„PRILOGA IX

SPEKTROFOTOMETRIČNO MERJENJE NA UV-OBMOČJU

PREDGOVOR

Spektrofotometrično merjenje na UV-območju lahko daje informacije o kakovosti maščobe, njenem stanju ohranitve in spremembah, ki so jih v njej povzročili tehnološki procesi. Absorpcijo valovnih dolžin, določenih v postopku, povzroči prisotnost konjugiranih dienov in trienov, ki so posledica oksidacije in/ali rafinacije. Te absorpcije so izražene kot specifične ekstinkcije (ekstinkcija 1-odstotne w/v raztopine maščobe v specificiranem topilu, v 10-milimetrski kiveti), konvencionalno označene s K (imenuje se tudi ‚ekstinkcijski koeficient‘).

1.   NAMEN

Ta priloga opisuje postopek za izvajanje spektrofotometričnega merjenja oljčnega olja na UV-območju.

2.   PRINCIP METODE

Vzorec se raztopi v zahtevanem topilu in absorbanca raztopine se izmeri pri specifični valovni dolžini glede na čisto topilo.

Specifične ekstinkcije pri 232 nm in 268 nm v izooktanu ali 232 nm in 270 nm v cikloheksanu se izračunajo za koncentracijo 1 % w/v v 10-milimetrski kiveti.

3.   OPREMA

3.1   Spektrofotometer, primeren za meritve pri ultravijoličnih valovnih dolžinah (220 nm do 360 nm), z zmožnostjo odčitavanja posameznih nanometrskih enot. Redni pregledi so priporočljivi zaradi natančnosti in obnovljivosti lestvic absorbance in valovnih dolžin ter zaradi razpršene svetlobe.

3.1.1   Lestvica valovnih dolžin: preveriti jo je mogoče z referenčnim materialom, ki ga sestavlja filter iz optičnega stekla s holmijevim oksidom ali raztopino holmijevega oksida (zatesnjeno ali ne), ki ima izrazite absorpcijske pasove. Referenčni material je namenjen preverjanju in kalibriranju lestvic valovnih dolžin spektrofotometrov za vidno in ultravijolično svetlobo z nominalnimi spektralnimi širinami 5 nm ali manj. Meritve se izvedejo proti zraku kot slepemu vzorcu v razponu valovnih dolžin od 640 do 240 nm v skladu z navodili, priloženimi referenčnemu materialu. Pri vsaki spremembi širine špranje se izvede korekcija bazne linije s prazno potjo svetlobnega pramena. Valovne dolžine v skladu s standardom so navedene v potrdilu referenčnega materiala.

3.1.2   Lestvica absorbance: preveriti jo je mogoče z zatesnjenim referenčnim materialom, ki je v prodaji in ki ga sestavljajo kisle raztopine kalijevega dikromata, v določenih koncentracijah in certificiranih vrednostih absorbance pri valovni dolžini maksimalne absorbance (v nadaljnjem besedilu: λmax) (iz 4 raztopin kalijevega dikromata in perklorove kisline, ki so zaprti v štirih ultravijoličnih kvarčnih kivetah za merjenje linearnosti in fotometrične natančnosti na ultravijoličnem območju). Raztopine kalijevega dikromata se izmerijo proti slepemu vzorcu uporabljene kisline, po korekciji bazne linije, v skladu z navodili, priloženimi referenčnemu materialu. Vrednosti absorbance so navedene v potrdilu referenčnega materiala.

Drug način preverjanja odzivnosti fotocelice in fotopomnoževalke je naslednji: natehtajte 0,2000 g čistega kalijevega kromata za spektrofotometrijo in raztopite 0,05 raztopine N kalijevega hidroksida v 1 000-mililitrsko graduirano bučko in dolijte do oznake. Vzemite natančno 25 ml dobljene raztopine, prenesite jo v 500-mililitrsko graduirano bučko in razredčite do oznake z isto raztopino kalijevega hidroksida.

Izmerite ekstinkcijo tako dobljene raztopine pri 275 nm, raztopino kalijevega hidroksida uporabite kot referenco. Ekstinkcija, izmerjena z uporabo 1 cm kivete, bi morala biti 0,200 ± 0,005.

3.2   Pravokotne kvarčne kivete, s pokrovčki, primerne za meritve pri ultravijoličnih valovnih dolžinah (220 do 360 nm), z optičnim dosegom 10 mm. Če jih napolnimo z vodo ali drugim primernim topilom, ne smejo kazati razlik med njimi za več kot 0,01 ekstinkcijske enote.

3.3   Merilne bučke z eno oznako s prostornino 25 ml, razred A.

3.4   Analitska tehtnica, ki omogoča tehtanje do 0,0001 g natančno.

4.   REAGENTI

Če ni določeno drugače, pri analizi uporabite le reagente priznane čistoče za analizo in destilirano ali demineralizirano vodo ali vodo enakovredne čistoče.

Topilo: izooktan (2,2,4-trimetilpentan) za merjenje pri 232 nm in 268 nm ter cikloheksan za merjenje pri 232 nm in 270 nm z absorbanco, manjšo od 0,12 pri 232 nm in manjšo od 0,05 pri 270 nm, proti destilirani vodi, izmerjeno v 10-milimetrski kiveti.

5.   POSTOPEK

5.1   Vzorec mora biti popolnoma homogen in brez suspendiranih nečistoč. Sicer ga je treba filtrirati skozi papir pri temperaturi približno 30 °C.

5.2   Točno natehtajte približno 0,25 g (na 1 mg natančno) tako pripravljenega vzorca v 25-mililitrsko merilno bučko, dopolnite do oznake s specificiranim topilom in homogenizirajte. Tako pripravljena raztopina mora biti popolnoma čista. Če je raztopina opalescentna ali motna, hitro prefiltrirajte skozi papir.

OPOMBA: Na splošno za merjenje absorbance deviških in ekstra deviških oljčnih olj pri 268 nm in 270 nm zadostuje masa 0,25–0,30 g. Za merjenje pri 232 nm je običajno potrebnega 0,05 g vzorca, zato se običajno pripravita dve ločeni raztopini. Za merjenje absorbance olj iz oljčnih tropin, rafiniranih oljčnih olj in oljčnih olj s primesmi je zaradi njihove večje absorbance običajno potreben manjši vzorec, npr. 0,1 g.

5.3   Če je potrebno, popravite bazno linijo (220–290 nm) s topilom v obeh kvarčnih kivetah (vzorčni in referenčni), potem napolnite vzorčno kvarčno kiveto s preskusno raztopino in izmerite ekstinkcije pri 232, 268 ali 270 nm nasproti topilu, ki se uporabi kot referenca.

Izmerjene ekstinkcijske vrednosti morajo biti v razponu od 0,1 do 0,8 ali v razponu linearnosti spektrofotometra, ki jo je treba preveriti. Če niso, je treba meritve ponoviti z ustreznimi bolj koncentriranimi ali bolj razredčenimi raztopinami.

5.4   Po opravljenih meritvah absorbance pri 268 ali 270 nm izmerite absorbanco pri λmax, λmax + 4 in λmax – 4. Na podlagi teh vrednosti absorbance se določi variacija specifične ekstinkcije (ΔΚ).

OPOMBA: λmax se obravnava kot 268 nm za izooktan, ki se uporablja kot topilo, in 270 nm za cikloheksan.

6.   IZRAŽANJE REZULTATOV

6.1   Zapišite specifične ekstinkcije (ekstinkcijske koeficiente) pri različnih valovnih dolžinah, izračunane, kot sledi:

pri čemer:

Κλ	=	specifična ekstinkcija pri valovni dolžini λ;
Ελ	=	ekstinkcija, izmerjena pri valovni dolžini λ;
c	=	koncentracija raztopine v g/100 ml;
s	=	dolžina poti kvarčne kivete v cm;

izražene na dve decimalni mesti natančno.

6.2   Variacija specifične ekstinkcije (ΔΚ)

Variacija absolutne vrednosti ekstinkcije (ΔΚ) se izračuna na naslednji način:

pri čemer je Km specifična ekstinkcija pri valovni dolžini maksimalne absorbance pri 270 nm in 268 nm, odvisno od uporabljenega topila.

Rezultati se izrazijo na dve decimalni mesti natančno.“

PRILOGA X

DOLOČANJE METILNIH ESTROV MAŠČOBNIH KISLIN S PLINSKO KROMATOGRAFIJO

1.   NAMEN

V tej prilogi so navodila za določanje prostih in vezanih maščobnih kislin v masti in oljih rastlinskega izvora s plinsko kromatografijo po njihovi pretvorbi v metil estre maščobnih kislin (FAME).

Vezane maščobne kisline triacilglicerolov (TAG) in glede na metodo esterifikacije proste maščobne kisline (FFA) se pretvorijo v metil estre maščobnih kislin (FAME), ki se določijo s kapilarno plinsko kromatografijo.

Metoda iz te priloge omogoča določitev FAME od C12 do C24, vključno z nasičenimi, cis in trans mononenasičenimi ter cis in trans polinenasičenimi metil estri maščobnih kislin.

2.   PRINCIP

Plinska kromatografija se uporablja za kvantitativno analizo FAME. FAME se pripravijo v skladu z delom A. Potem se vbrizgajo v injektor in v njem uparijo. Ločevanje FAME se izvaja z analitskimi kolonami s specifično polarnostjo in dolžino. Za ugotavljanje prisotnosti FAME se uporablja plamensko-ionizacijski detektor. Pogoji analize so določeni v delu B.

Kot nosilni plin (mobilna faza) v plinski kromatografiji FAME s plamensko-ionizacijskim detektorjem se lahko uporabi vodik ali helij. Vodik pospeši ločevanje in zagotovi ostrejše vrhove. Stacionarna faza je mikroskopska plast tankega tekočega filma na inertni trdni podlagi iz zlitega silicijevega dioksida.

Pri prehodu skozi kapilarno kolono hlapne spojine, ki se analizirajo, reagirajo s stacionarno fazo, ki je nanesena na notranji površini kolone. Zaradi različnih reakcij različnih spojin je čas eluiranja teh spojin različen, tj. retenzijski čas spojine za določen sklop analiznih parametrov. Primerjava retenzijskih časov se uporablja za določanje različnih spojin.

DEL A

PRIPRAVA METILNIH ESTROV MAŠČOBNIH KISLIN IZ OLJČNEGA OLJA IN OLJA IZ OLJČNIH TROPIN

1.   NAMEN

Ta del določa pripravo metilnih estrov maščobnih kislin. Vključuje metodi za pripravo metilnih estrov maščobnih kislin iz oljčnega olja in olja iz oljčnih tropin.

2.   PODROČJE UPORABE

Priprava metilnih estrov maščobnih kislin iz oljčnega olja in olja iz oljčnih tropin se izvaja s transesterifikacijo z metanolno raztopino kalijevega hidroksida pri sobni temperaturi. Potreba po čiščenju vzorca pred transesterifikacijo je odvisna od vsebnosti prostih maščobnih kislin v vzorcu in analitskega parametra, ki se lahko določi glede na naslednjo preglednico:

Kategorija olja	Metoda
Deviško oljčno olje z vsebnostjo kislin ≤ 2,0 %	1. maščobne kisline 2. transmaščobne kisline 3. ΔECN42 (po čiščenju z ekstrakcijo v trdni fazi na silikagelnih kartušah)
Rafinirano oljčno olje
Oljčno olje, sestavljeno iz rafiniranih oljčnih olj in deviških oljčnih olj
Rafinirano oljčno olje iz oljčnih tropin
Oljčno olje iz oljčnih tropin
Deviško oljčno olje z vsebnostjo kislin > 2,0 % Surovo oljčno olje iz oljčnih tropin	1. maščobne kisline (po čiščenju z ekstrakcijo v trdni fazi na silikagelnih kartušah) 2. transmaščobne kisline (po čiščenju z ekstrakcijo v trdni fazi na silikagelnih kartušah) 3. ΔECN42 (po čiščenju z ekstrakcijo v trdni fazi na silikagelnih kartušah)

3.   METODOLOGIJA

3.1   Transesterifikacija z metanolno raztopino kalijevega hidroksida pri sobni temperaturi

3.1.1   Princip

Metilni estri se pripravijo s transesterifikacijo z metanolno raztopino kalijevega hidroksida kot vmesna stopnja pred izvedbo umiljenja.

3.1.2   Reagenti

3.1.2.1   Metanol, ki vsebuje največ 0,5 % (m/m) vode.

3.1.2.2   Heksan kromatografske čistoče.

3.1.2.3   Heptan kromatografske čistoče.

3.1.2.4   Dietil eter, stabiliziran za analizo.

3.1.2.5   Aceton kromatografske čistoče.

3.1.2.6   Elucijsko topilo za čiščenje olja s kolonsko kromatografijo/kromatografijo z ekstrakcijo v trdni fazi, mešanica heksana/dietilnega etra 87/13 (v/v).

3.1.2.7   Kalijev hidroksid, približno 2 M metanolne raztopine: raztopite 11,2 g kalijevega hidroksida v 100 ml metanola.

3.1.2.8   Silikagelne kartuše, 1 g (6 ml), za ekstrakcijo v trdni fazi.

3.1.3   Oprema

3.1.3.1   Epruvete z navojnim zamaškom (s prostornino 5 ml), opremljene s priključkom iz politetrafluoroetilena.

3.1.3.2   Merilna in avtomatska pipeta, prostornine 2 ml in 0,2 ml.

3.1.4   Čiščenje vzorcev olj

Vzorci se po potrebi očistijo, pri čemer se olje spusti skozi silikagelno kartušo za ekstrakcijo v trdni fazi. Silikagelna kartuša (3.1.2.8) se vstavi v vakuumsko napravo za eluiranje in izpere s 6 ml heksana (3.1.2.2); izpiranje se izvede brez vakuuma. Potem se v kolono vnese raztopina olja (približno 0,12 g) v 0,5 ml heksana (3.1.2.2). Raztopina gre skozi kolono in nato eluira z 10 ml heksana/dietil etra (87:13 v/v) (3.1.2.6). Združena eluata se homogenizirata in ločita na dva enaka dela. Alikvot se odpari do suhega v rotacijskem izparilniku pod znižanim pritiskom in pri sobni temperaturi. Ostanek se raztopi v 1 ml heptana in raztopina je pripravljena na analizo maščobnih kislin s plinsko kromatografijo. Drugi alikvot se odpari in ostanek se raztopi v 1 ml acetona za analizo trigliceridov s HPLC, če je to potrebno.

3.1.5   Postopek

V epruveti z navojnim zamaškom in prostornino 5 ml (3.1.3.1) natehtajte približno 0,1 g vzorca olja. Dodajte 2 ml heptana (3.1.2.2) in pretresite. Dodajte 0,2 ml metanolne raztopine kalijevega hidroksida (3.1.2.7), zaprite epruveto z zamaškom, opremljenim s priključkom iz politetrafluoroetilena, in ga čvrsto zamašite ter močno tresite 30 sekund. Pustite, da se razsloji, dokler zgornja raztopina ne postane bistra. Z dekantiranjem ločite zgornjo plast, ki vsebuje metilne estre. Raztopina heptana je pripravljena za vbrizganje v plinski kromatograf. Priporočljivo je, da se raztopina do analize s plinsko kromatografijo hrani v hladilniku. Hramba raztopine več kot 12 ur ni priporočljiva.

DEL B

ANALIZA METILNIH ESTROV MAŠČOBNIH KISLIN S PLINSKO KROMATOGRAFIJO

1.   NAMEN

Ta del vključuje splošne smernice za uporabo plinske kromatografije s kapilarnimi kolonami za določanje kvalitativne in kvantitativne sestave mešanice metilnih estrov maščobnih kislin, dobljenih v skladu z metodo iz dela A.

Ta del se ne uporablja za polimerizirane maščobne kisline.

2.   REAGENTI

2.1   Nosilni plin

Inertni plin (helij ali vodik), popolnoma posušen in z vsebnostjo kisika, nižjo od 10 mg/kg.

Opomba 1:

Vodik lahko podvoji hitrost analize, vendar je nevaren. Varnostne naprave so na voljo.

2.2   Pomožni plini

2.2.1   Vodik (čistost ≥ 99,9 %), brez organskih nečistoč.

2.2.2   Zrak ali kisik, brez organskih nečistoč.

2.2.3   Dušik (čistost > 99 %).

2.3   Referenčni standard

Mešanica metilnih estrov čistih maščobnih kislin ali metilnih estrov maščobe poznane sestave, po možnosti podobne maščobi, ki jo je treba analizirati. Cis in trans izomeri oktadecenojskih, oktadekadienojskih in oktadekatrienojskih metilnih estrov so uporabni za določanje trans izomerov nenasičenih kislin.

Treba je paziti, da se prepreči oksidacija polinenasičenih maščobnih kislin.

3.   OPREMA

Navedena navodila se nanašajo na običajno opremo, ki se uporablja za plinsko kromatografijo, z uporabo kapilarnih kolon in plamensko ionizacijskega detektorja.

3.1   Plinski kromatograf

Plinski kromatograf vključuje naslednje elemente:

3.1.1   Sistem za vbrizgavanje

Uporabite sistem za vbrizgavanje s kapilarnimi kolonami, pri čemer mora biti sistem za vbrizgavanje posebej izdelan za uporabo s takšnimi kolonami. Lahko je tip sistema z deljenjem vzorca ali brez deljenja vzorca v koloni.

3.1.2   Peč

Peč je takšna, da lahko segreje kapilarno kolono na temperaturo najmanj 260 °C in ohranja želeno temperaturo do ± 0,1 °C natančno. Zadnja zahteva je zlasti pomembna, kadar se uporablja kapilarna kolona.

Uporaba programiranega temperaturnega gretja se priporoča v vseh primerih in zlasti za maščobne kisline z manj kot 16 ogljikovimi atomi.

3.1.3   Kapilarna kolona

3.1.3.1   Kolona, iz materiala, inertnega na snovi, ki naj bi se analizirale (običajno steklo ali kvarčno steklo). Notranji premer je med 0,20 in 0,32 mm. Notranja površina mora biti ustrezno obdelana (npr. površinska obdelava, pasiviranje) pred nanosom stacionarne faze. Za maščobne kisline ter cis in trans izomere maščobnih kislin zadostuje dolžina 60 m.

3.1.3.2   Primerne so kolone z vezano (zamreženo) stacionarno fazo tipa polarni polisiloksan (cianopropilsilikon).

Opomba 2:

Obstaja nevarnost, da polarni polisiloksani povzročijo težave pri določanju in ločevanju linolenske kisline in pri kislinah C20.

Nanosi so tanki, tj. 0,1 do 0,2 μm.

3.1.3.3   Namestitev in kondicioniranje kolone

Upoštevajte običajne varnostne ukrepe za montažo kapilarnih kolon, tj. namestitev kolone v peči (nosilec), izbira in montaža priključkov (tesnjenje), pozicioniranje končnih mest kolone v injektorju in na detektorju (zmanjšanje mrtvih volumnov). Pretok nosilnega plina za kolono dolžine 25 m in notranjega premera 0,3 mm naj bo 0,3 bara (30 kPa).

Kondicionirajte kolono s temperaturnim programiranjem peči s hitrostjo 3 °C/min od temperature okolja na temperaturo 10 °C pod temperaturo razpada stacionarne faze. Vzdržujte tako temperaturo peči eno uro do stabilizacije bazne linije. Ohladite jo na 180 °C in nadaljujte pod izotermičnimi pogoji.

Opomba 3:

Ustrezno predhodno kondicionirane kolone so na voljo v prodaji.

3.1.4   Plamensko ionizacijski detektor in konverter-ojačevalec

3.2   Brizgalka

Brizgalka je maksimalne kapacitete 10 μl z razdelki na 0,1 μl.

3.3   Sistem za pridobivanje podatkov

Sistem za pridobivanje podatkov je prek spleta povezan z detektorji in se uporablja s programsko opremo, primerno za integracijo in normalizacijo vrhov.

4.   POSTOPEK

Postopki, opisani v 4.1 do 4.3, se nanašajo na uporabo plamensko ionizacijskega detektorja.

4.1   Preskusni pogoji

4.1.1   Izbor optimalnih delovnih pogojev za kapilarne kolone

Zaradi učinkovitosti in prepustnosti kapilarnih kolon sta ločevanje sestavin in trajanje analize v veliki meri odvisna od pretoka nosilnega plina v koloni. Zato bo treba optimizirati delovne pogoje s prilagoditvijo tega parametra (ali preprosto izgube glave kolone), odvisno od tega, ali je cilj izboljšati ločevanje ali pospešiti analizo.

Naslednji pogoji so se izkazali za primerne za ločevanje FAME (C4 do C26). Primeri kromatogramov so navedeni v Dodatku B:

Temperatura injektorja:	250 °C
Temperatura detektorja:	250 °C
Temperatura peči:	165 °C (8 min) do 210 °C pri 2 °C/min
Nosilni plin hidrogen:	tlak v glavi kolone, 179 kPa
Skupni pretok:	154,0 ml/min
Delilno razmerje:	1:100
Volumen, ki se vbrizga:	1 μl

4.1.2   Določanje resolucije (glej Dodatek A)

Izračunajte resolucijo R dveh sosednjih vrhov I in II na podlagi naslednje formule:

R = 2 × ((dr(II) – d r(I))/(ω(I) + ω(II))) ali R = 2 × ((tr(II) – t r(I))/(ω(I) + ω(II))) (USP) (Farmakopeja Združenih držav Amerike)

ali

R = 1,18 × ((tr(II) – tr(I))/(ω0,5(I) + ω0,5(II))) (EP, BP, JP, DAB) (JP (Japonska farmakopeja), EP (Evropska farmakopeja), BP (Britanska farmakopeja))

pri čemer je:

d r(I)	retenzijska razdalja vrha I;
d r(II)	retenzijska razdalja vrha II;
t r(I)	retenzijski čas vrha I;
t r(II)	retenzijski čas vrha II;
ω(I)	širina baze vrha I;
ω(II)	širina baze vrha II;
ω0,5	širina vrha določene spojine na sredini višine vrha.

Če velja ω(I) ≈ ω(II), izračunajte R na podlagi naslednje formule:

R = (dr(II) – d r(I))/ω = (dr(II) – d r(I))/4σ

pri čemer je:

σ	običajno odstopanje (glej sliko 1 v Dodatku A).

Če je razdalja dr med dvema vrhovoma d r(II) – d r(I) enaka 4σ, je faktor ločljivosti R = 1.

Če vrhova nista popolnoma ločena, se tangenti na prevojnih točkah sekata na točki C. Da bi bila vrha popolnoma ločena, mora biti razdalja med njima enaka:

d r(II) – d r(I) = 6 σ, pri čemer je R = 1,5 (glej sliko 3 v Dodatku A).

5.   IZRAŽANJE REZULTATOV

5.1   Kvalitativna analiza

Identificirajte vrhove metilnih estrov v vzorcu iz kromatograma iz slike 1 v Dodatku B, po potrebi z interpolacijo ali primerjavo z referenčnimi mešanicami za vrhove metilnih estrov (kot je navedeno v točki 2.3).

5.2   Kvantitativna analiza

5.2.1   Določanje sestave

Izračunajte masni delež w i posameznih metilnih estrov maščobnih kislin, izražen kot masni odstotni delež metilnih estrov, na naslednji način:

5.2.2   Metoda izračuna

5.2.2.1   Splošni primer

Izračunajte vsebnost dane komponente i, izražene kot masni odstotni delež metilnih estrov, tako da določite površinski delež zadevnega vrha glede na vsoto površin vseh vrhov, na podlagi naslednje formule:

wi = (Ai/ΣA) × 100

pri čemer je:

Ai	površina vrha posameznega metilnega estra maščobnih kislin i;
ΣA	vsota površin vseh vrhov vseh metilnih estrov maščobnih kislin.

Rezultati se izrazijo na dve decimalni mesti natančno.

Opomba 4:

Pri maščobah in oljih je masni delež metilnih estrov maščobnih kislin enak masnemu deležu triacilglicerolov v gramih na 100 g. V primerih, ko ta predpostavka ni dovoljena, glej 5.2.2.2.

5.2.2.2   Uporaba korekcijskih faktorjev

V določenih primerih, na primer ob prisotnosti maščobnih kislin z manj kot osmimi ogljikovimi atomi ali kislinami s sekundarnimi skupinami, se površine popravijo s specifičnimi korekcijskimi faktorji (Fci). Ti faktorji se določijo za vsak instrument. V ta namen se uporabi primeren referenčni material s certificirano sestavo maščobnih kislin v ustreznem razponu.

Opomba 5:

Ti korekcijski faktorji niso enaki teoretičnim korekcijskim faktorjem plamensko-ionizacijskega detektorja iz Dodatka A, ki vključujejo tudi uspešnost sistema za vbrizgavanje itd. Vendar bi bilo treba v primeru večjih razlik preveriti uspešnost celotnega sistema.

Za to referenčno mešanico je masni odstotni delež FAME i podan s formulo:

wi = (mi /Σm) × 100

pri čemer:

m i je masa FAME i v referenčni mešanici;

Σm je vsota mas vseh sestavin kot FAME v referenčni mešanici.

Iz kromatograma referenčne mešanice izračunajte odstotni delež površine FAME i, kot sledi:

wi = (Ai/ΣA) × 100

pri čemer:

Ai je površina FAME i v referenčni mešanici;

ΣA je vsota vseh površin vseh FAME v referenčni mešanici.

Korekcijski faktor Fc se izračuna:

Fc = (mi × ΣA)/(Ai/Σm)

V vzorcu se masni odstotni delež posameznega FAME i izračuna:

wi = (Fi × Ai)/Σ (Fi × Ai)

Rezultati se izrazijo na dve decimalni mesti natančno.

Opomba 6:

Izračunana vrednost ustreza masnemu odstotnemu deležu posamezne maščobne kisline, ki je izračunan kot triacilgliceroli na 100 g maščobe.

5.2.2.3   Uporaba internega standarda

Pri nekaterih analizah (na primer, kadar vse maščobne kisline niso kvantificirane, kot v prisotnosti kislin s štirimi ali šestimi ogljiki ob kislinah s 16 ali 18 ogljikovimi atomi ali kadar je treba določiti absolutno količino maščobne kisline v vzorcu) je treba uporabiti interni standard. Pogosto se uporabljajo maščobne kisline s 5, 15 ali 17 ogljikovimi atomi. Treba je določiti (morebitni) korekcijski faktor za interni standard.

Masni odstotni delež sestavine i, izražen kot metilni estri, je potem podan s formulo:

wi = (mIS × Fi × Ai)/(m × FIS × AIS)

pri čemer:

A i je površina FAME i;

A IS je površina internega standarda;

F i je korekcijski faktor maščobne kisline i, izražene kot FAME;

F IS je korekcijski faktor internega standarda;

m je masa vzorca za analizo v miligramih;

m IS je masa internega standarda v miligramih.

Rezultati se izrazijo na dve decimalni mesti natančno.

6.   POROČILO O PRESKUSU

V poročilu o preskusu se navedejo metode, uporabljene za pripravo metilnih estrov in za analizo s plinsko kromatografijo. Navedejo se tudi vse delovne podrobnosti, ki v tej standardni metodi niso določene ali veljajo za neobvezne, skupaj s podrobnostmi kakršnega koli dogodka, ki bi lahko vplival na rezultate.

Poročilo o preskusu vključuje vse informacije, potrebne za popolno identifikacijo vzorca.

7.   TOČNOST

7.1   Rezultati medlaboratorijskega preskusa

Podrobnosti medlaboratorijskega preskusa glede točnosti metode so določene v Prilogi C k standardu IOC/T.20/Dok. št. 33. Vrednosti, ki izhajajo iz tega medlaboratorijskega preskusa, mogoče ne bodo ustrezale razponom koncentracij in matricam, ki se od danih razlikujejo.

7.2   Ponovljivost

Absolutna razlika med rezultatoma dveh neodvisnih posameznih preskusov, ki ju v kratkem časovnem presledku po enaki metodi na enakem preskusnem materialu v istem laboratoriju izvede isti izvajalec z uporabo iste opreme, ne sme biti v več kot 5 % primerov večja od vrednosti r iz preglednic 1 do 14 iz Priloge C k standardu IOC/T.20/Dok. št. 33.

7.3   Obnovljivost

Absolutna razlika med rezultatoma dveh posameznih preskusov, ki sta bila pridobljena po enaki metodi na enakem preskusnem materialu v različnih laboratorijih pri različnih izvajalcih, ki so uporabljali različno opremo, bo v največ 5 % primerov večja od vrednosti R iz preglednic 1 do 14 iz Priloge C k standardu IOC/T.20/Dok. št. 33.