BILAGA I

PROVTAGNINGSMETODER

1.   SYFTE OCH TILLÄMPNINGSOMRÅDE

Prov som är avsedda för offentlig kontroll av foder ska tas med de metoder som beskrivs nedan. Prov som har tagits på detta sätt ska anses vara representativa för partierna.

2.   PROVTAGNINGSPERSONAL

Proven ska tas av personer som medlemsstaterna har bemyndigat för detta.

3.   DEFINITIONER

parti: en mängd av en produkt som utgör en enhet och vars egenskaper antas vara enhetliga.

delprov: en viss mängd som tagits från ett ställe i partiet.

samlingsprov: en blandning av delprov som tagits från samma parti.

reducerat prov: en representativ del av samlingsprovet som erhållits ur detta genom reduktion.

slutligt prov: en del av det reducerade provet eller av det homogeniserade samlingsprovet.

4.   UTRUSTNING

4.1	Provtagningsutrustningen ska vara tillverkad av material som inte kan kontaminera de produkter som ska provtas. Medlemsstaterna kan officiellt godkänna sådan utrustning.

4.2   Utrustning som rekommenderas för provtagning av fast foder.

4.2.1   Manuell provtagning

4.2.1.1

Flatbottnad skyffel med vertikala sidor.

4.2.1.2

Provtagningsspjut med en lång skåra eller med olika fack. Provtagningsspjutets dimensioner måste lämpa sig för partiets egenskaper (behållarens djup, säckformat etc.) och fodrets partikelstorlek.

4.2.2   Mekanisk provtagning

Godkänd mekanisk utrustning får användas för provtagning på foder i rörelse.

4.2.3   Provdelare

Utrustning avsedd att dela upp provet i ungefär lika stora delar kan användas för tagning av delprov och beredning av reducerade och slutliga prov.

5.   KVANTITATIVA KRAV

5.A	Kontroll av ämnen eller produkter som är jämnt fördelade i fodret.
5.A.1	Parti Partiet ska vara av sådan storlek att prov kan tas i var och en av dess beståndsdelar.
5.A.2	Delprov
5.A.2.1	Löst foder:	Minsta antal delprov:
5.A.2.1.1	Partier på högst 2,5 ton	sju
5.A.2.1.2	Partier på mer än 2,5 ton	√ 20 gånger det antal ton som utgör partiet (1), som mest 40 delprov
5.A.2.2	Förpackat foder:	Minsta antal förpackningar som ska provtas (2):
5.A.2.2.1	Förpackningar på mer än 1 kg:
5.A.2.2.1.1	Partier på en till fyra förpackningar	samtliga förpackningar
5.A.2.2.1.2	Partier på fem till sexton förpackningar	fyra
5.A.2.2.1.3	Partier på mer än sexton förpackningar	√ det antal förpackningar som utgör partiet (1), som mest 20 förpackningar
5.A.2.2.2	Förpackningar på högst 1 kg	fyra
5.A.2.3	Flytande eller halvflytande foder:	Minsta antal behållare som ska provtas (2):
5.A.2.3.1	Behållare på mer än 1 liter:
5.A.2.3.1.1	Partier på en till fyra behållare	samtliga behållare
5.A.2.3.1.2	Partier på fem till sexton behållare	fyra
5.A.2.3.1.3	Partier på mer än sexton behållare	√ det antal behållare som utgör partiet (1), som mest 20 förpackningar
5.A.2.3.2	Behållare på högst 1 liter	fyra
5.A.2.4	Foderblock och saltstenar	Minsta antal block eller stenar som ska provtas (2): ett block eller en sten per parti om 25 enheter, som mest fyra block eller stenar
5.A.3	Samlingsprov Det krävs ett samlingsprov per parti. Det sammanlagda antalet delprov i ett samlingsprov ska vara minst följande:
5.A.3.1	Löst foder:	4 kg
5.A.3.2	Förpackat foder:
5.A.3.2.1	Förpackningar på mer än 1 kg	4 kg
5.A.3.2.2	Förpackningar på högst 1 kg	vikten av innehållet i fyra originalförpackningar
5.A.3.3	Flytande eller halvflytande foder:
5.A.3.3.1	Behållare på mer än 1 liter	4 liter
5.A.3.3.2	Behållare på högst 1 liter	volymen av innehållet i fyra originalbehållare
5.A.3.4	Foderblock eller saltstenar:
5.A.3.4.1	med en vikt på mer än 1 kg styck	4 kg
5.A.3.4.2	med en vikt på högst 1 kg styck	vikten av fyra foderblock eller saltstenar i ursprunglig storlek
5.A.4	Slutliga prov Vid behov tas det slutliga provet från samlingsprovet genom reduktion. Minst ett slutligt prov ska analyseras. Det slutliga prov som analyseras ska vara av minst följande mängd:
	Fast foder	500 g
	Flytande eller halvflytande foder	500 ml
5.B	Kontroll av främmande ämnen eller produkter som kan vara ojämnt fördelade i fodret, t.ex. aflatoxiner, mjöldryga, ricin och Crotalaria i foderråvaror (3)
5.B.1	Parti: se 5.A.1.
5.B.2	Delprov
5.B.2.1	Löst foder: se 5.A.2.1.
5.B.2.2	Förpackat foder:	Minsta antal förpackningar som ska provtas:
5.B.2.2.1	Partier på en till fyra förpackningar	samtliga förpackningar
5.B.2.2.2	Partier på fem till sexton förpackningar	fyra
5.B.2.2.3	Partier på mer än sexton förpackningar	√ det antal förpackningar som utgör partiet (1), som mest 40 förpackningar
5.B.3	Samlingsprov Antalet samlingsprov kommer att variera med partiets storlek. Minsta antal samlingsprov per parti som krävs anges nedan. De delprov som utgör ett samlingsprov ska tillsammans väga minst 4 kg.
5.B.3.1	Löst foder
	Partiets vikt i ton:	Minsta antal samlingsprov per parti:
	högst 1	1
	mer än 1 och högst 10	2
	mer än 10 och högst 40	3
	mer än 40	4
5.B.3.2	Förpackat foder
	Partiets storlek i antal förpackningar:	Minsta antal samlingsprov per parti:
	1–16	1
	17–200	2
	201–800	3
	fler än 800	4
5.B.4	Slutliga prov De slutliga proven tas från samlingsproven genom reduktion. Minst ett slutligt prov per samlingsprov måste analyseras. Vikten på det slutliga prov som analyseras ska vara minst 500 g.

6.   ANVISNINGAR OM UTTAGNING, BEREDNING OCH FÖRPACKNING AV PROVEN

6.1   Allmänt

Proven ska tas och beredas så snabbt som möjligt med beaktande av de försiktighetsåtgärder som krävs för att produkten varken ska förändras eller kontamineras. Instrument, ytor och behållare som kommer i kontakt med proven ska vara rena och torra.

6.2   Delprov

6.2.A   Kontroll av ämnen eller produkter som är jämnt fördelade i fodret

Delprov ska tas slumpvis i hela partiet och ha ungefär samma storlek.

6.2.A.1   Löst foder

Partiet indelas teoretiskt i ett antal ungefär lika stora delar. Ett antal delar som motsvarar antalet delprov enligt 5.A.2 väljs ut slumpvis, varefter minst ett prov tas från var och en av dessa delar.

Provtagningen kan, om så är lämpligt, göras medan partiet är i rörelse (vid lastning eller lossning).

6.2.A.2   Förpackat foder

När det antal förpackningar som krävs för provtagning enligt 5.A.2 har valts ut ska en del av innehållet i varje förpackning tas ut med spjut eller skyffel. Vid behov tas proven efter det att förpackningarna har tömts separat. Eventuella klumpar bryts upp om så krävs; detta görs separat för varje samlingsprov där klumparna först tas ut från provet och sedan återförs till detta.

6.2.A.3   Flytande eller halvflytande foder som är homogent eller kan homogeniseras

När det antal behållare som krävs för provtagning enligt 5.A.2 har valts ut ska innehållet vid behov homogeniseras och en mängd tas från varje behållare.

Delproven kan tas när innehållet lossas.

6.2.A.4   Flytande eller halvflytande foder som inte kan homogeniseras

När det antal behållare som krävs för provtagning enligt 5.A.2 har valts ut ska prov tas från olika nivåer.

Proven kan också tas när innehållet lossas, men de första fraktionerna ska då kastas.

I båda fallen ska den totala volymen vara minst tio liter.

6.2.A.5   Foderblock och saltstenar

När det antal block eller stenar som krävs för provtagning enligt 5.A.2 har valts ut ska en del av varje block eller sten tas ut.

6.2.B   Kontroll av främmande ämnen eller produkter som kan vara ojämnt fördelade i fodret, t.ex. aflatoxiner, mjöldryga, ricin och Crotalaria i foderråvaror

Partiet indelas teoretiskt i ett antal ungefär lika stora delar, motsvarande det antal samlingsprov som anges i 5.B.3. Om detta antal är större än ett ska det totala antalet delprov enligt 5.B.2 fördelas ungefär jämnt på de olika delarna. Därefter tas prov av ungefär samma storlek (4) så att proven från varje del tillsammans väger minst 4 kg, dvs. minimivikten för varje samlingsprov. Delprov som tagits från olika delar får inte ingå i samma samlingsprov.

6.3   Beredning av samlingsprov

6.3.A   Kontroll av ämnen eller produkter som är jämnt fördelade i fodret

Delproven ska blandas till ett enda samlingsprov.

6.3.B   Kontroll av främmande ämnen eller produkter som kan vara ojämnt fördelade i fodret, t.ex. aflatoxiner, mjöldryga, ricin och Crotalaria i foderråvaror

Delproven från varje del av partiet blandas och antalet samlingsprov enligt 5.B.3 bereds. Varje samlingsprovs ursprung ska noga registreras.

6.4   Beredning av slutliga prov

Materialet i varje samlingsprov blandas noggrant till ett homogeniserat prov (5). Vid behov ska samlingsprovet först reduceras till minst 2 kg eller 2 liter (reducerat prov), antingen med mekanisk eller automatisk delare eller med kvarteringsmetoden.

Därefter bereds minst tre slutliga prov av ungefär samma storlek enligt de kvantitativa kraven i 5.A.4 or 5.B.4. Varje prov placeras i en lämplig behållare. Alla nödvändiga försiktighetsåtgärder ska vidtas för att undvika att provets sammansättning förändras eller att provet kontamineras eller förfalskas under transport och lagring.

6.5   Förpackning av slutliga prov

Behållare och förpackningar ska förseglas och märkas (hela märkningen måste ingå i förseglingen) så att de inte kan öppnas utan att förseglingen skadas.

7.   REGISTRERING AV PROV

Alla provtagningar ska registreras så att varje parti entydigt kan identifieras.

8.   VIDAREBEFORDRAN AV PROV

För varje samlingsprov ska minst ett slutligt prov så snart som möjligt sändas till ett auktoriserat analyslaboratorium tillsammans med de upplysningar som den som utför analysen behöver.

---

(1)  Om det erhållna talet inte är ett heltal ska det avrundas till närmast högre heltal.

(2)  För förpackningar eller behållare med ett innehåll på högst 1 kg eller 1 liter och för foderblock eller saltstenar på högst 1 kg vardera ska samlingsprovet utgöras av innehållet i en originalförpackning eller originalbehållare, ett foderblock eller en saltsten.

(3)  Metoderna i 5.A ska användas för kontroll av aflatoxiner, mjöldryga, ricin och Crotalaria I helfoder och tilläggsfoder.

(4)  För förpackat foder ska en del av innehållet i de förpackningar som ska provtas tas ut med hjälp av ett spjut eller en skyffel efter det att förpackningarna om det behövs har tömts separat.

(5)  Eventuella klumpar ska brytas upp (om det behövs genom att de tas ut från provet och sedan återförs till detta), vilket görs separat för varje samlingsprov.

BILAGA II

ALLMÄNNA BESTÄMMELSER OM ANALYSMETODER FÖR FODER

A.   BEREDNING AV ANALYSPROV

1.   Syfte

De metoder som beskrivs nedan gäller beredning för analys av slutliga prov som skickats till kontrollaboratorierna efter provtagning i enlighet med bilaga I.

Dessa prov ska beredas så att den uppvägda mängden enligt analysmetoden är homogen och representativ för de slutliga proven.

2.   Försiktighetsåtgärder

Vilken provberedningsmetod som ska användas beror på analysmetoden. Det är därför viktigt att man ser till att provberedningsmetoden lämpar sig för den analysmetod som används.

Alla nödvändiga moment ska utföras på ett sådant sätt att man i görligaste mån undviker att provet kontamineras eller att dess sammansättning ändras.

Malning, blandning och siktning bör göras så snabbt som möjligt så att provet i minsta möjliga utsträckning utsätts för luft och ljus. Kvarnar och rivare som avsevärt kan hetta upp provet bör inte användas.

Malning för hand rekommenderas för foder som är särskilt känsliga för värme. Man bör också se till att apparaten inte i sig själv är en källa till kontaminering med spårelement.

Om provet inte kan beredas utan betydande förändringar av dess vattenhalt ska vattenhalten före och efter beredningen bestämmas med den metod som anges i bilaga III del A.

3.   Utförande

Dela provet i lämpliga analys- och referensprov med lämpliga neddelningsmetoder, t.ex. genom växelvisa skyffeltag eller med hjälp av spaltneddelare eller rotationsneddelare. Koning och kvartering rekommenderas inte eftersom det kan ge större neddelningsfel. Förvara referensprovet i en lämplig ren, torr behållare med lufttät förslutning, och bered analysprov på minst 100 g enligt nedan.

3.1   Foder som kan malas i befintligt tillstånd

Om inte annat anges i analysmetoderna siktas hela provet genom en sikt med kvadratiska maskor med sidan 1 mm (enligt ISO-rekommendation R565), efter malning om det behövs. Mal inte provet mer än nödvändigt.

Blanda det siktade provet och placera det i en lämplig ren, torr behållare med lufttät förslutning. Blanda provet igen i direkt samband med invägning för analys.

3.2   Foder som kan malas efter torkning

Om inte annat anges i metodbeskrivningen torkas provet till en vattenhalt på 8–12 % genom den förberedande torkning som görs vid bestämning av vattenhalt enligt bilaga III del A punkt 4.3. Fortsätt sedan enligt anvisningarna i 3.1.

3.3   Flytande eller halvflytande foder

Placera provet i en lämplig ren, torr behållare med lufttät förslutning. Blanda provet ordentligt i direkt samband med invägning för analys.

3.4   Öviga foder

Prov som inte kan beredas enligt någon av de föregående metoderna bör behandlas med någon annan metod som garanterar att de provportioner som vägs in för analys är homogena och representativa för det slutliga provet.

4.   Provförvaring

Proven ska förvaras vid en temperatur som inte påverkar deras sammansättning. Prov avsedda för analys av vitaminer eller ämnen som är särskilt ljuskänsliga ska förvaras i behållare av brunt glas.

B.   BESTÄMMELSER OM REAGENS OCH UTRUSTNING FÖR ANALYS

1.	Om inget annat anges för analysmetoden ska alla reagens vara analysrena (p.a.). Vid spåranalys ska reagensens renhet kontrolleras mot ett blankprov. Beroende på resultatet kan det krävas ytterligare rening av reagensen.

2.

Om det i metodbeskrivningen inte anges vilken typ av lösnings- eller spädningsmedel som ska användas för beredning av lösningar, spädning, sköljning eller tvättning ska vatten användas. I allmänhet ska vattnet vara demineraliserat eller destillerat. I särskilda fall, som anges i metodbeskrivningarna, ska vattnet behandlas med särskilda reningsmetoder.

3.	Eftersom viss utrustning normalt sett förekommer på kontrollaboratorier nämns i metodbeskrivningarna endast instrument och apparatur som är speciella eller som ska användas på ett speciellt sätt. Instrument och apparatur ska vara rena, särskilt när mycket små mängder ska bestämmas.

C.   VAL AV ANALYSMETOD OCH RESULTATANGIVELSE

1.   Extraktion

I många fall anges en specifik extraktionsmetod för en viss analysmetod. I allmänhet kan andra extraktionsmetoder än den som finns i metodbeskrivningen användas om det kan visas att den använda extraktionsmetoden har likvärdig extraktionseffektivitet för den analyserade matrisen som den metod som anges för analysmetoden.

2.   Rening

I många fall anges en specifik reningsmetod för en viss analysmetod. I allmänhet kan andra reningsmetoder än den som finns i metodbeskrivningen användas om det kan visas att den använda reningsmetoden ger likvärdiga analysresultat för den analyserade matrisen som den metod som anges för analysmetoden.

3.   Angivande av analysmetod som använts

I allmänhet har det fastställts en analysmetod för bestämning av varje enskilt ämne i fodret. Om det finns flera metoder ska den metod som kontrollaboratoriet använt anges i analysrapporten.

4.   Antal bestämningar

Resultatet som anges i analysrapporten ska vara det medelvärde som erhållits vid minst två bestämningar som gjorts på separata delar av provet med tillfredsställande repeterbarhet.

När det gäller analys av främmande ämnen gäller dock att om resultatet från den första bestämningen är betydligt (> 50 %) lägre än den specifikation som ska kontrolleras så behövs ingen ytterligare bestämning, förutsatt att lämpliga kvalitetsförfaranden används.

När det gäller kontroll av det deklarerade innehållet av ett ämne eller en beståndsdel gäller att om resultatet från den första bestämningen bekräftar det deklarerade innehållet, dvs. analysresultatet hamnar inom ett intervall för acceptabel variation jämfört med det deklarerade innehållet, behövs ingen ytterligare bestämning, förutsatt att lämpliga kvalitetsförfaranden används.

I en del fall definieras detta acceptabla variationsintervall, t.ex. i rådets direktiv 79/373/EEG (1).

5.   Rapportering av analysresultat

Analysresultatet ska uttryckas med lämpligt antal värdesiffror på det sätt som anges i metodbeskrivningen och ska vid behov korrigeras för vattenhalten i det slutliga provet före beredning.

6.   Mätosäkerhet och utbyte vid analys av främmande ämnen.

I fråga om främmande ämnen enligt direktiv 2002/32/EG, bl.a. dioxiner och dioxinlika PCB, gäller att om analysresultatet bedöms överstiga högsta tillåtna halt med hänsyn tagen till den utvidgade mätosäkerheten och korrigering för utbyte ska en produkt avsedd som foder inte anses uppfylla kraven på högsta tillåtna halt. För att bedöma om kraven uppfylls tar man den analyserade halten, korrigerad för utbyte, minus den utvidgade mätosäkerheten. Denna metod kan bara användas om det går att uppskatta mätosäkerheten och korrigering för utbyte med hjälp av analysmetoden (den kan exempelvis inte användas för mikroskopisk analys).

Analysresultatet ska rapporteras enligt följande (om analysmetoden gör det möjligt att uppskatta mätosäkerhet och utbyte):

a)	Korrigerat för utbyte, med uppgift om hur stort utbytet är. Korrigering är inte nödvändig om utbytet är 90–110 %.

b)	Som x +/– U, där x är analysresultatet och U den utvidgade mätosäkerheten, beräknad med en täckningsfaktor på 2, vilket ger en konfidensgrad på ca 95 %.

Om analysresultatet är betydligt (> 50 %) lägre än den specifikation som ska kontrolleras, och förutsatt att lämpliga kvalitetsförfaranden använts och att analysen endast syftar till att kontrollera om fodret uppfyller kraven i lagstiftningen, får analysresultatet rapporteras utan korrigering för utbyte. Utbyte och mätosäkerhet behöver inte anges i dessa fall.

---

(1)  EGT L 86, 6.4.1979, s. 30.

BILAGA III

ANALYSMETODER FÖR KONTROLL AV FODERRÅVARORS OCH FODERBLANDNINGARS SAMMANSÄTTNING

A.   BESTÄMNING AV VATTENHALT

1.   Syfte och tillämpningsområde

Med denna metod kan vattenhalten i foder bestämmas. Det bör framhållas att när det gäller foder som innehåller flyktiga ämnen, exempelvis organiska syror, bestäms också en betydande mängd flyktiga ämnen tillsammans med vatteninnehållet.

Metoden omfattar inte analys av mjölkprodukter som används som foderråvaror, analys av mineralämnen och blandningar som främst består av mineralämnen, analys av animaliska och vegetabiliska fetter och oljor eller analys av oljeväxtfrön och oljehaltiga frukter.

2.   Princip

Provet torkas på angivet sätt, alltefter fodrets beskaffenhet. Viktförlusten bestäms genom vägning. När det gäller fast foder med hög vattenhalt är det nödvändigt att göra en förberedande torkning.

3.   Utrustning

3.1

Kross av ej vattenabsorberande material som är lätt att rengöra, möjliggör snabb och jämn krossning utan nämnvärd värmeutveckling, så långt möjligt förhindrar kontakt med omgivande luft och som uppfyller kraven i 4.1.1 och 4.1.2 (t.ex. rivkvarnar med variabel malning, vattenkylda kvarnar eller liknande).

3.2	Analysvåg med en noggrannhet av 1 mg.

3.3	Torra behållare av korrosionsfri metall eller av glas och med lufttäta lock. Arbetsytan ska göra det möjligt att sprida ut provet till ca 0,3 g/cm2.

3.4	Elektrisk isotermisk ugn (± 2 oC) med god ventilation och möjlighet till snabb temperaturreglering (1).

3.5	Reglerbar elektrisk vakuumugn med oljepump och antingen en anordning för tillförsel av varm, torr luft eller ett torkmedel (t.ex. kalciumoxid).

3.6	Exsickator med tjock perforerad metall- eller porslinsplatta och med ett effektivt torkmedel.

4.   Utförande

Observera:

De moment som beskrivs i detta avsnitt måste utföras omedelbart efter det att provförpackningarna öppnats. Minst två parallella analyser ska utföras.

4.1   Beredning

4.1.1   Andra fodertyper än de som behandlas i 4.1.2 och 4.1.3

Ta minst 50 g av provet. Krossa eller sönderdela vid behov för att göra provet homogent med avseende på vattenhalt (se 6).

4.1.2   Spannmål och gröpe

Ta minst 50 g av provet. Mal till partiklar som till minst 50 % passerar genom en sikt med en maskvidd av 0,5 mm och som lämnar högst 10 % återstod på en rundmaskig sikt med en maskvidd av 1 mm.

4.1.3   Foder i flytande form eller pastaform samt foder som till större delen består av oljor och fetter

Ta ca 25 g av provet och väg med en noggrannhet av 10 mg. Tillsätt lämplig mängd vattenfri sand som vägts med en noggrannhet av 10 mg och blanda tills en homogen massa erhålls.

4.2   Torkning

4.2.1   Andra fodertyper än de som behandlas i 4.2.2 och 4.2.3

Väg en behållare (3.3) med lock med en noggrannhet av 1 mg. Väg upp ca 5 g av provet med en noggrannhet av 1 mg i den vägda behållaren och fördela det jämnt. Sätt in behållaren utan lock i ugnen som förvärmts till 103 oC. Sätt in behållaren i ugnen så snabbt som möjligt så att ugnstemperaturen inte sjunker alltför mycket. Låt torka i 4 timmar räknat från det att ugnstemperaturen åter stigit till 103 oC. Sätt på locket på behållaren, ta ut denna ur ugnen, låt svalna i 30–45 minuter i exsickatorn (3.6) och väg med en noggrannhet av 1 mg.

Foder som till större delen består av oljor och fetter torkas i ugnen i ytterligare 30 minuter vid 130 oC. Skillnaden i vattenhalt mellan de båda vägningarna får inte överstiga 0,1 %.

4.2.2   Spannmål, mjöl och gröpe

Väg en behållare (3.3) med lock med en noggrannhet av 0,5 mg. Väg upp ca 5 g av det krossade provet med en noggrannhet av 1 mg i den vägda behållaren och fördela det jämnt. Sätt in behållaren utan lock i ugnen som förvärmts till 130 oC. Sätt in behållaren i ugnen så snabbt som möjligt så att ugnstemperaturen inte sjunker alltför mycket. Låt torka i två timmar räknat från det att ugnstemperaturen åter stigit till 130 oC. Sätt på locket på behållaren, ta ut denna ur ugnen, låt svalna i 30–45 minuter i exsickatorn (3.6) och väg med en noggrannhet av 1 mg.

4.2.3

Foderblandningar som innehåller mer än 4 % sackaros eller laktos; foderråvaror som t.ex. johannesbrödsfrön, hydrolyserade spannmålsprodukter, malt, torkad betsnitsel, lösliga biprodukter från fisk- eller sockerindustrin; foderblandningar som innehåller mer än 25 % mineralsalter inklusive kristallvatten Väg en behållare (3.3) med lock med en noggrannhet av 0,5 mg. Väg upp ca 5 g av provet med en noggrannhet av 1 mg i den vägda behållaren och fördela det jämnt. Sätt in behållaren utan lock i vakuumugnen (3.5) som förvärmts till 80–85 oC. Sätt in behållaren i ugnen så snabbt som möjligt så att ugnstemperaturen inte sjunker alltför mycket. Ställ in trycket på 100 torr och låt torka vid detta tryck i 4 timmar, antingen med en torr varmluftsström eller med användning av torkmedel (ca 300 g till 20 prov). Om det senare alternativet väljs ska vakuumpumpen frånkopplas när det angivna trycket har uppnåtts. Räkna torkningstiden från det att ugnstemperaturen åter har nått 80–85 oC. Låt försiktigt ugnen återgå till atmosfärstryck. Öppna ugnen, sätt omedelbart lock på behållaren, ta ut den ur ugnen, låt svalna i 30–45 minuter i exsickatorn (3.6) och väg med en noggrannhet av 1 mg. Låt torka i ytterligare 30 minuter i vakuumugnen vid 80–85 oC och väg på nytt. Skillnaden i vattenhalt mellan de båda vägningarna får inte överstiga 0,1 %.

4.3   Förberedande torkning

4.3.1   Andra foder än de som behandlas i 4.3.2

Fasta foder med hög vattenhalt som försvårar krossning måste genomgå en förberedande torkning enligt följande:

Väg upp 50 g okrossat prov med en noggrannhet av 10 mg (pellets och briketter kan vid behov delas grovt) i en lämplig behållare (t.ex. en 20 × 12 cm aluminiumplåt med 0,5 cm upphöjd kant). Låt torka i ugn vid 60–70 oC tills vattenhalten har reducerats till 8–12 %. Ta ut provet ur ugnen, låt svalna utan lock i laboratoriet i 1 timme och väg med en noggrannhet av 10 mg. Krossa provet omedelbart enligt 4.1.1 och torka enligt 4.2.1 eller 4.2.3 beroende på fodrets beskaffenhet.

4.3.2   Spannmål

Spannmål med en vattenhalt över 17 % måste genomgå en förberedande torkning enligt följande:

Väg upp 50 g omalda spannmålskärnor med en noggrannhet av 10 mg i en lämplig behållare (t.ex. en 20 × 12 cm aluminiumplåt med 0,5 cm upphöjd kant). Låt torka i ugn i 5–7 minuter vid 130 oC. Ta ut provet ur ugnen, låt svalna utan lock i laboratoriet i två timmar och väg med en noggrannhet av 10 mg. Mal omedelbart enligt 4.1.2 och torka enligt 4.2.2.

5.   Beräkning av resultat

Vattenhalten (X) i procent av provet beräknas med nedanstående formler.

5.1   Torkning utan förberedande torkning

där:

m	=	provets ursprungliga vikt i gram
m0	=	det torkade provets vikt i gram.

5.2   Torkning med förberedande torkning

där:

m	=	provets ursprungliga vikt i gram
m1	=	provets vikt i gram efter förberedande torkning
m2	=	provets vikt i gram efter krossning eller malning
m0	=	det torkade provets vikt i gram.

5.3   Repeterbarhet

Skillnaden mellan resultaten från två parallella bestämningar som utförs på samma prov får inte överstiga 0,2 % av den absoluta vattenhalten.

6.   Anmärkning

Om det är nödvändigt att krossa provet och detta medför en iakttagbar förändring av vattenhalten, måste resultaten av analyserna av fodrets beståndsdelar korrigeras på grundval av provets ursprungliga vattenhalt.

B.   BESTÄMNING AV VATTENHALT I ANIMALISKA OCH VEGETABILISKA OLJOR OCH FETTER

1.   Syfte och tillämpningsområde

Med denna metod är det möjligt att bestämma halter av vatten och flyktiga ämnen i animaliska och vegetabiliska oljor och fetter.

2.   Princip

Provet torkas till konstant vikt (viktförlusten mellan två på varandra följande vägningar får inte överstiga 1 mg) vid 103 oC. Viktförlusten bestäms genom vägning.

3.   Utrustning

3.1	Flatbottnad skål av korrosionsresistent material, 8–9 cm i diameter och ca 3 cm hög.

3.2	Termometer med förstärkt kula och expansionsrör i överdelen, graderad från ca 80 oC till minst 110 oC och ca 10 cm lång.

3.3	Sandbad eller elektrisk värmeplatta.

3.4	Exsickator med ett effektivt torkmedel.

3.5	Analysvåg.

4.   Utförande

Väg med 1 mg noggrannhet upp ca 20 g av det homogeniserade provet på den torra, vägda skålen (3.1) där termometern (3.2) placerats. Upphetta på sandbadet eller värmeplattan (3.3) under ständig omrörning med termometern så att temperaturen stiger till 90 oC på ca 7 minuter.

Sänk värmen och ge akt på mängden bubblor som stiger från skålens botten. Temperaturen får inte överstiga 105 oC. Fortsätt att röra om och skrapa skålens botten tills det inte längre bildas några bubblor.

För att försäkra sig om att vattnet helt har avlägsnats upphettar man upprepade gånger till 103 ± 2 oC och kyler till 93 oC mellan upphettningarna. Därefter får provet svalna till rumstemperatur i exsickatorn (3.4) varefter det vägs. Detta upprepas tills viktförlusten mellan två på varandra följande vägningar inte längre överstiger 2 mg.

Observera:

Om provets vikt ökar efter flera upphettningar, tyder detta på att fettet har oxiderats. Resultatet beräknas då utifrån den vägning som gjordes omedelbart innan vikten började öka.

5.   Beräkning av resultat

Provets vattenhalt X i procent beräknas med formeln

där:

m	=	provets vikt i gram
m1	=	skålens vikt (i gram) inklusive innehåll före upphettning
m2	=	skålens vikt (i gram) inklusive innehåll efter upphettning.

Resultat under 0,05 % ska redovisas som ”under 0,05 %”.

Repeterbarhet

Skillnaden mellan resultaten från två parallella bestämningar som utförs på samma prov får inte överstiga 0,05 % av den absoluta vattenhalten.

C.   BESTÄMNING AV RÅPROTEINHALT

1.   Syfte och tillämpningsområde

Med denna metod kan råproteinhalten i foder bestämmas på grundval av kvävehalten, bestämd med Kjeldahlmetoden.

2.   Princip

Provet uppsluts med svavelsyra i närvaro av en katalysator. Syralösningen görs basisk med natriumhydroxidlösning. Ammoniaken destilleras av och samlas upp i en uppmätt kvantitet svavelsyra varefter syraöverskottet titreras med en standardlösning av natriumhydroxid.

Alternativt destilleras den frigjorda ammoniaken till ett överskott av borsyralösning, som sedan titreras med saltsyra eller svavelsyra.

3.   Reagens

3.1	Kaliumsulfat.

3.2	Katalysator: koppar(II)oxid, CuO, eller koppar(II)sulfatpentahydrat, CuSO4 5H2O.

3.3	Zinkgranulat.

3.4	Svavelsyra, ρ20 = 1,84 g/ml.

3.5	Svavelsyra, standardlösning, c(H2SO4) = 0,25 mol/l.

3.6	Svavelsyra, standardlösning, c(H2SO4) = 0,10 mol/l.

3.7	Svavelsyra, standardlösning, c(H2SO4) = 0,05 mol/l.

3.8	Metylrött (indikator): lös 300 mg metylrött i 100 ml etanol, σ = 95–96 % (v/v).

3.9	Natriumhydroxidlösning (teknisk kvalitet kan användas) β = 40 g/100 ml (m/v: 40 %).

3.10	Natriumhydroxid, standardlösning, c(NaOH) = 0,25 mol/l.

3.11	Natriumhydroxid, standardlösning, c(NaOH) = 0,10 mol/l.

3.12	Pimpstensgranulat som saltsyresköljts och glödgats.

3.13	Acetanilid (smältpunkt = 114 oC, N-halt = 10,36 %).

3.14	Sackaros (kvävefri).

3.15	Borsyra (H3BO3).

3.16	Indikatorlösning av metylrött: lös 100 mg metylrött i 100 ml etanol eller metanol.

3.17	Lösning av bromkresolgrönt: lös 100 mg bromkresolgrönt i 100 ml etanol eller metanol.

3.18

Borsyralösning (10–40 g/l beroende på vilken utrustning som används). Vid kolorimetrisk bestämning av ekvivalenspunkten ska indikatorerna metylrött och bromkresolgrönt tillsättas borsyralösningarna. För beredning av 1 liter borsyralösning tillsätts 7 ml lösning av metylrött (3.16) och 10 ml lösning av bromkresolgrönt (3.17) innan volymen justeras. Beroende på det vatten som används kan borsyralösningens pH variera mellan olika satser. Det är ofta nödvändigt med en liten tillsats av bas för att få ett positivt blankprov. Anmärkning: En tillsats av ca 3–4 ml NaOH (3.11) till 1 liter borsyra (10 g/l) ger vanligen en god justering. Lösningen förvaras i rumstemperatur skyddad från ljus och ammoniakångor.

3.19	Saltsyra, standardlösning, c(HCl) = 0,10 mol/l. Anmärkning: Andra koncentrationer av lösningarna (3.5, 3.6, 3.7, 3.10, 3.11 och 3.19) kan användas om beräkningarna korrigeras för detta. Koncentrationerna bör alltid anges med fyra decimaler.

4.   Utrustning

Lämplig utrustning för uppslutning, destillation och titrering enligt Kjeldahlmetoden.

5.   Utförande

5.1   Uppslutning

Väg upp 1 g av provet med 0,001 g noggrannhet och överför detta till uppslutningsapparatens kolv. Tillsätt 15 g kaliumsulfat (3.1), en lämplig mängd katalysator (3.2) (0,3–0,4 g koppar(II)oxid eller 0,9–1,2 g koppar(II)sulfatpentahydrat), 25 ml svavelsyra (3.4) och vid behov några korn pimpsten (3.12). Blanda.

Upphetta kolven först måttligt, och rotera den vid behov då och då tills innehållet har förkolnat och skummet försvunnit. Upphetta sedan intensivare tills vätskan kommit i konstant kokning. Värmen är tillräcklig om den kokande syran kondenserar på kolvens väggar. Se till att kolvens väggar inte blir överhettade och att organiska partiklar inte fastnar på dem.

När lösningen har blivit klar och ljusgrön fortsätts kokningen i ytterligare två timmar, varefter lösningen får svalna.

5.2   Destillation

Tillsätt försiktigt tillräckligt med vatten för att sulfaterna ska lösas upp fullständigt. Låt svalna. Tillsätt sedan några korn zinkgranulat (3.3) om så behövs. Fortsätt enligt 5.2.1 eller 5.2.2.

5.2.1   Destillation till svavelsyra

Tillför en exakt uppmätt mängd av 25 ml svavelsyra (3.5) eller (3.7), beroende på den förmodade kvävehalten, till destillationsapparatens uppsamlingskolv. Tillsätt några droppar metylrött (3.8).

Förbind kolven med destillationsapparatens kylare och sänk ned kylarens ände minst 1 cm (se anmärkning 8.3) i vätskan i uppsamlingskolven. Häll långsamt 100 ml natriumhydroxidlösning (3.9) i kolven utan att ammoniak försvinner (se anmärkning 8.1). Upphetta kolven tills ammoniaken har destillerats färdigt.

5.2.2   Destillation till borsyra

Om destillatets ammoniakinnehåll titreras manuellt används nedanstående förfarande. Om destillationsenheten är helautomatisk och inkluderar titrering av destillatets ammoniakinnehåll, ska tillverkarens bruksanvisning följas.

Ställ en uppsamlingskolv innehållande 25–30 ml borsyralösning (3.18) under kylarens utlopp på ett sådant sätt att utloppsröret mynnar under ytan i ett överskott av borsyralösning. Ställ in destillationsenheten så att 50 ml natriumhydroxidlösning (3.9) tillsätts. Använd destillationsenheten enligt tillverkarens bruksanvisning och destillera av den ammoniak som frigjorts genom tillsatsen av natriumhydroxidlösning. Samla upp destillatet i borsyralösningen. Mängden destillat (tiden för ångdestillation) beror på mängden kväve i provet. Följ tillverkarens bruksanvisning.

Anmärkning:

I en halvautomatisk destillationsenhet sker såväl tillsats av ett överskott av natriumhydroxid som ångdestillation automatiskt.

5.3   Titrering

Fortsätt enligt 5.3.1 eller 5.3.2.

5.3.1   Svavelsyra

Överskottet av svavelsyra titreras i uppsamlingskolven med natriumhydroxidlösning (3.10 eller 3.11), beroende på vilken koncentration av svavelsyra som använts, tills ekvivalenspunkten är nådd.

5.3.2   Borsyra

Uppsamlingskolvens innehåll titreras med standardlösning av saltsyra (3.19) eller med standardlösning av svavelsyra (3.6) med hjälp av en byrett. Den använda mängden titrator avläses.

Vid kolorimetrisk bestämning av ekvivalenspunkten nås denna så snart provet börjar skifta färg till rosa. Avläs byretten med 0,05 ml noggrannhet. En upplyst magnetomrörare eller en fotometer kan göra det lättare att påvisa färgomslaget.

Detta kan också göras automatiskt med hjälp av en ångdestillationsapparat med automatisk titrering.

Följ tillverkarens bruksanvisning för den använda destillationsapparaten eller destillations-/titreringsapparaten.

Anmärkning:

Om automatisk titrering används, inleds titreringen omedelbart efter det att destillationen har börjat, och 1 % borsyralösning (3.18) används. Med en helautomatisk destillationsenhet kan man också göra en potentiometrisk titrering av ammoniak, där ekvivalenspunkten bestäms genom kontinuerlig pH-mätning. I så fall används en automatisk titreringsapparat med en pH-meter som med hjälp av standardmetoder är noggrant kalibrerad i intervallet pH 4–7. Ekvivalenspunkten nås vid pH 4,6 där titrerkurvan är som brantast (inflexionspunkten).

5.4   Blankprov

För att säkerställa att reagensen är fria från kväve utförs ett blankprov (uppslutning, destillation och titrering) med 1 g sackaros (3.14) i stället för provet.

6.   Beräkning av resultat

Beräkningarna görs enligt 6.1 eller 6.2.

6.1   Beräkning för titrering enligt 5.3.1

Råproteinhalten i viktprocent beräknas med formeln

där:

V0	=	volymen (ml) NaOH (3.10 eller 3.11) i blankprovet
V1	=	volymen (ml) NaOH (3.10 eller 3.11) vid titreringen av provet
c	=	koncentrationen (mol/l) av natriumhydroxid (3.10 eller 3.11)
m	=	provets vikt i gram.

6.2   Beräkning för titrering enligt 5.3.2

6.2.1   Titrering med saltsyra

Råproteinhalten i viktprocent beräknas med formeln

där:

m	=	provets vikt i gram
c	=	koncentrationen (mol/l) av saltsyra i standardlösningen (3.19)
V0	=	volymen (ml) saltsyra i blankprovet
V1	=	volymen (ml) saltsyra i provet.

6.2.2   Titrering med svavelsyra

Råproteinhalten i viktprocent beräknas med formeln

där:

m	=	provets vikt i gram
c	=	koncentrationen (mol/l) av svavelsyra i standardlösningen (3.6)
V0	=	volymen (ml) svavelsyra (3.6) i blankprovet
V1	=	volymen (ml) svavelsyra (3.6) i provet.

7.   Verifiering av metoden

7.1   Repeterbarhet

Skillnaden mellan resultaten från två parallella bestämningar som utförs på samma prov får inte överstiga

—	0,2 % i absoluta tal för råproteinhalter under 20 %,

—	1,0 % av det högre värdet för råproteinhalter på 20–40 %,

—	0,4 % i absoluta tal för råproteinhalter över 40 %.

7.2   Noggrannhet

Utför analysen (uppslutning, destillation och titrering) på 1,5–2,0 g acetanilid (3.13) i närvaro av 1 g sackaros (3.14). 1 g acetanilid förbrukar 14,80 ml svavelsyra (3.5). Utbytet ska vara minst 99 %.

8.   Anmärkningar

8.1

Den använda apparaten kan vara manuell, halvautomatisk eller automatisk. Om apparaten kräver att materialet flyttas mellan uppslutnings- och destillationsstegen måste flyttningen ske utan förlust. Om destillationsapparaturens kolv inte är försedd med en dropptratt ska natriumhydroxiden tillsättas omedelbart innan kolven ansluts till kylaren, varvid vätskan långsamt hälls ned längs kolvens vägg.

8.2	Om det uppslutna materialet tjocknar görs bestämningen om med en större mängd svavelsyra (3.4) än den ovan angivna.

8.3	För produkter med låg kvävehalt kan volymen svavelsyra (3.7) som tillsätts i uppsamlingskolven vid behov minskas till 10–15 ml, varefter vatten fylls på till 25 ml.

8.4

För rutinanalyser kan alternativa metoder för bestämning av råprotein användas, men Kjeldahlmetoden som beskrivs i denna del C är referensmetoden. De resultat som erhålls med den alternativa metoden (t.ex. Dumas) måste för varje matris individuellt visas vara likvärdiga jämfört med referensmetoden. Resultaten kan dock skilja sig något från resultat erhållna med referensmetoden även om likvärdigheten har kontrollerats. Därför måste analysrapporten ange vilken metod som använts för bestämning av råprotein.

D.   BESTÄMNING AV UREA

1.   Syfte och tillämpningsområde

Med denna metod kan ureahalten i foder bestämmas.

2.   Princip

Provet slammas upp i vatten med klarmedel. Suspensionen filtreras. Ureahalten i filtratet bestäms efter tillsats av 4-dimetylaminobensaldehyd (4-DMAB) genom mätning av absorbansen vid våglängden 420 nm.

3.   Reagens

3.1	Lösning av 4-dimetylaminobensaldehyd: lös upp 1,6 g 4-DMAB i 100 ml 96 % etanol och tillsätt 10 ml saltsyra (ρ20 = 1,19 g/ml). Denna reagens håller sig i högst två veckor.

3.2	Carrez-lösning I: lös upp 21,9 g zinkacetat, Zn(CH3COO)2 2H2O, och 3 g isättika i vatten. Späd med vatten till 100 ml.

3.3	Carrez-lösning II: lös upp 10,6 g kaliumferrocyanid, K4Fe(CN)6 3H2O, i vatten. Späd med vatten till 100 ml.

3.4	Aktivt kol som inte absorberar urea (ska kontrolleras).

3.5	Urea, 0,1 % lösning (w/v).

4.   Utrustning

4.1	Rotationsskakapparat: ca 35–40 varv per minut.

4.2	Provrör: 160 × 16 mm med slipade glasproppar.

4.3	Spektrofotometer.

5.   Utförande

5.1   Analys av provet

Väg med en noggrannhet av 1 mg upp 2 g av provet i en 500 ml mätkolv tillsammans med 1 g aktivt kol (3.4). Tillsätt 400 ml vatten och 5 ml Carrez-lösning I (3.2), blanda i ca 30 sekunder och tillsätt 5 ml Carrez-lösning II (3.3). Blanda i 30 minuter på skakapparaten. Späd med vatten till full volym, skaka om och filtrera.

För över 5 ml av de transparenta, färglösa filtraten till provrör med slipade glasproppar, tillsätt 5 ml 4-DMAB-lösning (3.1) och blanda. Ställ provrören i ett vattenbad som håller 20 oC (+/– 4 oC). Mät efter 15 minuter provlösningens absorbans med spektrofotometer vid 420 nm. Jämför med blankprovslösningen av reagensen.

5.2   Kalibreringskurva

För över volymer på 1, 2, 4, 5 och 10 ml av urealösningen (3.5) till 100 ml mätkolvar och späd med vatten till full volym. Avlägsna 5 ml från varje lösning, tillsätt 5 ml 4-DMAB-lösning (3.1) till var och en av dem, homogenisera och mät absorbansen enligt ovan jämfört med en kontrollösning som innehåller 5 ml 4-DMAB-lösning och 5 ml ureafritt vatten. Konstruera kalibreringskurvan.

6.   Beräkning av resultat

Bestäm ureamängden i provet med hjälp av kalibreringskurvan.

Uttryck resultatet i procent av provet.

7.   Anmärkningar

7.1	Om ureahalten överstiger 3 %, reducera provet till 1 g eller späd den ursprungliga lösningen så att det inte finns mer än 50 mg urea per 500 ml.

7.2	Om ureahalten är låg, öka provmängden så mycket som kan ske med bibehållen transparens och färglöshet hos filtratet.

7.3	Om provet innehåller enkla kväveföreningar som aminosyror ska absorbansen mätas vid 435 nm.

E.   BESTÄMNING AV FLYKTIGA KVÄVEFÖRENINGAR

I.   GENOM MIKRODIFFUSION

1.   Syfte och tillämpningsområde

Med denna metod kan halten flyktiga kväveföreningar, uttryckt som ammoniak, bestämmas i foder.

2.   Princip

Provet extraheras med vatten och lösningen klaras och filtreras. De flyktiga kväveföreningarna avskiljs genom mikrodiffusion med kaliumkarbonatlösning, samlas upp i borsyrelösning och titreras med svavelsyra.

3.   Reagens

3.1	Triklorättiksyra, lösning 20 % (w/v).

3.2	Indikator: lös 33 mg bromkresolgrönt och 65 mg metylrött i 100 ml etanol 95–96 % (v/v).

3.3	Borsyralösning: lös 10 g borsyra i en 1 000 ml mätkolv med 200 ml etanol 95–96 % (v/v) och 700 ml vatten. Tillsätt 10 ml indikator (3.2). Blanda och justera vid behov lösningens färg till ljusrött genom att tillsätta natriumhydroxidlösning. 1 ml av lösningen fixerar maximalt 300 μg NH3.

3.4	Mättad kaliumkarbonatlösning: lös 100 g kaliumkarbonat i 100 ml kokande vatten. Låt svalna och filtrera.

3.5	Svavelsyra, 0,01 mol/l.

4.   Utrustning

4.1	Rotationsskakapparat: ca 35–40 varv per minut.

4.2	Conwayceller av glas eller plast (se diagram).

4.3	Mikrobyretter graderade i 1/100 ml.

5.   Utförande

Väg upp 10 g av provet med en noggrannhet av 1 mg och överför det tillsammans med 100 ml vatten till en 200 ml mätkolv. Blanda på skakapparaten i 30 minuter. Tillsätt 50 ml triklorättiksyralösning (3.1), späd med vatten till full volym, skaka kraftigt och filtrera genom ett veckat filtrerpapper.

Tillsätt med pipett 1 ml borsyrelösning (3.3) i den inre delen av Conwaycellen och 1 ml av provfiltratet i cellens krona. Täck delvis med det infettade locket. Droppa snabbt 1 ml mättad kaliumkarbonatlösning (3.4) i kronan och tillslut locket lufttätt. Rotera försiktigt cellen i horisontellt läge så att de två reagensen blandas. Inkubera antingen vid rumstemperatur i minst fyra timmar eller vid 40 oC i en timme.

Titrera med hjälp av en mikrobyrett (4.3) de flyktiga föreningarna i borsyralösningen med svavelsyra (3.5).

Utför ett blankprov med samma metod men utan analysprov.

6.   Beräkning av resultat

1 ml 0,01 M H2SO4 motsvarar 0,34 mg ammoniak.

Uttryck resultatet i procent av provet.

Repeterbarhet

Skillnaden mellan resultaten från två parallella bestämningar som utförs på samma prov får inte överstiga

—	10 % av det högre värdet för ammoniakhalter under 1,0 %,

—	0,1 % i absoluta tal för ammoniakhalter på 1,0 % eller högre.

7.   Anmärkning

Om provets ammoniakhalt överstiger 0,6 % ska det ursprungliga filtratet spädas ut.

CONWAY CELL

Scale 1/1

II.   GENOM DESTILLATION

1.   Syfte och tillämpningsområde

Med denna metod kan halten flyktiga kväveföreningar, uttryckt som ammoniak, bestämmas i fiskmjöl som är i det närmaste ureafritt. Den kan endast användas vid ammoniakhalter under 0,25 %.

2.   Princip

Provet extraheras med vatten och lösningen klaras och filtreras. De flyktiga kväveföreningarna avskiljs vid kokpunkten genom tillsats av magnesiumoxid och samlas upp i en bestämd mängd svavelsyra. Överskottet av svavelsyra återtitreras med natriumhydroxidlösning.

3.   Reagens

3.1	Triklorättiksyra, lösning 20 % (w/v).

3.2	Magnesiumoxid.

3.3	Skumdämpande emulsion (t.ex. silikon).

3.4	Svavelsyra, 0,05 mol/l.

3.5	Natriumhydoxidlösning, 0,1 mol/l.

3.6	Metylröttlösning, 0,3 %, i 95–96 % (v/v) etanol.

4.   Utrustning

4.1	Rotationsskakapparat: ca 35–40 varv per minut.

4.2	Destillationsapparat av Kjeldahltyp.

5.   Utförande

Väg upp 10 g av provet med en noggrannhet av 1 mg och överför det tillsammans med 100 ml vatten till en 200 ml mätkolv. Blanda på skakapparaten i 30 minuter. Tillsätt 50 ml triklorättiksyralösning (3.1), späd med vatten till full volym, skaka om kraftigt och filtrera genom ett veckat filtrerpapper.

Ta ut klart filtrat i en volym avpassad för den förmodade halten flyktiga kväveföreningar (100 ml brukar vara lämpligt). Späd till 200 ml och tillsätt 2 g magnesiumoxid (3.2) och några droppar skumdämpande emulsion (3.3). Lösningen ska ge basisk reaktion med lackmuspapper; om så inte är fallet tillsätts lite magnesiumoxid (3.2). Fortsätt enligt 5.2 och 5.3 i analysmetoden för bestämning av råproteinhalten (del C i denna bilaga).

Utför ett blankprov med samma metod men utan analysprov.

6.   Beräkning av resultat

1 ml 0,05 mol/l H2SO4 motsvarar 1,7 mg ammoniak.

Uttryck resultatet i procent av provet.

Repeterbarhet

Skillnaden mellan resultaten från två parallella bestämningar som utförs på samma prov får inte överstiga 10 % (relativt värde).

F.   BESTÄMNING AV AMINOSYROR (UTOM TRYPTOFAN)

1.   Syfte och tillämpningsområde

Med denna metod kan fria aminosyror (syntetiska och naturliga) och totalhalten aminosyror (peptidbundna och fria) i foder bestämmas med hjälp av en aminosyraanalysator. Den är tillämplig på följande aminosyror: cyst(e)in, metionin, lysin, treonin, alanin, arginin, asparaginsyra, glutaminsyra, glycin, histidin, isoleucin, leucin, fenylalanin, prolin, serin, tyrosin och valin.

Metoden skiljer inte mellan aminosyrornas salter och kan inte skilja mellan aminosyrornas D- och L-former. Den är inte användbar för bestämning av tryptofan eller hydroxyanaloger av aminosyror.

2.   Princip

2.1   Fria aminosyror

De fria aminosyrorna extraheras med utspädd saltsyra. Samextraherade kvävehaltiga makromolekyler fälls ut med sulfosalicylsyra och avlägsnas genom filtrering. Den filtrerade lösningens pH justeras till 2,20. Aminosyrorna separeras genom jonbyteskromatografi och bestäms fotometriskt vid 570 nm genom reaktion med ninhydrin.

2.2   Totalhalt aminosyror

Valet av förfarande beror på vilka aminosyror som ska bestämmas. Cyst(e)in och metionin måste oxideras till cysteinsyra respektive metioninsulfon före hydrolys. Tyrosin måste bestämmas i hydrolysat av ooxiderade prov. Alla övriga aminosyror som räknas upp i punkt 1 kan bestämmas i antingen det oxiderade eller ooxiderade provet.

Oxidation utförs vid 0 oC med en blandning av permyrsyra och fenol. Överskott av oxidationsreagens avlägsnas genom tillsats av dinatriumdisulfit. Det oxiderade eller ooxiderade provet hydrolyseras med saltsyra (3.20) i 23 timmar. Hydrolysatet justeras till pH 2,20. Aminosyrorna separeras genom jonbyteskromatografi och bestäms fotometriskt vid 570 nm (440 nm för prolin) genom reaktion med ninhydrin.

3.   Reagens

Dubbeldestillerat vatten eller vatten av likvärdig kvalitet ska användas (konduktivitet < 10 μS/cm).

3.1	Väteperoxid, w = 30 % (w/w).

3.2	Myrsyra, w = 98–100 % (w/w).

3.3

Fenol.

3.4	Dinatriumdisulfit

3.5	Natriumhydroxid.

3.6	5-sulfosalicylsyradihydrat.

3.7	Saltsyra, densitet ca 1,18 g/ml.

3.8	Trinatriumcitratdihydrat.

3.9	2,2'-tiodietanol (tiodiglykol).

3.10	Natriumklorid.

3.11	Ninhydrin.

3.12	Petroleumeter, kokpunktsintervall 40–60 oC.

3.13	Norleucin eller annan förening lämplig som intern standard.

3.14	Kvävgas (< 10 ppm syrgas).

3.15	1-oktanol.

3.16	Aminosyror.

3.16.1

Referenssubstanser enligt listan i punkt 1. Rena substanser, fria från kristallvatten. Torka i vakuum över P2O5 eller H2SO4 i 1 vecka före användning.

3.16.2

Cysteinsyra.

3.16.3

Metioninsulfon.

3.17	Natriumhydroxidlösning, c = 7,5 mol/l: Lös 300 g NaOH (3.5) i vatten och späd till 1 liter.

3.18	Natriumhydroxidlösning, c = 1 mol/l: Lös 40 g NaOH (3.5) i vatten och späd till 1 liter.

3.19	Myrsyra-fenollösning: Blanda 889 g myrsyra (3.2) med 111 g vatten och tillsätt 4,73 g fenol (3.3).

3.20	Hydrolysblandning, c = 6 mol HCl/l innehållande 1 g fenol/l: Tillsätt 1 g fenol (3.3) till 492 ml HCl (3.7) och späd med vatten till 1 liter.

3.21	Extraktionsblandning, c = 0,1 mol HCl/l innehållande 2 % tiodiglykol: Ta 8,2 ml HCl (3.7), späd med ca 900 ml vatten, tillsätt 20 ml tiodiglykol (3.9) och späd med vatten till 1 liter (blanda inte 3.7 och 3.9 direkt).

3.22	5-sulfosalicylsyra, ß = 6 %: Lös 60 g 5-sulfosalicylsyra (3.6) i vatten och späd till 1 liter.

3.23

Oxidationsblandning (permyrsyra-fenol): Blanda 0,5 ml väteperoxid (3.1) med 4,5 ml myrsyra-fenollösning (3.19) i en liten bägare. Inkubera i 20–30 oC i 1 timme för att permyrsyra ska bildas, kyl sedan i isvattenbad (15 min.) före tillsats till provet. Varning: Undvik hudkontakt, använd skyddskläder.

3.24	Citratbuffert, c = 0,2 mol Na+/l, pH 2,20: Lös 19,61 g natriumcitrat (3.8), 5 ml tiodiglykol (3.9), 1 g fenol (3.3) och 16,50 ml HCl (3.7) i ca 800 ml vatten. Justera pH till 2,20. Späd med vatten till 1 liter.

3.25	Elueringsbuffertar som lämpar sig för den analysator som ska användas (4.9).

3.26	Ninhydrinreagens som lämpar sig för den analysator som ska användas (4.9).

3.27	Standardlösningar av aminosyror. Dessa lösningar ska lagras vid en temperatur under 5 oC.

3.27.1

Stamlösningar av aminosyror (3.16.1). c = 2,5 μmol/ml av var och en i saltsyra. Finns att köpa i handeln.

3.27.2

Stamlösning av cysteinsyra och metioninsulfon, c = 1,25 μmol/ml. Lös 0,2115 g cysteinsyra (3.16.2) och 0,2265 g metioninsulfon (3.16.3) i citratbuffert (3.24) i en 1 000 ml mätkolv och späd till märket med citratbuffert. Kan lagras vid en temperatur under 5 oC i högst tolv månader. Denna lösning används ej om stamlösningen (3.27.1) innehåller cysteinsyra och metioninsulfon.

3.27.3

Stamlösning av intern standard, t.ex. norleucin, c = 20 μmol/ml. Lös 0,6560 g norleucin (3.13) i citratbuffert (3.24) i en mätkolv och späd till 250 ml med citratbuffert. Kan lagras vid en temperatur under 5 oC i högst 6 månader.

3.27.4

Kalibreringslösning av standardaminosyror för användning med hydrolysater, c = 5 nmol/50 μl för cysteinsyra och metioninsulfon och c = 10 nmol/50 μl för övriga aminosyror. Lös 2,2 g natriumklorid (3.10) i en 100 ml bägare med 30 ml citratbuffert (3.24). Tillsätt 4,00 ml stamlösning av aminosyror (3.27.1), 4,00 ml stamlösning av cysteinsyra och metioninsulfon (3.27.2) och 0,50 ml stamlösning av intern standard (3.27.3) om sådan används. Justera pH till 2,20 med natriumhydroxid (3.18). Överför kvantitativt till en 50 ml mätkolv, späd till märket med citratbuffert (3.24) och blanda. Kan lagras vid en temperatur under 5 oC i högst 3 månader. Se även punkt 9.1.

3.27.5

Kalibreringslösning av standardaminosyror för användning med hydrolysater beredda enligt 5.3.3.1 och för användning med extrakt (5.2). Kalibreringslösningen bereds enligt 3.27.4 men natriumkloriden utelämnas. Kan lagras vid en temperatur under 5 oC i högst 3 månader.

4.   Utrustning

4.1	100 eller 250 ml rundkolv med återloppskylare.

4.2	100 ml borosilikatglasflaska med skruvkork försedd med gummi/teflontätning (t.ex. Duran, Schott) för användning i ugn.

4.3	Ugn med fläktventilation och temperaturreglering med noggrannhet bättre än ± 2 oC.

4.4	pH-meter (tre decimalers noggrannhet).

4.5	Membranfilter (0,22 μm).

4.6	Centrifug.

4.7	Rotationsindunstare.

4.8	Mekanisk skakapparat eller magnetomrörare.

4.9

Aminosyraanlysator eller HPLC-utrustning med jonbytarkolonn, anordning för ninhydrin, derivatisering efter kolonnpassagen och fotometrisk detektor. Kolonnen fylls med sulfonerad polystyrenharts som kan separera aminosyrorna från varandra och från andra ninhydrinpositiva material. Flödet i buffert- och ninhydrinledningarna ombesörjs av pumpar vars flödesstabilitet är ± 0,5 % under en period som täcker både standardkalibreringskörningen och analysen av provet. Med vissa aminosyraanalysatorer kan man använda hydrolysmetoder där hydrolysatet har en natriumkoncentration på c = 0,8 mol/l och innehåller all överskottsmyrsyra från oxidationssteget. Andra ger inte en tillfredsställande separation av vissa aminosyror i hydrolysat med ett överskott av myrsyra och/eller hög natriumkoncentration. I detta fall reduceras syravolymen genom indunstning till ca 5 ml efter hydrolysen och före pH-justeringen. Indunstningen ska utföras i vakuum vid högst 40 oC.

5.   Utförande

5.1   Provberedning

Provet mals så att det kan passera genom en 0,5 mm sikt. Prov med hög vattenhalt ska antingen lufttorkas vid en temperatur på högst 50 oC eller frystorkas före malningen. Prov med hög fetthalt ska extraheras med petroleumeter (3.12) före malningen.

5.2   Bestämning av fria aminosyror i foder och förblandningar

Väg med 0,2 mg noggrannhet upp en lämplig mängd (1–5 g) av det beredda provet (5.1) i en E-kolv och tillsätt 100,0 ml av extraktionsblandningen (3.21). Blanda i 60 minuter med en mekanisk skakapparat eller magnetomrörare (4.8). Låt sedimentera och pipettera över 10,0 ml av supernatanten till en 100 ml bägare.

Tillsätt 5,0 ml sulfosalicylsyralösning (3.22) under omrörning och fortsätt röra om med hjälp av en magnetomrörare i fem minuter. Filtrera eller centrifugera supernatanten för att avlägsna eventuella fällningar. Överför 10,0 ml av den kvarvarande lösningen till en 100 ml bägare och justera pH till 2,20 med natriumhydroxidlösning (3.18), överför till en mätkolv av lämplig volym med citratbuffert (3.24) och späd till märket med buffertlösningen (3.24).

Om en intern standard används, tillsätt 1,00 ml av denna (3.27.3) för varje 100 ml färdig lösning och späd till märket med buffertlösningen (3.24).

Gå vidare till kromatografin enligt 5.4.

Om extrakten inte kromatograferas samma dag måste de förvaras vid en temperatur under 5 oC.

5.3   Bestämning av totalhalt aminosyror.

5.3.1   Oxidation

Väg med 0,2 mg noggrannhet upp 0,1–1 g av det beredda provet (5.1) i

—	en 100 ml rundkolv (4.1) för öppen hydrolys (5.3.2.3) eller,

—	en 250 ml rundkolv (4.1) om en låg natriumkoncentration är nödvändig (5.3.3.1) eller,

—	en 100 ml flaska med skruvkork (4.2) för sluten hydrolys (5.3.2.4).

Det invägda provet ska innehålla ca 10 mg kväve, och vattenhalten får inte överstiga 100 mg.

Ställ kolven/flaskan i ett isvattenbad och kyl till 0 oC, tillsätt 5 ml oxidationsblandning (3.23) och blanda med hjälp av en glasspatel med böjd spets. Tillslut kolven/flaskan innehållande spateln med en lufttät folie, ställ isvattenbadet innehållande den tillslutna behållaren i ett kylskåp vid 0 oC och låt stå i 16 timmar. Avlägsna provet ur kylskåpet efter 16 timmar och avlägsna överskottet av oxidationsreagens genom tillsats av 0,84 g dinatriumdisulfit (3.4).

Fortsätt till 5.3.2.1.

5.3.2   Hydrolys

5.3.2.1    Hydrolys av oxiderade prov

Tillsätt 25 ml av hydrolysblandningen (3.20) till det oxiderade prov som beretts enligt 5.3.1. Skölj ned eventuella provrester som fastnat på kärlets sidor och på spateln.

Fortsätt enligt 5.3.2.3 eller 5.3.2.4, beroende på vilken hydrolysmetod som används.

5.3.2.2    Hydrolys av ooxiderade prov

Väg med 0,2 mg noggrannhet upp 0,1–1 g av det beredda provet (5.1) i antingen en 100 ml eller 250 ml rundkolv (4.1) eller en 100 ml flaska med skruvkork (4.2). Det invägda provet ska innehålla ca 10 mg kväve. Tillsätt försiktigt 25 ml av hydrolysblandningen (3.20) och blanda med provet. Fortsätt enligt antingen 5.3.2.3 eller 5.3.2.4.

5.3.2.3    Öppen hydrolys

Tillsätt tre glaspärlor till blandningen i kolven (beredd enligt 5.3.2.1 eller 5.3.2.2) och återloppskoka i 23 timmar. Efter fullbordad hydrolys, skölj kylaren med 5 ml citratbuffert (3.24). Koppla bort kolven och kyl den i ett isvattenbad.

Fortsätt enligt 5.3.3.

5.3.2.4   Sluten hydrolys

Sätt in flaskan med blandningen, beredd enligt 5.3.2.1 eller 5.3.2.2, i en ugn (4.3) vid 110 oC. För att förhindra tryckökning (på grund av gasutveckling) och explosion bör skruvkorken sättas löst på flaskan under den första timmen. Tillslut inte flaskan med skruvkorken. Efter 1 timme dras skruvkorken åt och flaskan med får stå i ugnen (4.3) i 23 timmar. Efter fullbordad hydrolys, ta ut flaskan ur ugnen, öppna försiktigt skruvkorken och ställ flaskan i ett isvattenbad. Låt svalna.

Beroende på metod för pH-justering (5.3.3), överför flaskans innehåll kvantitativt till en 250 ml bägare eller till en 250 ml rundkolv med citratbuffert (3.24).

Fortsätt enligt 5.3.3.

5.3.3   Justering av pH

Beroende på aminosyraanalysatorns (4.9) natriumtolerans, fortsätt enligt 5.3.3.1 eller 5.3.3.2 för pH-justeringen.

5.3.3.1    Kromatografiska system (4.9) som kräver en låg natriumkoncentration

Det är tillrådligt att använda en stamlösning av intern standard (3.27.3) om aminosyraanalysatorn kräver en låg natriumkoncentration (om syravolymen måste reduceras).

Tillsätt i detta fall 2,00 ml stamlösning av intern standard (3.27.3) till hydrolysatet före indunstningen.

Tillsätt 2 droppar 1-oktanol (3.15) till det hydrolysat som erhållits enligt 5.3.2.3 eller 5.3.2.4.

Låt provet indunsta i rotationsindunstare (4.7) till 5–10 ml i vakuum vid 40 oC. Om volymen av någon anledning reduceras till mindre än 5 ml måste hydrolysatet kastas och analysen göras om.

Justera pH till 2,20 med natriumhydroxidlösning (3.18) och fortsätt till 5.3.4.

5.3.3.2    Alla övriga aminosyraanalysatorer (4.9)

Ta det hydrolysat som erhölls enligt 5.3.2.3 eller 5.3.2.4 och neutralisera det delvis genom att försiktigt och under omrörning tillsätta 17 ml natriumhydroxidlösning (3.17), och se till att temperaturen hålls under 40 oC.

Justera pH till 2,20 vid rumstemperatur med natriumhydroxidlösning (först 3.17 och sedan 3.18). Fortsätt till 5.3.4.

5.3.4   Provlösning för kromatografi

Överför kvantitativt det pH-justerade hydrolysatet (5.3.3.1 eller 5.3.3.2) med citratbuffert (3.24) till en 200 ml mätkolv och späd till märket med buffert (3.24).

Om en intern standard inte redan använts, tillsätt 2,00 ml av denna (3.27.3) och späd till märket med citratbuffert (3.24). Blanda omsorgsfullt.

Gå vidare till kromatografin enligt 5.4.

Om provlösningarna inte kromatograferas samma dag måste de förvaras vid en temperatur under 5 oC.

5.4   Kromatografi

Före kromatografin, låt extraktet (5.2) eller hydrolysatet (5.3.4) anta rumstemperatur. Skaka blandningen och filtrera en lämplig mängd genom ett 0,22 μm membranfilter (4.5). Den klara lösning som erhålls får genomgå jonbyteskromatografi i en aminosyraanalysator (4.9).

Injektionen kan utföras antingen manuellt eller automatiskt. Det är viktigt att samma mängd lösning ± 0,5 % alltid tillsätts kolonnen för analys av standardlösning och prov, utom när en intern standard används, och att kvoten natrium/aminosyra i standard- och provlösning är så lika som möjligt.

Hur ofta kalibreringsprov behöver köras beror i allmänhet på ninhydrinreagensens stabilitet och typen av analyssystem. Standarden eller provet späds med citratbuffert (3.24) för att ge en topparea för standarden på 30–200 % av provets aminosyratopparea.

Kromatografin av aminosyror varierar något beroende på typen av analysator och harts. Det valda systemet måste kunna separera aminosyrorna från varandra och från ninhydrinpositiva material. Kromatografisystemet bör i driftsområdet ge en linjär respons på förändringar i de aminsyramängder som tillförs kolonnen.

Under kromatografisteget gäller de botten/toppkvoter som anges nedan när en ekvimolär lösning (av de aminosyror som mäts) analyseras. Denna ekvimolära lösning måste innehålla minst 30 % av den maximala mängd av varje aminosyra som med noggrannhet kan bestämmas med analyssystemet (4.9).

För separering av treonin-serin bör botten/toppkvoten för den lägre av de två överlappande aminosyrorna på kromatogrammet inte överstiga 2:10. (Om endast cyst(e)in, metionin, treonin och lysin bestäms kommer otillräcklig separation från angränsande toppar att påverka bestämningen). För alla andra aminosyror måste separationen vara bättre än 1:10.

Systemet måste kunna separera lysin från ”lysinartefakter” och ornitin.

6.   Beräkning av resultat

Arean för provets och standardens toppar mäts för varje enskild aminosyra, och mängden (X) i gram aminosyra per kg prov beräknas med formeln

Om intern standard används, multiplicera med

A	=	topparea, hydrolysat eller extrakt
B	=	topparea, kalibreringsstandardlösning
C	=	topparea, intern standard i hydrolysat eller extrakt
D	=	topparea, intern standard, kalibreringsstandardlösning
M	=	molvikt för den aminosyra som bestäms
c	=	standardlösningens koncentration i μmol/ml
m	=	provets vikt (g) (korrigerad till ursprungsvikten om provet torkats eller avfettats)
V	=	ml totalt hydrolysat (5.3.4) eller ml beräknad total spädningsvolym för extraktet (6.1).

Cystin och cystein bestäms båda som cysteinsyra i hydrolysat av oxiderat prov, men beräknas som cystin (C6H12N2O4S2, molvikt 240,30 g/mol) med hjälp av molvikten 120,15 g/mol (= 0,5 × 240,30 g/mol).

Metionin bestäms som metioninsulfon i hydrolysat av oxiderat prov, men beräknas som metionin med hjälp av molvikten för metionin: 149,21 g/mol.

Tillsatt fritt metionin bestäms efter extraktion som metionin, för beräkningen används samma molvikt.

6.1.	Den totala spädningsvolymen för extrakten (F) för bestämning av fria aminosyror (5.2) beräknas med formeln V = Det färdiga extraktets volym

7.   Utvärderingen av metoden

Metoden testades i en internationell provningsjämförelse 1990 med fyra olika fodertyper (blandat grisfoder, foderblandning för slaktkycklingar, proteinkoncentrat, förblandning). Resultaten, efter eliminering av extremvärden, i form av medelvärden och standardavvikelser redovisas i nedanstående tabeller.

Medelvärden i g/kg

Referensmaterial	Aminosyra
	Treonin	Cyst(e)in	Metionin	Lysin
Grisfoder	6,94 n = 15	3,01 n = 17	3,27 n = 17	9,55 n = 13
Foderblandning för slaktkycklingar	9,31 n = 16	3,92 n = 18	5,08 n = 18	13,93 n = 16
Proteinkoncentrat	22,32 n = 16	5,06 n = 17	12,01 n = 17	47,74 n = 15
Förblandning	58,42 n= 16	—	90,21 n = 16	98,03 n = 16
n = Antal deltagande laboratorier.

7.1   Repeterbarhet

Repeterbarheten uttryckt som ”standardavvikelse inom laboratoriet” i ovannämnda provningsjämförelse redovisas i nedanstående tabell.

Standardavvikelse inom laboratoriet (Sr) i g/kg

Referensmaterial	Aminosyra
	Treonin	Cyst(e)in	Metionin	Lysin
Grisfoder	0,13 n = 15	0,10 n = 17	0,11 n = 17	0,26 n = 13
Foderblandning för slaktkycklingar	0,20 n = 16	0,11 n = 18	0,16 n = 18	0,28 n = 16
Proteinkoncentrat	0,48 n = 16	0,13 n = 17	0,27 n = 17	0,99 n = 15
Förblandning	1,30 n= 16	—	2,19 n = 16	2,06 n = 16
n = Antal deltagande laboratorier.

Variationskoefficient ( %) för standardavvikelse inom laboratoriet (Sr)

Referensmaterial	Aminosyra
	Treonin	Cyst(e)in	Metionin	Lysin
Grisfoder	1,9 n = 15	3,3 n = 17	3,4 n = 17	2,8 n = 13
Foderblandning för slaktkycklingar	2,1 n = 16	2,8 n = 18	3,1 n = 18	2,1 n = 16
Proteinkoncentrat	2,7 n = 16	2,6 n = 17	2,2 n = 17	2,4 n = 15
Förblandning	2,2 n= 16	—	2,4 n = 16	2,1 n = 16
n = Antal deltagande laboratorier.

7.2   Reproducerbarhet

Standardavvikelsen mellan laboratorier i ovannämnda provningsjämförelse redovisas i nedanstående tabell.

Standardavvikelse mellan laboratorier (SR) i g/kg

Referensmaterial	Aminosyra
	Treonin	Cyst(e)in	Metionin	Lysin
Grisfoder	0,28 n = 15	0,30 n = 17	0,23 n = 17	0,30 n = 13
Foderblandning för slaktkycklingar	0,48 n = 16	0,34 n = 18	0,55 n = 18	0,75 n = 16
Proteinkoncentrat	0,85 n = 16	0,62 n = 17	1,57 n = 17	1,24 n = 15
Förblandning	2,49 n= 16	—	6,20 n = 16	6,62 n = 16
n = Antal deltagande laboratorier.

Variationskoefficient ( %) för standardavvikelse mellan laboratorier (SR)

Referensmaterial	Aminosyra
	Treonin	Cyst(e)in	Metionin	Lysin
Grisfoder	4,1 n = 15	9,9 n = 17	7,0 n = 17	3,2 n = 13
Foderblandning för slaktkycklingar	5,2 n = 16	8,8 n = 18	10,9 n = 18	5,4 n = 16
Proteinkoncentrat	3,8 n = 16	12,3 n = 17	13,0 n = 17	3,0 n = 15
Förblandning	4,3 n= 16	—	6,9 n = 16	6,7 n = 16
n = Antal deltagande laboratorier.

8.   Användning av referensmaterial

Korrekt tillämpning av metoden ska verifieras genom analys av certifierade referensmaterial om sådana finns tillgängliga. Kalibrering med godkända kalibreringslösningar för aminosyror rekommenderas.

9.   Anmärkningar

9.1

På grund av skillnaderna mellan aminosyraanalysatorer bör de slutliga koncentrationerna hos kalibreringslösningarna för standardaminosyror (se 3.27.4 och 3.27.5) och hos hydrolysatet (se 5.3.4) användas som riktlinje. Det intervall där sambandet mellan det verkliga värdet och det med apparaten uppmätta värdet är linjärt, måste kontrolleras för alla aminosyror. Standardlösningen späds med citratbuffert så att man får toppar i mitten av intervallet.

9.2	I de fall HPLC används för att analysera hydrolysater måste försöksbetingelserna optimeras i enlighet med tillverkarens rekommendationer.

9.3	Om denna metod tillämpas på foder som innehåller mer än 1 % klorid (kraftfoder, mineralfoder eller tillskottsfoder) kan den uppmätta halten av metionin bli för låg. För att undvika detta måste provet behandlas på särskilt sätt.

G.   BESTÄMNING AV TRYPTOFAN

1.   Syfte och tillämpningsområde

Med denna metod kan totalhalten tryptofan och halten fritt tryptofan bestämmas i foder. Ingen åtskillnad görs mellan D- och L-formerna.

2.   Princip

För bestämning av totalhalten tryptofan hydrolyseras provet i alkalisk miljö med mättad bariumhydroxidlösning och upphettas till 110 oC i 20 timmar. Efter hydrolysen tillsätts en intern standard.

För bestämning av halten fritt tryptofan extraheras provet i lätt sur miljö i närvaro av den interna standarden.

Halten av tryptofan och intern standard i hydrolysatet eller extraktet bestäms med HPLC med fluorescensdetektion.

3.   Reagens

3.1	Dubbeldestillerat vatten eller vatten av likvärdig kvalitet ska användas (konduktivitet < 10 μS/cm).

3.2	Referenssubstans: tryptofan (renhet/halt ≥ 99 %) torkat under vakuum över fosforpentoxid.

3.3	Intern standard: α-metyltryptofan (renhet/halt ≥ 99 %) torkat under vakuum över fosforpentoxid.

3.4	Bariumhydroxidoktahydrat (undvik att exponera Ba(OH)2·8 H2O för större mängder luft, eftersom det då kan bildas BaCO3 som stör bestämningen) (jfr punkt 9.3).

3.5	Natriumhydroxid.

3.6	Ortofosforsyra, w = 85 % (w/w).

3.7	Saltsyra, ρ20 = 1,19 g/ml.

3.8	Metanol, HPLC-kvalitet.

3.9	Petroleumeter, kokpunktsintervall 40–60 oC.

3.10	Natriumhydroxidlösning, c = 1 mol/l: Lös 40,0 g NaOH (3.5) i vatten och späd till 1 liter med vatten (3.1).

3.11	Saltsyra, c = 6 mol/l: Späd 492 ml HCl (3.7) med vatten till slutvolymen 1 liter.

3.12	Saltsyra, c = 1 mol/l: Späd 82 ml HCl (3.7) med vatten till slutvolymen 1 liter.

3.13	Saltsyra, c = 0,1 mol/l: Späd 8,2 ml HCl (3.7) med vatten till slutvolymen 1 liter.

3.14	Ortofosforsyra, c = 0,5 mol/l: Späd 34 ml ortofosforsyra (3.6) med vatten (3.1) till slutvolymen 1 liter.

3.15	Koncentrerad tryptofanlösning (3.2), c = 2,50 μmol/ml: Lös 0,2553 g tryptofan (3.2) i saltsyra (3.13) i en 500 ml mätkolv och späd till märket med saltsyra (3.13). Lösningen kan lagras vid - 18 oC i högst 4 veckor.

3.16	Koncentrerad lösning av intern standard, c = 2,50 μmol/ml: Lös 0,2728 g α-metyltryptofan (3.3) i saltsyra (3.13) i en 500 ml mätkolv och späd till märket med saltsyra (3.13). Lösningen kan lagras vid - 18 oC i högst 4 veckor.

3.17

Standardkalibreringslösning av tryptofan och intern standard: Tag 2,00 ml koncentrerad tryptofanlösning (3.15) och 2,00 ml koncentrerad lösning av intern standard (α-metyltryptofan) (3.16). Späd med vatten (3.1) och metanol (3.8) till ungefär samma volym och metanolkoncentration (10–30 %) som det färdiga hydrolysatet. Denna lösning ska vara nyberedd. Den ska skyddas från direkt solljus under beredningen.

3.18	Ättiksyra.

3.19	1,1,1-triklor-2-metyl-2-propanol.

3.20	Etanolamin, w > 98 % (w/w).

3.21	Lösning av 1 gram 1,1,1-triklor-2-metyl-2-propanol (3.19) i 100 ml metanol (3.8).

3.22	Mobil fas för HPLC: 3,00 g ättiksyra (3.18) + 900 ml vatten (3.1) + 50,0 ml lösning (3.21) av 1,1,1-triklor-2-metyl-2-propanol (3.19) i metanol (3.8) (1 g/100 ml). Justera pH till 5,00 med etanolamin (3.20). Späd till 1 000 ml med vatten (3.1).

4.   Utrustning

4.1	HPLC-utrustning med en spektrofluorometrisk detektor.

4.2	HPLC-kolonn, 125 × 4 mm, C18, 3 μm packning, eller motsvarande.

4.3

pH-meter.

4.4	Polypropylenflaska, 125 ml, med vid hals och skruvkork.

4.5	Membranfilter, 0,45 μm.

4.6	Autoklav, 110 (± 2) oC, 1,4 (±0,1) bar.

4.7	Mekanisk skakapparat eller magnetomrörare.

4.8	Vortexblandare.

5.   Utförande

5.1   Provberedning

Provet mals så att det kan passera genom en 0,5 mm sikt. Prov med hög vattenhalt ska antingen lufttorkas vid en temperatur på högst 50 oC eller frystorkas före malningen. Prov med hög fetthalt ska extraheras med petroleumeter (3.9) före malning.

5.2   Bestämning av fritt tryptofan (extrakt)

Väg med en noggrannhet av 1 mg upp en lämplig mängd (1–5 g) av det beredda provet (5.1) i en E-kolv. Tillsätt 100,0 ml saltsyra (3.13) och 5,00 ml koncentrerad lösning av intern standard (3.16). Skaka eller blanda i 60 minuter med en mekanisk skakapparat eller magnetomrörare (4.7). Låt sedimentera och pipettera sedan över 10,0 ml av supernatanten till en bägare. Tillsätt 5 ml ortofosforsyra (3.14). Justera pH till 3 med natriumhydroxid (3.10). Tillsätt så mycket metanol (3.8) att koncentrationen blir 10–30 % i slutvolymen. Överför till en mätkolv av lämplig volym och späd med vatten till den volym som behövs för kromatografi (ungefär samma volym som standardkalibreringslösningen [3.17]).

Filtrera några ml av lösningen genom ett 0,45 μm membranfilter (4.5) före injektion i HPLC-kolonnen. Gå vidare till kromatografin enligt 5.4.

Skydda standardlösning och extrakt från direkt solljus. Om extrakten inte kan analyseras samma dag kan de lagras vid 5 oC i högst 3 dagar.

5.3   Bestämning av totalhalt tryptofan (hydrolysat)

Väg med en noggrannhet av 0,2 mg upp 0,1–1 g av det beredda provet (5.1) i en polypropylenflaska (4.4). Det invägda provet ska innehålla ca 10 mg kväve. Tillsätt 8,4 g bariumhydroxidoktahydrat (3.4) och 10 ml vatten. Blanda på en vortexblandare (4.8) eller med magnetomrörare (4.7). Lämna kvar den teflonbelagda magneten i blandningen. Skölj kärlets väggar med 4 ml vatten. Sätt på skruvkorken och skruva åt den löst. Sätt kärlet i en autoklav (4.6) med kokande vatten och låt ånga i 30–60 minuter. Stäng autoklaven och autoklavera vid 110 (± 2) oC i 20 timmar.

Sänk temperaturen till strax under 100 oC innan autoklaven öppnas. Tillsätt 30 ml rumstempererat vatten till den varma blandningen för att undvika kristallisering av Ba(OH)2·8 H2O. Skaka eller rör försiktigt. Tillsätt 2,00 ml koncentrerad lösning av intern standard (α-metyltryptofan) (3.16). Kyl kärlet i isvattenbad i 15 minuter.

Tillsätt 5 ml ortofosforsyra (3.14). Låt kärlet vara kvar i kylbadet och neutralisera lösningen med saltsyra (3.11) under omrörning. Justera pH till 3,0 med saltsyra (3.12). Tillsätt så mycket metanol att koncentrationen blir 10–30 % i slutvolymen. Överför till en mätkolv av lämplig volym och späd med vatten till den volym som behövs för kromatografi (t.ex. 100 ml). Tillsatsen av metanol bör göras utan att någon fällning bildas.

Filtrera några ml av lösningen genom ett 0,45 μm membranfilter (4.5) före injektion i HPLC-kolonnen. Gå vidare till kromatografin enligt 5.4.

Skydda standardlösning och hydrolysat mot direkt solljus. Om hydrolysaten inte kan analyseras samma dag kan de lagras vid 5 oC i högst tre dagar.

5.4   HPLC-bestämning

Följande betingelser för isokratisk eluering anges som vägledning. Andra betingelser kan väljas om de ger likvärdiga resultat (se även 9.1 och 9.2).

HPLC kolonn (4.2):	125 × 4 mm, C18, 3 μm packning eller motsvarande
Kolonntemperatur:	Rumstemperatur
Mobil fas (3.22):	3,00 g ättiksyra (3.18) + 900 ml vatten (3.1) + 50,0 ml lösning (3.21) av 1,1,1-triklor-2-metyl-2-propanol (3.19) i metanol (3.8) (1 g/100 ml). Justera pH till 5,00 med etanolamin (3.20). Späd till 1 000 ml med vatten (3.1)
Flödeshastighet:	1 ml/min
Total körningstid:	ca 34 minuter
Detektionsvåglängd:	excitation: 280 nm, emission: 356 nm.
Injektionsvolym:	20 μl

6.   Beräkning av resultat

Mängden tryptofan (X) i gram per 100 g prov beräknas med formeln

A	=	topparea för intern standard, kalibreringsstandardlösning (3.17)
B	=	topparea för tryptofan, extrakt (5.2) eller hydrolysat (5.3)
V1	=	volym i ml (2 ml) av koncentrerad tryptofanlösning (3.15) som satts till kalibreringslösningen (3.17)
c	=	koncentration i μmol/ml (= 2,50) av koncentrerad tryptofanlösning (3.15) som satts till kalibreringslösningen (3.17)
V2	=	volym i ml av koncentrerad lösning av intern standard (3.16) som satts till vid extraktionen (5.2) (= 5,00 ml) eller till hydrolysatet (5.3) (= 2,00 ml)
C	=	topparea för intern standard, extrakt (5.2) eller hydrolysat (5.3)
D	=	topparea för tryptofan, kalibreringsstandardlösning (3.17)
V3	=	volym i ml (2,00 ml) av koncentrerad lösning av intern standard (3.16) som satts till kalibreringsstandardlösningen (3.17)
m	=	provets vikt i gram (korrigerad till den ursprungliga vikten om provet har torkats och/eller avfettats)
M	=	molvikt för tryptofan (= 204,23 g/mol).

7.   Repeterbarhet

Skillnaden mellan resultaten från två parallella bestämningar som utförs på samma prov får inte överstiga 10 % av det högre värdet.

8.   Resultat av en provningsjämförelse

I en provningsjämförelse inom EU (fjärde jämförelsen) analyserades tre prov av upp till tolv laboratorier för att hydrolysmetoden skulle kunna certifieras. Varje prov analyserades fem gånger. Resultaten redovisas i nedanstående tabell.

	Prov 1 Grisfoder	Prov 2 Grisfoder med tillsats av L-tryptofan	Prov 3 Kraftfoder för grisar
L	12	12	12
n	50	55	50
Medelvärde [g/kg]	2,42	3,40	4,22
sr [g/kg]	0,05	0,05	0,08
r [g/kg]	0,14	0,14	0,22
CVr [ %]	1,9	1,6	1,9
SR [g/kg]	0,15	0,20	0,09
R [g/kg]	0,42	0,56	0,25
CVR [ %]	6,3	6,0	2,2

L	=	antal laboratorier som lämnade in resultat
n	=	antal återstående enskilda resultat efter eliminering av extremvärden (enligt Cochran-Dixons extremvärdestest)
sr	=	standardavvikelse för repeterbarhet
SR	=	standardavvikelse för reproducerbarhet
r	=	repeterbarhet
R	=	reproducerbarhet
CVr	=	variationskoefficient för repeterbarhet, %
CVR	=	variationskoefficient för reproducerbarhet, %

I en annan provningsjämförelse inom EU (tredje jämförelsen) analyserades två prov av upp till tretton laboratorier för certifiering av extraktionsmetoden för fritt tryptofan. Varje prov analyserades fem gånger. Resultaten redovisas i nedanstående tabell.

	Prov 4 Vete- och sojablandning	Prov 5 Vete- och sojablandning (= prov 4) med tillsats av tryptofan (0,457g/kg)
L	12	12
n	55	60
Medelvärde [g/kg]	0,391	0,931
sr [g/kg]	0,005	0,012
r [g/kg]	0,014	0,034
CVr [ %]	1,34	1,34
SR [g/kg]	0,018	0,048
R [g/kg]	0,050	0,134
CVR [ %]	4,71	5,11

L	=	antal laboratorier som lämnade in resultat
n	=	antalet återstående enskilda resultat efter eliminering av extremvärden (enligt Cochran-Dixons extremvärdestest)
sr	=	standardavvikelse för repeterbarhet
SR	=	standardavvikelse för reproducerbarhet
r	=	repeterbarhet
R	=	reproducerbarhet
CVr	=	variationskoefficient för repeterbarhet, %
CVR	=	variationskoefficient för reproducerbarhet, %

I ytterligare en provningsjämförelse inom EU analyserades fyra prov av upp till sju laboratorier för certifiering av metoden för tryptofanhydrolys. Resultaten redovisas i nedanstående tabell. Varje prov analyserades fem gånger.

	Prov 1 Blandat grisfoder (CRM 117)	Prov 2 Fiskmjöl med låg fetthalt (CRM 118)	Prov 3 Sojamjöl (CRM 119)	Prov 4 Skummjölkspulver (CRM 120)
L	7	7	7	7
n	25	30	30	30
Medelvärde [g/kg]	2,064	8,801	6,882	5,236
sr [g/kg]	0,021	0,101	0,089	0,040
r [g/kg]	0,059	0,283	0,249	0,112
CVr [ %]	1,04	1,15	1,30	0,76
SR [g/kg]	0,031	0,413	0,283	0,221
R [g/kg]	0,087	1,156	0,792	0,619
CVR [ %]	1,48	4,69	4,11	4,22

L	=	antal laboratorier som lämnade in resultat
n	=	antalet återstående enskilda resultat efter eliminering av extremvärden (enligt Cochran-Dixons extremvärdestest)
sr	=	standardavvikelse för repeterbarhet
SR	=	standardavvikelse för reproducerbarhet
r	=	repeterbarhet
R	=	reproducerbarhet
CVr	=	variationskoefficient för repeterbarhet, %
CVR	=	variationskoefficient för reproducerbarhet, %

9.   Anmärkningar

9.1

För att få bättre separation mellan tryptofan och α-metyltryptofan kan man prova att använda följande kromatografiska parametrar: Isokratisk eluering följt av gradientkolonnrening: HPLC-kolonn: 125 × 4 mm, C18, 5 μm packning eller motsvarande Kolonntemperatur: 32 oC Mobil fas: A: 0,01 mol/l KH2PO4/metanol, 95+5 (v+v) B: metanol Gradientprogram: 0 min 100 % A 0 % B   15 min 100 % A 0 % B   17 min 60 % A 40 % B   19 min 60 % A 40 % B   21 min 100 % A 0 % B   33 min 100 % A 0 % B Flödeshastighet: 1,2 ml/min Total körningstid: ca 33 min

9.2

Kromatografin varierar beroende på typen av HPLC och vilket slags packning som används i kolonnen. Det valda systemet måste klara av att ge baslinjeseparation mellan tryptofan och intern standard. Det är också viktigt att nedbrytningsprodukter tydligt kan separeras från tryptofan och intern standard. Man bör köra hydrolysat utan intern standard för att kunna upptäcka eventuella orenheter på baslinjen under den interna standarden. Det är viktigt att körningstiden är så lång att alla nedbrytningsprodukter hinner elueras ut, annars kan sena elueringstoppar störa efterföljande körningar. Kromatografisystemet måste ge linjär respons i driftsintervallet. Den linjära responsen ska mätas med en konstant koncentration (den normala) av intern standard och varierande koncentrationer av tryptofan. Det är viktigt att topparna för både tryptofan och intern standard ligger inom det linjära intervallet för HPLC-/fluorescenssystemet. Om topparna för tryptofan och/eller intern standard är för låga eller för höga bör bestämningen göras om med annan provstorlek och/eller slutvolym.

9.3	Bariumhydroxid Bariumhydroxid blir mer svårlösligt när det åldras. Detta ger en grumlig lösning för HPLC-bestämning, vilket kan ge alltför låga värden för tryptofan.

H.   BESTÄMNING AV RÅFETT

1.   Syfte och tillämpningsområde

Med denna metod kan råfetthalten i foder bestämmas. Metoden omfattar inte analys av oljeväxtfrön och oljehaltiga frukter.

Beroende på fodrets egenskaper och sammansättning samt bestämningens syfte används en av nedanstående två metoder.

1.1   Metod A – direkt extraherbart råfett

Denna metod är tillämplig på foderråvaror av vegetabiliskt ursprung, utom dem som omfattas av metod B.

1.2   Metod B – total råfetthalt

Denna metod är tillämplig på foderråvaror av animaliskt ursprung och på alla foderblandningar. Den ska användas för alla råvaror från vilka fett inte kan extraheras helt utan föregående hydrolys, till exempel gluten, jäst, potatisprotein och produkter som genomgår processer såsom extrudering, bearbetning till flingor samt uppvärmning.

1.3   Tolkning av resultaten

I samtliga fall där ett högre resultat fås genom metod B än metod A, ska resultatet av metod B räknas som det sanna värdet.

2.   Princip

2.1   Metod A

Provet extraheras med petroleumeter. Lösningsmedlet destilleras av och återstoden torkas och vägs.

2.2   Metod B

Provet behandlas under uppvärmning med saltsyra. Blandningen kyls och filtreras. Återstoden sköljs och torkas och bestäms enligt metod A.

3.   Reagens

3.1	Petroleumeter, kokpunktsintervall 40–60 oC. Bromtalet måste vara lägre än 1 och återstoden efter förångning mindre än 2 mg/100 ml.

3.2	Vattenfritt natriumsulfat.

3.3	Saltsyra, c = 3 mol/l.

3.4	Filtreringshjälpmedel, till exempel kiselgur, Hyflo-supercel.

4.   Utrustning

4.1	Extraktionsutrustning. Om denna är försedd med hävert (Soxhletapparat), ska förångningstakten vara sådan att ca tio kretslopp sker per timme. Om hävert saknas ska förångningstakten vara ca 10 ml per minut.

4.2	Extraktionshylsorna måste vara fria från ämnen som är lösliga i petroleumeter och ha en porositet som överensstämmer med kraven i 4.1.

4.3	Torkugn, antingen en vakuumtorkugn inställd på 75 ± 3 oC eller en varmluftsugn inställd på 100 ± 3 oC.

5.   Utförande

5.1   Metod A (se punkt 8.1)

Väg 5 gram av provet med en noggrannhet av 1 mg, överför det till en extraktionshylsa (4.2) och täck med en fettfri bomullstuss.

Placera hylsan i en extraktionsapparat (4.1) och extrahera i sex timmar med petroleumeter (3.1). Samla upp petroleumeterextraktet i en torr, vägd kolv med pimpstensskärvor (2).

Destillera av lösningsmedlet. Torka återstoden i 1,5 timmar i torkugnen (4.3). Kyl i en exsickator och väg. Torka igen i 30 minuter för att säkerställa att fettets vikt är konstant (viktförlusten mellan två på varandra följande vägningar får inte överstiga 1 mg).

5.2   Metod B

Väg upp 2,5 gram av provet med en noggrannhet av 1 mg (se punkt 8.2) i en 400 ml bägare eller en 300 ml E-kolv. Tillsätt 100 ml saltsyra (3.3) och pimpstensskärvor. Täck över bägaren med ett urglas eller koppla E-kolven till en återloppskylare. Låt blandningen koka sakta i 1 timme över en svag låga eller värmeplatta. Låt inte produkten fastna på behållarens insida.

Kyl och tillsätt så mycket filtreringshjälpmedel (3.4) att inget fett förloras under filtreringen. Filtrera genom ett fuktat, fettfritt, dubbelt filtrerpapper. Skölj återstoden i kallt vatten tills ett neutralt filtrat erhålls. Kontrollera att filtratet inte innehåller något fett. Om så ändå är fallet ska provet extraheras med petroleumeter, enligt metod A, före hydrolys.

Lägg det dubbla filtrerpappret med återstoden på ett urglas och torka i 1,5 timmar i varmluftsugnen (4.3) vid 100 ± 3 oC.

Placera det dubbla filtrerpappret med den torra återstoden i en extraktionshylsa (4.2) och täck med en fettfri bomullstuss. Placera hylsan i en extraktionsapparat (4.1) och följ anvisningarna i punkt 5.1 andra och tredje styckena.

6.   Resultatangivelse

Återstodens vikt uttrycks i procent av provet.

7.   Repeterbarhet

Skillnaden mellan resultaten av två parallella bestämningar som utförs på samma prov av samma person får inte överstiga

—	0,2 % i absoluta tal för råfetthalter under 5 %,

—	4,0 % av det högre värdet för halter på 5–10 %,

—	0,4 % i absoluta tal för halter över 10 %.

8.   Anmärkningar

8.1

För produkter med hög fetthalt, som är svåra att krossa eller från vilka det är svårt att få fram ett homogent reducerat prov, används följande förfarande. Väg upp 20 gram av provet med en noggrannhet av 1 mg och blanda med minst 10 gram vattenfritt natriumsulfat (3.2). Extrahera med petroleumeter (3.1) enligt punkt 5.1. Späd extraktet med petroleumeter (3.1) till 500 ml och blanda. Överför 50 ml av lösningen till en liten, torr, vägd kolv som innehåller pimpstensskärvor. Destillera bort lösningsmedlet, torka och följ anvisningarna i punkt 5.1 sista stycket. Avlägsna lösningsmedlet från extraktionsåterstoden i hylsan, krossa återstoden till 1 mm partikelstorlek, återför till extraktionshylsan (tillsätt inte natriumsulfat) och följ anvisningarna i punkt 5.1 andra och tredje styckena. Provets fetthalt i procent beräknas med formeln (10m1 + m2) × 5 där: m1 = återstodens vikt i gram efter första extraktionen (den alikvot av extraktet som används för analys) m2 = återstodens vikt i gram efter andra extraktionen.

8.2	För produkter med låg fetthalt kan provmängden ökas till 5 gram.

8.3	Sällskapsdjursfoder med hög vattenhalt kan behöva blandas med vattenfritt natriumsulfat före hydrolys och extraktion enligt metod B.

8.4	I punkt 5.2 kan det vara effektivare att använda varmt vatten i stället för kallt vatten för att tvätta återstoden efter filtrering.

8.5	Torktiden på 1,5 timmar kan behöva förlängas för vissa foder. För lång torktid bör undvikas eftersom detta kan leda till låga resultat. En mikrovågsugn kan också användas.

8.6	Förextraktion enligt metod A före hydrolys och upprepad extraktion enligt metod B rekommenderas om råfetthalten är högre än 15 %. Detta beror delvis på fodrets egenskaper och på typen av fett i fodret.

I.   BESTÄMNING AV VÄXTTRÅD

1.   Syfte och tillämpningsområde

Med denna metod är det möjligt att bestämma foders halt av fettfria organiska ämnen som är olösliga i sur och basisk miljö och som vanligen betecknas växttråd.

2.   Princip

Provet, som vid behov avfettas, behandlas i tur och ordning med kokande lösningar av svavelsyra och kaliumhydroxid i bestämda koncentrationer. Återstoden separeras genom filtrering på ett sintrat glasfilter och sköljs, torkas, vägs och föraskas vid en temperatur på 475–500 oC. Viktförlusten efter föraskning motsvarar andelen växttråd i analysprovet.

3.   Reagens

3.1	Svavelsyra, c = 0,13 mol/l.

3.2	Skumdämpningsmedel (t.ex. n-oktanol).

3.3	Filtreringshjälpmedel (Celite 545 eller motsvarande), upphettat till 500 oC i fyra timmar (8.6).

3.4

Aceton.

3.5	Petroleumeter, kokpunktsintervall 40–60 oC.

3.6	Saltsyra, c = 0,5 mol/l.

3.7	Kaliumhydroxidlösning, c = 0,23 mol/l.

4.   Utrustning

4.1

Värmeenhet för uppslutning med svavelsyra och kaliumhydroxidlösning, försedd med en hållare för filterdegeln (4.2) och ett utloppsrör med kran för avtappning av vätska samt anslutning för vakuum och eventuellt tryckluft. Innan enheten tas i bruk varje dag ska den förvärmas med kokande vatten i 5 minuter.

4.2	Glasfilterdegel med insmält filterskiva av sintrat glas, porstorlek 40–90 μm. Innan degeln används första gången, värm den till 500 oC i några minuter och låt den svalna (8.6).

4.3	Cylinder på minst 270 ml med återloppskylare, lämplig för kokning.

4.4	Torkugn med termostat.

4.5	Muffelugn med termostat.

4.6	Extraktionsenhet bestående av en stödplatta för filterdegeln (4.2) och med ett utloppsrör med kran för utsläpp av vakuum och vätska.

4.7	Kopplingsringar för ihopmontering av värmeenheten (4.1), filterdegeln (4.2) och cylindern (4.3) och för anslutning av extraktionsenheten (4.6) och filterdegeln.

5.   Utförande

Väg med 1 mg noggrannhet upp 1 g av det beredda provet i filterdegeln (4.2), (jfr punkterna 8.1, 8.2 och 8.3) och tillsätt 1 g filtreringshjälpmedel (3.3).

Montera ihop värmeenheten (4.1) och filterdegeln (4.2) och anslut sedan cylindern (4.3) till filterdegeln. Häll 150 ml kokande svavelsyra (3.1) i cylinder/degeluppställningen och tillsätt vid behov några droppar skumdämpningsmedel (3.2).

Koka upp vätskan inom 5 ± 2 minuter och låt koka kraftigt i exakt 30 minuter.

Öppna kranen till utloppsröret (4.1) och vakuumfiltrera svavelsyran genom filterdegeln. Tvätta återstoden tre gånger med 30 ml kokande vatten per gång och se till att återstoden vakuumfiltreras torr efter varje tvättning.

Stäng utloppskranen och häll 150 ml kokande kaliumhydroxidlösning (3.7) i cylinder/degeluppställningen. Tillsätt några droppar skumdämpningsmedel (3.2). Koka upp vätskan inom 5 ± 2 minuter och låt koka kraftigt i exakt 30 minuter. Filtrera och tvätta på samma sätt som vid behandlingen med svavelsyra.

Efter den sista tvättningen och torkningen kopplas degeln med innehåll loss och ansluts till extraktionsenheten (4.6). Anslut vakuum, tvätta återstoden i degeln tre gånger med 25 ml aceton (3.4) per gång och se till att återstoden vakuumfiltreras torr efter varje tvättning.

Torka degeln till konstant vikt i ugnen vid 130 oC. Låt den svalna i exsickator efter varje torkning och väg snabbt. Sätt in degeln i en muffelugn och föraska till konstant vikt (viktförlusten mellan två på varandra följande vägningar får inte överstiga 2 mg) vid 475–500 oC i minst 30 minuter.

Efter varje upphettning ska degeln först svalna i ugnen och sedan i exsickatorn innan den vägs.

Gör ett blankprov utan provet. Viktförlusten till följd av föraskningen får inte överstiga 4 mg.

6.   Beräkning av resultat

Provets växttrådhalt i procent beräknas med formeln

där:

m	=	provets vikt i gram
m0	=	viktförlust efter föraskning vid bestämningen, i gram
m1	=	viktförlust efter föraskning vid blankprovet, i gram.

7.   Repeterbarhet

Skillnaden mellan resultaten från två parallella bestämningar som utförs på samma prov får inte överstiga

—	0,6 % i absoluta tal om växttrådhalten är mindre än 10 %,

—	6 % av det högre värdet om växttrådhalten uppgår till 10 % eller mer.

8.   Anmärkningar

8.1

Foder som innehåller mer än 10 % råfett ska före analys avfettas med petroleumeter (3.5). Anslut filterdegeln (4.2) med innehåll till extraktionsenheten (4.6), anslut vakuum, tvätta återstoden tre gånger med 30 ml petroleumeter och se till att återstoden vakuumfiltreras torr. Anslut degeln med innehåll till värmeenheten (4.1) och fortsätt enligt beskrivningen i punkt 5.

8.2

Foder som innehåller fetter som inte kan extraheras direkt med petroleumeter (3.5) ska avfettas enligt beskrivningen i 8.1 och därefter avfettas ännu en gång efter kokning med syra. Efter kokning med syra och därpå följande tvättning ansluts degeln med innehåll till extraktionsenheten (4.6) och tvättas tre gånger med 30 ml aceton per gång och därefter ytterligare tre gånger med 30 ml petroleumeter per gång. Vakuumfiltrera torrt och fortsätt analysen från och med kaliumhydroxidbehandlingen enligt punkt 5.

8.3

Om fodret innehåller mer än 5 % karbonat, uttryckt som kalciumkarbonat, ansluts degeln (4.2) med det uppvägda provet till värmeenheten (4.1). Tvätta provet tre gånger med 30 ml saltsyra (3.6) per gång. Låt provet stå ca en minut efter varje tillsats innan det filtreras. Tvätta en gång med 30 ml vatten och fortsätt sedan enligt beskrivningen i 5.

8.4	Om den utrustning som används utgörs av ett stativ (flera deglar anslutna till samma värmeenhet) får två enskilda bestämningar av samma analysprov inte ingå i samma provserie.

8.5	Om det efter kokningen är svårt att filtrera de sura och basiska lösningarna blåses tryckluft genom värmeenhetens utloppsrör, varefter filtreringen fullföljes.

8.6	För att förlänga glasfilterdeglarnas livslängd bör temperaturen vid föraskningen inte överstiga 500 oC. Var noga med att undvika alltför hastiga temperaturförändringar vid uppvärmning och avkylning.

J.   BESTÄMNING AV SOCKER

1.   Syfte och tillämpningsområde

Med denna metod är det möjligt att bestämma halten av reducerande socker och totalhalten socker efter invertering, uttryckt som glukos eller, om så är lämpligt, sackaros med omvandlingsfaktorn 0,95. Metoden är tillämplig på foderblandningar. För andra typer av foder finns särskilda metoder. Om så krävs ska laktos bestämmas separat och tas med i resultatberäkningen.

2.   Princip

Sockerarterna extraheras i utspädd etanol. Lösningen klaras med Carrez-lösning I och II. Efter det att etanolen eliminerats bestäms kvantiteterna före och efter invertering med Luff-Schoorl-metoden.

3.   Reagens

3.1	Etanol 40 % (v/v), densitet: 0,948 g/ml vid 20o C, fenolftaleinneutral.

3.2	Carrez-lösning I: lös 21,9 g zinkacetat, Zn(CH3COO)2 2H2O, och 3 g isättika i vatten. Späd med vatten till 100 ml.

3.3	Carrez-lösning II: lös 10,6 g kaliumferrocyanid, K4Fe(CN)6 3H2O, i vatten. Späd med vatten till 100 ml.

3.4	Metylorange, lösning 0,1 % (w/v).

3.5	Saltsyra, 4 mol/l.

3.6	Saltsyra, 0,1 mol/l.

3.7	Natriumhydoxidlösning, 0,1 mol/l.

3.8

Luff-Schoorl-reagens: Häll citronsyralösningen (3.8.2) i natriumkarbonatlösningen (3.8.3) under noggrann omrörning. Tillsätt kopparsulfatlösningen (3.8.1) och späd med vatten till 1 liter. Låt stå över natten och filtrera. Kontrollera koncentrationen hos det erhållna reagenset (Cu 0,05 mol/l, Na2CO3 1 mol/l), se punkt 5.4 sista stycket. Lösningens pH ska vara ca 9,4.

3.8.1

Kopparsulfatlösning: lös 25 g järnfritt kopparsulfat, CuSO4 5H2O, i 100 ml vatten.

3.8.2

Citronsyralösning: lös 50 g citronsyra C6H8O7·H2O i 50 ml vatten.

3.8.3

Natriumkarbonatlösning: lös upp 143,8 g vattenfritt natriumkarbonat i ca 300 ml varmt vatten. Låt svalna.

3.9	Natriumtiosulfatlösning, 0,1 mol/l.

3.10	Stärkelselösning: tillsätt en blandning av 5 g löslig stärkelse i 30 ml vatten till 1 liter kokande vatten. Koka i tre minuter, låt svalna och tillsätt vid behov 10 mg kvicksilverjodid som konserveringsmedel.

3.11	Svavelsyra, 3 mol/l.

3.12	Kaliumjodidlösning, 30 % (w/v).

3.13	Granulerad pimpsten som kokats i saltsyra, sköljts med vatten och torkats.

3.14	3-metylbutan-1-ol.

4.   Utrustning

Rotationsskakapparat: ca 35–40 varv per minut.

5.   Utförande

5.1   Extraktion av provet

Väg med en noggrannhet av 1 mg upp 2,5 g av provet i en 250 ml mätkolv. Tillsätt 200 ml etanol (3.1) och blanda på skakapparaten i 1 timme. Tillsätt 5 ml Carrez-lösning I (3.2) och rör om i ca 30 sekunder. Tillsätt 5 ml Carrez-lösning II (3.3) och rör om i 1 minut. Späd med etanol (3.1) till full volym, homogenisera och filtrera. Ta undan 200 ml av filtratet och låt indunsta till ungefär halv volym så att det mesta av etanolen elimineras. Överför återstoden efter avdunstningen kvantitativt, med varmt vatten, till en 200 ml mätkolv, kyl, späd med vatten till full volym, homogenisera och filtrera vid behov. Denna lösning används för att bestämma halten av reducerande socker och, efter invertering, totalhalten socker.

5.2   Bestämning av reducerande socker

Pipettera av högst 25 ml av lösningen med ett innehåll av mindre än 60 mg reducerande socker uttryckt som glukos. Späd vid behov med destillerat vatten till 25 ml och bestäm halten reducerande socker med Luff-Schoorl-metoden. Resultatet uttrycks som procent glukos i provet.

5.3   Bestämning av totalhalten socker efter invertering

Pipettera över 50 ml av lösningen till en 100 ml mätkolv. Tillsätt några droppar metylorangelösning (3.4) och därefter – försiktigt och under ständig omrörning – saltsyra (3.5) tills vätskan blir tydligt röd. Tillsätt 15 ml saltsyra (3.6), sänk ned kolven i ett kraftigt kokande vattenbad och låt stå i 30 minuter. Kyl hastigt till ca 20 oC och tillsätt 15 ml natriumhydroxidlösning (3.7). Späd med vatten till 100 ml och homogenisera. Avlägsna högst 25 ml av lösningen med ett innehåll av mindre än 60 mg reducerande socker uttryckt som glukos. Späd vid behov med destillerat vatten till 25 ml och bestäm halten reducerande socker med Luff-Schoorl-metoden. Resultatet uttrycks som procent glukos i provet eller, om så är lämpligt, sackaros, genom att multiplicera med faktorn 0,95.

5.4   Titrering med Luff-Schoorl-metoden

Pipettera över 25 ml Luff-Schoorl-reagens (3.8) till en 300 ml E-kolv. Tillsätt exakt 25 ml av den klarade sockerlösningen. Tillsätt två korn pimpsten (3.13), hetta upp under omrörning för hand över medelstor öppen låga och låt vätskan koka i cirka två minuter. Ställ omedelbart E-kolven på ett asbestklätt trådnät med ett hål med ca 6 cm diameter under vilket en låga brinner. Lågan ska justeras så att endast E-kolvens botten hettas upp. Anslut en återloppskylare till E-kolven. Låt koka i exakt 10 minuter. Kyl omedelbart i kallt vatten och titrera efter ca 5 minuter på följande sätt:

Tillsätt 10 ml kaliumjodidlösning (3.12) och omedelbart därefter (försiktigt, på grund av risken för kraftig skumbildning) 25 ml svavelsyra (3.11). Titrera med natriumtiosulfatlösning (3.9) tills en matt gul färg uppträder, tillsätt stärkelseindikatorn (3.10) och slutför titreringen.

Utför samma titrering på en noggrant uppmätt blandning av 25 ml Luff-Schoorl-reagens (3.8) och 25 ml vatten efter tillsats av 10 ml kaliumjodidlösning (3.12) och 25 ml svavelsyra (3.11) utan kokning.

6.   Beräkning av resultat

Fastställ med hjälp av tabellen nedan den glukosmängd i mg som motsvarar skillnaden mellan resultaten av de båda titreringarna, uttryckt i mg 0,1 M natriumtiosulfat. Uttryck resultatet i procent av provet.

7.   Särskilda förfaranden

7.1

För foder som innehåller mycket melass eller som inte är särskilt homogena vägs 20 g upp och överförs med 500 ml vatten till en 1 000 ml mätkolv. Blanda på skakapparaten i en timme. Gör lösningen klar med Carrez-reagens I (3.2) och Carrez-reagens II (3.3) enligt beskrivningen i 5.1 men med fyra gånger större mängd av varje reagens. Späd till full volym med etanol 80 % (v/v). Homogenisera och filtrera. Avlägsna etanolen enligt beskrivningen i 5.1. Om det inte finns någon dextrinerad stärkelse, tillsätts destillerat vatten till full volym.

7.2

För melass och foderråvaror som innehåller mycket socker och som är nästan stärkelsefria (johannesbröd, torkad betsnitsel osv.), vägs 5 g upp i en 250 ml mätkolv, varefter 200 ml destillerat vatten tillsätts och lösningen blandas på skakapparaten i en timme eller mer om så behövs. Gör lösningen klar med Carrez-reagens I (3.2) och Carrez-reagens II (3.3) enligt beskrivningen i 5.1. Späd med kallt vatten till full volym, homogenisera och filtrera. Bestäm totalhalten socker enligt beskrivningen i 5.3.

8.   Anmärkningar

8.1	För att förhindra skumbildning är det lämpligt att (oberoende av volymen) tillsätta ca 1 ml 3-metylbutan-1-ol (3.14) före uppkokning med Luff-Schoorl-reagens.

8.2	Skillnaden mellan totalhalten socker efter invertering, uttryckt som glukos, och halten reducerande socker, uttryckt som glukos, multiplicerad med 0,95 ger sackaroshalten i procent.

8.3	För att bestämma halten reducerande socker med undantag av laktos kan två metoder användas:

8.3.1

För en ungefärlig beräkning multipliceras den laktoshalt som fastställts med en annan analysmetod med 0,675, och det erhållna resultatet dras från halten reducerande socker.

8.3.2

För en exakt beräkning av reducerande socker med undantag av laktos måste samma prov användas för de två slutliga bestämningarna. Den ena analysen utförs på en del av den lösning som erhållits enligt 5.1 och den andra på en del av den lösning som erhållits vid bestämningen av laktos med den metod som fastställts för detta ändamål (efter det att de andra sockerarterna jästs och lösningen klarats). I båda fallen bestäms mängden befintligt socker med Luff-Schoorl-metoden och beräknas i mg glukos. Det ena av värdena dras från det andra och skillnaden uttrycks i procent av provet. Exempel De två valda volymerna motsvarar vid varje bestämning ett prov på 250 mg. I det första fallet förbrukas 17 ml 0,1 M natriumtiosulfatlösning, vilket motsvarar 44,2 mg glukos, och i det andra fallet 11 ml, vilket motsvarar 27,6 mg glukos. Skillnaden är 16,6 mg glukos. Halten reducerande socker (med undantag av laktos) beräknad som glukos är alltså:

Värdetabell för 25 ml Luff-Schoorl-reagens

ml Na2S2O30,1 mol/l, uppvärmning 2 minuter, kokning 10 minuter

Na2S2O3 0,1 mol/l	Glukos, fruktos, invertsocker C6 H12 O6		Laktos C12H22O11		Maltos C12H22O11		Na2S2O3 0,1 mol/l
ml	mg	skillnad	mg	skillnad	mg	skillnad	ml
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23	2,4 4,8 7,2 9,7 12,2 14,7 17,2 19,8 22,4 25,0 27,6 30,3 33,0 35,7 38,5 41,3 44,2 47,1 50,0 53,0 56,0 59,1 62,2	2,4 2,4 2,5 2,5 2,5 2,5 2,6 2,6 2,6 2,6 2,7 2,7 2,7 2,8 2,8 2,9 2,9 2,9 3,0 3,0 3,1 3,1	3,6 7,3 11,0 14,7 18,4 22,1 25,8 29,5 33,2 37,0 40,8 44,6 48,4 52,2 56,0 59,9 63,8 67,7 71,7 75,7 79,8 83,9 88,0	3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,9 3,9 3,9 4,0 4,0 4,1 4,1 4,1	3,9 7,8 11,7 15,6 19,6 23,5 27,5 31,5 35,5 39,5 43,5 47,5 51,6 55,7 59,8 63,9 68,0 72,2 76,5 80,9 85,4 90,0 94,6	3,9 3,9 3,9 4,0 3,9 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,1 4,1 4,1 4,1 4,1 4,2 4,3 4,4 4,5 4,6 4,6	1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

K.   BESTÄMNING AV LAKTOS

1.   Syfte och tillämpningsområde

Med denna metod kan laktoshalten bestämmas i foder som innehåller mer än 0,5 % laktos.

2.   Princip

Sockerarterna löses upp i vatten. Lösningen fermenteras med jästen Saccharomyces cerevisiae som lämnar laktosen opåverkad. Efter klarning och filtrering bestäms laktoshalten i filtratet med Luff-Schoorl-metoden.

3.   Reagens

3.1	Suspension av Saccharomyces cerevisiae: slamma upp 25 g färsk jäst i 100 ml vatten. Suspensionen håller sig högst en vecka i kylskåp.

3.2	Carrez-lösning I: lös 21,9 g zinkacetat, Zn (CH3 COO)2 2H2O, och 3 g isättika i vatten. Späd med vatten till 100 ml.

3.3	Carrez-lösning II: lös 10,6 g kaliumferrocyanid, K4Fe(CN)6 3H2O, i vatten. Späd med vatten till 100 ml.

3.4

Luff-Schoorl-reagens: Häll citronsyralösningen (3.4.2) i natriumkarbonatlösningen (3.4.3) under noggrann omrörning. Tillsätt kopparsulfatlösningen (3.4.1) och späd med vatten till 1 liter. Låt stå över natten och filtrera. Kontrollera koncentrationen hos det erhållna reagenset (Cu 0,05 mol/l, Na2CO3 1 mol/l). Lösningens pH ska vara ca 9,4.

3.4.1

Kopparsulfatlösning: lös 25 g järnfritt kopparsulfat, CuSO4 5H2O, i 100 ml vatten.

3.4.2

Citronsyralösning: lös 50 g citronsyra, C6H8O7 · H2O, i 50 ml vatten.

3.4.3

Natriumkarbonatlösning: lös 143,8 g vattenfritt natriumkarbonat i ca 300 ml varmt vatten. Låt svalna.

3.5	Granulerad pimpsten som kokats i saltsyra, sköljts med vatten och torkats.

3.6	Kaliumjodidlösning, 30 % (w/v).

3.7	Svavelsyra, 3 mol/l.

3.8	Natriumtiosulfatlösning, 0,1 mol/l.

3.9	Stärkelselösning: tillsätt en blandning av 5 g löslig stärkelse i 30 ml vatten till 1 liter kokande vatten. Koka i 3 minuter, låt svalna och tillsätt vid behov 10 mg kvicksilverjodid som konserveringsmedel.

4.   Utrustning

Vattenbad med termostaten inställd på 38–40 oC.

5.   Utförande

Väg med en noggrannhet av 1 mg upp 1 g av provet i en 100 ml mätkolv. Tillsätt 25–30 ml vatten. Låt kolven stå i ett kokande vattenbad i 30 minuter och kyl sedan till ca 35 oC. Tillsätt 5 ml jästsuspension (3.1) och homogenisera. Låt kolven stå i vattenbad i två timmar vid en temperatur av 38–40 oC. Kyl därefter till ca 20 oC.

Tillsätt 2,5 ml Carrez-lösning I (3.2), rör om i 30 sekunder och tillsätt sedan 2,5 ml Carrez-lösning II (3.3) och rör om i ytterligare 30 sekunder. Späd med vatten till 100 ml, blanda och filtrera. Pipettera upp högst 25 ml av filtratet som bör innehålla 40–80 mg laktos och överför detta till en 300 ml E-kolv. Späd vid behov med vatten till 25 ml.

Utför ett blankprov på samma sätt med 5 ml jästsuspension (3.1). Fastställ laktoshalten enligt Luff-Schoorl på följande sätt: tillsätt exakt 25 ml Luff-Schoorl-reagens (3.4) och två korn pimpsten (3.5). Rör om för hand medan innehållet hettas upp över medelstor öppen låga och låt vätskan koka i ca 2 minuter. Ställ omedelbart E-kolven på ett asbestklätt trådnät med ett hål med ca 6 cm diameter under vilket en låga brinner. Lågan ska justeras så att endast E-kolvens botten hettas upp. Anslut en återloppskylare till E-kolven. Låt koka i exakt 10 minuter. Kyl omedelbart i kallt vatten och titrera efter ca 5 minuter på följande sätt:

Tillsätt 10 ml kaliumjodidlösning (3.6) och omedelbart därefter (försiktigt, på grund av risken för kraftig skumbildning) 25 ml svavelsyra (3.7). Titrera med natriumtiosulfatlösning (3.8) tills en matt gul färg uppträder, tillsätt stärkelseindikatorn (3.9) och slutför titreringen.

Utför samma titrering på en noggrant uppmätt blandning av 25 ml Luff-Schoorl-reagens (3.4) och 25 ml vatten efter tillsats av 10 ml kaliumjodidlösning (3.6) och 25 ml svavelsyra (3.7) utan kokning.

6.   Beräkning av resultat

Fastställ med hjälp av tabellen nedan den laktosmängd i mg som motsvarar skillnaden mellan resultaten av de båda titreringarna, uttryckt i ml 0,1 M natriumtiosulfat.

Uttryck resultatet som halten vattenfri laktos i procent av provet.

7.   Anmärkning

För produkter som innehåller mer än 40 % jäsbart socker används mer än 5 ml jästsuspension (3.1).

Värdetabell för 25 ml Luff-Schoorl-reagens

ml Na2S2O30,1 mol/l, uppvärmning 2 minuter, kokning 10 minuter

Na2S2O3 0,1 mol/l	Glukos, fruktos, invertsocker C6H12O6		Laktos C12H22O11		Maltos C12H22O11		Na2S2O3 0,1 mol/l
ml	mg	skillnad	mg	skillnad	mg	skillnad	ml
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23	2,4 4,8 7,2 9,7 12,2 14,7 17,2 19,8 22,4 25,0 27,6 30,3 33,0 35,7 38,5 41,3 44,2 47,1 50,0 53,0 56,0 59,1 62,2	2,4 2,4 2,5 2,5 2,5 2,5 2,6 2,6 2,6 2,6 2,7 2,7 2,7 2,8 2,8 2,9 2,9 2,9 3,0 3,0 3,1 3,1	3,6 7,3 11,0 14,7 18,4 22,1 25,8 29,5 33,2 37,0 40,8 44,6 48,4 52,2 56,0 59,9 63,8 67,7 71,7 75,7 79,8 83,9 88,0	3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,9 3,9 3,9 4,0 4,0 4,1 4,1 4,1	3,9 7,8 11,7 15,6 19,6 23,5 27,5 31,5 35,5 39,5 43,5 47,5 51,6 55,7 59,8 63,9 68,0 72,2 76,5 80,9 85,4 90,0 94,6	3,9 3,9 3,9 4,0 3,9 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,1 4,1 4,1 4,1 4,1 4,2 4,3 4,4 4,5 4,6 4,6	1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

L.   BESTÄMNING AV STÄRKELSE

POLARIMETRISK METOD

1.   Syfte och tillämpningsområde

Med denna metod är det möjligt att bestämma halten av stärkelse och nedbrytningsprodukter av stärkelse med hög molekylvikt i foder, i syfte att kontrollera att det deklarerade energivärdet är korrekt (bestämmelser i bilaga VII) och att rådets direktiv 96/25/EG (3) efterlevs.

2.   Princip

Metoden omfattar två bestämningar. I den första behandlas provet med utspädd saltsyra. Efter klarning och filtrering mäts lösningens optiska rotation polarimetriskt.

I den andra extraheras provet med 40 % etanol. Efter att filtratet surgjorts med saltsyra, klarats och filtrerats mäts den optiska rotationen på samma sätt som vid den första bestämningen.

Genom att multiplicera skillnaden mellan de båda mätningarna med en känd faktor erhålls provets stärkelsehalt.

3.   Reagens

3.1	Saltsyra, lösning 25 % (w/w), densitet: 1,126 g/ml.

3.2	Saltsyra, lösning 1,13 % (w/v). Koncentrationen måste kontrolleras genom titrering med 0,1 M natriumhydroxidlösning i närvaro av 0,1 % (w/v) metylrött i 94 % (v/v) etanol. För att neutralisera 10 ml krävs 30,94 ml 0,1 M NaOH.

3.3	Carrez-lösning I: lös 21,9 g zinkacetat, Zn(CH3COO)2 2H2O, och 3 g isättika i vatten. Späd med vatten till 100 ml.

3.4	Carrez-lösning II: lös 10,6 g kaliumferrocyanid, K4Fe(CN)6 3H2O, i vatten. Späd med vatten till 100 ml.

3.5	Etanol 40 % (v/v), densitet: 0,948 g/ml vid 20 oC.

4.   Utrustning

4.1	250 ml E-kolv med standardfog av slipat glas och återloppskylare.

4.2	Polarimeter eller sackarimeter.

5.   Utförande

5.1   Provberedning

Krossa provet tills det är tillräckligt finfördelat för att helt kunna passera genom en sikt med 0,5 mm runda maskor.

5.2   Bestämning av den totala optiska rotationen (P eller S) (se anmärkning 7.1)

Väg med en noggrannhet av 1 mg upp 2,5 g av det krossade provet i en 100 ml mätkolv. Tillsätt 25 ml saltsyra (3.2), skaka om så att provet fördelas jämnt och tillsätt ytterligare 25 ml saltsyra (3.2). Sänk ned kolven i ett kokande vattenbad under kraftig och jämn omskakning under de tre första minuterna för att förhindra agglomeratbildning. Vattenbadet måste innehålla så mycket vatten att det fortsätter att koka då kolven sänks ned i det. Kolven får inte tas upp ur vattenbadet vid omskakningen. Ta upp kolven ur vattenbadet efter exakt 15 minuter, tillsätt 30 ml kallt vatten och kyl omedelbart till 20 oC.

Tillsätt 5 ml Carrez-lösning I (3.3) och skaka i ca 30 sekunder. Tillsätt sedan 5 ml Carrez-lösning II (3.4) och skaka i ytterligare ca 30 sekunder. Späd med vatten till full volym, blanda och filtrera. Om filtratet inte är fullständigt klart (vilket är sällsynt) upprepas bestämningen med en större kvantitet Carrez-lösning I och II, till exempel 10 ml.

Lösningens optiska rotation mäts i ett 200 mm rör med polarimeter eller sackarimeter.

5.3   Bestämning av den optiska rotationen (P' eller S') hos ämnen som är lösliga i 40 % etanol

Väg med en noggrannhet av 1 mg upp 5 g av provet i en 100 ml mätkolv och tillsätt ca 80 ml etanol (3.5) (se anmärkning 7.2). Låt kolven stå i en timme i rumstemperatur och skaka under denna tid om kraftigt vid sex tillfällen så att provet blandas väl med etanolen. Späd med etanol (3.5) till full volym, blanda och filtrera.

Pipettera över 50 ml av filtratet (motsvarar 2,5 g av provet) till en 250 ml E-kolv, tillsätt 2,1 ml saltsyra (3.1) och skaka kraftigt. Anslut en återloppskylare till E-kolven och sänk därefter ned E-kolven i ett kokande vattenbad. Ta efter exakt 15 minuter upp E-kolven ur vattenbadet, överför innehållet till en 100 ml mätkolv (skölj med lite kallt vatten) och kyl till 20 oC.

Klara provet med Carrez-lösning I (3.3) och II (3.4), späd med vatten till full volym, blanda, filtrera och mät den optiska rotationen på det sätt som anges i 5.2 andra och tredje styckena.

6.   Beräkning av resultat

Stärkelsehalten ( %) beräknas på följande sätt:

6.1   Mätning med polarimeter

P	=	total optisk rotation i vinkelgrader
P'	=	optisk rotation i vinkelgrader för ämnen som är lösliga i 40 % (v/v) etanol
	=	specifik optisk rotation för ren stärkelse. De konventionella numeriska värdena för denna faktor är + 185,9o: risstärkelse + 185,7o: potatisstärkelse + 184,6o: majsstärkelse + 182,7o: vetestärkelse + 181,5o: kornstärkelse + 181,3o: havrestärkelse + 184,0o: andra typer av stärkelse och stärkelseblandningar i foderblandningar

6.2   Mätning med sackarimeter

S	=	total optisk rotation i sackarimetergrader
S'	=	optisk rotation i sackarimetergrader för ämnen som är lösliga i 40 % (v/v) etanol
N	=	vikt (g) av sackaros i 100 ml vatten som ger en optisk rotation på 100 sackarimetergrader vid mätning med ett 200 mm rör 16,29 g för franska sackarimetrar 26,00 g för tyska sackarimetrar 20,00 g för sackarimetrar av blandtyp  = specifik optisk rotation för ren stärkelse (se 6.1)

6.3   Repeterbarhet

Skillnaden mellan resultaten av två parallella bestämningar som utförs på samma prov får inte överstiga 0,4 i absoluta tal om stärkelsehalten är under 40 %, och 1 % i relativt värde om stärkelsehalten är 40 % eller högre.

7.   Anmärkningar

7.1	Om provet innehåller mer än 6 % karbonater, beräknat som kalciumkarbonat, måste dessa avlägsnas genom behandling med en väl avvägd mängd utspädd svavelsyra, innan den totala optiska rotationen bestäms.

7.2

För produkter med hög laktoshalt, som mjölkserum i pulverform och skummjölkspulver, används följande förfarande efter tillsats av 80 ml etanol (3.5): Anslut en återloppskylare till kolven och sänk därefter ned kolven i ett vattenbad vid 50 oC i 30 minuter. Låt svalna och fortsätt analysen enligt anvisningarna i 5.3.

7.3

Följande foderråvaror kan, om de förekommer i betydande mängder i fodret, störa bestämningen av stärkelsehalt med polarimeter och kan därigenom ge upphov till felaktiga resultat: — (Socker)betsprodukter som (socker)betmassa, (socker)betmelass, melasserad (socker)betmassa, (socker)betvinass, (bet)socker. — Citruspulpa. — Linfrön, linfröexpeller, extraherade linfrön. — Rapsfrö, rapsfröexpeller, extraherade rapsfrön, rapsfröskal. — Solrosfrön, extraherade solrosfrön, delvis skalade extraherade solrosfrön. — Kopraexpeller, extraherad kopra. — Potatispulpa. — Vattenfri jäst. — Inulinrika produkter (t.ex. snitsel och mjöl av jordärtskockor). — Fettgrevar.

M.   BESTÄMNING AV RÅASKA

1.   Syfte och tillämpningsområde

Med denna metod kan halten råaska i foder bestämmas.

2.   Princip

Provet föraskas vid 550 oC. Återstoden vägs.

3.   Reagens

Ammoniumnitrat, lösning 20 % (w/v).

4.   Utrustning

4.1	Värmeplatta.

4.2	Elektrisk muffelugn med termostat.

4.3	Deglar av kvarts, porslin eller platina; antingen rektangulära (ca 60 × 40 × 25 mm) eller cirkelformade (diameter: 60–75 mm, höjd: 20–40 mm).

5.   Utförande

Väg med en noggrannhet av 1 mg upp ca 5 g av provet (2,5 g för produkter som har benägenhet att svälla) i en degel som först har upphettats till 550 oC, svalnat och tarerats. Ställ degeln på värmeplattan och upphetta sakta tills provet förkolnar. Föraska enligt 5.1 eller 5.2.

5.1	Sätt in degeln i den kalibrerade muffelugnen inställd på 550 oC. Håll provet vid denna temperatur tills en vit, ljusgrå eller rödaktig aska bildas som förefaller fri från kolhaltiga partiklar. Ställ degeln i en exsickator, låt svalna och väg omedelbart.

5.2

Sätt in degeln i den kalibrerade muffelugnen inställd på 550 oC. Föraska i 3 timmar. Ställ degeln i en exsickator, låt svalna och väg omedelbart. Föraska på nytt i 30 minuter för att säkerställa att askans vikt är konstant (viktförlusten mellan två på varandra följande vägningar får inte överstiga 1 mg).

6.   Beräkning av resultat

Beräkna återstodens vikt med taran fråndragen.

Resultatet uttrycks i procent av provet.

7.   Anmärkningar

7.1

Askan av ämnen som är svåra att föraska måste först genomgå en förberedande föraskning i minst 3 timmar, kylas och sedan tillsättas några droppar 20 % ammoniumnitratlösning eller vatten (försiktigt så att inte askan sprids eller klumpar bildas). Fortsätt kalcineringen efter torkning i ugn. Upprepa förfarandet så många gånger som behövs tills föraskningen är fullständig.

7.2

För ämnen som är motståndskraftiga mot den behandling som beskrivs i 7.1 förfars på följande sätt: efter föraskning i tre timmar läggs askan i varmt vatten och filtreras genom ett litet askfritt filter. Föraska filtret och dess innehåll i den ursprungliga degeln. Överför filtratet till den avsvalnade degeln, låt indunsta tills det är torrt, föraska och väg.

7.3	För oljor och fetter: väg noggrant upp ett prov på 25 g i en degel av lämplig storlek. Förkola provet genom att antända den med en remsa askfritt filtrerpapper. Fukta efter förbränning med minsta möjliga mängd vatten. Torka och föraska enligt beskrivningen i punkt 5.

N.   BESTÄMNING AV ASKA SOM ÄR OLÖSLIG I SALTSYRA

1.   Syfte och tillämpningsområde

Med denna metod kan halten i foder av mineralämnen som är olösliga i saltsyra bestämmas. Två metoder kan användas beroende på typen av prov.

1.1	Metod A: tillämplig på organiska foderråvaror och på de flesta foderblandningar.

1.2	Metod B: tillämplig på mineralfoder och mineralfoderblandningar och på foderblandningar vilkas halt av ämnen som är olösliga i saltsyra överstiger 1 % enligt bestämning med metod A.

2.   Princip

2.1	Metod A: provet föraskas, askan kokas i saltsyra och den olösliga återstoden filtreras och vägs.

2.2	Metod B: provet behandlas med saltsyra. Lösningen filtreras varpå återstoden föraskas och den aska som erhålls behandlas enligt metod A.

3.   Reagens

3.1	Saltsyra, 3 mol/l.

3.2	Triklorättiksyra, lösning 20 % (w/v).

3.3	Triklorättiksyra, lösning 1 % (w/v).

4.   Utrustning

4.1	Värmeplatta.

4.2	Elektrisk muffelugn med termostat.

4.3	Deglar av kvarts, porslin eller platina, rektangulära (ca 60 × 40 × 25 mm) eller cirkelformade (diameter: 60–75 mm, höjd: 20–40 mm).

5.   Utförande

5.1   Metod A:

Föraska provet med samma metod som för bestämning av råaska. Aska som erhållits vid den analysen kan också användas.

Överför askan till en 250–400 ml bägare med 75 ml saltsyra (3.1). Koka upp långsamt och låt koka försiktigt i 15 minuter. Filtrera den varma lösningen genom ett askfritt filtrerpapper och skölj återstoden med varmt vatten tills ingen syrareaktion längre är märkbar. Torka filtret med återstoden och föraska i en tarerad degel vid lägst 550 oC och högst 700 oC. Kyl i exsickator och väg.

5.2   Metod B:

Väg med en noggrannhet av 1 mg upp 5 g av provet i en 250–400 ml bägare. Tillsätt 25 ml vatten och därefter 25 ml saltsyra (3.1), blanda och vänta tills gasutvecklingen upphör. Tillsätt ytterligare 50 ml saltsyra (3.1). Vänta tills gasutvecklingen upphör och ställ sedan bägaren i ett kokande vattenbad i 30 minuter eller längre så att eventuell stärkelse hydrolyseras fullständigt. Filtrera den fortfarande varma lösningen genom ett askfritt filter och tvätta filtret i 50 ml varmt vatten (jfr punkt 7). Lägg filtret med återstod i en degel, torka och föraska vid en temperatur av lägst 550 oC och högst 700 oC. Överför askan till en 250–400 ml bägare med 75 ml saltsyra (3.1). Fortsätt enligt beskrivningen i punkt 5.1 andra stycket.

6.   Beräkning av resultat

Beräkna återstodens vikt med taran fråndragen. Resultatet uttrycks i procent av provet.

7.   Anmärkning

Om filtreringen visar sig svår att genomföra ska analysen påbörjas på nytt, varvid de 50 ml saltsyra (3.1) ersätts med 50 ml 20 % triklorättiksyra (3.2) och filtret sköljs med en varm lösning av 1 % triklorättiksyra (3.3).

O.   BESTÄMNING AV KARBONATER

1.   Syfte och tillämpningsområde

Med denna metod kan mängden karbonater, konventionellt uttryckt som kalciumkarbonat, bestämmas i de flesta fodertyper.

I vissa fall (t.ex. för järnkarbonat) måste dock en särskild metod användas.

2.   Princip

Karbonaterna löses upp i saltsyra. Den koldioxid som frigörs samlas upp i ett mätglas, och dess volym jämförs med den som under samma förhållanden frigörs av en känd mängd kalciumkarbonat.

3.   Reagens

3.1	Saltsyra, densitet 1,10 g/ml.

3.2	Kalciumkarbonat.

3.3	Svavelsyra, ca 0,05 mol/l, färgad med metylrött.

4.   Utrustning

Scheibler-Dietrichapparat (se figur) eller motsvarande.

5.   Utförande

Väg upp en provmängd som beroende på dess karbonathalt ska vara

—	0,5 g för produkter som innehåller 50–100 % karbonater, uttryckt som kalciumkarbonat,

—	1 g för produkter som innehåller 40–50 % karbonater, uttryckt som kalciumkarbonat,

—	2–3 g för övriga produkter.

Placera provet i apparatens specialkolv (4), som är utrustad med ett litet rör av okrossbart material som innehåller 10 ml saltsyra (3.1) och anslut kolven till apparaten. Vrid trevägskranen (5) så att röret (1) öppnas. Ställ in vätskenivån på nollmarkeringen med hjälp av det flyttbara röret (2) som är fyllt med färgad svavelsyra (3.3) och anslutet till mätglaset (1). Vrid kranen (5) så att rören (1) och (3) förbinds och kontrollera att nivån är noll.

Luta kolven (4) så att saltsyran (3.1) sprids långsamt över provet. Jämna ut trycket genom att sänka röret (2). Skaka kolven (4) tills ingen koldioxid längre frigörs.

Återställ trycket genom att justera tillbaka vätskenivån till den ursprungliga i rören (1) och (2). Avläs efter några minuter när gasvolymen har blivit konstant.

Utför ett kontrolltest under samma förhållanden med 0,5 g kalciumkarbonat (3.2).

6.   Beräkning av resultat

Karbonathalten, uttryckt som kalciumkarbonat, beräknas med formeln

där:

X	=	% (w/w) karbonater, uttryckt som kalciumkarbonat, i provet
V	=	ml CO2 som frigörs av provet
V1	=	ml CO2 som frigörs av 0,5 g CaCO3
m	=	provets vikt i gram.

7.   Anmärkningar

7.1	Om provet väger mer än 2 g ska först 15 ml destillerat vatten tillsättas i kolven (4) och blandas med provet innan försöket påbörjas. Använd samma volym vatten vid kontrolltestet.

7.2	Om den apparat som används har andra dimensioner än Scheibler-Dietrichapparaten måste man göra motsvarande ändringar av det använda provets och kontrollsubstansens mängd samt vid resultatberäkningen.

P.   BESTÄMNING AV TOTALFOSFOR

FOTOMETRISK METOD

1.   Syfte och tillämpningsområde

Med denna metod kan totalfosforhalten bestämmas i foder. Metoden är särskilt lämplig för analys av produkter med låg fosforhalt. I vissa fall (fosforrika produkter) kan en gravimetrisk metod användas.

2.   Princip

Provet mineraliseras antingen genom torrföraskning (organiska foder) eller genom uppslutning med syra (mineralfoderblandningar och flytande foder) och läggs i en syralösning. Lösningen behandlas med molybdovanadatreagens. Absorbansen hos den gula lösning som då bildas mäts i spektrofotometer vid 430 nm.

3.   Reagens

3.1	Kalciumkarbonat.

3.2	Saltsyra, ρ20 = 1,10 g/ml (ca 6 mol/l).

3.3	Salpetersyra, ρ20 = 1,045 g/ml.

3.4	Salpetersyra, ρ20 = 1,38–1,42 g/ml.

3.5	Svavelsyra, ρ20 = 1,84 g/ml.

3.6	Molybdovanadatreagens: blanda 200 ml ammoniumheptamolybdatlösning (3.6.1), 200 ml ammoniumvanadatlösning (3.6.2) och 134 ml salpetersyra (3.4) i en 1 000 ml mätkolv. Späd med vatten till full volym.

3.6.1

Ammoniumheptamolybdatlösning: lös 100 g ammoniumheptamolybdat (NH4) 6Mo7O24·4H2O, i varmt vatten. Tillsätt 10 ml ammoniak (densitet 0,91 g/ml) och späd med vatten till 1 liter.

3.6.2

Ammoniumvanadatlösning: lös 2,35 g ammoniumvanadat NH4VO3 i 400 ml varmt vatten. Tillsätt långsamt under ständig omrörning 20 ml utspädd salpetersyra (7 ml HNO3 [3.4] + 13 ml vatten) och späd med vatten till 1 liter.

3.7	Standardfosforlösning, 1 mg/ml: lös 4,387 g kaliumdivätefosfat KH2PO4 i vatten. Späd med vatten till 1 liter.

4.   Utrustning

4.1	Deglar av kvarts, porslin eller platina.

4.2	Elektrisk muffelugn med termostaten inställd på 550 oC.

4.3	250 ml Kjeldahlkolv.

4.4	Mätkolvar och precisionspipetter.

4.5	Spektrofotometer.

4.6	Provrör, ca 16 mm i diameter, med proppar, 14,5 mm i diameter, volym 25–30 ml.

5.   Utförande

5.1   Beredning av lösningen

Lösningen bereds enligt 5.1.1 eller 5.1.2 beroende på typ av prov.

5.1.1   Vanlig metod

Väg upp 1 g eller mer av provet med en noggrannhet av 1 mg. Placera provet i en Kjeldahlkolv, tillsätt 20 ml svavelsyra (3.5), skaka om så att materialet helt impregneras med syra och så att den inte fastnar på kolvens väggar, upphetta och låt koka i 10 minuter. Låt svalna något, tillsätt 2 ml salpetersyra (3.4), upphetta försiktigt, låt svalna något, tillsätt lite mer salpetersyra (3.4) och upphetta åter till kokpunkten. Upprepa detta förfarande tills en färglös lösning erhålls. Kyl, tillsätt lite vatten, häll över vätskan i en 500 ml mätkolv och skölj ur Kjeldahlkolven med varmt vatten. Låt svalna, späd med vatten till full volym, homogenisera och filtrera.

5.1.2   Prov som innehåller organiska ämnen och som är fria från kalcium- och magnesiumdivätefosfat

Väg med en noggrannhet av 1 mg upp ca 2,5 g av provet i en degel. Blanda provet fullständigt med 1 g kalciumkarbonat (3.1). Föraska i ugnen vid 550 oC tills en vit eller grå aska erhålls (visst inslag av träkol har ingen betydelse). Överför askan till en 250 ml bägare. Tillsätt 20 ml vatten och saltsyra (3.2) tills skumningen upphör. Tillsätt ytterligare 10 ml saltsyra (3.2). Ställ bägaren i sandbad och indunsta fullständigt så att kiseldioxiden blir olöslig. Lös åter upp återstoden i 10 ml salpetersyra (3.3) och koka på sandbadet eller på en värmeplatta i 5 minuter utan fullständig indunstning. Häll över vätskan i en 500 ml mätkolv och skölj ur bägaren flera gånger med varmt vatten. Låt svalna, späd med vatten till full volym, homogenisera och filtrera.

5.2   Färgutveckling och mätning av absorbans

Späd ut en alikvot av det filtrat som erhållits enligt 5.1.1 eller 5.1.2 så att en fosforhalt av högst 40 μg/ml erhålls. Överför 10 ml av denna lösning till ett provrör (4.6) och tillsätt 10 ml molybdovanadatreagens (3.6). Homogenisera och låt stå i minst 10 minuter vid 20 oC. Mät absorbansen i spektrofotometer vid 430 nm mot en lösning av 10 ml molybdovanadatreagens (3.6) i 10 ml vatten.

5.3   Kalibreringskurva

Av standardlösningen (3.7) bereds lösningar som innehåller 5, 10, 20, 30 och 40 μg fosfor per ml. Ta 10 ml av var och en av dessa lösningar och tillsätt 10 ml molybdovanadatreagens (3.6). Homogenisera och låt stå i minst 10 minuter vid 20 oC. Mät absorbansen på det sätt som anges i 5.2. Konstruera kalibreringskurvan genom att avsätta absorbansvärdena mot motsvarande kvantiteter fosfor. Vid koncentrationer mellan 0 och 40 μg/ml är kurvan linjär.

6.   Beräkning av resultat

Bestäm mängden fosfor i provet med hjälp av kalibreringskurvan.

Resultatet uttrycks i procent av provet.

Repeterbarhet

Skillnaden mellan resultaten från två parallella bestämningar som utförs på samma prov får inte överstiga

—	3 % av det högre värdet för fosforhalter under 5 %,

—	0,15 % i absoluta tal för fosforhalter på 5 % eller mer.

Q.   BESTÄMNING AV KLOR I KLORIDER

1.   Syfte och tillämpningsområde

Med denna metod kan mängden klor i vattenlösliga klorider, konventionellt uttryckt som natriumklorid, bestämmas. Metoden är tillämplig på alla foder.

2.   Princip

Kloriderna löses upp i vatten. Om produkten innehåller organiskt material ska den klaras. Lösningen surgörs något med salpetersyra och kloriderna fälls ut som silverklorid genom tillsats av silvernitratlösning. Överskottet av silvernitrat titreras med ammoniumtiocyanatlösning enligt Volhardmetoden.

3.   Reagens

3.1	Ammoniumtiocyanatlösning 0,1 mol/l.

3.2	Silvernitratlösning 0,1 mol/l.

3.3	Mättad lösning av ammoniumjärnsulfat (NH4)Fe(SO4)2.

3.4	Salpetersyra, densitet 1,38 g/ml.

3.5	Dietyleter.

3.6

Aceton.

3.7	Carrez-lösning I: lös 21,9 g zinkacetat, Zn(CH3COO)2·2H2O, och 3 g isättika i vatten. Späd med vatten till 100 ml.

3.8	Carrez-lösning II: lös 10,6 g kaliumferrocyanid, K4Fe(CN)6·3H2O, i vatten. Späd med vatten till 100 ml.

3.9	Aktivt kol, fritt från klorider och inte kloridabsorberande.

4.   Utrustning

Rotationsskakapparat: ca 35–40 varv per minut.

5.   Utförande

5.1   Beredning av lösningen

Beroende på typ av prov bereds en lösning enligt 5.1.1, 5.1.2 eller 5.1.3.

Utför samtidigt ett blankprov utan det prov som ska analyseras.

5.1.1   Prov som är fria från organiskt material

Väg med en noggrannhet av 1 mg upp ett prov på högst 10 g som innehåller högst 3 g klor i kloridform. Överför provet och 400 ml vatten till en 500 ml mätkolv vid ca 20 oC. Blanda på skakapparaten i 30 minuter, späd till full volym, homogenisera och filtrera.

5.1.2   Prov som innehåller organiskt material med undantag av produkterna i 5.1.3

Väg med en noggrannhet av 1 mg upp ca 5 g av provet tillsammans med 1 g aktivt kol i en 500 ml mätkolv. Tillsätt 400 ml vatten (ca 20 oC) och 5 ml Carrez-lösning I (3.7), rör om i 30 sekunder och tillsätt därefter 5 ml Carrez-lösning II (3.8). Blanda på skakapparaten i 30 minuter, späd till full volym, homogenisera och filtrera.

5.1.3   Kokt foder, linfrökakor och linfrömjöl, produkter med hög halt linfrömjöl och andra produkter med hög halt mucilago eller kolloider (till exempel dextrinerad stärkelse)

Bered lösningen enligt beskrivningen i 5.1.2 men filtrera inte. Dekantera (centrifugera vid behov) och överför 100 ml av supernatanten till en 200 ml mätkolv. Blanda med aceton (3.6) och späd med detta lösningsmedel till full volym, homogenisera och filtrera.

5.2   Titrering

Pipettera över 25–100 ml (beroende på den förmodade klorhalten) av det filtrat som erhållits enligt 5.1.1, 5.1.2 eller 5.1.3 till en E-kolv. Analysprovet får inte innehålla mer än 150 mg klor (Cl). Späd vid behov med vatten till minst 50 ml, tillsätt 5 ml salpetersyra (3.4), 20 ml mättad ammoniumjärnsulfatlösning (3.3) och två droppar ammoniumtiocyanatlösning (3.1) som tillförs med hjälp av en byrett som är fylld till nollmarkeringen. Tillför silvernitratlösningen (3.2) med en byrett så att ett överskott på 5 ml erhålls. Tillsätt 5 ml dietyleter (3.5) och skaka kraftigt så att fällningen koagulerar. Titrera överskottet av silvernitrat med ammoniumtiocyanatlösningen (3.1) tills den rödbruna färgen har bestått i 1 minut.

6.   Beräkning av resultat

Mängden klor (X) uttryckt som procent natriumklorid beräknas med formeln

där:

V1	=	ml tillsatt silvernitratlösning 0,1 mol/l
V2	=	ml ammoniumtiocyanatlösning 0,1 mol/l som använts vid titreringen
m	=	provets vikt.

Om blankprovet visar att silvernitratlösning, 0,1 mol/l, har förbrukats ska detta värde dras från volymen (V1 – V2).

7.   Anmärkningar

7.1.	Titreringen kan även utföras potentiometriskt.

7.2.	Produkter med mycket hög fetthalt ska först avfettas med dietyleter eller petroleumeter.

7.3.	Vid analys av fiskmjöl kan titreringen utföras med Mohrs metod.

---

(1)  För torkning av spannmål, mjöl och gröpe måste ugnen ha så hög effekt att den vid en inställning på 131 oC åter uppnår denna temperatur på mindre än 45 minuter efter det att det maximala antalet prov har placerats i den för att torka samtidigt. Ventilationen måste vara så god att resultatet, efter två timmars torkning av så många prov av vanligt vete som ugnen rymmer, skiljer sig från resultatet efter fyra timmars torkning med mindre än 0,15 %.

(2)  Om fettet senare ska genomgå kvalitetstester, ersätts pimpstensskärvorna med glaspärlor.

(3)  EGT L 125, 23.5.1996, s. 35.

BILAGA IV

ANALYSMETODER FÖR KONTROLL AV HALTEN GODKÄNDA FODERTILLSATSER

A.   BESTÄMNING AV VITAMIN A

1.   Syfte och tillämpningsområde

Med denna metod kan halten av vitamin A (retinol) i foder och förblandningar bestämmas. Med vitamin A avses all-trans-retinylalkohol och dess cis-isomerer som bestäms med denna metod. Halten av vitamin A uttrycks som internationella enheter (IE) per kg, där 1 IE motsvarar aktiviteten hos 0,300 μg all-trans-vitamin A-alkohol eller 0,344 μg all-trans-vitamin A-acetat eller 0,550 μg all-trans-vitamin A-palmitat.

Kvantifieringsgränsen för vitamin A är 2 000 IE/kg.

2.   Princip

Provet hydrolyseras med kaliumhydroxid som lösts i etanol, och vitamin A extraheras sedan över till petroleumeter. Lösningsmedlet får därefter avdunsta, och återstoden av provet löses i metanol och späds vid behov till lämplig koncentration. Halten av vitamin A bestäms genom omvänd fas-kromatografi (RP-HPLC) med UV- eller fluorescensdetektor. De kromatografiska parametrarna väljs så att all-trans-vitamin A-alkohol inte separeras från sina cis-isomerer.

3.   Reagens

3.1	Etanol, σ = 96 %

3.2	Petroleumeter, kokpunktsintervall 40–60 oC

3.3

Metanol

3.4	Kaliumhydroxidlösning, c = 50 g/100 ml

3.5	Natriumaskorbatlösning, c = 10 g/100 ml (jfr punkt 7.7)

3.6	Natriumsulfid, Na2S· x H20, där x = 7–9

3.6.1

Natriumsulfidlösning, c = 0,5 mol/l i glycerol, ß = 120 g/l för x = 9 (jfr punkt 7.8)

3.7	Fenolftalein som lösts i etanol, c = 2 g/100 ml (3.1)

3.8	2-propanol

3.9	Mobil fas för HPLC: blandning av metanol (3,3) och vatten, t.ex. 980 + 20 (v + v). Det exakta förhållandet mellan volymerna anpassas efter kolonnens egenskaper.

3.10	Kvävgas, syrefri

3.11	All-trans-vitamin A-acetat, av extra hög renhetsgrad, med certifierad aktivitet, t.ex. 2,80 × 106 IE/g

3.11.1

Stamlösning av all-trans-vitamin A-acetat: Väg med en noggrannhet av 0,1 mg upp 50 mg vitamin A-acetat (3.11) i en 100 ml mätkolv. Lös i 2-propanol (3.8) och späd till märket med samma lösningsmedel. Den nominella halten av vitamin A i lösningen är 1 400 IE/ml. Den exakta halten ska bestämmas enligt 5.6.3.1.

3.12	All-trans-vitamin A-palmitat, av extra hög renhetsgrad, med certifierad aktivitet, t.ex. 1,80 × 106 IE/g

3.12.1

Stamlösning av all-trans-vitamin A-palmitat: Väg med en noggrannhet av 0,1 mg upp 80 mg vitamin A-palmitat (3.12) i en 100 ml mätkolv. Lös i 2-propanol (3.8) och späd till märket med samma lösningsmedel. Den nominella halten av vitamin A i lösningen är 1 400 IE/ml. Den exakta halten ska bestämmas enligt 5.6.3.2.

3.13	2,6-di-tert-butyl-4-metylfenol (BHT) (jfr punkt 7.5)

4.   Utrustning

4.1	Rotationsindunstare

4.2	Bruna glaskärl

4.2.1

Sättkolvar eller E-kolvar, 500 ml, med slipad hals

4.2.2

Smalhalsade mätkolvar, 10, 25, 100 och 500 ml, med slipade proppar

4.2.3

Koniska separertrattar, 1 000 ml, med slipade proppar

4.2.4

Rundkolvar, 250 ml, med slipad hals

4.3	Allihn-kylare, mantellängd 300 mm, med fog av slipat glas och adapter för gasinledningsrör

4.4	Veckat filtrerpapper för fasseparation, diameter 185 mm (t.ex. Schleicher & Schuell 597 HY 1/2)

4.5	HPLC-utrustning med injektionssystem

4.5.1

HPLC-kolonn, 250 × 4 mm, C18, 5 eller 10 μm packning eller motsvarande (prestandakriterium: en enda topp för alla isomerer av retinol vid normala HPLC-förhållanden)

4.5.2

UV- eller fluorescensdetektor, med variabel våglängd

4.6	Spektrofotometer med 10 mm kvartsceller

4.7	Vattenbad med magnetomrörare

4.8	Extraktionsapparat (se figur 1) bestående av:

4.8.1

Glascylinder, 1 liter, med slipad hals och propp.

4.8.2

Adapter av slipat glas med en sidoarm och ett justerbart rör genom mitten. Det justerbara röret bör ha U-formad nederdel och en pip i övre änden så att det övre vätskeskiktet i cylindern kan överföras till en separertratt.

5.   Utförande

Anmärkning:

Vitamin A är känsligt för (UV-)ljus och oxidation. Alla arbetsmoment bör därför utföras i skydd från ljus (bruna glaskärl eller glaskärl insvepta i aluminiumfolie) och från syre (spola med kvävgas). Vid extraktionen ersätts luften ovanför vätskan med kvävgas (undvik övertryck genom att lätta på proppen då och då).

5.1   Provberedning

Mal provet så att det kan passera genom en 1 mm sikt, men undvik friktionsvärme. För att undvika förlust av vitamin A måste malningen göras omedelbart innan provet vägs och förtvålas.

5.2   Förtvålning

Väg med en noggrannhet av 1 mg upp 2–25 g av provet, beroende på halten av vitamin A, i en 500 ml sättkolv eller E-kolv (4.2.1). Tillsätt – i tur och ordning, och samtidigt som flaskan eller kolven roteras – 130 ml etanol (3.1), ca 100 mg BHT (3.13), 2 ml natriumaskorbatlösning (3.5) och 2 ml natriumsulfidlösning (3.6). Flaskan eller kolven kopplas till en kylare (4.3) och ställs därefter i ett vattenbad med magnetomrörare (4.7). Värm till kokpunkten och låt återloppskoka i 5 minuter. Tillsätt 25 ml kaliumhydroxidlösning (3.4) genom kylaren (4.3) och låt återloppskoka i ytterligare 25 minuter under omrörning och i ett långsamt flöde av kvävgas. Skölj sedan kylaren med ca 20 ml vatten och kyl innehållet i flaskan eller kolven till rumstemperatur.

5.3   Extraktion

Överför genom dekantering den förtvålade lösningen kvantitativt till en 1 000 ml separertratt (4.2.3) eller till en extraktionsapparat (4.8) genom att skölja med sammanlagt 250 ml vatten. Skölj ur förtvålningskärlet först med 25 ml etanol (3.1) och sedan med 100 ml petroleumeter (3.2) och överför sköljvätskan till separertratten eller extraktionsapparaten. Förhållandet mellan vatten och etanol i de sammanslagna lösningarna bör vara omkring 2:1. Skaka kraftigt i 2 minuter och låt sedan stå i 2 minuter.

5.3.1   Extraktion med separertratt (4.2.3)

När skikten har separerat (jfr punkt 7.3) överförs skiktet med petroleumeter till en annan separertratt (4.2.3). Upprepa extraktionen två gånger med 100 ml petroleumeter (3.2) och två gånger med 50 ml petroleumeter (3.2).

Tvätta de sammanslagna extrakten i separertratten två gånger genom att tillsätta portioner på 100 ml vatten och sedan försiktigt rotera tratten (för att undvika att emulsioner bildas). Skaka sedan tratten upprepade gånger med portioner på 100 ml vatten, tills vattnet inte längre färgas vid tillsats av fenolftaleinlösning (3.7) (fyra tvättningar brukar räcka). Avlägsna vatten i suspension genom att filtrera det tvättade extraktet genom ett torrt veckat filtrerpapper för fasseparation (4.4) till en 500 ml mätkolv (4.2.2). Skölj ur separertratten och filtret med 50 ml petroleumeter (3.2), späd till märket med petroleumeter (3.2) och blanda omsorgsfullt.

5.3.2   Extraktion med extraktionsapparat (4.8)

När skikten har separerat (jfr punkt 7.3) ersätts glascylinderns (4.8.1) propp med adaptern av slipat glas (4.8.2). Den U-formade nederdelen av det justerbara röret ska mynna precis ovanför gränsytan mellan skikten. Överför det övre skiktet av petroleumeter till en 1 000 ml separertratt (4.2.3) genom att föra in kvävgas via sidoröret. Tillsätt 100 ml petroleumeter (3.2) till glascylindern, sätt i proppen och skaka kraftigt. Låt skikten separera och överför det övre skiktet till separertratten som ovan. Upprepa extraktionen med ytterligare 100 ml petroleumeter (3.2) och sedan två gånger med 50 ml-portioner av petroleumeter (3.2). Överför petroleumeterskikten till separertratten.

Tvätta de sammanslagna extrakten av petroleumeter enligt 5.3.1 och gå vidare enligt instruktionen i den punkten.

5.4   Beredning av provlösning för HPLC

Pipettera över en alikvot av petroleumeterlösningen (från 5.3.1 eller 5.3.2) till en 250 ml rundkolv (4.2.4). Låt lösningsmedlet avdunsta nästan fullständigt i en rotationsindunstare (4.1) med reducerat tryck och en temperatur på vattenbadet som inte överstiger 40 oC. Återställ atmosfärstryck genom att släppa in kvävgas (3.10) och ta sedan bort kolven från rotationsindunstaren. Avlägsna återstående lösningsmedel med en kvävgasström (3.10) och lös omedelbart upp återstoden av provet i en känd volym (10–100 ml) metanol (3.3). (Halten av vitamin A bör ligga i intervallet 5–30 IE/ml.)

5.5   Bestämning med HPLC

Vitamin A separeras i en kolonn för omvänd fas-kromatografi, C18, (4.5.1) och halten bestäms med en UV-detektor (325 nm) eller fluorescensdetektor (excitation: 325 nm, emission: 475 nm) (4.5.2).

Injicera en alikvot (t.ex. 20 μl) av den metanollösning som erhölls i 5.4 och eluera med den mobila fasen (3.9). Beräkna den genomsnittliga topphöjden (arean) för flera injektioner av samma provlösning och de genomsnittliga topphöjderna (areorna) för flera injektioner av kalibreringslösningarna (5.6.2).

HPLC-betingelser

Följande betingelser anges som vägledning. Andra betingelser kan väljas om de ger likvärdiga resultat.

HPLC-kolonn (4.5.1):	250 × 4 mm, C18, 5 eller 10 μm packning, eller motsvarande
Mobil fas (3.9):	Blandning av metanol (3.3) och vatten, t.ex. 980 + 20 (v + v).
Flödeshastighet:	1–2 ml/min
Detektor (4.5.2):	UV-detektor (325 nm) eller fluorescensdetektor (excitation: 325 nm, emission: 475 nm)

5.6   Kalibrering

5.6.1   Beredning av arbetslösningar

Pipettera över 20 ml stamlösning av vitamin A-acetat (3.11.1) eller 20 ml stamlösning av vitamin A-palmitat (3.12.1) till en 500 ml sättkolv eller E-kolv (4.2.1) och hydrolysera enligt 5.2 men utan tillsats av BHT. Extrahera sedan med petroleumeter (3.2) enligt 5.3 och späd till 500 ml med petroleumeter (3.2). Låt 100 ml av extraktet indunsta i en rotationsindunstare (jfr punkt 5.4) tills provet är nästan torrt. Avlägsna resterande lösningsmedel i en kvävgasström (3.10) och lös provet på nytt i 10,0 ml metanol (3.3). Den nominella halten av vitamin A i lösningen är 560 IE/ml. Den exakta halten ska bestämmas enligt 5.6.3.3. Arbetslösningen ska vara nyberedd.

Pipettera över 2,0 ml av arbetslösningen till en 20 ml mätkolv, späd till märket med metanol (3.3) och blanda. Den nominella halten av vitamin A i denna utspädda arbetslösning är 56 IE/ml.

5.6.2   Beredning av kalibreringslösningar och konstruktion av kalibreringskurva

För över 1,0, 2,0, 5,0 och 10,0 ml av den utspädda arbetslösningen till ett antal 20 ml mätkolvar, späd till märket med metanol (3.3) och blanda. Den nominella halten av vitamin A i dessa lösningar är 2,8 – 5,6 – 14,0 respektive 28,0 IE/ml.

Injicera upprepade gånger 20 μl av varje kalibreringslösning och bestäm de genomsnittliga topphöjderna (areorna). Använd de genomsnittliga topphöjderna (areorna) för att konstruera en kalibreringskurva med beaktande av resultatet av UV-kontrollen (5.6.3.3).

5.6.3   UV-standardisering av standardlösningar

5.6.3.1    Stamlösning av vitamin A-acetat

Pipettera över 2,0 ml stamlösning av vitamin A-acetat (3.11.1) till en 50 ml mätkolv (4.2.2) och späd till märket med 2-propanol (3.8). Den nominella halten av vitamin A i denna lösning är 56 IE/ml. Pipettera över 3,0 ml av den utspädda vitamin A-acetatlösningen till en 25 ml mätkolv och späd till märket med 2-propanol (3.8). Den nominella halten av vitamin A i denna lösning är 6,72 IE/ml. Mät UV-spektrumet för lösningen mot 2-propanol (3.8) i en spektrofotometer (4.6) mellan 300 och 400 nm. Extinktionsmaximum ska ligga mellan 325 och 327 nm.

Beräkning av halten av vitamin A:

Halten vitamin A (IE/ml) = E326 × 19,0

( för vitamin A-acetat = 1 530 vid 326 nm i 2-propanol)

5.6.3.2    Stamlösning av vitamin A-palmitat

Pipettera över 2,0 ml stamlösning av vitamin A-palmitat (3.12.1) till en 50 ml mätkolv (4.2.2) och späd till märket med 2-propanol (3.8). Den nominella halten av vitamin A i denna lösning är 56 IE/ml. Pipettera över 3,0 ml av den utspädda vitamin A-palmitatlösningen till en 25 ml mätkolv och späd till märket med 2-propanol (3.8). Den nominella halten av vitamin A i denna lösning är 6,72 IE/ml. Mät UV-spektrumet för lösningen mot 2-propanol (3.8) i en spektrofotometer (4.6) mellan 300 och 400 nm. Extinktionsmaximum ska ligga mellan 325 och 327 nm.

Beräkning av halten av vitamin A:

Halten vitamin A (IE/ml) = E326 × 19,0

( för vitamin A-palmitat = 957 vid 326 nm i 2-propanol)

5.6.3.3    Arbetslösning av vitamin A

Pipettera över 3,0 ml av den outspädda arbetslösning av vitamin A som beretts enligt 5.6.1 till en 50 ml mätkolv (4.2.2) och späd till märket med 2-propanol (3.8). Pipettera över 5,0 ml av denna lösning till en 25 ml mätkolv och späd till märket med 2-propanol (3.8). Den nominella halten av vitamin A i denna lösning är 6,72 IE/ml. Mät UV-spektrumet för lösningen mot 2-propanol (3.8) i en spektrofotometer (4.6) mellan 300 och 400 nm. Extinktionsmaximum ska ligga mellan 325 och 327 nm.

Beräkning av halten av vitamin A:

Halten vitamin A (IE/ml) = E325 × 18,3

( för vitamin A-alkohol = 1821 vid 325 nm i 2-propanol)

6.   Beräkning av resultat

Använd den genomsnittliga topphöjden (arean) för provlösningens vitamin A-toppar för att bestämma halten i IE/ml med hjälp av kalibreringskurvan (5.6.2).

Halten av vitamin A (IE/kg) i provet beräknas med formeln

[UI/kg]

där:

c	=	halten av vitamin A i provlösningen (5.4) i IE/ml
V1	=	provlösningens volym (5.4) i ml
V2	=	volym för den uttagna alikvoten (5.4) i ml
m	=	provets vikt i gram.

7.   Anmärkningar

7.1	För prov med låg halt av vitamin A kan det vara lämpligt att slå ihop petroleumeterextrakten från två förtvålningsomgångar (uppvägd mängd: 25 g) till en enda provlösning för bestämning med HPLC.

7.2	Det prov som ska bestämmas bör inte innehålla mer än 2 g fett.

7.3	Om ingen fasseparation äger rum tillsätts ca 10 ml etanol (3.1) för att få emulsionen att skikta sig.

7.4	För torskleverolja och andra rena fetter bör förtvålningstiden förlängas till 45–60 minuter.

7.5	I stället för BHT kan man använda hydrokinon.

7.6	Retinol-isomerer kan separeras med en kolonn för normal-fas-kromatografi. Topphöjderna (areorna) för alla cis- och trans-isomerer måste då läggas ihop vid beräkningen.

7.7	I stället för natriumaskorbatlösning kan man använda ca 150 mg askorbinsyra.

7.8	I stället för natriumsulfidlösning kan man använda ca 50 mg EDTA.

7.9

Vid bestämning av vitamin A i mjölkersättning måste följande beaktas: — Vid förtvålning (5.2): Det kan vara nödvändigt att öka mängden kaliumhydroxidlösning (3.4) på grund av mängden fett i provet. — Vid extraktion (5.3): Det kan vara nödvändigt att anpassa volymförhållandet mellan vatten och etanol (2:1) till följd av emulsioner. Gör ett utbytesförsök på ett separat prov för att kontrollera att bestämningsmetoden ger tillförlitliga resultat för just denna matris (mjölkersättning). Om utbytet är lägre än 80 % måste resultatet av bestämningen korrigeras för detta.

8.   Repeterbarhet

Skillnaden mellan resultaten från två parallella bestämningar som utförs på samma prov får inte överstiga 15 % av det högre värdet.

9.   Resultat av en provningsjämförelse  (1)

	Förblandning	Förblandat foder	Mineralkoncentrat	Proteinfoder	Smågrisfoder
L	13	12	13	12	13
N	48	45	47	46	49
Medelvärde [IE/kg]	17,02 × 106	1,21 × 106	537 100	151 800	18 070
sr [IE/kg]	0,51 × 106	0,039 × 106	22 080	12 280	682
r [IE/kg]	1,43 × 106	0,109 × 106	61 824	34 384	1 910
CVr [ %]	3,0	3,5	4,1	8,1	3,8
sR [IE/kg]	1,36 × 106	0,069 × 106	46 300	23 060	3 614
R [IE/kg]	3,81 × 106	0,193 × 106	129 640	64 568	10 119
CVR [ %]	8,0	6,2	8,6	15	20

L:	:	antal laboratorier
n	:	antal enskilda värden
sr	:	standardavvikelse för repeterbarhet
sR	:	standardavvikelse för reproducerbarhet
r	:	repeterbarhet
R	:	reproducerbarhet
CVr	:	variationskoefficient för repeterbarhet
CVR	:	variationskoefficient för reproducerbarhet

B.   BESTÄMNING AV VITAMIN E

1.   Syfte och tillämpningsområde

Med denna metod kan halten av vitamin E i foder och förblandningar bestämmas. Halten av vitamin E uttrycks som mg DL-alfa-tokoferolacetat/kg. 1 mg DL-alfa-tokoferolacetat motsvarar 0,91 mg DL-alfa-tokoferol (vitamin E).

Kvantifieringsgränsen för vitamin E är 2 mg/kg. Denna gräns kan bara uppnås med fluorescensdetektor. Med UV-detektor ligger kvantifieringsgränsen på 10 mg/kg.

2.   Princip

Provet hydrolyseras med kaliumhydroxid som lösts i etanol, och vitamin E extraheras över till petroleumeter. Lösningsmedlet får därefter avdunsta, och återstoden av provet löses i metanol och späds vid behov till lämplig koncentration. Halten av vitamin E bestäms genom omvänd fas-kromatografi (RP-HPLC) med fluorescens- eller UV-detektor.

3.   Reagens

3.1	Etanol, σ = 96 %

3.2	Petroleumeter, kokpunktsintervall 40–60 oC

3.3

Metanol

3.4	Kaliumhydroxidlösning, c = 50 g/100 ml

3.5	Natriumaskorbatlösning, c = 10 g/100 ml (jfr punkt 7.7)

3.6	Natriumsulfid, Na2S· x H20, där x = 7–9

3.6.1

Natriumsulfidlösning, c = 0,5 mol/l i glycerol, β = 120 g/l för x = 9 (jfr punkt 7.8)

3.7	Fenolftalein som lösts i etanol, c = 2 g/100 ml (3.1)

3.8	Mobil fas för HPLC: blandning av metanol (3.3) och vatten, t.ex. 980 + 20 (v + v). Det exakta förhållandet mellan volymerna anpassas efter kolonnens egenskaper.

3.9	Kvävgas, syrefri

3.10	DL-alfa-tokoferolacetat, av extra hög renhetsgrad, med certifierad aktivitet

3.10.1

Stamlösning av DL-alfa-tokoferolacetat: Väg med en noggrannhet av 0,1 mg upp 100 mg DL-alfa-tokoferolacetat (3.10) i en 100 ml mätkolv. Lös i etanol (3.1) och späd till märket med samma lösningsmedel. 1 ml av denna lösning innehåller 1 mg DL-alfa-tokoferolacetat. (För UV-kontroll, se 5.6.1.3; för stabilisering, se 7.4.)

3.11	DL-alfa-tokoferol, av extra hög renhetsgrad, med certifierad aktivitet

3.11.1

Stamlösning av DL-alfa-tokoferol: Väg med en noggrannhet av 0,1 mg upp 100 mg DL-alfa-tokoferol (3.11) i en 100 ml mätkolv. Lös i etanol (3.1) och späd till märket med samma lösningsmedel. 1 ml av denna lösning innehåller 1 mg DL-alfa-tokoferol. (För UV-kontroll, se 5.6.2.3; för stabilisering, se 7.4.)

3.12	2,6-di-tert-butyl-4-metylfenol (BHT) (jfr punkt 7.5)

4.   Utrustning

4.1	Rotationsindunstare

4.2	Bruna glaskärl

4.2.1

Sättkolvar eller E-kolvar, 500 ml, med slipad hals.

4.2.2

Smalhalsade mätkolvar, 10, 25, 100 och 500 ml, med slipade proppar.

4.2.3

Koniska separertrattar, 1 000 ml, med slipade proppar.

4.2.4

Rundkolvar, 250 ml, med slipad hals.

4.3	Allihn-kylare, mantellängd 300 mm, med fog av slipat glas och adapter för gasinledningsrör

4.4	Veckat filtrerpapper för fasseparation, diameter 185 mm (t.ex. Schleicher & Schuell 597 HY 1/2)

4.5	HPLC-utrustning med injektionssystem

4.5.1

HPLC-kolonn, 250 × 4 mm, C18, 5 eller 10 μm packning eller motsvarande.

4.5.2

Fluorescens- eller UV-detektor, med variabel våglängd.

4.6	Spektrofotometer med 10 mm kvartsceller

4.7	Vattenbad med magnetomrörare

4.8	Extraktionsapparat (se figur 1) bestående av:

4.8.1

Glascylinder, 1 liter, med slipad hals och propp.

4.8.2

Adapter av slipat glas med en sidoarm och ett justerbart rör genom mitten. Det justerbara röret bör ha U-formad nederdel och en pip i övre änden så att det övre vätskeskiktet i cylindern kan överföras till en separertratt.

5.   Utförande

Anmärkning:

Vitamin E är känsligt för (UV-)ljus och oxidation. Alla arbetsmoment bör därför utföras i skydd från ljus (bruna glaskärl eller glaskärl insvepta i aluminiumfolie) och från syre (spola med kvävgas). Vid extraktionen ersätts luften ovanför vätskan med kvävgas (undvik övertryck genom att lätta på proppen då och då).

5.1   Provberedning

Mal provet så att det kan passera genom en 1 mm sikt, men undvik friktionsvärme. För att undvika förlust av vitamin E måste malningen göras omedelbart innan provet vägs och förtvålas.

5.2   Förtvålning

Väg med en noggrannhet av 0,01 g upp 2–25 g av provet, beroende på halten av vitamin E, i en 500 ml sättkolv eller E-kolv (4.2.1). Tillsätt – i tur och ordning, och samtidigt som flaskan eller kolven roteras – 130 ml etanol (3.1), ca 100 mg BHT (3.12), 2 ml natriumaskorbatlösning (3.5) och 2 ml natriumsulfidlösning (3.6). Flaskan eller kolven kopplas till en kylare (4.3) och ställs därefter i ett vattenbad med magnetomrörare (4.7). Värm till kokpunkten och låt återloppskoka i 5 minuter. Tillsätt därefter 25 ml kaliumhydroxidlösning (3.4) genom kylaren (4.3) och låt återloppskoka i ytterligare 25 minuter under omrörning och ett långsamt flöde av kvävgas. Skölj sedan kylaren med ca 20 ml vatten och kyl innehållet i flaskan eller kolven till rumstemperatur.

5.3   Extraktion

Överför genom dekantering den förtvålade lösningen kvantitativt till en 1 000 ml separertratt (4.2.3) eller till en extraktionsapparat (4.8) genom att skölja med sammanlagt 250 ml vatten. Skölj ur förtvålningskärlet först med 25 ml etanol (3.1) och sedan med 100 ml petroleumeter (3.2) och överför sköljvätskan till separertratten eller extraktionsapparaten. Förhållandet mellan vatten och etanol i de sammanslagna lösningarna bör vara omkring 2:1. Skaka kraftigt i 2 minuter och låt sedan stå i 2 minuter.

5.3.1   Extraktion med separertratt (4.2.3)

När skikten har separerat (se punkt 7.3) överförs skiktet med petroleumeter till en annan separertratt (4.2.3). Upprepa extraktionen två gånger med 100 ml petroleumeter (3.2) och två gånger med 50 ml petroleumeter (3.2).

Tvätta de sammanslagna extrakten i separertratten två gånger genom att tillsätta portioner på 100 ml vatten och sedan försiktigt rotera tratten (för att undvika att emulsioner bildas). Skaka sedan tratten upprepade gånger med portioner på 100 ml vatten, tills vattnet inte längre färgas vid tillsats av fenolftaleinlösning (3.7) (fyra tvättningar brukar räcka). Avlägsna vatten i suspension genom att filtrera det tvättade extraktet genom ett torrt veckat filtrerpapper för fasseparation (4.4) till en 500 ml mätkolv (4.2.2). Skölj ur separertratten och filtret med 50 ml petroleumeter (3.2), späd till märket med petroleumeter (3.2) och blanda omsorgsfullt.

5.3.2   Extraktion med extraktionsapparat (4.8)

När skikten har separerat (jfr punkt 7.3) ersätts glascylinderns (4.8.1) propp med adaptern av slipat glas (4.8.2). Den U-formade nederdelen av det justerbara röret ska mynna precis ovanför gränsytan mellan skikten. Överför det övre skiktet av petroleumeter till en 1 000 ml separertratt (4.2.3) genom att föra in kvävgas via sidoröret. Tillsätt 100 ml petroleumeter (3.2) till glascylindern, sätt i proppen och skaka kraftigt. Låt skikten separera och överför det övre skiktet till separertratten som ovan. Upprepa extraktionen med ytterligare 100 ml petroleumeter (3.2) och sedan två gånger med 50 ml-portioner av petroleumeter (3.2). Överför petroleumeterskikten till separertratten.

Tvätta de sammanslagna extrakten av petroleumeter enligt 5.3.1 och gå vidare enligt instruktionen i den punkten.

5.4   Beredning av provlösning för HPLC

Pipettera över en alikvot av petroleumeterlösningen (från 5.3.1 eller 5.3.2) till en 250 ml rundkolv (4.2.4). Låt lösningsmedlet avdunsta nästan fullständigt i en rotationsindunstare (4.1) med reducerat tryck och en temperatur på vattenbadet som inte överstiger 40 oC. Återställ atmosfärstryck genom att släppa in kvävgas (3.9) och ta sedan bort kolven från rotationsindunstaren. Avlägsna återstående lösningsmedel med en kvävgasström (3.9) och lös omedelbart upp återstoden av provet i en känd volym (10–100 ml) metanol (3.3). (Halten av DL-alfa-tokoferol bör ligga i intervallet 5–30 μg/ml.)

5.5   Bestämning med HPLC

Vitamin E separeras i en kolonn för omvänd fas-kromatografi, C18, (4.5.1) och halten bestäms med fluorescensdetektor (excitation: 295 nm, emission: 330 nm) eller UV-detektor (292 nm) (4.5.2).

Injicera en alikvot (t.ex. 20 μl) av den metanollösning som erhölls i 5.4 och eluera med den mobila fasen (3.8). Beräkna de genomsnittliga topphöjderna (areorna) för flera injektioner av samma provlösning och de genomsnittliga topphöjderna (areorna) för flera injektioner av kalibreringslösningarna (5.6.2).

HPLC-betingelser

Följande betingelser anges som vägledning. Andra betingelser kan väljas om de ger likvärdiga resultat.

HPLC-kolonn (4.5.1):	250 × 4 mm, C18, 5 eller 10 μm packning, eller motsvarande
Mobil fas (3.8):	Blandning av metanol (3.3) och vatten, t.ex. 980 + 20 (v + v)
Flödeshastighet:	1–2 ml/min
Detektor (4.5.2)	Fluorescensdetektor (excitation: 295 nm, emission: 330 nm) eller UV-detektor (292 nm)

5.6   Kalibrering (DL-alfa-tokoferolacetat eller DL-alfa-tokoferol)

5.6.1   Standardlösning av DL-alfa-tokoferolacetat

5.6.1.1    Beredning av arbetslösning

Pipettera över 25 ml stamlösning av DL-alfa-tokoferolacetat (3.10.1) till en 500 ml sättkolv eller E-kolv (4.2.1) och hydrolysera enligt 5.2. Extrahera sedan med petroleumeter (3.2) enligt 5.3 och späd till 500 ml med petroleumeter. Låt 25 ml av extraktet indunsta i en rotationsindunstare (jfr punkt 5.4) tills provet är nästan torrt. Avlägsna resterande lösningsmedel i en kvävgasström (3.9) och lös provet på nytt i 25,0 ml metanol (3.3). Den nominella halten av DL-alfa-tokoferol i lösningen är 45,5 μg/ml, vilket motsvarar 50 μg DL-alfa-tokoferolacetat/ml. Arbetslösningen ska vara nyberedd.

5.6.1.2    Beredning av kalibreringslösningar och konstruktion av kalibreringskurva

Överför 1,0–2,0–4,0 och 10,0 ml av arbetslösningen till ett antal 20 ml mätkolvar. Späd till märket med metanol (3.3) och blanda. De nominella halterna av DL-alfa-tokoferolacetat i dessa lösningar är 2,5–5,0–10,0 och 25,0 μg/ml, vilket motsvarar 2,28–4,55–9,10 respektive 22,8 μg DL-alfa-tokoferol/ml.

Injicera upprepade gånger 20 μl av varje kalibreringslösning och bestäm de genomsnittliga topphöjderna (areorna). Använd de genomsnittliga topphöjderna (areorna) för att konstruera en kalibreringskurva.

5.6.1.3    UV-standardisering av stamlösningen av DL-alfa-tokoferolacetat (3.10.1)

Späd 5,0 ml stamlösning av DL-alfa-tokoferolacetat (3.10.1) till 25,0 ml med etanol och mät UV-spektrumet för denna lösning mot etanol (3.1) i en spektrofotometer (4.6) mellan 250 och 320 nm.

Absorptionsmaximum bör ligga vid 284 nm:

= 43,6 vid 284 nm i etanol 1 cm

Vid denna spädning bör extinktionskoefficienten ligga mellan 0,84 och 0,88.

5.6.2   Standardlösning av DL-alfa-tokoferol

5.6.2.1    Beredning av arbetslösning

Pipettera över 2 ml stamlösning av DL-alfa-tokoferol (3.11.1) till en 50 ml mätkolv. Lös tokoferolet i metanol (3.3) och späd till märket med samma lösningsmedel. Den nominella halten av DL-alfa-tokoferol i lösningen är 40 μg/ml, vilket motsvarar 44,0 μg DL-alfa-tokoferolacetat/ml. Arbetslösningen ska vara nyberedd.

5.6.2.2    Beredning av kalibreringslösningar och konstruktion av kalibreringskurva

Överför 1,0–2,0–4,0 och 10,0 ml av arbetslösningen till ett antal 20 ml mätkolvar. Späd till märket med metanol (3.3) och blanda. De nominella halterna av DL-alfa-tokoferol i dessa lösningar är 2,0–4,0–8,0 och 20,0 μg/ml, vilket motsvarar 2,20–4,40–8,79 respektive 22,0 μg DL-alfa-tokoferolacetat/ml.

Injicera upprepade gånger 20 μl av varje kalibreringslösning och bestäm de genomsnittliga topphöjderna (areorna). Använd de genomsnittliga topphöjderna (areorna) för att konstruera en kalibreringskurva.

5.6.2.3    UV-standardisering av stamlösningen av DL-alfa-tokoferol (3.11.1)

Späd 2,0 ml stamlösning av DL-alfa-tokoferol (3.11.1) till 25,0 ml med etanol och mät UV-spektrumet för denna lösning mot etanol (3.1) i en spektrofotometer (4.6) mellan 250 och 320 nm. Absorptionsmaximum bör ligga vid 292 nm:

= 75,8 vid 292 nm i etanol 1 cm

Vid denna spädning bör extinktionskoefficienten ligga på 0,6.

6.   Beräkning av resultat

Använd den genomsnittliga topphöjden (arean) för provlösningens vitamin E-toppar för att bestämma halten i μg/ml (beräknat som alfa-tokoferolacetat) med hjälp av kalibreringskurvan (5.6.1.2 eller 5.6.2.2).

Halten av vitamin E, w (mg/kg) i provet beräknas med formeln

[mg/kg]

där:

c	=	halten av vitamin E (uttryckt som alfa-tokoferolacetat) i provlösningen (5.4) i μg/ml
V1	=	provlösningens volym (5.4) i ml
V2	=	volym för den uttagna alikvoten (5.4) i ml
m	=	provets vikt i gram.

7.   Anmärkningar

7.1	För prov med låg halt av vitamin E kan det vara lämpligt att slå ihop petroleumeterextrakten från två förtvålningsomgångar (uppvägd mängd: 25 g) till en enda provlösning för bestämning med HPLC.

7.2	Det prov som ska bestämmas bör inte innehålla mer än 2 g fett.

7.3	Om ingen fasseparation äger rum tillsätts ca 10 ml etanol (3.1) för att få emulsionen att skikta sig.

7.4	Efter spektrofotometrisk bestämning av lösningen av DL-alfa-tokoferolacetat eller DL-alfa-tokoferol enligt 5.6.1.3 resp. 5.6.2.3, tillsätts ca 10 mg BHT (3.12) till denna (3.10.1 eller 3.10.2). Lösningen förvaras sedan i kylskåp (i högst 4 veckor).

7.5	I stället för BHT kan man använda hydrokinon.

7.6	Med en kolonn för normal-fas-kromatografi går det att separera alfa-, beta-, gamma- och delta-tokoferol.

7.7	I stället för natriumaskorbatlösning kan man använda ca 150 mg askorbinsyra.

7.8	I stället för natriumsulfidlösning kan man använda ca 50 mg EDTA.

7.9

Vitamin E-acetat hydrolyseras mycket snabbt i alkalisk miljö och är därför mycket känsligt för oxidation, särskilt i närvaro av spårelement som järn eller koppar. Vid bestämning av vitamin E i förblandningar som innehåller mer än 5 000 mg/kg finns det alltså en risk att vitamin E bryts ned. Därför bör en HPLC-metod med enzymatisk nedbrytning av vitamin E-beredningen utan någon alkalisk förtvålning användas för att bekräfta resultaten.

8.   Repeterbarhet

Skillnaden mellan resultaten från två parallella bestämningar som utförs på samma prov får inte överstiga 15 % av det högre värdet.

9.   Resultat av en provningsjämförelse  (2)

	Förblandning	Förblandat foder	Mineralkoncentrat	Proteinfoder	Smågrisfoder
L	12	12	12	12	12
N	48	48	48	48	48
Medelvärde [mg/kg]	17 380	1 187	926	315	61,3
sr [mg/kg]	384	45,3	25,2	13,0	2,3
r [mg/kg]	1 075	126,8	70,6	36,4	6,4
CVr [ %]	2,2	3,8	2,7	4,1	3,8
sR mg/kg]	830	65,0	55,5	18,9	7,8
R [mg/kg]	2 324	182,0	155,4	52,9	21,8
CVR [ %]	4,8	5,5	6,0	6,0	12,7

L	=	antal laboratorier
n	=	antal enskilda värden
sr	=	standardavvikelse för repeterbarhet
sR	=	standardavvikelse för reproducerbarhet
r	=	repeterbarhet
R	=	reproducerbarhet
CVr	=	variationskoefficient för repeterbarhet
CVR	=	variationskoefficient för reproducerbarhet

C.   BESTÄMNING AV SPÅRELEMENTEN JÄRN, KOPPAR, MANGAN OCH ZINK

1.   Syfte och tillämpningsområde

Med denna metod kan halten av spårelementen järn, koppar, mangan och zink i foder bestämmas. Kvantifieringsgränser:

—	järn (Fe): 20 mg/kg

—	koppar (Cu): 10 mg/kg

—	mangan (Mn): 20 mg/kg

—	zink (Zn): 20 mg/kg

2.   Princip

Provet löses upp i saltsyra efter destruktion av eventuellt organiskt material. Grundämnena järn, koppar, mangan och zink bestäms efter lämplig spädning genom atomabsorptionsspektrometri.

3.   Reagens

Inledande anmärkningar

Vid beredning av reagens och analyslösningar ska man använda vatten som är fritt från de katjoner som ska bestämmas, genom att det antingen har dubbeldestillerats i en destillationsapparat av borosilikatglas eller kvartsglas eller har genomgått dubbel behandling med jonbytarharts.

Reagensen måste minst vara av p.a.-kvalitet. Det ska kontrolleras genom ett blankprov att de är fria från det grundämne som ska bestämmas. Om det visar sig nödvändigt måste reagensen renas ytterligare.

I stället för de standardlösningar som beskrivs nedan kan i handeln förekommande standardlösningar användas, förutsatt att de är garanterade och att de kontrolleras före användning.

3.1	Saltsyra, d: 1,19 g/ml.

3.2	Saltsyra, 6 mol/l.

3.3	Saltsyra, 0,5 mol/l.

3.4	38–40 % fluorvätesyra (v/v) med en järnhalt (Fe) under 1 mg/l och en rest efter indunstning på mindre än 10 mg (i form av sulfat)/liter.

3.5	Svavelsyra (d: 1,84 g/ml).

3.6	Väteperoxid (ca 100 volymer syre [30 viktprocent]).

3.7	Standardlösning av järn (1 000 μg Fe/ml) beredd på följande sätt (eller motsvarande kommersiellt tillgängliga lösning): Lös upp 1 g järntråd i 200 ml 6 M saltsyra (3.2), tillsätt 16 ml väteperoxid (3.6) och späd till 1 liter med vatten.

3.7.1

Arbetslösning av järn (100 μg Fe/ml) beredd genom spädning av 1 del standardlösning (3.7) med 9 delar vatten.

3.8	Standardlösning av koppar (1 000 μg Cu/ml) beredd på följande sätt (eller motsvarande kommersiellt tillgängliga lösning): — Lös 1 g kopparpulver i 25 ml 6 M saltsyra (3.2), tillsätt 5 ml väteperoxid (3.6) och späd till 1 liter med vatten.

3.8.1

Arbetslösning av koppar (10 μg Cu/ml) beredd genom spädning av standardlösningen (3.8) med vatten (1:9) varefter den erhållna lösningen späds med vatten (1:9).

3.9	Standardlösning av mangan (1 000 μg Mn/ml) beredd på följande sätt (eller motsvarande kommersiellt tillgängliga lösning): — Lös 1 g manganpulver i 25 ml 6 M saltsyra (3.2) och späd till 1 liter med vatten.

3.9.1

Arbetslösning av mangan (10 μg Mn/ml) beredd genom spädning av standardlösningen (3.9) med vatten (1:9) varefter den erhållna lösningen späds med vatten (1:9).

3.10	Standardlösning av zink (1 000 μg Zn/ml) beredd på följande sätt (eller motsvarande kommersiellt tillgängliga lösning): — Lös 1 g zink i rems- eller bladform i 25 ml 6 M saltsyra (3.2) och späd till 1 liter med vatten.

3.10.1

Arbetslösning av zink (10 μg Zn/ml) beredd genom spädning av standardlösningen (3.10) med vatten (1:9) varefter den erhållna lösningen späds med vatten (1:9).

3.11	Lantankloridlösning: Lös 12 g lantanoxid i 150 ml vatten, tillsätt 100 ml 6 M saltsyra (3.2) och späd till 1 liter med vatten.

4.   Utrustning

4.1	Muffelugn med temperaturreglering och helst med skrivare.

4.2	Glaskärlen ska vara av resistent borosilikattyp, och utrustningen bör bara användas för bestämning av spårelement.

4.3	Atomabsorptionsspektrofotometer som motsvarar metodens krav i fråga om känslighet och precision inom det aktuella mätområdet.

5.   Utförande  (3)

5.1   Prov som innehåller organiskt material

5.1.1   Föraskning och beredning av lösningen för analys  (4)

5.1.1.1

Väg med en noggrannhet av 0,2 mg upp 5–10 g av provet i en degel av kvarts eller platina (jfr anmärkning b), torka i ugn vid 105 oC och sätt in degeln i den kalla muffelugnen (4.1). Stäng ugnen (jfr anmärkning c) och höj temperaturen gradvis till 450–475 oC under ca 90 minuter. Behåll denna temperatur under 4–16 timmar (t.ex. över natten) så att kolhaltigt material avlägsnas. Öppna därefter ugnen och låt den svalna (jfr anmärkning d). Fukta askan med vatten och för över den till en 250 ml bägare. Tvätta ur degeln med sammanlagt ca 5 ml saltsyra (3.1) och tillför sedan detta långsamt och försiktigt i bägaren. (CO2-bildning kan leda till en kraftig reaktion.) Tillsätt saltsyra (3.1) droppvis under skakning tills all bubbelbildning upphört. Låt provet indunsta fullständigt, under omrörning då och då med glasstav. Tillsätt 15 ml 6 M saltsyra (3.2) till återstoden, därefter ca 120 ml vatten. Rör med glasstaven, som ska stå kvar i bägaren, och täck över bägaren med ett urglas. Koka upp försiktigt och håll lösningen vid kokpunkten tills askan är fullständigt upplöst. Filtrera genom askfritt filtrerpapper och samla upp filtratet i en 250 ml mätkolv. Skölj bägaren och filtret en gång med 5 ml varm 6 M saltsyra (3.2) och två gånger med kokande vatten. Fyll mätkolven till märket med vatten (HCl-koncentration ca 0,5 M).

5.1.1.2

Om återstoden i filtret är svart (kol) sätts den in i ugnen på nytt och föraskas vid 450–475 oC. Denna föraskning, som bara tar några timmar (ca 3–5 timmar), är klar när askan blivit vit eller nästan vit. Lös upp återstoden i ca 2 ml saltsyra (3.1), låt indunsta fullständigt och tillsätt därefter 5 ml 6 M saltsyra (3.2). Lösningen upphettas och filtreras sedan över till mätkolven. Späd till märket med vatten (HCl-koncentration ca 0,5 M). Anmärkningar: a) Vid bestämning av spårelement är det viktigt att vara uppmärksam på riskerna för kontaminering, särskilt av zink, koppar och järn. Den utrustning som används vid provberedningen måste därför vara fri från dessa metaller. För att minska den allmänna risken för kontaminering ska bestämningen utföras i dammfri miljö med ytterst noggrant rengjord utrustning och omsorgsfullt diskade glaskärl. Bestämning av zink är särskilt känslig för många slag av kontaminering, t.ex. genom glas, reagens och damm. b) Vikten av det prov som ska föraskas beräknas utifrån fodrets ungefärliga halt av spårelement i förhållande till känsligheten hos den spektrofotometer som används. För vissa foder med låg halt av spårelement kan det vara nödvändigt att utgå från ett prov på 10–20 g och späda den slutliga lösningen till endast 100 ml. c) Föraskningen ska utföras i en stängd ugn utan tillförsel av luft eller syre. d) Pyrometern får inte visa högre temperatur än 475o C.

5.1.2   Spektrofotometrisk bestämning

5.1.2.1    Beredning av kalibreringslösningar

Bered, för vart och ett av de spårelement som ska bestämmas, en serie kalibreringslösningar utifrån arbetslösningarna (3.7.1, 3.8.1, 3.9.1 och 3.10.1) med en HCl-koncentration på ca 0,5 M för varje kalibreringslösning och, i fråga om järn, mangan och zink, en lantankloridkoncentration motsvarande 0,1 % La (w/v).

Koncentrationerna av spårelement måste väljas så att de ligger inom känslighetsområdet för den spektrofotometer som används. Följande tabeller ger exempel på sammansättningen hos typiska serier av kalibreringslösningar. Beroende på typen av spektrofotometer och dess känslighet kan det dock vara nödvändigt att välja andra koncentrationer.

Järn

μg Fe/ml	0	0,5	1	2	3	4	5
ml arbetslösning (3.7.1) (1 ml = 100 μg Fe)	0	0,5	1	2	3	4	5
ml HCl (3.2)	7	7	7	7	7	7	7
+ 10 ml lantankloridlösning (3.11); späd till 100 ml med vatten

Koppar

μg Cu/ml	0	0,1	0,2	0,4	0,6	0,8	1,0
ml arbetslösning (3.8.1) (1 ml = 10 μg Cu)	0	1	2	4	6	8	10
ml HCl (3.2)	8	8	8	8	8	8	8

Mangan

μg Mn/ml	0	0,1	0,2	0,4	0,6	0,8	1,0
ml arbetslösning (3.9.1) (1 ml = 10 μg Mn)	0	1	2	4	6	8	10
ml HCl (3.2)	7	7	7	7	7	7	7
+ 10 ml lantankloridlösning (3.11); späd till 100 ml med vatten

Zink

μg Zn/ml	0	0,05	0,1	0,2	0,4	0,6	0,8
ml arbetslösning (3.10.1) (1 ml = 10 μg Zn)	0	0,5	1	2	4	6	8
ml HCl (3.2)	7	7	7	7	7	7	7
+ 10 ml lantankloridlösning (3.11); späd till 100 ml med vatten

5.1.2.2    Beredning av lösning för analys

Vid bestämning av koppar kan den lösning som beretts enligt 5.1.1 normalt sett användas direkt. Om det är nödvändigt att justera dess koncentration så att den ligger i intervallet för kalibreringslösningarna pipetteras en alikvot till en 100 ml mätkolv och späds till märket med 0,5 M saltsyra (3.3).

Vid bestämning av järn, mangan och zink pipetteras en alikvot av den lösning som beretts enligt 5.1.1 till en 100 ml mätkolv. Tillsätt 10 ml lantankloridlösning (3.11) och späd till märket med 0,5 M saltsyra (3.3) (jfr punkt 8).

5.1.2.3    Blankprov

Blankprovet måste omfatta samtliga moment som anges i denna metod med den enda skillnaden att analysprovet utesluts. Kalibreringslösningen ”0” får inte användas som blankprov.

5.1.2.4    Mätning av atomabsorption

Mät atomabsorptionen hos kalibreringslösningarna och hos den lösning som ska analyseras med en oxiderande luft-acetylenlåga vid följande våglängder:

Fe: 248,3 nm

Cu: 324,8 nm

Mn: 279,5 nm

Zn: 213,8 nm

Utför varje mätning fyra gånger.

5.2   Mineralfoder

Om provet inte innehåller något organiskt material behövs ingen föregående föraskning. Följ anvisningarna från och med 5.1.1.1 andra stycket. Indunstning med fluorvätesyra kan uteslutas.

6.   Beräkning av resultat

Beräkna med hjälp av en kalibreringskurva halten av spårelementet i den lösning som ska analyseras och uttryck resultatet i milligram spårelement per kilogram prov (ppm).

7.   Repeterbarhet

Skillnaden mellan resultaten från två parallella bestämningar som utförs på samma prov av samma person får inte överstiga

—	5 mg/kg, i absoluta tal, för halter av spårelementet i fråga på upp till 50 mg/kg,

—	10 % av det högre värdet för halter av spårelementet i fråga på 50–100 mg/kg,

—	10 mg/kg, i absoluta tal, för halter av spårelementet i fråga på 100–200 mg/kg,

—	5 % av det högre värdet för halter av spårelementet i fråga som överstiger 200 mg/kg.

8.   Anmärkning

Höga halter av fosfater kan påverka bestämningen av järn, mangan och zink. Sådana interferenser måste korrigeras genom tillsats av lantankloridlösning (3.11). Denna tillsats behöver dock inte göras, vare sig till den lösning som ska analyseras eller till kalibreringslösningarna, om viktförhållandet Ca + Mg/P i provet är > 2.

D.   BESTÄMNING AV HALOFUGINON

DL-trans-7-brom-6-klor-3-[3-(3-hydroxi-2-piperidyl)acetonyl]quinazolin-4-(3H)-on-hydrobromid

1.   Syfte och tillämpningsområde

Med denna metod kan halten av halofuginon i foder bestämmas. Kvantifieringsgränsen är 1 mg/kg.

2.   Princip

Efter behandling med varmt vatten extraheras halofuginon, i form av den fria basen, till etylacetat och extraheras därefter, i form av hydroklorid, till en syralösning. Extraktet renas med jonbyteskromatografi. Halten av halofuginon bestäms genom omvänd fas-kromatografi (HPLC) med UV-detektor.

3.   Reagens

3.1	Acetonitril, HPLC-kvalitet

3.2	Amberlite XAD-2-harts

3.3	Ammoniumacetat

3.4	Etylacetat

3.5

Isättika

3.6	Halofuginon referenssubstans (DL-trans-7-brom-6-klor-3-[3-hydroxi-2-piperidyl)acetonyl]quinazolin-4-(3H)-on-hydrobromid, E 764)

3.6.1

Stamlösning av halofuginon, 100 μg/ml Väg med en noggrannhet av 0,1 mg upp 50 mg halofuginon (3.6) i en 500 ml mätkolv. Lös i ammoniumacetatbuffertlösning (3.18) och späd sedan med samma lösning till märket och blanda. Lösningen är stabil i tre veckor om den förvaras mörkt vid 5 oC.

3.6.2

Kalibreringslösningar För över 1,0–2,0–3,0–4,0 respektive 6,0 ml stamlösning (3.6.1) till en serie 100 ml mätkolvar. Späd till märket med den mobila fasen (3.21) och blanda. Koncentrationen av halofuginon i dessa lösningar är 1,0–2,0–3,0–4,0 respektive 6,0 μg/ml. Lösningarna ska vara nyberedda.

3.7	Saltsyra (ρ20 ca 1,16 g/ml)

3.8

Metanol

3.9	Silvernitrat

3.10	Natriumaskorbat

3.11	Natriumkarbonat

3.12	Natriumklorid

3.13	EDTA (etylendiamintetraättiksyra, dinatriumsalt)

3.14	Vatten, HPLC-kvalitet

3.15	Natriumkarbonatlösning, c = 10 g/100 ml

3.16	Natriumkloridmättad natriumkarbonatlösning, c = 5 g/100 ml Lös 50 g natriumkarbonat (3.11) i vatten. Späd till 1 liter och tillsätt natriumklorid (3.12) tills lösningen är mättad.

3.17	Saltsyra, ca 0,1 mol/l Späd 10 ml HCl (3.7) med vatten till 1 liter.

3.18	Ammoniumacetatbuffertlösning, ca 0,25mol/l Lös 19,3 g ammoniumacetat (3.3) och 30 ml ättiksyra (3.5) i vatten (3.14) och späd till 1 liter.

3.19

Förbehandling av Amberlite XAD-2-harts Skölj en lämplig mängd amberlit (3.2) med vatten tills alla kloridjoner har tvättats ur. Detta bekräftas genom en kontroll med silvernitrat (3.20) på sköljvattnet. Skölj därefter hartsen med 50 ml metanol (3.8). Häll bort metanolen och lagra hartsen i färsk metanol.

3.20	Silvernitratlösning, ca 0,1 mol/l Lös 0,17 g silvernitrat (3.9) i 10 ml vatten.

3.21

Mobil fas för HPLC Blanda 500 ml acetonitril (3.1) med 300 ml ammoniumacetatbuffertlösning (3.18) och 1 200 ml vatten (3.14). Justera pH till 4,3 med ättiksyra (3.5). Filtrera lösningen genom ett 0,22 μm filter (4.8) och avlufta den (t.ex. i ultraljudsbad i 10 minuter). Lösningen är stabil i en månad om den förvaras mörkt i ett slutet kärl.

4.   Utrustning

4.1	Ultraljudsbad

4.2	Rotationsindunstare

4.3

Centrifug

4.4	HPLC-utrustning med UV-detektor med variabel våglängd eller diod-array-detektor

4.4.1

HPLC-kolonn, 300 × 4 mm, C18, 10 μm packning, eller en motsvarande kolonn

4.5	Glaskolonn (300 × 10 mm) med sintrat glasfilter och avstängningsventil

4.6	Glasfiberfilter, diameter 150 mm

4.7	Membranfilter, 0,45 μm

4.8	Membranfilter, 0,22 μm

5.   Utförande

Anmärkning:

Halofuginon som fri bas är instabil i alkaliska lösningar och etylacetatlösningar. Det bör därför inte vara i etylacetat i mer än 30 minuter.

5.1   Allmänt

5.1.1

Ett blankprov analyseras för att kontrollera att varken halofuginon eller störande ämnen är närvarande.

5.1.2

Gör ett utbytesförsök genom analys av ett blankprov som spikats med ungefär samma mängd halofuginon som finns i provet. För spikning på nivån 3 mg/kg tillsätts 300 μl stamlösning (3.6.1) till 10 g av blankprovet. Blanda och vänta i 10 minuter innan extraktionen (5.2) påbörjas. Anmärkning: Blankprovet bör vara av liknande typ som analysprovet. Vid analys ska halofuginon inte kunna påvisas.

5.2   Extraktion

Väg med en noggrannhet av 0,1 g upp 10 gram av det beredda provet i ett 200 ml centrifugrör. Tillsätt 0,5 g natriumaskorbat (3.10), 0,5 g EDTA (3.13) samt 20 ml vatten och blanda. Ställ röret i vattenbad (80 oC) i 5 minuter. Låt svalna till rumstemperatur. Tillsätt därefter 20 ml natriumkarbonatlösning (3.15) och blanda. Tillsätt omedelbart därefter 100 ml etylacetat (3.4) och skaka röret kraftigt för hand i 15 sekunder. Ställ röret i ultraljudsbadet (4.1) i 3 minuter och lossa proppen. Centrifugera i 2 minuter och dekantera etylacetatfasen genom ett glasfiberfilter (4.6) till en 500 ml separertratt. Upprepa extraktionen av provet med en ny volym på 100 ml etylacetat. Tvätta de kombinerade extrakten i 1 minut med 50 ml natriumkloridmättad natriumkarbonatlösning (3.16). Häll bort vattenskiktet.

Extrahera det organiska skiktet i 1 minut med 50 ml saltsyra (3.17). Det undre syraskiktet tappas av till en 250 ml separertratt. Extrahera det organiska skiktet en gång till i 1,5 minuter med ytterligare 50 ml saltsyra och slå samman med det första extraktet. Tvätta de kombinerade syraextrakten genom att rotera kärlet i ca 10 sekunder med 10 ml etylacetat (3.4).

Överför vattenskiktet kvantitativt till en 250 ml rundkolv och häll bort den organiska fasen. Avlägsna allt resterande etylacetat från syralösningen i en rotationsindunstare (4.2). Vattenbadets temperatur bör inte överstiga 40 oC. Vid ett tryck på ca 25 mbar avdunstar allt resterande etylacetat inom 5 minuter vid 38 oC.

5.3   Rening

5.3.1   Förberedelse av amberlitkolonnen

Förbered en XAD-2-kolonn för varje provextrakt. För över 10 g förbehandlad amberlit (3.19) till en glaskolonn (4.5) med metanol (3.8). Sätt en liten propp av glasull i toppen av hartskolonnen. Låt metanolen rinna ur kolonnen och skölj hartsen med 100 ml vatten. Stoppa flödet när vätskan når toppen av hartskolonnen. Låt kolonnen komma i jämvikt i 10 minuter före användning. Se till att kolonnen aldrig torkar ut.

5.3.2   Rening av prov

För över extraktet (5.2) kvantitativt till toppen av den förberedda amberlitkolonnen (5.3.1) och eluera. Häll bort eluatet. Flödeshastigheten vid elueringen bör inte överskrida 20 ml/minut. Skölj rundkolven med 20 ml saltsyra (3.17) som därefter används för att skölja hartskolonnen. Avlägsna kvarvarande syralösning med en luftström. Häll bort sköljresterna. Tillsätt 100 ml metanol (3.8) i kolonnen och eluera 5–10 ml. Samla upp eluatet i en 250 ml rundkolv. Vänta i 10 minuter så att den återstående metanolen kommer i jämvikt med hartsen. Fortsätt elueringen med en flödeshastighet på högst 20 ml/minut och samla upp eluatet i samma rundkolv. Låt metanolen avdunsta i en rotationsindunstare (4.2). Vattenbadets temperatur bör inte överskrida 40 oC. Överför återstoden kvantitativt till en 10 ml mätkolv genom att använda den mobila fasen (3.21). Späd med den mobila fasen till märket och blanda. En alikvot av lösningen filtreras genom ett membranfilter (4.7). Denna lösning används sedan för HPLC-bestämningen (5.4).

5.4   HPLC-bestämning

5.4.1   Parametrar

Följande betingelser anges som vägledning. Andra betingelser kan väljas om de ger likvärdiga resultat.

HPLC-kolonn (4.4.1)

Mobil fas för HPLC (3.21)

Flödeshastighet: 1,5–2 ml/minut

Detektionsvåglängd: 243 nm

Injektionsvolym: 40–100 μl.

Kontrollera att det kromatografiska systemet är stabilt genom att upprepade gånger injicera en kalibreringslösning (3.6.2) med koncentrationen 3,0 μg/ml tills topphöjder (areor) och retentionstider är konstanta.

5.4.2   Kalibreringskurva

Injicera varje kalibreringslösning (3.6.2) upprepade gånger och mät topphöjderna (areorna) för varje koncentration. Konstruera en kalibreringskurva med kalibreringslösningarnas genomsnittliga topphöjder (areor) längs y-axeln och motsvarande koncentrationerna i μg/ml längs x-axeln.

5.4.3   Provlösning

Provextraktet (5.3.2) injiceras upprepade gånger, varvid samma volym ska användas som för kalibreringslösningarna. Bestäm därefter den genomsnittliga topphöjden (arean) för halofuginon.

6.   Beräkning av resultat

Använd den genomsnittliga topphöjden (arean) för provlösningens halofuginontoppar för att bestämma koncentrationen i μg/ml med hjälp av kalibreringskurvan.

Provets halofuginonhalt w (mg/kg) beräknas med formeln

där:

c	:	provlösningens halofuginonkoncentration i μg/ml
m	:	provets vikt i gram.

7.   Validering av resultat

7.1   Identitet

Analytens identitet kan bekräftas genom co-kromatografi eller genom användning av en diod-array-detektor med vars hjälp spektrumen för provextraktet och den kalibreringslösning (3.6.2) som innehåller 6,0 μg/ml jämförs.

7.1.1   Co-kromatografi

Ett provextrakt spikas genom tillsats av en lämplig mängd kalibreringslösning (3.6.2). Mängden tillsatt halofuginon bör motsvara den uppskattade mängden halofuginon i provextraktet.

Endast halofuginontoppens höjd ska öka efter det att hänsyn tagits till både den tillsatta mängden och spädningen av extraktet. Toppens bredd på halva höjden ska ligga inom ± 10 % av den ursprungliga bredden.

7.1.2   Diod-array-detektion

Resultaten utvärderas enligt följande kriterier:

a)	Våglängderna för prov- och standardspektrumens absorptionsmaximum, i toppens spets på kromatogrammet, ska ligga inom en marginal som beror på detektionssystemets upplösningsförmåga. För diod-array-detektion är denna i allmänhet ± 2 nm.

b)

Mellan 225 och 300 nm får prov- och standardspektrumen, i toppens spets på kromatogrammet, inte skilja sig åt för de delar av spektrumet där den relativa absorbansen är 10–100 %. Detta kriterium är uppfyllt om samma maximum observeras och avvikelsen mellan de två spektrumen inte vid någon mätpunkt överstiger 15 % av standardanalytens absorbans.

c)

Mellan 225 och 300 nm får spektrumen för den uppåtgående delen, spetsen och den nedåtgående delen av toppen från provextraktet inte skilja sig från varandra för de delar av spektrumet där den relativa absorbansen är 10–100 %. Detta kriterium är uppfyllt om samma maximum observeras och avvikelsen mellan spektrumen inte vid någon mätpunkt överstiger 15 % av absorbansen vid spetsen.

Om något av dessa kriterier inte är uppfyllt har analytens förekomst inte bekräftats.

7.2   Repeterbarhet

Skillnaden mellan resultaten från två parallella bestämningar som utförs på samma prov får inte överstiga 0,5 mg/kg för halofuginonhalter till och med 3 mg/kg.

7.3   Utbyte

För ett spikat blankprov ska utbytet vara minst 80 %.

8.   Resultat av en provningsjämförelse

I en provningsjämförelse (5) analyserades tre prov av åtta laboratorier.

Resultat

	Prov A (blankprov) Vid mottagandet	Prov B (mjöl)		Prov C (pellets)
		Vid mottagandet	Efter två månader	Vid mottagandet	Efter två månader
Medelvärde [mg/kg]	ND	2,80	2,42	2,89	2,45
SR [mg/kg]	—	0,45	0,43	0,40	0,42
CVR [ %]	—	16	18	14	17
Utbyte [ %]		86	74	88	75

ND	=	analyten har ej påvisats
SR	=	standardavvikelse för reproducerbarhet
CVR	=	variationskoefficient för reproducerbarhet, %

E.   BESTÄMNING AV ROBENIDIN

1,3-bis[(4-klorbensyliden)amin]guanidinhydroklorid

1.   Syfte och tillämpningsområde

Med denna metod kan robenidinhalten i foder bestämmas. Kvantifieringsgränsen är 5 mg/kg.

2.   Princip

Provet extraheras med surgjord metanol. Extraktet torkas och en alikvot renas i en kolonn med aluminiumoxid. Robenidinet elueras från kolonnen med metanol och koncentreras. Den erhållna lösningen späds med en lämplig volym av den mobila fasen. Halten av robenidin bestäms genom omvänd fas-kromatografi (HPLC) med UV-detektor.

3.   Reagens

3.1

Metanol

3.2	Surgjord metanol För över 4,0 ml saltsyra (ρ20 = 1,18 g/ml) till en 500 ml mätkolv. Späd med metanol (3.1) till märket och blanda. Denna lösning ska vara nyberedd.

3.3	Acetonitril, HPLC-kvalitet

3.4	Molekylsikt Typ 3A, 8–12 mesh (1,6–2,5 mm kulor, kristallint aluminiumsilikat, pordiameter 0,3 nm).

3.5	Aluminiumoxid, sur, aktivitetsgrad I, för kolonnkromatografi För över 100 g aluminiumoxid till ett lämpligt kärl och tillsätt 2,0 ml vatten. Förslut kärlet och skaka i ca 20 minuter. Förvara sedan i ett väl tillslutet kärl.

3.6	Kaliumdivätefosfatlösning, c = 0,025 mol/l Lös 3,40 g kaliumdivätefosfat i vatten (HPLC-kvalitet) i en 1 000 ml mätkolv. Späd till märket och blanda.

3.7	Dinatriumvätefosfatlösning, c = 0,025 mol/l Lös 3,55 g vattenfri (eller 4,45 g dihydrat eller 8,95 g dodekahydrat) dinatriumvätefosfat i vatten (HPLC-kvalitet) i en 1 000 ml mätkolv. Späd till märket och blanda.

3.8	Mobil fas för HPLC Blanda följande reagens:   650 ml acetonitril (3.3),   250 ml vatten (HPLC-kvalitet),   50 ml kaliumdivätefosfatlösning (3.6),   50 ml dinatriumvätefosfatlösning (3.7). Filtrera lösningen genom ett 0,22 μm filter (4.6) och avlufta den (t.ex. i ultraljudsbad i 10 minuter).

3.9	Referenssubstans Rent robenidin: 1,3-bis[(4-klorbensyliden)amin]guanidin-hydroklorid.

3.9.1

Stamlösning av robenidin: 300 μg/ml Väg med en noggrannhet av 0,1 mg upp 30 mg referenssubstans av robenidin (3.9). Lös i surgjord metanol (3.2) i en 100 ml mätkolv. Späd till märket med samma lösningsmedel och blanda. Slå in kolven i aluminiumfolie och förvara mörkt.

3.9.2

Arbetsstandardlösning av robenidin: 12 μg/ml För över 10,0 ml stamlösning (3.9.1) till en 250 ml mätkolv. Späd till märket med mobil fas (3.8) och blanda. Slå in kolven i aluminiumfolie och förvara mörkt.

3.9.3

Kalibreringslösningar För över 5,0–10,0–15,0–20,0 respektive 25,0 ml arbetsstandardlösning (3.9.2) till en serie 50 ml mätkolvar. Späd till märket med den mobila fasen (3.8) och blanda. Koncentrationen av robenidin i dessa lösningar är 1,2–2,4–3,6–4,8 respektive 6,0 μg/ml. Lösningarna ska vara nyberedda.

3.10	Vatten, HPLC-kvalitet

4.   Utrustning

4.1	Glaskolonn Kolonn i brunt glas, med avstängningsventil och en behållare med ca 150 ml volym, invändig diameter 10–15 mm, längd 250 mm.

4.2	Mekanisk skakapparat eller magnetomrörare

4.3	Rotationsindunstare

4.4	HPLC-utrustning med UV-detektor med variabel våglängd eller diod-array-detektor för intervallet 250–400 nm

4.4.1.

HPLC-kolonn: 300 × 4 mm, C18, 10 μm packning eller motsvarande

4.5	Glasfiberfilter (Whatman GF/A eller motsvarande)

4.6	Membranfilter, 0,22 μm

4.7	Membranfilter, 0,45 μm

5.   Utförande

Anmärkning:

Robenidin är ljuskänsligt. Bruna glaskärl bör därför användas vid alla arbetsmoment.

5.1   Allmänt

5.1.1

Ett blankprov analyseras för att kontrollera att varken robenidin eller störande ämnen är närvarande.

5.1.2

Gör ett utbytesförsök genom analys av ett blankprov (5.1.1) som spikats med ungefär samma mängd robenidin som finns i provet. För spikning på nivån 60 mg/kg överförs 3,0 ml stamlösning (3.9.1) till en 250 ml E-kolv. Indunsta lösningen till ca 0,5 ml i en kvävgasström. Tillsätt 15 g av blankprovet, blanda och vänta i 10 minuter innan extraktionen (5.2) påbörjas. Anmärkning: Blankprovet bör vara av liknande typ som analysprovet. Vid analys ska robenidin inte kunna påvisas.

5.2   Extraktion

Väg med en noggrannhet av 0,01 g upp ca 15 gram av det beredda provet och för över till en 250 ml E-kolv. Tillsätt 100,0 ml surgjord metanol (3.2), tillslut kolven och låt stå i 1 timme i skakapparat (4.2). Filtrera lösningen genom ett glasfiberfilter (4.5) och samla upp allt filtrat i en 150 ml E-kolv. Tillsätt 7,5 g molekylsikt (3.4), tillslut kolven och skaka i 5 minuter. Filtrera omedelbart genom ett glasfiberfilter. Spara lösningen för reningen (5.3).

5.3   Rening

5.3.1   Förberedelse av aluminiumoxidkolonnen

Sätt en liten propp av glasull i glaskolonnens (4.1) nedre öppning och pressa ihop den med en glasstav. Väg upp 11,0 g av den förbehandlade aluminiumoxiden (3.5) och för över till kolonnen. Försök minimera exponeringen för luft under detta arbetsmoment. Knacka försiktigt på kolonnens nederdel så att aluminiumoxiden sätter sig.

5.3.2   Rening av prov

Pipettera över 5,0 ml av det provextrakt som beretts enligt 5.2 till kolonnen. Håll pipettens spets nära kolonnväggen och låt lösningen absorberas av aluminiumoxiden. Eluera robenidinet från kolonnen med 100 ml metanol (3.1), flödeshastighet 2–3 ml/minut, och samla upp eluatet i en 250 ml rundkolv. Låt metanollösningen indunsta fullständigt i rotationsindunstaren (4.3) under reducerat tryck vid 40 oC. Lös upp återstoden i 3–4 ml mobil fas (3.8) och överför kvantitativt till en 10 ml mätkolv. Skölj kolven med flera volymer mobil fas om 1–2 ml och överför sköljvätskan till mätkolven. Späd till märket med samma lösningsmedel och blanda. En alikvot av lösningen filtreras genom ett 0,45 μm membranfilter (4.7). Denna lösning används sedan för HPLC-bestämningen (5.4).

5.4   HPLC-bestämning

5.4.1   Parametrar

Följande betingelser anges som vägledning. Andra betingelser kan väljas om de ger likvärdiga resultat.

HPLC-kolonn (4.4.1),

Mobil fas för HPLC (3.8),

Flödeshastighet: 1,5–2 ml/minut,

Detektionsvåglängd: 317 nm,

Injektionsvolym: 20–50 μl.

Kontrollera att det kromatografiska systemet är stabilt genom att upprepade gånger injicera en kalibreringslösning (3.9.3) med koncentrationen 3,6 μg/ml tills topphöjder och retentionstider är konstanta.

5.4.2   Kalibreringskurva

Injicera varje kalibreringslösning (3.9.3) upprepade gånger och mät topphöjderna (areorna) för varje koncentration. Konstruera en kalibreringskurva med kalibreringslösningarnas genomsnittliga topphöjder (areor) längs y-axeln och motsvarande koncentrationer i μg/ml längs x-axeln.

5.4.3   Provlösning

Provextraktet (5.3.2) injiceras upprepade gånger, varvid samma volym ska användas som för kalibreringslösningarna. Bestäm den genomsnittliga topphöjden (arean) för robenidin.

6.   Beräkning av resultat

Använd den genomsnittliga topphöjden (arean) för provlösningens robenidintoppar för att bestämma koncentrationen i μg/ml med hjälp av kalibreringskurvan (5.4.2).

Provets robenidinhalt w (mg/kg) beräknas med formeln

där:

c	=	provlösningens robenidinkoncentration i μg/ml
m	=	provets vikt i gram.

7.   Validering av resultat

7.1   Identitet

Analytens identitet kan bekräftas genom co-kromatografi eller genom användning av en diod-array-detektor med vars hjälp spektrumen för provextraktet och den kalibreringslösning (3.9.3) som innehåller 6 μg/ml jämförs.

7.1.1   Co-kromatografi

Ett provextrakt spikas genom tillsats av en lämplig mängd kalibreringslösning (3.9.3). Mängden tillsatt robenidin bör motsvara den uppskattade mängden robenidin i provextraktet.

Endast robenidintoppens höjd ska öka efter det att hänsyn tagits till både den tillsatta mängden och spädningen av extraktet. Toppens bredd på halva höjden ska ligga inom ± 10 % av den ursprungliga bredden

7.1.2   Diod-array-detektion

Resultaten utvärderas enligt följande kriterier:

a)	Våglängderna för prov- och standardspektrumens absorptionsmaximum, i toppens spets på kromatogrammet, ska ligga inom en marginal som beror på detektionssystemets upplösningsförmåga. För diod-array-detektion är denna i allmänhet ± 2 nm.

b)

Mellan 250 och 400 nm får prov- och standardspektrumen, i toppens spets på kromatogrammet, inte skilja sig åt för de delar av spektrumet där den relativa absorbansen är 10–100 %. Detta kriterium är uppfyllt om samma maximum observeras och avvikelsen mellan de två spektrumen inte vid någon mätpunkt överstiger 15 % av standardanalytens absorbans.

c)

Mellan 250 och 400 nm får spektrumen för den uppåtgående delen, spetsen och den nedåtgående delen av toppen från provextraktet inte skilja sig från varandra för de delar av spektrumet där den relativa absorbansen är 10–100 %. Detta kriterium är uppfyllt om samma maximum observeras och avvikelsen mellan spektrumen inte vid någon mätpunkt överstiger 15 % av absorbansen vid spetsen.

Om något av dessa kriterier inte är uppfyllt har analytens förekomst inte bekräftats.

7.2   Repeterbarhet

Skillnaden mellan resultaten från två parallella bestämningar som utförs på samma prov får inte överstiga 10 % av det högre värdet för robenidinhalter över 15 mg/kg.

7.3   Utbyte

För ett spikat blankprov ska utbytet vara minst 85 %.

8.   Resultat av en provningsjämförelse

I en provningsjämförelse inom EU fick tolv laboratorier analysera fyra prov av fjäderfä- och kaninfoder i form av mjöl eller pellets. För varje prov gjordes dubbla analyser. Resultaten redovisas i nedanstående tabell:

	Fjäderfä		Kanin
	Mjöl	Pellets	Mjöl	Pellets
Medelvärde [mg/kg]	27,00	27,99	43,6	40,1
sr [mg/kg]	1,46	1,26	1,44	1,66
CVr [ %]	5,4	4,5	3,3	4,1
SR [mg/kg]	4,36	3,36	4,61	3,91
CVR [ %]	16,1	12,0	10,6	9,7
Utbyte [ %]	90,0	93,3	87,2	80,2

sr	=	standardavvikelse för repeterbarhet
CVr	=	variationskoefficient för repeterbarhet, %
SR	=	standardavvikelse för reproducerbarhet
CVR	=	variationskoefficient för reproducerbarhet, %

F.   BESTÄMNING AV DICLAZURIL

(+)-4-klorfenyl [2,6-diklor-4-(2,3,4,5-tetrahydro-3,5-dioxo-1,2,4-triazin-2-yl)fenyl]acetonitril

1.   Syfte och tillämpningsområde

Med denna metod kan halten av diclazuril i foder och förblandningar bestämmas. Detektionsgränsen är 0,1 mg/kg och kvantifieringsgränsen 0,5 mg/kg.

2.   Princip

Efter tillsats av intern standard extraheras provet med surgjord metanol. För foder renas en alikvot av extraktet på en C18-kolonn för fastfasextraktion. Diclazuril elueras från kolonnen med en blandning av surgjord metanol och vatten. Efter indunstning löses återstoden i DMF/vatten. För förblandningar indunstas extraktet och återstoden löses i DMF/vatten. Diclazurilhalten bestäms med ternär-gradient omvänd fas-kromatografi (HPLC) med UV-detektor.

3.   Reagens

3.1	Vatten, HPLC-kvalitet.

3.2	Ammoniumacetat

3.3	Tetrabutylammoniumvätesulfat (TBHS)

3.4	Acetonitril, HPLC-kvalitet

3.5	Metanol, HPLC-kvalitet

3.6	N, N-dimetylformamid (DMF)

3.7	Saltsyra, ρ20 = 1,19 g/ml

3.8	Referenssubstans: diclazuril II-24: (+)-4-klorfenyl [2,6-diklor-4-(2,3,4,5-tetrahydro-3,5-dioxo-1,2,4-triazin-2-yl)fenyl]acetonitril med garanterad renhet, E771

3.8.1

Stamlösning av diclazuril, 500 μg/ml Väg med en noggrannhet av 0,1 mg upp 25 mg av diclazuril referenssubstans (3.8) i en 50 ml mätkolv. Lös i DMF (3.6), späd till märket med DMF (3.6) och blanda. Slå in kolven i aluminiumfolie eller använd en kolv av brunt glas. Förvara i kylskåp. Lösningen är stabil i 1 månad vid högst 4 oC.

3.8.2

Standardlösning av diclazuril, 50 μg/ml Överför 5,00 ml stamlösning (3.8.1) till en 50 ml mätkolv, späd till märket med DMF (3.6) och blanda. Slå in kolven i aluminiumfolie eller använd en kolv av brunt glas. Förvara i kylskåp. Lösningen är stabil i en månad vid högst 4 oC.

3.9	Intern standard: 2,6-diklor-(4-klorfenyl)-4-(4,5-dihydro-3,5-dioxo-1,2,4-triazin-2-(3H)-yl)-metylbensen-acetonitril

3.9.1

Stamlösning av intern standard, 500 μg/ml Väg med en noggrannhet av 0,1 mg upp 25 mg intern standard (3.9) i en 50 ml mätkolv. Lös i DMF (3.6), späd till märket med DMF (3.6) och blanda. Slå in kolven i aluminiumfolie eller använd en kolv av brunt glas. Förvara i kylskåp. Lösningen är stabil i 1 månad vid högst 4 oC.

3.9.2

Intern standardlösning, 50 μg/ml Överför 5,00 ml stamlösning av intern standard (3.9.1) till en 50 ml mätkolv, späd till märket med DMF (3.6) och blanda. Slå in kolven i aluminiumfolie eller använd en kolv av brunt glas. Förvara i kylskåp. Lösningen är stabil i 1 månad vid högst 4 oC.

3.9.3

Intern standardlösning för förblandningar, p/1 000 mg/ml (p = nominell halt av diclazuril i förblandningen i mg/kg) Väg med en noggrannhet av 0,1 mg upp p/10 mg intern standard i en 100 ml mätkolv, lös i DMF (3.6) i ett ultraljudsbad (4.6), späd till märket med DMF och blanda. Slå in kolven i aluminiumfolie eller använd en kolv av brunt glas. Förvara i kylskåp. Lösningen är stabil i 1 månad vid högst 4 oC.

3.10	Kalibreringslösning, 2 μg/ml. Pipettera över 2,00 ml diclazurilstandardlösning (3.8.2) och 2,00 ml intern standardlösning (3.9.2) till en 50 ml mätkolv. Tillsätt 16 ml DMF (3.6), späd till märket med vatten och blanda. Denna lösning ska vara nyberedd.

3.11	C18-fastfasextraktionskolonn, t.ex. Bond Elut, storlek: 1 cm3, sorbent: 100 mg.

3.12	Extraktionsmedel: surgjord metanol. Pipettera 5,0 ml saltsyra (3.7) till 1 000 ml metanol (3.5) och blanda.

3.13	Mobil fas för HPLC

3.13.1

Eluent A: ammoniumacetat–tetrabutylammoniumvätesulfatlösning. Lös 5 g ammoniumacetat (3.2) och 3,4 g TBHS (3.3) i 1 000 ml vatten (3.1) och blanda.

3.13.2

Eluent B: acetonitril (3.4).

3.13.3

Eluent C: metanol (3.5).

4.   Utrustning

4.1	Mekanisk skakapparat.

4.2	Utrustning för ternär-gradient-HPLC

4.2.1

HPLC-kolonn, Hypersil ODS, 3 μm packning, 100 × 4,6 mm, eller motsvarande

4.2.2

UV-detektor med variabel våglängd eller diod-array-detektor.

4.3	Rotationsindunstare

4.4	Membranfilter, 0,45 μm

4.5	Vakuumgrenrör

4.6	Ultraljudsbad

5.   Utförande

5.1   Allmänt

5.1.1   Blankprov

Ett blankprov analyseras för att kontrollera att varken diclazuril eller störande ämnen är närvarande. Blankprovet bör vara av liknande typ som analysprovet och varken diclazuril eller störande ämnen ska kunna påvisas i det.

5.1.2   Utbytesförsök

Gör ett utbytesförsök genom analys av ett blankprov som spikats med ungefär samma mängd diclazuril som finns i provet. För spikning på nivån 1 mg/kg, sätt 0,1 ml stamlösning av intern standard (3.8.1) till 50 g av ett blankprov, blanda noga och låt stå i 10 minuter. Blanda sedan flera gånger före extraktionen (5.2).

Om ett blankprov av samma typ som provet inte finns att tillgå (se 5.1.1) kan ett utbytesförsök göras med standardadditionsmetoden. Denna innebär att det prov som ska analyseras spikas med ungefär samma mängd diclazuril som finns i provet. Detta prov analyseras tillsammans med det ospikade provet, och utbytet beräknas sedan genom subtraktion.

5.2   Extraktion

5.2.1   Foder

Väg med 0,01 g noggrannhet upp ca 50 g prov. Överför detta till en 500 ml E-kolv, tillsätt 1,00 ml intern standardlösning (3.9.2) och 200 ml extraktionsmedel (3.12) och tillslut kolven. Skaka blandningen i skakapparaten (4.1) över natten. Låt stå i 10 minuter. Överför en 20 ml alikvot av supernatanten till ett lämpligt glaskärl och späd med 20 ml vatten. Överför denna lösning till en extraktionskolonn (3.11) och låt den passera genom kolonnen med hjälp av vakuum (4.5). Tvätta kolonnen med 25 ml av en blandning av extraktionsmedel (3.12) och vatten, 65 + 35 (v + v). Kasta de uppsamlade fraktionerna och eluera ämnena med 25 ml av en blandning av extraktionsmedel (3.12) och vatten, 80 + 20 (v + v). Indunsta denna fraktion i en rotationsindunstare (4.3) vid 60 oC tills den precis har torkat. Lös återstoden i 1,0 ml DMF (3.6), tillsätt 1,5 ml vatten och blanda. Filtrera genom ett membranfilter (4.4). Gå vidare till HPLC-bestämningen (5.3).

5.2.2   Förblandningar

Väg med 0,001 g noggrannhet upp ca 1 g prov. Överför detta till en 500 ml E-kolv, tillsätt 1,00 ml intern standardlösning (3.9.3) och 200 ml extraktionsmedel (3.12) och tillslut kolven. Skaka blandningen i skakapparaten (4.1) över natten. Låt stå i 10 minuter. Överför en alikvot på 10 000/p ml (p = nominell halt av diclazuril i förblandningen i mg/kg) av supernatanten till en rundkolv av lämplig storlek. Indunsta i en rotationsindunstare (4.3) under reducerat tryck vid 60 oC tills återstoden precis har torkat. Lös återstoden i 10,0 ml DMF (3.6), tillsätt 15,0 ml vatten (3.1) och blanda. Gå vidare till HPLC-bestämningen (5.3).

5.3   HPLC-bestämning

5.3.1   Parametrar

Följande betingelser anges som vägledning. Andra betingelser kan väljas om de ger likvärdiga resultat.

HPLC-kolonn (4.2.1):	100 × 4,6 mm, Hypersil ODS, 3 μm packning, eller motsvarande
Mobil fas :	Eluent A (3.13.1):	Vattenlösning av ammonium-acetat och tetrabutylammonium-vätesulfat
	Eluent B (3.13.2):	acetonitril
	Eluent C (3.13.3):	metanol
Elueringssätt:	— linjär gradient — utgångsförhållanden: A + B + C = 60 + 20 + 20 (v + v + v) — efter 10 minuters gradienteluering i 30 min. till: A + B + C = 45 + 20 + 35 (v + v + v). Skölj med B i 10 min.
Flödeshastighet:	1,5–2 ml/min
Injektionsvolym:	20 μl
Detektorvåglängd:	280 nm

Kontrollera det kromatografiska systemets stabilitet genom att upprepade gånger injicera kalibreringslösningen (3.10), som innehåller 2 μg/ml, till dess att topphöjder och retentionstider är konstanta.

5.3.2   Kalibreringslösning

Injicera 20 μl av kalibreringslösningen (3.10) upprepade gånger och bestäm den genomsnittliga topphöjden (arean) för diclazuril och den interna standarden.

5.3.3   Provlösning

Injicera 20 μl av provlösningen (5.2.1 eller 5.2.2) upprepade gånger och bestäm den genomsnittliga topphöjden (arean) för diclazuril och den interna standarden.

6.   Beräkning av resultat

6.1   Foder

Provets diclazurilhalt w (mg/kg) beräknas med formeln

[mg/kg]

där:

hd, s	=	topphöjd (area) för diclazuril i provlösningen (5.2.1)
hi, s	=	topphöjd (area) för den interna standarden i provlösningen (5.2.1)
hd, c	=	topphöjd (area) för diclazuril i kalibreringslösningen (3.10)
hi, c	=	topphöjd (area) för den interna standarden i kalibreringslösningen (3.10)
cd, c	=	diclazurilkoncentration i kalibreringslösningen i μg/ml (3.10)
m	=	provets vikt i gram
V	=	provextraktets volym i ml (= 2,5 ml), se 5.2.1.

6.2   Förblandningar

Provets diclazurilhalt w (mg/kg) beräknas med formeln

[mg/kg]

där:

hd, c	=	topphöjd (area) för diclazuril i kalibreringslösningen (3.10)
hi, c	=	topphöjd (area) för den interna standarden i kalibreringslösningen (3.10)
hd, s	=	topphöjd (area) för diclazuril i provlösningen (5.2.2)
hi, s	=	topphöjd (area) för den interna standarden i provlösningen (5.2.2)
cd, c	=	diclazurilkoncentration i kalibreringslösningen i μg/ml (3.10)
m	=	provets vikt i gram
V	=	provextraktets volym i ml (= 25 ml), se 5.2.2
p	=	nominell halt av diclazuril i mg/kg i förblandningen.

7.   Validering av resultaten

7.1   Identitet

Analytens identitet kan bekräftas genom co-kromatografi eller genom användning av en diod-array-detektor med vars hjälp spektrumen för provextraktet (5.2.1 eller 5.2.2) och kalibreringslösningen (3.10) jämförs.

7.1.1   Co-kromatografi

Ett provextrakt (5.2.1 eller 5.2.2) spikas genom tillsats av en lämplig mängd kalibreringslösning (3.10). Mängden tillsatt diclazuril bör vara samma som den mängd diclazuril som finns i provextraktet.

Endast höjden på diclazuriltoppen och på den topp som motsvarar den interna standarden ska öka efter det att hänsyn tagits till både den tillsatta mängden och spädningen av extraktet. Toppens bredd på halva höjden ska ligga inom ± 10 % av den ursprungliga bredden på toppen för diclazuril eller för den interna standarden i det ospikade provextraktet.

7.1.2   Diod-array-detektion

Resultaten utvärderas enligt följande kriterier:

a)	Våglängderna för prov- och standardspektrumens absorptionsmaximum, i toppens spets på kromatogrammet, ska ligga inom en marginal som beror på detektionssystemets upplösningsförmåga. För diod-array-detektion är denna i allmänhet ± 2 nm.

b)

Mellan 230 och 320 nm får prov- och standardspektrumen, i toppens spets på kromatogrammet, inte skilja sig åt för de delar av spektrumet där den relativa absorbansen är 10–100 %. Detta kriterium är uppfyllt om samma maximum observeras och avvikelsen mellan de två spektrumen inte vid någon mätpunkt överstiger 15 % av standardanalytens absorbans.

c)

Mellan 230 och 320 nm får spektrumen för den uppåtgående delen, spetsen och den nedåtgående delen av toppen från provextraktet inte skilja sig från varandra för de delar av spektrumet där den relativa absorbansen är 10–100 %. Detta kriterium är uppfyllt om samma maximum observeras och avvikelsen mellan spektrumen inte vid någon mätpunkt överstiger 15 % av absorbansen vid spetsen.

Om något av dessa kriterier inte är uppfyllt har analytens förekomst inte bekräftats.

7.2   Repeterbarhet

Skillnaden mellan resultaten från två parallella bestämningar som utförs på samma prov får inte överstiga

—	30 % av det högre värdet för diclazurilhalter på 0,5–2,5 mg/kg

—	0,75 mg/kg för diclazurilhalter på 2,5–5 mg/kg

—	15 % av det högre värdet för diclazurilhalter över 5 mg/kg

7.3   Utbyte

För ett spikat (blank)prov ska utbytet vara minst 80 %.

8.   Resultat av en provningsjämförelse

I en provningsjämförelse analyserades fem prov av elva laboratorier. Proven utgjordes av två förblandningar, en blandad med en organisk matris (O 100) och den andra med en oorganisk matris (A 100). Den teoretiska halten är 100 mg diclazuril per kg. De tre foderblandningarna för fjäderfä kom från tre olika företag (NL) (L1/Z1/K1). Den teoretiska halten är 1 mg diclazuril per kg. Laboratorierna instruerades att göra en eller två analyser av varje prov. (Närmare upplysningar om provningsjämförelsen finns i Journal of AOAC International, volym 77, nr 6, 1994, s. 1359–1361). Resultaten redovisas i nedanstående tabell.

	Prov 1 A 100	Prov 2 O 100	Prov 3 L1	Prov 4 Z1	Prov 5 K1
L	11	11	11	11	6
n	19	18	19	19	12
Medelvärde	100,8	103,5	0,89	1,15	0,89
Sr (mg/kg)	5,88	7,64	0,15	0,02	0,03
CVr ( %)	5,83	7,38	17,32	1,92	3,34
SR (mg/kg)	7,59	7,64	0,17	0,11	0,12
CVR ( %)	7,53	7,38	18,61	9,67	13,65
Nominell halt (mg/kg)	100	100	1	1	1

L	=	antal laboratorier
n	=	antal enskilda värden
Sr	=	standardavvikelse för repeterbarhet
CVr	=	variationskoefficient för repeterbarhet
SR	=	standardavvikelse för reproducerbarhet
CVR	=	variationskoefficient för reproducerbarhet

9.   Anmärkningar

Diclazurilresponsen måste tidigare ha visats vara linjär i det koncentrationsintervall mätningarna gäller.

G.   BESTÄMNING AV NATRIUMLASALOCID

Ett natriumsalt av en polyeter-monokarboxylsyra som produceras av Streptomyces lasaliensis

1.   Syfte och tillämpningsområde

Med denna metod kan halten natriumlasalocid bestämmas i foder och förblandningar. Detektionsgränsen är 5 mg/kg och kvantifieringsgränsen 10 mg/kg.

2.   Princip

Natriumlasalocid extraheras från provet med surgjord metanol och en bestämning görs med omvänd fas-kromatografi (HPLC) och en spektrofluorometrisk detektor.

3.   Reagens

3.1	Kaliumdivätefosfat (KH2PO4)

3.2	Ortofosforsyra, w = 85 % (w/w)

3.3	Lösning av ortofosforsyra, c = 20 % Späd 23,5 ml ortofosforsyra (3.2) med vatten till 100 ml.

3.4	6-metyl-2-heptylamin (1,5-dimetylhexylamin), w = 99 % (w/w)

3.5	Metanol, HPLC-kvalitet.

3.6	Saltsyra, densitet = 1,19 g/ml

3.7	Fosfatbuffertlösning, c = 0,01 mol/l Lös 1,36 gram KH2PO4 (3.1) i 500 ml vatten (3.11). Tillsätt 3,5 ml ortofosforsyra (3.2) och 10,0 ml 6-metyl-2-heptylamin (3.4). Justera pH till 4,0 med ortofosforsyralösningen (3.3) och späd med vatten (3.11) till 1 000 ml.

3.8	Surgjord metanol För över 5,0 ml saltsyra (3.6) till en 1 000 ml mätkolv. Späd till märket med metanol (3.5) och blanda. Denna lösning ska vara nyberedd.

3.9	Mobil fas för HPLC: lösning av fosfatbuffert och metanol 5 + 95 (v + v) Blanda 5 ml fosfatbuffertlösning (3.7) med 95 ml metanol (3.5).

3.10	Natriumlasalocid referenssubstans med garanterad renhet, C34H53O8Na (ett natriumsalt av en polyeter-monokarboxylsyra som produceras av Streptomyces lasaliensis), E763

3.10.1

Stamlösning av natriumlasalocid, 500 μg/ml Väg upp 50 mg natriumlasalocid (3.10) med en noggrannhet av 0,1 mg i en 100 ml mätkolv. Lös natriumlasalociden i surgjord metanol (3.8), späd till märket med samma lösningsmedel och blanda. Denna lösning ska vara nyberedd.

3.10.2

Arbetsstandardlösning av natriumlasalocid, 50 μg/ml Pipettera 10,0 ml stamlösning (3.10.1) till en 100 ml mätkolv. Späd till märket med surgjord metanol (3.8) och blanda. Denna lösning ska vara nyberedd.

3.10.3

Kalibreringslösningar Överför 1,0–2,0–4,0–5,0 och 10,0 ml arbetsstandardlösning (3.10.2) till en serie 50 ml mätkolvar. Späd till märket med surgjord metanol (3.8) och blanda. De erhållna lösningarna innehåller 1,0–2,0–4,0–5,0 respektive 10,0 μg natriumlasalocid per ml. Dessa lösningar ska vara nyberedda.

3.11	Vatten, HPLC-kvalitet.

4.   Utrustning

4.1	Termostatreglerat ultraljudsbad (eller skakapparat med vattenbad)

4.2	Membranfilter, 0,45 μm

4.3	HPLC-utrustning med injektor, anpassad för volymer på 20 μl

4.3.1

HPLC-kolonn, 125 × 4 mm, omvänd fas, C18, 5 μm packning eller motsvarande

4.3.2

Spektrofluorometer med variabel excitations- och emissionsvåglängd

5.   Utförande

5.1   Allmänt

5.1.1   Blankprov

Inför utbytesförsöket (5.1.2) analyseras ett blankprov för att kontrollera att varken natriumlasalocid eller störande ämnen är närvarande. Blankprovet bör vara av liknande typ som analysprovet och varken natriumlasalocid eller störande ämnen ska kunna påvisas i det.

5.1.2   Utbytesförsök

Gör ett utbytesförsök genom analys av ett blankprov som spikats med ungefär samma mängd natriumlasalocid som finns i provet. För spikning på nivån 100 mg/kg överförs 10,0 ml stamlösning (3.10.1) till en 250 ml E-kolv och får indunsta till dess att ca 0,5 ml återstår. Tillsätt 50 g av blankprovet, blanda ordentligt, låt stå i 10 minuter och blanda igen flera gånger före extraktionen (5.2).

Om ett blankprov av liknande typ som provet inte finns att tillgå (se 5.1.1), kan ett utbytesförsök göras med standardadditionsmetoden. Det prov som ska analyseras spikas då med ungefär samma mängd natriumlasalocid som finns i provet. Det erhållna provet analyseras sedan tillsammans med ett prov som inte spikats, och utbytet beräknas genom subtraktion.

5.2   Extraktion

5.2.1   Foder

Väg upp 5–10 g av provet med en noggrannhet av 0,01 gram i en 250 ml E-kolv med propp. Tillsätt med pipett 100,0 ml surgjord metanol (3.8). Sätt i proppen löst och rotera kolven för att dispergera provet. Ställ kolven i ett ca 40 oC ultraljudsbad (4.1) i 20 minuter. Ta upp kolven ur badet och låt den svalna till rumstemperatur. Låt stå i ca 1 timme så att de suspenderade partiklarna sjunker till botten. Filtrera en alikvot genom ett 0,45 μm membranfilter (4.2) till ett lämpligt kärl. Gå vidare till HPLC-bestämningen (5.3).

5.2.2   Förblandningar

Väg med en noggrannhet av 0,001 gram upp ca 2 gram av den omalda förblandningen i en 250 ml mätkolv. Tillsätt 100,0 ml surgjord metanol (3.8) och rotera kolven för att dispergera provet. Ställ kolven med innehåll i ett ca 40 oC ultraljudsbad (4.1) i 20 minuter. Ta upp kolven ur badet och låt den svalna till rumstemperatur. Späd till märket med surgjord metanol (3.8) och blanda omsorgsfullt. Låt stå i 1 timme så att de suspenderade partiklarna sjunker till botten. Filtrera en alikvot genom ett 0,45 μm membranfilter (4.2). Späd en lämplig volym av klart filtratet med surgjord metanol (3.8) så att en slutlig provlösning erhålls som innehåller ca 4 μg natriumlasalocid/ml. Gå vidare till HPLC-bestämningen (5.3).

5.3   HPLC-bestämning

5.3.1   Parametrar

Följande betingelser anges som vägledning. Andra betingelser kan väljas om de ger likvärdiga resultat.

HPLC-kolonn (4.3.1):	125 × 4 mm, omvänd fas C18, 5 μm packning eller motsvarande
Mobil fas (3.9):	Blandning av fosfatbuffertlösning (3.7) och metanol (3.5), 5+95 (v+v)
Flödeshastighet:	1,2 ml/min
Detektionsvåglängder:
Excitation:	310 nm
Emission:	419 nm
Injektionsvolym:	20 μl

Kontrollera att det kromatografiska systemet är stabilt genom att upprepade gånger injicera kalibreringslösningen (3.10.3) med koncentrationen 4,0 μg/ml till dess att topphöjder (areor) och retentionstider är konstanta.

5.3.2   Kalibreringskurva

Injicera varje kalibreringslösning (3.10.3) upprepade gånger och bestäm de genomsnittliga topphöjderna (areorna) för varje koncentration. Konstruera en kalibreringskurva med kalibreringslösningarnas genomsnittliga topphöjd (area) längs y-axeln och motsvarande koncentrationer i μg/ml längs x-axeln.

5.3.3   Provlösning

Injicera upprepade gånger de provextrakt som erhållits i 5.2.1 eller 5.2.2. Använd samma volym som för kalibreringslösningen. Bestäm de genomsnittliga topphöjderna (areorna) för natriumlasalocid.

6.   Beräkning av resultat

Använd den genomsnittliga topphöjd (area) som erhållits vid injektion av provlösningen (5.3.3) för att bestämma koncentrationen natriumlasalocid (μg/ml) med hjälp av kalibreringskurvan.

6.1   Foder

Halten av natriumlasalocid, w (mg/kg) i provet beräknas med formeln

[mg/kg]

där:

c	=	koncentrationen av natriumlasalocid i provlösningen (5.2.1) i μg/ml
V1	=	provextraktets volym i ml (= 100 ml), se 5.2.1
m	=	provets vikt i gram.

6.2   Förblandningar

Halten av natriumlasalocid, w (mg/kg) i provet beräknas med formeln

[mg/kg]

där:

c	=	koncentrationen av natriumlasalocid i provlösningen (5.2.1) i μg/ml
V2	=	provextraktets volym i ml (= 250 ml), se 5.2.2
f	=	spädningsfaktor, se 5.2.2
m	=	provets vikt i gram.

7.   Validering av resultaten

7.1   Identitet

Metoder som grundar sig på spektrofluorometri medför inte samma problem med interferenser som metoder med UV-detektion. Analytens identitet kan bekräftas genom co-kromatografi.

7.1.1   Co-kromatografi

Ett provextrakt (5.2.1 eller 5.2.2) spikas genom tillsats av en lämplig mängd kalibreringslösning (3.10.3). Mängden tillsatt natriumlasalocid bör vara ungefär lika stor som den ursprungliga mängden natriumlasalocid i provextraktet. Endast natriumlasalocidtoppens höjd ska öka i förhållande till mängden tillsatt natriumlasalocid och provextraktets spädning. Toppens bredd på halva höjden får inte avvika mer än ± 10 % från värdet för den ursprungliga topp som motsvarar det ospikade provextraktet.

7.2   Repeterbarhet

Skillnaden mellan resultaten från två parallella bestämningar som utförs på samma prov får inte överstiga

—	15 % av det högre värdet, för halter av natriumlasalocid på 30–100 mg/kg,

—	15 mg/kg, för halter på 100–200 mg/kg,

—	7,5 % av det högre värdet, för halter som överstiger 200 mg/kg.

7.3   Utbyte

För det spikade (blank)provet ska utbytet vara minst 80 %. För de spikade förblandningsproven ska utbytet vara minst 90 %.

8.   Resultat av en provningsjämförelse

I en provningsjämförelse (6) analyserades två förblandningar (prov 1 och 2) och fem fodertyper (prov 3–7) av tolv laboratorier. Varje prov analyserades två gånger. Resultaten redovisas i nedanstående tabell.

	Prov 1 Förblandning för kyckling	Prov 2 Förblandning för kalkon	Prov 3 Pellets för kalkon	Prov 4 Kycklingfoder	Prov 5 Kalkonfoder	Prov 6 Fjäderfäfoder A	Prov 7 Fjäderfäfoder B
L	12	12	12	12	12	12	12
n	23	23	23	23	23	23	23
Medelvärde [mg/kg]	5 050	16 200	76,5	78,4	92,9	48,3	32,6
sr [mg/kg]	107	408	1,71	2,23	2,27	1,93	1,75
CVr [ %]	2,12	2,52	2,24	2,84	2,44	4,00	5,37
sR [mg/kg]	286	883	3,85	7,32	5,29	3,47	3,49
CVR [ %]	5,66	5,45	5,03	9,34	5,69	7,18	10,70
Nominell halt [mg/kg]	5 000 (7)	16 000 (7)	80 (7)	105 (7)	120 (7)	50 (8)	35 (8)

L	=	antal laboratorier
n	=	antal enskilda värden
sr	=	standardavvikelse för repeterbarhet
sR	=	standardavvikelse för reproducerbarhet
CVr	=	variationskoefficient för repeterbarhet, %
CVR	=	variationskoefficient för reproducerbarhet, %

---

(1)  Genomförd av arbetsgruppen för foder inom Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs- und Forschungsanstalten (VDLUFA).

(2)  Genomförd av arbetsgruppen för foder inom Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs- und Forschungsanstalten (VDLUFA).

(3)  Andra metoder för uppslutning (t.ex. uppslutning med mikrovågor, under tryck) får användas om man kunnat visa att de ger liknande resultat.

(4)  Grönfoder (färskt eller torkat) innehåller ofta stora mängder silikater. Dessa måste avlägsnas, eftersom spårelement annars riskerar att kvarhållas. Prov från sådant foder måste därför behandlas enligt följande modifierade förfarande: Utför steg 5.1.1.1 till och med filtreringen. Skölj filtrerpapperet med den olösliga återstoden två gånger med kokande vatten, och lägg det sedan i en degel av kvarts eller platina. Glödga i muffelugnen (4.1) vid en temperatur lägre än 550 oC tills allt kolhaltigt material har försvunnit. Låt svalna. Tillsätt några droppar vatten, följt av 10–15 ml fluorvätesyra (3.4) och låt vätskan avdunsta fullständigt vid ca 150 oC. Eventuella kvarvarande silikater i återstoden löses upp i några milliliter fluorvätesyra (3.4) som därefter får avdunsta fullständigt. Tillsätt fem droppar svavelsyra (3.5) och upphetta tills ingen vit rök längre avges. Tillsätt 5 ml 6 M saltsyra (3.2) samt ca 30 ml vatten och upphetta på nytt. Filtrera över lösningen till en 250 ml mätkolv och späd till märket med vatten (HCl-koncentration ca 0,5 M). Fortsätt sedan bestämningen enligt punkt 5.1.2.

(5)  The Analyst 108, 1983, s. 1252–1256.

(6)  Analyst, 1995, 120, 2175–2180.

(7)  Halt deklarerad av tillverkaren.

(8)  Foder berett i laboratoriet.