	Rasva		ISO 1211:2001|IDF 1D:1996 ISO 1736:2000|IDF 9C:1987 ISO 2450:1999|IDF 16 C:1987 ISO 7208:1999|IDF 22B:1987 ISO 8262-3:2005|IDF 124-3:2005
			Proteiinit		ISO 8968-1|2|3:2001|IDF 20-1|2|3:2001
			Sakkaroosi (tavanomainen pitoisuus)		ISO 2911:2004|IDF 35:2004
			Sakkaroosi (vähäinen pitoisuus)			Huomautus 2
			Vesi (hapan kirnupiimäjauhe)		Liite XIX
			Vesi (makea kirnupiimäjauhe)		ISO 5537:2004|IDF26:2004
			Kuiva-aine (muut tuotteet)		Toimivaltaisen viranomaisen hyväksymät menetelmät
	Hera, myös tiivistetty tai lisättyä sokeria tai muuta makeutusainetta sisältävä; maidon luonnollisista aineosista koostuvat tuotteet	0404	Rasva		ISO 1736:2000|IDF 9C:1987 ISO 2450:1999|IDF 16C:1987 ISO 7208:1999|IDF 22B:1987
			Proteiinit		ISO 8968-1|2|3:2001|IDF 20-1|2|3:2001
			Sakkaroosi (tavanomainen pitoisuus)		ISO 2911:2004|IDF 35:2004
			Sakkaroosi (vähäinen pitoisuus)			Huomautus 2
		0404 90	Proteiinit		ISO 8968 1/2 2001|IDF 20-1/2:2001
			Vesi		IDF 21B:1987
			Kuiva-aine		ISO 6734:1989|IDF 15B:1991
			(Tiivistetyt tuotteet)		ISO 6731:1989|IDF 21B:1987
	Voi ja muut maitorasvat; maidosta valmistetut levitteet	0405	Rasva (jos ≤ 85 % m/m)		ISO 17189:2003|IDF 194:2003
		Voi	Vesi		ISO 3727-1:2001|IDF 80-1:2001
			Rasvaton kuiva-aine		ISO 3727-2:2001|IDF 80-2:2001
			NaCl		ISO 15648:2004|IDF 179:2004
			Rasva (jos > 99 % m/m)		IDF 24:1964
	Voiöljy		Vesi (jos rasva < 99 % m/m)		ISO 5536:2002|IDF 23:2002
	Juusto ja juustoaine	0406	Rasva		ISO 1735:2004|IDF 5:2004
			Kuiva-aine		ISO 5534:2004|IDF 4:2004
			Kuiva-aine (Ricotta)		ISO 2920:2004|IDF 58:2004
			NaCl		ISO 5943:2006|IDF 88:2006
			Laktoosi		ISO 5765-1/2:2002|IDF 79-1/2:2002
Asetus (ETY) N:o 2658/87	Rehuseokset	2309	Laktoosi		Liite XI

Huomautukset luetteloon Euroopan unionin vertailumenetelmistä

Huomautus 1: Maitorasvan erottaminen ISO-standardin 1740:1991 mukaisesti (valolta suojaaminen).

Huomautus 2: Vertailumenetelmää ei ole vahvistettu. Toimivaltaisen viranomaisen hyväksymät menetelmät.

Huomautus 3: Näyte valmistettava ISO-standardin 8261:2001|IDF 122:2001 mukaisesti.

Huomautus 4: Inkubointi 48 tunnin ajan 55 °C:n lämpötilassa. Pyrittävä välttämään kasvatusväliaineen kuivuminen.

Huomautus 5: Rasvattoman kuiva-aineen %-osuus m/m = kuiva-aineen %-osuus m/m – rasvan %-osuus m/m

Huomautus 6: Komission direktiivi 84/4/ETY.

Huomautus 7: Komission asetus (EY) N:o 2799/1999 (EYVL L 340, 31.12.1999, s. 3)

Huomautus 8: Komission direktiivi 78/633/ETY.

---

(1)  Rajoittamatta erityisasetuksen vaatimusten soveltamista.

(2)  Proteiinin vähimmäismäärä on 1 päivästä syyskuuta 2009 alkaen 34 %.

LIITE II

(3 artikla)

ARVIOINTI SIITÄ, ONKO ERÄ LAKISÄÄTEISTEN RAJOJEN MUKAINEN

1.   PERIAATE

Jos asiaa koskevassa lainsäädännössä on vahvistettu yksityiskohtaiset näytteenottomenetelmät, niitä on noudatettava. Kaikissa muissa tapauksissa tarkastettavasta erästä on otettava satunnaisesti vähintään kolme näyteyksikköä. Voidaan valmistaa yhdistetty näyte. Tulosta verrataan lakisääteisiin rajoihin laskemalla 95 prosentin luottamusväli, joka on 2 kertaa standardipoikkeama, jossa standardipoikkeama riippuu joko siitä, 1) onko menetelmä validoitu kansainvälisessä yhteistyössä ja muuttujille σr ja σR vahvistettu arvot tai siitä, 2) onko laskettu laboratorion sisäinen uusittavuus, kun kyseessä on sisäinen validointimenettely. Kyseinen luottamusväli osoittaa tuloksen mittausepävarmuuden.

2.   MENETELMÄ ON VALIDOITU KANSAINVÄLISESSÄ YHTEISTYÖSSÄ

Tällöin toistettavuuden standardipoikkeama σr ja uusittavuuden standardipoikkeama σR on vahvistettu ja laboratorio voi osoittaa noudattavansa validoitua menetelmää.

Lasketaan n kertaa toistetun mittauksen aritmeettinen keskiarvo

Lasketaan arvon laajennettu epävarmuus (k = 2) seuraavasti:

Jos lopullinen mittaustulos x = y 1 + y 2, x = y 1 – y 2, x = y 1 · y 2 tai x = y 1 / y 2, on käytettävä tällaisissa tapauksissa noudatettavia tavanomaisia menetelmiä standardipoikkeamien yhdistämiseksi.

Erän katsotaan olevan lakisääteisen ylärajan UL vastainen, jos

;

muutoin sen katsotaan olevan ylärajan UL mukainen.

Erän katsotaan olevan lakisääteisen alarajan LL vastainen, jos

;

muutoin sen katsotaan olevan ylärajan LL mukainen.

3.   SISÄINEN VALIDOINTIMENETTELY, JOHON LIITTYY UUSITTAVUUDEN SISÄISEN STANDARDIPOIKKEAMAN LASKEMINEN

Jos käytetään muita kuin tässä asetuksessa esitettyjä menetelmiä, eikä ole vahvistettu tarkkuutta koskevia toimenpiteitä, on suoritettava sisäinen validointi. Laajennetun epävarmuuden U laskukaavassa on käytettävä standardipoikkeamien σr ja σ R sijasta sisäisen toistettavuuden standardipoikkeamaa sir ja sisäisen uusittavuuden standardipoikkeamaa siR .

Päätöksentekoa koskevat säännöt ovat samat kuin vaihtoehdossa 1. Jos erän ei kuitenkaan katsota olevan lakisääteisten rajojen mukainen, mittaukset on toistettava tässä asetuksessa esitetyin menetelmin ja päätös tehtävä vaihtoehdon 1 mukaisesti.

LIITE III

(4 artikla)

ARVIOIJIEN ARVIOINTI JA AISTINVARAISISSA ANALYYSEISSÄ SAATUJEN TULOSTEN LUOTETTAVUUS

Seuraavia menetelmiä sovelletaan käytettäessä pisteytysmenetelmiä (IDF-standardi 99C:1997).

A.   TOISTETTAVUUSINDEKSIN MÄÄRITTÄMINEN

Arvioijan on arvioitava kahdentoista kuukauden aikana vähintään kymmenen sokeanäytettä, joita kutakin on kaksi kappaletta. Tämä tapahtuu tavallisesti useissa eri arviointitilaisuuksissa. Yksittäisiä tuotteen laatuominaisuuksia koskevat tulokset arvioidaan seuraavalla kaavalla:

jossa:

wI	:	toistettavuusindeksi
xi1	:	näytteen xi ensimmäisen arvioinnin pisteet
xi2	:	näytteen xi toisen arvioinnin pisteet
n	:	näytteiden lukumäärä

Arvioitavien näytteiden on oltava laadultaan tarpeeksi erilaisia. wI ei saa olla suurempi kuin 1,5 (viiden pisteen asteikko).

B.   POIKKEAMAINDEKSIN MÄÄRITTÄMINEN

Tätä indeksiä käytetään tarkistettaessa, käyttääkö arvioija laadun arvioinnissa samaa asteikkoa kuin ryhmä kokeneita arvioijia. Arvioijan antamia pisteitä verrataan ryhmän antamien pisteiden keskiarvoon.

Tulokset määritetään seuraavalla kaavalla:

jossa:

xi1; xi2	:	ks. A kohta
;	:	arvioijaryhmän antamien pisteiden keskiarvo näytteen xi ensimmäisessä ja toisessa arvioinnissa
n	:	näytteiden lukumäärä (vähintään kymmenen näytettä 12 kuukauden aikana)

Arvioitavien näytteiden on oltava laadultaan tarpeeksi erilaisia. DI ei saa olla suurempi kuin 1,5 (viiden pisteen asteikko).

Jäsenvaltioiden on ilmoitettava tämän menettelyn soveltamisessa ilmenevistä vaikeuksista.

Jos yksittäisen arvioijan havaitaan ylittävän poikkeus- tai toistettavuusindeksiin liittyvän 1,5:n rajan, virallisen viranomaisasiantuntijan on tehtävä kyseisen arvioijan parin seuraavan viikon aikana arvioimille näytteille yksi tai useampi uusintatarkastus tai tehtävä tämän kanssa yhdessä yksi tai useampi tarkastus. Tiivis seuranta on tarpeen sen päättämiseksi, jatketaanko tällaisen arvioijan käyttöä. Tulokset on kirjattava ja säilytettävä todisteena jatkotoimia varten.

C.   JÄSENVALTION ERI ALUEILLA JA ERI JÄSENVALTIOISSA SAATUJEN TULOSTEN VERTAILU

Vuosittain on järjestettävä mahdollisuuksien mukaan vähintään yksi koe, jonka avulla on mahdollista vertailla arvioijien eri alueilla saamia tuloksia. Jos tuloksissa ilmenee merkittäviä eroja, on toteutettava tarvittavat toimet niiden syiden selvittämiseksi ja vertailukelpoisiin tuloksiin pääsemiseksi.

Jäsenvaltiot voivat järjestää kokeita, joiden avulla on mahdollista vertailla oman maan arvioijien ja naapurijäsenvaltioiden arvioijien saamia tuloksia. Jos merkittäviä eroja ilmenee, on tehtävä perusteellinen tutkimus vertailukelpoisiin tuloksiin pääsemiseksi.

Jäsenvaltioiden on ilmoitettava komissiolle näiden vertailujen tuloksista.

LIITE IV

(4 artikla)

VOIN AISTINVARAINEN ARVIOINTI

1.   SOVELTAMISALA

Tässä esitetyn voin aistinvaraisen arviointimenettelyn tarkoituksena on tarjota käyttöön yhtenäinen menetelmä, jota voidaan soveltaa kaikissa jäsenvaltioissa.

Lisätietoja saa maitoa ja maitotuotteita koskevasta kansainvälisestä IDF-standardista IDF 99: aistinvaraista arviointia koskevan osuuden osat 1, 2 ja 3.

2.   MÄÄRITELMÄT

”Aistinvaraisella arvioinnilla” tarkoitetaan tuotteen ominaisuuksien tutkimista aistielinten avulla.

”Raadilla” tarkoitetaan valittujen arvioijien ryhmää, jonka jäsenet tekevät työtään arvioinnin aikana itsenäisesti ja vaikuttamatta toinen toisiinsa.

”Arvioijalla” tarkoitetaan henkilöä, joka on valittu, koska hänellä on kyky tehdä aistinvarainen arviointi. Tämän tyyppisten arvioijien kokemus voi olla vähäinen.

”Asiantuntija-arvioijalla” tarkoitetaan henkilöä, jonka aistiherkkyys on huomattava, jolla on merkittävä kokemus aistinvaraisen arvioinnin menetelmistä ja joka pystyy arvioimaan erilaisia tuotteita johdonmukaisesti ja luotettavasti. Tämän tyyppisillä arvioijilla on oltava hyvä pitkäkestoinen aistimuisti.

”Pisteytyksellä” tarkoitetaan aistinvaraista arviota, jonka raati ilmaisee numeroasteikolla. Arvioinnissa on käytettävä virhenimikkeistöä.

”Luokituksella” tarkoitetaan pisteytyksen perusteella tehtävää laatuluokitusta.

”Valvonta-asiakirjoilla” tarkoitetaan asiakirjoja, joihin kirjataan kunkin ominaisuuden pistemäärä ja tuotteen lopullinen luokitus. (Valvonta-asiakirjaan voidaan merkitä myös tuotteen kemiallinen koostumus.)

3.   ARVIOINTIHUONE

Lisätietoja standardeissa ISO 8589 ja ISO/DIS 22935–2 | IDF 99–2, kohta 7.

Järjestelyjen avulla on varmistettava, että ulkoiset tekijät eivät vaikuta arviointihuoneessa oleviin arvioijiin.

Arviointihuoneessa ei saa olla vieraita hajuja, ja huoneen on oltava helposti siivottavissa. Seinien on oltava vaaleat ja valoa heijastamattomat.

Arviointihuoneen ja sen valaistuksen on oltava sellaiset, että ne eivät vaikuta pisteytettävien tuotteiden ominaisuuksiin.

Huoneessa on oltava asianmukainen lämpötilan säätö, jotta voin lämpötila voidaan pitää tasaisena. Voin lämpötilan olisi luokitteluhetkellä oltava 12 °C (±2 °C).

4.   ARVIOIJIEN VALINTA

Arvioijan on tunnettava erityyppiset voit, ja hänen on oltava pätevä tekemään aistinvaraista luokitusta. Toimivaltaisen viranomaisen on tarkasteltava arvioijan pätevyyttä säännöllisesti (vähintään kerran vuodessa).

4.1   Lisätietoja yleisistä vaatimuksista ja seulontakokeista, joita voidaan tehdä ennen uuden arvioijan virallista käyttöä, on standardeissa ISO/DIS 22935–1 | IDF 99–1, kohta 4 (rekrytointi) ja kohta 5.1.

Koulutuksen on oltava jatkuvaa, ja arviointitilaisuuksia olisi järjestettävä säännöllisesti. Raadin koulutusta koskevia tietoja löytyy standardista ISO 8586–1.

4.2   Pohjakoulutuksen on katettava seuraavat aiheet:

—	aistinvaraisen arvioinnin yleisteoria ja käytännön merkitys,

—	aistituntemuksia koskevat menetelmät, asteikot ja kuvaukset,

—	aistinvaraisten ominaisuuksien havaitseminen ja tunnistaminen sekä aistihavaintoihin liittyvät erityisilmaisut,

—	voin valmistukseen liittyvä taustakoulutus,

—	validoidut vertailutuotteet ja näytteet, jotka auttavat arvioijaa tunnistamaan tuotteen makuja ja makujen intensiteettejä.

5.   RAATIA KOSKEVAT VAATIMUKSET

Raadissa on oltava pariton määrä arvioijia, kuitenkin vähintään kolme. Raadin jäsenten enemmistön on oltava toimivaltaisen viranomaisen työntekijöitä tai hyväksyttyjä henkilöitä, jotka eivät ole meijeriteollisuuden palveluksessa.

Raadin johtaja vastaa yleisesti koko menettelystä; hän voi olla raadin jäsen.

Ennen arviointia on otettava huomioon useita seikkoja, jotta arvioijat pystyisivät suoriutumaan tehtävistään mahdollisimman hyvin:

—	arvioija ei saa sairastaa tauteja, jotka voivat vaikuttaa hänen tehtäviinsä. Tällaisissa tapauksissa asianomainen arvioija on korvattava toisella arvioijalla,

—	voidakseen osallistua arviointiin arvioijien on saavuttava paikalle ajoissa ja varmistettava, että heillä on tarpeeksi aikaa arvioinnin suorittamiseen,

—	arvioijat eivät saa käyttää vahvasti tuoksuvia tuotteita (kuten parfyymeja, partavesiä ja deodorantteja) eivätkä syödä vahvasti maustettuja ruokia,

—	arvioijat eivät saa tupakoida, syödä tai juoda muuta kuin vettä arviointia edeltävän 30 minuutin aikana.

6.   SUORITUS

Kaikkien arvioijien olisi pätevyytensä ylläpitämiseksi osallistuttava säännöllisesti aistinvaraisen arvioinnin raateihin. Tiheys riippuu voin tuotantomääristä; mahdollisuuksien mukaan olisi järjestettävä vähintään yksi raati kuussa.

Vanhempien arvioijien olisi osallistuttava vuosittain tiettyyn määrään raateja, mahdollisuuksien mukaan vähintään kerran kolmessa kuukaudessa.

7.   NÄYTTEENOTTO JA NÄYTTEEN VALMISTELU

Puolueellisuuden välttämiseksi näytteiden nimettömyys on säilytettävä arvioinnin ajan. Näytteille on annettava koodit.

Tämä on järjestettävä ennen arviointia. Voi on kuljetettava arviointihuoneeseen lämpötilassa 6 °C ±2 °C.

Jos aistinvarainen arviointi tehdään kylmävarastolla, näyte otetaan voikairalla. Jos arviointi tehdään muualla kuin kylmävarastolla, näytettä on otettava vähintään 500 g. Voin lämpötilan tulisi arvioinnin ajan olla 12 °C (±2 °C) (vrt. standardi ISO/DIS 22935–2 | IDF 99–2, jonka mukaan voin arviointilämpötila on oltava 14 °C ±2 °C). Suuria poikkeamia on vältettävä kaikin keinoin.

8.   KUNKIN OMINAISUUDEN ARVIOINTI

8.1   Aistinvarainen arviointi koskee seuraavia kolmea ominaisuutta: ulkonäkö, koostumus ja maku.

”Ulkonäöllä” tarkoitetaan seuraavia piirteitä: väri, silmin havaittava puhtaus, fyysisten epäpuhtauksien ja homekasvun puuttuminen sekä irrallisen veden tasainen jakautuminen. Irrallisen veden esiintyminen tutkitaan IDF-standardin 112A/1989 mukaisesti.

”Koostumuksella” tarkoitetaan seuraavia piirteitä: rakenne, tekstuuri ja kiinteys. Levittyvyyttä voidaan seurata fyysisin keinoin, jos jokin jäsenvaltio niin haluaa tehdä kuluttajien vaatimuksiin vastaamiseksi. Komissio voi päättää tulevaisuudessa yhdenmukaistaa menetelmän.

”Rakenteella” tarkoitetaan tuotteen koossapysyvyyttä sitä kulutettaessa. Rakenne liitetään usein kiinteyteen ja levittyvyyteen, ja sen tulisi olla yhdenmukainen koko tuotteessa. Se liittyy läheisesti tekstuuriin ja on tuotteen kyky pysyä koossa oman painonsa alla. Se ilmenee vastavoimana leikattaessa ja sitä voidaan mitata mekaanisesti sekä suu- ja sormituntumalla.

”Maku” on ominaisuus, joka aistitaan suussa pääasiassa kielen makunystyröillä.

”Tuoksu” on ominaisuus, joka aistitaan nenällä ja hajuaistilla.

Huomattava poikkeama suositellusta lämpötilasta estää koostumuksen ja maun luotettavan arvioinnin. Lämpötilan merkitys on keskeinen.

Voin luokittelua on lykättävä, jos lämpötila on suositusarvojen ulkopuolella.

8.2   Kukin ominaisuus on arvioitava erikseen aistinvaraisesti. Pisteytyksen on oltava taulukon 1 mukainen.

8.3   Arvioijien voi olla aiheellista ennen varsinaisen arvioinnin alkua pisteyttää yhteisesti yhden tai useamman vertailunäytteen ulkonäkö, koostumus ja maku, jotta saavutetaan yhtenäinen arviointikäytäntö.

8.4   Hyväksymisen edellyttämät pistemäärät ovat seuraavat:

Ks. kohta 7 – Nimikkeistö ja pisteisiin sovellettavien kriteerien kuvaus pisteitä annettaessa.

	Enintään	Vaadittu
Ulkonäkö	5	4
Koostumus	5	4
Maku/tuoksu	5	4

—	Jos vaadittua pistemäärää ei saavuteta, virhe on kuvattava.

—	Kunkin arvioijan antama pistemäärä on kirjattava valvonta-asiakirjaan erikseen jokaisen ominaisuuden osalta.

—	Tuote hyväksytään tai hylätään enemmistön päätöksen perusteella.

—	Tuloksia, joissa kunkin ominaisuuden pistemäärät poikkeavat toisistaan enemmän kuin yhden pisteen verran, ei saisi esiintyä usein (enintään yhdessä näytteessä 20:stä). Muussa tapauksessa raadin johtajan on tarkistettava raadin pätevyys.

9.   VALVONTA

Raadin johtaja, jonka on oltava toimivaltaisen viraston virkamies, vastaa yleisesti koko menettelystä; hän voi olla raadin jäsen. Hänen on allekirjoitettava kunkin ominaisuuden yksittäiset pistemäärät valvonta-asiakirjaan ja sertifioitava tuotteen hyväksyminen tai hylkääminen.

10.   NIMIKKEISTÖ

Katso taulukkoa 2.

11.   KIRJALLISUUSVIITTEET

FIL-IDF 99C:1997 Sensory evaluation of dairy products by scoring – Reference method

ISO/DIS 22935 | IDF 99 International Standard for Milk and Milk Products – Sensory analysis – Parts 1–3

ISO 8586–1 Sensory analysis- General guidance for selection, training and monitoring of assessors – Part 1

ISO 8589 Sensory analysis – General guidance for the design of test rooms

FIL-IDF 112A:1989 Butter – Determination of water dispersion value

Taulukko 1

Voin pisteytys

Ulkonäkö			Koostumus			Maku ja tuoksu
Pisteet	Nro (1)	Huomautukset	Pisteet (laatuluokka)	Nro (1)	Huomautukset	Pisteet (laatuluokka)	Nro (1)	Huomautukset
5		Erittäin hyvä ihanteellinen paras laatu (tasaisen kuiva)	5		Erittäin hyvä ihanteellinen paras laatu (hyvin levittyvä)	5		Erittäin hyvä ihanteellinen paras laatu (ehdottoman puhdas, hienoin tuoksu)
4		Hyvä  (2) Ei ilmeisiä virheitä	4	17 18	Hyvä  (2) kova pehmeä	4		Hyvä  (2) Ei ilmeisiä virheitä
3	1 2 3 4 5 6 7 8	Tyydyttävä (lieviä virheitä) irrallista vettä epätasainen väri, kaksivärinen juovikas kirjava, marmoroitu väriläiskiä öljyn erottumista liikaa värjätty huokoinen	3	14 15 16 17 18	Tyydyttävä (lieviä virheitä) murea, hauras, mureneva paksu, salvamainen, rasvainen tahmea kova pehmeä	3	21 22 25 27 33 34 35	Tyydyttävä (lieviä virheitä) epäpuhdas vieras maku hapan keitetyn maku, palaneen maku rehun maku kitkerä, karvas liian suolainen
2	1 3 4 5 6 10 11 12	Huono (selviä virheitä) irrallista vettä juovikas kirjava, marmoroitu väriläiskiä öljyn erottumista vieraita aineita hometta liukenematonta suolaa	2	14 15 16 17 18	Huono (selviä virheitä) murea, hauras, mureneva paksu, salvamainen, rasvainen tahmea kova pehmeä	2	21 22 23 25 32 33 34 35 36 38	Huono (selviä virheitä) epäpuhdas vieras maku vanhan maku hapan hapettuneen maku, metallin maku rehun maku kitkerä, karvas liian suolainen ummehtunut, mädäntynyt kemikaalin maku
1	1 3 4 5 6 7 9 10 11 12	Erittäin huono (vakavia virheitä) irrallista vettä juovikas kirjava, marmoroitu väriläiskiä öljyn erottumista liikaa värjätty rakeinen vieraita aineita hometta liukenematonta suolaa	1	14 15 16 17 18	Erittäin huono (vakavia virheitä) murea, hauras, mureneva paksu, salvamainen, rasvainen tahmea kova pehmeä	1	22 24 25 26 28 29 30 31 32 34 35 36 37 38	Erittäin huono (vakavia virheitä) vieras maku juustomainen hapan hiivan maku homeen maku eltaantunut öljyinen, kalan maku talin maku hapettuneen maku, metallin maku kitkerä, karvas liian suolainen ummehtunut, mädäntynyt maltaan maku kemikaalin maku

Taulukko 2

Taulukko voin virheistä

I Ulkonäkö

1. irrallista vettä

2. epätasainen väri, kaksivärinen

3. juovikas

4. kirjava, marmoroitu

5. väriläiskiä

6. öljyn erottumista

7. liikaa värjätty

8. huokoinen

9. rakeinen

10. vieraita aineita

11. hometta

12. liukenematonta suolaa

II Koostumus

14. murea, hauras, mureneva

15. paksu, salvamainen, rasvainen

16. tahmea

17. kova

18. pehmeä

III Maku ja tuoksu

20. mauton

21. epäpuhdas (3)

22. vieras maku

23. vanhan maku

24. juustomainen

25. hapan

26. hiivan maku

27. a) keitetyn maku

b) palaneen maku

28. homeen maku

29. eltaantunut

30. öljyinen, kalan maku

31. talin maku

32. a) hapettuneen maku

b) metallin maku

33. rehun maku

34. kitkerä, karvas

35. liian suolainen

36. ummehtunut, mädäntynyt

37. maltaan maku

38. kemikaalin maku

---

(1)  Taulukko 2.

(2)  Virheet, jotka mainitaan kohdassa ”hyvä”, ovat hyvin pieniä poikkeamia tavoitellusta laadusta.

(3)  Tätä virhenimitystä on käytettävä mahdollisimman harvoin ja ainoastaan, jos virhettä ei voida kuvata tarkemmin.

LIITE V

(5 artikla)

VOIÖLJYN, VOIN JA KERMAN ENANTTIHAPPOTRIGLYSERIDIPITOISUUDEN MÄÄRITTÄMINEN KAASUKROMATOGRAFISELLA TRIGLYSERIDIEN MÄÄRITYSMENETELMÄLLÄ

1.   SOVELTAMISALA

Tätä menetelmää käytetään voiöljyn, voin ja kerman enanttihappotriglyseridipitoisuuden määrittämiseksi.

2.   ILMAISUT JA MÄÄRITELMÄ

Enanttihappopitoisuus: enanttihappotriglyseridipitoisuus, joka on määritelty tässä menetelmässä esitetyllä tavalla.

Huomautus: Voiöljyn ja voin enanttihappopitoisuus ilmaistaan kilogrammoina tuotetonnia kohden, ja kerman enanttihappopitoisuus ilmaistaan kilogrammoina maitorasvatonnia kohden.

3.   PERIAATE

Maitorasva uutetaan tuotteista standardin ISO 14156 | IDF 172:2001 mukaisesti. Enanttihappotrigyseridipitoisuuden määrä uutetussa rasvassa määritetään kapillaarikaasukromatografialla. Näytteestä saatua tulosta arvioidaan vertaamalla sitä sisäisenä standardina käytettyjen kapronihappotrigyseridien antamiin tuloksiin.

Huomautus: Myös tributyriinin on todettu olevan tyydyttävä sisäinen standardi.

4.   REAGENSSIT

Kaikkien reagenssien on oltava hyväksyttyä analyysilaatua.

4.1   n-heksaani

4.2   kapronihappotriglyseridistandardi, puhtaudeltaan vähintään 99 %

4.3   enanttihappotriglyseridistandardi, puhtaudeltaan vähintään 99 %

4.4   vedetön natriumsulfaatti (Na2SO4)

5.   LAITTEET JA TARVIKKEET

Tavalliset laboratoriovälineet ja erityisesti seuraavat:

5.1   analyysivaaka, tarkkuus 1 mg

5.2   mittapulloja, 10 ja 20 ml

5.3   sentrifugiputkia, 30 ml

5.4   pyöröhaihduttaja

5.5   uuni, jonka lämpötila voidaan pitää 50 °C:ssa (± 5 °C)

5.6   suodatinpapereita, keskinopea suodatus, halkaisija noin 15 cm

kaasukromatografialaitteisto

5.7.1   kaasukromatografi, jossa on split/splitless -injektori tai kolonniin liitetty injektori sekä liekki-ionisaatiodetektori

kaasukromatografikolonni, jossa stationaarifaasi, jota on käytetty onnistuneesti trigyseridien erottamisessa (dimetyylipolysiloksaani 100 % tai fenyylimetyylipolysiloksaani 5 % ja metyylipolysiloksaani 95 %). Valitaan stationaarifaasi, kolonnin pituus (4–15 m), sisähalkaisija (0,22–0,50 mm) ja nestekerroksen paksuus (vähintään 0,12 μm) laboratoriokokemuksen ja injektiojärjestelmän perusteella. Valitun kolonnin on joka tapauksessa sekä erotettava täydellisesti liuotinpiikki ja kapronihappotriglyseridi että tuotettava kapronihappo- ja enanttihappotriglyseridien piikkien välinen perusviivaresoluutio. Esimerkkejä sovellettavista edellytyksistä esitetään jäljempänä.

5.7.2.1   Esimerkkejä split-injektorin käyttöä koskevista edellytyksistä

—	kantajakaasu: helium

—	paine: 100 kPa

—	kolonni: kvartsilasinen kolonni, jonka pituus 12 m, sisähalkaisija 0,5 mm ja nestekerroksen paksuus 0,1 μm

—	stationäärifaasi: dimetyylipolysiloksaani 100 % tai fenyylimetyylipolysiloksaani 5 % ja dimetyylipolysiloksaani 95 % (esim. HT5)

—	kolonnin lämpötila: alkulämpötila 130 °C, jota pidetään yllä 1 minuutti, nostetaan 20 °C/min 260 °C:seen ja sitten 30 °C/min 360 °C:seen ja pidetään 10 minuuttia 360 °C:ssa

—	detektorin lämpötila: 370 °C

—	injektorin lämpötila: 350 °C

—	jakosuhde 1:30

—	Injektiotilavuus: 1 μl.

5.7.2.2   Esimerkkejä kolonniin liitetyn injektorin käyttöä koskevista edellytyksistä

—	kantajakaasu: vety (jatkuvan virtauksen järjestelmä)

—	paine: 89 kPa

—	kolonni: kvartsilasinen kolonni, jonka pituus 4 m, sisähalkaisija 0,32 mm ja nestekerroksen paksuus 0,25 μm

—	stationäärifaasi: 5 % fenyyli, 95 % dimetyylipolysiloksaani

—	kolonnin lämpötila: alkulämpötila 60 °C, joka pidetään 2 minuutin ajan, sitten nostetaan 35 °C/min 340 °C:seen ja pidetään tässä lämpötilassa 5 minuuttia

—	detektorin lämpötila: 350 °C

—	injektiotilavuus: 1 μl.

5.8   Injektioruisku, 5 μl

6.   NÄYTTEENOTTO

Laboratorion on tärkeää saada aidosti edustava näyte, joka ei ole vahingoittunut eikä muuttunut kuljetuksen tai varastoinnin aikana.

Tässä kansainvälisessä standardissa ei määritellä näytteenottomenetelmää. Suositellaan käytettäväksi IDF-standardissa 50C: 1995 tai ISO-standardissa 707–1997 – Maito ja maitotuotteet: näytteenottomenetelmät – esitettyä näytteenottomenetelmää.

7.   SUORITUS

7.1   Näytteen ja mitattavan näytteen esikäsittely

Toimitaan standardin ISO 14156 | IDF 172:2001 mukaisesti.

7.1.1   Voiöljy, voi

7.1.1.1   Sulatetaan 50–100 g näytettä uunissa (5.5).

7.1.1.2   Pannaan 0,5–1,0 g vedetöntä natriumsulfaattia (5.4) taitettuun suodatinpaperiin.

7.1.1.3   Suodatetaan rasva vedetöntä natriumsulfaattia sisältävän suodatinpaperin läpi ja kerätään suodos uunissa (5.5) pidettyyn dekanterilasiin. Kun sulanutta voita dekantoidaan suodatinpaperiin, varotaan heran siirtämistä.

7.1.2   Kerma

7.1.2.1   Näytteen lämpötilan on oltava 20 °C ± 2 °C.

7.1.2.2   Sekoitetaan näyte huolellisesti.

7.1.2.3   Laimennetaan sopiva määrä näytettä siten, että saadaan mittausta varten 100 ml:n näyte, jossa rasvan massaosuus on noin 4 %.

7.1.2.4   Rasvan uuttamiseksi kermasta toimitaan kuten raakamaidon ja homogenoidun maidon kanssa (ks. ISO 14156 | IDF 172:2001, kohta 8.3).

7.1.2.5   Punnitaan 1 g uutettua rasvaa 1 mg:n tarkkuudella 10 ml:n mittapulloon (5.2). Lisätään 1 ml kohdan 7.2.2 liuosta. Täytetään 10 ml:aan n-heksaanilla (4.1) ja homogenoidaan.

7.1.2.6   Siirretään 1 ml kohdan 7.1.1.2 liuosta 10 ml:n mittapulloon (5.2) ja laimennetaan 10 ml:aan n-heksaanilla (4.1).

7.2   Kalibrointistandardien valmistus

7.2.1   Liuotetaan 100 mg enanttihappotriglyseridiä (4.3) 10 ml:aan n-heksaania (4.1).

7.2.2   Liuotetaan 100 mg kapronihappotriglyseridiä (4.2) 10 ml:aan n-heksaania (4.1).

7.2.3   Siirretään 1 ml kohdan 7.2.2 liuosta 10 ml:n mittapulloon (5.2). Täytetään 10ml:aan n-heksaanilla (4.1).

7.2.4   Siirretään 1 ml kohdan 7.2.1 liuosta ja 1 ml kohdan 7.2.2 liuosta 10 ml:n mittapulloon (5.2). Täytetään 10 ml:aan n-heksaanilla (4.1).

7.2.5   Siirretään 1 ml kohdan 7.2.4 liuosta 10 ml:n mittapulloon (5.2) ja täytetään 10 ml:aan n-heksaanilla (4.1).

7.3   Kromatografinen määritys

7.3.1   Injektoidaan 1 μl standardiliuosta (7.2.5) kahdesti.

7.3.2   Injektoidaan 1 µl kumpaakin näyteliuosta.

Huomautus: Jos on valittu kolonniin liitetty injektorijärjestelmä, standardi- ja näyteliuoksia pitää laimentaa enemmän.

7.3.3   Toistetaan vaihetta 7.3.1 joka kolmannen näytteen jälkeen, jotta näyte saadaan kaksoisinjektoitujen standardien väliin. Tulokset perustuvat standardikromatogrammien vastekertoimien keskiarvoon.

8.   TULOSTEN LASKEMINEN

Integroidaan jokaisesta kromatogrammista enantti- ja kapronihappotriglyserideihin liittyvien piikkien pinta-alat.

Noudatetaan noita ohjeita jokaisen näytesarjan osalta, eli yhdessä näytesarjassa juuri ennen näytettä kaksoisinjektoitu standardi on STD1 ja juuri näytteen jälkeen kaksoisinjektoitu standardi on STD2.

8.1   Kalibrointi

8.1.1   Lasketaan jokaiselle STD1:lle vastekertoimet Rf1(a) ja Rf1(b).

Rf1 (a) tai (b) = (kapronihappotriglyseridipiikin pinta-ala/enanttihappotriglyseridipiikin pinta-ala) × 100

Lasketaan vastekertoimen keskiarvo Rf1.

Rf1 = (Rf1(a) + Rf1(b)) / 2

8.1.2   Lasketaan samalla tavoin STD2:n vastekertoimen keskiarvo Rf2.

8.1.3   Lasketaan vastekertoimen keskiarvo Rf.

Rf = (Rf1 + Rf2) /2

8.2   Näytteet

Lasketaan jokaisesta STD1:n ja STD2:n välillä saadusta näytteen kromatogrammista enanttihappopitoisuus C (kg/tonnia):

C = (enanttihappotriglyseridipiikin pinta-ala × Rf × 100)/(kapronihappotriglyseridipiikin pinta-ala × Wt × 1 000)

jossa:

—	Wt = otetun rasvan paino (g)

—	100 = laimennustilavuus näytettä varten

—	1 000 = muuntokerroin (μg/g:sta suhteeseen kg/tonnia)

Voinäytteissä otetaan huomioon voin rasvapitoisuus ja lasketaan korjattu pitoisuusarvo Cbutter (kg/voitonni).

Cbutter = Cfat × F

jossa F on voin rasvapitoisuus.

9.   TARKKUUS

Standardin ISO 5725–1 ja ISO 5725–2 mukaisesti tehtävää voin monilaboratoriotestiä koskevat tarkkuutta koskevat tiedot esitetään kohdassa 12.

Toistettavuus- ja uusittavuusrajojen arvot ilmaistaan 95 %:n todennäköisyystasolla, eikä niitä välttämättä voi soveltaa muihin kuin tässä esitettyihin pitoisuusalueisiin ja matriiseihin.

9.1   Toistettavuus

Kahden yksittäisen testituloksen, jotka sama henkilö on saanut samassa laboratoriossa lyhyen ajan kuluessa samalla menetelmällä ja samalla välineistöllä täysin samanlaiselle testimateriaalille, absoluuttinen ero saa korkeintaan 5 prosentissa tapauksista olla suurempi kuin 0,35 kg tonnia kohden.

9.2   Uusittavuus

Kahden yksittäisen testituloksen, jotka eri henkilöt ovat saaneet eri laboratorioissa samalla menetelmällä ja eri välineistöllä täysin samanlaiselle testimateriaalille, absoluuttinen ero saa korkeintaan 5 prosentissa tapauksista olla suurempi kuin 0,66 kg tonnia kohden.

10.   SALLITUT POIKKEAMAT: ALARAJAT (JOS MÄÄRÄT OVAT RIITTÄMÄTTÖMÄT)

10.1   Merkitystä tuotteesta on otettava kolme näytettä sen tarkastamiseksi, että tuote on merkitty oikein.

10.2   Voi ja voiöljy

10.2.1   Voitonnia kohden lisätään 11 kg enanttihappotriglyseridiä (puhtaus vähintään 95 %) eli 10,45 kg/t.

10.2.2   Tuoteanalyysin kolmesta näytteestä saatujen tulosten avulla tarkistetaan lisättyjen merkkiaineiden määrä ja homogeenisuus. Pienintä näistä arvoista verrataan seuraaviin raja-arvoihin:

—	9,51 kg/t (95 % pienimmästä lisättävästä määrästä puhtaudeltaan 95 % olevaa enanttihappotriglyseridiä, yksi määritys),

—	6,89 kg/t (70 % pienimmästä lisättävästä määrästä puhtaudeltaan 95 % olevaa enanttihappotriglyseridiä, yksi määritys),

—	interpoloinnissa arvojen 9,51 kg/t ja 6,89 kg/t välillä käytetään alhaisimman tuloksen antaneen näytteen merkkiainepitoisuutta.

10.3   Kerma

10.3.1   Maitorasvatonnia kohden lisätään 10 kg enanttihappotriglyseridiä (puhtaus vähintään 95 %) eli 9,50 kg/tonnia merkkiaineellista maitorasvaa

10.3.2   Tuoteanalyysin kolmesta näytteestä saatujen tulosten avulla tarkistetaan lisättyjen merkkiaineiden määrä ja homogeenisuus. Pienintä näistä arvoista verrataan seuraaviin raja-arvoihin:

—	8,60 kg/t (95 % pienimmästä lisättävästä määrästä puhtaudeltaan 95 % olevaa enanttihappotriglyseridiä, yksi määritys),

—	6,23 kg/t (70 % pienimmästä lisättävästä määrästä puhtaudeltaan 95 % olevaa enanttihappotriglyseridiä, yksi määritys).

—	interpoloinnissa arvojen 8,60 kg/t ja 6,23 kg/t välillä käytetään alhaisimman tuloksen antaneen näytteen merkkiainepitoisuutta.

11.   SALLITUT POIKKEAMAT: YLÄRAJAT (JOS MÄÄRÄ YLITTYY YLI 20 %)

11.1   Merkitystä tuotteesta on otettava kolme näytettä sen tarkastamiseksi, että tuote on merkitty oikein.

11.2   Voi ja voiöljy

11.2.1   Tuoteanalyysin kolmesta näytteestä saatujen tulosten avulla tarkistetaan lisättyjen merkkiaineiden määrä ja homogeenisuus. Tulosten keskiarvoa verrataan seuraaviin raja-arvoihin:

—	yläraja on 12,96 kg/t.

11.3   Kerma

11.3.1   Tuoteanalyysin kolmesta näytteestä saatujen tulosten avulla tarkistetaan lisättyjen merkkiaineiden määrä ja homogeenisuus. Tulosten keskiarvoa verrataan seuraaviin raja-arvoihin:

—	yläraja on 11,82 kg/t.

12.   LISÄTIEDOT: VOIRASVAN SISÄLTÄMÄN TRIENANTOAATIN TRIGLYSERIDIANALYYSILLÄ TEHDYN MÄÄRITYKSEN TULOSTEN TILASTOLLINEN ANALYYSI

Trienantoaattipitoisuuden määrittämiseksi merkkiaineellisessa voissa on tehty neljä laboratorioiden välistä koetta.

Ensimmäisen vaiheen kokeisiin osallistui 9 laboratoriota, joille ei määrätty mitään tiettyä määritysmenetelmää.

Toisen vaiheen kokeisiin osallistui 10 laboratoriota, jotka käyttivät neljää eri menetelmää:

—	metyyliheptanoaatin kvantifiointi käyttäen sisäisenä standardina n-nonaania tai metyylinonanoaattia,

—	trienantoaatin kvantifiointi käyttäen sisäisenä standardina trikaproaattia,

—	metyyliheptanoaatin kvantifiointi käyttäen kalibrointinäytettä/-seosta,

—	metyyliheptanoaatin kvantifiointi käyttäen kalibrointiseosta.

Jos määritettiin rasvahappometyyliestereitä, käytettiin lisäksi kahta erilaista metylointimenetelmää (De Francesco ja Christopherson & Glass).

Saatujen tulosten perustella kolmannen vaiheen testejä varten valittiin kaksi menetelmää:

—	metyyliheptanoaatin kvantifiointi käyttäen sisäisenä standardina n-nonaania tai metyylinonanoaattia,

—	trienantoaatin kvantifiointi käyttäen sisäisenä standardina trikaproaattia.

Seitsemän laboratorion tulokset osoittivat, että rasvahappometyyliestereiden määritysmenetelmä tuotti enemmän vaihtelua, minkä vuoksi päätettiin käyttää ainoastaan trienantoaatin määritystä triglyseridinä menetelmällä q ”trienantoaatin kvantifiointi käyttäen sisäisenä standardina trikaproaattia”. Lisäksi on tehtävä triglyseridimääritys kapillaarikolonnilla.

Neljännessä koevaiheessa neljää näytettä (A, B, C, D) kierrätettiin, ja tuloksia saatiin yhdeksästä laboratoriosta (taulukot 1 ja 2).

Kaksi laboratoriota (DE ja UE) analysoi näytteen rasvahappometyyliesterien määritysmenetelmällä.

Laboratorioiden vähäisen lukumäärän vuoksi tilastolaskelmat on tehty sekä kaikista tiedoista (kuvat 1 ja 2) rasvahappometyyliesterien määritystulokset mukaan luettuina että triglyseridimäärityksien tiedoista.

Testit rajojen ulkopuolelle jäävien laboratorioiden havaitsemiseksi:

—	näyte A: Dixon-, Cochran- ja Grubbs-testit tasoilla 1 ja 5 % osoittivat harha-arvoja yhdessä laboratoriossa,

—	näyte B: Grubbs-testi tasolla 5 % osoitti harha-arvoja yhdessä laboratoriossa,

—	näyte C: Dixon- ja Grubbs-testit tasoilla 1 ja 5 % osoittivat harha-arvoja yhdessä laboratoriossa,

—	näyte D: Dixon- ja Grubbs-testit tasoilla 1 ja 5 % osoittivat harha-arvoja yhdessä laboratoriossa.

Harha-arvoja antaneet laboratoriot on jätetty laskelman ulkopuolelle.

On syytä huomata, että rasvahappometyyliesterien määritysmenetelmällä saatuja tuloksia ei testeissä koskaan pidetty harha-arvoina.

Tarkkuusparametrit

Taulukoissa 1 ja 2 esitetään kaikkien laboratorioiden tulokset ja tarkkuusparametrit, jotka on laskettu hyväksyttävän laboratoriomäärän (8) perusteella. Laboratorioissa ei kuitenkaan valitettavasti käytetty samoja analyysimenetelmiä.

Taulukoissa 3 ja 4 esitetään ainoastaan triglyseridimääritysmenetelmällä saadut tulokset ja vastaavat tarkkuusparametrit. Parametrit voidaan hyväksyä, jos hyväksytään laboratorioiden vähäinen lukumäärä (6).

Kuvissa 3 ja 4 esitetään edellä kuvattuun kahteen sarjaan kuuluvia neljää näytettä koskevien mittaustietojen perusteella laskettujen Sr- ja SR-arvojen suuntaukset.

Taulukossa 5 esitetään Sr- ja SR-arvot yhdessä vastaavien yhdistettyjen arvojen sekä r- ja R-kokonaisparametrien kanssa.

Myös kriittinen ero 95 % todennäköisyydellä on laskettu.

Taulukko 1

Triglyseridien ja rasvahappometyyliesterien* määritysmenetelmien tilastolliset tulokset

Näyte A		R1	R2	Keskiarvo	Laboratorioiden lukumäärä rajojen ulkopuolelle jääneiden laboratorioiden poistamisen jälkeen	8
RENNES	FR1	11,0	11,1	11,1	Harha-arvoja antaneiden laboratorioiden lukumäärä	1
RIKILT	NL	11,2	11,2	11,2	Harha-arvoja antaneet laboratoriot	DК
ZPLA	DE*	11,6	11,8	11,7	Keskiarvo	11,3
ADAS	GB	11,4	11,2	11,3	Todellinen arvo	11,0
CNEVA	FR2	11,4	11,4	11,4	Toistettavuuden standardipoikkeama (Sr)	0,09
LODI	IT	11,1	11,3	11,2	Toistettavuuden suhteellinen standardipoikkeama (RSDr %)	0,80
EELA	FI	11,3	11,2	11,3	Toistettavuus r (95 %)	0,26
ISPRA	UE*	11,0	11,0	11,0	Suhteellinen toistettavuus r %	2,24
D.V.F.A.	DK	13,3	11,8	12,6	Uusittavuuden standardipoikkeama (SR)	0,23
					Uusittavuuden suhteellinen standardipoikkeama (RSDR %)	2,04
					Uusittavuus R (95 %)	0,84
					Suhteellinen uusittavuus R %	5,71
Näyte B		R1	R2	Keskiarvo	Laboratorioiden lukumäärä rajojen ulkopuolelle jääneiden laboratorioiden poistamisen jälkeen	8
RENNES	FR1	12,7	12,8	12,8	Harha-arvoja antaneiden laboratorioiden lukumäärä	1
RIKILT	NL	13,5	13,3	13,4	Harha-arvoja antaneet laboratoriot	DK
ZPLA	DE*	14,0	13,8	13,9	Keskiarvo	13,4
ADAS	GB	13,4	13,5	13,5	Todellinen arvo	13,5
CNEVA	FR2	13,3	13,4	13,4	Toistettavuuden standardipoikkeama (Sr)	0,14
LODI	IT	13,9	13,5	13,7	Toistettavuuden suhteellinen standardipoikkeama (RSDr %)	1,04
EELA	FI	13,4	13,2	13,3	Toistettavuus r (95 %)	0,40
ISPRA	UE*	13,2	13,3	13,3	Suhteellinen toistettavuus r %	2,91
D.V.F.A.	DK	14,1	14,8	14,5	Uusittavuuden standardipoikkeama (SR)	0,35
					Uusittavuuden suhteellinen standardipoikkeama (RSDR %)	2,61
					Uusittavuus R (95 %)	0,99
					Suhteellinen uusittavuus R %	7,31

Taulukko 2

Tilastotiedot triglyseridimääritysten ja rasvahappometyyliesterien* määritysten tuloksista

Näyte C		R1	R2	Keskiarvo	Laboratorioiden lukumäärä rajojen ulkopuolelle jääneiden laboratorioiden poistamisen jälkeen	8
RENNES	FR1	8,9	9,2	9,1	Harha-arvoja antaneiden laboratorioiden lukumäärä	1
RIKILT	NL	9,2	9,3	9,3	Harha-arvoja antaneet laboratoriot	DK
ZPLA	DE*	9,2	9,4	9,3	Keskiarvo	9,3
ADAS	GB	9,5	9,3	9,4	Todellinen arvo	9,3
CNEVA	FR2	9,4	9,4	9,4	Toistettavuuden standardipoikkeama (Sr)	0,14
LODI	IT	9,2	9,5	9,4	Toistettavuuden suhteellinen standardipoikkeama (RSDr %)	1,50
EELA	FI	9,4	9,6	9,5	Toistettavuus r (95 %)	0,40
ISPRA	UE*	9,4	9,3	9,4	Suhteellinen toistettavuus r %	4,20
D.V.F.A.	DK	10,7	10,9	10,8	Uusittavuuden standardipoikkeama (SR)	0,17
					Uusittavuuden suhteellinen standardipoikkeama (RSDR%)	1,82
					Uusittavuus R (95 %)	0,47
					Suhteellinen uusittavuus R %	5,10
Näyte D		R1	R2	Keskiarvo	Laboratorioiden lukumäärä rajojen ulkopuolelle jääneiden laboratorioiden poistamisen jälkeen	8
RENNES	R1	1,6	1,6	1,6	Harha-arvoja antaneiden laboratorioiden lukumäärä	1
RIKILT	NL	2,1	2,1	2,1	Harha-arvoja antaneet laboratoriot	DK
ZPLA	DE*	2,3	2,3	2,3	Keskiarvo	2,1
ADAS	GB	2,1	2,2	2,2	Todellinen arvo	2,1
CNEVA	FR2	2,1	2,1	2,1	Toistettavuuden standardipoikkeama (Sr)	0,08
LODI	IT	2,2	1,9	2,1	Toistettavuuden suhteellinen standardipoikkeama (RSDr %)	3,81
EELA	FI	2,3	2,3	2,3	Toistettavuus r (95 %)	0,22
ISPRA	UE*	2,3	2,3	2,3	Suhteellinen toistettavuus r %	10,67
D.V.F.A.	DK	3,4	2,9	3,2	Uusittavuuden standardipoikkeama (SR)	0,24
					Uusittavuuden suhteellinen standardipoikkeama (RSDR %)	11,43
					Uusittavuus R (95 %)	0,67
					Suhteellinen uusittavuus R %	32,00

Taulukko 3

Tilastotiedot triglyseridimääritysten ja rasvahappometyyliesterien* määritysten tuloksista

Näyte A		R1	R2	Keskiarvo	Laboratorioiden lukumäärä rajojen ulkopuolelle jääneiden laboratorioiden poistamisen jälkeen	6
RENNES	FR1	11,0	11,1	11,1	Harha-arvoja antaneiden laboratorioiden lukumäärä	1
RIKILT	NL	11,2	11,2	11,2	Harha-arvoja antaneet laboratoriot	DК
ADAS	GB	11,4	11,2	11,3	Keskiarvo	11,2
CNEVA	FR2	11,4	11,4	11,4	Todellinen arvo	11,0
LODI	IT	11,1	11,3	11,2	Toistettavuuden standardipoikkeama (Sr)	0,09
ËÈLA	FI	11,3	11,2	11,3	Toistettavuuden suhteellinen standardipoikkeama (RSDr %)	0,80
D.V.F.A.	DK	13,3	11,8	12,6	Toistettavuus r (95 %)	0,25
					Suhteellinen toistettavuus r %	2,24
					Uusittavuuden standardipoikkeama (SR)	0,13
					Uusittavuuden suhteellinen standardipoikkeama (RSDR %)	1,16
					Uusittavuus R (95 %)	0,36
					Suhteellinen uusittavuus R %	3,25
Näyte B		R1	R2	Keskiarvo	Laboratorioiden lukumäärä rajojen ulkopuolelle jääneiden laboratorioiden poistamisen jälkeen	6
RENNES	FR1	12,7	12,8	12,8	Harha-arvoja antaneiden laboratorioiden lukumäärä	1
RIKILT	NL	13,5	13,3	13,4	Harha-arvoja antaneet laboratoriot	DК
ADAS	GB	13,4	13,5	13,5	Keskiarvo	13,3
CNEVA	FR2	13,3	13,4	13,4	Todellinen arvo	13,5
LODI	IT	13,9	13,5	13,7	Toistettavuuden standardipoikkeama (Sr)	0,15
EELA	FI	13,4	13,2	13,3	Toistettavuuden suhteellinen standardipoikkeama (RSDr %)	1,13
D.V.F.A.	DK	14,1	14,8	14,5	Toistettavuus r (95 %)	0,42
					Suhteellinen toistettavuus r %	3,16
					Uusittavuuden standardipoikkeama (SR)	0,33
					Uusittavuuden suhteellinen standardipoikkeama (RSDR %)	2,48
					Uusittavuus R (95 %)	0,93
					Suhteellinen uusittavuus R %	6,94

Taulukko 4

Tilastotiedot triglyseridien määritysmenetelmän tuloksista

Näyte C		R1	R2	Keskiarvo	Laboratorioiden lukumäärä rajojen ulkopuolelle jääneiden laboratorioiden poistamisen jälkeen	6
RENNES	FR1	8,9	9,2	9,1	Harha-arvoja antaneiden laboratorioiden lukumäärä	1
RIKILT	NL	9,2	9,3	9,3	Harha-arvoja antaneet laboratoriot	DК
ADAS	GB	9,5	9,3	9,4	Keskiarvo	9,3
CNEVA	FR2	9,4	9,4	9,4	Todellinen arvo	9,3
LODI	IT	9,2	9,5	9,4	Toistettavuuden standardipoikkeama (Sr)	0,15
EELA	FI	9,4	9,6	9,5	Toistettavuuden suhteellinen standardipoikkeama (RSDr %)	1,61
D.V.F.A.	DK	10,7	10,9	10,8	Toistettavuus r (95 %)	0,42
					Suhteellinen toistettavuus r %	4,51
					Uusittavuuden standardipoikkeama (SR)	0,19
					Uusittavuuden suhteellinen standardipoikkeama (RSDR %)	2,04
					Uusittavuus R (95 %)	0,53
					Suhteellinen uusittavuus R %	5,71
Näyte D		R1	R2	Keskiarvo	Laboratorioiden lukumäärä rajojen ulkopuolelle jääneiden laboratorioiden poistamisen jälkeen	6
RENNES	FR1	1,6	1,6	1,6	Harha-arvoja antaneiden laboratorioiden lukumäärä	1
RIKILT	NL	2,1	2,1	2,1	Harha-arvoja antaneet laboratoriot	DK
					Keskiarvo	2,1
ADAS	GB	2,1	2,2	2,2	Todellinen arvo	2,1
CNEVA	FR2	2,1	2,1	2,1	Toistettavuuden standardipoikkeama (Sr)	0,09
LODI	IT	2,2	1,9	2,1	Toistettavuuden suhteellinen standardipoikkeama (RSDr %)	4,29
EELA	FI	2,3	2,3	2,3	Toistettavuus r (95 %)	0,26
D.V.F.A.	DK	3,4	2,9	3,2	Suhteellinen toistettavuus r %	12,01
					Uusittavuuden standardipoikkeama (SR)	0,25
					Uusittavuuden suhteellinen standardipoikkeama (RSDR%)	11,90
					Uusittavuus R (95 %)	0,69
					Suhteellinen uusittavuus R %	33,32

Taulukko 5

Toistettavuus ja uusittavuus (rasvahappometyyliesterit mukaan luettuina)

	Laboratorioiden lukumäärä	Harha-arvoja antaneet laboratoriot	Toistettavuus Sr (95 %)	Uusittavuus SR (95 %)
Näyte A	8	1	0,09	0,23
Näyte B	8	1	0,14	0,35
Näyte C	8	1	0,14	0,17
Näyte D	8	1	0,08	0,24
Yhdistetty arvo			0,116	0,256
			R	R
Yhdistetty arvo* 2.8			0,324	0,716
CrD95 =0.40 Trienantoaatin ilmoitettu puhtausaste = vähintään 95 %. Voirasvan sisältämän trienantoaatin ilmoitettu vähimmäisraja = 11 kg/t. Jos otetaan huomioon kriittinen ero 95 %:n todennäköisyydellä, kahden tuloksen keskiarvo ei saa olla pienempi kuin:   10,05 kg/tonni, jos on sisällytetty puhtausasteeltaan 95 % olevaa trienantoaattia.

Toistettavuus ja uusittavuus (rasvahappometyyliesterit pois luettuina)

	Laboratorioiden lukumäärä	Harha-arvoja antaneet laboratoriot	Toistettavuus Sr (95 %)	Uusittavuus SR (95 %)
Näyte A	6	1	0,09	0,13
Näyte B	6	1	0,15	0,33
Näyte C	6	1	0,15	0,19
Näyte D	6	1	0,09	0,25
Yhdistetty arvo			0,124	0,237
			r	R
Yhdistetty arvo* 2.8			0,347	0,663
CrD95 =0,36 Trienantoaatin ilmoitettu puhtausaste = vähintään 95 %. Voirasvan sisältämän trienantoaatin ilmoitettu vähimmäisraja = 11 kg/t. Jos otetaan huomioon kriittinen ero 95 %:n todennäköisyydellä, kahden tuloksen keskiarvo ei saa olla pienempi kuin:   10,09 kg/tonni, jos on sisällytetty puhtausasteeltaan 95 % olevaa trienantoaattia.

Kuva 1 (1)

Koetulokset: näyte A

Koetulokset: näyte B

Koetulokset: näyte C

Koetulokset: näyte D

Kuva 2

Toistettavuuden ja uusittavuuden standardipoikkemat eri tasoilla (triglyseridit ja rasvahappometyyliesterit)

Kuva 3

Toistettavuuden ja uusittavuuden standardipoikkemat eri tasoilla (triglyseridit)

Kuva 4

Esimerkki kolonniin liitetyn injektorin käytöstä

---

(1)  = Rasvahappometyyliesterien määritysmenetelmä

LIITE VI

(5 artikla)

VOIÖLJYN, VOIN TAI KERMAN VANILLIINIPITOISUUDEN MÄÄRITTÄMINEN HPLC-MENETELMÄLLÄ

1.   TARKOITUS JA SOVELTAMISALA

Tässä kuvataan menetelmä vanilliinin kvantitatiiviseksi määrittämiseksi voista, voiöljystä tai kermasta.

2.   PERIAATE

Tietynsuuruinen näyte uutetaan isopropanoli/etanoli/asetonitriili -seoksella (1:1:2). Pääosa rasvasta saostetaan jäähdyttämällä –15 °C:n ja –20 °C:n välillä, minkä jälkeen näyte sentrifugoidaan.

Laimennetaan vedellä, minkä jälkeen vanilliinipitoisuus määritetään HPLC-menetelmällä.

3.   LAITTEET JA TARVIKKEET

Tavalliset laboratoriovälineet ja erityisesti seuraavat:

3.1   pakastin, lämpötilansäätö välille 15 °C–20 °C

3.2   2 ml:n kertakäyttöruiskuja

3.3   kalvosuodattimia, huokoskoko 0,45 μm, joka kestää 5 % uuttoliuosta (4.4) sisältävää liuosta

3.4   nestekromatografi, johon kuuluu pumppu (virtaus 1,0 ml/min), injektiolaite (tilavuus 20 μl, käsikäyttöinen tai automaattinen), UV-detektori (aallonpituus 306 nm, 0,01 ÅU täysi asteikko), piirturi tai integraattori ja 25 °C:een säädetty pylvästermostaatti

3.5   HPLC-kolonni (pituus 250 mm, sisähalkaisija 4,6 mm) pakattu LiChrosper RP 18:lla (Merck, 5 μm) tai vastaavalla

3.6   esikolonni (pituus noin 20 mm, sisähalkaisija 3 mm) kuivapakattu LiChrospher RP 18:lla (5–10 μm) tai vastaavalla.

3.7   sentrifugi, kiihtyvyys 2 000 rpm

4.   REAGENSSIT

Kaikkien käytettävien reagenssien on oltava analyysipuhtausluokkaa.

4.1   Isopropanoli

4.2   Etanoli 96 % (v/v)

4.3   Asetonitriili

4.4   Uuttoliuos

Sekoitetaan isopropanolia (4.1), etanolia (4.2) ja asetonitriiliä (4.3) suhteessa 1:1:2 (v/v).

Vanilliini (4-hydroksi-3-metoksibentsaldehydi) ≥ 98 %

4.5.1   Vanilliinin kantaliuos (=500 μg/ml)

Punnitaan 0,1 mg:n tarkkuudella noin 50 mg (CM mg) vanilliinia (4.5) 100 ml:n mittapulloon, lisätään 25 ml uuttoliuosta (4.4) ja täytetään merkkiin vedellä.

4.5.2   Vanilliinin standardiliuos (=10 μg/ml)

Pipetoidaan 5 ml vanilliinin kantaliuosta (4.5.1) 250 ml:n mittapulloon ja täytetään merkkiin vedellä.

4.5.3   Metanoli, HPLC-laatua

4.5.4   Jääetikka

4.5.5   Vesi, HPLC-laatua

4.5.6   HPLC:n liikkuva faasi

Sekoitetaan 300 ml metanolia (4.5.3), noin 500 ml vettä (4.5.5) ja 20 ml etikkahappoa (4.5.4) 1 000 ml:n mittapullossa ja täytetään merkkiin vedellä (4.5.5). Suodatetaan 0,45 μm:n suodattimen läpi (3.3).

5.   SUORITUS

5.1   Näytteen esikäsittely

5.1.1   Voi

Lämmitetään näytettä kunnes se alkaa sulaa. Varotaan lämpötilan kohoamista paikallisesti yli 30 °C:een. Voi ei saa missään tapauksessa erottua kahteen faasiin. Kun näyte on tarpeeksi juokseva, homogenoidaan ravistamalla. Sekoitetaan voita 15 sekunnin ajan ennen näytteen ottamista. Punnitaan 1 mg:n tarkkuudella noin 5 g (SM g) voita 100 ml:n mittapulloon.

5.1.2   Voiöljy

Juuri ennen näytteenottoa pidetään voiöljyä sisältävää astiaa 40–50 °C:ssa lämpökaapissa kunnes öljy on sulanut täysin. Sekoitetaan näyte pyörivällä liikkeellä tai sekoittamalla välttäen liian voimakkaasta sekoittamisesta aiheutuvia ilmakuplia. Punnitaan 1 mg:n tarkkuudella noin 4 g (SM g) voiöljyä 100 ml:n mittapulloon.

5.1.3   Kerma

Lämmitetään näyte vesihauteessa tai lämpökaapissa 35–40 °C:n lämpötilassa. Sekoitetaan tasaiseksi pyörivällä liikkeellä ja tarvittaessa sekoittamalla. Jäähdytetään näyte nopeasti 20 ± 2 °C:seen. Jollei näyte ole homogeeninen, toistetaan sama menettely. Punnitaan 1 mg:n tarkkuudella noin 10 g (SM g) kermaa 100 ml:n mittapulloon.

5.2   Analyysiliuoksen valmistaminen

Lisätään noin 75 ml uuttoliuosta (4.4) näytteeseen (5.1.1, 5.1.2 tai 5.1.3), sekoitetaan tai ravistellaan voimakkaasti noin 15 minuutin ajan ja täytetään merkkiin uuttoliuoksella (4.4). Siirretään noin 10 ml tätä uutetta tulpalla varustettuun koeputkeen. Sijoitetaan koeputki pakastimeen (3.1) noin 30 minuutiksi. Sentrifugoidaan kylmää uutetta 5 minuuttia, noin 2 000 kierrosta minuutissa, ja dekantoidaan viipymättä. Annetaan dekantoidun liuoksen tulla huoneenlämpöiseksi. Pipetoidaan 5 ml dekantoitua liuosta 100 ml:n mittapulloon ja täytetään merkkiin vedellä. Suodatetaan osa siitä kalvosuodattimen läpi (3.3) ruiskulla (3.2). Suodos on valmis HPLC-määritykseen.

5.3   Kalibrointi

Pipetoidaan 5 ml vanilliinin standardiliuosta (4.5.2) 100 ml:n mittapulloon. Lisätään 5 ml uuttoliuosta (4.4) ja täytetään merkkiin vedellä. Tämä liuos sisältää 0,5 μg/ml vanilliinia.

5.4   Määritys HPLC:llä

Annetaan kromatografialaitteen stabiloitua noin 30 minuutin ajan. Injisoidaan standardiliuos (5.3). Toistetaan kunnes kahden perättäisen injektoinnin piikkien pinta-alojen tai korkeuksien välinen ero on alle 2 %. Edellä kuvatuissa olosuhteissa vanilliinin retentioaika on noin 9 minuuttia. Analysoidaan standardiliuos (5.3) kahdesti injisoimalla 20 μl. Injisoidaan 20 μl testiliuosta (5.2). Määritetään saadun vanilliinipiikin pinta-ala tai korkeus. Toistetaan standardiliuoksen (5.3) rinnakkaismääritys, kun näytteitä on injisoitu 10 kertaa (5.2).

6.   TULOSTEN LASKEMINEN

Lasketaan vanilliinipiikkien keskimääräinen piikin pinta-ala (tai korkeus) (AC) rinnakkaismäärityksistä molempien testiliuossarjojen alussa ja lopussa (yhteensä 4 pinta-alaa tai korkeutta).

Lasketaan vastekerroin (R):

jossa CM on vanilliinin massa milligrammoina (4.5.1).

Näytteen vanilliinipitoisuus (C, mg/kg) saadaan kaavasta

jossa:

AS	=	näytteen vanilliinipiikin pinta-ala tai korkeus
SM	=	näytteen massa grammoina (5.1.1, 5.1.2 tai 5.1.3).

Huomautus: Kun vanilliinipitoisuus analysoidaan kermasta, merkkiainepitoisuus on ilmaistava milligrammoina merkkiainetta/kilogrammassa voirasvaa. Tämä saadaan kertomalla C tekijällä 100/f, jossa f on kerman rasvapitoisuus prosentteina (m/m).

20	=	kerroin, jolla otetaan huomioon standardi- ja näytteiden laimennokset
0,96	=	korjauskerroin näytteen ensimmäisen laimennoksen rasvapitoisuudelle

Huomautus: Piikkien pinta-alojen sijasta voidaan käyttää piikkien korkeuksia (8.3).

7.   MENETELMÄN TARKKUUS

7.1   Toistettavuus (r)

Kahden määritystuloksen, jotka sama henkilö on saanut mahdollisimman lyhyen ajan kuluessa samalla välineistöllä täysin samanlaiselle testimateriaalille, ero saa olla enintään 16 mg/kg.

7.2   Uusittavuus (R)

Kahden määritystuloksen, jotka eri henkilöt ovat saaneet eri laboratorioissa eri välineistöllä täysin samanlaiselle testimateriaalille, välinen ero saa olla enintään 27 mg/kg.

8.   SALLITUT POIKKEAMAT

8.1   Merkitystä tuotteesta on otettava kolme näytettä homogeenisuuden tarkistamiseksi.

Vaniljasta tai synteettisestä vanilliinista saatu merkkiaine

8.2.1   4-hydroksi-3-metoksibentsaldehydiä lisätään 250 g voiöljy- tai voitonnia kohden. Kun merkitään kermaa, lisätään 250 g voirasvatonnia kohden.

8.2.2   Tuoteanalyysin kolmesta näytteestä saatujen tulosten avulla tarkistetaan lisättyjen merkkiaineiden määrä ja homogeenisuus. Pienintä näistä arvoista verrataan seuraaviin raja-arvoihin:

—	220,8 mg/kg (95 % pienimmästä lisättävästä määrästä),

—	158,3 mg/kg (70 % pienimmästä lisättävästä määrästä).

Interpoloinnissa arvojen 220,8 mg/kg ja 158,3 mg/kg välillä käytetään alhaisimman tuloksen antaneen näytteen merkkiainepitoisuutta.

Vaniljakodista tai näiden kokonaisuutteista saatu merkkiaine

8.3.1   4-hydroksi-3-metoksibentsaldehydiä lisätään 100 g voiöljy- tai voitonnia kohden. Kun merkitään kermaa, lisätään 100 g voirasvatonnia kohden.

8.3.2   Tuoteanalyysin kolmesta näytteestä saatujen tulosten avulla tarkistetaan lisättyjen merkkiaineiden määrä ja homogeenisuus. Pienintä näistä arvoista verrataan seuraaviin raja-arvoihin:

—	78,3 mg/kg (95 % pienimmästä lisättävästä määrästä),

—	53,3 mg/kg (70 % pienimmästä lisättävästä määrästä).

Interpoloinnissa arvojen 78,3 mg/kg ja 53,3 mg/kg välillä käytetään alhaisimman tuloksen antaneen näytteen merkkiainepitoisuutta.

9.   HUOMAUTUKSIA

9.1   Lisätyn vanilliinin takaisinsaanto tasolla 250 mg/kg voiöljyä vaihtelee välillä 97,0–103,8. Todettu keskimääräinen pitoisuus on ollut testeissä 99,9 % ja sen standardipoikkeama 2,7 %.

9.2   Standardiliuos sisältää 5 % uuttoliuosta, joka kompensoi näytteiden 5 %:n uuttoliuospitoisuudesta aiheutuvaa piikkien levenemistä. Tämän ansiosta kvantitatiivinen määritys voidaan suorittaa piikkien korkeuden avulla.

9.3   Analyysi perustuu lineaariseen kalibrointikuvaajaan, jonka leikkauspiste on nollassa.

9.4   Lineaarisuus tulisi tarkastaa käyttäen standardiliuoksen (4.5.2) sopivia laimennoksia ensimmäistä analyysiä suoritettaessa ja sen jälkeen säännöllisin väliajoin sekä aina, kun HPLC-laitteistoon on tehty muutoksia tai sitä on korjattu. Pastöroimattomassa kermassa tai siitä valmistetuissa tuotteissa olevat entsyymit voivat hajottaa vanilliinia vanilliinihapoksi, divanilliiniksi ja muiksi yhdisteiksi.

LIITE VII

(5 artikla)

BEETA-APO-8'-KAROTEENIHAPPOETYYLIESTERIN SPEKTROMETRINEN MÄÄRITYS VOIÖLJYSTÄ JA VOISTA

1.   TARKOITUS JA SOVELTAMISALA

Tässä kuvataan menetelmä beeta-apo-8'-karoteenihappoetyyliesterin (apokaroteeniesteri) kvantitatiiviseksi määrittämiseksi voista ja voiöljystä. Apokaroteeniesteri on kaikkien sellaisten menetelmässä kuvatuissa olosuhteissa valmistetussa uutteessa esiintyvien aineiden summa, jotka absorboivat valoa aallonpituudella 440 nm.

2.   PERIAATE

Voirasva liuotetaan petrolieetteriin ja absorbanssi mitataan aallonpituudella 440 nm. Apokaroteeniesterin pitoisuus määritetään ulkoiseen standardiin vertaamalla.

3.   LAITTEET JA TARVIKKEET

3.1   mittapipettejä, tilavuus 0,25; 0,50; 0,75 ja 1,0 ml

3.2   spektrofotometri, joka sopii käytettäväksi aallonpituudella 440 nm (ja 447–449 nm) ja jonka kyvettien valotie on 1 cm

3.3   mittapulloja, 20 ml ja 100 ml

3.4   analyysivaaka, herkkyys 0,1 mg, tarkkuus 1 mg, luettavuus 0,1 mg

3.5   uuni, 45 °C ± 1 °C

3.6   tuhkattomia suodatinpapereita, nopea suodatus

4.   REAGENSSIT

Kaikkien reagenssien on oltava tunnustettua analyysilaatua.

Apokaroteeniesterin suspensio (noin 20 %)

4.1.1   Suspension pitoisuus todetaan seuraavasti:

Suspensiota lämmitetään 45–50 °C:seen ja homogenoidaan avaamattomassa, alkuperäispakkauksessa. Mittapulloon (100 ml) punnitaan noin 400 mg, liuotetaan 20 ml:aan kloroformia (4.4) ja täytetään merkkiin sykloheksaanilla (4.5). Laimennetaan 5 ml tätä liuosta 100 ml:ksi sykloheksaanilla (liuos A). Laimennetaan 5 ml liuosta A 100 ml:ksi sykloheksaanilla. Mitataan absorbanssi aallonpituudella 447–449 nm (mitataan maksimi käyttäen sykloheksaania nollanäytteenä 1 cm:n kyveteillä).

Apokaroteeniesterin pitoisuus P (%) = (Abs max × 40 000)/(Msusp × 2 550) tai kehitetään: (Absmax /2 550) × (100/5) × (100/5) × (100/Msusp)

Absmax	=	mittaliuoksen maksimiabsorbanssi
Msusp	=	suspension massa (g)
2 550	=	vertailuabsorbanssi (1 %, 1 cm)
P	=	suspension puhtaus (pitoisuus) (%)

Huomautus: Apokaroteeniesterin suspensio on herkkä ilmalle, lämmölle ja valolle. Sitä voidaan säilyttää viileässä paikassa avaamattomassa, alkuperäisessä pakkauksessaan (typessä) noin 12 kuukautta. Avaamisen jälkeen sisältö on käytettävä nopeasti.

4.1.2   Apokaroteeniesterin standardiliuos, noin 0,2 mg/ml

Punnitaan 1 mg:n tarkkuudella noin 0,100g apokaroteeniesterisuspensiota (4.1.1) (W), liuotetaan liuotinbensiiniin (4.2), siirretään kvantitatiivisesti tilavuudeltaan 100 ml:n mittapulloon ja täytetään merkkiin liuotinbensiinillä.

Tämä liuos sisältää (W × P) 10 mg/ml apokaroteeniesteriä.

Huomautus: Liuosta on säilytettävä viileässä paikassa valolta suojattuna. Käyttämätön liuos säilyy kuukauden.

4.2   Liuotinbensiini (40–60 °C)

4.3   Natriumsulfaatti, vedetön, rakeina, kuivattu ennalta 102 °C:ssa kahden tunnin ajan.

4.4   Kloroformi

4.5   Sykloheksaani

5.   SUORITUS

5.1   Näytteen esikäsittely

5.1.1   Voiöljy

Näyte sulatetaan lämpökaapissa noin 45 °C:ssa.

5.1.2   Voi

Näyte sulatetaan lämpökaapissa noin 45 °C:ssa ja suodatetaan edustava osa noin 10g vedetöntä natriumsulfaattia (4.3) sisältävän suodattimen läpi voimakkaalta luonnon- ja keinovalolta suojatussa ympäristössä pitäen lämpötila 45 °C:ssa. Kerätään sopiva määrä voirasvaa.

5.2   Määritys

Punnitaan 1 mg:n tarkkuudella noin 1g voiöljyä tai voirasvaa (5.1.2), (M). Siirretään kvantitatiivisesti 20 ml:n (V) mittapulloon liuotinbensiiniä (4.2) käyttäen, täytetään merkkiin ja sekoitetaan huolellisesti.

Siirretään määräosa 1 cm:n kyvettiin ja mitataan absorbanssi aallonpituudella 440 nm käyttäen liuotinbensiiniä nollanäytteenä. Liuoksessa esiintyvän apokaroteeniesterin pitoisuus saadaan kalibrointikuvaajasta (C μg/ml).

5.3   Kalibrointi

Pipetoidaan 0; 0,25; 0,5; 0,75 ja 1,0 ml apokaroteeniesterin standardiliuosta (4.1.2) viiteen 100 ml:n mittapulloon. Laimennetaan merkkiin saakka liuotebensiinillä (4.2) ja sekoitetaan.

Liuosten pitoisuudet vaihtelevat välillä 0–2 μg/ml, ja ne lasketaan tarkasti vertaamalla standardiliuoksen (4.1.2) pitoisuuteen (W × P/10 mg/ml). Mitataan absorbanssit aallonpituudella 440 nm käyttäen petrolieetteriä (4.2) vertailuarvona.

Laaditaan kuvaaja, jossa absorbanssiarvot ovat y-akselilla ja apokaroteeniesterin konsentraatio x-akselilla. Lasketaan kalibrointikuvaajan yhtälö.

6.   TULOSTEN LASKEMINEN

6.1   Apokaroteeniesterin pitoisuus, ilmaistuna mg/kg tuotetta, saadaan seuraavasti:

Voiöljy: (C × V)/M

Voi: 0,82 (C × V)M

jossa:

C	=	apokaroteeniesterin pitoisuus (μg/ml) kalibrointikuvaajalta (5.3) luettuna
V	=	koeliuoksen (5.2) määrä (ml)
M	=	näytteen (5.2) massa (g)
0,82	=	korjauskerroin voin voirasvapitoisuudelle

7.   MENETELMÄN TARKKUUS

7.1   Toistettavuus

7.1.1   Voianalyysi

Kahden määritystuloksen, jotka sama henkilö on saanut mahdollisimman lyhyen ajan kuluessa samalla välineistöllä täysin samanlaiselle testimateriaalille, ero saa olla enintään 1,4 mg/kg.

7.1.2   Voiöljyanalyysi

Kahden määritystuloksen, jotka sama henkilö on saanut mahdollisimman lyhyen ajan kuluessa samalla välineistöllä täysin samanlaiselle testimateriaalille, ero saa olla enintään 1,6 mg/kg.

7.2   Uusittavuus

7.2.1   Voianalyysi

Kahden määritystuloksen, jotka eri henkilöt ovat saaneet eri laboratorioissa eri välineistöllä täysin samanlaiselle testimateriaalille, välinen ero saa olla enintään 4,7 mg/kg.

7.2.   2 Voiöljyanalyysi

Kahden määritystuloksen, jotka eri henkilöt ovat saaneet eri laboratorioissa eri välineistöllä täysin samanlaiselle testimateriaalille, välinen ero saa olla enintään 5,3 mg/kg.

7.3   Tarkkuustietojen lähde

Tarkkuutta koskevat tiedot määritettiin vuonna 1995 suoritetusta kokeesta, johon osallistui 11 laboratoriota ja jossa määritettiin 12 merkittyä näytettä (kuusi rinnakkaista sokeanäytettä) voin osalta ja 12 merkittyä näytettä (kuusi rinnakkaista sokeanäytettä) voiöljyn osalta.

8.   SALLITUT POIKKEAMAT

8.1   Merkitystä tuotteesta on otettava kolme näytettä sen tarkastamiseksi, että tuote on merkitty oikein.

8.2   Voi

8.2.1   Kokonaisarvo voille, tausta-absorbanssi mukaan lukien, on 22 mg/kg.

8.2.2   Tuoteanalyysin kolmesta näytteestä saatujen tulosten avulla tarkistetaan lisättyjen merkkiaineiden määrä ja homogeenisuus. Pienintä näistä arvoista verrataan seuraaviin raja-arvoihin:

—	17,7 mg/kg (95 % pienimmästä lisättävästä määrästä),

—	12,2 mg/kg (70 % pienimmästä lisättävästä määrästä).

Interpoloinnissa arvojen 17,7 mg/kg ja 12,2 mg/kg välillä käytetään alhaisimman tuloksen antaneen näytteen merkkiainepitoisuutta.

8.3   Voiöljy

8.3.1   Kokonaisarvo voiöljylle, tausta-absorbanssi mukaan lukien, on 24 mg/kg.

Tuoteanalyysin kolmesta näytteestä saatujen tulosten avulla tarkistetaan lisättyjen merkkiaineiden määrä ja homogeenisuus. Pienintä näistä arvoista verrataan seuraaviin raja-arvoihin:

—	19,2 mg/kg (95 % pienimmästä lisättävästä määrästä),

—	13,2 mg/kg (70 % pienimmästä lisättävästä määrästä).

Interpoloinnissa arvojen 19,2 mg/kg ja 13,2 mg/kg välillä käytetään alhaisimman tuloksen antaneen näytteen merkkiainepitoisuutta.

LIITE VIII

(5 artikla)

VOIN TAI VOIÖLJYN SISÄLTÄMÄN SITOSTEROLIN TAI STIGMASTEROLIN MÄÄRITYS KAASUKROMATOGRAFISESTI KAPILLAARIKOLONNILLA

1.   TARKOITUS JA SOVELTAMISALA

Tässä kuvataan menetelmä voin ja voiöljyn sisältämän sitosterolin tai stigmasterolin kvantitatiiviseksi määrittämiseksi. Sitosteroli on β-sitosterolin ja 22-dihydro-β-sitosterolin summa, kun muita sitosteroleita pidetään merkityksettöminä.

2.   PERIAATE

Voi tai voiöljy saippuoidaan kaliumhydroksidin avulla etanoliliuoksessa ja saippuoitumattomat osat uutetaan dietyylieetterillä.

Sterolit muutetaan trimetyylisilyylieettereiksi ja määritetään kaasukromatografisesti kapillaarikolonnin avulla. Sisäisenä standardina on betuliini.

3.   VÄLINEISTÖ

3.1   Saippuoimispullo, 150 ml, varustettuna palautusjäähdyttimellä, jossa on hioslasiliitokset

3.2   Erotussuppiloita, 500 ml

3.3   Pulloja, 250 ml

3.4   Paineentasauspulloja, 250 ml tai sisällöltään vastaavia, tarkoitettu pois heitettävän eetterin keräämiseen

3.5   Lasikolonni, 350 mm × 20 mm, varustettuna hioslasiliitoksella

3.6   Vesihaude tai termostoitu mantteli

3.7   Reaktiopulloja, 2 ml

Kaasukromatografialaitteisto, jossa voidaan käyttää kapillaarikolonnia, varustettuna split-laitteistolla, ja johon kuuluu:

3.8.1   termostoitu kolonniuuni, jossa voidaan ylläpitää haluttu lämpötila ±1 °C tarkkuudella

3.8.2   lämpötilasäätöinen injektori

3.8.3   liekki-ionisaatiodetektori ja signaalinmuunninvahvistin

3.8.4   integraattori-piirturi, jota voidaan käyttää signaalinmuunninvahvistimen (3.8.3) kanssa

3.9   Kvartsilasinen kapillaarikolonni, joka on kokonaan päällystetty BP 1:llä tai vastaavalla (tai muu vähintään saman resoluution kolonni) aineella tasaisesti 0,25 μm:n paksuudella; kolonnilla on pystyttävä erottamaan lanosterolin ja sitosterolin trimetyylisilyylijohdannaiset. Tähän tarkoitukseen sopii kolonni, jonka pituus on 12 m ja sisähalkaisija 0,2 mm.

3.10   Mikroruisku, jossa on karkaistusta teräksestä oleva neula, 1 μl, kaasukromatografiaa varten.

4.   REAGENSSIT

Kaikkien reagenssien on oltava tunnustettua analyysilaatua. Veden on oltava tislattua tai puhtaudeltaan vähintään sitä vastaavaa.

4.1   Etanoli, puhtaudeltaan vähintään 95 %

4.2   Kaliumhydroksidi, 60 % liuos, liuotetaan 600 g kaliumhydroksidia (vähintään 85 %) veteen ja täytetään 1 litraksi vedellä

Betuliini, puhtaudeltaan vähintään 99 %

Betuliiniliuoksia dietyylieetterissä (4.4)

4.3.1.1   Sitosterolin määritykseen käytettävän betuliiniliuoksen pitoisuuden on oltava 1,0 mg/ml.

4.3.1.2   Stigmasterolin määritykseen käytettävän betuliiniliuoksen pitoisuuden on oltava 0,4 mg/ml.

4.4   Dietyylieetteri, puhtaudeltaan analyysilaatua (ei sisällä peroksideja tai jäämiä)

4.5   Natriumsulfaatti, vedetön, rakeina, kuivattu ennalta 102 °C:ssa kahden tunnin ajan

4.6   Silylointireagenssi, esimerkiksi TRI-SIL (Pierce Chemical Co., Cat nro 49001) tai vastaava. (Varoitus: TRI-SIL on syttyvää, myrkyllistä, syövyttävää ja voi olla karsinogeenista. Laboratoriohenkilökunnan on tunnettava hyvin TRI-SIL:iin sovellettavat turvallisuusohjeet ja heidän on noudatettava välttämättömiä varotoimenpiteitä).

4.7   Lanosteroli

Sitosteroli, puhtaudeltaan tunnettu, vähintään 90 % (P)

Huomautus 1: Kalibrointiin käytettävien standardiaineiden puhtaus on määritettävä standardimenetelmän avulla. Lähdetään olettamuksesta, että kaikki näytteessä olevat sterolit esiintyvät kromatogrammissa, että piikkien kokonaispinta-ala edustaa 100-prosenttisesti steroleja ja että sterolit antavat saman detektorivasteen. Järjestelmän lineaarisuus on tarkistettava kyseeseen tulevilla pitoisuusalueilla.

4.8.1   Sitosterolin standardiliuos: valmistetaan noin 0,001 mg/ml:n tarkkuudella liuos, joka sisältää noin 0,5 mg/ml (W1) sitosterolia (4.8) dietyylieetterissä (4.4).

Stigmasteroli, puhtaudeltaan tunnettu, vähintään 90 % (P)

4.9.1   Stigmasterolin standardiliuos: valmistetaan 0,001 mg/ml:n tarkkuudella liuos, joka sisältää noin 0,2 mg/ml (W1) stigmasterolia (4.9) dietyylieetterissä (4.4)

4.10   Seos resoluutiotestiä varten: valmistetaan liuos, joka sisältää 0,05 mg/ml lanosterolia (4.7) ja 0,5 mg/ml sitosterolia (4.8) dietyylieetterissä (4.4).

5.   MENETELMÄ

5.1   Standardiliuosten valmistus kromatografiaa varten

Lisätään sisäinen standardiliuos (4.3.1) sopivaan sterolistandardiliuokseen samanaikaisesti saippuoidun näytteen (5.2.2) kanssa.

5.1.1   Sitosterolin standardiliuos kromatografiaa varten: siirretään 1 ml sitosterolin standardiliuosta (4.8.1) kahteen reaktiopulloon (3.7) ja poistetaan dietyylieetteri typpivirran avulla. Lisätään 1 ml sisäistä standardiliuosta (4.3.1.1) ja poistetaan dietyylieetteri typpivirran avulla.

5.1.2   Stigmasterolin kromatografinen standardiliuos: siirretään 1 ml stigmasterolin standardiliuosta (4.9.1) kahteen reaktiopulloon (3.7) ja poistetaan eetteri typpivirran avulla. Lisätään 1 ml sisäistä standardiliuosta (4.3.1.2) ja poistetaan eetteri typpivirran avulla.

5.2   Saippuoitumattomien fraktioiden valmistus:

5.2.1   Sulatetaan voinäyte enintään 35 °C:n lämpötilassa. Sekoitetaan se huolellisesti.

Punnitaan 1 mg:n tarkkuudella noin 1 g voita (W2) tai voiöljyä (W2) 150 ml:n pulloon (3.1). Lisätään 50 ml etanolia (4.1) ja 10 ml kaliumhydroksidiliuosta (4.2). Liitetään pulloon palautusjäähdytin ja kuumennetaan noin 75 °C:ssa 30 minuuttia. Irrotetaan jäähdytin ja annetaan pullon jäähtyä huoneenlämpötilaan.

5.2.2   Lisätään pulloon 1,0 ml sisäistä standardiliuosta (4.3.1.1, jos määritetään sitosterolia tai 4.3.1.2, jos määritetään stigmasterolia). Sekoitetaan huolellisesti. Siirretään pullon sisältö kvantitatiivisesti 500 ml:n erotussuppiloon (3.2). Huuhdellaan pullo 50 ml:lla vettä ja tämän jälkeen 250 ml:lla dietyylieetteriä (4.4). Erotussuppiloa ravistetaan voimakkaasti 2 minuutin ajan ja annetaan faasien erottua. Poistetaan alempi vesifaasi ja huuhdellaan eetterifaasi ravistellen neljällä peräkkäisellä 100 ml:n määrällä vettä.

Huomautus 2: Emulsion muodostumisen välttämiseksi on välttämätöntä, että kaksi ensimmäistä vesihuuhtelua suoritetaan varoen (10 kertaa käännellen). Kolmannessa huuhtelussa voidaan ravistella voimakkaasti 30 sekuntia. Jos emulsio muodostuu, se voidaan poistaa lisäämällä 5–10 ml etanolia. Jos etanolia lisätään, on välttämätöntä suorittaa vielä kaksi voimakasta vesihuuhtelua.

5.2.3   Kaadetaan kirkas, saippuaton eetterikerros lasikolonniin (3.5), joka sisältää 30 g vedetöntä natriumsulfaattia (4.5). Kerätään eetteri 250 ml:n pulloon (3.3). Lisätään yksi kiehumakivi ja haihdutetaan vesihauteessa tai termostoidussa manttelissa lähes kuivaksi huolehtien siitä, että poistettavat liuottimet kerätään talteen.

Huomautus 3: Jos näyteuutteet haihdutetaan kuivaksi liian korkeassa lämpötilassa, voi tapahtua sterolihäviöitä.

5.3   Trimetyylisilyylieettereiden valmistus

5.3.1   Siirretään pulloon jäänyt eetteriliuos 2 ml:n reaktiopulloon (3.7) 2 ml:lla eetteriä ja poistetaan eetteri typpivirran avulla. Pestään pullo kahdesti 2 ml:lla eetteriä, siirretään tämä pesuliuososa reaktiopulloon ja poistetaan eetteri joka kerta typellä.

5.3.2   Näyte silyloidaan lisäämällä 1 ml TRI-SILiä (4.6). Pullo suljetaan ja sitä ravistetaan voimakkaasti näytteen liukenemiseksi. Jos liukeneminen on epätäydellistä, lämmitetään 65–70 °C:seen. Annetaan seistä vähintään 5 minuutin ajan ennen injektointia kaasukromatografiin. Standardit silyloidaan samalla tavoin kuin näytteet. Erotuskyvyn testaamiseen käytettävä seos (4.10) silyloidaan samalla tavoin kuin näytteet.

Huomautus 4: Silyloinnin on tapahduttava vedettömissä oloissa. Betuliinin epätäydellinen silyloituminen näkyy betuliinipiikin lähellä olevana toisena piikkinä.

Etanolin läsnäolo silyloinnin aikana häiritsee silylointia. Se voi olla seurausta riittämättömästä huuhtelusta uuton aikana. Jos tämä ongelma toistuu, uuttovaiheeseen voidaan lisätä viides huuhtelu, joka tapahtuu ravistellen voimakkaasti 30 sekunnin ajan.

5.4   Kaasukromatografinen analyysi

5.4.1   Toimintaolosuhteiden valinta

Kaasukromatografi säädetään valmistajan ohjeiden mukaisesti.

Ohjeelliset ajon olosuhteet ovat seuraavat:

—	kolonnin lämpötila: 265 °C

—	injektorin lämpötila: 265 °C

—	detektorin lämpötila: 300 °C

—	kantajakaasun virtausnopeus: 0,6 ml/min

—	vedyn paine: 84 kPa

—	ilmanpaine: 155 kPa

—	jakosuhde: 10/1–50/1; jakosuhde on optimoitava valmistajan ohjeiden mukaisesti ja detektorin vasteen lineaarisuus on sitten validoitava kyseiselle pitoisuusalueelle. Huomautus 5: On erityisen tärkeää, että injektorin tiiviste puhdistetaan säännöllisesti.

—	Injektiotilavuus: 1 μl TMSE-liuosta.

Annetaan järjestelmän tasapainottua, kunnes saadaan riittävän stabiili vaste ennen minkään analyysin aloittamista.

Näitä olosuhteita voidaan muuttaa kolonnin ja kaasukromatografin ominaisuuksien mukaan, jotta saadaan seuraavat edellytykset täyttävät kromatogrammit:

—	sitosterolin piikin on erotuttava riittävästi lanosterolista. Kuviossa 1 esitetään tyypillisen kromatogrammi, jollainen on saatava erotustestiin käytetystä silyloidusta seoksesta (4.10),

—	seuraavien steroleiden suhteellisten retentioaikojen olisi oltava suunnilleen: — kolesteroli: 1.0 — stigmasteroli: 1.3 — sitosteroli: 1.5 — betuliini: 2.5,

—	betuliinin retentioajan olisi oltava noin 24 minuuttia.

5.4.2   Analyysin suoritus

Injektoidaan 1 μl silyloitua standardiliuosta (stigmasterolia tai sitosterolia) ja säädetään integraattorin kalibrointiparametrit.

Injektoidaan uudelleen 1 μl silyloitua standardiliuosta vastekertoimen määrittämiseksi suhteessa betuliiniin.

Injektoidaan 1 μl silyloitua näyteliuosta ja mitataan piikkien pinta-ala. Standardit on ajettava aina ennen ja jälkeen näytesarjan.

Standardien injektointi pitäisi yleensä suorittaa kuuden näytteen sarjan jälkeen.

Huomautus 6: Stigmasterolipiikin integroinnin olisi käsitettävä kuviossa 2 b olevassa 1, 2 ja 3 kohdassa osoitettujen pisteiden välinen alue.

Arvioitaessa sitosterolia kokonaisuudessaan sitosterolipiikin integroinnin olisi sisällettävä 22-dihydro-β-sitosterolipiikin (stigmastanoli) pinta-ala, joka eluoituu välittömästi sitosterolin jälkeen (kuvio 3 b).

6.   TULOSTEN LASKEMINEN

6.1   Määritetään sterolipiikin ja betuliinipiikin pinta-ala 2 standardeista jokaisen sarjan alussa ja lopussa ja lasketaan R1:

R1 = (standardin sterolipiikin keskipinta-ala)/(standardin betuliinipiikin keskipinta-ala)

Määritetään steroli- (stigmasteroli tai sitosteroli) ja betuliinipiikkien pinta-ala näytteestä ja lasketaan R2:

R2 = (näytteen sterolipiikin keskipinta-ala)/(näytteen betuliinipiikin keskipinta-ala)

W1	=	sterolin määrä (mg) 1 ml:ssa standardiliuosta (4.8.1 tai 4.9.1)
W2	=	näytteen paino (g) (5.2.1)
P	=	sterolistandardiliouksen puhtaus (4.8 tai 4.9)

Näytteen sterolipitoisuus (mg/kg) = ((R 2)/(R 1)) × ((W 1)/(W 2)) × P × 10

7.   MENETELMÄN TARKKUUS

7.1   Voi

7.1.1   Toistettavuus

7.1.1.1   Stigmasteroli

Kahden määritystuloksen, jotka sama henkilö on saanut mahdollisimman lyhyen ajan kuluessa samalla välineistöllä täysin samanlaiselle testimateriaalille, ero saa olla enintään 19,3 mg/kg.

7.1.1.2   Sitosteroli

Kahden määritystuloksen, jotka sama henkilö on saanut mahdollisimman lyhyen ajan kuluessa samalla välineistöllä täysin samanlaiselle testimateriaalille, ero saa olla enintään 23,0 mg/kg.

7.1.2   Uusittavuus

7.1.2.1   Stigmasteroli

Kahden määritystuloksen, jotka eri henkilöt ovat saaneet eri laboratorioissa eri välineistöllä täysin samanlaiselle testimateriaalille, välinen ero saa olla enintään 31,9 mg/kg.

7.1.2.2   Sitosteroli

Kahden määritystuloksen, jotka eri henkilöt ovat saaneet eri laboratorioissa eri välineistöllä täysin samanlaiselle testimateriaalille, ero saa olla enintään 8,7 % suhteessa määritysten keskiarvoon.

7.1.3   Tarkkuustietojen lähde

Tarkkuutta koskevat tiedot määritettiin vuonna 1992 suoritetusta kokeesta, johon osallistui 8 laboratoriota ja jossa määritettiin kuusi näytettä (kolme rinnakkaista sokeanäytettä) stigmasterolista ja kuusi näytettä (kolme rinnakkaista sokeanäytettä) sitosterolista.

7.2   Voiöljy

7.2.1   Toistettavuus

7.2.1.1   Stigmasteroli

Kahden määritystuloksen, jotka sama henkilö on saanut mahdollisimman lyhyen ajan kuluessa samalla välineistöllä täysin samanlaiselle testimateriaalille, ero saa olla enintään 10,2 mg/kg.

7.2.1.2   Sitosteroli

Kahden määritystuloksen, jotka sama henkilö on saanut mahdollisimman lyhyen ajan kuluessa samalla välineistöllä täysin samanlaiselle testimateriaalille, ero saa olla enintään 3,6 % suhteessa määritysten keskiarvoon.

7.2.2   Uusittavuus

7.2.2.1   Stigmasteroli

Kahden määritystuloksen, jotka eri henkilöt ovat saaneet eri laboratorioissa eri välineistöllä täysin samanlaiselle testimateriaalille, välinen ero saa olla enintään 25,3 mg/kg.

7.2.2.2   Sitosteroli

Kahden määritystuloksen, jotka eri henkilöt ovat saaneet eri laboratorioissa eri välineistöllä täysin samanlaiselle testimateriaalille, ero saa olla enintään 8,9 % suhteessa määritysten keskiarvoon.

7.2.3   Tarkkuustietojen lähde

Tarkkuutta koskevat tiedot määritettiin vuonna 1991 suoritetusta kokeesta, johon osallistui yhdeksän laboratoriota ja jossa määritettiin kuusi näytettä (kolme rinnakkaista sokeanäytettä) stigmasterolista ja kuusi näytettä (kolme rinnakkaista sokeanäytettä) sitosterolista.

8.   SALLITUT POIKKEAMAT

8.1   Merkitystä tuotteesta on otettava kolme näytettä sen tarkistamiseksi, että tuote on merkitty oikein.

8.2   Voi

8.2.1   Stigmasteroli

8.2.1.1   Stigmasterolia lisätään 150 g (puhtaus vähintään 95 %) voitonnia kohden eli 142,5 mg/kg tai 170 g (puhtaus vähintään 85 %) voitonnia kohden eli 144,5 mg/kg.

8.2.1.2   Tuoteanalyysin kolmesta näytteestä saatujen tulosten avulla tarkistetaan lisättyjen merkkiaineiden määrä ja homogeenisuus. Pienintä näistä arvoista verrataan seuraaviin raja-arvoihin:

—	115,8 mg/kg (95 % pienimmästä lisättävästä määrästä, kun stigmasterolin puhtaus on 95 %),

—	117,7 mg/kg (95 % pienimmästä lisättävästä määrästä, kun stigmasterolin puhtaus on 85 %),

—	80,1 mg/kg (70 % pienimmästä lisättävästä määrästä, kun stigmasterolin puhtaus on 95 %),

—	81,5 mg/kg (70 % pienimmästä lisättävästä määrästä, kun stigmasterolin puhtaus on 85 %).

Interpoloinnissa arvojen 115,8 mg/kg ja 80,1 mg/kg välillä tai arvojen 117,7 mg/kg ja 81,5 mg/kg välillä käytetään alhaisimman tuloksen antaneen näytteen merkkiainepitoisuutta.

8.2.2   Sitosteroli

8.2.2.1   Sitosterolia lisätään 600 g (puhtaus vähintään 90 %) voitonnia kohden eli 540 mg/kg.

8.2.2.2   Tuoteanalyysin kolmesta näytteestä saatujen tulosten avulla tarkistetaan lisättyjen merkkiaineiden määrä ja homogeenisuus. Pienintä näistä arvoista verrataan seuraaviin raja-arvoihin:

—	482,6 mg/kg (95 % pienimmästä lisättävästä määrästä, kun sitosterolin puhtaus on 90 %),

—	347,6 mg/kg (70 % pienimmästä lisättävästä määrästä, kun sitosterolin puhtaus on 90 %).

Interpoloinnissa arvojen 482,6 mg/kg ja 347,6 mg/kg välillä käytetään alhaisimman tuloksen antaneen näytteen merkkiainepitoisuutta.

8.3   Voiöljy

8.3.1   Stigmasteroli

8.3.1.1   Stigmasterolia lisätään 150 g (puhtaus vähintään 95 %) voiöljytonnia kohden eli 142,5 mg/kg tai 170 g (puhtaus vähintään 85 %) voiöljytonnia kohden eli 144,5 mg/kg.

8.3.1.2   Tuoteanalyysin kolmesta näytteestä saatujen tulosten avulla tarkistetaan lisättyjen merkkiaineiden määrä ja homogeenisuus. Pienintä näistä arvoista verrataan seuraaviin raja-arvoihin:

—	118,5 mg/kg (95 % pienimmästä lisättävästä määrästä, kun stigmasterolin puhtaus on 95 %),

—	120,4 mg/kg (95 % pienimmästä lisättävästä määrästä, kun stigmasterolin puhtaus on 85 %),

—	82,9 mg/kg (70 % pienimmästä lisättävästä määrästä, kun stigmasterolin puhtaus on 95 %),

—	84,3 mg/kg (70 % pienimmästä lisättävästä määrästä, kun stigmasterolin puhtaus on 85 %).

Interpoloinnissa arvojen 118,5 mg/kg ja 82,9 mg/kg välillä tai arvojen 120,4 mg/kg ja 84,3 mg/kg välillä käytetään alhaisimman tuloksen antaneen näytteen merkkiainepitoisuutta.

8.3.2   Sitosteroli

8.3.2.1   Sitosterolia lisätään 600 g (puhtaus vähintään 90 %) voiöljytonnia kohden eli 540 mg/kg.

8.3.2.2   Tuoteanalyysin kolmesta näytteestä saatujen tulosten avulla tarkistetaan lisättyjen merkkiaineiden määrä ja homogeenisuus. Pienintä näistä arvoista verrataan seuraaviin raja-arvoihin:

—	480,9 mg/kg (95 % pienimmästä lisättävästä määrästä, kun sitosterolin puhtaus on 90 %),

—	345,9 mg/kg (70 % pienimmästä lisättävästä määrästä, kun sitosterolin puhtaus on 90 %).

Interpoloinnissa arvojen 480,9 mg/kg ja 345,9 mg/kg välillä käytetään alhaisimman tuloksen antaneen näytteen merkkiainepitoisuutta.

Kuva 1

Erotuskyvyn testaamiseen tarkoitetun seoksen kromatogrammi

Täydellinen erottuminen on suotavav eli lanosterolipiikin jäljen on palattava perusviivalla ennen uudelleen nousua sitosterolipiikiksi, vaikka epätäydellinen erottuminen olisi hyväksyttävissä.

Kuva 2a	Kuva 2b
Stigmasteroli standardi	Stigmasterolilla denaturoitu voinäyte
Huomautus: Stigmasterolipiikin integroinnissa otettava mukaan pisteiden 1, 2 ja 3 väliset alueet.

Kuva 3a	Kuva 3b
Stigmasteroli standardi	Stigmasterolilla denaturoitu voinäyte
Huomautus: ß-sitosterolissa on usein epäpuhtautena stigmastanolia, joka eluoituu välittömästi ß-sitosterolin jälkeen. Näiden kahden piikin pinta-alat on laskettava yhteen, kun ß-sitosterolia arvioidaan kokonaisuudessaan.