| (6) | Dodajo se naslednja poglavja od C.31 do C.46: | „ | C.31 PRESKUS KOPENSKIH RASTLIN: PRESKUS VZNIKA IN RASTI SEJANCEV: | UVOD | 1. | Ta preskusna metoda je enakovredna Smernici za preskušanje OECD (TG) 208 (2006). Preskusne metode se ob upoštevanju znanstvenega napredka in uporabnosti za zakonodajno uporabo redno preverjajo. Ta posodobljena preskusna metoda je zasnovana za ocenjevanje potencialnih učinkov kemikalij na vznik in rast sejancev. Kot taka ne zajema kroničnih učinkov ali učinkov na razmnoževanje (npr. oploditev in razvoj semen, oblikovanje cvetov, zorenje plodov). Treba je upoštevati pogoje izpostavljenosti in lastnosti kemikalije, ki bo preskušena, s čimer se zagotovi uporaba ustreznih preskusnih metod (pri preskušanju kovin/kovinskih spojin je npr. treba upoštevati učinke vrednosti pH in povezanih protiionov) (1). Ta preskusna metoda ni namenjena rastlinam, ki so izpostavljene hlapom kemikalij. To preskusno metodo je mogoče uporabiti pri preskušanju splošnih kemikalij, biocidov in fitofarmacevtskih sredstev (ki so znani tudi kot izdelki za zaščito rastlin ali pesticidi). Razvita je bila na osnovi obstoječih metod (2)(3)(4)(5)(6)(7). Upoštevani so bili tudi drugi viri, ki se nanašajo na preskušanje rastlin (8)(9)(10). Uporabljene opredelitve so navedene v Dodatku 1. | NAČELO PRESKUSA | 2. | Preskus ocenjuje učinke na vznik sejancev in zgodnjo rast višjih rastlin po izpostavljenosti preskusni kemikaliji v tleh (ali drugem primernem matriksu tal). Semena se namestijo v stik s tlemi, tretiranimi s preskusno kemikalijo, po obdobju od 14 do 21 dni po 50-odstotnem vzniku sejancev v kontrolni skupini pa se ocenijo učinki nanje. Merjene končne točke so vizualna ocena vznika sejancev, suha teža poganjkov (alternativno sveža teža poganjkov) in v določenih primerih višina poganjkov ter ocena vidnih škodljivih učinkov na različne dele rastline. Meritve in opažanja se primerjajo s tistimi pri netretiranih kontrolnih rastlinah. | 3. | Odvisno od pričakovanega načina izpostavljenosti se preskusna kemikalija vnese v tla (ali v morebitni matriks umetnih tal) ali pa se nanese na površino tal; izbere se možnost, ki ustrezno predstavlja potencialni način izpostavljenosti kemikaliji. Vnos v tla se izvede s tretiranjem tal v razsutem stanju. Po nanosu se tla prenesejo v posode, nato pa se vanje posejejo semena dane rastlinske vrste. Nanosi na površino se izvedejo na tleh, prenesenih v posode, v katerih so že posejana semena. Preskusne enote (kontrole ter tretirana tla in semena) se nato namestijo v ustrezne pogoje, ki podpirajo kalitev/rast rastlin. | 4. | Lahko se izvede preskus za določanje krivulje odmerek-odziv ali pri eni sami koncentraciji/stopnji aplikacije kot mejni preskus v skladu s cilji študije. Če rezultati preskusa z eno samo koncentracijo/stopnjo aplikacije presegajo določeno raven strupenosti (npr. če so opaženi učinki večji od x %), se izvede preskus za določanje območja delovanja, s katerim se določijo zgornje in spodnje meje za strupenost, sledi pa mu preskus z več koncentracijami/stopnjami aplikacije za pridobitev krivulje odmerek-odziv. Uporabi se ustrezna statistična analiza za pridobitev učinkovite koncentracije ECx ali učinkovite stopnje aplikacije ERx (npr. EC25, ER25, EC50, ER50) za najbolj občutljive zadevne parametre. V tem preskusu je mogoče izračunati tudi koncentracijo brez opaznega učinka (NOEC) in najnižjo koncentracijo z opaznim učinkom (LOEC). | PODATKI O PRESKUSNI KEMIKALIJI | 5. | Naslednji podatki so uporabni za ugotavljanje pričakovanega načina izpostavljenosti in pri načrtovanju preskusa: strukturna formula, čistost, topnost v vodi, obstojnost v organskih topilih, porazdelitveni koeficient 1-oktanol/voda, vedenje pri sorpciji v tleh, parni tlak, kemijska stabilnost v vodi in na svetlobi ter biorazgradljivost. | VELJAVNOST PRESKUSA | 6. | Da bi bil preskus veljaven, morajo kontrole izpolnjevati naslednja merila: | — | vznik sejancev je vsaj 70-odstoten, | — | sejanci ne kažejo vidnih fitotoksičnih učinkov (npr. kloroze, nekroze, venenja, deformacij listov in stebel), rastline pa izkazujejo le normalno variacijo rasti in morfologije za to določeno vrsto, | — | srednja stopnja preživetja vzniknjenih kontrolnih sejancev v času trajanja študije je vsaj 90 %, | — | okoljski pogoji za določeno vrsto so enaki in rastni substrati vsebujejo enako količino matriksa tal, podpornih substratov ali substrata iz istega vira. | REFERENČNA KEMIKALIJA | 7. | Referenčno kemikalijo je v rednih časovnih razmikih mogoče preskusiti, da se preveri, ali se izvedba preskusa ter odziv določenih preskusnih rastlin in preskusni pogoji skozi čas niso znatno spremenili. Namesto tega je mogoče za oceno učinkovitosti preskusnega sistema v določenih laboratorijih uporabiti pretekle meritve biomase ali rasti, kar lahko služi kot interni laboratorijski ukrep kontrole kakovosti. | OPIS METODE | Naravna tla – umetni substrat | 8. | Rastline je mogoče gojiti v posodah s peščeno ilovico, ilovnatim peskom ali peščeno glinasto ilovico, ki vsebuje do 1,5 odstotka organskega ogljika (pribl. 3 odstotke organske snovi). Uporabi se lahko tudi komercialna prst za sajenje lončnic ali sintetična mešanica tal, ki vsebuje do 1,5 odstotka organskega ogljika. Če je znano, da ima preskusna kemikalija visoko afiniteto za glino, se glinenih tal ne sme uporabljati. Naravna tla je treba presejati na 2-milimetrske delce, da se homogenizirajo in da se odstranijo grobi delci. Poročati je treba o vrsti in teksturi, odstotku organskega ogljika, vrednosti pH in vsebnosti soli, izmerjeni kot električna prevodnost končnih pripravljenih tal. Tla je treba razvrstiti v skladu s standardnim sistemom za razvrščanje (11). Tla se lahko pasterizirajo ali toplotno obdelajo, da se zmanjša učinek talnih patogenov. | 9. | Pri naravnih tleh je zaradi spreminjajočih se fizikalnih/kemijskih lastnosti in mikrobnih populacij razlaga rezultatov lahko bolj zapletena. Te spremenljivke spreminjajo sposobnost zadrževanja vlage, sposobnost vezave kemikalije, zračnost ter vsebino hranil in elementov v sledovih. Poleg variacij teh fizikalnih dejavnikov bo obstajala tudi variacija kemijskih lastnosti, kot sta vrednost pH in redoks potencial, ki lahko vpliva na biološko razpoložljivost preskusne kemikalije (12)(13)(14). | 10. | Umetni substrati se običajno ne uporabljajo za preskušanje fitofarmacevtskih sredstev, lahko pa so uporabni pri preskušanju splošnih kemikalij ali tam, kjer se želi kar najbolj zmanjšati variabilnost naravnih tal in povečati primerljivost rezultatov preskusa. Uporabljeni substrati morajo biti iz inertnih materialov, ki kar najbolj zmanjšajo interakcijo s preskusno kemikalijo ali topilom kot nosilcem ali pa z obema. Ugotovljeno je, da so s kislino opran kremenov pesek, mineralna volna in steklene kroglice (npr. s premerom od 0,35 do 0,85 mm) primerni inertni materiali, ki kar najmanj absorbirajo preskusno kemikalijo (15), kar omogoča, da je kemikalija z vsrkavanjem prek korenin v kar največji meri na voljo sejancu. Med neprimernimi substrati so vermikulit, perlit in drugi zelo absorptivni materiali. Zagotovljene morajo biti hranilne snovi za rast rastlin, ki poskrbijo, da rastline niso v stresu zaradi pomanjkanja hranilnih snovi, to pa je treba, kadar je le mogoče, oceniti s kemijsko analizo ali z vizualno oceno kontrolnih rastlin. | Merila za izbiro preskusnih vrst | 11. | Da izbrana vrsta razvije niz odzivov, mora biti razumno obsežna, npr. glede svoje taksonomske pestrosti v rastlinskem kraljestvu, svoje porazdelitve, pogostnosti, značilnosti življenjskega cikla posamezne vrste in območja pojavljanja v naravi (8)(10)(16)(17)(18)(19)(20). Pri izbiri je treba upoštevati naslednje značilnosti potencialnih preskusnih vrst: | — | vrste imajo enotna semena, ki so lahko dostopna pri zanesljivih standardnih virih semen ter ki dosegajo skladno, zanesljivo in enakomerno kalivost ter enotno rast sejancev, | — | rastlino je mogoče preskusiti v laboratoriju ter lahko daje zanesljive in ponovljive rezultate v okviru preskusnih infrastruktur in primerjalno med njimi, | — | občutljivost preskušane vrste mora biti skladna z odzivi rastlin, odkritih v okolju, ki je izpostavljeno kemikaliji, | — | vrste so bile do neke mere uporabljene v predhodnih preskusih strupenosti, njihova uporaba, npr. pri bioloških preskusih herbicidov, presejanju za težke kovine, obremenitvenih preskusih za slanost in minerale ali študijah alelopatije, pa kaže občutljivost na mnogo različnih obremenilnih dejavnikov, | — | vrste so združljive z rastnimi pogoji preskusne metode, | — | zadoščajo merilom za veljavnost preskusa. | Nekatere od preskusnih vrst, ki so bile v preteklosti najbolj uporabljane, so navedene v Dodatku 2, potencialne nekmetijske rastline pa v Dodatku 3. | 12. | Število vrst, ki bodo preskušene, je odvisno od ustreznih zakonskih zahtev, zato v tej preskusni metodi ni navedeno. | Uporaba preskusne kemikalije | 13. | Kemikalijo je treba nanesti v ustreznem nosilcu (npr. vodi, acetonu, etanolu, polietilen glikolu, gumi arabikumu, pesku). Mogoče je preskusiti tudi zmesi (formulirane produkte ali formulacije), ki vsebujejo aktivne snovi in različne adjuvanse. | Vnos v tla/umetni substrat | 14. | Kemikalije, ki so topne v vodi ali suspendirane v vodi, se lahko dodajo vodi, nato pa se raztopina z ustrezno napravo za mešanje zmeša s tlemi. Ta vrsta preskusa je lahko ustrezna, če izpostavljenost kemikaliji poteka prek tal ali porne vode v tleh in če obstajajo pomisleki glede vsrkavanja prek korenin. Zmogljivost tal za zadrževanje vode zaradi dodajanja preskusne kemikalije ne sme biti presežena. Količina dodane vode mora biti enaka za vsako preskusno koncentracijo, vendar mora biti omejena, da se prepreči zbiranje aglomeratov tal v skupkih. | 15. | Kemikalije z nizko topnostjo v vodi je treba raztopiti v ustreznem hlapnem topilu (npr. acetonu, etanolu) in zmešati s peskom. Nato se med nenehnim mešanjem peska topilo lahko iz peska odstrani s tokom zraka. Tretirani pesek se zmeša z eksperimentalnimi tlemi. Vzpostavi se drug kontrolni vzorec, ki prejme le pesek in topilo. Vsem stopnjam tretiranja in drugi kontroli so dodane enake količine peska z zmešanim in odstranjenim topilom. Pri trdnih, netopnih preskusnih kemikalijah se suha tla in kemikalija zmešajo v ustrezni napravi za mešanje. Nato se tla dodajo v posode, v katere se takoj posejejo semena. | 16. | Če se namesto tal uporablja umetni substrat, je mogoče kemikalije, ki so topne v vodi, tik pred začetkom preskusa raztopiti v hranilni raztopini. Kemikalije, ki niso topne v vodi, a jih je mogoče v vodi suspendirati z nosilcem topila, je treba z nosilcem dodati hranilni raztopini. Kemikalije, ki niso topne v vodi in za katere ni na voljo nobenega nestrupenega nosilca, topnega v vodi, je treba raztopiti v ustreznem hlapnem topilu. Raztopina se zmeša s peskom ali steklenimi kroglicami in se namesti v rotavapor ter upari; na pesku oziroma kroglicah ostane enakomerna obloga kemikalije. Pred polnjenjem sadilne posode je treba tehtane deleže kroglic ekstrahirati z istim organskim topilom in preskušeno kemikalijo. | Nanos na površino | 17. | Za nanos preskusne kemikalije se pri fitofarmacevtskih sredstvih pogosto uporablja škropljenje površine tal s preskusno raztopino. Vsa oprema, uporabljena pri izvajanju preskusov, vključno z opremo za pripravo in dodajanje preskusne kemikalije, mora imeti takšni zasnovo in zmogljivost, da je mogoče preskuse, ki vključujejo to opremo, izvesti natančno, pokritost pa bo ponovljiva. Pokritost mora biti enotna prek celotne površine tal. Poskrbeti je treba, da ni možnosti adsorpcije kemikalije v opremo ali reagiranja kemikalije z opremo (npr. s plastičnimi cevmi in z lipofilnimi kemikalijami ali jeklenimi deli in elementi). Preskusna kemikalija se razprši na površino tal s posnemanjem značilnega nanašanja s škropilnico. V splošnem morajo biti količine razpršila v območju, ki se običajno uporablja v kmetijski praksi, o količinah (količini vode itd.) pa je treba poročati. Izbrati je treba tako vrsto šobe, ki bo omogočala enakomerno pokritost površine tal. Če se nanašajo topila in nosilci, je treba pripraviti drugo skupino kontrolnih rastlin, ki prejemajo le topilo/nosilec. To pri fitofarmacevtskih sredstvih, preskušanih v obliki formulacij, ni potrebno. | Preverjanje koncentracije/stopnje aplikacije preskusne kemikalije | 18. | Koncentracije/stopnje aplikacije je treba potrditi z ustreznim analitskim preverjanjem. Pri topnih kemikalijah je mogoče potrditi preverjanje koncentracij/stopenj aplikacije vseh preskusnih kemikalij z analizo preskusne raztopine z najvišjo koncentracijo, uporabljene pri preskusu, z dokumentacijo o naknadni razredčitvi in z uporabo umerjene opreme za nanos (npr. umerjenih steklenih posod za analizo, umerjene opreme za nanos s škropilnikom). Pri netopnih kemikalijah mora biti navedeno preverjanje spojin, poleg tega pa še mase preskusne kemikalije, dodane tlom. Če se zahteva dokazovanje homogenosti, bo morda potrebno analizirati tla. | POSTOPEK | Načrt preskusa | 19. | Semena istih vrst se posejejo v posode. Število semen, posejanih v posodo, je odvisno od vrste, velikosti posode in trajanja preskusa. Število rastlin na posodo mora biti takšno, da so v času trajanja preskusa omogočeni primerni rastni pogoji in da se prepreči nagnetenost. Največja gostota rastlin znaša približno 3–10 semen na 100 cm2, odvisno od velikosti semen. Kot primer se za 15-centimetrsko posodo priporočajo od ena do dve sadiki koruze, soje, paradižnika, kumar ali sladkorne pese, tri sadike oljne ogrščice ali graha in od 5 do 10 sadik čebule, pšenice ali drugih sejancev z majhnimi semeni. Število semen in posod za ponovitve (ponovitev je opredeljena kot posoda, zato rastline v isti posodi ne predstavljajo ponovitve) mora biti zadostno za optimalno statistično analizo (21). Treba je opozoriti, da bo variabilnost večja za preskusne vrste, pri katerih je uporabljenih manj večjih semen na posodo (ponovitev), v primerjavi s preskusnimi vrstami, pri katerih je mogoče uporabljati večje število manjših semen na posodo. Ta variabilnost se lahko kar najbolj zmanjša s sejanjem enakega števila semen v vsako posodo. | 20. | Z uporabo kontrolnih skupin se zagotovi, da so opazni učinki povezani samo z izpostavljenostjo preskusni kemikaliji ali se jih lahko pripiše tej izpostavljenosti. Ustrezna kontrolna skupina mora biti v vseh vidikih identična preskusni skupini, razen glede izpostavljenosti preskusni kemikaliji. V okviru danega preskusa morajo biti vse preskusne rastline, vključno s kontrolnimi, iz istega vira. Za preprečevanje pristranskosti se zahteva naključno dodeljevanje preskusnih in kontrolnih posod. | 21. | Izogibati se je treba semenom, prevlečenim z insekticidom ali fungicidom (tj. ‚obloženim‘ semenom). Vendar nekateri regulativni organi dovoljujejo uporabo določenih nesistemskih kontaktnih fungicidov (npr. kaptana, tirama) (22). Če obstaja skrb glede patogenov, ki se prenašajo s semeni, se semena lahko za kratek čas namočijo v razredčeno 5-odstotno raztopino hipoklorita, nato pa se dobro sperejo pod tekočo vodo in posušijo. Sanacija z drugimi fitofarmacevtskimi sredstvi ni dovoljena. | Preskusni pogoji | 22. | Preskusni pogoji se morajo približati pogojem, potrebnim za normalno rast preskušenih vrst in sort (v Dodatku 4 so navedeni primeri preskusnih pogojev). Rastline, ki vznikajo, se morajo vzdrževati glede na dobro vrtnarsko prakso v komorah, fitotronih ali rastlinjakih s kontroliranim okoljem. Pri uporabi prostorov, namenjenih za rast, te prakse običajno vključujejo nadzor in ustrezno pogosto (npr. dnevno) beleženje temperature, vlažnosti, koncentracije ogljikovega dioksida, svetlobe (obsevanosti, valovne dolžine, fotosintetsko aktivnega sevanja) in obdobja osvetljenosti, sredstev za zalivanje itd., s čimer se zagotovi zdrava rast, ki se presoja s kontrolnimi rastlinami izbranih vrst. Temperaturo v rastlinjakih je treba nadzirati z zračenjem, ogrevanjem in/ali hladilnimi sistemi. Za preskušanje v rastlinjakih se v splošnem priporočajo naslednji pogoji: | — | temperatura: 22 °C ± 10 °C, | — | vlažnost; 70 % ± 25 %, | — | obdobje osvetljenosti: najmanj 16 ur svetlobe, | — | obsevanost: 350 ± 50 μE/m2/s. Če obsevanost pade pod 200 μE/m2/s, valovna dolžina pa je 400–700 nm, je potrebna dodatna osvetlitev, razen pri določenih vrstah, ki ne potrebujejo toliko svetlobe. | Med trajanjem študije je treba spremljati okoljske pogoje in poročati o njih. Rastline je treba gojiti v neporoznih plastičnih ali glaziranih posodah, pod katere so podstavljeni pladnji ali krožnički. Posode se lahko redno premešča, da je variabilnost pri rasti rastlin (zaradi razlik v preskusnih pogojih v prostorih, namenjenih za rast) čim manjša. Posode morajo biti dovolj velike, da se omogoči normalna rast. | 23. | Za ohranjanje vitalnosti rastlin se lahko hranilnim snovem v tleh dodajajo dodatki. O potrebah po dodatnih hranilnih snoveh in času njihovega dodajanja je mogoče presoditi z opazovanjem kontrolnih rastlin. Priporočeno je zalivanje preskusnih posod od spodaj (npr. s stenjem iz steklenih vlaken). Vendar je mogoče z začetnim zalivanjem od zgoraj spodbuditi kalivost semen, pri nanosu na površino tal pa takšno zalivanje olajša prehod kemikalije v tla. | 24. | Specifični rastni pogoji morajo biti ustrezni za preskušane vrste in preiskovano preskusno kemikalijo. Kontrolne in tretirane rastline je treba gojiti v enakih okoljskih pogojih, vendar je treba izvesti ustrezne ukrepe za preprečevanje navzkrižne izpostavljenosti (npr. hlapnim kemikalijam) med različnimi tretiranji in izpostavljenosti kontrolnih rastlin preskusnim kemikalijam. | Preskušanje pri eni sami koncentraciji/stopnji aplikacije | 25. | Za določanje ustrezne koncentracije/stopnje aplikacije kemikalije za izvedbo preskusa z eno samo koncentracijo ali stopnjo (provokacijskega/mejnega preskusa) je treba upoštevati več dejavnikov. Pri splošnih kemikalijah ti dejavniki vključujejo fizikalne/kemijske lastnosti kemikalije. Za fitofarmacevtska sredstva je treba upoštevati fizikalne/kemijske lastnosti in vzorec uporabe preskusne kemikalije, njeno največjo koncentracijo ali stopnjo aplikacije, število aplikacij na sezono in/ali obstojnost preskusne kemikalije. Za ugotavljanje, ali ima splošna kemikalija fitotoksične lastnosti, je lahko primerno preskušanje pri najvišji ravni 1 000 mg/kg suhih tal. | Preskus za določanje območja delovanja | 26. | Po potrebi je mogoče izvesti preskus za določanje območja delovanja, s katerim so pridobljene smernice za koncentracije/stopnje, ki bodo preskušane v dokončni študiji odziva v odvisnosti od odmerka. Pri preskusu za določanje območja delovanja morajo biti med vrednostmi preskusnih koncentracij/stopenj precejšnji razmiki (znašati morajo npr. 0,1, 1,0, 10, 100 in 1 000 mg/kg suhih tal). Koncentracije/stopnje pri fitofarmacevtskih sredstvih lahko temeljijo na največji koncentraciji ali stopnji aplikacije, npr. 1/100, 1/10, 1/1 priporočene največje koncentracije ali stopnje aplikacije. | Preskušanje z več koncentracijami/stopnjami aplikacije | 27. | Namen preskusa z več koncentracijami/stopnjami aplikacije je ugotoviti razmerje med odmerkom in odzivom ter določiti vrednost ECx ali ERx za vznik, biomaso in/ali vizualne učinke v primerjavi z neizpostavljenimi kontrolami, kot zahtevajo regulativni organi. | 28. | Število in razmiki koncentracij ali stopenj aplikacije morajo biti zadostni, da se ustvari zanesljivo razmerje med odmerkom in odzivom ter regresijska enačba in da se poda ocena vrednosti ECx ali ERx. Izbrane koncentracije/stopnje aplikacije morajo zajemati vrednosti ECx ali ERx, ki se bodo ugotavljale. Če je, na primer, zahtevana vrednost EC50, je zaželeno preskušanje pri stopnjah, ki dosegajo od 20- do 80-odstotni učinek. Priporočeno število preskusnih koncentracij/stopenj aplikacij za doseganje tega je vsaj pet v geometrijski vrsti in še netretirana kontrola, faktor razmika med njimi pa ne sme biti večji kot tri. Za vsako tretirano ali kontrolno skupino mora biti število ponovitev vsaj štiri, skupno število semen pa vsaj 20. Za večjo statistično moč preskusa bo morda potrebnih več ponovitev določenih rastlin s slabo kalivostjo ali spremenljivo rastjo. Če se uporablja več preskusnih koncentracij/stopenj aplikacije, se lahko število ponovitev zmanjša. Če se ocenjuje vrednost NOEC, bo za doseganje želene statistične moči morda potrebnih več ponovitev (23). | Opažanja | 29. | Med obdobjem opazovanja, tj. od 14 do 21 dni po vzniku 50 % kontrolnih rastlin (tudi kontrol s topili, če je to smiselno), se pri rastlinah pogosto (vsaj tedensko in, če je mogoče, dnevno) opazuje, ali je prišlo do vznika, vidnih znakov fitotoksičnosti in umrljivosti. Ob koncu preskusa je treba zabeležiti meritev odstotka vznika in biomase preživelih rastlin ter vidne znake škodljivih učinkov na različne dele rastline. Med slednjimi so anomalije videza vzniknjenih sejancev, zakrnela rast, kloroza, razbarvanje, umrljivost in učinki na razvoj rastline. Končno biomaso je mogoče meriti s končno povprečno suho težo poganjkov preživelih rastlin, s spravilom poganjkov na površini tal in s sušenjem teh poganjkov pri 60 °C do konstantne teže. Namesto tega je končno biomaso mogoče meriti s svežo težo poganjkov. Če tako zahtevajo regulativni organi, je druga končna točka lahko višina poganjka. Za ocenjevanje opaznih strupenih učinkov je treba uporabljati enoten sistem točkovanja za vidne poškodbe. Primeri kvalitativnih in kvantitativnih vizualnih ocen so podani v virih (23)(24). | PODATKI IN POROČANJE | Statistična analiza | Preskus z eno samo koncentracijo/stopnjo | 30. | Podatke o vsaki rastlinski vrsti je treba analizirati z ustrezno statistično metodo (21). Treba je poročati o ravni učinka pri preskusni koncentraciji/stopnji ali nedoseganju danega učinka pri preskusni koncentraciji/stopnji (npr. o učinku, ki je < x % učinka, opaženega pri koncentraciji ali stopnji y). | Preskus z več koncentracijami/stopnjami | 31. | Z regresijsko enačbo se ugotovi razmerje med odmerkom in odzivom. Uporabljajo se lahko različni modeli: na primer, za oceno vrednosti ECx ali ERx (npr. EC25, ER25, EC50, ER50) in njenih meja zaupanja za vznik v obliki kvantnih podatkov so lahko primerne metode analiza logit in analiza probit, Weibullova metoda, metoda Spearman-Karber, prilagojena metoda Spearman-Karber itd. Za rast sejancev (težo in višino) kot zvezno končno točko je vrednost ECx ali ERx in njene meje zaupanja mogoče oceniti z ustrezno regresijsko analizo (npr. z Bruce-Versteegovo nelinearno regresijsko analizo (25)). Kadar je mogoče, mora biti R2 za najbolj občutljive vrste enak ali večji od 0,7, uporabljene preskusne koncentracije/stopnje pa zajemajo od 20- do 80-odstotne učinke. Če se ocenjuje vrednost NOEC, mora imeti prednost uporaba učinkovitih statističnih preskusov, ki jih je treba izbrati na podlagi porazdelitve podatkov (21)(26). | Poročilo o preskusu | 32. | V poročilu o preskusu morajo biti predstavljeni rezultati študij in podroben opis preskusnih pogojev ter temeljita razprava o rezultatih, analiza podatkov in zaključki, izpeljani iz analize. Treba je podati povzetek v preglednici in izvleček rezultatov. Poročilo mora vključevati naslednje: | | Preskusna kemikalija: | — | kemijski identifikacijski podatki, relevantne lastnosti preskušane kemikalije (npr. log Pow, topnost v vodi, parni tlak in informacije o usodi in vedenju v okolju, če so na voljo), | — | podrobnosti o pripravi preskusne raztopine in preverjanju preskusnih koncentracij, kot je navedeno v odstavku 18. | | Preskusne vrste: | — | podrobnosti preskusnega organizma: vrsta/sorta, družine rastlin, znanstvena in splošna imena, kar najpodrobneje opisana vir in zgodovina semena (npr. ime dobavitelja, odstotek kalivosti, velikost semena, številka razreda, serije ali skupine, leto ali rastna sezono pobiranja semena, datum ocene kalivosti), viabilnost itd., | — | število preskušanih vrst eno- in dvokaličnic, | — | razlogi za izbiro vrste, | — | opis shranjevanja, tretiranja in vzdrževanja semena. | | Preskusni pogoji: | — | oprema za preskušanje (npr. rastna komora, fitotron in rastlinjak), | — | opis preskusnega sistema (npr. velikosti in materialov posod ter količine tal), | — | lastnosti tal (tekstura ali vrsta tal: porazdelitev in razvrstitev delcev tal, fizikalne in kemijske lastnosti, vključno z odstotkom organske snovi, odstotek organskega ogljika in vrednost pH), | — | priprava tal/substrata (npr. tal, umetnih tal, peska in drugega) pred preskusom, | — | opis hranilnega gojišča, če je uporabljeno, | — | nanos kemikalije: opis metode nanosa, opis opreme, stopnje in količine izpostavljenosti, vključno s preverjanjem kemikalije, opis metode umerjanja in opis okoljskih pogojev med nanosom, | — | rastni pogoji: obsevanost (npr. PAR, fotosintetsko aktivno sevanje), obdobje osvetljenosti, največje/najmanjše temperature, program in metoda zalivanja, gnojenje, | — | število semen na posodo, število rastlin na odmerek, število ponovitev (posod) na stopnjo izpostavljenosti, | — | vrsta in število kontrol (negativnih in/ali pozitivnih kontrol, kontrole s topilom, če se uporablja), | — | trajanje preskusa. | | Rezultati: | — | preglednica vseh končnih točk za vsako ponovitev, preskusno koncentracijo/stopnjo in vrsto, | — | število in odstotek vzniknjenih semen v primerjavi s kontrolami, | — | meritve biomase (suho težo ali svežo težo poganjkov) rastlin v obliki odstotka kontrol, | — | višina poganjkov rastlin v obliki odstotka kontrol, če je merjena, | — | odstotek vidnih poškodb ter kvantitativni in kvalitativni opis vidnih poškodb (kloroza, nekroza, venenje, deformacije listov in stebel, pa tudi morebitna odsotnost učinkov) zaradi preskusne kemikalije v primerjavi s kontrolnimi rastlinami, | — | opis ocenjevalne lestvice, uporabljene za presojo vidnih poškodb, če obstaja vizualno ocenjevanje, | — | pri študijah z eno samo stopnjo je treba poročati o odstotku poškodb, | — | vrednosti ECx ali ERx (npr. EC50, ER50, EC25, ER25) in z njimi povezane meje zaupanja. Če se izvaja regresijska analiza, je treba določiti standardno napako za regresijsko enačbo in standardno napako za ocene posameznih parametrov (npr. naklon, presek), | — | vrednosti NOEC (in LOEC), če so izračunane, | — | opis uporabljenih statističnih postopkov in predpostavk, | — | grafični prikaz teh podatkov in razmerje med odmerkom in odzivom preskušanih vrst. | Odstopanja od postopkov, opisanih v tej preskusni metodi, in morebitne nenavadne dogodke med preskusom. | LITERATURA | (1) | Schrader, G., Metge, K., in Bahadir, M. (1998). Importance of salt ions in ecotoxicological tests with soil arthropods. Applied Soil Ecology, 7, 189–193. | (2) | Mednarodna organizacija za standardizacijo. (1993). ISO 11269-1. Kakovost tal – Določevanje učinka onesnažil na rastlinstvo – 1. del: Metoda merjenja zaviranja rasti korenin. | (3) | Mednarodna organizacija za standardizacijo. (1995). ISO 11269-2. Kakovost tal – Določevanje učinka onesnažil na rastlinstvo – 2. del: Učinki kemikalij na vznik in rast višjih rastlin. | (4) | American Standard for Testing Material (ASTM). (2002). E 1963-98. Standard Guide for Conducting Terrestrial Plant Toxicity Tests. | (5) | U.S. EPA. (1982). FIFRA, 40CFR, Part 158.540. Subdivision J, Parts 122-1 and 123-1. | (6) | US EPA. (1996). OPPTS Harmonized Test Guidelines, Series 850. Ecological Effects Test Guidelines: | — | 850.4000: Background – Non-target Plant Testing, | — | 850.4025: Target Area Phytotoxicity, | — | 850.4100: Terrestrial Plant Toxicity, Tier I (Seedling Emergence), | — | 850.4200: Seed Germination/Root Elongation Toxicity Test, | — | 850.4225: Seedling Emergence, Tier II, | — | 850.4230: Early Seedling Growth Toxicity Test. | (7) | AFNOR, X31-201. (1982). Essai d'inhibition de la germination de semences par une substance. AFNOR X31-203/ISO 11269-1. (1993) Determination des effets des polluants sur la flore du sol: Méthode de mesurage de l'inhibition de la croissance des racines. | (8) | Boutin, C., Freemark, K. E., in Keddy, C. J. (1993). Proposed guidelines for registration of chemical pesticides: Non-target plant testing and evaluation. Technical Report Series, št. 145. Canadian Wildlife Service (Headquarters), Environment Canada, Hull, Québec, Kanada. | (9) | Forster, R., Heimbach, U., Kula, C., in Zwerger, P. (1997). Effects of Plant Protection Products on Non-Target Organisms – A contribution to the Discussion of Risk Assessment and Risk Mitigation for Terrestrial Non-Target Organisms (Flora and Fauna). Nachrichtenbl. Deut. Pflanzenschutzd., št. 48. | (10) | Hale, B., Hall, J. C., Solomon, K., in Stephenson, G. (1994). A Critical Review of the Proposed Guidelines for Registration of Chemical Pesticides; Non-Target Plant Testing and Evaluation, Centre for Toxicology, University of Guelph, Ontario, Kanada. | (11) | Soil Texture Classification (US and FAO systems): Weed Science, 33, Suppl. 1 (1985) in Soil Sc. Soc. Amer. Ind. 26:305 (1962). | (12) | Audus, L. J. (1964). Herbicide behaviour in the soil. V: Audus, L. J., ur. The Physiology and biochemistry of Herbicides, London, New York, Academic Press, NY, poglavje 5, str. 163–206. | (13) | Beall, M. L., Jr., in Nash, R. G. (1969). Crop seedling uptake of DDT, dieldrin, endrin, and heptachlor from soil, J. Agro. 61:571–575. | (14) | Beetsman, G. D., Kenney, D. R., in Chesters, G. (1969). Dieldrin uptake by corn as affected by soil properties, J. Agro. 61:247–250. | (15) | U.S. Food and Drug Administration (FDA). (1987). Environmental Assessment Technical Handbook. Environmental Assessment Technical Assistance Document 4.07, Seedling Growth, 14 str., FDA, Washington, DC. | (16) | McKelvey, R. A., Wright, J. P., Honegger, J. L., in Warren, L. W. (2002). A Comparison of Crop and Non-crop Plants as Sensitive Indicator Species for Regulatory Testing. Pest Management Science vol. 58:1161– 1174. | (17) | Boutin, C.; Elmegaard, N., in Kjær, C. (2004). Toxicity testing of fifteen non-crop plant species with six herbicides in a greenhouse experiment: Implications for risk assessment. Ecotoxicology vol. 13(4): 349–369. | (18) | Boutin, C. in Rogers, C. A. (2000). Patterns of sensitivity of plant species to various herbicides – An analysis with two databases. Ecotoxicology vol. 9(4):255–271. | (19) | Boutin, C., in Harper, J. L. (1991). A comparative study of the population dynamics of five species of Veronica in natural habitats. J. Ecol. 9:155–271. | (20) | Boutin, C., Lee, H.-B., Peart, T. E., Batchelor, S. P., in Maguire, R. J. (2000). Effects of the sulfonylurea herbicide metsulfuron methyl on growth and reproduction of five wetland and terrestrial plant species. Envir. Toxicol. Chem. 19 (10): 2532–2541. | (21) | OECD (2006). Guidance Document, Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application. Series on Testing and Assessment, št. 54, Organizacija za gospodarsko sodelovanje in razvoj, Pariz. | (22) | Hatzios, K. K., in Penner, D. (1985). Interactions of herbicides with other agrochemicals in higher plants. Rev. Weed Sci. 1:1–63. | (23) | Hamill, P. B., Marriage, P. B., in Friesen, G. (1977). A method for assessing herbicide performance in small plot experiments. Weed Science 25:386–389. | (24) | Frans, R. E., in Talbert, R. E. (1992). Design of field experiments and the measurement and analysis of plant response. V: B. Truelove (ur.) Research Methods in Weed Science, 2. izdaja. Southern weed Science Society, Auburn, 15–23. | (25) | Bruce, R. D., in Versteeg, D. J.(1992). A Statistical Procedure for Modelling Continuous Toxicity Data. Environmental Toxicology and Chemistry 11, 1485– 1492. | (26) | Poglavje C.33 te priloge: Preskus razmnoževanja deževnikov (Eisenia fetida/Eisenia andrei). | Dodatek 1 | Opredelitve pojmov | Aktivna sestavina (a.i.) (ali aktivna snov (a.s.)) je snov, zasnovana za doseganje določenega biološkega učinka (npr. nadzora nad insekti, preprečevanje bolezni rastlin, zatiranje plevela na tretiranem območju), ki je znana tudi kot aktivna sestavina oziroma snov na tehnični stopnji. | Kemikalija pomeni snov ali zmes. | Fitofarmacevtska sredstva (sredstva za zaščito pridelka ali rastlin) ali pesticidi so snovi s posebno biološko aktivnostjo, ki se uporabljajo za zaščito pridelka pred škodljivimi organizmi (npr. glivičnimi boleznimi, insekti in kompetitivnimi rastlinami). | ECx – koncentracija z x-odstotnim učinkom ali ERx – stopnja z x-odstotnim učinkom je koncentracija ali stopnja, ki povzroči neželeno menjavo ali spremembo odstotka x v končni točki preskusa, merjeni glede na kontrolo (25- oziroma 50-odstotno zmanjšanje vznika, teže poganjkov, končnega števila prisotnih rastlin ali povečanje vidnih poškodb bi predstavljalo vrednost EC25/ER25 oziroma EC50/ER50). | Vznik je pojav koleoptila ali kotiledona nad površino tal. | Formulacija je komercialno formulirani produkt, ki vsebuje aktivno snov (aktivno sestavino), znan tudi kot končni pripravek (6) ali značilni končni izdelek (TEP (‚typical end-use product‘)). | Vrednost LOEC (Lowest Observed Effect Concentration) je najnižja koncentracija preskusne kemikalije, pri kateri je bil opažen učinek. V tem preskusu ima koncentracija, ki ustreza vrednosti LOEC, v danem obdobju izpostavljenosti statistično značilen učinek (p < 0,05) v primerjavi s kontrolo in je višja od vrednosti NOEC. | Neciljne rastline: rastline, ki so zunaj ciljnega območja rastlin. Pri fitofarmacevtskih sredstvih to navadno pomeni rastline zunaj tretiranega območja. | Vrednost NOEC (No Observed Effect Concentration) je najvišja koncentracija preskusne kemikalije, pri kateri ni bilo opaženega nobenega učinka. V tem preskusu koncentracija, ki ustreza vrednosti NOEC, v danem obdobju izpostavljenosti v primerjavi s kontrolo nima statistično značilnega učinka (p < 0,05). | Fitotoksičnost: škodljiva odstopanja (ocenjena z meritvami in vizualno) od normalnega vzorca videza in rasti rastlin kot odziv na dano kemikalijo. | Ponovitev je preskusna enota, ki predstavlja kontrolno skupino in/ali tretirano skupino. V teh študijah je posoda opredeljena kot ponovitev. | Vizualna ocena: ocena vidnih poškodb na podlagi opazovanja rastlinskega sestoja, vitalnosti, deformacij, kloroze, nekroze in splošnega videza v primerjavi s kontrolo. | Preskusna kemikalija: katera koli snov ali zmes, preskušena s to metodo. | Dodatek 2 | Seznam vrst, uporabljenih pri preskušanju rastlin v preteklosti | Družina | Vrsta | Splošna imena | DICOTYLEDONAE (DVOKALIČNICE) | Apiaceae (Umbelliferae) (kobulnice) | Daucus carota | korenje | Asteraceae (Compositae) (nebinovke (košarnice)) | Helianthus annuus | sončnice | Asteraceae (Compositae) (nebinovke (košarnice)) | Lactuca sativa | solata | Brassicaceae (Cruciferae) (križnice (kapusnice)) | Sinapis alba | bela gorjušica | Brassicaceae (Cruciferae) (križnice (kapusnice)) | Brassica campestris var. chinensis | kitajski kapus | Brassicaceae (Cruciferae) (križnice (kapusnice)) | Brassica napus | oljna ogrščica | Brassicaceae (Cruciferae) (križnice (kapusnice)) | Brassica oleracea var. capitata | zelje | Brassicaceae (Cruciferae) (križnice (kapusnice)) | Brassica rapa | strniščna repa | Brassicaceae (Cruciferae) (križnice (kapusnice)) | Lepidium sativum | kreša | Brassicaceae (Cruciferae) (križnice (kapusnice)) | Raphanus sativus | redkev | Chenopodiaceae (metlikovke) | Beta vulgaris | sladkorna pesa | Cucurbitaceae (bučevke) | Cucumis sativus | kumara | Fabaceae (Leguminosae) (metuljnice (stročnice)) | Glycine max (G. soja) | soja | Fabaceae (Leguminosae) (metuljnice (stročnice)) | Phaseolus aureus | mungo fižol | Fabaceae (Leguminosae) (metuljnice (stročnice)) | Phaseolus vulgaris | pritlikavi fižol, stročji fižol, vrtni fižol | Fabaceae (Leguminosae) (metuljnice (stročnice)) | Pisum sativum | grah | Fabaceae (Leguminosae) (metuljnice (stročnice)) | Trigonella foenum- graecum | božja rutica | metuljnice (stročnice) (Fabaceae (Leguminosae)) | Lotus corniculatus | navadna nokota | metuljnice (stročnice) (Fabaceae (Leguminosae)) | Trifolium pratense | črna detelja | metuljnice (stročnice) (Fabaceae (Leguminosae)) | Vicia sativa | grašica | Linaceae (lanovke) | Linum usitatissimum | lan | Polygonaceae (dresnovke) | Fagopyrum esculentum | ajda | Solanaceae (razhudnikovke) | Solanum lycopersicon | paradižnik | MONOCOTYLEDONAE (ENOKALIČNICE) | Liliaceae (Amarylladaceae) (lilijevke (narcisovke)) | Allium cepa | čebula | Poaceae (Gramineae) (trave) | Avena sativa | oves | Poaceae (Gramineae) (trave) | Hordeum vulgare | ječmen | Poaceae (Gramineae) (trave) | Lolium perenne | trpežna (angleška) ljuljka | Poaceae (Gramineae) (trave) | Oryza sativa | riž | Poaceae (Gramineae) (trave) | Secale cereale | rž | Poaceae (Gramineae) (trave) | Sorghum bicolor | sirek v zrnju, navadni sirek | trave (Poaceae (Gramineae)) | Triticum aestivum | pšenica | Poaceae (Gramineae) (trave) | Zea mays | koruza | Dodatek 3 | Seznam potencialnih nekmetijskih rastlin | Potencialne rastline za preskušanje strupenosti rastlin OECD. | Opomba: V naslednji preglednici so informacije o 52 nekmetijskih vrstah (viri so za vsak vnos navedeni v oklepajih). Navedene hitrosti vznika so vzete iz objavljene literature in služijo le kot splošno vodilo. Posamezne izkušnje se lahko razlikujejo glede na vir semena in druge dejavnike. | Botanično ime DRUŽINE vrste | (slovensko splošno ime) | Življenjska doba (7) in habitat | Teža semena | (mg) | Obdobje osvetljenosti za kalivost ali rast (8) | Globina sejanja | (mm) (9) | Čas do kalitve | (dni) (10) | Posebna tretiranja (11) | Preskus strupenosti (12) | Dobavitelji semen (13) | Druge reference (14) | APIACEAE (KOBULNICE) | Torilis japónica | (japonska oklobnica) | E, D; prizadeta območja, žive meje, pašniki (16, 19) | 1,7–1,9 (14, 19) | S = T (14) | 0 | (1, 19) | 5 (50 %) (19) | hladna stratifikacija (7, 14, 18, 19), morda je potrebno zorenje (19), tema zavira kalivost (1, 19), brez posebnih tretiranj (5) | NAKNADNO (5) | | | ASTERACEAE (NEBINOVKE) | Bellis perennis | (navadna marjetica) | T | travišča, orna zemljišča, trate (16, 19) | 0,09–0,17 (4, 19) | S = T (14) | 0 | (4) | 3 (50 %) (19) | 11 (100 %) (18) | obsevanost ne vpliva na kalivost (18, 19), brez posebnih tretiranj (4, 14) | NAKNADNO (4) | A, D, F | 7 | Centaurea cyanus | (plavica) | E | polja, obcestne površine, odprti habitati (16) | 4,1–4,9 (4, 14) | S = T (14) | 0–3 (2, 4, 14) | 14–21 (100 %) (14) | brez posebnih tretiranj (2, 4) | NAKNADNO (2,4) | A, D, E, F | 7 | Centaurea nigra | (črni glavinec) | T | polja, obcestne površine, odprti habitati (16, 19) | 2,4–2,6 (14, 19) | S = T (14) | 0 (19) | 3 (50 %) (19) | 4 (97 %) (18) | morda je potrebno zorenje (18, 19), tema zavira kalivost (19), brez posebnih tretiranj (5, 14, 26) | NAKNADNO (5, 22, 26) | A | | Inula helenium | veliki oman | T | vlažna, prizadeta mesta | (16) | 1–1,3 (4, 14, 29) | | 0 | (4, 29) | | brez posebnih tretiranj (4) | NAKNADNO (4) | A, F | | Leontodon hispidus | (navadni otavčič) | T | polja, obcestne površine, prizadeta območja (16, 19) | 0,85–1,2 (14, 19) | S = T (14) | 0 (19) | 4 (50 %) (19) | 7 (80 %) (18) | tema zavira kalivost (17, 18, 19) brez posebnih tretiranj (5, 23) | NAKNADNO (5, 22, 23) | | | Rudbeckia hirta | (srhkodlakava rudbekija) | D, T prizadeta območja | (16) | 0,3 (4, 14) | S = T (14) | 0 | (4, 33) | < 10 (100 %) (33) | brez posebnih tretiranj | (4, 14, 33) | NAKNADNO (4, 33) | C, D, E, F | | Solidago canadensis | kanadska zlata rozga | T | pašniki, odprta območja (16) | 0,06–0,08 (4, 14) | S = T (11) | 0 | (4) | 14–21 | (11) | zmešajte z enakim delom peska in 24 ur namakajte v 500 ppm GA (11), brez posebnih tretiranj (4) | NAKNADNO (4) | E, F | | Xanthium pensylvanicum | (pensilvanski bodič) | E | polja, odprti habitati (16) | 25–61 (14, 29) | | 0(1) | 5(29) | | tema lahko zavira kalivost (1), namakajte 12 ur v topli vodi (29) | PREDHODNO IN NAKNADNO (31) | A | | Xanthium spinosum | (trnati bodič) | E | odprti habitati (16) | 200 (14) | S = T (14) | S > T (6) | 10 | (6) | | opraskanje (14), brez posebnih tretiranj (6) | PREDHODNO IN NAKNADNO (6) | A | | Xanthium strumarium | (navadni bodič) | E | polja, odprti habitati (16) | 67,4 (14) | S = T (14) | 10–20 (6, 21) | | brez posebnih tretiranj | (6, 14, 21) | PREDHODNO IN NAKNADNO (6, 21, 28, 31) | A | | BRASSICACEAE (KRIŽNICE) | Cardamine pratensis | (travniška penuša) | T | polja, obcestne površine, trate (16, 19) | 0,6 (14, 19) | S = T (14) | 0 (19) | 5 (50 %) (19) | 15 (98 %) (18) | tema zavira kalivost (18, 19), brez posebnih tretiranj (5, 14, 22) | NAKNADNO (5, 22) | F | | CARYOPHYLLACEAE (KLINČNICE) | Lychnis flos-cuculi | (kukavičja lučca) | T | (16) | 0,21 (14) | S = T (14) | | < 14 (100 %) (14, 25) | morda je potrebno zorenje (18), brez posebnih tretiranj (5, 14, 15, 22–26) | NAKNADNO (5, 15, 22–26) | F | | CHENOPODIACEAE (METLIKOVKE) | Chenopodium album | (bela metlika) | E | robovi polj, prizadeta območja (16, 19) | 0,7–1,5 (14, 19, 34) | S = T (14) | 0 | (1, 19) | 2 (50 %) (19) | tretiranje se razlikuje glede na barvo semena (19), obdobje mirovanja pri shranjevanju na suhem (19), tema zavira kalivost (1, 18, 19), hladna stratifikacija (18), brez posebnih tretiranj (14, 34) | PREDHODNO IN NAKNADNO (28, 31, 34) | A | 32 | CLUSIACEAE (KRČNIČEVKE) | Hypericum perforatum | (šentjanževka) | T | polja, orna zemljišča, odprti habitati (16, 19) | 0,1–0,23 | (14, 19) | S = T | (14) | 0 | (1, 19) | 3 (19) | 11 (90 %) (18) | tema zavira kalivost (1, 18, 19), | brez posebnih tretiranj (5, 14, 15, 25, 27) | NAKNADNO | (5, 15, 25, 27) | A, E, F | | CONVOLVULACEAE (SLAKOVKE) | Ipomoea hederacea | (bršljanasti lepi slak) | E | obcestne površine, odprti habitati, koruzna polja (16) | 28,2 | (14) | S > T | (6, 10) | 10–20 | (6, 10, 21) | 4 (100 %) | (10) | obsevanost ne vpliva na kalivost (1), | brez posebnih tretiranj (6, 21) | PREDHODNO IN NAKNADNO | (6, 12, 21, 28) | A | | CYPERACEAE (OSTRIČEVKE) | Cyperus rotundus | (okrogla ostrica) | T | orne površine, pašniki, obcestne površine (16, 30) | 0,2 | (14) | S = T | (14) | 0 (1) | 10–20 (6, 10) | 12 (91 %) | (10) | tema zavira kalivost (1), | brez posebnih tretiranj (6, 10, 14) | PREDHODNO IN NAKNADNO | (6, 28, 31) | B | 7 | FABACEAE (METULJNICE) | Lotus corniculatus | (navadna nokota) | T | travnate površine, obcestne površine, odprti habitati (16, 19) | 1–1,67 | (14, 19) | S = T (14) | | 1 (50 %) | (19) | opraskanje (14, 19), | obsevanost ne vpliva na kalivost (18, 19) brez posebnih tretiranj (23, 25) | NAKNADNO | (5, 23, 25) | A, D, E, F | | Senna obtusifolia | (topolistna sena) | E | vlažni gozdovi (16) | 23–28 | (9) | S = T (14) | S > T (9) | 10–20 | (6,9) | | semena 24 ur namakajte v vodi (9), | opraskanje (14), viabilnost semena se razlikuje glede na barvo (1), brez posebnih tretiranj (6) | NAKNADNO | (6,9) | A | | Sesbania exaltata | (konoplja) | E | aluvialna tla (16) | 11–13 | (9, 14) | S > T (9) | 10-20 | (9, 21) | | semena 24 ur namakajte v vodi (9), | obsevanost ne vpliva na kalivost (1), brez posebnih tretiranj (21) | PREDHODNO IN NAKNADNO | (9, 21, 28, 31) | A | | Trifolium pratense | (črna detelja) | T | polja, obcestne površine, orna zemljišča (16, 19) | 1,4–1,7 | (14, 19) | S = T (14) | | 1 (50 %) | (19) | opraskanje (14, 18), | morda je potrebno zorenje (19), obsevanost ne vpliva na kalivost (1, 19), brez posebnih tretiranj (5) | NAKNADNO | (5) | A, E, F | | LAMIACEAE (USTNATICE) | Leonurus cardiaca | (deljenolistna srčnica) | T | odprta območja (16) | 0,75–1,0 | (4, 14) | S = T (14) | 0 | (4) | | brez posebnih tretiranj | (4, 14) | NAKNADNO | (4) | F | | Mentha spicata | (klasasta meta) | T | vlažna območja (16) | 2,21 | (4) | | 0 | (4) | | brez posebnih tretiranj | (4) | NAKNADNO | (4) | F | | Nepeta cataria | (mačja meta) | T | prizadeta območja (16) | 0,54 | (4, 14) | S = T (14) | 0 | (4) | | brez posebnih tretiranj | (2, 4, 14) | NAKNADNO | (2,4) | F | | Prunella vulgaris | (navadna črnoglavka) | T | orna zemljišča, travnata področja, prizadeta mesta (16, 19) | 0,58–1,2 | (4, 14, 19) | S = T (14) | 0 | (4, 19) | 5 (50 %) (19) | 7 (91 %) (18) | tema zavira kalivost (18, 19), | boljša kalivost z večjimi semeni (1), brez posebnih tretiranj (4, 14, 22) | NAKNADNO | (4, 22) | A, F | | Stachys officinalis | (navadni čistec) | T | travišča, robovi polj (19) | 14–18 | (14, 19) | S = T (14) | | 7 (50 %) | (19) | brez posebnih tretiranj | (5, 14, 22) | NAKNADNO | (5, 22) | F | | MALVACEAE (SLEZENOVKE) | Abutilón theophrasti | (baržunasti oslezovec) | E | polja, odprti habitati (16) | 8,8 | (14) | S = T (14) | 10–20 | (6, 10, 21) | 4 (84 %) | (10) | opraskanje (14), | brez posebnih tretiranj (5, 10, 21) | PREDHODNO IN NAKNADNO | (6, 22, 28, 31) | A, F | | Sida spinosa | (bodičasta sida) | E | polja, obcestne površine (16) | 3,8 | (14) | S = T (14) | 10–20 | (6, 21) | | opraskanje (14), | obsevanost ne vpliva na kalivost (1), brez posebnih tretiranj (6, 21) | PREDHODNO IN NAKNADNO | (6, 21, 28, 31) | A, F | | PAPAVERACEAE (MAKOVKE) | Papaver rhoeas | (poljski mak) | E | polja, orna zemljišča, prizadeta mesta (16, 19) | 0,1–0,3 | (4, 14, 19, 29) | S = T (14) | 0 | (4, 29) | 4 (50 %) | (19) | hladna stratifikacija in opraskanje (1, 19, 32), | brez posebnih tretiranj (4, 14, 29) | NAKNADNO | (4) | A, D, E, F, G | | POACEAE (TRAVE) | Agrostis tenuis | (tankolistna šopulja) | trate, pašniki (16) | 0,07 (14) | S > T (Ю) | 20 (10) | 10 (62 %) (10) | tema zavira kalivost (1, 17–19) brez posebnih tretiranj (10) | NAKNADNO (10) | A, E | | Alopecurus myosuroides | (njivski lisičji rep) | E | polja, odprti habitati (16) | 0,9–1,6 | (29, 34) | S = T (14) | 2 | (29) | < 24 (30 %) (34) | opraskanje (14), tretiranje s 101 mg/l KNO3 (14), topla stratifikacija (1), tema zavira kalivost (1), brez posebnih tretiranj (34) | PREDHODNO IN NAKNADNO | (28, 34) | A | 32 | Avena fatua | (gluhi oves) | E | kultivirana območja, odprti habitati (16) | 7–37,5 (14, 30) | S = T (14) | S > T (6) | 10–20 (6, 10) | 3 (70 %) (18) | opraskanje (7, 32), tema zavira kalitev (1), | hladna stratifikacija (1, 18), brez posebnih tretiranj (6, 10, 14) | PREDHODNO IN NAKNADNO (6, 10, 28, 31) | A | | Bromus tectorum | (strešna stoklasa) | E | polja, obcestne površine, orna zemljišča (16) | 0,45–2,28 (14, 29) | S = T (14) | 3 (29) | | obdobje zorenja (1, 7, 32), svetloba zavira kalivost (1), brez posebnih tretiranj (14) | PREDHODNO IN NAKNADNO (28, 31) | A | | Cynosurus cristatus | (navadni pasji rep) | T | polja, obcestne površine, odprti habitati (16, 19) | 0,5–0,7 (14, 19, 29) | S = T (14) | 0 (29) | 3 (50 %) (19) | obsevanost ne vpliva na kalivost (19), brez posebnih tretiranj (14, 29) | NAKNADNO (5) | A | | Digitaria sanguinalis | (krvavordeča srakonja) | E | polja, trate, odprti habitati (16) | 0,52–0,6 (14, 30) | S = T (14) | 10–20 (21). | 7 (75 %) | 14 (94 %) (7) | opraskanje, hladna stratifikacija in zorenje (1, 7, 14, 32), tretiranje s 101 mg/l KNO3 (14), tema zavira kalivost (1), brez posebnih tretiranj (21) | PREDHODNO IN NAKNADNO (18, 25, 31) | A | | Echinochloa crusgalli | (navadna kostreba) | E | (16) | 1,5 (14) | S = T (14) | S > T (3) | 10–20 (7, 21) | | opraskanje (7, 32), obsevanost ne vpliva na kalivost (1), brez posebnih tretiranj (3, 14, 21) | PREDHODNO IN NAKNADNO (3, 21, 28, 31) | A | | Elymus canadensis | (kanadski bored) | T | obrežna območja, prizadeta mesta (16) | 4–5 (14, 30) | S = T (11) | 1 | (11) | 14–28 | (11) | brez posebnih tretiranj | (2, 11) | NAKNADNO (2) | C, D, E | | Festuca pratensis | (travniška bilnica) | T | polja, vlažna območja (16, 19) | 1,53–2,2 (16, 19) | S = T (14) | S > T (10) | 20 (10) | 9 (74 %) (10) | 2 (50 %) (19) | brez posebnih tretiranj | (10, 19) | NAKNADNO (10) | A | 7 | Hordeum pusillum | (mali ječmen) | E | pašniki, obcestne površine, odprti habitati (16) | 3,28 (14) | | | | topla stratifikacija (1), obsevanost ne vpliva na kalivost (1) | PREDHODNO (31) | | 7 | Phieum pratense | (travniški mačji rep) | T | pašniki, orna polja, prizadeta mesta (16, 19) | 0,45 (14, 19) | S > T (10, 14) | 0–10 (10, 19) | 2 (74 %) (10) | 8 (50 %) (19) | tema zavira kalivost (19), obsevanost ne vpliva na kalivost (17), brez posebnih tretiranj (10, 14, 17, 19) | NAKNADNO (10) | A, E | | POLYGONACEAE (DRESNOVKE) | Polygonum convolvulus | (navadni slakovec) | E | odprti habitati, obcestne površine (16) | 5–8 (4, 14, 29) | S = T (20) | 0–2 (4, 29) | | hladna stratifikacija od 4 do 8 tednov (1, 2, 4, 20, 29), obsevanost ne vpliva na kalivost (1) | PREDHODNO IN NAKNADNO (1, 2, 20, 28, 31) | A | 32 | Polygonum lapathifolium | (ščavjelistna dresen) | E | vlažna tla (16) | 1,8–2,5 (14). | S > T (6) | | 5 (94 %) (18) | obsevanost ne vpliva na kalivost (1), tema zavira kalivost (18), hladna stratifikacija (1), brez posebnih tretiranj (5) | PREDHODNO IN NAKNADNO (6) | A, E | | Polygonum pennsylvanicum | (pensilvanska dresen) | E | polja, odprti habitati (16) | 3,6–7 (14, 29) | | 2 (29) | | hladna stratifikacija 4 tedne pri 0–5 °C (1, 29), tema zavira kalivost (1) | PREDHODNO (31) | A, E | | Polygonum periscaria | (breskvolistna dresen) | E | prizadeta območja, orna zemljišča (16, 19) | 2,1–2,3 (14, 19) | S > T (13) | 0 (19) | < 14 (13) | 2 (50 %) (19) | opraskanje, hladna stratifikacija, tretiranje z GA (14), hladna stratifikacija, zorenje (17–19), tema zavira kalivost (19), brez posebnih tretiranj (13) | NAKNADNO (13) | A | 32 | Rumex crispus | (kodrastolistna kislica) | T | orna polja, obcestne površine, odprta območja (16, 19) | 1,3–1,5 (4, 14, 19) | S = T (14, 33) | 0 | (4, 19, 33) | 3 (50 %) (19) | 6 (100 %) (33) | obsevanost ne vpliva na kalivost (18, 19), morda je potrebno zorenje (18), brez posebnih tretiranj (4, 14, 33) | NAKNADNO (4, 33) | A, E | 32 | PRIMULACEAE (JEGLIČEVKE) | Anagallis arvensis | (navadna kurja češnjica) | E | orna polja, odprta območja, prizadeta mesta (16, 19) | 0,4–0,5 (4, 14, 19) | S = T (14) | | 1 (50 %) (19) | hladna stratifikacija, tretiranje z GA (1, 14, 18, 19, 32), za kalivost je potrebna svetloba (1), brez posebnih tretiranj (2, 4) | NAKNADNO (2,4) | A, F | | RANUNCULACEAE (ZLATIČEVKE) | Ranunculus acris | (ripeča zlatica) | T | orna polja, obcestne površine, odprta območja (16, 19) | 1,5–2 (14, 19, 29) | S = T (14) | 1 | (29) | 41–56 (19, 29) | brez posebnih tretiranj | (5, 14, 22, 24–26) | NAKNADNO (5, 22, 24–26) | | 32 | ROSACEAE (ROŽNICE) | Geum urbanum | (navadna sretena) | T | žive meje, vlažna območja | (16, 19) | 0,8–1,5 (14, 19) | S = T (14) | 0 (19) | 5 (50 %) (19) | 16 (79 %) (18) | tema zavira kalivost (18, 19), topla stratifikacija (1), brez posebnih tretiranj (5, 14, 22, 25, 26) | NAKNADNO (5, 22, 25, 26) | A | | RUBIACEAE (BROŠČEVKE) | Galium aparine | (plezajoča lakota) | E | orna polja, vlažna območja, prizadeta mesta (16, 19) | 7–9 (14, 19) | S = T (14) | | 5 (50 %) (19) | 6 (100 %) (18) | hladna stratifikacija (1, 18, 19), obsevanost ne vpliva na kalivost (18, 19), svetloba zavira kalivost (1), brez posebnih tretiranj (6, 14) | PREDHODNO IN NAKNADNO (6, 28) | A | 32 | Galium mollugo | (navadna lakota) | T | žive meje, odprta območja (8) | 7 | (29) | S = T (14) | 2 | (29) | | brez posebnih tretiranj | (5, 14, 22, 24, 26, 29) | NAKNADNO (5, 22, 24, 26) | A | | SCROPHULARIACEAE (ČRNOBINOVKE) | Digitalis purpurea | (škrlatni naprstec) | D, T žive meje, odprta območja (16, 19) | 0,1–0,6 (4, 14, 19) | S = T (14) | 0 | (4, 19) | 6 (50 %) (19) | 8 (99 %) (18) | tema zavira kalivost (1,17–19), brez posebnih tretiranj (4, 22–26) | NAKNADNO (4, 22–26) | D, G, F | | Veronica persica | (perzijski jetičnik) | E | orna polja, odprta območja, prizadeta mesta (16, 19) | 0,5–0,6 (14, 19) | S = T (14) | 0 (19) | 3(19) | 5 (96 %) (18) | tema zavira kalivost (18, 19), hladna stratifikacija (18), brez posebnih tretiranj (14) | PREDHODNO IN NAKNADNO (28) | A | 32 | Navedeni dobavitelji semen | ID dobavitelja | Informacije o dobavitelju | A | Herbiseed | New Farm, Mire Lane, West End, Twyford RG10 0NJ VELIKA BRITANIJA + 44 1189349464 | www.herbiseed.com | B | Tropilab Inc. | 8240 Ulmerton Road, Largo, FL 33771-3948 ZDA | +1 7273444050 | www.tropilab.com | C | Pterophylla – Native Plants & Seeds | #316 Regional Road 60, RR#1, Walsingham, ON N0E 1X0 KANADA + 1 5195863985 | D | Applewood Seed Co. | 5380 Vivian St., Arvada, CO 80002 ZDA + 1 3034317333 | www.applewoodseed.com | E | Ernst Conservation Seeds | 9006 Mercer Pike, Meadville, PA 16335 ZDA | +1 8008733321 | www.ernstseed.com | F | Chiltern Seeds | Bortree Stile, Ulverston, Cumbria LA12 7PB VELIKA BRITANIJA | +44 1229581137 | www.chiltemseeds.co.uk | G | Thompson & Morgan | P.O. Box 1051, Fort Erie, ON L2A 6C7 KANADA + 1 8002747333 | www.thompson-morgan.com | NAVEDENI VIRI | (1) | Baskin, C. C., in Baskin, J. M. (1998). Seeds. Academic Press, Toronto. | (2) | Blackburn, L. G., in Boutin, C. (2003). Subtle effects of herbicide use in the context of genetically modified crops: a case study with glyphosate (Round-Up®). Ecotoxicology, 12:271–285. | (3) | Boutin, C., Lee, H.-B., Peart, T., Batchelor, P. S., in Maguire, R. J. (2000). Effects of the sulfonylurea herbicide metsulfuron methyl on growth and reproduction of five wetland and terrestrial plant species. Environmental Toxicology & Chemistry, 19(10):2532–2541. | (4) | Boutin, C., Elmegaard, N., in Kjaer, C. (2004). Toxicity testing of fifteen non-crop plant species with six herbicides in a greenhouse experiment: implications for risk assessment. Ecotoxicology, 13:349–369. | (5) | Breeze, V., Thomas, G., in Butler, R. (1992). Use of a model and toxicity data to predict the risks to some wild plant species from drift of four herbicides. Annals of Applied Biology, 121:669–677. | (6) | Brown, R. A., in Farmer, D. (1991). Track-sprayer and glasshouse techniques for terrestrial plant bioassays with pesticides. V: Plants for toxicity assessment: 2. izdaja. ASTM STP 1115, J. W. Gorsuch, W. R. Lower, W. Wang, in M. A. Lewis, ur. American Society for Testing & Materials, Philadelphia. Str. 197–208. | (7) | Buhler, D. D., in Hoffman, M. L. (1999). Anderson's guide to practical methods of propagating weeds and other plants. Weed Science Society of America, Lawrence, K. | (8) | Clapham, A. R., Tutin, T. G., in Warburg, E. F. (1981). Excursion flora of the British Isles, 3. izdaja, Cambridge University Press, Cambridge. | (9) | Clay, P. A., in Griffin, J. L. (2000). Weed seed production and seedling emergence response to late-season glyphosate applications. Weed Science, 48:481–486. | (10) | Cole, J. F. H., in Canning, L. (1993). Rationale for the choice of species in the regulatory testing of the effects of pesticides on terrestrial non-target plants. BCPC – Weeds. str. 151–156. | (11) | Fiely, M. (Ernst Conservation Seeds). (2004). Osebna komunikacija. (www.ernstseed.com). | (12) | Fletcher, J. S., Johnson, F. L., in McFarlane, J. C. (1990). Influence of greenhouse versus field testing and taxonomic differences on plant sensitivity to chemical treatment. Environmental Toxicology & Chemistry, 9:769–776. | (13) | Fletcher, J. S., Pfleeger, T. G., Ratsch, H. C., in Hayes, R. (1996). Potential impact of low levels of chlorsulfuron and other herbicides on growth and yield of nontarget plants. Environmental Toxicology & Chemistry, 15(7):1189–1196. | (14) | Flynn, S., Turner, R. M., in Dickie, J. B. (2004). Seed Information Database (release 6.0, okt. 2004) Royal Botanic Gardens, Kew (www.rbgkew.org.uk/data/sid). | (15) | Franzaring, J., Kempenaar, C., in van der Eerden, L. J. M. (2001). Effects of vapours of chlorpropham and ethofumesate on wild plant species. Environmental Pollution, 114:21–28. | (16) | Gleason, H. A., in Cronquist, A. (1991). Manual of vascular plants of northeastern United States and adjacent Canada, 2. izdaja. New York Botanical Garden, Bronx, NY. | (17) | Grime, J. P. (1981). The role of seed dormancy in vegetation dynamics. Annals of Applied Biology, 98:555–558. | (18) | Grime, J. P., Mason, G., Curtis, A. V., Rodman, J., Band, S. R., Mowforth, M. A. G., Neal, A. M., in Shaw, S. (1981). A comparative study of germination characteristics in a local flora. Journal of Ecology, 69:1017–1059. | (19) | Grime, J. P., Hodgson, J. G., in Hunt, R. 1988. Comparative plant ecology: a functional approach to common British species. Unwin Hyman Ltd., London. | (20) | Kjaer, C. (1994). Sublethal effects of chlorsulfuron on black bindweed (Polygonum convolvulus L.). Weed Research, 34, 453–459. | (21) | Klingaman, T. E., King, C. A., in Oliver, L. R. (1992). Effect of application rate, weed species, and weed stage of growth on imazethapyr activity. Weed Science, 40:227–232. | (22) | Marrs, R. H., Williams, C. T., Frost, A. J., in Plant, R. A. (1989). Assessment of the effects of herbicide spray drift on a range of plant species of conservation interest. Environmental Pollution, 59:71–86. | (23) | Marrs, R. H., Frost, A. J., in Plant, R. A. (1991). Effects of herbicide spray drift on selected species of nature conservation interest: the effects of plant age and surrounding vegetation structure. Environmental Pollution, 69:223–235. | (24) | Marrs, R. H., Frost, A. J., in Plant, R. A. (1991). Effects of mecoprop drift on some plant species of conservation interest when grown in standardized mixtures in microcosms. Environmental Pollution, 73:25–42. | (25) | Marrs, R. H., Frost, A. J., Plant, R. A., in Lunnis, P. (1993). Determination of buffer zones to protect seedlings of non-target plants from the effects of glyphosate spray drift. Agriculture, Ecosystems, & Environment, 45:283–293. | (26) | Marrs, R. H., in Frost, A. J. (1997). A microcosm approach to detection of the effects of herbicide spray drift in plant communities. Journal of Environmental Management, 50:369–388. | (27) | Marshall, E. J. P., in Bernie, J. E. (1985). Herbicide effects on field margin flora. BCPC – Weeds. str. 1021–1028. | (28) | McKelvey, R. A., Wright, J. P., in Honegger, J. L. (2002). A comparison of crop and non-crop plants as sensitive species for regulatory testing. Pest Management Science, 58:1161–1174. | (29) | Morton, S. (Herbiseed). (2004). Osebna komunikacija. (http://www.herbiseed.com). | (30) | USDA, NRCS. 2004. The Plants Database, version 3.5. (http://plants.usda.gov). National Plant Data Centre, Baton Rouge, LA 70874-4490 ZDA. | (31) | USEPA. (1999). One-Liner Database. [U.S. E.P.A./Office of Pesticide Programs/Environmental Fate and Effects Division/Environmental Epidemiology Branch]. | (32) | Webster, R. H. (1979). Technical Report No. 56: Growing weeds from seeds and other propagules for experimental purposes. Agricultural Research Council Weed Research Organization, Oxford. | (33) | White, A. L., in Boutin, C. (National Wildlife Research Centre, Environment Canada). 2004. Osebna komunikacija. | (34) | Zwerger, P., in Pestemer, W. (2000). Testing the phytotoxic effects of herbicides on higher terrestrial non-target plants using a plant life-cycle test. Z. PflKrankh. PflSchutz, Sonderh., 17:711–718. | Dodatek 4 | Primeri ustreznih rastnih pogojev za določene vrste kmetijskih rastlin | Naslednji pogoji so se izkazali za primerne pri 10 vrstah kmetijskih rastlin in jih je mogoče uporabljati kot vodilo tudi pri preskusih z določenimi drugimi vrstami v rastnih komorah: | Koncentracija ogljikovega dioksida: 350 ± 50 ppm. | Relativna vlažnost: 70 ± 5 % med obdobji osvetljenosti in 90 ± 5 % med obdobji teme. | Temperatura: 25 ± 3 °C podnevi, 20 ± 3 °C ponoči. | Obdobje osvetljenosti: 16 ur osvetljenosti/8 ur teme, pri čemer se predpostavlja, da je povprečna valovna dolžina od 400 do 700 nm. | Osvetljenost: svetlost 350 ± 50 μE/m2/s, merjeno na vrhu rastlinskega pokrova. | Vrste kmetijskih rastlin so: | — | paradižnik (Solanum lycopersicon), | — | navadna kumara (Cucumis sativus), | — | solata (Lactuca sativa), | — | soja (Glycine max), | — | glavnato zelje (Brassica oleracea var. capitata), | — | navadno korenje (Daucus carota), | — | oves (Avena sativa), | — | trpežna ljuljka (Lolium perenne), | — | koruza (Zea mays), | — | čebula (Allium cepa). | C.32. PRESKUS RAZMNOŽEVANJA ENHITREJEV | UVOD | 1. | Ta preskusna metoda je enakovredna Smernici za preskušanje OECD (TG) 220 (2004). Zasnovana je za uporabo pri ocenjevanju učinkov kemikalij na sposobnost razmnoževanja črva enhitreja, Enchytraeus albidus (Henle, 1873), v tleh. Načeloma temelji na metodi, ki jo je razvila nemška Zvezna agencija za okolje (1) in je bila preskušena s krožnim preskusom (2). Upoštevane so bile tudi druge metode za preskušanje strupenosti kemikalij za enhitreje in deževnike (3)(4)(5)(6)(7)(8). | ZAČETNI POMISLEKI | 2. | V tleh živeči kolobarniki iz rodu Enchytraeus so ekološko pomembna vrsta za ekotoksikološko preskušanje. Čeprav je enhitreje pogosto najti v tleh, ki vsebujejo deževnike, pa drži tudi to, da jih je pogosto veliko tudi v tleh, kjer deževnikov ni. Enhitreje je mogoče uporabljati v laboratorijskih preskusih ter v polterenskih in terenskih študijah. S praktičnega vidika je z mnogimi vrstami enhitrejev enostavno ravnati in jih gojiti, njihov generacijski čas pa je znatno krajši od generacijskega časa pri deževnikih. Zato preskus razmnoževanja z enhitreji traja le od 4 do 6 tednov, z deževniki (Eisenia fetida) pa 8 tednov. | 3. | Osnovne informacije o ekologiji in ekotoksikologiji enhitrejev v kopenskem okolju je mogoče najti v (9)(10)(11)(12). | NAČELO PRESKUSA | 4. | Odrasli črvi enhitrejev so izpostavljeni več koncentracijam preskusne kemikalije, vmešane v umetna tla. Preskus je mogoče razdeliti v dve fazi: (a) če na voljo ni dovolj informacij, preskus za določanje območja delovanja, v katerem je glavna končna točka smrtnost, ocenjena po dveh tednih izpostavljenosti, ter (b) dokončni preskus razmnoževanja, v katerem se oceni skupno število mladičev, ki jih je ustvaril starš, in preživetje staršev. Dokončni preskus traja šest tednov. Po prvih treh tednih se odrasli črvi odstranijo in zabeležijo se morfološke spremembe. Po dodatnih treh tednih se prešteje število potomcev, izleženih iz kokonov, ki so jih proizvedli starši. Sposobnost razmnoževanja živali, izpostavljenih preskusni kemikaliji, se za določitev (i) koncentracije brez opaznega učinka (NOEC) in/ali (ii) ECx (npr. EC10, EC50) z regresijskim modelom, s katerim se oceni koncentracijo, ki bi povzročila x-odstotno zmanjšanje sposobnosti razmnoževanja, primerja s sposobnostjo razmnoževanja pri kontrolah. Preskusne koncentracije morajo oklepati vrednost ECx (npr. EC10, EC50), tako da vrednost ECx nato izvira iz interpolacije in ne iz ekstrapolacije. | PODATKI O PRESKUSNI KEMIKALIJI | 5. | Po možnosti morajo biti znani topnost v vodi, vrednost log Kow, porazdelitveni koeficient tla/voda (npr. poglavje C.18 ali C.19 te priloge) in parni tlak preskusne kemikalije. Zaželene so dodatne informacije o usodi preskusne kemikalije v tleh, kot so hitrosti fotolize in hidrolize. | 6. | To preskusno metodo je mogoče uporabiti za vodotopne in nevodotopne kemikalije. Vendar se bodo načini nanosa preskusne kemikalije ustrezno razlikovali. Preskusna metoda se ne sme uporabljati pri hlapnih kemikalijah, tj. kemikalijah, za katere je Henryjeva konstanta ali porazdelitveni koeficient zrak/voda večja od ena, ali pri kemikalijah, pri katerih parni tlak pri 25 °C presega 0,0133 Pa. | VELJAVNOST PRESKUSA | 7. | Da preskus šteje kot veljaven, morajo kontrolni vzorci izpolnjevati naslednja merila: | — | smrtnost pri odraslih osebkih na koncu preskusa za določanje območja delovanja in po prvih treh tednih po preskusu razmnoževanja ne sme presegati 20 %, | — | s predpostavko, da je bilo pri pripravi preskusa uporabljenih 10 odraslih osebkov na posodo, mora biti na koncu preskusa povprečno ustvarjenih vsaj 25 mladičev, | — | koeficient variacije okrog povprečnega števila mladičev ob koncu preskusa razmnoževanja ne sme presegati 50 %. | Če preskus ne uspe izpolniti zgoraj naštetih meril za veljavnost, mora biti prekinjen, razen če je mogoče podati utemeljitev za nadaljevanje preskusa. Utemeljitev mora biti vključena v poročilo o preskusu. | REFERENČNA KEMIKALIJA | 8. | Referenčna kemikalija mora biti preskušana v rednih časovnih razmikih ali pa po možnosti vključena v vsak preskus, da se preveri, ali se odziv preskusnih organizmov v času ni pomembneje spremenil. Primerna referenčna kemikalija je karbendazim, za katerega je dokazano, da vpliva na preživetje in razmnoževanje enhitrejev (13)(14), mogoče pa je uporabiti tudi druge kemikalije, katerih podatki o strupenosti so dobro znani. V krožnem preskusu je bila uporabljena formulacija karbendazima, znana pod trgovskim imenom Derosal™, ki jo dobavlja družba AgrEvo Company (iz Frankfurta v Nemčiji) in ki vsebuje 360 g/l (32,18 %) aktivne sestavine (2). Vrednost EC50 za razmnoževanje, določena v krožnem preskusu, je bila v območju 1,2 ± 0,8 mg aktivne sestavine (a.s.)/kg suhe mase (2). Če je v preskusno serijo vključen pozitivni toksikološki standard, se uporablja ena koncentracija, število ponovitev pa mora biti enako kot v kontrolah. Za karbendazim se priporoča preskušanje 1,2 mg a.s./kg suhe teže (preskušane v obliki tekoče formulacije). | OPIS PRESKUSA | Oprema | 9. | Preskusne posode morajo biti izdelane iz stekla ali drugega kemijsko inertnega materiala. Primerni so stekleni kozarci (s prostornino npr. od 0,20 do 0,25 litra; premer: ≈ 6 cm). Posode morajo imeti prozorne pokrove (npr. iz stekla ali polietilena), ki so zasnovani tako, da čim bolj zmanjšajo izhlapevanje vode, pri tem pa omogočajo izmenjavo plinov med tlemi in ozračjem. Pokrovi morajo biti prozorni, da je omogočen prenos svetlobe. | 10. | Zahtevana je običajna laboratorijska oprema, zlasti naslednje: | — | sušilna omara, | — | stereomikroskop, | — | merilnik vrednosti pH in fotometer, | — | ustrezne natančne tehtnice, | — | ustrezna oprema za uravnavanje temperature, | — | ustrezna oprema za uravnavanje vlažnosti (ni nujna, če imajo posode za izpostavljanje pokrove), | — | inkubator ali majhna soba s klimatsko napravo, | — | pincete, kljuke ali zanke, | — | kad za razvijanje fotografij. | Priprava umetnih tal | 11. | V tem preskusu se uporabljajo umetna tla (5)(7) z naslednjo sestavo (na podlagi suhih tež, posušenih na konstantno težo pri 105 °C): | — | 10 % na zraku posušenega in fino mletega šotnega mahu (sprejemljiva je velikost delcev 2 ± 1 mm); pred uporabo tal, pripravljenih s svežo šaržo šote, v preskusu je priporočljivo preveriti, ali so tla primerna za gojenje črvov, | — | 20 % kaolinske gline (po možnosti naj bo vsebnost kaolinita nad 30 %), | — | približno od 0,3 do 1,0 % kalcijevega karbonata (CaCO3, zdrobljenega v prah, analitsko čistega) za doseganje vrednosti pH, ki znaša 6,0 ± 0,5; količina kalcijevega karbonata, ki bo dodana, je lahko odvisna zlasti od kakovosti/značilnosti šote, | — | približno 70 % na zraku posušenega kremenovega peska (odvisno od potrebne količine CaCO3), v glavnem finega peska z več kot 50 % delcev, ki merijo med 50 in 200 mikroni. | Pred uporabo tal v dokončnem preskusu je priporočljivo dokazati primernost umetnih tal za gojenje črvov in izpolnjevanje meril za veljavnost preskusa. Tako preverjanje je posebej priporočljivo za to, da se prepreči ogroženost preskusa, če se vsebnost organskega ogljika v umetnih tleh zniža, npr. z znižanjem vsebnosti mahu na vrednost 4–5 % in ustreznim zvišanjem vsebnosti peska. S takim znižanjem vsebnosti organskega ogljika se lahko zmanjšajo možnosti adsorpcije preskusne kemikalije na tla (organski ogljik), razpoložljivost preskusne kemikalije za črve pa se lahko poveča. Dokazano je, da lahko Enchytraeus albidus izpolnjuje merila za veljavnost v zvezi z razmnoževanjem, če se preskus izvaja z naravnimi tlemi z manjšo vsebnostjo organskega ogljika, npr. 2,7 % (15), (omejene) izkušnje pa kažejo, da je to mogoče doseči tudi pri umetnih tleh s 5 % šote. | Opomba: pri uporabi naravnih tal za dodatno preskušanje (na višjih stopnjah) je treba dokazati tudi primernost tal in izpolnjevanje meril za veljavnost preskusa. | 12. | Suhe sestavine tal se temeljito premešajo (npr. v velikem laboratorijskem mešalniku). To je treba storiti vsaj en teden pred začetkom preskusa. Zmešana tla je treba hraniti dva dneva, da se kislost uravnoteži/stabilizira. Za določanje vrednosti pH zmesi tal in 1 M kalijevega klorida (KCl) ali 0,01 M kalcijevega klorida (CaCl2) se uporablja raztopina v razmerju 1: 5 (glej (16) in Dodatek 3). Če so tla bolj kisla, kot je določeno z zahtevanim območjem (glej odstavek 11), jih je mogoče prilagoditi z dodajanjem ustrezne količine CaCO3. Če so tla preveč alkalna, jih je mogoče prilagoditi z dodajanjem večje količine zmesi, navedene v odstavku 11, vendar brez CaCO3. | 13. | Največja zmogljivost zadrževanja vode (water holding capacity – WHC) umetnih tal je določena v skladu s postopki, opisanimi v Dodatku 2. Dan ali dva pred začetkom preskusa se suha umetna tla predhodno navlažijo z dodajanjem zadostne količine deionizirane vode, da je pridobljena približno polovica končne vsebnosti vode, kar je od 40 do 60 % največje zmogljivosti zadrževanja vode. Na začetku preskusa so predhodno navlažena tla razdeljena na dele, ki ustrezajo številu preskusnih koncentracij (in referenčnih kemikalij, kadar je primerno) ter kontrol, uporabljenih za preskus. Vsebnost vlage se z dodajanjem raztopine preskusne kemikalije in/ali z dodajanjem destilirane ali deionizirane vode prilagodi na 40–60 % največje zmogljivosti zadrževanja vode (glej odstavke 19–21). Vsebnost vlage se določi na začetku in koncu preskusa (s sušenjem na konstantno težo pri 105 °C) in mora biti v optimalnem območju za preživetje črvov. Vsebnost vlage v tleh je mogoče preveriti z rahlim stiskanjem tal v roki; če je vsebnost vlage pravilna, se morajo med prsti pojaviti majhne kapljice vode. | Izbira in priprava preskusnih živali | 14. | Priporočena preskusna vrsta je Enchytraeus albidus (Henle, 1837) (enhitrej), član družine Enchytraeidae (red Oligochaeta, deblo Annelida). E. albidus je ena od najobsežnejših vrst kolobarnikov iz družine Enchytraeidae, pri kateri so zabeleženi tudi osebki, dolgi do 35 mm (17)(18). Vrsta E. albidus je razširjena po vsem svetu in jo najdemo v morskih, sladkovodnih in kopenskih habitatih, v glavnem v razkrajajočih se organskih snoveh (algah, kompostu), redko pa na travnikih (9). Njena široka ekološka toleranca in nekatere morfološke variacije kažejo na to, da morda obstaja več podvrst. | 15. | Vrsta E. albidus je na trgu na voljo kot hrana za ribe. Treba je preveriti, ali je kultura kontaminirana z drugimi, običajno manjšimi vrstami (1)(19). V primeru kontaminacije je treba vse črve oprati z vodo v petrijevki. Nato se (s stereomikroskopom) izberejo veliki odrasli osebki E. albidus za pripravo nove kulture in izločitev vseh drugih črvov. Vrsto E. albidus je mogoče enostavno gojiti v mnogih organskih snoveh (glej Dodatek 4). Življenjski cikel vrste E. albidus je kratek, ker zrelost doseže v obdobju med 33 dnevi (pri 18 °C) in 74 dnevi (pri 12 °C) (1). Za preskus se uporabijo le kulture, ki so bile brez težav 5 tednov (v času ene generacije) gojene v laboratoriju. | 16. | Primerne so tudi druge vrste rodu Enchytraeus, npr. E. buchholzi (Vejdovsky, 1879) ali E. crypticus (Westheide in Graefe, 1992) (glej Dodatek 5). Če se uporabijo druge vrste rodu Enchytraeus, jih je treba jasno identificirati in poročati o razlogih za izbiro. | 17. | Živali, uporabljene v preskusih, so odrasli črvi. Na področju kliteluma morajo imeti jajčeca (bele pike) in biti morajo približno enake velikosti (dolgi približno 1 cm). Sinhronizacija gojitvene kulture ni potrebna. | 18. | Če se enhitreji ne gojijo v isti vrsti tal in v pogojih (vključno s hranjenjem), uporabljenih za končni preskus, jih je treba aklimatizirati vsaj 24 ur in do tri dni. Na začetku je treba aklimatizirati število odraslih osebkov, ki je večje od števila, potrebnega za izvedbo preskusa, da je omogočena možnost zavrnitve poškodovanih ali kako drugače neprimernih osebkov. Ob koncu obdobja aklimatizacije se za preskus izberejo samo črvi, ki imajo jajčeca in se ne vedejo nenormalno (npr. ne poskušajo uiti iz tal). Črvi se s pinceto, s kljukami ali z zankami skrbno izberejo in namestijo v petrijevko, v kateri je malo sladke vode. V ta namen je primernejša rekonstituirana sladka voda, kot je predlagano v poglavju C.20 te priloge (Preskus razmnoževanja vrste Daphnia magna), saj deionizirana, demineralizirana ali vodovodna voda lahko črve poškoduje. Črvi se pregledajo pod stereomikroskopom in izločijo se vsi, ki nimajo jajčec. Pazljivo se odstranijo in izločijo vse pršice ali vsi skakači, ki so morda kontaminirali kulture. Zdravi črvi, ki se ne uporabijo za preskus, se vrnejo v založno kulturo. | Priprava preskusnih koncentracij | Preskusna kemikalija, topna v vodi | 19. | Raztopina preskusne kemikalije se pripravi v deionizirani vodi v količini, ki zadošča za vse ponovitve ene preskusne koncentracije. Priporočljivo je uporabljati zadostno količino vode, da se doseže zahtevana vsebnost vlage, tj. od 40 do 60 % največje vrednosti WHC (glej odstavek 13). Pred vstavljanjem v preskusno posodo se vsaka raztopina preskusne kemikalije temeljito zmeša z eno šaržo predhodno navlaženih tal. | Preskusna kemikalija, ki ni topna v vodi | 20. | Pri kemikalijah, ki niso topne v vodi, so pa topne v organskih topilih, se lahko preskusna kemikalija raztopi v najmanjši mogoči količini primernega vehikla (npr. acetona). Uporabijo se lahko le hlapna topila. Vehikel se razprši na majhno količino (npr. 2,5 g) finega kremenovega peska ali pa se z njo zmeša. Vehikel se odstrani tako, da vsaj eno uro izhlapeva v digestoriju. Ta zmes kremenovega peska in preskusne kemikalije se doda predhodno navlaženim tlom in po dodajanju ustrezne količine deionizirane vode temeljito zmeša, da se doseže zahtevana vlaga. Končna mešanica se namesti v preskusne posode. | 21. | Pri kemikalijah, ki so slabo topne v vodi in organskih topilih, se ekvivalent 2,5 g fino mletega kremenovega peska na preskusno posodo zmeša z določeno količino preskusne kemikalije, da nastane želena preskusna koncentracija. Ta zmes kremenovega peska in preskusne kemikalije se doda predhodno navlaženim tlom in po dodajanju ustrezne količine deionizirane vode temeljito zmeša, da se doseže zahtevana vsebnost vlage. Končna mešanica se porazdeli v preskusne posode. Postopek se ponovi za vsako preskusno koncentracijo, pripravi pa se tudi ustrezna kontrola. | 22. | Kemikalij se običajno ne sme preskušati pri koncentracijah, večjih od 1 000 mg/kg suhe mase tal. Vendar pa je v skladu s cilji določenega preskusa morda potrebno preskušanje pri višjih koncentracijah. | IZVEDBA PRESKUSOV | Preskusne in kontrolne skupine | 23. | Za vsako preskusno koncentracijo se količina preskusnih tal, ki ustreza 20 g suhe teže, postavi v preskusno posodo (glej odstavke 19–21). Pripravijo se tudi kontrolni vzorci brez preskusne kemikalije. Vsaki posodi se v skladu s postopki, opisanimi v odstavku 29, doda hrana. V vsako preskusno posodo se naključno razporedi po deset črvov. Črvi se previdno prenesejo v vsako preskusno posodo in na primer s pinceto, kljukami ali zankami namestijo na površino tal. Število ponovitev za preskusne koncentracije in za kontrolne vzorce je odvisno od uporabljenega načrta preskusa (glej odstavek 34). Preskusne posode se naključno namestijo v preskusni inkubator, njihovi položaji pa se naključno menjajo vsak teden. | 24. | Če se za nanos preskusne kemikalije uporablja vehikel, je treba poleg preskusne serije izvesti še eno kontrolno serijo, ki vsebuje kremenov pesek, na katerega se razprši ali z njim zmeša topilo. Koncentracija topila ali disperzijskega sredstva mora biti enaka tisti v preskusnih posodah s preskusno kemikalijo. Za kemikalije, ki jih je treba dodajanje v skladu s postopki, opisanimi v odstavku 21, se mora izvesti kontrolna serija, ki vsebuje dodaten kremenov pesek (2,5 g na posodo). | Preskusni pogoji | 25. | Preskusna temperatura je 20 ± 2 °C. Za preprečevanje uhajanja črvov iz tal se preskus izvaja v nadzorovanih ciklih svetlobe in teme (po možnosti 16 ur svetlobe in 8 ur teme) pri osvetljenosti od 400 do 800 luksov na območju preskusnih posod. | 26. | Za preverjanje vlažnosti tal se posode na začetku preskusa in nato enkrat tedensko stehtajo. Izguba mase se nadomesti z dodajanjem ustrezne količine deionizirane vode. Treba je opozoriti, da je mogoče izgubo vode zmanjšati z vzdrževanjem visoke relativne vlažnosti zraka (> 80 %) v preskusnem inkubatorju. | 27. | Vsebnost vlage in vrednost pH je treba meriti ob začetku in koncu preskusa za določanje območja delovanja in dokončnega preskusa. Meritve je treba opraviti v kontrolnih in tretiranih (z vsemi koncentracijami) vzorcih tal, ki so pripravljeni in vzdrževani na enak način kot preskusne kulture, ne vsebujejo pa črvov. Tem vzorcem tal je treba hrano dodati le v začetku preskusa, da se spodbudi mikrobna dejavnost. Količina dodane hrane mora biti enaka količini hrane, dodani preskusnim kulturam. Tem posodam med preskusom ni treba dodajati dodatne hrane. | Hranjenje | 28. | Uporablja se hrana, ki lahko vzdržuje populacijo enhitrejev. Kot primerna hrana so se izkazali ovseni kosmiči, po možnosti avtoklavirani pred uporabo, da se prepreči kontaminacija z mikrobi (primerno je tudi gretje). | 29. | Najprej se hrana ponudi tako, da se 50 mg grobo mletih ovsenih kosmičev zmeša s tlemi v vsaki posodi, še preden se vanjo namestijo črvi. Nato pa se hrana dobavlja tedensko, vse do 21. dneva. Hranjenje se 28. dne ne izvede, saj so odrasli osebki na tej stopnji odstranjeni, mladi črvi pa po tem potrebujejo relativno malo dodatne hrane. Hranjenje med preskusom obsega 25 mg grobo mletih ovsenih kosmičev na posodo, ki se previdno namestijo na površino tal, da ne poškodujejo črvov. Za zmanjšanje rasti gliv je treba kosmiče ovsa prekriti z majhno količino tal in jih tako zakopati v tla. Če hrana ostane nepoužita, je treba obrok zmanjšati. | Načrt za preskus za določanje območja delovanja | 30. | Po potrebi se preskus za določanje območja delovanja izvede na primer s petimi koncentracijami preskusnih kemikalij, ki znašajo 0,1, 1,0, 10, 100 in 1 000 mg/kg (suhe teže tal). Zadošča ena ponovitev za vsak tretirani in kontrolni vzorec. | 31. | Preskus za določanje območja delovanja traja dva tedna. Na koncu preskusa se oceni smrtnost črvov. Črv se zabeleži kot mrtev, če se na sprednjem koncu ne odziva na mehanske dražljaje. Pri odločanju o območju koncentracij za uporabo v dokončnem preskusu so poleg informacij o smrtnosti lahko koristne tudi dodatne informacije. Zato je treba zabeležiti tudi spremembe vedenja odraslih osebkov (npr. nezmožnost kopanja v tla, negibno ležanje ob stekleni steni preskusne posode) in morfologijo (npr. prisotnost odprtih ran) ter morebitno prisotnost mladičev. Slednjo je mogoče določiti z metodo barvanja, opisano v Dodatku 6. | 32. | Vrednost LC50 je mogoče približno določiti z izračunom geometrijske sredine podatkov o smrtnosti. Pri določanju razpona koncentracij za dokončni preskus se predpostavlja, da so učinki na razmnoževanje nižji od vrednosti LC50 za faktor, ki znaša do 10. Vendar je to razmerje empirično in je v vsakem posameznem primeru lahko drugačno. Dodatna opažanja iz preskusa za določanje območja delovanja, kot je pojav mladičev, lahko pripomorejo k natančnejši določitvi razpona koncentracij preskusne kemikalije, ki bo uporabljen v dokončnem preskusu. | 33. | Za natančno določitev vrednosti LC50 je priporočljivo izvajanje preskusa z vsaj štirimi ponovitvami vsake od koncentracij preskusne kemikalije in število koncentracij, ki je zadostno, da pri teh koncentracijah povzroči vsaj štiri različne statistično značilne povprečne odzive. Podobno število koncentracij in ponovitev za kontrole se uporablja, kadar je to primerno. | Načrt dokončnega preskusa razmnoževanja | 34. | Na podlagi priporočil, ki izhajajo iz krožnega preskusa, se predlagajo trije načrti (2). | — | Za določanje vrednosti NOEC je treba preskusiti vsaj pet koncentracij v geometrijski vrsti. Priporočene so štiri ponovitve za vsako preskusno koncentracijo in osem kontrol. Med koncentracijami mora biti razmik, katerega faktor ne sme presegati vrednosti 1,8. | — | Za določitev vrednosti ECx (npr. EC10, EC50) je treba preskusiti vsaj pet koncentracij, da se lahko ECx določi z interpolacijo in ne z ekstrapolacijo pa morajo koncentracije oklepati vrednost ECx. Priporočene so vsaj štiri ponovitve za vsako preskusno koncentracijo in štiri kontrolne ponovitve. Faktor razmika se lahko spreminja, tj. je v pričakovanem območju učinkov lahko manjši ali enak 1,8, pri višjih in nižjih koncentracijah pa je lahko nad 1,8. | — | Kombiniran pristop omogoča določitev vrednosti NOEC in ECx. Treba je uporabiti osem koncentracij za tretiranje v geometrijski vrsti. Priporočene so štiri ponovitve za vsako tretiranje in osem kontrol. Med koncentracijami mora biti razmik, katerega faktor ne sme presegati vrednosti 1,8. | 35. | Treba je uporabiti deset odraslih črvov na preskusno posodo (glej odstavek 23). V preskusno posodo se hrana doda na začetku preskusa in nato enkrat tedensko (glej odstavek 29) do vključno 21. dneva. Na 21. dan se vzorci tal previdno ročno pregledajo; poiščejo in preštejejo se živi odrasli črvi ter zabeležijo spremembe vedenja (npr. nezmožnost kopanja v tla, negibno ležanje ob stekleni steni preskusne posode) in morfologije (npr. odprte rane). Nato se vsi odrasli črvi odstranijo iz preskusnih posod in preskusnih tal. Preskusna tla, ki vsebujejo morebitne ustvarjene kokone, se inkubirajo dodatne tri tedne pri enakih preskusnih pogojih, razen hranjenja, ki poteka le 35. dan (tj. 25 mg grobo mletih ovsenih kosmičev na posodo). | 36. | Po šestih tednih se preštejejo črvi, ki so se na novo izlegli. Priporočljiva je metoda, ki temelji na barvanju z barvilom bengal rdeče (glej Dodatek 6), čeprav so se kot primerne izkazale tudi druge tehnike ekstrakcije z vlago (ne pa tudi s toploto) in flotacije (glej Dodatek 6) (4)(10)(11)(20). Barvanje z barvilom bengal rdeče je priporočljivo, ker ekstrakcijo iz substrata tal z vlago lahko ovira motnost zaradi delcev suspendirane gline. | Mejni preskus | 37. | Če pri največji koncentraciji v preskusu za določanje območja delovanja (tj. 1 000 mg/kg) ni opaženih učinkov, je mogoče preskus razmnoževanja s koncentracijo 1 000 mg/kg izvesti kot mejni preskus, da se dokaže, da je vrednost NOEC za razmnoževanje večja od te vrednosti. | Povzetek in časovni razpored preskusa | 38. | Faze preskusa je mogoče povzeti na naslednji način: | Čas | Preskus za določanje območja delovanja | Dokončni preskus | dan – 7 ali prej | — | priprava umetnih tal (mešanje suhih sestavin) | — | priprava umetnih tal (mešanje suhih sestavin) | dan – 5 | — | preverjanje vrednosti pH umetnih tal | — | merjenje največje vrednosti WHC tal | — | preverjanje vrednosti pH umetnih tal | — | merjenje največje vrednosti WHC tal | od dne – 5 do dne – 3 | — | razvrščanje črvov za aklimatizacijo | — | razvrščanje črvov za aklimatizacijo | od dne – 3 do dne 0 | — | aklimatizacija črvov vsaj 24 ur | — | aklimatizacija črvov vsaj 24 ur | dan – 1 | — | predhodna navlažitev umetnih tal in razdelitev v šarže | — | predhodna navlažitev umetnih tal in razdelitev v šarže | dan 0 | — | priprava založnih raztopin | — | nanos preskusne kemikalije | — | odtehtanje preskusnega substrata v preskusne posode | — | primešanje hrane | — | vnašanje črvov | — | merjenje vrednosti pH in vsebnosti vlage v tleh | — | priprava založnih raztopin | — | nanos preskusne kemikalije | — | odtehtanje preskusnega substrata v preskusne posode | — | primešanje hrane | — | vnašanje črvov | — | merjenje vrednosti pH in vsebnosti vlage v tleh | dan 7 | — | preverjanje vsebnosti vlage v tleh | — | preverjanje vsebnosti vlage v tleh | — | hranjenje | dan 14 | — | določitev smrtnosti odraslih osebkov | — | ocena števila mladičev | — | merjenje vrednosti pH in vsebnosti vlage v tleh | — | preverjanje vsebnosti vlage v tleh | — | hranjenje | dan 21 | | — | opazovanje vedenja odraslih osebkov | — | odstranjevanje odraslih osebkov | — | določitev smrtnosti odraslih osebkov | — | preverjanje vsebnosti vlage v tleh | — | hranjenje | dan 28 | | — | preverjanje vsebnosti vlage v tleh | — | brez hranjenja | dan 35 | | — | preverjanje vsebnosti vlage v tleh | — | hranjenje | dan 42 | | — | štetje mladih črvov | — | merjenje vrednosti pH in vsebnosti vlage v tleh | PODATKI IN POROČANJE | Obdelava rezultatov | 39. | Čeprav je v Dodatku 7 podan pregled, v tej preskusni metodi ni podana nobena dokončna statistična smernica za analizo rezultatov preskusa. | 40. | V preskusu za določanje območja delovanja je glavna končna točka smrtnost. Vendar je treba zabeležiti tudi spremembe vedenja odraslih osebkov (npr. nezmožnost kopanja v tla, negibno ležanje ob stekleni steni preskusne posode) in morfologije (npr. odprte rane) ter morebitno prisotnost mladičev. Za določanje vrednosti LC50 se običajno uporabi analiza probit (21) ali regresija logit. Vendar pa je mogoče v primerih, pri katerih ta analitska metoda ni primerna (npr. če so na voljo manj kot tri koncentracije z delnimi usmrtitvami), uporabiti alternativne metode. Te metode lahko vključujejo drseča povprečja (22), prilagojeno metodo Spearman-Karber (23) ali enostavno interpolacijo (npr. geometrijsko sredino vrednosti LC0 in LC100, izračunano s kvadratnim korenom zmnožka vrednosti LC0 in LC100). | 41. | V dokončnem preskusu je končna točka plodnost (tj. število ustvarjenih mladičev). Vendar je treba v končno poročilo, tako kot pri preskusu za določanje območja delovanja, zabeležiti vse druge znake škodljivega delovanja. Za statistično analizo morata biti izračunana aritmetična sredina in standardni odklon za razmnoževanje pri posamezni tretirani skupini in kontroli. | 42. | Če je izvedena analiza variance, je mogoče standardni odklon, s, in stopinje prostosti, df, nadomestiti z oceno skupne variance, pridobljene z analizo variance (ANOVA) oziroma z njenimi stopinjami prostosti, če varianca ni odvisna od koncentracije. V tem primeru uporabite enosmerne analize variance kontrol in tretiranih skupin. Te vrednosti se navadno izračunajo s komercialno programsko opremo za statistiko, pri čemer so rezultati glede na posodo uporabljeni kot ponovitve. Če se zdi, da je združevanje podatkov za negativne kontrole in kontrole s topilom bolj smiselno od preskušanja glede na enega od njih, jih je treba preskusiti, da se preveri, da med njimi ni značilnih razlik (za ustrezne preskuse glej odstavek 45 in Dodatek 7). | 43. | Nadaljnje statistično preskušanje in sklepanje je odvisno od tega, ali so vrednosti ponovitev normalno porazdeljene in homogene glede na svojo varianco. | Ocena vrednosti NOEC | 44. | Prednost mora imeti uporaba učinkovitih preskusov. Uporabiti je treba informacije npr. iz predhodnih izkušenj s krožnim preskušanjem ali druge podatke iz preteklih študij o tem, ali so podatki približno normalno porazdeljeni. Homogenost variance (homoskedastičnost) je bolj kritična. Izkušnje kažejo, da varianca pogosto narašča z naraščajočo srednjo vrednostjo. V teh primerih transformacija podatkov lahko privede do homoskedastičnosti. Vendar mora taka transformacija temeljiti na izkušnjah s podatki iz preteklih študij in ne na podatkih, ki se proučujejo. Pri homogenih podatkih je treba izvesti več t-preskusov, kot je Williamsov preskus (α = 0,05, enostranski) (24)(25) ali, v nekaterih primerih, Dunnettov preskus (26)(27). Velja pripomniti, da je treba v primeru neenake ponovitve popraviti vrednosti t iz preglednice tako, kot sta predlagala Dunnett in Williams. Včasih se odzivi zaradi velike variacije ne povečajo/zmanjšajo pravilno. V tem primeru velikega odklona od monotonosti je bolj primeren Dunnettov preskus. Če obstajajo odkloni od homoskedastičnosti, je morda smiselno natančneje proučiti možne učinke na variance, da se ugotovi, ali je mogoče uporabiti t-preskuse brez prevelike izgube učinkovitosti (28). Druga možnost je uporaba večkratnega U-preskusa, npr. Bonferronijevega U-preskusa po Holmu (29), ali – če ti podatki kažejo heteroskedastičnost, sicer pa so skladni z osnovnim monotonim razmerjem odmerek-odziv – drugega neparametričnega preskusa (npr. preskusa po Jonckheere-Terpstraju (30)(31) ali Shirleyjevega preskusa (32)(33)); uporaba takšnega preskusa ima v splošnem prednost pred t-preskusi za neenake variance. (Glej tudi shemo v Dodatku 7.) | 45. | Če je izveden mejni preskus in so izpolnjeni predpogoji za postopke parametričnih preskusov (normalnost, homogenost), je mogoče uporabiti parni Studentov t-preskus ali, namesto tega, postopek Mann-Whitneyjevega U-preskusa (29). | Ocena vrednosti ECx | 46. | Za izračun katere koli vrednosti ECx se po pridobitvi ustrezne funkcije odmerek-odziv za regresijsko analizo (linearno ali nelinearno) uporabijo srednje vrednosti glede na tretirano skupino. Za rast črvov v obliki zveznega odziva je mogoče vrednosti ECx oceniti z ustrezno regresijsko analizo (35). Med primernimi funkcijami za kvantne podatke (smrtnost/preživetje in število ustvarjenih potomcev) so normalna sigmoidna funkcija in logistične ali Weibullove funkcije, ki vsebujejo od dva do štiri parametre, pri čemer nekatere lahko modelirajo tudi odzive v obliki hormeze. Če je bila funkcija odmerek-odziv prilagojena z linearno regresijsko analizo, je treba v regresijski analizi pred ocenjevanjem vrednosti ECx najti značilni r2 (determinacijski koeficient) in/ali naklon, tako da se v enačbo, podano z regresijsko analizo, vstavi vrednost, ki ustreza x % srednje vrednosti kontrole. V skladu s Fiellerjem (navedeno v Finney (21)) ali z drugimi ustreznimi sodobnimi metodami se izračunajo 95-odstotne meje zaupanja. | 47. | Namesto tega se odziv lahko modelira kot odstotek ali razmerje parametra modela, ki se razlaga kot srednja vrednost odziva kontrole. V teh primerih je mogoče običajno (logistično, Weibullovo) sigmoidno krivuljo pogosto enostavno prilagoditi rezultatom s postopkom regresije probit (21). V teh primerih je treba utežno funkcijo prilagoditi za odzive metrik, kot je podano v Christensen (36). Če pa je ugotovljena hormeza, mora analizo probit nadomestiti logistična ali Weibullova funkcija s štirimi parametri, prilagojena s postopkom nelinearne regresije (36). Če podatkom ni mogoče prilagoditi primerne funkcije odmerek-odziv, je mogoče za oceno vrednosti ECx in njenih meja zaupanja uporabiti alternativne metode, kot so drseča povprečja po Thompsonu (22) in postopek prilagojene metode Spearman-Karber (23). | POROČILO O PRESKUSU | 48. | Poročilo o preskusu mora vsebovati naslednje informacije: | | Preskusna kemikalija: | — | fizikalno stanje in, kjer je ustrezno, fizikalno-kemijske lastnosti (npr. topnost v vodi, parni tlak), | — | kemijski identifikacijski podatki preskusne kemikalije po nomenklaturi IUPAC, številka CAS, serija, skupina, strukturna formula in čistost, | — | datum izteka roka uporabnosti vzorca. | | Preskusne vrste: | — | uporabljene preskusne vrste: vrsta, znanstveno ime, vir organizmov in pogoji gojenja. | | Preskusni pogoji: | — | sestavine in priprava umetnih tal, | — | metoda uporabe preskusne kemikalije, | — | opis preskusnih pogojev, vključno s temperaturo, vsebnostjo vlage, vrednostjo pH itd., | — | celoten opis načrta in postopkov poskusa. | | Rezultati preskusa: | — | smrtnost pri odraslih črvih po dveh tednih in število mladičev na koncu preskusa za določanje območja delovanja, | — | smrtnost pri odraslih črvih po treh tednih izpostavljenosti in celoten seznam mladičev na koncu dokončnega preskusa, | — | morebitni opaženi fizični ali patološki simptomi in spremembe vedenja pri preskusnih organizmih, | — | vrednosti LC50, NOEC in/ali ECx (npr. EC50, EC10) za razmnoževanje, če je mogoče nekatere od njih uporabiti znotraj intervalov zaupanja, krivulja prilagojenega modela, uporabljena za njegov izračun, ter vse informacije in opažanja, ki pripomorejo k razlagi rezultatov. | Odstopanja od postopkov, opisanih v tej preskusni metodi, in morebitni nenavadni dogodki med preskusom. | LITERATURA | (1) | Römbke, J. (1989). Entwicklung eines Reproduktionstests an Bodenorganismen – Enchytraeen. Abschlußbericht des Battelle-Instituts e.V. Frankfurt für das Umweltbundesamt (Berlin), FE-Vorhaben 106 03 051/01. | (2) | Römbke, J., in Moser, T. (1999). Organisation and Performance of an International Ringtest for the Validation of the Enchytraeid Reproduction Test. UBA-Texte 4/99, 150 + 223 str. | (3) | Westheide, W., in Bethge-Beilfuss, D. (1991). The sublethal enchytraeid test system: guidelines and some results, V: Modern Ecology: Basic and Applied Aspects. Uredila Esser, G., in Overdieck, D., str. 497–508. Elsevier, Amsterdam. | (4) | Dirven-Van Breemen, E., Baerselmann, R., in Notenboom, J. (1994). Onderzoek naar de Geschiktheid van de Potwormsoorten Enchytraeus albidus en Enchytraeus crypticus (Oligochaeta, Annelida) in Bodemecotoxicologisch Onderzoek. RIVM Rapport, št. 719102025. 46 str. | (5) | Poglavje C.8 te priloge, Strupenost za deževnike. | (6) | ISO (Mednarodna organizacija za standardizacijo) (1993). Soil Quality – Effects of pollutants on earthworms (Eisenia fetida). Part 1: Determination of acute toxicity using Artificial Soil substrate, št. 11268-1. ISO, Ženeva. | (7) | ISO (Mednarodna organizacija za standardizacijo) (1996). Soil Quality – Effects of pollutants on earthworms (Eisenia fetida). Part 2: Determination of effects on reproduction, No. 11268-2. ISO, Ženeva. | (8) | Rundgren, S., in A. K. Augustsson (1998). Test on the enchytraeid Cognettia sphagnetorum (Vejdovsky 1877). V: Løkke, H. in C. A. M. Van Gestel, Handbook of soil invertebrate toxicity tests. John Wiley and Sons, Chichester, 73–94. | (9) | Kasprzak, K. (1982). Review of enchytraeid community structure and function in agricultural ecosystems. Pedobiologia 23, 217–232. | (10) | Römbke, J. (1995). Enchytraeen (Oligochaeta) als Bioindikator, UWSF – Z. Umweltchem. Ökotox. 7, 246–249. | (11) | Dunger, W., in Fiedler, H. J. (1997). Methoden der Bodenbiologie. G. Fischer Verlag, Stuttgart, New York. | (12) | Didden, W. A. M. (1993). Ecology of terrestrial Enchytraeidae. Pedobiologia 37, 2–29. | (13) | Becker, H. (1991). Bodenorganismen – Prüfungskategorien der Forschung. UWSF – Z. Umweltchem. Ökotox. 3, 19–24. | (14) | Römbke, J., in Federschmidt, A. (1995). Effects of the fungicide Carbendazim on Enchytraeidae in laboratory and field tests, Newsletter on Enchytraeidae 4, 79–96. | (15) | Römbke, J., Riepert, F., in Achazi, R. (2000). Enchytraeen als Testorganismen. V: Toxikologische Beurteilung von Böden. Heiden S., Erb R., Dott W., in Eisentraeger A. (ur.). Spektrum Verl., Heidelberg. 59–81. | (16) | ISO (Mednarodna organizacija za standardizacijo) (1994). Kakovost tal – Določevanje pH, št. 10390. ISO, Ženeva. | (17) | Bell, A. W. (1958). The anatomy of Enchytraeus albidus, with a key to the species of the genus Enchytraeus. Ann. Mus. Novitat. 1902, 1– 13. | (18) | Nielsen, C. O., in Christensen, B. (1959). The Enchytraeidae, critical revision and taxonomy of European species. Natura Jutlandica 8-9, 1– 160. | (19) | Bouguenec, V., in Giani, N. (1987). Deux nouvelles especes d'Enchytraeus (Oligochaeta, Enchytraeidae) et rediscription d'E. bigeminus. Remarques sur le genre Enchytraeus. Ann. Limnol. 23, 9–22. | (20) | Korinkova, J., in Sigmund, J. (1968). The colouring of bottom-fauna samples before sorting, Vestnik Ceskoslovensko Spolecnosti Zoologicke 32, 300–305. | (21) | Finney, D. J. (1971). Probit Analysis (3. izdaja), str. 19–76. Cambridge Univ. Press. | (22) | Finney, D. J. (1978). Statistical Method in Biological Assay. -Charles Griffin & Company Ltd, London. | (23) | Hamilton, M. A., Russo, R. C., in Thurston, R.V. (1977). Trimmed Spearman-Karber Method for estimating median lethal concentrations in toxicity bioassays. Environ. Sci. Technol. 11(7), 714–719; Correction Environ. Sci. Technol. 12(1998), 417. | (24) | Williams, D. A. (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27, 103-117. | (25) | Williams, D. A. (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics 28, 519-531. | (26) | Dunnett, C. W. (1955). A multiple comparison procedure for comparing several treatments with a control. Amer. Statist. Ass. J. 50, 1096-1121. | (27) | Dunnett, C. W. (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics 20, 482-491. | (28) | Hoeven, N. van der (1998). Power analysis for the NOEC: What is the probability of detecting small toxic effects on three different species using the appropriate standardized test protocols? Ecotoxicology 7: 355–361. | (29) | Holm, S. (1979). A simple sequentially rejective multiple test procedure. Scand. J. Statist. 6, 65-70. | (30) | Jonckheere, A. R. (1954). A Distribution-free k-Sample Test Against Ordered Alternatives, Biometrika 41, 133– 145. | (31) | Terpstra, T. J. (1952). The Asymptotic Normality and Consistency of Kendall's Test Against Trend, When Ties are Present in One Ranking, Indagationes Math. 14, 327–333. | (32) | Shirley, E. A. (1979). The comparison of treatment to control group means in toxicology studies, Applied Statistics 28, 144– 151. | (33) | Williams, D. A. (1986). A Note on Shirley's Nonparametric Test for Comparing Several Dose Levels with a Zero-Dose Control, Biometrics 42, 183– 186. | (34) | Sokal, R. R., in F. J. Rohlf. (1981). Biometry. The Principle and practice of statistics in biological research. 2. izdaja. W. H. Freeman and Company. New York. | (35) | Christensen, E. R. (1984). Dose-response functions in aquatic toxicity testing and the Weibull model. Water Research 18, 213–221. | (36) | Van Ewijk, P. H., in Hoekstra, J. A. (1993). Calculation of the EC50 and its confidence interval when sub-toxic stimulus is present. Ecotox, Environ. Safety. 25, 25–32. | Dodatek 1 | Opredelitve pojmov | Za to preskusno metodo se uporabljajo naslednje opredelitve: | Kemikalija pomeni snov ali zmes. | ECx (učinkovita koncentracija za x-odstotni učinek) je koncentracija, ki na preskusnih organizmih v danem obdobju izpostavljenosti v primerjavi s kontrolno učinkuje x-odstotno. V tem preskusu so učinkovite koncentracije izražene kot masa preskusne kemikalije na suho maso preskusnih tal. | LC0 (koncentracija brez smrtnega učinka) je koncentracija preskusne kemikalije, ki v določenem časovnem obdobju ne ubije nobenega od izpostavljenih preskusnih organizmov. V tem preskusu je LC0 izražena kot masa preskusne kemikalije na suho maso preskusnih tal. | LC50 (srednja smrtna koncentracija) je koncentracija preskusne kemikalije, ki v določenem časovnem obdobju ubije 50 % izpostavljenih preskusnih organizmov. V tem preskusu je LC50 izražena kot masa preskusne kemikalije na suho maso preskusnih tal. | LC100 (popolnoma smrtna koncentracija) je koncentracija preskusne kemikalije, ki v določenem časovnem obdobju ubije 100 % izpostavljenih preskusnih organizmov. V tem preskusu je LC100 izražena kot masa preskusne kemikalije na suho maso preskusnih tal. | LOEC (najnižja koncentracija z opaznim učinkom) je najnižja koncentracija preskusne kemikalije, ki ima statistično značilen učinek (p < 0,05). V tem preskusu je vrednost LOEC izražena kot masa preskusne kemikalije na suho maso preskusnih tal. Vse preskusne koncentracije nad vrednostjo LOEC morajo običajno kazati učinek, ki je statistično različen od kontrole. Vsa odstopanja od zgoraj navedenega pri ugotavljanju vrednosti LOEC morajo biti utemeljena v poročilu o preskusu. | NOEC (koncentracija brez opaznega učinka) je najvišja koncentracija preskusne kemikalije tik pod vrednostjo LOEC, pri kateri ni opaznega učinka. V tem preskusu koncentracija, ki ustreza vrednosti NOEC, v danem obdobju izpostavljenosti v primerjavi s kontrolo nima statistično značilnega učinka (p < 0,05). | Hitrost razmnoževanja je srednja vrednost števila mladih črvov, ki jih ustvari določeno število odraslih osebkov v preskusnem obdobju. | Preskusna kemikalija je katera koli snov ali zmes, preskušena s to preskusno metodo. | Dodatek 2 | Določanje največje zmogljivosti zadrževanja vode | Določanje zmogljivosti zadrževanja vode umetnih tal | Ugotovljeno je bilo, da je primerna naslednja metoda. Opisana je v Prilogi C standarda ISO DIS 11268-2. | S primerno napravo (svedrastim vzorčevalnikom itd.) zberite določeno količino (npr. 5 g) substrata preskusnih tal. Pokrijte dno vzorčevalnika s koščkom filtrirnega papirja in ga po polnjenju z vodo postavite na stojalo v vodno kopel. Vzorčevalnik je treba postopoma potapljati, dokler nivo vode ni nad zgornjim delom tal. Nato ga je treba pustiti v vodi približno tri ure. Ker ni mogoče zadržati vse vode, ki jo absorbirajo talne kapilare, mora biti omogočeno, da se vzorec tal dve uri suši, tako da se vzorčevalnik postavi na ležišče iz zelo mokrega, fino mletega kremenovega peska, ki je nameščen v zaprti posodi (da se ne posuši). Nato je treba vzorec stehtati in pri 105 °C posušiti na konstantno maso. Zmogljivost zadrževanja vode (WHC) je nato mogoče izračunati po naslednjem postopku: | pri čemer je: | S | = | z vodo nasičeni substrat + masa vzorčevalnika + masa filtrirnega papirja, | T | = | tara (masa vzorčevalnika + masa filtrirnega papirja), | D | = | suha masa substrata. | VIR: | ISO (Mednarodna organizacija za standardizacijo) (1996). Soil Quality – Effects of pollutants on earthworms (Eisenia fetida). Part 2: Determination of effects on reproduction, št. 11268-2, ISO, Ženeva. | Dodatek 3 | Določanje vrednosti ph tal | Naslednja metoda za določanje vrednosti pH vzorca tal temelji na opisu v ISO 10390 (Kakovost tal – Določevanje pH). | Določena količina tal se pri sobni temperaturi suši vsaj 12 ur. Nato se izdela suspenzija tal (ki vsebuje vsaj 5 gramov tal) v petkratni količini volumna tal z 1 M analitsko čistega kalijevega klorida (KCl) ali 0,01 M raztopine analitsko čistega kalcijevega klorida (CaCl2). Suspenzija se nato pet minut temeljito stresa. Po stresanju se suspenzija vsaj 2 uri in največ 24 ur pusti, da se usede. Vrednost pH tekoče faze se nato meri z merilnikom vrednosti pH, ki je pred vsako meritvijo umerjen z ustreznimi vrstami pufrskih raztopin (npr. pH 4,0 in 7,0). | VIR: | ISO (Mednarodna organizacija za standardizacijo) (1994). Kakovost tal – Določevanje pH, št. 10390. ISO, Ženeva. | Dodatek 4 | Pogoji gojenja vrste enchytraeus | Enhitreje vrste Enchytraeus albidus (in drugih vrst Enchytraeus) je mogoče gojiti v velikih plastičnih posodah (npr. 30 × 60 × 10 cm), napolnjenih z zmesjo 1: 1 umetnih tal in naravne, nekontaminirane vrtne prsti. Kompostnemu materialu se je treba izogibati, saj lahko vsebuje strupene kemikalije, kot so težke kovine. Pred uporabo je treba iz tal odstraniti favno (npr. z globokim zamrzovanjem). Substrat, ki ga sestavljajo samo umetna tla, je tudi mogoče uporabiti, vendar je lahko hitrost razmnoževanja nižja od tiste pri substratu z mešanimi tlemi. Vrednost pH substrata, uporabljenega za gojenje, mora znašati 6,0 ± 0,5. | Kultura se hrani v temi pri temperaturi od 15 do 20 °C ± 2 °C. Izogibati se je treba temperaturam, višjim od 23 °C. Tla je treba ohranjati vlažna, ne pa mokra. Da je vsebnost vlage pravilna, kažejo majhne kapljice vode, ki se pojavijo med prsti ob rahlem stiskanju tal. Treba se je izogibati ustvarjanju anoksičnih pogojev, zato je treba poskrbeti, da pokrovi posod, v katerih so kulture, omogočajo zadostno izmenjavo plinov z ozračjem. Vsak teden je treba tla previdno prekopati, da se pospeši zračenje. | Črve je mogoče hraniti z ovsenimi kosmiči. Ovseni kosmiči morajo biti shranjeni v zatesnjenih posodah, pred uporabo pa jih je treba avtoklavirati ali segreti, da se prepreči kontaminacija s pršicami iz moke (npr. vrstami Glyzyphagus, Astigmata, Acarina) ali plenilskimi pršicami (npr. Hypoaspis (Cosmolaelaps) miles, Gamasida, Acarina). Po segrevanju je treba hrano zmleti, tako da jo je mogoče enostavno potresti po površini tal. Občasno se lahko ovsenim kosmičem dodajo vitamini, mleko in ribje olje. Druga primerna vira hrane sta pekovski kvas in ribja hrana ‚Tetramin‘. | Hranjenje poteka približno dvakrat tedensko. Ustrezno količino ovsenih kosmičev se potrese na površino tal ali ob prekopavanju tal za pospeševanje zračenja previdno vmeša v substrat. Absolutna količina ponujene hrane je odvisna od števila črvov v substratu. Če je bila vsa hrana použita v istem dnevu, kot je bila ponujena, je to lahko vodilo, da je treba količino hrane povečati. Obratno pa je treba, če hrana v času drugega hranjenja (en teden kasneje) še vedno ostaja na površini, količino zmanjšati. Hrano, kontaminirano z glivami, je treba odstraniti in zamenjati. Po treh mesecih je treba črve prenesti v sveže pripravljen substrat. | Pogoji gojenja veljajo za zadovoljive, če: (a) črvi ne skušajo zapustiti substrata tal, (b) se črvi skozi tla premikajo hitro, (c) imajo svetlečo zunanjo površino, na katero se ne lepijo delci, (d) so bolj ali manj bele barve, (e) so v kulturah črvi različnih starostnih obdobij, (f) se neprestano razmnožujejo. | Dodatek 5 | Izvedba preskusa pri drugih vrstah enchytraeus | Izbira vrst | Razen vrste E. albidus je mogoče uporabiti tudi druge vrste, vendar je treba preskusni postopek in merila za veljavnost ustrezno prilagoditi. Ker je veliko vrst Enchytraeus lahko dostopnih in jih je mogoče zadovoljivo gojiti v laboratoriju, je najpomembnejše merilo za izbiro drugih vrst, ne vrste E. albidus, ekološka pomembnost in, dodatno, primerljiva občutljivost. Lahko obstajajo tudi uradni razlogi za spremembo vrste. V državah, v katerih se npr. vrsta E. albidus ne pojavlja in je ni mogoče uvoziti (npr. zaradi omejitev v zvezi s karanteno), je treba uporabiti drugo vrsto Enchytraeus. | Primeri ustreznih alternativnih vrst | — | Enchytraeus crypticus (Westheide in Graefe, 1992): v zadnjih letih se ta vrsta pogosto uporablja v ekotoksikoloških študijah, ker jo je preprosto gojiti in preskušati. Vendar je majhna, zato je ravnanje z njo težje v primerjavi z vrsto E. albidus (še posebej v fazah pred uporabo metode barvanja). Ni zagotovo dokazano, da vrsta E. crypticus obstaja na polju, opisana je bila le na podlagi kultur deževnikov. Zato njene ekološke potrebe niso znane. | — | Enchytraeus buchholzi (Vejdovsky, 1879): to ime verjetno zajema skupino vrst v bližnjem sorodstvu, ki jih je morfološko težko ločiti. Ni priporočena za uporabo pri preskušanju, dokler ni ugotovljeno, kateri vrsti pripadajo posamezni osebki, uporabljeni v preskusu. E. buchholzi je navadno mogoče najti na travnikih in prizadetih območjih, kot so obcestne površine. | — | Enchytraeus luxuriosus: ta vrsta je bila prvotno znana kot E.
‚
minutus
‘, a je bila nedavno opisana (1). Prvič jo je odkril U. Graefe (iz Hamburga) na travniku blizu St. Peter-Ordinga (Schleswig-Holstein, Nemčija). E. luxuriosus je približno pol manjša od vrste E. albidus, a je večja od drugih tu opisanih vrst; ta vrsta bi lahko bila dobra alternativa vrsti E. albidus. | — | Enchytraeus bulbosus (Nielsen in Christensen, 1963): doslej so o tej vrsti poročali, da so jo našli v nemških in španskih mineralnih tleh, kjer je pogosta, vendar ne v velikem obsegu. V primerjavi z drugimi vrstami tega rodu jo je relativno enostavno določiti. O njenem vedenju v laboratorijskih preskusih ali njeni občutljivosti na kemikalije ni ničesar znanega. Vendar pa je bilo ugotovljeno, da jo je enostavno gojiti (E. Belotti, osebna komunikacija). | Pogoji gojenja | Vse zgoraj omenjene vrste Enchytraeus je mogoče gojiti v enakih substratih, kot se uporabljajo za vrsto E. albidus. Njihova manjša velikost pomeni, da so posode za gojenje lahko manjše in da je mogoče uporabiti enako hrano, vendar pa je treba prilagoditi velikost obroka. Življenjski cikel teh vrst je krajši od življenjskega cikla vrste E albidus, zato mora biti hranjenje pogostejše. | Preskusni pogoji | Preskusni pogoji so v splošnem enaki kot tisti za vrsto E. albidus, razen naslednjega: | — | velikost preskusne posode je lahko manjša (ni pa nujno), | — | trajanje preskusa razmnoževanja je lahko (ni pa nujno) krajše, tj. štiri namesto šest tednov, vendar trajanja preskusa za določanje območja delovanja ni dovoljeno spremeniti, | — | za štetje je zaradi majhnosti mladih črvov zelo priporočljiva metoda barvanja, | — | merilo za veljavnost, ki se nanaša na ‚število mladičev na preskusno posodo v kontrolnem vzorcu‘, je treba spremeniti v ‚50‘. | VIR | (1) | Schmelz, R. M., in Collado, R. (1999). Enchytraeus luxuriosus sp.nov., a new terrestrial oligochaete species (Enchytraeidae, Clitellata, Annelida). Carolinea 57, 93–100. | Dodatek 6 | Podroben opis tehnik ekstrakcije | Barvanje z barvilom bengal rdeče | To metodo, ki je bila najprej razvita v ekologiji celinskih voda (1), je za štetje mladih enhitrejev v preskusu razmnoževanja enhitrejev naprej predlagal W. de Coen (z Univerze v Gentu, Belgija). Neodvisno od njega so prilagojeno različico (barvilo bengal rdeče, zmešano s formaldehidom namesto z etanolom) razvili na inštitutu RIVM v Bilthovnu (2)(3). | Ob koncu dokončnega preskusa (tj. po šestih tednih) se tla iz preskusnih posod prenesejo v plitko posodo. Za ta namen je uporabna posoda Bellaplast ali kad za razvijanje fotografij z rebrastim dnom; slednja zato, ker ‚rebra‘ omejujejo premikanje črvov v polju opazovanja. Mladiči se fiksirajo z etanolom (s približno 5 ml na ponovitev). Posode se napolnijo z vodo do višine od 1 do 2 cm. Doda se nekaj kapljic (od 200 do 300 μl) barvila bengal rdeče (1-odstotna raztopina v etanolu) (alternativa je 0,5-odstotno barvilo eozin), obe sestavini pa se previdno zmešata. Po 12 urah bi morali biti črvi obarvani rdečkasto in bi jih moralo biti enostavno prešteti, ker bodo ležali na površini substrata. Zmes substrata/alkohola je namesto tega mogoče pred štetjem črvov sprati tudi prek sita (velikost mreže: 0,250 mm). S tem postopkom se bo nekaj kaolinita, šote in peska izpralo, rdečkasto obarvane črve pa bo laže videti in prešteti. Štetje olajšajo tudi osvetljene leče (leče velikosti vsaj 100 × 75 mm s faktorjem povečave od 2 do 3). | S tehniko barvanja se čas štetja skrajša na nekaj minut na posodo, kot vodilo pa lahko služi podatek, da bi morala ena oseba oceniti vse posode iz enega preskusa v največ dveh dneh. | Ekstrakcija z vlago | Ekstrakcijo z vlago je treba začeti takoj po koncu preskusa. Tla iz vsake preskusne posode se namestijo na plastična sita z velikostjo mreže približno 1 mm. Sita se nato obesijo v plastične sklede, tako da se ne dotikajo tal. Sklede se previdno polnijo z vodo, dokler vzorci v sitih niso popolnoma pod površino vode. Da se zagotovi stopnja izkoristka, ki znaša več kot 90 % prisotnih črvov, je treba uporabiti obdobje ekstrakcije 3 dni pri 20 ± 2 °C. Na koncu obdobja ekstrakcije se sita odstranijo in voda (razen majhne količine) se počasi odlije, pri čemer je treba paziti, da se ne kali usedlina na dnu skled. Plastične sklede se nato rahlo pretresejo, da se suspendira usedlina v vodi nad usedlino. Voda se prenese v petrijevko, ko pa se delci tal usedejo, je s stereomikroskopom in kleščami iz mehkega jekla mogoče določiti, odstraniti in prešteti enhitreje. | Flotacija | Metodo, ki temelji na flotaciji, je v opombi opisal R. Kuperman (4). Po fiksiranju vsebine preskusne posode z etanolom se tla poplavijo z disperzijo Ludox (koloidni kremen AM-30, suspenzija v vodi 30 % mase), ki naj sega od 10 do 15 mm nad površino tal. Po temeljitem mešanju tal s flotacijskim sredstvom od 2 do 3 minute je mogoče mlade črve, ki plavajo na površini, enostavno prešteti. | VIRI | (1) | Korinkova, J., in Sigmund, J. (1968). The colouring of bottom-fauna samples before sorting, Vestnik Ceskoslovensko Spolecnosti Zoologicke 32, 300–305. | (2) | Dirven-Van Breemen, E., Baerselmann, R., in Notenboom, J. (1994). Onderzoek naar de Geschiktheid van de Potwormsoorten Enchytraeus albidus en Enchytraeus crypticus (Oligochaeta, Annelida) in Bodemecotoxicologisch Onderzoek. RIVM Rapport, št. 719102025. 46 str. | (3) | Posthuma, L., Baerselmann, R., Van Veen, R. P. M., in Dirven-Van Breemen, E. M. (1997). Single and joint toxic effects of copper and zinc on reproduction of Enchytraeus crypticus in relation to sorption of metals in soils. Ecotox. Envir. Safety 38, 108–121. | (4) | Phillips, C. T., Checkai, R. T., in Kuperman, R. G. (1998). An alternative to the O'Connor Method for Extracting Enchytraeids from Soil. SETAC 19th Annual Meeting, Charlotte, ZDA. Abstract Book No. PMP069, str. 157. | Dodatek 7 | Pregled statistične ocene podatkov (določitev vrednosti noec) | Bonferronijev U-preskus | Preskus po Jonckheere-Terpstraju | Shirleyjev preskus | Dunnov preskus | Podatki: | Je variacija homogena? | Je porazdelitev normalna? | Parametrični preskusi | Da | Izločite kontrolo brez topila. | Sta obe kontroli enaki? U-preskus | Sta obe kontroli enaki? T-preskus. | Obe kontroli je mogoče združiti. | Dodatna kontrola s topilom? | Dodatna kontrola s topilom? | Statistično preskušanje ni priporočljivo. | Ali obstajajo vsaj štiri ponovitve na tretiranje? | Ni uspelo. | Pretvori podatke. | Da | Da | Da | Da | Da | Da | Ne | Ne | Ne | Ne | Ne | Ne | Dunnettov preskus | Williamsov preskus | Izločite kontrolo brez topila. | Obe kontroli je mogoče združiti. | Začetek | Neparametrični preskusi | C.33. PRESKUS RAZMNOŽEVANJA DEŽEVNIKOV (EISENIA FETIDA/EISENIA ANDREI) | UVOD | 1. | Ta preskusna metoda je enakovredna Smernici za preskušanje OECD (TG) 222 (2004). Zasnovana je za uporabo pri ocenjevanju učinkov kemikalij v tleh na sposobnost razmnoževanja (in druge subletalne končne točke) vrste deževnikov Eisenia fetida (Savigny, 1826) ali Eisenia andrei (Andre, 1963) (1) (2). Preskus je bil krožno preskušen (3). Obstaja preskusna metoda za preskus akutne strupenosti pri deževnikih (4). Objavljenih je več drugih mednarodnih in nacionalnih smernic za preskuse akutne in kronične strupenosti za deževnike (5)(6)(7)(8). | 2. | Vrsta Eisenia fetida/Eisenia andrei velja za eno od predstavnic talne favne in še posebej deževnikov. Na voljo so osnovne informacije o ekologiji deževnikov in njihovi uporabi pri ekotoksikološkem preskušanju (7)(9)(10)(11)(12). | NAČELO PRESKUSA | 3. | Odrasli črvi so izpostavljeni več koncentracijam preskusne kemikalije, vmešane v tla ali, v primeru pesticidov, nanesene na tla ali v tla s postopki, skladnimi z vzorcem uporabe kemikalije. Način nanosa je odvisen od namena preskusa. Območje preskusnih koncentracij je izbrano tako, da zajema subletalne in smrtne učinke v obdobju osmih tednov. Smrtnost in učinki na rast odraslih črvov so določeni po 4 tednih izpostavljenosti. Odrasli osebki se nato odstranijo iz tal in po nadaljnjih 4 tednih se s štetjem potomcev ocenijo učinki na razmnoževanje. Sposobnost razmnoževanja živali, izpostavljenih preskusni kemikaliji, se za določitev (i) koncentracije brez opaznega učinka (NOEC) in/ali (ii) ECx (npr. EC10, EC50) z regresijskim modelom, s katerim se oceni koncentracijo, ki bi povzročila x-odstotno zmanjšanje sposobnosti razmnoževanja, primerja s sposobnostjo razmnoževanja pri kontrolah. Preskusne koncentracije morajo oklepati vrednost ECx (npr. EC10, EC50), tako da vrednost ECx nato izvira iz interpolacije in ne iz ekstrapolacije (za opredelitve glej Dodatek 1). | PODATKI O PRESKUSNI KEMIKALIJI | 4. | Za pomoč pri zasnovi ustreznih preskusnih postopkov morajo biti na voljo naslednji podatki v zvezi s preskusno kemikalijo: | — | topnost v vodi, | — | log Kow, | — | parni tlak | — | ter informacije o usodi in vedenju v okolju, kadar je mogoče (npr. hitrost fotolize in hitrost hidrolize, če sta pomembni za vzorce uporabe). | 5. | To preskusno metodo je mogoče uporabiti pri vseh kemikalijah, ne glede na njihovo topnost v vodi. Preskusna metoda se ne sme uporabljati pri hlapnih kemikalijah, ki so tu opredeljene kot kemikalije, za katere je Henryjeva konstanta ali porazdelitveni koeficient zrak/voda večja od ena, ali pri kemikalijah, pri katerih parni tlak pri 25 °C presega 0,0133 Pa. | 6. | V tej preskusni metodi ni upoštevana morebitna razgradnja preskusne kemikalije v obdobju preskusa. Zato ni mogoče predpostavljati, da bodo koncentracije izpostavljenosti med celotnim preskusom ostale na začetnih vrednostih. V tem primeru je priporočena kemijska analiza preskusne kemikalije na začetku in koncu preskusa. | REFERENČNA KEMIKALIJA | 7. | Za zagotovitev, da so laboratorijski preskusni pogoji ustrezni, in za potrditev, da se odziv preskusnih organizmov skozi čas statistično ne spreminja, je treba določiti vrednost NOEC in/ali ECx referenčne kemikalije. Referenčno kemikalijo je priporočljivo preskusiti najmanj enkrat letno oz. vzporedno z določanjem strupenosti preskusne snovi, kadar se preskušanja opravljajo redkeje. Karbendazim ali benomil sta primerni referenčni kemikaliji, za kateri je dokazano, da vplivata na reprodukcijo (3). Značilne učinke je treba opaziti med (a) 1 in 5 mg aktivne sestavine (a.s.)/kg suhe mase ali (b) 250–500 g/ha ali 25–50 mg/m2. Če je v preskusno serijo vključen pozitivni toksikološki standard, se uporablja ena koncentracija, število ponovitev pa mora biti enako kot v kontrolah. | VELJAVNOST PRESKUSA | 8. | Da rezultat preskusa šteje kot veljaven, morajo kontrolni vzorci izpolnjevati naslednja merila: | — | vsaka ponovitev (ki vključuje 10 odraslih osebkov) ob koncu preskusa ustvari ≥ 30 mladičev, | — | koeficient variacije razmnoževanja je ≤ 30 %, | — | smrtnost pri odraslih osebkih v začetnih 4 tednih preskusa je ≤ 10 %. | Če preskus ne uspe izpolniti zgoraj naštetih meril za veljavnost, mora biti prekinjen, razen če je mogoče podati utemeljitev za nadaljevanje preskusa. Utemeljitev mora biti vključena v poročilo. | OPIS PRESKUSA | Oprema | 9. | Uporabiti je treba eno- ali dvolitrske preskusne posode iz stekla ali drugega kemijsko inertnega materiala. Površina prečnega prereza posod mora biti približno 200 cm2, tako da globina vlažnega substrata doseže 5–6 cm, ko je dodanih od 500 do 600 g suhe mase substrata. Zasnova posode mora omogočati izmenjavo plinov med substratom in ozračjem ter dostop svetlobe (npr. s perforiranim prozornim pokrovom), pri tem pa mora črvom preprečevati pobeg. Če je substrata znatno več od 500 do 600 g na preskusno posodo, je treba število črvov sorazmerno povečati. | 10. | Zahtevana je običajna laboratorijska oprema, posebej naslednje: | — | sušilnik, | — | stereomikroskop, | — | merilnik vrednosti pH in fotometer, | — | ustrezne natančne tehtnice, | — | ustrezna oprema za uravnavanje temperature, | — | ustrezna oprema za uravnavanje vlažnosti (ni nujna, če imajo posode za izpostavljanje pokrove), | — | inkubator ali majhna soba s klimatsko napravo, | — | pincete, kljuke ali zanke, | — | vodna kopel. | Priprava umetnih tal | 11. | V tem preskusu so uporabljena umetna tla (5)(7) z naslednjo sestavo (na podlagi suhih tež, posušenih na konstantno maso pri 105 °C): | — | 10 odstotkov šotnega mahu (z vrednostjo pH, ki je čim bližje vrednostim od 5,5 do 6,0, brez vidnih ostankov rastlin, posušenega na izmerjeno vsebnost vlage), | — | 20 odstotkov kaolinske gline (po možnosti naj bo vsebnost kaolinita nad 30 odstotki), | — | od 0,3 do 1,0 % kalcijevega karbonata (CaCO3, zdrobljenega v prah, analitsko čistega) za doseganje začetne vrednosti pH 6,0 ± 0,5, | — | 70 % na zraku posušenega kremenovega peska (odvisno od potrebne količine CaCO3), v glavnem finega peska z več kot 50 % delcev, ki merijo med 50 in 200 mikroni. | Opomba 1: potrebna količina CaCO3 bo odvisna od sestavin substrata tal, vključno s hrano, in jo je treba določiti z merjenjem podvzorcev tal tik pred preskusom. Vrednost pH je merjena v zmešanem vzorcu v 1 M raztopine kalijevega klorida (KCl) ali 0,01 M raztopine kalcijevega klorida (CaCl2) (13). | Opomba 2: vsebnost organskega ogljika v umetnih tleh je mogoče znižati, npr. z znižanjem vsebnosti šote na vrednost 4–5 % in ustreznim zvišanjem vsebnosti peska. S takim znižanjem vsebnosti organskega ogljika se lahko zmanjšajo možnosti adsorpcije preskusne kemikalije na tla (organski ogljik), razpoložljivost preskusne kemikalije za črve pa se lahko poveča. Dokazano je, da lahko Eisenia fetida izpolnjuje merila za veljavnost v zvezi z razmnoževanjem, če se preskus izvaja z naravnimi tlemi z manjšo vsebnostjo organskega ogljika (npr. 2,7 %) (14), izkušnje pa kažejo, da je to mogoče doseči tudi pri umetnih tleh s 5 % šote. Zato pred uporabo takih tal v dokončnem preskusu ni nujno dokazovati, ali so umetna tla primerna za omogočanje skladnosti preskusa z merili za veljavnost, razen če je vsebnost šote znižana bolj, kot je določeno zgoraj. | Opomba 3: pri uporabi naravnih tal za dodatno preskušanje (na višjih stopnjah) je treba dokazati tudi primernost tal in izpolnjevanje meril za veljavnost preskusa. | 12. | Suhe sestavine tal se v dobro prezračenem prostoru temeljito premešajo (npr. v velikem laboratorijskem mešalniku). Pred začetkom preskusa se suha umetna tla navlažijo z dodajanjem zadostne količine deionizirane vode, da je pridobljene približno polovico končne vsebnosti vode, kar je od 40 do 60 % največje zmogljivosti zadrževanja vode (kar ustreza vrednosti 50 ± 10 % suhe mase vlage). S tem je ustvarjen substrat, iz katerega med stiskanjem v roki ne izloči stoječa ali prosto tekoča voda. Največja zmogljivost zadrževanja vode (WHC) umetnih tal je določena v skladu s postopki, opisanimi v Dodatku 2, standardu ISO 11274 (15) ali enakovrednem standardu EU. | 13. | Če je preskusna kemikalija nanesena na površino tal ali vmešana v tla brez vode, je mogoče končno količino vode v umetna tla vmešati med pripravo tal. Če se preskusna kemikalija vmeša v tla skupaj z nekaj vode, je mogoče dodatno količino vode dodati skupaj s preskusno kemikalijo (glej odstavek 19). | 14. | Vsebnost vlage v tleh je določena ob začetku in koncu preskusa v skladu s standardom ISO 11465 (16) ali enakovrednim standardom EU, vrednost pH tal pa v skladu z Dodatkom 3 ali standardom ISO 10390 (13) ali enakovrednim standardom EU. Te določitve je treba izvesti v vzorcu kontrolnih tal in vzorcih tal s posameznimi preskusnimi koncentracijami. Ob preskušanju kislih ali bazičnih kemikalij vrednosti pH ni dovoljeno prilagajati. Med celotnim preskusom je treba vsebnost vlage spremljati z rednim tehtanjem posod (glej odstavka 26 in 30). | Izbira in priprava preskusnih živali | 15. | Vrsta, uporabljena v preskusu, je Eisenia fetida ali Eisenia andrei (1)(2). Za začetek preskusa so potrebni odrasli črvi v starosti od dveh mesecev do enega leta, ki imajo klitelum. Črve je treba izbrati iz sinhronizirane kulture z relativno homogeno starostno strukturo (Dodatek 4). Razlika v starosti posameznih osebkov v preskusni skupini ne sme biti večja od 4 tednov. | 16. | Izbrane črve je treba vsaj en dan aklimatizirati v vrsti substrata umetnih tal, ki bo uporabljena v preskusu. V tem obdobju je treba črve hraniti z enako hrano, kot bo uporabljena v preskusu (glej odstavke od 31 do 33). | 17. | Na začetku preskusa je treba posamezne skupine 10 črvov stehtati in jih naključno dodeliti preskusnim posodam. Pred tehtanjem se črvi operejo (z deionizirano vodo), odvečna voda pa se odstrani tako, da se črvi za kratek čas položijo na filtrirni papir. Mokra masa posameznih črvov mora znašati med 250 in 600 mg. | Priprava preskusnih koncentracij | 18. | Uporabita se lahko dve metodi nanosa preskusne kemikalije: vmešanje preskusne kemikalije v tla (glej odstavke 19–21) ali nanos na površino tal (glej odstavke 22–24). Izbira ustrezne metode je odvisna od namena preskusa. V splošnem se priporoča vmešanje preskusne kemikalije v tla. Vendar so morda potrebni postopki nanosa, ki so skladni z običajno kmetijsko prakso (npr. pršenje tekoče formulacije ali uporaba posebnih formulacij pesticidov, kot so zrnca ali obloge semen). Topila, ki se uporabljajo kot pomoč pri tretiranju tal s preskusno kemikalijo, je treba izbrati na podlagi njihove nizke stopnje strupenosti za deževnike, v načrt preskusa pa je treba vključiti ustrezno kontrolo s topilom (glej odstavek 27). | Vmešanje preskusne kemikalije v tla | Preskusna kemikalija, topna v vodi | 19. | Raztopina preskusne kemikalije v deionizirani vodi se pripravi tik pred začetkom preskusa v količini, ki zadošča za vse ponovitve ene preskusne koncentracije. Za lažjo pripravo preskusne raztopine je morda potrebno pomožno topilo. Priročno je pripraviti količino raztopine, ki je potrebna za doseganje končne vsebnosti vlage (od 40 do 60 % največje zmogljivosti zadrževanja vode). Raztopino je treba pred vstavljanjem v preskusno posodo temeljito zmešati s tlemi. | Preskusna kemikalija, ki ni topna v vodi | 20. | Preskusna kemikalija se raztopi v majhni količini primernega organskega topila (npr. acetona) in se nato razprši na majhno količino finega kremenovega peska ali pa se vanjo vmeša. Vehikel se nato odstrani tako, da vsaj nekaj minut izhlapeva v digestoriju. Tretirani pesek se nato temeljito zmeša s predhodno navlaženimi umetnimi tlemi. Nato se za doseganje končne vsebnosti vlage, ki mora znašati od 40 do 60 % največje zmogljivosti zadrževanja vode, doda in vmeša deionizirana voda (potrebna količina). Tla so nato pripravljena za namestitev v preskusne posode. Treba je paziti, ker so nekatera topila lahko strupena za deževnike. | Preskusna kemikalija, ki ni topna v vodi in organskih topilih | 21. | Pripravi se zmes, ki je sestavljena iz 10 g fino mletega industrijskega kremenovega peska in količine preskusne kemikalije, potrebne za doseganje preskusne koncentracije v tleh. Zmes se nato temeljito zmeša s predhodno navlaženimi umetnimi tlemi. Nato se za doseganje končne vsebnosti vlage, ki mora znašati od 40 do 60 % največje zmogljivosti zadrževanja vode, doda in vmeša deionizirana voda (potrebna količina). Tla so nato pripravljena za vstavljanje v preskusne posode. | Nanos preskusne kemikalije na površino tal | 22. | Tla se tretirajo po dodajanju črvov. Najprej se preskusne posode napolnijo z navlaženim substratom tal, stehtani črvi pa se položijo na površino. Zdravi črvi se običajno takoj zakopljejo v substrat, zato so vsi, ki po 15 minutah ostanejo na površini, opredeljeni kot poškodovani in jih je treba zamenjati. Če se črvi zamenjajo, je treba nove in zamenjane črve stehtati, tako da sta na začetku znani skupna živa teža izpostavljene skupine črvov in skupna teža posode s črvi. | 23. | Nanese se preskusna kemikalija. Pol ure po namestitvi črvov (ali pa, če so črvi prisotni na površini tal) se preskusne kemikalije ne sme nanašati na tla, da se prepreči neposredna izpostavljenost preskusni kemikaliji prek stika s kožo. Če je preskusna kemikalija pesticid, jo je morda primerno nanesti na površino tal s pršenjem. Preskusno kemikalijo je treba na površino tal nanesti čim bolj enakomerno s primerno laboratorijsko napravo za pršenje, da se posnema pršenje na polju. Pred nanosom je treba odstraniti pokrov preskusne posode in ga nadomestiti z oblogo, ki ščiti stranske stene posode pred pršilom. Oblogo je mogoče izdelati iz preskusne posode z odstranjeno podlogo. Nanos je treba izvesti pri temperaturi v območju variacije 20 ± 2 °C, za vodne raztopine, emulzije ali disperzije pa pri hitrosti nanosa vode med 600 in 800 μl/m2. Hitrost je treba preveriti s primerno tehniko kalibracije. Posebne formulacije, kot so zrnca ali obloge semen, je treba nanesti na način, skladen s kmetijsko uporabo. | 24. | Preskusne posode je treba eno uro pustiti nepokrite, da izhlapijo vsa hlapna topila, povezana z nanosom preskusne kemikalije. Treba je paziti, da v tem času noben črv ne pobegne iz preskusnih posod. | POSTOPEK | Preskusne in kontrolne skupine | 25. | Priporočljiva je obremenitev z 10 deževniki v 500–600 g suhe mase umetnih tal (tj. 50–60 g tal na črva). Če se uporabljajo velike količine tal, kot v primeru preskušanja pesticidov s posebnimi načini nanosa, npr. oblogami semen, je treba s povečanjem števila črvov vzdrževati obremenitev 50–60 g tal na črva. Za vsako kontrolno posodo in posodo za tretiranje je pripravljenih deset črvov. Črvi se operejo z vodo in obrišejo, nato pa za kratek čas postavijo na vpojni papir, da se odvečna voda odcedi. | 26. | Za preprečevanje sistematičnih napak pri razporejanju črvov v preskusne posode je treba s tehtanjem 20 črvov, naključno vzorčenih iz populacije, iz katere bodo odvzeti preskusni črvi, ugotoviti homogenost preskusne populacije. Po zagotovitvi homogenosti se nato skupine črvov izberejo, stehtajo in s postopkom naključnega določanja dodelijo preskusnim posodam. Po dodajanju preskusnih črvov je treba vsako posodo stehtati in tako zagotoviti, da obstaja podatek o začetni teži, ki ga je mogoče uporabiti kot osnovo za spremljanje vsebnosti vlage v tleh med celotnim preskusom, kot je opisano v odstavku 30. Nato se preskusne posode pokrijejo, kot je opisano v odstavku 9, in postavijo v preskusno komoro. | 27. | Za vsako od metod nanosa preskusne kemikalije, opisanih v odstavkih od 18 do 24, se pripravijo ustrezne kontrole. Za pripravo kontrol se upoštevajo ustrezni postopki, z izjemo dodajanja preskusne kemikalije. Zato se na kontrole, kjer je primerno, nanesejo organska topila, kremenov pesek ali drugi vehikli v koncentracijah/količinah, skladnih s koncentracijami/količinami, uporabljenimi pri tretiranih skupinah. Če je za dodajanje preskusni kemikaliji uporabljeno topilo ali drug vehikel, je treba zagotoviti, da vehikel ne vpliva na rezultat, zato je treba pripraviti tudi dodatno kontrolo brez vehikla in preskusne kemikalije ter jo preskusiti. | Preskusni pogoji | 28. | Preskusna temperatura je 20 ± 2 °C. Preskus se izvaja v nadzorovanih ciklih svetlobe in teme (po možnosti 16 ur svetlobe in 8 ur teme) pri osvetljenosti od 400 do 800 luksov na območju preskusnih posod. | 29. | Preskusne posode se med preskusom ne prezračujejo, vendar mora zasnova pokrovov preskusne posode omogočati izmenjavo plinov, pri tem pa omejevati izhlapevanje vlage (glej odstavek 9). | 30. | Vsebnost vode v substratu tal v preskusnih posodah se z rednim ponovnim tehtanjem preskusnih posod (razen njihovih pokrovov) vzdržuje med celotnim preskusom. Izgube se po potrebi nadomeščajo z deionizirano vodo. Vsebnost vode se od vsebnosti na začetku preskusa ne sme razlikovati za več kot 10 %. | Hranjenje | 31. | Za sprejemljivo velja vsa hrana, katere kakovost je dokazano primerna vsaj za ohranjanje teže črvov med preskusom. Izkušnje so pokazale, da je primerna hrana ovsena kaša ter kravji in konjski gnoj. S preverjanji je treba zagotoviti, da krave ali konji, od katerih je gnoj pridobljen, niso zdravljene ali tretirane s kemikalijami, kot so pospeševalci rasti, nematicidi ali podobni veterinarski proizvodi, ki lahko med preskusom škodljivo vplivajo na črve. Priporočen je samostojno zbrani kravji gnoj, saj so izkušnje pokazale, da lahko na trgu dostopni kravji gnoj, ki se uporablja kot gnojilo za vrt, škodljivo vpliva na črve. Gnoj mora biti pred uporabo posušen na zraku, fino zmlet in pasteriziran. | 32. | Preden se vsaka sveža šarža hrane uporabi v preskusu, je treba z njo nahraniti nepreskusno kulturo črvov, da se zagotovi njena primerna kakovost. Rast in proizvajanje kokonov ne smeta biti zmanjšana v primerjavi s črvi v substratu, ki ne vsebuje nove šarže hrane (pogoji, kot so opisani v preskusni metodi C.8(4)). | 33. | Hrana se prvič priskrbi en dan po dodajanju črvov in nanosu preskusne kemikalije na tla. Približno 5 g hrane se raztrese na površino tal vsake posode in navlaži z deionizirano vodo (približno 5–6 ml na posodo). Nato se hrana v 4-tedenskem preskusnem obdobju priskrbi enkrat tedensko. Če hrana ostaja nepoužita, je treba obrok zmanjšati, da se prepreči rast gliv ali plesni. Odrasli osebki se odstranijo iz tal 28. dan preskusa. Nato se v vsako preskusno posodo doda 5 g hrane. Hranjenja med preostalimi 4 tedni preskusa ni več. | Izbira preskusnih koncentracij | 34. | Predhodno poznavanje strupenosti preskusne kemikalije, npr. iz preskusa akutne strupenosti (4) in/ali iz študij za določanje območja delovanja, bi moralo biti v pomoč pri izbiri ustreznih preskusnih koncentracij. Po potrebi se izvede preskus za določanje območja delovanja z, na primer, petimi preskusnimi koncentracijami, ki znašajo 0,1, 1,0, 10, 100 in 1 000 mg/kg (suhe mase tal). Zadošča ena ponovitev za vsako tretirano skupino in kontrolo. Preskus za določanje območja delovanja traja dva tedna, ob koncu preskusa pa se oceni smrtnost. | Načrt poskusa | 35. | Ker za preskus ni mogoče predpisati enega samega statističnega povzetka, ta metoda nudi vse potrebno za določitev vrednosti NOEC in ECx. V predvidljivi prihodnosti bodo regulativni organi verjetno zahtevali vrednost NOEC. V bližnji prihodnosti bo morda zaradi statističnih in ekoloških pomislekov sprejeta bolj razširjena uporaba vrednosti ECx. Zato se na podlagi priporočil, ki izhajajo iz krožnega preskusa preskusne metode razmnoževanja enhitrejev, predlagajo trije načrti (17). | 36. | Pri določanju razpona koncentracij se upošteva naslednje: | — | Za določitev vrednosti NOEC je treba preskusiti vsaj pet/dvanajst koncentracij v geometrijski vrsti. Priporočene so štiri ponovitve za vsako preskusno koncentracijo in osem kontrol. Med koncentracijami mora biti razmik, katerega faktor ne sme presegati vrednosti 2,0. | — | Za določitev vrednosti ECx (npr. EC10, EC50) se priporoča število koncentracij, ki je zadostno, da povzroči vsaj štiri statistično značilne različne povprečne odzive. Priporoča se vsaj dve ponovitvi za vsako preskusno koncentracijo in šest kontrolnih ponovitev. Faktor razmika se lahko spreminja, tj. je v pričakovanem območju učinkov lahko manjši ali enak 1,8, pri višjih in nižjih koncentracijah pa je lahko nad 1,8. | — | Kombiniran pristop omogoča določitev vrednosti NOEC in ECx. Treba je uporabiti osem koncentracij za tretiranje v geometrijski vrsti. Priporočene so štiri ponovitve za vsako tretiranje in osem kontrol. Med koncentracijami mora biti razmik, katerega faktor ne sme presegati vrednosti 1,8. | Trajanje preskusa in meritve | 37. | Na 28. dan se odrasli črvi pregledajo in preštejejo. Zabeležita se tudi morebitno nenormalno vedenje (npr. nezmožnost kopanja v tla, negibno ležanje) in morebitna nenavadna morfologija (npr. odprte rane). Nato se vse odrasle črve odstrani iz preskusnih posod, prešteje in stehta. Iskanje odraslih osebkov je morda lažje, če so tla, ki vsebujejo črve, pred ocenjevanjem prenesena na čist pladenj. Pred tehtanjem se črvi, vzeti iz tal, operejo (z deionizirano vodo), odvečna voda pa se odstrani tako, da se črvi za kratek čas položijo na filtrirni papir. Vse črve, ki jih v tem trenutku ni mogoče najti, je treba zabeležiti kot mrtve, saj je treba predpostavljati, da so ti črvi pred ocenjevanjem umrli in se razgradili. | 38. | Če so bila tla odstranjena iz posod, se nato vrnejo (brez odraslih črvov, vendar z vsemi proizvedenimi kokoni). Nato se tla štiri dodatne tedne inkubirajo pri enakih preskusnih pogojih, razen hranjenja, ki se opravi le enkrat na začetku te faze preskusa (glej odstavek 33). | 39. | Ob koncu drugega 4-tedenskega obdobja se s postopki, opisanimi v Dodatku 5, določi število mladičev, izleženih iz kokonov v preskusnih tleh, in število kokonov. V celotnem obdobju preskusa je treba beležiti tudi vse znake poškodb pri črvih ali škodljivih učinkov nanje. | Mejni preskus | 40. | Če pri največji koncentraciji v preskusu za določanje območja delovanja (tj. 1 000 mg/kg) ni opaženih učinkov, bo preskus razmnoževanja izveden kot mejni preskus s koncentracijo 1 000 mg/kg. Mejni preskus bo ponudil možnost dokazovanja, da je vrednost NOEC za razmnoževanje večja od mejne koncentracije, pri čemer bo število črvov, uporabljenih v preskusu, kar najmanjše. Za tretirana tla in kontrolo je treba uporabiti osem ponovitev. | PODATKI IN POROČANJE | Obdelava rezultatov | 41. | Čeprav je v Dodatku 6 podan pregled, v tej preskusni metodi ni podana nobena dokončna statistična smernica za analizo rezultatov preskusa. | 42. | Ena od končnih točk je smrtnost. Vendar je treba zabeležiti tudi spremembe vedenja odraslih osebkov (npr. nezmožnost kopanja v tla, negibno ležanje ob stekleni steni preskusne posode) in morfologije (npr. odprte rane) ter morebitno prisotnost mladičev. Za določanje vrednosti LC50 se običajno uporabi analiza probit (18) ali regresija logit. Vendar pa je mogoče v primerih, pri katerih ta analitska metoda ni primerna (npr. če so na voljo manj kot tri koncentracije z delnimi usmrtitvami), uporabiti alternativne metode. Te metode lahko vključujejo drseča povprečja (19), prilagojeno metodo Spearman-Karber (20) ali enostavno interpolacijo (npr. geometrijsko sredino vrednosti LC0 in LC100, izračunano s kvadratnim korenom zmnožka vrednosti LC0 in LC100). | 43. | Druga končna točka je plodnost (tj. število ustvarjenih mladičev). Vendar je treba v končno poročilo, tako kot pri preskusu za določanje območja delovanja, zabeležiti vse druge škodljive znake. Za statistično analizo morata biti izračunani aritmetična sredina in standardni odklon za razmnoževanje pri posamezni tretirani skupini in kontroli. | 44. | Če je izvedena analiza variance, je mogoče standardni odklon, s, in stopinje prostosti, df, nadomestiti z oceno skupne variance, pridobljene z analizo variance (ANOVA) oziroma z njenimi stopinjami, če varianca ni odvisna od koncentracije. V tem primeru uporabite enosmerne analize variance kontrol in tretiranih skupin. Te vrednosti se navadno izračunajo s komercialno programsko opremo za statistiko, pri čemer so rezultati glede na posodo uporabljeni kot ponovitve. Če se zdi, da je združevanje podatkov za negativne kontrole in kontrole s topilom bolj smiselno od preskušanja glede na enega od njih, jih je treba preskusiti, da se preveri, da med njimi ni značilnih razlik (za ustrezne preskuse glej odstavek 47 in Dodatek 6). | 45. | Nadaljnje statistično preskušanje in sklepanje je odvisno od tega, ali so vrednosti ponovitev normalno porazdeljene in homogene glede na svojo varianco. | Ocena vrednosti NOEC | 46. | Prednost mora imeti uporaba učinkovitih preskusov. Uporabiti je treba informacije npr. iz predhodnih izkušenj s krožnim preskušanjem ali druge podatke iz preteklih študij o tem, ali so podatki približno normalno porazdeljeni. Homogenost variance (homoskedastičnost) je bolj kritična. Izkušnje kažejo, da varianca pogosto narašča z naraščajočo srednjo vrednostjo. V teh primerih transformacija podatkov lahko privede do homoskedastičnosti. Vendar mora taka transformacija temeljiti na izkušnjah s podatki iz preteklih študij in ne na podatkih, ki se proučujejo. Pri homogenih podatkih je treba izvesti več t-preskusov, kot je Williamsov preskus (α = 0,05, enostranski) (21)(22) ali, v nekaterih primerih, Dunnettov preskus (23)(24). Velja pripomniti, da je treba v primeru neenake ponovitve popraviti vrednosti t iz preglednice tako, kot sta predlagala Dunnett in Williams. Včasih se odzivi zaradi velike variacije ne povečajo/zmanjšajo pravilno. V tem primeru velikega odklona od monotonosti je bolj primeren Dunnettov preskus. Če obstajajo odkloni od homoskedastičnosti, je morda smiselno natančneje proučiti možne učinke na variance, da se ugotovi, ali je mogoče uporabiti t-preskuse brez prevelike izgube učinkovitosti (25). Druga možnost je uporaba večkratnega U-preskusa, npr. Bonferronijevega U-preskusa po Holmu (26), ali – če ti podatki kažejo heteroskedastičnost, sicer pa so skladni z osnovnim monotonim razmerjem odmerek-odziv – drugega neparametričnega preskusa (npr. preskusa po Jonckheere-Terpstraju (27)(28) ali Shirleyjevega preskusa (29)(30)); uporaba takšnega preskusa ima v splošnem prednost pred t-preskusi za neenake variance. (Glej tudi shemo v Dodatku 6.) | 47. | Če je izveden mejni preskus in so izpolnjeni predpogoji za postopke parametričnih preskusov (normalnost, homogenost), je mogoče uporabiti parni Studentov t-preskus ali, namesto tega, postopek Mann-Whitneyjevega U-preskusa (31). | Ocena vrednosti ECx | 48. | Za izračun katere koli vrednosti ECx se po pridobitvi ustrezne funkcije odmerek-odziv za regresijsko analizo (linearno ali nelinearno) uporabijo srednje vrednosti glede na tretirano skupino. Za rast črvov v obliki zveznega odziva je mogoče vrednosti ECx oceniti z ustrezno regresijsko analizo (32). Med primernimi funkcijami za kvantne podatke (smrtnost/preživetje) in število ustvarjenih potomcev so normalna sigmoidna funkcija in logistične ali Weibullove funkcije, ki vsebujejo od dva do štiri parametre, pri čemer nekatere lahko modelirajo tudi odzive v obliki hormeze. Če je bila funkcija odmerek-odziv prilagojena z linearno regresijsko analizo, je treba v regresijski analizi pred ocenjevanjem vrednosti ECx najti značilni r2 (determinacijski koeficient) in/ali naklon, tako da se v enačbo, podano z regresijsko analizo, vstavi vrednost, ki ustreza x % srednje vrednosti kontrole. V skladu s Fiellerjem (navedeno v Finney (18)) ali z drugimi ustreznimi sodobnimi metodami se izračunajo 95-odstotne meje zaupanja. | 49. | Namesto tega se odziv lahko modelira kot odstotek ali razmerje parametra modela, ki se razlaga kot srednja vrednost odziva kontrole. V teh primerih je mogoče običajno (logistično, Weibullovo) sigmoidno krivuljo pogosto enostavno prilagoditi rezultatom s postopkom regresije probit (18). V teh primerih je treba utežno funkcijo prilagoditi za odzive metrik, kot je podano v Christensen (33). Če pa je ugotovljena hormeza, mora analizo probit nadomestiti logistična ali Weibullova funkcija s štirimi parametri, prilagojena s postopkom nelinearne regresije (34). Če podatkom ni mogoče prilagoditi primerne funkcije odmerek-odziv, je mogoče za oceno vrednosti ECx in njenih meja zaupanja uporabiti alternativne metode, kot so drseča povprečja po Thompsonu (19) in postopek prilagojene metode Spearman-Karber (20). | POROČILO O PRESKUSU | 50. | Poročilo o preskusu mora vsebovati naslednje informacije: | | Preskusna kemikalija: | — | dokončen opis preskusne kemikalije, serija, skupina in številka CAS, čistost, | — | lastnosti preskusne kemikalije (npr. vrednost log Kow, topnost v vodi, parni tlak, Henryjeva konstanta (H) ter informacije o usodi in vedenju). | | Preskusni organizmi: | — | uporabljene preskusne živali: vrsta, znanstveno ime, vir organizmov in pogoji gojenja, | — | razpon starosti in velikosti (mase) preskusnih organizmov. | | Preskusni pogoji | — | podrobnosti o pripravi preskusnih tal, | — | največja zmogljivost zadrževanja vode v tleh, | — | opis tehnike, uporabljene za nanos preskusne kemikalije na tla, | — | podrobnosti o pomožnih kemikalijah, uporabljenih za dodajanje preskusne kemikalije, | — | podrobnosti o kalibraciji za opremo za pršenje, če je to smiselno, | — | opis načrta in postopkov poskusa, | — | velikost preskusnih posod in količina preskusnih tal, | — | preskusni pogoji: obsevanost, trajanje ciklov svetlobe in teme, temperatura, | — | opis režima hranjenja, vrsta in količina hrane, uporabljene v preskusu, datumi hranjenja, | — | vrednost pH in vsebnost vode v tleh na začetku in koncu preskusa. | | Rezultati preskusa: | — | smrtnost pri odraslih osebkih ( %) v vsaki preskusni posodi ob izteku prvih 4 tednov preskusa, | — | skupna masa odraslih osebkov na začetku preskusa v vsaki preskusni posodi, | — | spremembe telesne teže živih odraslih osebkov ( % začetne teže) v vsaki preskusni posodi po prvih štirih tednih preskusa, | — | število mladičev, ustvarjenih v vsaki preskusni posodi ob koncu preskusa, | — | opis očitnih ali patoloških simptomov ali jasnih sprememb vedenja, | — | rezultati, pridobljeni z referenčno preskusno kemikalijo, | — | vrednosti LC50, NOEC in/ali ECx (npr. EC50, EC10) za razmnoževanje, če je mogoče nekatere od njih uporabiti znotraj intervalov zaupanja, krivulja prilagojenega modela, uporabljena za njegov izračun, ter vse informacije in opažanja, ki pripomorejo k razlagi rezultatov, | — | grafični prikaz razmerja med odmerkom in odzivom, | — | rezultati, ki se nanašajo na vsako preskusno posodo. | Odstopanja od postopkov, opisanih v tej preskusni metodi, in morebitni nenavadni dogodki med preskusom. | LITERATURA | (1) | Jaenicke, J. (1982). ‚Eisenia foetida‘ is two biological species. Megadrilogica 4, 6–8. | (2) | Oien, N., in Stenerson, J. (1984). Esterases of earthworm – III. Electrophoresis reveals that Eisenia foetida (Savigny) is two species. Comp. Biochem. Physiol. 78c (2), 277–282. | (3) | Kula, C. (1996). Development of a test method on sublethal effects of pesticides on the earthworm species Eisenia fetida/Eisenia andrei – comparison of two ringtests. V: Riepert, F., Kula, C. (1996): Development of laboratory methods for testing effects of chemicals and pesticides on collembola and earthworms. Mitt. Biol. Bundesamst. f. Land- Forstwirtsch. Berlin-Dahlem, 320, str. 50–82. | (4) | Poglavje C.8 te priloge, Strupenost za deževnike (preskus). | (5) | ISO (Mednarodna organizacija za standardizacijo) (1996). Soil Quality – Effects of pollutants on earthworms (Eisenia fetida). Part 2: Determination of effects on reproduction, št. 11268-2. ISO, Ženeva. | (6) | ISO (Mednarodna organizacija za standardizacijo) (1993). Soil Quality – Effects of pollutants on earthworms (Eisenia fetida). Part 1: Determination of acute toxicity using Artificial Soil substrate, št. 11268-1. ISO, Ženeva. | (7) | SETAC (1998). Advances in Earthworm Ecotoxicology. Sheppard, S. C., Bembridge, J. D., Holmstrup, M. in L. Posthuma (ur.). SETAC Press, 456 str. | (8) | EPA (1996). Ecological effects test guidelines. Earthworm Subchronic Toxicity Test (850.62.00). United States Environmental Protection Agency. Office of Prevention, Pesticides and Toxic Substances. EPA712-C-96-167, april 1996. | (9) | Bouché, M. B. (1972). Lombriciens de France, Ecologie et systématique. Publication de l'Institut National de la Recherche Agronomique. | (10) | Edwards, C. A. (1983). Development of a standardized laboratory method for assessing the toxicity of chemical substances to earthworms. Report EUR 8714 EN, Commission of European Communities. | (11) | Greig-Smith, P. W., Becker, H., Edwards, P. J., in Heimbach, F. (ur.) (1992). Ecotoxicology of Earthworms. Intercept. | (12) | Edwards, C. A., in Bohlen, J. P. (1996). Biology and ecology of Earthworms, 3. izdaja. Chapman and Hall, London. | (13) | ISO (Mednarodna organizacija za standardizacijo) (1994). Kakovost tal – Določevanje pH, št. 10390. ISO, Ženeva. | (14) | Hund-Rinke, K., Römbke, J., Riepert, F., in Achazi, R. (2000). Beurteilung der Lebensraumfunktion von Böden mit Hilfe von Regenwurmtests. V: Toxikologische Beurteilung von Böden. Heiden S., Erb R., Dott W. in Eisentraeger A. (ur.). Spektrum Verl., Heidelberg. 59–81. | (15) | ISO (Mednarodna organizacija za standardizacijo) (1992). Kakovost tal – Določevanje karakteristik zadrževanja vode – Laboratorijske metode, št. 11274. ISO, Ženeva. | (16) | ISO (Mednarodna organizacija za standardizacijo) (1993). Kakovost tal – Ugotavljanje suhe snovi in vsebnosti vode na osnovi mase – Gravimetrijska metoda, št. 11465. ISO, Ženeva. | (17) | Römbke, J., in Moser, Th. (1999). Organisation and Performance of an International Ringtest for the validation of the Enchytraeid Reproduction Test. UBA-Texte 4/99, 150 + 223 str. | (18) | Finney, D. J. (1971). Probit Analysis (3. izdaja), str. 19–76. Cambridge Univ. Press. | (19) | Finney, D. J. (1978). Statistical Method in Biological Assay. -Charles Griffin & Company Ltd, London. | (20) | Hamilton, M. A., Russo, R. C., in Thurston, R.V. (1977). Trimmed Spearman-Karber Method for estimating median lethal concentrations in toxicity bioassays. Environ. Sci. Technol. 11(7), 714-719; Correction Environ. Sci. Technol. 12(1998), 417. | (21) | Williams, D. A. (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27, 103-117. | (22) | Williams, D. A. (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics 28, 519-531. | (23) | Dunnett, C. W. (1955). A multiple comparison procedure for comparing several treatments with a control. Amer. Statist. Ass. J. 50, 1096-1121. | (24) | Dunnett, C. W. (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics 20, 482-491. | (25) | Hoeven, N. van der (1998). Power analysis for the NOEC: What is the probability of detecting small toxic effects on three different species using the appropriate standardized test protocols? Ecotoxicology 7: 355–361. | (26) | Holm, S. (1979). A simple sequentially rejective multiple test procedure. Scand. J. Statist. 6, 65-70. | (27) | Jonckheere, A. R. (1954). A Distribution-free k-Sample Test Against Ordered Alternatives, Biometrika 41, 133– 145. | (28) | Terpstra, T. J. (1952). The Asymptotic Normality and Consistency of Kendall's Test Against Trend, When Ties are Present in One Ranking, Indagationes Math. 14, 327–333. | (29) | Shirley, E. A. (1979). The comparison of treatment to control group means in toxicology studies, Applied Statistics 28, 144– 151. | (30) | Williams, D. A. (1986). A Note on Shirley's Nonparametric Test for Comparing Several Dose Levels with a Zero-Dose Control, Biometrics 42, 183– 186. | (31) | Sokal, R. R., in Rohlf, F. J. (1981). Biometry. The Principle and practice of statistics in biological research. 2. izdaja. W.H. Freeman and Company. New York. | (32) | Bruce, R. D., in Versteeg, D. J. (1992). A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry 11:1485– 1494. | (33) | Christensen, E. R., (1984). Dose-response functions in aquatic toxicity testing and the Weibull model. Water Research 18, 213–221. | (34) | Van Ewijk, P. H., in Hoekstra, J. A. (1993). Calculation of the EC50 and its confidence interval when sub-toxic stimulus is present. Ecotox, Environ. Safety. 25, 25–32. | Dodatek 1 | Opredelitve pojmov | Pri tej preskusni metodi se uporabljajo naslednje opredelitve: | Kemikalija pomeni snov ali zmes. | ECx (učinkovita koncentracija za x-odstotni učinek) je koncentracija, ki na preskusnih organizmih v danem obdobju izpostavljenosti v primerjavi s kontrolo učinkuje x-odstotno. Vrednost EC50 je, na primer, koncentracija, pri kateri je ocenjeno, da na končno točko preskusa učinkuje 50-odstotno glede na izpostavljeno populacijo v določenem obdobju izpostavljenosti. V tem preskusu so učinkovite koncentracije izražene kot masa preskusne kemikalije na suho maso preskusnih tal ali kot masa preskusne kemikalije na enoto površine tal. | LC0 (koncentracija brez smrtnega učinka) je koncentracija preskusne kemikalije, ki v določenem časovnem obdobju ne ubije nobenega od izpostavljenih preskusnih organizmov. V tem preskusu je LC0 izražena kot masa preskusne kemikalije na suho maso preskusnih tal. | LC50 (srednja smrtna koncentracija) je koncentracija preskusne kemikalije, ki v določenem časovnem obdobju ubije 50 % izpostavljenih preskusnih organizmov. V tem preskusu je LC50 izražena kot masa preskusne kemikalije na suho maso preskusnih tal ali kot masa preskusne kemikalije na enoto površine tal. | LC100 (popolnoma smrtna koncentracija) je koncentracija preskusne kemikalije, ki v določenem časovnem obdobju ubije 100 % izpostavljenih preskusnih organizmov. V tem preskusu je LC100 izražena kot masa preskusne kemikalije na suho maso preskusnih tal. | LOEC (najnižja koncentracija z opaznim učinkom) je najnižja koncentracija preskusne kemikalije, ki ima statistično značilen učinek (p < 0,05). V tem preskusu je vrednost LOEC izražena kot masa preskusne kemikalije na suho maso preskusnih tal ali kot masa preskusne kemikalije na enoto površine tal. Vse preskusne koncentracije nad vrednostjo LOEC morajo običajno kazati učinek, ki je statistično različen od kontrole. Vsa odstopanja od zgoraj navedenega morajo biti utemeljena v poročilu o preskusu. | NOEC (koncentracija brez opaznega učinka) je najvišja koncentracija preskusne kemikalije tik pod vrednostjo LOEC, pri kateri ni opaznega učinka. V tem preskusu koncentracija, ki ustreza vrednosti NOEC, v danem obdobju izpostavljenosti v primerjavi s kontrolo nima statistično značilnega učinka (p < 0,05). | Hitrost razmnoževanja: srednja vrednost števila mladih črvov, ki jih ustvari določeno število odraslih osebkov v preskusnem obdobju. | Preskusna kemikalija je snov ali zmes, preskušena s to preskusno metodo. | Dodatek 2 | Določanje največje zmogljivosti zadrževanja vode | Kot primerna se je izkazala naslednja metoda za določanje največje zmogljivosti zadrževanja vode v tleh. Opisana je v Prilogi C standarda ISO DIS 11268-2 (1). | S primerno napravo za vzorčenje (svedrastim vzorčevalnikom itd.) zberite določeno količino (npr. 5 g) substrata preskusnih tal. Pokrijte dno vzorčevalnika s koščkom filtrirnega papirja, ga napolnite z vodo in ga nato postavite na stojalo v vodno kopel. Vzorčevalnik je treba postopoma potapljati, dokler nivo vode ni nad zgornjim delom tal. Nato ga je treba pustiti v vodi približno tri ure. Ker ni mogoče zadržati vse vode, ki jo absorbirajo talne kapilare, mora biti omogočeno, da se vzorec tal dve uri suši, tako da se vzorčevalnik postavi na ležišče iz zelo mokrega, fino mletega kremenovega peska, ki je nameščen v pokriti posodi (da se ne posuši). Nato je treba vzorec stehtati in pri 105 °C posušiti na konstantno maso. Zmogljivost zadrževanja vode (WHC) je nato mogoče izračunati po naslednjem postopku: | pri čemer je: | S | = | z vodo nasičeni substrat + masa vzorčevalnika + masa filtrirnega papirja, | T | = | tara (masa vzorčevalnika + masa filtrirnega papirja), | D | = | suha masa substrata. | VIR: | (1) | ISO (Mednarodna organizacija za standardizacijo) (1996). Soil Quality – Effects of pollutants on earthworms (Eisenia fetida). Part 2: Determination of effects on reproduction, št. 11268-2. ISO, Ženeva. | Dodatek 3 | Določanje vrednosti pH tal | Naslednja metoda za določanje vrednosti pH tal temelji na opisu v ISO 10390: Kakovost tal – Določevanje pH (1). | Določena količina tal se pri sobni temperaturi suši vsaj 12 ur. Nato se izdela suspenzija tal (ki vsebuje vsaj 5 gramov tal) v petkratni količini volumna tal z 1 M analitsko čistega kalijevega klorida (KCl) ali 0,01 M raztopine analitsko čistega kalcijevega klorida (CaCl2). Suspenzija se nato pet minut temeljito stresa ter se nato vsaj 2 uri in največ 24 ur pusti, da se usede. Vrednost pH tekoče faze se nato meri z merilnikom vrednosti pH, ki je pred vsako meritvijo umerjen z ustreznimi vrstami pufrskih raztopin (npr. pH 4,0 in 7,0). | VIR: | (1) | ISO (Mednarodna organizacija za standardizacijo) (1994). Kakovost tal – Določevanje pH, št. 10390. ISO, Ženeva. | Dodatek 4 | Gojenje deževnikov vrste Eisenia fetida/Eisenia andrei | Gojenje je po možnosti treba izvajati v klimatizirani komori pri temperaturi 20 °C ± 2 °C. Pri tej temperaturi in ob zadostni količini hrane črvi postanejo zreli po preteku približno 2 do 3 mesecev. | Obe vrsti je mogoče gojiti v zelo različnih živalskih odpadkih. Priporočeno gojišče je mešanica konjskega ali kravjega gnoja in šote v razmerju 50: 50. S preverjanji je treba zagotoviti, da krave ali konji, od katerih je gnoj pridobljen, niso zdravljene ali tretirane s kemikalijami, kot so pospeševalci rasti, nematicidi ali podobni veterinarski proizvodi, ki lahko med preskusom škodljivo vplivajo na črve. Priporočen je samostojno zbrani kravji gnoj iz ‚ekološkega‘ vira, saj so izkušnje pokazale, da lahko na trgu dostopni gnoj, ki se uporablja kot gnojilo za vrt, škodljivo vpliva na črve. Gojišče mora imeti vrednost pH približno 6–7 (uravnavano s kalcijevim karbonatom), majhno ionsko prevodnost (manj kot 6 mS/cm ali manj kot 0,5-odstotno koncentracijo soli) in ne sme biti pretirano kontaminirano z amonijakom ali živalskim urinom. Substrat mora biti vlažen, vendar ne preveč moker. Primerne so škatle za gojenje s prostornino od 10 do 50 litrov. | Za črve standardne starosti in velikosti (mase) je gojenje najbolje začeti s kokoni. Ko je kultura vzpostavljena, se vzdržuje tako, da se odrasli črvi za obdobje 14–28 dni namestijo v škatlo za gojenje s svežim substratom, kar omogoča produkcijo dodatnih kokonov. Nato se odrasli osebki odstranijo, mladiči, ustvarjeni iz kokonov, pa se uporabijo kot osnova za novo kulturo. Črvi se neprekinjeno hranijo z živalskimi odpadki in občasno prenesejo v svež substrat. Izkušnje so pokazale, da je primerna hrana na zraku posušen, fino zmlet kravji ali konjski gnoj ali ovsena kaša. Treba je zagotoviti, da krave ali konji, od katerih je pridobljen gnoj, niso zdravljene s kemikalijami, kot so pospeševalci rasti, ki lahko med dolgotrajnim gojenjem škodljivo vplivajo na črve. Črvi, ki so se izlegli iz kokonov, se uporabijo za preskušanje, ko dosežejo starost med 2 in 12 meseci in veljajo za odrasle. | Velja, da so črvi zdravi, če se premikajo skozi substrat, če ne skušajo zapustiti substrata in če se neprestano razmnožujejo. Izčrpanost substrata se kaže tako, da se črvi premikajo zelo počasi in da je njihov zadnji del rumen. V tem primeru je priporočena dobava novega substrata in/ali zmanjšanje gostote populacije živali. | Dodatek 5 | Tehnike štetja mladih črvov, izleženih iz kokonov | Ročno razvrščanje črvov iz substrata tal je časovno zelo potratno. Zato se priporočata dve alternativni metodi: | (a) | Preskusne posode se postavijo v vodno kopel, pri čemer na začetku temperatura znaša 40 °C, nato pa narašča do 60 °C. Po približno 20 minutah bi se morali mladi črvi pojaviti na površini tal, od koder jih je enostavno odstraniti in prešteti. | (b) | Preskusna tla se lahko izperejo prek sita z metodo, ki so jo razvili van Gestel in drugi (1) pod pogojem, da so bili šota in gnoj ali ovsena kaša, ki so bili dodani tlom, zmleti v fin prah. Dve siti z velikostjo mreže 0,5 mm (in premerom 30 cm) se postavita eno na drugega. Vsebina preskusne posode se opere skozi siti z močnim curkom vodovodne vode, pri čemer mladi črvi in kokoni večinoma ostanejo na zgornjem situ. Pomembno je opozoriti, da mora biti med tem postopkom celotna površina zgornjega sita ves čas mokra, tako da mladi črvi lebdijo na prevleki iz vode, kar preprečuje, da bi spolzeli skozi pore sita. Rezultati so najboljši, če je uporabljena ročka za tuš. | Ko je skozi sito opran ves substrat tal, se mladiče in kokone lahko spere z zgornjega sita v posodo. Nato se vsebina posode pusti stati, kar omogoča, da prazni kokoni lebdijo na površini vode, polni kokoni in mladi črvi pa potonejo na dno. Stoječo vodo se nato lahko odlije, mlade črve in kokone pa prenese v petrijevko, v kateri je malo vode. Črvi se za štetje lahko odstranijo z iglo ali pinceto. | Izkušnje so pokazale, da je metoda (a) primernejša za ekstrakcijo mladih črvov, ki jih je mogoče izprati celo skozi 0,5-milimetrsko sito. | Vedno je treba določiti učinkovitost metode, uporabljene za odstranjevanje črvov (in kokonov, če je to primerno) iz substrata tal. Če se črvi zbirajo z ročnim razvrščanjem, je postopek na vseh vzorcih priporočljivo izvesti dvakrat. | VIR: | (1) | Van Gestel, C. A. M., van Dis, W. A., van Breemen, E. M., Sparenburg, P. M. (1988). Comparison of two methods determining the viability of cocoons produced in earthworm toxicity experiments. Pedobiologia 32:367–371. | Dodatek 6 | Pregled statistične ocene podatkov (določitev vrednosti NOEC) | Bonferronijev U-preskus | Preskus po Jonckheere-Terpstraju | Shirleyjev preskus | Dunnov preskus | Podatki: | Je variacija homogena? | Je porazdelitev normalna? | Parametrični preskusi | Da | Izločite kontrolo brez topila. | Sta obe kontroli enaki? U-preskus | Sta obe kontroli enaki? T-preskus. | Obe kontroli je mogoče združiti. | Dodatna kontrola s topilom? | Dodatna kontrola s topilom? | Statistično preskušanje ni priporočljivo. | Ali obstajajo vsaj štiri ponovitve na tretiranje? | Ni uspelo. | Pretvori podatke. | Da | Da | Da | Da | Da | Da | Ne | Ne | Ne | Ne | Ne | Ne | Dunnettov preskus | Williamsov preskus | Izločite kontrolo brez topila. | Obe kontroli je mogoče združiti. | Začetek | Neparametrični preskusi | C.34. DOLOČANJE ZAVIRANJA DELOVANJA ANAEROBNIH BAKTERIJ – ZMANJŠANJE NASTAJANJA PLINA IZ ANAEROBNO GNIJOČEGA BLATA (IZ ODPLAK) | UVOD | 1. | Ta preskusna metoda je enakovredna Smernici za preskušanje OECD (TG) 224 (2007). Kemikalije, izpuščene v vodno okolje, prehajajo prek aerobnih in anaerobnih območij, kjer lahko razpadejo in/ali zavirajo delovanje bakterij; v nekaterih primerih lahko nemoteno ostajajo v anaerobnih območjih več desetletij in še dlje. Pri čiščenju odpadne vode je prva stopnja, primarni usedalnik, aerobna v tekočini supernatanta in anaerobna v blatu subnatanta. Temu sledi sekundarna stopnja z aerobnim območjem v bazenu za prezračevanje aktivnega blata in anaerobnim območjem v blatu subnatanta v bazenu sekundarnega usedalnika. Blato iz obeh stopenj je po navadi izpostavljeno anaerobnemu čiščenju, pri čemer nastajata metan in ogljikov dioksid, ki se običajno uporabljata za proizvodnjo električne energije. V širšem okolju je verjetno, da bodo kemikalije, ki dosežejo usedline v zalivih, rečnih ustjih in morju, ostale v teh anaerobnih območjih neomejeno dolgo, če niso biorazgradljive. Nekatere kemikalije bodo po možnosti dosegle ta območja v večjih deležih zaradi svojih fizikalnih lastnosti, kot so slaba topnost v vodi, visoka stopnja adsorpcije na suspendirane trdne snovi in nezmožnost aerobne biorazgradljivosti. | 2. | Čeprav je zaželeno, da so kemikalije, izpuščene v okolje, biorazgradljive v aerobnih in anaerobnih pogojih, je ključnega pomena, da takšne kemikalije ne zavirajo dejavnosti mikroorganizmov v nobenem od obeh območij. V Združenem kraljestvu je nekaj primerov popolnega zavrtja nastajanja metana, ki ga je povzročil, na primer, pentaklorofenol v industrijskih izpustih, kar je vodilo k dragemu prevozu zavrtega blata iz gnilišč na ‚varna mesta‘ in uvozu zdravo gnijočega blata iz sosednjih naprav. Obstaja pa veliko primerov manj resne prekinitve gnitja zaradi več drugih kemikalij, vključno z alifatskimi halogeniranimi ogljikovodiki (iz kemičnih čistilnic) in detergenti, kar je znatno poslabšalo učinkovitost gnilišča. | 3. | Samo ena preskusna metoda, C.11 (1), se ukvarja z zaviranjem delovanja bakterij (dihanja aktivnega blata); ocenjuje učinek preskusnih kemikalij na hitrost privzema kisika v prisotnosti substrata. Metoda se pogosto uporablja za zgodnje opozarjanje o možnih škodljivih učinkih kemikalij na aerobno čiščenje odpadnih vod, pa tudi kot kazalnik neinhibitornih koncentracij preskusnih kemikalij, ki bodo uporabljene v različnih preskusih biorazgradljivosti. Preskusna metoda C.43 (2) omogoča omejeno možnost za določanje strupenosti preskusne kemikalije za plin, ki ga proizvaja anaerobno blato, razredčeno na eno desetino svoje običajne koncentracije trdnih snovi, kar omogoča zahtevano natančnost pri oceni odstotka biorazgradljivosti. Ker je razredčeno blato lahko občutljivejše na inhibitorne kemikalije, se je skupina ISO odločila, da pripravi metodo z uporabo nerazredčenega blata. Pregledana so bila vsaj tri besedila (z Danske, iz Nemčije in iz Združenega kraljestva) in na koncu sta bila pripravljena dva standarda ISO; prvi, ISO 13 641-1 (3), z uporabo nerazredčenega blata, drugi, ISO 13 641-2 (4), pa z uporabo na eno stotino razredčenega blata, kar predstavlja blata in usedline z majhnimi populacijami bakterij. Pri obeh metodah je bil opravljen krožni preskus (5); 1. del je bil potrjen kot sprejemljiv standard, glede 2. dela pa je prišlo do nesoglasja. Predstavniki Združenega kraljestva so menili, da metoda zahteva nadaljnje proučevanje, ker je znaten delež udeležencev poročal o zelo majhnem ali ničnem nastajanju plina, deloma zato, ker je bil prostor za plin v odstotkih prevelik (pri 75 %) za optimalno občutljivost. | 4. | Zgodnejše delo v Združenem kraljestvu (6)(7) je opisovalo manometrično metodo z nerazredčenim gnijočim blatom in nepredelanim blatom iz odplak kot substratom v 500-mililitrskih bučkah; naprava je bila nerodna, smrad nepredelanega blata pa neprijeten. Kasneje so Wilson in drugi uspešno uporabili kompaktnejšo in priročnejšo napravo Sheltona in Tiedjeja (8), kot sta jo razvila Battersby in Wilson (9)(10). Kawahara in drugi (11) so v laboratoriju uspešno pripravili več standardnih blat za uporabo v preskusih za anaerobno biorazgradljivost in zaviranje pri več kemikalijah. Poleg tega je bilo pri izvedbi preskusa nepredelano blato kot substrat zamenjano z anaerobnim blatom, razredčenim na eno stotino, ali z blati, usedlinami itd. s šibkim delovanjem bakterij. | 5. | S to metodo je mogoče pridobiti informacije, ki so uporabne pri predvidevanju verjetnega učinka preskusne kemikalije na nastajanje plina v anaerobnih gniliščih. Vendar lahko le daljši preskusi, ki natančneje posnemajo delujoča gnilišča, pokažejo, ali lahko pride do prilagoditve mikroorganizmov preskusni kemikaliji in ali se lahko kemikalije, za katere je verjetno, da se bodo absorbirale in adsorbirale na blato, v daljšem časovnem obdobju, kot ga omogoča ta preskus, nakopičijo do koncentracije, ki je strupena. | NAČELO PRESKUSA | 6. | Alikvoti zmesi anaerobno gnijočega blata (od 20 g/l do 40 g/l vseh snovi v trdnem stanju) in razgradljiva raztopina substrata se inkubirajo do 3 dni v zatesnjenih posodah posamezno in hkrati z razponom koncentracij preskusne kemikalije. Količina nastalega plina (metana in ogljikovega dioksida) se meri prek povečanja tlaka (Pa) v steklenicah. Odstotek zaviranja nastajanja plina, ki so ga povzročile različne koncentracije preskusne kemikalije, se izračuna iz količin, pridobljenih v zadevnih preskusnih in kontrolnih steklenicah. Vrednost EC50 in druge učinkovite koncentracije se izračunajo iz krivulj odstotka zaviranja v primerjavi s koncentracijo preskusnih kemikalij ali, pogosteje, njenega logaritma. | INFORMACIJE O PRESKUSNI KEMIKALIJI | 7. | Preskusne kemikalije je običajno treba uporabljati v najčistejši obliki, ki je lahko dostopna, saj so lahko nečistote v nekaterih kemikalijah, npr. klorofenolih, precej bolj strupene od preskusne kemikalije same. Vendar je treba upoštevati potrebe po preskušanju kemikalij v obliki, v kateri so proizvedene/dane na trg. Uporaba formuliranih produktov običajno ni priporočljiva, pri slabo topnih preskusnih kemikalijah pa je uporaba formuliranega materiala lahko primerna. Lastnosti preskusne kemikalije, ki morajo biti na voljo, vključujejo topnost v vodi in nekaterih organskih topilih, parni tlak, adsorpcijski koeficient, hidrolizo in biorazgradljivost v anaerobnih pogojih. | UPORABA METODE | 8. | Preskus se uporablja pri kemikalijah, ki so topne ali netopne v vodi, vključno s hlapnimi kemikalijami. Vendar pa je posebna previdnost potrebna pri materialih z nizko topnostjo v vodi (glej vir (12)) in visoko hlapnostjo. Uporabljajo se lahko tudi inokulumi z drugih anaerobnih mest, npr. blat, nasičenih tal, usedlin. Anaerobne bakterijske sisteme, ki so bili prej izpostavljeni strupenim kemikalijam, je mogoče prilagoditi tako, da ohranijo svojo dejavnost v prisotnosti ksenobiotičnih kemikalij. Inokulumi iz prilagojenih bakterijskih sistemov lahko v primerjavi z inokulumi, pridobljenimi iz neprilagojenih sistemov, kažejo večjo toleranco na preskusne kemikalije. | REFERENČNE KEMIKALIJE | 9. | Za preverjanje postopka se referenčna kemikalija preskusi s postavitvijo ustreznih posod vzporedno kot del običajnih potekov preskusa; izkazalo se je, da je 3,5-diklorofenol dosleden zaviralec anaerobnega nastajanja plinov, pa tudi porabe kisika aktivnega blata in drugih biokemičnih reakcij. Dve drugi kemikaliji, metilen bis-tiocianat in pentaklorofenol, sta se izkazali kot močnejša zaviralca nastajanja metana od 3,5-diklorofenola, vendar pa rezultati pri njiju niso potrjeni. Pentaklorofenol se ne priporoča, ker ni lahko dostopen v čisti obliki. | OBNOVLJIVOST REZULTATOV | 10. | V mednarodnem krožnem preskusu (5) je bila obnovljivost med 10 sodelujočimi laboratoriji primerna le pri vrednostih EC50 za 3,5-diklorofenol in 2-bromo-etan sulfonsko kislino. (Razpon prve je bil od 32–502 mg/l, slednje pa 220–2 190 mg/l.) | Število laboratorijev | V mg/l | V mg/g blata | srednja vrednost | st. odklon | KV (%) | srednja vrednost | st. odklon | KV (%) | | 3,5-diklorofenol | 10 | 153 | 158 | 103 | 5 | 4,6 | 92 | | 2-bromo-etan sulfonska kislina | 10 | 1 058 | 896 | 85 | 34 | 26 | 76 | Podatki o EC50 iz krožnega preskusa – nerazredčeno blato | 11. | Visoki koeficienti variacije med laboratoriji v veliki meri kažejo na razlike v občutljivosti mikroorganizmov v blatu zaradi predhodne izpostavljenosti ali zaradi predhodne neizpostavljenosti preskusni kemikaliji ali drugim kemično sorodnim kemikalijam. Natančnost, s katero je bila določena vrednost EC50 na osnovi koncentracije blata, je bila komaj kaj boljša od ‚volumetrične‘ vrednosti (mg/l). Trije laboratoriji, ki so poročali o natančnosti svojih vrednosti EC50 za 3,5-diklorofenol, so kazali koeficiente variacije (22, 9 oziroma 18 % za EC50 mg/g), ki so bili precej nižji od koeficientov variacije srednjih vrednosti vseh desetih laboratorijev. Posamezne srednje vrednosti za omenjene tri laboratorije so bile 3,1, 3,2 oziroma 2,8 mg/g. Nižji, sprejemljivi koeficienti variacije znotraj laboratorijev v primerjavi s precej višjimi koeficienti med laboratoriji, namreč 9–22 % v prim. z 92 %, kažejo, da obstajajo značilne razlike med lastnostmi posameznih blat. | OPIS METODE | Naprava | 12. | Zahtevani so običajna laboratorijska oprema in naslednje: | a) | inkubator – biti mora zaščiten pred iskrami in nastavljen na 35 °C ± 2 °C; | b) | na tlak odporne preskusne posode ustrezne nazivne velikosti (15); vsaka mora biti opremljena z zaporko, prevlečeno s plinotesno prevleko, ki lahko prenese tlak približno 2 bar ali 2 × 105 Pa (za prevleko uporabite npr. PTFE = politetrafluoreten). Priporočljive so steklene serumske steklenice nazivne prostornine 125 ml in z dejansko prostornino približno 160 ml, zatesnjene s serumskimi zaporkami (16) in z aluminijastimi zapornimi obročki, vendar pa je mogoče uspešno uporabljati steklenice s skupno prostornino med 0,1 litra in 1 litrom; | c) | natančen merilnik tlaka (17) s priključkom za iglo; | d) | skupno nastajanje plina (metana in ogljikovega dioksida), merjeno z merilnikom tlaka, prilagojenim tako, da omogoča merjenje in odvajanje nastalega plina. Primer ustreznega instrumenta je ročni natančni merilnik tlaka, povezan z injekcijsko iglo; trojni plinotesni petelinček olajša sprostitev odvečnega tlaka (Dodatek 1). Notranjo prostornino cevi in ventila tipala diferenčnega tlaka je treba vzdrževati na čim manjši ravni, tako da so napake, ki nastanejo zaradi zanemarjanja prostornine opreme, nepomembne; | e) | izolirane posode za prevoz gnijočega blata; | f) | trojni petelinčki; | g) | sito s kvadratnimi 1-milimetrskimi odprtinami; | h) | rezervoar za gnijoče blato, steklena steklenica ali steklenica iz polietilena visoke gostote s prostornino približno 5 litrov, opremljena z mešalom in opremo za prehod toka dušikovega plina (glej odstavek 13) skozi prostor nad fazno mejo plin-kapljevina; | i) | membranski filtri (0,2 μm) za sterilizacijo substrata; | j) | mikrobrizge za plinotesno povezavo tipala diferenčnega tlaka (glej odstavek 12(c)) s prostorom nad fazno mejo plin-kapljevina v steklenicah (glej odstavek 12(b)); tudi za dodajanje netopnih tekočih preskusnih materialov v steklenice; | k) | komora z rokavicami: neobvezna, a priporočljiva, s rahlo pozitivnim tlakom dušika. | Reagenti | 13. | Ves čas se uporabljajo analitsko čisti reagenti. Ves čas je treba uporabljati dušikov plin visoke čistosti z vsebnostjo kisika, manjšo od 5 μl/l. | Voda | 14. | Če je v kateri koli fazi potrebna razredčitev, uporabite predhodno razplinjeno deionizirano vodo. Analitske kontrole te vode niso potrebne, poskrbite pa za redno vzdrževanje naprave za deionizacijo. Deionizirano vodo uporabite tudi za pripravo založnih raztopin. Pred dodajanjem anaerobnega inokuluma kateri koli raztopini ali razredčitvi preskusnega materiala se prepričajte, da raztopina ali razredčitev ne vsebujeta kisika. To storite z enournim razpihavanjem dušikovega plina skozi vodo za redčenje (ali skozi razredčitve) pred dodajanjem inokuluma, druga možnost pa je, da v ozračju brez kisika vodo za redčenje ogrejete do vrelišča in jo ohladite na sobno temperaturo. | Pregnito blato | 15. | Zberite aktivno gnijoče blato iz gnilišča v čistilni napravi za odpadne vode ali, namesto tega, iz laboratorijskega gnilišča, kjer se čisti blato večinoma iz gospodinjskih odplak. Praktične informacije o blatu iz laboratorijskega gnilišča je mogoče najti drugje (11). Če se namerava uporabiti prilagojeni inokulum, je mogoče razmisliti o gnijočem blatu iz čistilne naprave za industrijske odplake. Za zbiranje blata uporabite steklenice s širokim vratom, izdelane iz polietilena visoke gostote ali podobnega materiala, ki se lahko razteza. Steklenice za vzorce napolnite z blatom do približno 1 cm od vrha steklenic, steklenice dobro zatesnite, po možnosti z varnostnim ventilom (odstavek 12(e)), in jih postavite v izolirane posode (odstavek 12(d)), da kar najbolj zmanjšate možnost temperaturnega šoka; v teh posodah naj stojijo do prenosa v inkubator, v katerem se vzdržuje temperatura 35 °C ± 2 °C. Pri odpiranju steklenic poskrbite, da boste sprostili odvečni tlak plina, tako da previdno sprostite tesnilo ali pa uporabite trojni petelinček za sprostitev tlaka (odstavek 12(e)). Po možnosti blato uporabite v nekaj urah po zbiranju, v nasprotnem primeru ga do 3 dni, ko običajno ne pride do velike izgube aktivnosti, hranite pri temperaturi 35 °C ± 2 °C pod prostorom nad fazno mejo dušik-kapljevina, napolnjenim z dušikom. | Opozorilo – Gnijoče blato proizvaja vnetljive pline, ki povzročajo tveganje za požar in eksplozijo. Vsebuje tudi potencialno patogene organizme, zato pri ravnanju z njim upoštevajte ustrezne previdnostne ukrepe. Za zbiranje blata zaradi varnosti ne uporabljajte steklenih posod. | Inokulum | 16. | Blato tik pred uporabo rahlo premešajte in ga prek sita z odprtinami velikosti 1 mm2 (odstavek 12(f)) precedite v primerno steklenico (odstavek 12(g)) skozi prostor nad fazno mejo plin-kapljevina, skozi katerega se pomika tok dušika. Oddelite vzorec za merjenje koncentracije celotne količine suhih trdnih snovi (glej npr. ISO 11923 (13) ali enakovredni standard EU). V splošnem uporabljajte blato brez redčenja. Koncentracija trdnih snovi je običajno med 2 % in 4 % (m/v). Preverite vrednost pH in jo po potrebi prilagodite na 7 ± 0,5. | Preskusni substrat | 17. | V deionizirani vodi raztopite 10 g hranilnega bujona (npr. bujona Oxoid), 10 g kvasnega ekstrakta in 10 g D-glukoze ter razredčite na 100 ml. Sterilizirajte s filtracijo prek 0,2-mikrometrskega membranskega filtra (odstavek 12(h)) in uporabite takoj ali hranite pri temperaturi 4 °C, vendar največ en dan. | Preskusna kemikalija | 18. | Pripravite ločeno založno raztopino za vsako vodotopno preskusno kemikalijo, ki bo vsebovala na primer 10 g/l kemikalije v vodi za redčenje brez kisika (odstavek 14). Za pripravo reakcijskih zmesi, ki vsebujejo po stopnjah razvrščene koncentracije, uporabite ustrezne količine teh založnih raztopin. Namesto tega pripravite razredčeno serijo vsake založne raztopine, tako da bo količina, dodana preskusnim steklenicam, enaka za vsako zahtevano končno koncentracijo. Vrednost pH založnih raztopin mora biti po potrebi prilagojena na 7 ± 0,2. | 19. | Za preskusne kemikalije, ki niso zadostno topne v vodi, upoštevajte standard ISO 10 634 (12) ali enakovredni standard EU. Če je treba uporabiti organsko topilo, se izogibajte topilom, kot sta kloroform in ogljikov tetraklorid, za katera je dobro znano, da zavirajo nastajanje metana. V primernem hlapnem topilu, na primer acetonu ali dietil etru, pripravite raztopino ustrezne koncentracije kemikalije, ki ni topna v vodi. Potrebne količine raztopine topila dodajte v prazne preskusne steklenice (odstavek 12(b)), pred dodajanjem blata pa naj topilo izhlapi. Za druge obdelave uporabite standard ISO 10 634 (12) ali enakovredni standard EU, zavedajte pa se, da lahko morebitne površinsko aktivne snovi, uporabljene za pridobivanje emulzij, zavirajo anaerobno nastajanje plina. Če se zdi, da prisotnost organskih topil in emulgatorjev povzroča artefakte, se preskusna kemikalija lahko doda neposredno v preskusno zmes v obliki prahu ali tekočine. Hlapne kemikalije in v vodi netopne tekoče preskusne kemikalije se lahko z mikrobrizgami vbrizgajo v inokulirane serumske steklenice (odstavek 12(i)). | 20. | Preskusne kemikalije dodajajte v steklenice tako, da boste dobili geometrijsko vrsto koncentracij, na primer 500 mg/l, 250 mg/l, 125 mg/l, 62,5 mg/l, 31,2 mg/l in 15,6 mg/l. Če območje strupenosti ni znano na podlagi podobnih kemikalij, najprej izvedite predhodni preskus za določanje območja delovanja s koncentracijami 1 000 mg/l, 100 mg/l in 10 mg/l, da določite ustrezno območje. | Referenčna kemikalija | 21. | Pripravite vodno raztopino 3,5-diklorofenola (10 g/l), tako da med stresanjem postopno dodajate minimalno količino 5 mol/l raztopine natrijevega hidroksida trdni snovi, dokler se ne raztopi. Nato dodajte deoksigenirano vodo za redčenje (odstavek 14) do zahtevane količine; pri raztapljanju lahko pomaga ultrazvočno razbijanje. Če je v vsaj treh preskusih z različnim inokulumom (različni viri ali različni časi zbiranja) pridobljeno povprečno območje vrednosti EC50, se lahko uporabijo druge referenčne kemikalije. | MOTNJE/NAPAKE | 22. | Nekatere sestavine blata bi predvidoma lahko reagirale s potencialnimi zaviralci in zato ne bi bile več na voljo mikroorganizmom, zaviranje pa bi bilo manjše ali pa ga ne bi bilo. Če blato že vsebuje kemikalijo, ki je zaviralna, bi bili rezultati napačni, če bi bila ta kemikalija preskušena. Poleg teh možnosti obstaja več drugih ugotovljenih dejavnikov, ki lahko povzročijo napačne rezultate. Ti so našteti v Dodatku 3, skupaj z metodami odpravljanja napak ali vsaj zmanjševanja števila napak. | PRESKUSNI POSTOPEK | 23. | Število potrebnih ponovitev je odvisno od stopnje natančnosti, zahtevane za kazalnike zaviranja. Če so tesnila na steklenicah med trajanjem preskusa dovolj plinotesna, pripravite le eno serijo (vsaj tri ponovitve) preskusnih steklenic pri vsaki zahtevani koncentraciji. Podobno pripravite eno serijo steklenic z referenčno kemikalijo in en niz kontrol. Če pa so tesnila steklenic zanesljiva le pri enem prebadanju ali nekaj prebadanjih, pripravite serijo preskusnih steklenic (npr. tri ponovitve) za vsak časovni razmik (t), za katerega so rezultati zahtevani za vse koncentracije preskusne kemikalije, namenjene preskušanju. Podobno pripravite ‚t‘ serije steklenic za referenčno kemikalijo in kontrole. | 24. | Priporočljiva je uporaba komore z rokavicami (odstavek 12(j)). Vsaj 30 minut pred začetkom preskusa skozi komoro z rokavicami, ki vsebuje vso potrebno opremo, zaženite tok dušikovega plina. Poskrbite, da bo med rokovanjem s steklenicami in zatesnjevanjem steklenic temperatura blata v območju 35 °C ± 2 °C. | Predhodni preskus | 25. | Če aktivnost blata ni znana, je priporočljivo izvesti predhodni preskus. Pripravite kontrole, da dosežete, na primer, koncentracije trdnih snovi 10 g/l, 20 g/l in 40 g/l, ter substrat, vendar ne uporabite preskusne kemikalije. Pripravite tudi različne količine reakcijske zmesi, da pridobite tri ali štiri razmerja količine prostora nad fazno mejo plin-kapljevina in količine tekočine. Iz rezultatov količin plina, nastalih v različnih časovnih razmikih, se izpeljejo najprimernejši pogoji, ki omogočajo dve dnevni merjenji ustvarjenih znatnih količine plina in eno sprostitev tlaka na dan pri optimalni občutljivosti (18) brez nevarnosti eksplozij. | Dodajanje preskusnih kemikalij | 26. | V prazne preskusne steklenice (odstavek 12(b)) dodajte vodotopne preskusne kemikalije v obliki vodnih raztopin (odstavek 18). Uporabite vsaj trojne serije steklenic za vsako območje koncentracij (odstavek 20). Če so preskusne kemikalije netopne ali slabo topne, njihove raztopine v organskih topilih z mikrobrizgo injicirajte v prazne steklenice, da boste pridobili serije ponovitev vsake od petih koncentracij preskusne kemikalije. Prek površine raztopin v preskusnih steklenicah spustite curek dušikovega plina, da bo topilo izhlapelo. Namesto tega lahko dodate netopne trdne kemikalije v obliki tehtanih količin trdnih snovi neposredno v preskusne steklenice. | 27. | Če se tekoče preskusne kemikalije, ki niso topne ali so slabo topne v vodi, ne dodajo s topilom, jih v preskusne steklenice dodajte neposredno z mikrobrizgo po dodajanju inokuluma in preskusnega substrata (glej odstavek 30). Na enak način se lahko dodajajo hlapne preskusne kemikalije. | Dodajanje inokuluma in substrata | 28. | V 5-litrsko steklenico (odstavek 12(g)) zmešajte ustrezno količino presejanega gnijočega blata (glej odstavek 16), med tem pa skozi prostor nad fazno mejo plin-kapljevina pošiljajte tok dušikovega plina. Preskusne steklenice, ki vsebujejo vodne raztopine ali raztopine preskusnih kemikalij z izhlapelim topilom dve minuti spirajte s tokom dušikovega plina, da odstranite zrak. S pipeto z veliko konico ali z merilnim valjem odmerite alikvote, npr. 100 ml, dobro zmešanega blata v preskusne steklenice. Pipeto morate zaradi lažjega usedanja trdnih snovi iz blata nujno napolniti do točne zahtevane količine blata v enem samem koraku. Če je zajetega več, spraznite pipeto in začnite znova. | 29. | Nato dodajte zadostno raztopino substrata (odstavek 17), da bo koncentracija hranilnega bujona, kvasnega ekstrakta in D-glukoze v zmesi znašala po 2 g/l vsakega, pri tem pa mora skozi še vedno teči dušik. Naslednje je primer preskusnih serij. | Končna koncentracija preskusne kemikalije v preskusnih steklenicah | (mg/l) | Prostornina preskusne kemikalije | (ml) | Reagenti in medij | (ml) | založna raztopina | a) | 10 g/l | odstavek 18 | založna raztopina | b) | 1 g/l | odstavek 18 | voda za redčenje | odstavek 14 | inokulum | odstavek 16 | substrat | odstavek 17 | 0 | — | 0 | 1,0 | 100 | 2 | 1 | — | 0,1 | 0,9 | 100 | 2 | 3,3 | — | 0,33 | 0,67 | 100 | 2 | 10 | 0,1 | — | 0,9 | 100 | 2 | 33 | 0,33 | — | 0,67 | 100 | 2 | 100 | 1,0 | — | 0 | 100 | 2 | Celotna prostornina steklenice = 160 ml. Prostornina tekočine = 103 ml | Prostornina plina = 57 ml ali 35,6 % celotne prostornine. | 30. | Z dušikovim plinom podobno kot prej dobro sperite zadostno število praznih preskusnih steklenic, da odstranite morebitno hlapno in netopno tekočo preskusno kemikalijo (glej odstavek 27). | Kontrole in referenčne kemikalije | 31. | Pripravite vsaj trojne serije steklenic, ki naj vsebujejo samo blato in substrat ter bodo služile kot kontrole. Pripravite dodatne steklenice za ponovitve, ki naj vsebujejo blato in substrat ter dovolj založne raztopine referenčne kemikalije, 3,5-diklorofenola (odstavek 21), da bo končna koncentracija znašala 150 mg/l. Ta koncentracija bi morala zavreti nastajanje plina za približno 50 %. Namesto tega lahko pripravite serijo koncentracij referenčne kemikalije. Poleg tega pripravite štiri dodatne steklenice za merjenje pH, ki bodo vsebovale blato, deoksigenirano vodo in substrat. V dve steklenici dodajte preskusno kemikalijo v največji koncentraciji, ki bo preskušana, v preostali dve steklenici pa dodajte deoksigenirano vodo. | 32. | Poskrbite, da bodo vse steklenice – s preskusnimi in referenčnimi kemikalijami ter kontrolami – vsebovale enako količino (VR) tekočine; po potrebi za dopolnjevanje količine dodajte deoksigenirano deionizirano vodo (odstavek 14). Velikost prostora nad fazno mejo plin-kapljevina mora biti med 10 % in 40 % prostornine steklenice, dejansko vrednost pa je treba določiti na podlagi podatkov, pridobljenih iz predhodnega preskusa. Po dodajanju vseh sestavin v steklenice odstranite iglo, skozi katero priteka plin, in zatesnite vsako steklenico z zamaškom iz kavčuka in aluminijastim pokrovčkom (odstavek 12(b)), pri tem pa za lažje vstavljanje navlažite zamašek s kapljico deionizirane vode. S stresanjem zmešajte vsebini obeh steklenic. | Inkubacija steklenic | 33. | Prenesite steklenice v termostatsko nadzorovan inkubator, po možnosti opremljen s stresalnikom, katerega temperatura je vzdrževana v območju 35 °C ± 2 °C. Steklenice se inkubirajo v temi. Po približno 1 uri izenačite tlak v steklenicah s tlakom ozračja, tako da injekcijsko iglo, pritrjeno na merilnik tlaka (odstavek 12(c)), skozi tesnilo po vrsti vstavite v vsako steklenico, odprete ventil in počakate, da merilnik tlaka prikaže vrednost nič, na koncu pa zaprete ventil. Iglo je treba vstaviti pod kotom približno 45°, da se prepreči uhajanje plina iz steklenic. Če so steklenice inkubirane brez stresalne naprave, jih med inkubacijo vsak dan dvakrat ročno pretresite, da uravnotežite sistem. Steklenice inkubirajte in jih obrnite, da preprečite uhajanje plina skozi zaporko. Vendar pa obračanje v primerih, ko bi se netopne preskusne kemikalije lahko prilepile na dno bučke, ni primerno. | Merjenje tlaka | 34. | Ko steklenice dosežejo temperaturo 35 °C ± 2 °C, izmerite in zabeležite vrednost pH vsebine dveh od štirih steklenic, pripravljenih v ta namen, in zavrzite vsebino; preostali steklenici še naprej inkubirajte v temi. Dvakrat na dan v naslednjih 48 do 72 urah izmerite in zabeležite tlak v steklenicah, tako da iglo merilnika tlaka po vrsti vstavljate skozi tesnilo vsake steklenice, med merjenji pa iglo osušite. Med merjenjem, ki ga je treba izvesti čim hitreje, ohranjajte temperaturo vseh delov steklenice pri temperaturi inkubacije. Pustite, da se odčitek tlaka stabilizira, in ga zabeležite. Nato odprite ventil za zračenje in ga zaprite, ko odčitani tlak pade na nič. Običajno preskus nadaljujte 48 ur, merjeno od prvega izenačevanja tlaka, kar je označeno s ‚čas 0‘. Število odčitkov in prezračevanj mora biti za hlapne kemikalije omejeno na ena (ob koncu inkubacije) ali dve, da so izgube preskusne kemikalije kar najmanjše (10). | 35. | Če je odčitek tlaka negativen, ventila ne odpirajte. Včasih se v injekcijski igli in ceveh nabere vlaga, kar se odrazi na odčitku tlaka, ki je rahlo negativen. V tem primeru odstranite iglo, pretresite cevi, jih osušite s krpo in namestite novo iglo. | Merjenje vrednosti pH | 36. | Po zadnjem merjenju tlaka izmerite in zabeležite vrednost pH vsebine vsake steklenice. | PODATKI IN POROČANJE | Prikaz rezultatov | 37. | Izračunajte vsoto in povprečje tlakov, zabeleženih ob vsakem časovnem razmiku za vsako serijo steklenic za ponovitve ter izračunajte srednjo vrednost kumulativne bruto vrednosti tlaka plina ob vsakem časovnem razmiku za vsako serijo ponovitev. Za steklenice s kontrolno, preskusno in referenčno kemikalijo izrišite krivulje srednje vrednosti kumulativne vrednosti nastajanja plina (Pa) v odvisnosti od časa. Na linearnem delu krivulje izberite čas, običajno je to 48 ur, in iz enačbe [1] izračunajte odstotek zaviranja (I) za vsako koncentracijo: | I = (1 – Pt/PC) × 100 | [1], | pri čemer so: | I | odstotek zaviranja v %, | Pt | tlak plina, nastalega s preskusnim materialom v izbranem času v paskalih (Pa), | Pc | tlak plina, nastalega v kontroli v istem času v paskalih (Pa). | Priporočljivo je izrisati obe krivulji, tj. krivuljo I v odvisnosti od koncentracije in krivuljo I v odvisnosti od logaritma koncentracije, tako da je mogoče izbrati krivuljo, ki je bolj linearna. Vrednost EC50 (mg/l) ocenite vizualno ali z regresijsko analizo iz krivulje, ki je bolj linearna. Za primerjavo je morda bolj uporabno izraziti koncentracijo kemikalije v mg kemikalije/g celotne količine suhih trdnih snovi. Da pridobite to koncentracijo, delite volumetrično koncentracijo (mg/l) s prostorninsko koncentracijo suhih trdnih snovi v blatu (g/l) (odstavek 16). | 38. | Izračunajte odstotek zaviranja, dosežen z eno samo koncentracijo uporabljene referenčne kemikalije, ali vrednost EC50, če je proučenih dovolj koncentracij. | 39. | Z upoštevanjem umeritvene krivulje merilnika tlaka (Dodatek 2) pretvorite srednjo vrednost tlaka, pridobljenega v kontroli Pc (Pa), v prostornino in iz tega izračunajte prirast plina, izraženo v obliki prostornine, pridobljeno v 48 urah iz 100 ml nerazredčenega blata pri koncentraciji trdnih snovi od 2 % (20 g/l) do 4 % (40 g/l). | Merila za veljavnost | 40. | Rezultati medlaboratorijske primerjave ISO (5) so dokazali, da je referenčna kemikalija (3,5-diklorofenol) povzročila 50-odstotno zaviranje nastajanja plina v območju koncentracij od 32 mg/l do 510 mg/l s srednjo vrednostjo 153 mg/l (odstavek 10). To območje je tako široko, da trdnih meja za zaviranje ni mogoče z gotovostjo določiti kot merilo za veljavnost; to bi moralo postati mogoče, ko bo napredek pokazal, kako proizvesti bolj skladne inokulume. Prostornina nastalega plina v kontrolnih steklenicah v 48 urah se je gibala od 21 ml/g suhe snovi v blatu do 149 ml/g (srednja vrednost je bila 72 ml/g). Med prostornino nastalega plina in ustrezno vrednostjo EC50 ni bilo očitne zveze. Končna vrednost pH se je gibala med 6,1 in 7,5. | 41. | Preskus šteje kot veljaven, ko je v referenčni kontroli, ki vsebuje 150 mg/l 3,5-diklorofenola, pridobljeno zaviranje večje od 20 %, ko je v slepi kontroli nastalega več kot 50 ml plina na gram suhe snovi in ko je vrednost pH ob koncu preskusa v območju od 6,2 do 7,5. | Poročilo o preskusu | 42. | Poročilo o preskusu mora vsebovati naslednje informacije: | | Preskusna kemikalija | — | splošno ime, kemijsko ime, številka CAS, strukturna formula in pomembne fizikalno-kemijske lastnosti, | — | čistost (nečistote) preskusne kemikalije. | | Preskusni pogoji | — | prostornine tekočih vsebin in prostora nad fazno mejo plin-kapljevina v preskusnih posodah, | — | opisi preskusnih posod in merjenja plina (npr. vrsta merilnika tlaka), | — | uporaba preskusne in referenčne kemikalije v preskusnem sistemu, uporabljene preskusne koncentracije in uporaba kakršnih koli topil, | — | podrobnosti o uporabljenem inokulumu: ime čistilne naprave, opis vira čiščene odpadne vode (npr. obratovalna temperatura, retencijski čas blata, večinoma gospodinjske ali industrijske odplake itd.), koncentracija trdnih snovi, dejavnost nastajanja plina pri anaerobnem gnilišču, predhodna izpostavljenost ali morebitna predhodna prilagoditev strupenim kemikalijam ali mesto zbiranja blata, usedlin itd., | — | inkubacijska temperatura in območje, | — | število ponovitev. | | Rezultati: | — | vrednosti pH na koncu preskusa, | — | vsi izmerjeni podatki, zbrani v kontrolnih posodah s preskusno, slepo in referenčno kemikalijo, kot je ustrezno (npr. tlak v Pa ali milibarih), v preglednici, | — | odstotek zaviranja v preskusnih in referenčnih steklenicah ter krivulje zaviranje-koncentracija, | — | izračun vrednosti EC50, izražene v mg/l in mg/g, | — | nastajanje plina na gram blata v 48 urah, | — | razlogi za morebitno zavrnitev rezultatov preskusa, | — | razprava o rezultatih, vključno z morebitnimi odstopanji od postopkov v tej preskusni metodi, in razprava o morebitnih odstopanjih v rezultatih preskusa od tistega, kar bi bilo pričakovano, zaradi motenj in napak, | — | poleg tega pa tudi odgovor na vprašanje, ali je bil namen preskusa merjenje strupenosti za predhodno izpostavljene mikroorganizme ali za predhodno neizpostavljene mikroorganizme. | LITERATURA | (1) | Poglavje C.11 te priloge: Preskus zaviranja dihanja aktivnega blata. | (2) | Poglavje C.43 te priloge: Anaerobna biološka razgradljivost organskih spojin v pregnitem blatu: metoda z merjenjem nastajanja plina. | (3) | Mednarodna organizacija za standardizacijo (2003). ISO 13641-1 Kakovost vode – Določevanje zaviranja nastanka plina, ki ga proizvedejo anaerobne bakterije – 1. del: Splošen preskus. | (4) | Mednarodna organizacija za standardizacijo (2003). ISO 13641-2 Kakovost vode – Določevanje zaviranja nastanka plina, ki ga proizvedejo anaerobne bakterije – 2. del: Preskus z nizkimi koncentracijami biomase. | (5) | ISO (2000) Ring test of ISO 13 641-1 and ISO 13 641-2. Determination of inhibition of activity of anaerobic bacteria. BL 6958/A. Evans M. R., Painter, H. A. Brixham Environmental Laboratory, AstraZeneca UK Ltd., Brixham, TQ5 8BA, Združeno kraljestvo. | (6) | Swanwick, J. D., Foulkes, M. (1971). Inhibition of anaerobic digestion of sewage sludge by chlorinated hydrocarbons. Wat. Pollut. Control, 70, 58–70. | (7) | HMSO (1986). Determination of the inhibitory effects of chemicals and waste waters on the anaerobic digestion of sewage sludge. ISBN 0 117519 43 X, V: Methods for the Examination of Waters and Associated Materials, Združeno kraljestvo. | (8) | Shelton, D. R., Tiedje, J. M. (1984). General method for determining anaerobic biodegradation potential. Appl. Env. Microbiol. 47 850–857. | (9) | Battersby, N. S., in Wilson, V. (1988). Evaluation of a serum bottle technique for assessing the anaerobic biodegradability of organic compounds under methanogenic conditions. Chemosphere 17, 2441–2460. | (10) | Wilson, V., Painter, H. A., in Battersby, N. S. (1992). A screening method for assessing the inhibition of the anaerobic gas production from sewage sludge. Proc. Int. Symp. on Ecotoxicology. Ecotoxicological Relevance of Test Methods, GSF Forschungzentrum, Neuherberg, Nemčija (1990). Ur. Steinberg C. in Kettrup A., str. 117– 132 (1992). | (11) | Kawahara, K., Yakabe, Y., Chida, T., in Kida, K. (1999). Evaluation of laboratory-made sludge for an anaerobic biodegradability test and its use for assessment of 13 chemicals. Chemosphere, 39 (12), 2007–2018. | (12) | Mednarodna organizacija za standardizacijo (1995). ISO 10634: Kakovost vode – Navodilo za pripravo in obdelavo v vodi slabo topnih organskih spojin za nadaljnje vrednotenje njihove biorazgradljivosti v vodi. | (13) | Mednarodna organizacija za standardizacijo (1997). ISO 11923: Kakovost vode – Določevanje suspendiranih snovi s filtracijo skozi filter iz steklenih vlaken. | Dodatek 1 | Primer naprave za merjenje nastajanja bioplina s tlakom plina | Legenda: | 1 | – | merilnik tlaka | 2 | – | trojni plinotesni petelinček | 3 | – | injekcijska igla | 4 | – | plinotesno tesnilo (zaporni pokrovček in zaporka) | 5 | – | prostor nad fazno mejo plin-kapljevina | 6 | – | inokulum pregnitega blata | Preskusne posode v okolju s temperaturo 35 °C ± 2 °C. | Dodatek 2 | Pretvorba odčitkov merilnika tlaka | Odčitki merilnika tlaka so lahko prek umeritvene krivulje povezani s količinami plina, iz tega pa je mogoče izračunati količino nastalega plina na gram suhega blata v 48 urah. Ta kazalnik dejavnosti se uporablja kot eno od meril, s katerimi se ocenjuje veljavnost rezultatov preskusa. Umeritvena krivulja se ustvari z vbrizganjem znanih količin plina pri temperaturi 35 °C ± 2 °C v serumske steklenice, ki vsebujejo toliko vode, kolikor znaša količina reakcijske zmesi, VR. | — | V pet serumskih steklenic odmerite VR ml alikvotov vode, hranjene pri temperaturi 35 °C ± 2 °C. Steklenice zatesnite in jih za eno uro postavite v vodno kopel pri temperaturi 35 °C ± 2 °C, da se uravnotežijo. | — | Vklopite merilnik tlaka, pustite ga, da se stabilizira, in ga nastavite na ničlo. | — | Skozi tesnilo ene od steklenic vstavite injekcijsko iglo, odprite ventil in ga pustite odprtega, dokler merilnik tlaka ne pokaže vrednosti nič, nato pa zaprite ventil. | — | Postopek ponovite pri preostalih steklenicah. | — | V vsako steklenico vbrizgajte 1 ml zraka pri temperaturi 35 °C ± 2 °C. Vstavite iglo (na merilniku) v eno od steklenic in pustite, da se odčitek tlaka stabilizira. Zabeležite tlak, odprite ventil in ga pustite odprtega, dokler tlak ne doseže vrednosti nič, nato pa zaprite ventil. | — | Postopek ponovite pri preostalih steklenicah. | — | Celoten postopek ponovite z 2 ml, 3 ml, 4 ml, 5 ml, 6 ml, 8 ml, 10 ml, 12 ml, 16 ml, 20 ml in 50 ml zraka. | — | Izrišite krivuljo pretvorbe tlaka (Pa) v odvisnosti od injicirane prostornine (ml). V območju od 0 Pa do 70 000 Pa in od 0 ml do 50 ml nastajanja plina je odziv instrumenta linearen. | Dodatek 3 | Ugotovljeni dejavniki, ki lahko povzročijo napačne rezultate | (a) Kakovost pokrovčkov steklenic | Na trgu so na voljo različne vrste zapork za serumske steklenice; med temi jih v pogojih tega preskusa ob prebadanju z iglo veliko izgubi sposobnost tesnjenja, tudi takšne iz butilnega kavčuka. Včasih po prebadanju zaporke z injekcijsko iglo tlak zelo počasi pada. Za preprečevanje puščanja je priporočena uporaba plinotesnih zapork (odstavek 12(b)). | (b) Vlaga v injekcijski igli | V injekcijski igli in ceveh se včasih nakopiči vlaga, kar se odrazi na odčitku tlaka, ki je rahlo negativen. To popravite tako, da odstranite iglo, pretresete cevi, jih osušite s krpo in namestite novo iglo (odstavka 12(c) in 35). | (c) Kontaminacija s kisikom | Anaerobne metode so izpostavljene napakam, do katerih pride zaradi kontaminacije s kisikom, kar lahko oslabi nastajanje plina. Pri tej metodi je treba to možnost kar najbolj zmanjšati z uporabo strogo anaerobnih tehnik, vključno z uporabo komore z rokavicami. | (d) Nepredelani substrati v blatu | Na anaerobno nastajanje plina in občutljivost blata vplivajo substrati, ki so z inokulumom preneseni v preskusne steklenice. Pregnito blato iz anaerobnih gnilišč čistilnih naprav za gospodinjske odplake pogosto še vedno vsebuje prepoznavne snovi, kot so lasje in ostanki rastlin v obliki celuloze, zaradi česar je jemanje reprezentativnih vzorcev lahko oteženo. S presejanjem blata je mogoče nepredelane netopne snovi odstraniti, zato je verjetnost, da bo vzorčenje reprezentativno, večja (odstavek 16). | (e) Hlapne preskusne kemikalije | Hlapne preskusne kemikalije bodo sproščene v prostor v preskusnih steklenicah, ki je nad fazno mejo plin-kapljevina. Pri tem lahko med prezračevanjem po meritvah tlaka pride do izgube nekaj preskusnega materiala iz sistema, kar daje lažno visoke vrednosti EC50. Napako je mogoče zmanjšati s primerno izbiro razmerja med prostornino prostora nad fazno mejo plin-kapljevina in prostornino tekočine ter s tem, da po merjenju tlaka ne zračimo (10). | (f) Nelinearnost nastajanja plina | Če krivulja srednje vrednosti kumulativne vrednosti nastajanja plina v odvisnosti od časa inkubacije v obdobju 48 ur ni približno linearna, se je natančnost preskusa morda zmanjšala. Da ne pride do tega, je morda priporočljiva uporaba gnijočega blata iz drugega vira in/ali dodajanje povečane koncentracije preskusnega substrata/hranilnega bujona, kvasnega ekstrakta in glukoze (odstavek 29). | Dodatek 4 | Uporaba pri okoljskih vzorcih z nizko koncentracijo biomase – anaerobnih blatih, usedlinah itd. | UVOD | A.1 V splošnem je specifična mikrobna dejavnost (količina plina, nastalega na gram suhih trdnih snovi) pri naravno nastalih anaerobnih blatih, usedlinah itd. precej nižja od mikrobne dejavnosti pri anaerobnem blatu, pridobljenem iz odplak. Zato je treba pri merjenju zaviralnih učinkov kemikalij na te manj dejavne vzorce spremeniti nekatere pogoje poskusa. Pri teh manj dejavnih vzorcih sta možna dva poteka delovanja: | (a) | izvedite prilagojen predhodni preskus (odstavek 25) z nerazredčenim vzorcem blata, tal itd. pri temperaturi 35 °C ± 2 °C ali, za natančnejšo simulacijo, pri temperaturi mesta zbiranja vzorcev (kot v 1. delu standarda ISO 13641); | (b) | lahko pa izvedete preskus z razredčenim blatom iz gnilišča (v razmerju 1 proti 100), da posnamete šibko delovanje, pričakovano pri okoljskem vzorcu, vendar temperaturo vzdržujte v območju 35 °C ± 2 °C (kot v 2. delu standarda ISO 13641). | A.2 Možnost (a) je mogoče doseči z upoštevanjem tu opisane metode (enakovredne 1. delu standarda ISO 13641), nujno pa je izvesti predhodni preskus (odstavek 25) za določanje optimalnih pogojev, razen če so ti že znani iz prejšnjih preskusov. Vzorec blata ali usedline je treba temeljito zmešati, npr. v mešalniku, in ga po potrebi razredčiti z majhnim delom razplinjene vode za redčenje (odstavek 14), tako da je dovolj tekoč za prenos s široko pipeto ali merilnim valjem. Če se zdi, da bi utegnila manjkati hranila, se vzorec blata lahko centrifugira (v anaerobnih pogojih) in ponovno suspendira v mineralnem mediju, ki vsebuje kvasni ekstrakt (A.11). | A.3 Možnost (b). Ta možnost v razumni meri posnema šibko aktivnost okoljskih vzorcev, vendar ji manjka visoka koncentracija suspendiranih trdnih snovi, ki so prisotne v teh vzorcih. Vloga teh trdnih snovi pri zaviranju ni znana, vendar je mogoče, da bi lahko zaradi reakcije med preskusnimi kemikalijami in sestavinami blata ter adsorpcije preskusnih kemikalij na trdne snovi prišlo do zmanjšanja strupenosti preskusne kemikalije. | A.4 Naslednji pomemben dejavnik je temperatura: za natančno simulacijo je treba preskuse izvesti pri temperaturi mesta zbiranja vzorcev, saj je znano, da različne skupine združb bakterij, ki proizvajajo metan, delujejo v različnih temperaturnih območjih, namreč termofili (~30–35 °C), mezofili (20–25 °C) in psihrofili (< 20 °C), in lahko izkazujejo različne vzorce zaviranja. | A.5 Trajanje. V 1. delu splošnega preskusa z uporabo nerazredčenega blata je bilo nastajanje plina v obdobju 2–4 dni vedno zadostno, v 2. delu z blatom, razredčenim na eno stotino, pa v tem obdobju v krožnem preskusu plin ni nastal ali pa ga ni nastalo dovolj. Pri opisovanju slednjega preskusa Madsen in drugi (1996) pravijo, da mora trajati vsaj 7 dni. | Preskušanje z nizko koncentracijo biomase (možnost b) | Z dodajanjem ali menjavo nekaterih obstoječih odstavkov in pododstavkov v glavnem besedilu je treba izvesti naslednje preureditve in spremembe: | A.6 Dodatek k odstavku 6: Načelo preskusa; | ‚To tehniko je mogoče uporabiti z anaerobnim blatom, razredčenim v razmerju 1 proti 100, deloma za posnemanje šibkega delovanja blat in usedlin. Temperatura inkubacije je lahko enaka 35 °C ali pa enaka temperaturi na mestu, na katerem je bil vzorec odvzet. Ker je delovanje bakterij precej šibkejše od tistega v nerazredčenem blatu, je treba obdobje inkubacije podaljšati na vsaj 7 dni.‘ | A.7 Dodatek k odstavku 12 (a): | ‚inkubator mora biti zmožen delovati tudi pri nižjih temperaturah, in sicer do 15 °C.‘ | A.8 Dodatek dodatnega reagenta za odstavkom 13: | ‚Fosforna kislina (H3PO4), 85 mas. % v vodi.‘ | A.9 Dodatek na koncu odstavka 16: | ‚Uporabite končno koncentracijo 0,20 ± 0,05 g/l celotne količine suhih trdnih snovi v preskusu.‘ | A.10 Odstavek 17. Preskusni substrat | Ta substrat se ne sme uporabljati, nadomesti ga kvasni ekstrakt (glej odstavke 17; A.11, A.12, A.13). | A.11 Za redčenje anaerobnega blata je potreben mineralni medij, vključno z elementi v sledovih, temu mediju pa je zaradi pripravnosti dodan organski substrat, kvasni ekstrakt. | Dodatek za odstavkom 17: | ‚(a) | Preskusni mineralni medij s kvasnim ekstraktom. | Pripravljen je z 10-kratno koncentriranim preskusnim medijem (odstavek 17 (b); A.12) z raztopino elementov v sledovih (odstavek 17(c); A.13). Uporabite sveže dobavljen natrijev sulfid nonahidrat (odstavek 17(b); A.12), če ni svež, pa ga pred uporabo operite in posušite, da mu zagotovite zadostno redukcijsko sposobnost. Če se preskus izvaja brez komore z rokavicami (odstavek 12(j)), je treba koncentracijo natrijevega sulfida v založni raztopini povečati na 2 g/l (z 1 g/l). Natrijev sulfid se lahko za pridobivanje končne koncentracije 0,2 g/l doda tudi iz ustrezne založne raztopine prek zaporke zaprtih preskusnih steklenic, saj se s tem postopkom zmanjša tveganje oksidacije. Namesto tega se lahko uporabi titanov (III) citrat (odstavek 17(b)). Dodajte ga skozi zaporko zaprtih preskusnih steklenic, da dobite koncentracijo od 0,8 mmol/l do 1,0 mmol/l. Titanov (III) citrat je visoko učinkovit reducent z nizko strupenostjo, ki se pripravi, kot je opisano v nadaljevanju: 2,94 g trinatrijevega citrata dihidrata raztopite v 50 ml vode za redčenje brez kisika (odstavek 14) (kar da raztopino 200 mmol/l) in dodajte 5 ml raztopine titanovega (III) klorida (15 g/100 ml vode za redčenje). Z natrijevim karbonatom nevtralizirajte na vrednost pH 7 ± 0,5 in pod tokom dušikovega plina odmerite v ustrezno serumsko steklenico. Koncentracija titanovega (III) citrata v tej založni raztopini je 164 mmol/l. Preskusni medij uporabite takoj ali pa ga največ en dan hranite pri temperaturi 4 °C. | A.12 | (b) | Desetkratno koncentrirani preskusni medij, pripravljen z naslednjim: | brezvodnim kalijevim dihidrogenfosfatom (KH2PO4) | 2,7 g | dinatrijevim hidrogenfosfatom (Na2HPO4) | 4,4 g | (ali 11,2 g dodekahidrata) | amonijevim kloridom (NH4Cl) | 5,3 g | kalcijevim klorid dihidratom (CaCl2 · 2H2O) | 0,75 g | magnezijevim klorid heksahidratom (MgCl2 · 6H2O) | 1,0 g | železovim (II) klorid tetrahidratom (FeCl2 · 4H2O) | 0,2 g | resazurinom (redoks indikatorjem) | 0,01 g | natrijevim sulfid nonahidratom (Na2S · 9H2O) | 1,0 g | (ali titanovim (III) citratom) končna koncentracija | od 0,8 mmol/l do 1,0 mmol/l | raztopino elementov v sledovih (glej odstavek 17 (c); A.13) | 10,0 ml | kvasnim ekstraktom | 100 g | Raztopite v vodi za redčenje (odstavek 14) in dopolnite do: | 1 000 ml | A.13 | (c) | Raztopina elementov v sledovih, pripravljena z naslednjim: | manganovim (II) klorid tetrahidratom (MnCl2 · 4H2O) | 0,5 g | ortoborovo kislino (H3BO3) | 0,05 g | cinkovim kloridom (ZnCl2) | 0,05 g | bakrovim (II) kloridom (CuCl2) | 0,03 g | natrijevim molibdat dihidratom (Na2MoO4 · 2H2O) | 0,01 g | kobaltovim (II) klorid heksahidratom (CoCl2 · 6H2O) | 1,0 g | nikljevim (II) klorid heksahidratom (NiCl2 · 6H2O) | 0,1 g | dinatrijevim selenitom (Na2SeO3) | 0,05 g | Raztopite v vodi za redčenje (odstavek 14) in dopolnite do: | 1 000 ml‘ | A.14 Odstavek 25: Predhodni preskus | Nujno mora biti opravljen predhodni preskus, kot je opisan v odstavku 24, razen tega, da mora biti koncentracija trdnih snovi v blatu ena stotina podanih koncentracij, tj. 0,1 g/l, 0,2 g/l in 0,4 g/l. Inkubacija mora trajati najmanj 7 dni. | Opomba: v krožnem preskusu (5) je bil prostor nad fazno mejo plin-kapljevina pri 75 % celotne prostornine precej prevelik; biti mora v priporočenem območju od 10 % do 40 %. Ustrezno merilo je, da mora biti prostornina plina, nastalega pri približno 80-odstotnem zaviranju, merljiva s sprejemljivo natančnostjo (npr. od ± 5 % do ± 10 %). | A.15 Odstavki od 26 do 30: Dodajanje preskusne kemikalije, inokuluma in substrata. | Dodajanje se izvaja na enak način, kot je opisano v teh odstavkih, raztopino substrata (odstavek 17) pa nadomestita preskusni medij in substrat kvasnega ekstrakta (A.11). | Poleg tega je končna koncentracija suhih trdnih snovi v blatu zmanjšana z območja 2–4 g/l na območje 0,2 ± 0,05 g/l (A.9). Dva primera dodajanja sestavin preskusni zmesi sta podana v preglednici A.1, ki nadomesti preglednico v odstavku 29. | A.16 Odstavek 33: Inkubacija steklenic | Zaradi pričakovane manjše hitrosti nastajanja plina se inkubacija izvaja vsaj 7 dni. | A.17 Odstavek 34: Meritve tlaka | Če so zahtevane količine v plinski fazi, se za merjenje tlaka v prostoru steklenic nad fazno mejo plin-kapljevina uporablja enak postopek, kot je opisan v odstavku 34. Če bodo izmerjene celotne količine CO2 in CH4, se vrednost pH tekoče faze z vbrizganjem H3PO4 v vsako ustrezno steklenico in merjenjem tlaka po 30 minutah stresanja pri temperaturi preskusa zmanjša na približno 2. Vendar je mogoče več informacij o kakovosti inokuluma pridobiti z merjenjem tlaka v vsaki steklenici pred zakisljevanjem in po njem. Če je, na primer, hitrost nastajanja CO2 precej višja od hitrosti nastajanja metana, se lahko občutljivost fermentacijskih bakterij spremeni in/ali na metanogene bakterije po možnosti vpliva preskusna kemikalija. | A.18 Odstavek 36: Merjenje vrednosti pH | Če bo uporabljen H3PO4, je treba posebej za merjenje vrednosti pH pripraviti nekaj dodatnih steklenic brez dodanega H3PO4. | VIR: | Madsen, T., Rasmussen, H. B., in Nilsson, L. (1996), Methods for screening anaerobic biodegradability and toxicity of organic chemicals. Projekt št. 336, Inštitut za kakovost vode, Danska agencija za varstvo okolja, Köbenhavn. | Preglednica A.1 | Primeri priprave preskusa za serije preskusov | Sestavine reakcijske zmesi | Primer 1 | Primer 2 | Običajni vrstni red dodajanja | koncentracija pripravljenega inokuluma (g/l) | 0,42 | 2,1 | — | prostornina dodanega inokuluma (ml) | 45 | 9 | 4 | koncentracija inokuluma v preskusnih steklenicah (g/l) | 0,20 | 0,20 | — | prostornina dodanega preskusnega medija (ml) | 9 | 9 | 2 | prostornina dodane vode za redčenje (ml) | 36 | 72 | 3 | koncentracija kvasnega ekstrakta v preskusnih steklenicah (g/l) | 9,7 | 9,7 | — | prostornina založne raztopine preskusne kemikalije (ml) | 3 | 3 | 1 | celotna prostornina tekočine (ml) | 93 | 93 | — | Dodatek 5 | Opredelitve pojmov | Za to preskusno metodo se uporabljata naslednji opredelitvi: | Kemikalija pomeni snov ali zmes. | Preskusna kemikalija je snov ali zmes, preskušena s to preskusno metodo. | C.35 PRESKUS STRUPENOSTI Z VRSTO LUMBRICULUS V SISTEMU VODE IN USEDLINE Z UPORABO USEDLIN S PRIMEŠANO PRESKUSNO KEMIKALIJO | UVOD | 1. | Ta preskusna metoda je enakovredna Smernici za preskušanje OECD (TG) 225 (2007). Endobentoške živali, ki se hranijo z usedlinami, so lahko zelo izpostavljene kemikalijam, ki se vežejo z usedlinami, zato jih je treba obravnavati prednostno, npr. (1), (2), (3). Med temi uživalci usedlin imajo pomembno vlogo pri usedlinah vodnih sistemov vodni maloščetinci. Z bioturbacijo usedline in s tem, ko služijo kot plen, imajo te živali lahko močan vpliv na biološko razpoložljivost takšnih kemikalij za druge organizme, npr. bentivore vrste rib. V nasprotju z epibentoškimi organizmi se endobentoški vodni maloščetinci (npr. vrsta Lumbriculus variegatus) zakopljejo v usedlino in jedo delce usedline pod površino usedline. S tem je zagotovljena izpostavljenost preskusnih organizmov preskusni kemikaliji prek vseh mogočih načinov privzema (npr. s stikom z kontaminiranimi delci usedline in z zaužitjem teh delcev, pa tudi prek porne vode in vode nad usedlino). | 2. | Ta metoda je zasnovana za ocenjevanje učinkov podaljšane izpostavljenosti endobentoških maloščetincev vrste Lumbriculus variegatus (Müller) kemikalijam, povezanim z usedlinami. Temelji na obstoječih protokolih za preskušanje strupenosti usedline in kopičenja v organizmih, npr. (3), (4), (5), (6), (7), (8), (9), (10). Metoda je opisana za statične preskusne pogoje. Scenarij izpostavljenosti, uporabljen v tej preskusni metodi, je primešanje preskusne kemikalije v usedlino. Uporaba usedline s primešano preskusno kemikalijo poskuša posnemati usedlino, kontaminirano s preskusno kemikalijo. | 3. | Kemikalije, ki jih je treba preskusiti v zvezi z organizmi, živečimi v usedlinah, se običajno v tem delu obdržijo zelo dolgo. Organizmi, živeči v usedlinah, so lahko izpostavljeni na številne načine. Relativni pomen vsakega načina izpostavljenosti in čas, da ta prispeva k skupnim strupenim učinkom, sta odvisna od fizikalno-kemijskih lastnosti zadevne kemikalije in njene končne usode v živali. Pri kemikalijah, ki se močno adsorbirajo (npr. z log Kow > 5), ali kemikalijah, ki se kovalentno vežejo na usedlino, je lahko zaužitje kontaminirane hrane pomemben način izpostavljenosti. Da ne bi podcenili strupenosti takšnih kemikalij, se usedlini pred nanosom preskusne kemikalije doda hrana, potrebna za razmnoževanje (11). Opisana preskusna metoda je predstavljena dovolj podrobno, da je mogoče izvesti preskus, pri tem pa omogočiti prilagoditve načrta poskusa glede na pogoje v posameznih laboratorijih in različne lastnosti preskusnih kemikalij. | 4. | Cilj preskusne metode je določitev učinkov preskusne kemikalije na razmnoževanje in biomaso preskusnih organizmov. Merjena biološka parametra sta celotno število preživelih črvov in biomasa (suha teža) ob koncu izpostavljenosti. Ti podatki se nato za oceno koncentracije, ki bi povzročila x-odstotni učinek (npr. EC50, EC25 in EC10), analizirajo z regresijskim modelom, za določitev koncentracije brez opaznega učinka (NOEC) in najnižje koncentracije z opaznim učinkom (LOEC) pa s preskušanjem statističnih domnev. | 5. | V poglavju C.27 te priloge, ‚Preskus strupenosti s trzačami v sistemu vode in usedline z uporabo usedline s primešano preskusno snovjo‘ (6) je veliko ključnih in uporabnih podrobnosti za izvedbo predstavljene metode preskusa strupenosti usedline. Zato ta dokument služi kot osnova, na podlagi katere so bile izdelane spremembe, potrebne za izvajanje preskusov strupenosti z uporabo usedline z vrsto Lumbriculus variegatus. Nadaljnji dokumenti, ki so navedeni, so npr. Standardne smernice ASTM za določanje bioakumulacije z usedlinami povezanih onesnaževal v bentoških nevretenčarjih (3), Metode US EPA za merjenje strupenosti in bioakumulacije z usedlinami povezanih onesnaževal v sladkovodnih nevretenčarjih (7) in Standardne smernice ASTM za zbiranje, shranjevanje, določanje lastnosti in postopke ravnanja z usedlinami za toksikološko preskušanje ter izbiro vzorčevalnikov, uporabljenih za zbiranje bentoških nevretenčarjev (12). Poleg tega so pomembni viri informacij za sestavljanje tega dokumenta tudi praktične izkušnje, pridobljene med krožnim preskušanjem preskusne metode ((13), poročilo o krožnem preskusu), in podrobnosti iz literature. | OSNOVNI POGOJI IN NAPOTKI | 6. | Pred začetkom študije je treba pridobiti informacije o preskusni kemikaliji, kot so varnostni ukrepi, ustrezni pogoji shranjevanja in analitske metode. Smernice za preskušanje kemikalij s fizikalno-kemijskimi lastnostmi, zaradi katerih je preskušanje oteženo, so navedene v (14). | 7. | Pred izvedbo preskusa morajo biti znane naslednje informacije o preskusni kemikaliji: | — | splošno ime, kemijsko ime (po možnosti ime IUPAC), strukturna formula, registrska številka CAS, čistost, | — | parni tlak, | — | topnost v vodi. | 8. | Pred začetkom preskusa za koristne veljajo tudi naslednje dodatne informacije: | — | porazdelitveni koeficient oktanol/voda, Kow, | — | porazdelitveni koeficient organski ogljik/voda, izražen z vrednostjo Koc, | — | hidroliza, | — | fototransformacija v vodi, | — | biorazgradljivost, | — | površinska napetost. | 9. | Informacije o določenih lastnostih usedline, ki bodo uporabljene, je treba pridobiti pred začetkom preskusa (7). Za podrobnosti glej odstavke od 22 do 25. | NAČELO PRESKUSA | 10. | Črvi v podobnem fiziološkem stanju (sinhronizirani, kot je opisano v Dodatku 5) se izpostavijo seriji koncentracij strupene snovi, nanesene na fazo usedline sistema vode in usedline. Kot medij morata biti uporabljeni umetna usedlina in modelna razredčevalna voda. Kot kontrole služijo preskusne posode brez dodatka preskusne kemikalije. Preskusna kemikalija se primeša v usedlino v celoti za vsako raven koncentracije, da se kar najbolj zmanjša variabilnost med ponovitvami vsake ravni koncentracije, preskusni organizmi pa se nato vnesejo v preskusne posode, v katerih so koncentracije usedline in vode uravnotežene (glej odstavek 29). Preskusne živali se za 28 dni izpostavijo sistemu vode in usedline. Z vidika nizke vsebnosti hranil umetne usedline je treba usedlino dopolniti z virom hrane (glej odstavka 22 in 23 ter Dodatek 4), da se zagotovita rast in razmnoževanje črvov v kontroliranih pogojih. Na ta način je zagotovljeno, da so preskusne živali izpostavljene prek vode in usedline, pa tudi prek hrane. | 11. | Najprimernejša končna točka te vrste študije je vrednost ECx (npr. EC50, EC25 in EC10; učinkovita koncentracija, ki vpliva na x % preskusnih organizmov) za razmnoževanje oziroma biomaso v primerjavi s kontrolo. Vendar je treba opozoriti, da vrednost EC50 zaradi visoke negotovosti nizke vrednosti ECx (npr. EC10, EC25) z zelo visokimi 95-odstotnimi mejami zaupanja (npr. (15)) in statistične moči, izračunane med preskušanjem domnev, velja za najbolj robustno končno točko. Poleg tega se lahko izračunata koncentracija brez opaznega učinka (NOEC) in najnižja koncentracije z opaženim učinkom (LOEC) za biomaso in razmnoževanje, če načrt preskusa in podatki podpirajo te izračune (glej odstavke od 34 do 38). Načrt preskusa bo določen z namenom študije, izpeljavo vrednosti EC × ali NOEC. | REFERENČNO PRESKUŠANJE | 12. | Pričakovati je, da bo delovanje kontrolnih organizmov v zadostni meri dokazalo sposobnost laboratorija za izvedbo preskusa in, če so na voljo historični podatki, ponovljivost preskusa. Poleg tega se lahko v rednih časovnih razmikih izvedejo referenčni preskusi strupenosti z referenčno strupeno snovjo za oceno občutljivosti preskusnih organizmov. Referenčni preskusi strupenosti, ki trajajo 96 ur in potekajo samo v vodi, lahko zadovoljijo dokažejo občutljivost in stanje preskusnih živali (4)(7). Informacije o strupenosti pentaklorofenola (PCP) v popolnih preskusih (pri 28-dnevni izpostavljenosti usedlini, ki ji je primešana preskusna kemikalija) so vključene v Dodatek 6 in v poročilo o krožnem preskusu preskusne metode (13). Akutna strupenost PCP, ki velja le za vodo, je npr. opisana v (16). Te informacije je mogoče uporabiti za primerjavo občutljivosti preskusnega organizma v referenčnih preskusih s PCP kot referenčno strupeno snovjo. Pri vrsti L. variegatus se kot referenčna strupena snov priporoča kalijev klorid (KCl) ali bakrov sulfat (CuSO4) (4)(7). Doslej je bilo določanje meril kakovosti na osnovi podatkov o strupenosti za KCl težavno zaradi pomanjkanja podatkov o vrsti L. variegatus v literaturi. Informacije o strupenosti bakra za vrsto L. variegatus je mogoče najti v virih od (17) do (21). | VELJAVNOST PRESKUSA | 13. | Za veljavnost preskusa morajo biti izpolnjene naslednje zahteve: | — | krožni preskus (13) je dokazal, da se mora pri vrsti Lumbriculus variegatus povprečno število živih črvov na ponovitev v kontrolah na koncu izpostavljenosti v primerjavi s črvi na ponovitev na začetku izpostavljenosti povečati za faktor, ki znaša vsaj 1,8, | — | vrednost pH vode nad usedlino mora biti ves čas preskusa med 6 in 9, | — | koncentracija kisika v vodi nad usedlino med preskusom ne sme znašati manj kot 30 % nasičenosti zraka (air saturation value – ASV) pri preskusni temperaturi. | OPIS PRESKUSNE METODE | Preskusni sistem | 14. | Priporočajo se statični sistemi brez obnavljanja vode nad usedlino. Če je razmerje vode in usedline (glej odstavek 15) ustrezno, bo rahlo prezračevanje običajno zadoščalo za vzdrževanje količine vode na sprejemljivi ravni za preskusne organizme (ravni raztopljenega kisika npr. kar najbolj povečajte, kopičenje produktov izločanja pa kar najbolj zmanjšajte). Polstatične ali pretočne sisteme z občasnim ali kontinuiranim obnavljanjem vode nad usedlino je mogoče uporabiti le v izjemnih primerih, saj je pričakovati, da redno obnavljanje vode nad usedlino vpliva na kemijsko ravnotežje (npr. na izgube preskusne kemikalije iz preskusnega sistema). | Preskusne posode in naprave | 15. | Izpostavljanje mora potekati v steklenih čašah s prostornino npr. 250 ml in premerom 6 cm. Uporabljajo se lahko tudi druge posode, vendar morajo zagotavljati primerno globino usedline in vode nad njo. Vsaka posoda mora sprejeti plast formulirane usedline, debelo približno 1,5–3 cm. Razmerje med debelino usedline in globino vode nad njo mora biti 1: 4. Posode morajo imeti primerno prostornino, ki ustreza stopnji obremenitve, tj. s številom dodanih preskusnih črvov na enoto usedline (glej tudi odstavek 39). | 16. | Preskusne posode in druge naprave, ki bodo prišle v stik s preskusnimi kemikalijami, morajo biti v celoti steklene ali iz drugega kemijsko inertnega materiala. Pri vseh delih opreme se je treba izogibati uporabi materialov, ki se lahko raztopijo, adsorbirajo preskusno kemikalijo ali iz katerih se lahko izlužijo druge kemikalije in ki škodljivo učinkujejo na preskusne živali. Pri vsej opremi, ki ima stik s preskusnim medijem, je treba uporabiti politetrafluoroetilen (PTFE), nerjavno jeklo in/ali steklo. Za organske kemikalije, za katere je znano, da se adsorbirajo na steklo, se lahko zahteva silanizirano steklo. V teh primerih je treba opremo po uporabi zavreči. | Preskusne vrste | 17. | Preskusna vrsta, uporabljena v tej vrsti študije, je sladkovodni maloščetinec Lumbriculus variegatus (Müller). Ta vrsta prenese veliko različnih usedlin ter se pogosto uporablja za preskušanje strupenosti usedlin in bioakumulacije (npr. (3), (5), (7), (9), (13), (15), (16), (22), (23), (24), (25), (26), (27), (28), (29), (30), (31), (32), (33), (34), (35)). Treba je poročati o izvoru preskusnih živali, potrditvi identitete vrste (npr. (36)), pa tudi o pogojih gojenja. Če organizmi prihajajo iz internega gojišča, identifikacija vrst pred preskusom ni potrebna. | Gojenje preskusnih organizmov | 18. | Za zagotavljanje zadostnega števila črvov za izvajanje preskusov strupenosti usedlin je črve priročno stalno gojiti v laboratoriju. Smernice za metode gojenja vrste Lumbriculus variegatus v laboratoriju in viri začetnih kultur so podani v Dodatku 5. Za podrobnosti o gojenju te vrste glejte vire (3), (7), (27). | 19. | Za zagotovitev, da se preskusi izvajajo z živalmi iste vrste, je močno priporočljiva priprava kulture ene same vrste. Poskrbite, da kulture in še posebej črvi, uporabljeni v preskusih, ne bodo imeli vidnih bolezni in anomalij. | Voda | 20. | Za uporabo v preskusih je kot voda nad usedlino priporočljiva modelna razredčevalna voda v skladu s poglavjem C.1 te priloge (37); mogoče jo je uporabljati tudi za laboratorijske kulture črvov (za pripravo glej Dodatek 2). Po potrebi je mogoče uporabiti naravno vodo. Izbrana voda mora biti take kakovosti, ki omogoča rast in razmnoževanje preskusnih organizmov med aklimatizacijo in preskušanjem, ne da bi bili pri tem videti nenormalno ali bi se nenormalno vedli. Dokazano je, da vrsta Lumbriculus variegatus v tej vrsti vode preživi, raste in se razmnožuje (30), omogočena pa je tudi kar največja standardizacija preskusnih pogojev in pogojev gojenja. Če se uporablja rekonstituirana voda, je treba poročati o njeni sestavi, pred uporabo pa je treba določiti njene lastnosti, vsaj vrednost pH, vsebnost kisika in trdoto (izraženo v mg CaCO3/l). Uporabne informacije lahko prispeva tudi analiza vode pred uporabo glede na mikro onesnaževala (glej, npr., Dodatek 3). | 21. | Vrednost pH vode nad usedlino mora biti v območju od 6,0 do 9,0 (glej odstavek 13). Če je pričakovan povečan razvoj amonijaka, velja za uporabno, da se vrednost pH vzdržuje med 6,0 in 8,0. Za preskušanje npr. šibkih organskih kislin je priporočljivo uravnati vrednost pH z dodajanjem pufra vodi, ki bo uporabljena v preskusu, kot je opisano npr. v (16). Skupna trdota vode, uporabljene v preskusu, mora biti za naravno vodo med 90 in 300 mg CaCO3 na liter. V Dodatku 3 so povzeta dodatna merila za sprejemljivo vodo za redčenje v skladu s Smernico za preskušanje OECD št. 210 (38). | Usedlina | 22. | Ker nekontaminirane naravne usedline iz določenega vira niso nujno na voljo vse leto in ker lahko domorodni organizmi in prisotna mikroonesnaževala vplivajo na preskus, je treba po možnosti uporabljati formulirano usedlino (imenovano tudi rekonstituirana, umetna ali sintetična usedlina). Uporaba formulirane usedline kar najbolj zmanjša variabilnost preskusnih pogojev in vnos domorodnih živali. Naslednja formulirana usedlina temelji na umetni usedlini v skladu s (6), (39) in (40). Priporočena je za uporabo v tej vrsti preskusa ((6), (10), (30), (41), (42), (43)): | (a) | 4–5 % šotnega mahu (suha teža); pomembno je uporabiti šoto v obliki prahu, stopnja razpada: ‚srednja‘, fino mleto (velikost delcev ≤ 0,5 mm) in posušeno samo na zraku; | (b) | 20 ± 1 % kaolinske gline (suha teža) (vsebnost kaolinita po možnosti nad 30 %); | (c) | 75–76 % kremenovega peska (suha teža) (fin pesek, velikost zrn: ≤ 2 mm, vendar mora > 50 % delcev meriti med 50 in 200 μm); | (d) | deionizirana voda, 30–50 % suhe teže usedline poleg sestavnih delov suhe usedline; | (e) | kemijsko čist kalcijev karbonat (CaCO3) za uravnavo vrednosti pH v končni mešanici; | (f) | skupna vsebnost organskega ogljika v končni mešanici mora biti 2 % (± 0,5 %) suhe teže usedline, uravnava pa se z ustreznimi količinami šote in peska v skladu s točkama (a) in (c); | (g) | hrana, npr. uprašeni listi velike koprive (vrsta Urtica, v skladu s farmacevtskimi standardi, za prehrano ljudi) ali zmes uprašenih listov vrste Urtica in alfa celuloze (v razmerju 1: 1), pri 0,4–0,5 % suhe teže usedline poleg sestavnih delov suhe usedline; za podrobnosti glej Dodatek 4. | 23. | Vir šote, kaolinske gline, hrane in peska mora biti znan. Poleg točke g) je v poglavju C.27 te priloge (6) naštet alternativni rastlinski material, ki bo uporabljen kot vir prehrane: posušeni listi bele murve (Morus alba), plazeče detelje (Trifolium repens), špinače (Spinacia oleracea) ali žitne trave. | 24. | Izbrani vir hrane mora biti dodan pred primešanjem preskusne kemikalije usedlini ali med njim. Izbrani vir hrane mora v kontrolah omogočati vsaj še sprejemljivo razmnoževanje. Analiza umetne usedline ali njenih sestavin glede mikro onesnaževal pred uporabo bi lahko dala koristne informacije. Primer priprave formulirane usedline je opisan v Dodatku 4. Sprejemljiva je tudi mešanica suhih sestavin, če se dokaže, da se sestavine usedline po dodatku vode nad usedlino ne začnejo ločevati (da npr. šotni delci ne lebdijo) in da je šota ali usedlina zadostno kondicionirana (glej tudi odstavek 25 in Dodatek 4). Lastnosti umetne usedline morajo biti določene vsaj z virom sestavin, porazdelitvijo zrn glede na velikost (odstotkom peska, mulja in gline), skupno vsebnostjo organskega ogljika, vsebnostjo vode in vrednostjo pH. Merjenje redoks potenciala je neobvezno. | 25. | Po potrebi, npr. za posebne namene preskušanja, lahko kot preskusna in/ali gojitvena usedlina služijo tudi naravne usedline z nekontaminiranih mest (3). Vendar pa je treba naravni usedlini, če bo uporabljena, določiti značilnosti vsaj glede izvora (mesta zbiranja), vrednosti pH in amonijaka porne vode, skupne vsebnosti organskega ogljika (TOC) in vsebnosti dušika, porazdelitve delcev glede na velikost (odstotka peska, mulja in gline) in deleža vsebnosti vode (7), biti pa mora tudi nekontaminirana in ne sme vsebovati nobenih drugih organizmov, ki bi lahko tekmovali s preskusnimi ali jih plenili. Meritev redoks potenciala in sposobnosti izmenjave kationov je neobvezna. Prav tako se priporoča, naj se naravna usedlina pred primešanjem preskusne kemikalije sedem dni kondicionira v enakih pogojih, kakršni vladajo v poznejšem preskusu. Ob koncu tega obdobja kondicioniranja je treba vodo nad usedlino odstraniti in zavreči. | 26. | Voda, ki bo uporabljena, mora biti take kakovosti, ki omogoča preživetje in razmnoževanje kontrolnih organizmov med obdobjem izpostavljenosti, ne da bi bili pri tem videti nenormalno ali bi se nenormalno vedli. Kontrolni črvi se morajo zakopati v usedlino in jo uživati. Razmnoževanje v kontrolah mora biti vsaj takšno, kot ga določa merilo za veljavnost, opisano v odstavku 13. Prisotnost ali odsotnost iztrebkov na površini usedline, ki kaže, da črvi uživajo usedlino, mora biti zabeležena in lahko pomaga pri razlagi rezultatov preskusa v zvezi s potmi izpostavljenosti. Dodatne informacije o uživanju usedline je mogoče pridobiti z uporabo metod, opisanih v (24), (25), (44) in (45), ki podrobno opisujejo uživanje usedline ali izbiro delcev pri preskusnih organizmih. | 27. | Postopki ravnanja z naravnimi usedlinami pred uporabo v laboratoriju so opisani v (3), (7) in (12). Priprava in shranjevanje umetne usedline, priporočene za uporabo v preskusu z vrsto Lumbriculus, je opisana v Dodatku 4. | Uporaba preskusne kemikalije | 28. | Preskusna kemikalija se primeša usedlini. Ker se pričakuje, da je večina preskusnih kemikalij slabo topna v vodi, jih je za pripravo založne raztopine treba raztopiti v primernem organskem topilu (npr. acetonu, n-heksanu, cikloheksanu) v čim manjši količini. Založna raztopina mora biti za pripravo preskusnih raztopin razredčena z enakim topilom. Strupenost in hlapnost topila ter topnost preskusne kemikalije v izbranem topilu bi morale biti glavna merila za izbiro primernega sredstva za raztapljanje. Za vsako raven koncentracije mora biti uporabljena enaka količina ustrezne raztopine. Preskusna kemikalija se primeša v usedlino v celoti za vsako raven koncentracije, da se kar najbolj zmanjša variabilnost med ponovitvami vsake ravni koncentracije preskusne kemikalije. Vsaka od preskusnih raztopin se nato zmeša s kremenovim peskom, kot je opisano v odstavku 22 (npr. 10 g kremenovega peska na preskusno posodo). Ugotovljeno je, da količina 0,20–0,25 ml na gram peska zadošča za to, da je kremenov pesek v celoti namočen. Nato morajo topila izhlapeti do suhega stanja. Za kar najmanjše izgube preskusne kemikalije zaradi hkratnega izhlapevanja (npr. odvisnega od parnega tlaka kemikalije) mora biti prevlečeni pesek uporabljen takoj po sušenju. Suhi pesek se zmeša s primerno količino formulirane usedline z ustrezno ravnjo koncentracije. Upoštevati je treba količino peska, prinesenega z mešanico preskusne kemikalije in peska (usedlino je torej treba pripraviti z manj peska). Glavna prednost tega postopka je, da v usedlino ni vnesenega skoraj nič topila (7). Namesto tega se lahko, npr. pri naravni usedlini, preskusna kemikalija doda s primešanjem posušenega in fino zmletega dela usedline, kot je zgoraj opisano za kremenov pesek, ali pa z vmešanjem preskusne kemikalije v vlažno usedlino, pri čemer nato kakršno koli uporabljeno sredstvo za raztapljanje izhlapi. Paziti je treba, da je preskusna kemikalija, dodana usedlini, v njej temeljito in enakomerno razporejena. Po potrebi je mogoče za potrditev ciljnih koncentracij v usedlini in določanje stopnje homogenosti analizirati podvzorce. Za potrditev ciljnih koncentracij v usedlini je lahko uporabna tudi analiza podvzorcev preskusnih raztopin. Ker je za prevlečenje kremenovega peska s preskusno kemikalijo uporabljeno topilo, je treba uporabiti kontrolo s topilom, pripravljeno z enako količino topila, kot je uporabljena pri preskusnih usedlinah. Poročati je treba o metodah, uporabljenih za primešanje, in razlogih za izbiro določenega postopka primešanja, ki ni enak zgoraj opisanemu. Metode primešanja je mogoče prilagoditi fizikalno-kemijskim lastnostim preskusne kemikalije, npr. za preprečevanje izgub zaradi izhlapevanja med primeševanjem ali uravnoteževanjem. Dodatne smernice o postopkih primešanja so podane v Environment Canada (1995) (46). | 29. | Ko je usedlina s primešano preskusno kemikalijo pripravljena, porazdeljena v ponovitvene preskusne posode in je vanjo dotočena preskusna voda, je zaželeno, da se omogoči porazdelitev preskusne kemikalije iz usedline v vodno fazo (npr. (3)(7)(9)). To je po možnosti treba storiti v temperaturnih in prezračevalnih pogojih, ki bodo uporabljeni v preskusu. Ustrezen čas za uravnoteženje je odvisen od značilnosti usedline in kemikalije, lahko pa traja od več ur do več dni in v redkih primerih do več tednov (4–5 tednov) (npr. (27)(47)). V tem preskusu se ne čaka na uravnoteženje, temveč se za to priporoča obdobje od 48 ur do 7 dni. Tako bo čas za razgradnjo preskusne kemikalije najkrajši. Usedlino s primešano preskusno kemikalijo je, odvisno od namena študije, npr. če je treba posnemati okoljske pogoje, mogoče uravnoteževati ali starati preko daljšega obdobja. | 30. | Ob koncu obdobja za uravnoteženje je treba vzeti vsaj vzorce vode nad usedlino in glavnine usedline za analizo koncentracije preskusne kemikalije ter vsaj pri najvišji koncentraciji in nižji koncentraciji. Te analitske določitve preskusne kemikalije morajo omogočati izračun masne bilance in izražanje rezultatov na podlagi izmerjenih začetnih koncentracij. V splošnem vzorčenje moti ali uniči sistem vode in usedline. Zato navadno ni mogoče uporabiti istih ponovitev za vzorčenje usedlin in črvov. Pripraviti je treba dodatne ‚analitske‘ posode, ki bodo obdelane na enak način (vključno s prisotnostjo preskusnih organizmov), vendar se ne bodo uporabile za biološka opazovanja. Dimenzije posod je treba izbrati tako, da bodo omogočale količine vzorcev, ki jih zahteva analitska metoda. Podrobnosti vzorčenja so navedene v odstavku 53. | IZVEDBA PRESKUSA | Predhodni preskus | 31. | Če informacije strupenosti preskusne kemikalije za vrsto Lumbriculus variegatus niso na voljo, je lahko koristna izvedba predhodnega preskusa za določanje območja koncentracij, ki bodo preskušene v dokončnem preskusu, in za optimizacijo preskusnih pogojev dokončnega preskusa. Za ta namen se uporabi niz široko razmaknjenih koncentracij preskusne kemikalije. Črvi so izpostavljeni vsaki koncentraciji preskusne kemikalije v obdobju (npr. 28 dni, kot v dokončnem preskusu), ki omogoča oceno ustreznih preskusnih koncentracij; ponovitve niso zahtevane. Med predhodnim preskusom je treba opazovati in beležiti vedenje črvov, na primer izogibanje usedlini, ki bi ga lahko povzročila preskusna kemikalija in/ali usedlina. V predhodnem preskusu ne smejo biti preskušene koncentracije, višje od 1 000 mg/kg suhe teže usedline. | Dokončni preskus | 32. | V dokončnem preskusu mora biti uporabljenih in izbranih vsaj pet koncentracij, npr. na podlagi rezultata predhodnega preskusa za določanje območja delovanja (odstavek 31), in kot je opisano v odstavkih 35, 36, 37 in 38. | 33. | Poleg preskusne serije je treba izvesti še kontrolo (za ponovitve glej odstavke 36, 37 in 38), ki vsebuje vse sestavine, razen preskusne kemikalije. Če se za uporabo preskusne kemikalije uporablja kakršno koli sredstvo za raztapljanje, to ne sme imeti pomembnega vpliva na preskusne organizme, kar pokaže dodatna kontrola, v kateri je samo topilo. | Načrt preskusa | 34. | Načrt preskusa se nanaša na izbiro števila preskusnih koncentracij in razmikov med njimi, število posod za vsako koncentracijo in število dodanih črvov na posodo. Načrti za oceno vrednosti ECx in NOEC ter izvedbo mejnega preskusa so opisani v odstavkih 35, 36, 37 in 38. | 35. | S koncentracijami, vključenimi v preskus, bi morala biti zajeta koncentracija z učinkom (npr. EC50, EC25, EC10) in razpon koncentracije, v katerem je zanimiv vpliv preskusne snovi. Izogibati se je treba ekstrapolaciji veliko pod najnižjo koncentracijo, ki vpliva na preskusne organizme, ali veliko nad najvišjo preskušano koncentracijo. Če je – v izjemnih primerih – takšna ekstrapolacija izvedena, mora biti v poročilu to podrobno pojasnjeno. | 36. | Če je treba oceniti vrednost ECx, je treba preskusiti vsaj pet koncentracij in najmanj tri ponovitve za vsako koncentracijo; za kontrolo ali kontrolo s topilom, če se uporablja, se za izboljšanje ocene variabilnosti kontrole priporoča šest ponovitev. Vsekakor je priporočljivo uporabiti dovolj preskusnih koncentracij, da se omogoči dobra ocena modela. Faktor med koncentracijami ne sme biti večji od dve (izjema je dopustna, kadar je naklon krivulje koncentracija-odziv majhen). Število ponovitev na posamezno tretirano skupino se lahko zmanjša, če se poveča število preskusnih koncentracij v razponu 5–95 %. Povečanje števila ponovitev ali zmanjšanje velikosti razmikov med preskusnimi koncentracijami običajno vodi do ožjih intervalov zaupanja za preskus. | 37. | Če je treba oceniti vrednosti LOEC/NOEC, je treba uporabiti vsaj pet preskusnih koncentracij z vsaj štirimi ponovitvami (za kontrolo ali kontrolo s topilom, če se uporablja, se za izboljšanje ocene variabilnosti kontrole priporoča šest ponovitev), faktor med koncentracijami pa ne sme biti večji od dve. Nekatere informacije o statistični moči, ugotovljene med preskušanjem domnev v krožnem preskusu preskusne metode so podane v Dodatku 6. | 38. | Lahko se opravi mejni preskus (z uporabo ene preskusne koncentracije in kontrol), če do 1 000 mg/kg suhe teže usedline ni pričakovati nobenih učinkov (npr. iz preskusa določanja območja delovanja) ali če bo preskušanje ene same koncentracije dovolj za potrditev zadevne vrednosti NOEC. V slednjem primeru je treba v poročilo o preskusu vključiti podrobno utemeljitev za izbiro mejne koncentracije. Namen mejnega preskusa je izvesti preskus pri dovolj visoki koncentraciji, da lahko nosilci odločanja izključijo mogoče strupene učinke preskusne kemikalije, meja pa je določena pri koncentraciji, za katero ni pričakovati, da bi se pojavila v katerem koli primeru. Priporočenih je 1 000 mg/kg (suhe teže). Običajno je potrebnih vsaj šest ponovitev za tretirane skupine in kontrole. Nekatere informacije o statistični moči, ugotovljene med preskušanjem domnev v krožnem preskusu preskusne metode, so podane v Dodatku 6. | Pogoji izpostavljenosti | Preskusni organizmi | 39. | Preskus se izvede z vsaj 10 črvi za vsako ponovitev, uporabljeno za določanje bioloških parametrov. To število črvov ustreza približno 50– 100 mg mokre biomase. S predpostavko, da vsebnost suhe snovi znaša 17,1 % (48), to pomeni približno 9– 17 mg suhe biomase na posodo. V metodah US EPA (2000 (7)) je priporočena uporaba stopnje obremenitve, ki ne presega 1: 50 (suha biomasa: skupni organski ogljik). Za formulirano usedlino, opisano v odstavku 22, to ustreza približno 43 g usedline (suhe teže) na 10 črvov pri vsebnosti skupnega organskega ogljika, ki znaša 2,0 % suhe usedline. V primerih, ko je na posodo uporabljenih več kot 10 črvov, je treba ustrezno prilagoditi količino usedline in vode nad njo. | 40. | Vsi črvi, uporabljeni v preskusu, morajo prihajati iz istega vira in biti v enakem fiziološkem stanju (glej Dodatek 5). Izbrati je treba črve podobnih velikosti (glej odstavek 39). Priporočeno je, da se podvzorci serije ali zaloge črvov pred preskusom stehtajo, da se tako oceni srednja teža. | 41. | Črvi, ki bodo uporabljeni v preskusu, se odstranijo iz kulture (za podrobnosti glej Dodatek 5). Velike (odrasle) živali, ki ne kažejo znakov nedavne fragmentacije, se prenesejo v steklene posode (npr. petrijevke), ki vsebujejo čisto vodo. Nato se sinhronizirajo, kot je opisano v Dodatku 5. Po obnavljanju, ki traja od 10 do 14 dni, se za preskus uporabijo nepoškodovani, celi črvi podobne velikosti, ki po nežnem mehanskem dražljaju dejavno plavajo ali se plazijo. Če se preskusni pogoji razlikujejo od pogojev gojenja (npr. v temperaturi, režimu osvetljenosti in vodi nad usedlino), bi morala faza aklimatizacije, ki traja npr. 24 ur pri enaki temperaturi, režimu osvetljenosti in vodi nad usedlino, kot so uporabljeni v preskusu, zadoščati za prilagoditev črvov preskusnim pogojem. Prilagojene maloščetince je treba naključno dodeliti preskusnim posodam. | Hranjenje | 42. | Ker se hrana usedlini doda pred (ali med) vnosom preskusne kemikalije, se črvi med preskusom ne hrani še dodatno. | Svetloba in temperatura | 43. | Obdobje osvetljenosti v kulturi in preskusu običajno traja 16 ur (3), (7). Jakost svetlobe mora ostati nizka (npr. 100–500 lx), da se posnema naravne pogoje na površini usedline, izmeriti pa jo je treba vsaj enkrat med obdobjem izpostavljenosti. Temperatura mora biti ves čas preskusa 20 ± 2 °C. Na določen dani datum merjenja razlika v temperaturi med preskusnimi posodami ne sme presegati ± 1 °C. Preskusne posode je treba postaviti v preskusni inkubator ali preskusno območje naključno, da se npr. kar najbolj zmanjša vpliv mesta posode na razmnoževanje. | Prepihovanje | 44. | Vodo nad usedlino v preskusnih posodah je treba rahlo prepihovati (npr. z 2–4 mehurčki na sekundo) prek Pasteurjeve pipete, postavljene približno 2 cm nad površino usedline, da se usedlino čim manj vznemirja. Treba je paziti, da koncentracija raztopljenega kisika ne pade pod 30 % nasičenosti zraka (ASV). Dovod zraka je treba nadzirati in po potrebi vsaj enkrat na dan ob delavnikih prilagoditi. | Meritve kakovosti vode | 45. | V vodi nad usedlino je treba meriti naslednje parametre kakovosti: | Temperatura: | vsaj v eni preskusni posodi vsake ravni koncentracije in eni preskusni posodi kontrol enkrat na teden ter na začetku in koncu obdobja izpostavljenosti; po možnosti se lahko dodatno, npr. v enournih časovnih razmikih, izmeri temperatura okoliškega medija (zraka ali vodne kopeli). | Koncentracija raztopljenega kisika: | vsaj v eni preskusni posodi vsake ravni koncentracije in eni preskusni posodi kontrol enkrat na teden ter na začetku in koncu obdobja izpostavljenosti; izražena v mg/l in % ASV (nasičenosti zraka). | Dovod zraka: | treba ga je nadzirati in ga po potrebi vsaj enkrat na dan ob delavnikih prilagoditi. | Vrednost pH: | vsaj v eni preskusni posodi vsake ravni koncentracije in eni preskusni posodi kontrol enkrat na teden ter na začetku in koncu obdobja izpostavljenosti. | Skupna trdota vode: | vsaj v eni ponovitvi kontrol in eni preskusni posodi pri najvišji koncentraciji na začetku in koncu obdobja izpostavljenosti; izražena v mg/l CaCO3. | Skupna vsebnost amonijaka: | vsaj v eni ponovitvi kontrol in eni preskusni posodi vsake ravni koncentracije na začetku obdobja izpostavljenosti in nato trikrat na teden; izražena v mg/l NH4 + ali NH3 ali skupnega amonijaka-N. | Če je treba zaradi merjenja parametrov kakovosti vode iz posod odstraniti vzorce znatne količine vode, je za merjenje kakovosti vode priporočljivo pripraviti ločene posode, da se razmerje količine vode in usedline ne spremeni. | Biološka opazovanja | 46. | Med izpostavljenostjo je treba preskusne posode opazovati, da se vizualno ocenijo morebitne spremembe vedenja pri črvih (npr. izogibanje usedlini, iztrebke, vidne na površini usedline) v primerjavi s kontrolami. Opažanja je treba zabeležiti. | 47. | Ob koncu preskusa se vsaka ponovitev pregleda (dodatne posode, namenjene za kemijske analize, se lahko izključijo iz pregleda). Za odstranitev vseh črvov iz preskusne posode je treba uporabiti primerno metodo. Poskrbeti je treba, da so vsi odstranjeni črvi nepoškodovani. Ena možna metoda je presejanje črvov iz usedline. Uporabiti je mogoče mrežo iz nerjavnega jekla s primerno velikostjo odprtin. Večino vode nad usedlino se skrbno odlije, preostalo usedlino in vodo pa se stresa, da nastane blato, ki ga je mogoče presejati skozi sito. Z mrežo velikosti 500 μm večina delcev usedline zelo hitro preide skozi sito, vendar je treba presejanje izvesti hitro, da se črvi ne splazijo v mrežo ali skoznjo. Mreža velikosti 250 μm bo črvom preprečila, da bi se splazili vanjo ali skoznjo, vendar je treba paziti, da na mreži ostane kar najmanj delcev usedline. Presejano blato vsake ponovitvene posode je mogoče drugič presejati, da se zagotovo odstranijo vsi črvi. Alternativna metoda je lahko ogrevanje usedline s postavitvijo preskusnih posod v vodno kopel s temperaturo 50–60 °C; črvi zapustijo usedlino in jih je mogoče z njene površine zbrati z vroče polirano široko pipeto. Druga alternativna metoda je lahko pridobivanje blata usedline in zlivanje tega blata v plitvo ponev primerne velikosti. Iz plitve plasti blata je mogoče črve pobrati z jekleno iglo ali urarsko pinceto (ki se po možnosti uporablja kot vilice in ne kot klešče, da se črvi ne poškodujejo) in jih prenesti v čisto vodo. Po ločitvi črvov iz blata usedline se črvi operejo v preskusnem mediju in preštejejo. | 48. | Neodvisno od uporabljene metode morajo laboratoriji dokazati, da je njihovo osebje iz celotne usedline sposobno odstraniti vsaj 90 % organizmov. Določeno število preskusnih organizmov je, na primer, mogoče dodati kontrolni usedlini ali preskusnim usedlinam, stopnjo odstranitve pa je mogoče določiti po eni uri (7). | 49. | Zabeležiti in oceniti je treba skupno število živih in mrtvih osebkov na ponovitev. Za mrtve veljajo naslednje skupine črvov: | (a) | po nežnem mehanskem dražljaju ni nobene reakcije; | (b) | prisotni so znaki razkrajanja (v kombinaciji s točko ‚a‘); | (c) | pogrešani črvi. | Poleg tega je mogoče žive črve dodeliti eni od treh skupin: | (a) | veliki celi črvi (odrasli osebki) brez obnovljenih predelov telesa; | (b) | celi črvi z obnovljenimi predeli telesa svetlejše barve (tj. z novim zadnjim delom, z novim sprednjim delom ali z novima zadnjim in sprednjim delom); | (c) | neceli črvi (tj. nedavno fragmentirani črvi z neobnovljenimi predeli telesa). | Ta dodatna opažanja niso nujna, mogoče pa jih je uporabiti za dodatno razlago bioloških rezultatov (veliko število črvov, dodeljenih skupini c, lahko, na primer, kaže na zamudo pri razmnoževanju ali obnavljanju v danem tretiranju). Poleg tega je treba zabeležiti tudi morebitne opažene razlike v videzu tretiranih in kontrolnih črvov (npr. lezije povrhnjice, zabuhli deli telesa). | 50. | Takoj po štetju/oceni se živi črvi, najdeni v vsaki ponovitvi, prenesejo v posušene, predhodno stehtane in označene skodelice tehtnice (eno na ponovitev) ter ubijejo s kapljico etanola na skodelico tehtnice. Skodelice tehtnice se nato postavijo v sušilnik pri 100 ± 5 °C, da se čez noč posušijo, potem pa se po ohlajanju v eksikatorju stehtajo in določi se suha teža črvov (po možnosti v gramih in vsaj na 4 decimalke natančno). | 51. | Poleg skupne suhe teže je mogoče določiti suho težo brez pepela, kot je opisano v točki (49), da se upoštevajo anorganske sestavine, ki izvirajo iz zaužite usedline, prisotne v prebavnem traktu črvov. | 52. | Biomasa je določena kot skupna biomasa na ponovitev, vključno z odraslimi in mladimi črvi. Pri določanju biomase na ponovitev mrtvi črvi ne smejo biti upoštevani. | Preverjanje koncentracij preskusne kemikalije | Vzorčenje | 53. | Vzorci za kemijsko analizo preskusne kemikalije morajo biti odvzeti vsaj za najvišjo koncentracijo in eno nižjo, vsaj na koncu faze uravnoteženja (pred dodajanjem preskusnih organizmov) in na koncu preskusa. Za analizo morata biti vzorčeni vsaj glavnina usedline in voda nad usedlino. Vsak dan vzorčenja je treba vzeti vsaj dva vzorca na matriks in tretiranje. Enega od dveh vzorcev je mogoče shraniti kot rezervo (ki bo analizirana, če bo npr. začetna analiza zunaj razpona ± 20 % nominalne koncentracije). Pri specifičnih kemijskih lastnostih, npr. če je pričakovana hitra razgradnja preskusne kemikalije, se lahko časovni razpored analize na podlagi strokovnega mnenja natančneje določi (npr. s pogostejšim vzorčenjem, analizo več ravni koncentracij). Nato se vzorci lahko vzamejo na vmesne dni vzorčenja (npr. sedmi dan po začetku izpostavljenosti). | 54. | Vodo nad usedlino je treba zaradi čim manjšega vznemirjanja usedline vzorčiti tako, da se previdno odlije ali izčrpa. Zabeležiti je treba količino vzorcev. | 55. | Po tem, ko je voda nad usedlino odstranjena, se mora usedlina homogenizirati in prenesti v primerno posodo. Zabeleži se teža mokrega vzorca usedline. | 56. | Če je dodatno potrebna analiza preskusne kemikalije v porni vodi, je treba homogenizirane in stehtane vzorce centrifugirati, da se pridobi porna voda. Približno 200 ml mokre usedline je, na primer, mogoče natočiti v 250-mililitrske centrifugirne čaše. Nato je treba vzorce centrifugirati brez filtracije, da se loči porna voda, npr. pri 10 000 ± 600 × g 30–60 minut pri temperaturi, ki ne presega v preskusu uporabljene temperature. Po centrifugiranju se supernatant odlije ali nakapa s pipeto, pri čemer je treba paziti, da se prepreči vnos delcev, količina pa se zabeleži. Zabeleži se teža peleta preostale usedline. Če je vsak dan vzorčenja določena suha teža usedline, je ocena masne bilance ali obnove preskusne kemikalije v sistemu vode in usedline lažja. V nekaterih primerih koncentracij v porni vodi zaradi premajhnega vzorca morda ne bo mogoče analizirati. | 57. | Če analiza ni takojšnja, je treba vse vzorce shraniti na ustrezen način, npr. pri pogojih shranjevanja, ki so priporočeni za čim manjšo razgradnjo določene preskusne kemikalije (okoljski vzorci se npr. običajno shranjujejo pri – 18 °C v temi). Informacije o pravilnih pogojih shranjevanja za določeno preskusno kemikalijo, na primer trajanju in temperaturi shranjevanja, postopkih ekstrakcije itd., pridobite pred začetkom študije. | Analitska metoda | 58. | Ker so za celoten postopek pomembne točnost, natančnost in občutljivost analitske metode, uporabljene za preskusno kemikalijo, se je treba praktično prepričati, da so natančnost in reproduktivnost kemične analize ter ponovna pridobitev preskusne kemikalije iz vzorcev vode in usedline zadovoljive za določeno metodo vsaj pri najnižjih in najvišjih preskusnih koncentracijah. Prepričajte se tudi, da v kontrolnih komorah ni zaznati preskusne kemikalije v koncentracijah, višjih od meje določljivosti. Po potrebi popravite nominalne koncentracije za ponovno pridobivanje primešane preskusne kemikalije za nadzor kakovosti (npr. kjer je stopnja ponovnega pridobivanja zunaj območja 80– 120 % količine, v kateri je bila primešana preskusna kemikalija). V celotnem preskusu je treba z vsemi vzorci ravnati tako, da se kontaminacija in izguba čim bolj zmanjšata (npr. zaradi adsorpcije preskusne kemikalije na napravo za vzorčenje). | 59. | Zabeležiti je treba stopnjo ponovnega pridobivanja preskusne kemikalije, mejo zaznavnosti in mejo zaznavnosti v usedlini in vodi ter o njih poročati. | PODATKI IN POROČANJE | Obdelava rezultatov | 60. | Glavni obvezni spremenljivki odziva, ki jih je treba v preskusu statistično oceniti, sta biomasa in skupno število črvov na ponovitev. Neobvezno se lahko oceni tudi razmnoževanje (v obliki povečanja števila črvov) in rast (v obliki povečanja suhe biomase). V tem primeru je treba na začetku izpostavljenosti pridobiti oceno suhe teže črvov, npr. z merjenjem suhe teže reprezentativnega podvzorca serije sinhroniziranih črvov, ki bodo uporabljeni v preskusu. | 61. | Čeprav smrtnost ni končna točka tega preskusa, je treba smrtnosti oceniti v čim večji meri. Za oceno smrtnosti morajo črvi, ki ne reagirajo na nežen mehanski dražljaj, ali črvi, ki kažejo znake razkrajanja ter pogrešani črvi veljati za mrtve. Smrtnosti je pri razlagi rezultatov treba vsaj zabeležiti in upoštevati. | 62. | Učinkovite koncentracije morajo biti izražene v mg/kg suhe teže usedline. Če je rekuperacija preskusne kemikalije, merjene v usedlini ali v usedlini in vodi nad njo ob začetku izpostavljenosti med 80 in 120 % nominalnih koncentracij, je mogoče učinkovite koncentracije (ECx, NOEC, LOEC) izraziti na podlagi nominalnih koncentracij. Če ponovno pridobivanje odstopa od nominalnih koncentracij za več kot ± 20 % vrednosti nominalnih koncentracij, morajo učinkovite koncentracije (ECx, NOEC, LOEC) temeljiti na prvotno izmerjenih koncentracijah na začetku izpostavljenosti, npr. upoštevati morajo masno bilanco preskusne kemikalije v preskusnem sistemu (glej odstavek 30). V teh primerih je mogoče dodatne informacije za potrditev, da so bile preskusne usedline pravilno pripravljene, pridobiti iz analize založnih raztopin in/ali uporabljenih raztopin. | ECx | 63. | Vrednosti ECx za parametre, opisane v odstavku 60, se izračunajo z ustreznimi statističnimi metodami (npr. z analizo probit, logistično ali Weibullovo funkcijo, prilagojeno metodo Spearman-Karber ali enostavno interpolacijo). Navodila za statistično ocenjevanje so navedena v (15) in (50). Vrednost ECx je pridobljena tako, da je v navedeno enačbo vstavljena vrednost, ki ustreza x % srednje vrednosti kontrole. Za izračun vrednosti EC50 ali katere koli druge vrednosti ECx je treba srednjo vrednost glede na tretirano skupino ( ) analizirati z regresijsko analizo. | NOEC/LOEC | 64. | Če je statistična analiza namenjena določanju vrednosti NOEC/LOEC, je potrebna statistika glede na posodo (posamezne posode se štejejo za ponovitve). Uporabljene morajo biti ustrezne statistične metode. V splošnem se s pomočjo enostransko zastavljenega (manj obsežnega) preskušanja domnev pri p ≤ 0,05 proučijo škodljivi učinki preskusne snovi v primerjavi s kontrolo. Primeri so podani v naslednjih odstavkih. Navodila za izbiro ustreznih statističnih metod so navedena v (15) in (50). | 65. | Normalno porazdelitev podatkov je mogoče preskusiti npr. s preskusom ustreznosti prileganja Kolmogorov-Smirnov, preskusom razmerja med variacijskim razmikom in standardnim odklonom (preskusom R/s) ali Shapiro-Wilkovim preskusom (dvostranskim, p ≤ 0,05). Za preskus homogenosti variance se lahko uporabi Cochranov, Levenov ali Bartlettov preskus (dvostranski, p ≤ 0,05). Če so izpolnjeni predpogoji postopkov parametričnega preskusa (normalnosti, homogenosti variance), je mogoče izvesti enofaktorsko analizo variance (enofaktorsko ANOVA) in nato preskuse večkratne primerjave. Za izračun, ali obstajajo značilne razlike (p ≤ 0,05) med kontrolami in različnimi koncentracijami preskusnih snovi, je mogoče uporabiti parne primerjave (npr. Dunnettov t-preskus) ali regresivne trendnostne preskuse (npr. Williamsov preskus). V nasprotnem primeru je treba za določanje vrednosti NOEC in LOEC uporabiti neparametrične metode (npr. Bonferronijev U-preskus v skladu s trendnostnim preskusom po Holmu ali Jonckheere-Terpstraju). | Mejni preskus | 66. | Če je izveden mejni preskus (primerjava kontrole in samo ene tretirane skupine) in če so izpolnjeni predpogoji postopkov parametričnega preskusa (normalnost, homogenost), je mogoče s Studentovim preskusom (t-preskusom) preveriti odzive metrik (skupnega števila črvov in biomase v obliki suhe teže črvov). Če te zahteve niso izpolnjene, je mogoče uporabiti t-preskus za neenake variance (Welchev t-preskus) ali neparametrični preskus, kot je Mann-Whitneyjev U-preskus. Nekatere informacije o statistični moči, ugotovljene med preskušanjem domnev v krožnem preskusu metode, so podane v Dodatku 6. | 67. | Za določanje značilnih razlik med kontrolami (kontrolo in kontrolo s topilom) je mogoče ponovitve vsake kontrole preskusiti, kot je opisano za mejni preskus. Če ti preskusi ne zaznajo značilnih razlik, je mogoče vse ponovitve kontrol in kontrol s topilom združiti. V nasprotnem primeru je treba vse tretirane vzorce primerjati s kontrolo s topilom. | Razlaga rezultatov | 68. | Če je prišlo do odstopanja od te preskusne metode in kadar se izmerjene koncentracije preskusnih koncentracij pojavljajo na ravneh blizu meje zaznavnosti analitične metode, je treba rezultate razlagati previdno. Morebitna odstopanja od te preskusne metode je treba zabeležiti. | Poročilo o preskusu | 69. | Poročilo o preskusu naj vsebuje vsaj naslednje informacije: | — | Preskusna kemikalija: | — | kemijski identifikacijski podatki (splošno ime, kemijsko ime, strukturna formula, številka CAS itd.), vključno s čistostjo in analitsko metodo za kvantifikacijo preskusne snovi, virom preskusne kemikalije ter identiteto in koncentracijo vseh uporabljenih topil, | — | vse informacije o fizikalnem stanju in fizikalno-kemijskih lastnostih, kot so bile pridobljene pred začetkom preskusa (npr. topnost v vodi, parni tlak, porazdelitveni koeficient v tleh (ali usedlini, če je na voljo), log Kow, stabilnost v vodi itd.). | — | Preskusne vrste: | — | znanstveno ime, sev, vir, morebitna predhodna obdelava, aklimatizacija, pogoji gojenja itd. | — | Preskusni pogoji: | — | uporabljeni preskusni postopek (npr. statični, polstatični ali pretočni), | — | načrt preskusa (npr. število, material in velikost preskusnih komor, količina vode na posodo (za pretočne ali polstatične postopke: hitrost nadomeščanja količine vode), morebitno prezračevanje, uporabljeno pred preskusom in med njim, število ponovitev, število črvov na ponovitev ob začetku izpostavljenosti, število preskusnih koncentracij, trajanje kondicioniranja, obdobje za uravnoteženje, obdobje izpostavljenosti, pogostost vzorčenja), | — | globina usedline in vode nad njo, | — | metoda predhodne obdelave preskusne kemikalije in njeno primešanje/nanos, | — | nominalne preskusne koncentracije, podrobnosti o vzorčenju za kemijsko analizo in analitske metode, s katerimi so bile pridobljene koncentracije preskusne kemikalije, | — | lastnosti usedline, kot je opisano v odstavkih 24 in 25, in vse druge izvedene meritve, priprava formulirane usedline, | — | priprava preskusne vode (če se uporablja rekonstituirana voda) in lastnosti (koncentracija kisika, vrednost pH, prevodnost, trdota in vse druge izvedene meritve) pred začetkom preskusa, | — | podrobne informacije o hranjenju, vključno z vrsto hrane, pripravo, količino in načinom hranjenja, | — | jakost svetlobe in obdobja osvetljenosti, | — | metode, uporabljene za določanje vseh bioloških parametrov (npr. vzorčenja, pregledovanja, tehtanja preskusnih organizmov) in vseh abiotskih parametrov (npr. parametrov kakovosti vode in usedline), | — | količine in/ali teže vseh vzorcev za kemijsko analizo, | — | podrobne informacije o obdelavi vseh vzorcev za kemijsko analizo, vključno s podrobnostmi o pripravi, shranjevanju, postopkih primešanja preskusne kemikalije, ekstrakciji ter analitskih postopkih (in natančnosti) za preskusno kemikalijo in ponovno pridobivanje preskusne kemikalije. | — | Rezultati: | — | kakovost vode v preskusnih posodah (vrednost pH, temperatura, koncentracija raztopljenega kisika, trdota, koncentracije amonijaka in vse druge izvedene meritve), | — | skupna vsebnost organskega ogljika (TOC), razmerje med suho in mokro težo, vrednost pH usedline in vse druge izvedene meritve, | — | skupno število ter, če je določeno, število celih in necelih črvov v vsaki preskusni komori ob koncu preskusa, | — | suha teža črvov v vsaki preskusni komori ob koncu preskusa in, če je izmerjena, suha teža podvzorca črvov na začetku preskusa, | — | morebitno opaženo nenormalno vedenje v primerjavi s kontrolami (npr. izogibanje usedlini, prisotnost ali odsotnost iztrebkov), | — | morebitne opažene smrtnosti, | — | ocene strupenih končnih točk (npr. ECx, NOEC in/ali LOEC) in statistične metode, uporabljene za njihovo določitev, | — | nominalne preskusne koncentracije, izmerjene preskusne koncentracije in rezultati vseh izvedenih analiz za določitev koncentracije preskusne kemikalije v preskusnih posodah, | — | morebitna odstopanja od meril za veljavnost. | — | Vrednotenje rezultatov: | — | skladnost rezultatov z merili veljavnosti, navedenimi v odstavku 13, | — | obravnava rezultatov, vključno z vsemi vplivi na rezultat preskusa, ki izvirajo iz odstopanj od te preskusne metode. | LITERATURA | (1) | ES (2003). Tehnični usmeritveni dokument v podporo Direktivi Komisije 93/67/EGS o ocenjevanju tveganj v zvezi z novimi prijavljenimi snovmi, Uredbi Komisije (ES) št. 1488/94 o ocenjevanju tveganja, ki ga predstavljajo obstoječe snovi, in Direktivi 98/8/ES Evropskega parlamenta in Sveta o dajanju biocidnih pripravkov v promet; del I–IV. Urad za publikacije Evropske unije (Evropska komisija), Luksemburg. | (2) | OECD (1992a). Report of the OECD workshop on effects assessment of chemicals in sediment. OECD Monographs, št 60. Organizacija za gospodarsko sodelovanje in razvoj (OECD), Pariz. | (3) | ASTM International (2000). Standard guide for the determination of the bioaccumulation of sediment-associated contaminants by benthic invertebrates, E 1688-00a. V: ASTM International 2004 Annual Book of Standards. Zvezek 11.05. Biological Effects and Environmental Fate; Biotechnology; Pesticides. ASTM International, West Conshohocken, PA. | (4) | ASTM International (2002). Standard Test Method for Measuring the Toxicity of Sediment-Associated Contaminants with Freshwater Invertebrates, E1706-00. V: ASTM International 2004 Annual Book of Standards. Zvezek 11.05. Biological Effects and Environmental Fate; Biotechnology; Pesticides. ASTM International, West Conshohocken, PA. | (5) | Phipps, G. L., Ankley, G. T., Benoit, D. A., in Mattson, V. R. (1993). Use of the aquatic Oligochaete Lumbriculus variegatus for assessing the toxicity and bioaccumulation of sediment-associated contaminants. Environ.Toxicol. Chem. 12, 269–279. | (6) | Poglavje C.27 te priloge: Preskus strupenosti s trzačami v sistemu vode in usedline z uporabo usedline s primešano preskusno snovjo. | (7) | U.S. EPA (2000). Methods for measuring the toxicity and bioaccumulation of sediment-associated contaminants with freshwater invertebrates. Druga izdaja. EPA 600/R-99/064, U.S. Environmental Protection Agency, Duluth, MN, marec 2000. | (8) | Environment Canada (1997). Test for Growth and Survival in Sediment using Larvae of Freshwater Midges (Chironomus tentans or Chironomus riparius). Biological Test Method. Report SPE 1/RM/32. December 1997. | (9) | Hill, I. R., Matthiessen, P., Heimbach, F. (ur.) 1993, Guidance document on Sediment Toxicity Tests and Bioassays for freshwater and Marine Environments, From the SETAC-Europe Workshop On Sediment Toxicity Assessment, 8. – 10. november 1993, Renesse (Nizozemska). | (10) | BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. Uredila M. Streloke in H. Köpp. Berlin, 1995. | (11) | Riedhammer, C., in Schwarz-Schulz, B. (2001). The Newly Proposed EU Risk Assessment Concept for the Sediment Compartment. J. Soils Sediments 1(2), 105– 110. | (12) | ASTM International (2004). Standard guide for collection, storage, characterisation, and manipulation of sediment for toxicological testing and for selection of samplers used to collect benthic invertebrates. American Society for Testing and Materials, E 1391-03. | (13) | Egeler, Ph., Meller, M., Schallnaß, H. J., in Gilberg, D. (2005). Validation of a sediment toxicity test with the endobenthic aquatic oligochaete Lumbriculus variegatus by an international ring test. V sodelovanju z R. Nagelom in B. Karaoglanom. Poročilo nemški Zvezni agenciji za okolje (Umweltbundesamt Berlin), R&D, št.: 202 67 429. | (14) | OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. OECD Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment, št. 23. | (15) | Environment Canada (2003). Guidance Document on Statistical Methods for Environmental Toxicity Tests; peti osnutek, marec 2003; Report EPS 1/RM/___. | (16) | Nikkilä A., Halme A., Kukkonen J. V. K. (2003). Toxicokinetics, toxicity and lethal body residues of two chlorophenols in the oligochaete worm, Lumbriculus variegatus, in different sediments. Chemosphere 51: 35–46. | (17) | Baily, H. C., in Liu, D. H. W. (1980). Lumbriculus variegatus, a Benthic Oligochaete, as a Bioassay Organism. str. 205–215. V: Eaton, J. C., Parrish, P. R., in Hendricks, A. C. (ur.). Aquatic Toxicology, ASTM STP 707. American Society for Testing and Materials. | (18) | Chapman, K. K., Benton, M. J., Brinkhurst, R. O., in Scheuerman, P. R. (1999). Use of the aquatic oligochaetes Lumbriculus variegatus and Tubifex tubifex for assessing the toxicity of copper and cadmium in a spiked-artificial-sediment toxicity test. Environmental Toxicology. 14(2): 271–278. | (19) | Meyer, J. S., Boese, C. J., in Collyard, S. A. (2002). Whole-body accumulation of copper predicts acute toxicity to an aquatic oligochaete (Lumbriculus variegatus) as pH and calcium are varied. Comp. Biochem. Physiol. Del C 133:99– 109. | (20) | Schubauer-Berigan, M. K., Dierkes, J. R., Monson, P. D., in Ankley, G. T. (1993). pH-dependent toxicity of cadmium, copper, nickel, lead and zinc to Ceriodaphnia dubia, Pimephales promelas, Hyalella azteca and Lumbriculus variegatus. Environ. Toxicol. Chem. 12(7):1261– 1266. | (21) | West, C. W., Mattson, V. R., Leonard, E. N., Phipps, G. L., in Ankley, G. T. (1993). Comparison of the relative sensitivity of three benthic invertebrates to copper-contaminated sediments from the Keweenaw Waterway. Hydrobiol. 262:57–63. | (22) | Ingersoll, C. G., Ankley, G. T., Benoit D. A., Brunson, E. L., Burton, G. A., Dwyer, F. J., Hoke, R. A., Landrum, P. F., Norberg-King, T. J., in Winger, P. V. (1995). Toxicity and bioaccumulation of sediment-associated contaminants using freshwater invertebrates: A review of methods and applications. Environ. Toxicol. Chem. 14, 1885-1894. | (23) | Kukkonen, J., in Landrum, P. F. (1994). Toxicokinetics and toxicity of sediment-associated Pyrene to Lumbriculus variegatus (Oligochaeta). Environ. Toxicol. Chem. 13, 1457– 1468. | (24) | Leppänen, M. T., in Kukkonen, J. V. K. (1998a). Relationship between reproduction, sediment type and feeding activity of Lumbriculus variegatus (Müller): Implications for sediment toxicity testing. Environ. Toxicol. Chem. 17: 2196–2202. | (25) | Leppänen, M. T., in Kukkonen, J. V. K. (1998b). Factors affecting feeding rate, reproduction and growth of an oligochaete Lumbriculus variegatus (Müller). Hydrobiologia 377: 183– 194. | (26) | Landrum, P. F., Gedeon, M. L., Burton, G. A., Greenberg. M. S., in Rowland, C. D. (2002). Biological Responses of Lumbriculus variegatus Exposed to Fluoranthene-Spiked Sediment. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 42: 292–302. | (27) | Brunson, E. L., Canfield, T. J., Ingersoll, C. J., in Kemble, N. E. (1998). Assessing the bioaccumulation of contaminants from sediments of the Upper Mississippi river using field-collected oligochaetes and laboratory-exposed Lumbriculus variegatus. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 35, 191–201. | (28) | Ingersoll, C. G., Brunson, E. L., Wang, N., Dwyer, F. J., Ankley, G. T., Mount, D. R., Huckins J., Petty., J., in Landrum, P. F. (2003). Uptake and depuration of non-ionic organic contaminants from sediment by the oligochaete, Lumbriculus variegatus. Environmental Toxicology and Chemistry 22, 872–885. | (29) | Rodriguez, P., in Reynoldson, T. B. (1999). Laboratory methods and criteria for sediment bioassessment. V: Mudroch, A., Azcue, J. M. in Mudroch, P. (ur.): Manual of Bioassessment of aquatic sediment quality. Lewis Publishers, Boca Raton, CRC Press LLC. | (30) | Liebig, M., Egeler, Ph., Oehlmann, J., in Knacker, Th. (2005). Bioaccumulation of 14C-17α-ethinylestradiol by the oligochaete Lumbriculus variegatus in artificial sediment. Chemosphere 59, 271–280. | (31) | Brust, K., Licht, O., Hultsch, V., Jungmann, D., in Nagel, R. (2001). Effects of Terbutryn on Aufwuchs and Lumbriculus variegatus in Artificial Indoor Streams. Environ. Toxicol. Chemistry, Vol. 20, str. 2000–2007. | (32) | Oetken, M., Ludwichowski, K.-U., in Nagel, R. (2000). Sediment tests with Lumbriculus variegatus and Chironomus riparius and 3,4-dichloroaniline (3,4-DCA) within the scope of EG-AltstoffV. Po naročilu nemške Zvezne agencije za okolje (Umweltbundesamt Berlin), FKZ 360 12 001, marec, 2000. | (33) | Leppänen, M. T., in Kukkonen, J. V. K. (1998). Relative importance of ingested sediment and porewater as bioaccumulation routes for pyrene to oligochaete (Lumbriculus variegatus, Müller). Environ. Sci. Toxicol. 32, 1503– 1508. | (34) | Dermott, R., in Munawar, M. (1992). A simple and sensitive assay for evaluation of sediment toxicity using Lumbriculus variegatus (Müller). Hydrobiologia 235/236: 407–414. | (35) | Drewes, C. D., in Fourtner, C. R. (1990). Morphallaxis in an aquatic oligochaete, Lumbriculus variegatus: Reorganisation of escape reflexes in regenerating body fragments. Develop. Biol. 138: 94– 103. | (36) | Brinkhurst, R. O. (1971). A guide for the identification of British aquatic oligochaeta. Freshw. Biol. Assoc., Sci. Publ. št. 22. | (37) | Poglavje C.1 te priloge, Akutna strupenost za ribe (preskus). | (38) | OECD (1992c). Guidelines for Testing of Chemicals, št. 210. Fish, Early-life Stage Toxicity Test. OECD, Pariz. | (39) | Egeler, Ph., Römbke, J., Meller, M., Knacker, Th., Franke, C., Studinger, G., in Nagel, R. (1997). Bioaccumulation of lindane and hexachlorobenzene by tubificid sludgeworms (Oligochaeta) under standardised laboratory conditions. Chemosphere 35, 835–852. | (40) | Meller, M., Egeler, P., Roembke, J., Schallnass, H., Nagel, R., in Streit, B. (1998). Short-term Toxicity of Lindane, Hexachlorobenzene and Copper Sulphate on Tubificid Sludgeworms (Oligochaeta) in Artificial Media. Ecotox. and Environ. Safety, 39, 10–20. | (41) | Egeler, Ph., Römbke, J., Knacker, Th., Franke, C., in Studinger, G. (1999). Delavnica na temo ‚Bioaccumulation: Sediment test using benthic oligochaetes‘, 26.–27. 4. 1999, Hochheim/Main, Nemčija. Report on the R+D-project No. 298 67 419, Umweltbundesamt, Berlin. | (42) | Suedel, B. C., in Rodgers, J. H. (1993). Development of formulated reference sediments for freshwater and estuarine sediment testing. Environ. Toxicol. Chem. 13, 1163– 1175. | (43) | Naylor, C., in Rodrigues, C. (1995). Development of a test method for Chironomus riparius using a formulated sediment. Chemosphere 31: 3291–3303. | (44) | Kaster, J. L., Klump, J. V., Meyer, J., Krezoski, J., in Smith, M. E. (1984). Comparison of defecation rates of Limnodrilus hoffmeisteri using two different methods. Hydrobiologia 11, 181– 184. | (45) | Martinez-Madrid, M., Rodriguez, P., Perez-Iglesias, J. I., in Navarro, E. (1999). Sediment toxicity bioassays for assessment of contaminated sites in the Nervion river (Northern Spain). 2. Tubifex tubifex (Müller) reproduction sediment bioassay. Ecotoxicology 8, 111– 124. | (46) | Environment Canada (1995). Guidance document on measurement of toxicity test precision using control sediments spiked with a reference toxicant. Environmental Protection Series Report EPS 1/RM/30. | (47) | Landrum, P. F. (1989). Bioavailability and toxicokinetics of polycyclic aromatic hydrocarbons sorbed to sediments for the amphipod Pontoporeia hoyi. Environ. Sci. Technol. 23, 588–595. | (48) | Brooke, L. T., Ankley, G. T., Call, D. J., in Cook, P. M. (1996). Gut content and clearance for three species of freshwater invertebrates. Environ. Toxicol. Chem. 15, 223–228. | (49) | Mount, D. R., Dawson, T. D., in Burkhard, L. P. (1999). Implications of gut purging for tissue residues determined in bioaccumulation testing of sediment with Lumbriculus variegatus. Environ. Toxicol. Chem. 18, 1244– 1249. | (50) | OECD 2006. Current approaches in the statistical analysis of ecotoxicity data: A guidance to application. OECD Series on Testing and Assessment, št. 54, OECD, Pariz, Francija. | (51) | Liebig, M., Meller, M., in Egeler, P. (2004). Sedimenttoxizitätstests mit aquatischen Oligochaeten – Einfluss verschiedener Futterquellen im künstlichen Sediment auf Reproduktion und Biomasse von Lumbriculus variegatus. Proceedings 5/2004: Statusseminar Sedimentkontakttests. 24.–25. marec 2004. BfG (Bundesanstalt für Gewässerkunde), Koblenz, Nemčija, str. 107– 119. | Dodatna literatura o statističnih postopkih: | Dunnett, C. W. (1955). A multiple comparison procedure for comparing several treatments with a control. Amer. Statist. Ass. J. 50, 1096– 1121. | Dunnett, C. W. (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics 20, 482–491. | Finney, D. J. (1971). Probit Analysis (3. izdaja), str. 19–76. Cambridge Univ. Press. | Finney, D. J. (1978). Statistical Method in Biological Assay. Charles Griffin & Company Ltd, London. | Hamilton, M. A., Russo, R. C., in Thurston, R. V. (1977). Trimmed Spearman-Karber Method for estimating median lethal concentrations in toxicity bioassays. Environ. Sci. Technol. 11(7), 714–719; Correction: Environ. Sci. Technol. 12 (1998), 417. | Holm, S. (1979). A simple sequentially rejective multiple test procedure. Scand. J. Statist. 6, 65–70. | Sokal, R. R., in Rohlf, F. J. (1981) Biometry. The principles and practice of statistics in biological research. 2. izdaja. W. H. Freeman and Company. New York. | Miller, R. G., Jr. (1986). Beyond ANOVA, basics of applied statistics. John Wiley & Sons. New York. | Shapiro, S. S., in Wilk, M. B. (1965). An analysis of variance test for normality (complete samples). Biometrika 52: 591–611. | Williams, D. A. (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27, 103– 117. | Williams, D. A. (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics 28, 519–531. | Dodatek 1 | Opredelitve pojmov | Za to preskusno metodo se uporabljajo naslednje opredelitve: | Kemikalija pomeni snov ali zmes. | Obdobje kondicioniranja se uporablja za stabiliziranje mikrobne komponente usedline in odstranjevanje npr. amonijaka, ki izvira iz komponent usedline; gre za obdobje pred primešanjem preskusne kemikalije usedlini. Običajno se voda nad usedlino po kondicioniranju zavrže. | Vrednost ECx je koncentracija preskusne kemikalije v usedlini, ki v navedenem obdobju izpostavljenosti povzroči X-odstotni (npr. 50-odstotni) učinek na biološki parameter. | Obdobje za uravnoteženje se uporablja za porazdelitev preskusne kemikalije med trdno fazo, porno vodo in vodo nad usedlino; gre za obdobje po primešanju preskusne kemikalije usedlini in pred dodajanjem preskusnih organizmov. | Faza izpostavljenosti je čas, v katerem so preskusni organizmi izpostavljeni preskusni kemikaliji. | Formulirana usedlina ali rekonstituirana, umetna ali sintetična usedlina je zmes snovi, uporabljenih za posnemanje fizičnih sestavin naravne usedline. | Najnižja koncentracija z opaznim učinkom (LOEC) je najnižja preskušena koncentracija preskusne kemikalije, pri kateri je bilo opaženo, da ima snov značilen strupen učinek (pri p ≤ 0,05) v primerjavi s kontrolo. Vendar morajo imeti vse koncentracije nad vrednostjo LOEC učinek, ki je enak ali večji od učinka, opaženega pri vrednosti LOEC. Če teh dveh pogojev ni možno izpolniti, je treba podrobno razložiti, kako je bila izbrana vrednost LOEC (in s tem tudi vrednost NOEC). | Koncentracija brez opaznega učinka (NOEC) je preskusna koncentracija tik pod vrednostjo LOEC, ki v danem obdobju izpostavljenosti v primerjavi s kontrolo nima statistično značilnega učinka (p ≤ 0,05). | Porazdelitveni koeficient oktanol/voda (Kow, včasih izražen tudi kot Pow) je uravnoteženo razmerje topnosti kemikalije v n-oktanolu in vodi ter predstavlja lipofilnost kemikalije (poglavje A.24 te priloge). Vrednost Kow ali logaritem Kow (log Kow) se uporablja kot pokazatelj potenciala kemikalije za bioakumulacijo v vodnih organizmih. | Porazdelitveni koeficient organski ogljik/voda (Koc) je razmerje med koncentracijo kemikalije v/na delu usedline z organskim ogljikom in koncentracijo kemikalije v vodi v ravnotežnem stanju. | Voda nad usedlino je voda, ki prekriva usedlino v preskusni posodi. | Porna voda ali intersticijska voda je voda, ki zavzema prostor med delci usedline ali tal. | Usedlina s primešano kemikalijo je usedlina, ki ji je bila dodana kemikalija. | Preskusna kemikalija je snov ali zmes, preskušena s to preskusno metodo. | Dodatek 2 | Sestava priporočene rekonstituirane vode | (prevzeto iz poglavja C.1 te priloge (1)) | (a) | Raztopina kalcijevega klorida | Raztopite 11,76 g CaCl2 · 2H2O v deionizirani vodi: z deionizirano vodo dopolnite do 1 l. | (b) | Raztopina magnezijevega sulfata | Raztopite 4,93 g MgSO4 · 7H2O v deionizirani vodi: z deionizirano vodo dopolnite do 1 l. | (c) | Raztopina natrijevega bikarbonata | Raztopite 2,59 g NaHCO3 v deionizirani vodi: z deionizirano vodo dopolnite do 1 l. | (d) | Raztopina kalijevega klorida | Raztopite 0,23 g KCl v deionizirani vodi: z deionizirano vodo dopolnite do 1 l. | Vse kemikalije morajo biti analitsko čiste. | Prevodnost destilirane ali deionizirane vode ne sme presegati 10 μScm– 1. | 25 ml vsake od raztopin v točkah od (a) do (d) je zmešanih z deionizirano vodo, skupna količina pa je s to vodo dopolnjena do 1 l. Vsota kalcijevih in magnezijevih ionov v teh raztopinah je 2,5 mmol/l. | Razmerje ionov Ca in Mg je 4: 1, ionov Na in K pa 10: 1. Alkalnost KS4.3 te raztopine znaša 0,8 mmol/l. | Vodo za redčenje prepihujte, dokler ni dosežena nasičenost s kisikom, nato pa jo pred uporabo shranite za približno dva dni in je ne prepihujte več. | VIR | (1) | Poglavje C.1 te priloge, Akutna strupenost za ribe (preskus). | Dodatek 3 | Fizikalno-kemijske lastnosti sprejemljive vode za redčenje | Sestavina | Koncentracije | delci | < 20 mg/l | celotni organski ogljik | < 2 μg/l | neionizirani amonijak | < 1 μg/l | ostanek klora | < 10 μg/l | skupni organofosforni pesticidi | < 50 ng/l | skupni organoklorni pesticidi in poliklorirani bifenili | < 50 ng/l | skupni organski klor | < 25 ng/l | (prevzeto iz OECD (1992) (1)) | VIR | (1) | OECD (1992). Guidelines for Testing of Chemicals, št. 210. Fish, Early-life Stage Toxicity Test. OECD, Pariz. | Dodatek 4 | Priporočljiva umetna usedlina – navodila za pripravo in shranjevanje | Sestavine usedline | Sestavina | Lastnosti | % suhe teže usedline | šota | šotni mah, stopnja razpada: ‚srednja‘,sušen na zraku, brez vidnih ostankov rastlin, fino mlet (velikost delcev ≤ 0,5 mm) | 5 ± 0,5 | kremenov pesek | velikost zrn: > 2 mm, vendar mora > 50 % delcev meriti med 50 in 200 μm | 75–76 | kaolinska glina | vsebnost kaolinita ≥ 30 % | 20 ± 1 | vir hrane | npr. prah vrste Urtica (listov koprive), listi vrste Urtica dioica (velike koprive), fino mleti (velikost delcev ≤ 0,5 mm); v skladu s farmacevtskimi standardi, za prehrano ljudi; poleg suhe usedline | 0,4–0,5 % | organski ogljik | uravnava se z dodatkom šote in peska | 2 ± 0,5 | kalcijev karbonat | CaCO3, zdrobljen v prah, kemijsko čist, poleg suhe usedline | 0,05–1 | deionizirana voda | prevodnost ≤ 10 μS/cm, poleg suhe usedline | 30–50 | Opomba: Če so pričakovane povišane koncentracije amonijaka, npr. če je znano, da preskusna kemikalija zavira nitrifikacijo, je lahko koristna zamenjava 50 % koprivnega prahu, bogatega z dušikom, s celulozo (npr. s kemijsko čistim prahom α-celuloze velikosti delcev ≤ 0,5 mm; (1)(2)). | Priprava | Šota se posuši na zraku in zmelje v fin prah. Pripravi se suspenzija potrebne količine šote v prahu v deionizirani vodi, za kar se uporabi visoko zmogljiva naprava za homogenizacijo. Vrednost pH te suspenzije se s CaCO3 uravna na 5,5 ± 0,5. Suspenzija se vsaj dva dneva kondicionira z rahlim mešanjem pri 20 ± 2 °C, da se stabilizira vrednost pH in vzpostavi stabilna mikrobna komponenta. Vrednost pH se znova izmeri in mora biti 6,0 ± 0,5. Šotna suspenzija se nato zmeša z drugimi sestavinami (peskom in kaolinsko glino) in deionizirano vodo, da nastane homogena usedlina z vsebnostjo vode v razponu 30–50 % suhe teže usedline. Vrednost pH končne mešanice se znova izmeri in se po potrebi s CaCO3 uravna na od 6,5 do 7,5. Če pa je pričakovan razvoj amonijaka, je lahko vrednost pH usedline koristno ohranjati pod 7,0 (npr. med 6,0 in 6,5). Vzamejo se vzorci usedline, da se določita suha teža in vsebnost organskega ogljika. Če je pričakovan razvoj amonijaka, se formulirana usedlina lahko kondicionira sedem dni pri enakih pogojih, kakršni vladajo v poznejšem preskusu (razmerje usedline in vode je npr. 1: 4, višina plasti usedline pa enaka tisti v preskusnih posodah), preden ji je primešana preskusna kemikalija, tj. dotočiti je treba vodo, ki jo je treba prepihovati. Ob koncu obdobja kondicioniranja je treba vodo nad usedlino odstraniti in zavreči. Nato se kremenov pesek, ki mu je primešana preskusna kemikalija, za vsako raven tretiranja zmeša z usedlino, usedlino pa se porazdeli med ponovitvene preskusne posode in se ji dotoči preskusno vodo. Nato se posode inkubirajo pri enakih pogojih, kakršni vladajo v poznejšem preskusu. To je začetek obdobja za uravnoteženje. Vodo nad usedlino je treba prepihovati. | Izbrani vir hrane mora biti dodan pred primešanjem preskusne kemikalije usedlini ali med njim. Lahko se najprej zmeša s šotno suspenzijo (glej zgoraj). Vendar se je obsežni razgradnji vira hrane pred dodajanjem preskusnih organizmov – npr. v primeru dolgega obdobja za uravnoteženje – mogoče izogniti s čim krajšim časom med dodajanjem hrane in začetkom izpostavljenosti. Za zagotovitev, da je hrani primešana preskusna kemikalija, je treba vir hrane zmešati z usedlino najkasneje isti dan, ko se preskusna kemikalija primeša usedlini. | Shranjevanje | Suhe sestavine umetne usedline se lahko shranjujejo v suhem in hladnem prostoru pri sobni temperaturi. Pripravljeno usedlino, ki ji je primešana preskusna kemikalija, je treba v preskusu uporabiti takoj. Vzorci usedline s primešano preskusno kemikalijo se lahko nato do analize hranijo v pogojih, priporočenih za zadevno preskusno kemikalijo. | VIRA | (1) | Egeler, Ph., Meller, M., Schallnaß, H. J., in Gilberg, D. (2005). Validation of a sediment toxicity test with the endobenthic aquatic oligochaete Lumbriculus variegatus by an international ring test. V sodelovanju z R. Nagelom in B. Karaoglanom. Poročilo nemški Zvezni agenciji za okolje (Umweltbundesamt Berlin), R&D, št.: 202 67 429. | (2) | Liebig M., Meller M., in Egeler P. (2004). Sedimenttoxizitätstests mit aquatischen Oligochaeten – Einfluss verschiedener Futterquellen im künstlichen Sediment auf Reproduktion und Biomasse von Lumbriculus variegatus. Proceedings 5/2004: Statusseminar Sedimentkontakttests. 24.–25. marec 2004. BfG (Bundesanstalt für Gewässerkunde), Koblenz, Nemčija, str. 107–119. | Dodatek 5 | Metode gojenja vrste Lumbriculus variegatus | Vrsta Lumbriculus variegatus (Müller) iz družine Lumbriculidae in reda maloščetincev prebiva v sladkovodnih usedlinah in se pogosto uporablja v ekotoksikološkem preskušanju. V laboratorijskih pogojih jo je enostavno gojiti. Metode gojenja so opisane spodaj. | Metode gojenja | Pogoji gojenja vrste Lumbriculus variegatus so podrobno opisani v Phipps idr. (1993) (1), Brunson idr. (1998) (2), ASTM (2000) (3) in U.S. EPA (2000) (4). Kratek povzetek teh pogojev je opisan spodaj. Glavna prednost vrste L. variegatus je njeno hitro razmnoževanje, zaradi česar se v laboratorijsko gojenih populacijah izjemno hitro povečuje biomasa (npr. (1), (3), (4), (5)). | Črve je mogoče gojiti v velikih akvarijih (57–80 l) pri 23 °C z obdobjem osvetljenosti 16 ur svetlobe in 8 ur teme (100–1 000 lx) in z uporabo dnevno osveževane naravne vode (45–50 l na akvarij). Substrat se pripravi tako, da se nebeljene rjave papirnate brisače razrežejo na trakove, ki jih je nato mogoče za nekaj sekund zmešati z vodo za gojenje, zaradi česar nastanejo majhni deli papirnatega substrata. Ta substrat je nato mogoče takoj uporabiti v akvariju za gojenje vrste Lumbriculus; z njim se prekrije dno posode, lahko pa se tudi zamrzne v deionizirani vodi in tak shrani za kasnejšo uporabo. Svež substrat v posodi bo običajno zdržal približno dva meseca. | Vsaka kultura črvov se začne z od 500 do 1 000 črvi, hranjenimi z 10-mililitrsko suspenzijo, ki pri pogojih obnavljanja vode ali pretočnih pogojih vsebuje 6 g začetne hrane za gojenje trikrat na teden. Hranjenje statičnih in polstatičnih kultur mora biti manj pogosto, da se prepreči rast bakterij ali gliv. | V teh pogojih se število posameznih osebkov v kulturi običajno podvoji v obdobju približno od 10 do 14dni. | Namesto tega je vrsto Lumbriculus variegatus mogoče gojiti tudi v sistemu, ki ga sestavljata plast kremenovega peska, kakršen se uporablja za umetno usedlino (globine 1–2 cm), in rekonstituirana voda. Kot posode za gojenje se lahko uporabijo steklene posode ali posode iz nerjavnega jekla višine od 12 do 20 cm. Vodno telo je treba prek pasteurjeve pipete, nameščene približno 2 cm nad površino usedline, rahlo prepihovati (npr. z 2 mehurčkoma na sekundo). Za preprečevanje kopičenja npr. amonijaka je treba vodo nad usedlino zamenjati prek pretočnega sistema ali, vsaj enkrat na teden, ročno. Maloščetince je mogoče vzdrževati pri sobni temperaturi s 16 urami svetlobe (pri osvetljenosti 100–1 000 lx) in 8 urami teme. V polstatičnih kulturah (z obnavljanjem vode enkrat na teden) se črvi hranijo dvakrat na teden s hrano TetraMin (npr. 0,6–0,8 mg na cm2 površine usedline), ki jo je mogoče vnesti kot suspenzijo 50 mg hrane TetraMin na ml deionizirane vode. | Vrsto Lumbriculus variegatus je mogoče iz kultur odstraniti npr. s prenosom substrata s fino mrežo ali s prenosom organizmov z vroče polirano široko pipeto (premera približno 5 mm) v ločeno čašo. Če je v to čašo hkrati prenesen tudi substrat, se čaša, ki vsebuje črve, in substrat prek noči pustita v pretočnih pogojih, ki bodo iz čaše odstranili substrat, črvi pa bodo ostali na dnu posode. Nato jih je mogoče prenesti v na novo pripravljene gojitvene rezervoarje ali pa nadalje obdelati za preskus, kot je opisano v (3) in (4) ali v nadaljevanju. | Vprašanje, ki ga je pri uporabi vrste L. variegatus v preskusih z usedlino treba kritično obravnavati, je njen način razmnoževanja (z arhitomijo ali morfalakso, npr. (6)). S tem nespolnim razmnoževanjem nastaneta dva fragmenta, ki se določeno obdobje ne hranita, dokler se del glave ali repa ne obnovi (npr. (7), (8)). To pomeni, da izpostavljenost prek zaužitja kontaminirane usedline pri vrsti L. variegatus ne poteka neprekinjeno. | Zato je treba izvesti sinhronizacijo, da se kar najbolj zmanjša nenadzorovano razmnoževanje in regeneracija ter posledična velika variacija pri rezultatih preskusa. Do take variacije lahko pride, če so določeni osebki, ki so fragmentirali in se zato določeno obdobje ne hranijo, izpostavljeni preskusni kemikaliji manj od drugih osebkov, ki med preskusom ne fragmentirajo (9), (10), (11). Črve je treba od 10 do 14 dni pred začetkom izpostavljenosti umetno fragmentirati (sinhronizacija). Za sinhronizacijo je treba izbrati velike (odrasle) črve, ki po možnosti ne kažejo znakov nedavne morfalakse. Te črve je mogoče postaviti na objektno stekelce v kapljico vode za gojenje in jih s skalpelom razdeliti v srednjem delu telesa. Treba je paziti, da so zadnji deli podobne velikosti. Nato je treba zadnje dele pustiti, da v posodah za gojenje, ki vsebujejo enak substrat, kot je bil uporabljen v kulturi, in rekonstituirano vodo, ustvarijo nove glave. Na ustvarjanje novih glav kaže zakopavanje sinhroniziranih črvov v substrat (obnovljene glave je mogoče potrditi s pregledovanjem podvzorca pod binokularnim mikroskopom). Pričakuje se, da bodo preskusni organizmi nato v podobnem fiziološkem stanju. To ob pojavu razmnoževanja sinhroniziranih črvov z morfalakso med preskusom pomeni, da je od skoraj vseh živali pričakovati enako izpostavljenost usedlini, ki ji je primešana preskusna kemikalija. Hranjenje sinhroniziranih črvov se izvede enkrat, takoj ko se črvi začnejo zakopavati v substrat, ali 7 dni po delitvi. Režim hranjenja mora biti primerljiv z rednimi kulturami, priporočljivo pa je, da se sinhronizirani črvi hranijo z enakim virom hrane, kot bo uporabljen v preskusu. Črve je treba vzdrževati pri temperaturi preskusa 20 °C ± 2 °C. Po obnavljanju je treba za preskus uporabiti nepoškodovane, cele črve, ki po nežnem mehanskem dražljaju dejavno plavajo ali se plazijo. Poškodbe ali avtotomijo pri črvih je treba preprečevati; s črvi je treba rokovati npr. s pipetami, ki imajo vroče polirane robove, ali z iglami iz nerjavnega jekla. | Viri začetnih kultur za vrsto Lumbriculus variegatus (naslovi v ZDA so prevzeti iz (4)) | Evropa | ECT Oekotoxikologie GmbH | Böttgerstr. 2-14 | D-65439 Flörsheim/Main | Nemčija | Bayer Crop Science AG | Development – Ecotoxicology | Alfred-Nobel-Str. 50 | D-40789 Monheim | Nemčija | | | University of Joensuu | Laboratory of Aquatic Toxicology | Dept. of Biology | Yliopistokatu 7, P.O. Box 111 | FIN-80101 Joensuu | Finska | Dresden University of Technology | Institut für Hydrobiologie | Fakultät für Forst-, Geo- und Hydrowissenschaften | Mommsenstr. 13 | D-01062 Dresden | Nemčija | | | C.N.R.- I.R.S.A. | Italian National Research Council | Water Research Institute | Via Mornera 25 | I-20047 Brugherio MI | | | | ZDA | U.S. Environmental Protection Agency | Mid-Continent Ecological Division | 6201 Congdon Boulevard | Duluth, MN 55804 | Michigan State University | Department of Fisheries and Wildlife | No. 13 Natural Resources Building | East Lansing, MI 48824-1222 | | | U.S. Environmental Protection Agency | Environmental Monitoring System Laboratory | 26 W. Martin Luther Dr. | Cincinnati, OH 45244 | Wright State University | Institute for Environmental Quality | Dayton, OH 45435 | | | Columbia Environmental Research Center | U.S. Geological Survey | 4200 New Haven Road | Columbia, MO 65201 | Great Lakes Environmental Research | Laboratory, NOAA | 2205 Commonwealth Boulevard | Ann Arbor, MI 48105-1593 | VIRI | (1) | Phipps, G. L., Ankley, G. T., Benoit, D. A., in Mattson, V. R. (1993). Use of the aquatic Oligochaete Lumbriculus variegatus for assessing the toxicity and bioaccumulation of sediment-associated contaminants. Environ.Toxicol. Chem. 12, 269–279. | (2) | Brunson, E. L., Canfield, T. J., Ingersoll, C. J., in Kemble, N. E. (1998). Assessing the bioaccumulation of contaminants from sediments of the Upper Mississippi river using field-collected oligochaetes and laboratory-exposed Lumbriculus variegatus. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 35, 191–201. | (3) | ASTM International (2000). Standard guide for the determination of the bioaccumulation of sediment-associated contaminants by benthic invertebrates, E 1688–00a. V ASTM International 2004 Annual Book of Standards. Vol. 11.05. Biological Effects and Environmental Fate; Biotechnology; Pesticides. ASTM International, West Conshohocken, PA. | (4) | U.S. EPA (2000). Methods for measuring the toxicity and bioaccumulation of sediment-associated contaminants with freshwater invertebrates. Druga izdaja. EPA 600/R-99/064, U.S. Environmental Protection Agency, Duluth, MN, marec 2000. | (5) | Kukkonen, J., in Landrum, P. F. (1994). Toxicokinetics and toxicity of sediment-associated Pyrene to Lumbriculus variegatus (Oligochaeta). Environ. Toxicol. Chem. 13, 1457–1468. | (6) | Drewes C. D., in Fourtner, C. R. (1990). Morphallaxis in an aquatic oligochaete, Lumbriculus variegatus: Reorganisation of escape reflexes in regenerating body fragments. Develop. Biol. 138: 94–103. | (7) | Leppänen, M. T., in Kukkonen, J. V. K. (1998a). Relationship between reproduction, sediment type and feeding activity of Lumbriculus variegatus (Müller): Implications for sediment toxicity testing. Environ. Toxicol. Chem. 17: 2196–2202. | (8) | Leppänen, M. T., in Kukkonen, J. V. K. (1998b). Factors affecting feeding rate, reproduction and growth of an oligochaete Lumbriculus variegatus (Müller). Hydrobiologia 377: 183–194. | (9) | Brust, K., Licht, O., Hultsch, V., Jungmann, D., in Nagel, R. (2001). Effects of Terbutryn on Aufwuchs and Lumbriculus variegatus in Artificial Indoor Streams. Environ. Toxicol. Chemistry, Vol. 20, str. 2000–2007. | (10) | Oetken, M., Ludwichowski, K.-U., in Nagel, R. (2000). Sediment tests with Lumbriculus variegatus and Chironomus riparius and 3,4-dichloroaniline (3,4-DCA) within the scope of EG-AltstoffV. Po naročilu nemške Zvezne agencije za okolje (Umweltbundesamt Berlin), FKZ 360 12 001, marec, 2000. | (11) | Leppänen, M. T., in Kukkonen J. V. K. (1998). Relative importance of ingested sediment and porewater as bioaccumulation routes for pyrene to oligochaete (Lumbriculus variegatus, Müller). Environ. Sci. Toxicol. 32, 1503–1508. | Dodatek 6 | Povzetek rezultatov krožnega preskusa | ‚Preskus strupenosti usedline z vrsto Lumbriculus variegatus
‘ | Preglednica 1 | Rezultati posameznih potekov krožnega preskusa: srednja vrednost števila črvov v kontrolah in kontrolah s topilom na koncu preskusa; SD (standard deviation) = standardni odklon; KV (coefficient of variation) = koeficient variacije. | | Srednja vrednost števila črvov v kontrolah | SD | KV (%) | n | Srednja vrednost števila črvov v kontrolah s topilom | SD | KV (%) | n | | 32,3 | 7,37 | 22,80 | 3 | 39,0 | 3,61 | 9,25 | 3 | | 40,8 | 6,55 | 16,05 | 6 | 36,0 | 5,29 | 14,70 | 3 | | 41,5 | 3,54 | 8,52 | 2 | 38,5 | 7,05 | 18,31 | 4 | | 16,3 | 5,99 | 36,67 | 6 | 30,8 | 6,70 | 21,80 | 4 | | 24,3 | 10,69 | 43,94 | 3 | 26,3 | 3,06 | 11,60 | 3 | | 28,5 | 8,29 | 29,08 | 4 | 30,7 | 1,15 | 3,77 | 3 | | 28,3 | 3,72 | 13,14 | 6 | 28,8 | 2,56 | 8,89 | 6 | | 25,3 | 5,51 | 21,74 | 3 | 27,7 | 1,53 | 5,52 | 3 | | 23,8 | 2,99 | 12,57 | 4 | 21,3 | 1,71 | 8,04 | 4 | | 36,8 | 8,80 | 23,88 | 6 | 35,0 | 4,20 | 11,99 | 6 | | 33,0 | 3,58 | 10,84 | 6 | 33,5 | 1,73 | 5,17 | 4 | | 20,7 | 2,73 | 13,22 | 6 | 15,0 | 6,68 | 44,56 | 4 | | 42,0 | 7,07 | 16,84 | 6 | 43,7 | 0,58 | 1,32 | 3 | | 18,2 | 3,60 | 19,82 | 6 | 21,7 | 4,04 | 18,65 | 3 | | 32,0 | 3,95 | 12,34 | 6 | 31,3 | 4,79 | 15,32 | 4 | Srednja vrednost pri poskusih iz primerjave med laboratoriji | 29,59 | | 20,10 | | 30,61 | | 13,26 | | SD | 8,32 | | 10,03 | | 7,57 | | 10,48 | | n | 15 | | | | 15 | | | | najmanj | 16,3 | | | | 15,0 | | | | največ | 42,0 | | | | 43,7 | | | | KV (%) | 28,1 | | | | 24,7 | | | | Preglednica 2 | Rezultati posameznih potekov krožnega preskusa: srednja vrednost skupne suhe teže črvov na ponovitev v kontrolah in kontrolah s topilom na koncu preskusa; SD (standard deviation) = standardni odklon; KV (coefficient of variation) = koeficient variacije. | | Skupna suha teža črvov na ponovitev (kontrole) | SD | KV (%) | n | Skupna suha teža črvov na ponovitev (kontrole s topilom) | SD | KV (%) | n | | 24,72 | 6,31 | 25,51 | 3 | 27,35 | 4,08 | 14,93 | 3 | | 30,17 | 2,04 | 6,75 | 6 | 33,83 | 10,40 | 30,73 | 3 | | 23,65 | 3,61 | 15,25 | 2 | 28,78 | 4,68 | 16,28 | 4 | | 12,92 | 6,83 | 52,91 | 6 | 24,90 | 6,84 | 27,47 | 4 | | 21,31 | 4,17 | 19,57 | 3 | 25,87 | 5,30 | 20,49 | 3 | | 22,99 | 4,86 | 21,16 | 4 | 24,64 | 5,09 | 20,67 | 3 | | 18,91 | 1,91 | 10,09 | 6 | 19,89 | 1,77 | 8,89 | 6 | | 24,13 | 1,63 | 6,75 | 3 | 25,83 | 2,17 | 8,41 | 3 | | 22,15 | 3,18 | 14,34 | 4 | 22,80 | 2,60 | 11,40 | 4 | | 35,20 | 8,12 | 23,07 | 6 | 31,42 | 8,45 | 26,90 | 6 | | 41,28 | 5,79 | 14,02 | 6 | 41,42 | 4,37 | 10,55 | 4 | | 15,17 | 5,78 | 38,09 | 6 | 10,50 | 3,42 | 32,53 | 4 | | 35,69 | 8,55 | 23,94 | 6 | 38,22 | 1,23 | 3,21 | 3 | | 19,57 | 5,21 | 26,65 | 6 | 28,58 | 6,23 | 21,81 | 3 | | 29,40 | 2,16 | 7,34 | 6 | 31,15 | 2,70 | 8,67 | 4 | Srednja vrednost pri poskusih iz primerjave med laboratoriji | 25,15 | | 20,36 | | 27,68 | | 17,53 | | SD | 7,87 | | 12,56 | | 7,41 | | 9,10 | | n | 15 | | | | 15 | | | | najmanj | 12,9 | | | | 10,5 | | | | največ | 41,3 | | | | 41,4 | | | | KV (%) | 31,3 | | | | 26,8 | | | | Preglednica 3 | Strupenost PCP: povzetek končnih točk v krožnem preskusu; srednje vrednosti pri poskusih iz primerjave med laboratoriji za EC50, NOEC in LOEC; SD (standard deviation) = standardni odklon; KV (coefficient of variation) = koeficient variacije. | Biološki parameter | | Srednja vrednost pri preskusih iz primerjave med laboratoriji (mg/kg) | najmanj | največ | Faktor pri preskusih med laboratoriji | SD | KV (%) | Geometrijska sredina (mg/kg) | Skupno število črvov | EC50 | 23,0 | 4,0 | 37,9 | 9,4 | 10,7 | 46,3 | 19,9 | NOEC | 9,9 | 2,1 | 22,7 | 10,7 | 7,2 | 72,3 | 7,6 | LOEC | 27,9 | 4,7 | 66,7 | 14,2 | 19,4 | 69,4 | 20,9 | MDD (%) | 22,5 | 7,1 | 39,1 | | | | | Skupna suha teža črvov | EC50 | 20,4 | 7,3 | 39,9 | 5,5 | 9,1 | 44,5 | 18,2 | NOEC | 9,3 | 2,1 | 20,0 | 9,4 | 6,6 | 70,4 | 7,4 | LOEC | 25,7 | 2,1 | 50,0 | 23,5 | 16,8 | 65,5 | 19,4 | MDD (%) | 24,8 | 10,9 | 44,7 | | | | | Smrtnost/preživetje | LC50 | 25,3 | 6,5 | 37,2 | 5,7 | 9,4 | 37,4 | 23,1 | NOEC | 16,5 | 2,1 | 40,0 | 18,8 | 10,3 | 62,4 | 12,8 | LOEC | 39,1 | 4,7 | 66,7 | 14,2 | 18,1 | 46,2 | 32,6 | Razmnoževanje (povečanje števila črvov na ponovitev) | EC50 | 20,0 | 6,7 | 28,9 | 4,3 | 7,6 | 37,9 | 18,3 | NOEC | 7,9 | 2,1 | 20,0 | 9,4 | 5,2 | 66,0 | 6,4 | LOEC | 22,5 | 2,1 | 50,0 | 23,5 | 15,4 | 68,6 | 16,0 | MDD (%) | 29,7 | 13,9 | 47,9 | | | | | Rast (povečanje biomase na ponovitev) | EC50 | 15,3 | 5,7 | 29,9 | 5,2 | 7,1 | 46,5 | 13,7 | NOEC | 8,7 | 2,1 | 20,0 | 9,4 | 6,0 | 68,1 | 6,9 | LOEC | 24,0 | 2,1 | 50,0 | 23,5 | 15,7 | 65,5 | 17,3 | MDD (%) | 32,2 | 13,6 | 65,2 | | | | | MDD (minimum detectable difference): najmanjša zaznavna razlika v primerjavi s kontrolnimi vrednostmi med preskušanjem domnev, uporabljena kot merilo statistične moči. | VIR | Egeler, Ph., Meller, M., Schallnaß, H. J. in Gilberg, D. (2005). Validation of a sediment toxicity test with the endobenthic aquatic oligochaete Lumbriculus variegatus by an international ring test. V sodelovanju z R. Nagelom in B. Karaoglanom. Poročilo nemški Zvezni agenciji za okolje (Umweltbundesamt Berlin), R&D, št.: 202 67 429. | C.36 PRESKUS RAZMNOŽEVANJA PLENILSKE PRŠICE (HYPOASPIS (GEOLAELAPS) ACULEIFER) V TLEH | UVOD | 1. | Ta preskusna metoda je enakovredna Smernici za preskušanje OECD (TG) 226 (2008). Ta preskusna metoda je zasnovana za ocenjevanje učinkov kemikalij v tleh na sposobnost razmnoževanja vrste talne pršice Hypoaspis (Geolaelaps) aculeifer Canestrini (Acari: Laelapidae), zato omogoča oceno zaviranja hitrosti rasti določene populacije (1,2). Sposobnost razmnoževanja pri tem pomeni število mladičev na koncu obdobja preskušanja. Vrsta H. aculeifer predstavlja dodatno trofično raven za vrste, za katere so preskusne metode že na voljo. Za namen te preskusne metode velja, da zadošča preskus razmnoževanja brez razlikovanja in kvantifikacije različnih faz razmnoževalnega cikla. Za kemijske snovi z drugačnim scenarijem izpostavljenosti, ki ne poteka prek tal, so lahko primerni drugi pristopi (3). | 2. | Vrsta Hypoaspis (Geolaelaps) aculeifer velja za ustrezno predstavnico talne favne in še posebej plenilskih pršic. Živi po vsem svetu (5) ter jo je enostavno zbirati in gojiti v laboratoriju. Povzetek biologije vrste H. aculeifer je v Dodatku 7. Na voljo so osnovne informacije o ekologiji vrste pršice in njeni uporabi pri ekotoksikološkem preskušanju (4), (5), (6), (7), (8), (9), (10), (11), (12). | NAČELO PRESKUSA | 3. | Odrasle samice se izpostavijo razponu koncentracij preskusne kemikalije, vmešane v tla. Preskus se začne z 10 odraslimi samicami na ponovitveno posodo. Samci v preskus niso vneseni, saj izkušnje kažejo, da se samice takoj po tem, ko se izležejo iz faze deutonimfe, parijo, če so prisotni samci. Poleg tega bi vključitev samcev podaljšala preskus tako, da bi bilo potrebno zahtevno razlikovanje starostnih skupin. Zato samo parjenje ni del preskusa. Samice so vnesene v preskus 28–35 dni po začetku obdobja odlaganja jajčec pri sinhronizaciji (glej Dodatek 4), saj samice takrat lahko veljajo za že parjene in so že prešle fazo pred obdobjem odlaganja jajčec. Pri temperaturi 20 °C se preskus konča 14. dan po vnosu samic (dan 0), kar omogoča, da prvi potomci v kontroli dosežejo fazo deutonimfe (glej Dodatek 4). Za glavno merjeno spremenljivko se določi število mladičev na preskusne posode in dodatno še število preživelih samic. Sposobnost razmnoževanja pršic, izpostavljenih preskusni kemikaliji, se primerja s sposobnostjo razmnoževanja v kontrolah, da se določi vrednost ECx (npr. EC10, EC50) ali pa koncentracija brez opaznega učinka (NOEC) (za opredelitve pojmov glej Dodatek 1), odvisno od načrta poskusa (glej odstavek 29). Pregled časovnega načrta preskusa je podan v Dodatku 8. | INFORMACIJE O PRESKUSNI KEMIKALIJI | 4. | Po možnosti morajo biti znani topnost v vodi, vrednost log Kow, porazdelitveni koeficient tla/voda in parni tlak preskusne kemikalije. Zaželene so dodatne informacije o usodi preskusne kemikalije v tleh, kot so hitrosti biotske in abiotske razgradnje. | 5. | To preskusno metodo je mogoče uporabiti za vodotopne in nevodotopne kemikalije. Vendar se bodo načini nanosa preskusne kemikalije ustrezno razlikovali. Preskusna metoda se ne sme uporabljati pri hlapnih kemikalijah, tj. kemikalijah, za katere je Henryjeva konstanta ali porazdelitveni koeficient zrak/voda večja od ena, ali pri kemikalijah, pri katerih parni tlak presega 0,0133 Pa pri 25 °C. | VELJAVNOST PRESKUSA | 6. | Da rezultat preskusa šteje kot veljaven, morajo biti v netretiranih kontrolah izpolnjena naslednja merila: | — | srednja vrednost smrtnosti odraslih samic na koncu preskusa ne sme presegati 20 %, | — | srednja vrednost števila mladičev na ponovitev (z vnesenimi 10 odraslimi samicami) mora biti ob koncu preskusa vsaj 50, | — | koeficient variacije, izračunan za število mladičev pršic na ponovitev ob koncu dokončnega preskusa, ne sme presegati 30 %. | REFERENČNA KEMIKALIJA | 7. | Za zagotovitev, da so laboratorijski preskusni pogoji ustrezni, in za potrditev, da se odziv preskusnih organizmov ni spremenil skozi čas, je treba določiti vrednosti ECx in/ali NOEC referenčne kemikalije. Dimetoat (CAS 60-51-5) je primerna referenčna kemikalija, za katero je dokazano, da vpliva na velikost populacije (4). Kot alternativna referenčna kemikalija se lahko uporabi borova kislina (CAS 10043-35-3). S to kemikalijo je pridobljenih manj izkušenj. Obstajata dve možnosti načrta: | — | referenčno kemikalijo je mogoče preskusiti vzporedno z določanjem strupenosti vsake preskusne kemikalije pri eni koncentraciji, ki mora biti dokazana predhodno v študiji odziva v odvisnosti od odmerka, katere učinek mora biti > 50 % zmanjšanje števila potomcev. V tem primeru mora biti število ponovitev enako številu kontrol (glej odstavek 29), | — | druga možnost je preskušanje referenčne kemikalije enkrat do dvakrat letno v preskusu odziva v odvisnosti od odmerka. Glede na izbrani načrt se število koncentracij in ponovitev ter faktor razmika razlikujejo (glej odstavek 29), vendar mora biti dosežen odziv z 10–90-odstotnim učinkom (faktor razmika 1,8). Vrednost EC50 za dimetoat na podlagi števila mladičev mora biti v območju med 3,0 in 7,0 mg a.s./kg tal (suhe teže). Na podlagi rezultatov, ki so bili z borovo kislino pridobljeni do zdaj, mora biti vrednost EC50 na podlagi števila mladičev v območju med 100 in 500 mg/kg suhe teže tal. | OPIS PRESKUSA | Preskusne posode in oprema | 8. | Uporabiti je treba preskusne posode premera 3–5 cm (višina zemlje ≥ 1,5 cm), izdelane iz stekla ali drugega kemijsko inertnega materiala, s tesno prilegajočim se pokrovom. Prednost imajo navojni pokrovi in v tem primeru je posode mogoče prezračevati dvakrat tedensko. Druga možnost je uporaba pokrovov, ki omogočajo neposredno izmenjavo plinov med substratom in ozračjem (npr. gaze). Ker je treba med preskusom vzdrževati dovolj visoko vsebnost vlage, je v tem času nujno nadzorovati težo vsake posode za poskus in po potrebi doliti vodo. Če navojni pokrovi niso na voljo, je to lahko še posebej pomembno. Če se uporablja neprozorna posoda, mora biti pokrov iz materiala, ki omogoča dostop svetlobe (npr. s pomočjo perforiranega prozornega pokrova), pri tem pa mora pršicam preprečevati pobeg. Velikost in vrsta posode sta odvisni od metode ekstrakcije (za podrobnosti glej Dodatek 5). Če je ekstrakcija s toploto uporabljena neposredno v preskusni posodi, je na dno mogoče dodati mrežico z ustrezno velikostjo odprtin (do ekstrakcije zatesnjeno), globina tal pa mora biti zadostna, da omogoča nihanje temperature in vlage. | 9. | Zahtevana je standardna laboratorijska oprema, posebej naslednje: | — | po možnosti steklene posode z navojnimi pokrovi, | — | sušilna omara, | — | stereomikroskop, | — | krtače za prenos pršic, | — | merilnik vrednosti pH in merilnik osvetljenosti, | — | ustrezne natančne tehtnice, | — | ustrezna oprema za uravnavanje temperature, | — | ustrezna oprema za uravnavanje vlažnosti zraka (ni nujna, če so posode za izpostavljanje pokrite s pokrovi), | — | inkubator z uravnavanjem temperature ali majhna soba, | — | oprema za ekstrakcijo (glej Dodatek 5) (13), | — | viseči vir svetlobe z možnostjo uravnavanja, | — | kozarci za zbiranje ekstrahiranih pršic. | Priprava umetnih tal | 10. | Za ta preskus se uporabljajo umetna tla. Umetna tla sestavljajo naslednje sestavine (vse vrednosti temeljijo na suhi masi): | — | 5 % šotnega mahu, posušenega na zraku in fino mletega (sprejemljiva je velikost delcev 2 ± 1 mm), | — | 20 % kaolinske gline (po možnosti naj bo vsebnost kaolinita nad 30 %), | — | približno 74 % na zraku posušenega industrijskega peska (odvisno od potrebne količine CaCO3), v glavnem finega peska z več kot 50 % delcev, ki merijo med 50 in 200 mikroni. Natančna količina peska je odvisna od količine CaCO3 (glej spodaj); skupaj morata obe količini znašati do 75 %, | — | < 1,0 % kalcijevega karbonata (CaCO3, zdrobljenega v prah, analitsko čistega) za doseganje vrednosti pH, ki znaša 6,0 ± 0,5; količina kalcijevega karbonata, ki bo dodana, je lahko odvisna zlasti od kakovosti/značilnosti šote (glej opombo 1). | Opomba 1: potrebna količina CaCO3 bo odvisna od sestavin substrata tal in jo je treba določiti z merjenjem vrednosti pH podvzorcev tal tik pred preskusom (14). | Opomba 2: vsebnost šote v umetnih tleh odstopa od drugih preskusnih metod za organizme tal, pri katerih je v večini primerov uporabljenih 10 % šote (npr. (15)). Vendar običajna kmetijska tla glede na EPPO (16) ne vsebujejo več kot 5 % organske snovi in znižanje vsebnosti šote zato odraža zmanjšane možnosti naravnih tal za sorpcijo preskusne kemikalije na organski ogljik. | Opomba 3: po potrebi, npr. za posebne namene preskušanja, lahko kot preskusni in/ali gojitveni substrat služijo tudi naravna tla z neonesnaženih mest. Vendar pa je treba naravnim tlom, če bodo uporabljena, določiti značilnosti vsaj glede izvora (mesta zbiranja), vrednosti pH, teksture (porazdelitve delcev glede na velikost) in vsebnosti organske snovi. Če sta na voljo, je treba vključiti vrsto in ime tal glede na razvrstitev tal, tla pa ne smejo biti onesnažena. Če je preskusna kemikalija kovina ali organsko-kovinska spojina, je treba določiti tudi sposobnost izmenjave kationov (CEC) naravnih tal. Posebno pozornost je treba nameniti izpolnjevanju meril za veljavnost, saj osnovnih informacij o naravnih tleh običajno ni veliko. | 11. | Suhe sestavine tal se temeljito premešajo (npr. v velikem laboratorijskem mešalniku). Za določanje vrednosti pH se uporablja zmes tal in raztopine 1 M kalijevega klorida (KCl) ali 0,01 M kalcijevega klorida (CaCl2) v razmerju 1: 5 (glej (14) in Dodatek 3). Če so tla bolj kisla, kot je določeno z zahtevanim območjem (glej odstavek 10), jih je mogoče prilagoditi z dodajanjem ustrezne količine CaCO3. Če so tla preveč alkalna, jih je mogoče prilagoditi z dodajanjem večje količine zmesi, sestavljene iz prvih treh sestavin, navedenih v odstavku 10, vendar brez CaCO3. | 12. | Največja zmogljivost zadrževanja vode (water holding capacity – WHC) umetnih tal je določena v skladu s postopki, opisanimi v Dodatku 2. Od dva do sedem dni pred začetkom preskusa se suha umetna tla predhodno navlažijo z dodajanjem zadostne količine destilirane ali deionizirane vode, da je pridobljena približno polovica končne vsebnosti vode, kar je od 40 do 60 % največje zmogljivosti zadrževanja vode. Vsebnost vlage se z dodajanjem raztopine preskusne kemikalije in/ali z dodajanjem destilirane ali deionizirane vode prilagodi na 40–60 % največje zmogljivosti zadrževanja vode (glej odstavke 16– 18). Vsebnost vlage v tleh je treba dodatno preveriti z rahlim stiskanjem tal v roki; če je vsebnost vlage pravilna, se morajo med prsti pojaviti majhne kapljice vode. | 13. | Vsebnost vlage v tleh se določi ob začetku in koncu preskusa s sušenjem na konstantno težo pri 105 °C v skladu s standardom ISO 11465 (17), vrednost pH tal pa v skladu z Dodatkom 3 ali standardom ISO 10390 (14). Te meritve je treba izvesti v dodatnih vzorcih brez pršic, sestavljenih iz kontrolnih tal in tal s posamezno preskusno koncentracijo. Ob preskušanju kislih ali bazičnih kemikalij vrednosti pH tal ni dovoljeno prilagajati. Med celotnim preskusom je treba z rednim tehtanjem posod nadzorovati vsebnost vlage (glej odstavka 20 in 24). | Izbira in priprava preskusnih živali | 14. | Vrsta, uporabljena v preskusu, je Hypoaspis (Geolaelaps) aculeifer (Canestrini, 1883). Za začetek preskusa so potrebne odrasle samice, pridobljene iz sinhronizirane kohorte. Pršice je treba vnesti od 7 do 14 dni po tem, ko odrastejo, 28–35 dni po začetku odlaganja jajčec med sinhronizacijo (glej odstavek 3 in Dodatek 4). Zabeležiti je treba vir pršic ali dobavitelja in vzdrževanje laboratorijske kulture. Če je laboratorijska kultura vzdrževana, je priporočljivo potrjevanje identitete vrste vsaj enkrat na leto. Obrazec s podatki za identifikacijo je priložen v obliki Dodatka 6. | Priprava preskusnih koncentracij | 15. | Preskusna kemikalija se vmeša v tla. Organska topila, ki se uporabljajo kot pomoč pri tretiranju tal s preskusno kemikalijo, je treba izbrati na podlagi njihove nizke strupenosti za pršice, v načrt preskusa pa je treba vključiti ustrezno kontrolo s topilom (glej odstavek 29). | Preskusna kemikalija, topna v vodi | 16. | Raztopina preskusne kemikalije se pripravi v deionizirani vodi v količini, ki zadošča za vse ponovitve ene preskusne koncentracije. Priporočljivo je uporabljati zadostno količino vode, da se doseže zahtevana vsebnost vlage, tj. od 40 do 60 % največje vrednosti WHC (glej odstavek 12). Pred namestitvijo v preskusno posodo se vsaka raztopina preskusne kemikalije temeljito zmeša z eno šaržo predhodno navlaženih tal. | Preskusna kemikalija, ki ni topna v vodi | 17. | Pri kemikalijah, ki niso topne v vodi, so pa topne v organskih topilih, se preskusna kemikalija lahko raztopi v najmanjši mogoči količini primernega vehikla (npr. acetona). Uporabljajo se lahko samo hlapna topila. Pri uporabi takih vehiklov morajo vse preskusne koncentracije in kontrola vsebovati enako najmanjšo količino vehikla. Vehikel se razprši na majhno količino, npr. 10 g, finega kremenovega peska ali pa se z njo zmeša. Skupno vsebnost peska v substratu je treba popraviti glede na to količino. Vehikel se odstrani tako, da vsaj eno uro izhlapeva v digestoriju. Ta zmes kremenovega peska in preskusne kemikalije je dodana predhodno navlaženim tlom in temeljito zmešana z dodajanjem ustrezne količine deionizirane vode, da se doseže zahtevana vlažnost. Končna mešanica se vnese v preskusne posode. Ne pozabite, da so nekatera topila lahko strupena za pršice. Če strupenost topila za pršice ni znana, je zato priporočljiva uporaba dodatne kontrole z vodo brez vehikla. Če je v zadostni meri dokazano, da topilo (v koncentracijah, ki bodo uporabljene) nima učinka, je kontrola z vodo lahko izključena. | Preskusna kemikalija, ki je slabo topna v vodi in organskih topilih | 18. | Pri kemikalijah, ki so slabo topne v vodi in organskih topilih, se ekvivalent 2,5 g fino mletega kremenovega peska na preskusno posodo (na primer 10 g finega kremenovega peska za štiri ponovitve) zmeša z določeno količino preskusne kemikalije, da nastane želena preskusna koncentracija. Skupno vsebnost peska v substratu je treba popraviti glede na to količino. Ta zmes kremenovega peska in preskusne kemikalije se doda predhodno navlaženim tlom ter po dodajanju ustrezne količine deionizirane vode temeljito zmeša, da se doseže zahtevana vsebnost vlage. Končna mešanica se porazdeli v preskusne posode. Postopek se ponovi za vsako preskusno koncentracijo, pripravi pa se tudi ustrezna kontrola. | POSTOPEK | Preskusne in kontrolne skupine | 19. | Za vsako kontrolno in tretirano posodo se priporoča deset odraslih samic v 20 g suhe mase umetnih tal. Preskusne organizme je treba dodati v dveh urah po pripravi substrata za dokončni preskus (tj. po vnosu preskusne snovi). V posebnih primerih (npr. ko staranje velja za odločilni dejavnik) je mogoče čas med pripravo substrata za dokončni preskus in dodajanjem pršic podaljšati (za podrobnosti takšnega staranja glej (18)). Vendar je treba v takšnih primerih podati znanstveno utemeljitev. | 20. | Po dodajanju pršic v tla se pršicam priskrbi hrana, treba pa je tudi izmeriti začetno težo vsake preskusne posode, ki se bo med celotnim preskusom uporabljala kot referenca za nadzor vsebnosti vlage v tleh, kot je opisano v odstavku 24. Nato se preskusne posode pokrijejo, kot je opisano v odstavku 8, in postavijo v preskusno komoro. | 21. | Za vsako od metod nanosa preskusne kemikalije, opisanih v odstavkih od 15 do 18, se pripravijo ustrezne kontrole. Za pripravo kontrol se upoštevajo ustrezni postopki, z izjemo dodajanja preskusne kemikalije. Zato se v kontrole, kjer je primerno, vnesejo organska topila, kremenov pesek ali drugi vehikli v koncentracijah/količinah, kot so uporabljene pri tretiranjih. Če je za dodajanje preskusni kemikaliji uporabljeno topilo ali drug vehikel, je treba pripraviti tudi dodatno kontrolo brez vehikla ali preskusne kemikalije in jo preskusiti, če strupenost topila ni znana (glej odstavek 17). | Preskusni pogoji | 22. | Preskusna temperatura mora znašati 20 ± 2 °C. Temperaturo je treba vsaj enkrat dnevno zabeležiti in jo po potrebi prilagoditi. Preskus se izvaja v nadzorovanih ciklih svetlobe in teme (po možnosti 16 ur svetlobe in 8 ur teme) pri osvetljenosti od 400 do 800 luksov v bližini preskusnih posod. Zaradi primerljivosti so ti pogoji enaki kot v drugih ekotoksikoloških preskusih (npr. (15)). | 23. | Če so uporabljeni navojni pokrovčki, je treba s prezračevanjem preskusnih posod vsaj dvakrat tedensko zagotoviti izmenjavo plinov. Če so uporabljene prevleke iz gaze, je treba posebej paziti na vzdrževanje vsebnosti vlage v tleh (glej odstavka 8 in 24). | 24. | Vsebnost vode v talnem substratu v preskusnih posodah se z rednim tehtanjem preskusnih posod (npr. enkrat na teden) in po potrebi z dolivanjem vode v preskusne posode vzdržuje med celotnim preskusom. Izgube se po potrebi nadomeščajo z deionizirano vodo. Vsebnost vlage med preskusom se od začetne vrednosti ne sme razlikovati za več kot 10 %. | Hranjenje | 25. | Za primeren vir hrane so se izkazali gniloživi sirojedi (Tyrophagus putrescentiae (Schrank, 1781)). Primerni so lahko tudi majhni skakači (npr. mladiči vrste Folsomia candida Willem, 1902, ali Onychiurus fimatus (19), (20), enhitreji (npr. Enchytraeus crypticus, Westheide in Graefe, 1992) ali nematode (npr. Turbatrix silusiae, de Man, 1913)) (21). Hrano je pred uporabo v preskusu priporočljivo preskusiti. Za izpolnjevanje meril za veljavnost morata biti vrsta in količina hrane takšni, da zagotavljata zadostno število mladičev (odstavek 6). Za izbiro plena je treba upoštevati način delovanja preskusne snovi (akaricid je npr. lahko strupen tudi za prehranske pršice, glej odstavek 26). | 26. | Hrano je treba priskrbeti ad libitum (tj. vsakič v majhni količini (konico lopatice)). V ta namen je mogoče uporabiti tudi nizkotlačni sesalnik, kot je predlagano pri preskusu s skakači, ali fin slikarski čopič. Običajno zadošča, če je hrana priskrbljena na začetku preskusa in od dva- do trikrat na teden. Če se zdi, da je preskusna snov za plen strupena, je treba razmisliti o večji pogostosti hranjenja in/ali drugem viru hrane. | Izbira preskusnih koncentracij | 27. | Predhodno poznavanje strupenosti preskusne kemikalije, npr. iz študij za določanje območja delovanja, bi moralo biti v pomoč pri izbiri ustreznih preskusnih koncentracij. Po potrebi se izvede preskus za določanje območja delovanja s petimi koncentracijami preskusne kemikalije v razponu 0,1 – 1 000 mg/kg suhih tal z vsaj eno ponovitvijo za tretirane skupine in kontrole. Preskus za določanje območja delovanja traja 14 dni, po tem pa se določita smrtnost odraslih pršic in število mladičev. Razpon koncentracije v dokončnem preskusu mora biti po možnosti izbran tako, da vključuje koncentracije, pri katerih obstaja vpliv na število mladičev, na preživetje generacije mater pa ne. Vendar to ni mogoče pri kemikalijah, ki pri zelo podobnih koncentracijah povzročajo smrtne in subletalne učinke. S koncentracijami, vključenimi v preskus, bi morala biti zajeta koncentracija z učinkom (npr. EC50, EC25, EC10) in razpon koncentracije, v katerem je zanimiv vpliv preskusne snovi. Ekstrapolacija veliko pod najnižjo koncentracijo, ki vpliva na preskusne organizme, ali veliko nad najvišjo preskušano koncentracijo se sme izvesti le v izjemnih primerih, v poročilu pa mora biti to podrobno razloženo. | Načrt poskusa | Preskusi odziva v odvisnosti od odmerka | 28. | Zato se na podlagi priporočil, ki izhajajo iz drugega krožnega preskusa (preskusa razmnoževanja enhitrejev (22)), predlagajo trije načrti poskusa. Splošna primernost vseh teh načrtov je bila potrjena z rezultatom validacije vrste H. aculeifer. | 29. | Pri določanju razpona koncentracij se upošteva naslednje: | — | za določanje vrednosti ECx (npr. EC10, EC50), je treba preskusiti dvanajst koncentracij. Priporočene so vsaj dve ponovitvi za vsako preskusno koncentracijo in šest kontrolnih ponovitev. Faktor razmika se lahko spreminja, tj. je v pričakovanem območju učinkov lahko manjši ali enak 1,8, pri višjih in nižjih koncentracijah pa je lahko nad 1,8; | — | za določitev vrednosti NOEC je treba preskusiti vsaj pet koncentracij v geometrijski vrsti. Priporočene so štiri ponovitve za vsako preskusno koncentracijo in osem kontrol. Med koncentracijami mora biti razmik, katerega faktor ne sme presegati vrednosti 2,0; | — | kombiniran pristop omogoča določitev vrednosti NOEC in ECx. Treba je uporabiti osem koncentracij za tretiranje v geometrijski vrsti. Priporočene so štiri ponovitve za vsako tretiranje in osem kontrol. Med koncentracijami mora biti razmik, katerega faktor ne sme presegati vrednosti 1,8. | Mejni preskus | 30. | Če pri največji koncentraciji v preskusu za določanje območja delovanja (tj. 1 000 mg/kg suhe teže tal) ni opaženih učinkov, se dokončni preskus razmnoževanja lahko izvede kot mejni preskus s koncentracijo 1 000 mg/kg suhe teže tal. Mejni preskus bo ponudil možnost dokazovanja, da je vrednost NOEC EC10 za razmnoževanje večja od mejne koncentracije, pri čemer bo število pršic, uporabljenih v preskusu, čim manjše. Za tretirana tla in kontrolo je treba uporabiti osem ponovitev. | Trajanje preskusa in meritve | 31. | Zabeležiti je treba vse opažene razlike med vedenjem in morfologijo pršic v kontrolnih in tretiranih posodah. | 32. | Na 14. dan se preživele pršice odstranijo iz tal z ekstrakcijo s toploto/svetlobo ali z drugo ustrezno metodo (glej Dodatek 5). Mladiči (tj. ličinke, protonimfe in deutonimfe) in odrasli osebki se preštejejo ločeno. Vse odrasle pršice, ki jih v tem trenutku ni mogoče najti, je treba zabeležiti kot mrtve, pri čemer se predpostavlja, da so te pršice pred ocenjevanjem umrle in se razkrojile. Učinkovitost ekstrakcije je treba validirati enkrat ali dvakrat na leto z znanimi količinami odraslih osebkov in mladičev. Učinkovitost mora v povprečju znašati več kot 90 %, združeno za vse razvojne faze (glej Dodatek 5). Število odraslih osebkov in število mladičev se ne prilagajata glede na učinkovitost. | PODATKI IN POROČANJE | Obdelava rezultatov | 33. | Informacije o statističnih metodah, ki se lahko uporabijo za analizo rezultatov preskusa, so podane v odstavkih od 36 do 41. Poleg tega je treba upoštevati dokument OECD št. 54 z naslovom ‚Sodobni pristopi pri statistični analizi podatkov o ekotoksičnosti: smernice za uporabo‘ (31). | 34. | Glavna končna točka preskusa je sposobnost razmnoževanja, v tem primeru število mladičev, ustvarjenih na ponovitveno preskusno posodo (z vnesenimi 10 odraslimi samicami). Statistična analiza za sposobnost razmnoževanja zahteva izračun aritmetične sredine (X) in variance (s2) na tretirano skupino in kontrolo. Vrednosti X in s2 se uporabljata za postopke analize variance, kot so Studentov t-preskus, Dunnettov preskus in Williamsov preskus, ter za izračun 95-odstotnih intervalov zaupanja. | Opomba: ta glavna končna točka je enaka plodnosti, merjeni v obliki števila živečih mladičev, ustvarjenih med preskusom, deljenega s številom starševskih samic, vnesenih na začetku preskusa. | 35. | Število preživelih samic v netretiranih kontrolah je glavno merilo za veljavnost in ga je treba dokumentirati. V končno poročilo je treba, tako kot pri preskusu za določanje območja delovanja, zabeležiti tudi vse druge škodljive znake. | Vrednost ECx | 36. | Vrednosti ECx, vključno z njihovimi pripadajočimi zgornjimi in spodnjimi 95-odstotnimi mejami zaupanja za parameter, opisanimi v odstavku 34, se izračunajo z ustreznimi statističnimi metodami (npr. z analizo probit, logistično ali Weibullovo funkcijo, prilagojeno metodo Spearman-Karber ali enostavno interpolacijo). Vrednost ECx je pridobljena tako, da je v navedeno enačbo vstavljena vrednost, ki ustreza x % srednje vrednosti kontrole. Za izračun vrednosti EC50 ali katere koli druge vrednosti ECx je treba srednjo vrednost glede na tretirano skupino (X) analizirati z regresijsko analizo. | Vrednost NOEC/LOEC | 37. | Če je statistična analiza namenjena določanju vrednosti NOEC/LOEC, je potrebna statistika glede na posodo (posamezne posode se štejejo za ponovitve). Uporabljene morajo biti ustrezne statistične metode (v skladu z dokumentom OECD št. 54 z naslovom ‚Sodobni pristopi pri statistični analizi podatkov o ekotoksičnosti: smernice za uporabo‘. V splošnem se s pomočjo enostransko zastavljenega (manj obsežnega) preskušanja domnev pri p ≤ 0,05 proučijo škodljivi učinki preskusne snovi v primerjavi s kontrolo. Primeri so podani v naslednjih odstavkih. | 38. | Normalno porazdelitev podatkov je mogoče preskusiti npr. s preskusom ustreznosti Kolmogorov-Smirnov, preskusom razmerja med variacijskim razmikom in standardnim odklonom (preskusom R/s) ali Shapiro-Wilkovim preskusom (dvostranskim, p ≤ 0,05). Za preskus homogenosti variance se lahko uporabi Cochranov, Levenov ali Bartlettov preskus (dvostranski, p ≤ 0,05). Če so izpolnjeni predpogoji postopkov parametričnega preskusa (normalnosti, homogenosti variance), je mogoče izvesti enofaktorsko analizo variance (enofaktorsko ANOVA) in nato preskuse večkratne primerjave. Za izračun, ali obstajajo značilne razlike (p ≤ 0,05) med kontrolami in različnimi koncentracijami preskusnih snovi (izbira priporočljivega preskusa na podlagi dokumenta OECD št. 54 z naslovom Sodobni pristopi pri statistični analizi podatkov o ekotoksičnosti: smernice za uporabo) je mogoče uporabiti večkratne primerjave (npr. Dunnettov t-preskus) ali regresivne trendnostne preskuse (npr. Williamsov preskus v primeru monotonega razmerja odmerek-odziv). V nasprotnem primeru je treba za določanje vrednosti NOEC in LOEC uporabiti neparametrične metode (npr. Bonferronijev U-preskus v skladu s trendnostnim preskusom po Holmu ali Jonckheere-Terpstraju). | Mejni preskus | 39. | Če je izveden mejni preskus (primerjava kontrole in samo ene tretirane skupine) in če so izpolnjeni predpogoji postopkov parametričnega preskusa (normalnost, homogenost), je mogoče s Studentovim preskusom (t-preskusom) preveriti odzive metrik. Če te zahteve niso izpolnjene, je mogoče uporabiti t-preskus za neenake variance (Welchev t-preskus) ali neparametrični preskus, kot je Mann-Whitneyjev U-preskus. | 40. | Za določanje značilnih razlik med kontrolami (kontrolo in kontrolo s topilom) je mogoče ponovitve vsake kontrole preskusiti, kot je opisano za mejni preskus. Če ti preskusi ne zaznajo značilnih razlik, je mogoče vse ponovitve kontrol in kontrol s topilom združiti. V nasprotnem primeru je treba vse tretirane vzorce primerjati s kontrolo s topilom. | Poročilo o preskusu | 41. | Poročilo o preskusu mora vključevati vsaj naslednje informacije: | — | Preskusna kemikalija | — | identiteta preskusne kemikalije, ime, serija, skupina in številka CAS, čistost, | — | fizikalno-kemijske lastnosti preskusne kemikalije (npr. log Kow, topnost v vodi, parni tlak, Henryjevo konstanto (H) in po možnosti informacije o usodi preskusne kemikalije v tleh). | — | Preskusni organizmi | — | identifikacijski podatki in podatki o dobavitelju preskusnih organizmov, opis gojitvenih pogojev, | — | razpon starosti preskusnih organizmov. | — | Preskusni pogoji | — | opis načrta in postopkov poskusa, | — | podrobnosti o pripravi preskusnih tal; podrobno specifikacijo, če so uporabljena naravna tla (izvor, zgodovina, porazdelitev delcev glede na velikost, vrednost pH, vsebnost organske snovi in, če je na voljo, razvrstitev tal), | — | največja zmogljivost zadrževanja vode, | — | opis tehnike, uporabljene za nanos preskusne kemikalije na tla, | — | podrobnosti o pomožnih kemikalijah, uporabljenih za dodajanje preskusne kemikalije, | — | velikost preskusnih posod in suha masa preskusnih tal na posodo, | — | preskusni pogoji: obsevanost, trajanje ciklov svetlobe in teme, temperatura, | — | opis režima hranjenja, vrsta in količina hrane, uporabljene v preskusu, datumi hranjenja, | — | vrednost pH in vsebnost vode v tleh na začetku preskusa in med njim (v kontroli in vsaki tretirani skupini), | — | podroben opis metode ekstrakcije in učinkovitosti ekstrakcije. | — | Rezultati preskusa | — | število mladičev, ugotovljenih v vsaki preskusni posodi ob koncu preskusa, | — | število odraslih samic in smrtnost odraslih osebkov ( %) v vsaki preskusni posodi ob koncu preskusa, | — | opis očitnih simptomov ali jasnih sprememb vedenja, | — | rezultati, pridobljeni z referenčno preskusno kemikalijo, | — | statistični povzetek (vrednost ECx in/ali NOEC), vključno s 95-odstotnimi mejami zaupanja, in opis metode izračuna, | — | grafični prikaz razmerja med koncentracijo in odzivom, | — | odstopanja od postopkov, opisanih v tej preskusni metodi, in morebitni nenavadni dogodki med preskusom. | LITERATURA | (1) | Casanueva, M. E. (1993). Phylogenetic studies of the free-living and arthropod associated Laelapidae (Acari: Mesostigmata). Gayana Zool. 57, 21–46. | (2) | Tenorio, J. M. (1982). Hypoaspidinae (Acari: Gamasida: Laelapidae) of the Hawaiian Islands. Pacific Insects 24, 259–274. | (3) | Bakker, F. M., Feije, R., Grove, A. J., Hoogendorn, G., Jacobs, G., Loose, E. D., in van Stratum, P. (2003). A laboratory test protocol to evaluate effects of plant protection products on mortality and reproduction of the predatory mite Hypoaspis aculeifer Canestrini (Acari: Laelapidae) in standard soil. JSS – Journal of Soils and Sediments 3, 73–77. | (4) | Karg, W. (1993). Die freilebenden Gamasina (Gamasides), Raubmilben. 2. izdaja. V: Dahl, F. (Hrsg.): Die Tierwelt Deutschlands 59. Teil, G. Fischer, Jena, 523 str. | (5) | Ruf, A. (1991). Do females eat males?: Laboratory studies on the popualation development of Hypoaspis aculeifer (Acari: Parasitiformes). V: Dusbabek,F. in Bukva, V. (ur.): Modern Acarology. Academia Prague & SPD Academic Publishing bv, The Hague, Vol. 2, 487–492. | (6) | Ruf, A. (1995). Sex ratio and clutch size control in the soil inhabiting predatory mite Hypoaspis aculeifer (Canestrini 1883) (Mesostigmata, Dermanyssidae). Proc. 2nd Symp. EURAAC: str. 241–249. | (7) | Ruf, A. (1996). Life-history patterns in soil-inhabiting mesostigmatid mites. Proc. IXth Internat. Congr. Acarol. 1994, Columbus, Ohio: str. 621–628. | (8) | Krogh, P. H., in Axelsen, J. A. (1998). Test on the predatory mite Hypoaspis aculeifer preying on the collembolan Folsomia fimetaria. V: Lokke, H. in van Gestel, C. A. M.: Handbook of soil invertebrate toxicity tests. John Wiley Sons, Chichester, str. 239–251. | (9) | Løkke, H., Janssen, C. R., Lanno, R. P., Römbke, J., Rundgren, S., in Van Straalen, N. M. (2002). Soil Toxicity Tests – Invertebrates. V: Test Methods to Determine Hazards of Sparingly Soluble Metal Compounds in Soils. Fairbrother, A., Glazebrook, P. W., Van Straalen, N. M. in Tarazona, J. V. (ur.). SETAC Press, Pensacola, ZDA. 128 str. | (10) | Schlosser, H.-J., in Riepert, F. (1991/92). Entwicklung eines Prüfverfahrens für Chemikalien an Bodenraubmilben (Gamasina). 1. del: Biologie der Bodenraubmilbe Hypoaspis aculeifer Canestrini, 1883 (Gamasina) unter Laborbedingungen. Zool. Beiträge, 34, 395–433. | (11) | Schlosser, H.-J., in Riepert, F. (1992). Entwicklung eines Prüfverfahrens für Chemikalien an Boden-raubmilben (Gamasina). 2. del: Erste Ergebnisse mit Lindan und Kaliumdichromat in subletaler Dosierung. Zool. Beitr. N. F. 34, 413–433. | (12) | Heckmann, L.-H., Maraldo, K., in Krogh, P. H. (2005). Life stage specific impact of dimethoate on the predatory mite Hypoaspis aculeifer Canestrini (Gamasida: Laelapidae). Environmental Science & Technology 39, 7154–7157. | (13) | Petersen, H. (1978). Some properties of two high-gradient extractors for soil microarthropods, and an attempt to evaluate their extraction efficiency. Natura Jutlandica 20, 95– 122. | (14) | ISO (Mednarodna organizacija za standardizacijo) (1994). Kakovost tal – Določevanje pH, št. 10390. ISO, Ženeva. | (15) | Poglavje C.8 te priloge, Strupenost za deževnike. | (16) | EPPO (2003): EPPO Standards. Environmental risk assessment scheme for plant protection products. Poglavje 8. Soil Organisms and Functions. Bull. OEPP/EPPO Bull. 33, 195–209. | (17) | ISO (Mednarodna organizacija za standardizacijo) (1993). Kakovost tal – Ugotavljanje suhe snovi in vsebnosti vode na osnovi mase – Gravimetrijska metoda, št. 11465. ISO, Ženeva. | (18) | Fairbrother, A., Glazebrock, P. W., Van Straalen, N. M., in Tarazona, J. V. (2002). Test methods to determine hazards of sparingly soluble metal compounds in soils. SETAC Press, Pensacola, FL, ZDA. | (19) | Chi, H. 1981. Die Vermehrungsrate von Hypoaspis aculeifer Canestrini (Acarina, Laelapidae) bei Ernährung mit Onychiurus fimatus Gisin (Collenbola). Ges. allg. angew. Ent. 3:122– 125. | (20) | Schlosser, H. J., in Riepert, F. 1992. Entwicklung eines Prüfverfahrens für Chemikalien an Bodenraubmilden (Gamasina). Zool. Beitr. N. F. 34(3):395–433. | (21) | Heckmann, L.-H., Ruf, A., Nienstedt, K. M., in Krogh, P. H. 2007. Reproductive performance of the generalist predator Hypoaspis aculeifer (Acari: Gamasida) when foraging on different invertebrate prey. Applied Soil Ecology 36, 130– 135. | (22) | Poglavje C.32 te priloge, Preskus razmnoževanja enhitrejev. | (23) | ISO (Mednarodna organizacija za standardizacijo) (1994). Soil Quality – Effects of pollutants on earthworms (Eisenia fetida). Part 2: Determination of effects on reproduction, št. 11268-2. ISO, Ženeva. | (24) | Southwood, T. R. E. (1991). Ecological methods. With particular reference to the study of insect populations. (2. izdaja). Chapman & Hall, London, 524 str. | (25) | Dunger, W., in Fiedler, H. J. (1997). Methoden der Bodenbiologie (2. izdaja). G. Fischer, Jena, 539 str. | (26) | Lesna, I., in Sabelis, M. W. (1999). Diet-dependent female choice for males with ‚good genes‘ in a soil predatory mite. Nature 401, 581–583. | (27) | Ruf, A. (1989). Die Bedeutung von Arrhenotokie und Kannibalismus für die Populationsentwicklung von Hypoaspis aculeifer (Canestrini 1883) (Acari, Gamasina). Mitt. Deut. Ges. Allg. Angew. Ent. 7, 103– 107. | (28) | Ruf, A. (1993). Die morphologische Variabilität und Fortpflanzungsbiologie der Raubmilbe Hypoaspis aculeifer (Canestrini 1883) (Mesostigmata, Dermanyssidae). Dissertation, Universität Bremen. | (29) | Ignatowicz, S. (1974). Observations on the biology and development of Hypoaspis aculeifer Canestrini, 1885 (Acarina, Gamasides). Zoologica Poloniae 24, 11–59. | (30) | Kevan, D. K. McE., in Sharma, G. D. (1964). Observations on the biology of Hypoaspis aculeifer (Canestrini, 1884), apparently new to North America (Acarina: Mesostigmata: Laelaptidae). Acarologia 6, 647–658. | (31) | OECD (2006c). Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application. OECD environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment, št. 54. ENV/JM/MONO(2006)18. | Dodatek 1 | Opredelitve pojmov | Pri tej preskusni metodi se uporabljajo naslednje opredelitve (v tem preskusu so vse učinkovite koncentracije izražene kot masa preskusne kemikalije na suho maso preskusnih tal): | Kemikalija pomeni snov ali zmes. | NOEC (koncentracija brez opaznega učinka) je koncentracija preskusne kemikalije, pri kateri ni opaznega učinka. V tem preskusu koncentracija, ki ustreza vrednosti NOEC, v danem obdobju izpostavljenosti v primerjavi s kontrolo nima statistično značilnega učinka (p < 0,05). | LOEC (najnižja koncentracija z opaznim učinkom) je najnižja koncentracija preskusne kemikalije, ki ima v danem obdobju izpostavljenosti v primerjavi s kontrolo statistično značilen učinek (p < 0,05). | ECx (učinkovita koncentracija za x-odstotni učinek) je koncentracija, ki na preskusnih organizmih v danem obdobju izpostavljenosti v primerjavi s kontrolo učinkuje x-odstotno. Vrednost EC50 je, na primer, koncentracija, pri kateri je ocenjeno, da na končno točko preskusa učinkuje 50-odstotno glede na izpostavljeno populacijo v določenem obdobju izpostavljenosti. | Preskusna kemikalija je snov ali zmes, preskušena s to preskusno metodo. | Dodatek 2 | Določanje največje zmogljivosti zadrževanja vode | Kot primerna velja naslednja metoda za določanje največje zmogljivosti zadrževanja vode v tleh. Opisana je v Dodatku C standarda ISO DIS 11268-2 (Kakovost tal – Vpliv onesnaževal na deževnike (Eisenia fetida). 2. del: Določevanje vplivov na razmnoževanje (23)). | S primerno napravo za vzorčenje (svedrastim vzorčevalnikom itd.) zberite določeno količino (npr. 5 g) substrata preskusnih tal. Pokrijte dno vzorčevalnika s koščkom filtrirnega papirja, napolnjenega z vodo, in vzorčevalnik nato postavite na stojalo v vodno kopel. Vzorčevalnik je treba postopoma potapljati, dokler nivo vode ni nad zgornjim delom tal. Nato ga je treba pustiti v vodi približno tri ure. Ker ni mogoče zadržati vse vode, ki jo absorbirajo talne kapilare, mora biti omogočeno, da se vzorec tal dve uri suši, tako da se vzorčevalnik postavi na ležišče iz zelo mokrega, fino mletega kremenovega peska, ki je nameščen v pokriti posodi (da se ne posuši). Nato je treba vzorec stehtati in pri 105 °C posušiti na konstantno maso. Zmogljivost zadrževanja vode (WHC) je nato mogoče izračunati po naslednjem postopku: | pri čemer je: | S= z vodo nasičeni substrat + masa vzorčevalnika + masa filtrirnega papirja, | T= tara (masa vzorčevalnika + masa filtrirnega papirja), | D= suha masa substrata. | Dodatek 3 | Določanje vrednosti pH tal | Naslednja metoda za določanje vrednosti pH tal temelji na opisu v ISO 10390: Kakovost tal – Določevanje pH (16). | Določena količina tal se pri sobni temperaturi suši vsaj 12 ur. Nato se izdela suspenzija tal (ki vsebuje vsaj 5 gramov tal) v petkratni količini volumna tal z 1 M analitsko čistega kalijevega klorida (KCl) ali 0,01 M raztopine analitsko čistega kalcijevega klorida (CaCl2). Suspenzija se nato pet minut temeljito stresa in se nato vsaj 2 uri in največ 24 ur pusti, da se usede. Vrednost pH tekoče faze se nato meri z merilnikom vrednosti pH, ki je pred vsako meritvijo umerjen z ustreznimi vrstami pufrskih raztopin (npr. pH 4,0 in 7,0). | Dodatek 4 | Gojenje vrste Hypoaspis (Geolaelaps) aculeifer, prehranske pršice in sinhronizacija kulture | Gojenje vrste Hypoaspis (Geolaelaps) aculeifer: | Kulture je mogoče hraniti v plastičnih posodah ali steklenih kozarcih, napolnjenih z zmesjo mavca/oglenega prahu (v razmerju 9: 1). Vlažnost mavca je po potrebi mogoče vzdrževati z dodajanjem nekaj kapljic destilirane ali deionizirane vode. Temperature gojenja so optimalne, če so v območju 20 ± 2 °C, režim svetlobe/teme pa za to vrsto ni pomemben. Plen so lahko pršice vrste Typrophagus putrescentiae ali Caloglyphus (s prehranskimi pršicami je treba ravnati previdno, ker lahko pri ljudeh povzročajo alergije), za plen pa so primerni tudi nematode, enhitreji ali skakači. Njihov vir mora biti zabeležen. Razvoj populacije je mogoče začeti z eno samo samico, ker se samci razvijejo iz neoplojenih jajčec. Generacije se večinoma prekrivajo. Samica lahko živi vsaj 100 dni in lahko med svojo življenjsko dobo odloži približno 100 jajčec. Največja hitrost odlaganja jajčec je dosežena med 10. in 40. dnem (po tem, ko samica odraste) in znaša 2,2 jajčeca na samico na dan. Čas razvoja od jajčeca do odrasle samice je približno 20 dni pri temperaturi 20 °C. Predhodno je treba vzdrževati in hraniti več kot eno kulturo. | Gojenje vrste Typrophagus putrescentiae: | Pršice so gojene v stekleni posodi, napolnjeni s finim prahom pivskega kvasa, ki je za preprečevanje pobega nameščen v plastično vedro, napolnjeno z raztopino KNO3. Prehranske pršice se namestijo na vrh tega prahu. Nato se s pomočjo lopatice previdno zmešajo s prahom (ki ga je treba menjati dvakrat na teden). | Sinhronizacija kulture: | Osebki, uporabljeni v preskusu, morajo biti podobne starosti (približno 7 dni po tem, ko dosežejo fazo odraslosti). To se pri temperaturi gojenja 20 °C doseže na naslednji način: | Samice prenesite v čisto posodo za gojenje in dodajte dovolj hrane. | — | Dopustite od dva do tri dni za odlaganje jajčec, odstranite samice. | — | Odrasle samice med 28. in 35. dnem po tem, ko ste jih začeli nameščati v čiste posode za gojenje, odstranite za preskušanje. | Odrasle samice je mogoče zlahka ločiti od samcev in drugih razvojnih faz, ker so večje in bolj nabreknjene oblike ter imajo rjav dorzalni ščit (samci so vitkejši in ploski); barva neodraslih osebkov sega od bele do smetanaste. Razvoj pršic poteka približno po spodaj opisanem vzorcu, ki velja za temperaturo 20 °C (slika): jajčece 5 dni, ličinka 2 dni, protonimfa 5 dni, deutonimfa 7 dni, obdobje pred samičinim odlaganjem jajčec 2 dni. Potem so pršice odrasle. | Slika | Razvoj vrste Hypoaspis (Geolaelaps) aculeifer pri temperaturi 20 °C (odstranitev = samice, uporabljene za preskus). | 30 | 20 days | 10 | 0 | 35d | Removal | 28d | Adult | Deutonymph | Protonymph | Larva | Egg | egglaying | Odrasle preskusne živali se odstranijo iz sinhronizirane kulture in vnesejo v preskusne posode med 28. in 35. dnem po tem, ko so starševske samice začele odlagati jajčeca (tj. 7–14 dni po tem, ko so postale odrasle). S tem je zagotovljeno, da so preskusne živali že prešle obdobje pred odlaganjem jajčec in so se parile s samci, ki so tudi prisotni v posodi za gojenje. Opažanja pri laboratorijskih kulturah kažejo, da se samice parijo takoj ali kmalu po tem, ko odrastejo, če so prisotni samci (Ruf, Vaninnen, osebno opažanje). Obdobje sedmih dni je določeno zato, da je integracija v laboratorijsko rutino lažja in da je variabilnost razvoja posameznih osebkov med pršicami manjša. Obdobje odlaganja jajčec se mora začeti z vsaj enakim številom samic, ki je sčasoma potrebno za preskus (če je za preskus, na primer, potrebnih 400 samic, je treba dva ali tri dni omogočati odlaganje jajčec vsaj 400 samicam). Začetna točka za sinhronizirano populacijo mora biti vsaj 1 200 jajčec (razmerje med spoloma mora biti približno 0,5, smrtnost približno 0,2). Za preprečitev kanibalizma naj se v eni posodi ne goji več kot 20–30 samic, ki odlagajo jajčeca. | Dodatek 5 | Metode ekstrakcije | Ustrezna metoda za ločevanje osebkov iz tal/substrata pri mikropodih je ekstrakcija s toploto (glej spodnjo sliko). Metoda temelji na dejavnosti organizmov, zato je mogoče zabeležiti le mobilne osebke. Načelo ekstrakcije s toploto je postopno poslabševanje pogojev za organizme v vzorcu, tako da bodo zapustili substrat in padli v fiksirno tekočino (npr. etanol). Ključni točki sta trajanje ekstrakcije in poslabševanje pogojev za organizme od dobrih prek srednjih do slabih. Ekstrakcija mora biti pri ekotoksikoloških preskusih čim krajša, saj bi kakršna koli rast populacije med obdobjem ekstrakcije pokvarila rezultate. Po drugi strani morajo biti pogoji glede temperature in vlage v vzorcu vedno v takšnem območju, ki pršicam omogoča gibanje. Ogrevanje vzorca tal izsuši substrat. Če je izsuševanje prehitro, se lahko izsušijo tudi nekatere pršice, še preden uspejo pobegniti. | Zato je predlagan naslednji postopek (24) (25): | Naprava: Tullgrenovi lijaki ali primerljive metode, kot je npr. McFadyenova (ogrevanje od zgoraj, vzorec je položen nad lijak). | Režim ogrevanja: 25 °C za 12 ur, 35 °C za 12 ur, 45 °C za 24 ur (skupaj 48 ur). Temperaturo je treba meriti v substratu. | Fiksirna tekočina: 70-odstotni etanol | Podrobnosti: vzemite stekleno fiolo, ki je bila uporabljena v preskusu. Odstranite pokrov in okrog odprtine ovijte kos mreže ali tkanine. Velikost očesa na mrežici tkanine mora biti od 1,0 do 1,5 mm. Tkanino pritrdite z elastičnim trakom. Fiolo previdno obrnite okrog in jo postavite v napravo za ekstrakcijo. Tkanina preprečuje, da bi substrat pronical v fiksirno tekočino, pršicam pa omogoča, da lahko zapustijo vzorec. Z režimom ogrevanja začnite po tem, ko so vstavljene vse fiole. Ekstrakcijo končajte po 48 urah. Odstranite fiksirne fiole in s stereomikroskopom preštejte pršice. | Učinkovitost ekstrakcije pri izbrani metodi mora biti dokazana enkrat ali dvakrat letno z uporabo posod, ki vsebujejo znano število mladih in odraslih pršic, gojenih v netretiranem preskusnem substratu. Učinkovitost mora v povprečju znašati ≥ 90 %, združeno za vse razvojne faze. | Tullgrenova vrsta naprave za ekstrakcijo | Heat source | Vial of alcohol | Wire mesh barrier | Sample goes here | Način priprave preskusne fiole po koncu preskusa, pred ekstrakcijo | Test vessel | Elastic band | Mesh/fabric | Test substrate with mites | Dodatek 6 | Identifikacija vrste Hypoaspis (Geolaelaps) aculeifer | Podrazred/red/podred: | | Družina: | | Rod/podrod/vrsta: | Acari/Parasitiformes/Gamasida | | Laelapidae | | Hypoaspis (Geolaelaps) aculeifer | Avtor in datum: | Dr. F. Faraji, (MITOX), 23. januar 2007. | Uporabljena literatura: | Karg, W. (1993). Die freilebenden Gamasina (Gamasides), Raubmilben. Tierwelt Deutschlands 59, druga, revidirana izdaja: 1–523. | Hughes, A. M. (1976). The mites of stored food and houses. Ministry of Agriculture, Fisheries and Food, Technical Bulletin 9: 400 str. | Krantz, G. W. (1978). A manual of Acarology. Oregon State University Book Stores, Inc., 509 str. | Določevalne lastnosti: | Tektum z zaokroženim zobčastim robom; žlebiči hipostome z več kot 6 dentikli; kavdalne dorzalne sete Z4 niso zelo dolge; dlakaste dorzalne sete; normalen genitalni ščit, ni zelo povečan in ne dosega analnega ščita; zadnja polovica dorzalnega ščita brez set, ki nimajo parov; noge II in IV z nekaj gostimi makrosetami; dorzalna seta Z5 približno dvakrat daljša od J5; fiksni člen helicere z 12–14 zobmi in gibljivi člen z 2 zoboma; idiosoma dolga 520–685 μm. | Vrsta Hypoaspis miles se uporablja tudi pri biološkem nadzoru in jo je mogoče zamenjati z vrsto H. aculeifer. Glavna razlika je naslednja: | vrsta H. miles pripada podrodu Cosmolaelaps in ima dorzalne sete v obliki noža, vrsta H. aculeifer pa pripada podrodu Geolaelaps in ima dorzalne sete v obliki ščetin. | Izvime skice F. Faraji | Noga IV (samica) | Noga II (samica) | Hypoaspis aculeifer, dorzalni ščit z značilnimi setami | Hypoaspis miles po Hughes, 1976 | Hypoaspis aculeifer po Hughes, 1976 | 100 μm | 100 μm | 100 μm | 100 μm | 100 μm | Dodatek 7 | Osnovne informacije o biologiji vrste hypoaspis (geolaelaps) aculeifer | Vrsta Hypoaspis aculeifer pripada družini Lealapidae, redu Acari (pršice), razredu Arachnida, plemenu Arthropoda. Njeni pripadniki živijo v vseh vrstah tal in se hranijo z drugimi pršicami, nematodami, enhitreji in skakači (26). Če je hrane premalo, preidejo na kanibalizem (27). Telo plenilskih pršic je segmentirano na idiosomo in gnatosomo. Manjka jasno razločevanje idiosome v prosomi (glavi) in opistosomi (zadku). Gnatosoma (ščit glave) vsebuje organe za hranjenje, kot so palpi in helicere. Helicere so razcepljene na tri dele in imajo zobe različnih oblik. Razen za zaužitje hrane samci svoje helicere uporabljajo v glavnem za prenos spermatoforov v samice. Dorzalni ščit idiosomo pokriva skoraj v celoti. Velik del idiosome pri samici zavzemajo reproduktivni organi, ki so še posebej razločni tik pred odlaganjem jajčec. Ventralno je mogoče najti dva ščita, sternalnega in genitalnega. Vse noge imajo ščetine in trne. S ščetinami se pršice pri premikanju ali na površini tal zasidrajo. Prvi par nog v glavnem uporabljajo kot antene. Drugi par nog uporabljajo ne le za premikanje, temveč tudi za to, da se pritrdijo na plen. Trni četrtega para nog lahko služijo kot zaščita, pa tudi kot ‚pogon‘ (28). Samci v dolžino merijo 0,55–0,65 mm, tehtajo pa 10–15 μg. Samice v dolžino merijo 0,8–0,9 mm, tehtajo pa 50–60 μg (8)(28) (slika 1). | Slika 1 | Samica, samec, protonimfa in ličinka vrste H. aculeifer. | Pri temperaturi 23 °C pršice spolno dozorijo po 16 dneh (samice) oziroma 18 dneh (samci) (6). Samice prenašajo spermije v spolni odprtini, od koder bodo nato preneseni v jajčnik. V jajčniku spermiji zorijo in se shranijo. Do oploditve pride šele, ko spermiji v jajčniku dozorijo. Samice bodo oplojena ali neoplojena jajčeca odložile v grudah ali ločeno, po možnosti v špranje ali odprtine. Pršice, ki so se parile, lahko nosijo mladiče obeh spolov, iz jajčec samic, ki se niso parile, pa se izležejo samo mladiči moškega spola. Pršica v času razvoja do odraslosti preide štiri faze (jajčece – ličinka, ličinka – protonimfa, protonimfa – deutonimfa, deutonimfa – odrasli osebek). | Jajčece je mlečno belo, prosojno, ovalno in dolgo približno 0,37 mm ter ima trdno ovojnico. Glede na (8) ličinke merijo 0,42–0,45 mm. Imajo le tri pare nog. Na področju glave se razvijejo palpi in helicere. Helicere se uporabljajo za izvalitev iz jajčeca, saj imajo nekaj majhnih dentiklov. Po prvi levitvi, 1–2 dni po izvalitvi, se razvijejo protonimfe. Prav tako so bele, merijo 0,45–0,62 mm (8) in imajo štiri pare nog. Prisotni so vsi zobje na helicerah. Pršice v tem stadiju začnejo iskati hrano. V ta namen s helicerami prebodejo kutikulo plena in v plen izbrizgajo izloček za zunajčrevesno prebavo. Nato pršica hrano v obliki kaše lahko posrka. Helicere lahko uporabijo tudi za trganje večjih delov hrane (28). Po še eni levitvi se razvijejo deutonimfe. Merijo 0,60–0,80 mm (8) in so rumene do svetlo rjave barve. V tej fazi jih je mogoče ločiti na samice in samce. Po dodatni levitvi, med katero živali niso dejavne in se razvija rjavi ščit (po približno 14 dneh), pršice postanejo odrasle (28)(29)(30). Pri temperaturi 25 °C je njihova življenjska doba med 48 in 100 dnevi (27). | Dodatek 8 | Povzetek in časovni razpored glavnih ukrepov, ki jih je treba izvesti za preskus z vrsto hypoaspis | Čas (dnevi) | začetek preskusa = dan 0 | Dejavnost/opravilo | Dan od – 35 | do – 28 | Prenesite samice iz založne kulture v čiste posode, da začnete sinhronizacijo. | Dva dni pozneje: odstranitev samic. | Dva- do trikrat na teden: priskrbite dovolj hrane. | Dan – 5 (± 2) | Pripravite umetna tla. | Dan – 4 (± 2) | Določite WHC umetnih tal. | Čez noč posušite. | Naslednji dan: stehtajte vzorce in izračunajte WHC. | Dan – 4 (± 2) | Predhodno navlažite umetna tla, da dosežete 20–30 % WHC. | Dan 0 | Začnite preskus: dodajte preskusno kemikalijo umetnim tlom. | V vsako ponovitev vnesite 10 samic. | Stehtajte vsako ponovitev. | Pripravite abiotske kontrole za vsebnost vlage in vrednost pH, 2 ponovitvi za vsako tretiranje. | Čez noč posušite kontrole vlage. | Naslednji dan: stehtajte kontrole vlage. | Naslednji dan: izmerite vrednost pH posušenih abiotskih kontrol. | Dnevi 3, 6, 9, 12 (pribl.) | Vsaki ponovitvi priskrbite zadostno količino organizmov, ki predstavljajo plen. | Vsako ponovitev stehtajte in sčasoma dodajte izhlapelo vodo. | Dan 14 | Dokončajte preskus, pripravite ekstrakcijo za vse ponovitve in kontrole učinkovitosti ekstrakcije. | Čez noč posušite kontrole vsebnosti vode. | Naslednji dan: stehtajte kontrole vsebnosti vode. | Naslednji dan: izmerite vrednost pH posušenih kontrol. | Dan 16 | Dokončajte ekstrakcijo. | Dan 16+ | Zabeležite število odraslih osebkov in mladičev v ekstrahiranem materialu. | O rezultatih poročajte v obliki preglednic. | O postopku preskušanja poročajte na listih za protokol preskusa. | C.37 21-DNEVNI PRESKUS RIB: KRATKOTRAJNO PRESEJALNO PRESKUŠANJE ESTROGENEGA IN ANDROGENEGA DELOVANJA TER ZAVIRANJA AROMATAZE | UVOD | 1. | Ta preskusna metoda ustreza Smernici za preskušanje OECD (TG) 230 (2009). Preskus rib, s katerim je mogoče zaznati nekatere kemikalije z endokrinim delovanjem, je treba razviti in validirati zaradi pomislekov, da bi lahko okoljske ravni kemikalij zaradi interakcije teh kemikalij z endokrinim sistemom povzročile škodljive učinke za ljudi in prostoživeče živali. OECD se je leta 1998 začela ukvarjati s prednostno nalogo revidiranja obstoječih smernic ter priprave novih smernic za presejalne preskuse in preskušanje potencialnih povzročiteljev endokrinih motenj. Del naloge je bila priprava smernic za presejalno preskušanje kemikalij, ki so aktivne v endokrinem sistemu ribjih vrst. 21-dnevni presejalni preskus endokrinega delovanja pri ribah je prestal obsežen validacijski program, ki je vključeval medlaboratorijske študije z izbranimi kemikalijami, s katerimi sta bili dokazani ustreznost in zanesljivost preskusa za zaznavanje estrogenih kemikalij in kemikalij, ki zavirajo aromatazo (1) (2) (3) (4) (5), pri treh proučevanih vrstah rib (črnoglavem pisancu, japonski medaki in cebrici); zaznavanje androgenega delovanja je mogoče pri črnoglavem pisancu in medaki, vendar ne pri cebrici. S to preskusno metodo ni mogoče zaznati antiandrogenih kemikalij. Delo v zvezi z validacijo je pregledala skupina strokovnjakov, ki so jih imenovali nacionalni koordinatorji programa smernic za preskušanje (6). Preskus ni namenjen opredelitvi posebnih mehanizmov hormonskih motenj, ker imajo živali nepoškodovano os hipotalamus – hipofiza – spolne žleze (HPG), ki se lahko odziva na kemikalije, ki vplivajo na os HPG na različnih ravneh. Kratkotrajni preskus razmnoževanja rib (OECD TG 229) vključuje plodnost in, kot je primerno, histopatologijo spolnih žlez črnoglavega pisanca ter vse končne točke, ki jih zajema ta preskusna metoda. V OECD TG 229 so zajeti presejalni preskusi kemikalij, ki vplivajo na razmnoževanje prek različnih mehanizmov, vključno z endokrinimi načini. To je treba upoštevati pred izbiro najprimernejše preskusne metode. | 2. | V tej preskusni metodi je opisan presejalni preskus in vivo, v katerem se spolno zreli ribji samci in drsteče se ribje samice zadržujejo skupaj ter so izpostavljeni kemikaliji v omejenem delu njihovega življenjskega cikla (21 dni). Ob koncu 21-dnevnega obdobja izpostavljenosti se pri samcih in samicah izmerita ena ali dve, odvisno od uporabljene vrste, končni točki biomarkerja kot kazalnika estrogenega delovanja, zaviranja aromataze ali androgenega delovanja preskusne kemikalije; te končne točke so vitelogenin in sekundarne spolne značilnosti. Vitelogenin se meri pri črnoglavem pisancu, japonski medaki in cebrici, sekundarne spolne značilnosti pa se merijo le pri črnoglavem pisancu in japonski medaki. | 3. | Biološki preskus je presejalni preskus in vivo za nekatere endokrine načine delovanja, njegovo uporabo pa je treba obravnavati v okviru temeljnega okvira za preskušanje in oceno kemikalij, ki povzročajo endokrine motnje, ‚OECD Conceptual Framework for the Testing and Assessment of Endocrine Disrupting Chemicals‘ (28). | ZAČETNI POMISLEKI IN OMEJITVE | 4. | Vitelogenin običajno proizvajajo jetra samic oviparnih vretenčarjev kot odziv na kroženje endogenega estrogena. Je predhodna sestavina beljakovin jajčnega rumenjaka, ki po nastanku v jetrih potuje po krvnem obtoku do jajčnika, kjer jo absorbirajo in spremenijo razvijajoča se jajčeca. Vitelogenina v plazmi nezrelih ribjih samic in samcev skoraj ni mogoče zaznati, ker nimajo dovolj krožečega estrogena; jetra pa so sposobna sinteze in izločanja vitelogenina kot odziv na spodbujanje eksogenega estrogena. | 5. | Meritev vitelogenina je namenjena zaznavanju kemikalij z različnimi estrogenimi načini delovanja. Zaznavanje estrogenih kemikalij je mogoče z meritvijo indukcije vitelogenina pri ribjih samcih in je bilo obsežno dokumentirano v strokovno pregledani znanstveni literaturi (npr. (7)). Indukcija vitelogenina je bila dokazana tudi po izpostavljenosti androgenom, ki se lahko aromatizirajo (8) (9). Zaradi zmanjšanja ravni kroženja estrogena pri samicah, na primer z zaviranjem aromataze, ki spremeni endogeni androgen v naravni estrogen 17β-estradiol, se zmanjša raven vitelogenina, ki se uporablja za zaznavanje kemikalij, ki imajo lastnosti zaviranja aromataze (10) (11). Biološka pomembnost odziva vitelogenina na zaviranje estrogena/aromataze je bila dokazana in obsežno dokumentirana. Vendar je mogoče, da lahko na nastajanje VTG pri samicah vplivajo tudi splošna strupenost in neendokrini strupeni načini delovanja, npr. hepatotoksičnost. | 6. | Več merilnih metod je bilo uspešno pripravljenih in standardiziranih za redno uporabo. Med njimi so metode encimskega imunskega testa (ELISA), ki so specifične za posamezne vrste in uporabljajo imunokemijo za kvantifikacijo vitelogenina, nastalega v majhnih vzorcih krvi ali jeter, ki so bili odvzeti pri posameznih ribah (12) (13) (14) (15) (16) (17) (18). Za meritev VTG se vzorčijo kri črnoglavega pisanca, kri ali homogenat glave/repa cebrice in jetra medake. Pri medaki je korelacija med VTG, izmerjenim v krvi, in VTG, izmerjenim v jetrih, dobra (19). V Dodatku 6 so navedeni priporočeni postopki za odvzem vzorcev za analizo vitelogenina. Kompleti za merjenje vitelogenina so lahko dostopni; taki kompleti morajo temeljiti na validirani metodi ELISA, ki je specifična za posamezno vrsto. | 7. | Sekundarne spolne značilnosti ribjih samcev nekaterih vrst so izjemno vidne, jih je mogoče kvantificirati in se odzivajo na ravni kroženja endogenih androgenov; to velja za črnoglavega pisanca in medako, vendar ne za cebrico, ki nima sekundarnih spolnih značilnosti, ki jih je mogoče kvantificirati. Samice so sposobne razviti moške sekundarne spolne značilnosti, če so izpostavljene androgenim kemikalijam v vodi. V znanstveni literaturi je na voljo več študij, ki dokumentirajo te vrste odziva pri črnoglavem pisancu (20) in medaki (21). Zmanjšanje sekundarnih spolnih značilnosti pri samcih je treba zaradi majhne statistične moči razlagati previdno, pri čemer mora razlaga temeljiti na strokovni presoji in zanesljivosti dokazov. Ker cebrica nima sekundarnih spolnih značilnosti, ki jih je mogoče kvantificirati in se odzivajo na kemikalije z androgenim delovanjem, je njena uporaba v tem preskusu omejena. | 8. | Pri črnoglavem pisancu je glavni kazalnik eksogene androgene izpostavljenosti število drstnih izpuščajev na nosu ribje samice. Pri medaki je glavni označevalec eksogene izpostavljenosti androgenim kemikalijam pri ribjih samicah število bradavičastih podaljškov. V Dodatku 5A in Dodatku 5B so navedeni priporočeni postopki za spremljanje vrednotenja spolnih značilnosti pri črnoglavem pisancu oziroma medaki. | 9. | Opredelitve pojmov, uporabljene v tej preskusni metodi, so navedene v Dodatku 1. | NAČELO PRESKUSA | 10. | V preskusu so ribji samci in samice v razmnoževalnem stanju skupaj izpostavljeni v preskusnih posodah. Njihovo odraslo in razmnoževalno stanje omogočata jasno razlikovanje po spolu in zato s spolom povezano analizo posamezne končne točke ter zagotavljata njihovo občutljivost na eksogene kemikalije. Ob koncu preskusa se spol potrdi z makroskopskim pregledom spolnih žlez po ventralnem odprtju trebuha s škarjami. Pregled zadevnih pogojev biološkega preskusa je naveden v Dodatku 2. Preskus se običajno začne z ribo, ki je bila vzorčena iz populacije, ki se drsti; starajoče se živali se ne smejo uporabiti. Smernice glede starosti rib in razmnoževalnega stanja so navedene v razdelku Izbira rib. Preskus se izvede s tremi koncentracijami kemikalije za izpostavljanje, kontrolo z vodo in po potrebi kontrolo s topilom. Pri medaki in cebrici se uporabita dve posodi ali ponovitvi na tretiranje (vsaka posoda vsebuje 5 samcev in 5 samic), pri črnoglavem pisancu pa štiri posode ali ponovitve na tretiranje (vsaka posoda vsebuje 2 samca in 4 samice). To je namenjeno prilagoditvi teritorialnega vedenja samcev črnoglavega pisanca ob hkratni ohranitvi ustrezne moči preskusa. Izpostavljenost traja 21 dni, vzorčenje rib pa se izvaja 21. dan izpostavljenosti. | 11. | Pri vzorčenju na 21. dan se vse živali humano usmrtijo. Sekundarne spolne značilnosti se merijo pri črnoglavem pisancu in medaki (glej Dodatek 5A in Dodatek 5B); vzorci krvi se za določanje vitelogenina odvzamejo pri cebrici in črnoglavem pisancu, pri čemer se lahko pri cebricah namesto tega za določanje vitelogenina odvzame glava/rep (Dodatek 6), za analizo VTG pri medaki pa se odvzamejo jetra (Dodatek 6). | MERILA ZA SPREJEMLJIVOST PRESKUSA | 12. | Za sprejemljivost rezultatov preskusa morajo biti izpolnjeni naslednji pogoji: | — | smrtnost v kontrolah z vodo (ali topilom) ob koncu obdobja izpostavljenosti ne sme preseči 10 %, | — | koncentracija raztopljenega kisika mora biti v celotnem obdobju izpostavljenosti vsaj 60 % nasičenosti z zrakom (ASV), | — | razlika v temperaturi vode v različnih preskusnih posodah v obdobju izpostavljenosti nikoli ne sme biti večja od ± 1,5 °C in jo je treba vzdrževati v razponu 2 °C znotraj temperaturnih razponov, ki so določeni za preskusno vrsto (Dodatek 2), | — | na voljo morajo biti dokazi, da so se koncentracije preskusne kemikalije v raztopini zadovoljivo vzdrževale v okviru ± 20 % srednjih izmerjenih vrednosti. | OPIS METODE | Oprema | 13. | Običajna laboratorijska oprema in zlasti naslednje: | (a) | oksimetri in merilniki pH; | (b) | oprema za določanje trdote in alkalnosti vode; | (c) | ustrezne naprave za nadzor temperature in, po možnosti, stalno spremljanje; | (d) | bazeni, izdelani iz kemijsko inertnih materialov, ter primerne prostornine glede na priporočeno obremenitev in gostoto rib (glej Dodatek 2); | (e) | substrat za drstenje črnoglavega pisanca in cebrice; potrebne podrobnosti so navedene v Dodatku 4; | (f) | primerna točna tehtnica (tj. točna do ± 0,5 mg). | Voda | 14. | Za preskusno vodo se lahko uporabi katera koli voda, v kateri kaže preskusna vrsta primerno dolgotrajno preživetje in rast. V času preskusa mora biti voda konstantne kakovosti. Vrednost pH vode mora biti med 6,5 in 8,5, v enem preskusu pa mora biti v območju ± 0,5 pH enote. Za zagotovitev, da voda za redčenje ne bi neprimerno vplivala na rezultat preskusa (na primer s kompleksacijo preskusne kemikalije), je treba v časovnih razmikih odvzemati vzorce za analizo. Izvajati je treba meritve težkih kovin (npr. Cu, Pb, Zn, Hg, Cd in Ni), glavnih anionov in kationov (npr. Ca2+, Mg2+, Na+, K+, Cl– in SO4 2–), pesticidov (npr. skupnih organofosfornih in skupnih organoklornih pesticidov), skupnega organskega ogljika in suspendiranih trdnih snovi, na primer vsake tri mesece, kadar se ve, da je voda za redčenje razmeroma konstantne kakovosti. Če se dokaže, da je bila kakovost vode konstantna vsaj eno leto, se lahko meritve izvajajo manj pogosto, časovni razmiki pa se lahko podaljšajo (npr. na vsakih šest mesecev). Nekatere kemijske značilnosti sprejemljive vode za redčenje so navedene v Dodatku 3. | Preskusne raztopine | 15. | Preskusne raztopine izbranih koncentracij se pripravijo z redčenjem založne raztopine. Založno raztopino je treba po možnosti pripraviti preprosto z mešanjem ali stresanjem preskusne kemikalije v vodi za redčenje z uporabo mehanskih sredstev (npr. z mešanjem ali ultrazvočnim razbijanjem). Za pridobitev primerno koncentrirane založne raztopine se lahko uporabijo kolone za nasičevanje raztopine. Uporaba topila kot nosilca ni priporočena. Če je topilo potrebno, je treba vzporedno izvajati kontrolo s topilom z enako koncentracijo topila kot pri kemičnih obdelavah. Za kemikalije, ki jih je težko preskusiti, je lahko topilo tehnično najboljša rešitev; upoštevati je treba Smernico OECD za preskušanje strupenosti zahtevnih snovi in zmesi v vodnem okolju (22). Topilo se izbere na podlagi kemijskih lastnosti kemikalije. V Smernici OECD se priporoča največ 100 μl/l, kar je treba upoštevati. Vendar so bili v zadnjem pregledu (23) izraženi dodatni pomisleki glede uporabe topil za preskušanje endokrinega delovanja. Zato se priporoča, da se koncentracije topila po potrebi čim bolj zmanjšajo, kadar koli je to tehnično izvedljivo (odvisno od fizikalno-kemijskih lastnosti preskusne kemikalije). | 16. | Uporabil se bo pretočni preskusni sistem. Tak sistem stalno odmerja in redči založno raztopino preskusne kemikalije (npr. merilna črpalka, proporcionalni razredčevalnik in sistem naprav za nasičenje), da dovaja niz koncentracij v preskusne komore. Pretok založnih raztopin in vode za redčenje je treba preverjati v ustreznih časovnih razmikih, po možnosti vsak dan, med preskusom in se ne sme razlikovati za več kot 10 % med celotnim preskusom. Izogibati se je treba uporabi nizkokakovostnega cevnega materiala ali drugih materialov, ki lahko vsebujejo biološko aktivne kemikalije. Pri izbiri materiala za pretočni sistem je treba upoštevati morebitno adsorpcijo preskusne kemikalije v ta material. | Vzdrževanje rib | 17. | Preskusne ribe je treba izbrati iz laboratorijske populacije, po možnosti iz enega staleža, ki so se vsaj dva tedna pred preskusom aklimatizirale, kar zadeva kakovost vode in osvetljenost, v pogojih, podobnih tistim, ki se uporabijo v preskusu. Pomembno je, da sta obremenitev in gostota rib (za opredelitvi glej Dodatek 1) primerni za uporabljene preskusne vrste (glej Dodatek 2). | 18. | Po 48 urah od naselitve se zabeleži smrtnost, pri čemer se uporabijo naslednja merila: | — | smrtnost v sedmih dneh je večja od 10 % populacije: celotna serija se zavrne, | — | smrtnost med 5 in 10 % populacije: aklimatizacija sedem dodatnih dni; če je v drugih sedmih dneh smrtnost večja od 5 %, se zavrne celotna serija, | — | smrtnost v sedmih dneh manjša od 5 % populacije: serija se sprejme. | 19. | Bolezni rib se v obdobju aklimatizacije, obdobju pred izpostavljenostjo ali v obdobju izpostavljenosti ne smejo zdraviti. | Predhodna izpostavljenost in izbira rib | 20. | Priporoča se enotedensko obdobje predhodne izpostavljenosti, pri čemer so živali v posodah, podobnim posodam v dejanskem preskusu. Ribe je treba v celotnem obdobju vzdrževanja in med fazo izpostavljenosti hraniti ad libitum. Faza izpostavljenosti se začne s spolno dimorfnimi odraslimi ribami iz laboratorijske zaloge razmnoževalno zrelih živali (npr. z jasno vidnimi sekundarnimi spolnimi značilnostmi pri črnoglavem pisancu in medaki) in aktivnim drstenjem. Na splošno (vendar se to ne sme upoštevati brez opazovanja dejanskega razmnoževalnega stanja zadevne serije rib) morajo biti črnoglavi pisanci stari približno 20 (±2) tednov, če so bili v celotni življenjski dobi gojeni pri 25 ± 2 °C. Japonske medake morajo biti stare približno 16 (±2) tednov, če so bile v celotni življenjski dobi gojene pri 25 ± 2 °C. Cebrice morajo biti stare približno 16 (±2) tednov, če so bile v celotni življenjski dobi gojene pri 26 ± 2 °C. | NAČRT PRESKUSA | 21. | Uporabijo se tri koncentracije preskusne kemikalije, ena kontrola (z vodo) in po potrebi ena kontrola s topilom. Podatki se lahko analizirajo, da se določijo statistično značilne razlike med odzivi na tretiranje in odzivi v kontrolah. Te analize bodo pokazale, ali je za kemikalijo potrebno nadaljnje dolgotrajno preskušanje glede škodljivih učinkov (in sicer preživetje, razvoj, rast in razmnoževanje) namesto uporabe za oceno tveganja (24). | 22. | Pri cebrici in medaki se na 21. dan poskusa samci in samice iz posameznih stopenj tretiranja (5 samcev in 5 samic v vsaki od dveh ponovitev) ter kontrol vzorčijo za meritev vitelogenina in sekundarnih spolnih značilnosti, če je primerno. Pri črnoglavem pisancu se na 21. dan izpostavljenosti samci in samice iz posameznih ravni tretiranja (2 samca in 4 samice v vsaki od štirih ponovitev) in kontrol vzorčijo za meritev vitelogenina in sekundarnih spolnih značilnosti. | Izbira preskusnih koncentracij | 23. | Za namen tega preskusa je treba najvišjo preskusno koncentracijo določiti z najvišjo tolerančno koncentracijo (MTC), ki se določi z napravo za ugotavljanje razpona ali na podlagi drugih podatkov o strupenosti, ali 10 mg/l ali največjo topnostjo v vodi, odvisno od tega, katera vrednost je nižja. MTC je opredeljena kot najvišja preskusna koncentracija kemikalije, ki povzroči manj kot 10-odstotno smrtnost. Pri uporabi tega pristopa se domneva, da obstajajo empirični podatki o akutni strupenosti ali drugi podatki o strupenosti, na podlagi katerih je mogoče oceniti MTC. Ocena MTC je lahko netočna, pri čemer je običajno potrebna strokovna presoja. | 24. | Potrebne so tri preskusne koncentracije, ki se med seboj razlikujejo za konstantni faktor, ki ne presega 10, in kontrola z vodo za redčenje (ter po potrebi kontrola s topilom). Priporoča se razpon faktorjev razmika med 3,2 in 10. | POSTOPEK | Izbira in tehtanje preskusnih rib | 25. | Pomembno je, da se že na začetku preskusa čim bolj zmanjša variacija teže rib. Primerni razponi velikosti za različne vrste, priporočene za uporabo v tem preskusu, so navedeni v Dodatku 2. Za celotno serijo rib, uporabljenih v preskusu, je treba teže posameznih ribjih samcev in samic na začetku preskusa po možnosti vzdrževati v razponu ± 20 % aritmetične sredine teže istega spola. Priporočljivo je, da se pred preskusom stehta podvzorec staleža rib, da se oceni srednja teža. | Pogoji izpostavljenosti | Trajanje | 26. | Preskus traja 21 dni po obdobju predhodne izpostavljenosti. Priporočeno obdobje predhodne izpostavljenosti traja en teden. | Hranjenje | 27. | Ribe je treba hraniti ad libitum s primerno hrano (Dodatek 2) dovolj pogosto, da se vzdržuje telesna kondicija. Paziti je treba, da ne pride do rasti mikrobov in kalnosti vode. Kot splošna smernica se lahko dnevni obrok razdeli na dva ali tri enake dele za večkratno krmljenje, pri čemer morajo med posameznimi krmljenji preteči vsaj tri ure. En večji obrok je sprejemljiv zlasti ob vikendih. Hranjenje rib je treba prekiniti 12 ur pred vzorčenjem/nekropsijo. | 28. | Ribjo hrano je treba oceniti glede na prisotnost onesnaževal, kot so organoklorni pesticidi, policiklični aromatski ogljikovodiki (PAH) in poliklorirani bifenili (PCB). Izogibati se je treba hrani z višjo ravnjo fitoestrogenov, ki bi lahko ogrozili odziv preskusa na znani agonist estrogena (npr. 17-beta estradiol). | 29. | Neprebavljeno hrano in iztrebke je treba odstraniti iz preskusnih posod vsaj dvakrat na teden, npr. s previdnim čiščenjem dna posameznega bazena z uporabo sesalne natege. | Svetloba in temperatura | 30. | Obdobje osvetljenosti in temperatura vode morata biti ustrezna za preskusno vrsto (glej Dodatek 2). | Pogostost analitskih določitev in meritev | 31. | Pred začetkom obdobja izpostavljenosti je treba zagotoviti ustrezno delovanje sistema za dovajanje kemikalije. Vzpostaviti je treba vse potrebne analitske metode, vključno z zadostnim znanjem o stabilnosti kemikalije v preskusnem sistemu. Med preskusom se koncentracije preskusne kemikalije določijo v rednih časovnih razmikih, kot sledi: pretoke redčila in založne raztopine strupene snovi je treba po možnosti preveriti vsak dan, vendar vsaj dvakrat na teden, pri čemer se ves čas preskusa ne smejo razlikovati za več kot 10 %. Priporoča se, da se dejanske koncentracije preskusne kemikalije izmerijo v vseh posodah na začetku preskusa in nato v tedenskih časovnih razmikih. | 32. | Priporoča se, da rezultati temeljijo na merjenih koncentracijah. Če pa se je koncentracija preskusne kemikalije v raztopini zadovoljivo vzdrževala znotraj ± 20 % nominalne koncentracije ves čas preskusa, lahko rezultati temeljijo na nominalnih ali merjenih vrednostih. | 33. | Vzorce bo morda treba filtrirati (npr. z uporabo filtra z velikostjo por 0,45 μm) ali centrifugirati. Če je filtracija potrebna, je priporočeni postopek centrifugiranje. Če pa se preskusni material ne adsorbira na filtre, je lahko sprejemljivo tudi filtriranje. | 34. | Med preskusom je treba vsaj enkrat na teden v vseh preskusnih posodah izmeriti raztopljeni kisik, temperaturo in pH. Skupno trdoto in alkalnost je treba vsaj enkrat na teden izmeriti v kontrolah in eni posodi pri najvišji koncentraciji. Temperatura se po možnosti stalno spremlja v vsaj eni preskusni posodi. | Opažanja | 35. | Med potekom preskusa ali ob prekinitvi preskusa se ocenijo številni splošni (npr. preživetje) in glavni biološki odzivi (npr. ravni vitelogenina). Meritev in vrednotenje teh končnih točk ter njihova uporabnost so opisani v nadaljevanju. | Preživetje | 36. | Ribe je treba v obdobju preskusa pregledati vsak dan, vsako smrtnost zabeležiti, mrtve ribe pa čim prej odstraniti. Mrtve ribe se ne smejo nadomestiti niti v kontrolnih posodah niti v tretiranih posodah. Spol rib, ki poginejo med preskusom, je treba določiti z makroskopskim vrednotenjem spolnih žlez. | Obnašanje in videz | 37. | Vsako nenormalno obnašanje (glede na kontrole) je treba zabeležiti; to lahko vključuje znake splošne strupenosti, vključno s hiperventilacijo, nekoordiniranim plavanjem, izgubo ravnotežja in netipičnim mirovanjem ali hranjenjem. Zabeležiti je treba tudi zunanje nenormalnosti (kot sta hemoragija in razbarvanje). Take znake strupenosti je treba pri razlagi podatkov previdno obravnavati, ker lahko nakazujejo koncentracije, pri katerih biomarkerji endokrinega delovanja niso zanesljivi. Taka opažanja v zvezi z obnašanjem lahko zagotovijo tudi koristne kvalitativne informacije, ki kažejo mogoče zahteve za prihodnje preskušanje rib. Na primer teritorialna agresivnost normalnih samcev ali maskuliniziranih samic je bila opažena pri črnoglavem pisancu, ki je bil izpostavljen androgenemu delovanju; pri cebrici se značilno obnašanje pri parjenju in drstenju po svitanju zmanjša ali ga ovira izpostavljenost estrogenemu ali antiandrogenemu delovanju. | 38. | Ker se lahko nekateri vidiki videza (zlasti barva) pri rokovanju hitro spremenijo, je pomembno, da se kvalitativno opazovanje izvede pred odstranitvijo živali iz preskusnega sistema. Dosedanje izkušnje s črnoglavim pisancem kažejo, da lahko nekatere kemikalije z endokrinim delovanjem na začetku povzročijo spremembe naslednjih zunanjih značilnosti: barvo telesa (svetlo ali temno), vzorce obarvanja (prisotnost navpičnih prog) in obliko telesa (območje glave in prsi). Zato je treba opazovanje fizičnega videza rib izvesti med potekom preskusa in ob koncu študije. | Humano ubijanje rib | 39. | Na 21. dan, tj. ob prekinitvi izpostavljenosti, je treba ribe evtanazirati s primernimi količinami trikaina (trikain metan sulfonat, metakain, MS-222 (CAS 886-86-2), 100–500 mg/l, pufran s 300 mg/l NaHCO3 (natrijev bikarbonat, CAS 144-55-8)), da se zmanjša draženje sluznice; kri ali tkivo se nato vzorči za določitev vitelogenina, kot je pojasnjeno v razdelku Vitelogenin. | Opazovanje sekundarnih spolnih značilnosti | 40. | Nekatere kemikalije z endokrinim delovanjem lahko povzročijo spremembe pri določenih sekundarnih spolnih značilnostih (število drstnih izpuščajev pri samcu črnoglavega pisanca in bradavičastih podaljškov pri samcu medake). Kemikalije z nekaterimi načini delovanja lahko povzročijo nenormalen pojav sekundarnih spolnih značilnosti pri živalih nasprotnega spola; agonisti androgenega receptorja, kot so trenbolon, metiltestosteron in dihidrotestosteron, lahko na primer pri samici črnoglavega pisanca povzročijo razvoj izrazitih drstnih izpuščajev ali pa pri samici medake razvoj bradavičastih podaljškov (11) (20) (21). Obstajajo tudi poročila, da lahko agonisti estrogenega receptorja zmanjšajo število drstnih izpuščajev in velikost dorzalne strani trupa pred hrbtno plavutjo pri odraslih samcih (25) (26). Taka splošna morfološka opažanja lahko zagotovijo koristne kvalitativne in kvantitativne informacije, ki kažejo mogoče zahteve za prihodnje preskušanje rib. Število in velikost drstnih izpuščajev pri črnoglavem pisancu in bradavičastih podaljškov pri medaki se lahko kvantificira neposredno ali bolj praktično z ohranjenimi vzorci. Priporočeni postopki za vrednotenje sekundarnih spolnih značilnosti pri črnoglavem pisancu in medaki so navedeni v Dodatku 5A oziroma Dodatku 5B. | Vitelogenin (VTG) | 41. | Kri se odvzame iz repne arterije/vene s heparinizirano mikrohematokritsko kapilarno cevko ali namesto tega s srčno punkcijo z brizgo. Količine zbrane krvi so odvisne od velikosti ribe ter so običajno v razponu od 5 do 60 μl na posameznega črnoglavega pisanca in od 5 do 15 μl na posamezno cebrico. Plazma se od krvi loči s centrifugiranjem in shrani z inhibitorji protaze pri – 80 °C, dokler se ne analizira glede vitelogenina. Pri medaki pa se kot tkivni vir za določanje vitelogenina uporabijo jetra in pri cebrici homogenat glave/repa (Dodatek 6). Meritev VTG mora temeljiti na validirani homologni metodi ELISA, pri čemer se uporabijo homologni standard VTG in homologna protitelesa. Priporoča se uporaba metode, s katero je mogoče zaznati tako nizke ravni VTG, kot je nekaj ng/ml plazme (ali ng/mg tkiva), kar je raven naravnega ozadja pri neizpostavljenih ribjih samcih. | 42. | Nadzor kakovosti analize vitelogenina se zagotovi z uporabo standardov, slepih vzorcev in vsaj dvema analizama. Za vsako metodo ELISA je treba izvesti preskus vpliva matriksa (učinek razredčenja vzorca), da se določi najmanjši faktor razredčenja vzorca. Vsaka plošča ELISA, uporabljena za preskuse VTG, mora vsebovati naslednje vzorce za nadzor kakovosti: vsaj 6 kalibracijskih standardov, ki zajemajo razpon pričakovanih koncentracij vitelogenina, in vsaj en nespecifično vezalni preskus slepega vzorca (analiziran v dveh ponovitvah). Absorpcija teh slepih vzorcev mora biti manj kot 5 % največje absorpcije kalibracijskega standarda. Analizirana bosta vsaj dva alikvota (ponovitvi vdolbinic) posameznega razredčenja vzorca. Ponovitve vdolbinic, ki se razlikujejo za več kot 20 %, je treba ponovno analizirati. | 43. | Korelacijski koeficient (R2) za umeritvene krivulje mora biti večji od 0,99. Vendar visoka korelacija ni dovolj za zagotovitev ustrezne napovedi koncentracije v vseh razponih. Poleg dovolj visoke korelacije za umeritveno krivuljo mora biti koncentracija posameznega standarda, kot je izračunana po umeritveni krivulji, med 70 in 120 % nominalne koncentracije. Če se nominalne koncentracije oddaljujejo od regresijske premice kalibracije (npr. pri nižjih koncentracijah), bo morda treba umeritveno krivuljo razdeliti na nizke in visoke razpone ali uporabiti nelinearen model, ki bo ustrezal podatkom o absorpciji. Če se krivulja razdeli, mora biti R2 na obeh delih > 0,99. | 44. | Meja zaznavanja (LOD) je opredeljena kot koncentracija najnižjega analitskega standarda, meja določanja (LOQ) pa je opredeljena kot koncentracija najnižjega analitskega standarda, pomnoženega z najnižjim faktorjem razredčenja. | 45. | Vsak dan izvedbe preskusa vitelogenina se analizira obogateni vzorec, pripravljen z medpreskusnim referenčnim standardom (Dodatek 7). Razmerje med pričakovano koncentracijo in izmerjeno koncentracijo se sporoči skupaj z rezultati posameznih nizov preskusov, izvedenih isti dan. | PODATKI IN POROČANJE | Vrednotenje odziva biomarkerja z analizo variance (ANOVA) | 46. | Za določitev potencialnega endokrinega delovanja kemikalije se z analizo variance (ANOVA) primerjajo odzivi med tretiranji in kontrolnimi skupinami. Kadar se uporabi kontrola s topilom, je treba za vsako končno točko izvesti primeren statistični preskus med vodo za redčenje in kontrolami s topilom. Smernice za obravnavanje podatkov o vodi za redčenje in kontroli s topilom pri nadaljnji statistični analizi so navedene v OECD, 2006c (27). Vse podatke o biološkem odzivu je treba analizirati in sporočiti ločeno po spolu. Če niso izpolnjene zahtevane domneve za parametrske metode – nenormalna porazdelitev (npr. Shapiro-Wilkov preskus) ali heterogena varianca (Bartlettov ali Levenejev preskus), je potreben razmislek o preoblikovanju podatkov, da se poenotijo variance pred izvedbo ANOVA ali pred izvedbo tehtane ANOVA. Za nemonotoni odziv na odmerek se lahko uporabi Dunnettov preskus (parametrski) večkratnih primerjav med pari ali Mann-Whitneyjev preskus z Bonferroni-Holmovo prilagoditvijo (neparametrski). Če je odziv na odmerek približno monoton, se lahko uporabijo drugi statistični preskusi (npr. preskus po Jonckheere-Terpstraju ali Williamsov preskus). V pomoč pri odločitvi glede izbire najprimernejšega statističnega preskusa, ki naj se uporabi, je v Dodatku 8 zagotovljena statistična tabela poteka. Dodatne informacije so navedene v dokumentu OECD o sedanjih pristopih k statistični analizi podatkov o ekotoksičnosti (27). | Poročanje o rezultatih preskusa | 47. | Podatki študije morajo obsegati: | | Preskusna infrastruktura: | — | odgovorno osebje in njihove obveznosti v zvezi s študijo, | — | vsak laboratorij mora s sklopom reprezentativnih kemikalij dokazati usposobljenost. | | Preskusna kemikalija: | — | opredelitev preskusne kemikalije, | — | fizikalno stanje in ustrezne fizikalno-kemijske lastnosti, | — | metodo in pogostost priprave preskusnih koncentracij, | — | informacije o stabilnosti in biološki razgradljivosti. | | Topilo: | — | opredelitev topila (vrsta, uporabljena koncentracija), | — | utemeljitev izbire topila (če to ni voda). | | Preskusne živali: | — | vrsto in sev, | — | dobavitelja in specifično infrastrukturo dobavitelja, | — | starost rib na začetku preskusa in razmnoževalno stanje/stanje drstenja, | — | podrobnosti o postopku aklimatizacije živali, | — | telesno težo rib na začetku izpostavljenosti (iz podvzorca staleža rib). | | Preskusni pogoji: | — | uporabljeni preskusni postopek (vrsta preskusa, stopnja obremenitve, gostota rib itd.), | — | metodo priprave založnih raztopin in pretok, | — | nominalne preskusne koncentracije, tedensko izmerjene koncentracije preskusnih raztopin in uporabljeno analitsko metodo, sredine izmerjenih vrednosti in standardnih odklonov v preskusnih posodah ter dokaze, da se meritve nanašajo na koncentracije preskusne kemikalije v dejanski raztopini, | — | značilnosti vode za redčenje (vključno s pH, trdoto, alkalnostjo, temperaturo, koncentracijo raztopljenega kisika, koncentracijo sledi klora, skupnim organskim ogljikom, suspendiranimi trdnimi snovmi in vsemi ostalimi opravljenimi meritvami), | — | kakovost vode v preskusnih posodah: pH, trdota, temperatura in koncentracija raztopljenega kisika, | — | podrobne informacije o hranjenju (npr. vrsta hrane, vir, dana količina in pogostost dajanja ter analiza zadevnih onesnaževal, če je na voljo (npr. PCB, PAH in organoklorni pesticidi). | | Rezultati | — | dokaze, da kontrole izpolnjujejo merila za sprejemljivost preskusa, | — | podatke o smrtnosti za posamezne preskusne koncentracije in kontrole, | — | uporabljene tehnike statistične analize, obdelavo podatkov in utemeljitev uporabljenih tehnik, | — | podatke o bioloških opažanjih splošne morfologije, vključno s sekundarnimi spolnimi značilnostmi in vitelogeninom, | — | rezultate analize podatkov, po možnosti v obliki tabele in grafičnega prikaza, | — | pojav kakršnih koli neobičajnih reakcij rib in kakršnih koli vidnih učinkov, ki jih povzroči preskusna kemikalija. | SMERNICA ZA RAZLAGO IN SPREJEMLJIVOST REZULTATOV PRESKUSA | 48. | V tem razdelku je navedenih nekaj pomislekov, ki jih je treba upoštevati pri razlagi rezultatov preskusa za različne izmerjene končne točke. Rezultate je treba previdno razlagati, kadar se zdi, da preskusna kemikalija povzroča očitno strupenost ali vpliva na splošno stanje preskusne živali. | 49. | Pri določanju razpona preskusnih koncentracij je treba paziti, da se ne preseže najvišja tolerančna koncentracija, da bo mogoča smiselna razlaga podatkov. Kadar ni znakov strupenih učinkov, je pomembno, da se izvede vsaj eno tretiranje. Znake bolezni in znake strupenih učinkov je treba temeljito oceniti in o njih poročati. Možno je na primer, da na nastajanje VTG pri samicah vplivajo tudi splošna strupenost in neendokrini strupeni načini delovanja, npr. hepatotoksičnost. Vendar se lahko razlaga učinkov podkrepi z drugimi stopnjami tretiranja, na katere ne vpliva sistemska strupenost. | 50. | V zvezi s sprejemljivostjo rezultatov preskusa je treba upoštevati nekaj vidikov. Ravni VTG v kontrolnih skupinah samcev in samic morajo biti kot smernica izrazite ter ločene za približno tri rede velikosti pri črnoglavem pisancu in cebrici ter približno en red velikosti pri medaki. Primeri razpona vrednosti v kontrolnih in tretiranih skupinah so navedene v validacijskih poročilih (1) (2) (3) (4). Visoke vrednosti VTG pri samcih iz kontrol bi lahko ogrozile odzivnost preskusa in njegovo zmožnost za zaznavanje šibkih agonistov estrogena. Nizke vrednosti VTG pri samicah iz kontrol bi lahko ogrozile odzivnost preskusa ter njegovo zmožnost za zaznavanje inhibitorjev aromataze in antagonistov estrogena. Pri pripravi te smernice so bile uporabljene validacijske študije. | 51. | Če laboratorij še ni izvedel preskusa ali je prišlo do znatnih sprememb (npr. sprememba seva ali dobavitelja rib), se priporoča izvedba študije tehnične usposobljenosti. Priporočljivo je, da se uporabijo kemikalije, ki zajemajo različne načine delovanja ali vplive na številne preskusne končne točke. V praksi se vsak laboratorij spodbuja k vzpostavitvi lastnih podatkov o kontroli iz preteklih preskusov za samce in samice ter izvedbi pozitivne kontrole za estrogeno delovanje (npr. 17β-estradiol pri100 ng/l ali znan šibek agonist), ki povzroči povečanje VTG pri ribjih samcih, pozitivne kontrole za zaviranje aromataze (npr. fadrozol ali prokloraz pri 300 μg/l), ki povzroči zmanjšanje VTG pri ribjih samicah, in pozitivno kontrolo za androgeno delovanje (npr. 17β-trenbolon pri 5 μg/l), ki povzroči indukcijo sekundarnih spolnih značilnosti pri samicah črnoglavega pisanca in medake. Vsi ti podatki se lahko primerjajo z razpoložljivimi podatki iz validacijskih študij (1) (2) (3), da se zagotovi usposobljenost laboratorija. | 52. | Na splošno je treba meritve vitelogenina šteti za pozitivne, če se VTG pri samcih statistično značilno poveča (p < 0,05) ali pri samicah statistično značilno zmanjša (p < 0,05) vsaj pri najvišjem preskušenem odmerku v primerjavi s kontrolno skupino ter ob odsotnosti znakov splošne strupenosti. Pozitiven rezultat je nadalje podprt s prikazom biološko verjetnega razmerja med odmerkom in krivuljo odziva. Kot je bilo navedeno, zmanjšanje vitelogenina morda ni v celoti endokrinega izvora; vendar je treba pozitiven rezultat na splošno razlagati kot dokaz endokrinega delovanja in vivo ter si prizadevati za nadaljnjo pojasnitev. | LITERATURA | (1) | OECD (2006a). Report of the Initial Work Towards the Validation of the 21-Day Fish Screening Assay for the Detection of Endocrine active Substances (Phase 1A). OECD Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No.60, ENV/JM/MONO(2006)27. | (2) | OECD (2006b). Report of the Initial Work Towards the Validation of the 21-Day Fish Screening Assay for the Detection of Endocrine active Substances (Phase 1B). OECD Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No.61, ENV/JM/MONO(2006)29. | (3) | OECD (2007). Final report of the Validation of the 21-day Fish Screening Assay for the Detection of Endocrine Active Substances. Phase 2: Testing Negative Substances. OECD Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No.78, ENV/JM/MONO(2007)25. | (4) | Owens, J. W. (2007). Phase 3 report of the validation of the OECD Fish Screening Assay. CEFIC LRI Project, Endocrine. http://www.cefic-lri.org/index.php?page=projects (dostop 18.9.2008). | (5) | US EPA 2007. Validation of the Fish Short-Term Reproduction Assay: Integrated Summary Report. Unpublished report dated 15 December 2007. US Environmental Protection Agency, Washington, DC. 104 str. | (6) | OECD, 2008. Report of the Validation Peer Review for the 21-Day Fish Endocrine Screening Assay and Agreement of the Working Group of the National Coordinators of the Test Guidelines Programme on the Follow-up of this Report. OECD Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No.94, ENV/JM/MONO(2008)21. | (7) | Sumpter in Jobling (1995). Vitellogenesis as a biomarker for estrogenic contamination of the aquatic environment. Environmental Health Perspectives;103 Suppl 7: 173–8 Review. | (8) | Pawlowski, S., Sauer, A., Shears, J. A., Tyler, C. R., Braunbeck, T. (2004). Androgenic and estrogenic effects of the synthetic androgen 17alpha-methyltestosterone on sexual development and reproductive performance in the fathead minnow (Pimephales promelas) determined using the gonadal recrudescence assay. Aquatic Toxicology; 68(3): 277–91. | (9) | Andersen, L., Goto-Kazato, R., Trant, J. M., Nash, J. P., Korsgaard, B., Bjerregaard, P. (2006). Short-term exposure to low concentrations of the synthetic androgen methyltestosterone affects vitellogenin and steroid levels in adult male zebrafish (Danio rerio). Aquatic Toxicology; 76(3–4): 343–52. | (10) | Ankley, G. T., Kahl, M. D., Jensen, K. M., Hornung, M. W., Korte, J. J., Makynen, E. A., Leino, R. L. (2002). Evaluation of the aromatase inhibitor fadrozole in a short-term reproduction assay with the fathead minnow (Pimephales promelas). Toxicological Sciences; 67(1): 121–30. | (11) | Panter, G. H., Hutchinson, T. H., Hurd, K. S., Sherren, A., Stanley, R. D., Tyler, C. R. (2004). Successful detection of (anti-)androgenic and aromatase inhibitors in pre-spawning adult fathead minnows (Pimephales promelas) using easily measured endpoints of sexual development. Aquatic Toxicology; 70(1): 11–21. | (12) | Parks, L. G., Cheek, A. O., Denslow, N. D., Heppell, S. A., McLachlan, J. A., LeBlanc, G. A., Sullivan, C. V. (1999). Fathead minnow (Pimephales promelas) vitellogenin: purification, characterization and quantitative immunoassay for the detection of estrogenic compounds. Comparative Biochemistry and Physiology. Part C Pharmacology, toxicology and endocrinology; 123(2): 113–25. | (13) | Panter, G. H., Tyler, C. R., Maddix, S., Campbell, P. M., Hutchinson, T. H., Länge, R., Lye, C., Sumpter, J. P., 1999. Application of an ELISA to quantify vitellogenin concentrations in fathead minnows (Pimephales promelas) exposed to endocrine disrupting chemicals. CEFIC-EMSG research report reference AQ001. CEFIC, Bruselj, Belgija. | (14) | Fenske, M., van Aerle, R. B., Brack, S. C., Tyler, C. R., Segner, H., (2001). Development and validation of a homologous zebrafish (Danio rerio Hamilton- Buchanan) vitellogenin enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and its application for studies on estrogenic chemicals. Comp. Biochem. Phys. C 129 (3): 217–232. | (15) | Holbech, H., Andersen, L., Petersen, G. I., Korsgaard B., Pedersen, K. L., Bjerregaard, P. (2001). Development of an ELISA for vitellogenin in whole body homogenate of zebrafish (Danio rerio). Comparative Biochemistry and Physiology. Part C Pharmacology, toxicology and endocrinology; 130: 119– 131. | (16) | Rose, J., Holbech, H., Lindholst, C., Noerum, U., Povlsen, A., Korsgaard, B., Bjerregaard, P. 2002. Vitellogenin induction by 17β-estradiol and 17β-ethinylestradiol in male zebrafish (Danio rerio). Comp. Biochem. Physiol. C. 131: 531–539. | (17) | Brion, F., Nilsen, B. M., Eidem, J. K., Goksoyr, A., Porcher, J. M., Development and validation of an enzyme-linked immunosorbent assay to measure vitellogenin in the zebrafish (Danio rerio). Environmental Toxicology and Chemistry; vol 21: 1699– 1708. | (18) | Yokota, H., Morita, H., Nakano, N., Kang, I. J., Tadokoro, H., Oshima, Y., Honjo, T., Kobayashi, K. 2001. Development of an ELISA for determination of the hepatic vitellogenin in Medaka (Oryzias latipes). Jpn J Environ Toxicol 4:87–98. | (19) | Tatarazako, N., Koshio, M., Hori, H., Morita, M., in Iguchi, T., 2004. Validation of an enzyme-linked immunosorbent assay method for vitellogenin in the Medaka. Journal of Health Science 50: 301–308. | (20) | Ankley, G. T., Jensen, K. M., Makynen, E. A., Kahl, M. D., Korte, J. J., Homung, M. W., Henry, T. R., Denny, J. S., Leino, R. L., Wilson, V. S., Cardon, M. C., Hartig, P. C., Gray, L. E. (2003). Effects of the androgenic growth promoter 17-beta-trenbolone on fecundity and reproductive endocrinology of the fathead minnow. Environmental Toxicology and Chemistry; 22(6): 1350–60. | (21) | Seki, M., Yokota, H., Matsubara, H., Maeda, M., Tadokoro, H., Kobayashi, K. (2004). Fish full life-cycle testing for androgen methyltestosterone on medaka (Oryzias latipes). Environmental Toxicology and Chemistry; 23(3): 774–81. | (22) | OECD (2000) Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment. No. 23. Pariz. | (23) | Hutchinson, T. H., Shillabeer, N., Winter, M. J., Pickford, D. B., 2006a. Acute and chronic effects of carrier solvents in aquatic organisms: A critical review. Review. Aquatic Toxicology, 76; str. 69–92. | (24) | Hutchinson, T. H., Ankley, G. T., Segner, H., Tyler, C. R., 2006b. Screening and testing for endocrine disruption in fish-biomarkers as ‚signposts,‘ not ‚traffic lights,‘ in risk assessment. Environmental Health Perspectives; 114 Suppl 1: 106– 14. | (25) | Miles-Richardson, S. R., Kramer, V. J., Fitzgerald, S. D., Render, J. A., Yamini, B., Barbee, S. J., Giesy, J. P. 1999. Effects of waterborne exposure to 17β-estradiol on secondary sex characteristics and gonads of the fathead minnow (Pimephales promelas). Aquat. Toxicol. 47, 129– 145. | (26) | Martinovic, D., L. S. Blake, E. J. Durhan, K. J. Greene, M. D. Kahl, K. M. Jensen, E. A. Makynen, D. L. Villeneuve in G. T. Ankley. 2008. Characterization of reproductive toxicity of vinclozolin in the fathead minnow and co-treatment with an androgen to confirm an anti-androgenic mode of action. Environ. Toxicol. Chem. 27, 478–488. | (27) | OECD (2006c). Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application. OECD environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No.54. ENV/JM/MONO(2006)18. | (28) | OECD (2012) OECD Conceptual Framework for Testing and Assessment of Endocrine Disrupters (revised). Annex I to Draft Guidance Document on Standardised Test Guidelines for Evaluating Chemicals for Endocrine Disruption. Series on Testing and Assessment No 150. ENV/JM/MONO(2012)22. | Dodatek 1 | Okrajšave in opredelitev pojmov | Kemikalija : snov ali zmes. | KV : koeficient variacije. | ELISA : encimski imunski test. | Stopnja obremenitve : mokra teža rib na količino vode. | Gostota rib : število rib na količino vode. | VTG (vitelogenin) : fosfoglikoprotein in predstopnja rumenjakovih beljakovin, ki se običajno pojavi pri spolno aktivnih samicah vseh oviparnih vrst. | Os HPG : os hipotalamus – hipofiza – spolne žleze. | MTC : najvišja tolerančna koncentracija, ki predstavlja približno 10 % LC50. | Preskusna kemikalija : vsaka snov ali zmes, preskušena z uporabo te preskusne metode. | Dodatek 2 | Poskusni pogoji za endokrini presejalni preskus rib | 1. | Priporočene vrste | Črnoglavi pisanec | (Pimephales promelas) | Medaka | (Oryzias latipes) | Cebrica | (Danio rerio) | 2. | Vrsta preskusa | pretočni | pretočni | pretočni | 3. | Temperatura vode | 25 ± 2 °C | 25 ± 2 °C | 26 ± 2 °C | 4. | Kakovost osvetljenosti | fluorescenčne sijalke (široki spekter) | fluorescenčne sijalke (široki spekter) | fluorescenčne sijalke (široki spekter) | 5. | Jakost svetlobe | 10–20 μE/m2/s, 540–1 000 luksov ali 50–100 ft-c (ravni v laboratoriju) | 10–20 μE/m2/s, 540–1 000 luksov ali 50–100 ft-c (ravni v laboratoriju) | 10–20 μE/m2/s, 540–1 000 luksov ali 50–100 ft-c (ravni v laboratoriju) | 6. | Obdobje osvetljenosti (svitanje in mrak sta neobvezna, vendar se ne štejeta za potrebna) | 16 ur svetlobe, 8 ur teme | 12–16 ur svetlobe, 12-8 ur teme | 12–16 ur svetlobe, 12-8 ur teme | 7. | Stopnja obremenitve | < 5 g/l | < 5 g/l | < 5 g/l | 8. | Velikost preskusne komore | 10 l (minimum) | 2 l (minimum) | 5 l (minimum) | 9. | Količina preskusne raztopine | 8 l (minimum) | 1,5 l (minimum) | 4 l (minimum) | 10. | Zamenjave količin preskusnih raztopin | vsaj 6 na dan | vsaj 5 na dan | vsaj 5 na dan | 11. | Starost preskusnih organizmov | glej odstavek 20 | glej odstavek 20 | glej odstavek 20 | 12. | Približna mokra teža odrasle ribe (g) | samice: 1,5 ± 20 % | samci: 2,5 ± 20 % | samice: 0,35 ± 20 % | samci: 0,35 ± 20 % | samice: 0,65 ± 20 % | samci: 0,4 ± 20 % | 13. | Št. rib na preskusno posodo | 6 (2 samca in 4 samice) | 10 (5 samcev in 5 samic) | 10 (5 samcev in 5 samic) | 14. | Št. tretiranj | = 3 (plus ustrezno št. kontrol) | = 3 (plus ustrezno št. kontrol) | = 3 (plus ustrezno št. kontrol) | 15. | Št. posod na tretiranje | najmanj 4 | najmanj 2 | najmanj 2 | 16. | Št. rib na preskusno koncentracijo | 16 odraslih samic in 8 samcev (4 samice in 2 samca v vsaki ponovitveni posodi) | 10 odraslih samic in 10 samcev (5 samic in 5 samcev v vsaki ponovitveni posodi) | 10 odraslih samic in 10 samcev (5 samic in 5 samcev v vsaki ponovitveni posodi) | 17. | Način hranjenja | živi ali zamrznjeni odrasli solinski rakci ali njihovi navpliji dvakrat ali trikrat na dan (ad libitum), komercialno dostopna hrana ali kombinacija navedenega | navpliji solinskih rakcev dvakrat ali trikrat na dan (ad libitum), komercialno dostopna hrana ali kombinacija navedenega | navpliji solinskih rakcev dvakrat ali trikrat na dan (ad libitum), komercialno dostopna hrana ali kombinacija navedenega | 18. | Prezračevanje | brez, razen če koncentracija raztopljenega kisika pade pod 60 % nasičenosti | brez, razen če koncentracija raztopljenega kisika pade pod 60 % nasičenosti | brez, razen če koncentracija raztopljenega kisika pade pod 60 % nasičenosti | 19. | Voda za redčenje | čista površinska voda, voda iz vodnjaka ali modelna razredčevalna voda ali deklorirana vodovodna voda | čista površinska voda, voda iz vodnjaka ali modelna razredčevalna voda ali deklorirana vodovodna voda | čista površinska voda, voda iz vodnjaka ali modelna razredčevalna voda ali deklorirana vodovodna voda | 20. | Obdobje predhodne izpostavljenosti | priporočeno 7 dni | priporočeno 7 dni | priporočeno 7 dni | 21. | Trajanje izpostavljenosti kemikaliji | 21 dni | 21 dni | 21 dni | 22. | Biološke končne točke | preživetje | obnašanje | 2y spolne značilnosti | VTG | preživetje | obnašanje | 2y spolne značilnosti | VTG | preživetje | obnašanje | VTG | 23. | Sprejemljivost preskusa | raztopljeni kisik > 60 % nasičenosti; srednja temperatura 25 ± 2 °C; 90-odstotno preživetje rib v kontrolah; izmerjene preskusne koncentracije v razponu 20 % srednjih izmerjenih vrednosti na stopnjo tretiranja | raztopljeni kisik > 60 % nasičenosti; srednja temperatura 24 ± 2 °C; 90-odstotno preživetje rib v kontrolah; izmerjene preskusne koncentracije v razponu 20 % srednjih izmerjenih vrednosti na stopnjo tretiranja | raztopljeni kisik > 60 % nasičenosti; srednja temperatura 26 ± 2 °C; 90-odstotno preživetje rib v kontrolah; izmerjene preskusne koncentracije v razponu 20 % srednjih izmerjenih vrednosti na stopnjo tretiranja | Dodatek 3 | Nekatere kemične značilnosti sprejemljive vode za redčenje | Sestavina | Koncentracije | delci | < 20 mg/l | skupni organski ogljik | < 2 mg/l | neionizirani amoniak | < 1 μg/l | ostanek klora | < 10 μg/l | skupni organofosforni pesticidi | < 50 ng/l | skupni organoklorni pesticidi in poliklorirani bifenili | < 50 ng/l | skupni organski klor | < 25 ng/l | Dodatek 4A | Substrat za drstenje cebrice | Drstilni pladenj : popolnoma steklena laboratorijska posoda, na primer 22 × 15 × 5,5 cm (d × š × g), pokrita z odstranljivo rešetko iz nerjavnega jekla (širina mreže 2 mm). Rešetka mora prekriti odprtino laboratorijske posode pod robom. | Na rešetko je treba pritrditi substrat za drstenje. Zagotoviti mora strukturo, v katero se premaknejo ribe. Primerne so na primer umetne akvarijske rastline iz zelene plastike (opomba: proučiti je treba morebitno adsorpcijo preskusne kemikalije na plastični material). Plastični material je treba dovolj dolgo izpirati v zadostni količini tople vode za zagotovitev, da v preskusno vodo ne bo prešla nobena kemikalija. Pri uporabi steklenih materialov je treba zagotoviti, da se ribe med intenzivnim premikanjem ne poškodujejo niti niso utesnjene. | Razdalja med pladnjem in steklenimi ploščami mora biti vsaj 3 cm, da bi bilo zagotovljeno, da se ribe ne drstijo zunaj pladnja. Ikre, odložene na pladenj, padejo skozi rešetko in se lahko vzorčijo 45–60 minut po začetku osvetljenosti. Prozorne ikre niso sprijete in se lahko enostavno štejejo z uporabo prečne svetlobe. Če je v posodi pet samic, se do 20 iker na dan lahko šteje za nizko število, do 100 iker kot srednje in več kot 100 iker kot visoko število. Drstilni pladenj je treba odstraniti, zbrati ikre in drstilni pladenj ponovno postaviti v preskusno posodo čim pozneje zvečer ali zelo zgodaj zjutraj. Čas do ponovne postavitve rešetke ne sme presegati eno uro, saj bi sicer lahko substrat za drstenje vodil do posameznih parjenj in drstenj ob neobičajnem času. Če je treba zaradi razmer drstilni pladenj vstaviti pozneje, je treba to storiti vsaj 9 ur po začetku osvetljenosti. Drstenje se tako pozno ne začne več. | Dodatek 4B | Substrat za drstenje črnoglavega pisanca | V vsako preskusno komoro se postavijo dve ali tri kombinirane plastične/keramične/steklene plošče ali plošče iz nerjavnega jekla in drstilni pladnji (npr. 80 mm dolg siv polkrožen žleb na pladenj z robovi, dolg 130 mm) (glej sliko). Ustrezno pripravljene plošče iz PVC ali keramike so dokazano primerne za substrat za drstenje (Thorpe idr., 2007). | Priporočeno je, da so plošče pobrušene, da se izboljša oprijem. Pladenj mora biti tudi zaščiten, da se ribam prepreči dostop do iker, ki padejo skozi, razen če je bil za uporabljen substrat za drstenje dokazan učinkovit oprijem. | Podlaga je zasnovana tako, da zadrži vse ikre, ki se ne primejo površine plošče in bi zato padle na dno posode (ali tiste ikre, ki so odložene neposredno na ravno plastično podlago). Vse substrate za drstenje je treba pred uporabo izpirati v vodi za redčenje vsaj 12 ur. | VIRI | Thorpe, K. L., Benstead, R., Hutchinson, T. H., Tyler, C. R., 2007. An optimised experimental test procedure for measuring chemical effects on reproduction in the fathead minnow, Pimephales promelas. Aquatic Toxicology, 81, 90–98. | Dodatek 5A | Ocena sekundarnih spolnih značilnosti pri črnoglavem pisancu za zaznavanje nekaterih kemikalij z endokrinim delovanjem | Pregled | Potencialno pomembne značilnosti fizičnega videza odraslih črnoglavih pisancev pri preskušanju povzročiteljev endokrinih motenj vključujejo barvo telesa (tj. svetlo/temno), vzorce obarvanja (tj. prisotnost navpičnih prog), obliko telesa (tj. oblika glave in območja prsi, napetost trebuha) in posebne sekundarne spolne značilnosti (tj. število in velikost drstnih izpuščajev, velikost dorzalne strani trupa pred hrbtno plavutjo in leglica). | Drstni izpuščaji so na glavi (dorzalna stran trupa pred hrbtno plavutjo) razmnoževalno aktivnih samcev črnoglavega pisanca in so običajno razporejeni v dvostransko simetrični vzorec (Jensen idr., 2001). Pri kontrolnih samicah ter mladih samcih in samicah razvoj izpuščajev ni viden (Jensen idr., 2001). Okoli oči in med nosnicama samcev je lahko do osem posameznih izpuščajev. Največ izpuščajev in največji izpuščaji se nahajajo v dveh vzporednih linijah neposredno pod nosnicama in nad usti. Pri veliko ribah so skupine izpuščajev pod spodnjo čeljustjo; izpuščaji, ki so najbliže ustom, se običajno pojavljajo kot par, medtem ko lahko bolj ventralen sklop sestavljajo največ štirje izpuščaji. Dejansko število izpuščajev je redko večje od 30 (razpon 18–28; Jensen idr., 2001). Prevladujoči izpuščaji (v smislu števila) so prisotni kot posamezne, razmeroma okrogle strukture, katerih višina je približno enaka polmeru. Večina razmnoževalno aktivnih samcev ima tudi vsaj nekaj izpuščajev, ki so večji in izraziti, da jih ni mogoče razlikovati kot posamezne strukture. | Nekatere vrste kemikalij, ki povzročajo endokrine motnje, lahko povzročijo nenormalen pojav nekaterih sekundarnih spolnih značilnosti pri nasprotnem spolu; agonisti androgenih receptorjev, kot je 17β-metiltestosteron ali 17β-trenbolon, lahko pri samicah črnoglavega pisanca povzročijo razvoj drstnih izpuščajev (Smith 1974; Ankley idr., 2001; 2003), medtem ko lahko agonisti estrogenih receptorjev zmanjšajo število ali velikost drstnih izpuščajev pri samcih (Miles-Richardson idr. 1999; Harries idr. 2000). | V nadaljevanju je naveden opis opredelitve drstnih izpuščajev pri črnoglavem pisancu na podlagi postopkov, uporabljenih v laboratoriju Agencije za varstvo okolja ZDA (U. S. Environmental Protection Agency) v Duluthu, Minnesota. Specifični izdelki in/ali oprema se lahko nadomestijo s primerljivimi materiali, ki so na voljo. | Opazovanje je najboljše z uporabo osvetljenega povečevalnega stekla ali trikratno osvetljenega stereomikroskopa. Ribe se opazujejo dorzalno in anteriorno naprej (glava proti opazovalcu). | (a) | Ribe se postavijo v majhno petrijevko (npr. s premerom 100 mm) anteriorno naprej in ventralno navzdol. Iskalo se usmeri tako, da se omogoči identifikacija izpuščajev. Za identifikacijo območij z izpuščaji se riba nežno in počasi obrne z ene strani na drugo. Izpuščaji se preštejejo in ocenijo. | (b) | Opazovanje se ponovi na ventralni površini glave, tako da se riba v petrijevko postavi dorzalno anteriorno naprej. | (c) | Opazovanje posamezne ribe je treba zaključiti v 2 minutah. | Štetje in ocenjevanje izpuščajev | Za ocenjevanje prisotnosti in razvoja izpuščajev pri odraslih črnoglavih pisancih je bilo identificiranih šest posebnih območij. Za določitev lokacije in količine prisotnih izpuščajev je bila pripravljena predloga (glej konec tega Dodatka). Število izpuščajev se zabeleži, njihova velikost pa se lahko za vsak organizem kvantitativno razvrsti kot sledi: 0 – odsoten, 1 – prisoten, 2 – povečan in 3 – izrazit (slika 1). | Ocena 0 – odsotnost izpuščajev. Ocena 1 – prisoten, ta ocena se opredeli kot vsak izpuščaj z eno točko, v kateri je višina skoraj enaka polmeru (premeru). Ocena 2 – povečan, ta ocena se opredeli s tkivom, ki je po videzu podobno zvezdici in ima običajno veliko zvezdasto osnovo z brazdami ali gubami, ki izhajajo in središča. Izpuščaj je v višino pogosto bolj žagast, vendar je lahko občasno nekoliko zaokrožen. Ocena 3 – izrazit, ta ocena običajno pomeni razmeroma velik in zaokrožen izpuščaj z manj definirano strukturo. Ti izpuščaji se občasno nahajajo skupaj in tvorijo eno maso skupaj s posameznimi območji (B, C in D, opisana v nadaljevanju) ali njihovo kombinacijo. Obarvanost in oblika sta podobna oceni 2, vendar sta občasno razmeroma neselektivna. S tem ocenjevalnim sistemom je skupna ocena izpuščajev običajno < 50 pri normalnih kontrolnih samcih s številom izpuščajev od 18 do 20 (Jensen idr., 2001). | Slika 1 | Dejansko število izpuščajev pri nekaterih ribah je lahko večje od polj v predlogi (Dodatek A) za določeno območje ocenjevanja. V tem primeru se lahko označijo dodatne ocene, in sicer desno ali levo od polja. Zato ni treba, da je predloga simetrična. Dodatna tehnika označevanja izpuščajev, ki so v parih ali združeni navpično ob vodoravni ravnini ust, se lahko izvede z označevanjem dveh ocen izpuščajev v enem polju. | Območja označevanja: | A– izpuščaji okoli oči. Označeni dorzalno do ventralno okoli anteriornega očesnega obroča. Pri odraslih kontrolnih samcih jih je pogosto več, pri kontrolnih samicah jih ni, na splošno so v parih (en blizu vsakega očesa) ali sami pri samicah, izpostavljenih androgenom. | B– izpuščaji med nosnicama (pore senzornega kanala). Pri kontrolnih samcih so običajno v parih in v razvitejših fazah (2 – povečani ali 3 – izraziti). Niso prisotni pri kontrolnih samicah, pri čemer se pojavljajo in razvijajo pri samicah, izpostavljenih androgenom. | C– izpuščaji neposredno anteriorno na nosni odprtini, vzporedno z usti. Pri odraslih kontrolnih samcih so običajno povečani ali izraziti. Pri manj razvitih samcih ali samicah, tretiranih z androgenom, so prisotni ali povečani. | D– izpuščaji vzporedno z ustno linijo. Pri kontrolnih samcih so običajno ocenjeni kot razviti. Pri kontrolnih samicah niso prisotni, vendar so prisotni pri samicah, izpostavljenih androgenom. | E– izpuščaji na spodnji čeljusti, blizu ust, so običajno majhni in pogosto v parih. Pri kontrolnih ali tretiranih samcih in tretiranih samicah se razlikujejo. | F– izpuščaji ventralno na E. Pogosto so majhni in v parih. Prisotni so pri kontrolnih samcih in samicah, izpostavljenih androgenom. | VIRI | (1) | Ankley, G. T., Jensen, K. M., Kahl, M. D., Korte, J. J., Makynen, M. E. 2001. Description and evaluation of a short-term reproduction test with the fathead minnow (Pimephales promelas). Environ Toxicol Chem 20: 1276–1290. | (2) | Ankley, G. T., Jensen, K. M., Makynen, E. A., Kahl, M. D., Korte, J. J., Hornung, M. W., Henry, T. R., Denny, J. S., Leino, R. L., Wilson, V. S., Cardon, M. C., Hartig, P. C., Gray, E. L. 2003. Effects of the androgenic growth promoter 17-β trenbolone on fecundity and reproductive endocrinology of the fathead minnow. Environ Toxicol Chem 22: 1350–1360. | (3) | Harries, J. E., Runnalls, T., Hill, E., Harris, C. A., Maddix, S., Sumpter, J. P., Tyler, C. R. 2000. Development of a reproductive performance test for endocrine disrupting chemicals using pair-breeding fathead minnows (Pimephales promelas). Environ Sci Technol 34: 3003–3011. | (4) | Jensen, K. M., Korte, J. J., Kahl, M. D., Pasha, M. S., Ankley, G. T. 2001. Aspects of basic reproductive biology and endocrinology in the fathead minnow (Pimephales promelas). Comp Biochem Physiol C 128: 127–141. | (5) | Kahl, M. D., Jensen, K. M., Korte, J. J., Ankley, G. T. 2001. Effects of handling on endocrinology and reproductive performance of the fathead minnow. J Fish Biol 59: 515–523. | (6) | Miles-Richardson, S.R., Kramer, V. J., Fitzgerald, S. D., Render, J. A., Yamini, B., Barbee, S. J., Giesy, J. P. 1999. Effects of waterborne exposure of 17-estradiol on secondary sex characteristics and gonads of fathead minnows (Pimephales promelas). Aquat Toxicol 47: 129–145. | (7) | Smith, R. J. F. 1974. Effects of 17-methyltestosterone on the dorsal pad and tubercles of fathead minnows (Pimephales promelas). Can J Zool 52: 1031–1038. | Predloga za izpuščaje | Številska ocena | ID | 1 – prisoten | Datum | 2 – povečan | Skupna ocena | 3 – izrazit | | A | X1 | X1 | X1 | X1 | | B | X1 | X1 | X1 | X1 | | C | X1 | X1 | X1 | X1 | X1 | X1 | X1 | X1 | X1 | X1 | | D | X1 | X1 | X1 | X1 | X1 | X1 | X1 | X1 | X1 | X1 | | | E | X1 | X1 | | | F | X1 | X1 | X1 | X1 | Dodatek 5B | Ocena sekundarnih spolnih značilnosti pri medaki za zaznavanje nekaterih kemikalij z endokrinim delovanjem | V nadaljevanju je naveden opis bradavičastih podaljškov (*2), ki so sekundarna spolna značilnost pri medaki (Oryzias latipes). | (1) | Po odstranitvi jeter (Dodatek 6) se telo postavi v koničasto epruveto, ki vsebuje približno 10 ml 10-odstotnega nevtralno pufranega formalina (glava navzgor in rep navzdol). Če so spolne žleze fiksirane v raztopini, ki ni 10-odstotni nevtralno pufran formalin, se z rezilom naredi prečni rez čez telo med anteriornim območjem predrepne plavuti in anusom, pri čemer je treba paziti, da se ne poškodujejo gonopora in same spolne žleze (slika 3). Kranialna stran telesa ribe se vstavi v raztopino fiksativa, da se ohranijo spolne žleze, repna stran telesa ribe pa se vstavi v 10-odstotni nevtralno pufran formalin, kot je opisano zgoraj. | (2) | Ko se telo ribe vstavi v 10-odstotni nevtralno pufran formalin, se anteriorno območje predrepne plavuti prime s pinceto in za približno 30 sekund prepogne, da je predrepna plavut odprta. Pri prijemu predrepne plavuti s pinceto se nekaj plavutnic v anteriornem območju previdno prime, da se bradavičasti podaljški ne opraskajo. | (3) | Ko je predrepna plavut približno 30 sekund odprta, se telo ribe shrani v 10-odstotnem nevtralno pufranem formalinu pri sobni temperaturi do meritve bradavičastih podaljškov (meritev je treba izvesti po vsaj 24-urni fiksaciji). | Merjenje | (1) | Po vsaj 24-urni fiksaciji telesa ribe v 10-odstotnem nevtralnem pufranem formalinu se telo ribe vzame iz koničaste epruvete in formalin obriše s filtrirnim papirjem (ali papirnato brisačo). | (2) | Riba se obrne s trebušno stranjo navzgor. Nato se predrepna plavut previdno odreže z majhnimi secirnimi škarjami (predrepna plavut se po možnosti odreže z nekaj radiji (pterygiophore). | (3) | Anteriorni del odrezane predrepne plavuti se prime s pinceto in položi na objektno stekelce z nekaj kapljicami vode. Nato se predrepna plavut prekrije s krovnim stekelcem. Med prijemanjem predrepne plavuti s pinceto je treba paziti, da se bradavičasti podaljški ne opraskajo. | (4) | S števcem se pod biološkim mikroskopom (pokončni mikroskop ali obrnjeni mikroskop) prešteje število ploščic z bradavičastimi podaljški. Bradavičasti podaljški se prepoznajo, če je na posteriornem robu ploščice vidna majhna tvorba podaljškov. Na delovni list se zapiše število ploščic z bradavičastimi podaljški na vsaki plavutnici (npr. prva plavutnica: 0, druga plavutnica: 10, tretja plavutnica: 12 itd.), vsota teh števil po posameznih ribah pa se vnese v Excelovo preglednico. Po potrebi se predrepna plavut fotografira in na fotografiji prešteje število ploščic z bradavičastimi podaljški. | (5) | Po meritvi se predrepna plavut vstavi v koničasto epruveto, opisano v (1), in shrani. | Slika 1 | Diagram, na katerem so prikazane razlike v obliki in velikosti predrepne plavuti glede na spol. A, samec; B, samica. Oka, T. B., 1931. On the processes on the fin rays of the male of Oryzias latipes and other sex characters of this fish. J. Fac. Sci., Tokyo Univ., IV, 2: 209–218. | Slika 2 | A, podaljški na ploščicah predrepne plavutnice. J.P., ploščica; A.S., aksialni prostor; P., proces. B, distalna okončina plavutnice. Actinotrichia (Act.) so na vrhu. Oka, T. B., 1931. On the processes on the fin rays of the male of Oryzias latipes and other sex characters of this fish. J. Fac. Sci., Tokyo Univ., IV, 2: 209–218. | Slika 3 | Fotografija telesa ribe, na kateri je prikazana stran reza, če so spolne žleze fiksirane v raztopini za fiksiranje, ki ni 10-odstotni nevtralno pufran formalin. V tem primeru se preostalo telo z rezilom (rdeča) prereže med anteriornim delom predrepne plavuti in anusom, sprednji del ribe se vstavi v raztopino za fiksiranje spolnih žlez, zadnji del ribe pa se vstavi v 10-odstotni nevtralno pufran formalin. | Dodatek 6 | Priporočeni postopki odvzema vzorcev za analizo vitelogenina | Preprečiti je treba navzkrižno onesnaženje med vzorci VTG samcev in samic. | Postopek 1A: Črnoglavi pisanec, odvzem krvi iz repne vene/arterije | Po anesteziji se repno steblo delno prereže z rezilom skalpela, pri čemer se kri odvzame iz repne vene/arterije s heparinizirano mikrohematokritsko kapilarno cevko. Ko je kri odvzeta, se plazma hitro izolira s 3-minutnim centrifugiranjem pri 15 000 g (ali namesto tega 10 minut pri 15 000 g in 4 °C). Po želji se lahko po centrifugiranju določi odstotek hematokrita. Delež plazme se nato odstrani iz mikrohematokritske cevke in shrani v centrifugirki z 0,13 enotami aprotinina (inhibitor protaze) pri – 80 °C, dokler ni mogoče določiti vitelogenina. Odvzete količine plazme so običajno od 5 do 60 mikrolitrov na ribo, odvisno od velikost črnoglavega pisanca (ki je odvisna od spola) (Jensen idr., 2001). | Postopek 1B: Črnoglavi pisanec, odvzem krvi iz srca | Namesto tega se lahko kri odvzame tudi s srčno punkcijo s heparinizirano brizgo (1 000 enot heparina na ml). Kri se prenese v mikroepruvete (shranjene na ledu) in nato centrifugira (5 minut, 7 000 g, sobna temperatura). Plazmo je treba prenesti v čiste mikroepruvete (v alikvotih, če količina plazme to omogoča) in takoj zamrzniti pri – 80 °C, dokler se ne analizira (Panter idr., 1998). | Postopek 2A: Japonska medaka, odstranitev jeter pri medaki | Odstranitev preskusne ribe iz preskusne komore | (1) | Preskusno ribo je treba iz preskusne komore odstraniti z lovilno mrežico. Paziti je treba, da preskusna riba ne pade v druge preskusne komore. | (2) | Načeloma je treba preskusne ribe odstraniti po naslednjem vrstnem redu: kontrola, kontrola s topilom (če je primerno), najnižja koncentracija, srednja koncentracija, najvišja koncentracija in pozitivna kontrola. Poleg tega je treba odstraniti vse samce iz ene preskusne komore, preden se odstranijo preostale samice. | (3) | Spol posamezne preskusne ribe se določi na podlagi zunanjih spolnih značilnosti (npr. oblike predrepne plavuti). | (4) | Preskusna riba se vstavi v posodo za prenos in prenese na delovno postajo za odstranitev jeter. Preveri se, ali so oznake preskusne komore in posode za prenos točne ter potrdi, da sta število rib, ki so bile odstranjene iz preskusne komore, in število rib, ki ostanejo v preskusni komori, skladni s pričakovanji. | (5) | Če spola ni mogoče določiti na podlagi zunanjega videza rib, se odstranijo vse ribe iz preskusne komore. V tem primeru je treba spol določiti z opazovanjem spolnih žlez ali sekundarnih spolnih značilnosti pod stereomikroskopom. | Odstranitev jeter | (1) | Preskusna riba se iz posode za prenos prenese v raztopino za anestezijo z lovilno mrežico. | (2) | Ko je preskusna riba anestezirana, se prenese na filtrirni papir (ali papirnato brisačo) s pinceto (za splošno rabo). S pinceto se prime glava preskusne ribe, da se prepreči poškodba repa. | (3) | S površine preskusne ribe na filtrirnem papirju (ali papirnati brisači) se obriše voda. | (4) | Riba se obrne s trebušno stranjo navzgor. Nato se z majhnimi secirnimi škarjami naredi majhen prečni rez na sredini med ventralnim delom vratu in srednjim trebušnim delom. | (5) | V majhen rez se vstavijo secirne škarje, s katerimi se zareže v trebuh od točke pod škržnim plaščem do kranialne strani anusa po sredini trebuha. Paziti je treba, da se secirne škarje ne vstavijo pregloboko, s čimer se prepreči poškodba jeter in spolnih žlez. | (6) | Pod stereomikroskopom se izvedejo naslednji postopki. | (7) | Preskusna riba se s trebušno stranjo navzgor postavi na papirnato brisačo (na voljo je tudi petrijevka ali objektno stekelce). | (8) | Stene trebušne votline se razprejo z natančno pinceto, notranji organi pa se eksteriorizirajo. Po potrebi je sprejemljiva tudi eksteriorizacija notranjih organov z odstranitvijo ene strani stene trebušne votline. | (9) | Z drugo natančno pinceto se izpostavijo jetra in žolčnik. Nato se prime žolčni vod in odreže žolčnik. Paziti je treba, da se žolčnik ne poškoduje. | (10) | Na enak način se prime požiralnik in odstrani prebavni trakt. Paziti je treba, da iz prebavnega trakta ne uide vsebina. Odstranita se repni prebavni trakt iz anusa in trakt iz trebušne votline. | (11) | Z obrobja jeter se odrežeta masa maščobe in drugo tkivo. Paziti je treba, da se jetra ne opraskajo. | (12) | Z natančno pinceto se prime jetrno portalno polje, jetra pa se odstranijo iz trebušne votline. | (13) | Jetra se položijo na objektno stekelce. Po potrebi se s površine jeter z natančno pinceto odstranita vsa dodatna maščoba in nepomembno tkivo (npr. notranja plast trebušne votline). | (14) | Teža jeter se izmeri s tarirano 1,5-mililitrsko mikroepruveto z uporabo elektronske analitske tehtnice. Vrednost se zabeleži na delovnem listu (odčitek: 0,1 mg). Potrdijo se identifikacijski podatki na nalepki mikroepruvete. | (15) | Pokrov mikroepruvete z jetri se zapre. Shrani se na rešetki za hlajenje (ali rešetki za zamrzovanje). | (16) | Po odstranitvi enih jeter se instrumenti za seciranje očistijo ali nadomestijo s čistimi. | (17) | Jetra se iz vseh rib v posodi za prenos odstranijo, kot je opisano zgoraj. | (18) | Ko se odstranijo jetra iz vseh rib v posodi za prenos (tj. vseh samcev ali samic v preskusni komori), se vsi vzorci jeter postavijo na rešetko za epruvete z identifikacijsko nalepko in shranijo v zamrzovalniku. Če se jetra donirajo za predhodno tretiranje kmalu po odstranitvi, se vzorci prenesejo na naslednjo delovno postajo na rešetki za hlajenje (ali rešetki za zamrzovanje). | Po odstranitvi jeter je telo ribe na voljo za meritev sekundarnih spolnih značilnosti. | Vzorec | Vzorci jeter, odvzeti pri preskusnih ribah, se shranijo pri ≤ –70 °C, če se ne uporabijo za predhodno tretiranje kmalu po odstranitvi. | Slika 1 | Rez se s škarjami naredi neposredno anteriorno na prsno plavut. | Slika 2 | V srednjo črto trebuha se s škarjami zareže do točke, ki se nahaja približno 2 mm kranialno na anus. | Slika 3 | Trebušne stene se razširijo s prijemalkami, da se izpostavijo jetra in drugi notranji organi. (Namesto tega se lahko trebušne stene pripnejo s strani.) | Slika 4 | Jetra se neposredno secirajo in odstranijo s prijemalkami. | Slika 5 | Črevesje se s prijemalkami nežno umakne. | Slika 6 | Oba konca črevesja in vse pritrditve mezenterija se odrežejo s škarjami. | Slika 7 (samica) | Postopek je enak za samico. | Slika 8 | Končan postopek. | Postopek 2B: Japonska medaka (Oryzias latipes), predhodno tretiranje jeter za analizo vitelogenina | Iz kompleta za metodo ELISA se vzame steklenica pufra za homogenat in ohladi z zdrobljenim ledom (temperatura raztopine: ≤ 4 °C). Če se uporabi pufer za homogenat iz sistema EnBio ELISA, se raztopina odtaja pri sobni temperaturi, nato pa se steklenica ohladi z zdrobljenim ledom. | Količina pufra za homogenat za jetra se izračuna na podlagi njihove teže (za homogenat se na miligram teže jeter doda 50 μl homogenata). Če jetra tehtajo na primer 4,5 mg, je količina pufra za homogenat za jetra 225 μl. Za vsa jetra se pripravi seznam količin pufra za homogenat. | Priprava jeter za predhodno tretiranje | (1) | Neposredno pred predhodnim tretiranjem se iz zamrzovalnika vzame 1,5-mililitrska mikroepruveta z jetri. | (2) | Jetra samcev je treba predhodno tretirati pred jetri samic, da se prepreči onesnaženje vitelogenina. Poleg tega je treba preskusne skupine predhodno tretirati po naslednjem vrstnem redu: kontrola, kontrola s topilom (če je primerno), najnižja koncentracija, srednja koncentracija, najvišja koncentracija in pozitivna kontrola. | (3) | Število 1,5-mililitrskih mikroepruvet z vzorci jeter, vzetih iz zamrzovalnika ob danem času, ne sme presegati števila, ki se lahko hkrati centrifugira. | (4) | Na rešetki za zamrzovanje se 1,5-mililitrske mikroepruvete z vzorci jeter razporedijo glede na številko vzorca (jeter ni treba odtajati). | Izvedba predhodnega tretiranja | 1. Dodajanje homogenizacijskega pufra | (1) | Na seznamu se preveri količina pufra za homogenat, ki ga je treba uporabiti za posamezen vzorec jeter, mikropipeta pa se nastavi (razpon količine: 100–1 000 μl) na ustrezno količino. Na mikropipeto se namesti čista konica. | (2) | Pufer za homogenat se vzame iz steklenice za reagent in doda v 1,5-mililitrsko mikroepruveto z jetri. | (3) | Pufer za homogenat se v skladu z zgoraj opisanim postopkom doda v vse 1,5-mililitrske mikroepruvete z jetri. Konice mikropipete ni treba zamenjati z novo. Če je konica onesnažena ali bi lahko bila onesnažena, jo je treba zamenjati. | 2. Homogenizacija jeter | (1) | Na homogenizator mikroepruvete se namesti novo pestilo. | (2) | Pestilo se vstavi v 1,5-mililitrsko mikroepruveto. Homogenizator mikroepruvete se drži tako, da stisne jetra med površino pestila in notranjo steno 1,5-mililitrske mikroepruvete. | (3) | Homogenizator mikroepruvete mora delovati od 10 do 20 sekund. Med delovanjem se 1,5-mililitrska mikroepruveta ohlaja z zdrobljenim ledom. | (4) | Pestilo se dvigne iz 1,5-mililitrske mikroepruvete in približno 10 sekund pusti počivati. Nato se izvede vizualni pregled stanja suspenzije. | (5) | Če se v suspenziji opazijo deli jeter, se ponovita koraka (3) in (4), da se pripravi zadovoljiv homogenat jeter. | (6) | Suspendirani homogenat jeter se do centrifugiranja hladi na rešetki za zamrzovanje. | (7) | Za vsak homogenat se pestilo zamenja z novim. | (8) | Vsa jetra se homogenizirajo s pufrom za homogenat v skladu z zgoraj opisanim postopkom. | 3. Centrifugiranje suspendiranega homogenata jeter | (1) | Temperatura ohlajene komore za centrifugiranje se potrdi pri ≤ 5 °C. | (2) | V ohlajeno centrifugo se vstavijo 1,5-mililitrske mikroepruvete s suspendiranim homogenatom jeter (po potrebi se prilagodi ravnotežje). | (3) | Suspendirani homogenat jeter se 10 minut centrifugira pri 13 000 g in ≤ 5 °C. Če pa so supernatanti ustrezno ločeni, se lahko sila in čas centrifugiranja po potrebi prilagodita. | (4) | Po centrifugiranju se preveri, ali so supernatanti ustrezno ločeni (vrhnja plast: lipid, srednja plast: supernatant, spodnja plast: jetrno tkivo). Če ločitev ni ustrezna, se suspenzija ponovno centrifugira v enakih pogojih. | (5) | Vsi vzorci se odstranijo iz ohlajene centrifuge in na rešetki za zamrzovanje razvrstijo po številki vzorca. Paziti je treba, da se ločene plasti po centrifugiranju ne suspendirajo ponovno. | 4. Odvzemanje supernatanta | (1) | Štiri 0,5-mililitrske mikroepruvete se za shranjevanje supernatanta položijo na rešetko za epruvete. | (2) | Z mikropipeto se odvzame 30 μl vsakega supernatanta (ločenega kot srednja plast) in prenese v eno 0,5-mililitrsko mikroepruveto. Paziti je treba, da se ne odvzame lipid z vrhnje plasti ali jetrno tkivo s spodnje plasti. | (3) | Supernatant se odvzame in prenese v dve drugi 0,5-mililitrski mikroepruveti na enak način, kot je opisano zgoraj. | (4) | Z mikropipeto se odvzame preostali supernatant (če je mogoče: ≥ 100 μl). Nato se supernatant prenese v preostali 0,5-mililitrski mikroepruveti. Paziti je treba, da se ne odvzame lipid z vrhnje plasti ali jetrno tkivo s spodnje plasti. | (5) | Pokrov 0,5-mililitrske mikroepruvete se zapre in na nalepko zapiše količina supernatanta. Takoj zatem se mikroepruvete ohladijo na rešetki za zamrzovanje. | (6) | Za vsak supernatant se konica mikropipete zamenja z novo. Če se na konico prime veliko lipida, se takoj zamenja z novo, da se prepreči onesnaženje ekstrakta jeter z maščobo. | (7) | Ves centrifugirani supernatant se prenese v štiri 0,5-mililitrske mikroepruvete v skladu z zgoraj opisanim postopkom. | (8) | Ko se supernatant prenese v 0,5-mililitrske mikroepruvete, se te postavijo na rešetko za epruvete z identifikacijskimi nalepkami in takoj nato zamrznejo v zamrzovalniku. Če se koncentracije VTG merijo takoj po predhodnem tretiranju, se ena 0,5-mililitrska mikroepruveta (ki vsebuje 30 μl supernatanta) ohrani hladna na rešetki za epruvete in prenese na delovno postajo, kjer se izvaja preskus ELISA. V takem primeru se preostale mikroepruvete postavijo na rešetke za epruvete in zamrznejo v zamrzovalniku. | (9) | Po odvzemu supernatanta se ostanki primerno zavržejo. | Shranjevanje vzorca | Dokler se 0,5-mililitrske mikroperuvete s supernatantom homogenata jeter ne uporabijo za ELISA, se shranijo pri ≤ – 70 °C. | Postopek 3A: Cebrica, odvzem krvi iz repne vene/arterije | Takoj po anesteziji se repno steblo prečno prereže, pri čemer se kri iz repne arterije/vene odvzame s heparinizirano mikrohematokritsko kapilarno cevko. Količine krvi so v razponu od 5 do 15 μl in so odvisne od velikosti ribe. V mikrokapilarno cevko se doda enaka količina pufra aprotinina (6 μgml v PBS), plazma pa se od krvi loči s centrifugiranjem (5 minut pri 600 g). Plazma se zbere v preskusnih epruvetah in shrani pri – 20 °C, dokler se ne analizira glede vitelogenina ali drugih zadevnih beljakovin. | Postopek 3B: Cebrica, odvzem krvi s srčno punkcijo | Da se prepreči koagulacija krvi in razgradnja beljakovin, se vzorci odvzamejo v fosfatnem pufru s soljo (PBS), ki vsebuje heparin (1 000 enot/ml) in aprotinin, ki zavira proteazo (2 TIU/ml). Za sestavine pufra se priporočajo heparin, amonijeva sol in liofilizirani aprotinin. Za vzorčenje krvi se priporoča brizga (1 ml) s pritrjeno tanko iglo (npr. Braun Omnikan-F). Brizga mora biti predhodno napolnjena s pufrom (približno 100 μl), da se iz vseh rib v celoti eluirajo majhne količine krvi. Vzorci krvi se odvzamejo s srčno punkcijo. Najprej je treba ribe anestezirati z MS-222 (100 mg/l). Ustrezna stopnja anestezije uporabniku omogoča, da loči srčni utrip cebric. Med punkcijo srca naj bo bat brizge pod rahlo napetostjo. Odvzeta količina krvi je v razponu med 20 in 40 mikrolitri. Po srčni punkciji je treba zmes krvi/pufra prenesti v preskusno epruveto. Plazma se od krvi loči s centrifugiranjem (20 minut, 5 000 g) in jo je treba shraniti pri – 80 °C, dokler se ne potrebuje za analizo. | Postopek 3C Standardni delovni postopek: cebrica, homogenizacija glave in repa | (1) | Ribe se anestezirajo in evtanazirajo v skladu z opisom preskusa. | (2) | Glava in rep ribe se odrežeta v skladu s sliko 1. | Pomembno: med ravnanji s posameznimi ribami je treba vse instrumente za seciranje in rezalno desko sprati in ustrezno očistiti (npr. s 96-odstotnim etanolom), da se prepreči ‚vitelogeninsko onesnaženje‘ neinduciranih samcev zaradi samic ali induciranih samcev. | Slika 1 | rez zadaj | rez za hrbtno plavutjo | za analizo VTG | za analizo VTG | za histologijo spol. žlez | (3) | Teža zbranih glav in repov posameznih rib se izmeri na najbližji miligram. | (4) | Po tehtanju se deli vnesejo v ustrezne epruvete (npr. 1,5-mililitrske mikroepruvete) in zamrznejo pri – 80 °C do homogenizacije oz. dokler se neposredno ne homogenizirajo na ledu z dvema plastičnima pestiloma. (Druge metode se lahko uporabijo, če se izvajajo na ledu in zagotovijo homogeno maso.) Pomembno: epruvete je treba ustrezno oštevilčiti, da se lahko glava in rep ribe povežeta z ustreznim delom telesa, uporabljenim za histologijo spolnih žlez. | (5) | Ko dobimo homogeno maso, se ji doda 4-kratna teža tkiva ledeno mrzlega homogenizacijskega pufra (*3). Delo s pestiloma je treba nadaljevati, dokler zmes ni homogena. Pomembno opozorilo: za vsako ribo se uporabita dve novi pestili. | (6) | Vzorci se postavijo na led do začetka centrifugiranja pri 4 °C in 50 000 × g za 30 minut. | (7) | S pipeto se supernatant odmeri na dele po 20 μl v vsaj dve epruveti, tako da se konica pipete potopi pod plast maščobe na površini in supernatant previdno izsesa brez delcev maščobe ali peletov. | (8) | Epruvete se do uporabe shranijo pri – 80 °C. | Dodatek 7 | Obogateni vzorci vitelogenina in medpreskusni referenčni standard | Vsak dan izvedbe preskusov vitelogenina se analizira obogateni vzorec, pripravljen z medpreskusnim referenčnim standardom. Vitelogenin, uporabljen za pripravo medpreskusnega referenčnega standarda, je iz serije, ki se razlikuje od serije, uporabljene za pripravo kalibracijskih standardov za preskus, ki se izvaja. | Obogateni vzorec se pripravi z dodajanjem znane količine medpreskusnega standarda vzorcu plazme kontrolnih samcev. Vzorec se obogati, da se doseže koncentracija vitelogenina, ki je med 10- in 100-krat večja od pričakovane koncentracije vitelogenina pri kontrolnih ribjih samcih. Vzorec plazme kontrolnih samcev, ki se obogati, lahko izvira iz ene ribe ali pa je sestavljen iz več rib. | Podvzorec neobogatene plazme kontrolnih samcev se analizira v vsaj dveh ponovitvenih vdolbinicah. Tudi obogateni vzorec se analizira v vsaj dveh ponovitvenih vdolbinicah. Srednja količina vitelogenina v dveh neobogatenih vzorcih plazme kontrolnih samcev se doda izračunani količini vitelogenina, dodanega obogatenim vzorcem, da se določi pričakovana koncentracija. Razmerje med pričakovano koncentracijo in izmerjeno koncentracijo se sporoči skupaj z rezultati posameznih nizov preskusov, izvedenih isti dan. | Dodatek 8 | Tabela poteka za statistično analizo | Ugnezdena analiza variancje normalna. | Da | Ne | Dunnettov preskus ugnezdene analize varianc | Dunnov preskus s sredinami ponovitev | Ne | Ne | Da | Dunn ali Mann-Whitneyjev preskus s sredinami pon. | Transformacija za stabilizacijo | >=4 pon. na konc. | <=3 pon. na konc. | Dunnov | Da | Transformacija za normalizacijo? | Tamhane-Dunnettov preskus | >=4 pon. na konc. | <=3 pon. na konc. | Ugnezdena analiza varianc ni normalna. | Ne | Da | Transformacija za stabilizacijo varianc? | Dunnettov preskus | Neenake variance | Enake variance | Nemonoton | Regresivni Jonckheerov ali Williamsov preskus | Regresivni trendnostni preskus sredin ponovitev | Monoton | Tamhane-Dunnettov preskus ugnezdene analize varianc | Dunnov ali Mann-Whitneyjev preskus | Sredine ponovitev niso normalno porazdeljene. | Sredine ponovitev so normalno porazdeljene. | Regresivni Jonckheerov preskus | Sredine ponovitev niso normalne ali niso homogene | Sredine ponovitev so normalne in homogene | Določite, ali je odzivna odmerek monoton. | C.38 PRESKUS PREOBRAZBE DVOŽIVK | UVOD | 1. | Ta preskusna metoda ustreza Smernici za preskušanje OECD (TG) 231 (2009). Preskus, s katerim se lahko zaznajo kemikalije, ki so aktivne v ščitničnem sistemu vretenčarjev, je treba razviti in validirati zaradi pomislekov, da bi lahko okoljske ravni kemikalij povzročile škodljive učinke za ljudi in prostoživeče živali. OECD se je leta 1998 začela ukvarjati s prednostno nalogo revidiranja obstoječih smernic za preskušanje ter priprave novih smernic za presejalne preskuse in preskušanje potencialnih povzročiteljev endokrinih motenj. Del naloge je bila priprava smernic za preskušanje za presejalno preskušanje kemikalij, ki so aktivne v ščitničnem sistemu vretenčarjev. Predlagana sta bila 28-dnevna študija oralne strupenosti s ponavljajočimi se odmerki na glodavcih (poglavje B.7 te priloge) in preskus preobrazbe dvoživk (AMA). Izboljšana preskusna metoda B.7 je prestala validacijo, objavljena pa je bila revidirana preskusna metoda. Preskus preobrazbe dvoživk (AMA) je prestal validacijski program, ki je vključeval laboratorijske in medlaboratorijske študije, s katerimi sta bili dokazani ustreznost in zanesljivost preskusa (1) (2). Nato je validacijo preskusa strokovno pregledala skupina neodvisnih strokovnjakov (3). Ta preskusna metoda je rezultat izkušenj, pridobljenih med validacijskimi študijami za zaznavo kemikalij, ki vplivajo na ščitnico, in dela, opravljenega v državah članicah OECD. | NAČELO PRESKUSA | 2. | Preskus preobrazbe dvoživk (AMA) je presejalni preskus za empirično identifikacijo kemikalij, ki bi lahko vplivale na normalno funkcijo osi hipotalamus – hipofiza – ščitnica (HPT). AMA predstavlja posplošen model vretenčarja, saj temelji na ohranjenih strukturah in funkcijah osi HPT. Gre za pomemben preskus, ker je preobrazba dvoživk dobro proučen proces, odvisen od ščitnice, ki se odziva na kemikalije, aktivne v osi HPT, in je edini obstoječi preskus, s katerim se lahko zazna aktivnost ščitnice v živali, ki se morfološko razvija. | 3. | Splošni načrt poskusa zajema 21-dnevno izpostavljenost paglavcev Xenopus laevis v 51. fazi najmanj trem različnim koncentracijam preskusne kemikalije in kontroli z vodo za redčenje. Vsak preskusni tretirani vzorec ima štiri ponovitve. Gostota ličink na začetku preskusa je 20 paglavcev na preskusno posodo v vsaki tretirani skupini. Opazovane končne točke so dolžina zadnjega kraka, dolžina od ust do zadnjične odprtine (SVL), razvojna faza, mokra teža, histologija ščitnice in dnevna opazovanja smrtnosti. | OPIS METODE | Preskusna vrsta | 4. | Xenopus laevis se rutinsko goji v laboratorijih po vsem svetu in se lahko enostavno pridobi prek komercialnih dobaviteljev. Razmnoževanje se lahko pri tej vrsti skozi celo leto enostavno doseže z uporabo injekcij humanega horionskega gonadotropina (HCG), pri čemer se lahko nastale ličinke v velikem številu rutinsko gojijo do izbranih razvojnih faz, zaradi česar je mogoča uporaba protokolov preskusa, specifičnih za razvojno fazo. Za uporabo v preskusu so primernejše ličinke odraslih osebkov iz laboratorija. Čeprav to ni prednostni postopek, se lahko namesto tega jajčeca ali embrii pošljejo v laboratorij, ki izvaja preskus, in aklimatizirajo; pošiljanje v stadiju ličink za uporabo v preskusu ni sprejemljivo. | Oprema in potrebščine | 5. | Za izvedbo tega preskusa so potrebne naslednja oprema in potrebščine: | a) | sistem za izpostavljanje (glej opis v nadaljevanju); | b) | akvarij iz stekla ali nerjavnega jekla (glej opis v nadaljevanju); | c) | posode za gojenje; | d) | naprave za nadzor temperature (npr. grelniki ali hladilniki (prilagodljivi do 22 °C ± 1 °C)); | e) | termometer; | f) | binokularni stereomikroskop; | g) | digitalni fotoaparat z ločljivostjo vsaj 4 milijone slikovnih točk in funkcijo mikro; | h) | programska oprema za digitalizacijo slik; | i) | petrijevka (npr. 100 × 15 mm) ali prosojna plastična posodica primerljive velikosti; | j) | analitska tehtnica, s katero je mogoče meriti na 3 decimalna mesta natančno (mg); | k) | merilnik raztopljenega kisika; | l) | merilnik vrednosti pH; | m) | merilnik jakosti svetlobe, s katerim je mogoče meriti v luksih; | n) | različna laboratorijska steklena posoda in pripomočki; | o) | prilagodljive pipete (10 do 5 000 μl) ali različne pipete ustreznih velikosti; | p) | preskusna kemikalija v zadostnih količinah za izvedbo študije, po možnosti iz ene serije; | q) | analitski instrumenti, primerni za preskušano kemikalijo, ali pogodbene analitske storitve. | Kemijska preverljivost | 6. | AMA temelji na protokolu vodne izpostavljenosti, pri katerem se preskusna kemikalija uvaja v preskusne komore prek pretočnega sistema. Vendar pretočne metode omejujejo vrste kemikalij, ki se lahko preskusijo, kot določajo fizikalno-kemijske lastnosti kemikalije. Zato je treba pred uporabo tega protokola pridobiti osnovne informacije o kemikaliji, ki so pomembne za določitev preverljivosti, pri čemer je treba upoštevati Smernico OECD za preskušanje strupenosti zahtevnih snovi in zmesi v vodnem okolju (4). Značilnosti, ki kažejo, da bi lahko bilo kemikalijo težko preskusiti v vodnih sistemih, vključujejo: visok porazdelitveni koeficient oktanol/voda (log Kow), visoko hlapnost, občutljivost za hidrolizo in občutljivost za fotolizo v laboratorijskih svetlobnih pogojih. Za določanje preverljivosti so lahko pomembni tudi drugi dejavniki, ki jih je treba določiti na podlagi posameznega primera. Če ni mogoč uspešen preskus kemikalije z uporabo pretočnega preskusnega sistema, se lahko uporabi sistem s statičnim obnavljanjem. Če noben sistem ne more sprejeti preskusne kemikalije, se ne preskuša z uporabo tega protokola. | Sistem izpostavljenosti | 7. | Kadar je mogoče, ima pretočni sistem za redčenje prednost pred sistemom s statičnim obnavljanjem. Če fizikalnih in/ali kemijskih lastnosti katere koli preskusne kemikalije ni mogoče podrediti pretočnemu sistemu za redčenje, se lahko uporabi nadomestni sistem izpostavljenosti (npr. s statičnim obnavljanjem). Sestavni deli sistema, ki pridejo v stik z vodo, morajo biti iz stekla, nerjavnega jekla in/ali politetrafluoroetilena. Vendar se lahko uporabi tudi ustrezna plastika, če ne vpliva na študijo. Posode za izpostavljanje morajo biti akvariji iz stekla ali nerjavnega jekla, opremljeni z dvižnimi cevmi, pri čemer mora biti približna prostornina posode med 4,0 in 10,0 l, najmanjša globina vode pa med 10 do 15 cm. Sistem mora podpirati vse koncentracije izpostavljenosti in kontrolo s štirimi ponovitvami na tretiranje. Pretok v posamezni posodi mora biti konstanten zaradi vzdrževanja bioloških pogojev in izpostavljenosti kemikaliji (npr. 25 ml/min). Tretirane posode je treba naključno dodeliti na položaj v sistemu izpostavljenosti, da se zmanjšajo potencialni učinki zaradi položaja, vključno z majhnimi razlikami v temperaturi, jakosti svetlobe itd. Fluorescenčno osvetlitev je treba uporabiti za zagotovitev obdobja osvetljenosti 12 ur svetlobe: 12 ur teme pri jakosti od 600 do 2 000 luksov (lumnov/m2) na vodni gladini. Temperaturo vode je treba vzdrževati pri 22 °C ± 1 °C, pH med 6,5 in 8,5, koncentracijo raztopljenega kisika (DO) pa > 3,5 mg/l (> 40 % nasičenosti z zrakom) v posamezni preskusni posodi. Najnižjo temperaturo vode, pH in koncentracijo raztopljenega kisika je treba meriti vsak teden; temperaturo je po možnosti treba stalno meriti v vsaj eni preskusni posodi. V Dodatku 1 so opisani poskusni pogoji, v katerih je treba izvesti protokol. Za več informacij o vzpostavitvi pretočnega sistema izpostavljenosti in/ali sistemov s statičnim obnavljanjem glej Standardne smernice ASTM za izvajanje preskusov akutne strupenosti na preskusnih materialih z ribami, velikimi vretenčarji in dvoživkami (5) ter splošne preskuse vodne toksikologije. | Kakovost vode | 8. | Uporabi se lahko vsaka lokalno razpoložljiva voda (npr. izvirska voda ali vodovodna voda, prečiščena z ogljem), ki omogoča normalno rast in razvoj paglavcev X. laevis. Ker se lahko kakovost lokalne vode med posameznimi območji bistveno razlikuje, je treba izvesti analizo kakovosti vode, zlasti če niso na voljo historični podatki o uporabi vode za gojenje Xenopus. Posebno pozornost je treba nameniti zlasti zagotavljanju, da v vodi ni bakra, klora in kloraminov, ki so strupeni za žabe in paglavce. Priporoča se tudi analiza ravni naravnega ozadja fluorida, perklorata in klorata (stranski produkti dezinfekcije pitne vode) v vodi, ker so vsi ti anioni substrati prenašalca joda v ščitnični žlezi, pri čemer lahko višje ravni posameznega aniona kot moteči dejavniki vplivajo na rezultat študije. Analizo je treba izvesti pred začetkom preskušanja, v preskusni vodi pa običajno ne sme biti teh anionov. | Koncentracija jodida v preskusni vodi | 9. | Da lahko ščitnična žleza sintetizira ščitnični hormon, mora imeti ličinka na voljo dovolj jodida v vodi in hrani. Zdaj ni empiričnih smernic za najmanjše koncentracije jodida. Vendar lahko razpoložljivost jodida vpliva na odzivnost ščitničnega sistema na snovi, ki vplivajo na ščitnico, in spremeni bazalno aktivnost ščitnične žleze, tj. vidik, ki ga je treba upoštevati pri razlagi rezultatov histopatologije ščitnice. Zato je treba sporočiti izmerjene koncentracije jodida v preskusni vodi. Na podlagi razpoložljivih podatkov iz validacijskih študij je bilo dokazano, da je protokol uspešen, če so koncentracije jodida (I–) v preskusni vodi med 0,5 in 10 μg/l. Najprimernejša najmanjša koncentracija jodida v preskusni vodi mora biti 0,5 μg/l. Če je preskusna voda modelna razredčevalna voda iz deionizirane vode, je treba dodati najmanjšo koncentracija joda, tj. 0,5 μg/l. Vsako dodajanje jodovih ali drugih soli v vodo je treba navesti v poročilu. | Vzdrževanje živali | Oskrba odraslih osebkov in razmnoževanje | 10. | Oskrba odraslih osebkov in razmnoževanje potekata v skladu s standardnimi smernicami, podrobnejše informacije pa so navedene v standardnih smernicah za izvajanje preskusa teratogeneze embriov žab (FETAX) (6). Take standardne smernice zagotavljajo primer ustreznih metod oskrbe in parjenja, vendar jih ni treba strogo upoštevati. Za začetek razmnoževanja se v pare (3–5) odraslih samic in samcev injicira humani horionski gonadotropin (HCG). V samice in samce se injicira približno 800 IU – 1 000 IU oz. 600 IU–800 IU HCG, raztopljenega v 0,6–0,9-odstotni solni raztopini. Pari, ki se razmnožujejo, so v velikih posodah, v okolju, ki jih ne ovira, in v statičnih pogojih, da se spodbuja ampleksus. Dno vsake posode za razmnoževanje mora imeti navidezno dno iz mreže iz nerjavnega jekla ali plastike, ki omogoča prehajanje jajčnih legel na dno posode. Žabe, ki so injicirane pozno popoldne, običajno odložijo večino jajčec do sredine naslednjega jutra. Ko je odloženih in oplojenih dovolj jajčec, je treba odrasle osebke odstraniti iz posod za razmnoževanje. | Oskrba in izbira ličink | 11. | Ko so odrasli osebki odstranjeni iz posod za razmnoževanje, se jajčeca zberejo, pri čemer se njihova sposobnost preživetja oceni z reprezentativno podskupino embriov iz vseh posod za razmnoževanje. Najboljše posamezne mreste (za oceno kakovosti mrestov se priporočajo 2–3) je treba ohraniti na podlagi sposobnosti preživetja embriov in prisotnosti ustreznega števila (najmanj 1 500) embriov. Vsi organizmi, ki se uporabijo v študiji, morajo izhajati iz enega mresta (tj. mresti se ne smejo mešati). Embrii se prenesejo v veliko ploščato skodelico ali posodo, vsa očitno mrtva ali nenormalna jajčeca (glej opredelitev iz točke (5)) pa se odstranijo s pipeto ali kapalko. Zdravi embrii iz vsakega od treh mrestov se prenesejo v tri ločene posode za izvalitev. Štiri dni po namestitvi v posode za izvalitev se na podlagi sposobnosti preživetja in uspešne izvalitve izbere najboljši mrest, ličinke pa se prenesejo v ustrezno število posod za gojenje pri temperaturi 22 °C ± 1 °C. Poleg tega se v dodatne posode prenese nekaj dodatnih ličink, ki se bodo uporabile kot zamenjava v primeru smrti v posodah za gojenje v prvem tednu. S tem postopkom se ohranja stalna gostota organizmov, s čimer se zmanjša razvojna divergenca v kohorti enega mresta. Vse posode za gojenje je treba vsak dan očistiti z izčrpanjem. Kot previdnostni ukrep se namesto rokavic iz lateksa priporoča uporaba rokavic iz vinila ali nitrila. Poginule ličinke je treba vsakodnevno odstranjevati in dodajati nadomestne, da se ohranja gostota organizmov v prvem tednu. Hranjenje mora potekati vsaj dvakrat na dan. | 12. | V fazi pred izpostavljenostjo se paglavci prilagodijo pogojem iz faze dejanske izpostavljenosti, vključno z vrsto hrane, temperaturo, ciklom svetlobe in teme ter gojiščem. Zato se priporoča, da se v fazi pred izpostavljenostjo in v fazi izpostavljenosti uporabi enaka voda za gojenje/redčenje. Če se za vzdrževanje paglavcev v fazi pred izpostavljenostjo uporablja statični gojitveni sistem, je treba gojišče zamenjati v celoti vsaj dvakrat na teden. Natrpanost, ki je posledica velike gostote ličink v obdobju pred izpostavljenostjo, je treba preprečiti, ker bi lahko pomembno vplivala na razvoj paglavcev v naslednji fazi preskušanja. Zato gostota gojenja ne sme presegati približno štirih paglavcev/l gojišča (statični sistem izpostavljenosti) oz. 10 paglavcev/l gojišča (npr. pri pretoku 50 ml/min v sistemu pred izpostavljenostjo ali gojitvenem sistemu). V teh pogojih se morajo paglavci v 12 dneh razviti od 45./46. faze do 51. faze. Pri reprezentativnih paglavcih iz populacije tega staleža je treba vsak dan pregledati razvojno fazo, da se oceni ustrezno časovno obdobje za začetek izpostavljenosti. Skrbno je treba čim bolj zmanjšati stres in travmo za paglavce, zlasti med seljenjem, čiščenjem akvarija in ravnanjem z ličinkami. Preprečiti je treba stresne razmere/dejavnosti, kot so glasen in nenehen hrup, trkanje po akvariju, tresljaji v akvariju, čezmerna dejavnost v laboratoriju in hitre spremembe v okolju (razpoložljivost svetlobe, temperatura, pH, raztopljeni kisik, pretok vode itd.). Če se paglavci v 17 dneh po oploditvi ne razvijejo do 51. faze, je treba kot potencialnega krivca obravnavati čezmeren stres. | Gojenje in hranjenje ličink | 13. | Paglavce se v celotnem obdobju pred izpostavljenostjo (po Nieuwkoopovi in Faberjevi (NF) 45./46. fazi (8)) in v celotnem 21-dnevnem preskusnem obdobju hrani s t. i. komercialno krmo za paglavce, uporabljeno v validacijskih študijah (glej tudi Dodatek 1), ali z drugo hrano, ki dokazano omogoča enako uspešnost preskusa preobrazbe dvoživk. Način hranjenja v obdobju pred izpostavljenostjo je treba skrbno prilagoditi, da se izpolnijo potrebe razvijajočih se paglavcev. To pomeni, da je treba novo izvaljenim paglavcem večkrat na dan (vsaj dvakrat) dati manjši obrok hrane. Dovajanje čezmernih količin hrane je treba preprečiti, da i) se ohrani kakovost vode in ii) prepreči zamašitev filtrirnega aparata z delci in ostanki hrane. Pri krmi za paglavce, uporabljeni v validacijskih študijah, je treba dnevne obroke hrane malo pred začetkom preskusa povečati glede na rast paglavcev na približno 30 mg/žival/dan. V validacijskih študijah je bilo dokazano, da ta komercialno dostopna krma podpira ustrezno rast in razvoj paglavcev X. laevis in je v drobnih delcih, ki se v vodnem stolpcu dlje časa ne raztopijo in jih odplakne tok. Zato je treba skupno dnevno količino hrane razdeliti na manjše obroke in jo dovajati vsaj dvakrat na dan. Način hranjenja s to krmo je naveden v tabeli 1. Stopnje hranjenja je treba zabeležiti. Dovaja se lahko suha ali kot založna raztopina, pripravljena v vodi za redčenje. Tako založno raztopino je treba sveže pripraviti vsak drugi dan in jo hraniti pri 4 °C, kadar se ne uporablja. | Tabela 1 | Način hranjenja s komercialno krmo za paglavce, uporabljeno v validacijskih študijah za paglavce X. laevis, v delu preskusa preobrazbe dvoživk z živimi živalmi v pretočnih pogojih | Dan študije | Obrok hrane (mg krme/žival/dan) | 0–4 | 30 | 5–7 | 40 | 8–10 | 50 | 11–14 | 70 | 15–21 | 80 | Analitična kemija | 14. | Pred izvedbo študije je treba oceniti stabilnost preskusne kemikalije na podlagi informacij o njeni topnosti, razgradljivosti in hlapnosti. Preskusne raztopine iz vsake ponovitvene posode pri posamezni koncentraciji je treba vzorčiti za analize analitične kemije na začetku preskusa (dan 0) in vsak teden med preskusom za najmanj štiri vzorce. Priporočeno je tudi, da se vsaka preskusna koncentracija analizira med pripravo sistema, pred začetkom preskusa, da se preveri učinkovitost sistema. Poleg tega se priporoča, da se založne raztopine analizirajo, ko se zamenjajo, zlasti če prostornina založne raztopine ne zagotavlja zadostnih količin kemikalije, ki bi pokrivale trajanje rutinskih obdobij vzorčenja. V primeru kemikalij, ki jih pri nekaterih ali vseh koncentracijah, uporabljenih v preskusu, ni mogoče zaznati, je treba izmeriti založno raztopino in zabeležiti pretok sistema, da se izračunajo nominalne koncentracije. | Dodajanje kemikalije | 15. | Metoda, ki se uporablja za uvajanje preskusne kemikalije v sistem, se lahko razlikuje glede na njene fizikalno-kemijske lastnosti. Vodotopne kemikalije se lahko raztopijo v alikvotih preskusne vode pri koncentraciji, ki omogoča dodajanje pri ciljni preskusni koncentraciji v pretočnem sistemu. Kemikalije, ki so pri sobni temperaturi tekoče in težko topne v vodi, se lahko uvajajo z metodami saturacijske kolone za izmenjavo med tekočinama. Kemikalije, ki so pri sobni temperaturi trdne in težko topne v vodi, se lahko uvajajo s saturacijskimi kolonami iz steklene volne (7). Priporoča se uporaba preskusnega sistema brez nosilca, vendar imajo različne preskusne kemikalije različne fizikalno-kemijske lastnosti, zaradi katerih bodo verjetno potrebni različni pristopi za pripravo vode za izpostavljenost kemikalijam. Če je mogoče, se ne uporabijo topila ali nosilci, ker: i) lahko nekatera topila povzročijo strupenost in/ali neželene ali nepričakovane endokrinološke odzive, ii) lahko preskušanje kemikalij nad njihovo vodotopnostjo (kar se lahko pogosto zgodi pri uporabi topil) privede do netočnih določitev učinkovitih koncentracij in iii) lahko uporaba topil v dolgotrajnejših preskusih privede do znatne stopnje razvoja biofilma, povezanega z mikrobno dejavnostjo. Za kemikalije, ki jih je težko preskusiti, se lahko kot zadnja rešitev uporabi topilo, pri čemer je treba za določitev najboljše metode upoštevati Smernico OECD za preskušanje strupenosti zahtevnih snovi in zmesi v vodnem okolju (4). Topilo se izbere na podlagi kemijskih lastnosti kemikalije. Topila, za katera je bilo ugotovljeno, da so učinkovita za preskušanje strupenosti v vodnem okolju, vključujejo aceton, etanol, metanol, dimetil formamid in trietilen glikol. Če se uporabi topilo kot nosilec, morajo biti koncentracije topila nižje od kronične koncentracije brez opaznega učinka (NOEC); v skladu s Smernico OECD se priporoča največ 100 μl/l; v skladu z nedavnim pregledom se priporoča uporaba tako nizkih koncentracij topil, kot je 20 μl/l vode za redčenje (12). Če se uporabijo topila kot nosilci, je treba poleg kontrol brez topila (čista voda) oceniti ustrezne kontrole s topilom. Če kemikalije ni mogoče dodati prek vode zaradi fizikalno-kemijskih lastnosti (slaba topnost) ali omejene razpoložljivosti kemikalije, se lahko prouči uvajanje s prehrano. V zvezi s prehransko izpostavljenostjo je bilo opravljeno predhodno delo, vendar se ta način izpostavljenosti ne uporablja pogosto. Izbiro metode je treba dokumentirati in analitsko preveriti. | Izbira preskusnih koncentracij | Vzpostavitev visoke preskusne koncentracije | 16. | Za namen tega preskusa je treba visoko preskusno koncentracijo določiti z mejo topnosti preskusne kemikalije, najvišjo tolerančno koncentracijo (MTC) za akutno strupene kemikalije ali 100 mg/l (kar koli je najnižje). | 17. | MTC je opredeljena kot najvišja preskusna koncentracija kemikalije, ki povzroči manj kot 10-odstotno akutno smrtnost. Pri uporabi tega pristopa se domneva, da obstajajo empirični podatki o akutni smrtnosti, na podlagi katerih je mogoče oceniti MTC. Ocena MTC je lahko netočna, pri čemer je običajno potrebna strokovna presoja. Čeprav je lahko uporaba regresijskih modelov tehnično najzanesljivejši pristop za oceno MTC, se lahko uporaben približek MTC izpelje iz obstoječih akutnih podatkov z uporabo 1/3 vrednosti akutne LC50. Vendar podatki o akutni strupenosti za vrste, ki se preskušajo, niso nujno na voljo. Če podatki o akutni strupenosti, specifični za vrsto, niso na voljo, se lahko pri paglavcih, ki so reprezentativni (tj. so enake faze) za paglavce v preskusu AMA, opravi 96-urni preskus LC50. Če so na voljo podatki za druge vodne vrste (npr. študije LC50 pri ribah ali drugih dvoživkah), se lahko verjetna MTC oceni s strokovno presojo na podlagi ekstrapolacije med vrstami. | 18. | Če kemikalija ni akutno strupena in je topna pri koncentraciji, višji od 100 mg/l, pa je treba šteti za najvišjo preskusno koncentracijo (HTC) 100 mg/l, ker se ta koncentracija običajno šteje za ‚praktično nestrupeno‘. | 19. | Čeprav metode statičnega obnavljanja niso priporočeni postopek, se lahko uporabljajo, kadar pretočne metode niso ustrezne za doseganje MTC. Če se uporabijo metode statičnega obnavljanja, je treba dokumentirati stabilnost koncentracije preskusne kemikalije, pri čemer mora stabilnost ostati v mejah izvedbenih meril. Priporočajo se 24-urna obdobja obnavljanja. Obdobja obnavljanja, ki presegajo 72 ur, niso sprejemljiva. Ob koncu vsakega obdobja obnavljanja, neposredno pred obnavljanjem, je treba izmeriti parametre kakovosti vode (npr. raztopljeni kisik, temperaturo, pH itd.). | Razpon preskusnih koncentracij | 20. | Uporabiti je treba vsaj tri preskusne koncentracije in kontrole s čisto vodo (ter po potrebi kontrole z vehiklom). Najmanjša razlika med najnižjo in najvišjo preskusno koncentracijo mora biti približno en red velikosti. Največja ločitev odmerka je 0,1 in najmanjša 0,33. | POSTOPEK | Začetek in izvedba preskusa | Dan 0 | 21. | Izpostavljanje je treba začeti, ko zadostno število paglavcev iz založne populacije pred izpostavljenostjo doseže 51. razvojno fazo po Nieuwkoopu in Faberju (8), pri čemer so glede na oploditev stari manj ali točno 17 dni. Za izbiro preskusnih živali je treba zdrave paglavce iz založne populacije, ki so videti normalni, združiti v eni posodi, ki vsebuje primerno prostornino vode za redčenje. Za določanje razvojne faze je treba posamezne paglavce odstraniti iz skupne posode z majhno mrežo ali cedilom in jih prenesti v prozorno merilno komoro (npr. 100-milimetrsko petrijevko) z vodo za redčenje. Priporočljivo je, da se za določanje faze ne uporablja anestezija, vendar se lahko za anestezijo paglavcev uporabi 100 mg/l trikain metan sulfonata (npr. MS-222), ki je pred uporabo ustrezno pufran z natrijevim karbonatom (pH 7.0). Če se za anestezijo uporabi npr. MS-222, je treba metodologijo za njegovo ustrezno uporabo pridobiti v izkušenih laboratorijih in jo sporočiti skupaj z rezultati preskusa. Med prenosom je treba z živalmi ravnati zelo previdno, da se čim bolj zmanjša stres zaradi prenosa in se preprečijo poškodbe. | 22. | Razvojna faza živali se določi z binokularnim stereomikroskopom. Da se zmanjša končna variabilnost v razvojni fazi, je pomembno, da se faza določi čim bolj natančno. Po Nieuwkoopu in Faberju (8) je glavni razvojni znak za določitev 51. faze pri organizmih morfologija zadnjega kraka. Morfološke značilnosti zadnjega kraka je treba pregledati pod mikroskopom. Čeprav se je treba za določanje razvojne faze paglavcev seznaniti z Nieuwkoopovimi in Faberjevimi (8) smernicami v celoti, se lahko faza zanesljivo določi na podlagi izrazitih morfoloških znakov. Naslednja tabela se lahko uporabi za poenostavitev in standardizacijo postopka določanja faze skozi celotno študijo, tako da se določijo izraziti morfološki znaki, ki so povezani z različnimi fazami, pri čemer se predvideva, da je razvoj normalen. | Tabela 2 | Izraziti morfološki znaki za določanje faze na podlagi smernic Nieuwkoopa in Faberja | Izraziti morfološki znaki | Razvojna faza | 51 | 52 | 53 | 54 | 55 | 56 | 57 | 58 | 59 | 60 | 61 | 62 | 63 | 64 | 65 | 66 | zadnji krak | X | X | X | X | X | X | X | | | | | | | | | | sprednji krak | | | | | | X | X | X | X | X | | | | | | | kraniofacialna struktura | | | | | | | | | | X | X | X | X | | | | morfologija vohalnega živca | | | | | | | | | | | X | X | X | | | | dolžina repa | | | | | | | | | | | | | X | X | X | X | 23. | Za začetek preskusa morajo biti vsi paglavci v 51. fazi. Najizrazitejši morfološki znak za določanje navedene faze je morfologija zadnjega kraka, ki je prikazana na sliki 1. | Slika 1 | Morfologija zadnjega kraka pri paglavcu X. laevis v 51. fazi. | 24. | Poleg izbire razvojne faze se lahko uporabi neobvezna izbira velikosti poskusnih živali. Za ta namen je treba na dan 0 izmeriti dolžino celega telesa (ne SVL) na podvzorcu približno 20 paglavcev v 51. fazi po Nieuwkoopu in Faberju. Po izračunu srednje dolžine celega telesa te skupine živali se lahko določijo največje in najmanjše mejne dolžine celotnega telesa poskusnih živali, pri čemer je dovoljeni razpon srednje vrednosti ± 3 mm (srednje vrednosti razpona dolžin celotnega telesa med 24,0 in 28,1 mm za paglavce v 51. fazi). Vendar je določanje razvojne faze glavni parameter za ugotavljanje pripravljenosti posamezne preskusne živali. Paglavci, ki kažejo zelo vidne deformnosti ali poškodbe, je treba izključiti iz preskusa. | 25. | Paglavci, ki izpolnjujejo merila za fazo, opisana zgoraj, se zadržijo v posodi s čisto vodo za gojenje, dokler ni postopek določanja faze končan. Ko je določanje faze končano, se ličinke naključno razporedijo v tretirane posode za izpostavljenost, dokler ni v vsaki posodi po 20 ličink. V vsaki tretirani posodi se nato pregleda, ali so v njej živali, ki so videti nenormalno (npr. poškodbe, nenormalen način plavanja itd.). Očitno nezdrave paglavce je treba odstraniti iz tretiranih posod in jih nadomestiti z ličinkami, ki se na novo izberejo iz skupne posode. | Opažanja | 26. | Za bolj poglobljene informacije o postopkih prekinitve preskusa in obdelavi paglavcev glej Smernico OECD za histologijo ščitnice pri dvoživkah (9). | Meritve na 7. dan | 27. | Na 7. dan se iz vsake preskusne posode odstrani pet naključno izbranih paglavcev na ponovitev. Z uporabljenim naključnim postopkom je treba vsakemu organizmu, ki se preskuša, zagotoviti enako verjetnost izbire. To je mogoče doseči z uporabo katere koli metode naključnega vzorca, vendar je pri tem treba ujeti vsakega paglavca. Neizbrani paglavci se vrnejo v posodo, iz katere so bili zajeti, izbrani paglavci pa se humano evtanazirajo v npr. 150 do 200 mg/l MS-222 in ustrezno pufrajo z natrijevim karbonatom, da se doseže pH 7,0. Evtanazirani paglavci se sperejo v vodi in posušijo, nato pa se njihova telesna teža določi na najbližji miligram. Določijo se dolžina zadnjega kraka, dolžina od ust do zadnjične odprtine in razvojna faza (z binokularnim stereomikroskopom) vsakega paglavca. | Meritve na 21. dan (prekinitev preskusa) | 28. | Ob prekinitvi preskusa (21. dan) se preostali paglavci odstranijo iz preskusnih posod in humano evtanazirajo v npr. 150 do 200 mg/l MS-222 ter ustrezno pufrajo z natrijevim bikarbonatom, kot je navedeno zgoraj. Paglavci se sperejo v vodi in posušijo, nato pa se njihova telesna teža določi na najbližji miligram. Izmerijo se razvojna faza, SVL in dolžina zadnjega kraka vsakega paglavca. | 29. | Vse ličinke se za 48 do 72 ur prestavijo v Davidsonovo fiksirno raztopino kot vzorci celotnega telesa ali kot vzorci obrezanega tkiva glave, ki vključujejo spodnjo čeljust za histološko oceno. Za histopatologijo je treba vzorčiti skupaj pet paglavcev iz vsake ponovitvene posode. Ker je višina folikularnih celic odvisna od faze (10), je najustreznejši pristop vzorčenja za histološke analize uporaba osebkov iste faze, kadar koli je mogoče. Za izbiro osebkov iste faze je treba fazo vseh ličink prvič določiti pred izbiro ter nadaljnjo obdelavo za zbiranje podatkov in shranjevanje. To je potrebno, ker bo zaradi divergence pri razvoju prišlo do različnih porazdelitev faz v posameznih ponovitvenih posodah. | 30. | Živali, izbrane za histopatologijo (n = 5 iz vsake ponovitve), je treba uskladiti s srednjo fazo kontrol (združene ponovitve), kadar koli je mogoče. Če je v ponovitvenih posodah več kot pet ličink ustrezne faze, se pet ličink naključno izbere. | 31. | Če je v ponovitvenih posodah manj kot pet ličink ustrezne faze, je treba vzorčiti naključno izbrane osebke naslednje nižje ali višje razvojne faze, da se doseže skupna velikost vzorca petih ličink na ponovitev. Priporoča se, da se odločitev o vzorčenju dodatnih ličink iz naslednje nižje ali višje razvojne stopnje sprejme na podlagi splošne ocene porazdelitve faz v kontrolah in skupinah za kemične obdelave. To pomeni, da je treba vzorčiti dodatne ličinke iz naslednje nižje faze, če je kemična obdelava povezana z razvojno zaostalostjo. Če je kemična obdelava povezana s pospešitvijo razvoja, pa je treba vzorčiti dodatne ličinke iz naslednje višje faze. | 32. | V primerih resnih sprememb razvoja paglavcev zaradi tretiranja s preskusno kemikalijo se porazdelitev faz v skupinah za kemično obdelavo morda ne bo prekrivala z izračunano srednjo razvojno fazo kontrole. Samo v teh primerih je treba postopek izbire spremeniti z uporabo faze, ki se razlikuje od srednje faze kontrole, da se doseže vzorčenje ličink enake faze za histopatologijo ščitnice. Če so faze nedoločljive (tj. asinhronost), je treba za histološko analizo naključno izbrati 5 paglavcev iz vsake ponovitve. Vzorčenje katere koli ličinke, ki ni v fazi, enakovredni srednji razvojni fazi kontrole, je treba utemeljiti. | Določanje bioloških končnih točk | 33. | V 21-dnevni fazi izpostavljenosti se 7. in 21. dan izvede meritev primarnih končnih točk, vendar je treba preskusne živali opazovati vsak dan. V tabeli 3 je naveden pregled končnih točk meritev in ustreznih časovnih točk opazovanja. Podrobnejše informacije za tehnične postopke meritve zgornjih končnih točk in histološke ocene so navedene v smernicah OECD (9). | Tabela 3 | Časovne točke opazovanja za primarne končne točke pri AMA | Zgornje končne točke | Vsak dan | 7. dan | 21. dan | — | smrtnost | ߦ | | | — | razvojna faza | | ߦ | ߦ | — | dolžina zadnjega kraka | | ߦ | ߦ | — | dolžina od ust do zadnjične odprtine | | ߦ | ߦ | — | teža mokrega telesa | | ߦ | ߦ | — | histologija ščitnične žleze | | | ߦ | Zgornje končne točke | 34. | Razvojna faza, dolžina zadnjega kraka, SVL in mokra teža so zgornje končne točke AMA, pri čemer je vsaka na kratko obravnavana v nadaljevanju. Dodatne tehnične informacije za zbiranje teh podatkov, vključno s postopki za računalniško podprte analize, katerih uporaba se priporoča, so navedene v smernicah, na katere so navedeni sklici. | Razvojna faza | 35. | Razvojna faza paglavcev X. laevis se določi z merili za določanje faze po Nieuwkoopu in Faberju (8). Podatki o razvojni fazi se uporabijo pri ugotavljanju, ali je razvoj pospešen, asinhron, zakasnjen ali nespremenjen. Pospešen ali zakasnjen razvoj se določi s primerjavo med srednjo fazo, ki jo dosežejo kontrolne in tretirane skupine. Asinhroni razvoj je ugotovljen, če pregledana tkiva niso deformirana ali nenormalna, vendar je relativen čas morfogeneze ali razvoja različnih tkiv moten pri enem paglavcu. | Dolžina zadnjega kraka | 36. | Diferenciacijo in rast zadnjih krakov nadzorujejo hormoni ščitnice in so pomemben razvojni znak, ki se že uporablja za določanje razvojne faze. Razvoj zadnjega kraka se pri določanju razvojne stopnje uporablja kvalitativno, vendar se tukaj obravnava kot kvantitativna končna točka. Zato se dolžina zadnjega kraka meri kot končna točka za ugotavljanje učinkov na ščitnično os (slika 2). Zaradi doslednosti se dolžina zadnjega kraka meri na zadnjem levem kraku. Dolžina zadnjega kraka se oceni 7. dan in 21. dan preskusa. Na 7. dan je merjenje dolžine zadnjega kraka enostavno, kot je prikazano na sliki 2. Merjenje dolžine zadnjega kraka na 21. dan pa je bolj zapleteno zaradi ukrivljenosti kraka. Zato se mora meritev dolžine zadnjega kraka na 21. dan začeti pri telesni steni in nadaljevati po sredinski črti kraka prek vseh kotov odstopanja. Spremembe dolžine zadnjega kraka na 7. dan se štejejo za pomembne za potencialno aktivnost ščitnice, čeprav na 21. dan niso očitne. Meritve dolžin se pridobijo na podlagi digitalnih fotografij z uporabo programske opreme za analizo slik, kot je opisano v Smernici OECD za histologijo ščitnice pri dvoživkah (9). | Dolžina telesa in teža mokrega telesa | 37. | Določanje dolžine od ust do zadnjične odprtine (SVL) (slika 2) in mokre teže je v protokol preskusa vključeno, da se ocenijo možni učinki preskusne kemikalije na hitrost rasti paglavcev v primerjavi s kontrolno skupino, in je koristno pri ugotavljanju posplošene strupenosti za preskusno kemikalijo. Ker se lahko zaradi odstranitve adherentne vode za določanje teže ustvarijo stresni pogoji za paglavce in se lahko poškoduje njihova koža, se te meritve izvajajo na 7. dan pri paglavcih iz podvzorca, pri vseh ostalih paglavcih pa ob prekinitvi preskusa (21. dan). Zaradi doslednosti je treba kot repno mejo za meritev upoštevati kranialno stran zadnjične odprtine. | 38. | Dolžina od ust do zadnjične odprtine (SVL) se uporabi za oceno rasti paglavca, kot je prikazano na sliki 2. | Slika 2 | (A) Vrste meritev dolžine telesa in (B) meritve zadnjega kraka pri paglavcih X. laevis (1) | Histologija ščitnične žleze | 39. | Čeprav sta razvojna faza in dolžina zadnjega kraka pomembni končni točki za oceno sprememb pri metamorfnem razvoju, povezanih z izpostavljenostjo, se zakasnjeni razvoj sam po sebi ne more šteti za diagnostični kazalnik protiščitničnega delovanja. Nekatere spremembe so lahko opazne le z rutinsko histopatološko analizo. Diagnostična merila vključujejo hipertrofijo/atrofijo ščitnične žleze, hipertrofijo folikularnih celic, hiperplazijo folikularnih celic, dodatna kvalitativna merila pa območje svetline folikla, kakovost koloida in velikost/obliko folikularne celice. Poročati je treba o razvrstitvi resnosti (4 stopnje). Informacije o odvzemu in obdelavi vzorcev za histopatološko analizo in izvedbo histopatoloških analiz na vzorcih tkiva so na voljo v dokumentih ‚Preskus metamorfoze dvoživk: Del 1 – Tehnične smernice za morfološko vzorčenje in histološko pripravo‘ in ‚Preskus metamorfoze dvoživk: Del 2 – Pristop k branju študij, diagnostičnim merilom, razvrstitvi resnosti in atlasu‘ (9). Laboratoriji, ki preskus izvajajo prvič, se morajo pred izvedbo histološke analize in oceno ščitnične žleze zaradi usposabljanja posvetovati z izkušenimi patologi. Zaradi očitnih in znatnih sprememb zgornjih končnih točk, ki kažejo pospešen razvoj ali asinhronost, morda ne bo potrebna histopatološka analiza ščitnične žleze. Zaradi odsotnosti očitnih morfoloških sprememb ali dokazov o zakasnjenem razvoju pa so histološke analize upravičene. | Smrtnost | 40. | Vsak dan je treba pregledati, ali so v preskusnih posodah mrtvi paglavci, in zabeležiti številke za posamezne posode. Za vsak primer smrtnosti je treba zabeležiti datum, koncentracijo in številko posode. Mrtve živali je treba takoj po ugotovitvi smrtnosti odstraniti iz preskusnih posod. Stopnje smrtnosti, ki presegajo 10 %, lahko kažejo neustrezne preskusne pogoje ali strupene učinke preskusne kemikalije. | Dodatna opažanja | 41. | Primere nenormalnega obnašanja ter zelo vidne deformnosti in lezije je treba zabeležiti. Za vsako opaženo nenormalno obnašanje, velike deformnosti ali lezije je treba zabeležiti datum, koncentracijo in številko posode. Za normalno obnašanje je značilno, da paglavci v vodnem stolpcu z repom nad glavo redno ritmično udarjajo z repno plavutjo, redno prihajajo na površino, premikajo škržni poklopec in se odzivajo na dražljaje. Nenormalno obnašanje bi na primer vključevalo lebdenje na gladini, ležanje na dnu posode, obrnjen ali nepravilen način plavanja, odsotnost površinske aktivnosti in neodzivanje na dražljaje. Zabeležiti je treba tudi velike razlike pri porabi hrane med tretiranji. Velike deformnosti in lezije lahko med drugim vključujejo morfološke nenormalnosti (npr. deformacije krakov), hemoragične lezije, bakterijske ali glivične okužbe. Te ugotovitve so kvalitativne, pri čemer jih je treba obravnavati podobno kot klinične znake bolezni/stresa in jih primerjati s kontrolnimi živalmi. Če je pojavnost ali stopnja pojavnosti v izpostavljenih posodah večja kot v kontrolnih posodah, jo je treba obravnavati kot dokaz očitne strupenosti. | PODATKI IN POROČANJE | Zbiranje podatkov | 42. | Vse podatke je treba zbrati z elektronskimi ali ročnimi sistemi, ki upoštevajo dobro laboratorijsko prakso (GLP). Podatki študije morajo obsegati: | | Preskusna kemikalija: | — | opis preskusne kemikalije: fizikalno-kemijske lastnosti, informacije o stabilnosti in biološki razgradljivosti, | — | informacije in podatke o kemikaliji: metodo in pogostost priprave razredčin. Informacije o preskusni kemikaliji vključujejo aktualne in nominalne koncentracije preskusne kemikalije ter v nekaterih primerih nematične kemikalije, kot je ustrezno. Za založne raztopine in preskusne raztopine bodo morda potrebne meritve preskusne kemikalije, | — | topilo (če ni voda): utemeljitev izbire topila in opis topila (vrsta, uporabljena koncentracija). | | Preskusni pogoji: | — | operativne evidence: zajemajo opažanja v zvezi z delovanjem preskusnega sistema ter podpornega okolja in infrastrukture. Običajne evidence vključujejo: sobno temperaturo, preskusno temperaturo, obdobje osvetljenosti, stanje kritičnih delov sistema izpostavljenosti (npr. črpalke, števci ciklov, tlaki), pretoke, vodostaj, spremembe standardne steklenice in evidence prehranjevanja. Parametri splošne kakovosti vode vključujejo: pH, raztopljeni kisik, prevodnost, skupni jod, alkalnost in trdoto, | — | odstopanja od preskusne metode: te informacije morajo vključevati vse informacije ali pripovedne opise odstopanj od preskusne metode. | | Rezultati: | — | biološka opažanja in podatki: ti vključujejo dnevna opažanja smrtnosti, porabe hrane, nenormalnega načina plavanja, letargije, izgube ravnotežja, deformnosti, lezij itd. Opažanja in podatki, zbrani v vnaprej določenih časovnih razmikih, vključujejo: razvojno fazo, dolžino zadnjega kraka, dolžino od ust do zadnjične odprtine in mokro težo, | — | tehnike statistične analize in utemeljitev uporabljenih tehnik, rezultati statistične analize, po možnosti v tabeli, | — | histološki podatki: ti vključujejo pripovedne opise ter razvrščeno resnost in pogostnost specifičnih opažanj, kot je navedeno v smernici za histopatologijo, | — | ad-hoc opažanja: ta opažanja morajo vključevati pripovedne opise študije, ki jih ni mogoče razvrstiti v zgoraj opisane kategorije. | Poročanje podatkov | 43. | Dodatek 2 vsebuje razpredelnice za dnevno zbiranje podatkov, ki se lahko uporabijo kot smernica za vnos neobdelanih podatkov in izračune statističnega povzetka. Navedene so tudi tabele za poročanje, ki so uporabne za sporočanje povzetkov podatkov o končnih točkah. Tabele za poročanje za histološke ocene so navedene v Dodatku 2. | Izvedbena merila in sprejemljivost/veljavnost preskusa | 44. | Na splošno bodo posledica velikih odstopanj od preskusne metode podatki, nesprejemljivi za razlago ali poročanje. Zato so bila naslednja merila iz tabele 4 pripravljena kot smernica za določanje kakovosti izvedenega preskusa, splošne uspešnosti kontrolnih organizmov. | Tabela 4 | Izvedbena merila za AMA | Merilo | Sprejemljive meje | Preskusne koncentracije | V 21-dnevnem preskusu se ohranjajo pri ≤ 20 % KV (variabilnost izmerjenih preskusnih koncentracij). | Smrtnost v kontrolah | ≤ 10 % – smrtnost v nobeni ponovitvi v kontrolah ne sme preseči 2 paglavcev. | Najnižja srednja razvojna faza kontrol na koncu preskusa | 57 | Razpon razvojnih stopenj v kontrolni skupini | Deseti in 90. centil porazdelitve razvojnih faz se ne smeta razlikovati za več kot 4 faze. | Raztopljeni kisik | ≥ 40 % nasičenosti z zrakom (*4) | pH | pH je treba vzdrževati med 6,5 in 8,5. Razlike med ponovitvami/tretiranji ne smejo presegati 0,5. | Temperatura vode | 22 °C ± 1 °C – razlike med ponovitvami/tretiranji ne smejo presegati 0,5 °C. | Preskusne koncentracije brez očitne strupenosti | ≥ 2 | Uspešnost ponovitev | Ogrozita se lahko ≤ 2 ponovitvi v celotnem preskusu. | Posebni pogoji za uporabo topila | Če se uporabi topilo kot nosilec, je treba uporabiti kontrolo s topilom in kontrolo s čisto vodo ter poročati o rezultatih. | Statistično značilne razlike med kontrolno skupino s topilom in kontrolno skupino z vodo se obravnavajo posebej. Več informacij je navedenih v nadaljevanju. | Posebni pogoji za sistem s statičnim obnavljanjem | Poročati je treba o reprezentativnih kemijskih analizah pred obnavljanjem in po njem. | Ravni amoniaka je treba izmeriti neposredno pred obnavljanjem. | Vse parametre kakovosti vode iz tabele 1 iz Dodatka 1 je treba izmeriti neposredno pred obnavljanjem. | Obdobje obnavljanja ne sme biti daljše od 72 ur. | Ustrezen časovni razpored hranjenja (50 % dnevnega obroka komercialne krme za paglavce) | Veljavnost preskusa | 45. | Da se preskus šteje za sprejemljiv/veljaven, morajo biti izpolnjene naslednje zahteve: | | veljaven poskus v zvezi z negativnim preskusom za aktivnost ščitnice: | (1) | smrtnost v nobenem tretiranem vzorcu (vključno s kontrolami) ne sme preseči 10 %. Smrtnost pri nobeni ponovitvi ne sme preseči treh paglavcev, sicer se ponovitev šteje za ogroženo; | (2) | za analizo morata biti na voljo vsaj dve stopnji tretiranja, pri čemer so vse štiri ponovitve neogrožene; | (3) | za analizo morata biti na voljo vsaj dve stopnji tretiranja brez očitne strupenosti; | | veljaven poskus v zvezi s pozitivnim preskusom za aktivnost ščitnice: | (1) | v kontrolni skupini sta lahko največ dva smrtna primera paglavcev na ponovitev. | Način odločanja za izvedbo AMA | 46. | Način odločanja za AMA je bil pripravljen za zagotovitev smiselne pomoči pri izvedbi in razlagi rezultatov biološkega preskusa (glej tabelo poteka na sliki 3). Način odločanja v bistvu obravnava končne točke v navedenem naprednem razvoju, asinhroni razvoj in histopatologija ščitnice se obravnavata podrobno, zakasneli razvoj, dolžina od ust do zadnjične odprtine, teža mokrega telesa in parametri, na katere bi lahko vplivala splošna strupenost, pa se obravnavajo manj podrobno. | Slika 3 | Način odločanja za izvedbo AMA | Napredni razvoj (določen z uporabo razvojne faze, SVL in HLL) | 47. | Znano je le, da se napredni razvoj pojavi zaradi učinkov, ki so povezani s ščitničnim hormonom. To so lahko učinki perifernega tkiva, kot je neposredna interakcija z receptorjem ščitničnega hormona (kot je s T4) ali učinki, ki spreminjajo ravni kroženja ščitničnega hormona. V vsakem primeru se to šteje za ustrezen dokaz, da je kemikalija povezana z aktivnostjo ščitnice. Napredni razvoj se oceni na enega od dveh načinov. Prvič, splošna faza razvoja se lahko oceni s standardiziranim pristopom, kot sta ga opisala Nieuwkoop in Faber (8). Drugič, kvantificirajo se lahko specifične morfološke značilnosti, kot je dolžina zadnjega kraka na 7. in 21. dan, kar je pozitivno povezano z agonističnimi učinki na receptor ščitničnega hormona. Če se pojavi statistično značilen napredek pri razvoju ali dolžini zadnjega kraka, preskus kaže, da kemikalija vpliva na ščitnico. | 48. | Ocenjevanje prisotnosti pospešenega razvoja pri preskusnih živalih glede na kontrolno populacijo bo temeljilo na rezultatih statističnih analiz, izvedenih za naslednje štiri končne točke: | — | dolžina zadnjega kraka (normalizirana s SVL) na 7. dan študije, | — | dolžina zadnjega kraka (normalizirana s SVL) na 21. dan študije, | — | razvojna faza na 7. dan študije, | — | razvojna faza na 21. dan študije. | 49. | Statistične analize dolžine zadnjega kraka je treba izvesti na podlagi meritev dolžine zadnjega levega kraka. Dolžina zadnjega kraka se normalizira z razmerjem med dolžino zadnjega kraka in dolžino od ust do zadnjične odprtine posameznega osebka. Nato se primerja sredina normaliziranih vrednosti posamezne stopnje tretiranja. Pospešen razvoj se nato kaže z znatnim povečanjem srednje dolžine zadnjega kraka (normalizirane) v kemično obdelani skupini v primerjavi s kontrolno skupino na 7. dan študije in/ali 21. dan študije (glej Dodatek 3). | 50. | Statistične analize razvojne faze je treba izvesti na podlagi določitve razvojne faze v skladu z morfološkimi merili, ki sta jih opisala Nieuwkoop in Faber (8). Pospešen razvoj se kaže, če se na 7. in/ali 21. dan študije v primerjavi s kontrolno skupino z večkvantno analizo zazna znatno povečanje vrednosti, povezanih z razvojno fazo, v kemično obdelani skupini. | 51. | Pri preskusni metodi AMA se znaten učinek na katero koli od navedenih štirih končnih točk šteje kot ustrezen za zaznavo pospešenega razvoja. To pomeni, da znatnih učinkov na dolžino zadnjega kraka ob določeni časovni točki ni treba potrditi z znatnimi učinki na dolžino zadnjega kraka ob drugem času ali z znatnimi učinki na razvojno fazo ob tej določeni časovni točki. Znatnih učinkov na razvojno fazo ob določeni časovni točki pa ni treba potrditi z znatnimi učinki na razvojno fazo ob drugem času ali z znatnimi učinki na dolžino zadnjega kraka ob tej določeni časovni točki. Pomen dokazov pospešenega razvoja se bo kljub temu povečal, če bodo znatni učinki zaznani pri več kot eni končni točki. | Asinhroni razvoj (določen z merili za razvojno fazo) | 52. | Za asinhroni razvoj je značilna motnja relativnega časa morfogeneze ali razvoja različnih tkiv pri enem paglavcu. Nezmožnost jasne določitve razvojne faze organizma s skupino morfoloških končnih točk, ki se štejejo kot značilne za katero koli fazo, kaže, da se tkiva pri preobrazbi razvijajo asinhrono. Asinhroni razvoj je kazalnik aktivnosti ščitnice. Edini znani načini delovanja, ki povzročajo asinhroni razvoj, so učinki kemikalij na periferno delovanje ščitničnega hormona in/ali metabolizem ščitničnega hormona pri razvijajočih se tkivih, kot je ugotovljen pri inhibitorjih dejodaze. | 53. | Ocenjevanje prisotnosti asinhronega razvoja pri preskusnih živalih glede na kontrolno populacijo bo temeljil na splošni morfološki oceni preskusnih živali na 7. in 21. dan študije. | 54. | Opis normalnega razvoja Xenopus laevis, ki sta ga pripravila Nieuwkoop in Faber (8), zagotavlja okvir za opredelitev zaporedja normalnega preoblikovanja tkiva. Izraz ‚asinhroni razvoj‘ se nanaša izrecno na tista odstopanja v splošnem morfološkem razvoju paglavcev, ki preprečujejo dokončno določitev razvojne faze v skladu z Nieuwkoopovimi in Faberjevimi merili (8), ker ključni morfološki znaki kažejo značilnosti različnih faz. | 55. | Kot nakazuje izraz ‚asinhroni razvoj‘, je treba obravnavati le primere, ki kažejo odstopanja v napredovanju preoblikovanja posebnih tkiv glede na napredovanje preoblikovanja drugih tkiv. Nekateri klasični fenotipi vključujejo zakasnitev ali odsotnost razvoja sprednjega kraka kljub normalnemu ali naprednemu razvoju zadnjih krakov ali repnih tkiv ali zgodnjo resorpcijo škrg glede na fazo morfogeneze zadnjih krakov in resorpcije repa. Da žival kaže asinhroni razvoj, se zabeleži, če ji ni mogoče dodeliti faze, ker ne izpolnjujejo večine pomembnih razvojnih meril za dano fazo po Nieuwkoopu in Faberju (8) ali če obstaja izjemna zakasnitev ali pospešitev ene ali več ključnih značilnosti (npr. popolna resorpcija repa, ko še ni sprednjih krakov). Ta ocena se izvede kvalitativno in mora zajemati pregled vseh pomembnih značilnosti, ki sta jih navedla Nieuwkoop in Faber (8). Pri tem pa ni treba zabeležiti stanja razvoja različnih pomembnih značilnosti opazovanih živali. Živalim, pri katerih je zabeleženo, da kažejo asinhroni razvoj, se ne dodeli razvojna faza po Nieuwkoopu in Faberju (8). | 56. | Zato je glavno merilo, da se primeri nenormalnega morfološkega razvoja označijo kot ‚asinhroni razvoj‘, motnja relativnega časa preoblikovanja tkiva in morfogeneze tkiva, medtem ko morfologija prizadetih tkiv ni očitno nenormalna. Primer prikaza razlage splošnih morfoloških nenormalnosti je, da bo zadržana morfogeneza zadnjega kraka glede na razvoj drugih tkiv izpolnila merilo ‚asinhronega razvoja‘, medtem ko se primeri manjkajočih zadnjih krakov, nenormalnih števil (npr. ektrodaktilija in polidaktilija) ali drugih očitnih deformnosti krakov ne smejo šteti za ‚asinhroni razvoj‘. | 57. | V zvezi s tem morajo pomembni morfološki znaki, katerih usklajen metamorfni napredek je treba oceniti, vključevati morfogenezo zadnjih krakov, morfogenezo sprednjih krakov, pojav sprednjih krakov, fazo resorpcije repa (zlasti resorpcijo repne plavuti) in morfologijo glave (npr. velikost škrg, fazo resorpcije škrg, morfologijo spodnje čeljusti in protruzijo Mecklovega hrustanca). | 58. | Glede na različne načine kemijskega delovanja se lahko pojavijo različni splošni morfološki fenotipi. Nekateri klasični fenotipi vključujejo zakasnitev ali odsotnost razvoja sprednjega kraka kljub normalnemu ali naprednemu razvoju zadnjih krakov ali repnih tkiv, zgodnji resorpciji škrg glede na zadnje krake in preoblikovanju repa. | Histopatologija | 59. | Če kemikalija ne povzroča očitne strupenosti in ne pospešuje razvoja ali povzroča asinhronega razvoja, se histopatologija ščitnične žleze oceni na podlagi ustrezne smernice (9). Razvojna zaostalost, kadar ni strupenosti, je pomemben kazalnik protiščitničnega delovanja, vendar je analiza razvojne faze manj občutljiva in manj diagnostična kot histopatološka analiza ščitnične žleze. Zato je v tem primeru treba izvajati histopatološke analize ščitničnih žlez. V odsotnosti razvojnih učinkov so bili dokazani učinki na histologijo ščitnične žleze. Če se histopatologija ščitnice spremeni, se šteje, da kemikalija vpliva na ščitnico. Če v ščitničnih žlezah ni ugotovljen zakasnjeni razvoj ali histološke lezije, se šteje, da kemikalija ne vpliva na ščitnico. Ta odločitev se utemelji s tem, da na ščitnično žlezo vpliva TSH, pri čemer bodo vse kemikalije, ki kroženje ščitničnega hormona spremenijo dovolj, da se spremeni sekrecija TSH, povzročile histopatološke spremembe ščitničnih žlez. Kroženje ščitničnega hormona se lahko spremeni zaradi različnih načinov in mehanizmov delovanja. Čeprav raven ščitničnega hormona kaže na učinek, ki je povezan s ščitnico, to ni dovolj za določitev, kateri način ali mehanizem delovanja je povezan z odzivom. | 60. | Ker ta končna točka ni primerna za osnovne statistične pristope, je treba učinek, povezan z izpostavljenostjo kemikaliji, določiti s strokovnim mnenjem patologa. | Zakasneli razvoj (določen z uporabo razvojne faze, HLL, BW in SVL) | 61. | Zakasneli razvoj lahko povzročijo protiščitnični mehanizmi in posredna strupenost. Verjetno je, da zmeren zakasneli razvoj in očitni znaki strupenosti kažejo nespecifičen strupeni učinek. Ocenjevanje neščitnične strupenosti je bistven del preskusa, da se zmanjša verjetnost lažno pozitivnih rezultatov. Čezmerna smrtnost je jasen znak, da se pojavljajo drugi strupeni mehanizmi. Zmerna zmanjšanja rasti, kot so določena z mokro težo in/ali dolžino od ust do zadnjične odprtine, podobno kažejo neščitnično strupenost. Očitna povečanja rasti se pogosto ugotovijo pri kemikalijah, ki negativno vplivajo na normalen razvoj. Zato prisotnost večjih živali še ne pomeni neščitnične strupenosti. Vendar se pri določanju ščitnične strupenosti ne sme nikoli zanašati izključno na rast. Za določanje delovanja ščitnice je treba uporabiti rast skupaj z razvojno fazo in histopatologijo ščitnice. Pri določanju očitne strupenosti je treba obravnavati tudi druge končne točke, vključno z edemi, hemoragičnimi lezijami, letargijo, manjšo porabo hrane, neenakomernim/spremenjenim načinom plavanja itd. Če vse preskusne koncentracije kažejo znake očitne strupenosti, je treba preskusno kemikalijo ponovno oceniti pri nižjih preskusnih koncentracijah, preden se določi, ali bi lahko vplivala na ščitnico ali ne. | 62. | Statistično značilen zakasneli razvoj, kadar ni drugih znakov očitne strupenosti, kaže, da kemikalija vpliva na ščitnico (antagonistično). Kadar ni pomembnih statističnih odzivov, se lahko ta rezultat popravi z rezultati histopatologije ščitnice. | Statistične analize | 63. | Priporoča se, da se pri statističnih analizah podatkov upoštevajo postopki, opisani v dokumentu Sedanji pristopi k statistični analizi podatkov o ekotoksičnosti: smernica za uporabo (11). Za vse stalne kvantitativne končne točke (HLL, SVL, mokra teža), skladne z monotonim odzivom na odmerek, je treba za vzpostavitev znatnega učinka tretiranja na regresiven način uporabiti preskus po Jonckheere-Terpstraju. | 64. | Za stalne končne točke, ki niso skladne z monotonim odzivom na odmerek, je treba pri podatkih oceniti normalnost (priporoča se uporaba Shapiro-Wilkovega ali Anderson-Darlingovega preskusa) in homogenost varianc (priporoča se uporaba Levenejevega preskusa). Oba preskusa se izvedeta na ostankih iz analize variance. Namesto formalnih preskusov za normalnost in homogenost varianc se lahko uporabi strokovna presoja, čeprav se priporoča uporaba formalnih preskusov. Če je ugotovljena nenormalnost ali heterogenost varianc, je treba poiskati normalizacijsko pretvorbo, ki stabilizira variance. Če so podatki (morda po pretvorbi) normalno porazdeljeni s homogenostjo varianc, se znaten učinek tretiranja določi na podlagi Dunnettovega preskusa. Če so podatki (morda po pretvorbi) normalno porazdeljeni s heterogenostjo varianc, se znaten učinek tretiranja določi na podlagi Tamhane-Dunnettovega preskusa, preskusa T3 ali Mann-Whitney-Wilcoxonovega U-preskusa. Kadar ni mogoče najti normalizacijske pretvorbe, se znaten učinek tretiranja določi na podlagi Mann-Whitney-Wilcoxonovega U-preskusa in Bonferroni-Holmove prilagoditve vrednostim p. Dunnettov preskus se uporablja neodvisno od katerega koli F-preskusa analize variance, Mann-Whitneyjev preskus pa se uporablja neodvisno od katerega koli Kruskall-Wallisovega preskusa. | 65. | Visoka smrtnost ni pričakovana, vendar jo je treba oceniti na podlagi regresivnega Cochran-Armitageovega preskusa, kadar so podatki skladni z monotonostjo odziva na odmerek, sicer pa na podlagi Fisherjevega eksaktnega preskusa z Bonferroni-Holmovo prilagoditvijo. | 66. | Znaten učinek tretiranja za razvojno stopnjo se določi na podlagi regresivne uporabe preskusa po Jonckheere-Terpstraju, ki se uporablja za mediane ponovitev. Namesto tega je treba za določitev učinka uporabiti večkvantni Jonckheerov preskus od 20. do 80. centila, kar je tudi priporočljivo, ker upošteva spremembe profila porazdelitve. | 67. | Ustrezna enota analize je ponovitev, da podatke sestavljajo mediane ponovitev, če se uporablja preskus po Jonckheere-Terpstraju ali Mann-Whitneyjev U-preskus, ali ponovljena srednja vrednost, če se uporablja Dunnettov preskus. Monotonost odziva na odmerek se lahko oceni vizualno na podlagi ponovitve in sredin tretiranj ali na podlagi formalnih preskusov, kot so opisani zgoraj (11). Pri manj kot petih ponovitvah na tretirani vzorec ali kontrolo je treba uporabiti točne različice permutacije preskusa po Jonckheere-Terpstraju in Mann-Whitneyevega preskusa, če so na voljo. Statistična značilnost vseh navedenih preskusov je ocenjena na raven značilnosti 0,05. | 68. | Slika 4 je diagram poteka za izvedbo statističnih preskusov stalnih podatkov. | Slika 4 | Diagram poteka za statistične pristope za podatke o zveznem odzivu. | Posebni pomisleki o analizi podatkov | Uporaba ogroženih stopenj tretiranja | 69. | Pri določanju, ali se očitna strupenost kaže s ponovitvijo ali celotnim tretiranjem, se obravnava več dejavnikov, ki jih je treba izključiti iz analize. Očitna strupenost je opredeljena kot več kot dva smrtna primera v kateri koli ponovitvi, ki ju je mogoče pojasniti le s strupenostjo in ne s tehnično napako. Drugi znaki očitne strupenosti vključujejo hemoragijo, nenormalno obnašanje, nenormalne načine plavanja, anoreksijo in vse druge klinične znake bolezni. Za subletalne znake strupenosti bodo lahko potrebne kvalitativne ocene, ki jih je vedno treba izvesti za kontrolno skupino s čisto vodo. | Kontrole s topilom | 70. | Uporabo topila je treba obravnavati le kot zadnjo možnost, ko so bile obravnavane že vse druge možnosti dovajanja kemikalije. Če se uporabi topilo, je treba skladno izvesti kontrolo s čisto vodo. Ob koncu preskusa je treba izvesti oceno potencialnih učinkov topila. Ocena se izvede s statistično primerjavo kontrolne skupine s topilom in kontrolne skupine s čisto vodo. Najpomembnejše končne točke, ki jih je v tej analizi treba obravnavati, so razvojna faza, dolžina od ust do zadnjične odprtine in mokra teža, ker lahko nanje vpliva strupenost, ki ne vpliva na ščitnico. Če se pri teh končnih točkah ugotovijo statistično značilne razlike med kontrolno skupino s čisto vodo in kontrolno skupino s topilom, je treba končne točke študije za merila odziva določiti s kontrolo s čisto vodo. Če za nobeno izmerjeno spremenljivko odziva ni statistično značilne razlike med kontrolo s čisto vodo in kontrolo s topilom, je treba končne točke študije za merila odziva določiti z združenimi kontrolami z vodo za redčenje in topilom. | Tretirane skupine, ki dosežejo 60. razvojno fazo ali več | 71. | Po 60. fazi se velikost in teža paglavcev zmanjšata zaradi resorpcije in zmanjšanja absolutne vsebnosti vode. Zato meritev mokre teže in dolžine od ust do zadnjične odprtine v statističnih analizah ni mogoče ustrezno uporabiti za razlike v hitrostih rasti. Podatke o mokri teži in dolžini organizmov, ki so presegli 60. fazo po Nieuwkoopu in Faberju, je treba izključiti in se jih ne sme uporabiti pri analizah sredin ponovitev ali median ponovitev. Za analizo teh parametrov, povezanih z rastjo, se lahko uporabita dva različna pristopa. | 72. | Prvi pristop je, da se za statistično analizo mokre teže in/ali dolžine od ust do zadnjične odprtine obravnavajo le paglavci, katerih razvojna faza je nižja ali enaka 60. fazi. S tem pristopom naj bi se zagotovile ustrezno zanesljive informacije o resnosti možnih učinkov na rast, če se iz analiz umakne le majhen del preskusnih živali (≤ 20 %). Če večje število paglavcev v eni ali več nominalnih koncentracijah kaže razvojno fazo, višjo od 60. (≥ 20 %), je treba pri vseh paglavcih opraviti dvofaktorsko analizo variance in ugnezdeno strukturo variance, da se ocenijo učinki na rast zaradi kemične obdelave, pri čemer se upošteva učinek pozne razvojne faze na rast. V Dodatku 3 so navedene smernice za analizo teže in dolžine z dvofaktorsko analizo variance. | LITERATURA | (1) | OECD (2004). Report of the Validation of the Amphibian Metamorphosis Assay for the detection of thyroid active substances: Phase 1 – Optimisation of the Test Protocol. Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment. No. 77, Pariz. | (2) | OECD (2007). Final Report of the Validation of the Amphibian Metamorphosis Assay: Phase 2 – Multi-chemical Interlaboratory Study. Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment. No. 76. Pariz. | (3) | OECD (2008). Report of the Validation Peer Review for the Amphibian Metamorphosis Assay and Agreement of the Working Group of the National Coordinators of the Test Guidelines Programme on the Follow-up of this Report. Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment. No. 92. Pariz. | (4) | OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment. No. 23. Pariz. | (5) | ASTM (2002). Standard Guide for Conducting Acute Toxicity Tests on Test Materials with Fishes, Macroinvertebrates, and Amphibians. American Society for Testing and Materials, ASTM E729–96(2002), Filadelfija, PA. | (6) | ASTM (2004). Standard Guide for Conducting the Frog Embryo Teratogenesis Assay – Xenopus (FETAX). E 1439–98. | (7) | Kahl, M. D., Russom, C. L., DeFoe, D. L., in Hammermeister, D. E. (1999). Saturation units for use in aquatic bioassays. Chemosphere 39, str. 539–551. | (8) | Nieuwkoop, P. D., in Faber, J. (1994). Normal Table of Xenopus laevis. Garland Publishing, New York. | (9) | OECD (2007). Guidance Document on Amphibian Thyroid Histology. Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment. No. 82. Pariz. | (10) | Dodd, M. H. I., in Dodd, J. M. (1976). Physiology of Amphibia. Lofts, B. (ur.), Academic Press, New York, str. 467–599. | (11) | OECD (2006). Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application. Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment, No. 54. Pariz. | (12) | Hutchinson, T. H., Shillabeer, N., Winter, M. J., Pickford, D. B. (2006). Acute and chronic effects of carrier solvents in aquatic organisms: A critical review. Review. Aquatic Toxicology, 76; str. 69–92. | Dodatek 1 | Tabela 1 | Poskusni pogoji za 21-dnevni preskus preobrazbe dvoživk | Preskusna žival | Ličinka Xenopus laevis | Začetna faza ličinke | 51. faza po Nieuwkoopu in Faberju | Obdobje izpostavljenosti | 21 dni | Merila za izbiro ličink | razvojna faza in celotna dolžina (neobvezno) | Preskusne koncentracije | najmanj 3 koncentracije v približno enem redu velikosti | Režim izpostavljenosti | pretočni (priporočen) in/ali s statičnim obnavljanjem | Pretok preskusnega sistema | 25 ml/min (prostornina se v celoti zamenja približno vsake 2,7 ure) | Primarne končne točke/dnevi določitve | smrtnost | vsak dan | razvojna faza | 7. in 21. dan | dolžina zadnjega kraka | 7. in 21. dan | dolžina od ust do zadnjične odprtine | 7. in 21. dan | teža mokrega telesa | 7. in 21. dan | histologija ščitnice | 21. dan | Voda za redčenje/laboratorijska kontrola | deklorirana vodovodna voda (prečiščena z ogljem) ali enakovreden laboratorijski vir | Gostota ličink | 20 ličink/preskusno posodo (5/l) | Preskusna raztopina/preskusna posoda | 4–10 l (najmanj 10–15 cm vode)/stekleno preskusno posodo ali preskusno posodo iz nerjavnega jekla (npr. 22,5 cm × 14 cm × 16,5 cm) | Ponovitev | 4 ponovitvene preskusne posode/preskusno koncentracijo in kontrolo | Sprejemljiva stopnja smrtnosti v kontrolah | ≤ 10 % na ponovitveno preskusno posodo | Fiksiranje žleze | Število fiksiranih | vsi paglavci (najprej se jih oceni 5/ponovitev) | Regija | glava ali celo telo | Fiksacijska tekočina | Davidsonov fiksativ | Hranjenje | Hrana | Sera Micron® ali enakovredna | Količina/pogostost | za način hranjenja s Sera Micron® glej tabelo 1 | Osvetlitev | Obdobje osvetljenosti | 12 h svetlobe: 12 h teme: | Jakost | 600 do 2 000 luksov (izmerjeno na vodni gladini) | Temperatura vode | 22 °C ± 1 °C | pH | 6,5–8,5 | Koncentracija raztopljenega kisika (DO) | > 3,5 mg/l (> 40 % nasičenosti z zrakom) | Časovni razpored vzorčenja za analitično kemijo | enkrat/teden (4 vzorčenja/preskus) | Dodatek 2 | Tabele za poročanje za neobdelane podatke in povzete podatke | Tabela 1 | Splošne informacije o preskusni kemikaliji | Kemijske informacije | | Vnesite preskusno kemikalijo, enote koncentracije in tretiranja | | Preskusna kemikalija: | | | | Enote koncentracije: | | | | Tretiranje 1 | | | | Tretiranje 2 | | | | Tretiranje 3 | | | | Tretiranje 4 | | | | | | | | Datum (dan 0): | | Vnesite datum (mm/dd/ll) | | Datum (7. dan): | | Vnesite datum (mm/dd/ll) | | Datum (21. dan): | | Vnesite datum (mm/dd/ll) | Tabela 2 | Zbirni listi za neobdelane podatke za 7. in 21. dan | DAN X | DATUM 00/00/00 | | Koncentracija | Številka tretiranja | Številka ponovitve | Številka osebka | Označba osebka | Razvojna faza | Dolžina SVL (mm) | Dolžina zadnjega kraka (mm) | Mokra teža celotnega organizma (mg) | VRSTICA | TRET. | ŠT: TRET. | PON. | ŠT. OS. | OZN. OS. | FAZA | BL | HLL | TEŽA | 1 | 0,00 | 1 | | | | | | | | 2 | 0,00 | 1 | | | | | | | | 3 | 0,00 | 1 | | | | | | | | 4 | 0,00 | 1 | | | | | | | | 5 | 0,00 | 1 | | | | | | | | 6 | 0,00 | 1 | | | | | | | | 7 | 0,00 | 1 | | | | | | | | 8 | 0,00 | 1 | | | | | | | | 9 | 0,00 | 1 | | | | | | | | 10 | 0,00 | 1 | | | | | | | | 11 | 0,00 | 1 | | | | | | | | 12 | 0,00 | 1 | | | | | | | | 13 | 0,00 | 1 | | | | | | | | 14 | 0,00 | 1 | | | | | | | | 15 | 0,00 | 1 | | | | | | | | 16 | 0,00 | 1 | | | | | | | | 17 | 0,00 | 1 | | | | | | | | 18 | 0,00 | 1 | | | | | | | | 19 | 0,00 | 1 | | | | | | | | 20 | 0,00 | 1 | | | | | | | | 21 | 0,00 | 2 | | | | | | | | 22 | 0,00 | 2 | | | | | | | | 23 | 0,00 | 2 | | | | | | | | 24 | 0,00 | 2 | | | | | | | | 25 | 0,00 | 2 | | | | | | | | 26 | 0,00 | 2 | | | | | | | | 27 | 0,00 | 2 | | | | | | | | 28 | 0,00 | 2 | | | | | | | | 29 | 0,00 | 2 | | | | | | | | 30 | 0,00 | 2 | | | | | | | | 31 | 0,00 | 2 | | | | | | | | 32 | 0,00 | 2 | | | | | | | | 33 | 0,00 | 2 | | | | | | | | 34 | 0,00 | 2 | | | | | | | | 35 | 0,00 | 2 | | | | | | | | 36 | 0,00 | 2 | | | | | | | | 37 | 0,00 | 2 | | | | | | | | 38 | 0,00 | 2 | | | | | | | | 39 | 0,00 | 2 | | | | | | | | 40 | 0,00 | 2 | | | | | | | | 41 | 0,00 | 3 | | | | | | | | 42 | 0,00 | 3 | | | | | | | | 43 | 0,00 | 3 | | | | | | | | 44 | 0,00 | 3 | | | | | | | | 45 | 0,00 | 3 | | | | | | | | 46 | 0,00 | 3 | | | | | | | | 47 | 0,00 | 3 | | | | | | | | 48 | 0,00 | 3 | | | | | | | | 49 | 0,00 | 3 | | | | | | | | 50 | 0,00 | 3 | | | | | | | | 51 | 0,00 | 3 | | | | | | | | 52 | 0,00 | 3 | | | | | | | | 53 | 0,00 | 3 | | | | | | | | 54 | 0,00 | 3 | | | | | | | | 55 | 0,00 | 3 | | | | | | | | 56 | 0,00 | 3 | | | | | | | | 57 | 0,00 | 3 | | | | | | | | 58 | 0,00 | 3 | | | | | | | | 59 | 0,00 | 3 | | | | | | | | 60 | 0,00 | 3 | | | | | | | | 61 | 0,00 | 4 | | | | | | | | 62 | 0,00 | 4 | | | | | | | | 63 | 0,00 | 4 | | | | | | | | 64 | 0,00 | 4 | | | | | | | | 65 | 0,00 | 4 | | | | | | | | 66 | 0,00 | 4 | | | | | | | | 67 | 0,00 | 4 | | | | | | | | 68 | 0,00 | 4 | | | | | | | | 69 | 0,00 | 4 | | | | | | | | 70 | 0,00 | 4 | | | | | | | | 71 | 0,00 | 4 | | | | | | | | 72 | 0,00 | 4 | | | | | | | | 73 | 0,00 | 4 | | | | | | | | 74 | 0,00 | 4 | | | | | | | | 75 | 0,00 | 4 | | | | | | | | 76 | 0,00 | 4 | | | | | | | | 77 | 0,00 | 4 | | | | | | | | 78 | 0,00 | 4 | | | | | | | | 79 | 0,00 | 4 | | | | | | | | 80 | 0,00 | 4 | | | | | | | | Tabela 3 | Izračunani povzeti podatki o končnih točkah za 7. in 21. dan | | | Razvojna faza | SVL (mm) | Dolžina zadnjega kraka (mm) | Teža (mg) | TRET. | PON. | MIN | MEDIANA | MAKS | SREDINA | ST. ODKL. | SREDINA | ST. ODKL. | SREDINA | ST. ODKL. | 1 | 1 | 0 | #NUM! | 0 | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | 1 | 2 | 0 | #NUM! | 0 | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | 1 | 3 | 0 | #NUM! | 0 | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | 1 | 4 | 0 | #NUM! | 0 | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | 2 | 1 | 0 | #NUM! | 0 | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | 2 | 2 | 0 | #NUM! | 0 | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | 2 | 3 | 0 | #NUM! | 0 | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | 2 | 4 | 0 | #NUM! | 0 | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | 3 | 1 | 0 | #NUM! | 0 | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | 3 | 2 | 0 | #NUM! | 0 | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | 3 | 3 | 0 | #NUM! | 0 | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | 3 | 4 | 0 | #NUM! | 0 | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | 4 | 1 | 0 | #NUM! | 0 | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | 4 | 2 | 0 | #NUM! | 0 | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | 4 | 3 | 0 | #NUM! | 0 | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | 4 | 4 | 0 | #NUM! | 0 | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | Opomba: Izračuni v celicah so povezani z vnesenimi podatki iz tabele 2. | Tabela 4 | Podatki o dnevni smrtnosti | Dan preskusa | Datum | 1 | 2 | 3 | 4 | 1 | 2 | 3 | 4 | 1 | 2 | 3 | 4 | 1 | 2 | 3 | 4 | 0 | 00/00/00 | | | | | | | | | | | | | | | | | 1 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | 2 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | 3 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | 4 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | 5 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | 6 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | 7 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | 8 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | 9 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | 10 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | 11 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | 12 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | 13 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | 14 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | 15 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | 16 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | 17 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | 18 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | 19 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | 20 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | 21 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | Število ponovitev | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | Število tretiranj | 0 | | | | 0 | | | | 0 | | | | 0 | | | | Opomba: Izračuni v celicah so povezani z vnesenimi podatki iz tabele 1. | Tabela 5 | Merila kakovosti vode | Sistem izpostavljenosti (pretočni/s statičnim obnavljanjem) | Temperatura: | Jakost svetlobe: | Cikel svetlobe in teme: | Hrana: | Stopnja hranjenja: | pH vode: | Koncentracija jodida v preskusni vodi: | Tabela 6 | Povzetek kemičnih podatkov | Kemijsko ime: | Številka CAS: | Dan preskusa | Datum | 1 | 2 | 3 | 4 | 1 | 2 | 3 | 4 | 1 | 2 | 3 | 4 | 1 | 2 | 3 | 4 | 1 | 2 | 3 | 4 | 0 | 00/00/00 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | 1 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | 2 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | 3 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | 4 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | 5 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | 6 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | 7 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | 8 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | 9 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | 10 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | 11 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | 12 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | 13 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | 14 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | 15 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | 16 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | 17 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | 18 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | 19 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | 20 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | 21 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | Opomba: Izračuni v celicah so povezani z vnesenimi podatki iz tabele 1. | Tabela 7 | Tabele za histopatološko poročanje za glavna merila | Datum: | Kemikalija: | | | Patolog: | | Hipertrofija ščitnične žleze | Atrofija ščitnične žleze | Hipertrofija folikularnih celic | Hiperplazija folikularnih celic | | Hipertrofija ščitnične žleze | Atrofija ščitnične žleze | Hipertrofija folikularnih celic | Hiperplazija folikularnih celic | Oznaka kontrolne živali – ponovitev 1 | | | | | | Oznaka preskusne živali – ponovitev 1 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | Oznaka kontrolne živali – ponovitev 2 | | | | | | Oznaka preskusne živali – ponovitev 2 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | Skupaj: | | | | | Skupaj: | | | | | | Hipertrofija ščitnične žleze | Atrofija ščitnične žleze | Hipertrofija folikularnih celic | Hiperplazija folikularnih celic | | | Hipertrofija ščitnične žleze | Atrofija ščitnične žleze | Hipertrofija folikularnih celic | Hiperplazija folikularnih celic | Oznaka preskusne živali – ponovitev 1 | | | | | | Oznaka preskusne živali – ponovitev 1 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | Oznaka preskusne živali – ponovitev 2 | | | | | | Oznaka preskusne živali – ponovitev 2 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | Skupaj: | | | | | Skupaj: | | | | | Tabela 8 | Dodatna histopatološka merila | Datum: | Kemikalija: | | | Patolog: | | | | | | | Povečanje območja svetline folikla | Zmanjšanje območja svetline folikla | Povečanje območja svetline folikla | Zmanjšanje območja svetline folikla | Oznaka kontrolne živali – ponovitev 1 | | | | Oznaka preskusne živali – ponovitev 1 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | Oznaka kontrolne živali – ponovitev 2 | | | | Oznaka preskusne živali – ponovitev 2 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | Skupaj: | | | Skupaj: | | | | Povečanje območja svetline folikla | Zmanjšanje območja svetline folikla | | | Povečanje območja svetline folikla | Zmanjšanje območja svetline folikla | Oznaka preskusne živali – ponovitev 1 | | | | Oznaka preskusne živali – ponovitev 1 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | Oznaka preskusne živali – ponovitev 2 | | | | Oznaka preskusne živali – ponovitev 2 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | Skupaj: | | | Skupaj: | | | Tabela 9 | Pripovedni opisi histopatoloških ugotovitev | Datum: | Kemikalija: | Patolog: | | Pripovedni opis | Oznaka kontrolne živali – ponovitev 1 | | | | | | | | | | | Oznaka kontrolne živali – ponovitev 2 | | | | | | | | | | | | Oznaka preskusne živali – ponovitev 1 | | | | | | | | | | | Oznaka preskusne živali – ponovitev 2 | | | | | | | | | | | | Oznaka preskusne živali – ponovitev 1 | | | | | | | | | | | Oznaka preskusne živali – ponovitev 2 | | | | | | | | | | | | | Oznaka preskusne živali – ponovitev 1 | | | | | | | | | | | Oznaka preskusne živali – ponovitev 2 | | | | | | | | | | | Tabela 10 | Predloga tabele za poročanje za povzetke za dan x (7. ali 21. dan) AMA | | | Kontrola | Odmerek 1 | Odmerek 2 | Odmerek 3 | Končna točka | Ponovitev | Sredina | SO | KV | Š | Sredina | SO | KV | Š | Vrednost p | Sredina | SO | KV | Š | Vrednost p | Sredina | SO | KV | Š | Vrednost p | Zadnji krak Dolžina | (mm) | 1 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | 2 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | 3 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | 4 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | Sredina: | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | SVL | (mm) | 1 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | 2 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | 3 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | 4 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | Sredina: | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | Mokra teža | (mg) | 1 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | 2 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | 3 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | 4 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | Sredina: | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | Tabela 11 | Tabela za poročanje za povzetke za dan × (7. ali 21. dan) AMA | | | Kontrola | Odmerek 1 | Odmerek 2 | Odmerek 3 | | Ponovitev | Mediana | Min. | Maks. | Š | Mediana | Min. | Maks. | Š | Vrednost p | Mediana | Min. | Maks. | Š | Vrednost p | Mediana | Min. | Maks. | Mediana | Vrednost p | Razvojna faza | 1 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | 2 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | 3 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | 4 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | Sredina: | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | Dodatek 3 | Alternativna analiza teže in dolžine, kadar je razvojna faza pozna pri več kot 20 % paglavcev v eni koncentraciji ali več | Če večje število paglavcev v eni ali več nominalnih koncentracijah kaže razvojno fazo, višjo od 60. (≥ 20 %), je treba pri vseh paglavcih opraviti dvofaktorsko analizo variance in ugnezdeno strukturo variance, da se ocenijo učinki na rast zaradi kemične obdelave, pri čemer se upošteva učinek pozne razvojne faze na rast. | Priporoča se uporaba vseh podatkov, vendar je treba upoštevati učinek pozne razvojne faze. To omogoča dvofaktorska analiza variance z ugnezdeno strukturo variance. Če je razvojna faza živali 61. ali višja, je treba za pozno fazo izbrati „da“ (LateStage = „Yes“). V nasprotnem primeru je treba izbrati „ne“ (LateStage = „No“). Nato se lahko izvede dvofaktorska analiza variance s koncentracijo in LateStage ter njuno povezanostjo, pri čemer je Rep(Conc) naključni faktor, Tadpole(Rep) pa še en naključni učinek. Ponovitev se še vedno obravnava kot enota analize in zagotavlja v glavnem enake rezultate kot tehtana analiza sredin rep*latestage, tehtana s številom živali na sredino. Če podatki ne upoštevajo zahtev analize variance glede normalnosti ali homogenosti varianc, se lahko izvede pretvorba normalizirane porazdelitve, v čimer se odstrani navedena ovira. | Poleg standardnih F-preskusov analize variance za učinke Conc, LateStage in njihovih povezanosti se lahko interakcijski F-preskus razdeli na dva dodatna F-preskusa analize variance, pri čemer se en uporablja za srednje odzive pri koncentracijah za LateStage=„No“, drugi pa za srednje odzive pri koncentracijah za LateStage = „Yes“. Dodatne primerjave sredin tretiranj glede na kontrolo se izvedejo v vsaki fazi LateStage. Izvedejo se lahko analize trenda z ustreznimi nasprotji ali enostavne primerjave parov, če obstajajo dokazi nemonotonega odziva na odmerek v okviru ene stopnje spremenljivke LateStage. Bonferroni-Holmova prilagoditev vrednostim p se izvede le, če ustrezen F-del ni pomemben. To se lahko naredi v SAS in predvidoma v drugih statističnih programskih paketih. Zapleti se lahko pojavijo, če v nekaterih koncentracijah ni živali v pozni fazi, vendar se lahko ti primeri rešijo neposredno. | Dodatek 4 | Opredelitve | Kemikalija : snov ali zmes. | Preskusna kemikalija : vsaka snov ali zmes, preskušena z uporabo te preskusne metode. | C.39 PRESKUS RAZMNOŽEVANJA SKAKAČEV V TLEH | UVOD | 1. | Ta preskusna metoda ustreza Smernici za preskušanje OECD (TG) 232 (2009). Zasnovana je za ocenjevanje učinkov kemikalij na sposobnost razmnoževanja skakačev v tleh. Temelji na obstoječih postopkih (1) (2). Partenogenetska Folsomia candida in Folsomia fimetaria, ki se razmnožujeta spolno, sta dve najbolj razširjeni vrsti skakačev, ki sta primerni za gojenje in komercialno dostopni. Kadar je treba oceniti posebne habitate, kjer ni teh vrst, se lahko postopek razširi tudi na druge vrste skakačev, če lahko izpolnijo merila za veljavnost preskusa. | 2. | Talni skakači so ekološko pomembna vrsta za ekotoksikološko preskušanje. Skakači so šesteronožci s tankim zunanjim skeletom, ki je zelo prepusten za zrak in vodo, ter predstavljajo vrsto členonožcev z drugačnim načinom in stopnjo izpostavljenosti kot deževniki in enhitreji. | 3. | Gostote populacije skakačev običajno dosežejo 105 m– 2 v tleh in plasteh preperelega listja v več kopenskih ekosistemih (3) (4). Odrasli običajno merijo 0,5–5 mm, njihov prispevek k skupni živalski biomasi in dihanju tal pa je nizek in ocenjen na 1–5 % (5). Njihova najpomembnejša vloga bi zato lahko bila potencialno reguliranje procesov z mikrobivorizmom in plenjenjem mikrofavne. Skakači so plen za številne endogeične in epigeične nevretenčarje, kot so pršice, strige, pajki, krešiči in kratkokrilci. Skakači prispevajo k procesom razpadanja v kislih tleh, kjer bi lahko bili najpomembnejši talni nevretenčarji poleg enhitrejev, ker tam običajno ni deževnikov in dvojnonog. | 4. | F. fimetaria se nahaja po vsem svetu in je pogosto v različnih vrstah tal od peščenih do ilovnatih in od humusa do trhline. Je skakač, ki nima oči in pigmenta. Najden je bil v kmetijskih tleh po vsej Evropi (6). Je vsejed in se med drugim prehranjuje z mikroorganizmi fungus hypha, bakterijami, praživalmi in odpadki. Njegova interakcija poteka prek paše z infekcijami patogenih gliv (7) in lahko vpliva na mikorizo, kot je znano za F. candida. Tako kot večina vrst skakačev se razmnožuje spolno, pri čemer morajo biti samci stalno prisotni zaradi oploditve jajčec. | 5. | Tudi F. candida se nahaja povsod po svetu. Čeprav običajno ni prisotna v večini naravnih tal, se v večjem številu pogosto nahaja v tleh, bogatih s humusom. Je skakač, ki nima oči in pigmenta. Ima dobro razvito furko (skakalni organ), se aktivno premika s tekom in takoj skoči, če je ogrožen. Ekološka vloga F. candida je podobna vlogi F. fimetaria, vendar so njen habitat organsko bogatejša tla. Razmnožuje se partenogenetsko. Samcev je manj kot eden na tisoč. | NAČELO PRESKUSA | 6. | Sinhroni odrasli (F. fimetaria) ali mladi (F. candida) skakači so izpostavljeni različnim koncentracijam preskusne kemikalije, premešane v spremenjena umetna tla (8) s 5-odstotno vsebnostjo organske snovi (ali alternativna tla). Potek preskusa se lahko razdeli na dva koraka: | — | preskus za določanje območja delovanja, če ni na voljo ustreznih informacij o strupenosti, v katerem sta smrtnost in razmnoževanje glavni končni točki, ki se ocenjujeta po dveh tednih za F. fimetaria in treh tednih za F. candida, | — | končni preskus razmnoževanja, v katerem se ocenjujeta skupno število mladičev, ki so jih ustvarili starši, in preživetje staršev. Ta končni preskus traja tri tedne za F. fimetaria ali štiri tedne za F. candida. | Strupeni učinek preskusne kemikalije na smrtnost odraslih in njihovo sposobnost razmnoževanja se izrazi kot LCx in ECx s prilagajanjem podatkov ustreznemu modelu z nelinearno regresijo, da se oceni koncentracija, ki bi povzročila x-odstotno smrtnost ali manjšo sposobnost razmnoževanja, ali pa kot vrednost NOEC/LOEC (9). | INFORMACIJE O PRESKUSNI KEMIKALIJI | 7. | Priporočljivo je, da so znane fizikalne lastnosti, topnost v vodi, log Kow, porazdelitveni koeficient tla/voda in parni tlak preskusne kemikalije. Zaželene so dodatne informacije o končnem stanju preskusne kemikalije v tleh, kot so stopnje fotolize in hidrolize ter biotska razgradnja. Kadar so na voljo kemijska identifikacija preskusne kemikalije v skladu z nomenklaturo IUPAC, številka CAS, serija, skupina, strukturna formula in čistost, jih je treba dokumentirati. | 8. | Ta preskusna metoda se lahko uporabi za kemikalije, ki so v vodi topne ali netopne. Vendar se bo način uporabe preskusne kemikalije ustrezno razlikoval. Preskusna metoda se ne uporablja za hlapne kemikalije, tj. kemikalije, katerih Henryjeva konstanta ali porazdelitveni koeficient zrak/voda je večji od ena, ali kemikalije, katerih parni tlak presega 0,0133 Pa pri 25 °C. | VELJAVNOST PRESKUSA | 9. | Da se rezultati preskusa štejejo za veljavne, morajo biti v netretiranih kontrolah izpolnjena naslednja merila: | — | srednja smrtnost pri odraslih na koncu preskusa ne sme presegati 20 %, | — | povprečno število mladičev na posodo mora biti na koncu preskusa vsaj 100, | — | koeficient variacije, izračunan za število mladičev, mora biti na koncu končnega preskusa manj kot 30 %. | REFERENČNA KEMIKALIJA | 10. | Referenčno kemikalijo je treba preskusiti pri koncentraciji EC50 za izbrano vrsto preskusnih tal v rednih časovnih razmikih ali jo po možnosti vključiti v vsak preskusni vzorec, da se preveri, ali je raven odziva preskusnih organizmov v preskusnem sistemu normalna. Ustrezna referenčna kemikalija je borova kemikalija, ki mora razmnoževanje zmanjšati za 50 % (10) (11) pri približno 100 mg/kg suhe teže tal za obe vrsti. | OPIS PRESKUSA | Preskusne posode in oprema | 11. | Ustrezne preskusne posode so posode, ki lahko zadržujejo 30 g vlažne prsti. Izdelane morajo biti iz stekla ali inertne plastike (nestrupene). Vendar se je treba uporabi plastičnih posod izogibati, če se izpostavljenost preskusni kemikaliji zmanjša zaradi sorpcije. Preskusna posoda mora imeti presečno območje, ki omogoča dejansko globino tal v preskusni posodi od 2 do 4 cm. Posode morajo imeti pokrove (npr. iz stekla ali polietilena), ki so zasnovani za zmanjšanje izhlapevanja vode, medtem ko omogočajo izmenjavo plinov med tlemi in atmosfero. Posoda mora biti vsaj delno prozorna, da omogoča prenos svetlobe. | 12. | Potrebna je normalna laboratorijska oprema, zlasti: | — | sušilnik, | — | stereomikroskop, | — | merilnik vrednosti pH in merilnik osvetljenosti, | — | ustrezne natančne tehtnice, | — | ustrezna oprema za uravnavanje temperature, | — | ustrezna oprema za uravnavanje vlažnosti zraka (ni nujna, če so posode za izpostavljanje pokrite s pokrovi), | — | inkubator z uravnavanjem temperature ali majhen prostor, | — | prijemalke ali nizkotlačni sesalnik. | Priprava preskusnih tal | 13. | Uporabijo se spremenjena umetna tla (8) s 5-odstotno vsebnostjo organske snovi. Če umetna tla niso podobna naravnim, se lahko uporabijo tudi naravna tla. Priporočena sestava umetnih tal je naslednja (na podlagi suhih tež, posušenih na konstantno težo pri 105 °C): | — | 5 % šotnega maha, posušenega na zraku in fino mletega (sprejemljiva je velikost delcev 2 ± 1 mm), | — | 20 % kaolinske gline (vsebnost kaolinita po možnosti nad 30 %), | — | približno 74 % industrijskega peska, posušenega na zraku (odvisno od potrebne količine CaCO3), pretežno finega peska z več kot 50 % delcev med 50 in 200 mikronov. Točna količina peska je odvisna od količine CaCO3 (glej v nadaljevanju), pri čemer morata skupaj predstavljati 75 %, | — | 1,0 % kalcijevega karbonata (CaCO3, zdrobljen v prah, analitsko čisti) za zagotovitev pH 6,0 ± 0,5; količina kalcijevega karbonata, ki ga je treba dodati, je lahko odvisna pretežno od kakovosti/vrste šote (glej opombo 1). | Opomba 1: Količina CaCO3, ki je potrebna, bo odvisna od sestavin substrata tal in jo je treba določiti z merjenjem pH predinkubiranih podvzorcev vlažnih tal neposredno pred preskusom. | Opomba 2: Priporoča se merjenje pH ter po možnosti razmerja C/N, kationske izmenjalne kapacitete (CEC) in vsebnosti organske snovi v tleh, da se omogočita poznejša normalizacija in boljša razlaga rezultatov. | Opomba 3: Po potrebi se lahko npr. za namene posebnega preskušanja kot preskusni in/ali kulturni substrat uporabijo tudi naravna tla z neonesnaženih območij. Če se uporabijo naravna tla, pa je treba določiti vsaj njihov izvor (mesto odvzema), pH, teksturo (porazdelitev delcev glede na velikost), kationsko izmenjalno kapaciteto in vsebnost organske snovi, pri čemer ne smejo biti onesnažena. Preden se tla uporabijo pri končnem preskusu, je priporočljivo dokazati ustreznost naravnih tal za preskus in izpolnjevanje meril za veljavnost preskusa. | 14. | Suhe sestavine tal se temeljito premešajo (npr. v velikem laboratorijskem mešalniku). Največja zmogljivost zadrževanja vode (WHC) umetnih tal se določi v skladu s postopki iz Dodatka 5. Odstotek vlage v tleh za preskušanje je treba optimirati, da se zagotovi porozna struktura tal, ki skakačem omogoča vstop skozi pore. To je običajno 40–60 % največje zmogljivosti zadrževanja vode. | 15. | Suha umetna tla se predhodno navlažijo z dodajanjem dovolj deionizirane vode, da se zagotovi približno pol končne vsebnosti vode 2–7 dni pred začetkom preskusa, kar omogoča vzpostavitev ravnotežja/stabilizacijo kislosti. Za določitev pH se uporabi zmes tal in raztopine 1 M kalijevega klorida (KCl) ali 0,01 M kalcijevega klorida (CaCl2) v razmerju 1: 5 (v skladu z Dodatkom 6). Če so tla bolj kisla, kot je potrebno, se lahko prilagodijo z dodajanjem ustrezne količine CaCO3. Če so tla preveč alkalna, se lahko prilagodijo z dodajanjem anorganske kisline, ki ni škodljiva za skakače. | 16. | Predhodno navlažena tla se razdelijo na dele, ki ustrezajo številu preskusnih koncentracij (in referenčne kemikalije, kadar je primerno) ter kontrol, uporabljenih v preskusu. Dodajanje preskusnih kemikalij in uravnavanje vsebnosti vode potekata v skladu z odstavkom 24. | Izbira in priprava preskusnih živali | 17. | Priporočena vrsta je partenogena F. candida, ker je v krožnem preskusu preskusne metode (11) pogosteje izpolnjevala merila za veljavnost glede preživetja kot F. fimetaria. Če se uporabi alternativna vrsta, mora izpolnjevati merila za veljavnost iz odstavka 9. Na začetku preskusa morajo biti živali dobro nahranjene in stare 23–26 dni (F. fimetaria) oz. 9– 12 dni (F. candida). Pri vsaki ponovitvi je treba uporabiti 10 samcev in 10 samic za F. fimetaria ter 10 samic za F. candida (glej Dodatek 2 in Dodatek 3). Sinhrone živali se izberejo naključno iz posod, za vsako serijo, ki se doda ponovitvi, pa se preverita njihovo zdravje in fizično stanje. Vsaka skupina 10/20 osebkov se doda v naključno izbrano preskusno posodo, pri čemer se velike samice F. fimetaria izberejo, da se zagotovi razlikovanje od samcev F. fimetaria. | Priprava preskusnih koncentracij | 18. | Uporabijo se lahko štiri metode dodajanja preskusne kemikalije: 1) mešanje preskusne kemikalije v tla z vodo kot nosilcem, 2) mešanje preskusne kemikalije v tla z organskim topilom kot nosilcem, 3) mešanje preskusne kemikalije v tla s peskom kot nosilcem ali 4) dodajanje preskusne kemikalije na površino tal. Izbira ustrezne metode je odvisna od značilnosti kemikalije in namena preskusa. Na splošno se priporoča umešanje preskusne kemikalije v tla. Vendar bodo morda potrebni postopki dodajanja, ki so skladni s praktično uporabo preskusne kemikalije (npr. pršenje tekočega pripravka ali uporaba posebnih pesticidnih pripravkov, kot so zrnca ali obloge semen). Tla se tretirajo, preden se vanje vnesejo skakači, razen kadar se preskusna kemikalija doda na površino tal, pri čemer je treba skakačem omogočiti, da vstopijo v tla. | Preskusne kemikalija, ki je topna v vodi | 19. | Raztopina preskusne kemikalije se pripravi v deionizirani vodi v dovolj veliki količini za vse ponovitve ene preskusne koncentracije. Vsaka raztopina preskusne kemikalije se temeljito premeša z eno serijo predhodno namočenih tal, preden se doda v preskusno posodo. | Preskusna kemikalija, ki ni topna v vodi | 20. | Preskusna kemikalija, ki ni topna v vodi, vendar je topna v organskih topilih, se lahko raztopi v čim manjši prostornini ustreznega topila (npr. acetona), ki še zagotavlja ustrezno mešanje kemikalije v tleh, in zmeša z delom potrebnega kremenovega peska. Uporabijo se lahko le hlapna topila. Če se uporabi organsko topilo, morajo vse preskusne koncentracije in dodatna negativna kontrola s topilom vsebovati enako čim manjšo količino topila. Posode za dodajanje je treba pustiti odkrite dovolj dolgo, da topilo za dodajanje preskusne kemikalije izhlapi, s čimer se prepreči razgradnja preskusne kemikalije v tem času. | Preskusna kemikalija, ki je v vodi in organskih topilih slabo topna | 21. | Pri kemikalijah, ki so v vodi in organskih topilih slabo topne, se kremenov pesek, ki mora biti del vsega peska, dodanega tlom, zmeša s količino preskusne kemikalije, ki zagotovi potrebno preskusno koncentracijo. Ta mešanica kremenovega peska in preskusne kemikalije se doda predhodno navlaženim tlom in temeljito zmeša po dodajanju ustrezne količine deionizirane vode, da se zagotovi potreben odstotek vlage. Končna mešanica se razdeli v preskusne posode. Postopek se ponovi za vsako preskusno koncentracijo, pri čemer se pripravi tudi ustrezna kontrola. | Dodajanje preskusne kemikalije na površino tal | 22. | Če je preskusna kemikalija pesticid, je lahko ustrezno dodajanje na površino tal s pršenjem. Tla se tretirajo, ko se vanje dodajo skakači. Preskusne posode se najprej napolnijo z navlaženim substratom tal, dodajo se živali in nato se preskusne posode stehtajo. Da se prepreči neposredna izpostavljenost živali preskusni kemikaliji z neposrednim stikom, se preskusna kemikalija doda vsaj pol ure po vnosu skakačev. Preskusno kemikalijo je treba dodati na površino tal čim bolj enakomerno s primerno laboratorijsko napravo za pršenje, da se simulira pršenje na terenu. Dodajanje mora potekati pri temperaturi v razponu ± 2 °C, za vodne raztopine, emulzije ali disperzije pa pri stopnji nanosa v skladu s priporočili iz ocene tveganja. Stopnjo je treba preveriti z ustrezno kalibracijo. Posebne formulacije, kot so zrnca ali obloge semen, se lahko dodajajo, kot je skladno z uporabo v kmetijstvu. Hrana se doda po pršenju. | POSTOPEK | Preskusni pogoji | 23. | Srednja temperatura preskusa mora biti 20 °C ± 1 °C s temperaturnim razponom 20 °C ± 2 °C. Preskus se izvede pri nadzorovanih ciklih svetlobe in teme (po možnosti 12 ur svetlobe in 12 ur teme) z osvetljenostjo od 400 do 800 luksov na območju preskusnih posod. | 24. | Da se preveri vlažnost tal, se posode tehtajo na začetku preskusa, sredi preskusa in na koncu preskusa. Izguba vode > 2 % se nadomesti z dodajanjem deionizirane vode. Opozoriti je treba, da se lahko izguba vode zmanjša z vzdrževanjem visoke vlažnosti zraka (> 80 %) v preskusnem inkubatorju. | 25. | pH je treba izmeriti na začetku in koncu preskusa za določanje območja delovanja in končnega preskusa. Meritve je treba izvesti v enem dodatnem kontrolnem vzorcu in enem dodatnem vzorcu vzorcev tretiranih tal (vse koncentracije), ki se pripravi in vzdržuje enako kot preskusne kulture, vendar brez dodajanja skakačev. | Preskusni postopek in meritve | 26. | Za vsako koncentracijo se v preskusno posodo doda količina preskusnih tal, ki ustreza 30 g sveže teže. Pripravijo se tudi kontrole z vodo brez preskusne kemikalije. Če se za dodajanje preskusne kemikalije uporablja vehikel, je treba poleg preskusnih serij izvesti tudi kontrolne serije, ki vsebujejo samo vehikel. Koncentracija topila ali disperzijskega sredstva mora biti enaka kot koncentracija v preskusnih posodah s preskusno kemikalijo. | 27. | Posamezni skakači se previdno prenesejo v posamezno preskusno posodo (naključno porazdeljeni v preskusne posode) in položijo na površino tal. Za učinkovit prenos živali se lahko uporabi nizkotlačni sesalnik. Število ponovitev za preskusne koncentracije in kontrole je odvisno od uporabljenega načrta preskusa. Preskusne posode se naključno razporedijo po preskusnem inkubatorju in nato vsak teden naključno prerazporedijo. | 28. | Za preskus s F. fimetaria je treba uporabiti 20 odraslih osebkov, od tega 10 samcev in 10 samic, starih 23–26 dni. Na 21. dan se skakači ekstrahirajo iz tal in preštejejo. Pri F. fimetaria se spol loči po velikosti v seriji sinhronih živali, uporabljeni za preskus. Samice so značilno večje od samcev (glej Dodatek 3). | 29. | Za preskus s F. candida je treba uporabiti deset 9– 12 dni starih mladičev na preskusno posodo. Na 28. dan se skakači ekstrahirajo iz tal in preštejejo. | 30. | Kot primeren vir hrane se na začetku preskusa in po približno dveh tednih v vsako posodo doda ustrezna količina, npr. 2– 10 mg, zrnastega suhega pekovskega kvasa, ki je komercialno dostopen za uporabo v gospodinjstvu. | 31. | Na koncu preskusa se ocenita smrtnost in razmnoževanje. Po treh (F. fimetaria) ali štirih tednih (F. candida) se skakači ekstrahirajo iz preskusnih tal (glej Dodatek 4) in preštejejo (12). Skakač se šteje za mrtvega, če pri štetju ni prisoten. Metodi ekstrakcije in štetja morata biti validirani. Validacija vključuje učinkovitost ekstrakcije mladičev, ki je večja od 95 %, npr. z dodajanjem znanega števila v tla. | 32. | Praktični povzetek in časovni razpored preskusnega postopka sta opisana v Dodatku 2. | Načrt preskusa | Preskus za določanje območja delovanja | 33. | Po potrebi se preskus za določanje območja delovanja izvede na primer s petimi koncentracijami preskusne kemikalije, in sicer 0,1, 1,0, 10, 100 in 1 000 mg/kg suhe teže tal ter dvema ponovitvama za vsako tretiranje in kontrolo. Pri določanju območja koncentracij, ki jih je treba uporabiti pri preskusu za določanje območja delovanja, so lahko uporabne tudi dodatne informacije o smrtnosti in razmnoževanju skakačev, ki izhajajo iz preskusov s podobnimi kemikalijami ali iz literature. | 34. | Preskus za določanje območja delovanja traja dva tedna pri F. fimetaria in tri tedne pri F. candida, da se dobi eno leglo mladičev. Na koncu preskusa se ocenita smrtnost in razmnoževanje skakačev. Zabeležiti je treba število odraslih in pojav mladičev. | Končni preskus | 35. | Za določitev ECx (npr. EC10, EC50) je treba uporabiti dvanajst koncentracij. Priporočata se vsaj dve ponovitvi za vsako tretiranje s preskusno koncentracijo in šest kontrolnih ponovitev. Faktor oddaljenosti se lahko razlikuje glede na vzorec odziva na odmerek. | 36. | Za določitev NOEC/LOEC je treba preskusiti vsaj pet koncentracij v geometrijskem zaporedju. Priporočajo se vsaj štiri ponovitve za vsako tretiranje s preskusno koncentracijo in osem kontrol. Razmik med koncentracijami je treba določiti s faktorjem, ki ne presega 1,8. | 37. | Združen pristop omogoča določitev NOEC/LOEN in ECx. Pri tem združenem pristopu je treba uporabiti osem koncentracij za tretiranje v geometrijskem zaporedju. Priporočajo se vsaj štiri ponovitve za vsako tretiranje in osem kontrol. Razmik med koncentracijami je treba določiti s faktorjem, ki ne presega 1,8. | 38. | Če se pri preskusu za določanje območja delovanja ne opazijo učinki pri najvišji koncentraciji (tj. 1 000 mg/kg), se lahko kot mejni preskus izvede preskus razmnoževanja, pri čemer se uporabita preskusna koncentracija 1 000 mg/kg in kontrola. Z mejnim preskusom se zagotovi priložnost za dokaz, da pri mejni koncentraciji ni statistično značilnega učinka. Osem ponovitev je treba uporabiti tako za tretirana tla kot kontrolo. | PODATKI IN POROČANJE | Obdelava rezultatov | 39. | Sposobnost razmnoževanja je glavna končna točka (npr. število ustvarjenih mladičev na preskusno posodo). S statistično analizo, npr. postopki analize variance, se primerjajo tretiranja s t-preskusom, Dunnettovim preskusom ali Williamsovim preskusom. Za sredine posameznih tretiranj se izračunajo 95-odstotni intervali zaupanja. | 40. | Število preživelih odraslih v netretiranih kontrolah je pomembno merilo za veljavnost in ga je treba dokumentirati. Tako kot pri preskusu za določanje območja delovanja je treba v končnem poročilu navesti tudi vse druge škodljive znake. | LCx in ECx | 41. | Vrednosti ECx, vključno s spodnjimi in zgornjimi 95-odstotnimi mejami zaupanja za parameter, povezanimi z njimi, se izračunajo po ustreznih statističnih metodah (npr. logistična ali Weibullova funkcija, spremenjena metoda Spearman-Karber ali linearna interpolacija). ECx se pridobi tako, da se v postavljeno enačbo vstavi vrednost, ki ustreza x % sredine kontrole. Za izračun EC50 ali katere koli druge vrednosti ECx je treba za celoten niz podatkov opraviti regresijsko analizo. LC50 se običajno oceni z analizo probit ali podobno analizo, ki upošteva binomsko porazdeljene podatke o smrtnosti. | NOEC/LOEC | 42. | Če se bo NOEC/LOEC določala s statistično analizo, so potrebni statistični podatki (posamezne posode se štejejo za ponovitve) po posodah. Uporabiti je treba ustrezne statistične metode v skladu z dokumentom OECD št. 54 o sedanjih pristopih k statistični analizi podatkov o ekotoksičnosti: smernica za uporabo (9). Na splošno se škodljivi učinki preskusne kemikalije v primerjavi s kontrolo proučujejo s preskušanjem enostransko zastavljene hipoteze pri p ≤ 0,05. | 43. | Normalna porazdelitev in homogenost varianc se lahko preskusita z ustreznim statističnim preskusom, npr. Shapiro-Wilkovim preskusom oz. Levenejevim preskusom (p ≤ 0,05). Izvedejo se lahko enofaktorska analiza variance (ANOVA) in nadaljnje metode večkratne primerjave. Metode večkratne primerjave (npr. Dunnettov preskus) ali regresivni preskusi trenda (npr. Williamsov preskus) se lahko uporabijo za izračun, ali obstajajo znatne razlike (p ≤ 0,05) med kontrolami in različnimi koncentracijami preskusne kemikalije (izbira priporočenega preskusa v skladu s dokumentom OECD št. 54 (9)). V nasprotnem primeru se lahko za določitev NOEC in LOEC uporabijo neparametrične metode (npr. Bonferronijev U-preskus v skladu s preskusom trenda po Holmu ali Jonckheere-Terpstraju). | Mejni preskus | 44. | Če je bil mejni preskus (primerjava kontrol in izključeno enega tretiranja) izveden in so izpolnjeni predpogoji za postopke parametričnega preskusa (normalnost, homogenost), se lahko odzivi metrik ocenijo s t-preskusom. Če te zahteve niso izpolnjene, se lahko uporabi t-preskus za neenake variance (Welchev t-preskus) ali neparametrični preskus, kot je Mann-Whitneyjev U-preskus. | 45. | Za določanje znatnih razlik med kontrolami (kontrola in kontrola s topilom) se lahko ponovitve posameznih kontrol preskusijo, kot je opisano za mejni preskus. Če se znatne razlike s temi preskusi ne zaznajo, se lahko vse kontrolne ponovitve in kontrolne ponovitve s topilom združijo. V nasprotnem primeru je treba vsa tretiranja primerjati s kontrolo s topilom. | Poročilo o preskusu | 46. | V poročilu o preskusu morajo biti vsaj naslednje informacije: | | Preskusna kemikalija | — | identiteta preskusne kemikalije, serija, skupina in številka CAS, čistoča, | — | fizikalno-kemijske lastnosti preskusne kemikalije (npr. Kow, topnost v vodi, parni tlak, Henryjeva konstanta (H) in po možnosti informacije o končnem stanju preskusne kemikalije v tleh), če so na voljo, | — | formulacija preskusne kemikalije in navedba dodatkov, če se ne preskuša čista kemikalija. | | Preskusni organizmi | — | identifikacija vrste in dobavitelja preskusnih organizmov, opis pogojev razmnoževanja in starostni razpon preskusnih organizmov. | | Preskusni pogoji | — | opis načrta poskusa in postopkov, | — | podrobnosti o pripravi preskusnih tal, natančna specifikacija, če se uporabijo naravna tla (izvor, zgodovina, porazdelitev delcev glede na velikost, pH, vsebnost organske snovi), | — | zmogljivost tal za zadrževanje vode, | — | opis tehnike, uporabljene za dodajanje preskusne kemikalije v tla, | — | preskusni pogoji: jakost svetlobe, trajanje ciklov svetlobe in teme, temperatura, | — | opis načina hranjenja, vrsta in količina hrane, uporabljene v preskusu, datumi hranjenja, | — | pH in vsebnost vode v tleh na začetku in koncu preskusa (kontrola in posamezno tretiranje), | — | natančen opis metode ekstrakcije in učinkovitosti ekstrakcije. | | Rezultati preskusa | — | število mladičev, določeno v posamezni preskusni posodi na koncu preskusa, | — | število odraslih in njihova smrtnost ( %) v posamezni preskusni posodi na koncu preskusa, | — | opis očitnih fizioloških ali patoloških simptomov ali izrazitih sprememb v obnašanju, | — | rezultati, pridobljeni z referenčno preskusno kemikalijo, | — | vrednosti NOEC/LOEC, LCx za smrtnost in ECx za razmnoževanje (zlasti LC50, LC10, EC50, in EC10) skupaj s 95-odstotnimi intervali zaupanja. Graf prilagojenega modela, uporabljenega za izračun, enačba njegove funkcije in njegovi parametri (glej (9)), | — | vse informacije in opažanja, koristni za razlago rezultatov, | — | vrednost dejanskega preskusa, če se izvede preskušanje domnev (9), | — | odstopanja od postopkov, opisanih v tej preskusni metodi, in vsi nenavadni pojavi med preskusom, | — | veljavnost preskusa, | — | če se oceni NOEC, najmanjša zaznavna razlika. | LITERATURA | (1) | Wiles, J. A., in Krogh, P. H. (1998). Testing with the collembolans I. viridis, F. candida and F. fimetaria. V: Handbook of soil invertebrate toxicity tests (ur. H Løkke in CAM Van Gestel), str. 131– 156. John Wiley & Sons, Ltd., Chichester. | (2) | ISO (1999) Soil Quality – Effects of soil pollutants on Collembola (Folsomia candida): Method for determination of effects on reproduction. No. 11267. Mednarodna organizacija za standardizacijo, Ženeva. | (3) | Burges, A., in Raw, F. (ur.) (1967). Soil Biology. Academic Press. London. | (4) | Petersen, H., in Luxton, M. (1982). A comparative analysis of soil fauna populations and their role in decomposition processes. Oikos 39: 287–388. | (5) | Petersen, H. (1994). A review of collembolan ecology in ecosystem context. Acta Zoologica Fennica 195: 111– 118. | (6) | Hopkin, S. P. (1997). Biology of the Springtails (Insecta: Collembola). Oxford University Press. 330 str. (ISBN 0-19-854084-1). | (7) | Ulber, B. (1983). Einfluss von Onychirurus fimatus Gisin (Collembola, Onychiuridae) und Folsomia fimetaria L. (Collembola, Isotomidae) auf Pythium ultimum Trow. einen Erreger des Wurzelbrandes der Zuckerrübe. V: New trends in soil Biology (Lebrun, Ph., André, H. M., De Medts, A., Grégoire-Wibo, Wauthy, G. (ur.), Proceedings of the VI. international colloquium on soil zoology, Louvain-la-neuve (Belgija), od 30. avgusta do 2. septembra 1982, I Dieu-Brichart, Ottignies-Louvain-la-Neuve, str. 261–268. | (8) | Poglavje C.36 te priloge, Preskus razmnoževanja plenilske pršice (Hypoaspis (Geolaelaps) aculeifer) v tleh. | (9) | OECD (2006). Current approaches in the statistical analysis of ecotoxicity data: a guidance to application. OECD series on testing and assessment Number 54, ENV/JM/MONO(2006)18, OECD Pariz. | (10) | Scott-Fordsmand, J. J., in Krogh, P. H. (2005). Background report on prevalidation of an OECD springtail test guideline. Environmental Project Nr. 986. Miljøstyrelsen 61 str. Dansko ministrstvo za okolje. | (11) | Krogh, P. H. (2009). Toxicity testing with the collembolans Folsomia fimetaria and Folsomia candida and the results of a ringtest. Danska agencija za varstvo okolja, okoljski projekt št. 1256, str. 66. | (12) | Krogh, P. H., Johansen, K., in Holmstrup, M. (1998). Automatic counting of collembolans for laboratory experiments. Appl. Soil Ecol. 7, 201–205. | (13) | Fjellberg, A. (1980). Identification keys to Norwegian collembolans. Norsk Entomologisk Forening. | (14) | Edwards, C. A. (1955). Simple techniques for rearing Collembola, Symphyla and other small soil inhabiting arthropods. V: Soil Zoology (Kevan D. K. McE., ur.). Butterworths, London, str. 412–416. | (15) | Goto, H. E. (1960). Simple techniques for the rearing of Collembola and a not on the use of a fungistatic substance in the cultures. Entomologists' Monthly Magazine 96: 138– 140. | Dodatek 1 | Opredelitve | Za to preskusno metodo se uporabljajo naslednje opredelitve (v tem preskusu so vse učinkovite koncentracije izražene kor masa preskusne kemikalije na suho maso preskusnih tal): | Kemikalija je snov ali zmes. | NOEC (koncentracija brez opaznega učinka) je koncentracija preskusne kemikalije, pri kateri se učinki ne opazijo. V tem preskusu koncentracija, ki ustreza NOEC, v primerjavi s kontrolo nima statistično značilnega učinka (p < 0,05) v določenem obdobju izpostavljenosti. | LOEC (najnižja koncentracija z opaznim učinkom) je najnižja koncentracija preskusne kemikalije, ki ima v primerjavi s kontrolo statistično značilen učinek (p < 0,05) v določenem obdobju izpostavljenosti. | ECx (koncentracija z učinkom za x-odstotni učinek) je koncentracija, ki v primerjavi s kontrolo povzroči x-odstotni učinek na preskusni organizem v določenem obdobju izpostavljenosti. EC50 je na primer koncentracija, za katero se oceni, da bo imela v določenem obdobju izpostavljenosti učinek na končno točko preskusa pri 50 % izpostavljene populacije. | Preskusna kemikalija je vsaka snov ali zmes, preskušena z uporabo te preskusne metode. | Dodatek 2 | Glavni ukrepi in časovni razpored za izvedbo preskusa pri skakačih | Koraki preskusa so naslednji: | Čas (dan) | Ukrep | – 23 do – 26 | priprava sinhrone kultureF. Fimetaria; | – 14 | priprava umetnih tal (mešanje suhih sestavin); | preverjanje pH umetnih tal in ustrezna prilagoditev; | meritev največje zmogljivosti tal za zadrževanje vode; | – 9 do – 12 | priprava sinhrone kultureF. Candida; | – 2 do – 7 | predhodna navlažitev tal; | – 1 | razporeditev mladičev v skupine; | priprava založnih raztopin in dodajanje preskusne kemikalije, če je potrebno topilo; | 0 | priprava založne raztopine in dodajanje preskusne kemikalije, če je potrebna uporaba trdne kemikalije, vodotopne kemikalije ali dodajanja na površino; | meritev pH tal in tehtanje posod; | dodajanje hrane. Vnos skakačev; | 14 | preskus za določanje območja delovanja za F. fimetaria: prekinitev preskusa, ekstrakcija živali, meritev pH tal in izgube vode (teža); | končni preskusi: meritev odstotka vlage, nadomestitev vode in dodajanje 2–10 mg kvasa; | 21 | končni preskus za F. fimetaria: prekinitev preskusa, ekstrakcija živali, merjenje pH tal in izgube vode (teža); | preskus za določanje območja delovanja za F. candida: prekinitev preskusa, ekstrakcija živali, meritev pH tal in izgube vode (teža); | 28 | končni preskus za F. candida: prekinitev preskusa, ekstrakcija živali, meritev pH tal in izgube vode (teža). | Dodatek 3 | Smernica za gojenje in sinhronizacijo F. fimetaria in F. candida | Čas in trajanja iz te smernice je treba preveriti pri vsakem posameznem sevu skakačev za zagotovitev, da bo časovni razpored omogočal ustrezno sinhronizirane mladiče. Pojav odlaganja jajčec po prenosu odraslih osebkov v svež substrat in izvalitev iz jajčec določata ustrezen dan za zbiranje jajčec in sinhronih mladičev. | Priporoča se, da stalna založna kultura zajema npr. 50 posod/petrijevk. Prehranjevalne pogoje založne kulture je treba dobro vzdrževati s tedenskim hranjenjem, dodajanjem vode ter odstranjevanjem stare hrane in trupel. Premalo skakačev na substratu lahko privede do zaviranja zaradi večje rasti plesni. Če se založna kultura prepogosto uporablja za proizvajanje jajčec, se lahko kultura utrudi. Znaki utrujenosti so mrtvi odrasli in plesen na substratu. Jajčeca, ki ostanejo pri pridobivanju sinhronih živali, se lahko uporabijo za pomlajevanje kulture. | V sinhroni kulturi F. fimetaria se samci ločijo od samic zlasti po velikosti. Samci so očitno manjši od samic in hodijo hitreje od samic. Za pravilno izbiro spola je potrebne nekaj prakse in se lahko potrdi z mikroskopskim pregledom genitalnega dela (13). | 1. Gojenje | 1.a Priprava gojiščnega substrata | Gojiščni substrat je mavec (kalcijev sulfat) z aktivnim ogljem. To zagotavlja vlažen substrat, pri čemer je funkcija oglja absorpcija odpadnih plinov in iztrebkov (14) (15). Za lažje opazovanje skakačev se lahko uporabijo različne oblike oglja. Za F. candida in F. fimetaria se na primer uporablja oglje v prahu (zagotavlja črn/siv mavec): | Sestavine substrata: | — | 20 ml aktivnega oglja, | — | 200 ml destilirane vode, | — | 200 ml mavca | ali | — | 50 g aktivnega oglja v prahu, | — | 260–300 ml destilirane vode, | — | 400 g mavca. | Zmes substrata se pred uporabo strdi. | 1.b Razmnoževanje | Skakači so v posodah, kot so petrijevke (90 mm × 13 mm), katerih dno je prekrito z 0,5 cm debelo plastjo substrata iz mavca/oglja. Gojijo se pri 20 °C ± 1 °C ter ciklu 12 ur svetlobe in 12 ur teme (400–800 luksov). Posode so vedno vlažne, kar zagotavlja, da je relativna vlažnost zraka v njih 100-odstotna. To se lahko zagotovi s prisotnostjo proste vode v poroznem mavcu, vendar je treba preprečiti nastanek vodnega filma na površini mavca. Izguba vode se lahko prepreči z zagotavljanjem vlažnega zraka prostora. Vse mrtve živali in plesnivo hrano je treba odstraniti iz posod. Za spodbujanje proizvajanja jajčec je treba odrasle živali prenesti v petrijevke z novo pripravljenim substratom iz mavca/oglja. | 1.c Vir hrane | Kot edini vir hrane za F. candida in F fimetaria se uporablja zrnasti suhi pekovski kvas. Sveža hrana se dodaja enkrat ali dvakrat na teden, da se prepreči nastajanje plesni. V majhnem kupu se položi neposredno na mavec. Količino dodanega pekovskega kvasa je treba prilagoditi velikosti populacije skakačev, vendar na splošno ustreza 2–15 mg. | 2. Sinhronizacija | Preskus je treba izvesti s sinhroniziranimi živalmi, da se zagotovijo homogene preskusne živali enakega stadija in velikosti. Sinhronizacija omogoča tudi ločevanje samcev in samic F. fimetaria, ko so stari tri tedne, na podlagi spolnega dimorfizma, tj. razlik v velikosti. Spodnji postopek je predlog za pridobivanje sinhroniziranih živali (praktični koraki niso obvezni). | 2.a Sinhronizacija | — | Pripravijo se posode z 0,5 cm debelo plastjo substrata iz mavca/oglja. | — | Za odlaganje jajčec se 150–200 odraslih osebkov F. fimetaria in 50–100 F. candida iz najboljših 15–20 posod z založno kulturo s 4–8 tednov starim substratom prenese v posode, kjer se jih hrani s 15 mg pekovskega kvasa. Izogniti se je treba prenosu mladičev skupaj z odraslimi, saj lahko prisotnost mladičev zavira proizvajanje jajčec. | — | Kultura se vzdržuje pri 20 °C ± 1 °C (sredina mora biti 20 °C) ter ciklu 12 ur svetlobe in 12 ur teme (400–800 luksov). Zagotovita se razpoložljivost sveže hrane in nasičenost zraka z vodo. Zaradi pomanjkanja hrane se lahko živali iztrebljajo na jajčeca, kar povzroča rast plesni na njih, F. candida pa lahko poje lastna jajčeca. Po 10 dneh se jajčeca skrbno zberejo z iglo in lopatico ter prenesejo na ‚papir za jajčeca‘ (majhni kosi filtrirnega papirja, pomočeni v kašo iz mavca/oglja), ki se položi v posodo s svežim substratom iz mavca/oglja Substratu se doda nekaj zrn kvasa, ki spodbujajo mladiče, da zapustijo papir za jajčeca. Pomembno je, da sta papir za jajčeca in substrat vlažna, sicer lahko jajčeca dehidrirajo. Namesto tega se lahko odrasle živali odstranijo iz gojiščnih posod za sinhronizacijo, ko 2 ali 3 dni proizvajajo jajčeca. | — | Po treh dneh se bo večina jajčec na papirju za jajčeca izlegla, pri čemer se lahko nekateri mladiči nahajajo pod papirjem za jajčeca. | — | Za zagotovitev enako starih mladičev se papir za jajčeca, na katerem so neizvaljena jajčeca, odstrani iz petrijevke s prijemalkami. Mladiči, zdaj stari 0–3 dni, ostanejo v posodi in se hranijo s pekovskim kvasom. Neizvaljena jajčeca se zavržejo. | — | Jajčeca in izvaljeni mladiči se gojijo enako kot odrasli. Zlasti za F. fimetaria je treba sprejeti naslednje ukrepe: zagotovitev ustrezne sveže hrane, odstranjevanje stare in plesnive hrane in razdelitev mladičev v nove petrijevke po enem tednu, če je gostota večja od 200. | 2.b Ravnanje s skakači ob začetku preskusa | — | Devet do dvanajsti dni stari osebki F. candida ali 23–26 dni stari osebki F. fimetaria se zberejo, npr. s sesanjem, in spustijo v majhno posodo z vlažnim substratom iz mavca/oglja, pod binokularnim mikroskopom pa se pregleda njihovo fizično stanje (poškodovane živali se zavržejo). Vse korake je treba izvesti medtem, ko so skakači v vlažni atmosferi, da se prepreči stres zaradi pomanjkanja vode, npr. z uporabo namočenih površin itd. | — | Posoda se obrne navzdol, pri čemer se potrka nanjo, da se skakači prenesejo v tla. Statično elektriko je treba nevtralizirati, sicer lahko živali poletijo v zrak ali se prilepijo na stran preskusne posode in izsušijo. Za nevtralizacijo se lahko uporabi ionizator ali vlažna krpa pod posodo. | — | Hrano je treba razporediti po vsej površini tal in ne le v enem kupu. | — | Med prenosom in preskušanjem se ne sme udarjati po preskusnih posodah ali jih drugače fizično motiti, saj bi to lahko povečalo stiskanje tal in oviralo interakcijo med skakači. | 3. Alternativne vrste skakačev | Za preskušanje po tej preskusni metodi se lahko izberejo druge vrste skakačev, kot so Proisotoma minuta, Isotoma viridis, Isotoma anglicana, Orchesella cincta, Sinella curviseta, Paronychiurus kimi, Orthonychiurus folsomi in Mesaphorura macrochaeta. Pred uporabo alternativnih vrst morajo biti izpolnjeni številni predpogoji: | — | biti morajo nedvoumno identificirane, | — | izbiro vrste je treba utemeljiti, | — | zagotoviti je treba, da je v fazo preskušanja vključena reproduktivna biologija, da bo to med izpostavljenostjo potencialen cilj, | — | znana mora biti zgodovina življenja: starost pri zrelosti, trajanje razvoja jajčec in stadiji, v katerih poteka izpostavljenost, | — | s preskusnim substratom in virom hrane je treba zagotoviti optimalne pogoje za rast in razmnoževanje, | — | variabilnost mora biti ustrezno nizka za natančno in točno oceno strupenosti. | Dodatek 4 | Ekstrakcija in štetje živali | 1. Ekstrakcija se lahko izvede na dva načina. | 1.a | Prvi način: uporabi se lahko ekstraktor z nadzorovanim padanjem temperature, ki temelji na MacFadyenovih načelih (1). Toplota prihaja iz grelnega elementa na vrhu ekstrakcijske posode (uravnava se s termistorjem na površini vzorca tal). Temperatura v ohlajeni tekočini, ki obdaja zbiralno posodo, se uravnava s termistorjem na površini zbiralne posode (pod jedrom tal). Termistorja sta povezana s krmilno enoto, ki se lahko programira in poveča temperaturo glede na predhodno nastavljen urnik. Živali se zberejo v ohlajeni zbiralni posodi (2 °C) s spodnjo plastjo mavca/oglja. Ekstrakcija se začne pri 25 °C, pri čemer se temperatura vsakih 12 ur samodejno poveča za 5 °C, skupaj pa traja 48 ur. Ekstrakcija je končana po 12 urah pri 40 °C. | 1.b | Drugi način: po inkubacijski dobi po poskusu se število mladičev skakačev oceni s flotacijo. Za ta namen se preskus izvede v posodah s prostornino približno 250 ml. Na koncu preskusa se doda približno 200 ml vode. Tla se nežno premešajo s finim čopičem, kar skakačem omogoči lebdenje na vodni gladini. Vodi se lahko doda majhna količina, približno 0,5 ml, črne fotografske barve Kentmere, s čimer se zaradi večjega kontrasta med vodo in belimi skakači olajša štetje. Barva za skakače ni strupena. | 2. Štetje: | Šteje se lahko s prostim očesom ali pod svetlobnim mikroskopom z mrežo nad posodo za flotacijo ali s fotografiranjem površine posamezne posode in poznejšim štetjem skakačev na povečanih slikah ali projiciranih diapozitivih. Štetje se lahko izvede tudi s tehnikami digitalne obdelave slik (12). Vse tehnike morajo biti validirane. | Dodatek 5 | Določitev največje zmogljivosti tal za zadrževanje vode | Ugotovljeno je bilo, da je naslednja metoda za določanje največje zmogljivosti tal za zadrževanje vode (WHC) ustrezna. Opisana je v Prilogi C k ISO DIS 11268-2 (Kakovost tal – Vpliv onesnaževal na deževnike (Eisenia fetida). Del 2: Določitev vpliva na razmnoževanje). | Z ustrezno napravo na vzorčenje (npr. svedrasti vzorčevalnik) se zbere določena količina (npr. 5. g) substrata preskusnih tal. Dno vzorčevalnika se pokrije s kosom mokrega filtrirnega papirja, nato pa se postavi na podstavek v vodni kopeli. Vzorčevalnik je treba postopno potopiti, dokler ni nivo vode nad vrhom tal. Nato ga je treba pustiti v vodi približno tri ure. Ker ni mogoče ohraniti vse vode, ki so jo absorbirale kapilare v tleh, se mora vzorec tal odtekati dve uri, tako da se vzorčevalnik položi na podlago iz zelo mokrega fino drobljenega kremenovega peska v pokriti posodi (da se prepreči izsušitev). Nato je treba vzorec stehtati in sušiti do konstantne mase pri 105 °C. Zmogljivost zadrževanja vode (WHC) je treba izračunati, kot sledi: | pri čemer je: | S | = | substrat, prepojen z vodo + masa cevi + masa filtrirnega papirja, | T | = | tara (masa cevi + masa filtrirnega papirja), | D | = | suha masa substrata. | Dodatek 6 | Določanje pH tal | Naslednja metoda za določanje pH tal temelji na opisu iz ISO DIS 10390: Kakovost tal – Določanje pH. | Določena količina tal se suši pri sobni temperaturi vsaj 12 ur. Suspenzija tal (ki vsebuje vsaj 5 g tal) se nato naredi v petkratni prostornini tal z 1 M raztopine analitsko čistega kalijevega klorida (KCl) ali 0,01 M raztopine analitsko čistega kalcijevega klorida (CaCl2). Suspenzija se temeljito pretresa pet minut in nato počiva vsaj dve uri, vendar ne dlje kot 24 ur. Nato se pH tekoče faze izmeri z merilnikom vrednosti pH, ki je pred vsakim merjenjem kalibriran z ustrezno serijo puferskih raztopin (npr. pH 4,0 in 7,0). | C.40 PRESKUS STRUPENOSTI ŽIVLJENJSKEGA CIKLA S TRZAČAMI V SISTEMU VODE IN USEDLINE Z UPORABO VODE S PRIMEŠANO PRESKUSNO SNOVJO ALI USEDLINE S PRIMEŠANO PRESKUSNO SNOVJO | UVOD | 1. | Ta preskusna metoda ustreza Smernici za preskušanje OECD (TG) 233 (2010). Zasnovana je za ocenjevanje učinkov vseživljenjske izpostavljenosti sladkovodnega dvokrilca Chironomus sp. kemikalijam ter v celoti zajema prvo generacijo (generacija P) in zgodnji del druge generacije (generacija F1). Je razširitev obstoječih preskusnih metod C.28 (1) in C.27 (15) z uporabo scenarija izpostavljenosti vodi s primešano preskusno snovjo oziroma usedlini s primešano preskusno snovjo. Upošteva obstoječe protokole za preskušanje strupenosti za Chironomus riparius in Chironomus dilutus (ki sta se prej imenovala C. tentans (2)), ki so bili pripravljeni v Evropi in Severni Ameriki (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) ter nato krožno preskušeni (1) (7) (10) (11) (12). Uporabijo se lahko tudi druge dobro dokumentirane vrste trzače, npr. Chironomus yoshimatsui (13) (14). Celotna izpostavljenost traja približno 44 dni za C. riparius in C. yoshimatsui ter približno 100 dni za C. dilutus. | 2. | V tej preskusni metodi je opisan tako scenarij izpostavljenosti vodi kot scenarij izpostavljenosti usedlini. Izbira ustreznega scenarija izpostavljenosti je odvisna od namena uporabe preskusa. Scenarij izpostavljenosti, ki vključuje primešanje preskusne snovi v vodni stolpec, je namenjen simulaciji pojava zanašanja pesticidov in zajema začetno najvišjo koncentracijo v površinskih vodah. Primešanje preskusne snovi v vodo je uporabno tudi za druge vrste izpostavljenosti (vključno z razlitji kemikalij), vendar ne za procese kopičenja v usedlini, ki trajajo dlje od preskusnega obdobja. V tem primeru in če je odtekanje glavni način vnosa pesticidov v vodna telesa, je lahko primernejši načrt z usedlino s primešano preskusno snovjo. Če so drugi scenariji izpostavljenosti aktualni, se lahko načrt preskusa enostavno prilagodi. Če razporeditev preskusne kemikalije med vodno fazo in usedlino na primer ni aktualna in je treba čim bolj zmanjšati adsorpcijo v usedlino, se lahko predvidi uporaba nadomestne umetne usedline (npr. kremenovega peska). | 3. | Kemikalije, za katere je treba preskusiti organizme, živeče v usedlini, se lahko v usedlini ohranijo zelo dolgo. Organizmi, živeči v usedlinah, so lahko izpostavljeni na številne načine. Relativni pomen vsakega načina izpostavljenosti in čas, da ta prispeva k skupnim strupenim učinkom, sta odvisna od fizikalno-kemijskih lastnosti kemikalije. Pri kemikalijah, ki se močno adsorbirajo, ali kemikalijah, ki se kovalentno vežejo na usedlino, je lahko zaužitje onesnažene hrane pomemben način izpostavljenosti. Da ne bi podcenili strupenosti visoko lipofilnih kemikalij, se lahko predvidi uporaba hrane, dodane usedlini pred uporabo preskusne kemikalije (glej odstavek 31). Zato se lahko vključijo vsi načini izpostavljenosti in vsi življenjske faze. | 4. | Izmerjene končne točke so skupno število odraslih preobraženih osebkov (za prvo in drugo generacijo), hitrost razvoja (za prvo in drugo generacijo), razmerje med spoloma pri živih odraslih, v celoti preobraženih osebkih (za prvo in drugo generacijo), število nizov jajčec na samice (samo prva generacija) in fertilnost nizov jajčec (samo prva generacija). | 5. | Zelo se zelo priporoča formulirana usedlina. Ta ima pred naravnimi usedlinami več prednosti: | — | variabilnost pri poskusih je manjša, saj formulirana usedlina pomeni obnovljivi ‚standardizirani matriks‘, poleg tega ni več treba iskati virov neonesnaženih in čistih usedlin, | — | preskusi se lahko začnejo kadar koli, ne da bi se bilo treba ukvarjati s sezonsko variabilnostjo v preskusni usedlini, poleg tega usedline ni treba predhodno tretirati, da bi se odstranila domorodna favna, | — | nižji stroški v primerjavi z odvzemom zadostne količine usedline na terenu, potrebne za rutinsko preskušanje, | — | formulirana usedlina omogoča primerjave strupenosti in ustrezno razvrstitev kemikalije (3). | 6. | Uporabljene opredelitve pojmov so navedene v Dodatku 1. | NAČELO PRESKUSA | 7. | Ličinke trzače prvega stadija so izpostavljene razponu koncentracije preskusne kemikalije v sistemu vode in usedline. Preskus se začne z vnosom ličink prvega stadija (prva generacija) v preskusne čaše, ki vsebujejo usedlino s primešano preskusno snovjo, ali pa se preskusna kemikalija primeša v vodo po vnosu ličink. Ocenijo se preobrazba trzače, čas do preobrazbe in razmerje med spoloma pri živih odraslih, v celoti preobraženih trzačah. Preobraženi odrasli se prenesejo v kletke za razmnoževanje, da se olajšajo rojenje, parjenje in odlaganje jajčec. Ocenita se število odloženih nizov jajčec in njihova fertilnost. Iz teh nizov jajčec se pridobijo ličinke prvega stadija druge generacije. Te ličinke se prenesejo v sveže pripravljene preskusne čase (postopek primešanja preskusne snovi kot pri prvi generaciji), da se določi sposobnost preživetja druge generacije z oceno njihove preobrazbe, časa do preobrazbe in razmerja med spoloma pri v celoti preobraženih, živih trzačah (shematska predstavitev preskusa življenjskega cikla je navedena v Dodatku 5). Vsi podatki se analizirajo z regresivnim modelom, da se oceni koncentracija, ki bi povzročila x-odstotno zmanjšanje v zvezi z zadevno končno točko, ali s preskušanjem domnev, da se določi koncentracija brez opaznega učinka (NOEC). Pri slednjem je potrebna primerjava odzivov na tretiranje z ustreznimi odzivi na kontrolo s statističnimi preskusi. Opozoriti je treba, da so lahko pri scenariju z vodo s primešano preskusno snovjo v primeru kemikalij, ki se hitro razgradijo, ličinke v poznejši življenjski fazi posamezne generacije (npr. faza bube) izpostavljene znatno manjši ravni koncentracije v vodi nad usedlino kot ličinke prvega stadija. Če je to zadržek in je potrebna primerljiva stopnja izpostavljenosti za posamezno življenjsko fazo, se lahko predvidita naslednji spremembi preskusne metode: | — | vzporedni preskusi s primešanjem preskusne snovi v različnih življenjskih fazah ali | — | ponavljajoče se primešanje preskusne snovi (ali obnovitev vode nad usedlino) v preskusnem sistemu med obema preskusnima fazama (prva in druga generacija), pri čemer je treba razmike med primešanjem (obnovo) prilagoditi končnim značilnostim preskusne kemikalije. | Takšne spremembe so izvedljive le pri scenariju z vodo s primešano preskusno snovjo, vendar ne pri scenariju z usedlino s primešano preskusno snovjo. | INFORMACIJE O PRESKUSNI KEMIKALIJI | 8. | Znani morajo biti topnost preskusne kemikalije v vodi, njen parni tlak in log K ow, izmerjeni ali izračunani porazdelitveni koeficient v usedlini ter stabilnost v vodi in usedlini. Za kvantifikacijo preskusne kemikalije v vodi nad usedlino, porni vodi in usedlini mora biti na voljo zanesljiva analitska metoda z znano in izpričano natančnostjo ter mejo zaznavnosti. Koristni informaciji sta tudi strukturna formula in čistost preskusne kemikalije. Prav tako je koristno poznati obnašanje preskusne snovi v okolju (npr. disipacija, abiotska in biotska razgradnja itd.). Dodatne smernice za preskušanje kemikalij s fizikalno-kemijskimi lastnostmi, zaradi katerih je preskušanje oteženo, so navedene v (16). | REFERENČNE KEMIKALIJE | 9. | Referenčne kemikalije se lahko redno preskušajo kot sredstvo za zagotavljanje, da se občutljivost laboratorijske populacije ni spremenila. Tako kot pri vodnih bolhah je dovolj izvedba 48-urnega akutnega preskusa (v skladu s 17). Dokler ni na voljo validirana smernica za akutno preskušanje, se lahko predvidi kronični preskus v skladu s poglavjem C.28 te priloge. Primeri referenčnih strupenih snovi, ki so bile uspešno uporabljene v krožnih preskusih in validacijskih študijah, so: lindan, trifluralin, pentaklorofenol, kadmijev klorid in kalijev klorid (1) (3) (6) (7) (18). | VELJAVNOST PRESKUSA | 10. | Za veljavnost preskusa morajo biti izpolnjeni naslednji pogoji: | — | srednja preobrazba v kontrolnem tretiranju mora biti na koncu obdobja izpostavljenosti pri obeh generacijah vsaj 70-odstotna (1) (7), | — | pri C. riparius in C. yoshimatsui se mora 85 % vseh trzač, preobraženih v odrasle osebke, iz kontrolnega tretiranja v obeh generacijah pojaviti med 12. in 23. dnem po vnosu ličink prvega stadija v posode; pri C. dilutus je sprejemljivo obdobje od 20 do 65 dni, | — | srednje razmerje med spoloma pri živih odraslih, v celoti preobraženih osebkih (kot ženski ali moški del) v kontrolnem tretiranju obeh generacij mora biti vsaj 0,4, vendar ne več kot 0,6, | — | v vsaki kletki za razmnoževanje mora biti število nizov jajčec v kontrolah za prvo generacijo vsaj 0,6 na samico, dodano v kletko za razmnoževanje, | — | delež fertilnih nizov jajčec v posamezni kletki za razmnoževanje kontrol prve generacije mora biti vsaj 0,6, | — | na koncu obdobja izpostavljenosti je treba za obe generaciji v vsaki posodi izmeriti pH in koncentracijo raztopljenega kisika. Koncentracija kisika mora biti vsaj 60 % nasičenosti z zrakom (ASV (19)), pH vode nad usedlino pa mora biti v vseh posodah med 6 in 9, | — | temperatura vode se ne sme razlikovati za več kot ± 1,0 °C. | OPIS METODE | Preskusne posode in kletke za razmnoževanje | 11. | Ličinke se izpostavijo v 600-mililitrskih steklenih čašah s premerom približno 8,5 cm (glej Dodatek 5). Primerne so tudi druge posode, vendar morajo zagotavljati primerno debelino usedline in vode nad njo. Površina usedline mora biti dovolj velika, da zagotavlja 2 do 3 cm2 na ličinko. Razmerje med debelino usedline in globino vode nad njo mora biti približno 1: 4. Uporabiti je treba kletke za razmnoževanje (vsaka od treh mer mora biti najmanj 30 cm), ki imajo na vrhu in vsaj eni stranici gazo (velikost mreže je približno 1 mm) (glej Dodatek 5). V vsako kletko se za odlaganje jajčec postavi 2-litrska kristalizirka s preskusno vodo in usedlino. Tudi pri kristalizirki mora biti razmerje med debelino usedline in globino vode nad njo približno 1: 4. Ko se nizi jajčec poberejo iz kristalizirke, se prestavijo v 12-mestno mikrotitersko ploščo (en niz na vdolbinico, ki vsebuje vsaj 2,5 ml vode iz kristalizirke s primešano preskusno snovjo) in nato se plošče prekrijejo s pokrovom, da se prepreči znatno izhlapevanje. Uporabijo se lahko tudi druge posode, primerne za vzdrževanje nizov jajčec. Vse preskusne posode in druge naprave, ki bodo prišle v stik s preskusnim sistemom, razen mikrotiterskih plošč, morajo biti v celoti iz stekla ali drugega kemijsko inertnega materiala (npr. politetrafluoroetilena). | Izbira vrst | 12. | Če je mogoče, naj se v preskusu uporabi vrsta Chironomus riparius. Uporabi se lahko tudi C. yoshimatsui. C. dilutus je prav tako primerna, vendar je z njo težje delati in zahteva daljše preskusno obdobje. Podrobnosti metod gojenja C. riparius so navedene v Dodatku 2. Informacije o pogojih gojenja do na voljo tudi za C. dilutus (5) in C. yoshimatsui (14). Identifikacijo vrst je treba potrditi pred preskušanjem, ni pa to potrebno pred vsakim preskusom, če organizmi prihajajo iz internega gojišča. | Usedlina | 13. | Če je mogoče, je treba uporabiti formulirano usedlino (imenovano tudi rekonstituirana, umetna ali sintetična usedlina). Če se uporabi naravna usedlina, je treba določiti njene značilnosti (vsaj pH in vsebnost organskega ogljika, priporoča se tudi določitev drugih parametrov, kot sta razmerje C/N in granulometrija), poleg tega ne sme biti onesnažena in ne sme vsebovati drugih organizmov, ki bi lahko tekmovali z ličinkami trzač ali jih požrli. Priporoča se tudi, da se usedline pred preskušanjem sedem dni kondicionirajo v preskusnih pogojih. Priporoča se naslednja formulirana usedlina, kot je opisana v (1), (1) (20) (21): | a. | 4–5 % (suha teža) šote: čim bližje pH od 5,5 do 6,0; pomembno je uporabiti fino mleto šoto v prahu (velikost delcev ≤ 1 mm), sušeno le na zraku; | b. | 20 % (suhe teže) kaolinske gline (vsebnost kaolinita po možnosti nad 30 %); | c. | 75–76 % (suhe teže) kremenovega peska (prevladovati mora fini pesek, pri katerem je več kot 50 % delcev velikih od 50 do 200 μm); | d. | doda se deionizirana voda, tako da je v končni mešanici vlaga 30–50-odstotna; | e. | doda se kemijsko čist kalcijev karbonat (CaCO3), da se pH v končni mešanici usedline uravna na 7,0 ± 0,5; | f. | vsebnost organskega ogljika v končni mešanici mora biti 2 % (±0,5 %), uravnava pa se z ustreznimi količinami šote in peska v skladu s točkama (a) in (c). | 14. | Vir šote, kaolinske gline in peska mora biti znan. Preveriti je treba, da sestavine usedline niso kemično onesnažene (npr. da ne vsebujejo težkih kovin, organoklornih spojin, in organofosfornih spojin). Primer priprave formulirane usedline je opisan v Dodatku 3. Sprejemljiva je tudi mešanica suhih sestavin, če se dokaže, da se sestavine usedline po dodatku vode nad usedlino ne začnejo ločevati (npr. lebdenje šotnih delcev) in da je šota ali usedlina zadostno kondicionirana. | Voda | 15. | Za preskusno vodo je primerna vsaka voda, ki ustreza kemijskim značilnostim sprejemljive vode za redčenje, ki so navedene v dodatkih 2 in 4. Za gojiščno vodo in preskusno vodo je sprejemljiva vsaka primerna voda, naravna voda (površinska ali podzemna voda), modelna razredčevalna voda (glej Dodatek 2) ali deklorirana vodovodna voda, če trzače čas gojenja in preskušanja v njej preživijo brez znakov stresa. Na začetku preskusa mora biti pH preskusne vode med 6 in 9, skupna trdota pa ne sme biti večja od 400 mg/l kot CaCO3. Če se domneva, da bo prišlo do interakcije med ioni, ki povzročajo trdoto vode, in preskusno kemikalijo, je treba uporabiti vodo z manjšo trdoto (v takem primeru se torej ne sme uporabiti medij Elendt M4). Ves čas študije je treba uporabljati isto vrsto vode. Značilnosti vode, navedene v Dodatku 4, je treba izmeriti vsaj dvakrat na leto ali kadar se sumi, da so se morda te značilnosti bistveno spremenile. | Založne raztopine – voda s primešano preskusno snovjo | 16.a. | Preskusne koncentracije se izračunajo na podlagi koncentracij v vodnem stolpcu, tj. vodi nad usedlino. Preskusne raztopine izbranih koncentracij se običajno pripravijo z redčenjem založne raztopine. Založne raztopine je po možnosti treba pripraviti tako, da se preskusna snov raztopi v preskusni vodi. V nekaterih primerih bo morda treba uporabiti topila ali disperzijska sredstva, da se pripravi primerno koncentrirana založna raztopina. Primerna topila so na primer aceton, etilen glikol monoetil eter, etilen glikol dimetil eter, dimetil formamid in trietilen glikol. Disperzijska sredstva, ki se lahko uporabijo, so Cremaphor RH40, Tween 80, metil celuloza 0,01 % in HCO-40. Koncentracija sredstva za raztapljanje v končnem preskusnem mediju mora biti minimalna (tj. ≤ 0,1 ml/l) in enaka v vseh posodah s preskusno kemikalijo. Če se uporabi sredstvo za raztapljanje, to ne sme bistveno vplivati na preživetje, kar se kaže s kontrolo s topilom, ki se primerja z negativno kontrolo (z vodo). Vendar si je treba čim bolj prizadevati, da se taki materiali ne uporabijo. | Založne raztopine – usedlina s primešano preskusno snovjo | 16. b. | Usedline s primešano preskusno snovjo izbrane koncentracije se običajno pripravijo z dodajanjem raztopine preskusne kemikalije neposredno v usedlino. Založna raztopina preskusne kemikalije, raztopljene v deionizirani vodi, se zmeša s formulirano usedlino z valjčnim mlinom, mešalnikom za krmo ali ročno. Če je preskusna kemikalija slabo topna v vodi, se lahko raztopi v čim manjši prostornini ustreznega organskega topila (npr. heksana, acetona ali kloroforma). Ta raztopina se nato zmeša z 10 g finega kremenovega peska za vsako preskusno posodo. Topilo lahko izhlapi in ga je treba v celoti odstraniti iz peska. Pesek se nato zmeša z ustrezno količino usedline. Za raztapljanje, razpršitev ali emulgiranje preskusne kemikalije se lahko uporabijo samo tista sredstva, ki hitro izhlapijo. Ne smemo pozabiti, da je treba pri pripravi usedline upoštevati količino peska, vnesenega z mešanico preskusne kemikalije in peska (tj. usedlino je torej treba pripraviti z manj peska). Paziti je treba, da je preskusna kemikalija, dodana usedlini, v njej temeljito in enakomerno razporejena. Po potrebi se lahko podvzorci analizirajo, da se ugotovi stopnja homogenosti. | NAČRT PRESKUSA | 17. | Načrt preskusa se nanaša na izbiro števila preskusnih koncentracij in razmikov med njimi, število posod za vsako koncentracijo, število ličink na posodo ter število kristalizirk in kletk za razmnoževanje. Načrti za ECx, NOEC in mejni preskus so opisani v nadaljevanju. | Načrt za regresijsko analizo | 18. | S preskusom je treba zajeti učinkovito koncentracijo (ECx,) in razpon koncentracije, v katerem je učinek preskusne kemikalije aktualen, da se končna točka ne ekstrapolira zunaj meja dobljenih podatkov. Izogibati se je treba ekstrapolaciji veliko pod najnižjo ali nad najvišjo koncentracijo. Predhoden preskus za določanje območja delovanja v skladu s preskusnima metodama C.27 in C.28 je lahko uporaben za izbiro primernega razpona preskusnih koncentracij. | 19. | Pri pristopu ECx je za vsako koncentracijo potrebnih vsaj pet koncentracij in osem ponovitev. Za vsako koncentracijo je treba uporabiti dve kletki za razmnoževanje (A in B). Osem ponovitev se razdeli v dve skupini po štiri ponovitve za posamezno kletko za razmnoževanje. Ta združitev ponovitev je potrebna zaradi števila trzač, ki mora biti v kletki za zanesljivo oceno razmnoževanja. Vendar ima druga generacija ponovno osem ponovitev, ki se začnejo z izpostavljenimi populacijami v kletkah za razmnoževanje. Faktor med koncentracijami ne sme biti večji od 2 (izjema je dopustna, kadar naklon krivulje odmerek-učinek ni strm). Število ponovitev na posamezno posodo s preskusno kemikalijo se lahko zmanjša na šest (tri za vsako posodo za gojenje), če se poveča število preskusnih koncentracij z različnimi učinki. Povečanje števila ponovitev ali zmanjšanje velikosti razmikov med preskusnimi koncentracijami običajno vodi do ožjih intervalov zaupanja okrog ECX. | Načrt za oceno NOEC | 20. | Pri pristopu NOEC je treba uporabiti pet preskusnih koncentracij z vsaj osmimi ponovitvami (štiri za vsako kletko za razmnoževanje, A in B), faktor med koncentracijami pa ne sme biti večji od 2. Število ponovitev mora zadostovati, da se zagotovi ustrezna statistična moč za ugotovitev 20-odstotne razlike v primerjavi s kontrolo pri 5-odstotni stopnji značilnosti (α = 0,05). Za hitrost razvoja, plodnost in fertilnost je običajno ustrezna analiza variance (ANOVA), ki ji sledi Dunnettov ali Williamsov preskus (22–25). Za koeficient preobrazbe in razmerje med spoloma je lahko ustrezen Cochran-Armitageev preskus, Fisherjev eksaktni preskus (z Bonferronijevim popravkom) ali Mantel-Haenszelov preskus. | Mejni preskus | 21. | Mejni preskus se lahko izvede (ena preskusna koncentracija in kontrola(-e)), če v neobveznem predhodnem preskusu za določanje območja delovanja do največje koncentracije ni bilo opaženih učinkov. Namen mejnega preskusa je pokazati, da se vsi strupeni učinki preskusne kemikalije opazijo pri količinah, ki so večje od preskušene mejne koncentracije. Za vodo se predlaga 100 mg/l, za usedlino pa 1 000 mg/kg (suha teža). Običajno je potrebnih vsaj osem ponovitev za tretirane in kontrolne posode. Izkazati je treba ustrezno statistično moč za ugotovitev 20-odstotne razlike v primerjavi s kontrolo pri 5-odstotni stopnji značilnosti (α = 0,05). Pri odzivih metrik (npr. hitrost razvoja) je t-preskus primerna statistična metoda, če podatki izpolnjujejo zahteve tega preskusa (normalnost, homogenost varianc). Če te zahteve niso izpolnjene, se lahko uporabi t-preskus za neenake variance ali neparametrični preskus, kot je Wilcoxon-Mann-Whitneyjev preskus. Pri koeficientu preobrazbe je primeren Fisherjev eksaktni preskus. | POSTOPEK | Pogoji izpostavljenosti | Priprava sistema vode in usedline (primešanje preskusne snovi v vodo) | 22.a. | Formulirana usedlina (glej odstavka 13– 14 in Dodatek 3) se doda v vse preskusne posode in v kristalizirko, da nastane plast usedline, debela vsaj 1,5 cm (v kristalizirki je lahko nekoliko tanjša), vendar ne debelejša od 3 cm. Doda se voda (glej odstavek 15), da razmerje med debelino usedline in globino vode ne presega 1: 4. Po pripravi preskusnih posod je treba sistem vode in usedline približno sedem dni prezračevati, preden se dodajo ličinke prvega stadija prve ali druge generacije (glej odstavek 14 in Dodatek 3). Sistem vode in usedline v kristalizirkah se med preskusom ne prezračuje, ker jim ni treba podpirati preživetja (nizi jajčec so zbrani že pred izvalitvijo). Da se preprečita ločevanje sestavin usedline in ponovna suspenzija finega materiala med dodajanjem preskusne vode v vodni stolpec, se lahko usedlina med točenjem vode prekrije s plastičnim pokrovom. Pokrov se nato takoj odstrani. Primerna so lahko tudi druga sredstva. | Priprava sistema vode in usedline (usedlina s primešano preskusno snovjo) | 22. b. | Usedline s primešano preskusno snovjo, pripravljene v skladu z odstavkom 16b, se vnesejo v posode, nad usedlino pa se doda voda, da je razmerje med prostornino usedline in vode 1: 4. Plast usedline mora biti debela od 1,5 do 3 cm (v kristalizirki je lahko nekoliko tanjša). Da se prepreči ločevanje sestavin usedline in ponovna suspenzija finega materiala med dodajanjem preskusne vode v vodni stolpec, se lahko usedlina med točenjem vode prekrije s plastičnim pokrovom, ki se takoj nato odstrani. Primerna so lahko tudi druga sredstva. Ko je usedlina s primešano preskusno snovjo in vodo nad njo pripravljena, je zaželeno, da se omogoči razdelitev preskusne kemikalije iz usedline v vodno fazo (4) (5) (7) (18). To je po možnosti treba storiti v temperaturnih in prezračevalnih pogojih, ki bodo uporabljeni v preskusu. Ustrezen čas za uravnoteženje je odvisen od usedline in kemikalije, lahko pa traja od več ur do več dni in v redkih primerih do pet tednov. Ker bi bil tako na voljo čas za razgradnjo številnih kemikalij, se na uravnoteženje ne sme čakati, ampak se za to priporoča 48-urno obdobje. Vendar se lahko čas za uravnoteženje podaljša, če je znano, da je razpolovna doba razgradnje kemikalije v usedlini dolga (glej odstavek 8). Po koncu tega dodatnega obdobja za uravnoteženje je treba izmeriti koncentracijo preskusne kemikalije v vodi nad usedlino, porni vodi in usedlini vsaj pri najvišji in nižji koncentraciji (glej odstavek 38). Te analitske določitve preskusne kemikalije omogočajo izračun masne bilance in izražanje rezultatov na podlagi izmerjenih koncentracij. | 23. | Preskusne posode je treba pokriti (npr. s steklenimi ploščami). Po potrebi se lahko med študijo voda dotoči do prvotne prostornine, da se nadomesti izhlapevanje. Za to je treba uporabiti destilirano ali deionizirano vodo, da se prepreči kopičenje soli. Kristalizirke v kletkah za razmnoževanje niso pokrite in se lahko, vendar ni nujno, prilagodijo, da se nadomesti izguba vode v preskusnem obdobju, saj so nizi jajčec v stiku z vodo samo približno en dan, kristalizirke pa se uporabljajo le v kratki fazi preskusa. | Dodajanje preskusnih organizmov | 24. | Štiri do pet dni pred dodajanjem ličink prvega stadija za prvo generacijo je treba jajčna legla vzeti iz kulture in jih vstaviti v majhne posode v gojišču. Uporabi se lahko starejši medij iz založne kulture ali sveže pripravljeni medij. V vsakem primeru je treba v gojišče dodati majhno količino hrane, npr. nekaj kapljic filtrata iz fino mlete suspenzije ribje hrane v kosmičih (glej Dodatek 2). Uporabiti je treba samo sveže odložena jajčna legla. Ličinke se običajno izvalijo nekaj dni po tem, ko so bila jajčeca odločena (2 do 3 dni za C. riparius pri 20 °C ter 1 do 4 dni za C. dilutus pri 23 °C in C. yoshimatsui pri 25 °C), rast ličink pa poteka v štirih stadijih, od katerih vsak traja 4–8 dni. V preskusu je treba uporabiti ličinke prvega stadija (največ 48 ur po tem, ko se izvalijo). Stadij ličink bi se morda lahko preveril z merjenjem širine glave (7). | 25. | Dvajset ličink prvega stadija za prvo generacijo se s topo pipeto naključno vnese v vsako preskusno posodo, ki vsebuje sistem z vodo in usedlino. Med dodajanjem ličink v preskusne posode se ustavi prezračevanje vode, ki se ne sme izvajati še 24 ur potem, ko so bile ličinke dodane (glej odstavek 32). Glede na uporabljeni načrt preskusa (glej odstavka 19 in 20) je število uporabljenih ličink na koncentracijo vsaj 120 (6 ponovitev na koncentracijo) za pristop ECX in 160 za pristop NOEC (8 ponovitev na koncentracijo). Pri načrtu z usedlino s primešano preskusno snovjo se izpostavljenost začne z vnosom ličink. | Primešanje preskusne snovi v vodo nad usedlino | 26. | Štiriindvajset ur po vnosu ličink prvega stadija za prvo generacijo se preskusna kemikalija primeša v vodni stolpec nad usedlino, pri čemer se ponovno zagotovi rahlo prezračevanje (za mogoče spremembe načrta preskusa glej odstavek 7). Pod vodno gladino se s pipeto vnesejo majhne prostornine založnih raztopin preskusne kemikalije. Vodo nad usedlino je nato treba premešati, pri čemer je treba paziti, da se ne premeša še usedlina. Pri načrtu z vodo s primešano preskusno snovjo se izpostavljenost začne s primešanjem preskusne snovi v vodo (tj. en dan po vnosu ličink). | Zbiranje preobraženih odraslih osebkov | 27. | Preobražene trzače prve generacije se iz preskusnih posod zberejo vsaj enkrat, bolje pa dvakrat na dan (glej točko 36) z aspiratorjem, sesalnikom ali podobno napravo (glej Dodatek 5). Paziti je treba, da se odrasli osebki na poškodujejo. Zbrane trzače iz štirih preskusnih posod v okviru enega tretiranja se vnesejo v kletke za razmnoževanje, ki so jim bile predhodno dodeljene. Na dan prve preobrazbe (samca) se v kristalizirke pod vodno gladino s pipeto primeša majhna prostornina založne raztopine preskusne kemikalije (načrt z vodo s primešano preskusno snovjo). Vodo nad usedlino je nato treba premešati, pri čemer je treba paziti, da se ne premeša še usedlina. Koncentracija preskusne kemikalije v kristalizirki je običajno enaka kot v posodah za tretiranje, ki so dodeljene določeni kletki za razmnoževanje. Pri načrtu z usedlino s primešano preskusno snovjo se kristalizirke pripravijo približno 11. dan po začetku izpostavljenosti (tj. vnosu ličink prve generacije), da se lahko ravnotežje vzpostavi približno 48 ur pred prvim odlaganjem nizov jajčec. | 28. | Nizi jajčec se zberejo iz kristalizirke v kletki za razmnoževanje s pinceto ali topo pipeto. Vsak niz jajčec se vnese v posodo z gojiščem iz kristalizirke, iz katere je bil odvzet (npr. iz vdolbinice 12-mestne mikroplošče skupaj z vsaj 2,5 ml medija). Posode z nizi jajčec so pokrite s pokrovom, da se prepreči znatno izhlapevanje. Nizi jajčec se opazujejo vsaj šest dni po tem, ko so nastali, da se lahko razvrstijo kot fertilni ali nefertilni. | Za začetek druge generacije se iz vsake kletke za razmnoževanje izberejo trije ali bolje šest fertilnih nizov jajčec skupaj z nekaj hrane, ki omogoča izvalitev. Ti nizi jajčec bi morali nastati na vrhuncu obdobja odlaganja jajčec, ki se v kontrolah običajno pojavi okrog 19. dne preskusa. V idealnih pogojih se druga generacija vseh tretiranj začne na isti dan, vendar zaradi učinkov na razvoj ličink, povezanih s kemikalijami, to ni vedno mogoče. V takem primeru se lahko v višjih koncentracijah začne pozneje kot v tretiranjih z nižjimi koncentracijami in v kontroli (s topilom). | 29. a. | Pri načrtu z vodo s primešano preskusno snovjo se sistem z vodo in usedlino za drugo generacijo pripravi s primešanjem preskusne kemikalije v vodni stolpec nad usedlino približno 1 uro pred vnosom ličink prvega stadija v preskusne posode. Pod vodno gladino se s pipeto vnesejo majhne prostornine raztopin preskusne kemikalije. Vodo nad usedlino je nato treba premešati, pri čemer je treba paziti, da se ne premeša tudi usedlina. Po primešanju preskusne snovi se zagotovi rahlo prezračevanje. | 29. b. | Pri načrtu z usedlino s primešano preskusno snovjo se posode za izpostavljanje, ki vsebujejo sistem vode in usedline, za drugo generacijo pripravijo enako kot za prvo generacijo. | 30. | Dvajset ličink prvega stadija (največ 48 ur po tem, ko se izvalijo) druge generacije se s topo pipeto naključno vnese v vsako preskusno posodo, ki vsebuje sistem z vodo in usedlino s primešano preskusno snovjo. Med dodajanjem ličink prvega stadija v preskuse posode se ustavi prezračevanje vode, ki se ne sme izvajati še 24 ur potem, ko so bile ličinke dodane. Glede na uporabljeni načrt preskusa (glej odstavka 19 in 20) je število uporabljenih ličink na koncentracijo vsaj 120 (6 ponovitev na koncentracijo) za pristop ECX in 160 za pristop NOEC (8 ponovitev na koncentracijo). | Hrana | 31. | Ličinke v preskusnih posodah je treba hraniti po možnosti vsak dan ali vsaj trikrat na teden. Ustrezna količina hrane za mlade ličinke v prvih 10 dneh njihovega razvoja je 0,25–0,5 mg (0,35–0,5 mg za C. yoshimatsui) ribje hrane (suspenzija v vodi ali fino mleta hrana, npr. Tetra-Min ali Tetra-Phyll; glej podrobnosti v Dodatku 2) na ličinko na dan. Starejše ličinke lahko potrebujejo nekoliko več hrane: 0,5– 1,0 mg na ličinko na dan mora biti dovolj za preostanek preskusa. Obrok hrane je treba zmanjšati v vseh tretiranih vzorcih in kontrolah, če se opazi rast plesni ali smrtnost v kontrolah. Če razvoja plesni ni mogoče ustaviti, je treba preskus ponoviti. | Toksikološki pomen izpostavljenosti z zaužitjem je običajno večji pri kemikalijah z visoko afiniteto do organskega ogljika ali kemikalij, ki se kovalentno vežejo na usedlino. Zato se lahko pri preskušanju kemikalij s takimi lastnostmi količina hrane, potrebna za zagotovitev preživetja in naravno rast ličink, doda formulirani usedlini pred obdobjem stabilizacije, kar je odvisno od regulativnih zahtev. Da se prepreči poslabšanje kakovosti vode, je treba namesto ribje hrane uporabiti rastlinski material, npr. dodajanje 0,5 % (suhe teže) fino mletega listja velike koprive (Urtica dioica), bele murve (Morus alba), plazeče detelje (Trifolium repens), špinače (Spinacia oleracea) ali drugega rastlinskega materiala (Cerophyl ali α-celuloza). Dodajanje celotnega obroka vira organske hrane v usedlino pred primešanjem preskusne snovi ni niti nepomembno glede na kakovost vode in biološko učinkovitost (21) niti standardizirana metoda, vendar so nedavne študije dokazale, da ta metoda deluje (19) (26). Odraslih trzač v kletki za razmnoževanje običajno ni treba hraniti, vendar se plodnost in fertilnost povečata, če se jim kot vir hrane za odrasle preobražene osebke zagotovi vatna blazinica, namočena v nasičeno raztopino saharoze (34). | Pogoji inkubacije | 32. | Rahlo prezračevanje vode nad usedlino v preskusnih posodah se zagotavlja 24 ur po vnosu ličink prvega stadija obeh generacij in se izvaja ves čas preskusa (paziti je treba, da koncentracija raztopljenega kisika ne pade pod 60 % ASV). Prezračevanje se zagotavlja prek steklene pasteurjeve pipete, katere izhod je pritrjen 2 do 3 cm nad plastjo usedline in ki ustvarja nekaj mehurčkov na sekundo. Pri preskušanju hlapnih kemikalij je treba upoštevati, da se sistem z vodo in usedlino ne prezračuje, medtem ko je treba hkrati izpolniti merilo za veljavnost najmanj 60 % ASV (odstavek 10). Več smernic je na voljo v (16). | 33. | Preskus s C. riparius se izvaja pri konstantni temperaturi 20 °C (± 2 °C). Za C. dilutus in C. yoshimatsui sta priporočeni temperaturi 23 °C oziroma 25 °C (± 2 °C). Uporablja se 16-urno obdobje osvetljenosti, jakost svetlobe pa mora biti od 500 do 1 000 luksov. Pri kletkah za razmnoževanje se lahko doda ena ura faze svitanja in mraka. | Trajanje izpostavljenosti | 34. | Načrt z vodo s primešano preskusno snovjo: obdobje izpostavljenosti se pri prvi generaciji začne, ko se preskusna kemikalija primeša v vodo nad usedlino v preskusni posodi (to je en dan po vnosu ličink; za mogoče spremembe načrta izpostavljenosti glej odstavek 7). Izpostavljenost druge generacije ličink se začne takoj, ker se vnesejo v sistem z vodo in usedlino, v katerega je bila preskusna snov že primešana. Najdaljše trajanje izpostavljenosti pri C. riparius in C. yoshimatui je za prvo generacijo 27 dni, za drugo generacijo pa 28 dni (ličinke prve generacije preživijo en dan v posodah brez izpostavljenosti). Glede na prekrivanje celoten preskus traja približno 44 dni. Pri C. dilutus je najdaljše trajanje izpostavljenosti 64 dni za prvo generacijo oziroma 65 dni za drugo generacijo. Preskus traja skupaj približno 100 dni. | Načrt z usedlino s primešano preskusno snovjo: izpostavljenost se začne z vnosom ličink in traja najdlje 28 dni za obe generaciji pri C. riparius in C. yoshimatsui ter največ 65 dni za obe generaciji pri C. dilutus. | Opažanja | Preobrazba | 35. | Določita se čas razvoja ter skupno število v celoti preobraženih in živih samcev in samic trzače za obe generaciji. Samce je mogoče preprosto prepoznati po pahljačastih tipalkah in drži vitkega telesa. | 36. | Preskusne posode obeh generacij je treba opazovati vsaj trikrat na teden, da se vizualno oceni kakršno koli neobičajno obnašanje (npr. zapuščanje usedline, nenavadno plavanje) v primerjavi s kontrolo. V obdobju preobrazbe, ki se pri C. riparius in C. yoshimatsui začne približno 12 dni po vnosu ličink (20 dni po vnosu pri C. dilutus) se preobražene trzače preštejejo in opredelijo po spolu vsaj enkrat na dan, priporočljivo pa je dvakrat na dan (zgodaj zjutraj in pozno popoldne). Po identifikaciji se trzače prve generacije previdno odstranijo iz posod in prenesejo v kletko za razmnoževanje. Trzače druge generacije se odstranijo in po identifikaciji usmrtijo. Vse nize jajčec, odložene v preskusnih posodah prve generacije, je treba zbrati posamezno in jih prenesti z vsaj 2,5 ml naravne vode v 12-mestne mikroplošče (ali druge primerne posode), ki so pokrite s pokrovom, da se prepreči znatno izhlapevanje. Zabeležiti je treba tudi število mrtvih ličink in vidnih bub, ki se niso preobrazile. Primeri kletke za razmnoževanje, preskusne posode in sesalnika so navedeni v Dodatku 5. | Razmnoževanje | 37. | Učinki na razmnoževanje se ocenijo s številom nizov jajčec, ki jih odložijo trzače prve generacije, ter njihovo fertilnostjo. Nizi jajčec se enkrat na dan zberejo iz kristalizirke, ki je v vsaki posodi za gojenje. Nize jajčec je treba zbrati in prenesti z vsaj 2,5 ml naravne vode v 12-mestne mikroplošče (en niz jajčec v eno vdolbinico) ali druge primerne posode, ki so pokrite s pokrovom, da se prepreči znatno izhlapevanje. Za vsak niz jajčec se dokumentirajo naslednje lastnosti: dan odlaganja, velikost (normalna, tj. 1,0 ± 0,3 cm, ali majhna, običajno ≤ 0,5 cm) in struktura (običajna = oblika banane s spiralnim nizom jajčec ali nenormalna, npr. niz jajčec, ki ni v obliki spirale) ter fertilnost (fertilen ali nefertilen). Fertilnost niza jajčec se oceni v šestih dneh po tem, ko je bil odložen. Niz jajčec se šteje za fertilen, če se izvali vsaj ena tretjina jajčec. Skupno število samic, dodanih v kletko za razmnoževanje, se uporabi za izračun števila nizov jajčec na samico in število fertilnih nizov jajčec na samico. Po potrebi se lahko število jajčec v nizu jajčec oceni nedestruktivno z uporabo metode krožnega štetja (podrobno opisana v 32 in 33). | Analitske meritve | Koncentracija preskusne kemikalije | 38. | Na začetku (v primeru primešanja preskusne snovi v vodo po možnosti eno uro po vnosu preskusne snovi) in koncu preskusa je treba analizirati vsaj vzorce vode nad usedlino, porne vode in usedline, in sicer pri najvišji in nižji koncentraciji. To velja za posode iz obeh generacij. Iz kristalizirk v kletki za razmnoževanje se analizira samo voda nad usedlino, ker pridejo v stik z njo nizi jajčec (pri načrtu z usedlino s primešano preskusno snovjo se lahko predvidi analitska potrditev koncentracije usedline). Po potrebi se lahko med preskusom izvedejo nadaljnje meritve usedline, porne vode ali vode nad usedlino. Te določitve koncentracije preskusne snovi pokažejo obnašanje/porazdelitev preskusne kemikalije v sistemu vode in usedline. Za vzorčenje usedline in porne vode na začetku preskusa in med njim (glej odstavek 39) so potrebne dodatne preskusne posode za izvedbo analitskega določanja. Meritve usedline pri načrtu z vodo s primešano preskusno snovjo morda ne bodo potrebne, če je bila porazdelitev preskusne kemikalije med vodo in usedlino jasno določena v študiji vode/usedline v primerljivih pogojih (npr. razmerje med usedlino in vodo, vrsta vnosa, vsebnost organskega ogljika v usedlini) ali če je bilo dokazano, da izmerjene koncentracije v vodi nas usedlino ostajajo v razponu od 80 do 120 % nominalnih ali izmerjenih začetnih koncentracij. | 39. | Kadar se izvajajo vmesne meritve (npr. 7. in/ali 14. dan) in če so za analize potrebni veliki vzorci, ki jih ni mogoče odvzeti iz preskusnih posod, ne da bi to vplivalo na preskusni sistem, je treba analitske določitve izvesti na vzorcih iz dodatnih preskusnih posod, ki se tretirajo enako (vključno s prisotnostjo preskusnih organizmov), vendar se za biološka opažanja ne uporabljajo. | 40. | Za izolacijo intersticijske (= porne) vode se priporoča 30-minutno centrifugiranje pri npr. 10 000 g in 4 °C. Če pa se za preskusno kemikalijo izkaže, da se ne adsorbira na filtre, je sprejemljivo tudi filtriranje. V nekaterih primerih morda koncentracij v porni vodi zaradi premajhne prostornine v vzorcu ne bo mogoče analizirati. | Fizikalno-kemijski parametri | 41. | Ustrezno je treba izmeriti pH, raztopljeni kisik v preskusni vodi ter temperaturo vode v preskusnih posodah in kristalizirkah (glej odstavek 10). Na začetku in koncu preskusa je treba v kontrolah ter eni preskusni posodi in kristalizirki izmeriti trdoto in amoniak pri najvišji koncentraciji. | PODATKI IN POROČANJE | Obdelava rezultatov | 42. | Namen tega preskusa življenjskega cikla je določiti učinek preskusne kemikalije na razmnoževanje ter hitrost razvoja in skupno število v celoti preobraženih in živih samcev in samic trzače za dve generaciji. Za podatke o koeficientu preobrazbe je treba združiti samce in samice. Če ni statistično znatnih razlik med občutljivostjo obeh spolov v zvezi s hitrostjo razvoja, se lahko rezultati za samce in samice združijo za statistično analizo. | 43. | Učinkovite koncentracije, izražene kot koncentracije v vodi nad usedlino (za vodo s primešano preskusno snovjo) ali v usedlini (za usedlino s primešano preskusno snovjo), se običajno izračunajo na podlagi koncentracij, izmerjenih na začetku izpostavljenosti (glej odstavek 38). Za vodo s primešano preskusno snovjo se zato za vsako tretiranje izračuna povprečna vrednost koncentracij, običajno izmerjenih na začetku izpostavljenosti v vodi nad usedlino v posodah za obe generaciji in v kristalizirkah. Za usedlino s primešano preskusno snovjo se zato za vsako tretiranje izračuna povprečna vrednost koncentracij, običajno izmerjenih na začetku izpostavljenosti v posodah za obe generaciji (in neobvezno v kristalizirkah). | 44. | Za izračun točkovne ocene, tj. ECx, se lahko statistični podatki po posodah in kletkah za razmnoževanje uporabijo kot dejanske ponovitve. Pri izračunu intervala zaupanja za ECx je treba upoštevati variabilnost med posodami ali pa dokazati, da je ta zanemarljiva. Če se model prilega po metodi najmanjših kvadratov, je treba statistične podatke po posameznih posodah transformirati, da se izboljša homogenost variance. Vendar je treba vrednosti ECx izračunati po tem, ko so bili rezultati transformirani nazaj na prvotno vrednost (31). | 45. | Kadar je namen statistične analize določiti NOEC s preskušanjem domnev, je treba upoštevati variabilnost med posodami, kar se zagotovi z uporabo metod analize variance (npr. postopki Williamsovega in Dunnettovega preskusa). Williamsov preskus bi bil ustrezen, če se v teoriji pričakuje monotono razmerje odmerek-učinek, Dunnettov preskus pa bi bil ustrezen, kadar domneva o monotonosti ne drži. Namesto tega se lahko uporabijo robustnejši preskusi (27), kadar so običajne predpostavke analize variance kršene (31). | Koeficient preobrazbe | 46. | Koeficienti preobrazbe so kvantni podatki in se lahko analizirajo s Cochran-Armitageovim preskusom, uporabljenim regresivno (step-down), kadar se pričakuje monotono razmerje med odmerek-učinek in so ti podatki v skladu s tem pričakovanjem. Če niso, se lahko uporabi Fisherjev eksaktni preskus ali Mantel-Haenszelov preskus z Bonferroni-Holmovimi popravljenimi vrednostmi p. Če se izkaže, da je variabilnost med ponovitvami v okviru iste koncentracije večja, kot bi kazala binomska porazdelitev (pogosto imenovana ‚ekstra-binomska‘ variacija), potem je treba uporabiti robustni Cochran-Armitageev preskus ali Fisherjev eksaktni preskus, kot je predlagano v (27). | Vsota preobraženih živih trzač (samcev in samic) na posodo, ne , se določi in deli s številom vnesenih ličink, na : | pri čemer je: | ER | = | koeficient preobrazbe, | ne | = | število preobraženih živih trzač na posodo, | na | = | število vnesenih ličink na posodo (običajno 20). | Če je ne večje kot na (tj. če je bilo nenamerno vnesenih več ličink, kot je bilo predvideno), je treba na izenačiti z ne . | 47. | Alternativen pristop v primeru ekstra-binomske variacije, ki je ustreznejši za večje vzorce, je obravnavanje koeficienta preobrazbe kot zveznega odziva in uporaba postopkov, ki so skladni s temi podatki o ER. Velik vzorec je tu opredeljen kot število preobraženih osebkov in število nepreobraženih osebkov po posameznih ponovitvah (posodah), pri čemer je obojih več kot pet. | 48. | Za uporabo metod analize variance je treba vrednosti ER najprej transformirati z arkus sinus-korensko transformacijo ali Tukey-Freemanovo transformacijo, da se dobi približna normalna porazdelitev in da se variance izenačijo. Cochran-Armitageev preskus, Fisherjev eksaktni preskus (Bonferroni) ali Mantel-Haenszelov preskus se lahko uporabi, kadar se uporabljajo absolutne pogostosti. Pri arkus sinus-korenski transformaciji se izračuna arkus sinus (sin– 1) kvadratnega korena ER. | 49. | Za koeficiente preobrazbe se vrednosti ECx izračunajo z regresijsko analizo (npr. probit, logit ali Weibullov model (28)). Če regresijska analiza ni uspešna (npr. kadar sta manj kot dva delna odgovora), se lahko uporabijo druge neparametrične metode, kot sta drseče povprečje ali linearna interpolacija. | Hitrost razvoja | 50. | Srednji čas razvoja predstavlja srednji časovni razpon med vnosom ličink (dan 0 preskusa) in pojavom eksperimentalne kohorte trzač (za izračun dejanskega časa razvoja je treba upoštevati starost ličink ob vnosu). Hitrost razvoja (enota: (1/dan) je obratna času razvoja in predstavlja tisti delež razvoja ličink, ki se zgodi na dan. Za oceno teh raziskav strupenosti v usedlini je primernejša hitrost razvoja, saj je njena varianca manjša, poleg tega je bolj homogena in bližje normalni porazdelitvi v primerjavi s časom razvoja. Zato se lahko namesto časa razvoja za hitrost razvoja uporabijo učinkovitejši postopki parametričnega preskusa. Če se hitrost razvoja obravnava kot zvezni odziv, se lahko vrednosti ECx ocenijo z regresijsko analizo (npr. (29) (30)). NOEC za srednjo hitrost razvoja se lahko določi z metodami analize variance, npr. Williamsovim ali Dunnettovim preskusom. Ker se samci preobrazijo hitreje od samic, tj. njihova hitrost razvoja je večja, je smiselno poleg hitrosti razvoja vseh trzač skupaj izračunati tudi hitrost razvoja za vsak spol ločeno. | 51. | Za statistično preskušanje se za število trzač, opaženih na dan opazovanja x, domneva, da so se preobrazile na sredini časovnega intervala med dnevom x in dnevom x – l (l = dolžina intervala opazovanja, običajno 1 dan). Srednja hitrost razvoja na posodo ( ) se izračuna z enačbo: | pri čemer je: | : | srednja hitrost razvoja za posodo, | i | : | indeks intervala opazovanja, | m | : | največje število intervalov opazovanja, | fi | : | število trzač, preobraženih v intervalu opazovanja i, | ne | : | skupno število preobraženih trzač ob koncu poskusa (Σfi ), | xi | : | hitrost razvoja trzač, preobraženih v intervalu i, | pri čemer je: | dayi | : | dan opazovanja (dnevi od vnosa ličink), | li | : | dolžina intervala opazovanja i (dnevi, običajno 1 dan). | Razmerje med spoloma | 52. | Razmerja med spoloma so kvantni podatki in jih je zato treba oceniti s Ficherjevim eksaktnim preskusom ali drugimi ustreznimi metodami. Naravno razmerje med spoloma pri C. riparius je ena, tj. samci in samice so enako pogosti. Podatke o razmerju med spoloma je treba obravnavati enako za obe generaciji. Ker je največje število trzač na posodo (tj. 20) premajhno za smiselno statistično analizo, se sešteje skupno število v celoti preobraženih in živih trzač za posamezen spol v vseh posodah enega tretiranja. Ti netransformirani podatki se preskusijo glede na podatke iz kontrole (s topilom) ali združene kontrole v kontingenčni tabeli 2 × 2. | Razmnoževanje | 53. | Razmnoževanje se tako kot plodnost izračuna kot število nizov jajčec na samico. To natančneje pomeni, da se skupno število nizov jajčec, odloženih v kletki za razmnoževanje, deli s skupnim številom živih in nepoškodovanih samic, dodanih v navedeno kletko. NOEC za plodnost se lahko določi z metodami analize variance, npr. Williamsovim ali Dunnettovim preskusom. | 54. | Fertilnost nizov jajčec se uporabi za kvantifikacijo števila fertilnih nizov jajčec na samico. Skupno število nizov jajčec, odloženih v kletki za razmnoževanje, se deli s skupnim številom živih in nepoškodovanih samic, dodanih v navedeno kletko. NOEC za fertilnost se lahko določi z metodami analize variance, npr. Williamsovim ali Dunnettovim preskusom. | Poročilo o preskusu | 55. | V poročilu o preskusu morajo biti naslednje informacije: | | Preskusna kemikalija: | — | fizikalno stanje in fizikalno-kemijske lastnosti (topnost v vodi, parni tlak, log K ow, porazdelitveni koeficient v tleh (ali v usedlini, če je na voljo), stabilnost v vodi in usedlini itd.), | — | kemijski identifikacijski podatki (splošno ime, kemijsko ime, strukturna formula, številka CAS itd.), vključno s čistostjo in analitsko metodo za kvantifikacijo preskusne kemikalije. | | Preskusne vrste: | — | uporabljeni preskusni organizmi: vrsta, znanstveno ime, vir organizmov in pogoji razmnoževanja, | — | informacije o ravnanju z jajčnimi legli in ličinkami, | — | informacije o ravnanju s preobraženimi odraslimi osebki prve generacije s pomočjo sesalnika itd. (glej Dodatek 5), | — | starost preskusnih organizmov ob vnosu v preskusne posode za prvo in drugo generacijo. | | Preskusni pogoji: | — | uporabljena usedlina, tj. naravna ali formulirana (umetna), | — | naravna usedlina: lokacija in opis mesta vzorčenja usedline, vključno, če je mogoče, s preteklim onesnaženjem; značilnosti usedline: pH, vsebnost organskega ogljika, razmerje C/N in granulometrija (če je ustrezno), | — | formulirana usedlina: priprava, sestavine in značilnosti (vsebnost organskega ogljika, pH, vlaga itd., izmerjeni na začetku preskusa), | — | priprava preskusne vode (če se uporablja modelna razredčevalna voda) in značilnosti (koncentracija kisika, pH, trdota itd., izmerjeni na začetku preskusa), | — | globina usedline in vode nad njo v preskusnih posodah in kristalizirkah, | — | prostornina vode nad usedlino in porne vode; teža mokre usedline s porno vodo in brez nje v preskusnih posodah in kristalizirkah, | — | preskusne posode (material in velikost), | — | kristalizirke (material in velikost), | — | kletke za razmnoževanje (material in velikost), | — | način priprave založnih raztopin in preskusnih koncentracij za preskusne posode in kristalizirke, | — | vnos preskusne kemikalije v preskusne posode in kristalizirke: preskusne koncentracije, število ponovitev in topil, če so potrebna, | — | pogoji inkubacije za preskusne posode: temperatura, svetlobni cikel in jakost, prezračevanje (mehurčki na sekundo), | — | pogoji inkubacije za kletke za razmnoževanje in kristalizirke: temperatura, svetlobni cikel in jakost svetlobe, | — | pogoji inkubacije za nize jajčec v mikroploščah (ali drugih posodah): temperatura, svetlobni cikel in jakost svetlobe, | — | podrobne informacije o hranjenju, vključno z vrsto hrane, pripravo, količino in načinom. | | Rezultati: | — | nazivne preskusne koncentracije, izmerjene preskusne koncentracije in rezultati vseh analiz za določitev koncentracije preskusne kemikalije v preskusnih posodah in kristalizirkah, | — | kakovost vode v preskusnih posodah in kristalizirkah, tj. pH, temperatura, raztopljeni kisik, trdota in amoniak, | — | morebitna nadomestitev izhlapele preskusne vode v preskusnih posodah, | — | število preobraženih samcev in samic trzače na posodo ter na dan za prvo in drugo generacijo, | — | razmerje med spoloma pri v celoti preobraženih in živih trzačah na tretiranje za prvo in drugo generacijo, | — | število ličink, ki se niso preobrazile v trzače, na posodo za prvo in drugo generacijo, | — | odstotek/delež preobrazbe na ponovitev in preskusno koncentracijo (združeni samci in samice trzače) za prvo in drugo generacijo, | — | srednja hitrost razvoja v celoti preobraženih in živih trzač na ponovitev in stopnjo koncentracije (združeni samci in samice trzače) za prvo in drugo generacijo, | — | število nizov jajčec, odloženih v kristalizirkah, na kletko za razmnoževanje in dan, | — | lastnosti posameznega niza jajčec (velikost, oblika in fertilnost), | — | plodnost – skupno število nizov jajčec na skupno število samic, dodanih v kletko za razmnoževanje, | — | fertilnost – skupno število fertilnih nizov jajčec na skupno število samic, dodanih v kletko za razmnoževanje, | — | ocene strupenih končnih točk, npr. ECx (in s tem povezani intervali zaupanja), NOEC ter statistične metode, uporabljene za njihovo določitev, | — | razprava o rezultatih, vključno z vsemi vplivi na rezultat preskusa, ki izvirajo iz odstopanj od te preskusne metode. | LITERATURA | (1) | Poglavje C.28 te priloge, Preskus strupenost s trzačami v sistemu vode in usedline z uporabo vode s primešano preskusno snovjo. | (2) | Shobanov, N. A., Kiknadze, I. I., in Butler, M. G. (1999). Palearctic and Nearctic Chironomus (Camptochironomus) tentans Fabricius are different species (Diptera: Chironomidae). Entomologica Scandinavica, 30: 311–322. | (3) | Fleming, R., idr. (1994). Sediment Toxicity Tests for Poorly Water-Soluble Substances, Final Report to the European Commission, Report No: EC 3738. Avgust 1994. WRc, Združeno kraljestvo. | (4) | SETAC (1993). Guidance Document on Sediment toxicity Tests and Bioassays for Freshwater and Marine Environments, z delavnice WOSTA, ki je potekala na Nizozemskem. | (5) | ASTM International (2009). E1706-05E01: Test Method for Measuring the Toxicity of Sediment-Associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. V: Annual Book of ASTM Standards, Zvezek 11.06, Biological Effects and Environmental Fate; Biotechnology. ASTM International, West Conshohocken, PA. | (6) | Environment Canada (1997). Test for Growth and Survival in Sediment using Larvae of Freshwater Midges (Chironomus tentans or Chironomus riparius), Biological Test Method, Report SPE 1/RM/32, december 1997. | (7) | US-EPA (2000). Methods for Measuring the Toxicity and Bioaccumulation of Sediment-associated Contaminants with Freshwater Invertebrates, druga izdaja, EPA 600/R-99/064, marec 2000, sprememba prve izdaje iz junija 1994. | (8) | US-EPA/OPPTS 850.1735 (1996). Whole Sediment Acute Toxicity Invertebrates. | (9) | US-EPA/OPPTS 850.1790 (1996). Chironomid Sediment toxicity Test. | (10) | Milani, D., Day, K. E., McLeay, D. J., in Kirby, R. S. (1996). Recent intra- and inter-laboratory studies related to the development and standardisation of Environment Canada's biological test methods for measuring sediment toxicity using freshwater amphipods (Hyalella azteca) and midge larvae (Chironomus riparius), Technical Report, Environment Canada, National Water Research Institute, Burlington, Ontario, Kanada. | (11) | Norberg-King, T. J., Sibley, P. K., Burton, G. A., Ingersoll, C. G., Kemble, N. E., Ireland, S., Mount, D. R., in Rowland, C. D. (2006). Interlaboratory evaluation of Hyalella azteca and Chironomus tentans short-term and long-term sediment toxicity tests, Environ. Toxicol. Chem., 25: 2662–2674. | (12) | Taenzler, V., Bruns, E., Dorgerloh, M., Pfeifle, V., in Weltje, L. (2007). Chironomids: suitable test organisms for risk assessment investigations on the potential endocrine-disrupting properties of pesticides, Ecotoxicology, 16: 221–230. | (13) | Sugaya, Y. (1997). Intra-specific variations of the susceptibility of insecticides in Chironomus yoshimatsui, Jp. J. Sanit. Zool., 48: 345–350. | (14) | Kawai, K. (1986). Fundamental studies on chironomid allergy, I. Culture methods of some Japanese chironomids (Chironomidae, Diptera), Jp. J. Sanit. Zool., 37: 47–57. | (15) | Poglavje C.27 te priloge, Preskus strupenosti s trzačami v sistemu vode in usedline z uporabo usedline s primešano preskusno snovjo. | (16) | OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures, Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 23, ENV/JM/MONO(2000)6, OECD, Pariz. | (17) | Weltje, L., Rufli, H., Heimbach, F., Wheeler, J., Vervliet-Scheebaum, M., in Hamer, M. (2010). The chironomid acute toxicity test: development of a new test system, Integr. Environ. Assess. Management. | (18) | Environment Canada. (1995). Guidance Document on Measurement of Toxicity Test Precision Using Control Sediments Spiked with a Reference Toxicant, Report EPS 1/RM/30, september 1995. | (19) | Oetken, M., Nentwig, G., Löffler, D., Ternes, T., in Oehlmann, J. (2005). Effects of pharmaceuticals on aquatic invertebrates, Part I, The antiepileptic drug carbamazepine, Arch. Environ. Contam. Toxicol., 49: 353–361. | (20) | Suedel, B. C., in Rodgers, J. H. (1994). Development of formulated reference sediments for freshwater and estuarine sediment testing, Environ. Toxicol. Chem., 13: 1163– 1175. | (21) | Naylor, C., in Rodrigues, C. (1995), Development of a test method for Chironomus riparius using a formulated sediment, Chemosphere, 31: 3291–3303. | (22) | Dunnett, C. W. (1964). A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Amer. Statis. Assoc., 50: 1096– 1121. | (23) | Dunnett, C. W. (1964). New tables for multiple comparisons with a control, Biometrics, 20: 482–491. | (24) | Williams, D. A. (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics, 27: 103– 117. | (25) | Williams, D. A. (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics, 28: 510–531. | (26) | Jungmann, D., Bandow, C., Gildemeister, T., Nagel, R., Preuss, T. G., Ratte, H. T., Shinn, C., Weltje, L., in Maes, H. M. (2009). Chronic toxicity of fenoxycarb to the midge Chironomus riparius after exposure in sediments of different composition. J Soils Sediments, 9: 94– 102. | (27) | Rao, J. N. K., in Scott, A. J. (1992). A simple method for the analysis of clustered binary data. Biometrics, 48: 577–585. | (28) | Christensen, E. R. (1984), Dose-response functions in aquatic toxicity testing and the Weibull model, Water Res., 18: 213–221. | (29) | Bruce, R. D., in Versteeg, D. J. (1992). A statistical procedure for modelling continuous toxicity data, Environ. Toxicol. Chem., 11: 1485– 1494. | (30) | Slob, W. (2002). Dose-response modelling of continuous endpoints. Toxicol. Sci., 66: 298–312. | (31) | OECD (2006). Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: a Guidance to Application, OECD Series on Testing and Assessment No. 54, 146 str., ENV/JM/MONO(2006)18, OECD, Pariz. | (32) | Benoit, D. A., Sibley, P. K., Juenemann, J. L., in Ankley, G. T. (1997). Chironomus tentans life-cycle test: design and evaluation for use in assessing toxicity of contaminated sediments, Environ. Toxicol. Chem., 16: 1165– 1176. | (33) | Vogt, C., Belz, D., Galluba, S., Nowak, C., Oetken, M. in Oehlmann, J. (2007). Effects of cadmium and tributyltin on development and reproduction of the non-biting midge Chironomus riparius (Diptera) – baseline experiments for future multi-generation studies, J. Environ. Sci. Health Part A, 42: 1–9. | (34) | OECD (2010). Validation report of the Chironomid full life-cycle toxicity test, Forthcoming publication in the Series on Testing and Assessment, OECD, Pariz. | Dodatek 1 | Opredelitve | Za to preskusno metodo se uporabljajo naslednje opredelitve pojmov: | Kemikalija je snov ali zmes. | Formulirana usedlina ali rekonstituirana, umetna ali sintetična usedlina je zmes snovi, uporabljenih za posnemanje fizičnih sestavin naravne usedline. | Voda nad usedlino je voda, ki se nalije nad usedlino v preskusni posodi. | Intersticijska voda ali porna voda je voda, ki zavzema prostor med delci usedline in tal. | Voda s primešano preskusno snovjo je preskusna voda, ki ji je bila dodana preskusna kemikalija. | Preskusna kemikalija je vsaka snov ali zmes, preskušena z uporabo te preskusne metode. | Dodatek 2 | Priporočila za gojenje Chironomus riparius | 1. | Ličinke Chironomus se lahko gojijo v kristalizirkah ali večjih posodah. Na dno posode se nanese tanka plast finega kremenovega peska (debela približno od 5 do 10 mm). Za primeren substrat se je izkazal tudi kieselgur (npr. Merck, Art 8117) (zadošča tanjša plast, debela samo nekaj mm). Nato se doda primerna voda do globine več cm. Vodo je treba po potrebi dotočiti, da se nadomestijo izgube zaradi izhlapevanja in prepreči izsušitev. Voda se po potrebi lahko zamenja. Zagotoviti je treba rahlo prezračevanje. Posode, v katerih se gojijo ličinke, morajo biti v primerni kletki, ki bo preprečila pobeg odraslih preobraženih osebkov. Kletka mora biti dovolj velika, da lahko preobraženi odrasli osebki rojijo, sicer se lahko zgodi, da ne bo parjenja (najmanjša velikost je približno 30 × 30 × 30 cm). | 2. | Kletke morajo biti v prostoru s sobno temperaturo ali prostoru s konstantnim ozračjem pri 20 ± 2 °C s 16-urnim obdobjem osvetljenosti (jakost približno 1 000 luksov) in 8 urami teme. Po poročilih lahko manj kot 60-odstotna relativna vlažnost zraka ovira razmnoževanje. | Voda za redčenje | 3. | Uporabi se lahko vsaka primerna naravna ali sintetična voda. Običajno se uporabljajo voda iz vodnjaka, deklorirana vodovodna voda in umetni mediji (npr. medij Elendt ‚M4‘ ali ‚M7‘, glej v nadaljevanju). Vodo je treba pred uporabo prezračevati. Voda za gojenje se lahko po potrebi obnovi, tako da se uporabljena voda iz posod za gojenje skrbno pretoči ali izsesa, ne da bi se pri tem uničil ovoj ličink. | Hranjenje ličink | 4. | Ličinke Chironomus je treba hraniti s približno 250 mg ribje hrane v kosmičih (Tetra Min®, Tetra Phyll® ali druga podobna zaščitena znamka ribje hrane) na posodo na dan. Hrana se lahko daje v obliki suhega mletega prahu ali kot suspenzija v vodi: 1,0 g hrane v kosmičih se doda 20 ml vode za redčenje in zmeša, da nastane homogena mešanica. Ta pripravek se lahko daje v količini približno 5 ml na posodo na dan (pred uporabo ga je treba pretresti). Starejše ličinke lahko dobijo več hrane. | 5. | Hranjenje se prilagaja kakovosti vode. Če gojišče postane ‚moteno‘, je treba hranjenje zmanjšati. Dodajanje hrane je treba skrbno spremljati. Premalo hrane bo povzročilo selitev ličink v vodni stolpec, preveč hrane pa povečano mikrobno dejavnost in zmanjšane koncentracije kisika. Oboje lahko privede do počasnejše rasti. | 6. | Ko se pripravijo nove posode za gojenje, se lahko dodajo tudi celice nekaterih zelenih alg (npr. Scenedesmus subspicatus, Chlorella vulgaris). | Hranjenje preobraženih odraslih osebkov | 7. | Nekateri raziskovalci so predlagali, da se lahko kot hrana za odrasle preobražene osebke uporabi vatna blazinica, namočena v nasičeno raztopino saharoze. | Preobrazba | 8. | Pri 20 ± 2 °C se bo preobrazba v odrasle osebke iz posod za gojenje ličink začela po približno 13 do 15 dneh. Samce je mogoče preprosto razlikovati po pahljačastih tipalkah in suhem telesu. | Jajčna legla | 9. | Ko so v kletki za razmnoževanje odrasli osebki, je treba vse posode za gojenje ličink trikrat na teden preveriti glede morebitnih odloženih želatinastih jajčnih legel. Če so prisotna, jih je treba previdno odstraniti. Prenesti jih je treba v majhno posodo, ki vsebuje vzorec vode za razmnoževanje. Jajčna legla se uporabijo za pripravo nove posode za gojenje (npr. 2 do 4 jajčna legla/posodo) ali za preskuse strupenosti. | 10. | Ličinke prvega stadija bi se morale izvaliti po 2 ali 3 dneh. | Priprava novih posod za gojenje | 11. | Ko so gojišča vzpostavljena, bi moralo biti mogoče novo posodo za gojenje za ličinke pripraviti vsak teden ali manj pogosto, odvisno od zahtev preskušanja, stare posode pa odstraniti, ko se ličinke preobrazijo v odrasle osebke. S takim sistemom bo najpreprosteje zagotovljena redna oskrba z odraslimi osebki. | Končne koncentracije v preskusnih raztopinah ‚M4‘ in ‚M7‘ | 12. | Elendt (1990) je opisal medij ‚M4‘. Medij ‚M7‘ se pripravi kot medij ‚M4‘, razen za snovi, navedene v tabeli 1, za katere so koncentracije pri ‚M7‘ štirikrat nižje kot pri ‚M4‘. Preskusna raztopina se ne sme pripraviti po Elendt in Bias (1990), saj koncentracije NaSiO3 · 5H2O, NaNO3, KH2PO4 in K2HPO4, navedene za pripravo založnih raztopin, niso ustrezne. | Priprava medija ‚M7‘ | 13. | Vsaka založna raztopina (I) se pripravi posebej, sestavljena založna raztopina (II) pa se pripravi iz teh založnih raztopin (I) (glej tabelo 1). V 50 ml sestavljene založne raztopine (II), ki ji je dodana količina vsake založne raztopine makrohranilnih snovi, navedena v tabeli 2, se dolije deionizirana voda do 1 litra, da se pripravi medij ‚M7‘. Založna raztopina vitaminov se pripravi tako, da se trije vitamini dodajo v deionizirano vodo, kot je navedeno v tabeli 3, 0,1 ml sestavljene založne raztopine vitaminov pa se doda končnemu mediju ‚M7‘ malo pred uporabo. Založna raztopina vitaminov se hrani zamrznjena v majhnih alikvotih. Medij se prezračuje in stabilizira. | Tabela 1 | Založne raztopine elementov v sledeh za medija M4 in M7 | Založne raztopine (I) | Količina (mg) za pripravo 1 litra z deionizirano vodo | Za pripravo sestavljene založne raztopine (II): zmešajo se naslednje količine (ml) založnih raztopin (I) in dopolnijo do 1 litra z deionizirano vodo | Končne koncentracije v preskusnih raztopinah (mg/l) | M4 | M7 | M4 | M7 | H3BO3 (20) | 57 190 | 1,0 | 0,25 | 2,86 | 0,715 | MnCl2 · 4H2O (20) | 7 210 | 1,0 | 0,25 | 0,361 | 0,090 | LiCl (20) | 6 120 | 1,0 | 0,25 | 0,306 | 0,077 | RbCl (20) | 1 420 | 1,0 | 0,25 | 0,071 | 0,018 | SrCl2 · 6H2O (20) | 3 040 | 1,0 | 0,25 | 0,152 | 0,038 | NaBr (20) | 320 | 1,0 | 0,25 | 0,016 | 0,004 | Na2MoO4 · 2H2O (20) | 1 260 | 1,0 | 0,25 | 0,063 | 0,016 | CuCl2 · 2H2O (20) | 335 | 1,0 | 0,25 | 0,017 | 0,004 | ZnCl2 | 260 | 1,0 | 1,0 | 0,013 | 0,013 | CaCl2 · 6H2O | 200 | 1,0 | 1,0 | 0,010 | 0,010 | KI | 65 | 1,0 | 1,0 | 0,0033 | 0,0033 | Na2SeO3 | 43,8 | 1,0 | 1,0 | 0,0022 | 0,0022 | NH4VO3 | 11,5 | 1,0 | 1,0 | 0,00058 | 0,00058 | Na2EDTA · 2H2O (20) (21) | 5 000 | 20,0 | 5,0 | 2,5 | 0,625 | FeSO4 · 7H2O (20) (21) | 1 991 | 20,0 | 5,0 | 1,0 | 0,249 | Tabela 2 | Založne raztopine makrohranilnih snovi za medija M4 in M7 | | Količina za pripravo 1 litra z deionizirano vodo | (mg) | Količina založnih raztopin makrohranilnih snovi za pripravo medijev M4 in M7 | (ml/l) | Končne koncentracije v preskusnih raztopinah M4 in M7 | (mg/l) | CaCl2 · 2H2O | 293 800 | 1,0 | 293,8 | MgSO4 · 7H2O | 246 600 | 0,5 | 123,3 | KCl | 58 000 | 0,1 | 5,8 | NaHCO3 | 64 800 | 1,0 | 64,8 | NaSiO3 · 9H2O | 50 000 | 0,2 | 10,0 | NaNO3 | 2 740 | 0,1 | 0,274 | KH2PO4 | 1 430 | 0,1 | 0,143 | K2HPO4 | 1 840 | 0,1 | 0,184 | Tabela 3 | Založna raztopina vitaminov za medija M4 in M7 | Vse tri raztopine vitaminov so združene v eno. | | Količina za pripravo 1 litra z deionizirano vodo | (mg) | Količina dodane založne raztopine vitaminov za pripravo medijev M4 in M7 | (ml/l) | Končne koncentracije v preskusnih raztopinah M4 in M7 | (mg/l) | Tiamin hidroklorid | 750 | 0,1 | 0,075 | Cianokobalamin (B12) | 10 | 0,1 | 0,0010 | Biotin | 7,5 | 0,1 | 0,00075 | VIRI | BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system, uredila M. Streloke in H. Köpp. Berlin. | Elendt, B. P. (1990). Selenium deficiency in Crustacea, Protoplasma, 154: 25–33. | Elendt, B. P., in W.-R. Bias (1990). Trace nutrient deficiency in Daphnia magna cultured in standard medium for toxicity testing, Effects on the optimisation of culture conditions on life history parameters of D. magna, Water Research, 24: 1157–1167. | Dodatek 3 | Priprava formulirane usedline | SESTAVA USEDLINE | Sestava formulirane usedline mora biti naslednja: | Sestavina | Značilnosti | Delež suhe teže usedline v % | šota | šotni mah, čim bližje pH 5,5–6,0, brez vidnih ostankov rastlin, fino mlet (velikost delcev ≤ 1 mm) in sušen na zraku | 4–5 | kremenov pesek | velikost zrn: > 50 % delcev mora biti velikih 50–200 μm | 75–76 | kaolinska glina | vsebnost kaolinita ≥ 30 % | 20 | organski ogljik | uravnava se z dodatkom šote in peska. | 2 (± 0,5) | kalcijev karbonat | CaCO3, zdrobljen v prah, kemijsko čist. | 0,05–0,1 | voda | prevodnost ≤ 10 μS/cm | 30–50 | PRIPRAVA | Šota se posuši na zraku in zmelje v fin prah. Pripravi se suspenzija potrebne količine šote v prahu v deionizirani vodi, za kar se uporabi visoko zmogljiva naprava za homogenizacijo. Vrednost pH te suspenzije se s CaCO3 uravna na 5,5 ± 0,5. Suspenzija se vsaj dva dni kondicionira z rahlim mešanjem pri 20 ± 2 °C, da se stabilizira pH in vzpostavi stabilna mikrobna komponenta. Vrednost pH se znova izmeri in mora biti 6,0 ± 0,5. Šotna suspenzija se nato zmeša z drugimi sestavinami (peskom in kaolinsko glino) in deionizirano vodo, da nastane homogena usedlina z vsebnostjo vode v razponu 30 – 50 % suhe teže usedline. pH končne mešanice se znova izmeri in po potrebi uravna na 6,5 do 7,5 s CaCO3. Odvzamejo se vzorci usedline, da se določita suha teža in vsebnost organskega ogljika. Priporoča se, da se formulirana usedlina pred uporabo v preskusu strupenosti s trzačami sedem dni kondicionira v enakih pogojih, kot vladajo v poznejšem preskusu. | SHRANJEVANJE | Suhe sestavine za pripravo umetne usedline se lahko shranjujejo v suhem in hladnem prostoru pri sobni temperaturi. Formulirana (mokra) usedlina se pred uporabo v preskusu ne sme shranjevati. Uporabiti jo je treba takoj po 7-dnevnem obdobju kondicioniranja, s katerim se njena priprava konča. | VIRI | OECD (1984). Earthworm, Acute Toxicity Test, Test Guideline No. 207, Guidelines for the Testing of Chemicals, OECD, Pariz. | Meller, M., Egeler, P., Roembke, J., Schallnass, H., Nagel, R., in B. Streit (1998). Short-term toxicity of lindane, hexachlorobenzene and copper sulfate on tubificid sludgeworms (Oligochaeta) in artificial media, Ecotox. Environ. Safety, 39: 10–20. | Dodatek 4 | Kemijske značilnosti sprejemljive vode za redčenje | SESTAVINA | KONCENTRACIJE | delci | < 20 mg/l | skupni organski ogljik | < 2 mg/l | neionizirani amoniak | < 1 μg/l | trdota kot CaCO3 | < 400 mg/l (*5) | ostanek klora | < 10 μg/l | skupni organofosforni pesticidi | < 50 ng/l | skupni organoklorni pesticidi in poliklorirani bifenili | < 50 ng/l | skupni organski klor | < 25 ng/l | Dodatek 5 | Smernica za izvedbo preskusa | Primer kletke za razmnoževanje: | A | : | gaza na vrhu in vsaj eni stranici kletke (velikost mreže je približno 1 mm); | B | : | odprtina za vnos preobraženih odraslih osebkov v kletko za razmnoževanje in odstranjevanje odloženih nizov jajčec iz kristalizirk (na sliki niso prikazane); | C | : | kletka za razmnoževanje, dolga najmanj 30 cm, visoka najmanj 30 cm in široka najmanj 30 cm. | Primer preskusne posode: | A | : | pasteurjeva pipeta za dovajanje zraka v vodo nad usedlino; | B | : | stekleni pokrov za preprečevanje pobega preobraženih trzač; | C | : | gladina vode; | D | : | preskusna posoda (steklena časa s prostornino najmanj 600 ml); | E | : | plast usedline. | Primer sesalnika za zajetje odraslih trzač (puščici označujeta smer zračnega toka): | A | : | steklena cev (notranji premer približno 5 mm), priključena na samosesalno črpalko; | B | : | zamašek iz gume, preluknjan s stekleno cevjo (A). Znotraj je odprtina steklene cevi (A) prekrita z bombažem in gazo (velikost mreže je približno 1 mm), da se preprečijo poškodbe trzač, ko jih sesalnik posesa; | C | : | prozoren vsebnik (plastičen ali steklen, dolg približno 15 cm) za ujete trzače; | D | : | zamašek iz gume, preluknjan s cevjo (E). Zamašek D se odstrani z vsebnika C, da se trzače spustijo v kletko za razmnoževanje; | E | : | cev (plastična ali steklena, notranji premer približno 8 mm) za zbiranje odraslih trzač iz posode. | Shematski prikaz preskusa življenjskega cikla: | A | : | prva generacija – preskusne posode, ki vsebujejo sistem z vodo in usedlino, osem ponovitev, 20 ličink prvega stadija na posodo; | B | : | štiri preskusne posode za vsako kletko za razmnoževanje, A in B; | C | : | kletki za razmnoževanje (A in B) za rojenje, parjenje in odlaganje jajčec; | D | : | kristalizirki za odlaganje nizov jajčec; | E | : | mikroplošči, ena vdolbinica za vsak niz jajčec; | F | : | druga generacija – preskusne posode, ki vsebujejo sistem z vodo in usedlino, osem ponovitev, 20 ličink prvega stadija na posodo. | C.41 PRESKUS SPOLNEGA RAZVOJA RIB | UVOD | 1. | Ta preskusna metoda ustreza Smernici za preskušanje OECD (TG) 234 (2011). Temelji na sklepu iz leta 1998, da se pripravijo nove ali posodobijo obstoječe preskusne metode za spremljanje in preskušanje potencialnih povzročiteljev endokrinih motenj. Preskus spolnega razvoja rib (FSDT) je bil opredeljen kot obetavna preskusna metoda, ki zajema občutljivo življenjsko fazo rib, ki se odzivajo na kemikalije, podobne estrogenu in androgenu. Med letoma 2006 in 2010 se je izvajala medlaboratorijska validacija preskusne metode, pri čemer so bile validirane japonska medaka (Oryzias latipes), cebrica (Danio rerio) in zet (Gasterosteus aculeatus), črnoglavi pisanec (Pimephales promelas) pa je bil delno validiran (41) (42) (43). Ta protokol vključuje japonsko medako, zeta in cebrico. Protokol je načeloma razširitev OECD TG 210 Ribe, preskus strupenosti v zgodnji življenjski fazi (1), kjer se izpostavljenost nadaljuje, dokler niso ribe spolno diferencirane, tj. približno 60 dni po tem, ko se izvalijo (DPH), pri japonski medaki, zetu in cebrici (obdobje izpostavljenosti je lahko pri drugih vrstah, ki še bodo validirane, krajše ali daljše), pri čemer se dodajo endokrine občutljive končne točke. S preskusom spolnega razvoja rib se ocenjujejo učinki v zgodnji življenjski fazi in možne škodljive posledice kemikalij, ki domnevno povzročajo endokrine motnje (npr. inhibitorji estrogenov, androgenov in steroidogeneze) spolnega razvoja. Kombinacija dveh glavnih endokrinih končnih točk, koncentracija vitelogenina (VTG) in fenotipsko razmerje med spoloma omogočajo, da se s preskusom nakaže način delovanja preskusne kemikalije. Zaradi spremembe fenotipskega razmerja med spoloma, ki je pomembna za populacijo, se lahko preskus spolnega razvoja rib uporablja za oceno nevarnosti in tveganja. Če se preskus uporabi za oceno nevarnosti ali tveganja, pa se zet ne sme uporabiti, ker validacijski podatki, ki so do zdaj na voljo, kažejo, da so pri tej vrsti spremembe fenotipskega razmerja med spoloma, ki jih povzroči preskusna kemikalija, neobičajne. | 2. | Protokol temelji na ribah, ki so kemikalijam izpostavljene prek vode v spolno nestabilnem obdobju, v katerem naj bi bile ribe najbolj občutljive na učinke kemikalij, ki povzročajo endokrine motnje, ki ovirajo spolni razvoj. Glavni končni točki se izmerita kot kazalnika razvojnih kromosomskih aberacij, povezanih z endokrinim sistemom, koncentracije VTG in razmerja med spoloma (deleža po spolu), določena s histologijo spolnih žlez. Histopatologija spolnih žlez (ocena in določanje faze oocitov in spermatogenih celic) ni obvezna. Poleg tega se določi genetski spol, kadar koli je mogoče (npr. pri japonski medaki in zetu). Prisotnost označevalca genetskega spola je pomembna prednost, ker poveča moč statističnih podatkov o razmerju med spoloma in omogoči zaznavanje posamezne spremembe fenotipičnega spola. Druge zgornje končne točke, ki jih je treba izmeriti, vključujejo hitrost izvalitve, preživetje, dolžino in telesno težo. Preskusna metoda bi se lahko prilagodila drugim vrstam, ki niso omenjene zgoraj, če bi prestale enako validacijo, kot so jo japonska medaka, zet in cebrica, če so ribe iz kontrole ob koncu preskusa spolno diferencirane, če so ravni VTG dovolj visoke za zaznavanje pomembnih variacij, povezanih s kemikalijo, in če se z referenčnimi kemikalijami z endokrinim delovanjem ((anti-)estrogeni, (anti-)androgeni, inhibitorji aromataze itd.) vzpostavi občutljivost preskusnega sistema. Poleg tega mora OECD pregledati vsa validacijska poročila, ki se nanašajo na podatke o preskusu spolnega razvoja rib z uporabo drugih vrst, rezultat validacije pa se mora šteti za zadovoljivega. | Začetni pomisleki in omejitve | 3. | VTG običajno proizvajajo jetra samic oviparnih vretenčarjev kot odziv na kroženje endogenega estrogena (2). Je predhodna sestavina beljakovin jajčnega rumenjaka, ki po nastanku v jetrih potuje po krvnem obtoku do jajčnika, kjer jo absorbirajo in spremenijo razvijajoča se jajčeca. Sinteza VTG je pri nezrelih ribah in odraslih samcih rib zelo omejena, ker nimajo dovolj krožečega estrogena, čeprav zaznavna. Vendar so jetra sposobna sinteze in izločanja VTG kot odziv na spodbujanje eksogenega estrogena (3) (4) (5). | 4. | Meritev VTG je namenjena zaznavanju kemikalij z estrogenimi, antiestrogenimi in androgenimi načini delovanja ter kemikalijam, ki vplivajo na steroidogenezo, kot so na primer inhibitorji aromataze. Zaznavanje estrogenih kemikalij je mogoča z meritvijo indukcije VTG pri samcih in je bila obsežno dokumentirana v strokovno pregledani znanstveni literaturi. Indukcija VTG je bila dokazana tudi po izpostavljenosti androgenom, ki se lahko aromatizirajo (6) (7). Zaradi zmanjšanja ravni kroženja estrogena pri samicah, na primer z zaviranjem aromataze, ki spremeni endogeni androgen v naravni estrogen 17β-estradiol, se zmanjša koncentracija VTG, ki se uporablja za zaznavanje kemikalij, ki imajo lastnosti zaviranja aromataze, ali širše inhibitorjev steroidogeneze (33). Biološka pomembnost odziva VTG na zaviranje estrogena/aromataze je bila dokazana in obsežno dokumentirana (8) (9). Vendar je mogoče, da lahko na nastajanje VTG pri samicah vplivajo tudi splošna strupenost in neendokrini strupeni načini delovanja. | 5. | Za redno uporabo za kvantifikacijo VTG v krvi, jetrih, celotnem telesu ali odvzetih vzorcih homogenata glave/repa posameznih rib je bilo uspešno razvitih in standardiziranih več merilnih metod. Tako je pri cebrici, zetu in japonski medaki ter tudi pri delno validirani vrsti črnoglavega pisanca; na voljo so metode encimskega imunskega testa (ELISA), ki so specifične za posamezne vrste in uporabljajo imunokemijo za kvantifikacijo VTG (5) (10) (11) (12) (13) (14) (15) (16). Pri japonski medaki in cebrici je dobra povezava med VTG, izmerjenim v krvni plazmi, jetrih in vzorcih homogenata, čeprav bi lahko homogenati kazali nekoliko manjše vrednosti kot plazma (17) (18) (19). V Dodatku 5 so navedeni priporočeni postopki za odvzem vzorcev za analizo VTG. | 6. | Sprememba fenotipskega razmerja med spoloma (deleži po spolu) so končna točka, ki izraža spremembo spola. Načeloma lahko estrogeni, antiestrogeni, androgeni, antiandrogeni in kemikalije, ki zavirajo steroidogenezo, vplivajo na razmerje med spoloma pri ribah, ki se razvijajo (20). Dokazano je bilo, da je sprememba spola pri cebricah delno spremenljiva (21) po izpostavljenosti kemikaliji, ki je podobna estrogenu, pri čemer je sprememba spola po izpostavljenosti kemikaliji, ki je podobna androgenu, stalna (30). Spol se določi kot ženski, moški, dvospolni (v eni spolni žlezi so oociti in spermatogene celice) ali nediferenciran ter se pri posameznih ribah določi s histološkim pregledom spolnih žlez. Smernice so navedene v Dodatku 7 in Smernici OECD za določitev histopatologije, povezane z endokrinim sistemom, spolnih žlez pri ribah (22). | 7. | Genetski spol se pregleda prek genetskih označevalcev, kadar obstajajo pri dani vrsti rib. Pri japonski medaki se lahko ženski geni XX ali moški geni XY določijo z verižno reakcijo s polimerazo (PCR) ali z analizo na kromosom Y vezanega gena z domeno DM (prisotnost ali odsotnost domene DM), kot je opisano v (23) (24). Za zeta obstaja enakovredna metoda PCR za določitev genetskega spola, ki je opisana v Dodatku 10. Če se lahko posamezni genetski spol poveže s fenotipičnim spolom, se vrednost preskusa izboljša, pri čemer je zato treba genetski spol določiti pri vrstah z dokumentiranimi označevalci genetskega spola. | 8. | Glavni endokrini končni točki, tj. VTG in razmerje med spoloma, lahko skupaj dokažeta endokrini način delovanja (MOA) kemikalije (tabela 1). Razmerje med spoloma je biomarker, pomemben za populacijo (25) (26), za nekatere dobro opredeljene načine delovanja pa se lahko rezultati preskusa spolnega razvoja rib uporabijo za namene ocene nevarnosti in tveganja, če regulativna agencija meni, da je to ustrezno. Ti načini delovanja so zdaj estrogeni, androgeni in inhibitorji steroidogeneze. | Tabela 1 | Odziv endokrinih končnih točk na različne načine delovanja kemikalij: | ↑= povečevanje, ↓= zmanjševanje, – = se ne proučuje | MOA | VTG ♂ | VTG ♀ | Razmerje med spoloma | Viri | šibek agonist estrogena | ↑ | ↑ | ↑ ♀ ali ↑ nedif. | (27) (40) | močan agonist estrogena | ↑ | ↑ | ↑ ♀ ali ↑ nedif., ne ♂ | (28) (40) | antagonist estrogena | — | — | ↓ ♀, ↑ nedif. | (29) | agonist androgena | ↓ ali – | ↓ ali – | ↑ ♂, ne ♀ | (28) (30) | antagonist androgena | — | — | ↑ ♀ | ↑ dvospolni | (31) | inhibitor aromataze | ↓ | ↓ | ↓ ♀ | (33) | 9. | Preskus spolnega razvoja rib ne zajema razmnoževalne življenjske faze rib, zato je treba kemikalije, ki domnevno vplivajo na razmnoževanje pri nižjih koncentracijah kot na spolni razvoj, proučiti s preskusom, ki zajema razmnoževanje. | 10. | Opredelitve pojmov za namen te preskusne metode so navedene v Dodatku 1. | 11. | Cilj preskusa spolnega razvoja rib in vivo je določitev kemikalij z androgenimi in estrogenimi lastnostmi ter antiandrogenimi lastnostmi, antiestrogenimi lastnostmi in lastnostmi, ki zavirajo steroidogenezo. Fazi validacije preskusa spolnega razvoja rib (1 in 2) sta zajeli estrogene in androgene kemikalije ter kemikalije, ki zavirajo steroidogenezo. Učinki na antagoniste estrogena in androgena v preskusu spolnega razvoja rib so navedeni v tabeli 1, vendar so ti načini delovanja zdaj manj dokumentirani. | NAČELO PRESKUSA | 12. | V preskusu so ribe od novo oplojene ikre do konca spolne diferenciacije izpostavljene vsaj trem koncentracijam preskusne kemikalije, raztopljene v vodi. Preskusni pogoji morajo biti pretočni, razen če niso mogoči zaradi razpoložljivosti ali narave (npr. omejena topnost) preskusne kemikalije. Preskus se začne z vnosom novo oplojenih iker (pred brazdanjem blastodiska) v preskusne komore. Vnos posameznih vrst v komore je opisan v odstavku 27. Pri validiranih vrstah, tj. japonski medaki, zetu in cebrici, se preskus konča 60 dni po izvalitvi. Po koncu preskusa se vse ribe humano evtanazirajo. Za analizo VTG se odvzamejo biološki vzorci (krvna plazma, jetra ali homogenat glave/repa) posameznih rib, preostali del pa se fiksira za histološko oceno spolnih žlez, da se določi fenotipični spol; neobvezno se lahko opravi histopatologija (npr. določanje faze spolnih žlez, stopnja dvospolnosti). Pri vrstah, ki imajo ustrezne označevalce, se odvzame biološki vzorec (predrepna ali hrbtna plavut) za določitev genetskega spola (dodatka 9 in 10). | 13. | Pregled zadevnih preskusnih pogojev, specifičnih za validirane vrste, tj. japonsko medako, zeta in cebrico, je naveden v Dodatku 2. | INFORMACIJE O PRESKUSNI KEMIKALIJI | 14. | Na voljo morajo biti rezultati preskusa akutne strupenosti ali drugega kratkoročnega preskusa strupenosti [npr. preskusna metoda C.14 (34) in OECD TG 210 (1)], po možnosti izvedenega z vrstami, izbranimi za ta preskus. To pomeni, da sta znana topnost preskusne kemikalije v vodi in parni tlak preskusne kemikalije ter da je na voljo zanesljiva analitska metoda za kvantifikacijo kemikalije v preskusnih komorah z znano in izpričano točnostjo ter mejo zaznavnosti. | 15. | Druge uporabne informacije so strukturna formula, čistost kemikalije, stabilnost v vodi ali na svetlobi, Pow in rezultati preskusa za lahko biološko razgradljivost (metoda C.4) (35). | Merila za sprejemljivost preskusa | 16. | Za sprejemljivost rezultatov preskusa morajo biti izpolnjeni naslednji pogoji: | — | koncentracija raztopljenega kisika mora biti ves čas preskusa vsaj 60 % nasičenosti z zrakom (ASV), | — | razlika v temperaturi vode v različnih preskusnih komorah med obdobjem izpostavljenosti nikoli ne sme biti večja od ± 1,5 °C in jo je treba vzdrževati znotraj temperaturnih razponov, ki so določeni za preskusno vrsto (Dodatek 2), | — | na voljo mora biti validirana metoda za analizo kemikalije za izpostavljenost z mejo zaznavnosti, ki je znatno nižja od najnižje nominalne koncentracije, zbrati pa je treba dokaze, da so bile koncentracije preskusne kemikalije v raztopini zadovoljivo ohranjene v razponu ± 20 % srednjih izmerjenih vrednosti, | — | število vseh preživelih oplojenih iker v kontrolah in, kadar je primerno, v kontrolah s topilom mora biti večje ali enako mejnim vrednostim iz Dodatka 2, | — | merila sprejemljivosti, povezana z rastjo in lastnostmi spola ob koncu preskusa, temeljijo na podatkih iz kontrolnih skupin (združene kontrole s topilom in vodo, če pa se zelo razlikujejo, samo s topilom): | | Japonska medaka | Cebrica | Zet | Rast | Mokra teža ribe (osušene s pivnikom) | > 150 mg | > 75 mg | > 120 mg | Dolžina (standardna dolžina) | > 20 mm | > 14 mm | > 20 mm | Razmerje med spoloma (% samcev ali samic) | 30–70 % | 30–70 % | 30–70 % | — | Če se uporabi topilo, ne sme imeti statistično značilnega učinka na preživetje in ne sme povzročati učinkov endokrinih motilcev ali drugih škodljivih učinkov na zgodnje življenjske faze, kar se pokaže s kontrolo s topilom. | Če se opazi odstopanje od meril za sprejemljivost preskusa, je treba posledice obravnavati glede na zanesljivost podatkov o preskusu in te pomisleke vključiti v poročanje. | OPIS PRESKUSNE METODE | Preskusne komore | 17. | Uporabijo se lahko kakršne koli steklene, nerjavne ali druge kemijsko inertne komore. Komore morajo biti dovolj velike, da omogočajo skladnost s stopnjo obremenitve, navedeno v nadaljevanju. Priporočljivo je, da se preskusno komore naključno postavijo v preskusno območje. Bolj kot povsem naključni načrt se priporoča načrt naključne razdelitve v bloke, pri kateri so v vsakem bloku prisotne vse koncentracije. Preskusne komore morajo biti zaščitene pred neželenimi motnjami. | Izbira vrst | 18. | Priporočene vrste rib so navedene v Dodatku 2. Postopki za vključitev novih vrst so navedeni v odstavku 2. | Vzdrževanje starševskih rib | 19. | Podrobnosti o vzdrževanju starševskih rib v zadovoljivih pogojih so navedene v OECD TG 210 (1). Starševske ribe je treba enkrat ali dvakrat na dan hraniti z ustrezno hrano. | Ravnanje z embrii in ličinkami | 20. | Embrii in ličinke se lahko na začetku izpostavijo v glavni komori v manjših steklenih ali nerjavnih komorah, ki imajo mrežaste stranice ali konce, da se lahko skozi komoro pretaka preskusna kemikalija. Neturbulentni tok skozi te majhne komore se lahko doseže tako, da se komore obesijo na držalo, nameščeno tako, da premika posodo gor in dol, vendar tako, da so organizmi ves čas potopljeni. | 21. | Kadar se za zadrževanje iker v glavni preskusni komori uporabljajo posodice, rešetke ali mreže za ikre, je treba te priprave odstraniti, ko se ličinke izvalijo, obdržijo se le mreže, da ribe ne pobegnejo. Če je treba ličinke prenesti, se te ne smejo izpostaviti zraku in pri spuščanju rib iz posod za ikre se ne smejo uporabljati lovilne mrežice. Čas prenosa je različen, odvisno od vrste, in tudi ni vselej potreben. | Voda | 22. | Vsaka voda, v kateri je preživetje preskusne vrste v kontroli vsaj tako dobro kot v vodi, opisani v Dodatku 3, je primerna kot preskusna voda. Voda mora biti ves čas trajanja preskusa konstantne kakovosti. Za zagotovitev, da voda za redčenje ne bi neprimerno vplivala na rezultat preskusa (na primer z odzivom na preskusno kemikalijo) ali škodljivo učinkovala na produktivnost plemenskih rib, je treba v časovnih razmikih odvzemati vzorce za analizo. Skupni organski ogljik, prevodnost, pH in suspendirane trdne snovi je treba izmeriti na primer vsake tri mesece, če je znano, da je kakovost vode za redčenje razmeroma konstantna. Če je kakovost vode vprašljiva, je treba izvajati meritve težkih kovin (npr. Cu, Pb, Zn, Hg, Cd, Ni), glavnih anionov in kationov (npr. Ca2+, Mg2+, Na+, K+, Cl–, SO4 2–) ter pesticidov. Podrobnosti o kemijski analizi in odvzemu vode so navedene v odstavku 34. | Preskusne raztopine | 23. | Če je izvedljivo, je treba uporabiti pretočni sistem. Za pretočne preskuse je potreben sistem, ki stalno odmerja in redči založno raztopino preskusne kemikalije (npr. merilna črpalka, proporcionalni razredčevalnik in sistem naprav za nasičenje), da dovaja niz koncentracij v preskusne komore. Pretok založnih raztopin in vode za redčenje je treba med preskusom preverjati v časovnih razmikih in se ne sme razlikovati za več kot 10 % med celotnim preskusom. Ugotovljeno je bilo, da je primeren pretok enak prostornini vsaj petih preskusnih komor na 24 ur (1). Izogibati se je treba uporabi cevnega materiala ali drugih materialov, ki lahko vsebujejo biološko aktivne kemikalije ali adsorbirajo preskusno kemikalijo. | 24. | Založno raztopino je treba po možnosti pripraviti brez uporabe topil preprosto z mešanjem ali stresanjem preskusne kemikalije v vodi za redčenje z uporabo mehanskih sredstev (npr. z mešanjem ali ultrazvočnim razbijanjem). Če se preskusna kemikalija v vodi težko raztopi, je treba upoštevati postopke, opisane v Smernici OECD za preskušanje strupenosti zahtevnih snovi in zmesi v vodnem okolju (36). Uporabi topil se je treba izogniti, vendar bo v nekaterih primerih morda potrebna, da se pripravi primerno koncentrirana založna raztopina. Primeri ustreznih topil so navedeni v (36). | 25. | Polstatičnim preskusnim pogojem se je treba izogibati, razen če so utemeljeni s trdnimi razlogi, povezanimi s preskusno kemikalijo (npr. stabilnost, omejena razpoložljivost, visoki stroški ali nevarnost). Za polstatično tehniko se lahko uporabita dva različna postopka obnove; bodisi se pripravijo nove preskusne raztopine v čistih posodah ter se preživele ikre in ličinke nežno prenesejo v nove posode bodisi preskusni organizmi ostanejo v preskusnih komorah, medtem ko se vsak dan zamenja del (vsaj dve tretjini) preskusne vode. | POSTOPEK | Pogoji izpostavljenosti | Odvzem iker in trajanje | 26. | Da bi preprečili genetsko nagnjenost, se ikre odvzamejo pri vsaj treh parih ali skupinah, ki se parijo, premešajo in naključno izberejo za začetek preskusa. Opis umetne oploditve pri zetu je opisan v Dodatku 11. Preskus se mora začeti čim prej po tem, ko se ikre oplodijo, pri čemer se embrii po možnosti potopijo v preskusne raztopine pred začetkom brazdanja blastodiska ali čim prej po tej fazi in ne pozneje kot 12 ur po oploditvi. Preskus se mora izvajati do konca spolne diferenciacije v kontrolni skupini (pri japonski medaki, zetu in cebrici 60 dni po tem, ko se izležejo). | Obremenitev | 27. | Na začetku preskusa mora biti na eno koncentracijo vsaj 120 oplojenih iker, razdeljenih med vsaj 4 ponovitve (sprejemljiva je razporeditev v kontrole na podlagi kvadratnega korena). Ikre je treba naključno porazdeliti (z uporabo statističnih tabel za naključno razporeditev) med tretiranja. Stopnja obremenitve (za opredelitev glej Dodatek 1) mora biti dovolj nizka za vzdrževanje koncentracije raztopljenega kisika na vsaj 60 % nasičenosti z zrakom brez neposrednega prezračevanja komor. Za pretočne preskuse je priporočena stopnja obremenitve, ki nikoli ne presega 0,5 g/l na 24 ur in ne presega 5 g/l raztopine. Najpozneje 28 dni po oploditvi je treba število rib na ponovitev prerazporediti, da je v vsaki ponovitvi čim bolj enako število rib. Če se pojavi smrtnost, povezana z izpostavljenostjo, je treba število ponovitev ustrezno zmanjšati, da se ohrani čim bolj enaka gostota rib med stopnjami tretiranja. | Svetloba in temperatura | 28. | Obdobje osvetljenosti in temperatura vode morata biti ustrezna za preskusno vrsto (za poskuse pogoje za preskus spolnega razvoja rib glej Dodatek 2). | Hranjenje | 29. | Hrana in hranjenje sta ključna, zato je bistveno, da se pravilna hrana za posamezno fazo dovaja v ustreznih časovnih razmikih in v količini, ki je ustrezna za podporo normalne rasti. Hranjenje mora biti ad libitum, pri čemer je treba čim bolj zmanjšati presežek. Za zagotovitev ustrezne hitrosti rasti je treba ribe hraniti vsaj dvakrat na dan (ob vikendih je sprejemljivo enkrat na dan), med posameznimi krmljenji pa morajo preteči vsaj tri ure. Ostanke hrane in iztrebke je treba odstraniti, da se prepreči kopičenje odpadkov. S pridobljenimi izkušnjami se hrana in načini hranjenja stalno izpopolnjujejo, da se izboljšata preživetje in rast. Zato si je treba prizadevati za potrditev predlaganega načina pri priznanih strokovnjakih. Hranjenje je treba prekiniti 24 ur pred koncem preskusa. Primeri ustrezne hrane so navedeni v Dodatku 2 (glej tudi okvir OECD za preskušanje rib (39)). | Preskusne koncentracije | 30. | Preskusne kemikalije morajo biti razporejene, kot je opisano v Dodatku 4. Uporabiti je treba vsaj tri preskusne koncentracije v vsaj štirih ponovitvah. Pri izbiri obsega preskusnih koncentracij je treba upoštevati krivuljo odvisnosti LC50 od časa izpostavljenosti pri akutnih študijah. Če se bodo podatki uporabiti za oceno tveganja, se priporoča pet preskusnih koncentracij. | 31. | Koncentracij kemikalije, ki so višje od 10 % LC50 pri akutnem odraslem osebku ali 10 mg/l, katera koli je nižja, ni treba preskusiti. Najvišja preskusna koncentracija mora biti 10 % LC50 v življenjski fazi ličinke/mladiča. | Kontrole | 32. | Poleg preskusnih koncentracij je treba izvesti tudi kontrolo z vodo za redčenje (≥ 4 ponovitve) in, če je ustrezno, kontrolo s topilom (≥ 4 ponovitve). V preskusu se lahko uporabijo le topila, za katera je bilo dokazano, da nimajo statistično značilnega učinka na končne točke preskusa. | 33. | Če se uporabi topilo, njegova končna koncentracija ne sme biti večja od 0,1 ml/l (36) in mora biti enaka v vseh preskusnih komorah, razen v kontroli z vodo za redčenje. Vendar si je treba čim bolj prizadevati, da se taka topila ne uporabijo ali da so koncentracije topil čim nižje. | Pogostost analitskih določitev in meritev | 34. | Kemijsko analizo koncentracije preskusne kemikalije je treba izvesti pred začetkom preskusa, da se preveri skladnost z merili sprejemljivosti. Vse ponovitve je treba ločeno analizirati na začetku in koncu preskusa. Med preskusom je treba vsaj enkrat na teden analizirati eno ponovitev na preskusno koncentracijo, pri čemer se ponovitve sistematično zamenjujejo (1, 2, 3, 4, 1, 2 …). Če se vzorci shranijo za poznejšo analizo, je treba metodo shranjevanja vzorcev predhodno validirati. Vzorce je treba filtrirati (npr. skozi 0,45 μm velike pore) ali centrifugirati, da se zagotovijo določitve kemikalij v dejanski raztopini. | 35. | Med preskusom je treba meriti raztopljeni kisik, pH, skupno trdoto, prevodnost, slanost (če je ustrezno) in temperaturo v vseh preskusnih komorah. Raztopljeni kisik, slanost (če je ustrezno) in temperaturo je treba meriti vsaj enkrat na teden, pH, prevodnost in trdoto pa na začetku in koncu preskusa. Temperaturo je treba po možnosti stalno spremljati v vsaj eni preskusni komori. | 36. | Rezultati morajo temeljiti na merjenih koncentracijah. Če pa se je koncentracija preskusne kemikalije v raztopini zadovoljivo vzdrževala znotraj ± 20 % nominalne koncentracije ves čas preskusa, lahko rezultati temeljijo na nominalnih ali merjenih vrednostih. | Opažanja in meritve | Faze razvoja embria | 37. | Izpostavljenost se mora začeti čim prej po oploditvi in pred začetkom brazdanja blastodiska, vendar ne pozneje kot 12 ur po oploditvi, da se zagotovi izpostavljenost med zgodnjo fazo embrionalnega razvoja. | Izvalitev in preživetje | 38. | Vsaj enkrat na dan je treba opazovati izvalitev in preživetje ter to zapisati. Mrtve zarodke, ličinke in mladiče je treba odstraniti čim prej po tem, ko se opazijo, ker se lahko hitro razkrojijo in razpadejo zaradi delovanja drugih rib. Izjemna pazljivost je potrebna pri odstranjevanju posameznih mrtvih osebkov, da ne udarimo ali fizično poškodujemo sosednjih iker/ličink, saj so te izjemno nežne in občutljive. Merila za smrt so različna glede na življenjsko fazo: | — | za ikre: zlasti v zgodnjih fazah opazna izguba prosojnosti in sprememba barve, ki jo povzroči koagulacija in/ali obarjanje beljakovin, ki povzročajo bel moten videz, | — | za ličinke in mladiče: negibnost in/ali odsotnost dihalnega gibanja in/ali odsotnost srčnega utripa in/ali bela motna obarvanost osrednjega živčnega sistema in/ali pomanjkanje odzivanja na mehanske dražljaje. | Nenormalen videz | 39. | Zabeležiti je treba število ličink ali rib, pri katerih se kaže nenormalna oblika telesa, pri čemer je treba opisati videz in naravo nenormalnosti. Opozoriti je treba, da so nenormalni embrii in ličinke lahko naraven pojav, in jih je v kontrolah pri nekaterih vrstah lahko več odstotkov. Nenormalne živali je treba odstraniti iz preskusnih komor, ko poginejo. Vendar je treba v skladu z Direktivo 2010/63/EU Evropskega parlamenta in Sveta z dne 22. septembra 2010 o zaščiti živali, ki se uporabljajo v znanstvene namene, živali anestezirati in evtanazirati v skladu z opisom iz odstavka 44 ter jih za analizo podatkov obravnavati kot smrtne primere, če nenormalnosti povzročajo bolečino, trpljenje in stisko ali je mogoče zanesljivo predvideti trajne poškodbe in pogin. | Nenormalno obnašanje | 40. | Nenormalnosti, npr. hiperventilacijo, nekoordinirano plavanje, netipično mirovanje in netipično obnašanje pri hranjenju, je treba zapisati, ko je pojavijo. | Teža | 41. | Na koncu preskusa je treba vse preživele ribe evtanazirati (anestezirati, če je treba vzeti vzorce krvi) ter izmeriti mokro težo (osušeno s pivnikom) posameznih osebkov. | Dolžina | 42. | Na koncu preskusa je treba izmeriti dolžine (standardna dolžina) posameznih osebkov. | 43. | Na podlagi teh opažanj bodo za poročanje na voljo vsi ali nekateri podatki, navedeni v nadaljevanju: | — | skupna smrtnost, | — | število zdravih rib na koncu preskusa, | — | čas začetka in konca izvalitve, | — | dolžina in teža preživelih živali, | — | število deformiranih živali, | — | število rib, ki kažejo nenormalno obnašanje. | Vzorčenje rib | 44. | Ribe se vzorčijo ob zaključku preskusa. Vzorčene ribe je treba evtanazirati npr. z MS-222 (100–500 mg/l, pufran z 200 mg NaHCO3/l) ali FA-100 (4-alil-2-metoksifenol: evgenol) ter jih ločeno izmeriti in stehtati kot mokro težo (osušeno s pivnikom) ali anestezirati, če je treba vzeti vzorec krvi (glej odstavek 49). | Vzorčenje za analizo VTG in določitev spola s histološko oceno | 45. | Vse ribe je treba vzorčiti in pripraviti za analizo spola in VTG. Vse ribe je treba histološko analizirati, da se določi spol. Za meritve VTG je sprejemljivo podvzorčenje vsaj 16 rib iz vsake ponovitve. Za VTG je treba analizirati več rib, če se izkaže, da rezultati podvzorčenja niso jasni. | 46. | Postopek vzorčenja za VTG in določitev spola je odvisen od metode analize VTG. | Metoda homogenata glave/repa za analizo VTG | 47. | Riba se evtanazira. Glava in rep vsake ribe se ločita od njenega telesa z rezi s skalpelom neposredno za prsnimi plavutmi in neposredno za hrbtno plavutjo (glej sliko 1). Glave in repi rib se združijo, stehtajo ter ločeno oštevilčijo, zamrznejo v tekočem dušiku in shranijo pri – 70 °C ali manj za analizo VTG. Telo ribe se oštevilči in fiksira v ustreznem fiksativu za histološko oceno (22). Z uporabo te metode se VTG in histopatologija ocenita pri vsakem posameznem osebku, zato se lahko morebitna sprememba ravni VTG poveže s fenotipičnim spolom ribe ali genetskim spolom (japonska medaka in zet) ribe. Dodatne informacije so navedene v smernici za homogenizacijo (Dodatek 5) in smernici za kvantifikacijo VTG (Dodatek 6). | Metoda živega homogenata za analizo VTG | 48. | Riba se evtanazira. Jetra se secirajo in shranijo pri – 70 °C ali nižji temperaturi. Priporočeni postopki za odstranitev jeter in predhodno tretiranje so navedeni v OECD TG 229 (37) ali v poglavju C.37 te priloge (38). Jetra se nato ločeno homogenizirajo, kot je opisano v OECD TG 229 ali poglavju C.37 te priloge. Zbrani supernatant se uporabi za merjenje VTG s homogeno tehniko ELISA (glej Dodatek 6 za primer kvantifikacije pri cebrici ali OECD TG 229 (37) pri japonski medaki). Na podlagi tega pristopa se lahko pridobijo tudi podatki o VTG in histologiji spolnih žlez pri posameznih ribah. | Metoda krvne plazme za analizo VTG | 49. | Za pridobitev plazme se kri odvzame iz anestezirane ribe s srčno punkcijo, iz repne vede ali z rezom repa in centrifugira pri 4 °C. Plazma se do uporabe hrani pri – 70 °C ali nižji temperaturi. Za histologijo se cela riba evtanazira in fiksira. Vzorci plazme in ribe se ločeno oštevilčijo, da se ravni VTG povežejo s spolom ribe. | Slika 1 | Rezanje ribe za meritev VTG v homogenatu glava/rep in histološko oceno srednje rezine | Določitev genetskega spola | 50. | Pri vrstah, ki imajo ustrezne označevalce, se za določitev genetskega spola odvzame biološki vzorec posamezne ribe. Pri japonski medaki se odvzame iz predrepne ali hrbtne plavuti. Podroben opis, vključno z vzorčenjem tkiva in določanjem spola z metodo PCR, je naveden v Dodatku 9. Enako je za zeta opis vzorčenja tkiva in metode PCR za določanje spola naveden v Dodatku 10. | Meritev VTG | 51. | Meritev VTG mora temeljiti na kvantitativno in analitsko validirani metodi. Na voljo morajo biti informacije o variabilnosti metode pri preskusu in med preskusi, uporabljene v zadevnem laboratoriju. Vir laboratorijske in medlaboratorijske variabilnosti (najverjetneje) temelji na različnih razvojnih fazah populacije rib. Glede na variabilnost meritev VTG je treba NOEC, ki temeljijo le na tej končni točki, obravnavati zelo previdno. Na voljo so različne metode za oceno nastajanja VTG pri vrstah rib, obravnavanih v tem preskusu. Merilna tehnika, ki je razmeroma občutljiva in specifična, je določitev koncentracij proteinov z encimskim imunskim testom (ELISA). Uporabiti je treba homologna protitelesa (proti VTG iste vrste) in najpomembnejše homologne raztopine. | Določanje spola | 52. | Glede na postopek vzorčenja VTG se cela riba ali preostali srednji del vsake ribe vstavi v predhodno označeno kaseto za obdelavo in fiksira v ustreznem fiksativu za histološko določitev spola (neobvezno tudi za oceno določanja faze spolnih žlez). Smernice za fiksiranje in vstavljanje so navedene v Dodatku 7 in Smernici OECD za določitev histopatologije, povezane z endokrinim sistemom, spolnih žlez pri ribah (22). Ribe se po obdelavi vstavijo v parafinske bloke. Osebki se v parafinski blok vstavijo vzdolžno. Pri vsakem osebku se odvzame vsaj šest vzdolžnih rezin (debeline 3–5 μm) s sprednje ravnine, vključno s spolnim tkivom obeh spolnih žlez. Razmik med temi rezinami mora biti približno 50 μm pri samcih in 250 μm pri samicah. Ker pa vsak blok pogosto vsebuje samce in samice (če je v vsak blok vstavljen več kot en osebek), mora biti razmik med rezinami iz teh blokov približno 50 μm, dokler se ne pridobi vsaj šest rezin spolnih žlez od vsakega samca. Zato se lahko razmik med rezinami poveča na približno 250 μm pri samicah. Rezine se pobarvajo s hematoksilinom in eozinom ter pregledajo pod svetlobnim mikroskopom, pri čemer se osredotoči na spol (samec, samica, dvospolnik ali nediferencirani osebek). Dvospolnost je opredeljena kot prisotnost več kot enega oocita v testisu na šest analiziranih rezin ali spermatogenih celic (da/ne) v jajčnikih. Histopatologija ter določanje faze jajčnikov in testisov nista obvezna, če pa se izvedeta, je treba rezultate sistematično analizirati in o njih poročati. Opozoriti je treba, da je za nekatere vrste rib običajna nepopolna razvitost para spolnih žlez, pri čemer je lahko prisotna le ena spolna žleza (npr. japonska medaka in občasno cebrica). Vsa taka opažanja je treba zabeležiti. | 53. | Določitev genetskega spola pri posameznih osebkih japonske medake temelji na prisotnosti ali odsotnosti gena za določitev moškega spola, DMY, ki se nahaja na kromosomu Y. Genotipski spol medake se lahko določi s sekvenciranjem gena DMY iz DNA, ekstrahirane na primer iz kosa predrepne ali hrbtne plavuti. Prisotnost DMY kaže posameznika (samca) z geni XY ne glede na fenotip, medtem ko odsotnost DMY kaže posameznika (samico) z geni XX ne glede na fenotip (23). Smernice za pripravo tkiva in metodo PCR so navedene v Dodatku 9. Genetski spol se pri posameznih zetih določa tudi z metodo PCR, ki je opisana v Dodatku 10. | 54. | O pojavu dvospolnosti (za opredelitev glej Dodatek 1) je treba poročati. | Sekundarne spolne značilnosti | 55. | Sekundarne spolne značilnosti so pri vrstah, kot je japonska medaka, endokrino nadzorovane, zato je treba po možnosti opazovanje fizičnega videza rib izvesti na koncu izpostavljenosti. Pri japonski medaki je oblikovanje papil na zadnjem delu predrepne plavuti pri samicah občutljivo na androgen. V poglavju C.37 te priloge (38) so zadevne fotografije sekundarnih spolnih značilnosti pri samcih in androgeniziranih samic. | PODATKI IN POROČANJE | Obdelava rezultatov | 56. | Pomembno je, da se končna točka določi z najmočnejšim statističnim preskusom. Dvojnik je poskusna enota, vendar je treba v statistično preskušanje vključiti variabilnost v ponovitvah. V Dodatku 8 je na voljo diagram poteka za odločitev o uporabi najprimernejšega statističnega preskusa na podlagi značilnosti podatkov, pridobljenih s preskusom. Raven statistične značilnosti za vse vključene končne točke je 0,05. | Deleži spola in genetskega spola | 57. | Če obstaja monotoni odziv na odmerek, je treba deleže spola za znatne učinke (pristop NOEC/LOEC) izpostavljenosti analizirati s preskusom po Jonckheere-Terpstraju (preskus trenda). Če je ugotovljena nemonotonost, je treba uporabiti preskus med pari: Dunnettov preskus se uporabi, če se lahko pridobita normalnost in homogenost varianc. Tamhane-Dunnetov preskus se uporabi, če je prisotna homogenost varianc. Sicer se uporabi Mann-Whitneyjev preskus z Bonferroni-Holmovo prilagoditvijo. V Dodatku 8 je diagram poteka, v kateri so navedeni statistični podatki o deležih spola. Deleže spola je treba v tabelah predstaviti kot koncentracijski delež ± standardni odklon samcev, samic, dvospolnikov in nediferenciranih osebkov. Statistično značilnost je treba poudariti. Primeri so navedeni v validacijskem poročilu faze 2 preskusa spolnega razvoja rib (42). Genetski spol je treba sporočiti kot delež sprememb fenotipičnega spola samic, samcev, dvospolnikov in nediferenciranih osebkov. | Koncentracije VTG | 58. | Analizirati je treba pomemben učinek (pristop NOEC/LOEC) izpostavljenosti koncentracijam VTG. Bolj zaželen kot t-preskus z Bonferronijevim popravkom je Dunnettov preskus. Če se uporabi Bonferronijev popravek, je bolj zaželen Bonferroni-Holmov popravek. Dovoliti je treba logaritmično transformacijo VTG, da se dosežeta normalnost in homogenost varianc. Če je odziv na koncentracijo skladen z monotonostjo, ima preskus po Jonckheere-Terpstraju prednost pred vsemi navedenimi preskusi. Če se uporabi t-preskus ali Dunnettov preskus, za nadaljevanje ni potreben F-preskus pomembnosti analize variance. Podrobnosti so navedene v tabeli poteka v Dodatku 8. Rezultate je treba predstaviti v tabelah kot koncentracijske sredine ± standardni odklon samcev, samic, dvospolnikov in nediferenciranih osebkov. Poudariti je treba statistično značilnost za fenotipične samice in fenotipične samce. Primeri so navedeni v validacijskem poročilu faze 2 preskusa spolnega razvoja rib (42). | Dejanske koncentracije preskusne kemikalije | 59. | Dejanske koncentracije preskusne kemikalije v komorah je treba analizirati tako pogosto, kot je opisano v odstavku 34. Rezultate je treba sporočiti v tabelah kot srednjo koncentracijo ± standardni odklon na podlagi ponovitev in na podlagi koncentracij skupaj s poudarjenimi informacijami o številu vzorcev in izjemami pri srednji koncentraciji za tretiranje ± 20 %. Primeri so navedeni v validacijskem poročilu faze 2 preskusa spolnega razvoja rib (42). | Razlaga rezultatov | 60. | Rezultate preskusa je treba razlagati previdno, kadar so merjene koncentracije preskusne kemikalije v preskusnih raztopinah blizu meje zaznavnosti analitske metode. | Poročilo o preskusu | 61. | V poročilu o preskusu morajo biti naslednje informacije: | | Preskusna kemikalija | — | zadevne fizikalno-kemijske lastnosti, identifikacijski podatki kemikalije vključno s čistostjo in analitsko metodo za kvantifikacijo preskusne kemikalije. | | Preskusni pogoji | — | Uporabljeni postopek (npr. pretočni semi-statični/obnavljajoči; načrt preskusa, vključno s preskusnimi koncentracijami, metodo priprave založnih raztopin (v prilogi), pogostostjo obnavljanja (navesti je treba sredstvo za raztapljanje in njegovo koncentracijo, če se uporabi), | — | nominalne preskusne koncentracije, srednje vrednosti izmerjenih vrednosti in njihovi standardni odkloni v preskusnih komorah in metoda, s katero so bile te dobljene (uporabljeno analitsko metodo je treba predstaviti v prilogi), ter dokazi, da se meritve nanašajo na koncentracije preskusne kemikalije v pravi raztopini, | — | kakovost vode v preskusnih komorah, pH, trdota, temperatura in koncentracija raztopljenega kisika, | — | podrobne informacije o hranjenju (npr. vrsta hrane, vir, dana količina in pogostost dajanja ter analiza onesnaževal (npr. PCB, PAH in organoklorni pesticidi), če je ustrezno. | | Rezultati | — | Dokazi, da so kontrole izpolnjevale merila za veljavnost: podatke o hitrosti izvalitve je treba predstaviti v tabelah kot delež na ponovitev in na koncentracijo. Poudariti je treba izjeme pri merilih sprejemljivosti (v kontrolah). Preživetje je treba predstaviti kot delež na ponovitev in na koncentracijo. Poudariti je treba izjeme pri merilih za veljavnost (v kontrolah), | — | jasna navedba rezultatov, pridobljenih na različnih opazovanih končnih točkah: preživetje embriov in uspešna izvalitev; zunanje nenormalnosti, dolžina in teža; meritve VTG (ng/g homogenata, ng/ml plazme ali ng/mg jeter); histologija spolnih žlez, razmerje med spoloma, podatki o genetskem spolu, pojav katerih koli nenavadnih odzivov rib in vidnih učinkov zaradi preskusne kemikalije. | 62. | Rezultate preskusa je treba predstaviti kot srednje vrednosti ± standardni odklon (SD) ali standardno napako (SE). Statistične podatke je treba sporočiti vsaj kot NOEC in LOEC ter intervale zaupanja. Upoštevati je treba statistično tabelo poteka (Dodatek 8). | LITERATURA | (1) | OECD (1992), Fish, Early Life Stage Toxicity Test, Test Guideline No. 210, Guidelines for the Testing of Chemicals, OECD, Pariz. | (2) | Jobling, S., Sheahan, D., Osborne, J. A., Matthiessen, P., in Sumpter, J. P. (1996). ‚Inhibition of testicular growth in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) exposed to estrogenic alkylphenolic chemicals‘, Environmental Toxicology and Chemistry 15, str. 194–202. | (3) | Sumpter, J. P., in Jobling, S. (1995). ‚Vitellogenesis As A Biomarker for Estrogenic Contamination of the Aquatic Environment‘, Environmental Health Perspectives 103, str. 173– 178. | (4) | Tyler, C. R., van Aerle, R., Hutchinson, T. H., Maddix, S. in Trip, H. (1999). ‚An in vivo testing system for endocrine disruptors in fish early life stages using induction of vitellogenin‘, Environmental Toxicology and Chemistry 18, str. 337–347. | (5) | Holbech, H., Andersen, L., Petersen, G. I., Korsgaard, B., Pedersen, K. L. in Bjerregaard, P. (2001a). ‚Development of an ELISA for vitellogenin in whole body homogenate of zebrafish (Danio rerio)‘, Comparative Biochemistry and Physiology C-Toxicology & Pharmacology 130, str. 119– 131. | (6) | Andersen, L., Bjerregaard, P., in B. Korsgaard (2003). ‚Vitellogenin induction and brain aromatase activity in adult male and female zebrafish exposed to endocrine disrupters‘, Fish Physiology and Biochemistry 28, str. 319–321. | (7) | Orn, S., Holbech, H., Madsen, T. H., Norrgren, L., in Petersen, G. I. (2003). ‚Gonad development and vitellogenin production in zebrafish (Danio rerio) exposed to ethinylestradiol and methyltestosterone‘, Aquatic Toxicology 65, str. 397–411. | (8) | Panter, G. H., Hutchinson, T. H., Lange, R., Lye, C. M., Sumpter, J. P., Zerulla, M., in Tyler, C. R. (2002). ‚Utility of a juvenile fathead minnow screening assay for detecting (anti-)estrogenic substances‘, Environmental Toxicology and Chemistry 21, str. 319–326. | (9) | Sun, L. W., Zha, J. M., Spear, P. A., in Wang, Z. J. (2007). ‚Toxicity of the aromatase inhibitor letrozole to Japanese medaka (Oryzias latipes) eggs, larvae and breeding adults‘, Comparative Biochemistry and Physiology C-Toxicology & Pharmacology 145, str. 533–541. | (10) | Parks, L. G., Cheek, A. O., Denslow, N. D., Heppell, S. A., McLachlan, J. A., LeBlanc, G. A., in Sullivan, C. V. (1999). ‚Fathead minnow (Pimephales promelas) vitellogenin: purification, characterization and quantitative immunoassay for the detection of estrogenic compounds‘, Comparative Biochemistry and Physiology C-Toxicology & Pharmacology 123, str. 113– 125. | (11) | Brion, F., Nilsen, B. M., Eidem, J. K., Goksoyr, A., in Porcher, J. M. (2002). ‚Development and validation of an enzyme-linked immunosorbent assay to measure vitellogenin in the zebrafish (Danio rerio)‘, Environmental Toxicology and Chemistry 21, str. 1699– 1708. | (12) | Nishi, K., Chikae, M., Hatano, Y., Mizukami, H., Yamashita, M., Sakakibara, R., in Tamiya, E. (2002). ‚Development and application of a monoclonal antibody-based sandwich ELISA for quantification of Japanese medaka (Oryzias latipes) vitellogenin‘, Comparative Biochemistry and Physiology C-Toxicology & Pharmacology 132, str. 161– 169. | (13) | Hahlbeck, E., Katsiadaki, I., Mayer, I., Adolfsson-Erici, M., James, J., in Bengtsson, B. E. (2004). ‚The juvenile three-spined stickleback (Gasterosteus aculeatus L.) as a model organism for endocrine disruption – II – kidney hypertrophy, vitellogenin and spiggin induction‘, Aquatic Toxicology 70, str. 311–326. | (14) | Tatarazako, N., Koshio, M., Hori, H., Morita, M.. in Iguchi, T. (2004). ‚Validation of an enzyme-linked immunosorbent assay method for vitellogenin in the medaka‘, Journal of Health Science 50, str. 301–308. | (15) | Eidem, J. K., Kleivdal, H., Kroll, K., Denslow, N., van Aerle, R., Tyler, C., Panter, G., Hutchinson, T., in Goksoyr, A. (2006). ‚Development and validation of a direct homologous quantitative sandwich ELISA for fathead minnow (Pimephales promelas) vitellogenin. Aquatic Toxicology‘, 78, str. 202–206. | (16) | Jensen, K. M., in Ankley, G. T. (2006). ‚Evaluation of a commercial kit for measuring vitellogenin in the fathead minnow (Pimephales promelas)‘, Ecotoxicology and Environmental Safety 64, str. 101– 105. | (17) | Holbech, H., Petersen, G. I., Norman, A., Örn, S., Norrgren, L., in Bjerregaard, P. (2001b). ‚Suitability of zebrafish as test organism for detection of endocrine disrupting chemicals. Comparison of vitellogenin in plasma and whole body homogenate from zebrafish (Danio rerio) and rainbow trout (Oncorhynchus mykiss)‘, Nordic Council of Ministers, TemaNord 2001:597, str. 48–51. | (18) | Nilsen, B. M., Berg, K., Eidem, J. K., Kristiansen, S. I., Brion, F., Porcher, J. M. in Goksoyr, A. (2004). ‚Development of quantitative vitellogenin-ELISAs for fish test species used in endocrine disruptor screening‘, Analytical and Bioanalytical Chemistry 378, str. 621–633. | (19) | Orn, S., Yamani, S. in Norrgren, L. (2006). ‚Comparison of vitellogenin induction, sex ratio, and gonad morphology between zebrafish and Japanese medaka after exposure to 17 alpha-ethinylestradiol and 17 beta-trenbolone‘, Archives of Environmental Contamination and Toxicology 51, str. 237–243. | (20) | Scholz, S., in Kluver, N. (2009). ‚Effects of Endocrine Disrupters on Sexual, Gonadal Development in Fish, Sexual Development‘ 3, str. 136– 151. | (21) | Fenske, M., Maack, G., Schafers, C. in Segner, H. (2005). ‚An environmentally relevant concentration of estrogen induces arrest of male gonad development in zebrafish, Danio rerio‘, Environmental Toxicology and Chemistry 24, str. 1088– 1098. | (22) | OECD (2010), Guidance Document on the Diagnosis of Endocrine-related Histopathology in Fish Gonads, Series on Testing and Assessment No. 123, ENV/JM/MONO(2010)14, OECD, Pariz. | (23) | Kobayashi, T., Matsuda, M., Kajiura-Kobayashi, H., Suzuki, A., Saito, N., Nakamoto, M., Shibata, N., in Nagahama, Y. (2004). ‚Two DM domain genes, DMY and DMRT1, involved in testicular differentiation and development in the medaka, Oryzias latipes‘, Developmental Dynamics 231, str. 518–526. | (24) | Shinomiya, A., Otake, H., Togashi, K., Hamaguchi, S., in Sakaizumi M. (2004), ‚Field survey of sex-reversals in the medaka, Oryzias latipes: genotypic sexing of wild populations‘, Zoological Science 21, str. 613–619. | (25) | Kidd, K. A., Blanchfield, P. J., Mills, K. H., Palace, V. P., Evans, R. E., Lazorchak, J. M., in Flick, R. W. (2007). ‚Collapse of a fish population after exposure to a synthetic estrogen‘, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 104, str. 8897–8901. | (26) | Palace,V. P., Evans, R. E., Wautier, K. G., Mills, K. H., Blanchfield, P. J., Park, B. J., Baron, C. L., in Kidd, K. A. (2009). ‚Interspecies differences in biochemical, histopathological, and population responses in four wild fish species exposed to ethynylestradiol added to a whole lake‘, Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences 66, str. 1920– 1935. | (27) | Panter, G. H., Hutchinson, T. H., Hurd, K. S., Bamforth, J., Stanley, R. D., Duffell, S., Hargreaves, A., Gimeno, S., in Tyler, C. R. (2006). ‚Development of chronic tests for endocrine active chemicals – Part 1. An extended fish early-life stage test for oestrogenic active chemicals in the fathead minnow (Pimephales promelas)‘, Aquatic Toxicology 77, str. 279–290. | (28) | Holbech, H., Kinnberg, K., Petersen, G. I., Jackson, P., Hylland, K., Norrgren, L., in Bjerregaard, P. (2006). ‚Detection of endocrine disrupters: Evaluation of a Fish Sexual Development Test (FSDT)‘, Comparative Biochemistry and Physiology C-Toxicology & Pharmacology 144, str. 57–66. | (29) | Andersen, L., Kinnberg, K., Holbech, H., Korsgaard, B., in Bjerregaard, P. (2004). ‚Evaluation of a 40 day assay for testing endocrine disrupters: Effects of an anti-estrogen and an aromatase inhibitor on sex ratio and vitellogenin concentrations in juvenile zebrafish (Danio rerio)‘, Fish Physiology and Biochemistry 30, str. 257–266. | (30) | Morthorst, J. E., Holbech, H., in Bjerregaard, P. (2010). ‚Trenbolone causes irreversible masculinization of zebrafish at environmentally relevant concentrations‘, Aquatic Toxicology 98, str. 336–343. | (31) | Kiparissis,Y., Metcalfe, T. L., Balch, G. C. in Metcalf, C. D. (2003). ‚Effects of the antiandrogens, vinclozolin and cyproterone acetate on gonadal development in the Japanese medaka (Oryzias latipes)‘, Aquatic Toxicology 63, str. 391–403. | (32) | Panter, G. H., Hutchinson, T. H., Hurd, K. S., Sherren, A., Stanley, R. D., in Tyler, C. R. (2004). ‚Successful detection of (anti-) androgenic and aromatase inhibitors in pre-spawning adult fathead minnows (Pimephales promelas) using easily measured endpoints of sexual development‘, Aquatic Toxicology 70, str. 11–21. | (33) | Kinnberg, K., Holbech, H., Petersen, G. I., in Bjerregaard, P. (2007). ‚Effects of the fungicide prochloraz on the sexual development of zebrafish (Danio rerio)‘, Comparative Biochemistry and Physiology C-Toxicology & Pharmacology 145, str. 165– 170. | (34) | Poglavje C.14 te priloge, Preskus rasti ribjih mladic. | (35) | Poglavje C.4 te priloge, Razgradnja – biokemijska potreba po kisiku. | (36) | OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures, Series on Testing and Assessment No. 23, OECD, Pariz. | (37) | OECD (2009). Fish Short Term Reproduction Assay, Test Guideline No. 229, Guidelines for the Testing of Chemicals, OECD, Pariz. | (38) | Poglavje C.37 te priloge, 21-dnevni preskus rib: kratkotrajno presejalno preskušanje estrogenega in androgenega delovanja ter zaviranja aromataze. | (39) | OECD (2012). Fish Toxicity Testing Framework, Series on Testing and Assessment No. 171, OECD, Pariz. | (40) | Schäfers, C., Teigeler, M., Wenzel, A., Maack, G., Fenske, M., Segner, H. (2007). ‚Concentration- and time-dependent effects of the synthetic estrogen, 17 alpha-ethinylestradiol, on reproductive capabilities of the zebrafish, Danio rerio‘, Journal of Toxicology and Environmental Health-Part A, 70, 9– 10 str. 768–779. | (41) | OECD (2011), Validation Report (Phase 1) for the Fish Sexual Development Test, Series on Testing and Assessment No 141, ENV/JM/MONO(2011)22, OECD, Pariz. | (42) | OECD (2011), Validation Report (Phase 2) for the Fish Sexual Development Test, Series on Testing and Assessment No 142, ENV/JM/MONO(2011)23, OECD, Pariz. | (43) | OECD (2011), Peer Review Report of the validation of the Fish Sexual Development Test, Series on Testing and Assessment No 143, ENV/JM/MONO(2011)24, OECD, Pariz. | (44) | Direktiva 2010/63/EU Evropskega parlamenta in Sveta z dne 22. septembra 2010 o varstvu živali, ki se uporabljajo za znanstvene namene. UL L 276, 20.10.2010, str. 33. | Dodatek 1 | Okrajšave in opredelitev pojmov | Zgornja končna točka : povzroča učinke na ravni populacije. | ASV : nasičenost z zrakom (air saturation value). | Biomarker : povzroča učinke na ravni posameznega osebka. | Kemikalija : snov ali zmes. | Dph : dnevi po izvalitvi (days post hatch). | DMY : na kromosom Y vezan gen z domeno DM, ki je potreben za razvoj samcev medak. | ELISA : encimski imunski test. | Teža ribe : mokra teža ribe (osušene s pivnikom). | FSDT : preskus spolnega razvoja rib. | Os HPG : os hipotalamus – hipofiza – spolne žleze. | Dvospolne ribe : ribe z več kot enim oocitom v testisu na 6 analiziranih delov ali spermatogenimi celicami v jajčnikih (da/ne). | Stopnja obremenitve : mokra teža rib na prostornino vode. | MOA : način delovanja. | RT-PCR : verižna reakcija s polimerazo z reverzno transkriptazo. | Preskusna kemikalija : vsaka snov ali zmes, preskušena z uporabo te preskusne metode. | Nediferencirane ribe : ribe s spolnimi žlezami, ki ne kažejo zaznavnih zarodnih celic. | VTG : vitelogenin. | Dodatek 2 | Poskusni pogoji za preskus spolnega razvoja rib (sladkovodne vrste) | 1. | Priporočene vrste | japonska medaka (Oryzias latipes) | cebrica (Danio rerio) | zet (Gasterostreus aculeatus) | 2. | Vrsta preskusa | pretočni ali polstatični | pretočni ali polstatični | pretočni ali polstatični | 3. | Temperatura vode | 25 ± 2 °C | 27 ± 2 °C | 20 ± 2 °C | 4. | Kakovost osvetljenosti | fluorescenčne sijalke (široki spekter) | fluorescenčne sijalke (široki spekter) | fluorescenčne sijalke (široki spekter) | 5. | Jakost svetlobe | 10–20 μE/m2/s, 540–1 080 luksov ali 50–100 ft-c (ravni v laboratoriju) | 10–20 μE/m2/s, 540–1 080 luksov ali 50–100 ft-c (ravni v laboratoriju) | 10–20 μE/m2/s, 540–1 080 luksov ali 50–100 ft-c (ravni v laboratoriju) | 6. | Obdobje osvetljenosti | 12–16 ur svetlobe, 8–12 ur teme | 12–16 ur svetlobe, 8–12 ur teme | 16 ur svetlobe, 8 ur teme | 7. | Najmanjša velikost komore | posamezne komore morajo vsebovati vsaj 7 l vode | posamezne komore morajo vsebovati vsaj 7 l vode | posamezne komore morajo vsebovati vsaj 7 l vode | 8. | Zamenjave prostornin preskusnih raztopin | vsaj 5 na dan | vsaj 5 na dan | vsaj 5 na dan | 9. | Starost preskusnih organizmov ob začetku izpostavljenosti | novo oplojene ikre (zgodnji stadij blastule) | novo oplojene ikre (zgodnji stadij blastule) | novo oplojene ikre | 10. | Št. iker na tretiranje | najmanj 120 | najmanj 120 | najmanj 120 | 11. | Št. tretiranj | najmanj 3 (plus ustrezno št. kontrol) | najmanj 3 (plus ustrezno št. kontrol) | najmanj 3 (plus ustrezno št. kontrol) | 12. | Št. ponovitev na tretiranje | najmanj 4 (razen v primeru razporeditve v kontrole na podlagi kvadratnega korena) | najmanj 4 (razen v primeru razporeditve v kontrole na podlagi kvadratnega korena) | najmanj 4 (razen v primeru razporeditve v kontrole na podlagi kvadratnega korena) | 13. | Način hranjenja | živa Artemia, zamrznjeni odrasli morski rakci, hrana v kosmičih itd.; priporočeno je hranjenje dvakrat na dan | posebna hrana za zarod, živa Artemia, zamrznjeni odrasli morski rakci, hrana v kosmičih itd.; priporočeno je hranjenje dvakrat na dan | živa Artemia, zamrznjeni odrasli morski rakci, hrana v kosmičih itd.; priporočeno je hranjenje dvakrat na dan | 14. | Prezračevanje | brez, razen če koncentracija raztopljenega kisika pade pod 60 % nasičenosti | brez, razen če koncentracija raztopljenega kisika pade pod 60 % nasičenosti | brez, razen če koncentracija raztopljenega kisika pade pod 70 % nasičenosti | 15. | Voda za redčenje | čista površinska voda, vodovodna voda ali modelna razredčevalna voda | čista površinska voda, vodovodna voda ali modelna razredčevalna voda | čista površinska voda, vodovodna voda ali modelna razredčevalna voda | 16. | Trajanje izpostavljenosti preskusni kemikaliji | 60 dph | 60 dph | 60 dph | 17. | Biološke končne točke | uspešnost izvalitve, preživetje, morfologija velikih organov, VTG histologija spolnih žlez, genetski spol razmerje med spoloma | uspešnost izvalitve, preživetje morfologija velikih organov, VTG histologija spolnih žlez, razmerje med spoloma | uspešnost izvalitve, preživetje morfologija velikih organov, VTG histologija spolnih žlez, razmerje med spoloma | 18. | Merila sprejemljivosti preskusa za združene ponovitve kontrol | uspešna izvalitev > 80 % | uspešna izvalitev > 80 % | uspešna izvalitev > 80 % | preživetje po izvalitvi ≥ 70 % | preživetje po izvalitvi ≥ 70 % | preživetje po izvalitvi ≥ 70 % | rast (mokra teža ribe, osušena s pivnikom) > 150 mg | rast (mokra teža ribe, osušena s pivnikom) > 75 mg | rast (mokra teža ribe, osušena s pivnikom) > 120 mg | dolžina (standardna dolžina) > 20 mm | dolžina (standardna dolžina) > 14 mm | dolžina (standardna dolžina) > 20 mm | razmerje med spoloma (% samcev ali samic) | 30 %–70 % | razmerje med spoloma (% samcev ali samic) 30 %–70 % | razmerje med spoloma (% samcev ali samic) 30 %–70 % | Dodatek 3 | Kemijske značilnosti sprejmljive vode za redčenje | SESTAVINA | KONCENTRACIJA | delci | < 20 mg/l | skupni organski ogljik | < 2 mg/l | neionizirani amoniak | < 1 μg /l | ostanek klora | < 10 μg /l | skupni organofosforni pesticidi | < 50 ng/l | skupni organoklorni pesticidi in poliklorirani bifenili | < 50 ng/l | skupni organski klor | < 25 ng/l | Dodatek 4 | Iz preskusne metode C.14/Smernica za preskusne koncentracije | Stolpec (število koncentracij med 100 in 10 ali med 10 in 1) (*6) | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 32 | 46 | 56 | 63 | 68 | 72 | 75 | 10 | 22 | 32 | 40 | 46 | 52 | 56 | 3,2 | 10 | 18 | 25 | 32 | 37 | 42 | 1,0 | 4,6 | 10 | 16 | 22 | 27 | 32 | | 2,2 | 5,6 | 10 | 15 | 19 | 24 | | 1,0 | 3,2 | 6,3 | 10 | 14 | 18 | | | 1,8 | 4,0 | 6,8 | 10 | 13 | | | 1,0 | 2,5 | 4,6 | 7,2 | 10 | | | | 1,6 | 3,2 | 5,2 | 7,5 | | | | 1,0 | 2,2 | 3,7 | 5,6 | | | | | 1,5 | 2,7 | 4,2 | | | | | 1,0 | 1,9 | 3,2 | | | | | | 1,4 | 2,4 | | | | | | 1,0 | 1,8 | | | | | | | 1,3 | | | | | | | 1,0 | Dodatek 5 | Smernica za homogenizacijo glave in repa mladic cebrice, črnoglavega pisanca, zeta in japonske medake | Namen tega razdelka je opisati postopke, ki se izvedejo pred kvantifikacijo koncentracije VTG. Uporabijo se lahko tudi drugi postopki, katerih rezultat je primerljiva kvantifikacija VTG. Koncentracija VTG se lahko namesto v homogenatu glave/repa določi v krvni plazmi ali jetrih. | Postopek | 1. | Ribe se anestezirajo in evtanazirajo v skladu z opisom preskusa. | 2. | Glava in rep ribe se odrežeta v skladu z opisom preskusa. Opozorilo: med ravnanji s posameznimi ribami je treba vse instrumente za seciranje in rezalno desko sprati in ustrezno očistiti (npr. s 96-odstotnim etanolom), da se prepreči ‚onesnaženje‘ neinduciranih samcev z VTG samic ali induciranih samcev. | 3. | Teža zbranih glav in repov posameznih rib se izmeri na najbližji miligram. | 4. | Po tehtanju se deli vnesejo v ustrezne epruvete (npr. 1,5-mililitrske epruvete) in zamrznejo pri – 80 °C do homogenizacije oz. dokler se neposredno ne homogenizirajo na ledu z dvema plastičnima pestiloma. (Druge metode se lahko uporabijo, če se izvajajo na ledu in zagotovijo homogeno maso.) Opozorilo: epruvete je treba ustrezno oštevilčiti, da se lahko glava in rep ribe povežeta z ustreznim delom telesa, uporabljenim za histologijo spolnih žlez. | 5. | Ko dobimo homogeno maso, se ji doda 4–10-kratna teža tkiva ledeno mrzlega homogenizacijskega pufra (*7) (paziti je treba na raztopino). Delo s pestiloma je treba nadaljevati, dokler zmes ni homogena. Pomembno opozorilo: za vsako ribo se uporabita dve novi pestili. | 6. | Vzorci se postavijo na led do začetka centrifugiranja pri 4 °C in 50 000 g za 30 minut. | 7. | S pipeto se supernatant odmeri na dele po 20 do 50 μl (paziti je treba na količino) v vsaj dve epruveti, tako da se konica pipete potopi pod plast maščobe na površini in supernatant previdno izsesa brez delcev maščobe ali peletov. | 8. | Epruvete se do uporabe hranijo pri – 80 °C. | Opomba: homogenizacijski pufer je treba uporabiti na dan priprave. Med uporabo ga je treba postaviti na led. | Dodatek 6 | Smernica za kvantifikacijo vitelogenina v homogenatu glave in repa pri cebricah (Danio rerio) (spremenjen na podlagi Holbch idr., 2001). uporabijo se lahko drugi postopki, pri katerih se uporabljajo homologna antitelesa in raztopine | 1. | Mikrotiterske plošče (potrjena Maxisorp F96, Nunc, Roskilde, Danska), predhodno premazane s 5 μg/ml lipovitelin-IgG proti cebricam, se odtajajo in trikrat sperejo s pufrom za spiranje (*). | 2. | Prečiščena raztopina vitelogenina (22) pri cebricah se serijsko razredči na 0,2, 0,5, 1, 2, 5, 10 in 20 ng/ml v pufru za redčenje (**), vzorci pa se razredčijo vsaj 200-krat (da se prepreči vpliv matriksa) v pufru za redčenje in vnesejo na plošče. Kontrola preskusa se ponovi dvakrat. V vsako vdolbinico se doda 150 μl. Raztopine se dodajo v ponovitev in vzorce v treh ponovitvah. Čez noč se na stresalniku inkubirajo pri 4 °C. | 3. | Plošče se petkrat sperejo s pufrom za spiranje (*). | 4. | Hrenova peroksidaza (HRP), spojena z dekstranovo verigo (npr. AMDEX A/S, Danska), in konjugirana protitelesa se razredčijo v pufru za spiranje; dejanska raztopina se razlikuje po seriji in starosti. V vsako vdolbinico se doda 150 μl, plošče pa se eno uro inkubirajo na stresalniku pri sobni temperaturi. | 5. | Plošče se petkrat sperejo s pufrom za spiranje (*), dno plošč pa se skrbno očisti z etanolom. | 6. | V vsako vdolbinico se doda 150 μl TMB plus (***). Ploščo je treba pred svetlobo zaščititi z aluminijasto folijo ter opazovati razvoj barv na stresalniku. | 7. | Ko je umeritvena krivulja popolnoma razvita, se aktivnost encimov ustavi z vnosom 150 μl 0,2 M H2SO4 v vsako vdolbinico. | 8. | Absorpcija se meri pri 450 nm (npr. na čitalniku plošč Molecular Devices Thermomax). Podatki se analizirajo s povezano programsko opremo (npr. Softmax). | (*) | Pufer za spiranje: | založni PBS (****) | 500,0 | ml | BSA | 5,0 | g | Tween 20 | 5,0 | ml | Uravnati pH na 7,3 in napolniti do 5 l z Millipore H2O. Hraniti pri 4 °C. | (**) | Pufer za redčenje: | založni PBS (****) | 100,0 | ml | BSA | 3,0 | g | Tween 20 | 1,0 | ml | Uravnati pH na 7,3 in napolniti do 1 l z Millipore H2O. Hraniti pri 4 °C. | (***) | TMB plus je substrat, pripravljen za uporabo, ki ga proizvaja KemEnTec (Danska). Občutljiv je na svetlobo. Hraniti pri 4 °C. | (****) | Založni PBS | NaCl | 160,0 | g | KH2PO4 | 4,0 | g | Na2HPO4 2H2O | 26,6 | g | KCl | 4,0 | g | Uravnati pH na 6,8 in napolniti do 2 l z Millipore H2O. Hraniti pri sobni temperaturi. | Dodatek 7 | Smernica za pripravo tkivnih rezin za določanje spola in faze spolnih žlez | Cilj tega razdelka je opisati postopke, ki se izvedejo pred oceno histoloških rezin. Uporabijo se lahko drugi postopki, katerih rezultat je podobna določitev spola in faze spolnih žlez. | Ti postopki so z nekaj izjemami podobni za japonsko medako (JMD) in cebrico (ZF). | Evtanazija, nekropsija in fiksacija tkiva | Cilji: | 1. | zagotoviti humano žrtvovanje ribe; | 2. | pridobiti potrebne teže telesa in meritve; | 3. | oceniti sekundarne spolne značilnosti; | 4. | secirati tkivo za analizo VTG; | 5. | fiksirati spolne žleze. | Postopki: | 1. | ribo je treba žrtvovati neposredno pred nekropsijo. Če ni na voljo več obducentov, se zato ne sme usmrtiti več rib hkrati; | 2. | riba se z majhnim sakom odstrani iz preskusne komore in prenese na območje za nekropsijo v posodi za prenos; | 3. | riba se vnese v raztopino za evtanazijo, riba se iz raztopine odstrani, ko neha dihati in se ne odziva na zunanje dražljaje; | 4. | določi se mokra teža ribe; | 5. | Za pripravo tkiv za analizo VTG se lahko riba postavi na plutovinasto ploščo na mizico stereomikroskopa; | (a) | pri cebrici se glava odreže neposredno za prsno plavutjo, rep pa neposredno za hrbtno plavutjo; | (b) | pri japonski medaki se trebuh odpre z natančnim prerezom ob ventralni sredinski črti od prsnega obroča do točke, kranialne na anus. Jetra se previdno odstranijo z majhno prijemalko in škarjicami; | 6. | vzorci za analizo VTG se vstavijo v mikroepruvete in takoj zamrznejo v tekočem dušiku; | 7. | trup, vključno s spolnimi žlezami, se vstavi v predhodno označene plastične kasete za tkivo, ki se prenesejo v Davidsonov ali Bouinov fiksativ. Fiksativa mora biti vsaj desetkrat več od približne prostornine tkiv. Posoda s fiksativom se pet sekund nežno pretresa, da se zračni mehurčki odstranijo iz kasete; | 8. | (a) | vsa tkiva ostanejo v Davidsonovem fiksativu čez noč, naslednji dan pa se prenesejo v posamezne posode z 10-odstotnim nevtralno pufranim formalinom. Posode s kasetami se 5 sekund nežno stresajo, da se zagotovi ustrezna penetracija formalina v kasete; | (b) | tkiva ostanejo v Bouinovem fiksativu 24 ur, sledi pa prenos v 70-odstotni etanol. | Obdelava tkiva | Cilji: | 1. | dehidracija tkiva za ustrezno penetracijo parafina; | 2. | impregnacija tkiva s parafinom, da se ohrani neokrnjenost tkiva in ustvari trdna podlaga za mikrotomijo; | Postopki: | 3. | označene kasete s tkivom se odstranijo iz hrambe s formalinom/etanolom in postavijo v košare za obdelavo, košara za obdelavo se obremeni v napravi za obdelavo tkiva; | 4. | izbere se časovni načrt obdelave; | 5. | ko naprava za obdelavo tkiva konča obdelovalni cikel, se lahko košare prenesejo v napravo za vstavljanje. | Vstavljanje | Cilj: | ustrezna usmeritev vzorca v strjeni parafin za mikrotomijo. | Postopki: | 1. | košare s kasetami se odstranijo iz naprave za obdelavo in potopijo v s parafinom napolnjeno prednjo komoro grelne naprave za vstavljanje ali pa se kasete prestavijo v ločen parafinski grelnik; | 2. | prva kaseta, ki se bo vstavila, se odstrani iz prednje komore grelne konzole ali parafinskega grelnika. Pokrov kasete se odstrani in zavrže, na oznaki kasete pa se preverijo zabeležke o živali, da se pred vstavljanjem odpravijo morebitne neskladnosti; | 3. | izbere se ustrezno velik kalup za vstavljanje; | 4. | kalup se drži pod cevko dozirne konzole in napolni s tekočim parafinom; | 5. | vzorec se odstrani iz kasete in vstavi v stopljeni parafin v kalupu. To se ponovi pri 4–8 vzorcih za vsak kalup s parafinom. Mesto posamezne ribe se označi tako, da se prva riba položi pod kotom 180 stopinj glede na ribo 2–4/8; | 6. | vzorec se prekrije z dodajanjem dodatnega parafina; | 7. | kalup s podlago kasete se postavi na hladilno ploščo kriogene posode; | 8. | ko se parafin strdi, se blok (tj. strjeni parafin s tkivi in podlago kasete) odstrani iz kalupa. | Mikrotomija | Cilj: | rezanje in pritrditev histoloških rezin za barvanje. | Postopki: | 1. | začetna faza mikrotomije, ki se imenuje ‚seznanitev‘, se izvede po naslednjih korakih: | (a) | parafinski blok se vstavi v vpenjalo mikrotoma; | (b) | vpenjalo se z vrtenjem kolesa mikrotoma pomika naprej, s parafinske površine bloka pa se režejo debele rezine, dokler nož ne doseže vstavljenih tkiv; | (c) | debelina rezine se na mikrotomu nastavi na 3–5 mikronov. Vpenjalo se pomika naprej in z bloka se odreže več rezin, da se odstranijo vsi artefakti, ki so med grobimi rezi nastali na rezalni površini tkiva; | (d) | blok se lahko odstrani iz vpenjala in s srednjo stranjo naprej položi na led, da se tkivo zmoči; | 2. | naslednja faza mikrotomije je končno rezanje rezin in pritrditev tkivnih rezin na mikroskopske preparate. Ti postopki se izvedejo, kot sledi: | (a) | če je bil blok postavljen na led, se odstrani z njega in vstavi v vpenjalo mikrotoma; | (b) | vpenjalo se pri debelini rezine, nastavljene na 3–5 mikronov na mikrotomu, pomika naprej z vrtenjem kolesa mikrotoma, rezine se režejo z bloka, dokler ne dobimo ‚traka‘, ki vsebuje vsaj eno sprejemljivo rezino s spolnimi žlezami (če je med rezanjem potrebno, se lahko blok odstrani iz vpenjala, postavi na led, da se tkivo zmoči, in vstavi nazaj v vpenjalo); | (c) | rezine se plosko položijo na vodno gladino v vodni kopeli. Poskusi se obdržati vsaj eno rezino brez gub in zračnih mehurčkov, ujetih pod njo; | (d) | mikroskopsko objektno stekelce se potopi pod najboljšo rezino, ki se s stekelcem dvigne iz vode. Ta postopek se imenuje ‚pritrditev‘ rezine na preparat; | (e) | za sklop rib se pripravijo tri rezine. Druga in tretja rezina se odrežeta v razmiku 50 mikronov za prvo rezino. Če ribe niso vstavljene s spolnimi žlezami v isti rezalni ravnini, je treba narediti več rezin, da se zagotovi vsaj šest rezin s spolnimi žlezami za vsako ribo; | (f) | s pisalom za označevanje preparatov se na preparatu označi številka bloka, iz katerega je bil preparat ustvarjen; | (g) | preparat se položi na podstavek za barvanje; | (h) | blok se odstrani iz vpenjala in shrani s sprednjim delom naprej. | Barvanje, namestitev krovnega stekelca in označevanje preparatov | Cilji: | — | obarvanje rezin za histopatološko preiskavo; | — | trajno zatesnjeno pritrjena in obarvana tkiva; | — | trajno identificirane obarvane rezine, ki omogočajo popolno sledljivost; | Postopki: | 1. | barvanje: | (a) | preparati se pred barvanjem čez noč sušijo na zraku; | (b) | rezine se barvajo s hematoksilin-eozinom; | 2. | namestitev krovnega stekelca: | (a) | krovna stekelca se lahko namestijo ročno ali samodejno; | (b) | preparat se pomoči v ksilen ali TissueClear, odvečni ksilen/TissueClear pa se nežno odstrani s preparata; | (c) | v bližino konca preparata nasproti zamrznjenega konca ali na krovno stekelce se nanese približno 0,1 ml pritrditvenega medija; | (d) | krovno stekelce se med nameščanjem na preparat nagne pod majhnim kotom; | 3. | označevanje: | (a) | vsaka oznaka preparata mora vsebovati naslednje informacije: | (i) | ime laboratorija; | (ii) | vrsto; | (iii) | št. vzorca/št. Preparata; | (iv) | kemikalijo/skupino tretiranja; | (v) | datum. | Dodatek 8 | Statistični diagram poteka za analizo vitelogenina | Ne | Da | Ne | Da | Ne | Da | Ne | Dunnov preskus s sredinami ponovitev | Dunnov ali Mann-Whitneyjev preskus s sredinami pon. | Tamhane-Dunnettov preskus | Ugnezdena analiza varianc je normalna. | Sredine ponovitev niso normalne ali niso homogene. | Sredine ponovitev niso normalno porazdeljene. | Sredine ponovitev so normalno porazdeljene. | Tamhane-Dunnettov preskus ugnezdene analize varianc | Dunnettov preskus ugnezdene analize varianc | Dunnettov preskus | Transformacija za stabilizacijo varianc? | Neenake variance | Enake variance | Ne | Da | Da | Regresivni trendnostni preskus sredin ponovitev | <=3 pon. na konc. | Transformacija za stabilizacijo? | Dunnov ali Mann-Whitneyjev preskus | Transformacija za normalizacijo? | Ugnezdena analiza varianc ni normalna. | Monoton | Določite, ali je odziv na odmerek monoton. | Opustite kontrolo z vodo | >=4 pon. na konc. | <=3 pon. na konc. | Dunnov preskus | >=4 pon. na konc. | Regresivni Jonckheerov preskus | Regresivni Jonckheerov ali Williamsov preskus | Sredine ponovitev so normalne in homogene. | Nemonoton | Združite kontrole, ohranite podskupine | Primerjajte kontrole z Wilcoxonovim ali t-preskusom. Ali se kontrole razlikujejo? | Ali so prisotne kontrole s topilom in brez njega? | Ne | Da | statisTični diagram poteka za analizo razmerja med spoloma | Da | Ne | Za določitev NOEC se v primeru homogenih varianc (*), uporabi Dunnettov preskus, sicer Tamhane-Dunnettov (T3) preskus. | Za določitev NOEC se uporabi regresivni preskus po Jonckheere-Terpstraju (+). | Dunnov ali Mann-Whitneyjev U-preskus z Bonferroni-Holmovo prilagoditvijo za določitev NOEC. | Da | Ali so podatki normalno porazdeljeni? (*) | Ali so podatki skladni z monotonim odzivom na odmerek? | (‡) Ali izbira druge dogovorjene kontrole. | (*) Po arkus sinus-korenski transformaciji. | (+) Pri manj kot 5 poskusnih enotah na tretiranje je treba uporabiti preskus po J-T ali M-W preskus, če je na voljo. | Ne | Ne | Da | Ne | Kontrole se združijo. | Izpusti se kontrola z vodo (‡). | Kontrole se primerjajo s t-preskusom. Ali se kontrole razlikujejo? | Da | Ali je bilo uporabljeno topilo? | Dodatek 9 | Smernice za vzorčenje tkiva za določitev genetskega spola in določitev genetskega spola z metodo PCR | Vzorčenje tkiva, priprava in shranjevanje pred določanjem genetskega spola z metodo PCR pri medaki (pripravil laboratorij za vodne organizme družbe Bayer CropScience AG) | 1. | Pri vsaki ribi se z natančnimi škarjami odrežeta predrepna in hrbtna plavut in vstavita v epruveto s 100 μl ekstrakcijskega pufra 1 (podrobnosti o pripravi pufra so navedene v nadaljevanju). Po rezanju vsake ribe se škarje očistijo v čaši z destilirano H2O in osušijo s papirnato brisačo. | 2. | Tkiva plavuti se za lizo celic homogenizirajo s teflonskim pestičem mikroepruvete. Za vsako epruveto se uporabi novo pestilo, da se prepreči onesnaženje. Pestila se čez noč pustijo v 0,5 M NaOH, 5 minut spirajo v destilirani H2O ter do uporabe shranijo v etanolu ali sterilizirajo po avtoklaviranju. | 3. | Tkivo plavuti se lahko shrani tudi brez ekstrakcijskega pufra 1 na suhem ledu in nato v zamrzovalniku pri – 80 °C, da se prepreči degeneracija DNA. Vendar ekstrakcija poteka bolje, če se DNA ekstrahira hkrati (za ravnanje glej zgoraj; vzorce je treba odtajati na ledu po shranjevanju pri – 80 °C, preden se v epruvete doda pufer). | 4. | Po homogenizaciji se vse epruvete postavijo v vodno kopel, kjer 15 minut vrejo pri 100 °C. | 5. | Nato se s pipeto v vsako epruveto doda 100 μl ekstrakcijskega pufra 2 (podrobnosti o pripravi pufra so navedene v nadaljevanju). Vzorci se pri sobni temperaturi hranijo 15 minut in se pri tem občasno nežno ročno pretresejo. | 6. | Po tem se vse epruvete ponovno postavijo v vodno kopel, kjer še 15 minut vrejo pri 100 °C. | 7. | Epruvete se do nadaljnje analize zamrznejo pri – 20 °C. | Priprava pufra | Pufer PCR 1: | 500 mg N-lavroilsarkozina (npr. Merck KGaA, Darmstadt, GE) | 2 ml 5M NaCl | k 100 ml destilirane H2O | → avtoklav | Pufer PCR 2: | 20 g Chelex (npr. Biorad, Munich, GE) | nabrekne v 100 ml destilirane H2O | → avtoklav | Določanje genetskega spola (z metodo PCR) pri medaki (pripravila laboratorij za vodne organizme družbe Bayer CropScience AG in Universität Würzburg Biozentrum) | Pripravljene in zamrznjene epruvete (opisano v zgornjem oddelku) se odtajajo na ledu. Nato se centrifugirajo v mikrocentrifugirki (30 sekund pri največji hitrosti in sobni temperaturi). Za PCR se uporabi čisti supernatant iz oborine. Preprečiti je treba vsak prenos sledi Chelexa (lokaliziranega v oborini) v reakcijo PCR, saj bi to vplivalo na aktivnost Taq-polimeraze. Supernatant se uporabi neposredno ali pa se zamrzne (pri – 20 °C) in odtaja v več ciklih brez negativnega učinka na DNA za poznejše analize. | 1. Priprava ‚reakcijske zmesi‘ (25 μl na vzorec): | | Prostornina | Končna koncentracija | Matrična DNA | 0,5 μl–2 μl | | 10 × pufer PCR z MgCl2 | 2,5 μl | 1x | Nukleotidi (vsi dATP, dCTP, dGTP, dTTP) | 4 μl (5 mM) | 200 μM | Smerni začetni oligonukleotid (10 μM) (glej v nadaljevanju 3–5) | 0,5 μl | 200 nM | Protismerni začetni oligonukleotid (10 μM) (glej v nadaljevanju 3–5) | 0,5 μl | 200 nM | DMSO | 1,25 μl | 5 % | Voda (stopnje PCR) | do 25 μl | | Taq E-polimeraza | 0,3 μl | 1,5 U | 10 × pufer PCR z MgCl2: 670 mM Tris/HCl (pH 8,8 pri 25 °C), 160 mM (NH4)2SO4, 25 mM MgCl2, 0,1 % Tween 20 | Za vsako PCR (glej v nadaljevanju 3–5) je potreben poseben začetni oligonukleotid kot nova kombinacija ‚reakcijske zmesi‘ in ustrezne količine matrične DNA, ki je potrebna za vsak vzorec (glej zgoraj). Ustrezne prostornine se s pipetami prenesejo v nove epruvete. Po tem se vse epruvete zaprejo, mešajo (približno 10 sekund) in centrifugirajo (10 sekund pri sobni temperaturi). Nato se lahko začnejo ustrezni programi PCR. V vsakem programu PCR se uporabita še pozitivna kontrola (reprezentativen vzorec DNA z znano aktivnostjo in jasnimi rezultati) in negativna kontrola (1 μl destiliranega H2O). | 2. Priprava agaroznega gela (1 %) – med potekom programov PCR | — | 3 g agaroze se raztopijo v 300 ml pufra 1 × TAE (1-odstotni agarozni gel); | — | raztopina mora vreti v mikrovalovni pečici (približno 2–3 minute); | — | vročo raztopino je treba preliti v model za vlivanje, ki stoji na ledu; | — | po približno 20 minutah je agarozni gel pripravljen za uporabo; | — | agarozni gel se do konca programov PCR shrani v pufru 1 × TAE. | 3. Program PCR za aktin: | namen te reakcije PCR je dokazati, da se DNA v vzorcu ne poškoduje. | — | Poseben začetni oligonukleotid: | ‚Mact1(zgornji/smerni)‘ → TTC AAC AGC CCT GCC ATG TA | ‚Mact2(spodnji/protismerni)‘ → GCA GCT CAT AGC TCT TCT CCA GGG AG | — | Program: | 5 minut pri 95 °C | Cikel (35-krat): | Denaturacija | → 45 sekund pri 95 °C | Prileganje | → 45 sekund pri 56 °C | Podaljševanje | → 1 minuta pri 68 °C | 15 minut pri 68 °C | 4. Program PCR za gena X in Y: | v tem programu PCR za odkrivanje genov X in Y se uporabijo vzorci neokrnjene DNA. Pri moški DNA morata biti vidni dve progi, pri ženski DNA pa ena proga (po barvanju in gelski elektroforezi). V to izvajanje programa je treba vključiti eno pozitivno kontrolo za moške (vzorec XY) in eno za ženske (vzorec XX). | — | Poseben začetni oligonukleotid: | ‚PG 17,5‘ (zgornji/smerni) → CCG GGT GCC CAA GTG CTC CCG CTG | ‚PG 17,6‘ (spodnji/protismerni) → GAT CGT CCC TCC ACA GAG AAG AGA | — | Program: | 5 minut pri 95 °C | Cikel (40-krat): | Denaturacija | → 45 sekund pri 95 °C | Prileganje | → 45 sekund pri 55 °C | Podaljševanje | → 1 minuta 30 sekund pri 68 °C | 15 minut pri 68 °C | 5. Program PCR za gen Y kot ‚kontrola‘ za program PCR za gena X in Y: | ta program PCR preverja rezultate ‚programa PCR za gena X in Y‘. Pri ‚moških vzorcih‘ mora biti vidna ena proga, pri ‚ženskih vzorcih‘ pa proge ne smejo biti vidne (po barvanju in gelski elektroforezi). | — | Poseben začetni oligonukleotid: | ‚DMTYa (zgornji/smerni)‘ → GGC CGG GTC CCC GGG TG | ‚DMTYd (spodnji/protismerni)‘ → TTT GGG TGA ACT CAC ATG G | — | Program: | 5 minut pri 95 °C | Cikel (40-krat): | Denaturacija | → 45 sekund pri 95 °C | Prileganje | → 45 sekund pri 56 °C | Podaljševanje | → 1 minuta pri 68 °C | 15 minut pri 68 °C | 6. Barvanje vzorcev PCR | Raztopine za barvanje | 50-odstotni glicerol | 100 mM EDTA | 1-odstotni SDS | 0,25-odstotno bromofenolno modro | 0,25-odstotni ksilenksianol | V vsako epruveto se s pipeto doda 1 μl raztopine za barvanje. | 7. Začetek gelske elektroforeze: | — | pripravljeni 1-odstotni agarozni gel se prenese v komoro za gelsko elektroforezo, napolnjeno s pufrom 1 × TAE; | — | v utor na agaroznem gelu se s pipeto vnese 10–15 μl obarvanega vzorca PCR; | — | v ločen utor se s pipeto vnese tudi 5–15 μl Invitrogena (lestvica 1 kb); | — | elektroforezo je treba začeti z 200 V; | — | končati jo je treba po 30–45 minutah. | 8. Določanje prog: | — | agarozni gel je treba očistiti v destilirani H2O; | — | nato je treba agarozni gel za 15–30 minut prenesti v etidijev bromid; | — | po tem je treba v UV-svetlobni škatli posneti sliko agaroznega gela; | — | na koncu se vzorci analizirajo glede na pozitivno kontrolno progo (ali proge) in lestvico. | Dodatek 10 | Smernica za vzorčenje tkiva za določitev genetskega spola z metodo PCR pri zetu | Vzorčenje tkiva in ekstrakcija DNA | DNA se lahko ekstrahira z različnimi komercialno dostopnimi reagenti ter ročnimi in samodejnimi ekstrakcijskimi sistemi. V nadaljevanju je opisan protokol, ki se uporablja v laboratoriju Cefas Weymouth, kjer je potrebno, pa so bili dodani alternativni pristopi. | 1. | Z vsake posamezne ribe se z natančnimi škarjami odstrani majhen kos tkiva (10–20 mg) z dorzolateralnega območja (ko se odstranita glava in rep za analizo VTG). Tkivo se vnese v epruveto in postavi neposredno na tekoči dušik (za shranjevanje pri – 80 °C) ali napolni s 70-odstotnim etanolom (za prenos in naknadno shranjevanje pri 4 °C). Škarje se po uporabi za posamezno ribo očistijo v 70-odstotnem etanolu in nato v destilirani vodi ter osušijo s papirnato brisačo. | 2. | Etanol (če je bil uporabljen) se odstrani z aspiracijo, tkivo pa se čez noč razkroji s proteinazo K v 400 μl pufra ATL (Qiagen). Alikvot (200 μl) produkta razkroja se prenese v 96-mestni S-blok (Qiagen), DNA pa se ekstrahira v 96-mestnem formatu s sistemom Qiagen Universal BioRobot in priborom QIamp Investigator BioRobot. DNA se eluira v 50 μl proste vode DNaze in RNaze. Če se za ekstrakcijo DNA uporabljajo trda tkiva (kot je bodica ali prsna plavut), bo morda treba vzorec homogenizirati v liznem pufru s sistemom za lizo tkiva FastPrep® ali enakovrednim sistemom za razkroj tkiva. | Ali pa: | (a) | tkivo se čez noč razkraja s proteinazo K v 400 μl liznega pufra G2 (Qiagen), DNA pa se ekstrahira iz 200 μl produkta razkroja z enostavnim priborom EZ-1 DNA Tissue Kit in EZ-1 BioRobot ali enostavnim priborom DNA Mini Kit. DNA se eluira v 50 μl zmesi; | (b) | tkiva se obdelajo z reagentom DNAzol. Vzorci tkiv se v 1,5-mililitrski mikrocentrifugirki 10 minut razkrajajo v 1 ml DNAzola in nato 5 minut centrifugirajo pri 13 000 o/min, da se odstranijo vsi delci. Vzorec, ki je prestal lizo, se prenese v novo 1,5-mililitrsko mikrocentrifugirko s 500 μl 100-odstotnega molekularno čistega etanola in nato 10 minut centrifugira pri 13 000 o/min, da se DNA obori. Etanol se odstrani in nadomesti s 400 μl 70-odstotnega etanola molekulske stopnje, 5 minut centrifugira pri 13 000 o/min, kosi DNA pa se raztapljajo v 50 μl proste vode molekulske DNaze in RNaze. Če se uporabljajo trda tkiva (prsna plavut), bo morda treba vzorec pred ekstrakcijo DNA homogenizirati v liznem pufru s sistemom za lizo tkiva FastPrep® ali enakovrednim sistemom za razkroj tkiva. | 3. | DNA se shranjuje pri – 20 °C, dokler se ne potrebuje. | Pomembno opozorilo: med postopki je treba nositi rokavice. | Analiza verižne reakcije s polimerazo (PCR) | Amplifikacije so se izvedle z 2,5 μl ekstrakta DNA v 50 μl reakcijske zmesi z začetnimi oligonukleotidi lokusov (kot je opisano v Peichel idr., 2004. Current Biology 1:1416-1424): | smerni začetni oligonukleotid | 5′ GGG ACG AGC AAG ATT TAT TGG 3′; | protismerni začetni oligonukleotid | 5′ TAT AGT TAG CCA GGA GAT GG 3′. | Reagente PCR dobavljajo številni dobavitelji. V nadaljevanju opisana metoda se trenutno uporablja v laboratoriju Cefas Weymouth. | 1. Priprava ‚reakcijske zmesi‘ (50 μl na vzorec): | Izhodiščna zmes se pripravi, kot sledi. Pripravi se lahko vnaprej in se do uporabe shrani zamrznjena pri – 20 °C. Pripraviti je treba zadostno izhodiščno zmes za negativno kontrolo (samo voda stopnje molekularne biologije). | | Prostornina (založna koncentracija)/vzorec | Končna koncentracija | Reakcijski pufer 5xGoTaq® | 10 μl | 1x | MgCl2 | 5 μl (25 mM) | 2,5 mM | Nukleotidi (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) | 0,5 μl (25 mM vsak) | 250 μM vsak | Smerni začetni oligonukleotid | 0,5 μl (0,1 nmol/μl) | 2,0 μM | Protismerni začetni oligonukleotid | 0,5 μl (0,1 nmol/μl) | 2,0 μM | Voda stopnje molekularne biologije | 30,75 μl | | Polimeraza GoTaq | 0,25 μl | 1,25 U | — | V označeno 0,5-mililitrsko epruveto za PCR s tankimi stenami se odmeri 47,5 μl. | — | V ustrezno označeno epruveto se doda 2,5 μl čiste DNA. Postopek se ponovi za vse vzorce in negativno kontrolo. | — | Prekrije se z dvema kapljicama mineralnega olja. Namesto tega se lahko uporabi ciklični termostat z ogrevanim pokrovom. | — | Pokrovi se zaprejo. | — | Vzorci so se 5 minut denaturirali v cikličnem termostatu PTC-225 pri 94 ± 2 °C, temu pa je sledilo 39 enominutnih ciklov pri 94 ± 2 °C, 55 ± 2 °C in 72 ± 2 °C ter na koncu desetminutno podaljševanje pri 72 ± 2 °C. | 2. Priprava agaroznega gela (2 %): | Proizvodi PCR se običajno razgradijo na 20-odstotnem agaroznem gelu, ki vsebuje etidijev bromid. | Uporabi se lahko tudi kapilarni sistem elektroforeze. | — | Dva grama agaroze se odtehtata v 100 ml pufra 1 × TAE. | — | Pogreje se v mikrovalovni pečici (približno 2–3 minute), da se agaroza raztopi. | — | Dodata se 2 kapljici končne koncentracije etidijevega bromida 0,5 μg/ml. | — | Vroča raztopina se prenese v opremo za ulitje gela. | — | Gel naj se strdi. | 3. Gelska elektroforeza: | — | Agarozni gel se prenese v opremo za elektroforezo in potopi v pufer 1 × TAE. | — | V ločene vdolbinice se vnese 20 μl vsakega vzorca, pri čemer se v prosto vdolbinico doda molekulski velikostni standard (lestvica DNA 100 bp, Promega). | — | Elektroforeza se 30–45 minut izvaja pri 120 V. | 4. Vizualizacija proizvodov amplifikacije | Če je bil v agarozni gel vključen etidijev bromid, kot je opisano zgoraj, se proizvodi DNA vizualizirajo pod virom UV. V nasprotnem primeru se agarozni gel obarva tako, da se gel pred vizualizacijo za 30 minut prekrije z razredčeno raztopino etidijevega bromida (0,5 μg/ml v vodi). | Dodatek 11 | Smernica za postopek umetne oploditve pri zetu | Namen tega razdelka je opisati postopke za pridobitev oplojenih iker zeta za uporabo v preskusu spolnega razvoja rib. | Postopki | Pridobivanje semenčic samcev | 1. | Evtanazira se dobro obarvan samec želene populacije. | 2. | Moda se odrežejo z obeh strani ribe. Moda so običajno močno pigmentirane paličaste strukture, ki so že vidne ob lateralni sredinski črti telesa. Uporabi se lahko katera koli od naslednjih metod. | 3. | Z natančnimi škarjami se naredi 1–1,5-centimetrski rez z enim prerezom pod kotom približno 45 stopinj, ki se začne pri kloaki. | 4. | S skalpelom se naredi majhen rez na boku ribe nekoliko posteriorno na medenico in ventralno na lateralne ploščice. | 5. | Moda se odstranijo s finimi kleščami in vstavijo v petrijevko. | 6. | Vsako modo se prekrije s 100 μl sveže narejene Hankove končne raztopine (*8). | 7. | Moda se fino narežejo na kocke z britvico ali skalpelom. Pri tem se sprostijo semenčice, ki dajo Hankovi raztopini mlečen videz. | 8. | Tekočina s semenčicami se vnese v epruveto, pri čemer se pazi, da se s pipetiranjem vanjo ne vnesejo deli mod. | 9. | V epruveto se doda 800 μl Hankove končne raztopine in dobro premeša. | 10. | Po potrebi se lahko samec konzervira s fiksiranjem v 100-odstotnem etanolu ali drugem želenem fiksativu. To je zlasti pomembno, če se v okviru študije določa izvor potomstva glede na starše. | Pomembno opozorilo: čeprav se lahko večina potrebnih založnih raztopin pripravi vnaprej, je treba zalogo 5 in zato končno raztopino pripraviti svežo na dan uporabe. | Zaloga 1 | NaCl | 8,00 g | KCl | 0,40 g | Destilirana voda | 100 ml | Zaloga 2 | Na2HPO4 (brezvodni) | 0,358 g | KH2PO4 | 0,60 g | Destilirana voda | 100 ml | Zaloga 3 | CaCl2 | 0,72 g | Destilirana voda | 50 ml | Zaloga 4 | MgSO4 7H2O | 1,23 g | Destilirana voda | 50 ml | Zaloga 5 (sveže pripravljena) | NaHCO3 | 0,35 g | Destilirana voda | 10 ml | Opomba: če že imate nekatere od navedenih soli, vendar z drugačno vsebnostjo vode (tj. 2H2O namesto brezvodne), jih lahko uporabite, vendar najprej prilagodite maso na podlagi molekulske mase. | Za Hankovo končno raztopino se po naslednjem vrstnem redu združijo: | zaloga 1 | 1,0 ml | zaloga 2 | 0,1 ml | zaloga 3 | 0,1 ml | destilirana voda | 8,6 ml | zaloga 4 | 0,1 ml | zaloga 5 | 0,1 ml | Pred uporabo dobro premešajte. | Oploditev | 1. | V želeni populaciji se določijo velike in gravidne samice; samice so pripravljene na stiskanje šele, ko se vidijo ikre, ki izstopajo iz kloake. Za pripravljene samice je značilna ‚pokončna‘ drža. | 2. | S prstom oz. palcem se nežno premika po boku ribe do repa, da se spodbudi izločitev vrečke z ikrami v svežo petrijevko. Postopek se ponovi na drugi strani in riba vrne v posodo. | 3. | Ikre se lahko razporedijo (tvorijo enoslojno plast) s finim čopičem. Pomembno je, da se poskusi čim več iker izpostaviti semenčicam, k čemur pripomore čim večja površina iker. Pomembno opozorilo: ikre morajo biti vlažne, zato se obložijo z vlažnim robcem (pomembno je, da se ikre ne dotikajo vode neposredno, saj bi lahko horij, ki preprečuje oploditev, prehitro otrdel). Samice se zelo razlikujejo po številu iker, ki ga lahko proizvedejo, vendar bi moralo biti v povprečju iz ene gravidne samice enostavno pridobiti približno 150 iker. | 4. | Po celotni površini iker se s čopičem enakomerno porazdeli 25μl semenčic v Hankovi zmesi. Ko se oplojevanje začne, bodo ikre hitro otrdele in spremenile barvo (v minuti). Če se oceni, da je iker več kot 150, se postopek ponovi. Če ikre ne otrdijo v minuti, se doda nekaj semenčic. Pomembno opozorilo: z dodajanjem semenčic se stopnja oplojenosti morda ne bo izboljšala. | 5. | Ikre in raztopina s semenčicami morajo biti v stiku vsaj 15 minut, oplojene ikre pa je treba vstaviti v akvarij za izpostavljanje v uri in pol po oploditvi. | 6. | Postopek se ponovi z drugo samico, dokler ni zbrano želeno število iker. | 7. | Nekaj iker zadnje serije se prihrani in fiksira v 10-odstotni ocetni kislini. | Štetje in razporeditev iker v preskusnem akvariju | 1. | Ikre je treba enakomerno porazdeliti med vsako stopnjo tretiranja, da se prepreči genetska nagnjenost. Vsako serijo oplojenih iker je treba razporediti v enako velike skupine (toliko, kot je stopenj tretiranja) s topim instrumentom (npr. s širokimi entomološkimi kleščami ali inokulacijsko zanko). Če so cilj štiri ponovitve na tretiranje, pri čemer je v vsaki 20 iker, je treba razdeliti 80 iker na akvarij za izpostavljanje. Pomembno opozorilo: priporočljivo je dodati dodatnih 20 % (tj. 96 iker na stopnjo tretiranja), dokler se ne zagotovi 100-odstotna oploditev. | 2. | Ikre zeta so zelo nagnjenje h glivičnim okužbam izven gnezdišč, ki jih varujejo samci. Zato je ključnega pomena, da se vse ikre prvih pet dni preskusa tretirajo z metilensko modrim. Založna raztopina metilensko modrega se pripravi z 1 mg/ml in doda v akvarij za izpostavljanje, kjer je največja končna koncentracija 2,125 mg/l. Pomembno opozorilo: zeti se ne smejo izpostaviti metilensko modremu, ko se izvalijo, zato v sistemu za ublažitev do šestega dne ne sme biti več metilensko modrega. | 3. | Ikre se vsak dan pregledajo, pri čemer je treba dokumentirati vse mrtve ali neoplojene ikre. Pomembno opozorilo: dokler se ikre ne izvalijo, ne smejo zapustiti vode niti za krajši čas. | C.42 BIOLOŠKA RAZGRADLJIVOST V MORSKI VODI | SPLOŠNI UVOD | 1. | Ta preskusna metoda ustreza Smernici za preskušanje OECD (TG) 306 (1992). Ko so bile pripravljene izvirne preskusne metode, ni bilo znano, v kakšnem obsegu bi se lahko rezultati presejalnih preskusov lahke biološke razgradljivosti z uporabo sladke vode in komunalne odplake ali aktivnega blata kot inokuluma, uporabili za morsko okolje. V zvezi s tem so bili sporočeni različni rezultati (npr. (1)). | 2. | Veliko industrijskih odpadnih voda, ki vsebujejo različne kemikalije, doseže morje z neposrednim izpustom ali prek rečnih ustij in rek, v katerih so zadrževalni časi kratki v primerjavi z obdobjem, ki je potrebno za popolno biološko razgradnjo številnih prisotnih kemikalij. Zaradi vedno večje ozaveščenosti o potrebi, da je treba morsko okolje zaščititi pred vedno večjo obremenitvijo s kemikalijami in oceniti verjetno koncentracijo kemikalij v morju, so bile razvite preskusne metode za biološko razgradljivost v morski vodi. | 3. | Pri metodah, opisanih v tem poglavju, se naravna morska voda uporablja kot vodna faza in vir mikroorganizmov. V okviru prizadevanj za skladnost z metodami za lahko biološko razgradljivost v sladki vodi sta se proučevali uporaba ultrafiltrirane in centrifugirane morske vode ter uporaba morskih usedlin kot inokulumov. Ta proučevanja niso bila uspešna. Preskusni medij je zato naravna morska voda, predhodno tretirana, da se odstranijo grobi delci. | 4. | Da bi se lahko končna biološka razgradljivost ocenila z metodo stresanja bučke, je treba zaradi slabe občutljivosti analitske metode za raztopljeni organski ogljik (DOC) uporabiti razmeroma visoke koncentracije preskusne snovi. Zato je treba dodajati morsko vodo z mineralnimi hranilnimi snovmi (N in P), saj bi njihove nizke koncentracije sicer omejile odstranitev raztopljenega organskega ogljika. Pri metodi stresanja bučke je treba zaradi koncentracije dodane preskusne snovi dodati tudi hranilne snovi. | 5. | Zato metode niso preskusi za lahko biološko razgradljivost, ker se mikroorganizmom, ki so že prisotni v morski vodi, ne doda inokulum. Preskusi tudi niso simulacija morskega okolja, saj se dodajo hranilne snovi, koncentracija preskusne snovi pa je veliko višja, kot bi bila prisotna v morju. Zato se metode predlagajo v novem podrazdelku ‚Biološka razgradljivost v morski vodi‘. | UPORABA | 6. | Rezultati preskusa, ki bi se uporabili, ker sta vzorec uporabe in odstranjevanje zadevne snovi pokazala pot do morja, dajejo prvi vtis o biološki razgradljivosti v morski vodi. Če je rezultat pozitiven (> 70 % odstranjenega raztopljenega organskega ogljika; > 60 % teoretične potrebe po kisiku (TPK)), se lahko ugotovi, da je biološka razgradnja v morskem okolju mogoča. Vendar negativen rezultat ne izključuje takega potenciala, ampak kaže, da je potrebna nadaljnja študija, na primer z uporabo čim nižje koncentracije preskusne snovi. | 7. | Če je potrebna bolj končna vrednost hitrosti ali stopnje biološke razgradnje v morski vodi na določenem mestu, je v vsakem primeru treba uporabiti zahtevnejše, bolj prefinjene in zato dražje metode. Simulacijski preskus bi se na primer lahko uporabil s koncentracijo preskusne snovi, ki je bliže verjetni koncentraciji v okolju. Uporabila bi se lahko tudi neobogatena morska voda, ki ni predhodno tretirana, iz aktualne lokacije, primarna biološka razgradnja pa bi se lahko spremljala s specifično kemijsko analizo. Za končno biološko razgradljivost bi bile potrebne snovi, označene s 14C, da bi se lahko izmerile hitrosti izginjanja topnega organskega 14C in nastajanje 14CO2 pri pogojih, ki so realni za okolje. | IZBIRA METOD | 8. | Izbira metode, ki se bo uporabila, je odvisna od številnih dejavnikov. Naslednja tabela bo pripomogla k izbiri. Čeprav snovi, ki so topne v vodi pod ekvivalentom približno 5 mg C/l, z metodo stresanja bučke ni mogoče preskusiti, se lahko z njo načeloma preskusijo vsaj slabo topne snovi. | Tabela | Prednosti in slabosti metode stresanja bučke ter preskusa v zaprti steklenici | METODA | PREDNOSTI | SLABOSTI | STRESANJE BUČKE | — | enostavna oprema, razen analizatorja za C, | — | trajanje 60 dni ni težava, | — | ni motenj zaradi nitrifikacije, | — | lahko se prilagodi hlapnim snovem, | — | potreben je analizator za C, | — | uporabi se 5–40 mg DOC/l, lahko ima inhibitorni učinek, | — | določitev DOC je zahtevna pri nizkih koncentracijah v morski vodi (učinek klora), | — | DOC je v morski vodi občasno visoka, | ZAPRTA STEKLENICA | — | enostavna oprema, | — | enostavna določitev konca, | — | uporablja se nizka koncentracija preskusne snovi (2 mg/l), zato je manjša verjetnost zaviranja, | — | enostavna prilagoditev hlapnim snovem, | — | morda je težko ohranjati nepredušnost steklenic, | — | zaradi rasti bakterij po stenah so lahko rezultati napačni, | — | slepe vrednosti absorpcije O2 so lahko visoke zlasti po 28 dneh; lahko se preprečijo s staranjem morske vode, | — | mogoče motnje absorpcije O2 zaradi nitrifikacije | METODA STRESANJA BUČKE | UVOD | 1. | Ta metoda je različica prilagojenega presejalnega preskusa OECD, opisanega v poglavju C.4B te priloge (2). Končna različica je bila pripravljena kot rezultat krožnega preskusa, ki ga je za Evropsko komisijo pripravil danski inštitut za kakovost vode (3). | 2. | Tako kot pri spremljajočem preskusu v zaprti steklenici se rezultati tega preskusa ne smejo obravnavati kot kazalniki lahke biološke razgradljivosti, ampak se morajo uporabiti izrecno za pridobivanje informacij o biološki razgradljivosti snovi v morskih okoljih. | NAČELO METODE | 3. | Predhodno določena količina preskusne snovi se raztopi v preskusnem mediju, da nastane koncentracija 540 mg raztopljenega organskega ogljika (DOC)/l. Če se meje občutljivosti analiz organskega ogljika izboljšajo, lahko ima prednost uporaba nižjih koncentracij preskusne snovi, zlasti za inhibitorne snovi. Raztopina preskusne snovi v preskusnem mediju se inkubira z mešanjem v temi ali difuzni svetlobi v aerobnih pogojih pri stalni temperaturi (vzdrževani v razponu ± 2 °C), ki je običajno v obsegu 15–20 °C. Kadar je cilj študije simulacija okoljskih razmer, se lahko preskusi izvedejo izven običajnega temperaturnega razpona. Priporoča se, da preskus ne traja dlje kot približno 60 dni. Razgradnja sledi meritvam raztopljenega organskega ogljika (končna razgradnja) in v nekaterih primerih specifični analizi (primarna razgradnja). | INFORMACIJE O PRESKUSNI SNOVI | 4. | Da bi vedeli, ali se lahko preskus uporabi za določeno snov, morajo biti znane nekatere njene lastnosti. Določiti je treba vsebnost organskega ogljika v snovi, njena hlapnost ne sme povzročati bistvenih izgub med potekom preskusa, njena topnost v vodi pa mora biti večja ali enaka 2 540 mg C/l. Poleg tega se preskusna snov ne sme znatno adsorbirati na steklene površine. Za razlago dobljenih rezultatov so potrebne informacije o čistosti ali relativnih deležih glavnih sestavin preskusne snovi, zlasti kadar so rezultati mejni. | 5. | Informacije o strupenosti preskusne snovi za bakterije, kot se na primer meri v kratkotrajnih preskusih stopnje respiracije (4), so lahko koristne pri izbiri primernih preskusnih koncentracij in so lahko bistvene za pravilno razlago nizkih vrednosti biološke razgradnje. Vendar take informacije niso vedno zadostne za razlago rezultatov, dobljenih v preskusu biološke razgradnje, pri čemer je ustreznejši postopek, ki je opisan v odstavku 18. | REFERENČNE SNOVI | 6. | Da se preveri mikrobna dejavnost vzorca morske vode, je treba uporabiti ustrezne referenčne snovi. Primeri snovi, ki se lahko uporabijo v ta namen, so natrijev benzoat, natrijev acetat in anilin. Referenčne snovi se morajo razgraditi v razumnem času, sicer se priporoča, da se preskus ponovi z drugim vzorcem morske vode. | 7. | Pri krožnem preskusu za Evropsko komisijo, kjer so bili vzorci morske vode odvzeti na različnih lokacijah in v različnih časovnih obdobjih (3), sta bila lag faza (tL) in čas do 50-odstotne razgradnje (t50), ki ne vključuje lag faze, od 1 do 4 dni oziroma od 1 do 7 dni za natrijev benzoat. Za anilin je bil tL od 0 do 10dni, t50 pa od 1 do 10 dni. | OBNOVLJIVOST IN OBČUTLJIVOST METODE | 8. | Obnovljivost metode je bila določena s krožnim preskusom (3). Najnižjo koncentracijo preskusne snovi, za katero se lahko ta metoda uporabi z analizo raztopljenega organskega ogljika, v veliki meri določata meja zaznavnosti analize organskega ogljika (približno 0,5 mg C/l) in koncentracija raztopljenega organskega ogljika v uporabljeni morski vodi (običajno 35 mg/l za vodo iz odprtega morja). Osnovna koncentracija raztopljenega organskega ogljika ne sme preseči približno 20 % skupne koncentracije raztopljenega organskega ogljika po dodajanju preskusne snovi. Če to ni izvedljivo, se lahko osnovna koncentracija raztopljenega organskega ogljika občasno zniža s staranjem morske vode pred preskušanjem. Če se metoda uporabi le s specifično kemijsko analizo (s katero se meri primarna razgradnja), mora raziskovalec z zagotavljanjem dodatnih informacij dokumentirati, ali se lahko pričakuje končna razgradljivost. Dodatne informacije lahko vključujejo rezultate drugih preskusov za lahko ali inherentno biološko razgradljivost. | OPIS METODE | Oprema | 9. | Običajna laboratorijska oprema in: | a. | stresalnik, primeren za erlenmajerice prostornine 0,52 litra, bodisi z avtomatskim uravnavanjem temperature bodisi v prostoru s konstantno temperaturo 15–20 °C, ki se vzdržuje v razponu ± 2 °C; | b. | erlenmajerice z ozkim grlom, prostornine 0,52 litra; | c. | naprava za membransko filtracijo ali centrifuga; | d. | membranski filtri, 0,2–0,45 μm; | e. | analizator ogljika; | f. | oprema za specifično analizo (neobvezno). | Morska voda | 10. | V temeljito očiščeno posodo se odvzem vzorec morske vode in prenese v laboratorij, po možnosti v enem ali dveh dneh po odvzemu. Zagotovi se, da temperatura vzorca med prevozom ne bo znatno presegla temperature, ki bo uporabljena v preskusu. Natančno se opredeli lokacija vzorčenja in opiše njegovo stanje v zvezi z onesnaženostjo in hranilnimi snovmi. V opredelitev se zlasti pri obalnih vodah vključita število heterotrofnih mikrobnih kolonij ter določitev koncentracij raztopljenega nitrata, amoniaka in fosfata. | 11. | Za vzorec morske vode se navedejo naslednje informacije: | — | datum odvzema, | — | globina odvzema, | — | videz vzorca – moten itd., | — | temperatura v času odvzema, | — | slanost, | — | raztopljeni organski ogljik, | — | čas od odvzema do uporabe v preskusu. | 12. | Če se ugotovi, da je vsebnost raztopljenega organskega ogljika v vzorcu morske vode previsoka (odstavek 8), je priporočeno, da se morska voda pred uporabo stara približno en teden. Staranje poteka v aerobnih pogojih pri preskusni temperaturi in v temi ali pri difuzni svetlobi. Po potrebi je treba aerobne pogoje vzdrževati z rahlim prezračevanjem. Med staranjem se vsebnost lahko razgradljive organske snovi zmanjša. Krožni preskus (3) ni pokazal razlike med možnostjo razgradnje staranih in sveže odvzetih vzorcev morske vode. Morska voda se pred uporabo tretira tako, da se odstranijo grobi delci, npr. s filtriranjem skozi najlonski filter ali filter papir (ne membranski filter ali filter GF/C) ali s sedimentacijo in odlivanjem. Uporabljeni postopek je treba navesti. Če se izvede staranje, se po njem izvede predhodno tretiranje. | Založne raztopine za mineralne hranilne snovi | 13. | Iz analitsko čistih reagentov se pripravijo naslednje založne raztopine. | (a) | Kalijev dihidrogen ortofosfat, KH2PO4 | 8,50 g | Dikalijev hidrogen ortofosfat, K2HPO4 | 21,75 g | Dinatrijev hidrogen ortofosfat dihidrat, Na2HPO4 · 2H2O | 33,30 g | Amonijev klorid, NH4Cl | 0,50 g | Raztopiti in dopolniti do 1 litra z destilirano vodo. | | (b) | Kalcijev klorid, CaCl2 | 27,50 g | Raztopiti in dopolniti do 1 litra z destilirano vodo. | | (c) | Magnezijev sulfat heptahidrat, MgSO4 · 7H2O | 22,50 g | Raztopiti in dopolniti do 1 litra z destilirano vodo. | | (d) | Železov (III) klorid heksahidrat, FeCl3 · 6H2O | 0,25 g | Raztopiti in dopolniti do 1 litra z destilirano vodo. | | Obarjanje v raztopini (d) bi se lahko preprečilo z dodajanjem ene kapljice koncentrirane HCl ali 0,4 g etilendiamintetraocetne kisline (EDTA, dinatrijeva sol) na liter. Če se obarjenje pojavi v založni raztopini, se nadomesti s svežo raztopino. | Priprava preskusnega medija | 14. | Doda se 1 ml vsake od zgornjih založnih raztopin na liter predhodno tretirane morske vode. | Inokulum | 15. | Mikroorganizmom, ki so že prisotni v morski vodi, se ne doda poseben inokulum. Število heterotrofov, ki v preskusnem mediju morske vode tvorijo kolonije (in po možnosti tudi v izvirnih vzorcih morske vode), se (neobvezno) določi npr. s štetjem kolonij na ploščah, za kar se uporabi morski agar. To je zlasti zaželeno za vzorce iz obalnih ali onesnaženih mest. Heterotrofna mikrobna dejavnost v morski vodi se preveri s preskusom z referenčno snovjo. | Priprava bučk | 16. | Zagotovi se, da bo vsa steklena posoda temeljito očiščena, vendar ne nujno sterilna (npr. z alkoholno klorovodikovo kislino), sprana in posušena pred uporabo, da se prepreči onesnaženje z ostanki iz prejšnjih preskusov. Bučke je treba očistiti tudi pred prvo uporabo. | 17. | Preskusne snovi v dveh bučkah se ocenijo hkrati, skupaj z bučko za referenčno snov. V dveh ponovitvah se izvede slepi preskus brez preskusne ali referenčne snovi za določanje analitskih slepih vzorcev. Preskusne snovi, ki se lahko ustrezno dodajo prek koncentrirane založne raztopine, se raztopijo v preskusnem mediju, da se zagotovijo želene začetne koncentracije, ki so običajno 540 mg DOC/l. Referenčna snov se normalno preskusi pri začetni koncentraciji, ki ustreza 20 mg DOC/l. Če se uporabijo založne raztopine preskusnih in/ali referenčnih sovi, se zagotovite, da se slanost medija morske vode ne spremeni bistveno. | 18. | Če se lahko pričakujejo strupeni učinki ali jih ni mogoče izključiti, je v načrt preskusa priporočljivo vključiti dve ponovitvi preskusa zaviranja. Preskusna in referenčna snov se dodata v isto posodo, pri čemer naj bo zaradi primerjave koncentracija referenčne snovi običajno enaka kot pri kontrolnem preskusu (tj. 20 mg DOC/l). | 19. | V erlenmajerice se odmerijo primerne prostornine preskusnih raztopin (primerna količina ne presega polovice prostornine erlenmajeric), nato pa se vse erlenmajerice ohlapno pokrijejo (npr. z aluminijasto folijo), tako da bo mogoča izmenjava plinov med bučko in okoliškim zrakom. (Če se uporablja analiza raztopljenega organskega ogljika, vata ni primerna.) Posode se postavijo na stresalnik in se ves čas preskusa neprekinjeno stresajo pri zmernih obratih (npr. 100 o/min). Temperatura (15–20 °C v razponu ± 2 °C) se nadzoruje in posode se zaščitijo pred svetlobo, da se prepreči rast alg. Zagotovi se, da v zraku ni strupenih snovi. | Fizikalno-kemijski kontrolni preskus (neobvezno) | 20. | Če obstaja sum abiotske razgradnje ali mehanizma izgub, kot je hidroliza (težava le pri specifični analizi), izhlapevanje ali adsorpcija, je priporočljivo izvesti fizikalno-kemijski kontrolni preskus. Izvede se lahko z vnosom živosrebrovega (II) klorida (HgCl2) (23) (50– 100 mg/l) v posode s preskusno snovjo, da se ustavi mikrobna dejavnost. Znatno zmanjšanje raztopljenega organskega ogljika ali koncentracije specifične snovi v fizikalno-kemijskem kontrolnem preskusu kaže abiotske mehanizme odstranjevanja. (Če se uporabi živosrebrov klorid, je treba pri analizi raztopljenega organskega ogljika paziti na motnje ali zastrupitev katalizatorja.) | Število bučk | 21. | V značilnem poteku preskusa se uporabijo naslednje bučke: | bučki 1 in 2 | – | vsebujeta preskusno snov (preskusno suspenzijo), | bučki 3 in 4 | – | vsebujeta le morsko vodo (slepi), | bučka 5 | – | vsebuje referenčno snov (kontrola postopka), | bučka 6 | – | vsebuje preskusno in referenčno snov (kontrola strupenosti) – neobvezna, | bučka 7 | – | vsebuje preskusno snov in sterilizacijsko sredstvo (abiotska sterilna kontrola) – neobvezna. | Analiza raztopljenega organskega ogljika | 22. | Med potekom preskusa se v ustreznih razmikih odvzamejo vzorci za analizo raztopljenega organskega ogljika (Dodatek 1). Vzorci se vedno odvzamejo na začetku preskusa (dan 0) in 60. dan. Za opis časovnega poteka razgradnje je skupaj potrebnih vsaj pet vzorcev. Fiksnega časovnega razporeda vzorčenja ni mogoče določiti, ker se hitrost biološke razgradnje razlikuje. Za vsak vzorec se določi raztopljeni organski ogljik v dveh ponovitvah. | Vzorčenje | 23. | Potrebna prostornina vzorcev je odvisna od analitske metode (specifična analiza), uporabljenega analizatorja ogljika in postopka (membranska filtracija ali centrifugiranje), izbranega za tretiranje vzorca pred določanjem ogljika (odstavka 25 in 26). Pred vzorčenjem je treba zagotoviti, da je preskusni medij dobro premešan in da se material, prilepljen na steno bučke, raztopi ali suspendira. | 24. | Membransko filtracijo ali centrifugiranje je treba izvesti takoj po vzorčenju. Po potrebi se filtrirani ali centrifugirani vzorci shranijo pri 2–4 °C za največ 48 ur ali pod – 18 °C za daljša obdobja (vzorec se pred shranjevanjem zakisa na pH 2, če je znano, da to ne bo vplivalo na snov). | 25. | Membranski filtri (0,2–0,45 μm) so primerni le, če je zagotovljeno, da med filtriranjem ne izpuščajo ogljika in ne adsorbirajo snovi; npr. polikarbonski membranski filtri. Nekateri membranski filtri so impregnirani s površinsko aktivnimi snovmi za hidrofilizacijo in lahko sprostijo velike količine raztopljenega ogljika. Takšne filtre je treba pripraviti z vrenjem v deionizirani vodi tri zaporedna obdobja, pri čemer eno traja eno uro. Po vrenju je treba filtre shraniti v deionizirani vodi. Prvih 20 ml filtrata se zavrže. | 26. | Namesto membranske filtracije se lahko izbere centrifugiranje vzorcev. Centrifugira se 15 minut pri 40 000 m.s– 2 (~ 4 000 g), po možnosti v ohlajeni centrifugi. | Opomba: zdi se, da razlikovanje skupnega organskega ogljika (TOC) od raztopljenega organskega ogljika (TOC/DOC) s centrifugiranjem pri zelo nizkih koncentracijah ni mogoče, saj se bodisi ne odstranijo vse bakterije bodisi se ogljik kot del bakterijske plazme ponovno raztopi. Pri višjih preskusnih koncentracijah (> 10 mg C na liter) se zdi napaka pri centrifugiranju primerljivo majhna. | Pogostost vzorčenja | 27. | Če se analize izvajajo takoj po vzorčenju, se naslednji čas vzorčenja oceni ob upoštevanju rezultata analitskega določanja. | 28. | Če se vzorci ohranijo (odstavek 24) za poznejšo analizo, je treba odvzeti več kor pet vzorcev, kolikor je potrebno najmanjše število. Zadnji vzorec se analizira najprej, pri čemer je mogoče s postopno ‚vzvratno‘ izbiro ustreznih vzorcev pridobiti dober opis krivulje biološke razgradnje z razmeroma majhnim številom analitskih določitev. Če do konca preskusa ne pride do razgradnje, ni treba analizirati dodatnih vzorcev, pri čemer se lahko v takem primeru z ‚vzvratno‘ strategijo prihrani veliko analitskih stroškov. | 29. | Če se na krivulji razgradnje pred 60. dnem opazi ravnotežje, je treba preskus končati. Če je očitno, da se je razgradnja začela pred 60. dnem, vendar ni dosegla ravnotežja, se preskus podaljša za dodatno obdobje. | PODATKI IN POROČANJE | Obdelava rezultatov | 30. | Rezultati analize se zabeležijo na priloženi podatkovni list (Dodatek 2), vrednosti biološke razgradnje za preskusno in referenčno snov pa se izračunajo po naslednji enačbi: | pri čemer je: | Dt | = | razgradnja v odstotku raztopljenega organskega ogljika ali odstranitev specifične snovi ob času t, | Co | = | začetna koncentracija raztopljenega organskega ogljika ali specifične snovi v preskusnem mediju, | Ct | = | koncentracija raztopljenega organskega ogljika ali specifične snovi v preskusnem mediju ob času t, | Cbl(0) | = | začetna koncentracija raztopljenega organskega ogljika ali specifične snovi v slepem vzorcu, | Cbl(t) | = | koncentracija raztopljenega organskega ogljika ali specifične snovi v slepem vzorcu ob času t. | 31. | Razgradnja se navede kot odstotek odstranitve raztopljenega organskega ogljika (končna razgradnja) ali odstranitve specifične snovi (primarna razgradnja) ob času t. Koncentracije raztopljenega organskega ogljika se izračunajo na najbližji 0,1 mg na liter, srednje vrednosti Dt pa se zaokrožijo na najbližji celi odstotek. | 32. | Potek razgradnje se grafično prikaže na diagramu, kot je prikazano na sliki ‚Veljavnost in razlaga rezultatov‘. Če je na voljo dovolj podatkov, se iz krivulje izračunata lag faza (tL) in čas do 50-odstotne odstranitve od konca lag faze (t50). | Poročilo o preskusu | 33. | V poročilu o preskusu morajo biti naslednje informacije: | | Preskusna snov: | — | fizikalna narava in, kadar je to primerno, fizikalno-kemijske lastnosti, | — | identifikacijski podatki. | | Preskusni pogoji: | — | lokacija in opis mesta vzorčenja, stanje v zvezi z onesnaženostjo in hranilnimi snovmi (število kolonij, amoniak, fosfat, če je primerno), | — | značilnosti vzorca (datum vzorčenja, globina, videz, temperatura, slanost, raztopljeni organski ogljik (neobvezno), čas med odvzemom in uporabo v preskusu), | — | metoda staranja morske vode, če je bila uporabljena, | — | uporabljena metoda za predhodno tretiranje (filtracija/sedimentacija) morske vode, | — | uporabljena metoda za določitev raztopljenega organskega ogljika, | — | uporabljena metoda za specifično analizo (neobvezno), | — | uporabljena metoda za določitev števila heterotrofov v morski vodi (metoda štetja kolonij na ploščah ali alternativni postopek) (neobvezno), | — | druge metode (neobvezno), uporabljene za opis značilnosti morske vode (merjenje ATP itd.). | | Rezultati: | — | analitski podatki, navedeni na podatkovnem listu (Dodatek 2), | — | potek preskusa razgradnje se grafično prikaže na diagramu, ki kaže lag fazo (tL), naklon in čas (z začetkom ob koncu lag faze) do 50-odstotne odstranitve (t50). Lag faza se lahko grafično oceni, kot je prikazano na sliki v razdelku ‚Veljavnost in razlaga rezultatov‘, ali se ustrezno šteje kot čas, potreben za 10-odstotno razgradnjo, | — | odstotek razgradnje, izmerjen po 60 dneh ali ob koncu preskusa. | | Razprava o rezultatih. | Veljavnost in razlaga rezultatov | 34. | Rezultati, pridobljeni z referenčnimi snovmi, npr. natrijevim benzoatom, natrijevim acetatom ali anilinom, morajo biti primerljivi z rezultati, pridobljenimi s krožnim preskusom (3) (glej razdelek ‚Referenčne snovi‘, odstavek 7). Če so rezultati, pridobljenimi z referenčnimi snovmi, netipični, je treba preskus ponoviti z drugim vzorcem morske vode. Čeprav rezultatov preskusov zaviranja zaradi prispevka raztopljenega organskega ogljika, ki ga zagotovi preskusna snov, ni vedno mogoče enostavno razlagati, je znatno zmanjšanje stopnje odstranitve skupnega raztopljenega organskega ogljika v primerjavi s stopnjo iz kontrole pozitiven znak za strupene učinke. | 35. | Zaradi uporabljenih razmeroma visokih preskusnih koncentracij v primerjavi z večino naravnih sistemov (in zato neugodnim razmerjem med koncentracijami preskusnih snovi in drugih virov ogljika) se metoda šteje za predhodni preskus, ki se lahko uporabi za ugotovitev, ali je snov lahko biološko razgradljiva. V skladu s tem nizek rezultat ne pomeni nujno, da preskusna snov v morskem okolju ni biološko razgradljiva, ampak kaže, da bo za to ugotovitev potrebnega več dela. | Na spodnji sliki je prikazan teoretičen poskus razgradnje, ki kaže izvedljiv način ocene vrednosti tL (dolžina lag faze) in t50 (časovno obdobje, ki se začne pri tL), potrebnih za 50-odstotno odstranitev. | Bonferronijev U-preskus | Preskus po Jonckheere-Terpstraju | Shirleyjev preskus | Dunnov preskus | Podatki: | Je variacija homogena? | Je porazdelitev normalna? | Parametrični preskusi | Da | Izločite kontrolo brez topila. | Sta obe kontroli enaki? U-preskus | Sta obe kontroli enaki? T-preskus. | Obe kontroli je mogoče združiti. | Dodatna kontrola s topilom? | Dodatna kontrola s topilom? | Statistično preskušanje ni priporočljivo. | Ali obstajajo vsaj štiri ponovitve na tretiranje? | Ni uspelo. | Pretvori podatke. | Da | Da | Da | Da | Da | Da | Ne | Ne | Ne | Ne | Ne | Ne | Dunnettov preskus | Williamsov preskus | Izločite kontrolo brez topila. | Obe kontroli je mogoče združiti. | Začetek | Neparametrični preskusi | METODA Z ZAPRTO STEKLENICO | UVOD | 1. | Ta metoda je različica preskusa v zaprti steklenici (5) za morsko vodo, katere končna različica je bila pripravljena kot rezultat krožnega preskusa, ki ga je za Evropsko komisijo pripravil danski inštitut za kakovost vode (3). | 2. | Tako kot pri spremljajoči metodi stresanja bučke se rezultati tega preskusa ne smejo obravnavati kot kazalniki lahke biološke razgradljivosti, ampak se morajo uporabiti izrecno za pridobivanje informacij o biološki razgradljivosti snovi v morskih okoljih. | NAČELO METODE | 3. | Predhodno določena količina preskusne snovi se raztopi v preskusnem mediju v koncentraciji, ki je običajno 2– 10 mg preskusne snovi na liter (uporabi se lahko ena koncentracija ali več). Raztopina se v polni zaprti steklenici hrani v temi v kopeli ali posodi s konstantno temperaturo, ki se vzdržuje na ± 1 °C v razponu 15–20 °C. Kadar je cilj študije simulacija okoljskih razmer, se lahko preskusi izvedejo izven običajnega temperaturnega razpona, če se nadzor temperature ustrezno prilagodi. Razgradnji sledijo analize kisika v 28-dnevnem obdobju. | 4. | Krožni preskus je pokazal, da v večini primerov zaradi resnih motenj ne bi bilo mogoče zbrati koristnih informacij, če bi se preskus podaljšal na več kot 28 dni. Slepe vrednosti biokemijske potrebe po kisiku (BPK) so bile verjetno pretirano visoke zaradi rasti po stenah, ki jo povzroča pomanjkanje mešanja, in nitrifikacije. Zato je priporočeno trajanje preskusa 28 dni, če pa slepe vrednosti biokemijske potrebe po kisiku ostanejo v okviru 30-odstotne meje (odstavka 15 in 40), se lahko preskus podaljša. | INFORMACIJE O PRESKUSNI SNOVI | 5. | Da bi vedeli, ali se lahko preskus uporabi za določeno snov, morajo biti znane nekatere njene lastnosti. Empirična formula je potrebna, da se lahko izračuna teoretična potreba po kisiku (TPK) (glej dodatek 3); v nasprotnem primeru je treba določiti kemijsko potrebo snovi po kisiku (KPK), ki se šteje za referenčno vrednost. Uporaba kemijske potrebe po kisiku je manj zadovoljiva, ker nekatere snovi v preskusu kemijske potrebe po kisiku ne oksidirajo popolnoma. | 6. | Topnost snovi mora biti vsaj 2 mg/l, čeprav se načeloma lahko preskusijo tudi manj topne snovi (npr. z ultrazvočnim razbijanjem) in hlapne snovi. Za razlago dobljenih rezultatov so potrebne informacije o čistosti ali relativnih deležih glavnih sestavin preskusne snovi, zlasti kadar so rezultati mejni. | 7. | Informacije o strupenosti snovi za bakterije, kot se na primer meri v kratkotrajnih preskusih respiracije (4), so lahko zelo koristne pri izbiri primernih preskusnih koncentracij in so lahko bistvene za pravilno razlago nizkih vrednosti biološke razgradnje. Vendar take informacije niso vedno zadostne za razlago rezultatov, dobljenih v preskusu biološke razgradnje, pri čemer je ustreznejši postopek, ki je opisan v odstavku 27. | REFERENČNE SNOVI | 8. | Da se preveri mikrobna dejavnost vzorca morske vode, je treba uporabiti ustrezne referenčne snovi. Za ta namen se lahko uporabi (na primer) anilin, natrijev acetat ali natrijev benzoat. Pri teh snoveh se mora v razumnem času pojaviti vsaj 60-odstotna razgradnja (njihove teoretične potrebe po kisiku), sicer se priporoča, da se preskus ponovi z drugim vzorcem morske vode. | 9. | Pri krožnem preskusu za Evropsko komisijo, kjer so bili vzorci morske vode odvzeti na različnih lokacijah in v različnih časovnih obdobjih, sta bila lag faza (tL) in čas do 50-odstotne razgradnje (t50), ki ne vključuje lag faze, od 0 do 2 dni oziroma od 1 do 4 dni za natrijev benzoat. Za anilin sta bili vrednosti tL in t50 od 0 do 7 dni oziroma od 2 do 12 dni. | OBNOVLJIVOST | 10. | Obnovljivost metod je bila določena s krožnim preskusom za Evropsko komisijo (3). | OPIS METODE | Oprema | 11. | Običajna laboratorijska oprema in: | (a) | uporabijo se lahko BPK-steklenice s steklenimi zamaški in prostornino 250–300 ml ali steklenice z ozkim grlom in prostornino 250 ml; | (b) | več dvo-, tri- ali štirilitrskih steklenic z oznakami za litre za pripravo preskusa in polnjenje BPK-steklenic; | (c) | vodna kopel ali prostor s konstantno temperaturo za shranjevanje steklenic pri konstantni temperaturi (± 1 °C), kjer ni svetlobe; | (d) | oprema za analizo raztopljenega kisika; | (e) | membranski filtri, 0,2–0,45 μm (neobvezno); | (f) | oprema za specifično analizo (neobvezno). | Morska voda | 12. | V temeljito očiščeno posodo se odvzame vzorec morske vode in prenesite v laboratorij, po možnosti v enem ali dveh dneh po odvzemu. Zagotovi se, da temperatura vzorca med prevozom ne bo znatno presegla temperature, ki bo uporabljena v preskusu. | 13. | Natančno se opredeli lokacija vzorčenja in opiše njeno stanje v zvezi z onesnaženostjo in hranilnimi snovmi. V opredelitev se zlasti pri obalnih ali onesnaženih vodah vključita število heterotrofnih mikrobnih kolonij ter določitev koncentracij raztopljenega nitrata, amoniaka in fosfata. | 14. | Za vzorec morske vode se navedejo naslednje informacije: | — | datum odvzema, | — | globina odvzema, | — | videz vzorca – moten itd., | — | temperatura v času odvzema, | — | slanost, | — | raztopljeni organski ogljik (DOC), | — | čas od odvzema do uporabe v preskusu. | 15. | Če se ugotovi, da je vsebnost raztopljenega organskega ogljika v vzorcu visoka ali če se zdi, da bi bila slepa biokemijska potreba po kisiku po 28 dneh več kot 30 % potrebe referenčne snovi, se priporoča, da se morska voda pred uporabo stara približno en teden. | 16. | Staranje vzorca poteka v aerobnih pogojih pri preskusni temperaturi in v temi ali difuzni svetlobi. Po potrebi je treba aerobne pogoje vzdrževati z rahlim prezračevanjem. Med staranjem se vsebnost lahko razgradljive organske snovi zmanjša. Krožni preskus (3) ni pokazal razlike med možnostjo razgradnje staranih in sveže odvzetih vzorcev morske vode. | 17. | Morska voda se pred uporabo tretira tako, da se odstranijo grobi delci, npr. s filtriranjem skozi najlonski filter ali filter papir (ne membranski filter ali filter GF/C) ali s sedimentacijo in odlivanjem. Uporabljeni postopek je treba navesti. Če se izvede staranje, je treba izvesti tudi predhodno tretiranje. | Založne raztopine za mineralne hranilne snovi | 18. | Iz analitsko čistih reagentov se pripravijo naslednje založne raztopine. | (a) | Kalijev dihidrogen ortofosfat, KH2PO4 | 8,50 g | Dikalijev hidrogen ortofosfat, K2HPO4 | 21,75 g | Dinatrijev hidrogen ortofosfat dihidrat, Na2HPO4 · 2H2O | 33,30 g | Amonijev klorid, NH4Cl | 0,50 g | Raztopiti in dopolniti do 1 litra z destilirano vodo. | | (b) | Kalcijev klorid, CaCl2 | 27,50 g | Raztopiti in dopolniti do 1 litra z destilirano vodo. | | (c) | Magnezijev sulfat heptahidrat, MgSO4 · 7H2O | 22,50 g | Raztopiti in dopolniti do 1 litra z destilirano vodo. | | (d) | Železov (III) klorid heksahidrat, FeCl3 · 6H2O | 0,25 g | Raztopiti in dopolniti do 1 litra z destilirano vodo. | | Obarjanje v raztopini (d) bi se lahko preprečilo z dodajanjem ene kapljice koncentrirane HCl ali 0,4 g etilendiamintetraocetne kisline (EDTA, dinatrijeva sol) na liter. Če se obarjenje pojavi v založni raztopini, se nadomesti s svežo raztopino. | Priprava preskusnega medija | 19. | Na liter predhodno tretirane morske vode se doda 1 ml vsake od zgornjih založnih raztopin. Preskusni medij se nasiči z zrakom pri preskusni temperaturi, tako da se 20 minut prezračuje s čistim stisnjenim zrakom. Za namene kontrole se določi koncentracija raztopljenega kisika. Nasičena koncentracija raztopljenega kisika kot funkcija slanosti in temperature se lahko odčita iz nomograma, priloženega tej preskusni metodi (Dodatek 4). | Inokulum | 20. | Mikroorganizmom, ki so že prisotni v morski vodi, se ne doda poseben inokulum. Število heterotrofov, ki v preskusnem mediju morske vode tvorijo kolonije (in po možnosti tudi v izvirnem vzorcu morske vode), se (neobvezno) določi npr. s štetjem kolonij na ploščah, za kar se uporabi morski agar. To je zlasti zaželeno za vzorce iz obalnih ali onesnaženih mest. Heterotrofna mikrobna dejavnost v morski vodi se preveri s preskusom z referenčno snovjo. | Priprava preskusnih steklenic | 21. | Izvedejo se vsi potrebne priprave, vključno s staranjem in predhodno tretiranje morske vode pri izbrani preskusni temperaturi med 15 in 20 °C, ter zagotovi čistost, vendar ne sterilnost steklene posode. | 22. | Pripravijo se skupine BPK-steklenic za določanje biokemijske potrebe po kisiku preskusne in referenčne snovi v sočasnih preskusnih nizih. Vse analize se izvedejo na dveh steklenicah (slepi vzorci, referenčna in preskusna snov), tj. za vsako določanje se pripravita dve steklenici. Analize se izvajajo vsaj na dan 0 ter 5., 15. in 28. dan (štiri določitve). Pri analizah kisika je za štiri določitve skupaj potrebnih 3 × 2 × 4 = 24 steklenic (slepi vzorec, referenčna in preskusna snov) in zato približno 8 litrov preskusnega medija (za eno koncentracijo preskusne snovi). | 23. | V ustrezno velikih steklenicah (odstavek 11) se pripravijo ločene raztopine preskusne in referenčne snovi, tako da se v delno napolnjene velike steklenice najprej neposredno ali s koncentrirano založno raztopino dodata preskusna in založna snov. Preskusni medij se dodaja, dokler ne nastanejo končne želene koncentracije. Če se uporabijo založne raztopine preskusnih in/ali referenčnih sovi, je treba zagotoviti, da se slanost medija morske vode ne spremeni bistveno. | 24. | Koncentracije preskusne in referenčne snovi se izberejo ob upoštevanju: | (a) | topnosti raztopljenega kisika v morski vodi pri prevladujoči preskusni temperaturi in slanosti (glej priloženi nomogram v Dodatku 4); | (b) | slepe biokemijske potrebe morske vode po kisiku in | (c) | pričakovane biološke razgradljivosti preskusne snovi. | 25. | Topnost raztopljenega kisika je pri 15 °C in 20 °C ter slanosti 32 delov na tisoč (oceanska voda) približno 8,1 oziroma 7,4 mg/l. Poraba kisika morske vode same (respiracija v slepem vzorcu) je lahko 2 mg O2/l ali več, če morska voda ni starana. Zato se za zagotovitev ostanka znatne koncentracije kisika po oksidaciji preskusne snovi za snovi, ki bi se morale v preskusnih pogojih popolnoma razgraditi (kot so referenčne snovi), uporabi začetna koncentracija preskusne snovi, ki je približno 23 mg/l (odvisno od teoretične potrebe po kisiku). Manj razgradljive snovi se preskusijo pri nižjih koncentracijah, tj. do 10 mg/l, če se ne pojavijo strupeni učinki. Prednost lahko ima izvedba vzporednih preskusov z nizko (približno 2 mg/l) in visoko (približno 10 mg/l) koncentracijo preskusne snovi. | 26. | Vzporedno je treba določiti slepi kisik v steklenicah, ki ne vsebujejo niti preskusne niti referenčne snovi. | 27. | Če je treba določiti zaviralne učinke, se v ločenih velikih steklenicah (odstavek 13) pripravijo naslednji nizi raztopin: | (a) | 2 mg/l lahko razgradljive snovi, npr. katere koli navedene referenčne snovi; | (b) | x mg/l preskusne snovi (x je običajno 2); | (c) | 2 mg/l lahko razgradljive snovi plus x mg/l preskusne snovi. | Fizikalno-kemijski kontrolni preskus (neobvezno) | 28. | Če se izkoristi možnost uporabe specifičnih analiz, se lahko izvede fizikalno-kemijski poskus za preverjanje, ali se je preskusna snov odstranila z abiotskimi mehanizmi, kot je hidroliza ali adsorpcija. Fizikalno-kemijski kontrolni preskus se lahko izvede z vnosom živosrebrovega (II) klorida (HgCl2) (24) (50– 100 mg/l) v dve bučki s preskusno snovjo, da se ustavi mikrobna dejavnost. Znatno zmanjšanje koncentracije specifične snovi med preskusom kaže abiotske mehanizme odstranjevanja. | Število BPK-steklenic pri značilnem poteku preskusa | 29. | Pri značilnem poteku preskusa se uporabijo naslednje steklenice: | — | vsaj 8 steklenic s preskusno snovjo, | — | vsaj 8 steklenic izključno z morsko vodo, ki je okrepljena s hranilnimi snovmi, | — | vsaj 8 steklenic z referenčno snovjo in po potrebi, | — | 6 steklenic s preskusno in referenčno snovjo (kontrola strupenosti). | POSTOPEK | 30. | Takoj po pripravi je treba vsako raztopino izčrpati iz spodnje četrtine (ne z dna) ustrezno velike steklenice in z njo napolniti ustrezno skupino BPK-steklenic. V kontrolah nič (čas nič) se takoj analizira raztopljeni kisik (odstavek 33) ali pa se shranijo za poznejšo kemijsko analizo z obarjanjem z MnCl2 (manganov (II) klorid) in NaOH (natrijev hidroksid). | 31. | Preostale vzporedne BPK-steklenice se inkubirajo pri preskusni temperaturi (15–20 °C), shranijo v temi in umaknejo z inkubacijskega območja v ustreznih časovnih razmikih (npr. vsaj po 5, 15 in 28 dneh), pri čemer se v njih analizira raztopljeni kisik (odstavek 33). | 32. | Vzorci za specifično analizo se 15 minut membransko filtrirajo (0,2–0,45 μm) ali centrifugirajo (neobvezno). Če se ne analizirajo takoj, se hranijo pri 2–4 °C za največ 48 ur oz. pri – 18 °C za daljša obdobja (vzorec se pred shranjevanjem zakisa na pH 2, če je znano, da to ne bo vplivalo na snov). | Določanje raztopljenega kisika | 33. | Koncentracija raztopljenega kisika se določi s kemijsko ali elektrokemijsko metodo, ki je nacionalno ali mednarodno priznana. | PODATKI IN POROČANJE | Obdelava rezultatov | 34. | Na priložene podatkovne liste se zabeležijo analitski rezultati (Dodatek 5). | 35. | Biokemijska potreba po kisiku se izračuna kot razlika porabe kisika med slepim vzorcem in raztopino preskusne snovi v preskusnih pogojih. Neto poraba kisika se deli s koncentracijo (m/v) snovi, da se biokemijska potreba po kisiku izrazi kot BPK/mg preskusne snovi. Razgradnja je opredeljena kot razmerje med biokemijsko potrebo po kisiku in po možnosti teoretično potrebo po kisiku (TPK) ali kemijsko potrebo po kisiku (KPK) ter izražena v odstotkih (glej odstavek 36). | 36. | Za vsak čas vzorčenja se za preskusno in referenčno snov izračunajo vrednosti biološke razgradnje z eno od naslednjih enačb: | pri čemer je: | TPK | = | teoretična potreba po kisiku (izračun, Dodatek 3), | KPK | = | kemijska potreba po kisiku, določena s poskusom. | Opomba: občasno načina izračuna (odstotek teoretične potrebe po kisiku ali odstotek kemijske potrebe po kisiku) ne zagotovita enakih rezultatov; priporoča se uporaba teoretične potrebe po kisiku, ker v preskusu kemijske potrebe po kisiku nekatere snovi ne oksidirajo popolnoma. | 37. | Potek preskusa razgradnje se grafično prikaže na diagramu (glej primer v razdelku ‚Veljavnost in razlaga rezultatov‘). Če je na voljo dovolj podatkov, se iz krivulje biološke razgradnje izračunata lag faza (tL) in čas (t50) do 50-odstotne odstranitve od konca lag faze. | 38. | Če se uporabi specifična analiza (neobvezno), se odstotek primarne razgradnje navede kot odstotek odstranitve specifične snovi v preskusnem obdobju (popravljen za analitske slepe vzorce). | Poročilo o preskusu | 39. | Poročilo o preskusu mora vsebovati naslednje informacije: | | Preskusna snov: | — | fizikalna narava in, kadar je to primerno, fizikalno-kemijske lastnosti, | — | identifikacijski podatki. | | Preskusni pogoji: | — | lokacija in opis mesta vzorčenja: stanje v zvezi z onesnaženostjo in hranilnimi snovmi (število kolonij, nitrat, amoniak, fosfat, če je ustrezno), | — | značilnosti vzorca (datum vzorčenja, globina, videz, temperatura, slanost, raztopljeni organski ogljik (neobvezno), čas med odvzemom in uporabo v preskusu), | — | metoda staranja morske vode, če je bila uporabljena, | — | uporabljena metoda za predhodno tretiranje (filtracija/sedimentacija) morske vode, | — | uporabljena metoda za določanje kemijske potrebe po kisiku (če se je izvedlo), | — | uporabljena metoda za meritve kisika, | — | postopek disperzije za snovi, ki so v preskusnih pogojih slabo topne, | — | uporabljena metoda za določitev števila heterotrofov v morski vodi (metoda štetja kolonij na ploščah ali alternativni postopek), | — | uporabljena metoda za določanje raztopljenega organskega ogljika v morski vodi (neobvezno), | — | uporabljena metoda za specifično analizo (neobvezno), | — | druge neobvezne metode, uporabljene za opis značilnosti morske vode (merjenje ATP itd.). | | Rezultati: | — | analitski podatki, navedeni na podatkovnem listu (kot je priložen, Dodatek 5), | — | potek preskusa razgradnje, grafično prikazan na diagramu, ki kaže lag fazo (tL), naklon in čas (z začetkom ob koncu lag faze) do 50-odstotne odstranitve končne porabe kisika zaradi oksidacije preskusne snovi (t50). Lag faza se lahko grafično oceni, kot je prikazano na priloženi sliki, ali se ustrezno šteje kot čas, potreben za 10-odstotno razgradnjo, | — | odstotek razgradnje, izmerjen po 28 dneh. | | Razprava o rezultatih. | Veljavnost in razlaga rezultatov | 40. | Respiracija v slepem vzorcu ne sme preseči 30 % kisika v preskusni steklenici. Če tega merila ni mogoče izpolniti s sveže odvzeto morsko vodo, je treba morsko vodo pred uporabo starati (stabilizirati). | 41. | Upoštevati je treba možnost, da lahko snovi, ki vsebujejo dušik, vplivajo na rezultate. | 42. | Rezultati, pridobljeni z referenčnima snovema benzoatom in anilinom, morajo biti primerljivi z rezultati, pridobljenimi s krožnim preskusom (3) (odstavek 9). Če so rezultati, pridobljenimi z referenčnimi snovmi, netipični, je treba preskus ponoviti z drugim vzorcem morske vode. | 43. | Preskusna snov se lahko šteje za zaviralno za bakterije (pri uporabljeni koncentraciji), če je biokemijska potreba zmesi referenčne in preskusne snovi po kisiku manjša od vsote biokemijske potrebe ločenih raztopin obeh snovi po kisiku. | 44. | Zaradi razmeroma visokih preskusnih koncentracij v primerjavi z večino naravnih sistemov in zato neugodnim razmerjem med koncentracijami preskusne snovi in drugih virov ogljika se metoda šteje za predhodni preskus, ki se lahko uporabi za ugotovitev, ali je snov lahko biološko razgradljiva. V skladu s tem nizek rezultat ne pomeni nujno, da preskusna snov v morskem okolju ni biološko razgradljiva, ampak kaže, da bo za to ugotovitev potrebnega več dela. | Na spodnji sliki je prikazan teoretičen poskus razgradnje, ki kaže izvedljiv način ocene vrednosti tL (dolžina lag faze) in t50, časovnega obdobja (ki se začne pri tL), potrebnega za 50-odstotno končno porabo kisika zaradi oksidacije preskusne snovi. | Bonferronijev U-preskus | Preskus po Jonckheere-Terpstraju | Shirleyjev preskus | Dunnov preskus | Podatki: | Je variacija homogena? | Je porazdelitev normalna? | Parametrični preskusi | Da | Izločite kontrolo brez topila. | Sta obe kontroli enaki? U-preskus | Sta obe kontroli enaki? T-preskus. | Obe kontroli je mogoče združiti. | Dodatna kontrola s topilom? | Dodatna kontrola s topilom? | Statistično preskušanje ni priporočljivo. | Ali obstajajo vsaj štiri ponovitve na tretiranje? | Ni uspelo. | Pretvori podatke. | Da | Da | Da | Da | Da | Da | Ne | Ne | Ne | Ne | Ne | Ne | Dunnettov preskus | Williamsov preskus | Izločite kontrolo brez topila. | Obe kontroli je mogoče združiti. | Začetek | Neparametrični preskusi | LITERATURA | (1) | de Kreuk, J. F., in Hanstveit, A. O. (1981). Determination of the biodegradability of the organic fraction of chemical wastes. Chemosphere, 10 (6); 561-573. | (2) | Poglavje C.4-B te priloge: Določanje ‚dobre‘ biorazgradljivosti – Del III: Prilagojeni presejalni preskus OECD. | (3) | Nyholm, N., in Kristensen, P. (1987). Screening Test Methods for Assessment of Biodegradability of Chemical Substances in Seawater. Final Report of the ring test programme 1984– 1985, marec 1987, Komisija Evropskih skupnosti. | (4) | Poglavje C.11 te priloge: Biorazgradnja – preskus zaviranja dihanja aktivnega blata | (5) | Poglavje C.4-E te priloge: Določanje ‚dobre‘ biorazgradljivosti – Del VI: Preskus z zaprto steklenico. | Dodatek 1 | Določanje organskega ogljika v morski vodi | METODA STRESANJA BUČKE | Za določanje organskega ogljika v vzorcu vode organske spojine v vzorcu oksidirajo v ogljikov dioksid običajno z eno od naslednjih treh tehnik: | — | mokra oksidacija s persulfatom/ultravijoličnim obsevanjem, | — | mokra oksidacija s persulfatom/zvišano temperaturo (116–130 °C), | — | sežiganje. | Sproščeni CO2 se kvantificira z uporabo infrardeče spektrometrije ali titrimetrije. Druga možnost je redukcija CO2 na metan, ki se kvantificira s plamensko ionizacijskim detektorjem (FID). | Metoda s persulfatom/ultravijoličnim obsevanjem se običajno uporablja za analizo ‚čiste‘ vode z nizko vsebnostjo delcev. Zadnji metodi se lahko uporabljata za večino vzorcev vode, pri čemer je metoda s persulfatom/zvišano temperaturo najprimernejša za vzorce nizke stopnje, sežigalna tehnika pa za vzorce z vsebnostjo nehlapnega organskega ogljika (NVOC) veliko nad 1 mg C/l. | Motnje | Vse tri metode so odvisne od izločevanja ali izravnave anorganskega ogljika, ki je prisoten v vzorcu. Najpogosteje uporabljena metoda za izločevanje anorganskega ogljika je spiranje CO2 iz zakisanega vzorca, čeprav se s tem izgubijo tudi hlapne organske spojine (1). Za vsako matriko vzorčenja je treba zagotoviti popolno izločitev ali izravnavo anorganskega ogljika, glede na vrsto vzorca pa je treba poleg nehlapnega organskega ogljika določiti hlapni organski ogljik (VOC). | Visoke koncentracije klorida so razlog za manjšo učinkovitost oksidacije z uporabo metode s persulfatom/ultravijoličnim obsevanjem (2). Vendar se lahko ta motnja prepreči z uporabo oksidacijskega reagenta, spremenjenega z dodajanjem živosrebrovega (II) nitrata. Priporoča se, da se za oceno posamezne vrste vzorca, ki vsebuje klorid, uporabi največja dovoljena prostornina vzorca. Visoke koncentracije soli v vzorcu, analiziranem z metodo sežiganja, lahko povzročijo prekritje katalizatorja s soljo in čezmerno korozijo sežigalne cevi. V skladu z navodili proizvajalca je treba izvajati varnostne ukrepe. | Zelo motni vzorci in vzorci, ki vsebujejo delce, pri uporabi metode s persulfatom/ultravijoličnim obsedanjem morda ne bodo popolnoma oksidirali. | Primer ustrezne metode | Nehlapen organski ogljik se določi z oksidacijo s persulfatom/ultravijoličnim obsevanjem in nato kvantifikacijo sproščenega CO2, pri čemer se uporabi nedisperzivna infrardeča spektrometrija. | Oksidacijski reagent se prilagodi v skladu s predlogi iz (2), kot je opisano v navodilih proizvajalca: | (a) | 8,2 g HgCl2 in 9 6 g Hg(NO3)2 · H2O se raztopi v več sto mililitrih vode z reagentom z nizko koncentracijo ogljika; | (b) | 20 g K2S2O8 se raztopi v raztopini živosrebrove soli; | (c) | zmesi se doda 5 ml HNO3 (koncentracija); | (d) | reagent se razredči na 1 000 ml. | Motnja, ki jo povzroči klorid, se prepreči s 40 μl vzorca za 10-odstotni klorid in 200 μl vzorca za 1,9-odstotni klorid. Vzorci visokih koncentracij klorida in/ali večje prostornine vzorcev se lahko analizirajo v skladu s to metodo, če se prepreči kopičenje klorida v oksidacijski posodi. Če je ustrezno, se nato lahko za zadevno vrsto vzorca določi hlapen organski ogljik. | LITERATURA | (1) | ISO, Kakovost vode – Navodila za določanje skupnega organskega ogljika (TOC). Osnutek mednarodnega standarda ISO/DIS 8245, 16. januar, 1986. | (2) | American Public Health Association, Standard Methods for the Estimation of Water and Wastewater. American Water Works Association & Water Pollution Control Federation, 16. izdaja, 1985. | Tudi aktualno (vsebuje opis sistema avtoanalize): | (3) | Schreurs, W. (1978). An automated colorimetric method for the determination of dissolved organic carbon in seawater by UV destruction. Hydrobiological Bulletin 12, 137–142. | Dodatek 2 | Biološka razgradnja v morski vodi | METODA STRESANJA BUČKE | PODATKOVNI LIST | 1. | LABORATORIJ: | 2. | DATUM ZAČETKA PRESKUSA: | 3. | PRESKUSNA SNOV: | Naziv: | Koncentracija založne raztopine: | mg/l kot snov | Začetna koncentracija v mediju, to: | mg/l kot snov | : | mg DOC/l | 4. | MORSKA VODA: | Vir: | Datum odvzema: | Globina odvzema: | Videz ob odvzemu (npr. moten itd.): | Slanost ob odvzemu: | ‰ | Temperatura ob odvzemu: | °C | DOC ‚x‘ ur po odvzemu: | mg/l | Tretiranje pred preskusom (npr. filtriranje, sedimentacija, staranje itd.): | Število mikrobnih kolonij | — | izvirni vzorec: | kolonije/ml | | — | na začetku preskusa: | kolonije/ml | Druge značilnosti: | | | 5. | DOLOČITVE OGLJIKA: | Analizator ogljika: | | Št. bučke | | DOC po n dneh (mg/l) | 0 | n1 | n2 | n3 | nx | Preskus: morska voda s preskusno snovjo, okrepljena s hranilnimi snovmi | 1 | a1 | | | | | | a2 | | | | | | sredina, Ca(t) | | | | | | 2 | b1 | | | | | | b2 | | | | | | sredina, Cb(t) | | | | | | Slepi vzorec: morska voda brez preskusne snovi, okrepljena s hranilnimi snovmi | 1 | c1 | | | | | | c2 | | | | | | sredina, Cc(t) | | | | | | 2 | d1 | | | | | | d2 | | | | | | sredina, Cd(t) | | | | | | sredina, | | | | | | | | | | | 6. | VREDNOTENJE NEOBDELANIH PODATKOV: | Št. bučke | Izračun rezultatov | % razgradnje po n dneh | 0 | n1 | n2 | n3 | nx | 1 | 0 | | | | | 2 | 0 | | | | | Sredina (*9) | 0 | | | | | Opomba: | Podobne oblike se lahko uporabijo, če razgradnji sledi specifična analiza ter za referenčne snovi in kontrole strupenosti. | 7. | ABIOTSKA RAZGRADNJA (neobvezno) | | Čas (dni) | 0 | t | Koncentracija DOC (mg/l) v sterilnih kontrolah | Cs(o) | Cs(t) | Dodatek 3 | Izračun teoretične biokemijske potrebe po kisiku | METODA Z ZAPRTO STEKLENICO | Teoretična biokemijska potreba po kisiku snovi CcHhClclNnNanaOoPpSs molekulske mase MW se izračuna glede na: | Ta izračun pomeni, da se C mineralizira v CO2, H v H2O, P v P2O5 in Na v Na2O. Halogen se izloči kot vodikov halid in dušik kot amoniak. | Primer: | glukoza C6H12O6, MW = 180 | Molekulske mase soli, razen soli alkalnih kovin, se izračunajo ob predpostavki, da so bile soli hidrolizirane. | Predpostavlja se, da je žveplo oksidiralo na stopnjo + 6. | Primer: | natrijev n-dodecilbenzensulfonatC18H29SO3Na, MW = 348 | V primeru snovi, ki vsebujejo dušik, se lahko dušik izloči kot amoniak, nitrit ali nitrat, ki ustreza različnim teoretičnim potrebam po kisiku. | Če je bila v primeru sekundarnega amina z analizo opažena popolna tvorba nitrata: | (C12H25)2 NH, MW = 353 | Dodatek 4 | temperature (°C) | Salinity in: ‰ | Nomogram giving: | Saturation concentration of oxygen of various temperatures and salinities | mg O2/l | Dodatek 5 | Biološka razgradnja v morski vodi | METODA Z ZAPRTO STEKLENICO | PODATKOVNI LIST | 1. | LABORATORIJ: | 2. | DATUM ZAČETKA PRESKUSA: | 3. | PRESKUSNA SNOV: | Naziv: | Koncentracija založne raztopine: | mg/l | Začetna koncentracija v mediju morske vode: | mg/l | TPK ali KPK: | mg O2/mg preskusne snovi | 4. | MORSKA VODA: | Vir: | Datum odvzema: | Globina odvzema: | Videz ob odvzemu (npr. moten itd.): | Slanost ob odvzemu: | ‰ | Temperatura ob odvzemu: | °C | DOC ‚x‘ ur po odvzemu: | mg/l | Tretiranje pred preskušanjem (npr. filtriranje, sedimentacija, staranje itd.): | Število mikrobnih kolonij | — | izvirni vzorec: | kolonije/ml | | — | na začetku preskusa: | kolonije/ml | Druge značilnosti: | | | 5. | PRESKUSNI MEDIJ: | Temperatura po prezračevanju: | °C | Koncentracija O2 po prezračevanju in stanje pred začetkom preskusa: | mg O2/l | 6. | DOLOČANJE RAZTOPLJENEGA KISIKA: | Metoda: Winkler/elektroda | | Št. bučke | | mg O2/l po n dneh | 0 | 5 | 15 | 28 | Preskus: morska voda, okrepljena s hranilnimi snovmi, s preskusno snovjo | 1 | a1 | | | | | 2 | a2 | | | | | sredina preskusnega vzorca | | | | | Slepi vzorec: morska voda, okrepljena s hranilnimi snovmi, brez preskusne snovi | 1 | c1 | | | | | 2 | c2 | | | | | sredina slepega vzorca | | | | | Opomba: za referenčno snov in kontrolo strupenosti se lahko uporabi podobna oblika. | 7. | PORABA RAZTOPLJENEGA KISIKA: % RAZGRADNJE (% D): | | Razgradnja DO po n dneh | 5 | 15 | 28 | (mb – mt ) (25) | | | | | | | C.43 ANAEROBNA BIOLOŠKA RAZGRADLJIVOST ORGANSKIH SNOVI V PREGNITEM BLATU: Z MERJENJEM NASTAJANJA PLINA | UVOD | 1. | Ta preskusna metoda ustreza Smernici za preskušanje OECD (TG) 311 (2006). Obstajajo številni presejalni preskusi za ocenjevanje aerobne biološke razgradljivosti organskih snovi (preskusne metode C.4, C.9, C.10 in C.11 (1) ter OECD TG 302C (2)), rezultati njihove uporabe pa so se uspešno uporabljali za napovedovanje končnega stanja snovi v aerobnem okolju, zlasti v aerobnih fazah čiščenja odpadne vode. Aerobno se obravnavajo tudi različni deli snovi, ki niso topne v vodi, ter snovi, ki se adsorbirajo na trdne delce odplak, ker so prisotni v usedenih odplakah. Vendar se večji kosi teh snovi vežejo na primarno usedene odplake, ki se ločijo od neobdelanih odplak v usedalniku, preden se usedene odplake ali odplake, zbrane na površju, aerobno očistijo. Odplake, ki v intersticijski vodi vsebujejo nekatere topne snovi, se nato prenesejo v ogrevana gnilišča za anaerobno čiščenje. Ker v tem sklopu še ni preskusov za ocenjevanje anaerobne biološke razgradljivosti v anaerobnih gniliščih in je ta preskus namenjen zapolnitvi te vrzeli, morda ni uporaben za druge anoksične ekosisteme. | 2. | Respirometrične tehnike za merjenje količin nastalega plina, zlasti metana (CH4) in ogljikovega dioksida (CO2), v anaerobnih pogojih, so se uspešno uporabljale za ocenjevanje anaerobne biološke razgradljivosti. Birch idr. (3) so pregledali te postopke in sklenili, da je delo Sheltona in Tiedjea (4), ki temelji na zgodnjih študijah (5) (6) (7), najpodrobnejše. Metoda (4), ki so jo naprej razvili drugi (8) in je postala ameriški standard (9) (10), ni rešila težav v zvezi z različno topnostjo CO2 in CH4 v preskusnem mediju ter izračunom teoretičnega nastanka plina preskusne snovi. V poročilu ECETOC (3) je bila priporočena dodatna meritev vsebnosti raztopljenega anorganskega ogljika (DIC) v supernatantu, zaradi česar je tehnika postala širše uporabna. Metoda ECETOC je bila mednarodno kalibrirana (oz. krožno preskušena) in je postala standard ISO 11734 (11). | 3. | Ta preskusna metoda, ki temelji na ISO 11734 (11), opisuje presejalno metodo za vrednotenje možne anaerobne biološke razgradljivosti organskih snovi v specifičnih pogojih (tj. v anaerobnem gnilišču v danem času in razponu koncentracije mikroorganizmov). Ker se razredčeno blato uporablja z razmeroma visoko koncentracijo preskusne snovi in preskus običajno traja dlje od retencijskega časa v anaerobnih gniliščih, preskusni pogoji morda niti ne ustrezajo pogojem v anaerobnih gniliščih niti niso uporabni za ocenjevanje anaerobne biološke razgradljivosti organskih snovi v različnih okoljskih pogojih. Blato je preskusni snovi izpostavljeno največ 60 dni, kar je dlje od običajnega retencijskega časa blata (25 do 30 dni) v anaerobnih gniliščih, čeprav so lahko retencijski časi na industrijskih lokacijah veliko daljši. Predvidevanja na podlagi rezultatov tega preskusa niso tako prepričljiva kot predvidevanja v primeru aerobne biološke razgradnje, ker so dokazi, pridobljeni o obnašanju preskusne snovi pri ‚lahkih‘ aerobnih preskusih in simulacijskih preskusih ter v aerobnem okolju, dovolj prepričljivi, da obstaja povezava; za anaerobno okolje obstaja malo podobnih dokazov. Pojav popolne anaerobne biološke razgradnje se lahko predvidi, če se doseže 75–80 % teoretičnega nastanka plina. Velika razmerja snovi glede na biomaso, uporabljena v teh preskusih, pomenijo, da se bo snov, ki prehaja, verjetneje razgradila v anaerobnem gnilišču. Poleg tega se snovi, ki se v preskusu ne spremenijo v plin, morda ne bodo ohranile v okoljsko bolj realnih razmerjih med snovjo in biomaso. Pojavljajo se tudi druge anaerobne reakcije, s katerimi se lahko snovi vsaj delno razgradijo, npr. z dekloriranjem, vendar ta preskus ne zazna takih reakcij. Izginjanje preskusne snovi pa se lahko spremlja z uporabo specifičnih analitskih metod za njeno določanje (glej odstavke 6, 30, 44 in 53). | NAČELO PRESKUSA | 4. | Sprano pregnito blato (26), ki vsebuje nizke (< 10 mg/l) koncentracije anorganskega ogljika, se približno desetkrat razredči, da je koncentracija vseh snovi v trdnem stanju od 1 g/l do 3 g/l, in približno 60 dni inkubira pri 35 °C ± 2 °C v zatesnjenih posodah s preskusno snovjo pri 20 do 100 mg C/l. Aktivnost blata se meri z vzporedno slepo kontrolo z inokulumom blata v mediju in brez preskusne snovi. | 5. | Izmeri se naraščanje tlaka v prostoru v zaprti posodi nad fazno mejo plin-kapljevina zaradi nastajanja ogljikovega dioksida in metana. Večina nastalega CO2 se bo v preskusnih pogojih raztopila v tekoči fazi ali spremenila v karbonat ali vodikov karbonat. Ta anorganski ogljik se izmeri na koncu preskusa. | 6. | Količina ogljika (anorganskega in metana), ki nastane zaradi biološke razgradnje preskusne snovi, se izračuna iz neto nastalega plina in neto tvorbe anorganskega ogljika v tekoči fazi nad vrednostmi slepe kontrole. Obseg biološke razgradnje se izračuna iz skupnega anorganskega ogljika in nastalega metana-C kot odstotek izmerjene ali izračunane količine ogljika, dodanega preskusni snovi. Potek biološke razgradnje se lahko sledi zgolj z vmesnimi meritvami nastajanja plina. Primarna biološka razgradnja se lahko določi še s specifično analizo na začetku in koncu preskusa. | INFORMACIJE O PRESKUSNI SNOVI | 7. | Za pravilno razlago rezultatov morajo biti znani čistost, vodotopnost, hlapnost in adsorpcijske lastnosti preskusne snovi. Vsebnost organskega ogljika ( % m/m) preskusne snovi je treba določiti na podlagi njene kemijske strukture ali z meritvami. Pri hlapnih preskusnih snoveh k odločitvi o uporabnosti preskusa prispeva izmerjena ali izračunana Henryjeva konstanta. Informacije o strupenosti preskusne snovi za anaerobne bakterije so koristne pri izbiri ustrezne preskusne koncentracije in pri razlagi rezultatov, ki kažejo slabo biološko razgradljivost. Priporoča se vključitev nadzora zaviranja, razen če je znano, da preskusna snov ne zavira anaerobnih mikrobnih dejavnosti (glej odstavek 21 in ISO 13641-1 (12)). | UPORABNOST PRESKUSNE METODE | 8. | Preskusna metoda se lahko uporablja za vodotopne snovi; uporabi se lahko tudi za slabo topne in netopne snovi, če se uporabi metoda natančnega odmerjanja, npr. glej ISO 10634 (13). Na splošno je pri hlapnih snoveh potrebno odločanje na podlagi posameznega primera. Morda bo potrebno sprejeti posebne ukrepe, na primer zadrževanje plina med preskusom. | REFERENČNE SNOVI | 9. | Da se postopek preveri, se referenčna snov preskusi z določitvijo vzporednih ustreznih posod kot del običajnega poteka preskusa. Primeri so fenol, natrijev benzoat in polietilen glikol 400, pri čemer se pričakuje, da se bo v 60 dneh teoretični nastanek plina zmanjšal za več kot 60 % (npr. metan in anorganski ogljik) (3) (14). | OBNOVLJIVOST REZULTATOV PRESKUSA | 10. | Mednarodni krožni preskus (14) je dosegel dobro obnovljivost meritev tlaka plina med tremi posodami. Relativni standardni odklon (koeficient variacije, COV) je bil večinoma nižji od 20 %, čeprav se je ta vrednost ob prisotnosti strupenih snovi ali prosti koncu 60-dnevnega inkubacijskega obdobja pogosto povečala na > 20 %. Večji odkloni so bili ugotovljeni tudi v posodah s prostornino < 150 ml. Končne vrednosti pH preskusnega medija so bile v razponu 6,5–7,0. | 11. | S krožnim preskusom so bili pridobljeni naslednji rezultati. | Preskusna snov | Skupni podatki | n1 | Srednja razgradnja | (skupni podatki) | (%) | Relativni standardni odklon | (skupnih podatkov) | (%) | Veljavni podatki | n2 | Srednja razgradnja | (veljavni podatki) | (%) | Relativni standardni odklon | (veljavni podatki) | (%) | Podatki > 60 % razgradnja pri veljavnih preskusih | n3 | Palmitinska kislina | 36 | 68,7 ± 30,7 | 45 | 27 | 72,2 ± 18,8 | 26 | 19 = 70 % (*10) | Polietilen Glikol 400 | 38 | 79,8 ± 28,0 | 35 | 29 | 77,7 ± 17,8 | 23 | 24 = 83 % (*10) | 12. | Koeficienti variacije sredine vseh vrednosti, pridobljenih s palmitinsko kislino in polietilen glikolom 400, so bili 45 % (n = 36) oziroma 35 % (n = 38). Ko so se vrednosti < 40 % in > 100 % izpustile (prve domnevno zaradi neoptimalnih pogojev, druge iz neznanih razlogov), so se koeficienti variacije zmanjšali na 26 % oziroma 23 %. Deleža ‚veljavnih‘ vrednosti, ki so zagotovile vsaj 60 odstotno razgradnjo, sta bila 70 % za palmitinsko kislino in 83 % za polietilen glikol 400. Deleži odstotka biološke razgradnje, izpeljani iz meritev raztopljenega anorganskega ogljika, so bili razmeroma majhni, vendar različni. Za palmitinsko kislino sta bila razpon 0–35 % in sredina 12 % s koeficientom variacije 92 %, za polietilen glikol 400 pa razpon 0–40 % in sredina 24 % s koeficientom variacije 54 %. | OPIS PRESKUSNE METODE | Oprema | 13. | Potrebna je običajna laboratorijska oprema in naslednje: | a. | inkubator – zaščiten pred iskrami in z vzdrževano temperaturo 35 °C ± 2 °C, | b. | steklene preskusne posode, odporne proti tlaku, ustrezne nominalne velikosti (27), opremljene s plinotesnimi septumi, ki lahko vzdržijo približno 2 bara. Prostornina prostora v zaprti posodi nad fazno mejo plin-kapljevina mora biti približno od 10 % do 30 % celotne prostornine. Če se bioplin redno sprošča, je ustrezna približno 10-odstotna prostornina prostora v zaprti posodi nad fazno mejo plin-kapljevina, če pa se plin sprošča samo na koncu preskusa, je ustrezna 30-odstotna prostornina. Če se tlak sprošča ob vsakem vzorčenju, se priporočajo steklene serumske steklenice z nominalno prostornino 125 ml, skupno prostornino približno 160 ml, zatesnjene s serumskimi septumi (28) in aluminijastimi zapornimi obročki, | c. | naprava za merjenje tlaka (29), prilagojena tako, da omogoča meritve in izpuščanje nastalega plina, na primer natančni ročni merilnik tlaka, povezan s primerno injekcijsko iglo; trojni plinotesni petelinček olajša sproščanje prevelikega tlaka (Dodatek 1). Notranjo prostornino cevi in ventila pretvornika tlaka je treba ohranjati čim manjšo, da so napake zaradi zanemarjanja prostornine opreme neznatne, | Opomba: meritve tlaka se uporabijo neposredno za izračun količine ogljika, nastalega v prostoru v zaprti posodi nad fazno mejo plin-kapljevina (odstavki 42 do 44). Odčitki tlaka se lahko z grafom za pretvorbo pretvorijo tudi v prostornine (pri 35 °C in atmosferskem tlaku) nastalega plina. Ta graf sestavljajo podatki, ki se pridobijo z injiciranjem znanih prostornin dušikovega plina v niz preskusnih posod (npr. serumskih steklenic) pri 35 °C ± 2 °C in beleženjem posledičnih odčitkov stabiliziranega tlaka (glej Dodatek 2). Izračun je prikazan v opombi pri odstavku 44. | Opozorilo: pri uporabi mikrobrizg je treba paziti, da ne pride do poškodb z iglami. | d. | analizator ogljika, primeren za neposredno določitev anorganskega ogljika v razponu od 1 mg/l do 200 mg/l, | e. | zelo natančne brizge za plinaste in tekoče vzorce, | f. | magnetna mešala in sledilniki (neobvezno), | g. | komora, v katero posegamo z rokavicami (priporočeno). | Reagenti | 14. | Ves čas se uporabljajo analitsko čisti reagenti. | Voda | 15. | Destilirana ali deionizirana voda (deoksigenirana s prezračevanjem z dušikovim plinom, ki vsebuje manj kot 5 μl/l kisika), ki vsebuje manj kot 2 mg/l raztopljenega organskega ogljika (DOC). | Preskusni medij | 16. | Medij za redčenje se pripravi tako, da vsebuje naslednje sestavine v navedenih količinah: | Brezvodni kalijev dihidrogen fosfat (KH2PO4) | 0,27 g | Dinatrijev hidrogen fosfat dodekahidrat (Na2HPO4 · 12H2O)) | 1,12 g | Amonijev klorid (NH4Cl) | 0,53 g | Kalcijev klorid dihidrat (CaCl2 · 2H2O) | 0,075 g | Magnezijev klorid heksahidrat (MgCl2 · 6H2O) | 0,10 g | Železov (II) klorid tetrahidrat (FeCl2 · 4H2O) | 0,02 g | Resazurin (kazalnik kisika) | 0,001 g | Natrijev sulfid nonahidrat (Na2S · 9H2O) | 0,10 g | Založna raztopina elementov v sledovih (neobvezno, odstavek 18) | 10 ml | Doda se deoksigenirana voda (odstavek 15) | do 1 litra | Opomba: uporabiti je treba svež natrijev sulfid ali pa ga je treba pred uporabo sprati in posušiti, da se zagotovi zadostna sposobnost redukcije. Preskus bi se lahko izvedel brez uporabe komore, v katero posegamo z rokavicami (glej odstavek 26). V tem primeru je treba končno koncentracijo natrijevega sulfida v mediju povečati na 0,20 g Na2S · 9H2O na liter. Natrijev sulfid se lahko doda tudi iz primerne anaerobne založne raztopine prek septuma zaprtih preskusnih posod, saj se s tem postopkom zmanjša tveganje oksidacije. Natrijev sulfid se lahko zamenja s titanovim (III) citratom, ki se doda skozi septum zaprtih preskusnih posod pri končni koncentraciji 0,8 do 1,0 mmol/l. Titanov (III) citrat je zelo učinkovit reducent nizke strupenosti, ki se pripravi, kot sledi: v 50 ml deoksigenirane vode se raztopi 2,94 g trinatrijevega citrata dihidrata (da dobimo raztopino 200 mmol/l) in doda 5 ml 15-odstotne (m/v) raztopine titanovega (III) klorida). Z mineralno alkalijo se nevtralizira do pH 7 ± 0,2 in odmeri v ustrezno posodo pod tokom dušika. Koncentracija titanovega (III) citrata v tej založni raztopini je 164 mmol/l. | 17. | Sestavine preskusnega medija, razen reducenta (natrijev sulfid titanov citrat), se premešajo, raztopina pa neposredno pred uporabo približno 20 minut prezračuje z dušikovim plinom, da se odstrani kisik. Nato se neposredno pred uporabo medija doda primerna prostornina sveže pripravljene raztopine reducenta (pripravljene v deoksigenirani vodi). Po potrebi se pH medija prilagodi z razredčeno mineralno kislino ali bazo na pH 7 ± 0,2. | Založna raztopina elementov v sledovih | 18. | Da se izboljšajo procesi anaerobne razgradnje, zlasti če se uporabljajo nizke koncentracije (npr. 1 g/l) inokuluma, se priporoča, da preskusni medij vsebuje naslednje elemente v sledovih (11). | Manganov klorid tetrahidrat (MnCl2 · 4H2O) | 50 mg | Borova kislina (H3BO3) | 5 mg | Cinkov klorid (ZnCl2) | 5 mg | Bakrov (II) klorid (CuCl2) | 3 mg | Dinatrijev molibdat dihidrat (Na2MoO4 · 2H2O) | 1 mg | Kobaltov klorid heksahidrat (CoCl2 · 6H2O) | 100 mg | Nikljev klorid heksahidrat (NiCl2 · 6H2O) | 10 mg | Dinatrijev selenit (Na2SeO3) | 5 mg | Doda se deoksigenirana voda (odstavek 15) | do 1 litra | Preskusna snov | 19. | Preskusna snov se doda kot založna raztopina, suspenzija, emulzija ali neposredno kot trdna snov ali tekočina ali kot absorbirana na filter iz steklenih vlaken, da se dobi koncentracija največ 100 mg/l organskega ogljika. Če se uporabijo založne raztopine, se pripravi primerna raztopina z vodo (odstavek 15) (predhodno deoksigenirana s prezračevanjem z dušikovim plinom) take moči, da je dodana prostornina manj kot 5 % skupne prostornine reakcijske zmesi. Po potrebi se pH založne raztopine prilagodi na pH 7 ± 0,2. Za preskusne snovi, ki v vodi niso dovolj topne, glej ISO 10634 (13). V primeru uporabe topila se pripravi dodatna kontrola, pri čemer se topilo doda le v inokulirani medij. Izogibati se je treba organskim topilom, za katera je znano, da zavirajo nastajanje metana, kot sta kloroform in ogljikov tetraklorid. | Opozorilo: s strupenimi preskusnimi snovmi in snovmi, katerih lastnosti niso znane, je treba ravnati previdno. | Referenčne snovi | 20. | Referenčne snovi, kot so natrijev benzoat, fenol in polietilen glikol 400, so se uspešno uporabljale za preverjanje postopka, pri čemer so se v 60 dneh več kot 60-odstotno razgradile. Založna raztopina (v deoksigenirani vodi) izbrane referenčne snovi se pripravi enako kot za preskusno snov, njen pH pa se po potrebi uravna na 7 ± 0,2. | Kontrola zaviranja (pogojno) | 21. | Za pridobivanje informacij o strupenosti preskusne snovi za anaerobne mikroorganizme, da se ugotovi najprimernejša preskusna koncentracija, se preskusna snov in referenčna snov vneseta v posodo s preskusnim medijem (glej odstavek 16), in sicer vsaka v enaki koncentraciji, kot je bila dodana (glej odstavka 19 in 20 ter ISO 13641-1 (12)). | Pregnito blato | 22. | Pregnito blato se odvzame iz gnilišča v čistilni napravi odpadnih vod, ki čisti predvsem gospodinjske odplake. Opisati je treba vse značilnosti blata in sporočiti informacije o njegovem ozadju (glej odstavek 54). Če naj bi se uporabil prilagojeni inokulum, se lahko prouči uporaba pregnitega blata iz industrijske čistilne naprave. Za odvzem pregnitega blata se uporabijo plastenke s širokim grlom iz polietilena visoke gostote ali podobnega materiala, ki se lahko razširi. Plastenke se napolnijo z blatom do 1 cm pod vrhom in zatesnijo, po možnosti z varnostnim ventilom. Odvzeto blato se lahko po prevozu v laboratorij uporabi neposredno ali pa se postavi v laboratorijsko gnilišče. Odvečni bioplin se sprosti s previdnim odpiranjem plastenk z blatom. Kot vir inokuluma se lahko uporabi tudi laboratorijsko pridelano anaerobno blato, vendar je lahko njegov razpon delovanja zmanjšan. | Opozorilo: pregnito blato proizvaja vnetljive pline, ki predstavljajo tveganje požara ali eksplozije; vsebuje tudi potencialno patogene organizme, zato je treba pri ravnanju z njim upoštevati ustrezne varnostne ukrepe. Iz varnostnih razlogov se za odvzem blata ne uporabljajo steklene posode. | 23. | Da se zmanjšata nastajanje plina v ozadju in vpliv slepih kontrol, se lahko prouči predhodno gnitje blata. Če je predhodno gnitje potrebno, se mora blatu omogočiti gnitje brez dodajanja hranilnih snovi ali substratov pri 35 °C ± 2 °C do 7 dni. Ugotovljeno je bilo, da se s približno petdnevnim predhodnim gnitjem običajno optimalno zmanjša nastajanje plina v slepih vzorcih, ne da bi se nesprejemljivo povečala lag faza ali inkubacijsko obdobje v preskusni fazi ali ne da bi prišlo do nedejavnosti majhnega števila preskušanih snovi. | 24. | Za preskusne snovi, ki so slabo biološko razgradljive ali so domnevno slabo biološko razgradljive, se prouči predhodna izpostavljenost blata preskusni snovi, da se pridobi inokulum, ki je bolje prilagojen. V takem primeru se preskusna snov doda pregnitemu blatu v koncentraciji organskega ogljika, ki je od 5 mg/l do 20 mg/l, in inkubira največ dva tedna. Predhodno izpostavljena snov se pred uporabo previdno spere (glej odstavek 25), v poročilu o preskusu pa se navedejo pogoji predhodne izpostavljenosti. | Inokulum | 25. | Blato se spere (glej odstavke 22 do 24) neposredno pred uporabo, da se koncentracija anorganskega ogljika v končni preskusni suspenziji zmanjša na manj kot 10 mg/l. Blato se centrifugira v zatesnjenih centrifugirnih epruvetah (npr. 3 000 g 5 minut) in izpusti supernatant. Dobljeni peleti se suspendirajo v deoksigeniranem mediju (odstavka 16 in 17), suspenzija se ponovno centrifugira, supernatant pa se izpusti. Če se količina anorganskega ogljika ni dovolj zmanjšala, se lahko postopek spiranja blata ponovi največ dvakrat. To naj ne bi škodljivo vplivalo na mikroorganizme. Na koncu se pelet suspendira v potrebni prostornini preskusnega medija in določi koncentracija vseh snovi v trdnem stanju [npr. ISO 11923 (15)]. Končna koncentracija vseh snovi v trdnem stanju v preskusnih posodah mora biti v razponu od 1 g/l do 3 g/l (ali približno 10 % koncentracije v nerazredčenem pregnitem blatu). Zgornji postopki se izvedejo tako, da je blato v čim manjšem stiku s kisikom (uporabi se na primer dušikova atmosfera). | PRESKUSNI POSTOPEK | 26. | Naslednji začetni postopki se izvedejo s tehnikami, ki vzdržujejo čim manjši stik med pregnitim blatom in kisikom, npr. morda bo potrebno delo v komori, v katero posegamo z rokavicami, v dušikovi atmosferi in/ali s spiranjem plastenk z dušikom (4). | Priprava preskusa s preskusnim vzorcem in kontrolo | 27. | Pripravijo se vsaj tri preskusne posode (glej odstavek 13-b) za preskusno snov, slepe kontrole, referenčne snovi, kontrole zaviranja (pogojno) in komore za kontrolo tlaka (neobvezen postopek) (glej odstavke 7 in 19–21). Pripravijo se lahko tudi dodatne posode za ocenjevanje primarne biološke razgradnje s specifičnimi analizami preskusne snovi. Isti niz slepih kontrol se lahko uporabi za več preskusnih snovi v istem preskusu, če so prostornine prostora v zaprti posodi nad fazno mejo plin-kapljevina skladne. | 28. | Razredčeni inokulum se pred vnosom v posode pripravi npr. s široko pipeto. Alikvoti dobro premešanega inokuluma (odstavek 25) se dodajo tako, da je koncentracija vseh snovi v trdnem stanju enaka v vseh posodah (med 1 g/l in 3 g/l). Po potrebi se založne raztopine preskusne in referenčne snovi dodajo po uravnavanju pH na 7 ± 0,2. Preskusno snov in referenčno snov je treba dodati na najprimernejši način (odstavek 19). | 29. | Preskusna koncentracija organskega ogljika mora biti običajno med 20 in 100 mg/l (odstavek 4). Če je preskusna snov strupena, je treba preskusno koncentracijo zmanjšati na 20 mg C/l ali celo manj, če je treba izmeriti le primarno biološko razgradnjo s specifičnimi analizami. Opozoriti je treba, da se variabilnost rezultatov preskusa poveča pri nižjih preskusnih koncentracijah. | 30. | V posode s slepimi vzorci se doda enaka količina nosilca, kot se uporabi za odmerjanje preskusne snovi, namesto založne raztopine, suspenzije ali emulzije. Če je bila preskusna snov dodana s filtri iz steklenih vlaken ali organskimi topili, se v slepe vzorce doda filter ali toliko topila, kot ga je izhlapelo. Za merjene vrednosti pH se pripravi dodatna ponovitev s preskusno snovjo. Po potrebi se pH uravna na 7 ± 0,2 z majhnimi količinami razredčene mineralne kisline ali baze. V vse preskusne posode je treba dodati enake količine nevtralizacijskega sredstva. Sredstva ni treba dodati, če je bila vrednost pH založnih raztopin preskusne snovi in referenčne snovi že prilagojena (glej odstavka 19 in 20). Če je treba izmeriti primarno biološko razgradnjo, je treba iz posode za kontrolo pH ali iz dodatne preskusne posode odvzeti primeren vzorec, koncentracijo preskusne snovi pa je treba izmeriti s specifičnimi analizami. Če je treba reakcijske zmesi premešati, se lahko v posode dodajo prekriti magneti. | 31. | Zagotoviti je treba, da sta skupna prostornina tekočine V1 in prostornina prostora v zaprti posodi nad fazno mejo plin-kapljevina Vh enaki v vseh posodah. Vrednosti V1 in Vh se zabeležita. Vse posode je treba zatesniti s plinskim septumom in jih iz komore, v katero posegamo z rokavicami (glej odstavek 26), prenesti v inkubator (glej odstavek 13-a). | Netopne preskusne snovi | 32. | Stehtane količine snovi, ki so slabo topne v vodi, se dodajo neposredno v pripravljene posode. Če je uporaba topila potrebna (glej odstavek 19), se raztopina preskusne snovi ali suspenzije prenese v prazno posodo. Če je mogoče, naj topilo izhlapi s prehajanjem dušikovega plina skozi posode, nato pa se dodajo druge sestavine, tj. razredčeno blato (odstavek 25) in deoksigenirana voda, kot je potrebno. Pripraviti je treba tudi dodatno kontrolo s topilom (glej odstavek 19). Druge metode dodajanja netopnih snovi so opisane v ISO 10634 (13). Tekoče preskusne snovi se lahko z brizgo odmerijo v popolnoma pripravljene zatesnjene posode, če se pričakuje, da začetni pH ne bo presegel 7 ± 1, sicer pa se odmerijo, kot je opisano zgoraj (glej odstavek 19). | Inkubacije in meritve tlaka plina | 33. | Pripravljene posode se približno eno uro inkubirajo pri 35 °C ± 2 °C, da se omogoči uravnoteženje in sproščanje odvečnega plina v atmosfero, na primer s stresanjem posamezne posode, vstavitvijo igle merilnika tlaka (odstavek 13-c) skozi tesnilo in odpiranjem ventila, dokler se na merilniku tlaka ne prikaže vrednost nič. Če je v tej fazi ali ob vmesnih meritvah tlak prostora v zaprti posodi nad fazno mejo plin-kapljevina manjši od atmosferskega, je treba z dušikovim plinov ponovno vzpostaviti atmosferski tlak. Ventil se zapre (glej odstavek 13-c), inkubacija pa se nadaljuje v temi, pri čemer se zagotovi, da se vsi deli posode ohranjajo pri temperaturi za gnitje. Posode se po inkubaciji opazujejo od 24 do 48 ur. Če je supernatant v posodah izrazito rožnato obarvan, se zavržejo, tj. če je resazurin (glej odstavek 16) spremenil barvo, kar kaže na prisotnost kisika (glej odstavek 50). Čeprav lahko sistem majhne količine kisika zanemari, lahko višje koncentracije resno zavirajo potek anaerobne biološke razgradnje. Občasna zavrnitev posamezne posode iz niza treh je lahko sprejemljiva, vendar je treba pri večjem številu napak uvesti preiskavo eksperimentalnih postopkov in preskus ponoviti. | 34. | Vsebina vseh posod se previdno zmeša z nekajminutnim mešanjem ali stresanjem vsaj dvakrat ali trikrat na teden in neposredno pred vsakim merjenjem tlaka. S stresanjem se inokulum ponovno suspendira, pri čemer se zagotovi plinsko ravnotežje. Vse meritve tlaka je treba izvesti hitro, saj bi se lahko temperatura v preskusnih posodah znižala, kar bi povzročilo napačne meritve. Med merjenjem tlaka je treba v preskusnih posodah, vključno s prostorom v zaprti posodi nad fazno mejo plin-kapljevina, vzdrževati temperaturo za gnitje. Tlak plina se izmeri na primer tako, da se skozi septum vstavi injekcijska igla (odstavek 13-c), priključena na merilnik za spremljanje tlaka. Paziti je treba, da voda ne vstopi v injekcijsko iglo. Če se to zgodi, je treba mokre dele osušiti in namestiti novo iglo. Tlak je treba meriti v milibarih (glej odstavek 42). Tlak plina v posodah se lahko izmeri v rednih časovnih presledkih, na primer vsak teden, odvečni plin pa se lahko sprosti v atmosfero. Namesto tega se lahko tlak izmeri le na koncu preskusa, da se določi količina nastalega bioplina. | 35. | Priporoča se, da se izvedejo vmesne meritve tlaka, saj se na podlagi povečanega tlaka določi, kdaj se lahko preskus prekine, pri čemer se lahko upošteva tudi kinetika (glej odstavek 6). | 36. | Običajno se preskus konča po 60-dnevnem inkubacijskem obdobju, razen če krivulja biološke razgradnje, dobljena na podlagi meritev tlaka, prej doseže ravnotežje, tj. fazo, v kateri je bila dosežena največja razgradnja, krivulja biološke razgradnje pa se je zravnala. Če je vrednost ravnotežja manj kot 60 %, je razlaga otežena, ker kaže, da se je mineraliziral le del molekule ali da je prišlo do napake. Če ob koncu običajnega inkubacijskega obdobja plin nastaja, vendar ravnotežje očitno ni doseženo, je treba proučiti podaljšanje preskusa, da se preveri, ali bo ravnotežje (> 60 %) doseženo. | Merjenje anorganskega ogljika | 37. | Ob koncu preskusa po zadnji meritvi tlaka plina naj se blato usede. Posamezne posode se zaporedno odprejo in iz njih se nemudoma odvzame vzorec za določitev koncentracije (mg/l) anorganskega ogljika v supernatantu. Za supernatant se ne uporabi niti centrifugiranje niti filtriranje, ker bi prišlo do nesprejemljive izgube raztopljenega ogljikovega dioksida. Če supernatanta po vzorčenju ni mogoče analizirati, se za največ 2 dni shrani v zatesnjeni fioli brez prostora v zaprti posodi nad fazno mejo plin-kapljevina in ohlajen na približno 4 °C. Po merjenju anorganskega ogljika se izmeri in zabeleži vrednost pH. | 38. | Namesto tega se lahko anorganski ogljik v supernatantu določi posredno s sproščanjem raztopljenega anorganskega ogljika kot ogljikovega dioksida, ki se lahko izmeri v prostoru v zaprti posodi nad fazno mejo plin-kapljevina. Po zadnjem merjenju tlaka plina se tlak v vseh posodah uravna na atmosferski tlak. Vsebina posod se zakisa na približno pH 1, tako da se skozi septum zatesnjenih posod doda koncentrirana mineralna kislina (npr. H2SO4). Pretresene posode se približno 24 ur inkubirajo pri 35 °C ± 2 °C, tlak plina, ki nastane iz sproščenega ogljikovega dioksida, pa se izmeri z merilnikom tlaka. | 39. | Podobne meritve se izvedejo za ustrezne slepe vzorce, referenčne snovi in posode za kontrolo zaviranja, če so vključene (glej odstavek 21). | 40. | V nekaterih primerih, zlasti če se iste kontrolne posode uporabijo za več preskusnih snovi, je treba proučiti meritve vmesnih koncentracij anorganskega ogljika v preskusnih in kontrolnih posodah, kot je primerno. V tem primeru je treba pripraviti dovolj posod za vse vmesne meritve. Ta postopek ima prednost pred odvzemom vzorcev zgolj iz ene posode. Slednje se lahko izvede le, če se zdi, da potrebna prostornina za analizo raztopljenega anorganskega ogljika ni prevelika. Meritev raztopljenega anorganskega ogljika je treba izvesti po meritvi tlaka plina brez sproščanja odvečnega plina, kot je opisano v nadaljevanju: | — | skozi septum se brez odpiranja posod z brizgo odvzame čim manjša prostornina vzorcev supernatanta, pri čemer se določi anorganski ogljik v vzorcu, | — | po odvzemu vzorca se odvečni plin sprosti ali ne, | — | upoštevati je treba, da lahko še tako majhno zmanjšanje prostornine supernatanta (npr. približno 1 %) pomeni znatno povečanje prostornine plina v prostoru v zaprti posodi nad fazno mejo plin-kapljevina (Vh), | — | enačbe (glej odstavek 44) se popravijo z vstavitvijo Vh v enačbo 3, kot je potrebno. | Specifične analize | 41. | Če je treba določiti primarno anaerobno razgradnjo (glej odstavek 30), se iz posod, ki vsebujejo preskusno snov, na začetku in na koncu preskusa odvzame primerna prostornina vzorca za specifične analize. Če se to izvede, je treba pri izračunu rezultatov nastajanja plina upoštevati, da se bosta prostornini prostora v zaprti posodi nad fazno mejo plin-kapljevina (Vh) in tekočine (Vl) spremenili. Namesto tega se lahko vzorci za specifične analize odvzamejo iz dodatnih zmesi, ki so bile predhodno določene za ta namen (odstavek 30). | PODATKI IN POROČANJE | Obdelava rezultatov | 42. | Iz praktičnih razlogov se tlak plina meri v milibarih (1 mbar = 1h Pa = 102 Pa, 1 Pa = 1 N/m2), prostornina v litrih in temperatura v stopinjah Celzija. | Ogljik v prostoru v zaprti posodi nad fazno mejo plin-kapljevina | 43. | Ker tako 1 mol metana kot 1 mol ogljikovega dioksida vsebuje 12 g ogljika, se lahko masa ogljika v dani prostornini sproščenega plina izrazi kot: | m= 12 × 103×n | enačba [1], | pri čemer je: | m | = | masa ogljika (mg) v dani prostornini sproščenega plina, | 12 | = | relativna atomska masa ogljika, | n | = | število molov plina v dani prostornini. | Če plin, ki ni metan ali ogljikov dioksid (npr. N2O), nastane v znatnih količinah, je treba enačbo [1] spremeniti, da opisuje možnost učinkov nastalih plinov. | 44. | Na podlagi zakona plina se lahko n izrazi kot: | enačba [2] | pri čemer je: | p | = | tlak plina (paskali), | V | = | prostornina plina (m3), | R | = | plinska konstanta [8 314 J/(mol K)], | T | = | inkubacijska temperatura (kelvini). | S kombinacijo enačb [1] in [2] ter racionalizacijo za omogočanje nastajanja plina v slepih kontrolah. | enačba [3] | pri čemer je: | mh | = | masa neto ogljika, ki nastane kot plin v prostoru v zaprti posodi nad fazno mejo plin-kapljevina (mg), | Dp | = | sredina razlike med začetnim in končnim tlakom v preskusni posodi, od katere se odšteje ustrezna sredina v slepih posodah (milibari), | Vh | = | prostornina prostora v zaprti posodi nad fazno mejo plin-kapljevina v posodi (l), | 0,1 | = | pretvorba za newtone/m2 v milibare in m3 v litre. | Enačbo [4] je treba uporabiti za normalno inkubacijsko temperaturo, ki je 35 °C (308 K): | mh = 0,468(Δp·Vh ) | enačba [4] | Opomba: nadomestni izračun prostornine. Odčitki merilnika tlaka se pretvorijo v ml nastalega plina z umeritveno krivuljo, dobljeno z grafičnim prikazom injicirane prostornine (ml) glede na odčitke merilnika (Dodatek 2). Število molov (n) plina v prostoru v zaprti posodi nad fazno mejo plin-kapljevina se izračuna z deljenjem skupne količine nastalega plina (ml) s 25 286 ml/mol, kar je prostornina, ki jo zasede en mol plina pri 35 °C in standardnem atmosferskem tlaku. Ker tako 1 mol CH4 kot 1 mol CO2 vsebuje 12 g ogljika, se količina ogljika (mg) v prostoru v zaprti posodi nad fazno mejo plin-kapljevina (mh ) izračuna z enačbo [5]: | mh = 12 × 103×n | enačba [5] | Racionalizacija za omogočanje nastajanja plina v slepih kontrolah: | enačba [6] | pri čemer je: | mh | = | masa neto ogljika, ki nastane kot plin v prostoru v zaprti posodi nad fazno mejo plin-kapljevina (mg), | DV | = | sredina razlike med prostornino nastalega plina v prostoru v zaprti posodi nad fazno mejo plin-kapljevina v preskusnih posodah in posodah s slepimi kontrolami, | 25 286 | = | prostornina, ki jo zasede 1 mol plina pri 35 °C in 1 atmosferi. | 45. | Potek biološke razgradnje se lahko sledi z grafičnim prikazom povečanja skupnega tlaka Dp (milibari) v odvisnosti od časa, če je primerno. Na podlagi te krivulje se določi in zabeleži lag faza (dnevi). Lag faza je čas od začetka preskusa do začetka znatne razgradnje (glej na primer Dodatek 3). Če so bili odvzeti in analizirani vmesni vzorci supernatanta (glej odstavke 40, 46 in 47), se lahko namesto kumulativnega tlaka grafično prikaže skupni nastali ogljik (v plinu in tekočini). | Ogljik v tekočini | 46. | Količina metana v tekočini se zanemari, ker je znano, da je zelo slabo topen v vodi. Masa anorganskega ogljika v tekočini preskusne posode se izračuna z enačbo [7]: | ml =Cnet ×Vl | enačba [7] | pri čemer je: | ml | = | masa anorganskega ogljika v tekočini (mg), | Cnet | = | koncentracija anorganskega ogljika v preskusnih posodah, od katere se odšteje koncentracija v kontrolnih posodah na koncu preskusa (mg/l), | Vl | = | prostornina tekočine v posodi (l). | Skupni uplinjeni ogljik | 47. | Skupna masa uplinjenega ogljika v posodi se izračuna z enačbo [8]: | mt =mh +ml | enačba [8] | pri čemer je: | | mt = skupna masa uplinjenega ogljika (mg), | | mh in ml sta enaka zgornjim opredelitvam. | Ogljik preskusne snovi | 48. | Masa ogljika v preskusnih posodah, ki izhaja iz dodane preskusne snovi, se izračuna z enačbo [9]: | mv =Cc ×Vl | enačba [9] | pri čemer je: | mv | = | masa ogljika preskusne snovi (mg), | Cc | = | koncentracija ogljika preskusne snovi v preskusni posodi (mg/l), | Vl | = | prostornina tekočine v preskusni posodi (l). | Obseg biološke razgradnje | 49. | Odstotek biološke razgradnje se iz plina v prostoru v zaprti posodi nad fazno mejo plin-kapljevina izračuna z enačbo [10], skupni odstotek biološke razgradnje pa z enačbo [11]: | Dh = (mh /mv ) × 100 | enačba [10] | Dt = (mt /mv ) × 100 | enačba [11] | pri čemer je: | | Dh = biološka razgradnja iz plina v prostoru v zaprti posodi nad fazno mejo plin-kapljevina ( %), | | Dt = skupna biološka razgradnja ( %), | | mh mv in mt so enaki zgornjim opredelitvam. | Stopnja primarne biološke razgradnje se izračuna iz (neobveznih) meritev koncentracije preskusne snovi na začetku in koncu inkubacije z enačbo [12]: | Dp = (1 –Se /Si ) × 100 | enačba [12] | pri čemer je: | Dp | = | primarna razgradnja preskusne snovi ( %), | Si | = | začetna koncentracija preskusne snovi (mg/l), | Se | = | koncentracija preskusne snovi na koncu (mg/l). | Če metoda analize kaže znatne koncentracije preskusne snovi v neprilagojenem inokulumu anaerobnega blata, se uporabi enačba [13]: | Dp 1 = [1 – (Se –Seb )/(Si –Sib )] × 100 | enačba [13] | pri čemer je: | Dp 1 | = | popravljena primarna razgradnja preskusne snovi ( %), | Sib | = | začetna ‚očitna‘ koncentracija preskusne snovi v slepih kontrolah (mg/l), | Seb | = | ‚očitna‘ koncentracija preskusne snovi v slepih kontrolah na koncu (mg/l). | Veljavnost rezultatov | 50. | Uporabijo se lahko samo odčitki tlaka v posodah, ki ne kažejo rožnate obarvanosti (glej odstavek 33). Onesnaženje s kisikom se najbolj zmanjša z uporabo ustreznih tehnik za anaerobno ravnanje. | 51. | Upoštevati je treba, da je preskus veljaven, če referenčna snov doseže ravnotežje, ki predstavlja več kot 60-odstotno biološko razgradnjo (30). | 52. | Če pH na koncu preskusa preseže razpon 7 ± 1 in biološka razgradnja ni zadostna, se preskus ponovi z večjo puferno kapaciteto medija. | Zaviranje razgradnje | 53. | Nastajanje plina v posodah, ki vsebujejo preskusno snov in referenčno snov, mora biti vsaj enako nastajanju plina v posodah, ki vsebujejo samo referenčno snov, v nasprotnem primeru se kaže zaviranje nastajanja plina. V nekaterih primerih bo v posodah, ki vsebujejo preskusno snov brez referenčne snovi, nastalo manj plina kot v slepih kontrolah, kar kaže, da preskusna snov deluje kot inhibitor. | Poročilo o preskusu | 54. | V poročilo o preskusu se vključijo naslednje informacije: | | Preskusna snov: | — | splošno ime, kemijsko ime, številka CAS, strukturna formula in pomembne fizikalno-kemijske lastnosti, | — | čistost (nečistoče) preskusne snovi. | | Preskusni pogoji: | — | prostornine razredčene tekočine gnilišča (Vl ) in prostora v zaprti posodi nad fazno mejo plin-kapljevina v posodi, | — | opis preskusnih posod, glavne značilnosti meritve bioplina (npr. vrsta merilnika tlaka) in analizatorja anorganskega ogljika, | — | vnos preskusne snovi in referenčne snovi v preskusni sistem: uporabljena preskusna koncentracija in uporaba topil, | — | podrobnosti o uporabljenem inokulumu: naziv čistilne naprave, opis vira prečiščene odpadne vode (npr. obratovalna temperatura, retencijski čas blata, predvsem gospodinjski itd.), koncentracija, vse informacije, potrebne za utemeljitev tega, in informacije o vseh predhodnih tretiranjih inokuluma (npr. predhodno gnitje, predhodna izpostavljenost), | — | inkubacijska temperatura, | — | število ponovitev. | | Rezultati: | — | vrednosti pH in anorganskega ogljika na koncu preskusa, | — | koncentracija preskusne snovi na začetku in koncu preskusa, če je bila izvedena specifična meritev, | — | vsi izmerjeni podatki, zbrani v preskusu, slepe posode, posode z referenčno snovjo in posode za kontrolo zaviranja, kot je ustrezno (npr. tlak v milibarih, koncentracija anorganskega ogljika (mg/l) v obliki tabele (izmerjene podatke za prostor v zaprti posodi nad fazno mejo plin-kapljevina in tekočino je treba sporočiti ločeno), | — | statistična obdelava podatkov, trajanje preskusa ter diagram biološke razgradnje preskusne snovi, referenčne snovi in kontrole strupenosti, | — | odstotek biološke razgradnje preskusne snovi in referenčne snovi, | — | razlogi za morebitno zavrnitev rezultatov preskusa, | — | razprava o rezultatih. | LITERATURA | (1) | Naslednja poglavja te priloge: | | C.4 Določanje ‚dobre‘ biorazgradljivosti; | | C.9 Biorazgradnja – Zahn-Wellensev preskus; | | C.10 Simulacijski preskus za aerobno čiščenje odpadne vode: | A: Enote z aktivnim blatom, B: Biofilmi; | | C.11 Biorazgradnja – preskus zaviranja dihanja aktivnega blata. | (2) | OECD (2009) Inherent Biodegradability: Modified MITI Test (II), OECD Guideline for Testing of Chemicals, No. 302C, OECD, Pariz. | (3) | Birch, R. R., Biver, C., Campagna, R., Gledhill, W. E., Pagga, U., Steber, J., Reust, H., in Bontinck, W. J. (1989). Screening of chemicals for anaerobic biodegradation. Chemosphere 19, 1527– 1550. (Objavljeno tudi kot ECETOC Technical Report No. 28, junij 1988). | (4) | Shelton D. R., in Tiedje, J. M. (1984). General method for determining anaerobic biodegradation potential. Appl. Environ. Mircobiology, 47, 850–857. | (5) | Owen, W. F., Stuckey, DC., Healy J. B., Jr, Young L. Y., in McCarty, P. L. (1979). Bioassay for monitoring biochemical methane potential and anaerobic toxicity. Water Res. 13, 485–492. | (6) | Healy, J. B. Jr., in Young, L. Y. (1979). Anaerobic biodegradation of eleven aromatic compounds to methane. Appl. Environ. Microbiol. 38, 84–89. | (7) | Gledhill, W. E. (1979). Proposed standard practice for the determination of the anaerobic biodegradation of organic chemicals. Working document. Draft 2 no.35.24. American Society for Testing Materials, Filadelfija. | (8) | Battersby, N. S., in Wilson, V. (1988). Evaluation of a serum bottle technique for assessing the anaerobic biodegradability of organic chemicals under methanogenic conditions. Chemosphere, 17, 2441–2460. | (9) | E1192-92. Standard Test Method for Determining the Anaerobic Biodegradation Potential of Organic Chemicals. ASTM, Filadelfija. | (10) | US-EPA (1998) Fate, Transport and Transformation Test Guidelines OPPTS 835.3400 Anaerobic Biodegradability of Organic Chemicals. | (11) | Mednarodna organizacija za standardizacijo (1995) ISO 11 734 Kakovost vode – Vrednotenje ‚končne‘ anaerobne biorazgradljivosti organskih spojin v presnovljenem blatu – Metoda z merjenjem nastalega bioplina. | (12) | Mednarodna organizacija za standardizacijo (2003) ISO 13 641-1 Kakovost vode – Določevanje zaviranja nastanka plina, ki ga proizvedejo anaerobne bakterije – 1. del: Splošen preskus. | (13) | Mednarodna organizacija za standardizacijo (1995) ISO 10 634 Kakovost vode – Navodilo za pripravo in obdelavo v vodi slabo topnih organskih spojin za nadaljnje vrednotenje njihove biorazgradljivosti v vodi. | (14) | Pagga, U., in Beimborn, D. B., (1993). Anaerobic biodegradation test for organic compounds. Chemosphere, 27, 1499– 1509. | (15) | Mednarodna organizacija za standardizacijo (1997) ISO 11 923 Kakovost vode – Določevanje suspendiranih snovi s filtracijo skozi filter iz steklenih vlaken. | Dodatek 1 | Primer opreme za merjenje nastajanja bioplina s tlakom plina | Legenda: | 1 | – | Merilnik tlaka | 2 | – | Trojni plinotesni petelinček | 3 | – | Injekcijska igla | 4 | – | Plinotesno tesnilo (zaporni pokrovček in septum) | 5 | – | Prostor v zaprti posodi nad fazno mejo plin-kapljevina (Vh ) | 6 | – | Inokulum pregnitega blata (Vl ) | Preskusne posode v okolju s 35 °C ± 2 °C | Dodatek 2 | Pretvorba odčitkov merilnika tlaka | Odčitki merilnika tlaka so lahko povezani s prostorninami plina z umeritveno krivuljo, ki nastane z injiciranjem znanih prostornin zraka pri 35 °C ± 2 °C v serumske steklenice, ki vsebujejo toliko vode kot reakcijska zmes, V R: | — | odmeri se V R ml alikvotov vode in hrani v petih serumskih steklenicah pri 35 °C ± 2 °C. Steklenice se zatesnijo in za eno uro postavijo v vodno kopel pri 35 °C, da se vzpostavi ravnotežje, | — | merilnik tlaka se vklopi, pusti, da se stabilizira, in nastavi na nič, | — | injekcijska igla se vstavi skozi tesnilo ene od steklenic, ventil se odpre, dokler se na merilniku tlaka ne prikaže vrednost nič, in nato zapre, | — | postopek se ponovi pri ostalih steklenicah, | — | v vsako steklenico se injicira 1 ml zraka pri 35 °C ± 2 °C. Igla (merilnika) se vstavi skozi tesnilo eno od steklenic in pusti, da se meritve tlaka stabilizirajo. Tlak se zabeleži, ventil pa se odpre, dokler se na merilniku tlaka ne prikaže vrednost nič, in nato zapre, | — | postopek se ponovi pri ostalih steklenicah, | — | zgornji postopek se v celoti ponovi z 2 ml, 3 ml, 4 ml, 5 ml, 6 ml, 8 ml, 10 ml, 12 ml, 16 ml, 20 ml in 50 ml zraka, | — | grafično se prikaže krivulja pretvorbe tlaka (Pa) v odvisnosti od injicirane prostornine plina Vb (ml). Odziv instrumenta je linearen v razponu od 0 Pa do 70 000 Pa in od 0 ml do 50 ml nastalega plina. | Dodatek 3 | Primer krivulje razgradnje (skupno neto povečanje tlaka) | Gas pressure (m bar) | Time (days) | Plateau | Lag phase | 60 | 50 | 40 | 30 | 20 | 10 | 0 | 0 | 100 | 200 | 300 | 400 | 500 | Dodatek 4 | Primer podatkovnih listov za preskus anaerobne biološke razgradnje – podatkovni list za preskusno snov | Laboratorij: … | Preskusna snov: … | Preskus št. … | Preskusna temperatura: (°C): … | Prostornina prostora v zaprti posodi nad fazno mejo plin-kapljevina (V h): …(l) | Prostornina tekočine (V l): …(l) | Ogljik v preskusni snovi C c,v: …(mg/l) | mv (31): …(mg) | | Dan | p1 (preskus) | (milibari) | p2 (preskus) | (milibari) | p3 (preskus) | (milibari) | p (preskus) | sredina | (milibari) | p4 (slepi) | (milibari) | p5 (slepi) | (milibari) | p6 (slepi) | (milibari) | p (slepi) | sredina | (milibari) | p (neto) | preskus – slepi | sredina (milibari) | Δp (neto) | skupaj | (milibari) | mh | prostor v zaprti posodi nad fazno mejo plin-kapljevina C (32) | (mg) | Dh | biološka razgradnja (33) | (%) | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | C IC, 1 | preskus | (mg) | C IC, 2 | preskus | (mg) | C IC, 3 | preskus | (mg) | C IC | sredina – preskus | (mg) | C IC, 4 | slepi | (mg) | C IC, 5 | slepi | (mg) | C IC, 6 | slepi | (mg) | C IC | sredina – slepi | (mg) | C IC, net | preskus – slepi | sredina | (mg) | m l | tekočina C (34) | (mg) | m t | skupaj C (35) | (mg) | D t | biološka razgradnja (36) | (%) | Anorganski ogljik (konec) | | | | | | | | | | | | | pH (konec) | | | | | | | | | | | | | Laboratorij: … | Referenčna snov: … | Preskus št. … | Preskusna temperatura: (°C): … | Prostornina prostora v zaprti posodi nad fazno mejo plin-kapljevina (V h): …(l) | Prostornina tekočine (V l) (litri): … | Ogljik v referenčni snovi C c,v (mg/l): … | mv (37) …(mg): | | Dan | p 1 (ref.) | (milibari) | p 2 (ref.) | (milibari) | p 3 (ref.) | (milibari) | p (ref.) | sredina | (milibari) | p 4 (inhib.) | (milibari) | p 5 (inhib.) | (milibari) | p 6 (inhib.) | (milibari) | p (inhib.) | sredina | (milibari) | p (ref.) | ref. – slepi | (milibari) | Δ p (ref.) | skupaj | (milibari) | m h | prostor v zaprti posodi nad fazno mejo plin-kapljevina C (38) | (mg) | D h | Biološka razgradnja (39) | (%) | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | C IC, 1 | ref. | (mg) | C IC, 2 | ref. | (mg) | C IC, 3 | ref. | (mg) | C IC | ref. – sredina | (mg) | C IC, 4 | inhib. | (mg) | C IC, 5 | inhib. | (mg) | C IC, 6 | inhib. | (mg) | C IC | inhib. – sredina | (mg) | C IC, net | ref. – inhib. | (mg) | m l | tekočina C (40) | (mg) | m t | skupaj C (41) | (mg) | D t | biološka razgradnja (42) | (%) | Anorganski ogljik (konec) | | | | | | | | | | | | | pH (konec) | | | | | | | | | | | | | C.44 IZPIRANJE V TALNIH KOLONAH | UVOD | 1. | Ta preskusna metoda ustreza Smernici za preskušanje OECD (TG) 312 (2004). Umetne kemikalije lahko tla dosežejo neposredno z namerno uporabo (npr. agrokemikalije) ali po posrednih poteh (npr. odpadna voda → odpadno blato → tla ali zrak → mokro/suho odlaganje). Za oceno tveganja teh kemikalij je treba oceniti njihov potencial za transformacijo v tleh in premik (izpiranje) v globlje plasti tal ter postopno v podtalnico. | 2. | Na voljo je več metod za merjenje potenciala izpiranja kemikalij v tla v nadzorovanih laboratorijskih pogojih, tj. tankoplastna kromatografija tal, debeloplastna kromatografija tal, kolonska kromatografija tal ter meritve adsorpcije in desorpcije (1) (2). Pri neioniziranih kemikalijah porazdelitveni koeficient n-oktanol/voda (Pow) omogoča zgodnjo oceno njihovega potenciala adsorpcije in izpiranja (3) (4) (5). | 3. | Metoda, opisana v tej preskusni metodi, temelji na kolonski kromatografiji tal v oviranih tleh (za opredelitev glej Dodatek 1). Za določitev (i) potenciala izpiranja preskusne kemikalije in (ii) potenciala izpiranja produktov transformacije (študija s starimi ostanki) v tleh v nadzorovanih laboratorijskih pogojih se izvajata dve vrsti poskusov (43). Ta preskusna metoda temelji na obstoječih smernicah (6) (7) (8) (9) (10) (11). | 4. | Na delavnici OECD o izbiri tal/usedline, ki je bila leta 1995 v Belgiratu v Italiji (12), je bil dosežen dogovor o številu in vrstah tal za uporabo pri tej preskusni metodi. Sprejeta so bila tudi priporočila glede odvzemanja, obravnavanja in shranjevanja vzorcev tal za poskuse v zvezi z izpiranjem. | NAČELO PRESKUSNE METODE | 5. | Kolone iz ustrezno inertnega materiala (npr. stekla, nerjavnega jekla, aluminija, teflona, PVC itd.) so napolnjene s tlemi, nasičene in uravnotežene z raztopino ‚umetnega dežja‘ (za opredelitev glej Dodatek 1) ter nato osušene. Nato se površina vsake talne kolone tretira s preskusno kemikalijo in/ali starimi ostanki preskusne kemikalije. Umetni dež se nato vnese v talne kolone, izcedna voda pa se odvzame. Po izpiranju se tla odstranijo iz kolon in razdelijo na ustrezno število delov, odvisno od informacij, ki jih mora zagotoviti študija. V vseh delih tal in izcedni vodi se nato analizira preskusna kemikalija in, če je primerno, produkti transformacije ali druge aktualne kemikalije. | UPORABNOST PRESKUSNE METODE | 6. | Preskusna metoda se uporablja za preskusne kemikalije (neoznačene ali radioaktivno označene, npr.14C), za katere je na voljo dovolj natančna in občutljiva analitska metoda. Preskusna metoda se ne sme uporabljati za kemikalije, ki so hlapne v tleh in vodi ter zato ne ostanejo v tleh in/ali izcedni vodi v poskusnih pogojih te preskusne metode. | INFORMACIJE O PRESKUSNI KEMIKALIJI | 7. | Preskusne kemikalije brez oznake ali z radioaktivno oznako se lahko uporabijo za merjenje obnašanja izpiranja v talnih kolonah. Radioaktivno označene snovi so potrebne za proučevanje izpiranja produktov transformacije (stari ostanki preskusne kemikalije) in določitve masne bilance. Priporoča se oznaka14C, vendar so lahko koristni tudi drugi izotopi, kot so13C,15N,3H in 32P. Če je mogoče, se označi(-jo) najbolj stabilen(-lni) del(-i) molekule. Čistost preskusne kemikalije mora biti najmanj 95-odstotna. | 8. | Večino kemikalij je treba uporabiti kot eno snov. Vendar se lahko pri aktivnih snoveh v izdelkih za zaščito rastlin za proučevanje izpiranja matične preskusne snovi uporabljajo formulirani produkti, vendar je njihovo preskušanje potrebno zlasti, kadar bo zmes verjetno vplivala na hitrost sproščanja (npr. zrnaste formulacije ali formulacije z nadzorovanim sproščanjem). V zvezi s specifičnimi zahtevami za načrt preskusa zmesi bi lahko bilo koristno posvetovanje z regulativnim organom pred izvedbo preskusa. Za študije izpiranja starih ostankov je treba uporabiti čisto matično preskusno snov. | 9. | Pred izvajanjem preskusov izpiranja v talnih kolonah naj bi bile na voljo naslednje informacije o preskusni kemikaliji: | (1) | topnost v vodi [preskusna metoda A.6] (13); | (2) | topnost v organskih topilih; | (3) | parni tlak [preskusna metoda A.4] (13) in/ali Henryjeva konstanta; | (4) | porazdelitveni koeficient n-oktanol/voda [preskusni metodi A.8 in A.24] (13); | (5) | adsorpcijski koeficient (Kd, Kf ali KOC) [preskusni metodi C.18 in/ali C.19 ] (13); | (6) | hidroliza [preskusna metoda C.7] (13); | (7) | konstanta disociacije ((pKa) [OECD TG 112] (25); | (8) | aerobna in anaerobna transformacija v tleh [preskusna metoda C.23] (13). | Opomba: V ustreznih poročilih o preskusu je treba poročati o temperaturi, pri kateri so bile opravljene te meritve. | 10. | Količina preskusne kemikalije, vnesene v talne kolone, mora biti zadostna za zaznavo vsaj 0,5 % uporabljenega odmerka v katerem koli posameznem delu. Pri aktivnih kemikalijah v izdelkih za zaščito rastlin lahko količina uporabljene preskusne kemikalije ustrezna največji priporočeni stopnji uporabe (ena uporaba). | 11. | Na voljo mora biti primerna analitska metoda znane točnosti, natančnosti in občutljivosti za kvantifikacijo preskusne kemikalije in, če je ustrezno, njenih produktov transformacije v tleh in izcedni vodi. Znana mora biti tudi analitska meja zaznavnosti preskusne kemikalije in njenih pomembnih produktov transformacije (običajno vsaj vseh produktov transformacije ≥ 10 % uporabljenega odmerka, opaženega v študijah poteka transformacij, vendar raje katerih koli zadevnih produktov transformacije) (glej odstavek 17). | REFERENČNE KEMIKALIJE | 12. | Za oceno relativne mobilnosti preskusne kemikalije v tleh je treba uporabiti referenčne kemikalije z znanim obnašanjem pri izpiranju, kot je atrazin ali monuron, ki se lahko štejejo za snovi z zmernim izpiranjem (1) (8) (11). Za potrditev hidrodinamičnih lastnosti talne kolone je lahko koristna tudi nesorpcijska in nerazgradljiva polarna referenčna kemikalija (npr. tritij, bromid, fluoroscein, eozin) za sledenje gibanja vode v koloni. | 13. | Kemikalije analitskega standarda so lahko koristne tudi za določitev značilnosti in/ali opredelitev produktov transformacije, najdenih v delih tal in izcednih vodah s kromatografsko, spektroskopsko ali drugo ustrezno metodo. | OPREDELITVE IN ENOTE | 14. | Glej Dodatek 1. | MERILA KAKOVOSTI | Izkoristek | 15. | Vsota deležev preskusne kemikalije, najdenih v delih tal in izcedni vodi kolone po izpiranju, je izkoristek poskusa izpiranja. Izkoristki morajo biti v razponu od 90 % do 110 % pri radioaktivno označenih kemikalijah (11) in od 70 % do 110 % pri neoznačenih kemikalijah (8). | Ponovljivost in občutljivost analitske metode | 16. | Ponovljivost analitske metode za kvantifikacijo preskusne kemikalije in produktov transformacije se lahko preveri s ponovljeno analizo istega ekstrakta dela tal ali izcedne vode (glej odstavek 11). | 17. | Meja zaznavnosti analitske metode za preskusno kemikalijo in produkte transformacije mora biti najmanj 0,01 mg · kg– 1 v vsakem delu tal ali izcedni vodi (kot preskusna snov) ali 0,5 % uporabljenega odmerka v katerem koli posameznem delu, kar je manj. Opredeliti je treba tudi mejo določanja. | OPIS PRESKUSNE METODE | Preskusni sistem | 18. | Za preskus se uporabljajo kolone za izpiranje (deljive ali nedeljive) iz ustrezno inertnega materiala (npr. stekla, nerjavnega jekla, aluminija, teflona, PVC itd.) z notranjim premerom vsaj 4 cm in najmanjšo višino 35 cm. Preskusi se potencialno medsebojno delovanje materiala kolone in preskusne kemikalije in/ali njenih produktov transformacije. Primeri ustreznih deljivih in nedeljivih kolon so prikazani v Dodatku 2. | 19. | Za polnjenje talnih kolon se uporabljajo žlica, potisni bat in vibracijska oprema. | 20. | Za vnos umetnega dežja v talne kolone se lahko uporabljajo vlečni bat ali peristaltična črpalka, ročke za prho, steklenice za zagotavljanje stalne hitrosti pretoka ali enostavni liji kapalniki. | Laboratorijska oprema in kemikalije | 21. | Potrebna je standardna laboratorijska oprema, zlasti: | (1) | instrumenti za analizo, na primer oprema GLC, HPLC, TLC, vključno z ustreznimi sistemi zaznavanja za analiziranje označenih ali neoznačenih kemikalij ali inverzno metodo izotopskega redčenja; | (2) | instrumenti za identifikacijo (npr. MS, GC-MS, HPLC-MS, NMR itd.); | (3) | tekočinski scintilacijski števec za radioaktivno označeno preskusno kemikalijo; | (4) | oksidacijsko sredstvo za izgorevanje označenih snovi; | (5) | naprave za ekstrakcijo (na primer centrifugirke za hladno ekstrakcijo in naprava Soxhlet za kontinuirano ekstrakcijo pod refluksom); | (6) | instrumenti za koncentracijo raztopin in ekstraktov (npr. rotacijski evaporator). | 22. | Uporabljene kemikalije vključujejo: analitsko čista organska topila, kot so aceton, metanol itd., scintilacijsko tekočino, raztopino 0,01 M CaCl2 v destilirani ali deionizirani vodi (= umetni dež). | Preskusna kemikalija | 23. | Preskusno kemikalijo je treba za vnos v talno kolono raztopiti v vodi (deionizirani ali destilirani). Če je preskusna kemikalija v vodi slabo topna, se lahko vnese kot formuliran produkt (po potrebi po suspendiranju ali emulgiranju v vodi) ali v katerem koli organskem topilu. Če se uporabi organsko topilo, ga je treba uporabiti čim manj in mora pred začetkom procesa izpiranja izhlapeti s površine talne kolone. Trdne formulacije, kot so zrnca, je treba vnesti v trdni obliki brez vode; za boljšo razporeditev po površini talne kolone se lahko formulirani produkt pred uporabo zmeša z majhno količino kremenovega peska (npr. 1 g). | 24. | Količina preskusne kemikalije, vnesene v talne kolone, mora biti zadostna za zaznavo vsaj 0,5 % uporabljenega odmerka v katerem koli posameznem delu. Pri aktivnih kemikalijah v izdelkih za zaščito rastlin lahko temelji na največji priporočeni stopnji uporabe (stopnja enega nanosa), pri čemer mora biti pri matičnem spiranju in spiranju starih ostankov povezana s površino uporabljene talne kolone (44). | Referenčna kemikalija | 25. | Pri poskusih izpiranja je treba uporabiti referenčno kemikalijo (glej odstavek 12). Na površino talne kolone jo je treba nanesti podobno kot preskusno kemikalijo z ustrezno hitrostjo, ki omogoča primerno zaznavanje kot notranji standard skupaj s preskusno kemikalijo v isti talni koloni ali samostojno kot ločena talna kolona. Obe kemikaliji naj bi se uporabili v isti talni koloni, razen če sta obe kemikaliji podobno označeni. | Tla | Izbira tal | 26. | Za študije izpiranja z matično preskusno kemikalijo je treba uporabiti 3 do 4 tla z različnim pH, vsebnostjo organskega ogljika in teksturo (12) Smernice za izbiranje tal za poskuse izpiranja so navedene v tabeli 1. Pri preskusnih kemikalijah, ki jih je mogoče ionizirati, morajo izbrana tla zajeti širok razpon pH, da se oceni mobilnost kemikalije v njeni ionizirani in neionizirani obliki; vsaj troje tal mora imeti pH, pri katerem je preskusna kemikalija v mobilni obliki. | Tabela 1 | Smernice za izbiro tal za študije izpiranja | Tla št. | Vrednost pH | Organski ogljik | % | Vsebnost gline | % | Tekstura (*11) | 1 | > 7,5 | 3,5–5,0 | 20–40 | glinasta ilovica | 2 | 5,5–7,0 | 1,5–3,0 | 15–25 | muljasta ilovica | 3 | 4,0–5,5 | 3,0–4,0 | 15–30 | ilovica | 4 | < 4,0–6,0 (1) | < 0,5–1,5 (1) (2) | < 10–15 (1) | ilovnat pesek | 5 | < 4,5 | > 10 (3) | < 10 | ilovnat pesek/pesek | 27. | Občasno so lahko potrebne druge vrste tal, ki predstavljajo hladnejša, zmerna in tropska območja. Če se da prednost drugim vrstam tal, jih je zato treba opredeliti z istimi parametri in morajo imeti podobne razlike v lastnostih kot tiste, opisane v smernicah za izbiro tal za študije izpiranja (glej tabelo 1 zgoraj), čeprav niso popolnoma skladne z merili. | 28. | Za študije izpiranja s ‚starimi ostanki‘ je treba uporabiti ena tla (12). Vsebnost peska v njih mora biti > 70 % in vsebnost organskega ogljika med 0,5 in 1,5 % (npr. tla št. 4 v tabeli 1). Uporaba več vrst tal je lahko potrebna, če so podatki o produktih transformacije pomembni. | 29. | Vse vrste tal je treba opredeliti vsaj glede teksture [ % peska, % mulja, % gline v skladu s sistemi FAO in USDA za razvrščanje (14)], pH, kationske izmenjalne kapacitete, vsebnosti organskega ogljika, gostote v razsutem stanju (za ovirana tla) in zmogljivosti zadrževanja vode. Meritev mikrobne biomase je potrebna le za tla, ki se uporabljajo med staranjem/inkubacijo, izvedeno pred poskusom izpiranja s starimi odpadki. Informacije o dodatnih lastnostih tal (npr. razvrstitev tal, mineralogija gline, specifična površina) so lahko koristne pri razlagi rezultatov te študije. Za določitev značilnosti tal se lahko uporabijo metode, priporočene v virih (15) (16) (17) (18) (19). | Odvzemanje in shranjevanje tal | 30. | Tla je treba odvzeti z zgornje plasti (horizont A) do globine največ 20 cm. Ostanke vegetacije, makrofavne in kamnov je treba odstraniti. Tla (razen tal, ki se uporabljajo za staranje preskusne kemikalije) se sušijo na zraku pri sobni temperaturi (najbolje med 20 in 25 °C. Desagregacija (razdruževanje) se mora izvesti s čim manjšo silo, tako da se prvotna tekstura tal čim manj spremeni. Tla se presejejo skozi sito z luknjicami < 2 mm. Priporočena je previdna homogenizacija, saj se s tem poveča obnovljivost rezultatov. Tla se lahko pred uporabo shranijo pri sobni temperaturi in posušena na zraku (12). Nobena omejitev časa shranjevanja ni priporočena, vendar je treba tla, ki se shranjujejo več kot tri leta, pred uporabo ponovno analizirati glede na njihovo vsebnost organskega ogljika in pH. | 31. | Na voljo morajo biti podrobne informacije o preteklosti mesta vzorčenja, kjer se odvzemajo tla za preskus. Podrobnosti vključujejo točno lokacijo [natančno definirano z UTM (Universal Transversal Mercator-Projection/European Horizontal Datum) ali zemljepisnimi koordinatami], pokritost z vegetacijo, uporabo kemikalij za zaščito pridelka, uporabo organskih in anorganskih gnojil, dodatke bioloških materialov ali naključno onesnaženje (12). Če so bila tla v predhodnih štirih letih tretirana s preskusno kemikalijo ali analognimi strukturami, se ne smejo uporabiti v študijah izpiranja. | Preskusni pogoji | 32. | V obdobju preskušanja je treba kolone za izpiranje hraniti v temi pri sobni temperaturi, dokler se ta temperatura vzdržuje v razponu ± 2 °C. Priporočajo se temperature med 18 in 25 °C. | 33. | Umetni dež (0,01 M CaCl2) je treba neprekinjeno nanašati na površino talnih kolon s hitrostjo 200 mm v obdobju 48 ur (45); ta hitrost je enaka nanosu 251 ml za kolono z notranjim premerom 4 cm. Če je to potrebno za preskus, se lahko uporabijo tudi druge hitrosti umetnih padavin in daljše trajanje. | Izvajanje preskusa | Izpiranje z matično preskusno kemikalijo | 34. | Vsaj ponovitve kolon za izpiranje se napolnijo z netretiranimi, na zraku sušenimi in presejanimi tlemi (< 2 mm) do višine približno 30 cm. Za zagotovitev enotnega polnjenja se tla vnesejo v kolone v majhnih delih z žlico in s potisnim batom stisnejo s hkratnim nežnim vibriranjem tal, dokler se vrh talne kolone ne pogrezne. Enotno polnjenje je potrebno, da se v kolonah za izpiranje zagotovijo obnovljivi rezultati. Za podrobnosti o tehnikah polnjenja kolon glej vire (20) (21) in (22). Za nadzor obnovljivosti postopka polnjenja se določi skupna teža tal v kolonah (46), teže ponovitvenih kolon morajo biti podobne. | 35. | Ko so talne kolone napolnjene, se zmočijo z umetnim dežjem (0,01 M CaCl2) od spodaj navzgor, da voda izpodrine zrak iz por v tleh. Nato se v talnih kolonah vzpostavi ravnotežje, odvečna voda pa odteče zaradi težnosti. Metode za nasičevanje kolon so opisane v viru (23). | 36. | Nato se v talne kolone vnese preskusna kemikalija in/ali referenčna kemikalija (glej odstavke 23–25). Za homogeno razporeditev raztopin je treba suspenzije ali emulzije preskusne in/ali referenčne kemikalije enakomerno nanesti na površino talnih kolon. Če se za vnos preskusne kemikalije priporoča vključitev v tla, jo je treba zmešati z majhno količino (npr. 20 g) tal in nanesti na površino talne kolone. | 37. | Površine talnih kolon se nato prekrijejo s steklenim sintranim diskom, steklenimi kroglicami, filtri iz steklenih vlaken ali okroglim filtrirnim papirjem, da se umetni dež enakomerno razporedi po celotni površini in preprečijo motnje površine tal zaradi dežnih kapljic. Večji kot je premer kolone, bolj je treba paziti pri dodajanju umetnega dežja v talne kolone, da se zagotovi enakomerna porazdelitev umetnega dežja po celotni površini tal. Nato se umetni dež doda v talne kolone po kapljicah s pomočjo vlečnega bata ali peristaltične črpalke ali lija kapalnika. Po možnosti je treba izcedne vode zbrati v delih, njihove prostornine pa se zabeležijo (47). | 38. | Po izpiranju in odtekanju iz kolon se talne kolone razdelijo na ustrezno število delov, odvisno od informacij, ki jih mora zagotoviti študija, deli se ekstrahirajo z ustreznimi topili ali zmesmi topil, v njih pa se analizirajo preskusna kemikalija ter, kadar je ustrezno, produkti transformacije, skupna radioaktivnost in referenčna kemikalija. Izcedne vode ali deli izcednih vod se analizirajo neposredno ali po ekstrakciji za iste produkte. Če se uporabi preskusna kemikalija z radioaktivno oznako, je treba opredeliti vse dele, ki vsebujejo ≥ 10 % uporabljene radioaktivnosti. | Izpiranje s starimi ostanki | 39. | Sveža tla (ki niso bila predhodno sušena na zraku) se tretirajo s hitrostjo, ki ustreza površini talnih kolon (glej odstavek 24), z radioaktivno označeno preskusno kemikalijo in inkubirajo v aerobnih pogojih v skladu s preskusno metodo C.23 (13). Inkubacijsko obdobje (staranje) mora biti dovolj dolgo, da nastanejo znatne količine produktov transformacije; priporoča se obdobje staranja, ki traja polovico starosti preskusne kemikalije (48), vendar ne sme presegati 120 dni. Starana tla se pred izpiranjem analizirajo glede preskusne kemikalije in njenih produktov transformacije. | 40. | Kolone za izpiranje se do višine 28 cm napolnijo z istimi tlemi (vendar sušenimi na zraku), kot so bila uporabljena pri poskusu staranja, kot je opisano v odstavku 34, pri čemer se določi tudi skupna teža napolnjenih talnih kolon. Talne kolone se nato predhodno zmočijo, kot je opisano v odstavku 35. | 41. | Nato se preskusna kemikalija in njeni produkti transformacije nanesejo na površino talnih kolon v obliki starih ostankov tal (glej odstavek 39) kot 2 cm debel del tal. Skupna višina talnih kolon (netretirana tla + starana tla) naj ne bi presegla 30 cm (glej odstavek 34). | 42. | Izpiranje se izvede, kot je opisano v odstavku 37. | 43. | Po izpiranju se deli tal in izcedne vode analizirajo glede preskusne kemikalije, njenih produktov transformacije in neekstrahirane radioaktivnosti, kot je navedeno v odstavku 38. Za določitev količine starih odpadkov, ki se ohrani v zgornji dvocentimetrski plasti po izpiranju, je treba ta del analizirati ločeno. | PODATKI IN POROČANJE | Obdelava rezultatov | 44. | Količine preskusne kemikalije, produktov transformacije, snovi, ki jih ni mogoče ekstrahirati, in referenčne kemikalije, če je vključena, je treba navesti v % uporabljenega začetnega odmerka za vsak del tal v delu izcedne vode. Za vsako kolono je treba zagotoviti grafični prikaz deležev, ugotovljenih kot funkcija globin tal. | 45. | Če je v te študije izpiranja v kolonah vključena referenčna kemikalija, se lahko izpiranje kemikalije oceni na relativni lestvici z uporabo faktorjev relativne mobilnosti (RMF; za opredelitev glej Dodatek 3) (1) (11), ki omogoča primerjavo podatkov o izpiranju različnih kemikalij, pridobljenih pri različnih vrstah tal. Primeri vrednosti RMF za različne kemikalije za zaščito pridelka so navedeni v Dodatku 3. | 46. | Ocene Koc (adsorpcijski koeficient, normiran na organski ogljik) in Kom (porazdelitveni koeficient, normiran na organsko snov) se lahko pridobi tudi na podlagi rezultatov izpiranja v kolonah z uporabo povprečne razdalje izpiranja ali določenih povezav med RMF in Kom oziroma Koc (4) ali z uporabo enostavne kromatografske teorije (24). Vendar je treba slednjo metodo uporabljati previdno, zlasti ob upoštevanju, da proces izpiranja ne vključuje izključno nasičenih pogojev toka, ampak pogosto nenasičene sisteme. | Razlaga rezultatov | 47. | Študije izpiranja v kolonah, opisane v tej metodi, omogočajo določanje potenciala izpiranja ali mobilnosti preskusne kemikalije (v študiji matičnega izpiranja) in/ali njenih produktov transformacije (v študiji izpiranja starih ostankov) v tleh. Ti preskusi ne predvidevajo količinsko obnašanja pri izpiranju v terenskih pogojih, vendar se lahko uporabijo za primerjavo ‚sposobnosti izpiranja‘ ene kemikalije z drugimi, katerih obnašanje pri izpiranju je morda znano (24). Podobno ne merijo količinsko deleža uporabljene kemikalije, ki bi lahko dosegel podtalnico (11). Vendar lahko rezultati študij izpiranja v kolonah pomagajo pri odločanju, ali je treba izvesti dodatno polterensko ali terensko preskušanje za kemikalije, ki v laboratorijskih preskusih kažejo velik potencial mobilnosti. | Poročilo o preskusu | 48. | Poročilo mora vsebovati: | | Preskusna kemikalija in referenčna kemikalija (če se uporabi): | — | splošno ime, kemijsko ime (nomenklatura IUPAC in CAS), številko CAS, kemijsko strukturo (z navedbo položaja oznak, kadar se uporabi radioaktivno označena snov) in ustrezne fizikalno-kemijske lastnosti, | — | čistoče (nečistoče) preskusne kemikalije, | — | radiokemijsko čistost označene kemikalije in specifično aktivnost (kadar je primerno). | | Preskusna tla: | — | podrobnosti o mestu odvzema, | — | lastnosti tal, kot so pH, vsebnost organskega ogljika in gline, tekstura in gostota v razsutem stanju (za ovirana tla), | — | mikrobno dejavnost tal (le za tla, uporabljena za staranje preskusne kemikalije), | — | dolžino shranjevanja tal in razmere shranjevanja. | | Preskusni pogoji: | — | datume izvajanja študij, | — | dolžino in premer kolon za izpiranje, | — | skupno težo tal v talnih kolonah, | — | količino uporabljene preskusne kemikalije in, če je primerno, referenčne kemikalije, | — | količino, pogostost in trajanje nanašanja dodajanja umetnega dežja, | — | temperaturo poskusnega okolja, | — | število ponovitev (vsaj dve), | — | metode za analizo preskusne kemikalije, produktov transformacije in, kadar je primerno, referenčne kemikalije v različnih delih tal in izcednih vod, | — | metode za opis značilnosti in opredelitev produktov transformacije v delih tal in izcednih vod. | | Rezultati preskusa: | — | tabele z rezultati, izraženimi kot koncentracije in kot % uporabljenega odmerka za dele tal in izcednih vod, | — | masno bilanco, če je primerno, | — | prostornine izcednih vod, | — | razdalje izpiranja in, kadar je primerno, faktorje relativne mobilnosti, | — | grafični prikaz %, ugotovljenega v delih tal glede na globino dela tal, | — | razpravo o rezultatih in razlago rezultatov. | LITERATURA | (1) | Guth, J. A., Burkhard, N., in Eberle, D. O. (1976). Experimental Models for Studying the Persistence of Pesticides in Soil. Proc. BCPC Symposium: Persistence of Insecticides and Herbicides. | (2) | Russel, M. H. (1995). Recommended approaches to assess pesticide mobility in soil. In progress in Pesticide Biochemistry and Toxicology, Vol. 9 (Environmental Behaviour of Agrochemicals – T. R. Roberts in P. C. Kearney, ur.). J. Wiley & Sons. | (3) | Briggs, G. G. (1981). Theoretical and experimental relationships between soil adsorption, octanol-water partition coefficient, water solubilities, bioconcentration factors, and the parachor. J.Agric. Food Chem. 29, 1050– 1059. | (4) | Chiou, C. T., Porter, P. E., in Schmedding, D. W. (1983). Partition equilibria of non-ionic organic compounds between soil organic matter and water. Environ. Sci. Technol. 17, 227–231. | (5) | Guth, J. A. (1983). Untersuchungen zum Verhalten von Pflanzenschutzmitteln im Boden. Bull. Bodenkundliche Gesellschaft Schweiz 7, 26–33. | (6) | US-Environmental Protection Agency (1982). Pesticide Assessment Guidelines, Subdivision N. Chemistry: Environmental Fate. | (7) | Agriculture Canada (1987). Environmental Chemistry and Fate Guidelines for registration of pesticides in Canada. | (8) | Priloga I k Direktivi Komisije 95/36/ES z dne 14. julija 1995 o spremembi Direktive Sveta 91/414/EGS o dajanju fitofarmacevtskih sredstev v promet, UL L 172, 22.7.1995, str. 8. | (9) | Dutch Commission for Registration of Pesticides (1991). Application for registration of a pesticide. Section G: Behaviour of the product and its metabolites in soil, water and air. | (10) | BBA (1986). Richtlinie für die amtliche Prüfung von Pflanzenschutzmitteln, Teil IV, 4–2. Versickerungsverhalten von Pflanzenschutzmitteln. | (11) | SETAC (1995). Procedures for Assessing the Environmental Fate and Ecotoxicity of Pesticides. Mark R. Lynch, ur. | (12) | OECD (1995). Final Report of the OECD Workshop on Selection of Soils/Sediments. Belgirate, Italija, 18.–20. januar 1995. | (13) | Naslednja poglavja te priloge: | | Poglavje A.4, Parni tlak, | | Poglavje A.6, Topnost v vodi, | | Poglavje A.8, Porazdelitveni koeficient, metoda stresanja bučke, | | Poglavje A.24, Porazdelitveni koeficient, metoda tekočinske kromatografije visoke ločljivosti (HPLC), | | Poglavje C.7, Razgradnja – Abiotska razgradnja: hidroliza kot funkcija pH, | | Poglavje C.18, Adsorpcija/desorpcija z uporabo metode šaržnih preskusov ravnotežja, | | Poglavje C.23, Aerobna in anaerobna transformacija v tleh. | (14) | Soil Texture Classification (US and FAO systems). Weed Science, 33, Suppl. 1 (1985) and Soil Sci. Soc. Amer. Proc. 26, 305 (1962). | (15) | Methods of Soil Analysis (1986). Part 1, Physical and Mineralogical Methods (A. Klute, ur.). Agronomy Series No. 9, druga izdaja. | (16) | Methods of Soil Analysis (1982). Part 2, Chemical and Microbiological Properties (A. L. Page, R. H. Miller in D. R. Kelney, ur.). Agronomy Series No. 9, druga izdaja. | (17) | ISO Standard Compendium Environment (1994). Soil Quality – General aspects; chemical and physical methods of analysis; biological methods of analysis. Prva izdaja. | (18) | Mückenhausen, E. (1975). Die Bodenkunde und ihre geologischen, geomorphologischen, mineralogischen und petrologischen Grundlagen. DLG-Verlag, Frankfurt na Majni. | (19) | Scheffer, F., in Schachtschabel, P. (1998). Lehrbuch der Bodenkunde. F. Enke Verlag, Stuttgart. | (20) | Weber, J. B., in Peeper, T. F. (1977). In Research Methods in Weed Science, druga izdaja (B. Truelove, ur.). Soc. Weed Sci., Auburn, Alabama, 73–78. | (21) | Weber, J. B., Swain, L. R., Strek, H. J., in Sartori, J. L. (1986). In Research Methods in Weed Science, tretja izdaja (N.D. Camper, ur.). Soc. Weed Sci., Champaign, IL, 190–200. | (22) | Oliveira idr. (1996). Packing of sands for the production of homogeneous porous media. Soil Sci. Soc. Amer. J. 60(1): 49–53. | (23) | Shackelford, C. D. (1991). Laboratory diffusion testing for waste disposal. – A review. J. Contam. Hydrol. 7, 177–217. | (24) | Hamaker, J. W. (1975). Interpretation of soil leaching experiments. V: Environmental Dynamics of Pesticides (R. Haque, V. H. Freed, ur.), 115– 133. Plenum Press, New York. | (25) | OECD (1981). Dissociation constants in water. OECD Guideline for Testing of Chemicals, No. 4112, OECD, Pariz. | Dodatek 1 | Opredelitev pojmov in enote | Starani ostanki tal : preskusna kemikalija in produkti transformacije, prisotni v tleh po vnosu in dovolj dolgem obdobju, ki omogoča procese prenosa, adsorpcije, metabolizma in disipacije za spremembo porazdelitve in osnovnih kemijskih značilnosti nekaterih uporabljenih kemikalij (1). | Umetni dež : raztopina 0,01 M CaCl2 v destilirani ali deionizirani vodi. | Povprečna razdalja izpiranja : dno dela tal, kjer je kumulativna izkoriščena kemikalija 50 % skupne izkoriščene preskusne kemikalije [poskus normalnega izpiranja] ali (dno dela tal, kjer je kumulativna izkoriščena kemikalija 50 % skupne izkoriščene preskusne kemikalije) – ((debelina staranih ostankov tal)/2) [študija izpiranja starih ostankov]. | Kemikalija : snov ali zmes. | Izcedna voda : vodna faza, ki kaplja skozi talni profil ali talno kolono (1). | Izpiranje : proces, s katerim se kemikalija premakne navzdol po talnem profilu ali talni koloni (1). | Razdalja izpiranja : najgloblji del tal, v katerem je bilo po procesu izpiranja najdenih ≥ 0,5 % uporabljene preskusne kemikalije ali starih ostankov (enakovredna globini penetracije). | Meja zaznavnosti (LOD) in meja določanja (LOQ) : meja zaznavnosti (LOD) je koncentracija kemikalije, pod katero identitete kemikalije ni mogoče razlikovati od analitičnih artefaktov. Meja določanja (LOQ) je koncentracija kemikalije, pod katero koncentracije ni mogoče določiti s sprejemljivo natančnostjo. | Faktor relativne mobilnosti (RMF) : (razdalja izpiranja preskusne kemikalije (cm))/(razdalja izpiranja referenčne kemikalije (cm)). | Preskusna kemikalija : vsaka snov ali zmes, preskušena z uporabo te preskusne metode. | Produkt transformacije : vse kemikalije, ki so posledica biotskih ali abiotskih transformacijskih reakcij preskusne kemikalije, vključno s CO2 in produkti, ki so vezani v ostankih. | Tla : mešanica mineralnih in organskih kemičnih sestavin, slednje vsebujejo spojine z visoko vsebnostjo ogljika in dušika in z veliko molsko maso, ki jih poseljujejo majhni (večinoma mikro-) organizmi. Tla se lahko obdelujejo v dveh stanjih: | — | v neoviranem, kakor so se razvila s časom, z značilnimi plastmi različnih vrst tal; | — | oviranem, kakor jih navadno najdemo na ornih zemljiščih ali kakor se pojavljajo, kadar se vzorci jemljejo s kopanjem in se uporablja ta preskusna metoda (2). | (1) | Holland, P. T. (1996). Glossary of Terms Relating to Pesticides. IUPAC Reports on Pesticide (36). Pure & Appl. Chem. 68, 1167–1193. | (2) | OECD Test Guideline 304 A: Inherent Biodegradability in Soil (sprejeto 12. maja 1981). | Dodatek 2 | Slika 1 | Primer nedeljivih kolon za izpiranje iz stekla | z dolžino 35 cm in notranjim premerom 5 cm (1) | ← Steklena kolona, napolnjena s preskusnimi tlemi (če se preskušajo fotolabilni produk-ti, je treba kolone oviti v aluminijasto folijo) | ← Čep iz steklene volne, ki zadržuje tla v koloni | ← Plast kremenovega peska | ← Stekleni sintrani disk za preprečevanje motenj površine tal in enakomerno razporeditev umetnega dežja | ← Liji kapalniki za dovajanje umetnega dežja | ← Bučka z okroglim dom za zbiranje izcedne vode; ovita v aluminijasto folijo, da se prepreči fotoliza | (1) | Drescher, N. (1985). Moderner Acker- und Pflanzenbau aus Sicht der Pflanzenschutzmittelindustrie. In Unser Boden – 70 Jahre Agrarforschung der BASF AG, 225–236. Verlag Wissenschaft und Politik, Köln. | Slika 2 | Primer deljive kovinske kolone z notranjim premerom 4 cm (1) | (1) | Burkhard, N., Eberle D. O., in Guth, J. A. (1975). Model systems for studying the environmental behaviour of pesticides. Environmental Quality and Safety, Suppl. Vol. III, 203–213. | Dodatek 3 | Primeri faktorjev relativne mobilnosti (*12) (RMF) za različne kemikalije za zaščito pridelka (1) (2) in ustrezni razredi mobilnosti (4) | Razpon RMF | Kemikalija (RMF) | Razred mobilnosti | ≤ 0,15 | paration (< 0,15), flurodifen (0,15) | I | nemobilen | 0,15–0,8 | profenofos (0,18), propikonazol (0.23), diazinon (0,28), diuron (0,38), terbutilazin (0,52), metidation (0,56), prometrin (0,59), propazin (0,64), alaklor (0,66), metolaklor (0,68) | II | nekoliko mobilen | 0,8–1,3 | monuron (*13) (1,00), atrazin (1,03), simazin (1,04), fluometuron (1,18) | III | zmerno mobilen | 1,3–2,5 | prometon (1,67), cianazin (1,85), bromacil (1,91), karbutilat (1,98) | IV | precej mobilen | 2,5–5,0 | karbofuran (3,00), dioksakarb (4,33) | V | mobilen | > 5,0 | monokrotofos (> 5,0), mikrotofos (> 5,0) | VI | zelo mobilen | (1) | Guth, J. A. (1985). Adsorption/desorption. V Joint International Symposium ‚Physicochemical Properties and their Role in Environmental Hazard Assessment.‘ Canterbury, Združeno kraljestvo, 1.–3. julij 1985. | (2) | Guth, J. A., in Hörmann, W. D. (1987). Problematik und Relevanz von Pflanzenschutzmittel-Spuren im Grund (Trink-) Wasser. Schr.Reihe Verein WaBoLu, 68, 91–106. | (3) | Harris, C. I. (1967). Movement of herbicides in soil. Weeds 15, 214–216. | (4) | Helling, C. S. (1971). Pesticide mobility in soils. Soil Sci. Soc. Am. Proc. 35, 743–748. | (5) | McCall, P. J., Laskowski, D. A., Swann, R. L., in Dishburger, H. J. (1981). Measurements of sorption coefficients of organic chemicals and their use in environmental fate analysis. In Test Protocols for Environmental Fate and Movement of Toxicants. Proceedings of AOAC Symposium, AOAC, Washington D.C. | (6) | Hollis, J. M. (1991). Mapping the vulnerability of aquifers and surface waters to pesticide contamination at the national/regional scale. BCPC Monograph No. 47 Pesticides in Soil and Water, 165–174. | C.45 OCENA EMISIJ IZ LESA, TRETIRANEGA S SREDSTVI ZA ZAŠČITO LESA, V OKOLJE: LABORATORIJSKA METODA ZA LESNE PROIZVODE, KI NISO PREKRITI IN SO V STIKU S SLADKO VODO ALI MORSKO VODO | UVOD | 1. | Ta preskusna metoda ustreza Smernici za preskušanje OECD (TG) 313 (2007). Emisije iz lesa, tretiranega s sredstvi za zaščito lesa, v okolje je treba kvantificirati, da se omogoči ocena okoljskega tveganja tretiranega lesa. Preskusna metoda opisuje laboratorijsko metodo za oceno emisij iz lesa, tretiranega s sredstvi za zaščito lesa, v dveh primerih, kjer bi lahko emisije vstopile v okolje: | — | emisije iz tretiranega lesa v stiku s sladko vodo. Emisije s površine tretiranega lesa bi lahko vstopile v vodo; | — | emisije iz tretiranega lesa v stiku z morsko vodo. Emisije s površine tretiranega lesa bi lahko vstopile v vodo. | 2. | Ta preskusna metoda je namenjena preskušanju emisij iz lesa in lesnih proizvodov, ki niso prekriti in so v stiku s sladko vodo ali morsko vodo. Razredi uporabe se uporabljajo mednarodno in kategorizirajo biološko nevarnost, ki ji bodo izpostavljeni tretirani proizvodi. Razredi uporabe opredeljujejo tudi razmere, v katerih se tretirani proizvodi uporabljajo, in določajo ekosisteme (zrak, voda, tla), ki bi lahko bili izpostavljeni tveganju zaradi lesa, tretiranega s sredstvi za zaščito lesa. | 3. | Preskusna metoda je laboratorijski postopek za odvzem vzorcev (emisatov) iz vode, ki se uporablja za potapljanje tretiranega lesa, v vedno večjih časovnih razmikih po izpostavljenosti. Količina emisij v emisatu je povezana s površino lesa in trajanjem izpostavljenosti, da se oceni pretok v mg/m2/dan. Zato se lahko oceni pretok (hitrost izpiranja) po vedno daljših obdobjih izpostavljenosti. | 4. | Količina emisij se lahko uporabi pri oceni okoljskega tveganja tretiranega lesa. | ZAČETNI POMISLEKI | 5. | Mehanizem izpiranja s sladko vodo na površini lesa se ne šteje za enakega vrsti in resnosti izpiranja s površine lesa z morsko vodo. Zato je za sredstva ali zmesi za zaščito lesa, ki se uporabljajo za tretiranje lesa, uporabljenega v okoljih z morsko vodo, potrebna študija izpiranja lesa z morsko vodo. | 6. | Les mora v primeru lesa, tretiranega s sredstvom za zaščito lesa, predstavljati komercialno uporabljen les. Tretirati ga je treba v skladu z navodili proizvajalca sredstva za zaščito lesa ter v skladu z ustreznimi standardi in specifikacijami. Pred začetkom preskusa je treba navesti parametre za kondicioniranje lesa po tretiranju. | 7. | Vzorci lesa, ki se uporabijo, morajo predstavljati uporabljene lesne proizvode (npr. glede vrste, gostote in drugih lastnosti). | 8. | Preskus se lahko uporablja za les s postopkom penetracije ali površinskega nanosa ali za tretiran les, ki je dodatno obvezno površinsko tretiran (npr. z barvo, ki se nanese kot zahteva za komercialno uporabo). | 9. | Za določanje količine, vsebnosti in vrste emisij iz lesa so pomembni sestava, količina, pH in agregatno stanje vode. | NAČELO PRESKUSNE METODE | 10. | Preskusni vzorci lesa, tretiranega s sredstvi za zaščito lesa, se potopijo v vodo. Voda (emisat) se odvzame in kemijsko analizira večkrat v obdobju izpostavljenosti, ki je dovolj dolgo za izvedbo statističnih izračunov. Na podlagi analitskih rezultatov se izračunajo ravni emisije v mg/m2/dan. Navesti je treba obdobja vzorčenja. Preskusi z netretiranimi vzorci se lahko prekinejo, če se v prvih treh podatkovnih točkah ne zazna naravno ozadje. | 11. | Vključitev netretiranih vzorcev lesa omogoča določitev ravni naravnega ozadja emisatov iz lesa, ki niso uporabljena sredstva za zaščito lesa. | MERILA KAKOVOSTI | Točnost | 12. | Točnost preskusne metode za oceno emisij je odvisna od preskusnih vzorcev, ki predstavljajo komercialno tretiran les, kako voda predstavlja dejansko vodo in kako režim izpostavljenosti predstavlja naravne pogoje. | 13. | Točnost, natančnost in ponovljivost analitske metode je treba določiti pred izvedbo preskusa. | Obnovljivost | 14. | Odvzamejo in analizirajo se trije vzorci vode, srednja vrednost pa se šteje za vrednost emisije. Obnovljivost rezultatov v enem laboratoriju in med različnimi laboratoriji je odvisna od režima potopitve in lesa, uporabljenega kot preskusni vzorec. | Sprejemljiv razpon rezultatov | 15. | Sprejemljiv je razpon rezultatov tega preskusa, kjer se zgornje in spodnje vrednosti razlikujejo za manj kot en red velikosti. | PRESKUSNI POGOJI | Voda | 16. | Scenariji izpiranja s sladko vodo: za uporabo v preskusu izpiranja, če se ocenjuje les, izpostavljen sladki vodi, se priporoča deionizirana voda (npr. ASTM D 1193, tip II). Temperatura vode mora biti 20 °C ± 2 °C, izmerjeni pH in temperaturo vode pa je treba vključiti v poročilo o preskusu. Analiza vzorcev uporabljene vode, odvzetih pred potopitvijo tretiranih vzorcev, omogoča oceno analiziranih kemikalij v vodi. To je kontrola za določitev ravni naravnega ozadja kemikalij, ki se nato kemijsko analizirajo. | 17. | Scenariji izpiranja z morsko vodo: za uporabo v preskusu izpiranja, če se ocenjuje les, izpostavljen morski vodi, se priporoča sintetična morska voda (npr. ASTM D 1141, nadomestna oceanska voda brez težkih kovin). Temperatura vode mora biti 20 °C ± 2 °C, izmerjeni pH in temperaturo vode pa je treba vključiti v poročilo o preskusu. Analiza vzorcev uporabljene vode, odvzetih pred potopitvijo tretiranih vzorcev, omogoča oceno analiziranih kemikalij v vodi. To je kontrola za analizo ravni naravnega ozadja pomembnih kemikalij. | Preskusni vzorci lesa | 18. | Vrste lesa morajo biti značilne za vrste lesa, uporabljene za preskušanje učinkovitosti sredstev za zaščito lesa. Priporočene vrste so Pinus sylvestris L. (rdeči bor), Pinus resinosa Ait. (ameriški rdeči bor) ali Pinus spp (južni bor). Z drugimi vrstami se lahko izvedejo dodatni preskusi. | 19. | Uporabiti je treba les s premim potekom aksialnih elementov brez grč. Izogibati se je treba materialu smolnatega videza. Les mora predstavljati les, ki je komercialno dostopen. Zabeležiti je treba vir, gostoto in število letnic na 10 mm. | 20. | Preskusni vzorci lesa naj bi bili v skladu z velikostjo blokov iz EN 113(mere 25 mm × 50 mm × 15 mm) v sklopih po pet, pri čemer so vzdolžni profili vzporedni z aksialnimi elementi, čeprav se lahko uporabijo tudi druge mere, kot je 50 mm × 150 mm × 10 mm. Preskusni vzorec je treba v celoti potopiti v vodo. Preskusni vzorci morajo zajemati 100 % beljave. Vsak vzorec se edinstveno označi, da se lahko identificira kadar koli med preskusom. | 21. | Vsi vzorci morajo biti skobljani ali žagani tangentno na letnice, površine pa ne smejo biti obrušene. | 22. | Za analizo se uporabi vsaj pet sklopov preskusnih vzorcev lesa: trije sklopi vzorcev se tretirajo s sredstvom za zaščito lesa, en sklop vzorcev je netretiran, en sklop vzorcev pa se uporabi za oceno odstotka vlage po sušenju preskusnih vzorcev pred tretiranjem. Pripravi se dovolj preskusnih vzorcev za izbiro treh sklopov vzorcev, ki so v obsegu 5 % srednje vrednosti retencij sredstva za zaščito lesa vseh preskusnih vzorcev. | 23. | Vsi preskusni vzorci so na prečnem prerezu lesa zaščiteni s kemikalijo, ki preprečuje penetracijo sredstva za zaščito lesa v prečni prerez lesa vzorcev ali preprečuje izpiranje iz vzorcev prek prečnega prereza. Ločevati je treba med vzorci, ki se uporabljajo za površinski nanos, in postopki penetracije za nanos tesnilnega sredstva za prečni prerez lesa. Tesnilno sredstvo za prečni prerez lesa je treba nanesti pred tretiranjem le v primeru površinskega nanosa. | 24. | Prečni prerez lesa mora biti prost za tretiranje s postopki penetracije. Zato je treba prečni prerez lesa vzorcev zaščititi na koncu obdobja kondicioniranja. Emisijo je treba oceniti le za vzdolžno površino. Tesnilna sredstva je treba pregledati in po potrebi ponovno nanesti pred začetkom izpiranja, pri čemer se jih ne sme ponovno nanesti, ko se je izpiranje že začelo. | Posoda za potopitev | 25. | Posoda je izdelana iz inertnega materiala in je dovolj velika, da lahko sprejme pet vzorcev lesa v skladu z EN 113 v 500 ml vode, pri čemer je razmerje med površino in prostornino vode 0,4 cm2/ml. | Oprema za preskusne vzorce | 26. | Preskuse vzorce podpira oprema, ki zagotavlja, da so vse izpostavljene površine vzorca v stiku z vodo. | POSTOPEK TRETIRANJA S SREDSTVOM ZA ZAŠČITO LESA | Priprava tretiranih preskusnih vzorcev | 27. | Preskusni vzorec lesa, ki ga je treba tretirati s sredstvom za zaščito lesa, ki se preskuša, se tretira po metodi, določeni za sredstvo za zaščito lesa, kar je lahko s postopkom tretiranja s penetriranjem ali postopkom površinskega nanosa, ki je lahko potopitev, zanašanje ali premazovanje. | Sredstva za zaščito lesa, ki se nanašajo s postopki tretiranja s penetracijo | 28. | Pripraviti je treba raztopino sredstva za zaščito lesa, ki bo zagotovila določeno absorpcijo ali retencijo, kadar se nanaša s postopki tretiranja s penetracijo. Izmerijo se teža in mere preskusnega vzorca lesa. Postopek tretiranja s penetracijo mora biti takšen, kot je določen za nanos sredstev za zaščito na les, ki se uporablja kot razred uporabe 4 ali 5. Vzorec se po tretiranju ponovno stehta, retencija sredstva za zaščito lesa (kg/m3) pa se izračuna po enačbi: | 29. | Opozoriti je treba, da se lahko v tem preskusu uporabi les, tretiran v industrijskem obratu za obdelavo (npr. z vakuumsko impregnacijo). Uporabljene postopke je treba zabeležiti, retencijo materiala, ki je bil tretiran po teh postopkih, pa je treba analizirati in zabeležiti. | Sredstva za zaščito lesa, ki se nanašajo s postopki površinskega nanosa | 30. | Postopki površinskega nanosa vključujejo potopitev, zanašanje ali premazovanje preskusnih vzorcev lesa. Postopek in stopnja nanosa (npr. litri/m2) morata biti takšna, kot je določeno za površinski nanos sredstva za zaščito lesa. | 31. | V tem primeru je treba tudi opozoriti, da se lahko v tem preskusu uporablja tudi les, tretiran v industrijskem obratu za obdelavo. Uporabljene postopke je treba zabeležiti, retencijo materiala, ki je bil tretiran po teh postopkih, pa je treba analizirati in zabeležiti. | Kondicioniranje preskusnih vzorcev po tretiranju | 32. | Tretirane preskusne vzorce je treba po tretiranju kondicionirati v skladu s priporočili dobavitelja preskusnega sredstva za zaščito glede na zahteve za označevanje sredstva za zaščito lesa ali kot v skladu s praksami komercialnega tretiranja ali v skladu s standardom EN 252. | Priprava in izbira preskusnih vzorcev | 33. | Po kondicioniranju po tretiranju se izračuna srednja retencija skupine preskusnih izračunov, za meritve izpiranja pa se naključno izberejo trije reprezentativni sklopi vzorcev z retencijo v razponu 5 % sredine skupine. | POSTOPEK ZA MERITVE EMISIJE SREDSTVA ZA ZAŠČITO LESA | Metoda potopitve | 34. | Preskusni vzorci se stehtajo in nato v celoti potopijo v vodo, pri čemer se zabeležita datum in čas. Posoda se prekrije, da se zmanjša izhlapevanje. | 35. | Voda se menjuje v naslednjih razmikih: 6 ur, 1 dan, 2 dni, 4 dni, 8 dni, 15 dni, 22 dni, 29 dni (opomba: to so skupni časi, ne časi razmikov). Zabeležiti je treba čas in datum menjave vode ter maso vode, odvzete in posode. | 36. | Po vsaki menjavi vode se vzorec vode, v kateri je bil potopljen sklop preskusnih vzorcev, zadrži za poznejšo kemijsko analizo. | 37. | Postopek vzorčenja omogoča izračun profila količine emisij v odvisnosti od časa. Vzorce je treba shraniti v pogojih, v katerih se analit ohrani, npr. v hladilniku v temi, da se zmanjša mikrobna rast v vzorcih pred analizo. | MERITVE EMISIJ | Tretirani vzorci | 38. | V odvzeti vodi se kemijsko analizirajo aktivna snov in/ali zadevni produkti razgradnje/transformacije, če je primerno. | Netretirani vzorci | 39. | Odvzem vode (emisata) v tem sistemu in poznejša analiza kemikalij, ki so bile izprane iz netretiranih vzorcev lesa, omogočata oceno mogoče ravni emisije sredstva za zaščito lesa iz netretiranega lesa. Odvzem in analiza emisata po podaljšanjih obdobjih izpostavljenosti omogočata oceno hitrosti spremembe ravni emisije glede na čas. Ta analiza je kontrolni postopek za določitev ravni naravnega ozadja preskusne kemikalije v netretiranem lesu za potrditev, da les, uporabljen kot vir vzorcev, ni bil predhodno tretiran s sredstvom za zaščito lesa. | PODATKI IN POROČANJE | Kemijske analize | 40. | Odvzeta voda se kemijsko analizira, pri čemer se rezultat analize vode izrazi v ustreznih enotah, npr. μg/l. | Sporočanje podatkov | 41. | Vsi rezultati se zabeležijo. V Dodatku sta navedena primer predlaganega obrazca za beleženje za en sklop tretiranih preskusnih vzorcev in zbirna tabela za izračun srednjih vrednosti emisije v posameznih razmikih vzorčenja. | 42. | Dnevni pretok emisije v mg/m2/dan se izračuna tako, da se sredina treh meritev pri treh ponovitvah deli s številom dni potopitve. | Poročilo o preskusu | 43. | V poročilo o preskusu je treba navesti vsaj naslednje informacije: | — | naziv dobavitelja sredstva za zaščito lesa, ki se preskuša, | — | določeno edinstveno ime ali oznako preskušanega sredstva za zaščito lesa, | — | trgovsko ali splošno ime aktivnih snovi z generičnim opisom dodatkov (npr. pomožno topilo, smola) in sestavo v % m/m sestavin, | — | zadevno retencijo ali obremenitev (v kg/m3 oziroma l/m2), določeno za les, ki se uporabi v stiku z vodo, | — | vrste uporabljenega lesa z gostoto in hitrostjo rasti v letnicah na 10 mm, | — | obremenitev ali retencijo preskušenega sredstva za zaščito lesa in enačbo, ki se uporabi za izračun retencije, izražene kot l/m2 ali kg/m3, | — | metodo nanosa sredstva za zaščito lesa, pri čemer se navede uporabljen časovni razpored za postopek penetracije, in metodo nanosa, če se je uporabilo površinsko tretiranje, | — | datum nanosa sredstva za zaščito lesa in oceno odstotka vlage v preskusnih vzorcih, izraženo v odstotkih, | — | uporabljene postopke kondicioniranja, pri čemer se navedejo tip, pogoji in trajanje, | — | specifikacijo tesnilnega sredstva za prečni prerez lesa in število nanosov, | — | specifikacijo vseh poznejših tretiranj lesa, npr. specifikacijo dobavitelja, vrsto, značilnosti in obremenitev barve, | — | čas in datum posamezne potopitve, količino vode, uporabljene za posamezno potopitev preskusnih vzorcev, in količino vode, ki jo med potopitvijo absorbira les, | — | vsa odstopanja od opisane metode in vse dejavnike, ki bi lahko vplivali na rezultate. | LITERATURA | (1) | Evropski standard EN 84:1997: Zaščitna sredstva za les – Pospešeno staranje zaščitenega lesa pred biološkim preskušanjem – Postopek izpiranja. | (2) | Evropski standard EN 113/A1:2004: Zaščitna sredstva za les – Preskusna metoda za ugotavljanje preventivne učinkovitosti zaščitnih sredstev proti glivam odprtotrosnicam – Ugotavljanje toksičnih vrednosti. | (3) | Evropski standard EN 252:1989: Terenska preskusna metoda za ugotavljanje relativne preventivne učinkovitosti zaščitnega sredstva za les v stiku z zemljo. | (4) | Evropski standard EN 335 – Del 1: 2006. Trajnost lesa in lesnih materialov – Definicije razredov uporabe – Del 1: Splošno. | (5) | American Society for Testing and Materials Standards, ASTM D 1141– 1998. Standard Practice for the Preparation of Substitute Ocean Water, Without Heavy Metals. Annual Book of ASTM Standards, zvezek 11.02. | (6) | American Society for Testing and Materials Standards, ASTM D 1193–77 Type II – 1983. Specifications for Reagent Water. Annual Book of ASTM Standards, zvezek 11.01. | Dodatek 1 | Obrazec za beleženje za preskusno metodo | Ocena emisij iz lesa, tretiranega s sredstvi za zaščito lesa, v okolje: laboratorijska metoda za lesne proizvode, ki niso prekriti in so v stiku s sladko vodo ali morsko vodo | Preskusni laboratorij | | Sredstvo za zaščito lesa | Dobavitelj zaščitnega sredstva za les | | Določeno edinstveno ime ali oznaka zaščitnega sredstva za les | | Trgovinsko ali splošno ime zaščitnega sredstva za les | | Dodatki | | Ustrezna retencija za les, ki se uporabi v stiku z vodo | | Nanos | Metoda nanosa | | Datum nanosa | | Enačba, uporabljena za izračun retencije: | | Postopek kondicioniranja | | Trajanje kondicioniranja | | Tesnilno sredstvo za prečni prerez lesa/število nanosov | | Poznejše tretiranje | če je primerno | Preskusni vzorci | Vrste lesa | | Gostota lesa | (minimum … srednja vrednost … maksimum) | Hitrost rasti (letnice na 10 mm) | (minimum … srednja vrednost … maksimum) | Odstotek vlage | | Obseg preskusa (*14) | Retencija (npr. kg/m3) | Tretiran ‚x‘ | srednja vrednost in standardni odklon ali razpon za 5 vzorcev | Tretiran ‚y‘ | srednja vrednost in standardni odklon ali razpon za 5 vzorcev | Tretiran ‚z‘ | srednja vrednost in standardni odklon ali razpon za 5 vzorcev | Netretiran | | Variacija parametrov preskusne metode | npr. kakovost vode, mere preskusnih vzorcev itd. | Čas | Menjava vode | Masa vzorca | Absorpcija vode | Vzorec vode | Tretiran (sredina) | Netretiran | Tretiran (sredina) | Netretiran | | Preskusna voda | x | y | z | | Datum | g | g | g | g | št. | pH | pH | pH | pH | začetek | | | | | | | | | | | | | | | | 6 ur | | | | | | 1 | | | | | 24 ur | | | | | | 2 | | | | | 2 dni | | | | | | 3 | | | | | 4 dni | | | | | | 4 | | | | | 8 dni | | | | | | 5 | | | | | 15 dni | | | | | | 6 | | | | | 22 dni | | | | | | 7 | | | | | 29 dni | | | | | | 8 | | | | | | | | Za vsako aktivno snov je treba pripraviti ločene tabele. | Čas | Menjava vode | Rezultati analize | Netretirani vzorci | Tretirani vzorci | Koncentracija aktivne sestavine v vodi | mg/l | Izpuščena količina | mg/m2 | Raven emisije | mg/m2/dan | Koncentracija aktivne sestavine v vodi | Izpuščena količina | Raven emisije | x | y | z | Sredina | x | y | z | Sredina | x | y | z | Sredina | | Datum | mg/l | mg/l | mg/l | mg/l | mg/m2 | mg/m2 | mg/m2 | mg/m2 | mg/m2/dan | mg/m2/dan | mg/m2/dan | mg/m2/dan | 6 ur | | | | | | | | | | | | | | | | | 24 ur | | | | | | | | | | | | | | | | | 2 dni | | | | | | | | | | | | | | | | | 4 dni | | | | | | | | | | | | | | | | | 8 dni | | | | | | | | | | | | | | | | | 15 dni | | | | | | | | | | | | | | | | | 22 dni | | | | | | | | | | | | | | | | | 29 dni | | | | | | | | | | | | | | | | | Opomba: Ker bi se lahko rezultati netretiranih vzorcev uporabili za popravljanje ravni emisije iz tretiranih vzorcev, morajo biti prvi rezultati netretiranih vzorcev, vse vrednosti tretiranih vzorcev pa so ‚popravljene vrednosti‘. Popravi se lahko tudi začetna analiza vode. | Dodatek 2 | Opredelitve | Kemikalija : snov ali zmes. | Preskusna kemikalija : vsaka snov ali zmes, preskušena z uporabo te preskusne metode. | C.46 BIOAKUMULACIJA V BENTOŠKIH MALOŠČETINCIH, KI ŽIVIJO V USEDLINAH | UVOD | 1. | Ta preskusna metoda ustreza Smernici za preskušanje OECD (TG) 315 (2008). Endobentoške živali, ki jedo usedline, so lahko izpostavljene snovem v usedlinah (1). Med navedenimi živalmi, ki jedo usedline, imajo vodni maloščetinci pomembno vlogo v tleh vodnih sistemov. Živijo v usedlinah in so pogosto najpogostejše vrste, zlasti v habitatih z okoljskimi razmerami, ki so škodljive za druge živali. Z bioturbacijo usedlin in kot plen lahko te živali močno vplivajo na biološko razpoložljivost takih snovi za druge organizme, npr. bentivore vrste rib. V nasprotju z epibentoškimi organizmi se endobentoški vodni maloščetinci zarijejo v usedlino in jedo delce usedlin pod njihovo površino. Zato so ti organizmi izpostavljeni snovem prek številnih načinov absorpcije, vključno z neposrednim stikom, zaužitjem onesnaženih delcev usedline, porno vodo in vodo nad usedlino. Nekatere vrste bentoških maloščetincev, ki se trenutno uporabljajo pri ekotoksikološkem preskušanju, so opisane v Dodatku 6. | 2. | Med parametri, ki so značilni za bioakumulacijo snovi, so zlasti bioakumulacijski faktor (BAF), konstanta hitrosti absorpcije usedline (ks) in konstanta hitrosti izločanja (ke). Podrobnejše opredelitve navedenih parametrov so navedene v Dodatku 1. | 3. | Za oceno bioakumulacijskega potenciala snovi na splošno in proučitev bioakumulacije snovi, ki bi se lahko porazdelile v usedlini ali na njej, je potrebna preskusna metoda za posamezna področja (1) (2) (3) (4). | 4. | Ta preskusna metoda je zasnovana za oceno bioakumulacije snovi v usedlinah v endobentoških črvih maloščetincih. Preskusna snov se primeša v usedlino. Uporaba usedline s primešano preskusno snovjo naj bi simulirala onesnaženo usedlino. | 5. | Ta metoda temelji na obstoječih preskusnih metodah za strupenost usedlin in bioakumulacijo (1) (4) (5) (6) (7) (8) (9). Drugi koristni dokumenti so: razprave in rezultati mednarodne delavnice (11) ter rezultat mednarodnega krožnega preskusa (12). | 6. | Ta preskus se uporablja za stabilne, nevtralne organske snovi, ki se lahko združijo z usedlinami. S to metodo se lahko meri tudi bioakumulacija stabilnih kovinoorganskih spojin v usedlini (12). Ne uporablja se za kovine in druge elemente v sledovih (11), če se načrt preskusa ne spremeni glede na prostornine substrata in vode ter po možnosti glede na velikost vzorca tkiva. | PREDPOGOJ IN INFORMACIJE O PRESKUSNI SNOVI | 7. | Obstaja le nekaj dobro uveljavljenih kvantitativnih razmerij med strukturo in aktivnostjo (QSAR) za procese bioakumulacije, ki so trenutno na voljo (14). Najpogosteje uporabljeno razmerje je korelacija med bioakumulacijo in biokoncentracijo stabilnih organskih snovi ter njihovo lipofilnostjo (izražena kot logaritem porazdelitvenega koeficienta oktanol/voda (log Kow); za opredelitev glej Dodatek 1), ki je bil razvit za opis porazdelitve snovi med vodo in ribe. Na podlagi tega razmerja so bile vzpostavljene tudi korelacije za področje usedlin (15) (16) (17) (18). Korelacija Kow-log BCF je lahko kot pomembnejše kvantitativno razmerje med strukturo in aktivnostjo koristno za prvo predhodno oceno bioakumulacijskega potenciala snovi v usedlinah. Vendar lahko na BAF vpliva vsebnost lipidov preskusnega organizma in vsebnost organskega ogljika v usedlini. Zato se lahko tudi porazdelitveni koeficient organski ogljik/voda (Koc) uporabi kot pomembnejša determinanta bioakumulacije organskih snovi v usedlini. | 8. | Ta preskus se uporablja za: | — | stabilne organske snovi z vrednostmi log Kow med 3,0 in 6,0 (5) (19) ter superlipofilne snovi, ki kažejo log Kow več kot 6,0 (5), | — | snovi, ki se uvrščajo v razred organskih snovi, znanih po svojem bioakumulacijskem potencialu v živih organizmih, npr. površinsko aktivne snovi ali zelo adsorpcijske snovi (npr. visok Koc). | 9. | Pred začetkom študije je treba pridobiti informacije o preskusni snovi, kot so varnostni ukrepi, ustrezni pogoji shranjevanja, stabilnost in analitske metode. Navodila za preskušanje snovi, ki jih je težko preskušati zaradi fizikalno-kemijskih lastnosti, so na voljo v (20) in (21). Pred izvajanjem preskusa bioakumulacije z vodnimi maloščetinci morajo biti znane naslednje informacije o preskusni snovi: | — | splošno ime, kemijsko ime (najbolje ime IUPAC), strukturna formula, registrska številka CAS, čistost, | — | topnost v vodi [preskusna metoda A.6 (22)], | — | porazdelitveni koeficient oktanol/voda, Kow [preskusni metodi A.8 in A.24 (22)], | — | porazdelitveni koeficient usedlina/voda, izražen kot Kd ali Koc [preskusna metoda C.19 (22)], | — | hidroliza [preskusna metoda C.7 (22)], | — | fototransformacija v vodi (23), | — | parni tlak [preskusna metoda A.4 (22)], | — | lahka biološka razgradljivost [preskusni metodi C.4 in C.29 (22)], | — | površinska napetost [preskusna metoda A.5 (22)], | — | kritična micelna koncentracija (24). | Poleg navedenega bi bile pomembne naslednje informacije, kadar so na voljo: | — | biološka razgradnja v vodnem okolju [preskusni metodi C.24 in C.25 (22)], | — | Henryjeva konstanta. | 10. | Radioaktivno označene preskusne snovi lahko pospešijo analizo vodnih vzorcev, vzorcev usedlin in bioloških vzorcev ter se lahko uporabijo pri odločitvi, ali je treba identificirati in kvantificirati produkte razgradnje. Opisana metoda je bila validirana z mednarodnim krožnim preskusom (12) za snovi z oznako 14C. Če se merijo skupni radioaktivni ostanki, bioakumulacijski faktor (BAF) temelji na matični snovi, vključno z vsemi ohranjenimi produkti razgradnje. Študija metabolizma se lahko združi tudi s študijo bioakumulacije z analizo in kvantifikacijo deleža matične snovi in njenih produktov razgradnje v vzorcih, odvzetih na koncu absorpcijske faze ali na vrhuncu bioakumulacije. V vsakem primeru je priporočljivo, da izračun BAF temelji na koncentraciji matične snovi v organizmih in ne le na skupnih radioaktivnih ostankih. | 11. | Informacije, ki se zahtevajo poleg lastnosti preskusne snovi, so strupenost za vrsto maloščetincev, ki se uporabi v preskusu, kot je srednja smrtna koncentracija (LC50) v času, potrebnem za absorpcijsko fazo, da se zagotovi, da so izbrane koncentracije izpostavljenosti veliko nižje od ravni strupenosti. Prednost je treba dati vrednostim strupenosti, ki izhajajo iz dolgotrajnih raziskav subletalnih končnih točk (EC50), če so na voljo. Če taki podatki niso na voljo, se lahko koristne informacije zagotovijo s preskusom akutne strupenosti v pogojih, ki so enaki pogojem za preskus bioakumulacije, ali podatki o strupenosti za druge nadomestne vrste. | 12. | Na voljo mora biti ustrezna analitska metoda znane točnosti, natančnosti in občutljivosti za kvantifikacijo snovi v preskusnih raztopinah, usedlinah in biološkem materialu, pa tudi podrobnosti o pripravi in shranjevanju vzorcev ter varnostni listi za snov. Prav tako morajo biti znane analitske meje zaznavnosti preskusne snovi v vodi, usedlini in črvjem tkivu. Če se uporabi radioaktivno označena preskusna snov, morajo biti znani tudi specifična radioaktivnost (tj. Bq mol– 1), položaj radioaktivno označenega atoma in odstotek radioaktivnosti, povezan z nečistočami. Specifična radioaktivnost preskusne snovi mora biti čim večja, da se zaznajo čim nižje preskusne koncentracije (11). | 13. | Na voljo morajo biti informacije o značilnostih usedline, ki se uporabi (npr. izvor usedline ali njenih sestavin, pH in koncentracija amoniaka v porni vodi (naravne usedline), vsebnost organskega ogljika (TOC), porazdelitev delcev glede na velikost (odstotek peska, mulja in gline) in odstotek suhe teže) (6). | NAČELO PRESKUSA | 14. | Preskus obsega dve fazi: fazo absorpcije (izpostavljenost) in fazo izločanja (po izpostavljenosti). V fazi absorpcije so črvi izpostavljeni usedlini, ki ji je primešana preskusna snov, ter prekriti z modelno razredčevalno vodo in uravnoteženi, kot je primerno (11). Kontrolna skupna črvov se nahaja v enakih pogojih brez preskusne snovi. | 15. | Za fazo izločanja se črvi prenesejo v sistem usedline in vode brez preskusne snovi. Faza izločanja je potrebna za zbiranje informacij o hitrosti, s katero preskusni organizmi izločajo preskusno snov (19) (25). Faza izločanja je potrebna vedno, razen če je bila absorpcija preskusne snovi v fazi izpostavljenosti nepomembna (npr. ni statistične razlike med koncentracijo preskusne snovi v preskusnih in kontrolnih črvih). Če v fazi absorpcije ni bilo doseženo stabilno stanje, se lahko kinetika – BAFk, konstanti hitrosti absorpcije in izločanja – določi z rezultati iz faze izločanja. Sprememba koncentracija preskusne snovi v črvih ali na njih se spremlja ves čas trajanja obeh faz preskusa. | 16. | V fazi absorpcije se meritve izvajajo, dokler BAF ne doseže ravnotežja ali stabilnega stanja. Faza absorpcije bi običajno morala trajati 28 dni. Praktične izkušnje kažejo, da je 12- do 14-dnevna faza absorpcije dovolj, da več stabilnih nevtralnih organskih snovi doseže stabilno stanje (6) (8) (9). | 17. | Če pa stabilno stanje ni doseženo v 28 dneh, se faza izločanja začne s prenosom izpostavljenih maloščetincev v posode, ki vsebujejo enak medij brez preskusne snovi. Faza izločanja se prekine, ko se doseže 10-odstotna raven koncentracije, izmerjene v črvih na 28. dan faze absorpcije, ali po največ 10 dneh. Raven ostankov v črvih na koncu faze izločanja se zabeleži kot dodatna končna točka, npr. kot neizločeni ostanki (NER). Najbolje je, da se bioakumulacijski faktor (BAFss) izračuna kot razmerje koncentracije v črvih (Ca) in v usedlini (Cs) pri očitnem stabilnem stanju ter kot kinetični bioakumulacijski faktor, BAFK, kot razmerje med konstanto hitrosti absorpcije iz usedline (ks) in konstanto hitrosti izločanja (ke) ob predpostavki kinetike prvega reda. Če stabilno stanje ni doseženo v 28 dneh, se BAFK izračuna iz konstante hitrosti absorpcije in konstante hitrosti izločanja. Za izračun glej Dodatek 2. Če se kinetika prvega reda ne upošteva, je treba uporabiti bolj zapletene modele (Dodatek 2 in vir (25)). | 18. | Če stabilno stanje ni doseženo v 28 dneh, se lahko faza absorpcije podaljša, pri čemer se skupine izpostavljenih črvov, če so na voljo, izpostavijo nadaljnjim meritvam, dokler ni doseženo stabilno stanje; vzporedno se mora kljub temu na 28. dan faze absorpcije začeti faza izločanja. | 19. | Konstanta hitrosti absorpcije, konstanta hitrosti izločanja (ali konstante pri uporabi zapletenejših modelov), kinetični bioakumulacijski faktor (BAFK), in kjer je mogoče, meje zaupanja za vse te parametre se izračunajo po računalniških modelnih enačbah (za modele glej Dodatek 2). Ustreznost prileganja modela je mogoče ugotoviti na podlagi korelacijskega koeficienta ali determinacijskega koeficienta (koeficienti blizu ena pomenijo dobro prileganje). | 20. | Za zmanjšanje variabilnosti rezultatov preskusa za organske snovi z visoko lipofilnostjo je treba izraziti tudi bioakumulacijske faktorje glede na vsebnost lipidov v preskusnih organizmih in vsebnost organskega ogljika (TOC) v usedlini (faktor akumulacije v organizmih glede na usedlino ali BSAF v kg TOC usedline kg– 1 vsebnosti lipidov v črvih). Ta pristop temelji na izkušnjah in teoretskih korelacijah za vodno področje, kjer za nekatere kemijske razrede velja jasna povezava med potencialom snovi za bioakumulacijo in njeno lipofilnostjo, ki je bila dobro uveljavljena za ribe kot modelne organizme (14) (25) (27). Obstaja tudi povezava med vsebnostjo lipidov v preskusnih ribah in zaznano bioakumulacijo takih snovi. Podobne korelacije so bile ugotovljene tudi pri bentoških organizmih (15) (16) (17) (18). Če je na voljo dovolj črvjega tkiva, se lahko vsebnost lipidov v preskusnih živalih določi z uporabo istega biološkega materiala kot za določanje koncentracije preskusne snovi. Vendar je praktično uporabiti aklimatizirane kontrolne živali vsaj na začetku ali bolje na koncu faze absorpcije za meritev vsebnosti lipidov, ki se lahko nato uporabi za normaliziranje vrednosti BAF. | VELJAVNOST PRESKUSA | 21. | Za veljavnost preskusa veljata naslednja pogoja: | — | Skupna smrtnost črvov (v kontrolah in tretiranih vzorcih) do konca preskusa ne sme preseči 20 % začetnega števila. | — | Dokazati je treba tudi, da se črvi zarijejo v usedlino, kar omogoča čim večjo izpostavljenost. Za podrobnosti glej odstavek 28. | OPIS METODE | Preskusne vrste | 22. | V preskusu se lahko uporabi več vrst vodnih maloščetincev. Najpogosteje uporabljene vrste so navedene v Dodatku 6. | 23. | Da se dokaže zdravstveno stanje preskusnih živali (1) (6), je treba preskuse strupenosti (96 ur, samo v vodi) izvajati v rednih časovnih razmikih (npr. vsak mesec) z referenčno strupeno snovjo, kot je kalijev klorid (KCl) ali bakrov sulfat (CuSO4) (1). Če se referenčni preskusi strupenosti ne izvajajo v rednih časovnih razmikih, je treba serijo organizmov, ki se uporabijo v preskusu bioakumulacije v usedlini, preveriti z referenčno strupeno snovjo. Z meritvijo vsebnosti lipidov se lahko zagotovijo tudi koristne informacije o stanju živali. | Gojenje preskusnih organizmov | 24. | Da se zagotovi zadostno število črvov za izvajanje preskusov bioakumulacije, bo morda treba črve gojiti v stalni laboratorijski kulturi za posamezno vrsto. Metode laboratorijskega gojenja za izbrane preskusne vrste so povzete v Dodatku 6. Za podrobnosti glej vire (8) (9) (10) (18) (28) (29) (30) (31) (32). | Oprema | 25. | Pri vseh delih opreme se je treba izogibati uporabi materialov, ki se lahko raztopijo, adsorbirajo preskusne snovi ali iz katerih se lahko izperejo druge snovi in ki škodljivo učinkujejo na preskusne živali. Uporabiti je mogoče standardne pravokotne ali valjaste komore iz kemijsko inertnega materiala in s primerno prostornino, ki ustrezajo stopnji obremenitve, tj. številu preskusnih črvov. Pri dodajanju vode ali zraka se je treba izogibati uporabi mehkih plastičnih epruvet. Za vso opremo, ki je v stiku s preskusnim medijem, je treba uporabiti politetrafluoroetilen, nerjavno jeklo in/ali steklo. Pri snoveh z visokimi adsorpcijskimi koeficienti, kot so sintetični piretroidi, bo morda potrebno silanizirano steklo. V teh primerih je treba opremo po uporabi zavreči (5). Pri radioaktivno označenih preskusnih snoveh in hlapnih snoveh je potrebno pazljivo ravnanje, da se preprečita odstranitev in uhajanje odstranjene preskusne snovi. Uporabiti je treba lovilnike (npr. steklene plinske izpiralke), ki vsebujejo ustrezne absorbente za zadrževanje morebitnih ostankov, ki izparijo iz preskusnih komor (11). | Voda | 26. | Kakovost vode nad usedlino mora biti taka, da preskusni vrsti omogoča preživetje ves čas trajanja aklimatizacije in preskušanja, ne da bi pokazala kakršen koli neobičajen videz ali obnašanje. Priporoča se, da se v preskusih in laboratorijskih kulturah črvov kot voda nad usedlino uporabi modelna razredčevalna voda v skladu s preskusno metodo C.1 (25). Dokazano je bilo, da lahko v tej vodi preživi, raste in se razmnožuje več vrst (8), pri čemer se zagotovi čim večja standardizacija preskusnih pogojev in pogojev gojenja. Vodo je treba opredeliti vsaj glede pH, prevodnosti in trdote. Analiza vode, kar zadeva mikro onesnaževala, pred uporabo bi morala dati koristne informacije (Dodatek 4). | 27. | Voda mora biti ves čas preskusa enake kakovosti. pH vode nad usedlino mora biti med 6 in 9. Skupna trdota mora biti na začetku preskusa med 90 in 400 mg CaCO3 na liter (7). Razponi za pH in trdoto v navedeni modelni razredčevalni vodi so navedeni v preskusni metodi C.1 (25). Če obstaja sum interakcije med ioni, ki povzročajo trdoto vode, in preskusno snovjo, je treba uporabiti vodo z manjšo trdoto. V Dodatku 4 so povzeta dodatna merila za sprejemljivo vodo za redčenje v skladu z OECD TG 210 (34). | Usedlina | 28. | Usedlina mora biti take kakovosti, ki omogoča preživetje in po možnosti razmnoževanje preskusnih organizmov med aklimatizacijo in preskušanjem, ne da bi bili pri tem videti nenormalno ali bi se nenormalno obnašali. Črvi se morajo zariti v usedlino. Obnašanje pri zarivanju lahko vpliva na izpostavljenost in zato za BAF. Zato je treba izogibanje usedlini ali obnašanje pri zarivanju zabeležiti, kadar motnost vode nad usedlino omogoča taka opazovanja. Črvi (v kontrolah in tretiranih vzorcih) se morajo v usedlino zariti v 24 urah po vnosu v preskusne posode. Če se ne zarijejo ali se opazi izogibanje usedlini (npr. več kot 20 % v več kot polovici faze absorpcije), to pomeni, da preskusni pogoji niso ustrezni, da preskusni organizmi niso zdravi ali da to obnašanje sproža koncentracija preskusne snovi. V takem primeru je treba preskus ustaviti in ponoviti v boljših pogojih. Dodatne informacije o zaužitju usedline se lahko dobijo z metodami, opisanimi v (35) (36), ki določajo zaužitje usedline ali izbiro delcev v preskusnih organizmih. Če je vsaj prisotnost iztrebkov ali njihova odsotnost na površini usedline opazna, kar kaže, da so črvi usedlino zaužili, jo je treba zabeležiti in obravnavati pri razlagi rezultatov preskusa glede na načine izpostavljenosti. | 29. | V preskusih in laboratorijskih kulturah črvov se priporoča uporaba umetne usedline, ki temelji na umetnih tleh, opisanih v preskusni metodi C.8 (40) (Dodatek 5), saj naravne usedline primerne kakovosti morda niso na voljo celo leto. Poleg tega lahko domorodni organizmi in možna prisotnost mikro onesnaževal v naravnih usedlinah vplivajo na preskus. V umetni usedlini lahko preživi, raste in se razmnožuje več vrst (8). | 30. | Umetno usedlino je treba opredeliti vsaj glede izvora sestavin, porazdelitve velikosti zrn (delež peska, mulja in gline) vsebnosti organskega ogljika (TOC), vsebnosti vode in pH. Meritev redoks potenciala je neobvezna. Vendar se lahko kot preskusne usedline in/ali usedline za gojenje uporabijo naravne usedline z neonesnaženih mest (1). Naravne usedline je treba opredeliti vsaj glede izvora (mesto odvzema), pH in amoniaka porne vode, vsebnosti organskega ogljika (TOC), porazdelitve delcev glede na velikost (delež peska, mulja in gline) ter deleža vsebnosti vode (6). Če se pričakuje razvoj amoniaka, se priporoča, da se naravna usedlina pred primešanjem preskusne snovi sedem dni kondicionira v enakih pogojih, kot vladajo v poznejšem preskusu. Na koncu tega obdobja kondicioniranja je treba vodo nad usedlino odstraniti in zavreči. Analiza usedline ali njenih sestavin, kar zadeva mikro onesnaževala, pred uporabo bi lahko dala koristne informacije. | Priprava | 31. | Ravnanje z naravnimi usedlinami pred uporabo v laboratoriju je opisano v (1) (6) (44). Priprava umetne usedline je opisana v Dodatku 5. | Shranjevanje | 32. | Naravne usedline je treba v laboratoriju shranjevati čim manj časa. Po priporočilu U.S. EPA (6) je najdaljše obdobje shranjevanja 8 tednov v temi pri 4 ± 2 °C. V posodah za shranjevanje nad usedlino ne sme biti prostora v zaprti posodi nad fazno mejo plin-kapljevina. Priporočila za shranjevanje umetne usedline so navedena v Dodatku 5. | Aplikacija preskusne snovi | 33. | Usedlini se primeša preskusna snov. Postopek primešanja preskusne snovi vključuje prekritje ene ali več sestavin usedline s preskusno snovjo. Na primer kremenov pesek ali del njega (npr. 10 g kremenovega peska na preskusno posodo) se lahko namoči z raztopino preskusne snovi v ustreznem topilu, ki nato počasi izhlapi do suhega stanja. Prekriti del se lahko nato vmeša v vlažno usedlino. Pri pripravi usedline je treba upoštevati količino peska, prinesenega z mešanico preskusne snovi in peska, tj. usedlino je torej treba pripraviti z manj peska (6). | 34. | Pri naravni usedlini se lahko preskusna snov doda s primešanjem preskusne snovi v suhi del usedline, kot je opisano zgoraj za umetno usedlino, ali z vmešanjem preskusne snovi v mokro usedlino, pri čemer nato vsa uporabljena sredstva za raztapljanje izhlapijo. Primerna topila za primešanje preskusne snovi v usedlino so etanol, metanol, etilen glikol monometil eter, etilen glikol dimetil eter, dimetilformamid in trietilen glikol (5) (34). Strupenost in hlapnost topila ter topnost preskusne snovi v izbranem topilu morajo biti glavna merila za izbiro primernega sredstva za raztapljanje. Dodatna navodila glede postopkov primešanja preskusne snovi so navedena v Environment Canada (1995) (41). Paziti je treba, da je preskusna snov, dodana usedlini, v njej temeljito in enakomerno razporejena. Ponovitvene podvzorce usedline s primešano preskusno snovjo je treba analizirati, da se preveri koncentracija preskusne snovi v usedlini in da se določi stopnja homogenosti razporeditve preskusne snovi. | 35. | Ko je usedlina s primešano preskusno snovjo in vodo nad usedlino pripravljena, je zaželeno, da se omogoči porazdelitev preskusne snovi med usedlino in vodno fazo. To je po možnosti treba storiti v temperaturnih in prezračevalnih pogojih, ki bodo uporabljeni v preskusu. Ustrezen čas za uravnoteženje je odvisen od usedline in snovi, lahko pa traja od več ur do več dni in v redkih primerih do več tednov (4 do 5 tednov) (28) (42). V tem preskusu se na uravnoteženje ne čaka, ampak se za to priporoča obdobje od 48 ur do 7 dni. Odvisno od namena študije, npr. kdaj je treba posnemati okoljske razmere, se lahko usedlina s primešano preskusno snovjo uravnoteži ali stara dlje (11). | IZVEDBA PRESKUSA | Predhodni preskus | 36. | Da se izboljšajo preskusni pogoji končno veljavnega preskusa, npr. izbira koncentracije preskusnih snovi, trajanje faze absorpcije in izločanja, bi bilo koristno izvesti predhodni poskus. Med predhodnim preskusom je treba opazovati in zabeležiti obnašanje črvov, na primer izogibanje usedlini, tj. kadar črvi pobegnejo iz usedline, kar bi lahko povzročila preskusna snov in/ali sama usedlina. Izogibanje usedlini se lahko uporabi tudi kot subletalni parameter v predhodnem preskusu za oceno koncentracij preskusne snovi, ki se uporabijo v preskusu bioakumulacije. | Pogoji izpostavljenosti | Trajanje faze absorpcije | 37. | Preskusni organizmi so preskusni snovi izpostavljeni v fazi absorpcije. Prvi vzorec je treba odvzeti od 4 do 24 ur po začetku faze absorpcije. Fazo absorpcije je treba izvajati največ 28 dni (1) (6) (11), razen če se lahko dokaže, da je bilo ravnovesje doseženo že prej. Stabilno stanje je doseženo, ko: (i) je grafični prikaz bioakumulacijskih faktorjev v vseh obdobjih vzorčenja v odvisnosti od časa vzporeden s časovno osjo, (ii) se tri zaporedne analize BAF na vzorcih, odvzetih v razmiku najmanj dveh dni, druga od druge ne razlikujejo za več kot 20 % in (iii) ni statistično značilnih razlik med tremi obdobji vzorčenja (na podlagi statističnih primerjav, npr. analize variance in regresijske analize). Če stabilno stanje ni doseženo v 28 dneh, se lahko faza absorpcije konča z začetkom faze izločanja, pri čemer se lahko BAFK izračuna iz konstant hitrosti absorpcije in izločanja (glej tudi odstavke 16 do 18). | Trajanje faze izločanja | 38. | Prvi vzorec je treba odvzeti od 4 do 24 ur po začetku faze izločanja, ker se lahko v začetnem obdobju pojavijo hitre spremembe v ostankih tkiva. Prekinitev faze izločanja se priporoča, če je koncentracija preskusne snovi nižja od 10 % koncentracije v stabilnem stanju ali po najdaljšem trajanju, tj. 10 dneh. Raven ostankov v črvih na koncu faze izločanja se sporoči kot sekundarna končna točka. Na to obdobje pa lahko vendarle vpliva obdobje, v katerem koncentracija preskusne snovi v črvih ostaja nad analitsko mejo zaznavnosti. | Preskusni organizmi | Število preskusnih črvov | 39. | Število črvov na vzorec mora zagotavljati takšno maso črvjega tkiva, da je masa preskusne snovi na vzorec na začetku faze absorpcije oziroma na koncu faze izločanja znatno večja od meje zaznavnosti preskusne snovi v biološkem materialu. V navedenih delih faze absorpcije in faze izločanja je koncentracija v preskusnih živalih običajno razmeroma nizka (6) (8) (18). Ker je teža posameznih živali v več vrstah vodnih maloščetincev zelo majhna (5– 10 mg mokre teže na posamezno žival pri Lumbriculus variegatus in Tubifex tubifex), se lahko črvi zadevne ponovitvene preskusne komore združijo za tehtanje in analizo preskusne kemikalije. Pri preskusnih vrstah z večjo težo posameznih živali (npr. Branchiura sowerbyi) se lahko uporabijo ponovitve, ki vsebujejo en osebek, vendar je treba v takih primerih število ponovitev povečati za pet za vsako točko vzorčenja (11) Opozoriti pa je treba, da vrsta B. sowerbyi ni bila vključena v krožni preskus (12), zato se ne priporoča kot prednostna vrsta v preskusu. | 40. | Uporabiti je treba črve podobne velikosti (za L. variegatus glej Dodatek 6). Prihajati morajo iz istega vira in biti odrasle ali velike živali istega starostnega razreda (glej Dodatek 6). Teža in starost živali bi lahko znatno vplivali na vrednosti BAF (npr. zaradi različne vsebnosti lipidov in/ali prisotnosti jajc); te parametre je treba točno zabeležiti. Za meritev srednje mokre in suhe teže je treba pred začetkom preskusa stehtati suho težo podvzorca. | 41. | Pri Tubifex tubifex in Lumbriculus variegatus se v obdobju preskušanja pričakuje razmnoževanje. Odsotnost razmnoževanja v preskusu bioakumulacije je treba zabeležiti in upoštevati pri razlagi rezultatov preskusa. | Obremenitev | 42. | Uporabiti je treba visoka razmerja med usedlino in črvi ter vodo in črvi, da se čim bolj zmanjša koncentracija preskusne snovi v usedlini med fazo absorpcije in preprečijo zmanjševanja koncentracije raztopljenega kisika. Izbrana stopnja obremenitve mora ustrezati tudi naravnim gostotam populacije izbrane vrste (43). Za Tubifex tubifex se priporoča na primer stopnja obremenitve 1–4 mg črvjega tkiva (mokra teža) na gram mokre usedline (8) (11). V virih (1) in (6) se za L. variegatus priporoča stopnja obremenitve ≤ 1 g suhe teže črvjega tkiva na 50 g organskega ogljika v usedlini. | 43. | Črvi, ki se bodo uporabili v preskusu, se odstranijo iz kulture s presejanjem usedline za kulturo. Živali (odrasli ali veliki črvi brez znakov nedavne fragmentacije) se prenesejo v steklene posode (npr. petrijevke), ki vsebujejo čisto vodo. Če se preskusni pogoji razlikujejo od pogojev gojenja, mora biti dovolj 24-urna faza aklimatizacije. Pred tehtanjem se iz črvov odstrani odvečna voda. To se lahko izvede s previdnim prenosom črvov na predhodno navlaženo papirnato brisačo. Za sušenje črvov se ne priporoča uporaba absorpcijskega papirja, saj bi ta lahko povzročil stres pri črvih ali jih poškodoval. Brunson in drugi (1998) priporočajo uporabo 1,33-kratne količine neosušenih črvov glede na ciljno biomaso. Teh dodatnih 33 % ustreza razliki med osušenimi in neosušenimi črvi (28). | 44. | Na začetku faze absorpcije (dan 0 preskusa) se preskusni organizmi odstranijo iz komore za aklimatizacijo in naključno razporedijo v posode (npr. petrijevke), ki vsebujejo modelno razredčevalno vodo, tako da se v vsako posodo dodajajo skupine dveh črvov, dokler ni v vsaki posodi deset črvov. Vsaka od teh skupin črvov se lahko naključno prenese v ločene preskusne posode, npr. z mehkimi kleščami iz plavljenega jekla. Preskusne posode se nato inkubirajo v preskusnih pogojih. | Hranjenje | 45. | Ker je vsebnosti hranilnih snovi v umetni usedlini majhna, je treba usedlino izboljšati z virom hrane. Da se izpostavljenost preskusnih organizmov ne bi podcenila, npr. s selektivnim hranjenjem z neonesnaženo hrano, je treba usedlini pred vnosom preskusne snovi dodati hrano, ki je potrebna za razmnoževanje in rast preskusnih organizmov (glej Dodatek 5). | Razmerje med usedlino in vodo | 46. | Priporočeno razmerje med usedlino in vodo je 1: 4 (45). To razmerje se šteje za primerno za ohranjanje koncentracij kisika na ustreznih ravneh in preprečevanje kopičenja amoniaka v vodi na usedlino. Vsebnost kisika v vodi nad usedlino je treba ohranjati pri nasičenosti ≥ 40 %. Vodo nad usedlino je treba nežno prezračevati (npr. 2–4 mehurčki na sekundo) s pasteurjevo pipeto, nastavljene približno 2 cm nad površino usedline, da se čim bolj zmanjšajo motnje usedline. | Svetloba in temperatura | 47. | Obdobje osvetljenosti v kulturi in preskusu traja 16 ur (1) (6). Jakost svetlobe na območju preskusa mora biti približno 500 – 1 000 luksov. Temperatura mora biti ves čas preskusa 20 ± 2 °C. | Preskusne koncentracije | 48. | Za določanje kinetike absorpcije se uporabi ena koncentracija (čim nižja), vendar se lahko uporabi tudi druga (višja) koncentracija (npr. (46)). V tem primeru se vzorci odvzamejo in analizirajo v stabilnem stanju ali po 28 dneh, da se potrdi BAF, izmerjen pri nižji koncentraciji (11). Višjo koncentracijo je treba izbrati, da se izključijo škodljivi učinki (npr. z izbiro približno 1 % najnižje znane kronične učinkovite koncentracije ECx, kot je izpeljana iz zadevnih študij kronične strupenosti). Nižje preskusne koncentracije morajo biti znatno višje od meje zaznavnosti v vzorcih usedline in bioloških vzorcih z uporabljeno analitsko metodo. Če je učinkovita koncentracija preskusne snovi blizu analitski meji zaznavnosti, se priporoča uporaba radioaktivno označene preskusne snovi z visoko specifično radioaktivnostjo. | Tretirane in kontrolne ponovitve | 49. | Najmanjše število tretiranih ponovitev za kinetične meritve mora biti tri na točko vzorčenja (11) v celotni fazi absorpcije in izločanja. Dodatne ponovitve je treba uporabiti npr. za neobvezne dodatne datume vzorčenja. Za fazo izločanja se pripravi ujemajoče se število ponovitev z usedlino brez primešane preskusne snovi v vodi nad usedlino, da se lahko tretirani črvi na koncu faze absorpcije prenesejo iz določenih tretiranih posod v netretirane posode. Skupno število tretiranih ponovitev mora biti zadostno za fazo absorpcije in fazo izločanja. | 50. | Namesto tega se lahko črvi, namenjeni vzorčenju v fazi izločanja, izpostavijo v veliki posodi, ki vsebuje usedlino s primešano preskusno snovjo iste serije, kot je bila uporabljena za kinetiko absorpcije. Dokazati je treba, da so preskusni pogoji (npr. debelina usedline, razmerje med usedlino in vodo, obremenitev, temperatura, kakovost vode) primerljivi s ponovitvami, namenjenimi za fazo absorpcije. Na koncu faze absorpcije je treba iz te posode za analizo odvzeti vzorce vode, usedline in črvov, zadostno število velikih črvov, ki ne kažejo znakov nedavne fragmentacije pa je treba previdno odstraniti in prenesti v ponovitve, pripravljene za fazo izločanja (npr. deset organizmov na ponovitveno posodo). | 51. | Če se poleg vode ne uporabi nobeno drugo topilo, je treba za biološko analizo in analizo naravnega ozadja zagotoviti vsaj 9 ponovitev negativne kontrole (vsaj 3 vzorci na začetku, 3 na koncu absorpcije in 3 na koncu izločanja). Če se za nanos preskusne snovi uporabi sredstvo za raztapljanje, je treba izvesti kontrolo s topilom (na začetku je treba vzorčiti vsaj 3 ponovitve, 3 na koncu faze absorpcije in 3 na koncu faze izločanja). V tem primeru je treba za vzorčenje na koncu faze absorpcije zagotoviti vsaj 4 ponovitve negativne kontrole (brez topila). Te ponovitve je mogoče biološko primerjati s kontrolo s topilom, da se pridobijo informacije o morebitnem vplivu topila na preskusne organizme. Podrobnosti so navedene v Dodatku 3. | Pogostost meritev kakovosti vode | 52. | V fazi absorpcije in izločanja je treba v vodi nad usedlino izmeriti vsaj naslednje parametre kakovosti vode: | Temperatura | v eni posodi vsake stopnje tretiranja na datum vzorčenja in v eni kontrolni posodi enkrat na teden ter na začetku in koncu obdobja absorpcije in izločanja; zabeleži se lahko tudi temperatura v okoliškem mediju (zrak prostora ali vodna kopel) ali v eni reprezentativni preskusni posodi, npr. ves čas ali v urnih razmikih, | Vsebnost raztopljenega kisika | v eni posodi vsake stopnje tretiranja in v eni kontrolni posodi na datum vzorčenja; izrazi se v mg/L in % ASV (vrednost nasičenosti zraka), | Dovod zraka | nadzoruje se vsaj enkrat na dan (delavniki) in po potrebi prilagodi, | pH | v eni tretirani posodi vsake stopnje tretiranja na datum vzorčenja in v eni kontrolni posodi enkrat na teden ter na začetku in koncu obdobja absorpcije in izločanja, | Skupna trdota vode | vsaj v eni tretirani posodi in eni kontrolni preskusni posodi na začetku in koncu obdobja absorpcije in izločanja, izražena v mg/l CaCO3, | Skupna vsebnost amoniaka | vsaj v eni tretirani posodi in eni kontrolni preskusni posodi na začetku in koncu obdobja absorpcije in izločanja; izražena v mg/l NH4 + ali NH3 ali skupnega amonijskega dušika. | Vzorčenje in analiza črvov, usedline in vode | Časovni razpored vzorčenja | 53. | Primeri časovnih razporedov vzorčenja za 28-dnevno fazo absorpcije in 10-dnevno fazo izločanja so navedeni v Dodatku 3. | 54. | Vzorci vode in usedline se odvzamejo iz preskusnih komor za določitev koncentracije preskusne snovi pred vnosom črvov ter v fazah absorpcije in izločanja. Med preskusom se koncentracije preskusne snovi določijo v črvih, usedlini in vodi, da se spremlja razporeditev preskusne snovi v delih preskusnega sistema. | 55. | V fazi absorpcije in v fazi izločanja se črvi, usedlina in voda vzorčijo vsaj šestkrat. | 56. | Vzorčenje se nadaljuje, dokler se ne doseže ravnotežje (stabilno stanje) (glej Dodatek 1) ali 28 dni. Če se ravnotežje ne doseže v 28 dneh, naj se začne faza izločanja. Ko se začne faza izločanja, se določeni črvi prenesejo v ponovitvene komore, ki vsebujejo netretirano usedlino in vodo (glej odstavka 17 in 18). | Vzorčenje in priprava vzorcev | 57. | Vzorci vode se pridobijo z odlivanjem, izsesavanjem ali pipetiranjem prostornine, ki zadostuje za meritev količine preskuse snovi v vzorcu. | 58. | Preostala voda nad usedlino se previdno odlije ali izsesa iz preskusnih komor. Vzorce usedline je treba odvzeti previdno, da se črvi čim manj motijo. | 59. | V času vzorčenja se vsi črvi odstranijo iz ponovitve preskusa, npr. s suspendiranjem usedline z vodo nad usedlino in porazdelitvijo vsebine posameznih ponovitev na plitev pladenj ter pobiranjem črvov s prijemalkami iz plavljenega jekla. Na plitvem steklenem ali jeklenem pladnju se hitro sperejo z vodo. Odvečna voda se odstrani. Črvi se previdno prenesejo v predhodno stehtano posodo in stehtajo. Črvi se žrtvujejo z zamrzovanjem (npr. ≤ – 18 °C). Zabeležiti je treba prisotnost in število kokonov in/ali mladičev. | 60. | Na splošno je treba črve stehtati in žrtvovati takoj po vzorčenju brez faze čiščenja prebavil, da se pridobi konzervativen BAF, ki vključuje vsebino onesnaženih prebavil in preprečijo izgube telesnih ostankov v katerem koli obdobju čiščenja prebavil izključno v vodi (8). Pričakuje se, da se snovi z log Kow nad 5 v obdobju čiščenja prebavil izključno v vodi ne bodo znatno izločevale, medtem ko bi se lahko snovi z log Kow, nižjim od 4, lahko izgubile v znatnih količinah (47). | 61. | V fazi izločanja črvi čistijo svoja prebavila v čisto usedlino. To pomeni, da meritve, izvedene neposredno pred fazo izločanja, vključujejo usedlino prebavil, medtem ko se šteje, da se po prvih 4–24 urah faze izločanja večina vsebnosti onesnaženih prebavil nadomesti s čisto usedlino (11) (47). Koncentracija v črvih iz tega vzorca se lahko nato šteje za koncentracijo tkiva po čiščenju prebavil. Da bi upoštevali razredčenje koncentracije preskusne snovi z neonesnaženo usedlino v fazi izločanja, je mogoče oceniti težo vsebnosti prebavil iz razmerja med mokro težo črvov in težo pepela črvov ali razmerja med suho težo črvov in težo pepela črvov. | 62. | Če je namen specifične študije merjenje biološke razpoložljivosti in dejanskih ostankov tkiva v preskusnih organizmih, je treba stehtati, 6 ur čistiti v čisti vodi (47) in pred analizo ponovno stehtati vsaj podvzorec tretiranih živali (npr. iz treh dodatnih ponovitvenih posod), po možnosti vzorčenih v stabilnem stanju. Podatki o teži črvov in telesni koncentraciji tega podvzorca se lahko nato primerjajo z vrednostmi, pridobljenimi iz neočiščenih črvov. Črvi, namenjeni meritvi izločanja, se ne smejo čistiti pred prenosom v čisto usedlino, da se čim bolj zmanjša dodatni stres za živali. | 63. | Zaželeno je, da se vzorci vode, usedline in črvov analizirajo takoj (tj. 1–2 dni) po odstranitvi, da se prepreči razgradnja ali druge izgube ter da se v teku preskusa izračunata približni hitrosti absorpcije in izločanja. S takojšnjo analizo se izognemo tudi zamudam pri ugotavljanju, kdaj je bilo doseženo ravnotežje. | 64. | Če se analiza ne izvede takoj, je treba vzorce shraniti v ustreznih pogojih. Pred začetkom študije se pridobijo informacije o stabilnosti in ustreznih pogojih shranjevanja za določeno preskusno snov (npr. trajanje in temperatura shranjevanja, postopki ekstrakcije itd.). Če take informacije niso na voljo in se oceni, da so nujne, se lahko za določitev stabilnosti pri shranjevanju hkrati izvedejo kontrole tkiv s primešano preskusno snovjo. | Kakovost analitske metode | 65. | Ker je za celoten postopek pomembna točnost, natančnost in občutljivost analitske metode, uporabljene za preskusno snov, je treba praktično preveriti, da sta natančnost in obnovljivost kemijske analize, kakor tudi rekuperacija preskusne snovi iz vzorcev vode, usedline in črvov, zadovoljivi za določeno metodo. Zagotoviti je treba tudi, da se preskusna snov v kontrolnih komorah ne zazna v koncentracijah, ki so višje od naravnega ozadja. Po potrebi se vrednosti Cw, Cs in Ca popravijo za rekuperacije in vrednosti naravnega ozadja kontrol. Med celotnim preskusom je treba vse vzorce obravnavati tako, da se čim bolj zmanjšata onesnaženje in izguba (npr. zaradi adsorpcije preskusne snovi na napravi za vzorčenje). | 66. | Zabeležiti in sporočiti je treba skupno rekuperacijo in rekuperacijo preskusne snovi v črvih, usedlini, vodi in lovilnikih, če se uporabijo, ki vsebujejo absorbente za zadrževanje izhlapele preskusne snovi. | 67. | Ker se priporoča uporaba radioaktivno označenih snovi, je mogoče analizirati skupno radioaktivnosti (npr. matičnih snovi in produktov razgradnje). Če pa je analitsko izvedljivo, lahko kvantifikacija matične snovi in produktov razgradnje v stabilnem stanju ali na koncu faze absorpcije zagotovi pomembne informacije. Če se take meritve nameravajo izvesti, je treba vzorce izpostaviti ustreznim postopkom ekstrakcije, da se lahko matična snov ločeno kvantificira. Kadar zaznani produkt razgradnje predstavlja znaten delež (npr. > 10 %) radioaktivnosti, izmerjene v preskusnih organizmih v stabilnem stanju ali na koncu faze absorpcije, se priporoča identifikacija takih produktov razgradnje (5). | 68. | Zaradi nizke biomase osebkov pogosto ni mogoče določiti koncentracije preskusne snovi v posameznih črvih, razen če se kot preskusna vrsta uporabi Branchiura sowerbyi (40–50 mg mokre teže na črva) (11). Zato je združevanje osebkov, vzorčenih iz dane preskusne posode, sprejemljivo, vendar omejuje statistične postopke, ki se lahko uporabijo za podatke. Če sta določen statistični postopek in moč pomembna faktorja, je treba v preskus vključiti ustrezno število preskusnih živali in/ali ponovitvenih preskusnih komor, da se prilagodi zaželenemu združevanju, postopku in moči. | 69. | Priporoča se, da se BAF izrazi kot funkcija skupne mokre teže, skupne suhe teže ter po potrebi (npr. pri zelo lipofilnih snoveh) kot funkcija vsebnosti lipida in vsebnosti organskega ogljika usedline. Za določanje vsebnosti lipida je treba uporabiti ustrezne metode (48) (49). Kot standardna metoda (48) se lahko priporoči tehnika z ekstrakcijo kloroforma/metanola (50). Da bi se izognili uporabi kloriranih topil, pa se lahko uporabi prilagojena krožno preskušena metoda Bligha in Dyerja (50), kot je opisana v (51). Ker različne metode ne dajo enakih vrednosti (48), je pomembno navesti podrobnosti o uporabljeni metodi. Kadar je to mogoče, tj. če je na voljo dovolj črvjega tkiva, se vsebnost lipidov izmeri na istem vzorcu ali ekstraktu, kot je bil pripravljen za analizo preskusne snovi, ker je treba lipide pogosto odstraniti iz ekstrakta, preden se analizira s kromatografijo (5). Vendar je praktično uporabiti aklimatizirane kontrolne živali vsaj na začetku ali bolje na koncu faze absorpcije za meritev vsebnosti lipidov, npr. v treh vzorcih. | PODATKI IN POROČANJE | Obdelava rezultatov | 70. | Krivulja absorpcije preskusne snovi se dobi z grafičnim prikazom koncentracije preskusne snovi v črvih ali na njih v fazi absorpcije v odvisnosti od časa na aritmetični lestvici. Če je krivulja dosegla ravnotežje, se izračuna BAFss v stabilnem stanju: | 71. | Kinetični bioakumulacijski faktor (BAFK) se določi kot razmerje med ks in ke. Konstanta izločanja (ke) se običajno določi na podlagi krivulje izločanja (tj. grafičnega prikaza koncentracije preskusne snovi v črvih v fazi izločanja). Konstanta hitrosti absorpcije ne nato izračuna na podlagi kinetike krivulje absorpcije. Za izračun BAFK ter konstant hitrosti ks in ke je najbolje uporabiti računalniške metode za ocenjevanje nelinearnih parametrov (glej Dodatek 2). Če izločanje očitno ni prvega reda, je treba uporabiti kompleksnejše modele (25) (27) (52). | 72. | Faktor akumulacije v organizmih glede na usedlino (BSAF) se določi z normalizacijo BAFK za vsebnost lipidov v črvih in skupno vsebnost organskega ogljika v usedlini. | Razlaga rezultatov | 73. | Rezultate je treba razlagati previdno, kadar se izmerjene koncentracije preskusnih koncentracij pojavljajo na ravneh blizu meje zaznavnosti uporabljene analitske metode. | 74. | Jasno določeni krivulji absorpcije in izločanja sta pokazateljici kakovostnih podatkov o bioakumulaciji. Meje zaupanja za vrednosti BAF na podlagi dobro zasnovanih študij na splošno ne smejo presegati 25 % (5). | Poročilo o preskusu | 75. | Poročilo o preskusu mora vsebovati naslednje informacije: | | Preskusna snov | — | fizikalno stanje in fizikalno-kemijske lastnosti, npr. log Kow, topnost v vodi, | — | kemijske identifikacijske podatke; vir preskusne snovi, identiteto in koncentracijo vseh uporabljenih topil, | — | če gre za radioaktivno označeno snov, točen položaj radioaktivnih atomov, specifično radioaktivnost in odstotek radioaktivnosti, združene z nečistočami. | | Preskusne vrste | — | znanstveno ime, sev, vir, morebitno predhodno tretiranje, aklimatizacijo, starost, red velikosti itd. | | Preskusni pogoji | — | uporabljeni preskusni postopek (npr. statični, polstatični ali pretočni), | — | vrsto in značilnosti uporabljene osvetljenosti in obdobja osvetljenosti, | — | načrt preskusa (npr. število, material in velikost preskusnih komor, prostornina vode, masa in prostornina usedline,stopnja nadomeščene vodne prostornine (za pretočne ali polstatične postopke), vsako prezračevanje pred preskusom in med njim, število ponovitev, število črvov na ponovitev, število preskusnih koncentracij, trajanje faz absorpcije in izločanja, pogostost vzorčenja), | — | metodo priprave preskusne snovi in dodajanja preskusne snovi ter razloge za izbiro metode, | — | nominalne preskusne koncentracije, | — | vir sestavin umetne vode in usedline ali, če se uporabijo naravni mediji, vir vode in usedline, opis vsakega predhodnega tretiranja, rezultate vseh dokazovanj sposobnosti preskusnih živali za življenje in/ali razmnoževanje v uporabljenih medijih, značilnosti usedline (pH, amoniak v porni vodi (naravne usedline) vsebnost organskega ogljika (TOC), porazdelitev delcev glede na velikost (delež peska, mulja in gline), delež vsebnosti vode in vse druge izvedene meritve) ter značilnosti vode (pH, trdota, prevodnost, temperatura, koncentracija raztopljenega kisika, koncentracija sledi klora (če so bile merjene) in vse druge izvedene meritve), | — | nominalno in izmerjeno suho težo v % mokre teže (ali razmerje med suho težo in mokro težo) umetne usedline, izmerjeno suho težo v % mokre teže (ali razmerje med suho težo in mokro težo) za naravne usedline, | — | kakovost vode v preskusnih komorah, kot jo določajo temperatura, pH, amoniak, skupna trdota in koncentracija raztopljenega kisika, | — | podrobne informacije o tretiranju vzorcev vode, usedline in črvov, vključno s podrobnostmi o pripravi, shranjevanju, postopkih primešanja preskusne snovi, ekstrakciji in analitskih postopkih (in natančnosti) za preskusno snov ter o vsebnosti lipidov in rekuperaciji preskusne snovi. | | Rezultati | — | smrtnost kontrolnih črvov in črvov v posamezni preskusni komori ter vse zaznane subletalne učinke, vključno z nenormalnim obnašanjem (npr. izogibanje usedlini, prisotnost ali odsotnost iztrebkov, odsotnost razmnoževanja), | — | izmerjeno suho težo v % mokre teže (ali razmerje med suho težo in mokro težo) usedline in preskusnih organizmov (koristno za normalizacijo), | — | vsebnost lipidov v črvih, | — | krivulje, ki prikazujejo kinetiko absorpcije in izločanja preskusne snovi pri črvih ter čas do vzpostavitve stabilnega stanja, | — | Ca, Cs in Cw (s standardnim odklonom in razponom, če je primerno) za vse čase vzorčenja (Ca izražen v g kg– 1 mokre in suhe teže celega telesa, Cs izražen v g kg– 1 mokre in suhe teže usedline in Cw v mg l– 1). Če je potreben faktor akumulacije v organizmih glede na usedlino (BSAF, za opredelitev glej Dodatek 1) (npr. za primerjavo rezultatov dveh ali več preskusov, opravljenih z živalmi z različno vsebnostjo lipidov), je treba Ca dodatno izraziti v g kg– 1 vsebnosti lipidov v organizmu, Cs pa je treba izraziti v g kg– 1 organskega ogljika (OC) v usedlini, | — | BAF (izražen v kg mokre usedline kg– 1 mokrih črvov), konstanto hitrosti absorpcije usedline ks (izražen v g mokre usedline kg– 1 mokrih črvov d– 1) in konstanto hitrosti izločanja ke (izražena v d– 1); dodatno se lahko sporoči BSAF (izražen v kg organskega ogljika v usedlini kg– 1 vsebnosti lipidov v črvih), | — | neizločene ostanke (NER) na koncu faze izločanja, | — | če se izmerijo: deleže matične snovi, produktov razgradnje in vezanih ostankov (tj. delež preskusne snovi, ki ga ni mogoče ekstrahirati z običajnimi metodami ekstrakcije), zaznane v preskusnih živalih, | — | metode, uporabljene za statistične analize podatkov. | | Vrednotenje rezultatov | — | skladnost rezultatov z merili za veljavnost, navedenimi v odstavku 21, | — | nepričakovane ali nenavadne rezultate, npr. nepopolno izločanje preskusne snovi iz preskusnih živali; v takih primerih se lahko koristne informacije zagotovijo na podlagi predhodnih študij. | Dodatek 1 | Opredelitve in enote | Umetna usedlina ali formulirana ali rekonstituirana ali sintetična usedlina je zmes snovi, uporabljenih za posnemanje fizičnih sestavin naravne usedline. | Bioakumulacija je povečanje koncentracije preskusne snovi v organizmu ali na njem glede na koncentracijo preskusne snovi v okoliškem mediju. Izhaja iz procesov biokoncentracije in biomagnifikacije (glej v nadaljevanju). | Bioakumulacijski faktor (BAF) kadar koli med fazo absorpcije tega preskusa bioakumulacije je koncentracija preskusne snovi v preskusnem organizmu ali na njem (Ca v g kg– 1 mokre ali suhe teže), deljena s koncentracijo snovi v okoliškem mediju (Cs kot g kg– 1 mokre ali suhe teže usedline). Za sklicevanje na enoti Ca in Cs ima BAF enoto kg usedline kg– 1 črvov (15). | Bioakumulacijski faktorji, izračunani neposredno iz razmerja med konstanto hitrosti absorpcije usedline, ki se deli s konstanto hitrosti izločanja (ks oziroma ke, glej v nadaljevanju), se imenujejo kinetični bioakumulacijski faktor (BAFK). | Biokoncentracija je povečanje koncentracije preskusne snovi v organizmu ali na njem izključno zaradi absorpcije prek telesne površine, ki je odvisno od koncentracije preskusne snovi v okoliškem mediju. | Biomagnifikacija je povečanje koncentracije preskusne snovi v organizmu ali na njem predvsem zaradi absorpcije iz onesnažene hrane ali plena, ki je odvisno od koncentracije preskusne snovi v hrani ali plenu. Biomagnifikacija lahko vodi do prenosa ali kopičenja preskusne snovi v prehranjevalnem spletu. | Faktor akumulacije v organizmih glede na usedlino (BSAF) je na lipide normalizirana koncentracija preskusne snovi v/na preskusnem organizmu v stabilnem stanju, deljena s koncentracijo snovi v usedlini v stabilnem stanju, normalizirano na organski ogljik. Ca se nato izrazi v g kg– 1 vsebnosti lipidov v organizmu, Cs pa v g kg– 1 vsebnosti organskih snovi usedline. | Obdobje kondicioniranja se uporablja za stabilizacijo mikrobne komponente usedline in za odstranitev npr. amoniaka, ki izhaja iz sestavin usedline; poteka pred primešanjem preskusne snovi v usedlino. Voda nad usedlino se po kondicioniranju običajno zavrže. | Izločanje preskusne snovi je odstranitev te snovi iz tkiva preskusnega organizma z aktivnimi ali pasivnimi procesi, ki se pojavijo neodvisno od prisotnosti ali odsotnosti preskusne snovi v okoliškem mediju. | Faza izločanja je čas po prenosu preskusnih organizmov iz onesnaženega medija v medij brez preskusne snovi, v kateri se proučuje izločanje (ali neto izguba) snovi iz preskusnih organizmov. | Konstanta hitrosti izločanja (ke) je numerična vrednost, ki opredeljuje stopnjo znižanja koncentracije preskusne snovi v/na preskusnih organizmih po prenosu preskusnih organizmov iz medija s preskusno snovjo v medij brez kemikalije; ke se izrazi v d– 1. | Obdobje za uravnoteženje se uporablja za porazdelitev preskusne snovi med trdno fazo, porno vodo in vodo nad usedlino; poteka po primešanju preskusne snovi v usedlino in pred vnosom preskusnih organizmov. | Porazdelitveni koeficient oktanol/voda (Kow) je uravnoteženo razmerje topnosti snovi v n-oktanolu in vodi, včasih izraženo tudi kot Pow. Logaritem Kow (log Kow) se uporablja kot kazalnik potenciala kemikalije za bioakumulacijo. | Porazdelitveni koeficient organski ogljik/voda (Koc) je uravnoteženo razmerje med koncentracijo snovi v/na delu usedline z organskim ogljikom in koncentracijo snovi v vodi. | Voda nad usedlino je voda nad usedlino v preskusni posodi. | Ravnotežje ali stabilno stanje je opredeljeno kot ravnotežje med procesoma absorpcije in izločanja, ki potekata hkrati v fazi izpostavljenosti. Stabilno stanje je v grafičnem prikazu BAF v odvisnosti od časa v vsakem obdobju vzorčenja doseženo, ko krivulja postane vzporedna s časovno osjo in se tri zaporedne analize BAF na vzorcih, odvzetih v razmiku najmanj dveh dni, druga od druge ne razlikuje za več kot 20 % ter ni statistično značilnih razlik med tremi obdobji vzorčenja. Za preskusne snovi, ki se počasi absorbirajo, so primernejši sedemdnevni razmiki (5). | Porna voda ali intersticijska voda je voda, ki zavzema prostor med delci usedline ali tal. | Konstanta hitrosti absorpcije usedline (ks) je numerična vrednost, ki opredeljuje stopnjo povišanja koncentracije preskusne snovi v/na preskusnem organizmu zaradi absorpcije iz faze usedline. ks se izrazi v g usedline kg– 1 črvov d– 1. | Usedlina s primešano preskusno snovjo je usedlina, ki ji je bila dodana preskusna snov. | Bioakumulacijski faktor stabilnega stanja (BAFss) je BAF v stabilnem stanju in se ne spreminja znatno v daljšem časovnem obdobju, saj je koncentracija preskusne snovi v okoliškem mediju (Cs v g·kg– 1 mokre ali suhe teže usedline) v tem obdobju konstantna. | Faza absorpcije ali izpostavitve je čas, v katerem so preskusni organizmi izpostavljeni preskusni snovi. | Dodatek 2 | Izračun parametrov absorpcije in izločanja | Glavni cilj preskusa bioakumulacije je določitev bioakumulacijskega faktorja BAF. Izmerjeni BAF se lahko izračuna tako, da se koncentracija preskusne snovi v preskusnem organizmu, Ca, deli s koncentracijo preskusne snovi v usedlini, Cs, v stabilnem stanju. Če se stabilno stanje v fazi absorpcije ne doseže, se BAF izračuna enako kot za 28. dan. Vendar je treba navesti, ali BAF temelji na koncentracijah v stabilnem stanju ali ne. | Za izračun kinetičnega bioakumulacijskega faktorja (BAFK), konstante hitrosti absorpcije usedline (ks) in konstante hitrosti izločanja (ke) je najbolje uporabiti računalniške metode za ocenjevanje nelinearnih parametrov. Glede na časovne vrste povprečnih akumulacijskih faktorjev (Ca, srednje vrednosti vseh datumov vzorčenja/Cs, srednje vrednosti vseh datumov vzorčenja = AF) faze absorpcije na podlagi mokre teže črvov in usedline ter modelne enačbe | AF(t) = BAF × (1 – eke × t) | [enačba 1] | pri čemer je AF(t) razmerje med koncentracijo preskusne snovi v črvih in njene koncentracije v usedlini ob kateri koli dani časovni točki (t) faze absorpcije, ti računalniški programi izračunajo vrednosti za BAFK, ks in ke. | Ko se v fazi absorpcije doseže stabilno stanje (tj. t = ∞), se lahko enačba 1 poenostavi na | [enačba 2] | pri čemer je | ks | = | konstanta hitrosti absorpcije v tkivu [g usedline kg– 1 črvov d– 1], | ke | = | konstanta hitrosti izločanja [d– 1]. | Nato je ks/ke × Cs pristop za ugotavljanje koncentracije preskusne snovi v črvjem tkivu v stabilnem stanju (Ca,ss). | Faktor akumulacije v organizmih glede na usedlino (BSAF) je treba izračunati na naslednji način: | pri čemer je foc del organskega ogljika v usedlini in flip del lipidov v črvih, pri čemer oba temeljita na suhi teži ali mokri teži. | Glede na časovne vrste koncentracijskih vrednosti se lahko kinetika izločanja modelira z naslednjimi modelnimi enačbami in računalniškim izračunom na podlagi metode za ocenjevanje nelinearnih parametrov. | Srednji izmerjeni telesni ostanki na koncu faze absorpcije se priporočajo kot privzeta začetna točka. Vrednost, modelirana/ocenjena na podlagi faze absorpcije, se lahko uporabi le, če npr. izmerjena vrednost znatno odstopa od modeliranih telesnih ostankov. Za alternativno predhodno izpostavljenost črvov, namenjenih za izločanje, glej tudi odstavek 50; pri tem pristopu se šteje, da vzorci teh predhodno izpostavljenih črvov na dan 0 faze izločanja zagotavljajo realne telesne ostanke za začetek kinetike izločanja. | Če podatkovne točke, grafično prikazane v odvisnosti od časa, kažejo konstantno eksponentno padanje koncentracije preskusne snovi v živalih, je mogoče za opis časovnega poteka izločanja uporabiti enodelni model (enačba 4). | [enačba 3] | Procesi izločanja so včasih videti dvofazni, pri čemer v zgodnjih fazah Ca hitro upada, kar se v poznejših fazah izločanja spremeni v počasnejšo izgubo preskusnih snovi (8) (19) (25). Ti dve fazi je mogoče razložiti s predpostavko, da sta v organizmu dva različna dela, iz katerih se preskusna snov izloča z različno hitrostjo. V takih primerih je treba proučiti posebne vire (15) (16) (17) (25). | Dvodelno izločanje se opiše npr. z naslednjo enačbo (25): | [enačba 4] | A in B predstavljata velikost delov (v odstotku skupnih ostankov tkiva), pri čemer je A del s hitrim izločanjem snovi in B del s počasnih izločanjem preskusne snovi. Vsota A in B je 100 % celotne prostornine dela živali v stabilnem stanju. ka in kb predstavljata ustrezni konstanti izločanja [d– 1]. Če je dvodelni model prilagojen podatkom o očiščenju, se lahko konstanta hitrosti absorpcije ks določi, kot sledi (53) (54): | [enačba 5] | Kljub temu je treba te modelne enačbe uporabljati previdno, zlasti kadar se med preskusom spremeni biološka razpoložljivost preskusne snovi (42). | Namesto z zgoraj opisanimi modelnimi enačbami se lahko kinetika (ks in ke) izračuna tudi naenkrat z modelom kinetike prvega reda za vse podatke iz faz absorpcije in izločanja skupaj. Opis metode, ki lahko omogoča tak združeni izračun konstant hitrosti absorpcije in izločanja, je naveden v virih (55), (56) in (57). | Neizločene ostanke (NER) je treba izračunati kot sekundarno končno točko, tako da se razmerje med povprečno koncentracijo v črvih (Ca) na 10. dan faze izločanja in povprečno koncentracijo v črvih (Ca) v stabilnem stanju (28. dan faze absorpcije) pomnoži s 100: | Dodatek 3 | Primer časovnega razporeda vzorčenja za 28-dnevni preskus bioakumulacije | (a) Faza absorpcije (vključno s 4-dnevno fazo uravnoteženja) | Dan | Dejavnosti | – 6 | priprava šotne suspenzije za usedlino; 48-urno kondicioniranje suspenzije | – 4 | primešanje preskusne snovi v usedlino ali del usedline; mešanje vseh sestavin usedline; odstranitev vzorcev usedline iz tretiranih vzorcev in usedline iz kontrole s topilom za določitev koncentracije preskusne snovi; dodajanje vode nad usedlino; inkubacija pri preskusnih pogojih (faza uravnoteženja) | – 3/– 2 | ločitev preskusnih organizmov od kulture za aklimatizacijo | 0 | meritev kakovosti vode (glej odstavek 52); odstranjevanje ponovitev za odvzem vzorcev vode in usedline za določitev koncentracije preskusne snovi; naključna razporeditev črvov v preskusne komore, zadržanje dovolj podvzorcev črvov za določitev analitskih vrednosti naravnega ozadja; nadzor dovajanja zraka, če se uporabi zaprti preskusni sistem | 1 | odstranitev ponovitev za vzorčenje, nadzor dovajanja zraka, obnašanja črvov in kakovosti vode (glej odstavek 56), odvzem vzorcev vode, usedline in črvov za določitev koncentracije preskusne snovi | 2 | nadzor dovajanja zraka, obnašanja črvov in temperature | 3 | enako kot 1. dan | 4–6 | enako kot 2. dan | 7 | enako kot 1. dan; po potrebi nadomestitev izhlapele vode | 8–13 | enako kot 2. dan | 14 | enako kot 1. dan; po potrebi nadomestitev izhlapele vode | 15–20 | enako kot 2. dan | 21 | enako kot 1. dan; po potrebi nadomestitev izhlapele vode | 22–27 | enako kot 2. dan | 28 | enako kot 1. dan; meritev kakovosti vode (glej odstavek 52); konec faze absorpcije, zadržanje dovolj podvzorcev črvov za določitev analitskih vrednosti naravnega ozadja, mokre in suhe teže ter vsebnosti lipidov; prenos črvov iz preostalih izpostavljenih ponovitev v posode s čisto usedlino za fazo izločanja (brez čiščenja prebavil; vzorčenje vode, usedline in črvov iz kontrol s topilom; vzorčenje raztopin za lovljenje, če so bile uporabljene | | Dejavnosti pred izpostavljenostjo (faza uravnoteženja) je treba časovno načrtovati ob upoštevanju lastnosti preskusne snovi. Če je potrebno, 7-dnevno kondicioniranje pripravljene usedline v vodi nad usedlino pri 20 ± 2 °C; v tem primeru zgodnja priprava usedline! | | Dejavnosti, opisane za 2. dan, je treba izvajati vsak dan (vsaj ob delavnikih). | (b) Faza izločanja | Dan | Dejavnosti | – 6 | priprava šotne suspenzije za usedlino; 48-urno kondicioniranje suspenzije | – 4 | premešanje vseh sestavin usedline; odstranitev vzorcev usedline iz tretiranih vzorcev in usedline iz kontrole s topilom za določitev koncentracije preskusne snovi; dodajanje vode nad usedlino; inkubacija pri preskusnih pogojih | 0 (28. dan faze absorpcije) | meritev kakovosti vode (glej odstavek 52); prenos črvov in preostalih izpostavljenih ponovitev v posode s čisto usedlino; po 4–6 urah odstranitev ponovitev za odvzem vzorcev vode, usedline in črvov za določitev koncentracije preskusne snovi, naključna razporeditev črvov v preskusne komore | 1 | odstranitev ponovitev za vzorčenje, nadzor dovajanja zraka, obnašanja črvov in kakovosti vode (glej odstavek 52), odvzem vzorcev vode, usedline in črvov za določitev koncentracije preskusne snovi | 2 | nadzor dovajanja zraka, obnašanja črvov in temperature | 3 | enako kot 1. dan | 4 | enako kot 2. dan | 5 | enako kot 1. dan | 6 | enako kot 2. dan | 7 | enako kot 1. dan; po potrebi nadomestitev izhlapele vode | 8–9 | enako kot 2. dan | 10 | enako kot 1. dan; konec faze izločanja; meritev kakovosti vode (glej odstotek 52), vzorčenje vode, usedline in črvov iz kontrol s topilom; vzorčenje raztopin za lovljenje, če so bile uporabljene | | Usedlino pred začetkom faze izločanja je treba pripraviti enako kot pred fazo absorpcije. | | Dejavnosti, opisane za 2. dan, je treba izvajati vsak dan (vsaj ob delavnikih). | Dodatek 4 | Nekatere fizikalno-kemijske lastnosti sprejemljive vode za redčenje | SESTAVINA | KONCENTRACIJE | delci | < 20 mg/l | skupni organski ogljik | < 2 μg/l | neionizirani amoniak | < 1 μg/l | ostanek klora | < 10 μg/l | skupni organofosforni pesticidi | < 50 ng/l | skupni organoklorni pesticidi in poliklorirani bifenili | < 50 ng/l | skupni organski klor | < 25 ng/l | SESTAVA PRIPOROČENE MODELNE RAZREDČEVALNE VODE | (a) | Raztopina kalcijevega klorida | V deionizirani vodi se raztopi 11,76 g CaCl2 2H2O; deionizirana voda se dolije do 1 litra. | (b) | Raztopina magnezijevega sulfata | V deionizirani vodi se raztopi 4,93 g MgSO4 7H2O; deionizirana voda se dolije do 1 litra. | (c) | Raztopina natrijevega bikarbonata | V deionizirani vodi se raztopi 2,59 g NaHCO3; deionizirana voda se dolije do 1 litra. | (d) | Raztopina kalijevega klorida | V deionizirani vodi se raztopi 0,23 g KCl; deionizirana voda se dolije do 1 litra. | Vse kemikalije morajo biti analitsko čiste. | Prevodnost destilirane ali deionizirane vode ne sme preseči 10 μScm– 1. | Zmeša se 25 ml vsake raztopine od (a) do (d), deionizirana voda pa se dolije do skupne prostornine 1 l. Vsota kalcijevih in magnezijevih ionov v tej raztopini je 2,5 mmol/l. | Razmerje ionov Ca in Mg je 4: 1 ter ionov Na in K 10: 1. Kislinska zmogljivost KS4,3 te raztopine je 0,8 mmol/l. | Voda za redčenje se prezračuje, dokler se ne doseže nasičenost s kisikom, nato se za približno dva dni shrani brez dodatnega prezračevanja pred uporabo. | pH sprejemljive vode za redčenje mora biti v razponu 6–9. | Dodatek 5 | Umetna usedlina – priporočila za pripravo in shranjevanje | V nasprotju z zahtevami iz preskusne metode C.8 (40) je priporočena vsebnost šote v umetni usedlini 2 % namesto 10 % suhe teže, da ustreza nizki do zmerni vsebnosti organskih snovi naravnih usedlin (58). | Delež suhih sestavin umetne usedline: | Sestavina | Značilnosti | % suhe usedline | šota | šotni mah, stopnja razgradnje: ‚srednja‘, sušen na zraku, brez vidnih ostankov rastlin, fino drobljen (velikost delcev ≤ 0,5 mm) | 2 ± 0,5 | kremenov pesek | velikost zrn: ≤ 2 mm, vendar mora biti > 50 % delcev v razponu 50–200 μm | 76 | kaolinska glina | vsebnost kaolinita ≥ 30 % | 22 ± 1 | vir hrane | Folia urticae, listje Urtica sp. (velika kopriva) v prahu, fino mleto (velikost delcev ≤ 0,5 mm), ali zmes listja Urtica sp. v prahu z alfa celulozo (1: 1); v skladu s farmacevtskimi standardi, za prehrano ljudi; poleg suhe usedline | 0,4–0,5 % | kalcijev karbonat | CaCO3, zdrobljen v prah, kemijsko čist, poleg suhe usedline | 0,05–1 | deionizirana voda | prevodnost ≤ 10 μS/cm, poleg suhe usedline | 30–50 | Če se pričakujejo višje koncentracije amoniaka, npr. če je znano, da preskusna koncentracija zavira nitrifikacijo, bo morda koristno 50 % koprive v prahu nadomestiti s celulozo (npr. s kemijsko čistim prahom α-celuloze z velikostjo delcev ≤ 0,5 mm). | Priprava | Šota se posuši na zraku in zmelje v fin prah (velikost delcev ≤ 0,5 mm, ni vidnih ostankov rastlin). Suspenzija potrebne količine šote v prahu se pripravi z delom deionizirane vode, ki se doda suhi usedlini (za nastanek šotnega molja, ki ga je mogoče mešati, se je kot koristna prostornina vode izkazala 11,5-kratna suha teža šote (8)) s pomočjo visoko zmogljive naprave za homogenizacijo. | pH te suspenzije se s CaCO3 uravna na 5,5 ± 0,5. Suspenzija se vsaj dva dni kondicionira z rahlim mešanjem pri 20 ± 2 °C, da se stabilizira pH in vzpostavi stabilna mikrobna komponenta. pH se znova izmeri in po potrebi s CaCO3 uravna na 6,0 ± 0,5. Nato se vsa suspenzija umeša z drugimi suhimi sestavinami, pri čemer se upoštevajo vsi deli, uporabljeni za primešanje preskusne snovi. Preostala deionizirana voda se doda, da se dobi homogena usedlina. pH se znova izmeri in po potrebi s CaCO3 uravna na 6,5 do 7,5. Če pa se pričakuje razvoj amoniaka, je lahko koristno ohraniti pH usedline pod 7,0 (npr. med 6,0 in 6,5). Odvzamejo se vzorci usedline, da se določita suha teža in vsebnost organskega ogljika. Če se pričakuje razvoj amoniaka, se lahko umetna usedlina 7 dni kondicionira v enakih pogojih, kot vladajo v poznejšem preskusu (npr. razmerje med usedlino in vodo je 1: 4, višina plasti usedline kot v preskusnih posodah), preden se ji primeša preskusna snov, tj. prekriti jo je treba z vodo, ki mora biti prezračevana. Na koncu obdobja kondicioniranja je treba vodo nad usedlino odstraniti in zavreči. Odvzamejo se vzorci usedline, da se določita suha teža in skupna vsebnost organskega ogljika (npr. 3 vzorci). | Nato se kremenov pesek s primešano preskusno snovjo zmeša z usedlino za vsako stopnjo tretiranja, usedlina se razporedi v ponovitvene preskusne posode in prekrije s preskusno vodo (npr. razmerje med usedlino in vodo je 1: 4, višina plasti usedline v ko preskusnih posodah). Posode se nato inkubirajo v enakih pogojih kot vladajo v poznejšem preskusu. Tukaj se začne obdobje za uravnoteženje. Vodo nad usedlino je treba prezračevati. | Izbrani vir hrane je treba dodati pred primešanjem preskusne snovi v usedlino ali med njim. Na začetku se lahko zmeša s šotno suspenzijo (glej zgoraj). Čezmerna razgradnja vira hrane pred vnosom preskusnih organizmov, npr. v primeru dolgega obdobja za uravnoteženje, se lahko prepreči z ohranjanjem čim krajšega časa med dodajanjem hrane in začetkom izpostavljenosti. Da se zagotovi ustrezen stik hrane s preskusno snovjo, je treba vir hrane zmešati z usedlino najpozneje na dan primešanja preskusne snovi v usedlino. Izjeme so dovoljene, kadar dolžina obdobja za uravnoteženje povzroča mikrobno razgradnjo hrane pred vnosom preskusnih organizmov. Odvzamejo se vzorci usedline, da se določita suha teža in skupni organski ogljik (npr. 3 vzorci usedline s primešano preskusno snovjo ali kontrolne usedline). | Suho težo sestavin (šote, peska, kaolina) je treba sporočiti v gramih in deležu skupne suhe teže. | Tudi prostornino vode, ki jo je treba med pripravo usedline dodati suhim sestavinam, je treba sporočiti v deležu skupne suhe teže (npr. 100 % suhe teže + 46 % vode pomeni, da 1 000 g suhe teže sprejme skupaj 460 ml vode, kar je 1 460 g mokre usedline). | Shranjevanje | Suhe sestavine za umetno usedlino se lahko shranjujejo v suhem in hladnem prostoru pri sobni temperaturi. Pripravljena mokra usedlina se lahko za 2–4 tedne od dneva priprave hrani (le za nadaljnjo uporabo v gojišču) v temi pri 4 ± 2 °C (8). | Usedlino s primešano preskusno snovjo je treba uporabiti takoj, razen če obstajajo informacije o tem, da je mogoče določeno usedlino shranjevati, ne da bi to vplivalo na strupenost in biološko razpoložljivost preskusne snovi. Vzorci usedline s primešano preskusno snovjo se lahko do analize hranijo v pogojih, priporočenih za zadevno preskusno snov. | Dodatek 6 | Vrste maloščetincev, priporočene za preskušanje bioakumulacije | Tubifex tubifex (MÜLLER), Tubificidae, Oligochaeta | Maloščetinski tubifeks (Tubificidae, Oligochaeta) Tubifex tubifex (Müller) živi v sladkovodnih usedlinah v cevkah, ki so prevlečene s sluzjo. Črvi v teh cevkah živijo z glavo navzdol in se prehranjujejo z delci usedline, pri čemer izkoriščajo povezane mikro organizme in organske odpadke. Zadnji del običajno valovi v vodi nad usedlino zaradi dihanja. Čeprav ta vrsta naseljuje številne vrste usedlin po celotni severni polobli, ima Tubifex tubifex najraje razmeroma fine delce (59). Primernost te vrste za ekotoksikološko preskušanje je opisana na primer v (8) (29) (31) (39) (60) (62) (63). | Metode gojenja | Da se zagotovi zadostno število osebkov Tubifex tubifex za izvajanje preskusov bioakumulacije, bo morda treba črve gojiti v stalni laboratorijski kulturi. Za gojenje T. tubifex se priporoča sistem, ki zajema umetno usedlino na podlagi umetnih tal v skladu s preskusno metodo C.8 (40) in modelno razredčevalno vodo v skladu s preskusno metodo C.1 (8). | Kot posode za gojenje se lahko uporabijo posode iz stekla ali nerjavnega jekla višine od 12 do 20 cm. V vsaki posodi za gojenje je plast mokre umetne usedline, pripravljene, kot je opisano v Dodatku 5. Debelina plasti usedline mora omogočati naravno obnašanje črvov pri zarivanju (vsaj 2 cm debela plast za T. tubifex). V sistem se doda modelna razredčevalna voda. Pri tem je treba paziti, da se usedlina čim manj moti. Vodno telo se nežno prezračuje (npr. 2 mehurčka na sekundo z zrakom, filtriranim na 0,45 μm) s pasteurjevo pipeto, ki je nastavljena 2 cm nad površino usedline. Priporočena temperatura za gojenje je 20 ± 2 °C. | Črvi se v sistem za gojenje vnesejo z največjo obremenitvijo 20 000 osebkov/m2 površine usedline. Večja obremenitev bi lahko povzročila manjše hitrosti rasti in razmnoževanja (43). | Pri gojenju v umetnih usedlinah je treba črve hraniti. Prehrana, ki zajema fino mleto ribjo hrano, npr. TetraMin®, lahko služi kot dodatna hranilna snov (8); Klerks 1994, osebno sporočilo. Stopnje hranjenja morajo omogočati zadostno rast in razmnoževanje ter ohranjati kopičenje amoniaka in rast plesni v gojišču na čim nižji ravni. Hrana se lahko daje dvakrat na teden (npr. 0,6–0,8 mg/cm2 površine usedline). Praktične izkušnje so pokazale, da lahko uporaba hrane, ki je suspendirana in homogenizirana v deionizirani vodi, olajša homogeno razporeditev hrane po površini usedline v posodah za gojenje. | Da se prepreči kopičenje amoniaka, je treba vodo nad usedlino zamenjati s pretočnim sistemom ali ročno vsaj enkrat na teden. V založnih kulturah je treba usedlino zamenjati vsake tri mesece. | Vzorčenje črvov iz gojišča se lahko izvede s presejanjem gojitvene usedline skozi sito z luknjicami velikosti 1 mm, če so potrebni le odrasli osebki. Za zadržanje kokonov je primerna mreža z luknjicami velikosti 0,5 mm, za črvje mladiče pa sito z luknjicami velikosti 0,25 mm. Ko se usedlina preseje skozi sita, se ta lahko postavijo v modelno razredčevalno vodo. Črvi zapustijo mrežo in se lahko nato iz vode poberejo s prijemalkami iz plavljenega jekla ali pipeto z vroče poliranimi robovi. | Za začetek preskusa ali novih kultur se uporabijo samo nepoškodovani in jasno identificirani primerki Tubifex tubifex (npr. (64)). Bolne ali poškodovane črve in kokone, na katerih so se namnožili mikroorganizmi fungus hypha, je treba zavreči. | S sinhrono kulturo se lahko v primernih razmikih zagotovijo črvi določene starosti, ko so potrebni. Nove posode za gojenje se pripravijo v izbranih razmikih (npr. vsaka dva tedna), pri čemer se začnejo z živalmi določene starosti (npr. kokoni). V pogojih gojenja, opisanih tukaj, črvi odrastejo po 8–10 tednih. Kulture se lahko spravijo, ko črvi odložijo nove kokone, npr. po desetih tednih. Vzorčeni odrasli osebki se lahko uporabijo za preskuse, s kokoni pa se lahko začnejo nove kulture. | Lumbriculus variegatus (MÜLLER), Lumbriculidae, Oligochaeta | Lumbriculus variegatus (Lumbriculidae, Oligochaeta) prav tako živi v sladkovodnih usedlinah po vsem svetu in se pogosto uporablja v ekotoksikološkem preskušanju. Informacije o biologiji, pogojih gojenja in občutljivosti vrste so navedene v (1) (6) (9) (36). Lumbriculus variegatus se lahko z nekaj omejitvami gojijo tudi v umetni usedlini, ki se v skladu z (8) priporoča za T. tubifex. Ker ima L. variegatus v naravi raje bolj grobe usedline kot T. tubifex (59), lahko laboratorijske kulture v umetnih usedlinah, ki se uporabljajo za T. tubifex, poginejo po 4 do 6 mesecih. Praktične izkušnje so pokazale, da je lahko L. variegatus v peščenem substratu (npr. kremenov pesek, fini prod) v pretočnem sistemu, v katerem se ribja hrana uporablja kot vir hranilnih snovi več let brez obnovitve substrata. Velika prednost L. variegatus pred drugimi vrstami vodnih maloščetincev je hitro razmnoževanje, zaradi katerega se biomasa v laboratorijsko gojenih populacijah hitro poveča (1) (6) (9) (10). | Metode gojenja | Pogoji gojenja za Lumbriculus variegatus so podrobno opisani v Phipps in drugi (1993) (10), Brunson in drugi (1998) (28), ASTM (2000) (1) in U.S. EPA (2000) (6). V nadaljevanju je naveden kratek povzetek teh pogojev. | Črvi se lahko gojijo v velikih akvarijih (57–80 l) pri 23 °C z obdobjem osvetljenosti (100–1 000 luksov), ki obsega 16 ur svetlobe in 8 ur teme, ter vsakodnevno obnovljeno naravno vodo (45–50 l na akvarij). Substrat se pripravi z rezanjem nebeljenih brisač iz rjavega papirja na trakove, ki se lahko nato nekaj sekund meša z vodo za gojenje, da nastanejo majhni kosi papirnega substrata. Ta substrat se lahko nato neposredno uporabi v akvariju s kulturo Lumbriculus, tako da se prekrije dno posode, ali pa se za poznejšo uporabo shrani zamrznjen v deionizirani vodi. Nov substrat v posodi bo na splošno zdržal približno dva meseca. | Vsaka kultura črvov se začne s 500–1 000 črvi in se trikrat na teden hrani z 10 ml suspenzije, ki vsebuje 6 g začetne hrane za postrvi, v pogojih za obnovitev ali pretočnih pogojih. Statičnim ali polstatičnim kulturam se morajo zagotoviti manjše stopnje hranjenja, da se prepreči rast bakterij in plesni. Hrano in papirni substrat je treba analizirati glede snovi, ki jih je treba uporabiti v preskusih bioakumulacije. | V teh pogojih se število osebkov v kulturi običajno podvoji v približno 10 do 14 dneh. | Lumbriculus variegatus se lahko odstrani iz gojišč npr. s prenosom substrata s fino mrežo ali organizmov z vroče polirano široko (premer približno 5 mm) stekleno pipeto v ločeno čašo. Če se v to čašo prenese tudi substrat, se čaša s črvi in substratom čez noč pusti v pretočnih pogojih, v katerih se bo substrat odstranil iz čase, medtem ko bodo črvi ostali na dnu posode. Nato se lahko vnesejo v novo pripravljene posode za gojenje ali dodatno obdelajo za preskus, kot je opisano v (1) in (6). Poškodbe ali avtotomijo pri črvih je treba preprečiti npr. z uporabo pipet z vroče poliranimi robovi ali nerjavnimi pincetami za ravnanje s temi črvi. | Pri uporabi L. variegatus v preskusih bioakumulacije v usedlinah je treba kritično obravnavati njihov način razmnoževanja (arhitomija, ki ji sledi morfalaksa). S tem nespolnim razmnoževanjem nastaneta dva fragmenta, ki se določeno časovno obdobje ne prehranjujeta, dokler se glava ali del repa ne obnovi (npr. (36) (37)). To pomeni, da je pri L. variegatus absorpcija usedline in onesnaževala z zaužitjem morda ne odvijata hkrati, kot pri tubificidih, ki se ne razmnožujejo s fragmentacijo. | Zato je treba izvesti sinhronizacijo, da se čim bolj zmanjšata nenadzorovano razmnoževanje in obnavljanje ter s tem velike razlike v rezultatih preskusov. Do takih razlik lahko pride, če so nekateri osebki, ki so se fragmentirali in se zato določeno časovno obdobje niso prehranjevali, manj izpostavljeni preskusni snovi kot drugi osebki, ki se med preskusom ne fragmentirajo, npr. (38). Črve je treba 10 do 14 dni pred začetkom izpostavljenosti umetno fragmentirati (sinhronizacija) (65). Uporabiti je treba velike črve, ki po možnosti ne kažejo znakov nedavne fragmentacije. Ti črvi se lahko postavijo na objektno stekelce v kapljico vode za gojenje in s skalpelom secirajo po sredini telesa. Pri tem je treba paziti, da so zadnji deli podobne velikosti. Nato je treba zadnje dele do začetka izpostavljenosti pustiti v posodah za gojenje z istim substratom, kot je bil uporabljen v vodi za gojenje in modelni razredčevalni vodi, kjer se regenerirajo nove glave. Regeneracija novih glav se kaže, ko se sinhronizirani črvi zarijejo v substrat (prisotnost regeneriranih glav se lahko potrdi s pregledom reprezentativnega podvzorca pod binokularnim mikroskopom). Preskusni organizmi se nato pregledajo, da so v podobnem fiziološkem stanju. To pomeni, da se pričakuje, da bodo vse živali enako izpostavljene usedlini s primešano preskusno snovjo, ko se med preskusom pri sinhroniziranih črvih pojavi regeneracija z morfalakso. Sinhronizirane črve je treba hraniti takoj, ko se začnejo zarivati v substrat, ali 7 dni po seciranju. Način hranjenja mora biti primerljiv z navadnimi kulturami, vendar bi se lahko sinhronizirani črvi hranili z enakim virom hrane kot se uporabi v preskusu. Črve je treba shranjevati pri preskusni temperaturi, tj. 20 ± 2 °C. Po regeneraciji je treba za preskus uporabiti nepoškodovane in popolne črve podobne velikosti, ki aktivno plavajo ali se plazijo po nežnih mehanskih dražljajih. Poškodbe ali avtotomijo pri črvih je treba preprečiti npr. z uporabo pipet z vroče poliranimi robovi ali nerjavnimi pincetami za ravnanje s temi črvi. | Kadar se v preskusu uporabi Lumbriculus variegatus, se mora zaradi specifičnega načina razmnoževanja te vrste število črvov med preskusom povečati, če so pogoji ustrezni (6). Odsotnost razmnoževanja v preskusu bioakumulacije z L. variegatus je treba zabeležiti in upoštevati pri razlagi rezultatov preskusa. | Branchiura sowerbyi (BEDDARD), Tubificidae, Oligochaeta (vrsta ni validirana s krožnim preskusom) | Branchiura sowerbyi naseljujejo različne vrste usedlin v zajetjih, jezerih, ribnikih in rekah, avtohtono v tropskih območjih. Nahajajo se lahko tudi v toplih vodnih telesih severne poloble. Vendar so pogostejši v blatnih glinenih usedlinah z visoko vsebnostjo organske snovi. Črvi živijo v plasti usedline. Običajno je zarit tudi zadnji del črvov. Ta vrsta se enostavno identificira po škržnih lističih na zadnjem delu. Odrasli osebki lahko v dolžino dosežejo 9–11 cm, njihova mokra teža pa je 40–50 mg. Črvi se hitro razmnožujejo, pri čemer se njihovo število v temperaturnih pogojih in pogojih prehranjevanja, opisanih v nadaljevanju, podvoji v manj kot 2 tednih (Aston in drugi, 1982, (65)). B. sowerbyi se uporablja tako v študijah strupenosti kot v študijah bioakumulacije (Marchese in Brinkhurst 1996 (31), Roghair in drugi 1996 (67)). | Metode gojenja | V nadaljevanju so povzeti pogoji gojenja Branchiura sowerbyi (po Mercedes R. Marchese, INALI, Argentina in Carla J. Roghair, RIVM, Nizozemska). | Za gojenje preskusnih organizmov se ne zahteva enotna tehnika. Organizmi se lahko gojijo v neonesnaženi naravni usedlini (31). Praktične izkušnje so pokazale, da se z gojiščem iz naravne usedline in peska izboljša stanje črvov v primerjavi s čisto naravno usedlino (32) (67). Za to kulturo se lahko uporabijo čaše s prostornino 3 l, v katerih je 1 500 ml gojišča iz usedline in vode, ki vsebuje 375 ml naravne neonesnažene usedline (približno 10 % skupnega organskega ogljika, približno 17 % delcev ≤ 63 μm), 375 ml čistega peska (M32) in 750 ml modelne razredčevalne vode ali deklorirane vodovodne vode (31) (32) (67). Kot substrat za gojenje se lahko uporabijo tudi papirnate brisače, vendar je rast populacije manjša kot v naravni usedlini. V polstatičnih sistemih se vodna plast počasi prezračuje, vodo nad usedlino pa je treba obnoviti vsak teden. | V vsaki čaši je na začetku 25 mladih črvov. Po dveh mesecih se veliki črvi s pinceto poberejo iz usedline in vnesejo v novo čašo s sveže pripravljenim gojiščem iz usedline in vode. V stari čaši so tudi kokoni in mladi črvi. Tako se lahko spravi do 400 mladih črvov na čašo. Odrasli črvi se lahko vsaj eno leto uporabljajo za razmnoževanje. | Kulture je treba vzdrževati pri temperaturi 21 do 25 °C. Temperatura ne sme nihati za več kot ± 2 °C. Čas, potreben za razvoj embria od odložitve jajčeca do mladiča, ki zapusti kokon, je približno tri tedne pri 25 °C. Ugotovljeno je bilo, da je pri B. sowerbyi en preživeli črv v blatu pri 25 °C proizvede od 6,36 (31) do 11,2 (30) jajčec na preživelega črva. Število jajčec na kokon je od 1,8 do 2,8 (66) (69) ali do 8 (68). | Vsak teden je treba izmeriti raztopljeni kisik, trdoto vode, temperaturo in pH. Ribja hrana (npr. TetraMin®) se lahko doda kot suspenzija dvakrat ali trikrat na teden ad libitum. Črvi se lahko ad libitum hranijo tudi z odtajano zeleno solato. | Pomembna prednost te vrste je velika biomasa osebkov (do 40–50 mg mokre teže na osebek). Zato se lahko ta vrsta uporablja za preskušanje bioakumulacije neradioaktivno označenih preskusnih snovi. Izpostavi se lahko v sistemih, ki se uporabljajo za T. tubifex ali L. variegatus, z enim osebkom na ponovitev (11). Vendar je nato treba ponovitev povečati, razen če se uporabijo večje preskusne komore (11). Za to vrsto je treba prilagoditi tudi merilo za veljavnost v zvezi z obnašanjem med zarivanjem. | LITERATURA | (1) | ASTM International (2000). Standard guide for the determination of the bioaccumulation of sediment-associated contaminants by benthic invertebrates, E 1688-00a. V: ASTM International 2004 Annual Book of Standards. Zvezek 11.05. Biological Effects and Environmental Fate; Biotechnology; Pesticides. ASTM International, West Conshohocken, PA. | (2) | European Commission (EC) (2003). Technical Guidance Document on Risk Assessment in support of Commission Directive 93/67/EEC on Risk Assessment for new notified substances, Commission Regulation (EC) No 1488/94 on Risk Assessment for existing substances and Directive 98/8/EC of the European Parliament and of the Council concerning the placing of biocidal products on the market; Part I – IV. Urad za publikacije Evropskih skupnosti, Luksemburg. | (3) | OECD (1992a). Report of the OECD workshop on effects assessment of chemicals in sediment. OECD Monographs No. 60. Organizacija za gospodarsko sodelovanje in razvoj (OECD), Pariz. | (4) | Ingersoll, C. G., Ankley, G. T., Benoit D. A., Brunson, E. L., Burton, G. A., Dwyer, F. J., Hoke, R. A., Landrum, P. F., Norberg-King, T. J., in Winger, P.V. (1995). Toxicity and bioaccumulation of sediment-associated contaminants using freshwater invertebrates: A review of methods and applications. Environ. Toxicol. Chem. 14, 1885–1894. | (5) | Poglavje C.13 te priloge, Biokoncentracija: pretočni preskus na ribah. | (6) | U.S. EPA (2000). Methods for measuring the toxicity and bioaccumulation of sediment-associated contaminants with freshwater invertebrates. Druga izdaja. EPA 600/R-99/064, U.S. Environmental Protection Agency, Duluth, MN, marec 2000. | (7) | Poglavje C.27 te priloge, Preskus strupenosti s trzačami v sistemu vode in usedline z uporabo usedline s primešano preskusno snovjo. | (8) | Egeler, Ph., Römbke, J., Meller, M., Knacker, Th., Franke, C., Studinger, G., in Nagel, R. (1997). Bioaccumulation of lindane and hexachlorobenzene by tubificid sludgeworms (Oligochaeta) under standardised laboratory conditions. Chemosphere 35, 835–852. | (9) | Ingersoll, C. G., Brunson, E. L., Wang N., Dwyer, F. J., Ankley, G. T., Mount D. R., Huckins J., Petty. J., in Landrum, P. F. (2003). Uptake and depuration of nonionic organic contaminants from sediment by the oligochaete, Lumbriculus variegatus. Environmental Toxicology and Chemistry 22, 872–885. | (10) | Phipps, G. L., Ankley, G. T., Benoit, D. A., in Mattson, V. R. (1993). Use of the aquatic Oligochaete Lumbriculus variegatus for assessing the toxicity and bioaccumulation of sediment-associated contaminants. Environ.Toxicol. Chem. 12, 269–279. | (11) | Egeler, Ph., Römbke, J., Knacker, Th., Franke, C., in Studinger, G. (1999). Delavnica o ‚Bioaccumulation: Sediment test using benthic oligochaetes‘, 26.–27.april 1999, Hochheim am Main, Nemčija. Report on the R+D-project No. 298 67 419, Umweltbundesamt, Berlin. | (12) | Egeler, Ph., Meller, M., Schallnaß, H. J., in Gilberg, D. (2006). Validation of a sediment bioaccumulation test with endobenthic aquatic oligochaetes by an international ring test. Report to the Federal Environmental Agency (Umweltbundesamt Dessau), R&D No.: 202 67 437. | (13) | Kelly, J. R., Levine, S. N., Buttel, L. A., Kelly, A. C., Rudnick, D. T., in Morton, R. D. (1990). Effects of tributyltin within a Thalassia seagrass ecosystem. Estuaries 13, 301–310. | (14) | Nendza, M. (1991). QSARs of bioaccumulation: Validity assessment of log Kow/log BCF correlations. V: R. Nagel in R. Loskill (ur.): Bioaccumulation in aquatic systems. Contributions to the assessment. Proceedings of an international workshop, Berlin 1990. VCH, Weinheim. | (15) | Landrum, P. F., Lee II, H., in Lydy, M. J. (1992). Toxicokinetics in aquatic systems: Model comparisons and use in hazard assessment. Environ. Toxicol. Chem. 11, 1709–1725. | (16) | Markwell, R. D., Connell, D. W., in Gabric, A. J. (1989). Bioaccumulation of lipophilic compounds from sediments by oligochaetes. Wat. Res. 23, 1443–1450. | (17) | Gabric, A. J., Connell, D. W., in Bell, P. R. F. (1990). A kinetic model for bioconcentration of lipophilic compounds by oligochaetes. Wat. Res. 24, 1225–1231. | (18) | Kukkonen, J., in Landrum, P. F. (1994). Toxicokinetics and toxicity of sediment-associated Pyrene to Lumbriculus variegatus (Oligochaeta). Environ. Toxicol. Chem. 13, 1457–1468. | (19) | Franke, C., Studinger, G., Berger, G., Böhling, S., Bruckmann, U., Cohors-Fresenborg, D., in Jöhncke, U. (1994). The assessment of bioaccumulation. Chemosphere 29, 1501–1514. | (20) | OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. OECD Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 23. | (21) | U.S. EPA (1996). Special Considerations for Conducting Aquatic Laboratory Studies. Ecological Effects Test Guidelines. OPPTS 850.1000. Public Draft. EPA 712-C-96-113. U.S. Environmental Protection Agency. | (22) | Naslednja poglavja te priloge: | Poglavje A.4, Parni tlak, | Poglavje A.5, Površinska napetost, | Poglavje A.6, Topnost v vodi, | Poglavje A.8, Porazdelitveni koeficient, metoda stresanja bučke, | Poglavje A.24, Porazdelitveni koeficient, metoda tekočinske kromatografije visoke ločljivosti (HPLC), | Poglavje C.7, Razgradnja – Abiotska razgradnja: hidroliza kot funkcija pH, | Poglavje C.4 A–F, Določanje ‚dobre‘ biorazgradljivosti, | Poglavje C.19, Ocenjevanje adsorpcijskega koeficienta (Koc ) tal in odpadnega blata (blata iz čistilnih naprav) s tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti (HPLC), | Poglavje C.29, Dobra biorazgradljivost – CO2 v zaprtih posodah. | (23) | OECD (1996). Direct phototransformation of chemicals in water. Environmental Health and Safety Guidance Document Series on Testing and Assessment of Chemicals No. 3. OECD, Pariz. | (24) | Antoine, M. D., Dewanathan, S., in Patonay, G. (1991). Determination of critical micelles concentration of surfactants using a near-infrared hydrophobicity probe. Microchem. J. 43, 165–172. | (25) | Beek, B., Boehling, S., Bruckmann, U., Franke, C., Joehncke, U., in Studinger, G. (2000). The assessment of bioaccumulation. V: Hutzinger, O. (ur.), The Handbook of Environmental Chemistry, Vol. 2 Part J (ur. zvezka: B. Beek): Bioaccumulation – New Aspects and Developments. Springer-Verlag Berlin Heidelberg: 235–276. | (26) | Spacie, A., in Hamelink, J. L. (1982). Alternative models for describing the bioconcentration of organics in fish. Environ. Toxicol. Chem. 1, 309–320. | (27) | Hawker, D. W., in Connell, D. W. (1988). Influence of partition coefficient of lipophilic compounds on bioconcentration kinetics with fish. Wat. Res. 22, 701–707. | (28) | Brunson, E. L., Canfield, T. J., Ingersoll, C. J., in Kemble, N. E. (1998). Assessing the bioaccumulation of contaminants from sediments of the Upper Mississippi river using field-collected oligochaetes and laboratory-exposed Lumbriculus variegatus. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 35, 191–201. | (29) | Reynoldson, T. B., Thompson, S. P., in Bamsey, J. L. (1991). A sediment bioassay using the tubificid oligochaete worm Tubifex tubifex. Environ. Toxicol. Chem. 10, 1061–1072. | (30) | Aston, R. J., in Milner, A. G. P. (1981). Conditions for the culture of Branchiura sowerbyi (Oligochaeta: Tubificidae) in activated sludge. Aquaculture 26, 155–160. | (31) | Marchese, M. R., in Brinkhurst, R. O. (1996). A comparison of two tubificid species as candidates for sublethal bioassay tests relevant to subtropical and tropical regions. Hydrobiologia 334, 163–168. | (32) | Roghair, C. J., in Buijze, A. (1994). Development of sediment toxicity tests. IV. A bioassay to determine the toxicity of field sediments to the oligochaete worm Branchiura sowerbyi. RIVM Report 719102027. | (33) | Poglavje C.1 te priloge, Akutna strupenost za ribe. | (34) | OECD (1992c). Guidelines for Testing of Chemicals No. 210. Fish, Early-life Stage Toxicity Test. OECD, Pariz. | (35) | Kaster, J. L., Klump, J. V., Meyer, J., Krezoski, J., in Smith, M. E. (1984). Comparison of defecation rates of Limnodrilus hoffmeisteri using two different methods. Hydrobiologia 11, 181–184. | (36) | Leppänen, M. T., in Kukkonen, J. V. K. (1998). Factors affecting feeding rate, reproduction and growth of an oligochaete Lumbriculus variegatus (Müller). Hydrobiologia 377: 183–194. | (37) | Leppänen, M. T., in Kukkonen, J. V. K. (1998). Relationship between reproduction, sediment type and feeding activity of Lumbriculus variegatus (Müller): Implications for sediment toxicity testing. Environ. Toxicol. Chem. 17: 2196–2202. | (38) | Leppänen M. T., in Kukkonen J. V. K. (1998). Relative importance of ingested sediment and porewater as bioaccumulation routes for pyrene to oligochaete (Lumbriculus variegatus, Müller). Environ. Sci. Toxicol. 32, 1503–1508. | (39) | Martinez-Madrid, M., Rodriguez, P., Perez-Iglesias, J. I., in Navarro, E. (1999). Sediment toxicity bioassays for assessment of contaminated sites in the Nervion river (Northern Spain). 2. Tubifex tubifex (Müller) reproduction sediment bioassay. Ecotoxicology 8, 111–124. | (40) | Poglavje C.8 te priloge, Strupenost za deževnike. | (41) | Environment Canada (1995). Guidance document on measurement of toxicity test precision using control sediments spiked with a reference toxicant. Environmental Protection Series Report EPS 1/RM/30. | (42) | Landrum, P. F. (1989). Bioavailability and toxicokinetics of polycyclic aromatic hydrocarbons sorbed to sediments for the amphipod Pontoporeia hoyi. Environ. Sci. Toxicol. 23, 588–595. | (43) | Poddubnaya, T. L. (1980). Life cycles of mass species of Tubificidae (Oligochaeta). V: R. O. Brinkhurst in D. G. Cook (ur.): Aquatic Oligochaeta Biology, 175–184. Plenum Press, New York. | (44) | ASTM (1998). Standard guide for collection, storage, characterisation, and manipulation of sediment for toxicological testing. American Society for Testing and Materials, E 1391–94. | (45) | Hooftman, R. N., van de Guchte, K., in Roghair, C. J. (1993). Development of ecotoxicological test systems to assess contaminated sediments. Joint report no. 1: Acute and (sub)chronic tests with the model compound chlorpyrifos. RIVM-719102022. | (46) | Franke, C. (1996). How meaningful is the bioconcentration factor for risk assessment?. Chemosphere 32, 1897–1905. | (47) | Mount, D. R., Dawson, T. D., in Burkhard, L. P. (1999). Implications of gut purging for tissue residues determined in bioaccumulation testing of sediment with Lumbriculus variegatus. Environ. Toxicol. Chem. 18, 1244–1249. | (48) | Randall, R. C., Lee II, H., Ozretich, R. J., Lake, J. L., in Pruell, R. J. (1991). Evaluation of selected lipid methods for normalising pollutant bioaccumulation. Environ.Toxicol. Chem. 10, 1431–1436. | (49) | Gardner, W. S., Frez, W. A., Cichocki, E. A., in Parrish, C. C. (1985). Micromethods for lipids in aquatic invertebrates. Limnology and Oceanography, 30, 1099–1105. | (50) | Bligh, E. G., in Dyer, W. J. (1959). A rapid method of total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911–917. | (51) | De Boer, J., Smedes, F., Wells, D., in Allan, A. (1999). Report on the QUASH interlaboratory study on the determination of total-lipid in fish and shellfish. Round 1 SBT-2. Exercise 1000. EU, Standards, Measurement and Testing Programme. | (52) | Kristensen, P. (1991). Bioconcentration in fish: comparison of bioconcentration factors derived from OECD and ASTM testing methods; influence of particulate matter to the bioavailability of chemicals. Water Quality Institute, Danska. | (53) | Zok, S., Görge, G., Kalsch, W., in Nagel, R. (1991). Bioconcentration, metabolism and toxicity of substituted anilines in the zebrafish (Brachydanio rerio). Sci. Total Environment 109/110, 411–421 | (54) | Nagel, R. (1988). Umweltchemikalien und Fische – Beiträge zu einer Bewertung. Habilitationsschrift, Johannes Gutenberg-Universität Mainz, Nemčija. | (55) | Janssen, M. P. M., Bruins, A., De Vries, T. H., in Van Straalen, N. M. (1991). Comparison of cadmium kinetics in four soil arthropod species. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 20: 305–312. | (56) | Van Brummelen, T. C., in Van Straalen, N. M. (1996). Uptake and elimination of benzo(a)pyrene in the terrestrial isopod Porcellio scaber. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 31: 277–285. | (57) | Sterenborg, I., Vork, N. A., Verkade, S. K., Van Gestel, C. A. M., in Van Straalen, N. M. (2003). Dietary zinc reduces uptake but not metallothionein binding and elimination of cadmium in the springtail Orchesella cincta. Environ. Toxicol. Chemistry 22: 1167–1171. | (58) | Suedel, B. C., in Rodgers, J. H. (1993). Development of formulated reference sediments for freshwater and estuarine sediment testing. Environ. Toxicol. Chem. 13, 1163–1175. | (59) | Wachs, B. (1967). Die Oligochaeten-Fauna der Fließgewässer unter besonderer Berücksichtigung der Beziehung zwischen der Tubificiden-Besiedlung und dem Substrat. Arch. Hydr. 63, 310–386. | (60) | Oliver, B. G. (1987). Biouptake of chlorinated hydrocarbons from laboratory-spiked and field sediments by oligochaete worms. Environ. Sci. Technol. 21, 785–790. | (61) | Chapman, P. M., Farrell, M. A., in Brinkhurst, R. O. (1982a). Relative tolerances of selected aquatic oligochaetes to individual pollutants and environmental factors. Aquatic Toxicology 2, 47–67. | (62) | Chapman, P. M., Farrell, M. A., in Brinkhurst, R. O. (1982b). Relative tolerances of selected aquatic oligochaetes to combinations of pollutants and environmental factors. Aquatic Toxicology 2, 69–78. | (63) | Rodriguez, P., in Reynoldson, T. B. (1999). Laboratory methods and criteria for sediment bioassessment. V: A. Mudroch, J. M. Azcue, in P. Mudroch (ur.): Manual of Bioassessment of aquatic sediment quality. Lewis Publishers, Boca Raton, CRC Press LLC. | (64) | Brinkhurst, R. O. (1971). A guide for the identification of British aquatic oligochaeta. Freshw. Biol. Assoc., Sci. Publ. No. 22. | (65) | Egeler, Ph., Meller, M., Schallnaß, H. J., in Gilberg, D. (2005). Validation of a sediment toxicity test with the endobenthic aquatic oligochaete Lumbriculus variegatus by an international ring test. In co-operation with R. Nagel and B. Karaoglan. Report to the Federal Environmental Agency (Umweltbundesamt Berlin), R&D No.: 202 67 429. | (66) | Aston, R. J., Sadler, K., in Milner, A. G. P. (1982). The effect of temperature on the culture of Branchiura sowerbyi (Oligochaeta: Tubificidae) on activated sludge. Aquaculture 29, 137–145. | (67) | Roghair, C. J., Buijze, A., Huys, M. P. A., Wolters-Balk, M. A. H., Yedema, E. S. E., in Hermens, J. L. M. (1996). Toxicity and toxicokinetics for benthic organisms; II: QSAR for base-line toxicity to the midge Chironomus riparius and the tubificid oligochaete worm Branchiura sowerbyi. RIVM Report 719101026. | (68) | Aston, R. J. (1984). The culture of Branchiura sowerbyi (Tubificidae, Oligochaeta) using cellulose substrate. Aquaculture 40, 89–94. | (69) | Bonacina, C., Pasteris, A., Bonomi, G., in Marzuoli, D. (1994). Quantitative observations on the population ecology of Branchiura sowerbyi (Oligochaeta, Tubificidae). Hydrobiologia, 278, 267–274 | “ | (6) | the following Chapters C.31 to C.46 are added: | ‘ | C.31. TERRESTRIAL PLANT TEST: SEEDLING EMERGENCE AND SEEDLING GROWTH TEST | INTRODUCTION | 1. | This test method is equivalent to OECD Test Guideline (TG) 208 (2006). Test methods are periodically reviewed in the light of scientific progress and applicability to regulatory use. This updated test method is designed to assess potential effects of chemicals on seedling emergence and growth. As such it does not cover chronic effects or effects on reproduction (i.e. seed set, flower formation, fruit maturation). Conditions of exposure and properties of the chemical to be tested must be considered to ensure that appropriate test methods are used (e.g. when testing metals/metal compounds the effects of pH and associated counter ions should be considered) (1). This test method does not address plants exposed to vapours of chemicals. The test method is applicable to the testing of general chemicals, biocides and crop protection products (also known as plant protection products or pesticides). It has been developed on the basis of existing methods (2) (3) (4) (5) (6) (7). Other references pertinent to plant testing were also considered (8) (9) (10). Definitions used are given in Appendix 1. | PRINCIPLE OF THE TEST | 2. | The test assesses effects on seedling emergence and early growth of higher plants following exposure to the test chemical in the soil (or other suitable soil matrix). Seeds are placed in contact with soil treated with the test chemical and evaluated for effects following usually 14 to 21 days after 50 % emergence of the seedlings in the control group. Endpoints measured are visual assessment of seedling emergence, dry shoot weight (alternatively fresh shoot weight) and in certain cases shoot height, as well as an assessment of visible detrimental effects on different parts of the plant. These measurements and observations are compared to those of untreated control plants. | 3. | Depending on the expected route of exposure, the test chemical is either incorporated into the soil (or possibly into artificial soil matrix) or applied to the soil surface, which properly represents the potential route of exposure to the chemical. Soil incorporation is done by treating bulk soil. After the application the soil is transferred into pots, and then seeds of the given plant species are planted in the soil. Surface applications are made to potted soil in which the seeds have already been planted. The test units (controls and treated soils plus seeds) are then placed under appropriate conditions to support germination/growth of plants. | 4. | The test can be conducted in order to determine the dose-response curve, or at a single concentration/rate as a limit test according to the aim of the study. If results from the single concentration/rate test exceed a certain toxicity level (e.g. whether effects greater than x % are observed), a range-finding test is carried out to determine upper and lower limits for toxicity followed by a multiple concentration/rate test to generate a dose-response curve. An appropriate statistical analysis is used to obtain effective concentration ECx or effective application rate ERx (e.g. EC25, ER25, EC50, ER50) for the most sensitive parameter(s) of interest. Also, the no observed effect concentration (NOEC) and lowest observed effect concentration (LOEC) can be calculated in this test. | INFORMATION ON THE TEST CHEMICAL | 5. | The following information is useful for the identification of the expected route of exposure to the chemical and in designing the test: structural formula, purity, water solubility, solubility in organic solvents, 1-octanol/water partition coefficient, soil sorption behaviour, vapour pressure, chemical stability in water and light, and biodegradability. | VALIDITY OF THE TEST | 6. | In order for the test to be considered valid, the following performance criteria must be met in the controls: | — | the seedling emergence is at least 70 %; | — | the seedlings do not exhibit visible phytotoxic effects (e.g. chlorosis, necrosis, wilting, leaf and stem deformations) and the plants exhibit only normal variation in growth and morphology for that particular species; | — | the mean survival of emerged control seedlings is at least 90 % for the duration of the study; | — | environmental conditions for a particular species are identical and growing media contain the same amount of soil matrix, support media, or substrate from the same source. | REFERENCE CHEMICAL | 7. | A reference chemical may be tested at regular intervals, to verify that performance of the test and the response of the particular test plants and the test conditions have not changed significantly over time. Alternatively, historical biomass or growth measurement of controls could be used to evaluate the performance of the test system in particular laboratories, and can serve as an intra-laboratory quality control measure. | DESCRIPTION OF THE METHOD | Natural soil — Artificial substrate | 8. | Plants may be grown in pots using a sandy loam, loamy sand, or sandy clay loam that contains up to 1,5 percent organic carbon (approx. 3 percent organic matter). Commercial potting soil or synthetic soil mix that contains up to 1,5 percent organic carbon may also be used. Clay soils should not be used if the test chemical is known to have a high affinity for clays. Field soil should be sieved to 2 mm particle size in order to homogenise it and remove coarse particles. The type and texture, % organic carbon, pH and salt content as electronic conductivity of the final prepared soil should be reported. The soil should be classified according to a standard classification scheme (11). The soil could be pasteurised or heat treated in order to reduce the effect of soil pathogens. | 9. | Natural soil may complicate interpretation of results and increase variability due to varying physical/chemical properties and microbial populations. These variables in turn alter moisture-holding capacity, chemical-binding capacity, aeration, and nutrient and trace element content. In addition to the variations in these physical factors, there will also be variation in chemical properties such as pH and redox potential, which may affect the bioavailability of the test chemical (12) (13) (14). | 10. | Artificial substrates are typically not used for testing of crop protection products, but they may be of use for the testing of general chemicals or where it is desired to minimize the variability of the natural soils and increase the comparability of the test results. Substrates used should be composed of inert materials that minimize interaction with the test chemical, the solvent carrier, or both. Acid washed quartz sand, mineral wool and glass beads (e.g. 0,35 to 0,85 mm in diameter) have been found to be suitable inert materials that minimally absorb the test chemical (15), ensuring that the chemical will be maximally available to the seedling via root uptake. Unsuitable substrates would include vermiculite, perlite or other highly absorptive materials. Nutrients for plant growth should be provided to ensure that plants are not stressed through nutrient deficiencies, and where possible this should be assessed via chemical analysis or by visual assessment of control plants. | Criteria for selection of test species | 11. | The species selected should be reasonably broad, e.g., considering their taxonomic diversity in the plant kingdom, their distribution, abundance, species specific life-cycle characteristics and region of natural occurrence, to develop a range of responses (8) (10) (16) (17) (18) (19) (20). The following characteristics of the possible test species should be considered in the selection: | — | the species have uniform seeds that are readily available from reliable standard seed source(s) and that produce consistent, reliable and even germination, as well as uniform seedling growth; | — | plant is amenable to testing in the laboratory, and can give reliable and reproducible results within and across testing facilities; | — | the sensitivity of the species tested should be consistent with the responses of plants found in the environment exposed to the chemical; | — | they have been used to some extent in previous toxicity tests and their use in, for example, herbicide bioassays, heavy metal screening, salinity or mineral stress tests or allelopathy studies indicates sensitivity to a wide variety of stressors; | — | they are compatible with the growth conditions of the test method; | — | they meet the validity criteria of the test. | Some of the historically most used test species are listed in Appendix 2 and potential non-crop species in Appendix 3. | 12. | The number of species to be tested is dependent on relevant regulatory requirements, therefore it is not specified in this test method. | Application of the test chemical | 13. | The chemical should be applied in an appropriate carrier (e.g. water, acetone, ethanol, polyethylene glycol, gum Arabic, sand). Mixtures (formulated products or formulations) containing active ingredients and various adjuvants can be tested as well. | Incorporation into soil/artificial substrate | 14. | Chemicals which are water soluble or suspended in water can be added to water, and then the solution is mixed with soil with an appropriate mixing device. This type of test may be appropriate if exposure to the chemical is through soil or soil pore-water and that there is concern for root uptake. The water-holding capacity of the soil should not be exceeded by the addition of the test chemical. The volume of water added should be the same for each test concentration, but should be limited to prevent soil agglomerate clumping. | 15. | Chemicals with low water solubility should be dissolved in a suitable volatile solvent (e.g. acetone, ethanol) and mixed with sand. The solvent can then be removed from the sand using a stream of air while continuously mixing the sand. The treated sand is mixed with the experimental soil. A second control is established which receives only sand and solvent. Equal amounts of sand, with solvent mixed and removed, are added to all treatment levels and the second control. For solid, insoluble test chemicals, dry soil and the chemical are mixed in a suitable mixing device. Hereafter, the soil is added to the pots and seeds are sown immediately. | 16. | When an artificial substrate is used instead of soil, chemicals that are soluble in water can be dissolved in the nutrient solution just prior to the beginning of the test. Chemicals that are insoluble in water, but which can be suspended in water by using a solvent carrier, should be added with the carrier, to the nutrient solution. Water-insoluble chemicals, for which there is no non-toxic water-soluble carrier available, should be dissolved in an appropriate volatile solvent. The solution is mixed with sand or glass beads, placed in a rotary vacuum apparatus, and evaporated, leaving a uniform coating of chemical on sand or beads. A weighed portion of beads should be extracted with the same organic solvent and the chemical assayed before the potting containers are filled. | Surface application | 17. | For crop protection products, spraying the soil surface with the test solution is often used for application of the test chemical. All equipment used in conducting the tests, including equipment used to prepare and administer the test chemical, should be of such design and capacity that the tests involving this equipment can be conducted in an accurate way and it will give a reproducible coverage. The coverage should be uniform across the soil surfaces. Care should be taken to avoid the possibilities of chemicals being adsorbed to or reacting with the equipment (e.g. plastic tubing and lipophilic chemicals or steel parts and elements). The test chemical is sprayed onto the soil surface simulating typical spray tank applications. Generally, spray volumes should be in the range of normal agricultural practice and the volumes (amount of water etc. should be reported). Nozzle type should be selected to provide uniform coverage of the soil surface. If solvents and carriers are applied, a second group of control plants should be established receiving only the solvent/carrier. This is not necessary for crop protection products tested as formulations. | Verification of test chemical concentration/rate | 18. | The concentrations/rates of application must be confirmed by an appropriate analytical verification. For soluble chemicals, verification of all test concentrations/rates can be confirmed by analysis of the highest concentration test solution used for the test with documentation on subsequent dilution and use of calibrated application equipment (e.g., calibrated analytical glassware, calibration of sprayer application equipment). For insoluble chemicals, verification of compound material must be provided with weights of the test chemical added to the soil. If demonstration of homogeneity is required, analysis of the soil may be necessary. | PROCEDURE | Test design | 19. | Seeds of the same species are planted in pots. The number of seeds planted per pot will depend upon the species, pot size and test duration. The number of plants per pot should provide adequate growth conditions and avoid overcrowding for the duration of the test. The maximum plant density would be around 3 - 10 seeds per 100 cm2 depending to the size of the seeds. As an example, one to two corn, soybean, tomato, cucumber, or sugar beet plants per 15 cm container; three rape or pea plants per 15 cm container; and 5 to 10 onion, wheat, or other small seeds per 15 cm container are recommended. The number of seeds and replicate pots (the replicate is defined as a pot, therefore plants within the same pot do not constitute a replicate) should be adequate for optimal statistical analysis (21). It should be noted that variability will be greater for test species using fewer large seeds per pot (replicate), when compared to test species where it is possible to use greater numbers of small seeds per pot. By planting equal seed numbers in each pot this variability may be minimized. | 20. | Control groups are used to assure that effects observed are associated with or attributed only to the test chemical exposure. The appropriate control group should be identical in every respect to the test group except for exposure to the test chemical. Within a given test, all test plants including the controls should be from the same source. To prevent bias, random assignment of test and control pots is required. | 21. | Seeds coated with an insecticide or fungicide (i.e. “dressed” seeds) should be avoided. However, the use of certain non-systemic contact fungicides (e.g. captan, thiram) is permitted by some regulatory authorities (22). If seed-borne pathogens are a concern, the seeds may be soaked briefly in a weak 5 % hypochlorite solution, then rinsed extensively in running water and dried. No remedial treatment with other crop protection product is allowed. | Test conditions | 22. | The test conditions should approximate those conditions necessary for normal growth for the species and varieties tested (Appendix 4 provides examples of test condition). The emerging plants should be maintained under good horticultural practices in controlled environment chambers, phytotrons, or greenhouses. When using growth facilities these practices usually include control and adequately frequent (e.g. daily) recording of temperature, humidity, carbon dioxide concentration, light (intensity, wave length, photosynthetically active radiation) and light period, means of watering, etc., to assure good plant growth as judged by the control plants of the selected species. Greenhouse temperatures should be controlled through venting, heating and/or cooling systems. The following conditions are generally recommended for greenhouse testing: | — | temperature: 22 °C ± 10 °C; | — | humidity: 70 % ± 25 %; | — | photoperiod: minimum 16 hour light; | — | light intensity: 350 ± 50 μE/m2/s. Additional lighting may be necessary if intensity decreases below 200 μE/m2/s, wavelength 400 - 700 nm except for certain species whose light requirements are less. | Environmental conditions should be monitored and reported during the course of the study. The plants should be grown in non-porous plastic or glazed pots with a tray or saucer under the pot. The pots may be repositioned periodically to minimize variability in growth of the plants (due to differences in test conditions within the growth facilities). The pots must be large enough to allow normal growth. | 23. | Soil nutrients may be supplemented as needed to maintain good plant vigour. The need and timing of additional nutrients can be judged by observation of the control plants. Bottom watering of test containers (e.g. by using glass fiber wicks) is recommended. However, initial top watering can be used to stimulate seed germination and, for soil surface application it facilitates movement of the chemical into the soil. | 24. | The specific growing conditions should be appropriate for the species tested and the test chemical under investigation. Control and treated plants must be kept under the same environmental conditions, however, adequate measures should be taken to prevent cross exposure (e.g. of volatile chemicals) among different treatments and of the controls to the test chemical. | Testing at a single concentration/rate | 25. | In order to determine the appropriate concentration/rate of a chemical for conducting a single-concentration or rate (challenge/limit) test, a number of factors must be considered. For general chemicals, these include the physical/chemical properties of the chemical. For crop protection products, the physical/chemical properties and use pattern of the test chemical, its maximum concentration or application rate, the number of applications per season and/or the persistence of the test chemical need to be considered. To determine whether a general chemical possesses phytotoxic properties, it may be appropriate to test at a maximum level of 1 000 mg/kg dry soil. | Range-finding test | 26. | When necessary a range-finding test could be performed to provide guidance on concentrations/rates to be tested in definitive dose-response study. For the range-finding test, the test concentrations/rates should be widely spaced (e.g. 0,1, 1,0, 10, 100 and 1 000 mg/kg dry soil). For crop protection products concentrations/rates could be based on the recommended or maximum concentration or application rate, e.g. 1/100, 1/10, 1/1 of the recommended/maximum concentration or application rate. | Testing at multiple concentrations/rates | 27. | The purpose of the multiple concentration/rate test is to establish a dose-response relationship and to determine an ECx or ERx value for emergence, biomass and/or visual effects compared to un-exposed controls, as required by regulatory authorities. | 28. | The number and spacing of the concentrations or rates should be sufficient to generate a reliable dose-response relationship and regression equation and give an estimate of the ECx. or ERx. The selected concentrations/rates should encompass the ECx or ERx values that are to be determined. For example, if an EC50 value is required it would be desirable to test at rates that produce a 20 to 80 % effect. The recommended number of test concentrations/rates to achieve this is at least five in a geometric series plus untreated control, and spaced by a factor not exceeding three. For each treatment and control group, the number of replicates should be at least four and the total number of seeds should be at least 20. More replicates of certain plants with low a germination rate or variable growth habits may be needed to increase the statistical power of the test. If a larger number of test concentrations/rates are used, the number of replicates may be reduced. If the NOEC is to be estimated, more replicates may be needed to obtain the desired statistical power (23). | Observations | 29. | During the observation period, i.e. 14 to 21 days after 50 % of the control plants (also solvent controls if applicable) have emerged, the plants are observed frequently (at least weekly and if possible daily) for emergence and visual phytotoxicity and mortality. At the end of the test, measurement of percent emergence and biomass of surviving plants should be recorded, as well as visible detrimental effects on different parts of the plant. The latter include abnormalities in appearance of the emerged seedlings, stunted growth, chlorosis, discoloration, mortality, and effects on plant development. The final biomass can be measured using final average dry shoot weight of surviving plants, by harvesting the shoot at the soil surface and drying them to constant weight at 60 °C. Alternatively, the final biomass can be measured using fresh shoot weight. The height of the shoot may be another endpoint, if required by regulatory authorities. A uniform scoring system for visual injury should be used to evaluate the observable toxic responses. Examples for performing qualitative and quantitative visual ratings are provided in references (23) (24). | DATA AND REPORTING | Statistical analysis | Single concentration/rate test | 30. | Data for each plant species should be analyzed using an appropriate statistical method (21). The level of effect at the test concentration/rate should be reported, or the lack of reaching a given effect at the test concentration/rate (e.g., < x % effect observed at y concentration or rate) | Multiple concentration/rate test | 31. | A dose-response relationship is established in terms of a regression equation. Different models can be used: for example, for estimating ECx or ERx (e.g. EC25, ER25, EC50, ER50) and its confidence limits for emergence as quantal data, logit, probit, Weibull, Spearman-Karber, trimmed Spearman-Karber methods, etc. could be appropriate. For the growth of the seedlings (weight and height) as continuous endpoints ECx or ERx and its confidence limits can be estimated by using appropriate regression analysis (e.g. Bruce-Versteeg non-linear regression analysis (25)). Wherever possible, the R2 should be 0,7 or higher for the most sensitive species and the test concentrations/rates used encompass 20 % to 80 % effects. If the NOEC is to be estimated, application of powerful statistical tests should be preferred and these should be selected on the basis of data distribution (21) (26). | Test report | 32. | The test report should present results of the studies as well as a detailed description of test conditions, a thorough discussion of results, analysis of the data, and the conclusions drawn from the analysis. A tabular summary and abstract of results should be provided. The report must include the following: | | Test chemical: | — | chemical identification data, relevant properties of the chemical tested (e.g. log Pow, water solubility, vapour pressure and information on environmental fate and behaviour, if available); | — | details on preparation of the test solution and verification of test concentrations as specified in paragraph 18. | | Test species: | — | details of the test organism: species/variety, plant families, scientific and common names, source and history of the seed as detailed as possible (i.e. name of the supplier, percentage germination, seed size class, batch or lot number, seed year or growing season collected, date of germination rating), viability, etc.; | — | number of mono- and di-cotyledon species tested; | — | rationale for selecting the species; | — | description of seed storage, treatment and maintenance. | | Test conditions: | — | testing facility (e.g. growth chamber, phytotron and greenhouse); | — | description of test system (e.g., pot dimensions, pot material and amounts of soil); | — | soil characteristics (texture or type of soil: soil particle distribution and classification, physical and chemical properties including % organic matter, % organic carbon and pH); | — | soil/substrate (e.g. soil, artificial soil, sand and others) preparation prior to test; | — | description of nutrient medium if used; | — | application of the test chemical: description of method of application, description of equipment, exposure rates and volumes including chemical verification, description of calibration method and description of environmental conditions during application; | — | growth conditions: light intensity (e.g. PAR, photosynthetically active radiation), photoperiod, max/min temperatures, watering schedule and method, fertilization; | — | number of seeds per pot, number of plants per dose, number of replicates (pots) per exposure rate; | — | type and number of controls (negative and/or positive controls, solvent control if used); | — | duration of the test. | | Results: | — | table of all endpoints for each replicate, test concentration/rate and species; | — | the number and percent emergence as compared to controls; | — | biomass measurements (shoot dry weight or fresh weight) of the plants as percentage of the controls; | — | shoot height of the plants as percentage of the controls, if measured; | — | percent visual injury and qualitative and quantitative description of visual injury (chlorosis, necrosis, wilting, leaf and stem deformation, as well as, any lack of effects) by the test chemical as compared to control plants; | — | description of the rating scale used to judge visual injury, if visual rating is provided; | — | for single rate studies, the percent injury should be reported; | — | ECx or ERx (e.g. EC50, ER50, EC25, ER25) values and related confidence limits. Where regression analysis is performed, provide the standard error for the regression equation, and the standard error for individual parameter estimate (e.g. slope, intercept); | — | NOEC (and LOEC) values if calculated; | — | description of the statistical procedures and assumptions used; | — | graphical display of these data and dose-response relationship of the species tested. | Deviations from the procedures described in this test method and any unusual occurrences during the test. | LITERATURE | (1) | Schrader G., Metge K., and Bahadir M. (1998). Importance of salt ions in ecotoxicological tests with soil arthropods. Applied Soil Ecology, 7, 189-193. | (2) | International Organisation of Standards. (1993). ISO 11269-1. Soil Quality -- Determination of the Effects of Pollutants on Soil Flora — Part 1: Method for the Measurement of Inhibition of Root Growth. | (3) | International Organisation of Standards. (1995). ISO 11269-2. Soil Quality -- Determination of the Effects of Pollutants on Soil Flora — Part 2: Effects of Chemicals on the Emergence and Growth of Higher Plants. | (4) | American Standard for Testing Material (ASTM). (2002). E 1963-98. Standard Guide for Conducting Terrestrial Plant Toxicity Tests. | (5) | U.S. EPA. (1982). FIFRA, 40CFR, Part 158.540. Subdivision J, Parts 122-1 and 123-1. | (6) | US EPA. (1996). OPPTS Harmonized Test Guidelines, Series 850. Ecological Effects Test Guidelines: | — | 850.4000: Background — Non-target Plant Testing; | — | 850.4025: Target Area Phytotoxicity; | — | 850.4100: Terrestrial Plant Toxicity, Tier I (Seedling Emergence); | — | 850.4200: Seed Germination/Root Elongation Toxicity Test; | — | 850.4225: Seedling Emergence, Tier II; | — | 850.4230: Early Seedling Growth Toxicity Test. | (7) | AFNOR, X31-201. (1982). Essai d'inhibition de la germination de semences par une substance. AFNOR X31-203/ISO 11269-1. (1993) Determination des effets des polluants sur la flore du sol: Méthode de mesurage de l'inhibition de la croissance des racines. | (8) | Boutin, C., Freemark, K.E. and Keddy, C.J. (1993). Proposed guidelines for registration of chemical pesticides: Non-target plant testing and evaluation. Technical Report Series No.145. Canadian Wildlife Service (Headquarters), Environment Canada, Hull, Québec, Canada. | (9) | Forster, R., Heimbach, U., Kula, C., and Zwerger, P. (1997). Effects of Plant Protection Products on Non-Target Organisms — A contribution to the Discussion of Risk Assessment and Risk Mitigation for Terrestrial Non-Target Organisms (Flora and Fauna). Nachrichtenbl. Deut. Pflanzenschutzd. No 48. | (10) | Hale, B., Hall, J.C., Solomon, K., and Stephenson, G. (1994). A Critical Review of the Proposed Guidelines for Registration of Chemical Pesticides; Non-Target Plant Testing and Evaluation, Centre for Toxicology, University of Guelph, Ontario Canada. | (11) | Soil Texture Classification (US and FAO systems): Weed Science, 33, Suppl. 1 (1985) and Soil Sc. Soc. Amer. Proc. 26:305 (1962). | (12) | Audus, L.J. (1964). Herbicide behaviour in the soil. In: Audus, L.J. ed. The Physiology and biochemistry of Herbicides, London, New York, Academic Press, NY, Chapter 5, pp. 163-206. | (13) | Beall, M.L., Jr. and Nash, R.G. (1969). Crop seedling uptake of DDT, dieldrin, endrin, and heptachlor from soil, J. Agro. 61:571-575. | (14) | Beetsman, G.D., Kenney, D.R. and Chesters, G. (1969). Dieldrin uptake by corn as affected by soil properties, J. Agro. 61:247-250. | (15) | U.S. Food and Drug Administration (FDA). (1987). Environmental Assessment Technical Handbook. Environmental Assessment Technical Assistance Document 4.07, Seedling Growth, 14 pp., FDA, Washington, DC. | (16) | McKelvey, R.A., Wright, J.P., Honegger, J.L. and Warren, L.W. (2002). A Comparison of Crop and Non-crop Plants as Sensitive Indicator Species for Regulatory Testing. Pest Management Science vol. 58:1161-1174 | (17) | Boutin, C.; Elmegaard, N. and Kjær, C. (2004). Toxicity testing of fifteen non-crop plant species with six herbicides in a greenhouse experiment: Implications for risk assessment. Ecotoxicology vol. 13(4): 349-369. | (18) | Boutin, C., and Rogers, C.A. (2000). Patterns of sensitivity of plant species to various herbicides — An analysis with two databases. Ecotoxicology vol. 9(4): 255-271. | (19) | Boutin, C. and Harper, J.L. (1991). A comparative study of the population dynamics of five species of Veronica in natural habitats. J. Ecol. 9:155-271. | (20) | Boutin, C., Lee, H.-B., Peart, T.E., Batchelor, S.P. and Maguire, R.J.. (2000). Effects of the sulfonylurea herbicide metsulfuron methyl on growth and reproduction of five wetland and terrestrial plant species. Envir. Toxicol. Chem. 19 (10): 2532-2541. | (21) | OECD (2006). Guidance Document, Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application. Series on Testing and Assessment No 54, Organisation for Economic Co-operation and Development, Paris. | (22) | Hatzios, K.K. and Penner, D. (1985). Interactions of herbicides with other agrochemicals in higher plants. Rev. Weed Sci. 1:1-63. | (23) | Hamill, P.B., Marriage, P.B. and G. Friesen. (1977). A method for assessing herbicide performance in small plot experiments. Weed Science 25:386-389. | (24) | Frans, R.E. and Talbert, R.E. (1992). Design of field experiments and the measurement and analysis of plant response. In: B. Truelove (Ed.) Research Methods in Weed Science, 2nd ed. Southern weed Science Society, Auburn, 15-23. | (25) | Bruce, R.D. and Versteeg, D. J.(1992). A Statistical Procedure for Modelling Continuous Toxicity Data. Environmental Toxicology and Chemistry 11, 1485-1492. | (26) | Chapter C.33 of this Annex: Earthworm Reproduction Test (Eisenia fetida/Eisenia andrei). | Appendix 1 | Definitions | Active ingredient (a.i.) (or active substance (a.s.)) is a material designed to provide a specific biological effect (e.g., insect control, plant disease control, weed control in the treatment area), also known as technical grade active ingredient, active substance. | Chemical means a substance or a mixture. | Crop Protection Products (CPPs) or plant protection product (PPPs) or pesticides are materials with a specific biological activity used intentionally to protect crops from pests (e.g., fungal diseases, insects and competitive plants). | ECx. x % Effect Concentration or ERx. x % Effect Rate is the concentration or the rate that results in an undesirable change or alteration of x % in the test endpoint being measured relative to the control (e.g., 25 % or 50 % reduction in seedling emergence, shoot weight, final number of plants present, or increase in visual injury would constitute an EC25/ER25 or EC50/ER50 respectively). | Emergence is the appearance of the coleoptile or cotyledon above the soil surface. | Formulation is the commercial formulated product containing the active substance (active ingredient), also known as final preparation (6) or typical end-use product (TEP). | LOEC (Lowest Observed Effect Concentration) is the lowest concentration of the test chemical at which effect was observed. In this test, the concentration corresponding to the LOEC, has a statistically significant effect (p < 0,05) within a given exposure period when compared to the control, and is higher than the NOEC value. | Non-target plants: Those plants that are outside the target plant area. For crop protection products, this usually refers to plants outside the treatment area. | NOEC (No Observed Effect Concentration) is the highest concentration of the test chemical at which no effect was observed. In this test, the concentration corresponding to the NOEC, has no statistically significant effect (p < 0,05) within a given exposure period when compared with the control. | Phytotoxicity: Detrimental deviations (by measured and visual assessments) from the normal pattern of appearance and growth of plants in response to a given chemical. | Replicate is the experimental unit which represents the control group and/or treatment group. In these studies, the pot is defined as the replicate. | Visual assessment: Rating of visual damage based on observations of plant stand, vigour, malformation, chlorosis, necrosis, and overall appearance compared with a control. | Test Chemical: Any substance or mixture tested using this test method. | Appendix 2 | List of species historically used in plant testing | Family | Species | Common names | DICOTYLEDONAE | Apiaceae (Umbelliferae) | Daucus carota | Carrot | Asteraceae (Compositae) | Helianthus annuus | Sunflower | Asteraceae (Compositae) | Lactuca sativa | Lettuce | Brassicaceae (Cruciferae) | Sinapis alba | White Mustard | Brassicaceae (Cruciferae) | Brassica campestris var. chinensis | Chinese cabbage | Brassicaceae (Cruciferae) | Brassica napus | Oilseed rape | Brassicaceae (Cruciferae) | Brassica oleracea var. capitata | Cabbage | Brassicaceae (Cruciferae) | Brassica rapa | Turnip | Brassicaceae (Cruciferae) | Lepidium sativum | Garden cress | Brassicaceae (Cruciferae) | Raphanus sativus | Radish | Chenopodiaceae | Beta vulgaris | Sugar beet | Cucurbitaceae | Cucumis sativus | Cucumber | Fabaceae (Leguminosae) | Glycine max (G. soja) | Soybean | Fabaceae (Leguminosae) | Phaseolus aureus | Mung bean | Fabaceae (Leguminosae) | Phaseolus vulgaris | Dwarf bean, French bean, Garden bean | Fabaceae (Leguminosae) | Pisum sativum | Pea | Fabaceae (Leguminosae) | Trigonella foenum-graecum | Fenugreek | Fabaceae (Leguminosae) | Lotus corniculatus | Birdsfoot trefoil | Fabaceae (Leguminosae) | Trifolium pratense | Red Clover | Fabaceae (Leguminosae) | Vicia sativa | Vetch | Linaceae | Linum usitatissimum | Flax | Polygonaceae | Fagopyrum esculentum | Buckwheat | Solanaceae | Solanum lycopersicon | Tomato | MONOCOTYLEDONAE | Liliaceae (Amarylladaceae) | Allium cepa | Onion | Poaceae (Gramineae) | Avena sativa | Oats | Poaceae (Gramineae) | Hordeum vulgare | Barley | Poaceae (Gramineae) | Lolium perenne | Perennial ryegrass | Poaceae (Gramineae) | Oryza sativa | Rice | Poaceae (Gramineae) | Secale cereale | Rye | Poaceae (Gramineae) | Sorghum bicolor | Grain sorghum, Shattercane | Poaceae (Gramineae) | Triticum aestivum | Wheat | Poaceae (Gramineae) | Zea mays | Corn | Appendix 3 | List of potenatial non-crop species | OECD Potential Species for Plant Toxicity Testing | Note: The following table provides information for 52 non-crop species (references are given in brackets for each entry). Emergence rates provided are from published literature and are for general guidance only. Individual experience may vary depending upon seed source and other factors. | FAMILY Species Botanical Name | (English Common Name) | Lifespan (7) & Habitat | Seed Weight | (mg) | Photoperiod for germination or growth (8) | Planting Depth | (mm) (9) | Time to Germinate | (days) (10) | Special Treatments (11) | Toxicity Test (12) | Seed Suppliers (13) | Other References (14) | APIACEAE | Torilis japónica | (Japanese Hedge-parsley) | А, В disturbed areas, hedgerows, pastures (16, 19) | 1,7-1,9 (14, 19) | L = D (14) | 0 | (1, 19) | 5 (50 %) (19) | cold stratification (7, 14, 18, 19) maturation may be necessary (19) germination inhibited by darkness (1, 19) no special treatments (5) | POST (5) | | | ASTERACEAE | Bellis perennis | (English Daisy) | Ρ | grassland, arable fields, turf (16, 19) | 0,09-0,17 (4, 19) | L = D (14) | 0 | (4) | 3 (50 %) (19) | 11 (100 %) (18) | germination not affected by irradiance (18, 19) no special treatments (4, 14) | POST (4) | A, D, F | 7 | Centaurea cyanus | (Cornflower) | A | fields, roadsides, open habitats (16) | 4,1 -4,9 (4, 14) | L = D (14) | 0-3 (2, 4, 14) | 14-21 (100 %) (14) | no special treatments (2, 4) | POST (2,4) | A, D, E, F | 7 | Centaurea nigra | (Black Knapweed) | Ρ | fields, roadsides, open habitats (16, 19) | 2,4-2,6 (14, 19) | L = D (14) | 0 (19) | 3 (50 %) (19) | 4 (97 %) (18) | maturation may be necessary (18, 19) germination inhibited by darkness (19) no special treatments (5, 14, 26) | POST (5, 22, 26) | A | | Inula helenium | Elecampane | Ρ | moist, disturbed sites | (16) | 1-1,3 (4, 14, 29) | | 0 | (4, 29) | | no special treatments (4) | POST (4) | A, F | | Leontodon hispidus | (Big Hawkbit) | Ρ | fields, roadsides, disturbed areas (16, 19) | 0,85 -1,2 (14, 19) | L = D (14) | 0 (19) | 4 (50 %) (19) | 7 (80 %) (18) | germination inhibited by darkness (17, 18, 19) no special treatments (5, 23) | POST (5, 22, 23) | | | Rudbeckia hirta | (Black-eyed Susan) | Β, Ρ disturbed | (16) | 0,3 (4, 14) | L = D (14) | 0 | (4, 33) | < 10 (100 %) (33) | no special treatments | (4, 14, 33) | POST (4, 33) | C, D, E, F | | Solidago canadensis | Canada Goldenrod | Ρ | pasture, open areas (16) | 0,06-0,08 (4, 14) | L = D (11) | 0 | (4) | 14-21 | (11) | mix with equal part sand and soak in 500 ppm GA for 24 hrs (11) no special treatments (4) | POST (4) | E, F | | Xanthium pensylvanicum | (Common Cocklebur) | A | fields, open habitats (16) | 25-61 (14, 29) | | 0(1) | 5(29) | | germination may be inhibited by darkness (1) soak in warm water for 12 hrs (29) | PRE & POST (31) | A | | Xanthium spinosum | (Spiny Cocklebur) | A | open habitats (16) | 200 (14) | L = D (14) | L > D (6) | 10 | (6) | | scarification (14) no special treatments (6) | PRE & POST (6) | A | | Xanthium strumarium | (Italian Cocklebur) | A | fields, open habitats (16) | 67,4 (14) | L = D (14) | 10-20 (6, 21) | | no special treatments | (6, 14, 21) | PRE & POST (6, 21, 28, 31) | A | | BRASSICACEAE | Cardamine pratensis | (Cuckoo Flower) | Ρ | fields, roadsides, turf (16, 19) | 0,6 (14, 19) | L = D (14) | 0 (19) | 5 (50 %) (19) | 15 (98 %) (18) | germination inhibited by darkness (18, 19) no special treatments (5, 14, 22) | POST (5, 22) | F | | CARYOPHYLLACEAE | Lychnis flos-cuculi | (Ragged Robin) | Ρ | (16) | 0,21 (14) | L = D (14) | | < 14 (100 %) (14, 25) | maturation may be necessary (18) no special treatments (5, 14, 15, 22-26) | POST (5, 15, 22-26) | F | | CHENOPODIACEAE | Chenopodium album | (Lamb's Quarters) | A | field margins, disturbed areas (16, 19) | 0,7- 1,5 (14, 19, 34) | L = D (14) | 0 | (1, 19) | 2 (50 %) (19) | treatment differs depending on seed colour (19) dry storage dormancy (19) germination inhibited by darkness (1, 18, 19) cold stratification (18) no special treatments (14, 34) | PRE & POST (28, 31, 34) | A | 32 | CLUSIACEAE | Hypericum perforatum | (Common St. John's Wort) | Ρ | fields, arable land, open habitats (16, 19) | 0,1 -0,23 | (14, 19) | L= D | (14) | 0 | (1, 19) | 3 (19) | 11 (90 %) (18) | germination inhibited by darkness (1, 18, 19) | no special treatments (5, 14, 15, 25, 27) | POST | (5, 15, 25, 27) | A, E, F | | CONVOLVULACEAE | Ipomoea hederacea | (Purple Morning Glory) | A | roadsides, open habitats, cornfields (16) | 28,2 | (14) | L > D | (6, 10) | 10-20 | (6, 10, 21) | 4 (100 %) | (10) | germination not affected by irradiance (1) | no special treatments (6, 21) | PRE & POST | (6, 12, 21, 28) | A | | CYPERACEAE | Cyperus rotundus | (Purple Nutsedge) | Ρ | arable land, pastures, roadsides (16, 30) | 0,2 | (14) | L= D | (14) | 0 (1) | 10-20 (6, 10) | 12 (91 %) | (10) | germination inhibited by darkness (1) | no special treatments (6, 10, 14) | PRE & POST | (6, 28, 31) | B | 7 | FABACEAE | Lotus corniculatus | (Bird's-foot Trefoil) | Ρ | grassy areas, roadsides, open habitats (16, 19) | 1-1,67 | (14, 19) | L = D (14) | | 1 (50 %) | (19) | scarification (14, 19) | germination not affected by irradiance (18, 19) no special treatments (23, 25) | POST | (5, 23, 25) | A, D, E, F | | Senna obtusifolia | (Cassia, Sicklepod) | A | moist woods (16) | 23-28 | (9) | L = D (14) | L > D (9) | 10-20 | (6,9) | | soak seeds in water for 24 hours (9) | scarification (14) seed viability differs depending on colour (1) no special treatments (6) | POST | (6,9) | A | | Sesbania exaltata | (Hemp) | A | alluvial soil (16) | 11- 13 | (9, 14) | L > D (9) | 10-20 | (9, 21) | | soak seeds in water for 24 hours (9) | germination not affected by irradiance (1) no special treatments (21) | PRE & POST | (9, 21, 28, 31) | A | | Trifolium pratense | (Red Clover) | Ρ | fields, roadsides, arable land (16, 19) | 1,4- 1,7 | (14, 19) | L= D (14) | | 1 (50 %) | (19) | scarification (14, 18) | may need maturation (19) germination not affected by irradiance (1, 19) no special treatments (5) | POST | (5) | A, E, F | | LAM IAC E AE | Leonurus cardiaca | (Motherwort) | Ρ | open areas (16) | 0,75 -1,0 | (4, 14) | L= D (14) | 0 | (4) | | no special treatments | (4, 14) | POST | (4) | F | | Mentha spicata | (Spearmint) | Ρ | moist areas (16) | 2,21 | (4) | | 0 | (4) | | no special treatments | (4) | POST | (4) | F | | Nepeta cataria | (Catnip) | Ρ | disturbed areas (16) | 0,54 | (4, 14) | L= D (14) | 0 | (4) | | no special treatments | (2, 4, 14) | POST | (2,4) | F | | Prunella vulgaris | (Self-heal) | Ρ | arable fields, grassy areas, disturbed sites (16, 19) | 0,58 -1,2 | (4, 14, 19) | L= D (14) | 0 | (4, 19) | 5 (50 %) (19) | 7 (91 %) (18) | germination inhibited by darkness (18, 19) | greater germination with larger seeds (1) no special treatments (4, 14, 22) | POST | (4, 22) | A, F | | Stachys officinalis | (Hedge-nettle) | Ρ | grasslands, field margins (19) | 14-18 | (14, 19) | L= D (14) | | 7 (50 %) | (19) | no special treatments | (5, 14, 22) | POST | (5, 22) | F | | MALVACEAE | Abutilón theophrasti | (Velvetleaf) | A | fields, open habitats (16) | 8,8 | (14) | L= D (14) | 10-20 | (6, 10, 21) | 4 (84 %) | (10) | scarification (14) | no special treatments (5, 10, 21) | PRE & POST | (6, 22, 28, 31) | A, F | | Sida spinosa | (Prickly Sida) | A | fields, roadsides (16) | 3,8 | (14) | L= D (14) | 10-20 | (6, 21) | | scarification (14) | germination not affected by irradiance (1) no special treatments (6, 21) | PRE & POST | (6, 21, 28, 31) | A, F | | PAPAVERACEAE | Papaver rhoeas | (Poppy) | A | fields, arable land, disturbed sites (16, 19) | 0,1 -0,3 | (4, 14, 19, 29) | L= D (14) | 0 | (4, 29) | 4 (50 %) | (19) | cold stratification & scarification (1, 19, 32) | no special treatments (4, 14, 29) | POST | (4) | A, D, E, F, G | | POACEAE | Agrostis tenuis | (Common Bentgrass) | lawns, pastures (16) | 0,07 (14) | L > D (Ю) | 20 (10) | 10 (62 %) (10) | germination inhibited by darkness (1, 17-19) no special treatments (10) | POST (10) | A, E | | Alopecurus myosuroides | (Foxtail) | A | fields, open habitats (16) | 0,9-1,6 | (29, 34) | L = D (14) | 2 | (29) | < 24 (30 %) (34) | scarification (14) treat with 101 mg/L KNO3 (14) warm stratification (1) germination inhibited by darkness (1) no special treatments (34) | PRE & POST | (28, 34) | A | 32 | Avena fatua | (Wild Oats) | A | cultivated areas, open habitats (16) | 7-37,5 (14, 30) | L = D (14) | L > D (6) | 10-20 (6, 10) | 3 (70 %) (18) | scarification (7, 32) darkness inhibits germination (1) | cold stratification (1, 18) no special treatments (6, 10, 14) | PRE & POST (6, 10, 28, 31) | A | | Bromus tectorum | (Downy Brome) | A | fields, roadsides, arable land (16) | 0,45-2,28 (14, 29) | L = D (14) | 3 (29) | | maturation period (1, 7, 32) germination inhibited by light (1) no special treatments (14) | PRE & POST (28, 31) | A | | Cynosurus cristatus | (Dog's-tail Grass) | P | fields, roadsides, open habitats (16, 19) | 0,5-0,7 (14, 19, 29) | L = D (14) | 0 (29) | 3 (50 %) (19) | germination not affected by irradiance (19) no special treatments (14, 29) | POST (5) | A | | Digitaria sanguinalis | (Crabgrass) | A | fields, turf, open habitats (16) | 0,52-0,6 (14, 30) | L = D (14) | 10-20 (21) | 7 (75 %) | 14 (94 %) (7) | scarification, cold stratification, & maturation (1, 7, 14, 32) treat with 101 mg/L KNO3 (14) germination inhibited by darkness (1) no special treatments (21) | PRE & POST (18, 25, 31) | A | | Echinochloa crusgalli | (Barnyard Grass) | A | (16) | 1,5 (14) | L = D (14) | L > D (3) | 10-20 (7, 21) | | scarification (7, 32) germination not affected by irradiance (1) no special treatments (3, 14, 21) | PRE & POST (3, 21, 28, 31) | A | | Elymus canadensis | (Canada Wild Rye) | P | riparian, disturbed sites (16) | 4-5 (14, 30) | L = D (11) | 1 | (11) | 14-28 | (11) | no special treatments | (2, 11) | POST (2) | C, D, E | | Festuca pratensis | (Fescue) | P | fields, moist areas (16, 19) | 1,53-2,2 (16, 19) | L = D (14) | L > D (10) | 20 (10) | 9 (74 %) (10) | 2 (50 %) (19) | no special treatments | (10, 19) | POST (10) | A | 7 | Hordeum pusillum | (Little Barley) | A | pastures, roadsides, open habitats (16) | 3,28 (14) | | | | warm stratification (1) germination not affected by irradiance (1) | PRE (31) | | 7 | Phieum pratense | (Timothy) | P | pastures, arable fields, disturbed sites (16, 19) | 0,45 (14, 19) | L > D (10, 14) | 0-10 (10, 19) | 2 (74 %) (10) | 8 (50 %) (19) | germination inhibited by darkness (19) germination not affected by irradiance (17) no special treatments (10, 14, 17, 19) | POST (10) | A, E | | POLYGONACEAE | Polygonum convolvulus | (Black Bindweed) | A | open habitats, roadsides (16) | 5-8 (4, 14, 29) | L = D (20) | 0-2 (4, 29) | | cold stratification for 4 — 8 weeks (1, 2, 4, 20, 29) germination not affected by irradiance (1) | PRE & POST 1, 2, 20, 28, 31 | A | 32 | Polygonum lapathifolium | (Pale Persicaria) | A | moist soil (16) | 1,8-2,5 (14) | L > D (6) | | 5 (94 %) (18) | germination not affected by irradiance (1) germination inhibited by darkness (18) cold stratification (1) no special treatments (5) | PRE & POST (6) | A, E | | Polygonum pennsylvanicum | (Pennsylvania Smartweed) | A | fields, open habitats (16) | 3,6-7 (14, 29) | | 2 (29) | | cold stratification for 4 wks at 0 — 5oC (1, 29) germination inhibited by darkness (1) | PRE (31) | A, E | | Polygonum periscaria | (Smartweed) | A | disturbed areas, arable land (16, 19) | 2,1 -2,3 (14, 19) | L > D (13) | 0 (19) | < 14 (13) | 2 (50 %) (19) | scarification, cold stratification, GA treatment (14) cold stratification, maturation (17-19) germination inhibited by darkness (19) no special treatments (13) | POST (13) | A | 32 | Rumex crispus | (Curly Dock) | P | arable fields, roadsides open areas (16, 19) | 1,3-1,5 (4, 14, 19) | L = D (14, 33) | 0 | (4, 19, 33) | 3 (50 %) (19) | 6 (100 %) (33) | germination inhibited by darkness (18, 19) maturation may be necessary (18) no special treatments (4, 14, 33) | POST (4, 33) | A, E | 32 | PRIMULACEAE | Anagallis arvensis | (Scarlett Pimpernel) | A | arable fields, open areas, disturbed sites (16, 19) | 0,4-0,5 (4, 14, 19) | L = D (14) | | 1 (50 %) (19) | cold stratification, GA treatment (1,14, 18, 19, 32) light required for germination (1) no special treatments (2, 4) | POST (2,4) | A, F | | RANUNCULACEAE | Ranunculus acris | (Common Buttercup) | Ρ | arable fields, roadsides, open areas (16, 19) | 1,5-2 (14, 19, 29) | L = D (14) | 1 | (29) | 41 -56 (19, 29) | no special treatments | (5, 14, 22, 24 -26) | POST (5, 22, 24-26) | | 32 | ROSACEAE | Geum urbanum | (Yellow Avens) | Ρ | hedgerows, moist areas | (16, 19) | 0,8 — 1,5 (14, 19) | L = D (14) | 0 (19) | 5 (50 %) (19) | 16 (79 %) (18) | germination inhibited by darkness (18, 19) warm stratification (1) no special treatments (5, 14, 22, 25, 26) | POST (5, 22, 25, 26) | A | | RUBIACEAE | Galium aparine | (Cleavers) | A | arable fields, moist areas, disturbed sites (16, 19) | 7-9 (14, 19) | L = D (14) | | 5 (50 %) (19) | 6 (100 %) (18) | cold stratification (1, 18, 19) germination not affected by irradiance (18, 19) light inhibits germination (1) no special treatments (6, 14) | PRE & POST (6, 28) | A | 32 | Galium mollugo | (Hedge Bedstraw) | Ρ | hedgebanks, open areas (8) | 7 | (29) | L = D (14) | 2 | (29) | | no special treatments | (5, 14, 22, 24, 26, 29) | POST (5, 22, 24, 26) | A | | SCROPHULARIACEAE | Digitalis purpurea | (Foxglove) | Β, Ρ hedgerows, open areas (16, 19) | 0,1 -0,6 (4, 14, 19) | L = D (14) | 0 | (4, 19) | 6 (50 %) (19) | 8 (99 %) (18) | germination inhibited by darkness (1, 17-19) no special treatments (4, 22-26) | POST (4, 22 — 26) | D, G, F | | Veronica persica | (Speedwell) | A | arable fields, open areas, disturbed sites (16, 19) | 0,5-0,6 (14, 19) | L = D (14) | 0 (19) | 3(19) | 5 (96 %) (18) | germination inhibited by darkness (18, 19) cold stratification (18) no special treatments (14) | PRE & POST (28) | A | 32 | Seed Suppliers Cited | Supplier ID | Supplier Information | A | Herbiseed | New Farm, Mire Lane, West End, Twyford RG10 0NJ ENGLAND +44 (0) 1189 349 464 | www. herbiseed.com | B | Tropilab Inc. | 8240 Ulmerton Road, Largo, FL 33771-3948 USA | (727) 344 - 4050 | www.tropilab.com | C | Pterophylla — Native Plants & Seeds | #316 Regional Road 60, RR#1, Walsingham, ON N0E 1X0 CANADA (519) 586 - 3985 | D | Applewood Seed Co. | 5380 Vivian St., Arvada, CO 80002 USA (303) 431 - 7333 | www.applewoodseed.com | E | Ernst Conservation Seeds | 9006 Mercer Pike, Meadville, PA 16335 USA | (800) 873 - 3321 | www.ernstseed.com | F | Chiltern Seeds | Bortree Stile, Ulverston, Cumbria LA12 7PB ENGLAND | +44 1229 581137 | www.chiltemseeds.co.uk | G | Thompson & Morgan | P.O. Box 1051, Fort Erie, ON L2A 6C7 CANADA (800) 274 - 7333 | www.thompson-morgan.com | REFERENCES CITED | (1) | Baskin, C.C. & Baskin, J.M. 1998. Seeds. Academic Press, Toronto | (2) | Blackburn, L.G. & Boutin, C. 2003. Subtle effects of herbicide use in the context of genetically modified crops: a case study with glyphosate (Round-Up®). Ecotoxicology, 12:271-285. | (3) | Boutin, C., Lee, H-B., Peart, T., Batchelor, P.S., & Maguire, R.J. 2000. Effects of the sulfonylurea herbicide metsulfuron methyl on growth and reproduction of five wetland and terrestrial plant species. Environmental Toxicology & Chemistry, 19(10):2532-2541. | (4) | Boutin, C., Elmegaard, N., & Kjaer, C. 2004. Toxicity testing of fifteen non-crop plant species with six herbicides in a greenhouse experiment: implications for risk assessment. Ecotoxicology, 13:349-369. | (5) | Breeze, V., Thomas, G., & Butler, R. 1992. Use of a model and toxicity data to predict the risks to some wild plant species from drift of four herbicides. Annals of Applied Biology, 121:669-677. | (6) | Brown, R.A., & Farmer, D. 1991. Track-sprayer and glasshouse techniques for terrestrial plant bioassays with pesticides. In: Plants for toxicity assessment: 2nd volume. ASTM STP 1115, J.W. Gorsuch, W.R. Lower, W. Wang, & M.A. Lewis, eds. American Society for Testing & Materials, Philadelphia. pp 197 - 208. | (7) | Buhler, D.D. & Hoffman, M.L. 1999. Anderson's guide to practical methods of propagating weeds and other plants. Weed Science Society of America, Lawrence, K. | (8) | Clapham, A.R., Tutin, T.G., & Warburg, E.F. 1981. Excursion flora of the British Isles, 3rd ed. Cambridge University Press, Cambridge | (9) | Clay, P.A. & Griffin, J.L. 2000. Weed seed production and seedling emergence response to late-season glyphosate applications. Weed Science, 48:481-486. | (10) | Cole, J.F.H. & Canning, L. 1993. Rationale for the choice of species in the regulatory testing of the effects of pesticides on terrestrial non-target plants. BCPC — Weeds. pp. 151 - 156. | (11) | Fiely, M. (Ernst Conservation Seeds). 2004. Personal communication. (www.ernstseed.com) | (12) | Fletcher, J.S., Johnson, F.L., & McFarlane, J.C. 1990. Influence of greenhouse versus field testing and taxonomic differences on plant sensitivity to chemical treatment. Environmental Toxicology & Chemistry, 9:769-776. | (13) | Fletcher, J.S., Pfleeger, T.G., Ratsch, H.C., & Hayes, R. 1996. Potential impact of low levels of chlorsulfuron and other herbicides on growth and yield of nontarget plants. Environmental Toxicology & Chemistry, 15(7):1189-1196. | (14) | Flynn, S., Turner, R.M., and Dickie, J.B. 2004. Seed Information Database (release 6.0, Oct 2004) Royal Botanic Gardens, Kew (www.rbgkew.org.uk/data/sid) | (15) | Franzaring, J., Kempenaar, C., & van der Eerden, L.J.M. 2001. Effects of vapours of chlorpropham and ethofumesate on wild plant species. Environmental Pollution, 114:21-28. | (16) | Gleason, H.A. & Cronquist, A. 1991. Manual of vascular plants of northeastern United States and adjacent Canada, 2nd ed. New York Botanical Garden, Bronx, NY | (17) | Grime, J.P. 1981. The role of seed dormancy in vegetation dynamics. Annals of Applied Biology, 98:555-558. | (18) | Grime, J.P., Mason, G., Curtis, A.V., Rodman, J., Band, S.R., Mowforth, M.A.G., Neal, A.M., & Shaw, S. 1981. A comparative study of germination characteristics in a local flora. Journal of Ecology, 69:1017-1059. | (19) | Grime, J.P., Hodgson, J.G., & Hunt, R. 1988. Comparative plant ecology: a functional approach to common British species. Unwin Hyman Ltd., London | (20) | Kjaer, C. 1994. Sublethal effects of chlorsulfuron on black bindweed (Polygonum convolvulus L.). Weed Research, 34:453-459. | (21) | Klingaman, T.E., King, C.A., & Oliver, L.R. 1992. Effect of application rate, weed species, and weed stage of growth on imazethapyr activity. Weed Science, 40:227-232. | (22) | Marrs, R.H., Williams, C.T., Frost, A.J., & Plant, R.A. 1989. Assessment of the effects of herbicide spray drift on a range of plant species of conservation interest. Environmental Pollution, 59:71-86. | (23) | Marrs, R.H., Frost, A.J., & Plant, R.A. 1991. Effects of herbicide spray drift on selected species of nature conservation interest: the effects of plant age and surrounding vegetation structure. Environmental Pollution, 69:223-235. | (24) | Marrs, R.H., Frost, A.J., & Plant, R.A. 1991. Effects of mecoprop drift on some plant species of conservation interest when grown in standardized mixtures in microcosms. Environmental Pollution, 73:25-42. | (25) | Marrs, R.H., Frost, A.J., Plant, R.A., & Lunnis, P. 1993. Determination of buffer zones to protect seedlings of non-target plants from the effects of glyphosate spray drift. Agriculture, Ecosystems, & Environment, 45:283-293. | (26) | Marrs, R.H. & Frost, A.J. 1997. A microcosm approach to detection of the effects of herbicide spray drift in plant communities. Journal of Environmental Management, 50:369-388. | (27) | Marshall, E.J.P. & Bernie, J.E. 1985. Herbicide effects on field margin flora. BCPC — Weeds. pp. 1021-1028. | (28) | McKelvey, R.A., Wright, J.P., & Honegger, J.L. 2002. A comparison of crop and non-crop plants as sensitive species for regulatory testing. Pest Management Science, 58:1161-1174. | (29) | Morton, S. (Herbiseed). 2004. Personal communication. (http://www.herbiseed.com) | (30) | USDA, NRCS. 2004. The Plants Database, version 3.5. (http://plants.usda.gov). National Plant Data Centre, Baton Rouge, LA 70874-4490 USA | (31) | USEPA. 1999. One-Liner Database. [U.S. E.P.A./Office of Pesticide Programs/Environmental Fate and Effects Division/Environmental Epidemiology Branch]. | (32) | Webster, R.H. 1979. Technical Report No. 56: Growing weeds from seeds and other propagules for experimental purposes. Agricultural Research Council Weed Research Organization, Oxford. | (33) | White, A. L. & Boutin, C. (National Wildlife Research Centre, Environment Canada). 2004. Personal communication. | (34) | Zwerger, P. & Pestemer, W. 2000. Testing the phytotoxic effects of herbicides on higher terrestrial non-target plants using a plant life-cycle test. Z. PflKrankh. PflSchutz, Sonderh., 17:711-718. | Appendix 4 | Examples for appropriate growth conditions for certain crop species | The following conditions have been found suitable for 10 crop species, and can be used as a guidance for tests in growth chambers with certain other species as well: | Carbon dioxide concentration: 350 ± 50 ppm; | Relative humidity: 70 ± 5 % during light periods and 90 ± 5 % during dark periods; | Temperature: 25 ± 3 °C during the day, 20 ± 3 °C during the night; | Photoperiod: 16 hour light/8 hour darkness, assuming an average wavelength of 400 to 700 nm; | Light: luminance of 350 ± 50 μE/m2/s, measured at the top of the canopy. | The crop species are: | — | tomato (Solanum lycopersicon); | — | cucumber (Cucumis sativus); | — | lettuce (Lactuca sativa); | — | soybean (Glycine max); | — | cabbage (Brassica oleracea var. capitata); | — | carrot (Daucus carota); | — | oats (Avena sativa); | — | perennial ryegrass (Lolium perenne); | — | corn (Zea mays); | — | onion (Allium cepa). | C.32. ENCHYTRAEID REPRODUCTION TEST | INTRODUCTION | 1. | This test method is equivalent to OECD test guideline (TG) 220 (2004). It is designed to be used for assessing the effects of chemicals on the reproductive output of the enchytraeid worm, Enchytraeus albidus Henle 1873, in soil. It is based principally on a method developed by the Umweltbundesamt, Germany (1) that has been ring-tested (2). Other methods for testing the toxicity of chemicals to Enchytraeidae and earthworms have also been considered (3)(4)(5)(6)(7)(8). | INITIAL CONSIDERATIONS | 2. | Soil-dwelling annelids of the genus Enchytraeus are ecologically relevant species for ecotoxicological testing. Whilst enchytraeids are often found in soils containing earthworms it is also true that they are often abundant in many soils where earthworms are absent. Enchytraeids can be used in laboratory tests as well as in semi-field and field studies. From a practical point of view, many Enchytraeus species are easy to handle and breed, and their generation time is significantly shorter than that of earthworms. The duration for a reproduction test with enchytraeids is therefore only 4-6 weeks while for earthworms (Eisenia fetida) it is 8 weeks. | 3. | Basic information on the ecology and ecotoxicology of enchytraeids in the terrestrial environment can be found in (9)(10)(11)(12). | PRINCIPLE OF THE TEST | 4. | Adult enchytraeid worms are exposed to a range of concentrations of the test chemical mixed into an artificial soil. The test can be divided into two steps: (a) a range-finding test, in case no sufficient information is available, in which mortality is the main endpoint assessed after two weeks exposure and (b) a definitive reproduction test in which the total number of juveniles produced by parent animal and the survival of parent animals are assessed. The duration of the definitive test is six weeks. After the first three weeks, the adult worms are removed and morphological changes are recorded. After an additional three weeks, the number of offspring, hatched from the cocoons produced by the adults, is counted. The reproductive output of the animals exposed to the test chemical is compared to that of the control(s) in order to determine (i) the no observed effect concentration (NOEC) and/or (ii) ECx (e.g. EC10, EC50) by using a regression model to estimate the concentration that would cause a x % reduction in reproductive output. The test concentrations should bracket the ECx (e.g. EC10, EC50) so that the ECx then comes from interpolation rather than extrapolation. | INFORMATION ON THE TEST CHEMICAL | 5. | The water solubility, the log Kow, the soil water partition coefficient (e.g. Chapter C.18 or C.19 of this Annex) and the vapour pressure of the test chemical should preferably be known. Additional information on the fate of the test chemical in soil, such as the rates of photolysis and hydrolysis is desirable. | 6. | This test method can be used for water soluble or insoluble chemicals. However, the mode of application of the test chemical will differ accordingly. The test method is not applicable to volatile chemicals, i.e. chemicals for which the Henry's constant or the air/water partition coefficient is greater than one, or chemicals for which the vapour pressure exceeds 0,0133 Pa at 25 °C. | VALIDITY OF THE TEST | 7. | For the test to be valid, the following performance criteria should be met in the controls: | — | adult mortality should not exceed 20 % at the end of the range-finding test and after the first three weeks of the reproduction test. | — | assuming that 10 adults per vessel were used in setting up the test, an average of at least 25 juveniles per vessel should have been produced at the end of the test. | — | the coefficient of variation around the mean number of juveniles should not be higher than 50 % at the end of the reproduction test. | Where a test fails to meet the above validity criteria the test should be terminated unless a justification for proceeding with the test can be provided. The justification should be included in the test report. | REFERENCE CHEMICAL | 8. | A reference chemical should be tested either at regular intervals or possibly included in each test to verify that the response of the test organisms has not changed significantly over time. A suitable reference chemical is carbendazim, which has been shown to affect survival and reproduction of enchytraeids (13)(14), or other chemicals whose toxicity data are well known could be also used. A formulation of carbendazim known by the trade name of Derosal™ supplied by AgrEvo Company (Frankfurt, Germany) and containing 360 g/l (32,18 %) active ingredient was used in a ring-test (2). The EC50 for reproduction determined in the ring test was in the range of 1,2 ± 0,8 mg active ingredient (a.i) /kg dry mass (2). If a positive toxic standard is included in the test series, one concentration is used and the number of replicates should be the same as that in the controls. For carbendazim, the testing of 1,2 mg a.i./kg dry weight (tested as a liquid formulation) is recommended. | DESCRIPTION OF THE TEST | Equipment | 9. | The test vessels should be made of glass or other chemically inert material. Glass jars (e.g. volume: 0,20 - 0,25 litre; diameter: ≈ 6 cm) are suitable. The vessels should have transparent lids (e.g. glass or polyethylene) that are designed to reduce water evaporation whilst allowing gas exchange between the soil and the atmosphere. The lids should be transparent to allow light transmission. | 10. | Normal laboratory equipment is required, specifically the following: | — | drying cabinet; | — | stereomicroscope; | — | pH-meter and photometer; | — | suitable accurate balances; | — | adequate equipment for temperature control; | — | adequate equipment for humidity control (not essential if exposure vessels have lids); | — | incubator or small room with air-conditioner; | — | tweezers, hooks or loops; | — | photo basin. | Preparation of the artificial soil | 11. | An artificial soil is used in this test (5)(7) with the following composition (based on dry weights, dried to a constant weight at 105 °C): | — | 10 % sphagnum peat, air-dried and finely ground (a particle size of 2 ± 1 mm is acceptable); it is recommended to check that a soil prepared with a fresh batch of peat is suitable for culturing the worms before it is used in a test; | — | 20 % kaolin clay (kaolinite content preferably above 30 %); | — | approximately 0,3 to 1,0 % calcium carbonate (CaCO3, pulverised, analytical grade) to obtain a pH of 6,0 ± 0,5; the amount of calcium carbonate to be added may depend principally on the quality/nature of the peat; | — | approximately 70 % air-dried quartz sand (depending on the amount of CaCO3 needed), predominantly fine sand with more than 50 % of the particles between 50 and 200 microns. | It is advisable to demonstrate the suitability of an artificial soil for culturing the worms and for achieving the test validity criteria before using the soil in a definitive test. It is especially recommended to make such a check to ensure that the performance of the test is not compromised if the organic carbon content of the artificial soil is reduced, e.g. by lowering the peat content to 4-5 % and increasing the sand content accordingly. By such a reduction in organic carbon content, the possibilities of adsorption of test chemical to the soil (organic carbon) may be decreased and the availability of the test chemical to the worms may increase. It has been demonstrated that Enchytraeus albidus can comply with the validity criteria on reproduction when tested in field soils with lower organic carbon content than mentioned above (e.g. 2,7 %) (15), and there is experience — though limited — that this can also be achieved in artificial soil with 5 % peat. | Note: When using natural soil in additional (e.g. higher tier) testing, the suitability of the soil and achieving the test validity criteria should also be demonstrated. | 12. | The dry constituents of the soil are mixed thoroughly (e.g. in a large-scale laboratory mixer). This should be done at least one week before starting the test. The mixed soil should be stored for two days in order to equilibrate/stabilise the acidity. For the determination of pH a mixture of soil and 1 M potassium chloride (KCl) or 0,01 M calcium chloride (CaCl2) solution in a 1:5 ratio is used (see (16) and Appendix 3). If the soil is more acidic than the required range (see paragraph 11), it can be adjusted by addition of an appropriate amount of CaCO3. If the soil is too alkaline it can be adjusted by the addition of more of the mixture, referred to in paragraph 11, but excluding the CaCO3. | 13. | The maximum water holding capacity (WHC) of the artificial soil is determined in accordance with procedures described in Appendix 2. One or two days before starting the test, the dry artificial soil is pre-moistened by adding enough de-ionised water to obtain approximately half of the final water content, that being 40 to 60 % of the maximum water holding capacity. At the start of the test, the pre-moistened soil is divided into portions corresponding with the number of test concentrations (and reference chemical where appropriate) and controls used for the test. The moisture content is adjusted to 40-60 % of the maximum WHC by the addition of the test chemical solution and/or by adding distilled or de-ionised water (see paragraphs 19-21). The moisture content is determined at the beginning and at the end of the test (by drying to constant weight at 105 °C) and should be within the optimal range for the survival of the worms. A rough check of the soil moisture content can be obtained by gently squeezing the soil in the hand, if the moisture content is correct small drops of water should appear between the fingers. | Selection and preparation of test animals | 14. | The recommended test species is Enchytraeus albidus Henle 1837 (white potworm), a member of the family Enchytraeidae (order Oligochaeta, phylum Annelida). E. albidus is one of the largest species of enchytraeids, with specimens of up to 35 mm in length being recorded (17)(18). E. albidus has a world-wide distribution and is found in marine, freshwater and terrestrial habitats, mainly in decaying organic matter (seaweed, compost) and rarely in meadows (9). Its broad ecological tolerance and some morphological variations might indicate that different races exist. | 15. | E. albidus is commercially available, as a fish food. It should be checked whether the culture is contaminated by other, usually smaller, species (1) (19). If contamination occurs, all worms should be washed with water in a petri dish. Large adult specimens of E. albidus should then be selected (using a stereomicroscope) to start a new culture and all other worms are discarded. E. albidus can be bred easily in a wide range of organic materials (see Appendix 4). The life-cycle of E. albidus is short since maturity is reached between 33 days (at 18 °C) and 74 days (at 12 °C) (1). Only cultures that have been kept without problems in the laboratory for at least 5 weeks (one generation) will be used for the test. | 16. | Other species of the Enchytraeus genus are also suitable, e.g. E. buchholzi Vejdovsky 1879 or E. crypticus Westheide & Graefe 1992 (see Appendix 5). If other species of Enchytraeus are used, they must be clearly identified and the rationale for the selection of the species should be reported. | 17. | The animals used in the tests are adult worms. They should have eggs (white spots) in the clitellum region, and they should be approximately the same size (about 1 cm long). Synchronisation of the breeding culture is not necessary. | 18. | If the enchytraeids are not bred in the same soil type and under the conditions (including feeding) used for the final test they must be acclimatised for at least 24 hours and up to three days. A larger number of adults than that needed for performing the test should initially be acclimatised to allow scope for rejection of damaged or otherwise unsuitable specimens. At the end of the acclimatisation period, only worms containing eggs and exhibiting no behavioural abnormalities (e.g. trying to escape from the soil) are selected for the test. The worms are carefully removed using jeweller's tweezers, hooks or loops and placed in a petri dish containing a small amount of fresh water. Reconstituted fresh water as proposed in Chapter C.20 of this Annex (Daphnia magna Reproduction Test) is preferred for this purpose since de-ionised, de-mineralised or tap water could be harmful to the worms. The worms are inspected under a stereomicroscope and any that do not contain eggs are discarded. Care is taken to remove and discard any mites or springtails that might have infected the cultures. Healthy worms not used for the test are returned to the stock culture. | Preparation of test concentrations | Test chemical soluble in water | 19. | A solution of the test chemical is prepared in deionised water in a quantity sufficient for all replicates of one test concentration. It is recommended to use an appropriate quantity of water to reach the required moisture content, i.e. 40 to 60 % of the maximum WHC (see paragraph 13). Each solution of test chemical is mixed thoroughly with one batch of pre-moistened soil before being introduced into the test vessel. | Test chemical insoluble in water | 20. | For chemicals insoluble in water but soluble in organic solvents, the test chemical can be dissolved in the smallest possible volume of a suitable vehicle (e.g. acetone). Only volatile solvents should be used. The vehicle is sprayed on or mixed with a small amount, for example 2,5 g, of fine quartz sand. The vehicle is eliminated by evaporation under a fume hood for at least one hour. This mixture of quartz sand and test chemical is added to the pre-moistened soil and thoroughly mixed after adding an appropriate amount of de-ionised water to obtain the moisture required. The final mixture is introduced into the test vessels. | 21. | For chemicals that are poorly soluble in water and organic solvents, the equivalent of 2,5 g of finely ground quartz sand per test vessel is mixed with the quantity of test chemical to obtain the desired test concentration. This mixture of quartz sand and test chemical is added to the pre-moistened soil and thoroughly mixed after adding an appropriate amount of de-ionised water to obtain the required moisture content. The final mixture is divided between the test vessels. The procedure is repeated for each test concentration and an appropriate control is also prepared. | 22. | Chemicals should not normally be tested at concentrations higher than 1 000 mg/kg dry mass of soil. Testing at higher concentrations may however be required in accordance with the objectives of a specific test. | PERFORMANCE OF THE TESTS | Test groups and controls | 23. | For each test concentration, an amount of test soil corresponding to 20 g dry weight is placed into the test vessel (see paragraphs 19-21). Controls, without the test chemical, are also prepared. Food is added to each vessel in accordance with procedures described in paragraph 29. Ten worms are randomly allocated to each test vessel. The worms are carefully transferred into each test vessel and placed on the surface of the soil using, for example, jeweller's tweezers, hooks or loops. The number of replicates for test concentrations and for controls depends on the test design used (see paragraph 34). The test vessels are positioned randomly in the test incubator and these positions are re-randomised weekly. | 24. | If a vehicle is used for application of the test chemical, one control series containing quartz sand sprayed or mixed with solvent should be run in addition to the test series. The solvent or dispersant concentration should be the same as that used in the test vessels containing the test chemical. A control series containing additional quartz sand (2,5 g per vessel) should be run for chemicals requiring administration in accordance with the procedures described in paragraph 21. | Test conditions | 25. | The test temperature is 20 ± 2 °C. To discourage worms from escaping from the soil, the test is carried out under controlled light-dark cycles (preferably 16 hours light and 8 hours dark) with illumination of 400 to 800 lux in the area of the test vessels. | 26. | In order to check the soil humidity, the vessels are weighed at the beginning of the test and thereafter once a week. Weight loss is replenished by the addition of an appropriate amount of deionised water. It should be noted that loss of water can be reduced by maintaining a high air-humidity (> 80 %) in the test incubator. | 27. | The moisture content and the pH, should be measured at the beginning and the end of both the range-finding test and the definitive test. Measurements should be made in control and treated (all concentrations) soil samples prepared and maintained in the same way as the test cultures but not containing worms. Food should only be added to these soil samples at the start of the test to facilitate microbial activity. The amount of food added should be the same as that added to the test cultures. It is not necessary to add further food to these vessels during the test. | Feeding | 28. | A food capable of maintaining the enchytraeid population can be used. Rolled oats, preferably autoclaved before use to avoid microbial contamination (heating is also appropriate), have been found to be a suitable feeding material. | 29. | Food is first provided by mixing 50 mg of ground rolled oats with the soil in each vessel before introducing the worms. Thereafter, food is supplied weekly up to Day 21. Feeding is not carried out on Day 28 since the adults have been removed at this stage and the juvenile worms need relatively little additional food beyond this point. Feeding during the test comprises 25 mg of ground rolled oats per vessel placed carefully on the surface of the soil so as to avoid injuring the worms. In order to reduce fungal growth, the oats flakes should be buried in the soil by covering with small amounts of soil. If food remains uneaten the ration should be reduced. | Design for the range-finding test | 30. | When necessary, a range-finding test is conducted with, for example, five test chemical concentrations of 0,1, 1,0, 10, 100, and 1 000 mg/kg (dry weight of soil). One replicate for each treatment and control is sufficient. | 31. | The duration of the range-finding test is two weeks. At the end of the test, mortality of the worms is assessed. A worm is recorded as dead if it has no reaction to a mechanical stimulus at the anterior end. Additional information to mortality may also be useful in deciding on the range of concentrations to be used in the definitive test. Changes in adult behaviour (e.g. the inability to dig into the soil; lying motionless against the glass wall of the test vessel) and morphology (e.g. the presence of open wounds) should therefore also be recorded along with the presence of any juveniles. The latter can be determined using the staining method described in Appendix 6. | 32. | The LC50 can be approximately determined by calculating the geometrical mean of mortality data. In setting the concentration range for the definitive test, effects on the reproduction are assumed to be lower than the LC50 by a factor of up to 10. However, this is an empirical relation ship and in any specific case it might be different. Additional observations made in the range-finding test such as the occurrence of juveniles can help refine the test chemical concentration range to be used for the definitive test. | 33. | In order for an accurate determination of the LC50 performing the test using at least four replicates each of the test chemical concentration and an adequate number of concentrations to cause at least four statistically significantly different mean responses at these concentrations) is recommended. A similar number of the concentrations and replicates for the controls are used when they are applicable. | Design for the definitive reproduction test | 34. | Three designs are proposed based on recommendations arising from a ring test (2) | — | For determination of the NOEC, at least five concentrations in a geometric series should be tested. Four replicates for each test concentration plus eight controls are recommended. The concentrations should be spaced by a factor not exceeding 1,8. | — | For determination of the ECx (e.g. EC10, EC50), at least five concentrations should be tested and the concentrations should bracket ECx in order to enable ECx interpolation and not extrapolation At least four replicates for each test concentration and four control replicates are recommended. The spacing factor may vary, i.e. less than or equal to 1,8 in the expected effect range and above 1,8 at the higher and lower concentrations. | — | A combined approach allows for determination of both the NOEC and ECx. Eight treatment concentrations in a geometric series should be used. Four replicates for each treatment plus eight controls are recommended. The concentrations should be spaced by a factor not exceeding 1,8. | 35. | Ten adult worms per test vessel should be used (see paragraph 23). Food is added to the test vessels at the beginning of the test and then once a week (see paragraph 29) up to and including Day 21. On Day 21 the soil samples are carefully hand searched and living adult worms are observed and counted and changes in behaviour (e.g. inability to dig into the soil; lying motionless against the glass wall of the test vessel) and in morphology (e.g. open wounds) are recorded. All adult worms are then removed from the test vessels and the test soil. The test soil containing any cocoons that had been produced are incubated for three additional weeks under the same test conditions except that feeding takes place only on Day 35 (i.e. 25 mg ground rolled oats per vessel). | 36. | After six weeks, the newly hatched worms are counted. The method based on Bengal red staining (see Appendix 6) is recommended although other wet (but not heat) extraction and floatation techniques (see Appendix 6) have also proved suitable (4)(10)(11)(20). Bengal red staining is recommended because wet extraction from a soil substrate can be hampered by turbidity caused by suspended clay particles. | Limit test | 37. | If no effects are observed at the highest concentration in the range-finding test (i.e. 1 000 mg/kg), the reproduction test can be performed as a limit test, using 1 000 mg/kg in order to demonstrate that the NOEC for reproduction is greater than this value. | Summary and timetable for the test | 38. | The steps of the test can be summarised as follows: | Time | Range-finding test | Definitive test | Day –7 or earlier | — | Prepare artificial soil (mixing of dry constituents) | — | Prepare artificial soil (mixing of dry constituents) | Day –5 | — | Check pH of artificial soil | — | Measure max WHC of soil | — | Check pH of artificial soil | — | Measure max WHC of soil | Day –5 to –3 | — | Sort worms for acclimatisation | — | Sort worms for acclimatisation | Day — 3 to 0 | — | Acclimatise worms for at least 24 hours | — | Acclimatise worms for at least 24 hours | Day –1 | — | Pre-moisten artificial soil and distribute into batches | — | Pre-moisten artificial soil and distribute into batches | Day 0 | — | Prepare stock solutions | — | Apply test chemical | — | Weigh test substrate into test vessels | — | Mix in food | — | Introduce worms | — | Measure soil pH and moisture content | — | Prepare stock solutions | — | Apply test chemical | — | Weigh test substrate into test vessels | — | Mix in food | — | Introduce worms | — | Measure soil pH and moisture content | Day 7 | — | Check soil moisture content | — | Check soil moisture content | — | Feed | Day 14 | — | Determine adult mortality | — | Estimate number of juveniles | — | Measure soil pH and moisture content | — | Check soil moisture content | — | Feed | Day 21 | | — | Observe adult behaviour | — | Remove adults | — | Determine adult mortality | — | Check soil moisture content | — | Feed | Day 28 | | — | Check soil moisture content | — | No feeding | Day 35 | | — | Check soil moisture content | — | Feed | Day 42 | | — | Count juvenile worms | — | Measure soil pH and moisture content | DATA AND REPORTING | Treatment of results | 39. | Although an overview is given in Appendix 7, no definitive statistical guidance for analysing test results is given in this test method. | 40. | In the range finding test, the main endpoint is mortality. Changes in behaviour (e.g. inability to dig into the soil; lying motionless against the glass wall of the test vessel) and morphology (e.g. open wounds) of the adult worms should however also be recorded along with the presence of any juveniles. Probit analysis (21) or logistic regression should normally be applied to determine the LC50. However, in cases where this method of analysis is unsuitable (e.g., if less then three concentrations with partial kills are available), alternative methods can be used. These methods could include moving averages (22), the trimmed Spearman-Karber method (23) or simple interpolation (e.g., geometrical mean of LC0 and LC100, as computed by the square root of LC0 multiplied by LC100). | 41. | In the definitive test, test endpoint is fecundity (i.e. number of juveniles produced). However, as in the range-finding test, all other harmful signs should be recorded in the final report. The statistical analysis requires the arithmetic mean and the standard deviation per treatment and per control for reproduction to be calculated. | 42. | If an analysis of variance has been performed, the standard deviation, s, and the degrees of freedom, df, may be replaced by the pooled variance estimate obtained from the ANOVA and by its degrees of freedom, respectively — provided variance does not depend on the concentration. In this case, use the single variances of control and treatments. Those values are usually calculated by commercial statistical software using the per-vessel results as replicates. If pooling of data for the negative and solvent controls appears reasonable rather than testing against one of those, they should be tested to see that they are not significantly different (for appropriate tests see paragraph 45 and Appendix 7). | 43. | Further statistical testing and inference depends on whether the replicate values are normally distributed and are homogeneous with regard to their variance. | NOEC Estimation | 44. | The application of powerful tests should be preferred. One should use information e.g. from previous experience with ring-testing or other historic data on whether data are approximately normally distributed. Variance homogeneity (homoscedasticity) is more critical. Experience tells that the variance often increases with increasing mean. In these cases, a data transformation could lead to homoscedasticity. However, such a transformation should be based on experience with historic data rather than on data under investigation. With homogeneous data, multiple t-tests such as Williams' test (α = 0,05, one-sided) (24)(25) or in certain cases Dunnett's test (26)(27) should be performed. It should be noted that, in the case of unequal replication, the table t-values must be corrected as suggested by Dunnett and Williams. Sometimes, because of large variation, the responses do not increase/decrease regularly. In this case of strong deviation from monotonicity the Dunnett's test is more appropriate. If there are deviations from homoscedasticity, it may be reasonable to investigate possible effects on variances more closely to decide whether the t tests can be applied without losing much power (28). Alternatively, a multiple U-test, e.g. the Bonferroni-U-test according to Holm (29), or when these data exhibit heteroscedasticity but are otherwise consistent with a underlying monotone dose-response, an other non-parametric test [e.g. Jonckheere-Terpstra (30) (31) or Shirley (32) (33)] can be applied and would generally be preferred to unequal-variance t-tests. (see also the scheme in Appendix 7). | 45. | If a limit test has been performed and the prerequisites of parametric test procedures (normality, homogeneity) are fulfilled, the pair-wise Student t-test can be used or otherwise the Mann-Whitney-U-test procedure (29). | ECx Estimation | 46. | To compute any ECx value, the per-treatment means are used for regression analysis (linear or non-linear), after an appropriate dose-response function has been obtained. For the growth of worms as a continuous response, ECx- -values can be estimated by using suitable regression analysis (35). Among suitable functions for quantal data (mortality/survival and number of offspring produced) are the normal sigmoid, logistic or Weibull functions, containing two to four parameters, some of which can also model hormetic responses. If a dose-response function was fitted by linear regression analysis a significant r2 (coefficient of determination) and/or slope should be found with the regression analysis before estimating the ECx by inserting a value corresponding to x % of the control mean into the equation found by regression analysis. 95 %-confidence limits are calculated according to Fieller (cited in Finney (21)) or other modern appropriate methods. | 47. | Alternatively, the response is modelled as a percent or proportion of model parameter which is interpreted as the control mean response. In these cases, the normal (logistic, Weibull) sigmoid curve can often be easily fitted to the results using the probit regression procedure (21). In these cases the weighting function has to be adjusted for metric responses as given by Christensen (36). However, if hormesis has been observed, probit analysis should be replaced by a four-parameter logistic or Weibull function, fitted by a non-linear regression procedure (36). If a suitable dose-response function cannot be fitted to the data, one may use alternative methods to estimate the ECx, and its confidence limits, such as Moving Averages after Thompson (22) and the Trimmed Spearman-Karber procedure (23). | TEST REPORT | 48. | The test report must include the following information: | | Test chemical: | — | physical nature and, where relevant physical-chemical properties (e.g. water solubility, vapour pressure); | — | chemical identification of the test chemical according to IUPAC nomenclature, CAS-number, batch, lot, structural formula and purity; | — | expiry date of sample. | | Test species: | — | test animals used: species, scientific name, source of organisms and breeding conditions. | | Test conditions: | — | ingredients and preparation of the artificial soil; | — | method of application of the test chemical; | — | description of the test conditions, including temperature, moisture content, pH, etc.; | — | full description of the experimental design and procedures. | | Test results: | — | mortality of adult worms after two weeks and the number of juveniles at the end of the range-finding test; | — | mortality of adult worms after three weeks exposure and the full record of juveniles at the end of the definitive test; | — | any observed physical or pathological symptoms and behavioural changes in the test organisms; | — | the LC50, the NOEC and/or ECx (e.g. EC50, EC10) for reproduction if some of them are applicable with confidence intervals, and a graph of the fitted model used for its calculation all information and observations helpful for the interpretation of the results. | Deviations from procedures described in this test method and any unusual occurrences during the test. | LITERATURE | (1) | Römbke, J. (1989). Entwicklung eines Reproduktionstests an Bodenorganismen — Enchytraeen. Abschlußbericht des Battelle-Instituts e.V. Frankfurt für das Umweltbundesamt (Berlin), FE-Vorhaben 106 03 051/01. | (2) | Römbke, J. and Moser, T. (1999). Organisation and Performance of an International Ringtest for the Validation of the Enchytraeid Reproduction Test. UBA-Texte 4/99, 150 + 223 pp. | (3) | Westheide, W. and Bethge-Beilfuss, D. (1991). The sublethal enchytraeid test system: guidelines and some results, In: Modern Ecology: Basic and Applied Aspects. Ed. by Esser, G. and Overdieck, D. pp 497-508. Elsevier, Amsterdam, | (4) | Dirven-Van Breemen, E., Baerselmann, R. and Notenboom, J. (1994). Onderzoek naar de Geschiktheid van de Potwormsoorten Enchytraeus albidus en Enchytraeus crypticus (Oligochaeta, Annelida) in Bodemecotoxicologisch Onderzoek. RIVM Rapport Nr. 719102025. 46 pp. | (5) | Chapter C.8 of this Annex, Toxicity for Earthworms. | (6) | ISO (International Organization for Standardization) (1993). Soil Quality — Effects of pollutants on earthworms (Eisenia fetida). Part 1: Determination of acute toxicity using Artificial Soil substrate, No. 11268-1. ISO, Geneve. | (7) | ISO (International Organization for Standardization) (1996). Soil Quality — Effects of pollutants on earthworms (Eisenia fetida). Part 2: Determination of effects on reproduction, No. 11268-2. ISO, Geneve. | (8) | Rundgren, S. and A.K. Augustsson (1998). Test on the enchytraeid Cognettia sphagnetorum (Vejdovsky 1877). In: Løkke, H. and C.A.M. Van Gestel, Handbook of soil invertebrate toxicity tests. John Wiley and Sons, Chichester, 73-94. | (9) | Kasprzak, K. (1982). Review of enchytraeid community structure and function in agricultural ecosystems. Pedobiologia 23, 217-232. | (10) | Römbke, J. (1995). Enchytraeen (Oligochaeta) als Bioindikator, UWSF — Z. Umweltchem. Ökotox. 7, 246-249. | (11) | Dunger, W. and Fiedler, H.J. (1997). Methoden der Bodenbiologie. G. Fischer Verlag, Stuttgart, New York. | (12) | Didden, W.A.M. (1993). Ecology of terrestrial Enchytraeidae. Pedobiologia 37, 2-29. | (13) | Becker, H. (1991). Bodenorganismen — Prüfungskategorien der Forschung. UWSF — Z. Umweltchem. Ökotox. 3, 19-24. | (14) | Römbke, J. and Federschmidt, A. (1995). Effects of the fungicide Carbendazim on Enchytraeidae in laboratory and field tests, Newsletter on Enchytraeidae 4, 79-96. | (15) | Römbke, J., Riepert, F. & Achazi R. (2000): Enchytraeen als Testorganismen. In: Toxikologische Beurteilung von Böden. Heiden, S., Erb, R., Dott, W. & Eisentraeger, A. (eds.). Spektrum Verl., Heidelberg. 59-81. | (16) | ISO (International Organization for Standardization) (1994). Soil Quality — Determination of pH, No. 10390. ISO, Geneve. | (17) | Bell, A.W. (1958). The anatomy of Enchytraeus albidus, with a key to the species of the genus Enchytraeus. Ann. Mus. Novitat. 1902, 1-13. | (18) | Nielsen, C.O. and Christensen, B. (1959). The Enchytraeidae, critical revision and taxonomy of European species. Natura Jutlandica 8-9, 1-160. | (19) | Bouguenec, V. and Giani, N. (1987). Deux nouvelles especes d'Enchytraeus (Oligochaeta, Enchytraeidae) et rediscription d'E. bigeminus. Remarques sur le genre Enchytraeus. Ann. Limnol. 23, 9-22. | (20) | Korinkova, J. and Sigmund, J. (1968). The colouring of bottom-fauna samples before sorting, Vestnik Ceskoslovensko Spolecnosti Zoologicke 32, 300-305. | (21) | Finney, D.J. (1971). Probit Analysis (3rd ed.), pp. 19-76. Cambridge Univ. Press. | (22) | Finney, D.J. (1978). Statistical Method in Biological Assay. — Charles Griffin & Company Ltd, London. | (23) | Hamilton, M.A., R.C. Russo and R.V. Thurston. (1977). Trimmed Spearman-Karber Method for estimating median lethal concentrations in toxicity bioassays. Environ. Sci. Technol. 11(7), 714-719; Correction Environ. Sci. Technol. 12(1998), 417. | (24) | Williams, D.A., (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27, 103-117. | (25) | Williams, D.A., (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics 28, 519-531. | (26) | Dunnett, C.W., (1955). A multiple comparison procedure for comparing several treatments with a control. Amer. Statist. Ass. J. 50, 1096-1121. | (27) | Dunnett, C.W., (1964) New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics 20, 482-491. | (28) | Hoeven, N. van der, (1998). Power analysis for the NOEC: What is the probability of detecting small toxic effects on three different species using the appropriate standardized test protocols? Ecotoxicology 7: 355-361 | (29) | Holm, S., (1979): A simple sequentially rejective multiple test procedure. Scand. J. Statist. 6, 65-70. | (30) | Jonckheere, A. R. (1954); A Distribution-free k-Sample Test Against Ordered Alternatives, Biometrika 41, 133-145. | (31) | Terpstra, T. J. (1952); The Asymptotic Normality and Consistency of Kendall's Test Against Trend, When Ties are Present in One Ranking, Indagationes Math. 14, 327-333. | (32) | Shirley, E. A. (1979); The comparison of treatment to control group means in toxicology studies, Applied Statistics 28, 144-151. | (33) | Williams, D.A. (1986); A Note on Shirley's Nonparametric Test for Comparing Several Dose Levels with a Zero-Dose Control, Biometrics 42, 183-186. | (34) | Sokal, R.R. and F.J. Rohlf. (1981). Biometry. The Principle and practice of statistics in biological research. 2nd edition. W.H. Freeman and Company. New York. | (35) | Christensen, E.R., (1984). Dose-response functions in aquatic toxicity testing and the Weibull model. Water Research 18, 213-221. | (36) | Van Ewijk, P.H. and J.A. Hoekstra. (1993). Calculation of the EC50 and its confidence interval when sub-toxic stimulus is present. Ecotox, Environ. Safety. 25, 25-32. | Appendix 1 | Definitions | For the purpose of this test method the following definitions are applicable: | Chemical means a substance or a mixture. | ECx (Effect concentration for x % effect) is the concentration that causes an x % of an effect on test organisms within a given exposure period when compared with a control. In this test the effect concentrations are expressed as a mass of test chemical per dry mass of the test soil. | LC0 (No lethal concentration) is the concentration of a test chemical that does not kill any of exposed test organisms within a given time period. In this test the LC0 is expressed as a mass of test chemical per dry mass of the test soil. | LC50 (Median lethal concentration) is the concentration of a test chemical kills 50 % of exposed test organisms within a given time period. In this test the LC50 is expressed as a mass of test chemical per dry mass of the test soil. | LC100 (Totally lethal concentration) is the concentration of a test chemical kills 100 % of exposed test organisms within a given time period. In this test the LC100 is expressed as a mass of test chemical per dry mass of the test soil. | LOEC (Lowest Observed Effect Concentration) is the lowest test chemical concentration that has a statistically significant effect (p < 0,05). In this test the LOEC is expressed as a mass of test chemical per dry mass of the test soil. All test concentrations above the LOEC should normally show an effect that is statistically different from the control. Any deviations from the above in identifying the LOEC must be justified in the test report. | NOEC (No Observed Effect Concentration) is the highest test chemical concentration immediately below the LOEC at which no effect is observed. In this test, the concentration corresponding to the NOEC, has no statistically significant effect (p < 0,05) within a given exposure period when compared with the control. | Reproduction rate is the mean number of juvenile worms produced per a number of adults over the test period. | Test chemical is any substance or mixture tested using this test method. | Appendix 2 | Determination of the maximum water holding capacity | Determination of the water holding capacity of the artificial soil | The following method has been found appropriate. It is described in Annex C of the ISO DIS 11268-2. | Collect a defined quantity (e.g. 5 g) of the test soil substrate using a suitable device (auger tube etc.). Cover the bottom of the tube with a piece of filter paper and, after filling with water, place it on a rack in a water bath. The tube should be gradually submerged until the water level is above to the top of the soil. It should then be left in the water for about three hours. Since not all water absorbed by the soil capillaries can be retained, the soil sample should be allowed to drain for a period of two hours by placing the tube onto a bed of very wet finely ground quartz sand contained within a closed vessel (to prevent drying). The sample should then be weighed, dried to constant mass at 105 °C. The water holding capacity (WHC) can then be calculated as follows: | Where: | S | = | water-saturated substrate + mass of tube + mass of filter paper | T | = | tare (mass of tube + mass of filter paper) | D | = | dry mass of substrate | REFERENCES: | ISO (International Organization for Standardization) (1996). Soil Quality -Effects of pollutants on earthworms (Eisenia fetida). Part 2: Determination of effects on reproduction, No. 11268-2. ISO, Geneve. | Appendix 3 | Determination of soil pH | The following method for determining the pH of a soil sample is based on the description in ISO 10390 (Soil Quality — Determination of pH). | A defined quantity of soil is dried at room temperature for at least 12 hours. A suspension of the soil (containing at least 5 grams of soil) is then made up in five times its volume of either 1 M of analytical grade potassium chloride (KCl) or a 0,01 M solution of analytical grade calcium chloride (CaCl2). The suspension is then shaken thoroughly for five minutes. After shaking, the suspension is left to settle for at least 2 hours but not for longer than 24 hours. The pH of the liquid phase is then measured using a pH-meter, that has been calibrated before each measurement using an appropriate series of buffer solutions (e.g. pH 4,0 and 7,0). | REFERENCES: | ISO (International Organization for Standardization) (1994). Soil Quality — Determination of pH, No. 10390. ISO, Geneve. | Appendix 4 | Culturing conditions of Enchytraeus sp. | Enchytraeids of the species Enchytraeus albidus (as well as other Enchytraeus species) can be cultured in large plastic boxes (e.g. 30 × 60 × 10 cm) filled with a 1:1 mixture of artificial soil and natural, uncontaminated garden soil. Compost material must be avoided since it could contain toxic chemicals such as heavy metals. Fauna should be removed from the soil before use (e.g. by deep-freezing). A substrate comprising only of artificial soil can also be used but the reproduction rate may be lower than that obtained with a mixed soil substrate. The substrate used for culturing should have a pH of 6,0 ± 0,5. | The culture is kept in the dark at a temperature of 15 to 20 °C ± 2 °C. Temperatures higher than 23 °C must be avoided. The soil must be kept moist but not wet. The correct soil moisture content is indicated when small drops of water appear between the fingers when the soil is gently squeezed. The production of anoxic conditions must be avoided by ensuring that covers to culture containers allow adequate gaseous exchange with the atmosphere. The soil should be carefully broken up each week to facilitate aeration. | The worms can be fed on rolled oats. The oats should be stored in sealed vessels and autoclaved or heated before use in order to avoid infestation with flour mites (e.g. Glyzyphagus sp., Astigmata, Acarina) or predacious mites [e.g. Hypoaspis (Cosmolaelaps) miles, Gamasida, Acarina]. After a heat treatment, the food should be ground so that it can easily be strewn on the soil surface. From time to time, the rolled oats can be supplemented by the addition of vitamins, milk and cod-liver oil. Other suitable food sources are baker's yeast and the fish food “Tetramin”. | Feeding takes place approximately twice a week. An appropriate quantity of rolled oats is strewn on the soil surface or carefully mixed into the substrate when breaking up the soil to facilitate aeration. The absolute amount of food provided depends on the number of worms present in the substrate. As a guide, the amount of food should be increased if it is all consumed within one day of being provided. Conversely, if food still remains on the surface at the time of the second feeding (one-week later) it should be reduced. Food contaminated with fungal growth should be removed and replaced. After three months, the worms should be transferred into a freshly prepared substrate. | Culturing conditions are deemed satisfactory if the worms: (a) do not try to leave the soil substrate, (b) move quickly through the soil, (c) exhibit a shiny outer surface without adhering soil particles, (d) are more or less whitish in colour, (e) exhibit a variety of age ranges in the cultures and (f) reproduce continuously. | Appendix 5 | Test performance with other Enchytraeus species | Selection of species | Species other than E. albidus may be used but the test procedure and the validity criteria should be adapted accordingly. Since many Enchytraeus-species are readily available and can be satisfactorily maintained in the laboratory, the most important criterion for selecting a species other than E. albidus is ecological relevance and, additionally, comparable sensitivity. There may also be formal reasons for a change of species. For example, in countries where E. albidus does not occur and cannot be imported (e.g. due to quarantine restrictions), it will be necessary to use another Enchytraeus species. | Examples of suitable alternative species | — | Enchytraeus crypticus (Westheide & Graefe 1992): In recent years, this species has often been used in ecotoxicological studies because of the simplicity of its breeding and testing. However, it is small and this makes handling more difficult compared with E. albidus (especially at stages prior to use of the staining method). E. crypticus has not been found to exist with certainty in the field, having only been described from earthworm cultures. Its ecological requirements are therefore not known. | — | Enchytraeus buchholzi (Vejdovsky 1879): This name probably covers a group of closely related species that are morphologically difficult to distinguish. Its use for testing is not recommended until the individuals used in a test can be identified to species. E. buchholzi is usually found in meadows and disturbed sites such as roadsides. | — | Enchytraeus luxuriosus: This species was originally known as E.
“
minutus
”, but has been recently described (1). It was first found by U. Graefe (Hamburg) in a meadow close to St. Peter-Ording (Schleswig-Holstein, Germany). E. luxuriosus is approximately half the size of E. albidus but larger than the other species discussed here; this could make it a good alternative to E. albidus. | — | Enchytraeus bulbosus (Nielsen & Christensen 1963): This species has hitherto been reported from German and Spanish mineral soils, where it is common but not usually very abundant. In comparison to other small species of this genus, it is relatively easy to identify. Nothing is known about its behaviour in laboratory tests or its sensitivity to chemicals. It has, however, been found to be easy to culture (E. Belotti, personal communication). | Breeding conditions | All the Enchytraeus-species mentioned above can be cultured in the same substrates used for E. albidus. Their smaller size means that the culture vessels can be smaller and that, while the same food can be used, the ration size must be adjusted. The life-cycle of these species is shorter than for E. albidus and feeding should be carried out more frequently. | Test conditions | The test conditions are generally the same as those applying to E. albidus, except that: | — | the size of the test vessel can (but need not) be smaller; | — | the duration of the reproduction test can (but need not) be shorter, i.e. four instead of six weeks; however, the duration of the Range-Finding Test should not be changed; | — | in view of the small size of the juvenile worms the use of the staining method is strongly recommended for counting; | — | the validity criterion relating to “number of juveniles per test vessel in the control” should be changed to “50”. | REFERENCES | (1) | Schmelz, R.M. and Collado, R. (1999). Enchytraeus luxuriosus sp.nov., a new terrestrial oligochaete species (Enchytraeidae, Clitellata, Annelida). Carolinea 57, 93-100. | Appendix 6 | Detailed description of extraction techniques | Staining with Bengal red | This method, originally developed in limnic ecology (1) was first proposed for the counting of juvenile enchytraeids in the Enchytraeidae reproduction test by W. de Coen (University of Ghent, Belgium). Independently, a modified version (Bengalred mixed with formaldehyde instead of ethanol) was developed by RIVM Bilthoven (2)(3). | At the end of the Definitive Test (i.e. after six weeks), the soil in the test vessels is transferred to a shallow container. A Bellaplast vessel or a photo basin with ribbed bottom is useful for this purpose, the latter because the “ribs” restrict movement of the worms within the field of observation. The juveniles are fixed with ethanol (approx. 5 ml per replicate). The vessels are then filled with water up to a layer of 1 to 2 cm. A few drops (200 to 300 μl) of Bengal red (1 % solution in ethanol) are added (0,5 % eosin is an alternative) and the two components are mixed carefully. After 12 hours, the worms should be stained a reddish colour and should be easy to count because they will be lying on the substrate surface. Alternatively, the substrate/alcohol mixture can be washed through a sieve (mesh size: 0,250 mm) before counting the worms. Using this procedure, the kaolinite, peat, and some of the sand will be washed out and the reddish coloured worms will be easier to see and count. The use of illuminated lenses (lens size at least 100 × 75 mm with a magnification factor 2 to 3×) will also facilitates counting. | The staining technique reduces counting time to a few minutes per vessel and as a guide it should be possible for one person to assess all the vessels from one test in a maximum of two days. | Wet extraction | The wet extraction should be started immediately the test finishes. The soil from each test vessel is placed into plastic sieves with a mesh size of approximately 1 mm. The sieves are then suspended in plastic bowls without touching the bottom. The bowls are carefully filled up with water until the samples in the sieves are completely under the water surface. To ensure a recovery rate of more than 90 % of the worms present, an extraction period of 3 days at 20 ± 2 °C should be used. At the end of the extraction period the sieves are removed and the water (except for a small amount) is slowly decanted, taking care not to disturb the sediment at the bottom of the bowls. The plastic bowls are then shaken slightly to suspend the sediment in the overlying water. The water is transferred to a petri dish and, after the soil particles have settled), the enchytraeids can be identified, removed and counted using a stereomicroscope and soft steel forceps. | Flotation | A method based on flotation has been described in a note by R. Kuperman (4). After fixing the contents of a test vessel with ethanol, the soil is flooded with Ludox (AM-30 colloidal silica, 30 wt. % suspension in water) up to 10 to 15 mm above the soil surface. After thoroughly mixing the soil with the flotation agent for 2 – 3 minutes, the juvenile worms floating on the surface can easily be counted. | REFERENCES | (1) | Korinkova, J. and Sigmund, J. (1968). The colouring of bottom-fauna samples before sorting, Vestnik Ceskoslovensko Spolecnosti Zoologicke 32, 300-305. | (2) | Dirven-Van Breemen, E., Baerselmann, R. and Notenboom, J. (1994). Onderzoek naar de Geschiktheid van de Potwormsoorten Enchytraeus albidus en Enchytraeus crypticus (Oligochaeta, Annelida) in Bodemecotoxicologisch Onderzoek. RIVM Rapport Nr. 719102025. 46 pp. | (3) | Posthuma, L., Baerselmann, R., Van Veen, R.P.M. and Dirven-Van Breemen, E.M. (1997). Single and joint toxic effects of copper and zinc on reproduction of Enchytraeus crypticus in relation to sorption of metals in soils. Ecotox. Envir. Safety 38, 108-121. | (4) | Phillips, C.T., Checkai, R.T. and Kuperman, R.G. (1998). An alternative to the O'Connor Method for Extracting Enchytraeids from Soil. SETAC 19th Annual Meeting, Charlotte, USA. Abstract Book No. PMP069, p. 157. | Appendix 7 | Overview of the statistical assessment of data (NOEC determination) | Dunnett's Test | William Test | Transform data | Yes | Yes | Yes | Yes | No | Exclude control without solvent | Are both controls equal? U-Test | Are both controls equal? t-Test | Bonferroni — U-Test | Jonckheere-Terpstra Test | Shirley Test | Dunn's Test | Both controls might be pooled | Additional solvent control? | Additional solvent control? | Statistical testing not recommended | At least four replicates per treatment? | No success | Data: | Variation homogenous? | Distribution normal? | Yes | Yes | Yes | No | No | No | No | No | Exclude control without solvent | Both controls might be pooled | Start | Non-parametric Tests | Parametric Tests | C.33. EARTHWORM REPRODUCTION TEST (EISENIA FETIDA/ EISENIA ANDREI ) | INTRODUCTION | 1. | This test method is equivalent to OECD test guideline (TG) 222 (2004). It is designed to be used for assessing the effects of chemicals in soil on the reproductive output (and other sub-lethal end points) of the earthworm species Eisenia fetida (Savigny 1826) or Eisenia andrei (Andre 1963) (1)(2). The test has been ring-tested (3). A test method for the earthworm acute toxicity test exists (4). A number of other international and national guidelines for earthworm acute and chronic tests have been published (5)(6)(7)(8). | 2. | Eisenia fetida /Eisenia andrei are considered to be a one of representatives of soil fauna and earthworms in particular. Background information on the ecology of earthworms and their use in ecotoxicological testing is available (7)(9)(10)(11)(12). | PRINCIPLE OF THE TEST | 3. | Adult worms are exposed to a range of concentrations of the test chemical either mixed into the soil or, in case of pesticides, applied into or onto the soil using procedures consistent with the use pattern of the chemical. The method of application is specific to the purpose of the test. The range of test concentrations is selected to encompass those likely to cause both sub-lethal and lethal effects over a period of eight weeks. Mortality and growth effects on the adult worms are determined after 4 weeks of exposure. The adults are then removed from the soil and effects on reproduction assessed after a further 4 weeks by counting the number of offspring present in the soil. The reproductive output of the worms exposed to the test chemical is compared to that of the control(s) in order to determine the (i) no observed effect concentration (NOEC) and/or (ii) ECx (e.g. EC10, EC50) by using a regression model to estimate the concentration that would cause a x % reduction in reproductive output. The test concentrations should bracket the ECx (e.g. EC10, EC50) so that the ECx then comes from interpolation rather than extrapolation (see Appendix 1 for definitions). | INFORMATION ON THE TEST CHEMICAL | 4. | The following information relating to the test chemical should be available to assist in the design of appropriate test procedures: | — | water solubility; | — | log Kow; | — | vapour pressure; | — | and information on fate and behaviour in the environment, where possible (e.g. rate of photolysis and rate of hydrolysis where relevant to application patterns). | 5. | This test method is applicable to all chemicals irrespective of their water solubility. The test method is not applicable to volatile chemicals, defined here as chemicals for which Henry's constant or the air/water partition coefficient is greater than one, or to chemicals with vapour pressures exceeding 0,0133 Pa at 25 °C. | 6. | No allowance is made in this test method for possible degradation of the test chemical over the period of the test. Consequently it cannot be assumed that exposure concentrations will be maintained at initial values throughout the test. Chemical analysis of the test chemical at the start and the end of the test is recommended in that case. | REFERENCE CHEMICAL | 7. | The NOEC and/or the ECx of a reference chemical must be determined to provide assurance that the laboratory test conditions are adequate and to verify that the response of the test organisms does not change statistically over time. It is advisable to test a reference chemical at least once a year or, when testing is carried out at a lower frequency, in parallel to the determination of the toxicity of a test chemical. Carbendazim or benomyl are suitable reference chemicals that have been shown to affect reproduction (3). Significant effects should be observed between (a) 1 and 5 mg active ingredient (a.i.)/kg dry mass or (b) 250-500 g/ha or 25-50 mg/m2. If a positive toxic standard is included in the test series, one concentration is used and the number of replicates should be the same as that in the controls. | VALIDITY OF THE TEST | 8. | The following criteria should be satisfied in the controls for a test result to be considered valid: | — | each replicate (containing 10 adults) to have produced ≥ 30 juveniles by the end of the test; | — | the coefficient of variation of reproduction to be ≤ 30 %; | — | adult mortality over the initial 4 weeks of the test to be ≤ 10 %. | Where a test fails to meet the above validity criteria the test should be terminated unless a justification for proceeding with the test can be provided. The justification should be included in the report. | DESCRIPTION OF THE TEST | Equipment | 9. | Test containers made of glass or other chemically inert material of about one to two litres capacity should be used. The containers should have a cross-sectional area of approximately 200 cm2 so that a moist substrate depth of about 5-6 cm is achieved when 500 to 600 g dry mass of substrate is added. The design of the container cover should permit gaseous exchange between the substrate and the atmosphere and access to light (e.g. by means of a perforated transparent cover) whilst preventing the worms from escaping. If the amount of test substrate used is substantially more than 500 to 600 g per test container the number of worms should be increased proportionately. | 10. | Normal laboratory equipment is required, specifically the following: | — | drying cabinet; | — | stereomicroscope; | — | pH-meter and photometer; | — | suitable accurate balances; | — | adequate equipment for temperature control; | — | adequate equipment for humidity control (not essential if exposure vessels have lids); | — | incubator or small room with air-conditioner; | — | tweezers, hooks or loops; | — | water bath. | Preparation of the artificial soil | 11. | An artificial soil is used in this test (5)(7) with the following composition (based on dry weights, dried to a constant weight at 105 °C): | — | 10 per cent sphagnum peat (as close to pH 5,5 to 6,0 as possible, no visible plant remains, finely ground, dried to measured moisture content); | — | 20 per cent kaolin clay (kaolinite content preferably above 30 per cent); | — | 0,3 to 1,0 % calcium carbonate (CaCO3, pulverised, analysis grade) to obtain an initial pH of 6,0 ± 0,5. | — | 70 % air-dried quartz sand (depending on the amount of CaCO3 needed), predominantly fine sand with more than 50 % of the particles between 50 and 200 microns. | Note 1: The amount of CaCO3 required will depend on the components of the soil substrate including food, and should be determined by measurements of soil sub-samples immediately before the test. pH is measured in a mixed sample in a 1 M solution of potassium chloride (KCl) or a 0,01 M solution of calcium chloride (CaCl2) (13). | Note 2: The organic carbon content of the artificial soil may be reduced, e.g. by lowering the peat content to 4-5 % and increasing the sand content accordingly. By such a reduction in organic carbon content, the possibilities of adsorption of test chemical to the soil (organic carbon) may be decreased and the availability of the test chemical to the worms may increase. It has been demonstrated that Eisenia fetida can comply with the validity criteria on reproduction when tested in field soils with lower organic carbon content (e.g. 2,7 %) (14), and there is experience that this can also be achieved in artificial soil with 5 % peat. Therefore, it is not necessary before using such a soil in a definitive test to demonstrate the suitability of the artificial soil for allowing the test to comply with the validity criteria unless the peat content is lowered more than specified above. | Note 3: When using natural soil in additional (e.g. higher tier) testing the suitability of the soil and achieving the test validity criteria should also be demonstrated. | 12. | The dry constituents of the soil are mixed thoroughly (e.g. in a large-scale laboratory mixer) in a well ventilated area. Before starting the test, the dry artificial soil is moistened by adding enough de-ionised water to obtain approximately half of the final water content, that being 40 % to 60 % of the maximum water holding capacity (corresponding to 50 ± 10 % moisture dry mass). This will produce a substrate that has no standing or free water when it is compressed in the hand. The maximum water holding capacity (WHC) of the artificial soil is determined in accordance with procedures described in Appendix 2, ISO 11274 (15) or equivalent EU standard. | 13. | If the test chemical is applied on the soil surface or mixed into soil without water, the final amount of water can be mixed into the artificial soil during preparation of the soil. If the test chemical is mixed into the soil together with some water, the additional water can be added together with the test chemical (see paragraph 19). | 14. | Soil moisture content is determined at the beginning and at the end of the test in accordance with ISO 11465 (16) or equivalent EU standard, and soil pH in accordance with Appendix 3 or ISO 10390 (13) or equivalent EU standard. These determinations should be carried out in a sample of control soil and a sample of each test concentration soil. The soil pH should not be adjusted when acidic or basic chemicals are tested. The moisture content should be monitored throughout the test by weighing the containers periodically (see paragraph 26 and 30). | Selection and preparation of test animals | 15. | The species used in the test is Eisenia fetida or Eisenia andrei (1)(2). Adult worms between two months and one year old and with a clitellum are required to start the test. The worms should be selected from a synchronised culture with a relatively homogeneous age structure (Appendix 4). Individuals in a test group should not differ in age by more than 4 weeks. | 16. | The selected worms should be acclimatised for at least one day with the type of artificial soil substrate to be used for the test. During this period the worms should be fed on the same food to be used in the test (see paragraphs 31 to 33). | 17. | Groups of 10 worms should be weighed individually randomly assigning the groups to the test containers at the start of the test. The worms are washed prior to weighing (with deionised water) and the excess water removed by placing the worms briefly on filter paper. The wet mass of individual worms should be between 250 and 600 mg. | Preparation of test concentrations | 18. | Two methods of application of the test chemical can be used: mixing the test chemical into the soil (see paragraphs 19-21) or application to the soil surface (see paragraphs 22-24). The selection of the appropriate method depends on the purpose of the test. In general, mixing of the test chemical into the soil is recommended. However application procedures that are consistent with normal agricultural practice may be required (e.g. spraying of liquid formulation or use of special pesticide formulations such as granules or seed dressings). Solvents used to aid treatment of the soil with the test chemical should be selected on the basis of their low toxicity to earthworm and appropriate solvent control must be included in the test design (see paragraph 27). | Mixing the test chemical into the soil | Test chemical soluble in water | 19. | A solution of the test chemical in de-ionised water is prepared immediately before starting the test in a quantity sufficient for all replicates of one concentration. A co-solvent may be required to facilitate for the preparation of the test solution. It is convenient to prepare an amount of solution necessary to reach the final moisture content (40 to 60 % of maximum water holding capacity). The solution is mixed thoroughly with the soil substrate before introducing it into a test container. | Test chemical insoluble in water | 20. | The test chemical is dissolved in a small volume of a suitable organic solvent (e.g. acetone) and then sprayed onto, or mixed into, a small quantity of fine quartz sand. The solvent is then removed by evaporation in a fume hood for at least a few minutes. The treated sand is then mixed thoroughly with the pre-moistened artificial soil. De-ionised water is then added (an amount required) to achieve a final moisture content of 40 to 60 % of the maximum water holding capacity is then added and mixed in. The soil is then ready for placing in test containers vessels. Care should be taken that some solvents may be toxic to earthworms. | Test chemical insoluble in water and organic solvents | 21. | A mixture comprised of 10 g of finely ground industrial quartz sand with a quantity of the test chemical necessary to achieve the test concentration in the soil is prepared. The mixture is then mixed thoroughly with the pre-moistened artificial soil. De-ionised water is then added to an amount required to achieve a final moisture content of 40 to 60 % of the maximum water holding capacity is then added and mixed in. The soil is then ready for placing to the test containers. | Application of the test chemical to the soil surface | 22. | The soil is treated after the worms are added. The test containers are first filled with the moistened soil substrate and the weighed worms are placed on the surface. Healthy worms normally burrow immediately into substrate and consequently any remaining on the surface after 15 minutes are defined as damaged and must be replaced. If worms are replaced, the new ones and those substituted should be weighed so that total live weight of the exposure group of worms and the total weight of the container with worms at the start is known. | 23. | The test chemical is applied. It should not be added to the soil within half an hour of introducing the worms (or if worms are present on the soil surface) so as to avoid any direct exposure to the test chemical by skin contact. When the test chemical is a pesticide it may be appropriate to apply it to the soil surface by spraying. The test chemical should be applied to the surface of the soil as evenly as possible using a suitable laboratory-scale spraying device to simulate spray application in the field. Before application the cover of the test container should be removed and replaced by a liner which protects the side walls of the container from spray. The liner can be made from a test container with the base removed. The application should take place at a temperature within 20 ± 2 °C of variation and for aqueous solutions, emulsions or dispersions at a water application rate of between 600 and 800 μl/m2. The rate should be verified using an appropriate calibration technique. Special formulations like granules or seed dressings should be applied in a manner consistent with agricultural use. | 24. | Test containers should be left uncovered for a period of one hour to allow any volatile solvent associated with the application of the test chemical to evaporate. Care should be taken that no worm will escape from the test vessels within this time. | PROCEDURE | Test groups and controls | 25. | A loading of 10 earthworms in 500-600 g dry mass of artificial soil (i.e. 50-60 g of soil per worm) is recommended. If larger quantities of soil are used, as might be the case if testing pesticides with special modes of application such as seed dressings, the loading of 50-60 g of soil per worm should be maintained by increasing the number of worms. Ten worms are prepared for each control and treatment container. The worms are washed with water and wiped and then placed on absorbent paper for a short period to allow excess water to drain. | 26. | To avoid systematic errors in distributing the worms to the test containers the homogeneity of the test population should be determined by individually weighing 20 worms sampled randomly from the population from which the test worms are to be taken. Having ensured homogeneity, batches of worms are then be selected, weighed and assigned to test containers using a randomisation procedure. After the addition of the test worms, the weight of each test container should be measured to ensure that there is an initial weight that can be used as the basis for monitoring soil moisture content throughout the test as described in paragraph 30. The test containers are then covered as described in paragraph 9 and placed in the test chamber. | 27. | Appropriate controls are prepared for each of the methods of test chemical application described in paragraphs 18 to 24. The relevant procedures described are followed for preparing the controls except that the test chemical is not added. Thus, where appropriate, organic solvents, quartz sand or other vehicles are applied to the controls in concentrations/amounts consistent with those used in the treatments. Where a solvent or other vehicle is used to add the test chemical an additional control without the vehicle or test chemical should also be prepared and tested to ensure that the vehicle has no bearing on the result. | Test conditions | 28. | The test temperature is 20 ± 2 °C. The test is carried out under controlled light-dark cycles (preferably 16 hours light and 8 hours dark) with illumination of 400 to 800 lux in the area of the test containers. | 29. | The test containers are not aerated during the test but the design of the test vessel covers should provide opportunity for gaseous exchange whilst limiting evaporation of moisture (see paragraph 9). | 30. | The water content of the soil substrate in the test containers is maintained throughout the test by re-weighing the test containers (minus their covers) periodically. Losses are replenished as necessary with de-ionised water. The water content should not vary by more than 10 % from that at the start of the test. | Feeding | 31. | Any food of a quality shown to be suitable for at least maintaining worm weight during the test is considered acceptable. Experience has shown that oatmeal, cow or horse manure is a suitable food. Checks should be made to ensure that cows or horses from which manure is obtained are not subject to medication or treatment with chemicals, such as growth promoters, nematicides or similar veterinary products that could adversely affect the worms during the test. Self-collected cow manure is recommended, since experience has shown that commercially available cow manure used as garden fertiliser may have adverse effects on the worms. The manure should be air-dried, finely ground and pasteurised before use. | 32. | Each fresh batch of food should be fed to a non-test worm culture before use in a test to ensure that it is of suitable quality. Growth and cocoon production should not be reduced compared to worms kept in a substrate that does not contain the new batch of food (conditions as described in test method C.8(4)). | 33. | Food is first provided one day after adding the worms and applying the test chemical to the soil. Approximately 5 g of food is spread on the soil surface of each container and moistened with de-ionised water (about 5 ml to 6 ml per container). Thereafter food is provided once a week during the 4-week test period. If food remains uneaten the ration should be reduced so as to avoid fungal growth or moulding. The adults are removed from the soil on day 28 of the test. A further 5 g of food is then administered to each test container. No further feeding takes place during the remaining 4 weeks of the test. | Selection of test concentrations | 34. | Prior knowledge of the toxicity of the test chemical should help in selecting appropriate test concentrations, e.g. from an acute test (4) and/or from range-finding studies. When necessary, a range-finding test is conducted with, for example, five test concentrations of 0,1, 1,0, 10, 100, and 1 000 mg/kg (dry mass of soil). One replicate for each treatment and control is sufficient. The duration of the range-finding test is two weeks and the mortality is assessed at the end of the test. | Experimental design | 35. | Since a single summary statistic cannot be prescribed for the test, this test method makes provision for the determination of the NOEC and the ECx. A NOEC is likely to be required by regulatory authorities for the foreseeable future. More widespread use of the ECx, resulting from statistical and ecological considerations, may be adopted in the near future. Therefore, three designs are proposed, based on recommendations arising from a ring test of an enchytraeid reproduction test method (17). | 36. | In setting the range of concentrations, the following should be borne in mind: | — | For determination of the NOEC, at least five/twelve concentrations in a geometric series should be tested. Four replicates for each test concentration plus eight controls are recommended. The concentrations should be spaced by a factor not exceeding 2,0. | — | For determination of the ECx (e.g. EC10, EC50), an adequate number of concentrations to cause at least four statistically significantly different mean responses at these concentrations is recommended. At least two replicates for each test concentration and six control replicates are recommended. The spacing factor may vary, i.e. less than or equal to 1,8 in the expected effect range and above 1,8 at the higher and lower concentrations. | — | A combined approach allows for determination of both the NOEC and ECx. Eight treatment concentrations in a geometric series should be used. Four replicates for each treatment plus eight controls are recommended. The concentrations should be spaced by a factor not exceeding 1,8. | Test duration and measurements | 37. | On Day 28 the living adult worms are observed and counted. Any unusual behaviour (e.g. inability to dig into the soil; lying motionless) and in morphology (e.g. open wounds) are also recorded. All adult worms are then removed from the test vessels and counted and weighed. Transfer of the soil containing the worms to a clean tray prior to the assessment may facilitate searching for the adults. The worms extracted from the soil should be washed prior to weighing (with de-ionised water) and the excess water removed by placing the worms briefly on filter paper. Any worms not found at this time are to be recorded as dead, since it is to be assumed that such worms have died and decomposed prior to the assessment. | 38. | If the soil has been removed from the containers it is then returned (minus the adult worms but containing any cocoons that have been produced). The soil is then incubated for four additional weeks under the same test conditions except that feeding only takes place once at the start of this phase of the test (see paragraph 33). | 39. | At the end of the second 4-week period, the number of juveniles hatched from the cocoons in the test soil and cocoon numbers are determined using procedures described in Appendix 5. All signs of harm or damage to the worm should also be recorded throughout the test period. | Limit test | 40. | If no effects are observed at the highest concentration in the range-finding test (i.e. 1 000 mg/kg), the reproduction test would be performed as a limit test, using a test concentration of 1 000 mg/kg. A limit test will provide the opportunity to demonstrate that the NOEC for reproduction is greater than the limit concentration whilst minimising the number of worms used in the test. Eight replicates should be used for both the treated soil and the control. | DATA AND REPORTING | Treatment of results | 41. | Although an overview is given in Appendix 6, no definitive statistical guidance for analysing test results is given in this test method. | 42. | One endpoint is mortality. Changes in behaviour (e.g. inability to dig into the soil; lying motionless against the glass wall of the test vessel) and morphology (e.g. open wounds) of the adult worms should however also be recorded along with the presence of any juveniles. Probit analysis (18) or logistic regression should normally be applied to determine the LC50. However, in cases where this method of analysis is unsuitable (e.g., if less than three concentrations with partial kills are available), alternative methods can be used. These methods could include moving averages (19), the trimmed Spearman-Karber method (20) or simple interpolation (e.g., geometrical mean of LC0 and LC100, as computed by the square root of LC0 multiplied by LC100). | 43. | The other endpoint is fecundity (e.g. number of juveniles produced). However, as in the range-finding test, all other harmful signs should be recorded in the final report. The statistical analysis requires the arithmetic mean and the standard deviation per treatment and per control for reproduction to be calculated. | 44. | If an analysis of variance has been performed, the standard deviation, s, and the degrees of freedom (df) may be replaced by the pooled variance estimate obtained from the ANOVA and by its degrees of freedom, respectively — provided variance does not depend on the concentration. In this case, use the single variances of control and treatments. Those values are usually calculated by commercial statistical software using the per-vessel results as replicates. If pooling data for the negative and solvent controls appears reasonable rather than testing against one of those, they should be tested to see that they are not significantly different (for the appropriate test, consider paragraph 47 and Appendix 6). | 45. | Further statistical testing and inference depends on whether the replicate values are normally distributed and are homogeneous with regard to their variance. | NOEC Estimation | 46. | The application of powerful tests should be preferred. One should use information e.g. from previous experience with ring-testing or other historic data on whether data are approximately normally distributed. Variance homogeneity (homoscedasticity) is more critical. Experience tells that the variance often increases with increasing mean. In these cases, a data transformation could lead to homoscedasticity. However, such a transform should be based on experience with historic data rather than on data under investigation. With homogeneous data, multiple t-tests such as Williams' test (α = 0,05, one-sided) (21)(22) or in certain cases Dunnett's test (23)(24) should be performed. It should be noted that, in the case of unequal replication, the table t-values must be corrected as suggested by Dunnett and Williams. Sometimes, because of large variation, the responses do not increase/decrease regularly. In this case of strong deviation from monotonicity the Dunnett's test is more appropriate. If there are deviations from homoscedasticity, it may be reasonable to investigate possible effects on variances more closely to decide whether the t- tests can be applied without loosing much power (25). Alternatively, a multiple U-test, e.g. the Bonferroni-U-test according to Holm (26), or when these data exhibit heteroscedasticity but are otherwise consistent with a underlying monotone dose-response, an other non-parametric test (e.g. Jonckheere-Terpstra (27)(28) or Shirley (29) (30)) can be applied and would generally be preferred to unequal-variance t-tests. (see also the scheme in Appendix 6). | 47. | If a limit test has been performed and the prerequisites of parametric test procedures (normality, homogeneity) are fulfilled, the pair-wise Student-t-test can be used or otherwise the Mann-Whitney-U-test procedure (31). | ECx Estimation | 48. | To compute any ECx value, the per-treatment means are used for regression analysis (linear or non-linear), after an appropriate dose-response function has been obtained. For the growth of worms as a continuous response, ECx- -values can be estimated by using suitable regression analysis (32). Among suitable functions for quantal data (mortality/survival) and number of offspring produced are the normal sigmoid, logistic or Weibull functions, containing two to four parameters, some of which can also model hormetic responses. If a dose-response function was fitted by linear regression analysis a significant r2 (coefficient of determination) and/or slope should be found with the regression analysis before estimating the ECx by inserting a value corresponding to x % of the control mean into the equation found by regression analysis. 95 %-confidence limits are calculated according to Fieller (cited in Finney (18)) or other modern appropriate methods. | 49. | Alternatively, the response is modeled as a percent or proportion of model parameter which is interpreted as the control mean response. In these cases, the normal (logistic, Weibull) sigmoid curve can often be easily fitted to the results using the probit regression procedure (18). In these cases the weighting function has to be adjusted for metric responses as given by Christensen (33). However, if hormesis has been observed, probit analysis should be replaced by a four-parameter logistic or Weibull function, fitted by a non-linear regression procedure (34). If a suitable dose-response function cannot be fitted to the data, one may use alternative methods to estimate the ECx, and its confidence limits, such as Moving Averages after Thompson (19) and the Trimmed Spearman-Karber procedure (20). | TEST REPORT | 50. | The test report must include the following information: | | Test chemical: | — | a definitive description of the test chemical, batch, lot and CAS-number, purity; | — | properties of the test chemical (e.g. log Kow, water solubility, vapour pressure, Henry's constant (H) and information on fate and behaviour). | | Test organisms: | — | test animals used: species, scientific name, source of organisms and breeding conditions; | — | age, size (mass) range of test organisms. | | Test conditions | — | preparation details for the test soil; | — | the maximum water holding capacity of the soil; | — | a description of the technique used to apply the test chemical to the soil; | — | details of auxiliary chemicals used for administering the test chemical; | — | calibration details for spraying equipment if appropriate; | — | description of the experimental design and procedure; | — | size of test containers and volume of test soil; | — | test conditions: light intensity, duration of light-dark cycles, temperature; | — | a description of the feeding regime, the type and amount of food used in the test, feeding dates; | — | pH and water content of the soil at the start and end of the test. | | Test results: | — | adult mortality (%) in each test container at the end of the first 4 weeks of the test; | — | the total mass of adults at the beginning of the test in each test container; | — | changes in body weight of live adults (% of initial weight) in each test container after the first four weeks of the test; | — | the number of juveniles produced in each test container at the end of the test; | — | a description of obvious or pathological symptoms or distinct changes in behaviour; | — | the results obtained with the reference test chemical; | — | the LC50, the NOEC and/or ECx (e.g. EC50, EC10) for reproduction if some of them are applicable with confidence intervals, and a graph of the fitted model used for its calculation all information and observations helpful for the interpretation of the results; | — | a plot of the dose-response-relationship; | — | the results applicable to each test container; | Deviations from procedures described in this test method and any unusual occurrences during the test. | LITERATURE | (1) | Jaenicke, J. (1982). “Eisenia foetida” is two biological species. Megadrilogica 4, 6-8. | (2) | Oien, N. and J. Stenerson (1984). Esterases of earthworm — III. Electrophoresis reveals that Eisenia foetida (Savigny) is two species. Comp. Biochem. Physiol. 78c (2), 277 - 282. | (3) | Kula, C. (1996). Development of a test method on sublethal effects of pesticides on the earthworm species Eisenia fetida/Eisenia andrei — comparison of two ringtests. In: Riepert, F., Kula, C. (1996): Development of laboratory methods for testing effects of chemicals and pesticides on collembola and earthworms. Mitt. Biol. Bundesamst. f. Land- Forstwirtsch. Berlin-Dahlem, 320, p. 50-82. | (4) | Chapter C.8 of this Annex, Earthworm acute toxicity test. | (5) | ISO (International Organization for Standardization) (1996). Soil Quality — Effects of pollutants on earthworms (Eisenia fetida). Part 2: Determination of effects on reproduction, No.11268-2. ISO, Geneve. | (6) | ISO (International Organization for Standardization) (1993). Soil Quality — Effects of pollutants on earthworms (Eisenia fetida). Part 1: Determination of acute toxicity using artificial soil substrate, No.11268-1. ISO, Geneve. | (7) | SETAC (1998). Advances in Earthworm Ecotoxicology. Sheppard, S.C., Bembridge, J.D., Holmstrup, M., and L. Posthuma, (eds). SETAC Press, 456 pp. | (8) | EPA (1996). Ecological effects test guidelines. Earthworm Subchronic Toxicity Test (850.62.00). United States Environmental Protection Agency. Office of Prevention, Pesticides and Toxic Substances. EPA712-C-96-167, April 1996. | (9) | Bouché, M.B. (1972). Lombriciens de France, Ecologie et systématique. Publication de l'Institut National de la Recherche Agronomique. | (10) | Edwards, C.A. (1983). Development of a standardized laboratory method for assessing the toxicity of chemical substances to earthworms. Report EUR 8714 EN, Commission of European Communities. | (11) | Greig-Smith, P.W., H. Becker, P.J. Edwards and F. Heimbach (eds.) (1992). Ecotoxicology of Earthworms. Intercept. | (12) | Edwards, C.A. and J. P. Bohlen, (1996). Biology and ecology of Earthworms, 3rd Edition. Chapman and Hall, London. | (13) | (ISO (International Organization for Standardization) (1994). Soil Quality — Determination of pH, No. 10390. ISO, Geneve. | (14) | Hund-Rinke, K, Römbke, J., Riepert, F. & Achazi R. (2000): Beurteilung der Lebensraumfunktion von Böden mit Hilfe von Regenwurmtests. In: Toxikologische Beurteilung von Böden. Heiden, S., Erb, R., Dott, W. & Eisentraeger, A. (eds.). Spektrum Verl., Heidelberg. 59-81. | (15) | ISO (International Organization for Standardization) (1992). Soil Quality –Determination of water retention characteristics –Laboratory methods, No. 11274. ISO, Geneve. | (16) | ISO (International Organization for Standardization) (1993). Soil Quality –Determination of dry matter and water content on a mass basis — Gravimetric method, No. 11465. ISO, Geneve. | (17) | Römbke, J. and Th. Moser (1999). Organisation and Performance of an International Ringtest for the validation of the Enchytraeid Reproduction Test. UBA-Texte 4/99, 150+ 223 pp. | (18) | Finney, D.J. (1971). Probit Analysis (3rd ed.), pp. 19-76. Cambridge Univ. Press. | (19) | Finney, D.J. (1978). Statistical Method in Biological Assay. — Charles Griffin & Company Ltd, London. | (20) | Hamilton, M.A., R.C. Russo and R.V. Thurston. (1977). Trimmed Spearman-Karber Method for estimating median lethal concentrations in toxicity bioassays. Environ. Sci. Technol. 11(7), 714-719; Correction Environ. Sci. Technol. 12(1998), 417. | (21) | Williams, D.A., (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27, 103-117. | (22) | Williams, D.A., (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics 28, 519-531. | (23) | Dunnett, C.W., (1955). A multiple comparison procedure for comparing several treatments with a control. Amer. Statist. Ass. J. 50, 1096-1121. | (24) | Dunnett, C.W., (1964) New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics 20, 482-491. | (25) | Hoeven, N. van der, (1998). Power analysis for the NOEC: What is the probability of detecting small toxic effects on three different species using the appropriate standardized test protocols? Ecotoxicology 7: 355-361 | (26) | Holm, S., (1979): A simple sequentially rejective multiple test procedure. Scand. J. Statist. 6, 65-70. | (27) | Jonckheere, A. R. (1954); A Distribution-free k-Sample Test Against Ordered Alternatives, Biometrika 41, 133-145. | (28) | Terpstra, T. J. (1952); The Asymptotic Normality and Consistency of Kendall's Test Against Trend, When Ties are Present in One Ranking, Indagationes Math. 14, 327-333. | (29) | Shirley, E. A. (1979); The comparison of treatment to control group means in toxicology studies, Applied Statistics 28, 144-151. | (30) | Williams, D.A. (1986); A Note on Shirley's Nonparametric Test for Comparing Several Dose Levels with a Zero-Dose Control, Biometrics 42, 183-186. | (31) | Sokal, R.R. and F.J. Rohlf. (1981). Biometry. The Principle and practice of statistics in biological research. 2nd edition. W.H. Freeman and Company. New York. | (32) | Bruce R.D. and Versteeg D.J. (1992) A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry 11:1485-1494 | (33) | Christensen, E.R., (1984). Dose-response functions in aquatic toxicity testing and the Weibull model. Water Research 18, 213-221. | (34) | Van Ewijk, P.H. and J.A. Hoekstra. (1993). Calculation of the EC50 and its confidence interval when sub-toxic stimulus is present. Ecotox, Environ. Safety. 25, 25-32. | Appendix 1 | Definitions | The following definitions are applicable to this test method: | Chemical means a substance or a mixture. | ECx (Effect concentration for x % effect) is the concentration that causes an x % of an effect on test organisms within a given exposure period when compared with a control. For example, an EC50 is a concentration estimated to cause an effect on a test end point in 50 % of an exposed population over a defined exposure period. In this test the effect concentrations are expressed as a mass of test chemical per dry mass of the test soil or as a mass of the test chemical per unit area of the soil. | LC0 (No lethal concentration) is the concentration of a test chemical that does not kill any of exposed test organisms within a given time period. In this test the LC0 is expressed as a mass of test chemical per dry mass of the test soil. | LC50 (Median lethal concentration) is the concentration of a test chemical that kills 50 % of exposed test organisms within a given time period. In this test the LC50 is expressed as a mass of test chemical per dry mass of the test soil or as a mass of test chemical per unit area of soil. | LC100 (Totally lethal concentration) is the concentration of a test chemical kills 100 % of exposed test organisms within a given time period. In this test the LC100 is expressed as a mass of test chemical per dry mass of the test soil. | LOEC (Lowest Observed Effect Concentration) is the lowest test chemical concentration that has a statistically significant effect (p < 0,05) In this test the LOEC is expressed as a mass of test chemical per dry mass of the test soil or as a mass of test chemical per unit area of soil. All test concentrations above the LOEC should normally show an effect that is statistically different from the control. Any deviations from the above must be justified in the test report. | NOEC (No Observed Effect Concentration) is the highest test chemical concentration immediately below the LOEC at which no effect is observed. In this test, the concentration corresponding to the NOEC, has no statistically significant effect (p < 0,05) within a given exposure period when compared with the control. | Reproduction rate: Mean number of juvenile worms produced per a number of adults over the test period. | Test chemical means any substance or mixture tested using this test method. | Appendix 2 | Determination of the maximum water holding capacity of the soil | The following method for determining the maximum water holding capacity of the soil has been found to be appropriate. It is described in Annex C of the ISO DIS 11268-2 (1). | Collect a defined quantity (e.g. 5 g) of the test soil substrate using a suitable sampling device (auger tube etc.). Cover the bottom of the tube with a piece of filter paper fill with water and then place it on a rack in a water bath. The tube should be gradually submerged until the water level is above to the top of the soil. It should then be left in the water for about three hours. Since not all water absorbed by the soil capillaries can be retained, the soil sample should be allowed to drain for a period of two hours by placing the tube onto a bed of very wet finely ground quartz sand contained within a covered vessel (to prevent drying). The sample should then be weighed, dried to constant mass at 105 °C. The water holding capacity (WHC) can then be calculated as follows: | Where: | S | = | water-saturated substrate + mass of tube + mass of filter paper | T | = | tare (mass of tube + mass of filter paper) | D | = | dry mass of substrate | REFERENCES: | (1) | ISO (International Organization for Standardisation ) (1996). Soil Quality — Effects of pollutants on earthworms (Eisenia fetida). Part 2: Determination of effects on reproduction, No.11268-2. ISO, Geneve. | Appendix 3 | Determination of soil pH | The following method for determining the pH of a soil is based on the description given in ISO DIS 10390: Soil Quality — Determination of pH (1). | A defined quantity of soil is dried at room temperature for at least 12 h. A suspension of the soil (containing at least 5 grams of soil) is then made up in five times its volume of either a 1 M solution of analytical grade potassium chloride (KCl) or a 0,01 M solution of analytical grade calcium chloride (CaCl2). The suspension is then shaken thoroughly for five minutes and then left to settle for at least 2 hours but not for longer than 24 hours. The pH of the liquid phase is then measured using a pH-meter that has been calibrated before each measurement using an appropriate series of buffer solutions (e.g. pH 4,0 and 7,0). | REFERENCES: | (1) | ISO (International Organization for Standardization) (1994). Soil Quality — Determination of pH, No. 10390. ISO, Geneve. | Appendix 4 | Culturing of Eisenia fetida/Eisenia andrei | Breeding should preferably be carried out in a climatic chamber at 20 °C ± 2 °C. At this temperature and with the provision of sufficient food, the worms become mature after about 2 to 3 months. | Both species can be cultured in a wide range of animal wastes. The recommended breeding medium is a 50:50 mixture of horse or cattle manure and peat. Checks should be made to ensure that cows or horses from which manure is obtained are not subject to medication or treatment with chemicals, such as growth promoters, nematicides or similar veterinary products that could adversely affect the worms during the test. Self-collected manure obtained from an “organic” source is recommended, since experience has shown that commercially available manure used as garden fertiliser may have adverse effects on the worms. The medium should have a pH value of approximately 6 to 7 (adjusted with calcium carbonate), a low ionic conductivity (less than 6 mS/cm or 0,5 % salt concentration) and should not be contaminated excessively with ammonia or animal urine. The substrate should be moist but not too wet. Breeding boxes of 10 to 50-litre capacity are suitable. | To obtain worms of standard age and size (mass), it is best to start the culture with cocoons. Once the culture has been established it is maintained by placing adult worms in a breeding box with fresh substrate for 14 days to 28 days to allow further cocoons to be produced. The adults are then removed and the juveniles produced from the cocoons used as the basis for the next culture. The worms are fed continuously with animal waste and transferred into fresh substrate from time to time. Experience has shown that air-dried finely ground cow or horse manure or oatmeal is a suitable food. It should be ensured that cows or horses from which manure is obtained are not subject to medication treatment with chemicals, such as growth promoters, that could adversely affect the worms during long term culture. The worms hatched from the cocoons are used for testing when they are between 2 and 12 months old and considered to be adults. | Worms can be considered to be healthy if they move through the substrate, do not try to leave the substrate and reproduce continuously. Substrate exhaustion is indicated by worms moving very slowly and having a yellow posterior end. In this case the provision of fresh substrate and/or a reduction in stocking density is recommended. | Appendix 5 | Techniques for counting juvenile worms hatched from cocoons | Hand sorting of worms from the soil substrate is very time-consuming. Two alternative methods are therefore recommended: | (a) | The test containers are placed in a water bath initially at a temperature of 40 °C but rising to 60 °C. After a period of about 20 minutes the juvenile worms should appear at the soil surface from which they can be easily removed and counted. | (b) | The test soil may be washed through a sieve using the method developed by van Gestel et al. (1) providing the peat and the manure or oatmeal added to the soil were ground to a fine powder. Two 0,5 mm mesh size sieves (diameter 30 cm) are placed on top of each other. The contents of a test container are washed through the sieves with a powerful stream of tap water, leaving the young worms and cocoons mainly on the upper sieve. It is important to note that the whole surface of the upper sieve should be kept wet during this operation so that the juvenile worms float on a film of water, thereby preventing them from creeping through the sieve pores. Best results are obtained when a showerhead is used. | Once all the soil substrate has been washed through the sieve, juveniles and cocoons can be rinsed from the upper sieve into a bowl. The contents of the bowl are then left to stand allowing empty cocoons to float on the water surface and full cocoons and young worms to sink to the bottom. The standing water can then be poured off and the young worms and cocoons transferred to a petri dish containing a little water. The worms can be removed for counting using a needle or a pair of tweezers. | Experience has shown that method (a) is better suited to extraction of juvenile worms that might be washed through even a 0,5 mm sieve. | The efficiency of the method used to remove the worms (and cocoons if appropriate) from the soil substrate should always be determined. If juveniles are collected using the hand sorting technique it is advisable to carry out the operation twice on all samples. | REFERENCES: | (1) | Van Gestel, C.A.M., W.A. van Dis, E.M. van Breemen, P.M. Sparenburg (1988). Comparison of two methods determining the viability of cocoons produced in earthworm toxicity experiments. Pedobiologia 32:367-371. | Appendix 6 | Overview of the statistical assessment of data (NOEC determination) | Exclude control without solvent | Are both controls equal? U-Test | Are both controls equal? t-Test | Bonferroni — U-Test | Jonckheere-Terpstra Test | Shirley Test | Dunn's Test | Both controls might be pooled | Additional solvent control? | Additional solvent control? | Statistical testing not recommended | At least four replicates per treatment? | No success | Transform data | Data: | Variation homogenous? | Distribution normal? | Yes | Yes | Yes | Yes | Yes | Yes | Yes | No | No | No | No | No | No | Dunnett's Test | William Test | Exclude control without solvent | Both controls might be pooled | Start | Non-parametric Tests | Parametric Tests | C.34. DETERMINATION OF THE INHIBITION OF THE ACTIVITY OF ANAEROBIC BACTERIA — REDUCTION OF GAS PRODUCTION FROM ANAEROBICALLY DIGESTING (SEWAGE) SLUDGE | INTRODUCTION | 1. | This test method is equivalent to the OECD test guideline (TG) 224 (2007). Chemicals discharged to the aquatic environment pass through both aerobic and anaerobic zones, where they may be degraded and/or can inhibit bacterial activity; in some cases they can remain in anaerobic zones undisturbed for decades or longer. In waste water treatment the first stage, primary settlement, is aerobic in the supernatant liquid and anaerobic in the subnatant sludge. This is followed in the secondary stage by an aerobic zone in the activated sludge aeration tank and an anaerobic zone in the subnatant sludge in the secondary settlement tank. Sludge from both of these stages is usually subjected to anaerobic treatment, producing methane and carbon dioxide which are normally used to produce electricity. In the wider environment, chemicals reaching sediments in bays, estuaries and the sea are likely to remain in these anaerobic zones indefinitely if they are not biodegradable. Larger proportions of some chemicals will preferably reach these zones because of their physical properties, such as low solubility in water, high adsorption to suspended solids, as well as inability to be biodegraded aerobically. | 2. | While it is desirable that chemicals discharged to the environment should be biodegradable under both aerobic and anaerobic conditions, it is essential that such chemicals do not inhibit the activity of microorganisms in either zone. In the UK there have been a few cases of complete inhibition of methane production caused by, for example, pentachlorophenol in industrial discharges, leading to very costly transportation of inhibited sludge from the digesters to “safe” sites and importation of healthy digesting sludge from neighbouring installations. But there have been many cases of less severe disruption of digestion by several other chemicals, including aliphatic halohydrocarbons (dry-cleaning) and detergents, leading to significant impairment of digester efficiency. | 3. | Only one test method, C.11 (1), deals with inhibition of bacterial activity (Respiration of activated sludge), which assesses the effect of test chemicals on the rate of oxygen uptake in the presence of substrate. The method has been widely used to give early warning of possible harmful effects of chemicals on the aerobic treatment of wastewaters, as well as indicating non-inhibitory concentrations of test chemicals to be used in the various tests for biodegradability. Test method C.43 (2) offers a limited opportunity for determining the toxicity of a test chemical to gas production by anaerobic sludge, diluted to one tenth of its normal concentration of solids to allow the required precision in the assessment of percentage biodegradation. Because diluted sludge could be more sensitive to inhibitory chemicals, the ISO group decided to prepare a method using undiluted sludge. At least three texts were examined (from Denmark, Germany and the UK) and finally two ISO standards were prepared, one using undiluted sludge, ISO 13 641-1 (3) and the other using one hundredth diluted sludge, ISO 13 641-2 (4), to represent muds and sediments having low bacterial populations. Both methods were subjected to a ring-test (5); part 1 was confirmed as an acceptable standard but there was disagreement over part 2. The UK considered that, because a significant proportion of participants reported very little or no gas production, partly because the percentage gas space was too high (at 75 %) for optimal sensitivity, the method requires further investigation. | 4. | Earlier work in the UK (6)(7) described a manometric method using undiluted digesting sludge, plus raw sewage sludge as the substrate, in 500 ml flasks; the apparatus was cumbersome and the stench of the raw sludge was offensive. Later the more compact and convenient apparatus of Shelton and Tiedje (8) as developed by Battersby and Wilson (9) was successfully applied by Wilson et al. (10). Kawahara et al (11) successfully prepared more standard sludges in the laboratory for use in tests for anaerobic biodegradability and inhibition on a number of chemicals. Also, raw sludge as the substrate was replaced to carry out a test either with one hundredth diluted anaerobic sludge or with muds, sediments etc. of low bacterial activity. | 5. | This method can provide information that is useful in predicting the likely effect of a test chemical on gas production in anaerobic digesters. However, only longer tests simulating working digesters more closely can indicate whether adaptation of the microorganisms to the test chemical can occur or whether chemicals likely to be absorbed and adsorbed onto sludge can build up to a toxic concentration over a longer period than allowed in this test. | PRINCIPLE OF THE TEST | 6. | Aliquots of a mixture of anaerobically digesting sludge (20 g/l to 40 g/l total solids) and a degradable substrate solution are incubated alone and simultaneously with a range of concentrations of the test chemical.in sealed vessels for up to 3 days. The amount of gas (methane plus carbon dioxide) produced is measured by the increase in pressure (Pa) in the bottles. The percentage inhibition of gas production brought about by the various concentrations of the test chemical is calculated from the amounts produced in the respective test and control bottles. The EC50 and other effective concentrations are calculated from plots of percentage inhibition against the concentration of the test chemicals or, more usually, its logarithm. | INFORMATION ON THE TEST CHEMICAL | 7. | Test chemicals should normally be used in the purest form readily available, since impurities in some chemicals, e.g. chlorophenols, can be much more toxic than the test chemical itself. However, the needs to test chemicals in the form in which they are produced/made commercially available should be considered. The use of formulated products is not routinely recommended, but for poorly soluble test chemicals the use of formulated material may be appropriate. Properties of the test chemical which should be available include solubility in water and some organic solvents, vapour pressure, adsorption coefficient, hydrolysis and biodegradability under anaerobic conditions. | APPLICABILITY OF THE METHOD | 8. | The test is applicable to chemicals which are soluble or insoluble in water, including volatile chemicals. But special care is necessary with materials of low water-solubility (see ref. (12)) and of high volatility. Also, inocula from other anaerobic sites, e.g. muds, saturated soils, sediments, may be used. Anaerobic bacterial systems that have previously been exposed to toxic chemicals may be adapted to maintaining their activity in the presence of xenobiotic chemicals. Inocula from adapted bacterial systems may show a higher tolerance to the test chemicals compared to inocula obtained from non-adapted systems. | REFERENCE CHEMICALS | 9. | To check the procedure, a reference chemical is tested by setting up appropriate vessels in parallel as part of normal test runs; 3, 5-dichlorophenol has been shown to be a consistent inhibitor of anaerobic gas production, as well as of oxygen consumption by activated sludge and other biochemical reactions. Two other chemicals have been shown to be more inhibitory to methane production than 3, 5-dichlorophenol, namely methylene bis-thiocyanate and pentachlorophenol but results with them have not been validated. Pentachlorophenol is not recommended since it is not readily available in a pure form. | REPRODUCIBILITY OF THE RESULTS | 10. | In an international ring test (5) there was only fair reproducibility in EC50 values between the 10 participating laboratories for 3, 5-dichlorophenol and 2-bromo-ethane sulphonic acid. (The range for the former was 32 mg/l to 502 mg/l and for the latter 220-2 190 mg/l.) | Number of laboratories | As mg/l | As mg/g sludge | mean | s.d. | cv(%) | mean | s.d. | cv(%) | | 3, 5-Dichlorophenol | 10 | 153 | 158 | 103 | 5 | 4,6 | 92 | | 2-Bromo-ethane sulphonic acid | 10 | 1 058 | 896 | 85 | 34 | 26 | 76 | EC50 data from ring test — undiluted sludge | 11. | The high coefficients of variation between laboratories to a large extent reflect differences in the sensitivity of the sludge microorganisms due to either pre-exposure or no pre-exposure to the test chemical or other chemically related chemicals. The precision with which the EC50 value based on the sludge concentration was determined was barely better than the “volumetric” value (mg/l). The three laboratories which reported the precision of their EC50 values for 3,5-dichlorophenol showed much lower coefficients of variation (22, 9, and 18 % respectively for EC50 mg/g) than those of the means of all ten laboratories. The individual means for the three laboratories were 3,1, 3,2 and 2,8 mg/g, respectively. The lower, acceptable coefficients of variation within laboratories compared with the much higher coefficients between laboratory values, namely 9-22 % cf. 92 %, indicate that there are significant differences in the properties of the individual sludges. | DESCRIPTION OF THE METHOD | Apparatus | 12. | Usual laboratory equipment and the following are required: | (a) | Incubator — spark-proof and controlled at 35 °C ± 2 °C; | (b) | Pressure-resistant glass test vessels of an appropriate nominal size (15), each fitted with a gas-tight coated septum, capable of withstanding about 2 bar or 2 × 105 Pa (for coating use e.g. PTFE = polytetrafluorethene). Glass serum bottles of nominal volume 125 ml, with an actual volume of around 160 ml, sealed with serum septa (16) and crimped aluminium rings are recommended; but bottles of total volume between 0,1 and 1 litre may be used successfully; | (c) | Precision pressure-meter (17) and needle attachment | Total gas production (methane plus carbon dioxide) measured by means of a pressure-meter adapted to enable measurement and venting of the gas produced. An example of a suitable instrument is a hand-held precision pressure-meter connected to a syringe needle; a three-way gas-tight valve facilities the release of excess pressure (Appendix 1). It is necessary to keep the internal volume of the pressure transducer tubing and valve as low as possible, so that errors introduced by neglecting the volume of the equipment are insignificant; | (d) | Insulated containers, for transport of digesting sludge; | (e) | Three-way pressure valves; | (f) | Sieve, having a 1 mm square mesh; | (g) | Reservoir, for digesting sludge, a glass or high-density polyethylene bottle, capacity about 5 litre, fitted with a stirrer and facilities for passing a stream of nitrogen gas (see paragraph 13) through the headspace; | (h) | membrane filters (0,2 μm) for sterilising the substrate; | (i) | micro syringes, for the gas-tight connection of the pressure transducer (see paragraph 12(c)) to the headspace in the bottles (see paragraph 12(b)); also for adding insoluble liquid test materials into the bottles; | (j) | glove box, optional but recommended, with a slight positive pressure of nitrogen. | Reagents | 13. | Use analytical grade reagents throughout. Nitrogen gas, of high purity with a content of less than 5 μl/l oxygen, should be used throughout. | Water | 14. | If dilution is necessary at any stage, use deionised water previously de-aerated. Analytical controls on this water are not necessary, but ensure that the deionising apparatus is regularly maintained. Use deionised water also for the preparation of stock solutions. Prior to the addition of the anaerobic inoculum to any solution or dilution of test material, make sure that these are oxygen-free. This is done either by blowing nitrogen gas through the dilution water (or through the dilutions) for 1 hour before adding the inoculum, or alternatively by heating the dilution water to the boiling point and cooling to room temperature in an oxygen-free atmosphere. | Digested Sludge | 15. | Collect actively digesting sludge from a digester at a wastewater treatment plant, or alternatively, from a laboratory digester, treating sludge from predominantly domestic sewage. Practical information regarding sludge from a laboratory digester can be found elsewhere (11). If use of an adapted inoculum is intended, digesting sludge from an industrial sewage treatment plant may be considered. Use wide-necked bottles constructed from high-density polyethylene or a similar material, which can expand, for sludge collection. Add sludge to the sample bottles to within about 1 cm from the top of the bottles, seal them tightly, preferably with a safety valve (paragraph 12(e)), and place in insulated containers (paragraph 12(d)) to minimise temperature shock, until being transferred to an incubator maintained at 35 °C ± 2 °C. When opening the bottles, take care to release excess gas pressure either by cautiously loosening the seal, or by means of the three-way pressure-release valve (paragraph 12(e)). It is preferable to use the sludge within a few hours of collection, otherwise store at 35 °C ± 2 °C under a headspace of nitrogen for up to 3 days, when little loss of activity normally occurs. | Warning — Digesting sludge produces flammable gases which present fire and explosion risks: it also contains potentially pathogenic organisms, so take appropriate precautions when handling sludge. For safety reasons, do not use glass vessels for collecting sludge. | Inoculum | 16. | Immediately prior to use, mix the sludge by gentle stirring and pass it through a 1 mm2 mesh sieve (paragraph 12(f)) into a suitable bottle (paragraph 12(g)) through the headspace of which a stream of nitrogen is passed. Set aside a sample for measurement of the concentration of total dry solids (see e.g. ISO 11 923 (13) or equivalent EU standard). In general, use the sludge without dilution. The solids concentration is usually between 2 % and 4 % (w/v). Check the pH value of the sludge and, if necessary, adjust to 7 ± 0,5. | Test substrate | 17. | Dissolve 10 g nutrient broth (e.g. Oxoid), 10 g of yeast extract and 10 g of D-glucose in deionised water and dilute to 100 ml. Sterilise by filtration through a 0,2 μm membrane filter (paragraph 12(h)) and use immediately or store at 4 °C for not longer than 1 day. | Test chemical | 18. | Prepare a separate stock solution for each water-soluble test chemical to contain, for example, 10 g/l of the chemical in oxygen-free dilution water (paragraph 14). Use appropriate volumes of these stock solutions to prepare the reaction mixtures containing graded concentrations. Alternatively, prepare a dilution series of each stock solution so that the volume added to the test bottles is the same for each required final concentration. The pH of the stock solutions should be adjusted to 7 ± 0,2 if necessary. | 19. | For test chemicals which are insufficiently soluble in water, consult ISO 10 634 (12) or equivalent EU standard. If an organic solvent is needed to be used, avoid solvents such as chloroform and carbon tetrachloride, which are known strongly to inhibit methane production. Prepare a solution of an appropriate concentration of water-insoluble chemical in a suitable volatile solvent, for example, acetone, di-ethylether. Add the required volumes of solvent solution to the empty test bottles (paragraph 12(b)) and evaporate the solvent before the addition of sludge. For other treatments use ISO 10 634 (12) or equivalent EU standard, but be aware that any surfactants used to produce emulsions may be inhibitory to anaerobic gas production. If it is thought that the presence of organic solvents and emulsifying agents causes artefacts, the test chemical could be added directly to the test mixture as a powder or liquid. Volatile chemicals and water-insoluble liquid test chemicals may be injected into inoculated serum bottles, using micro-syringes (paragraph 12(i)). | 20. | Add test chemicals to the bottles to give a geometric series of concentrations, for example, 500 mg/l, 250 mg/l, 125 mg/l, 62,5 mg/l, 31,2 mg/l and 15,6 mg/l. If the range of toxicity is not known from similar chemicals, first carry out a preliminary range-finding test with concentration of 1 000 mg/l, 100 mg/l and 10 mg/l to ascertain the appropriate range. | Reference chemical | 21. | Prepare an aqueous solution of 3,5-dichlorophenol (10 g/l) by gradually adding the minimum amount of 5 mol/l of sodium hydroxide solution to the solid, while shaking, until it has dissolved. Then add de-oxygenated dilution water (paragraph 14) to the required volume; sonication may aid dissolution. Other reference chemicals may be used when the average range of the EC50 has been obtained in at least three tests with different inocula (different sources or different times of collection). | INTERFERENCE/ERRORS | 22. | Some constituents of sludge presumably could react with potential inhibitors making them unavailable to micro-organisms so giving lower, or no, inhibition. Also, if the sludge already contains a chemical which is inhibitory, erroneous results would be obtained when that chemical was subjected to the test. Apart from these possibilities, there are a number of identified factors which can lead to false results. These are listed in Appendix 3, together with methods of eliminating or at least reducing errors. | TEST PROCEDURE | 23. | The number of necessary replicates depends on the degree of precision required for the inhibition indices. If the bottle seals are sufficiently gas-tight over the duration of the test, set up just one batch (at least triplicates) of test bottles at each concentration required. Similarly, set up one batch of bottles with reference chemical and one set of controls. However, if the seals of the bottles are reliable for only one or a few piercings, set up a batch (e.g. triplicates) of the test bottles for each interval (t) for which results are required for all concentrations of a test chemical to be tested. Similarly, set up “t” batches of bottles for the reference chemical and for the controls. | 24. | The use of a glove box (paragraph 12(j)) is recommended. At least 30 minutes before starting the test, start a flow of nitrogen gas through the glove box containing all the necessary equipment. Ensure that the temperature of the sludge is within 35 °C ± 2 °C during handling and sealing of the bottles. | Preliminary Test | 25. | If the activity of the sludge is unknown, it is recommended to carry out a preliminary test. Set up controls to give, for example, concentrations of solids of 10 g/l, 20 g/l and 40 g/l plus substrate but use no test chemical. Also, use different volumes of reaction mixture in order to have three or four ratios of volume of headspace to volume of liquid. From the results of gas volumes produced at various time intervals, the most suitable conditions which allow two daily measurements yielding significant volumes of gas and release of pressure per day at optimal sensitivity (18) without fear of explosions. | Addition of test chemicals | 26. | Add water-soluble test chemicals to empty test bottles (paragraph 12(b)) as aqueous solutions (paragraph 18). Use at least triplicate sets of bottles for each of a range of concentrations (paragraph 20). In the case of insoluble and poorly soluble test chemical, inject solutions of these in organic solvents using a micro-syringe into empty bottles to give replicate sets of each five concentrations of test chemical. Evaporate the solvent by passing a jet of nitrogen gas over the surface of the solutions in the test bottles. Alternatively, add insoluble solid chemicals as weighed amounts of the solid directly to the test bottles. | 27. | If insoluble and poorly water-soluble liquid test chemicals are not added using a solvent, add them directly by micro-syringe to the test bottles after addition of inoculum and test substrate (see paragraph 30). Volatile test chemicals may be added in the same way. | Addition of inoculum and substrate | 28. | Stir an appropriate volume of sieved digesting sludge (see paragraph 16) in a 5 litre bottle (paragraph 12(g)), while passing a stream of nitrogen gas through the headspace. Flush test bottles, containing aqueous solutions or evaporated solvent solutions of test chemicals, with a stream of nitrogen gas, for about two minutes to remove air. Dispense aliquots, e.g. 100 ml, of the well-mixed sludge into the test bottles using a large-tipped pipette or a measuring cylinder. It is essential to fill the pipette in one step to the exact volume of sludge required because of the ease of settlement of sludge solids. If more is taken up, empty the pipette and start again. | 29. | Then add sufficient substrate solution (paragraph 17) to give a concentration of 2 g/l of each of the nutrient broth, yeast extract and D-glucose in the mixture, while nitrogen is still flushing through. The following is an example for test batches. | Final mass concentration of test chemical in test bottles | (mg/l) | Volume of test chemical | (ml) | Reagents and media | (ml) | Stock solution | (a) | 10 g/l | para. 18 | Stock solution | (b) | 1 g/l | para. 18 | Dilution water | para. 14 | Inoculum | para. 16 | Substrate | para. 17 | 0 | — | 0 | 1,0 | 100 | 2 | 1 | — | 0,1 | 0,9 | 100 | 2 | 3,3 | — | 0,33 | 0,67 | 100 | 2 | 10 | 0,1 | — | 0,9 | 100 | 2 | 33 | 0,33 | — | 0,67 | 100 | 2 | 100 | 1,0 | — | 0 | 100 | 2 | Total volume of bottle = 160 ml. Volume of liquid = 103 ml | Gas volume = 57 ml, or 35,6 % of total volume. | 30. | Similarly flush out with nitrogen gas sufficient empty test bottles to deal with any volatile and insoluble liquid test chemical (see paragraph 27). | Controls and reference chemical | 31. | Set up at least triplicate sets of bottles, containing sludge and substrate only, to act as controls. Set up further replicate bottles containing sludge and substrate plus sufficient stock solution of the reference chemical, 3,5-dichlorophenol (paragraph 21) to result in a final concentration of 150 mg/l. This concentration should inhibit gas production by about 50 %. Alternatively, set up a range of concentrations of the reference chemical. In addition, set up four extra bottles for pH measurement which contain sludge, de-oxygenated water and substrate. Add the test chemical to two bottles at the highest concentration being tested and add de-oxygenated water to the remaining two bottles. | 32. | Ensure that all bottles — test and reference chemicals, and controls — contain the same volume (VR) of liquid; where necessary, add de-oxygenated deionised water (paragraph 14) to make up the volume. The headspace should be between 10 % and 40 % of the bottle volume, the actual value being selected from the data obtained from the preliminary test. After adding all constituents to the bottles, remove the needle supplying the gas and seal each bottle with a rubber stopper and an aluminium cap (Paragraph 12(b)) moistening the stopper with a drop of deionised water to aid insertion. Mix the contents of each bottle by shaking. | Incubation of bottles | 33. | Transfer the bottles to the thermostatically controlled incubator, preferably equipped with a shaking device, and maintained at 35 °C ± 2 °C. The bottles are incubated in the dark. After about 1 hour, equalise the pressure in the bottles to atmosphere by inserting the syringe needle, attached to the pressure-meter (paragraph 12(c)), through the seal of each bottle in turn, open the valve until the pressure-meter reads zero and finally close the valve. The needle should be inserted at an angle of about 45° to prevent gas leaking from the bottles. If the bottles are incubated without shaking facility, shake manually twice each day during the total incubation period to equilibrate the system. Incubate the bottles and invert them to prevent any loss of gas through the septum. Inversion is, however, not appropriate in cases in which insoluble test chemicals may adhere to the bottom of the flask. | Pressure measurement | 34. | When the bottles have reached 35 °C ± 2 °C, measure and record the pH of the contents of two of the four bottles set up for the purpose and discard the contents; continue incubating remaining bottles in the dark. Measure and record the pressure in the bottles twice a day over the following 48 hours to 72 hours by inserting the needle of the pressure-meter through the seal of each bottle, in turn, drying the needle between measurements. Keep all parts of the bottle at the incubation temperature during the measurement, which should be carried out as quickly as possible. Allow the pressure reading to stabilise and record it. Then open the valve for ventilation and close it when the pressure reads zero. Continue the test usually for 48 hours from the time of first equalising the pressure, designated “time 0”. The number of readings and ventilations should be limited for volatile chemicals to one (at the end of incubation) or two to minimise loss of test chemical (10). | 35. | If the pressure reading is negative, do not open the valve. Moisture sometimes accumulates in the syringe needle and tubing, indicated by a small negative pressure reading. In this case remove the needle, shake the tubing, dry with a tissue and fit a new needle. | pH measurement | 36. | Measure and record the pH of the contents of each bottle after the final pressure measurement. | DATA AND REPORTING | Expression of results | 37. | Calculate the sum and average of the pressures recorded at each time interval for each set of replicate bottles and calculate the mean cumulative gross gas pressure at each time interval for each set of replicates. Plot curves of mean cumulative gas production (Pa) against time for control, test and reference bottles. Select a time on the linear part of the curve, usually 48 hours, and calculate the percentage inhibition (I) for each concentration from equation [1]: | I = (1 – Pt/PC) × 100 | [1], | where | I | = | percentage inhibition,in %; | Pt | = | the gas pressure produced with test material at selected time, in Pascal (Pa); | Pc | = | the gas pressure produced in the control at the same time, in Pascal (Pa). | It would be advisable to draw both plots, i.e. Plot I against concentration and also against logarithm of the concentration so that the curve which is nearer to linearity may be selected. Assess the EC50 (mg/l) value visually or by regression analysis from that curve nearer to linearity. For comparative purposes it may be more useful to express the concentration of the chemical as mg chemical/g of total dry solids. To obtain this concentration, divide the volumetric concentration (mg/l) by the volumetric concentration of dry sludge solids (g/l) (paragraph 16). | 38. | Calculate either the percentage inhibition achieved by the single concentration of the reference chemical used or the EC50 if a sufficient number of concentrations have been investigated. | 39. | Convert the mean pressure of the gas produced in the control Pc(Pa) to the volume by reference to the pressure-meter calibration curve (Appendix 2) and from this calculate the yield of gas, expressed as the volume produced in 48 hours from 100 ml undiluted sludge at a solids concentration of 2 % (20 g/l) to 4 % (40 g/l). | Validity criteria | 40. | Results from the ISO inter-laboratory trial (5) showed the reference chemical (3,5-dichlorophenol) caused 50 % inhibition of gas production in a range of concentrations of 32 mg/l to 510 mg/l mean 153 mg/l (paragraph 10). This range is so wide that firm limits for inhibition cannot confidentially be set as validity criteria; this should be possible when developments have shown how to produce more consistent inocula. The volumes of gas produced in control bottles in 48 hour ranged from 21 ml/g sludge dry matter to 149 ml/g (mean 72 ml/g). There was no obvious relation between volume of gas produced and the corresponding EC50 value. The final pH varied between 6,1 and 7,5. | 41. | The test is considered to be valid when an inhibition of greater than 20 % is obtained in the reference control containing 150 mg/l of 3,5-dichlorophenol, more than 50 ml of gas per g of dry matter is produced in the blank control and the pH value is within the range of 6,2 to 7,5 at the end of the test. | Test Report | 42. | The test report must include the following information: | | Test chemical | — | common name, chemical name, CAS number, structural formula and relevant physico-chemical properties; | — | purity (impurities) of test chemical. | | Test conditions | — | volumes of liquid contents and of headspace in test vessels; | — | descriptions of the test vessels and gas measurement (e.g. type of pressure-meter); | — | application of test chemical and reference chemical to the test system, test concentrations used and use of any solvents; | — | details of the inoculum used: name of sewage treatment plant, description of the source of waste water treated (e.g. operating temperature, sludge retention time, predominantly domestic sewage or industrial waste, etc.), concentration of solids, gas production activity of anaerobic digester, previous exposure or possible pre-adaptation to toxic chemicals or site of collection of mud, sediment etc; | — | incubation temperature and range; | — | number of replicates. | | Results | — | pH values at end of test; | — | all the measured data collected in the test, blank and reference chemical control vessels, as appropriate (e.g. pressure in Pa or millibars) in tabular form; | — | percentage inhibition in test and reference bottles, and the inhibition-concentration curves; | — | calculation of EC50 values, expressed as mg/l and mg/g; | — | gas production per g sludge in 48 hours; | — | reasons for any rejection of the test results; | — | discussion of results, including any deviations from the procedures in this test method and discuss any deviations in the test results due to interferences and errors from what would be expected; | — | address also whether the purpose of the test was to measure the toxicity to either pre-exposed or non pre-exposed microorganisms. | LITERATURE | (1) | Chapter C.11 of this Annex: Activated Sludge, Respiration Inhibition Test. | (2) | Chapter C.43 of this Annex: Anaerobic biodegradability of organic compounds in digested sludge: method by measurement of gas production. | (3) | International Organisation for Standardisation (2003) ISO 13 641-1 Water Quality — Determination of inhibition of gas production of anaerobic bacteria — Part 1: General Test. | (4) | International Organisation for Standardisation (2003) ISO 13 641-2 Water Quality — Determination of inhibition of gas production of anaerobic bacteria — Part 2: Test for low biomass concentrations. | (5) | ISO (2000) Ring test of ISO 13 641-1 and ISO 13 641-2. Determination of inhibition of activity of anaerobic bacteria. BL 6958/A. Evans MR, Painter HA. Brixham Environmental Laboratory, AstraZeneca UK Ltd., Brixham, TQ5 8BA UK. | (6) | Swanwick JD, Foulkes M (1971). Inhibition of anaerobic digestion of sewage sludge by chlorinated hydrocarbons. Wat. Pollut. Control, 70, 58-70. | (7) | HMSO (1986) Determination of the inhibitory effects of chemicals and waste waters on the anaerobic digestion of sewage sludge. ISBN 0 117519 43 X, In: Methods for the Examination of Waters and Associated Materials UK. | (8) | Shelton DR, Tiedje JM (1984). General method for determining anaerobic biodegradation potential. Appl. Env. Microbiol. 47 850-857. | (9) | Battersby NS and Wilson V (1988). Evaluation of a serum bottle technique for assessing the anaerobic biodegradability of organic compounds under methanogenic conditions. Chemosphere 17, 2441-2460. | (10) | Wilson V, Painter HA and Battersby NS (1992). A screening method for assessing the inhibition of the anaerobic gas production from sewage sludge. Proc. Int. Symp. on Ecotoxicology. Ecotoxicological Relevance of Test Methods, GSF Forschungzentrum, Neuherberg, Germany (1990). Eds. Steinberg C and Kettrup A, pp117-132 (1992). | (11) | Kawahara K, Yakabe Y, Chida T, and Kida K (1999). Evaluation of laboratory-made sludge for an anaerobic biodegradability test and its use for assessment of 13 chemicals. Chemosphere, 39 (12), 2007-2018. | (12) | International Organization for Standardization (1995) ISO 10 634 Water Quality — Guidance for the preparation and treatment of poorly water-soluble organic compounds for the subsequent evaluation of their biodegradability in an aqueous medium. | (13) | International Organization for Standardization (1997) ISO 11 923 Water Quality — Determination of suspended solids by filtration through glass-fibre filters. | Appendix 1 | Example of an apparatus to measure biogas production by gas pressure | Key: | 1 | — | Pressure-meter | 2 | — | 3-way gas-tight valve | 3 | — | Syringe needle | 4 | — | Gastight seal (crimp cap and septum) | 5 | — | Head space | 6 | — | Digested sludge inoculum | Test vessels in an environment of 35 °C ± 2 °C | Appendix 2 | Conversion of the pressure-meter | The pressure-meter readings may be related to gas volumes by means of a standard curve and from this the volume of gas produced per g dry sludge per 48 hours may be calculated. This activity index is used as one of the criteria by which to assess the validity of test results. The calibration curve is produced by injecting known volumes of gas at 35 °C ± 2 °C in serum bottles containing a volume of water equal to that of the reaction mixture, VR; | — | Dispense VR ml aliquots of water, kept at 35 °C ± 2 °C into five serum bottles. Seal the bottles and place in a water bath at 35 °C ± 2 °C for 1 hour to equilibrate; | — | Switch on the pressure-meter, allow to stabilise, and adjust to zero; | — | Insert the syringe needle through the seal of one of the bottles, open the valve until the pressure-meter reads zero and close the valve; | — | Repeat the procedure with the remaining bottles; | — | Inject 1 ml of air at 35 °C ± 2 °C into each bottle. Insert the needle (on the meter) through the seal of one of the bottles and allow the pressure reading to stabilise. Record the pressure, open the valve until the pressure reads zero and then close the valve; | — | Repeat the procedure with the remaining bottles; | — | Repeat the total procedure using 2 ml, 3 ml, 4 ml, 5 ml, 6 ml, 8 ml, 10 ml, 12 ml, 16 ml, 20 ml, and 50 ml of air; | — | Plot a conversion curve of pressure (Pa) against gas volume injected (ml). The response of the instrument is linear over the range 0 Pa to 70 000 Pa, and 0 ml to 50 ml of gas production. | Appendix 3 | Identified factors which can lead to false results | (a) Quality of the bottle-caps | Different types of septa for the serum bottles are available commercially; many of them, including butyl rubber, lose tightness when pierced with a needle under the conditions of this test. Sometimes the pressure falls very slowly once the septum has been pierced with the syringe needle. The use of gas-tight septa is recommended to overcome leaks (paragraph 12(b)). | (b) Moisture in the syringe needle | Moisture sometimes accumulates in the syringe needle and tubing, and is indicated by a small negative pressure reading. To rectify this remove the needle and shake the tubing, dry with a tissue and fit a new needle (paragraphs 12(c) and 35). | (c) Oxygen contamination | Anaerobic methods are subject to error from contamination by oxygen, which can cause lower gas production. In this method this possibility should be minimised by the use of strictly anaerobic techniques, including use of a glove box. | (d) Gross substrates in sludge | The anaerobic gas production and the sensitivity of the sludge are influenced by substrates which are transferred with the inoculum into the test bottles. Digested sludge from domestic anaerobic digesters still often contains recognisable matter like hair and plant residues of cellulose, which tend to make it difficult to take representative samples. By sieving the sludge gross insoluble matter can be removed, which makes representative sampling more likely (paragraph 16). | (e) Volatile test chemicals | Volatile test chemicals will be released into the headspace of the test bottles. This may result in the loss of some of the test material from the system during venting after pressure measurements, yielding falsely high EC50 values. By suitable choice of ratio of headspace volume to liquid volume and by not venting after taking pressure measurements, the error can be reduced (10). | (f) Non-linearity of gas production | If the plot of mean cumulative gas production against incubation time is not approximately linear over the 48h period, the accuracy of the test may be lowered. To overcome this, it may be advisable to use digesting sludge from a different source and/or to add an increased concentration of the test substrate-nutrient broth, yeast extract and glucose (paragraph 29). | Appendix 4 | Application to environmental samples of low biomass concentration — anaerobic muds, sediments, etc. | INTRODUCTION | A.1 In general, the specific microbial activity (volume of gas produced per g dry solids) of naturally occurring anaerobic muds, sediments, soils, etc, is much lower than that of anaerobic sludge derived from sewage. Because of this, when the inhibitory effects of chemicals on these less active samples are to be measured some of the experimental conditions have to be modified. For these less active samples there are two general course of action possible: | (a) | Carry out a modified preliminary test (paragraph 25) with the undiluted sample of mud, soil, etc at 35 °C ± 2 °C or at the temperature at the sample site of collection, for more accurate simulation (as in Part 1 of ISO 13 641); | (b) | Or make the test with a dilute (1 in 100) digester sludge to simulate the low activity expected from the environment sample, but maintain the temperature at 35 °C ± 2 °C (as in Part 2 of ISO 13 641). | A.2 Option (a) may be achieved by following the method described here (equivalent to Part 1 of ISO 13 641), but it is essential to make a preliminary test (paragraph 25) to ascertain optimal conditions, unless these are already known from previous testing. The mud or sediment sample should be thoroughly mixed, e.g. in a blender, and, if necessary, diluted with a small proportion of de-aerated dilution water (paragraph 14) so that it is sufficiently mobile to be transferred by a coarse-tipped pipette or a measuring cylinder. If it is considered that nutrients may be lacking, the mud sample may be centrifuged (under anaerobic conditions) and re-suspended in the mineral medium containing yeast extract (A.11) | A.3 Option (b). This reasonably mimics the low activity of environmental samples but lacks the high concentration of suspended solids present in these samples. The role of these solids in inhibition is not known, but it is possible that reaction between the test chemicals and constituents of the mud, as well as adsorption of the test chemicals onto the solids, could result in a lowering of toxicity of the test chemical. | A.4 Temperature is another important factor: for strict simulation, tests should be made at the temperature of the sample site, since different groups of methane-producing consortia of bacteria are known to operate within different temperature ranges, namely thermophiles (~ 30-35 °C), mesophiles (20-25 °C) and psychrophiles (< 20 °C), which may display different inhibitory patterns. | A.5 Duration. In the general test, Part 1, using undiluted sludge, the production of gas in the 2-4 days was always sufficient, while in Part 2 with one-hundred diluted sludge insufficient gas, if any, was produced in this period in the ring test. Madsen et al (1996), in describing this latter test, say at least 7 days should be allowed. | Testing with low biomass concentration (Option b) | The following changes and amendments should be made, adding to or replacing some existing paragraphs and sub-paragraphs of the main text. | A.6 Add to Paragraph 6: Principle of the test; | “This technique may be used with 1 in 100 diluted anaerobic sludge, partially to simulate the low activity of muds and sediments. The incubation temperature may be either 35 °C or that of the site from which the sample was collected. Since the bacterial activity is much less than in undiluted sludge, the incubation period should be extended to at least 7 days.” | A.7 Add to paragraph 12 (a): | “the incubator should be capable of operating down to temperatures of 15 °C.” | A.8 Add an extra reagent after Paragraph 13: | “Phosphoric acid (H3PO4), 85 % by mass in water.” | A.9 Add at end of Paragraph 16: | “Use a final concentration of 0,20 ± 0,05 g/l of total dry solids in the test.” | A.10 Paragraph 17. Test substrate | This substrate is not to be used, but is replaced by yeast extract (see paragraphs 17; A.11, A.12, A.13). | A.11 A mineral medium, including trace elements, for diluting anaerobic sludge, is required and for convenience the organic substrate, yeast extract, is added to this medium. | Add after Paragraph 17 | “(a) | Test mineral medium, with yeast extract. | This is prepared from a 10-fold concentrated test medium (paragraph 17 (b); A.12) with a trace element solution (paragraph 17 (c); A.13). Use freshly supplied sodium sulphide nonahydrate (paragraph 17 (b); A.12) or wash and dry it before use, to ensure that it has sufficient reducing capacity. If the test is performed without using a glove box (paragraph 12 (j)), the concentration of sodium sulphide in the stock solution should be increased to 2 g/l (from 1 g/l). Sodium sulphide may also be added from an appropriate stock solution through the septum of the closed test bottles, as this procedure will decrease the risk of oxidation, to obtain a final concentration of 0,2 g/l. Alternatively titanium (III) citrate (paragraph 17 (b)) may be used. Add it through the septum of closed test bottles to obtain a concentration of 0,8 mmol/l to 1,0 mmol/l. Titanium (III) citrate is a highly effective and a low-toxicity reducing agent, which is prepared as follows: Dissolve 2,94 g of trisodium citrate dihydrate in 50 ml of oxygen-free dilution water (paragraph 14) (which results in a 200 mmol/l solution) and add 5 ml of a titanium (III) chloride solution (15 g/100 ml dilution water). Neutralise to pH 7 ± 0,5 with sodium carbonate and dispense to an appropriate serum bottle under a stream of nitrogen gas. The concentration of titanium (III) citrate in this stock solution is 164 mmol/l. Use the test medium immediately or store at 4 °C for no longer than 1 day. | A.12 | (b) | Tenfold concentrated test medium, prepared with the following: | anhydrous potassium dihydrogenphosphate (KH2PO4) | 2,7 g | Disodium hydrogen phosphate (Na2HPO4) | 4,4 g | (or 11,2 g dodecahydrate) | ammonium chloride (NH4Cl) | 5,3 g | calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) | 0,75 g | magnesium chloride hexahydrate (MgCl2·6H2O) | 1,0 g | iron (II) chloride tetrahydrate (FeCl2·4H2O) | 0,2 g | resazurin (redox indicator) | 0,01 g | sodium sulphide nonahydrate (Na2S·9H2O) | 1,0 g | (or titanium (III) citrate) final concentration | 0,8 mmol/l to 1,0 mmol/l | trace element solution (see paragraph 17 (c); A.13) | 10,0 ml | yeast extract | 100 g | Dissolve in dilution water (paragraph 14) and make up to: | 1 000 ml | A.13 | (c) | Trace element solution, prepared with the following: | manganese (II) chloride tetrahydrate (MnCl2·4H2O) | 0,5 g | ortho-boric acid (H3BO3) | 0,05 g | zinc chloride (ZnCl2) | 0,05 g | copper (II) chloride (CuCl2) | 0,03 g | sodium molybdate dihydrate (Na2MoO4·2H2O) | 0,01 g | cobalt (II) chloride hexahydrate (CoCl2·6H2O) | 1,0 g | nickel (II) chloride hexahydrate (NiCl2·6H2O) | 0,1 g | disodium selenite (Na2SeO3) | 0,05 g | Dissolve in dilution water (paragraph 14) and make up to: | 1 000 ml” | A.14 Paragraph 25: Preliminary test | It is essential that a preliminary test is made as described in paragraph 24, except that the concentration of sludge solids should be one hundredth of those given, that is 0,1 g/l, 0,2 g/l and 0,4 g/l. The duration of incubation should be at least 7 days. | Note: In the ring test (5) the headspace volume was much too high at 75 % total volume; it should be in the recommended range of 10 %-40 %. The relevant criterion is that the volume of gas produced at around 80 % inhibition should be measurable with acceptable precision (e.g. ± 5 % to ± 10 %). | A.15 Paragraph 26 to 30: Addition of test chemical, inoculum and substrate. | The additions are made in the same way as described in these paragraphs, but the substrate solution (paragraph 17) is replaced by the test medium plus yeast extract substrate (A.11). | Also, the final concentration of dry sludge solids is reduced from 2 g/l - 4 g/l to 0,2 ± 0,05 g/l (A.9). Two examples of the addition of components to the test mixture are given in Table A.1, which replaces the table in paragraph 29. | A.16 Paragraph 33: Incubation of bottles | Because of the expected lower rate of gas production, incubation is carried on for at least 7 days. | A.17 Paragraph 34: Pressure measurements | The same procedure for measuring the pressure in the headspace of the bottles is used as described in paragraph 34 if the amounts in the gaseous phase are required. If total amounts of CO2 plus CH4 are to be measured, the pH of the liquid phase is reduced to about pH 2 by the injection of H3PO4 into each relevant bottle and measuring the pressure after 30 minutes shaking at the temperature of the test. However, more information on the quality of the inoculum may be obtained by measuring the pressure in each bottle before and after acidification. For example when the rate of CO2 production is much higher than that of methane, the sensitivity of the fermentative bacteria may be altered and/or methanogenic bacteria are preferentially affected by the test chemical. | A.18 Paragraph 36: pH measurement | If H3PO4 is to be used some extra bottles, to which no H3PO4 is added, would have to be set up especially for the pH measurement. | REFERENCE: | Madsen, T, Rasmussen, HB; and Nilsson, L (1996), Methods for screening anaerobic biodegradability and toxicity of organic chemicals. Project No.336, Water Quality Institute, Danish Environment Protection Agency, Copenhagen. | Table A.1. | Examples of the test set-up for test batches | Reaction Mixture constituents | Example 1 | Example 2 | Normal order of addition | Concentration of prepared inoculum (g/l) | 0,42 | 2,1 | — | Volume of inoculum added (ml) | 45 | 9 | 4 | Concentration of inoculum in test bottles (g/l) | 0,20 | 0,20 | — | Volume of test medium added (ml) | 9 | 9 | 2 | Volume of dilution water added (ml) | 36 | 72 | 3 | Concentration of yeast extract in test bottles (g/l) | 9,7 | 9,7 | — | Volume of test chemical stock solution (ml) | 3 | 3 | 1 | Total liquid volume (ml) | 93 | 93 | — | Appendix 5 | Definitions | For the purpose of this test method the following definitions are used: | Chemical means a substance or a mixture. | Test chemical means any substance or mixture tested using this test method. | C.35 SEDIMENT-WATER LUMBRICULUS TOXICITY TEST USING SPIKED SEDIMENT | INTRODUCTION | 1. | This test method is equivalent to OECD test guideline (TG) 225 (2007). Sediment-ingesting endobenthic animals are subject to potentially high exposure to sediment bound chemicals and should therefore be given preferential attention, e.g. (1), (2), (3). Among these sediment-ingesters, the aquatic oligochaetes play an important role in the sediments of aquatic systems. By bioturbation of the sediment and by serving as prey these animals can have a strong influence on the bioavailability of such chemicals to other organisms, e.g. benthivorous fish. In contrast to epibenthic organisms, endobenthic aquatic oligochaetes (e.g. Lumbriculus variegatus) burrow in the sediment, and ingest sediment particles below the sediment surface. This ensures exposure of the test organisms to the test chemical via all possible uptake routes (e.g. contact with, and ingestion of contaminated sediment particles, but also via porewater and overlying water). | 2. | This test method is designed to assess the effects of prolonged exposure of the endobenthic oligochaete Lumbriculus variegatus (Müller) to sediment-associated chemicals. It is based on existing sediment toxicity and bioaccumulation test protocols, e.g. (3), (4), (5), (6), (7), (8), (9), (10). The method is described for static test conditions. The exposure scenario used in this test method is spiking of sediment with the test chemical. Using spiked sediment is intended to simulate a sediment contaminated with the test chemical. | 3. | Chemicals that need to be tested towards sediment-dwelling organisms usually persist in this compartment over long time periods. Sediment-dwelling organisms may be exposed via several routes. The relative importance of each exposure route, and the time taken for each to contribute to the overall toxic effects, depends on the physical-chemical properties of the chemical concerned and its ultimate fate in the animal. For strongly adsorbing chemicals (e.g. with log Kow > 5) or for chemicals covalently binding to sediment, ingestion of contaminated food may be a significant exposure route. In order not to underestimate the toxicity of such chemicals, the food necessary for reproduction and growth of the test organisms is added to the sediment before application of the test chemical (11). The test method described is sufficiently detailed so that the test can be carried out whilst allowing for adaptations in the experimental design depending on the conditions in particular laboratories and the varied characteristics of test chemicals. | 4. | The test method is aimed to determine effects of a test chemical on the reproduction and the biomass of the test organisms. The measured biological parameters are the total number of surviving worms and the biomass (dry weight) at the end of the exposure. These data are analysed either by using a regression model in order to estimate the concentration that would cause an effect of x % (e.g. EC50, EC25, and EC10), or by using statistical hypothesis testing to determine the No Observed Effect Concentration (NOEC) and the Lowest Observed Effect Concentration (LOEC). | 5. | Chapter C.27 of this Annex, “Sediment-water chironomid toxicity test using spiked sediment” (6), provided many essential and useful details for the performance of the presented sediment toxicity test method. Hence, this document serves as a basis on which modifications necessary for conducting sediment toxicity tests with Lumbriculus variegatus were worked out. Further documents that are referred to are e.g. the ASTM Standard Guide for Determination of the Bioaccumulation of Sediment-Associated Contaminants by Benthic Invertebrates (3), the U.S. EPA Methods for Measuring the Toxicity and Bioaccumulation of Sediment-Associated Contaminants with Freshwater Invertebrates (7), and the ASTM Standard Guide for Collection, Storage, Characterization, and Manipulation of Sediments for Toxicological Testing and for selection of samplers used to collect benthic invertebrates (12). In addition, practical experience obtained during ring-testing the test method (13), ring-test report), and details from literature are major sources of information for drawing up this document. | PREREQUISITE AND GUIDANCE INFORMATION | 6. | Information on the test chemical such as safety precautions, proper storage conditions and analytical methods should be obtained before beginning the study. Guidance for testing chemicals with physical-chemical properties that make them difficult to perform the test is provided in (14). | 7. | Before carrying out a test, the following information about the test chemical should be known: | — | common name, chemical name (preferably IUPAC name), structural formula, CAS registry number, purity; | — | vapour pressure; | — | solubility in water. | 8. | The following additional information is considered useful before starting the test: | — | octanol-water partition coefficient, Kow; | — | organic carbon-water partitioning coefficient, expressed as Koc; | — | hydrolysis; | — | phototransformation in water; | — | biodegradability; | — | surface tension. | 9. | Information on certain characteristics of the sediment to be used should be acquired before the start of the test (7). For details see paragraphs 22 to 25. | PRINCIPLE OF THE TEST | 10. | Worms of similar physiological state (synchronised as described in Appendix 5) are exposed to a series of toxicant concentrations applied to the sediment phase of a sediment-water system. Artificial sediment and reconstituted water should be used as media. Test vessels without the addition of the test chemical serve as controls. The test chemical is spiked into the sediment in bulk for each concentration level in order to minimise variability between replicates of each concentration level, and the test organisms are subsequently introduced into the test vessels in which the sediment and water concentrations have been equilibrated (see paragraph 29). The test animals are exposed to the sediment-water systems for a period of 28 days. In view of the low nutrient content of the artificial sediment, the sediment should be amended with a food source (see paragraphs 22 to 23, and Appendix 4) to ensure that the worms will grow and reproduce under control conditions. In this way it is ensured that the test animals are exposed through the water and sediment as well as by their food. | 11. | The preferred endpoint of this type of study is the ECx (e.g. EC50, EC25, and EC10; effect concentration, affecting x % of the test organisms) for reproduction and biomass, respectively, compared to the control. It should however be noted, that considering the high uncertainty of low ECx (e.g. EC10, EC25) with extremely high 95 %-confidence limits (e.g. (15)) and the statistical power calculated during hypothesis testing, the EC50 is regarded the most robust endpoint. In addition, the No Observed Effect Concentration (NOEC), and the Lowest Observed Effect Concentration (LOEC) may be calculated for biomass, and reproduction, if the test design and the data support these calculations (see paragraphs 34 to 38). The purpose of the study, ECx or NOEC derivation, will determine the test design. | REFERENCE TESTING | 12. | Performance of the control organisms is expected to demonstrate sufficiently the ability of a laboratory to perform the test, and if historical data are available, the repeatability of the test. In addition, reference toxicity tests may be conducted in regular intervals using a reference toxicant to assess the sensitivity of the test organisms. 96 h reference toxicity tests in water only may satisfactorily demonstrate the sensitivity and condition of the test animals (4)(7). Information on the toxicity of pentachlorophenol (PCP) in complete tests (28 d exposure to spiked sediment) is included in Appendix 6, and in the report on the ring test of the Test Method (13). The acute, water-only toxicity of PCP is described e.g. in (16). This information can be used for comparison of test organism sensitivity in reference tests with PCP as reference toxicant. Potassium chloride (KCl) or copper sulphate (CuSO4) have been recommended as reference toxicants with L. variegatus (4)(7). To date, establishment of quality criteria based on toxicity data for KCl is difficult due to lack of literature data for L. variegatus. Information on the toxicity of copper towards L. variegatus can be found in (17) to (21). | VALIDITY OF THE TEST | 13. | For a test to be valid, the following requirements should be fulfilled: | — | A ring-test (13) has shown that for Lumbriculus variegatus, the average number of living worms per replicate in the controls should have increased by a factor of at least 1,8 at the end of exposure compared to the number of worms per replicate at the start of exposure. | — | The pH of the overlying water should be between 6 and 9 throughout the test. | — | The oxygen concentration in the overlying water should not be below 30 % of air saturation value (ASV) at test temperature during the test. | DESCRIPTION OF THE TEST METHOD | Test system | 14. | Static systems without renewal of the overlying water are recommended. If the sediment-to-water ratio (see paragraph 15) is appropriate, gentle aeration will normally suffice to keep the water quality at acceptable levels for the test organisms (e.g. maximise dissolved oxygen levels, minimise build-up of excretory products). Semi-static or flow-through systems with intermittent or continuous renewal of overlying water should only be used in exceptional cases, since regular renewal of overlying water is expected to affect chemical equilibrium (e.g. losses of test chemical from the test system). | Test vessels and apparatus | 15. | The exposure should be conducted in glass beakers of e.g. 250 ml measuring 6 cm in diameter. Other suitable glass vessels may be used, but they should guarantee a suitable depth of overlying water and sediment. Each vessel should receive a layer of approximately 1,5 – 3 cm of formulated sediment. The ratio of the depth of the sediment layer to the depth of the overlying water should be 1:4. The vessels should be of suitable capacity in compliance with the loading rate, i.e. the number of test worms added per weight unit of sediment, (see also paragraph 39). | 16. | Test vessels and other apparatus that will come into contact with the test chemical should be made entirely of glass or other chemically inert material. Care should be taken to avoid the use of materials, for all parts of the equipment that can dissolve, absorb test chemicals or leach other chemicals and have an adverse effect on the test animals. Polytetrafluoroethylene (PTFE), stainless steel and/or glass should be used for any equipment having contact with the test media. For organic chemicals known to adsorb to glass, silanised glass may be required. In these situations the equipment will have to be discarded after use. | Test species | 17. | The test species used in this type of study is the freshwater oligochaete Lumbriculus variegatus (Müller). This species is tolerant to a wide range of sediment types, and is widely used for sediment toxicity and bioaccumulation testing [e.g. (3), (5), (7), (9), (13), (15), (16), (22), (23), (24), (25), (26), (27), (28), (29), (30), (31), (32), (33), (34), (35)]. The origin of the test animals, the confirmation of species identity (e.g. (36)) as well as the culture conditions should be reported. Identification of species is not required prior to every test if the organisms come from an in-house culture. | Culturing of the test organisms | 18. | In order to have a sufficient number of worms for conducting sediment toxicity tests, it is useful to keep the worms in permanent laboratory culture. Guidance for laboratory culture methods for Lumbriculus variegatus, and sources of starter cultures are given in Appendix 5. For details on culturing this species see references (3), (7), (27). | 19. | To ensure that the tests are performed with animals of the same species, the establishment of single species cultures is strongly recommended. Ensure that the cultures and especially the worms used in the tests are free from observable diseases and abnormalities. | Water | 20. | Reconstituted water according to Chapter C.1 of this Annex (37) is recommended for use as overlying water in the tests; it can also be used for the laboratory cultures of the worms (see Appendix 2 for preparation). If required, natural water may be used. The chosen water must be of a quality that will allow the growth and reproduction of the test species for the duration of the acclimation and test periods without showing any abnormal appearance or behaviour. Lumbriculus variegatus has been demonstrated to survive, grow, and reproduce in this type of water (30), and maximum standardisation of test and culture conditions is provided. If a reconstituted water is used, its composition should be reported, and the water should be characterised prior to use at least by pH, oxygen content, and hardness (expressed as mg CaCO3/l). Analysis of the water for micropollutants prior to use might provide useful information (see, e.g., Appendix 3). | 21. | The pH of the overlying water should be in the range of 6,0 to 9,0 (see paragraph 13). If increased ammonia development is expected, it is considered useful to keep the pH between 6,0 and 8,0. For testing of e.g. weak organic acids, it is advisable to adjust the pH by buffering the water to be used in the test, as described e.g. by (16). The total hardness of the water to be used in the test should be between 90 and 300 mg CaCO3 per liter for natural water. Appendix 3 summarises additional criteria for acceptable dilution water according to OECD Guideline No. 210 (38). | Sediment | 22. | Since uncontaminated natural sediments from a particular source may not be available throughout the year, and indigenous organisms as well as the presence of micropollutants can influence the test, a formulated sediment (also called reconstituted, artificial or synthetic sediment) should preferably be used. Use of a formulated sediment minimises variability of test conditions as well as introduction of indigenous fauna. The following formulated sediment is based on the artificial sediment according to (6), (39) and (40). It is recommended for use in this type of test ((6), (10), (30), (41), (42), (43)): | (a) | 4-5 % (dry weight) sphagnum peat; it is important to use peat in powder form, degree of decomposition: “medium”, finely ground (particle size ≤ 0,5 mm), and only air-dried. | (b) | 20 ± 1 % (dry weight) kaolin clay (kaolinite content preferably above 30 %). | (c) | 75-76 % (dry weight) quartz sand (fine sand, grain size: ≤ 2 mm, but > 50 % of the particles should be in the range of 50-200 μm). | (d) | Deionised water, 30–50 % of sediment dry weight, in addition to the dry sediment components. | (e) | Calcium carbonate of chemically pure quality (CaCO3) is added to adjust the pH of the final mixture of the sediment. | (f) | The total organic carbon content (TOC) of the final mixture should be 2 % (± 0,5 %) of sediment dry weight and should be adjusted by the use of appropriate amounts of peat and sand, according to (a) and (c). | (g) | Food, e.g. powdered leaves of Stinging Nettle (Urtica sp., in accordance with pharmacy standards, for human consumption), or a mixture of powdered leaves of Urtica sp. with alpha-cellulose (1:1), at 0,4 - 0,5 % of sediment d.w., in addition to the dry sediment components; for details see Appendix 4. | 23. | The source of peat, kaolin clay, food material, and sand should be known. In addition to item g), Chapter C.27 of this Annex (6) lists alternative plant materials to be used as a source of nutrition: dehydrated leaves of mulberry (Morus alba), white clover (Trifolium repens), spinach (Spinacia oleracea), or cereal grass. | 24. | The chosen food source should be added prior to or during spiking the sediment with the test chemical. The chosen food source should allow for at least acceptable reproduction in the controls. Analysis of the artificial sediment or its constituents for micro-pollutants prior to use might provide useful information. An example for the preparation of the formulated sediment is described in Appendix 4. Mixing of dry constituents is also acceptable if it is demonstrated that after addition of overlying water a separation of sediment constituents (e.g. floating of peat particles) does not occur, and that the peat or the sediment is sufficiently conditioned (see also paragraph 25 and Appendix 4). The artificial sediment should be characterised at least by origin of the constituents, grain size distribution (percent sand, silt, and clay), total organic carbon content (TOC), water content, and pH. Measurement of redox potential is optional. | 25. | If required, e.g. for specific testing purposes, natural sediments from unpolluted sites may also serve as test and/or culture sediment (3). However, if natural sediment is used, it should be characterised at least by origin (collection site), pH and ammonia of the pore water, total organic carbon content (TOC) and nitrogen content, particle size distribution (percent sand, silt, and clay), and percent water content (7), and it should be free from any contamination and other organisms that might compete with, or prey on the test organisms. Measurement of redox potential and cation exchange capacity is optional. It is also recommended that, before it is spiked with the test chemical, the natural sediment be conditioned for seven days under the same conditions which prevail in the subsequent test. At the end of this conditioning period, the overlying water should be removed and discarded. | 26. | The sediment to be used must be of a quality that will allow the survival and reproduction of the control organisms for the duration of the exposure period without showing any abnormal appearance or behaviour. The control worms should burrow in the sediment, and they should ingest the sediment. Reproduction in the controls should at least be according to the validity criterion as described in paragraph 13. The presence or absence of fecal pellets on the sediment surface, which indicate sediment ingestion by the worms, should be recorded and can be helpful for the interpretation of the test results with respect to exposure pathways. Additional information on sediment ingestion can be obtained by using methods described in (24), (25), (44), and (45), which specify sediment ingestion or particle selection in the test organisms. | 27. | Manipulation procedures for natural sediments prior to use in the laboratory are described in (3), (7), and (12). The preparation and storage of the artificial sediment recommended to be used in the Lumbriculus test is described in Appendix 4. | Application of the test chemical | 28. | The test chemical is to be spiked to the sediment. As most test chemicals are expected to have low water solubility, they should be dissolved in a suitable organic solvent (e.g. acetone, n-hexane, cyclohexane) at a volume as small as possible in order to prepare the stock solution. The stock solution should be diluted with the same solvent to prepare the test solutions. Toxicity and volatility of the solvent, and the solubility of the test chemical in the chosen solvent should be the main criteria for the selection of a suitable solubilising agent. For each concentration level the same volume of the corresponding solution should be used. The sediment should be spiked in bulk for each concentration level in order to minimise between-replicate variability of the test chemical concentration. Each of the test solutions is then mixed with quartz sand as described in paragraph 22 (e.g. 10 g of quartz sand per test vessel). In order to soak the quartz sand completely, a volume of 0,20 - 0,25 ml per g of sand has been found sufficient. Thereafter, the solvent must be evaporated to dryness. In order to minimise losses of the test chemical through co-evaporation (e.g. depending on the chemical's vapour pressure), the coated sand should be used immediately after drying. The dry sand is mixed with the suitable amount of formulated sediment of the corresponding concentration level. The amount of sand provided by the test-chemical-and-sand mixture has to be taken into account when preparing the sediment (i.e. the sediment should thus be prepared with less sand). The major advantage of this procedure is that virtually no solvent is introduced to the sediment (7). Alternatively, e.g. for field sediment, the test chemical may be added by spiking a dried and finely ground portion of the sediment as described above for the quartz sand, or by stirring the test chemical into the wet sediment, with subsequent evaporating of any solubilising agent used. Care should be taken to ensure that the test chemical added to sediment is thoroughly and evenly distributed within the sediment. If necessary, subsamples may be analysed to confirm the target concentrations in the sediment, and to determine degree of homogeneity. It may also be useful to analyse subsamples of the test solutions to confirm the target concentrations in the sediment. Since a solvent is used for coating the test chemical on the quartz sand, a solvent control should be employed which is prepared with the same amount of the solvent as the test sediments. The method used for spiking, and the reasons for choosing a specific spiking procedure other than described above should be reported. The method of spiking may be adapted to the test chemical's physical-chemical properties, e.g. to avoid losses due to volatilisation during spiking or equilibration. Additional guidance on spiking procedures is given in Environment Canada (1995) (46). | 29. | Once the spiked sediment has been prepared, distributed to the replicate test vessels, and topped with the test water, it is desirable to allow partitioning of the test chemical from the sediment to the aqueous phase (e.g. (3)(7)(9)). This should preferably be done under the conditions of temperature and aeration used in the test. Appropriate equilibration time is sediment and chemicals specific, and can be in the order of hours to days and in rare cases up to several weeks (4-5 weeks) (e.g. (27)(47)). In this test, equilibrium is not awaited but an equilibration period of 48 hours to 7 days is recommended. Thus, time for degradation of the test chemical will be minimised. Depending on the purpose of the study, e.g., when environmental conditions are to be mimicked, the spiked sediment may be equilibrated or aged for a longer period. | 30. | At the end of this equilibration period, samples should be taken at least of the overlying water and the bulk sediment, at least at the highest concentration and a lower one, for analysis of the test chemical concentration. These analytical determinations of the test chemical should allow for calculation of mass balance and expression of results based on measured initial concentrations. In general, sampling disturbs or destroys the sediment water system. Therefore it is usually not possible to use the same replicates for sampling of sediment and worms. Additional “analytical” vessels of appropriate dimensions have to be set up, which are treated in the same way (including the presence of test organisms) but not used for biological observations. The vessel dimensions should be selected to provide the sample amounts required by the analytical method. Details of sampling are described in paragraph 53. | PERFORMANCE OF THE TEST | Preliminary test | 31. | If no information is available on the toxicity of the test chemical towards Lumbriculus variegatus, it may be useful to conduct a preliminary experiment in order to determine the range of concentrations to be tested in the definitive test, and to optimise the test conditions of the definitive test. For this purpose a series of widely spaced concentrations of the test chemical are used. The worms are exposed to each concentration of the test chemical for a period (e.g. 28 d as in the definitive test) which allows estimation of appropriate test concentrations; no replicates are required. The behaviour of the worms, for example sediment avoidance, which may be caused by the test chemical and/or by the sediment, should be observed and recorded during a preliminary test. Concentrations higher than 1 000 mg/kg sediment dry weight should not be tested in the preliminary test. | Definitive test | 32. | In the definitive test, at least five concentrations should be used and selected e.g. based on the result of the preliminary range-finding test (paragraph 31), and as described in paragraphs 35, 36, 37 and 38. | 33. | A control (for replication see paragraphs 36, 37 and 38) containing all constituents, except for the test chemical, is run in addition to the test series. If any solubilising agent is used for application of the test chemical, it should have no significant effect on the test organisms as revealed by an additional solvent-only control. | Test design | 34. | The test design relates to the selection of the number and spacing of the test concentrations, the number of vessels at each concentration and the number of worms added per vessel. Designs for ECx estimation, for estimation of NOEC, and for conducting a limit test are described in paragraphs 35, 36, 37 and 38. | 35. | The effect concentration (e.g. EC50, EC25, EC10) and the concentration range, over which the effect of the test chemical is of interest, should be bracketed by the concentrations included in the test. Extrapolating much below the lowest concentration affecting the test organisms or above the highest tested concentration should be avoided. If — in exceptional cases — such an extrapolation is done, a full explanation must be given in the report. | 36. | If the ECx is to be estimated, at least five concentrations and a minimum of three replicates for each concentration should be tested; six replicates are recommended for the control or — if used — the solvent control in order to improve the estimation of control variability. In any case, it is advisable that sufficient test concentrations are used to allow a good model estimation. The factor between concentrations should not be greater than two (an exception can be made in cases when the concentration response curve has a shallow slope). The number of replicates at each treatment can be reduced if the number of test concentrations with responses in the range of 5 – 95 % are increased. Increasing the number of replicates or reducing the size of the test concentration intervals tends to lead to narrower confidence intervals for the test. | 37. | If the LOEC/NOEC values are to be estimated, at least five test concentrations with at least four replicates (six replicates are recommended for the control or — if used — the solvent control in order to improve the estimation of control variability) should be used, and the factor between concentrations should not be greater than two. Some information on the statistical power found during hypothesis testing in the ring test of the test method is given in Appendix 6. | 38. | A limit test may be performed (using one test concentration and controls) if no effects are expected up to 1 000 mg/kg sediment d.w. (e.g. from a preliminary range-finding test), or if testing at a single concentration will be adequate to confirm a NOEC value of interest. In the latter case, a detailed rationale for selection of limit concentration should be included in the test report. The purpose of the limit test is to perform a test at a concentration sufficiently high to enable decision makers to exclude possible toxic effects of the chemical, and the limit is set at a concentration which is not expected to appear in any situation. 1 000 mg/kg (dry weight) is recommended. Usually, at least six replicates for both the treatment and controls are necessary. Some information on the statistical power found during hypothesis testing in the ring test of the test method is given in Appendix 6. | Exposure conditions | Test organisms | 39. | The test is conducted with at least 10 worms for each replicate used for determination of biological parameters. This number of worms corresponds to approximately 50 - 100 mg of wet biomass. Assuming a dry content of 17,1 % (48), this results in approximately 9 - 17 mg of dry biomass per vessel. U.S. EPA (2000 (7)) recommends to use a loading rate not exceeding 1: 50 (dry biomass: TOC). For the formulated sediment described in paragraph 22, this corresponds to approximately 43 g sediment (dry weight) per 10 worms at a TOC content of 2,0 % of dry sediment. In cases where more than 10 worms are used per vessel, the amount of sediment and overlying water should be adjusted accordingly. | 40. | The worms used in a test should all come from the same source, and should be animals of similar physiological state (see Appendix 5). Worms of similar size should be selected (see paragraph 39). It is recommended that a sub-sample of the batch or stock of worms is weighed before the test in order to estimate the mean weight. | 41. | The worms to be used in a test are removed from the culture (see Appendix 5 for details). Large (adult) animals that do not show signs of recent fragmentation are transferred to glass dishes (e.g. petri dishes) containing clean water. They are subsequently synchronised as described in Appendix 5. After regenerating for a period of 10 to 14 d, intact complete worms of similar size, which are actively swimming or crawling after a gentle mechanical stimulus, should be used for the test. If the test conditions differ from the culture conditions (e.g. in temperature, light regime, and overlying water), an acclimation phase of e.g. 24 h at temperature, light regime, and using the same overlying water as in the test should be sufficient to adapt the worms to the test conditions. The adapted oligochaetes should be allocated randomly to the test vessels. | Feeding | 42. | Since food is added to the sediment prior to (or during) application of the test chemical, the worms are not fed additionally during the test. | Light and temperature | 43. | The photoperiod in the culture and the test is usually 16 hours (3), (7). Light intensity should be kept low (e.g. 100-500 lx) to imitate natural conditions at the sediment surface, and measured at least once during the exposure period. The temperature should be 20 °C ± 2 °C throughout the test. On one given measuring date the difference of temperature between test vessels should not be higher than ± 1 °C. The test vessels should be placed in the test incubator or the test area in a randomised way, e.g. in order to minimise bias of reproduction due to vessel location. | Aeration | 44. | The overlying water of the test vessels should be gently aerated (e.g. 2 - 4 bubbles per second) via a pasteur pipette positioned approx. 2 cm above the sediment surface so as to minimise perturbation of the sediment. Care should be taken that the dissolved oxygen concentration does not fall below 30 % of air saturation value (ASV). Air supply should be controlled and — if necessary — adjusted at least once daily on workdays. | Water quality measurements | 45. | The following water quality parameters should be measured in the overlying water: | Temperature: | at least in one test vessel of each concentration level and one test vessel of the controls once per week and at the start and the end of the exposure period; if possible, temperature in the surrounding medium (ambient air or water bath) may be recorded additionally e.g. at hourly intervals; | Dissolved oxygen content: | at least in one test vessel of each concentration level and one test vessel of the controls once per week and at the start and the end of the exposure period; expressed as mg/l and % ASV (air saturation value); | Air supply: | should be controlled at least once daily on workdays and — if necessary — adjusted; | pH: | at least in one test vessel of each concentration level and one test vessel of the controls once per week and at the start and the end of the exposure period; | Total water hardness: | at least in one replicate of the controls and one test vessel at the highest concentration at the start and the end of the exposure period; expressed as mg/l CaCO3; | Total ammonia content: | at least in one replicate of the controls and in one test vessel of each concentration level at the start of the exposure period, and subsequently 3 × per week; expressed as mg/l NH4 + or NH3 or total ammonia-N. | If measurement of water quality parameters requires removal of significant water samples from the vessels, it may be advisable to set up separate vessels for water quality measurements so as not to alter the water-to-sediment volume ratio. | Biological observations | 46. | During the exposure, the test vessels should be observed in order to assess visually any behavioural differences in the worms (e.g. sediment avoidance, fecal pellets visible on the sediment surface) compared with the controls. Observations should be recorded. | 47. | At the end of the test, each replicate is examined (additional vessels designated for chemical analyses may be excluded from examination). An appropriate method should be used to recover all worms from the test vessel. Care should be taken that all worms are recovered uninjured. One possible method is sieving the worms from the sediment. A stainless steel mesh of appropriate mesh size can be used. Most of the overlying water is carefully decanted, and the remaining sediment and water is agitated to result in a slurry, which can be passed through the sieve. Using a 500 μm mesh, most of the sediment particles will pass the sieve very quickly; however, sieving should be done quickly, in order to prevent the worms from crawling into or through the mesh. Using a 250 μm mesh will prevent the worms from crawling into or through the mesh; however, care should be taken that as little as possible of the sediment particles is retained on the mesh. The sieved slurry of each replicate vessel may be passed through the sieve a second time in order to ensure that all worms are recovered. An alternative method could be warming of the sediment by placing the test vessels in a water bath at 50 – 60 °C; the worms will leave the sediment and can be collected from the sediment surface by use of a fire-polished wide-mouth pipette. Another alternative method could be to produce a sediment slurry and pour this slurry onto a shallow pan of suitable size. From the shallow layer of slurry the worms can be picked up by a steel needle or watchmakers' tweezers (to be used rather like a fork than forceps to avoid injuring the worms) and transferred to clean water. After separating the worms from the sediment slurry, these are rinsed in test medium and counted. | 48. | Independently of the method used, laboratories should demonstrate that their personnel are able to recover an average of at least 90 % of the organisms from whole sediment. For example, a certain number of test organisms could be added to control sediment or test sediments, and recovery could be determined after 1 h (7). | 49. | The total number of living and dead individuals per replicate should be recorded and assessed. The following groups of worms are considered to be dead: | a) | there is no reaction after a gentle mechanical stimulus | b) | there are signs of decomposition (in combination with “a”) | c) | number of missing worms | Additionally, the living worms can be assigned to one of three groups: | a) | large complete worms (adults) without regenerated body regions | b) | complete worms with regenerated, lighter-coloured body regions (i.e., with new posterior part, with new anterior part, or with both new posterior and anterior parts) | c) | incomplete worms (i.e., recently fragmented worms with non-regenerated body regions) | These additional observations are not mandatory, but can be used for additional interpretation of the biological results (for example, a high number of worms assigned to group c may indicate a delay of reproduction or regeneration in a given treatment). Additionally, if any differences in appearance (e.g. lesions of the integument, oedematous body sections) are observed between treated and control worms, these should be recorded. | 50. | Immediately after counting/assessment, the living worms found in each replicate are transferred to dried, pre-weighed and labelled weigh pans (one per replicate), and killed using a drop of ethanol per weigh pan. The weigh pans are placed in a drying oven at 100 ± 5 °C to dry overnight, after which they are weighed after cooling in a desiccator, and worm dry weight is determined (preferably in g, at least 4 post-decimal digits). | 51. | In addition to the total dry weight, the ash-free dry weight may be determined as described in (49) in order to account for inorganic components originating from ingested sediment present in the alimentary tract of the worms. | 52. | The biomass is determined as total biomass per replicate including adult and young worms. Dead worms should not be taken into account for the determination of biomass per replicate. | Verification of test chemical concentrations | Sampling | 53. | Samples for chemical analysis of the test chemical should be taken at least of the highest concentration and a lower one, at least at the end of the equilibration phase (before adding the test organisms), and at the end of the test. At least the bulk sediment and the overlying water should be sampled for analysis. At least two samples should be taken per matrix and treatment on each sampling date. One of the duplicate samples may be stored as a reserve (to be analysed e.g. in the event that initial analysis falls outside the ± 20 % range from the nominal concentration). In case of specific chemical properties, e.g. if rapid degradation of the test chemical is expected, the analytical schedule may be refined (e.g. more frequent sampling, analysis of more concentration levels) on the basis of expert judgment. Samples may then be taken on intermediate sampling dates (e.g. on day seven after start of exposure). | 54. | The overlying water should be sampled by carefully decanting or siphoning off the overlying water so as to minimise perturbation of the sediment. The volume of the samples should be recorded. | 55. | After the overlying water has been removed, the sediment should be homogenised and transferred to a suitable container. The weight of the wet sediment sample is recorded. | 56. | If analysis of the test chemical in the pore water is required additionally, the homogenised and weighed sediment samples should be centrifuged to obtain the pore water. For example, approximately 200 ml of wet sediment can be filled into 250 ml centrifugation beakers. Thereafter the samples should be centrifuged without filtration to isolate the porewater, e.g. at 10 000 ± 600 × g for 30 - 60 min at a temperature not exceeding the temperature used in the test. After centrifugation, the supernatant is decanted or pipetted taking care that no sediment particles are introduced, and the volume is recorded. The weight of the remaining sediment pellet is recorded. It may facilitate the estimation of the mass balance or recovery of the test chemical in the water-sediment system, if the sediment dry weight is determined at each sampling date. In some cases it might not be possible to analyse concentrations in the pore water as the sample size is too small. | 57. | Failing immediate analysis, all samples should be stored by an appropriate method, e.g. under the storage conditions recommended for minimum degradation of the particular test chemical (e.g., environmental samples are commonly stored at – 18 °C in the dark). Obtain information on the proper storage conditions for the particular test chemical — for example, duration and temperature of storage, extraction procedures, etc. — before beginning the study. | Analytical method | 58. | Since the whole procedure is governed essentially by the accuracy, precision and sensitivity of the analytical method used for the test chemical, check experimentally that the precision and reproducibility of the chemical analysis, as well as the recovery of the test chemical from water and sediment samples are satisfactory for the particular method at least at the lowest and highest test concentrations. Also, check that the test chemical is not detectable in the control chambers in concentrations higher than the limit of quantification. If necessary, correct the nominal concentrations for the recoveries of quality control spikes (e.g. where recovery is outside 80 - 120 % of spiked amount). Handle all samples throughout the test in such a manner so as to minimise contamination and loss (e.g. resulting from adsorption of the test chemical on the sampling device). | 59. | The recovery of test chemical, the limit of quantification, and the limit of detection in sediment and water should be recorded and reported. | DATA AND REPORTING | Treatment of results | 60. | The main mandatory response variables of the test to be evaluated statistically are the biomass and the total number of worms per replicate. Optionally, reproduction (as increase of worm numbers) and growth (as increase of dry biomass) could be also evaluated. In this case, an estimate of the dry weight of the worms at start of exposure should be obtained e.g. by measurement of the dry weight of a representative sub-sample of the batch of synchronised worms to be used for the test. | 61. | Although mortality is not an endpoint of this test, mortalities should be evaluated as far as possible. In order to estimate mortalities, the number of worms that do not react to a gentle mechanical stimulus or showed signs of decomposition, and the missing worms should be considered dead. Mortalities should at least be recorded and considered when interpreting the test results. | 62. | Effect concentrations should be expressed in mg/kg sediment dry weight. If the recovery of test chemical measured in the sediment, or in sediment and overlying water at start of exposure, is between 80 and 120 % of the nominal concentrations, the effect concentrations (ECx, NOEC, LOEC) may be expressed based on nominal concentrations. If recovery deviates from the nominal concentrations by more than ± 20 % of the nominal concentrations, the effect concentrations (ECx, NOEC, LOEC) should be based on the initially measured concentrations at the beginning of the exposure, e.g. taking into account the mass balance of the test chemical in the test system (see paragraph 30). In these cases, additional information can be obtained from analysis of stock and/or application solutions in order to confirm that the test sediments were prepared correctly. | ECx | 63. | ECx-values for the parameters described in paragraph 60 are calculated using appropriate statistical methods (e.g. probit analysis, logistic or Weibull function, trimmed Spearman-Karber method, or simple interpolation). Guidance on statistical evaluation is given in (15) and (50). An ECx is obtained by inserting a value corresponding to x % of the control mean into the equation found. To compute the EC50 or any other ECx, the per-treatment means ( ) should be subjected to regression analysis. | NOEC/LOEC | 64. | If a statistical analysis is intended to determine the NOEC/LOEC, per-vessel statistics (individual vessels are considered replicates) are necessary. Appropriate statistical methods should be used. In general, adverse effects of the test item compared to the control are investigated using one-tailed (smaller) hypothesis testing at p ≤ 0,05. Examples are given in the following paragraphs. Guidance on selection of appropriate statistical methods is given in (15) and (50). | 65. | Normal distribution of data can be tested e.g. with the Kolmogorov-Smirnov goodness-of-fit test, the Range-to-standard-deviation ratio test (R/s-test) or the Shapiro-Wilk test, (two-sided, p ≤ 0,05). Cochran's test, Levene test or Bartlett's test, (two-sided, p ≤ 0,05) may be used to test variance homogeneity. If the prerequisites of parametric test procedures (normality, variance homogeneity) are fulfilled, One-way Analysis of Variance (ANOVA) and subsequent multi-comparison tests can be performed. Pairwise comparisons (e.g. Dunnett's t-test) or step-down trend tests (e.g. Williams' test) can be used to calculate whether there are significant differences (p ≤ 0,05) between the controls and the various test item concentrations. Otherwise, non-parametric methods (e.g. Bonferroni-U-test according to Holm or Jonckheere-Terpstra trend test) should be used to determine the NOEC and the LOEC. | Limit test | 66. | If a limit test (comparison of control and one treatment only) has been performed and the prerequisites of parametric test procedures (normality, homogeneity) are fulfilled, metric responses (total worm number, and biomass as worm dry weight) can be evaluated by the Student test (t-test). The unequal-variance t-test (Welch t-test) or a non parametric test, such as the Mann-Whitney-U-test may be used, if these requirements are not fulfilled. Some information on the statistical power found during hypothesis testing in the ring test of the method is given in Appendix 6. | 67. | To determine significant differences between the controls (control and solvent control), the replicates of each control can be tested as described for the limit test. If these tests do not detect significant differences, all control and solvent control replicates may be pooled. Otherwise all treatments should be compared with the solvent control. | Interpretation of results | 68. | The results should be interpreted with caution if there were deviations from this test method, and where measured concentrations of test concentrations occur at levels close to the detection limit of the analytical method used. Any deviations from this test method must be noted. | Test report | 69. | The test report should include at least the following information: | — | Test chemical: | — | chemical identification data (common name, chemical name, structural formula, CAS number, etc.) including purity and analytical method for quantification of test chemical; source of the test chemical, identity and concentration of any solvent used. | — | any information available on the physical nature and physical-chemical properties as obtained prior to start of the test, (e.g. water solubility, vapour pressure, partition coefficient in soil (or in sediment if available), log Kow, stability in water, etc.); | — | Test species: | — | scientific name, source, any pre-treatment, acclimation, culture conditions, etc.. | — | Test conditions: | — | test procedure used (e.g. static, semi-static or flow-through); | — | test design (e.g. number, material and size of test chambers, water volume per vessel, sediment mass and volume per vessel, (for flow-through or semi-static procedures: water volume replacement rate), any aeration used before and during the test, number of replicates, number of worms per replicate at start of exposure, number of test concentrations, length of conditioning, equilibration and exposure periods, sampling frequency); | — | depth of sediment and overlying water; | — | method of test chemical pre-treatment and spiking/application; | — | the nominal test concentrations, details about the sampling for chemical analysis, and the analytical methods by which concentrations of the test chemical were obtained; | — | sediment characteristics as described in paragraphs 24 - 25, and any other measurements made; preparation of formulated sediment; | — | preparation of the test water (if reconstituted water is used) and characteristics (oxygen concentration, pH, conductivity, hardness, and any other measurements made) before the start of the test; | — | detailed information on feeding including type of food, preparation, amount and feeding regimen; | — | light intensity and photoperiod(s); | — | methods used for determination of all biological parameters (e.g. sampling, inspection, weighing of test organisms) and all abiotic parameters (e.g. water and sediment quality parameters); | — | volumes and/or weights of all samples for chemical analysis; | — | detailed information on the treatment of all samples for chemical analysis, including details of preparation, storage, spiking procedures, extraction, and analytical procedures (and precision) for the test chemical, and recoveries of the test chemical. | — | Results: | — | water quality within the test vessels (pH, temperature, dissolved oxygen concentration, hardness, ammonia concentrations, and any other measurements made); | — | total organic carbon content (TOC), dry weight to wet weight ratio, pH of the sediment, and any other measurements made; | — | total number, and if determined, number of complete and incomplete worms in each test chamber at the end of the test; | — | dry weight of the worms of each test chamber at the end of the test, and if measured, dry weight of a sub-sample of the worms at start of the test; | — | any observed abnormal behaviour in comparison to the controls (e.g., sediment avoidance, presence or absence of fecal pellets); | — | any observed mortalities; | — | estimates of toxic endpoints (e.g. ECx, NOEC and/or LOEC), and the statistical methods used for their determination; | — | the nominal test concentrations, the measured test concentrations and the results of all analyses made to determine the concentration of the test chemical in the test vessels; | — | any deviations from the validity criteria. | — | Evaluation of results: | — | compliance of the results with the validity criteria as listed in paragraph 13; | — | discussion of the results, including any influence on the outcome of the test resulting from deviations from this test method. | LITERATURE | (1) | EC (2003). Technical Guidance Document in support of Commission Directive 93/67/EEC on Risk Assessment for new notified substances, Commission Regulation (EC) No 1488/94 on Risk Assessment for existing substances and Directive 98/8/EC of the European Parliament and of the Council concerning the placing of biocidal products on the market; Part I — IV. Office for Official Publications of the EC (European Commission), Luxembourg. | (2) | OECD (1992a). Report of the OECD workshop on effects assessment of chemicals in sediment. OECD Monographs No. 60. Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD), Paris. | (3) | ASTM International (2000). Standard guide for the determination of the bioaccumulation of sediment-associated contaminants by benthic invertebrates, E 1688-00a. In ASTM International 2004 Annual Book of Standards. Volume 11.05. Biological Effects and Environmental Fate; Biotechnology; Pesticides. ASTM International, West Conshohocken, PA. | (4) | ASTM International (2002). Standard Test Method for Measuring the Toxicity of Sediment-Associated Contaminants with Freshwater Invertebrates, E1706-00. In ASTM International 2004 Annual Book of Standards. Volume 11.05. Biological Effects and Environmental Fate; Biotechnology; Pesticides. ASTM International, West Conshohocken, PA. | (5) | Phipps, G.L., Ankley, G.T., Benoit, D.A. and Mattson, V.R. (1993). Use of the aquatic Oligochaete Lumbriculus variegatus for assessing the toxicity and bioaccumulation of sediment-associated contaminants. Environ.Toxicol. Chem. 12, 269-279. | (6) | Chapter C.27 of this Annex, “Sediment-water chironomid toxicity test using spiked sediment”. | (7) | U.S. EPA (2000). Methods for measuring the toxicity and bioaccumulation of sediment-associated contaminants with freshwater invertebrates. Second Edition. EPA 600/R-99/064, U.S. Environmental Protection Agency, Duluth, MN, March 2000. | (8) | Environment Canada (1997). Test for Growth and Survival in Sediment using Larvae of Freshwater Midges (Chironomus tentans or Chironomus riparius). Biological Test Method. Report SPE 1/RM/32. December 1997. | (9) | Hill, I.R., Matthiessen, P., Heimbach, F. (eds), 1993, Guidance document on Sediment Toxicity Tests and Bioassays for freshwater and Marine Environments, From the SETAC-Europe Workshop On Sediment Toxicity Assessment, 8-10 November 1993, Renesse (NL). | (10) | BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H.Köpp. Berlin 1995. | (11) | Riedhammer C. & B. Schwarz-Schulz (2001). The Newly Proposed EU Risk Assessment Concept for the Sediment Compartment. J. Soils Sediments 1(2), 105-110. | (12) | ASTM International (2004). Standard guide for collection, storage, characterisation, and manipulation of sediment for toxicological testing and for selection of samplers used to collect benthic invertebrates. American Society for Testing and Materials, E 1391-03. | (13) | Egeler, Ph., Meller, M., Schallnaß, H.J. & Gilberg, D. (2005). Validation of a sediment toxicity test with the endobenthic aquatic oligochaete Lumbriculus variegatus by an international ring test. In co-operation with R. Nagel and B. Karaoglan. Report to the Federal Environmental Agency (Umweltbundesamt Berlin), R&D No.: 202 67 429. | (14) | OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. OECD Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 23. | (15) | Environment Canada (2003). Guidance Document on Statistical Methods for Environmental Toxicity Tests; fifth draft, March 2003; Report EPS 1/RM/___ | (16) | Nikkilä A., Halme A., Kukkonen J.V.K. (2003). Toxicokinetics, toxicity and lethal body residues of two chlorophenols in the oligochaete worm, Lumbriculus variegatus, in different sediments. Chemosphere 51: 35-46. | (17) | Baily H.C., & Liu D.H.W. (1980). Lumbriculus variegatus, a Benthic Oligochaete, as a Bioassay Organism. p. 205-215. In J.C. Eaton, P.R. Parrish, and A.C. Hendricks (eds). Aquatic Toxicology, ASTM STP 707. American Society for Testing and Materials. | (18) | Chapman K. K., Benton M. J., Brinkhurst R. O. & Scheuerman P. R. (1999). Use of the aquatic oligochaetes Lumbriculus variegatus and Tubifex tubifex for assessing the toxicity of copper and cadmium in a spiked-artificial-sediment toxicity test. Environmental Toxicology. 14(2): 271-278. | (19) | Meyer J.S., Boese C.J. & Collyard S.A. (2002). Whole-body accumulation of copper predicts acute toxicity to an aquatic oligochaete (Lumbriculus variegatus) as pH and calcium are varied. Comp. Biochem. Physiol. Part C 133:99-109. | (20) | Schubauer-Berigan M.K., Dierkes J.R., Monson P.D. & Ankley G.T. (1993). pH-dependent toxicity of cadmium, copper, nickel, lead and zinc to Ceriodaphnia dubia, Pimephales promelas, Hyalella azteca and Lumbriculus variegatus. Environ. Toxciol. Chem. 12(7):1261-1266. | (21) | West, C.W., V.R. Mattson, E.N. Leonard, G.L. Phipps & G.T. Ankley (1993). Comparison of the relative sensitivity of three benthic invertebrates to copper-contaminated sediments from the Keweenaw Waterway. Hydrobiol. 262:57-63. | (22) | Ingersoll, C.G., Ankley, G.T., Benoit D.A., Brunson, E.L., Burton, G.A., Dwyer, F.J., Hoke, R.A., Landrum, P. F., Norberg-King, T. J. and Winger, P.V. (1995). Toxicity and bioaccumulation of sediment-associated contaminants using freshwater invertebrates: A review of methods and applications. Environ. Toxicol. Chem. 14, 1885-1894. | (23) | Kukkonen, J. and Landrum, P.F. (1994). Toxicokinetics and toxicity of sediment-associated Pyrene to Lumbriculus variegatus (Oligochaeta). Environ. Toxicol. Chem. 13, 1457-1468. | (24) | Leppänen, M.T. & Kukkonen, J.V.K. (1998a). Relationship between reproduction, sediment type and feeding activity of Lumbriculus variegatus (Müller): Implications for sediment toxicity testing. Environ. Toxicol. Chem. 17: 2196-2202. | (25) | Leppänen, M.T. & Kukkonen, J.V.K. (1998b). Factors affecting feeding rate, reproduction and growth of an oligochaete Lumbriculus variegatus (Müller). Hydrobiologia 377: 183-194. | (26) | Landrum, P.F., Gedeon, M.L., Burton, G.A., Greenberg. M.S., & Rowland, C.D. (2002). Biological Responses of Lumbriculus variegatus Exposed to Fluoranthene-Spiked Sediment. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 42: 292-302. | (27) | Brunson, E.L., Canfield, T.J., Ingersoll, C.J. & Kemble, N.E. (1998). Assessing the bioaccumulation of contaminants from sediments of the Upper Mississippi river using field-collected oligochaetes and laboratory-exposed Lumbriculus variegatus. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 35, 191-201. | (28) | Ingersoll, C.G., Brunson, E.L., Wang N., Dwyer, F.J., Ankley, G.T., Mount D.R., Huckins J., Petty. J. and Landrum, P. F. (2003). Uptake and depuration of non-ionic organic contaminants from sediment by the oligochaete, Lumbriculus variegatus. Environmental Toxicology and Chemistry 22, 872-885. | (29) | Rodriguez, P. & Reynoldson, T.B. (1999). Laboratory methods and criteria for sediment bioassessment. In: A. Mudroch, J.M. Azcue & P. Mudroch (eds.): Manual of Bioassessment of aquatic sediment quality. Lewis Publishers, Boca Raton, CRC Press LLC. | (30) | Liebig, M., Egeler, Ph. Oehlmann, J., & Knacker, Th. (2005). Bioaccumulation of 14C-17α-ethinylestradiol by the oligochaete Lumbriculus variegatus in artificial sediment. Chemosphere 59, 271-280. | (31) | Brust, K., O. Licht, V. Hultsch, D. Jungmann & R. Nagel (2001). Effects of Terbutryn on Aufwuchs and Lumbriculus variegatus in Artificial Indoor Streams. Environ. Toxicol. Chemistry, Vol. 20, pp. 2000–2007. | (32) | Oetken, M., K.-U. Ludwichowski & R. Nagel (2000). Sediment tests with Lumbriculus variegatus and Chironomus riparius and 3,4-dichloroaniline (3,4-DCA) within the scope of EG-AltstoffV. By order of the Federal Environmental Agency (Umweltbundesamt Berlin), FKZ 360 12 001, March 2000. | (33) | Leppänen M.T. & Kukkonen J.V.K. (1998). Relative importance of ingested sediment and porewater as bioaccumulation routes for pyrene to oligochaete (Lumbriculus variegatus, Müller). Environ. Sci. Toxicol. 32, 1503-1508. | (34) | Dermott R. & Munawar M. (1992). A simple and sensitive assay for evaluation of sediment toxicity using Lumbriculus variegatus (Müller). Hydrobiologia 235/236: 407-414. | (35) | Drewes C.D. & Fourtner C.R. (1990). Morphallaxis in an aquatic oligochaete, Lumbriculus variegatus: Reorganisation of escape reflexes in regenerating body fragments. Develop. Biol. 138: 94-103. | (36) | Brinkhurst, R.O. (1971). A guide for the identification of British aquatic oligochaeta. Freshw. Biol. Assoc., Sci. Publ. No. 22. | (37) | Chapter C.1 of this Annex, Fish, Acute Toxicity Test. | (38) | OECD (1992c). Guidelines for Testing of Chemicals No. 210. Fish, Early-life Stage Toxicity Test. OECD, Paris. | (39) | Egeler, Ph., Römbke, J., Meller, M., Knacker, Th., Franke, C., Studinger, G. & Nagel, R. (1997). Bioaccumulation of lindane and hexachlorobenzene by tubificid sludgeworms (Oligochaeta) under standardised laboratory conditions. Chemosphere 35, 835-852. | (40) | Meller, M., P. Egeler, J. Roembke, H. Schallnass, R. Nagel and B. Streit. (1998). Short-term Toxicity of Lindane, Hexachlorobenzene and Copper Sulphate on Tubificid Sludgeworms (Oligochaeta) in Artificial Media. Ecotox. and Environ. Safety, 39, 10-20. | (41) | Egeler, Ph., Römbke, J., Knacker, Th., Franke, C. & Studinger, G. (1999). Workshop on “Bioaccumulation: Sediment test using benthic oligochaetes”, 26.-27.4.1999, Hochheim/Main, Germany. Report on the R+D-project No. 298 67 419, Umweltbundesamt, Berlin. | (42) | Suedel, B.C. and Rodgers, J.H. (1993). Development of formulated reference sediments for freshwater and estuarine sediment testing. Environ. Toxicol. Chem. 13, 1163-1175. | (43) | Naylor, C. and C. Rodrigues. (1995). Development of a test method for Chironomus riparius using a formulated sediment. Chemosphere 31: 3291-3303. | (44) | Kaster, J.L., Klump, J.V., Meyer, J., Krezoski, J. & Smith, M.E. (1984). Comparison of defecation rates of Limnodrilus hoffmeisteri using two different methods. Hydrobiologia 11, 181-184. | (45) | Martinez-Madrid, M., Rodriguez, P., Perez-Iglesias, J.I. & Navarro, E. (1999). Sediment toxicity bioassays for assessment of contaminated sites in the Nervion river (Northern Spain). 2. Tubifex tubifex (Müller) reproduction sediment bioassay. Ecotoxicology 8, 111-124. | (46) | Environment Canada (1995). Guidance document on measurement of toxicity test precision using control sediments spiked with a reference toxicant. Environmental Protection Series Report EPS 1/RM/30. | (47) | Landrum, P.F. (1989). Bioavailability and toxicokinetics of polycyclic aromatic hydrocarbons sorbed to sediments for the amphipod Pontoporeia hoyi. Environ. Sci. Technol. 23, 588-595. | (48) | Brooke, L.T., Ankley, G.T., Call, D.J. & Cook, P.M. (1996). Gut content and clearance for three species of freshwater invertebrates. Environ. Toxicol. Chem. 15, 223-228. | (49) | Mount, D.R., Dawson, T.D. & Burkhard, L.P. (1999). Implications of gut purging for tissue residues determined in bioaccumulation testing of sediment with Lumbriculus variegatus. Environ. Toxicol. Chem. 18, 1244-1249. | (50) | OECD 2006. Current approaches in the statistical analysis of ecotoxicity data: A guidance to application. OECD Series on Testing and Assessment No. 54, OECD, Paris, France. | (51) | Liebig M., Meller M. & Egeler P. (2004). Sedimenttoxizitätstests mit aquatischen Oligochaeten — Einfluss verschiedener Futterquellen im künstlichen Sediment auf Reproduktion und Biomasse von Lumbriculus variegatus. Proceedings 5/2004: Statusseminar Sedimentkontakttests. March 24-25, 2004. BfG (Bundesanstalt für Gewässerkunde), Koblenz, Germany. pp. 107-119. | Additional literature on statistical procedures: | Dunnett, C.W. (1955). A multiple comparison procedure for comparing several treatments with a control. Amer. Statist. Ass. J. 50, 1096-1121. | Dunnett, C.W. (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics 20, 482-491. | Finney, D.J. (1971). Probit Analysis (3rd ed.), pp. 19-76. Cambridge Univ. Press. | Finney, D.J. (1978). Statistical Method in Biological Assay. Charles Griffin & Company Ltd, London. | Hamilton, M.A., R.C. Russo and R.V. Thurston. (1977). Trimmed Spearman-Karber Method for estimating median lethal concentrations in toxicity bioassays. Environ. Sci. Technol. 11(7), 714-719; Correction: Environ. Sci. Technol. 12 (1998), 417. | Holm, S. (1979). A simple sequentially rejective multiple test procedure. Scand. J. Statist. 6, 65-70. | Sokal, R.R. and F.J. Rohlf. (1981) Biometry. The principles and practice of statistics in biological research. 2nd edition. W.H. Freeman and Company. New York. | Miller, R.G., Jr. (1986). Beyond ANOVA, basics of applied statistics. John Wiley & Sons. New York. | Shapiro S.S. & Wilk M.B (1965). An analysis of variance test for normality (complete samples). Biometrika 52: 591-611. | Williams, D.A. (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27, 103-117. | Williams, D.A. (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics 28, 519 531. | Appendix 1 | Definitions | For the purpose of this test method the following definitions are used: | A chemical means a substance or a mixture. | The conditioning period is used to stabilise the microbial component of the sediment and to remove e.g. ammonia originating from sediment components; it takes place prior to spiking of the sediment with the test chemical. Usually, the overlying water is discarded after conditioning. | The ECx is the concentration of the test chemical in the sediment that results in X % (e.g. 50 %) effect on a biological parameter within a stated exposure period. | The equilibration period is used to allow for distribution of the test chemical between the solid phase, the pore water and the overlying water; it takes place after spiking of the sediment with the test chemical and prior to addition of the test organisms. | The exposure phase is the time during which the test organisms are exposed to the test chemical. | Formulated sediment or reconstituted, artificial or synthetic sediment, is a mixture of materials used to mimic the physical components of a natural sediment. | The Lowest Observed Effect Concentration (LOEC) is the lowest tested concentration of a test chemical at which the chemical is observed to have a significant toxic effect (at p ≤ 0,05) when compared with the control. However, all test concentrations above the LOEC must have an effect equal to or greater than those observed at the LOEC. If these two conditions cannot be satisfied, a full explanation must be given for how the LOEC (and hence the NOEC) has been selected. | The No Observed Effect Concentration (NOEC) is the test concentration immediately below the LOEC which, when compared with the control, has no statistically significant effect (p ≤ 0,05), within a given exposure period. | The octanol-water partitioning coefficient (Kow; also sometimes expressed as Pow) is the ratio of the solubility of a chemical in n-octanol and water at equilibrium and represents the lipophilicity of a chemical (Chapter A.24 of this Annex). The Kow or its logarithm of Kow (log Kow) is used as an indication of the potential of a chemical for bioaccumulation by aquatic organisms. | The organic carbon-water partitioning coefficient (Koc) is the ratio of a chemical's concentration in/on the organic carbon fraction of a sediment and the chemical's concentration in water at equilibrium. | Overlying water is the water covering the sediment in the test vessel. | Pore water or interstitial water is the water occupying space between sediment or soil particles. | Spiked sediment is sediment to which test chemical has been added. | Test chemical means any substance or mixture tested using this test method. | Appendix 2 | Composition of the recommended reconstituted water | (adopted from Chapter C.1 of this Annex (1)) | (a) | Calcium chloride solution | Dissolve 11,76 g CaCl2·2H2O in deionised water; make up to 1 l with deionised water | (b) | Magnesium sulphate solution | Dissolve 4,93 g MgSO4·7H2O in deionised water; make up to 1 l with deionised water | (c) | Sodium bicarbonate solution | Dissolve 2,59 g NaHCO3 in deionised water; make up to 1 l with deionised water | (d) | Potassium chloride solution | Dissolve 0,23 g KCl in deionised water; make up to 1 l with deionised water | All chemicals must be of analytical grade. | The conductivity of the distilled or deionised water should not exceed 10 μScm– 1. | 25 ml each of solutions (a) to (d) are mixed and the total volume made up to 1 l with deionised water. The sum of the calcium and magnesium ions in these solutions is 2,5 mmol/l. | The proportion Ca:Mg ions is 4:1 and Na:K ions 10:1. The acid capacity KS4.3 of this solution is 0,8 mmol/l. | Aerate the dilution water until oxygen saturation is achieved, then store it for approximately two days without further aeration before use. | REFERENCE | (1) | Chapter C.1 of this Annex, Fish Acute Toxicity Test. | Appendix 3 | Physical-chemical characteristics of an acceptable dilution water | Component | Concentrations | Particulate matter | < 20 mg/l | Total organic carbon | < 2 μg/l | Unionised ammonia | < 1 μg/l | Residual chlorine | < 10 μg/l | Total organophosphorous pesticides | < 50 ng/l | Total organochlorine pesticides plus polychlorinated biphenyls | < 50 ng/l | Total organic chlorine | < 25 ng/l | Adopted from OECD (1992) (1) | REFERENCE | (1) | OECD (1992). Guidelines for Testing of Chemicals No. 210. Fish, Early-life Stage Toxicity Test. OECD, Paris. | Appendix 4 | Recommended artificial sediment — guidance on preparation and storage | Sediment constituents | Constituent | Characteristics | % of sediment dry weight | Peat | Sphagnum moss peat, degree of decomposition: “medium”, air dried, no visible plant remains, finely ground (particle size ≤ 0,5 mm) | 5 ± 0,5 | Quartz sand | Grain size: ≤ 2 mm, but > 50 % of the particles should be in the range of 50-200 μm | 75 - 76 | Kaolinite clay | Kaolinite content ≥ 30 % | 20 ± 1 | Food source | e.g. Urtica powder (Folia urticae), leaves of Urtica dioica (stinging nettle), finely ground (particle size ≤ 0,5 mm); in accordance with pharmacy standards, for human consumption; in addition to dry sediment | 0,4 - 0,5 % | Organic carbon | Adjusted by addition of peat and sand | 2 ± 0,5 | Calcium carbonate | CaCO3, pulverised, chemically pure, in addition to dry sediment | 0,05 - 1 | Deionised Water | Conductivity ≤ 10 μS/cm, in addition to dry sediment | 30 - 50 | Note: If elevated ammonia concentrations are expected, e.g. if the test chemical is known to inhibit nitrification, it may be useful to replace 50 % of the nitrogen-rich urtica powder by cellulose (e.g., α-Cellulose powder, chemically pure, particle size ≤ 0,5 mm; (1) (2)). | Preparation | The peat is air dried and ground to a fine powder. A suspension of the required amount of peat powder in deionised water is prepared using a high-performance homogenising device. The pH of this suspension is adjusted to 5,5 ± 0,5 with CaCO3. The suspension is conditioned for at least two days with gentle stirring at 20 ± 2 °C, to stabilise pH and establish a stable microbial component. pH is measured again and should be 6,0 ± 0,5. Then the peat suspension is mixed with the other constituents (sand and kaolin clay) and deionised water to obtain an homogeneous sediment with a water content in a range of 30–50 per cent of dry weight of the sediment. The pH of the final mixture is measured again and is adjusted to 6,5 to 7,5 with CaCO3 if necessary. However, if ammonia development is expected, it may be useful to keep the pH of the sediment below 7,0 (e.g. between 6,0 and 6,5). Samples of the sediment are taken to determine the dry weight and the organic carbon content. If ammonia development is expected, the formulated sediment may be conditioned for seven days under the same conditions which prevail in the subsequent test (e.g. sediment-water ratio 1 : 4, height of sediment layer as in test vessels) before it is spiked with the test chemical, i.e. it should be topped with water, which should be aerated. At the end of the conditioning period, the overlying water should be removed and discarded. Thereafter, the spiked quartz sand is mixed with the sediment for each treatment level, the sediment is distributed to the replicate test vessels, and topped with the test water. The vessels are then incubated at the same conditions which prevail in the subsequent test. This is where the equilibration period starts. The overlying water should be aerated. | The chosen food source should be added prior to or during spiking the sediment with the test chemical. It can be mixed initially with the peat suspension (see above). However, excessive degradation of the food source prior to addition of the test organisms — e.g. in case of long equilibration period — can be avoided by keeping the time period between food addition and start of exposure as short as possible. In order to ensure that the food is spiked with the test chemical, the food source should be mixed with the sediment not later than on the day the test chemical is spiked to the sediment. | Storage | The dry constituents of the artificial sediment may be stored in a dry, cool place or at room temperature. The prepared sediment spiked with the test chemical should be used in the test immediately. Samples of spiked sediment may be stored under the conditions recommended for the particular test chemical until analysis. | REFERENCES | (1) | Egeler, Ph., Meller, M., Schallnaß, H.J. & Gilberg, D. (2005). Validation of a sediment toxicity test with the endobenthic aquatic oligochaete Lumbriculus variegatus by an international ring test. In co-operation with R. Nagel and B. Karaoglan. Report to the Federal Environmental Agency (Umweltbundesamt Berlin), R&D No.: 202 67 429. | (2) | Liebig M., Meller M. & Egeler P. (2004). Sedimenttoxizitätstests mit aquatischen Oligochaeten — Einfluss verschiedener Futterquellen im künstlichen Sediment auf Reproduktion und Biomasse von Lumbriculus variegatus. Proceedings 5/2004: Statusseminar Sedimentkontakttests. March 24-25, 2004. BfG (Bundesanstalt für Gewässerkunde), Koblenz, Germany. pp. 107-119. | Appendix 5 | Culture methods for Lumbriculus variegatus | Lumbriculus variegatus (MÜLLER), Lumbriculidae, Oligochaeta is an inhabitant of freshwater sediments and is widely used in ecotoxicological testing. It can easily be cultured under laboratory conditions. An outline of culture methods is given in the following. | Culture methods | Culture conditions for Lumbriculus variegatus are outlined in detail in Phipps et al. (1993) (1), Brunson et al. (1998) (2), ASTM (2000) (3), U.S. EPA (2000) (4). A short summary of these conditions is given below. A major advantage of L. variegatus is its quick reproduction, resulting in rapidly increasing biomass in laboratory cultured populations (e.g. (1), (3), (4), (5)). | The worms can be cultured in large aquaria (57 - 80 l) at 23 °C with a 16 L:8 D photoperiod (100 – 1 000 lx) using daily renewed natural water (45 - 50 l per aquarium). The substrate is prepared by cutting unbleached brown paper towels into strips, which may then be blended with culture water for a few seconds to result in small pieces of paper substrate. This substrate can then directly be used in the Lumbriculus culture aquaria by covering the bottom area of the tank, or be stored frozen in deionised water for later use. New substrate in the tank will generally last for approximately two months. | Each worm culture is started with 500 – 1 000 worms, and fed a 10 ml suspension containing 6 g of trout starter food 3 times per week under renewal or flow-through conditions. Static or semi-static cultures should receive lower feeding rates to prevent bacterial and fungal growth. . | Under these conditions the number of individuals in the culture generally doubles in approximately 10 to 14 d. | Alternatively Lumbriculus variegatus can also be cultured in a system consisting of a layer of quartz sand as used for the artificial sediment (1 - 2 cm depth), and reconstituted water. Glass or stainless steel containers with a height of 12 to 20 cm can be used as culture vessels. The water body should be gently aerated (e.g. 2 bubbles per second) via a pasteur pipette positioned approx. 2 cm above the sediment surface. To avoid accumulation e.g. of ammonia, the overlying water should be exchanged using a flow-through system, or, at least once a week, manually. The oligochaetes can be held at room temperature with a photo period of 16 hours light (intensity 100 – 1 000 lx) and 8 hours dark. In the semi-static culture (water renewal once per week), the worms are fed with TetraMin twice a week (e.g. 0,6 - 0,8 mg per cm2 of sediment surface), which can be applied as a suspension of 50 mg TetraMin per ml de-ionized water. | Lumbriculus variegatus can be removed from the cultures e.g. by transferring substrate with a fine mesh net, or organisms using a fire polished wide mouth (approximately 5 mm diameter) glass pipette, to a separate beaker. If substrate is co-transferred to this beaker, the beaker containing worms and substrate is left overnight under flow-through conditions, which will remove the substrate from the beaker, while the worms remain at the bottom of the vessel. They can then be introduced to newly prepared culture tanks, or processed further for the test as outlined in (3) and (4), or in the following. | An issue to be regarded critically when using L. variegatus in sediment tests is its reproduction mode (architomy or morphallaxis, e.g. (6)). This asexual reproduction results in two fragments, which do not feed for a certain period until the head or tail part is regenerated (e.g., (7), (8)). This means that in L. variegatus exposure via ingestion of contaminated sediment does not take place continuously. | Therefore, a synchronisation should be performed to minimise uncontrolled reproduction and regeneration, and subsequent high variation in test results. Such variation can occur, when some individuals, which have fragmented and therefore do not feed for a certain time period, are less exposed to the test chemical than other individuals, which do not fragment during the test (9), (10), (11). 10 to 14 days before the start of exposure, the worms should be artificially fragmented (synchronisation). Large (adult) worms, which preferably do not show signs of recent morphallaxis should be selected for synchronisation. These worms can be placed onto a glass slide in a drop of culture water, and dissected in the median body region with a scalpel. Care should be taken that the posterior ends are of similar size. The posterior ends should then be left to regenerate new heads in a culture vessel containing the same substrate as used in the culture and reconstituted water until the start of exposure. Regeneration of new heads is indicated when the synchronised worms are burrowing in the substrate (presence of regenerated heads may be confirmed by inspecting a representative subsample under a binocular microscope). The test organisms are thereafter expected to be in a similar physiological state. This means, that when reproduction by morphallaxis occurs in synchronised worms during the test, virtually all animals are expected to be equally exposed to the spiked sediment. Feeding of the synchronised worms should be done once as soon as the worms are starting to burrow in the substrate, or 7 d after dissection. The feeding regimen should be comparable to the regular cultures, but it may be advisable to feed the synchronised worms with the same food source as is to be used in the test. The worms should be held at test temperature, at 20 ± 2 °C. After regenerating, intact complete worms, which are actively swimming or crawling upon a gentle mechanical stimulus, should be used for the test. Injuries or autotomy in the worms should be prevented, e.g. by using pipettes with fire polished edges, or stainless steel dental picks for handling these worms. | Sources of starter cultures for Lumbriculus variegatus (addresses in the U.S. adopted from (4)) | Europe | ECT Oekotoxikologie GmbH | Böttgerstr. 2-14 | D-65439 Flörsheim/Main | Germany | Bayer Crop Science AG | Development — Ecotoxicology | Alfred-Nobel-Str. 50 | D-40789 Monheim | Germany | | | University of Joensuu | Laboratory of Aquatic Toxicology | Dept. of Biology | Yliopistokatu 7, P.O. Box 111 | FIN-80101 Joensuu | Finland | Dresden University of Technology | Institut für Hydrobiologie | Fakultät für Forst-, Geo- und Hydrowissenschaften | Mommsenstr. 13 | D-01062 Dresden | Germany | | | C.N.R.- I.R.S.A. | Italian National Research Council | Water Research Institute | Via Mornera 25 | I-20047 Brugherio MI | | | | U.S.A. | U.S. Environmental Protection Agency | Mid-Continent Ecological Division | 6201 Congdon Boulevard | Duluth, MN 55804 | Michigan State University | Department of Fisheries and Wildlife | No. 13 Natural Resources Building | East Lansing, MI 48824-1222 | | | U.S. Environmental Protection Agency | Environmental Monitoring System Laboratory | 26 W. Martin Luther Dr. | Cincinnati, OH 45244 | Wright State University | Institute for Environmental Quality | Dayton, OH 45435 | | | Columbia Environmental Research Center | U.S. Geological Survey | 4200 New Haven Road | Columbia, MO 65201 | Great Lakes Environmental Research | Laboratory, NOAA | 2205 Commonwealth Boulevard | Ann Arbor, MI 48105-1593 | REFERENCES | (1) | Phipps, G.L., Ankley, G.T., Benoit, D.A. and Mattson, V.R. (1993). Use of the aquatic Oligochaete Lumbriculus variegatus for assessing the toxicity and bioaccumulation of sediment-associated contaminants. Environ.Toxicol. Chem. 12, 269-279. | (2) | Brunson, E.L., Canfield, T.J., Ingersoll, C.J. & Kemble, N.E. (1998). Assessing the bioaccumulation of contaminants from sediments of the Upper Mississippi river using field-collected oligochaetes and laboratory-exposed Lumbriculus variegatus. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 35, 191-201. | (3) | ASTM International (2000). Standard guide for the determination of the bioaccumulation of sediment-associated contaminants by benthic invertebrates, E 1688-00a. In ASTM International 2004 Annual Book of Standards. Volume 11.05. Biological Effects and Environmental Fate; Biotechnology; Pesticides. ASTM International, West Conshohocken, PA. | (4) | U.S. EPA (2000). Methods for measuring the toxicity and bioaccumulation of sediment-associated contaminants with freshwater invertebrates. Second Edition. EPA 600/R-99/064, U.S. Environmental Protection Agency, Duluth, MN, March 2000. | (5) | Kukkonen, J. and Landrum, P.F. (1994). Toxicokinetics and toxicity of sediment-associated Pyrene to Lumbriculus variegatus (Oligochaeta). Environ. Toxicol. Chem. 13, 1457-1468. | (6) | Drewes C.D. & Fourtner C.R. (1990). Morphallaxis in an aquatic oligochaete, Lumbriculus variegatus: Reorganisation of escape reflexes in regenerating body fragments. Develop. Biol. 138: 94-103. | (7) | Leppänen, M.T. & Kukkonen, J.V.K. (1998a). Relationship between reproduction, sediment type and feeding activity of Lumbriculus variegatus (Müller): Implications for sediment toxicity testing. Environ. Toxicol. Chem. 17: 2196-2202. | (8) | Leppänen, M.T. & Kukkonen, J.V.K. (1998b). Factors affecting feeding rate, reproduction and growth of an oligochaete Lumbriculus variegatus (Müller). Hydrobiologia 377: 183-194. | (9) | Brust, K., O. Licht, V. Hultsch, D. Jungmann & R. Nagel (2001). Effects of Terbutryn on Aufwuchs and Lumbriculus variegatus in Artificial Indoor Streams. Environ. Toxicol. Chemistry, Vol. 20, pp. 2000–2007. | (10) | Oetken, M., K.-U. Ludwichowski & R. Nagel (2000). Sediment tests with Lumbriculus variegatus and Chironomus riparius and 3,4-dichloroaniline (3,4-DCA) within the scope of EG-AltstoffV. By order of the Federal Environmental Agency (Umweltbundesamt Berlin), FKZ 360 12 001, March 2000. | (11) | Leppänen M.T. & Kukkonen J.V.K. (1998). Relative importance of ingested sediment and porewater as bioaccumulation routes for pyrene to oligochaete (Lumbriculus variegatus, Müller). Environ. Sci. Toxicol. 32, 1503-1508. | Appendix 6 | Summary of the ring test results | “Sediment Toxicity Test with Lumbriculus variegatus
” | Table 1 | Results of individual ring test runs: Mean worm numbers in the controls and solvent controls at the end of the test; SD = standard deviation; CV = coefficient of variation | | mean worm number in the controls | SD | CV (%) | n | mean worm number in the solvent controls | SD | CV (%) | n | | 32,3 | 7,37 | 22,80 | 3 | 39,0 | 3,61 | 9,25 | 3 | | 40,8 | 6,55 | 16,05 | 6 | 36,0 | 5,29 | 14,70 | 3 | | 41,5 | 3,54 | 8,52 | 2 | 38,5 | 7,05 | 18,31 | 4 | | 16,3 | 5,99 | 36,67 | 6 | 30,8 | 6,70 | 21,80 | 4 | | 24,3 | 10,69 | 43,94 | 3 | 26,3 | 3,06 | 11,60 | 3 | | 28,5 | 8,29 | 29,08 | 4 | 30,7 | 1,15 | 3,77 | 3 | | 28,3 | 3,72 | 13,14 | 6 | 28,8 | 2,56 | 8,89 | 6 | | 25,3 | 5,51 | 21,74 | 3 | 27,7 | 1,53 | 5,52 | 3 | | 23,8 | 2,99 | 12,57 | 4 | 21,3 | 1,71 | 8,04 | 4 | | 36,8 | 8,80 | 23,88 | 6 | 35,0 | 4,20 | 11,99 | 6 | | 33,0 | 3,58 | 10,84 | 6 | 33,5 | 1,73 | 5,17 | 4 | | 20,7 | 2,73 | 13,22 | 6 | 15,0 | 6,68 | 44,56 | 4 | | 42,0 | 7,07 | 16,84 | 6 | 43,7 | 0,58 | 1,32 | 3 | | 18,2 | 3,60 | 19,82 | 6 | 21,7 | 4,04 | 18,65 | 3 | | 32,0 | 3,95 | 12,34 | 6 | 31,3 | 4,79 | 15,32 | 4 | interlaboratory mean | 29,59 | | 20,10 | | 30,61 | | 13,26 | | SD | 8,32 | | 10,03 | | 7,57 | | 10,48 | | n | 15 | | | | 15 | | | | min | 16,3 | | | | 15,0 | | | | max | 42,0 | | | | 43,7 | | | | CV (%) | 28,1 | | | | 24,7 | | | | Table 2 | Results of individual ring test runs: Mean total dry weights of worms per replicate in the controls and solvent controls at the end of the test; SD = standard deviation; CV = coeff. of variation | | total dry weight of worms per replicate (controls) | SD | CV (%) | n | total dry weight of worms per replicate (solvent controls) | SD | CV (%) | n | | 24,72 | 6,31 | 25,51 | 3 | 27,35 | 4,08 | 14,93 | 3 | | 30,17 | 2,04 | 6,75 | 6 | 33,83 | 10,40 | 30,73 | 3 | | 23,65 | 3,61 | 15,25 | 2 | 28,78 | 4,68 | 16,28 | 4 | | 12,92 | 6,83 | 52,91 | 6 | 24,90 | 6,84 | 27,47 | 4 | | 21,31 | 4,17 | 19,57 | 3 | 25,87 | 5,30 | 20,49 | 3 | | 22,99 | 4,86 | 21,16 | 4 | 24,64 | 5,09 | 20,67 | 3 | | 18,91 | 1,91 | 10,09 | 6 | 19,89 | 1,77 | 8,89 | 6 | | 24,13 | 1,63 | 6,75 | 3 | 25,83 | 2,17 | 8,41 | 3 | | 22,15 | 3,18 | 14,34 | 4 | 22,80 | 2,60 | 11,40 | 4 | | 35,20 | 8,12 | 23,07 | 6 | 31,42 | 8,45 | 26,90 | 6 | | 41,28 | 5,79 | 14,02 | 6 | 41,42 | 4,37 | 10,55 | 4 | | 15,17 | 5,78 | 38,09 | 6 | 10,50 | 3,42 | 32,53 | 4 | | 35,69 | 8,55 | 23,94 | 6 | 38,22 | 1,23 | 3,21 | 3 | | 19,57 | 5,21 | 26,65 | 6 | 28,58 | 6,23 | 21,81 | 3 | | 29,40 | 2,16 | 7,34 | 6 | 31,15 | 2,70 | 8,67 | 4 | interlaboratory mean | 25,15 | | 20,36 | | 27,68 | | 17,53 | | SD | 7,87 | | 12,56 | | 7,41 | | 9,10 | | n | 15 | | | | 15 | | | | min | 12,9 | | | | 10,5 | | | | max | 41,3 | | | | 41,4 | | | | CV (%) | 31,3 | | | | 26,8 | | | | Table 3 | Toxicity of PCP: Summary of endpoints in the ring test; interlaboratory means for EC50, NOEC and LOEC; SD = standard deviation; CV = coefficient of variation | biological parameter | | Inter- laboratory mean (mg/kg) | min | max | Inter- laboratory factor | SD | CV (%) | geometr. mean (mg/kg) | total number of worms | EC50 | 23,0 | 4,0 | 37,9 | 9,4 | 10,7 | 46,3 | 19,9 | NOEC | 9,9 | 2,1 | 22,7 | 10,7 | 7,2 | 72,3 | 7,6 | LOEC | 27,9 | 4,7 | 66,7 | 14,2 | 19,4 | 69,4 | 20,9 | MDD (%) | 22,5 | 7,1 | 39,1 | | | | | total dry weight of worms | EC50 | 20,4 | 7,3 | 39,9 | 5,5 | 9,1 | 44,5 | 18,2 | NOEC | 9,3 | 2,1 | 20,0 | 9,4 | 6,6 | 70,4 | 7,4 | LOEC | 25,7 | 2,1 | 50,0 | 23,5 | 16,8 | 65,5 | 19,4 | MDD (%) | 24,8 | 10,9 | 44,7 | | | | | mortality/survival | LC50 | 25,3 | 6,5 | 37,2 | 5,7 | 9,4 | 37,4 | 23,1 | NOEC | 16,5 | 2,1 | 40,0 | 18,8 | 10,3 | 62,4 | 12,8 | LOEC | 39,1 | 4,7 | 66,7 | 14,2 | 18,1 | 46,2 | 32,6 | reproduction (increase of number of worms per replicate) | EC50 | 20,0 | 6,7 | 28,9 | 4,3 | 7,6 | 37,9 | 18,3 | NOEC | 7,9 | 2,1 | 20,0 | 9,4 | 5,2 | 66,0 | 6,4 | LOEC | 22,5 | 2,1 | 50,0 | 23,5 | 15,4 | 68,6 | 16,0 | MDD (%) | 29,7 | 13,9 | 47,9 | | | | | growth (biomass increase per replicate) | EC50 | 15,3 | 5,7 | 29,9 | 5,2 | 7,1 | 46,5 | 13,7 | NOEC | 8,7 | 2,1 | 20,0 | 9,4 | 6,0 | 68,1 | 6,9 | LOEC | 24,0 | 2,1 | 50,0 | 23,5 | 15,7 | 65,5 | 17,3 | MDD (%) | 32,2 | 13,6 | 65,2 | | | | | MDD: minimum detectable difference from the control values during hypothesis testing; used as a measure of statistical power. | REFERENCE | Egeler, Ph., Meller, M., Schallnaß, H.J. & Gilberg, D. (2005). Validation of a sediment toxicity test with the endobenthic aquatic oligochaete Lumbriculus variegatus by an international ring test. In co-operation with R. Nagel and B. Karaoglan. Report to the Federal Environmental Agency (Umweltbundesamt Berlin), R&D No.: 202 67 429. | C.36 PREDATORY MITE (HYPOASPIS (GEOLAELAPS) ACULEIFER) REPRODUCTION TEST IN SOIL | INTRODUCTION | 1. | This test method is equivalent to OECD test guideline (TG) 226 (2008). This test method is designed to be used for assessing the effects of chemicals in soil on the reproductive output of the soil mite species Hypoaspis (Geolaelaps) aculeifer Canestrini (Acari: Laelapidae), hence allowing for the estimation of the inhibition of the specific population growth rate (1,2). Reproductive output here means the number of juveniles at the end of the testing period. H. aculeifer represents an additional trophic level to the species for which test methods are already available. A reproduction test without discrimination and quantification of the different stages of the reproductive cycle is considered adequate for the purpose of this test method. For chemicalsubstances with another exposure scenario than via the soil other approaches might be appropriate (3). | 2. | Hypoaspis (Geolaelaps) aculeifer is considered to be a relevant representative of soil fauna and predatory mites in particular. It is worldwide distributed (5) and can easily be collected and reared in the laboratory. A summary on the biology of H. aculeifer is provided in Appendix 7. Background information on the ecology of the mite species and the use in ecotoxicological testing is available (4), (5), (6), (7), (8), (9), (10), (11), (12). | PRINCIPLE OF THE TEST | 3. | Adult females are exposed to a range of concentrations of the test chemical mixed into the soil. The test is started with 10 adult females per replicate vessel. Males are not introduced in the test, because experience has shown that females mate immediately or shortly after hatching from the deutonymph stage, if males are present. In addition, inclusion of males would prolong the test in a way that the demanding discrimination of age stages would become necessary. Thus, mating itself is not part of the test. The females are introduced into the test 28-35 days after the start of the egg laying period in the synchronisation (see Appendix 4), as the females can then be considered as already mated and having passed the pre-oviposition stage. At 20 °C the test ends at day 14 after introducing the females (day 0), which allows the first control offspring to reach the deutonymph stage (see Appendix 4). For the main measured variable, the number of juveniles per test vessels and additionally the number of surviving females are determined. The reproductive output of the mites exposed to the test chemical is compared to that of the controls in order to determine the ECx (e.g. EC10, EC50) or the no observed effect concentration (NOEC) (see Appendix 1 for definitions), depending on the experimental design (see paragraph 29). An overview of the test schedule is given in Appendix 8. | INFORMATION ON THE TEST CHEMICAL | 4. | The water solubility, the log Kow, the soil water partition coefficient and the vapour pressure of the test chemical should preferably be known. Additional information on the fate of the test chemical in soil, such as the rates of biotic and abiotic degradation, is desirable. | 5. | This test method can be used for water soluble or insoluble chemicals. However, the mode of application of the test chemical will differ accordingly. The test method is not applicable to volatile chemicals, i.e. chemicals for which the Henry's constant or the air/water partition coefficient is greater than one, or chemicals for which the vapour pressure exceeds 0,0133 Pa at 25 °C. | VALIDITY OF THE TEST | 6. | The following criteria should be satisfied in the untreated controls for a test result to be considered valid: | — | Mean adult female mortality should not exceed 20 % at the end of the test; | — | The mean number of juveniles per replicate (with 10 adult females introduced) should be at least 50 at the end of the test; | — | The coefficient of variation calculated for the number of juvenile mites per replicate should not be higher than 30 % at the end of the definitive test. | REFERENCE CHEMICAL | 7. | The ECx and/or NOEC of a reference chemical must be determined to provide assurance that the laboratory test conditions are adequate and to verify that the response of the test organisms did not change over time. Dimethoate (CAS 60-51-5) is a suitable reference chemical that has shown to affect population size (4). Boric acid (CAS 10043-35-3) may be used as an alternative reference chemical. Less experience has been gained with this chemical. Two design options are possible: | — | The reference chemical can be tested in parallel to the determination of the toxicity of each test chemical at one concentration, which has to be demonstrated beforehand in a dose response study to result in an effect of > 50 % reduction of offspring. In this case, the number of replicates should be the same as that in the controls (see paragraph 29). | — | Alternatively, the reference chemical is tested 1 - 2 times a year in a dose-response test. Depending on the design chosen, the number of concentrations and replicates and the spacing factor differ (see paragraph 29), but a response of 10 - 90 % effect should be achieved (spacing factor of 1,8). The EC50 for dimethoate based on the number of juveniles should fall in the range between 3,0 and 7,0 mg a.s./kg soil (dw). Based on the results obtained with boric acid so far, the EC50 based on the number of juveniles should fall in the range between 100 and 500 mg/kg dw soil. | DESCRIPTION OF THE TEST | Test vessels and equipment | 8. | Test vessels of 3 - 5 cm diameter (height of soil ≥ 1,5 cm), made of glass or other chemically inert material and having a close fitting cover, should be used. Screw lids are preferred and in that case, the vessels could be aerated twice a week. Alternatively, covers that permit direct gaseous exchange between the substrate and the atmosphere (e.g. gauze) can be used. Since moisture content must be kept high enough during the test, it is essential to control the weight of each experimental vessel during the test and replenish water if necessary. This may be especially important if no screw lids are available. If a non-transparent test vessel is used, the cover should be made of material that allows for access to light (e.g. by means of a perforated transparent cover) whilst preventing the mites from escaping. The size and type of the test vessel depends on the extraction method (see Appendix 5 for details). If heat extraction is applied directly to the test vessel, then a bottom mesh of appropriate mesh size could be added (sealed until extraction), and soil depth should be sufficient to allow for a temperature and moisture gradient. | 9. | Standard laboratory equipment is required, specifically the following: | — | preferably glass vessels with screw lids; | — | drying cabinet; | — | stereomicroscope; | — | brushes for transferring mites | — | pH-meter and luxmeter; | — | suitable accurate balances; | — | adequate equipment for temperature control; | — | adequate equipment for air humidity control (not essential if exposure vessels are covered by lids); | — | temperature-controlled incubator or small room; | — | equipment for extraction (see Appendix 5) (13) | — | overhead light panel with light control | — | collection jars for extracted mites. | Preparation of the artificial soil | 10. | For this test, an artificial soil is used. The artificial soil consists of the following components (all values based on dry mass): | — | 5 % sphagnum peat, air-dried and finely ground (a particle size of 2 ± 1 mm is acceptable); | — | 20 % kaolin clay (kaolinite content preferably above 30 %); | — | approximately 74 % air-dried industrial sand (depending on the amount of CaCO3 needed), predominantly fine sand with more than 50 % of the particles between 50 and 200 microns. The exact amount of sand depends on the amount of CaCO3 (see below), together they should add up to 75 %. | — | < 1,0 % calcium carbonate (CaCO3, pulverised, analytical grade) to obtain a pH of 6,0 ± 0,5; the amount of calcium carbonate to be added may depend principally on the quality/nature of the peat (see Note 1). | Note 1: The amount of CaCO3 required will depend on the components of the soil substrate and should be determined by measuring the pH of soil sub-samples immediately before the test (14). | Note 2: The peat content of the artificial soil deviates from other test methods on soil organisms, where in most cases 10 % peat is used (e.g. (15)). However, according to EPPO (16) a typical agricultural soil has not more than 5 % organic matter, and the reduction in peat content thus reflects the decreased possibilities of a natural soil for sorption of the test chemical to organic carbon. | Note 3: If required, e.g. for specific testing purposes, natural soils from unpolluted sites may also serve as test and/or culture substrate. However, if natural soil is used, it should be characterised at least by origin (collection site), pH, texture (particle size distribution) and organic matter content. If available, the type and name of the soil according to soil classification should be included, and the soil should be free from any contamination. In case the test chemical is a metal or organo-metal, the cation exchange capacity (CEC) of the natural soil should also be determined. Special attention should be paid to meet the validity criteria as background information on natural soils typically is rare. | 11. | The dry constituents of the soil are mixed thoroughly (e.g. in a large-scale laboratory mixer). For the determination of pH a mixture of soil and 1 M potassium chloride (KCl) or 0,01 M calcium chloride (CaCl2) solution in a 1:5 ratio is used (see (14) and Appendix 3). If the soil is more acidic than the required range (see paragraph 10), it can be adjusted by addition of an appropriate amount of CaCO3. If the soil is too alkaline it can be adjusted by the addition of more of the mixture comprising the first three components described in paragraph 10, but excluding the CaCO3. | 12. | The maximum water holding capacity (WHC) of the artificial soil is determined in accordance with procedures described in Appendix 2. Two to seven days before starting the test, the dry artificial soil is pre-moistened by adding enough distilled or de-ionised water to obtain approximately half of the final water content, that being 40 to 60 % of the maximum WHC. The moisture content is adjusted to 40-60 % of the maximum WHC by the addition of the test chemical solution and/or by adding distilled or de-ionised water (see paragraphs 16-18). An additional rough check of the soil moisture content should be obtained by gently squeezing the soil in the hand, if the moisture content is correct small drops of water should appear between the fingers. | 13. | Soil moisture content is determined at the beginning and at the end of the test by drying to constant weight at 105 °C in accordance with ISO 11465 (17) and soil pH in accordance with Appendix 3 or ISO 10390 (14). These measurements should be carried out in additional samples without mites, both from the control soil and from each test concentration soil. The soil pH should not be adjusted when acidic or basic chemicals are tested. The moisture content should be monitored throughout the test by weighing the vessels periodically (see paragraphs 20 and 24). | Selection and preparation of test animals | 14. | The species used in the test is Hypoaspis (Geolaelaps) aculeifer (Canestrini, 1883). Adult female mites, obtained from a synchronised cohort are required to start the test. Mites should be introduced ca. 7-14 days after becoming adult, 28 - 35 days after the start of the egg laying in the synchronisation (see paragraph 3 and Appendix 4). The source of the mites or the supplier and maintenance of the laboratory culture should be recorded. If a laboratory culture is kept, it is recommended that the identity of the species is confirmed at least once a year. An identification sheet is included as Appendix 6. | Preparation of test concentrations | 15. | The test chemical is mixed into the soil. Organic solvents used to aid treatment of the soil with the test chemical should be selected on the basis of their low toxicity to mites and appropriate solvent control must be included in the test design (see paragraph 29). | Test chemical soluble in water | 16. | A solution of the test chemical is prepared in deionised water in a quantity sufficient for all replicates of one test concentration. It is recommended to use an appropriate quantity of water to reach the required moisture content, i.e. 40 to 60 % of the maximum WHC (see paragraph 12). Each solution of test chemical is mixed thoroughly with one batch of pre-moistened soil before being introduced into the test vessel. | Test chemical insoluble in water | 17. | For chemicals insoluble in water but soluble in organic solvents, the test chemical can be dissolved in the smallest possible volume of a suitable vehicle (e.g. acetone). Only volatile solvents should be used. When such vehicles are used, all test concentrations and the control should contain the same minimum amount of the vehicle. The vehicle is sprayed on or mixed with a small amount, for example 10 g, of fine quartz sand. The total sand content of the substrate should be corrected for this amount. The vehicle is eliminated by evaporation under a fume hood for at least one hour. This mixture of quartz sand and test chemical is added to the pre-moistened soil and thoroughly mixed by adding an appropriate amount of de-ionised water to obtain the moisture required. The final mixture is introduced into the test vessels. Note that some solvents may be toxic to mites. It is therefore recommended to use an additional water control without vehicle if the toxicity of the solvent to mites is not known. If it is adequately demonstrated that the solvent (in the concentrations to be applied) has no effects, the water control may be excluded. | Test chemical poorly soluble in water and organic solvents | 18. | For chemicals that are poorly soluble in water and organic solvents, the equivalent of 2,5 g of finely ground quartz sand per test vessel (for example 10 g of fine quartz sand for four replicates) is mixed with the quantity of test chemical to obtain the desired test concentration. The total sand content of the substrate should be corrected for this amount. This mixture of quartz sand and test chemical is added to the pre-moistened soil and thoroughly mixed after adding an appropriate amount of deionised water to obtain the required moisture content. The final mixture is divided between the test vessels. The procedure is repeated for each test concentration and an appropriate control is also prepared. | PROCEDURE | Test groups and controls | 19. | Ten adult females in 20 g dry mass of artificial soil are recommended for each control and treatment vessel. Test organisms should be added within two hours after preparation of the final test substrate (i.e. after application of the test item). In specific cases (e.g. when ageing is considered to be a determining factor), the time between preparation of the final test substrate and the addition of the mites can be prolonged (for details of such ageing, see (18)). However, in such cases a scientific justification must be provided. | 20. | After the addition of the mites to the soil, the mites are provided with food and the initial weight of each test vessel should be measured to be used as reference for monitoring soil moisture content throughout the test as described in paragraph 24. The test vessels are then covered as described in paragraph 8 and placed in the test chamber. | 21. | Appropriate controls are prepared for each of the methods of test chemical application described in paragraphs 15 to 18. The relevant procedures described are followed for preparing the controls except that the test chemical is not added. Thus, where appropriate, organic solvents, quartz sand or other vehicles are applied to the controls in concentrations/amounts like in the treatments. Where a solvent or other vehicle is used to add the test chemical, an additional control without the vehicle or test chemical should also be prepared and tested in case the toxicity of the solvent is not known (see paragraph 17). | Test conditions | 22. | The test temperature should be 20 ± 2 °C. Temperature should be recorded at least daily and adjusted, if necessary. The test is carried out under controlled light-dark cycles (preferably 16 hours light and 8 hours dark) with illumination of 400 to 800 lux in the vicinity of the test vessels. For reasons of comparability, these conditions are the same as in other soil ecotoxicological tests (e.g. (15)). | 23. | Gaseous exchange should be guaranteed by aerating the test vessels at least twice a week in case screw lids are used. If gauze covers are used, special attention should be paid to the maintenance of the soil moisture content (see paragraphs 8 and 24). | 24. | The water content of the soil substrate in the test vessels is maintained throughout the test by weighing and if needed re-watering the test vessels periodically (e.g. once per week). Losses are replenished as necessary with de-ionised water. The moisture content during the test should not differ by more than 10 % from the start value. | Feeding | 25. | Cheese mites (Tyrophagus putrescentiae (Schrank, 1781)) have been shown to be a suitable food source. Small collembolans (e.g. juvenile Folsomia candida Willem, 1902 or Onychiurus fimatus (19), (20), enchytraeids (e.g. Enchytraeus crypticus Westheide & Graefe, 1992) or nematodes (e.g. Turbatrix silusiae de Man, 1913)) may be also suitable (21). It is recommended to check the food before using it in a test. The type and amount of food should secure an adequate number of juveniles in order to fulfil the validity criteria (paragraph 6). For the prey selection, the mode of action of the test item should be considered (e.g. an acaricide may be toxic to the food mites too, see paragraph 26). | 26. | Food should be provided ad libitum (i.e. each time a small amount (tip of a spatula)). For this purpose, also low suction exhaustor as proposed in the collembolan test or a fine paint brush can also be used. Supplying food at the beginning of the test and two to three times a week will usually be sufficient. When the test item appears to be toxic to the prey, an increased feeding rate and/or an alternative food source should be considered. | Selection of test concentrations | 27. | Prior knowledge of the toxicity of the test chemical should help in selecting appropriate test concentrations, e.g. from range-finding studies. When necessary, a range-finding test is conducted with five concentrations of the test chemical in the range of 0,1 – 1 000 mg/kg dry soil, with at least one replicate for treatments and control. The duration of the range finding test is 14 days, after which mortality of the adult mites and the number of juveniles is determined. The concentration range in the final test should preferably be chosen so that it includes concentrations at which juvenile numbers are affected while survival of the maternal generation is not. This, however, may not be possible for chemicals that cause lethal and sub-lethal effects at almost similar concentrations. The effect concentration (e.g. EC50, EC25, EC10) and the concentration range, over which the effect of the test chemical is of interest, should be bracketed by the concentrations included in the test. Extrapolating much below the lowest concentration affecting the test organisms or above the highest tested concentration should be done only in exceptional cases, and a full explanation should be given in the report. | Experimental design | Dose response tests | 28. | Three test designs are proposed, based on the recommendations arising from another ring test (Enchytraeid reproduction test (22)). The general suitability of all these designs was confirmed by the outcome of H. aculeifer validation. | 29. | In setting the range of concentrations, the following should be borne in mind: | — | For determination of the ECx (e.g. EC10, EC50), twelve concentrations should be tested. At least two replicates for each test concentration and six control replicates are recommended. The spacing factor may vary, i.e. less than or equal to 1,8 in the expected effect range and above 1,8 at the higher and lower concentrations. | — | For determination of the NOEC, at least five concentrations in a geometric series should be tested. Four replicates for each test concentration plus eight controls are recommended. The concentrations should be spaced by a factor not exceeding 2,0. | — | A combined approach allows for determination of both the NOEC and ECx. Eight treatment concentrations in a geometric series should be used. Four replicates for each treatment plus eight controls are recommended. The concentrations should be spaced by a factor not exceeding 1,8. | Limit test | 30. | If no effects are observed at the highest concentration in the range-finding test (i.e. 1 000 mg/kg dw soil), the definitive reproduction test can be performed as a limit test, using a test concentration of 1 000 mg/kg dw soil. A limit test will provide the opportunity to demonstrate that the NOEC or the EC10 for reproduction is greater than the limit concentration, whilst minimising the number of mites used in the test. Eight replicates should be used for both the treated soil and the control. | Test duration and measurements | 31. | Any observed differences between the behaviour and the morphology of the mites in the control and the treated vessels should be recorded. | 32. | On day 14 the surviving mites are extracted from the soil via heat/light extraction or by another appropriate method (see Appendix 5). The numbers of juveniles (i.e. larvae, protonymphs and deutonymphs) and adults are counted separately. Any adult mites not found at this time are to be recorded as dead, assuming that such mites have died and decomposed prior to the assessment. Extraction efficiency must be validated once or twice a year in controls with known numbers of adults and juveniles. Efficiency should be above 90 % on average combined for all developmental stages (see Appendix 5). Adult and juvenile counts are not adjusted for efficiency. | DATA AND REPORTING | Treatment of results | 33. | Information on the statistical methods that may be used for analysing the test results is given in paragraphs 36 to 41. In addition, OECD Document 54 on the “Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: a Guidance to Application” (31) should be consulted. | 34. | Test main endpoint is the reproductive output, here the number of juveniles produced per replicate test vessel (with 10 adult females introduced). The statistical analysis requires the arithmetic mean (X) and the variance (s2) for the reproductive output to be calculated per treatment and per control. X and s2 are used for ANOVA procedures such as the Student t test, Dunnett test, or Williams' test as well as for the computation of 95 % confidence intervals. | Note: This main endpoint is equivalent with fecundity measured as the number of living juveniles produced during the test divided by the number of parental females introduced at the start of the test. | 35. | The number of surviving females in the untreated controls is a major validity criterion and has to be documented. As in the range-finding test, all other harmful signs should be recorded in the final report as well. | ECx | 36. | ECx-values including their associated lower and upper 95 % confidence limits for the parameter described in paragraph 34 are calculated using appropriate statistical methods (e.g. probit analysis, logistic or Weibull function, trimmed Spearman-Karber method, or simple interpolation). An ECx is obtained by inserting a value corresponding to x % of the control mean into the equation found. To compute the EC50 or any other ECx, the per treatment means (X) should be subjected to regression analysis. | NOEC/LOEC | 37. | If a statistical analysis is intended to determine the NOEC/LOEC, per-vessel statistics (individual vessels are considered replicates) are necessary. Appropriate statistical methods should be used (according to OECD Document 54 on the Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application). In general, adverse effects of the test item compared to the control are investigated using one-tailed (smaller) hypothesis testing at p ≤ 0,05. Examples are given in the following paragraphs. | 38. | Normal distribution of data can be tested e.g. with the Kolmogorov-Smirnov goodness-of-fit test, the Range-to-standard-deviation ratio test (R/s-test) or the Shapiro-Wilk test (two-sided, p ≤ 0,05). Cochran's test, Levene test or Bartlett's test, (two-sided, p ≤ 0,05) may be used to test variance homogeneity. If the prerequisites of parametric test procedures (normality, variance homogeneity) are fulfilled, One-way Analysis of Variance (ANOVA) and subsequent multi-comparison tests can be performed. Multiple comparisons (e.g. Dunnett's t-test) or step-down trend tests (e.g. Williams' test in case of a monotonous dose-response relationship) can be used to calculate whether there are significant differences (p ≤ 0,05) between the controls and the various test item concentrations (selection of the recommended test according to OECD Document 54 on the Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: a Guidance to Application). Otherwise, non-parametric methods (e.g. Bonferroni-U-test according to Holm or Jonckheere-Terpstra trend test) should be used to determine the NOEC and the LOEC. | Limit test | 39. | If a limit test (comparison of control and one treatment only) has been performed and the prerequisites of parametric test procedures (normality, homogeneity) are fulfilled, metric responses can be evaluated by the Student test (t-test). The unequal-variance t-test (Welch t-test) or a non parametric test, such as the Mann-Whitney-U-test may be used, if these requirements are not fulfilled. | 40. | To determine significant differences between the controls (control and solvent control), the replicates of each control can be tested as described for the limit test. If these tests do not detect significant differences, all control and solvent control replicates may be pooled. Otherwise all treatments should be compared with the solvent control. | Test report | 41. | The test report should at least include the following information: | — | Test chemical | — | the identity of the test chemical, name, batch, lot and CAS-number, purity; | — | physico-chemical properties of the test chemical (e.g. log Kow, water solubility, vapour pressure, Henry's constant (H) and preferably information on the fate of the test chemical in soil). | — | Test organisms | — | identification and supplier of the test organisms, description of the culturing conditions; | — | age range of test organisms. | — | Test conditions | — | description of the experimental design and procedure; | — | preparation details for the test soil; detailed specification if natural soil is used (origin, history, particle size distribution, pH, organic matter content and if available the soil classification) | — | the maximum water holding capacity of the soil; | — | a description of the technique used to apply the test chemical to the soil; | — | details of auxiliary chemicals used for administering the test chemical; | — | size of test vessels and dry mass of test soil per vessel; | — | test conditions: light intensity, duration of light-dark cycles, temperature; | — | a description of the feeding regime, the type and amount of food used in the test, feeding dates; | — | pH and water content of the soil at the start and during the test (control and each treatment) | — | detailed description of the extraction method and extraction efficiency. | — | Test results | — | the number of juveniles determined in each test vessel at the end of the test; | — | number of adult females and adult mortality (%) in each test vessel at the end of the test | — | a description of obvious symptoms or distinct changes in behaviour; | — | the results obtained with the reference test chemical; | — | summary statistics (ECx and/or NOEC ) including 95 %-confidence limits and a description of the method of calculation; | — | a plot of the concentration-response-relationship; | — | deviations from procedures described in this test method and any unusual occurrences during the test. | LITERATURE | (1) | Casanueva, M.E. (1993). Phylogenetic studies of the free-living and arthropod associated Laelapidae (Acari: Mesostigmata). Gayana Zool. 57, 21-46. | (2) | Tenorio, J. M. (1982). Hypoaspidinae (Acari: Gamasida: Laelapidae) of the Hawaiian Islands. Pacific Insects 24, 259-274. | (3) | Bakker, F.M., Feije, R., Grove, A. J., Hoogendorn, G., Jacobs, G., Loose, E.D. and van Stratum, P. (2003). A laboratory test protocol to evaluate effects of plant protection products on mortality and reproduction of the predatory mite Hypoaspis aculeifer Canestrini (Acari: Laelapidae) in standard soil. JSS — Journal of Soils and Sediments 3, 73-77. | (4) | Karg, W. (1993). Die freilebenden Gamasina (Gamasides), Raubmilben. 2nd edition In: Dahl, F. (Hrsg.): Die Tierwelt Deutschlands 59. Teil, G. Fischer, Jena, 523 pp. | (5) | Ruf, A. (1991). Do females eat males?: Laboratory studies on the popualation development of Hypoaspis aculeifer (Acari: Parasitiformes). In: F. Dusbabek & V. Bukva (eds.): Modern Acarology. Academia Prague & SPD Academic Publishing bv, The Hague, Vol. 2, 487-492 | (6) | Ruf, A. (1995). Sex ratio and clutch size control in the soil inhabiting predatory mite Hypoaspis aculeifer (Canestrini 1883) (Mesostigmata, Dermanyssidae). Proc. 2nd Symp. EURAAC: p 241-249. | (7) | Ruf, A. (1996). Life-history patterns in soil-inhabiting mesostigmatid mites. Proc. IXth Internat. Congr. Acarol. 1994, Columbus, Ohio: p 621-628. | (8) | Krogh, P.H. and Axelsen, J.A. (1998). Test on the predatory mite Hypoaspis aculeifer preying on the collembolan Folsomia fimetaria. In: Lokke, H. and van Gestel, C.A.M.: Handbook of soil invertebrate toxicity tests. John Wiley Sons, Chichester, p 239-251. | (9) | Løkke, H., Janssen, C.R., Lanno, R.P., Römbke, J., Rundgren, S. and Van Straalen, N.M. (2002). Soil Toxicity Tests — Invertebrates. In: Test Methods to Determine Hazards of Sparingly Soluble Metal Compounds in Soils. Fairbrother, A., Glazebrook, P.W., Van Straalen, N.M. and Tarazona, J.V. (eds.). SETAC Press, Pensacola, USA. 128 pp. | (10) | Schlosser, H.-J. and Riepert, F. (1991/92). Entwicklung eines Prüfverfahrens für Chemikalien an Bodenraubmilben (Gamasina). Teil 1: Biologie der Bodenraubmilbe Hypoaspis aculeifer Canestrini, 1883 (Gamasina) unter Laborbedingungen. Zool. Beiträge, 34, 395-433. | (11) | Schlosser, H.-J. and Riepert, F. (1992). Entwicklung eines Prüfverfahrens für Chemikalien an Boden-raubmilben (Gamasina). Teil 2: Erste Ergebnisse mit Lindan und Kaliumdichromat in subletaler Dosierung. Zool. Beitr. N.F. 34, 413-433. | (12) | Heckmann, L.-H., Maraldo, K. and Krogh, P. H. (2005). Life stage specific impact of dimethoate on the predatory mite Hypoaspis aculeifer Canestrini (Gamasida: Laelapidae). Environmental Science & Technology 39, 7154-7157. | (13) | Petersen, H. (1978). Some properties of two high-gradient extractors for soil microarthropods, and an attempt to evaluate their extraction efficiency. Natura Jutlandica 20, 95-122. | (14) | ISO (International Organization for Standardization) (1994). Soil Quality — Determination of pH, No. 10390. ISO, Geneve. | (15) | Chapter C.8 of this Annex -. Toxicity for Earthworms. | (16) | EPPO (2003): EPPO Standards. Environmental risk assessment scheme for plant protection products. Chapter 8. Soil Organisms and Functions. Bull. OEPP/EPPO Bull. 33, 195-209. | (17) | ISO (International Organization for Standardization) (1993). Soil Quality –Determination of dry matter and water content on a mass basis — Gravimetric method, No. 11465. ISO, Geneve. | (18) | Fairbrother, A., Glazebrock, P.W., Van Straalen, N.M. and Tarazona, J.V. 2002. Test methods to determine hazards of sparingly soluble metal compounds in soils. SETAC Press, Pensacola, FL, USA. | (19) | Chi, H. 1981. Die Vermehrungsrate von Hypoaspis aculeifer Canestrini (Acarina, Laelapidae) bei Ernährung mit Onychiurus fimatus Gisin (Collenbola). Ges.allg..angew. Ent. 3:122-125. | (20) | Schlosser, H.J., und Riepert, F. 1992. Entwicklung eines Prüfverfahrens für Chemikalien an Bodenraubmilden (Gamasina). Zool.Beitr. N.F. 34(3):395-433. | (21) | Heckmann, L.-H., Ruf, A., Nienstedt, K. M. and Krogh, P. H. 2007. Reproductive performance of the generalist predator Hypoaspis aculeifer (Acari: Gamasida) when foraging on different invertebrate prey. Applied Soil Ecology 36, 130-135. | (22) | Chapter C.32 of this Annex- Enchytraeid reproduction test. | (23) | ISO (International Organization for Standardization) (1994). Soil Quality — Effects of pollutants on earthworms (Eisenia fetida). Part 2: Determination of effects on reproduction, No. 11268-2. ISO, Geneve. | (24) | Southwood, T.R.E. (1991). Ecological methods. With particular reference to the study of insect populations. (2nd ed.). Chapman & Hall, London, 524 pp. | (25) | Dunger, W. and Fiedler, H.J. (1997). Methoden der Bodenbiologie (2nd ed.). G. Fischer, Jena, 539 pp. | (26) | Lesna, I. and Sabelis, M.W. (1999). Diet-dependent female choice for males with “good genes” in a soil predatory mite. Nature 401, 581-583. | (27) | Ruf, A. (1989). Die Bedeutung von Arrhenotokie und Kannibalismus für die Populationsentwicklung von Hypoaspis aculeifer (Canestrini 1883) (Acari, Gamasina). Mitt. Deut. Ges. Allg. Angew. Ent. 7, 103-107. | (28) | Ruf, A. (1993). Die morphologische Variabilität und Fortpflanzungsbiologie der Raubmilbe Hypoaspis aculeifer (Canestrini 1883) (Mesostigmata, Dermanyssidae). Dissertation, Universität Bremen. | (29) | Ignatowicz, S. (1974). Observations on the biology and development of Hypoaspis aculeifer Canestrini, 1885 (Acarina, Gamasides). Zoologica Poloniae 24, 11-59. | (30) | Kevan, D.K. McE. and Sharma, G.D. (1964). Observations on the biology of Hypoaspis aculeifer (Canestrini, 1884), apparently new to North America (Acarina: Mesostigmata: Laelaptidae). Acarologia 6, 647-658. | (31) | OECD (2006c). Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application. OECD environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No.54. ENV/JM/MONO(2006)18 | Appendix 1 | Definitions | The following definitions are applicable to this test method (in this test all effect concentrations are expressed as a mass of test chemical per dry mass of the test soil): | Chemical is a substance or a mixture | NOEC (no observed effect concentration) is the test chemical concentration at which no effect is observed. In this test, the concentration corresponding to the NOEC, has no statistically significant effect (p < 0,05) within a given exposure period when compared with the control. | LOEC (lowest observed effect concentration) is the lowest test chemical concentration that has a statistically significant effect (p < 0,05) within a given exposure period when compared with the control. | ECx (effect concentration for x % effect) is the concentration that causes an x % of an effect on test organisms within a given exposure period when compared with a control. For example, an EC50 is a concentration estimated to cause an effect on a test end point in 50 % of an exposed population over a defined exposure period. | Test Chemical is any substance or mixture tested using this test method. | Appendix 2 | Determination of the maximum water holding capacity of the soil | The following method for determining the maximum water holding capacity of the soil is considered to be appropriate. It is described in Annex C of ISO DIS 11268-2 (Soil Quality — Effects of pollutants on earthworms (Eisenia fetida). Part 2: Determination of effects on reproduction (23)). | Collect a defined quantity (e.g. 5 g) of the test soil substrate using a suitable sampling device (auger tube etc.). Cover the bottom of the tube with a piece of filter paper filled with water and then places it on a rack in a water bath. The tube should be gradually submerged until the water level is above to the top of the soil. It should then be left in the water for about three hours. Since not all water absorbed by the soil capillaries can be retained, the soil sample should be allowed to drain for a period of two hours by placing the tube onto a bed of very wet finely ground quartz sand contained within a covered vessel (to prevent drying). The sample should then be weighed, dried to constant mass at 105 °C. The water holding capacity (WHC) can then be calculated as follows: | Where: | S= water-saturated substrate + mass of tube + mass of filter paper | T= tare (mass of tube + mass of filter paper) | D= dry mass of substrate | Appendix 3 | Determination of soil pH | The following method for determining the pH of a soil is based on the description given in ISO DIS 10390: Soil Quality — Determination of pH (16). | A defined quantity of soil is dried at room temperature for at least 12 h. A suspension of the soil (containing at least 5 grams of soil) is then made up in five times its volume of either a 1 M solution of analytical grade potassium chloride (KCl) or a 0,01 M solution of analytical grade calcium chloride (CaCl2). The suspension is then shaken thoroughly for five minutes and then left to settle for at least 2 hours but not for longer than 24 hours. The pH of the liquid phase is then measured using a pH-meter that has been calibrated before each measurement using an appropriate series of buffer solutions (e.g. pH 4,0 and 7,0). | Appendix 4 | Rearing of Hypoaspis (Geolaelaps ) aculeifer, food mites and synchronisation of culture | Rearing of Hypoaspis (Geolaelaps) aculeifer: | Cultures can be maintained in plastic vessels or glass jars filled with plaster of Paris / charcoal powder (9:1) mixture. The plaster can be kept moist by adding few drops of distilled or deionised water if required. Rearing temperatures are optimal between 20 ± 2 °C, light / dark regime is not relevant for this species. Prey can be Typrophagus putrescentiae or Caloglyphus sp. mites (food mites should be handled with care since they could cause allergies in humans), but nematodes, enchytraeids and collembolans are also suited as prey items. Their source should be recorded. Population development can start with a single female because males develop in unfertilised eggs. Generations are largely overlapping. A female can live at least 100 days and can deposit approximately 100 eggs during its lifetime. A maximum oviposition rate is reached between 10 and 40 days (after becoming adults) and amounts to 2,2 eggs female– 1 day– 1. Developmental time from egg to adult female is approximately 20 days at 20 °C. More than one culture should be maintained and held beforehand. | Rearing of Typrophagus putrescentiae: | The mites are kept in a glass vessel filled with fine brewers yeast powder which is put in a plastic bucket filled with KNO3-solution in order to avoid escaping. The food mites are placed on top of this powder. Afterwards, they are carefully mixed with the powder (which has to be replaced twice a week) using a spatula. | Synchronisation of culture: | Specimens that are used in the test should be of similar age (ca. 7 days after reaching the adult stage). At a rearing temperature of 20 °C this is achieved by | Transfer females to a clean rearing vessel and add sufficient food | — | Allow for two to three days of egg laying, remove females | — | Take adult females for testing between the 28th and 35th day after start placing female adults in clean rearing vessels. | Adult females can be easily distinguished from males and other developmental stages by their larger size, bloated shape and their brown dorsal shield (males are slimmer and flat), immatures are white to cream-coloured. The development of the mites follows approximately the pattern described below at 20 °C (figure): Egg 5d, Larva 2d, Protonymph 5d, Deutonymph 7d, preoviposition period of female 2d. Afterwards, the mites are adult. | Figure | Development of Hypoaspis (Geolaelaps) aculeifer at 20 °C. (removal = females used for the test) | 30 | 20 days | 10 | 0 | 35d | Removal | 28d | Adult | Deutonymph | Protonymph | Larva | Egg | egglaying | The adult test animals are removed from the synchronised culture and introduced into the test vessels between the 28th and the 35th day after the parental females have started egg laying (i.e. 7 – 14 days after they became adult). This ensures that the test animals have already passed their preoviposition period and have been mated by males that are also present in the culture vessel. Observations in laboratory cultures suggest, that females mate immediately or shortly after becoming adult if males are present (Ruf, Vaninnen, pers. obs.). The period of seven days is chosen to facilitate integration in laboratory routine and to buffer individual developmental variability among mites. The oviposition should be started with at least the same number of females that is eventually needed for the test (If for example 400 females are needed in the test, at least 400 females should be allowed to oviposit for two to three days. At least 1 200 eggs should be the starting point for the synchronised population (sex ratio ca. 0,5, mortality ca. 0,2). To avoid cannibalism, it is more feasible to keep not more than 20-30 ovipositing females in one vessel. | Appendix 5 | Extraction methods | For micro-arthropods a heat extraction is an appropriate method to separate specimens from the soil / substrate (see figure below). The method is based on the activity of the organisms, so only mobile specimens will have the chance to be recorded. The principle of the heat extraction is to make conditions for the organisms gradually worse in the sample, so that they will leave the substrate and fall in a fixing liquid (e.g. ethanol). Crucial points are the duration of the extraction and the gradient of good to moderate to bad conditions for the organisms. The duration of extraction for ecotoxicological tests have to be as short as possible, because any population growth during the time of extraction would falsify the results. On the other hand the temperature and moisture conditions in the sample have to be always in a range that allows the mites to move. The heating of a soil sample leads to a desiccation of substrate. If the desiccation is too quick, some mites might also desiccated before they managed to escape. | Therefore the following procedure is proposed (24) (25): | Apparatus: Tullgren funnel or comparable methods like e.g. McFadyen (heating from above, sample is put over a funnel) | Heating regime: 25 °C for 12 h, 35 °C for 12 h, 45 °C for 24 hours (in total 48 h). The temperature should be measured in the substrate. | Fixation liquid: 70 % ethanol | Details: Take glass vial that was used for the test. Remove lid and wrap a piece of mesh or fabric around the opening. The fabric should have a mesh size of 1,0 to 1,5 mm. Fix the fabric with an elastic band. Carefully turn the vial upside down and place it in the extraction apparatus. The fabric prevents substrate from trickling in the fixation liquid but allows mites to leave the sample. Start the heating regime after all vials are inserted. End the extraction after 48 hours. Remove fixation vials and count mites by means of a dissecting microscope. | The extraction efficiency of the chosen method must have been proven once or twice a year using vessels containing a known number of juvenile and adult mites kept in untreated test substrate. Efficiency should be ≥ 90 % on average combined for all developmental stages. | Tullgren-type extracting device | Heat source | Vial of alcohol | Wire mesh barrier | Sample goes here | How to prepare the test vial after the test is finished, before extraction | Test vessel | Elastic band | Mesh/fabric | Test substrate with mites | Appendix 6 | Identification of Hypoaspis (Geolaelaps ) aculeifer | Subclass/order/suborder: | | Family: | | Genus/subgenus/species: | Acari/Parasitiformes/Gamasida | | Laelapidae | | Hypoaspis (Geolaelaps) aculeifer | Author and Date: | F. Faraji, Ph.D. (MITOX), 23 January 2007 | Literature used: | Karg, W. (1993). Die freilebenden Gamasina (Gamasides), Raubmilben. Tierwelt Deutschlands 59, 2nd revised edition: 1-523. | Hughes, A.M. (1976). The mites of stored food and houses. Ministry of Agriculture, Fisheries and Food, Technical Bulletin 9: 400pp. | Krantz, G.W. (1978). A manual of Acarology. Oregon State University Book Stores, Inc., 509 pp. | Deterministic characteristics: | Tectum with rounded denticulate edge; hypostomal grooves with more than 6 denticles; caudal dorsal setae of Z4 not very long; dorsal setae setiform; genital shield normal, not very enlarged and not reaching the anal shield; posterior half of dorsal shield without unpaired setae; legs II and IV with some thick macrosetae; dorsal seta Z5 about two times longer than J5; fixed digit of chelicera with 12-14 teeth and movable digit with 2 teeth; Idiosoma 520-685 μm long. | Hypoaspis miles is also used in biological control and might get confused with H. aculeifer. The main difference is: | H. miles belongs to subgenus Cosmolaelaps and has knife-like dorsal setae while H. aculeifer belongs to subgenus Geolaelaps and has setiform dorsal setae. | Hypoaspis aculeifer, dorsal shield with characteristic setae | Hypoaspis aculeifer | Original drawings by F. Faraji | Hypoaspis miles After Hughes, 1976 | Hypoaspis aculeifer After Hughes, 1976 | Leg IV (female) | Leg II (female) | 100 μm | 100 μm | 100 μm | 100 μm | 100 μm | Appendix 7 | Basic information on the biology of Hypoaspis (Geolaelaps) aculeifer | Hypoaspis aculeifer belongs to the family Lealapidae, order Acari (mites), class Arachnida, tribe Arthropoda. They are living in all kinds of soil and feed on other mites, nematodes, enchytraeids and collembolans (26). In case of food shortage they switch to cannibalism (27). Predatory mites are segmented in idiosoma and gnathosoma. A clear differentiation of the idiosoma in prosoma (head) and opisthosoma (abdomen) is missing. The gnathosoma (head shield) contains the instruments for feeding such as palps and chelicera. The chelicers are trifurcated and tusked with teeth of different shape. Beside ingestion the males are using their chelicers mainly to transfer the spermatophores to the females. A dorsal shield covers nearly completely the idiosoma. A big part of the female idiosoma is occupied by the reproductive organs, which are in particular distinct shortly before egg deposition. Ventrally, two shields can be found, the sternal and the genital shield. All legs are provided with bristles and thorns. The bristles are used to anchor when moving in or on top of the soil. The first pair of legs is used mainly as antenna. The second pair of legs is used not only for moving but also to clinch the prey. The thorns of the fourth pair of legs can serve as protection as well as “moving motor” (28). Males are 0,55 - 0,65 mm long and have a weight of 10 - 15 μg. Females are 0,8 - 0,9 mm long and are weighing 50 - 60 μg (8) (28) (Fig 1). | Figure 1 | Female, male, protonymph and larvae of H. aculeifer. | At 23 °C, the mites become sexually mature after 16 days (females) and 18 days (males), respectively (6). The females carry over the sperms by the solenostom where they will be then transferred to the ovar. In the ovar the sperms mature and will be stored. Fertilisation takes place only after maturation of the sperms in the ovar. The fertilised or unfertilised eggs will be deposited by the females in clumps or separately, preferably in crevices or holes. Copulated females can bear juveniles of both sexes whereas from eggs of uncopulated females only male juveniles are hatching. During development to the adult four phases of development (egg — larvae, larvae — protonymph, protonymph — deutonymph, deutonymph — adult) are passed through. | The egg is milky white, hyaline, elliptical and approximately 0,37 mm long with a solid mantle. According to (8), the larvae are between 0,42 - 0,45 mm in size. They have only three pairs of legs. In the head region palps and chelicers are developed. The chelicers, having some few small denticles, are used to hatch from the egg. After the first moult, 1 - 2 days after hatching, the protonymphs are developed. They are also white, the size is 0,45 - 0,62 mm (8) and they have four pairs of legs. On the chelicers the teeth are completely present. Beginning with that stadium the mites start to forage. For that reason the cuticula of the prey is pierced with the chelicers and a secretion for the extra intestinal digestion is emitted into the prey. The food mash can then be sucked by the mite. The chelicers can also be used to rip bigger particles out of food nuggets (28). After one further moult the deutonymphs are developed. They are 0,60 - 0,80 mm (8) in size and yellow to light brown in colour. Beginning with that phase they can be separated into females and males. After further ecdysis, during which time the animals are inactive and the brown shield is developing (approx. after 14 days) the mites are adult (28) (29) (30).Their life span is between 48 and 100 days at 25 °C (27). | Appendix 8 | Summary and time schedule of the main actions to be taken in order to perform the Hypoaspis test | Time (days) | test start = day 0 | Activity / task | Day – 35 | to – 28 | Transfer females from stock culture to clean vessels to start synchronisation | 2 days later: removal of females | Twice or three times a week: supply with sufficient food | Day – 5 (+/- 2) | Prepare artificial soil | Day – 4 (+/- 2) | Determine WHC of artificial soil | Dry over night | Next day: weigh samples and calculate WHC | Day – 4 (+/– 2) | Pre moisture artificial soil to achieve 20 - 30 % of WHC | Day 0 | Start test: add test chemical to artificial soil | Introduce 10 females to each replicate | Weigh each replicate | Set up abiotic controls for moisture content and pH, 2 replicates for each treatment | Dry moisture controls over night | Next day: weigh moisture controls | Next day: measure pH of dried abiotic controls | Day 3, 6, 9, 12 (approx.) | Supply each replicate with sufficient amount of prey organisms | Weigh each replicate and eventually add evaporated water | Day 14 | Terminate test, set up extraction with all replicates plus extraction efficiency controls | Dry water content controls over night | Next day: weigh water content controls | Next day: measure pH of dried controls | Day 16 | Terminate extraction | Day 16 + | Record number of adults and juveniles in extracted material | Report results on template tables | Report testing procedure in test protocol sheets | C.37. 21-DAY FISH ASSAY: A SHORT-TERM SCREENING FOR OESTROGENIC AND ANDROGENIC ACTIVITY, AND AROMATASE INHIBITION | INTRODUCTION | 1. | This test method is equivalent to OECD test guideline (TG) 230 (2009). The need to develop and validate a fish assay capable of detecting certain endocrine active chemicals originates from the concerns that environmental levels of chemicals may cause adverse effects in both humans and wildlife due to the interaction of these chemicals with the endocrine system. In 1998, the OECD initiated a high-priority activity to revise existing guidelines and to develop new guidelines for the screening and testing of potential endocrine disrupters. One element of the activity was to develop a Test Guideline for the screening of chemicals active on the endocrine system of fish species. The 21-day Fish Endocrine Screening Assay underwent an extensive validation programme consisting of inter-laboratory studies with selected chemicals to demonstrate the relevance and reliability of the assay for the detection of oestrogenic and aromatase inhibiting chemicals (1, 2, 3, 4, 5) in the three fish species investigated (the fathead minnow, the Japanese medaka and the zebrafish); the detection of androgenic activity is possible in the fathead minnow and the medaka, but not in the zebrafish. This test method does not allow the detection of anti-androgenic chemicals. The validation work has been peer-reviewed by a panel of experts nominated by the National Coordinators of the Test Guideline Programme (6). The assay is not designed to identify specific mechanisms of hormonal disruption because the test animals possess an intact hypothalamic-pituitary-gonadal (HPG) axis, which may respond to chemicals that impact on the HPG axis at different levels. The Fish Short Term Reproduction assay (OECD TG 229) includes fecundity and, as appropriate, gonadal histopathology for the fathead minnow, as well as all endpoints included in this test method. OECD TG 229 provides a screening of chemicals which affect reproduction through various mechanisms including endocrine modalities. This should be considered prior to selecting the most appropriate test method. | 2. | This test method describes an in vivo screening assay where sexually mature male and spawning female fish are held together and exposed to a chemical during a limited part of their life-cycle (21 days). At termination of the 21-day exposure period, depending on the species used, one or two biomarker endpoint(s) are measured in males and females as indicators of oestrogenic, aromatase inhibition or androgenic activity of the test chemical; these endpoints are vitellogenin and secondary sexual characteristics. Vitellogenin is measured in fathead minnow, Japanese medaka and zebrafish, whereas secondary sex characteristics are measured in fathead minnow and Japanese medaka only. | 3. | This bioassay serves as an in vivo screening assay for certain endocrine modes of action and its application should be seen in the context of the “OECD Conceptual Framework for the Testing and Assessment of Endocrine Disrupting Chemicals” (28). | INITIAL CONSIDERATIONS AND LIMITATIONS | 4. | Vitellogenin is normally produced by the liver of female oviparous vertebrates in response to circulating endogenous oestrogen. It is a precursor of egg yolk proteins and, once produced in the liver, travels in the bloodstream to the ovary, where it is taken up and modified by developing eggs. Vitellogenin is almost undetectable in the plasma of immature female and male fish because they lack sufficient circulating oestrogen; however, the liver is capable of synthesizing and secreting vitellogenin in response to exogenous oestrogen stimulation. | 5. | The measurement of vitellogenin serves for the detection of chemicals with various oestrogenic modes of action. The detection of oestrogenic chemicals is possible via the measurement of vitellogenin induction in male fish, and it has been abundantly documented in the scientific peer-reviewed literature (e.g. (7)). Vitellogenin induction has also been demonstrated following exposure to aromatizable androgens (8, 9). A reduction in the circulating level of oestrogen in females, for instance through the inhibition of the aromatase converting the endogenous androgen to the natural oestrogen 17β-estradiol, causes a decrease in the vitellogenin level, which is used to detect chemicals having aromatase inhibiting properties (10, 11). The biological relevance of the vitellogenin response following oestrogenic/aromatase inhibition is established and has been broadly documented. However, it is possible that production of VTG in females can also be affected by general toxicity and non-endocrine toxic modes of action, e.g. hepatotoxicity. | 6. | Several measurement methods have been successfully developed and standardised for routine use. This is the case of species-specific Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) methods using immunochemistry for the quantification of vitellogenin produced in small blood or liver samples collected from individual fish (12, 13, 14, 15, 16, 17, 18). Fathead minnow blood, zebrafish blood or head/tail homogenate, and medaka liver are sampled for VTG measurement. In medaka, there is a good correlation between VTG measured from blood and from liver (19). Appendix 6 provides the recommended procedures for sample collection for vitellogenin analysis. Kits for the measurement of vitellogenin are widely available; such kits should be based on a validated species-specific ELISA method. | 7. | Secondary sex characteristics in male fish of certain species are externally visible, quantifiable and responsive to circulating levels of endogenous androgens; this is the case for the fathead minnow and the medaka — but not for zebrafish, which does not possess quantifiable secondary sex characteristics. Females maintain the capacity to develop male secondary sex characteristics, when they are exposed to androgenic chemicals in water. Several studies are available in the scientific literature to document this type of response in fathead minnow (20) and medaka (21). A decrease in secondary sex characteristics in males should be interpreted with caution because of low statistical power, and should be based on expert judgement and weight of evidence. There are limitations to the use of zebrafish in this assay, due to the absence of quantifiable secondary sex characteristics responsive to androgenic acting chemicals. | 8. | In the fathead minnow, the main indicator of exogenous androgenic exposure is the number of nuptial tubercles located on the snout of the female fish. In the medaka, the number of papillary processes constitutes the main marker of exogenous exposure to androgenic chemicals in female fish. Appendix 5A and Appendix 5B indicate the recommended procedures to follow for the evaluation of sex characteristics in fathead minnow and in medaka, respectively. | 9. | Definitions used in this test method are given in Appendix 1. | PRINCIPLE OF THE TEST | 10. | In the assay, male and female fish in a reproductive status are exposed together in test vessels. Their adult and reproductive status enables a clear differentiation of each sex, and thus a sex-related analysis of each endpoint, and ensures their sensitivity towards exogenous chemicals. At test termination, sex is confirmed by macroscopic examination of the gonads following ventral opening of the abdomen with scissors. An overview of the relevant bioassay conditions is provided in Appendix 2. The assay is normally initiated with fish sampled from a population that is in spawning condition; senescent animals should not be used. Guidance on the age of fish and on the reproductive status is provided in the section on Selection of fish. The assay is conducted using three chemical exposure concentrations as well as a water control, and a solvent control if necessary. Two vessels or replicates per treatment are used (each vessel containing 5 males and 5 females) in medaka and zebrafish, whereas four vessels or replicates per treatment are used (each vessel containing 2 males and 4 females) in fathead minnow. This is to accommodate the territorial behaviour of male fathead minnow while maintaining sufficient power of the assay. The exposure is conducted for 21 days and sampling of fish is performed at day 21 of exposure. | 11. | On sampling at day 21, all animals are killed humanely. Secondary sex characteristics are measured in fathead minnow and medaka (see Appendix 5A and Appendix 5B); blood samples are collected for determination of vitellogenin in zebrafish and fathead minnow, alternatively head/tail can be collected for the determination of vitellogenin in zebrafish (Appendix 6); liver is collected for VTG analysis in medaka (Appendix 6). | TEST ACCEPTANCE CRITERIA | 12. | For the test results to be acceptable the following conditions apply: | — | the mortality in the water (or solvent) controls should not exceed 10 % at the end of the exposure period; | — | the dissolved oxygen concentration should be at least 60 % of the air saturation value (ASV) throughout the exposure period; | — | the water temperature should not differ by more than ± 1,5 °C between test vessels at any one time during the exposure period and be maintained within a range of 2 °C within the temperature ranges specified for the test species (Appendix 2); | — | evidence should be available to demonstrate that the concentrations of the test chemical in solution have been satisfactorily maintained within ± 20 % of the mean measured values. | DESCRIPTION OF THE METHOD | Apparatus | 13. | Normal laboratory equipment and especially the following: | (a) | oxygen and pH meters; | (b) | equipment for determination of water hardness and alkalinity; | (c) | adequate apparatus for temperature control and preferably continuous monitoring; | (d) | tanks made of chemically inert material and of a suitable capacity in relation to the recommended loading and stocking density (see Appendix 2); | (e) | spawning substrate for fathead minnow and zebrafish, Appendix 4 gives the necessary details; | (f) | suitably accurate balance (i.e. accurate to ± 0,5 mg). | Water | 14. | Any water in which the test species shows suitable long-term survival and growth may be used as test water. It should be of constant quality during the period of the test. The pH of the water should be within the range 6,5 to 8,5, but during a given test it should be within a range of ± 0,5 pH units. In order to ensure that the dilution water will not unduly influence the test result (for example by complexion of test chemical), samples should be taken at intervals for analysis. Measurements of heavy metals (e.g. Cu, Pb, Zn, Hg, Cd, and Ni), major anions and cations (e.g. Ca2+, Mg2+, Na+, K+, Cl-, and SO4 2-), pesticides (e.g. total organophosphorus and total organochlorine pesticides), total organic carbon and suspended solids should be made, for example, every three months where dilution water is known to be relatively constant in quality. If water quality has been demonstrated to be constant over at least one year, determinations can be less frequent and intervals extended (e.g. every six months). Some chemical characteristics of acceptable dilution water are listed in Appendix 3. | Test solutions | 15. | Test solutions of the chosen concentrations are prepared by dilution of a stock solution. The stock solution should preferably be prepared by simply mixing or agitating the test chemical in dilution water by using mechanical means (e.g. stirring or ultrasonication). Saturation columns (solubility columns) can be used for achieving a suitable concentrated stock solution. The use of a solvent carrier is not recommended. However, in case a solvent is necessary, a solvent control should be run in parallel, at the same solvent concentration as the chemical treatments. For difficult test chemicals, a solvent may be technically the best solution; the OECD Guidance Document on aquatic toxicity testing of difficult substances and mixtures should be consulted (22). The choice of solvent will be determined by the chemical properties of the chemical. The OECD Guidance Document recommends a maximum of 100 μl/l, which should be observed. However a recent review (23) highlighted additional concerns when using solvents for endocrine activity testing. Therefore it is recommended that the solvent concentration, if necessary, is minimised wherever technically feasible (dependent on the physical-chemical properties of the test chemical). | 16. | A flow-through test system will be used. Such a system continually dispenses and dilutes a stock solution of the test chemical (e.g. metering pump, proportional diluter, saturator system) in order to deliver a series of concentrations to the test chambers. The flow rates of stock solutions and dilution water should be checked at intervals, preferably daily, during the test and should not vary by more than 10 % throughout the test. Care should be taken to avoid the use of low-grade plastic tubing or other materials that may contain biologically active chemicals. When selecting the material for the flow-through system, possible adsorption of the test chemical to this material should be considered. | Holding of fish | 17. | Test fish should be selected from a laboratory population, preferably from a single stock, which has been acclimated for at least two weeks prior to the test under conditions of water quality and illumination similar to those used in the test. It is important that the loading rate and stocking density (for definitions, see Appendix 1) be appropriate for the test species used (see Appendix 2). | 18. | Following a 48-hour settling-in period, mortalities are recorded and the following criteria applied: | — | mortalities of greater than 10 % of population in seven days: reject the entire batch; | — | mortalities of between 5 % and 10 % of population: acclimation for seven additional days; if more than 5 % mortality during second seven days, reject the entire batch; | — | mortalities of less than 5 % of population in seven days: accept the batch | 19. | Fish should not receive treatment for disease during the acclimation period, in the pre-exposure period, or during the exposure period. | Pre-exposure and selection of fish | 20. | A one-week pre-exposure period is recommended, with animals placed in vessels similar to the actual test. Fish should be fed ad libitum throughout the holding period and during the exposure phase. The exposure phase is started with sexually dimorphic adult fish from a laboratory supply of reproductively mature animals (e.g. with clear secondary sexual characteristics visible as far as fathead minnow and medaka are concerned), and actively spawning. For general guidance only (and not to be considered in isolation from observing the actual reproductive status of a given batch of fish), fathead minnows should be approximately 20 (± 2) weeks of age, assuming they have been cultured at 25 ± 2 °C throughout their lifespan. Japanese medaka should be approximately 16 (± 2) weeks of age, assuming they have been cultured at 25 ± 2 °C throughout their lifespan. Zebrafish should be approximately 16 (± 2) weeks of age, assuming they have been cultured at 26 ± 2 °C throughout their lifespan. | TEST DESIGN | 21. | Three concentrations of the test chemical, one control (water) and, if needed, one solvent control are used. The data may be analysed in order to determine statistically significant differences between treatment and control responses. These analyses will inform whether further longer term testing for adverse effects (namely, survival, development, growth and reproduction) is required for the chemical, rather than for use in risk assessment (24). | 22. | For zebrafish and medaka, on day 21 of the experiment, males and females from each treatment level (5 males and 5 females in each of the two replicates) and from the control(s) are sampled for the measurement of vitellogenin and secondary sex characteristics, where applicable. For fathead minnow, on day 21 of exposure, males and females (2 males and 4 females in each of the four replicates) and from the control(s) are sampled for the measurement of vitellogenin and secondary sex characteristics. | Selection of test concentrations | 23. | For the purposes of this test, the highest test concentration should be set by the maximum tolerated concentration (MTC) determined from a range finder or from other toxicity data, or 10 mg/l, or the maximum solubility in water, whichever is lowest. The MTC is defined as the highest test concentration of the chemical which results in less than 10 % mortality. Using this approach assumes that there are existing empirical acute toxicity data or other toxicity data from which the MTC can be estimated. Estimating the MTC can be inexact and typically requires some professional judgment. | 24. | Three test concentrations, spaced by a constant factor not exceeding 10, and a dilution-water control (and solvent control if necessary) are required. A range of spacing factors between 3,2 and 10 is recommended. | PROCEDURE | Selection and weighing of test fish | 25. | It is important to minimise variation in weight of the fish at the beginning of the assay. Suitable size ranges for the different species recommended for use in this test are given in Appendix 2. For the whole batch of fish used in the test, the range in individual weights for male and female fish at the start of the test should be kept, if possible, within ± 20 % of the arithmetic mean weight of the same sex. It is recommended to weigh a subsample of the fish stock before the test in order to estimate the mean weight. | Conditions of exposure | Duration | 26. | The test duration is 21 days, following a pre-exposure period. The recommended pre-exposure period is one week. | Feeding | 27. | Fish should be fed ad libitum with an appropriate food (Appendix 2) at a sufficient rate to maintain body condition. Care should be taken to avoid microbial growth and water turbidity. As a general guidance, the daily ration may be divided into two or three equal portions for multiple feeds per day, separated by at least three hours between each feed. A single larger ration is acceptable particularly for weekends. Food should be withheld from the fish for 12 hours prior to sampling/necropsy. | 28. | Fish food should be evaluated for the presence of contaminants such as organochlorine pesticides, polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs), polychlorinated biphenyls (PCBs). Food with an elevated level of phytoestrogens that would compromise the response of the assay to known oestrogen agonist (e.g. 17-beta estradiol) should be avoided. | 29. | Uneaten food and faecal material should be removed from the test vessels at least twice weekly, e.g. by carefully cleaning the bottom of each tank using a siphon. | Light and temperature | 30. | The photoperiod and water temperature should be appropriate for the test species (see Appendix 2). | Frequency of analytical determinations and measurements | 31. | Prior to initiation of the exposure period, proper function of the chemical delivery system should be ensured. All analytical methods needed should be established, including sufficient knowledge on the chemical stability in the test system. During the test, the concentrations of the test chemical are determined at regular intervals, as follows: the flow rates of diluent and toxicant stock solution should be checked preferably daily but as a minimum twice per week, and should not vary by more than 10 % throughout the test. It is recommended that the actual test chemical concentrations be measured in all vessels at the start of the test and at weekly intervals thereafter. | 32. | It is recommended that results be based on measured concentrations. However, if concentration of the test chemical in solution has been satisfactorily maintained within ± 20 % of the nominal concentration throughout the test, then the results can either be based on nominal or measured values. | 33. | Samples may need to be filtered (e.g., using a 0,45 μm pore size) or centrifuged. If needed, then centrifugation is the recommended procedure. However, if the test material does not adsorb to filters, filtration may also be acceptable. | 34. | During the test, dissolved oxygen, temperature, and pH should be measured in all test vessels at least once per week. Total hardness and alkalinity should be measured in the controls and one vessel at the highest concentration at least once per week. Temperature should preferably be monitored continuously in at least one test vessel. | Observations | 35. | A number of general (e.g. survival) and core biological responses (e.g. vitellogenin levels) are assessed over the course of the assay or at termination of the assay. Measurement and evaluation of these endpoints and their utility are described below. | Survival | 36. | Fish should be examined daily during the test period and any mortality should be recorded and the dead fish removed as soon as possible. Dead fish should not be replaced in either the control or treatment vessels. Sex of fish that die during the test should be determined by macroscopic evaluation of the gonads. | Behaviour and appearance | 37. | Any abnormal behaviour (relative to controls) should be noted; this might include signs of general toxicity including hyperventilation, uncoordinated swimming, loss of equilibrium, and atypical quiescence or feeding. Additionally external abnormalities (such as haemorrhage, discoloration) should be noted. Such signs of toxicity should be considered carefully during data interpretation since they may indicate concentrations at which biomarkers of endocrine activity are not reliable. Such behavioural observations may also provide useful qualitative information to inform potential future fish testing requirements. For example, territorial aggressiveness in normal males or masculinised females has been observed in fathead minnows under androgenic exposure; in zebrafish, the characteristic mating and spawning behaviour after the dawn onset of light is reduced or hindered by oestrogenic or anti-androgenic exposure. | 38. | Because some aspects of appearance (primarily colour) can change quickly with handling, it is important that qualitative observations be made prior to removal of animals from the test system. Experience to date with fathead minnows suggests that some endocrine active chemicals may initially induce changes in the following external characteristics: body colour (light or dark), coloration patterns (presence of vertical bands), and body shape (head and pectoral region). Therefore observations of physical appearance of the fish should be made over the course of the test, and at conclusion of the study | Humane killing of fish | 39. | At day 21, i.e. at termination of the exposure, the fish should be euthanized with appropriate amounts of Tricaine (Tricaine methane sulfonate, Metacain, MS-222 (CAS 886-86-2), 100-500 mg/l buffered with 300 mg/l NaHCO3 (sodium bicarbonate, CAS 144-55-8) to reduce mucous membrane irritation; blood or tissue is then sampled for vitellogenin determination, as explained in the Vitellogenin section. | Observation of secondary sex characteristics | 40. | Some endocrine active chemicals may induce changes in specialised secondary sex characteristics (number of nuptial tubercles in male fathead minnow, papillary processes in male medaka). Notably, chemicals with certain modes of action may cause abnormal occurrence of secondary sex characteristic in animals of the opposite sex; for example, androgen receptor agonists, such as trenbolone, methyltestosterone and dihydrotestosterone, can cause female fathead minnows to develop pronounced nuptial tubercles or female medaka to develop papillary processes (11, 20, 21). It also has been reported that oestrogen receptor agonists can decrease nuptial tubercle numbers and size of the dorsal nape pad in adult males (25, 26). Such gross morphological observations may provide useful qualitative and quantitative information to inform potential future fish testing requirements. The number and size of nuptial tubercles in fathead minnow and papillary processes in medaka can be quantified directly or more practically in preserved specimens. Recommended procedures for the evaluation of secondary sex characteristics in fathead minnow and medaka are available from Appendix 5A and Appendix 5B, respectively. | Vitellogenin (VTG) | 41. | Blood is collected from the caudal artery/vein with a heparinised microhematocrit capillary tubule, or alternatively by cardiac puncture with a syringe. Depending upon the size of the fish, collectable blood volumes generally range from 5 to 60 μl per individual for fathead minnows and 5-15 μl per individual for zebrafish. Plasma is separated from the blood via centrifugation, and stored with protease inhibitors at – 80 °C, until analysed for vitellogenin. Alternatively, in medaka the liver will be used, and in zebrafish the head/tail homogenate can be used as tissue-source for vitellogenin determination (Appendix 6). The measurement of VTG should be based upon a validated homologous ELISA method, using homologous VTG standard and homologous antibodies. It is recommended to use a method capable to detect VTG levels as low as few ng/ml plasma (or ng/mg tissue), which is the background level in unexposed male fish. | 42. | Quality control of vitellogenin analysis will be accomplished through the use of standards, blanks and at least duplicate analyses. For each ELISA method, a test for matrix effect (effect of sample dilution) should be run to determine the minimum sample dilution factor. Each ELISA plate used for VTG assays should include the following quality control samples: at least 6 calibration standards covering the range of expected vitellogenin concentrations, and at least one non-specific binding assay blank (analysed in duplicate). Absorbance of these blanks should be less than 5 % of the maximum calibration standard absorbance. At least two aliquots (well-duplicates) of each sample dilution will be analysed. Well-duplicates that differ by more than 20 % should be re-analysed. | 43. | The correlation coefficient (R2) for calibration curves should be greater than 0,99. However, a high correlation is not sufficient to guarantee adequate prediction of concentration in all ranges. In addition to having a sufficiently high correlation for the calibration curve, the concentration of each standard, as calculated from the calibration curve, should all fall between 70 and 120 % of its nominal concentration. If the nominal concentrations trend away from the calibration regression line (e.g. at lower concentrations), it may be necessary to split the calibration curve into low and high ranges or to use a nonlinear model to adequately fit the absorbance data. If the curve is split, both line segments should have R2 > 0,99. | 44. | The limit of detection (LOD) is defined as the concentration of the lowest analytical standard, and limit of quantitation (LOQ) is defined as the concentration of the lowest analytical standard multiplied by the lowest dilution factor. | 45. | On each day that vitellogenin assays are performed, a fortification sample made using an inter-assay reference standard will be analysed (Appendix 7). The ratio of the expected concentration to the measured concentration will be reported along with the results from each set of assays performed on that day. | DATA AND REPORTING | Evaluation of Biomarker Responses by Analysis of Variance (ANOVA) | 46. | To identify potential endocrine activity of a chemical, responses are compared between treatments and control groups using analysis of variance (ANOVA). Where a solvent control is used, an appropriate statistical test should be performed between the dilution water and solvent controls for each endpoint. Guidance on how to handle dilution water and solvent control data in the subsequent statistical analysis can be found in OECD, 2006c (27). All biological response data should be analysed and reported separately by sex. If the required assumptions for parametric methods are not met — non-normal distribution (e.g. Shapiro-Wilk's test) or heterogeneous variance (Bartlett's test or Levene's test), consideration should be given to transforming the data to homogenise variances prior to performing the ANOVA, or to carrying out a weighted ANOVA. Dunnett's test (parametric) on multiple pair-wise comparisons or a Mann-Whitney with Bonferroni adjustment (non-parametric) may be used for non-monotonous dose-response. Other statistical tests may be used (e.g. Jonckheere-Terpstra test or Williams test) if the dose-response is approximately monotone. A statistical flowchart is provided in Appendix 8 to help in the decision on the most appropriate statistical test to be used. Additional information can also be obtained from the OECD Document on Current Approaches to Statistical Analysis of Ecotoxicity Data (27). | Reporting of test results | 47. | Study data should include: | | Testing facility: | — | Responsible personnel and their study responsibilities | — | Each laboratory should have demonstrated proficiency using a range of representative chemicals | | Test chemical: | — | Characterisation of test chemical | — | Physical nature and relevant physicochemical properties | — | Method and frequency of preparation of test concentrations | — | Information on stability and biodegradability | | Solvent: | — | Characterization of solvent (nature, concentration used) | — | Justification of choice of solvent (if other than water) | | Test animals: | — | Species and strain | — | Supplier and specific supplier facility | — | Age of the fish at the start of the test and reproductive/spawning status | — | Details of animal acclimation procedure | — | Body weight of the fish at the start of the exposure (from a sub-sample of the fish stock) | | Test Conditions: | — | Test procedure used (test-type, loading rate, stocking density, etc.); | — | Method of preparation of stock solutions and flow-rate; | — | The nominal test concentrations, weekly measured concentrations of the test solutions and analytical method used, means of the measured values and standard deviations in the test vessels and evidence that the measurements refer to the concentrations of the test chemical in true solution; | — | Dilution water characteristics (including pH, hardness, alkalinity, temperature, dissolved oxygen concentration, residual chlorine levels, total organic carbon, suspended solids and any other measurements made) | — | Water quality within test vessels: pH, hardness, temperature and dissolved oxygen concentration; | — | Detailed information on feeding (e.g. type of food(s), source, amount given and frequency and analyses for relevant contaminants if available (e.g. PCBs, PAHs and organochlorine pesticides). | | Results | — | Evidence that the controls met the acceptance criteria of the test; | — | Data on mortalities occurring in any of the test concentrations and control; | — | Statistical analytical techniques used, treatment of data and justification of techniques used; | — | Data on biological observations of gross morphology, including secondary sex characteristics and vitellogenin; | — | Results of the data analyses preferably in tabular and graphical form; | — | Incidence of any unusual reactions by the fish and any visible effects produced by the test chemical | GUIDANCE FOR THE INTERPRETATION AND ACCEPTANCE OF THE TEST RESULTS | 48. | This section contains a few considerations to be taken into account in the interpretation of test results for the various endpoints measured. The results should be interpreted with caution where the test chemical appears to cause overt toxicity or to impact on the general condition of the test animal. | 49. | In setting the range of test concentrations, care should be taken not to exceed the maximum tolerated concentration to allow a meaningful interpretation of the data. It is important to have at least one treatment where there are no signs of toxic effects. Signs of disease and signs of toxic effects should be thoroughly assessed and reported. For example, it is possible that production of VTG in females can also be affected by general toxicity and non-endocrine toxic modes of action, e.g. hepatotoxicity. However, interpretation of effects may be strengthened by other treatment levels that are not confounded by systemic toxicity. | 50. | There are a few aspects to consider for the acceptance of test results. As a guide, the VTG levels in control groups of males and females should be distinct and separated by about three orders of magnitude in fathead minnow and zebrafish, and about one order of magnitude for medaka. Examples of the range of values encountered in control and treatment groups are available in the validation reports (1, 2, 3, 4). High VTG values in control males could compromise the responsiveness of the assay and its ability to detect weak oestrogen agonists. Low VTG values in control females could compromise the responsiveness of the assay and its ability to detect aromatase inhibitors and oestrogen antagonists. The validation studies were used to build that guidance. | 51. | If a laboratory has not performed the assay before or substantial changes (e.g. change of fish strain or supplier) have been made it is advisable that a technical proficiency study is conducted. It is recommended that chemicals covering a range of modes of action or impacts on a number of the test endpoints are used. In practice, each laboratory is encouraged to build its own historical control data for males and females and to perform a positive control chemical for estrogenic activity (e.g. 17β-estradiol at 100 ng/l, or a known weak agonist) resulting in increased VTG in male fish, a positive control chemical for aromatase inhibition (e.g. fadrozole or prochloraz at 300 μg/l) resulting in decreased VTG in female fish, and a positive control chemical for androgenic activity (e.g. 17β-trenbolone at 5 μg/l) resulting in induction of secondary sex characteristics in female fathead minnow and medaka. All these data can be compared to available data from the validation studies (1, 2, 3) to ensure laboratory proficiency. | 52. | In general, vitellogenin measurements should be considered positive if there is a statistically significant increase in VTG in males (p < 0,05), or a statistically significant decrease in females (p < 0,05) at least at the highest dose tested compared to the control group, and in the absence of signs of general toxicity. A positive result is further supported by the demonstration of a biologically plausible relationship between the dose and the response curve. As mentioned earlier, the vitellogenin decrease may not entirely be of endocrine origin; however a positive result should generally be interpreted as evidence of endocrine activity in vivo, and should normally initiate actions for further clarification. | LITERATURE | (1) | OECD (2006a). Report of the Initial Work Towards the Validation of the 21-Day Fish Screening Assay for the Detection of Endocrine active Substances (Phase 1A). OECD Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No.60, ENV/JM/MONO(2006)27. | (2) | OECD (2006b). Report of the Initial Work Towards the Validation of the 21-Day Fish Screening Assay for the Detection of Endocrine active Substances (Phase 1B). OECD Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No.61, ENV/JM/MONO(2006)29. | (3) | OECD (2007). Final report of the Validation of the 21-day Fish Screening Assay for the Detection of Endocrine Active Substances. Phase 2: Testing Negative Substances. OECD Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No.78, ENV/JM/MONO(2007)25. | (4) | Owens JW (2007). Phase 3 report of the validation of the OECD Fish Screening Assay. CEFIC LRI Project, Endocrine. http://www.cefic-lri.org/index.php?page=projects (accessed 18/09/08). | (5) | US EPA 2007. Validation of the Fish Short-Term Reproduction Assay: Integrated Summary Report. Unpublished report dated 15 December 2007. US Environmental Protection Agency, Washington, DC. 104 pp. | (6) | OECD, 2008. Report of the Validation Peer Review for the 21-Day Fish Endocrine Screening Assay and Agreement of the Working Group of the National Coordinators of the Test Guidelines Programme on the Follow-up of this Report. OECD Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No.94, ENV/JM/MONO(2008)21. | (7) | Sumpter and Jobling (1995). Vitellogenesis as a biomarker for estrogenic contamination of the aquatic environment. Environmental Health Perspectives;103 Suppl 7:173-8 Review. | (8) | Pawlowski S, Sauer A, Shears JA, Tyler CR, Braunbeck T (2004). Androgenic and estrogenic effects of the synthetic androgen 17alpha-methyltestosterone on sexual development and reproductive performance in the fathead minnow (Pimephales promelas) determined using the gonadal recrudescence assay. Aquatic Toxicology; 68(3):277-91. | (9) | Andersen L, Goto-Kazato R, Trant JM, Nash JP, Korsgaard B, Bjerregaard P (2006). Short-term exposure to low concentrations of the synthetic androgen methyltestosterone affects vitellogenin and steroid levels in adult male zebrafish (Danio rerio). Aquatic Toxicology; 76(3-4):343-52. | (10) | Ankley GT, Kahl MD, Jensen KM, Hornung MW, Korte JJ, Makynen EA, Leino RL (2002). Evaluation of the aromatase inhibitor fadrozole in a short-term reproduction assay with the fathead minnow (Pimephales promelas). Toxicological Sciences;67(1):121-30. | (11) | Panter GH, Hutchinson TH, Hurd KS, Sherren A, Stanley RD, Tyler CR (2004). Successful detection of (anti-)androgenic and aromatase inhibitors in pre-spawning adult fathead minnows (Pimephales promelas) using easily measured endpoints of sexual development. Aquatic Toxicology; 70(1):11-21. | (12) | Parks LG, Cheek AO, Denslow ND, Heppell SA, McLachlan JA, LeBlanc GA, Sullivan CV (1999). Fathead minnow (Pimephales promelas) vitellogenin: purification, characterization and quantitative immunoassay for the detection of estrogenic compounds. Comparative Biochemistry and Physiology. Part C Pharmacology, toxicology and endocrinology; 123(2):113-25. | (13) | Panter GH, Tyler CR, Maddix S, Campbell PM, Hutchinson TH, Länge R, Lye C, Sumpter JP, 1999. Application of an ELISA to quantify vitellogenin concentrations in fathead minnows (Pimephales promelas) exposed to endocrine disrupting chemicals. CEFIC-EMSG research report reference AQ001. CEFIC, Brussels, Belgium. | (14) | Fenske M., van Aerle, R.B., Brack, S.C., Tyler, C.R., Segner, H., (2001). Development and validation of a homologous zebrafish (Danio rerio Hamilton- Buchanan) vitellogenin enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and its application for studies on estrogenic chemicals. Comp. Biochem. Phys. C 129 (3): 217-232. | (15) | Holbech H, Andersen L, Petersen GI, Korsgaard B, Pedersen KL, Bjerregaard P. (2001). Development of an ELISA for vitellogenin in whole body homogenate of zebrafish (Danio rerio). Comparative Biochemistry and Physiology. Part C Pharmacology, toxicology and endocrinology; 130: 119-131 | (16) | Rose J, Holbech H, Lindholst C, Noerum U, Povlsen A, Korsgaard B, Bjerregaard P. 2002. Vitellogenin induction by 17β-estradiol and 17β-ethinylestradiol in male zebrafish (Danio rerio). Comp. Biochem. Physiol. C. 131: 531-539. | (17) | Brion F, Nilsen BM, Eidem JK, Goksoyr A, Porcher JM, Development and validation of an enzyme-linked immunosorbent assay to measure vitellogenin in the zebrafish (Danio rerio). Environmental Toxicology and Chemistry; vol 21: 1699-1708. | (18) | Yokota H, Morita H, Nakano N, Kang IJ, Tadokoro H, Oshima Y, Honjo T, Kobayashi K. 2001. Development of an ELISA for determination of the hepatic vitellogenin in Medaka (Oryzias latipes). Jpn J Environ Toxicol 4:87–98. | (19) | Tatarazako N, Koshio M, Hori H, Morita M and Iguchi T., 2004. Validation of an enzyme-linked immunosorbent assay method for vitellogenin in the Medaka. Journal of Health Science 50:301-308. | (20) | Ankley GT, Jensen KM, Makynen EA, Kahl MD, Korte JJ, Homung MW, Henry TR, Denny JS, Leino RL, Wilson VS, Cardon MC, Hartig PC, Gray LE (2003). Effects of the androgenic growth promoter 17-beta-trenbolone on fecundity and reproductive endocrinology of the fathead minnow. Environmental Toxicology and Chemistry; 22(6): 1350-60. | (21) | Seki M, Yokota H, Matsubara H, Maeda M, Tadokoro H, Kobayashi K (2004). Fish full life-cycle testing for androgen methyltestosterone on medaka (Oryzias latipes). Environmental Toxicology and Chemistry; 23(3):774-81. | (22) | OECD (2000) Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment. No. 23. Paris | (23) | Hutchinson TH, Shillabeer N, Winter MJ, Pickford DB, 2006a. Acute and chronic effects of carrier solvents in aquatic organisms: A critical review. Review. Aquatic Toxicology, 76; pp.69–92. | (24) | Hutchinson TH, Ankley GT, Segner H, Tyler CR, 2006b. Screening and testing for endocrine disruption in fish-biomarkers as “signposts”, not “traffic lights”, in risk assessment. Environmental Health Perspectives;114 Suppl 1:106-14. | (25) | Miles-Richardson, SR, Kramer VJ, Fitzgerald SD, Render JA, Yamini B, Barbee SJ, Giesy JP. 1999. Effects of waterborne exposure to 17β-estradiol on secondary sex characteristics and gonads of the fathead minnow (Pimephales promelas). Aquat. Toxicol. 47, 129-145. | (26) | Martinovic, D., L.S. Blake, E.J. Durhan, K.J. Greene, M.D. Kahl, K.M., Jensen, E.A. Makynen, D.L. Villeneuve and G.T. Ankley. 2008. Characterization of reproductive toxicity of vinclozolin in the fathead minnow and co-treatment with an androgen to confirm an anti-androgenic mode of action. Environ. Toxicol. Chem. 27, 478-488. | (27) | OECD (2006c). Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application. OECD environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No.54. ENV/JM/MONO(2006)18 | (28) | OECD (2012) OECD Conceptual Framework for Testing and Assessment of Endocrine Disrupters (revised). Annex I to Draft Guidance Document on Standardised Test Guidelines for Evaluating Chemicals for Endocrine Disruption. Series on Testing and Assessment No 150. ENV/JM/MONO(2012)22 | Appendix 1 | Abbreviations & definitions | Chemical : A substance or a mixture | CV : Coefficient of variation. | ELISA : Enzyme-Linked Immunosorbent Assay. | Loading rate : Wet weight of fish per volume of water. | Stocking density : Number of fish per volume of water. | VTG (Vitellogenin) : Phospholipoglycoprotein precursor to egg yolk protein that normally occurs in sexually active females of all oviparous species. | HPG axis : Hypothalamic-pituitary-gonadal axis. | MTC : Maximum Tolerated Concentration, representing about 10 % of the LC50. | Test chemical : Any substance or mixture tested using this test method. | Appendix 2 | Experimental conditions for the fish endocrine screening assay | 1. | Recommended species | Fathead minnow | (Pimephales promelas) | Medaka | (Oryzias latipes) | Zebrafish | (Danio rerio) | 2. | Test type | Flow-through | Flow-through | Flow-through | 3. | Water temperature | 25 ± 2 °C | 25 ± 2 °C | 26 ± 2 °C | 4. | Illumination quality | Fluorescent bulbs (wide spectrum) | Fluorescent bulbs (wide spectrum) | Fluorescent bulbs (wide spectrum) | 5. | Light intensity | 10-20 μE/m2/s, 540-1 000 lux, or 50-100 ft-c (ambient laboratory levels) | 10-20 μE/m2/s, 540-1 000 lux, or 50-100 ft-c (ambient laboratory levels) | 10-20 μE/m2/s, 540-1 000 lux, or 50-100 ft-c (ambient laboratory levels) | 6. | Photoperiod (dawn/dusk transitions are optional, however not considered necessary) | 16 h light, 8 h dark | 12-16 h light, 12-8 h dark | 12-16 h light, 12-8 h dark | 7. | Loading rate | < 5 g per l | < 5 g per l | < 5 g per l | 8. | Test chamber size | 10 l (minimum) | 2 l (minimum) | 5 l (minimum) | 9. | Test solution volume | 8 l (minimum) | 1.5 l (minimum) | 4 l (minimum) | 10. | Volume exchanges of test solutions | Minimum of 6 daily | Minimum of 5 daily | Minimum of 5 daily | 11. | Age of test organisms | See paragraph 20 | See paragraph 20 | See paragraph 20 | 12. | Approximate wet weight of adult fish (g) | Females: 1,5 ± 20 % | Males: 2,5 ± 20 % | Females: 0,35 ± 20 % | Males: 0,35 ± 20 % | Females: 0,65 ± 20 % | Males: 0,4 ± 20 % | 13. | No. of fish per test vessel | 6 (2 males and 4 females) | 10 (5 males and 5 females) | 10 (5 males and 5 females) | 14. | No. of treatments | = 3 (plus appropriate controls) | = 3 (plus appropriate controls) | = 3 (plus appropriate controls) | 15. | No. vessels per treatment | 4 minimum | 2 minimum | 2 minimum | 16. | No. of fish per test concentration | 16 adult females and 8 males (4 females and 2 males in each replicate vessel) | 10 adult females and 10 males (5 females and 5 males in each replicate vessel) | 10 adult females and 10 males (5 females and 5 males in each replicate vessel) | 17. | Feeding regime | Live or frozen adult or nauplii brine shrimp two or three times daily (ad libitum), commercially available food or a combination of the above | Brine shrimp nauplii two or three times daily (ad libitum), commercially available food or a combination of the above | Brine shrimp nauplii two or three times daily (ad libitum), commercially available food or a combination of the above | 18. | Aeration | None unless DO concentration falls below 60 % air saturation | None unless DO concentration falls below 60 % air saturation | None unless DO concentration falls below 60 % air saturation | 19. | Dilution water | Clean surface, well or reconstituted water or dechlorinated tap water | Clean surface, well or reconstituted water or dechlorinated tap water | Clean surface, well or reconstituted water or dechlorinated tap water | 20. | Pre-exposure period | 7 days recommended | 7 days recommended | 7 days recommended | 21. | Chemical exposure duration | 21 d | 21 d | 21 d | 22. | Biological endpoints | survival | behaviour | 2y sex characteristics | VTG | survival | behaviour | 2y sex characteristics | VTG | survival | behaviour | VTG | 23. | Test acceptability | Dissolved oxygen > 60 % of saturation; mean temperature of 25 ± 2 °C; 90 % survival of fish in the controls; measured test concentrations within 20 % of mean measured values per treatment level. | Dissolved oxygen > 60 % of saturation; mean temperature of 24 ± 2 °C; 90 % survival of fish in the controls; measured test concentrations within 20 % of mean measured values per treatment level. | Dissolved oxygen > 60 % of saturation; mean temperature of 26 ± 2 °C; 90 % survival of fish in the controls; measured test concentrations within 20 % of mean measured values per treatment level. | Appendix 3 | Some chemical characteristics of acceptable dilution water | Component | Concentrations | Particulate matter | < 20 mg/l | Total organic carbon | < 2 mg/l | Unionised ammonia | < 1 μg/l | Residual chlorine | < 10 μg/l | Total organophosphorus pesticides | < 50 ng/l | Total organochlorine pesticides plus polychlorinated biphenyls | < 50 ng/l | Total organic chlorine | < 25 ng/l | Appendix 4A | Spawning substrate for zebrafish | Spawning tray : all glass instrument dish, for example 22 × 15 × 5,5 cm (l × w × d), covered with a removable stainless steel wire lattice (mesh width 2 mm). The lattice should cover the opening of the instrument dish at a level below the brim. | On the lattice, spawning substrate should be fixed. It should provide structure for the fish to move into. For example, artificial aquaria plants made of green plastic material are suitable (NB: possible adsorption of the test chemical to the plastic material should be considered). The plastic material should be leached out in sufficient volume of warm water for sufficient time to ensure that no chemicals may be disposed to the test water. When using glass materials it should be ensured that the fish are neither injured nor cramped during their vigorous actions. | The distance between the tray and the glass panes should be at least 3 cm to ensure that the spawning is not performed outside the tray. The eggs spawned onto the tray fall through the lattice and can be sampled 45-60 min after the start of illumination. The transparent eggs are non-adhesive and can easily be counted by using transversal light. When using five females per vessel, egg numbers up to 20 at a day can be regarded as low, up to 100 as medium and more than 100 as high numbers. The spawning tray should be removed, the eggs collected and the spawning tray re-introduced in the test vessel, either as late as possible in the evening or very early in the morning. The time until re-introduction should not exceed one hour since otherwise the cue of the spawning substrate may induce individual mating and spawning at an unusual time. If a situation needs a later introduction of the spawning tray, this should be done at least 9 hours after start of the illumination. At this late time of the day, spawning is not induced any longer. | Appendix 4B | Spawning substrate for fathead minnow | Two or three combined plastic/ceramic/glass or stainless steel spawning tiles and trays are placed in each of the test chamber (e.g., 80 mm length of grey semi-circular guttering sitting on a lipped tray of 130mm length) (see picture). Properly seasoned PVC or ceramic tiles have demonstrated to be appropriate for a spawning substrate (Thorpe et al, 2007). | It is recommended that the tiles are abraded to improve adhesion. The tray should also be screened to prevent fish from access to the fallen eggs unless the egg adhesion efficiency has been demonstrated for the spawning substrate used. | The base is designed to contain any eggs that do not adhere to the tile surface and would therefore fall to the bottom of the tank (or those eggs laid directly onto the flat plastic base). All spawning substrates should be leached for a minimum of 12 hours, in dilution water, before use. | REFERENCES | Thorpe KL, Benstead R, Hutchinson TH, Tyler CR, 2007. An optimised experimental test procedure for measuring chemical effects on reproduction in the fathead minnow, Pimephales promelas. Aquatic Toxicology, 81, 90–98. | Appendix 5A | Assessment of secondary sex characteristics in fathead minnow for the detection of certain endocrine active chemicals | Overview | Potentially important characteristics of physical appearance in adult fathead minnows in endocrine disrupter testing include body colour (i.e. light/dark), coloration patterns (i.e. presence or absence of vertical bands), body shape (i.e. shape of head and pectoral region, distension of abdomen), and specialized secondary sex characteristics (i.e. number and size of nuptial tubercles, size of dorsal pad and ovipositor). | Nuptial tubercles are located on the head (dorsal pad) of reproductively-active male fathead minnows, and are usually arranged in a bilaterally-symmetric pattern (Jensen et al. 2001). Control females and juvenile males and females exhibit no tubercle development (Jensen et al. 2001). There can be up to eight individual tubercles around the eyes and between the nares of the males. The greatest numbers and largest tubercles are located in two parallel lines immediately below the nares and above the mouth. In many fish there are groups of tubercles below the lower jaw; those closest to the mouth generally occur as a single pair, while the more ventral set can be comprised of up to four tubercles. The actual numbers of tubercles is seldom more than 30 (range, 18-28; Jensen et al. 2001). The predominant tubercles (in terms of numbers) are present as a single, relatively round structure, with the height approximately equivalent to the radius. Most reproductively-active males also have, at least some, tubercles which are enlarged and pronounced such that they are indistinguishable as individual structures. | Some types of endocrine-disrupting chemicals can cause the abnormal occurrence of certain secondary sex characteristics in the opposite sex; for example, androgen receptor agonists, such as 17β-methyltestosterone or 17β-trenbolone, can cause female fathead minnows to develop nuptial tubercles (Smith 1974; Ankley et al. 2001; 2003), while oestrogen receptor agonists may decrease number or size of nuptial tubercles in males (Miles-Richardson et al. 1999; Harries et al. 2000). | Below is a description of the characterization of nuptial tubercles in fathead minnows based on procedures used at the U.S. Environmental Protection Agency lab in Duluth, MN. Specific products and/or equipment can be substituted with comparable materials available. | Viewing is best accomplished using an illuminated magnifying glass or 3X illuminated dissection scope. View fish dorsally and anterior forward (head toward viewer). | a) | Place fish in small Petri dish (e.g., 100 mm in diameter), anterior forward, and ventral down. Focus viewfinder to allow identification of tubercles. Gently and slowly roll fish from side to side to identify tubercle areas. Count and score tubercles. | b) | Repeat the observation on the ventral head surface by placing the fish dorsal anterior forward in the Petri dish. | c) | Observations should be completed within 2 min for each fish. | Tubercle Counting and Rating | Six specific areas have been identified for assessment of tubercle presence and development in adult fathead minnows. A template was developed to map the location and quantity of tubercles present (see end of this Appendix). The number of tubercles is recorded and their size can be quantitatively ranked as: 0- absence, 1-present, 2-enlarged and 3-pronounced for each organism (Fig. 1). | Rate 0- absence of any tubercle. Rating 1-present, is identified as any tubercle having a single point whose height is nearly equivalent to its radius (diameter). Rating 2- enlarged, is identified by tissue resembling an asterisk in appearance, usually having a large radial base with grooves or furrows emerging from the centre. Tubercle height is often more jagged but can be somewhat rounded at times. Rating 3- pronounced, is usually quite large and rounded with less definition in structure. At times these tubercles will run together forming a single mass along an individual or combination of areas (B, C and D, described below). Coloration and design are similar to rating 2 but at times are fairly indiscriminate. Using this rating system generally will result in overall tubercle scores of < 50 in a normal control male possessing a tubercle count of 18 to 20 (Jensen et al. 2001). | Figure 1 | The actual number of tubercles in some fish may be greater than the template boxes (Appendix A) for a particular rating area. If this happens, additional rating numbers may be marked within, to the right or to the left of the box. The template therefore does not need to display symmetry. An additional technique for mapping tubercles which are paired or joined vertically along the horizontal plane of the mouth could be done by double-marking two tubercle rating points in a single box. | Mapping regions: | A— Tubercles located around eye. Mapped dorsal to ventral around anterior rim of eye. Commonly multiple in mature control males, not present in control females, generally paired (one near each eye) or single in females exposed to androgens. | B— Tubercles located between nares, (sensory canal pores). Normally in pairs for control males at more elevated levels (2- enlarged or 3- pronounced) of development. Not present in control females with some occurrence and development in females exposed to androgens. | C— Tubercles located immediately anterior to nares, parallel to mouth. Generally enlarged or pronounced in mature control males. Present or enlarged in less developed males or androgen-treated females. | D— Tubercles located parallel along mouth line. Generally rated developed in control males. Absent in control females but present in androgen-exposed females. | E— Tubercles located on lower jaw, close to mouth, usually small and commonly in pairs. Varying in control or treated males, and treated females. | F— Tubercles located ventral to E. Commonly small and paired. Present in control males and androgen-exposed females. | REFERENCES | (1) | Ankley GT, Jensen KM, Kahl MD, Korte JJ, Makynen ME. 2001. Description and evaluation of a short-term reproduction test with the fathead minnow (Pimephales promelas). Environ Toxicol Chem 20:1276-1290. | (2) | Ankley GT, Jensen KM, Makynen EA, Kahl MD, Korte JJ, Hornung MW, Henry TR, Denny JS, Leino RL, Wilson VS, Cardon MC, Hartig PC, Gray EL. 2003. Effects of the androgenic growth promoter 17-β trenbolone on fecundity and reproductive endocrinology of the fathead minnow. Environ Toxicol Chem 22:1350-1360. | (3) | Harries JE, Runnalls T, Hill E, Harris CA,Maddix S, Sumpter JP, Tyler CR. 2000. Development of a reproductive performance test for endocrine disrupting chemicals using pair-breeding fathead minnows (Pimephales promelas). Environ Sci Technol 34:3003-3011. | (4) | Jensen KM, Korte JJ, Kahl MD, Pasha MS, Ankley GT. 2001. Aspects of basic reproductive biology and endocrinology in the fathead minnow (Pimephales promelas). Comp Biochem Physiol C 128:127-141. | (5) | Kahl MD, Jensen KM, Korte JJ, Ankley GT. 2001. Effects of handling on endocrinology and reproductive performance of the fathead minnow. J Fish Biol 59:515-523. | (6) | Miles-Richardson SR, Kramer VJ, Fitzgerald SD, Render JA, Yamini B, Barbee SJ, Giesy JP. 1999. Effects of waterborne exposure of 17-estradiol on secondary sex characteristics and gonads of fathead minnows (Pimephales promelas). Aquat Toxicol 47:129-145. | (7) | Smith RJF. 1974. Effects of 17-methyltestosterone on the dorsal pad and tubercles of fathead minnows (Pimephales promelas). Can J Zool 52:1031-1038. | Tubercle Template | Numerical Rating | ID | 1-present | Date | 2-enlarged | Total Score | 3-pronounced | | A | X1 | X1 | X1 | X1 | | B | X1 | X1 | X1 | X1 | | C | X1 | X1 | X1 | X1 | X1 | X1 | X1 | X1 | X1 | X1 | | D | X1 | X1 | X1 | X1 | X1 | X1 | X1 | X1 | X1 | X1 | | | E | X1 | X1 | | | F | X1 | X1 | X1 | X1 | Appendix 5B | Assessment of secondary sex characteristics in medaka for the detection of certain endocrine active chemicals | Below is a description of the measurement of papillary processes (*2), which are the secondary sex characteristics in medaka (Oryzias latipes). | (1) | After the excision of the liver (Appendix 6), the carcass is placed into a conical tube containing about 10 ml of 10 % neutral buffered formalin (upside: head, downside: tail). If the gonad is fixed in a solution other than 10 % neutral buffered formalin, make a transverse cut across the carcass between anterior region of anal fin and anus using razor, taking care not to harm the gonopore and gonad itself (Fig. 3). Place the cranial side of the fish body into the fixative solution to preserve the gonad, and the tail side of the fish body into the 10 % neutral buffered formalin as described above. | (2) | After placing the fish body into 10 % neutral buffered formalin, grasp the anterior region of the anal fin with tweezers and fold it for about 30 seconds to keep the anal fin open. When grasping the anal fin with tweezers, grasp a few fin rays in the anterior region with care not to scratch the papillary processes. | (3) | After keeping the anal fin open for about 30 seconds, store the fish body in 10 % neutral buffered formalin at room temperature until the measurement of the papillary processes (measurement should be conducted after fixing for at least 24 hours). | Measurement | (1) | After fixing the fish body in the 10 % neutral buffered formalin for at least 24 hours, pick up the fish carcass from the conical tube and wipe the formalin on the filter paper (or paper towel). | (2) | Place the fish abdomen side up. Then cut the anal fin using small dissection scissors carefully (it is preferable to cut the anal fin with small amount of pterygiophore). | (3) | Grasp the anterior region of the severed anal fin with tweezers and put it on a glass slide with a several drops of water. Then cover the anal fin with a cover glass. Be careful not to scratch the papillary processes when grasping the anal fin with tweezers. | (4) | Count the number of the joint plate with papillary processes using the counter under a biological microscope (upright microscope or inverted microscope). The papillary processes are recognized when a small formation of processes is visible on the posterior margin of joint plate. Write the number of joint plate with papillary processes in each fin ray to the worksheet (e.g. first fin ray: 0, second fin ray: 10, third fin ray: 12, etc.) and enter the sum of this number on the Excel spreadsheet by individual fish. If necessary, take a photograph of the anal fin and count the number of joint plate with papillary processes on the photograph. | (5) | After the measurement, put the anal fin into the conical tube described in (1) and store it. | Fig.1. | Diagram showing sexual difference in shape and size of the anal fin. A, male; B, female. Oka, T. B., 1931. On the processes on the fin rays of the male of Oryzias latipes and other sex characters of this fish. J. Fac. Sci., Tokyo Univ., IV, 2: 209-218. | Fig.2.A. | Processes on joint plates of anal fin-ray. J.P., joint plate; A.S., axial space; P., process. B, Distal extremity of fin-ray. Actinotrichia (Act.) are on the tip. Oka, T. B., 1931. On the processes on the fin rays of the male of Oryzias latipes and other sex characters of this fish. J. Fac. Sci., Tokyo Univ., IV, 2: 209-218. | Fig.3. | Photograph of fish body showing the cut site when the gonad is fixed in the fixing solution other than 10 % neutral buffered formalin. In that case, the remaining body will be cut off between anterior region of anal fin and anal using razor (red bar), and the head side of fish body will be put into the fixing solution for gonad and the tail side of the fish body will be put into the 10 % neutral buffered formalin. | Appendix 6 | Recommended procedures for sample collection for vitellogenin analysis | Care should be taken to avoid cross-contamination between VTG samples of males and females. | Procedure 1A: Fathead Minnow, Blood Collection from the Caudal Vein/Artery | After anaesthetisation, the caudal peduncle is partially severed with a scalpel blade and blood is collected from the caudal vein/artery with a heparinised microhematocrit capillary tube. After the blood has been collected, the plasma is quickly isolated by centrifugation for 3 min at 15 000
g (or alternatively for 10 min. at 15 000 g at 4 °C). If desired, percent hematocrit can be determined following centrifugation. The plasma portion is then removed from the microhematocrit tube and stored in a centrifuge tube with 0,13 units of aprotinin (a protease inhibitor) at – 80 °C until determination of vitellogenin can be made. Depending on the size of the fathead minnow (which is sex-dependent), collectable plasma volumes generally range from 5 to 60 microlitres per fish (Jensen et al. 2001). | Procedure 1B: Fathead Minnow, Blood Collection from Heart | Alternatively, blood may also be collected by cardiac puncture using a heparinized syringe (1 000 units of heparin per ml). The blood is transferred into Eppendorf tubes (held on ice) and then centrifuged (5 min, 7 000 g, room temperature). The plasma should be transferred into clean Eppendorf tubes (in aliquots if the volume of plasma makes this feasible) and promptly frozen at – 80 °C, until analyzed (Panter et al., 1998). | Procedure 2A: Japanese Medaka, Excision of the Liver in Medaka | Removal of the test fish from the test chamber | (1) | Test fish should be removed from the test chamber using the small spoon-net. Be careful not to drop the test fish into other test chambers. | (2) | In principle, the test fish should be removed in the following order: control, solvent control (where appropriate), lowest concentration, middle concentration, highest concentration and positive control. In addition, all males should be removed from one test chamber before the remaining females are removed. | (3) | The sex of each test fish is identified on the basis of external secondary sex characteristics (e.g. the shape of the anal fin). | (4) | Place the test fish in a container for transport and carry it to the workstation for excision of the liver. Check the labels of the test chamber and the transport container for accuracy and to confirm that the number of fish that have been removed from the test chamber and that the number of fish remaining in the test chamber are consistent with expectation. | (5) | If the sex cannot be identified by the fish's external appearance, remove all fish from the test chamber. In this case, the sex should be identified by observing the gonad or secondary sex characteristics under a stereoscopic microscope. | Excision of the liver | (1) | Transfer the test fish from the container for transport to the anaesthetic solution using the small spoon-net. | (2) | After the test fish is anaesthetised, transfer the test fish on the filter paper (or a paper towel) using tweezers (commodity type). When grasping the test fish, apply the tweezers to the sides of the head to prevent breaking the tail. | (3) | Wipe the water on the surface of the test fish on the filter paper (or the paper towel). | (4) | Place the fish abdomen side up. Then make a small transverse incision partway between the ventral neck region and the mid-abdominal region using dissection scissors. | (5) | Insert the dissection scissors into the small incision, and incise the abdomen from a point caudal to the branchial mantle to the cranial side of the anus along the midline of the abdomen. Be careful not to insert the dissection scissors too deeply so as to avoid damaging the liver and gonad. | (6) | Conduct the following operations under the stereoscopic microscope. | (7) | Place the test fish abdomen side up on the paper towel (glass Petri dish or slide glass are also available). | (8) | Extend the walls of the abdominal cavity with precision tweezers and exteriorise the internal organs. It is also acceptable to exteriorise the internal organs by removing one side of the wall of the abdominal cavity if necessary. | (9) | Expose the connected portion of the liver and gallbladder using another pair of precision tweezers. Then grasp the bile duct and cut off the gallbladder. Be careful not to break the gallbladder. | (10) | Grasp the oesophagus and excise the gastrointestinal tract from the liver in the same way. Be careful not to leak the contents of the gastrointestinal tract. Excise the caudal gastrointestinal tract from the anus and remove the tract from the abdominal cavity. | (11) | Trim the mass of fat and other tissues from the periphery of the liver. Be careful not to scratch the liver. | (12) | Grasp the hepatic portal area using the precision tweezers and remove the liver from the abdominal cavity. | (13) | Place the liver on the slide glass. Using the precision tweezers, remove any additional fat and extraneous tissue (e.g., abdominal lining), if needed, from the surface of the liver. | (14) | Measure the liver weight with 1.5 ml microtube as a tare using an electronic analytical balance. Record the value on the worksheet (read: 0,1 mg). Confirm the identification information on the microtube label. | (15) | Close the cap of the microtube containing the liver. Store it in a cooling rack (or ice rack). | (16) | Following the excision of one liver, clean the dissection instruments or replace them with clean ones. | (17) | Remove livers from all of the fish in the transport container as described above. | (18) | After the livers have been excised from all of the fish in the transport container (i.e., all males or females in a test chamber), place all liver specimens in a tube rack with a label for identification and store it in a freezer. When the livers are donated for pre-treatment shortly after the excision, the specimens are carried to the next workstation in a cooling rack (or ice rack). | Following liver excision, the fish carcass is available for measurement of secondary sex characteristics. | Specimen | Store the liver specimens taken from the test fish at ≤ – 70 °C if they are not used for the pre-treatment shortly after the excision. | Figure 1 | A cut is made just anterior to pectoral fins with scissors. | Figure 2 | The midline of abdomen is incised with scissors to a point approximately 2 mm cranial to the anus. | Figure 3 | The abdominal walls are spread with forceps for exposure of the liver and other internal organs. (Alternatively, the abdominal walls may be pinned laterally). | Figure 4 | The liver is bluntly dissected and excised using forceps. | Figure 5 | The intestines are gently retracted using forceps. | Testis 6 | Both ends of the intestines and any mesenteric attachments are severed using scissors. | Testis 7 (female) | The procedure is identical for the female. | Testis 8 | The completed procedure. | Procedure 2 B: Japanese Medaka (Oryzias latipes), Liver Pre-treatment for Vitellogenin Analysis | Take the bottle of homogenate buffer from the ELISA kit and cool it with crushed ice (temperature of the solution: ≤ 4 °C). If homogenate buffer from EnBio ELISA system is used, thaw the solution at room temperature, and then cool the bottle with crushed ice. | Calculate the volume of homogenate buffer for the liver on the basis of its weight (add 50 μl of homogenate buffer per mg liver weight for homogenate). For example, if the weight of the liver is 4,5 mg, the volume of homogenate buffer for the liver is 225 μl. Prepare a list of the volume of homogenate buffer for all livers. | Preparation of the liver for pre-treatment | (1) | Take the 1,5 ml microtube containing the liver from the freezer just before the pre-treatment. | (2) | Pre-treatment of the liver from males should be performed before females to prevent vitellogenin contamination. In addition, the pre-treatment for test groups should be conducted in the following order: control, solvent control (where appropriate), lowest concentration, middle concentration, highest concentration and positive control. | (3) | The number of 1,5 ml microtubes containing liver samples taken from the freezer at a given time should not exceed the number that can be centrifuged at that time. | (4) | Arrange the 1,5 ml microtubes containing liver samples in the order of specimen number on the ice rack (no need to thaw the liver). | Operation of the pre-treatment | 1. Addition of the homogenization buffer | (1) | Check the list for the volume of the homogenate buffer to be used for a particular sample of liver and adjust the micropipette (volume range: 100-1 000 μl) to the appropriate volume. Attach a clean tip to the micropipette. | (2) | Take the homogenate buffer from the reagent bottle and add the buffer to the 1,5 ml microtube containing the liver. | (3) | Add the homogenate buffer to all of 1,5 ml microtubes containing the liver according to the procedure described above. There is no need to change the micropipette tip to a new one. However, if the tip is contaminated or suspected to be contaminated, the tip should be changed. | 2. Homogenisation of the liver | (1) | Attach a new pestle for homogenisation to the microtube homogeniser. | (2) | Insert the pestle into the 1,5 ml microtube. Hold the microtube homogeniser to press the liver between the surface of the pestle and the inner wall of the 1,5 ml microtube. | (3) | Operate the microtube homogeniser for 10 to 20 seconds. Cool the 1,5 ml microtube with crushed ice during the operation. | (4) | Lift up the pestle from the 1,5 ml microtube and leave it at rest for about 10 seconds. Then conduct a visual check of the state of the suspension. | (5) | If pieces of liver are observed in the suspension, repeat the operations (3) and (4) to prepare satisfactory liver homogenate. | (6) | Cool the suspended liver homogenate on the ice rack until centrifugation. | (7) | Change the pestle to the new one for each homogenate. | (8) | Homogenise all livers with homogenate buffer according to the procedure described above. | 3. Centrifugation of the suspended liver homogenate | (1) | Confirm the temperature of the refrigerated centrifuge chamber at ≤ 5 °C. | (2) | Insert the 1,5 ml microtubes containing the suspended liver homogenate in refrigerated centrifuge (adjust the balance if necessary). | (3) | Centrifuge the suspended liver homogenate at 13 000g for 10 min at ≤ 5 °C. However, if the supernatants are adequately separated, centrifugal force and time may be adjusted as needed. | (4) | Following centrifugation, check that the supernatants are adequately separated (surface: lipid, intermediate: supernatant, bottom layer: liver tissue). If the separation is not adequate, centrifuge the suspension again under the same conditions. | (5) | Remove all specimens from the refrigerated centrifuge and arrange them in the order of specimen number on the ice rack. Be careful not to resuspend each separated layer after the centrifugation. | 4. Collection of the supernatant | (1) | Place four 0,5 ml microtubes for storage of the supernatant into the tube rack. | (2) | Collect 30 μl of each supernatant (separated as the intermediate layer) with the micropipette and dispense it to one 0,5 ml microtube. Be careful not to collect the lipid on the surface or the liver tissue in the bottom layer. | (3) | Collect the supernatant and dispense it to other two 0,5 ml microtubes in the same manner as described above. | (4) | Collect the rest of the supernatant with the micropipette (if feasible: ≥ 100 μl). Then dispense the supernatant to the remaining 0,5 ml microtube. Be careful not to collect the lipid on the surface or the liver tissue in the bottom layer. | (5) | Close the cap of the 0,5 ml microtube and write the volume of the supernatant on the label. Then immediately cool the microtubes on the ice rack. | (6) | Change the tip of the micropipette to the new one for each supernatant. If a large amount of lipid becomes attached to the tip, change it to the new one immediately to avoid contamination of the liver extract with fat. | (7) | Dispense all of the centrifuged supernatant to four 0,5 ml microtubes according to the procedure described above. | (8) | After dispensing the supernatant to the 0,5 ml microtubes, place all of them in the tube rack with the identification label, and then freeze them in the freezer immediately. If the VTG concentrations are measured immediately after the pre-treatment, keep one 0,5 ml microtube (containing 30 μl of supernatant) cool in the tube rack and transfer it to the workstation where the ELISA assay is conducted. In such case, place the remaining microtubes in the tube racks and freeze them in the freezer. | (9) | After the collection of the supernatant, discard the residue adequately. | Storage of the specimen | Store the 0,5 ml microtubes containing the supernatant of the liver homogenate at ≤ – 70 °C until they are used for the ELISA. | Procedure 3A: Zebrafish, Blood Collection from the Caudal Vein / Artery | Immediately following anaesthesia, the caudal peduncle is severed transversely, and the blood is removed from the caudal artery/vein with a heparinised microhematocrit capillary tube. Blood volumes range from 5 to 15 μl depending on fish size. An equal volume of aprotinin buffer (6 μgml in PBS) is added to the microcapillary tube, and plasma is separated from the blood via centrifugation (5 minutes at 600 g). Plasma is collected in the test tubes and stored at – 20 °C until analyzed for vitellogenin or other proteins of interest. | Procedure 3B: Zebrafish, Blood Collection by Cardiac Puncture | To avoid coagulation of blood and degradation of protein the samples are collected within Phosphate-buffered saline (PBS) buffer containing heparin (1 000 units/ml) and the protease inhibitor aprotinin (2 TIU/ml). As ingredients for the buffer, heparin ammonium salt and lyophilised aprotinin are recommended. For blood sampling, a syringe (1 ml) with a fixed thin needle (e.g. Braun Omnikan-F) is recommended. The syringe should be prefilled with buffer (approximately 100 μl) to completely elute the small blood volumes from each fish. The blood samples are taken by cardiac puncture. At first the fish should be anesthetized with MS-222 (100 mg/l). The proper plane of anaesthesia allows the user to distinguish the heartbeat of the zebrafish. While puncturing the heart, keep the syringe piston under weak tension. Collectable blood volumes range between 20 - 40 microliters. After cardiac puncture, the blood/buffer-mixture should be filled into the test tube. Plasma is separated from the blood via centrifugation (20 min; 5 000 g) and should be stored at – 80 °C until required for analysis. | Procedure 3C: SOP: Zebrafish, homogenisation of head & tail | (1) | The fish are anaesthetised and euthanised in accordance with the test description. | (2) | The head and tail are cut of the fish in accordance with Figure 1. | Important: All dissection instruments, and the cutting board should be rinsed and cleaned properly (e.g. with 96 % ethanol) between handling of each single fish to prevent “vitellogenin pollution” from females or induced males to uninduced males. | Figure 1 | Cut behind | Cut behind dorsal fin | For Vtg analysis | For Vtg analysis | For gonad histology | (3) | The weight of the pooled head and tail from each fish is measured to the nearest mg. | (4) | After being weighed, the parts are placed in appropriate tubes (e.g. 1,5 ml eppendorf) and frozen at – 80 °C until homogenisation or directly homogenised on ice with two plastic pistils. (Other methods can be used if they are performed on ice and the result is a homogenous mass). Important: The tubes should be numbered properly so that the head and tail from the fish can be related to their respective body-section used for gonad histology. | (5) | When a homogenous mass is achieved, 4 x the tissue weight of ice-cold homogenisation buffer (*3) is added. Keep working with the pistils until the mixture is homogeneous. Important note: New pistils are used for each fish. | (6) | The samples are placed on ice until centrifugation at 4 °C at 50 000 × g for 30 min. | (7) | Use a pipette to dispense portions of 20 μl supernatant into at least two tubes by dipping the tip of the pipette below the fat layer on the surface and carefully sucking up the supernatant without fat- or pellet fractions. | (8) | The tubes are stored at – 80 °C until use. | Appendix 7 | Vitellogenin fortification samples and inter-assay reference standard | On each day that vitellogenin assays are performed, a fortification sample made using an inter-assay reference standard will be analysed. The vitellogenin used to make the inter-assay reference standard will be from a batch different from the one used to prepare calibration standards for the assay being performed. | The fortification sample will be made by adding a known quantity of the inter-assay standard to a sample of control male plasma. The sample will be fortified to achieve a vitellogenin concentration between 10 and 100 times the expected vitellogenin concentration of control male fish. The sample of control male plasma that is fortified may be from an individual fish or may be a composite from several fish. | A subsample of the unfortified control male plasma will be analysed in at least two duplicate wells. The fortified sample also will be analysed in at least two duplicate wells. The mean quantity of vitellogenin in the two unfortified control male plasma samples will be added to the calculated quantity of vitellogenin added to fortification the samples to determine an expected concentration. The ratio of this expected concentration to the measured concentration will be reported along with the results from each set of assays performed on that day. | Appendix 8 | Decision flowchart for the statistical analysis | Dunnett test on nested ANOVA | No | Yes | Dunn or Mann-Whitney test on rep means | variance stabilising transform | >=4 reps per conc | <=3 reps per conc | Dunn test | Yes | No | Normalising transform? | Tamhane-Dunnett test | >=4 reps per conc | <=3 reps per conc | Nested ANOVA not normal | No | Yes | No | Yes | variance stabilising transformation | Dunnett test | Variances unequal | Variances equal | Not monotone | Stept-down Jonckheere or Williams' test | Step-down trendtest on replicate means | Monotone | Tamhane-Dunnett test on nested ANOVA | Dunn test on rep means | Dunn or Mann-Whitney test | Nested ANOVA normal | Rep means normally distributed | Rep means normally distributed | Step-down Jonckheere test | Rep means normal or not homogenous | Rep means normal & homogenous | Determine whether Dose-Response is monotone | C.38. THE AMPHIBIAN METAMORPHOSIS ASSAY | INTRODUCTION | 1. | This test method is equivalent to OECD test guideline (TG) 231 (2009). The need to develop and validate an assay capable of detecting chemicals active in the thyroid system of vertebrate species originates from concerns that environmental levels of chemicals may cause adverse effects in both humans and wildlife. In 1998, the OECD initiated a high-priority activity to revise existing TGs and to develop new TGs for the screening and testing of potential endocrine disrupters. One element of the activity was to develop a TG for the screening of chemicals active on the thyroid system of vertebrate species. Both an enhancement of the Repeated dose 28-day oral toxicity study in rodents (Chapter B.7 of this Annex) and the Amphibian Metamorphosis Assay (AMA) were proposed. The enhanced test method B.7 underwent validation and a revised test method has been issued. The Amphibian Metamorphosis Assay (AMA) underwent an extensive validation programme which included intra- and inter-laboratory studies demonstrating the relevance and reliability of the assay (1, 2). Subsequently, the validation of the assay was subject to peer-review by a panel of independent experts (3). This test method is the outcome of the experience gained during the validation studies for the detection of thyroid active chemicals, and of work conducted elsewhere in OECD member countries. | PRINCIPLE OF THE TEST | 2. | The Amphibian Metamorphosis Assay (AMA) is a screening assay intended to empirically identify chemicals which may interfere with the normal function of the hypothalamic-pituitary-thyroid (HPT) axis. The AMA represents a generalised vertebrate model to the extent that it is based on the conserved structures and functions of the HPT axis. It is an important assay because amphibian metamorphosis provides a well-studied, thyroid-dependent process which responds to chemicals active within the HPT axis, and it is the only existing assay that detects thyroid activity in an animal undergoing morphological development. | 3. | The general experimental design entails exposing stage 51 Xenopus laevis tadpoles to a minimum of three different concentrations of a test chemical and a dilution water control for 21 days. There are four replicates of each test treatment. Larval density at test initiation is 20 tadpoles per test tank for all treatment groups. The observational endpoints are hind limb length, snout to vent length (SVL), developmental stage, wet weight, thyroid histology, and daily observations of mortality. | DESCRIPTION OF THE METHOD | Test Species | 4. | Xenopus laevis is routinely cultured in laboratories worldwide and is easily obtainable through commercial suppliers. Reproduction can be easily induced in this species throughout the year using human chorionic gonadotropin (hCG) injections and the resultant larvae can be routinely reared to selected developmental stages in large numbers to permit the use of stage-specific test protocols. It is preferred that larvae used in the assay are derived from in-house adults. As an alternative although this is not the preferred procedure, eggs or embryos may be shipped to the laboratory performing the test and allowed to acclimate; the shipping of larval stages for use in the test is unacceptable. | Equipment and Supplies | 5. | The following equipment and supplies are needed for the conduct of this assay: | (a) | Exposure system (see description below); | (b) | Glass or stainless steel aquaria (see description below); | (c) | Breeding tanks; | (d) | Temperature controlling apparatus (e.g., heaters or coolers (adjustable to 22° ± 1 °C)); | (e) | Thermometer; | (f) | Binocular dissection microscope; | (g) | Digital camera with at least 4 megapixel resolution and micro function; | (h) | Image digitising software; | (i) | Petri dish (e.g. 100 × 15 mm) or transparent plastic chamber of comparable size; | (j) | Analytical balance capable of measuring to 3 decimal places (mg); | (k) | Dissolved oxygen meter; | (l) | pH meter; | (m) | Light intensity meter capable of measuring in lux units; | (n) | Miscellaneous laboratory glassware and tools; | (o) | Adjustable pipettes (10 to 5 000 μl) or assorted pipettes of equivalent sizes; | (p) | Test chemical in sufficient quantities to conduct the study, preferably of one lot; | (q) | Analytical instrumentation appropriate for the chemical on test or contracted analytical services. | Chemical Testability | 6. | The AMA is based upon an aqueous exposure protocol whereby test chemical is introduced into the test chambers via a flow-through system. Flow-through methods however, introduce constraints on the types of chemicals that can be tested, as determined by the physicochemical properties of the chemical. Therefore, prior to using this protocol, baseline information about the chemical should be obtained that is relevant to determining the testability, and the OECD Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures (4) should be consulted. Characteristics which indicate that the chemical may be difficult to test in aquatic systems include: high octanol water partitioning coefficients (log Kow), high volatility, susceptibility to hydrolysis, and susceptibility to photolysis under ambient laboratory lighting conditions. Other factors may also be relevant to determining testability and should be determined on a case by case basis. If a successful test is not possible for the chemical using a flow-through test system, a static renewal system may be employed. If neither system is capable of accommodating the test chemical, then the default is to not test it using this protocol. | Exposure System | 7. | A flow-through diluter system is preferred, when possible, over a static renewal system. If physical and/or chemical properties of any of the test chemicals are not amenable to a flow-through diluter system, then an alternative exposure system (e.g., static-renewal) can be employed. The system components should have water-contact components of glass, stainless steel, and/or Polytetrafluoroethylene. However, suitable plastics can be utilised if they do not compromise the study. Exposure tanks should be glass or stainless steel aquaria, equipped with standpipes that result in an approximate tank volume between 4,0 and 10,0 l and minimum water depth of 10 to 15 cm. The system should be capable of supporting all exposure concentrations and a control, with four replicates per treatment. The flow rate to each tank should be constant in consideration of both the maintenance of biological conditions and chemical exposure (e.g. 25 ml/min). The treatment tanks should be randomly assigned to a position in the exposure system in order to reduce potential positional effects, including slight variations in temperature, light intensity, etc. Fluorescent lighting should be used to provide a photoperiod of 12 hr light: 12 hr dark at an intensity that ranges from 600 to 2 000 lux (lumen/m2) at the water surface. Water temperature should be maintained at 22° ± 1 °C, pH maintained between 6,5 to 8,5, and the dissolved oxygen (DO) concentration > 3,5 mg/l (> 40 % of the air saturation) in each test tank. As a minimum water temperature, pH and dissolved oxygen should be measured weekly; temperature should preferably be measured continuously in at least one test vessel. Appendix 1 outlines the experimental conditions under which the protocol should be executed. For further information on setting up flow-through exposure systems and/or static renewal systems, please refer to the ASTM Standard Guide for Conducting Acute Toxicity Tests on Test Materials with Fishes, Macroinvertebrates, and Amphibians (5) and general aquatic toxicology tests. | Water quality | 8. | Any water that is locally available (e.g. springwater or charcoal-filtered tap water) and permits normal growth and development of X. laevis tadpoles could be used. Because local water quality can differ substantially from one area to another, analysis of water quality should be undertaken, particularly, if historical data on the utility of the water for raising Xenopus is not available. Special attention should be given that the water is free of copper, chlorine and chloramines, all of which are toxic to frogs and tadpoles. It is further recommended to analyse the water concerning background levels of fluoride, perchlorate and chlorate (by-products of drinking water disinfection) as all of these anions are substrates of the iodine transporter of the thyroid gland and elevated levels of each of these anions may confound the study outcome. Analysis should be performed before testing begins and the testing water should normally be free from these anions. | Iodide Concentration in Test Water | 9. | In order for the thyroid gland to synthesise TH, sufficient iodide needs to be available to the larvae through a combination of aqueous and dietary sources. Currently, there are no empirically derived guidelines for minimal iodide concentrations. However, iodide availability may affect the responsiveness of the thyroid system to thyroid active agents and is known to modulate the basal activity of the thyroid gland, an aspect that deserves attention when interpreting the results from thyroid histopathology. Therefore, measured aqueous iodide concentrations from the test water should be reported. Based on the available data from the validation studies, the protocol has been demonstrated to work well when test water iodide (I-) concentrations ranged between 0,5 and 10 μg/l. Ideally, the minimum iodide concentration in the test water should be 0,5 μg/l. If the test water is reconstituted from deionised water, iodine should be added at a minimum concentration of 0,5 μg/l. Any additional supplementation of the test water with iodine or other salts should be noted in the report. | Holding of animals | Adult Care and Breeding | 10. | Adult care and breeding is conducted in accordance with standard guidelines and the reader is directed to the standard guide for performing the Frog Embryo Teratogenesis Assay (FETAX) (6) for more detailed information. Such standard guidelines provide an example of appropriate care and breeding methods, but strict adherence is not required. To induce breeding, pairs (3-5) of adult females and males are injected with human chorionic gonadotropin (hCG). Female and male specimens are injected with approximately 800 IU-1 000 IU and 600 IU-800 IU, respectively, of hCG dissolved in 0,6-0,9 % saline solution. Breeding pairs are held in large tanks, undisturbed and under static conditions in order to promote amplexus. The bottom of each breeding tank should have a false bottom of stainless steel or plastic mesh which permits the egg masses to fall to the bottom of the tank. Frogs injected in the late afternoon will usually deposit most of their eggs by mid morning of the next day. After a sufficient quantity of eggs are released and fertilised, adults should be removed from the breeding tanks. | Larval Care and Selection | 11. | After the adults are removed from the breeding tanks, the eggs are collected and evaluated for viability using a representative sub-set of the embryos from all breeding tanks. The best individual spawn(s) (2-3 recommended to evaluate the quality of the spawns) should be retained based upon embryo viability and the presence of an adequate number (minimum of 1 500) of embryos. All the organisms used in a study should originate from a single spawning event (i.e., the spawns should not be co-mixed). The embryos are transferred into a large flat pan or dish and all obvious dead or abnormal eggs (see definition in (5)) are removed using a pipette or eyedropper. The sound embryos from each of the three spawns are transferred into three separate hatching tanks. Four days after being placed in the hatching tanks, the best spawn, based on viability and hatching success, is selected and the larvae are transferred into an appropriate number of rearing tanks at 22° ± 1 °C. In addition, some additional larvae are moved into extra tanks for use as replacements in the event that mortalities occur in the rearing tanks during the first week. This procedure maintains consistent organism density and thereby reduces developmental divergence within the cohort of a single spawn. All rearing tanks should be siphoned clean daily. As a precaution, vinyl or nitrile gloves are preferred to latex gloves. Mortalities should be removed daily and replacement larvae should be added back to maintain the organism density during the first week. Feeding should occur at least twice per day. | 12. | During the pre-exposure phase, tadpoles are acclimated to the conditions of the actual exposure phase, including the type of food, temperature, light-dark cycle and the culture medium. Therefore, it is recommended that the same culture/dilution water be used during the pre-exposure phase and the exposure phase. If a static culture system is used for maintaining tadpoles during the pre-exposure phase, the culture medium should be replaced completely at least twice per week. Crowding, caused by high larval densities during the pre-exposure period, should be avoided because such effects could markedly affect tadpole development during the subsequent testing phase. Therefore, the rearing density should not exceed approximately four tadpoles/l culture medium (static exposure system) or 10 tadpoles/l culture medium (with e.g. 50 ml/min flow rate in the pre-exposure or culturing system). Under these conditions, tadpoles should develop from stages 45/46 to stage 51 within twelve days. Representative tadpoles of this stock population should be inspected daily for developmental stage in order to estimate the appropriate time point for initiation of exposure. Care should be used to minimise stress and trauma to the tadpoles, especially during movement, cleaning of aquaria, and manipulation of larvae. Stressful conditions/activities should be avoided such as loud and/or incessant noise, tapping on aquaria, vibrations in the aquaria, excessive activity in the laboratory, and rapid changes in environmental media (light availability, temperature, pH, DO, water flow rates, etc.) If tadpoles do not develop to stage 51 within 17 days after fertilisation, excessive stress should be considered as a potential culprit. | Larval Culture and Feeding | 13. | Tadpoles are fed with e.g. the commercial tadpole feed used in the validation studies (see also appendix 1) throughout the pre-exposure period (after Nieuwkoop and Faber (NF) stage 45/46 (8)) and during the entire test period of 21 days, or other diet that has demonstrated to allow equal performance of the Amphibian Metamorphosis Assay. The feeding regime during the pre-exposure period should be carefully adjusted to meet the demands of the developing tadpoles. That is, small portions of food should be provided to the newly hatched tadpoles several times per day (at least twice). Excess food should be avoided in order i) to maintain water quality and ii) to prevent the clogging of gill filters with food particles and detritus. For the tadpole feed used in the validation studies, the daily food rations should be increased along with tadpole growth to approximately 30 mg/animal/day shortly before test initiation. This commercially available feed has been shown in the validation studies to support proper growth and development of X. laevis tadpoles, and is a fine particulate that stays suspended in the water column for a long period of time and is subject to washing out with the flow. Therefore, the total daily amount of food should be divided into smaller portions and fed at least twice daily. For this feed the feeding regime is outlined in Table 1. Feeding rates should be recorded. It can be fed dry or as a stock solution prepared in dilution water. Such a stock solution should be freshly prepared every other day and stored at 4 °C when not in use. | Table 1 | Feeding regime with commercial tadpole feed used in the validation studies for X. laevis tadpolesduring the in-life portion of the AMA in flow-through conditions | Study Day | Food ration (mg feed/animal/day) | 0-4 | 30 | 5-7 | 40 | 8-10 | 50 | 11-14 | 70 | 15-21 | 80 | Analytical Chemistry | 14. | Prior to conducting a study, the stability of the test chemical should be evaluated using existing information on its solubility, degradability and volatility. Test solutions from each replicate tank at each concentration should be sampled for analytical chemistry analyses at test initiation (day 0), and weekly during the test for a minimum of four samples. It is also recommended that each test concentration be analysed during system preparation, prior to test initiation, to verify system performance. In addition, it is recommended that stock solutions be analysed when they are changed, especially if the volume of the stock solution does not provide adequate amounts of chemical to span the duration of routine sampling periods. In the case of chemicals which cannot be detected at some or all of the concentrations used in a test, stock solutions should be measured and system flow rates recorded in order to calculate nominal concentrations. | Chemical Delivery | 15. | The method used to introduce the test chemical to the system can vary depending on its physicochemical properties. Water soluble chemicals can be dissolved in aliquots of test water at a concentration which allows delivery at the target test concentration in a flow-through system. Chemicals which are liquid at room temperature and sparingly soluble in water can be introduced using liquid:liquid saturator methods. Chemicals which are solid at room temperature and are sparingly soluble in water can be introduced using glass wool column saturators (7). The preference is to use a carrier-free test system, however different test chemicals will possess varied physicochemical properties that will likely require different approaches for preparation of chemical exposure water. It is preferred that effort be made to avoid solvents or carriers because: i) certain solvents themselves may result in toxicity and/or undesirable or unexpected endocrinological responses, ii) testing chemicals above their water solubility (as can frequently occur through the use of solvents) can result in inaccurate determinations of effective concentrations, and iii) the use of solvents in longer-term tests can result in a significant degree of “biofilming” associated with microbial activity. For difficult to test chemicals, a solvent may be employed as a last resort, and the OECD Guidance Document on aquatic toxicity testing of difficult substances and mixtures should be consulted (4) to determine the best method. The choice of solvent will be determined by the chemical properties of the chemical. Solvents which have been found to be effective for aquatic toxicity testing include acetone, ethanol, methanol, dimethyl formamide and triethylene glycol. In case a solvent carrier is used, solvent concentrations should be below the chronic No Observed Effect Concentration (NOEC); the OECD Guidance Document recommends a maximum of 100 μl/l; a recent review recommends that solvent concentrations as low as 20 μl/l of dilution water be used (12). If solvent carriers are used, appropriate solvent controls should be evaluated in addition to non-solvent controls (clean water). If it is not possible to administer a chemical via the water, either because of physicochemical characteristics (low solubility) or limited chemical availability, introducing it via the diet may be considered. Preliminary work has been conducted on dietary exposures; however, this route of exposure is not commonly used. The choice of method should be documented and analytically verified. | Selection of test concentrations | Establishing the High Test Concentration | 16. | For the purposes of this test, the high test concentration should be set by the solubility limit of the test chemical; the maximum tolerated concentration (MTC) for acutely toxic chemicals; or 100 mg/l, whichever is lowest. | 17. | The MTC is defined as the highest test concentration of the chemical which results in less than 10 % acute mortality. Using this approach assumes that there are existing empirical acute mortality data from which the MTC can be estimated. Estimating the MTC can be inexact and typically requires some professional judgment. Although the use of regression models may be the most technically sound approach to estimating the MTC, a useful approximation of the MTC can be derived from existing acute data by using 1/3 of the acute LC50 value. However, acute toxicity data may be lacking for the species on test. If species specific acute toxicity data are not available, then a 96-hour LC50 test can be completed with tadpoles that are representative (i.e., same stage) of those on test in the AMA. Optionally, if data from other aquatic species are available (e.g. LC50 studies in fish or other amphibian species), then professional judgment may be used to estimate a likely MTC based on inter-species extrapolation. | 18. | Alternatively, if the chemical is not acutely toxic and is soluble above 100 mg/l, then 100 mg/l should be considered the highest test concentration (HTC), as this concentration is typically considered “practically non-toxic.” | 19. | Although not the recommended procedure, static renewal methods may be used where flow-through methods are inadequate to achieve the MTC. If static renewal methods are used, then the stability of the test chemical concentration should be documented and remain within the performance criteria limits. Twenty-four hour renewal periods are recommended. Renewal periods exceeding 72 hours are not acceptable. Additionally, water quality parameters (e.g. DO, temperature, pH, etc.) should be measured at the end of each renewal period, immediately prior to renewal. | Test Concentration Range | 20. | There is a required minimum of three test concentrations and a clean water control (and vehicle control if necessary). The minimum test concentration differential between the highest and lowest should be about one order of magnitude. The maximum dose separation is 0,1 and the minimum is 0,33. | PROCEDURE | Test Initiation and Conduct | Day 0 | 21. | The exposure should be initiated when a sufficient number of tadpoles in the pre-exposure stock population have reached developmental stage 51, according to Nieuwkoop and Faber (8), and which are less than or equal to 17 days of age post fertilisation. For selection of test animals, healthy and normal looking tadpoles of the stock population should be pooled in a single vessel containing an appropriate volume of dilution water. For developmental stage determination, tadpoles should be individually removed from the pooling tank using a small net or strainer and transferred to a transparent measurement chamber (e.g. 100 mm Petri dish) containing dilution water. For stage determination, it is preferred not to use anaesthesia, however one may individually anaesthetise the tadpoles using 100 mg/l tricaine methanesulfonate (e.g. MS-222), appropriately buffered with sodium bicarbonate (pH 7,0), before handling. If used, methodology for appropriately using e.g. MS-222 for anaesthesia should be obtained from experienced laboratories and reported with the test results. Animals should be carefully handled during this transfer in order to minimise handling stress and to avoid any injury. | 22. | The developmental stage of the animals is determined using a binocular dissection microscope. To reduce the ultimate variability in developmental stage, it is important that this staging be conducted as accurately as possible. According to Nieuwkoop and Faber (8), the primary developmental landmark for selecting stage 51 organisms is hind limb morphology. The morphological characteristics of the hind limbs should be examined under the microscope. While the complete Nieuwkoop and Faber (8) guide should be consulted for comprehensive information on staging tadpoles, one can reliably determine stage using prominent morphological landmarks. The following table can be used to simplify and standardise the staging process throughout the study by identifying those prominent morphological landmarks associated with different stages, assuming that development is normal. | Table 2 | Prominent morphological staging landmarks based on Neuwkoop and Faber guidance | Prominent Morphological Landmarks | Developmental Stage | 51 | 52 | 53 | 54 | 55 | 56 | 57 | 58 | 59 | 60 | 61 | 62 | 63 | 64 | 65 | 66 | Hindlimb | X | X | X | X | X | X | X | | | | | | | | | | Forelimb | | | | | | X | X | X | X | X | | | | | | | Craniofacial structure | | | | | | | | | | X | X | X | X | | | | Olfactory nerve morphology | | | | | | | | | | | X | X | X | | | | Tail length | | | | | | | | | | | | | X | X | X | X | 23. | For test initiation, all tadpoles should be at stage 51. The most prominent morphological staging landmark for that stage is hind limb morphology, which is demonstrated in Figure 1. | Figure 1 | Hind limb morphology of a stage 51 X. laevis tadpole | 24. | In addition to the developmental stage selection, an optional size selection of the experimental animals may be used. For this purpose, the whole body length (not SVL) should be measured at day 0 for a sub-sample of approximately 20 NF stage 51 tadpoles. After calculation of the mean whole body length for this group of animals, minimum and maximum limits for the whole body length of experimental animals can be set by allowing a range of the mean value ± 3 mm (mean values of whole body length range between 24,0 and 28,1 mm for stage 51 tadpoles). However, developmental staging is the primary parameter in determining the readiness of each test animal. Tadpoles exhibiting grossly visible malformations or injuries should be excluded from the assay. | 25. | Tadpoles that meet the stage criteria described above are held in a tank of clean culture water until the staging process is completed. Once the staging is completed, the larvae are randomly distributed to exposure treatment tanks until each tank contains 20 larvae. Each treatment tank is then inspected for animals with abnormal appearance (e.g., injuries, abnormal swimming behaviour, etc.). Overtly unhealthy looking tadpoles should be removed from the treatment tanks and replaced with larvae newly selected from the pooling tank. | Observations | 26. | For more in-depth information on test termination procedures and processing of tadpoles, refer to the OECD Guidance Document on Amphibian Thyroid Histology (9). | Day 7 Measurements | 27. | On day 7, five randomly chosen tadpoles per replicate are removed from each test tank. The random procedure used should give each organism on test equal probability of being selected. This can be achieved by using any randomising method but requires that each tadpole be netted. Tadpoles not selected are returned to the tank of origin and the selected tadpoles are humanely euthanised in 150 to 200 mg/l e.g. MS-222, appropriately buffered with sodium bicarbonate to achieve pH 7,0. The euthanised tadpoles are rinsed in water and blotted dry, followed by body weight determination to the nearest milligram. Hind limb length, snout to vent length, and developmental stage (using a binocular dissection microscope) are determined for each tadpole. | Day 21 Measurements (Test Termination) | 28. | At test termination (day 21), the remaining tadpoles are removed from the test tanks and humanely euthanised in 150 to 200 mg/l e.g. MS-222, appropriately buffered with sodium bicarbonate, as above. Tadpoles are rinsed in water and blotted dry, followed by body weight determination to the nearest milligram. Developmental stage, SVL, and hind limb lengths are measured for each tadpole. | 29. | All larvae are placed in Davidson's fixative for 48 to 72 hours either as whole body samples or as trimmed head tissue samples containing the lower jaw for histological assessments. For histopathology, a total of five tadpoles should be sampled from each replicate tank. Since follicular cell height is stage dependent (10), the most appropriate sampling approach for histological analyses is to use stage-matched individuals, whenever possible. In order to select stage-matched individuals, all larvae should first be staged prior to selection and subsequent processing for data collection and preservation. This is necessary because normal divergence in development will result in differential stage distributions within each replicate tank. | 30. | Animals selected for histopathology (n = 5 from each replicate) should be matched to the median stage of the controls (pooled replicates) whenever possible. If there are replicate tanks with more than five larvae at the appropriate stage, then five larvae are randomly selected. | 31. | If there are replicate tanks with less than five larvae at the appropriate stage, then randomly selected individuals from the next lower or upper developmental stage should be sampled to reach a total sample size of five larvae per replicate. Preferably, the decision to sample additional larvae from either the next lower or upper developmental stage should be made based on an overall evaluation of the stage distribution in the control and chemical treatments. That is, if the chemical treatment is associated with a retardation of development, then additional larvae should be sampled from the next lower stage. In turn, if the chemical treatment is associated with an acceleration of development, then additional larvae should be sampled from the next upper stage. | 32. | In cases of severe alterations of tadpole development due to treatment with a test chemical, there might be no overlap of the stage distribution in the chemical treatments with the calculated control median developmental stage. In only these cases, the selection process should be modified by using a stage different from the control median stage to achieve a stage-matched sampling of larvae for thyroid histopathology. Furthermore, if stages are indeterminate (i.e., asynchrony), then 5 tadpoles from each replicate should be randomly chosen for histological analysis. The rationale underlying sampling of any larvae that are not at a stage equivalent to the control median developmental stage should be reported. | Determination of Biological Endpoints | 33. | During the 21 day exposure phase, measurement of primary endpoints is performed on days 7 and 21, however daily observation of test animals is necessary. Table 3 provides an overview of the measurement endpoints and the corresponding observation time points. More detailed information for technical procedures for measurement of apical endpoints and histological assessments is available in the OECD guidance documents (9). | Table 3 | Observation time points for primary endpoints in the AMA | Apical Endpoints | Daily | Day 7 | Day 21 | — | Mortality | ߦ | | | — | Developmental Stage | | ߦ | ߦ | — | Hind Limb Length | | ߦ | ߦ | — | Snout-Vent Length | | ߦ | ߦ | — | Wet Body Weight | | ߦ | ߦ | — | Thyroid Gland Histology | | | ߦ | Apical Endpoints | 34. | Developmental stage, hind limb length, SVL and wet weight are the apical endpoints of the AMA, and each is briefly discussed below. Further technical information for collecting these data is available in the guidance documents referenced including procedures for computer-assisted analysis which are recommended for use. | Developmental Stage | 35. | The developmental stage of X. laevis tadpoles is determined using the staging criteria of Nieuwkoop and Faber (8). Developmental stage data are used to determine if development is accelerated, asynchronous, delayed or unaffected. Acceleration or delay of development is determined by making a comparison between the median stage achieved by the control and treated groups. Asynchronous development is reported when the tissues examined are not malformed or abnormal, but the relative timing of the morphogenesis or development of different tissues is disrupted within a single tadpole. | Hind Limb Length | 36. | Differentiation and growth of the hind limbs are under control of thyroid hormones and are major developmental landmarks already used in the determination of developmental stage. Hind limb development is used qualitatively in the determination of developmental stage, but is considered here as a quantitative endpoint. Therefore, hind limb length is measured as an endpoint to detect effects on the thyroid axis (Figure 2). For consistency, hind limb length is measured on the left hind limb. Hind limb length is evaluated both at day 7 and at day 21 of the test. On day 7, measuring hind limb length is straightforward, as illustrated in Figure 2. However, measuring hind limb length on day 21 is more complicated due to bends in the limb. Therefore, measurements of hind limb length at day 21 should originate at the body wall and follow the midline of the limb through any angular deviations. Changes in hind limb length at day 7, even if not evident at day 21, are still considered significant for potential thyroid activity. Length measurements are acquired from digital photographs using image analysis software as described in the OECD Guidance Document on Amphibian Thyroid Histology (9). | Body Length and Wet Weight | 37. | Determinations of snout to vent length (SVL) (Figure 2) and wet weight are included in the test protocol to assess possible effects of test chemicals on the growth rate of tadpoles in comparison to the control group and are useful in detecting generalised toxicity to the test chemical. Because the removal of adherent water for weight determinations can cause stressful conditions for tadpoles and may cause skin damage, these measurements are performed on the day 7 sub-sampled tadpoles and all remaining tadpoles at test termination (day 21). For consistency, use the cranial aspect of the vent as the caudal limit of the measurement. | 38. | Snout to vent length (SVL) is used to assess tadpole growth as illustrated in Figure 2. | Figure 2 | (A) Types of body length measurements and (B) Hind limb length measurements for X. laevis tadpoles (1) | Thyroid Gland Histology | 39. | While developmental stage and hind limb length are important endpoints to evaluate exposure-related changes in metamorphic development, developmental delay cannot, by itself, be considered a diagnostic indicator of anti-thyroidal activity. Some changes may only be observable by routine histopathological analysis. Diagnostic criteria include thyroid gland hypertrophy/atrophy, follicular cell hypertrophy, follicular cell hyperplasia, and as additional qualitative criteria: follicular lumen area, colloid quality and follicular cell height/shape. Severity grading (4 grades) should be reported. Information on obtaining and processing samples for histological analysis and for performing histologic analyses on tissue samples is available in “Amphibian Metamorphosis Assay: Part 1 — Technical guidance for morphologic sampling and histological preparation” and “Amphibian Metamorphosis Assay: Part 2 — Approach to reading studies, diagnostic criteria, severity grading and atlas” (9). Laboratories performing the assay for the first time(s) should seek advice from experienced pathologists for training purpose prior to undertaking histological analysis and evaluation of the thyroid gland. Overt and significant changes in apical endpoints indicating developmental acceleration or asynchrony may preclude the necessity to perform histopathological analysis of the thyroid glands. However, absence of overt morphological changes or evidence of developmental delay warrants histological analyses. | Mortality | 40. | All test tanks should be checked daily for dead tadpoles and the numbers recorded for each tank. The date, concentration and tank number for any observation of mortality should be recorded. Dead animals should be removed from the test tank as soon as observed. Mortality rates exceeding 10 % may indicate inappropriate test conditions or toxic effects of the test chemical. | Additional Observations | 41. | Cases of abnormal behaviour and grossly visible malformations and lesions should be recorded. The date, concentration and tank number for any observation of abnormal behaviour, gross malformations or lesions should be recorded. Normal behaviour is characterised by the tadpoles being suspended in the water column with tail elevated above the head, regular rhythmic tail fin beating, periodic surfacing, operculating, and being responsive to stimulus. Abnormal behaviour would include, for example, floating on the surface, lying on the bottom of the tank, inverted or irregular swimming, lack of surfacing activity, and being nonresponsive to stimulus. In addition, gross differences in food consumption between treatments should be recorded. Gross malformations and lesions could include morphological abnormalities (e.g. limb deformities), hemorrhagic lesions, bacterial or fungal infections, to name a few. These determinations are qualitative and should be considered akin to clinical signs of disease/stress and made in comparison to control animals. If the occurrence or rate of occurrence is greater in exposed tanks than in the controls, then these should be considered as evidence for overt toxicity. | DATA AND REPORTING | Data Collection | 42. | All data should be collected using electronic or manual systems which conform to good laboratory practices (GLP). Study data should include: | | Test chemical: | — | Characterisation of the test chemical: physical-chemical properties; information on stability and biodegradability; | — | Chemical information and data: method and frequency of preparation of dilutions. Test chemical information includes actual and nominal concentrations of the test chemical, and in some cases, non-parent chemical, as appropriate. Test chemical measurements may be required for stock solutions as well as for test solutions; | — | Solvent (if other than water): justification of the choice of solvent, and characterisation of solvent (nature, concentration used); | | Test conditions: | — | Operational records: these consist of observations pertaining to the functioning of the test system and the supporting environment and infrastructure. Typical records include: ambient temperature, test temperature, photoperiod, status of critical components of the exposure system (e.g. pumps, cycle counters, pressures), flow rates, water levels, stock bottle changes, and feeding records. General water quality parameters include: pH, DO, conductivity, total iodine, alkalinity, and hardness; | — | Deviations from the test method: this information should include any information or narrative descriptions of deviations from the test method; | | Results: | — | Biological observations and data: these include daily observations of mortality, food consumption, abnormal swimming behaviour, lethargy, loss of equilibrium, malformations, lesions, etc. Observations and data collected at predetermined intervals include: developmental stage, hind limb length, snout vent length, and wet weight; | — | Statistical analytical techniques and justification of techniques used; results of the statistical analysis preferably in tabular form; | — | Histological data: these include narrative descriptions, as well as graded severity and incidence scores of specific observations, as detailed in the histopathology guidance document; | — | Ad hoc observations: these observations should include narrative descriptions of the study that do not fit into the previously described categories. | Data reporting | 43. | Appendix 2 contains daily data collection spreadsheets that can be used as guidance for raw data entry and for calculations of summary statistics. Additionally, reporting tables are provided that are convenient for communicating summaries of endpoint data. Reporting tables for histological assessments can be found in Appendix 2. | Performance Criteria and Test Acceptability/Validity | 44. | Generally, gross deviations from the test method will result in unacceptable data for interpretation or reporting. Therefore, the following criteria in Table 4 have been developed as guidance for determining the quality of the test performed, the general performance of the control organisms. | Table 4 | Performance criteria for the AMA | Criterion | Acceptable limits | Test concentrations | Maintained at ≤ 20 % CV (variability of measured test concentration) over the 21 day test | Mortality in controls | ≤ 10 % — mortality in any one replicate in the controls should not exceed 2 tadpoles | Minimum median developmental stage of controls at end of test | 57 | Spread of development stage in control group | The 10th and the 90th percentile of the development stage distribution should not differ by more than 4 stages | Dissolved Oxygen | ≥ 40 % air saturation (*4) | pH | pH should be maintained between 6,5-8,5. The inter-replicate/inter-treatment differentials should not exceed 0,5. | Water temperature | 22° ± 1 °C — the inter-replicate/inter-treatment differentials should not exceed 0,5 °C | Test concentrations without overt toxicity | ≥ 2 | Replicate performance | ≤ 2 replicates across the test can be compromised | Special conditions for use of a solvent | If a carrier solvent is used, both a solvent control and clean water control should be used and results reported | Statistically significant differences between solvent control and water control groups are treated specially. See below for more information | Special conditions for static renewal system | Representative chemical analyses before and after renewal should be reported | Ammonia levels should be measured immediately prior to renewal | All water quality parameters listed in Table 1of Appendix 1 should be measured immediately prior to renewal | Renewal period should not exceed 72 hours | Appropriate feeding schedule (50 % of the daily food ration of commercial tadpole feed) | Test Validity | 45. | The following requirements should be met to deem a test acceptable/valid: | | Valid experiment in a test determined to be negative for thyroid activity: | (1) | For any given treatment (including controls), mortality cannot exceed 10 %. For any given replicate, mortality cannot exceed three tadpoles, otherwise the replicate is considered compromised | (2) | At least two treatment levels, with all four uncompromised replicates, should be available for analysis | (3) | At least two treatment levels without overt toxicity should be available for analysis | | Valid experiment in a test determined to be positive for thyroid activity: | (1) | Mortality of no more than two tadpoles/replicate in the control group can occur | Decision logic for the conduct of the AMA | 46. | Decision logic was developed for the AMA to provide logical assistance in the conduct and interpretation of the results of the bioassay (see flow chart in Figure 3). The decision logic, in essence, weighs the endpoints in that advanced development, asynchronous development and thyroid histopathology are weighed heavily, while delayed development, snout-vent length and wet body weight, parameters that can potentially be affected by general toxicity, are weighed less heavily. | Figure 3 | Decision logic for the conduct of the AMA | Advanced development (determined using developmental stage, SVL and HLL) | 47. | Advanced development is only known to occur through effects which are thyroid hormone related. These may be peripheral tissue effects such as direct interaction with the thyroid hormone receptor (such as with T4) or effects which alter circulating thyroid hormone levels. In either case, this is considered sufficient evidence to indicate that the chemical has thyroid activity. Advanced development is evaluated in one of two ways. First, the general developmental stage can be evaluated using the standardised approach detailed in Nieuwkoop and Faber (8). Second, specific morphological features may be quantified, such as hind limb length, at both days 7 and 21, which is positively associated with agonistic effects on the thyroid hormone receptor. If statistically significant advances in development or hind limb length occur, then the test indicates that the chemical is thyroid active. | 48. | The evaluation of test animals for the presence of accelerated development relative to the control population will be based on results of statistical analyses performed for the following four endpoints: | — | hind limb length (normalised by SVL) on study day 7 | — | hind limb length (normalised by SVL) on study day 21 | — | developmental stage on study day 7 | — | developmental stage on study day 21. | 49. | Statistical analyses of hind limb length should be performed based on measurements of the length of the left hind limb. Hind limb length is normalised by taking the ratio hind limb length to snout-to-vent length of an individual. The mean of the normalised values for each treatment level are then compared. Acceleration of development is then indicated by a significant increase of mean hind limb length (normalised) in a chemical treatment group compared to the control group on study day 7 and/or study day 21 (see Appendix 3). | 50. | Statistical analyses of developmental stage should be performed based on determination of developmental stages according to the morphological criteria described by Nieuwkoop and Faber (8). Acceleration of development is indicated when the multi-quantal analysis detects a significant increase of developmental stage values in a chemical treatment group compared to the control group on study day 7 and/or study day 21. | 51. | In the AMA test method, a significant effect on any of the four endpoints mentioned above is regarded sufficient for a positive detection of accelerated development. That is, significant effects on hind limb length at a specific time point do not require corroboration by significant effects on hind limb length at the alternative time point nor by significant effects on developmental stage at this specific time point. In turn, significant effects on developmental stage at a specific time point do not require corroboration by significant effects at developmental stage on the alternative time point nor by significant effects on hind limb length at this specific time point. The weight of evidence for accelerated development will nevertheless increase if significant effects are detected for more than one endpoint. | Asynchronous development (determined using developmental stage criteria) | 52. | Asynchronous development is characterised by disruption of the relative timing of the morphogenesis or development of different tissues within a single tadpole. The inability to clearly establish the developmental stage of an organism using the suite of morphological endpoints considered typical of any given stage indicates that the tissues are developing asynchronously through metamorphosis. Asynchronous development is an indicator of thyroid activity. The only known modes of action causing asynchronous development are through effects of chemicals on peripheral thyroid hormone action and/or thyroid hormone metabolism in developing tissues such as is observed with deiodinase inhibitors. | 53. | The evaluation of test animals for the presence of asynchronous development relative to the control population will be based on gross morphological assessment of test animals on study day 7 and study day 21. | 54. | The description of normal development of Xenopus laevis by Nieuwkoop and Faber (8) provides the framework for identifying a sequential order of normal tissue remodelling. The term “asynchronous development” refers specifically to those deviations in tadpole gross morphological development that disallow the definitive determination of a developmental stage according to the criteria of Nieuwkoop and Faber (8) because key morphological landmarks show characteristics of different stages. | 55. | As implicated by the term “asynchronous development”, only cases showing deviations in the progress of remodelling of specific tissues relative to the progress of remodelling of other tissues should be considered. Some classical phenotypes include delay or absence of fore limb emergence despite normal or advanced development of hind limbs and tail tissues, or the precocious resorption of gills relative to the stage of hind limb morphogenesis and tail resorption. An animal will be recorded as showing asynchronous development if it cannot be assigned to a stage because it fails to meet a majority of the landmark developmental criteria for a given Niewkoop and Faber stage (8), or if there is extreme delay or acceleration of one or more key features (e.g. tail completely resorbed, but forelimbs not emerged). This assessment is performed qualitatively and should examine the full suite of landmark features listed by Nieuwkoop and Faber (8). However it is not necessary to record the developmental state of the various landmark features of animals being observed. Animals recorded as showing asynchronous development are not assigned to a Nieuwkoop and Faber (8) development stage. | 56. | Thus, a central criterion for designating cases of abnormal morphological development as “asynchronous development” is that the relative timing of tissue remodelling and tissue morphogenesis is disrupted whereas the morphology of affected tissues is not overtly abnormal. One example to illustrate this interpretation of gross morphological abnormalities is that retarded hind limb morphogenesis relative to development of other tissues will fulfil the criterion of “asynchronous development” whereas cases showing missing hind limbs, abnormal digits (e.g. ectrodactyly, polydactyly), or other overt limb malformations should not be considered as “asynchronous development”. | 57. | In this context, the major morphological landmarks that should be evaluated for their coordinated metamorphic progress should include hind limb morphogenesis, fore limb morphogenesis, fore limb emergence, the stage of tail resorption (particularly the resorption of the tail fin), and head morphology (e.g. gill size and stage of gill resorption, lower jaw morphology, protrusion of Meckel's cartilage). | 58. | Dependent on the mode of chemical action, different gross morphological phenotypes can occur. Some classical phenotypes include delay or absence of fore limb emergence in spite of normal or advanced development of hind limbs and tail tissues, precocious gill resorption relative to hind limb and tail remodelling. | Histopathology | 59. | If the chemical does not cause overt toxicity and does not accelerate development or cause asynchronous development, then histopathology of the thyroid glands is evaluated using the appropriate guidance document (9). Developmental retardation, in the absence of toxicity, is a strong indicator of anti-thyroid activity, but the developmental stage analysis is less sensitive and less diagnostic than the histopathological analysis of the thyroid gland. Therefore, conducting histopathological analyses of the thyroid glands is required in this case. Effects on thyroid gland histology have been demonstrated in the absence of developmental effects. If changes in thyroid histopathology occur, then the chemical is considered to be thyroid active. If no developmental delays or histological lesions are observed in the thyroid glands, then the chemical is considered to be thyroid inactive. The rationale for this decision is that the thyroid gland is under the influence of TSH and any chemical which alters circulating thyroid hormone sufficiently to alter TSH secretion will result in histopathological changes in the thyroid glands. Various modes and mechanisms of action can alter circulating thyroid hormone. So, while thyroid hormone level is indicative of a thyroid related effect, it is insufficient to determine which mode or mechanism of action is related to the response. | 60. | Because this endpoint is not amenable to basic statistical approaches, the determination of an effect associated with exposure to a chemical shall be made through expert opinion by a pathologist. | Delayed development (determined using developmental stage, HLL, BW, SVL) | 61. | Delayed development can occur through anti-thyroidal mechanisms and through indirect toxicity. Mild developmental delays coupled with overt signs of toxicity likely indicate a non-specific toxic effect. Evaluation of non-thyroidal toxicity is an essential element of the test to reduce the probability of false positive outcomes. Excessive mortality is an obvious indication that other toxic mechanisms are occurring. Similarly, mild reductions in growth, as determined by wet weight and/or SVL length, also suggest non-thyroidal toxicity. Apparent increases in growth are commonly observed with chemicals that negatively affect normal development. Consequently, the presence of larger animals does not necessarily indicate non-thyroidal toxicity. However, growth should never be solely relied upon to determine thyroid toxicity. Rather, growth, in conjunction with developmental stage and thyroid histopathology, should be used to determine thyroid activity. Other endpoints should also be considered in determining overt toxicity including oedema, haemorrhagic lesions, lethargy, reduced food consumption, erratic/altered swimming behaviour, etc. If all test concentrations exhibit signs of overt toxicity, the test chemical should be re-evaluated at lower test concentrations before determining whether the chemical is potentially thyroid active or thyroid inactive. | 62. | Statistically significant developmental delays, in absence of other signs of overt toxicity, indicate that the chemical is thyroid active (antagonistic). In the absence of strong statistical responses, this outcome may be augmented with results from thyroid histopathology. | Statistical analyses | 63. | Statistical analyses of the data should preferably follow procedures described in the document Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application (11). For all continuous quantitative endpoints (HLL, SVL, wet weight) consistent with a monotone dose-response, the Jonckheere-Terpstra test should be applied in step-down manner to establish a significant treatment effect. | 64. | For continuous endpoints that are not consistent with a monotone dose-response, the data should be assessed for normality (preferably using the Shapiro-Wilk or Anderson-Darling test) and variance homogeneity (preferably using the Levene test). Both tests are performed on the residuals from an ANOVA. Expert judgment can be used in lieu of these formal tests for normality and variance homogeneity, though formal tests are preferred. Where non-normality or variance heterogeneity is found, a normalising, variance stabilising transformation should be sought. If the data (perhaps after a transformation) are normally distributed with homogeneous variance, a significant treatment effect is determined from Dunnett's test. If the data (perhaps after a transformation) are normally distributed with heterogeneous variance, a significant treatment effect is determined from the Tamhane-Dunnett or T3 test or from the Mann-Whitney-Wilcoxon U test. Where no normalising transformation can be found, a significant treatment effect is determined from the Mann-Whitney-Wilcoxon U test using a Bonferroni-Holm adjustment to the p-values. The Dunnett test is applied independently of any ANOVA F-test and the Mann-Whitney test is applied independently of any overall Kruskall-Wallis test. | 65. | Significant mortality is not expected but should be assessed from the step-down Cochran-Armitage test where the data are consistent with dose-response monotonicity, and otherwise from Fisher's Exact test with a Bonferroni-Holm adjustment. | 66. | A significant treatment effect for developmental stage is determined from the step-down application of the Jonckheere-Terpstra test applied to the replicate medians. Alternatively, and preferably, the multi-quantal Jonckheere test from the 20th to the 80th percentile should be used for effect determination, as it takes into account changes to the distribution profile. | 67. | The appropriate unit of analysis is the replicate so the data consist of replicate medians if the Jonckheere-Terpstra or Mann-Whitney U test is used, or the replicate means if Dunnett's test is used. Dose-response monotonicity can be assessed visually from the replicate and treatment means or medians or from formal tests such as previously described (11). With fewer than five replicates per treatment or control, the exact permutation versions of the Jonckheere-Terpstra and Mann-Whitney tests should be used if available. The statistical significance of all tests indicated is judged at the 0,05 significance level. | 68. | Figure 4 is a flow-chart for performing statistical tests on continuous data. | Figure 4 | Flow-chart for statistical approaches for continuous response data | Special data analysis considerations | Use of compromised treatment levels | 69. | Several factors are considered when determining whether a replicate or entire treatment demonstrates overt toxicity and should be removed from analysis. Overt toxicity is defined as > 2 mortalities in any replicate that can only be explained by toxicity rather than technical error. Other signs of overt toxicity include haemorrhage, abnormal behaviours, abnormal swimming patterns, anorexia and any other clinical signs of disease. For sub-lethal signs of toxicity, qualitative evaluations may be necessary, and should always be made in reference to the clean water control group. | Solvent controls | 70. | The use of a solvent should only be considered as a last resort, when all other chemical delivery options have been considered. If a solvent is used, then a clean water control should be run in concert. At the termination of the test, an evaluation of the potential effects of the solvent should be performed. This is done through a statistical comparison of the solvent control group and the clean water control group. The most relevant endpoints for consideration in this analysis are developmental stage, SVL and wet weight, as these can be affected through non-thyroidal toxicities. If statistically significant differences are detected in these endpoints between the clean water control and solvent control groups, determine the study endpoints for the response measures using the clean water control. If there is no statistically significant difference between the clean water control and solvent control for all measured response variables, determine the study endpoints for the response measures using the pooled dilution-water and solvent controls. | Treatment groups achieving developmental stage 60 and above | 71. | After stage 60, tadpoles show a reduction in size and weight due to tissue resorption and reduction of absolute water content. Thus, measurements of wet weight and SVL cannot appropriately be used in statistical analyses for differences in growth rates. Therefore, wet weight and length data from organisms > NF60 should be censored and cannot be used in analyses of replicate means or replicate medians. Two different approaches could be used to analyse these growth-related parameters. | 72. | One approach is to consider only tadpoles with developmental stages lower or equal to stage 60 for the statistical analyses of wet weight and/or SVL. This approach is believed to provide sufficiently robust information about the severity of possible growth effects as long as only a small proportion of test animals are removed from the analyses (≤ 20 %). If an increased number of tadpoles show development beyond stage 60 (≥ 20 %) in one or more nominal concentration(s), then a two-factor ANOVA with a nested variance structure should be undertaken on all tadpoles to assess growth effects due to chemical treatments while taking into account the effect of late stage development on growth. Appendix 3 provides guidance on the two-factor ANOVA analysis of weight and length.. | LITERATURE | (1) | OECD (2004) Report of the Validation of the Amphibian Metamorphosis Assay for the detection of thyroid active substances: Phase 1 — Optimisation of the Test Protocol. Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment. No. 77, Paris. | (2) | OECD (2007) Final Report of the Validation of the Amphibian Metamorphosis Assay: Phase 2 — Multi-chemical Interlaboratory Study. Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment. No. 76. Paris | (3) | OECD (2008) Report of the Validation Peer Review for the Amphibian Metamorphosis Assay and Agreement of the Working Group of the National Coordinators of the Test Guidelines Programme on the Follow-up of this Report. Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment. No. 92. Paris | (4) | OECD (2000) Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment. No. 23. Paris | (5) | ASTM (2002) Standard Guide for Conducting Acute Toxicity Tests on Test Materials with Fishes, Macroinvertebrates, and Amphibians. American Society for Testing and Materials, ASTM E729-96(2002), Philadelpia, PA | (6) | ASTM (2004) Standard Guide for Conducting the Frog Embryo Teratogenesis Assay — Xenopus (FETAX). E 1439-98 | (7) | Kahl,M.D., Russom,C.L., DeFoe,D.L. & Hammermeister,D.E. (1999) Saturation units for use in aquatic bioassays. Chemosphere 39, pp. 539-551 | (8) | Nieuwkoop,P.D. & Faber,J. (1994) Normal Table of Xenopus laevis. Garland Publishing, New York | (9) | OECD (2007) Guidance Document on Amphibian Thyroid Histology. Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment. No. 82. Paris | (10) | Dodd,M.H.I. & Dodd,J.M. (1976) Physiology of Amphibia. Lofts,B. (ed.), Academic Press, New York, pp. 467-599 | (11) | OECD (2006) Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application. Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment, No. 54. Paris | (12) | Hutchinson TH, Shillabeer N, Winter MJ, Pickford DB, 2006. Acute and chronic effects of carrier solvents in aquatic organisms: A critical review. Review. Aquatic Toxicology, 76; pp.69–92. | Appendix 1 | Table 1 | Experimental Conditions for the 21-day Amphibian Metamorphosis Assay | Test Animal | Xenopus laevis larvae | Initial Larval Stage | Nieuwkoop and Faber stage 51 | Exposure Period | 21 days | Larvae Selection Criteria | Developmental stage and total length (optional) | Test Concentrations | Minimum of 3 concentrations spanning approximately one order of magnitude | Exposure Regime | Flow-through (preferred) and/or static-renewal | Test System Flow-Rate | 25 ml/min (complete volume replacement ca. every 2,7 h) | Primary Endpoints/Determination Days | Mortality | Daily | Developmental Stage | D 7 and 21 | Hind Limb Length | D 7 and 21 | Snout-Vent Length | D 7 and 21 | Wet Body Weight | D 7 and 21 | Thyroid Histology | D 21 | Dilution Water/Laboratory Control | Dechlorinated tap water (charcoal-filtered) or the equivalent laboratory source | Larval Density | 20 larvae/test vessel (5/l) | Test Solution/Test Vessel | 4-10 l (10-15 cm minimum water)/Glass or Stainless Steel test vessel (e.g., 22,5 cm × 14 cm × 16,5 cm) | Replication | 4 replicate test vessels/test concentration and control | Acceptable Mortality Rate in Controls | ≤ 10 % per replicate test vessel | Thyroid Fixation | Number Fixed | All tadpoles (5/replicate are evaluated initially) | Region | Head or whole body | Fixation Fluid | Davidson's fixative | Feeding | Food | Sera Micron® or equivalent | Amount/Frequency | See Table 1 for feeding regime using Sera Micron® | Lighting | Photoperiod | 12 h Light: 12 h dark | Intensity | 600 to 2 000 lux (Measured at Water Surface) | Water Temperature | 22° ± 1 °C | pH | 6,5 — 8,5 | Dissolved Oxygen (DO) Concentration | > 3,5 mg/l (> 40 % Air Saturation) | Analytical Chemistry Sample Schedule | Once/Week (4 Sample Events/Test) | Appendix 2 | Reporting tables for raw data and summary data | Table 1 | General test chemical information | Chemical information | | Enter test chemical, concentration units, and treatments | | Test chemical: | | | | Concentration units: | | | | Treatment 1 | | | | Treatment 2 | | | | Treatment 3 | | | | Treatment 4 | | | | | | | | Date (day 0): | | Enter date (mm/dd/yy) | | Date (day 7): | | Enter date (mm/dd/yy) | | Date (day 21): | | Enter date (mm/dd/yy) | Table 2 | Raw data collection sheets for days 7 and 21 | DAY X | DATE 00/00/00 | | Concentration | Treatment Number | Replicate Number | Individual number | Individual Idendifier | Developmental Stage | SVL Length (mm) | Hindlimb Length (mm) | Whole Organism wet weight (mg) | ROW | TRT | TRT# | REP | IND | ID# | STAGE | BL | HLL | WEIGHT | 1 | 0,00 | 1 | | | | | | | | 2 | 0,00 | 1 | | | | | | | | 3 | 0,00 | 1 | | | | | | | | 4 | 0,00 | 1 | | | | | | | | 5 | 0,00 | 1 | | | | | | | | 6 | 0,00 | 1 | | | | | | | | 7 | 0,00 | 1 | | | | | | | | 8 | 0,00 | 1 | | | | | | | | 9 | 0,00 | 1 | | | | | | | | 10 | 0,00 | 1 | | | | | | | | 11 | 0,00 | 1 | | | | | | | | 12 | 0,00 | 1 | | | | | | | | 13 | 0,00 | 1 | | | | | | | | 14 | 0,00 | 1 | | | | | | | | 15 | 0,00 | 1 | | | | | | | | 16 | 0,00 | 1 | | | | | | | | 17 | 0,00 | 1 | | | | | | | | 18 | 0,00 | 1 | | | | | | | | 19 | 0,00 | 1 | | | | | | | | 20 | 0,00 | 1 | | | | | | | | 21 | 0,00 | 2 | | | | | | | | 22 | 0,00 | 2 | | | | | | | | 23 | 0,00 | 2 | | | | | | | | 24 | 0,00 | 2 | | | | | | | | 25 | 0,00 | 2 | | | | | | | | 26 | 0,00 | 2 | | | | | | | | 27 | 0,00 | 2 | | | | | | | | 28 | 0,00 | 2 | | | | | | | | 29 | 0,00 | 2 | | | | | | | | 30 | 0,00 | 2 | | | | | | | | 31 | 0,00 | 2 | | | | | | | | 32 | 0,00 | 2 | | | | | | | | 33 | 0,00 | 2 | | | | | | | | 34 | 0,00 | 2 | | | | | | | | 35 | 0,00 | 2 | | | | | | | | 36 | 0,00 | 2 | | | | | | | | 37 | 0,00 | 2 | | | | | | | | 38 | 0,00 | 2 | | | | | | | | 39 | 0,00 | 2 | | | | | | | | 40 | 0,00 | 2 | | | | | | | | 41 | 0,00 | 3 | | | | | | | | 42 | 0,00 | 3 | | | | | | | | 43 | 0,00 | 3 | | | | | | | | 44 | 0,00 | 3 | | | | | | | | 45 | 0,00 | 3 | | | | | | | | 46 | 0,00 | 3 | | | | | | | | 47 | 0,00 | 3 | | | | | | | | 48 | 0,00 | 3 | | | | | | | | 49 | 0,00 | 3 | | | | | | | | 50 | 0,00 | 3 | | | | | | | | 51 | 0,00 | 3 | | | | | | | | 52 | 0,00 | 3 | | | | | | | | 53 | 0,00 | 3 | | | | | | | | 54 | 0,00 | 3 | | | | | | | | 55 | 0,00 | 3 | | | | | | | | 56 | 0,00 | 3 | | | | | | | | 57 | 0,00 | 3 | | | | | | | | 58 | 0,00 | 3 | | | | | | | | 59 | 0,00 | 3 | | | | | | | | 60 | 0,00 | 3 | | | | | | | | 61 | 0,00 | 4 | | | | | | | | 62 | 0,00 | 4 | | | | | | | | 63 | 0,00 | 4 | | | | | | | | 64 | 0,00 | 4 | | | | | | | | 65 | 0,00 | 4 | | | | | | | | 66 | 0,00 | 4 | | | | | | | | 67 | 0,00 | 4 | | | | | | | | 68 | 0,00 | 4 | | | | | | | | 69 | 0,00 | 4 | | | | | | | | 70 | 0,00 | 4 | | | | | | | | 71 | 0,00 | 4 | | | | | | | | 72 | 0,00 | 4 | | | | | | | | 73 | 0,00 | 4 | | | | | | | | 74 | 0,00 | 4 | | | | | | | | 75 | 0,00 | 4 | | | | | | | | 76 | 0,00 | 4 | | | | | | | | 77 | 0,00 | 4 | | | | | | | | 78 | 0,00 | 4 | | | | | | | | 79 | 0,00 | 4 | | | | | | | | 80 | 0,00 | 4 | | | | | | | | Table 3 | Calculated summaries for endpoint data from days 7 and 21 | | | Developmental Stage | SVL (mm) | Hindlimb Length (mm) | Weight (mg) | TRT | REP | MIN | MEDIAN | MAX | MEAN | STD DEV | MEAN | STD DEV | MEAN | STD DEV | 1 | 1 | 0 | #NUM! | 0 | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | 1 | 2 | 0 | #NUM! | 0 | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | 1 | 3 | 0 | #NUM! | 0 | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | 1 | 4 | 0 | #NUM! | 0 | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | 2 | 1 | 0 | #NUM! | 0 | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | 2 | 2 | 0 | #NUM! | 0 | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | 2 | 3 | 0 | #NUM! | 0 | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | 2 | 4 | 0 | #NUM! | 0 | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | 3 | 1 | 0 | #NUM! | 0 | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | 3 | 2 | 0 | #NUM! | 0 | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | 3 | 3 | 0 | #NUM! | 0 | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | 3 | 4 | 0 | #NUM! | 0 | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | 4 | 1 | 0 | #NUM! | 0 | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | 4 | 2 | 0 | #NUM! | 0 | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | 4 | 3 | 0 | #NUM! | 0 | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | 4 | 4 | 0 | #NUM! | 0 | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | Note: Cell calculations are associated with data entries into Table 2. | Table 4 | Daily mortality data | Test Day | Date | 1 | 2 | 3 | 4 | 1 | 2 | 3 | 4 | 1 | 2 | 3 | 4 | 1 | 2 | 3 | 4 | 0 | 00/00/00 | | | | | | | | | | | | | | | | | 1 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | 2 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | 3 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | 4 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | 5 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | 6 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | 7 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | 8 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | 9 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | 10 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | 11 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | 12 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | 13 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | 14 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | 15 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | 16 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | 17 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | 18 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | 19 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | 20 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | 21 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | Replicate count | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | Treatment Count | 0 | | | | 0 | | | | 0 | | | | 0 | | | | Note: Cell calculations are associated with data entries into Table 1. | Table 5 | Water Quality Criteria | Exposure System (flow-through/static renewal): | Temperature: | Light intensity: | Light-dark cycle: | Food: | Feeding rate: | water pH: | Iodine concentration in test water: | Table 6 | Summary chemistry data | Chemical Name: | Cas #: | Test Day | Date | 1 | 2 | 3 | 4 | 1 | 2 | 3 | 4 | 1 | 2 | 3 | 4 | 1 | 2 | 3 | 4 | 1 | 2 | 3 | 4 | 0 | 00/00/00 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | 1 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | 2 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | 3 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | 4 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | 5 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | 6 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | 7 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | 8 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | 9 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | 10 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | 11 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | 12 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | 13 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | 14 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | 15 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | 16 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | 17 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | 18 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | 19 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | 20 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | 21 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | Note: Cell calculations are associated with data entries into Table 1. | Table 7 | Histopathology reporting tables for core criteria | Date: | Chemical: | | | Pathologist: | | Thyroid gland hypertrophy | Thyroid gland atrophy | Follicular cell hypertrophy | Follicular cell hyperplasia | | Thyroid gland hypertrophy | Thyroid gland atrophy | Follicular cell hypertrophy | Follicular cell hyperplasia | Control Animal ID — replicate 1 | | | | | | Dose Animal ID — replicate 1 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | Control Animal ID — replicate 2 | | | | | | Dose Animal ID — replicate 2 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | Total: | | | | | Total: | | | | | | Thyroid gland hypertrophy | Thyroid gland atrophy | Follicular cell hypertrophy | Follicular cell hyperplasia | | | Thyroid gland hypertrophy | Thyroid gland atrophy | Follicular cell hypertrophy | Follicular cell hyperplasia | Dose Animal ID — replicate 1 | | | | | | Dose Animal ID — replicate 1 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | Dose Animal ID — replicate 2 | | | | | | Dose Animal ID — replicate 2 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | Total: | | | | | Total: | | | | | Table 8 | Additional histopathology criteria | Date: | Chemical: | | | Pathologist: | | | | | | | Follicular lumen area increase | Follicular lumen area decrease | Follicular lumen area increase | Follicular lumen area decrease | Control Animal ID — replicate 1 | | | | Dose Animal ID — replicate 1 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | Control Animal ID — replicate 2 | | | | Dose Animal ID — replicate 2 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | Total: | | | Total: | | | | Follicular lumen area increase | Follicular lumen area decrease | | | Follicular lumen area increase | Follicular lumen area decrease | Dose Animal ID — replicate 1 | | | | Dose Animal ID — replicate 1 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | Dose Animal ID — replicate 2 | | | | Dose Animal ID — replicate 2 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | Total: | | | Total: | | | Table 9 | Narrative descriptions for histopathological findings | Date: | Chemical: | Pathologist: | | Narrative description | Control Animal ID — replicate 1 | | | | | | | | | | | Control Animal ID — replicate 2 | | | | | | | | | | | | Dose Animal ID — replicate 1 | | | | | | | | | | | Dose Animal ID — replicate 2 | | | | | | | | | | | | Dose Animal ID — replicate 1 | | | | | | | | | | | Dose Animal ID — replicate 2 | | | | | | | | | | | | | Dose Animal ID — replicate 1 | | | | | | | | | | | Dose Animal ID — replicate 2 | | | | | | | | | | | Table 10 | Summary reporting table template for day x (7 or 21) of the AMA | | | Control | Dose 1 | Dose 2 | Dose 3 | Endpoint | Replicate | Mean | SD | CV | N | Mean | SD | CV | N | p-value | Mean | SD | CV | N | p-value | Mean | SD | CV | N | p-value | Hind Limb Length | (mm) | 1 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | 2 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | 3 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | 4 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | Mean: | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | SVL | (mm) | 1 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | 2 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | 3 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | 4 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | Mean: | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | Wet weight | (mg) | 1 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | 2 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | 3 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | 4 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | Mean: | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | Table 11 | Summary reporting table template for day x (7 or 21) developmental stage data for the AMA | | | Control | Dose 1 | Dose 2 | Dose 3 | | Replicate | Median | Min | Max | N | Median | Min | Max | N | p-value | Median | Min | Max | N | p-value | Median | Min | Max | Median | p-value | Developmental Stage | 1 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | 2 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | 3 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | 4 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | Mean: | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | Appendix 3 | Alternative Analysis of weight and length in the case of late stage development exceeding 20 % of tadpoles in one or more concentration(s) | If an increased number of tadpoles show development beyond stage 60 (≥ 20 %) in one or more nominal concentration(s), then a two-factor ANOVA with a nested variance structure should be undertaken on all tadpoles to assess growth effects due to chemical treatments while taking into account the effect of late stage development on growth. | The proposal is to use all data but take into account the effect of late stage development. This can be done with a two-factor ANOVA with a nested variance structure. Define LateStage = ’Yes’ for an animal if its developmental stage is 61 or greater. Otherwise, define LateStage = ’No’. Then a two-factor ANOVA with concentration and LateStage and their interaction can be done, with Rep(Conc) a random factor and Tadpole(Rep) another random effect. This still treats the rep as the unit of analysis and gives essentially the same results as a weighted analysis of rep*latestage means, weighted by the number of animals per mean. If the data violate the normality or variance homogeneity requirements of ANOVA, then a normalised rank-order transform can be done to remove that objection. | In addition to the standard ANOVA F-tests for the effects of Conc, LateStage, and their interactions, the interaction F-test can be “sliced” into two additional ANOVA F-test, one on the mean responses across concentrations for LateStage = ’No’ and another on the mean responses across concentrations for LateStage = ’Yes’. Further comparisons of treatment means against control are done within each level of LateStage. A trend-type analysis can be done using appropriate contrasts or simple pairwise comparisons can be done if there is evidence of non-monotone dose-response within a level of the LateStage variable. A Bonferroni-Holm adjustment to the p-values is made only if the corresponding F-slice is not significant. This can be done in SAS and, presumably, other statistical software packages. Complications can arise when there are no late stage animals in some concentrations, but these situations can be handled in a straight-forward fashion. | Appendix 4 | Definitions | Chemical : A substance or a mixture | Test chemical : Any substance or mixture tested using this test method | C.39. COLLEMBOLAN REPRODUCTION TEST IN SOIL | INTRODUCTION | 1. | This test method is equivalent to OECD test guideline (TG) 232 (2009). This test method is designed for assessing the effects of chemicals on the reproductive output of the collembolans in soil. It is based on existing procedures (1) (2). The parthenogenetic Folsomia candida and sexually reproducing Folsomia fimetaria are two of the most accessible species of Collembola, and they are culturable and commercially available. When specific habitats not covered by the two species need to be assessed the procedure is extensible also to other species of Collembola if they are able to fulfil the validity criteria of the test. | 2. | Soil-dwelling Collembola are ecologically relevant species for ecotoxicological testing. Collembolans are hexapods with a thin exoskeleton highly permeable to air and water, and represent arthropod species with a different route and a different rate of exposure compared to earthworms and enchytraeids. | 3. | Population densities of Collembola commonly reach 105 m– 2 in soil and leaf litter layers in many terrestrial ecosystems (3) (4). Adults typically measure 0,5 - 5 mm, their contribution to total soil animal biomass and respiration is low, estimated between 1 % and 5 % (5). Their most important role may therefore be as potential regulators of processes through microbivory and microfauna predation. Springtails are prey animals for a wide variety of endogeic and epigeic invertebrates, such as mites, centipedes, spiders, Carabidae and rove beetles. Collembola contribute to decomposition processes in acidic soils where they may be the most important soil invertebrates besides enchytraeids, since earthworms and diplopods are typically absent. | 4. | F. fimetaria has a worldwide distribution and is common in several soil types ranging from sandy to loamy soils and from mull to mor soils. It is an eyeless, unpigmented collembolan. It has been recorded in agricultural soils all over Europe (6). It has an omnivorous feeding habit, including fungal hyphae, bacteria, protozoa and detritus in its food. It interacts through grazing with infections of plant pathogenic fungi (7) and may influence mycorrhiza, as is known to be the case for F. candida. As most collembolan species it reproduces sexually requiring the permanent presence of males for egg fertilisation. | 5. | F. candida is also distributed worldwide. Although it is not common in most natural soils, it often occurs in very high numbers in humus rich sites. It is an eyeless, unpigmented collembolan. It has a well-developed furca (jumping organ) and an active running movement and jumps readily if disturbed. The ecological role of F. candida is similar to the role of F. fimetaria, but the habitats are more organic rich soils. It reproduces parthenogenetically. Males may occur at less than 1 per thousand. | PRINCIPLE OF THE TEST | 6. | Synchronous adult (F. fimetaria) or juvenile (F. candida) Collembola are exposed to a range of concentrations of the test chemical mixed into a modified artificial soil (8) using a 5 % organic matter content (or an alternative soil). The test scenario can be divided into two steps: | — | A range-finding test, in case no sufficient information on toxicity is available, in which mortality and reproduction are the main endpoints assessed after 2 weeks for F. fimetaria and 3 weeks for F. candida. | — | A definitive reproduction test in which the total number of juveniles produced by parent animals and the survival of parent animals are assessed. The duration of this definitive test is 3 weeks for F. fimetaria or 4 weeks for F. candida. | The toxic effect of the test chemical on adult mortality and reproductive output is expressed as LCx and ECx by fitting the data to an appropriate model by non-linear regression to estimate the concentration that would cause x % mortality or reduction in reproductive output, respectively, or alternatively as the NOEC/LOEC value (9). | INFORMATION ON THE TEST CHEMICAL | 7. | The physical properties, water solubility, the log Kow, the soil water partition coefficient and the vapour pressure of the test chemical should preferably be known. Additional information on the fate of the test chemical in soil, such as the rates of photolysis and hydrolysis and biotic degradation, is desirable. Chemical identification of the test chemical according to IUPAC nomenclature, CAS-number, batch, lot, structural formula and purity should be documented when available. | 8. | This Test Method can be used for water soluble or insoluble chemicals. However, the mode of application of the test chemical will differ accordingly. The test method is not applicable to volatile chemicals, i.e. chemicals for which the Henry's constant or the air/water partition coefficient is greater than one, or chemicals for which the vapour pressure exceeds 0,0133 Pa at 25 °C. | VALIDITY OF THE TEST | 9. | The following criteria should be satisfied in the untreated controls for a test result to be considered valid: | — | Mean adult mortality should not exceed 20 % at the end of the test; | — | The mean number of juveniles per vessel should be at least 100 at the end of the test; | — | The coefficient of variation calculated for the number of juveniles should be less than 30 % at the end of the definitive test. | REFERENCE CHEMICAL | 10. | A reference chemical should be tested at its EC50 concentration for the chosen test soil type either at regular intervals or possibly included in each test run to verify that the response of the test organisms in the test system are within the normal level. A suitable reference chemical is boric acid, which should reduce reproduction by 50 % (10) (11) at about 100 mg/kg dry weight soil for both species. | DESCRIPTION OF THE TEST | Test vessels and equipment | 11. | Containers capable of holding 30 g of moist soil are suitable test vessels. The material should either be glass or inert plastic (non-toxic). However, using plastic containers should be avoided if the test chemical exposure is decreased due to sorption. The test vessels should have a cross-sectional area allowing the actual soil depth within the test vessel to be 2-4 cm. The vessels should have lids (e.g. glass or polyethylene) that are designed to reduce water evaporation whilst allowing gas exchange between the soil and the atmosphere. The container should be at least partly transparent to allow light transmission. | 12. | Normal laboratory equipment is required, specifically the following: | — | drying cabinet; | — | stereo microscope; | — | pH-meter and luxmeter; | — | suitable accurate balances; | — | adequate equipment for temperature control; | — | adequate equipment for air humidity control (not essential if exposure vessels are covered by lids); | — | temperature-controlled incubator or small room; | — | forceps or a low-suction air flow device. | Preparation of the test soil | 13. | A modified artificial soil (8) is used with an organic matter content of 5 %. Alternatively a natural soil could be used, as the artificial soil does not resemble natural soils. The recommended composition of the artificial soil is as follows (based on dry weights, dried to a constant weight at 105 °C): | — | 5 % sphagnum peat, air-dried and finely ground (a particle size of 2 ± 1 mm is acceptable); | — | 20 % kaolin clay (kaolinite content preferably above 30 %); | — | approximately 74 % air-dried industrial sand (depending on the amount of CaCO3 needed), predominantly fine sand with more than 50 % of the particles between 50 and 200 microns. The exact amount of sand depends on the amount of CaCO3 (see below), together they should add up to 75 %. | — | 1,0 % calcium carbonate (CaCO3, pulverised, analytical grade) to obtain a pH of 6,0 ± 0,5; the amount of calcium carbonate to be added may depend principally on the quality/nature of the peat (see Note 1). | Note 1: The amount of CaCO3 required will depend on the components of the soil substrate and should be determined by measuring the pH of pre-incubated moist soil sub-samples immediately before the test. | Note 2: It is recommended to measure the pH and optionally the C/N ratio, Cation Exchange Capacity (CEC) and organic matter content of the soil in order to enable a normalisation at a later stage and to better interpret the results. | Note 3: If required, e.g. for specific testing purposes, natural soils from unpolluted sites may also serve as test and/or culture substrate. However, if natural soil is used, it should be characterised at least by origin (collection site), pH, texture (particle size distribution), CEC and organic matter content and it should be free from any contamination. For natural soil it is advisable to demonstrate its suitability for a test and for achieving the test validity criteria before using the soil in a definitive test. | 14. | The dry constituents of the soil are mixed thoroughly (e.g. in a large-scale laboratory mixer). The maximum water holding capacity (WHC) of the artificial soil is determined in accordance with procedures described in Appendix 5. The moisture content of the testing soil should be optimised to attain a loose porous soil structure allowing collembolans to enter into the pores. This is usually between 40-60 % of the maximum WHC. | 15. | The dry artificial soil is pre-moistened by adding enough de-ionised water to obtain approximately half of the final water content 2-7 days before the test start, in order to equilibrate/stabilise the acidity. For the determination of pH a mixture of soil and 1 M potassium chloride (KCl) or 0,01 M calcium chloride (CaCl2) solution in a 1:5 ratio is used (according to Appendix 6). If the soil is more acidic than the required range, it can be adjusted by addition of an appropriate amount of CaCO3. If the soil is too alkaline it can be adjusted by the addition of an inorganic acid harmless to collembolans. | 16. | The pre-moistened soil is divided into portions corresponding to the number of test concentrations (and reference chemical where appropriate) and controls used for the test. The test chemicals are added and the water content is regulated according to the paragraph 24. | Selection and preparation of test animals | 17. | The parthenogenetic F. candida is the recommended species, as in the ring testing of the test method (11) this species met the validity criteria for survival more often than F. fimetaria. If an alternative species is used, it should meet the validity criteria outlined in paragraph 9. At the start of the test the animals should be well fed and the age between 23-26 days for F. fimetaria and 9-12 days for F. candida. For each replicate, the number of F. fimetaria should be 10 males and 10 females, and for F. candida 10 females should be used (see Appendix 2 and Appendix 3). The synchronous animals are selected randomly from the dishes and their health and physical condition is checked for each batch added to a replicate. Each group of 10/20 individuals is added to a randomly selected test container and the big females of F. fimetaria are selected to ensure a proper distinction from the F. fimetaria males. | Preparation of test concentrations | 18. | Four methods of application of the test chemical can be used: 1) mixing the test chemical into the soil with water as a carrier, 2) mixing the test chemical into the soil with an organic solvent as a carrier, 3) mixing the test chemical into the soil with sand as a carrier, or 4) application of the test chemical onto the soil surface. The selection of the appropriate method depends on the characteristic of the chemical and the purpose of the test. In general, mixing of the test chemical into the soil is recommended. However, application procedures that are consistent with the practical use of the test chemical may be required (e.g. spraying of liquid formulation or use of special pesticide formulations such as granules or seed dressings). The soil is treated before the collembolans are added, except when the test chemical is added to the soil surface collembolans should be allowed to enter the soil. | Test chemical soluble in water | 19. | A solution of the test chemical is prepared in deionised water in a quantity sufficient for all replicates of one test concentration. Each solution of test chemical is mixed thoroughly with one batch of pre-moistened soil before being introduced into the test vessel. | Test chemical insoluble in water | 20. | For chemicals insoluble in water, but soluble in organic solvents, the test chemical can be dissolved in the smallest possible volume of a suitable solvent (e.g. acetone) still ensuring proper mixing of the chemical in the soil and mixing it with a portion of the quartz sand required. Only volatile solvents should be used. When an organic solvent is used, all test concentrations and an additional solvent negative control should contain the same minimum amount of the solvent. Application containers should be left uncovered for a certain period to allow the solvent associated with the application of the test chemical to evaporate, ensuring no dissipation of the toxic chemical during this time. | Test chemical poorly soluble in water and organic solvents | 21. | For chemicals that are poorly soluble in water and organic solvents, quartz sand, which should be a part of the total sand added to the soil, is mixed with the quantity of test chemical to obtain the desired test concentration. This mixture of quartz sand and test chemical is added to the pre-moistened soil and thoroughly mixed after adding an appropriate amount of deionised water to obtain the required moisture content. The final mixture is divided between the test vessels. The procedure is repeated for each test concentration and an appropriate control is also prepared. | Application of the test chemical onto the soil surface | 22. | When the test chemical is a pesticide, it may be appropriate to apply it onto the soil surface by spraying. The soil is treated after the collembolans are added. The test containers are first filled with the moistened soil substrate, and the animals added and then the test containers are weighted. In order to avoid any direct exposure of the animals with the test chemical by direct contact, the test chemical is applied at least half an hour after introducing the Collembola. The test chemical should be applied to the surface of the soil as evenly as possible using a suitable laboratory-scale spraying device to simulate spray application in the field. The application should take place at a temperature within ± 2 °C of variation and for aqueous solutions, emulsions or dispersions at a water application rate according to the risk assessment recommendations. The rate should be verified using an appropriate calibration technique. Special formulations like granules or seed dressings could be applied in a manner consistent with agricultural use. Food is added after spraying. | PROCEDURE | Test conditions | 23. | The test mean temperature should be 20 ± 1 °C with a temperature range of 20 ± 2 °C. The test is carried out under controlled light-dark cycles (preferably 12 hours light and 12 hours dark) with illumination of 400 to 800 lux in the area of the test vessels. | 24. | In order to check the soil humidity, the vessels are weighed at the beginning, in the middle and at the end of the test. Weight loss > 2 % is replenished by the addition of de-ionised water. It should be noted that loss of water can be reduced by maintaining a high air-humidity (> 80 %) in the test incubator. | 25. | The pH should be measured at the beginning and the end of both the range-finding test and the definitive test. Measurements should be made in one extra control sample and one extra sample of the treated (all concentrations) soil samples prepared and maintained in the same way as the test cultures, but without addition of the collembolans. | Test procedure and measurements | 26. | For each test concentration, an amount of test soil corresponding to 30 g fresh weight is placed into the test vessel. Water controls, without the test chemical, are also prepared. If a vehicle is used for application of the test chemical, one control series containing the vehicle alone should be run in addition to the test series. The solvent or dispersant concentration should be the same as that used in the test vessels containing the test chemical. | 27. | The individual springtails are carefully transferred into each test vessel (allocated randomly to the test vessels) and placed onto the surface of the soil. For efficient transfer of the animals, a low-suction air flow device can be used. The number of replicates for test concentrations and for controls depends on the test design used. The test vessels are positioned randomly in the test incubator and these positions are re-randomised weekly. | 28. | For the F. fimetaria test twenty adults, 10 males and 10 females, 23-26 days old should be used per test-vessel. On day 21 collembolans are extracted from the soil and counted. For F. fimetaria the gender are discriminated by size in the synchronised animal batch used for the test. Females are distinctively larger than the males (See Appendix 3) | 29. | For the F. candida test, ten 9-12 days old juveniles per test vessel should be used. On day 28, the collembolans are extracted from the soil and counted. | 30. | As a suitable food source, a sufficient amount, e.g. 2-10 mg, of granulated dried baker's yeast, commercially available for household use, is added to each container at the beginning of the test and after about 2 weeks. | 31. | At the end of the test, mortality and reproduction are assessed. After 3 weeks (F. fimetaria) or 4 weeks (F. candida), collembolans are extracted from the test soil (see Appendix 4) and counted (12). A collembolan is recorded as dead if not present in the extraction. The extraction and counting method should be validated. The validity includes extraction efficiency of juveniles greater than 95 %, e.g. by adding a known number to soil. | 32. | Practical summary and timetable of the test procedure are described in Appendix 2. | Test design | Range-finding test | 33. | When necessary, a range-finding test is conducted with, for example, five test chemical concentrations of 0,1, 1,0, 10, 100, and 1 000 mg/kg dry weight of soil and two replicates for each treatment and control. Additional information, from tests with similar chemicals or from literature, on mortality or reproduction of Collembola may also be useful in deciding on the range of concentrations to be used in the range-finding test. | 34. | The duration of the range-finding test is two weeks for F. fimetaria and 3 weeks for F. candida to ensure one clutch of juveniles has been produced. At the end of the test, mortality and reproduction of the Collembola are assessed. The number of adults and the occurrence of juveniles should be recorded. | Definitive test | 35. | For determination of the ECx (e.g. EC10, EC50), twelve concentrations should be tested. At least two replicates for each test concentration treatment and six control replicates are recommended. The spacing factor may vary depending on the dose-response pattern. | 36. | For determination of the NOEC/LOEC, at least five concentrations in a geometric series should be tested. Four replicates for each test concentration treatment plus eight controls are recommended. The concentrations should be spaced by a factor not exceeding 1,8. | 37. | A combined approach allows for determination of both the NOEC/LOEC and ECx. For this combined approach, eight treatment concentrations in a geometric series should be used. Four replicates for each treatment plus eight controls are recommended. The concentrations should be spaced by a factor not exceeding 1,8. | 38. | If no effects are observed at the highest concentration in the range-finding test (i.e. 1 000 mg/kg), the reproduction test can be performed as a limit test, using a test concentration of 1 000 mg/kg and the control. A limit test will provide the opportunity to demonstrate that there is no statistically significant effect at the limit concentration. Eight replicates should be used for both the treated soil and the control. | DATA AND REPORTING | Treatment of results | 39. | The reproductive output is the main endpoint (e.g. the number of juveniles produced per test vessel). The statistical analysis, e.g. ANOVA procedures, compares treatments by Student t-test, Dunnett's test, or Williams' test. 95 % confidence intervals are calculated for individual treatment means. | 40. | The number of surviving adults in the untreated controls is a major validity criterion and should be documented. As in the range-finding test, all other harmful signs should be reported in the final report as well. | LCx and ECx | 41. | ECx-values, including their associated lower and upper 95 % confidence limits for the parameter, are calculated using appropriate statistical methods (e.g. logistic or Weibull function, trimmed Spearman-Karber method, or simple interpolation). An ECx is obtained by inserting a value corresponding to x % of the control mean into the equation found. To compute the EC50 or any other ECx, the complete data set should be subjected to regression analysis. LC50 is usually estimated by probit analysis or similar analysis that takes into account the binomially distributed mortality data. | NOEC/LOEC | 42. | If a statistical analysis is intended to determine the NOEC/LOEC, per-vessel statistics (individual vessels are considered replicates) are necessary. Appropriate statistical methods should be used according to OECD Document 54 on the Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: a Guidance to Application (9). In general, adverse effects of the test chemical compared to the control are investigated using one-tailed hypothesis testing at p ≤ 0,05. | 43. | Normal distribution and variance homogeneity can be tested using an appropriate statistical test, e.g. the Shapiro-Wilk test and Levene test, respectively (p ≤ 0,05). One-way Analysis of Variance (ANOVA) and subsequent multi-comparison tests can be performed. Multiple comparisons (e.g. Dunnett's test) or step-down trend tests (e.g. Williams' test) can be used to calculate whether there are significant differences (p ≤ 0,05) between the controls and the various test chemical concentrations (selection of the recommended test according to OECD Document 54 (9)). Otherwise, non-parametric methods (e.g. Bonferroni-U-test according to Holm or Jonckheere-Terpstra trend test) could be used to determine the NOEC and the LOEC. | Limit test | 44. | If a limit test (comparison of control and one treatment only) has been performed and the prerequisites of parametric test procedures (normality, homogeneity) are fulfilled, metric responses can be evaluated by the Student test (t-test). The unequal-variance t-test (Welch t-test) or a non parametric test, such as the Mann-Whitney-U-test may be used, if these requirements are not fulfilled. | 45. | To determine significant differences between the controls (control and solvent control), the replicates of each control can be tested as described for the limit test. If these tests do not detect significant differences, all control and solvent control replicates may be pooled. Otherwise all treatments should be compared with the solvent control. | Test report | 46. | The test report should at least include the following information: | | Test chemical | — | the identity of the test chemical, batch, lot and CAS-number, purity; | — | physico-chemical properties of the test chemical (e.g. log Kow, water solubility, vapour pressure, Henry's constant (H) and preferably information on the fate of the test chemical in soil) if available; | — | the formulation of the test chemical and the additives should be specified if not the pure chemical is tested; | | Test organisms | — | identification of species and supplier of the test organisms, description of the breeding conditions and age range of test organisms; | | Test conditions | — | description of the experimental design and procedure; | — | preparation details for the test soil; detailed specification if natural soil is used (origin, history, particle size distribution, pH, organic matter content); | — | water holding capacity of the soil; | — | description of the technique used to apply the test chemical to the soil; | — | test conditions: light intensity, duration of light-dark cycles, temperature; | — | a description of the feeding regime, the type and amount of food used in the test, feeding dates; | — | pH and water content of the soil at the start and end of the test (control and each treatment); | — | detailed description of the extraction method and extraction efficiency; | | Test results | — | the number of juveniles determined in each test vessel at the end of the test; | — | number of adults and their mortality (%) in each test vessel at the end of the test; | — | a description of obvious physiological or pathological symptoms or distinct changes in behaviour; | — | the results obtained with the reference test chemical; | — | the NOEC/LOEC values, LCx for mortality and ECx for reproduction (mostly LC50, LC10, EC50, and EC10) together with 95 % confidence intervals. A graph of the fitted model used for calculation, its function equation and its parameters (See (9)); | — | all information and observations helpful for the interpretation of the results; | — | power of the actual test if hypothesis testing is done (9); | — | deviations from procedures described in this Test Method and any unusual occurrences during the test; | — | validity of the test; | — | for NOEC, when estimated, the minimal detectable difference. | LITERATURE | (1) | Wiles JA and Krogh PH (1998) Testing with the collembolans I. viridis, F. candida and F. fimetaria. In Handbook of soil invertebrate toxicity tests (ed. H Løkke and CAM Van Gestel), pp. 131-156. John Wiley & Sons, Ltd., Chichester | (2) | ISO (1999) Soil Quality — Effects of soil pollutants on Collembola (Folsomia candida): Method for determination of effects on reproduction. No. 11267. International Organisation for Standardisation, Geneve | (3) | Burges A and Raw F (Eds) (1967) Soil Biology. Academic Press. London | (4) | Petersen H and Luxton M (1982) A comparative analysis of soil fauna populations and their role in decomposition processes. Oikos 39: 287-388 | (5) | Petersen H (1994) A review of collembolan ecology in ecosystem context. Acta Zoologica Fennica 195: 111-118 | (6) | Hopkin SP (1997). Biology of the Springtails (Insecta: Collembola). Oxford University Press. 330pp (ISBN 0-19-854084-1) | (7) | Ulber B (1983) Einfluss von Onychirurus fimatus Gisin (Collembola, Onychiuridae) und Folsomia fimetaria L. (Collembola, Isotomidae) auf Pythium ultimum Trow. einen Erreger des Wurzelbrandes der Zuckerrübe. In New trends in soil Biology (Lebrun Ph, André HM, De Medts A, Grégoire-Wibo, Wauthy G (Eds), Proceedings of the VI. international colloquium on soil zoology, Louvain-la-neuve (Belgium), 30 August-2 September 1982, I Dieu-Brichart, Ottignies-Louvain-la-Neuve, pp. 261-268 | (8) | Chapter C.36 of this Annex, Predatory mite (Hypoaspis (Geolaelaps) aculeifer) reproduction test in soil. | (9) | OECD (2006), Current approaches in the statistical analysis of ecotoxicity data: a guidance to application. OECD series on testing and assessment Number 54, ENV/JM/MONO(2006)18, OECD Paris | (10) | Scott-Fordsmand JJ and Krogh PH (2005) Background report on prevalidation of an OECD springtail test guideline. Environmental Project Nr. 986. Miljøstyrelsen 61 pp. Danish Ministry for the Environment. | (11) | Krogh, P.H., 2009. Toxicity testing with the collembolans Folsomia fimetaria and Folsomia candida and the results of a ringtest. Danish Environmental Protection Agency, Environmental Project No. 1256, pp. 66. | (12) | Krogh PH, Johansen K and Holmstrup M (1998) Automatic counting of collembolans for laboratory experiments. Appl. Soil Ecol. 7, 201-205 | (13) | Fjellberg A (1980) Identification keys to Norwegian collembolans. Norsk Entomologisk Forening. | (14) | Edwards C.A. (1955) Simple techniques for rearing Collembola, Symphyla and other small soil inhabiting arthropods. In Soil Zoology (Kevan D.K. McE., Ed). Butterworths, London, pp. 412-416 | (15) | Goto HE (1960) Simple techniques for the rearing of Collembola and a not on the use of a fungistatic substance in the cultures. Entomologists' Monthly Magazine 96:138-140. | Appendix 1 | Definitions | The following definitions are applicable to this test method (in this test all effect concentrations are expressed as a mass of test chemical per dry mass of the test soil): | Chemical is a substance or a mixture. | NOEC (no observed effect concentration) is the test chemical concentration at which no effect is observed. In this test, the concentration corresponding to the NOEC, has no statistically significant effect (p < 0,05) within a given exposure period when compared with the control. | LOEC (lowest observed effect concentration) is the lowest test chemical concentration that has a statistically significant effect (p < 0,05) within a given exposure period when compared with the control. | ECx (Effect concentration for x % effect) is the concentration that causes an x % of an effect on test organisms within a given exposure period when compared with a control. For example, an EC50 is a concentration estimated to cause an effect on a test end point in 50 % of an exposed population over a defined exposure period. | Test chemical is any substance or mixture tested using this test method. | Appendix 2 | Main actions and timetable for performing a collembolan test | The steps of the test can be summarised as follows: | Time (day) | Action | – 23 to – 26 | Preparation of synchronous F. fimetaria culture | – 14 | Prepare artificial soil (mixing of dry constituents) | Check pH of artificial soil and adjust accordingly | Measure max WHC of soil | – 9 to – 12 | Preparation of synchronous F. candida culture | – 2 to – 7 | Pre-moist soil | – 1 | Distribute juveniles into batches | Prepare stock solutions and apply test chemical if solvent required | 0 | Prepare stock solutions and apply test chemical if solid chemical, water soluble or surface application is required. | Measure soil pH and weigh the containers. | Add food. Introduce collembolans. | 14 | Range-finding test F. fimetaria: Terminate test, extract animals, measure soil pH and loss of water (weight) | Definitive tests: Measure moisture content and replenish water and add 2-10 mg yeast | 21 | Definitive F. fimetaria test: Terminate test, extract animals, measure soil pH and loss of water (weight) | Range-finding F. candida: Terminate test, extract animals, measure soil pH and loss of water (weight) | 28 | Definitive F. candida test: Terminate test, extract animals, measure soil pH and loss of water (weight) | Appendix 3 | Guidance on rearing and synchronisation of F. fimetaria and F. candida | The time and durations given in this guidance should be checked for each specific collembolan strain to ensure that timing will allow for sufficient synchronised juveniles. Basically, the incidence of oviposition after the adults are transferred to fresh substrate and egg hatching determines the appropriate day for egg collection and collection of synchronous juveniles. | It is recommended to have a permanent stock culture consisting of e.g. 50 containers/Petri dishes. The stock culture should be kept in a good feeding condition by weekly feeding, watering and removal of old food and carcasses. Too few collembolans on the substrate may result in inhibition by more fungal growth. If the stock culture is used for egg production too often, the culture may get fatigue. Signs of fatigue are dead adults and mould on the substrate. The remaining eggs from the production of synchronous animals can be used to rejuvenate the culture. | In a synchronous culture of F. fimetaria, males are distinguished from females primarily by size. Males are clearly smaller than females, and the walking speed of the males is faster than for females. Correct selection of the gender requires little practice and can be confirmed by microscopic inspection of the genital area (13). | 1. Rearing | 1.a. Preparation of culturing substrate | The culturing substrate is plaster of Paris (calcium sulphate) with activated charcoal. This provides a moist substrate, with the function of the charcoal being to absorb waste gases and excreta (14) (15). Different forms of charcoal may be used to facilitate observations of the Collembola. For example, powdered charcoal is used for F. candida and F. fimetaria (producing a black/grey plaster of Paris): | Substrate constituents: | — | 20 ml of activated charcoal | — | 200 ml of distilled water | — | 200 ml of plaster of Paris | or | — | 50 g of activated pulverized charcoal | — | 260-300 ml of distilled water | — | 400 g plaster of Paris. | The substrate mixture is allowed to set before use. | 1.b. Breeding | Collembolans are held in containers such as Petri dishes (90 mm × 13 mm), with the bottom covered by a 0,5 cm layer of plaster /charcoal substrate. They are cultured at 20 ± 1 °C at a light-dark cycle of 12-12 hours (400-800 Lux). Containers are kept moist at all times ensuring that the relative humidity of the air within the containers is 100 %. This can be guaranteed by presence of free water within the porous plaster, but avoiding generating a water film on the plaster surface. Water loss can be prevented by providing a humid ambient air. Any dead individuals should be removed from the containers, as should any mouldy food. To stimulate production of eggs it is necessary to transfer the adult animals to Petri dishes with newly prepared plaster of Paris/charcoal substrate. | 1.c. Food source | Granulated dried baker's yeast is used as the sole food supply for both F. candida and F. fimetaria. Fresh food is provided once or twice a week, to avoid moulding. It is placed directly on the plaster of Paris in a small heap. The mass of baker's yeast added should be adjusted to the size of the collembolan population, but as a general rule 2-15 mg is sufficient. | 2. Synchronisation | The test should be performed with synchronised animals to obtain homogeneous test animals of the same instar and size. Furthermore, the synchronisation enables discrimination of F. fimetaria males and females from the age of 3 weeks and onwards based on sexual dimorphism, i.e. size differences. The procedure below is a suggestion on how to obtain synchronised animals (the practical steps are optional). | 2.a. Synchronisation. | — | Prepare containers with a 0,5 cm layer of plaster of Paris/charcoal substrate. | — | For egg laying transfer 150-200 adult F. fimetaria and 50-100 F. candida from the best 15-20 containers of the stock culture with 4-8 weeks old substrate to the containers and feed them 15 mg baker's yeast. Avoid bringing juveniles together with adults as presence of juveniles may inhibit egg production. | — | Keep the culture at 20 ± 1 °C (the mean should be 20 °C) and a light-dark cycle of 12-12 hours (400-800 Lux). Ensure that fresh food is available and the air is water saturated. Lack of food may lead the animals to defecate on the eggs resulting in fungal growth on the eggs or F. candida may cannibalise its own eggs. After 10 days the eggs are carefully collected with a needle and spatula and moved to “egg-paper” (small pieces of filter paper dipped in plaster of Paris/charcoal slurry) which is placed in a container with fresh plaster/charcoal substrate. A few grains of yeast are added to the substrate to attract the juveniles and make them leave the egg-paper. It is important that the egg-paper and substrate are humid, or the eggs will dehydrate. As an alternative, adult animals may be removed from the synchronisation culture boxes after producing eggs for 2 or 3 days. | — | After three days most of the eggs on the egg-paper will have hatched, and some juveniles may be found under the egg-paper. | — | To have evenly aged juveniles, the egg-paper with un-hatched eggs is removed from the Petri dish with forceps. The juveniles, now 0-3 days, stay in the dish and are fed baker's yeast. Un-hatched eggs are discharged. | — | Eggs and hatched juveniles are cultured in the same manner as the adults. In particular for F. fimetaria the following measures should be taken: ensuring sufficient fresh food, old moulding food is removed, after 1 week the juveniles are divided into new Petri dishes provided that the density is above 200. | 2.b. Handling collembolans at test initiation | — | 9-12 days old F. candida or the 23-26 days old F. fimetaria are collected, e.g. by suction, and released into a small container with moist plaster/charcoal substrate and their physical condition is checked under the binocular (injured and damaged animals are disposed). All steps should be done while keeping the collembolans in a moist atmosphere to avoid drought stress, e.g. by using wetted surfaces etc. | — | Turn the container up-side down and knock on it to transfer the collembolans to the soil. Static electricity should be neutralised, otherwise the animals may just fly into the air, or stick to the side of the test container and dry out. An ioniser or a moist cloth below the container may be used for neutralisation. | — | The food should be spread all over the soil surface and not just in one lump. | — | During transportation and during the testing period it should be avoided to knock or otherwise physically disturb the test containers, as this may increase the compaction of the soil, and hamper the interaction between the collembolans. | 3. Alternative Collembolan species | Other collembolan species may be selected for testing according to this test method such as Proisotoma minuta, Isotoma viridis, Isotoma anglicana, Orchesella cincta, Sinella curviseta, Paronychiurus kimi, Orthonychiurus folsomi, Mesaphorura macrochaeta. A number of prerequisites should be fulfilled in advance before using alternative species: | — | They should be unequivocally identified; | — | The rationale for the selection of the species should be given; | — | It should be ensured that the reproductive biology is included in the testing phase so it will be a potential target during the exposure; | — | The life-history should be known: age at maturation, duration of egg development, and instars subject to exposure; | — | Optimal conditions for growth and reproduction should be provided by the test substrate and food supply; | — | Variability should be sufficiently low for precise and accurate toxicity estimation. | Appendix 4 | Extraction and counting of animals | 1. Two methods of extraction can be performed. | 1.a. | First method: A controlled temperature gradient extractor based on principles by MacFadyen can be used (1). The heat coming from a heating element at the top of the extraction box (regulated through a thermistor placed on the surface of the soil sample). The temperature in the cooled liquid surrounding the collecting vessel is regulated through a thermistor situated at the surface of the collection box (placed below the soil core). The thermistors are connected to a programmable controlling unit which raises the temperature according to a pre-programmed schedule. Animals are collected in the cooled collecting box (2 °C) with a bottom layer of plaster of Paris/charcoal. Extraction is started at 25 °C and the temperature is increased automatically every 12 h by 5 °C and has a total duration of 48 hours. After 12 h at 40 °C the extraction is finished. | 1.b. | Second method: After the experimental incubation period the number of juvenile Collembola present is assessed by flotation. For that purpose the test is performed in the vessels of approximately 250 ml volume. At the end of the test approx. 200 ml of distilled water are added. The soil is gently agitated with a fine paintbrush to allow Collembola to float to the water surface. A small amount, approx. 0,5 ml, of black Kentmere photographic dye may be added to the water to aid counting by increasing the contrast between the water and the white Collembola. The dye is not toxic to Collembola. | 2. Counting: | Counts of numbers may be carried out by eye or under a light microscope using a grid placed over the floatation vessel or by photographing the surface of each vessel and later counting the Collembola on enlarged prints or projected slides. Counts may also be performed using digital image processing techniques (12). All techniques should be validated. | Appendix 5 | Determination of the maximum WHC of the soil | The following method for determining the maximum water holding capacity (WHC) of the soil has been found to be appropriate. It is described in Annex C of ISO DIS 11268-2 (Soil Quality — Effects of pollutants on earthworms (Eisenia fetida). Part 2: Determination of effects on reproduction). | Collect a defined quantity (e.g. 5 g) of the test soil substrate using a suitable sampling device (auger tube etc.). Cover the bottom of the tube with a wet piece of filter paper and then place it on a rack in a water bath. The tube should be gradually submerged until the water level is above to the top of the soil. It should then be left in the water for about three hours. Since not all water absorbed by the soil capillaries can be retained, the soil sample should be allowed to drain for a period of two hours by placing the tube onto a bed of very wet finely ground quartz sand contained within a covered vessel (to prevent drying). The sample should then be weighed, dried to constant mass at 105 °C. The water holding capacity (WHC) should be calculated as follows: | Where: | S | = | water-saturated substrate + mass of tube + mass of filter paper | T | = | tare (mass of tube + mass of filter paper) | D | = | dry mass of substrate | Appendix 6 | Determination of soil pH | The following method for determining the pH of a soil is based on the description given in ISO DIS 10390: Soil Quality — Determination of pH. | A defined quantity of soil is dried at room temperature for at least 12 h. A suspension of the soil (containing at least 5 grams of soil) is then made up in five times its volume of either a 1 M solution of analytical grade potassium chloride (KCl) or a 0,01 M solution of analytical grade calcium chloride (CaCl2). The suspension is then shaken thoroughly for five minutes and then left to settle for at least 2 hours but not for longer than 24 hours. The pH of the liquid phase is then measured using a pH-meter that has been calibrated before each measurement using an appropriate series of buffer solutions (e.g. pH 4,0 and 7,0). | C.40. SEDIMENT-WATER CHIRONOMID LIFE-CYCLE TOXICITY TEST USING SPIKED WATER OR SPIKED SEDIMENT | INTRODUCTION | 1. | This test method is equivalent to OECD Testing Guideline (TG) 233 (2010). It is designed to assess the effects of life-long exposure of chemicals on the freshwater dipteran Chironomus sp., fully covering the 1st generation (P generation) and the early part of the 2nd generation (F1 generation). It is an extension of the existing test methods C.28 (1) or C.27 (15) using a spiked-water exposure scenario or a spiked sediment scenario, respectively. It takes into account existing toxicity test protocols for Chironomus riparius and Chironomus dilutus (previously named C. tentans (2)) that have been developed in Europe and North America (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) and subsequently ring-tested (1) (7) (10) (11) (12). Other well documented chironomid species may also be used, e.g. Chironomus yoshimatsui (13) (14). The complete exposure duration is ca. 44 days for C. riparius and C. yoshimatsui, and –ca. 100 days for C. dilutus. | 2. | Both water and sediment exposure scenarios are described in this test method. The selection of an appropriate exposure scenario depends on the intended application of the test. The water exposure scenario, spiking of the water column, is intended to simulate a pesticide spray drift event and covers the initial peak concentration in surface waters. Water spiking is also useful for other types of exposure (including chemical spills), but not for accumulation processes within the sediment lasting longer than the test period. In that case, and also when run-off is the main entry route of pesticides into water bodies, a spiked sediment design may be more appropriate. If other exposure scenarios are of interest, the test design may be readily adapted. For example, if the distribution of the test chemical between the water phase and the sediment layer is not of interest and adsorption to the sediment has to be minimised, the use of surrogate artificial sediment (e.g. quartz sand) may be considered. | 3. | Chemicals that require testing of sediment-dwelling organisms may persist in sediment over long periods. Sediment-dwelling organisms may be exposed via a number of routes. The relative importance of each exposure route, and the time taken for each to contribute to the overall toxic effect, is dependent on the physical-chemical properties of the chemical. For strongly adsorbing chemicals or for chemicals covalently binding to sediment, ingestion of contaminated food may be a significant exposure route. In order not to underestimate the toxicity of highly lipophilic chemicals, the use of food added to the sediment before application of the test chemical may be considered (see paragraph 31). Therefore, it is possible to include all routes of exposure and all life stages. | 4. | Measured endpoints are the total number of adults emerged (for both 1st and 2nd generations), development rate (for both 1st and 2nd generations), sex ratio of fully emerged and alive adults (for both 1st and 2nd generations), number of egg ropes per female (1st generation only) and fertility of the egg ropes (1st generation only). | 5. | Formulated sediment is strongly recommended. Formulated sediment has several advantages over natural sediments: | — | experimental variability is reduced because it forms a reproducible “standardised matrix” and the need to source uncontaminated clean sediment is eliminated; | — | tests can be initiated at any time without encountering seasonal variability in the test sediment and there is no need to pre-treat the sediment to remove indigenous fauna; | — | reduced cost compared to field collection of sufficient quantities required for routine testing; | — | formulated sediment allows for comparisons of toxicity across studies and ranking chemicals accordingly (3). | 6. | Definitions used are given in Appendix 1. | PRINCIPLE OF THE TEST | 7. | First instar chironomid larvae are exposed to a concentration range of the test chemical in a sediment-water system. The test starts by placing first instar larvae (1st generation) into test beakers containing spiked sediment or alternately the test chemical is spiked into the water after addition of the larvae. Chironomid emergence, time to emergence and sex ratio of the fully emerged and alive midges are assessed. Emerged adults are transferred to breeding cages, to facilitate swarming, mating and oviposition. The number of egg ropes produced and their fertility are assessed. From these egg ropes, first instar larvae of the 2nd generation are obtained. These larvae are placed into freshly prepared test beakers (spiking procedure as for the 1st generation) to determine the viability of the 2nd generation through an assessment of their emergence, time to emergence and the sex ratio of the fully emerged and alive midges (a schematic presentation of the life-cycle test is provided in Appendix 5). All data are analysed either by a regression model to estimate the concentration that would cause X % reduction in the relevant endpoint, or by using hypothesis testing to determine a No Observed Effect Concentration (NOEC). The latter requires a comparison of treatment responses with the appropriate control responses using statistical tests. It should be noted that in the spiked water scenario, in case of fast degrading chemicals, the later life stages of each generation (e.g. pupal phase) might be exposed to a considerably lower concentration level in the overlying water than the 1st instar larvae. If this is a concern, and a comparable exposure level for each life stage is needed, the following amendments of the test method might be considered: | — | parallel runs with spiking at different life stages, or | — | repeated spiking (or overlying water renewal) of the test system during both test phases (1st and 2nd generation), whereby the spiking (renewal) intervals should be adjusted to the fate characteristics of the test chemical. | Such amendments are only feasible in the spiked water scenario, but not in the sediment spiked scenario. | INFORMATION ON THE TEST CHEMICAL | 8. | The water solubility of the test chemical, its vapour pressure and log Kow , measured or calculated partitioning into sediment and stability in water and sediment should be known. A reliable analytical method for the quantification of the test chemical in overlying water, pore water and sediment with known and reported accuracy and limit of detection should be available. Useful information includes the structural formula and purity of the test chemical. Chemical fate of the test chemical (e.g. dissipation, abiotic and biotic degradation, etc.) is also useful. Further guidance for testing chemicals with physical-chemical properties that make them difficult to perform the test is provided in (16). | REFERENCE CHEMICALS | 9. | Reference chemicals may be tested periodically as a means of assuring that the sensitivity of the laboratory population has not changed. As with daphnids it would be sufficient to perform a 48-h acute test (following 17). However, until a validated acute guideline is available a chronic test according to Chapter C.28 of this Annex may be considered. Examples of reference toxicants used successfully in ring-tests and validation studies are: lindane, trifluralin, pentachlorophenol, cadmium chloride and potassium chloride. (1) (3) (6) (7) (18). | VALIDITY OF THE TEST | 10. | For the test to be valid the following conditions apply: | — | the mean emergence in the control treatment should be at least 70 % at the end of the exposure period for both generations (1) (7); | — | for C. riparius and C. yoshimatsui, 85 % of the total emerged adult midges from the control treatment in both generations should occur between 12 and 23 days after the insertion of the first instar larvae into the vessels; for C. dilutus, a period of 20 to 65 days is acceptable; | — | the mean sex ratio of fully emerged and alive adults (as female or male fraction) in the control treatment of both generations should be at least 0,4, but not exceed 0,6; | — | for each breeding cage the number of egg ropes in the controls of the 1st generation should be at least 0,6 per female added to the breeding cage; | — | the fraction of fertile egg ropes in each breeding cage of the controls of the 1st generation should be at least 0,6; | — | at the end of the exposure period for both generations, pH and the dissolved oxygen concentration should be measured in each vessel. The oxygen concentration should be at least 60 % of the air saturation value (ASV (19)), and the pH of overlying water should be between 6 and 9 in all test vessels; | — | the water temperature should not differ by more than ± 1,0 °C. | DESCRIPTION OF THE METHOD | Test vessels and breeding cages | 11. | The larvae are exposed in 600 ml glass beakers measuring ca. 8,5 cm in diameter (see Appendix 5). Other vessels are suitable, but they should guarantee a suitable depth of overlying water and sediment. The sediment surface should be sufficient to provide 2 to 3 cm2 per larvae. The ratio of the depth of the sediment layer to the depth of the overlying water should be ca. 1:4. Breeding cages (minimum 30 cm in all three dimensions) with a gauze (mesh size ca. 1 mm) on the top and one side of the cage as a minimum should be used (see Appendix 5). In each cage a 2 l crystallising dish, containing test water and sediment, is placed for oviposition. Also for the crystallising dish, the ratio of the depth of the sediment layer to the depth of the overlying water should be around 1:4. After egg ropes are collected from the crystallising dish they are placed into a 12-well microtiter plate (one rope per well containing at least 2,5 ml water from the spiked crystallising dish) after which the plates are covered with a lid to prevent significant evaporation. Other vessels suitable for keeping the egg ropes may also be used. With the exception of the microtiter plates, all test vessels and other apparatus that will come into contact with the test system should be made entirely of glass or other chemically inert material (e.g. Polytetrafluoroethylene). | Selection of species | 12. | The species to be used in the test is preferably Chironomus riparius. C. yoshimatsui may also be used. C. dilutus is also suitable but more difficult to handle and requires a longer test period. Details of culturing methods are given in Appendix 2 for C. riparius. Information on culture conditions are also available for C. dilutus (5) and C. yoshimatsui (14). Identification of the species should be confirmed before testing but is not required prior to every test if the organisms come from an in-house culture. | Sediment | 13. | Formulated sediment (also called reconstituted, artificial or synthetic sediment) should preferably be used. However, if natural sediment is used, it should be characterised (at least pH, organic carbon content, determination of other parameters such as C/N ratio and granulometry are also recommended) and should be free from any contamination and other organisms that may compete with, or consume chironomid larvae. It is also recommended, before testing, that sediments are conditioned for seven days under test conditions. The following formulated sediment, as described in (1), is recommended (1) (20) (21): | (a) | 4-5 % (dry weight) peat: as close to pH 5,5 to 6,0 as possible; it is important to use peat in powder form, finely ground (particle size ≤ 1 mm) and only air dried; | (b) | 20 % (dry weight) kaolin clay (kaolinite content preferably above 30 %); | (c) | 75-76 % (dry weight) quartz sand (fine sand should predominate with more than 50 per cent of the particles between 50 and 200 μm); | (d) | Deionised water is added to obtain moisture of the final mixture in the range of 30–50 %; | (e) | Calcium carbonate of chemically pure quality (CaCO3) is added adjust the pH of the final mixture of the sediment to 7,0 ± 0,5; | (f) | Organic carbon content of the final mixture should be 2 % (± 0,5 %) and is to be adjusted by the use of appropriate amounts of peat and sand, according to (a) and (c). | 14. | The source of peat, kaolin clay and sand should be known. The sediment components should be checked for the absence of chemical contamination (e.g. heavy metals, organochlorine compounds, organophosphorous compounds). An example for the preparation of the formulated sediment is described in Appendix 3. Mixing of dry constituents is also acceptable if it is demonstrated that after addition of overlying water a separation of sediment constituents (e.g. floating of peat particles) does not occur, and that the peat or the sediment is sufficiently conditioned. | Water | 15. | Any water which conforms to the chemical characteristics of acceptable dilution water as listed in Appendices 2 and 4 is suitable as test water. Any suitable water, natural water (surface or ground water), reconstituted water (see Appendix 2) or dechlorinated tap water are acceptable as culturing water and test water, if chironomids will survive in it for the duration of the culturing and testing without showing signs of stress. At the start of the test, the pH of the test water should be between 6 and 9 and the total hardness not higher than 400 mg/l as CaCO3. However, if there is an interaction suspected between hardness ions and the test chemical, lower hardness water should be used (and thus, Elendt Medium M4 should not be used in this situation). The same type of water should be used throughout the entire study. The water quality characteristics listed in Appendix 4 should be measured at least twice a year or when it is suspected that these characteristics may have changed significantly. | Stock solutions — Spiked water | 16. a. | Test concentrations are calculated on the basis of water column concentrations, i.e. the water overlying the sediment. Test solutions of the chosen concentrations are usually prepared by dilution of a stock solution. Stock solutions should preferably be prepared by dissolving the test chemical in test water. The use of solvents or dispersants may be required in some cases in order to produce a suitably concentrated stock solution. Examples of suitable solvents are acetone, ethylene glycol monoethyl ether, ethylene glycol dimethylether, dimethylformamide and triethylene glycol. Dispersants which may be used are Cremophor RH40, Tween 80, methylcellulose 0,01 % and HCO-40. The solubilising agent concentration in the final test medium should be minimal (i.e. ≤ 0,1 ml/l) and should be the same in all treatments. When a solubilising agent is used, it should have no significant effects on survival as revealed by a solvent control in comparison with a negative (water) control. However, every effort should be made to avoid the use of such materials. | Stock solutions — Spiked sediment | 16. b. | Spiked sediments of the chosen concentration are usually prepared by addition of a solution of the test chemical directly to the sediment. A stock solution of the test chemical dissolved in deionised water is mixed with the formulated sediment by rolling mill, feed mixer or hand mixing. If poorly soluble in water, the test chemical can be dissolved in as small a volume as possible of a suitable organic solvent (e.g. hexane, acetone or chloroform). This solution is then mixed with 10 g of fine quartz sand for each test vessel. The solvent is allowed to evaporate and it should be totally removed from sand; the sand is then mixed with the suitable amount of sediment. Only agents which volatilise readily can be used to solubilise, disperse or emulsify the test chemical. It should be born in mind that the sand provided by the test chemical and sand mixture, should be taken into account when preparing the sediment (i.e. the sediment should thus be prepared with less sand). Care should be taken to ensure that the test chemical added to sediment is thoroughly and evenly distributed within the sediment. If necessary, subsamples can be analysed to determine degree of homogeneity. | TEST DESIGN | 17. | The test design relates to the selection of the number and spacing of the test concentrations, the number of vessels at each concentration, the number of larvae per vessel, the number of crystallising dishes and breeding cages. Designs for ECx, NOEC and a limit test are described below. | Design for analysis by regression | 18. | The effect concentration (ECx) and the concentration range over which the effect of the test chemical is of interest, should be spanned by the test, such that the endpoint is not extrapolated outside the bounds of the data generated. Extrapolation much below the lowest or above the highest concentration should be avoided. A preliminary range-finding test according to Test Methods C.27 or C.28 may be helpful for selecting a suitable range of test concentrations. | 19. | For an ECx approach, at least five concentrations and eight replicates for each concentration are required. For each concentration two breeding cages should be used (A and B). The eight replicates are divided into two groups of four replicates to serve each breeding cage. This merger of replicates is necessary due to the number of midges needed in the cage for sound reproduction assessments. However, the 2nd generation has eight replicates again, which are initiated from the exposed populations in the breeding cages. The factor between concentrations should not be greater than two (an exception could be made in cases when the dose response curve has a shallow slope). The number of replicates at each treatment can be reduced to six (three for each breeding case) if the number of test concentrations with different responses is increased. Increasing the number of replicates or reducing the size of the test concentration intervals tends to lead to narrower confidence intervals around the ECX. | Design for estimation of a NOEC | 20. | For a NOEC approach, five test concentrations with at least eight replicates (4 for each breeding cage, A and B) should be used and the factor between concentrations should not be greater than two. The number of replicates should be sufficient to ensure adequate statistical power to detect a 20 % difference from the control at the 5 % level of significance (α = 0,05). For the development rate, fecundity and fertility an analysis of variance (ANOVA) is usually appropriate, followed by Dunnett's test or Williams' test (22-25). For the emergence ratio and sex ratio the Cochran-Armitage, Fisher's exact (with Bonferroni correction), or Mantel-Haentzal tests may be appropriate. | Limit test | 21. | A limit test may be performed (one test concentration and control(s)) if no effects are observed in the optional preliminary range-finding test up to a maximum concentration. The purpose of the limit test is to indicate that any toxic effects of the test chemical are found at levels greater than the limit concentration tested. For water, 100 mg/l and for sediment 1 000 mg/kg (dry weight) are suggested. Usually, at least eight replicates for both the treatment and control are necessary. Adequate statistical power to detect a 20 % difference from the control at the 5 % level of significance (α = 0,05) should be demonstrated. With metric responses (e.g. development rate), the t-test is a suitable statistical method if data meet the requirements of this test (normality, homogeneous variances). An unequal-variance t-test or a non-parametric test, such as the Wilcoxon-Mann-Whitney test may be used, if these requirements are not fulfilled. With the emergence ratio, Fisher's exact test is appropriate. | PROCEDURE | Conditions of exposure | Preparation of the water-sediment system (water spiking) | 22. a. | Formulated sediment (see paragraphs 13-14 and Appendix 3) is added to each test vessel and crystallising dish to form a layer of at least 1,5 cm (for the crystallising dish it may be somewhat lower) but maximally 3 cm. Water (see paragraph 15) is added so that the ratio of the depth of the sediment layer and the depth of the water does not exceed 1:4. After preparation of the test vessels the sediment-water system should be left under gentle aeration for approximately seven days prior to addition of the first instar larvae of the 1st or 2nd generation (see paragraph 14 and Appendix 3). The sediment-water system of the crystallising dishes is not aerated during the test, since they do not need to support larval survival (before hatching the egg ropes are already collected). To avoid separation of sediment ingredients and re-suspension of fine material during addition of test water in the water column, the sediment can be covered with a plastic disc while water is poured onto it. The disc is removed immediately afterwards. Other devices may also be appropriate. | Preparation of the water-sediment system (spiked sediment) | 22. b. | The spiked sediments prepared according to paragraph 16b are placed in the vessels and crystallising dish and overlying water is added to produce a sediment-water volume ratio of 1:4. The depth of the sediment layer should be in the range of 1,5 to 3 cm (it may be somewhat lower for the crystallising dish). To avoid separation of sediment ingredients and re-suspension of fine material during addition of test water in the water column, the sediment can be covered with a plastic disc while water is poured onto it, and the disc removed immediately afterwards. Other devices may also be appropriate. Once the spiked sediment with overlying water has been prepared, it is desirable to allow partitioning of the test chemical from the sediment to the aqueous phase (4) (5) (7) (18). This should preferably be done under the conditions of temperature and aeration used in the test. Appropriate equilibration time is sediment and chemical specific, and can be in the order of hours to days and in rare cases up to five weeks. As this would leave time for degradation of many chemicals, equilibrium is not awaited but an equilibration period of 48 hours is recommended. However, when the degradation half-life of the chemical in sediment is known to be long (see paragraph 8), the equilibration time may be extended. At the end of this further equilibration period, the concentration of the test chemical should be measured in the overlying water, the pore water and the sediment, at least at the highest concentration and a lower one (see paragraph 38). These analytical determinations of the test chemical allow for calculation of a mass balance and expression of results based on measured concentrations. | 23. | Test vessels should be covered (e.g. by glass plates). If necessary, during the study the water levels may be topped up to the original volume in order to compensate for evaporation. This should be performed using distilled or deionised water to prevent any build-up of salts. Crystallising dishes in the breeding cages are not covered and may, but do not need to be adjusted to compensate for water loss during the test period, since the egg ropes are only in contact with the water for about one day and the dishes are only used during a short phase of the test. | Addition of test organisms | 24. | Four to five days before adding the first instar larvae for the 1st generation, egg masses should be taken from the culture and placed in small vessels in culture medium. Aged medium from the stock culture or freshly prepared medium may be used. In any case, a small amount of food, e.g. a few droplets of filtrate from a finely ground suspension of flaked fish food, should be added to the culture medium (see Appendix 2). Only freshly laid egg masses should be used. Normally, the larvae begin to hatch a couple of days after the eggs are laid (2 to 3 days for C. riparius at 20 °C and 1 to 4 days for C. dilutus at 23 °C and C. yoshimatsui at 25 °C) and larval growth occurs in four instars, each of 4-8 days duration. First instar larvae (maximum 48 h post hatching) should be used in the test. The instar stage of larvae can potentially be checked using head capsule width (7). | 25. | Twenty first instar larvae for the 1st generation are allocated randomly to each test vessel containing the sediment-water system, using a blunt pipette. Aeration of the water is stopped whilst adding larvae to test vessels and should remain so for 24 hours following addition of larvae (see paragraph 32). According to the test design used (see paragraphs 19 and 20), the number of larvae used per concentration is at least 120 (6 replicates per concentration) for the ECX approach and 160 for the NOEC approach (8 replicates per concentration). In the spiked sediment design, exposure starts with the addition of the larvae. | Spiking the overlying water | 26. | Twenty-four hours after adding the first instar larvae for the 1st generation, the test chemical is spiked into the overlying water column, and slight aeration is again supplied (for possible amendments of the test design, see paragraph 7). Small volumes of the test chemical stock solutions are applied below the surface of the water using a pipette. The overlying water should then be mixed with care not to disturb the sediment. In the spiked water design, exposure starts with the spiking of the water (i.e. one day after addition of the larvae). | Collecting emerged adults | 27. | Emerged midges of the 1st generation are collected at least once, but preferably twice a day (see point 36) from the test vessels using an aspirator, exhauster or similar device (see Appendix 5). Special care should be taken not to damage the adults. The collected midges from four test vessels within one treatment are released into a breeding cage to which they had been previously assigned. At the day of first (male) emergence, crystallising dishes are spiked by pipetting a small volume of the test chemical stock solution below the water surface (spiked water design). The overlying water should then be mixed with care not to disturb the sediment. The concentration of test chemical in the crystallising dish is nominally the same as in the treatment vessels which are assigned to that specific breeding cage. For the spiked sediment design, the crystallising dishes are prepared at around day 11 after the start of the exposure (i.e. addition of the 1st generation larvae) so that they can equilibrate for about 48 hours before the first egg ropes are produced. | 28. | Egg ropes are collected from the crystallising dish in the breeding cage using tweezers or a blunt pipette. Each egg rope is placed into a vessel containing culture medium from the crystallising dish it was collected from (e.g. a well of a 12-well micro-plate together with at least 2,5 ml of medium). The vessels with the egg ropes are covered with a lid to prevent significant evaporation. Egg ropes are kept for observation for at least six days after they have been produced so that they can be classified as fertile or infertile. | For starting the 2nd generation, at least three but preferably six fertile egg ropes are selected from each breeding cage and together with some food allowed to hatch. These egg ropes should have been produced at the peak of oviposition, which normally occurs around test day 19 in the controls. Ideally, the 2nd generation of all treatments is initiated on the same day, but due to chemical related effects on larval development, this may not always be possible. In such a case, the higher concentrations may be initiated later than the lower treatments and the (solvent) control. | 29. a. | In the spiked water design, the sediment-water system for the 2nd generation is prepared by spiking the test chemical into the overlying water column ca. 1 hour before adding the first instar larvae to the test vessels. Small volumes of the test chemical solutions are applied below the surface of the water using a pipette. The overlying water should then be mixed with care not to disturb the sediment. After spiking, slight aeration is supplied. | 29. b. | In the spiked sediment design, the exposure vessels containing the sediment-water system for the 2nd generation are prepared in the same way as for the 1st generation. | 30. | Twenty first instar larvae (maximum 48 h post hatching) of the 2nd generation are allocated randomly to each test vessel containing the spiked sediment-water system, using a blunt pipette. Aeration of the water should be stopped while adding the first instar larvae to the test vessels and remain so for another 24 hours after addition of the larvae. According to the test design used (see paragraphs 19 and 20), the number of larvae used per concentration is at least 120 (6 replicates per concentration) for the ECX approach and 160 for the NOEC approach (8 replicates per concentration). | Food | 31. | It is necessary to feed the larvae in the test vessels, preferably daily or at least three times per week. Fish-food (a suspension in water or finely ground food, e.g. Tetra-Min or Tetra-Phyll; see details in Appendix 2) of 0,25 - 0,5 mg (0,35 - 0,5 mg for C. yoshimatsui) per larvae per day is an adequate amount of food for young larvae during the first 10 days of their development. Slightly more food may be necessary for older larvae: 0,5 - 1,0 mg per larvae per day should be sufficient for the rest of the test. The food ration should be reduced in all treatments and control if fungal growth is seen or if mortality is observed in controls. If fungal development cannot be stopped the test should be repeated. | The toxicological relevance of exposure via ingestion is generally higher in chemicals with a high affinity for organic carbon or chemicals covalently binding to the sediment. Hence, when testing chemicals with such properties, the amount of food necessary to ensure survival and natural growth of the larvae may be added to the formulated sediment before the stabilisation period, depending on the regulatory demand. To prevent deterioration of the water quality, plant material should be used instead of fish food, e.g. addition of 0,5 % (dry weight) finely ground leaves of stinging nettle (Urtica dioica), mulberry (Morus alba), white clover (Trifolium repens), spinach (Spinacia oleracea) or other plant material (Cerophyl or α-cellulose). Addition of the complete ration of an organic food source to the sediment before spiking is not trivial with respect to water quality and biological performance (21), nor a standardised method, but recent studies provide indications that this method works (19) (26). Adult midges in the breeding cage need no feeding normally, but fecundity and fertility are enhanced when a cotton wool pad soaked in a saturated sucrose solution is offered as a food source for emerged adults (34). | Incubation conditions | 32. | Gentle aeration of the overlying water in the test vessels is supplied 24 hours after addition of the first instar larvae of both generations and is continued throughout the test (care should be taken that the dissolved oxygen concentration does not fall below 60 % of ASV). Aeration is provided through a glass Pasteur pipette of which the outlet is fixed 2-3 cm above the sediment layer giving a few bubbles/sec. When testing volatile chemicals, consideration should be given not to aerate the sediment-water system, while at the same time the validity criterion of minimal 60 % ASV (paragraph 10) should be fulfilled. Further guidance is provided in (16). | 33. | The test with C. riparius is conducted at a constant temperature of 20 °C (± 2 °C). For C. dilutus and C. yoshimatsui, recommended temperatures are 23 °C and 25 °C (± 2 °C), respectively. A 16 hours photoperiod is used and the light intensity should be 500 to 1 000 lux. For the breeding cages an additional one hour dawn and dusk phase may be included. | Exposure duration | 34. | Spiked water design: The exposure period of the 1st generation starts when the test chemical is spiked into the overlying water of the test vessels (which is one day after insertion of the larvae — for possible amendments of the exposure design, see paragraph 7). Exposure of the 2nd larval generation starts immediately, since they are inserted into a sediment-water system that has been already spiked. The maximum exposure duration for the 1st generation is 27 days and for the 2nd generation 28 days (the 1st generation larvae spend one day in the vessels without exposure) for C. riparius and C. yoshimatsui. Considering the overlap, the complete test duration is approximately 44 days. For C. dilutus, maximum exposure durations are 64 and 65 days, for the 1st and 2nd generation, respectively. The total duration is approximately 100 days. | Spiked sediment design: exposure starts with the addition of the larvae and is maximum 28 days for both generations for C. riparius and C. yoshimatsui and maximum 65 days for both generations for C. dilutus. | Observations | Emergence | 35. | Development time and the total number of fully emerged and alive male and female midges are determined for both generations. Males are easily identified by their plumose antennae and thin body posture. | 36. | Test vessels of both generations should be observed at least three times per week to make visual assessment of any abnormal behaviour of the larvae (e.g. leaving sediment, unusual swimming), compared to the control. During the period of emergence, which starts about 12 days after insertion of the larvae for C. riparius and C. yoshimatsui (after 20 days for C. dilutus), emerged midges are counted and sexed at least once, but preferably twice a day (early morning and late afternoon). After identification, the midges of the 1st generation are carefully removed from the vessels and transferred to a breeding cage. Midges of the 2nd generation are removed and killed after identification. Any egg ropes deposited in the test vessels of the 1st generation should be collected individually and transferred with at least 2,5 ml native water to 12-well microplates (or other suitable vessels) which are covered with a lid to prevent significant evaporation. The number of dead larvae and visible pupae that have failed to emerge should also be recorded. Examples of a breeding cage, test vessel and exhauster are provided in Appendix 5. | Reproduction | 37. | Effects on reproduction are assessed via the number of egg ropes produced by the 1st generation of midges and the fertility of these egg ropes. Once per day the egg ropes are collected from the crystallising dish that is placed in each breeding container. The egg ropes should be collected and transferred with at least 2,5 ml native water to a 12-wells microplate (one egg rope in each well) or other suitable vessels, which are covered with a lid to prevent significant evaporation. The following characteristics are documented for each egg rope: day of production, size (normal, i.e. 1,0 ± 0,3 cm or small; typically ≤ 0,5 cm), and structure (normal = banana-form with spiralled egg string or abnormal, e.g. unspiralled egg string) and fertility (fertile or infertile). Over the course of six days after it was produced the fertility of an egg rope is assessed. An egg rope is considered fertile when at least one third of the eggs hatch. The total number of females added to the breeding cage is used to calculate the number of egg ropes per female and the number of fertile egg ropes per female. If required, the number of eggs in an egg rope can be estimated non-destructively by using the ring count method (detailed in 32 and 33). | Analytical measurements | Concentration of the test chemical | 38. | As a minimum, samples of the overlying water, pore water and the sediment should be analysed at the start of exposure (in case of water spiking preferably one hour after application) and at the end of the test, at the highest concentration and a lower one. This applies to vessels from both generations. From the crystallising dishes in the breeding cage only the overlying water is analysed, since this is what the egg ropes come into contact with (for the spiked sediment design an analytical confirmation of the sediment concentration may be considered). Further measurements of sediment, pore water or overlying water during the test may be conducted if deemed necessary. These determinations of test chemical concentration inform on the behaviour/partitioning of the test chemical in the water-sediment system. Sampling of sediment and pore water at the start and during the test (see paragraph 39) requires additional test vessels to perform analytical determinations. Measurements in sediment in the spiked water design might not be necessary if the partitioning of the test chemical between water and sediment has been clearly determined in a water/sediment study under comparable conditions (e.g. sediment to water ratio, type of application, organic carbon content of sediment), or if measured concentrations in the overlying water are shown to remain within 80 to 120 % of the nominal or measured initial concentrations.. | 39. | When intermediate measurements are made (e.g. at day 7 and/or 14) and if the analysis needs large samples which cannot be taken from test vessels without influencing the test system, analytical determinations should be performed on samples from additional test vessels treated in the same way (including the presence of test organisms) but not used for biological observations. | 40. | Centrifugation at e.g. 10 000 g at 4 °C for 30 min is the recommended procedure to isolate interstitial (= pore) water. However, if the test chemical is demonstrated not to adsorb to filters, filtration may also be acceptable. In some cases it might not be possible to analyse concentrations in the pore water as the sample volume may be too small. | Physical-chemical parameters | 41. | pH, dissolved oxygen in the test water and temperature of the water in the test vessels and crystallising dishes should be measured in an appropriate manner (see paragraph 10). Hardness and ammonia should be measured in the controls and in one test vessel and crystallising dish at the highest concentration at the start and the end of the test. | DATA AND REPORTING | Treatment of results | 42. | The purpose of this life-cycle test is to determine the effect of the test chemical on the reproduction and, for two generations, the development rate and the total number of fully emerged and alive male and female midges. For the emergence ratio data of males and females should be pooled. If there are no statistically significant differences between the sensitivities in the development rate of the separate sexes, male and female results may be pooled for statistical analysis. | 43. | Effect concentrations expressed as concentrations in the overlaying water (for spiked water) or in the sediment (for spiked sediment), are usually calculated based on measured concentrations at the beginning of the exposure (see paragraph 38). Therefore, for spiked water, the concentrations typically measured at the beginning of the exposure in the overlying water of the vessels for both generations and those of the crystallising dishes are averaged for each treatment. For spiked sediment, the concentrations typically measured at the beginning of the exposure in the vessels for both generations (and optionally those of the crystallising dishes) are averaged for each treatment. | 44. | To compute a point estimate, i.e. an ECx, the per-vessel and per-breeding cage statistics may be used as true replicates. In calculating a confidence interval for any ECx the variability among vessels should be taken into account, or it should be shown that this variability is so small that it can be ignored. When the model is fitted by Least Squares, a transformation should be applied to the per-vessel statistics in order to improve the homogeneity of variance. However, ECx values should be calculated after the response is transformed back to the original value (31). | 45. | When the statistical analysis aims at determining the NOEC by hypothesis testing, the variability among vessels needs to be taken into account, which is guaranteed by using ANOVA methods (e.g. Williams' and Dunnett's test procedures). Williams' test would be appropriate when a monotonic dose-response is expected in theory and Dunnett's test would be appropriate where the monotonicity hypothesis does not hold. Alternatively, more robust tests (27) can be appropriate in situations where there are violations of the usual ANOVA assumptions (31). | Emergence ratio | 46. | Emergence ratios are quantal data, and can be analysed by the Cochran-Armitage test applied in a step-down manner where a monotonic dose-response is expected and these data are consistent with this expectation. If not, a Fisher's exact or Mantel-Haentzal test with Bonferroni-Holm adjusted p-values can be used. If there is evidence of greater variability between replicates within the same concentration than a binomial distribution would indicate (often referenced to as “extra-binomial” variation), then a robust Cochran-Armitage or Fisher exact test such as proposed in (27), should be used. | The sum of live midges (males plus females) emerged per vessel, ne , is determined and divided by the number of larvae introduced, na : | where: | ER | = | emergence ratio | ne | = | number of live midges emerged per vessel | na | = | number of larvae introduced per vessel (normally 20) | When ne is larger than na (i.e. when unintentionally more than the foreseen number of larvae where introduced) na should be made equal to ne . | 47. | An alternative approach that is most appropriate for large sample sizes, when there is extra binomial variance, is to treat the emergence ratio as a continuous response and use procedures consistent with these ER data. A large sample size is defined here as the number emerged and the number not emerging both exceeding five, on a per replicate (vessel) basis. | 48. | To apply ANOVA methods, values of ER should first be transformed by the arcsin-sqrt transformation or Tukey-Freeman transformation to obtain an approximate normal distribution and to equalise variances. The Cochran-Armitage, Fisher's exact (Bonferroni), or Mantel-Haentzal tests can be applied when using the absolute frequencies. The arcsin-sqrt transformation is applied by taking the inverse sine (sine– 1) of the square root of ER. | 49. | For emergence ratios, ECx-values are calculated using regression analysis (e.g. probit, logit or Weibull models (28)). If regression analysis fails (e.g. when there are less than two partial responses), other non-parametric methods such as moving average or simple interpolation can be used. | Development rate | 50. | Mean development time represents the mean time span between the introduction of larvae (day 0 of the test) and the emergence of the experimental cohort of midges (for calculation of the true development time, the age of larvae at the time of introduction should be considered). The development rate (unit: 1/day) is the reciprocal of the development time and represents that portion of larval development which takes place per day. Development rate is preferred for the evaluation of these sediment toxicity studies as its variance is lower, and it is more homogeneous and closer to a normal distribution compared to the development time. Hence, more powerful parametric test procedures may be used with development rate unlike development time. For development rate as a continuous response, ECx-values can be estimated by regression analysis (e.g. (29) (30)). A NOEC for the mean development rate can be determined via ANOVA methods, e.g. Williams or Dunnett's test. Since males emerge earlier than females, i.e. have a higher development rate, it makes sense to calculate the development rate for each gender separately in addition to that for the total midges. | 51. | For statistical testing, the number of midges observed on inspection day x are assumed to be emerged at the mean of the time interval between day x and day x – l (l = length of the inspection interval, usually 1 day). The mean development rate per vessel ( ) is calculated according to: | where: | : | mean development rate per vessel | i | : | index of inspection interval | m | : | maximum number of inspection intervals | fi | : | number of midges emerged in the inspection interval i | ne | : | total number of midges emerged at the end of experiment (= Σfi ) | xi | : | development rate of the midges emerged in interval i | where: | dayi | : | inspection day (days since introduction of the larvae) | li | : | length of inspection interval i (days, usually 1 day) | Sex ratio | 52. | Sex ratios are quantal data and should therefore be evaluated by means of a Fisher's exact test or other appropriate methods. The natural sex ratio of C. riparius is one, i.e. males and females are equally abundant. For both generations the sex ratio data should be treated identically. Since the maximum number of midges per vessel (i.e. 20) is too low for a meaningful statistical analysis, the total number of fully emerged and alive midges for each gender is summed over all vessels of one treatment. These untransformed data are tested against the (solvent) control or pooled control data in a 2 × 2 contingency table. | Reproduction | 53. | Reproduction, as fecundity, is calculated as the number of egg ropes per female. More specific, the total number of egg ropes produced in a breeding cage is divided by the total number of alive and undamaged females added to that cage. A NOEC for fecundity can be determined via ANOVA methods, e.g. Williams or Dunnett's test. | 54. | Fertility of the egg ropes is used to quantify the number of fertile egg ropes per female. The total number of fertile egg ropes produced in a breeding cage is divided by the total number of alive and undamaged females added to that cage. A NOEC for fertility can be determined via ANOVA methods, e.g. Williams or Dunnett's test. | Test report | 55. | The test report should provide the following information: | | Test chemical: | — | physical nature and physical-chemical properties (water solubility, vapour pressure, log Kow , partition coefficient in soil (or in sediment if available), stability in water and sediment etc.); | — | chemical identification data (common name, chemical name, structural formula, CAS number, etc.) including purity and analytical method for the quantification of the test chemical. | | Test species: | — | test organisms used: species, scientific name, source of organisms and breeding conditions; | — | information on how the egg masses and larvae were handled; | — | information on handling of the emerged adults of the 1st generation with the help of an exhauster etc (see Appendix 5) | — | age of the test organisms at the time of insertion into the test vessels of the 1st and 2nd generation. | | Test conditions: | — | sediment used, i.e. natural or formulated (artificial) sediment; | — | natural sediment: location and description of sediment sampling site, including, if possible, contamination history; sediment characteristics: pH, organic carbon content, C/N ratio and granulometry (if appropriate). | — | formulated sediment: preparation, ingredients and characteristics (organic carbon content, pH, moisture, etc. measured at the start of the test); | — | preparation of the test water (if reconstituted water is used) and characteristics (oxygen concentration, pH, hardness, etc. measured at the start of the test); | — | depth of sediment and overlaying water for the test vessels and crystallising dishes; | — | volume of overlying and pore water; weight of wet sediment with and without pore water for the test vessels and the crystallising dishes; | — | test vessels (material and size); | — | crystallising dishes (material and size); | — | breeding cages (material and size) | — | method of preparation of stock solutions and test concentrations for the test vessels and crystallising dishes; | — | application of the test chemical into the test vessels and crystallising dishes: test concentrations, number of replicates and solvents if needed; | — | incubation conditions for the test vessels: temperature, light cycle and intensity, aeration (bubbles per second); | — | incubation conditions for the breeding cages and the crystallising dishes: temperature, light cycle and intensity; | — | incubation conditions for the egg ropes in the micro plates (or other vessels): temperature, light cycle and intensity: | — | detailed information on feeding including type of food, preparation, amount and feeding regime. | | Results: | — | nominal test concentrations, measured test concentrations and the results of all analyses to determine the concentration of the test chemical in the test vessels and crystallising dishes; | — | water quality within the test vessels and crystallising dishes, i.e. pH, temperature, dissolved oxygen, hardness and ammonia; | — | replacement of evaporated test water for the test vessels, if any; | — | number of emerged male and female midges per vessel and per day for the 1st and 2nd generation; | — | sex ratio of fully emerged and alive midges per treatment for the 1st and 2nd generation | — | number of larvae which failed to emerge as midges per vessel for the 1st and 2nd generation; | — | percentage/fraction of emergence per replicate and test concentration (male and female midges pooled) for the 1st and 2nd generation; | — | mean development rate of fully emerged and alive midges per replicate and treatment rate (male and female midges separate and also pooled) for the 1st and 2nd generation; | — | number of egg ropes deposited in the crystallising dishes per breeding cage and day; | — | characteristics of each egg rope (size, shape and fertility); | — | fecundity — total number of egg ropes per total number of females added to the breeding cage; | — | fertility — total number of fertile egg ropes per total number of females added to the breeding cage; | — | estimates of toxic endpoints e.g. ECx (and associated confidence intervals), NOEC and the statistical methods used for its determination; | — | discussion of the results, including any influence on the outcome of the test resulting from deviations from this test method. | LITERATURE | (1) | Chapter C.28 of this Annex, Sediment-water chironomid toxicity test using spiked water. | (2) | Shobanov, N.A., Kiknadze, I.I. and M.G. Butler (1999), Palearctic and Nearctic Chironomus (Camptochironomus) tentans Fabricius are different species (Diptera: Chironomidae). Entomologica Scandinavica, 30: 311–322. | (3) | Fleming, R. et al. (1994), Sediment Toxicity Tests for Poorly Water-Soluble Substances, Final Report to the European Commission, Report No: EC 3738. August 1994. WRc, UK. | (4) | SETAC (1993), Guidance Document on Sediment toxicity Tests and Bioassays for Freshwater and Marine Environments, From the WOSTA Workshop held in the Netherlands. | (5) | ASTM International (2009), E1706-05E01: Test Method for Measuring the Toxicity of Sediment-Associated Contaminants with Freshwater Invertebrates, In: Annual Book of ASTM Standards, Volume 11.06, Biological Effects and Environmental Fate; Biotechnology. ASTM International, West Conshohocken, PA. | (6) | Environment Canada (1997), Test for Growth and Survival in Sediment using Larvae of Freshwater Midges (Chironomus tentans or Chironomus riparius), Biological Test Method, Report SPE 1/RM/32, December 1997. | (7) | US-EPA (2000), Methods for Measuring the Toxicity and Bioaccumulation of Sediment-associated Contaminants with Freshwater Invertebrates, Second edition, EPA 600/R-99/064, March 2000, Revision to the first edition dated June 1994. | (8) | US-EPA/OPPTS 850.1735 (1996), Whole Sediment Acute Toxicity Invertebrates. | (9) | US-EPA/OPPTS 850.1790 (1996), Chironomid Sediment toxicity Test. | (10) | Milani, D., Day, K.E., McLeay, D.J. and R.S. Kirby (1996), Recent intra- and inter-laboratory studies related to the development and standardisation of Environment Canada's biological test methods for measuring sediment toxicity using freshwater amphipods (Hyalella azteca) and midge larvae (Chironomus riparius), Technical Report, Environment Canada, National Water Research Institute, Burlington, Ontario, Canada. | (11) | Norberg-King, T.J., Sibley, P.K., Burton, G.A., Ingersoll, C.G., Kemble, N.E., Ireland, S., Mount, D.R. and C.D. Rowland (2006), Interlaboratory evaluation of Hyalella azteca and Chironomus tentans short-term and long-term sediment toxicity tests, Environ. Toxicol. Chem., 25: 2662-2674. | (12) | Taenzler, V., Bruns, E., Dorgerloh, M., Pfeifle, V. and L. Weltje (2007), Chironomids: suitable test organisms for risk assessment investigations on the potential endocrine-disrupting properties of pesticides, Ecotoxicology, 16: 221-230. | (13) | Sugaya, Y. (1997), Intra-specific variations of the susceptibility of insecticides in Chironomus yoshimatsui, Jp. J. Sanit. Zool., 48: 345-350. | (14) | Kawai, K. (1986), Fundamental studies on chironomid allergy, I. Culture methods of some Japanese chironomids (Chironomidae, Diptera), Jp. J. Sanit. Zool., 37: 47-57. | (15) | Chapter C.27 of this Annex, Sediment-water chironomid toxicity test using spiked sediment. | (16) | OECD (2000), Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures, Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 23, ENV/JM/MONO(2000)6, OECD, Paris. | (17) | Weltje, L., Rufli, H., Heimbach, F., Wheeler, J., Vervliet-Scheebaum, M. and M. Hamer (2010), The chironomid acute toxicity test: development of a new test system, Integr. Environ. Assess. Management. | (18) | Environment Canada. (1995), Guidance Document on Measurement of Toxicity Test Precision Using Control Sediments Spiked with a Reference Toxicant, Report EPS 1/RM/30, September 1995. | (19) | Oetken, M, Nentwig, G., Löffler, D, Ternes, T. and J. Oehlmann (2005), Effects of pharmaceuticals on aquatic invertebrates, Part I, The antiepileptic drug carbamazepine, Arch. Environ. Contam. Toxicol., 49: 353-361. | (20) | Suedel, B.C. and J.H. Rodgers (1994), Development of formulated reference sediments for freshwater and estuarine sediment testing, Environ. Toxicol. Chem., 13: 1163-1175. | (21) | Naylor, C. and C. Rodrigues (1995), Development of a test method for Chironomus riparius using a formulated sediment, Chemosphere, 31: 3291-3303. | (22) | Dunnett, C.W. (1964), A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Amer. Statis. Assoc., 50: 1096-1121. | (23) | Dunnett, C.W. (1964), New tables for multiple comparisons with a control, Biometrics, 20: 482-491. | (24) | Williams, D.A. (1971), A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics, 27: 103-117. | (25) | Williams, D.A. (1972), The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics, 28: 510-531. | (26) | Jungmann, D., Bandow, C., Gildemeister, T., Nagel, R., Preuss, T.G., Ratte, H.T., Shinn, C., Weltje, L. and H.M. Maes (2009), Chronic toxicity of fenoxycarb to the midge Chironomus riparius after exposure in sediments of different composition. J Soils Sediments, 9: 94-102. | (27) | Rao, J.N.K. and A.J. Scott (1992), A simple method for the analysis of clustered binary data. Biometrics, 48: 577-585. | (28) | Christensen, E.R. (1984), Dose-response functions in aquatic toxicity testing and the Weibull model, Water Res., 18: 213-221. | (29) | Bruce, R.D. and D.J. Versteeg (1992), A statistical procedure for modelling continuous toxicity data, Environ. Toxicol. Chem., 11: 1485-1494. | (30) | Slob, W. (2002), Dose-response modelling of continuous endpoints. Toxicol. Sci., 66: 298-312. | (31) | OECD (2006), Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: a Guidance to Application, OECD Series on Testing and Assessment No. 54, 146 pp., ENV/JM/MONO(2006)18, OECD, Paris. | (32) | Benoit, D.A., Sibley, P.K., Juenemann, J.L. and G.T. Ankley (1997), Chironomus tentans life-cycle test: design and evaluation for use in assessing toxicity of contaminated sediments, Environ. Toxicol. Chem., 16: 1165-1176. | (33) | Vogt, C., Belz, D., Galluba, S., Nowak, C., Oetken, M. and J. Oehlmann (2007), Effects of cadmium and tributyltin on development and reproduction of the non-biting midge Chironomus riparius (Diptera) — baseline experiments for future multi-generation studies, J. Environ. Sci. Health Part A, 42: 1-9. | (34) | OECD (2010), Validation report of the Chironomid full life-cycle toxicity test, Forthcoming publication in the Series on Testing and Assessment, OECD, Paris. | Appendix 1 | Definitions | For the purpose of this test method the following definitions are used: | Chemical is a substance or a mixture. | Formulated sediment or reconstituted, artificial or synthetic sediment is a mixture of materials used to mimic the physical components of natural sediment. | Overlying water is the water placed over sediment in the test vessel. | Interstitial water or pore water is the water occupying space between sediment and soil particles. | Spiked water is the test water to which test chemical has been added. | Test chemical is any substance or mixture tested using this test method. | Appendix 2 | Recommendations for culture of Chironomus riparius | 1. | Chironomus larvae may be reared in crystallising dishes or larger containers. Fine quartz sand is spread in a thin layer of about 5 to 10 mm deep over the bottom of the container. Kieselgur (e.g. Merck, Art 8117) has also been shown to be a suitable substrate (a thinner layer of up to a very few mm is sufficient). Suitable water is then added to a depth of several cm. Water levels should be topped up as necessary to replace evaporative loss, and prevent desiccation. Water can be replaced if necessary. Gentle aeration should be provided. The larval rearing vessels should be held in a suitable cage which will prevent escape of the emerging adults. The cage should be sufficiently large to allow swarming of emerged adults, otherwise copulation may not occur (minimum is ca. 30 × 30 × 30 cm). | 2. | Cages should be held at room temperature or in a constant environment room at 20 ± 2 °C with a photo period of 16 hour light (intensity ca. 1 000 lux), 8 hours dark. It has been reported that air humidity of less than 60 % RH can impede reproduction. | Dilution water | 3. | Any suitable natural or synthetic water may be used. Well water, dechlorinated tap water and artificial media (e.g. Elendt “M4” or “M7” medium, see below) are commonly used. The water should be aerated before use. If necessary, the culture water may be renewed by pouring or siphoning the used water from culture vessels carefully without destroying the tubes of larvae. | Feeding larvae | 4. | Chironomus larvae should be fed with a fish flake food (Tetra Min®, Tetra Phyll® or other similar brand of proprietary fish food), at approximately 250 mg per vessel per day. This can be given as a dry ground powder or as a suspension in water: 1,0 g of flake food is added to 20 ml of dilution water and blended to give a homogenous mix. This preparation may be fed at a rate of about 5 ml per vessel per day. (shake before use.) Older larvae may receive more. | 5. | Feeding is adjusted according to the water quality. If the culture medium becomes “cloudy”, the feeding should be reduced. Food additions should be carefully monitored. Too little food will cause emigration of the larvae towards the water column, and too much food will cause increased microbial activity and reduced oxygen concentrations. Both conditions can result in reduced growth rates. | 6. | Some green algae (e.g. Scenedesmus subspicatus, Chlorella vulgaris) cells may also be added when new culture vessels are set up. | Feeding emerged adults | 7. | Some experimenters have suggested that a cotton wool pad soaked in a saturated sucrose solution may serve as a food for emerged adults. | Emergence | 8. | At 20 ± 2 °C adults will begin to emerge from the larval rearing vessels after approximately 13 - 15 days. Males are easily distinguished by having plumose antennae and thin body. | Egg masses | 9. | Once adults are present within the breeding cage, all larval rearing vessels should be checked three times weekly for deposition of the gelatinous egg masses. If present, the egg masses should be carefully removed. They should be transferred to a small dish containing a sample of the breeding water. Egg masses are used to start a new culture vessel (e.g. 2 - 4 egg masses/vessel) or are used for toxicity tests. | 10. | First instar larvae should hatch after 2 - 3 days. | Set-up of new culture vessels | 11. | Once cultures are established it should be possible to set up a fresh larval culture vessel weekly or less frequently depending on testing requirements, removing the older vessels after adult midges have emerged. Using this system a regular supply of adults will be produced with a minimum of management. | Preparation of test solutions “M4” and “M7” | 12. | Elendt (1990) has described the “M4” medium. The “M7” medium is prepared as the “M4” medium except for the substances indicated in Table 1, for which concentrations are four times lower in “M7” than in “M4”. The test solution should not be prepared according to Elendt and Bias (1990) for the concentrations of NaSiO3 · 5H2O, NaNO3, KH2PO4 and K2HPO4 given for the preparation of the stock solutions are not adequate. | Preparation of the “M7”-medium | 13. | Each stock solution (I) is prepared individually and a combined stock solution (II) is prepared from these stock solutions (I) (see Table 1). Fifty ml from the combined stock solution (II) and the amounts of each macro nutrient stock solution which are given in Table 2 are made up to 1 litre of deionised water to prepare the “M7” medium. A vitamin stock solution is prepared by adding three vitamins to deionised water as indicated in Table 3, and 0,1 ml of the combined vitamin stock solution are added to the final “M7” medium shortly before use. The vitamin stock solution is stored frozen in small aliquots. The medium is aerated and stabilised. | Table 1 | Stock solutions of trace elements for medium M4 and M7 | Stock solutions (I) | Amount (mg) made up to 1 litre of deionised water | To prepare the combined stock solution (II): mix the following amounts (ml) of stock solutions (I) and make up to 1 litre of deionised water | Final concentrations in test solutions (mg/l) | M4 | M7 | M4 | M7 | H3BO3 (20) | 57 190 | 1,0 | 0,25 | 2,86 | 0,715 | MnCl2·4H2O (20) | 7 210 | 1,0 | 0,25 | 0,361 | 0,090 | LiCl (20) | 6 120 | 1,0 | 0,25 | 0,306 | 0,077 | RbCl (20) | 1 420 | 1,0 | 0,25 | 0,071 | 0,018 | SrCl2·6H2O (20) | 3 040 | 1,0 | 0,25 | 0,152 | 0,038 | NaBr (20) | 320 | 1,0 | 0,25 | 0,016 | 0,004 | Na2MoO4·2H2O (20) | 1 260 | 1,0 | 0,25 | 0,063 | 0,016 | CuCl2·2H2O (20) | 335 | 1,0 | 0,25 | 0,017 | 0,004 | ZnCl2 | 260 | 1,0 | 1,0 | 0,013 | 0,013 | CaCl2·6H2O | 200 | 1,0 | 1,0 | 0,010 | 0,010 | KI | 65 | 1,0 | 1,0 | 0,0033 | 0,0033 | Na2SeO3 | 43,8 | 1,0 | 1,0 | 0,0022 | 0,0022 | NH4VO3 | 11,5 | 1,0 | 1,0 | 0,00058 | 0,00058 | Na2EDTA·2H2O (20) (21) | 5 000 | 20,0 | 5,0 | 2,5 | 0,625 | FeSO4·7H2O (20) (21) | 1 991 | 20,0 | 5,0 | 1,0 | 0,249 | Table 2 | Macro nutrient stock solutions for medium M4 and M7 | | Amount made up to 1 litre of deionised water | (mg) | Amount of macro nutrient stock solutions added to prepare medium M4 and M7 | (ml/l) | Final concentrations in test solutions M4 and M7 | (mg/l) | CaCl2 · 2H2O | 293 800 | 1,0 | 293,8 | MgSO4 · 7H2O | 246 600 | 0,5 | 123,3 | KCl | 58 000 | 0,1 | 5,8 | NaHCO3 | 64 800 | 1,0 | 64,8 | NaSiO3 · 9H2O | 50 000 | 0,2 | 10,0 | NaNO3 | 2 740 | 0,1 | 0,274 | KH2PO4 | 1 430 | 0,1 | 0,143 | K2HPO4 | 1 840 | 0,1 | 0,184 | Table 3 | Vitamin stock solution for medium M4 and M7 | All three vitamin solutions are combined to make a single vitamin stock solution. | | Amount made up to 1 litre of deionised water | (mg) | Amount of vitamin stock solution added to prepare medium M4 and M7 | (ml/l) | Final concentrations in test solutions M4 and M7 | (mg/l) | Thiamine hydrochloride | 750 | 0,1 | 0,075 | Cyanocobalamin (B12) | 10 | 0,1 | 0,0010 | Biotine | 7,5 | 0,1 | 0,00075 | REFERENCES | BBA (1995), Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system, Edited by M. Streloke and H. Köpp. Berlin. | Elendt, B.P. (1990), Selenium deficiency in Crustacea, Protoplasma, 154: 25-33. | Elendt, B.P. and W.-R. Bias (1990), Trace nutrient deficiency in Daphnia magna cultured in standard medium for toxicity testing, Effects on the optimisation of culture conditions on life history parameters of D. magna, Water Research, 24: 1157-1167. | Appendix 3 | Preparation of formulated sediment | SEDIMENT COMPOSITION | The composition of the formulated sediment should be as follows: | Constituent | Characteristics | % of sediment dry weight | Peat | Sphagnum moss peat, as close to pH 5,5-6,0 as possible, no visible plant remains, finely ground (particle size ≤ 1 mm) and air dried | 4 - 5 | Quartz sand | Grain size: > 50 % of the particles should be in the range of 50-200 μm | 75 - 76 | Kaolinite clay | Kaolinite content ≥ 30 % | 20 | Organic carbon | Adjusted by addition of peat and sand | 2 (± 0,5) | Calcium carbonate | CaCO3, pulverised, chemically pure | 0,05 - 0,1 | Water | Conductivity ≤ 10 μS/cm | 30 - 50 | PREPARATION | The peat is air dried and ground to a fine powder. A suspension of the required amount of peat powder in deionised water is prepared using a high-performance homogenising device. The pH of this suspension is adjusted to 5,5 ± 0,5 with CaCO3. The suspension is conditioned for at least two days with gentle stirring at 20 ± 2 °C, to stabilise pH and establish a stable microbial component. pH is measured again and should be 6,0 ± 0,5. Then the peat suspension is mixed with the other constituents (sand and kaolin clay) and deionised water to obtain an homogeneous sediment with a water content in a range of 30–50 per cent of dry weight of the sediment. The pH of the final mixture is measured once again and is adjusted to 6,5 to 7,5 with CaCO3 if necessary. Samples of the sediment are taken to determine the dry weight and the organic carbon content. Then, before it is used in the chironomid toxicity test, it is recommended that the formulated sediment be conditioned for seven days under the same conditions which prevail in the subsequent test. | STORAGE | The dry constituents for preparation of the artificial sediment may be stored in a dry and cool place at room temperature. The formulated (wet) sediment should not be stored prior to its use in the test. It should be used immediately after the 7 days conditioning period that ends its preparation. | REFERENCES | OECD (1984), Earthworm, Acute Toxicity Test, Test Guideline No. 207, Guidelines for the Testing of Chemicals, OECD, Paris. | Meller, M., Egeler, P., Roembke, J., Schallnass, H., Nagel, R. and B. Streit (1998), Short-term toxicity of lindane, hexachlorobenzene and copper sulfate on tubificid sludgeworms (Oligochaeta) in artificial media, Ecotox. Environ. Safety, 39: 10-20. | Appendix 4 | Chemical Characteristics of an Acceptable Dilution water | CONSTITUENT | CONCENTRATIONS | Particulate matter | < 20 mg/l | Total organic carbon | < 2 mg/l | Unionised ammonia | < 1 μg/l | Hardness as CaCO3 | < 400 mg/l (*5) | Residual chlorine | < 10 μg/l | Total organophosphorus pesticides | < 50 ng/l | Total organochlorine pesticides plus polychlorinated biphenyls | < 50 ng/l | Total organic chlorine | < 25 ng/l | Appendix 5 | Guidance for test performance | Example of a breeding cage: | A | : | gauze on the top and at least one side of the cage (mesh size ca. 1 mm) | B | : | aperture for placing the emerged adults inside the breeding cage and to remove the laid egg ropes from the crystallisation dishes (not shown in this graphic) | C | : | breeding cage size minimum 30 cm length, 30 cm height and 30 cm width | Example of a test vessel: | A | : | pasteur pipette for air supply of the overlying water | B | : | glass lid to prevent emerged midges from escaping | C | : | water surface layer | D | : | test vessel (glass beaker minimum 600 ml) | E | : | sediment layer | Example of an exhauster for capturing adult midges (arrows indicate air flow direction): | A | : | glass tube (inner diameter ca. 5 mm) connected to a self-priming pump | B | : | cork of vulcanised rubber, perforated with glass tube (A). On the inside, the opening of glass tube (A) is covered with some cotton and a gauze (mesh size ca. 1 mm) to prevent damaging the midges when they are sucked into the exhauster | C | : | transparent container (plastic or glass, length ca. 15 cm) for captured midges | D | : | cork of vulcanised rubber, perforated with tube (E). To release midges into the breeding cage, cork D is released from container C | E | : | tube (plastic or glass, inner diameter ca. 8 mm) to collect adult midges from vessel | Schematic presentation of a life-cycle test: | A | : | 1st generation — test vessels containing a sediment-water system, eight replicates, 20 first instar larvae per vessel | B | : | four test vessels for each breeding cage, A and B | C | : | breeding cages (A and B) for swarming, mating and oviposition | D | : | crystallising dishes for deposition of egg ropes | E | : | micro plates, one well for each egg rope | F | : | 2nd generation — test vessels containing a sediment-water system, eight replicates, 20 first instar larvae per vessel | C.41. FISH SEXUAL DEVELOPMENT TEST | INTRODUCTION | 1. | This test method is equivalent to OECD test guideline (TG) 234 (2011). It is based on a decision from 1998 to develop new or update existing test methods for the screening and testing of potential endocrine disrupters. The Fish Sexual Development Test (FSDT) was identified as a promising test method covering a sensitive fish life stage responsive to both oestrogen and androgen-like chemicals. The test method went through an inter-laboratory validation exercise from 2006 to 2010, where Japanese medaka (Oryzias latipes), zebrafish (Danio rerio) and three spined stickleback (Gasterosteus aculeatus) were validated and fathead minnow (Pimephales promelas) was partially validated (41) (42) (43). This protocol includes Japanese medaka, the three-spined stickleback and zebrafish. The protocol is in principle an enhancement of OECD TG 210 Fish, Early Life Stage Toxicity Test (1), where the exposure is continued until the fish are sexually differentiated, i.e. about 60 days post-hatch (dph) for Japanese medaka, the three-spined stickleback and zebrafish (the exposure period can be shorter or longer for other species that are validated in the future), and endocrine-sensitive endpoints are added. The FSDT assesses early life-stage effects and potential adverse consequences of putative endocrine disrupting chemicals (e.g. oestrogens, androgens and steroidogenesis inhibitors) on sexual development. The combination of the two core endocrine endpoints, vitellogenin (VTG) concentration and phenotypic sex ratio enable the test to indicate the mode of action of the test chemical. Due to the population-relevant change in phenotypic sex ratio, the FSDT can be used for hazard and risk assessment. However, if the test is used for hazard or risk assessment, the stickleback should not be used because the validation data available so far showed that in this species the alterations of phenotypic sex ratio by the test chemicals were uncommon. | 2. | The protocol is based on fish exposed via water to chemicals during the sex labile period in which the fish is expected to be most sensitive to the effects of endocrine disrupting chemicals that interfere with sexual development. Two core endpoints are measured as indicators of endocrine-associated developmental aberrations, the VTG concentrations and sex ratios (proportions of sex) determined via gonad histology. Gonadal histopathology (evaluation and staging of oocytes and spermatogenetic cells) is optional. Additionally, the genetic sex is determined whenever possible (e.g. in Japanese medaka and the three spined stickleback). The presence of a genetic sex marker is a considerable advantage as it increases the power of the sex ratio statistics and enables the detection of individual phenotypic sex reversal. Other apical endpoints that should be measured include hatching rate, survival, length and body weight. The test method might be adaptable to other species than those mentioned above provided that the other species undergo a validation equal to the one accomplished for Japanese medaka, the three-spined stickleback and zebrafish, that the control fish are sexually differentiated at the end of the test, that VTG levels are sufficiently high to detect significant chemical-related variations, and that sensitivity of the test system is established using endocrine active reference chemicals ((anti)-oestrogens, (anti)-androgens, aromatase inhibitors etc). In addition, any validation report(s) referring to FSDT data using other species should be reviewed by the OECD, and the validation outcome should be considered as satisfactory. | Initial considerations and limitations | 3. | VTG is normally produced by the liver of female oviparous vertebrates in response to circulating endogenous oestrogen (2). It is a precursor of egg yolk proteins and, once produced in the liver, travels in the bloodstream to the ovary, where it is taken up and modified by developing eggs. The VTG synthesis is very limited, though detectable, in immature fish and adult male fish because they lack sufficient circulating oestrogen. However, the liver is capable of synthesising and secreting VTG in response to exogenous oestrogen stimulation (3) (4) (5). | 4. | The measurement of VTG serves for the detection of chemicals with oestrogenic, anti-oestrogenic, androgenic modes of action and chemicals that interfere with steroidogenesis as for example aromatase inhibitors. The detection of oestrogenic chemicals is possible via the measurement of VTG induction in male fish, and it has been abundantly documented in the scientific peer-reviewed literature. VTG induction has also been demonstrated following exposure to aromatisable androgens (6) (7). A reduction in the circulating level of oestrogen in females, for instance through the inhibition of the aromatase converting the endogenous androgen to the natural oestrogen 17β-oestradiol, causes a decrease in the VTG concentration, which is used to detect chemicals having aromatase inhibiting properties or steroidogenesis inhibitors more broadly (33). The biological relevance of the VTG response following oestrogenic/aromatase inhibition is established and has been broadly documented (8) (9). However, it is possible that production of VTG in females can also be affected by general toxicity and non-endocrine toxic modes of action. | 5. | Several measurement methods have been successfully developed and standardised for routine use to quantify VTG in blood, liver, whole body or head/tail homogenate samples collected from individual fish. This is the case for zebrafish, three-spined stickleback and Japanese medaka and also the partially validated species fathead minnow; species-specific Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) methods using immunochemistry for the quantification of VTG are available (5) (10) (11) (12) (13) (14) (15) (16). In Japanese medaka and zebrafish, there is a good correlation between VTG measured from blood plasma, liver and homogenate samples although homogenates tend to show slightly lower values than plasma (17) (18) (19). Appendix 5 provides the recommended procedures for sample collection for VTG analysis. | 6. | Change in the phenotypic sex ratio (proportions of sex) is an endpoint reflecting sex reversal. In principle, oestrogens, anti-oestrogens, androgens, anti-androgens and steroidogenesis inhibiting chemicals can affect the sex ratio of developing fish (20). It has been shown that this sex reversal is partly reversible in zebrafish (21) following oestrogen-like chemical exposure, whereas sex reversal following androgen-like chemical exposure is permanent (30). The sex is defined as female, male, intersex (both oocytes and spermatogenetic cells in one gonad) or undifferentiated, determined in individual fish via histological examination of the gonads. Guidance is given in Appendix 7 and in the OECD Guidance Document on the Diagnosis of Endocrine-Related Histopathology of Fish Gonads (22). | 7. | Genetic sex is examined via genetic markers when they exist in a given fish species. In Japanese medaka the female XX or male XY genes can be detected by Polymerase Chain-Reaction (PCR), or the Y-linked DM domain gene (DMY) can be analysed (DMY negative or positive) as described in (23) (24). In three-spined stickleback, there is an equivalent PCR method for genetic sex determination described in Appendix 10. Where the genetic sex can be individually linked to the phenotypic sex, the power of the test is improved and therefore genetic sex should be determined in species with documented genetic sex markers. | 8. | The two core endocrine endpoints, VTG and sex ratio, can in combination demonstrate the endocrine mode of action (MOA) of the chemical (Table 1). The sex ratio is a population relevant biomarker (25) (26) and for some well defined modes of action, the FSDT results may be used for hazard and risk assessment purposes when deemed appropriate by the regulatory agency. These modes of action are at present oestrogens, androgens and steroidogenesis inhibitors. | Table 1 | Reaction of the endocrine endpoints to different modes of action of chemicals | ↑ = increasing, ↓ = decreasing, — = not investigated | MOA | VTG ♂ | VTG ♀ | Sex ratio | References | Weak oestrogen agonist | ↑ | ↑ | ↑♀ or ↑Undiff | (27) (40) | Strong oestrogen agonist | ↑ | ↑ | ↑♀ or ↑Undiff, No ♂ | (28) (40) | Oestrogen antagonist | — | — | ↓♀, ↑Undiff. | (29) | Androgen agonist | ↓ or — | ↓ or — | ↑♂, No ♀ | (28) (30) | Androgen antagonist | — | — | ↑♀ | ↑Intersex | (31) | Aromatase inhibitor | ↓ | ↓ | ↓♀ | (33) | 9. | The FSDT does not cover the reproductive life stage of the fish and therefore chemicals that are suspected to affect reproduction at lower concentrations than sexual development should be examined in a test that covers reproduction. | 10. | Definitions for the purpose of this Test Method are given in Appendix 1. | 11. | The in vivo FSDT is intended to detect chemicals with androgenic and oestrogenic properties as well as anti-androgenic, anti-oestrogenic and steroidogenesis inhibiting properties. The FSDT validation phases (1 and 2) did cover oestrogenic, androgenic and steroidogenesis inhibiting chemicals. The effects in the FSDT of oestrogen- and androgen antagonists can be seen in Table 1 but these MOA are less documented at present time. | PRINCIPLE OF THE TEST | 12. | In the test, fish are exposed, from newly fertilised egg until the completion of sexual differentiation, to at least three concentrations of the test chemical dissolved in water. The test conditions should be flow-through unless not possible due to the availability or nature (e.g. limited solubility) of the test chemical. The test starts with the placing of newly fertilised eggs (before cleavage of the blastodisc) in the test chambers. The loading of the chambers is described for each species in paragraph 27. For the validated fish species, Japanese medaka, the three-spined stickleback and zebrafish, the test is terminated at 60 dph. At test termination, all fish are euthanised humanely. A biological sample (blood plasma, liver or head/tail homogenate) is collected for VTG analysis from each fish and the remaining part is fixed for histological evaluation of the gonads to determine the phenotypic sex; optionally, histopathology (e.g. staging of gonads, severity of intersex) can be performed. A biological sample (the anal- or the dorsal fin) for the determination of the genetic sex is taken in species possessing appropriate markers (Appendices 9 and 10). | 13. | An overview of relevant test conditions specific for validated species: Japanese medaka, the three-spined stickleback and zebrafish is provided in Appendix 2. | INFORMATION ON THE TEST CHEMICAL | 14. | Results from an acute toxicity test or other short-term toxicity assay [e.g. test method C.14 (34) and OECD TG 210 (1)], preferably performed with the species chosen for this test, should be available. This implies that the water solubility and the vapour pressure of the test chemical are known and a reliable analytical method for the quantification of the chemical in the test chambers, with known and reported accuracy and limit of detection, is available. | 15. | Other useful information includes the structural formula, purity of the chemical, stability in water and light, pKa, Pow and results of a test for ready biodegradability (Test Method C.4) (35). | Test acceptance criteria | 16. | For the test results to be acceptable the following conditions apply: | — | The dissolved oxygen concentration should be at least 60 per cent of the air saturation value (ASV) throughout the test; | — | The water temperature should not differ by more than ± 1,5 °C between test chambers at any one time during the exposure period and be maintained within the temperature ranges specified for the test species (Appendix 2); | — | A validated method for analysis of the exposure chemical with a detection limit well below the lowest nominal concentration should be available and evidence should be gathered to demonstrate that the concentrations of the test chemical in solution have been satisfactorily maintained within ± 20 % of the mean measured values; | — | Overall survival of fertilised eggs in the controls and, where relevant, in the solvent controls, should be greater than or equal to the limits defined in Appendix 2; | — | Acceptance criteria related to growth and proportions of sex at termination of the test are based on data from the control groups (pooled solvent and water control unless they are significantly different, then solvent only): | | Japanese medaka | Zebrafish | Three-spined stickleback | Growth | Fish wet weight, blotted dry | > 150 mg | > 75 mg | > 120 mg | Length (standard length) | > 20 mm | > 14 mm | > 20 mm | Sex ratio (% males or females) | 30-70 % | 30-70 % | 30-70 % | — | When a solvent is used it should have no statistical significant effect on survival and should not produce any endocrine disrupting effects or other adverse effects on the early-life stages as revealed by a solvent control. | If a deviation from the test acceptance criteria is observed, the consequences should be considered in relation to the reliability of the test data and these considerations should be included in the reporting. | DESCRIPTION OF THE TEST METHOD | Test chambers | 17. | Any glass, stainless steel or other chemically inert chambers can be used. The dimensions of the chambers should be large enough to allow compliance with loading rate criteria given below. It is desirable that test chambers be randomly positioned in the test area. A randomised block design with each concentration being present in each block is preferable to a completely randomised design. The test chambers should be shielded from unwanted disturbance. | Selection of species | 18. | Recommended fish species are given in Appendix 2. The procedures for inclusion of new species are given in paragraph 2. | Holding of parental fish | 19. | Details on holding the parental fish under satisfactory conditions may be found in OECD TG 210(1). Parental fish should be fed once or twice a day with appropriate food. | Handling of embryos and larvae | 20. | Initially, embryos and larvae may be exposed within a main chamber in smaller glass or stainless steel chambers, fitted with mesh sides or ends to permit a flow of test chemical through the chamber. Non-turbulent flow through these small chambers may be induced by suspending them from an arm arranged to move the chamber up and down but always keeping the organisms submerged. | 21. | Where egg containers, grids or meshes have been used to hold eggs within the main test chamber, these restraints should be removed after the larvae hatch, except that meshes should be retained to prevent the escape of the fish. If there is a need to transfer the larvae, they should not be exposed to the air and nets should not be used to release fish from egg containers. The timing of this transfer varies with the species and transfer may not always be necessary. | Water | 22. | Any water in which the test species shows control survival at least as good as in water described in Appendix 3 is suitable as test water. It should be of constant quality during the period of the test. In order to ensure that the dilution water will not unduly influence the test result (for example by reacting with the test chemical) or adversely affect the performance of the brood stock, samples should be taken at intervals for analysis. Total organic carbon, conductivity, pH and suspended solids should be measured, for example every three months where dilution water is known to be relatively constant in quality. Measurements of heavy metals (e.g. Cu, Pb, Zn, Hg, Cd, Ni), major anions and cations (e.g. Ca2+, Mg2+, Na+, K+, Cl–, SO4 2–) and pesticides should be done, if water quality is questionable. Details about chemical analysis and water collection can be found in paragraph 34. | Test solutions | 23. | Flow-through system should be used if practically possible. For flow-through tests, a system that continually dispenses and dilutes a stock solution of the test chemical (e.g. metering pump, proportional diluter, and saturator system) is necessary to deliver a series of concentrations to the test chambers. The flow rates of stock solutions and dilution water should be checked at intervals during the test and should not vary by more than 10 % throughout the test. A flow rate equivalent to at least five test chamber volumes per 24 hours has been found suitable (1). Care should be taken to avoid the use of plastic tubing or other materials, some of which may contain biologically active chemicals or may adsorb the test chemical. | 24. | The stock solution should preferably be prepared without the use of solvents by simply mixing or agitating the test chemical in the dilution water by using mechanical means (e.g. stirring or ultrasonication). If the test chemical is difficult to dissolve in water, procedures described in the OECD Guidance Document on aquatic toxicity testing of difficult substances and mixtures should be followed (36). The use of solvents should be avoided but may be necessary in some cases in order to produce a suitably concentrated stock solution. Examples of suitable solvents are given in (36). | 25. | Semi-static test conditions should be avoided unless justification is provided on compelling reasons associated with the test chemical (e.g. stability, limited availability, high cost or hazard). For the semi-static technique, two different renewal procedures may be followed. Either new test solutions are prepared in clean chambers and surviving eggs and larvae gently transferred into the new chambers, or the test organisms are retained in the test chambers whilst a proportion (at least two thirds) of the test water is changed daily. | PROCEDURE | Conditions of Exposure | Collection of eggs and duration | 26. | To avoid genetic bias, eggs are collected from a minimum of three breeding pairs or groups, mixed and randomly selected to initiate the test. For the three-spined stickleback, see the description of artificial fertilisation in Appendix 11. The test should start as soon as possible after the eggs have been fertilised, the embryos preferably being immersed in the test solutions before cleavage of the blastodisc commences, or as close as possible after this stage and no later than 12 h post fertilisation. The test should continue until sexual differentiation in the control group is completed (60 dph for Japanese medaka, the three-spined stickleback and zebrafish). | Loading | 27. | The number of fertilised eggs at the start of the test should be at least 120 per concentration divided between a minimum of 4 replicates (square root allocation to control is accepted). The eggs should be randomly distributed (by using statistical tables for randomisation) among treatments. The loading rate (for definition, see Appendix 1) should be low enough in order that a dissolved oxygen concentration of at least 60 % of the ASV can be maintained without direct aeration of the chambers. For flow-through tests, a loading rate not exceeding 0,5 g/l per 24 hours, and not exceeding 5 g/l of solution at any time is recommended. No later than 28 days post fertilisation the number of fish per replicate should be redistributed, so that each replicate contains as equal a number of fish as possible. If exposure related mortality occurs, the number of replicates should be reduced appropriately so that fish density between treatment levels is kept as equal as possible. | Light and temperature | 28. | The photoperiod and water temperature should be appropriate for the test species (see Appendix 2 for experimental conditions for the FSDT). | Feeding | 29. | Food and feeding are critical, and it is essential that the correct food for each stage is supplied at appropriate time intervals and at a level sufficient to support normal growth. Feeding should be ad libitum whilst minimising the surplus. To obtain a sufficient growth rate, fish should be fed at least twice daily (accepting once daily on weekends), separated by at least three hours between each feed. Surplus food and faeces should be removed, as necessary, to avoid accumulation of waste. As experience is gained, food and feeding regimes are continuously being refined to improve survival and optimise growth. Effort should therefore be made to confirm the proposed regime with acknowledged experts. Feeding should be withheld 24 hours before ending the test. Examples of appropriate food items are listed in Appendix 2 (see also the OECD Fish Testing Framework (39). | Test concentrations | 30. | Test chemicals should be spaced as described in Appendix 4. A minimum of three test concentrations in at least four replicates should be used. The curve relating LC50 to period of exposure in the acute studies available should be considered when selecting the range of test concentrations. Five test concentrations are recommended if the data are to be used for risk assessment. | 31. | Concentrations of the chemical higher than 10 % of the acute adult LC50 or 10 mg/l, whichever is the lower, need not be tested. The maximum test concentration should be 10 % of the LC50 on the larval/juvenile life-stage. | Controls | 32. | A dilution water control (≥ 4 replicates) and, if relevant, a solvent control (≥ 4 replicates) should be run in addition to the test concentrations. Only solvents that have been investigated not to have any statistical significant influence on the test endpoints should be used in the test. | 33. | Where a solvent is used, its final concentration should not be greater than 0,1 ml/l (36) and it should be the same concentration in all test chambers, except the dilution water control. However, every effort should be made to avoid the use of such solvent or keep solvent's concentrations to a minimum. | Frequency of Analytical Determinations and Measurements | 34. | Chemical analysis of the test chemical concentration should be performed before initiation of the test to check compliance with the acceptance criteria. All replicates should be analysed individually at the beginning and termination of the test. One replicate per test concentration should be analysed at least once per week during the test, changing systematically between replicates (1,2,3,4,1,2…). If samples are stored to be analysed at a later time, the storage method of the samples should be previously validated. Samples should be filtered (e.g. using a 0,45 μm pore size) or centrifuged to ensure that the determinations are made on the chemical in true solution. | 35. | During the test, dissolved oxygen, pH, total hardness, conductivity, salinity (if relevant), and temperature should be measured in all test chambers. As a minimum dissolved oxygen, salinity (if relevant), and temperature should be measured weekly, and pH, conductivity and hardness at the beginning and at the end of the test. Temperature should preferably be monitored continuously in at least one test chamber. | 36. | Results should be based on measured concentrations. However, if the concentration of the test chemical in solution has been satisfactorily maintained within ± 20 % of the nominal concentration throughout the test, then the results can either be based on nominal or measured values. | Observations and measurements | Stage of embryonic development | 37. | The exposure should begin as soon as possible after fertilisation and before cleavage of the blastodisc commences and no later than 12 h post fertilisation to ensure exposure during early embryonic development. | Hatching and survival | 38. | Observations on hatching and survival should be made at least once daily and numbers recorded. Dead embryos, larvae and juvenile fish should be removed as soon as observed since they can decompose rapidly and may be broken up by the actions of the other fish. Extreme care should be taken when removing dead individuals not to knock or physically damage adjacent eggs/larvae, these being extremely delicate and sensitive. Criteria for death vary according to life stage: | — | for eggs: particularly in the early stages, a marked loss of translucency and change in coloration, caused by coagulation and/or precipitation of protein, leading to a white opaque appearance; | — | for larvae and juvenile fish: immobility and/or absence of respiratory movement and/or absence of heart-beat and/or white opaque coloration of central nervous system and/or lack of reaction to mechanical stimulus. | Abnormal appearance | 39. | The number of larvae or fish showing abnormality of body form should be recorded, and the appearance and the nature of the abnormality described. It should be noted that abnormal embryos and larvae occur naturally and can be of the order of several per cent in the control(s) in some species. Abnormal animals should only be removed from the test chambers on death. However, in accordance with Directive 2010/63/EU of the European Parliament and of the Council of 22 September 2010 on the protection of animals used for scientific purposes, if abnormalities result in pain, suffering and distress or lasting harm, and death can be reliably predicted, animals should be anaesthetised and euthanised according to the description in paragraph 44 and treated as mortality for data analysis.. | Abnormal behaviour | 40. | Abnormalities, e.g. hyperventilation, uncoordinated swimming, atypical quiescence and atypical feeding behaviour should be recorded at appearance. | Weight | 41. | At the end of the test all surviving fish should be euthanised (anaesthetised if blood samples should be taken), and individual wet weight (blotted dry) should be measured. | Length | 42. | At the end of the test, individual lengths (standard length) should be measured. | 43. | These observations will result in some or all of the following data being available for reporting: | — | cumulative mortality; | — | numbers of healthy fish at end of test; | — | time to start of hatching and end of hatching; | — | length and weight of surviving animals; | — | numbers of deformed larvae; | — | numbers of fish exhibiting abnormal behaviour. | Sampling of fish | 44. | Fish sampling is performed at termination of the test. Sampled fish should be euthanised with e.g. MS-222 (100-500 mg per l buffered with 200 mg NaHCO3 per l) or FA-100 (4-allyl-2-methoxyphenol: eugenol) and individually measured and weighed as wet weight (blotted dry) or anaesthetised if a blood sample should be taken (see paragraph 49). | Sampling for VTG analysis and sex determination via histological evaluation | 45. | All fish should be sampled and prepared for analysis of sex and VTG. All fish should be analysed histologically to determine sex. For the VTG measurements, a sub-sampling of at least 16 fish from each replicate is accepted. More fish should be analysed for VTG if the results of the sub-sampling turn out to be unclear. | 46. | The sampling procedure for VTG and sex determination is dependent on the VTG analysis method: | Head/tail homogenate method for VTG analysis | 47. | The fish is euthanised. Head and tail of each fish are separated from the body of the fish by cuts made right behind the pectoral fins, and right behind the dorsal fin, using a scalpel (See Figure 1). The head and tail part from each fish are pooled, weighed and individually numbered, frozen in liquid nitrogen and stored at – 70° or less for VTG analysis. The body part of the fish is numbered and fixed in an appropriate fixative for histological evaluation (22). By use of this method VTG and histopathology are evaluated on each individual and a possible change in the VTG level can thus be related to the phenotypic sex of the fish or genetic sex (Japanese medaka and the three-spined stickleback) of the fish. For further information see guidance for homogenisation (Appendix 5) and guidance for VTG quantification (Appendix 6). | Liver homogenate method for VTG analysis | 48. | The fish is euthanised. The liver is dissected out and stored at – 70 °C or below. Recommended procedures for liver excision and pre-treatment are available in OECD TG 229 (37) or Chapter C.37 of this Annex (38). Livers are then individually homogenised as described in OECD TG 229 or Chapter C.37 of this Annex. The supernatant collected is used for measuring VTG with a homologous ELISA technique (see Appendix 6 for an example of quantification in zebrafish or OECD TG 229 (37) for Japanese medaka). Following this approach, it is also possible to have individual fish data on both VTG and gonad histology. | Blood plasma method for VTG analysis | 49. | Blood is collected from the anaesthetised fish by cardiac puncture, caudal vein or tail cutting, and centrifuged at 4 °C for plasma collection. The plasma is stored at – 70 °C or below until use. The whole fish is euthanised and fixed for histology. Both plasma samples and fish are numbered individually to relate VTG levels to the sex of the fish. | Figure 1 | How to cut a fish for measurement of VTG in head/tail homogenate and histological evaluation of the mid section | Genetic sex determination | 50. | A biological sample for the determination of the genetic sex is taken from individual fish in species possessing appropriate markers. For Japanese medaka, the anal fin or dorsal fin is collected. A detailed description is given in Appendix 9 including tissue sampling and sex determination by a PCR-method. Equally, for the three spined stickleback, a description of tissue sampling and a sex determining PCR-method is given in Appendix 10. | VTG measurement | 51. | The measurement of VTG should be based upon a quantitative and analytically validated method. Information should be available upon the intra-assay and inter-assay variability of the method used in a given laboratory. The source of inter- and intra-laboratory variability is (most likely) based on the different developing stages of the fish population. Considering the variability of VTG measurement, NOECs based on this endpoint alone should be treated with great care. Different methods are available to assess VTG production in the fish species considered in this assay. A measurement technique that is both relatively sensitive and specific is the determination of protein concentrations via enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Homologous antibodies (raised against VTG of the same species) and most important homologous standards should be used. | Sex determination | 52. | Dependent on the VTG sampling procedure, whole fish or the remaining mid-section of each fish is placed in a pre-labelled processing cassette and fixed in an appropriate fixative for histological determination of sex (optionally also for evaluation of gonadal staging). Guidance on fixation and embedding is provided in Appendix 7 as well as in the OECD Guidance Document on the Diagnosis of Endocrine-Related Histopathology of Fish Gonads (22). After processing, the fish are embedded in paraffin blocks. The individuals should be placed longitudinally in the paraffin block. At least six longitudinal sections (3-5 μm in thickness) in a frontal plane including gonadal tissue from both gonads are taken from each individual. The interval between these sections should be approximately 50 μm for males and 250 μm for females. However, since each block will often contain males and females (if more than one individual are embedded in each block), the interval between sections from these blocks should be approximately 50 μm until at least six sections of the gonads from each male are obtained. Thereafter, the interval between sections can be increased to approximately 250 μm for the females. Sections are stained with haematoxylin and eosin and examined by light-microscopy with focus on sex (male, female, intersex or undifferentiated). Intersex is defined as presence of more than one oocyte in testis per six sections analysed or spermatogenic cells (yes/no) in ovaries. Histopathology and staging of ovaries and testis is optional but if investigated, the results should be statistically analyzed and reported. It should be noted that some fish species naturally lack a fully developed pair of gonads and only one gonad may be present (e.g. Japanese medaka and occasionally zebrafish). All such observations should be recorded. | 53. | Genetic sex determination in individual Japanese medaka is based on the presence or absence of the medaka male-sex determining gene, DMY, which is located on the Y chromosome. The genotypic sex of medaka can be identified by sequencing the DMY gene from DNA extracted from for instance a piece of anal fin or dorsal fin. The presence of DMY indicates a XY (male) individual regardless of phenotype, while the absence of DMY indicates a XX (female) individual regardless of phenotype (23). Guidance for tissue preparation and PCR method is given in Appendix 9. The genetic sex determination in individual three-spined stickleback is also performed via a PCR method, described in Appendix 10. | 54. | The occurrence of intersex (for definition, see Appendix 1) should be reported. | Secondary sexual characteristics | 55. | Secondary sexual characteristics are under endocrine control in species like the Japanese medaka; therefore observations of physical appearance of the fish should if possible be made at the end of the exposure. In the Japanese medaka, the papillary formation on the posterior part of the anal fin in females is androgen sensitive. Chapter C.37 of this Annex (38) provides relevant photographs of male secondary sex characteristics and androgenised females. | DATA AND REPORTING | Treatment of results | 56. | It is important that the strongest valid statistical test determine the endpoint. The replicate is the experimental unit but intra-replicate variability should be included in the statistical testing. A decision flow-chart is available in Appendix 8 to help with the most appropriate statistical test to use based on the characteristic of the data obtained from the test. Statistical significance level is 0,05 for all endpoints included. | Proportions of sex and genetic sex | 57. | The proportions of sex should be analysed for significant effect (NOEC/LOEC approach) of exposure by Jonckheere-Terpstra (Trend test) if a monotone dose-response exists. If non-monotonicity is found then a pair wise test should be applied: Use Dunnett's test if normality and homogenous variance can be obtained. Use Tamhane-Dunnett if heterogeneous variance is present. Otherwise use exact Mann-Whitney test with Bonferroni-Holm adjustment. A flow chart describing the statistics of the proportions of sex is placed in Appendix 8. The proportions of sex should be presented in tables as concentration proportions ± SD of males, females, intersex and undifferentiated. Statistical significance should be highlighted. Examples are presented in the FSDT Phase 2 validation report (42). Genetic sex should be reported as percentage of phenotypic sex reversal of males, females, intersex and undifferentiated. | VTG concentrations | 58. | VTG concentrations should be analysed for significant effect (NOEC/LOEC approach) of exposure. The Dunnett test is preferable to the t-test with Bonferroni correction. Where a Bonferroni correction is used, the Bonferroni-Holm correction is preferable. Allowance should be made for log-transformation of VTG to achieve normality and variance homogeneity. Next, if the concentration-response is consistent with monotonicity, then the JonckheereTerpstra test is preferable to any of the above. If t-tests or Dunnett's test is used, there is no need for a ANOVA significance F-test in order to proceed. For details see the flow chart in Appendix 8. Results should be reported in tables as concentration means ± SD for males, females, intersex and undifferentiated separately. Statistical significance for phenotypic females and phenotypic males should be highlighted. Examples are presented in the FSDT Phase 2 validation report (42). | Test chemical actual concentrations | 59. | The actual chamber concentrations of the test chemical should be analysed in frequencies described in paragraph 34. Results should be reported in tables as mean concentration ± SD on replicate basis as well as on concentration basis with information on number of samples and with outliers from the mean treatment concentration ± 20 % highlighted. Examples can be found in the FSDT Phase 2 validation report (42). | Interpretation of results | 60. | The test results should be interpreted with caution where measured test chemical concentrations in test solutions occur at levels near the detection limit of the analytical method. | Test report | 61. | The test report should include the following information: | | Test chemical | — | Relevant physical-chemical properties; chemical identification data including purity and analytical method for quantification of the test chemical. | | Test conditions | — | Test procedure used (e.g. flow-through semi-static/renewal); test design including test concentrations, method of preparation of stock solutions (in an Annex), frequency of renewal (the solubilising agent and its concentration should be given, when used); | — | The nominal test concentrations, the means of the measured values and their standard deviations in the test chambers and the method by which these were attained (the analytical method used should be presented in an Annex);Evidence that the measurements refer to the concentrations of the test chemical in true solution; | — | Water quality within test chambers: pH, hardness, temperature and dissolved oxygen concentration; | — | Detailed information on feeding (e.g. type of food(s), source, amount given and frequency and analyses for contaminants (e.g. PCBs, PAHs and organochlorine pesticides) if relevant. | | Results | — | Evidence that controls met the validity criteria: data on hatching rate should be presented in tables as percentage per replicate and per concentration. Outliers from the acceptance criteria (in controls) should be highlighted. Survival should be presented as percentage per replicate and per concentration. Outliers from the validity criteria (in controls) should be highlighted; | — | Clear indication of the results obtained on the different endpoints observed: embryo survival and hatching success; external abnormalities; length and weight; VTG measurements (ng/g homogenate, ng/ml plasma or ng/mg liver); gonadal histology, sex ratio, genetic sex data; incidence of any unusual reactions by the fish and any visible effects produced by the test chemical. | 62. | The results should be presented as mean values ± standard deviation (SD) or standard error (SE). Statistics should be reported as a minimum as NOEC and LOEC and confidence intervals. The statistical flow chart (Appendix 8) should be followed. | LITERATURE | (1) | OECD (1992), Fish, Early Life Stage Toxicity Test, Test Guideline No. 210, Guidelines for the Testing of Chemicals, OECD, Paris. | (2) | Jobling, S., D. Sheahan, J.A. Osborne, P. Matthiessen, and J.P. Sumpter, 1996, “Inhibition of testicular growth in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) exposed to estrogenic alkylphenolic chemicals”, Environmental Toxicology and Chemistry 15, pp. 194-202. | (3) | Sumpter, J.P. and S. Jobling, 1995, “Vitellogenesis As A Biomarker for Estrogenic Contamination of the Aquatic Environment”, Environmental Health Perspectives 103, pp. 173-178. | (4) | Tyler, C.R., R.van Aerle, T.H. Hutchinson, S. Maddix, and H. Trip (1999), “An in vivo testing system for endocrine disruptors in fish early life stages using induction of vitellogenin”, Environmental Toxicology and Chemistry 18, pp. 337-347. | (5) | Holbech, H., L. Andersen, G.I. Petersen, B. Korsgaard, K.L. Pedersen, and P. Bjerregaard (2001a), “Development of an ELISA for vitellogenin in whole body homogenate of zebrafish (Danio rerio)”, Comparative Biochemistry and Physiology C-Toxicology & Pharmacology 130, pp. 119-131. | (6) | Andersen, L., P. Bjerregaard, and B. Korsgaard (2003), “Vitellogenin induction and brain aromatase activity in adult male and female zebrafish exposed to endocrine disrupters”, Fish Physiology and Biochemistry 28, pp. 319-321. | (7) | Orn, S., H. Holbech, T.H. Madsen, L. Norrgren, and G.I. Petersen (2003), “Gonad development and vitellogenin production in zebrafish (Danio rerio) exposed to ethinylestradiol and methyltestosterone”, Aquatic Toxicology 65, pp. 397-411. | (8) | Panter, G.H., T.H. Hutchinson, R. Lange, C.M. Lye, J.P. Sumpter, M. Zerulla, and C.R. Tyler (2002), “Utility of a juvenile fathead minnow screening assay for detecting (anti-)estrogenic substances”, Environmental Toxicology and Chemistry 21, pp. 319-326. | (9) | Sun, L.W., J.M. Zha, P.A. Spear, and Z.J. Wang (2007), “Toxicity of the aromatase inhibitor letrozole to Japanese medaka (Oryzias latipes) eggs, larvae and breeding adults”, Comparative Biochemistry and Physiology C-Toxicology & Pharmacology 145, pp. 533-541. | (10) | Parks, L.G., A.O. Cheek, N.D. Denslow, S.A. Heppell, J.A. McLachlan, G.A. LeBlanc, and C.V.Sullivan (1999), “Fathead minnow (Pimephales promelas) vitellogenin: purification, characterization and quantitative immunoassay for the detection of estrogenic compounds”, Comparative Biochemistry and Physiology C-Toxicology & Pharmacology 123, pp. 113-125. | (11) | Brion, F., B.M. Nilsen, J.K. Eidem, A. Goksoyr, and J.M. Porcher (2002), “Development and validation of an enzyme-linked immunosorbent assay to measure vitellogenin in the zebrafish (Danio rerio)”, Environmental Toxicology and Chemistry 21, pp. 1699-1708. | (12) | Nishi, K., M. Chikae, Y. Hatano, H. Mizukami, M. Yamashita, R. Sakakibara, and E. Tamiya (2002), “Development and application of a monoclonal antibody-based sandwich ELISA for quantification of Japanese medaka (Oryzias latipes) vitellogenin”, Comparative Biochemistry and Physiology C-Toxicology & Pharmacology 132, pp. 161-169. | (13) | Hahlbeck, E., I. Katsiadaki, I. Mayer, M. Adolfsson-Erici, J. James, and B.E. Bengtsson (2004), “The juvenile three-spined stickleback (Gasterosteus aculeatus L.) as a model organism for endocrine disruption — II — kidney hypertrophy, vitellogenin and spiggin induction”, Aquatic Toxicology 70, pp. 311-326. | (14) | Tatarazako, N., M. Koshio, H. Hori, M. Morita, and T. Iguchi (2004), “Validation of an enzyme-linked immunosorbent assay method for vitellogenin in the medaka”, Journal of Health Science 50, pp. 301-308. | (15) | Eidem, J.K., H. Kleivdal, K. Kroll, N. Denslow, R. van Aerle, C. Tyler, G. Panter, T. Hutchinson, and A. Goksoyr (2006), “Development and validation of a direct homologous quantitative sandwich ELISA for fathead minnow (Pimephales promelas) vitellogenin. Aquatic Toxicology”, 78, pp. 202-206. | (16) | Jensen, K.M. and G.T. Ankley (2006), “Evaluation of a commercial kit for measuring vitellogenin in the fathead minnow (Pimephales promelas)”, Ecotoxicology and Environmental Safety 64, pp. 101-105. | (17) | Holbech, H., Petersen, G. I., Norman, A., Örn, S, Norrgren, L., and Bjerregaard, P (2001b), “Suitability of zebrafish as test organism for detection of endocrine disrupting chemicals. Comparison of vitellogenin in plasma and whole body homogenate from zebrafish (Danio rerio) and rainbow trout (Oncorhynchus mykiss)”, Nordic Council of Ministers, TemaNord 2001:597, pp. 48-51. | (18) | Nilsen, B.M., K. Berg, J.K. Eidem, S.I. Kristiansen, F. Brion, J.M. Porcher, and A. Goksoyr (2004), “Development of quantitative vitellogenin-ELISAs for fish test species used in endocrine disruptor screening”, Analytical and Bioanalytical Chemistry 378, pp. 621-633. | (19) | Orn, S., S. Yamani, and L. Norrgren (2006), “Comparison of vitellogenin induction, sex ratio, and gonad morphology between zebrafish and Japanese medaka after exposure to 17 alpha-ethinylestradiol and 17 beta-trenbolone”, Archives of Environmental Contamination and Toxicology 51, pp. 237-243. | (20) | Scholz, S. and N. Kluver (2009), “Effects of Endocrine Disrupters on Sexual, Gonadal Development in Fish, Sexual Development 3”, pp. 136-151. | (21) | Fenske, M., G. Maack, C. Schafers, and H. Segner (2005), “An environmentally relevant concentration of estrogen induces arrest of male gonad development in zebrafish, Danio rerio”, Environmental Toxicology and Chemistry 24, pp. 1088-1098. | (22) | OECD (2010), Guidance Document on the Diagnosis of Endocrine-related Histopathology in Fish Gonads, Series on Testing and Assessment No. 123, ENV/JM/MONO(2010)14, OECD, Paris. | (23) | Kobayashi, T., M. Matsuda, H. Kajiura-Kobayashi, A. Suzuki, N. Saito, M. Nakamoto, N. Shibata, and Y. Nagahama (2004), “Two DM domain genes, DMY and DMRT1, involved in testicular differentiation and development in the medaka, Oryzias latipes”, Developmental Dynamics 231, pp. 518-526. | (24) | Shinomiya, A., H. Otake, K. Togashi, S. Hamaguchi, and M. Sakaizumi (2004), “Field survey of sex-reversals in the medaka, Oryzias latipes: genotypic sexing of wild populations”, Zoological Science 21, pp. 613-619. | (25) | Kidd, K.A., P.J. Blanchfield, K.H. Mills, V.P. Palace, R.E. Evans, J.M. Lazorchak, and R.W. Flick (2007), “Collapse of a fish population after exposure to a synthetic estrogen”, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 104, pp. 8897-8901. | (26) | Palace,V.P., R.E. Evans, K.G. Wautier, K.H. Mills, P.J. Blanchfield, B.J. Park, C.L. Baron, and K.A. Kidd (2009), “Interspecies differences in biochemical, histopathological, and population responses in four wild fish species exposed to ethynylestradiol added to a whole lake”, Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences 66, pp. 1920-1935. | (27) | Panter, G.H., T.H. Hutchinson, K.S. Hurd, J. Bamforth, R.D. Stanley, S. Duffell, A. Hargreaves, S. Gimeno, and C.R. Tyler (2006), “Development of chronic tests for endocrine active chemicals — Part 1. An extended fish early-life stage test for oestrogenic active chemicals in the fathead minnow (Pimephales promelas)”, Aquatic Toxicology 77, pp. 279-290. | (28) | Holbech, H., K. Kinnberg, G.I. Petersen, P. Jackson, K. Hylland, L. Norrgren, and P. Bjerregaard (2006), “Detection of endocrine disrupters: Evaluation of a Fish Sexual Development Test (FSDT)”, Comparative Biochemistry and Physiology C-Toxicology & Pharmacology 144, pp. 57-66. | (29) | Andersen, L., K. Kinnberg, H. Holbech, B. Korsgaard, and P. Bjerregaard (2004), “Evaluation of a 40 day assay for testing endocrine disrupters: Effects of an anti-estrogen and an aromatase inhibitor on sex ratio and vitellogenin concentrations in juvenile zebrafish (Danio rerio)”, Fish Physiology and Biochemistry 30, pp. 257-266. | (30) | Morthorst, J.E., H. Holbech, and P. Bjerregaard (2010), “Trenbolone causes irreversible masculinization of zebrafish at environmentally relevant concentrations”, Aquatic Toxicology 98, pp. 336-343. | (31) | Kiparissis,Y., T.L. Metcalfe, G.C. Balch, and C.D. Metcalf (2003), “Effects of the antiandrogens, vinclozolin and cyproterone acetate on gonadal development in the Japanese medaka (Oryzias latipes)”, Aquatic Toxicology 63, pp. 391-403. | (32) | Panter, G.H., T.H. Hutchinson, K.S. Hurd, A. Sherren, R.D. Stanley, and C.R. Tyler (2004), “Successful detection of (anti-) androgenic and aromatase inhibitors in pre-spawning adult fathead minnows (Pimephales promelas) using easily measured endpoints of sexual development”, Aquatic Toxicology 70, pp. 11-21. | (33) | Kinnberg, K., H. Holbech, G.I. Petersen, and P. Bjerregaard (2007), “Effects of the fungicide prochloraz on the sexual development of zebrafish (Danio rerio)”, Comparative Biochemistry and Physiology C-Toxicology & Pharmacology 145, pp. 165-170. | (34) | Chapter C.14 of this Annex, Fish Juvenile Growth Test. | (35) | Chapter C.4 of this Annex, Ready Biodegradability. | (36) | OECD (2000), Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures, Series on Testing and Assessment No. 23, OECD, Paris. | (37) | OECD (2009), Fish Short Term Reproduction Assay, Test Guideline No. 229, Guidelines for the Testing of Chemicals, OECD, Paris. | (38) | Chapter C.37 of this Annex, 21-Day Fish Assay: A Short Term Screening for Oestrogenic and Androgenic Activity, and Aromatase Inhibition. | (39) | OECD (2012), Fish Toxicity Testing Framework, Series on Testing and Assessment No. 171, OECD, Paris | (40) | Schäfers, C., Teigeler, M., Wenzel, A., Maack, G., Fenske, M., Segner, H (2007), “Concentration- and time-dependent effects of the synthetic estrogen, 17 alpha-ethinylestradiol, on reproductive capabilities of the zebrafish, Danio rerio” Journal of Toxicology and Environmental Health-Part A, 70, 9-10 pp 768-779. | (41) | OECD (2011), Validation Report (Phase 1) for the Fish Sexual Development Test, Series on Testing and Assessment No 141, ENV/JM/MONO(2011)22, OECD, Paris. | (42) | OECD (2011), Validation Report ( Phase 2) for the Fish Sexual Development Test, Series on Testing and Assessment No 142, ENV/JM/MONO(2011)23, OECD, Paris. | (43) | OECD (2011), Peer Review Report of the validation of the Fish Sexual Development Test, Series on Testing and Assessment No 143, ENV/JM/MONO(2011)24, OECD, Paris. | (44) | Directive 2010/63/EU of the European Parliament and of the Council of 22 September 2010 on the protection of animals used for scientific purposes. OJ L 276, 20.10.2010, p. 33. | Appendix 1 | Abbreviations and definitions | Apical endpoint : Causing effect at population level | ASV : Air saturation value | Biomarker : Causing effect at individual level | Chemical : A substance or a mixture. | Dph : Days post hatch | DMY : Y-specific DM-domain gene required for male development in the medaka fish | ELISA : Enzyme-Linked Immunosorbent Assay | Fish weight : Fish wet weight (blotted dry) | FSDT : Fish Sexual Development Test | HPG axis : Hypothalamic-pituitary-gonadal axis | Intersex fish : Fish with more than one oocyte in testis per 6 sections analysed or spermatogenetic cells in ovaries (yes/no) | Loading rate : Wet weight of fish per volume of water | MOA : Mode of action | RT-PCR : Reverse Transcriptase Polymerase Chain-Reaction | Test chemical : Any substance or mixture tested using this test method. | Undifferentiated fish : Fish with gonads exhibiting no discernible germ cells. | VTG : Vitellogenin | Appendix 2 | Experimental conditions for the FSDT (freshwater species) | 1. | Recommended species | Japanese medaka (Oryzias latipes) | Zebrafish (Danio rerio) | Three-spined Stickleback (Gasterostreus aculeatus) | 2. | Test type | Flow-through or semi-static | Flow-through or semi-static | Flow-through or semi-static | 3. | Water temperature | 25 ± 2 °C | 27 ± 2 °C | 20 ± 2 °C | 4. | Illumination quality | Fluorescent bulbs (wide spectrum) | Fluorescent bulbs (wide spectrum) | Fluorescent bulbs (wide spectrum | 5. | Light intensity | 10-20 μE/m2/s, 540-1 080 lux, or 50-100 ft-c (ambient laboratory levels) | 10-20 μE/m2/s, 540-1 080 lux, or 50-100 ft-c (ambient laboratory levels) | 10-20 μE/m2/s, 540-1 080 lux, or 50-100 ft-c (ambient laboratory levels) | 6. | Photoperiod | 12-16 h light, 8-12 h dark | 12-16 h light, 8-12 h dark | 16 h light, 8 h dark | 7. | Minimum chamber size | Individual chambers should contain a minimum of 7 l water volume | Individual chambers should contain a minimum of 7 l water volume | Individual chambers should contain a minimum of 7 l water volume | 8. | Volume exchanges of test solutions | Minimum of 5 daily | Minimum of 5 daily | Minimum of 5 daily | 9. | Age of test organisms at start of exposure | Newly fertilised eggs (Early blastula stage) | Newly fertilised eggs (Early blastula stage) | Newly fertilised eggs | 10. | No. of eggs per treatment | Minimum 120 | Minimum 120 | Minimum 120 | 11. | No. of treatments | Minimum 3 (plus appropriate controls) | Minimum 3 (plus appropriate controls) | Minimum 3 (plus appropriate controls) | 12. | No. replicates per treatment | Minimum 4 (unless square root allocation to controls) | Minimum 4 (unless square root allocation to controls) | Minimum 4 (unless square root allocation to controls) | 13. | Feeding regime | Live Artemia, frozen adult brine shrimp, flake food, etc. It is recommended to feed twice daily | Special fry food, live Artemia, frozen adult brine shrimp, flake food, etc. It is recommended to feed twice daily | Live Artemia, frozen adult brine shrimp, flake food, etc. It is recommended to feed twice daily | 14. | Aeration | None unless DO concentration falls below 60 % saturation | None unless DO concentration falls below 60 % saturation | None unless DO concentration falls below 70 % saturation | 15. | Dilution water | Clean surface, well or reconstituted water | Clean surface, well or reconstituted water | Clean surface, well or reconstituted water | 16. | Test chemical exposure duration | 60-dph | 60-dph | 60-dph | 17. | Biological endpoints | Hatching success, Survival Gross- morphology, VTG gonadal histology, Genetic sex, Sex ratio | Hatching success, Survival Gross- morphology, VTG gonadal histology, Sex ratio | Hatching success, Survival Gross- morphology, VTG gonadal histology, Sex ratio | 18. | Test acceptability criteria for pooled replicates of controls | Hatching success > 80 % | Hatching success > 80 % | Hatching success > 80 % | Post hatch survival ≥ 70 % | Post hatch survival ≥ 70 % | Post hatch survival ≥ 70 % | growth (Fish wet weight, blotted dry) > 150 mg | growth (Fish wet weight, blotted dry) > 75 mg | growth (Fish wet weight, blotted dry) > 120 mg | Length (standard length) > 20mm | Length (standard length) > 14 mm | Length (standard length) > 20 mm | Sex ratio (% males or females) | 30 %-70 % | Sex ratio (% males or females) 30 %-70 % | Sex ratio (% males or females) 30 %-70 % | Appendix 3 | Chemical characteristics of an acceptable dilution water | CONSTITUENT | CONCENTRATION | Particular matter | < 20 mg/l | Total organic carbon | < 2 mg/l | Unionised ammonia | < 1 μg/l | Residual chlorine | < 10 μg/l | Total organophosphorus pesticides | < 50 ng/l | Total organochlorine pesticides plus polychlorinated biphenyls | < 50 ng/l | Total organic chlorine | < 25 ng/l | Appendix 4 | From test method C.14/Guidance on test concentrations | Column (Number of concentrations between 100 and 10, or between 10 and 1) (*6) | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 32 | 46 | 56 | 63 | 68 | 72 | 75 | 10 | 22 | 32 | 40 | 46 | 52 | 56 | 3,2 | 10 | 18 | 25 | 32 | 37 | 42 | 1,0 | 4,6 | 10 | 16 | 22 | 27 | 32 | | 2,2 | 5,6 | 10 | 15 | 19 | 24 | | 1,0 | 3,2 | 6,3 | 10 | 14 | 18 | | | 1,8 | 4,0 | 6,8 | 10 | 13 | | | 1,0 | 2,5 | 4,6 | 7,2 | 10 | | | | 1,6 | 3,2 | 5,2 | 7,5 | | | | 1,0 | 2,2 | 3,7 | 5,6 | | | | | 1,5 | 2,7 | 4,2 | | | | | 1,0 | 1,9 | 3,2 | | | | | | 1,4 | 2,4 | | | | | | 1,0 | 1,8 | | | | | | | 1,3 | | | | | | | 1,0 | Appendix 5 | Guidance for homogenisation of head & tail from juvenile zebrafish, fathead minnow, three spined stickleback and Japanese medaka | The purpose of this section is to describe the procedures that occur prior to the quantification of the VTG concentration. Other procedures that result in comparable VTG quantification can be used. It is an option to determine the VTG concentration in blood plasma or liver instead of head/tail homogenate. | Procedure | 1. | The fish are anaesthetised and euthanised in accordance with the test description. | 2. | The head and tail are cut of the fish in accordance with the test description. Important: All dissection instruments, and the cutting board should be rinsed and cleaned properly (e.g. with 96 % ethanol) between handling of each single fish to prevent “VTG pollution” from females or induced males to un-induced males. | 3. | The weight of the pooled head and tail from each fish is measured to the nearest mg. | 4. | After being weighed, the parts are placed in appropriate tubes (e.g. 1,5 ml eppendorf) and frozen at – 80 °C until homogenisation or directly homogenised on ice with two plastic pistils. (Other methods can be used if they are performed on ice and the result is a homogenous mass). Important: The tubes should be numbered properly so that the head and tail from the fish can be related to their respective body-section used for gonad histology. | 5. | When a homogenous mass is achieved an amount of 4-10 time the tissue weight of ice-cold homogenisation buffer (*7) is added (note the dilution). Keep working with the pistils until the mixture is homogeneous. Important note: New pistils are used for each fish. | 6. | The samples are placed on ice until centrifugation at 4 °C at 50 000 g for 30 min. | 7. | Use a pipette to dispense portions of 20 to 50 μl (note the amount) supernatant into at least two tubes by dipping the tip of the pipette below the fat layer on the surface and carefully sucking up the supernatant without fat- or pellet fractions. | 8. | The tubes are stored at – 80 °C until use. | Note: The homogenisation buffer should be used the same day as manufactured. Place on ice during use | Appendix 6 | Guidance for quantification of head & tail homogenate vitellogenin in zebrafish (Danio rerio) (modified from Holbech et al., 2001). other procedures using homologous antibodies and standards can be used | 1. | Microtiter plates (certified Maxisorp F96, Nunc, Roskilde Denmark) previously coated with 5 μg/ml anti zebrafish lipovitellin-IgG are thawed and washed 3 times with washing buffer (*). | 2. | Purified zebrafish vitellogenin standard (22) is serially diluted to 0,2, 0,5, 1, 2, 5, 10 and 20 ng/ml in dilution buffer (**) and samples are diluted at least 200 times (to prevent matrix effect) in dilution buffer and applied to the plates. An assay control is applied in duplicate. 150 μl are applied to each well. Standards are applied in duplicate and samples in triplicate. Incubate over night at 4 °C on a shaker. | 3. | The plates are washed 5 times with washing buffer (*) | 4. | HRP coupled to a dextran chain (e.g. AMDEX A/S, Denmark) and conjugated antibodies are diluted in washing buffer; Actual dilution differs by batch and age. 150 μl are applied to each well and the plates are incubated for 1 hour at room temperature on a shaker. | 5. | The plates are washed 5 times with washing buffer (*) and the bottom of the plates is carefully cleaned with ethanol. | 6. | 150 μl TMB plus (***) are applied to each well. Protect the plate against light with tinfoil, and watch the colour development on a shaker. | 7. | When the standard curve is fully developed the enzyme activity is stopped by adding 150 μl 0,2 M H2SO4 to each well. | 8. | The absorbance is measured at 450 nm (e.g. on a Molecular Devices Thermomax plate reader). Data are analysed on the associated software (e.g. Softmax). | (*) | Washing buffer: | PBS-stock (****) | 500,0 | ml | BSA | 5,0 | g | Tween 20 | 5,0 | ml | Adjust pH to 7,3 and fill to 5 l with millipore H2O. Store at 4 °C. | (**) | Dilution buffer: | PBS-Stock (****) | 100,0 | ml | BSA | 3,0 | g | Tween 20 | 1,0 | ml | Adjust pH to 7,3 and fill to 1 l with millipore H2O. Store at 4 °C. | (***) | TMB plus is a “ready-to-use” substrate produced by KemEnTec (Denmark). It is sensitive to light. Store at 4 °C. | (****) | PBS stock | NaCl | 160,0 | g | KH2PO4 | 4,0 | g | Na2HPO4 · 2H2O | 26,6 | g | KCl | 4,0 | g | Adjust pH to 6,8 and fill with millipore H2O to 2 l. Store at room temperature. | Appendix 7 | Guidance for the preparation of tissue sections for sex determination and staging of gonads | The purpose of this section is to describe the procedures that occur prior to the evaluation of histological sections. Other procedures that result in similar sex determination and gonadal staging can be used. | With a few exceptions, these procedures are similar for Japanese medaka (JMD) and zebrafish (ZF). | Euthanasia, Necropsy, and Tissue Fixation | Objectives: | 1. | Provide for the humane sacrifice of fish. | 2. | Obtain necessary body weights and measurements. | 3. | Evaluate secondary sex characteristics. | 4. | Dissect tissues for VTG analysis. | 5. | Fixation of the gonads. | Procedures: | 1. | Fish should be sacrificed immediately prior to necropsy. Therefore, unless multiple prosectors are available, multiple fish should not be sacrificed simultaneously. | 2. | Using the small dip net, a fish is removed from the experimental chamber and transported to the necropsy area in the transport container. | 3. | The fish is placed in the euthanasia solution. The fish is removed from the solution when there is cessation of respiration and the fish is unresponsive to external stimuli. | 4. | The fish is wet weighed. | 5. | For preparation of tissues for VTG analysis, the fish can be placed on a corkboard on the stage of a dissecting microscope. | (a) | For zebrafish the head is cut right behind the pectoral fin and tail is cut right behind the dorsal fin. | (b) | For Japanese medaka the abdomen is opened via a carefully made incision that extends along the ventral midline from the pectoral girdle to a point just cranial to the anus. Using the small forceps and small scissors, the liver is carefully removed. | 6. | Specimen for VTG analysis are placed in eppendorf tubes and immediately frozen in liquid nitrogen. | 7. | The carcass including the gonads is placed into a pre-labelled plastic tissue cassette, which is transferred into Davidson's or Bouin's fixative. The volume of fixative should be at least 10 times the approximated volume of the tissues. The fixative container is gently agitated for five seconds to dislodge air bubbles from the cassette. | 8. | (a) | All tissues remain in Davidson's fixative overnight, followed by transfer to individual containers of 10 % neutral buffered formalin the next day. Containers with cassettes are gently agitated for 5 seconds to ensure adequate penetration of formalin into cassettes. | (b) | Tissues remain in Bouins fixative for 24 h, followed by transfer to 70 % ethanol. | Tissue Processing | Objectives: | 1. | Dehydrate tissue for adequate penetration of paraffin. | 2. | Impregnate the tissue with paraffin to maintain tissue integrity and create a firm surface for microtomy. | Procedures: | 3. | Labelled tissue cassettes are removed from formalin/ethanol storage and the cassettes are placed in the processing basket(s). The processing basket is loaded in the tissue processor. | 4. | The processing schedule is selected. | 5. | After the tissue processor has completed the processing cycle, the basket(s) may be transferred to the embedded station. | Embedding | Objective: | Properly orient the specimen in solidified paraffin for microtomy. | Procedures: | 1. | The basket(s) of cassettes is/are removed from the processor and immersed in the paraffin-filled front chamber of the embedding station thermal console or the cassettes are moved to a separate paraffin heater. | 2. | The first cassette to be embedded is removed from the front chamber of the thermal console or the paraffin heater. The cassette lid is removed and discarded, and the cassette label is checked against the animal records to resolve potential discrepancies prior to embedding. | 3. | An appropriately sized embedding mould is selected. | 4. | The mould is held under the spout of the dispensing console and filled with molten paraffin. | 5. | The specimen is removed from the cassette and placed in the molten paraffin in the mould. This is repeated with 4-8 specimens for each paraffin mould. The position of individual fish is marked by putting fish no 1 in 180 degrees to fish 2-4/8. | 6. | Additional paraffin is added to cover the specimen. | 7. | The mould with the cassette base is placed on the cooling plate of the cryo console. | 8. | After the paraffin has solidified, the block (i.e., the hardened paraffin containing the tissues and the cassette base) is removed from the mould. | Microtomy | Objective: | Cut and mount histological sections for staining. | Procedures: | 1. | The initial phase of microtomy termed “facing” is conducted as follows: | (a) | The paraffin block is placed in the chuck of the microtome. | (b) | The chuck is advanced by rotating the microtome wheel and thick sections are cut from the paraffin surface of the block until the knife reaches the embedded tissues. | (c) | The section thickness on the microtome is set between 3 - 5 microns. The chuck is advanced and multiple sections are cut from the block to remove any artefacts created on the cut surface of the tissue during rough trimming. | (d) | The block can be removed from the chuck and placed facedown on ice to soak the tissue. | 2. | The next phase of microtomy is final sectioning and mounting of tissue sections on slides. These procedures are conducted as follows: | (a) | If the block has been placed on ice, the block is removed from the ice and replaced in the chuck of the microtome. | (b) | With the section thickness on the microtome set to 3 - 5 microns, the chuck is advanced by rotating the microtome wheel. Sections are cut from the block until a “ribbon” containing at least one acceptable section including the gonads has been produced. (As necessary during sectioning, the block may be removed from the chuck, placed on ice to soak the tissue, and replaced in the chuck.) | (c) | The sections are floated flat on the surface of the water in the water bath. An attempt is made to obtain at least one section that contains no wrinkles and has no air bubbles trapped beneath it. | (d) | A microscope slide is immersed beneath the best section, which is lifted out of the water using the slide. This process is referred to as “mounting” the section on the slide. | (e) | Three sections are prepared for a set of fish. The second and third sections are taken at 50 micron intervals following the first section. If the fish are not embedded with their gonads in the same sectioning level, more sections are to be made to ensure that at least six sections including the gonads are obtained from each fish. | (f) | With a slide-marking pen, the block number from which the slide was produced is recorded on the slide. | (g) | The slide is placed in a staining rack. | (h) | The block is removed from the chuck and placed facedown for storage. | Staining, Cover slipping, and Slide Labelling | Objectives: | — | Stain the sections for histopathological examination | — | Permanently seal mounted and stained tissues. | — | Permanently identify stained sections in a manner that allows complete traceability. | Procedures: | 1. | Staining | (a) | Slides are air-dried overnight before staining. | (b) | The sections are stained by Hematoxylin-Eosin. | 2. | Cover slipping | (a) | Cover slips can be applied manually or automatically. | (b) | A slide is dipped in xylene or TissueClear, and the excess xylene/TissueClear is gently knocked off the slide. | (c) | Approximately 0,1 ml of mounting medium is applied near the end of the slide opposite to the frosted end or on the cover slip. | (d) | The cover slip is tilted at a shallow angle as it is applied to the slide. | 3. | Labelling | (a) | Each slide label should contain the following information. | (i) | Laboratory name | (ii) | Species | (iii) | Specimen No./Slide No. | (iv) | Chemical/Treatment group | (v) | Date | Appendix 8 | Statistical Flow Chart for vitellogenin analysis | Tamhane-Dunnett test on nested ANOVA | Dunnett test on nested ANOVA | Dunnett test | variances stabilising transform? | Variances unequal | Variances equal | No | Yes | Yes | Step-down trend test on replicate means | <=3 reps per conc | variances stabilising transform? | Dunn or Mann-Whitney test | Normalising transform? | Nested ANOVA not normal | Nested ANOVA normal | Monotone | Determine whether Dose-Response is monotone | Drop water control | Dunn or Mann-Whitney test on rep means | Dunn test on rep means | >=4 reps per conc | <=3 reps per conc | Dunn test | Tamhane-Dunnett test | >=4 reps per conc | Step-down Jonckheere test | Step-down Jonckheere or Williams' test | Rep means not normal or not homogenous | Rep means normal & homogenous | Rep means not normally distributed | Rep means normally distributed | Not monotone | Combine controls, retains subgroups | Compare controls using Wilcoxon or T-test. Do controls differ? | Both solvent and non-solvent control are present | No | No | No | Yes | No | No | Yes | Yes | Yes | Statistical Flow Chart for sex ratio analysis | Apply step-down Jonckheere-Terpstra test (+) to determine NOEC | Dunn or Mann-Whitney U-test w/Bonferroni-Holm adjustment to determine NOEC | Yes | Use Dunnett test if homogenous variances (*), Tamhane-Dunnett (T3) test otherwise, to determine NOEC | Are data normally distributed? (*) | Are data consistent with monotone dose-response? | (‡) Or other agreed control selection | (*) After arcsin square-root transform | (+) With fewer than 5 experimental units per treatment exact J-T or M-W test should be used if available | No | No | Yes | No | Combine controls | Drop water control (‡) | Compare controls using t-Test. Do controls differ? | No | Yes | Yes | Is solvent used? | Appendix 9 | Guidance for tissue sampling for genetic sex determination and for genetic sex determination by PCR-method | Tissue sampling, preparation and storage before determination of genetic sex by PCR-method in medaka (Prepared by the Laboratory for Aquatic Organisms of Bayer CropScience AG) | 1. | With fine scissors the anal or the dorsal fin will be cut off in each individual fish and placed into a tube filled with 100 μl of extraction-buffer 1 (details on buffer preparation see below). The scissors will be cleaned after each single fish in a beaker filled up with distilled H2O and dried with a paper tissue. | 2. | Now the fin-tissues will be homogenised by a micro tube teflon pistil for the lysis of cells. For each tube a new pistil will be used to prevent any contaminations. The pistils will be placed overnight in 0,5 M NaOH, rinse for 5 minutes in distilled H2O and stored in ethanol or sterile after autoclave until use. | 3. | It is also possible to store the fin tissue without any extraction-buffer 1 on dry-ice and then at – 80 °C refrigerator to prevent any degeneration of the DNA. But the extraction runs better, if you extract the DNA at the same time (handling see above; samples should be thawed on ice after storaging at – 80 °C before the buffer will be filled in the tubes). | 4. | After homogenizing all tubes will be placed in a water bath and boiled for 15 minutes at 100 °C. | 5. | Then 100 μl of the extraction buffer 2 (details on buffer preparation see below) will be pipetted into each tube. The samples will be stored at room temperature for 15 minutes and in the meantime they will be sometimes gently shaken by hand. | 6. | Afterwards all tubes will be placed in the water bath again and boiled for another 15 minutes at 100 °C. | 7. | Until further analysis the tubes will be frozen at – 20 °C. | Buffer preparation | PCR-buffer 1: | 500 mg N-Lauroylsarcosine (e.g. Merck KGaA, Darmstadt, GE) | 2 ml 5M NaCl | ad 100 ml dest. H2O | → autoclave | PCR-buffer 2: | 20 g Chelex (e.g. Biorad, Munich, GE) | To swell in 100 ml dest. H2O | → autoclave | Determination of genetic sex (by PCR-method) in medaka (Prepared by the Laboratory for Aquatic Organisms of Bayer CropScience AG and Universität Würzburg Biozentrum) | The prepared and frozen tubes (described in the above section) will be thawed on ice. After that, they will be centrifuged using an Eppendorf centrifuge (30 sec at max. speed, at room temperature). For the PCR, the clear supernatant separated from the precipitate will be used. It has absolutely to be avoided that any traces of Chelex (localized in the precipitate) are transferred to the PCR reaction, because this will interfere with the “Taq”-polymerase activity. The supernatant will be used directly or can be stored frozen (at – 20 °C) and rethawed again in several cycles without negative impact on the DNA for later analyses. | 1. Preparation of the “Reaction Mix” (25 μl per sample): | | Volume | Final Concentration | Template DNA | 0,5μl-2μl | | 10xPCR-buffer with MgCl2 | 2,5μl | 1x | Nucleotides (each of dATP, dCTP, dGTP, dTTP) | 4μl (5mM) | 200μM | Forward Primer (10μM) (see below 3-5) | 0,5μl | 200nM | Reverse Primer (10μM) (see below 3-5) | 0,5μl | 200nM | DMSO | 1,25μl | 5 % | Water (PCR grade) | up to 25μl | | Taq E- Polymerase | 0,3μl | 1,5U | 10xPCR-buffer with MgCl2: 670mM Tris/HCl (pH8,8 at 25 °C), 160mM (NH4)2SO4, 25mM MgCl2, 0,1 %Tween 20 | For each PCR (see below 3-5) the special primer as a new combination of “Reaction-Mix” and the adequate needed amount of template DNA for each sample (see above) is needed. The respective volumes will be transferred into new tubes using pipettes. After that all tubes will be closed, stirred (ca. 10 sec) and centrifuged (10 sec, at room temperature). Now the respective PCR-programmes can be started. Additionally a positive control (exemplary DNA sample with known activity and clear results) and a negative control (1 μl dest. H2O) will be used in each PCR-programme. | 2. Preparation of the agarose gel (1 %) — During running PCR-programmes: | — | Solve 3 g agarose in 300 ml 1 × TAE-buffer (1 % agarose gel) | — | This solution should be boiled using an microwave (ca. 2-3 min) | — | Transfer the hot solution into a special casting box, which lies on ice | — | After ca. 20 min the agarose gel is ready to use | — | Storage the agarose gel in 1 × TAE-buffer until the end of the PCR-programmes | 3. Actin-PCR-programme: | This PCR-reaction is aimed to demonstrate that the DNA in the sample is not harmed. | — | Special primer: | “Mact1(upper/forward)” → TTC AAC AGC CCT GCC ATG TA | “Mact2(lower/reverse)” → GCA GCT CAT AGC TCT TCT CCA GGG AG | — | Programme: | 5 min 95 °C | Cycle (35-times): | Denaturation | → 45 sec at 95 °C | Annealing | → 45 sec at 56 °C | Elongation | → 1 min at 68 °C | 15 min 68 °C | 4. X- and Y-Gene-PCR-programme: | The samples with intact DNA will be used in this PCR-programme to detect the X- and Y-Genes. Male DNA should show one double-band and female DNA should show one single band (after staining and gel-electrophoresis). For this programme-run one positive control for males (XY-sample) and one for females (XX-sample) should be included. | — | Special primer: | “PG 17,5” (upper/forward) → CCG GGT GCC CAA GTG CTC CCG CTG | “PG 17,6” (lower/reverse) → GAT CGT CCC TCC ACA GAG AAG AGA | — | Programme: | 5 min 95 °C | Cycle (40-times): | Denaturation | → 45 sec at 95 °C | Annealing | → 45 sec at 55 °C | Elongation | → 1 min 30 sec at 68 °C | 15 min 68 °C | 5. Y-Gene-PCR-programme as “control” for X- and Y-Gene-PCR-programme: | This PCR-programme verifies the results of the “X- and Y-Gene-PCR-programme”. The “male-samples” should show one band and the “female-samples” shouldn't show any band (after staining and gel-electrophoresis). | — | Special primer: | “DMTYa (upper/forward)” → GGC CGG GTC CCC GGG TG | “DMTYd (lower/reverse)” → TTT GGG TGA ACT CAC ATG G | — | Programme: | 5 min 95 °C | Cycle (40-times): | Denaturation | → 45 sec at 95 °C | Annealing | → 45 sec at 56 °C | Elongation | → 1 min at 68 °C | 15 min 68 °C | 6. Staining of the PCR-samples: | Staining solution: | 50 % Glycerol | 100 mM EDTA | 1 % SDS | 0,25 % Bromphenolblue | 0,25 % Xylenecyanol | Pipette 1 μl of the staining solution into each single tube | 7. Start of the Gel-Electrophoresis: | — | The prepared 1 % agarose gel will be transferred into a gel-electrophoresis-chamber filled with 1 × TAE-Buffer | — | 10 - 15 μl of each stained PCR-sample will be pipetted into an agarose gel slot | — | Also 5 - 15 μl of the 1kb-“Ladder”(Invitrogen) will be pipetted into a separate slot | — | Start the electrophoresis by 200 V | — | Stop after 30-45 min | 8. Determination of the bands: | — | Clean the agarose gel in distilled H2O | — | Now transfer the agarose gel into Ethidium bromide for 15 - 30 min | — | After that, a picture of the agarose gel should be taken in an UV-light-box | — | Finally the samples are analysed in comparison to the positive control-band (or bands) and the ladder | Appendix 10 | Guidance on tissue sampling for genetic sex determination by PCR method in the three-spined stickleback | Tissue sampling and DNA extraction | DNA can be extracted using a variety of commercially available reagents and both manual and automated extraction systems. The protocol used at the Cefas Weymouth laboratory is outlined below, and the alternative approaches have been added where appropriate. | 1. | With fine scissors, a small piece of tissue (10-20 mg) from the dorsolateral area (after removing the head and tail for VTG analysis), is removed from each individual fish. The tissue is added into a tube and either placed directly in liquid nitrogen (for storage at – 80 °C) or filled with 70 % ethanol (for transport and subsequent storage at 4 °C). The scissors are cleaned after each single fish in 70 % ethanol then in distilled water and dried with tissue paper. | 2. | The ethanol (if present) is removed by aspiration and the tissue is digested overnight with proteinase K in 400 μl of ATL buffer (Qiagen). An aliquot (200 μl) of the digest is transferred to a 96-well S-block (Qiagen) and the DNA extracted in a 96-well format using the Qiagen Universal BioRobot and the QIamp Investigator BioRobot kit. The DNA is eluted in a 50 μl of DNase and RNase free water. If using hard tissues to extract DNA (such as a spine or a pectoral fin) it may be necessary to homogenise the sample in the lysis buffer using a FastPrep® tissue lyser or equivalent tissue disruption system. | Alternatively, | (a) | the tissue is digested overnight with proteinase K in 400 μl of G2 lysis buffer (Qiagen) and DNA is extracted from 200 μl of the digest using either the EZ-1 DNA easy tissue kit and the EZ-1 biorobot or the DNA easy tissue mini kit. The DNA is eluted in a 50 μl volume. | (b) | The tissues are processed using the DNAzol reagent. Briefly, tissue samples are lysed in 1ml of DNAzol for 10 minutes in a 1,5 ml micro centrifuge tube and then centrifuged at 13 000 rpm for 5 minutes to remove any particulate matter. The lysed sample is then transfered to a new 1,5 ml micro centrifuge tube containing 500 μl of 100 % molecular grade ethanol and then centrifuged at 13 000 rpm for 10 minutes to precipitate the DNA. The ethanol is removed and replaced with 400 μl of 70 % molecular grade ethanol, centrifuged at 13 000 rpm for 5 minutes and the DNA pellet is dissolved in 50 μl molecular DNase and RNase free water. Again, when using the hard tissues (pectoral fin) it may be necessary to homogenise the sample in the lysis buffer using a FastPrep® tissue lyser or equivalent tissue disruption system prior to extracting the DNA. | 3. | The DNA is stored at – 20 °C until required. | Important note: gloves must be worn during the procedures. | Polymerase chain reaction (PCR) analysis | Amplifications were performed using 2,5 μl of the DNA extract in a 50 μl reaction volume using the Idh locus primers (as described by Peichel et al., 2004. Current Biology 1:1416-1424): | Forward primer | 5' GGG ACG AGC AAG ATT TAT TGG 3' | Reverse primer | 5' TAT AGT TAG CCA GGA GAT GG 3' | There are numerous suppliers of suitable PCR reagents. The method outlined below is that currently used at the Cefas Weymouth laboratory. | 1. Preparation of the “Reaction Mix” (50 μl per sample): | A mastermix is prepared as follows. This can be prepared in advance and stored frozen at – 20 °C until required. Make sufficient mastermix for a negative control (molecular biology grade water only). | | Volume (stock conc.)/ sample | Final Concentration | 5xGoTaq® Reaction Buffer | 10μl | 1x | MgCl2 | 5 μl (25 mM) | 2,5 mM | Nucleotides (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) | 0,5 μl (25 mM each) | 250 μM each | Forward Primer | 0,5μl (0,1 nmol/μl) | 2,0 μM | Reverse Primer | 0,5μl (0,1 nmol/μl) | 2,0μM | Molecular biology grade water | 30,75 μl | | GoTaq polymerase | 0,25 μl | 1,25U | — | Dispense 47,5 μl to a labelled 0,5 ml thin walled PCR tube. | — | Add 2,5 μl of the purified DNA to the appropriately labelled tube. Repeat for all samples and the negative control. | — | Over lay with 2 drops of mineral oil. Alternatively, use a thermal cycler with a heated lid. | — | Close the lids. | — | Samples were denatured in a Peltier PTC-225 thermal cycler at 94 ± 2 °C for 5 minutes followed by 39 cycles of 94 ± 2 °C for 1 minute, 55 ± 2 °C for 1 minute, 72 ± 2 °C for 1 minute, and a final extension of 72 ± 2 °C for 10 minutes. | 2. Preparation of the agarose gel (2 %): | Traditionally the PCR products are resolved on a 20 % agarose gel containing ethidium bromide. | Capillary based electrophoresis systems can also be used. | — | Weigh 2 g agarose in 100 ml 1 × TAE-buffer | — | Heat in a microwave (ca. 2-3 min) to dissolve the agarose. | — | Add 2 drops of ethidium bromide final concentration 0,5 μg/ml | — | Transfer the hot solution into the gel casting equipment. | — | Allow the gel to harden | 3. Gel-Electrophoresis: | — | Transferred the agarose gel to the electrophoresis equipment and submerge in 1 × TAE-buffer | — | Load 20 μl of each sample to a separate well, adding a molecular weight marker (100 bp DNA ladder, Promega) to a spare well. | — | Electrophoresis is performed at 120 V for 30-45 minutes. | 4. Visualisation of the amplification products | If the ethidium bromide was incorporated in to the agarose gel as described above, the DNA products are visualised under a UV source. Alternatively the agarose gel is stained by covering the gel in a dilute solution of ethidium bromide (0,5 μg/ml in water) for 30 minutes prior to visualisation. | Appendix 11 | Guidance for artificial fertilisation procedure for the three-spined stickleback | The purpose of this section is to describe the procedures to obtain fertilised eggs from the three-spined stickleback in view of using them in the FSDT. | Procedures | Obtaining sperm from the males | 1. | A well-coloured male of the desired population is euthanised. | 2. | The testes are dissected from each side of the fish. The testes are generally heavily pigmented, rod shaped structures that are readily apparent at the lateral midline of the body. Use either of the following methods: | 3. | Using a pair of fine scissors, begin at the cloaca and make a 1-1,5 cm incision with a single snip angled at about 45 degrees. | 4. | Use a scalpel to make a small incision in the side of the fish slightly posterior to the pelvis and just ventral of the lateral plates. | 5. | The testes are removed using fine forceps and placed into a petri dish. | 6. | Each testis is covered with 100 μl freshly made Hank's final solution (*8). | 7. | The testes are finely diced by using a razor blade or scalpel. This will release sperm and give the Hank's solution a milky appearance. | 8. | The fluid containing sperm is added into a tube, while trying not to include any pieces of testes tissue when pipetting. | 9. | 800 μl of Hank's final solution are added into the tube and mixed well. | 10. | If required, the male can be preserved by fixing in 100 % ethanol or other desired fixative. This is particularly important if the study is assigning parental origin of offsprings. | Important note: Although most of the stock solutions required can be made in advance, stock 5 and subsequently the final solution, should be made up fresh on the day of use. | Stock 1 | NaCl | 8,00 g | KCl | 0,40 g | Distilled water (DW) | 100 ml | Stock 2 | Na2HPO4 (anhydrous) | 0,358 g | KH2PO4 | 0,60 g | DW | 100 ml | Stock 3 | CaCl2 | 0,72 g | DW | 50 ml | Stock 4 | MgSO4 .7H2O | 1,23 g | DW | 50 ml | Stock 5 (freshly prepared) | NaHCO3 | 0,35 g | DW | 10 ml | Note: If you already have some of the above salts but with different water content (i.e. 2H2O instead of anhydrous) you can still use it but first adjust weight based on molecular weight). | For Hank's final solution combine in the following order: | stock 1 | 1,0 ml | stock 2 | 0,1 ml | stock 3 | 0,1 ml | DW | 8,6 ml | stock 4 | 0,1 ml | stock 5 | 0,1 ml | Mix well before use. | Fertilisation | 1. | Large, gravid females are identified from the desired population; females are ready for squeezing only when you can see eggs protruding from the cloaca. Ready females have the characteristic “head up” posture. | 2. | Gently run a finger or thumb down the side of the fish towards the tail to encourage the expulsion of an egg sack into a fresh petri dish. Repeat on the other side and return the fish to its tank. | 3. | The eggs can be spread out (forming a monolayer) using a fine paintbrush. It is important to try and expose as many eggs as possible to the sperm so maximising the surface area of the eggs is helpful. Important note: Keep the eggs humid by laying damp tissue around them (it is important the eggs do not touch water directly as this can prematurely harden the chorion preventing fertilisation). There is a large variation in the number of eggs each female can produce but as an average, about 150 eggs should be easily obtained from a single gravid female. | 4. | 25μl of sperm in Hank's mixture is spread evenly over the whole surface of the eggs using the paintbrush. The eggs will quickly harden and change colour (within a minute) once fertilisation has begun. If the estimated number of eggs is more than 150, repeat the procedure. Similarly if the eggs don't harden within a minute add a bit more sperm. Important note: Adding more sperm does not necessarily improve fertilisation rate. | 5. | The eggs and the sperm solution should be left to “interact” for at least 15 minutes and the fertilised eggs should be placed into the exposure aquaria within 1,5 hours post fertilisation. | 6. | The procedure is repeated using another female until the desired number of eggs is collected. | 7. | Spare few eggs from the last batch and fix them in 10 % acetic acid. | Counting and distributing eggs in test aquaria | 1. | Eggs should be evenly distributed between each treatment level to avoid genetic bias. Each batch of fertilised eggs should be separated into equal size groups (as many as the treatment levels) by the use of a blunt instrument (i.e. wide-blade entomology forceps or use of an inoculation loop). If you aim for 4 replicates per treatment, with 20 eggs each then you need to distribute 80 eggs per exposure aquaria. Important note: It is advisable to add an extra 20 % (i.e. 96 eggs per treatment level) until you are confident that you obtain 100 % fertilisation rates. | 2. | Stickleback eggs are very prone to fungal infections outside the father-guarded nest. In this respect, treatment of all eggs with methylene blue during the first 5 days of the test is critically important. A stock solution of methylene blue is prepared at 1 mg/ml and added to the exposure aquaria to give a maximum final concentration of 2,125 mg/l. Important note: Sticklebacks should not be exposed to methylene blue once hatched so the system should be free of methylene blue by day 6. | 3. | The eggs are inspected daily and any dead or unfertilised eggs are recorded as such. Important note: The eggs should never be outside water until they hatch even for very brief periods. | C.42 BIODEGRADABILITY IN SEAWATER | GENERAL INTRODUCTION | 1. | This test method is equivalent to OECD Test Guideline (TG) 306 (1992). When the original test methods were developed, it was not known to what extent results from the screening tests for ready biodegradability using freshwater, and sewage effluent or activated sludge as inoculum, could be applied to the marine environment. Variable results on this point have been reported (e.g. (1)). | 2. | Many industrial waste waters, containing a variety of chemicals, reach the sea either by direct discharge or via estuaries and rivers in which the residence times are low compared with the period necessary for complete biodegradation of many of the chemicals present. Because of the growing awareness of the need to protect the marine environment against increasing loads of chemicals and the need to estimate the probable concentration of chemicals in the sea, test methods for biodegradability in seawater have been developed. | 3. | The methods described here use natural seawater both as the aqueous phase and as the source of micro-organisms. In an endeavour to conform with the methods for ready biodegradability in freshwater, the use of ultra-filtered and centrifuged seawater was investigated, as was the use of marine sediments as inocula. These investigations were unsuccessful. The test medium therefore is natural seawater pre-treated to remove coarse particles. | 4. | In order to assess ultimate biodegradability with the Shake Flask Method, relatively high concentrations of the test substance have to be used because of the poor sensitivity of the dissolved organic carbon (DOC) analytical method. This in turn necessitates the addition to the seawater of mineral nutrients (N and P), the low concentrations of which would otherwise limit the removal of DOC. It is also necessary to add the nutrients in the Closed Bottle Method because of the concentration of the added test substance. | 5. | Hence, the methods are not tests for ready biodegradability since no inoculum is added in addition to the micro-organisms already present in the seawater. Neither do the tests simulate the marine environment since nutrients are added and the concentration of test substance is very much higher than would be present in the sea. For these reasons the methods are proposed under a new subsection “Biodegradability in Seawater”. | APPLICATION | 6. | The results of the tests, which would be applied because the pattern of use and disposal of the substance in question indicated a route to the sea, give a first impression of biodegradability in seawater. If the result is positive (> 70 % DOC removal; > 60 % ThOD — theoretical oxygen demand), it may be concluded that there is a potential for biodegradation in the marine environment. However, a negative result does not preclude such a potential but indicates that further study is necessary, for example, using as low a concentration of the test substance as possible. | 7. | In either case, if a more definitive value for the rate or degree of biodegradation in seawater at a particular site is required, other more complex and sophisticated, and hence more costly, methods would have to be applied. For example, a simulation test could be applied using a concentration of test substance nearer to the likely environmental concentration. Also, non-fortified, non-pre-treated seawater taken from the location of interest could be used and primary biodegradation could be followed by specific chemical analysis. For ultimate biodegradability, 14C-labelled substances would be necessary in order that the rates of the disappearance of soluble organic 14C and the production of 14CO2 at environmentally realistic concentrations could be measured. | CHOICE OF METHODS | 8. | The selection of which method to use depends on a number of factors; the following Table is given to help the selection. While substances of water solubility below the equivalent of about 5 mg C/l cannot be tested in the Shake Flask Method, at least, in principle, poorly soluble substances may be tested in the Closed Bottle Method. | Table | Advantages and disadvantages of the shake flask and closed bottle test | METHOD | ADVANTAGES | DISADVANTAGES | SHAKE FLASK | — | simple apparatus except C analyser | — | 60 d duration is not a problem | — | no interference from nitrification | — | can be adapted for volatile substances | — | needs C analyser | — | uses 5-40 mg DOC/1, could be inhibitory | — | DOC determination is difficult at low concentrations in seawater (chloride effect) | — | DOC sometimes high in seawater | CLOSED BOTTLE | — | simple apparatus | — | simple end determination | — | uses low concentration of test substance (2 mg/l) thus less chance of inhibition | — | easily adapted for volatile substances | — | could be difficult to maintain air-tightness of bottles | — | wall growth of bacteria can lead to false values | — | blank O2 uptake values can be high especially after 28 days; could be overcome by ageing the seawater | — | possible interference from O2 uptake by nitrification | SHAKE FLASK METHOD | INTRODUCTION | 1. | This method is a seawater variant of the Modified OECD Screening Test described in Chapter C.4B of this Annex (2). It was finalised as a result of a ring test organized for the European Commission (EC) by the Danish Water Quality Institute (3). | 2. | In common with the accompanying marine Closed Bottle Method, the results from this test are not to be taken as indicators of ready biodegradability, but are to be used specifically for obtaining information about the biodegadability of substances in marine environments. | PRINCIPLE OF THE METHOD | 3. | A pre-determined amount of the test substance is dissolved in the test medium to yield a concentration of 5-40 mg dissolved organic carbon (DOC)/l. If the limits of sensitivity of organic carbon analyses are improved, the use of lower concentrations of test substance may be advantageous, particularly for inhibitory substances. The solution of the test substance in the test medium is incubated under agitation in the dark or in diffuse light under aerobic conditions at a fixed temperature (controlled to ± 2 °C) which will normally be within the range 15-20 °C. In cases where the objective of the study is to simulate environmental situations, tests may be carried out beyond this normal temperature range. The recommended maximum test duration is about 60 days. Degradation is followed by DOC measurements (ultimate degradation) and, in some cases, by specific analysis (primary degradation). | INFORMATION ON THE TEST SUBSTANCE | 4. | In order to know whether the test may be applied to a particular substance, some of its properties must be known. The organic carbon content of the substance must be established, its volatility must be such that significant losses do not occur during the course of the test and its solubility in water should be greater than the equivalent of 25-40 mg C/l. Also, the test substance should not significantly adsorb onto glass surfaces. Information on the purity or the relative proportions of major components of the test substance is required in order that the results obtained can be interpreted, especially when the result lies close to the “pass” level. | 5. | Information on the toxicity of the test substance to bacteria, for example as measured in short-term respiration rate tests (4), may be useful when selecting appropriate test concentrations and may be essential for the correct interpretation of low biodegradation values. However, such information is not always sufficient for interpreting results obtained in the biodegradation test and the procedure described in paragraph 18 is more suitable. | REFERENCE SUBSTANCES | 6. | Suitable reference substances must be used to check the microbial activity of the seawater sample. Sodium benzoate, sodium acetate and aniline are examples of substances which may be used for this purpose. The reference substances must be degraded within a reasonably short time span, otherwise it is recommended that the test be repeated using another seawater sample. | 7. | In the EC ring test where seawater samples were taken at different locations and at different times of the year (3), the lag phase (tL) and time to achieve 50 per cent degradation (t50), excluding the lag phase, were 1 to 4 days and 1 to 7 days respectively for sodium benzoate. For aniline the tL ranged from 0 to 10 days, whilst the t50 ranged from 1 to 10 days. | REPRODUCIBILITY AND SENSITIVITY OF THE METHOD | 8. | The reproducibility of the method was established in the ring test (3). The lowest concentration of test substance, for which this method can be used with DOC analysis, is largely determined by the detection limit of the organic carbon analysis (about 0,5 mg C/l, at present) and the concentration of dissolved organic carbon in the seawater used (usually of the order of 3-5 mg/l for water from the open sea). The background concentration of DOC should not exceed about 20 % of the total DOC concentration after addition of test substance. If this is not feasible, the background concentration of DOC may sometimes be reduced by ageing the seawater prior to testing. If the method is used with specific chemical analysis only (by which primary degradation is measured), the investigator must document, by supplying additional information, whether ultimate degradability can be expected. This additional information may consist of the results from other tests for ready or inherent biodegradability. | DESCRIPTION OF THE METHOD | Apparatus | 9. | Normal laboratory apparatus and: | a. | Shaking machine accommodating 0,5-2 litre Erlenmeyer flasks, either with automatic temperature control or used in a constant temperature room at 15-20 °C controlled to ± 2 °C; | b. | Narrow neck, 0,5-2 litre Erlenmeyer flasks; | c. | Membrane filtration apparatus, or centrifuge; | d. | Membrane filters, 0,2-0,45 μm; | e. | Carbon analyser; | f. | Equipment for specific analysis (optional). | Seawater | 10. | Collect a sample of seawater in a thoroughly cleansed container and transport to the laboratory, preferably within one or two days of collection. During transport, do not allow the temperature of the sample to exceed significantly the temperature to be used in the test. Identify the sampling location precisely and describe it in terms of its pollutional and nutrient status. Especially for coastal waters, include in this characterization a heterotrophic microbial colony count and the determination of the concentrations of dissolved nitrate, ammonium and phosphate. | 11. | Provide the following information for the seawater sample itself: | — | date of collection; | — | depth of collection; | — | appearance of sample — turbid, etc.; | — | temperature at the time of collection; | — | salinity; | — | DOC; | — | delay between collection and use in the test. | 12. | If the DOC content of the seawater sample is found to be high (paragraph 8), it is recommended that the seawater be aged for about a week prior to use. Age by storing under aerobic conditions at the test temperature and in the dark or in diffuse light. If necessary, maintain aerobic conditions by gentle aeration. During ageing, the content of easily degradable organic material is reduced. In the ring test (3), no difference was revealed between the degradation potential of aged and freshly collected seawater samples. Prior to use, pre-treat the seawater to remove coarse particles, e.g. by filtration through a nylon filter or coarse paper filter (not membrane or GF-C filters), or by sedimentation and decanting. The procedure used must be reported. Carry out pre-treatment after ageing, if used. | Stock solutions for mineral nutrients | 13. | Prepare the following stock solutions, using analytical grade reagents: | (a) | Potassium dihydrogen orthophosphate, KH2PO4 | 8,50 g | Dipotassium hydrogen orthophosphate, K2HPO4 | 21,75 g | Disodium hydrogen orthophosphate dihydrate, Na2HPO4·2H2O | 33,30 g | Ammonium chloride, NH4Cl | 0,50 g | Dissolve and make up to 1 litre with distilled water. | | (b) | Calcium chloride, CaCl2 | 27,50 g | Dissolve and make up to 1 litre with distilled water. | | (c) | Magnesium sulphate heptahydrate, MgSO4·7H2O | 22,50 g | Dissolve and make up to 1 litre with distilled water. | | (d) | Iron (III) chloride hexahydrate, FeCl3·6H2O | 0,25 g | Dissolve and make up to 1 litre with distilled water. | | Precipitation in solution (d) may be prevented by adding one drop of concentrated HCl or 0,4 g ethylenediaminetetra-acetic acid (EDTA, disodium salt) per litre. If a precipitate forms in a stock solution, replace it with freshly made solution. | Preparation of test medium | 14. | Add 1 ml of each of the above stock solutions per litre of pre-treated seawater. | Inoculum | 15. | Do not add a specific inoculum in addition to the micro-organisms already present in the seawater. Determine (optionally) the number of colony-forming heterotrophs in the seawater test medium (and preferably also in the original seawater samples) e.g. by plate count, using marine agar. This is particularly desirable for samples from coastal or polluted sites. Check the heterotrophic microbial activity in the seawater by performing a test with a reference substance. | Preparation of flasks | 16. | Ensure that all glassware is scrupulously clean, not necessarily sterile, (e.g. using alcoholic hydrochloric acid), rinsed and dried before use in order to avoid contamination with residues from previous tests. The flasks must also be cleaned before first use. | 17. | Evaluate test substances in duplicate flasks simultaneously, together with a single flask for the reference substance. Carry out a blank test, in duplicate, with neither test nor reference substance for the determination of analytical blanks. Dissolve the test substances in the test medium — they may be conveniently added via a concentrated stock solution — to give the desired starting concentrations of normally 5-40 mg DOC/l. Test the reference substance normally at a starting concentration corresponding to 20 mg DOC/l. If stock solutions of test and/or reference substances are used, ensure that the salinity of the seawater medium is not greatly altered. | 18. | If toxic effects can be expected or cannot be ruled out, it may be advisable to include an inhibition experiment, in duplicate, in the test design. Add the test and reference substances to the same vessel, the concentration of the reference substance being normally the same as in the control test (i.e. 20 mg DOC/l) in order to allow comparison. | 19. | Dispense adequate amounts of test solutions into the Erlenmeyer flasks (up to about half the flask volume is a convenient amount) and subsequently provide each flask with a loose cover (e.g. aluminium foil) that makes gas exchange between the flask and the surrounding air possible. (Cotton wool plugs are unsuitable if DOC analysis is used). Place the vessels on the shaker and shake continuously at a gentle rate (e.g. 100 rpm) throughout the test. Control the temperature (15-20 °C and within ± 2 °C), and shield the vessels from light in order to avoid growth of algae. Ensure that the air is free of toxic materials. | Physical-chemical control test (optional) | 20. | If abiotic degradation or loss mechanisms are suspected, such as hydrolysis (a problem with specific analysis only), volatilization, or adsorption, it is advisable to perform a physical-chemical control experiment. This can be done by adding mercury (II) chloride (HgCl2) (23) (50-100 mg/l) to vessels with test substance in order to stop microbial activity. A significant decrease in DOC or specific substance concentration in the physical-chemical control test indicates abiotic removal mechanisms. (If mercury chloride is used, attention should be paid to interferences or catalyst poisoning in DOC analysis.) | Number of flasks | 21. | In a typical run, the following flasks are used: | Flasks 1 & 2 | — | containing test substance (test suspension); | Flasks 3 & 4 | — | containing seawater only (blank); | Flask 5 | — | containing reference substance (procedure control); | Flask 6 | — | containing test and reference subtance (toxicity control) — optional; | Flask 7 | — | containing test substance and sterilising agent (abiotic sterile control)-optional. | DOC analysis | 22. | In the course of the test, withdraw samples at suitable intervals for DOC analysis (Appendix 1). Always take samples at the start of the test (day 0) and at day 60. A minimum of five samples in total are required to describe the time-course of degradation. No fixed time schedule for sampling can be stated as the rate of biodegradation varies. Carry out the DOC determination in duplicate on each sample. | Sampling | 23. | The required volume of the samples depends upon the analytical method (specific analysis), on the carbon analyser used, and on the procedure (membrane filtration or centrifugation) selected for sample treatment before carbon determination (paragraphs 25 and 26). Before sampling ensure that the test medium is mixed well and that any material adhering to the wall of the flask is dissolved or suspended. | 24. | Membrane-filter or centrifuge immediately after sampling. If necessary, store the filtered or centrifuged samples at 2-4 °C for up to 48 hours or below – 18 °C for longer periods (if it is known that the substance will remain unaffected, acidify to pH 2 before storing). | 25. | Membrane filters (0,2-0,45 μm) are suitable if it is ensured that they neither release carbon nor adsorb the substance in the filtration step e.g. polycarbonate membrane filters. Some membrane filters are impregnated with surfactants for hydrophilization and may release considerable quantities of dissolved carbon. Prepare such filters by boiling in deionised water for three consecutive periods, each of one hour. After boiling, store the filters in deionised water. Discard the first 20 ml of the filtrate. | 26. | Centrifugation of the samples may be chosen as an alternative to membrane filtration. Centrifuge at 40 000 m·s– 2 (~ 4 000 g) for 15 minutes, preferably in a refrigerated centrifuge. | Note: The differentiation of Total Organic Carbon (TOC) over DOC (TOC/DOC) by centrifugation at very low concentrations does not seem to work, since either not all bacteria are removed, or carbon as part of the bacterial plasma is redissolved. At higher test concentrations (> 10 mg C per litre), the centrifugation error seems to be comparatively small. | Frequency of sampling | 27. | If analyses are performed immediately after sampling, assess the next sampling time by considering the result of the analytical determination. | 28. | If samples are preserved (paragraph 24) for analysis at a later time, take more samples than the required minimum number of five. Analyse the last samples first, and by a step-wise “backwards” selection of appropriate samples for analysis, it is possible to obtain a good description of the biodegradation curve with a relatively small number of analytical determinations. If no degradation has taken place by the end of the test, no further samples need to be analysed, and in this situation, the “backwards” stategy may save considerable analytical costs. | 29. | If a plateau on the degradation curve is observed before the 60th day, end the test. If degradation has obviously started by day 60, but has not reached a plateau, extend the experiment for a further period. | DATA AND REPORTING | Treatment of results | 30. | Record the analytical results on the attached data sheet (Appendix 2), and calculate the biodegradation values for both test and reference substances from the equation: | where: | Dt | = | degradation in percentage DOC or specific substance removal at time t, | Co | = | starting concentration of DOC or specific substance in the test medium, | Ct | = | concentration of DOC or specific substance in the test medium at time t, | Cbl(0) | = | starting concentration of DOC or specific substance in the blank, | Cbl(t) | = | concentration of DOC or specific substance in the blank at time t. | 31. | State degradation as the percentage DOC removal (ultimate degradation) or specific substance removal (primary degradation) at time t. Calculate the DOC concentrations to the nearest 0,1 mg per litre, and round up the means of the Dt values to the nearest whole per cent. | 32. | Illustrate the course of the degradation graphically in a diagram as shown in the figure in “Validity and interpretation of results”. If there are sufficient data, calculate from the curve the lag phase (tL) and the time to reach 50 per cent removal from the end of the lag phase (t50). | Test report | 33. | The test report must contain the following information: | | Test substance: | — | physical nature and, where relevant, physicochemical properties; | — | identification data. | | Test conditions: | — | location and description of the sampling site; pollutional and nutrient status (colony count, nitrate, ammonium, phosphate if appropriate); | — | characteristics of the sample (date of sampling, depth, appearance, temperature, salinity, DOC (optional), delay between collection and use in the test; | — | method used (if any) for ageing of the seawater; | — | method used for pre-treatment (filtration/sedimentation) of the seawater; | — | method used for DOC determination; | — | method used for specific analysis (optional); | — | method used for determining the number of heterotrophs in the seawater (plate count method or alternative procedure) (optional); | — | other methods (optional) used to characterise the seawater (ATP measurements, etc.). | | Results: | — | analytical data reported on a data sheet (Appendix 2); | — | the course of the degradation test is represented graphically in a diagram showing the lag phase (tL), slope, and time (starting from the end of the lag phase) to reach 50 per cent removal (t50). The lag phase may be estimated graphically as shown in the figure in the “Validity and interpretation of results” section or conveniently taken as the time needed for 10 per cent degradation; | — | percentage degradation measured after 60 days, or at end of test. | | Discussion of results. | Validity and interpretation of results | 34. | The results obtained with the reference substances e.g. sodium benzoate, sodium acetate or aniline, should be comparable to results obtained in the ring test (3) (refer to section on “Reference substances”, paragraph 7). If results obtained with reference substances are atypical, the test should be repeated using another seawater sample. Although results of inhibition tests may not always be straightforward to interpret because of the contribution of DOC by the test substance, a significant reduction of the total DOC removal rate, compared with that of the control, is a positive sign of toxic effects. | 35. | Owing to the relatively high test concentrations used as compared with most natural systems (and consequently an unfavourable ratio between the concentrations of test substances and other carbon sources), the method is to be regarded as a preliminary test which can be used to indicate whether or not a substance is easily biodegradable. Accordingly a low result does not necessarily mean that the test substance is not biodegradable in marine environments, but indicates that more work will be necessary in order for this to be established. | An example of a theoretical degradation experiment illustrating a feasible way of estimating the values of tL (length of “lag phase”) and t50 (time interval, starting at tL), needed to reach 50 per cent removal, is given in the figure below. | Dunnett's Test | William Test | Transform data | Yes | Yes | Yes | Yes | No | Exclude control without solvent | Are both controls equal? U-Test | Are both controls equal? t-Test | Bonferroni — U-Test | Jonckheere-Terpstra Test | Shirley Test | Dunn's Test | Both controls might be pooled | Additional solvent control? | Additional solvent control? | Statistical testing not recommended | At least four replicates per treatment? | No success | Data: | Variation homogenous? | Distribution normal? | Yes | Yes | Yes | No | No | No | No | No | Exclude control without solvent | Both controls might be pooled | Start | Non-parametric Tests | Parametric Tests | CLOSED BOTTLE METHOD | INTRODUCTION | 1. | This method is a seawater variant of the Closed Bottle Test (5) and was finalised as a result of a ring test organised for the European Commission (EC) by the Danish Water Quality Institute (3). | 2. | In common with the accompanying marine Shake Flask Method, results of this test are not to be taken as indications of ready biodegradability, but are to be used specifically for obtaining information about the biodegradability of substances in marine environments. | PRINCIPLE OF THE METHOD | 3. | A pre-determined amount of the test substance is dissolved in the test medium in a concentration of usually 2-10 mg of test substance per litre (one or more concentrations may be used). The solution is kept in a filled closed bottle in the dark in a constant temperature bath or enclosure controlled to ± 1 °C within a range of 15-20 °C. In those cases where the objective of the study is to simulate environmental situations, tests may be carried out beyond this normal temperature range providing suitable adjustments are made for temperature control. The degradation is followed by oxygen analyses over a 28-day period. | 4. | The ring test showed that if the test was extended beyond 28 days no useful information could be gathered, in most cases, due to severe interferences. The blank biological oxygen demand (BOD) values were excessively high probably due to wall growth, caused by lack of agitation, and to nitrification. Thus, the recommended duration is 28 days, but if the blank BOD value remains within the 30 per cent limit (paragraphs 15 and 40) the test could be prolonged. | INFORMATION ON THE TEST SUBSTANCE | 5. | In order to know whether the test may be applied to a particular substance, some of its properties must be known. The empirical formula is required so that the theoretical oxygen demand (ThOD) may be calculated (see Appendix 3); otherwise the chemical oxygen demand (COD) of the substance must be determined to serve as the reference value. The use of COD is less satisfactory since some substances are not fully oxidised in the COD test. | 6. | The solubility of the substance should be at least 2 mg/l, though in principle less soluble substances could be tested (e.g. using ultra sonication) as could volatile substances. Information on the purity or the relative proportions of major components of the test substance is required in order that the results obtained can be interpreted, especially when the result lies close to the “pass” level. | 7. | Information on the toxicity of the substance to bacteria e.g. as measured in short-term respiration tests (4) may be very useful when selecting appropriate test concentrations and may be essential for the correct interpretation of low biodegradation values. However, such information is not always sufficient for interpreting results obtained in the biodegradation test and the procedure described in paragraph 27 is more suitable. | REFERENCE SUBSTANCES | 8. | Suitable reference substances must be used to check the microbial activity of the seawater sample. Aniline, sodium acetate or sodium benzoate (for example) may be used for this purpose. A degradation of these substances of at least 60 per cent (of their ThOD) must occur within a reasonably short time span, otherwise it is recommended that the test be repeated using another seawater sample. | 9. | In the EC ring-test where seawater samples were taken at different locations and at different times of the year, the lag phase (tL) and the time to achieve 50 per cent degradation (t50), not including the lag phase, were 0 to 2 days and 1 to 4 days respectively for sodium benzoate. For aniline the tL and t50 values were 0 to 7 and 2 to 12 days respectively. | REPRODUCIBILITY | 10. | The reproducibility of the methods was established in the EC ring test (3). | DESCRIPTION OF THE METHOD | Apparatus | 11. | Normal laboratory equipment and: | (a) | 250-300 ml BOD bottles with glass stoppers or narrow neck 250 ml bottle with glass stoppers may be used; | (b) | Several 2-, 3- and 4- litre bottles with litre marks for the preparation of the experiment and for the filling of the BOD bottles; | (c) | Waterbath or constant temperature room for keeping the bottles at constant temperature (± 1 °C) with the exclusion of light. | (d) | Equipment for analysis of dissolved oxygen; | (e) | Membrane filters, 0,2-0,45 μm (optional); | (f) | Equipment for specific analysis (optional). | Seawater | 12. | Collect a seawater sample in a thoroughly cleansed container and transport to the laboratory, preferably within one or two days of collection. During transport do not allow the temperature of the sample to exceed significantly the temperature to be used in the test. | 13. | Identify the sampling location precisely and describe it in terms of its pollutional and nutritional status. Especially for coastal or polluted waters, include in this characterisation a heterotrophic microbial colony count and the determination of concentrations of dissolved nitrate, ammonium and phosphate. | 14. | Provide the following information for the seawater sample itself: | — | date of collection; | — | depth of collection; | — | appearance of sample — turbid etc.; | — | temperature at the time of collection; | — | salinity; | — | dissolved organic carbon (DOC); | — | delay between collection and use in the test. | 15. | If the DOC content of the sample is found to be high or if it is thought that the blank BOD after 28 days would be more than 30 per cent of that of the reference substances, it is recommended that the seawater be aged for about a week prior to use. | 16. | Age the sample by storing it under aerobic conditions at the test temperature and in the dark or in diffuse light. If necessary, maintain aerobic conditions by gentle aeration. During ageing, the content of easily degradable organic material is reduced. In the ring-test (3), no difference was revealed between the degradation potential of aged and freshly collected seawater samples. | 17. | Prior to use, pretreat the seawater to remove coarse particles e.g. by filtration through a nylon filter or a coarse paper filter (not membrane or GF-C filters), or by sedimentation and decanting. Report the procedure used. Pretreat after ageing, if used. | Stock solutions for mineral nutrients | 18. | Prepare the following stock solutions using analytical grade reagents: | (a) | Potassium dihydrogen orthophosphate, KH2PO4 | 8,50 g | Dipotassium hydrogen orthophosphate, K2HPO4 | 21,75 g | Disodium hydrogen orthophosphate dihydrate, Na2HPO4·2H2O | 33,30 g | Ammonium chloride, NH4Cl | 0,50 g | Dissolve and make up to 1 litre with distilled water. | | (b) | Calcium chloride, CaCl2 | 27,50 g | Dissolve and make up to 1 litre with distilled water. | | (c) | Magnesium sulphate heptahydrate, MgSO4·7H2O | 22,50 g | Dissolve and make up to 1 litre with distilled water. | | (d) | Iron (III) chloride hexahydrate, FeCl3·6H2O | 0,25 g | Dissolve and make up to 1 litre with distilled water. | | Precipitation in solution (d) may be prevented by adding one drop of concentrated HCl or 0,4 g ethylenediaminetetra-acetic acid (EDTA, disodium salt) per litre. If a precipitate forms in a stock solution, replace it with freshly made solution. | Preparation of test medium | 19. | Add per litre of pre-treated seawater 1 ml of each of the above stock solutions. Saturate the test medium with air at the test temperature by aerating with clean compressed air for about 20 minutes. Determine the concentration of dissolved oxygen for control purposes. The saturated concentration of dissolved oxygen as a function of salinity and temperature may be read from the nomogram enclosed with this test method (Appendix 4). | Inoculum | 20. | Do not add a specific inoculum in addition to the micro-organisms already present in the seawater. Determine (optionally) the number of colony-forming heterotrophs in the seawater test medium (and preferably also in the original seawater sample), e.g. by plate count using a marine agar. This is particularly desirable for samples from coastal or polluted sites. Check the heterotrophic microbial activity in the seawater by performing a test with a reference substance. | Preparation of test bottles | 21. | Perform all necessary manipulations including ageing and pre-treatment of the seawater at the chosen test temperature between 15 to 20 °C, ensuring cleanliness, but not sterility of all glassware. | 22. | Prepare groups of BOD bottles for the determination of the BOD of the test and reference substances in simultaneous experimental series. Perform all analyses on duplicate bottles (blanks, reference and test substances), i.e. prepare two bottles for each determination. Perform analyses at least on days 0, 5, 15 and 28 (four determinations). For oxygen analyses, four determinations require a total of 3 × 2 × 4 = 24 bottles (blank, reference and test substance), and thus about 8 litres of test medium (for one concentration of test substance). | 23. | Prepare separate solutions of test and reference substances in large bottles of sufficient volume (paragraph 11) by first adding test and reference substances either directly or by using a concentrated stock solution to the partly filled large bottles. Add further test medium to give the final desired concentrations. If stock solutions of test and/or reference substances are used, ensure that the salinity of the seawater medium is not significantly altered. | 24. | Select concentrations of test and reference substances by taking into account: | (a) | the solubility of dissolved oxygen in seawater at the prevailing test temperature and salinity (see the enclosed nomogram — Appendix 4); | (b) | the blank BOD of the seawater; and | (c) | the expected biodegradability of the test substance. | 25. | At 15 °C and 20 °C and 32 parts per thousand salinity (ocean water), the solubility of dissolved oxygen is about 8,1 and 7,4 mg/l respectively. The oxygen consumption of the seawater itself (blank respiration) may be 2 mg O2/l or more, if the seawater is not aged. Therefore in order to ensure a significant oxygen concentration remaining after oxidation of the test substance, use a starting concentration of test substance of about 2-3 mg/l (depending on the ThOD) for the substances that are expected to become completely degraded under the conditions of the test (such as reference substances). Test less degradable substances at higher concentrations, up to about 10 mg/l, provided that toxic effects do not occur. It can be advantageous to run parallel tests with a low (about 2 mg/l) and a high (about 10 mg/l) concentration of test substance. | 26. | An oxygen blank must be determined in parallel in bottles containing neither test or reference substance. | 27. | If inhibitory effects are to be determined, prepare the following series of solutions in separate large bottles (paragraph 13): | (a) | 2 mg per litre of an easily-degradable substance, e.g. any of the reference substances mentioned; | (b) | x mg per litre of test substance (x is usually 2); | (c) | 2 mg per litre of the easily-degradable substance plus x mg per litre of test substance. | Physical-chemical control test (optional) | 28. | If the option of using specific analyses is used, a physical-chemical experiment may be performed in order to check whether the test substance is removed by abiotic mechanisms, such as hydrolysis or adsorption. A physical-chemical control test may be performed by adding mercury (II) chloride (HgCl2) (24) (50-100 mg/l) to duplicate flasks with test substance in order to stop microbial activity. A significant decrease in specific substance concentration in the course of the test indicates abiotic removal mechanisms. | Number of BOD bottles in a typical run | 29. | In a typical run the following bottles are used: | — | at least 8 containing test substance; | — | at least 8 containing nutrient-fortified seawater only; | — | at least 8 containing reference substance, and when necessary | — | 6 bottles containing test and reference substances (toxicity control). | PROCEDURE | 30. | After preparation, immediately siphon each solution, from the lower quarter (not from the bottom) of the appropriate large bottle, to fill the respective group of BOD bottles. Immediately analyse the zero controls (time zero) for dissolved oxygen (paragraph 33) or preserve them for later chemical analysis by precipitation with MnCl2 (manganese (II) chloride) and NaOH (sodium hydroxide). | 31. | Incubate the remaining parallel BOD bottles at the test temperature (15-20 °C), keep in the dark, and remove from the incubation area at appropriate time intervals, (e.g. after 5, 15 and 28 days as a minimum) and analyse for dissolved oxygen (paragraph 33). | 32. | Membrane filter (0,2-0,45 μm) or centrifuge, for 15 minutes, samples for specific analyses (optional). Store for up to 48 hours at 2-4 °C, or for longer periods at – 18 °C, if not analysed immediately (if it is known that the test substance will remain unaffected, acidify to pH 2 before storing). | Dissolved oxygen determination | 33. | Determine the concentration of dissolved oxygen using a chemical or electrochemical method which is recognised nationally or internationally. | DATA AND REPORTING | Treatment of Results | 34. | Record analytical results on the attached data sheets (Appendix 5). | 35. | Calculate the BOD as the difference of the oxygen depletion between a blank and a solution of test substance under the conditions of the test. Divide the net oxygen depletion by the concentration (w/v) of the substance in order to express the BOD as mg BOD/mg test substance. The degradation is defined as the ratio of the biochemical oxygen demand to either, preferably, the theoretical oxygen demand (ThOD) or the chemical oxygen demand (COD) and expressed as a percentage (see paragraph 36). | 36. | Calculate the biodegradation values for each sampling time for both test and reference substances using one or other of the equations: | where: | ThOD | = | theoretical oxygen demand (calculation, Appendix 3) | COD | = | chemical oxygen demand, determined experimentally. | Note: Sometimes the two ways of calculation (percentage of the ThOD or percentage of the COD) do not give the same results; it is preferable to use ThOD, since some substances are not fully oxidised in the COD test. | 37. | Illustrate the course of the degradation test graphically in a diagram (see example in section on “Validity and interpretation of results”. If there are sufficient data, calculate the lag phase (tL) and the time (t50) to reach 50 per cent removal from the end of the lag phase from the biodegradation curve. | 38. | If specific analysis is used (optional), state the percentage of primary degradation as the percentage of specific substance removal within the test period (corrected for analytical blanks). | Test Report | 39. | The test report must contain the following information: | | Test substance: | — | physical nature and, where relevant, physicochemical properties; | — | identification data. | | Test conditions: | — | location and description of the sampling site: pollutional and nutrient status (colony count, nitrate, ammonium, phosphate if appropriate); | — | characteristics of the sample (date of sampling, depth, appearance, temperature, salinity, DOC (optional), delay between collection and use in the test); | — | method used (if any) for ageing of the seawater; | — | method used for pre-treatment (filtration/sedimentation) of the seawater; | — | method used for the COD determination (if performed); | — | method used for the oxygen measurements; | — | dispersion procedure for substances which are poorly soluble under the test conditions; | — | method used for determining the number of heterotrophs in the seawater (plate count method or alternative procedure); | — | method used for determining DOC in seawater (optional); | — | method used for specific analysis (optional); | — | other optional methods used to characterise the seawater (ATP measurements, etc.). | | Results: | — | analytical data reported on a data sheet (as attached, Appendix 5); | — | the course of the degradation test represented graphically in a diagram showing the lag phase, (tL), slope and time (starting from the end of the lag phase) to reach 50 per cent of the final oxygen uptake caused by oxidation of the test substance (t50). The lag phase may be estimated graphically as shown in the attached figure, or conveniently taken as the time needed for 10 per cent degradation; | — | per cent degradation measured after 28 days. | | Discussion of results. | Validity and interpretation of results | 40. | The blank respiration should not exceed 30 per cent of the oxygen in the test bottle. If it is not possible to meet this criterion using freshly collected seawater, the seawater must be aged (stabilized) before use. | 41. | The possibility that nitrogen-containing substances may affect the results should be considered. | 42. | Results obtained with the reference substances sodium benzoate and aniline should be comparable to the results obtained in the ring-test (3) (paragraph 9). If results obtained with reference substances are atypical, the test should be repeated using another seawater sample. | 43. | The test substance can be considered to be inhibitory to bacteria (at the concentration used) if the BOD of the mixture of reference and test substances is less than the sum of the BOD of the separate solutions of the two substances. | 44. | Owing to the relatively high test concentrations as compared with most natural systems, and consequently an unfavourable ratio between the concentrations of test substance and other carbon sources, the method is to be regarded as a preliminary test which can be used to indicate whether or not a substance is easily biodegradable. Accordingly, a low result does not necessarily mean that the test substance is not biodegradable in marine environments, but indicates that more work will be necessary in order for this to be established. | An example of a theoretical degradation experiment illustrating a feasible way of estimating the values of tL (length of “lag phase”) and t50, time interval (starting at tL), needed to reach 50 % of the final oxygen uptake caused by oxidation of the test substance, is given below: | Exclude control without solvent | Are both controls equal? U-Test | Are both controls equal? t-Test | Bonferroni — U-Test | Jonckheere-Terpstra Test | Shirley Test | Dunn's Test | Both controls might be pooled | Additional solvent control? | Additional solvent control? | Statistical testing not recommended | At least four replicates per treatment? | No success | Transform data | Data: | Variation homogenous? | Distribution normal? | Yes | Yes | Yes | Yes | Yes | Yes | Yes | No | No | No | No | No | No | Dunnett's Test | William Test | Exclude control without solvent | Both controls might be pooled | Start | Non-parametric Tests | Parametric Tests | LITERATURE | (1) | de Kreuk J.F. and Hanstveit A.O. (1981). Determination of the biodegradability of the organic fraction of chemical wastes. Chemosphere, 10 (6); 561-573. | (2) | Chapter C.4-B of this Annex: Determination of “Ready” Biodegradability Part III Modified OECD Screening Test | (3) | Nyholm N. and Kristensen P. (1987). Screening Test Methods for Assessment of Biodegradability of Chemical Substances in Seawater. Final Report of the ring test programme 1984-1985, March 1987, Commission of the European Communities. | (4) | Chapter C.11 of this Annex: Biodegradation — Activated Sludge, Respiration Inhibition Test. | (5) | Chapter C.4-E of this Annex: Determination of “Ready” Biodegradability, Part VI. Closed Bottle Test. | Appendix 1 | Determination of organic carbon in seawater | SHAKE FLASK METHOD | For the determination of organic carbon of a water sample, the organic compounds in the sample are oxidized to carbon dioxide using generally one of the following three techniques: | — | wet-oxidation by persulphate/UV-irradiation; | — | wet-oxidation by persulfate/elevated temperature (116-130 °C); | — | combustion. | Evolved CO2 is quantified employing infra-red spectrometry or titrimetry. Alternatively, CO2 is reduced to methane, which is quantified on a flame ionization detector (FID). | The persulfate/UV-method is commonly used for the analysis of “clean” water with low content of particulate matter. The latter two methods can be applied to most kinds of water samples, the persulfate/elevated temperature-oxidation being most suitable for low-level samples, and the combustion technique being applicable for samples with non-volatile organic carbon (NVOC) content well above 1 mg C/l. | Interferences | All three methods are dependent on eliminating or compensating for inorganic carbon (IC) present in the sample. Purging of CO2 from the acidified sample is the most frequently used method to eliminate the IC, although this also results in a loss of volatile organic compounds (1). The complete elimination or compensation of IC must be ensured for each sample matrix, and volatile organic carbon (VOC) must be determined in addition to NVOC dependent on the sample type. | High chloride concentrations result in decreased oxidation efficiency using the persulfate/UV-method (2). Application of an oxidation reagent modified by the addition of mercury (II) nitrate may, however, remove this interference. It is recommended that the maximum tolerable sample volume be used to evaluate each type of chloride-containing sample. High salt concentrations in sample analysed using the combustion method can cause salt coating of the catalyst and excessive corrosion of the combustion tube. Precautions should be taken according to the manufacturer's manual. | Highly turbid samples as well as samples containing particulate matter may be incompletely oxidized when employing the persulfate/UV-method. | An example of a suitable method | Non-volatile organic carbon is determined by oxidation with persulfate/UV-irradiation and subsequent quantification of evolved CO2 employing non-dispersive infra-red spectrometry. | The oxidation reagent is modified in accordance with the suggestions given in (2) as described in the manufacturer's manual: | a) | 8,2 g HgCl2 and 9,6 g Hg(NO3)2·H2O are dissolved in several hundred millilitres of low carbon concentration reagent water. | b) | 20 g K2S2O8 are dissolved in the mercuric salt solution. | c) | 5 ml HNO3 (conc.) are added to the mixture. | d) | the reagent is diluted to 1 000 ml. | The interference from chloride is removed using a 40 μl sample volume for 10 per cent chloride and 200 μl sample volume for 1,9 per cent chloride. Samples of high chloride concentrations and/or larger sample volumes can be analysed according to this method provided that build-up of chloride in the oxidation vessel is prevented. Determination of volatile organic carbon can subsequently be performed, if relevant, for the sample type in question. | LITERATURE | (1) | ISO, Water quality — determination of total organic carbon. Draft International Standard ISO/DIS 8245, January 16, 1986. | (2) | American Public Health Association, Standard Methods for the Estimation of Water and Wastewater. American Water Works Association & Water Pollution Control Federation, 16th edition, 1985. | Also of interest (gives a description of an autoanalysis system): | (3) | Schreurs W. (1978). An automated colorimetric method for the determination of dissolved organic carbon in seawater by UV destruction. Hydrobiological Bulletin 12, 137-142. | Appendix 2 | Biodegradation in seawater | SHAKE FLASK METHOD | DATA SHEET | 1. | LABORATORY: | 2. | DATE AT START OF TEST: | 3. | TEST SUBSTANCE: | Name: | Stock solution concentration: | mg/l as substance | Initial concentration in medium, to: | mg/l as substance | : | mg DOC/l | 4. | SEAWATER: | Source: | Date of collection: | Depth of collection: | Appearance at time of collection (e.g. turbid, etc.): | Salinity at collection: | ‰ | Temperature at collection: | °C | DOC “x” hours after collection: | mg/l | Pretreatment prior to testing (e.g. filtration, sedimentation, ageing, etc.): | Microbial colony count | — | original sample: | colonies/ml | | — | at start of test: | colonies/ml | Other characteristics: | | | 5. | CARBON DETERMINATIONS: | Carbon analyser: | | Flask no. | | DOC after n days (mg/l) | 0 | n1 | n2 | n3 | nx | Test: nutrient-fortified seawater with test substance | 1 | a1 | | | | | | a2 | | | | | | mean, Ca(t) | | | | | | 2 | b1 | | | | | | b2 | | | | | | mean, Cb(t) | | | | | | Blank: nutrient-fortified seawater without test substance | 1 | c1 | | | | | | c2 | | | | | | mean, Cc(t) | | | | | | 2 | d1 | | | | | | d2 | | | | | | mean, Cd(t) | | | | | | mean, | | | | | | | | | | | 6. | EVALUATION OF RAW DATA: | Flask No. | Calculation of results | % Degradation after n days | 0 | n1 | n2 | n3 | nx | 1 | 0 | | | | | 2 | 0 | | | | | Mean (*9) | 0 | | | | | Note: | Similar formats may be used when degradation is followed by specific analysis and for the reference substance and toxicity controls. | 7. | ABIOTIC DEGRADATION (optional) | | Time (days) | 0 | t | DOC conc. (mg/l) in sterile control | Cs(o) | Cs(t) | Appendix 3 | Calculation of the theoretical biochemical oxygen demand | CLOSED BOTTLE METHOD | The ThOD of the substance CcHhClclNnNanaOoPpSs of the molecular weight MW is calculated according to: | This calculation implies that C is mineralised to CO2, H to H2O, P to P2O5 and Na to Na2O. Halogen is eliminated as hydrogen halide and nitrogen as ammonia. | Example: | Glucose C6H12O6, MW = 180 | Molecular weights of salts other than those of the alkali metals are calculated on the assumption that the salts have been hydrolysed. | Sulphur is assumed to be oxidised to the state of + 6. | Example: | Sodium n-dodecylbenzenesulphonate C18H29SO3Na, MW = 348 | In the case of nitrogen-containing substances the nitrogen may be eliminated as ammonia, nitrite, or nitrate corresponding to different theoretical biochemical oxygen demands. | Suppose full nitrate formation had been observed by analysis in the case of a secondary amine: | (C12H25)2 NH, MW = 353 | Appendix 4 | temperature (°C) | salinity | in: ‰ | Nomogram giving: | Saturation concentration of oxygen of various temperatures and salinities | mg O2/l | Appendix 5 | Biodegradation in seawater | CLOSED BOTTLE METHOD | DATA SHEET | 1. | LABORATORY: | 2. | DATE AT START OF TEST: | 3. | TEST SUBSTANCE: | Name: | Stock solution concentration: | mg/l | Initial conc. in seawater medium: | mg/l | ThOD or COD: | mg O2/mg test substance | 4. | SEAWATER: | Source: | Date of collection: | Depth of collection: | Appearance at time of collection (e.g. turbid, etc.): | Salinity at collection: | ‰ | Temperature at collection: | °C | DOC “x” hours after collection: | mg/l | Pre-treatment prior to testing (e.g. filtration, sedimentation, ageing, etc.): | Microbial colony count | — | original sample: | colonies/ml | | — | at start of test: | colonies/ml | Other characteristics: | | | 5. | TEST MEDIUM: | Temperature after aeration: | °C | O2 concentration after aeration and standing before start of test: | mg O2/l | 6. | DO DETERMINATION: | Method: Winkler/electrode | | Flask no. | | mg O2/l after n days | 0 | 5 | 15 | 28 | Test: nutrient — fortified seawater with test substance | 1 | a1 | | | | | 2 | a2 | | | | | Mean test | | | | | Blank: nutrient — fortified seawater, but without test substance | 1 | c1 | | | | | 2 | c2 | | | | | Mean blank | | | | | Note: Similar format may be used for reference substance and toxicity controls. | 7. | DO DEPLETION: % DEGRADATION ( %D): | | DO depletion after n days | 5 | 15 | 28 | (mb – mt ) (25) | | | | | | | C.43. ANAEROBIC BIODEGRADABILITY OF ORGANIC SUBSTANCES IN DIGESTED SLUDGE: BY MEASUREMENT OF GAS PRODUCTION | INTRODUCTION | 1. | This test method is equivalent to OECD Test Guideline (TG) 311 (2006). There are a number of screening tests for assessing aerobic biodegradability of organic substances (Test methods C.4, C.9, C.10, and C.11 (1) and OECD TG 302C (2)) and the results of applying these have been successfully used to predict the fate of substances in the aerobic environment, particularly in the aerobic stages of waste water treatment. Various proportions of water-insoluble substances, as well as of those which adsorb on to sewage solids, are also dealt with aerobically, since they are present in settled sewage. However, the larger fractions of these substances are bound to the primary settled sludge, which is separated from raw sewage in settlement tanks before the settled, or supernatant, sewage is treated aerobically. The sludge, containing some of the soluble substances in the interstitial liquid, is then passed to heated digesters for anaerobic treatment. As yet there are no tests in this series for assessing anaerobic biodegradability in anaerobic digesters and this test is targeted to fill this gap; it is not necessarily applicable to other anoxic environmental compartments. | 2. | Respirometric techniques that measure the amounts of gas produced, mainly methane (CH4) and carbon dioxide (CO2), under anaerobic conditions have been used successfully for assessing anaerobic biodegradability. Birch et al (3) reviewed these procedures and concluded that the work of Shelton and Tiedje (4), based on earlier studies (5)(6)(7), was the most comprehensive. The method (4), which was further developed by others (8) and has become the American standards (9)(10), did not resolve problems related to the differing solubilities of CO2 and CH4 in the test medium and to the calculation of the theoretical gas production of a test substance. The ECETOC report (3) recommended the additional measurement of the dissolved inorganic carbon (DIC) content of the supernatant liquid, which made the technique more widely applicable. The ECETOC method was subjected to an international calibration exercise (or ring test) and became the ISO Standard, ISO 11734 (11). | 3. | This test method, which is based on ISO 11734 (11), describes a screening method for the evaluation of potential anaerobic biodegradability of organic substances under a specific condition (i.e. in an anaerobic digester at a given time and range of concentration of micro-organisms). Because a diluted sludge is used with a relatively high concentration of test substance and the duration of the test typically is longer than the retention time in anaerobic digesters, the conditions of the test do not necessarily correspond to the conditions in anaerobic digesters, nor is it applicable for the assessment of anaerobic biodegradability of organic substances under different environmental conditions. Sludge is exposed to the test substance for up to 60 days, which is longer than the normal sludge retention time (25 to 30 days) in anaerobic digesters, though at industrial sites retention times may be much longer. Predictions from the results of this test cannot be made as convincingly as they can be made in the case of aerobic biodegradation, since the evidence accrued on the behaviour of test substances in “ready” aerobic tests and in simulation tests and the aerobic environment is sufficient to be confident that there is a connection; little similar evidence exists for the anaerobic environment. Complete anaerobic biodegradation can be assumed to occur if 75 %-80 % of theoretical gas production is achieved. The high ratios of substance to biomass used in these tests mean that a substance which passes is more likely to be degraded in an anaerobic digester. Additionally, substances which fail to be converted to gas in the test may not necessarily persist at more environmentally realistic substance-to-biomass ratios. Also, other anaerobic reactions occur by which substances may be at least partially degraded, e.g. by dechlorination, but this test does not detect such reactions. However, by applying specific analytical methods for determining the test substance, its disappearance may be monitored (see paragraphs 6, 30, 44 and 53). | PRINCIPLE OF THE TEST | 4. | Washed digested sludge (26), containing low (< 10 mg/l) concentrations of inorganic carbon (IC), is diluted about ten-fold to a total solids concentration of 1 g/l to 3 g/l and incubated at 35 °C ± 2 °C in sealed vessels with the test substance at 20 to 100 mg C/l for up to 60 days. Allowance is made for measuring the activity of the sludge by running parallel blank controls with sludge inoculum in the medium but without test substance. | 5. | The increase in headspace pressure in the vessels resulting from the production of carbon dioxide and methane is measured. Much of the CO2 produced will be dissolved in the liquid phase or transformed into carbonate or hydrogen carbonate under the conditions of the test. This inorganic carbon is measured at the end of the test. | 6. | The amount of carbon (inorganic plus methane) resulting from the biodegradation of the test substance is calculated from the net gas production and net IC formation in the liquid phase in excess of blank control values. The extent of biodegradation is calculated from total IC and methane-C produced as a percentage of the measured or calculated amount of carbon added as test substance. The course of biodegradation can be followed by taking intermediate measurements of gas production only. Additionally the primary biodegradation can be determined by specific analyses at the beginning and end of the test. | INFORMATION ON THE TEST SUBSTANCE | 7. | The purity, water solubility, volatility and adsorption characteristics of the test substance should be known to enable correct interpretation of results to be made. The organic carbon content (% w/w) of the test substance needs to be known either from its chemical structure or by measurement. For volatile test substances, a measured or calculated Henry's law constant is helpful in deciding whether the test is applicable. Information on the toxicity of the test substance for anaerobic bacteria is useful in selecting an appropriate test concentration, and for interpreting results showing poor biodegradability. It is recommended to include the inhibition control unless it is known that the test substance is not inhibitory to anaerobic microbial activities (see paragraph 21 and ISO 13641-1 (12)). | APPLICABILITY OF THE TEST METHOD | 8. | The test method may be applied to water-soluble substances; it may also be applied to poorly soluble and insoluble substances, provided that a method of exact dosing is used e.g. see ISO 10634 (13). In general, a case by case decision is necessary for volatile substances. Special steps may have to be taken, for example, not releasing gas during the test. | REFERENCE SUBSTANCES | 9. | To check the procedure, a reference substance is tested by setting up appropriate vessels in parallel as part of normal test runs. Phenol, sodium benzoate and polyethylene glycol 400 are examples and would be expected to be degraded by more than 60 % theoretical gas production (i.e. methane and inorganic carbon) within 60 days (3)(14). | REPRODUCIBILITY OF TEST RESULTS | 10. | In an international ring test (14) there was good reproducibility in gas pressure measurements between triplicate vessels. The relative standard deviation (coefficient of variation, COV) was mainly below 20 %, although this value often increased to > 20 % in the presence of toxic substances or towards the end of the 60-d incubation period. Higher deviations were also found in vessels of volume < 150 ml. Final pH values of the test media were in the range 6,5-7,0. | 11. | The following results were obtained in the ring test. | Test substance | Total data | n1 | Mean degradation | (of total data) | (%) | Relative Standard deviation | (of total data) | (%) | Valid data | n2 | Mean degradation | (of valid data) | (%) | Relative Standard deviation | (of valid data) | (%) | Data > 60 % degradation in valid tests | n3 | Palmitic acid | 36 | 68,7 ± 30,7 | 45 | 27 | 72,2 ± 18,8 | 26 | 19 = 70 % (*10) | Polyethylene Glycol 400 | 38 | 79,8 ± 28,0 | 35 | 29 | 77,7 ± 17,8 | 23 | 24 = 83 % (*10) | 12. | The coefficients of variation of the mean for all values obtained with palmitic acid and polyethylene glycol 400 were as high as 45 % (n = 36) and 35 % (n = 38) respectively. When values of < 40 % and > 100 % were omitted (the former being assumed to be due to sub-optimal conditions, the latter due to unknown reasons), the COVs were reduced to 26 % and 23 %, respectively. The proportions of “valid” values attaining at least 60 % degradation were 70 % for palmitic acid and 83 % for polyethylene glycol 400. The proportions of the percentage biodegradation derived from DIC measurements were relatively low but variable. For palmitic acid the range was 0-35 %, mean 12 %, with COV of 92 % and for polyethyleneglycol 400 0-40 %, mean 24 %, with COV of 54 %. | DESCRIPTION OF THE TEST METHOD | Apparatus | 13. | Usual laboratory equipment and the following are required: | (a) | Incubator — spark-proof and controlled at 35 °C ± 2 °C; | (b) | Pressure-resistant glass test vessels of an appropriate nominal size (27), each fitted with a gas-tight septum, capable of withstanding about 2 bar. The headspace volume should be about 10 % to 30 % of the total volume. If biogas is released regularly, about 10 % headspace volume is appropriate, but if the gas release is made only at the end of the test 30 % is appropriate. Glass serum bottles, of nominal volume 125 ml, total volume around 160 ml, sealed with serum septa (28) and crimped aluminium rings are recommended when the pressure is released at each sampling time; | (c) | Pressure-measuring device (29) adapted to enable measurement and venting of the gas produced, for example, a hand-held precision pressure meter connected to a suitable syringe needle; a 3-way gas-tight valve facilitates the release of excess pressure (Appendix 1). It is necessary to keep the internal volume of the pressure transducer tubing and valve as low as possible, so that errors introduced by neglecting the volume of the equipment are insignificant; | Note — The pressure readings are used directly to calculate the amount of carbon produced in the headspace (paragraphs 42 to 44). Alternatively, the pressure readings may be converted to volumes (at 35 °C, atmospheric pressure) of gas produced using a conversion graph. This graph is constructed from data obtained by injecting known volumes of nitrogen gas into a series of test vessels (e.g. serum bottles) at 35° +/– 2 °C and recording the resulting stabilised pressure readings (See Appendix 2). The calculation is shown in the Note in paragraph 44. | Warning — Take care to avoid needle-stick injuries when using micro-syringes. | (d) | Carbon analyser, suitable for the direct determination of inorganic carbon in the range of 1 mg/l to 200 mg/l; | (e) | Syringes of high precision for gaseous and liquid samples; | (f) | Magnetic stirrers and followers (optional); | (g) | Glove box (recommended). | Reagents | 14. | Use analytical grade reagents throughout. | Water | 15. | Distilled or deionised water (de-oxygenated by sparging with nitrogen gas containing less than 5 μl/l oxygen), containing less than 2 mg/l dissolved organic carbon (DOC). | Test medium | 16. | Prepare the dilution medium to contain the following constituents at the stated amounts; | Anhydrous potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | 0,27 g | Disodium hydrogen phosphate dodecahydrate (Na2HPO4 · 12H2O)) | 1,12 g | Ammonium chloride (NH4Cl) | 0,53 g | Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) | 0,075 g | Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2·6H2O) | 0,10 g | Iron (II) chloride tetrahydrate (FeCl2·4H2O) | 0,02 g | Resazurin (oxygen indicator) | 0,001 g | Sodium sulphide nonahydrate (Na2S·9H2O) | 0,10 g | Stock solution of trace elements (optional, paragraph 18) | 10 ml | Add de-oxygenated water (paragraph 15) | to 1 litre | Note: Freshly supplied sodium sulphide should be used or it should be washed and dried before use, to ensure sufficient reductive capacity. The test may be performed without using a glove box (see paragraph 26). In this case, the final concentration of sodium sulphide in the medium should be increased to 0,20 g of Na2S · 9H2O per litre. Sodium sulphide may also be added from an appropriate anaerobic stock solution through the septum of the closed test vessels as this procedure will decrease the risk of oxidation. Sodium sulphide may be replaced by titanium (III) citrate, which is added through the septum of closed test vessels at a final concentration of 0,8 to 1,0 mmol/l. Titanium (III) citrate is a highly effective and low-toxicity reducing agent, which is prepared as follows: Dissolve 2,94 g of trisodium citrate dihydrate in 50 ml of de-oxygenated water (to result in a solution of 200 mmol/l) and add 5 ml of a 15 % (w/v) titanium (III) chloride solution. Neutralise to pH 7 ± 0,2 with mineral alkali and dispense to an appropriate vessel under a stream of nitrogen. The concentration of titanium (III) citrate in this stock solution is 164 mmol/l. | 17. | Mix the components of the test medium except the reducing agent (sodium sulphide titanium citrate) and sparge the solution with nitrogen gas for about 20 min immediately before use to remove oxygen. Then add the appropriate volume of freshly prepared solution of the reducing agent (prepared in de-oxygenated water) just before use of the medium. Adjust the pH of the medium, if necessary, with dilute mineral acid or alkali to 7 ± 0,2. | Stock solution of trace elements (optional) | 18. | It is recommended that the test medium should contain the following trace elements to improve anaerobic degradation processes, especially if low concentrations (e.g. 1g/l) of inoculum are used (11). | Manganese chloride tetrahydrate (MnCl2 · 4H2O) | 50 mg | Boric acid (H3BO3) | 5 mg | Zinc chloride (ZnCl2) | 5 mg | Copper (II) chloride (CuCl2) | 3 mg | Disodium molybdate dihydrate (Na2MoO4 · 2H2O) | 1 mg | Cobalt chloride hexahydrate (CoCl2 · 6H2O) | 100 mg | Nickel chloride hexahydrate (NiCl2 · 6H2O) | 10 mg | Disodium selenite (Na2SeO3) | 5 mg | Add de-oxygenated water (paragraph 15) | to 1 litre | Test substance | 19. | Add the test substance as a stock solution, suspension, emulsion, or directly as solid or liquid, or as absorbed on to glass-fibre filter to give a concentration of no more than 100 mg/l organic carbon. If stock solutions are used, prepare a suitable solution with water (paragraph 15) (previously de-oxygenated by sparging with nitrogen gas) of such a strength that the volume added is less than 5 % of the total volume of reaction mixture. Adjust the pH of the stock solution to pH 7 ± 0,2 if necessary. For test substances which are insufficiently soluble in water, consult ISO 10634 (13). If a solvent is used, prepare an additional control, with the solvent only added to the inoculated medium. Organic solvents which are known to inhibit methane production, such as chloroform and carbon tetrachloride, should be avoided. | Warning — Handle with care toxic test substances, and those whose properties are not known. | Reference substances | 20. | Reference substances such as sodium benzoate, phenol and polyethylene glycol 400 have been used successfully to check the procedure, being biodegraded by more than 60 % within 60 days. Prepare a stock solution (in de-oxygenated water) of the chosen reference substance in the same way as for the test substance and adjust to pH 7 ± 0,2 if necessary. | Inhibition control (conditional) | 21. | In order to obtain information on the toxicity of the test substance to anaerobic micro-organisms to find the most appropriate test concentration, add the test substance and reference substance to a vessel containing the test medium (see paragraph 16), each at the same concentrations as added, respectively (see paragraphs 19 and 20 and see also ISO 13641-1 (12)). | Digested sludge | 22. | Collect digested sludge from a digester at a waste water treatment plant which treats predominantly domestic sewage. The sludge should be fully characterised and its background information should be reported (see paragraph 54). If use of adapted inoculum is intended, digested sludge from an industrial sewage treatment plant may be considered. Use wide-necked bottles constructed from high-density polyethylene or a similar material, which can expand, for the collection of the digested sludge. Add sludge to within about 1cm of the top of the bottles and seal tightly, preferably with a safety valve. After transport to the laboratory, the collected sludge may be used directly or placed in a laboratory-scale digester. Release excess biogas by opening bottles of sludge carefully. Alternatively, laboratory-grown anaerobic sludge may be used as a source of inoculum but its spectrum of activity may have been impaired. | Warning — Digested sludge produces flammable gases which present fire and explosion risks: it also contains potentially pathogenic organisms, so take appropriate precautions when handling sludge. For safety reasons, do not use glass vessels for collecting sludge. | 23. | In order to reduce background gas production and to decrease the influence of the blank controls, pre-digestion of the sludge may be considered. If pre-digestion is required, the sludge should be allowed to digest without the addition of any nutrients or substrates at 35 °C ± 2 °C for up to 7 days. It has been found that pre-digestion for about 5 days usually gives an optimal decrease in gas production of the blank without unacceptable increases in either lag or incubation periods during the test phase or loss of activity towards a small number of substances tested. | 24. | For test substances which are, or are expected to be, poorly biodegradable, consider pre-exposure of the sludge to the test substance to obtain an inoculum which is better adapted. In such a case, add the test substance at an organic carbon concentration of 5 mg/l to 20 mg/l to the digested sludge and incubated for up to 2 weeks. Wash the pre-exposed sludge carefully before use (see paragraph 25) and indicate in the test report the conditions of the pre-exposure. | Inoculum | 25. | Wash the sludge (see paragraphs 22 to 24) just prior to use, to reduce the IC concentration to less than 10 mg/l in the final test suspension. Centrifuge the sludge in sealed tubes (e.g. 3 000 g during 5 min) and discharge the supernatant. Suspend the resulting pellet in de-oxygenated medium (paragraphs 16 and 17), re-centrifuge the suspension and discharge the supernatant liquid. If the IC has not been sufficiently lowered, the washing procedure of the sludge could be repeated twice as a maximum. This does not appear to affect the micro-organisms adversely. Finally, suspend the pellet in the requisite volume of test medium and determine the concentration of total solids [e.g. ISO 11923 (15)]. The final concentration of total solids in the test vessels should be in the range of 1 g/l to 3 g/l (or about 10 % of that in undiluted digested sludge). Conduct the above operations in such a way that the sludge has minimal contact with oxygen (e.g. use a nitrogen atmosphere). | TEST PROCEDURE | 26. | Perform the following initial procedures using techniques to keep the contact between digested sludge and oxygen as low as practicable, for example, it may be necessary to work within a glove box in an atmosphere of nitrogen and/or purge the bottles with nitrogen (4). | Preparation of test and control assays | 27. | Prepare at least triplicate test vessels (see paragraph 13-b) for the test substance, blank controls, reference substance, inhibition controls (conditional) and pressure control chambers (optional procedure) (see paragraphs 7, 19 to 21). Additional vessels for the purpose of evaluating primary biodegradation using test substance specific analyses may also be prepared. The same set of blank controls may be used for several test substances in the same test as long as the headspace volumes are consistent. | 28. | Prepare the diluted inoculum before adding it to the vessels e.g. by the means of a wide-mouthed pipette. Add aliquots of well-mixed inoculum (paragraph 25) so that the concentration of total solids is the same in all vessels (between 1 g/l and 3 g/l). Add stock solutions of the test and reference substance after adjustment to pH 7 ± 0,2, if necessary. The test substance and the reference substance should be added using the most appropriate route of administration (paragraph 19). | 29. | The test concentration of organic carbon should normally be between 20 and 100 mg/l (paragraph 4). If the test substance is toxic, the test concentration should be reduced to 20 mg C/l, or even less if only primary biodegradation with specific analyses is to be measured. It should be noted that the variability of the test results increases at lower test concentrations. | 30. | For blank vessels, add an equivalent amount of the carrier used to dose the test substance instead of a stock solution, suspension or emulsion. If the test substance was administered using glass fibre filters or organic solvents, add to the blanks a filter or an equivalent volume solvent that has been evaporated. Prepare an extra replicate with test substance for the measurement of the pH value. Adjust the pH to 7 ± 0,2, if necessary, with small amounts of dilute mineral acid or alkali. The same amounts of neutralising agents should be added to all the test vessels. These additions should not have to be made since the pH value of the stock solutions of the test substance and reference substance have already been adjusted (see paragraphs 19 and 20). If primary biodegradation is to be measured, an appropriate sample should be taken from the pH-control vessel, or from an additional test vessel, and the test substance concentration should be measured using specific analyses. Covered magnets may be added to all the vessels if the reaction mixtures are to be stirred (optional). | 31. | Ensure that the total volume of liquid V1 and the volume of headspace Vh are the same in all vessels; note and record the values of V1 and Vh. Each vessel should be sealed with a gas septum and transferred from the glove box (see paragraph 26) into the incubator (see paragraph 13-a). | Insoluble test substances | 32. | Add weighed amounts of substances, which are poorly soluble in water, directly to the prepared vessels. When the use of a solvent is necessary (see paragraph 19), transfer the test substance solution or suspension into the empty vessels. Where possible, evaporate the solvent by passing nitrogen gas through the vessels and then add the other ingredients, namely, diluted sludge (paragraph 25), and de-oxygenated water as required. An additional solvent control should also be prepared (see paragraph 19). For other methods of adding insoluble substances, ISO 10634 (13) can be consulted. Liquid test substances may be dosed with a syringe into the completely prepared sealed vessels, if it is expected that the initial pH will not exceed 7 ± 1, otherwise dose as described above (see paragraph 19). | Incubation and gas pressure measurements | 33. | Incubate the prepared vessels at 35 °C ± 2 °C for about 1h to allow equilibration and release excess gas to the atmosphere, for example, by shaking each vessel in turn, inserting the needle of the pressure meter (paragraph 13-c) through the seal and opening the valve until the pressure meter reads zero. If at this stage, or when making intermediate measurements, the headspace pressure is less than atmospheric, nitrogen gas should be introduced to re-establish atmospheric pressure. Close the valve (see paragraph 13-c) and continue to incubate in the dark, ensuring that all parts of the vessels are maintained at the digestion temperature. Observe the vessels after incubation for 24 to 48 h. Reject vessels if the contents of the vessels show a distinct pink coloration in the supernatant liquid, i.e. if Resazurin (see paragraph 16) has changed colour indicating the presence of oxygen (see paragraph 50). While small amounts of oxygen may be tolerated by the system, higher concentrations can seriously inhibit the course of anaerobic biodegradation. The rejection of the occasional single vessel of a set of triplicates may be accepted, but the incidence of more failures than this must lead to an investigation of the experimental procedures as well as the repeating of the test. | 34. | Carefully mix the contents of each vessel by stirring or by shaking for a few minutes at least 2 or 3 times per week and soon before each pressure measurement. Shaking re-suspends the inoculum and ensures gaseous equilibrium. All pressure measurements should be taken quickly, since the test vessels could be subject to lowering of temperature, leading to false readings. While measuring pressure the whole test vessel including the headspace should be maintained at the digestion temperature. Measure the gas pressure, for example, by inserting through the septum the syringe needle (paragraph 13-c) connected to the pressure-monitoring meter. Care should be taken to prevent entry of water into the syringe needle; if this occurs the wet parts should be dried and a new needle fitted. The pressure should be measured in millibars (see paragraph 42). The gas pressure in the vessels may be measured periodically e.g. weekly, and optionally the excess gas is released to the atmosphere. Alternatively the pressure is measured only at the end of the test to determine the amount of biogas produced. | 35. | It is recommended that intermediate readings of gas pressure be made, since pressure increase provides guidance as to when the test may be terminated and allows the kinetics to be followed (see paragraph 6). | 36. | Normally end the test after an incubation period of 60 days unless the biodegradation curve obtained from the pressure measurements has reached the plateau phase before then; that is the phase in which the maximal degradation has been reached and the biodegradation curve has levelled out. If the plateau value is less than 60 % interpretation is problematic because it indicates that only part of the molecule has been mineralised or that an error has been made. If at the end of the normal incubation period, gas is being produced but a plateau phase is obviously not reached, then it should be considered to prolong the test to check whether the plateau (> 60 %) will be reached. | Measurement of inorganic carbon | 37. | At the end of the test after the last measurement of gas pressure, allow the sludge to settle. Open each vessel in turn and immediately take a sample for the determination of the concentration (mg/l) of inorganic carbon (IC) in the supernatant liquor. Neither centrifugation nor filtration should be applied to the supernatant liquor, since there would be an unacceptable loss of dissolved carbon dioxide. If the liquor cannot be analysed on being sampled, store it in a sealed vial, without headspace and cooled to about 4 °C for up to 2 days. After the IC measurement, measure and record the pH value. | 38. | Alternatively, the IC in the supernatant may be determined indirectly by release of the dissolved IC as carbon dioxide that can be measured in the headspace. Following the last measurement of gas pressure, adjust the pressure in each of the test vessels to atmospheric pressure. Acidify the contents of each vessel to approximately pH 1 by adding of concentrated mineral acid (e.g. H2SO4) through the septum of the sealed vessels. Incubate the shaken vessels at 35 °C ± 2 °C for approximately 24 hours and measure the gas pressure resulting from the evolved carbon dioxide by using the pressure meter. | 39. | Make similar readings for the corresponding blank, reference substance and, if included, inhibition control vessels (see paragraph 21). | 40. | In some cases, especially if the same control vessels are used for several test substances, measurements of intermediate IC concentrations in test and control vessels should be considered, as appropriate. In this case, a sufficient number of vessels should be prepared for all the intermediate measurements. This proceeding is preferred to taking all samples from one vessel only. The latter can only be done if the required volume for DIC analysis is not deemed to be too high. The DIC measurement should be made after measuring the gas pressure without release of excess gas as described below: | — | take as small a volume as possible of supernatant samples with a syringe through the septum without opening the vessels and IC in the sample is determined; | — | after having taken the sample the excess gas is released, or not; | — | it should be taken into account that even a small decrease in the supernatant volume (e.g. about 1 %) can yield a significant increase in the headspace gas volume (Vh); | — | the equations (see paragraph 44) are corrected by increasing Vh in equation 3, as necessary. | Specific analyses | 41. | If primary anaerobic degradation (see paragraph 30) is to be determined, take an appropriate volume of sample for specific analyses at the beginning and at the end of the test from the vessels containing the test substance. If this is done, note the volumes of headspace (Vh) and of the liquid (Vl) will be changed and take this into account when calculating the results of gas production. Alternatively samples may be taken for specific analyses from additional mixtures previously set up for the purpose (paragraph 30). | DATA AND REPORTING | Treatment of results | 42. | For practical reasons, the pressure of the gas is measured in millibars (1 mbar = 1h Pa = 102 Pa; 1 Pa = 1 N/m2), the volume in litres and temperature in degrees Celsius. | Carbon in the headspace | 43. | Since 1 mol of methane and 1 mol carbon dioxide each contain 12 g of carbon, the mass of carbon in a given volume of evolved gas may be expressed as: | m= 12 × 103×n | Equation [1] | where: | m | = | mass of carbon (mg) in a given volume of evolved gas; | 12 | = | relative atomic mass of carbon; | n | = | number of moles of gas in the given volume. | If a gas other than methane or carbon dioxide (e.g. N2O) is generated in considerable amounts, the formula [1] should be amended in order to describe the possibility of effects by gases generated. | 44. | From the gas laws n may be expressed as: | Equation [2] | where: | p | = | pressure of the gas (Pascals); | V | = | volume of the gas (m3); | R | = | molar gas constant [8,314 J/(mol K)]; | T | = | incubation temperature (Kelvins). | By combination of equations [1] and [2] and rationalising to allow for blank control production of gas: | Equation [3] | where: | mh | = | mass of net carbon produced as gas in the headspace (mg); | Δp | = | mean of the difference between initial and final pressures in the test vessels minus the corresponding mean in the blank vessels (millibars); | Vh | = | volume of headspace in the vessel (l); | 0,1 | = | conversion for both newtons/m2 to millibars and m3 to litres. | Equation [4] should be used for the normal incubation temperature of 35 °C (308 K): | mh = 0,468(Δp·Vh ) | Equation [4] | Note: Alternative volume calculation. Pressure meter readings are converted to ml of gas produced using the standard curve generated by plotting volume (ml) injected versus meter reading (Appendix 2). The number of moles (n) of gas in the headspace of each vessel is calculated by dividing the cumulative gas production (ml) by 25 286 ml/mole, which is the volume occupied by one mole of gas at 35 °C and standard atmospheric pressure. Since 1 mole of CH4 and 1 mole of CO2 each contain 12 g of carbon, the amount of carbon (mg) in the headspace (mh ) is given by Equation [5]: | mh = 12 × 103×n | Equation [5] | Rationalising to allow for blank control production of gas: | Equation [6] | where: | mh | = | mass of net carbon produced as gas in the headspace (mg); | ΔV | = | mean of the difference between volume of gas produced in headspace in the test vessels and blank control vessels; | 25 286 | = | volume occupied by 1 mole gas at 35 °C, 1 atmosphere. | 45. | The course of biodegradation can be followed by plotting the cumulated pressure increase Δp (millibars) against time, if appropriate. From this curve, identify and record the lag phase (days). The lag phase is the time from the start of the test until significant degradation starts (for example see Appendix 3). If intermediate samples of supernatant were taken and analysed (see paragraphs 40, 46 and 47), then the total C produced (in gas plus that in liquid) may be plotted instead of only the cumulative pressure. | Carbon in the liquid | 46. | The amount of methane in the liquid is ignored since its solubility in water is known to be very low. Calculate the mass of inorganic carbon in the liquid of the test vessels using equation [7]: | ml =Cnet ×Vl | Equation [7] | where: | ml | = | mass of inorganic carbon in the liquid (mg); | Cnet | = | concentration of inorganic carbon in the test vessels minus that in the control vessels at the end of the test (mg/l); | Vl | = | volume of liquid in the vessel (l). | Total gasified carbon | 47. | Calculate the total mass of gasified carbon in the vessel using equation [8]: | mt =mh +ml | Equation [8] | where: | | mt = total mass of gasified carbon (mg); | | mh and ml are as defined above. | Carbon of test substance | 48. | Calculate the mass of carbon in the test vessels derived from the added test substance using equation [9]: | mv =Cc ×Vl | Equation [9] | where: | mv | = | mass of test substance carbon (mg); | Cc | = | concentration of test substance carbon in the test vessel (mg/l) | Vl | = | volume of liquid in the test vessel (l). | Extent of biodegradation | 49. | Calculate the percentage biodegradation from headspace gas using equation [10] and the total percentage biodegradation using equation [11]: | Dh = (mh /mv ) × 100 | Equation [10] | Dt = (mt /mv ) × 100 | Equation [11] | where: | | Dh = biodegradation from headspace gas (%); | | Dt = total biodegradation (%); | | mh , mv and mt are as defined above. | The degree of primary biodegradation is calculated from the (optional) measurements of the concentration of the test substance at the beginning and end of incubation, using equation [12]: | Dp = (1 –Se /Si ) × 100 | Equation [12] | where: | Dp | = | primary degradation of test substance (%); | Si | = | initial concentration of test substance (mg/l); | Se | = | concentration of test substance at end (mg/l). | If the method of analysis indicates significant concentrations of the test substance in the unamended anaerobic sludge inoculum, use equation [13]: | Dp 1 = [1 – (Se –Seb )/(Si –Sib )] × 100 | Equation [13] | where: | Dp 1 | = | corrected primary degradation of test substance (%); | Sib | = | initial “apparent” concentration of test substance in blank controls (mg/l); | Seb | = | “apparent” concentration of test substance in blank controls at end (mg/l). | Validity of results | 50. | Pressure readings should be used only from vessels that do not show pink coloration (see paragraph 33). Contamination by oxygen is minimised by the use of proper anaerobic handling techniques. | 51. | It should be considered that the test is valid if the reference substance reaches a plateau that represents more than 60 % biodegradation (30). | 52. | If the pH at the end of the test has exceeded the range 7 ± 1 and insufficient biodegradation has taken place, repeat the test with increased buffer capacity of the medium. | Inhibition of degradation | 53. | Gas production in vessels containing both the test substance and reference substance should be at least equal to that in the vessels containing only reference substance; otherwise, inhibition of gas production is indicated. In some cases gas production in vessels containing test substance without reference substance will be lower than that in the blank controls, indicating that the test substance is inhibitory. | Test report | 54. | The test report must include the following information: | | Test substance: | — | common name, chemical name, CAS number, structural formula and relevant physical-chemical properties; | — | purity (impurities) of test substance. | | Test conditions: | — | volumes of diluted digester liquor (Vl ) and of the headspace (Vh ) in the vessel; | — | description of the test vessels, the main characteristics of biogas measurement (e.g. type of pressure meter) and of the IC analyser; | — | application of test substance and reference substance to test system: test concentration used and any use of solvents; | — | details of the inoculum used: name of sewage treatment plant, description of the source of waste water treated (e.g. operating temperature, sludge retention time, predominantly domestic, etc.), concentration, any information necessary to substantiate this and information on any pre-treatment of the inoculum (e.g. pre-digestion, pre-exposure); | — | incubation temperature; | — | number of replicates. | | Results: | — | pH and IC values at the end of the test; | — | concentration of test substance at the beginning and end of the test, if a specific measurement has been performed; | — | all the measured data collected in the test, blank, reference substance and inhibition control vessels, as appropriate (e.g. pressure in millibars, concentration of inorganic carbon (mg/l)) in tabular form (measured data for headspace and liquid should be reported separately); | — | statistical treatment of data, test duration and a diagram of the biodegradation of test substance, reference substance and inhibition control; | — | percentage biodegradation of test substance and reference substance; | — | reasons for any rejection of the test results; | — | discussion of results. | LITERATURE | (1) | The following chapters of this Annex: | | C.4, Determination of Ready Biodegradability; | | C.9, Biodegradation — Zahn-Wellens Test; | | C.10, Simulation Test — Aerobic Sewage Treatment: | A: Activated Sludge Units, B: Biofilms | | C.11, Biodegradation — Activated sludge respiration inhibition | (2) | OECD (2009) Inherent Biodegradability: Modified MITI Test (II), OECD Guideline for Testing of Chemicals, No. 302C, OECD, Paris | (3) | Birch, R. R., Biver, C., Campagna, R., Gledhill, W.E., Pagga,U., Steber, J., Reust, H. and Bontinck, W.J. (1989) Screening of chemicals for anaerobic biodegradation. Chemosphere 19, 1527-1550. (Also published as ECETOC Technical Report No. 28, June 1988). | (4) | Shelton D.R. and Tiedje, J.M. (1984) General method for determining anaerobic biodegradation potential. Appl. Environ. Mircobiology, 47, 850-857. | (5) | Owen, W.F., Stuckey, DC., Healy J.B., Jr, Young L.Y. and McCarty, P.L. (1979) Bioassay for monitoring biochemical methane potential and anaerobic toxicity. Water Res. 13, 485-492. | (6) | Healy, J.B.Jr. and Young, L.Y. (1979) Anaerobic biodegradation of eleven aromatic compounds to methane. Appl. Environ. Microbiol. 38, 84-89. | (7) | Gledhill, W.E. (1979) Proposed standard practice for the determination of the anaerobic biodegradation of organic chemicals. Working document. Draft 2 no.35.24. American Society for Testing Materials, Philadelphia. | (8) | Battersby, N.S. and Wilson, V. (1988) Evaluation of a serum bottle technique for assessing the anaerobic biodegradability of organic chemicals under methanogenic conditions. Chemosphere, 17, 2441-2460. | (9) | E1192-92. Standard Test Method for Determining the Anaerobic Biodegradation Potential of Organic Chemicals. ASTM, Philadelphia. | (10) | US-EPA (1998) Fate, Transport and Transformation Test Guidelines OPPTS 835.3400 Anaerobic Biodegradability of Organic Chemicals. | (11) | International Organization for Standardization (1995) ISO 11 734 Water Quality — Evaluation of the ultimate anaerobic biodegradation of organic compounds in digested sludge — Method by measurement of the biogas production. | (12) | International Organization for Standardization (2003) ISO 13 641-1 Water Quality — Determination of inhibition of gas production of anaerobic bacteria — Part 1 General Test. | (13) | International Organization for Standardization (1995) ISO 10 634 Water Quality — Guidance for the preparation and treatment of poorly water-soluble organic compounds for the subsequent evaluation of their biodegradability in an aqueous medium. | (14) | Pagga, U. and Beimborn, D.B., (1993) Anaerobic biodegradation test for organic compounds. Chemosphere, 27, 1499-1509. | (15) | International Organization for Standardization (1997) ISO 11 923 Water Quality — Determination of suspended solids by filtration through glass-fibre filters. | Appendix 1 | Example of an apparatus to measure biogas production by gas pressure | Key: | 1 | — | Pressure meter | 2 | — | 3-way gas-tight valve | 3 | — | Syringe needle | 4 | — | Gastight seal (crimp cap and septum) | 5 | — | Head space (Vh ) | 6 | — | Digested sludge inoculum (Vl ) | Test vessels in an environment of 35 °C ± 2 °C | Appendix 2 | Conversion of the pressure-meter | The pressure-meter readings may be related to gas volumes by means of a standard curve produced by injecting known volumes of air at 35 °C ± 2 °C into serum bottles containing a volume of water equal to that of the reaction mixture, V R: | — | Dispense V R ml aliquots of water, kept at 35 °C ± 2 °C into five serum bottles. Seal the bottles and place in a water bath at 35 °C for 1 hour to equilibrate; | — | Switch on the pressure-meter, allow to stabilise, and adjust to zero; | — | Insert the syringe needle through the seal of one of the bottles, open the valve until the pressure meter reads zero and close the valve; | — | Repeat the procedure with the remaining bottles; | — | Inject 1 ml of air at 35 °C ± 2 °C into each bottle. Insert the needle (on the meter) through the seal of one of the bottles and allow the pressure reading to stabilise. Record the pressure, open the valve until the pressure reads zero and then close the valve; | — | Repeat the procedure for the remaining bottles; | — | Repeat the total procedure above using 2 ml, 3 ml, 4 ml, 5 ml, 6 ml, 8 ml, 10 ml, 12 ml, 16 ml, 20 ml and 50 ml of air; | — | Plot a conversion curve of pressure (Pa) against gas volume injected Vb (ml). The response of the instrument is linear over the range 0 Pa to 70 000 Pa, and 0 ml to 50 ml of gas production. | Appendix 3 | Example of a degradation curve (cumulative net pressure increase) | Gas pressure (m bar) | Time (days) | Plateau | Lag phase | 60 | 50 | 40 | 30 | 20 | 10 | 0 | 0 | 100 | 200 | 300 | 400 | 500 | Appendix 4 | Example of data sheets for the anaerobic biodegradation test — Data sheet for the test substance | Laboratory: … | Test substance: … | Test No.: … | Test temperature: (°C): … | Volume of headspace (Vh ): …(l) | Volume of liquid (Vl ): …(l) | Carbon in test substance Cc,v : …(mg/l) | mv (31): …(mg) | | Day | p 1 (test) | (mbar) | p 2 (test) | (mbar) | p 3 (test) | (mbar) | p (test) | mean | (mbar) | p 4 (blank) | (mbar) | p 5 (blank) | (mbar) | p 6 (blank) | (mbar) | p (blank) | mean | (mbar) | p (net) | test — blank | mean (mbar) | Δp (net) | Cumulative | (mbar) | mh | headspace C (32) | (mg) | Dh | Biodegradation (33) | (%) | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | C IC, 1 | test | (mg) | C IC, 2 | test | (mg) | C IC, 3 | test | (mg) | C IC | test mean | (mg) | C IC, 4 | blank | (mg) | C IC, 5 | blank | (mg) | C IC, 6 | blank | (mg) | C IC | blank mean | (mg) | C IC, net | test -blank | mean | (mg) | m l | liquid C (34) | (mg) | m t | total C (35) | (mg) | D t | Biodegradation (36) | (%) | IC (end) | | | | | | | | | | | | | pH (end) | | | | | | | | | | | | | Laboratory: … | Reference substance: … | Test No.: … | Test temperature: (°C): … | Volume of headspace (Vh ): …(l) | Volume of liquid (Vl ) (litres): … | Carbon in reference substance C c,v (mg/l): … | mv (37) (mg): | | Day | p 1 (ref.) | (mbar) | p 2 (ref.) | (mbar) | p 3 (ref.) | (mbar) | p (ref.) | mean | (mbar) | p 4 (inhib.) | (mbar) | p 5 (inhib.) | (mbar) | p 6 (inhib.) | (mbar) | p (inhib.) | mean | (mbar) | p (ref.) | ref. — blank | (mbar) | Δp (ref.) | cumulative | (mbar) | m h | headspace C (38) | (mg) | D h | Biodegradation (39) | (%) | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | C IC, 1 | ref. | (mg) | C IC, 2 | ref. | (mg) | C IC, 3 | ref. | (mg) | C IC | ref. mean | (mg) | C IC, 4 | inhib. | (mg) | C IC, 5 | inhib. | (mg) | C IC, 6 | inhib. | (mg) | C IC | inhib. mean | (mg) | C IC, net | ref. — inhib. | (mg) | m l | liquid C (40) | (mg) | m t | total C (41) | (mg) | D t | Biodegradation (42) | (%) | IC (end) | | | | | | | | | | | | | pH (end) | | | | | | | | | | | | | C.44. LEACHING IN SOIL COLUMNS | INTRODUCTION | 1. | This test method is equivalent to OECD Test Guideline (TG) 312 (2004). Man-made chemicals may reach soil directly via deliberate application (e.g. agrochemicals) or via indirect routes (e.g. via waste water → sewage sludge → soil or air → wet/dry deposition). For risk assessment of these chemicals, it is important to estimate their potential for transformation in soil and for movement (leaching) into deeper soil layers and eventually into groundwater. | 2. | Several methods are available to measure the leaching potential of chemicals in soil under controlled laboratory conditions, i.e. soil thin-layer chromatography, soil thick-layer chromatography, soil column chromatography, and adsorption — desorption measurements (1)(2). For non-ionised chemicals, the n-octanol-water partition coefficient (Pow) allows an early estimation of their adsorption and leaching potential (3)(4)(5). | 3. | The method described in this test method is based on soil column chromatography in disturbed soil (see Appendix 1 for definition). Two types of experiments are performed to determine (i) the leaching potential of the test chemical, and (ii) the leaching potential of transformation products (study with aged residues) in soils under controlled laboratory conditions (43). The test method is based on existing methods (6)(7)(8)(9)(10)(11). | 4. | An OECD Workshop on soil/sediment selection, held at Belgirate, Italy in 1995 (12) agreed on the number and type of soils for use in this test method. It also made recommendations with regard to collection, handling and storage of soil samples for leaching experiments. | PRINCIPLE OF THE TEST METHOD | 5. | Columns made of suitably inert material (e.g. glass, stainless steel, aluminium, teflon, PVC, etc.) are packed with soil and afterwards saturated and equilibrated with an “artificial rain” solution (for definition see Appendix 1) and allowed to drain. Then the surface of each soil column is treated with the test chemical and/or with aged residues of the test chemical. Artificial rain is then applied to the soil columns and the leachate is collected. After the leaching process the soil is removed from the columns and is sectioned into an appropriate number of segments depending on the information required from the study. Each soil segment and the leachate are then analysed for the test chemical and, if appropriate, for transformation products or other chemicals of interest. | APPLICABILITY OF THE TEST METHOD | 6. | The test method is applicable to test chemicals (unlabelled or radio-labelled: e.g. 14C) for which an analytical method with sufficient accuracy and sensitivity is available. The test method should not be applied to chemicals which are volatile from soil and water and thus do not remain in soil and/or leachate under the experimental conditions of this test method. | INFORMATION ON THE TEST CHEMICAL | 7. | Unlabelled or radio-labelled test chemicals can be used to measure the leaching behaviour in soil columns. Radio-labelled material is required for studying the leaching of transformation products (aged residues of the test chemical) and for mass balance determinations. 14C-labelling is recommended but other isotopes, such as 13C, 15N, 3H, 32P, may also be useful. As far as possible, the label should be positioned in the most stable part(s) of the molecule. The purity of the test chemical should be at least 95 %. | 8. | Most chemicals should be applied as single substance However, for active substances in plant protection products, formulated products may be used to study the leaching of the parent test substance but their testing is particularly required when the mixture is likely to affect the release rate (e.g. granular or controlled release formulations). Regarding mixture specific requirements for test design, it may be useful to consult with the regulatory authority prior to conducting the test. For aged residue leaching studies, the pure parent test substance should be used. | 9. | Before carrying out leaching tests in soil columns, the following information on the test chemical should preferably be available: | (1) | solubility in water [test method A.6] (13); | (2) | solubility in organic solvents; | (3) | vapour pressure [test method A.4] (13) and Henry's Law constant; | (4) | n-octanol/water partition coefficient [test methods A.8 and A.24] (13); | (5) | adsorption coefficient (Kd, Kf or KOC) [test methods C.18 and/or C.19] (13); | (6) | hydrolysis [test method C.7] (13); | (7) | dissociation constant (pKa) [OECD TG 112] (25); | (8) | aerobic and anaerobic transformation in soil [test method C.23] (13) | Note: The temperature at which these measurements were made should be reported in the respective test reports. | 10. | The amount of test chemical applied to the soil columns should be sufficient to allow for detection of at least 0,5 % of the applied dose in any single segment. For active chemicals in plant protection products, the amount of test chemical applied may correspond to the maximum recommended use rate (single application). | 11. | An appropriate analytical method of known accuracy, precision and sensitivity for the quantification of the test chemical and, if relevant, of its transformation products in soil and leachate must be available. The analytical detection limit for the test chemical and its significant transformation products (normally at least all transformation products ≥ 10 % of applied dose observed in transformation pathway studies, but preferably any relevant transformation products of concern) should also be known (see paragraph 17). | REFERENCE CHEMICALS | 12. | Reference chemicals with known leaching behaviour such as atrazine or monuron which can be considered moderate leachers in the field should be used for evaluating the relative mobility of the test chemical in soil (1)(8)(11). A nonsorbing and non degradable polar reference chemical (e.g. tritium, bromide, fluorescein, eosin) to trace the movement of water in the column may also be useful to confirm the hydrodynamic properties of the soil column. | 13. | Analytical standard chemicals may also be useful for the characterisation and/or identification of transformation products found in the soil segments and in the leachates by chromatographic, spectroscopic or other relevant methods. | DEFINITIONS AND UNITS | 14. | See Appendix 1. | QUALITY CRITERIA | Recovery | 15. | The sum of the percentages of the test chemical found in the soil segments and the column leachate after leaching gives the recovery for a leaching experiment. Recoveries should range from 90 % to 110 % for radio-labelled chemicals (11) and from 70 % to 110 % for non-labelled chemicals (8). | Repeatability and sensitivity of analytical method | 16. | Repeatability of the analytical method to quantify test chemical and transformation products can be checked by duplicate analysis of the same extract of a soil segment or of a leachate (see paragraph 11). | 17. | The limit of detection (LOD) of the analytical method for the test chemical and for the transformation products should be at least 0,01 mg · kg- 1 in each soil segment or leachate (as test chemical) or 0,5 % of applied dose in any single segment whichever is lower. The limit of quantification (LOQ) should also be specified. | DESCRIPTION OF THE TEST METHOD | Test system | 18. | Leaching columns (sectionable or non-sectionable) made of suitably inert material (e.g. glass, stainless steel, aluminium, teflon, PVC, etc.) with an inner diameter of at least 4 cm and a minimum height of 35 cm are used for the test. Column materials should be tested for potential interactions with the test chemical and/or its transformation products. Examples of suitable sectionable and non-sectionable columns are shown in Appendix 2. | 19. | Spoon, plunger and vibration apparatus are used for filling and packing the soil columns. | 20. | For application of artificial rain to the soil columns, piston or peristaltic pumps, showering heads, Mariotte bottles or simple dropping funnels can be used. | Laboratory equipment and chemicals | 21. | Standard laboratory equipment is required, in particular the following: | (1) | analytical instruments such as GLC, HPLC and TLC equipment, including the appropriate detection systems for analysing labelled or unlabelled chemicals or inverse isotope dilution method; | (2) | instruments for identification purposes (e.g. MS, GC-MS, HPLC-MS, NMR, etc.); | (3) | liquid scintillation counter for radio-labelled test chemical; | (4) | oxidiser for combustion of labelled material; | (5) | extraction apparatus (for example, centrifuge tubes for cold extraction and Soxhlet apparatus for continuous extraction under reflux); | (6) | instrumentation for concentrating solutions and extracts (e.g. rotating evaporator). | 22. | Chemicals used include: organic solvents, analytical grade, such as acetone, methanol, etc.; scintillation liquid; 0,01 M CaCl2 solution in distilled or deionised water (= artificial rain). | Test chemical | 23. | To apply the test chemical to the soil column it should be dissolved in water (deionised or distilled). If the test chemical is poorly soluble in water, it can be applied either as formulated product (if necessary after suspending or emulsifying in water) or in any organic solvent. In case an organic solvent is used, it should be kept to a minimum and should be evaporated from the surface of the soil column prior to start of leaching procedure. Solid formulations, such as granules, should be applied in the solid form without water; to allow a better distribution over the surface of the soil column, the formulated product may be mixed with a small amount of quartz sand (e.g. 1 g) before application. | 24. | The amount of test chemical applied to the soil columns should be sufficient to allow for detection of at least 0,5 % of the applied dose in any single segment. For active chemicals in plant protection products, this may be based on the maximum recommended use rate (single application rate) and, for both parent and aged leaching, should be related to the surface area of the soil column used (44). | Reference chemical | 25. | A reference chemical should be used in the leaching experiments (see paragraph 12). It should be applied to the soil column surface in a similar way as the test chemical and at an appropriate rate that enables adequate detection either as an internal standard together with the test chemical on the same soil column or alone on a separate soil column. It is preferred that both chemicals be run on the same column, except when both chemicals are similarly labelled. | Soils | Soil selection | 26. | For leaching studies with the parent test chemical 3 to 4 soils with varying pH, organic carbon content and texture should be used (12). Guidance for selection of soils for leaching experiments is given in Table 1 below. For ionisable test chemicals the selected soils should cover a wide range of pH, in order to evaluate the mobility of the chemical in its ionised and unionised forms; at least 3 soils should have a pH at which the test chemical is in its mobile form. | Table 1 | Guidance for selection of soils for leaching studies | Soil No. | pH value | Organic carbon | % | Clay content | % | Texture (*11) | 1 | > 7,5 | 3,5 - 5,0 | 20 - 40 | clay loam | 2 | 5,5 - 7,0 | 1,5 - 3,0 | 15 - 25 | silt loam | 3 | 4,0 - 5,5 | 3,0 - 4,0 | 15 - 30 | loam | 4 | < 4,0 - 6,0 (1) | < 0,5 - 1,5 (1) (2) | < 10 - 15 (1) | loamy sand | 5 | < 4,5 | > 10 (3) | < 10 | loamy sand/sand | 27. | Other soil types may sometimes be necessary to represent cooler, temperate and tropical regions. Therefore, if other soil types are preferred, they should be characterised by the same parameters and should have similar variations in properties as those described in the guidance for selection of soils for leaching studies (see Table 1 above), even if they do not match the criteria exactly. | 28. | For leaching studies with “aged residues”, one soil should be used (12). It should have a sand content > 70 % and an organic carbon content between 0,5 - 1,5 % (e.g. soil No. 4 in Table 1). Use of more soil types may be necessary if data on the transformation products are important. | 29. | All soils should be characterised at least for texture [% sand, % silt, % clay according to FAO and USDA classification systems (14)], pH, cation exchange capacity, organic carbon content, bulk density (for disturbed soil) and water holding capacity. Measurement of microbial biomass is only required for the soil which is used in the ageing/incubation period carried out before the aged leaching experiment. Information on additional soil properties (e.g. soil classification, clay mineralogy, specific surface area) may be helpful for interpreting the results of this study. For determination of soil characteristics the methods recommended in references (15)(16)(17)(18)(19) can be used. | Collection and storage of soils | 30. | The soils should be taken from the top layer (A-horizon) to a maximum depth of 20 cm. Remains of vegetation, macro-fauna and stones should be removed. The soils (except those used for ageing the test chemical) are air-dried at room temperature (preferably between 20-25 C). Disaggregation should be performed with minimal force, so that the original texture of the soil will be changed as little as possible. The soils are sieved through a ≤ 2 mm sieve. Careful homogenisation is recommended, as this enhances the reproducibility of the results. Before use the soils can be stored at ambient temperature and kept air dried (12). No limit on storage time is recommended but soils stored for more than 3 years should be re-analysed prior to use with respect to their organic carbon content and pH. | 31. | Detailed information on the history of the field sites from where the test soils are collected should be available. Details include exact location [exactly defined by UTM (Universal Transversal Mercator-Projection/European Horizontal Datum) or geographical co-ordinates], vegetation cover, treatments with crop protection chemicals, treatments with organic and inorganic fertilisers, additions of biological materials or accidental contamination (12). If soil has been treated with the test chemical or its structural analogues within the previous four years, these soils should not be used for leaching studies. | Test conditions | 32. | During the test period, the soil leaching columns should be kept in the dark at ambient temperature as long as this temperature is maintained within a range of ± 2 °C. Recommended temperatures are between 18 and 25 °C. | 33. | Artificial rain (0,01 M CaCl2) should be applied continuously to the surface of the soil columns at a rate of 200 mm over a period of 48 hours (45); this rate is equivalent to an application of 251 ml for a column with an inner diameter of 4 cm. If needed for the purpose of the test, other rates of artificial rainfall and longer duration may additionally be used. | Performance of the test | Leaching with parent test chemical | 34. | At least duplicate leaching columns are packed with untreated, air-dried and sieved soil (< 2 mm) up to a height of approximately 30 cm. To obtain uniform packing, the soil is added to the columns in small portions with a spoon and pressed with a plunger under simultaneous gentle column vibration until the top of the soil column does not sink in further. Uniform packing is required for obtaining reproducible results from leaching columns. For details on column packing techniques, see references (20) (21) and (22). To control the reproducibility of the packing procedure, the total weight of the soil packed in the columns is determined (46); the weights of the duplicate columns should be similar. | 35. | After packing, the soil columns are pre-wetted with artificial rain (0,01 M CaCl2) from bottom to top in order to displace the air in the soil pores by water. Thereafter the soil columns are allowed to equilibrate and the excess water is drained off by gravity. Methods for column saturation are reviewed in reference (23). | 36. | Then the test chemical and/or the reference chemical are applied to the soil columns (see also paragraphs 23-25). To obtain a homogeneous distribution the solutions, suspensions or emulsions of the test and/or reference chemical should be applied evenly over the surface of the soil columns. If incorporation into soil is recommended for the application of a test chemical, it should be mixed in a small amount (e.g. 20 g) of soil and added to the surface of the soil column. | 37. | The surfaces of the soil columns are then covered by a glass sinter disk, glass pearls, glass fibre filters or a round filter paper to distribute the artificial rain evenly over the entire surface and to avoid disturbance of the soil surface by the rain drops. The larger the column diameter the more care is needed for the application of the artificial rain to the soil columns to ensure an even distribution of the artificial rain over the soil surface. Then the artificial rainfall is added to the soil columns drop-wise with the aid of a piston or a peristaltic pump or a dropping funnel. Preferably, the leachates should be collected in fractions and their respective volumes are recorded (47). | 38. | After leaching and allowing the columns to drain, the soil columns are sectioned in an appropriate number of segments depending on the information required from the study, the segments are extracted with appropriate solvents or solvent mixtures and analysed for the test chemical and, when appropriate, for transformation products, for total radioactivity and for the reference chemical. The leachates or leachate fractions are analysed directly or after extraction for the same products. When radio-labelled test chemical is used, all fractions containing ≥ 10 % of the applied radioactivity should be identified. | Leaching with aged residues | 39. | Fresh soil (not previously air-dried) is treated at a rate corresponding to the surface area of the soil columns (see paragraph 24) with the radio-labelled test chemical and incubated under aerobic conditions according to Test Method C.23 (13). The incubation (ageing) period should be long enough to produce significant amounts of transformation products; an ageing period of one half-life of the test chemical is recommended (48), but should not exceed 120 days. Prior to leaching, the aged soil is analysed for the test chemical and its transformation products. | 40. | The leaching columns are packed up to a height of 28 cm with the same soil (but air-dried) as used in the ageing experiment as described in paragraph 34 and the total weight of the packed soil columns is also determined. The soil columns are then pre-wetted as described in paragraph 35. | 41. | Then the test chemical and its transformation products are applied to the surface of the soil columns in the form of aged soil residues (see paragraph 39) as a 2 cm soil segment. The total height of the soil columns (untreated soil + aged soil) should preferably not exceed 30 cm (see paragraph 34). | 42. | The leaching is carried out as described in paragraph 37. | 43. | After leaching, soil segments and leachates are analysed as indicated in paragraph 38 for the test chemical, its transformation products and not-extracted radioactivity. To determine how much of the aged residue is retained in the top 2-cm layer after leaching, this segment should be analysed separately. | DATA AND REPORTING | Treatment of results | 44. | The amounts of test chemical, transformation products, non-extractables and, if included, of the reference chemical should be given in % of applied initial dose for each soil segment and leachate fraction. A graphical presentation should be given for each column plotting the percentages found as a function of the soil depths. | 45. | When a reference chemical is included in these column leaching studies, the leaching of a chemical can be evaluated on a relative scale using relative mobility factors (RMF; for definition see Appendix 3) (1)(11) which allows the comparison of leaching data of various chemicals obtained with different soil types. Examples of RMF-values for a variety of crop protection chemicals are given in Appendix 3. | 46. | Estimates of Koc (organic carbon normalised adsorption coefficient) and Kom (organic matter normalised distribution coefficient) can also be obtained from column leaching results by using average leaching distance or established correlations between RMF and Kom respectively Koc (4) or by applying simple chromatographic theory (24). However, the latter method should be used with caution especially when considering that the leaching process does not solely involve saturated flow conditions, but rather unsaturated systems. | Interpretation of results | 47. | The column leaching studies described in this method allow determining the leaching or mobility potential in soil of the test chemical (in the parent leaching study) and/or its transformation products (in the aged residue leaching study). These tests do not quantitatively predict leaching behaviour under field conditions, but they can be used to compare the “leachability” of one chemical with others whose leaching behaviour may be known (24). Likewise, they do not quantitatively measure the percentage of applied chemical that might reach ground water (11). However, the results of column leaching studies may assist in deciding whether additional semi-field or field testing has to be carried out for chemicals showing a high mobility potential in laboratory tests. | Test report | 48. | The report must include: | | Test chemical and reference chemical (when used): | — | common name, chemical name (IUPAC and CAS nomenclature), CAS number, chemical structure (indicating position of label when radio-labelled material is used) and relevant physical-chemical properties; | — | purities (impurities) of test chemical; | — | radiochemical purity of labelled chemical and specific activity (where appropriate). | | Test soils: | — | details of collection site; | — | properties of soils, such as pH, organic carbon and clay content, texture and bulk density (for disturbed soil); | — | soil microbial activity (only for soil used for ageing of test chemical); | — | length of soil storage and storage conditions. | | Test conditions: | — | dates of the performance of the studies; | — | length and diameter of leaching columns; | — | total soil weight of soil columns; | — | amount of test chemical and, if appropriate, reference chemical applied; | — | amount, frequency and duration of application of artificial rain; | — | temperature of experimental set-up; | — | number of replications (at least two); | — | methods for analysis of test chemical, transformation products and, where appropriate, of reference chemical in the various soil segments and leachates; | — | methods for the characterisation and identification of transformation products in the soil segments and leachates. | | Test results: | — | tables of results expressed as concentrations and as % of applied dose for soil segments and leachates; | — | mass balance, if appropriate; | — | leachate volumes; | — | leaching distances and, where appropriate, relative mobility factors; | — | graphical plot of % found in the soil segments versus depth of soil segment; | — | discussion and interpretation of results. | LITERATURE | (1) | Guth, J.A., Burkhard, N. and Eberle, D.O. (1976). Experimental Models for Studying the Persistence of Pesticides in Soil. Proc. BCPC Symposium: Persistence of Insecticides and Herbicides. | (2) | Russel, M.H. (1995). Recommended approaches to assess pesticide mobility in soil. In progress in Pesticide Biochemistry and Toxicology, Vol. 9 (Environmental Behaviour of Agrochemicals — T.R. Roberts and P.C. Kearney, Eds.). J. Wiley & Sons. | (3) | Briggs, G.G. (1981). Theoretical and experimental relationships between soil adsorption, octanol-water partition coefficient, water solubilities, bioconcentration factors, and the parachor. J.Agric. Food Chem. 29, 1050-1059. | (4) | Chiou, C.T., Porter, P.E. and Schmedding, D.W. (1983). Partition equilibria of non-ionic organic compounds between soil organic matter and water. Environ. Sci. Technol. 17, 227-231. | (5) | Guth, J.A. (1983). Untersuchungen zum Verhalten von Pflanzenschutzmitteln im Boden. Bull. Bodenkundliche Gesellschaft Schweiz 7, 26-33. | (6) | US-Environmental Protection Agency (1982). Pesticide Assessment Guidelines, Subdivision N. Chemistry: Environmental Fate. | (7) | Agriculture Canada (1987). Environmental Chemistry and Fate Guidelines for registration of pesticides in Canada. | (8) | Annex I to Commission Directive 95/36/EC of 14 July 1995 amending Council Directive 91/414/EEC concerning the placing of plant protection products on the market, OJ L 172, 22.7.1995, p. 8. | (9) | Dutch Commission for Registration of Pesticides (1991). Application for registration of a pesticide. Section G: Behaviour of the product and its metabolites in soil, water and air. | (10) | BBA (1986). Richtlinie für die amtliche Prüfung von Pflanzenschutzmitteln, Teil IV, 4-2. Versickerungsverhalten von Pflanzenschutzmitteln. | (11) | SETAC (1995). Procedures for Assessing the Environmental Fate and Ecotoxicity of Pesticides. Mark R. Lynch, Ed. | (12) | OECD (1995). Final Report of the OECD Workshop on Selection of Soils/Sediments. Belgirate, Italy, 18-20 January 1995. | (13) | The following chapters of this Annex: | | Chapter A.4, vapour pressure | | Chapter A.6, Water solubility | | Chapter A.8, Partition coefficient, shake flask method | | Chapter A.24, Partition coefficient, HPLC method | | Chapter C.7, degradation — abiotic degradation: hydrolysis as a function of pH | | Chapter C.18, Adsorption/desorption using a batch equilibrium method | | Chapter C.23, Aerobic and anaerobic transformation in soil | (14) | Soil Texture Classification (US and FAO systems). Weed Science, 33, Suppl. 1 (1985) and Soil Sci. Soc. Amer. Proc. 26, 305 (1962). | (15) | Methods of Soil Analysis (1986). Part 1, Physical and Mineralogical Methods (A. Klute, Ed.). Agronomy Series No. 9, 2nd Edition. | (16) | Methods of Soil Analysis (1982). Part 2, Chemical and Microbiological Properties (A.L. Page, R.H. Miller and D.R. Kelney, Eds.). Agronomy Series No. 9, 2nd Edition. | (17) | ISO Standard Compendium Environment (1994). Soil Quality — General aspects; chemical and physical methods of analysis; biological methods of analysis. First Edition. | (18) | Mückenhausen, E. (1975). Die Bodenkunde und ihre geologischen, geomorphologischen, mineralogischen und petrologischen Grundlagen. DLG-Verlag, Frankfurt/Main. | (19) | Scheffer, F. and Schachtschabel, P. (1998). Lehrbuch der Bodenkunde. F. Enke Verlag, Stuttgart. | (20) | Weber, J.B. and Peeper, T.F. (1977). In Research Methods in Weed Science, 2nd Edition (B. Truelove, Ed.). Soc. Weed Sci., Auburn, Alabama, 73-78. | (21) | Weber, J.B., Swain, L.R., Strek, H.J. and Sartori, J.L. (1986). In Research Methods in Weed Science, 3rd Edition (N.D. Camper, Ed.). Soc. Weed Sci., Champaign, IL, 190-200. | (22) | Oliveira, et al. (1996). Packing of sands for the production of homogeneous porous media. Soil Sci. Soc. Amer. J. 60(1): 49-53. | (23) | Shackelford, C. D. (1991). Laboratory diffusion testing for waste disposal. — A review. J. Contam. Hydrol. 7, 177-217. | (24) | (Hamaker, J.W. (1975). Interpretation of soil leaching experiments. In Environmental Dynamics of Pesticides (R. Haque, V.H. Freed, Eds), 115-133. Plenum Press, New York. | (25) | OECD (1981). Dissociation constants in water. OECD Guideline for Testing of Chemicals, No. 4112, OECD, Paris | Appendix 1 | Definitions and units | Aged soil residue : Test chemical and transformation products present in soil after application and following a period long enough to allow transport, adsorption, metabolism, and dissipation processes to alter the distribution and chemical nature of some of the applied chemical (1). | Artificial rain : 0,01 M CaCl2 solution in distilled or deionised water. | Average Leaching Distance : Bottom of soil section where cumulative recovered chemical = 50 % of total recovered test chemical [normal leaching experiment], or; (bottom of soil section where cumulative recovered chemical = 50 % of total recovered test chemical) — ((thickness of aged residue layer)/2) [aged residue leaching study] | Chemical : a substance or a mixture. | Leachate : Aqueous phase percolated through a soil profile or a soil column (1). | Leaching : Process by which a chemical moves downward through the soil profile or a soil column (1). | Leaching distance : Deepest soil segment in which ≥ 0,5 % of the applied test chemical or aged residue was found after the leaching process (equivalent to penetration depth). | Limit of detection (LOD) and limit of quantification (LOQ) : The limit of detection (LOD) is the concentration of a chemical below which the identity of the chemical cannot be distinguished from analytical artefacts. The limit of quantification (LOQ) is the concentration of a chemical below which the concentration cannot be determined with an acceptable accuracy. | RMF Relative Mobility Factor : (leaching distance of test chemical (cm))/(leaching distance of reference chemical (cm)) | Test chemical : Any substance or mixture tested using this test method. | Transformation product : All chemicals resulting from biotic or abiotic transformation reactions of the test chemical including CO2 and products that are bound in residues. | Soil : A mixture of mineral and organic chemical constituents, the latter containing compounds of high carbon and nitrogen content and of high molecular weights, populated by small (mostly micro-) organisms. Soil may be handled in two states: | — | undisturbed, as it has developed with time, in characteristic layers of a variety of soil types; | — | disturbed, as it is usually found in arable fields or as occurs when samples are taken by digging and used in this test method (2). | (1) | Holland, P.T. (1996). Glossary of Terms Relating to Pesticides. IUPAC Reports on Pesticide (36). Pure & Appl. Chem. 68, 1167-1193. | (2) | OECD Test Guideline 304 A: Inherent Biodegradability in Soil (adopted 12 May 1981). | Appendix 2 | Figure 1 | Example of non- sectionable leaching columns made of glass | With a length of 35 cm and an inner diameter of 5 cm (1) | ← Glass wool plug to keep the soil in the column | ← Layer of quartz sandsurface | ← Glass column filled with test soil (when testing photolabile products columns should be wrapped in aluminium foil) | ← Glass sinter disc to avoid disturbance of the soil surface and to evenly distribute the artificial rain | ← Dropping funnels for application of artificial rain | ← Round-bottom flask for collection of leachate; wrapped in aluminium foil to exclude photolysis | (1) | Drescher, N. (1985). Moderner Acker- und Pflanzenbau aus Sicht der Pflanzenschutzmittelindustrie. In Unser Boden — 70 Jahre Agrarforschung der BASF AG, 225-236. Verlag Wissenschaft und Politik, Köln. | Figure 2 | Example of a sectionable metal column with 4 cm inner diameter (1) | (1) | Burkhard, N., Eberle D.O. and Guth, J.A. (1975). Model systems for studying the environmental behaviour of pesticides. Environmental Quality and Safety, Suppl. Vol. III, 203-213. | Appendix 3 | Examples of Relative Mobility Factors (*12) (RMF) for a variety of Crop protection chemicals (1)(2) and corresponding mobility classes (4) | RMF-Range | Chemical (RMF) | Mobility Class | ≤ 0,15 | Parathion (< 0,15), Flurodifen (0,15) | I | immobile | 0,15 - 0,8 | Profenophos (0,18), Propiconazole (0,23), Diazinon (0,28), Diuron (0,38), Terbuthylazine (0,52), Methidathion (0,56), Prometryn (0,59), Propazine (0,64), Alachlor (0,66), Metolachlor (0,68) | II | slightly mobile | 0,8 - 1,3 | Monuron (*13) (1,00), Atrazine (1,03), Simazine (1,04), Fluometuron (1,18) | III | moderately mobile | 1,3 - 2,5 | Prometon (1,67), Cyanazine (1,85), Bromacil (1,91), Karbutilate (1,98) | IV | fairly mobile | 2,5 - 5,0 | Carbofuran (3,00), Dioxacarb (4,33) | V | mobile | > 5,0 | Monocrotophos (> 5,0), Dicrotophos (> 5,0) | VI | very mobile | (1) | Guth, J.A. (1985). Adsorption/desorption. In Joint International Symposium “Physicochemical Properties and their Role in Environmental Hazard Assessment”. Canterbury, UK, 1-3 July 1985. | (2) | Guth, J.A. and Hörmann, W.D. (1987). Problematik und Relevanz von Pflanzenschutzmittel-Spuren im Grund (Trink-) Wasser. Schr.Reihe Verein WaBoLu, 68, 91-106. | (3) | Harris, C.I. (1967). Movement of herbicides in soil. Weeds 15, 214-216. | (4) | Helling, C.S. (1971). Pesticide mobility in soils. Soil Sci. Soc. Am. Proc. 35, 743-748. | (5) | McCall, P.J., Laskowski, D.A., Swann, R.L. and Dishburger, H.J. (1981). Measurements of sorption coefficients of organic chemicals and their use in environmental fate analysis. In Test Protocols for Environmental Fate and Movement of Toxicants. Proceedings of AOAC Symposium, AOAC, Washington D.C. | (6) | Hollis, J.M. (1991). Mapping the vulnerability of aquifers and surface waters to pesticide contamination at the national/regional scale. BCPC Monograph No. 47 Pesticides in Soil and Water, 165-174. | C.45. ESTIMATION OF EMISSIONS FROM PRESERVATIVE — TREATED WOOD TO THE ENVIRONMENT: LABORATORY METHOD FOR WOODEN COMMODITIES THAT ARE NOT COVERED AND ARE IN CONTACT WITH FRESH WATER OR SEAWATER | INTRODUCTION | 1. | This test method is equivalent to OECD test guideline (TG) 313 (2007). The emissions from preservative-treated wood to the environment need to be quantified to enable an environmental risk assessment of the treated wood. This test method describes a laboratory method for the estimation of emissions from preservative-treated wood in two situations where emissions could enter the environment: | — | Emissions from treated wood in contact with fresh water. Emissions from the surface of the treated wood could enter the water. | — | Emissions from treated wood in contact with seawater. Emissions from the surface of the treated wood could enter the seawater. | 2. | This test method is intended for testing the emissions from wood and wooden commodities that are not covered and are in contact with fresh water or seawater. Use Classes are used internationally and categorise the biological hazard to which the treated commodity will be subjected. Use Classes also define the situation in which the treated commodity is used and determine the environmental compartments (air, water, soil) which are potentially at risk from the preservative treated wood. | 3. | The test method is a laboratory procedure for obtaining samples (emissate) from water used to immerse treated wood, at increasing time intervals after exposure. The quantity of emissions in the emissate is related to the surface area of the wood and the length of exposure, to estimate a flux in mg/m2/day. The flux (leaching rate) after increasing periods of exposure can thus be estimated. | 4. | The quantity of emissions can be used in an environmental risk assessment of the treated wood. | INITIAL CONSIDERATIONS | 5. | The mechanism of leaching at the wood surface by fresh water is not assumed to be identical in nature and severity to leaching from a wood surface by seawater. Thus, for wood preservative products or mixtures used to treat wood used in seawater environs, a wood leaching study for seawater is necessary. | 6. | The wood, in the case of wood treated with a wood preservative, should be representative of commercially used wood. It should be treated in accordance with the preservative manufacturer's instructions and in compliance with appropriate standards and specifications. The parameters for the post treatment conditioning of the wood prior to the commencement of the test should be stated. | 7. | The wood samples used should be representative of the commodities used (e.g., with regard to species, density and other characteristics). | 8. | The test can be applied to wood using a penetrating process or superficial application or to treated wood which has an additional mandatory surface treatment (e.g., paint that is applied as a requirement for commercial use). | 9. | The composition, amount, pH and the physical form of water is important in determining the quantity, content and nature of emissions from wood. | PRINCIPLE OF THE TEST METHOD | 10. | Preservative-treated wood test specimens are immersed in water. The water (emissate) is collected and chemically analysed multiple times over the exposure period sufficient to perform statistical calculations. Emission rates in mg/m2/day are calculated from analytical results. The sampling periods should be recorded. Tests with untreated samples can be discontinued if there is no background detected in the first three data points. | 11. | The inclusion of untreated wood specimens allows for the determination of background levels for emissates from wood other than the preservative used. | QUALITY CRITERIA | Accuracy | 12. | The accuracy of the test method to estimate emission depends upon the test specimens being representative of commercially treated wood, how representative the water is of real water and how the exposure regime is representative of natural conditions. | 13. | The accuracy, precision and repeatability of the analytical method should be determined before conducting the test. | Reproducibility | 14. | Three water samples are collected and analysed and the mean value is taken as the emission value. The reproducibility of the results within one laboratory and between different laboratories depends upon the immersion regime and the wood used as test specimens. | Acceptable Range of Results | 15. | A range of results from this test where the upper and lower values differ by less than one order of magnitude is acceptable. | TEST CONDITIONS | Water | 16. | Freshwater leaching scenarios: Deionised water (e.g., ASTM D 1193 Type II) is recommended for use in the leaching test when wood exposed to freshwater is to be evaluated. The water temperature shall be 20 °C +/– 2 °C and the measured pH and water temperature included in the test report. Analysis of samples of the water used taken before immersion of the treated specimens allows the estimation of the analysed chemicals in the water. This is a control to determine background levels of chemicals which are then chemically analysed. | 17. | Seawater leaching scenarios: Synthetic seawater (e.g., ASTM D 1141 Substitute Ocean Water, without Heavy Metals) is recommended for use in the leaching test when wood exposed to seawater is to be evaluated. The water temperature shall be 20 °C +/– 2 °C and the measured pH and water temperature included in the test report. Analysis of samples of the water used taken before immersion of the treated specimens allows the estimation of the analysed chemicals in the water. This is a control for the analysis of background levels for chemicals of importance. | Wood Test Specimens | 18. | The wood species should be typical of the wood species used for the efficacy testing of wood preservatives. The recommended species are Pinus sylvestris L. (Scots pine), Pinus resinosa Ait. (red pine) or Pinus spp (Southern pine). Additional tests may be made using other species. | 19. | Straight grained wood without knots should be used. Material of a resinous appearance should be avoided. The wood should be typical of wood which is available commercially. The source, density and number of annual rings per 10 mm should be recorded. | 20. | Wood test specimens are recommended to be sets of five according to EN 113 size blocks (25 mm × 50 mm × 15 mm dimensions) with the longitudinal faces parallel to the grain of the wood, although other dimensions such as 50 mm, by 150 mm, by 10 mm may be used. The test specimen should be completely immersed into the water. Test specimens shall consist of 100 % sapwood. Each specimen is uniquely marked so that it can be identified throughout the test. | 21. | All test specimens should be planed or plane sawn and the surfaces should not be sanded. | 22. | The number of sets of wood test specimens used for analysing is at least five: three sets of specimens are treated with preservative, one set of specimens is untreated and one set of specimens for the estimation of the oven dry moisture content of the test specimens before treatment. Sufficient test specimens are prepared to allow selection of three sets of specimens which are within 5 % of the mean value of the preservative retentions of the pool of test specimens. | 23. | All test specimens are end-sealed with a chemical which prevents penetration of preservative into the end grain of the specimens or prevents leaching from the specimens via the end grain. It is necessary to distinguish between specimens used for superficial application and penetration processes for the application of the end-sealant. The application of the end-sealant has to be applied prior to treatment only in case of superficial application. | 24. | The end-grain has to be open for treatments by penetration processes. Therefore, the specimens have to be end-sealed at the end of the conditioning period. The emission has to be estimated for the longitudinal surface area only. Sealants should be inspected and reapplied if necessary prior to initiating leaching and should not be reapplied after leaching has been initiated. | Immersion Container | 25. | The container is made of an inert material and is large enough to contain 5 EN113 wood specimens in 500 ml of water resulting in a surface area to water volume ratio of 0,4 cm2/ml. | Specimen Test Assembly | 26. | The test specimens are supported on an assembly which allows all exposed surfaces of the specimen to be in contact with water. | PROCEDURE FOR PRESERVATIVE TREATMENT | Preparation of the Treated Test Specimens | 27. | The wood test specimen to be treated with the preservative under test is treated by the method specified for the preservative, which may be by a penetrating treatment process or a superficial application process, which may be with a dip, spray or brush. | Preservatives to be applied by penetrating treatment process | 28. | A solution of the preservative should be prepared that will achieve the specified uptake or retention when applied using the penetrating treatment process. The wood test specimen is weighed and its dimensions are measured. The penetrating treatment process should be as specified for the application of the preservative to wood for use in Use Class 4 or 5. The specimen is again weighed after treatment and the retention of the preservative (kg/m3) is calculated from the equation: | 29. | Note that timber treated in an industrial treatment plant (e.g. by vacuum pressure impregnation) may be used in this test. The procedures used should be recorded and the retention of material treated in this way must be analysed and recorded. | Preservatives to be applied by superficial application processes | 30. | The superficial application process includes dipping, spraying or brushing of the wood test specimens. The process and application rate (e.g. litres/m2) should be as specified for the superficial application of the preservative. | 31. | Also note in this case, timber treated in an industrial treatment plant may be used in this test. The procedures used should be recorded and the retention of material treated in this way must be analysed and recorded. | Conditioning of the Test Specimens after Treatment | 32. | After treatment, the treated test specimens should be conditioned in accordance with the recommendations made by the supplier of the test preservative according to the preservative label requirements or as in accordance with commercial treatment practices or in accordance with EN 252 Standard. | Preparation and Selection of Test Specimens | 33. | After post treatment conditioning, the mean retention of the group of test specimens is calculated and three representative sets of specimens with a retention within 5 % of the mean for the group are randomly selected for leaching measurements. | PROCEDURE FOR PRESERVATIVE EMISSION MEASUREMENTS | Immersion Method | 34. | The test specimens are weighed and subsequently totally immersed in the water and the date and time recorded. The container is covered to reduce evaporation. | 35. | The water is replaced at the following intervals: 6 hours, 1 day, 2 days, 4 days, 8 days, 15 days, 22 days, 29 days (note: these are total times not interval times). The time and date of the water change and the mass of water recovered from the container should be recorded. | 36. | After each water exchange, a sample of water in which the set of test specimens has been immersed is retained for subsequent chemical analysis. | 37. | The sampling procedure allows the calculation of the profile of the quantity of emissions against time. Samples should be stored under conditions that preserve the analyte e.g., in a refrigerator in the dark to reduce microbial growth in the sample before analysis. | EMISSION MEASUREMENTS | Treated Samples | 38. | Collected water is chemically analysed for the active substance and/or relevant degradation/transformation products, if appropriate. | Untreated Samples | 39. | Collection of the water (emissate) in this system and subsequent analysis of chemicals that had leached from the untreated wood samples allow the estimation of the possible emission rate of the preservative from untreated wood. Collection and analysis of the emissate after increasing time periods of exposure allow the rate of change of the emission rate with time to be estimated. This analysis is a control procedure to determine background levels of the test chemical in untreated wood to confirm that the wood used as a source of samples had not been previously treated with the preservative. | DATA AND REPORTING | Chemical Analyses | 40. | The collected water is chemically analysed and the water analysis result is expressed in appropriate units, e.g., μg/l. | Reporting of Data | 41. | All results are recorded. The Appendix shows an example of a suggested recording form for one set of treated test specimens, and the summary table for calculating the mean emission values over each sampling interval. | 42. | The daily emission flux in mg/m2/day is calculated by taking the mean of the three measurements from the three replicates and dividing by the number of days of immersion. | Test Report | 43. | At least the following information shall be provided in the test report: | — | The name of the supplier of the preservative under test; | — | The specific and unique name or code of the preservative tested; | — | The trade or common name of the active ingredient(s) with a generic description of the co-formulants (e.g. co-solvent, resin), and the composition in % m/m of the ingredients; | — | The relevant retention or loading (in kg/m3 or l/m2, respectively) specified for wood used in contact with water; | — | The species of wood used, with its density, and growth rate in rings per 10 mm; | — | The loading or retention of the preservative tested and the formula used to calculate the retention, expressed as l/m2 or kg/m3; | — | The method of application of the preservative, specifying the treatment schedule used for a penetrating process, and the method of application if a superficial treatment was used; | — | The date of application of the preservative, and an estimate of the moisture content of the test specimens, expressed as a percentage; | — | Conditioning procedures used, specifying the type, conditions and duration; | — | Specification of the end sealant used and the number of times applied; | — | Specification of any subsequent treatment of the wood, e.g. specification of the supplier, type, characteristics and loading of a paint; | — | The time and date of each immersion event, the amount of water used for the immersion of the test specimens at each event, and the amount of water absorbed by the wood during immersion; | — | Any variation from the described method and any factors that may have influenced the results. | LITERATURE | (1) | European Standard, EN 84 — 1997. Wood preservatives. Accelerated ageing of treated wood prior to biological testing. Leaching procedure. | (2) | European Standard, EN 113/A1 — 2004. Wood preservatives. Test method for determining the protective effectiveness against wood destroying basidiomycetes. Determination of the toxic values. | (3) | European Standard, EN 252 — 1989. Field test method for testing the relative protective effectiveness of a wood preservative in ground contact. | (4) | European Standard, EN 335 — Part 1: 2006. Durability of wood and wood-based products — Definition of use classes — Part1: General. | (5) | American Society for Testing and Materials Standards, ASTM D 1141 — 1998. Standard Practice for the Preparation of Substitute Ocean Water, Without Heavy Metals. Annual Book of ASTM Standards, Volume 11.02. | (6) | American Society for Testing and Materials Standards, ASTM D 1193-77 Type II — 1983. Specifications for Reagent Water. Annual Book of ASTM Standards, Volume 11.01. | Appendix 1 | Recording form for test method | Estimation of Emissions from Preservative-Treated Wood to the Environment: Laboratory Method for Wooden Commodities that are not Covered and are in Contact with Fresh Water or Seawater | Test house | | Wood preservative | Supplier of the preservative | | Specific and unique name or code of the preservative | | Trade or common name of the preservative | | Co-formulants | | Relevant retention for wood used in contact with water | | Application | Application method | | Date of application | | Formula used to calculate the retention: | | Conditioning procedure | | Duration of conditioning | | End sealant/number of times applied | | Subsequent treatment | if relevant | Test specimens | Wood species | | Density of the wood | (minimum … mean value … maximum) | Growth rate (rings per 10 mm) | (minimum … mean value … maximum) | Moisture content | | Test assemblies (*14) | Retention (e.g. kg/m3) | Treated “x” | Mean value and standard deviation or range for 5 specimens | Treated “y” | Mean value and standard deviation or range for 5 specimens | Treated “z” | Mean value and standard deviation or range for 5 specimens | Untreated | | Variation of test method parameters | e.g. water quality, dimension of test specimens etc. | Time | Water exchange | Specimen mass | Water uptake | Water sample | Treated (mean) | Untreated | Treated (mean) | Untreated | | Test water | x | y | z | | Date | g | g | g | g | no. | pH | pH | pH | pH | start | | | | | | | | | | | | | | | | 6h | | | | | | 1 | | | | | 24h | | | | | | 2 | | | | | 2 d | | | | | | 3 | | | | | 4 d | | | | | | 4 | | | | | 8 d | | | | | | 5 | | | | | 15 d | | | | | | 6 | | | | | 22 d | | | | | | 7 | | | | | 29 d | | | | | | 8 | | | | | | | | Please prepare separate tables for each active ingredient | Time | Water exchange | Analytical Results | Untreated specimens | Treated specimens | Concentration a.i. in water | mg/l | Quantity emitted | mg/m2 | Emission rate | mg/m2/d | Concentration a.i. in water | Quantity emitted | Emission rate | x | y | z | Mean | x | y | z | Mean | x | y | z | Mean | | Date | mg/l | mg/l | mg/l | mg/l | mg/m2 | mg/m2 | mg/m2 | mg/m2 | mg/m2/d | mg/m2/d | mg/m2/d | mg/m2/d | 6h | | | | | | | | | | | | | | | | | 24h | | | | | | | | | | | | | | | | | 2 d | | | | | | | | | | | | | | | | | 4 d | | | | | | | | | | | | | | | | | 8 d | | | | | | | | | | | | | | | | | 15 d | | | | | | | | | | | | | | | | | 22 d | | | | | | | | | | | | | | | | | 29 d | | | | | | | | | | | | | | | | | Note: Since results from untreated may have to be used to correct emission rates from treated samples, the untreated results should come first and all values for treated samples would be “corrected values”. There may also be a correction for the initial water analysis. | Appendix 2 | Definitions | Chemical : A substance or a mixture. | Test chemical : Any substance or mixture tested using this test method. | C.46. BIOACCUMULATION IN SEDIMENT-DWELLING BENTHIC OLIGOCHAETES | INTRODUCTION | 1. | This test method is equivalent to OECD test guideline (TG) 315 (2008) Sediment-ingesting endobenthic animals may be exposed to sediment bound substances (1). Among these sediment-ingesters, aquatic oligochaetes play an important role in the bottoms of the aquatic systems. They live in the sediment and often represent the most abundant species especially in habitats with environmental conditions adverse to other animals. By bioturbation of the sediment and by serving as prey these animals can have a strong influence on the bioavailability of such substances to other organisms, e.g. benthivorous fish. In contrast to epibenthic organisms, endobenthic aquatic oligochaetes burrow in the sediment, and ingest sediment particles below the sediment surface. Because of that, these organisms are exposed to substances via many uptake routes including direct contact, ingestion of contaminated sediment particles, porewater and overlying water. Some species of benthic oligochaetes that are currently used in ecotoxicological testing are described in Appendix 6. | 2. | The parameters which characterise the bioaccumulation of a substance include first of all the bioaccumulation factor (BAF), the sediment uptake rate constant (ks) and the elimination rate constant (ke). Detailed definitions of these parameters are provided in Appendix 1. | 3. | To assess the bioaccumulation potential of substances in general, and to investigate the bioaccumulation of substances which tend to partition into or onto the sediments, a compartment-specific test method is needed (1)(2)(3)(4). | 4. | This test method is designed to assess bioaccumulation of sediment-associated substances in endobenthic oligochaete worms. The test substance is spiked into the sediment. Using spiked sediment is intended to simulate a contaminated sediment. | 5. | This method is based on existing sediment toxicity and bioaccumulation test methods (1)(4)(5)(6)(7)(8)(9). Other useful documents are: the discussions and results of an international workshop (11), and the outcome of an international ring test (12). | 6. | This test applies to stable, neutral organic substances, which tend to associate with sediments. Bioaccumulation of sediment-associated, stable metallo-organic compounds can also be measured with this method (12). It is not applicable to metals and other trace elements (11) without modification of the test design with respect to substrate and water volumes, and possibly tissue sample size. | PREREQUISITE AND INFORMATION ON TEST SUBSTANCE | 7. | There are only a few well established Quantitative Structure-Activity Relationships (QSAR) concerning bioaccumulation processes presently available (14). The most widely used relationship is the correlation between the bioaccumulation and bioconcentration of stable organic substances and their lipophilicity (expressed as the logarithm of the octanol-water partition coefficient (log Kow); see Appendix 1 for definition), respectively, which has been developed for the description of a substance partitioning between water and fish. Correlations for the sediment compartment have also been established using this relationship (15)(16)(17)(18). The log Kow-log BCF correlation as a major QSAR may be helpful for a first preliminary estimation of the bioaccumulation potential of sediment-associated substances. However, the BAF may be influenced by lipid content of the test organism and the organic carbon content of the sediment. Therefore the organic carbon-water partition coefficient (Koc) may also be used as a major determinant of the bioaccumulation of sediment-associated organic substances. | 8. | This test is applicable to: | — | stable, organic substances having log Kow values between 3,0 and 6,0 (5)(19) and superlipophilic substances that show a log Kow of more than 6,0 (5); | — | substances which belong to a class of organic substances known for their bioaccumulation potential in living organisms, e.g. surfactants or highly adsorptive substances (e.g. high Koc). | 9. | Information on the test substance such as safety precautions, proper storage conditions and stability, and analytical methods should be obtained before beginning the study. Guidance for testing substances with physical-chemical properties that make them difficult to test is provided in (20) and (21). Before carrying out a test for bioaccumulation with aquatic oligochaetes, the following information about the test substance should be known: | — | common name, chemical name (preferably IUPAC name), structural formula, CAS registry number, purity; | — | solubility in water [test method A.6 (22) ]; | — | octanol-water partition coefficient, Kow [test methods A.8, A.24 (22)]; | — | sediment-water partition coefficient, expressed as Kd or Koc [test method C.19 (22)]; | — | hydrolysis [test method C.7 (22)]; | — | phototransformation in water (23); | — | vapour pressure [test method A.4 (22)]; | — | ready biodegradability [test methods C.4 and C.29 (22)]; | — | surface tension [test method A.5 (22)]; | — | critical micelles concentration (24). | In addition the following information — when available- would be relevant: | — | biodegradation in the aquatic environment [test methods C.24 and C.25 (22)]; | — | Henry's law constant. | 10. | Radiolabelled test substances can facilitate the analysis of water, sediment and biological samples, and may be used to determine whether identification and quantification of degradation products should be made. The method described here was validated in an international ring test (12) for 14C-labelled substances. If total radioactive residues are measured, the bioaccumulation factor (BAF) is based on the parent substance including any retained degradation products. It is also possible to combine a metabolism study with a bioaccumulation study by analysis and quantification of the percentage of parent substance and its degradation products in samples taken at the end of the uptake phase or at the peak level of bioaccumulation. In any case, it is recommended that BAF calculation be based on the concentration of the parent substance in the organisms and not only on total radioactive residues. | 11. | In addition to the properties of the test substance, other information required is the toxicity to the oligochaete species to be used in the test, such as a median lethal concentration (LC50) for the time necessary for the uptake phase, to ensure that selected exposure concentrations are much lower than toxic levels. If available, preference should be given to toxicity values derived from long-term studies on sublethal endpoints (EC50). If such data are not available, an acute toxicity test under conditions identical with the bioaccumulation test conditions, or toxicity data on other surrogate species data may provide useful information. | 12. | An appropriate analytical method of known accuracy, precision, and sensitivity for the quantification of the substance in the test solutions, in the sediment, and in the biological material must be available, together with details of sample preparation and storage as well as material safety data sheets. Analytical detection limits of the test substance in water, sediment, and worm tissue should also be known. If a radiolabelled test substance is used, the specific radioactivity (i.e. Bq mol– 1), the position of the radiolabelled atom, and the percentage of radioactivity associated with impurities must also be known. The specific radioactivity of the test substance should be as high as possible in order to detect test concentrations as low as possible (11). | 13. | Information on characteristics of the sediment to be used (e.g. origin of sediment or its constituents, pH and ammonia concentration of the pore water (field sediments), organic carbon content (TOC), particle size distribution (per cent sand, silt, and clay), and per cent dry weight) should be available (6). | PRINCIPLE OF THE TEST | 14. | The test consists of two phases; the uptake (exposure) phase and the elimination (post-exposure) phase. During the uptake phase, worms are exposed to sediment spiked with the test substance, topped with reconstituted water and equilibrated as appropriate (11). Groups of control worms are held under identical conditions without the test substance. | 15. | For the elimination phase the worms are transferred to a sediment-water-system free of test substance. An elimination phase is necessary to gain information on the rate at which the test substance is excreted by the test organisms (19)(25). An elimination phase is always required unless uptake of the test substance during the exposure phase has been insignificant (e.g. there is no statistical difference between the concentration of the test substance in test and control worms). If a steady state has not been reached during the uptake phase, determination of the kinetics — BAFk, uptake and elimination rate constant(s) — may be done using the results of the elimination phase. Change of the concentration of the test substance in/on the worms is monitored throughout both phases of the test. | 16. | During the uptake phase, measurements are made until BAF has reached a plateau or steady state. By default, the duration of the uptake phase should be 28 days. Practical experience has shown that a 12 to 14-day uptake phase is sufficient for several stable, neutral organic substances to reach steady-state (6)(8)(9). | 17. | However, if the steady state is not reached within 28 d, the elimination phase is started by transferring exposed oligochaetes to vessels containing the same medium without the test substance. The elimination phase is terminated when either the 10 % level of the concentration measured in the worms on day 28 of the uptake phase is reached, or after a maximum duration of 10 d. The residue level in the worms at the end of the elimination phase is reported as an additional endpoint, e.g. as Non-eliminated residues (NER). The bioaccumulation factor (BAFss) is calculated preferably both as the ratio of concentration in worms (Ca) and in the sediment (Cs) at apparent steady state, and as a kinetic bioaccumulation factor, BAFK as the ratio of the rate constant of uptake from sediment (ks) and the elimination rate constant (ke) assuming first-order kinetics. If a steady state is not reached within 28 days, calculate BAFK from the uptake rate and elimination rate constant(s). For calculation see Appendix 2. If first-order kinetics are not applicable, more complex models should be employed (Appendix 2 and reference (25). | 18. | If a steady state is not achieved within 28 days, the uptake phase may optionally be extended subjecting groups of exposed worms — if available — to further measurements until steady state is reached; in parallel, the elimination phase should nevertheless be started on day 28 of the uptake phase. | 19. | The uptake rate constant, the elimination rate constant (or constants, where more complex models are involved), the kinetic bioaccumulation factor (BAFK), and where possible, the confidence limits of each of these parameters are calculated from computerised model equations (see Appendix 2 for models). The goodness of fit of any model can be determined from the correlation coefficient or the coefficient of determination (coefficients close to 1 indicate a good fit). | 20. | To reduce variability in test results for organic substances with high lipophilicity, bioaccumulation factors should be expressed additionally in relation to the lipid content of the test organisms and to the organic carbon content (TOC) in the sediment (biota-sediment accumulation factor or BSAF in kg sediment TOC kg– 1 worm lipid content). This approach is based on experiences and theoretical correlations for the aquatic compartment, where — for some chemical classes — there is a clear relationship between the potential of a substance to bioaccumulate and its lipophilicity, which has been well established for fish as model organisms (14)(25)(27). There is also a relationship between the lipid content of the test fish and the observed bioaccumulation of such substances. For benthic organisms, similar correlations have been found (15)(16)(17)(18). If sufficient worm tissue is available, the lipid content of the test animals may be determined on the same biological material as the one used to determine the concentration of the test substance. However, it is practical to use acclimatised control animals at least at start or — preferably — at the end of the uptake phase to measure the lipid content, which can then be used to normalise the BAF values. | VALIDITY OF THE TEST | 21. | For a test to be valid the following conditions apply: | — | The cumulative mortality of the worms (controls and treatments) until the end of the test should not exceed 20 % of the initial number. | — | In addition, it should be demonstrated that the worms burrow in the sediment to allow for maximum exposure. For details see paragraph 28. | DESCRIPTION OF THE METHOD | Test species | 22. | Several species of aquatic oligochaetes can be used for the test. The most commonly used species are listed in Appendix 6. | 23. | Toxicity tests (96 h, in water only) should be conducted at regular intervals (e.g. every month) with a reference toxicant such as potassium chloride (KCl) or copper sulfate (CuSO4) (1) to demonstrate the health conditions of the test animals (1)(6). If reference toxicity tests are not conducted at regular intervals, the batch of organisms to be used in a sediment bioaccumulation test should be checked using a reference toxicant. Measurement of the lipid content might also provide useful information on the condition of the animals. | Culture of the test organisms | 24. | In order to have a sufficient number of worms for conducting bioaccumulation tests the worms may have to be kept in permanent single-species laboratory culture. Laboratory culture methods for the selected test species are summarised in Appendix 6. For details see references (8)(9)(10)(18)(28)(29)(30)(31)(32). | Apparatus | 25. | Care should be taken to avoid the use of materials for all parts of the equipment that can dissolve, absorb test substances or leach other substances and have an adverse effect on the test animals. Standard rectangular or cylindrical chambers, made of chemically inert material and of suitable capacity in compliance with the loading rate, i.e. the number of test worms can be used. The use of soft plastic tubing for administering water or air should be avoided. Polytetrafluoroethylene, stainless steel and/or glass should be used for any equipment having contact with the test media. For substances with high adsorption coefficients, such as synthetic pyrethroids, silanised glass may be required. In these situations the equipment will have to be discarded after use (5). For radiolabelled test substances, and for volatile substances, care should be taken to avoid stripping and the escape of stripped test substance. Traps (e.g. glass gas washing bottles) containing suitable absorbents to retain any residues evaporating from the test chambers should be employed (11). | Water | 26. | The overlying water must be of a quality that will allow the survival of the test species for the duration of the acclimation and test periods without them showing any abnormal appearance or behaviour. Reconstituted water according to test method C.1 (25) is recommended for use as overlying water in the tests as well as in the laboratory cultures of the worms. It has been demonstrated that several test species can survive, grow, and reproduce in this water (8), and maximum standardisation of test and culture conditions is provided. The water should be characterised at least by pH, conductivity and hardness. Analysis of the water for micro-pollutants prior to use might provide useful information (Appendix 4). | 27. | The water should be of constant quality during the period of a test. The pH of the overlying water should be between 6 and 9. The total hardness should be between 90 and 400 mg CaCO3 per litre at the start of the test (7). Ranges for pH and hardness in the mentioned reconstituted water are given in test method C.1 (25). If there is an interaction suspected between hardness ions and the test substance, lower hardness water should be used. Appendix 4 summarises additional criteria of an acceptable dilution water according to OECD TG 210 (34). | Sediment | 28. | The sediment must be of a quality that will allow the survival and preferably the reproduction of the test organisms for the duration of the acclimation and test periods without them showing any abnormal appearance or behaviour. The worms should burrow into the sediment. Burrowing behaviour can have an influence on the exposure, and consequently on the BAF. Therefore, sediment avoidance or burrowing behaviour of the test organisms should be recorded, where turbidity of the overlying water allows such observations. The worms (control and treatments) should burrow in the sediment within a period of 24 h after addition to the test vessels. If permanent burrowing failure or sediment avoidance are observed (e.g. more than 20 % over more than half of the uptake phase), this indicates that either the test conditions are not appropriate, or the test organisms are not healthy, or that the concentration of the test substance elicits this behaviour. In such a case the test should be stopped and repeated at improved conditions. Additional information on sediment ingestion can be obtained by using methods described in (35)(36), which specify sediment ingestion or particle selection in the test organisms. If observable, at least the presence or absence of fecal pellets on the sediment surface, which indicate sediment ingestion by the worms, should be recorded and considered for the interpretation of the test results with respect to exposure pathways. | 29. | An artificial sediment based on the artificial soil described in test method C.8 (40) is recommended for use in both the tests and the laboratory cultures of the worms (Appendix 5), since natural sediments of appropriate quality may not be available throughout the year. In addition, indigenous organisms as well as the possible presence of micropollutants in natural sediments might influence the test. Several test species can survive, grow, and reproduce in the artificial sediment (8). | 30. | The artificial sediment should be characterised at least by origin of the constituents, grain size distribution (percent sand, silt, and clay), organic carbon content (TOC), water content, and pH. Measurement of redox potential is optional. However, natural sediments from unpolluted sites may serve as test and/or culture sediment (1). Natural sediments should be characterised at least by origin (collection site), pH and ammonia of the pore water, organic carbon content (TOC), particle size distribution (percent sand, silt, and clay), and percent water content (6). It is recommended that, before it is spiked with the test substance, the natural sediment be conditioned for seven days under the same conditions which prevail in the subsequent test, if ammonia development is expected. At the end of this conditioning period, the overlying water should be removed and discarded. Analysis of the sediment or its constituents for micro-pollutants prior to use might provide useful information. | Preparation | 31. | Handling of natural sediments prior to their use in the laboratory is described in (1)(6)(44). The preparation of the artificial sediment is described in Appendix 5. | Storage | 32. | The storage of natural sediments in the laboratory should be as short as possible. U.S. EPA (6) recommends a maximum storage period of 8 weeks at 4 ± 2 °C in the dark. There should be no headspace above the sediment in the storage containers. Recommendations for the storage of artificial sediment are given in Appendix 5. | Application of the test substance | 33. | The sediment is spiked with the test substance. The spiking procedure involves coating of one or more of the sediment constituents with the test substance. For example, the quartz sand, or a portion thereof (e.g. 10 g of quartz sand per test vessel), can be soaked with a solution of the test substance in a suitable solvent, which is then slowly evaporated to dryness. The coated fraction can then be mixed into the wet sediment. The amount of sand provided by the test-substance-and-sand mixture has to be taken into account when preparing the sediment, i.e. the sediment should thus be prepared with less sand (6). | 34. | With a natural sediment, the test substance may be added by spiking a dried portion of the sediment as described above for the artificial sediment, or by stirring the test substance into the wet sediment, with subsequent evaporating of any solubilising agent used. Suitable solvents for spiking wet sediment are ethanol, methanol, ethylene glycol monomethyl ether, ethylene glycol dimethyl ether, dimethylformamide and triethylene glycol (5)(34). Toxicity and volatility of the solvent and the solubility of the test substance in the chosen solvent should be the main criteria for the selection of a suitable solubilising agent. Additional guidance on spiking procedures is given in Environment Canada (1995)(41). Care should be taken to ensure that the test substance added to sediment is thoroughly and evenly distributed within the sediment. Replicated sub-samples of the spiked sediment should be analysed to check the concentrations of the test substance in the sediment, and to determine the degree of homogeneity of test substance distribution. | 35. | Once the spiked sediment with overlying water has been prepared, it is desirable to allow partitioning of the test substance between the sediment and the aqueous phase. This should preferably be done under the conditions of temperature and aeration used in the test. Appropriate equilibration time is sediment and substance specific, and can be in the order of hours to days and in rare cases up to several weeks (4-5 weeks) (28)(42). In this test, equilibrium is not awaited but an equilibration period of 48 hours to 7 days is recommended. Depending on the purpose of the study, e.g., when environmental conditions are to be mimicked, the spiked sediment may be equilibrated or aged for a longer period (11). | PERFORMANCE OF THE TEST | Preliminary test | 36. | It may be useful to conduct a preliminary experiment in order to optimise the test conditions of the definitive test, e.g. selection of test substance concentration(s) and duration of the uptake and elimination phases. The behaviour of worms, for example sediment avoidance, i.e. the worms escape from the sediment which may be caused by the test substance and/or by the sediment itself, should be observed and recorded during a preliminary test. Sediment avoidance may also be used as a sub-lethal parameter in a preliminary test for estimating the test substance concentration(s) to be used in a bioaccumulation test. | Exposure conditions | Duration of the uptake phase | 37. | The test organisms are exposed to the test substance during the uptake phase. The first sample should be taken between 4 and 24 h after start of uptake phase. The uptake phase should be run for up to 28 days (1)(6)(11) unless it can be demonstrated that equilibrium has been reached earlier. The steady state occurs when: (i) a plot of the bioaccumulation factors at each sampling period against time is parallel to the time axis; (ii) three successive analyses of BAF made on samples taken at intervals of at least two days vary no more than ± 20 % of each other; and (iii) there are no significant differences between the three sampling periods (based on statistical comparisons e.g. analysis of variance and regression analysis). If the steady state has not been reached by 28 days, the uptake phase may be ended by starting the elimination phase, and the BAFK can be calculated from the uptake and elimination rate constants (see also paragraphs 16 to 18). | Duration of the elimination phase | 38. | The first sample should be taken between 4 and 24 h after start of elimination phase, since during the initial period, rapid changes in tissue residue may occur. It is recommended to terminate the elimination phase either when the concentration of test substance is less than 10 % of steady-state concentration, or after a maximum duration of 10 days. The residue level in the worms at the end of the elimination phase is reported as a secondary endpoint. The period may, however, be governed by the period over which the concentration of the test substance in the worms remains above the analytical detection limit. | Test organisms | Numbers of test worms | 39. | The number of worms per sample must provide a mass of worm tissue such that the mass of test substance per sample at the beginning of the uptake phase and at the end of the elimination phase, respectively, is significantly higher than the detection limit for the test substance in biological material. In the mentioned stages of uptake and elimination phases the concentration in the test animals is usually relatively low (6)(8)(18). Since the individual weight in many species of aquatic oligochaetes is very low (5-10 mg wet weight per individual for Lumbriculus variegatus and Tubifex tubifex), the worms of a given replicate test chamber may be pooled for weighing and test chemical analysis. For test species with higher individual weight (e.g. Branchiura sowerbyi) replicates containing one individual may be used, but in such cases the number of replicates should be increased to five per sampling point (11). It should however be noted that B. sowerbyi was not included in the ring test (12), and is therefore not recommended as a preferable species in the method. | 40. | Worms of similar size should be used (for L. variegatus see Appendix 6). They should come from the same source, and should be adult or large animals of the same age class (see Appendix 6). The weight and age of an animal may have a significant effect on the BAF-values (e.g. due to different lipid content and/or presence of eggs); these parameters should be recorded accurately. To measure the mean wet and dry weight a sub-sample of worms should be weighed before starting the test. | 41. | With Tubifex tubifex and Lumbriculus variegatus, reproduction is expected during the test period. A lack of reproduction in a bioaccumulation test should be recorded, and considered when interpreting the test results. | Loading | 42. | High sediment-to-worm and water-to-worm ratios should be used in order to minimise the reduction of test substance concentration in the sediment during the uptake phase, and to avoid decreases in dissolved oxygen concentration. The chosen loading rate should also correspond to naturally occurring population densities of the chosen species (43). For example, for Tubifex tubifex, a loading rate of 1-4 mg of worm tissue (wet weight) per gram of wet sediment is recommended (8)(11). References (1) and (6) recommend a loading rate of ≤ 1 g dry weight of worm tissue per 50 g sediment organic carbon for L. variegatus. | 43. | The worms to be used in a test are removed from the culture by sieving the culture sediment. The animals (adult or large worms without signs of recent fragmentation) are transferred to glass dishes (e.g. petri dishes) containing clean water. If the test conditions differ from the culture conditions, an acclimation phase of 24 h should be sufficient. Prior to weighing, excess water should be removed from the worms. This can be done by gently placing the worms on a pre-moistened paper tissue. It is not recommended to use absorbing paper to dry the worms as this may cause stress or damage to the worms. Brunson et al. (1998) recommend using non-blotted worms of approximately 1,33 times the target biomass. These additional 33 % correspond to the difference between blotted and non-blotted worms (28). | 44. | At the start of the uptake phase (day 0 of the test), the test organisms are removed from the acclimatisation chamber and distributed randomly to vessels (e.g. petri dishes) containing reconstituted water by adding groups of two worms to each vessel, until each vessel contains ten worms. Each of these groups of worms are then randomly transferred to separate test vessels, e.g. using soft steel forceps. The test vessels are subsequently incubated under test conditions. | Feeding | 45. | In view of the low nutrient content of the artificial sediment, the sediment should be amended with a food source. In order not to underestimate the exposure of the test organisms, e.g. by selectively feeding uncontaminated food, the food necessary for reproduction and growth of the test organisms should be added to the sediment once before or during application of the test substance (see Appendix 5). | Sediment-water ratio | 46. | The recommended sediment-water ratio is 1:4 (45). This ratio is considered suitable to maintain oxygen concentrations at appropriate levels, and to avoid the build-up of ammonia in the overlying water. The oxygen content in the overlying water should be maintained at ≥ 40 % saturation. The overlying water of the test vessels should be gently aerated (e.g. 2 - 4 bubbles per second) via a pasteur pipette positioned approximately 2 cm above the sediment surface so as to minimise perturbation of the sediment. | Light and temperature | 47. | The photoperiod in the culture and the test is 16 hours (1)(6). Light intensity in the test area should be kept at about 500-1 000 lx. The temperature should be 20 ± 2 °C throughout the test. | Test concentrations | 48. | One test concentration (as low as possible) is used for determination of the uptake kinetics, but a second (higher) concentration may be used (e.g. (46)). In that case, samples are taken and analysed at steady state or after 28 d to confirm the BAF measured at the lower concentration (11). The higher concentration should be selected so that adverse effects can be excluded (e.g. by choosing approximately 1 % of the lowest known chronic effect concentration ECx as derived from relevant chronic toxicity studies). The lower test concentration should be significantly higher than the detection limit in sediment and biological samples by the analytical method used. If the effect concentration of the test substance is close to the analytical detection limit, the use of radiolabelled test substance with high specific radioactivity is recommended. | Treated and Control Replicates | 49. | The minimum number of treated replicates for kinetic measurements should be three per sampling point (11) throughout uptake and elimination phase. Additional replicates should be employed e.g. for optional additional sampling dates. For the elimination phase, a matching number of replicates is prepared with non-spiked sediment and overlying water, so that the treated worms can be transferred from designated treated vessels to non-treated vessels at the end of the uptake phase. The total number of treated replicates should be sufficient for both uptake and elimination phase. | 50. | Alternatively, the worms designated for sampling during the elimination phase may be exposed in one large container containing spiked sediment of the same batch as used for uptake kinetics. It should be demonstrated that the test conditions (e.g. sediment depth, sediment water ratio, loading, temperature, water quality) are comparable to the replicates designated for the uptake phase. At the end of the uptake phase, water, sediment and worm samples should be taken from this container for analysis, and a sufficient number of large worms that show no sign of recent fragmentation, should be removed carefully and transferred to the replicates prepared for the elimination phase (e.g. ten organisms per replicate vessel). | 51. | If no solvent other than water is used, at least 9 replicates of a negative control (at least 3 sampled at start, 3 at end of uptake and 3 at end of elimination) should be provided for biological and background analysis. If any solubilising agent is used for application of the test substance, a solvent control should be run (at least 3 replicates should be sampled at start, 3 at the end of the uptake phase, and 3 at the end of the elimination phase). In this case, at least 4 replicates of a negative control (no solvent) should be provided for sampling at the end of the uptake phase. These replicates can be compared biologically with the solvent control in order to gain information on possible influence of the solvent on the test organisms. Details are given in Appendix 3. | Frequency of water quality measurements | 52. | As a minimum, the following water quality parameters should be measured in the overlying water during uptake and elimination phase: | Temperature | in one vessel of each treatment level per sampling date, and in one control vessel once per week and at the start and the end of the uptake and elimination period; temperature in the surrounding medium (ambient air or water bath) or in one representative test vessel may also be recorded e.g. in continuous or hourly intervals; | Dissolved oxygen content | in one vessel of each treatment level, and in one control vessel per sampling date; expressed as mg/L and % ASV (air saturation value); | Air supply | controlled at least once per day (workdays) and adjusted if needed; | pH | in one treated vessel of each treatment level per sampling date, and in one control vessel once per week and at the start and the end of the uptake and elimination period; | Total water hardness | at least in one treated vessel and one control test vessel at the start and the end of the uptake and elimination period, expressed as mg/l CaCO3; | Total ammonia content | at least in one treated vessel and one control test vessel at the start and the end of the uptake and elimination period; expressed as mg/l NH4 + or NH3 or total ammonia-N. | Sampling and analysis of worms, sediment, and water | Sampling Schedule | 53. | Examples of sampling schedules for a 28-day uptake phase and a 10-day elimination phase are given in Appendix 3. | 54. | Sample the water and sediment from the test chambers for determination of test substance concentration before adding the worms, and during both uptake and elimination phases. During the test the concentrations of test substance are determined in the worms, sediment, and water in order to monitor the distribution of the test substance in the compartments of the test system. | 55. | Sample the worms, sediment, and water on at least six occasions during the uptake as well as the elimination phase. | 56. | Continue sampling until a plateau (steady state) has been established (see Appendix 1) or for 28 days. If the plateau has not been reached within 28 days, begin the elimination phase. When beginning the elimination phase, transfer the designated worms to replicate chambers containing untreated sediment and water (see also paragraphs 17 and 18). | Sampling and sample preparation | 57. | Obtain water samples by decanting, siphoning or pipetting a volume sufficient for measuring the quantity of the test substance in the sample. | 58. | The remaining overlying water is carefully decanted or siphoned from the test chamber(s). Sediment samples should be taken carefully, causing minimal disturbance of the worms. | 59. | Remove all worms from the test replicate at the sampling time, e.g. by suspending the sediment with overlying water and spreading the contents of each replicate on a shallow tray and picking the worms using soft steel forceps. Rinse them quickly with water in a shallow glass or steel tray. Remove the excess water. Transfer the worms carefully to a pre-weighed vessel and weigh them. Sacrifice the worms by freezing (e.g. ≤ – 18 °C). The presence and number of cocoons and/or juveniles should be recorded. | 60. | In general, the worms should be weighed and sacrificed immediately after sampling without a gut purging phase to obtain a conservative BAF which includes contaminated gut content, and to avoid losses of body residues during any gut-purging period in water only (8). Substances with log Kow above 5 are not expected to be eliminated significantly during any gut-purging period in water only, while substances with log Kow lower than 4 may be lost in notable amounts (47). | 61. | During the elimination phase, the worms purge their gut in clean sediment. This means, measurements immediately before the elimination phase include contaminated gut sediment, while after the initial 4-24 h of the elimination phase, most of the contaminated gut content is assumed to be replaced by clean sediment (11)(47). The concentration in the worms of this sample may then be considered as the tissue concentration after gut purge. To account for dilution of the test substance concentration by uncontaminated sediment during the elimination phase, the weight of the gut content may be estimated from worm wet weight/worm ash weight or worm dry weight/worm ash weight ratios. | 62. | If the purpose of a specific study is to measure the bioavailability and true tissue residues in the test organisms, then at least a sub-sample of treated animals (e.g. from three additional replicate vessels), preferably sampled during steady state, should be weighed, purged in clean water for a period of 6 hours (47), and weighed again before analysis. Data on worm weight and body concentration of this sub-sample can then be compared to values obtained from un-purged worms. The worms designated for measurement of elimination should not be purged before the transfer to clean sediment to minimise additional stress for the animals. | 63. | Preferably analyse the water, sediment, and worm samples immediately (i.e. within 1-2 d) after removal in order to prevent degradation or other losses and to calculate the approximate uptake and elimination rates as the test proceeds. Immediate analysis also avoids delay in determining when a plateau has been reached. | 64. | Failing immediate analysis, the samples should be stored under appropriate conditions. Obtain information on the stability and proper storage conditions for the particular test substance before beginning the study, (e.g. duration and temperature of storage, extraction procedures, etc.). If such information is not available and it is judged to be necessary, spiked control tissues can be run concurrently to determine storage stability. | Quality of analytical method | 65. | Since the whole procedure is governed essentially by the accuracy, precision and sensitivity of the analytical method used for the test substance, check experimentally that the precision and reproducibility of the chemical analysis, as well as the recovery of the test substance from water, sediment and worm samples are satisfactory for the particular method. Also, check that the test substance is not detectable in the control chambers in concentrations higher than background. If necessary, correct the values of Cw, Cs and Ca for the recoveries and background values of controls. Handle all samples throughout the test in such a manner so that contamination and loss are minimised (e.g. resulting from adsorption of the test substance on the sampling device). | 66. | The overall recovery and the recovery of test substance in worms, sediment, water, and, if employed, in traps containing absorbents to retain evaporated test substance, should be recorded and reported. | 67. | Since the use of radiolabelled substances is recommended, it is possible to analyse for total radioactivity (i.e. parent and degradation products). However, if analytically feasible, quantification of parent substance and degradation products at steady state or at the end of the uptake phase can provide important information. If it is intended to perform such measurements, the samples should then be subjected to appropriate extraction procedures so that the parent substance can be quantified separately. Where a detected degradation product represents a significant percentage (e.g. > 10 %) of the radioactivity measured in the test organisms at steady state or at the end of the uptake phase, it is recommended to identify such degradation products (5). | 68. | Due to low individual biomass, it is often not possible to determine the concentration of test substance in each individual worm, unless Branchiura sowerbyi (40-50 mg wet weight per worm) is used as test species (11). Therefore, pooling of the individuals sampled from a given test vessel is acceptable, but it does restrict the statistical procedures which can be applied to the data. If a specific statistical procedure and power are important considerations, then an adequate number of test animals and/or replicate test chambers to accommodate the desired pooling, procedure and power, should be included in the test. | 69. | It is recommended that the BAF is expressed both as a function of total wet weight, total dry weight, and, when required (e.g. for highly lipophilic substances) as a function of the lipid content and the TOC of the sediment. Suitable methods should be used for determination of lipid content (48)(49). The chloroform/methanol extraction technique (50) may be recommended as standard method (48). However, to avoid the use of chlorinated solvents, a ring-tested modification of the Bligh & Dyer method (50) as described in (51) might be used. Since the various methods do not give identical values (48), it is important to detail the method used. When possible, i.e. if sufficient worm tissue is available, the lipid content is measured in the same sample or extract as that produced for analysis for the test substance, since the lipids often have to be removed from the extract before it is analysed by chromatography (5). However, it is practical to use acclimatised control animals at least at start or — preferably — at the end of the uptake phase to measure the lipid content, e.g. in three samples. | DATA AND REPORTING | Treatment of results | 70. | The uptake curve of the test substance is obtained by plotting in arithmetic scale the concentration of test substance in/on the worms during the uptake phase against time. If the curve has reached a plateau, calculate the steady state BAFss: | 71. | Determine the kinetic bioaccumulation factor (BAFK) as the ratio ks/ke. The elimination constant (ke) is usually determined from the elimination curve (i.e. a plot of the concentration of the test substance in the worms during the elimination phase). The uptake rate constant ks is then calculated from the uptake curve kinetics. The preferred method for obtaining BAFK and the rate constants, ks, and ke, is to use non-linear parameter estimation methods on a computer (see Appendix 2). If the elimination is obviously not first-order, then more complex models should be employed (25)(27)(52). | 72. | The biota-sediment accumulation factor (BSAF) is determined by normalising the BAFK for the worm lipid content and the sediment total organic carbon content. | Interpretation of results | 73. | The results should be interpreted with caution where measured concentrations of test concentrations occur at levels close to the detection limit of the analytical method used. | 74. | Clearly defined uptake and elimination curves are an indication of good quality bioaccumulation data. Generally the confidence limits for the BAF values from well-designed studies should not exceed 25 % (5). | Test report | 75. | The test report must include the following information. | | Test substance | — | physical nature and, physicochemical properties e.g. log Kow, water solubility; | — | chemical identification data; source of the test substance, identity and concentration of any solvent used; | — | if radiolabelled, the precise position of the labelled atoms, the specific radioactivity, and the percentage of radioactivity associated with impurities. | | Test species | — | scientific name, strain, source, any pre-treatment, acclimation, age, size-range, etc.. | | Test conditions | — | test procedure used (e.g. static, semi-static or flow-through); | — | type and characteristics of illumination used and photoperiod(s); | — | test design (e.g. number, material and size of test chambers, water volume, sediment mass and volume, water volume replacement rate (for flow-through or semi-static procedures), any aeration used before and during the test, number of replicates, number of worms per replicate, number of test concentrations, length of uptake and elimination phases, sampling frequency); | — | method of test substance preparation and application as well as reasons for choosing a specific method; | — | the nominal test concentrations; | — | source of the constituents of the artificial water and sediment or — if natural media are used — origin of the water and the sediment, description of any pre-treatment, results of any demonstration of the ability of the test animals to live and/or reproduce in the media used, sediment characteristics (pH and ammonia of the pore water (natural sediments), organic carbon content (TOC), particle size distribution (percent sand, silt, and clay), percent water content, and any other measurements made) and water characteristics (pH, hardness, conductivity, temperature, dissolved oxygen concentration, residual chlorine levels (if measured), and any other measurements made); | — | the nominal and measured dry weight in % of wet weight (or dry weight-to-wet weight ratio) of the artificial sediment; the measured dry weight in % of wet weight (or dry weight-to-wet weight ratio) for field sediments; | — | water quality within the test chambers as characterised by temperature, pH, ammonium, total hardness, and dissolved oxygen concentration; | — | detailed information on the treatment of water, sediment, and worm samples, including details of preparation, storage, spiking procedures, extraction, and analytical procedures (and precision) for the test substance and lipid content, and recoveries of the test substance. | | Results | — | mortality of the control worms and the worms in each test chamber and any observed sublethal effects including abnormal behaviour (e.g., sediment avoidance, presence or absence of fecal pellets, lack of reproduction); | — | the measured dry weight in % of wet weight (or dry weight-to-wet weight ratio) of the sediment and the test organisms (useful for normalisation); | — | the lipid content of the worms; | — | curves showing the uptake and elimination kinetics of the test substance in the worms, and the time to steady state; | — | Ca, Cs and Cw (with standard deviation and range, if appropriate) for all sampling times (Ca expressed in g kg– 1 wet and dry weight of whole body, Cs expressed in g kg– 1 wet and dry weight of sediment, and Cw in mg l– 1). If a biota-sediment accumulation factor (BSAF; see Appendix 1 for definition) is required (e.g. for comparison of results from two or more tests performed with animals of differing lipid content), Ca should additionally be expressed as g kg– 1 lipid content of the organism, and Cs should be expressed as g kg– 1 organic carbon (OC) of the sediment; | — | BAF (expressed in kg wet sediment kg– 1 wet worm), sediment uptake rate constant ks (expressed in g wet sediment kg– 1 of wet worm d– 1), and elimination rate constant ke (expressed in d– 1); BSAF (expressed in kg sediment OC kg– 1 worm lipid content) may be reported additionally; | — | Non-eliminated residues (NER) at end of elimination phase; | — | if measured: percentages of parent substance, degradation products, and bound residues (i.e. the percentage of test substance that cannot be extracted with common extraction methods) detected in the test animals; | — | methods used for statistical analyses of the data. | | Evaluation of results | — | compliance of the results with the validity criteria as listed in paragraph 21; | — | unexpected or unusual results, e.g. incomplete elimination of the test substance from the test animals; in such cases results from any preliminary study may provide useful information. | Appendix 1 | Definitions and units | Artificial sediment, or formulated, reconstituted or synthetic sediment, is a mixture of materials used to mimic the physical components of a natural sediment. | Bioaccumulation is the increase in concentration of the test substance in or on an organism relative to the concentration of the test substance in the surrounding medium. Bioaccumulation results from both bioconcentration and biomagnification processes (see below). | The bioaccumulation factor (BAF) at any time during the uptake phase of this bioaccumulation test is the concentration of test substance in/on the test organism (Ca in g kg– 1 wet or dry weight) divided by the concentration of the substance in the surrounding medium (Cs as g kg– 1 of wet or dry weight of sediment). In order to refer to the units of Ca and Cs, the BAF has the units of kg sediment kg– 1 worm (15). | Bioaccumulation factors calculated directly from the ratio of the sediment uptake rate constant divided by the elimination rate constants (ks and ke, respectively — see below) are termed kinetic bioaccumulation factor (BAFK). | Bioconcentration is the increase in concentration of the test substance in or on an organism, resulting exclusively from uptake via the body surface, relative to the concentration of the test substance in the surrounding medium. | Biomagnification is the increase in concentration of the test substance in or on an organism, resulting mainly from uptake from contaminated food or prey, relative to the concentration of the test substance in the food or prey. Biomagnification can lead to a transfer or accumulation of the test substance within food webs. | The biota-sediment accumulation factor (BSAF) is the lipid-normalised steady state concentration of test substance in/on the test organism divided by the organic carbon-normalised concentration of the substance in the sediment at steady state. Ca is then expressed as g kg– 1 lipid content of the organism, and Cs as g kg– 1 organic content of the sediment. | The conditioning period is used to stabilise the microbial component of the sediment and to remove e.g. ammonia originating from sediment components; it takes place prior to spiking of the sediment with the test substance. Usually, the overlying water is discarded after conditioning. | The elimination of a test substance is the loss of this substance from the test organism tissue by active or passive processes that occurs independently of presence or absence of the test substance in the surrounding medium. | The elimination phase is the time, following the transfer of the test organisms from a contaminated medium to a medium free of the test substance, during which the elimination (or the net loss) of the substance from the test organisms is studied. | The elimination rate constant (ke) is the numerical value defining the rate of reduction in the concentration of the test substance in/on the test organism, following the transfer of the test organisms from a medium containing the test substance to a chemical-free medium; ke is expressed in d– 1. | The equilibration period is used to allow for distribution of the test substance between the solid phase, the pore water and the overlying water; it takes place after spiking of the sediment with the test substance and prior to addition of the test organisms. | The octanol-water partitioning coefficient (Kow) is the ratio of substance's solubility in n-octanol and in water at equilibrium, also sometimes expressed as Pow. The logarithm of Kow (log Kow) is used as an indication of a substance's potential for bioaccumulation by aquatic organisms. | The organic carbon-water partitioning coefficient (Koc) is the ratio of a substance's concentration in/on the organic carbon fraction of a sediment and the substance's concentration in water at equilibrium. | Overlying water is the water lying on top of the sediment in the test vessel. | A plateau or steady state is defined as the equilibrium between the uptake and elimination processes that occur simultaneously during the exposure phase. The steady state is reached in the plot of the BAF at each sampling period against time when the curve becomes parallel to the time axis and three successive analyses of BAF made on samples taken at intervals of at least two days are within 20 % of each other, and there are no statistically significant differences among the three sampling periods. For test substances which are taken up slowly, more appropriate intervals would be seven days (5). | Pore water or interstitial water is the water occupying space between sediment or soil particles. | The sediment uptake rate constant (ks) is the numerical value defining the rate of increase in the concentration of the test substance in/on the test organism resulting from uptake from the sediment phase. ks is expressed in g sediment kg– 1 of worm d– 1. | Spiked sediment is sediment to which test substance has been added. | The steady state bioaccumulation factor (BAFss) is the BAF at steady state and does not change significantly over a prolonged period of time, the concentration of the test substance in the surrounding medium (Cs as g kg– 1 of wet or dry weight of sediment) being constant during this period of time. | The uptake or exposure phase is the time during which the test organisms are exposed to the test substance. | Appendix 2 | Calculation of uptake and elimination parameters | The main endpoint of a bioaccumulation test is the bioaccumulation factor, BAF. The measured BAF can be calculated by dividing the concentration of the test substance in the test organism, Ca, by the concentration of the test substance in the sediment, Cs, at steady state. If the steady state is not reached during the uptake phase, the BAF is calculated in the same manner for day 28. However, it should be noted whether the BAF is based on steady state concentrations or not. | The preferred means for obtaining the kinetic bioaccumulation factor (BAFK), the sediment uptake rate constant (ks) and the elimination rate constant (ke) is to use non-linear parameter estimation methods on a computer. Given the time series of average accumulation factors (Ca, mean values of each sampling date/Cs, mean values of each sampling date = AF) of the uptake phase based on worm and sediment wet weight, and the model equation | AF(t) = BAF × (1 – eke × t) | [equation 1] | where AF(t) is the ratio of concentration of the test substance in worms and its concentration in the sediment at any given time point (t) of the uptake phase, these computer programs calculate values for BAFK, ks and ke. | When steady state is reached during the uptake phase (i.e. t = ∞), equation 1 may be reduced to: | [equation 2] | where | ks | = | uptake rate constant in tissue [g sediment kg– 1 of worm d– 1] | ke | = | elimination rate constant [d– 1] | Then ks/ke × Cs is an approach to the concentration of the test substance in the worm tissue at steady state (Ca,ss). | The Biota-Sediment Accumulation Factor (BSAF) should be calculated as follows: | where foc is the fraction of sediment organic carbon, and flip is the fraction of worm lipid, both based either on dry weight, or on wet weight. | Given a time series of concentration values, the elimination kinetics can be modelled using the following model equations and a computer calculation based non-linear parameter estimation method. | The mean measured body residue at the end of the uptake phase is recommended as the default starting point. The value modeled/estimated from the uptake phase should only be used, e.g. if the measured value deviates significantly from the modelled body residue. See also paragraph 50 for alternative pre-exposure of worms designated for elimination; with this approach, samples of these pre-exposed worms on day 0 of the elimination phase are thought to provide a realistic body residue to start the elimination kinetics with. | If the data points plotted against time indicate a constant exponential decline of the test substance concentration in the animals, a one-compartment model (equation 4) can be used to describe the time course of elimination. | [equation 3] | Elimination processes sometimes appear to be biphasic, showing a rapid decline of Ca during the early phases, that changes to a slower loss of test substances in the later phases of the elimination (8)(19)(25)). The two phases can be interpreted by the assumption, that there are two different compartments in the organism, from which the test substance is lost with different velocity. In these cases specific literature should be studied (15)(16)(17)(25). | A two-compartment elimination is described e.g. by the following equation (25): | [equation 4] | A and B represent the size of the compartments (in percent of overall tissue residue), where A is the compartment with rapid loss of substance, and B the compartment with slow loss of test substance. The sum of A and B equals 100 % of the whole animal compartment volume at steady state. ka and kb represent the corresponding elimination constants [d– 1]. If the two compartment model is fitted to the depuration data, the uptake rate constant ks may be determined as follows (53)(54): | [equation 5] | Nevertheless, these model equations should be used with caution, especially when changes in the test substance's bioavailability occur during the test (42). | As an alternative to the model equations described above, the kinetics (ks and ke) may also be calculated in one run by applying the first order kinetics model to all data from both the uptake and elimination phase together. For a description of a method that may allow for such a combined calculation of uptake and elimination rate constants, references (55), (56) and (57) may be consulted. | The Non-Eliminated Residues (NER) should be calculated as a secondary endpoint by multiplying the ratio of the average concentration in the worms (Ca) on day 10 of the elimination phase and the average concentration in the worms (Ca) at steady state (day 28 of uptake phase) by 100: | Appendix 3 | Example of a Sampling Schedule for a 28-day Bioaccumulation Test | a) Uptake phase (including a 4 d- equilibration phase) | Day | Activities | – 6 | Preparation of peat suspension for sediment; conditioning of the suspension for 48 h; | – 4 | Spiking of the sediment or sediment fraction; mixing of all sediment constituents; removing sediment samples of treated and solvent control sediment for determination of test substance concentration; addition of overlying water; incubation at test conditions (equilibration phase); | – 3/– 2 | Separation of the test organisms from the culture for acclimatisation; | 0 | Measurement of water quality (see paragraph 52); removing replicates for taking samples of water and sediment for determination of test substance concentration; randomised distribution of the worms to the test chambers; retaining of sufficient sub-samples of worms for determination of analytical background values; controlling air supply, if closed test system is used; | 1 | Remove replicates for sampling; controlling air supply, worm behaviour, water quality (see paragraph 56); taking water, sediment and worm samples for determination of test substance concentration; | 2 | Controlling air supply, worm behaviour and temperature; | 3 | Same as day 1; | 4 - 6 | Same as day 2; | 7 | Same as day 1; compensate evaporated water if necessary; | 8 - 13 | Same as day 2; | 14 | Same as day 1; compensate evaporated water if necessary; | 15 - 20 | Same as day 2; | 21 | Same as day 1; compensate evaporated water if necessary; | 22 - 27 | Same as day 2; | 28 | Same as day 1; measurement of water quality (see paragraph 52); end of uptake phase; retaining of sufficient subsamples of worms for determination of analytical background values, wet and dry weight, and lipid content; transfer worms from remaining exposed replicates to vessels containing clean sediment for elimination phase (no gut-purging); sampling of water, sediment and worms from solvent controls; sampling of trapping solutions, if installed. | | Pre-exposure activities (equilibration phase) should be scheduled taking into account the properties of the test substance. If required, conditioning of the prepared sediment under overlying water at 20 ± 2 °C for 7 days; in this case, earlier preparation of the sediment! | | Activities described for day 2 should be performed daily (at least on workdays). | b) Elimination phase | Day | Activities | – 6 | Preparation of peat suspension for sediment; conditioning of the suspension for 48 h; | – 4 | Mixing of all sediment constituents; removing sediment samples of treated and solvent control sediment for determination of test substance concentration; addition of overlying water; incubation at test conditions; | 0 (day 28 of uptake phase) | Measurement of water quality (see paragraph 52); transfer worms from remaining exposed replicates to vessels containing clean sediment; after 4 - 6 h removing replicates for taking samples of water, sediment and worms for determination of test substance concentration; randomised distribution of the worms to the test chambers; | 1 | Remove replicates for sampling; controlling air supply, worm behaviour, water quality (see paragraph 52); taking water, sediment and worm samples for determination of test substance concentration; | 2 | Controlling air supply, worm behaviour and temperature; | 3 | Same as day 1; | 4 | Same as day 2; | 5 | Same as day 1; | 6 | Same as day 2; | 7 | Same as day 1; compensate evaporated water if necessary; | 8 - 9 | Same as day 2; | 10 | Same as day 1; end of elimination phase; measurement of water quality (see paragraph 52); sampling of water, sediment and worms from solvent controls; sampling of trapping solutions, if installed. | | Preparation of the sediment prior to start of elimination phase should be done in the same manner as before the uptake phase. | | Activities described for day 2 should be performed daily (at least on workdays). | Appendix 4 | Some physical-chemical characteristics of an acceptable dilution water | CONSTITUENT | CONCENTRATIONS | Particular matter | < 20 mg/l | Total organic carbon | < 2μg/l | Unionised ammonia | < 1 μg/l | Residual chlorine | < 10 μg/l | Total organophosphorous pesticides | < 50 ng/l | Total organochlorine pesticides plus polychlorinated biphenyls | < 50 ng/l | Total organic chlorine | < 25 ng/l | COMPOSITION OF THE RECOMMENDED RECONSTITUTED WATER | (a) | Calcium chloride solution | Dissolve 11,76 g CaCl2·2H2O in deionised water; make up to 1 l with deionised water | (b) | Magnesium sulphate solution | Dissolve 4,93 g MgSO4·7H2O in deionised water; make up to 1 l with deionised water | (c) | Sodium bicarbonate solution | Dissolve 2,59 g NaHCO3 in deionised water; make up to 1 l with deionised water | (d) | Potassium chloride solution | Dissolve 0,23 g KCl in deionised water; make up to 1 l with deionised water | All chemicals must be of analytical grade. | The conductivity of the distilled or deionised water should not exceed 10 μScm– 1. | 25 ml each of solutions (a) to (d) are mixed and the total volume made up to 1 l with deionised water. The sum of the calcium and magnesium ions in this solution is 2,5 mmol/l. | The proportion Ca:Mg ions is 4:1 and Na:K ions 10:1. The acid capacity KS4.3 of this solution is 0,8 mmol/l. | Aerate the dilution water until oxygen saturation is achieved, then store it for approximately two days without further aeration before use. | The pH of an acceptable dilution water should be in the range of 6 - 9. | Appendix 5 | Artificial sediment — preparation and storage recommendations | In contrast to the requirements in test method C.8 (40) the peat content of the artificial sediment is recommended to be 2 % instead of 10 % of dry weight, in order to correspond to a low to moderate organic content of natural sediments (58). | Percentage of dry constituents of the artificial sediment: | Constituent | Characteristics | % of dry sediment | Peat | Sphagnum moss peat, degree of decomposition: “medium”, air dried, no visible plant remains, finely ground (particle size ≤ 0,5 mm) | 2 ± 0,5 | Quartz sand | Grain size: ≤ 2 mm, but > 50 % of the particles should be in the range of 50-200 μm | 76 | Kaolinite clay | Kaolinite content ≥ 30 % | 22 ± 1 | Food source | Folia urticae, powdered leaves of Urtica sp. (stinging nettle), finely ground (particle size ≤ 0,5 mm), or a mixture of powdered leaves of Urtica sp. with alpha-cellulose (1:1); in accordance with pharmacy standards, for human consumption; in addition to dry sediment | 0,4 - 0,5 % | Calcium carbonate | CaCO3, pulverised, chemically pure, in addition to dry sediment | 0,05 - 1 | Deionised Water | Conductivity ≤ 10 μS/cm, in addition to dry sediment | 30 - 50 | If elevated ammonia concentrations are expected, e.g. if the test substance is known to inhibit the nitrification, it may be useful to replace 50 % of the nitrogen-rich urtica powder by cellulose (e.g., α-Cellulose powder, chemically pure, particle size ≤ 0,5 mm). | Preparation | The peat is air-dried and ground to a fine powder (grain size ≤ 0,5 mm, no visible plant remains). A suspension of the required amount of peat powder is prepared using a portion of the deionised water to be added to the dry sediment (a water volume of 11,5 × dry weight of peat has been found useful to produce a stirrable peat slurry (8)) using a high-performance homogenising device. | The pH of this suspension is adjusted to 5,5 ± 0,5 with CaCO3. The suspension is conditioned for at least two days with gentle stirring at 20 ± 2 °C, to stabilise pH and establish a stable microbial component. The pH is measured again and is adjusted to 6,0 ± 0,5 with CaCO3 if necessary. Then all of the suspension is mixed with the other dry constituents, taking into account any portion used for spiking. The remaining deionised water is added to obtain a homogeneous sediment. The pH is measured again and is adjusted to 6,5 to 7,5 with CaCO3 if necessary. However, if ammonia development is expected, it may be useful to keep the pH of the sediment below 7,0 (e.g. between 6,0 and 6,5). Samples of the sediment are taken to determine the dry weight and the organic carbon content. If ammonia development is expected, the artificial sediment may be conditioned for seven days under the same conditions which prevail in the subsequent test (e.g. sediment-water ratio 1: 4, height of sediment layer as in test vessels) before it is spiked with the test substance, i.e. it should be topped with water, which should be aerated. At the end of the conditioning period, the overlying water should be removed and discarded. Samples of the sediment are taken to determine dry weight and total organic carbon content (e.g. 3 samples). | Thereafter, the spiked quartz sand is mixed with the sediment for each treatment level, the sediment is distributed to the replicate test vessels, and topped with the test water (e.g. sediment-water ratio 1 : 4, height of sediment layer as in test vessels). The vessels are then incubated at the same conditions which prevail in the subsequent test. This is where the equilibration period starts. The overlying water should be aerated. | The chosen food source should be added prior to or during spiking the sediment with the test substance. It can be mixed initially with the peat suspension (see above). However, excessive degradation of the food source prior to addition of the test organisms — e.g. in case of long equilibration period — can be avoided by keeping the time period between food addition and start of exposure as short as possible. In order to ensure that the food is in sufficient contact with the test substance, the food source should be mixed with the sediment not later than on the day the test substance is spiked to the sediment. Exceptions may be made where the length of the equilibration period leads to excessive microbial degradation of the food before the test organisms are added. Samples of the sediment are taken to determine dry weight and total organic carbon (e.g. 3 samples of spiked or control sediment). | The dry weight of the components (peat, sand, kaolin) should be reported in g and in per cent of total dry weight. | The volume of water to be added to the dry components during preparation of the sediment should also be reported in per cent of total dry weight (e.g. 100 % dry weight + 46 % water means 1 000 g d.w. receive a total of 460 ml water, which results in 1 460 g wet sediment). | Storage | The dry constituents of the artificial sediment may be stored in a dry, cool place at room temperature. The prepared, wet sediment may be stored (for further use in the culture only) at 4 ± 2 °C in the dark for a period of 2 to 4 weeks from the day of preparation (8). | Sediment spiked with the test substance should be used immediately unless there is information indicating that the particular sediment can be stored without affecting the toxicity and bioavailability of the test substance. Samples of spiked sediment may be stored under the conditions recommended for the particular test substance until analysis. | Appendix 6 | Oligochaetes species recommended for bioaccumulation testing | Tubifex tubifex (MÜLLER),Tubificidae, Oligochaeta | The tubificid oligochaete (Tubificidae, Oligochaeta) Tubifex tubifex (Müller) lives in freshwater sediments in tubes which are lined with mucus. In these tubes the worms dwell head down, ingesting sediment particles utilising the associated microorganisms and organic debris. The posterior portion usually undulates in the overlying water for respiration purposes. Although this species inhabits a wide range of sediment types all over the northern hemisphere, Tubifex tubifex prefers relatively fine grain sizes (59). The suitability of this species for ecotoxicological testing is described for example in (8)(29)(31)(39)(60)(62)(63). | Culture methods | In order to have a sufficient number of Tubifex tubifex for conducting bioaccumulation tests the worms have to be kept in permanent laboratory culture. A system consisting of artificial sediment based on the artificial soil according to Test Method C.8 (40) and reconstituted water according to test method C.1 is recommended for T. tubifex culture (8). | Glass or stainless steel containers with a height of 12 to 20 cm can be used as culture vessels. Each culture container is loaded with a layer of wet artificial sediment prepared as described in Appendix 5. The depth of the sediment layer should allow for natural burrowing behaviour of the worms (2 cm minimum depth for T. tubifex). Reconstituted water is added to the system. Care should be taken to minimise disturbing the sediment. The water body is gently aerated (e.g. 2 bubbles per second with 0,45 μm-filtered air) via a pasteur pipette positioned 2 cm above the sediment surface. The recommended culture temperature is 20 ± 2 °C. | The worms are added to the culture system with a maximum loading of 20 000 individuals/m2 sediment surface. A higher loading may cause a reduction in growth and reproduction rates (43). | In artificial sediment cultures, the worms have to be fed. A diet consisting of finely ground fish food, e.g. TetraMin® can serve as additional nutrition (8); Klerks 1994, personal communication. The feeding rates should allow for sufficient growth and reproduction and should keep build-up of ammonia and fungal growth in the culture at a minimum. Food may be administered twice a week (e.g. 0,6 - 0,8 mg per cm2 of sediment surface). Practical experience has shown that application of food suspended and homogenised in deionised water may facilitate homogeneous food distribution on the sediment surface in the culture containers. | To avoid accumulation of ammonia, the overlying water should be exchanged using a flow-through system, or, at least once a week, manually. Sediment should be changed every three months in the stock cultures. | Sampling of worms from the culture can be done by sieving the culture sediment through a 1 mm sieve if only adults are required. For retaining cocoons a 0,5 mm mesh, and for juvenile worms a 0,25 mm sieve is suitable. The sieves can be placed into reconstituted water after the sediment has passed through. The worms leave the mesh and can then be picked from the water using a soft steel forceps or a pipette with fire-polished edges. | Only intact and clearly identified specimens of Tubifex tubifex (e.g. (64)) are used to start a test or new cultures. Diseased or injured worms as well as cocoons infested with fungal hyphae have to be discarded. | A synchronised culture can provide worms of a specified age in suitable intervals when desired. New culture vessels are set up in the chosen intervals (e.g. every two weeks), starting with animals of a certain age (e.g. cocoons). At the culture conditions described here the worms are adult after 8 - 10 weeks. The cultures can be harvested, when the worms have laid new cocoons, e.g. after ten weeks. The sampled adults can be used for tests, and new cultures can be started with the cocoons. | Lumbriculus variegatus (MÜLLER), Lumbriculidae, Oligochaeta | Lumbriculus variegatus (Lumbriculidae, Oligochaeta) is also an inhabitant of freshwater sediments worldwide and is widely used in ecotoxicological testing. Information on the biology, culture conditions, and sensitivity of the species can be obtained from (1)(6)(9)(36). Lumbriculus variegatus can also be cultured in the artificial sediment recommended for T. tubifex according to (8) within certain limitations. Since, in nature L. variegatus prefers more coarse sediments than T. tubifex (59), laboratory cultures with the artificial sediment used for T. tubifex may cease after 4 to 6 months. Practical experience has shown that L. variegatus can be held in a sandy substratum (e.g. quartz sand, fine gravel) in a flow-through system using fish food as nutritional source over several years without renewing the substratum. A major advantage of L. variegatus over other aquatic oligochaete species is its quick reproduction, resulting in rapidly increasing biomass in laboratory-cultured populations (1)(6)(9)(10). | Culture methods | Culture conditions for Lumbriculus variegatus are outlined in detail in Phipps et al. (1993) (10), Brunson et al. (1998) (28), ASTM (2000) (1), U.S. EPA (2000) (6). A short summary of these conditions is given below. | The worms can be cultured in large aquaria (57 - 80 l) at 23 °C with a 16L:8D photoperiod (100 - 1 000 lux) using daily renewed natural water (45 - 50 l per aquarium). The substrate is prepared by cutting unbleached brown paper towels into strips, which may then be blended with culture water for a few seconds to result in small pieces of paper substrate. This substrate can then directly be used in the Lumbriculus culture aquaria by covering the bottom area of the tank, or be stored frozen in deionised water for later use. New substrate in the tank will generally last for about two months. | Each worm culture is started with 500 - 1 000 worms, and fed a 10 ml suspension containing 6 g of trout starter food 3 times per week under renewal or flow-through conditions. Static or semi-static cultures should receive lower feeding rates to prevent bacterial and fungal growth. Food and paper substrate should be analysed for the substances to be used in bioaccumulation tests. | Under these conditions the number of individuals in the culture generally doubles in about 10 to 14 d. | Lumbriculus variegatus can be removed from the cultures e.g. by transferring substrate with a fine mesh net, or organisms using a fire polished wide mouth (about 5 mm diameter) glass pipette, to a separate beaker. If substrate is co-transferred to this beaker, the beaker containing worms and substrate is left overnight under flow-through conditions, which will remove the substrate from the beaker, while the worms remain at the bottom of the vessel. They can then be introduced to newly prepared culture tanks, or processed further for the test as outlined in (1) and (6). Injuries or autotomy in the worms should be prevented, e.g. by using pipettes with fire polished edges, or stainless steel picks for handling these worms. | An issue to be regarded critically when using L. variegatus in sediment bioaccumulation tests is its reproduction mode (architomy followed by morphallaxis). This asexual reproduction results in two fragments, which do not feed for a certain period until the head or tail part is regenerated (e.g. (36)(37)). This means that in L. variegatus sediment and contaminant uptake via ingestion may not take place continuously as in tubificids, which do not reproduce by fragmentation. | Therefore, a synchronisation should be performed to minimise uncontrolled reproduction and regeneration, and subsequent high variation in test results. Such variation can occur, when some individuals, which have fragmented and therefore do not feed for a certain time period, are less exposed to the test substance than other individuals, which do not fragment during the test, e.g. (38). 10 to 14 days before the start of exposure, the worms should be artificially fragmented (synchronisation) (65). Large worms should be used, which preferably do not show signs of recent fragmentation. These worms can be placed onto a glass slide in a drop of culture water, and dissected in the median body region with a scalpel. Care should be taken that the posterior ends are of similar size. The posterior ends should then be left to regenerate new heads in a culture vessel containing the same substrate as used in the culture and reconstituted water until the start of exposure. Regeneration of new heads is indicated when the synchronised worms are burrowing in the substrate (presence of regenerated heads may be confirmed by inspecting a representative subsample under a binocular microscope). The test organisms are thereafter expected to be in a similar physiological state. This means, that when regeneration by morphallaxis occurs in synchronised worms during the test, virtually all animals are expected to be equally exposed to the spiked sediment. Feeding of the synchronised worms should be done as soon as the worms are starting to burrow in the substrate, or 7 d after dissection. The feeding regimen should be comparable to the regular cultures, but it may be advisable to feed the synchronised worms with the same food source as is to be used in the test. The worms should be held at test temperature, at 20 ± 2 °C. After regenerating, intact complete worms of similar size, which are actively swimming or crawling upon a gentle mechanical stimulus, should be used for the test. Injuries or autotomy in the worms should be prevented, e.g. by using pipettes with fire polished edges, or stainless steel picks for handling these worms. | When using Lumbriculus variegatus in the test, due to the specific reproduction mode of this species, an increase of the number of worms should occur during the test, if conditions are appropriate (6). A lack of reproduction in a bioaccumulation test with L. variegatus should be recorded, and considered when interpreting the test results. | Branchiura sowerbyi (BEDDARD), Tubificidae, Oligochaeta (not validated in ring test) | Branchiura sowerbyi inhabits a variety of sediment types of reservoirs, lakes, ponds and rivers, originally in tropical areas. They can be also found in warm water bodies of the northern hemisphere. However, they are more abundant in mud-clay sediments with high organic matter content. Furthermore, the worms are living in the sediment layer. Even the posterior end of the worms is usually burrowed. This species is easily identified from the gill filaments on their posterior part. The adults can reach a length of 9 - 11 cm and a wet weight of 40-50 mg. The worms have a high rate of reproduction, show population doubling times of less than 2 weeks and under the conditions of temperature and feeding described below (Aston et al., 1982, (65)). B. sowerbyi has been used both in toxicity and bioaccumulation studies (Marchese & Brinkhurst 1996, (31) Roghair et al. 1996, (67) respectively). | Culture methods | A summary of culture conditions for Branchiura sowerbyi is given below (provided by Mercedes R. Marchese, INALI, Argentina, and Carla J. Roghair, RIVM, The Netherlands). | No single technique for culturing the test organisms is required. The organisms can be cultured using uncontaminated, natural sediment (31). Practical experience showed that a medium consisting of natural sediment and sand improves the condition of the worms compared to pure natural sediment (32)(67). 3 L-beakers containing 1 500 ml sediment/water medium, consisting of 375 ml of natural uncontaminated sediment (about 10 % Total Organic Carbon; about 17 % of the particles ≤ 63 μm), 375 ml of clean sand (M32), and 750 ml of reconstituted or dechlorinated tap water can be used for the culture (31)(32)(67). Paper towels also can be used as a substrate for culturing, but population growth is lower than in natural sediment. In semi-static systems the water layer in the beaker is slowly aerated, and the overlying water should be renewed weekly. | Each beaker contains 25 young worms to start with. After two months the large worms are picked out of the sediment with a pair of tweezers and are put in a new beaker with freshly made sediment/water medium. The old beaker also contains cocoons and young worms. Up to 400 young worms per beaker can be harvested in this way. Adults worms can be used for reproduction for at least one year. | The cultures should be maintained at a temperature of 21 to 25 °C. Variation of temperature should be kept below ± 2 °C. The time required for embryonic development from an egg being laid until the young leaves the cocoon is approximately three weeks at 25 °C. The egg production obtained per surviving worm in B. sowerbyi was found to range from 6,36 (31) to 11,2 (30) in mud at 25 °C. The number of eggs per cocoon ranges from 1,8 to 2,8 (66)(69) or up to 8 (68). | Dissolved oxygen, water hardness, temperature, and pH should be measured weekly. Fish food (e.g. TetraMin®) can be added as suspension two or three times per week ad libitum. The worms can also be fed with thawed lettuce ad libitum. | A major advantage of this species is the high individual biomass (up to 40 - 50 mg wet weight per individual). Therefore this species may be used for testing bioaccumulation of non-radiolabelled test substances. It can be exposed in the systems used for T. tubifex or L. variegatus with a single individual per replicate (11). Replication, however, should then be increased, unless larger test chambers are used (11). Also, the validity criterion related to burrowing behaviour needs to be adjusted for this species. | LITERATURE | (1) | ASTM International (2000). Standard guide for the determination of the bioaccumulation of sediment-associated contaminants by benthic invertebrates, E 1688-00a. In ASTM International 2004 Annual Book of Standards. Volume 11.05. Biological Effects and Environmental Fate; Biotechnology; Pesticides. ASTM International, West Conshohocken, PA. | (2) | European Commission (EC) (2003). Technical Guidance Document on Risk Assessment in support of Commission Directive 93/67/EEC on Risk Assessment for new notified substances, Commission Regulation (EC) No 1488/94 on Risk Assessment for existing substances and Directive 98/8/EC of the European Parliament and of the Council concerning the placing of biocidal products on the market; Part I - IV. Office for Official Publications of the European Communities, Luxembourg. | (3) | OECD (1992a). Report of the OECD workshop on effects assessment of chemicals in sediment. OECD Monographs No. 60. Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD), Paris. | (4) | Ingersoll, C.G., Ankley, G.T., Benoit D.A., Brunson, E.L., Burton, G.A., Dwyer, F.J., Hoke, R.A., Landrum, P. F., Norberg-King, T. J. and Winger, P.V. (1995). Toxicity and bioaccumulation of sediment-associated contaminants using freshwater invertebrates: A review of methods and applications. Environ. Toxicol. Chem. 14, 1885-1894. | (5) | Chapter C.13 of this Annex, Bioconcentration Flow Thorough Fish test. | (6) | U.S. EPA (2000). Methods for measuring the toxicity and bioaccumulation of sediment-associated contaminants with freshwater invertebrates. Second Edition. EPA 600/R-99/064, U.S. Environmental Protection Agency, Duluth, MN, March 2000. | (7) | Chapter C.27 of this Annex, Sediment water Chironomid toxicity test using spliked sediment | (8) | Egeler, Ph., Römbke, J., Meller, M., Knacker, Th., Franke, C., Studinger, G. & Nagel, R. (1997). Bioaccumulation of lindane and hexachlorobenzene by tubificid sludgeworms (Oligochaeta) under standardised laboratory conditions. Chemosphere 35, 835-852. | (9) | Ingersoll, C.G., Brunson, E.L., Wang N., Dwyer, F.J., Ankley, G.T., Mount D.R., Huckins J., Petty. J. and Landrum, P. F. (2003). Uptake and depuration of nonionic organic contaminants from sediment by the oligochaete, Lumbriculus variegatus. Environmental Toxicology and Chemistry 22, 872-885. | (10) | Phipps, G.L., Ankley, G.T., Benoit, D.A. and Mattson, V.R. (1993). Use of the aquatic Oligochaete Lumbriculus variegatus for assessing the toxicity and bioaccumulation of sediment-associated contaminants. Environ.Toxicol. Chem. 12, 269-279. | (11) | Egeler, Ph., Römbke, J., Knacker, Th., Franke, C. & Studinger, G. (1999). Workshop on “Bioaccumulation: Sediment test using benthic oligochaetes”, 26.-27.04.1999, Hochheim/Main, Germany. Report on the R+D-project No. 298 67 419, Umweltbundesamt, Berlin. | (12) | Egeler, Ph., Meller, M., Schallnaß, H.J. & Gilberg, D. (2006). Validation of a sediment bioaccumulation test with endobenthic aquatic oligochaetes by an international ring test. Report to the Federal Environmental Agency (Umweltbundesamt Dessau), R&D No.: 202 67 437. | (13) | Kelly, J.R., Levine, S.N., Buttel, L.A., Kelly, A.C., Rudnick, D.T. & Morton, R.D. (1990). Effects of tributyltin within a Thalassia seagrass ecosystem. Estuaries 13, 301-310. | (14) | Nendza, M. (1991). QSARs of bioaccumulation: Validity assessment of log Kow/log BCF correlations. In: R. Nagel and R. Loskill (eds.): Bioaccumulation in aquatic systems. Contributions to the assessment. Proceedings of an international workshop, Berlin 1990. VCH, Weinheim | (15) | Landrum, P.F., Lee II, H., & Lydy, M.J. (1992). Toxicokinetics in aquatic systems: Model comparisons and use in hazard assessment. Environ. Toxicol. Chem. 11, 1709-1725. | (16) | Markwell, R.D., Connell, D.W. & Gabric, A.J. (1989). Bioaccumulation of lipophilic compounds from sediments by oligochaetes. Wat. Res. 23, 1443-1450. | (17) | Gabric, A.J., Connell, D.W. & Bell, P.R.F. (1990). A kinetic model for bioconcentration of lipophilic compounds by oligochaetes. Wat. Res. 24, 1225-1231. | (18) | Kukkonen, J. and Landrum, P.F. (1994). Toxicokinetics and toxicity of sediment-associated Pyrene to Lumbriculus variegatus (Oligochaeta). Environ. Toxicol. Chem. 13, 1457-1468. | (19) | Franke, C., Studinger, G., Berger, G., Böhling, S., Bruckmann, U., Cohors-Fresenborg, D. and Jöhncke, U. (1994). The assessment of bioaccumulation. Chemosphere 29, 1501-1514. | (20) | OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. OECD Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 23. | (21) | U.S. EPA (1996). Special Considerations for Conducting Aquatic Laboratory Studies. Ecological Effects Test Guidelines. OPPTS 850.1000. Public Draft. EPA 712-C-96-113. U.S. Environmental Protection Agency. | (22) | The following chapters of this Annex: | Chapter A.4, vapour pressure | Chapter A.5, Surface tension | Chapter A.6, Water solubility | Chapter A.8, Partition coefficient, shake flask method | Chapter A.24, Partition coefficient, HPLC method | Chapter C.7, degradation — abiotic degradation: hydrolysis as a function of pH | Chapter C.4 A-F Determination of ready biodegradability | Chapter C.19, Estimation of the adsorption coefficient (Koc ) on soil and on sewage sludge using high performance liquid chromatography (HPLC) | Chapter C.29, Ready biodegradability CO2 in sealed vessels | (23) | OECD (1996). Direct phototransformation of chemicals in water. Environmental Health and Safety Guidance Document Series on Testing and Assessment of Chemicals No. 3. OECD, Paris. | (24) | Antoine, M.D., Dewanathan, S. & Patonay, G. (1991). Determination of critical micelles concentration of surfactants using a near-infrared hydrophobicity probe. Microchem. J. 43, 165-172. | (25) | Beek, B., S. Boehling, U. Bruckmann, C. Franke, U. Joehncke & G. Studinger (2000). The assessment of bioaccumulation. In Hutzinger, O. (editor), The Handbook of Environmental Chemistry, Vol. 2 Part J (Vol. editor: B. Beek): Bioaccumulation — New Aspects and Developments. Springer-Verlag Berlin Heidelberg: 235-276. | (26) | Spacie, A. & Hamelink, J.L. (1982). Alternative models for describing the bioconcentration of organics in fish. Environ. Toxicol. Chem. 1, 309-320. | (27) | Hawker, D.W. & Connell, D.W. (1988). Influence of partition coefficient of lipophilic compounds on bioconcentration kinetics with fish. Wat. Res. 22, 701-707. | (28) | Brunson, E.L., Canfield, T.J., Ingersoll, C.J. & Kemble, N.E. (1998). Assessing the bioaccumulation of contaminants from sediments of the Upper Mississippi river using field-collected oligochaetes and laboratory-exposed Lumbriculus variegatus. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 35, 191-201. | (29) | Reynoldson, T.B., Thompson, S.P. and Bamsey, J.L. (1991). A sediment bioassay using the tubificid oligochaete worm Tubifex tubifex. Environ. Toxicol. Chem. 10, 1061-1072. | (30) | Aston, R.J. & Milner, A.G.P. (1981). Conditions for the culture of Branchiura sowerbyi (Oligochaeta: Tubificidae) in activated sludge. Aquaculture 26, 155-160. | (31) | Marchese, M.R. & Brinkhurst, R.O. (1996). A comparison of two tubificid species as candidates for sublethal bioassay tests relevant to subtropical and tropical regions. Hydrobiologia 334, 163-168. | (32) | Roghair, C.J. & Buijze, A. (1994). Development of sediment toxicity tests. IV. A bioassay to determine the toxicity of field sediments to the oligochaete worm Branchiura sowerbyi. RIVM Report 719102027. | (33) | Chapter C.1 of this Annex, Fish, Acute Toxicity Test. | (34) | OECD (1992c). Guidelines for Testing of Chemicals No. 210. Fish, Early-life Stage Toxicity Test. OECD, Paris. | (35) | Kaster, J.L., Klump, J.V., Meyer, J., Krezoski, J. & Smith, M.E. (1984). Comparison of defecation rates of Limnodrilus hoffmeisteri using two different methods. Hydrobiologia 11, 181-184. | (36) | Leppänen, M.T. & Kukkonen, J.V.K. 1998: Factors affecting feeding rate, reproduction and growth of an oligochaete Lumbriculus variegatus (Müller). Hydrobiologia 377: 183-194. | (37) | Leppänen, M.T. & Kukkonen, J.V.K. 1998: Relationship between reproduction, sediment type and feeding activity of Lumbriculus variegatus (Müller): Implications for sediment toxicity testing. Environ. Toxicol. Chem. 17: 2196-2202. | (38) | Leppänen M.T. & Kukkonen J.V.K. (1998). Relative importance of ingested sediment and porewater as bioaccumulation routes for pyrene to oligochaete (Lumbriculus variegatus, Müller). Environ. Sci. Toxicol. 32, 1503-1508. | (39) | Martinez-Madrid, M., Rodriguez, P., Perez-Iglesias, J.I. & Navarro, E. (1999). Sediment toxicity bioassays for assessment of contaminated sites in the Nervion river (Northern Spain). 2. Tubifex tubifex (Müller) reproduction sediment bioassay. Ecotoxicology 8, 111-124. | (40) | Chapter C.8 of this Annex, Toxicity for Earthworms. | (41) | Environment Canada (1995). Guidance document on measurement of toxicity test precision using control sediments spiked with a reference toxicant. Environmental Protection Series Report EPS 1/RM/30. | (42) | Landrum, P.F. (1989). Bioavailability and toxicokinetics of polycyclic aromatic hydrocarbons sorbed to sediments for the amphipod Pontoporeia hoyi. Environ. Sci. Toxicol. 23, 588-595. | (43) | Poddubnaya, T.L. (1980). Life cycles of mass species of Tubificidae (Oligochaeta). In: R.O. Brinkhurst and D.G. Cook (eds.): Aquatic Oligochaeta Biology, 175-184. Plenum Press, New York. | (44) | ASTM (1998). Standard guide for collection, storage, characterisation, and manipulation of sediment for toxicological testing. American Society for Testing and Materials, E 1391-94. | (45) | Hooftman, R.N., van de Guchte, K. & Roghair, C.J. (1993). Development of ecotoxicological test systems to assess contaminated sediments. Joint report no. 1: Acute and (sub)chronic tests with the model compound chlorpyrifos. RIVM-719102022. | (46) | Franke, C. (1996). How meaningful is the bioconcentration factor for risk assessment?. Chemosphere 32, 1897-1905. | (47) | Mount, D.R., Dawson, T.D. & Burkhard, L.P. (1999). Implications of gut purging for tissue residues determined in bioaccumulation testing of sediment with Lumbriculus variegatus. Environ. Toxicol. Chem. 18, 1244-1249. | (48) | Randall, R.C., Lee II, H., Ozretich, R.J., Lake, J.L. & Pruell, R.J. (1991). Evaluation of selected lipid methods for normalising pollutant bioaccumulation. Environ.Toxicol. Chem. 10, 1431-1436. | (49) | Gardner, W.S., Frez, W.A., Cichocki, E.A. & Parrish, C.C. (1985). Micromethods for lipids in aquatic invertebrates. Limnology and Oceanography, 30, 1099-1105. | (50) | Bligh, E.G. & Dyer, W.J. (1959). A rapid method of total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911-917. | (51) | De Boer, J., Smedes, F., Wells, D. & Allan, A. (1999). Report on the QUASH interlaboratory study on the determination of total-lipid in fish and shellfish. Round 1 SBT-2. Exercise 1000. EU, Standards, Measurement and Testing Programme. | (52) | Kristensen, P. (1991). Bioconcentration in fish: comparison of bioconcentration factors derived from OECD and ASTM testing methods; influence of particulate matter to the bioavailability of chemicals. Water Quality Institute, Denmark. | (53) | Zok, S., Görge, G., Kalsch, W. & Nagel, R. (1991). Bioconcentration, metabolism and toxicity of substituted anilines in the zebrafish (Brachydanio rerio). Sci. Total Environment 109/110, 411-421 | (54) | Nagel, R. (1988). Umweltchemikalien und Fische — Beiträge zu einer Bewertung. Habilitationsschrift, Johannes Gutenberg-Universität Mainz, Germany. | (55) | Janssen, M.P.M., A Bruins, T.H. De Vries & Van Straalen, N.M. (1991). Comparison of cadmium kinetics in four soil arthropod species. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 20: 305-312. | (56) | Van Brummelen, T.C. & Van Straalen, N.M. (1996). Uptake and elimination of benzo(a)pyrene in the terrestrial isopod Porcellio scaber. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 31: 277-285. | (57) | Sterenborg, I., Vork, N.A., Verkade, S.K., Van Gestel, C.A.M. & Van Straalen, N.M. (2003). Dietary zinc reduces uptake but not metallothionein binding and elimination of cadmium in the springtail Orchesella cincta. Environ. Toxicol. Chemistry 22: 1167-1171. | (58) | Suedel, B.C. and Rodgers, J.H. (1993). Development of formulated reference sediments for freshwater and estuarine sediment testing. Environ. Toxicol. Chem. 13, 1163-1175. | (59) | Wachs, B. (1967). Die Oligochaeten-Fauna der Fließgewässer unter besonderer Berücksichtigung der Beziehung zwischen der Tubificiden-Besiedlung und dem Substrat. Arch. Hydr. 63, 310-386. | (60) | Oliver, B. G. (1987). Biouptake of chlorinated hydrocarbons from laboratory-spiked and field sediments by oligochaete worms. Environ. Sci. Technol. 21, 785-790. | (61) | Chapman, P.M., Farrell, M.A. & Brinkhurst, R.O. (1982a). Relative tolerances of selected aquatic oligochaetes to individual pollutants and environmental factors. Aquatic Toxicology 2, 47-67. | (62) | Chapman, P.M., Farrell, M.A. & Brinkhurst, R.O. (1982b). Relative tolerances of selected aquatic oligochaetes to combinations of pollutants and environmental factors. Aquatic Toxicology 2, 69-78. | (63) | Rodriguez, P. & Reynoldson, T.B. (1999). Laboratory methods and criteria for sediment bioassessment. In: A. Mudroch, J.M. Azcue & P. Mudroch (eds.): Manual of Bioassessment of aquatic sediment quality. Lewis Publishers, Boca Raton, CRC Press LLC. | (64) | Brinkhurst, R.O. (1971). A guide for the identification of British aquatic oligochaeta. Freshw. Biol. Assoc., Sci. Publ. No. 22. | (65) | Egeler, Ph., Meller, M., Schallnaß, H.J. & Gilberg, D. (2005). Validation of a sediment toxicity test with the endobenthic aquatic oligochaete Lumbriculus variegatus by an international ring test. In co-operation with R. Nagel and B. Karaoglan. Report to the Federal Environmental Agency (Umweltbundesamt Berlin), R&D No.: 202 67 429. | (66) | Aston, R.J., Sadler, K. & Milner, A.G.P. (1982). The effect of temperature on the culture of Branchiura sowerbyi (Oligochaeta: Tubificidae) on activated sludge. Aquaculture 29, 137-145. | (67) | Roghair, C.J., Buijze, A., Huys, M.P.A., Wolters-Balk, M.A.H., Yedema, E.S.E. & Hermens, J.L.M. (1996). Toxicity and toxicokinetics for benthic organisms; II: QSAR for base-line toxicity to the midge Chironomus riparius and the tubificid oligochaete worm Branchiura sowerbyi. RIVM Report 719101026. | (68) | Aston, R.J. (1984). The culture of Branchiura sowerbyi (Tubificidae, Oligochaeta) using cellulose substrate. Aquaculture 40, 89-94. | (69) | Bonacina, C., Pasteris, A., Bonomi, G. & Marzuoli, D. (1994). Quantitative observations on the population ecology of Branchiura sowerbyi (Oligochaeta, Tubificidae). Hydrobiologia, 278, 267-274 | ’ |
